ШТАММ БАКТЕРИЙ Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF POLYHYDROXY ALKANOATES AND PRODUCTION METHOD THEREOF

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма-продуцента полимеров гидроксиалкановых кислот (ПГА) и способа их получения. Эти полимеры термопластичны, характеризуются высокой биологической совместимостью и разрушаемостью в биологических средах, поэтому перспективны для различных сфер применения: в медицине (хирургические элементы, имплантаты, матриксы функционирующих клеток), в фармакологии (для создания долговременных лекарственных систем с контролируемым выходом препаратов, предметов гигиены и санитарии), в сельском хозяйстве (биоразрушаемые покрытия и упаковка удобрений и пестицидов с целью адресной доставки).
Среди продуцентов ПГА известны различные прокариотические микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам, способные расти на различных субстратах (сахарах, органических кислотах, отходах сельского хозяйства и промышленности) и синтезировать эти полимеры [Madison L.L., Huisman G.V. Metabolic engineering of poly (3-hydroxyalkanoates): From DNA to plastic // Microbiol. And Molecular Biology Rev. - 1999. - Vol.63. - P.1-25]. Однако для промышленного применения выделено несколько высокопродуктивных микроорганизмов. Это водородокисляющие бактерии Alcaligenes latus, Alcaligenes eutrophus (переименованные из Ralstonia и Wautersia eutropha, в настоящее время отнесенные к роду Cupriavidus), азотфиксаторы Azotobacter vinelandii, метилотрофы Methylomonas, Methylobacterium organophilum [Madison L.L., Huisman G.V. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): From DNA to plastic // Microbiol. And Molecular Biology Rev. - 1999. - Vol.63. - P.1-25], синтезирующие, в основном, полимер 3-гидроксимасляной кислоты (3-гидроксибутират (3-ПГБ)), который является наиболее изученным и распространенным представителем ПГА. 3-ПГБ - это высококристалличный (степень кристалличности - свыше 70%) термопласт, высокая биосовместимость которого базируется на том, что гидроксимасляная кислота является естественным метаболитом клеток и тканей высших организмов и человека [Reusch R.N., Sparrow A.W., Gardiner J.
Transport of poly-beta-hydroxybutyrate in human plasma // Biochim. Biophys Acta. - 1992. - V.1123. - P.33-40].
Несмотря на то что поли-3-ПГБ обладает высокой биологической совместимостью, деградирует в биологических средах и может быть использован для получения различных медицинских изделий, его недостатком является то, что он не кристаллизуется упорядоченно, поэтому этот тип ПГА достаточно трудно перерабатывать в изделия, которые характеризуются низкой ударной прочностью, жесткостью и «старятся» во времени [Lakshmi S., Laurencin С. Biodegradable polymers as biomaterials // Prog. Polym. Sci. - 2007. V.32. - P.762-798].
4
12
Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной C-цепи, от C до C и выше. Мономерный состав ПГА определяет их базовые свойства. Однако синтез гетерополимерных ПГА (т.е. полимеров, образованных мономерами с различной длиной C-цепи) - сложная технологическая задача, решение которой возможно несколькими путями. Первый заключается в поиске новых штаммов - продуцентов ПГА и создании специализированных условий для их выращивания. Второй путь предполагает конструирование генетически модифицированных организмов, в которых объединяют гены, контролирующие синтез ПГА из различных природных штаммов.
Известны штаммы-продуценты многокомпонентных и разнообразных по составу ПГА, образованных не только мономерами 3-гидроксибутирата, но и другими мономерами: 2-гидроксибутиратом, 2-гидроксивалератом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом, 3-гидроксиоктаноатом, 3-гидроксидодеканоатом, а также 4-гидроксибутироатом, 4-гидроксивалератом и их сополимерами. Эти ПГА, в отличие от гомогенного 3-ПГБ, характеризуются более высокой скоростью биодеградации, большей эластичностью и способностью перерабатываться в разнообразные изделия с высокими физико-механическими характеристиками [патенты США №:5,245,023 (September 14, 1993); 6,323,010 (November 27, 2001); 6,316,262 (November 13,2001); 6,593,116 (Jule 15, 2003); 6,689,589 (February 10, 2004); 6,838,493 (January 4, 2005); 7,229,804 (June 12, 2007)].
Недостатки данных штаммов-продуцентов гетерополимерных ПГА, заключаются в том, что они являются генетически модифицированными организмами, требуют для роста специализированных дорогостоящих сред, а также характеризуются нестабильностью в процессе культивирования и возможностью снижения или утраты способности синтезировать ПГА требуемого состава.
