Выявление гемостатической активности лекарственных форм, содержащих нанокомпоненты

УДК 615.31, 615.04

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-3-34-38

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕМОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ, СОДЕРЖАЩИХ НАНОКОМПОНЕНТЫ

Барсукова Ю.Н., Мельникова О.А., Петров А.Ю.

ФГБОУ ВО "Уральский государственный медицинский университет", г. Екатеринбург, Российская Федерация

IDENTIFICATION OF HEMOSTATIC ACTIVITY OF MEDICINAL FORMS CONTAINING NANOCOMPONENTS

Barsukova Yu.N., Melnikova O.A., PetrovA.Yu.

Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russian Federation

Аннотация. Изучено действие многокомпонентных фармацевтических композиций, представленных в двух лекарственных формах, на изменения показателей коагулограммы. Состав композиций представлен аминокапроно-вой кислотой (ингибитор фибринолиза), хлоридом железа (противоанемическое действие), хлоридом натрия (изотонирование раствора), наночасти-цами железа (улучшение проникновения в очаг повреждения). Состояние системы гемостаза оценивали унифицированными методами, позволяющими охарактеризовать основные фазы свертывающего процесса: активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время, содержание фибриногена. Установлено укорачивание времени свертывания крови под влиянием разработанных композиций. Максимально выраженный гемостатиче-ский эффект среди растворов проявил образец № 2 (3,0 г хлорида железа, 4,0 г. аминокапроновой кислоты и 0,1 г. натрия хлорида). Применение данного образца способствовало укорачиванию времени свертывания крови относительно контрольных исследований в 1,7 - 2, 0 раза. Наиболее выраженный гемостатический эффект среди мягких лекарственных форм проявили образцы с минимальной концентрацией нанокомпонента (0,01%), причем вид нанокомпонента на данный эффект не оказывает статистически значимого влияния.

Ключевые слова; наночастицы, гемостаз, кровотечение, коагулограмма, кровь.

Annotation. The effect of multicomponent pharmaceutical compositions presented in two dosage forms on changes in coagulogram indices was studied. The components of the compositions are represented by ami-nocaproic acid (fibrinolysis inhibitor), iron chloride (antianemic effect), sodium chloride (solution isotonation), iron nanoparticles (improvedpenetration into the lesion). The state of the hemostasis system was assessed by standardized methods that allowed us to characterize the main phases of the coagulation process: activated partial thromboplastin time, prothrombin time, thrombin time, fibrinogen content. The shortening of blood coagulation time was established under the influence of the developed compositions. The most pronounced hemostatic effect among the solutions was exhibited by sample No. 2 (3.0 g of ferric chloride, 4.0g of aminocaproic acid and 0.1 g of sodium chloride). The use of this sample contributed to the shortening of blood coagulation time relative to control studies in 1.7 - 2.0 times. The most pronounced hemo-static effect among soft dosage forms was exhibited by samples with a minimum concentration of nanocompo-nent (0.01%), and the type of nanocomponent does not exert a statistically significant effect on this effect.

Keywords; nanoparticles, hemostasis, bleeding, coagulation, blood.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Барсукова Ю. Н., Мельникова О. А. Мягкая лекарственная форма с наночастицами для остановки кровотечения: обоснование со_става и технология получения //Разработка

REFERENCES

[1] Barsukova Ju. N., Mel'nikova O. A. Mjagkaja le-karstvennaja forma s nanochasticami dlja ostanovki krovotechenija: obosnovanie sostava i _tehnologija poluchenija //Razrabotka i

и регистрация лекарственных средств. -2019. - Т. 8. - №. 2. - С. 48-54.

[2] Nakielski P., Pierini F. Blood interactions with nano-and microfibers: recent advances, challenges and applications in nano-and microfi-brous hemostatic agents //Acta biomaterialia. -2019. - V. 84. - P. 63-76.

[3] Lippi G., Plebani M., Favaloro E. J. Technological advances in the hemostasis laboratory //Semi-nars in thrombosis and hemostasis. - Thieme Medical Publishers, 2014. - V. 40. - №. 02. - P. 178-185.

