СПОСОБ ФОТОХИМИОТЕРАПИИ ВИТИЛИГО
METHOD OF PHOTOCHEMOTHERAPY OF VITILIGO

Изобретение относится к медицине и направлено на лечение витилиго методом фотохимиотерапии с использованием фотосенсибилизирующего средства.
Витилиго – хроническое заболевание, клиническим проявлением которого является формирование на коже и ее производных, а также слизистых оболочках депигментированных пятен различной формы и размера, возникающих вследствие разрушения и снижения количества меланоцитов.
Фотохимиотерапия витилиго основывается на использовании в качестве фотосенсибилизаторов соединений фурокумаринового ряда (псораленов) в комбинации с длинноволновым ультрафиолетовым излучением (PUVA-терапия). Примерами применяемых в клинической практике фотосенсибилизаторов являются фурокумарины растительного происхождения (препарат «Аммифурин», Россия), а также синтетические препараты («Оксорален», Австрия; «Пувален», Финляндия; «Ламадин», Франция).
Известен фотосенсибилизатор, представляющий собой композицию, содержащую в качестве активного вещества псоралены, и образующую пленку на коже при нанесении (патент № CN1327836C, МПК A61P17/00, A61K35/78). Наличие пленкообразующего вещества в предлагаемой композиции способствует повышению эффективности чрескожного проникновения активного вещества и увеличению длительности его нахождения в зоне нанесения.
Недостатком указанной композиции является малая эффективность трансдермального переноса активного вещества, которая составляет 0.5-6 %. Кроме того, в данном изобретении отсутствует раскрытие специфики, сроков и пояснений к пролонгации терапевтического действия.
Традиционная схема фотохимиотерапии витилиго при лечении распространенных форм витилиго предполагает пероральное применение фотосенсибилизатора с последующим УФА облучением [Федеральные клинические рекомендации по ведению больных витилиго// Российское общество дерматовенерологов и косметологов. Москва, 2015]. УФА облучение начинают с ½ минимальной эритемной дозы (МЭД), постепенно увеличивают до 5-6 МЭД. Процедуры проводят в виде повторных курсов, состоящих из 15-25 процедур (2-3 раза в неделю) с интервалом 1-3 месяца или одного продолжительного курса, включающего 100 процедур и более. Каждая процедура требует приема в среднем 40 мг активного вещества, что соответствует приему 100-150 таблеток препаратов из ряда псораленов за один курс. Такая схема лечения является дорогостоящей, учитывая как цену самого препарата, так и необходимость проведения сеансов ультрафиолетового облучения и содержания больного в стационаре. Кроме того, следует учитывать, что лечение этим методом сопровождается наибольшим количеством побочных эффектов, а также может приводить к выраженной гиперпигментации и формированию резкого контраста между пораженной, репигментированной и видимо здоровой кожей.
При лечении больных с ограниченными формами заболевания применяют терапию в виде наружного использования растворов фотосенсибилизатора с последующим облучением УФА [Опыт применения фотосенсибилизирующего препарата Аммифурин. Информация для специалистов// ЗАО «Фармцентр ВИЛАР». Москва, 2012. с. 12]. Такая терапия обладает меньшим количеством побочных эффектов, по сравнению с их системным применением, поскольку обеспечивает снижение системного побочного действия на организм и нагрузку на ЖКТ. Однако такой метод является менее эффективным и при этом не менее дорогостоящим и ресурсозатратным: он предполагает проведение терапии в виде 4-6 повторных курсов, состоящих из 20-25 процедур (3-4 раза в неделю) с интервалом 1-1,5 месяца, и требует стационарного пребывания пациента в лечебном учреждении.
Меньшая терапевтическая эффективность фотохимиотерапии витилиго с использованием наружных форм фотосенсибилизаторов, по сравнению с пероральными, обусловлена избирательной проницаемостью кожного покрова. Роговой слой кожи выполняет роль барьера для проникновения поверхностно нанесенных веществ. Таким образом, при аппликации на поверхность кожи активного вещества малый процент его преодолевает кожный барьер и оказывает терапевтическое воздействие, в то время как большая часть препарата остается на поверхности кожного покрова. Следовательно, классическая схема терапии является нерациональной и требует усовершенствования. Обеспечение аккумуляции лекарственной композиции в зоне патологии способно повысить ее терапевтическую эффективность.
С целью снижения токсических эффектов фотохимиотерапии, были разработаны различные подходы к ее воплощению. Предлагалось применение таких добавок, как производные бензилиден-камфоры, которые способны поглощать часть падающего УФ-излучения и защищать тем самым кожный покров от негативных эффектов, связанных с применением псораленов в сочетании с УФА-излучением (патент № US4994263A, МПК A61K31/365). Была показана перспективность использования фотосенсибилизаторов на основе фурокумаринов ангелицинового ряда (соединения метилангелицина), обладающих меньшей токсичностью по сравнению с фурокумаринами псораленового ряда (патент № US5001147A, МПК A61K31/35). Кроме того, предлагалось использование коротковолнового ультрафиолета (УФБ излучение 311 нм) вместо длинноволнового (патент № US6979327B2, МПК A61N5/06).
В качестве прототипа выбрана указанная выше стандартная методика фотохимиотерапии витилиго, включающая аппликацию на поверхность кожи фотосенсибилизирующего средства, содержащего в качестве активного вещества псоралены, с последующим длинноволновым ультрафиолетом облучением, начиная с ½ минимальной эритемной дозы (МЭД), постепенно увеличивая до 5-6 МЭД [Опыт применения фотосенсибилизирующего препарата Аммифурин. Информация для специалистов// ЗАО «Фармцентр ВИЛАР». Москва, 2012. с. 12].
Технической проблемой заявляемого изобретения является разработка способа амбулаторной фотохимиотерапии витилиго, отличающегося адресностью и терапевтической точностью.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в формировании очагов репигментации методом фотохимиотерапии при оптимизации схемы терапии, достигаемой сокращением длительности ультрафиолетового облучения, количества процедур, усовершенствованием технологии внедрения лекарственного препарата, уменьшением продолжительности курсового лечения, возможность перевода данной категории пациентов со стационарного режима терапии на амбулаторный за счет повышения эффективности трансдермального переноса и аккумуляции активного вещества в коже и ее придатках (в частности, в волосяных фолликулах).
