Антибиотический потенциал защитныгх пептидов семян сорного злака - ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli L. )

Антибиотический потенциал защитных пептидов семян сорного злака — ежовника обыкновенного

Е. А. РОГОЖИН'2, А. Н. СМИРНОВ3

1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

2 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе, Москва

3 Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва

Antibiotic Potential of Defense Peptides Derived from the Seeds of a Wild Grass — Barnyard Grass

E. A. ROGOZHIN12, A. N. SMIRNOV3

1 M. M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Moscow

2 G. F. Gause Institute of New Antibiotics, Moscow

3 Russian State Agrarian University — Moscow Timiryazev Agricultural Academy, Moscow

Проведена работа по оценке ингибирующего действия комплексов пептидов семян ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli L.), принадлежащих к различным семействам PR-белков растений (дефензинов, липид-переносящих белков, ингибиторов протеиназ типа Боуман-Бирка и бифункциональных ингибиторов трипсина/альфа-амилазы злаков) и харпино-подобных пептидов (альфа-харпининов), на ряд условно-патогенных мицеллиальных грибов рода Aspergillus «луночным» методом, а также бактерицидного эффекта по отношению к грамположительной бактерии Staphylococcus aureus с помощью лазерной проточной цитофотометрии. Был показан преимущественный антифунгальный эффект в отношении к коллекционных культур грибов-микромицетов из рода Aspergillus (A.oryzae, A.niger, A.terreus, A.nutans), что выражалось в количественном подавлении степени прорастания конидий и скорости нарастания гиф. Статистически достоверным бактерицидным действием обладал только представитель семейства липид-переносящих белков. Полученные данные, с одной стороны, позволяют рассматривать данный дикий злак как потенциальный донор высокоактивных полипептидов для защиты культурных Однодольных от болезней, вызываемых специфичными грибными патогенами, а с другой стороны, как источник природных пептидных антибиотиков нового поколения.

Ключевые слова: ежовник обыкновенный, Echinochloa crusgalli, дикий злак, антифунгальная активность, бактерицидная активность, пептидные антибиотики.

The article evaluates the inhibitory effect of peptide complexes derived from barnyard grass (Echinochloa crusgalli L.) seeds belonging to various families of plant RP proteins (defensins, lipidtransfer proteins, protease inhibitors of Bowman-Birktype, and bifunctional inhibitors of trypsin/alpha-amylase derived from grasses) and harpino-like peptides (alpha-harpinins) on a number of opportunistic mycelial fungi of the Aspergillus genus by the «alveolar» method, as well as bactericidal effect towards GramPositive bacterium Staphylococcus aureus with the use of flow cytometry and photometry.The primary antifungal effect was observed with respect to the culture collection of fungi-micromycetesof Aspergillus spp. (A.oryzae, A.niger, A.terreus, A.nutans), which was expressed in quantitative suppression of hyphal growth and conidia germination. Only the EcLTP peptide had a statistically significant bactericidal action.The data obtained, on the one hand, allow us to consider this wild grass as a potential donor of highly active polypeptides used for protection of cultivated monocotyledonous plants from diseases caused by specific fungal pathogens, and, on the other hand, as a source of next-generation natural peptide antibiotics.

Keywords: barnyard grass, Echinochloa crusgalli, weed grass, antifungal activity, bactericidal activity, peptide antibiotics.

Введение

Проблема поиска новых источников получения антибиотиков в последние годы является актуальной, особенно на фоне получивших достаточно широкое распространение случаев резистентности бактериальных и грибных патогенов — возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных. В качестве таких «доноров» но© Е. А. Рогожин, А. Н. Смирнов 2018

Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, Б.Пироговская, 11, стр. 1. НИИИНА им. Г.Ф.Гаузе

вых антибиотических соединений традиционно рассматриваются новые виды и штаммы бактерий (представители родов Streptomyces, Bacillus и др.) и почвенных грибов (Trichoderma spp., Emericellopsis spp. и др.) [1—6], обладающих в естественных ареалах своего обитания ярко выраженной антагонистической активностью по отношению к менее конкурентоспособным формам микроорганизмов (грибам, бактериям, актино-мицетам), а также те из них (Cordyceps spp., Beauveria spp., Paecilomyces spp. и др.), которые используют в качестве пищевого субстрата разнооб-

Антифунгальная активность защитных пептидов семян ежовника против условно-патогенных грибов рода Aspergillus «луночным» методом, ИК50, мкМ.

