СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
METHOD OF PRODUCING BIOLOGICAL FLUID FOR MORPHOLOGICAL STUDY

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может найти применение при диагностике и лечении заболеваний верхних дыхательных путей.
Известно, что организм человека состоит из устойчивых структур - клеток и высокодинамичных биологических жидкостей. Эти системы являются взаимодополняющими. Если высокодинамичные структуры могут существовать без клеточных форм, то клеточные структуры не могут существовать без жидкостных сред, так как поступление питательных веществ и выброс продуктов жизнедеятельности клеток осуществляется путем обмена внутриклеточных и внеклеточных жидкостей организма.
Биологический материал организма, в том числе биологические жидкости, отделяемое из ран, секреты желез, субстраты или гомогенаты тканей, несет в себе информацию о состоянии внутренней среды и является предметом лабораторных исследований для диагностики различных патологических состояний.
Для исследования химического состава разных по структурно-функциональному назначению тканей организма человека производится их гомогенизация. Известно достаточно много способов гомогенизации тканей. Однако во всех существующих способах гомогенизации используют добавление к гомогенату ткани различных жидкостных сред. Эта необходимость вызвана тем, что в результате гомогенизации, как правило, получается достаточно густая масса, исследование которой затруднительно. В то же время такое разведение нарушает динамику течения физико-химических процессов, происходящих в исследуемой ткани в естественном состоянии.
Известен способ гистологического исследования ткани небных миндалин (Хмельницкая Н.М. «Морфологическая характеристика функционального состояния небных миндалин как органа иммуногенеза» Арх. патологии, 1983, т.45, №2, стр.83-88).
При использовании данного способа взятый во время операции кусочек удаленной небной миндалины фиксируют в 10% растворе формалина в течение 48 часов. После фиксации проводят продольный разрез миндалин небных от верхнего полюса к нижнему, чтобы получить возможность при гистологическом исследовании изучить зевную поверхность миндалин.
Вырезанные из фиксированного материала кусочки подсушивают на фильтровальной бумаге и помещают в спирты восходящей крепости (500, 700, 960 и абсолютный). После обезвоживания в спиртах фиксированные кусочки переносят в смесь спирта с ксилолом на 1-3 часа, затем в ксилол до просветвления (30 минут). Далее материал помещают в расплавленную смесь парафина с хлороформом на 1-3 часа, с последующей заливкой в парафин. После охлаждения из парафина вырезают блоки с заключенным в них объектом исследования. Парафиновые блоки наклеивают на деревянные колодки. Тонкие срезы толщиной 5 мкм наклеивают на предметное стекло. Препараты окрашивают гематоксилин-эозином, азур-эозином с последующим изучением под световым микроскопом. Увеличение 10·60, 10·90 с иммерсией.
Этот способ позволяет получить тканевый материал, пригодный для морфологического исследования, однако этот материал не является биологической жидкостью. Материал представляет собой окрашенный срез ткани, который не отражает динамики естественных процессов, протекающих в ней в нативном виде.
На таком срезе можно изучить только клеточную структуру ткани. Поскольку в процессе приготовления материала используют химическую обработку и дегидратацию, то в результате он представляет собой не биологическую жидкость, а является искусственно дегидратированным биологическим субстратом. Вследствие этого невозможно провести исследование структуризации полученного биологического материала методами клиновидной и краевой дегидратации.
По составу биологические жидкости являются лиотропными жидкими кристаллами. Это структурно упорядоченные растворы биологических молекул, в том числе - амфифильных, которыми являются липиды. Амфифильными называются молекулы, имеющие в своем составе растворимую в воде ионную и нерастворимую часть, обладающие отчетливыми двулучепреломляющими свойствами кристаллов.
Самые незначительные изменения в процессе жизнедеятельности организма проявляются в изменении структурной упорядоченности лиотропных жидких кристаллов. Элементы биологических жидкостей моментально реагируют изменением своей структуры на любые воздействия внешнего и внутреннего характера, что позволяет следить за течением заболевания в процессе лечения и осуществлять оперативную коррекцию терапевтических программ.
Методы клиновидной и краевой дегидратации биологических жидкостей дают возможность получения интегрированной информации, заложенной в особенностях морфологической картины твердой фазы биологических жидкостей, так как дегидратированная биологическая жидкость представляет собой тонкую пленку и фактически является тонким «срезом» неклеточной ткани организма.
Изучение динамики патологических процессов, происходящих в тканях организма при заболеваниях уха, горла, носа, с помощью новой диагностической технологии впервые было проведено в отделении оториноларингологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского (руководитель отделения - проф. В.Г.Зенгер) и показало возможности использования этой технологии в диагностике заболеваний ЛОР-органов, в том числе на ранних стадиях, а также прогнозировании и исхода патологического процесса, оценки эффективности проводимой терапии.