2
2
2
Указанный технический результат достигается тем, что в способе фотохимиотерапии витилиго, включающем аппликацию на поверхность кожи фотосенсибилизирующего средства, содержащего в качестве активного вещества псоралены, с последующим длинноволновым ультрафиолетом облучением, согласно решению, в качестве фотосенсибилизирующего средства выбирают средство на основе субмикронных пористых частиц карбоната кальция размером менее 1.5 мкм, содержащих 2-20% активного вещества Амми большой плодов фурокумарины (Ammi majus fructuum furocumarines) в виде спиртовой суспензии в дозе 15-20 мг частиц/см, что в пересчете на активное вещество соответствует 0.3-4 мг/см, с последующим воздействием при помощи терапевтического низкоинтенсивного ультразвука интенсивностью не более 1 Вт/см в течение 1-4 минут, при этом облучение длинноволновым ультрафиолетом (УФА, λ=320-400 нм) осуществляют в течение времени, соответствующего 1/4-1/3 минимальной эритемной дозы (МЭД) УФА, не превышая 1/2 МЭД УФА, фотохимиотерапию проводят в виде повторных курсов, состоящих из 10 процедур частотой 1 раз в неделю, с интервалом 50 дней, при этом дополнительно проводят сеанс облучения ультрафиолетом без фотосенсибилизирующего средства 1 раз в неделю.
Постепенная деградация контейнеров в течение 12 дней, вплоть до их полной резорбции, внутри волосяных фолликулов обеспечивает пролонгированное высвобождение активного вещества, осуществляя его адресную доставку вглубь фолликула и прилегающие области. Согласно схеме терапии, общее количество процедур в год составляет 60 сеансов.  Процедуры проводят в виде повторных курсов, состоящих из 10 процедур частотой 2 раза в неделю, включающих в себя 2 сеанса облучения ультрафиолетом, один из которых сопровождается аппликацией лекарственной композиции, с интервалом 50 дней. Количество курсов в год достигает 6.
Изобретение поясняется чертежами, описание которых приведено ниже.
Фиг. 1. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а, в) и через 48 часов после (б, г) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 0.5 минут (1/20 МЭД): изображения (а, б) и (в, г) соответствуют двум разным респондентам.
Фиг. 2. Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а, в) и через 48 часов после (б, г) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 0.5 минут (1/20 МЭД): изображения (а, б) и (в, г) соответствуют двум разным респондентам.
Фиг.  3. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а, в) и через 48 часов после (б, г) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 5 минут (1/2 МЭД): изображения (а, б) и (в, г) соответствуют двум разным респондентам.
Фиг. 4. Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а, в) и через 48 часов после (б, г) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 5 минут (1/2 МЭД): изображения (а, б) и (в, г) соответствуют двум разным респондентам.
Фиг. 5. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и через 48 часов после (б) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 3 минут (1/3 МЭД).
Фиг. 6. Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и через 48 часов после (б) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 3 минут (1/3 МЭД).
Фиг. 7. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 15 дней после облучения
Фиг. 8.Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г, д) нанесения свободного раствора AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 15 дней после облучения, д – через 75 дней после облучения.
Фиг. 9. Изображения ненагруженных частиц карбоната кальция, полученные методом сканирующей электронной микроскопии при различных увеличениях.
Фиг. 10. Изображения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, полученные методом сканирующей электронной (а) и флуоресцентной конфокальной микроскопии (б)
Фиг. 11. А-сканы контрольного участка кожи (а) и участка с внедрением частиц карбоната кальция, нагруженных AMFF (б), полученные in vivo с помощью оптической когерентной томографии. Длина масштабного отрезка соответствует 500 мкм, прямоугольниками выделены пустые (а) и обильно заполненные частицами (б) волосяные фолликулы.
Фиг. 12. Флуоресцентные изображения волоса, изъятого из фолликула, до (а–в) и после внедрения нагруженных AMFF частиц (г–е), полученные методом сканирующей лазерной конфокальной микроскопии: а, г - светлопольные изображения; б, д - флуоресцентные изображения; в, е - наложение светлопольного и флуоресцентного каналов.
Фиг. 13. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г) нанесения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 72 часа после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 15 дней после облучения.
Фиг. 14. Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г, д) нанесения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 15 дней после облучения, д – через 75 дней после облучения.
Фиг. 15. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г) нанесения ненагруженных частиц карбоната кальция, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 15 дней после облучения.
Фиг. 16. Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г) нанесения ненагруженных частиц карбоната кальция, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 75 дней после облучения.
2
Фиг. 17. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г) ультразвукового воздействия длительность 2 минут интенсивностью 0.5 Вт/см, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 15 дней после облучения.
2
Фиг. 18. Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после (б, в, г) ультразвукового воздействия длительность 2 минут интенсивностью 0.5 Вт/см, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 75 дней после облучения.
Фиг. 19. Микрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после облучения длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 15 дней после облучения.
Фиг. 20. Макрофотографии зон предплечья здорового добровольца до (а) и после облучения длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД): б – через 48 часов после облучения, в – через 7 дней после облучения, г – через 75 дней после облучения.
Фиг. 21. Кинетика индекса меланина: А – зона с внедрением ненагруженных частиц карбоната кальция; график Б – зона с внедрением частиц карбоната кальция, нагруженных фотосенсибилизатором; график В – зона с аппликацией раствора фотосенсибилизатора. 1 – до нанесения исследуемой композиции и УФА-облучения; 2 – через 15 минут после УФА-облучения; 3 – через 24 часа; 4 – через 48 часов; 5 – через 96 часов; 6 – через 120 часов; 7 – через 168 часов (7 дней); 8 – через 192 часа; 9 – через 360 часов (15 дней) после УФА-облучения.
Фиг. 22. Микрофотографии зоны в области очага витилиго у добровольца до и после нанесения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД).
Фиг. 23. Макрофотографии зоны в области очага витилиго у добровольца до и после нанесения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД).
