Изменение экспрессии pd-l1 и PD-L2 в клеточных линиях меланомы человека при воздействии различных лекарственных форм аранозы и «Пустых» липосом

изменение экспрессии PD-L1 и PD-L2 в клеточных линиях мелаиомы человека при воздействии различных лекарственных форм аранозы и «пустых» липосом

Введение. В последние годы достигнут значительный прогресс в иммунотерапии опухолей, однако пока мало информации о влиянии химиопрепаратов на взаимодействие опухоли и иммунной системы. Вызывает интерес вопрос о возможности лечения блокаторами PD-1 и его лигандов после химиотерапии.

Цель исследования — изучить изменение экспрессии матричной РНК(мРНК) и поверхностных молекул PD-L1 и PD-L2 в клеточных линиях меланомы человека после воздействия лекарственных форм аранозы — лиофилизата для приготовления раствора для инъекций (араноза-лио) и липосомальной, а также «пустых» липосом, не содержащих аранозы. Материалы и методы. Исследование проводили на 11 клеточных линиях метастатической меланомы человека, 5 из которых несли мутацию ВБЛР. В количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени исследовали уровень экспрессии генов PD-L1 и PD-L2. В реакции иммунофлуоресценции оценивали экспрессию белков PD-L1 и PD-L2.

Результаты. МРНК PD-L1 и PD-L2 экспрессируется на меньшем уровне в клеточных линиях, имеющих мутации BRЛF, но различия достоверны только для PD-L2 (р = 0,1373 и р = 0,0207 соответственно). Экспрессия поверхностных белков PD-L1 и PD-L2 в необработанных препаратами клеточных линиях детектируется только на клеточных линиях с диким типом ВБЛЕ. В целом, после воздействия липосомальной аранозы уровень экспрессии мРНК PD-L1 и PD-L2 становится значительно ниже (р = 0,0004 и р = 0,0442 соответственно), чем в необработанных линиях. Араноза-лио и «пустые» липо-сомы в основном привели к увеличению уровня экспрессии PD-L1 (р <0,0001 и р = 0,0005 соответственно) и PD-L2 (р = 0,0005 и р = 0,0025). Но на отдельных линиях наблюдался противоположный эффект. Изменения экспрессии белков PD-L1 и PD-L2 не коррелируют с изменениями уровня экспрессии мРНК. Экспрессия белка PD-L1 после инкубации с липосомальной аранозой повышается по сравнению с необработанными линиями (р = 0,0269), а после воздействия аранозы-лио и «пустых» липосом — уменьшается (р = 0,0663 и р = 0,7213 соответственно). Экспрессия белка PD-L2 после воздействия липосомальной аранозы значимо не меняется (р = 0,1141), а после инкубации с аранозой-лио и «пустыми» липосомами уменьшается (р = 0,0021 и р = 0,008).

Выводы. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей и еще раз подтверждают, что уровень мРНК и белков PD-L1 и PD-L2 изменяется при различных воздействиях. Лекарственные формы аранозы, а также «пустые» липосомы оказывают разное влияние на экспрессию как мРНК, так и белков PD-L1 и PD-L2.

Ключевые слова: PD-L1, PD-L2, араноза, меланома

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-74-81

the influence of aranoza drug formulations and «empty» liposomes on the expression

of pd-l1 h pd-l2 in human melanoma cell lines

A.V. Ponomarev, V.A. Misyurin, A.A. Rudakova, A.V. Misyurin, M.A. Baryshnikova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow 115478, Russia

Introduction. In recent years, significant progress has been achieved in immunotherapy of tumors, however, little is known about the crosstalk between the tumor and the immune system. It seems reasonable to rise the question of patients treatment with PD-1 and its li-gands blockers after chemotherapy.

Objective. To investigate the expression of cell surface molecules PD-L1 and PD-L2 both at the mRNA and protein levels in human melanoma cell lines after exposure to «Aranoza, lyophilisate for preparation of solution for injections» (aranoza-lio), liposomal formulation of aranoza and «empty» liposomes without aranoza.

Materials and methods. In this study we used 11 melanoma cell lines, 5 of which carried the BRAF mutation. In quantitative polymerase chain reaction in real time we investigated the level of PD-L1 and PD-L2 gene expression. Using flow cytometry we evaluated the expression of cell surface antigens PD-L1 and PD-L2.

