ПОДСЧЕТ ТРОМБОЦИТОВ
CALCULATION OF PLATELETS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к устройству для сбора данных о пробе, способу и системе для объемного подсчета тромбоцитов в пробе крови.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
9
Тромбоциты или кровяные пластинки (бляшки Биццоцеро) являются циркулирующими элементами крови, полученными из цитоплазмы гигантской клетки - мегакариоцита. Они не являются клетками в строгом смысле слова и не содержат ядра. Они играют важную роль в гемостазе (при остановке кровотечения), сокращении тромбов, восстановлении поврежденных кровеносных сосудов и воспалении и, в общем случае, присутствуют в концентрации около 250×10 на литр крови. Время их существования в крови обычно составляет 8-10 дней. Они маленькие и имеют форму диска диаметром около 2 мкм и объемом около 7 фл (фемтолитр). Тромбоцит содержит вещества, вовлеченные в тромбообразование в крови, которые хранятся в определенных областях блокирования внутри тромбоцита и высвобождаются при активации тромбоцита, например, при образовании трещин при повреждении кровяного сосуда.
9
Определение количества тромбоцитов часто бывает важным в связи с лечением пациента. Этот анализ может быть необходим для диагностирования ряда заболеваний. Например, низкий уровень количества тромбоцитов (менее 50×10 на литр крови) указывает на тромбоцитофению, которая является обычной причиной предрасположенности к кровотечению. Низкая концентрация тромбоцитов может иметь место из-за их пониженной выработки, вызванной, например, повреждением костного мозга в результате апластической анемии, острой лейкемии, миеломы или цитостатики, пониженным временем существования тромбоцитов или изменением в распределении тромбоцитов, таким как сращивание (агрегация) тромбоцитов. С другой стороны, повышенная концентрация тромбоцитов может являться результатом хронических воспалительных расстройств (тромбоцитоз), таких как ревматический артрит или автономная выработка тромбоцитов в костном мозге (тромбоцитемия), и может приводить к образованию сгустков крови, т.е. тромбозу.
Желательно, чтобы результаты анализа были получены как можно быстрее для сведения к минимуму времени ожидания для пациентов и дать возможность врачу принять решение относительно лечения и диагноза непосредственно при проведении первого обследования пациента. Поэтому было бы предпочтительным обеспечить способ анализа, который может быть быстро проведен врачом или медсестрой без необходимости направления пробы в лабораторию.
Сегодня подсчет тромбоцитов обычно осуществляется автоматизированным счетчиком Култера, посредством которого компоненты крови (клетки и тромбоциты) выявляют путем измерения электропроводности или полного сопротивления. В патенте US 4240029 раскрыто устройство для подсчета кровяных пластинок и красных кровяных телец при помощи преобразователя апертурного типа, который способен четко сортировать по размеру кровяные пластинки и красные кровяные тельца.
Другой автоматизированный способ для подсчета тромбоцитов использует рассеивание лазерного излучения в проточном цитометре. Кровяные пластинки выявляют по их относительно малому размеру, на что указывает измеренное рассеивание света. Применение этого способа раскрыто, например, в патенте US 5817519.
Другие способы оценки посчитанного числа кровяных пластинок состоят в использовании определенных антител кровяных пластинок, например, как раскрыто в WO 00/25140, или измерением количества протеина, выделяющегося из области блокирования кровяной пластинки, например, тромбоспондина или β-тромбоглобулина в пробе, как раскрыто в патенте US 6027904.
TM
Тромбоциты также иногда подсчитывают с помощью микроскопа согласно способу Брехнера-Кронкита, посредство которого пробу крови смешивают с раствором оксалата аммония, после чего тромбоциты, которые видны в виде светлых точек с темными краями, подсчитывают с помощью микроскопа по методу фазового контраста. Другой известный способ подсчета тромбоцитов состоит в использовании коммерчески доступного реагента Plaxan в сочетании со счетной камерой, такой как камера Беркера. В счетной камере предусмотрена решетка (сетка), разделяющая ее на четко определенные малые объемы. Посчитанное число тромбоцитов может быть определено вычислением количества тромбоцитов на ячейку решетки. Подсчет тромбоцитов достигается вручную аналитиком, который должен иметь достаточный опыт для проведения анализа, чтобы выполнить надежный анализ. Эти анализы времяемкие. Кроме того, так как анализы проводятся вручную, результаты анализа могут отличаться в зависимости от конкретного лица, проводившего анализ.