Фиг. 24. Макрофотографии, сделанные в лучах лампы Вуда, зоны в области очага витилиго у добровольца до и после нанесения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД).
Фиг. 25. Микрофотографии контрольной зоны в области очага витилиго у добровольца (без нанесения частиц и воздействия длинноволновым ультрафиолетом).
Фиг. 26. Макрофотографии контрольной зоны в области очага витилиго у добровольца (без нанесения частиц и воздействия длинноволновым ультрафиолетом).
Фиг. 27. Макрофотографии контрольной зоны в области очага витилиго у добровольца (без нанесения частиц и воздействия длинноволновым ультрафиолетом), сделанные в лучах лампы Вуда.
Фиг. 28. Микрофотографии зоны в области за пределами очага витилиго у добровольца (здоровая область) до и после нанесения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД).
Фиг. 29. Макрофотографии зоны в области за пределами очага витилиго у добровольца (здоровая область) до и после нанесения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор AMFF, сопровождаемого облучением длинноволновым ультрафиолетом в течение 2.5 минут (1/4 МЭД).
Фиг. 30. Микрофотографии контрольной зоны в области за пределами очага витилиго у добровольца (без нанесения частиц и воздействия длинноволновым ультрафиолетом).
Фиг. 31. Микрофотографии контрольной зоны в области за пределами очага витилиго у добровольца (без нанесения частиц и воздействия длинноволновым ультрафиолетом).
Позициями на фигурах обозначены:
1 – незаполненные волосяные фолликулы;
2 – заполнение волосяных фолликулов частицами карбоната кальция;
3 – россыпь частиц карбоната кальция.
Раскрытие изобретения.
Предлагаемый способ фотохимиотерапии витилиго предполагает применение иммобилизованной в микроконтейнеры формы фотосенсибилизатора фурокумаринового ряда (псоралена) в комбинации с длинноволновым ультрафиолетовым излучением.
2
2
3
Контейнеры представляют собой микроразмерные или субмикронные пористые частицы карбоната кальция в кристаллографической модификации ватерита. Предлагаемая матрица является биосовместимой, биоразлагаемой и обладает рядом таких достоинств, как мягкие условия разрушения (растворение при рН<6.5), простота приготовления и низкая себестоимость. Синтез частиц осуществляется путем кристаллизации из раствора при непосредственном сливании стерильных эквиобъемных эквимолярных растворов солей хлорида кальция (CaCl) и карбоната натрия (NaCO) с последующей промывкой образовавшегося осадка 95% этиловым спиртом и сушкой в асептических условиях при температуре 25-60 °С.
Высокопористая архитектура ватеритных контейнеров обеспечивает иммобилизацию до 20 вес.% фотосенсибилизатора псораленового ряда (под вес.% подразумевается отношение массы иммобилизованного активного вещества к массе частиц).
2
2
2
Предлагаемый способ фотохимиотерапии включает использование запатентованного ранее способа трансдермальной доставки биологически активных веществ (патент № RU2633928 МПК A61K9/16) с целью повышения эффективности трансдермального переноса и аккумуляции фотосенсибилизатора в коже и в волосяных фолликулах. Лекарственная форма представляет собой порошок для приготовления суспензий для наружного применения. Предполагается диспергирование порционной навески сухих частиц в медицинском антисептическом растворе до концентрации диапазона 0.1-1.0 мг/мл непосредственно перед применением. Трансфолликулярная доставка контейнеров осуществляется путем аппликации суспензии частиц на поверхность кожи в области патологии до достижения дозы 15-20 мг частиц/см, что в пересчете на активное вещество соответствует 0.3-4 мг/см, и последующего их внедрения при помощи терапевтического ультразвука (0.89-1 МГц) интенсивностью не более 1 Вт/см в течение 1-4 минут. Такой подход обеспечивает увеличение эффективности и глубины заполнения волосяных фолликулов ватеритными контейнерами, а значит позволяет повысить эффективность трансдермального переноса и аккумуляции в коже и волосяных фолликулах фотосенсибилизатора, содержащегося в них.
Известно, что при витилиго, последними участки депигментации покидают меланоциты, локализующиеся в волосяных фолликулах [Pathak M.A., Riley F.C., Fitspatrik T.B.// Journal of Invest. Dermatol. 1962. 435–443]. Именно эти меланоциты являются привлекательной мишенью для воздействия лекарственных препаратов и ультрафиолетовых лучей. Таким образом, при адресном введении осуществляется доставка фотосенсибилизатора в участки максимальной концентрации меланоцитов. Активированные меланоциты способны мигрировать с внешнего корневого влагалища волосяного фолликула в базальный клеточный слой репигментировать ахромические участки.
Таким образом, предлагаемая в заявляемом способе форма фотосенсибилизатора, иммобилизованного в матрицу частиц карбоната кальция, отличается от обычной наружной формы препаратов, во-первых, адресностью действия, поскольку обеспечивает доставку лекарственной композиции в зоне сосредоточения стволовых клеток меланоцитов (пространство волосяных фолликулов), что приводит к увеличению локальной концентрации действующего вещества в зоне патологии и позволяет повысить эффективность терапии. Использование подхода трансдермальной доставки фотосенсибилизаторов позволит снизить токсические эффекты и нагрузку на ЖКТ, благодаря отсутствию эффекта первого прохождения [Kajimoto K. et al. International Journal of Pharmaceutics, 2011, 403, p. 57-65].
Кроме того, такой препарат обладает пролонгированным действием, поскольку высвобождение иммобилизованного фотосенсибилизатора в пространстве сально-волосяного фолликула происходит в процессе деградации внедренных частиц (в течение 8-12 дней). Применение такого подхода к фототерапии витилиго позволяет сократить число терапевтических процедур, а также обеспечить перевод пациентов с хроническими дерматозами со стационарного режима терапии на амбулаторный.
После процедуры внедрения частиц с фотосенсибилизатором осуществляется смывка их избытка с поверхности кожи при помощи ватного тампона.
