Влияние электростатических полей на регенерационные процессы и гормональную систему картофеля в условиях in vitro

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Известия ТСХА, выпуск 2, 2006 год

УДК 635.21:581.1

ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ " НА РЕГЕНЕРАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ И ГОРМОНАЛЬНУЮ СИСТЕМУ КАРТОФЕЛЯ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Н.Н. ТРЕТЬЯКОВ, В.Н. ОВЧИННИКОВА*, Т.И. ЛУЗИНА**, Ч. СУВД

Воздействие на растения электрическими полями представляет интерес для изучения регулирования процессов регенерации в культуре тканей и клеток растений, роста и развития регенерантов, в т. ч. полученных на основе генной инженерии, где необходима быстрая регенерация с целью предотвращения нежелательной сомаклональной изменчивости и создания лучших условий для прохождения отдельных этапов морфогенеза.

Проведенные в 1985-1995 гг. на кафедре физиологии растений МСХА исследования показали возможность активно влиять электрическими полями на процессы морфогенеза ряда с.-х. культур (кукуруза, огурец, томат, картофель, плодовые и ягодные культуры) [5-7, 22].

В 2002-2004 гг. при участии сотрудников МСХА, ВНИИ СБ РАСХН и Орловского госуниверситета проведены комплексные исследования по применению электростатического поля на отдельных этапах культивирования растений картофеля в условиях in vitro. Выявлено стимулирующее действие отдельных уровней и направленности электростатического поля на регенерацию меристем, клональное микроразмножение, каллусогенез, адвентивное побегообразование разных типов эксплантов, интенсивность видимого фотосинтеза и темнового дыхания, топографию градиентов БЭП (биоэлектрических потенциалов) [18-21]. В настоящей статье приводятся результаты определения гормонального статуса пробирочных растений картофеля 3 генотипов на этапе клонального размножения.

Появление эндогенных электрических токов, входящих в растущие и выходящих из закончивших рост участков клетки, является одной из наиболее ранних реакций, в процессе дифференцировки растительных клеток, характеризующихся полярным типом роста. Эти электрические токи, как правило, предшествуют морфологическим

изменениям [28]. Поляризация и, в

первую очередь, возникновение электрических токов имеет важное значение в росте и развитии зародыша [24]. Обработка слабым электрическим полем увеличивает прирост массы каллуса, значительно повышает частоту формирования корней, почек и побегов [8], стимулирует соматический эмбриогенез в культуре мезофильных протопластов [26]. Напротив, под действием

* Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной

биотехнологии (ВНИИ СБ РАСХН).

Орловский Государственный Университет.

электростатических полей и низкочастотных полей высокой напряженности выявлены значительные повреждения надземной части растения: кончиков листьев у ячменя; подавление роста и понижение урожайности на 30% у кукурузы, сорго, бобовых; повреждение клеток эпидермиса, нарушение хода деления клеток [23-25].

Гормональная система — важнейший фактор регуляции процессов жизнедеятельности растений [10]. Место синтеза ИУК — апикальная меристема побега. Отсюда ауксин передвигается по живым клеткам проводящих пучков до кончиков корней. Цитокинины образуются в корневой системе и по сосудам ксилемы пассивно транспортируются во все части растения. Синтез АБК происходит в стареющих листьях и корневом чехлике. Вполне вероятно, что изменение аксиальных градиентов биоэлектрических потенциалов растений может оказывать влияние не только на транспорт минеральных, но и органических соединений, в т. ч. и эндогенных фитогормонов. Еще в 1932 г. Went высказал предположение о том, что именно перемещение фи-тогормонов из мест синтеза к зонам роста может быть связано с электрическим зарядом растительных тканей. Это было в дальнейшем подтверждено Н.Г. Холодным, показавшим передвижение ауксина в электрическом поле в сторону положительно заряженных участков растительных тканей.

Воздействие электростатического поля на этапе микроразмножения способствует увеличению дополнительной пролиферации пазушных почек и усилению роста микропобега, уменьшению величины пластохрона, что обеспечивает увеличение количества зачаточных

листьев, места синтеза ауксинов, стимулирует рост меристематичес-ких верхушек в длину [9]. Работая с трудноукореняемыми черенками ивы, Domanski с соавторами [27] при помощи ростовых биотестов показали, что пропускание электрического тока вызывает выделение в среду для укоренения ростовых протомеров, веществ, одним из которых может быть ИУК. Известно, что базипетальный транспорт ауксина играет существенную роль в процессе корнеобразования. В работе Стрельцова и др. [17] при воздействии на апикальную и базаль-ную части черенков розы разностью потенциалов в 15В наблюдалось усиление каллусогенеза и корнеоб-разования без применения ростовых веществ, заметно стимулировался рост побегов старовозрастных аномальных пробирочных растений стевии с одновременным приобретением ими нормальной морфологии. Одновременно отмечалось 100%-ное укоренение побегов, что совсем не проявлялось у необработанных пробирочных растений. Эту закономерность авторы объясняют тем, что при воздействии электростатического поля усиливается экспрессия генов, ответственных за рост, активизируется синтез эндогенных ауксинов, цитокининов,гиббереллинов.

