Способ in vitro выделения, амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот инфекционных агентов, набор

1. Способ in vitro выделения, амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот инфекционных агентов (возбудителей инфекции) из бесклеточной фракции биологической жидкости, включающий введение бесклеточной фракции биологической жидкости в контакте, по меньшей мере, с одним детергентом и, по меньшей мере, одним ферментом, расщепляющим нуклеиновые кислоты.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий экстракцию и секвенирование нуклеиновых кислот возбудителей инфекции.
3. Способ in vitro по п. 1 или 2, отличающийся тем, что включает стадии:
а) введения бесклеточной фракции биологической жидкости в контакт, по меньшей мере, с одним детергентом и, по меньшей мере, с одним ферментом, расщепляющим нуклеиновые кислоты,
б) экстракции нуклеиновых кислот возбудителей инфекции,
в) необязательно обратного транскрибирования геномных РНК возбудителей инфекции,
г) амплификации геномной ДНК и/или кДНК возбудителей инфекции и
д) секвенирования амплифицированной геномной ДНК и/или кДНК возбудителей инфекции.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором секвенирование нуклеиновых кислот возбудителей инфекции осуществлют методом секвенирования следующего поколения.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором возбудитель инфекции выбран из группы, включающий бактерии, грибы, вирусы, простейшие и паразиты.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором, по меньшей мере, один детергент выбран из группы, включающей неионогенный детергент и/или цвиттерионный детергент и/или анионный детергент, предпочтительно, по меньшей мере, одним детергентом является неионогенный детергент.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором, по меньшей мере, один детергент выбран из группы, включающей сапонин, Triton, NP-40, Tween и их производные.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором, по меньшей мере, одним детергентом является сапонин с содержанием сапогенина от около 5% до около 50%.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором, по меньшей мере, одним ферментом, расщепляющим нуклеиновые кислоты, является нуклеаза, обладающая активностью ДНКаз и/или РНКаз.
10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором, по меньшей мере, один фермент, расщепляющий нуклеиновые кислоты, выбран из группы, включающей включающей ДНКазу Baseline-ZERO, бензоназу, ДНКазу I, ДНКазу II, эндонуклеазу III, эндонуклеазу IV, эндонуклеазу V, эндонуклеазу VIII, экзонуклеазу I, экзонуклеазу III, экзонуклеазу V, экзонуклеазу VII, экзонуклеазу VIII, экзонуклеазу Т, лямбда-экзонуклеазу, микрококковую нуклеазу, нуклеазу золотистой фасоли, нуклеазу BAL-31, нуклеазу Р1, нуклеазу S1, Т4 эндонуклеазу V, Т5 экзонуклеазу, Т7 эндонуклеазу I и Т7 экзонуклеазу.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором присутствие остаточных клеток внутри фракции не влияет на доступность или обогащение возбудителя инфекции во фракции.
12. Набор, содержащий:
а) по меньшей мере, один детергент, выбранный из группы, включающей сапонин, Triton, NP-40, Tween или их производное;
б) по меньшей мере, один расщепляющий нуклеиновые кислоты фермент, выбранный из группы, включающей включающей ДНКазу Baseline-ZERO, бензоназу, ДНКазу I, ДНКазу II, эндонуклеазу III, эндонуклеазу IV, эндонуклеазу V, эндонуклеазу VIII, экзонуклеазу I, экзонуклеазу III, экзонуклеазу V, экзонуклеазу VII, экзонуклеазу VIII, экзонуклеазу Т, лямбда-экзонуклеазу, микрококковую нуклеазу, нуклеазу золотистой фасоли, нуклеазу BAL-31, нуклеазу Р1, нуклеазу S1, Т4 эндонуклеазу V, Т5 экзонуклеазу, Т7 эндонуклеазу I и Т7 экзонуклеазу;
в) необязательно, реактивы и
г) необязательно инструкции по применению в способе согласно настоящему изобретению.
13. Набор по п. 12, в котором реактивы выбраны из группы, включающей реактивы для экстракции нуклеиновых кислот, реактивы для обратной транскрипции, реактивы для амплификации нуклеиновых кислот, реактивы для очистки нуклеиновых кислот, реактивы для выбора размеров нуклеиновых кислот, реактивы для количественной оценки нуклеиновых кислот, реактивы для подготовки библиотек нуклеиновых кислот, реактивы для секвенирования библиотек нуклеиновых кислот и средства внутреннего контроля.
-
14. Набор по п. 12 или 13, в котором реактивы включают реактивы для экстракции нуклеиновых кислот, обратную транскриптазу, ДНК-полимеразу Vent ехо, дНТФ, олигонуклеотидные праймеры с последовательностью, представленной любой из последовательностей SEQ ID NO: 1 или 3-13, олигонуклеотидные праймеры с последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO: 2, экзонуклеазу I и/или шарики SPRI.