Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными аэробными метилотрофными бактериями Methylobacterium extorquens D10, образующими цитокинины, ауксины и витамин B12

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 1. С. 215-225

Биология =

УДК 581.1;581.143.5

Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными аэробными метилотрофными бактериями Methylobacterium extorquens D10, образующими цитокинины, ауксины и витамин B12

Н.В. Доронина, Д.Н. Федоров, М.В. Шихсаидов, О.Н. Понаморева

Аннотация. Исследовано влияние розовоокрашенных аэробных метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens D10 на рост и морфогенез растений табака и пшеницы, размножаемых in vitro. Колонизация метилобактериями эксплантов приводила к их стабильной ассоциации с растениями, у которых повышались скорость роста, регенерационный потенциал и способность к корнеобразованию.

В культуральной жидкости M. extorquens D10 обнаружены цитокинины и ауксины, а в клетках — высокое содержание витамина B12. Полученные данные указывают на перспективность применения метилобактерий в биотехнологии растений.

Ключевые слова: аэробные метилотрофные бактерии, Methy-lobacterium extorquens, колонизация растений, стимуляция роста и морфогенеза, зеатин (рибозид), индолилуксусная кислота, витамин B12.

Аэробные метилотрофные бактерии, использующие метанол и другие окисленные или замещенные производные метана, но не метан, в качестве источников углерода и энергии, называются метилобактериями. Они широко распространены в природе и ассоциированы с растениями. Метилобактерии обнаружены в семенах, филлосфере и ризосфере растений (Corpe and Rheem, 1989; Holland, 1997; Доронина с соавт., 2000, 2004). Это обусловлено тем, что летучие органические Ci-соединения являются естественными продуктами метаболизма растений. Ежегодно растения образуют около 100 млн. т С метанола, который поступает в атмосферу (Galbally and Kirstine, 2002). В разных компартментах растительных клеток обнаружены интермедиаты Ci-метаболизма: метанол (1 мкмоль/г веса сырой биомассы), формиат (0.1-1 мкмоль/г веса сырой биомассы) и формальдегид (0.1-10 мкмоль/г веса сы-

рой биомассы), которые участвуют в биосинтезе белков, нуклеиновых кислот, пантотеновой кислоты, большого количества метилированных соединений и связаны со стабилизацией пектина и деградацией лигнина в клеточных стенках растений (Hanson and Roje, 2001). Большая часть формальдегида обратимо связана с различными клеточными нуклеофилами (глутатионом, аргинином, тетрагидрофолатом), в то же время метанол и формиат могут освобождаться из С i-метаболизма растительных клеток и выделяться в межклеточное пространство, откуда через устьица поступают в атмосферу. В связи с этим не удивительно, что метилобактерии присутствуют в филло-сфере и ризосфере, успешно конкурируя с другими микроорганизмами. При этом, в отличие от патогенов, метилобактерии не оказывают негативного воздействия на растения. Наоборот, они регулируют рост и развитие растений посредством синтеза фитогормонов, повышают устойчивость растений при различных стрессах, способствуют выживаемости (Доронина с соавт., 2009).

Недавно нами выделен из ризосферы пырея ползучего (Elytrigia repens L.) штамм D10, на основании секвенирования гена 16S рРНК имеющий гомологию 99.9% с типовой культурой Methylobacterium extorquens ВКМ B-2064T (=NCIMB 9399T) и в связи с этим, отнесенный к данному виду. Однако в отличие от типовой культуры, штамм D10 является ограниченнофакультативным метилотрофом: не растет на богатых средах (кровяном и мясопептонном агаре, сахарах, аминокислотах), следовательно, не способен расти на средах, используемых для культивирования растений in vitro, не может быть патогенен для человека и животных и более перспективен как стимулятор роста и развития растений.

Цель данной работы — анализ влияния штамма Methylobacterium extorquens D10 на рост и морфогенез колонизированных им растений, культивируемых in vitro, и его способности синтезировать цитокинины, ауксины и витамин Bi2.

