ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЙ КОМПЛЕКС, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
IMMUNOSTIMULATING COMPLEX, METHOD FOR PREPARING AND USING IT

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предлагается способ получения и применения однородного по суперструктуре тубулярного иммуностимулирующего комплекса, обеспечивающего доставку антигенов и природных медиаторов на основе липидов и сапонинов из морских гидробионтов.
Создание нового поколения высоко эффективных вакцин связано с использованием изолированных антигенов, способных обеспечить более сильный высокоспецифический иммунный ответ к бактериальным, вирусным патогенам и опухолевым клеткам.
В современных технологиях изготовления вакцинных препаратов большое внимание уделяют проблеме поиска и конструирования различных носителей для антигенов, назначением которых является оптимальная форма доставки антигена иммунокомпетентным клеткам, направленный транспорт, защита антигена от биодеградирующих механизмов (протеаз, нуклеаз и др.), адъювантный эффект за счет собственной иммуномодулирующей активности носителя и представление антигена соответствующими клетками.
Известен иммуностимулирующий комплекс (ИСКОМ), представляющий собой липид-сапониновые частицы, состоящие из смеси растительных тритерпеновых гликозидов QuilA из растения Quillajia saponaria, холестерина и фосфолипидов в соотношении 3:2:6 [пат. RU 2120302, опубл. 20.10.1998 г.].
Антигены в составе ИСКОМ более иммуногены, чем в других коллоидных системах типа липосом. QuilA сапонины в составе носителя обладают иммуностимулирующими свойствами и необходимы для его структурирования. Адъювантная активность ИСКОМ позволяет индуцировать существенный специфический иммунный ответ гуморального и клеточного типа при использовании доз антигена намного меньших, чем в обычных вакцинах.
Основным недостатком ИСКОМ как системы доставки антигенов является токсичность при внутривенном введении препарата, главной причиной которой является относительно высокая гемолитическая активность сапонинов QuilA. Внутримышечное введение ИСКОМ сопровождается воспалительными и болевыми реакциями; в связи с этим в настоящее время использование в клинике QuilA сапонинов в качестве адъюванта ограничивается пероральным введением.
2
Наиболее близким к заявляемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является иммуностимулирующий комплекс, объединяющий систему доставки антигенов и природных медиаторов на основе липидов из морских гидробионтов [пат.RU №2311926, опубл. 12.10.2007] - прототип. Недостатки, присущие ИСКОМам, устранены в прототипе заменой фосфолипидного компонента на моногалактозилдиацилглицерид (МГДГ) из морских макрофитов, а сапонина Quil А на тритерпеновый гликозид из кукумарии японской - кукумариозид А-2 (КД) при весовом соотношении КД:холестерин:МГДГ, равном 3:2:6. Полученый носитель антигенов имеет ультрамикроскопическую тубулярную структуру, представленную тубулами с диаметром поперечного сечения около 40 нм, в связи с чем был назван тубулярным иммуностимулирующим комплексом или ТИ-комплексом. В условиях экспериментальной иммунизации мышей этот носитель с антигеном в виде мономерной формы порина из Yersinia pseudotuberculosis показал значительно более низкую токсичность и более сильный гуморальный ответ на антиген, чем классические ИСКОМы, адъювант Фрейда и липосомы, а также показал перспективу использования ТИ-комплексов в качестве нового типа носителей антигенов [Tsybulskii AV et al. Elaboration of newadjuvant lipid-saponin complex and its use at experimental immunization by bacterial antigen. Biomed Khim(Rus.) 2007; 53(3): 297-306].
Основным недостатком ТИ-комплекса при весовом соотношении компонентов, равном 3:2:6, является то, что при получении коллоидной дисперсии в реакционной среде находится достаточно большое количество исходного материала и промежуточных структур. Это характерно не только для формирования ТИ-комплекса, но и классических ИСКОМ, полученных методом гидратации пленки липида. Сами по себе эти фрагменты (исходный материал и промежуточные структуры) не представляют опасности при иммунизации, но существенно снижают эффективность носителя антигенов и воспроизводимость результатов. Кроме того, при введении ТИ-комплекса иммунизируемым животным исходная коллоидная смесь сильно разбавляется фосфатным буфером (в 75 раз) до необходимых для введения концентраций. Далее из разбавленной смеси отбирается необходимый объем для введения экспериментальным животным. Количество ТИ-комплексов в этих объемах неравномерно из-за большого разбавления исходной коллоидной смеси, что приводит к большому разбросу результатов.
