СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА ЭКЗОСОМ
METHOD FOR ISOLATION AND ANALYSIS OF EXOSOMES

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к методу для выделения внеклеточных везикул из биологических жидкостей животных и человека, а также идентификации молекул на их поверхности. Изобретение может быть использовано для различных диагностических целей, а также для оценки эффективности терапии.
Различные внеклеточные, окруженные мембраной везикулы, такие как экзосомы (диаметром 50-150 нм), простасомы (диаметром 50-500 нм) и микровезикулы (диаметром 100-1000 нм), выделяются в межклеточное пространство клетками различных тканей и органов в норме и при патологиях. Эти частицы можно обнаружить практически в любых биологических жидкостях, таких как культуральная среда для роста культур клеток, плазма крови, моча, синовиальная жидкость, спинномозговая жидкость, и др. Основной физиологической функцией экзосом считается перенос веществ и информации от клетки к клетке. Биохимический состав экзосом сохраняет черты сходства с клеткой-продуцентом, то есть эти везикулы содержат определенные специфические наборы молекул, включающие белки, липиды, метаболиты и нуклеиновые кислоты, характерные для материнских клеток. Неопластическая трансформация сопровождается активацией секреции экзосом, причем опухолевые экзосомы играют значимую роль в развитии заболевания. В настоящее время в многочисленных исследованиях продемонстрирована перспективность разработки методов диагностики различных заболеваний (в частности, онкологических) на основе анализа циркулирующих экзосом (Wan M, Ning B, Spiegel S, Lyon CJ, Hu TY. Tumor-derived exosomes (TDEs): How to avoid the sting in the tail. Med Res Rev. 2020 Jan; 40(1):385-412; Lee S, Mankhong S, Kang JH. Extracellular Vesicle as a Source of Alzheimer's Biomarkers: Opportunities and Challenges. Int J Mol Sci. 2019 Apr 8;20(7). pii: E1728), при этом многие методологические аспекты анализа экзосом с целью диагностики нуждаются в дальнейшей проработке.
Несмотря на известность ряда способов диагностики онкологических заболеваний на основе анализа содержимого экзосом, на сегодняшний день на рынке сохраняется потребность в новых, специфичных и эффективных способах их выделения или анализа.
Известны способы для очистки или выделения микровезикул и экзосом, включающие отбор биологической жидкости, взаимодействие жидкости с подложкой, имеющей поверхность с массивом экзосом-связывающих лигандов, обеспечивающих связывание экзосом или микровезикул с экзосом-связывающими лигандами и отделение подложки от жидкости с получением композиции или изолята экзосом или микровезикул. Причем каждый лиганд находится в форме, богатой электронами группы при рН 4-8, и массив экзосом-связывающих лигандов позволяет экзосомам или микровезикулам связываться с подложкой (см. RU 2748234, МПК G01N 1/18, опубл.  21.05.2021).
Однако предложенный способ не лишен недостатков, среди которых стоит выделить: 1) сложность модификации подложки массивом экзосом-связывающих лигандов; 2) отсутствие специфически экзосом-связывающих лигандов; 3) необходимость пробподготовки для удаления клеточного дебриса, загрязнения и микровезикул из жидкости до взаимодействия жидкости с подложкой.
Известен способ  выделения экзосом из плазмы крови, в котором используют комплексы СПМЧ/АптCD63, содержащие супермагнитные частицы (СПМЧ) диаметром 1 мкм, покрытые стрептавидином и ДНК аптамеры АптCD63, модифицированные молекулой биотина, при этом комплексы формируют путем инкубации 1 мкг СПМЧ, покрытых стрептавидином, и 5 наномоль АптCD63, модифицированных молекулой биотина, при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего комплексы СПМЧ/АптCD63 отмывают от несвязавшихся молекул аптамера фосфатно-солевым буфером, добавляют к плазме крови объемом 10-100 мкл и инкубируют в течение 10-12 часов при температуре +4°C с целью образования комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома, который может быть использован для последующего анализа экзосомальных белков методом проточной цитометрии (см. RU2741638, МПК C12N5/00, опубл. 28.01.2021).