Методика

Для изучения влияния метилобактерии на рост и морфогенез растений использовали гнотобиотические растения табака (Nicotiana tabacum L.) сорт Самсун и пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) сорт Мироновская, культивируемые in vitro. Стерильные растения культивировали на среде Мурасиге-Скуга (МС) (Murashige and Skoog, 1962). Проростки (3 см) табака культивировали в стеклянных пробирках (20 х 3 см) с 15 мл агаризованной среды МС. В качестве эксплантов для индукции каллуса у пшеницы использовали незрелые зародыши растений, образовавшиеся на 14-16 сутки после цветения. Зародыши вычленяли из семян и переносили на чашки Петри с агаризованной средой МС с добавлением 2.0 мг/л 2,4-дихлорофеноксиуксусной кислоты (2,4-D). Через две недели после начала культивирования учитывали число образовавшихся первичных побегов зародыша. Эти побеги удаляли как в контрольных, так и опытных вариантах. В конце нулевого пассажа

(через один месяц от начала культивирования эксплантов) оценивали кул-лусообразующую способность эксплантов пшеницы и число морфогенных каллусов. Как морфогенные, так и неморфогенные каллусы, переносили на среду МС с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина и 0.05 мг/л ин-долилуксусной кислоты (ИУК). Регенеранты пшеницы 4-5 см отделяли от каллуса и переносили в стандартную среду МС, содержащую 1 мг/л ИУК для укоренения.

Все растения культивировали при температуре 22-24 0С, фотопериоде 16 ч и интенсивности освещенности 2000 люкс. Культивирование растений в теплице проводили при температуре 22-24 0C, относительной влажности воздуха 60-70 % и освещенности 2500 люкс. Проростки табака колонизовали, нанося культуру бактерий стерильной кисточкой на всю поверхность черенка. Контрольные растения обрабатывали стерильной средой «К» с 0.5 % метанола.

Для исследования влияния метилобактерий на морфогенез пшеницы мягкой проводили инокуляцию незрелых зародышей непосредственно при вычленении их из семени, полностью погружая зародыши на 3 мин в бактериальную суспензию клеток в экспоненциальной фазе роста. После обработки зародыши пшеницы подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и переносили на среду для каллусообразования и культивировали в тех же условиях, что и неколонизованные экспланты. В качестве контроля использовали незрелые зародыши пшеницы, обработанные в течение 3 мин средой «К» с 0.5 % метанола.

Содержание пигментов (хлорофиллов a и b и каротиноидов) в одномесячных укорененных регенерантах пшеницы измеряли спектрофотометрически при длинах волн 662 и 664 нм, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов a и b и 440.5 нм — максимум каротиноидов. Перед анализом листья взвешивали, затем замораживали в жидком азоте и растирали в ступке, добавляя к гомогенату охлажденный (—200С) 80%-ный ацетон. Экстракцию ацетоном проводили при —200С в течение 2 ч в темноте, осадок отделяли центрифугированием (19000 g, 15 мин), супернатант использовали для измерений содержания пигментов (Васильева, 1978). Полученный осадок дважды промывали 80 %-ным ацетоном, высушивали под вакуумом и экстрагировали растворимые белки 50 мМ Трис-HCl с 5 мМ ЭДТА при комнатной температуре в течение 1 ч. Нерастворимую фракцию удаляли центрифугированием (19000 g, 15 мин). В супернатанте определяли содержание растворимых белков по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Удельную плотность листа (УПЛ) определяли как отношение единицы массы листа к единице площади (г/дм2). Возрастание или уменьшение величины УПЛ адекватно изменению ассимиляционной поверхности листа (Чернядьев, 2001).

В работе использовали стандартные методы статистической обработки (Лакин, 1990). Биологической параллелью (повторностью) служили 250 экс-плантов пшеницы и 10 пробирок с единичными проростками табака.

Для тестирования растительных тканей на присутствие метилобактерий и определения их количества на колонизованных растениях образец растирали в стерильной ступке и суспендировали в среде «К». После приготовления серии разведений, аликвоты суспензий высевали на агаризованную среду «К» (2 % агара Difco, США), инкубировали при 29 0С в течение 7 сут и просчитывали колонии (КОЕ).

