БИОЧИП С МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СИСТЕМОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ (ВАРИАНТЫ)
MULTIPLEX IDENTIFICATION SYSTEM BIOCHIP (VERSIONS)

Область изобретения
Изобретение относится к области изготовления биочипов, которые могут быть использованы в качестве диагностических средств в области медицины, ветеринарии, биотехнологии, криминалистики, защиты окружающей среды и пищевой промышленности.
Уровень техники
Известно большое количество технических решений, касающихся применения биочипов для диагностики, в которых в качестве зондов, размещенных на поверхности биочипа, используют нуклеиновые кислоты, белки, антитела, антигены, клетки и ткани.
В существующих методах диагностики используют как параллельные анализы множества индивидуальных биочипов, например при анализе присутствия генно-модифицированных материалов в пищевых продуктах, так и последовательные анализы, которые применяют для контроля течения лечения в медицинских учреждениях или при контроле параметров загрязненности окружающей среды. В процессе параллельного и последовательного анализа часто возникает необходимость маркирования тех объектов, которые подвергаются диагностике.
В связи с развитием компьютерных баз данных, в которых размещают данные анализа, существует возможность долгого архивного хранения результатов диагностики с тем, чтобы использовать эти результаты на протяжении длительного времени, например для исследования здоровья пациентов. Однако в связи с возможностью несанкционированного доступа в компьютерные базы данных и из-за возможности внешнего редактирования данных анализа с помощью стандартных графических программ компьютерные базы не могут заменить архивное хранение биочипов, прошедших сканирование. Реальные образцы биочипов трудно подделать, поскольку как материал подложки, так и используемые реактивы отличаются друг от друга в разных партиях. Вторичное сканирование биочипов, взятых из архива, дает возможность проверки тех данных, которые занесены в компьютерные базы данных.
Кроме того, существуют аппаратные возможности сравнения непосредственно двух биочипов, один из которых взят из архива, в дифференциальном режиме без применения данных, взятых из компьютерных баз. Таким образом, биочипы, находящиеся во временном или постоянном архиве хранения, могут быть использованы для принятия решений в особо важных случаях, например при диагностике заболеваний или в криминалистике.
В большинстве случаев для диагностики используют биочипы или диагностические слайды с одним идентификатором в виде штрихкода [1-6]. В других вариантах формируют область для нанесения графической информации [7-9]. Известно, когда для идентификации применяют несколько однотипных идентификаторов [10] или используют несколько идентификаторов разного типа, к которым относятся штрихкод, магнитный элемент и буквенно-цифровой идентификатор [11].
Существующие способы идентификации биочипов содержат ограничения, связанные с трудностью поиска биочипов в известных устройствах, применяемых для хранения биочипов. К недостатку конструкций биочипов, использующих идентификаторы, размещенные на лицевой поверхности биочипов, относится необходимость извлечения биочипов из устройств, предназначенных для их хранения, для осуществления процесса считывания параметров идентификаторов. Обычно устройства для хранения слайдов или биочипов выполнены в виде коробок [12, 13] или стоек [14], в которых доступ к идентификатору биочипа возможен лишь при извлечении биочипа из устройства хранения.
Другие варианты конструкций связаны с установкой слайдов и биочипов в плоские держатели или платформы [15-17]. Такое решение приводит к высокой стоимости хранения и транспортировки из-за низкой плотности размещения слайдов или биочипов и требуют дополнительных средств для идентификации самих платформ и плоских держателей, что снижает эффективность их применения.
Известны системы поиска химических компонентов, размещенных в микроплашках, содержащих идентификаторы на основе штрихкодов, содержащих множество ячеек (например, на 864 ячейки), которые размещены на стеллажах [18]. Для идентификации используют идентификаторы, размещенные не только на лицевой поверхности во вспомогательной зоне плашки, но и индикаторы, размещенные на торцевой поверхности плашек [19]. Однако толщина биочипов, выполненных на основе стеклянных слайдов или полимерных листов, в большинстве случаев находится в пределах от 0,8 до 1,5 мм, что недостаточно для размещения на такой узой торцевой поверхности известных типов идентификаторов.
Таким образом, к общему недостатку известных систем идентификации относится трудность поиска местонахождения отдельных биочипов или слайдов с образцами после проведения сканирования и установке биочипов или слайдов в держатели на временное или постоянное хранение.
Технической задачей настоящего изобретения является повышение эффективности поиска слайдов или биочипов, размещенных во временных или постоянных хранилищах, за счет разработки новой многофункциональной системы идентификации для слайдов или биочипов, позволяющей упростить поиск слайдов или биочипов во временных или постоянных архивах.
Другой технической задачей изобретения является разработка конструкции слайда или биочипа, которая позволяет дополнительно с усовершенствованием идентификации слайда или биочипа упростить поиск образцов биоматериалов, которые размещены во временных или в постоянных архивах после диагностики.
Другой технической задачей изобретения является разработка конструкции слайда или биочипа, которая дополнительно с идентификацией слайда или биочипа позволяет упростить поиск параметров предыдущих данных диагностики, размещенных в электронных базах данных, без дополнительного поиска слайдов или биочипов в архиве.
Сущность изобретения
Одним из объектов изобретения является биочип с многофункциональной системой идентификации для диагностики, содержащий базовый элемент, кластеры, зонды, идентификатор, верхнее и нижнее многослойное покрытие и дополнительный элемент, который размещен в одной плоскости с базовым элементом и расположен рядом с торцом базового элемента, при этом базовый и дополнительный элементы закреплены друг относительно друга с помощью клеевых слоев, которыми снабжены многослойные покрытия. Верхнее многослойное покрытие размещено на поверхности базового и дополнительного элементов, выполнено сплошным и на его поверхности расположены кластеры с зондами или верхнее покрытие имеет сквозные отверстия, образующие зоны для размещения кластеров с зондами. Идентификатор наклеен на верхнее многослойное покрытие или выполнен в виде графического изображения, нанесенного на поверхность верхнего многослойного покрытия, при этом верхнее многослойное покрытие выполнено из материала, обеспечивающего возможность его разрезания в зоне сопряжения торцов базового и дополнительного элементов. Нижнее многослойное покрытие выполнено сплошным или содержит сквозные отверстия, расположение которых совпадает с положением отверстий в верхнем многослойном покрытии, при этом нижнее многослойное покрытие выполнено из гибкого материала, обеспечивающего возможность поворота дополнительного элемента, с размещенным на нем идентификатором, относительно базового элемента на угол до 180 градусов после разрезания верхнего многослойного покрытия, в зоне сопряжения торцов базового и дополнительного элементов.
Другим объектом изобретения является биочип с многофункциональной системой идентификации для диагностики, содержащий базовый элемент, кластеры, зонды, идентификатор, элемент, который размещен в одной плоскости с базовым элементом, выполнен из общей пластины вместе с базовым элементом и соединен с ним перемычкой, при этом базовый и дополнительный элементы закреплены друг относительно друга с помощью верхнего и нижнего многослойного покрытия, снабженных клеевыми слоями. Верхнее многослойное покрытие размещено на поверхности базового и дополнительного элементов, выполнено сплошным и на его поверхности расположены кластеры с зондами или покрытие имеет сквозные отверстия, образующие зоны для размещения кластеров с зондами, при этом идентификатор наклеен на верхнее многослойное покрытие или выполнен в виде графического изображения, нанесенного на поверхность верхнего многослойного покрытия, при этом верхнее многослойное покрытие выполнено из материала, обеспечивающего возможность его разрезания в зоне перемычки между базовым и дополнительным элементами. Нижнее многослойное покрытие выполнено сплошным или содержит сквозные отверстия, расположение которых совпадает с положением отверстий в верхнем многослойном покрытии, при этом нижнее многослойное покрытие выполнено из гибкого материала, обеспечивающего возможность поворота дополнительного элемента, с размещенным на нем идентификатором, относительно базового элемента на угол до 180 градусов после разрезания верхнего многослойного покрытия, в зоне перемычки между базовым и дополнительным элементами и последующего разрушения перемычки.
