СПОСОБ ОЧИСТКИ ВИТАМИН-К-ЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ, ТАКИХ КАК КОАГУЛЯЦИОННЫЙ ФАКТОР IX

1. Способ производства витамин-К-зависимого белка без содержания прионов с последовательными стадиями очистки, включающими хроматографию, отличающийся тем, что
- по меньшей мере, одну стадию хроматографии выполняют с использованием мультимодальной смолы,
- обеспечивают фракцию, содержащую витамин-К-зависимый белок в водном растворе,
- фракцию, содержащую витамин-К-зависимый белок, приводят в контакт с мультимодальной смолой при рН 6-9;
- мультимодальную смолу со связанным витамин-К-зависимым белком необязательно промывают водным промывочным буфером с целью удаления примесей и задержки витамин-К-зависимого белка перед элюированием витамин-К-зависимого белка,
- витамин-К-зависимый белок элюируют с мультимодальной смолы при рН 6-9 буфером, содержащим аргинин, и
- необязательно осуществляют сбор фракций, содержащих витамин-К-зависимый белок, в очищенной или обогащенной форме.
2. Способ по п.1, где витамин-К-зависимый белок представляет собой FIX, происходящий из плазмы крови, или рекомбинантно полученный FIX.
3. Способ по п.1 или 2, в котором мультимодальная смола содержит части, связанные с матрицей, и эти части способны взаимодействовать с витамин-К-зависимым белком в водном окружении с помощью ионных взаимодействий и взаимодействий другого типа, таких как водородная связь, гидрофобные или тиофильные взаимодействия.
4. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что водный раствор содержит витамин К-зависимый белок в растворе соли проводимостью, соответствующей от приблизительно 5 до приблизительно 200 мСм/см при 25°С и/или в элюирующем буфере с проводимостью, соответствующей от приблизительно 5 до приблизительно 200 мСм/см при 25°С.
5. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что аргинин присутствует в концентрациях 0,1-0,3 и 0,7-1М, в частности 0,3-0,7М.
6. Способ по п.5, отличающий тем, что витамин-К-зависимый белок элюируют буфером с рН от приблизительно 6 до приблизительно 9, в частности с рН от приблизительно 6 до приблизительно 8 или с рН 7.
7. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что элюирующий буфер дополнительно содержит агенты, выбранные из группы, состоящей из органических соединений с, по меньшей мере, одной гидроксильной группой, таких как спирт, органических соединений с, по меньшей мере, одной аминогруппой, таких как аминокислота, по меньшей мере, одного соединения для регулирования ионной силы буфера, такого как неорганические соли, выбранного из группы, состоящей из хлорида натрия, фосфата натрия, сульфата натрия, хлорида калия, фосфата калия, сульфата калия, хлорида магния, хлорида кальция, хлорида бария, сульфата бария, сульфата аммония, по меньшей мере, одного неионного детергента, по меньшей мере, одного буферного вещества для регулирования рН от приблизительно 6 до приблизительно 9, в частности при приблизительно нейтральном значении, или их комбинаций.
8. Способ по п.7, отличающий тем, что указанный спирт выбран из группы, состоящей из метанола, пропанола, этиленгликоля и пропиленгликоля; неорганическая соль выбрана из группы, состоящей из KCl и NaCl; неионный детергент выбран из группы, состоящей из Tween 20, Tween 80 и Pluronic F68; буферное вещество выбрано из группы, состоящей из цитрата натрия, гистидина, HEPES, MES, Трис-основания и ацетата натрия при рН 6-9, цитрата натрия для выравнивания при рН 6-7,5 и Трис-основания для выравнивания рН в диапазоне 7,5-9.
9. Способ по п.1 или 2, где витамин-К-зависимый белок элюируют комбинацией хлорид натрия/этиленгликоль, или комбинацией аргинин/хлорид натрия, или комбинацией аргинин/этиленгликоль.
10. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что «мультимодальная» хроматографическая смола содержит, по меньшей мере, одно из следующих соединений:
а. положительно заряженный лиганд N-бензил-N-метилэтаноламина,
b. отрицательно заряженный лиганд 2-(бензоиламино)бутановой кислоты,
с. лиганд фенилпропила,
d. лиганд N-гексила,
е. лиганд 4-меркаптоэтилпиридина,
f. лиганд 3-((3-метил-5-((тетрагидрофуран-2-илметил)амино)фенил)амино)бензойной кислоты, или их комбинаций.
11. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что «мультимодальную» хроматографическую смолу выбирают из следующих коммерчески доступных смол: НЕР Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; МЕР Hypercel™.
12. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что стадия мультимодальной хроматографии объединена со стадией аффинной хроматографии витамин-К-зависимого белка, где аффинность обеспечивается лигандом на основе белка, экспрессированного в дрожжах, и чистота финального элюата составляет более 90%.
13. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что последовательность очистки дополнительно содержит стадии удаления/инактивации патогенов, включающие стадию химической инактивации, ультрафильтрацию, стадии хроматографии или их комбинации, где указанные стадии основаны на различных физиологических свойствах удаляемого патогена.
14. Способ по п.1 или 2, отличающий тем, что последовательность очистки дополнительно включает следующие стадии:
i. катионная мультимодальная смола, такая как Capto MMC;
ii. стадия химической инактивации вирусов с липидной оболочкой, в частности инактивация растворителем/детергентом, включающим три-N-бутилфосфат и Triton Х-100;
iii. аффинная смола на основе белкового лиганда, такого как лиганд, состоящий из экспрессированного в дрожжах фрагмента антитела к витамин-К-зависимому белку;
iv. стадия удаления патогена с помощью фильтрации со средним размером поры приблизительно 20 нм, такая как Planova 20N;
v. анионообменная смола, такая как Q Sepharose FF или Capto Q;
vi. стадия ультрафильтрации, такая как Pellicon 3, с пределом исключения 10 кДа.
15. Способ по п.14, отличающий тем, что стадия мультимодальной хроматографии объединена со стадией аффинной хроматографии, где аффинность обеспечивается лигандом на основе экспрессированного в дрожжах белка, и чистота финального продукта аффинной хроматографической смолы составляет более 95%.
16. Способ по п.15, отличающий тем, что выполняют дополнительную(ые) хроматографическую(ие) стадию(и), выбранную(ые) из эксклюзионной хроматографии, анионного обмена, катионного обмена, хроматографии гидрофобного взаимодействия и аффинной хроматографии на основе иммобилизованного металла, отличающийся тем, что чистота финального продукта составляет более 99%.