ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПИЩЕВАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ НАРУШЕНИЙ МОТОРНОЙ ФУНКЦИИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ИЛИ УМЕНЬШЕНИЯ СИМПТОМОВ ТАКИХ НАРУШЕНИЙ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND FOOD COMPOSITION FOR PREVENTION OF IMPAIRMENT OF GASTROINTESTINAL TRACT MOTOR FUNCTION OR REDUCTION OF SUCH IMPAIRMENT SYMPTOMS

Область изобретения
Изобретение относится к фармацевтической композиции и пищевой композиции для профилактики нарушений моторной функции желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) или уменьшения симптомов таких нарушений и, в частности, к фармацевтической композиции, которая эффективна в профилактике и лечении нарушений моторной функции ЖКТ путем использования экстракта Chamaecyparis obtusa, и пищевой композиции, которую можно употреблять в пищу.
Уровень техники
Регулятор моторной функции ЖКТ можно применять при диспепсии или запорах, проявлениях синдрома раздраженной кишки, нарушении моторики ЖКТ, связанном с сахарным диабетом или химиотерапией, при обструкции кишечника, связанной с нарушением моторной функции пищеварительного тракта или при нарушениях моторики ЖКТ, обусловленных миотонической дистрофией.
Моторика ЖКТ регулируется внешней нервной системой, в частности, симпатической и парасимпатической, и собственной нервной системой ЖКТ, а также внутренними факторами или препаратами. В регуляции моторики участвуют также автономные факторы ЖКТ, такие как спонтанная активность гладких мышц кишечной стенки и интерстициальные клетки Кахаля (ИКК).
Интенсивные исследования, проведенные в эксперименте на животных в последнее десятилетие, показали, что функцию водителя ритма, обеспечивающего типичные фазические сокращения желудка, тонкой и толстой кишки, выполняют интерстициальные клетки Кахаля (Huizinga JD, Zarate N, Farrugia G, Physiology, Injury and Recovery of Interstitial Cells of Cajal: Basic and Clinical Science, Gastroenterology, 2009 November; 137 (5): 1548-56).
Интерстициальные клетки Кахаля - это основные клетки, регулирующие моторику ЖКТ. Физиологические функции этих клеток включают в себя: 1) генерирование медленных волн, которые вызывают спонтанное сокращение гладких мышц; 2) участие в распространении медленных волн вдоль ЖКТ; нейротрансмиссию между нервными окончаниями и гладкими мышцами; 4) модуляцию сенсорных стимулов, например, стимулов, возникающих в рецепторах растяжения.
Интерстициальные клетки Кахаля экспрессируют ген c-kit, который является протоонкогеном. Для идентификации ИКК в тканях прибегают к иммуногистохимическому исследованию. Кроме того, известно, что c-kit и его лиганд фактор стволовых клеток (SCF) играют существенную роль в развитии ИКК.
Исследования ИКК, выполненные к настоящему времени, были посвящены в основном морфологии этих клеток. Уменьшение количества ИКК и морфологические изменения в этих клетках, выявленные в клинической практике при кишечной непроходимости, болезни Гиршпрунга, хроническом запоре, диабетической гастроэнтеропатии, свидетельствуют о том, что нарушение моторики ЖКТ при заболеваниях ЖКТ тесно связано с клетками Кахаля (Ohlsson В, Veress В, Lindgren S, Sundkvist G. Enteric ganglioneuritis and abnormal interstitial cells of Cajal: Features of inflammatory bowel diseas. Inflamm Bowel Dis. 2007 Jun; 13 (6): 721-6 / Ordog T. Interstitial cells of Cajal in diabetic gastroenteropathy. Neurogastroenterol Motil 2008 Jan; 20 (1): 8-18).
Описание изобретения
Для преодоления описанных выше проблем в настоящем изобретении для профилактики нарушений моторной функции ЖКТ или уменьшения симптомов таких нарушений предлагается фармацевтическая композиция и пищевая композиция с использованием экстракта Chamaecyparis obtusa. В частности, цель настоящего изобретения состояла в подтверждении возможности регуляции моторики ЖКТ путем изменения электрической активности ИКК.
