Способ топографического ориентирования для обнаружения нервного кольца у личинок паразитических нематод отряда Strongylida
METHOD FOR TOPOGRAPHIC ORIENTATION FOR DETECTING THE NERVE RING IN LARVAE OF PARASITIC NEMATODES OF THE ORDER STRONGYLIDA

Изобретение относится к методам для диагностики и может быть использовано в сферах здравоохранения, сельского хозяйства, ветеринарии и биологии для обнаружения нервного кольца в теле паразитических нематод отряда Strongylida (например, личинок первого возраста (L1) из семейств Dictyocaulidae и Protostrongylidae и личинок третьего возраста (L3) из семейств Ancylostomatidae, Molineidae, Strongylidae и Trichostrongylidae).
Личинки паразитических нематод отряда Strongylida - это полупрозрачные организмы, длиной 0,3-1,5 мм. Для их дифференциальной диагностики сопоставляют морфологические и морфометрические характеристики, одной из которых является расстояние от головного конца до нервного кольца, определяемое у личинок, наблюдаемых в световой микроскоп. Нервное кольцо - это очень нежная и трудноуловимая структура. Известны следующие ориентиры для ее обнаружения:
1) опубликованные измерения расстояния от головного конца до нервного кольца у личинок конкретных видов. Например, у L1 Umingmakstrongylus pallikuukensis (Protostrongylidae) нервное кольцо лежит на расстоянии 91-120 (108±7,05) мкм от головного конца (Hoberg Е.P. et al. Umingmakstrongylus pallikuukensis gen. nov. et sp. nov. (Nematoda: Protostrongylidae) from muskoxen, Ovibos moschatus, in the central Canadian Arctic, with comments on biology and biogeography // Canadian Journal of Zoology. - 1995. - T. 73. - №. 12. - C. 2266-2282), а у L1 Varestrongylus eleguneniensis из того же семейства - на расстоянии 87-196 мкм (Verocai G.G. et al. Varestrongylus eleguneniensis sp. n. (Nematoda: Protostrongylidae): a widespread, multi-host lungworm of wild North American ungulates, with an emended diagnosis for the genus and explorations of biogeography // Parasites & Vectors. - 2014. - T. 7. - №. 1. - C. 1-22.)
2) указание на то, что «нервное кольцо лежит впереди экскреторного отверстия в виде еле заметной перетяжки вокруг пищевода» (Поляков П.А. Прижизненная дифференциальная диагностика стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных по инвазионным личинкам // Рукопись дис. канд. вет. наук. - 1953.);
Недостатками этих ориентиров являются следующие:
1) абсолютные значения расстояния от головного конца до нервного кольца даны в виде диапазона, который в отношении микроорганизма достаточно широк;
2) абсолютные значения расстояния даже для изученных видов стронгилид варьируют в связи с внутривидовым полиморфизмов нематод, а также средой, и методом их изучения (личинки могут сжиматься или разбухать/расплющиваться под воздействием спирта, формалина, глицерина и их смесей, воздействия пламенем, давления покровного стекла и так далее);
3) абсолютные размеры уже изученных видов могут оказаться бесполезны для малоизученных или абсолютно новых;
4) привязка к экскреторному отверстию, хоть и значительно сужает диапазон поиска (поскольку экскреторное отверстие располагается в передней части личинки), является не достаточно конкретной;
5) во всех упомянутых случаях нет опубликованной пошаговой инструкции по поиску нервного кольца у личинки, что особенно важно для начинающих исследователей или тех специалистов, кто редко сталкивается с этой паразитической группой.
Таким образом, непосредственного аналога предлагаемый способ не имеет.
Технический результат заключается в том, что предлагаемый способ позволяет уверенно обнаруживать положение нервного кольца у личинок паразитических нематод отряда Strongylida.
Технический результат достигается тем, что получают ряд последовательных фотоизображений личинки; осуществляют склейку панорамы по глубине резкости из полученных снимков (стекинг); на полученном изображении определяют головной конец личинки; находят экскреторное отверстие и идущий к нему экскреторный канал; проводят прямую линию так, чтобы она повторяла собой засечку, образованную экскреторным каналом, и продолжала ее, пересекая продольную ось симметрии; отражают полученную линию таким образом, чтобы точка отражения совпадала с экскреторным отверстием, а ось отражения была перпендикулярна продольной оси симметрии; в точке пересечения отраженной линии с продольной осью симметрии проводят перпендикуляр к продольной оси симметрии; обнаруживают искомое нервное кольцо лежащим вдоль проведенного перпендикуляра.
