Устройство для лазерной биопечати

Полезная модель относится к биотехнологиям и биомедицине и может применяться, например, для создания двухмерных и трехмерных структур из биообъектов, отбора микропроб для выделения микроорганизмов.
Известно устройство для биопечати (биопринтер), работающее по принципу капельной струйной печати (патент RU 2558290, «Биопринтер», МПК С12М 3/00, опубл. 27.07.2015). Основными недостатками устройства являются низкая точность позиционирования, малая производительность (скорострельность), недостаточный диапазон размеров образующихся микрокапель и наличие эффекта сопла, негативно влияющего на выживаемость живых систем.
Известен биопринтер в виде разнесенного в пространстве устройства (Guillemot F., Souquet A., Catros S., Guillotin В., Lopez J., Faucon M., Pippenger В., Bareille R., Remy M., Bellance S., Chabassier P., Fricain J.C., Amedee J. High-throughput laser printing of cells and biomaterials for tissue engineering // Acta Biomater. Acta Materialia Inc., - 2010. - Vol. 6 - №7. - P. 2494-2500.). В принтере перемещение донорной пластинки с биообъектами относительно неподвижного лазерного луча происходит с помощью шаговых моторов.
Основным недостатком известного устройства является то, что оно не представляет из себя единой компактной системы, т.е. не является мобильным. Кроме того, такое устройство обладает низкой точностью позиционирования и недостаточной производительностью, что обусловлено использованием для перемещения донорной пластинки шаговых двигателей.
Указанных недостатков лишено устройство, которое по числу совпадающих существенных признаков выбрано в качестве прототипа (Юсупов В.И., Жигарьков B.C., Чурбанова Е.С, Чутко Е.А, Евлашин С.А, Горленко М.В., Чепцов B.C. Минаев Н.В., Баграташвили В.Н. "Лазероиндуцированный перенос гелевых микрокапель для клеточной печати" // Квантовая электроника. 2017. Т. 47. №12. С. 1158-1165). Данное устройство, может быть использовано для лазерной биопечати. Оно содержит жесткую раму, импульсный лазер, сканер, фокусирующее устройство, устройство для размещения донорной подложки, устройство для трехмерного позиционирования акцепторной подложки и цифровую видеокамеру. В устройстве излучение с импульсного лазера поступает на гальваносканирующую головку и далее через фокусирующий объектив на донорную подложку, на которую предварительно был нанесен тонкий слой биоматериала в геле. Образовавшиеся в результате лазерного воздействия гелевые микрокапли с биоматериалом переносятся на акцепторную подложку, размещенную на устройстве, обеспечивающем ее трехмерное позиционирование. Контроль за работой осуществляют посредством управляющего компьютера, с которым соединены лазер, гальваносканер и система трехмерного позиционирования.
Известное устройство позволяет осуществлять перенос гелевых микрокапель с живыми микрообъектами и формировать структуры на акцепторной подложке. Благодаря применению гальваносканирующей головки для перемещения лазерного луча по поверхности донорной подложки известное устройство обладает высокой производительностью.
Однако существенным недостатком известного устройства является необходимость предварительного нанесения тонкого слоя биоматериала в геле на донорную пластинку. Кроме того, само наличие донорной пластинки с поглощающим металлическим слоем приводит к появлению в перенесенных микрокаплях нежелательных наночастиц материала этого слоя. Все это приводит к уменьшению стерильности и увеличенному времени на пробоподготовку. Помимо этого, известное устройство не позволяет осуществлять биопечать и отбор проб непосредственно с поверхности жидких сред.
Задачей предлагаемой полезной модели является повышение стерильности, уменьшение времени на пробоподготовку и реализация возможности осуществления биопечати и отбора проб непосредственно с поверхности жидких сред.
Техническим результатом является создание эффективного устройства для лазерной биопечати без донорной пластинки, которое не требует затрат времени на пробоподготовку и позволяет осуществлять биопечать и отбор проб непосредственно с поверхности жидких сред.
Поставленные техническая задача и результат достигаются в результате того, что в устройстве для лазерной биопечати, содержащем импульсный лазер, гальваносканер, фокусирующую систему, устройство для крепления акцепторной подложки и блок управления, применен лазер с длиной волны 2,6-3,6 мкм, акцепторная подложка размещена непосредственно за фокусирующей системой на устройстве крепления, обращена одной стороной к поверхности жидкости и выполнена из материала прозрачного для излучения, например, из сапфира.
Существо полезной модели поясняется на фигурах.
Фиг.1 - схема устройства;
Фиг. 2 - последовательные кадры скоростной съемки, полученные при воздействии сфокусированным излучением, состоящим из 170 импульсов, на поверхность воды (отмеченной пунктирной линией).
Фиг. 3 - фотографии участков поверхности чашек Петри с выросшими колониями клеток.
Устройство содержит импульсный лазер 1, генерирующий импульсный луч 2, гальваносканер 3, за которым по ходу луча размещена фокусирующая система 4. За системой 4 установлена акцепторная подложка 5, размещенная на устройстве крепления 6. Функционирование устройства контролируется блоком управления 7.
