Роль полиморфизмов генов глутаматци- стеинлигазы в развитии сахарного диабета 2 типа у жителей Курской области

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

УДК 575.174.015.3:616.379-008.64

DOI: 10.18413/2313-8955-2018-4-1-39-52

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И.

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ГЛУТАМАТЦИСТЕИНЛИГАЗЫ В РАЗВИТИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА У ЖИТЕЛЕЙ КУРСКОЙ ОБЛАСТИ

ФГБОУ ВО Курский государственный медицинский университет Минздрава России,

кафедра фармацевтической технологии, улица Карла Маркса, 3, г. Курск, 305041, Россия E-mail: azzzzar@yandex.ru

Аннотация. Актуальность. Глутаматцистеинлигаза (GCL) является первым ферментом синтеза глутатиона, внутри- и внеклеточного антиокси-данта, нарушение обмена которого играет важную роль в патогенезе сахарного диабета 2 типа (СД2). Проблема. Изучены связи полиморфизмов генов GCLC (-129 C>T, rsl7883901) и GCLM (-588 C>T, rs41303970) с риском развития СД2 и про/антиоксидантным статусом жителей Курской области. Материалы и методы. В исследование были включены 700 больных СД2 (269 мужчин и 431 женщина) со средним возрастом 59,24 ±8,77 лет, находившихся на стационарном лечении в эндокринологи-

Т/* и "1—1 \j \j \j

ческом отделении Курской Городской клинической больницы скорой медицинской помощи с ноября 2015 г по май 2017 г. Группу контроля составили 718 практически здоровых добровольцев (311 мужчин и 407 женщин) со средним возрастом 58,61±7,65 лет. Генотипирование полиморфизмов генов GCLC (-129 C>T, rs17883901) и GCLM (-588 C>T, rs41303970) было выполнено методом ПЦР в режиме реального времени с дискриминацией аллелей с помощью TaqMan зондов. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью онлайн программы SNPStats. Результаты. Частоты генотипов GCLC и GCLM между группами пациентов с СД2 и контроля не отличались (р>0,05). При раздельном сравнении больных СД2 мужчин и женщин со здоровыми лицами оказалось, что генотип Т/Т гена GCLC ассоциирован с повышенным риском развития заболевания исключительно в подгруппе мужчин (OR 1,65, 95% CI 1,05-2,61, p=0,03) и особенно среди курящих пациентов (OR 2,36, 95% CI 1,19-4,65, p=0,01); у них же обнаружено и более частое по сравне-нию со здоровыми носительство аллеля Т гена GCLC (OR 1,69, 95%CI 1,11-2,58, p=0,02), а также более высокое содержание окисленного глутатиона GSSG и перекиси водорода в плазме крови (р<0,05). Выводы. Курение и носительство редкого аллеля Т гена GCLC (rs17883901) увеличивают риск развития СД2 у мужчин, что может способствовать формированию дисбаланса в про- и антиоксидантной системе.

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Ключевые слова: сахарный диабет 2 типа; однонуклеотидный полиморфизм; GCLC; GCLM; генетическая предрасположенность.

Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Kursk State Medical University" of the Ministry of Health of the Russian Federation,

3 Karl Marks St., Kursk, 305041 E-mail: azzzzar@yandex.ru

Abstract. Relevance. Glutamate-cysteine ligase (GCL) is the first enzyme of the glutathione cycle, intra- and extracellular antioxidant, whose impaired metabolism plays an important role in type 2 diabetes (T2D) pathogenesis. Problem. The authors study associations of the GCLC (-129 C>T, rs17883901) and GCLM (-588 C>T, rs41303970) polymorphisms with the risk of T2D development and pro/antioxidant status in the population of Kursk region. Materials and methods. The study groups included 700 T2D patients (269 males and 431 females) of mean age 59,24±8,77 who were admitted to the endocrinological department of Kursk Emergency Hospital from November 2015 to May 2017, and 718 healthy subjects (311 males and 407 females) of mean age 58,61±7,65. Genotyping of GCLC (-129 C>T, rs17883901) and GCLM (-588 C>T, rs41303970) polymorphisms was performed by PDAF, PCR, real-time discrimination of alleles using TaqMan probes. Statistical analysis was performed with the use of the on-line software SNPStats. Results. There was no difference in genotype distribution among type 2 DM and control subjects in GCLC and GCLM genes (p>0,05). Sex-stratified analysis revealed association of T/T genotype of GCLC gene with an increased risk of T2D development exclusively in males (OR 1,65, 95%CI 1,05-2,61, p=0,03) and particularly in a subgroup of smokers (OR 2,36, 95%CI 1,19-4,65, p=0,01); they also showed an increased frequency of rare allele T of GCLC gene (OR 1,69, 95%CI 1,112,58, p=0,02), and elevated plasma levels of oxidized glutathione GSSG and hydrogen peroxide. Conclusions. Smoking and rare allele T of the GCLC gene (rs17883901) increase susceptibility to T2D in males and contribute to formation of imbalance in pro- and antioxidant systems.