Другим объектом изобретения является биочип с многофункциональной системой идентификации для диагностики, содержащий базовый элемент, кластеры, зонды, идентификатор и снабженный верхним и нижним многослойными покрытиями, вторым идентификатором и двумя дополнительными элементами, для размещения соответственно первого и второго идентификаторов. Дополнительные элементы размещены в одной плоскости с базовым элементом и расположены друг за другом так, что торец базового элемента прилегает к первому торцу первого дополнительного элемента, а торец второго дополнительного элемента прилегает ко второму торцу первого дополнительного элемента, при этом базовый элемент, первый и второй дополнительные элементы размещены между верхним и нижним многослойными покрытиями и закреплены друг относительно друга с помощью клеевых слоев, которыми снабжены многослойные покрытия. Верхнее многослойное покрытие размещено на верхней поверхности базового, первого и второго дополнительных элементов, выполнено сплошным и на его поверхности расположены кластеры с зондами или покрытие имеет сквозные отверстия, образующие зоны для размещения кластеров с зондами. Первый и второй идентификаторы наклеены на верхнее многослойное покрытие или выполнены в виде графического изображения, нанесенного на поверхность верхнего многослойного покрытия, при этом верхнее многослойное покрытие выполнено из материала, обеспечивающего возможность его разрезания в зоне сопряжения торцов базового и первого дополнительного элементов и в зоне сопряжения торцов первого и второго дополнительных элементов. Нижнее многослойное покрытие выполнено сплошным или содержит сквозные отверстия, расположение которых совпадает с положением отверстий в верхнем многослойном покрытии, при этом нижнее многослойное покрытие выполнено из гибкого материала, обеспечивающего возможность разрезания нижнего многослойного покрытия в зоне сопряжения торцов первого и второго дополнительных элементов, с возможностью отсоединения второго элемента от биочипа и последующего поворота первого дополнительного элемента с размещенным на нем идентификатором относительно базового элемента на угол до 180 градусов, после разрезания верхнего многослойного покрытия в зоне сопряжения торцов базового элемента и первого элемента.
Другим объектом изобретения является биочип с многофункциональной системой идентификации для диагностики, содержащий базовый элемент, кластеры, зонды, идентификатор и снабженный вторым идентификатором и двумя дополнительными элементами, для размещения соответственно первого и второго идентификаторов, дополнительные элементы размещены в одной плоскости с базовым элементом, выполнены из общей пластины вместе с базовым элементом, расположены друг за другом, соединены друг с другом с помощью перемычек, при этом торец базового элемента через перемычку соединен с торцом первого дополнительного элемента, торец второго дополнительного элемента соединен со вторым торцом первого дополнительного элемента, при этом базовый элемент, первый и второй дополнительные элементы дополнительно скреплены друг с другом с помощью клеевых слоев, которыми снабжены верхнее и нижнее многослойные покрытия. Верхнее многослойное покрытие размещено на поверхности базового, первого и второго дополнительных элементов, выполнено сплошным и на его поверхности расположены кластеры с зондами или покрытие имеет сквозные отверстия, образующие зоны для размещения кластеров с зондами, при этом идентификаторы наклеены на верхнее многослойное покрытие или выполнены в виде графического изображения, нанесенного на поверхность верхнего многослойного покрытия, при этом верхнее многослойное покрытие выполнено из материала, обеспечивающего возможность его разрезания в зонах перемычек. Нижнее многослойное покрытие прикреплено клеевым слоем к задним поверхностям базового элемента и задним поверхностям первого и второго дополнительных элементов, выполнено в виде сплошного массива или содержит сквозные отверстия, расположение которых совпадает с положением отверстий в верхнем многослойном покрытии, при этом нижнее многослойное покрытие выполнено из материала, обеспечивающего возможность разрезания покрытия в зоне перемычки между первым и вторым дополнительным элементом, с возможностью последующего разрушения перемычки и отсоединения второго элемента с идентификатором от первого элемента, соединенного с базовым элементом, где возможность поворота первого дополнительного элемента с размещенным на нем идентификатором относительно базового элемента на угол до 180 градусов обеспечивают за счет гибких свойств нижнего многослойного покрытия после разрезания верхнего многослойного покрытия в зоне перемычки между базовым и первым дополнительным элементами и разрушения данной перемычки.
Верхнее и нижнее многослойные покрытия выполнены из материалов, входящих в группу, состоящую из: i) непрозрачных материалов, ii) светопроницаемых материалов, iii) светоотражающих материалов, iv) светопоглощающих материалов. Базовый элемент и дополнительные элементы изготавливают из полимеров, металлов, керамики, стекла или из их комбинации толщиной от 0,5 мм до 10 мм. В качестве материала гибкого мультислоя используют полимеры, металлы или их комбинацию толщиной от 0,05 до 1,0 мм. Светоотражающая поверхность выполнена зеркальной или световозвращающей и нанесена на поверхность самоклеящейся пленки или металлической пленки.
Наклейка-идентификатор выполнена в виде графического идентификатора, магнитного носителя или их комбинации.
Перечень фигур
На фиг.1 приведен фрагмент сечения биочипа, содержащего базовый элемент и дополнительный элемент, где а) базовый и дополнительный элементы выполнены из отдельных плоских элементов, б) базовый и дополнительный элементы выполнены из единой твердой основы, которая содержит выемку между базовым и индикаторным элементами.
На фиг.2. приведен фрагмент сечения биочипа, содержащего базовый элемент и первый и второй дополнительные элементы, причем базовый и дополнительные элементы выполнены из единой твердой основы и последовательно соединены друг с другом с помощью первой и второй перемычки.
На фиг.3. приведена схема трансформирования биочипа на этапах диагностики и хранения.
На фиг.4 приведена изометрическая проекция составных частей биочипа, содержащего два идентификатора и две рабочие зоны, выполненного на основе трех планарных элементов, соединенных друг с другом перемычками, к которым крепят верхнее и нижнее многослойное покрытие.
На фиг.5. приведен вариант мультичипа, который может быть использован для изготовления индивидуальных биочипов.
На фиг.6 представлены варианты формирования флюоресцентных сигналов с использованием отражающей поверхности, где а) отражающая поверхность выполнена зеркальной, б) отражающая поверхность выполнена из световозвращающего материала.
На фиг.7 приведены результаты усиления флюоресцентного сигнала в зависимости от расстояния между флюоресцентной меткой и зеркальной поверхностью, где а) изображение кластеров без зеркальной поверхности; б), в), г) изображение кластеров с применением зеркального слоя, размещенного соответственно на расстоянии 1 мм, 3 мм и 6 мм от рабочей поверхности биочипа.
На фиг.8 приведены сечения фрагментов биочипа для разных вариантов верхнего и нижнего многослойного покрытия, где а) верхнее многослойное покрытие содержит отражающую поверхность, б) нижнее многослойное покрытие содержит отражающие поверхности, размещенные под рабочими зонами биочипа, в) верхнее многослойное покрытие содержит полимер, адаптированный к иммобилизации белков.
