СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19
METHOD OF USING RECOMBINANT PROTEINS SARS-COV-2 AS PART OF A TEST SYSTEM FOR ELISA TEST WITH DETERMINING IGM, IGG, IGA CLASS ANTIBODY LEVELS IN BLOOD SERUM/PLASMA OF COVID-19 PATIENTS

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, в частности, к использованию генноинженерных биотехнологий в совершенствовании тест-систем для серологической диагностики COVID-19 c целью оценки гуморального иммунного ответа у инфицированных лиц и эпидемиологической характеристики инфекционного процесса у населения, а в перспективе - для определения эффективности вакцинации и иммунотерапии при получении и внедрении соответствующих лечебно-профилактических препаратов против SARS-CoV-2.
Распространение среди людей вируса SARS-CoV-2 (тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2), послужившего причиной инфекционного заболевания под названием СOVID-19, началось в Китае в конце 2019 года, привело к крупной глобальной вспышке, носящей характер пандемии, и в настоящее время является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире.
Человечество сталкивается с коронавирусами зоонозной природы уже в третий раз. В 2002 году в китайской провинции Гуандун впервые была зарегистрирована атипичная пневмония, вызванная вирусом SARS-CoV, что привело в 2003 году к глобальной пандемии с 10%-ной летальностью [1]. Это заболевание с 2004 года у людей не регистрируется. В 2012 году в Саудовской Аравии был зарегистрирован другой короновирус MERS-CoV, он продолжает заражать людей с ограниченной передачей инфекции от человека к человеку и встречается примерно в 27 странах. Природным резервуаром обоих короновирусов являются летучие мыши, которые передают возбудителя промежуточным хозяевам (пальмовым циветтам для SARS-CoV и верблюдам-дромадерам для MERS-CoV), что, в свою очередь, приводит к заражению людей [1, 2].
В отличие от SARS-CoV и MERS-CoV, SARS-CoV-2, зарегистрированный в Ухане (Китай) в декабре 2019 года, характеризуется быстрым распространением и вирулентной передачей от человека к человеку [3], что привело к глобальной пандемии при летальности в среднем около 4% [4], не завершившейся до настоящего времени. SARS-CoV-2 также является зоонозным вирусом с летучими мышами в качестве его естественного резервуара [3], но промежуточные хозяева не идентифицированы [5].
Подобно SARS-CoV и MERS-CoV, SARS-CoV-2 представляет собой вирус, содержащий одноцепочечную +-цепь РНК и относящийся к семейству Coronaviridae и роду бетакороновирусов [3]. Геном этих патогенов кодирует четыре основных структурных белка: спайк-белок (S-белок), оболочечный белок (E), мембранный белок (M) и нуклеокапсид (N), а также приблизительно 16 неструктурных белков (nsp1-16) и от пяти до восьми вспомогательных белков. Среди них белок S играет важную роль в прикреплении вируса к клетке хозяина, слиянии с клеточной мембраной, проникновении в клетку. S-белок имеет тримерную структуру, он содержит субъединицу S1, ответственную за связывание вируса с рецептором, и субъединицу S2, ответственную за слияние вируса с клеточной мембраной [1, 2]. Субъединица S1 имеет V-образную структуру, в ее составе выделяют N-концевой домен (NTD) и C-концевой домен, каждый из которых может быть рецептор-связывающим доменом (RBD) в зависимости от разновидности короновируса и поражаемых им клеток того или иного хозяина [5]. Во время инфекционного процесса короновирус сначала взаимодействует через S1-RBD с рецептором клетки хозяина, вызывая конформационные изменения в субъединице S2, которые приводят к слиянию вируса и проникновению в клетку-мишень [1, 2].
Различные коронавирусы используют различные домены внутри субъединицы S1 для распознавания рецепторов клетки-мишени. SARS-CoV-2 и SARS-CoV связывают ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2), экспрессируемый пневмоцитами и энтероцитами, в то время как MERS-CoV связывает дипептидилпептидазу 4 (DPP4) клеток печени или легких [1, 2, 6].
В статье S.F.Ahmed et al. [7], датируемой мартом этого года, подчеркивается, что в настоящее время отсутствует информация об иммуногенных эпитопах, определяющих специфичность антител или реакции Т-клеток, у вируса SARS-CoV-2. Однако, предварительные исследования на основе полногеномного филогенетического анализа показывают, что SARS-CoV-2 очень похож на SARS-CoV - 79,6% идентичности геномных последовательностей [3, 8,9], имеет аналогичный механизм проникновения в клетки и те же чувствительные рецепторы на клетках человека [8, 10]. Из-за этого очевидного сходства между двумя вирусами, предыдущие исследования, которые обеспечили понимание защитных иммунных реакций против SARS-CoV, потенциально могут быть использованы для интепретации данных по SARS-CoV-2.
В то же время существуют и определенные отличительные особенности в молекулярной структуре SARS-CoV-2. A.C.Walls et al. [11] определили наличие участка расщепления фурином на границе S1/S2 SARS-CoV-2 S-белка как новую особенность, отличающую этот вирус от SARS-CoV. Элиминация этого участка умеренно влияет на S-опосредованное проникновение SARS-CoV-2 в клетки in vitro и может способствовать расширению тропизма этого вируса, как это происходило с другими высокопатогенными вирусами (возбудителями птичьего гриппа и болезни Ньюкасла) [12, 13].
Золотым стандартом лабораторной диагностики COVID-19 в настоящее время является полимеразная цепная реакция обратной транскрипции (ОT-ПЦР)[14]. Несмотря на доступность методов молекулярно-биологического анализа в клинической практике, в целом ряде случаев отмечаются как ложно-положительные, так и ложно-отрицательные результаты [15, 16]. Для верификации диагноза в ходе обследования пациентов широко использовался метод рентгендиагностики - компьютерная томография [14, 16]. Вместе с тем даже на ранних этапах наблюдения пациентов с COVID-19 как в стационаре, так и при амбулаторном обследовании крайне желательно было исследовать серологический статус пациента, а именно: наличие иммунного ответа на белки вируса. Было отмечено, что даже на относительно ранних этапах развития инфекции IgM-опосредованный ответ на белковые компоненты CОVID-19 может быть использован в качестве диагностического маркера для принятия положительного решения о наличии у пациента вируса [17].
