ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ БИБЛИОТЕКИ ОДИНОЧНЫХ ЯДЕР И ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Способ получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или одиночных клеток, включающий:
(a) получение множества клеток в первом множестве компартментов;
(b) воздействие на множество клеток каждого компартмента заданным условием;
(c) приведение ядер, выделенных из клеток каждого компартмента, или клеток каждого компартмента в контакт с хеширующим олигонуклеотидом,
где с выделенными ядрами или клетками связана по меньшей мере одна копия хеширующего олигонуклеотида,
где хеширующий олигонуклеотид содержит хеширующий индекс,
где хеширующий индекс в каждом компартменте содержит индексную последовательность, которая отличается от индексных последовательностей в других компартментах, для получения хешированных ядер или хешированных клеток; и
(d) объединение хешированных ядер или хешированных клеток из разных компартментов для получения объединенных хешированных ядер или объединенных хешированных клеток.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий воздействие на клетки или ядра поперечно-сшивающим соединением для фиксации хеширующих олигонуклеотидов к клеткам или выделенным ядрам.
3. Способ по п. 2, в котором поперечно-сшивающее соединение содержит параформальдегид, формалин или метанол.
4. Способ по п. 1, в котором заданное условие включает в себя воздействие агента.
5. Способ по п. 1 или 4, в котором агент содержит белок, нерибосомный белок, поликетид, органическую молекулу, неорганическую молекулу, молекулу РНК или молекулу, вызывающую РНК-интерференцию, углевод, гликопротеин, нуклеиновую кислоту, лекарственное средство или их комбинацию
6. Способ по п. 1, в котором хеширующий олигонуклеотид содержит одноцепочечную нуклеиновую кислоту.
7. Способ по п. 1, в котором хеширующий олигонуклеотид состоит из одноцепочечной нуклеиновой кислоты.
8. Способ по пп. 1, 6 или 7, в котором нуклеиновая кислота хеширующего олигонуклеотида содержит ДНК, РНК или их комбинацию.
9. Способ по п. 1, в котором хеширующий олигонуклеотид содержит домен, который опосредует специфическое связывание хеширующего олигонуклеотида с поверхностью клеток или ядер.
10. Способ по п. 9, в котором домен содержит лиганд, антитело или аптамер.
11. Способ по п. 1, в котором связь между хеширующим олигонуклеотидом и клетками или выделенными ядрами является неспецифической.
12. Способ по п. 11, в котором неспецифическая связь между хеширующим олигонуклеотидом и клетками или выделенными ядрами осуществляется посредством абсорбции.
13. Способ по п. 1, дополнительно включающий обработку объединенных хешированных клеток или объединенных хешированных ядер с использованием способа комбинаторного индексирования одиночных клеток для получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер, где нуклеиновые кислоты содержат множество индексов.
14. Способ по п. 13, где способ комбинаторного индексирования одиночных клеток представляет собой секвенирование транскриптомов одиночных ядер, секвенирование транскриптомов одиночных клеток и секвенирование хроматина с доступными транспозонами, полногеномное секвенирование в одиночных ядрах, секвенирование хроматина с доступными транспозонами в одиночных ядрах, sci-HiC, DRUG-seq, sci-CAR, sci-MET, sci-Crop, sci-perturb или sci-Crispr.
