Комплекс низкомолекулярных ингибиторов yac увеличивает уровень экспрессии Dmrt1 в клетках Сертоли транзиторной зоны семенника мыши в культуре

DOI: 10.23868/201811037

комплекс низкомолекулярных ингибиторов yac увеличивает уровень экспрессии DMRT1 в клетках сертоли транзиторной зоны семенника мыши в культуре

А.Ю. Кулибин1, Е.А. Малолина1 2

1 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия

2 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи, Москва, Россия

a combination of small molecular inhibitors yac increases expression levels of dmrt1 in the culture of Sertoli cells from the transitional zone of mouse testis

A.Yu. Kulibin1, E.A. Malolina1' 2

1 N.K. Koltzov Institute of Developmental Biology of the RAS, Moscow, Russia

2 N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

e-mail: Kulibin.A.BKRJ@gmail.com

В отделе семенника половозрелой мыши, содержащем тран-зиторную зону семенных канальцев и сеть семенника, присутствует популяция клеток, способных к активной пролиферации в культуре. Так как в этих клетках in vitro экспрессируются многие гены, специфические для клеток Сертоли, они были названы клетками Сертоли транзиторной зоны. Отличительной чертой этих клеток является пониженный уровень экспрессии Dmrtl — транскрипционного фактора, важного для дифференцировки клеток Сертоли и поддержания развития гонады по мужскому типу. Целью настоящей работы стал поиск условий культивирования клеток Сертоли транзиторной зоны, обеспечивающих максимальную экспрессию Dmrtl, и дальнейшее тестирование функциональных свойств этих клеток.

Установлено, что добавление к культуре комплекса низкомолекулярных ингибиторов YAC (Y-27632, A-83-01 и CHIR99021) значительно увеличивает долю клеток Сертоли транзиторной зоны, экспрессирующих Dmrtl. Продемонстрировано, что клетки Сертоли транзиторной зоны, культивировавшиеся в среде с YAC, сохраняют повышенный уровень Dmrtl, а при со-культивировании с клетками неонатальных семенников в 3d культуре формируют канальцеподобные структуры. По данным иммунофлуоресцентного и ПЦР РВ анализов, клетки Сертоли из культуры с YAC поддерживают развитие половых клеток в 3D культуре вплоть до стадии зиготены профазы мейоза I. Результаты работы свидетельствуют о том, что клетки Сертоли транзиторной зоны, культивирующиеся в среде с YAC, очень близки к клеткам Сертоли семенных канальцев и могут выполнять функции клеток Сертоли в условиях 3D культуры.

ключевые слова: клетки Сертоли, транзиторная зона семенника, Dmrtl, дифференцировка половых клеток in vitro.

Введение

Клетки Сертоли (КС) — соматические клетки семенников млекопитающих, составляющие основу эпителия семенных канальцев и поддерживающие в них развитие половых клеток. В эмбриональном и постнатальном развитии КС пролиферируют и обладают способностью формировать семенные канальцы de novo, в 3D культуре и при трансплантации [1-3]. В течение пубертатного периода КС дифференцируются и у большинства млекопитающих, в том числе у человека, теряют способность к пролиферации и обеспечению регенерации семенных канальцев.

Однако в экспериментах на лабораторных животных было показано, что КС, располагающиеся в транзитор-ных зонах (ТЗ) — концевых участках семенных канальцев, впадающих в сеть семенника (систему полостей, по которой сперматозоиды транспортируются из семенника в придаток), дольше сохраняют способность к пролиферации, например, у крыс [4] и способны про-лиферировать во взрослом состоянии у сирийских хомяков [5]. По нашим данным, клетки, полученные из фрагментов семенников мышей, содержащих ТЗ и сеть