Серологические исследования имеют решающее значение для определения уровня протективного иммунитета среди населения, подтверждения контакта с вирусом в анамнезе и выявления высокореактивных доноров человека для получения реконвалесцентной сыворотки в качестве терапевтического средства. Чувствительная и специфичная идентификация титров антител к коронавирусу SARS-Cov-2 может способствовать скринингу широких групп населения для решения вопроса об о возможности их привлечения к работе в сложной эпидемиологической обстановке. В первую очередь это касается медицинских работников для выявления тех, кто уже обладает иммунитетом, и может быть задействован для работы с инфицированными больными, минимизируя риск распространения вируса среди коллег и других пациентов. К указанной группе населения относятся также работники социальной сферы, госсслужащие, работники торговли. Общее число гражданского населения, для которого потребуются серологические исследования в России может исчисляться десятками миллионов. Необходимость проведения широкомасштабного тестирования среди военных и работников правоохранительных органов также не вызывает сомнений и является серьезным вызовом. Помимо актуальности использования в социально-эпидемиологическом плане, серологические методы имеют и клиническое значение. Они позволяют детально характеризовать иммунный ответ на SARS-CoV-2 как качественным, так и количественным образом, прогнозировать тяжесть течения COVID-19, быть одним из критериев выздоровления [18].
В связи с этим одной из актуальных проблем, связанных с диагностикой COVID-19, остается разработка основных принципов и подходов, как и собственно создание тест-систем для обнаружения антител к SARS-CoV-2, c учетом особенностей молекулярной структуры вирусного возбудителя, определяющих его антигенные и иммуногенные свойства.
Показано, что спайк-белок (S) к SARS-CoV-2 обладает высокой иммуногенностью и является основной мишенью для нейтрализующих антител [5]. Современные тест-системы с использованием S-антигенов для серологического обнаружения антител к SARS-CoV-2 характеризуются, как правило, довольно высокой специфичностью. В то же время установлено, что большинство антител вырабатывается против N-белка нуклеокапсида SARS-CoV-2, а методы серодиагностики с использованием в качестве антигена N-белка обладают наиболее высоким уровнем чувствительности. В связи с этим в настоящее время созданы различные спайк(S)-содержащие или нуклеопротеин(N)-содержащие основанные на коммерческих или собственных разработках тест-системы для серодиагностики COVID-19 [19].
Выработка антител к указанным белкам или их фрагментам происходит с различной динамикой и характеризует различные стороны иммунного процесса в ответ на короновирус.
Профиль антител имеет жизненно важное значение для современных запросов на серологические анализы и интерпретации результатов теста на антитела, при этом серологическая диагностика приобретает особо важное значение в более поздние периоды COVID-19, когда вирусная нагрузка SARS-CoV-2 значительно падает и утрачивает клинико-диагностическую значимость. Поскольку большинство пациентов имеют повышенные титры антител примерно через 10 дней после появления симптомов, исследование образцов сыворотки на наличие антител разных классов позволяет не только контролировать период выхода больного из инфекционного процесса, но и (в случае серийных исследований) весьма полезно с эпидемиологической точки зрения [20].
Методом иммуноферментного анализа установлено, что количество IgG в сыворотке крови может повышаться одновременно или раньше, чем количество IgM против SARS-CoV-2, при этом большинство пациентов имеют также более раннюю сероконверсию IgG, чем IgM [21]. Впрочем, этот вывод может быть объяснен в том числе и низкой чувствительностью используемых тестов. Уровень IgG- и, особенно, IgM-антител в сыворотке крови не коррелировал с клинической тяжестью заболевания, тогда как повышение уровня IgA-антител четко соответствовало тяжелому течению COVID-19 [22]. У погибших пациентов развивался более быстрый рост анти-S антител по сравнению с пациентами, которые выздоравливали, с последующим ранним снижением В-клеточного иммунитета и нарушением нейтрализующей способности антител [23]. На экспериментальной модели острой респираторной короновирусной инфекции с использованием макак показано, что анти-S IgG стимулировали легочные провоспалительные реакции и вызывали острое повреждение легких вследствие, по мнению авторов публикации, стимулирующего воздействия этих антител через Fcγ-рецептор на макрофаги [24].
Более того, результаты, свидетельствующие о корреляции между уровнем антител, обнаруженных при иммуноферментном анализе, и титром нейтрализации вируса, были бы особенно важны для разработки вакцинных препаратов, а также для использования реконвалесцентной плазмы или терапевтических моноклональных антител, которые могут улучшить клинический исход или парадоксальным образом вызвать иммунопатологическое повреждение у реципиента [20].
Иными словами, показатели содержания антител разных классов в сыворотке крови несут достаточно много полезной информации о патогенезе и течении COVID-19, будут чрезвычайно полезны в будущем при оценке эффективности создаваемых вакцинных препаратов и средств иммунотерапии, что требует дальнейшего совершенствования подходов к способам осуществления иммунологического анализа этих показателей.
Учитывая сравнительно небольшой период времени, прошедший от начала пандемии COVID-19, патентная база, посвященная серодиагностике этого заболевания, пока невелика.
Для одновременного обнаружения N-белка SARS-CoV-2, а также IgM- и IgG-антител к этому короновирусу китайскими исследователями предложено иммунохроматографическое устройство с коллоидным золотом [25]. Предложен также набор коллоидного золота и способ его получения для совместного обнаружения антител IgM / IgG к коронавирусу [26].
Несмотря на оригинальность предложенного метода, большинство зарегистрированных полезных продуктов, связанных с проблемой серодиагностики короновирувирусной инфекции, касаются иммуноферментного анализа. Так, имеются наборы реагентов для иммуноферментного анализа, позволяющие количественно определять уровни IgG к нуклепротеину (N) или спайк-белку (S) вируса SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови, слюне, носовой жидкости человека [27, 28, 29], а также уровня IgM-антител к SARS-CoV-2[30], в том числе к S-белку [31].
Определенного внимания заслуживает способ диагностики атипичных пневмоний с использованием рекомбинантных белков, содержащих диагностически значимые антигенные детерминанты белков коронавируса, связанного с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS-CoV) - патент Российской Федерации на изобретение 2253870 от 10.06.2005 г. «Рекомбинантные белки, содержащие диагностически значимые антигенные эпитопы белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом, и последовательности синтетических генов, кодирующие диагностически значимые антигенные детерминанты белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом» [32]. Способ предусматривает получение генетических конструкций и синтез на их основе рекомбинантных белков короновируса (SARS-CoV), близкого (но неравнозначного) по геному к SARS-CoV-2. В то же время данный способ диагностики не может быть аналогом настоящего изобретения, поскольку сориентирован, в основном, на полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), но не на серодиагностику короновирусной инфекции, возможность реализации которой с использованием характеризуемых рекомбинантных вирусных белков указывается только в принципе.
Что касается тест систем для серодиагностики COVID-19 с использованием иммуноферментного анализа на основе антигенов SARS-CoV-2, то первым этапом их разработки является получение и использование таких иммуногенно значимых белков, которые позволяли бы с наибольшей эффективностью и на наиболее ранних этапах заболевания выявлять антитела разных классов к данному вирусному возбудителю.