Описание
Описание терминов
Под термином «биочип» подразумевается устройство, в состав которого входит базовый и первый дополнительный элементы или базовый и первый и второй дополнительные элементы, выполненные на основе твердого носителя, и не менее одного гибкого многослойного покрытия, снабженного клеящим слоем, который объединяет базовый элемент и первый дополнительный элемент или базовый элемент, первый и второй дополнительные элементы в единую многослойную конструкцию. Причем базовый элемент и дополнительные элементы могут быть выполнены: а) из единого твердого носителя и связаны перемычкой или б) выполнены из раздельных элементов. На поверхности рабочей зоны, размещенной на базовом элементе, формируют кластеры с зондами. В границах первого и второго дополнительных элементов размещают первый и второй идентификаторы, характеризующие параметры индивидуального биочипа. Идентификаторы выполняют в виде отдельных многопараметрических идентификаторов, например штрихкодов или магнитных лент. Возможно дополнительное нанесение кодовых, цифровых или буквенных идентификаторов на вспомогательной поверхности базового элемента рядом с рабочей зоной или рядом с кластерами.
Под термином «твердый носитель» подразумевается твердый планарный элемент, преимущественно прямоугольной формы. В качестве материалов, из которых изготовлены твердые носители, могут быть использованы полимеры, стекло, металл, слюда, керамика или их комбинации.
На выбор материала слайда влияют физико-механические свойства слайдов: термопластичность, возможность штамповки и формирования в расплавленном состоянии, возможность выдерживать температурные циклы при проведении гибридизации, стойкость к химическим реагентам, входящим в состав гибридизационной смеси и растворов для промывок. Термопластичные пластмассы обеспечивают возможность штамповки и формирования выбранной формы слайда из расплава полимера. Полимеры выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. Используя термопластичные свойства полимеров на поверхности слайда могут быть сформированы выемки, выступы, барьеры, канавки.
В рамках данного изобретения под термином «базовый элемент» понимают отдельный твердый плоский элемент или элемент, выполненный из единой заготовки совместно с первым и вторым дополнительным элементами при изготовлении биочипа. На поверхности рабочей зоны базового элемента в процессе изготовления биочипа формируют кластеры с зондами, характеризующими индивидуальный биочип. Как конструктивный элемент биочипа базовый элемент выполняет две функции. В соответствии с основной функцией базовый элемент является носителем зондов, которые иммобилизуют на поверхность базового элемента или на поверхность верхнего многослойного покрытия в границах рабочих зон, размещенных на поверхности базового элемента при формировании биочипа. Второй функцией, которую базовый элемент выполняет в качестве конструктивного элемента биочипа, является функция крепления многослойного покрытия на поверхности базового элемента для создания гибридизационных объемов. В этом случае базовый элемент выполняет вспомогательную функцию твердого носителя для гибкого многослойного покрытия.
В зависимости от задач диагностики размеры базового элемента, на котором размещают зонды, могут быть меньше или больше стандартных стеклянных слайдов. Базовый элемент может являться элементом конструкции, в которую входит держатель базового элемента. При выборе размеров базового элемента более предпочтительно использовать не только стандартные размеры индивидуальных слайдов, равные 25 мм × 75 мм, но и другие размеры [20]. Например, для сокращения расходов на подготовку индивидуальных биочипов возможно использовать размеры базового элемента, габариты которых составляют значение 12,5 мм × 75 мм, либо мини - базовые элементы размером 25 мм × 37,5 мм, либо 12,5 мм × 37,5 мм. Возможно применение других размеров базового элемента более 4 мм × 4 мм и менее 120 мм × 120 мм.
Один из аспектов изобретения включает выбор материала, из которого выполняют биочип. Выбор оптических свойств материала базового элемента биочипа зависит от способа регистрации данных диагностики. Разные типы меток регистрируют разными физическими методами. Наиболее широко распространены способы измерения пропускания [21, 22], измерения отраженных сигналов [23, 24] или измерения флуоресцентных сигналов [25, 26].
Исходя из выбранного типа метки и способа регистрации материал, из которого изготавливают слайд, может представлять собой однородный твердый материал, например стекло, слюду, полимер, металл, керамику. При изготовлении слайдов из полимеров они могут быть прозрачными, матовыми, белыми, черными или цветными. Для измерения результатов диагностики в режиме пропускания материал слайда должен обладать величиной пропускания света не менее 80-90%. При измерении отраженного, например колориметрического, сигнала требования к материалу слайда связаны с качеством формирования белой отражающей поверхности. При измерении сигналов в режиме флуоресценции необходимо, чтобы материал слайда или внешней поверхности многослойного покрытия обладал минимальной собственной флуоресценцией.
В зависимости от способа регистрации флуоресценции материал может быть прозрачным, выполненным из стекла или прозрачного пластика, например полиметилметакрилата, или выполнен в виде непрозрачного материала, например черного цвета, обладающего минимальной отражающей способностью, выполненного, например, из полихлорвинила.
Результаты диагностики, отражающие взаимодействие между исследуемым образцом и зондом, детектируют с помощью меток. В рамках данного изобретения могут быть использованы любые метки, выбранные из группы, состоящей из флуоресцентных, колориметрических, ферментных, радиоактивных меток, меток, связанных с резонансным переносом энергии (FRET, BRET), меток, излучающих сигнал люминесценции (хемилюминесцентные или биолюминесцентные метки).
Наибольшее распространение получили биочипы с иммобилизованными олигонуклеотидами и белками. В зависимости от выбранного типа метки, которая иммобилизуется с исследуемым фрагментом ДНК или антитела, используют каталитические, лигандные, флуоресцентные или радиоактивные метки. В качестве каталитических меток используют гемин, цианкобаламин или флавин. В качестве лигандных меток используют биотин, диоксигенин или динитробензол. В качестве флуоресцентных меток используют Су3, Су5, Су7, FAM, TAMRA, R6G, R110, ROX или JOE. Приведенные перечни меток включают, но не ограничивают других вариантов меток, которые можно использовать для детектирования сигнала.
Под термином «дополнительный элемент» подразумевается твердый плоский планарный элемент, который преимущественно выполнен в виде прямоугольной формы. Дополнительный элемент может быть выполнен в виде отдельного твердого плоского элемента или в виде элемента, выполненного из единой заготовки при изготовлении биочипа совместно с базовым элементом. Первый и второй дополнительные элементы биочипа предназначены для крепления первого и второго идентификаторов, размещенных на поверхности верхнего многослойного покрытия или на поверхности дополнительных элементов в форме этикеток, снабженных клеящим слоем. Второй дополнительный элемент снабжен, по меньшей мере, одним технологическим отверстием, которое позволяет обеспечивать: а) крепление биочипа в пространстве камер для промывок и сушки, б) крепление второго элемента, снабженного вторым идентификатором, на устройстве хранения исследуемого образца выполненного, например, в виде пакетов, коробок, или для фиксации идентификатора на устройствах хранения объемных объектов, используемых для криминалистических исследований, или для хранения идентификаторов в медицинских картах.
Первый и второй дополнительные элементы могут обеспечить возможность установки на поверхности биочипа дополнительных защитных элементов в виде пленок, листов или пластин для защиты поверхности индивидуальных чипов при хранении или при проведении гибридизации.
Дополнительные технологические отверстия во втором дополнительном элементе (см. фиг.2) позволяют: а) группировать несколько биочипов в виде блокнотов. Материал дополнительного элемента может быть аналогичным или отличаться от материала базового элемента по физико-химическим свойствам или по цвету.
В качестве материала первого и второго дополнительных элементов предпочтительно использовать полимеры. Полимеры выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. Толщина дополнительного элемента предпочтительно должна выбираться одинаковой с толщиной используемого базового элемента или базового элемента, установленного в рамке, и лежать в пределах от 0,5 мм до 10 мм.
Под термином «многослойное покрытие» подразумевается узел, который является основным элементом для формирования биочипа. Многослойное покрытие содержит, по меньшей мере, два гибких слоя с разными физико-химическими свойствами. Многослойное покрытие может содержать композицию, по меньшей мере, из двух слоев, входящих в группу, состоящую из: i) гибкого полимерного слоя, ii) клеящего слоя, iii) отражающего слоя, iv) светопроницаемого слоя, v) непрозрачного слоя, vi) поглощающего слоя, vii) слоя, предназначенного для отображения идентификаторов биочипа, выбираемых из группы штрихкодов, магнитной ленты, индуктивных датчиков и их комбинаций.
