Анализ полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы в популяции Северо-Западного региона России, у атлетов и у долгожителей

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА

1,2,3А.С. Глотов, 1,2,3О.С. Глотов, 12М.В. Москаленко,

3В.А. Рогозкин, 'Т.Э. Иващенко, 'B.C. Баранов

'НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург; 2Санкт-Петербургский государственный университет; 3НИИ физической культуры, Санкт-Петербург

# Методом ПЦР/ПДРФ анализа в группах атлетов, долгожителей и в популяционной выборке исследован полиморфизм генов ренин-ангиотензиновой системы: ангио-тензиногена — AGT (М235Т), ан-гиотензинпревращающего фермента — АСЕ (І/D), рецептора ангиотензиногена — AGT2R1 (А1166С). По сравнению с популяционной группой у гребцов отмечено увеличение частоты генотипов М/Т гена AGT (46 и 34%) и І/D гена АСЕ (55 и 48% соответственно) и снижение частоты генотипа А/С гена AGT2R1 (38 и 51%). Показано достоверное увеличение частоты генотипа М/Т гена AGT у долгожителей по сравнению с популяционной группой (56 и 34% соответственно, *2=12,961, df=2, р=0,0015). Полученные данные позволяют предполагать важную роль ре-нин-ангиотензиновой системы в процессах старения и сохранения активной физической работоспособности.

Ключевые слова:генетическая предрасположенность; полиморфизм; ассоциация; популяция; долгожители; спортсмены; ген AGT; ген АСЕ: ген AGTRI, мульти-факториальные заболевания; ре-нин-ангиотензиновая система; сердечно-сосудистая система.

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ РЕНИН-АНГИОТЕНЗИНОВОЙ СИСТЕМЫ В ПОПУЛЯЦИИ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО РЕГИОНА РОССИИ, У АТЛЕТОВ И У ДОЛГОЖИТЕЛЕЙ

ВВЕДЕНИЕ

Благодаря прогрессу в изучении генома человека появилась реальная возможность не только проводить точную молекулярную диагностику всех генных болезней, но в определенной мере судить о предрасположенности человека к различным заболеваниям и даже оценивать его некоторые врожденные функциональные (физиологические) особенности [1-5]. С этой целью проводят анализ полиморфизма генов, принимающих участие в тех или иных метаболических процессах. При этом основное внимание уделяют функционально значимым полиморфным заменам нуклеотидов в молекуле ДНК, которые по-разному влияют на функциональную активность соответствующих генопродуктов. Большое значение в таких исследованиях имеет изучение полиморфизма генов, продукты которых обеспечивают различные звенья одной той же или близко сопряженных метаболических цепей, то есть входящих в одну генную сеть. Такой системный подход позволяет более адекватно оценить роль соответствующего полиморфного аллеля в формировании функционального статуса организма. Удобную модель для таких исследований представляет ренин-ангиотензиновая система. Белковые продукты ее генов играют ключевую роль в регуляции кровяного давления и гомеостатической функции почек и обеспечивают, таким образом, важнейшие компенсаторные физиологические процессы в организме.

Анализ генетического полиморфизма человека зачастую ограничивается сравнительным анализом аллельных частот и распределения генотипов в популяции и у больных с различными мультифакториаль-ными заболеваниями, что обусловлено, прежде всего, задачами практического здравоохранения — предиктивной (профилактической) медицины [1-3]. Не меньшее значение, однако, имеет изучение особенностей генетического полиморфизма среди «условно здоровых» групп населения, таких как долгожители, спортсмены, новорожденные и другие. Предполагается, что такого рода исследования также могут дать важную информацию о роли и функциях того или иного гена в сложной генетической сети, формирующей функциональный статус организма человека. Известно, что генетический полиморфизм тесно свя-

зан с физическими возможностями человека, то есть имеет непосредственное отношение к высоким спортивным достижениям [4,6-8]. Основные направления исследований в области спортивной генетики связаны с генами ренин-ангиотензиновой системы как основного маркера состояния сердечно-сосудис-той системы. Наиболее изученным среди них является полиморфизм 1/Б по гену ангиотензин-превраща-ющего фермента (АСЕ), для которого показана ассоциация определенных генотипов и аллелей с той или иной способностью к физической нагрузке. Имеются ориентировочные данные и о наличии ассоциации аллельных вариантов генов ренин-ангиотензиновой системы с продолжительностью жизни.

