БИОМАРКЕРЫ ТУБЕРКУЛЕЗА
TUBERCULOSIS BIOMARKERS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к детекции TB, в частности, TB у детей.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Детекция TB является проблемой, особенно у детей. Существующий золотой стандарт включает бактериологическую оценку. Однако получение образцов мокроты может быть затруднительным. Даже при успешном получении в образцах мокроты от детей можно наблюдать недостаток бацилл, что делает прямую детекцию в образце затруднительной или невозможной. В этих условиях необходимо осуществлять культивирование для увеличения небольшого количества бацилл в образце до детектируемых уровней. Это является затруднительным и затратным и требует специализированных лабораторных ресурсов, что является недостатком. Что более важно, в случае детей у культуры все равно отсутствует чувствительность. Кроме того, культивирование занимает приблизительно шесть недель, и это приводит к клинически значимой задержке в постановке диагноза, что представляет собой серьезную проблему в отношении исхода у пациента. Кроме того, особенно сложно получать образцы мокроты у детей, как практически, так и в отношении объема. Подвергание пациентов, особенно детей, теоретически выбранному лечению без точного диагноза накладывает серьезное бремя расходов, а также приводит к медицинским рискам и осложнениям, которые повлечет за собой эта стадия лечения.
Mycobacterium tuberculosis
M.tb.
Dhanasekaran et al 2013 (Genes and Immunity vol 14 pages 356-364) описывают идентификацию биомаркеров инфекции  () и заболевание у вакцинированных БЦЖ маленьких детей в Южной Индии. Описана комбинация 11 биомаркеров с лишь умеренной дискриминационной способностью. Не наблюдали различий в экспрессии цитокинов в нестимулированных супернатантах цельной крови (стр. 359-360).
В WO2014/020343 (Proteinlogic Ltd) описывают биомаркеры для диагностики и/или мониторинга туберкулеза. В нем описывают взрослых. TB детей упомянут лишь единожды, и возраст индивидуумов не указан. Единственный пример ограничен взрослыми.
Kumar et al 2013 (Clinical and Vaccine Immunology vol 20 pages 704-711) описывают циркулирующие биомаркеры легочного и внелегочного туберкулеза у детей. Описано, что TB у детей ассоциирован с повышенными уровнями TGF-бета, ИЛ-21 и ИЛ-23 в плазме. Описано, что не наблюдали значимых различий цитокинов, главным образом, интерферонов типа 17 и типа 1, или большинства цитокинов, ассоциированных с иммуномодуляцией.
Hur et al 2015 (Journal of Infection vol 70 pages 346-355) описывают дополнительные биомаркеры для улучшения диагностики туберкулеза и мониторинга терапевтических эффектов. Обсуждают VEGF. Не описывают TB у детей.
Serene et al 2012 (Biomarkers vol 17 pages 1-8) описывают биомаркеры хозяина, имеющие клиническую значимость, при туберкулезе: обзор исследований экспрессии генов и белков. Упомянуты ИЛ-6, ИЛ-22 и IP-10. Не описывают TB у детей.
Sutherland et al 2012 (PLoS ONE vol 7 epub: e30324) описывают высокоточную диагностику плеврального туберкулеза посредством иммунологического анализа плеврального выпота. Упомянуты ИЛ-6 и IP-10. Работа сфокусирована на взрослых. Работа сфокусирована на плевральной жидкости.
В WO2015/040377 (Medical Research Council) описывают биомаркеры туберкулеза. Упомянуты ИЛ-1ra, FGF и VEGF. Работа сфокусирована на взрослых. Работа сфокусирована на мокроте.
Mycobacterium tuberculosis
M.tb.
Современным золотым стандартом диагностики является прямая детекция инфекционного патогена  () в клиническом образце, таком как мокрота.
Дифференцирование активного туберкулеза (TB) и других инфекций дыхательных путей (OD) представляет собой основную проблему в лечении детей с предположительным интраторакальным TB.
Настоящее изобретение предназначено для решения проблем современного уровня техники.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Известные в этой области способы основаны на анализе мокроты или выделении и обработке (такой как стимуляции) лейкоцитов. В отличие от этого, детекция, предлагаемая авторами настоящего изобретения, основана на показателях, которые можно обнаружить непосредственно в образцах, взятых у пациента. В частности, детекция, предлагаемая авторами настоящего изобретения, основана на образце крови и прямой детекции маркеров, присутствующих в этом образце крови. Оно обладает преимуществом, состоящим в пригодности для разработки теста, осуществляемого в месте оказания медицинской помощи. Оно обладает преимуществом, состоящим в избегании манипуляций и стимуляций, являющихся частью способов, известных в этой области. В частности, изобретение преимущественно основано на использовании нестимулированного супернатанта крови.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способу диагностики TB у индивидуума, включающему:
(a) получение образца от указанного индивидуума, где указанный образец выбран из группы, состоящей из: крови, сыворотки и плазмы;
(b) определение в указанном образце концентраций следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10 и VEGF;
(c) преобразование концентрации каждого биомаркера, определенной на стадии (b), в децильное значение; и
(d) преобразование каждого децильного значения в бинарное наличие или отсутствие посредством сравнения децильных значений (c) со следующими конкретными квантильными пороговыми значениями:
Биомаркер
Конкретное квантильное пороговое значение
ИЛ-1ra
3
ИЛ-6
6
ИЛ-7
8
ИЛ-8
9
ИЛ-12p70
9
Основной FGF
3
IP-10
4
VEGF
9
где децильное значение, совпадающее с конкретным квантильным пороговым значением или превышающее его, преобразуют в бинарное наличие биомаркера и децильное значение ниже конкретного квантильного порогового значения преобразуют в бинарное отсутствие биомаркера;
где детекция наличия каждого из указанных биомаркеров свидетельствует о том, что индивидуум имеет TB.
Предпочтительно, стадия (c) преобразования каждой концентрации, определенной на стадии (b), в децильное значение включает стадии:
(ci) сравнения концентрации каждого биомаркера, определенной на стадии (b), с референсной плотностью распределения концентраций указанного биомаркера; и
(cii) считывания децильного значения из плотности распределения для концентрации указанного биомаркера.
Предпочтительно, стадия (c) преобразования каждой концентрации, определенной на стадии (b), в децильное значение включает стадии:
(ci) сравнения концентрации каждого биомаркера, определенного на стадии (b), для ядерной оценки плотности концентраций указанного биомаркера; и
(cii) считывание децильного значения из ядерной оценки плотности для концентрации указанного биомаркера.
Предпочтительно, референсную плотность распределения или ядерную оценку плотности получают посредством измерения концентрации биомаркера у ряда индивидуумов, например, минимум 100 индивидуумов, и компилирования этих измерений в плотности распределения/ядерной оценке плотности. Альтернативно, можно использовать плотности распределения (ядерные оценки плотности), представленные на фигурах 2-9 в настоящем описании. В этом варианте осуществления стадия (c) преобразования каждой концентрации, определенной на стадии (b), в децильное значение включает стадии:
(ci) сравнения концентрации каждого биомаркера, определенной на стадии (b), с соответствующей референсной плотностью распределения/ядерной оценкой плотности концентраций указанного биомаркера, выбранной из фигур 2-9; и
(cii) считывания децильного значения из плотности распределения/ядерной оценки плотности для концентрации указанного биомаркера.
Предпочтительно, определение концентрации каждого биомаркера включает:
(bi) детекцию посредством приведения образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, способным специфически связываться с биомаркером; и
(bii) количественный анализ указанного связывания.
Предпочтительно, определение концентрации каждого биомаркера включает детекцию мРНК биомаркера, где детекция мРНК включает:
(bi) приведение образца в контакт с зондами или праймерами нуклеиновых кислот, специфическими для биомаркера; и
(bii) количественный анализ указанных зондов или праймеров.
Предпочтительно, указанный зонд или праймер является неприродной последовательностью нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, указанный зонд или праймер является искусственной или сделанной человеком молекулы. Предпочтительно, указанный зонд или праймер выделяют и/или очищают. Предпочтительно, указанный зонд или праймер содержит одноцепочечную нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, указанный зонд или праймер содержит метку, присоединенную к нему. Предпочтительно, указанную метку присоединяют ковалентно. Предпочтительно, указанная метка может являться флуоресцентной или радиоактивной меткой или Qdot, нанокристаллом или наночастицей, наиболее предпочтительно - флуоресцентной меткой.
Предпочтительно, указанный образец является образцом сыворотки или плазмы.
Предпочтительно, указанная сыворотка или плазма, по существу, не содержит клетки.
Предпочтительно, возраст индивидуума составляет 16 лет или менее, предпочтительно - 15 лет или менее. Предпочтительно, возраст индивидуума составляет 2 года или более, предпочтительно - 5 лет или более. Предпочтительно, возраст индивидуума составляет от 5 до 15 лет.
В одном из вариантов осуществления, предпочтительно, указанный способ дополнительно включает определение в указанном образце концентрации биомаркера EC-стимулированного VEGF (конкретное квантильное пороговое значение 2).
В одном из аспектов изобретение относится к набору, содержащему реагенты для специфической детекции каждого из следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10 и VEGF.
В одном из аспектов изобретение относится к набору, содержащему реагенты для специфической детекции мРНК, кодирующей каждый из следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10 и VEGF.
Предпочтительно, каждый из указанных реагентов содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, scFv, Fv, rIgG и диатела.
В одном из аспектов изобретение относится к устройству, содержащему набор материалов, которые совместно способны специфически связываться со следующими биомаркерами: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основным FGF, IP-10 и VEGF, каждый материал в наборе способен специфически связываться с одним из указанных биомаркеров.
В одном из аспектов изобретение относится к устройству, содержащему набор материалов, с помощью которых можно определять мРНК, специфичную для каждого из следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10 и VEGF, с помощью каждого материала в наборе можно специфически определять одну из указанных мРНК.
Предпочтительно, указанное устройство является устройством для иммунохроматографического анализа.
В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения индивидуума, включающему осуществление способа, описанного выше, где, если определено, что индивидуум имеет TB, указанного индивидуума подвергают лечению по схеме 2HRZE/4HR (2 месяца HRZE, затем 4 месяца HR, где H=изониазид, R=рифампицин, Z=пиразинамид, E=этамбутол).
В одном из аспектов изобретение относится к применению HRZE, где H=изониазид, R=рифампицин, Z=пиразинамид, E=этамбутол, для лечения TB у индивидуума, где способ, описанный выше, осуществляют в отношении указанного индивидуума, где, если определено, что индивидуум имеет TB, то указанного индивидуума подвергают лечению HRZE в течение двух месяцев, а затем указанному индивидууму вводят HR в течение четырех месяцев. Предпочтительно, выбирают схему лечения указанного индивидуума с введением по меньшей мере три раза в неделю в течение первых двух месяцев, предпочтительно, выбирают схему лечения указанного индивидуума с ежедневным введением в течение первых двух месяцев.
В одном из аспектов изобретение относится к таблеткам H 75 мг+R 150 мг+Z 400 мг+E 275 мг для лечения TB у индивидуума, где способ, описанный выше, осуществляют в отношении указанного индивидуума, где если определено, что индивидуум имеет TB, то указанного индивидуума подвергают лечению HRZE в течение двух месяцев, а затем вводят 3 таблетки H 75 мг+1,5 таблетки R 150 мг в течение четырех месяцев.
В одном из аспектов изобретение относится к способу выбора схемы лечения, включающему
осуществление способа, описанного выше, где если определено, что индивидуум имеет TB, то выбирают схему лечения 2HRZE/4HR (2 месяца HRZE, затем 4 месяца HR, где H=изониазид, R=рифампицин, Z=пиразинамид, E=этамбутол).
В одном из аспектов изобретение относится к применению комбинации материалов, каждый из которых распознает, специфически связывается или имеет аффинность к одному из следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основному FGF, IP-10 и VEGF, где указанная комбинация включает по меньшей мере один такой материал для каждого из указанных биомаркеров, для облегчения диагностики TB у индивидуума. Предпочтительно, указанный материал содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В одном из аспектов изобретение относится к применению комбинации материалов, каждый из которых распознает, специфически связывается или имеет аффинность к мРНК одного или нескольких из следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10 и VEGF, для облегчения диагностики TB у индивидуума. Предпочтительно, указанный материал содержит праймер или зонд нуклеиновой кислоты.
В одном из аспектов изобретение относится к устройству, включающему логический блок, сконфигурированный для осуществления способа, описанного выше.
В одном из аспектов изобретение относится к компьютерному программному продукту, который при выполнении на компьютере пригоден для осуществления стадий способа, описанных выше.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения описывают идентификацию новых биомаркеров носителя в случае TB у детей. Авторы настоящего изобретения предполагали, что можно идентифицировать уникальную биологическую сигнатуру заболевания TB у детей.
Mycobacterium tuberculosis
"TB" означает туберкулез, являющийся заболеванием, вызываемым бактерией (иногда обозначаемой как MTB).
В области TB существует проблема разработки простого диагностического теста. Тест должен быть надежным. Тест должен быть точным. Теоретически тест должен включать минимум инструментария/оборудования, особенно потому что TB зачастую является проблемой в развивающихся странах, где лаборатории могут быть немногочисленными и/или географически удаленными от пациентов, подвергаемых тестированию.