Тем не менее, есть необходимость ускорить и упростить существующие автоматизированные способы определения посчитанного числа тромбоцитов, чтобы проводить анализ для ухода за пациентом.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является создание простого анализа для проведения объемного подсчета тромбоцитов. Дополнительной задачей изобретения является создание быстрого анализа без необходимости использования сложной аппаратуры или дорогостоящей подготовки пробы.
Поставленные задачи частично или полностью достигаются путем создания устройства для сбора данных о пробе, а также способа и системы согласно независимым пунктам формулы изобретения. Предпочтительные варианты воплощения очевидны из зависимых пунктов формулы.
Таким образом, предусмотрено устройство для сбора данных о пробе для объемного подсчета тромбоцитов в пробе крови. Устройство для сбора данных о пробе содержит измерительную полость для приема пробы крови. Измерительная полость имеет заранее заданную фиксированную толщину. Устройство для сбора данных о пробе дополнительно содержит реагент, который размещен в сухой форме на поверхности, определяющей измерительную полость, причем указанный реагент содержит гемолизирующее средство для лизиса (растворения) красных кровяных клеток в пробе крови и произвольно подобранный краситель для избирательного окрашивания тромбоцитов в пробе крови.
Устройство для сбора данных о пробе дает возможность напрямую получать пробу цельной крови в измерительной полости и осуществлять ее анализ. Нет никакой необходимости в подготовке пробы. В действительности пробу крови можно засосать в измерительную полость прямо из проколотого пальца пациента. Применение устройства для сбора данных о пробе с реагентом позволяет провести внутри этого устройства реакцию, которая делает пробу готовой к анализу. Реакция начинается, когда проба крови входит в контакт с реагентом. Таким образом, нет никакой необходимости в ручной подготовке пробы, что делает анализ особенно удобным, так как проводится прямо в кабинете для осмотра, пациент при этом ожидает.
Так как реагент используется в сухой форме, устройство для сбора данных о пробе можно транспортировать и хранить в течение длительного времени потери годности устройства к применению. Таким образом, устройство для сбора данных о пробе с реагентом может быть изготовлено и подготовлено задолго до проведения анализа пробы крови.
В то время как многие существующие способы позволяют считать различные кровяные клетки и даже подгруппы кровяных клеток, устройство для сбора данных о пробе согласно настоящему изобретению особо приспособлено для выполнения объемного подсчета тромбоцитов. Реагент содержит гемолизирующее средство, которое будет лизировать (растворять) в пробе крови красные кровяные клетки, но не тромбоциты. Это исключает возможности подсчета красных кровяных клеток в пробе. С другой стороны, лизис красных кровяных клеток упрощает возможность различать и идентифицировать тромбоциты в пробе крови. Также могут присутствовать некоторые неповрежденные белые кровяные клетки, но они будут мало сравнимы с тромбоцитами и легко отличимы от тромбоцитов по размеру и внешнему виду.
Произвольно подобранный краситель обеспечивает маркировку отдельных тромбоцитов. Это один способ обеспечить возможность отдельно рассматривать или обнаруживать тромбоциты.
Другой путь обеспечения возможности отдельно рассматривать или обнаруживать тромбоциты заключается в анализе с учетом фазового контраста, предпочтительно через микроскоп с использованием метода фазового контраста. Также можно использовать краситель в сочетании с рассмотрением фазового контраста. Тромбоциты можно обнаружить, например, путем сканирования полости для измерения или получения изображения полости для измерения. Подсчет тромбоцитов может быть выполнен суммированием количества отдельно обнаруженных тромбоцитов в заданном объеме.
Согласно изобретению предложен также способ объемного подсчета тромбоцитов в пробе крови. Способ содержит следующие шаги: сбор данных о пробе крови в полости для измерений устройства для сбора данных о пробе, причем указанная полость для измерений удерживает реагент, содержащий гемолизирующее средство и произвольно подобранный краситель для взаимодействия с пробой, так что тромбоциты окрашиваются; облучение содержащей тромбоциты пробы, получение цифрового изображения увеличенной облученной пробы в полости для измерений, при этом тромбоциты различают путем избирательного окрашивания и/или по фазовому контрасту, и цифровой анализ цифрового изображения для идентификации тромбоцитов и определения числа тромбоцитов в пробе.
