СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАТРИКС-СВЯЗАННЫХ ВЕЗИКУЛ ИЗ МОНОСЛОЙНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК И КЛЕТОЧНЫХ СФЕРОИДОВ
METHOD FOR PRODUCTION OF MATRIX-BOUND VESICLES FROM MONOLAYER CELL CULTURES AND CELL SPHEROIDS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения матрикс-связанных везикул (МСВ) из монослойных 2D и трехмерных 3D клеточных культур в форме сфероидов и может быть использовано, в частности, для характеризации субпопуляций нановезикул и получения бесклеточных продуктов для регенеративной медицины. Кроме того, за счет иммуномодулирующих свойств МСВ, выражающихся в регуляции воспалительных реакций, изобретение может найти применение при разработке препаратов для лечения пациентов с COVID-19 для терапии и профилактики острого респираторного дистресс-синдрома, вызванного коронавирусной инфекцией.
Уровень техники
Международное общество по внеклеточным везикулам (ISEV) определило внеклеточные везикулы как частицы естественного происхождения, образующиеся в результате секреции клетками, окруженные липидной мембраной и не способные к репликации (Théry C, Witwer KW, Aikawa E t al., Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018 Nov 23;7(1):1535750. doi: 10.1080/20013078.2018.1535750). По размерам, составу липидов и белков, способам синтеза и происхождению выделяют многочисленные подгруппы внеклеточных везикул. В последние годы активно изучают их регуляторную роль в регенерации и онтогенезе (Cha H, Hong S, Park JH, Park HH. Stem Cell-Derived Exosomes and Nanovesicles: Promotion of Cell Proliferation, Migration, and Anti-Senescence for Treatment of Wound Damage and Skin Ageing. Pharmaceutics. 2020 Nov 24;12(12):1135. doi: 10.3390/pharmaceutics12121135). Внеклеточные везикулы находят широкое применение в тканевой инженерии, в том числе при формировании биочернил для биопечати и бесклеточных биоактивных конструктов (Balistreri CR, De Falco E, Bordin A, Maslova O, Koliada A, Vaiserman A. Stem cell therapy: old challenges and new solutions. Mol Biol Rep. 2020 Apr;47(4):3117-3131. doi: 10.1007/s11033-020-05353-2). Матрикс-связанные везикулы (МСВ) - новый, недавно открытый тип нановезикул, секретируемых клетками вместе с компонентами внеклеточного матрикса и играющих важную роль в поддержании гомеостаза, регуляции регенерации и воспалительного ответа (Hussey GS, Pineda Molina C, Cramer MC, Tyurina YY, Tyurin VA, Lee YC, El-Mossier SO, Murdock MH, Timashev PS, Kagan VE, Badylak SF. Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv. 2020 Mar 20;6(12):eaay4361. doi: 10.1126/sciadv.aay4361; Huleihel L, Hussey GS, Naranjo JD, Zhang L, Dziki JL, Turner NJ, Stolz DB, Badylak SF. Matrix-bound nanovesicles within ECM bioscaffolds. Sci Adv. 2016 Jun 10;2(6):e1600502. doi: 10.1126/sciadv.1600502). МСВ устойчивы к действию детергентов и ряда ферментов, отличаются от секретируемых клетками в ростовые среды экзосом липидным составом мембраны и профилем регуляторных микроРНК, выполняют иммуномодулирующую функцию (Патент WO202181231 A1). Активация МСВ связана с повреждением внеклеточного матрикса, на чем и основаны механизмы локальной регуляции регенерации и воспаления с участием МСВ (Huleihel L, Hussey GS, Naranjo JD, Zhang L, Dziki JL, Turner NJ, Stolz DB, Badylak SF. Matrix-bound nanovesicles within ECM bioscaffolds. Sci Adv. 2016 Jun 10;2(6):e1600502. doi: 10.1126/sciadv.1600502). Высокий регенеративный потенциал внеклеточного матрикса может быть обусловлен именно наличием в нем МСВ. Добавление выделенных очищенных и охарактеризованных МСВ в тканеинженерные конструкты повышает их биологическую активность и совместимость с тканями реципиента.