Для каждого респондента предварительно определяется минимальная эритемная (МЭД) - условная единица, применяемая в фототерапии для обозначения количества энергии ультрафиолетовых лучей, которое вызывает пороговую, т. е. минимальную, но ясно очерченную, эритемную реакцию кожи.
Согласно предлагаемой схеме фототерапии витилиго, проводится облучение длинноволновым ультрафиолетом (УФА, λ=320-400 нм) зоны внедрения частиц в течение 2-3 минут, что соответствует 1/4 - 1/3 минимальной эритемной дозы (МЭД) УФА, не превышая 1/2 МЭД.
Фотосенсибилизатор, применяемый в сочетании с УФА облучением, повышает чувствительность кожи к ультрафиолетовым лучам и индуцирует, тем самым, образование меланина в меланоцитах эпидермиса и волосяных фолликулов, что способствует восстановлению утраченной пигментации при витилиго: меланин синтезируется из α-амино-β-(п-гидроксифенил) пропионовой кислоты (тирозина) в меланоцитах в результате цепочки окислительных превращений, а затем поступает в клетки эпидермиса – кераноциты, накапливается и распространяется, восстанавливая утраченную пигментацию участка кожи. Механизм клинического действия связывают с фотоприсоединением псораленов к молекулам ДНК слоя эпидермиса (цитотоксический эффект) и образованием реакционноспособных фотоокисленных молекул, способных ковалентно присоединяться к белкам, окислять ненасыщенные жирные кислоты [Ягодвик Н. З., Белугина И. Н. Принципы терапии псориаза //Международный медицинский журнал. – 2004]. Это приводит к торможению клеточной пролиферации, подавлению патологической кератинизации, оказывает влияние на метаболизм простагландинов, проницаемость клеточных мембран. Накопление окисленных продуктов, повышение окислительного потенциала кожи и ингибирование пролиферативных процессов оказывают терапевтический эффект.
Схема терапии предусматривает общеклиническое исследование перед началом терапии (сбор анамнеза, осмотр, проведение лабораторных исследований: общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи). Кроме того, каждому респонденту на протяжении всего периода исследования проводится мониторинг лабораторных общеклинических показателей (общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи) каждые 10 дней.
Согласно предлагаемой схеме терапии общее количество процедур в год составляет 60 сеансов.  Процедуры проводят в виде повторных курсов, состоящих из 10 процедур (2 раза в неделю, включающих в себя 2 сеанса облучения ультрафиолетом, один из которых сопровождается аппликацией лекарственной композиции) с интервалом 50 дней. Количество курсов в год достигает 6.
Примеры реализации способа
Здоровые добровольцы.
Пример 1. УФА-облучение с применением раствора фотосенсибилизатора
Исследование проводится in vivo на внешней поверхности предплечья здорового добровольца: возрастной диапазон – 25 - 30 лет; 1-3 фототип кожи (по Фитцпатрику). Перед проведением исследования респонденты подписали информированное согласие на выполнение манипуляций. Проводился мониторинг состояния волосяных фолликулов и уровня меланина в исследуемой области с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия). Создание макро- и микроизображений производилось компетентным практикующим врачом, чтобы избежать диверсификации во время процедуры. Анализ данных был выполнен двумя независимыми специалистами.
Для каждого больного предварительно определяется минимальная эритемная доза (МЭД) ультрафиолетового облучения - условная единица, применяемая в фототерапии для обозначения количества энергии ультрафиолетовых лучей, которое вызывает пороговую (т. е. минимальную, но ясно очерченную) эритемную реакцию кожи.
2
В качестве фотосенсибилизатора псораленового ряда применяется препарат «Аммифурин» (Россия) - Амми большой плодов фурокумарины (Ammi majus fructuum furocumarines, AMFF). Осуществляется нанесение раствора AMF на поверхность кожи здоровых добровольцев с последующим воздействием при помощи низкоинтенсивного терапевтического ультразвука УЗТ-1.01Ф («МедТеКо», Россия) частотой 0.88 МГц и интенсивностью 0.4 Вт/см в течение 2 минут на область аппликации.
После внедрения раствора фотосенсибилизатора осуществляется смывка его избытка с поверхности кожи. При визуальном осмотре в зоне нанесения фотосенсибилизатора до облучения не наблюдалось дополнительных очагов пигментации, отсутствовал сосудистый компонент (Фиг.1а, 1в, 2а, 2в, 3а, 3в, 4а, 4в, 5а, 6а, 7а, 8а).
Далее осуществляется сеанс УФА-облучения с помощью люминесцентной лампы мощностью 9 Вт (METEC-SUNNY 2000, Германия). С целью подбора оптимального режима облучения, время экспозиции варьировалось в пределах от 0.5 мин (1/20 МЭД) до 5 минут (1/2 МЭД). Результаты представлены в виде макрофотографий очага внедрения до (Фиг. 2a, 2в, 4а, 4в, 6а, 8а) и после облучения (Фиг. 2б, 2г, 4б, 4г, 6б, 8б), а также микрофотографий дерматоскопической картины с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия) до (Фиг. 1а, 1в, 3а, 3в, 5а, 7а) и через 48 часов после облучения (Фиг. 1б, 1г, 3б, 3г, 5б, 7б).
При экспозиции ультрафиолетового излучения в течение 0.5 мин двум респондентам с 1 и 2 фототипом кожи (что соответствовало 1/20 МЭД данных респондентов) при клиническом осмотре не наблюдалось появления очагов пигментации в зоне нанесения раствора (Фиг. 2б, 2г). При проведении дерматоскопического исследования клинически значимых изменений не выявлено (Фиг. 1б, 1г). Данный режим облучения признан неэффективным для проведения терапии.
При облучении области нанесения фотосенсибилизатора двум респондентам со 2 и 3 фототипом кожи в течение 5 мин (что соответствовало ½ МЭД данных респондентов) при клиническом осмотре через 48 часов после проведения сеанса терапии наблюдалось появление очагов эритемы ярко-розового цвета (Фиг. 4б, 4г). При проведении дерматоскопии отмечалось появление ярко выраженного сосудистого компонента, чешуек белесоватого цвета (Фиг. 3б, 3г). Субъективно респондентов беспокоили чувство жжения и незначительный зуд. Данный режим облучения признан избыточным и принят за крайнюю границу УФА облучения, превышение которой считается неприемлемым при проведении терапии.