Пептид/гриб A.oryzae A.niger A.terreus A.nutans

Ec-AMP-Dl/2 4,0 4,0 8,0 16,0

EcAMPl/3 16,0 16,0 >32 >32

EcLTP <4,0 <4,0 8,0 8,0

EcBBTI 16,0 16,0 >32 >32

EcBFTI 32,0 >32 >32 >32

разных беспозвоночных (насекомых, клещей, нематод) [7—10]. Однако в подавляющем большинстве случаев такие антимикробные соединения обладают целым рядом побочных эффектов, наиболее распространённый из который — цитоток-сичность для эукариотических клеток, что накладывает существенные ограничения на дальнейшие перспективы их потенциального применения в медицине, ветеринарии и животноводстве. На этом фоне растения представляют собой более привлекательные источники новых и разнообразных по структуре и функции полипептидов с антимикробными свойствами (АМП). Ранее в серии предыдущих исследований был детально исследован состав защитных пептидов (антимикробных и ингибиторов гидролаз насекомых) в семенах ежовника с целью выявления степени их вклада в повышенную устойчивость дикорастущих злаков к комплексу биотических стрессовых факторов окружающей среды [11—15].

Цель данной работы заключалась в изучении антимикробного потенциала ряда защитных пептидов семян ежовника на комплекс условно-патогенных мицеллиальных грибов из рода Aspergillus, а также бактерицидного эффекта по отношению к грамположительной бактерии Staphylococcus aureus.

Материал и методы

Биологический материал. Семена. Использовались семена ежовника (E.crusgalli L.), собранные в Краснодарском крае летом 2004 г. Семена хранились в сухом проветриваемом помещении при температуре 16—18°С.

Микроорганизмы. Культуры мицеллиальных грибов — A.oryzae штамм VKM F-55, A.niger штамм VKM F-33, A.terreus штамм VKM F-65, A.nutans штамм VKM F-3910 были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН, в работе по определению бактерицидной активности был использован штамм Staphylococcus aureus Cowan I, полученный из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасеви-ча) и меченый флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) (Molecular Probes, США).

Выделение защитных пептидов из семян ежовника проводили в точном соответствии с методиками, описанными в работах [11, 13, 14].

Оценку антифунгального действия защитных пептидов осуществляли «луночным» микрометодом, представляющим собой модификацию диско-диффузионного способа испытаний антибиотических соединений in vitro, согласно [16]. Были использованы четыре действующих концентрации полипе-пептидов в диапазоне 4—32 мкМ. Измерение диаметра колоний грибов проводили по истечении 120 ч инкубирования в трёх повторностях, ИК50 рассчитывали путём соотнесения

среднего диаметра (в мм) как половину или менее от отрицательного контроля (добавление дистиллированной воды). В качестве контрольного варианта использовали коммерческий антимикотический препарат — амфотерицин Б (40 мкг/мл).

Изучение бактерицидного действия АМП ежовника методом лазерной проточной цитометрии и фотометрического метода проводили в точном соответствии с методикой, описанной в работах [17, 18]. Использовали четыре действующих концентрации пептидов, полученных методом двукратного разведения — 9—72 мкМ). В качестве контрольного варианта использовали коммерческий антибиотик — ванкомицин (50 мкг/мл).

