Комплексный биопрепарат для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов, повышения продуктивности и способ получения этого биопрепарата
COMPLEX BIOLOGICAL PRODUCT FOR OPTIMIZING THE MINERAL NUTRITION OF PLANTS, PROTECTING AGAINST PHYTOPATHOGENS, INCREASING PRODUCTIVITY AND A METHOD FOR PRODUCING THIS BIOLOGICAL PRODUCT

Группа изобретений относится к сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии и может быть использована для повышения урожая сельскохозяйственных культур за счет оптимизации азотного, фосфорного питания, стимуляции роста растений и биозащиты их от грибных инфекций.
Одним из факторов получения высоких урожаев сельскохозяйственных культур является обеспечение растений такими необходимыми элементами как азот, фосфор, калий, магний и др., что достигается использованием минеральных и органических удобрений, в том числе и комплексных.
Длительное применение азотных и фосфорных минеральных удобрений приводит к закислению почв, а из-за высокой скорости растворения азота происходят потери действующего вещества до 50%. Недостатком калийных удобрений является содержание хлора. Органоминеральные удобрения экологичны, аккумулятивны, обладают регуляторным действием. Недостатками органоминеральных удобрений являются необходимость использования дорогостоящего оборудования, длительных технологических операций, использования трудноразлагаемых компонентов и компонентов, вызывающих засоление. При использовании в качестве органической составляющей отходов животноводства возникает необходимость их обеззараживания. Отсутствие животноводческих комплексов и деревообрабатывающих производств ограничивает использование данных удобрений.
Для повышения продуктивности растений используют инокуляцию семян активными штаммами ассоциативных и симбиотических азотфиксирующих бактерий (патент RU 2464308 С2, 27.05.2012; патент RU 2529958 С1, 10.10.2014; патент RU 2728641 С1, 30.07.2020; патент UA 126060 U, 11.06.2018; патент UA 100771 U, 10.08.2015), фосфатмобилизующих бактерий (патент RU 2676926 С1, 11.01.2019; патент UA 99010 U, 12.05.2015). В практике сельского хозяйства применяют инокуляцию микроорганизмами для стимуляции роста растений и защиты их от патогенов (патент RU 2121271 С1, 10.11.1998; патент RU 2650777 С1, 17.04.2018; патент RU 2302114 С1, 10.07.2007). К недостаткам штаммов и инокулянтов, приведенных в указанных патентах, можно отнести нестабильность действия, которую можно объяснить конкуренцией между интродуцируемым штаммом и микрофлорой, сформированной в агроценозах.
Известно, что в природных условиях микроорганизмы существуют в виде структурированных ассоциаций (Николаев, Ю.А., Плакунов, В.К. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология, 2007. - Т. 76. - №2. - С. 149-163). В сельскохозяйственной биотехнологии применяют ассоциации микроорганизмов для сбраживания силоса (патент RU 2268299 С2, 20.01.2006), переработки органических отходов сельского хозяйства (А.с. SU 1049537 А1, 23.10.1983), снижения эмиссии аммиака и/или метана в органических удобрениях или почвах (патент RU 2710059 С2, 24.12.2019), биоремидиации почвы (патент RU 272071 С2, 20.03.2006; патент RU 2509150 С2, 10.03.2014), защиты растений от патогенов и вредителей (патент RU 2626543 С2, 16.05.2017; патент RU 2313941 С2, 10.01.2008; патент UA 119652 U, 25.09.2017).
Известен микробный препарат на основе ассоциации аэробных спорообразующих бактерий Bacillus subtilis К4, Bacillus subtilis Be-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 (патент RU 2314693 C2, 20.01.2008). Препарат имеет широкий спектр действия: повышение плодородия почвы, ее оздоровление, стимуляция роста растений. Вместе с тем, кроме ассоциации бактерий, препарат содержит наполнители (каолин, соевую муку), микроэлементы, витамины отдушку в виде гидролизата смеси хвойного экстракта и хлорофиллокаротиновой пасты. Последние компоненты готовят заранее по специальной технологии с использованием определенного оборудования, что усложняет технологический процесс получения препарата. Кроме того, препарат рекомендован для обработки почвы.