Накоплен большой фактический материал, свидетельствующий о том, что фитогормоны играют значительную роль в изменении биоэлектрической активности и соответственно ионного обмена клетки [10-14].

Методика

Исследования проводили в лаборатории физиологии растений МСХА и лаборатории ВНИИСБ, анализы гормонов на кафедре ботаники и физиологии растений Орловского

госуниверситета. В серии опытов изучали влияние электростатического поля (ЭСП) на гормональный статус растений на этапе клональ-ного микроразмножения пробирочных растений картофеля.

В качестве модельного объекта использовали растения сортов Удача (селекция ВНИИ КХ), Шийр-6 (монгольской селекции) и Романо (голландской селекции). Сорта различаются по срокам созревания (Удача и Шийр-6 — раннеспелые, Романо — позднеспелый) и другим физиологическим особенностям в полевых условиях, а также скоростью роста, реакцией на гормональные и внешние условия и другие показатели в культуре in vitro.

Все культуральные работы проводили по методике, описанной Р.Г.Бутенко. Культуральная среда МС с добавлением витаминов содержала сахарозу — 20 г/л, агар — 8 г/л. Для индуцирования корнеоб-разования (ризогенеза) применял!: [3-индолилмасляную кислоту в концентрации 0,1 мг/л. Растения культивировали в климатической камере при 16-часовой продолжительности светового дня, температуре +20"С ночью и +25°С днем, освещенности 3000 лк.

Применяли бесконтактный способ воздействия ЭСП разной полярности на ход морфогенеза на этапе микрочеренкования растений картофеля in vitro. Регенерация пазушных почек, ризогенез, последующее развитие растений проходило на фоне постоянного воздействия электростатических полей напряженностью (Е = +10 кВ/м и Е = = —10 кВ/м). ЭСП создавали генератором высокого напряжения В-524 в специальной установке, разработанной в лаборатории кафедры физиологии растений МСХА.

Воздействие электростатическим

полем на растения было постоянным на протяжении всего пассажа (30 дней).

Интенсивность С02-газообмена на свету и в темноте определяли газоанализатором ГОА-4 (0-0,05% С02) по «замкнутому» контуру [1], учитывали изменение концентрации С02 в воздухе после прохождения через последовательную цепочку из 4 пробирок с вегетирующим микропобегами растений картофеля.

Экстракцию эндогенных ИУК, цитокининов и АБК проводили комплексным методом [4] отдельно из апикальной и базальной частей побегов картофеля (2-3 см), предварительно зафиксированных жидким азотом. Модификация метода состояла в экстракционной очистке гормонов по Веселову [3]. После упаривания экстракта на роторном испарителе ИР-1М (Россия) до водного остатка отделяли аликвоту для определения цитокининов. После под-кисления водного остатка (рН 2-3) дважды экстрагировали ИУК и АБК диэтиловым эфиром. Из объединенной органической фазы кислые ауксины и АБК реэкстрагировали 1%-м гидрокарбонатом натрия в соотношении 1: 3. Органическую фазу отделяли и отбрасывали, а из водной (после подкисления до рН 2~3) вновь дважды извлекали ауксины и АБК диэтиловым эфиром и метилировали их диазометаном. Алик-воту водного остатка для определения цитокининов доводили 5%-м раствором гидрокарбоната натрия до нейтрального рН. Экстракцию цитокининов проводили бутанолом, а их разделение путем хроматографии на бумаге (ватман 1) в системе растворителей — бутанол : аммиак : вода (3 : 1 : 1) с последующим элюированием 80%-м этанолом

зон хроматограммы с R( зеатинри-бозида (0,4-0,5) и Rf зеатина (0,7 — 0,8). Содержание фитогормонов определяли методом иммунофер-ментного анализа [3, 12] с использованием реактивов фирмы «Ура-линвест» (Уфа) на плашечном микрофотометре («Диа-М», Россия). В качестве стандартов были взяты: ИУК, АБК, зеатин («Serva», Германия), зеатинрибозид («Sigma», США). Анализ содержания гормонов в апикальной и базальной частях растений позволяет судить о создаваемых различными электростатическими полями градиенте гормонов.

Результаты и их обсуждение

Целью нашей работы было выяснение влияния ЭСП полярной направленности на гормональный баланс и регенерационные процессы пробирочных растений картофеля S. tuberosum. Остановимся на результатах проведенных опытов по действию электростатических полей (ЭСП) разной направленности и напряженности на биометрические показатели и СОа-газообмен растений на различных этапах технологии клонального микроразмножения.

Пробирочные растения, выращенные в условиях ЭСП, существенно отличались от контрольных темпами роста и органогенеза, градиентами и уровнем биоэлектрических потенциалов, интенсивностью С02-газообмена.

Следует отметить стимуляцию физиологической активности по большинству показателей в поле напряженностью Е = +10 кВ/м. Так, высота побега, сухая масса растений, максимальный БЭП

значительно превышали показатели контрольных растений, в среднем на 22,8 %. В то же время рост корней значительно замедлялся и составлял лишь 70,2% от контроля. Воздействие же полем Е = -10 кВ/м оказало меньшее влияние на прирост фотосинтезирующей части растений всех сортов. Количество междоузлий находилось в прямой корреляции с приростом надземной части побега. Однако увеличение общей длины корней 1-го порядка в этом поле было значительным — на 25,5% выше контроля [18, 20].