Задачей заявляемого технического решения является получение однородной тубулярной формы адъювантного носителя антигена (ТИ-комплексов) без посторонних включений и снижение токсичности этого иммуностимулирующего комплекса.
Задачей заявляемого изобретения является также оптимизация применения полученного ТИ-комплекса при иммунизации животных, обеспечивающая его максимальную иммуногенность при отсутствии осложнений после вакцинации.
2
Задача получения однородной тубулярной формы и снижения токсичности ТИ-комплексов решается изменением соотношения исходных компонентов препаратов. Оптимальным образом задача получения однородной тубулярной формы и снижения токсичности носителя антигенов решается формированием ТИ-комплекса, структурообразующей основой которого является комплекс из тритерпенового гликозида кукумариозида А-2 (КД), холестерина и полярного липида МГДГ из морских макрофитов при их весовом соотношении 6:2:4, что обеспечивает максимальную однородность формирования иммуностимулирующего ТИ-комплекса и его наименьшую токсичность.
МГДГ из морских макрофитов должны быть хроматографически чистыми, а структура их жирнокислотного состава подтверждена с помощью ГЖХ.
2
Препарат КД получают из голотурии Cucumaria japonica с помощью высокоэффективной жидкостной хромато-масспектрометрии (Авилов С.А., Тищенко Л.Я., Стоник В.А. Строение кукумариозида А-2 - тритерпенового гликозида из голотурии Cucumaria japonica / Химия природных соединений, 1984. №6. С.799-800). Структура КД подтверждена с помощью ЯМР и хромато-массспектрометрии.
Формирование ТИ-комплексов осуществляют методом гидратации пленки липида по методике, описанной ниже.
Задача оптимизации способа применения полученных ТИ-комплексов при иммунизации животных, обеспечивающая максимальную иммуногенность при отсутствии осложнений после вакцинации, решается:
- уменьшением разбавления исходного ТИ-комплекса и нахождением его оптимального количества при введении в организм животных;
- изменением формы вводимого в состав ТИ-комплекса антигена, а именно, включением в состав иммуностимулирующего комплекса тримера порина из Yersinia pseudotuberculosis вместо мономера.
2
Липид-сапониновый ТИ-комплекс при соотношении КД:ХОЛ:МГДГ, равном 6:2:4, получают следующим образом. Растворы холестерина и МГДГ в хлороформе при их весовом соотношении, равном 2:4, упаривают под вакуумом до удаления хлороформа и добавляют 6 весовых частей 0,4 процентного водного раствора кукумариозида А-2, смесь солюбилизируют, после чего доводят суммарную концентрацию липидов (холестерина и МГДГ) до 2 мг в 1 мл суспензии фосфатно-солевым буфером при рН 7,2, после чего озвучивают полученную суспензию ультразвуковым дезинтегратором в течение 5 минут. Получают липид-сапониновый ТИ-комплекс в виде водной суспензии, стабильный при температуре - 4°С более трех месяцев.
Впервые обнаружено, что максимальная однородность ТИ-комплексов, полученных этим способом, в значительной степени зависит от правильно выбранного соотношения формирующих матрицу компонентов - КД:холестерина:МГДГ - и достигается при их весовом соотношении 6:2:4.
Для исследования структуры липид сапонинового комплекса, полученного при разных соотношениях исходных компонентов, использовали метод энергетической фильтрации трансмиссионной электронной микроскопии (EFTEM), позволяющий получать высококонтрастные изображения образцов окрашенных фосфорно-вольфрамовой кислотой (негативно контрастированные) и не окрашенных образцов, позволяющих обнаружить частицы слабо рассеивающих электронов и не имеющих характерной морфологии (МГДГ, холестерин и др.) и детально охарактеризовать ультраструктуру частиц суспензии.