[4] Бежин А. И. и др. Гемостатическая активность новых аппликационных средств на основе карбоксиметилцеллюлозы //Вестник новых медицинских технологий. - 2011. - Т. 18. - №. 3.

[5] Галстян Г. М., Суханова Г. А. Введение в гемостаз, современные препараты крови и их влияние на коагуляцию //Медицинский совет. - 2013. - №. 5-6. - С. 11-16.

registracija lekarstvennyh sredstv. - 2019. - T. 8.

- №. 2. - S. 48-54.

[2] Nakielski P., Pierini F. Blood interactions with nano-and microfibers: recent advances, challenges and applications in nano-and microfibrous hemostatic agents //Acta biomaterialia. - 2019. -V. 84. - P. 63-76.

[3] Lippi G., Plebani M., Favaloro E. J. Technological advances in the hemostasis laboratory //Semi-nars in thrombosis and hemostasis. - Thieme Medical Publishers, 2014. - V. 40. - №. 02. - P. 178-185.

[4] Bezhin A. I. i dr. Gemostaticheskaja aktivnost' no-vyh applikacionnyh sredstv na osnove kar-boksimetilcelljulozy //Vestnik novyh medicinskih tehnologij. - 2011. - T. 18. - №. 3.

[5] Galstjan G. M., Suhanova G. A. Vvedenie v gemo-staz, sovremennye preparaty krovi i ih vlijanie na koaguljaciju //Medicinskij sovet. - 2013. - №. 5-6.

- S. 11-16.

Введение. В связи с выраженной потребностью медицины в лекарственных препаратах для остановки кровотечений, их разработка является актуальной задачей [1]. В этом плане особый интерес вызывают местные гемостатические формы, доля которых на фармацевтическом рынке незначительна. Они действуют направленно и могут быть использованы как при повреждении крупных сосудов, так и при диффузном кровотечении. Однако все усилия разработчиков могут быть не реализованы, если лекарственная форма не будет обладать необходимым уровнем фармакологической активности. В связи с этим особое значение приобретает проведение фармакологических исследований новых лекарственных композиций, в том числе содержащих наноком-поненты [2].

В рамках поставленной задачи был разработан состав гемостатического средства, включающий в качестве действующих веществ хлорид железа (III), аминокапроно-вую кислоту. Железо содержится в гемоглобине крови, участвует в кроветворении, введение его в данный препарат приводит к проявлению гемостатических свойств и предотвращает развитие

анемии. Введение аминокапроновой кислоты ингибирует активаторы профибри-нолизина и тормозит его превращение в фибринолизин. Для мягкой лекарственной формы в качестве мазевой основы выбрана смесь полиэтиленгликолей (ПЭГ) с молекулярной массой 400 и 1000, которая обеспечивает необходимую степень растворимости. Особенностью состава мягких форм является наличие наночастиц оксида железа (Fe304) или железа, покрытого углеродной оболочкой (Fe@C). В составе лекарственной формы они обеспечивают улучшение биодоступности. Данные наночастицы получены левитационно-струйным методом в среде газа-носителя в Институте физики металлов Уральского отделения Российской академии наук.

Цель исследования. Изучить показатели коагулограмм и оценить эффективность разработанных лекарственных форм, в том числе с нанокомпонентом.

Материал и методы исследования. Оценку гемостатической активности разработанных лекарственных форм проводили методом электрокоагулографии нативной донорской крови здоровых доноров-добровольцев (in vitro). Исследования осуществляли с применением

автоматического коагулометра ACL TOP 700 (IL Werfen, США) при помощи диагностических реагентов «Ренам». Измерения проводили в трех параллелях с постановкой контрольного опыта. В качестве контроля выступала нативная донорская кровь без добавления реагентов, раствор для инфузий аминокапроновой кислоты и мазь на основе полиэтиленгликолей 400 и 1000, а также без добавления действующих веществ. Полученные данные обработаны статистически с вычислением средних величин и их средних ошибок.

Методы оценки гемостатическо!