Результаты и обсуждение

Исследование антифунгальной активности защитных пептидов семян ежовника «луночным» методом. Используемая в настоящей работе адаптация микологической методики позволяет эффективно оценивать антифунгальную (фунгистати-ческую) активность веществ (в частности, антимикробных белков и пептидов), как правило, доступных в малых количествах. Данное тестирование позволяет выявить различие между действием разных АМП преимущественно на скорость роста колоний грибов из разных таксономических групп, вызывающих опасные болезни с.-х. культур, а также условно-патогенных форм, представляющих опасность для человека и теплокровных животных. Для оценки антибиотической активности был использован ряд защитных пептидов, ранее выделенных из семян ежовника с антимикробными свойствами против фитопато-генных микроорганизмов — смесь высокогомологичных дефензинов Ес-АМР-Б1/2 [11], смесь харпино-подобных пептидов группы ЕсАМР (формы «1» и «3») [13, 14], липид-переносящий белок ЕсЬТР [15], а также два представителя ингибиторов гидролитических ферментов (ЕсББТ1 и ЕсБЬТ1) [13]. Были использованы четыре действующих концентрации полипептидов в диапазоне 4—32 мкМ. Результаты (ИК50, мкМ) приведены в таблице.

По данным тестирования антифунгальной активности, можно заключить, что все тестируемые молекулы обладали биологическим действием на выбранный спектр грибных патогенов, однако специфичность была отличной, что выразилось по разнице в количественном аспекте степени инги-бирования: так, наиболее устойчив к действию данных молекул оказался вид А.пШат, в том время как для А.огугав и А^вг отмечена наибольшая степень восприимчивости. Что касается спектра действия, то липид-переносящий белок ЕсЬТР и

смесь высокогомологичных дефензинов Ec-AMP-D1/2 показали максимальный эффект и отсутствие явно выраженной внутривидовой специфичности действия, что подтверждается полученными ранее данными по их активности на фитопатоген-ные грибы и оомицеты, в том числе при совместном действии [11, 13, 15, 19], а также, согласно литературным данным, для некоторых их гомологов [20, 21]. Для двух представителей ингибиторов ги-дролаз был отмечен достаточно низкий уровень активности на выбранные виды, несмотря на полученные данные по их влиянию на супрессию развития возбудителя фитофтороза — оомицет Phytophthora infestans — на растительной ткани (искусственно инокулированные патогеном клубни картофеля) [13], как и ряда сообщений об участии ингибиторов протеиназ злаков в реализации иммунитета растений к болезням [22—24].

Изучение бактерицидного действия АМП семян ежовника с помощью проточной цитофотометрии. Результаты оценки уровня бактерицидного действия исследуемого комплекса пептидов семян ежовника, для которых в рамках проведённых ранее исследований было отмечено наличие анти-фунгальной активности [12, 15], позволили установить, что только инкубация бактериальных клеток с EcLTP в диапазоне действующих концентраций более 18 мкМ приводили к более чем 50% цитолитическому эффекту (ИК50 определена на уровне 18 мкМ) (рисунок).

При этом стоит упомянуть, что дальнейшее снижение содержания данного пептида путём двукратного разведения до уровня 4,5 мкМ не приводило к значимому уменьшению количества бактерий S.aureus с повреждённой оболочкой (42% от их общего числа). Полученные данные, с одной стороны, согласуются с эффектом количественного действия данного АМП на оомицет P.infestans in vitro, а с другой стороны, позволяют рассматривать эту молекулу в качестве единственного цитолитика в исследуемом комплексе эффекторных молекул семян этого вида злаков. В качестве сравнения можно упомянуть, что смесь харпино-подобных пептидов EcAMP1/3 продемонтрировала слабый уровень активности по отношению к S.aureus в данном тесте вплоть до концентрации 72 мкМ, несмотря на то, что в проведённых ранее тестах диско-диффузионного метода был отмечен их супрессивный эффект по отношению к ряду как грамположителньых, так и грамотрицательных фитопатогенных бактерий (Pseudomonas syringe, Clavibacter michiga-nensis, Pectobacterium carotovorum) на уровне 12— 24 мкМ [13, 14], что, однако, может являться следствием проявления данной молекулой бак-териостатического действия наряду с фунгиста-тическим [12, 25]. Интересно, что для ближайшего структурного гомолога (по аминокислот -

Бактерицидная активность АМП семян ежовника против S.aureus методом проточной цитофотометрии: контроль (минус) — без добавления пептида, контроль (плюс) — инкубирование в присутствии ванкомицина (50 мкг/мл).

