Выделение и скрининг микроорганизмов - эффективных деструкторов полиароматических углеводородов

Вестник ДВО РАН. 2008. № 1

А.А.ОЛЕЙНИКОВА, Л.Ф.СУРЖКО, А.В.ГАРАБАДЖИУ

Выделение и скрининг микроорганизмов -эффективных деструкторов полиароматических углеводородов

Рассматривается возможность биоремедиации городских почв, загрязненных ПАУ, в частности бенз(а)пиреном. Приводятся результаты выделения и отбора культур микроорганизмов — эффективных деструкторов ПАУ, дается оценка их деструктивной способности в модельных опытах с различными ПАУ и на основе натурных экспериментов.

Isolation and screening of microorganisms — efficient destroyers of polycyclic aromatic hydrocarbons.

А.А.ОЬЕЮТКОУА, L.F.SURZHKO (LTD «ECOPROM», Saint-Petersburg), A.V.GARABADZHIU (Saint-Petersburg State Technological Institute, Technical University).

From samples of soil, polluted by 1,2 benz^)pyrene, 3,4 benz^Jpyrene and benzofluoranthene, 20 cultures of microorganisms, capable to grow on PAH and perspective for bioremediation ofpolluted soils, were isolated. Three cultures, identified as Micrococcus sp. 3а-1, Bacillus sphaericus 5—1 and B. sphaericus 5—4, showed the greatest efficiency for phenanthrene degradation. The initial content of phenanthrene in medium was 100 mg/l. The given cultures were capable to transform 85.5% of benz^pyrene in soil for 180 day of laboratory experiment. In situ experiment showed 25—45% purification of soil from benz^)pyrene within 3 summer months.

Основным техногенным источником полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в городах является автотранспорт, на долю которого приходится более 80% валовых выбросов загрязняющих веществ [10]. Индикаторное значение для всех ПАУ имеет бенз(а)пирен, поскольку он всегда присутствует там, где присутствуют другие ПАУ, а также обладает наиболее выраженной канцерогенной активностью и наибольшей стабильностью [3]. Так, время полураспада под воздействием естественных природных процессов составляет для фенантрена 3,5-5 мес, для бенз(а)пирена - 4-6 лет [15]. Содержание бенз(а)пирена в почве в черте крупных городов, в частности Санкт-Петербурга, достигает 130 мкг/кг [8] при норме 20,0 мкг/кг [11]. Следовательно, негативное воздействие ПАУ на окружающую среду и здоровье населения входит в число наиболее острых экологических и социальных проблем города.

Снизить содержание ПАУ в окружающей среде можно за счет микробиологических процессов их трансформации. Способы использования эффективного штамма Pseudomonas sp. H.T.1830 для биоремедиации сточных вод, содержащих бенз(а)пирен и фенол, одной из первых исследовала Е.М.Юровская [13]. В последнее время интерес к микроорганизмам - деструкторам ПАУ усилился, изучаются пути деградации последних и перспективы создания биопрепаратов для очистки почв и вод [1, 2, 4, 16].

Целью данной работы является оценка возможности биоремедиации городских почв, загрязненных ПАУ.

Для исследований использовали отобранные в Санкт-Петербурге образцы почв, загрязненных 1,2 бенз(а)пиреном, 3,4 бенз(а)пиреном и бензофлуорантеном [7]. Накопительные культуры инкубировали в жидкой минеральной среде [12] с добавлением различных ПАУ (нафталин, фенантрен, антрацен) и образцов загрязненной почвы. Культивирование

ОЛЕЙНИКОВА Анна Александровна - аспирант, ГАРАБАДЖИУ Александр Васильевич - доктор химических наук (Санкт-Петербургский технологический институт), СУРЖКО Лариса Федоровна - кандидат технических наук (ЗАО «ЭКОПРОМ», Санкт-Петербург).

проводили при температуре 16-18°С в течение 3-5 сут на качалке в динамических условиях (180-220 об/мин).

Выделение чистых культур осуществляли путем рассева накопительных культур методом предельных разведений на агаризованные среды, содержащие в качестве единственного источника углерода и энергии нафталин, фенантрен, антрацен в концентрации 25 и 50 мг/л.

Критерием отбора микроорганизмов - наиболее эффективных деструкторов ПАУ на первом этапе служил диаметр их колоний. В результате выделено 20 культур микроорганизмов; 6 из них оказались способны к активному росту на нафталине и фенантрене (1г; 2б; 3г; 3а-1; 5-1; 5-4) и только 4 культуры (1г; 3а-1; 5-1; 5-4) - к более активному росту на антрацене в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 1). В дальнейшем использовали культуры 1г; 2б; 3б; 3а-1; 5-1; 5-4 как наиболее эффективно растущие на средах с исследованными ПАУ.

