СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И У ЛЮДЕЙ
METHOD OF INHIBITING HIV REPLICATION IN CELLS OF MAMMALS AND HUMANS

Область техники
Это изобретение относится к области биомедицины, а точнее к терапиям инфекционных заболеваний и, в частности, инфекционного заболевания, вызываемого вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). В настоящем изобретении описывается способ ингибирования репликации ВИЧ посредством изменения цитоскелета, особенно тех белков, которые образуют цитоскелетные промежуточные филаменты (IF). Настоящее изобретение также относится к применению агентов, которые негативно модулируют или модифицируют цитоскелет, с целью производства лекарственных средств для предупреждения и лечения ВИЧ-инфекции.
Предпосылки создания изобретения
Возникновение ВИЧ/СПИД (синдром приобретенного иммунного дефицита)-пандемии принадлежит к числу наиболее значительных проблем со здоровьем, возникающих во всем мире в последние тридцать лет. Оно привело к разработке антиретровирусных терапий, способных остановить прогрессирование инфекции и снизить смертность (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG. Boletin de la Organizacion Mundial de la Salud 2009; 87: 488-488).
В соответствии с оценкой по UNAIDS (Объединенной программе ООН по ВИЧ/СПИДу), приведенной в отчете за 2008 год, было 33 миллиона ВИЧ-инфицированных людей, 2,7 миллиона из которых были новыми случаями, выявленными в 2008 году. В соответствии с оценкой 67% охватывающих весь мир инфекций возникают в странах Африки, расположенных южнее Сахары (Report on global AIDS epidemic 2008. Geneva, UNAIDS). В соответствии с бюллетенем, опубликованным Всемирной организацией здравоохранения в 2009 году, существуют две основные тенденции во всем мире: общее поражение популяции стран Африки, расположенных южнее Сахары, и концентрация инфекции в специфических группах риска в остальном мире, соответственно (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG 2009. Boletin de la Organizacion Mundial de la Salud 2009; 87: 488-488).
Ежегодная частота возникновения ВИЧ-инфекции достигла максимума в середине 1990-ых годов (Bongaarts J, Buettner T, Heiling G, Pelletier F. Popul. Dev. Rev. 2008; 34: 199-224). Однако общее число ВИЧ-инфицированных людей продолжает увеличиваться в Африке вследствие устойчиво высокого коэффициента заболеваемости, вызываемой вирусом, и устойчиво высокой скорости роста популяции (De Cock K, Crowley SP, Lo YR, Granich RM, Williams BG 2009. Boletin de la Organizacion Mundial de la Salud 2009; 87: 488-488).
Появление вариантов ВИЧ, которые являются резистентными к имеющимся в настоящее время лекарственным средствам против ВИЧ, и плохое соблюдение лечения пациентами остаются основными причинами неблагоприятного исхода лечения. Резистентность вируса отмечали с начала антиретровирусной монотерапии, что привело к появлению комбинированной терапии против ВИЧ с использованием двух или более средств против ВИЧ, каждое из которых с отличным механизмом действия. Коэффициенты заболеваемости и смертности значительно снизились среди подвергнутых лечению пациентов с внедрением высокоэффективной антиретровирусной терапии (HAART). В этой терапии объединены нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы (PR). Тем не менее, терапия с использованием множества лекарственных средств не устраняет ВИЧ полностью, при этом длительное лечение, как правило, приводит к резистентности к нескольким лекарственным средствам. Половина пациентов, получающих комбинированную терапию против ВИЧ, не полностью поддается лечению, в основном вследствие резистентности вируса к одному или нескольким используемым лекарственным средствам. Кроме того, резистентность вируса была выявлена у недавно инфицированных пациентов, что значительно ограничивает возможные варианты лечения этих пациентов.
Успех комбинированной терапии против ВИЧ дал прогноз в отношении возможного уничтожения вируса. Однако в латентно инфицированных клетках, а также в тканях было описано существование вирусных резервуаров, в которых вирус сохраняется независимо от терапии. В соответствии с оценкой требуется более 70 лет непрерывного лечения для уничтожения вирусных резервуаров, событие, считающееся невероятным, поскольку терапия предполагает вторичные эффекты и порой смертельные метаболические осложнения, такие как лактоцитоз, сахарный диабет, липодистрофия, панкреатит и другие (Iglesias E 2009. Biotecnologia Aplicada 26: 189-194).
Соблюдение антиретровирусной терапии против ВИЧ является одной из самых обсуждаемых проблем, касающихся HAART, и особенно ингибиторов PR (протеазы), вследствие быстрого появления резистентности вируса в случае нерегулярного приема лекарственных средств или прерывания лечения. Существует несколько причин несоблюдения лечения, включающих непереносимость лекарственных средств, сложные схемы введения, неблагоприятный исход лечения, взаимодействия лекарственных средств, социально-экономические проблемы и другие.
Комбинированная терапия замедляет прогрессирование СПИДа, но не излечивает инфицированных пациентов (Marsden MD, Zack JA 2009. J. Antimicrob. Chemoth. 63: 7-10). Даже когда терапия преобразовывало эту инфекцию в хроническое заболевание, а не смертельную болезнь, а также увеличивала среднюю вероятность продолжительности жизни среди пациентов до уровней, подобных таковым для общей популяции, она, тем не менее, представляет нерешенные серьезные проблемы, которые требуют поиска новых стратегий для уменьшения используемых антиретровирусных средств. Это является целью поиска новых вариантов лечения.
Все недостатки имеющихся терапий против ВИЧ подкрепляют необходимость в новых лекарственных средствах против ВИЧ, различающихся, главным образом, своими механизмами и/или мишенями действия. Целью настоящего изобретения является обеспечение способа ингибирования репликации и/или инфицирования ВИЧ. Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение способа ингибирования репликации и/или инфицирования ВИЧ, который характеризуется механизмом, отличным от ингибирования полимеразы ВИЧ или протеазы ВИЧ. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа ингибирования репликации и/или инфицирования ВИЧ посредством нацеливания на клетку-хозяина, а не вирус. В частности, целью настоящего изобретения является нацеливание на цитоскелет, а конкретнее на промежуточные филаменты (IF) клетки-хозяина. В частности, другой целью настоящего изобретения является нацеливание на белки хозяина виментин и кератин-10. Полагают, что при нацеливании на клетку-хозяина ВИЧ будет, вероятно, труднее продуцировать «ускользнувшие» мутанты. Виментин и кератин-10 важны для структуры IF, и настоящее изобретение показало, что они являются мишенью, подходящей для ингибирования ВИЧ. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение агентов и фармацевтических композиций, которые разрушают IF клетки или уменьшают количество белков хозяина виментина и/или кератина-10.
С помощью настоящего изобретения достигается по крайней мере одна из вышеупомянутых целей.
Краткое изложение сущности настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к изменению цитоскелета клетки млекопитающего в качестве способа ингибирования репликации и/или инфицирования ВИЧ. Цитоскелет представляет собой трехмерную каркасную структуру, которая способствует сохранности клетки и играет несколько ролей в клетке. Его образуют три основные структуры: микротрубочки, микрофиламенты и промежуточные филаменты (IF). IF включают совокупность белков, специфических для каждого типа клетки, среди них находятся виментин и кератин-10.
Виментин является белком с молекулярной массой (М.м.), составляющей 58 кДа, образующим IF и обычно экспрессируемым в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, в некоторых эпителиальных клетках и в мезенхимных клетках (Alberts B, Johnson A, Lewis J., Raff M, Roberts K., Walter P. 2002. Molecular Biology of the Cell, 4th ed., Garland Publishing, New York). Известно, что виментин является субстратом протеазы (PR) ВИЧ, и предполагают, что действие PR затрагивает виментин, следовательно, возможно, затрагивает структуру цитоскелета (Blanco R, Carrasco L, Ventoso I 2003. J. Biol. Chem. 278: 1086-1093). Было также установлено, что лечение N-концевыми пептидами виментина, получаемыми в результате протеолитического процессирования, способно к изменению архитектуры клеточного ядра. Это изменение архитектуры ядра также отмечено в ВИЧ-инфицированных клетках (Shoeman RL, Huttermann C, Hartig R, Traub P 2001. Mol. Biol. Cell 12: 143-154). Полученные ранее данные наводят на мысль о том, что жизненный цикл ВИЧ зависит от разрезания виментина.
Кератины включают совокупность белков IF (приблизительно 30 членов) в диапазоне молекулярной массы от 10 до 68 кДа. Их классификация и нумерация были осуществлены в соответствии с их М.м. и их электрофоретическим поведением в кислой (pKi=4-6; тип I) и нейтральной - основной среде (pKi=6-8; тип II). Кератин-10 представляет собой кератин типа I с М.м., составляющей приблизительно 60 кДа, обнаруженный в основном в IF полностью дифференцированных эпидермальных клеток (Zhou XM 1988. J. Biol. Chem. 263: 15584-15589). Настоящее изобретение направлено на способ ингибирования репликации и/или инфицирования ВИЧ в клетке млекопитающего, включающий разрушение (структуры) цитоскелетных IF в указанной клетке млекопитающего. Кроме того, настоящее изобретение также направлено на агенты, которые разрушают цитоскелетные IF, для предупреждения или лечения ВИЧ-инфекции.
В первом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ ингибирования репликации ВИЧ в клетке млекопитающего, при этом указанный способ включает разрушение или негативное модулирование (структуры) цитоскелетных IF в клетке млекопитающего. В частности, указанной клеткой млекопитающего является клетка, являющаяся мишенью инфицирования вирусом ВИЧ.
В предпочтительном варианте осуществления указанного способа IF включают белки виментин и/или кератин-10.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанного способа способ включает уменьшение количества виментина и/или кератина-10 в указанных IF с целью разрушения или негативного модулирования (структуры) цитоскелетных промежуточных филаментов и/или уменьшение количества свободного виментина и/или кератина-10, доступного для создания новых IF.
Тем не менее, в другом предпочтительном варианте осуществления указанного способа способ включает уменьшение экспрессии генов, кодирующих белки виментин и/или кератин-10, с целью разрушения или негативного модулирования (структуры) цитоскелетных промежуточных филаментов.