Таким образом, целью настоящей работы было комплексное изучение особенностей функционального полиморфизма нескольких генов ренин-ангиотензиновой системы, а именно АСЕ (1Ю), АОТ (М235Т), АОТЫ1 (А1166С) у спортсменов и долгожителей в сравнении с таковыми в популяции населения Северо-Западного региона России.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы образцы ДНК, выделенные из клеток буккального эпителия 56-ти спортсме-нов-гребцов (мужчины 18-22 лет) высокого спортивного разряда (1-ый разряд, к.м.с, м.с.), и образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов перифе-рической крови 147-ми лиц старше 70-ти лет: мужчины (п=29) и женщины (п=118). В качестве контроля использованы образцы ДНК здоровых не родственных индивидуумов мужского (п=59) и женского пола (п=57) в возрасте 18-45 лет, проживающих в Северо-Запад-ном регионе России.

Методами полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов исследован полиморфизм трех генов: АОТ, АСЕ, АОТЯ1. Типы изученных полиморфных аллелей, последовательности олигопраймеров и размеры ампли-фицированных фрагментов приведены в табл. 1.

Реакционная смесь для амплификации, объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-

НС1, pH 8.8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1 е.а. Taq-ДНК-по-лимеразы («СибЭнзим» г.Новоси-бирск). Для амплификации использовали програм-мируемый термоциклер фирмы «Perkin Elmer», Cetus (США) или ДНК-ам-плификатор фирмы «ДНК-технология» (Россия). После предварительной денатурации ДНК (10 мин при 94°С) проводили амплификацию в режиме:

-для гена AGT (10 циклов): денатурация 94°С (7 мин), 10 циклов амплификации: 94°С (1 мин), 68°С (1 мин), 72°С (1 мин) и 18 циклов амплификации: 90°С (30 сек), 68° С (1 мин), 72°С (30 сек). Заключительный синтез 72° С — 10 мин.

- для гена АСЕ (30 циклов): денатурация при 94°С (7 мин), 30 циклов амплификации: 94°С (1 мин), 60°С (1 мин), 72°С (1 мин). Заключительный синтез 72°С — 5 мин.

-для гена AGTR1 (38 циклов): денатурация 94°С (7 мин), 38 циклов амплификации: 94°С (1 мин), 57°С (1 мин), 72°С (1 мин). Заключительный синтез 72°С — 7 мин.

Продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции: Tthl 1II — для гена AGT (165 п.о. — М аллель, фрагменты 139 п.о. и 26 п.о. — Т аллель); BstDEI — для reHaAGTRl (165 п.о. — А аллель, фрагменты 109 п.о. и 56 п.о. — С аллель). Ферментативный гидролиз ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы изготовителя. Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 6% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

Для статистического анализа использован стандартный метод у! (программа GraphPad InStat).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты анализа частот генотипов и аллелей генов AGT, АСЕ и AGTR1 в популяции, в группе долгожителей и спортсменов представлены в табл. 2 и 3. Распределение соответствующих генотипов по всем генам ренин-ангиотензиновой системы в популя-ци-

Таблица 1

Характеристика генов АСТ, АСЕ, АСТИ!, структуры олигопраймеров, используемых для их изучения

Ген Локализация гена Изученный полиморфизм гена Размер амплифированного фрагмента Структура праймера

AGT 1q42-q43 М235Т (Т—>С мутация) 165 п.о. 5'-CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3 5'-CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC-3

