Способ активации миогенной дифференцировки миобластов
METHOD FOR ACTIVATING THE MYOGENIC DIFFERENTIATION OF MYOBLASTS

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, фармакологии и клинической фармакологии, и может быть использовано для изучения механизмов дифференцировки миобластов и оценки влияния на нее фармакологических веществ.
Линия клеток C2C12 представляет собой мышиные миобластные клетки, происходящие из сателлитных клеток, обладающие способностью спонтанно дифференцироваться в мышечные волокна после удаления сыворотки [D. Yaffe, O. Saxel. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. Vol. 270. P. 725 – 727. 1977; H.M. Blau, C.P. Chiu, C. Webster. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. Vol.  32, P. 1171-1180. 1983]. При этом дифференцируется около 50% клеток, а остальные миобласты остаются в недифференцированном состоянии [N. Yoshida, S. Yoshida, K. Koishi, K. Masuda, Y. Nabeshima. Cell heterogeneity upon myogenic differentiation: down-regulation of MyoD and Myf-5 generates 'reserve cells. J. Cell Sci. Vol. 111. P. 769-779. 1998].
Данная клеточная линия является классической моделью для изучения механизмов дифференцировки миобластов и оценки влияния на нее фармакологических веществ. Известно, что флаваноид (-)-Epicatechin индуцируeт миогенную дифференцировку клеток линии С2С12 за счет индукции прегнан Х рецептора [M. Ortiz-Flores et al. PXR is a target of (-)-epicatechin in skeletal muscle. Heliyon. Vol. 6, N 10, e05357 (2020); doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e05357].
Известо, что альфа-магостин активирует миогенную дифференцировку миобластов [M. Lin, S. Zhou, K. Sakamoto. Alpha Mangostin promotes myogenic differentiation of C2C12 mouse myoblast cells. Biochemical and Biophysical Research Communications
Vol. 528, Is.1, 2020, P. 193-198. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2020.04.128].
Известно, что эпикатехин вызывает MyoD-зависимую дифференцировку миобластов и миогенную конверсию фибробластов [Lee S.J. et al. Epicatechin elicits MyoD-dependent myoblast differentiation and myogenic conversion of fibroblasts. Plos One. 2017. DOI: 10.1371 / journal.pone.0175271].
Техническим результатом изобретения является разработка простого, эффективного способа активации миогенной дифференцировки миобластов клеточной линии C2C12.
Для достижения технического результата выполнено следующее исследование.
2
Эксперимент был проведен in vitro на линии клеток мышиных миобластов С2С12, предоставленной Институтом биологии гена (Москва). Клетки культивировали при 37ºС и 5% содержании СО в инкубаторе WS-189C (World Science, Корея) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) (Sigma-Aldrich, Германия), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Германия), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich, Германия) соответственно. После достижения 70−90% конфлюентности клетки снимали с флакона добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Sigma-Aldrich, Германия), высевали в 6-луночные планшеты (Сorning, США).
Были сформированы следующие экспериментальные группы:
- клетки до дифференцировки – инкубация 7 дней с питательной средой, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (n=3);
- индукция дифференцировки миобластов – клетки инкубировали 7 дней с дифференцировочной питательной средой, содержащей 2% лошадиной сыворотки (Sigma-Aldrich, Германия), L-глутамин (4 мМ), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (n=3) [J. Sin et al. Mitophagy is required for mitochondrial biogenesis and myogenic differentiation of C2C12 myoblasts. Autophagy. Vol.12 (2), P. 369-380. 2016; doi: 10.1080/15548627.2015.1115172];
- индукция дифференцировки миобластов с добавлением этилметилгидроксипиридина сукцината (ЭМГПС) (Фармасофт, Россия) – клетки инкубировали 7 дней в дифференцировочной питательной среде, содержащей этилметилгидроксипиридина сукцинат в концентрации 10 мкМ в течение 7 дней (n=3).
Визуализацию клеток выполняли с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX-53 («Olympus», Япония).
7
После окончания экспозиции, клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich, США), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 минут при +4°С и постоянном перемешивании из расчета 10 клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, BeckmanCoulter, США).
Цитоплазматические белки (30 мкг) подвергали электрофорезу с использованием TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit (Bio-Rad, США) в буферной системе Laemmli (BioRad,США). Перед загрузкой образцы обрабатывались в соответствии с протоколом Bio-Rad, их смешивали с буфером для образцов Laemmli (Bio-Rad, США), содержащем 2,5% β-меркаптоэтанола (Bio-Rad, США) в соотношении 1:3, инкубировали 10 мин при температуре 70°C. Гели прогоняли при 100 В в течение 90 мин.