There is a cell population capable of active proliferation in culture in the compartment of adult mouse testis consisting of transitional zone of seminiferous tubules and rete testis. These cells were termed Sertoli cells of the transitional zone because they express many specific Sertoli cell genes in culture. A feature of these cells is a low level of Dmrtl expression, a transcription factor important for Sertoli cell differentiation and male sex determination. In the current research, the culture conditions have been optimized to increase Dmrtl expression in Sertoli cells of the transitional zone and then functional properties of these cells have been tested. It was shown that a combination of small molecular inhibitors YAC (Y-27632, A-83-01 and CHIR99021) substantially increases the number of Sertoli cells of the transitional zone expressing Dmrtl. It was demonstrated that Sertoli cells of the transitional zone maintained in medium with YAC remain the high level of Dmrtl expression even after their transfer to 3D culture where they form seminiferous tubule-like structures with neonatal testicular cells. According to immunofluorescence and real-time PCR data Sertoli cells treated with YAC supported germ cell differentiation to the zy-gotene stage of meiotic prophase I in 3D culture. These results suggest that Sertoli cells of the transitional zone maintained in medium with YAC closely resemble Sertoli cells from seminiferous tubules and can function as Sertoli cells in 3D culture.

Keywords: Sertoli cells, testicular transitional zone, Dmrt1, germ cell differentiation in vitro.

семенника и обозначаемые нами общим термином ТЗ КС, формируют колонии in vitro и активно пролиферируют, даже если получены от половозрелых животных [6]. В КС ТЗ экспрессируются такие ключевые для КС транскрипционные факторы как Wt1, Sox9, Nr5a1, Gata4, Dmrt1 [7], хотя экспрессия не всех перечисленных транскрипционных факторов происходит на уровне дифференцированных КС семенных канальцев [6]. Так, в культуре КС ТЗ был снижен уровень экспрессии Dmrt1, и клетки в колониях были гетерогенны по его экспрессии [6]. Dmrt1 — транскрипционный фактор, важный как для дифференцировки КС в постнатальном развитии, так и для поддержания фенотипа КС во взрослом состоянии [8, 9]. Остается открытым вопрос, можно ли поднять уровень Dmrt1 в культуре КС ТЗ, чтобы сделать их максимально похожими на дифференцированные КС семенных канальцев.

Нами было показано, что КС ТЗ, даже несмотря на низкий уровень Dmrt1, способны принимать участие в формировании семенных канальцев и поддерживать развитие половых клеток в 3D культуре [10]. Однако способность

КС ТЗ встраиваться в семенные канальцы не была оценена количественно, также осталось неизвестно, как повышение уровня Dmrtl в КС ТЗ повлияет на этот процесс и на поддержание развития половых клеток.

Целью настоящей работы стал поиск условий культивирования КС ТЗ, обеспечивающих максимальную экспрессию Dmrt1 , и дальнейшее тестирование функциональных свойств таких клеток.

Материал и методы

Экспериментальные животные

В работе использовали самцов мышей линии C57BÍ/6 в возрасте 4-6 сут. и 2-3 мес., самцов мышей линии С57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1 Osb/J возрастом 2-З мес., все клетки которых экспрессируют GFP под промотором гена бета-актина, и самцов мышей ICR возрастом 4-6 сут. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с нормами, изложенными в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» и в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» Комиссии по биоэтике ИБР РАН.

Получение и культивирование КС ТЗ

Для выделения первичной культуры КС ТЗ фрагменты семенников мышей возрастом 2-З мес., содержащие ТЗ и сеть семенника, обрабатывали коллагеназой IV типа (3 мг/мл, Sigma, США), ДНКазой I типа (0,1 мг/ мл, Sigma) и трипсином (0,125 %, Thermo Fisher, США) по методике, описанной нами ранее [6]. Первичную культуру КС ТЗ мышей возрастом 6-сут. выделяли, инкубируя фрагменты семенников один раз в смеси коллагеназы и ДНКазы (15 мин.), а затем два раза в смеси гиалурони-дазы (2мг/мл, Sigma) и ДНКазы (по 20 мин.).

Клетки культивировали в культуральных планшетах, покрытых матригелем (Corning, США), в СО2-инкубаторе (З7°С, 5 % CO2). В качестве основы для всех культураль-ных сред использовали DMEM/F12 с GÍutaMAX (Thermo Fisher), содержащую пируват натрия, инсулин/транс-феррин/селенит (ITS) и пенициллин/стрептомицин.

