СПОСОБ РАННЕГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЗАДЕРЖКИ РОСТА ПЛОДА
METHOD FOR EARLY PREDICTION OF FETAL GROWTH RETARDATION

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и перинатологии, и может найти широкое применение для раннего (в 6-9 недель беременности) прогнозирования задержки роста плода (ЗРП).
ЗРП является серьезным осложнением беременности, приводящим к высокой перинатальной заболеваемости и смертности. Частота этой акушерской патологии не снижается до настоящего времени и составляет в разных странах от 5 до 40% (Стрижаков А.Н., Макацария А.Д., Тимохина Е.В., Баймурадова С.М., Козлова У.А. Клиническое значение приобретенных и наследственных форм тромбофилий в патогенезе синдрома задержки роста плода // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2009. Т. 8, №2. С. 16-21; Dessi A., Ottonello G., Fanos V., J. Physiopathology of intrauterine growth retardation: from classic data to metabolomics // Matern. Fetal Neonatal. Med. 2012. Vol. 25(5). P. 13-18; Sharma D., Shastri S., Sharma P. Intrauterine Growth Restriction: Antenatal and Postnatal Aspects // Clin. Med. Insights Pediatr., 2016. Vol. 10. P. 67-83; Kady S.M., Gardosi J. Perinatal mortality and fetal growth restriction // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 2004. Vol. 18. P. 397-410; Leitner Y., Harel S., Geva R., Eshel R., Yaffo A., Many A. Neurodevelopmental outcome of children with intrauterine growth retardation: a longitudinal, 10-year prospective study // J. Child. Neurol. 2007. Vol. 22(5). P. 580-587). В настоящее время, несмотря на многочисленные исследования и определенные успехи, сохраняется трудность в раннем и объективном прогнозировании ЗРП, которое необходимо для совершенствования тактики лечения этой патологии. Вышеизложенное определяет актуальность разработки данного способа.
Среди известных в научно-медицинской и патентной литературе методов диагностики ЗРП можно отметить ультразвуковые исследования ряда фетометрических показателей в сопоставлении с нормальными показателями для определенного срока гестации, однако они информативны только в третьем триместре.
Для выявления ЗРП используется доплерометрическое картирование сосудов матки и определение состояния их кровоснабжения на основании индекса пульсации (Бунин А.Т., Федорова М.В. Синдром задержки развития плода: патогенез, клиника, диагностика и лечение // Акушерство и гинекология. 1988. №7. С. 74-78.). Известно также определение объемного кровотока в аорте плода, пупочной вене или внутренней сонной артерии с последующим анализом кривых скоростей кровотока (систоло-диастолическое отношение и индекс резистентности). Однако эти показатели неспецифичны и могут в одинаковой степени изменятся при разных патологических состояниях, в частности при преэклампсии (Сидорова И.С., Никитина Н.А. Современный взгляд на проблему преэклампсии: аргументы и факты // Акушерство и гинекология. 2013. №5. С. 10-16). Причем предикторная ценность всех этих способов прогнозирования ЗРП во второй половине беременности является низкой, так как остается мало времени для профилактики развития данной патологии.
Известен способ диагностики задержки роста плода (патент РФ №2172958, 2001) путем анализа периферической крови, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и определение аллеля PL-All гена гликопротеина IIIa при наличии которого диагностируют задержку внутриутробного развития плода. Недостатком данного способа является:
1. Сложность, невозможность проведения таких исследований в условиях обычных акушерских стационаров, не имеющих специального оборудования, необходимого для проведения полимеразных цепных реакций;
2. Невозможность осуществлять прогноз развития ЗРП, что затрудняет своевременное проведение лечебно-профилактических мероприятий.
3. Отсутствие сведений о точности способа.
В патенте РФ №2425379 (2011) предложен способ диагностики задержки роста плода путем определения в амниотической жидкости в сроки 16-19 недель беременности методом капиллярного электрофореза содержания аргинина и пролина, расчета коэффициента их отношения и при величине коэффициента, равного 3,2 и выше, диагностирования задержки роста плода.
Данный метод:
1. Инвазивен, используются околоплодные воды, взятые во втором триместре беременности, что может проводиться только высококвалифицированным специалистом, имеющим разрешение на проведение этой процедуры.