При действии электростатического поля на осевые градиенты биоэлектрических потенциалов растений картофеля на этапе микрочеренкования отмечено существенное увеличение градиентов БЭП у скороспелого сорта картофеля Удача и Шийр-6 при выращивании растений в ЭСП Е = +10кВ/м, реакция позднеспелого сорта Романо была менее выраженной [22].

Под влиянием ЭСП Е = —10 кВ/м у сортов Удача и Шийр отмечено существенное снижение осевого градиента БЭП, соответственно на 9 и 5 % по сравнению с контролем. Наоборот, у растений сорта Рома-но превышение градиента БЭП было значительным и составило 19%.

Процесс прямой регенерации (адвентивного побегообразования) после 30 дней пассажа под воздействием ЭСП существенно ускорялся в последующем при пересадке растений на среды соответствующего гормонального состава. В конце 2-го пассажа выход регенерантов увеличивался в лучших вариантах на 22-165% [19].

Ведущим фактором процессов регенерации целого растения в культуре in vitro является эндогенная регуляция донорно-акцептор-ных отношений фотосинтеза, дыха-

ния, роста, транспорта и распределения ассимилятов и др., осуществляемая гормональной и другими системами регуляции.

В связи с этим была исследована взаимосвязь формирования биомассы пробирочными растениями с фотосинтезом и темновым дыханием.

В табл. 1 представлены показатели С02-газообмена растений картофеля в период взятия проб для определения содержания гормонов. При этом определяли интенсивность видимого фотосинтеза (Р), темнового дыхания массу рас-

тений в вариантах опыта. Как видно из полученных данных, степень влияния электростатических полей (ЭСП) на фотосинтетический и дыхательный газообмен, общую массу растений зависела от особенностей сорта, а также направленности ЭСП. По всем сортам показано преимущество пробирочных растений при воздействии поля Е = = +10 кВ/м перед контролем и полем Е = -10 кВ/м по сухой массе, особенно скороспелых сортов Удача и Шийр-6. Растения медленно растущего позднеспелого сорта Рома-но в контроле и опытных вариантах электростатических полей в этот период онтогенеза имели ин-

тенсивность видимого фотосинтеза (Р) и темнового дыхания (R) в 2-3 раза меньшую по сравнению с растениями скороспелой группы. Следует также отметить, что у растений в электростатическом поле Е = = -10 кВ/м существенно возрастала дыхательная компонента С02-га-зообмена и отношение R/Р по сравнению с растениями картофеля в поле Е = +10 кВ/м. Электростатические поля, очевидно, существенно влияли на поглощение растениями и использование углерода органических соединений питательных сред in vitro. Этим отчасти можно также объяснить обнаруженные между вариантами различия в суточном балансе С02 в расчете на 1 г сухой массы пробирочных растений. По данным биометрических показателей отмеченное явление, возможно, связано с увеличением затрат метаболитов на дыхание корней вследствие увеличения корневой массы по отношению к зеленой фо-тосинтезирующей части пробирочного растения [20].

Многие изменения в биометрических показателях и газообмене пробирочных растений, очевидно, связаны с изменением гормонального статуса под действием электростатического поля.

Таблица 1

Показатели С02-газообмена пробирочных растений картофеля

Сорт Вариант (напряженность ЭСП, Е) Р, мг/ч на 1 г сухой массы XR, мг/ч на 1 г сухой массы SR/P, % Рд, МГ/Ч на 1 г сухой массы Баланс С02, мг/сут на 1 г сухой массы Сухая масса растения, г

Удача

Романо

Шийр-6

Контроль + 10 кВ/м -10 кВ/м Контроль +10 кВ/м -10 кВ/м Контроль +10 кВ/м -10 кВ/м

7,10±0,36 6,99±0,37 6,23±0,61

1,87±0,09 2,64+0,32 2,69±0,27 8,90+0,71 8,66+0,92 9,25±0,75

3,67+0,63 3,16+0,82 4,17±0,15

1,90±0,29 1,88+0,26 2,14±0.33 2,43±0,51 2,41±0,70 3,80±0,35

51.7 10,78±0,70 45,2 10,15+0,91 66,9 10,4±0,67

101,6 3,77±0,38

71.2 4,52±0,58 79,6 4,83±0,46

27.3 11,44±1,33

27.8 11,27±1,27 41,1 13,05±0,81

84,3±7,8 0,0180±0,0025

86,5±9,6 0,0267±0,0032

66,3+9,3 0,0196±0,0025

14,7±1,1 0,0116±0,0011

27,2±3,1 0,0125±0,0016

25,8±4,4 0,0116+0,0011

122,1 ±8,8 0,0188±0,0012

122,4+15,1 0,0209±0,0031

117,6±13,4 0,0191+0,0024

Общепризнано, что в каждый период развития растения и его отдельных органов поддерживается определенное содержание и соотношение гормонов, гормональный статус.