Однако указанный способ обладает рядом недостатков, к которым можно отнести: 1) длительное время инкубации СПМЧ/АптCD63 с образцом для образования комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома; 2) необходимость инкубации СПМЧ/АптCD63 с образцом при температуре +4°C; 3) использование центрифугирования для отделения комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома от не связавшихся компонентов образца, что может приводить к необратимой адгезии (слипание) нескольких комплексов, что в свою очередь может искажать последующих качественный и количественный анализ; 4) использование достаточно крупных СПМЧ (диаметр 1 мкм), имеющих меньшую седиментационную устойчивость (устойчивость частиц против их оседания под действием силы тяжести), что может влиять на эффективность образования  комплекса СПМЧ/АптCD63/экзосома.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ изоляции специфических субпопуляций экзосом
и их анализа (см.  RU2733884, МПК G01N 33/50, опубл. 07.10.2020), включающий получение образца биологической жидкости, осуществление контакта указанного образца с модифицированной частицей таким образом, чтобы направляющие дарпины модифицированной частицы связались с, по меньшей мере, одним специфичным маркером, содержащимся во внеклеточной везикуле, образуя комплекс частица-везикула; отделение комплекса частица-везикула от несвязавшихся везикул и модифицированных частиц; детектирование отделенного комплекса частица-везикула. Модифицированная частица состоит из ядра диаметром от 100 нм до 1 мкм, состоящего из частиц диоксида кремния; частиц благородного металла, сорбированных на поверхности ядра, где благородным металлом является золото; направляющих дарпинов, иммобилизованных на частицах благородного металла, и имеющих сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе внеклеточной везикулы, содержащейся в образце биологической жидкости.
Недостатком данного способа является использование направляющих молекул, иммобилизованных на наночастицах, специфичных к HER2 или EpCAM рецепторам. Данные рецепторы наблюдаются только у определённых групп экзосом, а значит, вероятность образования комплекса наночастица-экзосома уменьшается, по сравнению с системой, где в качестве лигандов для образования комплекса выступают направляющие молекулы, специфичные к рецептору CD63 (мембранный белок из класса тетраспанинов, который присутствует в мембране большинства экзосом). В патенте также отсутствуют данные о специфичности и чувствительности данного способа выделения экзосом.
Техническая проблема заключается в создании быстрого и доступного способа выделения субпопляций экзосом преимущественно из плазмы крови и обеспечении последующего анализа поверхностных экзосомальных белков флуоресцентными методами (методом проточной цитометрии, методом флуоресцентной спектроскопии и микроскопии). Изобретение направлено на создание нового подхода для выделения и анализа циркулирующих экзосом и экзосомальных компонентов с целью создания новых методов диагностики и мониторинга онкологических заболеваний.
Технический результат заключается в упрощении и сокращении сроков выделения экзосом, а также в повышении достоверности анализа. Техническим результатом также является повышение чувствительности и специфичности детекции экзосомных маркеров.
,  согласно решению,
Проблема решается тем, что в способе выделения внеклеточных экзосом, содержащих, по меньшей мере, один специфичный маркер,  включающем получение образца биологической жидкости; получение модифицированных субмикронных частиц, имеющих сродство к, по меньшей мере, одному маркеру, и содержащих ядро из наночастиц в неорганической матрице из диоксида кремния, покрытое оболочкой, осуществление контакта указанного образца с модифицированными субмикронными частицами с образованием комплексов частица-экзосома; отделение комплексов частица-экзосома от несвязавшихся экзосом и модифицированных субмикронных частиц субмикронная частица содержит в ядре наночастицы оксида железа, покрытых стрептавидином и полиэлектролитной оболочкой, образованной полиалиламиногирохлоридом и полиакриловой кислотой, а также направляющие аптамеры, иммобилизованные на поверхности субмикронных частиц, и имеющие сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе внеклеточной экзосомы, при этом отделение комплекса частица-экзосома осуществляют градиентом магнитного поля, а размер ядра субмикронных частиц выбирают диаметром от 300 нм до 500 нм.