Для дальнейшего развития этого направления и его полноценного использования в различных специальностях необходимо получение и исследование как можно большего материала биологических жидкостей в норме и при различных заболеваниях. Это позволит создать базу данных для описания и характеристики морфотипов различных биологических жидкостей организма человека как в норме, так и при патологии, а также обнаружить структурные маркеры различных патологических процессов, определить и разработать основные параметры, критерии и алгоритм диагностики патологического процесса.
Известен также способ получения носового секрета для морфологического исследования, включающий забор носового секрета с поверхности слизистой оболочки полости носа, центрифугирование смеси биологического материала с физиологическим раствором и исследование надосадочной жидкости (см. патент RU №2287161, G01N 33/487, А61М 1/00, 10.11.2006).
Носовой секрет смешивают с 0,5 мл физиологического раствора хлорида натрия, центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 900g, а полученную надосадочную жидкость в объеме 2,0-2,5 мкл наносят на поверхность стекла в виде капли и высушивают ее методом клиновидной или краевой дегидратации до получения структуры твердой фазы.
Недостатком данного способа является то, что для морфологического исследования получают внеклеточную жидкость в разведении, что уменьшает ценность исследования, так как системная самоорганизация биологической жидкости в определенной степени ослабляется.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению является способ получения биологической жидкости для морфологического исследования, включающий получение из биологической ткани жидкого субстрата путем гомогенизации (см. патент RU №2293324, G01N 33/487, 10.02.2007).
В качестве биологической ткани используют полипную ткань верхних дыхательных путей или слизистую оболочку верхних дыхательных путей, гомогенат которой центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 900g. Полученную надосадочную жидкость в объеме 2,0-2,5 мкл наносят на поверхность в виде капли и высушивают ее методом клиновидной или краевой дегидратации до получения структуры твердой фазы.
Недостатком данного способа является то, что он не применим для больных хроническим тонзиллитом в качестве морфологического критерия (маркера) выраженности воспалительного процесса.
Технический результат заявляемого решения заключается в повышении информационной ценности исследования путем выявления нового морфологического критерия (маркера) выраженности воспалительного процесса для больных хроническим тонзиллитом, получения характеристики морфотипа и повышения системной самоорганизаци биологической жидкости.
Для достижения указанного результата в способе получения биологической жидкости для морфологического исследования, включающем получение из биологической ткани жидкого субстата путем гомогенизации, гомогенат которой центрифугируют в течениие 15 минут со скоростью 900g, а полученную надосадочную жидкость в объеме 2,0-2,5 мкл наносят на поверхность стекла в виде капли и высушивают ее методом клиновидной или краевой дегидратации до получения структуры твердой фазы, согласно изобретению в качестве биологической ткани используют миндаликовую ткань больных хроническим тонзиллитом.
В заявляемом решении исследованию подлежит внеклеточная структура - открытая самоорганизующаяся биологическая система в виде надосадочной жидкости гомогената миндаликовой ткани.
Заявляемый способ решает задачу преобразования молекулярных процессов биологической жидкости в диапазон видимых структурных зон в форме устойчивых твердофазных образований.
Научная и практическая новизна морфологического исследования небных миндалин заключается в том, что текстура фаций твердой фазы исследуемой биологической жидкости представляет интегральную картину процессов, происходящих в ее жидкой фазе на молекулярном уровне, что позволяет проводить диагностику физиологического и патофизиологического состояния организма даже на самых ранних (доклинических этапах) заболевания.
Это представляет принципиально новый подход к исследованию патогенеза, диагностике и лечению заболеваний.
Предложение поясняется чертежами, где на фиг.1 представлена фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больного Т. из примера 1; на фиг.2 представлена фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больной Ж. из примера 2; на фиг.3 представлена фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больного С. из примера 3; на фиг.4 представлена фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больного К. из примера 4; на фиг.5 представлена фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больной С. из примера 5; на фиг.6 представлена фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больного 3. из примера 6; на фиг.7 представлена фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больной С. из примера 7.
Способ осуществляют следующим образом.
Получение биологического материала для исследования производят прямо в операционной. Кусочек удаленной миндаликовой ткани взвешивают, измельчают и гомогенизируют в гомогенизаторе. Гомогенат помещают в пробирку и центрифугируют в течение 15 минут с частотой 900g. После центрифугирования надосадочную жидкость набирают в лабораторную пипетку и наносят на предметное стекло для исследования в виде капли размером 2,5 мкл. Препарат изучают под микроскопом через 12-72 часов после его приготовления.
