19
Применение 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана в качестве контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии на ядрах F
19
APPLICATION OF 1,3-BIS(PERFLUORO-TERT-BUTYL)PROPANE AS A CONTRAST AGENT FOR MAGNETIC RESONANCE IMAGING ON F NUCLEI

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к созданию биологически инертных эффективных контрастных соединений для получения магнитно-резонансных изображений, используемых в клинической диагностике.
Создание новых эффективных методов диагностики - одно из центральнных направлений современной биомедицины. Магнитно-резонансная томография (МРТ), в которой для визуализации структур внутренних органов используется наблюдение сигналов от ядер водорода молекул воды и органических молекул, входящих в состав мягких тканей и биологических жидкостей организма, за последние 30 лет стала одним из основных методов медицинских обследований. МРТ позволяет получать наиболее полную информацию о строении отдельных внутренних органов человека и животных, а также и всего тела в виде послойных срезов в разных плоскостях. Высокая разрешающая способность современных ЯМР-томографов, полная безвредность обследования для пациента (отсутствие облучения), а также возможность трехмерной визуализации объектов привели к тому, что МРТ прочно вошла в медицинскую практику во всех странах мира.
Несмотря на то, что с помощью МРТ на протонах достигнуты выдающиеся результаты в ранней диагностике патологий сердечно-сосудистой системы, в обнаружении канцерогенеза на начальных стадиях, в диагностике многих других социально-значимых заболеваний, жизнь выдвигает перед медиками и специалистами по МРТ все новые и все более сложные задачи. При этом все отчетливее проявляются и вполне очевидные недостатки традиционной МРТ на протонах.
13
23
31
19
1
1
Одной из наиболее изучаемых стратегий для преодоления этих недостатков - разработка «второго цвета» изображения за счет использования гетероядерного МРТ на таких ядрах, как С, Na, Р и F, в добавление к Н-МРТ. В этом случае к анатомической картине в серой шкале H-изображения добавится МРТ-изображение другого цвета, несущее дополнительную информацию от добавочного ядра. Высокий магнитный момент ядра фтора 19, близкая к протонам относительная чувствительность и его 100%-ное природное содержание, делают фторсодержащие соединения (фторуглероды, ФУ), наиболее привлекательными для МРТ, они могут служить контрастными агентами (КА) и выполнять роль идеальных меток с высокой специфичностью. Определенным препятствием для использования ФУ, является их одновременная гидрофобность и липофобность, которые делают ФУ нерастворимыми в воде и биоматериалах. Метод, позволяющий обойти неблагоприятные физико-химические характеристики фторуглеродных соединений и гарантировать высокую локальную концентрацию фтора в желаемой части тела, заключается в получении устойчивых наноразмерных эмульсий ФУ в воде. Первые наноразмерные эмульсии фторуглеродов были созданы около 50 лет назад в качестве кровезаменителей для транспортировки кислорода и углекислого газа. В последние годы эти эмульсионные системы привлекают все большее внимание исследователей. Эмульсии можно формировать, используя различные гидрофильные полимеры в широком диапазоне размеров частиц (90 нм - 1 мкм) и поверхностных зарядов (-95 мВ - 65 мВ). Поверхность эмульсионных частиц может модифицироваться, ковалентно или нековалентно через in-situ или post-эмульсионную модификацию. Таким образом, частицы эмульсии могут служить средством доставки широкого круга лекарственных препаратов и/или служить метками для различных типов клеток. Фторуглеродное ядро при этом служит контрастным агентом для МРТ.
19
МРТ и спектроскопия на ядрах F позволяет идентифицировать клетки различных типов после того, как их удается пометить с помощью наноразмерных частиц ФУ in-vitro или in-vivo.
19
19
При внутривенном введении ФУ-эмульсии ее частицы захватываются моноцитами, В-клетками, нейтрофильными гранулоцитами и локальными макрофагами, которые становятся помеченными F и могут «высвечиваться» после инфильтрации этих клеток в зонах воспаления с помощью F-MPT.