Полученные данные о содержании гормонов дают представление о гормональном статусе растений в конце пассажа, предшествующего переносу растений картофеля (ре-генерантов) в установку для получения миниклубней или в теплицы (парники) для получения адаптированной к полевым условиям рассады картофеля. Как показали полевые исследования, клонированные в ЭСП напряженностью Е = +10 кВ/м растения имели лучшую приживаемость и семенную продуктивность по сравнению с растениями в контрольных условиях (вне ЭСП Е = = +10 кВ/м). Для анализа гормонального состояния растений картофеля под действием ЭСП разной напряженности и направленности использовали такие показатели, как содержание гормона в мкг/г сухой массы в апикальной и базальной частях побега, градиент и направление градиента гормона в побеге, процентное соотношение ИУК и зе-атина.

Содержание ИУК. Известно, что ауксины влияют на деятельность

камбия, а также дифференциров-ку флоэмы и ксилемы [16].

Ауксин влияет на все фазы роста клеток, на энергетический обмен, увеличивает интенсивность фотосинтеза и дыхания, усиливает сопряжение окисления с фосфорилиро-ванием. Ауксины определяют полярность, направление транспорта веществ в растении, апикальное доминирование. Осевая полярность — это наличие хорошо развитой продольной оси, несущей латеральные органы — боковые побеги и корни, листья, определяющей порядок закладки и взаимодействия тканей и органов растения. Возникающие при поляризации клеток и тканей градиенты морфогенетических факторов определяют дифференциальную активность генома. В процессе поляризации у растений наиболее существенное значение имеет уровень и активный базипетальный транспорт ауксина [14].

Данные о влиянии электростатического поля на содержание ИУК в апикальной и базальной зонах побега растений картофеля изучавшихся сортов представлены в табл. 2.

В побегах картофеля всех изученных сортов в контроле (без воздействия ЭСП) наблюдался базипеталь-ный градиент содержания ауксина,

Таблица 2

Влияние электростатического поля на содержание ИУК в апикальной и базальной зонах побега растений картофеля разных сортов

Вариант (напряженность ЭСП, Е) Зона побега Сорта

Удача Романо Шийр-6

содержание ИУК градиент содержание ИУК градиент содержание ИУК градиент

Контроль . + 10 кВ/м -10 кВ/м

Апикальная Базальная

Апикальная Базальная

Апикальная Базальная

4,48±0,31 0,49 3,99±0,28

6,32±0,56 5,20 1,12±0,08

22,44±1,57 8,28 14,16±1,13

14,16±0,13 9,68 6,32±0,50 2,77

4,48±0,35 3,55±0,24

28,25±2,54 23,77 28,30+1,98 14,14

4,48+0,31 14,16±0,99

13,56±1,08 12,76 4,50±0,31 3,08 0,80±0,07 1,42±0,10

так как максимум гормона отмечен в апикальной части побега. Величина градиента была различной: максимальная у сорта Романо — 9,6 мкг/г сухой массы, минимальная — у сорта Удача — 0,5, а у сорта Шийр-6 — 2,8 мкг/г. Максимальная величина градиента у позднеспелого сорта Ро-мано связана с существенно большим содержанием ауксина в апикальной ростовой зоне побега по сравнению с другими сортами. По содержанию ИУК в базальной зоне сорта различались незначительно.

ЭСП разной полярности оказали неоднозначное влияние на содержание ИУК в зонах стебля. ЭСП с Е = = +10 кВ/м повысило уровень содержания эндогенной ИУК в апикальной зоне побега у всех сортов. Тогда как эффект в базальной зоне зависел от сортовой специфичности. А именно: содержание ИУК уменьшилось против контроля у сорта Удача, повысилось у сорта Шийр-6 и не изменилось у позднеспелого сорта Романо. Иная картина наблюдалась при нахождении ра-стений-регенерантов в ЭСП с Е = = -10 кВ/м. Содержание ауксина несколько снизилось в обеих зонах побега как у сорта Романо, так и Шийр-6. Напротив, у сорта Удача содержание ауксина существенно возросло. Несмотря на изменение уровня гормона в зонах побега картофеля под воздействием изучавшихся ЭСП направление градиента ауксина в побеге осталось базипе-талъным. Вместе с тем, его величина возросла против контроля у всех сортов. Для сортов Романо и Шийр-6 максимальный эффект наблюдался под воздействием Е = = +10 кВ/м, а для сорта Удача — в ЭСП с Е = -10 кВ/м.

Содержание зеатина. Цитоки-нинами богаты все меристематичес-кие ткани. В основном они синтези-

руются в корнях, а затем пассивно транспортируются в надземные органы растений. В условиях in vitro цитокинины стимулируют растяжение клеток у изолированных листьев, отрезков стеблей или коле-оптилей. В опытах В.Н. Овчинниковой [15] показано, что с увеличением в среде концентрации цитокининов снижалась корнеообразовательная активность черенков картофеля. Зеатин сильнее всего ингибировал корнеобразование по сравнению с 6-БАП и кинетином. На средах с ци-токининами наблюдалось интенсивное развитие боковых побегов и столонов, клубнеобразование. Как снижение, так и увеличение концентрации цитокининов в среде приводило к уменьшению числа растений с клубнями и числа клубней на растении. Как правило, базаль-ные черенки картофеля образуют большее число клубней на растении, чем апикальные черенки.

