Экспрессия генов цитокинов и факторов роста в печени после субтотальной резекции у крыс

экспрессия генов цитокинов и факторов роста в печени после субтотальной резекции у крыс

А.В.Ельчанинов 123, Т.Х. Фатхудинов 123, Н.Ю. Усман123, И.В. Арутюнян12, А.В. Макаров 123, ЕЮ. Кананыхина 12, Э.Ш. Раимова 3, Г.Б. Большакова 2, Г.Т. Сухих 1

1 Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. ак. В.И. Кулакова, Москва, Россия

2 Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва, Россия

3 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия

Cytokines and growth factors genes expression after subtotal liver resection in rats

A.V. Elchaninov1 2 3, TKh. Fatkhudinov1 2 3, N.Y. Usman 1 2 3, I.V. Arutyunyan 1 2 3, A.V. Makarov1 2 3, E.Y. Kananykhina 1 2, ESh. Raimova 3, GB. Bolshakova 2, G.T. Sukhikh 1

1 Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia

2 Scientific Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russia

3 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

Регенерации печени млекопитающих после 70% резекции посвящено большое количество исследований . Субтотальная резекция печени часто приводит к печеночной недостаточности . Подобное состояние в онкологии и трансплантологии известно как синдром малого остатка органа

Цель работы — изучить динамику экспрессии генов основных сигнальных молекул при регенерации печени после субтотальной резекции у крыс . На самцах крыс породы Вистар воспроизведена модель регенерации печени после субтотальной резекции С помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени изучена экспрессия генов illb, il6, il10, tnfa, tweak, mmp9, fgf2, tgfb, hgf, vegf, sdfa, ang. Выявлено две фазы повышенной экспрессии генов, которые соответствуют первому и второму пикам пролиферации гепатоцитов . Для первой фазы характерно повышение экспрессии mmp9, il6, il10, fgf2, tgfb. Во вторую фазу была повышена экспрессия hgf, tnfa, tweak, illb. Кроме того, мы обнаружили повышение экспрессии гена фактора транскрипции SOX9, а также гена, кодирующего TWEAK, что указывает на возможную роль резидентных прогениторных клеток в регенерации печени крыс после такой травмы

На наш взгляд, наличие двух фаз повышенной экспрессии генов при регенерации печени крыс после субтотальной резекции связано с двумя волнами пролиферации гепатоцитов, а также с наличием запасов факторов роста в печени

Ключевые слова: печень, регенерация, субтотальная резекция, цитокины, факторы роста

Liver regeneration after 70% resection is one of the most studied models of tissue regeneration . Small residual liver volume after massive hepatectomy or partial liver transplantation is a major cause of subsequent liver dysfunction known in oncology and transplantology as small-for-size syndrome . The aim of this study was to evaluate the influence of 80% liver resection on cytokines and growth gens expression in rat .

Male Wistar rats were subjected to 80% and sacrificed at different times after surgery . Untreated animals served as controls Serum and liver samples were obtained to investigate liver function, cytokines and growth factors genes expression: illb, il6, il10, tnfa, tweak, mmp9, fgf2, tgfb, hgf, vegf, sdfa, ang with quantitative RT-PCR . it was revealed two phases increased expression of genes that correspond to the first and second peak hepatocytes proliferation The first phase was characterized by increased expression mmp9, il6, il10, fgf2, tgfb. The second phase was characterized by increased expression of hgf, tnfa, tweak, illb. Furthermore, we have found increased expression of the transcription factor SOX9 gene, and the gene encoding TWEAK, indicating a possible role for resident progenitor cells in the regenerating liver of rats after subtotal resection

in our opinion the two phases of increased gene expression during liver regeneration in rats after subtotal resection are associated with two waves of hepatocyte proliferation, and the presence of growth factors reserves in the liver