19
Накопление ФУ в зонах повреждений может происходить не только за счет работы ретикулоэндотолиальной системы, но и за счет течей в эндотелиальном барьере. В печеночных синусоидах имеются нарушения эндотелия с порами порядка 100 нм, селезенка имеет щели в несколько сот нм, а в эндотелии воспаленной ткани и опухолях имеются поры порядка 400 нм. Эти поры позволяют наночастицам эмульсий из кровеносного русла проникать в ткани. Так как опухоли, так же как воспаленные ткани, характеризуются повышенным притоком крови и сниженным дренажем через лимфатическую систему, наночастицы временно там накапливаются. Этот эффект может использоваться и для терапевтических целей и для F визуализации.
19
Степень F-маркировки зоны воспаления зависит от количества и активности моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов в кровеносном русле и способности фторуглеродных эмульсионных частиц диффундировать через эндотелиальный барьер. Именно эти факторы ответственны за брутто количество фторуглеродной метки, оказавшейся в зоне воспаления.
Однако для конечного детектирования критически важно и строение ФУ используемого в качестве контраста, а именно количество магнитно-эквивалентных атомов фтора в его молекуле, имеющих одинаковый химический сдвиг в ЯМР-спектре.
1
В настоящее время в мире используется достаточно ограниченное число ФУ для приготовления наноразмерных эмульсий. Главным образом это ФУ, предназначенные для кровезамещающих эмульсий с газотранспортной функцией. Выбор и производство этих ФУ определялся набором критериев необходимых для создания кровезаменителей с газотранспортной функцией. Для этой цели требовались инертные ФУ способные давать стабильные эмульсии и достаточно быстро выводящиеся из организма. Для МРТ-визуализации помимо этих критериев, возникает требование максимальной контрастности, то есть максимально большого количества магнитно-эквивалентных атомов фтора на грамм-молекулу ФУ при минимально возможном времени релаксации T.
19
19
2
В настоящее время для целей F-MPT в научной литературе наиболее популярны два самых контрастных соединения - перфтор-15-краун-5 эфир (Exfluor Research ТХ), имеющий в своем составе 20 магнитно-эквивалентных атомов фтора, составляющих 65,5% молекулы [WO 2005/072780 А2, Cellular labeling for nuclear magnetic resonance teghniques, Eric T. Arens] и перфторполиэфир (ПФПЭ) (Fomblin Z) - линейный перфорированный олигомер окиси тетрафторэтилена. ПФПЭ представляет собой высоко гидрофобное и олеофобное масло с высокой температурой кипения, молекулярным весом порядка 1700 Da и низким поверхностным натяжением. В каждой молекуле содержится порядка 55 атомов фтора и основная их часть, т.е. атомы фтора, входящие во фрагменты -CFO, являются магнитно-эквивалентными и дают в спектре ЯМР F синглет [Jelena М. Janjic, Mangala Srinivas, Deepak K.K. Kadayakkara, and Eric Т. Ahrens, Self-delivering Nanoemulsions for Dual Fluorine-19 MRI and Fluorescence Detection, J. Am. Chem. Soc, 2008, 130, 2832-2841. US Pat. 8,227,610 B2, 2012, Compositions and methods for producing cellular labels for nuclear magnetic resonance techniques, Jelena Janjic, Eric T. Arens]. Концевые сложноэфирные группы этих ПФПЭ превращали в различные производные, содержащие красители. Ковалентно связанные флюоресцентные фрагменты на фторированной молекуле позволяют проводить дополнительный оптический контроль за клетками.
Эти соединения используются исключительно в опытах на животных, поскольку время их полувыведения из организма превышает 150 дней.