Согласно изобретению дополнительно предложена система для объемного подсчета тромбоцитов в пробе крови. Система содержит устройство для сбора данных о пробе, как описано выше. Система дополнительно содержит измерительное устройство, содержащее держатель пробы для устройства для сбора данных о пробе, предназначенный для приема устройства, которое удерживает пробу крови в полости для измерений, и источник света для облучения пробы крови. Измерительное устройство дополнительно содержит систему для формирования изображения, содержащую систему для увеличения и средство для получения цифрового изображения для получения увеличенного цифрового изображения облученной пробы в полости для измерений, в которой тромбоциты различают за счет избирательного окрашивания красителем и/или по фазовому контрасту. Измерительное устройство также содержит анализатор изображения, предназначенный для анализа полученного цифрового изображения для выявления тромбоцитов и определения числа тромбоцитов в пробе крови.
Способ и система по изобретению обеспечивают очень простой анализ пробы крови для определения посчитанного числа тромбоцитов. Анализ не требует сложной измерительной аппаратуры или продвинутых шагов, которые должны быть предприняты оператором. Поэтому он может быть выполнен непосредственно при обследовании пациента без потребности в квалифицированном специалисте. В измерительном устройстве использованы свойства устройства для сбора данных о пробе для проведения анализа пробы неразбавленной, цельной крови, которая непосредственно подается в измерительную полость. Измерительное устройство обеспечивает отображение объема пробы для объемного подсчета тромбоцитов с одного изображения.
Проба крови смешивается с реагентом в полости для измерений. В течение нескольких минут реакции пробы крови с реагентом получают гемолизированные красные кровяные клетки, а если предусмотрен краситель, то окрашенные тромбоциты, после чего проба готова для оптического измерения. Проба крови может быть перемешана с реагентом, например, диспергированием, или диффузией реагента в пробу крови, или активной вибрацией, или приведением в движение устройства для сбора данных о пробе, что вызывает перемешивание в полости для измерений.
Устройство для сбора данных о пробе содержит корпус, имеющий две плоских поверхности для ограничения указанной полости для измерений. Плоские поверхности размещены на заранее заданном расстоянии друг от друга, чтобы устанавливать толщину пробы для оптического измерения. Это значит, что устройство для сбора данных о пробе предусматривает четко определенную толщину для оптического измерения, которую можно использовать для точного определения посчитанного числа тромбоцитов на единицу объема пробы крови. Объем анализируемой пробы будет точно установлен по толщине полости для измерений и поверхности пробы, с которой формируется изображение. Таким образом, точно установленный объем может быть использован для связывания числа тромбоцитов с объемом пробы крови, так что определяется посчитанное объемное число тромбоцитов.
Измерительная полость предпочтительно имеет равномерную толщину 50-170 микрон. Толщина, как минимум в 50 микрон, означает, что в измерительной полости проба крови не размазывается в монослой, и это позволяет анализировать большой объем крови при малой площади поперечного сечения. Таким образом, для получения надежных значений посчитанного числа тромбоцитов может быть проанализирован достаточно большой объем пробы крови при использовании относительно малого изображения пробы крови. Толщина в более предпочтительном варианте составляет, как минимум 80 микрон, что делает возможным проведение анализа при меньшей площади поперечного сечения или при большем объеме пробы. Кроме того, при толщине как минимум 50 мкм и, более предпочтительно, 80 микрон также упрощается изготовление измерительной полости, имеющей точно установленную толщину между двумя плоскими поверхностями.
Для большинства проб, помещенных в полость, имеющую толщину около 100 микрон, посчитанное число тромбоцитов может быть так велико, что будут иметь место отклонения из-за размещения тромбоцитов на верхних концах друг у друга. Однако влияние таких отклонений будет отнесено к посчитанному числу тромбоцитов и, таким образом, может быть отрегулировано посредством статистической коррекции результатов, по меньшей мере, для больших значений посчитанного числа тромбоцитов. Статистическая коррекция может быть основана на калибровках измерительной аппаратуры. Если толщину полости дополнительно уменьшить, например, до 50 мкм, то эта коррекция может быть менее сложной, но это может уравновешивать неблагоприятные эффекты при указанной выше малой толщине.
Кроме того, толщина полости для измерений достаточно мала, чтобы обеспечить получение цифрового изображения так, чтобы можно было проводить анализ на всю глубину измерительной полости одновременно. Так как в измерительном устройстве должна быть использована система увеличения, то непросто достичь большой глубины резкости пространственного изображения. Поэтому толщина измерительной полости, предпочтительно, не должна превышать 150 микрон, чтобы всю толщину можно было одновременно анализировать в цифровом изображении. Глубина резкости пространственного изображения может быть установлена, чтобы регулировать толщину полости для измерений до 170 микрон.
