Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas12 и препарат для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях
METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE CRISPR/Cas 12 RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX AND PREPARATION FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS

Область техники
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к направляющим РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) РНК вируса SARS-CoV-2, а также к способам получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas12 и к самим препаратам.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции РНК вируса SARS-CoV-2 после проведения специфической амплификации фрагментов генома SARS-CoV-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний, в том числе для разработки методов диагностики вновь возникающих инфекций.
Уровень техники
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов (Chen J.S., Ma Е., Harrington L.B., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018; 360(6387): 436-9. doi: 10.1126/science.aar6245).
He менее важным приложением системы CRISPR/Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге (Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Lee J.W., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017; 356(6336): 438-42. doi: 10.1126/science.aam9321).
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках (Gootenberg J.S., Abudayyeh О.О., Kellner M.J., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018; 360(6387): 439-44. doi: 10.1126/science.aaq0179).
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ (Myhrvold С, Freije С.А., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018; 360(6387): 444-8. doi: 10.1126/science.aas8836).
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/Cas.
В ходе изучения уровня техники были найдены научные статьи, описывающие разработку технологий для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro, основанных на применении белков систем направленного редактирования генома.
J.P. Broughton и соавторы описали технологию DETECTR для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, где в качестве мишени для амплификации методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), служили гены N и Е SARS-CoV-2, а детекция проходила с помощью Cas12a в формате тест-полоски. Чувствительность описанного метода варьировала от 70 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [J.P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C.L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, et al., CRISPR Cas12-based detection of SARS-CoV-2, Nature Biotechnology 38 (2020) 870-874, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4].
Cas12a также был использован для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в методе, названном AIOD-CRISPR. В качестве мишени был выбран ген N, амплификация фрагмента которого проводилась в ходе изотермической реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA). Чувствительность AIOD-CRISPR составляла 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [X. Ding, К. Yin, Z. Li, R. Lalla, E. Ballesteros, M Sfeir, C. Liu, Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat. Commun. 2020 (18) (2020) https://doi.org/10.1038/s41467-020-18575-6].
Кроме того, была разработана технология ENHANCE, позволяющая выявлять от 3 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию, в которой предварительная амплификация фрагмента гена N осуществлялась методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью модифицированного Cas12a [L.T. Nguyen, В.М. Smith, Р.К. Jain, Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection, Nat. Commun. 11 (4906) (2020), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-l].
L.U. Guo и соавторы в совей работе описали технологию CASdetec, которая позволяла выявлять 100-500 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию. В основе технологии лежала изотермическая амплификация с помощью рекомбиназы, совмещенная с обратной транскрипцией (RT-RAA). Мишенью для амплификации служил фрагмент гена RdRp SARS-CoV-2. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью Cas12b [L.u. Guo, X. Sun, X. Wang, С.Liang, H. Jiang, Q. Gao, et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discov 6 (1) (2020), https://doi.org/10.1038/s41421-020-0174-y].
При использовании платформы SHERLOCK для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в качестве мишени были описаны гены S и Orflab. Предварительная амплификация проводилась с применением изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA), перед детекцией с помощью Cas13a проводили дополнительный этап in vitro транскрипции. Технология SHERLOCK позволяла выявить 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [F. Zhang, О.О. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, С.Sciences, L. Mathers, A protocol for detection of COVTD-19 using CRISPR diagnostics, Bioarchive. (2020) 1 8].
Кроме методов, перечисленных выше, для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 была предложена диагностическая платформа FELUDA. Выявление РНК вируса SARS-CoV-2 (гены NSP8 и N) происходило после обратной транскрипции с помощью Cas9. Чувствительность метода оценивалась в 3,16-10 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [S.M. Mohd. Azhar, Rhythm Phutela, Asgar Hussain Ansari, Dipanjali Sinha, Namrata Sharma, Manoj Kumar, Meghali Aich, Saumya Sharma, Khushboo Singhal, Harsha Lad, Pradeep K. Patra, Govind Makharia, Giriraj Ratan Chandak, Debojyoti Chakraborty, Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, BioRxiv. (2020). doi:: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167].
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий (менее 3 копий РНК на реакцию) РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro с помощью Cas12, а также в разработке способов получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas12 на их основе.
Раскрытие сущности
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR/Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:
- высокая чувствительность;
- возможность проведения диагностики у постели больного;
- возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;
- скорость и простота анализа;
- сниженная стоимость анализа;
- отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;
- отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.
Изобретение относится к новым средствам направляющим РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции РНК вируса SARS-CoV-2 в биологических образцах.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат возможность ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до единичных (1,64) копий РНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до 10 раз. Также предложенное изобретение позволяет увеличить выход продукта реакции, получив желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК, и обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.
Технический результат достигается за счет:
- разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRTSPR-Cas12 для ультра чувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-5, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками РНК вируса SARS-CoV-2, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2;
- применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU №2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/Cas, пригодных для детекции РНК вируса SARS-CoV-2 в ультра низких концентрациях (единичные копии);
- разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-9, для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2;
- оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2;
- определения условий проведения ультрачувствительной детекции РНК вируса SARS-CoV-2 и установления последовательности стадий метода.