Тем не менее, в другом предпочтительном варианте осуществления указанного способа разрушения указанных IF достигают посредством введения в указанную клетку млекопитающего терапевтически эффективной дозы агента, выбираемого из группы, состоящей из полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот и химических соединений. В одном предпочтительном варианте осуществления указанным агентом является пептид, выбираемый из группы пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1-10, и их гомологов. В другом предпочтительном варианте осуществления указанным агентом является интерферирующая РНК или антисмысловой олигонуклеотид, мишенью которой(ого) являются гены виментина и/или кератина-10 или их транскрипты. Тем не менее, в другом предпочтительном варианте осуществления указанным агентом является химическое соединение или липидное производное.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается агент, который разрушает или негативно модулирует цитоскелетные IF, для предупреждения или лечения ВИЧ-инфекции.
В предпочтительном варианте осуществления этого аспекта указанные IF включают виментин и/или кератин-10.
В другом предпочтительном варианте агента в соответствии с настоящим изобретением указанный агент вызывает/успешно осуществляет уменьшение количества виментина и/или кератина-10 в указанных IF.
В другом предпочтительном варианте такого агента агент уменьшает экспрессию генов, кодирующих виментин и/или кератин-10.
В другом предпочтительном варианте агента в соответствии с настоящим изобретением указанный агент выбирают из группы, состоящей из полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот и химических соединений.
В другом предпочтительном варианте агента в соответствии с настоящим изобретением указанный агент включает пептид, выбираемый из группы пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1-10, и их гомологов.
В другом предпочтительном варианте агента в соответствии с настоящим изобретением указанным агентом является интерферирующая РНК или антисмысловой олигонуклеотид, мишенью которой(ого) являются гены виментина и/или кератина-10 или их транскрипты.
В другом предпочтительном варианте агента в соответствии с настоящим изобретением указанным агентом является интерферирующая РНК, выбираемая из группы, состоящей из короткой интерферирующей РНК, короткой шпилечной РНК и микроРНК. Предпочтительно указанная интерферирующая РНК включает последовательность из 15-50 нуклеотидов, комплементарную району информационной РНК белков виментина и/или кератина-10, предпочтительно 18-25 нуклеотидов.
12,14
В другом предпочтительном варианте агента в соответствии с настоящим изобретением указанным агентом является химическое соединение, и указанным соединением является липидное соединение или липидное производное. Предпочтительно указанным липидным соединением является циклопентеноновый простагландин 15-дезокси-∆--PGJ2 (15d-PGJ2).
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции, при этом указанная композиция включает агент в соответствии с настоящим изобретением, описанный выше, который разрушает или негативно модулирует цитоскелетные IF в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
В предпочтительном варианте композиции в соответствии с настоящим изобретением указанный агент выбирают из группы, состоящей из полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот и химических соединений, которые разрушают IF, которые включают виментин и/или кератин-10.
В предпочтительном варианте композиции в соответствии с настоящим изобретением указанным агентом является пептид, выбираемый из группы, состоящей из пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1-10, и их гомологов.
Предпочтительно указанным агентом является интерферирующая РНК или антисмысловой олигонуклеотид, мишенью которой(ого) являются гены виментина и/или кератина-10 или их транскрипты.
В предпочтительном в высокой степени варианте агента в соответствии с настоящим изобретением указанный агент применяется для лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции, или применяется для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции. Лечение или предупреждение ВИЧ-инфекции включает привязку к ингибированию или блокировке репликации вируса.
В предпочтительном варианте указанной фармацевтической композиции интерферирующую РНК выбирают из группы, состоящей из короткой интерферирующей РНК, короткой шпилечной РНК и микроРНК.
12,14
В предпочтительном варианте указанной фармацевтической композиции химическим соединением является липидное соединение или липидное производное. Предпочтительно указанным липидным соединением является циклопентеноновый простагландин 15-дезокси-∆--PGJ2.
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается фармацевтическая комбинация, включающая агент, который разрушает цитоскелетные IF в соответствии с настоящим изобретением, как описано здесь выше, и по крайней мере одно лекарственное средство против ВИЧ. Примеры лекарственных средств против ВИЧ, подходящие для применения в аспектах настоящего изобретения, включают ингибиторы протеазы ВИЧ, наиболее предпочтительно ингибитор протеазы, который выбирают из группы, состоящей из атазанавира (Reyataz), ампренавира (Agenerase), дарунавира (Prezista), нелфинавира (Viracept), саквинавира (Invirase или Fortovase), индинавира (Crixivan), фосампренавира (Lexiva или Telzir), лопинавира (Aluvia), ритонавира (Norvir), типранавира (Aptivir), функциональных производных этих лекарственных средств и их комбинаций, таких как лопинавир+ритонавир (Kaletra). Другими антиретровирусными средствами, которые могут применяться в аспектах настоящего изобретения, являются ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (nNRTI), такие как эфавиренз (Stocrin) и невирапин (Viramune), этравирин (Intelence), рилпивирин (TMC-278), ловирид (R89439), делавирдин (Rescriptor), функциональные производные этих лекарственных средств и их комбинации. Другими антиретровирусными средствами, которые могут применяться в аспектах настоящего изобретения, являются нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI) или являющиеся аналогами нуклеозидов ингибиторы обратной транскриптазы (NARTI), такие как ламивудин (3TC или Epivir), абакавир (Ziagen), зидовудин (AZT или Retrovir AZT), ставудин (d4T или Zerit), залцитабин (ddC или Hivid), диданозин (ddI или Videx), эмтрицитабин (FTC или Emtriva), тенофовир (Viread), априцитабин (AVX754), стампидин, элвуцитабин (L-Fd4C), рацивир, амдоксовир, функциональные производные этих лекарственных средств и их комбинации, такие как эмтрицитабин+тенофовир (Truvada), зидовудин+ламивудин (Combivir) и абакавир+ламивудин+зидовудин (Trizivir).
Помимо вышеупомянутых антиретровирусных средств фармацевтическая комбинация настоящего изобретения может включать комбинации различных классов антиретровирусных средств, перечисленных выше, такие как комбинации эфавиренз+зидовудин+ ламивудин, эфавиренз+тенофовир+эмтрицитабин, лопинавир, усиленный с помощью ритонавира+зидовудина+ламивудина, и лопинавир, усиленный с помощью ритонавира+тенофовира+эмтрицитабина.
В предпочтительном варианте фармацевтической комбинации в соответствии с настоящим изобретением агенты и лекарственные средства вводят одновременно, по отдельности или последовательно, в качестве части схемы введения доз.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ лечения или предупреждения ВИЧ-инфекции у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективной дозы фармацевтической композиции в соответствии с любым из пунктов 20-26 формулы изобретения или фармацевтической комбинации в соответствии с любым из пунктов 27-28.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Относительная интенсивность зон белков человека виментина и кератина-10, идентифицированных с помощью сравнительного протеомного анализа. На панели А демонстрируется уменьшение белка виментина в культурах, подвергнутых обработке экстрактом с анти-ВИЧ активностью. На панели В демонстрируется уменьшение белка кератина-10 в культурах, подвергнутых обработке экстрактом с анти-ВИЧ активностью. «Усы» означают среднеквадратические отклонения.
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
Фиг. 2. Выявление белков виментина и кератина-10 в культурах с устойчивым сайленсингом каждого из обоих белков. Виментин (А) и кератин-10 (В) оценивали с помощью Вестерн-блоттинга в линии клеток МТ4, подвергнутой сайленсингу каждого белка, MT4 и MT4, соответственно. Культуры MT4 и MT4 продемонстрировали уменьшенную экспрессию соответствующего белка по сравнению с культурой клеток МТ4. Белок β-актин использовали в качестве контроля для нормализации результатов анализа с помощью Вестерн-блоттинга. Каждый вариант был проанализирован на дублирующих дорожках. На этой фигуре К-10 означает кератин-10.
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
Фиг. 3. Ингибирование репликации ВИЧ в культурах клеток MT4 и MT4, оцененное с помощью оценки антигена р24. Культуры клеток МТ4, MT4 и MT4 заражали штаммом Bru ВИЧ-1 с множественностью заражения, составляющей 0,01. Репликация вируса была ингибирована на более чем 90% в культурах клеток MT4 и MT4. «Усы» означают среднеквадратические отклонения.
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
Фиг. 4. Анализ заражения лентивирусным вектором pLGW в культурах клеток МТ4, MT4 и MT4. Культивируемые клетки трансдуцировали лентивирусным вектором, что напоминает первые стадии цикла репликации вируса ВИЧ-1 после вхождения, также несущим ген-репортер GFP. А) Культуры клеток MT4 и MT4 продемонстрировали уменьшенный процент флуоресцентных клеток после трансдукции лентивирусом по сравнению с клетками МТ4 без сайленсинга. Усы» означают среднеквадратические отклонения. В) Полученные при проточной цитометрии гистограммы для каждой культуры.
vim(s)
K-10(s)
Фиг. 5. Структурный анализ IF в культурах клеток МТ4. Культуры клеток МТ4, MT4 и MT4 были исследованы с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Культуры с сайленсингом (В, С) продемонстрировали укороченные IF вместо длинных филаментов, отмечаемых в культурах клеток МТ4 без сайленсинга, используемых в качестве контроля (А). Панель D демонстрирует фрагментированные IF в результате действия пептида, идентифицированного как SEQ ID NO: 1, на клетки МТ4.
Фиг. 6. Ингибирование репликации ВИЧ-1 в клетках МТ4 с помощью пептидов. А) Клетки инкубировали с пептидом в течение 24 ч и далее заражали штаммом HXB1 ВИЧ-1 с множественностью заражения, составляющей 0,05. Репликация вируса была ингибирована на высокий процент, который также увеличивался вместе с увеличением концентрации пептида. «Усы» означают среднеквадратические отклонения. В) Клетки инкубировали с пептидами в течение 24 ч и далее заражали штаммом Bru ВИЧ с множественностью заражения, составляющей 0,01. Половина ингибирующей концентрации (IC50) находилась на наномолярном уровне в случае всех пептидов.
Фиг. 7. Ингибирование репликации ВИЧ-1 с помощью различных пептидов в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC). Эти клетки подвергали предварительной стимуляции, обработке различными концентрациями пептидов и далее инфицированию штаммом Bru ВИЧ-1. Пептиды ингибировали репликацию ВИЧ дозозависимым образом.
Фиг. 8. Ингибирование репликации ВИЧ-2 с помощью пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. PBMC подвергали предварительной стимуляции, обработке различными концентрациями пептидов и далее инфицированию штаммом CBL-20 ВИЧ-2. Пептиды ингибировали репликацию ВИЧ-2 дозозависимым образом.