Цифровое изображение может быть получено при глубине резкости, которая, по меньшей мере, соответствует толщине измерительной полости. Выражение «глубина резкости» означает длину в направлении вдоль оптической оси, которая изображена в достаточном фокусе, чтобы обеспечить анализ изображения для выявления клеток, размещенных в пределах этой длины. Эта «глубина резкости» может быть больше обычной глубины резкости, определяемой положениями оптических элементов.
Так как цифровое изображение получают при глубине резкости пространственного изображения, которая соответствует, по меньшей мере, толщине измерительной полости, то достигается достаточный фокус по всей толщине пробы, так что проба в измерительной полости может быть одновременно проанализирована на всю толщину в цифровом изображении пробы. Не следует делать очень резкий фокус на особой части пробы, достаточно получить хороший фокус для всей толщины пробы, чтобы идентифицировать количество тромбоцитов в пробе. Это означает, что тромбоцит может быть несколько расплывчатым и, тем не менее, может считаться находящимся в фокусе глубины резкости пространственного изображения.
Реагент, содержащий гемолизирующее средство и, в частности, краситель, может быть введен в измерительную полость устройства для сбора данных о пробе и растворен или суспендирован в жидкости. Реагент может быть потом переведен в сухую форму (порошок) испарением при комнатной температуре и давлении или активирован нагреванием или вакуумированием, или лиофилизированием. Если реагент должен быть выпарен при комнатной температуре и давлении или при нагревании, то его предпочтительно следует растворить или суспендировать в летучей жидкости, такой как метанол.
Реагент, включающий все эти компоненты, согласно настоящему изобретению, предпочтительно является растворимым и/или суспендируемым в жидкой пробе, которая должна быть проанализирована, и, предпочтительно, предназначен оставаться в растворе/суспензии в течение всего анализа. Поскольку, как указано выше, способ подобран для детектирования тромбоцитов по всей толщине измерительной полости и нет никакой необходимости выводить или связывать тромбоциты с поверхностью наблюдения, то также нет необходимости связывать тромбоциты или в любом другом случае избегать растворения/суспендирования реагента или любого другого компонента этого реагента. В противоположность этому использование растворимого/суспендируемого реагента, предпочтительно, легкорастворимого/суспендируемого реагента способствует смешению реагента с жидкой пробой и ускоряет любые реакции между реагентом и жидкой пробой, включая тромбоциты, которые должны быть посчитаны.
Произвольно выбранный краситель может быть предназначен для селективного окрашивания мембраны, цитоплазмы, гранул или любой другой части тромбоцитов или их сочетания. Это значит, что тромбоциты могут быть выявлены в виде цветных точек и поэтому легко посчитаны в цифровом изображении.
TM
Произвольно выбранный краситель может являться одним из группы метиленового голубого, эозин метиленового голубого, азур эозин метиленового голубого, Plaxan, хематоксилина, метиленового зеленого, толуидинового голубого, гентианового фиолетового, аналогов судана, галлоцианина и аналогов фуксина. Однако следует принять во внимание, что краситель не ограничен этой группой, и можно использовать много других веществ. Предпочтительно выбранный краситель представляет собой эозин метиленовый голубой или азур эозин метиленовый голубой.
Гемолизирующее средство может представлять собой соль четвертичного аммония, сапонин, желчную кислоту, такую как диоксихолат, дигитоксин, змеиный яд, глюкопиранозид или неиноногенное моющее средство типа Тритона. Однако следует принять во внимание, что гемолизирующее средство не ограничено этой группой, и можно использовать много других веществ. Предпочтительно гемолизирующее средство представляет собой сапонин.
Устройство для сбора данных о пробе может дополнительно содержать вход пробы (впускное отверстие), связывающий измерительную полость с внешней стороной указанного устройства, причем указанный вход предназначен для приема пробы крови. Вход пробы может быть предназначен для втягивания пробы крови под действием капиллярной силы, а полость для измерений может дополнительно втягивать кровь из входа пробы. В результате проба крови может быть легко собрана в измерительной полости путем простого приведения входа пробы в контакт с кровью. Тогда капиллярные силы и измерительная полость будут втягивать внутрь полости точно определенное количество крови. Кроме того, пробу крови можно всасывать или проталкивать в измерительную полость посредством приложения к устройству для сбора данных о пробе внешней накачивающей силы. Согласно другой альтернативе пробу крови можно набрать в пипетку и затем вводить в измерительную полость с помощью пипетки.