Активно используются менее контрастные соединения, разработанные ранее для приготовления кровезаменителей с газотранспортной функцией - перфтороктилбромид и транс-бис(перфторбутил)этилен (F-44-E) [Christoph Jacobya, Sebastian Temmea, Friederike Mayenfelsb, Nicole Benoitc, Marie Pierre Krafft, Rolf Schubertb, Jurgen Schradera and Ulrich Flogela, Probing different perfluorocarbons for in vivo inflammation imaging by 19F MRI: image reconstruction, biological half-lives and sensitivity, NMR Biomed. 2014; 27: 261-271].
Эти соединения имеют более короткие сроки полувыведения - 14 и 28 дней соответственно. Однако, ЯМР-спектры этих соединений имеют сложную структуру (несколько сигналов с различным химическим сдвигом) и только 8 и 6 магнитно-эквивалентных атомов фтора соответственно в каждом из этих соединений. В перфтороктилбромиде магнитно-эквивалентные атомы фтора составляют 30,5%, а в транс-бис(перфторбутил)этилене 24,6%.
2
Описан целенаправленный синтез частично фторированных соединений - перфорированных эфиров различного строения, содержащих одну или две концевые CFH-группы [RU №2159610, 27.11.2000. Мур Джордж Дж., Флинн Ричард М., Гуэрра Мигель А.. Физиологически приемлемые эмульсии, содержащие гидриды перфторуглеродного эфира, и способы их использования.]. Показано, что данные соединения приобретают повышенную липофильность и скорость их выведения заметно возрастает. При этом токсических свойств за период наблюдения не наблюдалось. Однако эти соединения имели сложные ЯМР-спектры и, априори, не высокие контрастные показатели.
Перспективным перфорированным фрагментом для введения в молекулу магнитно-эквивалентных атомов фтора является перфтор-трет-бутильная группа. В результате замещения 4 гидроксильных групп в пентаэритрите на перфтор-трет-бутоксильные группы было синтезировано соединение, названное авторами Perfecta, которое содержит 36 магнитно-эквивалентных атомов фтора [Ilaria Tirotta, Alfonso Mastropietro, Chiara Cordiglieri, Lara Gazzera, Fulvio Baggi, Giuseppe Baselli, Maria Grazia Bruzzone, Ileana Zucca, Gabriella Cavallo, Giancarlo Terraneo, Francesca Baldelli Bombelli, Pierangelo Metrangolo, and Giuseppe Resnati, A Superfluorinated Molecular Probe for Highly Sensitive in Vivo19F-MRI. J. Am. Chem. Soc, 2014, 136 (24), pp 8524-8527].
Однако это соединение имеет М 1008, т. пл. 60°С и не может выводиться из организма в разумные сроки.
19
Существует потребность в расширении арсенала контрастных агентов на основе фторорганических соединений, применимых для F-MRT, которые должны отвечать следующим требованиям:
- максимально возможное содержание магнитно-эквивалентных атомов фтора в молекуле;
- оптимальные для целей МРВ времена релаксации Т1 и Т2.
- достаточная для целевого применения биологическая инертность;
- температура кипения, лежащая в интервале 140-170°С или упругость пара, которая обеспечит достаточную скорость испарения вещества через мембрану альвеол;
- достаточная липофильность, за которую может отвечать углеводородный фрагмент гибридной молекулы, который должен обеспечивать проницаемость сквозь липидную мембрану альвеол.
Фторуглероды могут накапливаться в тканях человека при вдыхании, проглатывании или внутривенном введении на некоторое время. Поскольку метаболизму эти соединения не подвергаются из-за чрезвычайной прочности C-F связи, основным путем их выведения является выдыхание через легкие. Время, в течение которого они остаются в организме, зависит от скорости диффузии молекул через клеточные мембраны в альвеолах легких. Таким образом, ключевыми параметрами, влияющими на скорость выведения фторуглеродов, являются их липофильность и молекулярная масса (упругость пара): чем они лучше проникают сквозь липидную мембрану альвеол и чем более они летучи, тем короче их период полувыведения, который может варьироваться от часов до лет. Фактически, реализуются мембранные процессы с фазовым переходом или испарение через мембрану (первапорация).