Метод клиновидной дегидратации заключается в следующем.
Каплю биологической жидкости наносят на обезжиренное предметное стекло, расположенное строго горизонтально. При этом диаметр капли составляет 5-7 мм. Затем каплю высушивают при температуре 20-25°С и относительной влажности 65-70% при минимальной влажности окружающего воздуха. При высыхании капля должна быть неподвижной. Продолжительность периода высыхания (до момента анализа структуры) составляет 12-24 часа. Клиновидная дегидратация обуславливает особые условия самоорганизации, в результате формируется сухая пленка (фация) со специфическими структурами, представляющими собой индивидуальные биологические параметры. Фация - это структурный макропортрет, отражающий молекулярные взаимоотношения в биологической жидкости, а значит и протекающие в ней патофизиологические процессы. Клиновидная дегидратация позволяет решить проблему преобразования молекулярных процессов биологической жидкости в диапазон видимых структурных зон в форме устойчивых твердофазных образований. В этом состоит наибольшая ценность метода клиновидной дегидратации для клинической диагностики. Ни один другой метод лабораторной диагностики не дает информации столь значительного объема и качества.
Метод краевой дегидратации заключается в следующем.
Испарение жидкости в капле, находящейся на предметном стекле, происходит из-под так называемой «аналитической ячейки», сформированной наложением на каплю покровного стекла. Испарение происходит через узкую щель между поверхностями стекол, то есть медленно - в течение 48-72 часов.
Если методом клиновидной дегидратации достигается быстрое (12-24 часа) формирование структур, а именно структуризация (системная самоорганизация), то при краевой дегидратации создаются условия для роста отдельных кристаллов, то есть кристаллизация (локальная организация). Внешний их вид при микроскопии трактуется как текстура или морфотип. Исследования системной и локальной организации дегидратированной капли производят с помощью микроскопии.
Заявляемый способ позволяет получить гомогенат ткани миндалины, который содержит как внеклеточную, так и внутриклеточную биологическую жидкость, что позволяет более полно осуществить ее анализ как системы.
Способ поясняется следующими примерами.
Пример 1. Больной Торопов И.К., 28 лет. Было проведено хирургическое лечение хронического декомпенсированного тонзиллита (удаление небных миндалин). Во время операции получен кусочек миндаликовой ткани. Затем кусочек ткани взвесили, измельчили и гомогенизировали в гомогенизаторе. Гомогенат поместили в пробирку и центрифугировали в течение 15 минут с частотой 900g. После центрифугирования надосадочную жидкость набрали в лабораторную пипетку и нанесли на предметное стекло в виде капли размером 2,5 мкл для исследования методом клиновидной дегидратации. Препарат изучали под микроскопом через 12 часов после его приготовления. Фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больного Т. представлена на фиг.1.
В фации имеются две зоны: центральная и периферическая. Центральная зона занимает большую часть фации, представлена в основном аморфным веществом (белковый состав), слабо прослеживаются мелкие солевые кристаллические структуры. Периферическая зона представлена аморфным белковым составом. Радиальные трещины единичные, не симметричные, местами воронкообразно расширены, формирование конкреций нарушено. Прослеживающиеся конкреции не симметричны, полиморфны. Асимметрия, полиморфизм структур, отсутствие типичных для нормы структур системной и подсистемной самоорганизации свидетельствует о патологическом характере процесса в миндаликовой ткани и снижении функциональной активности небных миндалин.
Пример 2. Больная Жилинская М.Н., 32 года. Было проведено хирургическое лечение хронического декомпенсированного тонзиллита. Во время операции получен кусочек миндаликовой ткани. Затем кусочек ткани взвесили, измельчили и гомогенизировали в гомогенизаторе. Гомогенат поместили в пробирку и центрифугировали в течение 15 минут с частотой 900g. После центрифугирования надосадочную жидкость набрали в лабораторную пипетку и нанесли на предметное стекло в виде капли размером 2,5 мкл для исследования методом клиновидной дегидратации. Препарат изучали под микроскопом через 12 часов после его приготовления. Фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больной Ж. представлена на фиг.2.
В фации нет разделения на зоны. Имеются множественные радиальные трещины поперечные трещины, отдельности и конкреции. Большинство трещин воронкообразно расширено. Представленная картина свидетельствует об активности биохимических процессов в небной миндалине, что может указывать на воспалительный их характер.
