Способ прогнозирования риска колонизации кишечника Klebsiella pneumoniae у недоношенных детей в неонатальном периоде
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF INTESTINAL COLONIZATION BY KLEBSIELLA PNEUMONIAE IN PRETERM INFANTS IN THE NEONATAL PERIOD

Изобретение относится к области медицины, в частности к неонатологии и может быть использовано, для раннего прогнозирования риска колонизации кишечника K. pneumoniae у недоношенных детей в неонатальном периоде. Изобретение обеспечивает выделение группы высокого риска и возможность коррекции тактики ведения и терапевтических воздействий недоношенных детей на этапах выхаживания.
Klebsiella spp.
Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), оказывают прямое влияние на исходы лечения пациентов и рассматриваются в контексте проблемы обеспечения качества медицинской помощи. Одним из ведущих возбудителей, вызывающих ИСМП, является
Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae)
Enterobacteriaceae
- типичный представитель семейства , который является распространенным возбудителем как внебольничных, так и внутрибольничных инфекций. Глобальное распространение в больницах, множественная устойчивость к антимикробным средствам, высокие адаптивные свойства, способность формировать гипервирулентные госпитальные клоны определяет безусловную актуальность этой проблемы.
K. pneumoniae
Наиболее уязвимой группой с точки зрения развития клебсиеллезных ИСМП являются дети. Низкий возраст гестации пациента играет ключевую роль для риска инфицирования  поскольку с ним связаны дефицит массы тела, незрелость основных органов и систем новорожденного ребенка и, как следствие, необходимость пребывания в отделениях патологии новорожденных, реанимации и интенсивной терапии. Эта позиция определяет неизбежность риска для этой категории пациентов, невозможность выбора стратегии избегания риска, а, следовательно, необходимость выбора стратегии минимизации риска.
K. pneumoniaе
Klebsiella spp
K. pneumoniaе
По данным Кузьменко С.А. и соавт. (2020 г.) в педиатрических стационарах г. Кемерово и Кемеровской области в период с 2012 по 2019 гг., штамм  преобладает над всеми представителями бактерий рода . - 85,32%, что свидетельствует об их высоком распространении среди детей. В медицинских организациях стран мира частота встречаемости  у детей несколько ниже: в Индии составляет 10,8%, в Корее - 13,8%, в Иране - 27,5% соответственно[Wattal C., Goel N. Pediatric blood cultures and antibiotic resistance: an overview // Indian J Pediatr. - 2020. - 87 (2). - P. 125-131.doi: 10.1007/s12098-019-03123-y., Mahmoudi S., Mahzari M., Banar M., Pourakbari B., Ashtiani M. T. H., Mohammadi M, Valian S.K., Mamishi S. Antimicrobial resistance patterns of Gram-negative bacteria isolated from bloodstream infections in an Iranian referral pediatric hospital: A 5.5-year study// j Glob antimicrob resist. - 2017. - 11.- P. 17-22. doi: 10.1016/j.jgar.2017.04.013. ].
K. pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
В связи с тем, что обнаружение  в клиническом материале может быть ассоциировано с такими нозологические формами как пневмония, инфекция мочевыделительной системы, абсцесс печени, неонатальный сепсис (А.В. Устюжанин, Г.Н. Чистякова, И.И. Ремизова Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена uge, детектированного в штаммах  // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2020. - Т.19. - №3. - 28-32. DOI: 10.31631/2073-3046-2020-19-3-28-32), раннее выявление колонизации кишечника данным возбудителем дает возможность предотвратить развитие инфекционного процесса.
Аналогами данного изобретения являются:
Klebsiella
spp
Proteus spp.
Citrobacter spp.
Staphylococcus spp
7
3
8
4
7
3
6
• Способ прогнозирования состояния микробиоты кишечника новорожденных путем определения синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) у беременных методом водородного дыхательного теста с лактулозой, отличающийся тем, что при обнаружении синдрома избыточного бактериального роста у матери прогнозируется нарушение формирования микробиоценоза кишечника новорожденного. Продемонстрировано, что у новорожденных, у матерей которых во время беременности диагностирован СИБР, концентрация условно-патогенной флоры в возрасте 1 месяца жизни составила: . 10КОЕ/г против 10КОЕ/г в группе контроля,  10КОЕ/г против 10КОЕ/г,  10КОЕ/г против 10КОЕ/г и . 10КОЕ/г против 0 соответственно (p ≤0,005 во всех случаях) (Патент на изобретение № 2685508 Способ прогнозирования состояния микробиоты кишечника новорожденных от 19.04.2019 г. (Ковалева О.В., Литяева Л.А., Масакова М.В). Все новорожденные имели клинические проявления инфекции. Недостатком предложенного способа является: приобретение специального оборудования, длительность проведения самой процедуры (измерение концентрации водорода через каждые 15 минут в течение часа).