A.B. Пономарев, В.А. Мисюрин, A.A. Рудакова, A.B. Мисюрин, M.A. Барышникова

ФГБУ«РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Контакты: Александр Васильевич Пономарев kl8546@yandex.ru

Results. PD-L1 and PD-L2 mRNA are expressed at a lower level in cells with BRAF mutations, differences were significant only for PD-L2 (p = 0.1373 andp = 0.0207respectively). A high basal level of protein PD-L1 and PD-L2 expression was observed in wild type BRAF melanoma cells. After exposure to liposomal aranoza the level of PD-L1 and PDL-2 mRNA expression was significantly reduced (p = 0.0004 andp = 0.0442 respectively) in compare to control non-treated cells. It is of interest, aranoza-lio and «empty» liposomes increased the expression of PD-L1 (p <0.0001 and p = 0.0005 respectively) and PDL2 (p = 0.0005 and p = 0.0025). Of note, we observed an opposite effect in some melanoma cell lines. Moreover, changes in the expression of proteins PD-L1 and PD-L2 did not correlate with the mRNA level. The expression of PD-L1 protein after incubation with the liposomal aranoza increased dramatically compared to non-treated cells (p = 0.0269). Aranoza-lio and «empty» liposomes decreased the expression of PD-L1 protein (p = 0.0663 and p = 0.7213 respectively). The protein level of PD-L2 after exposure to liposomal aranoza did not change significantly (p = 0.1141), however, aranoza-lio and «empty» liposomes reduced the expression of PD-L2 (p = 0.0021 andp = 0.008).

Conclusion. These findings are consistent with those of other researchers and confirm that the level of PD-L1 and PD-L2 mRNA and protein are modulated after treatment. Also, various drug formulations of Aranoza, as well as the «empty» liposomes, have different effects on the expression of PD-L1 and PD-L2 mRNA and proteins.

Key words: PD-L1, PD-L2, aranoza, melanoma

Введение

В последние годы значительное развитие получила иммунотерапия опухолей. Разрешены к применению или находятся на последних фазах клинических испытаний новые иммунотерапевтические препараты для лечения меланомы, в том числе бло-каторы взаимодействия PD-1 с PD-L1/PD-L2 [1, 2]. Данные препараты показывают хорошие результаты по сравнению с традиционной химиотерапией опухолей [3]. Было замечено, что их эффективность зависит от наличия или отсутствия молекулы PD-L1 в опухоли [4]. В нормальной физиологии система PD-L1/PD-1 играет важную роль в предотвращении аутоиммунных реакций. PD-1 обычно экспрессиру-ется на Т- и В-клетках [5]. PD-1 взаимодействует с 2 лигандами: PD-L1 (В7-Н1, CD274) и PDL2 (В7^С, CD273), которые демонстрируют совершенно разные паттерны экспрессии. В норме PD-L1 (CD274) экс-прессируется на многих популяциях иммунных клеток [6], тогда как PD-L2 (CD273) экспрессируется на небольшом уровне в дендритных клетках и активированных макрофагах [7, 8]. Экспрессия PD-L1 на уровне матричной РНК (мРНК) высока в нормальных человеческих органах, включая сердце, скелетные мышцы, плаценту и легкие [9], однако экспрессия белка PD-L1 у здоровых субъектов имму-ногистохимически [10] не обнаруживается.

Интересно, что белок PD-L1 индуцируется в различных нелимфоидных клетках, включая эпителиальные [11, 12] и эндотелиальные [13], в ответ на воспалительные цитокины, присутствующие в очаге заболевания. Например, в воспаленной коже PD-L1 экспрессируется в некоторых клетках микрососудов и кератиноцитах, но в здоровой коже не обнаруживается [14]. Экспрессия PD-L1 в эпителиальных клетках почечных канальцев детектируется у пациентов с почечными заболеваниями, такими как ин-терстициальный нефрит, волчаночный нефрит

и IgA-нефропатия. Экспрессия PD-L1 на этих клетках in vitro повышалась после их стимуляции интер-лейкином-1 альфа, липополисахаридом, фактором некроза опухоли альфа, интерфероном гамма или ан-ти-CD40-антителами [15]. Таким образом, эпителиальная экспрессия PD-L1 индуцируется воспалительными стимулами как in vitro, так и in vivo [16].

Возможно, иммунологические механизмы, индуцирующие экспрессию PD-L1, также могут быть связаны с лекарственной устойчивостью к химиотерапии. Есть данные, что в некоторых клеточных линиях меланомы человека повышалась экспрессия поверхностного PD-L1 после выработки резистентности к вемурафенибу в процессе культивирования с препаратом [17, 18].

Несмотря на значительные успехи иммунотерапии, на сегодняшний день стандартным методом лечения пациентов с метастатической меланомой кожи без BRAF/cKIT-мутации остается химиотерапия [19].