Для изучения влияния различных факторов, содержащихся в среде, на экспрессию КС ТЗ Dmrt1 провели три серии экспериментов на культуре КС ТЗ от мышей возрастом 2-3 мес. В первой серии экспериментов КС ТЗ с начала культивирования поддерживали на среде, которая, кроме основных компонентов, перечисленных выше, включала в себя 1 % фетальной бычьей сыворотки (FBS (HyCÍone, США), LIF (1 нг/мл, SCI Store, Россия), IGF-1 (10 нг/мл, SCI Store) и либо один из низкомолекулярных ингибиторов: Y-27632 (Y, 10 |jM, Abcam, Великобритания), A-83-01 (A, 0,5 |М, Sigma, США) или CHIR99021 (C, 3 jM, Sigma, США), — либо их сочетание: YC или YAC.

Во второй серии экспериментов к основной среде добавляли lIf, IGF-1 и YAC, а также сыворотку в двух разных концентрациях: 1% FBS или 10 % FBS, либо заменители сыворотки: 10 % KSR (Thermo Fisher, США) или 1 % AÍbuMAX I Lipid-Rich BSA (Thermo Fisher, США). В третьей серии экспериментов кроме основных компонентов в состав среды входили 1 % FBS, YAC и один из факторов роста: EGF (10 нг/мл, SCI Store), IGF-1 (10 нг/мл), LIF (1 нг/мл), FGF2 (50 нг/мл, SCI Store, Россия)) или фолликулостиму-лирующий гормон (ФСГ 2ME/мл, Organon, Нидерланды). На культуре КС ТЗ мышей возрастом 6 сут. была сделана ограниченная серия экспериментов: к основной среде добавляли: 1 % FBS, 10 % KSR или 10 % KSR в сочетании с YAC. Смену среды проводили каждые двое сут.

Иммунофлуоресцентная окраска культур ТЗ КС

По достижении культурами КС ТЗ конфлюэнтного состояния (9 сут. для культуры клеток от двух-трехмесячных мышей и 3 сут. — от мышей возрастом 6 сут.) проводили иммунофлуоресцентную окраску по методике, описанной нами ранее [6]. Использовали первичные антитела против Wt1 (Santa Cruz Biotechnology, США, sc-192, 1:100) и Dmrtl (Santa Cruz Biotechnology, sc-377167, 1:50) и соответствующие вторичные антитела с флуоресцентной меткой (Thermo Fisher, A11008 и A31571, 1:500). Препараты фотографировали на микроскопе Leica DMI6000 (Германия), анализировали и проводили подсчеты с помощью программного обеспечения CellProfiler.

3D со-культура ТЗ КС и клеток

семенников неонатальных мышей

Для проверки способности формировать семенные канальцы в условиях 3D со-культуры суспензию клеток из культуры КС ТЗ половозрелых GFP-мышей, культивировали в 2D условиях в течение 9 сут., затем соединяли (в соотношении 1:10) с суспензией клеток семенников мышей линии C57Bl/6 возрастом 4-6 сут., заключали в коллаген I типа (1,5 мг/мл, Thermo Fisher) по методике, описанной ранее [3], и культивировали на границе фаз жидкость/ газ в среде с 10 % KSR в течение 2 нед. Суспензию клеток семенников мышей линии C57Bl/6 возрастом 4-6 сут. получали путем долговременной (1 ч.) инкубации фрагментов семенников в смеси коллагеназы IV типа (3 мг/ мл), ДНКазы I типа (0,1 мг/мл) и гиалуронидазы (2 мг/ мл) [3]. В качестве контроля использовали 3D со-культуру КС из семенных канальцев (СК) половозрелых GFP-мышей с клетками семенников неонатальных мышей. Первичную культуру КС СК получали из фрагментов семенников, содержащих только извитые семенные канальцы, по той же методике, что и культуру КС ТЗ. КС ТЗ и КС СК перед помещением в 3D условия культивировали в двух вариантах сред: на среде, которая, кроме основных компонентов, содержала 1 % FBS, и на среде, кроме основных компонентов содержащей 1 %% FBS и YAC.

В экспериментах по оценке дифференцировки половых клеток в 3D-культуре вместо семенников мышат линии C57Bl/6 использовали семенники мышей ICR возрастом 4-6сут., из которых получали клеточную суспензию по модифицированной методике, способствующей лучшему сохранению жизнеспособности половых клеток во время выделения [2]: ткань семенника инкубировали в растворе трипсина (0,25 %) и ДНКазы I типа (0,1 мг/мл) 10 мин. при 37 °С. Анализ результатов 3D культивирования проводили на 21 сут.

