Филогенетическое сравнение вируса лейкоза крупного рогатого скота

УДК 619:616.98:578.828.11 ББК 40.48.73

О.Б. Генджиева

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ СРАВНЕНИЕ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Аннотация. В статье дается анализ генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота выделенных от животных в некоторых хозяйствах Республики Калмыкия и сравнительный филогенетический анализ полученных фрагментов провирусного генома.

Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, генотип вируса, ДНК анализ, полиморфизм вируса, нуклеотидная последовательность, распространение болезни, инфицированность и заболеваемость.

O. B. Gendzhiyeva

PHYLOGENETIC COMPARISON OF THE VIRUS OF LEUKOSIS OF CATTLE

Annotation. In article the analysis of a genotipichesky variety of a virus of leukosis of cattle allocated from animals in some farms of the Republic of Kalmykia and the comparative phylogenetic analysis of the received fragments of a pro-virus genome is given.

Key words: virus of leukosis of cattle, genotype of a virus, DNA analysis, polymorphism of a virus, nukleotidny sequence, illness distribution, infitsirovannost and incidence.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание вирусной этиологии. В России оно занимает одно из первых мест в списке распространенных заболеваний. Этиологическим агентом лейкоза крупного рогатого скота является BLV (bovine leukemia virus), относящийся к классу Deltaretrovirus, семейству Retro-viridae [2, С. 7-9; 3, С. 65-68; 5, С. 190; 10, С. 608].

Вирус поражает В - лимфоциты, кроме того, он может поражать Т-лимфоциты, моноциты и гранулоциты [9, С. 39; 11, С. 101]. Также установлено, что BLV большей (чем другие вирусы) степени отражает генетические и биологические сходства с ВИЧ [4, С. 111].

1 I 418-1600 I 11546-2135 I I 2132-4669 I 4615-7461 I

Рис. 1. Упрощенная морфологическая и генетическая структура ВЛКРС.

BLV имеет следующую генетическую структуру: s-LTR-gag-pol-env-pXbl-LTR-3. LTR состоит из 530 пар оснований. Донорный сайт сплайсинга находится в R- участке. За LTR следует лидерная последовательность в 97 пар. Первую открытую рамку считывания составляет ген gag (нуклеотиды 628-1806). Данный ген кодирует трансляцию группоспецифического белка предшественника структурных белков, в частности, р24. Через 500 пар после концевого триплета gag начинается вторая рамка считывания для pol, кодирующего 852 аминокислоты ( позиции 2317-4875). Ген pol кодирует полипептиды, обладающие ревертазной (РНК-зависимой ДНК -полимеразной) активностью. Возможно, что этот же ген кодирует эндонуклеазу. Третью рамку составляет ген env (позиции 4821-6368) и кодирует 515 аминокислот, составляющих поверхностный гликопротеид gp51 и трансмембранный белок gp30.

Рис. 2. Схема генома ВЛКРС (американский изолят).

В противоположность pol продукту gp30 выявляет большую гомологию с вирусами лейкозов мышей, чем с вирусами лейкозов птиц, что позволяет предпологать химерную природу BLV [4,С. 114].

В организме хозяина хронически персистирующий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности, на преодоление более эффективных защитных механизмов хозяина. Поэтому наряду с генетическим статусом макроорганизма во внимание необходимо принимать генетическую изменчивость самого патогена, который, возможно, в процессе длительной персистенции способен изменять свою патогенность как в сторону комменсализма, так и усиления патогенных свойств.

Генетическая вариабельность BLV у инфицированного крупного рогатого скота достаточно хорошо охарактеризована [10, С. 609]. На основании метода ПДРФ и ДНК секвенирования BLV классифицировано три подгруппы вируса: бельгийская, австралийская и японская [11]. Методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) выявлено шесть BLV вариантов по гену env-gp51 из Японии [10, 11], Америки и Европы. Географическое распределение генотипов BLV неоднородно.

По данным Y. Asfaw (2004), встречаются животные, в организме которых циркулирует более чем один генотип вирус лейкоза одновременно.

Имеются сообщения о возможной роли различных вариантов ВЛКРС в развитии инфекционного процесса [8, С. 493]. Данные о функциональной значимости полиморфизмов, патогенных свойствах генотипов, их способности избегать иммунного надзора со стороны организма хозяина остаются не до конца изученными.