Комплекс частица-экзосома дополнительно содержит дарпин, иммобилизованный на поверхности экзосом, обладающий сродством к другому специфичному маркеру, содержащемуся во внеклеточной экзосоме.
Дополнительно осуществляют детектирование отделенного комплекса частица-экзосома методом флуоресценции для выделения фракции патологических экзосом.
В качестве аптомера используют направляющие молекулы, специфичные с мембранному белку CD63.
В качестве дарпина используют дарпин с флуоресцентной меткой, специфичный к мембранному белку EpCam.
Изобретение поясняется чертежами:
на фиг. 1 приведена общая структурная организация субмикронной частицы и пример детекции ее взаимодействия с экзосомой;
на фиг. 2. А – гистограммы, показывающие распределения гидродинамического размера внеклеточных экзосом и их концентрации после выделения из плазмы и клеточных культур, используя эксклюзионную хроматографию, В - изображения, полученные после сканирующей электронной микроскопии, образцов внеклеточных экзосом, высушенных на кремниевой подложке, С - результат вестерн-блоттинга выделенных внеклеточных везикул для проверки присутствия/отсутствия маркеров EpCAM и CD63;
на фиг. 3 - гистограммы флуоресцентного сигнала A - Cy5 и B - FITC;
на фиг. 4 - результаты испытания специфичности разработанных субмикронных частиц к экзосомам, выделенных из клеток MCF-7 и CHO, а также из плазмы крови здоровых пациентов, содержащих мембранные белки CD63 и EpCAM;
на фиг. 5 - результаты исследования чувствительности разработанных субмикронных частиц к экзосомам, выделенных из клеток MCF-7 и CHO, а также из плазмы крови здоровых пациентов (пунктирная линия и серый прямоугольник соответствуют уровню шума и его отклонению. Исследования проводились методом проточной флуоресцентной цитометрии. MFI – среднее значение флуоресцентного сигнала).
Позициями на чертежах обозначены:
1 – MB-Str (субмикронная частица из диоксида кремния, содержащая наночастицы оксида железа и покрытая стрептавидином);
2 – инкубация субмикронной частицы с аптамерами (например, биотинулированными олигонуклеотидами);
3 – MB-Str-Apt (субмикронная частица с направляющими молекулами (аптамеры), специфичными к мембранному белку CD63);
4 – инкубация субмикронной частицы с экзосомами;
5 – MB-Str-Apt-Exo (комплекс субмикронная частица-экзосома);
6 – инкубация комплекса субмикронная частица-экзосома с дарпинами (DARPins) с флуоресцентной меткой, специфичных к мембранному рецептору экзосом EpCAM, для верификации специфичного взаимодействия экзосом с наночастицами методом флуоресценции;
7 – MB-Str-Apt-Exo-DARPin (комплекс субмикронная частица-экзосома-дарпин);
8 – MB-Str-Apt-BSA-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1 % по массе) и анти- EpCAM дарпином);
9 – MB-Str-Apt-BSA-MCF7-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1% по массе), экзосомами из клеток MCF7 и анти-EpCAM дарпином).
10 – MB-Str-Apt-DARPin (MB-Str-Apt после инкубации с анти-EpCAM дарпином);
11 – MB-Str-Apt-BSA-Plasma-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1% по массе), экзосомами из плазмы крови здоровых пациентов и анти-EpCAM дарпином);
12 – MB-Str-Apt-BSA-CHO-DARPin (MB-Str-Apt после последовательной инкубации с бычьим сывороточным альбумином (1% по массе), экзосомами из клеток CHO и анти-EpCAM дарпином);
in vitro
Способ реализуется следующим образом. Получают образец биологической жидкости, в качестве которой может использоваться кровь, плазма крови, сыворотка крови, слюна или моча, включающая экзосому. Также экзосомы могут быть выделены из культуральной среды, используемой для роста клеток . В предпочтительных вариантах изобретения биологической жидкостью, из которой выделяются внеклеточные везикулы, является плазма или сыворотка крови.
