Экспериментальное изучение проницаемости кожи при трансдермальном введении гипоксена

ловодия.

Заключение. Выявлен кумулятивный эффект неблагоприятного сочетания гипертонической болезни и варикозного расширения вен нижних конечностей, а также всех результативных мультифакториальных заболеваний родителей женщин на состояние здоровья, течение беременности и некоторые антропометрические показатели новорожденных их дочерей. Сочетание гипертонической болезни и варикозного расширения вен нижних конечностей у родителей отражается на подверженности их дочерей хроническому тонзиллиту, хроническому бронхиту, хроническому аднекситу, нейроциркуляторной дистонии, варикозному расширению вен нижних конечностей. Пограничное и выраженное маловодие при сочетании гипертонической болезни и варикозного расширения вен нижних конечностей у родителей наблюдалось у каждой пятой беременной (21,2±5,1%, P<0,05). Сочетание гипертонической болезни, варикозного расширения вен нижних конечностей, хронического гастрита, язвенной болезни желудка и/или 12-перстной кишки у родителей ассоциируется с более низкой массой тела (дефицит 292,6 г, P<0,01) и меньшей окружностью головы (дефицит 0,7 см, P<0,05) новорожденных их дочерей, а также с высоким удельным весом пограничного и выраженного маловодия (31,3±8,3%, P<0,05). Полученные негативные результаты кумулятивного эффекта рассматриваемых неблагоприятных сочетаний свидетельствуют о формировании сочетанной наследственной предрасположенности к указанным выше мультифакториальным заболеваниям, проявляющейся недостаточным или неэффективным функционированием амниона (маловодие) и фето-плацентарной системы (признаки прена-тальной гипотрофии). К возможным патогенетическим механизмам развития указанных патологических изменений можно отнести фактор сниженной сосудистой перфузии и фактор нарушенного пищеварения. Причем, как маловодие, так и пренатальная гипотрофия могут реализоваться вторично вследствие сниженного иммунного статуса беременной, наличия внутриутробного инфицирования вирусной природы и фето-плацентарной недостаточности, что подтверждается данными [5,10-13].

Выводы.

1. Сочетание гипертонической болезни и варикозного расширения вен нижних конечностей у родителей сопровождается высокой подверженностью их дочерей к хроническому тонзиллиту, хроническому бронхиту, хроническому аднекситу, нейроцир-куляторной дистонии, варикозному расширению вен нижних конечностей, а также с тенденцией к маловодию.

2. Сочетание гипертонической болезни, варикозного расширения вен нижних конечностей, хронического гастрита, язвенной болезни желудка и/или двенадцатиперстной кишки родителей ассоциируется с высокой вероятностью маловодия, а также с более низкой массой тела и меньшей окружностью головы новорожденных их дочерей.

В случае регистрации сочетания гипертонической болезни, варикозного расширения вен нижних конечностей, хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у родителей женщин беременным следует проводить:

1. целенаправленный ультразвуковой мониторинг количества околоплодных вод, сопутствующих маловодию патологических состояний плаценты и плода;

2. осуществлять плановую профилактику внутриутробного инфицирования, фето-плацентарной недостаточности, гипотрофии новорожденного.

Литература

1. Генетические аспекты невынашивания беременности / Ковалевская Т.С. [и др.] // Медицинская генетика. - 2003. -Т.2,№11. - С. 480-484.

2. Геном человека и гены «предрасположенности» (Введение в предикгивную медицину) / B.C. Баранов [и др.]. - СПб.: Интермедика, 2000. - 272 с.

3. Крылов, А.А. К проблеме сочетаемости заболеваний /А. А. Крылов // Клиническая медицина. - 2000. - T.78,№1. - С. 56-59.

4. Ларина, Т.А. Состояние органов дыхания у больных гипертонической болезнью /Т.А. Ларина // Клиническая медицина. - 2002. - T.80,№1. - С. 37-40.

5. Охапкин, М.Б. Фето-плацентарная недостаточность у беременных с экстрагенитальной патологией (патогенез, диагностика и лечение): Автореф. дис. ... доктора мед. Наук / М.Б. Охапкин.- М., 1993.- 42 с.