Для достижения этой цели предлагается фармацевтическая композиция, призванная предупредить нарушение моторики ЖКТ или уменьшить симптомы таких нарушений, причем фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента экстракт Chamaecyparis obtusa.
Варьируя электрическую активность ИКК, можно предупредить нарушения моторики ЖКТ или уменьшить симптомы таких нарушений.
Экстракт Chamaecyparis obtusa можно получить из листьев, ствола и веток этого растения способом экстракции сверхкритической жидкостью или экстракции горячей водой.
Экстракция сверхкритической жидкостью длится от 30 до 240 минут при температуре 35-45°C и давлении 100-500 бар, в качестве поверхностной жидкости при этом способе используют диоксид углерода.
Кроме того, для достижения поставленной цели в изобретении предлагается пищевая композиция, включающая в качестве активного ингредиента экстракт Chamaecyparis obtusa.
Полезные эффекты
Как было сказано выше, с помощью композиций по изобретению можно предупредить или уменьшить симптомы заболеваний, ассоциированных с нарушениями моторики ЖКТ, таких как диспепсия или запоры, синдром раздраженной кишки, нарушения моторики ЖКТ, связанные с сахарным диабетом или химиотерапией, обструкция кишечника, связанная с нарушением моторной функции пищеварительного тракта или с миотонической дистрофией. В частности, моторику ЖКТ можно эффективно регулировать, изменяя электрическую активность ИКК.
Краткое описание чертежей
Подробное описание и соответствующие фигуры позволят более отчетливо представить цели, особенности и преимущества настоящего изобретения:
На фиг.1-4 представлены графики, иллюстрирующие результаты GC/MS анализа экстракта Chamaecyparis obtusa, приведенных в качестве примеров, иллюстрирующих варианты осуществления изобретения.
На фиг.5 показан график, иллюстрирующий изменения электрической активности ИКК при воздействии под влиянием экстракта Chamaecyparis obtusa по изобретению.
Лучший вариант осуществления изобретения
В дальнейшем приводится подробное описание фармацевтической композиции и пищевой композиции, предлагаемой для профилактики и лечения нарушений моторики ЖКТ в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения.
Фармацевтическая композиция и пищевая композиция для профилактики и лечения нарушений моторики ЖКТ в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения включают в качестве активного ингредиента экстракт Chamaecyparis obtusa.
Экстракт Chamaecyparis obtusa можно получить разными способами. Например, можно залить экстракционным раствором листья, ствол или ветки Chamaecyparis obtusa для экстракции горячей водой, cold needle или thermoneedle. В этом случае экстрагирующий раствор добавляют к Chamaecyparis obtusa в весовом соотношении 1:2-20, перемешивают, проводят экстракцию при 10-150°C в течение 1-24 часов. В качестве экстракционного раствора можно использовать по меньшей мере один из группы, состоящей из воды, С1-С4 низших спиртов, полиспиртов или их смеси. С1-С4 низшие спирты могут включать метанол, этанол и т.д. Полиспирты могут включать бутиленгликоль, пропиленгликоль, пентиленгликоль. Смеси могут включать смесь воды и низшего спирта, смесь воды и полиспирта, смесь воды и низшего спирта и полиспирта или смесь воды, низшего спирта и полиспирта.
Кроме того, экстракт Chamaecyparis obtusa можно получить кипячением с обратным холодильником, способом ультразвуковой экстракции или экстракции сверхкритической жидкостью. Кроме того, экстракт Chamaecyparis obtusa может также включать экстракты, полученные способами, упомянутыми выше, и путем обычной очистки. Например, экстракт Chamaecyparis obtusa может также включать активные фракции, полученные способом экстракции с использованием ультрафильтрационной мембраны, имеющей постоянное значение отсечения по молекулярной массе, различных способов экстракции, основанных на хроматографии и различных дополнительных способов очистки.
Экстракт Chamaecyparis в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения получают по меньшей мере из одной из частей этого растения: листьев, ствола или веток способом экстракции горячей водой или экстракции сверхкритической жидкостью.