Keywords: liver, regeneration, subtotal resection, cytokines, growth factors

Введение

Регенерации печени млекопитающих после различного рода повреждений посвящено много исследований . Большинство работ выполнено на лабораторных грызунах, у которых воспроизведена модель восстановления массы печени после 70% резекции [1]. Значительно меньше работ касается регенерации печени после малой (примерно 30%) и субтотальной (примерно 80%) резекций [2, 3]. Несомненно, актуальным является изучение особенностей регенерации печени млекопитающих после резекции разного объема. Однако особенный интерес представляет исследование регенерации печени после субтотальной резекции. Это связано с тем, что в онкологии и трансплантологии существует так называемая проблема «малого остатка органа» . Пересаживаемая часть донорской печени оказывается слишком малой для поддержания гомеостаза в организме реципиента, что ведет к развитию острой

e-mail: fatkhudinov@gmail . com

печеночной недостаточности . Подобное состояние развивается и у пациентов, которым произведена достаточно обширная резекция печени в связи с опухолевым процессом [3, 4].

Наибольшее значение при регенерации печени после резекции разных объемов отводится экспрессии ряда интерлейкинов П1_-1Ь, ^-6, И-10), а также факторов роста (HGF, TGFb, FGF2, Т^а и др . ), которые играют ведущую роль в регуляции пролиферации гепатоцитов [5—7]. Данные по экспрессии указанных факторов при регенерации печени после субтотальной резекции противоречивы По данным одних авторов экспрессия ^-1Ь, ^-6, ^-10, HGF, TGFb, FGF2 и др . после субтотальной резекции повышена на протяжении первых 2—3 сут . после операции [8—10], другим авторам удалось зафиксировать только однократное повышение экспрессии того или иного фактора при регенерации печени [4].

В связи с противоречивостью данных об экспрессии тех или иных факторов регенерации после субтотальной резекции печени данный вопрос требует дальнейших исследований.

Цель работы — изучить динамику экспрессии генов основных сигнальных молекул при регенерации печени после субтотальной резекции у крыс

Материал и методы

Экспериментальная модель

Исследование проводили на самцах крыс (п = 75) аутбредного стока Вистар массой 300—400 г, полученных из питомника Филиала ИБХ РАН (Пущино, Россия). Содержание и использование животных осуществляли в соответствии с Приказом министерства здравоохранения СССР №755 от 12 августа 1977 г . «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» .

У подопытных животных производили субтотальную резекцию печени. Крыс наркотизировали диэти-ловым эфиром (МедХимПром, Россия), после чего вскрывали брюшную полость и удаляли срединную, левую боковую и правую верхнюю доли печени (всего 80% общей массы печени), операцию проводили в период с 9 00 до 11 00 ч

Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира через 3, 6, 12, 24, 30, 48 и 72 ч , а также через 5, 7 и 10 сут после резекции печени (5—6 животных на каждый срок) .

Показателем полноты регенерации печени служило восстановление массы печени, которую оценивали с помощью взвешивания целого органа перед гистологическим исследованием В качестве контроля использовали интактных крыс, одновозрастных с оперированными животными (п = 10) .

Оценка функции печени

Для оценки восстановления функций печени в сыворотке крови подопытных крыс определяли концентрацию альбумина с помощью фотометрического

теста с бромкрезоловым зеленым (Albumin DiaS, Диакон-ДС, Россия) и активность аланинамино-трансферазы (АЛТ) фотометрическим тестом (ALAT (GPT Dias), Диакон-ДС, Россия) . Забор крови у экспериментальных животных осуществляли под эфирным наркозом пунктированием левого желудочка .

Гистологическое исследование

Для гистологического исследования печень фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, после стандартной проводки заливали в парафин, далее готовили срезы толщиной 5—7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином .

Для исследования пролиферации гепатоцитов определяли их митотический индекс, выраженный в промилле (%о) . Митозы подсчитывали на гистологических срезах печени, окрашенных гематоксилином и эозином (на 6000 клеток для каждого животного) .