Иммунофлуоресцентная окраска 3D со-культур

Образцы 3D со-культур окрашивали тотально антителами к Sox9 (Millipore, США, AB5535, 1:200), Dmrt1, GFP (ThermoFisher, A10262, 1:400), Ddx4 (Abcam, ab13840, 1:200), Stra8 (Abcam, ab49602, 1:200) и Scp3 (Abcam, ab15093, 1:200) и соответствующими вторичными антителами (Thermo Fisher, A10036, A21207 и A11039, 1:500); инкубацию с антителами проводили при 37 °С в течение 18 ч. Канальцеподобные структуры, сформировавшиеся в гелях, фотографировали на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5, анализировали и проводили подсчет доли GFP-положительных КС ТЗ в их составе с помощью программного обеспечения CellProfiler.

ПЦР анализ

Анализ экспрессии Ddx4, Stra8 и Sycp1 также осуществляли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ). РНК из образцов 3D культур выделяли с помощью RNeasy

таблица. Специфические олигонуклеотиды для проведения ПЦР РВ

Название гена

Последовательности прямых

Длина продукта ПЦР, пн

Hprt

f GCA GTA CAG CCC CAA AAT GG г GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT

f CAG TTT GCA ATG TGA GCT TTG г GGG GGA AAT GTG TTT CAT CTT

f GTT TCC TGC GTG TTC CAC AAG г CAC CCG AGG CTC AAG CTT C

f TGA GGG GAA GCT CAC GGT T г CGA ACA GTG TGA AGG GCT TTT G

52 100 151 127

Mini Kit (Qiagen, США) по протоколу фирмы-производителя. Из РНК получали кДНК с применением MMLV RT kit (Евроген, Россия). ПЦР РВ проводили на StepOnePÍus ReaÍ-Time PCR System (AppÍied Biosystems, США), используя SYBR green qPCRmix-HS with ROX (Евроген, Россия)) и прай-меры (Евроген) (табл.), референс-ген — Hprt. Относительное количество РНК (reÍative quantification of RNA, RQ) вычисляли по 2-AACt методу [11]. В качестве контроля специфичности прохождения реакции ПЦР РВ, продукты анализировали с помощью агарозного гель-электрофореза и системы гель-визуализации Universa! Hood II (Bio-Rad, США).

Статистический анализ

Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. Все количественные данные представляли в виде: среднее ± стандартная ошибка среднего значения. Сравнение количественных показателей групп выполняли с использованием U-критерия Манна-Уитни.

результаты

Поиск условий культивирования ТЗ КС половозрелой мыши возрастом 2-3 мес., обеспечивающих максимальную экспрессию Dmrt1, заключался в оптимизации состава среды культивирования. Было поставлено 3 серии экспериментов: в первой серии проверяли влияние на уровень Dmrt1 низкомолекулярных ингибиторов, во второй — сыворотки или заменителей сыворотки, в третьей — факторов роста или ФСГ. В 1 серии было обнаружено, что добавление к культуре КС ТЗ ингибитора Rho-ассоциированной ки-назы Y-27632 (Y) и ингибитора гликоген-синтазы-киназы 3 CHIR99021 (С) по отдельности и вместе достоверно увеличивало долю Dmrt1 + КС ТЗ (рис. 1А). Внесение в культуру одного ингибитора рецептора TGF-ß1 типа A-83-01 (A) не увеличивало числа Dmr^-^ ТЗ, однако в сочетании с двумя другими веществами (Y и С), то есть при добавлении полного комплекса низкомолекулярных ингибиторов YAC, доля Dmrt1 +-КС ТЗ была максимальной и составляла ЗЗ,9±2,З % (рис. 1А).

Во 2 серии экспериментов было установлено, что оптимальным является поддержание культуры КС ТЗ в среде с 1 % FBS, так как увеличение концентрации сыворотки или ее замена на KSR или AÍbuMax достоверно уменьшало долю Dmrt1+-клеток в культуре (рис. 1Б). Исходя из результатов 1 и 2 серий экспериментов, в 3 серии к среде с YAC и 1 % FBS добавляли по отдельности факторы роста или ФСГ. Оказалось, что LIF, IGF-1, FGF2 и ФСГ значимо снижали уровень Dmrt1 в культуре по сравнению со средой без факторов, EGF не изменял количества Dmrt1 + клеток (рис. 1В). Таким образом, был определен состав среды, при культивировании в которой в КС ТЗ мышей 2-3 мес. максимально до 50,З±4,5 % увеличивался уровень Dmrt1: DMEM:F12 с 1 % FBS и YAC (рис. 1В, Д, Е).