По мнению R.G. Felmer (2005), за атипичные формы инфекции ответственны особые варианты ВЛКРС по гену env gp51. Так как заболевание лейкозом наблюдается после длительного периода латенции, для того, чтобы клетки, инфицированные про-вирусной ДНК, не были подвергнуты апоптозу, BLV и HTLV приобрели способность ограничивать экспрессию собственных белков до крайне низкого уровня в течение

длительного периода [7]. Животные, инфицированные такими вариантами вируса, остаются серо- негативными на протяжении длительного времени и таким образом являются источником распространения инфекции.

По данным П.Н. Смирнова (2009), 6-й генотип, циркулирующий на территории Новосибирской области, является менее иммуногенным, чем 1-й генотип. Поэтому животные, инфицированные 6-м генотипом BLV, длительное время могут оставаться в стаде источником инфекции.

Таким образом, важно установить различия в проявлении видов вируса лейкоза с целью своевременной изоляции животных - носителей менее иммуногенных типов вируса.

Цель исследований: Изучить генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупного рогатого скота выделенных от животных в некоторых хозяйствах Республики Калмыкия и провести сравнительный филогенетический анализ полученных фрагментов провирусного генома.

Методика. Использовали образцы провирусной ДНК, выделенные из цельной крови коров калмыцкой породы из хозяйств Городовиковского района Республики Калмыкия (табл. 1) в возрасте старше 5 лет.

Генотипирование BLV по гену gag. На начальном этапе образцы ДНК животных были исследованы в ПЦР

Экстракцию ДНК из 100 мкл цельной крови проводили с помощью коммерческих наборов реагентов отечественного производства по инструкции производителя. При этом использовали методики сорбции нуклеиновых кислот (НК) на сорбенте с последующей элюцией ДНК буферным раствором или преципитации НК спиртом. Элюцию осуществляли в 50 мкл ТЕ-буфера.

Для амплификации и секвенирования участка гена pol ВЛКРС размером 438 п.о. использовали разработанные праймеры PF2 (5’-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT C-3’), Pr2 (5’-CCG ACA GAG AGC GAG GAG AG-3’). Проверка качества, термодинамический анализ выбранных праймеров выполнены с помощью программы OLIGO v.4.0.

ПЦР проводили на матрице ДНК ВЛКРС в программируемом термоциклере “Терцик” в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл ДНК пробы, 5 мкл буфера ПЦР, 3мМ MgCl2, 10 мМ каждого дНТФ, по 10 пмоль каждого праймера, 5 ед. полимеразы Taq, бидистиллированную воду. Для прохождения реакции амплификации искомого участка ДНК использовали следующие параметры: начальная денатурация ДНК при 95°С - 3 мин; затем 35 циклов: 94°С - 20 с, 62°С -30 с, 72°С - 1 мин; 72°С - 3 мин.

Фрагменты ДНК после ПЦР в объеме 15 мкл анализировали методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, содержащем 2,5 мкл раствора бромистого этидия, с использованием маркера молекулярных масс Gene Pak DNA Ladder M100 отечественного производства. Результаты гель-электрофореза регистрировали с помощью системы гельдокументирования PowerShotA510. Очистку ампликонов проводили коммерческим набором реагентов для быстрой элюции ДНК из агарозных гелей отечественного производителя согласно прилагаемой инструкции.

Для определения нуклеотидной последовательности использовали набор реактивов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и автоматический анализатор ABI PRISM 3130в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование образцов ДНК проводили во ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате секвенирования, были

идентифицированы в базах данных GenBank/EMBL с помощью сервиса BLAST fhttp://bIastncbi.nIm.nih.gov/BIastcgi).

Филогенетический анализ выполняли с помощью программы Mega 3.1. Дендрограммы построены дистанционными методами присоединения соседей NJ (neighbor-joining method, Saitou and Nei, 1987), минимума эволюции ME (minimum evolution, CavaIIi-Sforza and Edwards, 1967, Saitou and Imanishi,1989, Rzhetsky and Nei, 1993) с использованием р-дистанций, модели Kimura (2 параметра). Статистическую достоверность топологии филогенетического древа оценивали с помощью метода бутстрэп-анализа при количестве случайных выборок 100 и 1000. Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности гена pol изолятов ВЛКРС, представленные в базах данных GenBank /EMBL.

Результаты и обсуждение:

По результатам серологических исследований методом РИД антитела к вирусу лейкоза КРС выявляются в 23 (77%) случаях (РИД+), 7 (23%) животных являются серонегативными (РИД-).