Устройство для сбора данных о пробе может быть одноразовым, т.е. пригодным для использования только один раз. Устройство для сбора данных о пробе содержит набор для выполнения подсчета тромбоцитов, так как устройство может принимать пробу крови и содержит все реагенты, необходимые для подачи образца для подсчета клеток. Это возможно, так как устройство для сбора данных о пробе предназначено для использования только один раз и может быть изготовлено без учета возможностей его очистки и повторного применения реагента. Также устройство для сбора данных о пробе может быть сформовано из пластичного материала и поэтому по более низким расценкам. Таким образом, эффективно использовать одноразовое устройство для сбора данных о пробе.
Если используют краситель, пробу можно облучать светом с длиной волны, соответствующей пику поглощения красителя. Следовательно, окрашенные тромбоциты, которые содержат накопления красителя, будут обнаружены при низком коэффициенте пропускания света.
В этом случае облучение может быть произведено с помощью лазерного источника. Лазерный источник может давать излучение строго определенной длины волны, соответствующей поглощению красителя. Кроме того, лазерный источник дает направленное излучение, сводя к минимуму возмущения рассеянного светового излучения, так что точка низкого коэффициента светопропускания будет четко различима.
Кроме того, облучение может быть произведено с помощью светоизлучающего диода. Этот источник света, более того, может обеспечить достаточные условия облучения, чтобы правильно отличать тромбоциты от другого материала в пробе.
Кроме того, особенно в случае использования метода фазового контраста для облучения пробы может быть использована вольфрамово-галоидная лампа.
Цифровое изображение может быть получено при использовании силы увеличения 3-200х, более предпочтительно 4-20х. В этих пределах силы увеличения увеличение тромбоцитов достаточно для их обнаружения, тогда как глубина резкости пространственного изображения может быть подобрана так, чтобы она перекрывала толщину пробы. Низкая сила увеличения означает, что может быть достигнута большая глубина резкости пространственного изображения. Однако если используют низкую силу увеличения, тромбоциты могут трудно поддаваться обнаружению. Более низкая сила увеличения может быть использована при увеличении числа пикселей (минимальных элементов изображения) в полученном изображении, т.е. при улучшении разрешающей способности цифрового изображения.
Одна альтернатива состоит в том, чтобы использовать фазовый контрастный микроскоп при использовании фазового сдвига, являющегося результатом какого-то облучения светом сталкивающихся мембран и других структур пробы крови. В этом случае тромбоциты анализируемой пробы крови будут появляться в виде светлых блестящих точек с темной периферией.
Анализ включает в себя выявление областей высокого светопоглощения в цифровом изображении. Анализ может дополнительно включать в себя выявление черных или темных точек в цифровом изображении или, при использовании фазового контраста (с весьма высоким увеличением), выявление темных колец, соответствующих периферии тромбоцита.
Анализ может дополнительно включать в себя электронное увеличение полученного цифрового изображения. В то время как пробу увеличивают для получения ее увеличенного цифрового изображения, полученное цифровое изображение само по себе может быть увеличено электронным способом для упрощения проведения различий между объектами, которые находятся очень близко друг к другу в полученном цифровом изображении.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
В дальнейшем изобретение будет пояснено подробно в описании предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на сопровождающие чертежи, на которых:
фиг.1 изображает схему устройства для получения данных о пробе согласно изобретению;
фиг.2 - схему устройства для получения данных о пробе согласно другому варианту воплощения изобретения;
фиг.3 - схему измерительного устройства согласно изобретению;
фиг.4 - последовательность операций способа согласно изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Устройство 10 (фиг.1) для получения данных о пробе согласно изобретению является одноразовым и должно быть уничтожено после использования. Это значит, что устройство 10 для получения данных о пробе не требует сложного обращения. Устройство 10 для получения данных о пробе в предпочтительном варианте выполнено из пластичного материала и может быть изготовлено путем формования литьем под давлением. Это делает изготовление устройства 10 для получения данных о пробе простым и дешевым, вследствие чего можно снизить цену.
Устройство 10 для получения данных о пробе содержит корпус 12, имеющий основание 14, к которому может прикасаться оператор, не производя какого-либо вмешательства в результаты анализа. Основание 14 может также иметь выступы 16, что позволяет вставлять держатель в анализатор (аналитическую аппаратуру). Выступы 16 могут быть пригнаны так, что устройство 10 для получения данных о пробе было правильно размещено в анализаторе.