Метилобактерии выращивали на среде «К», содержащей (г/л): KH2PO4 - 2; (NH4)2SÜ4 - 2; NaCl - 0.5; MgSÜ4 х 7H2O - 0.025; FeSÜ4 х 7H2O — 0.002, рН 7.2 при 29 0С в колбах объемом 0.75 л на качалке (180 об/мин). Метанол вносили в стерильные среды в концентрации 0.5 % (по объему). Для колонизации растений использовали жидкие культуры метилобактерии в конце экспоненциальной фазы роста с оптической плотностью суспензии 1.6-1.8 (600 нм), соответствующей концентрации бактерий 1 х 109 клеток/мл. При анализе содержания в культуральной среде ауксинов, использовали среду, в которой источником азота служил KNO3 (1 г/л) вместо (NH4)2SÜ4.

Для анализа содержания в культуральной жидкости фитогормонов, 1 л культуральной среды M. extorquens D10 в конце экспоненциальной фазы роста центрифугировали (10000 g, 20 мин), клетки удаляли. Лиофилизованную культуральную жидкость суспендировали в 80 % метаноле и выдерживали в темноте в течение 16 ч при +4 0С. После упаривания метанола, водный остаток нейтрализовали до pH 7.5 и экстрагировали цитокинины равным объемом водонасыщенного бутанола.

Ауксины эктрагировали из подкисленного водного остатка (HCl до pH 2.5-3.0) культуральной жидкости метилобактерии равным объемом этилаце-тата. Бутанольные и этилацетатные экстракты упаривали, сухие остатки растворяли в 80%-ном этиловом спирте.

Идентификацию цитокининов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ауксинов — ВЭЖХ, а также с помощью масс-спектрометра Finnigan MAT3430 при напряжении в инжекторе 70 электронвольт (Доронина с соавт., 2002). В качестве стандартов использовали зеатин, зеатинрибозид, бензиламинопурин, изо-пентениладенин, изопентениладенозин, ИУК, индолил-3-молочную кислоту (ИМК), индолил-3-пировиноградную кислоту (ИПвК), индолил-3-ацетамид, индолил-3-уксусный альдегид, индолил-3-метанол («Sigma», США).

Содержание витамина B12 анализировали с помощью ауксотрофного по витамину B12 штамма Escherichia coli 113-3, как описано ранее (Иванова с соавт., 2006).

Результаты и их обсуждение

При колонизации метилобактериями растений табака визуально наблюдали более интенсивный рост этих растений, по сравнению с контрольными неколонизованными (рис. 1). Все колонизованные растения отличались от

контрольных по внешнему виду и даже при культивировании на средах без

Рис. 1. Растения табака на среде МС без витаминов через 2 недели культивирования: 1-контроль, 2-колонизованные Methylobacterium

extorquens D10

витаминов, имели ярко-зеленую окраску, большие листья и хорошо развитые корни.

В качестве эксплантов пшеницы использовали незрелые зародыши сорта Мироновская яровая. Уже на третьи сутки после эксплантирования незрелых зародышей на среде для каллусообразования начиналось образование каллусной ткани, как на контрольных, так и на инокулированных метилобак-терией эксплантах. На 6-7 сутки культивирования этот процесс наблюдали у всех способных к каллусогенезу эксплантов пшеницы. Завершение процесса каллусообразования у эксплантов, инокулированных M. extorquens D10 и контрольных, был отмечен к 14 сут. Известно, что у незрелых зародышей пшеницы, помещенных на среду для каллусообразования, нередко происходит нежелательное явление — прорастание первичного (апикального) побега на 7-14 сут культивирования, рост которого значительно тормозит образование каллусной ткани в дальнейшем, и соответственно — выход побегов. Индукцию первичного каллуса и интенсивное прорастание первичного побега объясняют высоким уровнем эндогенных цитокининов в клетках незрелых зародышей пшеницы, что позволяет рассматривать гормональный баланс как возможную основу компетентности тканей растения к образованию морфогенного каллуса (Копертех, Бутенко, 1995а, б). В наших экспериментах инокуляция эксплантов M. extorquens D10 приводила к значительному снижению числа основных побегов, образующихся из ткани незрелого зароды-