6. Павлов, О.Г. Системное исследование медико-социальной детерминации гестоза (статья) / О. Г. Павлов // Вестник новых медицинских технологий.- 2009.- Т.ХУ1, №2.- С. 135137.

7. Павлов, О.Г. Системный подход к анализу причин развития инфекций у новорожденных в раннем неонатальном периоде / О.Г. Павлов // Вестник новых медицинских технологий.- 2010.-Т.ХУП, №3.- С. 74-76.

8. Павлов, О.Г. Системо-образующие факторы развития ранних послеродовых инфекций / О. Г. Павлов // Вестник новых медицинских технологий.- 2011.- Т.ХУШ, №1.- С. 23-25.

9. Пузырев, В.П. Генетика мультифакториальных заболеваний: между прошлым и будущим / В. П. Пузырев// Медицинская генетика.- 2003.- Т.2, №12.- С. 498-508.

10. Сидорова, И.С. Диагностика и лечение внутриутробной инфекции в различные периоды беременности / И. С. Сидорова, И.О. Макаров, С.М. Воеводин // Акушерство и гинекология. -2004. - №2. - С. 40-45.

11. Тютюник, В.Л. Морфофункциональное состояние системы мать-плацента-плод при плацентарной недостаточности и инфекции / В.Л. Тютюник, В.А. Бурлев, З.С. Зайдиева // Акушерство и гинекология. - 2003. - №6. - С. 11-16.

12. Цхай, В.Б. Перинатальные аспекты хронической фето-плацентарной недостаточности при внутриутробном инфицировании: Автореф. дис. ... доктора мед. наук. - Красноярск, 2000. -39 с.

13. Ширинкина Е.В. Влияние плацентита на фето-плацентарную гемодинамику и течение неонатального периода: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Пермь, 2003. - 23 с.

14. Шульга, О.А. Иммуногенетические факторы в патогенезе язвенной болезни: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - СПб., 1995. - 21 с.

COMBINED PARENTS' SOMATIC PATHOLOGY AND THEIR DAUGHTERS' REPRODUCNIVE FUNCTION

O.G. PAVLOV Tula State University, Medical Institute

The article highlights detecting combined pathologic effects of most prevalent multifactorial parents' diseases upon the features of pregnancy course and their daughters' outcome of labor. It is revealed that parents' hypertension combined with varicose lower extreme vein disease is associated with their daughters' high liability to chronic tonsillitis, chronic bronchitis, chronic adnexitis, neuro-circulatory dystonia, varicose veins of lower extremities. The combination of hypertension, varicose vein disease, chronic gastritis and stomach or duodenum peptic ulcer of females' parents results in lower foetus anthropometric indices. In the both variants of parents' somatic pathology combination the probability of oligohydramnios at their daughters increases.

Key words: somatic pathology, hereditary predisposition, female reproductive function.

УДК 615.033

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ КОЖИ ПРИ ТРАНСДЕРМАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ГИПОКСЕНА

С.О. ЛОСЕНКОВА, В.Е. НОВИКОВ, Э.Ф. СТЕПАНОВА*

Статья представляет результаты изучения проницаемости кожи крыс in vivo и in vitro при использовании трансдермального пластыря с гипоксеном. Трансдермальный транспорт гипоксена фиксирован методом in vitro через слой кожи с удалённой гиподермой. Ключевые слова: трансдермальный пластырь, гипоксен, кожа, метод диализа in vitro и in vivo.