Полимеразная цепная реакция в режиме

реального времени

Экспрессию изучаемых генов определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Таблица. Используемые праймеры

Ген 5'-праймер 3'-праймер

illb CTGTCTGACCCATGTGAGCT ACTCCACTT TGGTCTTGACTT

il6 TACATATGTTCTCAGGGA GAT GGTAGAAACGGAACTCCAG

il10 GCCCAGAAATCAAGGAGCAT TGAGTGTCACGTAGGCTT CTA

tnfa CCACCACGCTCTTCTGTCTA GCTACGGGCTTGTCACTCG

iNOs CGCTGGTTTGAAACTTCTCAG GGCAAGCCATGTCTGTGAC

mmp9 ATGGTTTCTGCCCCAGTGAG CACCAGCGATAACCATCCGA

hgf GGCCATGGTGCTACACTCTT TTGTGGGGGTACTGCGAATC

tgfb CCGCAACAACGCAATCTATG AGCCCTGTATTCCGTCTCCTT

fgf2 CAAGCGGCTCTACTGCAAG GCCGTCCATCTTCCTTCATA

vegfa GCAGCGACAAGGCAGACTAT GAGGGAGTGAAGGAGCAACC

sdfa CCCTGCCGATTCTTTGAGAG TGGGCTGTTGTGCTTACTTG

sox9 AGAGGCCACCGAACAGACT TGCTCAGCTCACCGATGTC

tweak GATGGAGCACAGGCAGGTG TGGCTGAGAATTCTTCCAG

actß GAGATTACTGCCCTGGCTCC GCTCAGTAACAGTCCGCCTA

b2m CTCGCTCGGTGACCGTGAT GGACAGATCTGACATCTCGA

gapdh GCGAGATCCCGCTAACATCA CCCTTCCACGATGCCAAAGT

Для анализа экспрессии генов использовали метод определения порогового цикла (Ct) и вычисления относительной экспрессии гена по методу Pfaffl [11] с учетом рекомендаций Vandesompele [12]. В качестве эндогенного контроля использовали гены домашнего хозяйства actin-p, b2m, gapdh.

Статистический анализ

Полученные данные анализировали с использованием программы SigmaStat 3 . 5 (SystatSoftwarelnc, США) . Сравнение двух митотических индексов проводили с помощью z-критерия . Полученные данные об относительной экспрессии сравнивали, применяя U-критерий Манна — Уитни . При сравнении более двух групп использовали ранговый дисперсионный анализ ANOVA on Ranks . Различия считали статистически значимыми при p<0,05 .

Результаты

Выживаемость животных

Смертность животных после субтотальной резекции составила примерно 50%, при этом гибель крыс наблюдали только в первые 2 сут . после операции, что согласуется с литературными данными [13].

Восстановление массы и функции печени

Субтотальная резекция не препятствовала регенерации печени: у выживших животных наблюдали постепенное увеличение массы органа . Через 10 сут . после резекции масса печени у подопытных животных не отличалась от массы печени интактных крыс (р>0,05, рис . 1А) . Кроме того, к этому же сроку концентрация альбумина и активность АЛТ в сыворотке крови оперированных крыс не отличались от показателей контрольных животных (р>0,05, рис . 2) . Таким образом, можно заключить, что регенерация печени крыс после субтотальной резекции происходит за 10 сут

г

20 л

50 .

А

МИ, % 12

Б

3 сут.

7 сут

10 сут

1 сут. 2 сут 3 сут 5 сут 7 сут 10 сут

Рис. 1. Показатели регенерации печени крыс после субтотальной резекции: А — масса печени крыс после субтотальной гепатэктомии (по оси абсцисс — время после операции, по оси ординат — масса печени (г); К — масса печени контрольных животных); Б — митотический индекс гепатоцитов (по оси абсцисс — время после операции, по оси ординат — митотический индекс (%о));

* — различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, р<0,05

г/дл 40 1

35

30

25 20 15 10 5 0

А

Б

Е/л 500

450

400

350

300

250

200

150

100

_I

1

3 сут.

7 сут.

10 сут.

3 сут.

7 сут.

10 сут.

