Способ диагностирования in vitro болезни Альцгеймера на основании редокс-статуса альбумина в спинномозговой жидкости
METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSING OF ALZHEIMER'S DISEASE ON BASIS OF ALBUMIN REDOX-STATUS IN CEREBROSPINAL FLUID

Данное изобретение относится к разделу клинической диагностики и, в частности, относится к способу диагностирования in vitro болезни Альцгеймера (AD) на основании определения редокс-статуса альбумина в спинно-мозговой жидкости (CSF), в частности, содержания меркаптоальбумина (НМА), представляющего собой восстановленную форму альбумина, содержащую цистеин Cys-34 в форме свободной тиоловой группы.
AD представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, обычно характеризующееся утратой краткосрочной памяти и других умственных способностей (таких как высшие когнитивные функции) по мере гибели нейронов и атрофии различных областей головного мозга. Средняя продолжительность заболевания с момента постановки диагноза составляет приблизительно 10 лет, однако эта продолжительность может варьировать в прямо пропорциональной зависимости от тяжести заболевания и времени постановки диагноза.
AD представляет собой наиболее распространенную форму деменции; она неизлечима и смертельна и чаще всего возникает у лиц старше 65 лет, хотя в некоторых случаях может развиваться и в 40-летнем возрасте.
Как правило, первым симптомом является неспособность к запоминанию нового, но его часто путают с возрастным или стрессовым поведением. При подозрении на AD клинико-диагностические процедуры, доступные при жизни пациента, до настоящего времени основывались на рекомендациях и критериях, разработанных Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта и Ассоциацией по борьбе с болезнью Альцгеймера и родственными заболеваниями (NINCDS-ADRDDA) (McKhann et al., 1984), которые главным образом базируются на клиническом заключении в соответствии с результатами нейропсихологических тестов, свидетельствах родственников и друзей пациента и общей неврологической оценкой. Неврологическое обследование также может включать исследование изображений головного мозга (нейровизуализацию).
В настоящее время не существует достоверного способа диагностирования AD, не считая посмертного гистологического анализа мозга пациента.
nd
Вместе с тем, известно, что человеческий альбумин представляет собой негликозилированный белок массой 66 кДа. В количественном отношении это наиболее значимый белок плазмы крови, и его концентрация в нормальной плазме составляет от 35 до 50 г/л, составляя вплоть до 60% от общих белков плазмы (Peters Т.J.: All About Albumin; Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. Academic Press, San Diego, 1996). Аналогичным образом, альбумин также является наиболее распространенным белком в CSF, составляя около 67% от общего белка, при этом его концентрация составляет около 200 мг/л (Edward J. Thompson, 2005, The roster of CSF proteins, PROTEINS OF THE CEREBROSPINAL FLUID: Analysus and Interpretation in the Diagnosis and Treatment of Neurological Disease, 2 Ed. London, UK: Elsevier Acadmic Press.: 13-31).
Структура человеческого альбумина состоит из полипептида из 585 аминокислот и приблизительно 67% альфа-спиралей при отсутствии бета-слоев (Otagiri М., Chuang V.T. Pharmaceutically important pre- and posttranslational modifications on human serum albumin. Biol Pharm Bull 2009; 32: 527-534). Человеческий альбумин содержит 6 остатков метионина и 35 остатков цистеина, где последние вовлечены в образование 17 дисульфидных связей. Cys-34 является единственным свободным цистеином во всей молекуле. Альбумин человека выполняет определенные антиоксидантные функции благодаря своим способностям связывать различные лиганды и свойствам захватывать радикалы, которые все тесно связаны с его структурой.
Хотя имеется много возможностей окисления альбумина, Cys-34 является сайтом, особенно чувствительным к окислению/восстановлению. Таким образом, в целом правомочно судить о редокс-статусе альбумина по Cys-34. При хроматографическом разделеним альбумина получают три фракции в зависимости от редокс-статуса Cys-34 (Peters, 1996, см. выше):
(1) восстановленная форма с цистеином в форме свободной тиоловой группы, называемая человеческим меркаптоальбумином (НМА);
(2) окисленная форма с цистеином, образующим дисульфидную связь с низкомолекулярным соединением, содержащим тиоловую группу, преимущественно с цистеином или цистеинил-глицином, хотя также с гомоцистеином и глутатионом, называемая человеческим не-меркаптоальбумином-1 (HNA1); и
(3) наиболее окисленная форма с цистеином в виде сульфиновой или сульфоновой кислоты, обозначаемая как человеческий не-меркаптоальбумин-2 (HNA2).
У здорового психически нормального человека приблизительно 61-69% общего альбумина плазмы находится в форме НМА, 27-35% в форме HNA1 и 3-5% в форме HNA2 (Oettl К., et al. Oxidative damage of albumin in advanced liver disease. Biochim Biophys. Acta 2008; 1782: 469-473; Oettl K. and Marsche G. Redox State of Human Serum Albumin in Terms of Cysteine-34 in Health and Disease. Methods Enzymol. 2010; 474: 181-95; and Oettl K. et al. Oxidative albumin damage in chronic liver failure: relation to albumin binding capacity; liver dysfunction and survival. J Hepatol, 2013, 59: 978-983). Общепризнано, что окисление НМА и HNA1 является обратимым, тогда как окисление HNA2 представляет собой необратимый процесс.
