Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки
METHOD OF ACTIVATING ERYTHROPOESIS OF LABORATORY ANIMALS AFTER RADIATION EXPOSURE

Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления регенерации костного мозга лабораторных животных (мыши).
Известно использование сочетанной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для восстановления селезенки после лучевой нагрузки (Патент RU №2551937, МПК G09B 23/28, А61К 35/44, А61Р 43/00, опубл. 10.06.2015). В данном способе лабораторным мышам через час после облучения проводят внутривенную аллогенную трансплантацию ММСК в дозе 6,5 млн клеток/кг и ГСК в дозе 400 тыс. клеток/кг, полученных из плаценты самок-мышей при сроке гестации 14 дней.
Этот способ предназначен только для восстановления основных морфометрических показателей селезенки.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ активации кроветворения введением РНК в дозе 30 мкг/100 г массы животного (крысы) в условиях воздействия ионизирующего облучения в дозе 6 Гр (Геворкян Н.М. Влияние предварительного введения суммарной РНК клеток костного мозга на динамику восстановления эритропоэза у крыс после острого гамма-облучения / Н.М. Геворкян, Н.В. Тишевская, А.А. Болотов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2016. - Т. 161, №5. - С. 670-673.) - прототип.
Данный способ используют для восстановления эритропоэза у крыс, однако количество ретикулоцитов в периферической крови недостаточно высокое.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к активации эритропоэза.
Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в увеличении количества ретикулоцитов в периферической крови.
Технический результат достигается путем сочетанной внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс. клеток/кг, выделенных из хориона плаценты.
Сущность изобретения состоит в эффективном взаимодействии заявляемого количественного состава ММСК и ГСК, выделенных из хориона плаценты, и эффективном влиянии их на восстановление гемопоэза.
Эффективность применения ММСК в качестве котрансплантата при введении ГСК обусловлена тем, что они вырабатывают цитокины и факторы роста, необходимые для хоуминга и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток (Kavanagh D.J. et al., 2011, Kavanagh, D.J. Hematopoietic stem cell homing to injured tissues / D.J. Kavanagh, N. Kali // Stem Cell Revolution. - 2011. - Vol. 7. - P. 672-682.
ММСК синтезируют компоненты матрикса, в том числе фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны. При этом ММСК способны дифференцироваться в клетки стромы, которая обеспечивает синтез экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микроокружение, необходимое для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток (Chow A. et al., 2011; Jones Е. et al., 2011, Chow, A. Bone marrow CD169 macrophages promote the retention of hematopoietic stem and progenitor cells in the mesenchymal stem cell niche / A. Chow, D. Lucas, A. Hidalgo, S. Mendez-Ferrer, D. Hashimoto, C. Scheiermann // Journal of Experimental Medicine. - 2011. - Vol. 208. - P. 261-271; Jones, E. Mesenchymal stem cells and bone regeneration: current status / E. Jones, X. Yang // Injury. - 2011. - Vol. 42. - P. 562-568).
Кроме того, ММСК обладают свойством продуцировать противовоспалительные цитокины, а также обеспечивать стимуляцию ангиогенеза (Kavanagh Н. et al., 2011; Kidd S. et al., 2010).
Способность ММСК оказывать иммуносупрессивное действие может обеспечить приживление аллогенного трансплантата (Aldinucci A. et al., 2010; Gebler A. et al., 2012; Han Z. et al., 2012, Aldinucci, A. Inhibition of immune synapse by altered dendritic cell actin distribution: a new pathway of mesenchymal stem cell immune regulation / A. Aldinucci, L. Rizzetto, L. Pieri // Journal of Immunology. - 2010. - Vol. - 185, №9. - P. 5102-5110).
Выделение ММСК хемоаттрактантов для ГСК обеспечивает направленный хоуминг ГСК, а формирование соответствующего микроокружения дополнительно улучшает приживление трансплантированных аллогенных ГСК (Zhang Y. et al., 2004, Jorgensen С. et al., 2010).
Из анализа научно-технической и патентной литературы эффективного влияния на активацию эритропоэза заявляемой совокупности признаков нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных мышах-самцах в возрасте 6-8 месяцев с массой 20-22 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.
Лабораторные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. Лабораторным животным опытной группы внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 5,9 млн. клеток/кг и 295 тыс. клеток/кг, суспендированных в 0,2 мл 0,9% NaCl. Животным контрольной подгруппы вводили 0,2 мл 0,9% NaCl внутривенно. Забой лабораторных животных осуществлялся на 7 сутки трансплантации клеток.
Клеточные культуры
Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США, Kidder В. L.HDAC1 regulates pluripotency and lineage specific transcriptional networks in embryonic and trophoblast stem cells / B.L. Kidder, S. Palmer // Nucleic Acids Res. - 2011. - P. 1-15) обработки ткани плаценты.
Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (Uchida, N. ABC transporter activities of murine hematopoietic stem cells vary according to their developmental and activation status / N. Uchida, B. Dykstra, K. Lyons, F. Leung, M. Kristiansen, C. Eaves // Blood. - 2004. - Vol. 103, №12. - P. 4487-4495).
Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD117, Sca-1 и отрицательных по Lin-(CD45, С3е, Ly-6G, M1/70, Ter-119).
В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела РЕ labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).
Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.
Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-), был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).
6
2
2
Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из хориона плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1×10 клеток на 1 см. Культивирование ММСК проводилось в условиях СО - инкубатора при температуре 37°С с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 часов инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.
При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.
Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagen type I и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).
Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCell Technologies», Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски von Kossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil Red О (J.J. Minguell et al., 2004, Minguell, J.J. Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac disease / J.J. Minguell, A. Erices // Experimental Biology and Medicine. - 2006. - Vol. 231, №1. - P. 39-49
Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.
Морфологическое исследование крови
Кровь для исследования брали у мышей из хвостовой вены. Подсчет количества эритроцитов проводили в счетной камере Горяева (Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Медицина, 1975. - 360 с.).
При определении числа ретикулоцитов их подсчитывали в окрашенных бриллиант - крезил - блау мазках крови на 2000 эритроцитов. (Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Медицина, 1975. - 360 с.).
Препараты были исследованы с помощью микроскопа Micros МС-50 (Австрия), фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой cam V400.
Статистический анализ
Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено по критерию Манна-Уитни (U). Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17.0). Вероятность различий считалась достоверной при значениях р<0,05.
Как видно из таблицы, на 7 сутки по заявляемому способу содержание ретикулоцитов в периферической крови существенно выше, чем в прототипе. Таким образом выявлено, что трансплантация плацентарных ММСК и ГСК по заявляемому способу обеспечивает активацию эритропоэза в существенно большей степени, чем способ по прототипу.