Ряд исследований посвящен комбинации традиционной химиотерапии или таргетной терапии с иммунотерапией, в частности, изучается влияние хими-опрепаратов на индукцию противоопухолевого иммунитета, что может помочь в выборе оптимального сочетания препаратов и в итоге улучшить клинический эффект [20—22].

В настоящее время многие комбинации имму-нопрепаратов с химиопрепаратами находятся еще на доклинической стадии исследования. Часто непонятно, будет ли химиотерапия способствовать иммуногенности опухоли или же, наоборот, окажет иммуносупрессивный эффект, который может нивелировать положительное воздействие иммунотерапии. Для большинства таких комбинаций требуются тщательные клинические исследования [23].

К числу химиопрепаратов, применяемых для лечения метастатической меланомы, относятся и производные нитрозомочевины, в том числе араноза. Для

76 Оригинальные статьи

лечения меланомы кожи зарегистрирована лекар- Кроме лекарственных форм аранозы исследова-ственная форма аранозы «лиофилизат для приготов- ли воздействие на клетки «пустых» липосом того же ления раствора для инъекций» (араноза-лио). В лабо- состава, который использовался для липосомальной ратории разработки лекарственных форм НИИ аранозы. экспериментальной диагностики и терапии опухолей Клетки инкубировали с лекарственными форма-(НИИ ЭДиТО) ФГБУ «Российский онкологический ми аранозы в концентрации 0,5 ИК50 в течение 24 ч. научный центр им. Н.Н. Блохина» (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) Минздрава России создана новая ле- Подготовка клеточного материала и выделение карственная форма аранозы — липосомальная [24, 25]. общей РНК В исследованиях [26, 27] было показано, что липосо- Клетки снимали с культуральных флаконов мальная араноза in vitro оказывает воздействие на кле- 0,02 % раствором Версена объемом 2 мл, содержа-точные линии, устойчивые к аранозе-лио. Было обна- щим 0,25 % трипсина. Клетки находились в трипси-ружено, что лекарственные формы аранозы не 2 мин при постоянном наблюдении за их состоя-по-разному воздействуют на клетки меланомы [28, 29]. нием с помощью микроскопа. Добавляли 10 мл В связи с этим мы решили изучить влияние 2 буфера STE (0,1 моль натрия хлорида, 1 моль Трис-лекарственных форм аранозы — лиофилизата HCl pH 8,0, 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной для приготовления раствора для инъекций и липосо- кислоты) и центрифугировали в течение 5 мин мальной, а также «пустых» липосом, не содержащих при 800 об/мин. Удаляли супернатант, а клеточный аранозу, на экспрессию мРНК и поверхностных осадок ресуспендировали в 5 мл 0,9 % раствора на-молекул PD-L1 и PD-L2 в клеточных линиях мела- трия хлорида и центрифугировали в течение 5 мин номы человека. при 1200 об/мин. Из полученного осадка клеток далее выделяли РНК. Материалы и методы Выделение РНК из предварительно обработанных образцов производилось по протоколу, предло-Клеточные линии женному P. Chomczynski и N. Sacchi [33]. Подготов-Исследования проводили на 11 клеточных лини- ленный клеточный материал лизировали в 0,5 мл ях метастатической меланомы кожи человека: mel гуанидин-тиоцианатного буфера (4 моль тиоцианата Cher, mel H, mel Gus, mel BGF, mel Hn, mel Ibr, mel Il, гуанидина, 25 ммоль цитрата натрия, 0,5 % N-лау-mel Is, mel Me, mel Mtp и mel Si, выделенных из опу- рил-саркозината натрия и 0,1 моль р-меркаптоэта-холевого материала больных, проходивших лечение нола). Во время лизиса материал пропускали через в НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. иглу 19G не менее 20 раз. Далее в пробирку добавля-Н.Н. Блохина» Минздрава России [30]. Клеточные ли 0,5 мл водонасыщенного фенола (pH 5,2) линии различались по степени дифференцировки и 0,125 мл раствора ацетата натрия (pH 4,2), встряхи-и наличию или отсутствию мутаций гена BRAF [31, вали и добавляли 0,25 мл хлороформа. Полученную 32]. Линии mel Hn, mel Ibr, mel Il, mel Is, mel Si несут смесь встряхивали до молочно-белого цвета и цен-мутацию BRAF. Клеточные линии культивировали трифугировали в течение 10 мин при 12 000 об/мин в среде RPMI-1640, содержащей 10 % телячьей эм- и охлаждении до +4 °C. После центрифугирования бриональной сыворотки, 10 ммоль HEPES, 2 ммоль отбирали 0,65 мл верхней водной фазы, содержащей L-глутамина, пенициллин (25 000 Ед) — стрептоми- клеточную РНК, и смешивали ее с 0,65 мл изопропа-цин (25 000 мкг), пируват натрия, 0,1 % раствор ами- нола. Инкубирование РНК в изопропаноле прово-нокислот и 0,1 % раствор витаминов при +37 °C дилось в течение 20 ч при температуре —20 °C. После в атмосфере 5 % СО2 (полная среда). Клетки поддер- инкубирования РНК осаждали центрифугированием живали в логарифмической фазе роста постоянным в течение 10 мин при 12 000 об/мин, удаляли суперпересевом культуры через 3—4 дня. натант и 2 раза промывали в 80 % этаноле. После Противоопухолевые препараты промывок осадок РНК высушивали в термостате ♦ «Араноза, лиофилизат для приготовления в течение 20 мин при +37 °С, растворяли в 20 мкл раствора для инъекций, 500 мг» (арано- деионизованной воды и измеряли концентрацию за-лио) производства филиала «Наукопро- раствора. фи» ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» Мин- Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) здрава России; с использованием ревертазы брали 2 мкг мРНК, вы- ♦ липосомальная лекарственная форма ара- деленной на предыдущем этапе. Реакцию обратной нозы (липосомальная араноза), предостав- транскрипции проводили с использованием фермен-ленная лабораторией разработки лекар- та RevertAid Reverse Transcriptase и коммерческого ственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ набора реактивов (Fermentas, США) в условиях, им. Н. Н. Блохина» Минздрава России. предложенных фирмой-производителем. Для отжи-