При комбинировании в одной молекуле фторсодержащего и углеводородного фрагментов возникает необходимость учитывать возможные метаболические превращения. Многие ксенобиотики, попав в организм, подвергаются биотрансформации и выделяются в виде метаболитов. Алканы подвергаются ферментативной атаке посредством α, β или ω-гидроксилирования в микросомах печени. Биологический смысл явления - превращение химического вещества в форму, удобную для выведения из организма. Известно, что насыщенные н-алканы легко окисляются до жирных кислот у крыс. Как первичные, так и вторичные связи С-Н могут быть атакованы. В ходе биопревращений липофильный и, следовательно, трудновыводимый ксенобиотик становится гидрофильным продуктом, что обусловливает возможность его быстрой экскреции.
Сочетание в одной молекуле фторсодержащего и углеводородного фрагментов повышает гидрофобность молекулы и потенциально замедляет процесс гидроксилирования, однако вносит дополнительный риск возможного дегидрофторирования с высвобождением токсичного иона фтора. Для минимизации или предотвращения потенциальной токсичности необходимо, чтобы связь между фторалкильной и углеводородной частью молекулы была спроектирована таким образом, чтобы свести к минимуму возможность ферментативных или неферментативных реакций деградации. Наилучшим путем является соединение перфторалкильной и углеводородной частей гибридной молекулы через третичный атом углерода. Максимально замедлить или вообще исключить возможность метаболизма углеводородного фрагмента гибридной молекулы может гантелеобразная структура, в которой углеводородная часть находится между двумя перфторалкильными группами. Такая молекула будет максимально гидрофобна. Центральная углеводородная часть молекулы будет придавать определенную липофильность гибридной молекуле, что будет влиять на скорость ее выведения из организма через механизм первапорации. Соответственно, время нахождения вещества в организме будет снижаться.
Известны фторорганические соединения, включающее перфторуглеродный и углеводородный фрагменты, где углеводородная часть находится между двумя перфторалкильными группами, например 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропан (CAS Registry Number 67728-37-4) [Kirby V. Sherer, Novel fluorohydrocarbons, US Patent 4,173,654 Nov. 6, 1979. CA No 67728-37-4]. Данное соединение было синтезировано для использования в качестве кровезаменителя или электронной жидкости.
В литературе не имеется данных о токсичности и контрастных свойствах этого соединения.
19
Задача изобретения состояла в разработке эффективного контрастного агента, обладающего свойствами, которые делают возможным его применение in vivo для МРТ на ядрах F.
19
Технический результат - новый фторорганический контрастный агент для МРТ на ядрах F, применимый на живых объектах и расширение ассортимента контрастных веществ для МРТ.
19
Поставленная задача решается применением 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана в качестве контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии на ядрах F, причем 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропан используют в виде наноразмерной водной эмульсии на живых объектах.
1,3-Бис(перфтор-трет-бутил)пропан содержит 18 магнитно-эквивалентных атомов фтора, которые дают интенсивный сигнал с химическим сдвигом -66,95 м.д. Содержание атомов фтора в молекуле составляет 71,25% (М=480). Для сравнения, прототип - молекула PERFECTA (М=1008) - содержит 36 магнитно-эквивалентных атомов фтора, но их содержание в молекуле составляет 67,83%. Таким образом, при одинаковом мольной концентрации в единице исследуемого методом МРТ объема объекта, будет содержаться чуть большее чем у Perfecta количество атомов фтора, обеспечивающих интенсивность сигнала. Т. кип. 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана равна 154-155°С, что соответствует ранее сформулированным требованиям.
1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропан образуется при взаимодействии перфтор-трет-бутил аниона с дибромпропаном. Авторы настоящего изобретения осуществили синтез 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана по следующей схеме:
Изобретение иллюстрируется приведенными фигурами и примерами.
На фиг. 1 представлены спектры ЯМР 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана:
1
19
(А) Н-ЯМР, (Б) F-ЯМР.