15. Способ по п. 14, дополнительно включающий
(e) распределение подгрупп объединенных хешированных клеток или хешированных ядер во второе множество компартментов и приведение каждой подгруппы в контакт с обратной транскриптазой или ДНК-полимеразой и праймером, где праймер в каждом компартменте содержит первую индексную последовательность, которая отличается от первых индексных последовательностей в других компартментах, для получения индексированных ядер, содержащих индексированные фрагменты нуклеиновых кислот;
(f) объединение индексированных клеток или индексированных ядер для создания объединенных индексированных клеток или объединенных индексированных ядер;
(g) распределение подгрупп объединенных индексированных клеток или объединенных индексированных ядер в третье множество компартментов и введение второй индексной последовательности в индексированные фрагменты нуклеиновых кислот для создания клеток с двойным индексированием или ядер с двойным индексированием, содержащих фрагменты нуклеиновых кислот с двойным индексом, где введение включает в себя лигирование, удлинение праймера, амплификацию или транспонирование;
(h) объединение клеток с двойным индексированием или ядер с двойным индексированием для получения объединенных ядер или клеток с двойным индексом;
(i) распределение подгрупп клеток или объединенных ядер с двойным индексированием в четвертое множество компартментов и введение третьей индексной последовательности в индексированные фрагменты нуклеиновых кислот для создания клеток с тройным индексированием или ядер с тройным индексированием, содержащих фрагменты нуклеиновых кислот с тройным индексом, где введение включает в себя лигирование, удлинение праймера, амплификацию или транспонирование;
(j) объединение фрагментов с тройным индексом для получения таким образом библиотеки секвенирования, содержащей транскриптомные нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер.
16. Способ по п. 15, в котором (g) включает в себя приведение каждой подгруппы в контакт с транспосомным комплексом, где транспосомный комплекс в каждом компартменте содержит транспозазу и вторую индексную последовательность в условиях, подходящих для лигирования второй индексной последовательности к концам индексированных фрагментов нуклеиновых кислот, содержащих первую индексную последовательность, для получения ядер с двойным индексированием, содержащих фрагменты нуклеиновых кислот с двойным индексом, где вторая индексная последовательность отличается от вторых индексных последовательностей в других компартментах.
17. Способ по п. 15, в котором (i) включает в себя приведение каждой подгруппы в контакт с праймером, содержащим третью индексную последовательность и универсальную последовательность праймера, где приведение в контакт включает в себя условия, подходящие для амплификации и встраивания третьей индексной последовательности в концы фрагментов нуклеиновых кислот с двойным индексом, где третья индексная последовательность отличается от третьих индексных последовательностей в других компартментах.
18. Способ по п. 1, в котором компартменты содержат лунку или каплю.
19. Способ по пп. 15-17, дополнительно включающий:
получение поверхности, содержащей множество сайтов амплификации,
где сайты амплификации содержат по меньшей мере две популяции присоединенных одноцепочечных захватных олигонуклеотидов, имеющих свободный 3’-конец,
приведение поверхности, содержащей сайты амплификации, в контакт с фрагментами с тройным индексом в условиях, подходящих для получения множества сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов из отдельного фрагмента, содержащего множество индексов.
20. Композиция, содержащая хешированные клетки или хешированные ядра по п. 1.
21. Композиция, содержащая объединенные хешированные клетки или объединенные хешированные ядра по п. 1.
22. Многолуночный планшет, где компартменты многолуночного планшета содержат композицию по п. 20 или 21.
23. Многолуночный планшет по п. 22, где компартмент многолуночного планшета содержит от 50 до 100 000 000 клеток или ядер.
24. Капля, где капля содержит композицию по п. 20 или 21.
25. Капля по п. 24, где капля содержит от 50 до 100 000 000 клеток или ядер.
26. Способ получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или одиночных клеток, включающий:
(a) получение первого множества компартментов, содержащих выделенные ядра или клетки, и приведение выделенных ядер или клеток каждого компартмента в контакт с хеширующим олигонуклеотидом,
где с выделенными ядрами или клетками связана по меньшей мере одна копия хеширующего олигонуклеотида,
где хеширующий олигонуклеотид содержит нуклеиновую кислоту и хеширующий индекс,
где хеширующий индекс в каждом компартменте содержит индексную последовательность, которая отличается от индексных последовательностей в других компартментах, для получения хешированных ядер или хешированных клеток; и
(b) объединение хешированных ядер или хешированных клеток из разных компартментов для получения объединенных хешированных ядер или объединенных хешированных клеток.