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 2'2017 том 16 |vol. 16

га использовали смесь случайных гексамеров («Син-тол», Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления РНК. Пробу доводили до конечного объема 165 мкл деио-низованной водой.

количественная полимеразная цепная реакция

в реальном времени

Количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили с использованием 2-кратной реакционной смеси (40 ммоль Трис-HCl, 100 ммоль хлорида калия, 4 ммоль хлорида магния, 1 ммоль каждого из 4 дезоксирибонуклеотидов и 0,2 ммоль ß-меркаптоэтанола) и Taq-полимеразы (Fermentas, США). В каждую пробу было добавлено 5 мкл кДНК, 250 нмоль прямого и 250 нмоль обратного праймеров, и 140 нмоль флуоресцентного зонда. Подбор праймеров и флуоресцентных зондов проводили с использованием программы Vector NTI 10 на основе данных нуклеотидных последовательностей генов PD-L1 и PD-L2, доступных на интернет-ресурсе PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).

В каждом образце был исследован уровень экспрессии генов PD-L1 и PD-L2. Уровень экспрессии рассчитывали количественно относительно уровня экспрессии гена ABL.

Данный эксперимент проводили на приборе DT-Lite («ДНК-Технология», Россия).

Программа проведения реакций была следующей: предварительная обработка в течение 5 мин при +94 °C и 45 циклов денатурации в течение 10 с при +94 °C с последующим отжигом праймеров и синтезом в течение 12 с при +60 °C.

Для детекции флуоресценции был выбран канал Hex. Измерения велись по общепризнанной методике относительно гена ABL, уровень экспрессии которого был принят за 100 % [34]. Измерения уровня экспрессии проводились в 3 независимых повторах, после чего для анализа было рассчитано среднее значение. В качестве положительного контроля использовали векторы pET-15b, экспрессирующие клонированные геномные последовательности. Правильность синтезированных олигонуклеотидных последовательностей подтверждена секвенированием по Сэнгеру на анализаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

реакция иммунофлуоресценции

После 24 ч инкубации с исследуемыми препаратами клетки снимали с культуральных флаконов раствором Версена и 2 раза отмывали натрий-фосфатным буфером. Разносили в пробирки по 50 мкл и добавляли по 20 мкл антител к PD-L1 (CD274FITC, 558 065, BD Pharmingen™) и к PD-L2 (CD273APC, 557 926, BD Pharmingen™). Инкубировали в течение

30 мин, после чего 2 раза отмывали в натрий-фосфатном буфере. Подсчет проводили на проточном цито-флуориметре BD FACSCanto II с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (Bekton Dickinson, США). Измерения проводили в 3 независимых повторах, после чего для анализа было рассчитано среднее значение.

Статистический анализ данных

Для сравнения базового уровня экспрессии PD-L1 и PD-L2 между разными группами клеток линий меланомы, различающихся по таким признакам, как наличие или отсутствие мутаций гена BRAF и степень дифференцировки, использовался одно-факторный дисперсионный анализ (analysis of variation, ANOVA). Для сравнения эффектов, оказываемых на уровень экспрессии PD-L1 и PD-L2 различными формами аранозы, был использован T-критерий Уилкоксона для связных выборок. Анализ был проведен в программе STATISTICA версии 7. Различия считали достоверными при уровне значимости p <0,05.