Были исследованы различные варианты соотношения компонентов ТИ-комплексов (примеры 1-5). На фиг.1-5 представлены электронно-микроскопические фотографии матрицы ТИ-комплекса при различном соотношении компонентов в системе КД:ХОЛ:МГДГ - фиг.1 - 3:2:6 (пример 1); фиг.2 - 1,5:2:6 (пример 2); фиг.3-6:2:6 (пример 3); фиг.4 - 6:2:4 (пример 4); фиг.5 - 6:2:10 (пример 5). На снимках представлены негативно контрастированные образцы с длиной масштабной линии 200 и 100 нм (снимки А, Б) и не окрашенные образцы с длиной масштабной линии 200 и 100 нм (снимки В, Г).
ТИ-комплекс, описанный в прототипе, с весовым соотношением компонентов КД:ХОЛ:МГДГ, равным 3:2:6, изображен на негативно контрастированных образцах (фиг.1, снимки А, Б); снимки свидетельствуют о наличии типичных тубулярных частиц. На не окрашенных препаратах видно присутствие вещества, не входящего в состав тубулярных частиц и представляющего, вероятно, избыток не включившихся липидов МГДГ и холестерина (фиг.1, снимки В, Г). Снижение (относительно прототипа) доли КД в липид-сапониновой системе вдвое - КД:ХОЛ:МГДГ (1.5:2:6) - привело к резкому увеличению количества вещества, не входящего в состав тубулярных частиц, что хорошо видно на неокрашенных образцах (фиг.2, снимки В, Г). Собственно трубочки утонули в этом веществе. Тогда как на негативно контрастированных образцах обнаруживается большое количество типичных тубул (фиг.2, снимки А,Б). Повышение доли КД (относительно прототипа) в липид-сапониновой системе вдвое - КД:ХОЛ:МГДГ (6:2:6) - привело к формированию более однородной системы, чем в прототипе. На неокрашенных образцах обнаруживаются небольшие количества вещества, не вошедшего в состав тубул (фиг.3, снимки В, Г). На негативно контрастрованных образцах видны типичные тубулярные частицы (фиг.3, снимки А, Б). Дальнейшее снижение доли липидов в липид-сапониновой системе до КД:ХОЛ:МГДГ (6:2:4) привело к формированию однородной системы, содержащей только тубулярные частицы и практически не содержащей постороннего вещества (видно на не окрашенных образцах) (фиг.4, снимки В, Г). На негативно контрастированных образцах видны тубулярные частицы типичного строения (фиг.4, снимки А,Б). Повышение доли липидов в липид-сапониновой системе при КД:ХОЛ:МГДГ, равном (6:2:10), привело к возрастанию количества вещества, не вошедшего в состав тубул (фиг.5, снимки В,Г) в сравнении с системой КД:ХОЛ:МГДГ (6:2:6).
Следовательно, для формирования тубулярных частиц в липид-сапониновых системах очень важно, чтобы весовое соотношение КД:ХОЛ было равным 3:2, тогда как весовое содержание МГДГ не обязательно должно быть постоянным и равным 4. Вполне допустимы ТИ-комплексы, в которых весовое соотношение КД:ХОЛ:МГДГ равно 6:2:4-6.
Однако предпочтительным является вариант с соотношением компонентов в системе ТИ-комплекса КД:ХОЛ:МГДГ, равным 6:2:4 (пример 4, фиг.4, снимки А-Г). Такое соотношение исходных компонентов обеспечивает условия для максимальной однородности и наиболее эффективного формирования трубчатых наночастиц, которые являются носителями антигенов, а также исключает образование каких-либо других частиц.
Увеличение содержания КД в 2 раза в предлагаемом ТИ-комплексе по сравнению с комплексом, описанным в прототипе, потребовало сравнительной проверки его гемолитической активности (токсичности), так как индивидуальный КД имеет высокую гемолитическую активность. Это подтверждается полученными ранее экспериментальными данными.