Для определения относительного количества миозина, α-актина, Myod, миогенина, методом вестерн-блот использовали первичные мышиные моноклональные антитела (sc-377460 MyoD (G-1) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США; sc-12732 myogenin (F5D) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США; sc-53092, MYH1/2/3 (N3.36) Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США; sc-53142, Smooth Muscle Actin (B4), Monoclonal Antibody, Santa cruz biotechnology,inc, США) в концентрации 1:200. Визуализацию первичных антител осуществляли с использованием вторичных кроличьих антител (Rabbit anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen) в разведении 1:4000.
Белки визуализировали хемилюминесценцией с помощью Chemi Doc XRS+ (Bio-Rad, США). Интенсивность полученных полос (бэндов) анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad, США).
Количество белков оценивали относительно содержания белка домашнего хозяйства GAPDH (первичные GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody (GA1R), DyLight 68, Invitrogen, США, разведение 1:1000, вторичные антитела - вторичные кроличьи антитела к первичным антителам GAPDH - Rabbitanti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, Invitrogen, США, разведение 1:4000).
Полученные результаты анализировали с помощью программ «Stat Soft Statistica 13.0» (США, номер лицензии JPZ811I521319AR25ACD-W) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). Результаты представлены в виде M±SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), множественные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Смена питательной среды, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, на среду с содержанием 2% лошадиной сыворотки запускало процесс дифференцировки миобластов. Клетки меняли свою форму: из отростчатых или веретенообразных они превращались в более вытянутые. В дальнейшем отдельные миобласты сливались и формировали миотубы - веретенообразные структуры длиной 100-600 мкм, шириной 30-50 мкм с несколькими ядрами. Максимально выраженные изменения наблюдались на 7 день (фиг. 1).
Добавление этилметилгидроксипиридина сукцината усиливало процесс дифференцировки миобластов клеточной линии С2С12. Большее количество клеток меняли форму и сливались в миотубы.
Данные морфологические изменения сопровождались следующей динамикой в уровне белков клеток (фиг. 2). Количество миозина в клетках линии С2С12 на 7 день эксперимента, при использовании обычной дифференцировочной среды и среды с добавлением этилметилгидроксипиридина сукцината статистически значимо увеличивалось по сравнению с показателями клеток до дифференцировки на 35,6% (р=0,004) и 64,4% (р=0,001) соответственно. В группах с тестируемыми веществами отличий от клеток на 7 день при использовании обычной дифференцировочной среды отмечено не было.
Уровень α-актина статистически значимо не отличался в клетках до и после дифференцировки. В то же время при использовании этилметилгидроксипиридина сукцината отмечалось увеличение содержания α-актина на 94,4 % (р=0,02) по сравнению с клетками до дифференцировки и на 62% (р=0,02) по сравнению с клетками на 7 день дифференцировки.
Содержание Myod (Myogenic determination gene number 1), который является главным регулятором миогенеза, в клетках линии С2С12 до дифференцировки и на 7 день дифференцировки не отличался. Однако, внесение в дифференцировочную питательную среду этилметилгидроксипиридина сукината приводило к увеличению количества Myod на 31,1 % (р=0,016) по сравнению с клетками до дифференцировки, а также на 19,1% (р=0,002) по сравнению с клетками на 7 день дифференцировки.
Количество миогенина, другого регуляторного белка, статистически значимо возрастало в клетках на 7 день при обычных условиях дифференцировки на 44,3% (р=0,02), а при добавлении этилметигидроксипиридина сукцината в питательную среду на 94,8% (р=0,007) по сравнению с клетками линии С2С12 до дифференцировки. Этилметилгидроксипиридина сукцинат также стимулировал увеличение количества миогенина по сравнению с клетками на 7 день в обычных условиях дифференцировки на 35% (р=0,03).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината 10 мкМ на дифференцировку клеток линии С2С12, х200. Фазово-контрастная микроскопия.
#
Фиг. 2. Относительное количество Myod, миогенина, миозина, актина в клетках линии С2С12 при воздействии этилметилгидроксипиридина сукцината в концентрации 10 мкМ в течение 7 дней.  Примечание: статистически значимые отличия * - p<0,05 по сравнению с клетками до дифференцировки;  - p<0,05 по сравнению с клетками на 7 день дифференцировки
Таким образом, показано, что инкубирование клеточной линии С2С12 в дифференцировочной питательной среде с добавлением этилметилгидроксипиридина сукцината до достижения концентрации в среде 10 мкМ в течение 7 дней ускоряет процесс миогенной дифференцировки миобластов, о чем свидетельствуют морфологические изменения клеток, а также повышение уровня специфических мышечных белков α-актина, миозина и факторов миогенной дифференцировки – MyoD и миогенина.