Устройство работает следующим образом.
Первоначально на устройстве для крепления акцепторной подложки 6 устанавливают акцепторную подложку 5. По сигналу с блока управления 7 с использованием предварительно заложенной программы, импульсный лазер 1 излучает один импульсный луч или серию лучей на гальваносканер 3. Лазерный луч 2 с помощью гальваносканера 3 направляется в нужном направлении и с помощью фокусирующей системы 4, пройдя через акцепторную подложку 5, установленную на устройстве крепления акцепторной подложки 6, фокусируется на поверхности исследуемой жидкой среды. После того, как лазерный импульс поглощается в локальной области в поверхностном слое жидкой среды, из этой области происходит перенос микроскопического количества жидкости в виде микрокапли на акцепторную подложку 5. Таким образом, на акцепторной подложке могут быть собраны микрокапли, являющиеся пробами жидкой среды, или сформирована необходимая структура из биологического материала, в том числе состоящая из нескольких слоев.
Достижение заявленного технического результата, а именно, создания эффективного устройства для лазерной биопечати без донорной пластинки, которое не требует затрат времени на пробоподготовку и позволяет осуществлять биопечать и отбор проб непосредственно с поверхности жидких сред, происходит из-за того, что в устройстве используется излучение, хорошо поглощающееся в воде, применяется акцепторная подложка прозрачная для этого излучения, а также применен принцип, по которому на акцепторную подложку переносятся микрокапли непосредственно с поверхности жидкой среды. Технически это достигается использованием излучения с длиной волны в диапазоне пика поглощения в воде 2.6-3.6 мкм и прозрачной акцепторной подложки 5, сквозь которую проходят лазерные лучи перед их фокусировкой на поверхности образца.
В отличие от прототипа, в предлагаемом устройстве не используется донорная подложка, и отсутствуют затраты времени на пробоподготовку.
Конкретное оформление заявляемого устройства, а именно, импульсный лазер, гальваносканер, фокусирующая система, устройство крепления акцепторной подложки и блок управления могут быть стандартными. Акцепторная подложка может быть изготовлена из сапфира, который прозрачен для излучения в диапазоне пика поглощения в воде 2.6-3.6 мкм. Характеристики импульсного лазерного излучения (длительность, частота импульсов и их количество в пачке, энергия в импульсе, параметры лазерного пучка), гальваносканера, фокусирующей системы зависят от поставленной задачи.
Пример использования полезной модели.
Авторами был изготовлен образец устройства для лазерной биопечати. Источником излучения служил лазер FL S-3050 (IPG Photonics, РФ) с длиной волны 3 мкм, длительностью импульса 1.5 не, энергией в импульсе от 0.8 мкДж, частотой генерации импульсов 8 МГц, снабженный на выходе гальваносканером. В качестве фокусирующей системы использовалась сапфировая линза с фокусным расстоянием 40 мм. Блок управления позволял задавать количество импульсов в пачке.
На фиг. 2 показаны последовательные кадры скоростной съемки, полученные при воздействии сфокусированным излучением созданного устройства, состоящим из 170 импульсов, на поверхность воды (отмеченной пунктирной линией). Цифры под кадрами показывают время с момента воздействия в миллисекундах. Видно, что такое воздействие привело на первом этапе (0.1 мс) к формированию направленной вертикально вверх микроструи воды, от которой отделяется микрокапля. На следующих кадрах прослеживается вертикальное движение вверх этой микрокапли (отмечена стрелкой). Скорость этой микрокапли составляет ~2.5 м/с. Таким образом, проведенные эксперименты со скоростной камерой показали возможность переноса микрокапель жидкость с их поверхности в сторону акцепторной подложки.
Для проверки работоспособности созданного устройства и пригодности для биопечати были проведены эксперименты по переносу на акцепторную подложку микрокапель воды с микроорганизмами. В качестве микроорганизмов использовался штамм кишечной палочки (Escherichia coli). Для переноса использовалась суспензия клеток в воде с плотностью 109 шт/мл. После переноса микрокапель микрокапель суспензии на поверхность акпторной подложки, подложку с каплями прижимали к поверхности агара, находящегося в чашке Петри. Далее чаши инкубировали при температуре +37°С в течение 2 дней.
На фиг. 3 показаны фотографии участков поверхности чашек Петри с выросшими колониями клеток. На фигуре жирными линиями фломастера выделены области, в которые осуществлялся перенос микрокапель, а черными пунктирными кривыми - участки с образованными колониями клеток. Цифры над рисунками показывают количество импульсов в пачке, которое использовалось для переноса микрокапель. Биологические испытания показали, что жизнеспособность микроорганизмов, перенесенных с помощью созданного устройства, сохраняется: они способны активно размножаться и создавать колонии.
Проведенные испытания показали, что созданное устройство позволяет проводить лазерную биопечать без донорной пластинки, поэтому не требуется затрат времени на пробоподготовку, и, кроме того, оно позволяет осуществлять биопечать и отбор проб непосредственно с поверхности жидких сред. Заявленный технический результат полностью достигнут, что подтверждает промышленную применимость полезной модели.