Таблица 1
Гемолитическая активность компонентов липид-сапонинового комплекса и ТИ-комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ, с разным весовым соотношением
Комплекс и его компоненты
ED50-КД
ED50 МГДГ
ED50 ТИ-комплекса
КД
0.78 мкг/мл
QA
25 мкг/мл
МГДГZМ
44.24 мкг/мл
МГДГSР
47.6 мкг/мл
6-2-15ZM
3.6 мкг/мл
9.1 мкг/мл
13.6 мкг/мл
6-2-15SP
12.6 мкг/мл
31.6 мкг/мл
47.6 мкг/мл
3-2-6ZM
11.7 мкг/мл
23.4 мкг/мл
43 мкг/мл
3-2-6SP
16.6 мкг/мл
33.18 мкг/мл
60.84 мкг/мл
6-2-4ZM
36 мкг/мл
24 мкг/мл
71.9 мкг/мл
6-2-4SP
54.6 мкг/мл
36.14 мкг/мл
109.2 мкг/мл
2
В таблице 1 приведена сравнительная оценка гемолитической активности ТИ-комплексов разного состава. ED50 ТГ - доза КД, вызывающая гемолиз 50% эритроцитов, ED50 МГДГ- доза МГДГ, вызывающая гемолиз 50% эритроцитов, ED50 ТИ-комплекса - доза ТИ-комплексов с различным составом компонентов кукумариозид-холестерин-МГДГ, вызывающая гемолиз 50% эритроцитов. КД - кукумариозид А-2, QA - сумма сапонинов Quillaja saponaria. ZM-, SP- - Zostera marina, Sargassum pallidum соответственно, как источники выделения МГДГ.
Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что гемолитическая активность индивидуального КД много выше суммы сапонинов Quillaja saponaria, однако при введении КД в состав ТИ-комплекса совместно с МГДГ токсичность падает в 50-70 раз. Наименьшую токсичность проявляет комплекс с весовым соотношением КД:ХОЛ:МГДГ 6:2:4. По сравнению с прототипом (комплексом с весовым соотношением компонентов 3:2:6) гемолитическая активность снижается почти в 2 раза.
Впервые обнаружено, что заявляемый ТИ-комплекс, полученный при соотношении КД:ХОЛ:МГДГ, равном 6:2:4, является наиболее оптимальным в отношении не только гомогенности и воспроизводимости результатов иммунизации, но и безопасности по сравнению с иными исследованными комплексами антигенов.
Для решения задачи оптимизации применения полученных ТИ-комплексов при иммунизации животных, обеспечивающей максимальную иммуногенность носителя антигенов при отсутствии осложнений после вакцинации, провели ряд экспериментов.
Изучена зависимость устойчивости ТИ-комплекса от его разбавления фосфатно-солевым буфером, а также проведены исследования по определению оптимального объема разбавленного носителя антигенов перед иммунизацией животных.
В прототипе для достижения необходимой концентрации вводимых веществ исходный ТИ-комплекс подвергался разбавлению в 60-75 раз фосфатно-солевым буфером перед иммунизацией животных.
Количество носителя антигена, в котором весовое соотношение КД:ХОЛ:МГДГ равно 3:2:6, составляло 1 мкг КД на 1 мышь, что соответствовало 75 кратному разбавлению исходного препарата комплекса с начальной концентрацией липидов 1 мг/мл и КД 0,375 мг/мл. При этом комплекс вводился животным в 200 мкл фосфатно-солевого буфера. Получаемые результаты имели широкий разброс и слабую воспроизводимость, что не допустимо в практической медицине.
Исследование устойчивости ТИ-комплекса при весовом соотношении КД:ХОЛ:МГДГ, равном 3:2:6, показало, что при его разбавлении фосфатно-солевым буфером происходит постепенное разрушение тубулярных наночастиц и увеличивается количество вещества, не входящего в состав тубул (фиг.6,7, снимки А-Г.). На фиг.6 (снимки А-Г) приведены негативно контрастированные образцы электронных микрофотографий липид-сапонинового комплекса КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением исходных компонентов 3:2:6 при различных разбавлениях фосфатно-солевым буфером:
А - исходный комплекс; масштабная линия соответствует 200 нм.
Б - разбавление в 5 раз; масштабная линия соответствует 200 нм.
В - разбавление в 10 раз; масштабная линия соответствует 200 нм.
