Генетические различия восточноевропейской и азиатской популяций вируса клещевого энцефалита сибирского подтипа

Генетические различия восточноевропейской и азиатской

популяций вируса клещевого энцефалита сибирского подтипа

1 "2 "2 1 Карань Л.С. , Погодина В.В. , Фролова Т.В. , Платонов А.Е.

Genetic diversity of East European and Asian strains of tick-borne encephalitis virus belonging to Siberian genotype

Karan L.S., Pogodina V. V., Frolova T. V., Platonov A. Ye.

1 Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва

2 Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва

© Карань Л.С., Погодина В.В., Фролова Т.В., Платонов А.Е.

Исследованы 40 штаммов вируса клещевого энцефалита, относящиеся к сибирскому генотипу. Анализ нуклеотидной последовательности участка гена Е длиной 211 н.п. показал формирование двух кластеров. Один из них объединяет штаммы восточноевропейского топоварианта (ВЕ), другой — азиатского (А). В 234-м аминокислотном положении гена Е у 17 из 20 исследованных штаммов ВЕ топоварианта находится гистидин (H), у остальных трех — глутамин (Q) или тирозин (Y). Среди 20 штаммов азиатского топоварианта у 13 в позиции 234 присутствует гистидин (H), у 7 — глутамин (Q).

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, сибирский генотип, восточноевропейская и азиатская популяции, се-квенирование.

We have studied 40 strains of tick-borne encephalitis virus attributed to Siberian genotype. The fragment of E gene (211 nt) has been sequenced for all strains. Futher analysis has evidenced the formation of two clusters. One of them includes the strains of East European (EE) origin, the other comprises the strains of Asian origin (A). 17 of 20 East European strains have histidin (H) in amino acid position 234 of gene E, the remaining 3 have either glutamine (Q) or tyrosine (Y). 13 Asian strains have histidine and 7 Asian strains have glutamine in amino acid position 234.

Key words: tick-borne encephalitis virus, Siberian genotype, East European and Asian populations, sequencing.

УДК 616.988.25-002.954.2

Введение очагах КЭ. Но при накоплении данных по разным гео-

графически удаленным друг от друга очагам, где вы-Вирус клещевого энцефалита (КЭ) имеет широкое является одинаковый генотип, можно внутри генотипа географическое р^простр^нж, а вызываемое им выявить подгруппы. Так, сибирский генотип вируса заболевание отличлегм п°лим°рфизм°м клини^ких клещевого энцефалита отличается от дальневосточно-форм. В °сн°вн°м это выражается в разн°м соотн°- го и европейского наличием аминокислоты лейцин (L) шении клинических синдр°мов остр°г° пери°да, а в позиции 206 гена Е. В позиции 234 гена Е штаммы также в различнот тяжести их течения, исходах остро- сибирского генотипа также имеют маркерные амино-

го першда, частоте развития прогредиентных форм кислоты: гистидин (Н) или глутамин (Q), что делит их

[3]. Кроме того, частота встречаемости различных на две подгруппы [1, 2].

форм клещевого энцефалита зависит от географиче- В данном исследовании были изучены штаммы и

ского расположения эпидемического °чага. изоляты сибирского генотипа вируса КЭ (ВКЭ) с ази-

Течение инфекционного процесса, безусловно, атской и восточноевропейской территории России с

определяется как состоянием макроорганизма, так и целью обнаружить факторы, способствующие этому

свойствами самого вируса, заложенными в его геноме. разделению или являющиеся его следствием. В настоящее время выделяют три основных генотипа

вируса клещевого энцефалита (дальневосточный, си- Материал и методы

бирский и европейский) и проводится большая работа В работе использована коллекция штаммов вируса

по изучению генотипов, циркулирующих в разных клещевого энцефалита, изолированных Н.Г. Бочковой,

Вирусные инфекции

Л.С. Левиной, Г.В. Маленко, А.Г. Трухиной, В.В. Погодиной, а также изоляты, полученные другими авторами [5, 6, 10]. Характеристика штаммов и их геноти-пирование описаны ранее [7—9]. Анализу нуклеотид-ной последовательности подвергали образцы вирусной РНК, изолированной непосредственно из клещей и аутоптатов [8].

Вирусная РНК из штаммов, клинического и полевого материла выделялась с применением набора «Рибо-золь-В» («Амплисенс», ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва). Нуклеотидная последовательность определялась на приборе «Applied Biosystem 3100 Genetic Analyser» с реактивами «Big Dye», версия 1.1 по инструкции производителя [7, 8].