ОБРАЗЕЦ
Образец можно получать от индивидуума. Индивидуум, предпочтительно, является млекопитающим, наиболее предпочтительно - человеком.
in vitro
Предпочтительно, способы не включают конкретно получение образца. Предпочтительно, образец является образцом .
in vitro,
in vitro
Способы по изобретению, предпочтительно, осуществляют в отношении выделенного образца от индивидуума, подвергаемого исследованию. Таким образом, предпочтительно, способы являются способами, которые можно осуществлять в лабораторных условиях без необходимости присутствия индивидуума. Предпочтительно, способы осуществляют  т.е. предпочтительно способы являются способами. Предпочтительно, способы являются экстракорпоральными способами.
Предпочтительно, изобретение можно использовать в анализе нуклеиновых кислот. Предпочтительно, нуклеиновую кислоту получают из образца, полученного от интересующего индивидуума, например, посредством выделения нуклеиновой кислоты из лейкоцитов в образце. Предпочтительно, образец содержит нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, образец состоит из нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, нуклеиновая кислота содержит или является мРНК или кДНК, предпочтительно - мРНК.
Наиболее предпочтительно, изобретение можно использовать в анализе белковых биомаркеров. Наиболее предпочтительно, анализируют белки в образце.
in vitro
Предпочтительно, образец является образцом.
Предпочтительно, образец является экстракорпоральным образцом.
Предпочтительно, образец является кровью.
Предпочтительно, образец является супернатантом крови.
Предпочтительно, образец является сывороткой. Сыворотку можно получать в виде жидкости, полученной из образца крови, подвергнувшегося свертыванию.
Предпочтительно, образец является плазмой. Плазму можно получать в виде жидкости, полученной из образца крови, центрифугированного для осаждения присутствующих клеток крови. Альтернативно, плазму можно получать посредством фильтрации для удаления присутствующих клеток крови.
Предпочтительно, кровь или супернатант крови/сыворотка/плазма являются нестимулированными.
Преимуществом изобретения является то, что при анализе каждый измеряемый биомаркер преобразуют в бинарный выходной сигнал. Например, каждый исследуемый цитокиновый биомаркер преобразуют в бинарную точку данных "Да/Нет". В отличие от этого, для существующих способов, известных в этой области, необходимы количественные данные.
Преимуществом изобретения является то, что достигают диагностической точности на уровне, сравнимом с бактериологическим культивированием. Преимуществом изобретения является то, что нет задержек времени, сравнимых с задержками времени при бактериологическом культивировании.
В способах, известных в этой области, используют клетки, бактериальные клетки или выделенные клетки крови. Преимуществом изобретения является то, что нет необходимости культивировать и выделять клетки.
Преимуществом изобретения является то, что анализируют ответ носителя/сигнатуру носителя. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что предпринимаемые попытки создать анализ крови на TB сфокусированы на провокации или стимуляции иммунных клеток от индивидуума и исследовании ответа. Однако, по существу, при этом подходе всегда исследуют "вторичный ответ". Он является ответом, возникающим благодаря "памяти" иммунной системы, ранее уже сталкивавшейся с бактерией TB. Прежде всего, для этого необходима стимуляция образца бактериями или антигенами, что является трудоемким и дорогостоящим. Однако, что более важно, по существу, с помощью этого типа подходов можно анализировать только вторичный ответ. В отличие от этого, настоящее изобретение относится к оценке первичного ответа. Это особенно важно и применимо в случае детей, т.к. очевидно, что каждый отдельный пациент в какой-то момент своей жизни подвергается воздействию TB в первый раз. Если способ, такой как способ, известный в этой области, сфокусирован лишь на оценке вторичного ответа, то маловероятно, что с его помощью когда-либо можно будет определить ответ в первый раз, когда такой индивидуум подвергается воздействию TB. Преимуществом изобретения является то, что оценивают прямой первичный ответ.
Предпочтительно, образец является бесклеточным образцом. Предпочтительно, образец не содержит клетки.
Предпочтительно, клетки удаляют из образца крови посредством центрифугирования и получения супернатанта.
Клетки можно удалять из образца любым известным в этой области способом. Например, фильтрацией.
Основной причиной исключения клеток из анализа является то, что кровь является темно-красной из-за наличия эритроцитов. Как правило, стадия детекция, используемая для оценки наличия или отсутствия биомаркеров, является светочувствительной. Таким образом, предпочтительно, образец не содержит клетки во избежание ошибки из-за красного цвета крови. По существу, можно использовать любой подход, с помощью которого можно преодолевать наличие темно-красного цвета цельной крови. Предпочтительно, он может представлять собой лизис клеток. Более предпочтительно, клетки удаляют из крови до анализа. Предпочтительно, это осуществляют посредством центрифугирования. Предпочтительно, это можно осуществлять посредством фильтрации. Предпочтительно, это можно осуществлять посредством иммунохроматографии.
В некоторых условиях в способе по изобретению можно использовать образец цельной крови, например, при использовании иммунохроматографии. В этом случае, образец цельной крови помещают в устройство для иммунохроматографического анализа. Затем жидкий компонент, такой как плазма/сыворотка, мигрирует таким образом, что в момент оценки он является бесклеточным.
ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ДРУГИЕ УСТРОЙСТВА
Для иммунохроматографического анализа (LFA) необходима минимальная инфраструктура, и его используют для разработки дешевых и простых устройств для быстрой медицинской диагностики и скрининга, тестирования в месте оказания медицинской помощи или лабораторного использования. Анализ основан на детекции наличия конкретного аналита-мишени в образце для, главным образом, качественного и иногда количественного анализа. Распространенные области применения LFA включают домашний тест на беременность, мониторинг диабета и быструю диагностику ВИЧ или паразитарных и бактериальных инфекций.
Sajid M, Kawde A, Daud M. Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review. Journal of Saudi Chemical Society. 2014
Как описано в обзорных статьях (таких как ), типичная тест-полоска для LFA состоит из четырех частей:
⋅ Прокладки для нанесения образца:
Она является абсорбирующей прокладкой, сделанной из целлюлозы или стекловолокна, на которую наносят образец, и ее основной функцией является транспорт образца (например, крови), содержащего аналит, "дальше" к другой части тест-полоски для LFA. С помощью нее также можно предварительно обрабатывать образец, включая разделение на компоненты, такие как плазма, до его транспортировки.
⋅ Прокладки с конъюгатом:
она содержит иммобилизованное и меченое антитело, специфичное для аналита-мишени. Антитело конъюгировано с окрашенными частицами, такими как латексные частицы или частицы наноразмера, и конъюгат меченого антитела высвобождается после контакта без передвижения жидкого образца.
⋅ Нитроцеллюлозной или реакционной мембраны:
Эта мембрана делает возможным движение комплексов, образовавшихся в прокладке с конъюгатом под действием капиллярного эффекта. Мембрану дополнительно разделяют на тестовые и контрольные линии.
⋅ Адсорбирующей прокладки:
Эта прокладка действует как "сток" на конце тест-полоски, и она предназначена для дополнительного приближения образца к области реакции под действием капиллярного эффекта.
На фигуре 10 показан стандартный внешний вид устройства для иммунохроматографического анализа (Saied Assadollahi, Christiane Reininger, Roland Palkovits, Peter Pointl and Thomas Schalkhammer. 'From Lateral Flow Devices to a Novel Nano-Color Microfluidic Assay.' Sensors 2009(9);6084-6100; doi:10,3390/s90806084).
Иммунохроматографический анализ можно осуществлять в двух основных форматах, представляющих собой сэндвич-анализ и конкурентный анализ. LFA сэндвич-типа предназначен для детекции высокомолекулярных молекул включая белки со множеством антигенных участков (например, ВИЧ, hCG), в то время как конкурентные анализы предназначены для тестирования низкомолекулярных соединений с отдельными эпитопами. При LFA сэндвич-типа при положительном тестировании будут наблюдать окрашенные полосы на тестовой линии, в то время как при конкурентном LFA на тестовой линии будут наблюдать окрашенную полосу в случае отрицательных образцов.
Мультиплексный формат детекции
В клинической диагностике более высокая специфичность или точность прогнозирования в случае множества взаимозависящих аналитов, определяемых одновременно в одинаковых условиях, привела к разработке мультиплексного формата детекции LFA, используемого для детекции нескольких аналитов-мишеней (Panhotra BR, Hassan ZU, Joshi CS, Bahrani A. Visual detection of multiple viral amplicons by dipstick assay: its application in screening of blood donors a welcome tool for the limited resource settings. Journal of clinical microbiology. 2005 Dec;43(12):6218; ответ автора -9. PubMed PMID: 16333138. Pubmed Central PMCID: 1317223; Corstjens PL, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Wiesmeijer KC, Riuttamaki T, van Meijgaarden KE, et al. Lateral flow assay for simultaneous detection of cellular-and humoral immune responses. Clinical biochemistry. 2011 Oct;44(14-15):1241-6. PubMed PMID: 21763300. Pubmed Central PMCID: 3177995). В этом формате анализ осуществляют с помощью тест-полоски с количеством тестовых линий, равным количеству аналитов-мишеней, как описано для детекции четырех основных типов папилломавируса человека (HPV) (Xu Y, Liu Y, Wu Y, Xia X, Liao Y, Li Q. Fluorescent probe-based lateral flow assay for multiplex nucleic acid detection. Analytical chemistry. 2014 Jun 17;86(12):5611-4. PubMed PMID: 24892496).
На фигуре 11 показан мультиплексный формат детекции LFA (Ye Xu, Yinghua Liu, Yan Wu, Xiaohu Xia, Yiqun Liao and Qingge Li. 'Flourescent Probe-Based Lateral Flow Assay for multiplex Nucleic Acid Detection.' Anal Chem., 2014, 86(12), 5611-5614).
Клиническое применение
Иммунохроматографические анализы находят применение в клинической диагностике и как тесты для использования в месте оказания медицинской помощи посредством детекции клинических аналитов в плазме, сыворотке, моче и других клинических образцах. Очевидным примером являются наборы для домашнего теста на беременность. В случае туберкулеза (TB) тест на липоарабиноманнан (LAM) в моче является тестом LFA с низкой чувствительностью (52-59%), но высокой специфичностью (>94%) (Lawn SD, Dheda K, Kerkhoff AD, Peter JG, Dorman S, Boehme CC, et al. Determine TB-LAM lateral flow urine antigen assay for HIV-associated tuberculosis: recommendations on the design and reporting of clinical studies. BMC infectious diseases. 2013;13:407. PubMed PMID: 24004840. Pubmed Central PMCID: 3846798). Авторы настоящего изобретения недавно сообщали, что использование репортерной технологии флуоресцентных апконвертированных фосфоров (UCP) в комбинации с LFA для одновременной детекции IP-10 и CCL4 на одной тест-полоске обладает потенциалом для разработки теста на плевральный TB для использования в месте оказания медицинской помощи (Sutherland JS, Mendy JF, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Use of lateral flow assays to determine IP-10 and CCL4 levels in pleural effusions and whole blood for TB diagnosis. Tuberculosis (Edinb). 2015).
По результатам многоцентрового исследования, проведенного в Африке, сообщали о применимости низкотехнологичной и надежной платформы UCP-LFA в качестве удобного количественного анализа для детекции множества хемокинов в цельной крови (Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Multi-center evaluation of a user-friendly lateral flow assay to determine IP-10 and CCL4 levels in blood of TB and non-TB cases in Africa. Clinical biochemistry. 2015 Aug 15. PubMed PMID: 26285074).
Таким образом, изобретение относится к устройству, содержащему набор материалов, вместе способных связываться с каждым из следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основным FGF, IP-10 и VEGF, каждый материал в наборе способен связываться с одним из указанных биомаркеров, где указанное устройство является устройством для иммунохроматографического анализа. В этом варианте осуществления набор материалов, предпочтительно, содержит количество тестовых линий, равное количеству биомаркеров. Предпочтительно, каждая тестовая линия содержит материал, способный связываться с одним таким биомаркером. Предпочтительно, каждая тестовая линия содержит материал, способный связываться с другим таким биомаркером.
Альтернативно, если устройство содержит "чип" или "биочип", набор может включать пространственное расположение материалов, такое как решетка или другое определенное расположение, такое как геометрический узор.
Предпочтительно, каждый материал, способный связываться с одним из указанных биомаркеров, иммобилизуют в устройстве.
Предпочтительно, каждый материал, способный связываться с одним из указанных биомаркеров, модифицируют.
Предпочтительно, каждый материал, способный связываться с одним из указанных биомаркеров, метят. Предпочтительно, метку присоединяют ковалентно. Предпочтительно, метка является красителем.
2
Предпочтительно, каждый материал, способный связываться с одним из указанных биомаркеров, является другим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, где его антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')-фрагмента, scFv, Fv, rIgG и диатела.
in vitro
Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является не принадлежащим человеку антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются рекомбинантными, например, полученными посредством экспрессии  рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент очищают и/или выделяют.
Также можно использовать неантительные реагенты для детекции, например, белковых биомаркеров, как описано выше (например, для детекции в способах, в качестве материала в устройствах, в качестве реагентов в наборах или для другого применения по изобретению), например, частиц фагового дисплея, экспонирующих специфические связывающие пептиды, аффимеры, аптамеры, специфические белковые или пептидные последовательности, связывающие нуклеиновые кислоты, низкомолекулярные соединения с конкретными связывающими свойствами или другие такие специфичные партнеры по связыванию описываемых биомаркеров.