Keywords: type 2 diabetes mellitus; single nucleotide polymorphism; GCLC; GCLM; genetic predisposition.

Yu.E. Azarova, E.Yu. Klyosova A.I. Konoplya

THE ROLE OF POLYMORPHISMS OF GLUTAMATE-CYSTEINE LIGASE IN TYPE 2 DIABETES MELLITUS SUSCEPTIBILITY IN KURSK POPULATION

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Введение. Сахарный диабет - это серьезное хроническое заболевание, которое развивается, когда поджелудочная железа не вырабатывает достаточно инсулина или когда организм не способен эффективно использовать выработанный им инсулин [4]. В настоящее время каждый одиннадцатый житель планеты страдает диабетом, что в общем составляет 425 млн человек, три четверти которых - это люди трудоспособного возраста [12]. По предварительным оценкам исследования NATION, в нашей стране более 6 млн. больных, подавляющее большинство которых имеют диабет 2 типа [2]. Помимо стремительных темпов роста заболеваемости СД2, его характерными особенностями являются тенденция к омоложению возраста дебюта, относительно поздняя диагностика заболевания в связи с длительным бессимптомным течением и полиморбидность, особенно в сочетании с сердечнососудистыми заболеваниями и ожирением [3]. К моменту диагностики СД 2 типа у половины пациентов уже присутствуют осложнения, приводящие к снижению качества жизни, ранней инвали-дизации и преждевременной смерти. СД 2 типа - это ведущая причина потери зрения, нетравматических ампутаций и развития терминальных стадий почечной недостаточности [1].

Сахарный диабет 2 типа (СД2) входит в группу мультифакториальной патологии и развивается в результате соче-танного действия генетических и средо-вых факторов. Согласно базе данных GeneCards, 564 гена ассоциированы с различными фенотипами СД2, такими как дисфункция бета-клеток поджелудочной железы и инсулинорезистент-ность периферических тканей. В результате пятидесяти трех полногеномных ис-

следований, установлено 720 однонук-леотидных вариантов, ассоциированных с заболеванием. Тем не менее, эта информация не дает полного представления о функциональной значимости обнаруженных полиморфизмов и их вклада в формирование того отрицательного метаболического фундамента, на фоне которого происходит манифестация заболевания.

Очень важным и широко обсуждаемым в литературе звеном патогенеза СД2 является нарушение работы антиок-сидантной системы, главным представителем которой как внутри, так и вне клеток служит трипептид гамма-глутамилцистеинилглицин, или глутати-он. Первым и единственным регулятор-ным ферментом глутатионового цикла выступает глутаматцистеинлигаза, состоящая из двух субъединиц - каталитической ^^^ и модифицирующей (GCLM). Гены, кодирующие эти белки, полиморфны и вовлечены в патогенез таких заболеваний, как инфаркт миокарда и бронхиальная астма. Данные о возможном вкладе этих генов в развитии СД2 отсутствуют.

Целью настоящего исследования стало изучение связи полиморфизмов генов GCLC (-129 ОГ, ге 17883901) и GCLM (-588 О^ ^41303970) с риском развития СД2 и про/антиоксидантным статусом жителей Курской области.

Материал и методы. На основе письменного информированного согласия в исследование включено 700 больных СД2 (269 мужчин и 431 женщина со средним возрастом 59,24±8,77 лет), получавших стационарное лечение в эндокринологическом отделении Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи с ноября 2015 по май 2017 года. Группу контроля со-

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

ставили 718 практически здоровых добровольцев (311 мужчин и 407 женщин со средним возрастом 58,61±7,65 лет). Диагноз СД2 устанавливался на основании обнаружения гипергликемии >7,1 ммоль/л натощак, или гипергликемии >11,1 ммоль/л в любое время суток независимо от приема пищи, и/или уровня гликированного гемоглобина >6,5% [4]. Лица контрольной группы имели нормальные показатели углеводного обмена. Все обследованные были уроженцами преимущественно Курской области и были неродственны друг другу. Протокол исследования был одобрен Региональным этическим комитетом при Курском государственном медицинском университете.

У всех обследуемых производили забор 6 мл венозной крови натощак в вакуумные пробирки с ЭДТА. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [14]. Генотипирование полиморфизмов генов ОСЬС и ОСЬМ проводили с помощью полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени с дискриминацией аллелей TaqMan зондами согласно протоколам, описанным в литературе

[9, 11].