Известен биопрепарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и улучшения качества продукции, содержащий бактерии разных родов (патент RU 2322061 С2, 20.04.2008). Препарат состоит из смеси суспензий бактерий родов Agrobacterium, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Ervinia, Rhodopseudomonas. К существенным недостаткам такого препарат можно отнести сложность приготовления и применения. Для получения препарата каждый штамм выращивают на оптимальной для него среде (следовательно, требуется большой набор сред), что при значительных объемах производства затруднительно. Затем готовят суспензию путем смыва культур 9% раствором хлорида натрия, следующий этап - получение суспензии бактерий в защитной сахорожелатиновой среде в одинаковой для всех штаммов оптической площади и формирование ассоциации в заданном соотношении (в %). Изменение концентрации одного из штаммов может увеличить гормональную нагрузку на растение. Далее в зависимости от назначения препарат разводят в 1:200, 1:100 или 1:1000. Препарат может быть использован для осенней, весенней и летней обработок почвы, корневой и внекорневой подкормок в период вегетации растений, а также предпосевной обработки семян. Семена обрабатывают путем замачивания на 1-2 часа, что увеличивает время от обработки до посева.
Известен комплекс микробных препаратов (КМП), рекомендованный для повышения урожайности сельскохозяйственных культур, стимуляции роста и развития растений, повышения устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессовым факторам (Еговцева А.Ю., Мельничук Т.Н. Влияние предпосевной обработки семян комплексом микробных препаратов на микробоценоз ризосферы ячменя озимого // Биомика. - 2018. - Т. 10 (2). - С. 202-205; Баранская М.И., Чайковская Л.А., Немтинов В.И. Воздействие биоагентов микробных препаратов (Rhizobium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3, Paenibacillus polymyxa П) на семена Nigella damascena L. // Таврический вестник аграрной науки. - 2020. - №3 (23). - С. 18-25; Чайковская Л.А., Баранская М.И., Овсиенко О.Л., Клименко Н.Н. Влияние микробных препаратов на адаптивный потенциал озимой пшеницы при воздействии тяжелых металлов// Таврический вестник аграрной науки. - 2019. - №4 (20). - С. 123-132). КМП получают путем механического смешивания готовых препаратов Rhizobium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 и Paenibacillus polymyxa П в соотношении 1:1:1 с тщательным перемешиванием. Недостатком такого препарата является необходимость его использования сразу после приготовления смеси, нестабильность при длительном хранении, а также точная концентрация (при 100 мл на гектарную норму семян нужно по 33 мл препарата).
В основу предложенного изобретения поставлена задача получения стабильно эффективного комплексного биопрепарата путем совместного глубинного культивирования коллекционных штаммов бактерий, селекционированных по доминирующей функциональной направленности.
Технический результат изобретения - обеспечение потребности растений в макроэлементах минерального питания, стимуляция их роста, защита от фитопатогенной микробиоты и как следствие повышение продуктивности сельскохозяйственных культур.
9
Решение поставленной задачи достигается созданием комплексного биопрепарата для оптимизации минерального питания растений, защиты от фитопатогенов, повышения продуктивности на основе штаммов бактерий Agrobacterium radiobacter 204, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 и Paenibacillus polymyxa П13НК, получаемого их совместным культивированием, при котором коллекционные культуры штаммов пересевают на скошенный гороховый агар, через 2-3 суток делают смыв в жидкую питательную среду и культивируют в течение 48 часов, получая маточные культуры, после чего кукурузно-мелассную питательную среду засевают маточными культурами штаммов A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 одновременно в количестве по 1,5% каждого штамма от объема среды, после чего в 24-часовую культуру двух штаммов вносят маточную культуру штамма P. polymyxa П13НК (2% от объема культуры) и культивируют в течение 48 часов до получения титра 10 КОЕ в 1 мл при температуре 28-30°С при скорости вращения качалки 170-220 об/мин. Титр Agrobacterium radiobacter 204 в биопрепарате составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ.
Биопрепарат разработан на основе коллекционных штаммов бактерий разной функциональной направленности (азотфиксаторующей, фосфатмобилизующей, ростстимулирующей и биопротекторной), благодаря чему достигается комплексное воздействие на рост и развитие сельскохозяйственных культур.
Штамм ризосферных азотфиксирующих бактерий Agrobacterium (Rhizobium) radiobacter 204 (А.с. 1621433, C05F 11/08, C12N 1/20, 15.09.1990) переводит азот в доступную растению форму, является основой микробиологического препарата, рекомендованного для предпосевной обработки семян с целью повышения урожайности сельскохозяйственных культур.
Фосфатмобилизующий штамм почвенных бактерий Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 (патент RU 2676926 C1; C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/01; 11.01.2019) обладает способностью продуцировать фитогормоны и трансформировать труднорастворимые минеральные фосфаты в усвояемые для растений формы. Штамм является основой микробиологического препарата, использующегося для оптимизации минерального питания растений, стимуляции их роста и повышения урожайности.