АСЕ 17q23 І/D в 17 интроне I аллель — 477 п.о. D аллель — 190 п.о. 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 5'-ATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3

AGTR1 3q2I-q23 А1166С 165 п.о. 5'-CACCATGTTTTGAGGTTGAGTGACA-3 5'-AAAGTCGGTTCAGTCCACATAATGC-3

Таблица 2

Распределение генотипов и частот аллелей генов АСГ, АСЕ, АСТИ 1 в популяции, у гребцов

и у лиц пожилого возраста

АСТ Частоты аллелей.% X2:df=2 Частоты генотипов. % X2; df = 4

М Т 1,008 р = 0,6040 ММ МТ тт 8,817 р = 0,0658

Популяционная выборка (п = 59) 61,0 ±5,7 39,0 ± 7,2 44,1 33,9 22,0

Гребцы (п = 56) 53,6 ±6,4 46,4 ±6,9 30,4 46,4 23,2

Лица пожилого возраста (п = 29) 56,9 ± 8,6 43,1 ±9,9 24,1 65,5 10,3

АСЕ I D 3,31 р = 0,1911 II ID DD 2,489 р = 0,6466

Популяционная выборка (п = 59) 46,6 ± 6,7 53,4 ±6,3 22,4 48,3 29,3

Гребцы (п = 56) 47,3 ±6,8 52,7 ± 6,5 19,6 55,4 25,0

Лица пожилого возраста (п = 29) 56,9 ± 8,6 43,1 ±9,9 31,0 51,7 17,2

АСТШ А С 1,065 р = 0,5870 АА АС СС 4,432 р = 0,3507

Популяционная выборка (п = 59) 69,5 ±5,1 30,5 ±7,7 44,1 50,8 5,1

Г ребцы (п = 56) 75,9 ± 04,6 24,1 ± 8,2 57,1 37,5 5,4

Лица пожилого возраста (п = 29) 74,1 ±6,7 25,9+ 11,3 58,6 31,0 10,4

Таблица 3

Распределение генотипов и частот аллелей генов АСГ, АСЕ, АвТШ в популяции и у лиц пожилого возраста

AGT Частоты аллелей,% X2; df = 1 Частоты генотипов, % x2;df=2

М Т 1,306 р = 0,2532 ММ МТ ТТ 6,440 р - 0,04

Популяционная выборка (п = 57) 61,4 ± 5,8 38,6 ±7,3 43,9 35,1 21,1

Лица пожилого возраста (п = 118) 53,0 ±4,5 47,0 ± 4,7 26,3 53,4 20,3

АСЕ I D 0,08013 р = 0,7771 II ID DD 2,202 р - 0,3326

Популяционная выборка (п = 57) 49,1 ±6,7 50,9 ±6,6 29,8 38,6 31,6

Лица пожилого возраста (п = 118) 47,0 ± 4,7 53,0 ±4,5 22,0 50,0 28,0

AGTR1 А С 2,58 р-0,1082 АА АС СС 4,802 р = 0,0906

Популяционная выборка (п = 57) 84,8 ± 3,7 15,2 ±8,7 69,6 30,4 0

Лица пожилого возраста (п = 118) 75,4 ±3,2 24,6 ± 5,7 55,1 40,7 4,2

онной группе Северо-Западного региона России, в группе гребцов и у лиц пожилого возраста соответствовало распределению Харди-Вайнберга (р > 0,05, с1Г = 2, для мужчин и р > 0,05, с!Г = 2, для женщин соответственно).