Пример 3. Больной Слесарчук С.Н., 19 лет. Было проведено хирургическое лечение хронического декомпенсированного тонзиллита. Во время операции получен кусочек миндаликовой ткани. Затем кусочек ткани взвесили, измельчили и гомогенизировали в гомогенизаторе. Гомогенат поместили в пробирку и центрифугировали в течение 15 минут с частотой 900g. После центрифугирования надосадочную жидкость набрали в лабораторную пипетку и нанесли на предметное стекло в виде капли размером 2,5 мкл для исследования методом клиновидной дегидратации. Препарат изучали под микроскопом через 12 часов после его приготовления. Фация структур твердой фазы надосадочной жидкости гомогената небных миндалин больного С. представлена на фиг.3.
В фации имеются две зоны: центральная и периферическая. Центральная зона занимает половину фации, представлена множественными полиморфными конкрециями, которые расположены асимметрично. В периферической зоне аморфный белковый состав. Радиальные трещины воронкообразно расширены. Асимметрия, полиморфизм структур свидетельствует о патологическом характере процесса в миндаликовой ткани.
Пример 4. Больной Кротов М.М., 28 лет. Диагноз: Хронический тонзиллит (декомпенсированный). В мае 2008 в СПб НИИ ЛОР было проведено плановое хирургическое вмешательство: Двусторонняя тонзилэктомия. Биологическая жидкость небных миндалин, полученная предлагаемым нами способом, была переведена в твердую фазу методом клиновидной дегидратации. Структуры твердой фазы проанализированы под световым микроскопом БИМАМ Р-13, представлены на фиг.4.
Полученная картина ясно свидетельствует о выраженном активно протекающем воспалительном процессе. При исследовании установлено наличие одной зоны - центральной и отсутствие переходной и краевой зон, что указывает на большое количество белковых компонентов в биологической жидкости, а большие промежутки между радиальными трещинами указывают на активность процесса самоорганизации, что связано с действием в биологической жидкости компенсаторно-приспособительных механизмов.
Пример 5. Больная Суржикова М.И. 25 лет. Диагноз: Хронический тонзиллит (декомпенсированный). В январе 2008 г. в СПб НИИ ЛОР было проведено плановое хирургическое вмешательство: Двусторонняя тонзилэктомия. Биологическая жидкость небных миндалин, полученная предлагаемым нами способом, была переведена в твердую фазу методом клиновидной дегидратации. Структуры твердой фазы проанализированы под световым микроскопом БИМАМ Р-13, представлены на фиг.5.
Полученная картина свидетельствует о выраженном воспалительном процессе и состоянии декомпенсации. При исследовании установлено наличие одной зоны - центральной и отсутствие переходной и краевой зон, что указывает на большое количество белковых компонентов в биологической жидкости, а также отсутствие полной системной самоорганизации и характерных для нее структур (отдельности, конкреции и др.).
Пример 6. Больной Зернов А.Н. 40 лет. Диагноз. Хронический тонзиллит (декомпенсированный). В феврале 2008 г. в СПб НИИ ЛОР было проведено плановое хирургическое вмешательство: Двусторонняя тонзилэктомия. Биологическая жидкость небных миндалин, полученная предлагаемым нами способом, была переведена в твердую фазу методом клиновидной дегидратации. Структуры твердой фазы проанализированы под световым микроскопом БИМАМ Р-13, представлены на фиг.6.
Полученная картина свидетельствует о выраженном патологическом процессе в миндалинах и состоянии декомпенсации. При исследовании установлено наличие в центральной зоне асимметричных структур-конкреций и отсутствие полной картины системной самоорганизации и характерных для нее структур (отдельности и др.).
Пример 7. Больная Сырова Т.К. 32 года. Диагноз: Хронический тонзиллит (декомпенсированный). В марте 2008 в СПб НИИ ЛОР было проведено плановое хирургическое вмешательство: Двусторонняя тонзилэктомия. Биологическая жидкость небных миндалин, полученная предлагаемым нами способом, была переведена в твердую фазу методом клиновидной дегидратации. Структуры твердой фазы проанализированы под световым микроскопом БИМАМ Р-13, представлены на фиг.7.
Полученная картина свидетельствует о выраженном воспалительном процессе в миндалинах и состоянии декомпенсации. При исследовании установлено наличие широкой центральной зоны, сплошь заполненной аморфной гомогенной белковой массой, что свидетельствует о большом количестве белков в биологической жидкости, а также практически отсутствие признаков самоорганизации и всех характерных для нее структур (радиальные трещины, отдельности конкреции и др.).
Способ прошел апробацию в Федеральном государственном учреждении "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт уха, горла, носа и речи Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (СПб НИИ ЛОР Росмедтехнологий).