Фиг. 9. Уменьшение виментина в присутствии пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7, 8 и 9. Линию клеток МТ4 инкубировали с указанными пептидами в концентрации каждого = 50 мкМ в течение 24 ч. Виментин выявляли методом с использованием Вестерн-блоттинга. Соответствующие виментину полосы продемонстрировали уменьшенную интенсивность в культурах, обработанных пептидами.
Фиг. 10. Оценка интернализации пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1 (А) и SEQ ID NO:3 (В), в линию клеток МТ4. На диаграмме представлен процент флуоресцентных клеток, соответствующий проникновению пептидов в концентрациях, составляющих 5, 10, 20 и 40 мкМ, и в различные моменты времени в линию клеток МТ4. Сс: не подвергнутые обработке клетки. «Усы» означают среднеквадратические отклонения.
12,14
Фиг. 11. Ингибирование репликации ВИЧ-1 липидным производным. Клетки МТ4 инкубировали с различными концентрациями циклопентенонового простагландина 15-дезокси-∆--PGJ2 (15d-PGJ2) и далее заражали ВИЧ-1 (штаммом Bru) с множественностью заражения, составляющей 0,01. Простагландин 15d-PGJ2 ингибировал репликацию ВИЧ-1. «Усы» означают среднеквадратические отклонения.
Подробное описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение решает вышеупомянутую задачу и описывает способ ингибирования репликации ВИЧ посредством разрушения цитоскелета, точнее белков, образующих цитоскелетные IF.
В рамках настоящего изобретения в состав указанных IF могут входить кислый кератин, основный кератин, виментин, десмин, глиальный фибриллярный кислый белок, периферин, нейрофиламентный (NF) белок, интернексин, филенсин, факинин и ламин.
В варианте осуществления настоящего изобретения в состав указанных IF могут входить белки виментин и кератин. Конкретнее, виментин и кератин-10 могут образовывать указанные IF. Измененный цитоскелет ингибирует репликацию вируса ВИЧ в клетках человека.
Под разрушением цитоскелетных IF подразумевается, что структура IF модифицируется или изменяется так, что снижается количество белков, образующих цитоскелетные IF, и/или структурный разрыв цитоскелетных IF на более короткие субъединицы и/или изменение структурной формы сети цитоскелета и/или разборка IF. Описываемый здесь цитоскелет относится к каркасной структуре клетки или «скелету», содержащейся в цитоплазме, и составлен из белка. Цитоскелет присутствует во всех клетках, он играет важные роли как во внутриклеточном переносе, так и в клеточном делении. Его образуют три основные структуры: микротрубочки, микрофиламенты и промежуточные филаменты (IF). Цитоскелет обеспечивает структуру и форму клетки. Цитоскелетные элементы взаимодействуют активно и непосредственно с клеточными мембранами.
Определяемые здесь IF представляют собой семейство родственных белков, которые имеют общие структурные признаки и особенности последовательностей. Промежуточные филаменты имеют средний диаметр, составляющий 10 нанометров, который находится между таковым актина (микрофиламентов) и микротрубочек. Большинство типов промежуточных филаментов является цитоплазматическим, но один тип, ламины, являются ядерным. Существует приблизительно 70 различных генов, кодирующих различные белки промежуточных филаментов, специфические для каждого тира клетки, среди которых находятся белки виментин и кератин-10.
Используемый здесь термин «виментин» относится к члену семейства белков промежуточных филаментов, идентифицируемому по справочной последовательности в NCBI: NP_003371.2, имеющему последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11. Белки виментины образуют нитеобразные полимеры в ряде стадий сборки, начинающемся с антипараллелей, полусовмещенных парных димеров (или тетрамеров) с образованием филаментов длиной, равной единице, (ULF), которые собираются в продольном направлении с образованием полного филамента.
Используемый здесь термин «кератин» относится к семейству фиброзных структурных белков промежуточных филаментов. Белки кератины образуют нитеобразные полимеры в ряде стадий сборки, начинающемся с димеризации, димеры собираются в тетрамеры и октамеры и, в конечном счете, в ULF, способные к отжигу конец-в-конец в длинные филаменты. Каждый кератин типа I коэкспрессируется со специфическим партнером - кератином типа II, и каждая пара кератинов, которая образуется по мере совместной сборки специфических предпочтительных и предопределенных пар, является характеристической и указывающей на дифференциацию и специализацию конкретного типа эпителиальной клетки.
Используемый здесь термин «кератин-10» относится к кератину, цитоскелетному типа I, 10, члену семейства белков промежуточных филаментов, идентифицируемому по номеру доступа в Swiss-Prot: Q6EIZ0.1, имеющему последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12.
Используемый здесь термин «ген» относится к последовательности ДНК, включающей, но без ограничения, последовательность ДНК, которая может транскрибироваться в мРНК, которая может транслироваться в полипептидные цепи, транскрибироваться в рРНК или тРНК или служить в качестве сайтов распознавания ферментами и другими белками, вовлеченными в репликацию, транскрипцию и регуляцию ДНК. Этот термин относится к любой последовательности ДНК, включающей несколько функционально связанных фрагментов ДНК, таких как район промотора, 5' нетранслируемый район (5' UTR), кодирующая область (которая может кодировать или может не кодировать белок) и 3' нетранслируемый район (3' UTR), включающий сайт полиаденилирования. Обычно 5' UTR, кодирующая область и 3' UTR транскрибируются в РНК, кодирующая область которой, в случае кодирующего белок гена, транслируется в белок. Ген обычно включает интроны и экзоны.
Используемый здесь термин «ген виментина» относится к гену, кодирующему белок виментин или его гомолог.
Используемый здесь термин «ген кератина-10» относится к гену, кодирующему белок кератин-10 или его гомолог.
Термин «разрушение», как здесь используется применительно к разрушению промежуточных филаментов, как здесь указано, относится к нарушению функции или структурной организации. В частности, разрушение может включать разрыв структуры, ингибирование полимеризации, ингибирование образования и биосинтеза, в том числе ингибирование образования первичных, вторичных и третичных структур белков и т.д.
Термин «негативное модулирование», как здесь используется применительно к негативному модулированию промежуточных филаментов, как здесь указано, относится к такому изменению функции или структурной организации, которое приводит к потере или уменьшению биологической функции указанных филаментов.
Используемый здесь термин «цитоскелетные промежуточные филаменты (IF)» относится к промежуточным филаментам в качестве типа цитоскелетных элементов, и их размер является промежуточным по сравнению с таковым актина и микротрубочек. Вместе эти три структуры благоприятствуют сохранности структуры, форме клетки и подвижности клетки и органелл. Цитоскелетные промежуточные филаменты постоянно подразделяют на пять типов: типы I и II: кислый кератин и основный кератин. Кератины также имеют подтипы, которые являются уникальными для различных эпителиальных клеток; тип III: виментин в фибробластах, эндотелиальных клетках и лейкоцитах; десмин в мышце; глиальный фибриллярный кислый белок в астроцитах и других типах глии и периферин в волокнах периферических нервов; тип IV: нейрофиламентные (NF) белки H (тяжелый), M (средний) и L (низкомолекулярный), интернексин, филенсин и факинин; и тип V: ламины.
Используемый здесь термин «структура цитоскелетных промежуточных филаментов (IF)» относится к спиральной организации тетрамеров филаментов. Каждый мономер промежуточных филаментов состоит из альфа-спирального палочковидного домена, который соединяет амино-конец (головку) с карбоксильным концом (хвостом). Палочковидные домены свертываются вокруг другого филамента с образованием димера. N- и C-концы каждого филамента являются совмещенными. Некоторые промежуточные филаменты образуют гомодимеры, другие образуют гетеродимеры. Затем димеры образуют размещенные в шахматном порядке тетрамеры, которые выстроены в ориентации головка-хвост. Этот тетрамер считается основной субъединицей промежуточного филамента. Конечный промежуточный филамент представляет собой спиральный ряд этих тетрамеров.
В контексте описания этого изобретения термин «лечение» относится к любым и всяким применениям, которые вылечивают состояние или заболевание или его симптомы, предотвращают установление состояния или заболевания или его симптомов, или по-другому предотвращают или препятствуют или реверсируют прогрессирование состояния или заболевания или других нежелательных симптомов абсолютно любым способом.
Используемый здесь термин «терапевтически эффективная доза» относится к нетоксичному количеству терапевтического средства, достаточному для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, например, лечения, уменьшения интенсивности или предупреждения желаемого заболевания или состояния или для проявления выявляемого терапевтического или профилактического эффекта. Эффект можно выявить, например, по химическим маркерам или уровням антигенов. Терапевтические эффекты также включают ослабление физических симптомов. Точное эффективное количество для субъекта будет зависеть от размера и состояния здоровья субъекта, природы и степени заболевания, и терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Поэтому бесполезно устанавливать точное эффективное количество заранее. Однако эффективное количество для конкретной ситуации можно определить с помощью обычного экспериментирования и решается практикующим врачом.
В рамках настоящего изобретения эффективная доза будет составлять от приблизительно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг композиций полинуклеотидов или полипептидов у индивидуума, которому ее вводят.
Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель» относится к носителю для введения терапевтического средства, такого как полипептид, полинуклеотид и другие терапевтические средства. Этот термин относится к любому фармацевтическому носителю, который сам не вызывает продукцию антител, вредных для индивидуума, получающего композицию, и который можно вводить без чрезмерной токсичности. Подходящими носителями могут быть большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие реагенты или эмульгаторы, рН-буферные вещества и т.п. Всестороннее обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей имеется в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Обычно терапевтические композиции готовят в виде инъецируемых препаратов, в виде либо жидких растворов, либо суспензий, или в твердых формах, подходящих либо для приготовления раствора или суспензии в жидких носителях, либо для прямого приема. В определение фармацевтически приемлемого носителя включены липосомы, как и аэрозоли.