При проведении сеанса фототерапии с 3-минутной экспозицией ультрафиолетового излучения респонденту со 2 фототипом кожи (что соответствовало 1/3 МЭД данного респондента) при визуальном осмотре наблюдалось появление очагов эритемы светло-розового цвета (Фиг. 6б). Дерматоскопическое исследование выявило наличие выраженного сосудистого компонента, очагов пигментации светло-коричневого цвета, а также чешуек белесоватого цвета через 48 часов после облучения (Фиг. 5б). Однако, при проведении терапии респондента беспокоило незначительно выраженное чувство жжения в месте внедрения. Режим признан менее эффективным, ввиду присутствия субъективных ощущений, но приемлемым для проведения терапии.
При экспозиции ультрафиолетового излучения в течение 2.5 мин респонденту с 1 фототипом кожи (что соответствовало 1/4 МЭД данного респондента) при клиническом осмотре через 48 часов наблюдалось появление очагов пигментации в зоне нанесения раствора от коричневого до красно-коричневого цвета (Фиг. 8б). При проведении дерматоскопического исследования отмечалось диффузное распределения пигмента с выраженным сосудистым компонентом и большим количеством чешуек белесоватого цвета (Фиг. 7б). Данный режим облучения был принят за оптимальный и внесен в схему проведения фотохимиотерапии.
Дальнейший мониторинг области облучения ультрафиолетом показал постепенное прогрессирование изменений клинической картины с заметным усилением интенсивности пигментации: область постепенно приобретала красно-коричневую окраску (Фиг. 7в, 8в) и в результате был сформирован очаг гиперпигментации ярко-коричневого цвета овальной формы с четкими границами (Фиг. 7г, 8г). Через 75 дней зона нанесения имела выраженный коричневый оттенок, было отмечено разрастание и выравнивание пигментации по всей области внедрения фотосенсибилизатора (Фиг. 8д).
На протяжении всего периода проведения исследования побочных эффектов со стороны органов и систем у респондентов не наблюдалось. В общеклинических анализах (общем анализе крови, биохимическом анализе крови, общем анализе мочи) патологии выявлено не было.
Таким образом, было установлено, что нанесение раствора фотосенсибилизатора с последующим УФА-облучением зоны нанесения в течение 2.5 минут (1/4 МЭД) приводит к появлению очагов пигментации с относительно равномерным характером распределения по всей зоне внедрения.
Пример 2. УФА-облучение с применением фотосенсибилизатора, иммобилизованного в частицы карбоната кальция
о
Синтез ватеритных контейнеров производится по методике [Parakhonskiy B.V. et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (2012) 1195–1197], согласно которой 1-М растворы дигидрата хлорида кальция и карбоната натрия одинаковых объемов смешиваются с этиленгликолем, а затем между собой, содержание ЭГ в смеси составляет 83% от ее общего объема. Перемешивание реакционной смеси осуществляется с помощью магнитной мешалки со скоростью 600 оборотов в минуту в течение 3 часов при комнатной температуре. Далее проводится троекратная промывка осадка частиц карбоната кальция трижды 95% этиловым спиртом и сушка при температуре 60С в течение 30 минут. В качестве фотосенсибилизатора псораленового ряда применяется препарат «Аммифурин» (Россия) - Амми большой плодов фурокумарины (Ammi majus fructuum furocumarines, AMFF). Иммобилизация фотосенсибилизатора осуществляется методом его адсорбции из раствора, для чего навеска сухих частиц карбоната кальция выдерживается в растворе иммобилизуемого вещества в течение 30 минут при непрерывном встряхивании с помощью шейкера. Затем осадок частиц однократно промывается 95% раствором этилового спирта и высушивается в асептических условиях при температуре 25 °С.
2
Далее проводится интрафолликулярное внедрение полученных носителей фотосенсибилизатора путем аппликации суспензии частиц карбоната кальция на поверхность кожи здоровых добровольцев с последующей обработкой зоны нанесения низкоинтенсивным терапевтическим ультразвуком УЗТ-1.01Ф («МедТеКо», Россия) частотой 0.88 МГц и интенсивностью 0.4 Вт/см в течение 2 минут с целью увеличения трансдермального переноса суспензии. После нанесения полученной суспензии на поверхность кожи внешней поверхности предплечья здорового добровольца избыток частиц смывается с поверхности кожи ватным тампоном, смоченным в воде.
Исследование проводится in vivo на внешней поверхности предплечья здорового добровольца: возрастной диапазон – 25 - 26 лет; 1-2 фототип кожи (по Фитцпатрику). Проводился мониторинг состояния волосяных фолликулов и уровня меланина в исследуемой области до проведения эксперимента с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия); эритемомеланинометра «ЭММ-002Е» (Россия). Создание макро- и микроизображений производилось компетентным практикующим врачом, чтобы избежать диверсификации во время процедуры. Анализ данных был выполнен двумя независимыми специалистами.
Исследование морфологии полученных структур было произведено при помощи сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на приборе MIRA II LMU (Tescan) со сканирующим электронным микроскопом XL 30 ESEM FEG (Philips). СЭМ-изображения частиц карбоната кальция до загрузки фотосенсибилизатором AMFF приведены на Фиг. 9, средний размер полученных контейнеров составил 0.7±0.2 мкм. Частицы обладают пористой структурой (Фиг. 9б), что определяет высокую эффективность включения лекарственных форм в их объем, а также обуславливает развитость поверхности, увеличивая ее адсорбционную емкость. СЭМ-изображение нагруженных препаратом AMFF частиц приведено на Фиг. 10а.
