Способ децеллюляризации и криоконсервации роговичной лентикулы для интрастромальной кератофакии
METHOD FOR DECELLULARIZATION AND CRYOPRESERVATION OF CORNEAL LENTICULE FOR INTRASTROMAL KERATOPHAKIA

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано с целью проведения рефракционных вмешательств на роговице с помощью интрастромальной кератофакии, используя при этом в качестве трансплантата криоконсервированную и децеллюляризированную роговичную лентикулу.
Известная рефракционная операция СМАЙЛ (ее фирменное название Refractive Lenticule Extraction (ReLEx) SMall Incision Lenticule Extraction (SMILE/СМАИЛ) позволяет исправлять миопию и миопический астигматизм путем формирования в строме роговицы дисковидной лентикулы определенной толщины и диаметра. В конце операции данная лентикула извлекается из глаза и утилизируется. Лентикула состоит из коллагенового каркаса и клеточного содержимого. Поэтому данный роговичный материал может расцениваться как истинный трансплантат, что расширяет возможности для интрастромальной кератофакии. В настоящее время для интрастромальной кератофакии описаны случаи использования аллогенной и децеллюляризированной роговичной лентикулы. Децеллюляризация как метод удаления клеточного содержимого из коллагенового каркаса роговичной ткани является наиболее предпочтительным с точки зрения уменьшения риска развития реакций иммунного отторжения после ее транспантации в строму роговицы. В связи с тем, что потребность в донорском материале в глазных тканевых банках с каждым годом увеличивается, поиск оптимальных условий хранения децеллюляризированной роговичной лентикулы для интрастромальной кератофакии является актуальным.
В отечественной и зарубежной литературе отсутствуют сведения о криоконсервации децеллюляризированной роговичной лентикулы для интрастромальной кератофакии.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа децеллюляризации и криоконсервации роговичной лентикулы для интрастромальной кератофакии с использованием процедуры децеллюляризации лентикулы - гипертонический (1,5 М) раствор натрия хлорида с нуклеазами (растворы ДНКазы 5 Ед/мл и РНКазы 5 Ед/мл) и ее криоконсервации в растворе диметильсульфоксида (ДМСО).
Технический результат, получаемый в результате решения этой задачи, состоит в создании в короткие сроки банка роговичной ткани (лентикул), обладающих сохранностью коллагенового каркаса и отсутствием клеточного содержимого, что обусловливает их высокую прозрачность и низкий уровень иммунногенности.
Указанный технический результат достигается тем, что в заявленном способе децеллюляризации и криоконсервации роговичной лентикулы для интрастромальной кератофакии, в стерильных условиях инкубируют лентикулу в 1,5 М растворе хлорида натрия в течение 48 часов с заменой через 24 часа, затем лентикулу инкубируют в растворе ДНКазы 5 Ед/мл и РНКазы 5 Ед/мл в течение 48 часов, после чего лентикулу промывают в фосфатно-буферном растворе (PBS), рН 7,4, в течение 72 часов, с заменой раствора PBS каждые 24 часа, на всех этапах децеллюляризации лентикулы используют непрерывное встряхивание в термошейкере при комнатной температуре; после децеллюляризации лентикулу криоконсервируют в стерильных условиях, для чего лентикулу сначала трижды по 5 минут отмывают в растворе PBS и переносят в криопробирку, содержащую 0,9 мл раствора для хранения роговицы и 0,1 мл 10% диметильсульфоксида. Далее криопробирку с лентикулой помещают в контейнер для криоконсервации, который на ночь переносят в холодильник с температурой минус 80 градусов по Цельсию, на следующий день контейнер с лентикулой переносят в сосуд Дьюара (с жидким азотом с температурой минус 196 градусов по Цельсию; за сутки до запланированной процедуры интрастромальной кератофакии лентикулу извлекают из сосуда Дьюара и размораживают в течение 5 минут на водяной бане при 37 градусах по Цельсию, затем проводят е трехкратный цикл отмывания в растворе PBS, после чего лентикулу переносят в операционный блок для проведения процедуры интрастромальной кератофакии.
Пример 1.
Сначала выполняется децеллюляризация лентикулы. На всех этапах децеллюляризации лентикулы используется непрерывное встряхивание в термошейкере при комнатной температуре.
Для этого в стерильных условиях ламинарного бокса II класса безопасности инкубируют лентикулу в 1,5 М растворе хлорида натрия в течение 48 часов. Замена 1,5 М раствора хлорида натрия проводится через 24 часа. Затем лентикулу инкубируют в растворе ДНКазы 5 Ед/мл и РНКазы 5 Ед/мл в течение 48 часов. В конце лентикулу промывают в фосфатно-буферном растворе (PBS), рН 7,4 в течение 72 часов, с заменой раствора PBS каждые 24 часа.
Далее после децеллюляризации лентикулы проводится ее криоконсервация в стерильных условиях ламинарного бокса II класса безопасности. Децеллюляризированная лентикула сначала трижды по 5 минут отмывается в растворе PBS и переносится в криопробирку, содержащую 0,9 мл «Раствора для хранения роговицы» (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и 0,1 мл 10% диметильсульфоксида (ДМСО) (PanReac AppliChem, Германия). Далее криопробирку с лентикулой помещают в контейнер для криоконсервации Cool Cell LX (Biocision, США), который на ночь переносится в низкотемпературный холодильник, где снижение температуры осуществляется постепенно со скоростью 1 градус в минуту до минус 80 градусов по Цельсию. На следующий день контейнер с лентикулой переносится в сосуд Дьюара (Cryo Diffusion, Франция) с жидким азотом с температурой минус 196 градусов по Цельсию. Лентикулы хранятся данным способом до востребования. За сутки до запланированной процедуры интрастромальной кератофакии криоконсервированную лентикулу извлекают из сосуда Дьюара и размораживают в течение 5 минут на водяной бане при 37°С. Затем проводят ее трехкратный цикл отмывания: сначала трижды по 5 минут в растворе PBS; далее в течение 12-15 часов лентикула отмывается в растворе PBS с использованием термошейкера при комнатной температуре; в конце, трижды по 5 минут отмывают в PBS. После этого лентикулу переносят в операционный блок для проведения процедуры интрастромальной кератофакии.