Оптимизированная питательная среда для укоренения побегов винограда в культуре in vitro, сорт "Августин"
OPTIMIZED NUTRIENT MEDIUM FOR ROOTING GRAPE SHOOTS IN IN VITRO CULTURE, "AUGUSTINE" CULTIVAR

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала при помощи методов клонального микроразмножения.
Известны питательные среды различного минерального состава, предназначенные для укоренения ягодных и плодовых растений in vitro (Алексеенко Л.В. Подбор питательных сред для клонального микроразмножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники / Алексеенко Л.В., Высоцкий В.А / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М., 1997. - Т. IV. - С.77-82, Шипунова А.А. Подбор минеральной основы питательных сред для клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях. / Шипунова А.А., Высоцкий В.А./ Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М, 2001. Т. VII. С.158-163).
1
2
Наиболее часто для укоренения побегов, полученных в культуре in vitro, исследователи используют половину макро- и микросолей по прописи, разработанной Мурасиге и Скуга (MS /), (Murashige Т., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497).
Для наиболее эффективного ее применения исследователи практически всегда оптимизируют ее состав, изменяя гормональный фон или вводя различные добавки в виде аминокислот, витаминов, препаратов нового поколения (Белошапкина О.О. Использование биопрепаратов при клональном микроразмножении земляники / Белошапкина О.О., Жаркова И. В.// Докл. ТСХА. - 2001. - №273, ч. 2. - С.284-289). Значительно реже исследователи изменяют минеральный состав и, как правило, незначительно.
При этом следует отметить, что минеральный состав среды Мурасиге и Скуга (МС) плохо подходит для укоренения побегов, полученных in vitro, так как среда разрабатывалась для культивирования каллусов и каллусных клеток и учитывает, прежде всего, условия для их развития. Соотношение и концентрации макроэлементов в среде неоптимальные относительно потребности в них микрорастений винограда, что в процессе культивирования приводит к дисбалансу минеральных солей, сдвигу рН питательной среды и как следствие ухудшает параметры развития микрорастений винограда.
1
2
4
3
3
2
4
4
2
2
4
2
2
2
3
3
4
2
4
2
2
4
4
2
2
2
Наиболее часто применяемая среда для укоренения (MS /) содержит следующие компоненты мг/л: NHNO - 825; KNO - 950; KНРO - 85; MgSO*7HO - 185 мг/л, СаСl - 220; FeSO*7HO - 13,4-13,8; Na ЭДТА 2НO - 18,5-18,9; НВO - 3,0-3,2; MnSO*4HO - 11,0-11,4; ZnSO*7HO - 4,1-4,5; KJ - 0,40-0,44; NaMoO - 0,11-0,15; CuSO*5HO - 0,011-0,015; CoCI⋅6HO - 0,011-0,015; миоинозит - 40-60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,2-0,3; аскорбиновая кислота 0,4-0,6; ИМК - 0,5-1,5; сахароза - 14000-16000; агар - 6000-8000; остальное бидистиллированная вода до 1 л; рН - 5,5-5,9.
Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда - Н2, разработанная для укоренения побегов винограда, полученных на этапе пролиферации (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / ВНИИВиПП «Магарач» (П.Я. Голодрига, В.А. Зленко, Л.А. Чекмарев), ИФР АН СССР (Р.Г. Бутенко), ИФР АН УССР (Б.А. Левенко), и др. - Ялта: Издательская группа ВНИИ ВиПП «Магарач», 1986 - 56 с).
Недостатками данной среды для укоренения являются высокое содержание хлора, несбалансированность элементов по магнию и фосфору, а также низкое содержание хелата железа и микроэлементов (1/4 прописи МС), что при укоренении побегов негативно сказывается на регенерации корней и последующем развитии побегов и листьев. Кроме того, несбалансированное содержание макроэлементов часто провоцирует рост каллусной ткани и преждевременное старение эксплантов.