Известно, что цитокинины ускоряют метаболизм и рост изолированных органов [29]. Ауксины и ци-токинины синтезируются в полярных органах и их взаимодействие может играть значительную роль в регуляции сбалансированного роста [16].

Данные о влиянии ЭСП на содержание зеатина в апикальной и ба-зальной зонах побега картофеля изученных сортов представлены в табл. 3. Градиент цитокинина в побегах картофеля зависел от сорта: у сортов Удача и Шийр-6, как и в случае с ауксином, он был базипе-тальным, а у позднеспелого сорта Романо — акропетальным, так как максимум зеатина содержался в базальной зоне побега.

Что касается абсолютной величины градиента, то следует отметить следующее: в отличие от ауксинов максимальный градиент ци-

Влияние электростатического поля на содержание зеатина в апикальной и базальной зонах побега растений картофеля разных сортов

Вариант (напряженность ЭСП, Е) Зона побега Сорта

Удача Романо Шийр-6

содержание ИУК градиент содержание ИУК градиент содержание ИУК градиент

Контроль +10 кВ/м -10 кВ/м

Апикальная Базальная

Апикальная Базальная

Апикальная Базальная

14,12±1,27 13,23 0,89±0,08

3,56±0,32 3,06 0,50±0,05

1,42±0,13 0,53 0,89±0,07

0,32±0,03 0,89±0,07

0,20±0,02 3,56+0,36

1,42±0,12 5,64±0,51

0,57

3,36

4,20

8,93+0,89 1,41+0,12

8,84+0,79 3,26±2,26

0,89±0,08 0,32±0,03

7,50 5,58 0,57

токинина наблюдался у сорта Удача (13,23 мкг/г сухой массы), а минимальный — у сорта Романо (0,57 мкг/г).

Электростатическое поле с Е = = +10 кВ/м оказало противоположное действие на содержание цито-кининов в апикальной зоне побега по сравнению с ИУК. Уровень зеатина уменьшился. Количество гормона в базальной зоне данного варианта зависело от сорта: снизилось у сорта Удача и повысилось у сортов Романо и Шийр-6.

В результате пребывания реге-нерантов картофеля в электростатическом поле напряженностью -10 кВ/м еще в большей степени уменьшилось содержание зеатина в базальной и апикальной зонах побега сорта Удача по сравнению с вариантом Е = +10 кВ/м. Существенное снижение уровня гормона отмечено и у сорта Шийр-6. Напротив, у позднеспелого сорта Романо количество зеатина в побеге было выше в варианте с Е = -10 кВ/м по сравнению с контролем и Е = +10 кВ/м.

Специфическое действие ЭСП на уровень зеатина в зонах побега не .изменило направление градиентов цитокинина у сортов. Однако снизилась (в отличие от ауксина) величина базипетального градиента у

сортов Удача и Шийр-6 и увеличился акропетальный градиент у сорта Романо. Напряженность ЭСП в разной степени снизила градиент гормона зеатина у сортов Удача и Шийр-6 против контроля: в большей степени в варианте, где Е = = -10 кВ/м (соответственно в 25 и 13 раз) и в значительно меньшей степени при Е = +10 кВ/м (соответственно в 4 и 1,3 раза). Напротив, у сорта Романо действие ЭСП увеличило величину акропетально-го градиента в побегах картофеля. В данном случае несколько более эффективным было действие поля Е = —10 кВ/м.

Содержание абсцизовой кислоты (АБК). АБК синтезируется главным образом в стареющих листьях и корневом чехлике и транспортируется в другие части растений. АБК играет ведущую роль в регулировании покоя, ингибирует рост почек. АБК отводится роль медиатора в становлении защитных реакций, способствующих повышению устойчивости растений. Некоторые авторы отмечают способность АБК усиливать приток продуктов фотосинтеза к аттрагирующим центрам (семена, клубни) [13]. Появляются данные о роли АБК в процессах активного роста, о высоком содержании АБК в

активно растущих органах различных растений [2], что свидетельствует о полифункциональности АБК.

Зоны побега регенерантов картофеля различались не только содержанием фитогормонов с положительным знаком действия, но и уровнем абсцизовой кислоты (табл. 4). И в данном случае в побеге наблюдался градиент гормона. У сортов Удача и Шийр-6 отмечен базипеталь-ный градиент АБК (так же, как для ИУК и зеатина) и акропетальный у сорта Романо (как для зеатина). Максимальный градиент АБК наблюдался у сорта Шийр-6 (18,88 мкг/г сухой массы), а минимальный — у сорта Романо (4,9 мкг/г).

Воздействие ЭСП, вне зависимости от характеристики напряженности, увеличило содержание АБК в апикальной зоне у сортов Удача и Романо, но уменьшило у сорта Шийр-6. В базальной части побега сорта Романо количество АБК возросло как в варианте ЭСП Е = = +10 кВ/м, так и Е = -10 кВ/м. У сорта Удача в базальной зоне отмечено снижение АБК при ЭСП Е = +10 кВ/м, а у сорта Шийр-6 при Е = -10 кВ/м.