Под термином «гибкий слой» в рамках данного изобретения подразумевается полимерный слой, который используется для формирования слоев или в котором формируют сквозные отверстия для создания гибридизационных объемов. Гибкий слой может дополнительно выполнять несущую функцию элементов биочипа при соединении базового элемента и первого и второго дополнительных элементов и может иметь толщину более чем 0,05 мм или более 0,1 мм, 0,3 мм, 1,0 мм. Клеящие слои имеют толщину более чем 0,01 мм. Отражающий слой имеет толщину более чем 0,001 мм. Светопроницаемый слой имеет толщину более чем 0,01 мм. Непрозрачный слой имеет толщину более чем 0,01 мм. Поглощающий слой имеет толщину более чем 0,001 мм. Модифицирующий и/или поглощающий слои наносятся на активные поверхности биочипов в процессе изготовления.
В перечень слоев, используемых для создания биочипов, ориентированных на анализ белков, антител, ферментов, в качестве материала слоя для иммобилизации зондов, могут входить такие полимерные материалы, как нейлон, нитроцеллюлоза, PVDF и другие полимеры.
В состав многослойного покрытия могут входить: а) гибкие слои, снабженные одним клеящим слоем, б) гибкие слои, снабженные двумя клеящими слоями и нанесенными на верхнюю и нижнюю поверхности гибкого слоя, в) гибкие слои, не снабженные клеящим слоем, г) комбинации слоев, входящих в пункты а), б), в). Гибкие слои, формирующие многослойные покрытия, размещены друг над другом и соединены таким образом, что одна из поверхностей верхнего или нижнего многослойного покрытия содержит самоклеящийся слой, который приклеивают к верхней и/или нижней поверхности несущих элементов биочипа или слайда, например путем создания давления.
Адгезивный или клеевой слой должен создавать прочную связь между поверхностью слайдов, поверхностью несущего элемента и многослойным покрытием. Эта связь должна быть стабильной и не должна нарушаться при изменении температуры внешней окружающей среды в диапазоне от -20 до 60°С. Адгезионный слой должен сохранять свои клеящие параметры в условиях действия реагентов, используемых для промывок поверхности слайдов или при формировании модифицирующего слоя на поверхности слайдов, или реагентов, участвующих в формировании раствора для гибридизации.
Под термином «зонд» подразумевается одна из двух связываемых молекул, которые взаимодействуют друг с другом посредством специфичного нековалентного взаимодействия. Молекула зонда иммобилизована на рабочей поверхности биочипа, а качество связывания определяется выбором структуры зонда. В состав группы типичных пар молекул, которые используют при изготовлении белковых и ДНК-чипов, могут входить олигонуклеотиды, белки, антигены, антитела, ферменты. Анализируемое вещество включает один или несколько типов молекул, которые необходимо диагностировать.
Под термином «кластер» подразумевается часть активной рабочей поверхности биочипа, на которой иммобилизованы зонды одного типа. На рабочей поверхности биочипов со средним уровнем плотности размещают до 500 кластеров, в которых размещают от 2 до 20 типов зондов. Кластеры могут иметь форму прямоугольника, квадрата, круга, эллипса, многоугольника, треугольника или представлять собой линейную структуру, выраженную линейной последовательностью точек. Кластеры могут наноситься на модифицированную поверхность слайдов [21] или закрепляться на немодифицированной поверхности [27].
Под термином «вспомогательная поверхность» понимается поверхность биочипа, расположенная вне пределов рабочих зон, на которых размещены кластеры с зондами.
Описание
В процессе изучения свойств полимерных материалов, с нанесенным на их поверхность клеящим слоем, в условиях изменяющейся температуры в диапазоне от -10°С до +60°С, а также в растворах буферов для гибридизации или в растворах для модификации поверхности полимеров было обнаружено, что гибкие полимерные материалы, с нанесенными на них клеящими слоями, например выполненные в виде самоклеящихся пленок, позволяют создать множество вариантов недорогих мультичипов.
Известны технические решения, в которых самоклеящиеся пленки применяют для выполнения лишь одной функции при изготовлении биочипов. К таким функциям, например, относится: создание гибридизационных объемов [28, 29], закрепление на поверхности гибкого основания твердых слайдов с модифицированной поверхностью [30], крепление на поверхности твердого субстрата твердых слайдов [31], а также приклеивание на твердую поверхность слайдов гибких полимерных пленок для формирования активной поверхности [32]. Известно применение ПВХ в качестве конструкционного элемента биочипов. Однако в известных решениях используют одну функцию ПВХ, например для создания поверхностного слоя [33] или для применения в качестве клейкой основы для приклеивания внешнего слоя на слайд [32].
Известен аналог симметричного расположения двух слоев полимерного материала над верхней и нижней поверхностью индивидуального слайда, используемого в спектроскопии [34]. Данное устройство содержит лишь четыре рабочих зоны на поверхности стеклянного слайда, а квадратная форма держателя слайда не предназначена для применения данных конструкций в широко известных сканерах, работающих с биочипами и размещенных на прямоугольных пластинах размером 25×75 мм. Кроме того, устройство не предназначено для проведения гибридизации на поверхности слайда, поскольку в материалах нет данных о возможности работы конструкции с нанесенными растворами при повышенных температурах, требуемых для гибридизации. Настоящее изобретение устраняет все вышеперечисленные недостатки аналогов.
Предлагаемое техническое решение устанавливает иной подход в конструировании биочипов или слайдов, поскольку предполагает использовать трансформируемую конструкцию, изменяющую свою конфигурацию в течение процесса диагностики.
Кроме этого, в данном изобретении для повышения эффективности и удешевления производства биочипов материалы гибких слоев, входящих в состав многослойного покрытия, выбирают такими, чтобы они могли выполнять одновременно, по крайней мере, несколько независимых функций.
Первая, конструкционная, функция связана с поддержкой и креплением базового элемента и первого и второго дополнительных элементов друг относительно друга на всех этапах производства биочипа, начиная от этапа обработки поверхности слайдов до этапа диагностики.
Второй функцией, которую может выполнять материал гибких слоев, входящих в многослойное покрытие, является создание разделенных друг от друга гибридизационных зон на поверхности базового элемента, входящего в состав биочипа. Гибридизационные зоны формируют выполняя сквозные отверстия в материале гибкой основы.
Третья функция гибких слоев связана с выбором материала гибкого слоя и его физико-химических свойств поверхности. К таким свойствам относятся: а) обеспечение возможности иммобилизации зондов на модифицированной или немодифицированной поверхности гибкого слоя, б) возможность формирования отражающей поверхности для усиления сигналов флюоресценции, в) возможность выбора гибкого слоя с поверхностью, которая осуществляет тушение флуоресценции.
К четвертой функции гибкого слоя, размещенного на внешней поверхности многослойного покрытия, можно отнести возможность нанесения на его поверхности графического изображения штрихкода или иной графической цифровой или буквенной информации, идентифицирующих как отдельные биочипы, так и кластеры.
К пятой функции, которую может выполнять гибкий слой в конструкции биочипа, можно отнести возможность легкого отделения от биочипа второго дополнительного элемента для идентификации исследуемых проб для последующего хранения в архиве и возможность формирования гибкого шарнирного соединения для обеспечения возможности поворота первого дополнительного элемента относительно базового элемента на угол от 0 до 180 градусов или на 90 градусов.
В качестве дополнительного информативного параметра при построении биочипа возможно использовать цвет полимера, входящего в состав верхнего или нижнего гибкого слоя, что позволяет привязать цвет биочипов к той диагностической функции, которую они выполняют.