На фиг. 2 показаны фотографии, поясняющие процесс изготовления эмульсии: (а) смесь фторуглерода и Проксанола-268 до эмульгирования при простом перемешивании; (б) та же смесь сразу после завершения эмульгирования; (в) визуальный анализ прозрачности полученной эмульсии.
19
На фиг. 3 представлены F-MPT изображения лабораторной крысы, полученные в разное время после введения 0.5 мл 10%-ной эмульсии 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана.
Графики изменения значений интегрального сигнала в печени (А) и жировой ткани (Б) стечением времени представлены на фиг. 4.
На фиг. 5 изображена зависимость выживаемости клеток от концентрации 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана.
Пример 1. Получение 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана
2
4
В трехгорлую колбу объемом 250 мл, снабженную магнитной мешалкой, термометром и охлаждаемой жидким азотом насадкой, соединенной со склянкой Тищенко с HSO, помещали 150 мл диглима и высушенного при 300°С в вакууме и тщательно измельченного CsF (24 г, 158 ммоль). После интенсивного перемешивания в течение 15 минут медленно барботировали в полученную суспензию перфторизобутилен (30 г, 150 ммоль), предварительно собранный при охлаждении жидким азотом в сосуде Шленка, перемешивание проводили до получения практически гомогенного раствора, представляющего собой равновесный раствор перфтор-трет-бутилата цезия в диглиме. К полученному раствору по каплям добавляли 1,3-дибромпропан (14.8 г, 75 ммоль) в 15 мл диглима в течение 30 минут. Температура реакционной смеси при этом повышалась до 35°С и наблюдалось образование желтоватого осадка. Реакционную смесь перемешивали 2 часа и оставляли на ночь.
3
3
К полученному раствору с обильным осадком присоединяли прямой холодильник с ловушкой, охлаждаемой сухим льдом, и отгоняли продукты реакции, отбирая фракции с т. кип. 35-70°С (20 мл, основной продукт фракции - моногидроперфторизобутан (CF)CH) и с т. кип. 145-155°С (70 мл). К последней фракции добавляли равный объем воды, отделяли нижний органический слой, промывали его 5%-ным раствором HCl, затем несколько раз водой. Далее к органическому слою (при комнатной температуре загустевает) добавляли равный объем метанола и оставляли в холодильнике. Через 20 минут получали раствор с бесцветным кристаллическим осадком. Жидкую фазу отделяли, осадок "растапливали" при температуре 40°С и всю процедуру повторяли еще раз. После отделения жидкой фазы осадок сушили в вакууме водоструйного насоса 2 часа. В результате был получен 1,3-бис-перфтор-трет-бутилпропан, 13.0 г (выход 37%), т. кип. 154-155°С.
1
19
3
Спектры ЯМР Н и F регистрировали на спектрометрах Bruker АМХ-400 и АМХ-300 с частотой 400.13 и 376.50 МГц при 20°С, отнесение сигналов проводили относительно сигнала остаточных протонов растворителя (CDCl).
1
19
13
13
1
1
19
13
3
2
2
2
3
3
C-F
C-F
Анализ полученного продукта проводили методом регистрации Н, F и С спектров ЯМР, представленных на фиг. 1. Окончательный вывод о строении соединения сделан на основании данных полученных методом HSQC С-Н спектроскопии ЯМР. Спектры ЯМР (CDCl, δ, м.д., J/Гц): Н ЯМР: 2.06 (м, 6Н, СНСНСН). F-ЯМР: -66.95 (с, 18F, 2 (CF)C). С ЯМР: 17.60, 27.39, 58.57, (м, J=25.3,), 119.90 (кв, J=297.5).
19
19
Тестирование синтезированного 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана проводили на 7 Тл MP томографе BrukerBioSpec 70/30 USR. Релаксационные измерения проводили также и на 0.5 Тл клиническом МР-томографе BrukerTomikon S50. Для проведения F-MPT исследований в поле 7 Тл использовали объемную РЧ катушку фирмы Bruker «птичья клетка» (birdcage) внутреннего диаметра 72 мм. Для проведения F-MPT исследований в поле 0.5 Тл использовали специально разработанную приемо-передающую РЧ-катушку, работающую на частоте ядер фтора 19.83 МГц.