Для биохимических исследований, 6 мл венозной крови забирали в вакуумные пробирки с гепарином лития в качестве антикоагулянта и сразу же центрифугировали 10 минут при 3500 об./мин. с охлаждением до 4°С. Плазму для детекции перекиси водорода аликвотировали по 200 мкл и замораживали при -80°С. Плазму для определения содержания глутатиона предварительно депротеини-зировали ледяным раствором 5%-ой ме-тафосфорной кислоты и центрифугировали 10 минут при 12000 об./мин. Надо-

садочную жидкость аликвотировали по 100 мкл и замораживали при -80°С. Непосредственно перед анализом образцы разбавляли десятикратно для снижения концентрации метафосфорной кислоты до 0,5%. Концентрацию H2O2 измеряли флуориметрическим методом с использованием набора реагентов ROS/RNS OxiSelect CellBiolabs. Уровень GSSG оценивали колориметрически с помощью набора Total Glutathione CellBiolabs. Абсорбцию и флуоресценцию измеряли на микропланшетном ридере Varioscan Flash (Thermo Fisher Scientific).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью онлайн программы SNPStats. Различия рассматривали как значимые при р<0,05. Поправку на множественное тестирование вводили с использованием онлайн софта FDR Calculator при уровне значимости Q<0,2 [6].

Результаты и обсуждение. В таблице 1 приведены данные по сравнительному анализу частот генотипов и аллелей изучаемых генов у больных СД2 и здоровых лиц. Частоты генотипов GCLC и GСLM между группами пациентов с СД2 и контроля не отличались (р>0,05). При раздельном сравнении больных мужчин и женщин с контролем было выявлено, что генотипы С/Т и Т/Т гена GCLC ассоциированы с повышенным риском развития заболевания только в подгруппе мужчин (OR 1,65, 95CI 1,052,61, p=0,03) с учетом коррекции по полу, возрасту и индексу массы тела; также в группе больных СД2 мужчин обнаружено и более частое (10,4%) по сравнению со здоровыми (6,4%) носительство редкого аллеля Т гена GCLC (OR 1,69, 95CI 1,11-2,58, p=0,02).

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Таблица 1

Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изучаемых генов

Table 1

Ген Генотип/ аллель Группа больных Контрольная группа P Q OR CI для OR

n % n %

Общие выборки

GCLC, -129 C>T (rs17883 901) C/C 596 85,1 580 86,6 0,43 0,56 1,00 -

C/T 93 13,3 84 12,5 1,09 0,79-1,50

T/T 11 1,6 6 0,9 1,84 0,67-5,02

C/T+T/T 104 14,9 90 13,4 0,40 0,56 1,14 0,84-1,55

T - 8,2 - 7,2 0,34 0,56 1,16 0,87-1,54

GCLM, -588 C>T (rs41303 970) C/C 477 68,3 442 66,3 0,12 0,39 1,00 -

C/T 193 27,6 182 27,3 0,98 0,77-1,25

T/T 28 4,0 43 6,4 0,60 0,36-0,98

C/T+T/T 221 31,7 225 33,7 0,39 0,56 0,91 0,72-1,14

T - 17,8 - 20,1 0,13 0,39 0,86 0,71-1,05

Мужчины

GCLC, -129 C>T (rs17883 901) C/C 218 81 268 87,6 0,07 0,36 1,00 -

C/T 46 17,1 36 11,8 1,57 0,98-2,52

T/T 5 1,9 2 0,6 3,08 0,59-16,03

C/T+T/T 51 19,0 38 12,4 0,03 0,27 1,65 1,05-2,61

T - 10,4 - 6,4 0,02 0,27 1,69 1,11-2,58

GCLM, -588 C>T (rs41303 970) C/C 180 66,9 204 67,3 0,50 0,56 1,00 -

C/T 79 29,4 82 27,1 1,09 0,76-1,58

T/T 10 3,7 17 5,6 0,67 0,30-1,49

C/T+T/T 89 33,1 99 32,7 0,92 0,92 1,02 0,72-1,45

T - 18,4 - 19,0 0,80 0,85 0,96 0,71-1,29

Женщины

GCLC, -129 C>T (rs17883 901) C/C 378 87,7 312 85,7 0,50 0,56 1,00 -

C/T 47 10,9 48 13,2 0,79 0,51-1,22

T/T 6 1,4 4 1,1 1,33 0,37-4,80

C/T+T/T 53 12,3 52 14,3 0,38 0,56 0,83 0,55-1,25

T - 6,8 - 7,8 0,47 0,56 0,87 0,59-1,27

GCLM, -588 C>T (rs41303 970) C/C 297 69,2 238 65,4 0,16 0,41 1,00 -

C/T 114 26,6 100 27,5 0,90 0,65-1,24

T/T 18 4,2 26 7,1 0,55 0,30-1,04

C/T+T/T 132 30,8 126 34,6 0,22 0,50 0,83 0,61-1,12

T - 17,5 - 21,0 0,08 0,36 0,80 0,62-1,02

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Учитывая мультифакториальную природу СД2, нам представлялось важным оценить вклад курения как фактора риска в предрасположенность к развитию заболевания. Оказалось, что ассоциация генотипов С/Т и Т/Т гена ОСЬС с риском развития СД2 есть только в под-

группе больных диабетом курящих мужчин ДО 2,36, 95а 1,19-4,65, p=0,01, таблица 2) и отсутствует у некурящих (таблица 3). Эта ассоциация осталась значимой и после поправки на множественное тестирование ^=0,12).