27. Способ получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или одиночных клеток, включающий:
(a) получение первого множества компартментов, содержащих выделенные ядра или клетки, и приведение выделенных ядер или клеток каждого компартмента в контакт с хеширующим олигонуклеотидом,
где с выделенными ядрами или клетками связывается по меньшей мере одна копия хеширующего олигонуклеотида посредством абсорбции,
где хеширующий олигонуклеотид содержит нуклеиновую кислоту и хеширующий индекс,
где хеширующий индекс в каждом компартменте содержит индексную последовательность, которая отличается от индексных последовательностей в других компартментах, для получения хешированных ядер или хешированных клеток; и
(b) объединение хешированных ядер или хешированных клеток из разных компартментов для получения объединенных хешированных ядер или объединенных хешированных клеток.
28. Способ получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества ядер или клеток, включающий:
(a) получение множества компартментов, содержащих ядра или клетки, где ядра или клетки содержат хеширующий олигонуклеотид, который содержит специфичный для компартмента индекс;
(b) объединение ядер или клеток из разных компартментов во втором компартменте для получения объединенных хешированных ядер или объединенных хешированных клеток.
29. Способ по п. 28, дополнительно включающий воздействие на клетки каждого компартмента заданного условия или воздействие на клетки каждого компартмента заданного условия с последующим выделением ядер из множества клеток перед стадией (a).
30. Способ по п. 29, в котором заданное условие включает в себя воздействие агента.
31. Способ по п. 30, в котором агент содержит белок, нерибосомный белок, поликетид, органическую молекулу, неорганическую молекулу, молекулу РНК или молекулу, вызывающую РНК-интерференцию, углевод, гликопротеин, нуклеиновую кислоту, лекарственное средство или их комбинацию.
32. Композиция, содержащая множество популяций нормализующих олигонуклеотидов, где композиция содержит первую популяцию нормализующих олигонуклеотидов, содержащих первую индексную последовательность, и другие популяции нормализующих олигонуклеотидов, каждая из которых содержит уникальную индексную последовательность, отличную от индексных последовательностей других популяций, и где концентрация каждой популяции одинакова.
33. Композиция, содержащая множество популяций нормализующих олигонуклеотидов, где композиция содержит первую популяцию нормализующих олигонуклеотидов, содержащих первую индексную последовательность, и другие популяции нормализующих олигонуклеотидов, каждая из которых содержит уникальную индексную последовательность, отличную от индексных последовательностей других популяций, и где концентрации по меньшей мере двух из популяций отличаются.
34. Композиция, содержащая множество популяций нормализующих олигонуклеотидов, где композиция содержит первую популяцию нормализующих олигонуклеотидов, содержащих набор первых индексных последовательностей, и другие популяции нормализующих олигонуклеотидов, каждая из которых содержит набор уникальных индексных последовательностей, отличных от набора индексных последовательностей других популяций, и где концентрация каждой популяции одинакова.
35. Композиция, содержащая множество популяций нормализующих олигонуклеотидов, где композиция содержит первую популяцию нормализующих олигонуклеотидов, содержащих набор первых индексных последовательностей, и другие популяции нормализующих олигонуклеотидов, каждая из которых содержит набор уникальных индексных последовательностей, отличных от набора индексных последовательностей других популяций, и где концентрации по меньшей мере двух из популяций отличаются.
36. Композиция по любому из пп. 32-35, где композиция содержит от 2 до 100 популяций нормализующих олигонуклеотидов.
37. Композиция по любому из пп. 32-35, в которой нормализующие олигонуклеотиды содержат одноцепочечную ДНК.
38. Композиция по любому из пп. 32-35, в которой нормализующие олигонуклеотиды содержат уникальный молекулярный идентификатор.
39. Композиция по любому из пп. 32-35, в которой нормализующие олигонуклеотиды содержат универсальную последовательность.
40. Композиция по любому из пп. 32-35, в которой нормализующие олигонуклеотиды содержат ненуклеотидный компонент.