Устройство 10 для получения данных о пробе дополнительно содержит вход 18 пробы (загрузочное отверстие для пробы). Вход 18 пробы расположен между противоположными стенками внутри устройства 10 для получения данных о пробе, причем стенки расположены так близко друг к другу, что во входе 18 создавалась капиллярная сила. Вход 18 сообщается с внешней стороной устройства 10 для получения данных о пробе, чтобы обеспечить возможность засасывания крови в устройство. Устройство 10 для получения данных о пробе дополнительно содержит измерительную полость 20, которая находится между противоположными стенками внутри устройства. Измерительная полость 20 расположена так, что сообщается с входом 18 пробы. Стенки, задающие границы измерительной полости 20, расположены ближе друг к другу, чем стенки входа пробы, так что капиллярная сила может засасывать кровь из входа 18 пробы в измерительную полость 20.
Стенки измерительной полости 20 расположены на расстоянии 50-170 микрон друг от друга, а более предпочтительно, на расстоянии 80-150 микрон. Расстояние является одинаковым для всей измерительной полости 20. Толщина измерительной полости 20 определяет исследуемый объем крови. Так как результат анализа предстоит сравнить с объемом исследуемой пробы крови, то толщина измерительной полости 20 должна быть очень точной, т.е. внутри измерительной полости 20 и между различными измерительными полостями различных устройств 10 для получения данных о пробе допустимы только очень малые изменения толщины. Толщина позволяет анализировать относительно большой объем пробы при малой площади поверхности полости. Толщина теоретически позволяет тромбоцитам располагаться на верхних концах друг у друга внутри измерительной полости 20, но это может поясняться статистической моделью.
Поверхность стенки измерительной полости 20, по меньшей мере, частично покрыта реагентом 22. Реагент 22 можно высушить замораживанием, нагревом или вакуумом и нанести на поверхность измерительной полости 20, кровь будет входить в контакт с реагентом 22 и инициировать реакцию между ней и этим реагентом.
Реагент 22 наносят путем введения (помещения) его в измерительную полость 20 при использовании пипетки или дозатора. При введении в измерительную полость 20 реагент 22 растворен в воде или органическом растворителе. Растворитель может заполнять измерительную полость 20 вместе с реагентом 22. Потом производят высушивание, так что растворитель будет испаряться, а реагент 22 будет прилипать к поверхностям измерительной полости 20.
Согласно альтернативному способу изготовления устройство 10 для получения данных о пробе можно сформулировать путем прикрепления двух частей друг к другу, посредством чего одна часть образует нижнюю стенку (дно), а другая часть образует верхнюю стенку измерительной полости 20. Это позволяет реагенту 22 высохнуть на открытой поверхности перед прикреплением двух частей друг к другу.
TM
Реагент 22 содержит гемолизирующее средство и произвольно подобранный краситель. Гемолизирующее средство может представлять собой соль четвертичного аммония, сапонин, желчную кислоту, такую как деоксихолат, дигитоксин, змеиный яд, глюкопиранозид или неиноногенное моющее средство типа Тритона, предпочтительно, сапонин. Краситель, если он используется, может представлять собой метиленовый голубой, эозин метиленовый голубой, азур эозин метиленовый голубой, Plaxan, хематоксилин, метиленовый зеленый, толуидиновый голубой, гентиановый фиолетовый, аналоги судана, галлоцианин или аналог фуксина. Когда проба крови входит в контакт с реагентом 22, гемолизирующее средство будет действовать так, чтобы лизировать (растворять) красные кровяные клетки, так что эти клетки смешиваются с плазмой крови. Кроме того, краситель в случае его использования, может накапливаться в тромбоцитах, например в их мембранах. В случае использования красителя реагент 22 должен содержать достаточные количества этого красителя, чтобы отчетливо окрашивать все тромбоциты. Таким образом, краситель, который будет смешиваться с плазмой крови, часто будет в избытке. Избыток красителя даст однородный и низкий уровень фона красителя в плазме крови. Накопленный в тромбоцитах краситель будет различим на уровне фона красителя.
Реагент 22 может также содержать другие составляющие, которые могут быть активными, т.е. принимать участие в химической реакции с пробой крови, или неактивными, т.е. не принимать участия в этой реакции. Активные составляющие могут быть включены, например, для катализа гемолизирующего или окрашивающего действия. Неактивные составляющие могут быть включены, например, для улучшения присоединения реагента 22 к поверхности стенки измерительной полости 20.
В течение нескольких минут проба крови будет реагировать с реагентом 22, так что красные кровяные клетки лизируются, и краситель в случае его использования накапливается в тромбоцитах.