Разработаны и подробно описаны протоколы выделения МСВ из внеклеточного матрикса таких органов как мочевой пузырь, подслизистая оболочка тонкой кишки, дерма кожи, а также из монослойных культур фибробластов мыши линии NIH/3T3 и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) человека. Но отсутствует единый протокол выделения МСВ из 2D монослойных клеточных культур и из 3D культур в форме клеточных сфероидов.
°
Для выделения МСВ из внеклеточного матрикса из различных тканей (мочевой пузырь, кишечник, дерма кожи) применяют различные ферменты и их комбинации: пепсин, коллагеназу, эластазу, гиалуронидазу, либеразу, протеиназу К или солевые растворы, иногда совмещая обработку с циклами замораживания/расставания или механической дезагрегацией, обработкой детергентами. Ферментирование внеклеточного матрикса из тканей занимает 12, или 36, или 48 часов при +4С или +25°С, время и протокол варьируют в зависимости от источника внеклеточного матрикса.
2
Длительное время занимает подготовка внеклеточного матрикса к ферментированию, особенно, если его получают из тканей. Так, при выделении МСВ из дермы кожи ткань обрабатывают 0.25% раствором трипсина 6 часов, 70% этанолом 10 часов, 3% H2O2 15 минут, 1% Triton X-100 0,26% ЭДТА/0,6% трис 6 часов и дополнительно 2 часа смесью 0.1% перуксусной кислоты и 4% этанола, инкубацию проводят на шейкере с частотой перемешивания 300 раз в мин, осуществляют лиофилизацию и измельчение через сито с размером пор 0.4мм (40 mesh size). При выделении МСВ из подслизистой оболочки тонкой кишки и стенки мочевого пузыря применяют механическую дезагрегацию, децеллюляризацию смесью 0.1% перуксусной кислоты и 4% этанола 2 часа на шейкере с частотой перемешивания 300 раз в мин, лиофилизацию и измельчение через сито с размером пор 0.25 мм (60 mesh size). Для последующего ферментирования внеклеточного матрикса и выделения МСВ берут по 5 мг полученного порошка и обрабатывают 24 часа при 25°С в профильтрованных через шприцевые насадки с диаметром пор 0.22 мкм растворах ферментов: 1) протеиназой К (0.1 мг/мл) в буфере (50 мМ tris HCl pH 8 и 200 мМ NaCl) 2) коллагеназой (0.1 мг/мл) в буфере (50 мМ tris HCl pH 8 5 мМ CaClи 20 0мМ NaCl) 3) пепсином (1 мг/мл) в 0.01 M HCl с последующей нейтрализацией до рН 7.4 с помощью NaOH. В контрольных образцах без ферментирования 5 мг порошка внеклеточного матрикса ресуспендировали в 50 мМ tris HCl (pH 7.4) и 200 мМ NaCl. Дальнейшее выделение МСВ осуществляли последовательным центрифугированием ферментированного внеклеточного матрикса: 10 мин при 500g (3 раза), 20 мин при 2500g (3 раза), 30 мин при 10 000g (3 раза), ультрацентрифугированием 70 мин при +4°С 100 000g с последующим ресуспендированием в 500 мкл фосфатно-солевого буфера и фильтрацией через шприцевую фильтрационную насадку с диаметром пор 0.22 мкм (Huleihel L, Hussey GS, Naranjo JD, Zhang L, Dziki JL, Turner NJ, Stolz DB, Badylak SF. Matrix-bound nanovesicles within ECM bioscaffolds. Sci Adv. 2016 Jun 10;2(6):e1600502. doi: 10.1126/sciadv.1600502).