Таблица 1

N п/п Номер живот- ного Хозяйство РИД ПЦР

1 1 КФХ Демкин П.В. + +

2 2 + +

3 3 + +

4 4 + -

5 5 + +

6 6 - -

7 7 - -

8 8 + +

9 9 - +

10 10 - -

11 1 п.Шин-Бядл. Южный индосектор + +

12 3 + +

13 5 + +

14 8 + +

15 9 + +

16 10 + +

17 11 + +

18 15 + +

19 17 + -

20 18 + +

21 1 с. Дружное, индосектор + +

22 2 + +

23 3 + +

24 4 + +

25 5 + +

26 1 БАК КТУ гурт Алиева А.М. - -

27 2 + -

28 3 - -

29 4 - -

30 5 + +

При проведении ПЦР анализа ДНК провируса лейкоза КРС обнаруживается в крови у 21 животного (ПЦР+), у 9 животных по результатам ПЦР ДНК провируса не детектируется.

При сравнении результатов серологических и молекулярно-биологических исследований обнаружены случаи несоответствия для животных под номерами: 9 (КФХ Демкин П.В.) - РИД-/ПЦР+; 4 (КФХ Демкин П.В.), 17 (п. Шин-Бядл, южный индосектор), 2(БАК КТУ гурт Алиева А.М.) - РИД+/ПЦР-. В 26 случаях выявлено совпадение результатов РИД и ПЦР (Табл.1).

Амплификацию искомого фрагмента гена pol проводили с использованием разработанных праймеров PF2-PR2, комплементарных участку pol гена ВЛКРС. Методом ПЦР получены фрагменты генома изолятов провируса ВЛКРС размером 438 п.о., выделенные от взрослых серопозитивных коров. Сравнительная характеристика исследованного изолята провируса приведена в табл. 2.

Таблица 2

Характеристика исследуемых изолятов провируса ВЛКРС

Регион Изолят Количество изолятов

Тульская область 09/2677, 09/2692 TULA 2

Рязанская » 09/7, 09/14 RYAZAN 2

Калужская » 10/12, 09/7E, 10/14, 10/13 KALUGA 4

Ростовская » 09/5164, 09/6077 ROSTOV 2

Московская » 10/2137 MOSCOW 1

Вологодская » 10/19 VOLOGDA 1

Республика Калмыкия 10/8k, 10/2d, 10/5b KALMIKIYA 3

Алтайский край 10/5t, 10/6ch ALTAY 2

Препарат антигена ВЛКРС K+FLK-BLV 1

По данным Козыревой Н.Г.[1]

Нуклеотидные последовательности исследуемых изолятов ВЛКРС были выровнены с соответствующими консенсусными последовательностями провирусного гена pol изолятов ВЛКРС. По результатам филогенетического анализа гена pol построены дендрограммы (рис.1).

Изоляты из России отличаются от штаммов из США (M10987 BLV GAGA), Северной Италии (S83529) и также США (NC001414, AF033818), составляющих отдельные клады. Согласно топологии древа на рис. 1 (массив составляет 24 последовательности), изоляты 09/2677 TULA и 09/2692 TULA сходны с бразильским изолятом DQ288979 (100%), а также проявляют наибольшее сходство с японским К02120 (99,4%) и американским EF600696 (99,7%). В данном случае по полученным результатам можно предположить о происхождении инфицирования скота.

Изолят 10/2137 MOSCOW имеет высокую степень родства (99%) с аргентинским штаммом AF 257515. Идентичными между собой являются изоляты 09/7 RYAZAN и 09/7E KALUGA, 10/14 KALUGA, а также 09/5164 ROSTOV и 10/5b KALMIKIYA, 10/2d KALMIKIYA.

По результатам филогенетического анализа образцов ДНК на основе гена pol провируса лейкоза КРС выявлена принадлежность исследуемых изолятов провируса лейкоза КРС, циркулирующих на территории республики Калмыкии к большой группе изолятов, к которой отнесены штаммы из Аргентины, Австралии, Японии, США,

Бразилии, отличной от двух других (рис.1). При этом данные изоляты отличаются от штаммов из США (М10987 BLV GAGA), Северной Италии (S83529) и также США (NC001414, AF033818), составляющих отдельные клады (рис.2).

• 10/12 KALUGA О 09/6077 ROSTOV

64

О 10/5t ALTAY М16017 (USA) ,•10/14 KALUGA  09/7 RYAZAN 'Ф 09/7E KALUGA

10/13 KALUGA 10/8k KALMIKIYA ---------О 10/6Ch ALTAY

.O 09/5164 ROSTOV

♦ 10/2d KALMIKIYA !♦ 10/5b KALMIKIYA

721

---V 1 0/21 37 MOSCOW

----------AF257515

-------D00647

09/2677 TULA

09/2692 TULA DQ288979 Brasil

-------------K02120

K+FLK-BLV

63' EF600696

, 09/14 RYAZAN

10/19 VOLOGDA

Рис. 1. Ветвь филогенетического древа.