41. Композиция по п. 40, в которой ненуклеотидный компонент включает в себя белок.
42. Композиция по п. 41, в которой ненуклеотидный компонент включает в себя белок.
43. Композиция по любому из пп. 33 или 35, где первая популяция присутствует в композиции в самой низкой концентрации нормализующих олигонуклеотидов, а одна из других популяций присутствует в композиции в самой высокой концентрации нормализующих олигонуклеотидов, и где самая низкая и самая высокая концентрации отличаются в 1-10 000 раз.
44. Множество компартментов, где каждый компартмент содержит композицию по любому из пп. 32-35.
45. Множество компартментов по п. 44, где компартменты содержат лунки или капли.
46. Множество компартментов по п. 44, где каждый компартмент дополнительно содержит ядра или клетки, и где множество популяций нормализующих олигонуклеотидов связаны с ядрами или клетками.
47. Множество компартментов по п. 44, где концентрация нормализующих олигонуклеотидов в каждой популяции выбрана из диапазона от по меньшей мере 0,001 зептомоль до не более чем 100 аттомоль.
48. Популяция ядер или клеток, где ядра или клетки содержат композицию по любому из пп. 32-35, и где члены каждой популяции нормализующих олигонуклеотидов связаны с ядрами или клетками.
49. Популяция по п. 48, в которой связь между ядрами или клетками и нормализующими олигонуклеотидами является неспецифической.
50. Способ нормализации библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или одиночных клеток, включающий:
(a) получение первого множества компартментов, содержащих выделенные ядра или клетки;
(b) приведение выделенных ядер или клеток каждого компартмента в контакт с композицией по любому из пп. 32-35, где члены каждой популяции нормализующих олигонуклеотидов связаны с выделенными ядрами или клетками; и
(c) объединение меченых ядер или меченых клеток разных компартментов для получения объединенных меченых ядер или объединенных меченых клеток.
51. Способ по п. 50, дополнительно включающий воздействие на клетки каждого компартмента заданного условия или воздействие на клетки каждого компартмента заданного условия с последующим выделением ядер из множества клеток перед стадией (a).
52. Способ по п. 51, в котором заданное условие включает в себя воздействие агента.
53. Способ по п. 52, в котором агент содержит белок, нерибосомный белок, поликетид, органическую молекулу, неорганическую молекулу, молекулу РНК или молекулу, вызывающую РНК-интерференцию, углевод, гликопротеин, нуклеиновую кислоту, лекарственное средство или их комбинацию
54. Способ по п. 50, дополнительно включающий перед стадией (b) приведение выделенных ядер или клеток каждого компартмента в контакт с хеширующим олигонуклеотидом,
где с выделенными ядрами или клетками связана по меньшей мере одна копия хеширующего олигонуклеотида,
где хеширующий олигонуклеотид содержит нуклеиновую кислоту и хеширующий индекс,
где хеширующий индекс в каждом компартменте содержит индексную последовательность, которая отличается от индексных последовательностей в других компартментах и отличается от индексных последовательностей нормализующих олигонуклеотидов, присутствующих в компартменте, для получения меченых хешированных ядер или меченых хешированных клеток; и
объединение меченых хешированных ядер или меченых хешированных клеток разных компартментов для получения объединенных меченых хешированных ядер или объединенных меченых хешированных клеток.
55. Способ по п. 50, дополнительно включающий воздействие на клетки или ядра поперечно-сшивающим соединением для фиксации нормализующих олигонуклеотидов к клеткам или выделенным ядрам.
56. Способ по п. 55, в котором поперечно-сшивающее соединение содержит параформальдегид, формалин или метанол.
57. Способ по п. 50, в котором связь между нормализующим олигонуклеотидом и клетками или выделенными ядрами является неспецифической.
58. Способ по п. 57, в котором неспецифическая связь между нормализующим олигонуклеотидом и клетками или выделенными ядрами осуществляется посредством абсорбции.