В настоящее время трансдермальный путь введения лекар-

* Смоленская государственная медицинская академия; Пятигорская государственная фармацевтическая академия, E-mail: losenkova-so@mail.ru

ственных веществ (ЛВ) является рациональным. Чрескожный транспорт ЛВ обеспечивают основы (переносчики), к которым относятся гидрофильные и гидрофобные жировые вещества, водные растворы, эмульсии и гели [2]. В этой связи проблема проницаемости кожи приобретает все более важное значение. С терапевтической целью на кожу наносят ряд лекарственных форм, эффективность которых во многом зависит от проникновения их через эпидермальный барьер. При экспериментальном изучении проницаемости кожи необходимо учитывать, что кожа лабораторных животных обладает более высокой проницаемостью, чем кожа человека. С учетом этих особенностей кожа кроликов, белых крыс и морских свинок может быть использована в качестве экспериментальной модели. Установлено, что изолированная кожа продолжительное время (до 2 месяцев) сохраняет барьерные свойства в отношении проницаемости при условии ее хранения в холодильнике.

Материалы и методы исследования. Для проведения исследования сконструирован трансдермальный пластырь с гипок-сеном площадью 25см2 следующего состава: поливинилпирроли-дон К30 среднемолекулярный (Biochemica), 1,2-пропиленгликоль, натрия метабисульфит, субстанция гипоксена (0,05, Корпорация Олифен), спирт этиловый 95%. Аналогичного состава сконструирована матрица без лекарственного вещества (контроль).

Определяли проницаемость кожи in vivo на лоскутах кожи, связанных двумя концами с животным. Внутрибрюшинно крысам (массой 180-220грамм, n=6) вводили водный раствор хлоралгидрата 300 мг/кг животного. На участке кожи спины крысы тщательно удаляли шерсть, делали два разреза длиной 10 см, расстояние между которыми составляет 4-5 см; между разрезами кожу отделяли от подлежащих тканей. Поверхность кожи (эпидермиса) обрабатывали 20% спиртовым раствором и тщательно вытирали. Спиртовой раствор низкой концентрации размягчает и мацерирует роговой слой эпидермиса, что способствует проникновению веществ через кожу. Далее накладывали часть пластыря площадью 2 см2 (4 мг гипоксена).

Параллельно проводили контрольный опыт, для чего на кожу наносили пластырь без ЛВ площадью 2 см2. Под лоскут кожи, связанной с животным двумя концами, помещали небольшой резервуар, заполненный водой очищенной (V=10 мл). Водный раствор, омывавший гиподермальную поверхность кожи, на эпидермис которой наносили испытуемый пластырь, исследовали методом УФ-спектрофотометрии на спектрофотометре СФ 200002. В случае необходимости готовили разведение, для чего пробы диализата, взятые из разных резервуаров (опытного и контрольного) по 3,0 мл, переносили в чистые пробирки, к ним добавляли по 7,0 мл воды очищенной. В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную. Толщина слоя 10 мм. Гипоксен согласно ФСП «7% раствор гипоксена для инъекций» в диапазоне волн 200-380 нм имеет плечо 303-307 нм [6].

В качестве экспериментальной модели для изучения проницаемости кожи in vitro нами использована переживающая кожа крыс. Для проведения биофармацевтических исследований с поверхности спины крыс (n=6) тщательно удаляли шерсть. Лоскуты кожи освобождали не только от подкожной жировой клетчатки, но и слоя гиподермы, обильно пронизанного сетью капилляров. Проверяли лоскут под лупой на целость поверхностной части эпидермиса, укладывали между двумя салфетками, хорошо смоченными физиологическим раствором, и переносили в чашку Петри [2]. Опыты ставили сразу же после взятия материала. Испытуемый пластырь площадью 2 см2 аналогичным образом наносили на кожу животного, предварительно смоченную спиртом этиловым 20%. Проницаемость изолированной кожи определяли с использованием диализатора. Параллельно проводили контрольный опыт. Кожа служила мембраной, разделяющей пластырь с гипоксеном и среду для диализа. В качестве диализной среды использован изотонический раствор натрия хлорида 50,0 мл. В 0,9% растворе натрия хлорида «переживающая» кожа длительное время сохраняет свои функции. Диализ проводили в термостате при температуре 37±0,5°С. Отбор проб диализата производили через каждый час наблюдения. При этом объём жидкости отобранный для пробы (3 мл) возвращали тем же объёмом изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость для этой

цели находилась в термостате вместе с диализатором, для поддержания температуры эксперимента. В случае превышения значений оптической плотности выше 2,0 готовили разведение диализата опытного и контрольного образцов. К отобранным пробам (3,0 мл) прибавляли 7,0 мл изотонического раствора натрия хлорида. Аналогично регистрировали УФ-спектры в диапазоне волн 200-380 нм.

