СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БУТАНОЛА
METHOD OF OBTAINING BUTANOL

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения органических растворителей - бутанола, ацетона и этанола путем биосинтеза углеводсодержащих материалов.
Наиболее ценным из указанных органических растворителей является бутанол.
Бутанол - это дорогостоящий органический растворитель, широко применяется при изготовлении нитролаков и масляных лаков, в производстве сложных растворителей, синтетической резины и шелка, при экстрагировании фармацевтических препаратов, служит сырьем для производства практически всех пластмасс и их растворителей, поэтому на рынке химических реактивов и веществ имеет постоянно большой спрос.
Органические растворители используются во многих отраслях промышленности, а также могут быть использованы в качестве биотоплива.
4
9
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
Бутиловый спирт (бутанол) СНOН - бесцветная жидкость с характерным запахом сивушного масла. Известны нормальный первичный бутиловый спирт СН(СН)ОН, нормальный вторичный бутиловый спирт СНСНСН(ОН)СН, изобутиловый спирт (СН)СНСНOН, триметилкарбинол (СН)СОН.
В промышленности бутанол получают оксосинтезом из пропилена с использованием никель-кобальтовых катализаторов при 130-150°С и давлении 20-35 МПа.
Бутанол начали производить в 10-х годах XX века микробиологическим путем с использованием бактерии Clostridium acetobutylicum. Сырьем для производства была глюкоза сахарного тростника, свеклы, кукурузы, пшеницы, маниоки.
Известно, что бактерии Clostridium acetobutylicum при сбраживании различных углеводов синтезируют одновременно три целевых продукта: бутанол, ацетон и этанол, процентное соотношение которых примерно 60:30:10 (соответственно). Это соотношение не является строго постоянным и может изменяться в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения, в зависимости от свойств штамма-продуцента, от особенностей технологии, видов сбраживаемого сырья.
Так, при культивировании на мучных средах различные штаммы Clostridium acetobutylicum синтезируют общее количество растворителей, составляющие 18-19 г/л, в том числе 11-12 г/л бутанола и 4-5 г/л ацетона. Кроме того, на средах из муки обязательно синтезируется 1,5-2,5 г/л этанола (Корнеева О.С. Жеребцов Н.А. и др. Роль амилолитических ферментов Clostridium acetobutylicum в биосинтезе растворителей, Биотехнология, 1986 г., №3, стр.133-136).
Известен способ повышения выхода растворителей при культивировании бактерий Clostridium acetobutylicum на мучных средах за счет предварительного разжижения крахмала рециркулируемой бражкой, содержащей активные амилолитические ферменты. При этом общий выход растворителей достигает 19 г/л, а время брожения сокращается на 9 ч (SU 1604852).
Совершенствования известных отечественных технологий в ацетоно-бутиловом производстве касались, как правило, создания приемов с целью повышения выхода целевых продуктов, главным образом, бутанола, как наиболее ценного продукта.
При этом сбраживаемым сырьем традиционно была мука - пшеничная, кукурузная, реже ржано-пшеничная, т.е. пищевое крахмалистое сырье. Следует учесть также, что производственный штамм на отечественных предприятиях, вырабатывающих бутанол и ацетон методом брожения, был фактически один предложенный при вводе первого ацетоно-бутилового завода страны- Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4361.
Результаты исследований отечественных ученых (Логоткин И.С. Технология ацетоно-бутилового брожения. - М., 1958 г., с.144-153) позволили перевести ацетоно-бутиловое производство на смешанное сырье - муку и мелассу, как новый способ, предусматривающий снижение расхода пищевого сырья - муки и замену на непищевое сырье - мелассу.
Отечественные работы по использованию иных видов сырья, в частности, древесных гидролизатов (Яровенко В.Л. и др. «Непрерывное брожение в ацетоно-бутиловом производстве», Нальчик, 1962 г.), получаемых кислотным гидролизом, были частью основного направления исследований этого коллектива, и касались разработки способа непрерывного ацетоно-бутилового брожения, с использованием уже упомянутого производственного штамма бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В -4361. Промышленного применения эти работы не нашли, но с появлением нового вида сырья появились разработки по созданию новых штаммов-продуцентов бутанола и ацетона (SU №1604852, 1988).
В настоящее время самыми многочисленными являются работы, связанные с повышением выхода бутанола как конечного продукта, а также с поиском новых микроорганизмов и конструированию штаммов, накапливающих максимальное количество бутанола при переработке воспроизводимых источников сырья.