3
Оптическое исследование процесса иммобилизации AMFF в CaCO-контейнеры проведено методом флуоресцентной микроскопии на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Великобритания) и данные представлены на Фиг. 10б. По сравнению с ненагруженными матрицами, данные частицы имели более гладкую поверхность (Фиг. 10а), а также обладали выраженной флуоресценцией при возбуждении лазером с λ=405 нм (Фиг. 10б), что свидетельствует об успешности включения в них фотосенсибилизатора. Количественное определение эффективности загрузки препарата осуществлялось путем исследования спектров флуоресценции исходного раствора и собранных в процессе загрузки частиц надосадочных жидкостей с помощью многофункционального гибридного фотометра для микропланшетов Synergy H1 (BioTek, США). Препарат обладает выраженной флуоресценцией с максимумом на λ=460 нм при возбуждении светом с длиной волны λ=405 нм. Спектрофлуориметрическое исследование показало, что эффективность загрузки AMFF в контейнеры, представляющая собой отношение массы загруженного действующего вещества к массе частиц, выраженное в процентах, составила 2%.
Визуализация и изучение состояния волосяных фолликулов in vivo были проведены методом оптической когерентной томографии (ОКТ) с помощью установки для спектральной ОКТ OCP930SR (Thorlabs, США) со следующими параметрами: центральная длина волны излучения 930±5 нм, ширина полосы излучения 100±5 нм, длина области сканирования 6 мм, аксиальное и латеральное разрешение на воздухе 6.2 мкм и 9.6 мкм, соответственно. Результаты визуализации участка кожи до и после нанесения суспензии частиц представлены Фиг. 11а и 11б, соответственно.
Незаполненные волосяные фолликулы контрольного участка (темные каналы, выделенные прямоугольниками, на Фиг. 11а четко различимы на продольных виртуальных ОКТ-сканах кожи. Изображение после внедрения контейнеров демонстрирует обильное заполнение фолликулов на всю визуализируемую глубину (заполненные фолликулы выделены прямоугольниками на Фиг. 11б.
Для оценки эффективности интрафолликулярного внедрения AMFF с помощью ватеритных контейнеров, осуществлялась также экстракция не менее 10 волос из области внедрения с последующим исследованием флуоресцентного сигнала от них методом конфокальной флуоресцентной микроскопии (Leica TCS SP8, Leica Microsystems, Великобритания) при возбуждении лазером с длиной волны λ=405 нм. Флуоресцентные изображения волос, изъятых из фолликулов до и после внедрения контейнеров, приведены на Фиг. 12а-в и Фиг. 12г-е, соответственно.
3
Наличие яркого флуоресцентного сигнала, регистрируемого от россыпи частиц после разрушения волосяного «мешочка», (Фиг. 12д-е) указывает на успешность переноса фотосенсибилизатора по волосяным фолликулам при помощи CaCO частиц. Отсутствие выраженной флуоресценции при заданных параметрах съемки до внедрения частиц (Фиг. 12б-в) подтвердило, что указанный сигнал относится к внедренным в фолликул контейнерам.
После внедрения частиц карбоната кальция, содержащих фотосенсибилизатор, в волосяные фолликулы внешней поверхности предплечья здорового добровольца осуществляется смывка его избытка с поверхности. При визуальном осмотре в зоне нанесения фотосенсибилизатора до облучения не наблюдалось дополнительных очагов пигментации, отсутствовал сосудистый компонент (Фиг. 13а, 14а).
Согласно схеме лечения, далее проводится сеанс УФА-облучения участков внедрения суспензии с помощью люминесцентной лампы (METEC-SUNNY 2000, Германия) в течение 2.5 минут (1/4 МЭД данного респондента) и изучается характер пигментации кожи. Данные дерматоскопического исследования области приведены на Фиг. 17. Фотофиксация исследуемых участков проводилась через 48 часов, 7 и 75 дней, результаты представлены на Фиг. 14б, 14в, 14г, соответственно.
В течении всего исследования в области аппликации при визуальном осмотре наблюдалось постепенное появление пигмента от светло-коричневого до красно-коричневого цвета в зоне нанесения суспензии частиц кальция карбоната нагруженных фотосенсибилизатором с диффузным, равномерным его распределением по всей зоне внедрения (Фиг. 14б, 14в, 14г). Через 75 дней зона нанесения имела выраженный коричневый оттенок, было отмечено разрастание и выравнивание пигментации по всей области внедрения фотосенсибилизатора (Фиг. 14д). При проведении дерматоскопии наблюдалось скопление пигмента ярко-коричневого цвета с тенденцией к перифолликулярной локализации; наличие сосудистого компонента и чешуек белесоватого цвета (Фиг. 13б, 13в, 13г).
На протяжении всего периода проведения исследования побочных эффектов со стороны органов и систем у респондентов не наблюдалось. В общеклинических анализах (общем анализе крови, биохимическом анализе крови, общем анализе мочи) патологии выявлено не было.
Таким образом, при нанесении суспензии частиц карбоната кальция нагруженных фотосенсибилизатором отмечается появление диффузных очагов пигментации с преимущественной концентрацией пигмента вокруг волосяных фолликулов, что свидетельствует об успешной доставке фотосенсибилизатора в пространство волосяных фолликулов.  В целом пигментация исследуемой области носила более равномерный характер и выраженный характер, чем при применении раствора фотосенсибилизатора (сравнение Фиг. 8д и Фиг. 14д).
Пример 3. УФА-облучение с применением ненагруженных частиц карбоната кальция (контроль 1)
Исследование проводится in vivo на внешней поверхности предплечья здорового добровольца (возрастной диапазон – 25 - 26 лет; 1-2 фототип кожи по Фитцпатрику) по схеме, описанной в примере 2, с тем отличием, что вместо нагруженных фотосенсибилизатором частиц применяются ненагруженные частицы карбоната кальция. Параметры ультразвукового воздействия и облучения выбраны те же, что и в примере 2.
Данные дерматоскопического исследования области приведены на Фиг. 15. Фотофиксация исследуемых участков проводилась до, а также через 48 часов, 7 и 75 дней после облучения УФА, результаты представлены на Фиг. 16.
При визуальном осмотре и при проведении дерматоскопического исследования клинически значимых изменений не выявлено на протяжении всего периода исследования.
