Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria

2014. Специальный выпуск

Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума

става резидентной микрофлоры кожи рассматривается как дисбактериоз, на фоне которого могут развиваться различные патологические состояния. Целью данного исследования было создание безопасного и эффективного профилактического средства на основе бактериофагов, нормализующего микробиоценоз кожных покровов человека.

На основании комплексного анализа микро-биоты подмышечных впадин 66 здоровых лиц и 33 больных, страдающих бромидрозом, определены представители данного биотопа, вызывающие дисбактериоз. Полуколичественная оценка микробного состава микробиоты кожи подмышечных впадин у здоровых лиц варьировала в интервале 4—5 ^ КОЕ/мл, у больных — 6—7 ^ КОЕ/мл. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по фено-типическим свойствам, труднокультивируемых и коринебактерий — масс-спектрометрическим методом и путем амплификации гена гроБ с последующим прямым секвенированием амплифи-цированных фрагментов. У здоровых лиц идентифицировано 62 культуры, относящихся к 11 видам коринебактерий, из них наибольший удельный вес имели С.tuberculostearicum (46,8%), C. amycolatum (24,3%) и C. ureicelerivorans (8,1%), С. соукое (4,8%) и С. ассокт (3,2%) встречались в меньшем проценте случаев, остальные коринебактерии выделяли в единичном проценте случаев. При обследовании больных идентифицировано 14 культур, относящихся к 7 видам рода СогупеЬаЫепит, из них наибольший удельный вес имели С. tuberculostearicum (33,7%), С. игекектотт (26,6%) и С. тиа/аскт (13,3%), остальные виды идентифицированы в единичных случаях.

На следующем этапе были изолированы из объектов окружающей среды и отобраны, используя фенотипическую и молекулярно-генетическую оценку, штаммы бактериофагов, активные в отношении выделенных у больных с бромидрозом видов коринебактерий. Оригинальные фаговые геномы были представлены двунитевой ДНК, в них отсутствовали гены, кодирующие токсины, другие факторы вирулентности и определяющие умеренный путь развития бактериофага. Проведена оценка токсичности фагового препарата для лабораторных животных. С учетом микробиологического, геномного и биоинформационного анализов выделенных фагов, полученный коктейль перспективен для нормализации микробиоценоза кожных покровов человека.

Т016 ОБ ОПЫТЕ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ПРИ ВСПЫШКАХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В ОРГАНИЗОВАННЫХ ДЕТСКИХ КОЛЛЕКТИВАХ УДМУРТСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

Ю.В. Бушмакина

Управление Роспотребнадзора по Удмуртской Республике, Ижевск, Россия

В Удмуртской Республике в среднем ежегодно регистрируется от 11.000 до 13.000 случаев заболеваний острыми кишечными инфекциями (далее ОКИ). Удельный вес вспышечной заболеваемости в общей структуре заболеваемости ОКИ составляет от 3,2 до 3,5% в отдельные годы. В последние годы, как при спорадической, так и при вспышечной заболеваемости, наблюдается тенденция роста интенсивных и экстенсивных показателей заболеваемости вирус-

ными диареями и снижение соответствующих показателей заболеваемости бактериальными диареями. В структуре расшифрованных кишечных инфекций доля вирусных диарей выросла с 45,1% в 2009 году до 61,8% в 2013 г. Аналогичные изменения отмечались и при вспышечной заболеваемости ОКИ: так, удельный вес эпидемических очагов ОКИ вирусной этиологии вырос с 36,3% в 2009 г. (12 из 33 эпидемических очагов) до 60% в 2013 г. (3 из 5 эпидемических очагов). Вместе с тем, актуальность возбудителей «традиционных» бактериальных кишечных инфекций (сальмонел-леза, дизентерии) в формировании эпидемических очагов в организованных детских коллективах по-прежнему сохраняется. Кроме того, бактериальные диареи у детей, как правило, характеризуются более тяжелым клиническим течением по сравнению с вирусными диареями. В связи с этим, возникает необходимость организации адекватных профилактических мероприятий при купировании эпидемических очагов кишечных инфекций бактериальной этиологии. При регистрации большинства вспышек, вызванных возбудителями бактериальной этиологии (сальмонеллой энтеритидис, шигеллой Флекснер) в организованных детских коллективах в Удмуртской Республике применялись специфические бактериофаги с профилактической целью контактным лицам. Случаи заболеваний среди контактных лиц, которым проводилось фагирование с профилактической целью, зарегистрированы не были. Таким образом, в Удмуртской Республике отмечается положительный опыт применения сальмонеллезного и дизентерийно -го бактериофагов при регистрации вспышек кишечных инфекций бактериальной этиологии в организованных детских коллективах.