Результаты

Клеточные линии метастатической меланомы кожи человека инкубировали в течение 24 ч с лекарственными формами аранозы — аранозой-лио и ли-посомальной, а также с «пустыми» липосомами, после чего оценивали изменение экспрессии мРНК и белков PD-L1 и PD-L2.

Некоторые клеточные линии — mel Cher, mel Bgf, mel Me — имеют высокий базовый уровень мРНК PD-L1 или PD-L2 (табл. 1). МРНК PD-L1 и PD-L2 экспрессируется на меньшем уровне в клетках, имеющих мутации гена BRAF, но эти различия были достоверны только для PD-L2 (p = 0,1373 и p = 0,0207 соответственно).

Уровень экспрессии мРНК PD-L1 и PD-L2 не зависит от степени дифференцировки клеточных линий меланомы (р = 0,8922 и р = 0,9582 соответственно) [31].

Определен уровень экспрессии поверхностных белков PD-L1 и PD-L2 в клеточных линиях метастатической меланомы человека (табл. 2). Экспрессия поверхностных белков PD-L1 и PD-L2 в не обработанных препаратами клеточных линиях чаще всего невысока или отсутствует. Положительная экспрессия хотя бы 1 из исследуемых белков детектируется только на 5 линиях из 11 (mel Cher, mel Gus, mel Bgf, mel Me, mel Mtp). Интересно, что все клетки, экспрессирующие белки PD-L1 или PD-L2, не имеют мутации гена BRAF.

Анализ изменения уровня экспрессии мРНК PD-L1 и PD-L2 показал, что араноза в разных лекарственных формах оказывает неодинаковые эффекты. В целом, после воздействия липосомальной аранозы

Таблица 1. Изменение экспрессии мРНК PD—L1 и PD—L2 в клеточных линиях метастатической меланомы человека

Клеточная линия Мутации BRAF Экспрессия мРНК, %

Необработанные клетки Араноза-лио Липосомальная араноза «Пустые» липосомы

PD-L1 PD-L2 PD-L1 PD-L2 PD-L1 PD-L2 PD-L1 PD-L2

mel Hn + 8,84 0,39 50,00 0,00 10,88 0,00 131,95 0,00

mel Ibr + 0,68 0,63 2,92 3,12 8,84 1,46 1,56 2,06

mel Il + 5,44 0,73 21,76 13,40 7,69 2,92 18,95 15,39

mel Is + 0,63 0,00 0,78 0,01 0,36 0,26 0,90 0,04

mel Si + 1,79 6,25 0,78 0,01 0,36 0,26 0,90 0,04

mel Cher - 70,71 20,31 123,11 40,61 5,44 1,18 214,35 151,57

mel H - 11,66 1,10 246,23 174,11 26,79 4,12 6,70 20,31

mel Gus - 4,12 16,49 0,78 17,68 8,84 7,18 10,88 263,90

mel Bgf - 12,50 75,79 1,27 107,18 0,96 3,35 12,50 123,11

mel Me - 23,33 81,23 5,44 17,68 5,08 7,69 7,18 21,76

mel Mtp - 8,80 13,40 1,46 4,42 0,01 1,67 1,10 1,10

II

Таблица 2. Изменение экспрессии поверхностных белков PD—L1 и PD—L2 в клеточных линиях метастатической меланомы человека

Клеточная линия мутации BRAF Антиген-положительные клетки, %

Необработанные клетки Араноза-лио Липосомальная араноза «Пустые» липосомы

PD-L1 PD-L2 PD-L1 PD-L2 PD-L1 PD-L2 PD-L1 PD-L2

mel Cher - 4,1 2,4 1 0,5 16,2 0,3 2,6 7,4

mel Gus - 0,7 30,8 1,3 24,8 20,1 2,8 1,3 0,6

mel Bgf - 4,5 95,5 0,1 98 6,3 1,9 0,7 15,8

mel Me - 0,8 9,9 0,9 0,7 0,7 1,7 1,9 25,9

mel Mtp - 2,1 14 1,9 0,2 2,3 1,1 1,1 17,4

уровень экспрессии PD-L1 и PD-L2 становится значительно ниже (р = 0,0004 и р = 0,0442 соответственно), чем в исходных линиях. Но есть исключения: в линиях те1 1Ьг, те1 Н и те1 Gus уровень экспрессии гена PD-L1 увеличился. Араноза-лио и «пустые» ли-посомы в основном привели к увеличению уровня экспрессии PD-L1 (р <0,0001 и р = 0,0005 соответственно) и PD-L2 (р = 0,0005 и р = 0,0025) (рис. 1). На отдельных линиях наблюдался противоположный эффект (табл. 1).