К факторам, изменяющим физико-химическое состояние кожного покрова и влияющим на его проницаемость для различных веществ, относят разнообразные факторы и прежде всего внешние: ионофорез, сонофорез, электрофорез. Ионофорез -использование внешнего электрического тока для того, чтобы транспортировать заряженную молекулу сквозь кожу. В настоящее время проводится много исследований, изучающих использование этой методики для доставки больших молекул лекарственных средств. Нами использован прибор Beauty Skin (модель Вцт-0503В, Корея), использующий новейшую технологию гальванических ионов для доставки питательных веществ к самым глубоким слоям кожи. Гальванические эффекты включают в себя очищение, проникновение питательных веществ, стимулирование коллагеновых и эластиновых волокон, которые самостоятельно начинают восстанавливать свою структуру естественным путём. Прибор включает 4 инновационных технологии: гальваническая и вибрационная, технология глубокого проникновения инфракрасных лучей, титановое покрытие. Вибрационная технология повышает циркуляцию и улучшает клеточный метаболизм.

Предварительно перед декапитацией животного два участка кожи крысы, очищенные от шерсти, обрабатывали ионовым чипом прибора (титановая панель), последовательно используя 3 режима слабого уровня согласно инструкции по применению: «очищение», «массаж», «питание» кожи. Каждый режим длился 4 минуты. В это время животные находились под эфирным наркозом (n=6). В качестве проводящей системы использовали про-пиленгликоль 1,2. По окончании воздействия кожу тщательно протирали 20% спиртом этиловым. Далее животное декапитиро-вали под эфирным наркозом и отделяли лоскуты переживающей кожи как указано ранее, удаляя гиподерму. Аналогичным образом на один лоскут накладывали пластырь с гипоксеном (опыт), на другой матрицу без ЛВ (контроль). Сверху поверхность опытной и контрольной пробы ещё раз обработали чипом в режиме «питание» в течение 4 минут. В этом режиме сложный катионо-вый процесс позволяет проникать веществам в глубокие слои кожи. Далее проницаемость изолированной кожи определяли с использованием диализатора и изотонического раствора натрия хлорида в качестве диализной среды.

Результаты и их обсуждение. Белки кожи имеют собственное поглощение в области 230-300 нм и мешают обнаружению гипоксена [4]. Максимумы поглощения в опытном и контрольном резервуаре (276±2 нм) не отличаются друг от друга и свидетельствуют о высвобождении только белков из гиподермы в опытах in vivo, а также экспериментах in vitro в первые 6 часов наблюдения (рис. 1).

Отличительных особенностей между УФ-спектрами (по положению экстремумов) разведений опытного и контрольного резервуаров на протяжении первых 6 часов эксперимента не зафиксировано (рис.2). Через 6 часов от начала эксперимента наблюдали различия в значениях оптической плотности при 305±2 нм в опытном и контрольном образце. При этом через 24 часа наблюдения значения Бопыт. превышали значения Бконтр. в 2,5 раза (рис.3). В дальнейшем значения Бконтр. достоверно не изменялись, при этом значения Бопыт. возрастали на протяжении всего последующего периода наблюдения.

Прибавление хлороформа или 10% раствора хлорной кислоты, последующее центрифугирование с целью коагуляции белка [4] не обеспечило достаточную для последующего спек-трофотометрического анализа полноту его осаждения и не способствовало обнаружению гипоксена.

На 2сутки эксперимента визуально зафиксирована сине-зелёная окраска диализата опытного образца в отличие от контрольного.