Достоверных различий в частотах аллелей генов ренин-ангиотензиновой системы между группой гребцов и популяционной группой не обнаружено (р > 0,3908, с1Г = 1). Вместе с тем у гребцов по сравнению с популяционной группой отмечена тенденция к увеличению частоты генотипов М/Т по гену АвТ и 1Ю по гену АСЕ (46 и 34% для гена АСТ и 55 и 48% для гена АСЕ соответственно). Эти различия, однако, оказались недостоверными (^2 = 2,59; с1Г = 2, р = 0,2739 и у1 - 0,5746; с1Г = 2, р = 0,7503, для генов АОТ и АСЕ соответственно). Для гена АСТШ была выявлена обратная тенденция — уменьшение частоты гетерозигот (А/С) у атлетов (38% у гребцов по сравнению с 51% такого генотипа в контроле, %2 = 2,132; с!Г = 2, р = 0,3444). Частоты генотипов, предраспола-

гающих к повышенному артериальному давлению (Т/Т по гену AGT, D/D по гену АСЕ и С/С по гену AGTR1) в группе гребцов и в популяции практически не отличались (р > 0,7292, df = 1). Таким образом, проведенный анализ не позволил обнаружить существенных отличий частот аллелей и генотипов у ат-летов-гребцов, в сравнении с популяционной выборкой. Вместе с тем представляет интерес выявленная тенденция к увеличению числа гетерозигот по генам AGT и АСЕ у спортсменов при одновременном снижении в этой группе гетерозигот по гену рецептора ангиотензиногена AGTR1.

Анализ полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы не выявил различий в частотах соответствующих аллелей у долгожителей (как у мужчин, так и у женщин) и в популяционной группе (р > 0,2532, df = 1). При этом, однако, частота генотипа М/Т по гену AGT у лиц пожилого возраста оказалась почти в два раза выше по сравнению с таковой в популяции и составила 65,5% у лиц мужского пола

и 53,4% у лиц женского пола. В контрольной группе мужчин и женщин частоты М/Т генотипа составляли 33,9% {у! = 7,877; сИ" = 2, р = 0,005) и 35,1% (%2 = 6,44; (11* = 2, р = 0,04) соответственно. В группе долгожителей выявлено также некоторое увеличение частоты гено-типа 1Ш по гену АСЕ. Однако данные различия оказались недостоверными (р > 0,2272, с1Г = 2). Кроме того, у долгожителей мужского пола отмечено уменьшение частоты гетерозиготного генотипа (А/С) гена АОТЯ1 (3% у долгожителей и 5% в контроле, у! = 3,354; сИ" = 2, р = 0,1869), тогда как для долгожителей женского пола выявлена обратная тенденция — увеличение гетерозиготных генотипов (%2 = 4,802; сИ" = 2, р = 0,0906). Частота данного аллеля у долгожительниц оказалась в 2 раза ниже, чем у долгожителей (%2 = 6,452; ёГ = 1, р = 0,011).

Полученные данные свидетельствуют о наличии ассоциации определенных генотипов по генам ренин-ангиотензиновой системы с долгожительством и с повышенной физической работоспособностью. Особенно четко прослеживается такая связь в отношении полиморфизма М235Т по гену АОТ. При этом доминирующим среди долгожителей оказался генотип (М/Т). Частота его оказалась заметно повышенной и среди спортсменов.

Такое увеличение числа гетерозигот М/Т по гену АОТ представляется вполне логичным. Известно, что ренин, воздействуя на ангиотензиноген (продукт гена АОТ), превращает его в ангиотензин I, который, в свою очередь, служит субстратом для ангиотензин-превращающего фактора (продукт гена АСЕ), конвертирующего ангиотензин I в ангиотензин II. Последний обладает активным сосудосуживающим эффектом и повышает артериальное давление. Считают, что ангиотензин II играет роль в патогенезе гипертонической болезни, увеличивая периферическое сосудистое сопротивление, а также вызывает гипертрофию левого желудочка [1, 2, 6-8, 12].

Складывается впечатление, что с возрастом происходит элиминация из популяции гомозигот М/М и Т/Т по гену АОТ. В группе гребцов также выявлено увеличение числа индивидуумов с генотипом М/Т, что косвенно свидетельствует о связи между нагрузкой, сочетающей силу и выносливость, и тенденцией к долгожительству. Таким образом, гетерозиготность по генам АОТ и АСЕ можно рассматривать как наследственный фактор, ассоциированный с долгожительством и способностью к активному занятию спортом.