СИГНАТУРА
С помощью подходов, известных в этой области, идентифицируют чрезвычайно крупные сигнатуры, например, требующие анализов 50 или более отдельных биомаркеров. Преимуществом изобретения является то, что для сигнатуры необходим анализ всего 8 биомаркеров.
Предпринимавшиеся ранее попытки включали проточную цитометрию. Однако проточная цитометрия является чрезвычайно трудоемкой, дорогостоящей и не подходит для теста, осуществляемого у постели больного/в месте оказания медицинской помощи.
Подходы, известные в этой области, включают анализ транскриптома (т.е. мРНК). Однако, эти подходы, как правило, также включают оценку по меньшей мере 50 генов, что затруднительно.
В разделе с примерами представлены данные, подтверждающие AUC/специфичность/чувствительность способов по изобретению.
Что наиболее важно, представлены положительные и отрицательные прогностические значения. В области TB прогностические значения могут считаться даже более важными, чем чувствительность/специфичность способа. Преимуществом является то, что настоящее изобретение обеспечивает крайне надежные положительные и отрицательные прогностические значения. Более подробно это описано ниже в разделе "Прогностические значения/применение способа".
Авторы настоящего изобретения осуществили обширный и комплексный анализ, включающий множественный интеллектуальный выбор для получения сигнатуры из 8 биомаркеров. В частности, необходимо отметить, что эта конкретная сигнатура обладает особыми свойствами. Например, она значительно отличается от сигнатуры из 7 биомаркеров, которая является неподходящей. Анализ сигнатуры с попытками исключить какой-либо из 8 описанных биомаркеров привел к снижению специфичности на приблизительно 50% и/или снижению прогностического значения на приблизительно 25%. На этих фигурах четко проиллюстрировано, что идея о сигнатуре из 8 биомаркеров по изобретению не является итеративным или случайным выбором, но представляет клинически применимую информацию, что является новым этапом по сравнению с информацией, получаемой с использованием количества маркеров всего на один меньше. Неожиданно, что таким образом можно наблюдать такой резкий и выраженный эффект.
Предпочтительно, сигнатура содержит 8 биомаркеров.
Предпочтительно, биомаркеры приведены в таблице ниже.
РЕФЕРЕНСНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Предпочтительно, референсные последовательности интересующих биомаркеров являются такими, как приведено в следующей таблице:
Биомаркер
Регистрационный номер белка (UniProtKB)
Каноническая последовательность
Изоформы белка
Название гена
Регистрационный номер мРНК (публикация RefSeq 73)
ИЛ-1ra
P18510
P18510-1
P18510-2 P18510-3 P18510-4
<i>IL1RN</i>
NM_173841.2NM_000577.4NM_173842.2NM_173843.2
ИЛ-6
P05231
P05231-1
<i>ИЛ-6</i>
NM_000600.3
ИЛ-7
P13232
P13232-1
P13232-2P13232-3
<i>IL7</i>
NM_000880.1NM_001199886.1NM_001199887.1NM_001199888.1
ИЛ-8
P10145
P10145-1
P10145-2
<i>CXCL8</i>
NM_000584.3
ИЛ-12p70
P29460
P29460-1
<i>IL12B</i>
NM_002187.2
Основной FGF
P09038
P09038-4
P09038-1P09038-2P09038-3
<i>FGF2</i>
NM_002006.4
IP-10
P02778
P02778-1
<i>CXCL10</i>
NM_001565.3
VEGF
P15692
P15692-1
P15692-2P15692-3P15692-4P15692-5P15692-6P15692-8P15692-9P15692-10P15692-11P15692-12P15692-13P15692-14P15692-15P15692-16P15692-17P15692-18
<i>VEGFA</i>
NM_001025366.2NM_001025367.2NM_001025368.2NM_001025369.2NM_001025370.2NM_001033756.2NM_001171622.1NM_001171623.1NM_001171624.1NM_001171625.1NM_001171626.1NM_001171627.1NM_001171628.1NM_001171629.1NM_001171630.1NM_001204384.1NM_001204385.1NM_001287044.1NM_001317010.1NM_003376.5
Таким образом, последовательности включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Специалисту в этой области нужно лишь идентифицировать правильный ген/белок, используемый в анализе. Представленное руководство не предназначено для жесткого ограничения изобретения представленными конкретными примерами последовательностей. Известно, что последовательности генов (и, таким образом, белковые последовательности) варьируются от индивидуума к индивидууму, например, из-за аллельной изменчивости или мутаций. Представленная информация предназначена для помощи специалисту в практическом осуществлении изобретения посредством анализа правильного гена. В конечном итоге, по существу, анализируют продукт гена (такой как мРНК или, более предпочтительно, белок). Таким образом, минорные или минимальные аллельные или мутационные различия между индивидуумами не важны, важно то, что правильный ген (продукт гена) анализируют с использованием представленного руководства.
Предпочтительно, если используют название биомаркера, это означает соответствующую аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты из таблицы, представленной выше. В случае аминокислотных последовательностей предпочтительной является каноническая последовательность. В случае последовательностей нуклеиновой кислоты предпочтительной является самая последняя (например, с большим номером) последовательность нуклеиновой кислоты.
Следует понимать, что изобретение в равной степени можно использовать для детекции фрагментов, вариантов или мутантов этих биомаркеров. Предпочтительно, любые такие фрагменты, варианты или мутанты имеют по меньшей мере 80% идентичности последовательности по отношению к референсным последовательностям на всем протяжении указанных фрагментов, вариантов или мутантов, предпочтительно - 90%, предпочтительно - 95%, предпочтительно - 98% идентичности последовательности на всем протяжении указанных фрагментов, вариантов или мутантов.
ПУБЛИКАЦИЯ БАЗЫ ДАННЫХ
Последовательности, хранящиеся в базах данных, могут изменяться с течением времени. Предпочтительно, используют текущую версию баз данных последовательностей. Альтернативно, используют публикацию, действительную на дату подачи заявки.
Как известно специалисту в этой области, регистрационные номера могут представлять собой версии/датированные регистрационные номера. Цитируемые регистрационные номера для текущей записи в базе данных являются такими, как указано выше, но с опущением десятичной точки и любых последующих цифр, например, в случае VEGFa версия/датированный регистрационный номер представляет собой P15692-18; текущую запись получали с использованием P15692 и т.д.
GenBank является базой данных о генетических последовательностях NIH, аннотированной коллекцией всех общедоступных последовательностей ДНК (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA; Nucleic Acids Research, 2013 Jan;41(D1):D36-42), и представленные регистрационные номера относятся к ней, если не очевидно иное. Предпочтительно, публикация базы данных GenBank, на которую ссылаются, относится к публикации NCBI-GenBank 210.0 от 15 октября 2015 года.
UniProt (Universal Protein Resource) является всеобъемлющим каталогом информации о белках ('UniProt: a hub for protein information' Nucleic Acids Res. 43: D204-D212 (2015)). Во избежание сомнений, используют публикацию UniProt 2015_11.
Более подробно, используют публикацию 2015_11 (11-Nov-2015) базы данных UniProt (UniProtKB) консорциума UniProt, включающего European Bioinformatics Institute (EBI), SIB Swiss Institute of Bioinformatics и Protein Information Resource (PIR).
ЛЕЧЕНИЕ
Следует отметить, что лечение TB представляет собой минимум шестимесячную программу с использованием лекарственных средств. Она является дорогостоящей и может быть очень требовательной к пациенту. Дозы необходимо вводить регулярно, например, множество доз в неделю и, в идеале, ежедневно, что очень затруднительно для медицинского учреждения, а также пациента. Таким образом, в этой области проблемой является избежание ненадлежащего лечения пациентов, т.е. неправильного прописывания лекарственных средств от TB пациенту, фактически не имеющему TB. Настоящее изобретение помогает решить эту проблему, предоставляя надежный инструмент для диагностики (или для помощи в диагностике).
Если в контексте способа по изобретению решено, что индивидуум имеет TB, то лечащий врач должен прописывать лечение TB. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу лечения пациента, включающему определение того, имеет ли он TB, способами, представленными в настоящем описании, где, если пациента определяют как имеющего TB, то ему прописывают или, что более предпочтительно, проводят лечение TB. В другом варианте осуществления способы по изобретению используют для облегчения диагностики пациента, который, в строгом смысле, может не присутствовать на стадии диагностики (т.е. в этом варианте осуществления изобретение, в строгом смысле, не направлено на диагностику в целях излечения); затем лечащий врач может учитывать информацию, полученную с использованием изобретения, при диагностике и/или планировании лечения указанного индивидуума.
Таким образом, преимуществом изобретения является то, что можно избегать использования ненужных лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления тест по изобретению находит свое применение в качестве подтверждающего теста, а не исключающего теста. Другими словами, если способы по изобретению используют для определения того, имеет ли индивидуум TB, его определенно необходимо лечить от TB. Альтернативно, если используют способы по изобретению, и не определено, что индивидуум имеет TB, то полезным может быть дальнейшее исследование - предпочтительно, не "исключают", что индивидуум, вероятно, имеет TB, если способами по изобретению не определяют, что он имеет TB.
Что касается "подтверждающего" теста, способы по изобретению имеют свойства, сравнимые с золотым стандартом в этой области (бактериальная культура). Таким образом, преимуществом изобретения является то, что положительный результат при использовании способов по изобретению относится к очень высокому уровню достоверности того, что индивидуум имеет TB, и его необходимо лечить от TB.
Предпочтительно, лечение TB является таким, как рекомендует Всемирная Организация здравоохранения (ВОЗ). Периодически ВОЗ может улучшать свои руководства, предпочтительно, лечение осуществляют по руководствам, действительным на момент практического осуществления изобретения для лечения индивидуума. Более предпочтительно, это лечение осуществляют по руководствам, действительным на дату подачи настоящей заявки. Если необходимо какое-либо дополнительное руководство, наиболее предпочтительно, лечение осуществляют по руководствам, представленным в публикации ВОЗ "Guidelines for national programmes, fourth edition" 2010 года ISBN: 9789241547833 (например, http://www.who.int/tb/publications/9789241547833/en/). Таким образом, этот документ включен в настоящее описание в качестве ссылки, в частности, в качестве руководства для конкретной схемы лечения от TB.
Примеры лечения представлены ниже.
Предпочтительно, лечение TB включает стандартный 6-месячный курс из 4 противомикробных лекарственных средств, как рекомендовано ВОЗ.
Предпочтительно, лечение TB включает 6 месяцев введения рифампицина.
Предпочтительно, лечение TB включает шесть (6) месяцев введения конкретных противотуберкулезных лекарственных средств (изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола в течение первых 2 месяцев, а затем 4 месяца введения только изониазида и рифампицина).
Предпочтительно, пациентов с TB можно подвергать ежедневному лечению в ходе агрессивной фазы, а затем три раза в неделю в ходе фазы продолжения [2HRZE/4(HR)3]; предпочтительно, за каждой дозой следят напрямую. Альтернативно, можно использовать введение три раза в неделю на всем протяжении терапии [2(HRZE)3/4(HR)3] при условии, что за каждой дозой следят напрямую, и у пациента нет ВИЧ, или он не живет в условиях с преобладанием ВИЧ.
Предпочтительно, введение осуществляют не менее 3 раз в неделю. Предпочтительно, введение осуществляют 3 раза в неделю или более. Наиболее предпочтительно, введение осуществляют ежедневно.
Наиболее предпочтительно, частота введения для пациентов с TB является ежедневной на всем протяжении терапии [2HRZE/4HR].
Предпочтительно, если у пациента есть ВИЧ, или он живет в условиях с преобладанием ВИЧ, введение является ежедневным на всем протяжении терапии.
Краткое изложение руководства ВОЗ по лечению (публикация ВОЗ 2010 года "Guidelines for national programmes, fourth edition", стр. 5):
Таблица A. Стандартная схема и частота введения для новых пациентов с TB
Агрессивная фаза
Фаза продолжения
Комментарии
2 месяца HRZE<sup>a</sup>
4 месяца HR
2 месяца HRZE
4 месяца HRE
Применимо только в странах с высокими уровнями резистентности к изониазиду у новых пациентов с TB, и где не осуществляют тестирование на восприимчивость к изониазиду (или его результаты недоступны) перед началом фазы продолжения
a ВОЗ больше не рекомендует исключение этамбутола в течение агрессивной фазы лечения для пациентов с некавернозным легочным TB с отрицательным мазком мокроты или внелегочным заболеванием, о которых известно, что они являются ВИЧ-отрицательными
Частота введения
Комментарии
Агрессивная фаза
Фаза продолжения
Ежедневно
Ежедневно
Оптимально
Ежедневно
3 раза в неделю
Приемлемая альтернатива для любых новых пациентов с TB, получающих лечение под прямым наблюдением
3 раза в неделю
3 раза в неделю
Приемлемая альтернатива при условии, что пациент получает лечение под прямым наблюдением и не имеет ВИЧ, или не живет в условиях с преобладанием ВИЧ (см. главу 5)
Примечание
: Ежедневное (а не 3 раза в неделю) введение в ходе агрессивной фазы может помочь в профилактике приобретенной лекарственной резистентности у пациентов с TB, начинающих лечение с резистентностью к изониазиду (см. приложение 2)
Используемые сокращения:
H=изониазид,
R=рифампицин,
Z=пиразинамид,
E=этамбутол,
S=стрептомицин.
