СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИКАХЕКСИЧЕСКИМ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ СВОЙСТВАМИ И СНИЖАЮЩЕЕ УРОВЕНЬ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
AGENT POSSESSING ANTI-CACHEXIC, ANTI-TUMOUR PROPERTIES AND REDUCING ENDOGENOUS INTOXICATION LEVEL

Изобретение относится к медицине, фармацевтической промышленности и онкологии, а именно к созданию лекарственных средств на основе новогаленового препарата, для лечения опухолевых заболеваний и раковой кахексии и снижения эндогенной интоксикации. Изобретение позволяет существенно ослабить симптомы кахексии, не оказывает побочных эффектов, способствует набору массы тела и дает возможность продолжения лечения противоопухолевыми препаратами.
Кахексия - это состояние, сопровождающееся неконтролируемой потерей веса, анемией, отеками, потерей аппетита и т.д. (Uomo et al., J Pancreas (Online) 2006; 7(2): 157-162). Четко сформулированного определения кахексии до сих пор не существует, известно только, что «Пациенты с развитой кахексией отличаются анорексией, чувством быстрого насыщения, тяжелой потерей веса, слабостью, анемией и отеками. <…> Плохое физическое состояние при кахексии может быть связано со многими факторами, включая потерю массы тела, сниженное потребление пищи, а также утомляемостью или депрессией» (Fearon et al. Am J Clin Nutr 2006; 83: 1345-50).
Кахексия может развиваться при некоторых хронических заболеваниях, таких как злокачественные опухоли, туберкулез, диабет, болезни крови, патология эндокринной системы, инфекциях и синдроме приобретенного иммунодефицита. Более того, развивающееся при злокачественной опухоли истощение прогрессирует на фоне эффективного лечения из-за побочных эффектов противоопухолевых препаратов, в том числе и миелотоксичности (Dewys WD et al. Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Med 1980; 69: 491-7; Steinborn С, Anker SD, Basic Appi Myol 13 (4): 191-201, 2003; Morley JE et al., Am J Clin Nutr 2006, 83: 735-43).
Лечение кахексии - это очень сложный процесс, так как по мере ее развития пациент ослабевает, возникают метаболические расстройства, нарушаются механизмы неспецифической резистентности и иммунитета. В связи с этим, продолжение лечения противоопухолевыми лекарствами, которые, как правило, отличаются высоким уровнем токсичности, может оказаться невозможным.
Таким образом, кахексия часто становится одним из основных препятствий для проведения лечения злокачественного новообразования.
Применение белковых и других пищевых добавок для лечения кахексии может провоцировать прогрессирование злокачественной опухоли из-за того, что аминокислоты являются строительным материалом и, в первую очередь, для быстро делящихся опухолевых клеток и сократить продолжительность жизни пациента.
Известен препарат «Пиндолол», который рекомендуется использовать для стимуляции прибавления массы тела и профилактики потери веса у пациентов, страдающих хроническими заболеваниями, включая злокачественные опухоли (RU 2485950). Действие данного препарата, содержащего β-адреноблокатор, основано на снижении активности симпатической нервной системы. Недостатками данного средства является то, что он способствует улучшению только психологического состояния пациентов и увеличивает их аппетит, но не влияет на основную причину развития опухолевой кахексии - интоксикацию, вызванную активным метаболизмом опухолевой ткани. Таким образом, препарат является симптоматическим, а не патогенетическим средством. Кроме того, «Пиндолол» имеет огромный список побочных эффектов: бессонница, утомляемость, слабость, нарушение пищеварения и др., которые при длительном применении препарата обеспечивают обратный эффект - прогрессирование кахексии.
Известно, что применение березового гриба (Чаги или Трутовика скошенного - Inonotus obliquus) в медицинской практике в составе симптоматического средства, облегчающего состояние раковых больных, достигается болеутоляющим эффектом и снимает явления истощения (RU 111909). Настой применяется при злокачественных опухолях всех локализаций, но наилучший эффект наблюдается при раке желудка, легких и других органов, богато снабженных кровеносными сосудами. Лекарство менее эффективно при локализации опухоли в костях, коже, головном мозге. Недостатком указанного средства является тот факт, что данное лечение также является симптоматическим. Отвары и настои чаги только улучшают самочувствие больных, уменьшают боли, но не избавляют от опухоли. Препарат имеет и противопоказания: его не рекомендуется употреблять при заболеваниях, сопровождающихся задержкой жидкости в организме. Кроме того, при использовании данного средства, запрещается внутривенное введение глюкозы и применение пенициллина, что может привести к нежелательным побочным эффектам. Установлено, что при длительном применении чаги у некоторых больных отмечалась повышенная возбудимость вегетативной нервной системы, хотя при уменьшении дозы препарата или его полной отмене это явление постепенно исчезало (Саакян К.Р., Ващенко К.Ф., Дармограй Р.Е. Чага (черный березовый гриб) Обзор).