2. Диагностика в этом сроке не позволяет осуществить превентивные меры по предотвращению данной акушерской патологии.
3. Несмотря на утверждение о специфичности метода, не указана ее величина (в %), изменение содержания аминокислот в околоплодных водах в 16-18 недель гестации обнаружено и при преэклампсии (Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Палиева Н.В., Аллилуев И.А., Каушанская Л.В., Ларичкин А.В. Дисбаланс свободных аминокислот в околоплодных водах при преэклампсии // Акушерство и гинекология. 2019. №2. С. 60-67.).
+
+
+
3
Известен способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода (патент РФ №2526178, 2014), отличающийся тем, что с ранних сроков беременности определяют относительное содержание CD3/CD16CD56-лимфоцитов, уровень С-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) в венозной крови женщин. Вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле:
1
2
3
PI=-0,8911Х-0,0321Х-2,3669Х+11,0779,
1
+
+
+
где X - относительное содержание CD3/CD16CD56-лимфоцитов, %;
2
Х - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл;
3
Х - концентрация sTNF-R, нг/мл.
При PI<0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI>0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния.
К недостаткам способа относятся:
1. Многокомпонентность, сложный расчет, затрудняющий получение заключения о прогнозе.
+
2. Отсутствие сведений о точности и особенно специфичности способа, поскольку изменение многих иммунологических параметров в том числе используемых CD-лимфоцитов имеет место и при гестозе (патент РФ№2265221, 2005).
В патенте РФ №2540928, 2015 предложен способ прогнозирования развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени, по которому в периферической венозной крови после выделения ДНК проводят анализ генов факторов коагуляции. 20210G/A FII, 1691G/A FV и 10976G/A FVII. В случае выявления аллеля 10976G FVII и генотипа 10976GG FVII прогнозируют повышенный риск развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-й степени у беременных. При наличии комбинаций генотипа 20210GG FII и аллеля 10976А FVII; аллелей 20210G FII, 10976А FVII с генотипом 1691GG FV или аллелей 20210G FII и 10976А FVII прогнозируют низкий риск развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени.
К недостаткам этого способа можно отнести следующие:
1. Методическая сложность: выделение ДНК и анализ нескольких генов факторов коагуляции. Для их изучения необходима современная генетическая лаборатория.
2. Не проведены аналогичные аналитические исследования у женщин с плацентарной недостаточностью без формирования синдрома ЗРП. В то же время, такое осложнение гестации наблюдается довольно часто. Необходимо исключить в этом случае выявление аллеля 10976GFVII и генотипа 10976GGFVII, чтобы доказать роль в этих реакциях именно ЗРП.
3. Отсутствие сведений о точности способа.
Известен способ прогнозирования степени риска развития синдрома задержки роста плода (патент №2578386, 2016), включающий сбор аналитических, антропометрических данных, возраст матери при наступлении настоящей беременности, определение многочисленных клинических показателей и эхографических признаков, проводят бальную оценку выявленных показателей. При сумме баллов 1-30 определяют низкую степень риска развития синдрома задержки роста плода. При сумме баллов 55-70 - высокую степень риска.
Недостатком данного способа, как и некоторых приведенных уже способов, является:
1. Позднее определение прогностических показателей (только во II и III триместрах), повышение которых (в баллах) рассматривается как риск развития синдрома ЗРП, хотя в III триместре эта акушерская патология, особенно при высокой сумме баллов, может уже иметь место.
2. Чрезвычайная многочисленность прогностических параметров.
3. Отсутствие сведений о точности и специфичности способа.
4. Использование только относительных параметров снижает чувствительность способа.
Прототипом заявляемого изобретения выбран способ раннего прогнозирования синдрома задержки развития плода (патент РФ №2295132, 10.03.2007) путем исследования периферической венозной крови беременной женщины, отличающейся тем, что в 6-12 недель гестации определяют показатель содержания васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) и при его значениях, равных или меньших 20 пг/мл, прогнозируют развитие синдрома задержки развития плода.