Направляющие РНК, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным фрагментам генома вируса SARS-CoV-2. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
- SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 2;
- SEQ ID NO: 3;
- SEQ ID NO: 4;
- SEQ ID NO: 5;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
- или комплементарной любой из них,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента генома вируса SARS-CoV-2, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным участкам генома вируса SARS-CoV-2. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
- SEQ ID NO: 6;
- SEQ ID NO: 7;
- SEQ ID NO: 8;
- SEQ ID NO: 9;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
- или комплементарной любой из них,
или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae), пригодные для использования для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях (единичные копии).
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, с инструкцией по применению.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса SARS-CoV-2, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-9. При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.
Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas12 предусматривает:
(i) синтез направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-5,
(ii) объединение Cas-белка семейства CRISPR/Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i), и при необходимости (iii) лиофильную сушку рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas, полученного на стадии (ii), с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas.
В предложенном способе синтез направляющих РНК может быть проведен методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 тМ и равного объема изо пропило во го спирта.
Также предложенный способ предусматривает непосредственно перед объединением с Cas-белком прогрев направляющей РНК при 90°С в течение 5 минут и медленное остывание до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.
Предложен препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, который может быть получен раскрытым в настоящей заявке способом. Препарат содержит Cas-белок семейства CRISPR/Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQID NO: 1-5.
Препарат может быть представлен как в жидкой форме - раствора указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas, так и в виде лиофилизата - лиофильно высушенного порошка указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус SARS-CoV-2. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, спинномозговой жидкости, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие РНК вируса SARS-CoV-2.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 (размером 260 п.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
8 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,0002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 2. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 и белок LbCpf1.
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26413 и белок LbCpf1.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26432 и белок LbCpf1.
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26451 и белок LbCpf1.
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpf1.
Фиг. 7. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 №26413, crRNA SARS-CoV-2 №26432, crRNA SARS-CoV-2 №26451, crRNA SARS-CoV-2 №26460 соответственно.
Фиг. 8. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием 10 клинических образцов, где М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 №26413, crRNA SARS-CoV-2 № 26432, crRNA SARS-CoV-2 №26451, crRNA SARS-CoV-2 №26460 соответственно.
Фиг. 10. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием десятикратных разведениий препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента, где М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 №26413, crRNA SARS-CoV-2 № 26432, crRNA SARS-CoV-2 №26451, crRNA SARS-CoV-2 №26460 соответственно.
Примеры осуществления изобретения
ПРИМЕР 1. ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА SARS-COV-2 ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса SARS-CoV-2 для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1. Перечень участков генома вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpf1 из Lachnospiraceae).
Направляющие РНК, специфически узнающие фрагменты в геноме вируса SARS-CoV-2, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.
ПРИМЕР 2. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ
Подготовку материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 проводят методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В качестве модельной матрицы фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 биологического образца используют синтетическую РНК, полученную методом in vitro транскрипции. В качестве матрицы для синтеза модельной РНК используют плазмидную ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащую в своем составе фрагмент гена, кодирующего Е белок вируса SARS-CoV-2 (размером 260 п. о.).
Синтез кДНК фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят методом обратной транскрипции с использованием специфического олигонуклеотида E-pr Revl с SEQ ID NO: 7 (Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2) и обратной транскриптазы Superscript™ II (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 42°С.
Предварительную амплификацию фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят с использованием специфических олигонуклеотидов E-pr Fori и E-pr Revl с SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 соответственно, приведенных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Продукты амплификации, кодирующие фрагмент генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Размер амплифицированных фрагментов составляет 260 пар нуклеотидов. Температурный профиль амплификации:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации: 95°С - 15 сек,
55°С-45 сек, 72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
В ходе подготовки материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, проводят титрование модельной РНК, синтезированной на матрице pGEM-T-SARS-CoV-2, путем приготовления серийных разведений (Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной РНК-матрицы, содержащей фрагмент генома вируса SARS-CoV-2).
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1).
Подготовленный описанным способом материал без предварительной очистки используют для экспериментов по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.
ПРИМЕР 3. ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА SARS-COV-2
Для получения направляющих РНК для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2.
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:
1) получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым фрагментом генома вируса SARS-CoV-2, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;
2) очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2;
3) синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2;
4) очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 26333 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA S ARS-CoV-2 № 26333, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 № 26413, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 26413 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №26413, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 № 26432, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 26432 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA S ARS-CoV-2 №26432, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 № 26451, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 26451 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №26451, составляет 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 № 26460, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 26460 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA S ARS-CoV-2 № 26460, составляет 62 пары нуклеотидов.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, содержащие РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae:
1) денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2) 35 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С -45 сек, 72°С - 30 сек;
3) финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса вируса SARS-CoV-2, проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 тМ и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.