При использовании прибора Beauty Skin уже через 4 часа от начала эксперимента наблюдали различия в значениях оптиче-

ской плотности при 305±2нм, при этом значения Бопыт. превышали значения Бконтр. в 1,23раза, через 6 часов наблюдения в 1,37раза, а через 24 часа в 2,23раза. Сине-зелёное окрашивание диализата опытного образца зафиксировано уже через 24часа эксперимента, что свидетельствует о более высокой скорости чрескожного проникновения лекарственного вещества под воздействием гальванических эффектов, что подтверждается многочисленными литературными источниками.

Рис. 1 - УФ-спектры разведений из опытного резервуара через 5, 22 и 25 часов наблюдения (максимумы 276,6 нм).

Рис. 2 - УФ-спектры диализата из контрольного и опытного резервуаров через 2часа наблюдения. Примечание: по оси ординат - значения оптической плотности, по оси абсцисс - значения длинны волны.

Рис. 3. УФ-спектры разведений диализата из контрольного и опытного

резервуаров через 24часа наблюдения. Примечание: отсчёт от оси абсцисс: 1-спектр диализата контрольного образца, 2-спектр диализата опытного образца.

Для количественной оценки степени высвобождения и проникновения гипоксена накладывали сконструированный пластырь на предварительно очищенную от шерсти и гидратирован-ную кожу крыс-самцов (n=6) площадью 5 см2 (содержание гипоксена 10 мг) на 2 суток эксперимента. По истечении времени наблюдения осуществляли смыв с поверхности кожи водой очищенной. Помещали раствор в колбу на 250,0 мл, доводили до метки данным растворителем, 5мл разведения помещали в колбу на 25,0 мл и доводили до метки. Профильтрованное разведение анализировали спектрофотометрически в диапазоне волн 200380 нм, в качестве раствора сравнения использовали воду очищенную.

Содержание гипоксена вычисляли по формуле 1 следующим образом:

Dix КхахУ1х V2. х Урсо §г = D0xV0xV х Унав. где: D1 -оптическая плотность разведения компонентов пластыря, снятых с поверхности кожи; а - навеска РСО гипоксена в граммах (0,05); V1, V2 - объём разведения исследуемого образца (250 и 25 мл); D0 - оптическая плотность раствора РСО гипоксена; У, V0 - объёмы разведения РСО гипоксена (50 и 50 мл), мл; У нав. - количество мл исследуемого образца, используемое в разведении (5 мл); К- поправочный коэффициент влияния основы на степень поглощения гипоксена (высчитывается экспериментально); Урсо - количество мл РСО, используемое в разведении (2 мл).

С учётом технологических потерь при конструировании пластыря на поверхности кожи через 48 часов наблюдения было обнаружено 92,50±2% гипоксена.

В опытах in vivo нам не удалось зафиксировать проникновение гипоксена через кожу. Хотя и существует общая закономерность в проницаемости веществ через клеточную мембрану и кожу, на пути проникновения вещества через кожу встречаются многочисленные препятствия, значительно отличающиеся по физико-химическим свойствам от клеточной мембраны. К ним относятся поверхностная жировая пленка, роговой слой эпидермиса, шиповатый и базальный слои его, базальная мембрана. В собственно коже препятствием проникающему веществу могут быть основное вещество, стенки кровеносных и лимфатических сосудов и другие ткани. Кроме того, проникающее вещество должно преодолеть электрический барьер кожи [2]. В опытах in vitro показано проникновение гипоксена через кожу с удалённой гиподермой.

Гипоксен является полифенольным соединением. Уникальность гипоксена заключается не только в особенностях его химического строения, но и своеобразии химических свойств. Анти-гипоксический эффект препарата связан с наличием в его структуре полифенольного хинонового компонента. Гипоксен обладает высокой электрон-объемной емкостью, связанной с полимеризацией фенольных ядер в орто- положении. Окислительно-восстановительный потенциал составляет 300 мВ. Тиосульфатная группировка обеспечивает ему заметное антиоксидантное действие, стимулирует нейтрализацию продуктов ПОЛ [3]. В молекуле гипоксена одновременно может существовать до 12 гидроксиль-ных групп, способных одномоментно или последовательно связать большое количество свободных радикалов. Полифенолы относятся к восстанавливающим агентам. Они также обладают сродством к хелатным комплексам металлов. В щелочной среде при взаимодействии с некоторыми реактивами полифенолы приобретают синюю окраску.