Рис. 2. Показатели функционального состояния печени: А — концентрация альбумина в сыворотке крови крыс (по оси абсцисс — время после операции, по оси ординат — концентрация альбумина (г/дл)); Б — активность АЛТ в сыворотке крови крыс (по оси абсцисс — время после операции, по оси ординат — активность АЛТ (Е/л)); К — показатель животных контрольной группы;

* — различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, р<0,05

к

к

к

Митотическая активность

гепатоцитов

Основным механизмом восстановления массы печени после субтотальной резекции является ми-тотическое размножение гепатоцитов в оставшихся долях печени [13]. Было обнаружено несколько особенностей пролиферации гепатоцитов после субтотальной резекции: позднее начало митотической активности и наличие двух пиков митотического индекса (большего через 48—72 ч . и меньшего через 7 сут . после операции) (рис . 1Б). Кроме того, несмотря на восстановление массы печени к 10 сут после операции, наблюдались единичные митозы гепатоцитов на этом сроке, что свидетельствует о продолжающемся морфогенезе

Динамика экспрессии генов сигнальных

молекул

При изучении экспрессии генов сигнальных молекул (табл . ) было обнаружено, что в зависимости от реакции на субтотальную резекцию печени все рассматриваемые гены можно разделить на три группы . Первая группа объединяет гены, экспрессия которых достоверно повышалась по сравнению с контролем в ранний период (3—48 ч . ) регенерации печени после выполненной операции . К этим генам относятся il6, il10, inos, mmp9, fgf2, tgfb, sox9 (рис . 3) . Вторая группа генов, экспрессия которых статистически значимо повышалась на поздних сроках регенерации (5—10 сут . ), включала illb, tnfa, tweak, inos, hgf (рис 4) В третью группу вошли гены, которые реагировали на субтотальную резекцию достоверным снижением экспрессии в тот или иной период регенерации — ang, vegf, sdfa (рис . 5).

Обсуждение

Большинство данных о генах, регулирующих регенерацию печени млекопитающих, получено на модели восстановления массы органа после 70% резекции [1, 7]. Последовательность генов, экспрессия которых повышается при регенерации печени, определяется реакцией органа на острую травму и следующей за ней фазой восстановительного процесса [5, 6]. Исходя из этого, первой повышается экспрессия про- и антивоспалительных цитокинов, регулирующих вступление гепатоцитов в митотический цикл, а позднее увеличивается экспрессия факторов роста, обеспечивающих прохождение гепатоцитами митотического цикла [5, 6]. С этим согласуются наши данные: в первую очередь, через 3—6 ч . после операции повышалась экспрессия il6 и il10 (рис . 3).

В соответствии с литературными данными зкс-прессия hgf, tgfb и других генов при регенерации печени млекопитающих после частичной гепатэктомии остается повышенной в основном в течение первых 48 ч [7] Результаты исследований по субтотальной резекции печени противоречивы В некоторых работах отмечается повышение экспрессии hgf, tgfb, egf и других генов только в течение первых 2—3 сут . регенерации печени [4]. В ряде других исследований отмечается повышенная экспрессия генов на протяжении всего периода регенерации печени, вплоть до 14 сут . после операции [8—10]. Однако в нашей работе были обнаружены две фазы повышенной экспрессии генов: ранняя фаза — в течение 3—48 ч . после резекции, и поздняя — в течение 5—10 сут .

Видимо, наличие двух фаз повышенной экспрессии генов при регенерации печени крыс после субтотальной резекции связано с двумя волнами пролиферации гепатоцитов. Различия в наборе генов, экспрессия которых повышается в раннюю или позднюю фазы регенерации, определяются, на наш взгляд, несколькими причинами Во-первых, для раннего периода регенерации печени характерно повышение экспрессии генов острой фазы (illb, il6, 1110), и тесно связанного с ними — mmp9 [1, 7], что согласуется с нашими данными . Кроме того, на временную динамику экспрессии генов будет оказывать влияние наличие запаса фактора роста в печени, который высвобождается во время регенерации . В таком случае экспрессия гена данного фактора будет повышаться только после истощения депо, что характерно для HGF, который является главным митогеном гепатоцитов при регенерации печени [1, 7]. Если же запасы фактора роста в самой печени невелики, то следует ожидать активации экспрессии гена уже на раннем этапе восстановления печени . Вероятно, этим объясняется динамика экспрессии tgfb, который кодирует фактор роста, останавливающий регенерацию печени, а также fgf2, являющегося слабым митогеном для гепатоцитов и эндотелиоцитов [1, 7]. Также в раннем периоде регенерации печени повышается экспрессия генов острой фазы, кодирующих синтез недепонируемых факторов.