Известен природный штамм Alcaligenes eutrophus B-5786 (депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ), способный с высокими выходами синтезировать 3-полигидроксибутират на смесях диоксида углерода, кислорода и водорода [патент РФ №2053292, МПК C12N 1/20, опубл. 27.01.1996 г., (прототип)].
Известен способ получения гетерополимера 3-оксимасляной и 3-оксивалериановой кислот, заключающийся в культивировании штамма Alcaligenes eutrophus ВКПМ B-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат - водород и двуокись углерода или соли уксусной кислоты с добавлением валериановой или пропионовой кислоты, при лимите азота [патент РФ №2051968, МПК C12P 7/62, опубл. 10.01.1996 г., (прототип)].
5
Недостатки штамма В-5786 и способа получения на его основе ПГА заключаются в высокой чувствительности к солям алкановых кислот с длиной С-цепи свыше C, неспособности синтезировать сополимеры 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом, а также неспособность использовать глюкозу и другие сахара в качестве ростового субстрата.
Техническим результатом изобретения является выявление нового продуктивного штамма, способного устойчиво синтезировать с высокими (70-90%) выходами технологичные гетерополимерные ПГА, содержащие в качестве макровключений (свыше 10-20 мол.%), помимо 3-гидроксибутирата, другие мономеры (3-гидроксивалерат, 3-гидроксигексаноат, 4-гидроксибутират), имеющие степень кристалличности не выше 50%, растущие на различных субстратах, включая смеси углекислоты с кислородом и водородом различного происхождения, сахара (фруктоза, глюкоза) и спектр органических кислот (ацетат, бутират, а также валерат, гексаноат, бутуролактон и др.) и имеющего более широкие границы физиологического действия по отношению к перечисленным субстратам, являющихся предшественниками мономеров (4-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата) и усиливающих образование гетерополимерных ПГА.
Технический результат достигается тем, что выявлен штамм Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646, который является продуцентом полигидроксиалканоатов.
Технический результат достигается также и тем, что в способе получения полигидроксиалканоатов по п.1, заключающемся в культивировании штамма-продуцента в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат с дополнительным источником углерода, при лимите азота, новым является то, что в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646, в качестве ростового субстрата используют глюкозу или фруктозу, или 3-масляную кислоту, или газовую смесь - водород, кислород и двуокись углерода, или синтез-газ в смеси с кислородом, а в качестве дополнительного источника углерода используют раствор 3-валерата калия, или растворы 3-валерата калия и 3-гексаноата калия, или растворы 3-валерата калия, 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-маслянной кислоты и 4-буторолактона, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона и 3-валерата калия, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона и 3-валерата калия, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона и 3-гексаноата калия, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона, 3-валерата калия и 3-гексаноата калия.
Заявляемый штамм является одним из вариантов, выделенных из культуры глюкозоусваивающего штамма Ralstonia eutropha B-8562 (штамм получен в результате длительной селекции штамма B-5786 на средах с единственным источником углерода - глюкозой, штамм депонирован в ВКПМ) в процессе длительной многоступенчатой селекции по эффективности синтеза многокомпонентных ПГА, образованных мономерами с различной длиной С-цепи, на ростовой среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или смеси органических кислот. Для отбора штамма, способного эффективно синтезировать гетерополимерные ПГА, в состав ростовой среды дополнительно вводили натриевые соли алкановых кислот (пентановой, гексановой, октановой и др.), стимулирующие синтез 3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата, 3-гидроксигептаноата и др.) или 4-бутуролактон, стимулирующий образование 4-гидроксибутирата. Штамм в отличие от прототипа устойчив к воздействию более высоких концентраций токсических субстратов (CO, соли алкановых кислот, 4-бутуролактон).
