Морфологические изменения кожи в ответ на субдермальное введение монофиламентных нитей из полидиоксанона

УДК 616.5

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЖИ В ОТВЕТ НА СУБДЕРМАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ МОНОФИЛАМЕНТНЫХ НИТЕЙ ИЗ ПОЛИДИОКСАНОНА

© 2019 Е.В. Штыркова1, С.В. Полетаева1, А.В. Медведева2, В.В. Масляков1, А.А. Супильников1, А.Б. Бучарская2

1Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Саратовский медицинский университет «Реавиз», Саратов 2ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов

Введение. В статье приведены результаты морфологического исследования реакции тканей у подопытных животных в ответ на субдермальную имплантацию монофиламентных нитей из материала полидиоксанона. Данная методика получила распрастранение сравнительно недавно и целью ее применения является профилактика и коррекция возрастных изменений кожного лоскута.

Цель исследования: изучить морфологические изменения кожи, возникающие в ответ на субдермальное введение монофиламентных нитей из полидиоксанона.

Материалы и методы. Конструкция для процедуры имплантации состоит из инъекционной иглы-проводника и нити из полидиоксанона, половина которой помещена в полость иглы, а вторая половина находится снаружи и зафиксирована держателем. Игла-проводник вводится под кожу, параллельно ее поверхности, на всю длину иглы.

Результаты. Проведенное исследование показало, что субдермальная имплантация монофиламентных нитей из полидиоксанона не сопровождалась выраженным экссудативным воспалением, не вызывало аллергической реакции (полное отсутствие эозинофилов в инфильтрате), выраженного фиброзирования стромы с разрастанием грубой рубцовой соединительной ткани (коллаген вокруг нитей в виде тонких прослоек). Воспалительный инфильтрат вокруг нитей из полидиоксанона представлен слабовыраженными очагами продуктивного воспаления, при этом в динамике наблюдается уменьшение площади воспалительного инфильтрата. По результатам иммуногистохимического окрашивания антителами к CD31, выявлено стимулирующее воздействие имплантации нитей на новообразование волокнистого компонента в окружающей соединительной ткани, включая зону вокруг нитей, пограничную зону и надлежащую дерму кожи.

Выводы. 1. Процедура субдермальной имплантации нитей из материала полидиоксанона является безопасной, т.к. не вызывает процессов некробиоза, дистрофических изменений окружающих тканей, паретиче-ских изменений и тромбоза сосудов, а также дистрофических изменений нервных волокон и деструктивных изменений придатков кожи.

2. Имплантация нитей из полидиоксанона оказывает эффективное стимулирующее действие на новообразование волокнистого компонента в окружающей соединительной ткани.

3. Имплантация нитей из полидиоксанона оказывает стимулирующее влияние на неоангиогенез в окружающей гиподерме и надлежащей дерме кожи.

Ключевые слова: кожа, морфологические изменения, субдермальное введение, монофиламентные нити из полидиоксанона.

Введение. Возрастные изменения, отмечаемые визуально, в первую очередь касаются изменения качества кожи. С возрастом снижаются показатели ее упругости и эластичности, следствием чего является образование морщин и избытка кожного лоскута на лице и на теле [7, 8]. Морфологические изменения включают истончение дермального слоя и атрофию дермальных сосочков, по причине снижения синтетической активности фибробластов -главного пула клеток, синтезирующих волокнистые компоненты и основное вещество межклеточного матрикса. Также происходит обеднение кровеносными сосудами дермы и гипо-

дермы, и атрофия подкожно-жировой клетчатки [1, 4, 5, 11]. Для профилактики и коррекции подобных изменений используются методы эстетической медицины, в перечень которых входит субдермальная имплантация монофиламентных нитей из биодеградируемого материала полидиоксанона [3, 6, 10]. Данная методика применяется на территории РФ сравнительно недавно. Ранее для подкожной имплантации применялись нити из инертного нерассасываю-щегося материала - золота [11]. Затем, корейскими специалистами введена практика имплантации биорезорбируемых нитей из полидиоксанона [9, 13]. Позже эту методику переняли отечественные специалисты-косметологи. Сейчас на территории РФ метод подкожного введения нитей из биодеградируемых материалов применяется с целью коррекции начальных возрастных изменений кожи лица, либо в комплексной коррекции выраженных возрастных изменений [2]. К данным изменением относятся: снижение тургора и эластичности кожи, начальные признаки гравитационного птоза и наличие поверхностных и глубоких морщин.

Цель исследования: изучить морфологические изменения кожи, возникающие в ответ на субдермальное введение монофиламентных нитей из полидиоксанона.

Материалы и методы. Конструкция для процедуры имплантации состоит из инъекционной иглы-проводника и нити из полидиоксанона, половина которой помещена в полость иглы, а вторая половина находится снаружи и зафиксирована держателем. Игла-проводник вводится под кожу, параллельно ее поверхности, на всю длину иглы. На обратном ходе иглы нить отделяется от проводника, оставаясь в тканях. Уровень постановки нитей - субдермально. Длина иглы-носителя 38 мм, нити - 50 мм, диаметр иглы - 29G, толщина USP 6-0.

Исследование проведено на десяти белых лабораторных крысах-самках трехмесячного возраста, вес особей составлял 200-220 г. В области спины, слева от позвоночного столба, на 2 см выше хвоста, имплантировано по 4 нити из полидиоксанона, параллельно друг другу, на расстоянии 1-1,5 мм. В области имплантации сбрита шерсть, правила асептики и антисептики соблюдены. Для выявления морфологических изменений и их динамики, 5 крыс были гуманно умерщвлены спустя 21 день эксперимента и оставшиеся 5 крыс - через 90 дней. Из места введения нитей для гистологического исследования были взяты фрагменты кожи размером 1,5^1,5 см, в качестве контроля взяты интактные образцы кожи с противоположной стороны от позвоночного столба.

Были изготовлены парафиновые блоки с кусочками кожи и подкожной клетчатки в количестве 20 штук. Произведена окраска гематоксилином и эозином всех гистологических препаратов. Отдельно оценивали параметры в зоне вокруг нитей, пограничной зоне и дерме кожи.

Для оценки степени неокапиллярогенеза использовали иммуногистохимический метод. Иммуногистохимическое окрашивание выполняли на срезах с парафиновых блоков, используя авидин-биотиновый пероксидазный метод с антителами к CD31(DAKO) и Factor VIII (DAKO) (для визуализации эндотелия сосудов) с помощью автоматизированного окрашивания на Ventana Benchmark. Для выявления коллагеновых и эластических волокон использовалось комбинированное окрашивание по Вейгерту-Ван Гизону. Были изготовлены парафиновые блоки с кусочками кожи и подкожной клетчатки в количестве 16 штук. Произведена окраска гематоксилином и эозином всех гистологических препаратов. Отдельно оценивали параметры в зоне вокруг нитей, пограничной зоне и дерме кожи.

Для оценки степени неокапиллярогенеза использовали иммуногистохимический метод. Иммуногистохимическое окрашивание выполняли на срезах с парафиновых блоков, используя авидин-биотиновый пероксидазный метод с антителами к CD31 (DAKO) (для визуализа-

ции эндотелия сосудов) с помощью автоматизированного окрашивания на Ventana Benchmark. CD31 антиген - мембранный гликопротеин 100 кД в эндотелиальных клетках (яркое окрашивание), слабое окрашивание наблюдается в нейтрофилах, макрофагах, моноцитах. CD34 антиген (маркер эндотелия) не использовали по причине перекрестного окрашивания коллагена базальной мембраны сосудов. Все исследования выполняли с блоков контрольной группы и группы сравнения.

Для выявления коллагеновых и эластических волокон использовалось комбинированное окрашивание по Вейгерту-Ван Гизону. Это интегрированный метод выявления эластических волокон, соединительной ткани, коллагена и клеточных ядер, основанный на сродстве к эластическим волокнам комплекса фуксин-резорцин, образующегося в результате преципитации между резорцином, основным фуксином и хлоридом железа. Ядра окрашиваются в черный цвет, коллагеновые волокна - в различные оттенки розового, эластические волокна - от пурпурно-красных до коричневых, фон и эритроциты - желтые. Для объективизации исследования использовали количественный метод оценки плотности сосудов с применением метода компьютерной морфометрии. Морфометрические исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Leica DM400B, цифровой камеры Leica DFC420 C, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения компьютерного анализа изображения Leica Qwin Standart V.3.1.0.

В каждом случае анализировались 20 полей зрения при увеличении х200. ценка выраженности конкретного показателя (фиброза) рассчитывалась занимаемую им относительную площадь.

Для количественной оценки неоангиогенеза и плотности васкуляризации сосудов определяли среднее количество капилляров в 1 мм2. Для оценки выраженности воспалительного инфильтрата и вызревания грануляционной ткани изучали 20 полей зрения при большом увеличении (х400), определяли количество и относительную долю следующих клеток: лимфоциты, плазмоциты, нейтрофилы, макрофаги. Полученные данные обрабатывали статистически посредством электронных таблиц Microsoft Excel и «Биостатистика»: вычисляли средние арифметические, стандартное отклонение. Нормальность распределения признаков определяли по критерию Шапиро - Уилка. Обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев для множественных выборок Крускала-Уоллиса и Нью-мена-Кейлса. При уровне значимости p < 0,05 выявленные различия считались статистически значимыми.

Результаты. В гистологических препаратах от крыс опытных групп в коже и подлежащих тканях не были выявлены: некробиотические и дистрофические изменения, отек и вакуольная дегенерация соединительной ткани, паретические изменения и тромбоз сосудов, обширные очаги кровоизлияний с формированием рассеянных, очаговых или диффузных, воспалительных инфильтратов, деструктивные изменения придатков кожи, в т.ч. волосяных фолликулов, дистрофических изменений нервных волокон.

При микроскопическом исследовании препаратов кожи с подкожно-жировой клетчаткой и поверхностным слоем мышечной ткани у крыс исследуемой группы на 21 сутки после введения нитей наблюдается слабая круглоклеточная и гистиоцитарная инфильтрация с примесью единичных нейтрофилов, инфильтрат ограничен участками вокруг нитей. В пограничной зоне выявляется малоклеточная отечная ткань, подобная грануляционной вследствие большого количества новообразованных капилляров, при отсутствии в ней нейтрофилов. В

пограничных участках наблюдается узкая зона зрелой соединительной ткани со слабо выраженным коллагеногенезом. Клетки фибробластического ряда незначительно преобладают над нежными тонкими волокнами коллагена (рис. 1).

Рис. 1. Инфильтрат вокруг нитей на 21-й день эксперимента, малоклеточная отечная ткань с большим количеством новообразованных капилляров. Узкая зона зрелой соединительной ткани со слабо выраженным коллагеногенезом в пограничных участках. Окраска гематоксилин и эозин, увел. 250

В гистологических препаратах, полученных от животных опытной группы на 90 сутки после введения нитей, в пограничной зоне выявлено формирование множественных капилляров. В пограничных участках перивазально обнаруживаются единичные плазмоциты, макрофаги. В зоне вокруг нитей выявляется крайне слабая продуктивная реакция с уменьшением количества лимфоцитов и многоядерных клеток, снижением общего числа и плотности клеток, на фоне образования волокон коллагена, концентрически окружающих нити, и мелких новообразованных сосудов, вовлеченных в инфильтрат вокруг нитей. При том выделяются две зоны: непосредственно нити отграничены тонком слое коллагена, затем следуют слои гистиоцитов, чередующихся с концентрическими структурами волокон, по периферии -слабый лимфо-плазмоцитарный инфильтрат (рис. 2).

Рис. 2. Инфильтрат вокруг нитей на 90 день, опытная группа, концентрические слои тонких волокон коллагена, единичные многоядерные клетки. Окр. гематоксилин и эозин, увел. х 300

Динамика изменения состава воспалительного инфильтрата в зоне вокруг введенных нитей у экспериментальных животных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Динамика изменения состава воспалительного инфильтрата в зоне вокруг введенных нитей

у экспериментальных животных

Серия экспери- Среднее количество Относительная доля клеточных элементов

мента (сроки клеток воспали- Лимфоциты Плазмоциты Нейтрофилы Макрофаги, (в т.ч.

наблюдения) тельного инфильтрата в мм2 гигантские многоядерные клетки)

Контроль 0 0 0 0 0

21сутки 156 9 38 6 47

90 сутки 41 29 22 0 49

При оценке результатов окрашивания по Вейгерт-Ван Гизон в участках вокруг нитей наблюдается узкая зона зрелой соединительной ткани с умеренно выраженным коллагеноге-незом. В пограничных участках наблюдается формирование зрелой соединительной ткани и дифференцированных фиброцитов (рис. 3, 4) Выявлено достоверное увеличение удельной площади соединительной ткани в препаратах от крыс обеих экспериментальных групп по сравнению с препаратами контрольной группы, при этом нарастала относительная площадь не только коллагеновых, но и эластических волокон (табл. 2). Также необходимо отметить нарастание площади волокон в течение эксперимента, т.е. в препаратах опытной группы на 90-й день эксперимента по сравнению с опытной группой на 21-й день.

Оценка результатов иммуногистохимического окрашивания маркером неоангиогенеза CD 31 ^АКО) проводилась в фиброзной ткани вокруг нитей, в зоне введения нитей и пограничной зоне. Далее показатели сравнивались с контрольной группой препаратов (рис. 5).

Рис. 3. Коллагеногенез в виде концентрических слоев вокруг нитей на 21-й день эксперимента. Окр. Вейгерт-Ван Гизон, увел. х100

Рис. 4. Коллагеногенез в виде концентрических волокон вокруг нитей, в пограничной зоне вокруг новообразованных сосудов на 90й день эксперимента. Окр. Вейгерт-Ван Гизон, увел. х150

Рис. 5. Препарат гиподермы контрольной группы, иммуногистохимическое окр. антителами к СБ31, увел. х60

Таблица 2

Динамика изменений в тканях дермы и подлежащих тканях в зоне введения нитей из полидиоксанона у экспериментальных животных

Серия эксперимента (сроки наблюдения) Соотношение площади эластических и коллагено-вых волокон (%/%) Объемная плотность тканей

мышечной соединительной жировой

Контроль 6\94 16 70 14

21сутки 22\78* 16 75* 9*

90сутки 36\64* 16 79* 5*

Примечание: *а< 0,05 по сравнению со значением показателя в контроле.

В гистологических препаратах, полученных от животных опытной группы на 21 сутки, в пограничной зоне была выявлена неравномерная пролиферация эндотелиальных клеток, формирующих единичные зрелые капилляры. В пограничных участках наблюдается узкая зона зрелой соединительной ткани со слабо выраженным коллагеногенезом (рис. 6).

Рис. 6. Увеличение плотности сосудов в опытной группе на 21 день эксперимента, иммуногистохимическое

окр. антителами к CD31, увел. х150

При исследовании препаратов от крыс опытной группы на 90 сутки выявлены зоны пролиферации фибробластических клеток с дифференцировкой в фиброциты, наблюдаются участки неокапиллярогенеза. Соединительнотканные волокна структурно окрашены эозином, дифференцированы (рис. 7).

Рис. 7. Участки неокапиллярогенеза вокруг нитей опытной группы на 90й день эксперимента, иммуногистохимическое окр. антителами к CD31, увел. х150

Таким образом, при иммуногистохимическом окрашивании с антителами к СБ31 выявлено достоверное увеличение плотности капилляров перифокально в участках вокруг нитей, а также в дерме кожи, в строме мышечной ткани (табл. 3).

Таблица 3

Динамика изменений сосудистой плотности в зоне вокруг введенных нитей, в пограничной зоне и в тканях дермы у экспериментальных животных, в препаратах, окрашенных антителами к CD31

Серия эксперимента

вокруг нитей пограничная зона дерма

Контроль - 22,12 34,08

21 сутки 49,4 39,3* 48,5*

90 сутки 54,6 43,7* 52,5*

Примечание: *а < 0,05 по сравнению со значением показателя в контроле.

Обсуждение. Проведенное исследование показало, что субдермальная имплантация мо-нофиламентных нитей из полидиоксанона не сопровождалась выраженным экссудативным воспалением, не вызывало аллергической реакции (полное отсутствие эозинофилов в инфильтрате), выраженного фиброзирования стромы с разрастанием грубой рубцовой соединительной ткани (коллаген вокруг нитей в виде тонких прослоек). Воспалительный инфильтрат вокруг нитей из полидиоксанона представлен слабовыраженными очагами продуктивного воспаления, при этом в динамике наблюдается уменьшение площади воспалительного инфильтрата. Присутствие макрофагов в инфильтрате свидетельствует о модуляции ими про-лиферативной и синтетической функции фибробластов и активизации миграции и пролиферации эндотелиоцитов и процессов ангиогенеза путем паракринной стимуляции. Макрофаги играют большую роль в неоангиогенезе. Вырабатываемые ими факторы роста и колониести-мулирующие факторы оказывают митогенное действие на эндотелиоциты и фибробласты, стимулируя соответственно неоангиогенез и продукцию коллагена. Это подтверждается данными окрашивания по Вейгерт-Ван Гизон, при оценке результатов которого выявлено достоверное увеличение площади коллагеновых и эластических волокон в исследуемой группе препаратов по сравнению с контролем. При этом площадь волокон, как коллагеновых, так и эластических, нарастала от 21-го к 90-му дню эксперимента. Коллагеновые волокна обуславливают прочность и плотность ткани, а эластические волокна - обратимую деформацию ткани при действии растяжения. Соответственно, новообразование коллагеновых и эластических волокон, наблюдаемое при субдермальной имплантации нитей из полидиоксанона, позволяет сделать предположение о положительном влиянии имплантации нитей из полидиок-санона на упруго-эластические характеристики кожного лоскута. По результатам иммуноги-стохимического окрашивания антителами к CD31, выявлено стимулирующее воздействие имплантации нитей на новообразование волокнистого компонента в окружающей соединительной ткани, включая зону вокруг нитей, пограничную зону и надлежащую дерму кожи.

Выводы:

1. Процедура субдермальной имплантации нитей из материала полидиоксанона является безопасной, т.к. не вызывает процессов некробиоза, дистрофических изменений окружающих тканей, паретических изменений и тромбоза сосудов, а также дистрофических изменений нервных волокон и деструктивных изменений придатков кожи.

2.Имплантация нитей из полидиоксанона оказывает эффективное стимулирующее действие на новообразование волокнистого компонента в окружающей соединительной ткани.

3. Имплантация нитей из полидиоксанона оказывает стимулирующее влияние на неоан-гиогенез в окружающей гиподерме и надлежащей дерме кожи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Ахтямов С.Н., Кягова А.А. Клинико-морфологические особенности старения кожи // Вестник дерматологии и венерологии. - 2005. - № 4. - С. 60-64.

2 Груздев Д.А., Кодяков А.А. Особенности применения биостимулирующих нитей у пациентов разных возрастных групп // Вестник новых медицинских технологий [Электронный журнал]. - 2015. - № 1.

3 Груздев Д.А., Кодяков А.А., Федоров П.Г. Общие принципы нитевой коррекции // Метаморфозы. - 2016. -№ 14. - С. 34-38.

4 Гунин А.Г., Петров В.В., Васильева О.В., Голубцова Н.Н. Кровеносные сосуды в дерме человека в процессе старения // Успехи геронтологии. - 2014. - Т. 27. - № 1. - С. 54-61.

5 Зорин В.Л., Зорина А.И., Петракова О.С., Черкасов В.Р. Дермальные фибробласты для лечения дефектов кожи // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. - Т. 4. - № 4. - С. 26-40.

6 Кодяков А.А., Федоров П.Г. Тенденции эстетической медицины и нитевые методы омоложения // Инъекционные методы в косметологии. - 2017. - № 1. - С. 4-10.

7 Целуйко С.С., Малюк Е.А., Корнеева Л.С., Красавина Н.П. Морфофункциональная характеристика дермы кожи и ее изменения при старении (обзор литературы) // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. -2016. - № 60. - С. 11-116.

8 Шепитько В.И., Ерошенко Г.А., Лисаченко О.Д. Возрастные аспекты строения кожи лица человека // Свгг медицини та бюлогп. - 2013. - № 3-2 (40). - С. 91-97.

9 Kim H, Bae IH, Ko HJ, Choi JK, Park YH, Park WS. Novel polydioxanone multifilament scaffold device for tissue regeneration. Dermatol Surg. 2016 Jan; 42(1): 63-7.

10 Lee H, Yoon K, Lee M. Outcome of facial rejuvenation with polydioxanone thread for Asians. Cosmet. Laser Ther. 2017 Dec 22: 1-4.

11 Rondo W. Jr.,Vidarte G.,Michalany N. Hystologic study of the skin with gold thread implantation Plast. Reconstr. Surg. 1996. Jan.; 97 (1): 256-258.

12 Varani J., Dame M., Rittie L., et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin. Roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 2006; 168(6): 18611868.

13 Yun Y, Choi I. Effect of thread embedding acupuncture for facial wrinkles and laxity: a single-arm, prospective, open-label study. Integrative Medicine Research. 2017;6(4):418-426. doi:10.1016/j.imr.2017.09.002.

Рукопись получена: 25 апреля 2019 г. Принята к публикации: 7 мая 2019 г.