Термин «гомолог», как здесь используется и применительно к пептиду, относится к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, идентичную, как установлено с помощью совмещения последовательности, например, с Blast и т.д., последовательностям SEQ ID NO: 1-10 на по крайней мере 70%, предпочтительно на по крайней мере 75%, более предпочтительно на по крайней мере 85%, 90% или даже 90%, и способному разрушать, негативно модулировать или модифицировать цитоскелет, особенно белки, образующие цитоскелетные IF, а точнее белки виментин и кератин-10. Подходящими гомологами являются пептиды с консервативными аминокислотными заменами. Соответственно, когда заменено менее 10% аминокислот, более соответственно - менее 5%, менее 3%, и наиболее предпочтительно, когда заменено менее 1% аминокислот. Соответственно, когда заменено менее 10 аминокислотных остатков, более соответственно - менее 5, и наиболее соответственно, когда заменено менее 2 аминокислот. Консервативной заменой является замена, при которой аминокислоту заменяют другой очень схожей аминокислотой, которая оказывает незначительный эффект на активность белка или не оказывает такой эффект. «Консервативной заменой» является замена аминокислоты другой аминокислотой, имеющей такой же результирующий электронный заряд и приблизительно такой же размер и форму. Аминокислоты с алифатическими или замещенными алифатическими боковыми цепями аминокислот имеют приблизительно одинаковый размер, когда общее число атомов углерода и гетероатомов в их боковых цепях отличается на не более чем приблизительно четыре атома. Они имеют приблизительно одинаковую форму, когда число ветвей в их боковых цепях отличается на не более чем одну ветвь. Считают, что аминокислоты с фенильными или замещенными фенильными группами в их боковых цепях имеют приблизительно одинаковый размер и форму. Ниже перечислены пять групп аминокислот. Замена аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой из той же самой группы приводит к консервативной замене. Группа I: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистеин и не встречающиеся в природе аминокислоты с С1-С4 алифатическими или гидроксил-замещенными, С1-С4 алифатическими боковыми цепями (неразветвленными или моноразветвленными). Группа II: глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота и не встречающиеся в природе аминокислоты с замещенными карбоксильными группами, С1-С4 алифатическими боковыми цепями (неразветвленными или с одной точкой разветвления). Группа III: лизин, орнитин, аргинин и не встречающиеся в природе аминокислоты с замещенными аминогруппами или гуанидинами, С1-С4 алифатическими боковыми цепями (неразветвленными или с одной точкой разветвления). Группа IV: глютамин, аспарагин и не встречающиеся в природе аминокислоты с амид-замещенными, С1-С4 алифатическими боковыми цепями (неразветвленными или с одной точкой разветвления). Группа V: фенилаланин, фенилглицин, тирозин и триптофан.
Термин «% идентичности последовательностей» определяется здесь как процент нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты, которые идентичны нуклеотидам в представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, после совмещения последовательностей и необязательно введения пропусков, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Способы и компьютерные программы для совмещений хорошо известны в данной области техники. Используемые здесь термины «последовательность нуклеиновой кислоты» и «нуклеотиды» также охватывают неприродные молекулы, основанные на последовательностях нуклеиновых кислот и/или происходящие из них, такие как, например, искусственно модифицированные последовательности нуклеиновых кислот, пептидо-нуклеиновые кислоты, а также последовательности нуклеиновых кислот, включающие по крайней мере один модифицированный нуклеотид и/или неприродный нуклеотид, такой как, например, инозин.
Термин «РНК-интерференция» относится к процессу, в ходе которого интерферирующая РНК вызывает внутриклеточную деградацию специфической мРНК и который может использоваться для препятствования трансляции желаемой мРНК-мишени.
Термин «интерферирующая РНК» относится к агенту в виде двух- или одноцепочечной РНК (интерферирующей РНК), под которым подразумевается небольшая молекула нуклеиновой кислоты, используемая для РНК-интерференции. Агенты в виде коротких интерферирующих РНК, длина которых составляет приблизительно 15-30 нуклеотидов, называют «малыми или короткими интерферирующими РНК». Агенты в виде более длинных интерферирующих РНК обычно называют «двухцепочечными РНК» или «дцРНК», другие формы агентов в виде интерферирующих РНК представляют собой молекулы микроРНК и коротких шпилечных РНК. Агенты в виде интерферирующих РНК могут быть немодифицированными или химически модифицированными молекулами нуклеиновых кислот. Агенты в виде интерферирующих РНК могут быть химически синтезированными или экспрессированными с вектора, или ферментативно синтезированными. Использование агента в виде химически модифицированной интерферирующей РНК может улучшить одно или более свойств агента в виде интерферирующей РНК благодаря увеличенной резистентности к деградации, увеличенной специфичности к составляющим мишени, увеличенному поглощению клетками и т.п. Молекула ДНК, с которой транскрибируется дцРНК или короткая интерферирующая РНК (например, в виде шпилечного дуплекса), также обеспечивает РНК-интерференцию. Молекулы ДНК для транскрибирования дцРНК описаны в патенте США с № 6573099 и в публикациях заявок на патенты США с № 20020160393 и 20030027783. Молекулы ДНК для транскрибирования короткой интерферирующей РНК рассматриваются в Tuschl and Borkhardt, Molecular Interventions, 2: 158 (2002).
Используемый здесь термин «антисмысловая РНК» относится к любой РНК, которая связывается с мРНК с достаточным сродством для уменьшения количества белка, транслируемого с мРНК. Количество белка, транслируемого с мРНК, предпочтительно уменьшается на более чем 20%, более предпочтительно на более чем 50%, 70% и 80% и наиболее предпочтительно уменьшается на более чем 90%. Материалы и способы для антисмысловых РНК хорошо известны в данной области техники.
Используемый здесь термин «экспрессия» относится к транскрипции и устойчивой аккумуляции смысловой (мРНК) и антисмысловой РНК, получаемой с фрагмента нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Экспрессия может также относиться к трансляции мРНК в полипептид. «Антисмысловое ингибирование» относится к продукции транскриптов в виде антисмыловых РНК, способных к подавлению экспрессии белка-мишени.
Под термином «ингибирование экспрессии» подразумевается сайленсинг или деактивация гена или нуклеиновой кислоты, который относится к выявляемому уменьшению транскрипции и/или трансляции являющейся мишенью последовательности нуклеиновой кислоты, т.е. последовательности, являющейся мишенью интерферирующей РНК, или уменьшению количества или активности являющейся мишенью последовательности или белка по сравнению с нормальным уровнем, который выявляется в отсутствие интерферирующей РНК или другой последовательности нуклеиновой кислоты. Выявляемое уменьшение может быть до приблизительно 5% или 10% или доходить вплоть до приблизительно 80%, 90% или 100%. Обычное выявляемое уменьшение составляет приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70%.
Используемый здесь термин «липидное соединение» относится к аналогам жирных кислот, получаемым, например, из мононенасыщенных жирных кислот, полиненасыщенных жирных кислот и липидов, включающих 1-6 тройных связей.
«ВИЧ» представляет собой являющийся ретровирусом вирус иммунодефицита человека, вирус, который вызывает иммунный дефицит в результате поражения CD4+ клеток в организме. Используемый здесь термин «ВИЧ» включает любой ВИЧ, в том числе любые группы и подтипы (клады) ВИЧ-1 и ВИЧ-2, например, группы М и О ВИЧ-1; настоящее изобретение включает каждый из известных кладов; предпочтительным является ВИЧ-1.
Используемый здесь термин «репликация» относится к процессу, в ходе которого фермент полимераза синтезирует комплементарную цепь молекулы нуклеиновой кислоты. В конкретном контексте настоящего изобретения термин «репликация», как используется применительно к вирусу, относится к завершению полного или всего жизненного цикла вируса, в ходе которого инфекционные вирусные частицы или вирионы прикрепляются к поверхности клетки-хозяина (обычно связываются со специфической молекулой клеточной поверхности, которая обеспечивает специфичность инфицирования). После попадания внутрь клетки вирионы лишаются покрытия, и вирусные гены начинают экспрессировать белки, необходимые для репликации генома и синтеза новых белков для создания новых капсидов и ядер, приводя к сборке являющихся потомством инфекционных вирусных частиц, которые сами способны к инфицированию новых клеток-хозяев и репликации в них. Таким образом, жизненный цикл вируса является завершенным только, если, в пределах одиночной клетки, инфицирование одной или несколькими вирусными частицами или вирионами пройдет весь путь до продукции полностью инфекционных вирусных частиц потомства. В конкретном случае ретровирусов полный жизненный цикл вируса включает инфекционные вирусные частицы, содержащие вирусную РНК, входящую в клетку, при этом РНК подвергается обратной транскрипции в ДНК, ДНК интегрируется в хромосому хозяина в виде провируса, и инфицированные клетки продуцируют вирионные белки и собирают их вместе с полноразмерной вирусной геномной РНК в новые, в равной степени инфекционные частицы.
Используемый здесь термин «клетка-хозяин» относится к клетке, используемой для экспрессии вирусного генома или размножения вектора или вируса.
Используемый здесь термин «CD4+ клетки» относится к основной классификации Т-лимфоцитов, относящихся к тем, которые имеют антиген CD4.
В частности, настоящее изобретение относится к способам негативного модулирования, модифицирования или разрушения цитоскелетных IF. Предпочтительные IF содержат белки виментин и/или кератин-10. В предпочтительном варианте осуществления способ включает уменьшение количества виментина и/или кератина-10 в IF. Уменьшение виментина и/или кератина-10 можно произвести несколькими путями. Предпочтительным вариантом осуществления является уменьшение или ингибирование экспрессии генов, кодирующих виментин и/или кератин-10. Более предпочтительно, когда уменьшаются уровни представленности виментина и/или кератина-10 в IF, или изменяется структура цитоскелетных виментина и/или кератина-10. Структуру IF цитоскелета можно изменить посредством модификации структуры белков IF, например, посредством расщепления или неправильного сворачивания, предпочтительно структуры виментина и/или кератина-10.
Данные, упоминаемые в технической литературе, наводят на мысль, что во время жизненного цикла ВИЧ требуется разрезание виментина. Как ни удивительно, в настоящем изобретении репликация вируса ингибируется благодаря тому, что, по-видимому, является природным механизмом, функционирующим во время инфицирования вирусом. Попытка разрушить цитоскелет и/или удалить виментин в качестве способа ингибирования инфицирования ВИЧ не является очевидной, на самом деле, можно было бы ожидать, что инфицирование будет намного быстрее, поскольку разрушение цитоскелета также происходит во время нормального инфицирования.