Г - разбавление в 75 раз; масштабная линия соответствует 100 нм.
При разбавлении в 5 раз признаков разрушения структуры исходного комплекса не наблюдается (фиг.6, снимок Б). При разбавлении в 10 раз происходит малозаметное изменение структуры комплекса (фиг.6, снимок В), тогда как при разбавлении в 75 раз наблюдается практически полное его разрушение (фиг.6, снимок Г). Это, по-видимому, и является причиной низкой воспроизводимости результатов иммунизации при применении ТИ-комплекса, являющегося прототипом.
На фиг.7 приведены негативно контрастированные (снимки А, Б) и не окрашенные образцы (снимки В, Г) электронных микрофотографий липид-сапонинового комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением 6:2:4, разбавленных в 10 раз фосфатно-солевым буфером. Такое соотношение исходных компонентов ТИ-комплекса, как было отмечено выше, обеспечивает наиболее эффективное формирование трубчатых наночастиц, являющихся носителями антигенов, и исключает образование каких-либо других частиц. Снимки (А-Г) фиг.7 свидетельствуют о том, что разбавление исходного препарата в 10 раз не приводит к изменению структуры трубчатых наночастиц.
Из полученных данных следует, что с целью снижения разбавления исходного препарата и предотвращения его разрушения при введении животным липид-сапониновых ТИ-комплексов, следует использовать минимально возможные объемы исходного препарата. Это обеспечивает сохранение тубулярной структуры носителя антигена, отсутствие частиц, не имеющих характерной морфологии (МГДГ, холестерин и др.) и, следовательно, хорошую воспроизводимость результатов с их минимальным разбросом при иммунизации животных.
Дальнейшее снижение разбавления комплекса невозможно, так как технически сложно иммунизировать животных препаратами ТИ-комплексов, объем которых меньше 10 мкл.
Сравнение негативно контрастированных образцов электронных микрофотографий снимков (А,Б), представленных на фигуре 7, и снимка В (фиг.6) ТИ-комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением 3:2:6 при его разбавлении в 10 раз фосфатно-солевым буфером, свидетельствует о том, что для приготовления комплекса при иммунизации животных предпочтительней использовать комплекс с соотношением 6:2:4, чем комплекс с соотношением компонентов 3:2:6, так как количество тубулярных частиц в единице объема комплекса в первом случае много больше, чем во втором.
Приведенные данные исследований показывают, что оптимальное решение задачи применения исходного ТИ-комплекса с весовым соотношением компонентов КД:ХОЛ:МГДГ, равным 6:2:4, при иммунизации животных достигается при разбавлении носителя антигена в 10 раз фосфатно-солевым буфером (фиг.7, снимки А-Г); при этом объем препарата при иммунизации составляет 10 мкл на мышь.
Задача оптимизации способа применения полученного ТИ-комплекса при иммунизации животных, обеспечивающего его максимальную иммуногенность при отсутствии осложнений после вакцинации, решается также изменением формы вводимого в структуру ТИ-комплеса порина из Y.pseudotuberculosis. В качестве амфифильного мембранного антигена использованы термически обработанные мономерная и тримерная формы порина из наружной мембраны возбудителя псевдотуберкулеза Y.pseudotuberculosis. Этот белок обладает видовой специфичностью, иммуногенностью, отсутствием гемолитической активности и других видов токсичности.
Проведены исследования иммуногенной активности мономера и тримера порина из Y. pseudotuberculosis вне и в составе ТИ-комплекса.
Хорошо известно, что все антигены (вирусные или бактериальные) проявляют максимальный иммунологический эффект в составе микроорганизма, что связано, вероятно, с поддержанием определенной конформации белкового антигена, оптимальной для проявления антигенных свойств. Выделение и перенесение антигена в состав любого другого носителя требует изучения влияния последнего на его активность.