Чувствительность и специфичность различных коммерческих тест-систем, используемых в настоящее время, отличаются друг от друга и зависят от сроков тестирования.
Так, сравнительное испытание двух сертифицированных версий Euroimmun SARS-CoV-2 IgG ELISA (Любек, Германия) и Vircell COVID-19 ELISA IgG (Гранада, Испания), а также версии Assure Tech Rapid Test (Франкфурт, Германия) при определении IgG-антител с S-белку, а в случае Vircell COVID-19 ELISA еще и к N-белку, в одноволновом варианте (450 нм) показали следующее. На ранней стадии инфекции (с 5-ого по 9-й день после появления положительного результата ПЦР) Vircell ELISA тест-система показала чувствительность 70,6%, Assure Tech Rapid Test - чувствительность 62,5% и Euroimmun ELISA - чувствительность 58,8%. За более поздний период (10-18 дней) Euroimmun ELISA и Assure Tech Rapid Test показали чувствительность 93,8%, Vircell ELISA - 100% [33]. Чувствительность тест-системы Euroimmun SARS-CoV-2 ELISA для обнаружения IgA-антител была значительно ниже [34].
Cравнение специфичности 4-х коммерческих тест-систем для обнаружения IgG на поздних сроках заболевания показало следующие величины: анти SARS-CoV-2 ELISA IgG (Euroimmun, Германия) - 96,2%, New Coronavirus COVID-19 IgG ELISA (Epitopediagnostics, США) - 88,7%, recomWell SARS-CoV-2 IgG ELISA (Microgen, Германия) - 100%, и SARS-CoV-2 Virachip IgG (Viramed, Германия) - 100% [35].
В препринте статьи F.Amanat et al. [18], которая может рассматриваться как прототип данного изобретения, описаны результаты сравнительных исследований по созданию двух различных версий рекомбинантного спайк-белка SARS-CoV-2. Первая конструкция позволяла получить полноразмерную тримерную и стабилизированную версию S-белка, а вторая - только рецептор-связывающий домен (RBD). Полноразмерная нуклеотидная последовательность, синтезированная промышленным путем, была модифицирована путем удаления участка расщепления, распознаваемого фурином, и введения двух стабилизирующих мутаций, далее была клонирована в вектор pCAGGS для экспрессии в клетках млекопитающих и в модифицированный двойной вектор pFastBac для экспрессии в клетках насекомых. Рецептор-связывающий домен (RBD, аминокислоты от 319 до 541, RVQP....CVNF) вместе с сигнальным пептидом (аминокислоты 1-14, MFVF…TSGS) плюс гексагистидиновая метка был клонирован в аналогичные векторы, но его экспрессия в клетках млекопитающих оказалась гораздо более эффективной, чем в клетках насекомых. Полученные рекомбинантные белки были использованы в составе тест-систем для иммуноферментного анализа и испытаны в реакциях с сыворотками людей, больных COVID-19 и другими вирусными инфекциями с измерением оптической плотности в лунках при длине волны 490 нм. Все образцы плазмы/сыворотки больных COVID-19 показывали одинаково высокий положительный результат в отношении как RBD-домена, так и полноразмерного S-белка, в то время как с другими образцами сыворотки в обоих случаях была получена только фоновая реактивность. Авторы сделали вывод о взаимозаменяемости обоих типов использованных тест-систем, хотя эффективность полноразмерного белка была несколько выше, чем у RBD-домена. Было показано также, что в реакции с названными вариантами рекомбинантных белков принимали участие антитела классов IgM, IgG (преимущественно IgG3), IgA, зарегистрировать которые удавалось даже в инактивированных в течение 1 часа при 56°С сыворотках.
При всех положительных результатах процесса создания описанных тест-систем для серодиагностики COVID-19 методом иммуноферментного анализа к относительным недостаткам указанного прототипа следует отнести сложность работы с клетками млекопитающих и насекомых как носителями созданных генетических конструкций, использование довольно сложных по своей структуре и способам получения рекомбинантных белков в виде модифицированного полноразмерного S-белка, отсутствие в составе тест-системы N-белка с его позитивным влиянием на чувствительность серологического метода.
Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является создание такой тест-системы для иммуноферментного анализа, которая позволила бы выявлять у человека, инфицированного SARS-CoV-2, или больного COVID-19 антитела к короновирусу, принадлежащие к разным классам иммуноглобулинов, с эффективностью, не уступающей таковой при использовании других тест-систем, но значительно упрощающей (и, соответственно, удешевляющей) процесс получения ее основных компонентов. Технический результат заключается в создании заявленной тест-системы, упрощение способа её создания при сохранении высокой её эффективности.
Для решения поставленной технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагаются следующие технические решения.
Генетические конструкции pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N с  нуклеотидными  последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, на основе плазмиды DHFR Control Template, содержащие искусственно синтезированные нуклеотидные последовательности ДНК фрагментов RBD-SD1, и NTD  S-белка вируса SARS-CoV-2, а также нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2, представленные как SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, соответственно, которые объединены в единой рамке считывания с последовательностями узнавания TEV-протеазы и шести гистидинами.
Рекомбинантные белки-антигены RBD-SD1и NTD, содержащие антигенные детерминанты S-белка вируса SARS-CoV-2, и N, содержащий антигенные детерминанты нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2, с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, соответственно, кодируемые ДНК-последовательностями. Указанные рекомбинантные белки получены путем извлечения белков из разрушенных клеток электрокомпетентного штамма BL21(DE3) E.coli, трансформированных через электропорацию плазмидной ДНК с последующей селекцией бактерий, устойчивых к ампициллину.
Применение совместно трех рекомбинантных белков RBD-SD1, NTD и N, имеющих аминокислотные последовательности соответственно SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9, для определения антител IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания, в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом.
Иммуносорбент, содержащий одновременно три рекомбинантных белка-антигена NTD, RBD-SD1 и N, имеющих аминокислотные последовательности, соответственно, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9, для определения IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19. Иммуносорбент представляет собой планшет 96-луночный, разборный, выполненный из полистирола.
Тест- система для иммуноферментного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентов COVID-19, содержащая сорбент, набор реагентов, концентрат конъюгата раздельного определения содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания. Отличительной особенностью тест-системы является то, что в качестве сорбента выбран иммуносорбент.
В качестве каждого из наборов реагентов для определения суммарного и раздельного содержания IgM-, IgG-, IgA-антител SARS-CoV-2 включает положительный контроль (К+), отрицательный контроль (К-), раствор для разведения образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, ТМБ-хромоген, концентрат промывочного раствора, стоп-реагент.
