Молекулярно-генетическая дифференциация штаммов frаnсisеllа тulаrеnsis, различающихся по таксономической принадлежности и вирулентности

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ШТАММОВ FRANCISELLA TULARENSIS, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ И ВИРУЛЕНТНОСТИ

М.И. Кормилицына, И.С. Мещерякова, Т.В. Михайлова

ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, Москва

Francisella tularensis является этиологическим агентом туляремии - природно-очаговой зоонозной инфекции. В настоящее время классификация рода Francisella и вида F.tularensis (F.t.) основана на результатах сравнительного анализа 16S рибосомальной РНК франци-селл (Sjöstedt, 2005). Одним из методов идентификации внутривидовых таксонов (подвидов) F.t. является высоковариабельный геномный регион различий - RD1 (Broekhuijen et.al.,2003). Информация о геномах фран-циселл вместе с развитием генетических инструментов приблизили к пониманию молекулярных основ вирулентности представителей отдельных таксонов F.t. Однако до настоящего времени недостаточно известно о факторах патогенности туляремийного микроба.

Одним из факторов патогенности многих бактерий являются гомологи генов - пилей 4 типа (п4т), которые также обнаружены в геномах всех подвидов F.t. (Gil et.al.,2004; Larsson et.al.,2005). При этом выявлены потенциально существенные различия в генах, кодирующих пилевый блок штаммов разных подвидов F.t., в том числе вакцинного штамма (Rohmer et.al.,2006; Chakraborty et.al.,2008). Показано, что некоторые мутации в генах п4т изменяли вирулентность F.t. для мышей (Forslund et.al.,2006; Hager et.al.,2006; Chakraborty et.al.,2008; Zogaj et.al.,2008). Так, Forslund с соавт. (2006, 2010) установили, что один из пилевых генов - pilA (pilEl), кодирующий поверхностный белок PilA, является необходимым для проявления вирулентных свойств F.t. holarctica и F.t. tularensis для мышей при подкожном введении. Вследствие мутации ген pilA был потерян в вакцинном штамме LVS (15), что подтверждает значение PilA для вирулентности. В связи с этим пиле-вые гены могут быть по крайней мере частично ответственны за патогенность возбудителя туляремии.

Ряд авторов в регионе генома RD18 обнаружили ген, который кодирует белок FTT0918 наружной мембраны, играющий важную роль в метаболизме железа. Показано, что этот белок необходим для проявления вирулентности F.t. (Svensson et. al., 2005; Twine et. al., 2005; Lindgren et.al., 2009; Salomonsson et. al., 2009).

Штаммы Francisella коллекции лаборатории туляремии не были охарактеризованы по генам вирулентности, включая гены п4т и FTT0918.

Цель данной работы: идентифицировать коллекционные и свежеизолированные штаммы Francisella, различающиеся по таксономической принадлежности и вирулентности, используя молекулярно-генетические методы исследования, выявить в ДНК штаммов Francisella локусы генов, ответственные за вирулентность возбудителя туляремии.

Методы исследования и результаты. Были исследованы 112 лабораторных штаммов Francisella в ПЦР со следующими праймерами: 1) TUL4G для детекции участка гена tul4 (lpnA), кодирующего иммуногенный эпитоп белка м.м. 17 кД наружной мембраны F.tularensis; 2) RD1 для выявления высоковариабельного геномного региона различий RD1.

Использование ПЦР-тест-системы TUL4G позволило идентифицировать все штаммы, относящиеся к виду F.tularensis, что свидетельствует о ее видоспеци-фичности. ПЦР с праймерами RD1 обеспечила четкую дифференциацию штаммов F.tularensis четырех подвидов: F.t.subsp. holarctica, в том числе биовара japónica; F.t. subsp. mediasiatica; F.t.subsp. tularensis и F.t. subsp. novicida на основании различий в размерах амплифи-цированных нуклеотидных последовательностей ДНК. Штаммы F.t.subsp. novicida(-like) не были определены с помощью праймерной пары RD1, что свидетельствовало о необходимости подбора специфических прай-меров для идентификации подобных штаммов.

Таким образом, молекулярно-генетическое тестирование с помощью ПЦР позволило осуществить видовую и внутривидовую идентификацию изученных штаммов франциселл. Вместе с тем не были выявлены различия между штаммами F.tularensis по вирулентности.

С целью дискриминации F.t. по вирулентности выбраны специфические олигонуклеотиды для ПЦР, направленные на выявление участков генов пилей и FTT0918. Исследованы 50 штаммов Francisella: F.t. subsp. holarctica - 15 вирулентных (биовары Erys и Eryr и japónica), 1 аттенуированный природный изолят, 12 вариантов вакцинного штамма 15НИИЭГ (антибиотико-резистентные и рекомбинантные), 3 авирулентных; F.t. subsp. mediasiatica - 2 вирулентных и 1 авирулент-ный; F.t. subsp. tularensis - 2 вирулентных и 3 аттенуи-рованных; F.t. subsp. novicida /novicida-like/ - 3; F. philo-miragia - 2. Штаммы культивировали на цистин-сер-дечном агаре с гемоглобином при температуре 37°С в течение 1 сут. Далее готовили суспензию микробных клеток (~ 109 м.к. в 1 мл 0,9 % NaCl), которую инакти-вировали при температуре 98-99° в течение 20 мин. Для выделения ДНК применяли коммерческие наборы «ДНК-ЭКСПРЕСС» или «Проба-НК». Для амплификации участков генов в ПЦР использовали тест-системы со следующими ген-специфическими праймерами: АВ -для участка гена pilA (номенклатура Forslund et.al., 2006); PE2-81F и PE2-294R - pilE2; PE3-88F и PE3-313R - pilE3; PE4-91F и PE4-339R - pilE4; PE5-119F и PE5-283R -pilE5; PF-667F и PF-1030R - pilF; PT-186F и PT682R -pilT; PD-38F и PD-198R - pilD; PQ-1259F и PQ-1547R -