Возможно выполнение вспомогательной зоны базового элемента в цветовой гамме, отличной от цветовых гамм первого и второго дополнительных элементов. Выбор определенного цвета для базового элемента, первого и второго идентификатора позволяет упростить работу оператора при проведении гибридизации и при сканировании результатов, поскольку может являться дополнительной информацией, позволяющей определить тип биочипов, который связан с определенным цветом вспомогательной зоны или цветом первого или второго идентификаторов.
Совокупность более пяти технических функций гибких слоев позволяет получить синергический положительный эффект, который не был получен ранее, поскольку для создания биочипов использовалось не более двух функций гибкого слоя.
В рамках данного изобретения для создания многослойного покрытия возможно использовать широкий спектр полимеров. Материал, из которого изготавливают гибкое многослойное покрытие, может быть выполнен из прозрачных или цветных гибких полимеров, полимеров, которые снабжены отражающим слоем, полимеров с малым уровнем автофлуоресценции, полимеров, способных к модификации поверхности или к непосредственной иммобилизации на ее поверхности олигонуклеотидных или белковых зондов.
К таким материалам можно отнести полиэтилен, полипропилен, поливинилхлорид (ПВХ). Наиболее предпочтительным является полимерный носитель, выполненный из поливинилхрода с нанесенным на него слоем клея. Например, фирма 3М (США) [35] и фирма Orafol (Германия) выпускают широкий спектр самоклеющихся материалов, выполненных на основе прозрачного, белого и цветного поливинилхлорида, а также самоклеящихся материалов, содержащих отражающий слой, выполненный в виде зеркальной или световозвращающей поверхности.
В предлагаемом изобретении техническая задача решается с помощью материалов, которые позволяют исключить термические расширения и расслоение слоев в процессе изготовления многослойного покрытия на его основе. В качестве примера, который включает, но не ограничивает объем изобретения, в качестве материала, из которого выполнены гибкие слои многослойного покрытия, предпочтительно использовать поливинилхлорид.
Неочевидность технического решения дополнительно связана с одновременным использованием всех технологических возможностей ПВХ. Разнообразие известных типов ПВХ позволяет создать биочип с новыми усовершенствованными возможностями.
К этим возможностям ПВХ для построения биочипов относятся: а) выбор цвета вспомогательной поверхности биочипов для создания цветовой гаммы мультичипа, б) применение самоклеящейся пленки с отражающей поверхностью, например выполненной с напыленным слоем алюминия или выполненной в виде световозвращающей поверхности, в) выбор разной толщины слоя ПВХ для регулирования объема гибридизационной смеси, г) возможность эффективной модификации поверхности ПВХ для активизации поверхности и иммобилизации зондов, д) нанесение на внешний слой гибкой основы графического изображения, например, в виде штрихкодов или других цифровых или буквенных идентификаторов.
Анализ уровня техники показал, что ни одно из изобретений, известных из уровня техники, не решало комплексную задачу упрощения процедуры поиска биочипов в архивах.
При разработке конструкции биочипа с многофункциональными идентификаторами было обнаружено, что введение в конструкцию биочипа, основанного на базовом элементе, первого дополнительного элемента с осуществлением возможности его поворота относительно поверхности базового элемента биочипа в диапазоне углов от 0 до 180 градусов или на 90 градусов позволяет обеспечить считывание данных с первого идентификатора при его установлении в устройство хранения без дополнительного извлечения биочипа из устройства хранения, как это представлено на фиг.3. Введение в конструкцию второго дополнительного элемента и размещение на нем второго идентификатора, который предпочтительно имеет ту же кодовую комбинацию, что и первый идентификатор, позволяет идентифицировать объекты исследования, размещенные в отдельных устройствах (коробках, пакетах, мешках, бутылях, пробирках). Такая комбинация функций первого и второго идентификаторов позволяет, в условиях современных клиник, обеспеченных компьютерными системами, обеспечить быстрый поиск по данным первого и второго идентификаторов как цифровых данных диагностики, размещенных в базе данных, так и быстрый поиск реальных образцов биочипов, прошедших этап сканирования в разное время и размещенных во временных и постоянных архивах, а также осуществить быстрый поиск образцов исследуемого материала в случае, когда необходимо провести дополнительную диагностику.
Этим достигается положительный эффект, связанный с сокращением времени поиска заданного биочипа в большом массиве архива биочипов. Данная функция особенно необходима в лечебных учреждениях для сравнения данных исследований в процессе лечения пациента.
К другой неочевидной функции первого и второго дополнительного элемента можно отнести возможность крепления к их поверхности защитной пленки для защиты поверхности сформированных биочипов при транспортировке и в качестве покрывных элементов, защищающих испарение гибридизационной жидкости при проведении гибридизации. Таким образом, все перечисленные дополнительные возможности, связанные с введением в состав биочипа первого и второго дополнительных элементов, с обеспечением возможности отсоединения второго дополнительного элемента от биочипа и с обеспечением возможности размещения первого дополнительного элемента в вертикальном положении, позволяют получить общий синергический положительный результат, связанный с удобством, простотой высокой эффективностью и надежностью поиска биочипов или объектов диагностики, размещенных в постоянных или временных архивах.
На фиг.1-4 и фиг.7 приведены примеры конструкций для разных вариантов биочипов. На фиг.5 представлен вариант выполнения мультичипа, с помощью которого изготовляется одновременно несколько индивидуальных биочипов. На фиг.1а и 1б приведены варианты наиболее простых конструкций биочипов, содержащих базовый элемент и дополнительный элемент. Биочип (10) содержит базовый элемент (1) и дополнительный элемент (2), а также верхнее (5) и нижнее (6) многослойные покрытия. В первом варианте, приведенном на фиг.1а, базовый и дополнительный элементы выполнены из отдельных плоских элементов. Верхнее (5) многослойное покрытие размещено на верхней поверхности базового (1) элемента и первого (2) дополнительного элемента. В верхнем многослойном покрытии выполнено, по меньшей мере, одно отверстие (7), положение которого совпадает с рабочей зоной биочипа. Кластеры (3) с зондами (4) размещены на верхней поверхности биочипа в пределах рабочей зоны. При проведении гибридизации стены отверстий (7), сформированных в верхнем (5) многослойном покрытии, ограничивают растекание гибридизационной жидкости. Толщиной верхнего многослойного покрытия можно регулировать объем гибридизационной жидкости. Для устранения высыхания гибридизационной жидкости на поверхность верхнего (5) многослойного покрытия накладывают покрывной элемент (на фиг.1 не показан), который выполнен съемным и края которого упираются на вспомогательную поверхность биочипа, фиксируя постоянный объем гибридизационной смеси. Нижнее многослойное покрытие (6) прикреплено к нижним поверхностям базового (1) элемента и первого (2) дополнительного элемента. Нижнее многослойное покрытие в зависимости от выбора типа биочипа и способов сканирования результатов гибридизации может быть распределено по всей поверхности базового элемента или содержать отверстия, размещенные над отверстиями в верхнем многослойном покрытии, или занимать часть поверхности, расположенной во вспомогательной зоне базового элемента. Такая конструкция позволяет осуществить прохождение световых потоков через прозрачный твердый носитель базового элемента и используется для измерения пропускания светового потока через исследуемое вещество. В других вариантах, которые более подробно описаны в примерах, нижнее многослойное покрытие может быть непрозрачным или содержать отражающую поверхность. После проведения гибридизации и сканирования результатов диагностики оператор перед установкой биочипа в устройство временного или постоянного хранения разделяет верхнее многослойное покрытие на части, сопряженные с базовым (1) элементом и дополнительным (2) элементом в зоне (8) сопряжения торцевых поверхностей базового и дополнительного элементов. При этом за счет гибких свойств нижнего многослойного покрытия, которое выполняет функцию шарнира (в зоне (9) между базовым элементом и первым дополнительным элементом), дополнительный элемент (2) может быть повернут относительно горизонтальной поверхности базового (1) элемента на угол в 90 градусов и в таком виде установлен в устройство хранения. Это расположение дополнительного элемента позволяет обеспечить свободный доступ к данным, зафиксированным на идентификаторе (14), закрепленном на дополнительном элементе, например в виде штрихкода, и осуществить возможность сканирования этих данных без извлечения биочипа или слайда из устройства (11) для хранения. Блок хранения (11) может содержать дополнительный идентификатор (11) (см фиг.3) и может, в зависимости от размеров, содержать от 10 до 1000 биочипов. Установка блоков друг над другом в вертикальной и горизонтальной плоскости по координатам ХУ позволяет значительно расширить количество хранимых биочипов и позволяет использовать автоматизированные системы поиска, аналогичные тем, которые используются для поиска плашек, с размещенными биоматериалами.