Описанное выше стандартное лечение, предпочтительно, не используют в случае TB с множественной лекарственной устойчивостью (MDR TB). Предпочтительно, тестирование на восприимчивость к лекарственным средствам осуществляют перед лечением в соответствии с руководствами ВОЗ. В случае лечения пациента с TB, лечение которого являлось неуспешным, или другого пациента с высокой вероятностью TB с множественной лекарственной устойчивостью (MDR-TB), предпочтительно, его необходимо начинать с эмпирической для MDR схемы лечения в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение используют в отношении "новых" TB, т.е. новых пациентов, тестируемых по изобретению.
Дальнейшее или дополнительное лечение может зависеть от любого поставленного диагноза, как правило, с использованием антибиотиков, если диагноз представляет собой бактериальную инфекцию дыхательных путей.
Введение можно осуществлять с помощью таблетки или инъекции, такой как внутримышечная инъекция. В случае схем HRZE/HR, предпочтительно, введение осуществляют с помощью таблетки.
Типичные таблетки содержат следующие дозы:
таблетки H 75 мг+R 150 мг+Z 400 мг+E 275 мг.
Индивидуумам вводят или прописывают количество таблеток в соответствии с их массой тела (и/или, при необходимости, любыми другими важными факторами) для достижения правильной дозы. Это количество может включать доли таблетки. Типичная доза для индивидуума с массой тела 30-39 кг представляет собой 2 таблетки H 75 мг+R 150 мг+Z 400 мг+E 275 мг ежедневно в течение первых 2 месяцев лечения, а затем 1,5 таблетки H 150 мг+R 150 мг в течение от 3 до 6 месяцев лечения. Определение точной дозы, например, на основе массы тела, осуществляет лечащий врач.
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Авторы настоящего изобретения рассматривали стандартные подходы для статистического анализа. Однако авторы настоящего изобретения имели представление о том, что стандартные модели регрессии, как правило, приводят к излишнему оптимизму. Это особенно верно, учитывая многомерность данных, возникающих из-за большого количества цитокиновых ковариат, некоторые из которых сильно коррелируют друг с другом. По различным причинам, авторы настоящего изобретения использовали другой подход и одновременно пытались уменьшить набор маркеров (т.е. снизить число неизвестных), одновременно используя штрафы на уменьшение при статистическом анализе. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что их аргументация заключалась в том, что если в сигнатуре оценивают два маркера, движущихся в одном направлении, то качественно одинаковую информацию получают из двух сравнимых источников. Это дает возможность убрать один из этих маркеров, таким образом, упрощая сигнатуру, не ухудшая качества получаемой информации. Из этого следует, что если в двух анализах получают информацию в двух разных направлениях, то с помощью этого можно получить дополнительную информацию для улучшения сигнатуры. Таким образом, авторы настоящего изобретения стремились удалить любые маркеры, которые можно посчитать статистически родственными друг другу, таким образом, получая улучшенную эмпирическую (уменьшенную) сигнатуру, все еще имеющую исключительные диагностические характеристики.
ВЫБОР МАРКЕРОВ
Авторы настоящего изобретения осуществляли объективный выбор маркеров. Известные в этой области подходы имели тенденцию к использованию подхода "случай-контроль". В кратком изложении, его можно охарактеризовать как фокусирование на TB как субъекте исследования, выбор здоровых пациентов, выбор пациентов, имеющих TB, и сравнение здоровых пациентов с пациентами с TB. В отличие от этого, авторы настоящего изобретения планировали исследование "случай-контроль" с проспективной когортой (т.е. когортное исследование "случай-контроль"). Они выбирали когорту детей с использованием одного и того же способа выбора для идентификации детей в различных географических областях. Только затем они идентифицировали в этих когортах пациентов, имеющих TB, и пациентов, не имеющих TB. Что более важно, авторы настоящего изобретения выбирали сравнение TB с OD (т.е. "другим респираторным заболеванием, но не TB"). Оно являлось ключевым клиническим решением для идентификации пациентов с TB по сравнению с пациентами с другими заболеваниями, не являющимися TB. Таким образом, в этой области можно считать проблемой дифференциацию пациентов с TB и пациентов с "другим заболеванием".
Другим недостатком известных в этой области исследований является то, что они, как правило, сфокусированы, на биомаркерах, таких как цитокины, описанные или ассоциированные с TB. В отличие от этого, авторы настоящего изобретения использовали полностью объективный подход и не выбирали биомаркеры по ассоциации TB. Они осуществляли слепой анализ и получали сигнатуру из 8 биомаркеров, не зная, что представляют собой эти отдельные биомаркеры. Только затем авторы настоящего изобретения анализировали особенности биомаркеров в их сигнатуре. Одним из примеров неожиданного результата этого подхода является рассмотрение ИФНγ. В этой области существует представление о том, что ИФНγ связан с TB. Фактически, в подходах, известных в этой области, ИФНγ и/или IP-10 пытаются использовать в качестве биомаркеров TB. Крайне удивительно, что сигнатура биомаркеров, приведенная в настоящем описании, не содержат ИФНγ.
M. tuberculosis
Quantiferon ("QFT", коммерчески доступный в Qiagen Inc.) представляет собой анализ высвобождения интерферона-гамма (ИФНγ), общеизвестный как IGRA, и он является современной альтернативой туберкулиновой кожной пробе (TST или пробе Манту). В целом, в QFT измеряют клеточно-опосредованный иммунный ответ (цитокины) к очень специфическим антигенам TB. Тест осуществляют, собирая цельную кровь (1 мл) в каждую из трех пробирок для сбора крови. Когда кровь инфицированного пациента при QFT стимулируют -специфическими антигенами, их T-клетки отвечают, секретируя цитокин, названный ИФНγ. Концентрацию ИФНγ в плазме определяют с использованием чувствительного ELISA.
M.tb
комбинацию
совместно
Таким образом, Quantiferon ("QFT") является коммерческим анализом, в котором измеряют ИФНγ после стимуляции крови антигенами, специфическими для . На современном уровне техники также исследовали некоторые анализы IP-10. Однако, хотя IP-10, по имеющимся сведениям, более надежен, чем ИФНγ (т.е. после стимуляции высвобождается на гораздо более высоком уровне), сам по себе он не может служить для различения между заболеванием TB и TB-сенсибилизацией, аналогично ИФНγ, что является проблемой в этой области. Предпочтительно, в настоящем изобретении, где описывают  маркеров, используемых , а не по отдельности, можно отличать TB от OD. Это основано на представлении авторов настоящего изобретения о том, что, учитывая комплексность заболевания TB, комбинация маркеров, а не один маркер, имеет большую мощность и специфичность для различения TB и TB-сенсибилизации и/или другого заболевания.
Более подробно, авторы настоящего изобретения использовали необщепринятый подход, анализируя различные цитокины и хемокины и преобразуя значения каждого из них в децили. Начиная с 27 цитокинов/хемокинов в качестве кандидатов, каждый из них преобразовывали в 10 децилей, получая 270 для каждого стимулированного пациента и 270 для каждого нестимулированного пациента.
Это представляет собой категориальный (а не непрерывный) подход, который сам по себе является ключевой частью инновационного подхода. Этот подход ранее никогда не применяли к анализу цитокинов. Он обладает преимуществами, включающими устранение искажающего эффекта смещения или выбора используемых биомаркеров.
Панель из 27 исходных кандидатов не имела какой-либо ранее описанной ассоциации с TB. Например, они не являлись TB-специфическими. Главным образом, их можно рассматривать в качестве "иммунной панели". Они просто являются маркерами, связанными с лимфоцитами, как часть коммерческого набора, не представленного каким-либо образом на рынке или направленного на TB. В качестве иллюстрации того, насколько неожиданными являлись результаты, даже авторы настоящего изобретения не прогнозировали того, что будет найдено с использованием этого подхода.
В одном из вариантов осуществления анализ можно осуществлять следующим образом:
плотность распределения > 10 децилей > каждый из них делают бинарной квантилью.
В одном из вариантов осуществления можно осуществлять следующим образом:
плотность распределения > децили > 10 - квантили равного размера > использование каждой квантили в качестве порогового значения для получения бинарной переменной.
Следует отметить, что каждый цитокин может находиться в разном диапазоне концентраций таким образом, что каждая из децилей может отличаться между отдельными биомаркерами. Однако, распределение каждого отдельного биомаркера, предпочтительно, разделяют на 10 децилей (т.е. 10 квантилей равного размера) в соответствии со своим собственным диапазоном концентраций, когда он присутствует; затем значение каждого биомаркера, определенного для пациента, преобразуют в дециль из этой плотности распределения.
Следует отметить, что настоящее изобретение направлено на достижение клинического решения о том, имеет ли индивидуум TB или OD.
Изобретение можно использовать в качестве инструмента для скрининга, такого как скрининг популяции.
Преимуществом изобретения является то, что оно полезно при принятии клинического решения о том, имеет ли пациент TB или OD.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕЦИЛЕЙ
Децили получают стандартными способами статистического анализа. Получение децилей является математическим частотным подходом, который можно осуществлять с помощью любого статистического программного обеспечения. Конкретная переменная (например, измеренный цитокин) с количественными значениями при измерении у нескольких индивидуумов, будут иметь плотность распределения, которую затем используют для получения децилей, состоящих из 10 квантилей равного размера.
В случае если потребуется какое-либо дополнительное руководство, наиболее предпочтительно, децили получают, как описано в примерах ниже.
ИНДИВИДУУМЫ
Настоящее изобретение можно использовать по отношению к любому индивидууму, начиная с новорожденных.
Настоящее изобретение можно использовать по отношению к взрослым или детям.
Предпочтительно, возраст индивидуума составляет 18 лет или менее, предпочтительно - 16 лет или менее, предпочтительно - 15 лет или менее, предпочтительно - 7 лет или менее, предпочтительно - 6 лет или менее, предпочтительно - 5 лет или менее, предпочтительно - 2 года или менее.
Следует отметить, что у большинства иммунная система функционирует как "взрослая", начиная с возраста от 2 до 5 лет. Таким образом, предпочтительно, возраст индивидуума составляет по меньшей мере от 2 до 5 лет. Предпочтительно, возраст индивидуума составляет по меньшей мере 2 года. Предпочтительно, возраст индивидуум составляет по меньшей мере 3 года, предпочтительно - по меньшей мере 4 года, наиболее предпочтительно - по меньшей мере 5 лет.
Предпочтительно, индивидуум является ребенком.
Предпочтительно, возраст индивидуума составляет 16 лет или менее.
Предпочтительно, возраст индивидуума составляет 15 лет или менее.
Предпочтительно, возраст индивидуума составляет от 2 до 16 лет, предпочтительно - от 3 до 16, предпочтительно - от 4 до 16, предпочтительно - от 5 до 16 лет.
Предпочтительно, возраст индивидуума составляет от 2 до 15 лет, предпочтительно - от 3 до 15, предпочтительно - от 4 до 15, предпочтительно - от 5 до 15 лет.
Предпочтительно, у индивидуума, подлежащего тестированию, присутствует по меньшей мере один из следующих симптомов: кашель, потеря веса, потоотделение, опухание лимфоузлов и, необязательно, сепсис.
Настоящее изобретение можно использовать по отношению к интраторакальному TB.
Настоящее изобретение можно использовать по отношению к легочному TB.
Настоящее изобретение можно использовать по отношению к внелегочному TB.
Настоящее изобретение можно использовать по отношению к пациентам, не инфицированным ВИЧ.
Настоящее изобретение можно использовать по отношению к пациентам, инфицированным ВИЧ.
Следует отметить, что, т.к. способ основан на иммунном ответе, маловероятно, что любой индивидуум с количеством CD4 клеток 50 или меньше будет демонстрировать ответ. Таким образом, предпочтительно, индивидуум имеет количество CD4 клеток 51 или более. В качестве референса, нормальное количество CD4 клеток у здорового человека составляет приблизительно 1000.
ДЕТЕКЦИЯ
Предпочтительно, биомаркеры, представленные в настоящем описании, определяют походящими способами, известными в этой области. Например, биомаркеры можно определять с помощью одного или нескольких антител, специфически распознающих указанные биомаркеры.
2
Например, биомаркеры можно определять с помощью антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано выше, где его антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')-фрагмента, scFv, Fv, rIgG и диатела.
Способ оценки связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для детекции маркеров определяет технический специалист. В случае если потребуется какое-либо руководство, можно использовать ELISA для каждого из идентифицированных цитокинов, например, один ELISA для каждого биомаркера. Ниже представлены примеры подходящих реагентов ELISA.
ELISA для цитокинов, включенных в сигнатуру по изобретению, можно получать коммерческим путем из следующих компаний, при этом, при необходимости, указаны примеры названий продуктов/подробностями:
ELISA сэндвич-типа Quantikine от R&D Systems UK, 19 Barton Lane, Abingdon Science Park, Abingdon, OX14 3NB, United Kingdom (Tel +44 (0)800 37 34 15).
Human Platinum Elisa или ELISA высокой чувствительности от eBioscience, Ltd.(Ireland, United Kingdom), 2nd Floor, Titan Court, 3 Bishop Square, Hatfield, AL10 9NA, United Kingdom.