Для реализации способа получают модифицированные частицы, имеющие сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе экзосомы, содержащейся в образце биологической жидкости, в частности, к мембранному белку CD63).
Процесс получения модифицированной наночастицы заключается в следующем (фиг.1)
На субмикронную частицу 1, имеющую субмикронное ядро диаметром 300 нм - 500 нм, состоящее из наночастиц оксида железа, покрытое стрептавидином, наносят направляющие молекулы. Для этого инкубируют субмикронные частицы 1 с направляющими молекулами - биотинулированными олигонуклеотидами (аптамеры) 2, имеющими сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе экзосом, содержащемся в образце биологической жидкости. Аптамеры содержат флуоресцентные метки.
Полученные субмикронные частицы с аптамерами 3 инкубируют 4 с экзосомами путем контакта образца биологической жидкости с модифицированными субмикронными частицами, таким образом, чтобы направляющие биотинулированные олигонуклеотиды (аптамеры) модифицированной субмикронной частицы 3 связались с по меньшей мере одним специфичным маркером, содержащимся во внеклеточной экзосоме, образуя комплекс субмикронная частица-экзосома 5.
Далее отделяют комплекс субмикронная частица-экзосома 5 от несвязавшихся экзосом и модифицированных субмикронных частиц. Наличие наночастиц магнетита в составе субмикронного ядра позволяет осуществлять их выделение посредством градиента магнитного поля (магнитной сепарации).
Отделенный комплекс субмикронная частица-экзосома 5 детектируют для выделения фракции патологических экзосом из общего популяции наноразмерных экзосом, циркулирующих в биологических жидкостях.
В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что детекцию отделенного комплекса субмикронная частица-экзосома 5 осуществляют при помощи детекции флуоресценции.
Для анализа экзосом дополнительно осуществляют контакт (инкубацию) 6 отделенного комплекса субмикронная частица-экзосома с направляющим дарпином, обладающим сродством к другому специфичному маркеру, содержащемуся во внеклеточной экзосоме. В результате получают комплекс субмикронная частица-экзосома-дарпин 7. В качестве  дарпинов (DARPins)  используют дарпины с флуоресцентной меткой, специфичные к мембранному рецептору экзосом EpCam, Полученный комплекс 7 детектируют для верификации специфичного взаимодействия экзосом с наночастицами методом флуоресценции.
Сродством, или аффинностью, лиганда к белку-мишени (например, рецептору), называется сила связывания лиганда с белком-мишенью. Сила связывания лиганда с белком-мишенью определяется не только силой прямых взаимодействий лиганда с данным белком (например, рецептором), но и микроокружением белковой молекулы. В результате связывания направляющей молекулы частиц с маркером, присутствующем в составе внеклеточной везикулы, образуется комплекс частица-везикула. Маркером может служить как поверхностная молекула (например, мембранный рецептор), так и молекула, находящаяся внутри везикулы, и которая может экспонироваться при частичном лизисе везикулы. Маркером может быть белковая молекула, так и биомолекула небелковой природы, ассоциированная с каким-либо заболеванием, например, ганглиозид, ассоциированный с экзосомами.
Одной из задач настоящего изобретения является разработка диагностических подходов на основе анализа содержимого экзосом, существующих в биологических жидкостях субъекта, и выделяемых, например, клетками опухоли, при помощи биосенсора, состоящего из субмикронных частиц (содержащих наночастицы предпочтительно, из оксида железа, например, маггемита или магнетита, поверхностно модифицированных стрептавидином, к которому прикреплены распознающие молекулы. Распознающие молекулы специфически связывают рецепторы на поверхности экзосом. Примерами распознающих молекул являются биотинулированные олигонуклеотиды (аптамеры), антитела или их антиген-распознающие фрагменты, или дарпины (DARPin - designed ankyrin repeat proteins).