Другой вариант воплощения устройства для получения данных о пробе будет описан со ссылкой на фиг.2. Устройство 110 для получения данных о пробе содержит камеру 120, образующую измерительную полость. Устройство 110 для получения данных о пробе имеет вход 118 (загрузочное отверстие) в камеру 120 для подачи крови в камеру 120. Камера 120 подсоединена к насосу (не показан) через всасывающий шланг 121. Насос может прикладывать силу всасывания к камере 120 через всасывающий шланг 121, так что кровь может засасываться в камеру 120 через вход 118. Устройство 110 для получения данных о пробе может быть отсоединено от насоса перед проведением измерения. Как и измерительная полость устройства для получения данных о пробе, камера 120 имеет строго определенную толщину, задавая этим толщину исследуемой пробы. Кроме того, на стенки камеры 120 нанесен реагент 122 для взаимодействия с пробой крови.
Устройство 30 (фиг.3) для объемного подсчета тромбоцитов содержит держатель 32 пробы для размещения устройства 10 для получения данных о пробе с пробой крови. Держатель 32 пробы предназначен для установки устройства 10 для получения данных о пробе, так что измерительная полость 20 устройства 10 для получения данных о пробе расположена соответствующим образом внутри устройства 30. Устройство 30 содержит источник 34 света для освещения пробы крови внутри устройства 10 для получения данных о пробе. Источник 34 света может представлять собой лампу накаливания, которая излучает свет во всей видимой области спектра.
Если используется краситель, то, будучи накопленным в тромбоцитах, этот краситель будет поглощать свет определенных длин волн, так что тромбоциты будут появляться в цифровом изображении пробы. Если получено цветное изображение, то тромбоциты будут появляться в виде характерно окрашенных точек. В случае получения черно-белого изображения тромбоциты будут появляться в виде темных точек на более светлом фоне.
Если используется прием фазового контраста, то не нужно никакого окрашивания, хотя может быть практичным окрасить каким бы то ни было образом, чтобы далее способствовать обнаружению тромбоцитов, и тромбоциты будут появляться в виде светлых точек с темной периферией.
Кроме того, источником 34 света (излучения) может быть лазер или светоизлучающий диод. Это может быть использовано для увеличения контрастности изображения, так что тромбоциты могут быть легко обнаружены. В этом случае источник 34 света обеспечивает электромагнитное излучение с длиной волны, которая соответствует пику поглощения красителя. Длина волны должна быть дополнительно выбрана так, чтобы поглощение составных частей крови было относительно низким. Кроме этого, устройство для получения данных о пробе должно быть, по существу, прозрачным по отношению к используемой длине волны. Например, если в качестве красителя используют метиленовый голубой, то источник 34 света может быть подобран так, чтобы излучать свет с длиной волны 667 нм.
Устройство 30 дополнительно содержит систему 36 формирования изображения, которая расположена на противоположной стороне держателя 32 пробы по отношению к источнику 34 света. Таким образом, система 36 формирования изображения предназначена для приема излучения, которое пропущено через пробу крови. Система 36 формирования изображения содержит систему 38 увеличения и средство 40 получения изображения. Система 38 увеличения предназначена для обеспечения силы увеличения 3-200х, более предпочтительно 4-20х. В пределах этих диапазонов силы увеличения можно различать тромбоциты. Кроме того, глубина резкости пространственного изображения системы 38 увеличения может быть подобрана так, чтобы соответствовать, по меньшей мере, толщине измерительной полости 20.
Система 38 увеличения содержит объектив или систему 42 линз, которая расположена близко к держателю 32 пробы, и окуляр или систему 44 линз, которая расположена на расстоянии от объектива 42. Объектив 42 обеспечивает первое увеличение пробы, которое дополнительно увеличивается окуляром 44. Система 38 увеличения может содержать дополнительные линзы для достижения подходящего увеличения и формирования изображения пробы. Система 38 увеличения расположена так, что проба в измерительной полости 20 при размещении в держателе 32 пробы будет сфокусирована на фокальной плоскости средств 40 получения изображения.
Если в измерительную аппаратуру (фиг.3) включен микроскоп фазового контраста, то между источником 34 света и держателем пробы 32 размещен конденсатор, причем кольцевой зазор конденсатора расположен между источником 34 света и держателем 32 пробы, то фазовая плоскость расположена между объективом 42 и средством 40 получения изображения.