1
Для измерения времени T использовали ИП инверсия-восстановление со следующими параметрами сканирования:
90
180
1
s
s
- для поля 7 Тл: в качестве возбуждающего 90° (Р) и инвертирующего 180° (P) применяли импульсы прямоугольной формы одинаковой мощности с длительностями 450 и 900 мкс; задержка между срабатыванием ИП (d) - 8 с; проводили 16 экспериментов с различными задержками между 180° и 90° импульсами (d) - 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1, 1.4, 1.8, 2.5, 3, 4, 5, 7 с; количество dummy сканов (d) - 4, накоплений (n) - 8. Полное время сканирования - 26 мин 26 с.
180
90
1
s
s
- для поля 0.5 Тл: P=900 мкс, Р=450 мкс, d=5 с, проводили 13 экспериментов с параметром d=0.001, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.35, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5 с, d=0, n=1.
2
90
180
1
s
s
20
2
180
90
1
20
s
s
Для измерения времени Т в поле 7 Тл использовали метод CPMG (Карра-Перселла-Мейбума-Гилла) со следующими параметрами сканирования: Р=450 мкс, рефокусирующий P=900 мкс, d=8 с, n=8, d=16. Задержка между соседними импульсами (d) - 50 мс. В экспериментах регистрировали 32 эхо сигнала. При измерении времени Т в поле 0.5 Тл использовали ИП спиновое эхо со следующими параметрами сканирования: P=900 мкс, Р=450 мкс, d=5 с, d=10, 20, 40, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700 мс, d=0, n=1.
1
2
В табл. 1 приведены полученные значения времен релаксации T и Т для 1,3-ди(перфтор-трет-бутил)пропана в поле напряженностью 7 Т и 0,5 Т.
Эмульсии 1,3-ди(перфтор-трет-бутил)пропана получали с помощью ультразвукового диспергатора UltrasonicHeatSystem W375. Была приготовлена 10% об. эмульсия с использованием в качестве стабилизатора блок-сополимера окиси этилена и окиси пропилена - Проксанола-268 в концентрации 13%. На фиг. 2 представлены фотографии процесса изготовления эмульсии.
Процесс изготовления эмульсии заключался в следующем. В стеклянную кювету с круглым дном объемом 25 мл помещали 9 мл 13% водного раствора Проксанола-268 и 1,7 г эмульгируемого фторсодержащего соединения. Зонд диспергатора диаметром 1 см погружали в кювету и производили «озвучивание» смеси, охлаждаемой водой со льдом в пульсирующем режиме 50/50 в течение 5-6 минут. Затем проводили визуальный контроль за состоянием эмульсии и в случае недостаточной прозрачности процесс повторяли.
19
Синтезированный 1,3-ди(перфтор-трет-бутил)пропан в виде наноразмерной эмульсии был испытан в качестве контрастного вещества для метода F-MPT на лабораторных крысах.
~
19
Животным (беспородные самки весом 250 г) внутривенно вводили через яремную вену по 0.5 мл 10 об. %-ной эмульсии. Изучали поведение 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана в организме, характер его распределения в органах и тканях и определяли время выведения этого соединения из организма крыс. Внешнего токсического эффекта от введенной эмульсии у животных не наблюдали. МРТ-исследования проводили через 1 ч после введения эмульсии в течение 21 дня. На фиг. 3 представлены F-MPT изображения лабораторной крысы, полученные в разное время после введения 0.5 мл 10%-ной эмульсии 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана, а на фиг. 4 - графики выведения 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана из печени (фрагмент А) и из жировой ткани (фрагмент Б).