Т017 ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ БАКТЕРИЙ РОДА LISTERIA

Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина

ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», Ульяновск, Россия

Особая опасность листериоза возникла в Европе и Северной Америке в конце ХХ в. в связи с лавинообразным увеличением случаев контаминации пищевых продуктов листериями и летальностью до 60% у людей I группы риска. Поэтому листериоз получил наименование «пищевой инфекции» и медицинские специалисты нашей страны с 1992 г. стали признавать его как эпидемическую инфекцию.

В связи с ужесточением Европейских и Российских законодательных актов по реализации продуктов питания (пищевого сырья) при наличии листерий есть необходимость разработки системы выявления и дифференцировки бактерий рода Listeria. Бактериофаги являются простым и надежным инструментом для решения указанной проблемы.

Целью работы является разработка схемы выделения бактериофагов бактерий вида L. monocytogenes методом индукции из лизогенных культур.

Для достижения поставленной цели необходимо подобрать оптимальные параметры воздействия индуцирующих факторов на бактериальную клетку и взаимодействия бактериальных клеток и фаговых корпускул, определить рациональный метод очищения фаголизата.

Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным Н.А. Ка-

Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума

Инфекция и иммунитет

пыриной, M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski, Э. Каттер, А. Сулаквелидзе, C.P. Sword, M.J. Pickett, С.Н. Золотухина.

В качестве тест-штамма для оптимизации параметров индукции использовали вирулентный штамм L. Monocytogenes — 766, индикаторным служил референс-штамм L. monocytogenes 9-127. В качестве индуцирующего агента использовали ультрафиолетовые лучи (УФ-лучи), источником которых служила ртутно-кварцевая лампа, дающая не менее 90 % излучаемой энергии в виде УФ-лучей с длиной волны 254 нм. Плотность среды при облучении, время экспозиции и расстояние до источника света варьировали.

В результате проведенных исследований выделены три листериозных бактериофага, разработана оптимальная схема выделения методом индукции УФ-лучами. Экспериментально установлено, что для облучения наилучшим образом подходит жидкая слабощелочная среда, время экспозиции — 30 с, расстояние до источника излучения — 40 см.

Т018 АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОРДЕТЕЛЛЁЗА ЖИВОТНЫХ И БРОНХОСЕПТИКОЗА ЛЮДЕЙ

Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова

ФГБОУВПО УГСХА им. П.А Столыпина

В России отсутствуют официальные статистические данные по распространению бордетеллёза животных и бронхосептикоза людей, что, по-нашему мнению, обусловлено отсутствием эффективных мер детекции возбудителя.

Мы разработали тест-систему индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica (ТСИИ), включающую бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты.

Бактериологическая детекция бактерий B. bronchiseptica включает взятие глубоких мазков из глотки на 2 чашки Петри с дифференциально-диагностической средой с селективными компонентами и без них и культивирование в течение 24—48 ч при t 35—37°С. Далее проведение отбора характерных колоний и дополнительное изучение их свойств. Срок проведения исследования 72—96 ч. Иммунологическая детекция бактерий B. bronchiseptica проводится как дополнение бактериологической идентификации при помощи пластинчатой реакции агглютинации на предметном стекле или реакции диффузной пре-цепитации. Максимальный срок проведения анализа в течение часа. Молекулярно-генетическая детекция бактерий B. bronchiseptica включает выделение нуклеиновых кислот из культур сорбентным способом, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с системами праймеров, детекция с помощью горизонтального электрофореза и в режиме «реального времени». Программа проведения ПЦР с электрофоретической детекцией — 1) 95°С—5 мин,

