Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при возрастной патологии

Materials of conference

УДК 616.37-053.9:615.27

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ВОЗРАСТНОЙ ПАТОЛОГИИ

С. И. Тарновская, В. В. Бенберин Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Санкт-Петербург, Россия

PEPTIDERGIC REGULATION OF PATHOLOGICAL PANCREATIC FUNCTION IN AGEING

S. I. Tarnovskaya, V. V. Benberin Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia

© С. И. Тарновская, В. В. Бенберин, 2013 г.

При старении культуры клеток поджелудочной железы наблюдалось снижение экспрессии важных для поддержания функциональной активности панкреатических клеток сигнальных молекул Ptf1a, Ngn3, Pdx1, Pax6, Foxa2, Nkx2.2 и Pax4. Введение пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 увеличивало экспрессию сигнальных молекул, восстанавливая их до уровня в «молодых» культурах. Предполагается, что пептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 осуществляет свое биологическое действие через связывание с промоторной областью генов, что приводит к активации их экспрессии. Полученные в результате молекулярного моделирования модели и взаимодействия пептидов с азотистыми основаниями нуклеотидов подтверждают ранее выдвинутые предположения о возможности и характере образования комплексов пептидов с ДНК.

Ключевые слова: экспрессия генов, факторы дифференцировки, поджелудочная железа, ДНК-пептидные комплексы.

The decrease of main cell differentiation factors expression Ptf1a, Ngn3, Pdx1, Pax6, Foxa2, Nkx2.2 and Pax4 in pancreas was observed during ageing. Under the influence of H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 peptide the expression of differentiation factors in ageing cell culture was increased and the level of the expression was conformed to young cell culture. It is supposed that H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 peptide realizes its biological effect through binding with promoter region of genes that leads to activation of their expression. The models received as a result of molecular modeling of interaction of peptides with the nitrogenous bases of nucleotides confirm early made assumptions of opportunity and nature of DNA-peptide complexes formation.

Keywords: gene expression, differentiation factors, pancreas, DNA-peptide complexes.

Частота встречаемости сахарного диабета 2-го типа и хронического панкреатита неуклонно возрастает [1]. Причиной ассоциированного с возрастом развития сахарного диабета 2-го типа и хронического панкреатита является уменьшение численности ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы. На субклеточном уровне патология поджелудочной железы во многом обусловлена нарушением экспрессии транскрипционных факторов, регулирующих дифференциров-ку клеток поджелудочной железы. Важнейшими факторами дифференцировки клеток поджелудочной железы являются Ptf1a, Ngn3, Pdx1, Pax6, Foxa2, Nkx2.2 и Pax4 [2, 3]. Белок Pdx1 регулирует пролиферацию и дифференцировку всех типов клеток поджелудочной железы. Белок Ptf1a участвует в дифференцировке ацинарных клеток поджелудочной железы, а также регулирует экспрессию генов ферментов экзокринных клеток поджелудочной железы, включая эластазу-1 и амилазу. Снижение экспрессии гена Ptf1a наблюдается в опухолевых клетках при раке в поджелудочной железе [2]. Белки Pax6, Foxa2, Nkx2.2

и Pax4 активируют экспрессию генов в инсулин-продуцирующих в-клетках, глюкагонпродуци-рующих а-клетках и секретирующих панкреатический полипептид PP-клетках островков Лангер-ганса [4]. Экспрессия Pax6 и Pax4 также обнаружена в соматостатинсодержащих 8-клетках [5]. Известно, что мутации в генах Pax6, Foxa2 и Nkx2.2 являются причиной развития сахарного диабета, вызванного нарушением синтеза инсулина в в-клетках.

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии синтезирован пептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2. В экспериментальных исследованиях на животных и у пожилых больных с сахарным диабетом 2-го типа показано, что тетра-пептид снижает уровень сахара в крови [6]. Установлено, что при aллокcановом сахарном диабете у крыс тетрапептид способствует достоверному снижению уровня глюкозы в крови на 35%, что коррелирует с уменьшением количества летальных исходов. Клинические испытания тетрапеп-тида показали его эффективность у людей, страдающих сахарным диабетом 1-го и 2-го типов [6].

Материалы конференции

Так, под влиянием тетрапептида у пациентов снижался уровень глюкозы натощак и при стандартном глюкозотолерантном тесте, также было отмечено уменьшение концентрации инсулина в плазме крови и индекса инсулинорезистентности. Кроме того, установлено, что тетрапептид способен проникать в ядро и ядрышко клеток и модулировать действие эндонуклеаз на ДНК [7]. Однако молекулярный механизм его действия до конца не изучен.

Целью исследования явилось изучение молекулярных механизмов действия пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 на дифференцировку ацинар-ных и островковых клеток поджелудочной железы при старении.