В настоящее время, антитела или их антиген-распознающие фрагменты являются стандартным подходом для распознавания биомолекул в диагностических целях. Однако в предпочтительных вариантах данного изобретения для распознавания рецепторов на внеклеточных везикулах использовались биотинулированные олигонуклеотиды (аптамеры) и специфические дарпины, которые обладают рядом необходимых функциональных свойств, опережая фрагменты антител по таким показателям как стабильность, простота производства, специфичность и стоимость.
Дарпины представляют собой класс неиммуноглобулиновых белков, которые имеют небольшой размер и очень высокую стабильность за счет своей структуры (Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015;55: 489-511). Дарпины состоят из плотно упакованных повторов, состоящих обычно из 33 аминокислотных остатков. Каждый повтор образует структурную единицу, состоящую из β-поворота (β-turn), за которым следуют две антипараллельные α-спирали; при этом белок может состоять из 3-10 повторов, включая 2 повтора с обоих краев, обладающих гидрофильной поверхностью и придающих стабильность всему белку. Специфичность дарпинов к конкретному лиганду на поверхности частицы может быть селектирована при помощи мутагенеза и методов, известных специалистам, таких как рибосомный или фаговый дисплеи (Plückthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511), при этом специфичность дарпинов может достигать больших значений, чем стандартная для антител. Например, были отселектированы дарпины, которые специфически связываются с рецептором 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2), сверхэкспрессируемым при раке молочной железы и раке яичников (Jost, C., et al., (2013) Structural Basis for Eliciting a Cytotoxic Effect in HER2-Overexpressing Cancer Cells Via Binding to the Extracellular Domain of HER2. Structure 21, 1979–1991). Также, была продемонстрирована возможность связывания дарпинов с 5 нм наночастицами золота без потери их функциональных свойств; при этом такие конъюгаты эффективно взаимодействовали с клетками, содержащими распознающие рецепторы (Deyev S, et al., Synthesis, Characterization, and Selective Delivery of DARPin-Gold Nanoparticle Conjugates to Cancer Cells. Bioconjug Chem. 2017 Oct 18;28(10):2569-2574). Также существует возможность генерировать специфические дарпины в мультиспецифическом формате, соединяя несколько распознающих дарпинов вместе в одной структуре. Благодаря своей структуре (внутренние гидрофобные повторы фланкированы гидрофильными повторами, вместе образуя структуру типа «соленоид»), дарпины показывают высокую термодинамическую стабильность против разворачивания, вызванного нагреванием или химическими агентами, и стабильны в водных растворах в течение продолжительного времени в высоких концентрациях (> 100 мг/мл). Это выгодно отличает их от фрагментов антител, которые имеют склонность к агрегации. Далее, дарпины могут экспрессироваться с очень высоким выходом в растворимой форме в цитоплазме E. coli, составляя до 30% общего клеточного белка (до 10-20 г на литр жидкой культуры в ферментере, см. http://www.molecularpartners.com). Таким образом, производство дарпинов является простой и отлаженной процедурой, известной специалистам.
in vitro
in vivo
Альтернативным решением также является применение аптамеров. Аптамеры представляют собой фрагменты ДНК или РНК с уникальными трехмерными структурами, которые с высокой селективностью и аффинностью связываются с низко- и высокомолекулярными мишенями. Поиск аптамеров, как правило, проводится с помощью технологии систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) [S. Ni et al., Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(8), 1683; C. Platella et al., Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017, 1861(5): 1429-1447; J. Zhou and J. Rossi, Nat Rev Drug Discov. 2017, 6(3): 181–202]. Аптамеры не только не уступают антителам, но и обладают рядом преимуществ - высокой стабильностью  и , низкой иммуногенностью, малой молекулярной массой. Простота синтеза, возможность химической модификации и конъюгации расширяют возможности применения аптамеров - от создания распознающей части биосенсоров до систем адресной доставки и непосредственном использовании в качестве лекарственных средств. Особенно важным небольшой размер аптамеров становится при модификации различных наночастиц, так как обычно конъюгация приводит к присоединению нескольких аптамеров - от 1 до 20 на частицу. Это позволяет увеличить эффективность связывания с мишенью за счет увеличения авидности при меньшем влиянии на свойства частицы по сравнению с антителами.