Способ получения порин-содержащих ТИ-комплексов включает получение липидного комплекса из КД, холестерина и МГДГ, взятых в весовом соотношении 6:2:4, с последующим добавлением поринового белка в необходимой концентрации (пример 6, фиг.8, снимки А-Г). Сначала смешивают растворы холестерина и МГДГ в хлороформе при весовом соотношении холестерина и МГДГ 2:4, упаривают под вакуумом до удаления хлороформа и добавляют 6 весовых частей 0,4 процентного водного раствора КД, смесь солюбилизируют, после чего доводят суммарную концентрацию липидов (холестерина и МГДГ) до 2 мг в 1 мл суспензии фосфатно-солевым буфером при рН 7,2. К полученному ТИ-комплексу добавляют порин, который вводят в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,2) в дозах, соответствующих 0,1 мкг белка на 1 мкг содержания КД, а именно 75 мкг на 1 мл полученной смеси. Полученную суспензию озвучивают ультразвуковым дезинтегратором в течение 5 минут и оставляют на 2 часа. Амфифильные мембранные антигены, подобные пориновому белку из Y. pseudotuberculosis, включаются самопроизвольно в ТИ-комплекс.
Полученный препарат представляет собой водную суспензию порин-липид-сапонинового комплекса, стабильную при температуре (-4°С) более трех месяцев. Подлинность препарата определяется качественным и количественным составом исходных компонентов (КД, холестерина и МГДГ).
Для оценки связывания порина с ТИ-комплексом проводят ультрацентрифугирование при 540000×g в течение 45 минут. Содержание несвязанного белка определяют в надосадочной жидкости методом Лоури; обнаружено, что количество белка, включенного в ТИ-комплекс составляет не менее 98%.
Полученый порин-содержащий ТИ-комплекс, разводят в 10 раз фосфатно-солевым буфером, после чего он готов для иммунизации.
При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что при взаимодействии порина с ТИ-комплексом образуется комплексный препарат порина, инкорпорированный в структуру матрицы ТИ-комплекса; при этом морфологическая структура ТИ-комплекса не нарушается даже при разведении буферным раствором в 10 раз (фиг.8, снимки А-Г).
Для оценки иммунологического эффекта действия мономерной и тримерной форм порина в составе ТИ-комплекса, определяют содержание антипориновых антител в сыворотке крови мышей. Проведены исследования для определения содержания антипориновых антител в сыворотке крови мышей при двукратной иммунизации чистым порином (тримерная и мономерная формы) и порином в составе ТИ-комплексов в дозе 0,1 мкг/мышь через 14 суток после первой иммунизации. В экспериментах использован подкожный способ введения препаратов.
На фиг.9 представлены результаты исследования содержания антипориновых антител в сыворотке крови мышей при двукратной иммунизации чистым порином (тримерная и мономерная формы) и порином в составе ТИ-комплексов в дозе 0,1 мкг/мышь через 14 суток после первой иммунизации. По оси ординат - показатели содержания специфических антипориновых антител, определенные методом иммуноферментного анализа и выраженные в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм (разведение сыворотки крови 1/100). По оси абсцисс -экспериментальные группы животных. Обозначения: ТП - тример порина, МП - мономер порина денатурированный, ТП+ТИ (ульва) - тример порина, инкорпорированный в ТИ-комплекс, содержащий МГДГ из Ulva fenestrate; МП+ТИ (ульва) - мономер порина, инкорпорированный в ТИ-комплекс, содержащий МГДГ из Ulva fenestrate. Исследования подтверждают, что иммунологическая активность тримера порина, то есть именно той формы, в которой этот белок функционирует в бактерии, в 2 раза выше, чем у мономера и в индивидуальном виде и в составе ТИ-комплекса.
Впервые обнаружено, что при создании вакцин нового поколения на основе ТИ-комплексов следует использовать антигены, максимально приближенные к их нативному состоянию.
Возможность осуществления заявляемых изобретений демонстрируется следующими примерами.
Пример 1. Приготовление препарата липид-сапонинового комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением (3:2:6).
5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа, 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, а 4 мг КД растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Автоматической пипеткой на 200 мкл отбирают 75 мкл раствора МГДГ и 25 мкл раствора холестерина, упаривают досуха в струе воздуха при температуре 60°С, к сухому остатку прибавляют 47 мкл раствора КД, в смесь добавляют 453 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2 автоматической пипеткой на 1000 мкл. Суспензию озвучивают 5 минут ультразвуковым дезинтегратором при 10% максимальной мощности в режиме «7» (0.7 с работа, 0.3 с перерыв). Конечная концентрация липидов составляет 1 мг в 1 мл суспензии. После обработки ультразвуком препарат оставляют при комнатной температуре на 2 часа.