Создание готовых рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих белок семейства CRISPR/Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, и соответствующую направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (hi vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную соответствующую направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления фрагментов генома вируса SARS-CoV-2.
ПРИМЕР 4. ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, содержащих LbCpf1 из Lachnospiraceae, готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:
- 10× буфер (100 тМ TrisHCl рН 8,0, 1 М NaCl);
- 50 тМ MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);
- 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 или crRNA SARS-CoV-2 №26413 или crRNA SARS-CoV-2 №26432 или crRNA SARS-CoV-2 №26451 или crRNA SARS-CoV-2 №26460);
- 10 pmol флуоресцентный зонд (FAM-TTA-TT-BHQ1);
- Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса вируса SARS-CoV-2);
- вода mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задают следующие параметры реакции:
60 циклов:
37°С - 35 сек,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной РНК, синтезированной на основе плазмидной ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащей в своем составе фрагмент геном вируса SARS-CoV-2 размером 260 п. о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных фрагментов, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 или crRNA SARS-CoV-2 №26413 или crRNA SARS-CoV-2 №26432 или crRNA SARS-CoV-2 №26451 или crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpf1, на Фиг. 2-6 соответственно. Отметим, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 10-ом цикле анализа (10 минут), и более чем в 50 раз в среднем на на 25-ом цикле анализа (25 минут).
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием различных направляющих РНК (Фиг. 7). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса SARS-CoV-2 с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №26413>crRNA SARS-CoV-2 №26333>crRNA SARS-CoV-2 №26432>crRNA SARS-CoV-2 №26451 ≈ crRNA SARS-CoV-2 №26460.
ПРИМЕР 5. ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт.), содержащих вирус SARS-CoV-2 (ранее подтверждено с помощью ПЦР в реальном времени).
Для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и соответствующих направляющих РНК, была проведена предварительная амплификация фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты РНК.
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 8).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью выявлять единичные копии (1,64 копии/реакция) вируса SARS-CoV-2 в препаратах РНК, выделенных из клинических образцов. Стоит отметить, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 № 26413 и crRNA SARS-CoV-2 №26432, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 23-ем цикле анализа (23 минуты) и более чем в 50 раз в среднем на 40-ом цикле (40 минут). Значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №26451 и crRNA SARS-CoV-2 №26460, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 37-ом цикле анализа (37 минут) и более чем в 50 раз в среднем на 48-ом цикле (48 минут). На Фиг. 9 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 № 26333 или crRNA SARS-CoV-2 № 26413 или crRNA SARS-CoV-2 № 26432 или crRNA SARS-CoV-2 №26451 или crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpf1.
В заключение были проведены эксперименты по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 в последовательных разведениях препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента. Для этого были подготовлены серийные десятикратные разведения препарата РНК от 1:10 до 1:100000000 (Таблица 5. Серийные разведения РНК вируса SARS-CoV-2, выделенной из клинического образца).
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации, как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 10).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в препарате РНК, разведенном в 100000 раз. При этом при использовании направляющей РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, обладающей наибольшей эффективностью, значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в 49 раз. На Фиг. 11 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 или crRNA SARS-CoV-2 №26413 или crRNA SARS-CoV-2 №26432 или crRNA SARS-CoV-2 №26451 или crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpf1.
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas системы CRISPR-Cas12 ультрачувствительно выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2 в реакции после предварительной амплификации в препаратах РНК (в том числе разведенных в 100000 раз), выделенных из клинических образцов, содержащих вирус SARS-CoV-2.
--->
Перечень последовательностей
<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
<120>
<160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 9
<210> SEQ ID NO: NO 1
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 1 (crRNA SARS-CoV-2 №26333):
aau uuc uac uaa gug uag aug ugg uau ucu ugc uag uua c 40
<210> SEQ ID NO: NO 2
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 2 (crRNA SARS-CoV-2 №26413):
aau uuc uac uaa gug uag auu aac acg aga gua aac gua a 40
<210> SEQ ID NO: NO 3
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 3 (crRNA SARS-CoV-2 №26432):
aau uuc uac uaa gug uag auu acg uuu acu cuc gug uua a 40
<210> SEQ ID NO: NO 4
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 4 (crRNA SARS-CoV-2 №26451):
aau uuc uac uaa gug uag aug acc aga aga uca gga acu c 40
<210> SEQ ID NO: NO 5
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 5 (crRNA SARS-CoV-2 №26460):
aau uuc uac uaa gug uag aug uuc guu uag acc aga aga u 40
<210> SEQ ID NO: NO 6
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 6 (E-pr_For1):
gga aga gac agg tac gtt aat agt taa tag cg 32
<210> SEQ ID NO: NO 7
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 7 (E-pr_Rev1):
gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat ata a 37
<210> SEQ ID NO: NO 8
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 8 (E-pr_For2):
cgt taa tag tta ata gcg tac ttc ttt ttc ttg c 34
<210> SEQ ID NO: NO 9
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 9 (E-pr_Rev2):
gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat a  34
<---