ИССЛЕДОВАНИЕ МАРКЕРОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ

Исследование маркеров митохондриальной дисфункции мононуклеарных лейкоцитов крови у больных с хронической обструктивной болезнью легких

Э.С. Бельских, О.М. Урясьев, В.И. Звягина, С.В. Фалетрова, Н.А. Попко, С.Р. Ахмедова

Целью исследования было изучение показателей энергетического обмена и окислительного стресса моноядерных лейкоцитов как маркеров митохондриальной дисфункции у больных с неинфекционным обострением ХОБЛ. Установлено, что у больных с ХОБЛ в мононуклеарах периферической крови происходило нарушение функций митохондрий, что подтверждалось срывом антиоксидантной защиты, интенсификацией окислительной модификации белков и снижением активности сукцинатдегидрогеназы.

Ключевые слова: ХОБЛ, митохондриальная дисфункция, окислительная модификация белков, моно-нуклеарные лейкоциты.

Study of markers of mitochondrial dysfunction of mononuclear blood leukocytes in patients with chronic obstructive pulmonary disease

E.S. Belskikh, O.M. Uryas'ev, V.I. Zvyagina, S.V. Faletrova, N.A. Popko, S.R. Achmedova

Ryazan State Medical University, Vysokovol'tnaja, 9, 390026, Ryazan, Russian Federation

The aim of the study was to investigate the indicators of energy metabolism and oxidative stress of mononuclear leukocytes as markers of mitochondrial dysfunction in patients with non-infectious acute exacerbation of COPD. It was found that in patients with COPD in the mononuclear cells of peripheral blood, mitochondrial dysfunction occurred, which was confirmed by the breakdown of antioxidant protection, the intensification of the oxidative modification of proteins and a decrease in the activity of succinate dehydrogenase.

Keywords: COPD, mitochondrial dysfunction, oxidative modification of proteins, mononuclear leukocytes.

Введение

В настоящее время в патогенезе хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) активно изучается роль нарушения функционирования митохондрий [6, 9, 10]. Предполагается, что митохондриальная дисфункция тканей

легких связана с персистирующим воспалением дыхательных путей и может стать новой терапевтической целью у больных с ХОБЛ [7, 9, 10]. Для оценки выраженности митохондриальной дисфункции, обусловленной, например, дыхательной недостаточностью, может использоваться активность ферментов митохондриальной дыхательной

цепи и концентрация их субстратов [7, 11]. Под действием табачного дыма нарушения функций митохондрий развиваются в клетках различных тканей и органов, в том числе в клетках крови, что обуславливает системный характер заболевания [2]. При этом оценка выраженности нарушения функционирования митохондрий в мононуклеарных лейкоцитах крови более доступна по сравнению с исследованием клеток эпителия или гладкой мускулатуры стенки бронхов [6, 8, 12].

Целью данного пилотного исследования стало изучение показателей энергетического обмена и маркеров окислительного стресса моноядерных лейкоцитов для оценки митохондриальной дисфункции в лимфоцитах и моноцитах у больных с неинфекционным обострением ХОБЛ.

Материалы и методы

Проведение научной работы было одобрено ЛЭК РязГМУ (протокол от 07.10.2016 № 2). Критериями включения в группу больных ХОБЛ служили возраст от 40 до 75 лет, исходный постбронходилатационный модифицированный индекс Тиффно < 0,7. Критериями исключения для всех групп служили хирургические вмешательства на легких в анамнезе, злоупотребление алкоголем и наркотиками, пациенты с легочными заболеваниями, отличными от ХОБЛ, или имеющие значимые воспалительные заболевания, другие хронические заболевания внутренних органов в фазе декомпенсации, моноцитоз (> 11 %) в результатах общего анализа крови. В исследование было включено 47 мужчин-курильщиков в возрасте от 40 до 75 лет (медиана — 66 [61; 70] лет), которые были разделены на две группы. Первая группа служила контролем и включала 10 здоровых добровольцев, средний возраст которых составил 63 [56; 71] года. После определения функции внешнего дыхания (спирометр М1сгоЬаЬ, М1сгоМе^са1, Великобритания) 37 больных с ХОБЛ, госпитализированных по поводу неинфекционного обострения, были разделены на группы ХОБЛ 2 (группа 2, п = 17, 50 % < ОФВ1 < 80 %) и ХОБЛ 3 (группа 3, п = 20, 30 % < ОФВ1 < 50 %). Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту

(р1-2 = 0,84; р1-3 = 0,98, р2-3 = 0,62).

Мононуклеарные лейкоциты получали с помощью пробирок с разделительным гелем и фиколлом (BD Уас^атег СРТ, США) из венозной крови, которую забирали на второй день госпитализации утром до еды. Полученные клетки подвергали троекратной отмывке раствором 0,9 % NaC1 с центрифугированием при 3000 оборотах в минуту в течение 5 минут.