Наборы BD OptEIA от BD Biosciences, Edmund Halley Road, Oxford Science Park, Oxford, OX4 4DQ (Tel.: +44 1865 781 666; Fax: +44 1865 781 627).
Как будет понятно специалисту в этой области, отдельные ELISA для каждого цитокина могут быть трудоемкими, и/или для них потребуются большие объемы образцов. Таким образом, преимуществом является осуществление детекции в мультиплексном формате или в одном образце, если это возможно. Это дает преимущества, такие как малый объем (особенно важно для педиатрического тестирования, где желательны меньшие объемы крови/сыворотки) и комбинация цитокинов (меньше трудозатрат для осуществления тестирования).
Есть множество коммерческих поставщиков подходящих мультиплексных наборов, применимых для детекции биомаркеров из сигнатуры, например:
Панель магнитных частиц для анализа цитокинов/хемокинов человека MILLIPLEX MAP - иммунологический мультиплексный анализ, кат. №: HCYTOMAG-60K, доступный в Merck-Millipore, Suite 21, Building 6, Croxley Green Business Park, Watford, Hertfordshire WD18 8YH, United Kingdom.
Набор Human Luminex Performance Assay Base Kit, панель A [кат. № LUH000] от R&D Systems UK, 19 Barton Lane, Abingdon Science Park, Abingdon, OX14 3NB, United Kingdom (Tel: +44 (0) 800 37 34 15).
Панель 1 цитокинов/хемокинов/факторов роста человек (45-плексная), (кат. №: EPX450-12171-901) от eBioscience, Ltd., (Ireland, United Kingdom), 2nd Floor, Titan Court, 3 Bishop Square, Hatfield, AL10 9NA, United Kingdom.
Наиболее предпочтительно, используемые антитела могут быть такими, как в коммерчески доступном 27-плексном наборе цитокинов Th-1/Th-2 человека Bio-Rad (кат. № #M500KCAF0Y от Bio-Rad Laboratories Ltd., Bio-Rad House, Maxted Road, Hemel Hempstead, Hertfordshire, HP2 7DX, United Kingdom). Наиболее предпочтительно, детекцию цитокинов из сигнатуры по изобретению осуществляют с использованием этого набора.
Необходимо отметить, что преобладающее в этой области мнение состоит в том, что для анализа требуется стимуляция клеток. Стимуляцию можно осуществлять посредством презентации с использованием бактерий, или презентации с использованием антигена, или любой другой подходящей формы стимуляции. Однако, следует отметить, что все эти типы стимуляции направлены на анализ вторичных ответов. Преимуществом изобретения является то, что анализируют нестимулированные образцы. В частности, преимуществом является то, что образец получают из нестимулированной крови.
В частности, при исследовании ключевой панели из 8 биомаркеров, предпочтительно, в изобретении пренебрегают стадией стимуляции; предпочтительно, изобретение не включает стадию стимуляции; предпочтительно, изобретение исключает стадию стимуляции.
В некоторых вариантах осуществления можно использовать девятый или последующий маркер, для таких дополнительных маркеров, при необходимости, можно использовать стадию стимуляции.
Наиболее предпочтительно, в изобретении пренебрегают стадией стимуляции. Наиболее предпочтительно, изобретение не включает стадию стимуляции. Наиболее предпочтительно, изобретение исключает стадию стимуляции.
Детекция нуклеиновой кислоты
Например, биомаркеры можно определять в форме нуклеиновой кислоты, например, посредством детекции одной или нескольких мРНК, кодирующих биомаркеры.
Если желательно регистрировать/определять нуклеиновые кислоты с помощью микрочипов, см. Anderson et al 2014 (N Engl J Med. 2014 May 1;370(18):1712-23 'Diagnosis of childhood туберкулез и host РНК expression in Africa.' ILULU Consortium; KIDS TB Study Group.)
мРНК-технологии, предпочтительно, используют в лабораторных условиях.
В общих чертах, детекция мРНК может включать следующие стадии:
⋅ стабилизацию РНК можно осуществлять с использованием конкретного реагента,
⋅ выделение РНК,
⋅ транскрипцию в кДНК,
⋅ амплификацию,
⋅ использование чипа,
⋅ считывание данных.
Разумеется, специалисту в этой области будет понятно, что некоторые стадии являются необязательными или их можно комбинировать, например, стабилизация/выделение могут не потребоваться, если транскрипцию можно осуществлять непосредственно в образце. Например, использование чипа может не потребоваться, если амплифицированный материал анализируют напрямую.
Таким образом, по существу, необходимыми стадиями являются:
⋅ выделение нуклеиновой кислоты
⋅ анализ нуклеиновой кислоты для определения уровня экспрессии мРНК интересующих маркеров
⋅ считывание данных.
В случае мультиплексной детекции, предпочтительно, используют флуорогенный олигонуклеотидный зонд, специфический для гена-мишени/амплифицированной мишени. Зонды Taqman являются общеупотребительными для мультиплексного анализа, но их также можно использовать, если мультиплексный анализ не является необходимым. Протоколы указаны производителем, например, Applied Biosystems (5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, US).
Для флуорогенных зондов можно использовать различные красители; примеры, которые могут быть применимыми в зависимости от буферных условий и типа термоциклера, приведены в таблице ниже (таблица от Qiagen Inc):
* Спектры испускания могут варьироваться в зависимости от буферных условий.
Краситель
Максимум возбуждения (нм)
Максимум испускания (нм)*
Флуоресцеин
490
513
Oregon Green
492
517
FAM
494
518
SYBR Green I
494
521
TET
521
538
JOE
520
548
VIC
538
552
Yakima Yellow
526
552
HEX
535
553
Cy3
552
570
Bodipy TMR
544
574
NED
546
575
TAMRA
560
582
Cy3,5
588
604
ROX
587
607
Техасский красный
596
615
LightCycler Red 640 (LC640)
625
640
Bodipy 630/650
625
640
Alexa Fluor 647
650
666
Cy5
643
667
Alexa Fluor 660
663
690
Cy 5.5
683
707
Протоколы хорошо известны в этой области, например, использование систем для ПЦР в реальном времени StepOne и/или StepOne по инструкциям производителя (Applied Biosystems (5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, US).
Можно использовать другие анализы, если мультиплексный анализ не является желательным, например, после обратной транскрипции, используя красители, связывающиеся с двухцепочечной ДНК и становящиеся флуоресцентными. Например, можно использовать SYBR green 1 (Qiagen Inc./Qiagen Ltd. Skelton House, Lloyd Street North,Manchester M15 6SH, UK).
Можно создавать анализы с использованием праймеров и зондов, применимые в изобретении, или приобретать уже готовые, для интересующего гена-мишени т.е. биомаркеров по изобретению. Например, можно использовать протокол Applied Biosystems/ThermoFisher Scientific (5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, US) для SYBR green 1 по индивидуальному заказу ("Design and optimization of SYBR Green assays"), включая общедоступные инструменты для дизайна праймеров, обсуждаемые в этой статье. Таким образом, этот документ включен в настоящее описание в качестве ссылки конкретно для дизайна протоколов с праймерами/зондами и детекции нуклеиновых кислот.
В случае если потребуется какое-либо дополнительное руководство, см. примеры ниже.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КВАНТИЛЕЙ/ДЕЦИЛЕЙ
Предпочтительно, преобразование концентрации каждого определяемого биомаркера в децильное значение включает стадии:
(ci) сравнения концентрации каждого определяемого биомаркера с референсной плотностью распределения концентраций указанного биомаркера; и
(cii) считывания децильного значения из плотности распределения для концентрации указанного биомаркера.
"Плотность распределения" демонстрирует суммарное группирование данных, разделенных на взаимоисключающие классы, и число вхождений в класс. Таким образом, можно получать плотность распределения даже при использовании небольшого количества точек данных, такого как 30 (например, экзаменационные оценки 30 детей в классе). Чем больше используемое количество индивидуумов (т.е. точек данных), тем более репрезентативным будет распределение истинной совокупности, т.е. более нормальным будет распределение плотности распределения. Биологические переменные, например, масса, рост, артериальное давление, концентрация гемоглобина, электролиты в крови, измерения цитокинов и т.д., как правило, отклоняются. Таким образом, для получения кривой нормального распределения для таких биологических переменных с использованием нормальной гистограммы, например, потребуются очень большие количества точек данных, что может быть затруднительным. Таким образом, используют непараметрические способы, такие как ядерная оценка плотности, что представляет собой оценку плотности со сглаживанием данных. Это особенно полезно, когда авторы настоящего изобретения хотят представить распределение таких данных с использованием разумного размера выборки, например, 100 или более.
Таким образом, когда в настоящем описании упоминают "плотность распределения", предпочтительно, это может включать непараметрический эквивалент, такой как непараметрическая оценка плотности, такая как оценка плотности со сглаживанием данных, наиболее предпочтительно, ядерная оценка плотности.
Что касается фигур 2-9, оси Y соответствующим образом помечены как "плотность", т.к. они свидетельствуют о ядерной оценке плотности.
Более подробно, ядерная оценка плотности распределения является статистическим подходом со сглаживанием данных для демонстрации плотности распределения. В отличие от общепринятой "гистограммы", она является непараметрическим способом, что делает ее очень подходящей для типа данных, представленных в настоящем описании, которые, подобно большинству биологических данных, не следуют нормальному распределению Гаусса. Базовая гистограмма отражает частоту в виде количества или доли, и проблемы, связанные с гистограммами, включают то, что они не являются гладкими и зависят от ширины бинов (т.е. столбиков) и конечной точки бинов, которые можно выбирать произвольно. Однако ядерная оценка плотности устраняет зависимость от конечной точки бинов посредством отсутствия учета пропуска в интервале измерений цитокинов в определенном диапазоне, что позволяет достигать гладкой оценки плотности. Ось Y на фигурах 2-9 можно просто описать как: "вероятностная функция плотности каждого соответствующего маркера".
Предпочтительно, референсную плотность распределения (или ядерную оценку плотности) получают посредством измерения концентрации биомаркера у ряда индивидуумов, например, минимум 100 индивидуумов, и компилирования этих измерений в плотность распределения (или ядерную оценку плотности).
Альтернативно, можно использовать плотности распределения (ядерные оценки плотности), представленные на фигурах 2-9 в настоящем описании.
Предпочтительно, стадия (c) преобразования каждой концентрации, определенной на стадии (b), в децильное значение включает стадии:
(ci) сравнения концентрации каждого биомаркера, определенной на стадии (b), с соответствующей референсной плотностью распределения или ядерной оценкой плотности концентраций указанного биомаркера, выбранной из фигур 2-9; и
(cii) считывания децильного значения из плотности распределения или ядерной оценки плотности для концентрации указанного биомаркера.
В одном из вариантов осуществления децильные/квантильные пороговые значения можно повышать или заменять абсолютными пороговыми значениями, выраженными как абсолютные концентрации биомаркеров в образце. Примеры абсолютных пороговых значений представлены в таблице ниже:
Биомаркер
Конкретное квантильное пороговое значение
Диапазон концентраций для конкретной квантили (пг/мл)
Абсолютное пороговое значение концентрации т.е. ≥ XX (пг/мл)
ИЛ-1ra
3
76,0-99,5
76,0
ИЛ-6
6
759,0-1203,0
759,0
ИЛ-7
8
167,0-269,0
167,0
ИЛ-8
9
20196,0-25900,0
20196,0
ИЛ-12p70
9
596,0-776,0
596,0
Основной FGF
3
125,5-145,0
125,5
IP-10
4
3096,5-4537,0
3096,5
VEGF
9
3378,0-5381,0
3378,0
В одном из вариантов осуществления децильные/квантильные пороговые значения можно повышать или заменять диапазоном концентраций для конкретной интересующей квантили, выраженным как диапазон абсолютных концентраций биомаркеров в образце. Примеры диапазонов концентраций представлены в таблице выше.
ТЕСТИРОВАНИЕ В МЕСТЕ ОКАЗАНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
Во многих вариантах осуществления специалист в этой области может выбирать анализ концентраций маркеров в лаборатории или исследовательском центре.
Изобретение также можно применять в качестве теста в месте оказания медицинской помощи. Предпочтительно, изобретение также можно применять в качестве теста у постели больного.
Если изобретение является тестом в месте оказания медицинской помощи/у постели больного, предпочтительно, образец является кровью или плазмой. Если изобретение является тестом в месте оказания медицинской помощи/у постели больного, предпочтительно, маркеры анализируют в форме белков.
Если изобретение является тестом в месте оказания медицинской помощи/у постели больного, предпочтительно, детекция является иммунологической детекцией.
Если изобретение является тестом в месте оказания медицинской помощи/у постели больного, предпочтительно, тест осуществляют в формате иммунохроматографического анализа.
ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ ЗНАЧЕНИЯ/ПРИМЕНЕНИЕ СПОСОБА
В таблице ниже представлены дополнительные результаты в отношении прогностических значений биосигнатуры. Авторы настоящего изобретения представили и сравнили PPV и NPV биосигнатуры со способами, известными в этой области. Авторы настоящего изобретения дополнительно показали, что они имеют наглядные сравнимые свойства относительно золотого стандарта культивирования. Высокая специфичность и положительное прогностическое значение по изобретению позволяют изменять решения, касающиеся лечения. Это позволяет точно прописывать лекарственные средства для TB, определенного по изобретению. Это также позволяет избежать траты ресурсов при прописывании необязательных лекарственных средств. Это дополнительно демонстрирует применимость изобретения.