В случаях, когда необходимо обеспечить временное хранение и разделение поверхностей, накладываемых друг на друга биочипов или слайдов с образцами, дополнительный элемент поворачивают на 180 градусов по отношению к верхней поверхности базового элемента. Тем самым может быть обеспечена возможность формирования двойной толщины с одной стороны биочипа, что позволяет отделить рабочие поверхности биочипов от задних нерабочих поверхностей за счет пространства, создаваемого толщиной дополнительного элемента.
Во втором варианте биочипа, приведенном на фиг.1б, базовый и дополнительный элементы выполнены из единой твердой основы, которая содержит выемку (15) между базовым (1) и дополнительным (2) элементами, в выемке сформирована перемычка (16) между базовым и дополнительным элементами. Как и в первом варианте, верхнее многослойное покрытие (5) размещено на лицевых поверхностях базового и дополнительного элементов биочипа, а второе многослойное покрытие (6) расположено на общей задней поверхности, включающей поверхности, относящиеся к базовому и дополнительному элементам, и поверхности, относящейся к перемычке. После проведения гибридизации и сканирования оператор разъединяет верхнее многослойное покрытие (5), отделяя базовую и дополнительную части верхнего многослойное покрытия (5) друг от друга в зоне сопряжения (8) боковых поверхностей базового элемента и дополнительного элемента. Осуществляя нажим на дополнительный элемент (2), оператор разрушает перемычку (16), тем самым осуществляя возможность нижнему (6) гибкому слою выполнить функцию шарнира, соединяющего базовый (1) и дополнительный (2) элементы. Как и в первом варианте биочипа, представленном на фиг.1а, первый дополнительный элемент (2) автоматически устанавливается в вертикальном положение по отношению к горизонтальному положению базового элемента (1), далее биочип размещается в устройстве для хранения (11), осуществляя доступ к информации, размещенной на идентификаторе (14).
На фиг.2 приведен вариант биочипа (20), который содержит базовый элемент (21), первый дополнительный элемент (22) и второй (28) дополнительный элемент, выполненные из единой твердой основы, которая содержит первую (30) и вторую (31) выемки, соответственно между базовым (21) и первым (22) дополнительным элементами и между первым (22) дополнительным элементом и вторым (28) дополнительным элементом.
На фиг.3 приведена схема, поясняющая последовательность трансформирования формы биочипа (20) на разных этапах диагностики и хранения. До или после проведения гибридизации оператор разъединяет верхнее (25) многослойное покрытие в зоне, расположенной над второй (31) перемычкой, и разделяет нижнее (26) многослойное покрытие под второй (31) перемычкой, разделяя многослойное покрытие между первым (22) и вторым (28) дополнительными элементами. Затем оператор разрушает вторую перемычку (31) и отделяет второй (28) дополнительный элемент от биочипа (20). С помощью технологического отверстия (38) второй дополнительный элемент (28) с установленным на нем идентификатором может быть установлен на контейнер с образцами исследуемого материала, которые могут быть размещены в пакетах и/или в пробирках, или вложен в материалы исследований или в карту больного, идентифицируя таким образом результаты диагностики с объектом исследования в случае их поиска в электронных базах данных или в случае поиска образца исследуемого материала по данным, зарегистрированным в базах данных, для проведения вторичной диагностики.
Затем оператор проводит сканирование биочипа с помощью сканера (35), обрабатывает результаты диагностики с помощью программного обеспечения с помощью компьютера (36) и осуществляет передачу данных анализа по линии связи (37) в центральный банк данных, в котором хранятся изображения и данные диагностики, которые могут быть идентифицированы в соответствии с кодами первого и второго идентификаторов.
На заключительном этапе оператор разрезает верхнее (25) многослойное покрытие биочипа (20), отделяя базовую (21) и дополнительную (22) части верхнего многослойного покрытия друг от друга, и осуществляя нажим на дополнительный элемент (22), разрушает перемычку (30), тем самым осуществляя возможность установки первого дополнительного элемента (22) в вертикальное положение за счет гибких свойств нижнего многослойного покрытия (26) для последующей установки биочипа (20) в устройство хранения (11).
Приведенные примеры включают, но не ограничивают других вариантов биочипа, общей особенностью которых является то, что первый идентификатор размещен на стороне, противоположной гибкому многослойному покрытию, выполняющему возможность поворота первого дополнительного элемента.
На фиг.4 приведена изометрическая проекция биочипа, содержащего две рабочие зоны на базовом элементе. Базовый (40) элемент соединен с помощью первой (41) перемычки с первым (42) дополнительным элементом, который в свою очередь соединен с помощью второй (43) перемычки со вторым (44) дополнительным элементом. На верхнее многослойное покрытие (45) графическим способом нанесены или размещены выполненные на отдельных ярлыках, снабженных клеящим слоем, первый (47) и второй (48) идентификаторы, а также графическим способом нанесены линия (46) разреза верхнего многослойного покрытия в зоне между первым дополнительным и базовым элементом и вторая (49) линия разреза между первым дополнительным элементом и вторым дополнительным элементом. В приведенном варианте верхнее многослойное покрытие (45) выполнено из самоклеящейся пленки. Нижнее многослойное покрытие (50) содержит три слоя. Первый слой (51) выполняет роль прокладки, снабженной двухсторонним клеящим слоем. Первый клеящий слой приклеивают к задней стороне биочипа, ко второму клеящему слою приклеивают отражающий слой (52), который защищают с задней стороны дополнительным слоем (53) самоклеящейся пленки. На задней поверхности последнего слоя предварительно наносят графическое изображение линии разреза между первым и вторым дополнительными элементами для их последующего разделения. В верхнем (45) многослойном покрытии и в прокладке (51) сформированы отверстия (55), совпадающие с положением рабочих зон базового элемента (40).
На фиг.5 приведен вариант мультичипа, который включает, но не ограничивает других вариантов и может быть использован для изготовления индивидуальных биочипов. Структура биочипов, входящих в состав мультичипа, может быть аналогична структуре биочипа, приведенного на фиг.4.
Мультичип содержит общий для всех биочипов несущий элемент (61), который связан с каждым из биочипов индивидуальной перемычкой (68). Перемычки выполняют роль промежуточного несущего элемента и дают возможность осуществлять конструктивные функции при работе с мультичипом на разных этапах изготовления, в том числе при промывках, сушках, печати кластеров на рабочей поверхности. В несущем элементе могут быть сформированы технологические отверстия (63), позволяющие дополнительное крепление мультичипа или соединение нескольких мультичипов в виде папок или блокнотов для транспортировки или хранения. Твердые носители в форме слайдов (64) и несущий элемент (61) расположены планарно, в одной плоскости, и формируют планарный слой, к которому крепится, по меньшей мере, одно гибкое многослойное покрытие.