Араноза-лио и «пустые» липосомы уменьшают уровень экспрессии белка PD-L1 в линиях меланомы (р = 0,0663 и р = 0,7213 соответственно). Инкубация с липосомальной аранозой, напротив, приводит к значительному повышению уровня экспрессии белка PD-L1 по сравнению с исходными линиями (р = 0,0269) (рис. 2а).

Инкубация с аранозой-лио и «пустыми» липосо-мами уменьшает уровень экспрессии белка PD-L2 (р = 0,0021 и р = 0,008). Уровень экспрессии PD-L2 после воздействия липосомальной аранозы значимо не изменился (р = 0,1141) (рис. 2б).

Заключение

Мы обнаружили, что белки PD-L1 и PD-L2 экспрессируются только на клеточных линиях с диким типом ВВАР. Экспрессия мРНК и белка PD-L1 и PD-L2 на BRAF-отрицательных линиях достаточно заметно меняется после инкубации клеток как с разными лекарственными формами аранозы, так и с «пустыми» липосомами, однако изменения уровня белка не коррелируют с изменениями уровня мРНК. Учитывая тот факт, что в некоторых клеточных линиях «пустые» липосомы значимо

Оригинальные статьи 79

100 %

80 %

urn

: 60 %

fg =5 40 %

CD О

Я 1

О l-Q.O > 20 %

100 %

ucq

80 % *l60 %

й ^

о l-

Q.O > 20 %

Без обработки Араноза-лио Липосомаль- «Пустые» ная араноза липосомы

Без обработки Араноза-лио Липосомаль- «Пустые» ная араноза липосомы

Рис. 1. Изменение уровня экспрессии мРНКPD—L1 (А) и PD—L2 (Б) после воздействия исследуемыми препаратами

В

2 &

16 % 14 %

12 %

(V

гъ ^

О

CD

10 % 8 %

6 % 4 %

2 %

б

В

2

70 %

60 %

50 %

и

(V ^

О-о 40 %

U ш

*§30 %

о

m

у 20 %

10 %

Без обработки Араноза-лио Липосомаль- «Пустые» ная араноза липосомы

ITU

Без обработки Араноза-лио Липосомаль- «Пустые» ная араноза липосомы

Рис. 2. Изменение уровня экспрессии белков PD—L1 (а) и PD—L2 (б) после воздействия исследуемыми препаратами

повышают уровень экспрессии мРНК PD-L1 или PD-L2, становится ясно, что подобные изменения могут быть вызваны не только противоопухолевыми химиопрепаратами. Однако мы не можем объяснить, какие механизмы задействованы при повышении уровня экспрессии мРНК PD-L1 или PD-L2 под влиянием аранозы-лио или «пустых» липосом.

В схожих исследованиях на клеточных линиях меланомы человека отмечена важность сигнальных белков MAPK и STAT3 в увеличении уровня экспрессии мРНК и белка PD-L1 при воздействии вемура-фениба [17, 18] и STAT3 — в поддержании конститутивной экспрессии PD-L1 [35]. Также можно отметить, что в экспериментах in vitro на линиях плоскоклеточного рака пищевода человека облучение увеличивало поверхностную экспрессию PD-L1. Для плоскоклеточного рака пищевода лучевая терапия является хорошо налаженным лечебным воздействием и обеспечивает преимущества в выживаемости [36]. Для молекулы PD-L2 подобных данных в литературе не найдено.

В исследовании К.А. Schats и соавт. на 46 образцах метастазов меланомы изучали присутствие поверхностного PD-L1 методом иммуногистохимии

и его мРНК на 21 образце из 46. Данные иммуногистохимии показали высокую корреляцию с данными экспрессии мРНК PD-L1. Во всех образцах, где была измерена мРНК PD-L1, была обнаружена ее экспрессия на уровне от 1 до 250 % [37]. Эти результаты схожи с нашими данными, полученными на клеточных линиях, не обработанных препаратами. Схожие данные по экспрессии PD-L1 были получены на клеточных линиях меланомы человека и в работах других ученых [17, 18].

Наши результаты подтверждают данные других исследователей о том, что уровень мРНК и белка PD-L1 в клеточных линиях нестабилен.