На основании результатов, полученных на культурах КС ТЗ половозрелых мышей, мы протестировали три варианта сред (с добавлением 1 % FBS, 10 % KSR, 10 % KSR и YAC) на культуре КС ТЗ мыши возрастом 6сут. Было установлено, что при культивировании КС ТЗ в среде с 1 % FBS количество Dmrtl +-клеток невелико — 9,9±0,5 % (рис. 1Г). Однако, в отличие от культуры КС ТЗ половозрелой мыши, при замене FBS на 10 % KSR доля Dmrt1+-клеток резко возрастала (до 46,8±3,0 %); добавление к среде YAC увеличивало этот показатель до 69,4±3,9 % (рис. 1Г, К).

Культуры КС ТЗ с разным уровнем Dmrt1 различались и морфологически. В культурах с небольшим количеством Dmrt1 +-клеток большинство КС ТЗ не имели типичной для эпителиальных клеток полигональной формы и были больше похожи на фибробластоподобные клетки (рис. 1Ж, З), в то время как в культурах, высоко экспрес-сирующих Dmrt1, колонии КС ТЗ имели эпителиальную морфологию (рис. 1Д, Е, И, К).

Для проверки способности формировать семенные канальцы, КС ТЗ половозрелых GFP-мышей с высоким (выращенные на среде с YAC) и низким (выращенные на среде без YAC) уровнем Dmrt1 со-культивировали с клетками семенников неонатальных мышей в 3D условиях. Было показано, что КС ТЗ из обеих культур (GFp+/Sox9+ клетки) способны встраиваться в канальцеподобные структуры, формируемые клетками неонатальных семенников (рис. 2А, Б), причем доля GFP+^С ТЗ в канальцеподобных структурах не различалась в обоих типах культур (рис. 2 В). Однако экспрессия Dmrt1 в 3D культуре КС ТЗ, выращенной в среде с YAC, была выше, чем в среде без YAC (рис. 2В), и доля Dmrt1 +-КС ТЗ среди всех КС ТЗ в канальцах для среды с YAC составляла 72,3±1,1 %, а для среды без YAC только 45,8±9,2 %. Зрелые КС СК практически не встраивались в канальцеподобные структуры (рис. 2В).

Способность КС ТЗ поддерживать развитие половых клеток оценивали в 3D со-культуре КС ТЗ, выращенных в среде с YAC, и клеток семенников неонатальных мышей. В качестве контролей были использованы 3D-культуры, содержащие либо суспензию клеток семенника мышонка, либо КС ТЗ. На 21 сут. культивирования в канальце-подобных структурах были обнаружены половые клетки на разных стадиях дифференцировки, ассоциированные с GFP+^С ТЗ. Часть КС тЗ контактировала со спермато-гониями (рис. 3А), наименее дифференцированными половыми клетками, окрашивающимися на Dmrt1 и маркер всех половых клеток Ddx4. Они располагались на базаль-ной мембране канальцеподобных структур в одном ряду с ядрами КС ТЗ, часть из которых также экспрессирова-ла Dmrt1 (рис. 3А). В других канальцеподобных структурах КС ТЗ были ассоциированы с половыми клетками, окрашивающимися на Ddx4, но не экспрессирующими

2-3-месячная мышь

Б

6-суточная мышь

г

EGF 1СР-] 1.11

DMEM :Г 12+1 %FnS+ITS IY АС+

IO°/.KSR+ KWiKSR t%FBS

YAC

DMFM:FI2

сосгав среды

* 'DAPI-" i

Л - .

состав среды

состав среды

. .. г. . • •• 2-3 мес ; ,;.s •"

1 %FB S+ITS+YAC 1

ш :

- . n.

'ч1

бсут /. \ , , .