Заявляемый штамм Cupriavidus eutrophus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), коллекционный номер ВКПМ B-10646.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками:
2
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицателен, клетки-палочки (молодые - короткие, в стационарной фазе - разной длины, размеры 0.3-0.5×1.2-2.0 мк), подвижные (молодые - монотрихи, с возрастом - перетрихи). Слабоподвижен. Оптимум роста 30-31°C, pH 6,7-7,2. На агаризованной среде с пептоном (гетеротрофные условия роста) образуют морфологически однородные округлые колонии, светло-кремовые, непрозрачные со слегка волнистым краем диаметром 2-4 мм. На минеральной агаризованной среде (автотрофные условия роста) колонии мелкие (1,5-2,5 мм), светло-серые, полупрозрачные. В жидкой питательной среде представляет однородную суспензию (минеральная среде Шлегеля, содержащая в качестве источника углерода смесь монокарбоновых кислот (или сахара, органические кислоты, аминокислоты, спирты) при гетеротрофном росте, при автотрофии - смесь диоксида углерода, водорода и кислорода. Облигатный аэроб. Факультативный хемолитоавтотроф. Оксидазоположителен. Гидролитическими ферментами не обладает. Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. Обладает широким органотрофным потенциалом и способен в качестве источника углерода использовать: сахара (глюкоза, фруктоза), аминокислоты (аланин, серин, лейцин, гистидин, триптофан, глутаминовую, аспарагиновую, лизин), органические кислоты (щавелевую, лимонную, янтарную, фумаровую, уксусную, 3-и 4-масляную кислоту, пентапновую, гексановую, октановую, нонановую), спирты (этанол, глицерин), 4-бутуролактон, CO и CO. В качестве источника азота использует нитраты, соли аммония, карбамид, аминокислоты. Активность ферментов цикла ПГА составляет (U/мин×мг белка): β-кетотиолазы 3.57-4.26, ацетоацетил-CoA-редуктазы 0.98-1.23, ПГА-синтазы 0.08-0.10 E., (D)-гидроксибутиратдегидрогеназы 0.18-0.22. Содержание ГЦ пар нуклеотидов в ДНК равно 66%. Клонирован и охарактеризован ДНК фрагмент 1381 н.п., включающий нуклеотидную последовательность гена 16S rRNA штамма В-10646.
4
9
Ростовые характеристики: штамм растет на минеральной среде с сахарами или органическими кислотами, а также в атмосфере водорода, двуокиси углерода и кислорода, специфических факторов роста и органических добавок не требуется. Границы физиологического действия рН в диапазоне 4.4-8.6, штамм сохраняет способность к росту в диапазоне температур 20-41°C. Стабильно сохраняет свои характеристики при варьировании условий культивирования и сред (замена источника углерода и энергии, низкие или высокие значения активной реакции среды, повышение температуры до 35°C, использование в качестве ростового токсического субстрата - 4-бутуролактон и соли монокарбоновых кислот. На полной питательной среде удельная скорость роста - до 0.45 1/ч, продуктивность - до 2 г/л час, содержание общего азота - до 12%, белка - до 65%, при дефиците азота в среде накапливает полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (полгидроксиалканоаты, ПГА), максимально до 97% различного химического состава (содержащих мономеры с длиной С-цепи от C до C).
2
4
2
2
4
4
2
3
6
5
7
2
4
3
3
2
2
4
2
2
2
4
2
4
2
2
Культивирование бактерий проводят в стерильном режиме с использованием литровых колб, заполненных средой Шлегеля на 40-50% по объему на термостатируемой качалке или с использованием автоматизированного ферментационного комплекса BioFlo 110 («New Brunswic», США) объемом 15 л, который позволяет реализовать асептический режим при стабилизации основных параметров культуры (pH, температура, концентрация кислорода и азота в культуре) на минеральной солевой среде следующего состава (г/л): NaHPO·HO - 9.1, KHPO - 1.5; MgSO HO - 0.2, FeCHO·7HO - 0.25, NHCl - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: HBO - 0.228, CoCe×6HO - 0.030, CuSO×5HO - 0.008, MnCe×4HO - 0.008, ZnSO×7HO - 0.176, NaMoO×2HO - 0.050, NiCe - 0.008 (г/л). Коэффициент заполнения ферментера составляет от 0.3 до 0.5, число оборотов мешалки 1000-1500 (об/мин).
2
2
2
При гетеротрофном режиме - исходная концентрация сахаров - 10-15 г/л с подпиткой культуры субстратом с использованием перистальтического насоса-дозатора, аэрация культуры - стерильным воздухом. В автотрофном режиме в качестве источника углерода и энергии используют смесь газов (CO, H, O) с соотношением компонентов как 1:2:7 по объему. Газовую смесь с помощью компрессора мембранного типа непрерывно прокачивают через культуру с расходом 10-14 л/мин. Контроль состава газовой смеси проводят в непрерывном режиме с помощью серийных газоанализаторов, а также на хроматографе ЛХМ-80 МД («Хроматограф», Россия) (детектор - катарометр, газ-носитель - аргон).