В настоящем изобретении в состав биосенсора входят субмикронные частицы следующей структуры. Основа (ядро) частиц – неорганическая матрица, например, диоксид кремния, содержащая наночастицы оксида железа, например, маггемит или магнетит. В предпочтительном варианте, в качестве основы могут использоваться частицы диоксида кремния диаметром от 300 нм до 500 нм, содержащие наночастицы оксида железа, покрытые стрептавидином.
Заключительный этап синтеза активных частиц для биосенсора – иммобилизация специфичных направляющих молекул (аптамеров). Иммобилизация происходить за счет нековалентного взаимодействия (комплекс биотин-стрептавидин). В предпочтительном варианте в качестве направляющих молекул используются биотинулированные аптамеры, имеющих сродство к по меньшей мере одному маркеру, присутствующему в составе внеклеточной везикулы.
Метод детекции экзосомных маркеров при помощи получаемых субмикронных частиц может быть реализован различными способами. После связывания, специфического направляющего аптамера с маркером на экзосоме, комплекс субмикронная частица-экзосома может быть отделен от несвязанных субмикронных частиц и экзосом при помощи градиента магнитного поля, путем приложения постоянного магнита к пробирке с образцом, в результате чего комплекс субмикронная частица-экзосома может удерживаться у стенки пробирки, в то время как несвязанные частицы и экзосомы могут быть удалены пипеткой. Комплекс субмикронная частица-экзосома может быть вновь суспендирован после того, как магнит будет удален от пробирки. Выделение несвязанных субмикронные частиц и экзосом градиентом магнитного поля также может происходить в микрофлюидном устройстве путем приложения постоянного магнита к микроканалу при прохождении в микроканале субмикронных частиц, экзосом и комплекса субмикронная частица-экзосома. Различные методы разделения экзосом известны специалистам (см., например, Nareg Ohannesian et al., Commercial and emerging technologies for cancer diagnosis and prognosis based on circulating tumor exosomes, 2020, J. Phys. Photonics 2 032002). Те же методы могут быть использованы для отделения комплексов субмикронная частица-везикула от несвязавшихся везикул и несвязавшихся модифицированных наночастиц.
Дальнейшую детекцию связавшейся везикулы/экзосомы можно проводить при помощи специфичных антител, содержащих флюоресцентную метку (фиг. 1). Для повышения специфичности распознавания опухоль-ассоциированной экзосомы в процессе детекции могут быть применены несколько различных специфических дарпинов к разным опухоль-ассоциированным белкам, предположительно присутствующим в составе экзосомы. При получении положительного сигнала связывания с наночастицами, делается вывод о наличии опухоль-ассоциированных экзосом в тестируемой биологической жидкости.
Существенным параметром используемых в изобретении частиц является их размер - от 300 нм до 500 нм. Более крупные частицы обладают малой подвижностью, склонностью к спонтанной седиментации, что существенно уменьшает эффективность связывания с экзосомами. Более мелкие частицы могут иметь пониженную коллоидную стабильность (склонность образовывать агломераты); также, связывание более мелких частиц с экзосомой приведёт к затруднению или невозможности их отделения от других экзосом (размер комплекса наночастица-экзосома не будет существенно отличаться от размера внеклеточных, везикул, присутствующих в растворе).