Таблица 1

Рост культур на агаршованных ПАУ-содержащих средах

Культура Диаметр колоний, см

Нафталин Фенантрен Антрацен

25 мг/л 50 мг /л 25 мг/л 50 мг/л 25 мг/л 50 мг /л

1 1,0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

1г 1,6 1,5 1,5 1,5 1,0 1,0

1а 1,6 1,5 1,3 1,3 0,6 0,3

1а-1 1,0 0,9 0,5 0,5 0,3 0,3

2 1,6 1,5 0,6 0,6 0,5 0,5

2а 1,0 1,0 0,8 0,8 0,3 0,3

2б 1,7 1,6 1,0 1,0 0,3 0,3

3 0,8 0,6 0,5 0,5 0,3 0,3

3г 1,5 1,5 1,1 1,1 0,5 0,5

3б 1,5 1,5 1,3 1,3 0,3 0,3

3а-1 2,0 2,0 2,0 1,5 1,5 1,5

4 1,0 1,0 0,5 0,5 0,3 0,3

4а 1,0 0,6 0,5 0,5 0,3 0,3

4б 0,5 0,5 0,5 0,5 0,3 0,3

4г 1,5 1,5 0,8 0,8 0,3 0,3

5 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 0,3

5-1 2,0 2,0 1,5 1,5 1,3 1,0

5-4 2,0 2,0 1,5 1,0 1,0 1,0

5-2 0,8 0,8 0,5 0,5 0,3 0,3

5-3 1,0 1,0 0,8 0,5 0,3 0,3

Еще один критерий отбора эффективных культур - деструкторов ПАУ - максимальная величина деструкции фенантрена в жидких средах. В колбы Эрленмейэра, содержащие по 100 мл минеральной среды [12] и 100 мг/л фенантрена, вносили клеточные суспензии культур. Начальная концентрация микроорганизмов в среде составляла 1-2 х 106 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц). Параллельно ставили стерильный контроль. Инкубацию клеток проводили в течение 3 и 7 сут при 1 = 16-18 °С в динамических условиях на качалке. Остаточное содержание фенантрена в культуральной жидкости проводили на установке «Флюорат-02-3М» по методу Я.С.Каменцева [4].

Две из исследованных культур (5-1 и 5-4) оказались способны к деструкции фенантрена на 40,8 и 39% соответственно, культура 2б - на 27, 3а-1 - на 35,2, 1г - на 30, 3б - на 5%

(минимальный уровень деструкции). Результаты 7-суточного эксперимента показали, что наиболее высокую степень деструкции (89,7-96,4%) имеют культуры 5-4; 5-1; 3а-1 (табл. 2).

Таблица 2

Остаточное содержание фенантрена при деструкции в жидких средах

Вариант опыта Концентрация фенантрена, мг/л Степень деструкции, %

Контроль 98,5 / 92,8 0/0

3а-1 65,8 / 3,38 35,2 / 96,4

5-1 58,27 / 6,3 40,8 / 93,2

5-4 60,4 / 9,56 39 / 89,7

1г 68,95 / 12,4 30 / 86,6

2б 71,78 / 35,17 27,13 / 62,1

3б 93,4 / 67,2 5,0 / 27,6

Примечание. В числителе - длительность эксперимента 3 сут, в знаменателе - 7 сут.

Почвенный лабораторный эксперимент. Определяли способность культур и составленной из них искусственной ассоциации к деструкции ПАУ в почве, загрязненной бенз(а)пиреном. Загрязненная почва отбиралась на газоне в Московском районе Санкт-Петербурга. Эксперимент проводили в течение 180 сут с культурами 3а-1, 5-1, 5-4, которые на протяжении предыдущих экспериментов показали себя как наиболее эффективно трансформирующие индивидуальные ПАУ Исходное содержание бенз(а)пирена в загрязненной стерильной почве составляло 2,2 мг/кг. Стерильную почву использовали, чтобы избежать влияния местной микрофлоры и быть уверенными в работе интродуцированных микроорганизмов.

Стерилизацию почвы проводили дробно, текучим паром в автоклаве. Почву прогревали 3-5 раз по 10-15 мин, затем помещали в термостат и выдерживали при температуре 28-30°С в течение 8-12 ч для прорастания жизнеспособных спор. Процедуру повторяли в течение 3-5 сут.