ной последовательности) EcAMP1 — АМП из семян кукурузы (Zea mays L.) MBP-1 было продемонстрировано как бактерицидное (на примере Escherichia coli), так и бактериостатическое действие (на примере Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis) [26], при этом активность по отношению к E.coli прямым образом зависела от фолдинга данной молекулы [27].

Заключение

Таким образом, были получены новые данные касательно степени ингибирующего действия комплексов пептидов семян ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli L.), принадлежащих к различным семействам PR-белков растений и харпино-подобных пептидов (альфа-хар-пининов) на ряд условно-патогенных мицелли-альных грибов рода Aspergillus, а также бактерицидного эффекта по отношению к грамположи-тельной бактерии Staphylococcus aureus. Был показан антифунгальный эффект по отношению к коллекционным культурам грибов-микромице-тов из рода Aspergillus (A.oryzae, A.niger, A.terreus, A.nutans), что выражалось в количественном подавлении степени прорастания конидий и скорости нарастания гиф. Бактерицидным действием обладал только представитель семейства липид-переносящих белков. Полученные в результате проведённой работы результаты позволяют рассматривать данный дикий злак как потенциальный донор высокоактивных полипептидов для защиты культурных Однодольных от болезней, вызываемых специфичными грибными патогенами, а также как источник природных пептидных антибиотиков нового поколения.

Благодарности

Настоящая работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант № 16-34-60217-мол_а_дк) (раздел «Исследование антифунгальной активности защитных пептидов семян ежовника «луночным» методом), Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности» в рамках научного проекта РФФИ № 16-44-240509-р_а (раздел «Изучение бактерицидного действия АМП семян ежовника с помощью проточной цитофотометрии»).

ЛИТЕРАТУРА

1. Садыкова B.C., КураковА.В., КуваринаА.Е, Тюрин А.П., Рогожин Е.А., Коршун В.А. Образование штаммом Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 антибиотиков — пептаиболов. Проблемы медицинской микологии. — 2015. - № 17(1). - С. 41—46. / Sadykova V.S, KurakovA.V, Kuvarina A.E., Tyurin A.P., Rogozhin E.A., Korshun V.A. Obrazovanie shtammom Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 antibiotikov — peptaibolov. Problemy medicinskoj mikologii 2015; 17(1): 41—46. [in Russian]

2. Садыкова B.C., КураковА.В., Коршун В.А., Рогожин EA, Громовым Т.И, Куварина А.Е, БарановаАА Антимикробная активность веществ, продуцируемых штаммом Trichoderma citrinoviride ВКПМ-1228: оптимизация лабораторного культивирования и спектр действия индивидуальных пептаиболов. Антибиотики и химиотер. — 2015.—Т. 60. — № 11—12. — С. 3—8. / Sadykova V.S., Kurakov A.V., Korshun V.A., Rogpzhin E.A., Gromovyh T.I, Kuvarina A.E, Baranova AA Antimikrobnaya aktivnost' veshchestv, pro-duciruemyh shtammom Trichoderma citrinoviride VKPM-1228: optimizaciya laboratornogo kul'tivirovaniya i spektr dejstviya individual'nyh peptaibolov. Antibiotiki i khimioter 2015; 60(11—12): 3—8. [in Russian]

3. BloudoffK, Schmeing T.M.Structural and functional aspects of the non-ribosomal peptide synthetase condensation domain superfamily: discovery, dissection and diversity. Biochim Biophys Acta 2017; 1865(11 Pt B): 1587—1604.

4. Inostroza A., Lara L, Paz C, Perez A., Galleguillos F, Hernandez V., Becerra J., Gonz6lez-Rocha G, Silva M. Antibiotic activity of Emerimicin IV isolated from Emericellopsis minima from Talcahuano Bay, Chile. Nat Prod Res 2017; 3: 1—4.