°
Известен способ выделения МСВ из мочевого пузыря свиньи, включающий следующие этапы: механическое удаление серозной, подслизистой и мышечных оболочек, децеллюляризацию слизистой оболочки (0.1% перуксусная кислота, 4% этанол 4 часа на шейкере с частотой перемешивания 300 раз в мин), лиофилизацию и измельчение через сито с размером пор 0.25 мм (60 mesh size). В дальнейшем по 100 мг порошка ткани ресуспендировали в 10 мл диссоциирующего раствора, использовали несколько вариантов: 1) коллагеназа (0.1 мг/мл, type XI, Sigma-Aldrich), 2) Либераза (0.01 мг/мл, Liberase TH, Sigma-Aldrich), 3) протеиназа К (0.1 мг/мл, Invitrogen), 4) буфер (50 мМ трис рН 8, 5 мМ CaCl2, 200 mM NaCl), перемешивали на вортексе на максимальной скорости 10 сек и инкубировали ночь при комнатной температуре на шейкере, затем последовательно центрифугировали 500g 10 мин, 2500g 20 мин, 10 000g 30 мин 3 раза, супернатант после стерилизации через шприцевую фильтрационную насадку с диаметром пор 0.22 мкм хранили при -80С. Впоследствии для выделения МСВ применили 1) ультрацентрифугирование 100 000g 2 часа +4°С, 2) ультрафильтрацию через фильтр 100 KDa Amicon с центрифугированием 20 мин при 4000g, 3) разделение в градиенте плотности с помещением 2 мл 50% OptiPrep на дно чистой пробирки для ультрацентрифуги, сверху наслаиванием 10 мл 2% OptiPrep и образца, ультрацентрифугированием 100 000g 2 часа +4°С и сбором средней фракции, 4) хроматографию с лиофилизацией и ресуспендированием образцов в 1 мл воды без частиц, нанесением на миниколонки 1,5х12см с сефарозой 2В, отбором фракций с высоким содержанием частиц и низким содержанием белка и ультрафильтрацией (Quijano LM, Naranjo JD, El-Mossier SO, Turner NJ, Pineda Molina C, Bartolacci J, Zhang L, White L, Li H, Badylak SF. Matrix-Bound Nanovesicles: The Effects of Isolation Method upon Yield, Purity, and Function. Tissue Eng Part C Methods. 2020 Oct;26(10):528-540. doi: 10.1089/ten.TEC.2020.0243).
Во всех описанных выше протоколах подготовка тканей, внеклеточного матрикса и его ферментирование перед выделением МСВ длительны, многостадийны и связаны с применением многочисленных химических агентов, которые могут оказать влияние на содержимое выделяемых везикул. Так, известно, что перуксусная кислота влияет на метаболизм и жизнеспособность клеток, воздействуя непосредственно на белки (Viola KS, Rodrigues EM, Tanomaru-Filho M, Carlos IZ, Ramos SG, Guerreiro-Tanomaru JM, Faria G. Cytotoxicity of peracetic acid: evaluation of effects on metabolism, structure and cell death. Int Endod J. 2018 May;51 Suppl 4:e264-e277. doi: 10.1111/iej.12750), т.е. может повлиять и на структурно-функциональный состав выделяемых МСВ. Также перуксусная кислота не всегда эффективно удаляет клетки из ткани, что было показано при децеллюляризации почек (Poornejad N, Schaumann LB, Buckmiller EM, Momtahan N, Gassman JR, Ma HH, Roeder BL, Reynolds PR, Cook AD. The impact of decellularization agents on renal tissue extracellular matrix. J Biomater Appl. 2016 Oct;31(4):521-533. doi: 10.1177/0885328216656099). Либераза при выделении клеток из биоптатов хорошо сохраняет поверхностные белки и обеспечивает высокие выходы жизнеспособных клеток (Lv D, Ma QH, Duan JJ, Wu HB, Zhao XL, Yu SC, Bian XW. Optimized dissociation protocol for isolating human glioma stem cells from tumorspheres via fluorescence-activated cell sorting. Cancer Lett. 2016 Jul 10;377(1):105-15. doi: 10.1016/j.canlet.2016.04.022). Однако при выделении овариальных фолликулов либераза малоэффективна (Schmidt VM, Isachenko V, Rappl G, Rahimi G, Hanstein B, Morgenstern B, Mallmann P, Isachenko E. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 2018 Jun 2;16(1):57. doi: 10.1186/s12958-018-0374-6), при выделении эндокринных клеток поджелудочной железы либераза дает меньший выход функциональных клеток, чем коллагеназа NB1 (Brandhorst H, Friberg A, Nilsson B, Andersson HH, Felldin M, Foss A, Salmela K, Tibell A, Tufveson G, Korsgren O, Brandhorst D. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 2010;19(1):3-8. doi: 10.3727/096368909X477507).