Заявители идентифицировали цитоскелетные белки виментин и кератин-10 с помощью сравнительного протеомного анализа клеток МТ, подвергнутых обработке фракцией экстракта из лейкоцитов человека, демонстрирующей анти-ВИЧ активность. Было установлено, что экстракт из лейкоцитов, обладающий анти-ВИЧ активностью, демонстрирует уменьшение и/или дестабилизацию виментина и/или кератина-10 и/или IF. Ранее Thomas и др. продемонстрировали, что антитело против виментина способно блокировать связывание гликопротеина gp120 ВИЧ с виментином на клеточной поверхности, предотвращая вхождение вируса в клетку (Thomas EK, Connelly RJ, Pennathur S, Dubrousky L, Haffar OK, Bukrinsky MI 1996. Viral Immunol. 9: 73-87). Как ни удивительно, очень низкие уровни ингибирования репликации вируса были выявлены в экспериментальных условиях, проверенных в случае настоящего изобретения, используя антитело против виментина (нацеленное на уменьшения инфицирования ВИЧ). Thomas и др. использовали антитело против виментина, блокируя тем самым виментин, открытый для доступа антитела. Это очень отличается от принципа действия, предложенного в настоящем изобретении. В настоящем изобретении виментин подвергают изменению и/или уменьшают, чтобы разрушить IF. Посредством блокирования виментина, как это делает Thomas и др., IF не подвергаются изменению. Экспериментальные данные также подтверждают отличный принцип действия в способах настоящего изобретения. Очень высокий процент ингибирования репликации вируса, вплоть до 100%, был получен в случае уменьшения уровней виментина и/или дестабилизации структуры виментина в клетке-мишени, как отмечено в примерах 2, фиг. 3 и 4, в то время как у Thomas et al. был отмечен составляющий 47% максимум ингибирования.
Кроме того, нет сообщений о связывании кератина-10 с вирусным белком gp120, а совершенно верно, что репликация ВИЧ также ингибировалась в результате ингибирования и/или дестабилизации кератина-10, как показано в примере 2, фиг. 3 и 4.
Чтобы далее вникнуть в механизм ингибирования репликации ВИЧ, была использована экспериментальная система, в случае которой вхождение в клетку не опосредуется вирусным белком gp120. Эта система включает не реплицирующийся лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1, не имеющий gp120 и также экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP). Как показано в примере 2, отмечалось эффективное «инфицирование» клеток МТ4 этим лентивирусом, и культуры продемонстрировали высокий процент экспрессии GFP, указывающий на эффективное проникновение в клетку и интеграцию в геном клетки этого лентивирусного вектора. В этой системе «инфицирования» лентивирусом на основе ВИЧ-1 уменьшение виментина порождает существенное уменьшение «инфицирования» лентивирусом, как показано в примере 2. Это служит доказательством того, что способ, используемый в настоящем изобретении, для ингибирования инфицирования ВИЧ не связан со связыванием gp120 с виментином, как предложено Thomas и др. Следовательно, это изобретение относится к способу, о котором ранее не сообщалось, для ингибирования инфицирования ВИЧ.
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
Кроме того, было продемонстрировано с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ), что IF дестабилизированы в клетках МТ4 с сайленсингом виментина (MT4), а также в клетках с сайленсингом кератина-10 (MT4), что приводит к ингибированию «инфицирования» лентивирусным вектором на основе ВИЧ-1 (пример 3). Клетки MT4 и MT4 были получены посредством введения шпилечных РНК, специфических для каждого из генов, кодирующих белки.
Разрушения IF можно достичь с помощью агента, выбираемого из группы, состоящей из полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот и химических соединений. В предпочтительном варианте осуществления агентом является пептид, более предпочтительно пептидом является пептид, выбираемый из группы, состоящей из пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1-10, и их гомологов.
В другом предпочтительном варианте осуществления агентом является интерферирующая РНК или антисмысловой олигонуклеотид, мишенью которой(ого) являются гены виментина и/или кератина-10.
12,14
В другом предпочтительном варианте осуществления агентом является химическое соединение или липидное производное. Подходящим липидным соединением является циклопентеноновый простагландин 15-дезокси-∆--PGJ2.
В настоящем изобретении описываются способы лечения и/или предупреждения инфицирования клеток человека ВИЧ. Эти способы включают разрушение IF и, в частности, разрушение виментина и/или кератина-10 в клетке, чтобы предотвратить или осуществить лечение ВИЧ-инфекции в клетке.
Негативная регуляция имеет место в клетке-хозяине ВИЧ данного субъекта, в рамках способов предотвращения или ингибирования эффективного инфицирования клеток-хозяев субъекта. Таким образом, настоящее изобретение также включает способы лечения и/или предупреждения инфицирования субъекта ВИЧ.
Ингибирование инфицирования ВИЧ, используя описанные в настоящем изобретении способы, применимо как на клеточном уровне, так в отношении всего организма. Термин ингибирование значит полное или частичное ингибирование инфицирования.
В настоящем изобретении описывается манипулирование IF и, в частности, цитоскелетными белками виментином и/или кератином-10 для ингибирования репликации ВИЧ. Эта стратегия дает преимущество, состоящее в минимальной или несуществующей резистентности вируса, по сравнению с антиретровирусными средствами, имеющимися в настоящее время, поскольку эти белки являются эндогенными клеточными белками, а не вирусными. Механизмы действия лекарственных средств настоящего изобретения функционируют с использованием путей, отличных от тех, которые уже описаны, и демонстрирующих большую способность к ингибированию. Поэтому комбинация их с лекарственными средствами, имеющимися в настоящее время, против ВИЧ-инфекции увеличит, возможно, эффективность лечений против ВИЧ. Кроме того, применение терапевтических средств настоящего изобретения можно было бы сочетать с новыми стратегиями лечения, уже предложенными в существующем уровне технике, например, трансплантацией стволовых клеток, имеющих модифицированные эндогенные гены. Терапевтический способ настоящего изобретения обеспечивает новую альтернативу для тех пациентов, которые демонстрируют резистентность к множеству лекарственных средств, которые представляют высокий процент среди пациентов, подвергаемых лечению с использованием имеющейся в настоящее время терапии.
Несмотря на возможное повреждение структуры IF, приводящее к токсичности и даже гибели клетки, неожиданное основное достижение этого изобретения включает ингибирование инфицирования ВИЧ без затрагивания жизнеспособности клетки, при этом все это добавляет даже больше новизны в счет лечения пациентов, инфицированных ВИЧ.
Настоящее изобретение также включает применение агентов, которые негативно модулируют, модифицируют, или разрушают цитоскелет, точнее белки, образующие цитоскелетные IF и, в частности, виментин и/или керамин-10, для производства фармацевтического средства для предупреждения или лечения ВИЧ-инфекции. Такие агенты могут быть слиты и/или конъюгированы с другими молекулами. Такие агенты включают пептидоподобные соединения, интерферирующую РНК и липидные соединения, порождающие негативную модуляцию или модификацию цитоскелета, IF, и, в частности, те агенты, которые негативно модулируют виментин и/или кератин-10.
Виментин и/или кератин-10 можно негативно модулировать посредством приведения клетки в контакт с агентом, который негативно модулирует виментин и/или кератин-10. Этот агент можно приготовить в виде лекарственного препарата для увеличения его способности к проникновению в клетку, при необходимости. Негативной модуляции можно достичь посредством введения агента субъекту, при этом такой агент негативно модулирует виментин и/или кератин-10 в клетках субъекта. Агент вводят так, чтобы он контактировал с клетками субъекта, которые уже инфицированы ВИЧ или которые потенциально могут инфицироваться. Такие клетки называют здесь клетками-хозяевами ВИЧ. Введение агента включает приведение агента в контакт с клеткой-хозяином. Пути введения включают парентеральный путь и пути, с помощью которых агент доставляют через слизистую оболочку субъекта. В конкретном варианте аспектов настоящего изобретения клеткой-хозяином является клетка CD4+.
В варианте осуществления настоящего изобретения негативной модуляции или модификации можно достичь посредством оказания непосредственного воздействия на виментин и/или кератин-10, с помощью уменьшения или экспрессии гена, или синтеза белка, с помощью модификации структуры филаментов, образованных этими белками, с помощью дестабилизации структуры филаментов или уменьшения их активности/функции.
В контексте настоящего изобретения негативная модуляция (или модификация) включает ингибирование уровня белков виментина и/или кератина-10 в клетке или модификацию, дестабилизацию, разборку или даже разрушение структуры IF, содержащих эти белки, в клетке.
Любой агент, известный в качестве средства, ингибирующего или негативно модулирующего IF и, в частности, виментин и/или кератин-10, может использоваться для ингибирования ВИЧ-инфекции, в соответствии со способом, который раскрыт в настоящем изобретении.
Аналогично, ВИЧ-инфекцию можно также ингибировать, используя подобные пептидам или полипептидам агенты, которые негативно модулируют или дестабилизируют IF и, в частности, виментин и/или кератин-10. Такие агенты включают эндогенные белки или белки, которые в норме не присутствуют в клетке-хозяине. Они могли бы быть, например, мутированными белками, созданными с помощью методов генетической инженерии белками, пептидами, синтетическими пептидами, рекомбинантными белками, химерными белками, фрагментами антител, гуманизированными белками, гуманизированными антителами, химерными антителами, модифицированными белками и фрагментами всякого из них.
vim(s)
K-10(s)
В настоящем изобретении установлено, что использование пептидов, способных разрушать структуру IF, в частности, тех, которые содержат виментин и/или кератин-10, приводит к сильному ингибированию инфицирования клеток МТ4 ВИЧ, что подтверждает результаты, полученные в клетках MT4 и MT4. Это служит поддержкой применения этих пептидов для предупреждения или лечения ВИЧ-инфекции, в качестве части настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления аспектов настоящего изобретения пептидами являются пептиды, идентифицированные в последовательностях, перечисленных как SEQ ID NO: 1-10. Настоящее изобретение также включает применение гомологов этих пептидов. Пептиды могут быть слиты с другой молекулой, например, они могут быть слиты с проникающим пептидом.
Агентом, применимым для предупреждения или лечения ВИЧ, в соответствии с настоящим изобретением является такой агент, который способен ингибировать экспрессию генов виментина и/или кератина-10, или синтеза их белков, или структуры IF, которые содержат виментин и/или кератин-10. Предпочтительный агент, в соответствии с настоящим изобретением, включает агент, который вызывает сайленсинг генов виментина и/или кератина-10 или их транскриптов посредством РНК-интерференции, такой как короткая интерферирующая РНК, короткая шпилечная РНК или микроРНК.