1б0

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ

pilQ (Gil et al., 2004). Для амплификации участка гена FTT0918 были использованы пары праймеров 0918cis (Salomonsson et.al., 2009). Программы амплификации реакционных смесей состояли из циклов: I - 94°- 5 мин, II - (94°- 30 сек, Т отжига - 30 сек, 72°- 59 сек) х 30-40 циклов, III - 72°- 3 мин и 10°- режим хранения; Т отжига составляла 59°с праймерами AB/PE5/PD/PF; 60° -PE3 и 0918cis; 61°- PE2/PT/PQ; 64°- PE4.

У всех исследованных штаммов F.t. четырех подвидов выявлены участки пилевых генов: pilE2, pilE3; pilE4; pilE5; pilF; pilT; pilD и pilQ, продукты амплификации которых составили 214, 226, 248, 164, 364, 497, 161 и 289 п.н. соответственно. При использовании олиго-нуклеотидов АВ у вирулентных штаммов F.t. 3-х подвидов и F.t.novicida был обнаружен специфический участок гена pilA (~500 п.н.), который отсутствовал у вакцинного 15НИИЭГ, его вариантов и авирулентных штаммов F.t. subsp.holarctica. Вместе с тем pilA был выявлен как у вирулентных, так и аттенуированных штаммов F.t. подвидов tularensis и mediasiatica.

Для дискриминации вакцинных и авирулентных штаммов от вирулентных дополнительно использованы праймеры 0918cis, фланкирующие участок гена FTT0918. В результате был идентифицирован делеци-

рованный участок гена FTT0918 у вакцинного 15НИИ-ЭГ, его вариантов и авирулентных штаммов F.t. subsp. ^1агсйса (~2400 п.н.). Однако нами не выявлен специфический продукт амплификации (~4400 п.н.) в ДНК вирулентных штаммов К^ 3-х подвидов, который был обнаружен Salomonsson ейа1., 2009.

Штаммы F.phi1omiragia не были идентифицированы с помощью ПЦР со всеми указанными праймера-ми, что подтверждает таксономическую самостоятельность этого вида.

Таким образом, использование ПЦР-тест-систем с праймерами АВ и 0918cis позволило дискриминировать вирулентные штаммы К^1ю1агйтса от вакцинного 15НИИЭГ, его вариантов и авирулентных штаммов. Потеря полноценного гена рПА у штамма 15НИИЭГ, возможно, является одной из существенных генетических причин его аттенуации, что подтверждает данные, полученные Fors1und е^а1., 2006; Rohmer е^а1., 2006; Sa1omonsson et.aU, 2009 при исследовании штамма LVS (производного от 15НИИЭГ).

Полученные результаты вносят определенный вклад в изучение генов Кш1агег^, ответственных за вирулентность, и могут служить основой для продолжения поиска факторов патогенности возбудителя туляремии.

К ВОПРОСУ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА

Д.А. Ковалев, Ю.К. Кулаков*, Л.В. Ляпустина, Е.Н. Мисетова, С.И. Головнева

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, *ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, Москва

Бруцеллез является широко распространенной зоо-нозной инфекцией, вызываемой большим числом различных хозяевоспецифических грамотрицательных бактерий рода Brucella. В России основными патогенными видами бруцелл являются: B.melitensis, вызывающая наиболее тяжелые формы эпидемической заболеваемости, часто с хроническим течением; B.abortus и B.suis, обусловливающие спорадическую заболеваемость; B.canis, выделяемая в России с 1994 г. от собак и представляющая потенциальную опасность для человека.

Одним из существенных недостатков в средствах и методах борьбы с бруцеллезом в Российской Федерации является несовершенная система дифференциации и систематики выделяемых изолятов, которая проводится путем анализа большого набора тестов, включающих серологическую специфичность, ростовые потребности, биохимические свойства. Молекулярные методы типирования возбудителя до штаммового уровня широко не используются в России, что не позволяет решать важные задачи молекулярной эпидемиологии и систематики штаммов бруцеллезного микроба, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных государств.

В настоящее время существует очень мало доступных способов субтипирования бруцеллезных изолятов

для ретроспективного эпидемиологического анализа. Данное типирование затруднено из-за высокого уровня (более 90 %) гомологии ДНК внутри рода Brucella.

Описанная ранее методика определения гипервариабельности в коротких тандемных последовательностях для типирования штаммов некоторых бактериальных патогенов, имеющих также высокий уровень гомологии ДНК (Y.pestis, B.anthracis, M.tuberculosis), нашла в настоящее время широкое применение. Использование данного подхода для генотипирования бруцелл стало возможным в начале текущего столетия, когда был сиквенирован геном трех видов бруцеллезного микроба, показавший наличие в геноме возбудителя бруцеллеза присутствия более 100 локусов, содержащих тандемные повторы различной длины, имеющих как видовой, так и в ряде случаев штаммовый генетический полиморфизм.

В настоящее время исследователи используют несколько схем мультилокусного VNTR-типирования (MLVA) с разными локусами бруцелл. Наиболее часто в MLVA используют комбинацию локусов, предложенную P. Le Fleche et al., которая включает восемь маркеров с хорошей возможностью к видовой идентификации, обозначенных как минисателлитный набор, и семь - с большей дискриминационной способностью (микросателлитный набор).