Известен способ производства бутанола с использованием нового штамма термофильных бактерий Сl. thermosaccharolyticum, сбраживающего глюкозу, целлюлозу, мальтозу, целлобиозу при 55-62°С с повышенным выходом бутанола; при этом брожение идет в течение 1-4 дней, питательная среда содержит источник азотного и органического питания, неорганические соли. С целью повышения выхода бутанола в среду при выращивании штамма вносят 0.1-1.0 часть (вес.) бутанола (JP 61209594).
Известен способ производства бутанола с использованием нового мутантного штамма Clostridium beijerinckii BA101 (WO 9851813), обеспечивающего высокий выход бутанола, который составляет от 18 до 21 г/л при батарейном или непрерывном брожении.
Известен способ производства бутанола с использованием нового мутантного штамма Clostridium pasteurianum CA 101, полученный ферментацией в анаэробных условиях в среде азота при 37°С в течение 12 часов, при отделении клеток центрифугированием и с обработкой мутагеном N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином с последующим культивированием в среде, содержащей кротониловый спирт; полученный мутантный штамм имеет высокую резистентность к кротониловому спирту и высокую продуктивность по бутанолу (JP 3058782).
В приведенных выше источниках содержатся данные, как правило, о немногочисленных источниках, сбраживаемых этими штаммами.
В условиях поиска возобновляемых источниках сырья, главным образом не пищевого, растительного происхождения, расширенный ряд сбраживаемых углеводов при использование штамма в качестве продуцента, становятся весьма актуальным. Одним из критериев оценки эффективности штамма становится возможность сбраживания как можно большего числа углеводов и универсальность в усвоении соединений азота. Сам способ получения бутанола надлежит оценивать как последовательность технологических операций:
- сбраживание расширенного ряда углеводов,
- максимальное накопление бутанола,
- экономичный по энергозатратам способ выделения конечного продукта из сброженной питательной среды.
Наиболее близким к предложенному является способ получения бутанола с использованием штамма бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 5359 (S-3716). (Патент RU №2080382).
Способ осуществляют следующим образом: штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 5359 (S-3716) пастеризуют в кипящей воде 1 мин, суспензию спор помещают для оживления на картофельно-глюкозную среду. Приготовленную питательную среду помещают в бродильную емкость, стерилизуют при 120°С в течение 40 мин и охлаждают до температуры 36°С. Туда же вносят посевной материал (суспензию спор нового штамма) в количестве 0,01 л (или 2% от объема сбраживаемой среды) и процесс брожения ведут при температуре 36°С в течение 18-20 ч до получения культуры в экспоненциальной фазе роста. Затем вегетативным посевным материалом засевают ферментационную среду, содержащую свеклосахарную мелассу, рН среды 6,2. Приготовленную ферментационную среду помещают в аппарат для анаэробного сбраживания, стерилизуют при 0,8 атм в течение 20 мин, затем сразу охлаждают до температуры 36°С. После этого туда же вносят вегетативный посевной материал штамма бактерий Clostridium acetobutylicum и процесс брожения ведут при температуре 36°С в течение 36-40 ч до окончания процесса брожения. В культуральной жидкости определяют содержание н-бутанола и ацетона методом газовой хроматографии и величину несброженных сахаров.
К недостаткам известного способа следует отнести использование в качестве предлагаемого сырья для сбраживания - свеклосахарной мелассы, поскольку в настоящее время меласса является основным сырьем в пищевой промышленности при получении хлебопекарских дрожжей, в производстве кормового белка для животноводства. Возможность сбраживания широкого спектра углеводов указанным штаммом не описана. Эти обстоятельства значительно сокращают применение способа. Следует отметить, что штамм, используемый в описываемом способе, получен с помощью химических мутагенов, поэтому существует значительная степень риска при его использовании в производстве из-за вероятности расщепления мутанта и потери ценных свойств.
Технической задачей настоящего изобретения является создание способа получения бутанола, обеспечивающего высокий от сброженных углеводов выход бутанола и возможность использования широкого спектра углеводов, получаемых, например, при переработке отходов деревообрабатывающей промышленности, или отходов молочной промышленности.
Для решения этой задачи предложен способ получения бутанола, включающий подготовку углеводсодержащего сырья, культивирование на питательной среде с помощью бактерий, отгонку органических растворителей и газов и выделение целевого продукта, характеризующийся тем, что используют штамм бактерий Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D.
Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН.
Штамм имеет следующие культурально-морфологические и физиологические признаки.
Морфология клеток:
Вегетативные клетки бактерий с хорошей подвижностью, крупные палочковидные, одиночные или попарно, короткими цепочками, в зависимости от стадии развития культуры. Окраска по Граму положительная. Образуют эндоспоры. Тип образования спор бацилярный, споры овальные, диаметр 2-2.5 мкм.
Размер клеток: на 5-8 часу роста d=1.3-1.5 мкм, цепочки, длинные палочки, l=12-20 мкм; на 20-32 часу роста d=1.3-1.5 мкм, подвижные палочки (иногда попарно) 1=5-8 мкм.
Культурально-морфологические признаки на разных питательных средах
Агаризованная картофельная среда с глюкозой.
Через 48 часов роста в анаэробных условиях образует круглые гладкие с ровными краями колонии размером от 1.0 до 2.0-2.2 мм.
Структура колоний однородная, цвет - от светло-серого до белого, непрозрачные, поверхность гладкая, блестящая.
Среда мелассно-мучная.
Через 48 часов роста в анаэробных условиях образует круглые гладкие колонии размером от 1.0 до 2.0 мм, края ровные, структура однородная, цвет серо-белый, прозрачные, блестящие, выпуклые.
Среда с ферментолизатом древесных опилок и добавками.
Через 48 часов роста в анаэробных условиях при 37°С образует колонии размером до 1.0 мм, белые, непрозрачные, круглые, края ровные, поверхность блестящая.
Физиолого-биохимические признаки:
Облигатный гетеротрофный анаэроб.
Желатину разжижает.
На мясо-пептонном агаре (посев уколом) - слабый рост, разрывает газами брожения.
Отношение к источникам углерода.
Сбраживает: крахмал, мальтозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, ксилозу, галактозу, маннит, маннозу, арабинозу, лактозу, декстрин, целлобиозу.
Не сбраживает: раффинозу, дульцит.
Отношение к источникам азота:
Усваивает соединения азота в восстановленной форме.
Отношение к источникам фосфора:
Усваивает соединения фосфора.
Потребность в факторах роста:
Необходимы: биотин и парааминобензойная кислота.
Отношение к температуре:
Растет при температуре 30-38°С, оптимум 36-37°С.
Растет при значениях рН 4.5-7.0, оптимальные значения рН 5.5-6.5.
Хранение штамма - в виде спор на жидкой питательной среде картофельно-глюкозной, на мелассно-мучной, на среде с ферментолизатом древесных опилок в лиофилизированном состоянии.
Хранение в запаянных стеклянных пробирках при температуре от плюс 4°С до плюс 25°С.
При этом культивирование штамма Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D ведут в среде и условиях, благоприятных для его роста.
Для приготовления питательной среды в качестве сырья могут быть использованы отходы деревоперерабатывающей промышленности, подвергаемые предварительной обработке. Это может быть измельчение древесной щепы и ее ферментолиз с выделением в раствор простых сахаров - гексоз и пентоз.
При этом питательная среда имеет следующий состав:
ферментолизат хвойно-лиственных опилок - 2,85 л
(соотношение глюкоза: ксилоза - 8:2-4:6
концентрация сбраживаемых углеводов - 4-6%)
автолизат кормовых дрожжей - 3 г/л
биотин - 0,5-3 мкг/л
парааминобензойная кислота - 0,003 г/л
Для приготовления питательной среды в качестве сырья может быть использована лактоза молочной сыворотки - отхода молочной промышленности и сыроварения.
Выделение целевого продукта может осуществляться одним из известных способов, например, дистилляцией, адсорбцией, с помощью мембран. Способ осуществляют следующим образом:
В ферментер, содержащий раствор минеральных солей, необходимый набор витаминов и один из следующих источников углеводов:
- глюкозу,
- маннозу,
- ксилозу,
- галактозу
- ферментолизат не пищевых полисахаридов растений, содержащий глюкозу, маннозу, ксилозу, арабинозу, отделенных от остатков древесины - лигнина, или
- лактозу молочной сыворотки,
в концентрации 2-4%.