Известен препарат «Целекоксиб», изобретение относится к использованию ингибиторов циклооксигеназы-2 ("СОХ-2 ингибиторы") для лечения и профилактики опухолей, нарушений, связанных с опухолями и кахексии (RU 2190399). Действие основано на способности СОХ-2 ингибировать продуцирование провоспалительных цитокинов, особенно IL-1 и TNF-α, и лейкотриенов, в частности LTB4, а также ингибировать костную резорбцию и оказывать анальгетический, противовоспалительный и антипиретический эффекты. Недостатками данного средства являются его побочные эффекты, а именно высокий риск желудочно-кишечных осложнений, включая кровотечение, изъязвление и перфорацию желудка или кишечника. Эти осложнения могут возникнуть в любое время применения НПВС без предвещающих симптомов, возможен фатальный исход. Более высокий риск серьезных осложнений со стороны ЖКТ имеют пожилые пациенты, вероятность проявления этих осложнений повышается также при длительном применении. У пожилых пациентов с кахексией при явлениях сердечной недостаточности и при нарушении функции печени - лечение необходимо начинать с минимальных доз. То есть применение препарата у лиц с уже развившейся кахексией имеет серьезные ограничения.
Известен метод лечения потери мышечной массы путем включения в рацион дополнительного количества аминокислот, стимулирующих анаболические процессы в скелетных мышцах. Например, в патенте US Patent Application Publication No. 2004/0122097 Verlaan et al. описали питательные добавки, содержащие лейцин и белок, стимулирующие формирование мышечных тканей. Предшественники лейцина, такие как пируват, и метаболиты, такие как β-гидрокси-β-метилбутират и α-кетоизокапроат, проявляют свойства, подобные лейцину. Следует заметить, что β-гидрокси-β-метилбутират не производится человеком в каких-либо клинически значимых количествах и, следовательно, должен пополняться. Главный недостаток этого метода в том, что он противопоказан для лечения кахексии, развившейся на фоне злокачественных новообразований, так как введение в рацион аминокислот будет способствовать прогрессированию роста опухоли.
Таким образом, в настоящее время все существующие средства для лечения кахексии обладают рядом серьезных недостатков:
1) большое количество побочных эффектов;
2) только симптоматическое лечение;
3) длительное использование еще более усугубляет кахексию.
Кроме того, ни один противоопухолевый препарат не только не обладает противокахексическим эффектом из-за собственной токсичности, но и наоборот, усугубляет истощение организма.
Бессмертник песчаный (Helichrysum arendrium (L.) MOENCH) - многолетнее травянистое растение, семейства Сложноцветные. Естественный ареал - практически вся территория Европы и Средняя Азия. В России встречается в Европейской части, Западной Сибири, на Кавказе. В народной медицине бессмертник песчаный применяют при гастритах, запорах, колитах, используют как печеночное средство, для регуляции желчеобразования и желчевыделения, назначение препаратов бессмертника оправдано при начальных стадиях желчнокаменной болезни. (http://www.rasteniya-lecarstvennie.ru/102-lekarstvennoe-rastenie-bessmertnik-peschanyj.html).
В экспериментах на крысах установлено влияние водных экстрактов бессмертника песчаного на уровень индуцированного диоксидином перекисного окисления липидов в крови. Выявлена способность экстракта бессмертника снижать содержание молекул средней массы на 18% (МСМ) и малонового диальдегида на 49% (МДА) только при внутримышечном введении. Однако эти данные свидетельствуют о снижении перекисного окисления под действием внешнего фактора. Авторами не была изучена степень выраженности эндогенной интоксикации при введении экстракта на фоне опухолевого процесса, а также влияние его на уровень гидроперекисей липидов, не была показана эффективность неинвазивного перорального метода введения препарата (Курчатова М.А., Дурнова Н.А., Афанасьева Г.А., Экспериментальная и клиническая фармакология. Том 78, №7 (2015) 2015).
Ранее нами была установлена противоопухолевая активность экстракта бессмертника при внутримышечном ведении (Скворцова В.В., Наволокин Н.А., Bulletin of Medical Internet Conferences. Volume 3. Issue 2 2013.), но не был отмечен антикахексический эффект и эффективность действия экстракта при пероральном введении.