ЭСП не изменило направление градиентов содержания АБК у исследуемых сортов, но существенно увеличило величину базипетально-

го градиента у сорта Удача и акро-петального у сорта Романо. Напротив, величина базипетального градиента снизилась у сорта Шийр-6. Напряженность ЭСП Е = +10 кВ/м была более эффективной для сорта Романо (градиент АБК увеличился почти в 10 раз), в то время как у сорта Удача величина градиента увеличилась в 3 раза, а у сорта Шийр-6 снизилась в 2 раза. В варианте с напряжённостью Е = -10 кВ/м градиент АБК минимально увеличился у сорта Романо (в 2 раза), а максимально — у сорта Удача (почти в 4 раза).

Регуляторное действие гормонов в растении определяется не только их содержанием, но и соотношением. Соотношение гормонов различных групп определяет процессы роста, ход морфо- и органогенеза и соответственно уровень физиоло-го-биохимических процессов в растениях, отдельных его частях и органах. В наших опытах соотношение ИУК и зеатина существенно различалось в апикальной и базальной частях побега контрольных растений (табл. 5). В апикальной части растений скороспелых сортов Удача и Шийр-6 в сумме этих 2 гормонов преобладало содержание ци-токинина (зеатина), а у позднеспелого сорта Романо _— ИУК. В ба-

Таблица 4

Влияние электростатического поля на содержание АБК в апикальной и базальной зонах побега растений картофеля разных сортов

Вариант (напряженность ЭСП, Е) Зона побега Сорта

Удача Романо Шийр-6

содержание ИУК градиент содержание ИУК градиент содержание ИУК градиент

Контроль +10 кВ/м -10 кВ/м

Апикальная Базальная

Апикальная Базальная

Апикальная Базальная

8,93±0,71 2,24±0,16 22,44±2,02 1,41 ±0,12

31,70±2,54 6,32±0,51

6,69 21,03 25,38

1,42+0,11 6,32+0,44 22,44±1,79 70,96±5,68

6,32±0,44 15,89±1,27

4,90 48,50 9,57

22,44±1,79 3,56±0,32 15,89±1,43 6,12±0,43 8,93±0,71 0,72±0,06

18,88

9,77

38,21

Влияние электростатического поля на относительное содержание ИУК и зеатина в апикальной и базальной частях побега пробирочного картофеля

Сорта

Вариант (напряженность ЭСП, Е) Зона побега Удача Шийр-6 Романо

ИУК+ зеатин, мкг/г % ИУК % зеатина ИУК+ зеатин, мкг/г % ИУК % зеатина ИУК+ зеатин, мкг/г % ИУК % зеатина

Контроль Апикальная 18,6 24 76 15,25 41 59 14,48 98 2

Базальная 4,88 82 18 4,96 72 28 5,37 83 17

+ 10 кВт/м Апикальная 9,88 64 36 37,14 76 24 28,45 99 1

Базальная 1,62 69 31 17,42 81 19 8,04 56 44

-10 кВ/м Апикальная 23,86 94 6 5,39 84 16 14,98 90 10

Базальная 15,05 94 6 1,74 82 18 6,44 12 88

зальной части растений сортов Удача и Шийр-6, наоборот, преобладало содержание ИУК. У сорта Ро-мано также преобладала ИУК. Подавляющее присутствие ИУК в апикальной и базальной частях растений этого сорта выражалось соответственно 98 и 83%. Воздействие ЭСП изменило соотношение групп гормонов в апикальной и базальной (прикорневой) частях побега пробирочных растений картофеля. ЭСП напряженностью Е = +10 кВ/м увеличило процентную долю содержания ИУК в сумме гормонов в апикальной части побега у всех изученных сортов. Напротив, в базальной части повысилась доля цито-кинина. Наиболее наглядно это проявилось у сортов Романо и Удача. Иной эффект наблюдался при нахождении регенерантов в ЭСП Е = —10 кВ/м. Отмечено существенное снижение доли зеатина во всех зонах побега: на 70 и 12% у сорта Удача и 43 и 10% у сорта Шийр-6. У сорта Романо наблюдалось повышение уровня цитокинина на 8 и 61%. Известно, что соотношение ауксинов и цитокининов влияет на преимущественный рост побегов или корней.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что длитель-

ное (30 дней) воздействие на пробирочные растения картофеля ЭСП существенно повлияло на содержание и соотношение ИУК, зеатина и АБК. Отмечены сортовые особенности в изменении гормонального статуса растений под влиянием длительного воздействия ЭСП. Содержание фитогормонов в пробирочных растениях картофеля является результатом эндогенных синтезов и поступлением ИМК из питательных сред. Воздействие ЭСП на пробирочные растения картофеля, очевидно, влияет на все процессы, определяющие содержание конкретных фитогормонов (синтез, метаболизм, образование конъюгатов, транспорт и др.) Это влияние прямое и косвенное, через другие метаболические процессы растений. Изменение гормонального статуса растений под влиянием ЭСП может быть как причиной, так и следствием физиологических процессов (рост, С02-газообмен, БЭП и др.).