К недостаткам данного способа можно отнести:
1. Необходимость оборудования для иммуноферментного анализа, которое зачастую отсутствует в акушерских стационарах некрупных городов.
2. Недостаточные точность (81,25%) и специфичность (87,5%).
3. Изменение показателя этого важного фактора роста, связанное с дисфункцией эндотелия, в I триместре гестации имеет место и при других осложнениях беременности, в том числе угрозе прерывания беременности, гестозе, плацентарной недостаточности, для которых также характерна эндотелиальная дисфункция (Орлов А.В. Скрининговые маркеры физиологической и осложненной беременности // Автореф. дис.…докт. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2006. 48 с; Зенкина З.В., Линде В.А., Друккер Н.А., Некрасова М.Г., Шкотова Е.О., Ганиковская Ю.В. Дисбаланс биологически активных веществ околоплодных вод и его значение в патогенезе поздних преждевременных родов // Материалы XV Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». Москва, 2014. С. 61-62.).
В связи с этим специфичность способа прогноза, основанного на определении только этого фактора невелика.
Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.
Задачей изобретения является разработка высокоинформативного способа, позволяющего в 6-9 недель прогнозировать задержку роста плода.
Поставленная задача решается следующим образом: в периферической венозной крови женщины определяют уровень карбонильных производных и при его величине выше 1,9 мкмоль/л прогнозируют задержку роста плода с точностью 98%.
Технический результат, получаемый в ходе использования изобретения, состоит в повышении точности и специфичности прогнозирования задержки роста плода, что позволяет своевременно проводить превентивную терапию этой патологии до появления клинических признаков.
Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать развитие задержки роста плода по однократному определению в периферической венозной крови женщин в 6-9 недель беременности содержания карбонильных производных.
В сложной цепи нарушений, приводящих к развитию задержки роста плода, важное значение имеют молекулярно-биохимические изменения в системе мать-плацента-плод, происходящие в результате различных внешних или внутренних причин, в том числе в результате внутриутробной гипоксии, которая по данным литературы имеет место при ЗРП (Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Авруцкая В.В., Каушанская Л.В., Дурницына О.А. Нарушение плацентарного обмена аминокислот при задержке роста плода // Биомедицинская химия. 2017. Т. 63, №3. С. 266-271). Во многом метаболические повреждения во время осложнившейся беременности определяются нарушением состояния белков, выполняющих многочисленные регуляторные функции и являющихся той «молекулярной машиной», которая реализует информационную программу клеток. Повреждение структуры белков в условиях гипоксии проявляются в их окислительной модификации, окисленные формы белков служат ранними маркерами повреждения клеток. Одной из основных реакций окисления белков является карбонилирование (Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб.: Изд-во «Медицинская пресса», 2006. 400 с). Поскольку карбонилированию способны подвергаться различные белки, обладающие ферментативной и гормональной активностью, а также выполняющие трофические функции, спектр реакций, регулируемых ими, достаточно широк.
Поэтому изменение степени окислительного карбонилирования белков, проявляющееся в повышении уровня карбонильных производных, может явиться одним из патогенетических механизмов формирования и дальнейшего развития задержки роста плода.
Нами установлены прогностические параметры развития данной акушерской патологии беременности в 6-9 недель по определению в периферической венозной крови уровня карбонильных производных и при его величине выше 1,9 мкмоль/л прогнозируют развитие задержки роста плода.
Подробное описание способа и примеры его клинического использования.
Способ осуществляется следующим образом.