РНК-интерференция относится к типу селективного посттрансляционного процесса сайленсинга генов, который разрушает специфическую информационную РНК (мРНК) с помощью молекулы, которая связывается с мРНК и ингибирует ее процессирование. Например, она может ингибировать трансляцию мРНК или деградировать ее. В контексте настоящего изобретения интерферирующая РНК относится к любому типу интерферирующей РНК, в том числе, но без ограничения, короткой интерферирующей РНК, короткой шпилечной РНК, эндогенной микроРНК и искусственной микроРНК.
Используемый здесь термин «короткая интерферирующая РНК» относится к нуклеиновой кислоте, образующей двойную цепь РНК, которая способна к уменьшению или ингибированию экспрессии генов виментина и/или кератина-10. Последовательность короткой интерферирующей РНК может соответствовать полной последовательности генов виментина и/или кератина-10. Длина типичной короткой интерферирующей РНК составляет по крайней мере 15-50 нуклеотидов, предпочтительно - 19-30 нуклеотидов. Короткую интерферирующую РНК можно химически синтезировать, продуцировать с помощью in vitro транскрипции или продуцировать в клетке, которую специально используют для ее продуцирования.
Термин «короткая шпилечная РНК» используется здесь в качестве типа короткой интерферирующей РНК. Эти короткие шпилечные РНК могут быть составлены из короткой антисмысловой цепи, например, из 19-25 нуклеотидов и последующей петли из 5-9 нуклеотидов и аналогичной смысловой цепи. Альтернативно, нуклеотидной петле и последующей антисмысловой цепи может предшествовать смысловая цепь. Короткие шпилечные РНК функционируют как короткая интерферирующая РНК и/или вид короткой интерферирующей РНК, но они отличаются тем, что у коротких шпилечных РНК выявляются особые, подобные шпилькам структуры для увеличения стабильности. Эти короткие шпилечные РНК в качестве других агентов, описываемых здесь, могут доставляться в виде плазмид, ретровирусов и лентивирусов и экспрессироваться с таких промоторов, как промотор для полимеразы III U6 или другие.
Способы доставки агента типа интерферирующей РНК в клетку-мишень могут включать, например, введение композиции, содержащей этот агент, или приведение указанной композиции в непосредственный контакт с клеткой, например, приведение гемопоэтической клетки в контакт с композицией, содержащей интерферирующую РНК. В другом случае агент типа интерферирующей РНК можно непосредственно ввести с помощью любого пути прямого внесения в кровоток, такого как венозный или артериальный путь, например, с помощью гидродинамической инъекции или катетеризации. В некоторых случаях агент в виде интерферирующей РНК можно доставляться в конкретные органы или системно. Коллоидные дисперсионные системы могут использоваться в качестве носителей для увеличения in vivo стабильности агентов.
Агенты могут ингибировать экспрессию генов виментина и/или кератина-10 за счет механизмов, схожих с таковыми, используемыми, например, олигонуклеотидом или аналогом нуклеиновой кислоты. Они включают, например, пептидонуклеиновую кислоту (ПНК), псевдокомплементарную ПНК, закрытую нуклеиновую кислоту и их производные. Последовательности нуклеиновых кислот кодируют белки, которые действуют в качестве репрессоров транскрипции, антисмысловые молекулы, рибозимы, небольшие ингибиторные последовательности нуклеиновых кислот, такие как интерферирующая РНК, короткая шпилечная РНК, короткая интерферирующая РНК, микроРНК и антисмысловые олигонуклеотиды.
Агенты могут напоминать по форме любую структуру, присутствующую в норме или нет, при уровнях, вводимых в клетку или организм. Можно идентифицировать или создать агенты, такие как химические вещества, небольшие молекулы, аптамеры, которые негативно модулируют IF и, в частности, виментин и/или кератин-10. В контексте настоящего изобретения аптамерами являются одноцепочечные нуклеиновые кислоты, демонстрирующие вполне определенные трехмерные структуры, которые способствуют их связыванию с молекулами-мишенями таким образом, который концептуально схож с таковым для антител. В аптамерах объединены оптимальные свойства как небольших молекул, так и антител, в том числе их высокая специфичность и сродство, химическая стабильность, низкая иммуногенность и способность к воздействию на белок-белковые взаимодействия. Агент может функционировать сразу же, как введен, но он может также подвергаться модификации или использоваться внутриклеточно для порождения негативной модуляции виментина и/или кератина-10. Например, введение последовательности нуклеиновой кислоты в клетку и ее транскрипция приводит к продукции нуклеиновой кислоты и/или белка, которые ингибируют белок IF и, в частности, виментин и/или кератин-10 в клетке.
Агент может включать вектор. Векторы могут быть эписомными, например, плазмидами, векторами, происходящими из вирусов, таких как цитомегаловирусы, аденовирусы и т.д., или могут интегрироваться в геном клетки-мишени, например, векторы, происходящие из ретровирусов, вирус мышиного лейкоза Молони, ВИЧ-1, вирус птичьего лейкоза и другие. Векторы на основе ВИЧ или вируса лейкоза кошек могут использоваться для трансфекции неделящихся клеток. Могут использоваться векторы, в которых объединены различные ретровирусы.
В существующем уровне техники было описано несколько вирусных и связанных с вирусами векторов. Такие векторы могут использоваться в качестве носителей для переноса конструкции нуклеиновой кислоты в клетку. Конструкции можно интегрировать в геномы вирусов с нерепликативным циклом, подобные аденовирусам (аденоассоциированным вирусам), вирусам простого герпеса и другим, включающим ретровирусные и лентивирусные векторы, для инфицирования или трансдукции клеток. Векторы на основе ВИЧ могут, в частности, применяться в клетках-хозяевах ВИЧ.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает фармацевтическую композицию, включающую агент в соответствии с настоящим изобретением. Агенты, упоминаемые в настоящем изобретении и содержащиеся в указанной композиции, могут быть объединены друг с другом или быть соединены с другими терапевтическими средствами, такими как, но без ограничения, уже известные лекарственные средства против ВИЧ (например, зидовудин (AZT)).
В предпочтительном варианте осуществления негативную модуляцию IF и, в частности, виментина и/или кератина-10 применяют в настоящем изобретению к клеткам, которые могут быть инфицированы ВИЧ, с целью предотвращения или уменьшения инфицирования ВИЧ этой клетки. В предпочтительном варианте осуществления клеткой человека является клетка CD4+. Применение такой негативной модуляции ко всему организму, человеку или примату, может быть эффективным терапевтическим лечением организма против ВИЧ-инфекции.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая комбинация, включающая агент в соответствии с настоящим изобретением и лекарственное средство против ВИЧ. В случае фармацевтической комбинации агенты и лекарственные средства, являющиеся ее частью, могут вводиться одновременно, по отдельности или последовательно.
Преимущества настоящего изобретения
Настоящее изобретение является предпочтительным по сравнению с имеющимися в настоящее время антиретровирусными средствами, поскольку оно отменяет резистентность вируса или уменьшает вероятности ее возникновения до минимума. Это обусловлено клеточным эндогенным, а не вирусным происхождением IF и, в частности, белков виментина и кератина-10.
Лекарственные средства настоящего изобретения действуют с высокой ингибиторной способностью за счет механизмов, отличных от тех, которые уже описаны в предшествующем уровне техники. Поэтому их комбинация с имеющимися в настоящее время терапевтическими средствами, специфическими в отношении ВИЧ-инфекции, увеличит, возможно, эффективность лечений против ВИЧ.
С другой стороны, применение терапевтических средств настоящего изобретения можно было бы сочетать с новыми вариантами лечения, предложенными в существующем уровне технике, например, трансплантацией стволовых клеток, имеющих модифицированные эндогенные гены.
Настоящее изобретение предлагает новую терапию пациентам, резистентным к множеству лекарственных средств, которые представляют высокий процент среди пациентов, подвергаемых лечению с использованием имеющейся в настоящее время терапии.
Способы доставки
После приготовления фармацевтические композиции настоящего изобретения могут (1) вводиться субъекту непосредственно; (2) доставляться ex vivo, в клетки, полученные от субъекта; или (3) доставляться in vitro для экспрессии рекомбинантных белков.
Непосредственную доставку композиций будут, как правило, осуществлять с помощью инъекции, либо подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, либо внутримышечно, либо доставлять в интерстициальное пространство ткани. Композиции можно также вводить в нервную систему. Другие способы введения включают местные, пероральные применения, суппозитории и трансдермальные применения, иглы и генные пушки или гипоспреи. Лечением с использованием введения доз может быть схема с использованием однократной дозы или схема с использованием многократных доз.
Способы ex vivo доставки и реимплантации трансформированных клеток субъекту известны в данной области техники и описываются, например, в публикации международной заявки с № WO 93/14778. Примеры клеток, пригодных для ex vivo применений, включают, например, стволовые клетки, особенно гемопоэтические, лимфатические клетки, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.
Как правило, доставку нуклеиновых кислот в случае ex vivo и in vitro применений можно осуществить, например, с помощью трансфекции с использованием декстрана, преципитации фосфатом кальция, трансфекции с использованием полибрена, электропорации, инкапсуляции полинуклеотида(ов) в липосомы и прямой микроинъекции ДНК, все из которых хорошо известны в данной области техники. Способы введения полинуклеотидов (например, коротких интерферирующих РНК) в клетку известны в данной области техники. Способы введения нуклеиновой кислоты включают, например, трансфекцию с использованием фосфата кальция, DEAE-декстрана, электропорацию или трансфекцию с использованием липосом. Альтернативно, используют прямую инъекцию полинуклеотида. Однако предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты вводят в клетку с использованием вектора, предпочтительно вирусного вектора. Указанный вектор предпочтительно включает ретровирусный, аденовирусный, аденоассоциированный вирусный или лентивирусный вектор.
Различные способы используют для введения терапевтической композиции непосредственно в конкретное место в теле. Также используют рецептор-опосредованную, направленную доставку терапевтических композиций, содержащих антисмысловой полинуклеотид, субгеномные полинуклеотиды или антитела, в конкретные ткани. Методы рецептор-опосредованной доставки ДНК описаны, например, в Findeis et al., Trends in Biotechnol. (1993) 11: 202-205; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542-546.
Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды, предпочтительно вводят в диапазоне от приблизительно 100 нг до приблизительно 200 мг полинуклеотидов в случае местного применения в протоколах генной терапии. Диапазоны концентраций от приблизительно 500 нг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг или от приблизительно 20 мкг до приблизительно 100 мкг полинуклеотидов могут также использоваться во время протокола генной терапии. Во внимание будут приниматься такие факторы, как принцип действия и эффективность трансформации и экспрессии, которые будут оказывать влияние на дозу, требуемую для максимальной эффективности полинуклеотидов. Если желательна экспрессия в большей степени в большем охвате ткани, могут потребоваться большие количества полинуклеотидов или те же количества, вводимые повторно в последовательном протоколе введений, или несколько введений в различные примыкающие или близко расположенные части ткани, например, нервное окончание или синапсы, для вызова положительного терапевтического результата. Во всех случаях обычное экспериментирование в клинических испытаниях определит конкретные диапазоны для оптимального терапевтического эффекта. Более полное описание векторов для генной терапии, особенно ретровирусных векторов, содержится в WO 98/00542.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Сравнительный протеомный анализ клеток МТ, подвергнутых обработке экстрактом из лейкоцитов, демонстрирующим анти-ВИЧ активность
Линию клеток МТ4 подвергали обработке экстрактом из лейкоцитов, демонстрирующим анти-ВИЧ активность (Fernandez-Ortega C; Dubed M; Ruibal I; Vilarrubia OL; Menendez JC; Navea L et al. 1996, Biotherapy 9: 33-40), и результирующий профиль экспрессии белков сравнивали с контролем в виде не подвергнутых обработке клеток. Клетки лизировали и центрифугировали при 12000 оборотов/мин в течение 20 мин. Супернатант отбирали, а осадок подвергали второй процедуре лизиса. После второй стадии центрифугирования в тех же условиях второй супернатант коллекционировали вместе с первым супернатантом, далее обезжиривая с помощью этилового спирта и алкилируя с использованием полиакриламида. Впоследствии дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) осаждали, и выполняли двумерный электрофорез, используя 12,5-3% полиакриламидный гель в Трис-трициновом буфере, при 4°С.
Снимки аналитических гелей анализировали, используя программное обеспечение Melanie 5. Белковые зоны, которые идентифицировали, вырезали из препаративных гелей и далее расщепляли трипсином. Являющиеся результатом протеолиза пептиды экстрагировали для масс-спектрометрического анализа, и масс-спектры получали, используя гибридный масс-спектрометр с ортогональной геометрией QTOF-2 и с оснащением источником ионизации наноспреем.
Полученные при ESI-MS/MS спектры анализировали, и для идентификации белков выполняли соответствующие поиски в базе данных неповторяющихся последовательностей белков Национального центра биотехнологической информации США и в базе данных Европейской лаборатории молекулярной биологии Германии. В образцах, подвергнутых обработке экстрактом из лейкоцитов с анти-ВИЧ активностью, было выявлено уменьшение цитоскелетных белков, в частности тех, которые образуют IF (виментина и кератина-10) (фиг. 1).
Пример 2: Интерферирующая РНК против виментина и кератина-10 ингибирует инфицирование ВИЧ
2
2
vim(s)
K-10(s)
Линию клеток МТ4 подвергали трансдукции, используя лентивирусные векторы pLenti-shRNAvim или pLenti-shRNAK-10, которые несут последовательность, кодирующую шпилечную РНК, которая вызывает сайленсинг экспрессии белков виментина и кератина, соответственно. Эти лентивирусные векторы были собраны с помощью упаковки в линии клеток 293Е, трансдуцированной четырьмя плазмидами. Указанными плазмидами были pLP1, pLP2, pLP/VSVG и p-shRNA, последняя является специфической для либо виментина, либо кератина-10. Вектор pLP1 кодирует генные продукты последовательностей gag/pol ВИЧ-1. pLP/VSVG кодирует поверхностный белок вируса везикулярного стоматита, а p-shRNA содержит геном лентивирусного вектора, который несет последовательности, кодирующие специфические для виментина или кератина-10 шпилечные РНК (Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T. et al., 2004 Nucleic Acids Research 32: 936-948; Santa Cruz Biotechnology). Все плазмиды были амплифицированы в штамме XL-1 Escherichia coli в селекционных условиях с использованием ампициллина. Все четыре плазмидных вектора были подвергнуты очистке до качества, соответствующего трансфекции, с помощью колоночной хроматографии и приведены вместе в контакт с линией пакующих клеток 293Т в присутствии полиэтиленимина. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С в атмосфере 5% СО, и вирионы далее очищали с помощью ультрацентрифугирования при 20000 × g. После очистки лентивирусного вектора клетки МТ4 трансдуцировали, и рекомбинанты отбирали по резистентности к бластицидину. Рекомбинантные клоны изолировали методом предельного разведения и культивировали в среде RPMI, дополненной до 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), в атмосфере 5% СО и 95% относительной влажности при 37°С до сбора. Суммарный белок экстрагировали из культур, и сайленсинг виментина был выявлен с помощью Вестерн-блоттинга в клетках МТ4 (MT4), а также в случае кератина-10 в клетках MT4 с сайленсингом кератина-10. Трансдуцированнные культуры продемонстрировали уменьшенную экспрессию виментина или кератина-10 по сравнению с контролем в виде не трансдуцированных клеток, соответственно (фиг. 2).
Анти-ВИЧ активность оценивали в двух системах заражения:
vim(s)
K-10(s)
2
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
Система А: Клетки с устойчивым сайленсингом белка виментина (MT4) или кератина-10 (MT4) культивировали в среде RPMI, дополненной до 10% FBS, в атмосфере 5% СО и 95% относительной влажности при 37°С. Заражение суммарным вирусом выполняли в культурах клеток MT4, MT4 и МТ4. Штамм вируса Bru использовали с множественностью заражения, составляющей 0,01, и репликацию оценивали посредством определения концентрации антигена р24 в супернатантах культур методом ELISA. Клетки MT4 и MT4 продемонстрировали ингибирование на приблизительно 90% репликации вируса по сравнению с культурами клеток МТ4 без сайленсинга каждого из этих белков (фиг. 3).
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
Система В: Культуры клеток MT4, MT4 и МТ4 заражали лентивирусным вектором, несущим часть генома ВИЧ-1, в которой отсутствуют гены, вовлеченные в инвазионную способность и вхождение (pLGW). Этот вектор был сконструирован посредством упаковки продуктов четырех плазмид в линии клеток 293Т. Указанными плазмидами были pLP1, pLP2, pLP/VSVG и pLGFP, при этом последняя кодирует GFP. Плазмида pLP1 кодирует генные продукты последовательностей gag/pol ВИЧ-1. Плазмида pLP2 несет генетическую последовательность белка Rev ВИЧ-1, а pLP/VSVG кодирует поверхностный белок вируса везикулярного стоматита. Плазмида pLGFP кодирует GFP, а также несет последовательность для упаковки, последовательности элементов, отвечающих на Rev, (RRE) ВИЧ, а также длинные концевые повторы (LTR) ВИЧ-1 с 3'-делецией, составляющие геном лентивирусного вектора. Следили за экспрессией GFP в качестве маркера завершения цикла репликации вируса после вхождения и до интеграции. Результаты отслеживали с помощью флуоресцентной микроскопии, и количество флуоресцентных клеток было уменьшенным в культурах MT4 и MT4 по сравнению с таковым в культурах клеток МТ4 (не представленные данные). Образцы анализировали с помощью проточной цитометрии, и количество флуоресцентных клеток из-за экспрессии GFP было уменьшенным почти на 70% по сравнению с культурами клеток МТ4 без сайленсинга (фиг. 4).
Пример 3: Изменения структуры промежуточных филаментов в клетках МТ4
vim(s)
K-10(s)
vim(s)
K-10(s)
Прежде всего, клетки MT4, MT4 и МТ4 фиксировали в 3,2% глутаральдегида в течение 1 ч при 4°С, а затем фиксировали в 2% тетраоксиде осмия в течение 1 ч при 4°С. Впоследствии их промывали 0,1 М забуференным фосфатом солевым раствором (PBS), pH 7,2 и обезвоживали при увеличивающихся концентрациях этанола (30, 50, 70 и 100%) в течение 10 мин для каждой концентрации при 4°С. Было осуществлено включение, и ультратонкие срезы толщиной 40-50 нм были получены в ультрамикротоме (NOVA, LKB), которые помещали на никелевые сетки с 400 отверстиями. После получения ультратонких срезов и помещения их на сетки их контрастировали с помощью насыщенного ацетата уранила и цитрата свинца и далее исследовали под микроскопом JEOL JEM 2000 EX (JEOL). Пять микрофотографий анализировали при различных увеличениях. Интактные IF клеток МТ4 представлены на фиг. 5А, между тем эти структуры казались укороченными в клетках MT4 и MT4 (фиг. 5В и С, соответственно). Панель D демонстрирует этот эффект в IF, вызванный действием пептида (пептида, идентифицированного как SEQ ID NO: 1), который демонстрирует структуру виментина в клетках МТ4. В этих условиях отмечалось ингибирование репликации вируса. Белки виментин или кератин-10 были идентифицированы в IF с помощью иммуномикроскопии.
Пример 4. Синтетические пептиды, которые ингибируют репликацию ВИЧ в клетках МТ4
Были синтезированы пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям кератина-10 человека, кератина 1 человека и виментина человека (Goldman RD, Khuon S, Hao Chou Y, Opal P, Steinert PM 1996, J. Cell Biol. 134: 971-983; Steinert PM, Yang JM, Bale SJ, Compton JG 1993, BBRC 197: 840-848). Один из пептидов содержал проникающий в клетку пептид, конъюгированный на его С-конце (Vallespi MG, Fernandez JR, Torrens I, Garcia I, Garay H, Mendoza O et al. 2009. J. Peptide Science 16: 40-47). Анти-ВИЧ активность указанных пептидов оценивали, используя систему заражения суммарным вирусом, в присутствии различных штаммов вируса: HXB1 (клон IIIB ВИЧ-1) и Bru. Линию клеток МТ4 инкубировали с пептидом в течение 24 ч до заражения вирусом. Анализы, включающие девять копий для каждого экспериментального варианта, проводили при значениях множественности заражения, составляющих 0,01 и 0,05. Значение для вирусного антигена р24 определяли в культурах клеток, используя анализ типа ELISA, и результаты представляли в виде процента ингибирования вируса или в виде процента инфицирования, оба по отношению к концентрации пептида. Значительное ингибирование репликации вируса было отмечено в присутствии пептидов, и когда культуры подвергали заражению при высокой концентрации вируса (SEQ ID NO: 1, фиг.6А), и при множественности заражения, составляющей 0,01 (фиг. 6В). IC50 пептидов находилась в наномолярном диапазоне.