Достоверность различий оценивали по критериям Стьюдента, Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса (существенным считали различие, если показатель достоверности р < 0,05).

Состояние системы гемостаза оценивали унифицированными методами [3, 4], позволяющими охарактеризовать основные фазы свертывающего процесса: активированное частичное тромбопласти-новое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ), содержание фибриногена (ФГ) (табл. 1.):

Таблица 1. активности разработанных форм

Показатель Значение Метод определения Референтное значение

Активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АПТВ или АЧТВ) Характеризует интегральное состояние гемостаза после контактной активации, а именно влияние на факторы (I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII) Определяется время свертывания плазмы крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефали-ном)активации 25,4-38,4 с.

Протромбиновое время (ПВ) Характеризует суммарную активность факторов про-тромбинового комплекса, продуцируемых печенью Определяется время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы в присутствии ионов кальция и избытка тканевого тромбопла-стина По Квику - 70 -140, % МНО - 0.90 -1.20

Тромбиновое время (ТВ) Отражает время, необходимое для образования фибри-нового сгустка под действием тромбина Определяется время образования фибринового сгустка 11-17,8 с.

Концентрация фибриногена (ФГ) Характеризует образование фибрина, представляет собой финальный этап формирования тромба Исследуемую плазму крови разбавляют в 10 раз с целью снижения влияния ингибиторов тромбина. 2,00 - 4,00 г/л.

Результаты исследования и их об- наружного применения представлены в суждение. Результаты выявления гемо- таблице 2, для мягких форм в таблице 3 со-статической активности разработанных ответственно. лекарственных форм в виде раствора для

Таблица 2.

Показатели коагулограмм при изучении кровоостанавливающей активности раствора для наружного применения*

№ образца Состав образца Показатели коагулограммы

ЖХ\АК\НХ\ВО, г. АПТВ, с ПВ ТВ, с ФГ, г\л

по Квику, % МНО

1 0.2\0.2\0.4\100 18±1 80,6±2 1,04±0,4 6±2 3,1

2 0.3\0.4\0.1\100 15 ±2 67,7±0,9 0,95±0,3 5±1 3,0

3 0.2\0.4\0.2\100 21±1 78,7±0,9 1,01±0,4 8,3±2 3,2

4 - \0.5 \-\100 38±4 90,4±1,2 1,15±0,6 19±1 3,3

5 Контроль 35 ± 4 91,6±2 1,14±0,4 17,4±4 3.3

*Примечание: ЖК - железа хлорид, АК - аминокапроновая кислота, НХ- натрия хлорид, ВО - вода очищенная, АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время, ПВ - протромбино-вое время, МНО - международное нормализованное соотношение, ТВ - тромбиновое время, ФГ -фибриноген

Интерпретация данных коагуло-граммы при использовании растворов по показателю АПТВ позволяет утверждать, что наибольшее влияние на внутренние и внешние факторы свертывания оказывает влияние образец 2. В сравнении с контролем время свертывания плазмы крови сократилось на 57%. Определение протром-бинового времени по Квику при применении лекарственной формы уменьшилось от 91,6 % (контроль) до 67,7 % (образец 2). Возможно, это связано с тем, что показатель протромбиновое время зависит от функции печени синтезировать белки. Это позволяет судить о влиянии разработанной гемостатической композиции на коа-гуляционные факторы VII, V, X, II. Значительное влияние разработанная местная гемостатическая форма оказывает на

Таблица 3.

Показатели коагулограмм при изучении кровоостанавливающей активности мягких лекарственных форм с наночастицами*

показатель тромбиновое время, а именно при ее применении укорачивается время от 17 до 5 секунд (образец 2). Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина является заключительным этапом образования сгустка. Все анализируемые образцы оказали влияние на снижение концентрации фибриногена, следовательно, лекарственная форма оказывает влияние на конечный этап свёртывания крови (образование фибрина из фибриногена). В результате анализа показателей коагулограммы можно утверждать об активации внутрисосудистого гемостаза: в результате применения разработанной лекарственной формы уровень показателей АЧТВ, ТВ, ПВ достоверно снижался в сравнении с контрольными образцами.