ша. Как в контрольных, так и инокулированных метилобактериями вариантах можно было легко выделить два типа ткани. Первый тип — морфогенная каллусная ткань, плотная, беловато-желтая, с темно-зелеными участками — регенерационными центрами. Второй тип — неморфогенная, оводненная, рыхлая, белая. Обработка незрелых зародышей пшеницы метилобактерия-ми стимулировала образование морфогенного каллуса, частота образования морфогенных клеточных линий была выше на 20%, по сравнению с контрольными эксплантами (табл. 1), а образование каллусной ткани в этих вариантах шло интенсивнее на 3-5 сут. Учитывая положительное влияние исследуемых нами бактерий на образование морфогенного каллуса, ожидалось и увеличение выхода растений-регенерантов при переносе каллусов на среду для регенерации побегов, так как существует корреляция между частотой образования морфогенных каллусов и способностью к регенерации (Копертех, Бутенко 1995а). Все полученные регенеранты легко укоренялись на среде МС для укоренения и были готовы для переноса в почву.

Таблица 1

Влияние МеЬНу1оЬаоЬегтт ехЬощиепв Б10 на развитие основного побега, частоту образования морфогенных каллусов и регенерацию побегов пшеницы мягкой (ТпЫеит аевЬтит Ь.) из незрелого зародыша, % от общего числа эксплантов *

Вариант растений Прорастание первичного побега, % Эффективность образования морфогенного каллуса, % Частота регенерации побегов, %

Контроль (стерильные) 19.7 ± 3.8 30.1 ± 0.4 20.6 ± 1.4

Опыт (колонизованные) 13.3 ± 0.6 50.1 ± 0.8 25.3 ± 0.6

* Приведены средние арифметические из трех биологических повторностей и их стандартные отклонения.

На всех этапах культивирования незрелых зародышей пшеницы мы определяли наличие метилобактерий и их количество. Количество метилобак-терий на одном незрелом зародыше после 3 суток его культивирования на питательной среде для инициации каллусогенеза составило 1 х 103 КОЕ. Количество метилобактерий на одном каллусе после месячного культивирования на среде для инициации почек и побегов составило 3-5 х 103 КОЕ, тогда как количество бактерий на одном растении-регенеранте пшеницы, выращенном на среде для укоренения, составило 20-30 х 103 КОЕ. Это указывает на стабильную колонизацию пшеницы метилобактериями.

В таблице 2 представлены некоторые фотосинтетические характеристики растений пшеницы: общее содержание пигментов, растворимых белков листа в мг/г сырой массы, а также удельная плотность листа (УПЛ) как коло-

низованных метилобактериями регенерантов, так и контрольных растений. Колонизация растений M. extorquens D10 увеличивала содержание зеленых и желтых пигментов в листьях на 50 %. Все колонизованные варианты растений характеризовались более высоким содержанием растворимых белков и УПЛ, по сравнению с контрольными вариантами.

Таблица 2

Некоторые свойства регенерантов пшеницы мягкой

Вариант Содержание пигментов, мг/г веса сырой биомассы Содержание растворенных белков, мг/г веса сырой биомассы УПЛ, г веса сырой биомассы/дм2

Контроль 0.32 ± 0.05 11.3 ± 0.6 0.16 ± 0.02

Опыт 0.45 ± 0.04 17.5 ± 0.7 0.22 ± 0.01

Известно, что величина УПЛ четко коррелирует с интенсивностью фотосинтеза, возрастая на первых этапах роста листа и снижаясь при его старении (Чернядьев, 2001). Однако в вариантах регенерации колонизованных ме-тилотрофами побегов развитие шло более интенсивно и побеги-регенеранты были получены на 2-4 недели раньше, чем в контрольных вариантах.