9
Вносят инокулят бактерий Clostridium acetobutylicum, с плотностью клеток 1-2 млрд/мл. Через 30 мин после засева начинается интенсивное выделение газов брожения, через 5-6 часов синтез органических кислот и на 10-12 часах - интенсивный синтез органических растворителей, скорость которого достигает максимума к 28-36 часу. В это время концентрация клеток бактерий в аппарате также максимальна - 3·10 кл/мл суспензии. В это же время начинают удаление растворителей до уровня 0,2% содержания бутанола и одновременную подачу в аппарат раствора углеводов и минеральных солей, поддерживая концентрацию углеводов в аппарате в пределах 0,8-1,2%.
Пример 1. Получение бутанола с использованием заявляемого способа на питательной среде, содержащей в качестве источника углеводов ферментолизат хвойно-лиственных опилок.
3
4
2
4
Штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в виде спор в запаянной пробирке, пастеризуют на кипящей водяной бане в течение 1 минуты. Суспензией спор инокулируют 150 мл стерильной жидкой картофельно-глюкозной среды, имеющей следующий состав: картофель-37 г/л, глюкоза-0,75 г/л, СаСО - 0,3 г/л, (NN)SO - 0,225 г/л, рН - 6,2, стерилизуют 40 мин при 120°С. Выращивание ведут в термостате при 37°С.
Через 12 часов роста при 36,5°С (экспоненциальная фаза роста бактерий) полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулируют стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 литра (полезная емкость 3 литра).
Состав среды: ферментолизат хвойно-лиственных опилок - 2,85 л (соотношение глюкоза: ксилоза - 8:2, концентрация сбраживаемых углеводов - 5,4%) автолизат кормовых дрожжей - 1,5 г/л биотин - 3 мкг/л парааминобензойная кислота (ПАБК) - 0,003 г/л
Стерилизацию ферментолизата (2.85 л) проводят через подготовленный мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. В стерильный ферментер вносят, соблюдая правила асептики, предварительно простерилизованный при 115°С раствор, в количестве 200 мл, состоящий из автолизата кормовых дрожжей, биотина и ПАБК. Ферментацию ведут при 36,5°С. Брожение заканчивается через 40 часов. По окончании брожения методом газовой хроматографии определяют содержание бутанола, ацетона и этанола, содержание несброженных сахаров.
Сумма растворителей составляла 22,41 г/л, в том числе:
бутанол 15,90 г/л (70,95%) ацетон 6,01 г/л (26,82%), этанол - 0,50 г/л (2,23%) Несброженный сахар - 0,28 г/л.
Выделение растворителей из ферментационной среды осуществляют дистилляцией.
Пример 2. Получение бутанола с использованием заявляемого способа на питательной среде, содержащей в качестве источника углеводов упаренную подсырную молочную сыворотку.
Заявляемый штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в запаянной пробирке, пастеризовали в кипящей водяной бане в течение 1 мин. Суспензией спор инокулировали стерильную питательную среду, состоящую из мелассы и муки в соотношении 1:1 (в пересчете на сбраживаемые углеводы). Через 12 часов роста в термостате при 36,5°С полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулировали подготовленную стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 л (объем среды 3 л).
Состав среды: - упаренная подсырная молочная сыворотка - 2.85 л
(содержание лактозы 20 г/л, т.е. 57,0 г)
сахароза - 100 г жмых зародышей пшеницы - 3,0 г/л
Концентрация углеводов в среде составляла 5,4%.
Сахарозу вносили в молочную сыворотку и стерилизовали при 110°С в течение 30 минут. Измельченный в тонкий порошок жмых вносили в 25 мл дистиллированной воды и стерилизовали при 110°С в течение 20 минут и вносили в стерильную питательную среду при соблюдении правил асептики.
Инокулировали 150 мл. Ферментация проходила при 36,5°С. По окончании брожения определяли содержание растворителей, несброженные углеводы, объем выделившегося газа.
Сумма растворителей составила 18,68 г/л, в том числе:
Бутанол 15,78 г/л (84,48%), ацетон 2,3 г/л (12,31%), этанол - 0,6 г/л (3,21%).
Содержание несброженного сахара 0,25 г/л.
Выделение растворителей из ферментационной среды осуществляют адсорбцией на активированном угле.
Таким образом, преимуществами предложенного способа получения бутанола является возможность использования широкого спектра углеводов, содержащихся в возобновляемых источниках сырья, таких как отходы деревообрабатывающей промышленности; отходах молочной промышленности; снижение себестоимости целевых продуктов, улучшение инфраструктуры перерабатывающих отраслей промышленности путем утилизации их отходов.