Технической задачей настоящего изобретения является расширение арсенала отечественных средств на основе природного растительного сырья комплексного действия, обладающих способностью снижать или предотвращать развитие опухолевой кахексии, в том числе за счет этиотропного (противоопухолевой активности) и патогенетического воздействий (снижения эндогенной интоксикации).
Преимуществами предлагаемого нового антикахексического лекарственного средства, созданного на основе экстракта бессмертника, служат низкая токсичность, доступность сырья, из которого получают средство, а также широкий спектр положительных эффектов.
Так, препарат обладает собственным противоопухолевым эффектом (снижение темпов роста опухоли). Одним из патогенетических механизмов лечебного эффекта является снижение выраженности эндогенной интоксикации, что подтверждается уменьшением уровней малонового диальдегида (МДА), гидроперекисей липидов (ГПЛ), молекул средней массы (МСМ), накапливающихся в крови при опухолевом росте. В работе продемонстрированы возможности как перорального, так и внутримышечного способов введения препарата.
Нами впервые установлено новое антикахексическое свойство средства. Новое антикахексическое лекарственное средство представляет собой упаренный экстракт цветков и листьев бессмертника песчаного, полученный путем их измельчения, экстракцией спиртом 96%, выпариванием экстракта, добавлением хлороформа, центрифугированием и разделением на водную и хлороформную фракции, с последующим удалением хлороформной фракции. Экстракцию спиртом проводят на водяной бане до кипения и кипятят в течение 14-15 минут, выпаривают при температуре 55-60°C. Выпаренный экстракт разводят сначала дистиллированной водой 40-50°C, затем добавляют хлороформ в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, далее отделяют водную фракцию и высушивают ее (RU 2482863).
Средство представляет собой упаренный вязкий прозрачный экстракт с приятным терпким резким запахом, светло желтого цвета, смешивается с водой и спиртом этиловым в любых соотношениях и имеет следующий химический состав: нарингин и его растворимый агрегат, прунин, кверцетин, апигенин и нарингенин, а также 5-О-глюкозид апигенина и изосалипурпозид. Методом молекулярной абсорбционной спектроскопии установлено, что экстракт содержит 73.48 мг флавоноидов в пересчете на рутин или 17.94 мг в пересчете на кверцетин на 1 г сухой массы экстракта, что составляет 20.99% и 5.13% соответственно.
Полученный таким образом экстракт представляет собой биологически активную композицию, с новыми фармакологическими свойствами, а именно противоопухолевым, антиоксидантным и ранее не известными как для растения бессмертника песчаного, так и для описанного выше средства противокахексическим эффектом.
Параметры подлинности и качества средства.
Сбор материала. Материалом служило сырье бессмертника песчаного (цветки), собранное в Лысогорском районе Саратовской области в окрестностях с. Атаевка в июле 2014 г. Высушенные листья и цветки бессмертника песчаного предварительно измельчали для более полной экстракции.
По сравнению с получаемыми ранее водными и спиртовыми извлечениями из травы бессмертника, полученный нами упаренный экстракт цветков и листьев бессмертника нетоксичен, что обусловлено химическим составом и подтверждено ранее на крысах [Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., 2013, 2014].
Нами впервые была проведена экспериментальная работа по установлению антикахексического и противоопухолевого эффекта.
В эксперименте, проводимом в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.], использовано 30 самцов белых лабораторных крыс массой 150±50 гр, которым имплантировали подкожно, в области лопатки, по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма саркомы-45, полученного из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Животные с перевиваемой саркомой методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс - первую и вторую опытные, получавшие экстракт бессмертника перорально и внутримышечно в дозировке 1 г/кг и третью - группу сравнения, животные с перевиваемой опухолью, но без воздействия. В опытных группах крысам раствор вводили перорально (в одной группе) и внутримышечно (во второй), ежедневно, в течение двух недель, начиная через 78 часов после трансплантации опухоли.
3
контр
опыт
контр
контр
опыт
Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=A×B×C/1000 (мм), где А - ширина, В - толщина, С - высота опухоли в мм. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждые день от начала эксперимента. Высчитывали индекс торможения роста опухоли (ИТРО) - показатель эффективности противоопухолевого препарата, вычисляли по формуле: ИТРО [(М-М)/М]*100%, где М - средняя масса опухоли в группе контроль, а М - опытной группы.