Определение концентрации бенз(а)пирена проводили на анализаторе жидкости «Флю-орат-02» с приставкой ВЭЖХ-3 [5, 6]. Остаточное содержание бенз(а)пирена в опытах составляло от 0,32 до 0,47 мг/кг. Самими эффективными оказались варианты с культурой 3а-1 и ассоциацией (табл. 3): в обоих случаях степень деструкции составляла 85,5% за все время эксперимента (180 сут). Следовательно, при совместном использовании данные культуры не оказывают угнетающего воздействия друг на друга, что позволяет достигать максимального эффекта очистки.

Таблица 3

Деструкция бенз(а)пирена в почве в лабораторных условиях

Вариант опыта Концентрация бенз(а)пирена, мг/кг Деструкция, %

исходная остаточная

Контроль 2,2 2,2 0

5-4 2,2 0,38 82,7

5-1 2,2 0,47 78,6

3а-1 2,2 0,32 85,5

Ассоциация из 3 культур 2,2 0,32 85,5

В заключение провели полевой эксперимент на территории действующей автозаправочной станции в Санкт-Петербурге. Почва была загрязнена бенз(а)пиреном, нефтепродуктами и металлами в повышенных концентрациях, мг/кг: Си до 65,0; N1 до 9,0; РЬ до 91; Сг до 11 и 2п до 72. Исходная концентрация бенз(а)пирена и нефтепродуктов в почве составляла 0,492 и 705 мг/кг соответственно. Использовали изолированные лизиметры с закрытым дном, располагающиеся рядом друг с другом. Размер одного лизиметра -20 х 20 см, высота слоя почвы в каждом из них составляла 30 см. Биомассу вносили в виде водной суспензии по 200 мл на лизиметр с концентрацией жизнеспособных клеток 108 С.

Эксперимент включал следующие варианты (табл. 4): контроль с добавкой минеральных удобрений и проведением агромероприятий - еженедельного рыхления почвы (1); контроль без использования удобрения и рыхления (2); пять опытных вариантов с внесением культур, удобрений и проведением агромероприятий (3-7). Опытные варианты включали использование трех монокультур (3-5) и ассоциации из них (6) в равном соотношении, а также использование ассоциации совместно с нефтеокисляющим биопрепаратом «Руден» (7) [14]. Нефтеокисляющий препарат применяли для очистки почвы от нефтяных углеводородов. Почву во всех вариантах увлажняли до 60%. Время проведения эксперимента - июнь-август 2006 г. Среднесуточная температура составляла в июне +15°С, в июле +17°С, в августе +14°С.

Таблица 4

Биотрансформация бенз

Вариант опыта* Бенз(а)пирен Нефтепродукты

содержание, мг/кг степень деструкции**, % содержание, мг/кг степень деструкции**, %

1 0,485 0 640 0

2 0,478 1,45 220 65,6

3 0,360 25,8 / 24,7 150 76,6 / 31,8

4 0,344 29 / 29,1 160 75 / 27,3

5 0,348 28,3 / 27,2 150 76,6 / 31,8

6 0,268 44,8 / 44 160 75 / 27,3

7 0,276 43,1 / 42,3 87 86,4 / 60,5

* Пояснения в тексте.

** В числителе - по отношению к первому контролю, в знаменателе - по отношению ко второму контролю.

Для предотвращения дополнительного загрязнения ПАУ и нефтепродуктами лизиметры укрывались защитной полиэтиленовой пленкой.

Результаты эксперимента показали, что использование культур позволяет снизить содержание бенз(а)пирена на 25-44,8% во всех опытных вариантах, в то время как в контрольных вариантах содержание бенз(а)пирена оставалось практически неизменным. Уменьшение нефтепродуктов в контроле с агромероприятиями связано с работой аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры, которая присутствует в почвах, загрязненных нефтяными углеводородами. Однако внесение микроорганизмов способствует одновременному уменьшению концентрации бенз(а)пирена и нефтяных углеводородов. Таким образом, использование данных культур является перспективным для деструкции полиаро-матических углеводородов, а также способствует деградации нефтяных углеводородов.

