СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОБНАРУЖЕНИЯ МИКОТОКСИНА Т-2 В ЖИДКИХ ПРОБАХ
METHOD FOR IMMUNOENZYMOMETRIC DETECTION OF T-2 MYCOTOXIN IN LIQUID SAMPLES

Изобретение относится к биохимическим методам анализа, в частности к иммуноферментному анализу, и может быть использовано в санитарно-эпидемиологических, медицинских и ветеринарных исследованиях.
Микотоксин Т-2 (3-гидрокси-4,15-диацетокси-8-изобутирилокси-12,13-эпокси-трихтец-9-ен) является вторичным метаболитом плесневых грибов рода Fusarium, развивающихся на зерновых и некоторых других сельскохозяйственных культурах.
В связи с тем, что практически невозможно полностью предотвратить заражение сельскохозяйственной продукции микроскопическими грибами и загрязнение их микотоксином Т-2, основной мерой защиты от неблагоприятного воздействия этого токсина является гигиеническое регламентирование его содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах, с последующим контролем качества и отбраковкой загрязненных продуктов. В связи с этим, важное значение приобретает поиск и изучение способов обнаружения микотоксина Т-2 в продовольственном сырье и пищевых продуктах.
Известны физико-химические способы обнаружения микотоксина Т-2: тонкослойная хроматография (Scott P.M. et al. // Appl. Microbiol. - 1970; Методика выполнения измерений массовой доли микотоксинов в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом тонкослойной хроматографии. М-МВИ-68-00/НПО «Мониторинг». - С.-П., М., 2000), газожидкостная хроматография (Cohen, H et al. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. - 1984; Rood, H.D. et al. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. - 1988; Rosen J.D. // J. Chromatogr., 1988), газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (Roach J.А. // Biomed. Environ. Mass Spectrom. - 1989), высокоэффективная жидкостная хроматография (Kuronen P. // Arch. Environ. Contam. Toxcicol. - 1989). Однако эти способы для достижения приемлемого уровня чувствительности анализа предполагают проведение продолжительной и трудоемкой пробоподготовки, обеспечивающей концентрирование токсина в пробе и удаление из нее балластных примесей; кроме того, пробоподготовка в таких случаях включает химическую модификацию очищенного токсина для обеспечения его летучести, и(или) для обеспечения его окраски, так как микотоксин Т-2 не поглощает свет ни в видимой, ни в ультрафиолетовой областях и не флуоресцирует. Такой сложный комплекс пробоподготовки вынуждает исследователя использовать для анализа дорогостоящее оборудование, большие объемы различных химических реагентов, что обусловливает необходимость проведения анализа только в специализированных лабораториях и только высококвалифицированными специалистами, что в свою очередь затрудняет применение этих методов для массового контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов.
Известен ряд серологических способов обнаружения микотоксина Т-2.
Может быть использован радиоиммунный анализ (Fontelo P.A. // Appl. Environ. Microbiol. - 1983), однако использование радиоактивных изотопов предусматривает наличие специально оборудованных лабораторий и квалифицированного персонала, что делает его весьма дорогостоящим, а так же малоприменимым для массового использования.
Известен способ прямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализ (Gendloff Е.Н. // Appl. Environ. Microbiol. - 1984; De Saeger S., Peteghem C.V. // Appl. Environ. Microbiol. - 1996; Sibanda L. // J. Agric. Food Chem. - 2000). В данном способе на первом этапе специфические антитела иммобилизуют на твердой поверхности, затем на иммобилизованные антитела наносят одновременно раствор, содержащий свободный микотоксин (контроль или проба) и раствор, содержащий конъюгат микотоксина с ферментной меткой (чаще всего конъюгат с пероксидазой хрена), при этом конъюгат и свободный микотоксин конкурируют за места связывания с антителами. На следующем этапе вносят субстратно-индикаторный раствор, происходит цветная реакция, после чего либо визуально, либо инструментально учитывают результат. У данного метода, общим с заявленным, является наличие стадии конкурентного связывания, однако проведение такого анализа связано со сложной процедурой подготовки иммобилизованных антител, к тому же для такой процедуры как правило необходимы моноклональные антитела против микотоксина, приготовление которых сопряжено с целым рядом дорогостоящих процедур.
Известны методы иммуноферментного обнаружения микотоксина Т-2 путем непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (Nagayama S. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1984; Hart L.P. et al. // United states patent №4772551. - 1988; Pal A. et al. // Anal. Chem. - 2004). Наиболее близким к заявленному является способ, предложенный Г.Кононенко и соавт. (Кононенко Г.П. и др. Иммуноферментный метод определения Т-2 токсина в контаминированном зерне. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - Том 35, №4, - стр.457-462). На поверхности лунок планшета для иммуноферментного анализа иммобилизуют конъюгат микотоксина Т-2 с белковым носителем, на следующей стадии в лунки вносят раствор, содержащий микотоксин (проба или контроль) и раствор специфических поликлональных кроличьих антител, после инкубации планшет промывают. Затем вносят иммуноферментный конъюгат, специфичный к кроличьим антителам, планшет вновь промывают. Вносят субстратно-индикаторный раствор, после остановки цветной реакции серной кислотой учитывают результаты.