Была определена нуклеотидная последовательность участка гена Е длиной 211 н.п., включающая области двух вышеуказанных маркерных аминокислот, 32 штаммов и 8 изолятов ВКЭ сибирского подтипа. В дальнейшем проводился анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей в программе Mega 2.1.

Результаты

В результате по маркерной аминокислоте в позиции 234 гена Е исследованные образцы ВКЭ разделились следующим образом: 30 имели в 234-й позиции гена Е гистидин (Н), 8 — глутамин (Q), а 2 вологодских штамма образовали новую, ранее не описанную подгруппу, содержащую в 234-й позиции гена Е тирозин (Y). При анализе таких характеристик изученных штаммов, как объект изоляции (при исследовании материала от больного учитывались форма и исход заболевания) и территория изоляции штамма, определенную закономерность для объединения штаммов по типу аминокислоты удалось установить только по географическому признаку.

Изученные штаммы и изоляты сибирского подтипа разделились на четыре подгруппы: две — для штаммов, выделенных на азиатской территории (азиатский топовариант), и две — для выделенных на восточноевропейской территории (восточноевропейский топовариант) (таблица).

1. Азиатская подгруппа H234—Za (прототип — штамм «Zausaev»): 13 штаммов выделены в Томской, Кемеровской, Иркутской, Читинской, Свердловской областях, Красноярском и Приморском краях от боль-

ных острой формой КЭ с летальным исходом и хроническим КЭ и из клещей I. persulcatus.

2. Восточноевропейская подгруппа И234—Yar (прототип — штамм «Yaroslavl-142»): 17 штаммов выделены в Ярославской, Вологодской, Ленинградской областях, Литве и Эстонии из I. persulcatus, I. ricinus и от больных острой формой КЭ с летальным исходом и без такового.

3. Азиатская подгруппа Q234—Vs (прототип — штамм «Vasilchenko»): 7 штаммов выделены в Кемеровской, Иркутской, Новосибирской областях из I. persulcatus, от больных острым и хроническим КЭ.

4. Восточноевропейская подгруппа Y234—Vol: 2 вологодских штамма.

Распределение топовариантов сибирского генотипа в зависимо-

сти

от аминокислоты в позиции 234 гена Е

Аминокислота в позиции 234 гена E Топоварианты Обозначение варианта Обозначение топо-варианта и прото-типный штамм

Гистидин

Глутамин

Тирозин

Следует отметить, что штамм «Vologda-365» содержит в 234-й позиции аминокислоту глутамин и не внесен ни в одну подгруппу.

Таким образом, из 20 штаммов азиатской популяции гистидин выявлен у 13 штаммов (65%), а глутамин — у 7 (35%). А из 20 штаммов восточноевропейской популяции 17 имели гистидин (85%), 1 — глутамин (5%) и 2 штамма содержали тирозин (10%) в позиции 234 гена Е (рис. 1).

а

б

Рис. 1. Распределение изолятов ВКЭ в зависимости от аминокислоты в позиции 234 гена Е в двух вирусных популяциях: восточноевропейской (а) и азиатской (б) При построении дендрограммы на основе полученных авторами настоящей статьи нуклеотидных последовательностей образовались два кластера, один из которых представляет азиатский топовариант, другой — восточноевропейский. При этом необходимо отметить и некоторые исключения, характерные для обоих

кластеров. В группу азиатского топоварианта попадают и два вологодских штамма, имеющих маркерную аминокислоту тирозин. В группе восточноевропейского топоварианта оказался изолят «Ekatermbшrg-42», выделенный из клещей I. реп'и1саШ' в 2003 г.

Отдельный кластер, включающий изоляты «Кете-гоуо-25» и «Ы1уа-48», относящиеся к обоим изученным топовариантам, образуют самостоятельную ветвь на представленной дендрограмме. Штамм «Vologda-365», несмотря на имеющуюся в 234-й позиции аминокислоту глутамин, по нуклеотидной последовательности объединяется с восточноевропейским кластером (рис. 2).