59. Способ по п. 54, дополнительно включающий обработку объединенных меченых хешированных клеток или объединенных меченых хешированных ядер с использованием способа комбинаторного индексирования одиночных клеток для получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или одиночных клеток, где нуклеиновые кислоты содержат множество индексов.
60. Способ по п. 59, где способ комбинаторного индексирования одиночных клеток представляет собой секвенирование транскриптомов одиночных ядер, секвенирование транскриптомов одиночных клеток и секвенирование хроматина с доступными транспозонами, полногеномное секвенирование в одиночных ядрах, секвенирование хроматина с доступными транспозонами в одиночных ядрах, sci-HiC, DRUG-seq, sci-CAR, sci-MET, sci-Crop, sci-perturb или sci-Crispr.
61. Способ нормализации библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или одиночных клеток, включающий:
(a) получение выделенных ядер или клеток;
(b) приведение выделенных ядер или клеток в контакт с композицией по любому из пп. 32-35, где члены каждой популяции нормализующих олигонуклеотидов связаны с выделенными ядрами или клетками; и
(c) распределение подгрупп меченых ядер или меченых клеток на множество компартментов.
62. Способ по п. 61, дополнительно включающий воздействие на клетки заданного условия или воздействие на клетки заданного условия с последующим выделением ядер из множества клеток перед стадией (a).
63. Способ по п. 62, в котором заданное условие включает в себя воздействие агента.
64. Способ по п. 63, в котором агент содержит белок, нерибосомный белок, поликетид, органическую молекулу, неорганическую молекулу, молекулу РНК или молекулу, вызывающую РНК-интерференцию, углевод, гликопротеин, нуклеиновую кислоту, лекарственное средство или их комбинацию.
65. Способ по п. 61, дополнительно включающий после стадии (с) приведение выделенных ядер или клеток каждого компартмента в контакт с хеширующим олигонуклеотидом,
где с выделенными ядрами или клетками связана по меньшей мере одна копия хеширующего олигонуклеотида,
где хеширующий олигонуклеотид содержит нуклеиновую кислоту и хеширующий индекс,
где хеширующий индекс в каждом компартменте содержит индексную последовательность, которая отличается от индексных последовательностей в других компартментах и отличается от индексных последовательностей нормализующих олигонуклеотидов, присутствующих в компартменте, для получения меченых хешированных ядер или меченых хешированных клеток; и
объединение меченых хешированных ядер или меченых хешированных клеток разных компартментов для получения объединенных меченых хешированных ядер или объединенных меченых хешированных клеток.
66. Способ по п. 61, дополнительно включающий воздействие на клетки или ядра поперечно-сшивающим соединением для фиксации нормализующих олигонуклеотидов к клеткам или выделенным ядрам.
67. Способ по п. 66, в котором поперечно-сшивающее соединение содержит параформальдегид, формалин или метанол.
68. Способ по п. 61, в котором связь между нормализующим олигонуклеотидом и клетками или выделенными ядрами является неспецифической.
69. Способ по п. 68, в котором неспецифическая связь между нормализующим олигонуклеотидом и клетками или выделенными ядрами осуществляется посредством абсорбции.
70. Способ по п. 65, дополнительно включающий обработку объединенных меченых хешированных клеток или объединенных меченых хешированных ядер с использованием способа комбинаторного индексирования одиночных клеток для получения библиотеки секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты из множества одиночных ядер или одиночных клеток, где нуклеиновые кислоты содержат множество индексов.
71. Способ по п. 70, где способ комбинаторного индексирования одиночных клеток представляет собой секвенирование транскриптомов одиночных ядер, секвенирование транскриптомов одиночных клеток и секвенирование хроматина с доступными транспозонами, полногеномное секвенирование в одиночных ядрах, секвенирование хроматина с доступными транспозонами в одиночных ядрах, sci-HiC, DRUG-seq, sci-CAR, sci-MET, sci-Crop, sci-perturb или sci-Crispr.