В настоящее время в генной сети сердечно-сосудистых заболеваний ориентировочно насчитывается около 150 генов. Гены ренин-ангиотензиновой системы только одна, хотя и очень важная группа этих генов. Требуются дальнейшие исследования на больших популяционных выборках, чтобы оценить значение

функционально значимого полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы как молеку-лярных маркеров потенциальных возможностей сердечно-сосудистых системы, от состояния которой зависят не только спортивные рекорды, но что еще более важно — качество и продолжительность жизни.

Работа выполнена при поддержке гранта CRDF «Молекулярно-биологические основы здоровья человека и окружающей среды Северо-Запада России» (ST-012-0) и персональных грантов поддержки научно-исследовательской работы аспирантов вузов МО РФ 2003-2004 гг. (грант № А03-2.12-14 и № АОЗ-2.12-16).

Литература

1. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности» (Введение в предиктивную медицину) — СПб.: Интермедика, 2000 г.

2. Баранов B.C. Молекулярная медицина: молекулярная диагностика, превентивная медицина и генная терапия // Молекулярная биология. — 2000. — Т. 34, № 4. — С. 684-695.

3. Определение генетической предрасположенности к наследственным и мультифакториальным заболеваниям. Генетический паспорт: Методические рекомендации. — СПб.: Фолиант, 2001. — 48 с.

4. Рогожин В.А. Расшифровка генома человека и спорт//Теория и практика физической культуры. — 2001. — №. 6. — С. 60-63.

5. Степанов В.А. Этногеномика неселения Северной Евразии. — Томск: Печатная мануфактура, 2002. — 244 с.

6. Karjalainen J., Kujala U.M., Stolt A., Mantysaari М., Viitasalo М., Kainulainen К., Kontula К. Angiotensinogen gene M235T polymorphism predicts left ventricular hypertrophy in endurance athletes // J. Am. Coll. Cardiol. — 1999. — Vol. 34. — P. 494-499.

7. Nazarov f.B., Woods D.R., Montgomery H.E., Shneider O.V., Kazakov V.I., Tomilin N.V., Rogozkin V.A. The angiotensin converting enzyme I/D polymorphism in Russian athletes // Eur. J. Hum. Genet. —2001, — Vol. 9. —P. 797-80).

8. Montgomery HE., Marshall R., Hemingway H., et al. Human gene for physical performance//Nature.— 1998. — Vol. 21. — P. 221-222.

Analysis of genes polymorphisms of renin-angiotensine systems in population, athletes and elderly people

'•2JGlotovA.S..UJ Glotov O.S., 12Moskalenko M. V.- ,2RogozkinVA., 3Ivashchenko T.E.,'Baranov V.S.

1 Ott's Institute of Obstetrics and Gynecology RAMS, St,-Petersburg, 2St.-Petersburg State University, St-Petersburg,3St.-Petersburg Scientific Research Institute of Physical Culture, St-Petersburg; Russia

& SUMMARY: We analyzed AGT (M235T), ACE (I/D), AGTR1 (A1166C) genes polymorphisms of renin-angiotensine systems in population, athletes and elderly people by PCR/RFLP methods. It was shown increasing of M/T genotype of AGT gene in rowers compared with population group (46 and 34%, accordantly), I/D of ACE (55 and 48%, accordantly) and decreasing of A/C genotype of AGTR1 gene (38 and 51%). It was detected significantly increasing of M/T genotype of AGT gene elderly people compared with population group (56 and 34%, accordantly, x2=II,828, p=0,0006). The received data allow to make the assumption of a possible role renin-angiotensine systems in process of ageing and active physical working capacity.

KEY WORDS: genetic predisposition; polymorphism; association; population; elderly people; rowers; gene AGT; gene ACE; gene AGTR1; multifactorial disease; renin-angiotensine system; cardiovascular system.