Оптимальны для скорости роста значения pH 6.7-7.2, оптимум температуры среды для размножения 29.5-31.5°C. Соотношение газов в смеси при автотрофном росте (% об.): диоксид углерода 5-10, кислород 10-25 (в зависимости от плотности культуры), водород от 30 до 70 (ингибирования нет). Солевая среда Шлегеля (состав указан выше). При гетеротрофном росте - все параметры и среда Шлегеля аналогично автотрофному росту, источник углерода (сахара и/или органические кислоты) - 10-15 г/л.
Таким образом, для заявляемого штамма характерны:
- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава,
- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном виде,
- высокая активность ферментов, контролирующих синтез ПГА,
- способность к синтезу ПГА с высокими выходами,
- устойчивость к воздействию С-субстратов - стимуляторов синтеза гетерополимерных ПГА,
- способность к синтезу гетерополимерных ПГА, образованных различными мономерами с макровключениями последних,
- способность к синтезу ПГА, имеющих степень кристалличности ниже 50%.
Для реализации режима синтеза ПГА заявляемым штаммом, штамм Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 выращивают в периодическом режиме на среде Шлегеля в автотрофном режиме (на газовой смеси водорода:кислорода:углекислоты) или гетеротрофно на сахарах или органических кислотах: на первом этапе при избытке углеродного субстрата на полной питательной среде; на втором этапе - в безазотной среде. Для образования ПГА с различным составом мономеров в состав среды с помощью перистальтического насоса дозатора в культуру вносят дополнительный углеродный субстрат в виде солей кислот (масляной или валериановой, гексановой, октановой, нонановой), а или 4-буторолактон и др. В зависимости от дозы подаваемого дополнительного углеродного субстрата и времени ферментации соотношение мономеров с различной длиной С-цепи в полимере варьируется в широких пределах, при этом синтезируются гетерополимерные ПГА, имеющие степень кристалличности 50% и менее.
Концентрацию ПГА в клеточной биомассе и состав мономеров в нем определяли после предварительного метанолиза проб на хроматомасс-спектрометре Agilent 5975Inert, фирмы «Agilent» (США). Выделение полимера из биомассы проводили дихлорметаном, полученный экстракт после его концентрирования на роторном испарителе Rotavapor R-210 (Швейцария) осаждали изопропанолом. Для получения высокоочищенных образцов процедуру перерастворения и осаждения проводили несколько раз. Полимер высушивали в боксе-ламинаре и анализировали физико-химические характеристики.
С использованием системы гель-проникающей хроматографии «Waters Breeze System» фирмы «Waters» (США) определяли молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение полимеров относительно полистероловых стандартов фирмы «Sigma-Aldrich». Рентгеноструктурный анализ и определение степени кристалличности образцов выполнены на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE фирмы «Bruker» (Германия) (графитовый монохроматор на отраженном пучке). Для определения температурных характеристик ПГА проводили комплексный термический анализ образцов с использованием синхронного термоанализатора STA 449 Jupiter фирмы NETZCSH (Германия), сочетающего одновременное измерение изменений массы (термогравиметрия) и тепловых потоков (дифференциальная сканирующая калориметрия).
Получение полигидроксиалканоатов на основе штамм Cupriavidus eutrophus B-10646 иллюстрируют следующие примеры:
Пример 1.
2
4
2
2
4
4
2
3
6
5
7
2
4
3
3
2
2
4
2
2
2
4
2
4
2
2
4
Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646 суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 10 г/л, NaHPO·HO - 9.1, KHPO - 1.5; MgSO·HO - 0.2, FeCHO·7HO - 0.25, NHCl - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: HBO - 0.228, СоСе×6HO - 0.030, CuSO×5HO - 0.008, MnCe×4HO - 0.008, ZnSO×7HO - 0.176, NaMoO×2HO - 0.050, NiCe - 0.008 (г/л). Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0.3-0.5 в термостатируемой качалке. Культивирование проводят в течение 16 ч при 30°C и pH 7.0. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе BioFlo 110 («New Brunswic», США) объемом 15 л, который позволяет реализовать асептический режим при стабилизации основных параметров культуры (pH, температура, концентрация кислорода и азота в культуре) на минеральной солевой среде следующего состава (г/л): Коэффициент заполнения ферментера составляет от 0.3 до 0.5, регулируемое число оборотов мешалки 1000-1500 (об/мин). Выращивание бактерий проводят при 30°С и pH 7.0 при текущей концентрации глюкозы в культуре 5-10 г/л и NHCl - 0.1-0.2 г/л, растворы которых подаются в культуру насом-дозатором раздельными потоками. Через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 24 ч при подаче в культуру раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 40 ч при общем выходе полимера 96% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 99.4; 3-гидроксивалерат - 0.4; 3-гидроксигексаноат - 0.2 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№1).