Безопасность почвы, очищенной с помощью ассоциации из 3 культур, оценивали по всхожести и росту семян ячменя и овса, поскольку сельскохозяйственные культуры считаются самыми чувствительными к загрязнениям ПАУ и нефтепродуктами [9]. На рисунке представлены параметры тестируемых растений - всхожесть семян, длина корешков и высота зеленой части стебля на чистой, загрязненной бенз(а)пиреном (в концентрации

2,2 мг/кг) и очищенной почве. В качестве чистой использовали почву, отобранную в лесополосе в Ленинградской области. Химико-аналитические исследования почв показали, что концентрация бенз(а)пирена, нефтепродуктов и тяжелых металлов - ниже уровня ПДК. Очевидно, что данный уровень загрязнения оказывает воздействие на все контролируемые показатели. Степень фитотоксичности загрязненной почвы [6] по отношению к чистой контрольной составляет 23-27% по проявлению ингибирования всхожести семян, от 14% (овес) до 43,6% (ячмень) - по ингибированию роста корней, 28-30% - по угнетению роста стебля.

Фитотестирование почв: проростки овса (темные столбики) и ячменя (светлые столбики). 1 -троль, 2 - загрязненная почва, 3 - биоочищенная почва

кон-

В почве, очищенной с помощью ассоциации, фитотоксичность, судя по показателям роста овса и ячменя, значительно уменьшается, а также полностью снимается ингибирующее влияние бенз(а)пирена на всхожесть семян.

Выделенные культуры были идентифицированы методом 16S РНК рибосом: 3а-1 - как Micrococcus sp; 5-1 и 5-4 - как Bacillus, вероятнее всего В. sphaericus. Культуры непатогенны и способны к эффективной деструкции фенантрена, а также бенз(а)пирена в натурных условиях, таким образом, могут использоваться при создании биопрепаратов для биоремедиации почв, загрязненных ПАУ

ЛИТЕРАТУРА

1. Бабошин М. А., Финкельштейн З.И., Головлева Л. А. Кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rho-dochrous и Pseudomonas fluorescens // Микробиология. 2003. Т. 72, № 2. С. 194-198.

2. Бабошин М.А., Баскунов Б.П., Финкельштейн З.И. и др. Микробная трансформация фенантрена и антрацена // Микробиология. 2005. Т. 74, № 3. С. 357-364.

3. Дмитриев В.В., Фрумин Г. Т. Экологическое нормирование и устойчивость природных систем. СПб., 2004. 294 с.

4. Каменцев Я.С., Сафонова Е. Ф., Квитко К.В. Способ оценки доз фенантрена в культурах микроорганизмов // Экобиотехнология: борьба с нефтяными загрязнениями окружающей среды: сб. тез. докл. конф. Пущино, 2001. С. 89-90.

5. Методика М 03-04-02-2002. Методика выполнения измерения массовой доли бенз(а)пирена в пробах почв, грунтов, донных отложений и твердых отходов методом ВЭЖХ с использованием анализатора жидкости «Флюорат-02» в качестве флуометрического детектора. СПб., 2002.

6. Методы экспериментальной микологии: справочник / под. ред. В.И.Билай. Киев: Наук. думка, 1982. 550 с.

7. Олейникова А.А., Янкевич М.И., Суржко Л.Ф., Гарабаджиу А.В. Биоремедиация городских территорий, загрязненных ПАУ // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: материалы Междунар. конф., Саратов, 14-16 сент. 2005. Саратов: Науч. кн., 2005. С. 83-84.

8. Охрана окружающей среды, природопользование и обеспечение экологической безопасности в Санкт-Петербурге в 2005 г. / под ред. Д.А.Голубева, Н.Д.Сорокина. СПб., 2006. С. 273-283.

9. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т. 36, № 6. С. 652-655.

10. Постановление Правительства № 507-ПП от 12.07.2005 г. «О регулировании передвижения автотранспортных средств на отдельных городских территориях».

11. СанПиН 2.1.7.1287-03. Почва, очистка населенных мест, бытовые и промышленные отходы, санитарная охрана почвы. Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы.

12. Суржко Л.Ф., Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев В.И., Головлева Л. А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. Т. 64, № 3. С. 393-398.

13. Юровская Е.М. Микробиологическая очистка сточных вод. Киев: Здоров’я, 1984. 228 с.

14. Яненко А.С., Аракелян Е.И., Герасимова Т.В. и др. Способ очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений. Пат. РФ № 2039714.

15. Cerniglia C.E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodegrad. 1992. Vol. 3, N 2-3. P. 351-368.

16. Hunter R.D., Ekunwe S.I., Dodor D.E. Bacillus subtilis is a potential degrader of pyrene and benzo[a]pyrene

// Int. J. Environ. Res. Public. Health. (Switzerland). 2005. Vol. 2, N 2. P 267-271.