19
По результатам данного исследования можно заключить, что через ~1.5 ч после введения 0.5 мл 10%-эмульсии 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана F-сигнал ЯМР регистрируется от области введения (яремной вены), а также в печении селезенке. При этом пик накопления 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана в печени приходится на 4-ый час после введения эмульсии. Эффективное время выведения 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана из печени составляет ~0.11±0.01 дня (~2.6±0.2 ч).
19
Постепенно 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропан начинает накапливаться в жировой ткани, и максимальный F-сигнал от данного соединения регистрируется на 2-ой день после введения эмульсии. В области легких сигнал не визуализируется.
Эффективное время выведения 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана из жировой ткани составляет ~4.8±0.4 дня. Учитывая данные спектроскопии, можно полагать, что полное время выведения 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана из организма лабораторной крысы при указанном количестве эмульсии составляет ~30 дней.
2
Оценку токсичности 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана проводили с помощью клеточного теста. Для экспериментов использовали клеточную линию человека ПФЧ (неопухолевые фибробласты человека, иммортализованные h-TERT), которая была протестирована в American Type Culture Collection, США. Клетки культивировали в среде DMEM. В культуральную среду добавляли следующие компоненты до конечных концентраций: эмбриональную телячью сыворотку - 10%, L-глутамин - до 2 mM, пенициллин - 100 ЕД/мл, стрептомицин - до 100 мкг/мл (среды и добавки производства ПанЭко, Россия), инкубацию проводили при 37°С, 5% CO в увлажненной атмосфере. В экспериментах использовали культуру в логарифмической фазе роста. Для профилактики микоплазменного заражения использовали препарат Mycokill (GE, США). Перед началом экспериментов проводили не менее трех пассажей на свободной от антимикоплазменного препарата среде.
Образец 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана использовали в виде раствора 20 мМ в ДМСО. Раствор хранили при +4°С, размораживали при комнатной температуре непосредственно перед использованием.
МТТ-тест для исследования цитотоксичности
50
Цитотоксическое действие соединений исследовали методом МТТ-теста (по способности восстановления желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола в темно-синий кристаллический формазан митохондриями живых клеток). По результатам исследования цитотоксичности построены кривые выживаемости и определены показатели IC (концентрации, необходимые для гибели 50% клеток).
2
2
Клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в 190 мкл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37°С, 5% CO, в увлажненной атмосфере. Вносили по 10 мкл исследуемого раствора в культуральной среде, приготовленных серийными разведениями из исходного раствора, до конечных концентраций 0,4-200 мкмоль/л (конечная концентрация растворителя не превысила 0,5% об.). Контролем служили клетки без препарата (интактный контроль). Положительным контролем служил доксорубицин (Teva, Нидерланды), показавший цитотоксичность 0,5 мкМ. В эксперименте клетки инкубировали 72 часа при 37°С, 5% CO, в увлажненной атмосфере, за 2 часа до окончания инкубации клеточную среду меняли на свежую и в лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия). После окончания инкубации клеток с МТТ-реагентом культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 540 нм. Процент клеток, выживших при действии каждой концентрации исследуемого вещества, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных лунок (значения последних приняты за 100%). Каждую концентрацию изучали с 3-х кратной статистикой, приводили усредненные данные по результатам четырех независимых экспериментов. Стандартные отклонения приведенных на графике средних значений не превысили 10% от среднего.
50
1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропан вызывает дозозависимую гибель, но показатель IC не достигнут. До 25 мкМ соединение вызывает незначительную гибель клеток. На фиг. 5 представлена зависимость выживаемости клеток от концентрации 1,3-бис(перфтор-трет-бутокси)пропана.
19
Таким образом, комплекс исследований 1,3-бис(перфтор-трет-бутил)пропана показал его высокую эффективность в качестве контрастного вещества для магнитно-резонансного сканирования на ядрах F, его скорость выведения из организма составляет примерно 30 дней, что существенно меньше, чем у аналогов и прототипа, соединение нетоксично при применяемых концентрациях, как по результатам клеточного теста, так и по результатам in vivo экспериментов в течение их проведения.