№ образца Вид и масса наночастиц в составе образца, г. Показатели коагулограммы

АПТВ, с ПВ ТВ, с ФГ, г\л

по Квику, % МНО

1 Наночастицы Fe@C - 0.01 22 ±2 70,5±0,9 0,95±0,3 7,6±1 3,0

2 Наночастицы Fe@C - 0.1 35±1 85,0±0,7 1,05±0,6 8,1±2 3,0

3 Наночастицы Fe@C - 1.0 39±1 88,2±1 1,10±0,6 10,1±1 3,0

4 Наночастицы Fe304 - 0.01 20 ±2 71,7±0,9 0,98±0,3 7,3±1 3,0

5 Наночастицы Fe304 - 0.1 26±1 80,1±0,5 1,09±0,6 11,5±2 3.3

6 Наночастицы Fe304 - 1.0 31±1 81,7±0,9 1,12±0,6 18,2±1 3,0

7 ПЭГ-400-74,4 ПЭГ-1000-18,6 39± 3 92,7±0,4 1,18±0,6 17,9±4 3,0

8 Контроль 35 ± 4 91,6±2 1,14±0,4 17,4±4 3,0

*Примечание: Состав мазей представлен: аминокапроновая кислота - 5,0 г., хлорид железа (III) -2.0 г., ПЭГ-400 - 74,4г., ПЭГ-1000 -18,6 г. АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время, ПВ - протромбиновое время, МНО - международное нормализованное соотношение, ТВ -тромбиновое время, ФГ - фибриноген

Интерпретация данных коагуло-граммы при изучении кровоостанавливающей активности мягких лекарственных форм с наночастицами (табл. 3) по показателю АПТВ позволяет утверждать, что

наибольшее влияние на факторы свертывания оказывают влияния образцы 1 и 4 с наименьшим содержанием наночастиц (0,01%). Снижение значения АЧТВ в сравнении с контролем время свертывания

плазмы крови сократилось на 40%, это свидетельствует о влиянии исследуемой нанокомпонентной композиции на свёртываемость крови. Влияние нанокомпо-нентных мягких форм на факторы про-тромбинового комплекса доказывает снижение протромбинового времени.

Значительное влияние разработанная местная гемостатическая форма оказывает на показатель тромбиновое время, а именно при ее применении укорачивается время от 17 до 7 секунд (образец 1 и 4). Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина является заключительным этапом образования сгустка. Все анализируемые образцы мягких форм оказали влияние на снижение концентрации фибриногена, следовательно, лекарственная форма оказывает влияние на конечный этап свёртывания крови (образование фибрина из фибриногена).

При проведении коагуллопатиче-ских исследований по выявлению гемоста-тической активности разработанных ге-мостатических форм доказано, что все они обеспечивают укорачивание времени свертывания крови. Максимально выраженный гемостатический эффект среди растворов проявил образец № 2 (3,0 г хлорида железа, 4,0 г. аминокапроновой кислоты и 0,1 г. натрия хлорида). Наиболее высокий гемостатический эффект среди мазей проявили образцы с минимальной концентрацией нанокомпонента (0,01%), причем вид нанокомпонента на данный эффект не оказывает значительного влияния. Из этого можно сделать вывод, что увеличение концентрации наночастиц не оказывает статистически значимого влияния на гемостатические свойства препарата, максимально эффективной концентрацией наночастиц с необходимым фармакологическим эффектом можно считать - 0,01%.

Выводы. Исследуемые образцы разрабатываемой гемостатической композиции показали снижение концентрации фибриногена, следовательно, лекарственные формы оказывают влияние на конечный этап свёртывания крови (образование фибрина из фибриногена). В результате анализа показателей коагулограммы можно утверждать об активации внутри-сосудистого гемостаза: в результате применения разработанной лекарственной формы уровень показателей АЧТВ, ТВ, ПВ достоверно снижался в сравнении с контрольными образцами. Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанные составы обладают выраженной гемостатической активностью и могут быть рекомендованы в качестве средств для остановки местных видов кровотечений.