Известен способ получения МСВ с использованием цвиттерионного детергента CHAPS и ДНКазы 1 типа для децеллюляризации клеточных пластов из МСК и с последующим выделением МСВ или коллагеназой I-типа, или смесью коллагеназы I-типа и гиалуронидазы, или трипсина (Патент RU2739912 C14 Селина Д.В, Efimenko A. Y. Матрикс-связанные везикулы, выделенные из внеклеточного матрикса, в регуляции дифференцировки мезенхимных стволовых клеток in vitro. Тезисы конференции «Ломоносов 2021»). Известно, что применение CHAPS не влияет на морфологию и белковый состав экзосом (Musante L, Saraswat M, Duriez E, Byrne B, Ravidà A, Domon B, Holthofer H. Biochemical and physical characterisation of urinary nanovesicles following CHAPS treatment. PLoS One. 2012;7(7):e37279. doi: 10.1371/journal.pone.0037279; Wubbolts R, Leckie RS, Veenhuizen PT, Schwarzmann G, Möbius W, Hoernschemeyer J, Slot JW, Geuze HJ, Stoorvogel W. Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation. J Biol Chem. 2003 Mar 28;278(13):10963-72. doi: 10.1074/jbc.M207550200.), однако может стабилизировать некоторые белки (Sah H, Kim KS. Improvement of interfacial protein stability by CHAPS. Biotechnol Lett. 2006 Apr;28(8):567-70. doi: 10.1007/s10529-006-0016-5). Также CHAPS не проникают через липидные мембраны, хотя в высоких концентрациях могут влиять на фосфолипиды (Rodi PM, Bocco Gianello MD, Corregido MC, Gennaro AM. Comparative study of the interaction of CHAPS and Triton X-100 with the erythrocyte membrane. Biochim Biophys Acta. 2014 Mar;1838(3):859-66. doi: 10.1016/j.bbamem.2013.11.006). Ферментативная обработка трипсином может удалять важные сигнальные пептиды с поверхности клеточных мембран и секретируемых ими везикул (Zhang, B., Shan, H., Li, D., Li, Z. R., Zhu, K. S., Jiang, Z. B., & Huang, M. S. (2012). Different methods of detaching adherent cells significantly affect the detection of TRAIL receptors. Tumori Journal, 98(6), 800-803; Tsuji, K., Ojima, M., Otabe, K., Horie, M., Koga, H., Sekiya, I., & Muneta, T. (2017). Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell transplantation, 26(6), 1089-1102.). Кроме того, применение центрифугирования при 10 000g может существенно снижать выход нановезикул (Livshits, M. A., Khomyakova, E., Evtushenko, E. G., Lazarev, V. N., Kulemin, N. A., Semina, S. E., Generozov, E. V., & Govorun, V. M. (2015). Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific reports, 5, 17319. https://doi.org/10.1038/srep17319).
Недостатками описанных примеров выделения МСВ являются долгая обработка материала и применение последовательно различных химических агентов и ферментов с промежуточными этапами трудоемкой пробоподготовки.
2
2
2
При выделении МСВ из монослойных культур клеток протоколы подготовки внеклеточного матрикса быстрее, чем при выделениях из тканей. Так, культуры МСК человека и линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 после 14 дней культивирования на культуральных флаконах площадью 75см с посевной плотностью 3500 клеток/см при смене ростовой среды раз в 3 суток и добавлении на последние 7 суток в среду 50 мкМ фосфата аскорбиновой кислоты (ascorbic acid 2-phosphate Sigma -Aldrich) децеллюляризовали 5 мин в 0.5% Triton Х-100 в 20 мМ хлориде аммония - нашатырном спирте с последующими 3 отмывками очищенной деионизованной водой. Ферментирование полученного внеклеточного матрикса осуществляли 1 час при 37°С в растворе 100 нг/мл либеразы (Liberase DL Roche) в буфере (50 мМ tris HCl pH 7.5 5 мМ CaCl и 200 мМ NaCl). Для выделения МСВ применяли последовательное центрифугирование: 500g 10 мин, 2500g 20 мин, 10 000g 30 мин и ультрацентрифугирование 100 000g 70 мин при +4°С. Перед ультрацентрифугированием раствор пропускали через шприцевые фильтрационные насадки с размером пор 0.22 мкм, после ультрацентрифугирования ресуспендировали осадки МСВ в фосфатно-солевом буфере (Hussey GS, Pineda Molina C, Cramer MC, Tyurina YY, Tyurin VA, Lee YC, El-Mossier SO, Murdock MH, Timashev PS, Kagan VE, Badylak SF. Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv. 2020 Mar 20;6(12):eaay4361. doi: 10.1126/sciadv.aay4361). Недостатком описанного способа является применение единственного фермента при достаточно длительном времени обработки материала.