В частности, предпочтительно, чтобы экстракт Chamaecyparis obtusa был получен способом экстракции сверхкритической жидкостью.
В примере с экстракцией горячей водой, приведенном в предпочтительном варианте осуществления изобретения, воду к Chamaecyparis obtusa добавляют в весовом соотношении 5-15:1, проводят экстракцию при 80-120°C в течение 5-20 часов.
Способ экстракции сверхкритической жидкостью эффективен в связи с низкой вязкостью сверхкритической жидкости, высокой проникающей способностью и высокой скоростью экстракции, которые объясняются высоким коэффициентом диффузии. Кроме того, экстракцию сверхкритической жидкостью выполняют при относительно низкой температуре, что позволяет избежать термического повреждения. Достоинство экстракции сверхкритической жидкостью заключается и в том, что экстракционный остаток и растворитель можно легко отделить из-за большой разницы в плотности между образцом и сверхкритической жидкостью.
Сверхкритическая жидкость - это жидкость при высокой температуре и давлении, которой воздействуют на сверхкритический целевой материал, например, диоксид углерода, воду, спирт или гелий, при критической температуре и давлении. Сверхкритическая жидкость по существу имеет такую же плотность, как обычная жидкость, однако значительно меньшую вязкость, приближающуюся к вязкости газа, и значительно более высокую диффузионную способность, которая около 100 раз превышает диффузионную способность типичной жидкости. Сверхкритическая жидкость при воздействии на экстракционную мишень позволяет получить экстракт высокой чистоты.
В настоящем изобретении в качестве сверхкритической жидкости можно использовать диоксид углерода, при этом предпочтительно, чтобы экстракция протекала при 35-45°C, давлении 100-500 бар и времени экстракции от 30 до 240 мин. Чем выше давление, тем эффективнее экстракция. В этом случае, однако, содержание фитонцидных ингредиентов снижено. Поэтому предпочтительно, чтобы давление, необходимое для увеличения выхода фитонцидных ингредиентов с небольшой молекулярной массой, было в пределах 150-200 бар.
Подготовка к экстракции сверхкритической жидкостью может включать очистку, сушку и распыление Chamaecyparis obtusa. Чтобы воспрепятствовать улетучиванию фитонцидных ингредиентов из Chamaecyparis obtusa, предпочтительно, чтобы сушка проводилась на воздухе при низкой температуре или способом сублимационной сушки.
При сверхкритической экстракции можно использовать жидкую смесь, в которой имеется совместный растворитель, в свою очередь смешанный с диоксидом углерода в качестве сверхкритической жидкости. Сорастворителем может быть по меньшей мере одно из следующих веществ: этанол, метанол, вода, этилацетат, гексан и диэтиловый эфир. Предпочтительно, чтобы в качестве сорастворителя использовался 80-100% этанол.
Фармацевтическая композиция по изобретению для регуляции моторики ЖКТ может содержать 0,01-99 мас.%, но предпочтительно, чтобы содержание экстракта Chamaecyparis obtusa составляло 0,05-50 мас.% общей массы фармацевтической композиции.
Лекарственные формы с фармацевтической композицией по изобретению включают препараты для приема внутрь: порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии или сиропы, а также препараты для инъекций, ингаляции, суппозитории и пластырь.
Фармацевтическая композиция по изобретению может включать также фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или растворитель в зависимости от того, какими свойствами хотят наделить композицию.
Фармацевтическая композиция по изобретению, назначаемая внутрь, может включать в себя фармацевтически приемлемое формообразующее вещество, в частности, связующее вещество (например, пептизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу и др.); наполнитель (например, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, фосфат кальция и др.); лубриканты (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния и др.), дезинтегранты (например, картофельный крахмал, натрия крахмалгликолат и др.) или увлажняющий агент (например, лаурилсульфат натрия). В типичном случае фармацевтическая композиция по изобретению представляет собой твердую лекарственную форму: гранулы, порошок, таблетки, капсулы. Таблетки и капсулы могут быть покрыты оболочкой по способу, известному специалистам в данной области.