Штамм Paenibacillus polymyxa П13НК - антагонист фитопатогенных микроскопических грибов, по эффективности не уступает химическим протравителям - фундазолу, максиму, байтану. Штамм депонирован 17.10.2019 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05221.
Таким образом, основными свойствами бактерий, составляющих комплексный биопрепарат являются: азотфиксация, фосфатмобилизация, фитостимуляция и контроль патогенных микромицетов.
Штаммы A. radiobacter 204, L. nimipressuralis CCM 32-3 и P. polymyxa П13НК не проявляют антагонизма друг к другу на агаризованных питательных средах, что было установлено методом перпендикулярных штрихов и блочков (Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. 6-е изд., перераб. и доп./ Н.С. Егоров. - М.: Изд-во ММГУ; Наука, 2004. - 528 с. - С. 156-157). В условиях совместного периодического культивирования трех штаммов отмечали доминирование P. polymyxa П13НК, в связи с чем были подобраны оптимальные концентрации бактерий и период их инокуляции в жидкую питательную среду. При одновременном засеве жидкой питательной среды отмечалось ускорение роста трех штаммов, при этом P. polymyxa П13НК доминировал, что было установлено как микроскопированием, так и по количеству КОЕ. Исследовали комбинации штаммов и их количественное соотношение при одновременном и раздельном во времени (через 12, 16, 20, 24 часа) засеве жидкой питательной среды. Установили, что оптимальным является способ глубинного культивирования, при котором одновременно засевается питательная среда штаммами A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 в соотношении 1:1 (по 1,5% от объема питательной среды). После 24 часов культивирования вносят P. polymyxa П13НК, в количестве, составляющем 2% от объема суточной бинарной культуры.
Комплексный препарат готовят следующим образом.
1. Для получения посевного материала коллекционные культуры штаммов пересевают на скошенный гороховый агар (каждую отдельно), через 2-3 суток делают смыв в жидкую питательную среду, после чего культивируют в течение 48 часов (маточная культура).
9
2. Кукурузно-мелассная (1:1) питательная среда засевается полученными указанным в п. 1 способом маточными культурами штаммов A. radiobacter 204 и L. nimipressuralis CCM 32-3 одновременно в количестве по 1,5% каждого штамма от объема среды. Маточную культуру штамма P. polymyxa П13НК вносят в 24-часовую культуру двух штаммов (2% от объема культуры) и культивируют в течение 48 часов до получения титра 10КОЕ в 1 мл при температуре 28-30°С при скорости вращения качалки 170-220 об/мин.
При совместном культивировании трех штаммов в готовом препарате титр Agrobacterium radiobacter 204 составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ. Для определения титра каждой культуры бактерий при совместном культивировании использовали стрептомициновую метку (Метод общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхарда и др. - М.: Мир, 1984. - 472 с. - С. 29-31; Вернер Браун. Генетика бактерий. - М.: «Наука», 1968. - 446 с. - С. 134).
Бактерии сохраняют жизнеспособность и численное соотношение в течение 5 месяцев при температуре хранения до 15°С.
Препарат применяют для предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур из расчета 100 мл на 1 гектарную норму семян.
Пример 1. Исследовали динамику роста штаммов в условиях совместного периодического культивирования
Результаты кинетического описания роста бактерий, представленные в таблице 1, свидетельствуют об увеличении абсолютной скорости роста, количества клеточных делений и о сокращении продолжительности генераций клеток при совместном культивировании штаммов.
Пример 2. При разработке микробного препарата важным является не только получение жизнеспособных клеток, а и сохранение их функциональности.
Исследовали азотфиксирующую активность бактерий при моно- и совместном культивировании. Результаты исследований показали повышение азотфиксирующей активности штаммов в тройной (совместной) культуре (таблица 2).
Пример 3. В лабораторных условиях семена озимой пшеницы (тест-культура) обрабатывали разведенным в 10 и 100 раз комплексным биопрепаратом и раскладывали в чашки Петри по 25 семян в 5-кратном повторении. Количество биопрепарата и рабочих растворов соответствовало рекомендованным в производстве (100 мл препарата на гектарную норму семян; рабочий раствор составляет 1,8% от массы семян). Результаты проведенного опыта, свидетельствующие об улучшении посевных качеств семян, приведены в таблице 3.
Пример 4.
В лабораторных опытах исследовали влияние комплекса микробных препаратов на развитие проростков рыжика посевного (фиг. 1).