Из полученных результатов следует, что использование метилобактерий в разработке оптимальных систем регенерации пшеницы in vitro, может служить новым биотехнологическим приёмом индукции первых стадий морфогенеза. Этот прием не только значительно повышает частоту регенерации, но и сокращает сроки получения побегов-регенерантов пшеницы. Колонизованные метилобактерией растения значительно лучше переносили высадку в теплицу и открытый грунт. Очевидно, влияние фитогормонов и предположительно других веществ, синтезируемых метилобактериями, на фотосин-тетический аппарат растений позволяет получать оздоровленные растения с более легкой и короткой адаптацией к условиям in vivo.

ВЭЖХ анализ бутанольных экстрактов культуральной жидкости ме-тилобактерии выявил наличие зеатинрибозида (рис.2). Кроме того, мощное корнеобразование у колонизованных метилобактериями растений табака in vitro на средах без фитогормонов указывало на синтез ауксинов. Анализ индольных соединений, выделенных из культуральной жидкости M. extorquens D10 методом ВЭЖХ, выявил ИУК в качестве доминирующего соединения (рис.3), структура ИУК дополнительно подтверждена масс-спектрометрически (рис.4).

Количество синтезируемого витамина B12 определяли в экстракте разрушенных клеток M. extorquens D10, поскольку витамин B12 не экскретируется бактериями. M. extorquens D10 синтезирует витамин B12 с выходом 850 мкг/г сухой биомассы. Согласно литературным данным, растения не способны

Рис. 2. Обращено-фазовая ВЭЖХ цитокининов из культуральной жидкости Methylobacterium extorquens D10. Хроматографическое разделение проводили на колонке Separon Six-C18 (5 мкм, Laboratorni Pristroje, Прага) 50 % метанолом со скоростью 0.5 мл/мин. Вещества детектировали с помощью УФ-детектора OE 308/1 (Венгрия) при 254 нм

Рис. 3. Обращено-фазовая ВЭЖХ ауксинов из культуральной жидкости Methylobacterium extorquens D10. Хроматографическое разделение проводили на колонке Separon Six-C18 (5 мкм, Laboratorni Pristroje, Прага) в градиенте 10-50 % метанола, подкисленным муравьиной кислотой до pH 2.8, со скоростью 0.5 мл/мин. Вещества детектировали с помощью УФ-детектора OE 308/1 (Венгрия) при 280 нм

синтезировать витамин В12, поэтому метилобактерии, ассоциированные с растениями, могут поставлять этот витамин, необходимый для реакций изомеризации и трансметилирования.

Рис. 4. Масс-спектрометрический анализ доминирующего ауксина, выделенного из культуральной жидкости Methylobacterium extorquens D10

Связь между растениями и метилобактериями взаимовыгодна. Метилобактерии зависят от растений в своих питательных нуждах и как физического местообитания. В свою очередь, растения зависят от метилобактерий, удаляющих вредные метаболиты, образуемые во время роста растений, например, метанол, формальдегид и формиат. При этом, в отличие от патогенов, метилобактерии не оказывают негативного воздействия на растения. Напротив, метилобактерии поставляют витамины, регулируют рост и развитие растений посредством синтеза фитогормонов — цитокининов и ауксинов, повышают устойчивость растений к различным стрессам, способствуют выживаемости.

Использование метилобактерий может стать стратегией целенаправленного улучшения свойств и урожайности растений. Облигатные и ограниченно-факультативные метилобактерии имеют очевидные преимущества перед факультативными и являются перспективными для колонизации гнотобиотических растений с низкой регенерационной способностью, поскольку не растут на богатых средах, используемых для культивирования in vitro. Дальнейшее изучение физиолого-биохимических и молекулярно-генетических основ фитосимбиоза аэробных метилобактерий позволит понять принципы этого взаимодействия и более эффективно реализовать метаболический потенциал метилобактерий в современной биотехнологии растений.

Список литературы

1. Васильева В.Е. Методы биохимического анализа растений. Л.: ЛГУ, 1978. 192 с.