Задача, на решение которой направлено изобретение, является повышение количества и качества укорененных побегов и преодоление сортовой специфики виноградного растения на этапе укоренения.
4
3
3
4
2
2
2
Задача, на решение которой направлено изобретение, решается оптимизацией концентрации и соотношением макросолей, входящих в состав питательной среды: NHNO уменьшается до 825 мг/л; KNO - 950 мг/л; уровень содержания фосфора в среде уменьшается в два раза, MgSO⋅7HO - 220 мг/л, СаСl×2НО - хлористый кальций также в два раза 220 мг/л.
Таким образом предлагаемая оптимизированная питательная среда предоставляет из себя следующий состав: Таблица 1.
Пример осуществления способа:
В питательную среду вносят следующие компоненты (концентрации в мг): при следующем соотношении компонентов, мг/л:
Агар-агар
7000
Сахароза
15000
KNО<sub>3</sub> - азотнокислый калий
950
NH<sub>4</sub>NО<sub>3</sub> - азотнокислый аммоний
825
MgSО<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>О - сернокислый магний
185
CaCl<sub>2</sub>×2Н<sub>2</sub>О - хлористый кальций
220
КН<sub>2</sub>РО<sub>4</sub> - фосфорнокислый калий
85
Мезоинозит
100
KI - йодистый калий
0,42
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub> - борная кислота
3,1
ZnSО<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>О - сернокислый цинк
4,3
MnSО<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>О - сернокислый марганец
1,1
CuSО<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>О - сернокислая медь
0,025
NiCl<sub>2</sub> - хлористый никель
0,025
Никотиновая кислота
1
Пиридоксин В<sub>6</sub>
1
Тиамин В<sub>1</sub>
1
FeSО<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>О - сернокислое железо
27,8
Трилон БNa<sub>2</sub>ЭДТА×2Н<sub>2</sub>O
37,2
Уголь активированный
5000
рН среды
6,6
В начале объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают рН 6,4-6,6 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,7-1,0 атм. (температура 119-121°С) в течение 20-25 мин. После остывания среды осуществляют высадку срезанных с этапа пролиферации побегов.
Испытание оптимизированной прописи питательной среды показало эффективность ее применения в сорте «Августин» учувствовавшего в испытании. Влияние разработанной питательной среды, для укоренения срезанных с пролиферации побегов, на их рост и развитие через 70 дней, представлено в табл. 2.
Как видно, из представленных данных в варианте, где для укоренения побегов примененяли разработанную пропись питательной среды, укореняемость микропобегов была лучше, стабильно улучшалось их развитие, а также снижалось число отбракованных эксплантов из-за некроза или отсутствия развития.
4
3
3
4
2
2
2
Таким образом, установлено, что соотношение макросолей, входящих в состав питательной среды: NHNO уменьшенное до 825 мг/л KNO - 950 мг/л; уровень содержания фосфора в среде уменьшенное в два раза, MgSO⋅7HO - 220 мг/л, СаСI×2НO - хлористый кальций также в два раза 220 мг/л. заметно повышает процессы регенерации и развития микрорастений на этапе укоренения побегов.
Использование предложенной оптимизированной питательной среды для укоренения микропобегов винограда в условиях in vitro обеспечивает по сравнению с существующей следующие преимущества:
1. Повышает количество укоренных побегов винограда in vitro, срезанных с этапа пролиферации, и соответственно выход укорененных микрорастений в среднем на 20,0-30,0%. Соответственно снижает количество отбракованных эксплантов из-за некроза и отсутствия развития.
2. Заметно улучшает развитие микрорастений винограда, ростовые процессы при этом ускоряются минимум в два раза.
3. В разработанной питательной среде для достижения значительного положительного эффекта предусмотрено использование стандартных и общепринятых (в клональном микроразмножении растений) компонентов и не требуется дополнительно применение редких или малоизученных физиологически активных веществ.
Изобретение позволяет повысить количество и качество укорененных побегов.