истинная
животного
3
Также каждый день животное взвешивали, для оценки динамики массы тела. Для более объективного анализа результатов высчитывали истинную массу животных (с вычетом теоретической массы опухоли): М=М-Vp, где М - это масса при взвешивании, V - объем опухоли, р - плотность прививаемой саркомы (0,83 г/см).
Изменение динамики роста опухоли.
3
В группе сравнения объем прививаемой опухоли к концу эксперимента составил 25,58±3,72 см.
3
3
При внутримышечном введении экстракта бессмертника отмечали статистически значимое (р<0.005) замедление темпов роста перевиваемой саркомы по сравнению с контролем с 10 дня эксперимента. На момент окончания эксперимента объем опухоли в группе с внутримышечным введением бессмертника составлял 7,66±1,37 см, т.е. был на 70% меньше, чем в группе сравнения - 25,58±3,72 см (р<0.005). ИТРО по массе в среднем составил 47,8% (Фиг. 1).
3
При пероральном ведении экстракта бессмертника наблюдали статистически значимое (р<0.05) замедление темпов роста опухоли по сравнению с группой сравнения, начиная с 9 дня. На момент окончания эксперимента объем опухоли в исследуемой группе был на 64,6% меньше объема опухоли группы сравнения - 9,05±2,96 см. ИТРО по массе опухоли составил 49,3% (Фиг. 1).
Динамика дельты массы тела животных с перевиваемой опухолью.
Измерение проводилось следующим путем: сначала высчитывалась теоретическая массы перевиваемой саркомы (объем опухоли умножался на плотность), затем для получения более объективных данных производилось вычитание из общей массы крысы теоретической массы опухоли, в результате получалась истинная масса животного. Далее высчитывали дельту массы тела животных в каждый день эксперимента, по формуле: масса животного в день эксперимента минус масса животного до начала эксперимента.
При оценке динамики дельты истинной массы тела животных в группе сравнения отмечали тенденцию к развитию опухолевой кахексии: животные похудели в ходе эксперимента на 18%.
При введении экстракта бессмертника как пероральным, так и внутримышечным путем, наблюдали стабильность массы и небольшое, но стабильное, ее увеличение по ходу всего эксперимента. На конец эксперимента были получены следующие результаты:
- истинная масса тела животных в группе с пероральным путем введения экстракта бессмертника увеличилась на 11,9% относительно массы на момент начала эксперимента (Фиг. 2);
- истинная масса тела крыс в группе с внутримышечным путем введения экстракта бессмертника увеличилась на 11,8% относительно массы на момент начала эксперимента (Фиг. 2).
Нами была проведена экспериментальная работа по изучению влияния экстракта бессмертника на уровень эндогенной интоксикации (содержание маркеров оксидативного стресса в плазме крови) на фоне опухолевого роста
Опухолевый процесс моделировали путем подкожного введения 25% взвеси клеток альвеолярного рака печени (РС-1) (банк опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН). Через 1,5 месяца после перевивки опухоли животных разделили на 3 группы (по 6 животных в группе): группа сравнения - с опухолью без воздействия и две группы животных с опухолью при однократном внутримышечном и пероральном введениях экстракта бессмертника песчаного в дозировке 1 г/кг.
Животные выводились из эксперимента через сутки после введения экстракта. Степень выраженности эндогенной интоксикации и активности процессов перекисного окисления липидов, развивающейся на фоне опухолевого процесса, оценивали по содержанию МДА, ГПЛ и МСМ в сыворотке крови крыс с использованием спектрофотометрических методов исследования.
Были получены следующие результаты.
В группе сравнения показатели МСМ составили 0,3085 (0,15-0,44) (U/ml); МДА32,2964 (27,93-35,03) (pmol/mL); ГПЛ - 5,88 (3,07-16,98) (U/ml).
В сыворотке крови животных с опухолевым процессом при пероральном введении экстракта бессмертника отмечается снижение МСМ - на 5%, МДА - на 95%, ГПЛ - на 44% по сравнению с соответствующими показателями группы животных с опухолью без введения изучаемого препарата.
В группе с использованием внутримышечного способа введения экстракта бессмертника отмечается снижение МСМ - на 29%, МДА - на 95%, ГПЛ - на 40,5% по сравнению с показателями животных с опухолью без введения препарата бессмертника.
Таким образом, введение экстракта бессмертника значительно снижает интенсивность процессов липопероксидации, уровень промежуточных продуктов свободнорадикального окисления липидов в сыворотке крови животных, что свидетельствует о снижении степени выраженности эндогенной интоксикации. Кроме того, установлено, что экстракт способен снижать уровень ГПЛ в сыворотке крови животных. Ранее не был описан указанный эффект препаратов на основе бессмертника и, в частности, экстракта, полученного описанным способом.