Жидкие лекарственные формы для приема внутрь включают, например, сиропы, эмульсии или суспензии, или сухие вещества, которые перед употреблением комбинируют с водой или другими подходящими растворителями.
Жидкие лекарственные формы могут включать также фармацевтически приемлемые добавки, например, суспензии (например, сорбитовый сироп, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидрогенизированный пищевой жир и др.), эмульгатор (например, лектин, гуммиарабик и др.), неводный растворитель (например, миндальное масло, масляный сложный эфир, этиловый спирт и др.); или антисептический агент (например, метил- или пропил-р-гидроксибензоат, сорбиновую кислоту и др.). В фармацевтическую композицию по изобретению предпочтительно включить по меньшей мере один фармацевтически приемлемый подсластитель, например, сахарин, сахарин натрия, сахарин кальция, аспартам, ацесульфам калия, цикламат натрия, элитам, сахаристые вещества на основе дигидрохалкона, монеллин, стевиозид или сукралозу (4,1′,6′-тридеоксигаллактосукроза) и любой объемный подсластитель (например, сорбитол, маннитол, фруктозу, сукрозу, мальтозу, изомальт, глюкозу, гидрогенизированный сироп глюкозы, ксилитол, карамель, мед и т.д.).
Композиции для неорального применения включают стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензию, эмульгатор, агент сублимационной сушки, суппозитории и т.д. Пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие, как оливковое, инъекционные препараты сложных эфиров, например этилового эфира олеиновой кислоты, можно применять в качестве неводного растворителя и в виде суспензии. Витепсол, макрогол, твин 61, масло какао и его лауриновый заменитель, глицеринизированный желатин - все эти вещества можно использовать в качестве основы для изготовления суппозиториев.
Дозы фармацевтической композиции по изобретению могут варьироваться в зависимости от общего состояния больного и его массы тела, тяжести заболевания, лекарственной формы, пути введения, интервалов между введениями и т.д., но могут быть подобраны также специалистом в данной области. Например, фармацевтическую композицию по изобретению можно назначить в дозе от 0,0001 до 100 мг/кг, предпочтительно от 0,001 до 100 мг/кг в сутки. Дозу фармацевтической композиции по изобретению можно назначать один или несколько раз в сутки.
Фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить различными путями млекопитающим, включая домашний скот и человека. Фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить через рот, ректально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, вагинально, трансдермально, эндокраниально и интрацеребрально.
В альтернативном варианте осуществления изобретения предлагается пищевая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента экстракт Chamaecyparis obtusa, которая может регулировать моторную функцию ЖКТ. Пищевая композиция по изобретению может включать экстракт Chamaecyparis obtusa в количестве 0,01-60 мас.% от общей массы пищевой композиции.
Под пищевой композицией понимаем пищу, которую обычно принимает человек, и которая в собирательном смысле включает те продукты, которые человек ест и пьет, но в настоящем изобретении тип пищевой композиции не ограничен. Пищевую композицию можно составить, смешивая в различные типы известные пищевые добавки и пищевые продукты, включая напитки, гранулы, порошок, пилюли, капсулы, натуральные пищевые продукты, макаронные изделия, кондитерские изделия, мясо, рыбу, салат, блюда из тушеного мяса или рыбы, вареный рис и т.д. Предпочтительно готовить пищевую композицию как одну композицию, подобранную из напитков, гранул, порошков, пилюль и капсул. Пищевую композицию легко составить и можно употребить в любое время и в любом месте.
Примеры пищевых добавок включают сахариды, например моносахариды, дисахариды, полисахариды или сахарный спирт, вкусовое вещество, например тауматин, экстракт стевии, сахарин или аспартам, нутриентные добавки, витамины, пищевой электролит, вкусовое вещество, красящее вещество, усиливающий агент (например, сыр, шоколад и т.д.), fectic acid, альгиновая кислота, органическую кислоту, протективный коллоидный загуститель, регулятор рН, стабилизатор, антисептический агент, глицерин, спирт и карбонизатор.