Высокая степень сходства для анализируемых штаммом с перечисленными международными изолятами в среднем составляет от 97-100% в зависимости от референсной последовательности. Максимальное совпадение выявлено с изолятом М16017_^А: в случае штамма 10/8к_ВЕМКШ" выявлено 100% сходство; для штаммов 10/2d_DRUGNOE, 10/5b_GURT_ALIEVA такое совпадение составляет 98-99% (рис 2 ).

Дендрограмма построена дистанционным методом минимума эволюции (МЕ) с использованием р-дистанций и бутстрэп-анализа (N=1000). Массив составляет 16 последовательностей.

---------М2120 ^ CG)_Japan

DQ288979_ Brazil

,1 K+ FLK-BLV

731 EF600696_FLK-BLV _USA i AF257515_Argentina

981 FJ914764_Argentina D00647 Australia

DQ288980 Brazil

DQ288981_Brazil DQ288977_Brazil I DQ288973 _Brazil DQ288972_Brazil IA 10/8k_DEMKIN 1-------M16017 USA

A 10/2d DRUGNOE

s^A 10/5b GURT ALIEVA

Рис2. Ветвь филогенетического древа.

75

39

23

55

88

Распределение вируса лейкоза крупного рогатого скота на территории Городови-ковского района Республики Калмыкия в зависимости от его генотипа неоднородно.

Снижение интенсивности мониторинга и несвоевременная изоляция реагирующих ПЦР животных неминуемо приводят к росту показателей инфицированности и заболеваемости. Согласно литературным данным, это может быть результатом сочетанной эволюции вируса и хозяина, приведшей, с одной стороны, к появлению нового генетического варианта вируса, способного более эффективно распространяться благодаря снижению собственных антигенных и иммуногенных характеристик и избегать благодаря этому иммунного надзора, а с другой стороны - к увеличению в стадах доли животных с низкой эффективностью реагирования на данный генотип, что может быть связано с особенностями кровной и породной принадлежности и наличием в геноме хозяина определенных генотипов по некоторым генам цитокиновой сети [9, С. 41].

Список литературы

1. Козырева Н.Г. Филогенетический анализ участка гена pol изолятов провируса лейкоза КРС, обнаруженных у животных из различных хозяйств регионов Российской Федерации //Доклады РАСХН. - 2011. - №6. - С. 48-50.

2. Крикун В. А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность // Ветеринария. - 2002. - № 6. - С. 7-9.

3. Прохватилова Л. Б., Ломакин А. И., Колосов С. Н., Дрыгин В. В., Рыба-

ков С. С., Гусев А. А. Диагностика лейкоза КРС методом полимеразной цепной реакции // Вестник РАСХН. - 1998. - № 5. - С. 65-68.

4. Смирнов П. Н. Болезнь века - лейкоз крупного рогатого скота. - Новосибирск, 2007. - 302 с.

5. Смирнов П. Н., Незавитин А. Г., Смирнова В. В., Храмцов В. В. Проблемы лейкоза животных. - Новосибирск, 1992. - 468 с.

6. Смирнов П.Н. Генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупного рогатого скота разной породной принадлежности // Аграрный вестник Урала. - 2009. -№7(69). - С. 89-91.

7. Сюрин В. Н., Самуйленко А. Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Вирусные болезни животных. - М., 1998. - 928 с.

8. Asfaw Y., Tsuduku S., Konishi M. et al. Distribution and superinfection of bovine leukemia virus genotypes in Japan. // Arch. Virol. - 2005. - V.150. - P. 493-505.

9. Felmer R. G. Molecular analysis of a 444 bp fragment of the BLV gp51 env gene reveals a high frequency of non-silent point mutations and suggest the presence of two subgroups of BLV in Chile // Vet. Microbiology. - 2005. - № 108. - P. 39-47.

10. Heeney J., Valli P., Jacobs R., Valli V. Evidence for bovine leukemia virus infection of peripheral blood monocytes and limited antigen expression in bovine lymphoid tissue. Lab.Invest. - 1992. - № 66. - P. 608-617.

11. Licursi M., Inoshima Y., Wu D., Yokoyama Т., Gonzales E. Т., Sentsui H. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts // Virus Research. - 2002. - № 86. - P. 101-110.

12. Sagata N., Yasunaga Т., Tsuzuku-Kawamura J., Ohishi K., Ogawa Y., Ikawa Y. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to other retroviruses /PNAS/ - 1985. - № 82. - P. 677-681.