Таблица 2

Сравнительный анализ частот генотипов изучаемых генов среди курящих

Table 2

Comparative analysis of frequencies of the studied gene genotypes

and alleles in smokers

Ген Генотип /аллель Группа больных Контрольная группа P Q OR CI для OR

n % n %

Все курящие

GCLC, -129 C>T (rs17883 901) C/C 198 81,5 194 87,4 0,15 0,45 1,00 -

C/T 39 16,1 26 11,7 1,52 0,88-2,60

T/T 6 2,5 2 0,9 2,78 0,55-14,10

C/T+T/T 45 18,5 28 12,6 0,068 0,27 1,61 0,96-2,70

GCLM, -588 C>T (rs41303 970) C/C 162 66,9 148 67,3 0,31 0,62 1,00 -

C/T 72 29,8 58 26,4 1,17 0,77-1,78

T/T 8 3,3 14 6,4 0,57 0,23-1,42

C/T+T/T 80 33,1 72 32,7 0,78 0,85 1,06 0,71-1,57

Курящие мужчины

GCLC, -129 C>T (rs17883 901) C/C 148 80,9 130 90,9 0,03 0,18 1,00 -

C/T 30 16,4 12 8,4 2,19 1,08-4,45

T/T 5 2,7 1 0,7 4,36 0,5037,83

C/T+T/T 35 19,1 13 9,1 0,01 0,12 2,36 1,19-4,65

GCLM, -588 C>T (rs41303 970) C/C 122 66,7 99 70,2 0,71 0,85 1,00 -

C/T 55 30,1 37 26,2 1,23 0,74-2,02

T/T 6 3,3 5 3,5 0,96 0,27-3,23

C/T+T/T 61 33,3 42 29,8 0,47 0,81 0,19 0,74-1,92

Курящие женщины

GCLC, -129 C>T (rs17883 901) C/C 50 83,3 64 81 0,88 0,88 1,00

C/T 9 15 14 17,7 0,79 0,31-2,00

T/T 1 1,7 1 1,3 0,88 0,0515,38

C/T+T/T 10 16,7 15 19 0,62 0,82 0,80 0,33-1,96

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Ген Генотип /аллель Группа больных Контрольная группа P Q OR CI для OR

n % n %

GCLM, -588 C>T (rs41303 970) C/C 40 67,8 49 62 0,22 0,53 1,00

C/T 17 28,8 21 26,6 1,03 0,48-2,22

T/T 2 3,4 9 11,4 0,28 0,06-1,40

C/T+T/T 19 32,2 30 38 0,56 0,83 0,81 0,39-1,65

Таблица 3

Сравнительный анализ частот генотипов изучаемых генов среди некурящих

Table 3

Comparative analysis of frequencies of the studied gene genotypes

and alleles in non-smokers

Ген Генотип/ аллель Группа больных Контрольная группа P Q OR CI для OR

n % n %

Все неку рящие

GCLC, -129 C>T (rs1788 3901) C/C 398 87,1 386 86,2 0,96 0,96 1,00 -

C/T 54 11,8 58 12,9 0,95 0,63-1,43

T/T 5 1,1 4 0,9 1,07 0,28-4,11

C/T+T/ T 59 12,9 62 13,8 0,83 0,91 0,96 0,65-1,42

GCLM, -588 C>T (rs4130 3970) C/C 315 69,1 294 65,8 0,4 0,86 1,00 -

C/T 121 26,5 124 27,7 0,92 0,68-1,24

T/T 20 4,4 29 6,5 0,67 0,37-1,23

C/T+T/T 141 30,9 153 34,2 0,35 0,86 0,87 0,65-1,16

Некурящие мужчины

GCLC, -129 C>T (rs1788 3901) C/C 70 81,4 143 85,1 0,47 0,86 1,00 -

C/T 16 18,6 24 14,3 1,35 0,68-2,71

T/T 0 0 1 0,6 0 -

C/T+T/T 16 18,6 25 14,9 0,46 0,86 1,30 0,65-2,59

GCLM, -588 C>T (rs4130 3970) C/C 58 67,4 109 65,3 0,73 0,91 1,00 -

C/T 24 27,9 46 27,5 1,00 0,56-1,81

T/T 4 4,7 12 7,2 0,63 0,19-2,05

C/T+T/T 28 32,6 58 34,7 0,78 0,91 0,93 0,53-1,61

Некурящие женщины

GCLC, -129 C>T C/C 328 88,4 243 86,8 0,6 0,90 1,00

C/T 38 10,2 34 12,1 0,79 0,48-1,30

T/T 5 1,4 3 1,1 1.28 0,30-5,42

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Ген (rs1788 3901) Генотип/ аллель Группа больных Контрольная группа P Q OR CI для OR

n % n %

C/T+T/T 43 11,6 37 13,2 0,43 0,86 0,83 0,52-1,33

GCLM, -588 C>T (rs4130 3970) C/C 257 69,5 185 66,1 0,5 0,86 1,00 -

C/T 97 26,2 78 27,9 0,88 0,62-1,26

T/T 16 4,3 17 6,1 0,69 0,34-1,40

C/T+T/T 113 30,5 95 33,9 0,33 0,86 0,85 0,61-1,18

Анализ биохимических показателей редокс-статуса обследуемых показал, что уровни перекиси водорода и окисленного глутатиона значимо выше в группе пациентов с СД2 (р=0,024 и 0,004, соответственно) по сравнению с контролем (таблица 4). Это же характерно и для подгруппы больных СД2 муж-

чин. Стратификационный анализ концентрации Н2О2 и 0880 по курению выявил значимо более высокие уровни этих показателей у всех курящих в общем и курящих мужчин в частности (таблица 5); в группе некурящих различий по содержанию Н2О2 и 0880 обнаружено не было (таблица 6).