Увеличение экспрессии PD-L1 и PD-L2 в опухолевых клетках может способствовать защите опухоли от иммунного ответа. В нашем исследовании липосомальная форма аранозы не вызывала значительного повышения уровня экспрессии мРНК PD-L1 и PD-L2 в исследованных линиях меланомы человека. Мы обнаружили, что, несмотря на повышение уровня экспрессии мРНК PD-L1 или PD-L2 под действием аранозы-лио или «пустых» липосом, экспрессия белков PD-L1 или PD-L2 значимо не повышается, а в большинстве случаев, наоборот, снижается.

б

а

а

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Franklin C., Livingstone E., Roesch A. et al. Immunotherapy in melanoma: recent advances and future directions. Eur J Surg Oncol 2017;43(3):604-11. DOI: 10.1016/j.ejso.2016.07.145. PMID: 27769635.

2. Ключагина Ю.И., Соколова З.А., Барышникова МА. Роль рецептора PD1 и его лигандов PDL1 и PDL2

в иммунотерапии опухолей. Онкопедиатрия 2017;4(1):49-55. DOI: 10.15690/onco.v4i1.1684.

3. Guan X., Wang H., Ma F. et al. The efficacy and safety of programmed cell death 1 and programmed cell death 1 ligand inhibitors for advanced melanoma: a me-ta-analysis of clinical trials following the PRISMA guidelines. Medicine (Baltimore) 2016;95(11):e3134.

DOI: 10.1097/MD.0000000000003134. PMID: 26986169.

4. Patel S.P., Kurzrock R. PD-L1 expression as a predictive biomarker in cancer immu-notherapy. Mol Cancer Ther 2015;14(4):847-56.

DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-14-0983. PMID: 25695955.

5. Pauken K.E., Wherry E.J. Overcoming T-cell exhaustion in infection and cancer. Trends Immunol 2015;36(4):265-76. DOI: 10.1016/j.it.2015.02.008.

6. Topalian S.L., Drake C.G., Pardoll D.M. Targeting the PD-1/B7-H1(PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Op Immunol 2012;24(2):207-12.

DOI: 10.1016/j.coi.2011.12.009. PMID: 22236695.

7. Loke P., Allison J.P. PD-L1 and PD-L2 are differentially regulated by Th1 and Th2 cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(9):5336-41. DOI: 10.1073/ pnas.0931259100. PMID: 12697896.

8. 8. Tseng S.Y., Otsuji M., Gorski K. et al. B7-DC, a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties for T-cells. J Exp Med 2001;193(7):839-46. DOI: 10.1084/jem.193.7.839.

PMID: 11283156.

9. Dong H., Zhu G., Tamada K., Chen L. B7-H1, a 3rd member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med 1999;5(12):1365-9.

DOI: 10.1038/70932. PMID: 10581077.

10. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R. et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med 2002;8(8):793-800.

DOI: 10.1038/nm730. PMID: 12091876.

11. Nakazawa A., Dotan I., Brimnes J. et al. The expression and function of costimula-tory molecules B7H and B7-H1 on colo-

nic epithelial cells. Gastroenterology

2004;126(5):1347-57.

DOI: http://dx.doi.org/10.1053/j.gas-

tro.2004.02.004.

PMID: 15131796.

12. Youngnak-Piboonratanakit P., Tsushima F., Otsuki N. et al. The expression of B7-H1 on keratinocytes in chronic inflammatory mucocutaneous disease and its regulatory role. Immunol Lett 2004;94(3):215-22. DOI: 10.1016/j.imlet.2004.05.007. PMID: 15275969.

13. Rodig N., Ryan T., Allen J.A. et al. Endothelial expression of PD-L1 and PD-L2 down-regulates CD8+ T-cell activation and cytolysis. Eur J Immunol 2003;33(11):3117-26.

DOI: 10.1002/eji.200324270. PMID: 14579280.

14. Mazanet M.M., Hughes C.C. B7-H1 is expressed by human endothelial cells and suppresses T-cell cytokine synthesis. J Immunol 2002;169(7):3581-8.

DOI: https://doi.org/10.4049/jimmu-

nol.169.7.3581.

PMID: 12244148.

15. Chen Y., Zhang J., Li J. et al. Expression of B7-H1 in inflammatory renal tubular epithelial cells. Nephron Exp Nephrol 2006;102(3-4):e81-92.

DOI: 10.1159/000089686. PMID: 16282703.

16. Ritprajak P., Azuma M. Intrinsic and extrinsic control of expression of the immu-noregulatory molecule PD-L1 in epithelial cells and squamous cell carcinoma. Oral Oncol 2015;51(3):221-8.

DOI: 10.1016/j.oraloncology.2014.11.014. PMID: 25500094.

17. Jiang X., Zhou J., Giobbie-Hurder A.

et al. The activation of MAPK in melanoma cells resistant to BRAF inhibition promotes PD-L1 expression that is reversible by MEK and PI3K inhibition. Clin Cancer Res 2013;19(3):598-609. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-2731. PMID: 23095323.