5. Daniel J.F, FilhoE.R. Peptaibols oftrichoderma. Nat Prod Rep 2007; 24 (5): 1128—41.

6. Szekeres A., Leitgeb B, Kredics L, AntalZ, Hatvani L, Manczinger L, V6gvu,lgyi C. Peptaibols and related peptaibiotics of Trichoderma. A review. Acta Microbiol Immunol Hung 2005; 52 (2): 137—68.

7. Chirim J., Danies G, Sierra R, Schauer N, Trenkamp S, Restrepo S, Sanjuan T. Metabolomic profile and nucleoside composition of Cordyceps nidus sp. nov. (Cordycipitaceae): A new source of active compounds. PLoS One 2017; 12(6): e0179428.

8. Sharma S.K., Gautam N, Atri N.S. Optimized extraction, composition, antioxidant and antimicrobial activities of exo and intracellular polysac-charides from submerged culture of Cordyceps cicadae. BMC Complement Altern Med 2015; 15: 446.

9. Liu J, Li F, Kim E.L, Li J.L., Hong J, Bae K.S., Chung H.Y., Kim H.S, Jung J.H. Antibacterial polyketides from the jellyfish-derived fungus Paecilomyces variotii. J Nat Prod 2011; 74(8): 1826—9.

10. Lira S.P., Vita-Marques A.M., Seleghim M.H., Bugni T.S., LaBarbera D.V., Sette L.D., Sponchiado S.R., Ireland C.M., Berlinck R.G. New destruxins from the marine-derived fungus Beauveria felina. J Antibiot (Tokyo) 2006; 59 (9): 553—63.

11. Odintsova T.I., Rogozhin E.A., Baranov Yu.V, Musolyamov A.Kh, Yalpani N, Egorov Ts.A, Grishin E.V. Seed defensins of barnyard grass Echinochloa crusgalli (L.) Beauv. Biochimie 2008; 90: 1667—1673.

12. Nolde S.B., Vassilevski A.A., Rogozhin E.A., Barinov N.A., Balashova T.A., Samsonova O.V., Baranov Y.V., Feofanov A.V., Egorov T.A., ArsenievA.S., Grishin E.V. Disulfide-stabilized helical hairpin structure of a novel antifungal peptide EcAMP1 from seeds of barnyard grass (Echinochloa crus-galli). J Biol Chem 2011; 286 (28): 25145—25153.

13. Rogozhin E.A., Ryazantsev D.Y., Grishin E.V., Egorov T.A., Zavriev S.K. Defense peptides from barnyard grass (Echinochloa crusgalli L.) seeds // Peptides, 2012, V. 38 (1), P. 33—40.

14. Ryazantsev D.Yu., Rogozhin E.A., Dimitrieva T.V., Drobyazina P.E., Khadeeva N.V., Egorov T.A., Grishin E.V., Zavriev S.K. A novel hairpin-

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Рогожин Евгений Александрович — к.х.н, н.с. лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва

Авторы выражают благодарность заведующему лабораторией №92 клинической иммунологии ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, д.м.н., профессору Пинегину Б.В. за помощь в проведении испытаний бактерицидной активности АМП, а также научному сотруднику лаборатории биотехнологии отдела иммунологии ЦНИИ Туберкулеза к.б.н. Николаеву А.А. за помощь в интерпретации результатов оценки бактерицидной активности АМП.

like antimicrobial peptide from barnyard grass (Echinochloa crusgalli L.) seeds: Structure-functional and molecular-genetics characterization. Biochimie 2014; 99: 63—70.

15. Рогожин Е.А., Одиниова Т.И., Мусолямов А.Х., Смирнов А.Н., Бабаков А.В., Егоров Ц.А., Гришин Е.В. Выделение и характеристика нового липид-переносящего белка из зерновок ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli). Прикладная биохимия и микробиология. — 2009. — Т. 45. — № 4. — С. 403—409. / Rogozhin E.A., Odincova T.I., Musolyamov A.KH, Smirnov A.N., Babakov A.V., Egorov C.A., Grishin E.V. Vydelenie i kharakteristika novogo lipid-perenosyashchego belka iz zer-novok ezhovnika obyknovennogo (Echinochloa crusgalli). Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya 2009; 45 (4): 403—409. [in Russian]