Альбумин может подвергаться различным структурным модификациям, что означает, что модифицируется его форма и, следовательно, его связывающие свойства, а также редокс-статус (Oettl К. et al., 2010, см. выше).
Данное изобретение основано на неожиданном открытии того, что у пациентов с диагностированной AD при жизни содержание восстановленной формы альбумина (НМА) в спинномозговой жидкости (CSF) значительно ниже, чем у здоровых контрольных субъектов эквивалентного возрастного диапазона. Данный феномен не наблюдался в отношении содержания НМА в плазме крови, также при сравнении со здоровыми контрольными субъектами эквивалентного возрастного диапазона. Таким образом, говоря иными словами, обнаружили, что у пациентов с диагностированной AD при жизни разница или соотношение между уровнями НМА в CSF и плазме увеличено по сравнению с такой разницей у здоровых контрольных субъектов эквивалентного возрастного диапазона. Таким образом, два вышеупомянутых маркера, т.е. содержание НМА в CSF и разница или соотношение между уровнями НМА в CSF и плазме, являются полезными для диагностирования AD.
Как упоминалось выше, достоверный диагностический тест на AD проводят посмертно и поэтому диагностика у живого пациента базируется на клиническом заключении в соответствии с результатами неврологических тестов, свидетельствами членов семьи и друзей пациента, а также общей неврологической оценкой. Поэтому тест, предложенный в данном изобретении, представляет собой средство диагностики, которое является объективным, количественным, удобным для интерпретации, надежным, воспроизводимым в различных диагностических центрах, относительно недорогим и, в отличие от некоторых нейропсихологических тестов, не подверженным влиянию культурных аспектов, таких как уровень образования пациента.
В данном документе термин «здоровый субъект» и его форма в множественном числе относятся к субъектам, не страдающим AD.
Таким образом, в первом аспекте данное изобретение относится к способу диагностирования болезни Альцгеймера (AD) in vitro, включающему следующие стадии:
а) определение содержания меркаптоальбумина (НМА) в образце спинномозговой жидкости (CSF) пациента; и
б) сравнение содержания, определенного на стадии (а), с содержанием НМА в CSF от здоровых субъектов.
В предпочтительном воплощении, если на стадии (б) способа по данному изобретению содержание НМА, определенное на стадии (а), меньше, чем это содержание у здоровых субъектов, то это указывает на AD; предпочтительно у пациента диагностируют AD.
В предпочтительном воплощении как вышеупомянутые пациент, так и здоровые субъекты являются людьми, предпочтительно взрослыми людьми.
В другом предпочтительном воплощении содержание НМА в CSF измеряют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с флуоресцентным детектированием (FLD) с использованием длин волн возбуждения и эмиссии 280 и 340 нм, соответственно, на основе методики, описанной Oettl К., 2010, (см. выше). Количественное определение НМА осуществляют по высоте характерного пика, полученного на соответствующей хроматограмме.
Порог отсечения, который определяют путем рассчитывания ROC-кривой после доведения процентных значений чувствительности и специфичности до максимальных значений (91% и 100%, соответственно), ниже которого считают, что содержание НМА, измеренное на стадии (а), указывает на AD и/или приводит к постановке диагноза AD у пациента, предпочтительно составляет 37% (масс/об.).
Во втором воплощении настоящее изобретение относится к способу диагностирования in vitro болезни Альцгеймера (AD), включающему следующие стадии:
а) определение содержания меркаптоальбумина (НМА) в образце спинномозговой жидкости (CSF) и образце крови или плазмы пациента;
б) определение разницы или соотношения между содержанием НМА в образце CSF и содержанием НМА в образце крови или плазмы, определенными на стадии (а); и
в) сравнение разницы или соотношения, определенных на стадии (б), с соответствующими разницей или соотношением у здоровых субъектов.
На стадии (б) способа согласно указанному второму воплощению предусматривается, что определяемая разница представляет собой: разницу между содержанием НМА в образце CSF и содержанием НМА в образце крови или плазмы, определенными на стадии (а); или разницу между содержанием НМА в образце крови или плазмы и содержанием НМА в образце CSF, определенными на стадии (а). В предпочтительном воплощении на стадии (б) разницу между содержанием НМА в образце CSF и содержанием НМА в образце крови или плазмы, определенными на стадии (а), определяют в форме соотношения (величина НМА в плазме/величина НМА в CSF).