Диагностическая точность тестов относительно "составного референсного стандарта"
"Вся диагностика TB" как "составной референсный стандарт"
Чувствительность(%) (95%CI)
Специфичность (%) (95%CI)
PPV(%)(95%CI)
NPV(%)(95%CI)
Рентгенография грудной клетки (предшествующий уровень техники)
76(62-86)
34(26-43)
34(25-43)
76(62-87)
Клинический алгоритм (предшествующий уровень техники)
15(7-28)
99(95-100)
89(52-100)
73(65-79)
Культивирование (предшествующий уровень техники)
36(23-50)
100(97-100)
100(82-100)
78(71-84)
Биосигнатура (изобретение)
23
99
92
75
(12-36)
(95-100)
(64-100)
(67-81)
ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Ключевой набор из 8 биомаркеров предпочтительно анализировать в нестимулированных образцах. Однако в некоторых вариантах осуществления полезной может быть дополнительная оценка девятого или последующего маркера; предпочтительно, такой девятый или последующий маркер содержит стимулированный маркер, такой как EC-стимулированный VEGF. Предпочтительно, пороговое значение для EC-стимулированного VEGF представляет собой дециль 2. Во избежание сомнений, детали, касающиеся биомаркера "VEGF" в отношении EC-стимулированного VEGF, являются такими, как указано выше в ключевой панели из 8 биомаркеров по изобретению ("VEGF").
Способ облегчения диагностики TB у индивидуума, включающий:
(a) получение образца от указанного индивидуума, где указанный образец выбран из группы, состоящей из: крови, сыворотки и плазмы;
(b) определение в указанном образце концентрации следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10 и VEGF;
(c) преобразование концентрации каждого биомаркера, определенного на стадии (b), в децильное значение; и
(d) преобразование каждого децильного значения в бинарное наличие или отсутствие посредством сравнения децильных значений (c) со следующими конкретными квантильными пороговыми значениями:
Биомаркер
Конкретное квантильное пороговое значение
ИЛ-1ra
3
ИЛ-6
6
ИЛ-7
8
ИЛ-8
9
ИЛ-12p70
9
Основной FGF
3
IP-10
4
VEGF
9
где децильное значение, совпадающее с конкретным квантильным пороговым значением или превышающее его, преобразуют в бинарное наличие биомаркера и децильное значение ниже конкретного квантильного порогового значения преобразуют в бинарное отсутствие биомаркера;
где определение наличия каждого из указанных биомаркеров свидетельствует о повышенной вероятности того, что индивидуум имеет TB.
Способ дифференциации TB и OD у индивидуума, включающий:
осуществление стадий (a)-(d), указанных выше,
где определение наличия каждого из указанных биомаркеров свидетельствует о том, что индивидуум имеет TB.
Способ сбора информации, применимой в диагностике TB у индивидуума, включающий:
осуществление стадий (a)-(d), указанных выше,
где определение наличия каждого из указанных биомаркеров свидетельствует о том, что индивидуум имеет TB.
Способ диагностики TB у индивидуума, включающий:
осуществление стадий (a)-(d), указанных выше,
где определение наличия каждого из указанных биомаркеров обеспечивает диагностику того, что индивидуум имеет TB.
Способ выбора индивидуума для проведения лечения TB, включающий:
осуществление стадий (a)-(d), указанных выше,
где определение наличия каждого из указанных биомаркеров позволяет выбирать указанного индивидуума для проведения указанного лечения.
Способ, включающий стадии выбора индивидуума для проведения лечения TB посредством:
осуществления стадий (a)-(d), указанных выше,
где определение наличия каждого из указанных биомаркеров позволяет выбирать указанного индивидуума для проведения указанного лечения и проводить указанное лечение указанного индивидуума.
Способ лечения TB у индивидуума, включающий осуществление схемы лечения 2HRZE/4HR (2 месяца HRZE, затем 4 месяца HR, где H=изониазид, R=рифампицин, Z=пиразинамид, E=этамбутол) в отношении индивидуума, как определено, имеющего каждый из следующих биомаркеров: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10 и VEGF. Изобретение также относится к указанному способу, дополнительно включающему тестирование индивидуума перед стадией введения для определения того, что индивидуум имеет следующие биомаркеры: ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основной FGF, IP-10 и VEGF. Предпочтительно, тестирование осуществляют посредством осуществления стадий (a)-(d), указанных выше.
Поскольку описанные выше варианты осуществления изобретения реализуют, по меньшей мере, частично с использованием контролируемого программным обеспечением устройства для обработки данных, следует понимать, что компьютерную программу, обеспечивающую такой контроль посредством программного обеспечения, и носитель данных, на котором хранят компьютерную программу, рассматривают в качестве аспектов настоящего изобретения. Очевидно, что в нескольких способах по изобретению одна стадия (как правило, стадия (a)) включает получение образца от индивидуума, очевидно, что стадию, как правило, не будут осуществлять с использованием контролируемого программным обеспечением устройства для обработки данных; предпочтительно, стадию осуществляют вручную или пренебрегают ей в вариантах осуществления, осуществляемых с использованием контролируемого программным обеспечением устройства для обработки данных.
Таким образом, изобретение относится к устройству, такому как компьютер, содержащему логический блок, электронные схемы или код, сконфигурированный для осуществления способа, как описано выше.
Таким образом, изобретение относится к функциональному компьютерному программному продукту, выполняемому на компьютере, для осуществления способа, как описано выше.
Конкретные дополнительные и предпочтительные аспекты приведены в сопутствующих независимых и зависимых пунктах формулы изобретения. При необходимости, признаки зависимых пунктов формулы изобретения можно комбинировать с признаками независимых пунктов формулы изобретения, и в комбинациях, иных, чем конкретно указано в формуле изобретения.
Когда признаки устройства описывают как функциональные, следует понимать, что это включает признаки устройства, выполняющего эту функцию или адаптированного или сконфигурированного для выполнения этой функции.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Варианты осуществления настоящего изобретения далее будут описаны, в качестве примера, со ссылкой на сопутствующие чертежи, на которых:
На фигуре 1 показаны оптимальные модели LASSO с цитокиновыми ковариатами, скорректированными по возрасту и происхождению. Панели a, b, c: оптимальная модель LASSO, скорректированная по возрасту и происхождению, определяемая посредством 5-кратной перекрестной валидации в обучающей совокупности. Панели d, e, f: диаграмма "ящик с усами", на которой представлена вероятность заболевания TB у индивидуумов с бактериологически подтвержденным TB, клинически диагностированным TB и OD в обучающей совокупности, как спрогнозировано с помощью идентифицированной биосигнатуры. Панели g, h, i: AUC, свидетельствующая о дискриминирующей способности идентифицированной биосигнатуры для классификации подтвержденного TB и OD в независимой тестовой совокупности.
На фигуре 2 показана плотность распределения для ИЛ-1ra.
На фигуре 3 показана плотность распределения для ИЛ-6.
на фигуре 4 показана плотность распределения для ИЛ-7.
На фигуре 5 показана плотность распределения для ИЛ-8.
На фигуре 6 показана плотность распределения для ИЛ-12p70.
На фигуре 7 показана плотность распределения для основного FGF.
На фигуре 8 показана плотность распределения для IP-10.
На фигуре 9 показана плотность распределения для VEGF.
На фигуре 10 показано устройство для иммунохроматографического анализа.
На фигуре 11 показана мультиплексный формат детекции с помощью устройства для иммунохроматографического анализа.
ПРИМЕРЫ
Способы
Краткое описание когорт
Детей возрастом менее 15 лет, подвергнутых воздействию взрослой формы инфекционного TB в бытовых условиях, активно отслеживали и подвергали скринингу на симптомы, вызывающие подозрение на заболевание TB в соответствующих домовладениях. Затем детей с предположительным интраторакальным TB подвергали дальнейшей подробной оценке и исследованиям для установления их статуса TB. Всего в эксперименты по определению биосигнатуры с использованием иммуно-эпидемиологического подхода включали 173 детей с предположительным интраторакальным TB, проспективно набранных в Гамбии (n=150) и Великобритании (n=23).
Анализ стимуляции цельной крови(WBA)
M.tb
in vitro
M.tb
2
Что касается когорты из Гамбии, WBA проводили при включении в пределах 4 часов после венепункции. 100 мкл неразведенной гепаринизированной цельной крови инкубировали в двух параллелях с использованием антигенов слитого белка ESAT-6/CFP-10 (EC; конечная концентрация 10 мкг/мл; любезно предоставленного профессором Tom Ottenhoff, Leiden University Medical Center, The Netherlands) и положительного (PHA-L, Sigma Chemicals, UK; конечная концентрация 10 мкг/мл) и отрицательного (среда RPMI 1640; BioWittaker, Verviers, Belgium) контролей. После инкубации в течение ночи при 37°C и 5% CO собирали супернатант, дубликаты объединяли и хранили при -20°C перед анализом. В эту когорту добавляли образцы из эквивалентного исследования домохозяйств из Великобритании, осуществленного BK. Что касается когорты детей из Великобритании, авторы настоящего изобретения также получали соответствующие демографические и клинические данные и получали супернатанты из IGRA (теста Quantiferon-TB Gold In-Tube (QFT-G) (Cellestis, Australia). Аналогично анализу для внутреннего пользования, в этом коммерчески доступном анализе высвобождения ИФНγ  используют стимуляцию свежей цельной крови в трех отдельных пробирках, предпочтительно, содержащих антигены  (ESAT-6, CFP10 и TB7.7), положительные (фитогемагглютинин-L) и отрицательные (ничего) контроли. Эти образцы транспортировали в Гамбию в замороженном виде для объединенного анализа.
Супернатанты WBA от детей из Гамбии и супернатанты QFT от детей из Великобритании использовали для мультиплексного анализа цитокинов (MCA). MCA осуществляли в иммунологической лаборатории MRCTB в Гамбии, при этом образцы из Гамбии и Великобритании случайным образом распределяли по планшетам для мультиплексного анализа.
Мультиплексный анализ цитокинов (MCA)
Авторы настоящего изобретения осуществляли обширный анализ MCA посредством Luminex с использованием нестимулированных и EC-стимулированных супернатантов WBA от детей из Гамбии и супернатантов QFT (из пробирок QFT с антигеном и отрицательным контролем) от детей из Великобритании. Супернатанты культур анализировали с использованием 27-плексного набора для анализа цитокинов Th-1/Th-2 человека Bio-Rad по инструкциям производителя и как описано ранее [1]. Анализируемыми цитокинами являлись: ИЛ-1b, ИЛ-1ra, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12p70, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, эотаксин, основной FGF, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФНγ, ИЛ-10, MCP-1(MCAF), MIP-1a, MIP-1b, PDGF-bb, RANTES, ФНО и VEGF. После предварительного увлажнения фильтровального планшета 50 мкл суспензии частиц добавляли в каждую лунку и дважды промывали. Затем, предпочтительно, добавляли 50 мкл образцов и стандартов, тестируемых по отдельности и в двух параллелях, запаивали планшет, встряхивали в течение 30 секунд при 1100 об./мин, а затем инкубировали в течение одного часа при 300 об./мин. Планшет промывали трижды, добавляли 25 мкл заранее разведенного детекторного антитела и планшет встряхивали и инкубировали в течение 30 минут при 300 об./мин в темноте. После промывки 50 мкл 1-кратного стрептавидина-PE добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 10 минут со встряхиванием при 300 об./мин. Планшет снова промывали и суспендировали содержимое в 125 мкл буфера для анализа, запаивали, смешивали и незамедлительно анализировали с помощью анализатора Bio-plex с использованием программного обеспечения Bioplex manager (версии 4.0; Bio-Rad, USA) и низких настроек фотоэлектронного умножителя (PMT). Концентрации цитокинов ниже уровня детекции, обозначенного как "OOR" в программном обеспечении Bioplex, при анализе вычисляли как нуль.
Статистический анализ
Авторы настоящего изобретения анализировали данные, полученные при мультиплексном анализе цитокинов (MCA) с использованием нестимулированных и EC-стимулированных супернатантов цельной крови для идентификации специфичной для носителя мультицитокиновой биосигнатуры, ассоциированной с TB у детей. Для этих анализов нестимулированные и антиген-специфичные цитокиновые ответы при 27-плексном MCA анализировали в качестве отдельных переменных. Авторы настоящего изобретения распределяли исследуемых индивидуумов в обучающую совокупность (80% индивидуумов) и независимую тестовую совокупность(20%). Затем авторы настоящего изобретения использовали обобщенную линейную модель (GLM) с использованием штрафа в соответствии с оператором наименьшей абсолютной редукции и выбора (LASSO) для соответствия моделям логистической регрессии в обучающей совокупности с поправкой на возраст в годах и происхождение образца, исходно с бактериологически подтвержденным TB (золотой стандарт) по сравнению с респираторными заболеваниями, имитирующими TB, но не являющимися TB (группа OD) в качестве переменной бинарного исхода. В модели LASSO используют вероятность с максимальным штрафом по отношению к абсолютному размеру коэффициентов регрессии, редуцируя их в сторону нуля, т.е. используют штраф по норме L1 в отношении коэффициентов регрессии. Эта операция приводит к выбору переменной (некоторые коэффициенты регрессии равны нулю), и предварительные значения ненулевых коэффициентов регрессии редуцируются в сторону нуля. Эта методология подходит для данных о цитокинах, среди которых было много показателей, многие из которых могут сильно коррелировать.