Предлагается способ определения антител IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови с использованием рекомбинантных белков, включающий следующие этапы: внесение в лунки контрольных образцов и анализируемых образцов, перемешивание, инкубирование иммуносорбента с последующей промывкой, добавлением реагентов, оценкой оптической плотности.
В качестве анализируемого образца используют сыворотку или плазму крови больных COVID-19 или инфицированных этим вирусом.
E.coli
Для решения заявленной технической проблемы, а именно осуществления тестирования пациентов и скрининга населения и получения максимально адекватного технического результата, в состав разрабатываемой тест-системы для иммуноферментного анализа был введен не один белок короновируса, как в остальных описанных к настоящему времени полезных продуктах, а одновременно три рекомбинантных белка, соответствующих по структуре наиболее адекватным эпитопам белков вируса. В результате биоинформационного и экспериментального анализа в данном изобретении были идентифицированы фрагменты, соответствующие NTD-фрагменту S-белка, RBD-фрагменту S-белка и нуклеопротеину вируса SARS-CoV-2. Созданные генетические конструкции на основе вектора DHFR Control Template были предназначены для получения целевых рекомбинантных белков, путем электропорации в бактериальные клетки  штамма BL21(DE3), что придавало им устойчивость к ампициллину как фактору селекции трансформированных бактерий.
В процессе поэтапного выполнения патентных исследований осуществлялись:
- создание генетических конструкций pLVI-RDB-SD1 (SEQ ID NO:1), pLVI-NTD (SEQ ID NO:2) и pLVI-N (SEQ ID NO:3) на основе искусственно синтезированных фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидные последовательности фрагментов RBD-SD1 (SEQ ID NO:4), и NTD(SEQ ID NO:5), спайк-гликопротеина вируса SARS-CoV-2, а также нуклеопротеина (SEQ ID NO:6), вируса SARS-CoV-2 путем их клонирования в плазмиду DHFR Control Template;
E.coli
- трансформация электрокомпетентных клеток  штамма BL21(DE3) путем электропорации плазмидной ДНК, содержащей созданные генетические конструкции, с последующим получением целевых рекомбинантных белков-антигенов RBD-SD1 (SEQ ID NO:7),NTD (SEQ ID NO:8), и N (SEQ ID NO:9);
- сорбирование полученных трех рекомбинантных антигенных белков-антигенов RBD-SD1, NTD и N с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 в лунках разборного полистиролового планшета как основы тест-системы для иммуноферментного анализа;
- формирование 4-х видов тест-систем для иммуноферментного выявления антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека: (1) «SARS-CoV-2-антитела IgM-IgG-IgA тест»; (2) «SARS-CoV-2-антитела IgG тест»; (3) «SARS-CoV-2-антителаIgM тест»; (4) «SARS-CoV-2-антитела IgA тест»;
- апробация созданной тест-системы в клинических условиях.
Создание генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N (с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, соответствено).
Искусственно синтезированные фрагменты ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности фрагментов RBD-SD1 (receptor binding domain-subdomain 1) (SEQ ID NO:4), и NTD (N-terminal domain) (SEQ ID NO:5), спайк-белка (S-protein) и последовательность белка нуклеопротеина (N-protein) (SEQ ID NO:6) вируса Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) были клонированы в плазмиду DHFR Control Template (New England BioLabs) с использованием эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI и получением экспрессионных генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N, имеющих нуклеотидные последовательностиSEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 соответственно (рисунок 1).
Полученные таким образом генетические конструкции содержат:
- точку начала репликации плазмид pUCori;
E.coli
- последовательность гена β-лактамазыE.coli(AmpR), продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов  к антибиотику ампициллину;
- промоторную последовательность Т7;
- одну из нуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты RBD-SD1 (330-590 аминокислотных остатков), NTD S-белка (17-305 аминокслотных остатков) и нуклеотидную последовательность N-белка (1-419 аминокислотных остатков) вируса SARS-CoV-2, объединенные в единой рамке считывания с последовательностями узнавания TEV-протеазы и шести гистидинами;
- терминаторную последовательность Т7.
Получение рекомбинантных белков-антигенов RBD-SD1, NTD и N, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, соответственно.
E.coli
Плазмидной ДНК экспрессионных генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N трансформируют электрокомпетентные клетки  штамма BL21(DE3) методом электропорации. Селекцию трансформантов проводят на минимальной среде 2YT, содержащий антибиотик ампициллин 100мкг/мл.
Единичные выросшие клоны для каждой из генетических конструкций pLVI-RDB-SD1, pLVI-NTD и pLVI-N помещают в жидкую среду 2YT, содержащий антибиотик ампициллин 100мкг/мл и выращивают в течение 16 часов при 37°С в термостатируемой качалке при перемешивании 180 об/мин. Аликвоту выросшей клеточной суспензии (1/100) переносят в свежую жидкую среду 2YT, содержащий антибиотик ампициллин 100мкг/мл и выращивают в течение 16 часов при 37°С в термостатируемой качалке при перемешивании 180 об/мин до достижении 0,6 ОЕ/мл. Далее к клеточной суспензии добавляют индуктор IPTG до конечной концентрации 1мМ и выращивают в течение 7 часов при 30°С в термостатируемой качалке при перемешивании 180 об/мин.
По окончании для каждого из белков-антигенов RDB-SD1, NTD и N клетки осаждают центрифугированием при 7000g, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в лизирующем буфере (50мМ Трис-HCl, 100мМ натрия хлористого, 5% глицерин, 10мМ ЭДТА, 0,5мМ β-меркаптоэтанол рН 7,4), клетки разрушают ультразвуковой обработкой. Полученный раствор осветляют центрифугированием при 10000g 10 минут, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 2М натрия хлористого, 10мМ ЭДТА, рН 8.0. Полученный раствор осветляют центрифугированием при 10000g 10 мин, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 2% тритон Х-100, 10мМ ЭДТА, рН 8.0. Полученный раствор центрифугируют при 10000g 10 минут, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 2% тритон Х-100 рН 8.0. Полученный раствор центрифугируют при 10000g 10 минут, супернатант отбрасывают, клеточный осадок суспендируют в буфере 50мМ Трис-HCl, 4М гуанидин рН 8.0. Таким образом, получают растворы, содержащие один из рекомбинантных белков-антигенов RDB-SD1, NTD и N.
Колонку, содержащую сорбент NiNTA уравновешивают буфером нанесения (50мМ Трис-HCl, 4М гуанидин рН 8.0), наносят раствор, содержащий один из рекомбинантных белков RDB-SD1, NTD и N. Колонку промывают 20 объемами буфера нанесения, связавшийся белок элюируют буфером для элюции (50мМ Трис-HCl, 4М гуанидин, 300мМ имидазол рН 8.0). Таким образом, получают раствор, содержащий один из очищенных рекомбинантных белков-антигенов RDB-SD1, NTD и N (приложение 2).