Средство 40 получения изображения предназначено для получения цифрового изображения пробы. Средство 40 получения изображения может представлять собой любой вид цифровой камеры, например CCD-камера. Размер пикселя цифровой камеры накладывает ограничение на систему 36 формирования изображения, так что пятно рассеяния в фокальной плоскости не может превышать размера пикселя в пределах глубины резкости пространственного изображения. Цифровая камера 40 будет получать цифровое изображение пробы в измерительной полости 20, в которой вся толщина пробы подходящим образом сфокусирована в цифровом изображении для подсчета тромбоцитов. Система 36 формирования изображения будет определять поверхность измерительной полости 20, которая будет отображена в цифровом изображении. Поверхность, отображаемая вместе с толщиной измерительной полости 20, определяет объем отображаемой пробы. Система формирования 36 изображения установлена так, чтобы подходить по размеру отображаемым пробам крови в устройствах 10 для получения данных о пробе. Нет никакой необходимости менять настройку системы 36 формирования изображения. Предпочтительно размещать указанную систему в кожухе (оболочке) так, чтобы настройка случайно не сбилась.
Устройство 30 дополнительно содержит анализатор 46 изображения. Анализатор 46 изображения подключен к цифровой камере 40 для приема цифровых изображений, полученных цифровой камерой 40. Анализатор 46 изображения предназначен для идентифицирования промежуточных оригиналов в цифровом изображении, которые соответствуют тромбоциту, для расчета количества тромбоцитов, представленных в цифровом изображении. Таким образом, анализатор 46 изображения может обеспечить идентификацию черных точек на более светлом фоне. Анализатор 46 изображения может обеспечить первое электронное увеличение цифрового изображения перед анализом цифрового изображения. Это значит, что анализатор 46 изображения может обеспечить более легкое различение тромбоцитов, которые отображены близко друг к другу, даже несмотря на то, что электронное увеличение цифрового изображения сделает его несколько размытым.
Анализатор 46 изображения может подсчитать количество тромбоцитов на единицу объема крови делением количества тромбоцитов, идентифицированных в цифровом изображении, на объем пробы крови, который четко определен, как описано выше. Объемный подсчет тромбоцитов может быть представлен на дисплее устройства 30.
Анализатор 46 изображения может быть реализован в виде блока обработки данных, который содержит коды для проведения анализа изображения.
Последовательность этапа способа объемного подсчета тромбоцитов показана на фиг.4. Способ заключается в том, что помещают пробу крови в устройство для сбора данных о пробе (этап 102). В устройство для сбора данных о пробе помещают неразбавленную пробу цельной крови. Проба может быть получена из капиллярной или венозной крови. Проба капиллярной крови может быть затянута в измерительную полость прямо из проколотого пальца пациента. Проба крови входит в контакт с реагентом в устройстве для сбора данных о пробе, вызывая реакцию. Красные кровяные клетки будут лизированы (растворены), а краситель накапливается в тромбоцитах. В течение нескольких минут после получения пробы крови эта проба готова к анализу. Устройство для сбора данных о пробе размещают в анализаторе (этап 104). Анализ может быть запущен нажатием кнопки анализатора. Кроме того, анализ автоматически запускается при обнаружении анализатором наличия устройства для сбора данных о пробе.
Пробу облучают (этап 106) и получают цифровое изображение с увеличением пробы (этап 108). Пробу облучают электромагнитным излучением с длиной волны, соответствующей пику поглощения красителя. Это значит, что цифровое изображение будет содержать черные или более темные точки в положениях тромбоцитов.
Полученное цифровое изображение переносят в анализатор изображения, который производит анализ по изображению (этап 110) для подсчета числа черных точек в цифровом изображении.
9
Представленные здесь способ и устройство могут, например, быть использованы для подсчета приблизительно 25000 тромбоцитов, который дает более твердую статистическую уверенность в полученных результатах. Нормальный здоровый взрослый человек имеет посчитанное число тромбоцитов около 250×10 тромбоцитов на литр крови. Это означает, что в пробах, имеющих объем около 0,1 мкл найдено 25000 тромбоцитов. Например, если в измерительной полости, имеющей толщину 100 мкм, отображена поверхность 1,0×1,0 мм, то отображаемый объем составляет 0,10 мкл. Часть полученного изображения может быть отобрана для анализа. Таким образом, полученное изображение может быть, прежде всего, грубо проанализировано, чтобы не допустить никаких аномалий в той его части, которая используется для определения посчитанного числа тромбоцитов. Часть полученного изображения, используемая (отобранная) для анализа, может быть выбрана так, чтобы иметь соответствующий размер, так что будет проанализирован достаточный объем пробы крови.
Следует подчеркнуть, что описанные здесь предпочтительные варианты воплощения не ограничивают изобретение, и возможно много альтернативных воплощений в пределах объема правовой охраны, установленного приложенной формулой изобретения.