Материалы и методы. Исследование выполняли на культурах эмбриональных клеток поджелудочной железы MIA PaCa-21 и 14 пассажей, полученных в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург). Первый пассаж расценивали как «молодые», а 14-й пассаж — как «старые» культуры в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007). Культуры клеток разделили на 3 группы: в 1-ю группу (контрольную) вводили физиологический раствор, во 2-ю группу добавляли контрольный тетрапептид H-Ala-Glu-Asp-Leu-OH в концентрации 20 нг/мл, а в 3-ю группу — тетрапептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 в концентрации 20 нг/мл. Клетки культивировали во флаконах площадью 25 см2 («JetBiofil») в 5 мл ростовой среды при температуре 37 °C в среде ДМЕМ с добавлением L-глутамина («Билот»), 15% сыворотки плодов коровы SC-BIOL («Биолот») и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Исходная концентрация клеток составила 106 клеток/мл. Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела Rtf1a, Pdx1, Pax6, Foxa2 NKx2.2, Pax4 (1 : 50, «Abcam») и вторичные антитела — биотинилиро-ванные антимышиные иммуноглобулины («Novo-castra»). Пермеабилизацию проводили с применением 0,1 % тритона Х100. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диаминобензидина («EnVision Detection System», Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse). Оценку результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическим методом на микроскопе Nikon Eclipse E400 с помощью цифровой камеры Nikon DXM1200 и программного обеспечения «Vidеotest Morphology 5.0». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при Х200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Концентрацию соответствующих мРНК белков Rtf1a, Pdx1, Pax6, Foxa2 NKx2.2, Pax4 оценивали методом количественного ПЦР-анализа. Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли в программе Stati-

stica 7.0. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Оптимальные трехмерные структуры тетра-пептидов Lys-Glu-Asp-Trp и Ala-Glu-Asp-Leu находили методом конформационного поиска молекулярной динамикой в силовом поле Amber12: EHT [8]. Влияние растворителя учитывали в неявном виде с введением внутренней диэлектрической константы, равной 1, а внешней 80. С конфор-мерами, полученными методом конформационно-го поиска, в дальнейшем проводился докинг с ДНК. При построении молекулы двухцепочечной ДНК учитывалась В-форма молекулы со стандартными большой (2,1 нм) и малой (1,1 нм) бороздками. Выбирались следующие последовательности: TCTCC, TCCCT, GCCTC, GCCCC, CTCCT, CTCCC, CGGTG, CGCCC, CCTGG, CCTCT, CCCTC, CCAGG, CCAGC, CCACA, CAGGC, CAGCC, AGCTC, AGAAA. После построения молекулы ДНК протонировались при условиях pH 7 и T = 300 K и проводилась оптимизация их геометрии в поле Amber12EHT. Для моделирования комплекса двухцепочечной ДНК с тетрапептидами Lys-Glu-Asp-Trp и Ala-Glu-Asp-Leu использовали метод молекулярного докинга, суть которого состояла в подборе оптимальной взаимной ориентации молекул при их связывании и образовании стабильного комплекса. При расчете оптимальных ориентаций тетрапептидов в дуплексе ДНК учитывали площадь контакта, количество водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. В качестве сайта связывания выбиралась вся молекула ДНК. Решения докинга ранжировались по величинам оценочной функции: чем более отрицательно значение оценочной функции, тем сильнее взаимодействие.

Выраженность взаимодействия пептида с ДНК определяли величиной отрицательных значений ДЕ: чем энергия более отрицательна, тем сильнее взаимодействие.

Результаты и обсуждение. При старении культуры клеток поджелудочной железы наблюдалось значительное снижение экспрессии важных для поддержания функциональной активности панкреатических клеток сигнальных молекул. Так, при старении культуры экспрессия факторов дифференцировки Ptf1a и Pdx1, регулирующих развитие клеток — предшественников всех ацинарных и островковых клеток поджелудочной железы, снижалась на 80 и 63%. Такие изменения могут вызвать нарушения экзокринной и эндокринной функций поджелудочной железы и развитие хронического панкреатита и сахарного диабета. Введение пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 увеличивало экспрессию белков Ptf1a и Pdx1 в клетке, восстанавливая их до уровня в «молодых» культурах. В созревании а-, Р-, 8- и РР-клеток поджелудочной железы участвуют факторы дифференцировки Pax6, Foxa2, Nkx2.2. Их экс-

Materials of conference

прессия при старении снижалась на 50, 70 и 74% соответственно. При введении пептида значимый эффект наблюдался для фактора дифференци-ровки а-клеток Рахб: пептид восстановил его уровень в клетке до «молодых» культур. Пептид также стимулировал экспрессию белка Foxa2, однако не восстановил ее до нормы. Экспрессия белка Рах4, секретируемого предшественниками 8-клеток и в-клеток, при старении культур и введении пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 практически не изменялась. Следовательно, пептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 способствовал разнонаправленной дифференцировке клеток поджелудочной железы. Методом количественной полимеразной цепной реакции было показано, что увеличение экспрессии вышеперечисленных белков при введении пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 коррел-лирует с увеличением их матричной РНК в клетке. Это указывает на эпигенетический механизм действия пептида. Скорее всего, пептид подобно транскрипционным факторам, связывается с про-моторными участками специфических генов и запускает их экспрессию.