Общим заявленного способа и ближайшего известного являются все стадии (иммобилизация твердофазного антигена, конкурентное связывание, введение ферментной метки, цветная реакция), однако имеются особенности, затрудняющие использование этого способа. Поскольку чистый токсин является гаптеном, т.е. не вызывает иммунный ответ, следовательно, не может сам по себе использоваться для иммунизации животных, для этой цели используют антиген, синтезированный из микотоксина и белка-носителя (обычно бычий сывороточный альбумин). Таким образом, в сыворотке крови животного после иммунизации таким антигеном появляются антитела не только к микотоксину, но и к белку-носителю (т.е. к бычьему сывороточному альбумину), при этом антитела против белка-носителя могут быть специфичны к различным детерминантам молекулы белка. Эти детерминанты могут быть схожи у различных белков, особенно внутри групп, например альбумины. Поскольку микотоксин Т-2 является низкомолекулярным соединением, он не может быть в чистом виде использован в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе в качестве антигена твердой фазы, для этой цели так же используется конъюгат, синтезированный из микотоксина Т-2 и белка носителя. У ближайшего способа в качестве антигена твердой фазы предлагается использовать конъюгат с желатином, либо кроличьим сывороточным альбумином, либо яичный альбумин. В связи с тем, что для иммунизации животных предлагается использовать конъюгат микотоксина Т-2 с бычьим сывороточным альбумином при использовании в конкурентном иммуноферментном анализе нативной гипериммунной сыворотки, полученной от этих животных, невозможно добиться специфичности, что и вынуждает на этапе конкурентного связывания для этой цели использовать особым образом выделенные специфические поликлональные антитела. Процесс получения специфических поликлональных антител является весьма трудоемким и включает целый ряд физико-химических методов с использованием специального оборудования, что существенно повышает стоимость анализа. Кроме того, по этой же причине ближайший способ характеризуется определенным уровнем специфичности и как следствие определенным пределом обнаружения микотоксина Т-2 в пробе.
Задачей изобретения является повысить специфичность конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа за счет снижения неспецифических взаимодействий между подложкой и специфическими компонентами.
Техническим решением задачи является использование в процессе проведения иммуноферментного анализа твердофазного антигена, в состав которого входит такой белок-носитель, к которому у животного продуцента сыворотки гарантированно отсутствуют антитела, что приводит к повышению специфичности анализа при обнаружении микотоксина, повышению чувствительности, а также позволяет при проведении конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа использовать в качестве препарата антител гипериммунную сыворотку.
Поставленная задача достигается тем, что в качестве белка-носителя в составе твердофазного антигена используют антиген фракции 1 чумного микроба (по Baker), который является абсолютно видоспецифичным белком, то есть у животных - продуцентов сыворотки, не болевших чумой, исключается наличие антител к этому белку.
Пример 1
В лунки полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 0,1 мл раствора твердофазного антигена в рабочем разведении. Планшет инкубируют в течение 30 минут при температуре 35°С. После инкубации лунки планшета трижды промывают забуференным фосфатами физиологическим раствором с добавлением твина-20. После удаления остатков буфера из лунок в них последовательно вносят по 0,05 мл контрольных растворов микотоксина Т-2 или анализируемых проб, затем по 0,05 мл кроличьей гипериммунной сыворотки в рабочем разведении. Стадию конкурентного связывания так же проводят в течение 30 минут при температуре 35°С. После инкубации планшет вновь трижды промывают забуференным фосфатами физиологическим раствором с добавлением твина-20, затем в лунки вносят по 0,1 мл раствора иммуноферментного пероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кролика, который инкубируют в лунках при температуре 35°С в течение 30 минут. После трехкратной промывки лунок в них вносят по 0,1 мл раствора перекисной субстратно-индикаторной смеси, реакция перекисного окисления субстрата проводят в течение 20 минут в темноте. После чего реакцию останавливают внесением раствора серной кислота по 0,1 мл в лунку. Результаты анализа учитывают визуально, либо с помощью планшетного фотометра. Отсутствие окрашенного продукта перекисной реакции в лунке указывает на наличие в пробе внесенного в эту лунку микотоксина Т-2.
Пример 2
На нитроцеллюлозную полоску наносят точечно 5 мкл твердофазного антигена, подсушивают, полоску помещают в физиологический раствор, содержащий 20% твин-20. После этого погружают полоску в раствор гипериммунной сыворотки, с одновременным внесением в этот раствор анализируемой пробы (контрольную полоску погружают в раствор, не содержащий микотоксин Т-2), проводят конкурентное связывание в течение 20 минут. После этого полоску вновь промывают физиологическим раствором с твином-20. Затем полоску инкубируют в растворе антивидового иммуноферментного конъюгата в течение 20 минут. После промывки полоску переносят в раствор субстратно-индикаторной смеси. Результаты учитывают визуально по истечении 10 минут. Отсутствие окрашенного продукта перекисной реакции указывает на наличие в анализируемой пробе микотоксина Т-2.