Сущность изобретения поясняется фигурами, где:
на Фиг. 1 схематично изображен общий вид личинки паразитической нематоды отряда Strongylida: А - вид спереди на головной конец (апикально); Б - вид сбоку (латерально); серым обозначено нервное кольцо;
на Фиг. 2 представлены отрисованные изображения личинки первого возраста (L1) вида Elaphostrongylus rangiferi (Protostrongylidae); А - рисунок оптического светового среза, позволяющий увидеть внутренние структуры (ЭО - экскреторное отверстие и идущий к нему в виде засечки экскреторный канал; АО - анальное отверстие (анус) и идущий к нему в виде засечки терминальный участок кишки); Б - рисунок вида личинки с поверхности, де хорошо видно латеральное крыло (ЛК), совпадающее с продольной осью симметрии личинки;
на Фиг. 3 представлен фотоснимок личинки третьего возраста (L3) рода Nematodirus (Molineidae), иллюстрирующий углы наклона засечек, образованных экскреторным каналом (указан черной стрелкой в квадратной врезке увеличенного фрагмента) и терминальным участком кишки личинки (указан белой стрелкой в квадратной врезке увеличенного фрагмента): линии, проведенные через эти засечки, пересекаются в точке, лежащей за пределами тела распрямленной личинки с ее дорсальной (спинной) стороны;
на Фиг. 4 схематично изображен общий вид сбоку (латерально) личинки паразитической нематоды отряда Strongylida, серым обозначено нервное кольцо: А - видны засечки, образованные экскреторным каналом (указано черной стрелкой) и терминальным участком кишки (указано белой стрелкой); Б - то же, с добавлением: 1) продольной оси симметрии (штрих-пунктирная линия); 2) линий, продолжающих две засечки, до пересечения друг с другом в точке, лежащей за пределами тела распрямленной личинки с ее дорсальной (спинной) стороны; 3) отраженной линии, проходящей через засечку, образованную экскреторным каналом (ось отражения - штриховая линия - перпендикулярна продольной оси симметрии личинки - штрих-пунктирной линии); 4) перпендикуляра, на котором лежит нервное кольцо, проведенного к продольной оси симметрии личинки через точку пересечения с отраженной линией;
на Фиг. 5 представлено фотоизображение личинки первого возраста (L1) вида Orthostrongylus macrotis (Protostrongylidae), полученное в результате стекинга (склейки панорамы по глубине резкости): А - крупный план участка личинки, содержащего нервное кольцо и экскреторный канал с добавлением: 1) продольной оси симметрии, соответствующей контурам латерального крыла (штриховая линия); 2) линии, продолжающей засечку, образованную экскреторным каналом; 3) линии, являющейся отражением предыдущей, при том, что точка отражения совпадает с экскреторным отверстием, а ось отражения (штриховая линия) перпендикулярна продольной оси симметрии личинки; 4) перпендикуляра (на котором лежит нервное кольцо), проведенного к продольной оси симметрии личинки через точку пересечения с отраженной линий; Б - общий вид личинки с обозначением нервного кольца (НК), экскреторного отверстия (ЭО), которым открывается экскреторный канал, визуализированный в виде светлой засечки; анального отверстия (АО), которым открывается терминальный участок кишки, визуализированный в виде светлой засечки.
Способ реализуется следующим образом:
1) получают ряд последовательных, с разной глубиной резкости, фотоизображений исследуемой личинки паразитической нематоды отряда Strongylida, находящейся в латеральном (боковом) положении во временном микропрепарате (на предметном стекле в капле водопроводной воды или иной специальной жидкости и накрытой покровным стеклом), помещенном на предметный столик светового микроскопа (путем фотосъемки через оптико-механический адаптер на цифровую фотокамеру через специальный тубус микроскопа / съемки на фотокамеру микроскопа через специальный тубус / съемки на фотокамеру мобильного телефона или цифровую фотокамеру через окуляр микроскопа) при х20 увеличении объектива микроскопа в режиме светлого поля или фазового контраста;
2) в компьютерной программе - растровом графическом редакторе (например, CombineZP, Helicon Focus или PhotoShop) осуществляют склейку панорамы по глубине резкости из полученных снимков - так называемый стекинг, чтобы получить одно изображение личинки, на котором одинаково четко будут видны как внутренние, так и поверхностные структуры, в частности - латеральное крыло, совпадающее с продольной осью симметрии;
3) на полученном изображении определяют головной конец по более округлой форме и хвостовой - по более заостренной;
4) находят экскреторное отверстие и идущий к нему экскреторный канал, которые располагаются ближе к головному концу с вентральной (брюшной) и выглядят как небольшая засечка на теле личинки, расположенная под углом к продольной оси симметрии (латеральному крылу) личинки и не заходящая за эту ось, причем угол расположения засечки таков, что линия, продолжающая ее, пересечет линию, продолжающую засечку анального отверстия и терминального участка кишки личинки (расположенных ближе к хвостовому концу с вентральной стороны) в точке, лежащей за пределами тела распрямленной личинки с ее дорсальной (спинной) стороны;
5) с помощью средств рисования графического редактора в отдельном слое изображения личинки проводят прямую линию так, чтобы она повторяла собой засечку, образованную экскреторным каналом, и продолжала ее, пересекая продольную ось симметрии (латеральное крыло);
6) отражают полученную линию таким образом, чтобы точка отражения совпадала с экскреторным отверстием, а ось отражения была перпендикулярна продольной оси симметрии (латеральному крылу) личинки, то есть, чтобы отраженная линия пересекала продольную ось симметрии (латеральное крыло) в точке, лежащей ближе к головному концу, чем само экскреторное отверстие;
7) в точке пересечения отраженной линии с продольной осью симметрии (латеральным крылом) проводят перпендикуляр к продольной оси симметрии (латеральному крылу);
8) обнаруживают искомое нервное кольцо лежащим вдоль проведенного перпендикуляра.
Таким образом, полезность предлагаемого изобретения заключается в том, что предлагаемый способ позволяет уверенно обнаруживать положение нервного кольца у личинок паразитических нематод отряда Strongylida для последующего измерения расстояния до него от головного конца и использования полученных промеров в целях дифференциальной диагностики.