Полученный препарат исследовали методом трансмиссионной электронной микроскопии; на фиг.1, снимки А-Г представлены электронно-микроскопические фотографии частиц суспензии, полученных по примеру 1.
Трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ) проводили на трансмиссионном электронном микроскопе LIBRA 120 при ускоряющем напряжении 120 KB. Для исследования каждого препарата липид-сапонинового комплекса использовали не окрашенные и негативно контрастированые фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК) образцы. Негативно контрастированные образцы исследовали методом энергетической фильтрации трансмиссионной электронной микроскопии (EFTEM) в пике нулевых энергетических потерь, что позволяет получать высококонтрастные изображения, детально характеризующие ультраструктуру присутствующих в суспензии частиц.
Для приготовления образцов использовали медные сетки 300-400 меш, покрытые формваровой пленкой-подложкой. Образцы готовили следующим образом: микрошприцем равномерно наносили на сетку 1-2 мкл липид-сапониновой суспензии, а затем высушивали ее в потоке теплого воздуха. Высушенную сетку трижды отмывали бидистиллированной водой по 3 мкл, наносили ее микрошприцем и оттягивали фильтровальной бумагой. Для получения неокрашенных образцов отмытые сетки высушивали в потоке теплого воздуха. Для получения негативно контрастированных образцов на отмытую сетку наносили микрошприцем 1 мкл 0,5% раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) рН 7,2 и окончательно высушивали в потоке теплого воздуха.
Негативно контрастированные образцы с длиной масштабной линии 200 и 100 нм (снимки А, Б) и не окрашенные образцы с длиной масштабной линии 200 и 100 нм (снимки В, Г). ТИ-комплекс, описанный в прототипе, с весовым соотношением компонентов КД:ХОЛ:МГДГ, равным 3:2:6, на негативно контрастированных образцах (фиг.1, снимки А, Б) показывает наличие типичных тубулярных частиц. На не окрашенных препаратах видно присутствие вещества, не входящего в состав тубулярных частиц, и представляющего, вероятно, избыток не включившегося липида МГДГ и холестерина (фиг.1, снимки В, Г).
Пример 2. Приготовление препарата липид-сапонинового комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением (1,5:2:6).
5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа, 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, а 4 мг КД растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Отбирают 75 мкл раствора МГДГ и 25 мкл раствора холестерина, упаривают досуха в струе воздуха при температуре 60°С, к сухому остатку прибавляют 94 мкл раствора КД, в смесь добавляют 406 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2. Далее - по примеру 1.
Снижение доли КД в составе ТИ-комплекса, полученного по примеру 2, в два раза приводит к резкому увеличению количества вещества, не входящего в состав тубулярных частиц, что хорошо видно на неокрашенных образцах (фиг.2, снимки В, Г). Собственно трубочки утонули в этом веществе. Тогда как на негативно контрастированных образцах обнаруживают большое количество типичных тубул (фиг.2, снимки А, Б).
Пример 3. Приготовление препарата липид-сапонинового комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением (6:2:6).
5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа, 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, а 4 мг КД растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Отбирают 66.6 мкл раствора МГДГ и 33.4 мкл раствора холестерина, упаривают досуха в струе воздуха при температуре 60°С, к сухому остатку прибавляют 125 мкл раствора КД, в смесь добавляют 375 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2. Далее - по примеру 1.
Повышение вдвое доли КД в липид-сапониновой системе КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением исходных компонентов 6:2:6 приводит к формированию более однородной системы, чем в ТИ-комплексе по примеру 1. На негативно контрастированных образцах видны типичные тубулярные частицы (фиг.3, снимки А, Б). На неокрашенных образцах обнаруживают небольшие количества вещества, не вошедшего в состав тубул (фиг.3, снимки В, Г).
Пример 4. Приготовление препарата липид-сапонинового комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением (6:2:4).