2. Метанотрофы и метилобактерии обнаружены в тканях древесных растениях в зимний период / Н.В. Доронина [и др.] // Микробиология. 2004. Т.73, №6. С.817-824.

3. Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А. Новые данные о способности метилобактерий и метанотрофов синтезировать ауксины // Микробиология. 2002. Т.71, №1. С.130-132.

4. Доронина Н.В., Кудинова Л.В., Троценко Ю.А. Methylovorus mays — новый вид аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями // Микробиология. 2000. Т.69, №5. С.599-603.

5. Стимуляция облигатными метилотрофными бактериями морфогенеза и анти-грибной устойчивости китайской капусты Brassica chinensis L /Н.В. Доронина [и др.] // Биотехнология. 2009. №6. С.57-61.

6. Образование витамина B12 аэробными метилотрофными бактериями / Е.Г. Иванова [и др.] // Микробиология. 2006. Т.75, №4. С.570-572.

7. Копертех Л.Г., Бутенко Р.Г. Ацетон как нетрадиционная добавка к среде культивирования клеток пшеницы // ДАН. 1995. Т.342. С.115-118.

8. Копертех Л.Г., Бутенко Р.Г. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro // Физиология растений. 1995. Т.42. С.555-558.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

10. Мurashige T., Skoog F. Revised Medium for Growth and Bioassay with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. V.15. P.473-497.

11. Чернядьев И.И. Удельная плотность листа как характеристика фотосинте-тического аппарата // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. С.466-471.

12. Corpe W.A., Rheem S. Ecology of the methylotrophic bacteria living on leaf surfaces // FEMS Microbiol. Ecol. 1989. V.62. №2. P.243-248.

13. Galbally I.E., Kirstine W. The production of methanol by flowering plants and the global cycle of methanol // J. Atmosph. Chem. 2002. V.43. P.195-229.

14. Hanson A.D., Roje S. One-carbon metabolism in higher plants // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V.52. P.119-137.

15. Holland M.A. Occam’s razor applied to hormonology. Are cytokinins produced by plants? // Plant Physiol. 1997. V.115, №3. Р.865-868.

16. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent / O.H. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. 1951. V.193. P.265-275.

Доронина Нина Васильевна (doronina@ibpm.pushchino.ru), д.б.н., ведущий научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Фёдоров Дмитрий Николаевич (dnfedorov@rambler.ru), младший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Шихсаидов Максим Валерьевич (shikhsaidov@rambler.ru), магистрант, Пущинский государственный университет.

Понаморева Ольга Николаевна (olga@tsu.tula.ru), к.х.н., доцент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Stimulation of growth and morphogenesis of plants by associative aerobic methylotrophic bacteria Methylobacterium extorquens D10, producing cytokinins, auxins and vitamin Bi2.

N.V. Doronina, D.N. Fedorov, M.V. Shikhsaidov, O.N. Ponamoreva

Abstract. The effect of pink-pigmented aerobic methylotrophic bacteria Methylobacterium extorquens D10 on growth and morphogenesis of tobacco and wheat explants propagated in vitro was studied. Colonization of the explants with methylobacteria led to the stable association with plants, which showed a higher growth rate, regeneration potential and rhizogenesis ability. In spent media of M. extorquens D10 cytokinins and auxins were detected. The cells of methylobacteria contained the high level of vitamin B12. The present data suggest the promising use of aerobic methylobacteria in plant biotechnology.

Keywords: aerobic methylotrophic bacteria, Methylobacterium extorquens, plant colonization, stimulation of growth and morphogenesis, zeatin (riboside), indoleacetic acid, vitamin B12..

Doronina Nina (doronina@ibpm.pushchino.ru), doctor of biological sciences, senior staff research scientist, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Fedorov Dmitry (dnfedorov@rambler.ru), junior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Shikhsaidov Maksim (shikhsaidov@rambler.ru), undergraduate student, Pushchino State University.

Ponamoreva Olga (olga@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.

Поступила 23.10.2009