Подготовка проб тканей внутренних органов в судебно-химическом анализе для инструментальных методов исследования

I Применение СО-оксиметрии в постмортальной диагностике отравлений

• Р.Р. Краснова, Г. Ю. Аксенова,

О. Г. Заторкина, Н. В. Коблова, Н. А. Крупина ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» МЗ МО (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно) Аннотация: Доклад посвящен вопросам применения СО-оксиметрии в постмортальной диагностике отравлений на анализаторе ABL80 FLEX CO-OX, выпускаемого фирмой Radiometer Medical ApS, выявлены преимущества перед другими методиками определения карбоксиге-моглобина (COHb) и метгемоглобина (MtHb). Ключевые слова: постмортальная токсикология, карбоксигемоглобин, метгемоглобин

Application of CO-Oximetry in postmortem toxicology

• R.R. Krasnova, G. Y. Aksenova,

O. G. Zatorkina, N. V. Koblova, N. A. Krupina Abstaract: The report focuses on the application of CO-oximetry in the postmortem diagnostics on analyzer ABL80FLEX CO-OX (Radiometer Medical ApS); found advantages over other methods of determining carboxyhemoglobin (COHb) and methemoglobin (MtHb).

Keywords: postmortem toxicology, carbon monoxide poisoning, carboxyhemoglobin, methemoglobin

ВВЕДЕНИЕ

В постмортальной диагностике отравлений широко используются различные методики определения карбок-сигемоглобина в крови. Анализатор ABL80FLEX CO-OX позволяет сократить время анализа карбоксигемоглобина и метгемоглобина в крови. Метод СО-оксиметрии нашел широкое применение в диагностической практике острых и хронических отравлений оксидом углерода, при анализе газов крови и кислотно-основного баланса крови для экспресс-диагностики неотложных состояний, отравлений. Следует иметь в виду, что СО-оксиметры первоначально были разработаны для клинических целей и анализа свежей крови.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

При использовании СО-оксиметра для анализа постмортальной крови следует учитывать, что в постмортальной крови возможно более высокое содержание метгемоглобина (MtHb) и/или сульфгемоглобина (SHb); в постмортальной крови возможно более низкое содержание общего гемоглобина (ctHb); постмортальная кровь может быть не гомогенной и содержать микрокоагуляты, различные включения, которые не присутствуют в крови, взятой при жизни. Эти изменения могут быть вызваны обстоятельствами смерти, так MtHb появляется при горении или является следствием процесса гниения крови после смерти. Сероводород и окисление материала при гниении ведет к образованию SHb и MtHb соответственно в гнилой крови и, потенциально, могут влиять на результаты измерений Сонь на СО-оксиметре. Кроме того, уровень точности СО-оксиметрии потенциально снижен, если общий гемоглобин ниже уровня при жизни. Несмотря на потенциальное влияние указанных факторов в загнившей крови и сравнении газо-хроматографического метода определения СОШ и СО-оксиметрии при 6 длинах волн показало, что СО-оксиметрия является надежным методом определения СОШ> в постмортальной кро-

ви, даже если пробы загнившие, когда CtHb (общий Hb) >1 г/дл (> 10 г/л).

Кроме того, СО-оксиметр ABL80FLEX CO-OX обеспечивает: ультразвуковой гемолиз прямо в измерительной камере; использование малого размера пробы (70 мкл); автоматический контроль качества; автоматическую калибровку; время «жизни» кассеты на 200 проб и калибровочного пакета на борту после начала использования - 60 дней; диапазон измерения COHb и MetHb - от 0,0-100%; также прибор снабжен детектором пузырьков воздуха в пробе.

Принцип действия прибора основан на оптических свойствах специально подготовленной в процессе анализа цельной крови. Ультразвуковые колебания с частотой 30 кГц, сгенерированные кварцевым генератором, создают микропузырьки, которые разрывают мембраны эритроцита и выпускают молекулы гемоглобина. Полученный материал исследуется в блоке спектрометра, который содержит электронику, чтобы преобразовать световые сигналы в электрические для обработки данных. Обработанная информация выводится на экран.

ВЫВОДЫ

При использовании метода СО-оксиметрии отмечена высокая надежность данного метода, снижении уровня погрешности измерения при сокращении времени исследования.

Кроме того, что отравление окисью углерода является частой причиной смертельных исходов при пожарах, отравление также может быть связано с непрофессиональным использованием печей, отапливающихся дровами, или использованием газовых котлов и/или газовых колонок, установленных в помещениях с плохой вентиляцией, что при неполном сгорании кислорода ведет к образованию СО. Уровень COHb в крови у регулярно курящих может составлять 3-5%, достигая 10% у злостных курильщиков, выкуривающих более 2-3 пачек сигарет в день. При судебно-медицинском исследовании уровень COHb в трупной крови свыше 50% указывает, что отравление окисью углерода является основной причиной смерти. Уровень 10-50% показывает, что вдыхание СО внесло свой вклад в механизм гибели и, несомненно, погибший был жив в момент начала пожара. Уровень COHb ниже 10% означает, что пострадавший либо был мертв к началу пожара, либо умер вскоре после возгорания.

Повышенная концентрация метгемоглобина (метге-моглобинемия) снижает оксигенацию (снабжение кислородом) клеток ткани, вызывая цианоз. Тяжелая метгемо-глобинемия (метгемоглобин > 70% общего гемоглобина) является потенциально смертельной. Метгемоглобине-мия может быть вызвана дефектом врожденного гена, но гораздо чаще возникает в результате воздействия экзогенных окислителей - химикатов или лекарственных средств.