Таким образом, аппликация ненагруженных частиц карбоната кальция с последующим воздействием терапевтическим ультразвуком и сеансом ультрафиолетового облучения не дает выраженного клинического эффекта. Частицы карбоната кальция сами по себе не вносят вклада в формирование пигментации.
Пример 4. УФА-облучение с применением ультразвука (контроль 2)
Исследование проводится in vivo на внешней поверхности предплечья здорового добровольца: возрастной диапазон – 25 - 26 лет; 1-2 фототип кожи (по Фитцпатрику) по схеме, описанной в примере 2, с тем отличием, что исследуемая область остается свободной от внедрения как частиц карбоната кальция, так и фотосенсибилизатора. Параметры ультразвукового воздействия и облучения выбраны те же, что и в примере 2.
Данные дерматоскопического исследования области приведены на Фиг. 17. Фотофиксация исследуемых участков проводилась до, а также через 48 часов, 7 и 75 дней после облучения УФА, результаты представлены на Фиг. 18.
При визуальном осмотре и при проведении дерматоскопического исследования клинически значимых изменений не выявлено на протяжении всего периода исследования.
На протяжении всего периода исследования при клиническом осмотре не было выявлено клинически значимых изменений. При проведении дерматоскопического исследования клинически значимых изменений выявлено не было.
Таким образом, воздействие терапевтического ультразвука с комбинации не дает клинически значимых изменений и не вносит вклада в формирование пигментации.
Пример 5. Зона исследования, свободная от воздействий (контроль 3)
Исследование проводится in vivo на внешней поверхности предплечья здорового добровольца: возрастной диапазон – 25 - 26 лет; 1-2 фототип кожи (по Фитцпатрику). В данной зоне исследования не проводилось каких-либо воздействий (интактная кожа).
Проводился мониторинг состояния волосяных фолликулов и уровня меланина в исследуемой области до проведения эксперимента с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия); эритемомеланинометра «ЭММ-002Е» (Россия). Данные дерматоскопического исследования области приведены на Фиг. 19. Фотофиксация исследуемых участков проводилась до, а также через 48 часов, 7 и 75 дней после облучения УФА, результаты представлены на Фиг. 20.
На протяжении всего периода исследования в зоне, свободной от терапевтического воздействия, при визуальном осмотре и дерматоскопии клинически значимых изменений выявлено не было. Такая зона была выбрана в каждом из описанных в примерах 1-4 исследовании и использована в качестве референсной с целью выявления клинически значимых эффектов.
Вывод по примерам 1 – 5
Сопоставление результатов, полученных при проведении описанных исследований (примеры 1-5), позволяет сделать вывод об эффективности предлагаемого подхода для формирования очагов пигментации у здоровых добровольцев.
Результаты мониторинга уровня меланина в зонах исследования от времени после УФА-облучения, выполненного с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия) и эритемомеланинометра «ЭММ-002Е» (Россия), представлены на Фиг. 21, где график А – зона с внедрением ненагруженных частиц карбоната кальция; график Б – зона с внедрением частиц карбоната кальция, нагруженных фотосенсибилизатором; график В – зона с аппликацией раствора фотосенсибилизатора.
На Фиг. 21 отчетливо различимы две волны пигментации после УФА-облучения. Первая – так называемое, мгновенное пигментное потемнение, объясняется фотоокислением уже присутствующих в тканях предшественников меланина. Этот процесс начинается сразу же после воздействия УФА-излучения и длится до 72 часов. Далее, на первый план выходит пигментация, называемая замедленным пигментным потемнением и являющаяся следствием расширения пула меланоцитов и активацией продукции меланина – «вторая волна пигментации» [Fajuyigbe D. et al. Pigment Cell Melanoma 2016; 29 (6): 607–618; Pathak M.A. et al. Journal of Invest. Dermatol. 1962: 435 – 443]. Таким образом, при адресной доставке фотосенсибилизатора в объем волосяных фолликулов с помощью частиц карбоната кальция минимизируется фотосенсибилизатор-стимулированная мобилизация присутствующих в эпидермисе предшественников меланина, что обуславливает более умеренный характер пигментации этой зоны в течение первых 96 часов, по сравнению с зоной, где осуществлялась аппликация свободной формы препарата. Через 168 часов больший вклад в формирование очага пигментации вносит «вторая волна», вызванная активацией продукции меланина, и, в связи с этим, интенсифицируется пигментация зоны c внедрением нагруженных фотосенсибилизатором частиц.
Поскольку, при витилиго последними участки депигментации покидают меланоциты, локализующиеся в волосяных фолликулах, то именно они являются привлекательной мишенью для воздействия лекарственных препаратов и ультрафиолетовых лучей.  Таким образом, при адресном введении осуществляется доставка фотосенсибилизатора в участки максимальной концентрации меланоцитов. В связи с этим, предложенный способ адресной доставки AMFF позволяет оптимизировать методику фотохимиотерапевтического воздействия.
Таким образом установлено, что частицы карбоната кальция, выступающие в роли контейнера-носителя, способны осуществить адресную доставку фотосенсибилизатора AMFF в пространство волосяных фолликулов. Данный подход обеспечивает высокую избирательность и терапевтическую точность, что гарантирует увеличение эффективности фотохимиотерапии при его применении.
Пациенты с витилиго.
Пример 6. УФА-облучение зоны очага витилиго с применением фотосенсибилизатора, иммобилизованного в частицы карбоната кальция
Исследование проводится in vivo в области очага витилиго у пациента (возрастной диапазон – 25 - 26 лет; 1-2 фототип кожи по Фитцпатрику). Перед проведением исследования респонденты подписали информированное согласие на выполнение манипуляций.
2
Осуществляется аппликация частиц карбоната кальция, нагруженных фотосенсибилизатором AMFF, на поверхность исследуемой области очага витилиго с последующей обработкой зоны нанесения низкоинтенсивным терапевтическим ультразвуком УЗТ-1.01Ф («МедТеКо», Россия) частотой 0.88 МГц и интенсивностью 0.4 Вт/см в течение 2 минут с целью увеличения трансдермального переноса суспензии. После внедрения избыток частиц смывается с поверхности кожи ватным тампоном, смоченным в воде.