5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа, 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, а 4 мг КД растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Отбирают 84 мкл раствора МГДГ и 17 мкл раствора холестерина, упаривают досуха в струе воздуха при температуре +60°С, к сухому остатку прибавляют 62.5 мкл раствора КД, в смесь добавляют 437.5 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2. Далее - по примеру 1.
Обнаружено, что снижение доли липидов в составе ТИ-комплексов по сравнению с комплексами, полученными в примерах 1-3, приводит к формированию однородной системы, содержащей только тубулярные частицы и практически не содержащей постороннего вещества (фиг.4, снимки В, Г). На негативно контрастированных образцах видны тубулярные частицы типичного строения (фиг.4, снимки А, Б).
Пример 5. Приготовление препарата липид-сапонинового комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ с весовым соотношением (6:2:10).
5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа, 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, а 4 мг КД растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Отбирают 75 мкл раствора МГДГ и 25 мкл раствора холестерина, упаривают досуха в струе воздуха при температуре 60°С, к сухому остатку прибавляют 23 мкл раствора КД, в смесь добавляют 477 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2. Далее - по примеру 1.
Повышение доли липидов в липид-сапониновой системе в данном примере приводит к формированию ТИ-комплекса с хорошей тубулярной структурой (фиг.5, снимки А,Б), но одновременно возрастает количество вещества, не вошедшего в состав тубул (фиг.5, снимки В, Г) по сравнению с ТИ-комплексом, полученным по примеру 4.
Пример 6. Приготовление препарата комплекса, состоящего из 4 весовых частей МГДГ, 2 весовых частей холестерина, 6 весовых частей КД и 0.6 весовых частей тримера порина для иммунизации мышей.
5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа, 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, а 4 мг КД растворяют в 1 мл дистиллированной воды. 70 мкл раствора тримера порина из Yersinia pseudotuberculosis в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мг/мл, содержащий 0,125% октилгликозида, подвергают диализу в течение 12 часов против 10 мл чистого фосфатно-солевого буфера через целлофановую мембрану. Автоматической пипеткой на 200 мкл отбирают 66 мкл раствора МГДГ и 33 мкл раствора холестерина, упаривают досуха в струе воздуха при температуре 60°С, к сухому остатку прибавляют 125 мкл раствора КД, в смесь добавляют 375 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2 автоматической пипеткой на 1000 мкл. Суспензию озвучивают 5 минут ультразвуковым дезинтегратором при 10% максимальной мощности в режиме «7» (0.7 с работа, 0.3 с перерыв). Концентрация липидов в полученной суспензии составляет 1 мг в 1 мл суспензии. Немедленно после обработки ультразвуком автоматической пипеткой на 200 мкл отбирают 100 мкл полученной липид-сапониновой суспензии и соединяют с 10 мкл раствора порина, взятого с помощью автоматической пипетки на 20 мкл, смесь встряхивают на миксере Vortex в течение 1 минуты. После встряхивания препарат оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Непосредственно перед введением мышам к полученному препарату автоматической пипеткой на 1000 мкл прибавляют 890 мкл фосфатно-солевого буфера и перемешивают смесь 5-6 раз, переворачивая пробирку. Получают комплекс, в котором конечная концентрация липидов составляет 0,1 мг/мл, КД 0,1 мг/мл, порина 0,01 мг/мл. На фиг.8 (снимки А-Г) приведены данные электронно-микроскопических исследований полученного комплекса, подтверждающие, что морфологическая структура ТИ-комплекса не нарушается даже при 10-кратном разбавлении его буферным раствором.
Полученные экспериментальные данные подтверждают, что:
- заявляемый способ получения иммуностимулирующего комплекса нового состава позволяет формировать менее токсичные по сравнению с прототипом, однородные ТИ-комплексы без дополнительных включений;
- предлагаемый способ применения заявляемого иммуностимулирующего комплекса является наиболее оптимальным и пригодным для внедрения в практику иммунизации животных;
- использование заявляемого изобретения может найти применение в медицине и ветеринарии в качестве эффективного адъювантного носителя микробиальных антигенов в составе анти-инфекционных вакцин нового поколения.