Примеры напитков включают экстракт Chamaecyparis obtusa от 0,01 до 60 мас.%, очищенную воду 5-70 мас.%, таурин 0,1-5 мас.%, лимонную кислоту 0,1-5 мас.%, витамин A 0,1-5 мас.%, витамин B 0,1-5 мас.% и углеводы 10-20 мас.%. Примеры углеводов включают обычный сахар, в том числе моносахарид, такой как глюкоза или фруктоза, дисахарид, такой как мальтоза или сукроза, и полисахарид, такой как декстрин или циклодекстрин, ксилитол, сорбитол, эритритол и т.д.
Кроме того, пищевая композиция может включать также различные виды вкусовых веществ вместе с обычными напитками. Примеры вкусовых агентов включают натуральные вкусовые агенты, такие как тауматин или экстракт стевии и синтетический вкусовой агент, такой, как сахарин или аспартам. Кроме того, напиток может включать мякоть плодов для приготовления натурального сока или овощного напитка, которые можно употреблять по отдельности или в комбинации.
Твердая композиция, например, гранулы, порошок, таблетки или капсулы, может включать 0,01-60 мас.% экстракта Chamaecyparis obtusa и может далее включать адгезивы, витамины и углеводы.
Далее приводятся примеры для лучшего понимания данного изобретения, но это примеры лишь одного из различных вариантов осуществления изобретения, которые даны лишь с иллюстративной целью и не исчерпывают всего изобретения.
Экстракция
1. Сбор и предварительная обработка образцов
Для проведения теста были использованы деревья, произрастающие в районе Jangsung в южной части Кореи. Деревья Chamaecyparis obtusa, собранные в октябре 2010 г., были куплены в Jangsung Chamaecyparis Obtusa Farming Union Corporation.
Листья Chamaecyparis obtusa отделяли и отмывали водой для удаления чужеродных частиц, затем помещали в полиэтиленовый пластиковый мешок и запечатывали его для хранения при 4°C в холодильной камере. Проводили низкотемпературную сушку холодным воздухом с помощью низкотемпературной сушилки воздухом (GCT-0615, Green Cool Tech) при 35°C в течение около 24 ч. Листья высушенного Chamaecyparis obtusa измельчали в порошок с помощью миксера и сразу подвергали экстракции с помощью устройства для экстракции сверхкритической жидкостью.
2. Кондиционирование процесса экстракции
2
Образец Chamaecyparis obtusa подвергали предварительной обработке (то есть листья измельчали в порошок), помещали в специальное оборудование SCFE-0500, II-shin Autoclave, Co., LTD, Корея) для экстракции сверхкритической жидкостью (экстракция сверхкритической жидкостью CO (0,5 л)).
2
2
2
Перед введением образца в кристаллизационный бак температуру в баке доводили до 40°C. Когда температура в кристаллизационном баке стабилизировалась на уровне 40°C, образец Chamaecyparis obtusa инъецировали в кристаллизационный бак с помощью насоса высокого давления и затем через верхний контур вводили заранее определенное количество антирастворителя (CO), пока давление в кристаллизационном баке не достигало тестового уровня 100-200 бар. При введении газа клапан регулировали так, чтобы давление в кристаллизационном баке менялось линейно. Спустя заранее установленное время (30-240 мин) после введения газа клапан в нижней части кристаллизационного бака открывали для медленного выхода газа, а через верхнюю часть кристаллизационного бака вводили чистый CO, поддерживая таким образом давление в кристаллизационном баке на постоянном уровне. После введения CO давление снижали и собирали экстракт Chamaecyparis obtusa.
3. Эффективность экстракции Chamaecyparis obtusa
Для исследования эффективности получения экстракта Chamaecyparis obtusa в зависимости от условий экстракции при фиксированной температуре экстракции на уровне 40°C рассчитывали выход экстракта в зависимости от времени в процентах для различных уровней давления. Результаты определения представлены в табл.1.
Выход экстракции (%) рассчитывали по формуле: количество экстракта (г)/доза образца (г)×100. Количество экстракта (г) рассчитывали, вычитая из количества взятого исходно образца количество образца, которое осталось после завершения экстракции.