Полученные очищенные рекомбинантные белки-антигены RDB-SD1, NTD и N вносятся в раствор 68,6 мМ бикарбоната натрия, 31,4 мМ карбоната натрия, 4М мочевинырН 8.0, в количестве, соответствующием конечной концентрации 400 нг/мл RDB-SD1, 100 нг/мл NTD и 400/мл нг N. По 100 мкл полученного раствора смеси белков-антигенов вносят в лунки разборных стандартных плоскодонных 96-луночных планшетов («ООО Биомедикал», Россия) и инкубируют при 4°С 16 часов без перемешивания. По окончании инкубации удаляют раствор из лунок, вносят по 150 мкл дистиллированной воды, инткубируют 1 минуту, воду удаляют. В каждую лунку планшета вносят по 150 мкл блокирующего раствора (2,83 г/л натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-ти водного, 0,34 г/л натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-х водного, 0,48 г/л бензоат натрия, 63,73 г/л сахароза, 0,09 г/л казеината натрия 2 мг/л гентамицин сульфат, 001мл/л Проклин 300). Планшеты инкубируют 1 час при комнатной температуре без перемешивания. По окончании инкубации удаляют блокирующий раствор и высушивают досуха при комнатной температуре. Полученный планшет хранят при температуре 6±2°С до трех месяцев и используют согласно инструкции.
Формирование тест-системы дляиммуноферментного определения раздельного содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме крови больных и реконвалесцентовCOVID-19.
Используя рекомбинантные антигены SARS-CoV-2, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 соответственно, сорбированные в лунках разборного полистиролового планшета, в составе тест-системы было сформировано 4 набора для иммуноферментного выявления антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека. Сокращенные наименования тест-систем:
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgM-IgG-IgA тест»,
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgG тест»,
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgM тест»,
- «SARS-CoV-2-Антитела ИБХ РАН IgA тест».
Данные тест-системы рекомендуется использовать в клинической лабораторной практике для определения наличия антител против коронавируса SARS-CoV-2 при проведении скрининговых исследований крови, при мониторинге эпидемиологической ситуации среди населения и оценке степени распространения инфекции, при прогнозировании тяжести течения COVID-19.
В состав каждой тест-системы входят:
- иммуносорбент - 96-луночный планшет, в лунках которого сорбированы рекомбинантные антигены SARS-CoV-2, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 соответственно. Планшет выполнен из бесцветного полистирола, с плоским дном, разборный - 2 шт.;
- положительный контроль (К+) - 1 × 2,5 мл;
- отрицательный контроль (К-) - 1 × 2,5 мл;
- раствор для разведения образцов (РРО) - 1 × 2,5 мл;
- концентрат конъюгата для определения раздельного содержания IgM- или IgG- или IgA-антител к вирусу SARS-CoV-2 или их суммарного содержания в сыворотке/плазме (Кг(х11)) - 1 × 2,5 мл;
- раствор для разведения конъюгата (РРК) - 1 × 2,5 мл;
- ТМБ-хромоген - 1 × 2,5 мл;
- концентрат промывочного раствора, 25-кратный (КПР(х26)) - 1 × 2,5 мл;
- стоп-реагент - 1 × 2,5 мл;
а также следующие принадлежности:
- клейкая лента для заклеивания иммуносорбента - 6 штук;
- одноразовые ванночки для реагентов - 6 штук;
- одноразовые сменные наконечники к дозаторам пипеточным (10-300 мкл) - 40 штук;
- инструкция по применению набора реагентов - 1 штука.
invitro
Тест-система рассчитана на проведение 192 определений, включая 6контрольных. Она предназначена для ручной постановки и для постановки на автоматических анализаторах для иммуноферментного анализа открытого типа с возможностью, как дробного использования планшета (набора), так и использования для постановки целого планшета (набора); предназначена для диагностики ; должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре от+2 до +8°С в течение всего срока годности (12 месяцев).
Принцип воспроизведения теста включает следующие этапы. Внесение контрольных образцов - по 100 мкл положительного контроля (К+) и по 100 мкл отрицательного контроля (К-).В остальные лунки вносится по 90 мкл раствора для разведения образцов (РРО) и по 10 мкл анализируемых образцов сыворотки крови с последующим перемешиванием. Иммуносорбент заклеивается клейкой пленкой и инкубируется в термостатирующем шейкере при температуре (37±2)°С и постоянном встряхивании (700-800 об\мин) в течение 30 минут. По окончании инкубации лунки планшета промываются 5 раз. Во все лунки вносится по 100 мкл рабочего разведения конъюгата с последующим инкубированием при тех же условиях и 5-кратным промыванием. В лунки добавляется по 100 мкл раствора ТМБ-хромогена. Иммуносорбент заклеивается новой клейкой пленкой и инкубируется в защищенном от света месте при температуре (20±5) °С в течение 15 минут. В лунки вносится по 100 мкл стоп-реагента для остановки цветной реакции. Не более чем через 15 минут после остановки цветной реакции на фотометреизмеряется оптическую плотность в лунках в двухволновом режиме (450/620-700 нм). Допускается измерение при одной длине волны с фильтром 450 нм.
-ср
крит
крит
-ср
Для учета результатов расчитывается среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (ОПК) и вычисляется ОП по формуле: ОП = ОПК + А, где А - коэффициент, значение которого приведено в аналитическом паспорте (паспорте контроля качества)
обр
обр
крит
Далее рассчитывается индекс позитивности для каждого исследуемого образца по формуле: ИП = ОП/ ОП
обр
обр
обр
При ИП ≥ 1,1 исследуемый образец сыворотки (плазмы) крови следует считать положительным (образец содержит антитела IgA и/или IgM и/или IgG к коронавирусу SARS-CoV-2), при ИП< 0,9 исследуемый образец сыворотки (плазмы) крови следует считать отрицательным, при значении 0,9 <ИП< 1,1 исследуемый образец сыворотки (плазмы) крови следует расценивать как сомнительный.
Клиническая апробация способа проводилась с использованием образцов крови 150 человек, из которых 33 условно здоровых человека контрольной группы и 117пациентов с верифицированным диагнозом COVID-19,находившихся на стационарном лечении. Степень поражения легких оценивалась по данным компьютерной томографии: у 9 больных с тяжелым течением COVD-19 наблюдалась наиболее высокая (третья-четвертая) степень поражениялегких, у остальных больных со среднетяжелым течением заболевания в 25% случаев наблюдалась низкая (первая) степень поражения легких, в 50% случаев - вторая степень, еще у 25% - третья степень. У 11 человек имелась сопутствующая системная патология, среди которых только 2 человека имели тяжелое течение заболевания. Всем включенным в исследование субъектам выполнялось исследованием методом ПЦР с целью обнаружения возбудителя SARS-Cov-2 и подтверждения диагноза COVID-19.