Пример 2.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 24 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 3 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 40 ч при общем выходе полимера 87% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 6.4; 3-гидроксивалерат - 93.1; 3-гидроксигексаноат - 0.5 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№2).
Пример 3.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч подачу азота в культуру прекращают, и культивирование продолжают 16 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - 5 г/л) и раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 32 ч при общем выходе полимера 87.9% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 73.0 мол.%; 3-гидроксивалерат - 26.1 мол.%; 3-гидроксигексаноат - 1.09 мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№3).
Пример 4.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 24 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-валерата калия и раствора 3-гексаноата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущие концентрации в культуре, соответственно, 3-валерата и 3-гексаноата, 3 г/л и 1 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 40 ч при общем выходе полимера 74.6% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 60.5; 3-гидроксивалерат - 33.0; 3-гидроксигексаноат - 6.5 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№4).
Пример 5.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 34 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-валерата калия, раствора 3-гексаноата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущие концентрации в культуре, соответственно, 3-валерата и 3-гексаноата, 3 г/л и 1 г/л), а также раствора акрилата (текущая концентрация в культуре - 1.5 г/л). Акрилат используют в качестве ингибитора цикла бета-окисления жирных кислот с целью избежания разрушения С-цепи добавляемого в культуру 3-гексаноата и, тем самым, повышения его включения в ПГА. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 64.6% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 37.8; 3-гидроксивалерат - 26.0; 3-гидроксигексаноат - 36.2 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№5).
Пример 6.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 34 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-валерата калия (текущая концентрация 2.5 г/л), раствора 3-гексаноата калия (текущая концентрация в культуре 2.0 г/л), раствора акрилата (текущая концентрация в культуре - 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 75.0% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 33.9; 3-гидроксивалерат - 30.1; 3-гидроксигексаноат - 36.0 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№6).
Пример 7.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 30 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-гексаноата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре 2.5 г/л) и раствора акрилата (текущая концентрация в культуре - 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 46 ч при общем выходе полимера 79.0% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 43.7; 3-гидроксивалерат - следы; 3-гидроксигексаноат - 56.3 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№7).
Пример 8.
4
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют фруктозу при текущей концентрации в культуре 5-10 г/л и NHCl - 0.1-0.2 г/л. Через 12 ч подачу азота в культуру прекращают, и культивирование продолжают 22 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-буторолактона в качестве дополнительного источника углерода и прекурсора образования мономеров 4-гидроксибутирата (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 44 ч при общем выходе полимера 87.2% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 70.1; 4-гидроксибутират - 12.0; 3-гидроксивалерата - 1.4; 3-гидроксигексаноат - 0.6 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№8).
Пример 9.
4
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют фруктозу при текущей концентрации в культуре 5-10 г/л и NHCl - 0.1-0.2 г/л. Через 16 ч подачу азота в культуру прекращают, и культивирование продолжают 22 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 4-буторолактона и раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущие концентрации которых в культуре составляют по 2.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 38 ч при общем выходе полимера 80.0% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 55.4; 4-гидроксибутират - 8.0; 3-гидроксивалерата - 36.6; 3-гидроксигексаноат - следы (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№9).
Пример 10.
4
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют фруктозу при текущей концентрации в культуре 5-10 г/л и NHCl - 0.1-0.2 г/л. Через 16 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 36 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 4-бутуролактона (текущая концентрация в культуре составляют 2.5 г/л) и раствора 3-валерата калия (текущая концентрация в культуре - 3 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 52 ч при общем выходе полимера 76.9% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 34.8; 4-гидроксибутират - 18.0; 3-гидроксивалерата - 46.6; 3-гидроксигексаноат - 0.6 (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№10).
Пример 11.
4
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют 3-масляную кислоту при текущей концентрации масляной кислоты в культуре 5 г/л и NHCl - 0.1-0.2 г/л. Через 16 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 26 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-буторолактона в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 42 ч при общем выходе полимера 73% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 70.3; 4-гидроксибутират - 28.5; 3-гидроксивалерата - 0.8; 3-гидроксигексаноат - 0.4 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№11).
Пример 12.