Как видно из табл.1, при одном и том же давлении экстракции эффективность ее повышалась с увеличением времени экстракции. В целом, результаты подтвердили, что в случае экстракции горячей водой выход экстракта составляет менее 5%, а при экстракции сверхкритической жидкостью выход экстракта был очень высокий.
4. Анализ ингредиентов экстракта Chamaecyparis obtusa
Образец экстракта Chamaecyparis obtusa тщательно взбалтывали в гексане, флотирующие частицы удаляли с помощью центрифугирования и жидкость пропускали через микрофильтр (0,45 мкм) для приготовления экстракта Chamaecyparis obtusa. Анализ ингредиентов экстракта Chamaecyparis obtusa выполнен на оборудовании GC/MS (240-MS, Varian) при следующих условиях: колонка VF-5ms (30 мм×0,25 мм×0,25 мм), газ-носитель гелий Не (1 мл/мин), температура инъекции 250°C, скорость повышения температуры в печи от 50 до 300°C/3°C, инъекционный объем 1 мкл, коэффициент разделения 10:1. Ингредиенты взвешивали с помощью масс-селективного детектора (MDS) при диапазоне масс от 28 до 550 в режиме сканирования.
Сначала измеряли время удерживания ингредиентов, которые содержатся в экстракте Chamaecyparis obtusa и которые экстрагировали при 40°C, давлении 150 бар в течение 180 мин (см. график на фиг.1). Это время сравнивали со временем удерживания 33 стандартных веществ, принадлежащих к фитонцидам; результаты качественного анализа экстракта Chamaecyparis obtusa приведены в табл.2.
Данные, приведенные на фиг.1 и в табл.1, подтверждают, что первичные ингредиенты экстракта Chamaecyparis obtusa были идентичны фитонцидным ингредиентам. Фитонцидные ингредиенты, содержащиеся в экстракте Chamaecyparis obtusa, в большинстве своем характеризуются пиками на 40-й минуте или менее.
Кроме того, результаты показали также, что, если экстракцию проводили при более высоком уровне давления, многие пики появлялись даже после 40-й минуты. Это, по-видимому, объясняется тем, что из листьев Chamaecyparis obtusa при высоком уровне давления экстрагировались ингредиенты, имеющие более высокую молекулярную массу. Следовательно, чтобы увеличить содержание фитонцидных ингредиентов, обладающих высокой летучестью и имеющих низкую молекуярную массу (100~300), предпочтительно, чтобы ингредиенты, содержащиеся в экстракте Chamaecyparis obtusa, были экстрагированы при относительно низком уровне давления, то есть при уровне не более 200 бар.
Далее, было исследовано различие в содержании ингредиентов в экстракте Chamaecyparis obtusa в зависимости от способа предварительной сушки. В процессе сушки возможно улетучивание ингредиентов, обладающих высокой летучестью. Сушку осуществляли двумя способами - холодным воздухом и сублимацией.
Проведено сравнение двух образцов экстракта Chamaecyparis obtusa - высушенного холодным воздухом (при 40°C, давлении 150 бар в течение 180 мин) и сублимацией (при 40°, давлении 150 бар в течение 180 мин). Результаты сравнения отражены на графике, приведенном на фиг.2. В табл.3 приведены данные о содержании первичных ингредиентов в экстракте Chamaecyparis obtusa. Сушке глубоким замораживанием подвергали листья Chamaecyparis obtusa; она проводилась на сублимационной сушилке OPR-FDT-8650, OPERON в течение 72 часов.
Как видно из фиг.2 и табл.3, степень улетучивания соответствующих ингредиентов варьировалась в зависимости от примененного способа сушки, но общее содержание ингредиентов при сушке холодным воздухом было на 1% больше, чем при сушке глубоким замораживанием. Таким образом, эти данные подтвердили отсутствие достоверной разницы в содержании фитонцидных ингредиентов при сушке указанными двумя способами. Тем не менее, низкотемпературная сушка холодным воздухом имеет незначительное преимущество, так как содержание ингредиентов, получаемых при экстракции, несколько больше.