Авторы настоящего изобретения аппроксимировали цитокиновые ковариаты в качестве категориальных и непрерывных переменных и их комбинации. Категориальные цитокиновые ковариаты конструировали с помощью разделения значений цитокинов на децили посредством разделения плотности распределения каждого значения цитокина на 10 квантилей равного размера, которые затем аппроксимировали в модели в качестве 10 бинарных переменных для каждого цитокина с использованием 10 квантилей в качестве порогового значения. Оптимальную модель LASSO определяли с использованием 5-кратной перекрестной валидации в обучающей совокупности, которую затем использовали для классификации бактериологически подтвержденного TB и OD в независимой тестовой совокупности, независимо от происхождения. Оптимальную модель определяли как модель с наивысшим параметром штрафа ('лямбда), что приводило к наименьшей ошибке прогнозирования и лучшей AUC при перекрестной валидации. Перекрестная валидация заменяет классический способ с поправкой на множественные сравнения. Кроме того, он естественным образом защищает от переобучения и является способом оценки того, как модель будет генерализовать независимый набор данных. Прогностические свойства оптимальной модели LASSO определяли посредством оценки прогностической вероятности в случае TB и площадей под кривыми зависимости чувствительности от частоты ложно положительных результатов (AUC).
Результаты
Всего 53 детям из комбинированной когорты ставили диагноз TB и начинали стандартное лечение TB; у 24 был бактериологически подтвержденный TB, и у 29 TB диагностировали с учетом клинических и рентгенографических признаков без положительных микробиологических тестов. Сто двадцати детям ставили диагноз OD и подвергали лечению. Более подробно, тридцать пять из 150 детей из Гамбии имели TB, включая 16 с бактериологически подтвержденным TB и 19 с клинически диагностированным TB, в то время как 115 имели OD. Из 23 детей из Великобритании 18 ставили диагноз TB (8 с подтвержденным TB и 10 с клинически диагностированным TB), в то время как 5 имели 5 OD. Никто из детей из Гамбии или Великобритании не был ВИЧ-инфицированным. В таблице 1 показано, что распределение исходных профилей детей из Гамбии и Великобритании было сравнимым.
Таблица 1: Демографический профиль детей по происхождению
Характеристики
Всего
Гамбия
Великобритания
N =173
N=150
N=23
Возраст:
Годы, Медиана(IQR)
6 (3-9)
6 (3-9)
7 (3-12)
<5 лет, n/N(%)
65/173 (38)
55/150 (37)
10/23 (43)
Пол:
Мужской, n/N (%)
88 (51)
76 (51)
12 (52)
ВИЧ:
Положительный, n/N(%)
0
0
0
Шрам от БЦЖ:
Присутствует, n/N (%)
117/164 (71)
99/141 (70)
18/23 (78)
TST:
≥10 мм,n/N(%)
98/171 (57)
82/149 (55)
16/22 (72)
IGRA:
Положительный, n/N(%)
120/173 (69)
103/150 (69)
17/23 (74)
Профиль продукции цитокинов и хемокинов при подтвержденном TB по сравнению с OD
Концентрации цитокинов и хемокинов, полученные при 27-плексном мультиплексном анализе цитокинов в нестимулированных супернатантах и EC-стимулированных супернатантах от детей с бактериологически подтвержденным TB, сравнивали с уровнями у детей с OD посредством многофакторного линейного регрессионного анализа с поправкой на возраст и происхождение. Значения в случае нестимулированных супернатантов и EC-специфические значения (т.е. значения для EC-стимулированных супернатантов минус значения для нестимулированногоотрицательного контроля) для каждого цитокина или хемокина анализировали как отдельные переменные.
Таблица 2. Разность средних для концентрации (пг/мл) 27 маркеров: подтвержденный TB по сравнению с OD
Аналиты
Значения для нестимулированных супернатантов (пг/мл)
ESAT-6/CFP-10-специфические значения(пг/мл)
Подтвержденный TB по сравнению с OD
Подтвержденный TB по сравнению с OD
Разность средних
95%CI
Значение PΩ
Разность средних
95%CI
Значение PΩ
ИЛ-1b
307,7
-961,8-1577,1
0,633
41,3
-4025,6-4108,3
0,984
ИЛ-1ra
118,2
13,4-222,9
0,027
336,9
-359,5-1033,4
0,340
ИЛ-2
43,9
-71,7-159,6
0,454
4995,1
1981,2-8009,0
0,001
ИЛ-4
58,8
-2,3-119,9
0,059
76,4
-52,4-205,2
0,243
ИЛ-5
36,8
-17,8-91,4
0,185
-39,9
-670,3-590,3
0,900
ИЛ-6
1289,8
-1193,7-773,3
0,306
-555,1
-4207,1-3097,0
0,764
ИЛ-7
181,8
90,0-273,6
0,000
-82,1
-140,9--23,3
0,007
ИЛ-8
2555,1
-388,3-5498,6
0,088
-1800,4
-5554,9-1954,1
0,345
ИЛ-9
81,6
-28,1-191,1
0,144
-61,9
-281,8-157,9
0,578
ИЛ-10
51,2
-140,7-243,2
0,598
28,1
-3357,7-3413,9
0,987
ИЛ-12p70
153,5
43,0-263,9
0,007
7,1
-158,9-173,0
0,933
ИЛ-13
129,1
26,7-231,6
0,014
728,2
-331,4-1787,8
0,176
ИЛ-15
1258,5
468,4-2048,6
0,002
-237,7
-928,7-453,3
0,498
ИЛ-17
116,3
11,9-220,7
0,029
122,6
-20,3-265,5
0,092
Эотаксин
214,2
75,5-352,9
0,003
13,4
-138,5-165,2
0,862
Основной FGF
114,9
13,6-216,1
0,026
65,5
-59,7-190,8
0,303
Г-КСФ
222,9
51,3-394,6
0,011
1009,0
-793,6-2811,6
0,270
ГМ-КСФ
41,4
-185,6-268,4
0,719
236,1
-81,0-553,2
0,143
ИФНγ
81,4
4,8-158,0
0,038
2148,9
-1144,4-5442,4
0,199
IP-10
4631,9
877,2-8386,7
0,016
-434,3
-4602,8-3734,2
0,837
MCP1-MCAF
4739,8
-314,5-9794,1
0,066
-3830,4
-9061,8-1400,9
0,150
MIP1a
2721,4
-337,5-5780,3
0,081
-939,9
-4887,5-3007,8
0,639
MIP1b
4400,8
364,0-8437,5
0,033
-3997,5
-8244,7-249,8
0,065
PDGF
326,1
-1053-1705,3
0,641
437,8
-575,8-1451,2
0,395
RANTES
-106,3
-1446,0-1233,4
0,876
273,5
-943,5-1490,6
0,657
ФНО
273,8
-1,7-549,3
0,051
-399,0
-4033,0-3234,9
0,828
VEGF
1977,7
1116,1-2839,2
0,000
-491,6
-1224,0-240,8
0,187
Ω
Скорректировано по возрасту в годах и происхождению
95%CI= 95% доверительный интервал для разности средних
Как показано в таблице 2, из 27 анализируемых цитокинов и хемокинов, концентрации ИЛ-1ra, ИЛ-7, ИЛ-12p70, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, эотаксина, основного FGF, Г-КСФ, ИФНγ, IP10, MIP1b и VEGF в нестимулированных супернатантах были значимо выше у детей с подтвержденным TB по сравнению с детьми с OD. Что касается EC-специфических концентраций всех аналитов, только ИЛ-2 и ИЛ-7 значимо отличались между группами. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаруживали, что концентрации в нестимулированных образцах были значимо выше в случае всех аналитов у детей ил Великобритании по сравнению с детьми из Гамбии, независимо от возраста или диагноза (значение p<0,001 для всех), за исключением значения ИЛ-7 в нестимулированных образцах, в случае которого не наблюдали значимых различий (данные не представлены). В отличие от этого, EC-специфические концентрации аналитов были значимо ниже у детей из Великобритании по сравнению с детьми из Гамбии, независимо от возраста и диагноза (значение p <0,001 для всех), за исключением EC-специфических концентраций ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-7, ИЛ-13, ИФНγ и RANTES, в случае которых не наблюдали значимых различий.
Идентификация специфичной для носителя биосигнатуры для диагностики TB у детей
Используя GLM со штрафом LASSO для аппроксимации бинарной логистической регрессионной модели с поправкой на возраст в годах и происхождение с 5-кратной перекрестной валидацией в обучающей совокупности, с помощью комбинации девяти категориальных цитокинов оптимально прогнозировали TB или OD со средней AUC при перекрестной валидации 0,82. Каждый из девяти цитокинов являлся бинарной переменной с пороговым значением.
Цитокины представляли собой (в скобках указано конкретное квантильное пороговое значение для каждого): нестимулированные ИЛ-1ra (3), ИЛ-6 (6), ИЛ-7 (8), ИЛ-8 (9), ИЛ-12p70 (9), основной FGF (3), IP-10 (4), VEGF (9) и EC-стимулированный VEGF (2). При использовании в отношении независимой тестовой совокупности эта модель позволяла надежно классифицировать подтвержденный TB и OD с AUC 0,91(95% CI 0,80-1,0), как графически представлено на фигуре 1.
Точность диагностики и дополнительное значение мультицитокиновой биосигнатуры
биосигнатуру 1
биосигнатуру 2
биосигнатура 1"
"биосигнатура 2"
"
Конкретные пороговые значения квантилей для каждого цитокина в биосигнатуре позволяли авторам настоящего изобретения преобразовывать биосигнатуру бинарный (положительный или отрицательный) тест. Авторы настоящего изобретения исследовали точность диагностики как две отдельные переменные, т.е. "" (комбинацию всех 9 идентифицированных цитокинов) и " (комбинацию только 8 цитокинов из нестимулированных супернатантов). Когда авторы настоящего изобретения сравнивали результаты для новых мультицитокиновых биосигнатур с точной классификацией заболевания(т.е. бактериологически подтвержденным TB (= подтвержденный TB), клинически диагностированным TB (= вероятный TB) другим респираторным заболеванием, но не TB (OD)), как определено ВОЗ [2], "являлась положительной в 8% случаев подтвержденного TB и 7% клинически диагностированного TB. Однако имела относительно более высокую чувствительность с положительным результатом в 21% и 24% случаев подтвержденного и клинически диагностированного TB, соответственно. Обе версии биосигнатуры были отрицательными у 119 из 120 случаев OD, приводя к очень высокой специфичности 99,2% (таблица 3).
Таблица 3: Свойства биосигнатур относительно точной классификации TB
Исправленные рекомендации ВОЗ по выявлению заболеваний TB*
Подтвержденный TB (N=24), n(%)
Клинически диагностированный TB (N=29), n(%)
OD (не TB) (N=120), n(%)
<i>"Биосигнатура 1"</i>+
2 (8)
2 (7)
1 (0,8)
<i>"Биосигнатура 1"</i>-
22 (92)
27 (93)
119 (99,2)
Подтвержденный TB (N=24), n(%)
Клинически диагностированный TB (N=29), n(%)
OD (не-TB) (N=120), n(%)
<i>"Биосигнатура 2"</i>+
5 (21)
7 (24)
1 (0,8)
<i>"Биосигнатура 2"</i>-
19 (79)
22 (76)
<b>119 (99,2)</b>
+=положительная;
-=отрицательная;
%= процентная доля, т.е.n/N
(*W.H.O. Definitions and reporting framework for Tuberculosis - версия 2013 года, Geneva, Switzerland. www.who.int/iris/bitstream/10665/79199/1/9789241505345_eng.pdf [доступно на 03 декабря 2014])
"биосигнатура 2"
биосигнатуры 2"
M.tb
"биосигнатуры 2"
"биосигнатура 2"
M.tb
M.tb
"биосигнатуры 2"
M.tb
"биосигнатуры 2"
биосигнатуры 2"
M.tb
"биосигнатуры 2"
При использовании составного референсного стандарта для всех детей с диагностированным активным TB , полученная лишь измаркеров в нестимулированных супернатантах, являлась положительной у 12 из всех 53 детей с диагностированным активным TB, приводя к чувствительности 23% (95% CI 12-36). Что касается отдельных тестов, чувствительность "была значимо выше, чем в случае микроскопии мазка (5,7%; значение p=0,020), но сравнимой с культивированием (35,9%; значение p=0,127). Комбинация и микроскопии мазка являлась положительной у 15 из 53 детей с активным TB, приводя к чувствительности 28,3%, что было значимо выше чувствительности микроскопии мазка в отдельности (5,7%; p<0,001). Аналогично, в комбинации с культивированием имела чувствительность 49,1%, что было значимо выше чувствительности культивирования в отдельности (35,9%; p<0,001). Чувствительность в комбинации с культивированием была значимо выше, чем в случае в комбинации с микроскопией (p<0,001), но была сравнимой с чувствительностью комбинации ", микроскопии и культивирования (p=0,320). Использованиев комбинации с этими диагностическими тестами не приводило к какому-либо изменению специфичности тестов.