Кроме того, на динамику экспрессии генов клеток печени при ее регенерации может оказывать влияние то, что многие факторы роста, регулирующие этот процесс, синтезируются в других органах так, показано, что после 70% резекции печени hgf начинает активно экспрессироваться не только в клетках регенерирующего органа, но еще и легких, почках и селезенке [14, 15]. Видимо, с этим связано то, что мы не обнаружили повышенной экспрессии hgf в печени после субтотальной резекции на ранней стадии регенерации

Стоит также обратить внимание на то, что среди генов, чья экспрессия, как мы установили, повышалась после субтотальной резекции печени у крыс, большинство являются генами макрофагов: illb, il6, il10, inos, tnfa, tweak, что указывает на ключевую роль данной популяции клеток в координации регенерации печени [6].

В соответствии с литературными данными TNFa и iL6 образуют регуляторную систему, которая стимулирует в гепатоците экспрессию так называемых генов раннего ответа, что приводит к вступлению клетки в митотический цикл [5, 6]. Помимо прочего, показано, что TNFa/iL6 стимулируют образование iNOS, которая вместе с NO защищает гепатоциты от высокого уровня TNFa/iL6 [16].

Кроме того, в настоящее время появились данные о том, что iL6 индуцирует синтез HGF, который, помимо стимуляции пролиферации эпителиальных клеток и подавления апоптоза, вместе с iL10, оказывает противовоспалительный эффект [17].

FGF2, так же, как и HGF, обладает широким спектром эффектов: стимулирует пролиферацию, анги-огенез и др Взаимодействие провоспалительных цитокинов и FGF2 активно изучается. Так, показано, что М2 макрофаги способны индуцировать в тканях экспрессию fgf2 [18]. Кроме того, установлено, что iL1b стимулирует синтез и высвобождение FGF2 из эндотелиоцитов [19].

4,00 3,5С

з,ое

2,50

2,ое

1,50 1,00 0,50 0,00

Ал

- гЦ

А

¿А.

12,00

10,00

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

0,00

к

Б

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

В 2,50

1 i ^ 4 I

i J л

1,00

0,50

0,00

^ 1 [к М Д

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

Д

Е

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

Рис. 3. Гены, экспрессия которых повышалась через 3—48 ч . после субтотальной резекции печени:

А — экспрессия гена ¡16; Б — экспрессия гена ¡110; В — экспрессия гена ¡NOs; Г — экспрессия гена ттр9; Д — экспрессия гена fgf2; Е — экспрессия гена Ьд^Ь; Ж — экспрессия гена sox9 .

Белые столбцы — показатели контрольной группы; серые столбцы — показатели экспериментальной группы . По оси абсцисс — время после операции, по оси ординат — относительная экспрессия в условных единицах (у . е . ) .

* — различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, р<0,05

Г

А

Б

5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

fu

к

ii

6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

В

I

il

6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

Г

6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

Рис. 4. Гены, экспрессия которых повышалась через 5—10 ч . после субтотальной резекции печени: А — экспрессия гена illb; Б — экспрессия гена tnf-a; В — экспрессия гена hgf; Г — экспрессия гена tweak. Белые столбцы — показатели контрольной группы; серые столбцы — показатели экспериментальной группы . По оси абсцисс — срок после операции, по оси ординат — относительная экспрессия в условных единицах (у . е . ) . * — различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, p<0,05

А

I

it

ifl

i

i

Ш

3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

Б

* * *

Uj

Ш

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

В

i

I

rii

I

i

Ш

Рис. 5. Гены, которые реагировали на субтотальную резекцию печени только снижением экспрессии: А — экспрессия гена апд; Б — экспрессия гена vegf; В — экспрессия гена sdfa .

Белые столбцы — показатели контрольной группы; серые столбцы — показатели экспериментальной группы . По оси абсцисс — срок после операции, по оси ординат — относительная экспрессия в условных единицах (у . е . ).

* — различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, р<0,05

6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут.

3 ч

3 ч

3 ч

3 ч

3 ч

Роль в регенерации печени lL1b и IL10 в настоящее время активно изучается . Показано, что данные цитокины подавляют пролиферацию гепатоцитов и, таким образом, вместе с TGFb приводят к завершению восстановительных процессов в печени [20].

Также обращает на себя внимание обнаруженная нами повышенная экспрессия sox9 и tweak, что косвенно указывает на возможное участие резидентных стволовых клеток в регенерации печени крыс после субтотальной резекции. SOX9 является транскрипционным фактором, который участвует в гистогенезе многих тканей млекопитающих [21]. В настоящее время SOX9 рассматривают как маркер резидентных прогениторных клеток печени [21, 22]. TWEAK относится к семейству белков TNF и, как показано, играет определенную роль в регуляции пролиферации гепатоцитов при регенерации печени . Кроме того, считают, что TWEAK посредством его рецептора fn14 участвует в регуляции активности резидентных прогениторных клеток печени [22].

Помимо генов с повышенной экспрессией мы обнаружили, что vegf, sdfa, ang на всем протяжении регенерационного процесса экспрессировались в оперированной печени на более низком уровне, чем у интактных животных (рис . 5) . VEGF и ангиогенин стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов в ходе регенерации печени [23], а SDFa вызывает миграцию клеток красного костного мозга в печень при различного рода повреждениях [24]. Возможно, снижение экспрессии генов указанных факторов в печени происходит за счет повышенного их синтеза в других органах, а также за счет того, что активно экспрессиру-ющиеся факторы роста при данном виде повреждения берут на себя роль других факторов роста

Большинство изученных генов, в том числе и те, у которых удалось обнаружить повышенную экспрессию, на некоторых сроках после операции экспрес-сировались с меньшей активностью по сравнению с контролем так, мы обнаружили сниженную экспрес-

ЛИТЕРАТУРА:

I. Michalopoulos G . K ., DeFrances M . C . Liver regeneration Science 1997; 276(5309): 60-6 .

2 . Mitchell C ., Nivison M ., Jackson L . F . et al . Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor links hepatocyte priming with cell cycle progression during liver regeneration . J . Biol . Chem . 2005; 280(4): 2562-8 .

3 . Ninomiyaa M ., Shirabea K ., Terashic T . et al . Deceleration of regenerative response improves the outcome of rat with massive he-patectomy . Am . J . Transplant . 2010; 10(7): 1580-7 .

4 . Sowa J . P . , Best J ., Benko T. et al . Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration . World J . Gastroenterol . 2008; 14(46): 7093-100 .

5 . Fausto N . Liver Regeneration . J . Hepatol . 2000; 32(1 Suppl . ): 19-31.

6 . Fausto N ., Campbell J . S ., Riehle K . J . Liver Regeneration . Hepa-tology 2006; 43(2 Suppl 1): S45-53 .

7 Michalopoulos G K Advances in liver regeneration Expert Rev Gastroenterol . Hepatol . 2014; 8(8): 897-907 .

8 . Panis Y . , Lomri N ., Emond J . C . Early gene expression associated with regeneration is intact after massive hepatectomy in rats . J . Surg . Res . 1998; 79(2): 103-8 .

9 Mason S , Daveau Y , Hiron M et al Differential regenerative response and expression of growth factors following hepatectomy of variable extent in rats . Liver 1999; 19(4): 312-7 .

10 . Scotte M ., Masson S ., Lyoumi S . et al . Cytokine gene expression in liver following minor or major hepatectomy in rat . Cytokine 1997; 9(11): 859-67 .