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению (прототипом) является способ получения матрикс-связанных везикул (международная заявка WO2017151862A1). Способ заключается в ферментативной обработке высушенного и измельченного в порошок внеклеточного матрикса  коллагеназой (0.1 мг/мл), протеиназой К (0.1 мг/мл) или пепсином (1.0 мг/мл) в течение 12, 24, 36 или 48 часов при температуре +4°С - +25°С, с/без замораживанием и оттаиванием, с/без обработкой детергентами. Для отделения МСВ от фибрилл ферментированного внеклеточного матрикса проводят центрифугирование при 300-1000g в течение 10-15 мин, затем при 2000-3000g в течение 20-30 мин, затем при 10 000-15 000g в течение 25-40 мин, описанные этапы проводят однократно или 2-5 раз каждый. Из полученного супернатанта выделяют МСВ ультрацентрифугированием при 100 000-150 000g в течение 60-90 мин и осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере или в стерильной воде. Также высушенный и измельченный в порошок внеклеточный матрикс после децеллюляризации без ферментирования обрабатывают в солевом растворе, например, 0.1-3 М KCl в течение 10-120 мин при +4°С - +50°С, затем последовательно центрифугируют при 2000-5000g в течение 20-40 мин, и ультрацентрифугируют при 100 000-150 000g в течение 30-180 мин. Для удаления крупных частиц диаметром более 500-10000 нм может быть применена микрофильтрация с последующей ультрафильтрацией.
Недостатками описанного способа являются трудоемкая длительная обработка и отсутствие протокола получения внеклеточного матрикса от трехмерных клеточных культур - сфероидов.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка простого и эффективного способа получения МСВ из монослойных культур и клеточных сфероидов, обеспечивающего сокращение времени обработки.
Раскрытие сущности изобретения
9
9
Техническим результатом изобретения является обеспечение высокого выхода (2,9x10- 3,8x10 везикул с 1 млн клеток) матрикс-связанных везикул из монослойных клеточных культур и трехмерных клеточных культур в форме сфероидов при сокращении времени обработки материала до 3 часов. Предлагаемый способ обеспечивает короткое время обработки материала с высоким выходом матрикс-связанных везикул как из двумерных монослойных культур, так и из трехмерных клеточных культур в форме сфероидов.
Технический результат достигается за счет реализации способа получения матрикс-связанных везикул из культур клеток, включающего децеллюляризацию клеточных культур, их ферментативную обработку с получением ферментированного внеклеточного матрикса, отделение матрикс-связанных везикул от фибрилл ферментированного внеклеточного матрикса посредством центрифугирования. При этом децеллюляризацию проводят 0,5% раствором Triton X-100 в 20 мМ нашатырного спирта в течение не менее 5 минут из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов, а ферментативную обработку проводят раствором ферментов, содержащим диспазу, коллагеназу I и коллагеназу II, взятых в концентрациях 1,5 МЕ/мл, 2 мг/мл, 1 мг/мл, соответственно, из расчета не менее 1 мл раствора на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов.
При этом ферментативную обработку проводят, предпочтительно, при инкубации раствора при 37°С в течение не менее 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15-20 раз/мин, а отделение матрикс-связанных везикул проводят при последовательном центрифугировании при 500g в течение 10 минут, при 2500g в течение 20 минут с последующим ультрацентрифугированием. Ультрацентрифугирование проводят, предпочтительно, при 100000g в течение 70 минут при 4°C.
Использование заявляемого изобретения сокращает суммарное время обработки материала, включающее децеллюляризацию клеточных культур, ферментирование внеклеточного матрикса и отделение МСВ от фибрилл внеклеточного матрикса до 3 часов, тогда как в прототипе этап ферментативной обработки внеклеточного матрикса составляет не менее 12 часов (течение 12, 24, 36 или 48 часов), и последующий этап отделения МСВ от фибрилл матрикса занимает 4-10 часов.