18. Atefi M., Avramis E., Lassen A. et al. Effects of MAPK and PI3K pathways on PD-L1 expression in melanoma. Clin Cancer Res 2014;20(13):3446-57. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-2797. PMID: 24812408.

19. Практические рекомендации по лекарственному лечению злокачественных опухолей (RUSSCO). Под ред. В.М. Моисеенко. М.: Российское общество клинической онкологии, 2016. 524 с.

20. Gotwals P., Cameron S., Cipolletta D.

et al. Prospects for combining targeted and conventional cancer therapy with immu-notherapy. Nat Rev Cancer

2017;17(5):2866-301. DOI: 10.1038/nrc.2017.17. PMID:28338065.

21. Simeone E., Grimaldi A.M., Festino L. et al. Combination treatment of patients with BRAF-mutant melanoma: a new standard of care. BioDrugs 2017;31(1):51-61. DOI: 10.1007/s40259-016-0208-z. PMID: 28058658.

22. Ascierto PA., Agarwala S., Botti G. et al. Future perspectives in melanoma research: meeting report from the «melanoma bridge». Napoli, December 1st-4th 2015.

J Transl Med 2016;14(1):313. DOI: 10.1186/s12967-016-1070-y. PMID: 27846884.

23. Harris S.J., Brown J., Lopez J. et al. Im-muno-oncology combinations: raising the tail of the survival curve. Cancer Biol Med 2016;13(2):171—93.

DOI: 10.20892/j.issn.2095-3941.2016.0015. PMID: 27458526.

24. Козеев Г.С. Разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевого препарата араноза. Автореф. ... дисс. кацд. фарм. наук. М., 2013. 25 c.

25. Козеев С.Г., Барышникова МА., Полозкова С.А., Оборотова НА. Разработка наноструктурированной липосомальной формы аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2012;11(2):24.

26. Козеев С.Г., Барышникова МА., Афанасьева Д.А. и др. Сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2012;11(2):24.

27. Грищенко Н.В., Альбассит Б., Барышникова М.А. и др. Сравнение цитоток-сического действия лекарственных форм противоопухолевых препаратов из класса нитрозомочевины апоптоза. Российский биотерапевтический журнал 2014;13(1):41-53.

28. Афанасьева Д.А., Мисюрин В.А., Пономарев А.В. и др. Изменение уровня экспрессии гена CD95/FAS в клетках линий меланомы под воздействием липосомальной аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(3):34-9.

DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-3-34-39.

29. Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Хоченкова Ю.А. и др. Липосомальная араноза не индуцирует аутофагию. Российский биотерапевтический журнал 2015;14(1):15—8.

30. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы — основа для создания противоопухолевых вакцин. Вестник РАМН 2005;7:37-40.

31. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экспрессия рако-во-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. Сибирский онкологический журнал 2010;37(1):29-39.

32. Рябая О.О., Цыганова И.В., Сидорова Т.И. и др. Влияние активирующих мутаций V600 гена BRAF на способность клеток меланомы к аутофагии. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи 2013;3:68-72.

33. Chomczynski P., Sacchi N. The singlestep method of RNA isolation by acid guani-dinium thiocyanate-phenol-chloroform

extraction: twenty something years on. Nat Protoc 2006;1(2):581-5. PMID: 17406285.

34. Moore F.R., Rempfer C.B, Press R.D. Quantitative BCR-ABL1 RQ-PCR fusion transcript monitoring in chronic myelogenous leukemia. Press Methods Mol Biol 2013;999:1-23.

DOI: 10.1007/978-1-62703-357-2_1. PMID:23666687.

35. Lienlaf M., Perez-Villarroel P., Knox T.

et al. Essential role of HDAC6 in the regulation of PD-L1 in melanoma. Mol Oncol 2016;10(5):735-50. DOI: 10.1016/j.molonc.2015.12.012. PMID: 26775640.

36. Chen M.F., Chen P.T., Chen W.C. et al. The role of PD-L1 in the radiation response and prognosis for esophageal squamous cell carcinoma related to IL-6 and T-cell immunosuppression. Oncotarget 2016;7(7):7913-24.

DOI: 10.18632/oncotarget.6861. PMID: 26761210.

37. Schats KA, Van Vre EA, De Schepper S. et al. Validated programmed cell death li-gand 1 immunohistochemistry assays (E1L3N and SP142) reveal similar immune cell staining patterns in melanoma when using the same sensitive detection system. Histopathology 2017;70(2):253-63. DOI: 10.1111/his.13056. PMID: 27496355.