ЭСП существенно изменяет гормональную полярность растений — осевые градиенты гормонов. Осевые градиенты содержания фитогормо-нов, очевидно, характеризуют уровень аксиальной полярности побега пробирочного растения картофеля как одного из факторов, опре-

деляющих ход процессов морфо- и органогенеза, уровень отдельных физиологических и биохимических процессов растений. В большинстве случаев в наших опытах отмечено более устойчивое положительное влияние на гормональную систему пробирочных растений картофеля ЭСП с напряжением Е = +10 кВ/м. В ряде случаев отмечено положительное действие ЭСП с напряжением Е = -10 кВ/м.

В последующем целесообразно изучить гормональную систему растений при разных сочетаниях (при очередных пассажах) отрицательных и положительных ЭСП и длительности их воздействия на процессы регенерации, рост и развитие растений в условиях in vitro.

ЭСП, способствуя оптимизации гормонального статуса растений, очевидно, активирует адаптивные процессы к стрессам, которые неизбежно испытывают пробирочные растения в условиях in vitro (малый объем корнеобитаемой и воздушной среды в пробирке, недостаточное освещение и др.). Поэтому при последующих технологических процессах, связанных с пересадкой растений в полевые условия, рас-тения-регенеранты после воздействия ЭСП оказываются более продуктивными по количеству и качеству семенных клубней.

Выводы

1. Пробирочные растения изучавшихся сортов картофеля в контроле и при действии ЭСП отличались по содержанию гормонов в аксиальной и базальной частях побегов.

2. Содержание ауксина (ИУК) в растениях сортов Удача, Шийр-6 и Романо в вариантах опыта варьировало соответственно по сортам (в мкг/г сухой массы) в пределах 1,12-22,44; 1,42-28,3 и 0,8-28,25; цитокинина (зеатин) по тем

же сортам соответственно 0,50-14,12; 0,32-8,93; 0,2-5,64; содержание АБК в пределах 1,41-31,7; 0,72-22,44; 1,42 — 70,96.

3. Выявлены аксиальные градиенты содержания фитогормонов в растениях изучавшихся сортов картофеля в связи с их различным содержанием в апикальной и базальной частях побега. Установлено наличие базипетального градиента ИУК у всех изученных сортов, акропе-тального градиента зеатина и АБК у позднеспелого сорта Романо и базипетального градиента зеатина и АБК у раннеспелых сортов Удача и Шийр-6. Различия в уровне фитогормонов, очевидно, имеют генетическую основу.

4. Культивирование растений картофеля в условиях электростатического поля (ЭСП) повлияло на содержание гормонов в апикальной и базальной зонах побега, но не изменило направление градиентов фитогормонов по сравнению с контролем, однако оказало воздействие на их величину. Так, ЭСП Е = +10 кВ/м увеличило градиент ИУК у всех сортов, а также АБК у сортов Удача и Ро-мано, уровень зеатина — у сорта Рома-но; уменьшило градиент АБК у сорта Шийр-6 и уровень зеатина у сорта Ро-мано.

5. Электростатическое поле Е = +10 кВ/м снизило уровень зеатина, увеличило концентрацию ИУК и АБК в апикальной части побега. ЭСП Е = —10 кВ/м уменьшило эффективность действия на содержание зеатина и АБК и увеличило уровень ИУК. Влияние ЭСП разной напряженности на количество гормонов в базальной зоне побега зависело от сорта.

6. Между содержанием и соотношением гормонов пробирочных растений картофеля, их осевых градиентов и функциональной активностью пробирочных растений имеет место сложная связь, выраженная в изменении интенсивности СО--газообмена, уровня и градиента, хода процессов морфо- и органогенеза, накопления биомассы при действии различных электростатических полей.

7. Мы полагаем, что электростимуляция перспективна при регенерации

растений в культуре ткани, которые трудно переходят к органогенезу или из сомаклонов, а также из культур, полученных на основе генной инженерии, где необходима ускоренная регенерация с целью предотвращения нежелательной генетической изменчивости.

8. Гормональную систему растений картофеля (содержание фитогормонов, аксиальные градиенты), сложившуюся при выращивании в ЭСП Е=+10 кВ/м и обеспечившую лучшее развитие пробирочных растений, очевидно, следует признать более благоприятной для ре-генерационных процессов растений в условиях проведенных опытов по сравнению с контролем.

ЛИТЕРАТУРА

Диас С., Вера-Рамос Т.Ю. и др. Стимуляция слабым электрическим током регенерации растений в культуре тканей кукурузы // Биотехнология, 2001. № 5. С. 58-63. — 9. Кулаева О.Н. Фитогормо-ны как регуляторы активности генетического аппарата и синтеза белка у растений. М.: Наука, 1985. С. 62-84. — 10. Кулаева О.Н. Как регулируется жизнь растений // Соровский Образовательный журнал, 1995. № 1. С. 20-27. — 11. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравай-ко Н.Н. и др. Иммуноферментная тест-система для определения цитокининов // Физиология растений, 1990. Т. 37. Вып. 1. С. 193-199. — 12. Кудоярова Г.Р. и др. Иммуноферментный анализ регуляторов роста и развития растений. Применение в физиологии и экологии. Уфа:

БНЦ УрО АН СССР, 1990. — 13. Масло-1. Аканов Э.Н. Метод герметичной ка- ва С.П., Коф Э.М. Интенсивность дыха-меры в агрометеорологических и агро- ния и содержания абсцизовой кислоты физиологических исследованиях. АФИ в подземном побеге столонообразующих ВАСХНИЛ. Автореф. канд. дисс. Л., 1989. — растений // Иммуноанализ регулято-2. Белътская Е.В., Кондратьева В.В., Ки- ров роста в решении проблем физиоло-риченко Е.Б. // Изв.АН. Серия биологи- гии растений, растениеводства и био-ческая, 1997. Т. 3. С. 261-265. — 3. Весе- технологии. Уфа: БГУ, 2000. С. 38-40. — С.Ю. Использование антител для 14. Медведев С.С. Физиология растений.