•-Е -i

Yaroslavl-115

Vologda-3

Vologda-365

Estonia-20

Ekaterinburg-42

Yaroslavl-30

Yaroslavl-140

AY363854-Yaroslavl-142

Volkhov-4

AY363847-Volkhov-2

AY363859-Yaroslavl-97

AY363857-Yaroslavl-102

AY363855-Yaroslavl-2

Vologda-911

Yaroslavl-173

Vologda-476

Vologda-509

Vologda-478

Litva-48

Kemerovo-25

AY363862-Irkutsk-508

L40361-Vasilchenko

AY363865-Irkutsk-305

AY363851-Irkutsk-215

AY363850-Irkutsk-6

AY363861-Irkutsk-518

Kemerovo-34

AY363858-Krasnoyarsk-154

Ekaterinburg-76

Ekaterinburg-74

Ekaterinburg-57

Ekaterinburg-56

Vologda-496

Vologda-658

AF527415-Zausaev

AY363852-Irkutsk-41

AY363860-Irkutsk-437

AY363863-Irkutsk-515

AY363864-Irkutsk-3

Primorye-592

AB062064-Sofjin

U27495-Neudoerfl

0.01

Рис. 2. Дендрограмма, отражающая уровень генетического родства изолятов ВКЭ на участке гена Е длиной 211 н.п. (построена по методу иРОМЛ с применением алгоритма пропорциональных расстояний): восточноевропейский (I) и азиатский (II) топоварианты

На основании полученных данных видно, что из изученных региональных вирусных популяций наиболее сложной по составу является вологодская популяция сибирского подтипа ВКЭ. Восточно-Европейская равнина является зоной совместного обитания I. persulcatus и I. ricinus и связанной с ними фауны млекопитающих [1, 2, 4]. Урал служит переходной территорией между европейской и азиатской частью России, что, возможно, и определяет гетерогенность

циркулирующих здесь штаммов ВКЭ, некоторые из которых близки к восточноевропейским («Ека1еппЪш^-42»).

Заключение

В представленной работе показана неоднородность популяции вируса клещевого энцефалита, относящаяся к сибирскому генотипу. Обнаруженные аминокислотные маркеры, позволяющие выделить гео-

графические топоварианты, являются устойчивыми в эволюционном плане (время выделения штаммов восточноевропейского топоварианта: 1943—2002 гг., азиатского топоварианта: 1961—2003 гг.). На данном этапе авторы смогли установить лишь связь данного маркера с территорией изоляции и отсутствие очевидной связи с источником изоляции (клещи или человек) или с формой и тяжестью заболевания. Безусловно, инвазивность, вирулентность вируса и его иммуно-генность зависят от общего эффекта всех произошедших в его геноме мутаций.

В настоящее время авторами статьи проводится изучение полноразмерного гена Е для указанных штаммов и изолятов. Сравниваются изоляты, полученные непосредственно из клещей и пассированные на культуре клеток или на животных для изучения процессов аттенуации. Разрабатываются методики анализа неструктурных генов ВКЭ. Возможно, новые полученные данные позволят ответить на вопрос о биологической значимости выявленных аминокислотных мутаций.

Литература

1. Вотяков В.И., Злобин В.И., Мешаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии. Новосибирск: Наука, 2002. 438 с.

2. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. Иркутск:

РИО ВСНЦ СО РАМН, 2003. 272 с.

3. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Новосибирск: Гос. мед. академия МЗ РФ, 2001. 360 с.

4. Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В. Районирование ареала вируса клещевого энцефалита. М., 1981. 148 с.

5. Краминская Н.Н., Живоляпина Р.Р., Мейерова Р.А. Опыт вирусологического изучения гиперкинетических форм клещевого энцефалита с прогредиентным течением // Актуальные проблемы вирусологии и профилактики вирусных заболеваний. М., 1972. С. 224—225.

6. Левкович Е.Н. Вирусологические и иммунологические исследования вспышки энцефалита в Ленинградской области // Весенне-летний энцефалит в Ленинградской области. Л., 1945. С. 82—93.

7. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: генетическая и антигенная характеристика штаммов // Вопр. вирусологии. 2004. № 4. С. 20—25.

8. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др. Сравнительный анализ вирулентности сибирского и дальневосточного подтипов вируса клещевого энцефалита на основе экспериментальных и клинических данных // Вопр. вирусологии. 2004. № 6. С. 24—30.

9. Gritsun T.S., Venugopal K., Zanotto M. et al. Complete sequence of two tick-borne flaviviruses isolated from Siberia and the UK: analysis and significance of the 5' and 3' UTRs // Virus. Res. 1997. Vol. 49. P. 27—30.

10. Gritsun T.S., Frolova T.V., ZhankovA.I. et al. Characterization of a Siberian virus isolated from a patient with progressive chronic tick-borne encephalitis // J. Virol. 2003. Vol. 7. P. 25—36.

Поступила в редакцию 06.01.2006 г.