2) 95°С—10 сек, 62°С—10 сек, 72°С—20 сек — 40 циклов,

3) 72°С—2 мин; для детекции в режиме реального времени — 1) 95°С - 5 мин, 2) 95°С - 10 сек, 62°С -15 сек — 40 циклов, 3) 72°С — 1 мин. Детекция бактерий B. bronchiseptica специфическими фагами осуществляют с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием биопрепарата «ББР-117 УГСХА». РНФ позволяет обнаружить бордетеллы в концентрации от 103 м.к. в 1 мл исследуемого биома-

териала за 26 часов без выделения чистой культуры. В качестве дополнения к бактериологической детекции проводят реакцию «стекающей капли». Срок исследования составляет до 66 ч.

ТСИИ возможно использовать для подтверждения клинического диагноза, выявления атипичных форм заболевания, обнаружения бактерионосителей в окружении больных животных, а также для установления ретроспективного диагноза.

Т019 БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова

ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина

Для детекции бактерий Bordetella bronchiseptica мы разработали биопрепараты.

Для выделения чистой культуры бактерий B. bronchiseptica сконструирована дифференциально-диагностическая среда (состав г/л: пептон ферментативный 20,0; сернокислое железо — 0,02 г/л, сернокислый магний — 0,4 г/л, хлорид натрия 4,5—6,5 г/л, крахмал 5,0 г/л, мочевина 5,0 г/л, лактоза — 0,7; бромтимоловый синий — 0,02; хлорид бария — 0,4); селективные добавки (цефазолин — 0,004 г/л, ампициллин — 0,0025 г/л, флуконазол, миконазол — 0,002 г/л. рН среды 7,0+0,2. Для антигенной детекции возбудителя бордетеллёза предлагаем использовать антиген B. bronchiseptica, получаемый методом ультразвуковой дезинтеграцией (частота 23 кГц, амплитуда колебаний 7 микрон, в течение 1 мин. на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом) и иммунную сыворотку, получаемую гипериммунизацией кроликов (предварительное внутримышечное введение смеси адъюванта Фрейнда с бордетеллёзным антигеном 1:1 в дозе 0,5 мл с последующим внутривенным введением антигена кроликам в дозах 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл с интервалом 3 дня и забором крови через 20 дней).

Для обнаружения ДНК бактерий B.bronchiseptica в биоматериале без выделения чистой культуры или как подтверждение бактериологического исследования рекомендуем праймеры (Pr1-1 (5' ccttccagcacctggcggtacgagttgctcc 3'), Pr1-2 (5' ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3') для гена BfrAДHКB.bronchisepft'ca; Pr3-1 (5'ggacgaccaggatcacatcttcc 3'), Pr3-2 (5' gctttcctggtagttgg-cgtagg 3') для гена BfrZ; Pr4-1 (5' gcattgctccatcctgttgtgcg 3'), Pr4-2 (5' gatgggttatctgagcgcgc 3') для гена Cytochrom—C—oxidase и Pr5-1 (5' ctacgggggaaagcggggga 3'), Pr5-1 (5' gaccgtactccccaggcggt 3') для гена 16S rRNA), флуоресцентный зонд для системы праймеров участка гена bfrZ.

Для обнаружения бактерий B. bronchiseptica реакцией нарастания титра фага (РНФ) без выделения чистой культуры или в качестве подтверждения бактериологического исследования методом «стекающей капли» рекомендуем применять фаговый биопрепарат ББР—117 УГСХА. Технологические параметры изготовления препарата: получение борде-теллёзных фагов ультрафиолетовой детекцией культуры, соотношение количества фаговых корпускул и бактериальных клеток индикаторных штаммов В. bronchiseptica — 1:2, время инкубации при температуре 37°С — 7 ч, обработка хлороформом в пропорции 1:10 в течение 15 мин.