Далее осуществляется сеанс УФА-облучения с помощью люминесцентной лампы мощностью 9 Вт (METEC-SUNNY 2000, Германия) в течение 2.5 минут (1/4 МЭД).
Было проведено 10 процедур по описанной схеме частотой 2 раза в неделю, включающих в себя 2 сеанса облучения ультрафиолетом, один из которых сопровождается аппликацией лекарственной композиции. Осуществлялся мониторинг состояния кожного покрова и волосяных фолликулов в исследуемой области до проведения эксперимента с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия) и фотофиксация области. Таким образом, длительность терапии составляла 5 недель, мониторинг формирования пигментации продолжался в течение последующих 5 месяцев после прекращения терапии. Создание макро- и микроизображений производилось компетентным практикующим врачом, чтобы избежать диверсификации во время процедуры. Анализ данных был выполнен двумя независимыми специалистами. Микрофотографии дерматоскопической картины области исследования до и после облучения приведены на Фиг. 22, макрофотографии на Фиг. 23. С целью проведения дифференциального диагноза и динамического наблюдения фотофиксация очага так же проводилась в сопровождении лампы Вуда, результаты представлены на Фиг. 24.
На протяжении всего периода исследования при визуальном осмотре наблюдалось постепенное формирование очагов репигментации ярко-коричневого цвета, локализующиеся по периферии и в центре очага, постепенное сглаживание границ очага поражения, умеренное вовлечение сосудистого компонента. При проведении дерматоскопии наблюдались образование скоплений пигмента ярко-коричневого цвета с тендецией к перифолликулярной локализации и умеренно выраженный сосудистый компонент. Субъективных ощущений у пациента не отмечалось.
Кроме того, на протяжении всего периода проведения исследования побочных эффектов со стороны органов и систем у респондентов не наблюдалось. В общеклинических анализах (общем анализе крови, биохимическом анализе крови, общем анализе мочи) патологии выявлено не было.
Таким образом, внедрение частиц карбоната кальция, нагруженных фотосенсибилизатором AMFF, приводит к появлению очагов репигментации не только по периферии очага, но и точечно в центре, что свидетельствует как об успешной доставке частиц в волосяные фолликулы, так и о выраженном терапевтическом эффекте от их применения.
Пример 7.  Зона очага витилиго, свободная от воздействий (контроль 4)
Исследование проводится in vivo в области очага витилиго у пациента (возрастной диапазон – 25 - 26 лет; 1-2 фототип кожи по Фитцпатрику). Проводился мониторинг состояния волосяных фолликулов в исследуемой области до проведения эксперимента с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия) и фотофиксация области. Микрофотографий дерматоскопической картины области исследования до и после облучения приведены на Фиг. 25, макрофотографии на Фиг. 26, макрофотографии, выполненные с лампой Вуда, на Фиг. 27.
На протяжении всего периода исследования в зоне, свободной от терапевтического воздействия, при визуальном осмотре и дерматоскопии клинически значимых изменений выявлено не было. Такая зона была выбрана и использована в качестве референсной с целью выявления клинически значимых эффектов при проведении терапии.
Пример 8. УФА-облучение зоны исследования в пределах здоровой кожи с применением фотосенсибилизатора, иммобилизованного в частицы карбоната кальция
Исследование проводится in vivo в области за пределами очага витилиго у пациента (в пределах здоровой кожи) возрастного диапазона 25-26 лет с 1-2 фототипом кожи (по Фитцпатрику) по схеме, отписанной в примере 6. Проводился мониторинг состояния волосяных фолликулов в исследуемой области до проведения эксперимента с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия) и фотофиксация области. Микрофотографий дерматоскопической картины области исследования до и после облучения приведены на Фиг. 28, макрофотографии на Фиг. 29.
На протяжении всего периода исследования при визуальном осмотре и дерматоскопии наблюдалось появление очагов пигментации, обусловленное воздействием ультрафиолетового излучения. Пигментация носила диффузный характер.
Пример 9. Зона исследования в пределах здоровой кожи, свободная от воздействий (контроль 5)
Исследование проводится in vivo в области за пределами очага витилиго у пациента (в пределах здоровой кожи) возрастного диапазона 25-26 лет с 1-2 фототипом кожи (по Фитцпатрику) по схеме, отписанной в примере 6. Проводился мониторинг состояния волосяных фолликулов в исследуемой области до проведения эксперимента с использованием аппарата Soft Plus (Callegari, Италия) и фотофиксация области. Микрофотографий дерматоскопической картины области исследования до и после облучения приведены на Фиг. 30, макрофотографии на Фиг. 31.
В данной зоне исследования не проводилось каких-либо воздействий (контроль).
На протяжении всего периода исследования в зоне, свободной от терапевтического воздействия, при визуальном осмотре и дерматоскопии клинически значимых изменений выявлено не было. Такая зона была выбрана и использована в качестве референсной с целью выявления клинически значимых эффектов при проведении терапии.
Вывод по примерам 6 – 9
Сопоставление результатов, полученных при проведении исследований на больных с витилиго (примеры 6-9), позволяет сделать вывод об эффективности предлагаемого терапевтического подхода. Применение частиц карбоната кальция, нагруженных фотосенсибилизатором, в совокупности с УФА-излучением обеспечило появление репигментации с четкой тенденцией к перифолликулярной локализации. Притом, очаги репигментации располагались как по периферии, так и в центре очага - в местах локализации волосяных фолликулов, что свидетельствует о возможной активации меланоцитов, находящихся в пределах волосяного фолликула. Данные дерматоскопического исследования в данной зоне также свидетельствуют об перифолликулярном характере репигментации. В зоне исследования, локализованной в пределах здоровой кожи, подверженной ультрафиолетовому облучению, также наблюдались очаги пигментации с диффузным распределением пигмента, без тендеции к перифолликулярной локализации. В то время, как в зонах очага и здоровой кожи, свободных от воздействий, клинически значимых изменений выявлено не было.
Предлагаемый способ позволяет увеличить эффективность терапии, снизить риск развития побочных эффектов, упростить процедуру лечения, а также повысить приверженность к терапии со стороны пациента.