16. Рогожин Е.А., Защев Д.В, Смирнов А.Н. Микрометод определения фунгистатической активности белков растительного происхождения. Известия Тимирязевской с-х академии. — 2011. — № 5. — С. 79—84. / Rogozhin E.A., Zajcev D.V., Smirnov A.N. Mikrometod opredeleniya fungistaticheskoj aktivnosti belkov rastitel'nogo proiskhozhdeniya. Izvestiya Timiryazevskoj s.-kh. Akademii 2011; 5: 79—84. [in Russian]

17. Будихина А.С., Михайлова Н.А., Биткова Е.Е., Хватов В.Б., Пинегин Б.В. Изучение бактерицидной и ингибирующей активности сыворотки крови с помощью проточной цитометрии и фотометрического метода. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии — 2007. — № 2. — С. 53—57. / Budikhina A.S., Mikhajlova N.A., Bitkova E.E., KHvatov V.B., Pinegin B.V. Izuchenie baktericidnoj i ingibiruyushchej aktivnosti syvorotki krovi s pomoshch'yu protochnoj citometrii i fotometricheskogo metoda. ZHurnal mikrobiologii, ehpi-demiologii i immunobiologii. 2007; 2: 53—57. [in Russian]

18. БудихинаА.С., Олиферук Н.С., Пинегин Б.В. Оценка бактерицидной активности сыворотки крови с помощью лазерной проточной ци-тофлюорометрии. Клиническая лабораторная диагностика. — 2006. — № 10. — С. 48—49. / Budikhina A.S., Oliferuk N.S, Pinegin B.V. Ocenka baktericidnoj aktivnosti syvorotki krovi s pomoshch'yu lazernoj protochnoj citoflyuorometrii. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika 2006; 10: 48—49. [in Russian]

19. Rogozhin E, Zaytsev D. A synergistic effect of two plant antimicrobial peptides from defensin and lipid-transfer protein families towards Phytophthora infestans. Phytopathology 2016; 106 (S4): 156.

20 Malaguti M., Dinelli G., Leoncini E., Bregola V., Bosi S., Cicero A.F., Hrelia S. Bioactive peptides in cereals and legumes: agronomical, biochemical and clinical aspects. Int J Mol Sci 2014; 15 (11): 21120—35.

21. Kitts D.D., Weiler K. Bioactive proteins and peptides from food sources. Applications of bioprocesses used in isolation and recovery. Curr Pharm Des 2003; 9 (16): 1309—23.

22. Schuppan D, Zevallos V. Wheat amylase trypsin inhibitors as nutritional activators of innate immunity. Dig Dis 2015; 33 (2): 260—3.

23. Srikanth S, ChenZ.Plant Protease Inhibitors in Therapeutics-Focus on Cancer Therapy. Front Pharmacol 2016; 8 (7): 470.

24. Bateman K.S., James M.N.Plant protein proteinase inhibitors: structure and mechanism of inhibition. Curr Protein Pept Sci 2011; 12 (5): 340—7.

25. Vasilchenko A.S., Yuryev M, Ryazantsev D.Yu, Zavriev S.K., Feofanov A.V., Grishin E.V., Rogozhin E.A. Studying of cellular interaction of hairpin-like peptide EcAMP1 from barnyard grass (Echinochloa crusgalli L.) seeds with plant pathogenic fungus Fusarium solani using microscopy techniques. Scanning 2016; 38 (6): 591—598.

26. Duvick J.P., Rood T, Rao A.G., Marshak D R. Purification and characterization of a novel antimicrobial peptide from maize (Zea mays L.) kernels. J Biol Chem 1992; 267 (26): 18814—20.

27. Sousa D.A., Porto W.F., Silva M.Z., da Silva T.R., Franco O.L. Influence of Cysteine and Tryptophan Substitution on DNA-Binding Activity on Maize a-Hairpinin Antimicrobial Peptide. Molecules 2016; 21(8): E1062.

Смирнов Алексей Николаевич — д.б.н., профессор кафедры защиты растений ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К. А. Тимирязева», Москва