Осуществление изобретения
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Клетки культивируют на чашках Петри в течение 14 дней для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Клеточные сфероиды формируют путем культивирования клеток в неадгезивных условиях в течение 3-7 суток в микролунках агарозных планшетов, полученных, например, с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США). Непосредственно перед выделением матрикс-связанных везикул (МСВ) сфероиды собирают в центрифужные пробирки путем промывания планшетов со сфероидами средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществляется при помощи микроскопа, при необходимости процедура промывки планшета средой повторяется. В случае работы с монослойными культурами клеток из адгезивных культуральных емкостей с клетками, например, чашек Петри, сливают ростовую среду, трижды промывают фосфатно-солевым буфером. Аналогично промывают собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды, для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки ростовую среду отбирают и добавляют фосфатно-солевой буфер. Пробирку аккуратно встряхивают несколько раз, процедуру промывки сфероидов повторяют трижды.
Затем клеточные монослои и сфероиды обрабатывают децеллюляризирующим раствором 0.5% Triton X-100 в 20 мМ гидроксида аммония в течение 5 минут из расчета не менее 1 мл на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов. Монослойные культуры клеток после децеллюляризации трижды промывают деионизированной водой, клеточные сфероиды также трижды отмывают деионизированной водой, пассивно осаждая их между отмывками.
Затем осуществляют протеолиз внеклеточного матрикса путем добавления раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл), коллагеназа I (2 мг/мл) и коллагеназа II (1 мг/мл) из расчета не менее 1 мл на 1,5-2 млн клеток или 600-800 сфероидов и инкубируют при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирок 15-20 раз/мин для более эффективного расщепления матрикса.
Полученный после протеолиза внеклеточного матрикса раствор помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносят в чистые пробирки и центрифугируют при 2500g в течение 20 минут. Шприцем собирают супернатант из центрифужных пробирок и переносят в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор не менее 0,22 мкм.
Пробирки для ультрацентрифуги попарно уравновешивают с точностью до 0,01 г, при необходимости допускается разведение проб стерильной деионизированной водой. Ультрацентрифугирование проводят при 100000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирают,  ресуспендируют осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере или стерильной деионизованной воде, переносят в чистые эппендорфы или криовиалы и используют или хранят при -80°С.
Ниже представлены примеры выделения МСВ из монослойных культур и сфероидов из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) и клеток линий эмбриональных фибробластов мыши NIH 3Т3 при ферментативной обработке различными диссоциирующими агентами, при этом суммарное время обработки материалов не превышало 3 часов.
Пример 1
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 1,5 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 2
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 1,5 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора коллагеназы I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной деионизованной воде и переносили в чистые эппендорфы.
Пример 3
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 2 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора коллагеназы II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 4
МСК пупочного канатика человека культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 2 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего  0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной деионизованной воде и переносили в чистые эппендорфы, хранили при -80°С.
Пример 5
Клеточные сфероиды из МСК пупочного канатика человека (600 сфероидов, 1500 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществлялся при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой проводили три раза. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере (MR-1, BioSan) с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирку с расщепленным внеклеточным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 6
Клеточные сфероиды из МСК пупочного канатика человека (800 сфероидов, 2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществляли при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывались 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 mM нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, после чего трижды повторяли описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирки с расщепленным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 7
Клетки линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 2 млн клеток для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10)  в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной деионизованной воде, переносили в чистые эппендорфы.
Пример 8
Клетки линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 культивировали на чашке Петри в течение 14 дней до достижения монослоя и количества 1,5 млн для достаточного синтеза внеклеточного матрикса. Из чашки сливали культуральную среду и трижды промывали ее фосфатно-солевым буфером. Затем чашку обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут и снова трижды промывали деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Чашку инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин, затем переносили ее содержимое в центрифужную пробирку и центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Пример 9
Клеточные сфероиды из линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 (600 сфероидов, 2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществляли при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывались 1 мл децеллюляризирующего 0,5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 mM нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, после чего трижды повторяли описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора диспазы (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирки с расщепленным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильной дионизованной воде и переносили в чистые эппендорфы.