Индивидуальные биочипы отделяют друг относительно друга по линиям (65), графически отображенным на верхнем и нижнем многослойных покрытиях мультичипа. В верхнем многослойном покрытии (66) мультичипа могут быть сформированы отверстия (68), совпадающие с положением рабочих зон индивидуальных биочипов. Аналогичные отверстия могут быть выполнены в прокладке (69). Один из промежуточных слоев (70), в составе нижнего многослойного покрытия мультичипа, содержит отражающую поверхность. Нижний слой (71) защищает отражающий слой (70).
Известно, что фирма Telechem International Inc. [36] выпускает биочипы с зеркальной поверхностью, размещенной на задней поверхности слайдов, из которых формируют биочипы. Однако такое решение достаточно дорого, поскольку использует технологии напыления. Известны технические решения по размещению зеркальной или световозвращающей поверхности на лицевой поверхности биочипов [37] или многослойные конструкции, содержащие оптические элементы внутри слоев [38]. Однако для изготовления простых и дешевых массовых чипов более предпочтительно использовать отражающие поверхности, выполненные на основе самоклеящихся пленок.
Предпочтительно использовать в качестве световозвращающих материалов покрытия, разработанные фирмой 3М. Фирма предлагает широкий спектр многослойных световозвращающих покрытий, которые выполнены с применением сфер [39] или микроструктурированных поверхностей [40, 41, 42]. Наиболее перспективны световозвращающие пленки алмазного типа. Например, пленка серии 3990 VIP фирмы 3М представляет собой материал на основе микропризм, которые обеспечивают более высокую световозвращающую способность. Пленки с нанесенным световозвращающим слоем снабжены самоклеящимся составом и наклеиваются при комнатной температуре. Световозвращающая поверхность материалов, основанная на использовании кубических уголковых призм, изготавливается методом литья или формовки призматических элементов на нижней поверхности очень тонкой подложки. В зависимости от типа материала, на одном квадратном сантиметре поверхности размещается от 7300 до более чем 15500 призм (техническое описание фирмы 3М).
На фиг.6а представлен вариант отражения падающего света (75) на отражающей зеркальной поверхности (78) биочипа (80), размещенной за задней поверхностью базового элемента (81) биочипа, на лицевой поверхности которого размещены кластеры (82) с зондами (83), снабженными флуоресцентными красителями. Световой поток (75) падает на поверхность биочипа, на которой размещены кластеры (82) с зондами (83), вызывая первый поток флуоресценции образца S1, поступающий на вход оптической системы считывателя (35). Далее световой поток (75) проходит через прозрачный слой (81) носителя базового элемента и отражается от зеркальной поверхности (78). Зеркальная поверхность (78) прижата к обратной поверхности базового элемента с помощью защитного слоя (79), снабженного клеевым слоем. Отраженный сигнал (76) проходит через прозрачный носитель (81) и возбуждает второй поток флуоресценции S3, воздействуя на очередной кластер (84), зонды (85), снабженные флуоресцентными метками, испускают потоки флуоресценции в разные стороны, в том числе и в направлении, противоположном входу оптической системы. При этом поток флуоресценции отражается от зеркального слоя (78) и возвращается на вход оптической системы в виде потоков S2, S4. Таким образом, от одного падающего потока (22) формируется четыре потока флуоресценции Sсум.=S1+S2+S3+S4.
На фиг.6б представлен вариант преобразования падающего света (86) на биочип (81), в качестве отражающей поверхности которого используется световозвращающая поверхность (89), выполненная из самоклеящейся пленки. Световой поток (86), падающий под углом к оси оптической системы сканера (35), вызывает поток R1 флуоресценции меток, которые содержатся в кластере (82). Потоки флуоресценции распространяются в разные стороны, в том числе и падают в сторону светоотражающей поверхности (89). Падающий поток флюоресценции дважды преломляется на треугольной поверхности светоотражателя (89) и возвращается в сторону оптической приемной поверхности в виде потока R2. Падающий поток (86), пройдя через прозрачный носитель базового элемента (90) и кластер (82), размещенный на его поверхности (91), также преломляется на световозвращающей поверхности (89) и возвращается обратно в сторону излучателя света. Проходя второй раз через кластер (82), отраженный свет возбуждает второй поток R3 флуоресценции. Часть потока флуоресценции отражается от световозвращающей поверхности (89) и поступает на вход оптической системы (35) в виде потока R4 флуоресценции. Суммарный поток флуоресценции, поступающий на вход оптической системы (35), равен сумме четырех потоков Rсум.=R1+R2+R3+R4. Общий сигнал флуоресценции теоретически может быть в четыре раза больше, чем при сканировании обычных биочипов. Однако с учетом поглощения и рассеяния света на носителе образца и с учетом эффективности работы световозвращающей поверхности, которая снижается при увеличении угла наклона падающего потока (86), типа и качества светоотражающей поверхности, расстояния Н от рабочей поверхности (91) с иммобилизированными кластерами (82) до световозвращающей поверхности (89), данное техническое решение позволяет обеспечить возврат светового потока и повысить дополнительную освещенность объекта максимально не в четыре раза, как в случае с зеркалом, а от двух до трех раз, в зависимости от типа световозвращающего материала и величины угла наклона падающего света. Следует отметить, что световозвращающее покрытие, выпускаемое в промышленных масштабах, существенно дешевле, чем светоотражающие поверхности, выполняющие не световозвращение, а концентрацию флуоресцентного сигнала [43]. Известны технические решения по разработке световозвращающих пленок [42] с увеличенной эффективностью световозвращающих структур при малых углах наклона падающего света, что делает применение светоотражающих поверхностей еще более привлекательным.
Ниже показан пример, который подтверждает возможности биочипов, снабженных зеркальной поверхностью. Приведено измерение зависимости яркости свечения кластеров, размещенных в ячейке, от расстояния между задней поверхностью ячейки и зеркалом.
Таблица
Зависимость яркости свечения кластеров в ячейке толщиной 1,0 мм от расстояния между задней поверхностью ячейки и зеркалом, которое имеет коэффициент отражения света k=0,87
Условия регистрации
Расстояние от рабочей поверхности биочипа до зеркала (мм)
Среднее значение яркости свечения кластеров (усл. ед.)
Увеличение яркости
Без зеркала
-
41,8
1
С зеркалом
1,1
143,6
3,44
2
123,6
2,96
3
114,0
2,73
6
92,0
2,20
11
70,0
1,67
Проведенный эксперимент показывает, что приведенная в описании конструкция устройства позволяет работать не только с хорошими и дорогими зеркалами (при k>0,95), но и с зеркалами среднего качества (например, с k=0,87). В последнем случае снижение яркости по отношению к теоретически достижимой величине (для k=0,87), равной 3,5, составляет несколько процентов (измеренная величина увеличения яркости равна 3,44).
На фиг.7 представлены фотографии кластеров при различных расстояниях от задней поверхности ячейки до зеркала, при которых проводились измерения (столбец 2 таблицы).
Как видно из результатов эксперимента, даже при расстоянии в 11 мм яркость точек кластеров увеличивается в 1,67 раза.
Примеры
Ниже приведены примеры применения самоклеящихся пленок для изготовления разных типов биочипов.
Пример 1. Биочип с отражающей поверхностью и гибридизационным объемом
На фиг.8а приведен вариант биочипа (93), который в отличие от известного решения [37] содержит гибридизационные объемы (94), сформированные за счет толщины верхнего многослойного покрытия (95), наклеенного на отражающий слой (96), приклеенный на верхние поверхности базового (97) элемента и первого (98) и второго (99) дополнительных элементов, которые выполнены в виде независимых элементов и крепятся друг с другом за счет верхнего (100) и нижнего (101) многослойных покрытий.