10%KSR+YAC

Рис. 1. Культуры КС ТЗ, количественная оценка доли Dmrtl +-клеток: А-Г — количество Dmrtl +-КС ТЗ в культурах, полученных от мышей возрастом 2-3 мес., на 9 сут. культивирования в средах различного состава (А-В) и отмышей возрастом 6 сут. на 3 сут. культивирования (Г); Д, Ж, И — культуры КС ТЗ мышей возрастом 2-3-мес. в среде с YAC (Д) и без YAC (Ж) и мышей возрастом 6 сут. в среде с 10 % KSR (И); Е, З, К — экспрессия маркеров КС Wt1 и Dmrtl культурами КС ТЗ мышей возрастом 2-3-мес. (Е — среда с YAC, З — без YAC) и 6 сут. (К, среда с YAC). Д, Ж, И — фазовый контраст; Е, З, К — иммунофлуоресцентная реакция, ядра докрашены DAPI *различия в количестве Dmrtl +-клеток статистически значимы при p<0,05; пунктир — контуры колонии; L — Lif; I — IGF-1

Отги (рис. 3Б), что свидетельствовало о дифференци-ровке половых клеток в 30 культуре. Некоторые половые клетки, расположенные рядом с КС ТЗ и не окрашивающиеся на 0тги, экспрессировали индуктор мейоза Б^а8, то есть являлись либо дифференцированными сперматогониями, либо сперматоцитами на стадии пре-лептотены-лептотены (рис. 3В). Наиболее дифференцированные половые клетки экспрессировали белок си-наптонемного комплекса Бср3, специфический рисунок окраски на который (тонкие нити), а также размеры ядер

указывают на то, что эти клетки находились на стадии зи-готены профазы мейоза (рис. ЗГ).

Анализ экспрессии 0Сх4, Б^а8 и Буср1 (кодирует еще один белок синаптонемного комплекса), проведенный с помощью ПЦР РВ, подтвердил присутствие половых клеток, в том числе мейотических, в 30 со-культурах (рис. 4А, Б). Причем уровень экспрессии генов-маркеров половых клеток в со-культуре КС ТЗ и клеток семенников неонаталь-ных мышей был значительно выше, чем в культуре только клеток семенников неонатальных мышей (рис. 4А).

A Sox9 GFP XY Q * * -и YZ И- 1 * * XY * • YZ i i ^

___Ф_____ • *т> • _ у € < rJг Ш - BVj >

% . Ъ 4 * ifc- • YAC~ \ • • • ,Р V i W 1 100 мкм 1ч í \¿ +

В

Рис. 2. 3D со-культуры GFP+-KC ТЗ с клетками семенника мышонка и доля КС ТЗ в канальцеподобных структурах через 2 нед. культивирования: А, Б — максимальные ортогональные проекции, полученные с серии конфокальных снимков коллагеновых гелей

Рис. 3. Коллагеновые гели, содержащих СРР+-КС ТЗ, клетки мыши возрастом 6 сут. и развивающиеся половые клетки, 3 нед. культивирования: А — СРР+-КС ТЗ в канальцеподобных структурах, контактирующие с П((х4+/Птг11 +-сперматогониями; Б — П((х4+/Птг11 --половыми клетками, вступившими в мейоз; В — половыми клетками, экспрессирующими индуктор мейоза Б1па8; Г — сперматоцитами I порядка на стадии зиготены, экспрессирующими белок синаптонемного комплекса БорЗ. Иммунофлуоресцентная реакция, ядра клеток докрашены йРА95. *СРР+-КС ТЗ, примыкающие к половым клеткам, стрелка — СРР+/ОтпЪ1 +-КС ТЗ, окруженные половыми клетками, пунктирная линия — ядро сперматоцита, увеличенное на вставке, визуализированы окрашенные на БорЗ нити синаптонемного комплекса

Рис. 4. ПЦР РВ анализ присутствия половых клеток различных типов в 3D культурах: А — количественные результаты ПЦР РВ; Б — агарозный гель-электрофорез продуктов ПЦР РВ, продукты амплификации кДНК различных маркеров присутствуют в 3D культурах КС ТЗ и (или) клеток семенника мыши возрастом 6 сут. (дорожки, 1, 2), но отсутствуют в гелях, содержащих только КС ТЗ (дорожка 3). Варианты: 1 — Мыш.+ТЗ — гели с клетками семенника мышонка и ТЗ КС; 2 — Мышонок — только клетки семенника мышонка; 3 — Контроль — только КС ТЗ. *различия в экспрессии статистически значимы при p<0,05 (n=3). RQ — relative quantity