Существуют четыре типа полифенол-белкового взаимодействия: водородное, гидрофобное, ионное и ковалентное. Фенольные вещества способны к обратимому взаимодействию с белками или необратимому, сопровождающемуся участием кислорода и кова-лентной конденсацией. Многие белки осаждаются полифенолами.

Фенольные антиоксиданты эффективно подавляют реакции ПОЛ, но практически не способны защищать белки от окислительного повреждения [1]. Им свойственно наличие в определенных условиях прооксидантных свойств в зависимости от концентрации, от интенсивности и длительности протекания процессов СРО и от наличия в среде катионов металлов переходной валентности.

Увеличение значений D опытного образца с 6 часа наблю-

дения возможно связано с тем, что высвобождающийся гипоксен как полифенольное соединение вступает в полифенол-белковое взаимодействие с образованием белого осадка, при этом диализат в опытном резервуаре более мутный, чем в контрольном, на что указывает и значение оптической плотности. Дальнейшее увеличение концентрации гипоксена в диализате способствует увеличению значений Dопыт. за счёт дальнейшего образования полифенол-белкового комплекса в виде осадка.

Сине-зелёная окраска диализата опытного резервуара через 2 суток наблюдения свидетельствует о возможной протекающей реакции полифенольного соединения (гипоксена) в щёлочной среде.

В водной среде молекула полифенольного соединения существует в виде равновесного комплекса «хинон-семихинон-фенол», важнейшая роль в котором принадлежит семихинонному феноксиметильному радикалу. Полифенольные соединения способны к процессу, называемому «семихинонной осцилляцией», позволяющей им выступать в качестве универсальной буферной ёмкости, которая акцептирует или донирует протоны и электроны, обусловливая регуляцию окислительно-восстановительного баланса организма [5].

Выводы.

1.За счёт присутствия белков кожи количественное определение гипоксена в диализате затруднено.

2.В исследованиях in vitro зафиксировано высвобождения гипоксена через слой кожи крыс с удалённой гиподермой.

3.Применение технологии гальванических ионов прибора Beauty Skin позволяет изменить скорость проникновения гипок-сена через кожу с удалённой гиподермой.

3.На поверхности кожи крыс через 48 часов наблюдения было обнаружено 92,50±2% гипоксена.

Литература

1. Зайцев, В.Г. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия / В.Г.Зайцев, О.В. Островский, В.И. Закревский // Эксперим. и клинич. фармакология.- 2003.- Т. 66, № 4.- С. 6670.

2. Колпаков, Ф.И. Проницаемость кожи / Ф.И. Колпаков.-М.: Медицина, 1973.- 154 с.

3. Оковитый, С.В. Антигипоксанты / С.В. Оковитый, А.В. Смирнов // Эксперим. и клинич. фармакология.- 2001.- Т. 64, № 3.- С. 76-80.

4. Фармакокинетика ксимедона / В.И.Погорельцев [и др.] // Химико-фармацевтический журнал.- №7, 2006.- С.5-8.

5. Стресс-протективное действие диприма / В.Г. Спрыгин В.Г. [и др.] // Эксперим. и клинич. фармакология.- 2002.- Т. 65, № 4.- С. 56-58.

6. ФСП «7% раствор гипоксена в ампулах».

EXPERIMENTAL STUDYING OF PERMEABILITY OF THE SKIN AT TRANSDERMAL INTRODUCTION OF HYPOXEN

S.O. LOSENKOVA, V.YE. NOVIKOV, E.F. STEPANOVA

Smolensk State Medical Academy Pyatigorsk State Pharmacological Academy

The article presents the results of studying the skin of rats in vivo and in vitro using a transdermal plaster with hypoxen. Transdermal transport of hypoxen is fixed by a method in vitro through a layer of a skin with removed hypoderm.

Key words: transdermal plaster, hypoxen, skin, method of dialysis in vitro and in vivo.