Выделенные мононуклеары ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды. В суспензии подсчитывали количество клеток с последующим добавлением детергента

(10 мкл Triton X-100) и заморозкой. После разморозки суспензию использовали для определения биохимических показателей с последующим пересчетом на 106 кл/мл суспензии.

В качестве показателя антиоксидантной защиты определяли активность супероксиддисмутазы (СОД) по методу Костюка В.А. [1]. Активность сукцинат-дегидрогеназы (СДГ), относящейся ко II комплексу дыхательной цепи митохондрий, определяли по реакции восстановления гексацианоферрата (III) калия [3]. С помощью набора Succinate Colorimetric Assay Kit (Sigma-Aldrich, США) изучали концентрацию янтарной кислоты, субстрата СДГ. Для оценки окислительной деструкции белков использовали метод, основанный на реакции взаимодействия карбонильных групп и аминогрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином в модификации Фоминой М.А., Абаленихиной Ю.В. Резервно-адаптационный потенциал окислительной модификации белков (РАП ОМБ) рассчитывался по формуле

5 МК ОМБ

где S СП ОМБ — площадь под кривой спектра поглощения спонтанно окисленно-модифицированных белков;

S МК ОМБ — площадь под кривой спектра поглощения белков окисленных с помощью реактива Фентона [4, 5].

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ StatP1us 6.0. Соответствие выборок нормальному распределению проверяли посредством критерия Шапиро-Уилка. Так как распределение в выборках носило характер, отличный от нормального, применялся критерий Манна-Уитни для попарного сравнения исследуемых групп, для множественных сравнений — критерий Краскела-Уоллиса. Статистически значимыми считали отличия при вероятности нулевой гипотезы об отсутствии различий р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

У больных с обострением ХОБЛ (таблица) в монону-клеарах по сравнению с показателями контрольной группы наблюдалось значительное увеличение содержания спонтанных окислительно модифицированных белков (в 2,94 раза, р = 0,0075), выраженное снижение активности СОД (в 3,3 раза, р = 0,000014) и СДГ(в 2,96 раза, р = 0,0088), уменьшение количества янтарной кислоты (в 1,93 рааз, р = 0,004). Исследование РАП ОМБ выявило снижение показателя у больных с ХОБЛ по сравнению с контрольной группой (в 2,84 раза, р = 0,0091).

Таблица

Биохимические показатели мононуклеарных лейкоцитов крови исследуемых групп

Исследуемый показатель Здоровые добровольцы

Активность СОД, у.е./ 106 клеток в 1 мл суспензии 66 [43; 67] (Р™ = 0,000014 Pl 2 = 0,003 р,.з = 0,006) 20 [16; 26] ¿,-ХОБЛ в 3'3 Р^ 19,5 [16,48; 25,49] |12 в 3,38 раза 20,85 [15,54; 26,96] |13 в 3,16 раза

Активность СДГ, нмоль сукцината/ мин* 106 клеток в 1 мл суспензии 77[67; 163] (PI-хобл ^ 0,0088 Р,.2 = 0,03 р1.з = 0,03) 26 [12; 43] ^1-ХОБЛ В 2'96 раза 16,88 [10,30; 40,54] |12 в 4,56 раза 30,67 [14,20; 43,20] |13 в 2,51 раза

Концентрация сукцината, нмоль на 106 клеток в1мл суспензии 559 [463;763] (Р,-ХОБЛ-0,004 Р12 = 0,013 Р1.3 = 0,01) 290 [237; 419] ¿,-ХОБЛ в !'93 Р33 273 [241; 446] в 2,05 раз 296 [381; 361] в 1,89 раз

8 СП ОМБ 51 [45; 62] (PI-ХОБЛ = 0,0075 Р12 = 0,018 Р,.3 = 0,017) 150 [70; 291] Т.-ХОБЛ82'94?333 124,65 [72,85; 206,25] |2_, в 2,44 раза 149,55 [65,80; 297,75] |3_, в 2,93 раза

8 МК ОМБ 167 [150; 189] 182 [99; 231] 232 [225; 239] 146 [87; 211]

РАП ОМБ, % 65,9 [64,51; 66,33] (Р™ = 0,0091) 23,2 [3,63; 33,6] ^1-ХОБЛ В 2'84 раза 46,7 [17,2; 67,64] Р2.3= 0,045 |12 в 1,4 раза 23,1 [0,9; 26,2] |13 в 2,9 раз |2 3 в 2,02 раза

Результаты представлены в форме: медиана [1-й квартиль; 3-й квартиль]; СОД — супероксиддисмутаза, СДГ — сукцинатдегидрогеназа; S — значение площади под кривой спектра светопоглощения, СП ОМБ — спонтанные окисленно модифицированные белки, МК ОМБ — металл-катализируемые окисленные производные белков, РАП — резервно-адаптационный потенциал окислительной модификации белков; п — количество больных в группе исследуемых.

Увеличение уровня окислительно поврежденных белков, вероятно, было связано повреждением мононуклеарных лейкоцитов вследствие срыва антиоксидантной защиты клеток, что подтверждалось снижением уровня активности СОД. Снижение концентрации янтарной кислоты и уменьшение активности СДГ, играющих важную роль в обеспечении адаптации митохондрий к гипоксии, указывало на нарушение процессов энергообмена и развитие митохондриальной дисфункции в моноцитах и лимфоцитах периферической крови у больных с обострением ХОБЛ.

При сравнении исследуемых показателей мононуклеаров крови больных групп ХОБЛ 2 и ХОБЛ 3 наблюдалось

статистически значимое уменьшение РАП ОМБ в группе ХОБЛ 3 по сравнению с ХОБЛ 2 = 0,0091), что,

возможно, указывало на более тяжелое течение заболевания.

Выводы

У больных с обострением ХОБЛ в мононуклеарах периферической крови наблюдается нарушение функций митохондрий, что подтверждается срывом антиоксидантной защиты и интенсификацией окислительной модификации белков. Выраженное снижение РАП ОМБ в мононуклеар-

ных лейкоцитах периферической крови больных с обострением тяжелой ХОБЛ создает предпосылки для нарушения их функциональной активности при обострении заболевания.

Исследование выполнено в рамках реализации вну-тривузовского гранта ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России № 2/17 «Исследование митохондриальной дисфункции лимфоцитов крови у больных хронической обструктивной болезнью легких как возможного предиктора тяжести заболевания».

Авторы выражают благодарность коллективу пульмонологического отделения ГБУ РО ОКБ г. Рязани за помощь в проведении исследования.

Литература

1. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопросы медицинской химии. — 1990. -и№ 2. — P. 88-91.

2. Ли Л. А., Лебедько О.А., Козлов В. К. Оценка дисфункции митохондрий при внебольничной пневмонии у детей // Дальневосточный медицинский

журнал. — 2015. — № 2. — P. 30-36.

3. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / под ред. М.И. Прохоровой. — Л.: Изд-во Ленинградского университета,

1982. — 327 с.

4. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Окислительная модификация белков тканей при изменении синтеза оксида азота. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. — 192 с.

5. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях: методические рекомендации // ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России. — Рязань: РИО РязГМУ, 2014. — 60 с.

6. Agrawal A., Mabalirajan U. Rejuvenating cellular respiration for optimizing respiratory function: targeting mitochondria // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2016; 310 (2): 103-113. DOI: 10.1152/ ajplung.00320.2015

7. Brand M.D., Nicholls D.G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells // Biochemical Journal. 2011; 437 (3): 297-312. DOI: 10.1042/BJ4370575u

8. Gayan-Ramirez G., Decramer M. Mechanisms of striated muscle dysfunction during acute exacerbations of COPD // Journal of Applied Physiology 2013; 114 (9): 1291-1299. DOI: 10.1152/japplphysi-ol.00847.2012

9. Hoffmann R.F., Zarrintan S., Brandenburg S.M. et al. Prolonged cigarette smoke exposure alters mitochondrial structure and function in airway epithelial cells // Respiratory Research. 2013; 14 (1): 97. DOI: 10.1186/1465-9921-14-97

10. Lerner C. A., Sundar I. K., Rahman I. Mitochon-drial redox system, dynamics, and dysfunction in lung inflammaging and COPD // International Journal of Biochemistry and Cell Biology 2016; 81: 294-306. DOI: 10.1016/j.biocel.2016.07.026

11. Lukyanova L. D., Kirova Y. I. Mitochondria-controlled signaling mechanisms of brain protection in hypoxia // Frontiers in Neuroscience 2015; 9: 320. DOI: 10.3389/fnins.2015.00320

12. Zinellu E., Zinellu A., Fois A.G. et al. Circulating biomarkers of oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease: a systematic review // Respiratory

Research 2016; 17 (1): 150. DOI: 10.1186/s12931-016-0471-z

Сведения об авторах

Бельских Эдуард Сергеевич — аспирант кафедры факультетской терапии, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России; 398000, г. Липецк, ул. Ибаррури, д. 6, кв. 74: +7 920 979 6846; E-mail: ed.bels@yandex.ru.

Урясьев Олег Михайлович — д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской терапии, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Звягина Валентина Ивановна — канд. биол. наук, доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО болезней, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Фалетрова Светлана Васильевна — ассистент кафедры факультетской терапии, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Попко Наталья Анатольевна — студентка 5 курса педиатрического факультета, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Ахмедова Сабина Руслановна — студентка 3 курса лечебного факультета, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.