Таблица 4

Концентрации H2O2 и GSSG в плазме больных СД2 и здоровых лиц

Table 4

Группа больных контрольная группа

Параметр, мкмоль/л Ср.±ст.ош. n Ср.±ст.ош. n P Q

Общая выборка

H2O2 3,23±1,35 214 2,76±1,21 50 0,024 0,036

GSSG 2,28±1,69 208 1,45±1,43 40 0,004 0,012

Мужчины

H2O2 3,12±1,15 68 2,27±1,07 20 0,004 0,012

GSSG 2,41±1,71 67 1,16±0,92 15 0,008 0,016

Женщины

H2O2 3,28±1,43 146 3,08±1,20 30 0,48 0,48

GSSG 2,23±1,68 141 1,62±1,66 25 0,10 0,12

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Таблица 5

Концентрации H2O2 и GSSG в плазме курящих больных СД2 и здоровых лиц

Table 5

Группа больных Контрольная группа

Параметр, мкмоль/л Ср.±ст.ош. n Ср.±ст.ош. n P Q

Все курящие

H2O2 3,23±1,14 62 2,51±1,20 15 0,03 0,06

GSSG 2,24±1,73 60 0,92±0,98 11 0,007 0,04

Курящие мужчины

H2O2 3,17±1,05 42 2,36±1,03 11 0,03 0,06

GSSG 2,41±1,71 39 1,03±1,25 7 0,049 0,57

Курящие женщины

H2O2 3,36±1,31 20 2,93±1,71 4 0,57 0,57

GSSG 2,44±1,81 21 0,73±0,11 4 0,08 0,12

Таблица 6

Концентрации H2O2 и GSSG в плазме некурящих больных СД2 и здоровых лиц

Table 6

Группа больных Контрольная группа

Параметр, мкмоль/л Ср.±ст.ош. n Ср.±ст.ош. n P Q

Все некурящие

H2O2 3,23±1,43 152 2,86±1,22 35 0,16 0.24

GSSG 2,23±1,67 148 1,64±1,54 29 0,08 0,16

Некурящие мужчины

H2O2 3,04±1,32 26 2,15±1,19 9 0,08 0,16

GSSG 2,40±1,75 28 1,27±0,56 8 0,08 0,16

Некурящие женщины

H2O2 3,27±1,46 126 3,11±1,15 26 0,60 0,60

GSSG 2,19±1,66 120 1,78±1,77 21 0,31 0,37

Результаты нашего исследования впервые наглядно демонстрируют значимую ассоциацию генотипа Т/Т гена GCLC с повышенным риском развития СД2 у мужчин. Эта ассоциация обнаружена и в подгруппе курящих мужчин, больных СД2. Уровень окисленного глу-татиона нами был использован как маркер прооксидантной составляющей редокс-статуса обследуемых лиц.

Роль полиморфизмов GCLC и GCLM в патогенезе СД2 связана со снижением активности промоторов изучаемых генов у носителей аллелей Т по сравнению с носителями диких аллелей С при воздействии активных форм кислорода, что было убедительно показано в работах японских исследовательских групп [13, 15]. Снижение экспрессии регуляторного фермента глутаматцистеинлигазы при-

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

водит к снижению синтеза глутатиона, способствуя формированию окислительного стресса и, как следствие, повышению чувствительности клеток к различным повреждающим факторам, таким как свободные радикалы, перекисные соединения и токсичные компоненты табачного дыма. Бета-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы более других страдают в этих условиях ввиду исходно низкого содержания ан-тиоксидантов [20]. Накопление активных форм кислорода оказывает ингиби-рующее влияние на экспрессию гена инсулина путем репрессии двух ключевых транскрипционных факторов, Maf A и PDX-1, [8, 10] а также запускает апоптоз путем активации киназ ASK-1 и JNK [17, 19, 21]. Усиление апоптоза приводит к необратимому снижению массы функционирующих Р-клеток [22] и нарастанию хронической гипергликемии, классического диагностического признака СД2.