Описанная выше предпочтительная структура частиц для биосенсора (основа (Fe3O4)-Streptavidin-BiotinOligo) обладает рядом преимуществ по сравнению с аналогами. Основными преимуществами являются: 1) хорошая коллоидная стабильность частиц за счет свойств комплекса стрептавидин-биотин и аптамера; 2) возможность эффективного связывания с экзосомами за счет авидности аптамера; 3) возможность эффективного разделения комплексов частиц с экзосомами с помощью градиента магнитного поля; 4) возможность использования комбинации градиента магнитного поля и микрофлюидного устройства; 5) возможность использования дарпинов, имеющих сродство к нескольким маркерам, присутствующих в составе внеклеточной везикулы.
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример конкретного выполнения
Методика получения частиц. Иммобилизация направляющих молекул на модифицированные стрептавидином магнитные частицы
Для демонстрации осуществления изобретения в качестве направляющей молекулы был выбран аптамер, специфичный к рецептору CD63 (молекулярная масса 11002), имеющий следующую нуклеотидную последовательность: (Biotin Pro)ca-ccc-cac-ctc-gct-ccc-gtg-aca-cta-atg-cta-(Cy5). CD63 рецептор присутствует на поверхности большего количества экзосом в независимости от источника выделения.
В других вариантах изобретения могут быть использованы другие аптамеры, антитела или их антиген-распознающие фрагменты, специфичные к различным структурам, присутствующих в экзосомах.
0,05 мл стрептавидин-модифицированных частиц оксида железа (1 мг/мл, 300-500 нм диаметром) были растворены в 0,95 мл ультрачистой воды (MilliQ system, удельное сопротивление 18 МОм см). Затем 0,02 мл биотин-модифицированных аптамеров (100 пкмоль/мкл), специфичных к рецептору CD63, с нуклеотидной последовательность (Biotin Pro)ca-ccc-cac-ctc-gct-ccc-gtg-aca-cta-atg-cta-(Cy5) были добавлены к стрептавидин-модифицированных субмикронных частиц, содержащих наночастицы оксида железа. Далее раствор оставляли при постоянном перемешивании на 12 часов при 4°С. Далее следовала промывка в фосфатном буфере pH 7.4 (не менее 3 раз) частиц от непрореагировавших аптамеров путем осаждения частиц градиентом магнитного поля, используя постоянный магнит (величина остаточной намагниченности не менее 500 мТл). После промывки объем модифицированных частиц оксида железа был доведен до 1 мл фосфатным буфером pH 7.4.
Флуоресцентный анализ
В качестве распознающей молекулы был выбран дарпин (HE)3-EC1, специфичный к рецептору EpCam (Патент на изобретение RU2733884, заявка № 2020102930, Приоритет от 24.01.2020), имеющий следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1: SHEHEHEGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILVANGADVNAYFGTTPLHLAAAHGRLEIVEVLLKNGADVNAQDVWGITPLHLAAYNGHLEIVEVLLKYGADVNAHDTRGWTPLHLAAINGHLEIVEVLLKNVADVNAQDRSGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAAKLN
В других вариантах изобретения могут быть использованы другие дарпины, антитела или их антиген-распознающие фрагменты, специфичные к различным структурам, присутствующих в экзомосах.
Для верификации взаимодействия экзосом с направляющими молекулами на поверхности модифицированных стрептавидином частиц, содержащих наночастицы оксида железа, использовали метод проточной флуоресцентной цитометрии. Субмикронные частицы, содержащие наночастицы оксида железа, модифицированные стрептавидином и флуоресцентно-меченными аптамером, специфичным к CD63 рецептору на поверхности экзосом, инкубировали в 1% водном растворе бычьего сывороточного альбумина 20 мин. После инкубации частицы промывали в фосфатном буфере путем осаждения частиц в градиенте магнитного поля. Осадок ресуспендировали в 0,9 мл фосфатного буфера. Затем частицы инкубировали с экзосомами, выделенных из клеточных линий (инвазивной аденокарциномы протоков молочной железы человека - MCF7; яичника хомяка – CHO), а также с экзосомами, выделенных из плазмы крови здоровых доноров при комнатной температуре в течение 20 мин с последующей промывкой в фосфатном буфере с помощью осаждения частиц градиентом магнитного поля. Осадок ресуспендировали в 0,98 мл фосфатного буфера. Далее добавляли 0,02 мл раствора, флуоресцентно-меченного (FITC) дарпина (HE)3-EC1, специфичного к рецептору EpCam (1,3 мг/мл в фосфатном буфере, pH 7.4) и инкубировали в течение 20 мин с последующей промывкой в фосфатном буфере (не менее пяти раз). Осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера. Таким образом, после проведения двух этапов на выходе получали комплекс: субмикронная магнитная частица – экзосома – дарпин. После чего данный комплекс был охарактеризован методом флуоресцентной проточной цитометрии с использованием системы проточной цитометрии CytoFLEX (Beckmann Coulter).