Учебник. СПб.: Изд-во С.-Перб. Ун-та, 2004. — 15. Овчинникова В.Н. Индукция клубнеобразования картофеля в куль-сов П.В., Мазин В.В., Турецкая Р.Х. и др. туре in vitro. Автореф. канд. дисс. М..

лов

количественного определения, очистки и локализации регуляторов роста растений. Уфа: Изд-во БГУ, 1998. — 4. Вла-

Комплексный метод определения природных регуляторов роста. Первичный анализ незрелых семян кукурузы на активность свободных ауксинов, гибберел-линов и цитокининов // Физиология растений, 1979. Т. 26. Вып. 3. С. 648-655. —

1992. — 16. Пузина Т.И. Кириллова И.Г.

Ключевые соотношения фитогормонов и их роль в регуляции физиологических процессов растений картофеля // Им-муноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, ра-

5. Деменко В.И., Каменская К.И., Треть- стениеводства и биотехнологии. Уфа:

яков Н.Н. Влияние электростатического поля на рост и развитие плодовых и ягодных растений in vitro /,/ Доклады ТСХА, 1995. Вып. 226а. С. 107-110. — 6. Деменко В.И. Проблемы и возможности микроклонального размножения садовых растений. Введение в культуру // Изв. ТСХА. 2005. Вып. 2. С. 48-58. — 7. Камен-

БГУ. 2000. С. 41-46. — 17. Стрельцов Б.Н.

и др. Электрофизиологическая стимуляция черенков // Цветоводство, 1984. № 5. — 18. Сувд Ч., Овчинникова В.Н., Па-

ничкин Л.А. и др. Регенерация меристем и рост черенков картофеля при кло-нальном микроразмножении in vitro под действием электрического поля / / С.-х.

ская К.И., Шогенов Ю.Х., Третьяков Н.Н. биотехнология, 2004. № 1. С. 73-77. —

Функциональная роль градиентов потенциалов в растениях // Электрофизиологические методы в изучении функционального состояния растений. М.: МСХА, 1988. С. 1—14. — 8. Китлаев Г.Б.,

19. Сувд Ч., Третьяков Н.Н., Овчинникова В.Н. и др. Влияние ЭСП на прямую регенерацию корневых и стеблевых эк-сплантов картофеля in vitro // Изв. ТСХА, 2004. № 2. С. 69-75. — 20. Сувд Ч.,

Третьяков Н.Н., Аканов Э.Н. и др. Действие элекстростатического поля на этапе клонального микроразмножения картофеля на С02-газообмен и морфогенез растений // Изв. ТСХА, 2004. Вып. 4. С. 60-68. — 21. Третьяков Н.Н., Сувд Ч., Паничкин Л.А. и др. Особенности действия электростатического поля на динамику осевых градиентов биоэлектрических потенциалов растений картофеля на этапе микрочеренкования / / Докл. РАСХН, 2004. № 5 С. 3-6. — 22. Шоге-нов Ю.Х., Третьяков Н.Н. и др. Влияние внешних и биогенных низкоэнергетических потенциалов на адаптацию растений в теплицах. Изв. ТСХА, 2000. Вып. 3. С. 61-77. — 23. Banskoke et al. // Some

U.S.Researsch results / Pul. By CIGRE. Paris, 1978. Pap. 36-05. — 24. Browley S.Y., Wetherell D.R.Robinson K.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984. V. 81. № 19. P. 60646067. — 25. Chvojka L., Volf ova A., Resla-va J. et al. // M. Kaminek, D.W.S. Mok, F. Zazumalova (eds.). Phisiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants Academic Publishing, The Hague, The Netherlands, 1992. P. 369-372. — 26. Dijak M.,Smith D.L., Wilson T.J. Brown D.C. // Plant Cell report. 1986. V. 5. № 6. P. 468470. — 27. Domanski et al. // Acta Agrobot, 1978. V. 31. № 1-2. P. 173- 179. — 28. Roy. Mich.: St. Joseph, 1981. — Weisenseek, Dorn, Jaffe // Plant Physiol. 1979. V. 64. № 4. P. 512-518.

Статья поступила 28 декабря 2005 г.

SUMMARY

Electrostatic field (ESF) influence on plant hormone status at a clonal micro reproduction stage with test-tube potato plants was studied. ESF favouring optimization of plants' hormone status, apparently activates adoptive processes to stress, under which all test-tube plants live inevitably under in vitro conditions (small volume for roots, of air medium, insufficient lighting etc.). Therefore subsequent technological processes related with plants' replantation in a field, plants-regenerants after ESF influence become more productive as far as quality and quantity of seed tubers are concerned.