Важным дополнительным по отношению к описанным выше механизмом действия свободнорадикальных соединений является активация экспрессии эндотелина I и ангиотензина II, которые связываются с рецепторами протеинки-назы С, увеличивая таким образом фос-форилирование сериновых и треонино-вых остатков Р-субъединиц инсулиново-го рецептора с последующим торможением фосфорилирования тирозиновых остатков субстрата инсулинового рецептора 1 (СИР-1) и угнетением ферментативной активности фосфатидилинози-тол-3-киназы, продуцирующей фосфати-дилинозитолтрисфосфат [7]. В результате отсутствия этого вторичного посредника рецепции инсулина, первичные эффекты действия гормона (активация глюкозных транспортеров ГЛЮТ и де-

фосфорилирование ключевых ферментов межуточного обмена) на пострецептор-ном уровне не реализуются, что приводит к развитию феномена инсулинорези-стентности периферических тканей, ограничению потребления глюкозы скелетными миоцитами и адипоцитами и усугублению гипергликемии.

Выявленная нами ассоциация генотипа Т/Т гена GCLC с предрасположенностью к СД2 в подгруппе мужчин была установлена у курящих больных и отсутствовала у некурящих пациентов. Аналогичным образом вели себя и биохимические показатели редокс-статуса обследуемых: окисленный глутатион и перекись водорода были значимо повышены в группе больных СД2 мужчин и подгруппе больных мужчин-

курильщиков. Следует отметить, что доля курящих среди мужчин составила 75,3%, а среди женщин - 8,9%. Курение является известным фактором риска развития СД2 [5] из-за стимуляции генерации чрезвычайно реакционноспособных радикалов и прямого токсического действия на клетки поджелудочной железы и другие ткани, метаболические нарушения которых патогенетически связаны с заболеванием [18]. Повышение концентрации активных форм кислорода при СД2 было установлено и в других исследованиях [16, 23], но ни в одном из них не проводился анализ их содержания раздельно у мужчин и женщин.

Выводы:

1. Полиморфный локус гена GCLC (ге 17883901) ассоциирован с повышенным риском развития СД2 у мужчин Курской области.

2. Редокс статус больных СД2 мужчин характеризуется повышенным содержанием перекиси водорода H2O2 в плазме крови и накоплением димера окисленного глутатиона GSSG.

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

3. Курение и носительство редкого аллеля Т гена GCLC (rs17883901) увеличивают риск развития СД2 у мужчин и способствуют формированию дисбаланса в про- и антиоксидантной системе.

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.

Список литературы

1. Аметов А.С., Соловьева О.Л. Окислительный стресс при сахарном диабете 2-го типа и пути его коррекции // Проблемы эндокринологии. 2011. Т. 57, № 6. С. 52-56.

2. Дедов И.И., Шестакова М.В., Гал-стян Г.Р. Распространенность сахарного диабета 2 типа у взрослого населения России (исследование NATION) // Сахарный диабет. 2016. Т. 19, № 2. С. 104-112.

3. Инициация и интенсификация саха-роснижающей терапии у больных сахарным диабетом 2 типа: обновление консенсуса совета экспертов Российской ассоциации эндокринологов (2015 г.) / И.И. Дедов, М.В. Шестакова, А.С. Аметов, М.Б. Анциферов, Г.Р. Галстян, А.Ю. Майоров, А.М. Мкртумян, Н.А. Петунина, О.Ю. Сухарева // Сахарный диабет. 2015. Т. 18, №. 1. С. 5-23.

4. Alberti K.G.M.M., Zimmet P.F. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Provisional report of a WHO consultation // Diabetic medicine. 1998. 15(7). Pp. 539-553.

5. American Diabetes Association. Smoking and diabetes // Diabetes Care. 2003. 26(1). Pp. 89-91.

6. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing // Journal of the royal statistical society. Series B (Methodological). 1995. Pp. 289-300.

7. Chang Y.C., Chuang L.M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of type 2 diabetes: from molecular mechanism to Clinical implication // Am J Transl Res. 2010. 2(3). Pp. 316-331.

8. Guo S., Dai C., Guo M. Inactivation of specific b cell transcription factors in type 2 diabetes // The Journal of clinical investigation. 2013. 123(8). Pp. 3305-3316.

9. Hanzawa R., Ohnuma T., Nagai Y., Shibata N., Maeshima H., Baba H., Arai H. No association between glutathi-one-synthesis-related genes and Japanese schizophrenia // Psychiatry and clinical neurosciences. 2011. 65(1). Pp. 39-46.

10. Harmon J.S., Stein R., Robertson R.P. Oxidative stress-mediated, post- translational loss of MafA protein as a contributing mechanism to loss of insulin gene expression in glu-cotoxic beta cells // J Biol Chem. 2005. 280. Pp. 11107-11113.

11. Hashemi M., Hoseini H., Yaghmaei P., Moazeni-Roodi A., Bahari A., Hashemzehi, N., Shafieipour S. Association of polymorphisms in glutamate-cysteine ligase catalytic subunit and microsomal triglyceride transfer protein genes with nonalcoholic fatty liver disease // DNA and cell biology. 2011. 30(8). Pp. 569-575.

12. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas 8th Edition Brussels, Belgium. idf.org. 2017. Pp. 1-4.