Результаты опыта показали, что инокуляция семян рыжика посевного стимулирует развитие проростка. Так, в варианте с применением комплексного биопрепарата установлено увеличение длины корешка в 1,8 раз и длины побега на 15% в сравнении с контролем.
Пример 5. В вегетационном опыте на субстратах вермикулит и чернозем южный под влиянием комплексного биопрепарата было отмечено увеличение всхожести семян Triticum aestivum L. На вермикулите всхожесть инокулированных семян составляла 93,3% при 66,7% в контрольном варианте, на черноземе южном - 73,3% при 33,3% - в контроле (фиг. 2).
По высоте инокулированные растения, выросшие на вермикулите, на 22,2% превышали контрольные, что свидетельствует о фитостимулирующем действии микробного препарата, полученного путем совместного культивирования.
Пример 6. Изучали влияние инокуляции комплексным биопрепаратом на численность диазотрофов и азотфиксирующую активность в ризоплане и ризосфере Triticum aestivum L.
2
4
По результатам микробиологического анализа на вермикулите численность диазотрофов в ризоплане Triticum aestivum L. составляла 4,7 млн КОЕ на 1 корень. В варианте с комплексным биопрепаратом зафиксирована азотфиксирующая активность 63,6±4,64 наномоль СН/ час на 1 корень, что может свидетельствовать о синергизме биокомпонентов в препарате (таблица 4).
В почве ризосферы инокулированных растений численность диазотрофов и азотфиксирующая активность превышали контроль (без инокуляции) в 1,6 и 1,5 раза соответственно (таблица 5).
Пример 7. В условиях полевого опыта на черноземе обыкновенном по предшественнику черный пар исследовали влияние комплексного биопрепарата на биологическую активность в ризосфере и продуктивность озимой пшеницы. Показано повышение потенциальной азотфиксирующей активности и содержание подвижного фосфора в ризосфере озимой пшеницы (таблица 6), что является положительным фактом, особенно учитывая сокращение внесения доз минеральных удобрений под сельскохозяйственные культуры.
Инокуляция обеспечила увеличение зерновой продуктивности пшеницы на 8,2 ц/га (14,4%) к контролю (таблица 7).
Повышение зерновой продуктивности в сравнении с химическим протравителем свидетельствует как об оптимизации питания растений и стимуляции, так и о защите от болезнетворных организмов. В лабораторных условиях отмечено увеличение антифунгальной активности совместной культуры в 1,2 раза в сравнении с монопрепаратом на основе биопротекторного штамма Paenibacillus polymyxa П13НК. Было установлено, что применение комплексного биопрепарата повышает устойчивость растений озимой пшеницы к корневым гнилям, возбудителями которых являются микромицеты родов Fusarium, Bipolaris, Alternaria. Так, применение комплексного биопрепарата в посевах пшеницы способствовало снижению распространения корневых гнилей на 11,8% по сравнению с контролем (49,6%) и развития заболеваемости в 2,1 раза.
Выращивание пшеницы с применением комплексного биопрепарата экономически выгодно за счет снижения себестоимости полученной продукции. Этот прием экологичен.
Пример 8. Полученный комплексный микробный препарат испытывали в условиях полевых опытов в посевах риса. Установлено, что, что предпосевная обработка семян повышает продуктивность растений: увеличение количества метелок на 3,6%, количества семян в метелке - на 32,9%, урожая зерна риса - на 48,1% (таблица 9).
Пример 9. В условиях полевого опыта на черноземе южном исследовали влияние инокуляции семян комплексным микробным препаратом на продуктивность подсолнечника. Полученные результаты показывают, что комплексный биопрепарат обеспечивает повышение урожая гибридов подсолнечника на 13,6-14,7% (таблица 10).
Таким образом, разработан эффективный многокомпонентный микробный препарат на основе коллекционных штаммов азотфиксирующих, фосфатмобилизирующих бактерий и бактерий-антагонистов фитопатогенов. Разработан способ получения комплексного микробного препарата путем совместного культивирования трех штаммов, при котором титр Agrobacterium radiobacter 204 составляет 48%, Lelliottia nimipressuralis CCM 32-3 - 49% и Paenibacillus polymyxa П13НК - 3% от общего числа КОЕ.
Обработка биопрепаратом перед посевом повышает всхожесть семян, улучшает посевные свойства и зерновую продуктивность сельскохозяйственных культур. Установлено увеличение нитрогеназной активности и содержания подвижного фосфора в ризосфере растений в фазу цветения, что свидетельствует об активности почвенной микробиоты и обеспеченности элементами минерального питания растений. Применение комплексного биопрепарата повышает эффективность растительно-микробного взаимодействия в агрофитоценозах.