Пример 1.
Для эксперимента был взята белая лабораторная крыса-самец, которой имплантировали подкожно в области лопатки 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма саркома-45, полученного из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Через 3 суток после перевивки экспериментальному животному в течение 12 дней перорально вводился экстракт бессмертника в дозировке 1000 мг/кг.
3
Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=A×B×C/1000, где А - ширина, В - толщина, С - высота опухоли в мм. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждые день от начала эксперимента. Также каждый день животное взвешивали, для оценки динамики массы тела. Для более объективного анализа результатов высчитывали истинную массу животных (с вычетом теоритической массы опухоли): Масса истинная =M-Vp, где М - это масса при взвешивании, V - объем опухоли, р - плотность привитой опухоли (0,83 г/см).
Были получены следующие данные.
Динамика массы тела (г): 1 день - 106; 2 день -108; 3 день - 107; 4 день - 108; 5 день - 111; 6 день - 115,5; 7 день - 117; 8 день - 121; 9 день - 125; 10 день - 127; 11 день - 129; 12 день - 131; 13 день - 133. В результате отмечали тенденцию к увеличению массы тела крысы с начала лечения к концу эксперимента.
3
Динамика объема опухоли (см): 1 день - 0,37; 2 день - 0,42; 3 день - 0,51; 4 день - 0,62; 5 день - 0,68; 6 день - 0,79; 7 день - 1,54; 8 день - 2,1; 9 день - 4,21; 10 день - 5,9; 11 день - 9,56; 12 день - 12,2; 13 день - 14,1. Таким образом, опухоль продолжала расти, однако вводимый экстракт замедлял темп роста опухоли, по сравнению со стандартной динамикой роста саркомы 45.
Динамика массы тела с вычетом теоретической массы опухоли (г): 1 день - 105,7; 2 день - 107,6; 3 день - 106,65; 4 день - 107,5; 5 день - 110,4; 6 день - 114,3; 7 день - 115,7; 8 день - 119,2; 9 день - 121,5; 10 день - 122,1; 11 день - 121,6; 12 день - 120,8; 13 день - 121,7. В результате, несмотря на тот факт, что у данного животного была привита саркома-45, а, как известно, злокачественные новообразования приводят к кахексии, крыса, получавшая экстракт бессмертника, набирала массу тела. При этом если вычесть массу опухоли в конце эксперимента из массы крысы, то остается прирост массы тела относительно веса крысы до эксперимента. Также имелась тенденция к замедлению темпов роста самой опухоли у данного животного, по сравнению с описанным выше стандартным ростом саркомы 45.
Пример 2.
Для эксперимента был взята белая лабораторная крыса-самец, которой имплантировали подкожно в области лопатки 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма альвеолярного рака печени (РС-1). Через 1,5 месяца после перевивки опухоли животному однократно внутримышечно ввели экстракт бессмертника песчаного в дозировке 1 г/кг. Затем вывели из эксперимента через сутки после введения экстракта. Степень выраженности эндогенной интоксикации и активности процессов перекисного окисления липидов, развивающейся на фоне опухолевого процесса, оценивали по содержанию МДА, ГПЛ и МСМ в сыворотке крови крысы с использованием спектрофотометрических методов исследования.
Были получены следующие результаты.
У крысы показатели МСМ составили 0,15 (U/ml); МДА - 1,52 (pmol/mL); ГПЛ -3,5 (U/ml).
В результате, по сравнению с описанным выше значениями продуктов ПОЛ у животных с раком печени, введение экстракта бессмертника привело к снижению продуктов ПОЛ (МДА, ГПЛ и МСМ), несмотря на тот факт, что у данного животного был привит рак печени, а, как известно, злокачественные новообразования приводят к интоксикации.
Таким образом, как видно из описания и примеров, средство, представляющее собой сухой экстракт цветов и листьев бессмертника песчаного, полученного вышеописанным способом, обладает антикахексическим и противоопухолевым свойствами и снижает эндогенный уровень интоксикации. Применение экстракта на всем протяжении эксперимента не приводит к формированию резистентности и способствует увеличению массы тела животных и снижает темпы роста опухоли. Особенностью данного препарата является одновременное его воздействие на причину развития кахексии и механизм ее развития, что может быть весьма перспективным для лечения кахексии у онкологических больных, так как не является токсичным и обладает собственной противоопухолевой активностью.