13. Koide S.I., Kugiyama K., Sugiyama S., Nakamura S.I., Fukushima H., Honda O., Ogawa H. Association of polymorphism in glu-tamate-cysteine ligase catalytic subunit gene with coronary vasomotor dysfunction and myocardial infarction // Journal of the American College of Cardiology. 2003. 41(4). Pp. 539-545.

14. Maniatis T. Molecular cloning // A Laboratory Manual, 1982.

15. Nakamura S.I., Kugiyama K., Sugiyama S., Miyamoto S., Koide S.I., Fukushima H., Ogawa H. Polymorphism in the 5'-flanking region of human glutamate-cysteine ligase modifier subunit gene is associated with myocardial infarction // Circulation. 2002. 105(25). Pp. 2968-2973.

16. Nourooz-Zadeh J., Tajaddini-Sarmadi J., McCarthy S., Betteridge D.J., Wolff S.P. Elevated levels of authentic plasma hydroper-

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

oxides in NIDDM // Diabetes. 1995. 44. Pp. 1054-1058.

17. Palit S., Kar S., Sharma G., Das P.K. Hesperetin induces apoptosis in breast carcinoma by triggering accumulation of ROS and activation of ASK1/JNK pathway // Journal of cellular physiology. 2015. 230(8). Pp. 1729-1739.

18. Pan A., Wang Y., Talaei M., Hu F.B., Wu T. Relation of active, passive, and quitting smoking with incident type 2 diabetes: a systematic review and meta-analysis // The lancet Diabetes & endocrinology. 2015. 3(12). Pp. 958-967.

19. Shiizaki S., Naguro I., Ichijo H. Activation mechanisms of ASK1 in response to various stresses and its significance in intracellular signaling // Advances in biological regulation. 2013. 53(1). Pp. 135-144.

20. Tiedge M., Lortz S., Drinkgern J. Relation between antioxidant enzyme gene expression and antioxidant defense status of insulin-producing cells // Diabetes. 1997. 46(11). Pp. 1733-1742.

21. Watanabe T., Sekine S., Naguro I., Sekine Y., Ichijo H. Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1)-p38 pathway-dependent cytoplasmic translocation of the orphan nuclear receptor NR4A2 is required for oxidative stress-induced necrosis // Journal of Biological Chemistry. 2015. 290(17). Pp. 10791-10803.

22. Wright E., Scism-Bacon J.L., Glass L.C. Oxidative stress in type 2 diabetes: the role of fasting and postprandial glycaemia // Int. J. Clin. Pract. 2006. 60(3). Pp. 308-314.

23. Yoshida K., Hirokawa J., Tagami S., Kawakami Y., Urata Y., Kondo T. Weakened cellular scavenging activity against oxidative stress in diabetes mellitus: regulation of glutathione synthesis and efflux // Diabetologia. 1995. 38. Pp. 201-210.

References

1. Ametov, A.S., Solovieva, O.L. (2011), "Okislitel'niy stress pri sakharnom diabete 2-go tipa i puti yego korrektsii" [Oxidative stress in type 2 diabetes mellitus and ways of its correc-

tion], Problemy endokrinologii, 57(6), 52-56. Russian.

2. Dedov, I.I., Shestakova, M.V., Galsty-an, G.R. (2016), "Rasprostranennost' sakharnogo diabeta 2 tipa u vzroslogo nasele-niya Rossii (issledovaniye NATION)" [The prevalence of type 2 diabetes mellitus in the adult population of Russia (NATION study)], Sakharnyy diabet, 19(2), 104-112. Russian.

3. Dedov, I.I., Shestakova, M.V., Ametov, A.S., Antsiferov, M.B., Galstyan, G.R., Mayorov, A.Yu., Mkrtumyan, A.M., Petunina, N.A., Sukhareva, O.Yu. (2015), "Initsiatsiya i intensifikatsiya sakharosnizhayushchey terapii u bol'nykh sakharnym diabetom 2 tipa: ob-novleniye konsensusa soveta ekspertov Ros-siyskoy assotsiatsii endokrinologov (2015 g.)" [Initiation and intensification of antihypergly-cemic therapy in type 2 diabetes mellitus: Update of the Russian Association of Endocrinologists expert consensus document (2015)], Sakharnyy diabet, 18(1), 5-23. Russian.

4. Alberti, K.G.M.M., Zimmet, P.F. (1998), "Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Provisional report of a WHO consultation", Diabetic medicine, 15(7), 539-553.

5. American Diabetes Association. Smoking and diabetes, Diabetes Care. (2003), 26(1), 89-91.

6. Benjamini, Y., Hochberg, Y. (1995), "Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing", Journal of the royal statistical society. Series B (Methodological), 289-300.

7. Chang, Y.C., Chuang, L.M. (2010) "The role of oxidative stress in the pathogenesis of type 2 diabetes: from molecular mechanism to Clinical implication", Am J Transl Res, 2(3), 316-331.

8. Guo, S., Dai, C., Guo M. (2013), "Inac-tivation of specific b cell transcription factors in type 2 diabetes", The Journal of clinical investigation, 123(8), 3305-3316.

