СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОМЕРОВ ХИТИНА И N-ДЕАЦЕТИЛИРОВАННЫХ ПО ТЕРМИНАЛЬНОМУ ОСТАТКУ ПРОИЗВОДНЫХ ЭТИХ СОЕДИНЕНИЙ

Способ ферментативного получения олигомеров хитина и N-деацетилированных по терминальному остатку производных этих соединений, заключающийся в том, что осуществляют биосинтез in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобий, контролирующего синтез этих соединений, отличающийся тем, что при биосинтезе in vivo используют фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, контролирующий синтез олигомеров, состоящих из пяти и шести остатков N-ацетилглюкозамина, а также получают деацетилированные производные тетра-N-ацетилхитопентаозу и пента-N-ацетилхитогексаозу с помощью другого фермента хитоолигосахарид деацетилазы и осуществляют деацетилирование олигомеров хитина in vitro с помощью выделенного после рефолдинга рекомбинантного фермента хитоолигосахарид деацетилазы, для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина и их N-деацетилированных производных проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α генов Mesorhizobium loti и Rhizobium sp. GRH2 NodC и NodB, кодирующих N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и хитоолигосахарид деацетилазу, амплифицикацию генов NodC и NodB осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательностей генов NodC и NodB) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации NodC и NodB генов Mesorhizobium loti используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti CIAM 1803 - коллекция ГНУ ВНИИСХМ, http://www.arriam.spb.ru/rus/lab10, а также ДНК штамма Rhizobium sp. GRH2, в результате получают продукты амплификации размером около 1300 п.о. (NodC) и около 700 п.о. (NodB), соответственно, амплифицированные копии NodC гена Mesorhizobium loti и Rhizobium sp. GRH2 клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1, а гена NodB - в векторе pK18 по сайтам EcoR1 и BamH с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиды, содержащие полноразмерные гены NodC и NodB, кодирующие N-ацетил-глюкозаминилтрансферазу и хитоолигосахарид деацетилазу, и используют их для экспрессии генов NodC и NodB в бактериях Escherichia coli, в векторах pUC19, и pK18 гены NodC и NodB находятся под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетил-глюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих генетическую конструкцию (плазмиду pUC19 со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti или Rhizobium sp. GRH2), в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу и гекса-N-ацетилхитогексаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti составляет около 0,1-0,5 г/л бактериальной культуры, количество синтезированной гекса-N-ацетилхитогексаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH2 составляет до 0,1 г/л бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированных веществ, который подтверждает, что синтезированные вещества являются пента-N-ацетилхитопентаозой и гекса-N-ацетилхитогексаозой, для синтеза N-деацетилированных по терминальному остатку олигомеров хитина осуществляют трансформацию Escherichia coli DH5α одновременно двумя плазмидами - pUC19, содержащей ген NodC (pUC19/NodC), и pK18, содержащей ген NodB (pK18/NodB), экспрессию N-ацетил-глюкозаминилтрансферазы (NodC) и хитоолигосахарид деацетилазы (NodB) осуществляют при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих обе генетические конструкции pUC19/NodC и pK18/NodB, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют N-деацетилированные по терминальному остатку олигомеры хитина - тетра-N-ацетилхитопентаозу и пента-N-ацетилхитогексаозу, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированных веществ; деацетилирование олигомеров хитина (пента-N-ацетилхитопентаозы и гекса-N-ацетилхитогексаозы) in vitro осуществляют восстановлением нативной конформации рекомбинантного белка хитоолигосахарид деацетилазы, при инкубации олигомеров хитина (пентамера и гексамера) с ферментом хитоолигосахарид деацетилазой Mesorhizobium loti, полученным в результате рефолдинга, в процессе ферментативной реакции получают тетра-N-ацетилхитопентаозу и пента-N-ацетилхитогексаозу, осуществляют амплификацию полноразмерного гена NodB Mesorhizobium loti CIAM 1803, амплифицированный ген NodB клонируют в векторе pRSETb по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, в векторе pRSETb клонированный ген находится под контролем промотора для РНК-полимеразы фага Т7, экспрессию хитоолигосахарид деацетилазы (NodB) осуществляют в штамме Escherichia coli C41 после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом в течение ночи, бактерии собирают центрифугированием и обрабатывают ультразвуком, при экспрессии рекомбинантного белка хитоолигосахарид деацетилазы Mesorhizobium loti, белок нарабатывают накоплением его в бактериях в виде белковых образований (телец включения) из объема культуральной среды - 500-600 мл, для рефолдинга хитоолигосахарид деацетилазы из телец включения, белок растворяют в 60 мМ трис-HCl (рН 9,0), содержащем 0,3% лаурилсаркозил, 1 мМ дитиотрейтол при комнатной температуре, для обеспечения правильного формирования дисульфидной связи, белковый раствор разбавляют водой 1:3, добавляя 1/100 объема 240 мМ восстановленного глутатиона (до конечной концентрации 2,4 мМ) и 1/100 объема 2,4 мМ окисленного глутатиона (до конечной концентрации 0,024 мМ), белковый раствор диализуют в течение ночи при +4°С против буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl (рН 8,5), 2,4 мМ восстановленного глутатиона и 0,024 мМ окисленного глутатиона, таким образом, осуществляют рефолдинг фермента ризобий хитоолигосахарид деацетилазы, ферментативную активность хитоолигосахарид деацетилазы определяют в реакции деацетилирования пента-N-ацетилхитопентаозы, посредством определения образующегося ацетата, реакционная смесь для определения активности этого фермента содержит 20 мМ MOPS (рН 7,2), 0,5 мг пента-N-ацетилхитопентаозы, реакцию деацетилирования проводят в течение 20 ч при 28°С, образование ацетата определяют спектрофотометрически при 340 нм.