Чтобы исследовать летучесть и остаточное содержание фитонцидных ингредиентов в экстракте Chamaecyparis obtusa, было отобрано два опытных образца с экстракта, полученного из заданного количества Chamaecyparis obtusa (условия экстракции 40°C, 150 бар, 180 мин), подвергнутого сушке холодным воздухом; один образец оставляли на воздухе, другой запечатывали для хранения. Через 3 дня соответствующие образцы растворяли в гексане и подвергали анализу. Результаты анализа показаны на графике GC/MS на фиг.3, а содержание первичных ингредиентов приведено в табл.4.
Как видно из фиг.3 и табл.4, когда экстракт Chamaecyparis obtusa хранили на воздухе в течение 3 дней, какие-либо пики не наблюдались до 20 мин. Более 95% ингредиентов, имеющих пик до истечения 20 мин, улетучивались. Ингредиенты, пики которых приходятся на период до 20 мин, имели относительно низкую молекулярную массу и большинство из них улетучились в течение 3 дней, в то время как ингредиенты, у которых пики приходились на период после 40-й минуты, имели относительно большую молекулярную массу и большинство из них не улетучилось. Это отчетливо подтверждалось пиками, появлявшимися до 20-й минуты, по сравнению с образцом, который был запечатан и оставлен на хранение на 3 дня.
Кроме того, подтвердилось, что некоторые ингредиенты, включая цис-неролидол, неролидол-транс, цедрол и т.д. в образцах, находившихся на воздухе в течение 3 дней, сохранились в больших количествах, чем ингредиенты в образцах, запечатанных и хранившихся в течение 3 дней. Из этого факта можно сделать вывод, что ингредиенты с высоким молекулярным весом были концентрированными, в то время как ингредиенты с низким молекулярным весом улетучились.
Результаты проведенных выше экспериментов подтвердили также, что оптимальные условия для получения большего количества экстракта Chamaecyparis obtusa с высоким содержанием фитонцидных ингредиентов при экстракции сверхкритической жидкостью соответствовали 40°C и давлению 150-240 бар. Подходящее время экстракции, необходимое для эффективного выхода экстракта, составило 30-240 мин, предпочтительно 180-240 мин.
При получении экстракта Chamaecyparis obtusa из образца Chamaecyparis obtusa, высушенного на холодном воздухе, при оптимальных условиях экстракции 40°C, 150 бар и 180 мин были исследованы изменения в ингредиентах в зависимости от циклов экстракции. Для этой цели определяли содержание ингредиентов в экстракте Chamaecyparis obtusa, полученном при одном цикле экстракции (экстракт 1 цикла) и в экстракте Chamaecyparis obtusa, полученном в двух циклах (экстракт 2 циклов) при тех же условиях. Результаты анализа представлены графически на фиг.4, а содержание первичных ингредиентов приведено в табл.5.
Как видно из фиг 4 и табл.5, количество фитонцидных ингредиентов, полученных при одном цикле экстракции, составило около 23,6%, количество, экстрагированное за два цикла, - около 45,5%. Тем самым подтвердилось положение о том, что фитонцидные ингредиенты высокой чистоты можно получить при повторной экстракции.
Регуляция моторной функции ЖКТ
Моторика ЖКТ регулируется внешней нервной системой, каковой является симпатическая или парасимпатическая нервная система, собственной, или внутренней, нервной системой ЖКТ, внутренними факторами и лекарствами. Кроме того, автономные факторы ЖКТ, такие как спонтанная активность гладких мышц кишечника и ИКК, также участвуют в осуществлении моторной функции ЖКТ. Данный тест выполняют с целью подтвердить, что моторику ЖКТ можно регулировать с помощью экстракта Chamaecyparis obtusa, изменяя электрическую активность ИКК.
1. Изоляция ИКК
Использованы 10-15-дневные мыши линии Balb/C независимо от пола, которых усыпляли эфиром и умерщвляли, вызывая дислокацию шейных позвонков. Затем вскрывали брюшную полость и иссекали сегменты толстой кишки. Иссеченные сегменты разрезали в контейнере с бикарбонатным раствором Кребса-Рингера при комнатной температуре. После фиксирования ткани булавкой с помощью препаровочных микроножниц удаляли слизистую оболочку под оптическим микроскопом и обнажали слой циркулярных мышц. Изолированную мышечную ткань переносили в раствор Хэнка, содержащий 0,1% коллагеназы (Worthington Biochemical Co., Lakewood, USA), 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) и 0,1% ингибитора трипсина (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) без ионов кальция Ca+2 с последующим гашением при постоянной температуре 37°C в течение 13 мин. После этого реакционный раствор восстанавливали раствором Хэнка без ионов кальция и тщательно перемешивали стеклянной пипеткой с тупым концом для изолирования клеток.