3
-1
-1
У беременных женщин, обследуемых в рамках программы «Акушерский мониторинг», проводимый в амбулаторно-консультативном отделении НИИ акушерства и педиатрии ФБОУ ВО «РостГМУ» Минздрава России для прогнозирования возможного развития осложненной гестации, включая задержку роста плода, утром натощак производят забор периферической венозной крови. Для анализа используют сыворотку крови, полученную после центрифугирования цельной крови 5-10 минут при 1500 об/мин (достаточно 0,1 мл), разбавленную физиологическим раствором в соотношении 1:5. При анализе окислительной модификации белков контрольная и опытная пробы содержат 0,05 мл разбавленной сыворотки и 0,95 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 7,4). После 10 минут инкубации при 37° на водяной бане в опытные пробирки приливают по 1 мл 0,01 М раствора 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ). В контрольные пробы добавляют вместо 2,4-ДНФГ равный объем 2М раствора HCl. Для осаждения белков в каждую пробу вносят по 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Далее осадок промывают смесью этилового спирта и этилацетата в соотношении 1:1. Полученный осадок растворяют в 3 мл 8 М раствора мочевины. В результате окислительной модификации белков появляются карбонильные производные, которые в присутствии 2,4-ДНФГ образуют 2,4-динитрофенилгидразоны. Оптическую плотность образовавшегося соединения регистрируют спектрофотометрически при длине волны 363 нм. Расчет уровня карбонильных производных проводят, используя коэффициент молярной экстинкции 22×10 Мсм (Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма // Методические рекомендации. СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. 104 с.). Результаты выражают в мкмоль/л. Время выполнения анализа - 1,2 часа.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1: пациентка К-ва, 22 года. Обследовалась в амбулаторно-консультативном отделении НИИАП. Обратилась в первом триместре беременности по поводу угрозы невынашивания, проявляющейся тянущими болями внизу живота. При УЗ исследовании отмечался гипертонус шейки. При лабораторном исследовании венозной крови женщины в 6 недель беременности было установлено содержание карбонильных производных, равное 2,0 мкмоль/л, что свидетельствовало о возможности развития задержки роста плода. В связи с этим пациентка была отнесена к группе риска по формированию данного осложнения беременности и продолжала наблюдаться в амбулаторно-консультативном отделении. В сроке 33 недели беременности УЗ исследования выявлено ЗРП. Женщина была госпитализирована в стационар, наблюдалась и получала терапию в соответствии со стандартом оказания медицинской помощи. Беременность завершилось срочными родами в сроке 39-40 нед. и рождением доношенного ребенка с массой тела 2800 г, ростом 50 см, оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Диагноз ребенка при рождении - ЗРП.
Пример 2: пациентка А-о, 24 года. Обратилась в амбулаторно-консультативное отделение НИИАП в 8 недель беременности с отягощенным акушерским анамнезом: медицинский аборт, вегетососудистая дистония по гипотоническому типу, аутоиммунный тиреоидит, гипотиреоз. При лабораторном исследовании крови выявлено, что уровень карбонильных производных был равен 1,9 мкмоль/л, что свидетельствует об отсутствии прогноза задержки роста плода. В течение всего периода гестации пациентка наблюдалась в амбулаторно-консультативном отделении. В 31-ю неделю беременности при УЗИ размеры плода соответствовали гестационному сроку. Беременность завершилась срочными родами в сроке 39-40 недель и рождением живого доношенного ребенка с массой тела 3410 г, ростом 51 см, оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. Диагноз при рождении: здоров.
По заявляемому способу обследованы 64 женщины, у которых в 6-9 недель беременности в венозной крови определено содержание карбонильных производных. Из обследованных пациенток у 16 уровень карбонильных производных был выше 1,9 мкмоль/л. Из них у 15 развилась ЗРП и лишь у одной развития этой патологии не происходило. У 48 беременных содержание карбонильных производных было 1,9 мкмоль/л и ниже, и во всех случаях ЗРП отсутствовала. Анализ полученных величин показал, что истинно-положительный результат имел место в 15 случаях, ложно-положительный - в одном случае, истинно-отрицательный результат был в 48 случаях, ложно-отрицательный отсутствовал.
Из приведенных данных следует, что точность и специфичность способа - 98%. Вышеизложенное подтверждает прогностическую ценность метода. Таким образом, заявляемый способ более эффективен по сравнению с известными, и обладает рядом преимуществ:
1. Высокая точность и специфичность - 98%.
2. Доступность применения способа в широкой клинической практике.
3. Быстрота получения результатов исследования.
4. Возможность раннего прогнозирования ЗРП.
Апробация заявляемого изобретения проведена на достаточном по объему клиническом материале, что подтверждает работоспособность метода.
Заявляемый способ прогнозирования задержки роста плода позволяет своевременно проводить превентивную терапию этой акушерской патологии, что в конечном итоге будет благоприятно влиять на перинатальные исходы и снижение заболеваемости новорожденных.