У больных COVID-19, включенных в исследование с 1-го по 7-й день болезни, во всех случаях наблюдался положительный результат ПЦР. Учитывая динамику выработки антител к SARS-CoV-2, отмеченную в литературе, эти больные были разделены на 2 группы - группа 1 с 1-го по 3-й день болезни (4 человека) и группа 2 с 4-го по 7-й день болезни (15 человек). В наблюдениях с 8-го по 19-й день болезни результат ПЦР мог быть как положительным, так и отрицательным, но в последнем случае в анамнезе всегда имелся положительный результат. Эти больные составили группу 3 исследования (70 человек). После 19-го дня болезни ПЦР, как правило, была отрицательной при наличии в анамнезе положительного результата - группа 4 (28 человек).
Определение диагностических критериев, диагностического значения и рекомендаций для выполнения совокупного определения уровней иммуноглобулинов классов IgM-IgG-IgAпроводилось на спектрофотометре "Лазурит" (Dynex, США)с использованием комплекса рекомбинантных белков и тест-системы для иммуноферментного анализа, входящих в предмет данного изобретения, в сопоставлении со стандартным методом с использованием набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов к SARS-CoV-2 с помощью полноразмерного S-белка, выпускаемого компанией «Генериум» (Владимирская область) и утвержденного 06.04.2020 г.
Статистическая обработка результатов проводилась на основе пакета статистических программ SPSS, версия 23.
2
1
Как показано в таблице 1, по результатам определения общего набора иммуноглобулинов всех трех классов (IgM, IgG, IgA) сравниваемые тест-системы равноценно выявляют высокую достоверность различий между показателями у больных и здоровых людей (р< 0,05), начиная с 4-го дня болезни. В то же время по результатам автоматизированного ИФА на одном и том же приборе тесты разных производителей достоверно отличались друг от друга(р< 0,001), но только при исследовании образцов сыворотки/плазмы крови в сроки, начиная с 8-го дня от начала заболевания.
обр
Для определения критериальных значений теста и его диагностической значимости в сравнительном аспекте вычислялись 95%-ные доверительные интервалы индексов позитивности образцов (ИП) в каждой группе больных и в контроле, а путем построения ROC-кривых устанавливалось соотношение чувствительности и специфичности каждого теста в соответствии с закономерностями линейной регрессии. Количественным выражением диагностической значимости служила площадь под ROC-кривой (AUC) при ее максимальном значении, равном 1 [36].
Как следует из рисунка 2А, между 95%-ными доверительными интервалами показателей у здоровых и больных людей в обоих тестах были отмечены довольно существенные различия. С учетом стандартных отклонений можно утверждать, что показатели оптической плотности по тесту ИБХ при значениях ≥1,1с высокой диагностической значимостью (AUC = 0,743) свидетельствовали о наличии у больного COVID-19. Незначительно ниже была диагностическая значимость (AUC = 0,714) тест-системы компании «Генериум» при значениях≥ 1,1, как указывается в инструкции к набору реагентов (рисунок 2Б).
обр
В то же время обращает на себя внимание тот факт, что в тест-системе ИБХ более чем у половины больных на 4-7 день от начала COVID-19 (группа 2) показатели ИФА позволяли определять диагностически значимый уровень антител. При использовании тест-системы компании "Генериум" на первой неделе заболевания обнаружить антитела на диагностически значимом уровне (ИП ≥1,1) практически невозможно. Чтобы подтвердить этот вывод, определялось соотношение чувствительности и специфичности обеих тест-систем в единицах AUC только на ранних этапах заболевания, то есть в группах 1 и 2 в сравнении с контролем (рисунок 2В). Для тест-системы ИБХ величина AUCв этой ситуации возрастала до 0,785, а для тест-системы компании "Генериум", наоборот, падала - до 0,699.
Таким образом, тест-система, служащая предметом данной заявки и предназначенная для обнаружения антител к SARS-CoV-2, проявляла большую чувствительность и может использоваться для серодиагностики COVID-19 уже на 4-7 день от начала заболевания.
Клинико-диагностические возможности теста ИБХ отчетливо проявлялись и при исследовании показателей выработки антител, принадлежащих к отдельным классам иммуноглобулинов.
На рисунке 3 показаны 95% доверительные интервалы показателей ИФА по определению IgMв сыворотке крови больных COVID-19 в разные сроки от начала заболевания, а также диагностическая значимость теста по результатам построения ROC-кривой при использовании заявляемой тест-системы производства ИБХ РАН (рисунок 3А) и тест-системы сравнения производства компании "Генериум" (рисунок 3Б). Заявляемая тест-система выявляла IgM-антитела на диагностически значимом уровне в период от 4-го до 19-го дня болезни при величине AUC = 0,685, в то время как тест-система сравнения, несмотря на рост уровня IgM, закономерностей такого повышения не выявляла, а ее результаты не были диагностически значимыми, поскольку AUC была ниже 0,5 и составляла 0,356.
На рисунке 4 показаны результаты анализа по аналогичному определению содержания IgG-антител в сыворотке больных COVID-19. Обе тест-системы показывали возрастание уровней антител до диагностически значимого уровня (сероконверсию) на 4-7 день от начала заболевания и сохранение этого уровня на протяжении всей болезни, включая период реконвалесценции. Оценка диагностического значения сравниваемых тест-систем по величинам AUC показала, что заявляемая тест-система проявляла умеренную диагностическую значимость (AUC = 0,688, рисунок 4А), но более высокую, чем тест-система сравнения (AUC = 0,577, рисунок 4Б).
На рисунке 5 представлены результаты анализа уровней IgA-антител к SARS-CoV-2. Обе тест-системы выявляли рост антител этого класса в период от 8-го до 19-го дня болезни с примерно одинаковой диагностической значимостью (величина AUC cоставляла, соответственно, 0,700 и 0,702).
Таким образом, апробация заявляемой тест-системы в клинических условия показала, что она способна выявлять антитела к SARS-CoV-2 у больных COVID-19 в сроки, примерно соответствующие данным, представленным в современной литературе. По диагностической значимости она обладает рядом преимуществ перед другой отечественной тест-системой, ранее сертифицированной в стране. Есть основание считать, что установленные преимущества связаны с расширением (до 3-х) спектра белков-носителей антигенных детерминант в составе заявляемой тест-системы. По сравнению с зарубежными аналогами, получение рекомбинантных белков, входящих в тест-систему, не связано с клетками млекопитающих или насекомых, а предполагает использование бактериальной культуры, что более выгодно с экономической точки зрения. Оценка соотношения чувствительности и специфичности заявляемой тест-системы с помощью единиц AUC, особенно при суммарном определении антител разных классов, демонстрирует ее конкурентоспособность.