Исследованы конформационные особенности пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 и контрольного пептида H-Ala-Glu-Asp-Leu-OH. Оказалось, что у пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 существует 14 энергетически выгодных конформаций, а у контрольного пептида — 160 конформаций. Все найденные конформации пептида H-Lys-Glu-Asp-Тгр-КН2 имеют похожую трехмерную структуру и образуют пи-катионные взаимодействия ин-дольных колец триптофана и аминогрупп лизина. Показано, что пи-катионная связь стабилизирует пространственную структуру пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2. Контрольный пептид Н-А1а-

Glu-Asp-Leu-OH более лабильный. Наличие положительных и отрицательных областей в молекуле пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 придает ей свойства диполя. Предполагается, что биологический эффект пептида H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 реализуется через связывание с участками генов. Проведенный анализ конформаций пептидов H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 и Н-А1а^1и^р-Ьеи-ОН позволил создать модели взаимодействия пептидов с участками ДНК. В промоторных областях генов факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы обнаружено 18 схожих последовательностей нуклеотидов длиной 5 п. н. Результаты докинга пептидов с этими последовательностями нуклеотидов показали, что пептид H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 на 1-2 ккал/моль образует более устойчивые комплексы, чем пептид H-Ala-Glu-Asp-Leu-OH. Взаимодействие пептидов H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 и Н-А1а^1и^р-Leu-OH с нуклеотидами осуществлялось за счет вандерваальсовых электростатических взаимодействий и образования водородных связей между функциональными группами обеих молекул. Оказалось, что пептиды не интеркалируют в азотистые основания ДНК, не разрушая ее вторичную структуру. Пептиды взаимодействуют с большой бороздкой ДНК по нескольким положениям: N7 гуанина, N6 аденина, С5 тимина и N4 цитозина. Полученные в результате молекулярного моделирования структурные модели и выявленные особенности взаимодействия пептидов с азотистыми основаниями последовательностей нуклеотидов подтверждают ранее выдвинутые предположения о возможности и характере образования комплексов пептидов с нуклеиновыми кислотами [9].

Литература

1. Wild S., Roglic G., Green A., Sicree R., King H. Global Prevalence of Diabetes Estimates for the Year 2000 and Projections for 2030 // Diabetes Care. — 2004. — Vol. 27. — № 5. — P. 1047-1053.

2. Doyle M. J., Sussel L. Nkx2.2 Regulates P-Cell Function in the Mature Islet // Diabetes. — 2007. — Vol. 56. — № 8. — P. 1999-2007.

3. Pedersen J. K, Nelson S. B., Jorgensen M. C., Henseleit K. D., Fujitani Y., Wright C. V. E., Sander M., Serup P. Endodermal expression of Nkx6 genes depends differentially on Pdx1 // Developmental biology. — 2005. — Vol. 288. — № 2. — P. 487-501.

4. Коркушко О. В., Шатило В. Б., Хавинсон В. Х., Антонюк-Щеглова И. А. Дополнительный сахароснижаю-щий эффект тетрапептида панкрагена у пожилых больных с сахарным диабетом 2-го типа // Кровообращение и гемостаз. — 2009. — № 3-4. — С. 102-106.

5. St-Onge L., Sosa-Pineda B., Chowdhury K., Mansouri A., Gruss P. Pax6 is required for differentiation of glucagon-producing a-cells in mouse pancreas // Nature. — 1997. — Vol. 387. — № 6631. — P. 406-409.

6. Sellick G. S., Barker K. T., Stolte-Dijkstra I. et al. Mutations in PTF1A cause pancreatic and cerebellar agenesis // Nat. Genet. — 2004. — Vol. 36. — № 12. — P. 1301-1305.

7. Fedoreyeva L. I., Kireev I. I., Khavinson V. Kh., Vanyushin B. F. Penetration of Short Fluorescence-Labeled Peptides into the Nucleus in HeLa Cells and in vitro Specific Interaction of the Peptides with Deoxyribooligonucleotides and DNA // Biochemistry. — 2011. — Vol. 76. — № 11. — P. 1210-1219.

8. Case D. A., Cheatham T. E., Darden T. A. et al. The Amber biomolecular simulation programs. // J. Computat. Chem. — 2005. — Vol. 26. — P. 1668-1688.

9. Khavinson V, Shataeva L, Chernova A. DNA double-helix binds regulatory peptides similarly to transcription factors // Neuroendocrinol. Lett. — 2005. — Vol. 26. — P. 237-241.