9. Hanzawa, R., Ohnuma, T., Nagai, Y., Shibata, N., Maeshima, H., Baba, H., Arai, H. (2011), "No association between glutathi-

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

one-synthesis-related genes and Japanese schizophrenia", Psychiatry and clinical neurosciences, 65(1), 39-46.

10. Harmon, J.S., Stein, R., Robertson, R.P. (2005), "Oxidative stress-mediated, post-translational loss of MafA protein as a contributing mechanism to loss of insulin gene expression in glucotoxic beta cells", J Biol Chem, 280, 11107-11113.

11. Hashemi, M., Hoseini, H., Yaghmaei, P., Moazeni-Roodi, A., Bahari, A., Hashemzehi, N., Shafieipour, S. (2011), "Association of polymorphisms in glutamate-cysteine ligase catalytic subunit and microsomal triglyceride transfer protein genes with nonalcoholic fatty liver disease", DNA and cell biology, 30(8), 569-575.

12. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas 8th Edition (2017). Brussels: Belgium. idf.org, 1-4.

13. Koide, S.I., Kugiyama, K., Sugiyama, S., Nakamura, S.I., Fukushima, H., Honda, O., Ogawa, H. (2003), "Association of polymorphism in glutamate-cysteine ligase catalytic subunit gene with coronary vasomotor dysfunction and myocardial infarction", Journal of the American College of Cardiology, 41(4), 539545.

14. Maniatis T. (1982), "Molecular cloning", A Laboratory Manual.

15. Nakamura, S.I., Kugiyama, K., Sugiyama, S., Miyamoto, S., Koide, S.I., Fukushima, H., Ogawa, H. (2002), "Polymorphism in the 5'-flanking region of human glutamate-cysteine ligase modifier subunit gene is associated with myocardial infarction", Circulation, 105(25), 2968-2973.

16. Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., McCarthy, S., Betteridge, D.J., Wolff, S.P. (1995), "Elevated levels of authentic plasma hydroperoxides in NIDDM", Diabetes, 44, 1054-1058.

17. Palit, S., Kar, S., Sharma, G., Das, P.K. (2015), "Hesperetin induces apoptosis in breast carcinoma by triggering accumulation of ROS and activation of ASK1/JNK pathway", Journal of cellular physiology, 230(8), 1729-1739.

18. Pan, A., Wang, Y., Talaei, M., Hu, F.B., Wu, T. (2015), "Relation of active, passive, and quitting smoking with incident type 2 diabetes: a systematic review and metaanalysis", The lancet Diabetes & endocrinology, 3(12), 958-967.

19. Shiizaki, S., Naguro, I., Ichijo, H. (2013), "Activation mechanisms of ASK1 in response to various stresses and its significance in intracellular signaling", Advances in biological regulation, 53(1), 135-144.

20. Tiedge, M., Lortz, S., Drinkgern, J. (1997), "Relation between antioxidant enzyme gene expression and antioxidant defense status of insulin-producing cells", Diabetes. 46(11), 1733-1742.

21. Watanabe, T., Sekine, S., Naguro, I., Sekine, Y., Ichijo, H. (2015), "Apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1)-p38 pathway-dependent cytoplasmic translocation of the orphan nuclear receptor NR4A2 is required for oxidative stress-induced necrosis", Journal of Biological Chemistry, 290(17), 10791-10803.

22. Wright, E., Scism-Bacon, J.L., Glass, L.C. (2006), "Oxidative stress in type 2 diabetes: the role of fasting and postprandial gly-caemia", Int. J. Clin. Pract, 60(3), 308-314.

23. Yoshida, K., Hirokawa, J., Tagami, S., Kawakami, Y., Urata, Y., Kondo, T. (1995), "Weakened cellular scavenging activity against oxidative stress in diabetes mellitus: regulation of glutathione synthesis and efflux", Diabeto-logia, 38, 201-210.

Азарова Юлия Эдуардовна - доцент кафедры биологической химии КГМУ; заведующая лабораторией биохимической генетики и метаболомики НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, кандидат медицинских наук.

Клесова Елена Юрьевна - инженер-биотехнолог НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ.

Конопля Александр Иванович -заведующий кафедрой биологической химии КГМУ, доктор медицинских наук, профессор.

Азарова Ю.Э., Клесова Е.Ю., Конопля А.И. Роль полиморфизмов генов глутаматцистеинлигазы в развитии сахарного

диабета 2 типа у жителей Курской области // Научный результат. Медицина и фармация. - Т.4, №1,2018.

Azarova Yuliya Eduardovna - Associate Professor, Department of Biological Chemistry, Kursk State Medical University; Head of the Laboratory of Biochemical Genetics and Metabolomics, Research Institute for Genetic and Molecular Epidemiology, Kursk State Medical University, PhD in Medicine.

Klyosova Elena Yurevna - Engineer-biotechnologist, Research Institute for Genetic and Molecular Epidemiology, Kursk State Medical University.

Konoplya Alexander Ivanovich -Head of the Department of Biological Chemistry, Kursk State Medical University, Holder of Ha-bilitation Degree in Medicine, Professor.