Обсуждение

В настоящей работе было установлено, что добавление к культуре ТЗ КС комплекса низкомолекулярных ингибиторов YAC значительно увеличивает долю КС ТЗ, экспрессиру-ющих Dmrtl. Причем повышенный уровень Dmrtl сохраняется в таких КС ТЗ и при их переносе, совместно с клетками неонатальных семенников, в 3D культуру. Было продемонстрировано, что КС ТЗ, культивировавшиеся как на среде с YAC, так и без YAC, встраиваются в формирующиеся в 3D культуре семенные канальцы с одинаковой эффективностью. КС ТЗ из культуры с YAC поддерживали развитие половых клеток в 3D культуре вплоть до стадии зиготены профазы мейоза I. Комплекс низкомолекулярных ингибиторов YAC используется для культивирования различных типов стволовых клеток и клеток-предшественниц [12], он способствует выживанию клеток и активирует их пролиферацию. Нами было выявлено, что в культуре КС ТЗ мышей возрастом 2-3 мес. и 6 сут. YAC существенно увеличивал долю КС ТЗ, положительно окрашивающихся на Dmrtl. Однако в культуре всегда остаются и Dmrtl --КС ТЗ, которые могут находиться либо среди Dmrtl +-КС ТЗ, либо лежат в виде отдельных колоний. Возможно, для 100 % экспрессии Dmrtl нужны дополнительные факторы, хотя все добавки, кроме YAC, протестированные в настоящем исследовании (EGF, IGF-1, LIF, FGF2, ФСГ), не увеличивали долю Dmrt1+-клеток в культуре. Более вероятным объяснением кажется гетерогенность самих КС ТЗ, то есть часть этих клеток, по-видимому, в принципе не способна к экспрессии Dmrt1. Также необходимо отметить, что на уровень экспрессии Dmrt1 влияет выбор сыворотки или ее заменителя (KSR или AlbuMax), а также возраст животного, от которого берется материал. Интересно, что доля Dmrt1 +-клеток в культуре КС ТЗ мышей возрастом 6сут., поддерживаемой в среде с 10 % KSR, была значительно выше, чем в культуре с 1 % сыворотки FBS, в то время как в культуре КС ТЗ половозрелых мышей наблюдалась обратная зависимость. Вероятно, заменители сыворотки — 10 % KSR или 1 % AlbuMax, с одной стороны, не содержат, в отличие от сыворотки, факторов роста или ингибиторов, снижающих экспрессию Dmrt1,

поэтому неонатальные КС ТЗ показывают в среде с 10 % KSR высокий уровень Dmrtl даже без добавления YAC. С другой стороны, в заменителях сыворотки, возможно, недостает компонентов, обеспечивающих лучшее выживание и прикрепление клеток к субстрату. Этот факт оказывается критическим для КС ТЗ взрослых животных, которые сложнее поддерживать в культуре, чем клетки мышонка. В связи с этим для достижения высокого уровня Dmrtl в такой культуре приходится использовать сыворотку, но нейтрализовать часть ее компонентов с помощью YAC.

Интересные результаты были получены при совместном культивировании КС ТЗ половозрелых мышей с не-онатальными клетками семенника мышонка. Во-первых, КС ТЗ встраивались в формирующиеся канальцеподоб-ные структуры с высокой эффективностью — 8-10 %, с учетом того, что общее число КС ТЗ в со-культуре составляет только 10 %. Во-вторых, КС ТЗ, выращенные в среде с YAC и без YAC, принимали участие в формировании канальцев с одинаковой частотой. При этом доля Dmrt1+-клеток среди всех КС ТЗ, выращенных в среде без YAC и встроившихся в канальцы, составляла примерно 45 %, что значительно выше этого показателя в 2D культуре КС ТЗ в среде без YAC перед их переносом в 3D культуру—2,5±0,9 %. Таким образом, просто совместное культивирование КС ТЗ с клетками неонатальной гонады в 3D условиях уже активирует в них экспрессию Dmrtl. Необходимо отметить, что КС СК, экспрессирующие Dmrtl на высоком уровне, в отличие от КС ТЗ, выращенных в среде с YAC, практически не способны встраиваться в формирующиеся в 3D культуре семенные канальцы.