Выводы
M.tb
Т.к. показано, что иммунные факторы организма-носителя, такие как ИФНγ, важны, но недостаточны для подтверждения или исключения TB [3, 4], целью настоящего исследования являлось изучение иных цитокинов, чем ИНФγ, которые могут помочь в дифференциации TB и OD у детей из Гамбии и Великобритании, т.к. различение этих двух клинических картин важно для начала правильной терапии. В предшествующих исследованиях определены другие цитокины, такие как ФНО, ИЛ-12 (p40), ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 и ИЛ-17, FGF и VEGF, которые, как обнаружено, важны при иммунном ответе против и/или в различении TB и OD [1, 5, 6].
M.tb
Авторы настоящего изобретения идентифицировали уникальную, квантиль-специфичную биосигнатуру из 9 цитокинов, посредством которой оптимально различают бактериологически подтвержденный TB и OD, независимо от возраста и происхождения детей. С помощью биосигнатуры также прогнозировали вероятность активного TB у детей с клинически диагностированным TB, сравнимую с бактериологически подтвержденным TB. В частности, авторы настоящего изобретения использовали скорректированную по возрасту и происхождению регрессионную модель LASSO для идентификации квантиль-специфической комбинации нестимулированного ИЛ-1ra, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-12p70, основного FGF, IP-10, VEGF и EC-стимулированного VEGF, с помощью которой оптимально различают бактериологически подтвержденный TB и OD с AUC 0,91 в независимой тестовой совокупности. Свойства этой биосигнатуры не зависели от сенсибилизации в группах с клиническим исходом, в то время как восемь из 9 цитокинов в биосигнатуре получали из нестимулированных супернатантов. Основным преимуществом настоящего исследования является проспективный подход, использованный в исключительно педиатрическом эпидемиологическом исследовании, при этом идентифицированная биосигнатура в использованной когорте содержит цитокины, о которых известно, что они ассоциированы с иммунитетом к TB.
M.tb
ex vivo
Авторы настоящего изобретения раздельно исследовали точность диагностики при использовании биосигнатуры из 8 цитокинов, содержащей только маркеры из нестимулированных супернатантов и полной биосигнатуры из 9 цитокинов посредством сравнения результатов с классификацией заболевания по рекомендациям ВОЗ и составным референсным стандартом у всех детей с диагностированным активным TB. Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что биосигнатура из 8 нестимулированных цитокинов имела относительно более высокую чувствительность, чем полная биосигнатура из 9 цитокинов, с помощью обеих версий биосигнатуры различали активный TB и OD с очень высокой специфичностью 99,2%. С помощью биосигнатуры из нестимулированных 8 цитокинов определяли сравнимое количество случаев TB среди всех детей с диагностированным TB в настоящем исследовании относительно культивирования  и демонстрировали существенное дополнительное значение при комбинировании с рутинными диагностическими тестами для TB. Он демонстрировал сравнимо более высокую специфичность, но меньшую чувствительность относительно шкалы риска на основе анализа транскриптов 51 гена в цельной крови, идентифицированных в международном исследовании маркеров TB у детей в Южной и Восточной Африке, а также комбинации трех маркеров ФНО, ИЛ-12 (p40) и ИЛ-17 в стимулированных антигеном супернатантах цельной крови у взрослых из Гамбии [1,7]. Однако, специфичность этой педиатрической биосигнатуры сравнима со специфичностью комбинации ИЛ-13, FGF и ИФНγ в образцах мокроты в другом исследовании взрослых из Гамбии, что приводило к на 96% правильной классификации последовательно включенных, подтвержденных посредством культивирования случаев TB и OD с чувствительностью 85% и специфичностью 96% [6].
M.tb,
Ряд факторов делает эту биосигнатуру из нестимулированных цитокинов особенно многообещающим подходом для использования в странах с высокими показателями TB. Во-первых, квантиль-специфические пороговые значения для каждого из цитокинов-компонентов означает, что показания легко можно преобразовывать в бинарный тест с положительным или отрицательным результатом, что делает их легче интерпретируемыми. Во-вторых, эта мультицитокиновая биосигнатура, полученная только из маркеров из нестимулированных супернатантов, обладала эпидемиологическими свойствами, схожими с культивированием по потенциально не вызывает такую же задержку или риск контаминации, как в случае культивирования. В-третьих, она обладает очевидным потенциалом для уменьшения предполагаемого лечения TB у детей в условиях первичной медицинской помощи в развивающихся странах, где диагностика TB, главным образом, основана на использовании микроскопии мазка, а также специализированных центрах с возможностями рентгенографии, использования Xpert и/или культивирования. Это является результатом существенного повышения количества детей, которых будут рассматривать в качестве имеющих активный TB при использовании в комбинации с рутинными диагностическими тестами. В-четвертых, эту мультицитокиновую биосигнатуру из нестимулированных цитокинов потенциально можно измерять напрямую в образцах сыворотки или плазмы без дополнительных затрат, обучения или инфраструктуры, необходимой для стимуляции антигеном и инкубации в лаборатории. Таким образом, биосигнатура из 8 цитокинов является наиболее предпочтительным вариантом осуществления изобретения.
Пример 2: Детекция на основе нуклеиновых кислот
В этом примере авторы настоящего изобретения описывают обработку образцов для иллюстрирования применения изобретения/генной сигнатуры для облегчения диагностики TB (такого как TB у детей) посредством детекции нуклеиновых кислот, такой как детекция РНК (мРНК).
1. Сбор образцов:
Образец крови собирают в пробирку, содержащую стабилизатор РНК, такую как пробирка PaxGene или пробирка Tempus.
Альтернативно, в образец добавляют тризол.
Такой образец можно хранить в холодильнике или морозильной камере до обработки.
При хранении в холодильнике время хранения исчисляется в днях, при хранении в морозильной камере время хранения может исчисляться месяцами.
2. Обработка образцов
В зависимости от пробирки для сбора и стабилизатора, выбирают подходящие коммерчески доступные наборы для выделения РНК и используют их по инструкциям производителя.
В этом примере используют наборы Qiagen, содержащие центрифужные колонки и промывочные буферы для выделения РНК.
Тотальную РНК, включающую микроРНК, выделяют этими известными способами.
3. Обратная транскрипция
Для получения ДНК, которую можно амплифицировать, при реакции транскрипции сначала необходимо преобразовать из мРНК в кДНК. Это осуществляют посредством добавления случайных праймеров для RT, dNTP, обратной транскриптазы и буферов для RT в подходящих количествах с последующей инкубацией с термоциклированием, как известно в этой области.
Таким образом, РНК обратно транскрибируют в ДНК.
4. Амплификация
Затем кДНК можно амплифицировать с использованием праймеров и/или зондов, специфичных для интересующих транскриптов биомаркеров, как описано выше, предпочтительно, вместе с праймерами и/или зондами, специфичными для референсных генов, в целях нормализации.
Для удобства в этом примере праймеры и/или зонды для каждого исследуемого цитокина, внутренних контролей и эндогенных контрольных генов добавляют с мастер-миксом вместе с матрицей кДНК и осуществляют реакции ПЦР в трех параллелях в одиночном или мультиплексном формате с использованием устройства для ПЦР в реальном времени.
Ссылки:
PloS one
1. Sutherland JS, deJong BC, Jeffries DJ, AdetifaIM, OtaMO. Production ofTNF- alpha,IL-12(p40) andIL-17 can discriminatebetween activeTB disease and latent infection in aWest African cohort.2010: 5(8): e12365.
2. W.H.O. Definitions and reporting framework forTuberculosis-версия 2013 года, Geneva, Switzerland. www.who.int/iris/bitstream/10665/79199/1/9789241505345_eng.pdf [доступно на 03 декабря 2014], 2013.
The Lancet infectious diseases
3. Kaufmann SH. Factandfiction in tuberculosis vaccineresearch: 10years later.2011: 11(8): 633-640.
The Journal of experimental medicine
4. Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA, Bloom BR. An essentialrole forinterferon gammain resistanceto Mycobacterium tuberculosis infection.1993: 178(6): 2249-2254.
CytokineGrowth Factor Rev
5. Algood HM, Chan J, Flynn JL. Chemokines and tuberculosis.2003: 14(6):467-477.
TheEuropean respiratoryjournal:official journal of theEuropean Societyfor Clinical RespiratoryPhysiology
6. OtaMO, MendyJF, DonkorS, Togun T, DaramyM, GomezMP, ChegouNN, Sillah AK, Owolabi O, Kampmann B, Walzl G, Sutherland JS.Rapid diagnosis oftuberculosis using ex vivo host biomarkers in sputum.2014: 44(1): 254-257.
TheNew England journal ofmedicine
7. Anderson ST, KaforouM, Brent AJ, Wright VJ,Banwell CM, ChagalukaG, Crampin AC, Dockrell HM, French N, Hamilton MS, Hibberd ML, Kern F,Langford PR, LingL, MlothaR, OttenhoffTH,PienaarS, PillayV, Scott JA, TwahirH, Wilkinson RJ,Coin LJ, Heyderman RS,Levin M, EleyB. Diagnosis ofchildhood tuberculosis and host RNA expression in Africa.2014: 370(18):1712-1723.
Список последовательностей
>sp|P05231|ИЛ-6_Интерлейкин-6 человека OS=Homo sapiens GN=ИЛ-6 PE=1 SV=1
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
>sp|P18510|ИЛ-1RA_антагонист рецептора интерлейкина-1 человека OS=Homo sapiens GN=IL1RN PE=1 SV=1
MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P18510-2|ИЛ-1RA_изоформа 2 антагонист рецептора интерлейкина-1 человека OS=Homo sapiens GN=IL1RN
MALETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P18510-3| ИЛ-1RA_изоформа 3 антагонист рецептора интерлейкина-1 человека OS=Homo sapiens GN=IL1RN
MALADLYEEGGGGGGEGEDNADSKETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P18510-4| ИЛ-1RA_изоформа 4 антагонист рецептора интерлейкина-1 человека OS=Homo sapiens GN=IL1RN
MQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P13232|ИЛ-7_интерлейкин-7 человека OS=Homo sapiens GN=IL7 PE=1 SV=1
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
>sp|P13232-2|ИЛ-7_изоформа 2 интерлейкина-7 человека OS=Homo sapiens GN=IL7
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
>sp|P13232-3| ИЛ-7_изоформа 3 интерлейкина-7 человека OS=Homo sapiens GN=IL7
MKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
>sp|P10145|ИЛ-8_интерлейкин-8 человека OS=Homo sapiens GN=CXCL8 PE=1 SV=1
MTSKLAVALLAAFLISAALCEGAVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS
>sp|P10145-2|ИЛ-8_изоформа 2 интерлейкина-8 человека OS=Homo sapiens GN=CXCL8
MTSKLAVALLAAFLISAALCEGAVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKAEVPENRGMDS
>sp|P29460|ИЛ-12B_бета-субъединица интерлейкина-12 человека OS=Homo sapiens GN=IL12B PE=1 SV=1
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
FGF2
Основной FGF; P09038;
MVGVGGGDVE DVTPRPGGCQ ISGRGARGCN GIPGAAAWEA ALPRRRPRRH PSVNPRSRAA GSPRTRGRRT EERPSGSRLG DRGRGRALPG GRLGGRGRGR APERVGGRGR GRGTAAPRAA PAARGSRPGP AGTMAAGSIT TLPALPEDGG SGAFPPGHFK DPKRLYCKNG GFFLRIHPDG RVDGVREKSD PHIKLQLQAE ERGVVSIKGV CANRYLAMKE DGRLLASKCV TDECFFFERL ESNNYNTYRS RKYTSWYVAL KRTGQYKLGS KTGPGQKAIL FLPMSAKS
>sp|P02778|CXL10_хемокин 10 с мотивом C-X-C человека OS=Homo sapiens GN=CXCL10 PE=1 SV=2
MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP
>sp|P15692|VEGFA_фактор роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA PE=1 SV=2
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-2|VEGFA_изоформа VEGF189 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-3|VEGFA_изоформа VEGF183 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-4|VEGFA_изоформа VEGF165 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-5|VEGFA_изоформа VEGF148 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKM
>sp|P15692-6|VEGFA_изоформа VEGF145 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVCDKPRR
>sp|P15692-8|VEGFA_изоформа VEGF165B фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRSLTRKD
>sp|P15692-9|VEGFA_изоформа VEGF121 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKCDKPRR
>sp|P15692-10|VEGFA_изоформа VEGF111 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRCDKPRR
>sp|P15692-11|VEGFA_изоформа L-VEGF165 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-12|VEGFA_изоформа L-VEGF121 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKCDKPRR
>sp|P15692-13|VEGFA_изоформа L-VEGF189 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-14|VEGFA_изоформа L-VEGF206 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-15|VEGFA_изоформа 15 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRSLTRKD
>sp|P15692-16|VEGFA_изоформа 16 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-17|VEGFA_изоформа 17 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKM
>sp|P15692-18|VEGFA_изоформа 18 фактора роста эндотелия сосудов A человека OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MTDRQTDTAPSPSYHLLPGRRRTVDAAASRGQGPEPAPGGGVEGVGARGVALKLFVQLLGCSRFGGAVVRAGEAEPSGAARSASSGREEPQPEEGEEEEEKEEERGPQWRLGARKPGSWTGEAAVCADSAPAARAPQALARASGRGGRVARRGAEESGPPHSPSRRGSASRAGPGRASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRCDKPRR