Получение растений томата, трансформированных геном preS2-S-HDEL, с целью разработки кандидатной съедобной вакцины против гепатита в

воздействий внешней среды развитием большей доли неассимилирующих тканей, что можно рассматривать как проявление защитной функции. Фотосинтетический аппарат ели сибирской состоит главным образом из ассимилирующей ткани. Можно предположить, что эволюция фотосинтетического аппарата сосны обыкновенной шла в направлении увеличения доли структурных тканей и повышения фотосин-тетической активности мезофилла, а у ели сибирской — по пути увеличения массы ассимилирующей ткани, без усиления структуры хвои и повышения активности работы мезофилла. Возможно, большая уязвимость мезофилла ели сибирской к неблагоприятному воздействию внешних факторов, таких как засуха и высокая температура, объясняет ее мезофитность, строгую приуроченность к увлажненным местам произрастания. У сосны обыкновенной большая защищенность мезофилла и его высокая фото-синтетическая активность позволяет ей произрастать в более широком ареале, что объясняет ее распространение не только в районе проведения исследований, но и за его пределами.

литература

1. Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей / Г.Г. Фурст.

- М.: Наука. 1979. - 153 с.

2. Щербатюк А.С. Многоканальные установки с СО2 — газоанализаторами для лабораторных и полевых исследований / А.С. Щербатюк // Инфракрасные газоанализаторы в изучении газообмена растений. — М.: Наука, 1990. — С. 38 — 54.

А.С. Столбиков, Н.И. Рекославская, Р.К. Саляев

получение растений томата, трансформированных геном pRES2-S-HDEL, с целью разработки кандидатной съедобной вакцины против гепатита в

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

Одним из перспективных и быстро развивающихся направлений растительного «биофарминга» является использование трансгенных растений в качестве продуцентов съедобных вакцин нового поколения, создающих перспективу широкой и эффективной иммунизации населения. Съедобные вакцины обладают существенными преимуществами: во-первых, они дешевы и относительно легки в получении, что позволит распространять их в страны с разным уровнем экономического благополучия, во-вторых, применение оральных вакцин сводит к минимуму риск возникновения аллергических реакций. Съедобные вакцины являются более безопасными, так как не содержат живых ослабленных патогенных организмов. Инъекционные вакцины в основном индуцируют системный иммунитет, в то время как иммунизация слизистой часто приводит к стимуляции не только мукозного, но и системного иммунитета.

Г епатит В — очень распространенная и опасная вирусная инфекция. Каждый год в мире фиксируется 50 млн. заболевших только острой формой гепатита В. Из них до 600 тыс. больных умирает (Амосов, 2006). Число носителей этого заболевания возросло за 10 лет с 200 млн. до 300 млн. человек (Purcell, 1994; Thanavala et al., 1995).

Целью настоящей работы явилось получение трансгенных по гену preS2-S-HDEL растений томата, продуцирующих основной антигенный белок вируса гепатита В HBsAg.

Исходным материалом для генетической трансформации были выбраны 2-х недельные проростки томата сорта Вентура. Экспланты томата выращивались в стерильных условиях при температуре 30 °С в условиях постоянного освещения, в качестве питательной среды использовалась среда Мурасиге и Скуга. Для генетической модификации использовали агробактерию штамма LBA 4404, содержащею плазмиду pBINp35S-preS2-S-HDEL, в которой также находился селективный ген npt II, ответственный за устойчивость к антибиотику канамицину. Агробактерия была любезно предоставлена сотрудниками ГНЦ ВБ «ВЕКТОР».

Целевой ген preS2-S кодирует 2 поверхностных полипептида оболочки гепатита В. Исследования показывают, что при совместной экспрессии генов S и preS2 иммунный ответ проявляется сильнее (Jilg, 1998; Joung et al., 2007). Из этого следует, что при введении двух этих генов в геном растения, можно получить более эффективную вакцину против гепатита В. Для большей стабильности и увеличения содержания антигенного белка в ряде работ используют сигнальную последовательность HDEL (гистидин-аспартат-глутамат-лейцин), адресующую синтезируемый антиген в эндоплазматический ретикулум. Поэтому в настоящей работе в качестве целевого гена использована последовательность preS2-S-HDEL.

Трансформация эксплантов проводилась уколом инфицированной Agrobacterium tumefaciens иглой в верхушечную точку роста между семядолями. Затем трансформированные проростки помещали на

селективную среду, содержащую 50 — 60 мг/л канамицина, где в течение 2 — 4 недель у них образовывались зачатки корешков, в случае если трансформация прошла успешно.

Устойчивость к антибиотику определяли по способности растений к корнеобразованию и дальнейшему росту, а также отсутствию хлороза. После того как у эксплантов образовывались корешки, растения пересаживались с селективной среды в воду на одни сутки, а затем в сосуды с влажной фильтровальной бумагой, где они находились до тех пор, пока у них не образовывалась разветвленная корневая система, обычно этот процесс занимал от 2 до 4 недель.

После того, как растения образовали хорошо разветвленную корневую систему, их пересаживали в сосуды с влажным стерильным песком. В этих сосудах растения подвергались адаптации к внешним условиям, в особенности к воздействию более сухой атмосферы. Затем растения пересаживали в почву. Образовавшиеся плоды в недозрелом и зрелом состояниях собирали и помещали на хранение в холодильную камеру с температурой воздуха —20 °С.

Успешность инсерции целевого гена в ядерный геном томата выявляли с помощью ПЦР анализа листьев и плодов растений, которые прошли селекцию на канамицине. Наличие основного антигенного белка гепатита В в тканях трансформированных растений выявлялось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). После положительного ИФА, в целях избежания случайной ошибки, а также для подтверждения эффективности тест-системы, проводили подтверждающий ИФА.

Полученные результаты позволили заключить, что данный метод генетической трансформации вполне пригоден для растений томата. Эффективность трансформации составила 2,3 %. Результаты селекции на среде с канамицином подтвердили экспрессию гена npt II в трансгенных растениях. Была подобрана система адаптации растений, прошедших селекцию, к условиям внешней среды. В итоге были получены вполне здоровые и жизнеспособные трансгенные растения, обладающие нормальным плодоношением, фенотипически не отличающиеся от контрольных не трансформированных растений. С помощью ПЦР и иммуноферментного анализов установлена интеграция и экспрессия целевого гена preS2-S-HDEL в листьях и плодах трансформированных растений поколения Т0. Получены также растения поколения Т1 в листьях и плодах которых с помощью прямого и подтверждающего иммуноферментного анализа обнаружено значительное количество основного антигенного белка гепатита В HBsAg, что свидетельствует об успешной экспрессии целевого гена.

Полученные результаты открывают возможность использование в дальнейшем плодов растений томата трансгенных по гену preS2-S-HDEL, в предклинических и клинических испытаниях в качестве кандидатной съедобной вакцины против гепатита В.

Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ № 2176р.

литература

1. Амосов А.Д. Гепатит В / А.Д. Амосов. - Новосибирск: Изд-во «Вектор-Бест», 2006. — 128 с.

2. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen / Y. Thanavala, Y-F. Yang, P. Lyons et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1995. - Vol. 92, N 8. - P. 3358-3361.

3. Jilg W. Novel hepatitis B vaccines / W. Jilg // Vaccine. - 1998. - Vol. 16. - P. 65-68.

4. Oral immunogenicity of potato-derived HBsAg middle protein in BALB/c mice / Y.H. Joung, J.W. Youm, J.H. Jeon et al. // Vaccine. - 2007. - Vol. 25, N 3. - P. 577-584.

5. Purcell R.H. Hepatitis Viruses: Changing Patterns of Human Disease / R.H. Purcell // PNAS. - 1994.

- Vol. 91. - P. 2401 -2406.

И.А. Теркина1, Т. Мимура2

участие микробного сообщества в мобилизации фосфатов в озере бива

1 Лимнологический институт СО РАН

Озеро Бива - это древнее и самое большое пресноводное озеро в Японии с площадью 670 км2 и максимальной глубиной 104 м. Озеро состоит из двух бассейнов: северного (глубоководного) и южного (мелководного). В начале XX века северный бассейн был олиготрофным. В 60-х годах прошлого века над озером нависла серьезная экологическая угроза, связанная с интенсивным эвтрофированием водоема. Результатом загрязнения явилось ускоренное повышение биопродуктивности водоема в результате накопления в воде биогенных веществ. Это могло привести к нехватке кислорода в воде, заморам, гибели флоры и фауны. Японцы приняли самые решительные меры по спасению одного из древнейших озер планеты и на сегодняшний день трофический статус озера - мезотрофное. В процессе эвтрофирования водоемов особая роль принадлежит фосфору - одному из важнейших биогенных элементов, необходи-