Когда на стадии (б) определяют разницу между содержанием НМА в образце CSF и содержанием НМА в образце крови или плазмы, определенными на стадии (а), в предпочтительном воплощении, если на стадии (в) способа по настоящему изобретению разница, определенная на стадии (б), например соотношение между величиной НМА в плазме и величиной НМА в CSF (НМА плазмы/НМА CSF), больше, чем эта разница у здоровых субъектов, то это указывает на AD; более предпочтительно у пациента диагностируют AD. Если определяемая разница является какой-либо иной, специалист в области техники сможет внести необходимые модификации в способ по настоящему изобретению (например в отношении сравнения с соответствующей величиной разницы у здоровых субъектов).
Дополнительно и предпочтительно образец крови или плазмы представляет собой образец плазмы.
В предпочтительном воплощении как пациент, так и здоровые субъекты, упомянутые выше, являются людьми, предпочтительно взрослыми людьми.
В другом предпочтительном воплощении содержание НМА в CSF измеряют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с флуоресцентным детектированием (FLD) с использованием длин волн возбуждения и эмиссии 280 и 340 нм, соответственно, на основе методики, описанной Oettl К., 2010, (см. выше). Количественное определение НМА осуществляют с учетом высоты характерного пика, полученного на соответствующей хроматограмме.
Порог отсечения, определяемый путем рассчета ROC-кривой после доведения процентных значений чувствительности и специфичности до максимальных значений (100%), на основании которого делают заключение, что разница, установленная на стадии (б), например соотношение значения НМА в плазме и значения НМА в CSF (НМА плазмы/НМА CSF), указывает на AD и/или приводит к постановке диагноза AD у пациента, предпочтительно составляет 1,1.
Для лучшего понимания данное изобретение ниже описано более детально, со ссылкой на прилагаемые графические материалы, которые приведены в качестве примера, и со ссылкой на примеры, приведенные в целях иллюстрации, но не ограничивающие объем изобретения.
На Фиг. 1 показано содержание НМА, установленное по высоте пика НМА (в процентах), полученное для образцов плазмы и CSF от контролей (здоровых субъектов, в соответствии с определением, приведенным выше) и пациентов с AD. По оси ординат (ось «у») показана высота пика НМА (выраженная в процентах), а по оси абсцисс (ось «х») показаны группы (здоровые контроли слева и пациенты с AD справа). Кроме того, в каждой группе результаты, полученные в образцах CSF, приведены слева, а результаты, полученные для образцов плазмы, приведены справа.
Специалисту в области техники очевидно, что, если содержание НМА в CSF пациентов с AD меньше, чем содержание НМА в CSF здоровых субъектов, это также отразится на содержании двух других фракций альбумина, в соответствии с редокс-статусом Cys-34, т.е. НА1 и/или НА2, также будут изменяться и также могут указывать на AD.
ПРИМЕР
Пример 1. Исследование с диагностированием болезни Альцгеймера посредством измерения содержания НМА в CSF или разницы между указанным содержанием и содержанием НМА в плазме
В рамках мультицентрового рандомизированного слепого контролируемого исследования на 42 пациентах, получавших альбумин в терапевтических целях, у которых была диагностирована AD от легкой до умеренной степени тяжести, было проведено данное исследование для анализа содержания НМА в CSF, а также разницы между указанным содержанием и содержанием НМА в плазме.
Для этого определяли содержание НМА в исходных образцах (до начала клинического исследования) от вышеупомянутых пациентов, как в CSF (n=34), так и в плазме (n=37), а также в CSF (n=16) и плазме (n=37) здоровых субъектов. Вышеупомянутые образцы CSF во всех случаях получали путем люмбальной пункции, а образцы плазмы получали путем забора крови и последующего отделения плазмы, всегда следуя стандартным медицинским процедурам, установленным для данной цели.
Упомянутые образцы CSF и плазмы делили на аликвоты и замораживали при температуре -70°С или ниже немедленно после получения. Перед анализом содержания НМА образцы размораживали при комнатной температуре и, в случае образцов плазмы, определяли концентрацию альбумина иммунонефелометрически или каким-либо другим эквивалентным способом. Содержание НМА измеряли непосредственно в случае образцов CSF, тогда как образцы плазмы разводили фосфатным буфером с рН 6,87 до концентрации менее 10 мг/мл. Затем исследовали окисленные формы альбумина с помощью HPLC-FLD, как описано выше.
Полученные результаты представлены на Фиг. 1. Как можно видеть на данной фигуре, пациенты с AD демонстрируют значительное снижение содержания НМА в CSF по сравнению со здоровыми субъектами, тогда как в плазме это снижение несколько менее выражено. Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что диагностический потенциал имеет не только содержание НМА в CSF, но также и разница между указанным содержанием и содержанием НМА в плазме.
Для пациентов с AD медианное значение, полученное для содержания НМА в CSF, составляет 9,6%, тогда как медиана содержания в плазме составляет 54,1%, соотношение (НМА плазмы/НМА CSF) составляет 5,64. При этом для здоровых субъектов медианное значение содержания НМА в CSF составляет 77,4%, а в плазме 65,6%, соотношение (НМА плазмы/НМА CSF) составляет 0,85.