Способ иллюстрируется следующими рисунками:
Рис. 1. Схемы экспрессионных генетических конструкций pLVI-RDB-SD1(А), pLVI-NTD(Б) и pLVI-N (В).
Рис. 2. 95%-ные доверительные интервалы показателей суммарного содержания IgM/IgG/IgA антител к SARS-CoV-2 (2А) и ROC-кривые их диагностической значимости у здоровых людей и больныхCOVID-19 в тест-системе, служащей предметом данного изобретения, и в тест-системе производства компании «Генериум», на протяжении всего заболевания (2Б) и в его начальном периоде (2В).
Рис. 3. 95%-ные доверительные интервалы содержания IgM-антител в сыворотке крови больных COVID-19 в разные периоды заболевания и ROC-кривые их диагностической значимости в заявляемой тест-системе производства ИБХ РАН (3A) и в тест-системе производства компании «Генериум» (3Б).
Рис. 4. 95%-ные доверительные интервалы содержания IgG-антител в сыворотке крови больных COVID-19 в разные периоды заболевания и ROC-кривые их диагностической значимости в заявляемой тест-системе производства ИБХ РАН (4A) и в тест-системе производства компании «Генериум» (4Б).
Рис. 5. 95%-ные доверительные интервалы содержания IgA-антител в сыворотке крови больных COVID-19 в разные периоды заболевания и ROC-кривые их диагностической значимости в заявляемой тест-системе производства ИБХ РАН (5A) и в тест-системе производства компании «Генериум» (5Б).
Нуклеотидные последовательности каждой из трех экспрессионных генетических конструкций, а также аминокислотные последовательности целевых рекомбинантных белков представлены в разделе «Нуклеотидные последовательности».
В таблице 1 показаны результаты исследования с использованием тест-систем для ИФА с одновременным выявлением иммуноглобулинов классов IgM, IgG, IgA к SARS-CoV-2, являющихся предметом данного изобретения (производитель ИБХ РАН) и выпускаемых компанией «Генериум».
Таблица 1.
Группаисследования
Индексы позитивности образцов:медиана (минимум; максимум)
р<sub>1</sub>
Тест на IgM-IgG-IgA(ИБХ РАН)
Тест на IgM-IgG-IgA(«Генериум)
Без учета сроков заболевания
Здоровые люди, n = 33
0,13 [0,09; 0,50]
0,08 [0,04; 0,030]
<0,001*
Больные COVID-19, n= 117
2,05 [0,10; 3,25]
1,48 [0,05; 2,56]
<0,001*
р<sub>2</sub>
<0,001*
<0,001*
Группа 1 больных COVID-19 (1-3 дни болезни)
Здоровые люди, n = 33
0,13 [0,09; 0,50]
0,08 [0,04; 0,030]
<0,001*
Больные COVID-19, n = 4
0,33 [0,12; 0,54]
0,67 [0,10; 1,25]
0,897
р<sub>2</sub>
0,272
0,164
Группа 2 больных COVID-19 (4-7 дни болезни)
Здоровые люди, n = 33
0,13 [0,09; 0,50]
0,08 [0,04; 0,030]
<0,001*
Больные COVID-19, n = 15
0,32[0,10; 2,97]
0,31[0,05; 2,01]
0,312
р<sub>2</sub>
0,001*
0,001*
Группа 3 больных COVID-19 (8-19 дни болезни)
Здоровые люди, n = 33
0,13 [0,09; 0,50]
0,08 [0,04; 0,030]
<0,001*
Больные COVID-19, n = 70
2,07[0,10; 3,25]
1,50[0,09; 2,56]
<0,001*
р<sub>2</sub>
<0,001*
<0,001*
Группа 4 больных COVID-19 (после 19-го дня болезни)
Здоровые люди, n = 33
0,13 [0,09; 0,50]
0,08 [0,04; 0,030]
<0,001*
Больные COVID-19, n = 28
2,57[0,29; 3,05]
1,70[0,28; 2,38]
0,027*
р<sub>2</sub>
<0,001*
<0,001*
1
2
3
р - вероятность различий по критерию Манна-Уитни между результатами разных тестов отдельно у здоровых и больных людей; р - вероятность различий по критерию Манна-Уитни между группами здоровых и больных людей в рамках одной тест-системы; р - вероятность различий по критерию Манна-Уитни между группами больных людей при сравнении с предыдущей группой рамках одной тест-системы; * - достоверность различий при р < 0,05
Литература
1. Du L. The spike protein of SARS-CoV - a target for vaccine and therapeuticdevelopment //Nat Rev Microbiol,2009. Vol. 7, N 3. - P. 226-236.
2. Du L. MERS-CoV spike protein: a key target for antivirals // Expert Opin TherTargets,2017. - Vol. 21, N 2. - P. 131-143.
3. Zhou P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin // Nature, 2020. - Vol. 579, N 7798. - P. 270-273.
4. Jiang S. An emerging coronavirus causing pneumonia outbreak in Wuhan, China: calling for developing therapeutic and prophylactic strategies //Emerg Microbes Infect, 2020. - Vol. 9, N 1. - P. 275-277.
5. Ou X., Liu Y., Lei X., Li P., Mi D., Ren L., Guo L., Guo R., Chen T., Hu J., Xiang Z., Mu Z., Chen X., Chen J., Hu K., Jin Q., Wang J., Qian Z. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV //Nat Commun, 2020. - Vol. 11. - P. 1620.
6. Zhou Y., Yang Y., Huang J., Jiang S., Du L. Advances in MERS-CoV vaccines and therapeutics based on the receptor-binding domain // Viruses, 2019. - Vol. 11, N 1. - Pii:E60.
7. Ahmed S.F., Quadeer A.A., McKay M.R. Preliminary identification of potential vaccine targets for the COVID-19 coronavirus (SARS-CoV-2) based on SARS-CoV immunological studies // Viruses, 2020. - Vol. 12, N 3. - Pii: 254.
8. Zhou P., Yang X.-L., Wang X.-G., Hu B., Zhang L., Zhang W., Si H.-R., Zhu Y., Li B., Huang C.-L., et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin // Nature. 2020. - Vol. 579, N 7798. - P. 270-273.