Подготовка проб тканей внутренних органов в судебно-химическом анализе для инструментальных методов исследования

• Р. Р. Краснова, З. Н. Артамонова, Н. А. Крупина ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» МЗ МО (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно) Аннотация: Доклад посвящён вопросу подготовки биологического материала - тканей внутренних органов для инструментальных методов исследования. Проведён анализ применяемых за рубежом методик экстракции токсикологически значимых веществ из биоло-

гических тканей для современных инструментальных исследований, которые были внедрены в практику судебно-химического отдела. Внедрение новых высокочувствительных инструментальных методов позволило уменьшить размерность проб, что способствует экономии реактивов и высокотоксичных растворителей, экстракты содержат меньше соэкстрактивных веществ, затрудняющих идентификацию искомых лекарственных веществ и наркотических средств.

Ключевые слова: подготовка проб, ткани внутренних органов, судебная токсикология

The sample preparation of autopsy's tissues in forensic toxicology for instrumental methods

• R. R. Krasnova, Z. N. Artamonova, N. A. Krupina Abstract: The report focuses on the issue of sample preparation of biological material - autopsy's tissue for instrumental methods of analysis. The new high-sensitivity instrumental methods give the possibility to reduce the dimension of the sample. The sample preparation of 5 g autopsy tissues (liver, kidney) samples was evaluated for acid, neutral and basic drugs.

Keywords: sample preparation, autopsy tissues, forensic toxicology

ВВЕДЕНИЕ

Хроматографические методы заняли ведущее место среди наиболее эффективных методов анализа и широко используется в судебно-химических и химико-токсикологических лабораториях. Внедрение новой современной высокочувствительной аппаратуры позволило уменьшить размерность проб тканей внутренних органов. Изолирование токсикологически значимых веществ из тканей внутренних органов по систематическому ходу (размерность проб 25-100 г) имеют ряд существенных недостатков: они являются малочувствительными к ряду лекарственных соединений, не обеспечивают достаточной степени очистки, требуют большого количества органических растворителей, которые являются опасными для здоровья сотрудников и загрязняют окружающую среду.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель нашего исследования - изучить методику использования малых навесок биологического материала для проведения анализа на наличие наркотических и лекарственных веществ на современном, новейшем лабораторном оборудовании, внедренном в практическую работу в нашем отделе: газовые хроматографы (ГХ) с масс-селективными детекторами (ГХ/МС), ГХ с азотно-фосфорным детектором (ГХ/АФД) Agilent Technologies и «Маэстро», высокоэффективный жидкостной хроматограф с диодно-матричным детектором Agilent Technologis 1200 (ВЭЖХ-ДМД).

Работа проводилась на модельных образцах бланковой ткани печени, с добавлением к объектам стандартных растворов лекарственных веществ и наркотических средств, таких как, амитриптилин, анаприлин, верапамил, диазепам, димедрол, но-шпа, клозапин, фенобарбитал, морфин, кодеин. Параллельно исследовался и экспертный материал.

Все исследования проводились с использованием оборудования для пробоподготовки: шейкерная водяная баня, блендер, рН-метр, центрифуги от 3 до 9 тысяч об/ мин, аппараты для встряхивания - шейкеры, вортексы; термостат, концентраторы экстрактов, дозаторы и прочее лабораторное оборудование.

Ферментативное разрушение 5 г тканей внутренних органов (средняя проба) проводилось с использованием трипсина. Также использовалось и разрушение 5 г тканей внутренних органов (средняя проба) блендером. Полученные гомогенаты использовались для производства жидкость-жидкостной экстракции на различные группы наркотических средств, сильнодействующих и лекарственных веществ.

В отделе внедрены:

• методы экстракции гомогената эквивалента 0.5 г ткани внутренних органов бутилацетатом и этилацетатом: для скрининга, идентификации и определения лекарственных веществ и наркотических средств (проведение исследований методами ГХ/МС и ГХ/АФД);

• метод экстракции гомогената эквивалента 0.5 г ткани внутренних органов смесью н - гексан - дихлорметан -изопропанол (60:40:2): для скрининга, идентификации и определения лекарственных веществ (проведение исследований методом ВЭЖХ/ДМД);

• метод экстракции гомогената эквивалента 0.5 г ткани внутренних органов после проведения ферментативного гидролиза смесью хлористый метилен - изо-бутанол (9:1) с проведением реакции дериватизации - силилирования: для скрининга, идентификации и определения наркотических средств группы опия, кокаина и его метаболитов, и других психотропных веществ (проведение исследований методом ГХ/МС);

• метод экстракции гомогената эквивалента 0.5 г ткани внутренних органов хлористым метиленом с проведением реакции дериватизации с применением пентафтор-пропионового ангидрида: для скрининга, идентификации и определения производных фенилалкиламина и других наркотических и психотропных веществ (проведение исследований методом ГХ/МС);

• метод экстракции гомогената ткани внутренних органов с проведением реакции дериватизации - силилиро-вания: для обнаружения тетрагидроканнабинола (ТГК), его метаболитов: ТГК-ОН, ТГК-СООН и «синтетических каннабиноидов» (проведение исследований методом ГХ/ МС).

ВЫВОДЫ

1. Использование ГХ/МС, ГХ/АФД, ВЭЖХ/ДМД для скрининга, идентификации и определения лекарственных веществ и наркотических средств в биоматериале удовлетворяет требованиям по чувствительности, селективности, специфичности обеспечивает надежные результаты судебно-химических исследований (СХИ).

2. Использование вышеуказанных методов экстракции и их комбинация в процессе производства СХИ позволяет проводить исследования на широкий спектр токсикологически значимых веществ.

3. В результате внедрения и использования при проведении СХИ различных схем пробоподготовки тканей внутренних органов из малых навесок увеличилась эффективность проводимых исследований по идентификации лекарственных веществ и наркотических средств, сократилось количество ложноотрицательных результатов.