В предыдущей работе нами было установлено, что КС ТЗ, выращенные в среде без YAC, поддерживают развитие половых клеток до мейотических стадий [10]. В настоящей работе мы подтвердили этот результат. Кроме того, с помощью иммунофлуоресцентной реакции на специфические мейотические маркеры и ПЦР-анализа генов, экс-прессирующихся в половых клетках, мы уточнили, что развитие половых клеток, находящихся в непосредственном контакте с КС ТЗ, доходит до стадии зиготены 1-го деления мейоза. Для получения более дифференцированных клеток, по-видимому, нужно увеличить время 3D культивирования. Например, при 3D культивировании неонатальных клеток семенника мыши гаплоидные маркеры появляются только через 7 нед. культивирования [2]. По данным ПЦР-анализа, присутствие в 3D со-культуре КС ТЗ в 5-10 раз увеличивало экспрессию генов-маркеров половых клеток (рис. 4А), так что возможно, что КС ТЗ не только поддерживают половые клетки при контактном взаимодействии, но и секретируют паракринные факторы, способствующие пролиферации и дифференцировке половых клеток, непосредственно не связанных с КС ТЗ.

Результаты проделанной работы свидетельствуют о том, что КС ТЗ, при правильно подобранных условиях культивирования, очень близки к КС СК и могут функционировать как КС в условиях 3D культуры. Следовательно, в дальнейшем КС ТЗ могут быть использованы не только для фундаментальных исследований, но и для разработки методов клеточной терапии патологий яичка человека.

Благодарности

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП ИБР им. Н.К. Кольцова РАН, при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-34-60119 мол_а_дк, ФИМТ № 0108-2018-0012 и РНФ № 17-74-10076 (при финансовой поддержке этого гранта выполнены работы по количественной оценке способности ТЗ КС принимать участие в образовании канальцеподобных структур в 3D культурах и поддерживать развитие половых клеток).

ni/ITEPATyPA:

1. Shinohara T., Orwig K.E., Avarbock M.R. et al. Restoration of spermatogenesis in infertile mice by Sertoli cell transplantation. Biol. Reprod. 2003; 68(3): 1064-71.

2. Yokonishi T., Sato T., Katagiri K. et al. In vitro reconstruction of mouse seminiferous tubules supporting germ cell differentiation. Biol. Re-prod. 2013; 89(1): 15.

3. Zhang J., Hatakeyama J., Eto K. et al. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. Gen. Comp. Endocrinol. 2014; 205: 121-32.

4. Figueiredo A.F., França L.R., Hess R.A. et al. Sertoli cells are capable of proliferation into adulthood in the transition region between the seminiferous tubules and the rete testis in Wistar rats. Cell Cycle 2016; 15(18): 2486-96.

5. Aiyama Y., Tsunekawa N., Kishi K. et al. Niche for GFRa1-positive spermatogonia in the terminal segments of the seminiferous tubules in hamster testes. Stem Cells 2015; 33(9): 2811-24.

6. Kulibin A. Yu., Malolina E.A. Only a small population of adult Sertoli cells actively proliferates in culture. Reproduction 2016; 152(4): 271-81.

7. Buganim Y., Itskovich E., Hu Y.C. et al. Direct reprogramming of fibroblasts into embryonic Sertoli-like cells by defined factors. Cell Stem Cell 2012; 11: 373-86.

8. Raymond C.S., Murphy M.W., O'Sullivan M.G. et al. Dmrtl, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes Dev. 2000; 14(20): 2587-95.

9. Minkina A., Matson C.K., Lindeman R.E. et al. DMRT1 protects male gonadal cells from retinoid-dependent sexual transdifferentiation. Dev. Cell 2014; 29(5): 511-20.

10. Кулибин А.Ю., Малолина Е.А. Характеристика минорной популяции активно пролиферирующих в культуре клеток Сертоли из тран-зиторной зоны яичка взрослых мышей. Молек. Мед. 2017; 15(6): 28-31.

11. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 2001; 4: 402-8.

12. Katsuda T., Kawamata M., Hagiwara K. et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell 2017; 20(1): 41-55.

Поступила: 18.062018