4
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют 3-масляную кислоту при текущей концентрации масляной кислоты в культуре 5 г/л и NHCl - 0.1-0.2 г/л. Через 20 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 26 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-бутуролактона в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л) и раствора 3-гексаноата калия (текущая концентрация 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 46 ч при общем выходе полимера 70% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 49.3; 4-гидроксибутират - 21.5; 3-гидкроксивалерат -0.8; 3-гидроксигексаноат - 28.4 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№12).
Пример 13.
4
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют 3-масляную кислоту при текущей концентрации масляной кислоты в культуре 5 г/л и NHCl - 0.1-0.2 г/л. Через 20 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 30 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-бутуролактона в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л) и раствора 3-валерата калия (текущая концентрация 1.5 г/л) и раствора 3-гексаноата калия (текущая концентрация 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 75% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 36.3; 4-гидроксибутират 16.5; 3-гидроксивалерат -26.8; 3-гидроксигексаноат - 20.4 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№13).
Пример 14.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют смесь газов следующего состава (в об.%): водород 70, кислород 20 и двуокись углерода 10, которую из газгольдера объемом 50 л через систему микробиологических фильтров прокачивают непрерывно через культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Через 24 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают еще 26 ч при подаче в культуру раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 82% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 46.1; 3-гидроксивалерат - 53.0; 3-гидроксигексаноат - 0.9 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№14).
Пример 15.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют синтез-газ, получаемый газификацией бурых углей [согласно патенту РФ №2207375, МПК C12P 7/42, опубл. 27.06.2003 г.] или конверсией природного газа [а.с. СССР №1233483, опубл. 1985 - №32] и кислород, используемая газовая смесь содержит (в об.%): водород 60, кислород 20 и двуокись углерода 10, окись углерода 10, которую из газгольдера объемом 50 л через систему микробиологических фильтров прокачивают непрерывно через культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Через 30 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают еще 30 ч при подаче в культуру раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л) и 3-гексаноата калия (текущая концентрация 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 60 ч при общем выходе полимера 80% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 42.8; 3-гидроксивалерат - 36.0; 3-гидроксигексаноат - 20.9 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№15).
Использование штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646 в качестве продуцента ПГА, варьирования концентрации и типа углеродного субстрата, а также длительности культивирования, позволяет получать спектр разнообразных ПГА, образованных различными мономерами и существенно различающихся по физико-химическим свойствам (таблица 1).
Таблица 1
Состав и физико-химические свойства ПГА, синтезируемые Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646
№
Состав ПГА - соотношение мономеров (мол.%)
Свойства ПГА
3-ГБ
3-ГВ
3-ГГ
4-ГБ
М<sub>в</sub>, Да
ПД(n)
C<sub>х</sub>, %
T<sub>пл.</sub>,°C
T°<sub>дегр.</sub>,°C
1
99.4
0.4
0.2
-
1340329
2.64
78*
182
286
2
6.4
93.1
0.5
-
1111446
3.49
41
159
260
3
73.0
26.1
1.09
-
1501622
2.27
50
176
272
4
60.5
33.0
6.5
-
1200451
2.67
40
167
276
5
37.8
26.0
36.2
-
986912
2.86
32
166
277
6
33.9
30.1
36.0
-
812892
2.64
36
169
281
7
43.7
0.1
56.2
-
1240854
3.12
30
167
280
8
70.1
1.4
0.6
12.0
844256
2.31
38
170
278
9
55.4
36.6
сл.
8.0
1113866
2.32
43
168
278
10
34.8
46.6
0.6
18.0
965401
2.59
25
166
274
11
70.3
0.8
0.4
28.5
568412
1.91
12
167
272
12
49.3
0.8
28.4
21.5
1349215
2.98
45
171
283
13
36.3
26.8
20.4
16.5
1216090
2.67
46
177
278
14
46.1
53.0
0.9
-
1230218
2.46
44
164
267
15
42.8
36.0
20.9
-
1109216
2.89
50
176
280
Примечание:
* - в качестве примера приведен гомополимерный поли 3-гидроксибутират, имеющий высокую степень кристалличности 3-ГБ-3 гидроксибутират; 3-ГВ-3 гидроксивалерат; 3-ГГ-3 гидроксигексаноат; 4-ГБ-4 гидроксибутират;
M<sub>в</sub> - молекулярная масса, Да - дальтон; ПД (n) - полидисперсность; С<sub>х</sub>, % - степень кристалличности; T<sub>пл.</sub>°C - температура плавления; Т<sub>дегр.</sub>°C - температура термической деградации.