Пример 5. Синтетические пептиды, которые ингибируют репликацию ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови
PBMC были выделены из цельной крови здоровых индивидуумов с использованием градиентов плотности хлорида цезия и фиколла. Клетки подвергали предварительной стимуляции в течение 2 дней в среде RPMI, дополненной до 20% FBS, 100 Е/мл интерлейкина 2 (IL-2) и 5 мкг/мл фитогемагглютинина (PHA). Впоследствии их сохраняли в среде без PHA и засевали с плотностью 150000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. Через 24 ч добавляли пептиды в различных концентрациях, и культуры подвергали инфицированию штаммом Bru ВИЧ-1 с множественностью заражения, составляющей 0,01. Культуры поддерживали в течение 7 дней со сменой среды и добавлением пептидов каждые 3 дня. Культуры собирали, и супернатанты отбирали для определения присутствия вирусного белка р24. Пептиды ингибировали репликацию ВИЧ-1 дозозависимым образом (фиг. 7). Схожие результаты, касающиеся IC50, в наномолярном диапазоне были получены в случае культур, инфицированных штаммом BaL1 ВИЧ-1.
Пример 6. Ингибирование ВИЧ-2 с помощью синтетических пептидов
PBMC были выделены из цельной крови здоровых индивидуумов с использованием градиентов плотности фиколла. Клетки подвергали предварительной стимуляции в течение 2 дней средой RPMI, дополненной до 20% FBS, 100 Е/мл IL-2 и 5 мкг/мл PHA. Впоследствии их сохраняли в среде без PHA и засевали с плотностью 150000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. Через 24 ч добавляли пептиды в различных концентрациях, и культуры подвергали инфицированию штаммом CBL-20 ВИЧ-2. Культуры поддерживали в течение 7 дней со сменой среды каждые 3 дня и добавлением пептидов. Культуры собирали, и супернатанты отбирали для определения присутствия вирусного белка р24. Пептиды ингибировали репликацию ВИЧ-2 дозозависимым образом (фиг. 8).
Пример 7. Уменьшение виментина в присутствии пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1, 4, 5, 7, 8 и 9
Линию клеток МТ4 инкубировали с 50 мкМ каждого пептида в течение 24 ч. Белок виментин выявляли методом с использованием Вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты ресуспендировали в 1% натрия додецилсульфата (SDS) и вносили в 10% полиакриламидный гель, а далее переносили на целлюлозную мембрану Hybond-P. С целью иммуновыявления использовали антитела против виментина и β-актина (в качестве контроля). В качестве второго антитела использовали конъюгат с пероксидазой антитела против IgG мыши. Активность фермента пероксидазы визуализировали, используя диаминобензидин, в присутствии перекиси водорода и PBS. Белок виментин был уменьшенным в клетках МТ4, обработанных пептидами (фиг. 9).
Пример 8. Проникновение в клетку пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3
2
Клетки HeLa CD4+ засевали в среду RPMI, дополненную до 10% FBS, и инкубировали до достижения 60% конфлюэнтности монослоя. Клетки МТ4 засевали с плотностью 50000 клеток на лунку в среду RPMI, дополненную до 10% FBS. Пептиды, идентифицированных как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, ресуспендировали в воде для инъекции и оценивали в концентрациях, составляющих 5, 10, 20 и 40 мкМ. Пептиды инкубировали в течение 24 при 37°С в атмосфере 5% СО, и проникновение оценивали спустя 15, 30 и 60 мин. Спустя каждый период времени клетки собирали и сразу же анализировали с помощью проточной цитометрии. Анализировали три копии для каждого экспериментального варианта. Пептиды были способны к проникновению сами в клетки МТ4, как продемонстрировано на фиг. 10.
Пример 9. Липидное производное, которое связывается с виментином и ингибирует репликацию ВИЧ-1
12,14
Известно, что циклопентеноновый простагландин 15-дезокси-∆--PGJ2 (15d-PGJ2) связывается с белком виментином (Stamatakis K, Sanchez-Gomez FJ, Perez-Sala D 2006, J. Am. Soc. Nephrol. 17: 89-98). В настоящем изобретении было установлено, что 15d-PGJ2 ингибирует репликацию ВИЧ in vitro. Анализ антивирусной активности проводили на клетках МТ4, заражаемых ВИЧ-1 (штаммом Bru). Клетки инкубировали с различными концентрациями 15d-PGJ2 и далее заражали ВИЧ-1 с множественностью заражения, составляющей 0,01. Спустя 5-дневный период инкубации культуры клеток собирали, и производили оценку белка р24 в супернатантах (фиг. 11).
Пример 10. Эффект синтетических пептидов и 15d-PGJ2 на PBMC ВИЧ-1-инфицированных пациентов
PBMC были выделены из цельной крови ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов с использованием градиентов плотности фиколла. Клетки подвергали предварительной стимуляции и обработке пептидами так же, как описано в примере 5, или подвергали обработке 5 мкМ 15d-PGJ2. Оценку репликации осуществляли посредством определения концентрации антигена р24 в супернатантах культур методом ELISA. Значения для р24 были значительно уменьшенными в PBMC, обработанных пептидами или липидным производным, по сравнению не подвергнутыми обработке клетками (таблица 1). Это означало, что ингибирование репликации ВИЧ-1 обусловлено обработкой этими соединениями.
Таблица 1Процент ингибирования ВИЧ в PBMC инфицированных индивидуумов, которые были подвергнуты обработке ex vivo пептидами или 15d-PGJ2
<img file="00000001.tif" he="88" wi="103" img-content="undefined" img-format="tif" />
Структуру IF анализировали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, следуя методологии, приведенной в примере 3. Установлено, что IF были очень короткими в тех PBMC инфицированных индивидуумов, которые были обработаны пептидами или липидным производным, по сравнению с не подвергнутыми обработке клетками.
Пример 11. Интерферирующая РНК против виментина и кератина-10 ингибирует ВИЧ в PBMC инфицированных индивидуумов
PBMC были выделены из цельной крови ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов с использованием градиента плотности фиколла. Клетки подвергали предварительной стимуляции в течение 2 дней в среде RPMI, дополненной до 20% FBS, 100 Е/мл IL-2 и 5 мкг/мл PHA. Впоследствии их сохраняли в среде без PHA и далее подвергали трансдукции лентивирусными векторами pLenti-shRNAvim или pLenti-shRNAK-10, которые несут последовательность, кодирующую шпилечную РНК для сайленсинга белков виментина и кератина, соответственно. Векторы были получены, как описано в примере 2. Оценку репликации осуществляли посредством определения концентрации антигена р24 в супернатантах культур методом ELISA. PBMC с сайленсингом белков виментина или кератина-10 продемонстрировали высокую степень ингибирования репликации вируса по сравнению с культурами без сайленсинга каждого из этих белков.
Таблица 2Процент ингибирования ВИЧ-1 в PBMC инфицированных индивидуумов, которые были трансдуцированы короткой шпилечной РНК, специфической для виментина или кератина-10
<img file="00000002.tif" he="26" wi="133" img-content="undefined" img-format="tif" />
Структуру IF анализировали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, следуя методологии, приведенной в примере 3. Установлено, что IF по структуре были короче в тех PBMC инфицированных индивидуумов, которые были трансдуцированы лентивирусными векторами, по сравнению с не трансдуцированными клетками.
Пример 11. Лечение ВИЧ-1-инфицированных пациентов композициями, содержащими пептиды, идентифицированные как SEQ ID NO: 1 и 2
3
3
Восемь ВИЧ-1-сероположительных пациентов, в случае которых прошло менее года с момента диагностики и которые имели значения для CD4+ Т-клеток, превышающие 350 клеток/мм, были подвергнуты лечению композицией, содержащей пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 1, или композицией, содержащей пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 2. Пептиды вводили в дозе 150 мг в день, и за пациентами следили вплоть до 6 месяцев, следя за вирусной нагрузкой и количествами CD4+ Т-клеток. Вирусная нагрузка была неопределяемой у двух из пациентов после лечения, и уменьшенной в более чем 1,5 log у остальных шести пациентов. С другой стороны, у семи пациентов зарегистрировано увеличение CD4+ Т-клеток выше 50 клеток/мм, в то время как количества CD4+ Т-клеток уменьшались у остальных пациентов. Структуру IF анализировали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии в соответствии с методологией, приведенной в примере 3, у двух пациентов, подвергнутых лечению пептидом, идентифицированным как SEQ ID NO: 1, и у трех пациентов, подвергнутых лечению SEQ ID NO: 2. IF выглядели укороченными во всех случаях.
Пример 12. Лечение ВИЧ-1 инфицированных больных составами, содержащими пептиды, идентифицированные как SEQ ID NO: 3-10
3
Шестнадцати серопозитивным по ВИЧ-1 пациентам, диагностированных не позднее одного года, и с количеством CD4+ Т-клеток выше 350 клеток/мм, вводили состав, содержащий один из пептидов, идентифицированных как SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 10. Пептиды вводили в количестве 150 мг в день и пациентов наблюдали в течение 6 месяцев по вирусной нагрузке и количеству CD4+ Т-клеток. Вирусная нагрузка не была обнаружена у трех пациентов; снижалась более чем в 1,5-log раз у других 12 пациентов и оставалась стабильной у одного пациента.
3
С другой стороны, у 13 пациентов наблюдалось увеличение CD4+ Т-клеток выше 50 клеток/мм, при этом количество CD4+ Т-клеток оставалось стабильным у трех других пациентов. Структуре IF в мононуклеарных клетках периферической крови анализировали с помощью трасмиссионной электронной микроскопии, в соответствии с методикой, описанной в Примере 3. Было исследовано шесть пациентов: один пациент получал пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 3; один пациент получали пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 5; один пациент получал пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 6; один пациент получал пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 8; один пациент получали пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 9; один пациент получал пептид, идентифицированный как SEQ ID NO: 12. Перегруппировка IF наблюдалась во всех случаях. Эффект на IF был обратим.