Результаты испытания разработанных субмикронных частиц
Результаты испытания специфичности метода с помощью разработанных частиц с анти-CD63 аптамером с Cy5 меткой и анти-EpCам дарпинами с FITC меткой к экзосомам, выделенных из клеток MCF-7 и CHO, а также из плазмы здоровых пациентов, содержащих мембранные белки CD63 и EpCAM, представлены на фиг. 3 и фиг. 4. Взаимодействие анти-CD63 аптамера с Cy5 меткой с частицами MB-Str 1 подтверждается гистограммой флуоресцентного для частиц MB-Str-Apt 3 на фиг. 3А. Образование комплекса частица-экзосома-дарпин следует из данных на фиг. 3В, где показаны гистограммы флуоресцентного сигнала частиц MB-Str 1, MB-Str-Apt 3, Str-Apt-BSA-DARPin 8, MB-Str-Apt-BSA-MCF7-DARPin 9. На фиг. 4 приведены результаты тестирования специфичности разработанной системы, из которых следует, что экзосомы из клеток MCF-7 (MB-Str-Apt-BSA-MCF7-DARPin 9) и из плазмы здоровых пациентов (MB-Str-Apt-BSA-Plasma-DARPin 11) имеют большее количество мембранного белка EpCam при использовании анти-EpCam дарпинов, по сравнению с экзосомами из клеток CHO (MB-Str-Apt-BSA-CHO-DARPin 12). Для сравнения на фиг. 4 приведены, величины флуоресцентного сигнала частиц (MB-Str 1, MB-Str-Apt-DARPin 10, Str-Apt-BSA-DARPin 8), использовавшихся в качестве контрольных образцов.
8
2
5
На фиг. 5 представлены результаты испытания чувствительности метода к экзосомам, полученным от клеточных линий MCF-7 и CHO, и из плазмы крови здоровых пациентов. Экзосомы из клеток MCF-7 и из плазмы крови здоровых пациентов, показали повышенную экспрессию белка EpCam, что подтверждают результаты вестерн-блота (фиг. 2). На фиг. 5 приведены средние значение флуоресцентного сигнала, нормированного на максимальное значение анти-EpCam дарпина с FITC меткой в результате образования комплекса при различной концентрации экзосом в образцах (10 экзосом в миллилитре - верхний предел, 10 экзосом в миллилитре – нижний предел). По результатам проведенных экспериментов удалось определить предел детекции комплекса, который составляет 10 экзосом в миллилитре.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Описываемый способ выделения внеклеточных везикул может быть использован в процессе диагностики, прогнозирования развития или определения риска развития заболевания у субъекта. В некоторых вариантах изобретения медицинские показания для применения указанного способа выбирают из заболеваний кровеносной системы или онкологических заболеваний, например, злокачественных заболеваний кроветворной системы, предстательной железы, рака яичника или других органов и тканей.
Способ обеспечивает возможность выделения специфичных экзосом для ранней диагностики онкологических заболеваний и оценки эффективности лечения (за счет наличия на поверхности субмикронных частиц молекул, обеспечивающих взаимодействие с характерными белками, находящимися на поверхности экзосом).