Пример 2. Биочип с отражающей поверхностью, размещенной на задней поверхности прозрачного базового элемента
На фиг.8б приведен вариант биочипа (102), в котором отражающая поверхность (103) размещена за задней поверхностью базового элемента (104). В данном варианте отражающая поверхность размещается не по всей поверхности биочипа, а находится под рабочими зонами (105), что позволяет снизить уровень отражающих световых потоков от вспомогательной поверхности и снизить уровень фона.
Пример 3. Белковый чип
На фиг.8в приведен вариант белкового чипа (106), который отличается от известных вариантов [32, 44] тем, что имеет гибридизационные объемы (107), выполненные с помощью верхнего слоя (108), входящего в состав верхнего многослойного покрытия (109), в который входит слой полимера (110) и прокладка (111), снабженная двухсторонним клеевым слоем для фиксации слоя (110) относительно поверхности базового элемента (112), первого дополнительного элемента (114) и второго дополнительного элемента (115), к обратной поверхности которых прикреплено нижнее многослойное покрытие (116). Отличие заключается в том, что белковый чип имеет мультифункциональную систему идентификации, выполненную с применением первого и второго дополнительных элементов, которые отсоединяются и обеспечивают обзор идентификаторов в соответствии с ранее приведенным описанием.
Промышленная применимость
Биочип (варианты) имеет простую конструкцию, недорог в изготовлении и может быть доступен для проведения медицинской, ветеринарной и других типов диагностик в небольших лабораториях.
Биочип представляет возможность отделения второго дополнительного элемента от первого дополнительного элемента и базового элемента и размещения второго идентификатора на контейнерах, содержащих биологические образцы, предназначенные для анализа, а также представляет возможность поворота первого дополнительного элемента на угол в 90 градусов относительно поверхности базового элемента, что обеспечивает свободный доступ к первому идентификатору при размещении биочипа в устройствах для временного или постоянного хранения и обеспечивает возможность быстрого поиска биочипов, в том числе с помощью автоматических систем.
Таким образом, сочетание введенных новых элементов конструкции и осуществление возможности трансформирования положения отдельных узлов биочипа друг относительно друга позволяет повысить эффективность поиска биочипов и исследуемых образцов во время постоянного или временного хранения.
Литература
1. Kalra K.L. et al. Sample processing system. US Patent Appl. 20060153736 (July 13, 2006).
2. Zeleny et al. Automatic imaging and analysis of microarray biochips. US Patent 6,215,894 (April 10, 2001).
3. Clements J. et al. Use of ceramic labels for identifying biomolecule immobilizing subtrates. US Patent 6,498,032 (December 24, 2002).
4. McLellan A. et al. Microscope slide cover with integrated reservoir. US Patent Appl. 20050270642 (December 8, 2005).
5. Kavanaugh С. Microscope slide having bar code indicia inscribed thereon. US Patent 5,919,553 (July 6, 1999).
6. Kojima Y. et al. Method for preparing biochip and biochip. JP Patent Applic. 2004-028734 (29.01.2004).
7. Olofson R. Microscope slide with contrasting surfaces on opposite sides. US Patent 5,598,295 (January 28, 1997).
8. Rosenberg H. Microscope slide with top and bottom marking surfaces. US Patent 4,679,914 (July 14, 1987).
9. Knittel W. Microscope slide having a marking region. US Patent 6,982,828 (January 3, 2006).
10. Jacobs A. et al. Clinically intelligent diagnostic devices and methods. US Patent Appl. 20020095073 (July 18, 2002).
11. Kocher Т. Microarray identification means. US Patent Appl. 20030231986 (December 18, 2003).
12. Chouinard R. et al. Slide case with removable rack. US Patent 7,160,514 (January 9, 2007).
13. Davis R. et al. Apparatus for transporting specimen slides. US Patent 5,021,218 (June 4, 1991).
14. Regan et al. Microarray storage device for use in an automated microarray handling system. US Patent Appl. 6,361,745 (March 26, 2002).
15. Namiki N. Filing sheet for microscope slides. US Patent 4,236,635 (December 2, 1980).
16. Del Buono S. Slide holder. US Patent 6,118,582 (September 12, 2000).
17. Williams J. et al. Method and apparatus for facilitating the creation and analysis of microarrays. US Patent Appl. 20060263795 (November 23, 2006).
18. Stylli С. et al. Methods for rapidly identifying useful chemicals in liquid sample. US Patent Appl. 20020012611 (January 31, 2002).
19. Oldham M. et al. Sample carrier device incorporating radio frequency identification, and method. US Patent Appl. 20050242963 (November 3, 2005).
20. Kronick M.N. et al. Manufacture and use of non-standard size microarray slides. US Patent Applic. 20060141507 (June 29. 2006).
21. Белецкий И.П. и др. Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. Патент RU 2265668 (2005.12.10).
22. Wang J. et al. CCD-based biochip reader. US Patent Applic. 20050179900 (August 18, 2005).
23. Yguerabide J. et al. Apparatus for reading signals generated from resonance light scattered particle labels. US Patent Applic. 20030112432 (June 19, 2003).
24. Bevis С.et al. Darkfield inspection system having photodetector array. US Patent 7,061,598 (June 13, 2006).
25. Барский В.Е и др. Флуоресцентный микроскоп. Патент RU 2182328 (2002.05.10).
26. Montagu J. et al. Reading of fluorescent arrays. US Patent Applic. 20060127946 (June 15, 2006).
27. Зарытова В.Ф. и др. Способ получения ДНК-чипов. Патент RU 2236467 (2004.09.20).
28. Lee J. et al. Patch for microarray reaction chamber having adhesive means support and two or more adhesive materials. US Patent Appl. 20050136459 (June 23, 2005).
29. Yin Li-Te et al. Biochip containing reaction wells and method for producing same and use thereof. US Patent Appl. 20050106607 (May 19, 2005).
30. Agrawal A. et al. Tiled biochips and the methods of making the same. US Patent Applic. 20030224506 (December 4,2003).
31. Henninger D. et al. Array substrate holder. US Patent Applic. 20020085960 (July 4, 2002).
32. Lebrun S. Substrate chemistry for protein immobilization on a rigid support. US Patent Appl. 20040063220 (April 1, 2004).
33. Solomon K. et al. Composite microarray slides. US Patent Applic. 20030219816 (November 27, 2003).
34. Eden et al. Dry slide for diagnostic tests. US Patent 5,411,893 (May 2, 1995).
35. 3M Diamond Grade VIP Reflective Sheeting Series 3990. Техническое описание фирмы Minnesota Mining and Manufacturing (3M) Product Bulletin 3990. November 2003 (http://multimedia.mmm.com/).
36. Microarray High Sensitivity Mirror Substrates. Материалы фирмы TeleChem International Inc. (http://arrayit.com/Products/Substrates/Mirror/mirror.html).
37. Garini Y. Optical detection method for improved sensitivity. US Patent 6,552,794 (April 22, 2003).
38. Matsushita Т. et al. Component, apparatus, and method for analyzing molecules. US Patent 6,999,166 (February 14, 2006).
39. Mori Y. Retroreflective sheet comprising microspheres, the diameter and refractive index of which being specifically related to the refractive indices of layers directly in contact therewith. US Patent 5,962,121 (October 5, 1999).
40. Smith K. et al. Cube corner cavity based retroreflectors with transparent fill material. US Patent Appl. 20010033907 (October 25, 2001).
41. Smith K. et al. Flexible cube-corner retroreflective sheeting. US Patent Appl. 20020126382 (September 12, 2002).
42. Smith K. Retroreflective sheeting having high retroreflectance at low observation angles. US Patent Appl. 20070081245 (April 12, 2007).
43. Kim. Y.M. Biochip scanner having means of collecting fluorescence to minimize loss of fluorescence and reduce noises produced by environment kights. Patent KR 20050008148 (2005-01-21).
44. Wagner P. et al. Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof. US Patent 6,365,418 (April 2, 2002).