2. Культивирование ИКК
2
2
Изолированные клетки разделяли и переносили на стерильное покровное стекло, покрытое мышиным коллагеном (2,5 г/мл Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA), помещенное в 35-миллиметровый культуральный сосуд. Через 10 мин наливали культуральную среду для гладких мышц (SmGm) (Clonetics Corp., San Diego, Ca, USA), содержащую фактор стволовых клеток (SCF) (5 нг/мл, Sigma) и 2% антибиотика/антимотика (Gibco-BRL) и сосуд помещали в культиватор при 95% O- 5% CO при 37°C. На следующий день после культивации из культурального раствора удаляли только 2% антибиотика/антимикотика для изменения питательного раствора. Эксперименты выполняли через два дня после начала культивирования.
Культивированные ИКК идентифицировали, используя антитела против коммерческого белка (АСК2, Gibco-BRL), и выполняли иммунофлюоресценцию, используя краситель Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). После иммунофлюоресценции клетки исследовали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (FV300, Olympus, Japan).
3. Регистрация потенциала и тока в клеточной мембране
Культуральные среды с клетками переносили с помощью контроллера постоянной температуры, установленного на инвертированном микроскопе, и внеклеточный раствор пропускали через него со скоростью 2-3 мл/мин. С помощью метода локальной фиксации потенциала, примененного в конфигурации whole-cell («целая клетка»), регистрировали мембранный потенциал клетки при фиксированном трансмембранном токе и трансмембранный ток при фиксированном мембранном потенциале. Сигналы на выходе из усилителя (Axopatch 1-D, Axon Instruments, Foster, С A, USA) выводили на цифровой осциллоскоп и на регистрирующее устройство. Настройку фиксированного и стимулирующего потенциала и регистрацию тока осуществляли с помощью устройства pClamp (версия 6, Axon instruments) и на IBM-совместимом компьютере. Мембранные токи клетки регистрировали при фиксированном потенциале -80 мВ. Эксперименты выполняли при 29°C.
4. Результаты
При фиксированном токе мембранный потенциал ИКК оказался равным -57±5 мВ, частота пейсмекерной активности - 5±2 цикла/мин. Экстракт Chamaecyparis obtusa, полученный из образца этого растения (условия экстракции: 40°C, 150 бар, 180 мин), подвергнутого сушке холодным воздухом, был растворен в воде до концентрации 0,05%. Раствор с подобранной концентрацией наносили на ИКК. Как видно из графика (А), отражающего результаты эксперимента, частота пейсмекерной активности ИКК возрастала. График (В) на фиг.5 - при частоте 5 концентрация экстракта Chamaecyparis obtusa возросла до 0,1%, низкая поляризация мембраны приводила к увеличению частоты пейсмекерных стимулов, генерируемых ИКК.
Как было описано выше, результаты экспериментов подтвердили, что экстракт Chamaecyparis obtusa может регулировать моторику ЖКТ, изменяя электрическую активность ИКК как пейсмекерных клеток ЖКТ.
Хотя типичные варианты осуществления изобретения были подробно описаны выше, необходимо иметь в виду, что многие описанные варианты и модификации основной концепции изобретения, с которыми может столкнуться специалист в данной области, охватываются вариантами осуществления изобретения, указанными в прилагаемой формуле изобретения.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение можно эффективно применять в качестве лекарства или пищи для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушением моторики ЖКТ, например диспепсии и запоров, синдрома раздраженной кишки, диабетической гастроэнтеропатии, а также нарушений моторики кишечника, связанных с химиотерапией, обструкции, связанной с этими нарушениями или с миотонической дистрофией.