9. Lu R., Zhao X., Li J., Niu P., Yang B., Wu H., Wang W., Song H., Huang B., Zhu N., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: Implications for virus origins and receptor binding // Lancet, 2020. - Vol. 395, N 10224. - P. 565-574.
10. Letko M., Marzi A., Munster V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B β-coronaviruses // Nat Microbiol, 2020. - Vol. 5. - P. 562-569.
11. Walls A.C., Park Y.J., Tortorici M.A., Wall A., McGuire A.T., Veesler D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein //Cell, 2020. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.058 [Epub ahead of print].
11. Klenk H.D., Garten W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity // Trends Microbiol, 1994. - Vol. 2, N 2. - P. 39-43.
12. Steinhauer D.A. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus // Virology, 1999. - Vol. 258, N 1. - P. 1-20.
13. Ai T., Yang Z., Hou H., Zhan C., Chen C., Lv W., Tao Q., Sun Z., Xia L. Correlation of Chest CT and RT-PCR Testing in Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) in China: A Report of 1014 Cases // Radiology, 2020: 200642.
14. Xiao A.T., Tong Y.X., Zhang S. False-negative of RT-PCR and prolonged nucleic acid conversion in COVID-19: Rather than recurrence // J Med Virol,2020. - 10.1002/jmv.25855.doi: 10.1002/jmv.25855. Online ahead of print.
15. Li Y., Yao L., Chen L., Song Y., Cai Z., Yang C. Stability issues of RT-PCR testing of SARS-CoV-2 for hospitalized patients clinically diagnosed with COVID-19 //J Med Virol, 2020. - Vol. 92, N 7. - P. 903-908.
16. Xiang F., Wang X., He X., Peng Z., Yang B., Zhang J., Zhou Q., Ye H., Ma Y., Li H., Wei X., Cai P., Ma W.L. Antibody detection and dynamic characteristics in patients with COVID-19 // Clin Infect Dis, 2020. ciaa461. doi: 10.1093/cid/ciaa461. Online ahead of print.
17. AmanatF., StadlbauerD., StrohmeierS., NguyenT.H.O., ChromikovaV., McMahonM., JiangK., ArunkumarG.A., JurczyszakD., PolancoJ., Bermudez-GonzalezM., KleinerG., AydilloT., MiorinL., FiererD., LugoL.A., KojicE.M., StoeverJ., LiuS.T.H., Cunningham-RundlesC., FelgnerP.L., MoranT., Garcia-SastreA., CaplivskiD., ChengA., KedzierskaK., VapalahtiO., HepojokiJ.M., SimonV., KrammerF. AserologicalassaytodetectSARS-CoV-2 seroconversioninhumans // https://doi.org/10.1101/2020.03.17.20037713.medRxiv preprint 2. - 2020.
18. Kohmer N., Westhaus S., Rühl C., Cieseka S., Rabenau H.F. Brief clinical evaluation of six high-throughput SARS-CoV-2 IgG antibody assays // J Clin Virol, 2020. - Vol. 129. - P. 104480.
19. To K.K.W, Tsang O.T.Y., Leung W.S., Tam A.R., Wu T.C., Lung D.C., et al. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study // Lancet Infect Dis, 2020. doi: 10.1016/S1473-3099(20)30196-1[Epub ahead of print].
20. Zhang W., Du R.H., Li B. Molecular and serological investigation of 2019-nCoV infected patients: implication of multiple shedding routes // Emerg Microbes Infect, 2020. - Vol. 9, N 1. - P. 386-389.
21. Yu H.Q., Sun B.Q., Fang Z.F., Zhao J.C., Liu X.Y., Li Y.M., et al. Distinct features of SARS-CoV-2-specific IgA response in COVID-19 patients // Eur Resp J, 2020. Doi: 10.1183/13993003.01526-2020.[Epub ahead of print].
21. Zhang L., Zhang F., Yu W. Antibody responses against SARS coronavirus are correlated with disease outcome of infected individuals // J Med Virol, 2006. - Vol. 78, N 1. - P. 1-8.
22. Liu L., Wei Q., Lin Q. Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophage responses during acute SARS-CoV infection // JCI Insight, 2019. - Vol. 4, N 4. - e123158.
23. Заявка на патент CN111024954A от 17.04.2020 г. (на китайском языке). Иммунохроматографическое устройство с коллоидным золотом для совместного обнаружения антигена и антитела COVID-19 и способ его применения. Подана 09.03.2020 ShenzhenYiruiBiotechnologyCo., Ltd.
24. Заявка на патент CN111089962A от 01.05.2020 г. (на китайском языке).Набор коллоидного золота для совместного обнаружения нового антитела IgM / IgG к коронавирусу и способ его получения. Подана 25.03.2020 г. ChungshanBiologicalEngineeringCompany, Ltd.
25. Полезный продукт EH4395 /Humananti-2019-nCoV(N) IgGELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4395/
26. Полезный продукт EH4397 /Humananti-SARS-CoV2(N) IgGELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4397/
27. Полезный продукт EH4940 /Humananti-SARS-CoV2(N) IgMELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4940/
28. Полезный продукт EH4941 /Humananti-2019 nCoV(S) IgGELISAKit, компанияFineTest, https://www.fn-test.com/product/eh4941/
29. Полезный продукт EH4942 /Human Anti-2019 nCoV(S) IgM ELISA Kit, компания Fine Test, https://www.fn-test.com/product/eh4942/
30. Патент РФ 2253870, опубл. 10.06.2005 г. (Бюллетень 16). Рекомбинантные белки, содержащие диагностически значимые антигенные эпитопы белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом, и последовательности синтетических генов, кодирующие диагностически значимые антигенные детерминанты белков короновируса (SARS-CoV), cвязанного с тяжелым острым респираторным синдромом. Патентообладатель -ООО Научно производственное объединение "Диагностические системы".
31. Kohmer N., Westhaus S., Rühl C., Cieseka S., Rabenau H.F. Clinical performance of SARS-CoV-2 IgG antibody tests and potential protective immunity // bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.08.085506.
32. Beavis K.G., Matushek S.M., Abeleda A.P.F., Bethel C.,Hunt C., Gillen S., Moran A., Tesic V. Evaluation of the EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA Assay for detectionof IgA and IgG antibodies // J Clin Virol, 2020. - Vol. 129. - P. 104468.
33. Krüttgen A., Cornelissen C.G., Dreher M., Hornef M.,Imöhl M., Kleines M. Comparison of four new commercial serologic assays for determination ofSARS-CoV-2 IgG // J Clin Virol, 2020. - Vol. 128. P. 104394.
34. Zhou X., Obuchowski N., McClishD.Statistical Methods in Diagnostic Medicine // John Wiley & Sons, New York. - 2002.