СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ КАК ПЕРЕНОСЧИКА РНК ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
METHOD FOR QUALITATIVE ASSESSMENT OF EFFICACY OF OLEIC ACID AS RNA CARRIER THROUGH BIOLOGICAL MEMBRANES

Изобретение относится к области биохимии и фундаментальной медицины, в частности к средствам, облегчающим первичный скрининг потенциальных лекарственных препаратов, и может быть использовано, например, для подбора эффективных переносчиков РНК через биологические мембраны.
Прогресс в области молекулярной биологии и биотехнологии в последние десятилетия позволил медицине вплотную приблизиться к лечению наследственных болезней путем управления экспрессией генов с помощью чужеродной РНК. Осталась нерешенной проблема направленной доставки этой РНК внутрь клеток через биологические мембраны. Предлагают использовать с этой целью наночастицы алмазов и окислов некоторых металлов, аполипопротеин А-1 и др. Выбрать лучшее из предложенного трудно, поскольку для регистрации трансмембранного переноса авторы используют качественные и полуколичественные методы. В частности, известен и широко применяется флуоресцентный метод, основанный на присоединении флуоресцирующего красителя к РНК, инкубации этого комплекса в присутствии переносчика с суспензией клеток и последующего наблюдения свечения в клетках с помощью микроскопа [см., напр. 1]. Результат анализа качественный.
Целью настоящего изобретения является создание простого, но полноценного количественного метода для оценки эффективности переносчиков РНК через биологические мембраны.
Цель достигается тем, что в качестве модели для такой оценки используются сочные мешочки спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus со спектрофотометрическим определением РНК в клетках и окружающем растворе.
Пример осуществления предлагаемого способа
260
Препарат Виталанг-1, представляющий собой чистую высокополимерную дрожжевую РНК с теоретической весовой экстинкцией 20,0 ОЕ/мг, выделяли по методу [2].
260
Препарат Виталанг-2 с весовой экстинкцией 17,8 ОЕ/мг выделяли по методу [3]. Препарат содержит в своем составе 10,8% олеиновой кислоты.
Для определения способности препаратов Виталанг-1 и Виталанг-2 проникать через биологические мембраны в 3 одинаковых стеклянных флакончика на 6 мл с завинчивающимися пробками помещали по 7 продолговатых сочных мешочков спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus и заливали их:
260
1-й - 4,8 мл водного раствора Виталанга-1 (27,3 ОЕ/мл),
260
2-й - 4,8 мл водного раствора Виталанга-2 (27,1 ОЕ/мл),
3-й - 4,8 мл дистиллированной воды.
260
260
Через 22 ч инкубации при комнатной температуре замеряли оптическую плотность растворов в 1-ом и 2-ом флакончиках против 3-го. Получилось: в 1-ом - 26,4 ОЕ/мл, во 2-ом - 22,9 ОЕ/мл.
Т.е. клетки поглотили Виталанга-2 в 4,7 раза больше, чем Виталанга-1. Далее растворы из флакончиков сливали и промывали каждый 5-ю порциями по 5 мл дистиллированной воды. Замерив оптическую плотность 5-й порции из 1-го и 2-го флакончика против 3-го, получили:
260
в 1-ом - 0,024 ОЕ/мл,
260
во 2-ом - 0,019 ОЕ/мл.
Сочные мешочки во всех 3-х флакончиках измельчали стеклянной палочкой, из полученных суспензий отбирали по 100 мкл раствора и, разбавив его в 50 раз дистиллированной водой, замеряли оптическую плотность растворов из 1-го и 2-го флакончика против 3-го. Получилось:
260
в 1-ом - 0,065 ОЕ/мл,
260
во 2-ом - 0,318 ОЕ/мл.
Т.е. Виталанг-2 проникает через биологические мембраны минимум в 4,9 раза эффективнее Виталанга-1, при этом спектры поглощения извлеченной из сочных мешочков РНК идентичны таковым для исходных соединений.
Таким образом, предложенный метод позволяет количественно оценить способность переносчика (в нашем случае олеиновой кислоты) транспортировать РНК через биологические мембраны. Для более точной количественной оценки эффективности переносчика нетрудно снять и соответствующие кинетические кривые.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).
Источники информации
1. Зубжицкий Ю.Н. Метод люминесцентной микроскопии в микробиологии, вирусологии и иммунологии, Л., 1964.
2. Патент RU 2392328 С2, 10.10.2009.
3. Патент RU 2403288 С1, 10.11.2010.