II. Pfaffl M . W . A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR . Nucleic Acids Res . 2001; 29(9): e45 .

12 . Vandesompele J ., De Preter K ., Pattyn F . et al . Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes Genome Biol 2002; 3(7): RESEARCH0034

13 . Романова Л . К . Регуляция восстановительных процессов . Москва: Издательство Московского Университета; 1984

14 . Yanagita K ., Nagaike M ., Ishibashi H . Lung may have an endocrine function producing hepatocyte growth factor in response to in-

сию tweak в период 6—24 ч . , tnfa через 3 и 12 ч . , tgfb и illb через 12 ч . , hgf через 24, 48 и 72 ч . На раннем этапе регенерации это, видимо, объясняется стрессовой реакцией печени на тяжелую травму, а на стадиях, следующих после повышенной экспрессии того или иного гена, разрушением большого количества мРНК с помощью микроРНК [25]

Заключение

Таким образом, в ходе выполненной нами работы был установлен ряд особенностей регенерации печени крыс после субтотальной резекции В первую очередь это касается динамики пролиферации гепатоцитов, где было обнаружено два пика мито-тической активности, при этом первый пик приходился на ранний период регенерации (48—72 ч . ), а второй — на поздний (7 сут . ) . Также были выявлены особенности экспрессии некоторых ключевых генов регенерации печени после субтотальной резекции Было обнаружено две фазы повышенной экспрессии генов, которые соответствуют первому и второму пикам пролиферации гепатоцитов . Каждая фаза различается набором генов с повышенной экспрессией . Для первой фазы характерно повышение экспрессии mmp9, il6, il10, fgf2, tgfb. Во вторую фазу была повышена экспрессия hgf, tnfa, tweak, illb. Кроме того, после субтотальной резекции было выявлено повышение экспрессии гена фактора транскрипции SOX9, а также гена, кодирующего TWEAK, что указывает на возможную роль резидентных прогениторных клеток в регенерации печени крыс после такой травмы .

Благодарности

Данная работа была выполнена при финансовой поддержке РФФИ

jury of distal organs . Biochem . Biophys . Res . Commun . 1992; 182(2): 802-9

15 Kono S , Nagaike M , Matsumoto K et al Marked induction of hepatocyte growth factor mRNA in intact kidney and spleen in response to injury of distant organs Biochem Biophys Res Commun 1992; 186(2): 991-8 .

16 . Rai R . M ., Lee F .Y . J ., Rosen A . et al . Impaired liver regeneration in inducible nitric oxide synthasedeficient mice . PNAS USA 1998; 95: 13829934 .

17 Coudriet G M , He J , Trucco M et al Hepatocyte growth factor modulates interleukin-6 production in bone marrow derived macrophages: implications for inflammatory mediated diseases . PLoS One 2010; 5(11): e15384 .

18 . Jetten N . , Verbruggen S ., Gijbels M . J . et al . Anti-inflammatory M2, but not pro-inflammatory M1 macrophages promote angiogenesis in vivo . Angiogenesis 2014; 17(1): 109-18 .

19 . Presta M ., Dell'Era P ., Mitola S . et al . Fibroblast growth fac-tor/fibroblast growth factor receptor system in angiogenesis . Cytokine Growth Factor Rev . 2005; 16(2): 159-78 .

20 Yin S , Wang H , Park O et al Enhanced liver regeneration in IL-10-deficient mice after partial hepatectomy via stimulating inflammatory response and activating hepatocyte STAT3 . Am . J . Pathol . 2011; 178(4): 1614-21.

21 Furuyama K , Kawaguchi Y , Akiyama H et al Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine . Nat . Genet . 2011; 43(1): 34-41.

22 Bird T G , Lu W Y , Boulter L et al Bone marrow injection stimulates hepatic ductular reactions in the absence of injury via macrophage-mediated TWEAK signaling . PNAS USA 2013; 110(16): 6542-7 .

23 Leve L D Liver sinusoidal endothelial cells and liver regeneration . J . Clin . Invest. 2013; 123(5): 1861-6 .

24 . Dalgetty D . M ., Medine C . N ., Iredale J . P . et al . Progress and future challenges in stem cell-derived liver technologies Am J Physiol . Gastrointest . Liver Physiol . 2009; 297: G241-8 .

25 . Chen Y ., Verfaillie C . M . MicroRNAs: the fine modulators of liver development and function . Liver Int . 2014; 34(7): 976-90 .

Поступила: 05.10.2015