Пример 10
Клеточные сфероиды из линии эмбриональных фибробластов мыши NIH/3Т3 (800 сфероидов, 2000 клеток в сфероиде), культивировавшиеся в течение 7 суток на агарозных планшетах, полученных с помощью 3D Petri Dish (Microtissue, США), собирали в центрифужную пробирку объемом 15 мл путем многократного промывания планшетов средой при помощи механической пипетки. Контроль снятия сфероидов с планшета осуществлялся при помощи микроскопа. Собранные в центрифужную пробирку клеточные сфероиды трижды промывали фосфатно-солевым буфером от остатков культуральной среды. Для этого после пассивного осаждения сфероидов на дно пробирки среду отбирали и добавляли фосфатно-солевой буфер, пробирку аккуратно встряхивали несколько раз, и затем дважды повторяли процедуру осаждения и промывки. После промывки сфероиды обрабатывали 1 мл децеллюляризирующего 0.5% раствора Triton X-100 (Panreac, 142314.1611) в 20 мМ нашатырного спирта (Сигма Тек, Ч.Д.А. ГОСТ 3760-79 ОКП 26 1141 0012 10) в течение 5 минут, после чего трижды повторяли описанную выше процедуру осаждения и промывки сфероидов деионизированной водой. Протеолиз внеклеточного матрикса осуществляли путем добавления 1 мл раствора следующих ферментов: диспаза (1,5 МЕ/мл, Gibco™, 17105041), коллагеназа I (2 мг/мл, Gibco™, 17100017) и коллагеназа II (1 мг/мл, Gibco™, 17101015). Инкубировали в термостате при 37°С в течение 40 мин на мини-рокер-шейкере с частотой перемешивания содержимого пробирки 15-20 раз/мин. Пробирки с расщепленным матриксом центрифугировали при 500g в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 2500g в течение 20 минут. Стерильным шприцем супернатант собирали из центрифужной пробирки и переносили в пробирки для ультрацентрифуги, пропуская через фильтрационную шприцевую насадку с диаметром пор 0,22 мкм. Ультрацентрифугирование проводили при 100 000g в течение 70 минут при 4°C. По окончании ультрацентрифугирования супернатант осторожно отбирали, затем ресуспендировали осадок в стерильном фосфатно-солевом буфере, переносили в чистые эппендорфы и хранили при -80°С.
Проводили оценку выхода матрикс-связанных везикул, выделенных в соответствии с примерами 1-10.
Выход матрикс-связанных везикул оценивали путем анализа траекторий наночастиц на приборе NanoSight NS300 (Malvern, Великобритания). В таблице 1 приведены данные о концентрации матрикс-связанных везикул в образцах при использовании разных ферментов и их комбинаций на этапе протеолиза внеклеточного матрикса (примеры 1-10).
Таблица 1. Выход матрикс-связанных везикул
Пример
Культура
Условия культивирования
Концентрация частиц, выделенных с 1млн клеток
1
МСК
2D
2,1x10<sup>9 </sup>±1,0
2
МСК
2D
0,9x10<sup>9 </sup>±0,2
3
МСК
2D
1,8x10<sup>9 </sup>±0,7
4
МСК
2D
3,8x10<sup>9 </sup>±0,6
5
МСК
3D
0,7x10<sup>9 </sup>±0,2
6
МСК
3D
3,5x10<sup>9 </sup>±0,2
7
3Т3
2D
1,3x10<sup>9 </sup>±0,3
8
3Т3
2D
2,9x10<sup>9 </sup>±0,3
9
3Т3
3D
1,6x10<sup>9 </sup>±0,3
10
3Т3
3D
3,4x10<sup>9 </sup>±0,2
Как видно из таблицы 1, применение в качестве диссоциирующего агента смеси ферментов - диспазы (1,5 МЕ/мл), коллагеназы I (2 мг/мл) и коллагеназы II (1 мг/мл), примеры 4, 6, 8, 10 позволяет добиться большего выхода матрикс-связанных везикул. Использование каждого из ферментов в отдельности (примеры 1-3, 5, 7, 9) приводило к уменьшению выхода везикул.