Streptococcus spp.; Peptostreptococcus spp.; Staphylococcus aureus; Gardenerella vaginalis; Peptococcus spp.; Capnocytophaga spp.; Stomatococcus spp.; Bacterioides spp.; Enterococcus faecalis; Neisseria gonorrhea; Escherichia coli; Lactobacillus spp.; Clostridium spp.,
Adenovirus; Parvovirus; Cytomegalovirus; Epstein-Barr virus; Herpes simplex virus; Influenza А
• Известен способ прогнозирования инфицирования новорожденных и родильниц, который заключается в бактериологическом исследовании околоплодных вод, полученных после преждевременного разрыва околоплодных оболочек при недоношенной беременности на сроке 22-36 недель беременности. Пробы исследуют на инфекционные агенты ( а также вирусы - .) и затем прогнозируют инфицирование новорожденных и родильниц выявленными инфекционными агентами (Патент на изобретение № 2449277 от 27.04.2012 способ прогнозирования инфицирования новорожденных и родильниц (авторы: Набережнев Ю.И., Орлова В.С., Головченко О.В., Калашникова И.В.). Недостаток данного способа - длительность и трудоемкость выделения инфекционных агентов.
K. pneumoniae
K. variicola
K. quasipneumoniae
У
,
• Y. Sun et al. (2021) был разработан и валидирован мультиплексный количественный ПЦР-анализ (qPCR) для определения клебсиелл (,  и  вместе взятых) относительно общего количества копий бактериальной ДНК в ректальных мазках. становлено что высокий уровень Klebsiella spp., измеряемый по плотности и определяемый, как >22% от общего количества бактерий, был в значительной степени связан с последующим развитием инфекции (Sun Y, Patel A, SantaLucia J, Roberts E, Zhao L, Kaye K, Rao K, Bachman MA. Measurement of Klebsiella Intestinal Colonization Density To Assess Infection Risk. mSphere. 2021 Jun 30;6(3):e0050021. doi: 10.1128/mSphere.00500-21. Epub 2021 Jun 23. PMID: 34160234; PMCID: PMC8265666).
Несмотря на эффективность использования, недостатками этого способа является обследование колонизированных клебсиеллой пациентов и связь с развитием инфекционного заболевания, а не возможный риск колонизациии.
K. pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика
Наиболее близкими аналогами заявляемого изобретения являются опубликованные в журнале «Эпидемиология и вакцинопрофилактика» результаты С.А. Кузьменко и соавт. (2020), Авторами определены факторы высокого риска инфицирования пациентов  искусственное вскармливание (OR = 9,21, 95% [ДИ = 3,31-35,45], р = 0,0001), искусственная вентиляция легких (OR = 7,36, 95% [ДИ = 3,92-14,09], р = 0,0001), ингаляции через небулайзер (OR = 5,34, 95% [ДИ =2,49-10,90], р = 0,0001), санация верхних дыхательных путей (OR = 4,62, 95% [ДИ =2,49-8,56], р = 0,0001), малый срок гестации (OR = 2,55, 95% [ДИ =1,38-4,69], р=0,001), недостаток массы тела (OR = 2,48, 95% [ДИ = 1,34-4,56], р = 0,002), постановка очистительной клизмы (OR = 1,80, 95% [ДИ = 0,78-3,81], р = 0,088), зондирование желудка (OR = 1,79, 95% [ДИ = 0,85-3,54], р = 0,065) (Кузьменко С.А., Шмакова М.А., Брусина Е.Б. Факторы риска инфицирования  пациентов детских медицинских организаций. . 2020;19(2):40-47. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2020-19-2-40-4).
K. pneumoniae
K. pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter сloacae, Pantoea spp
Однако, несмотря на высокие значения показателя отношение шансов (OR) и статистической значимости (р) искусственное вскармливание и малый срок гестации не всегда являются факторами высокого риска инфицирования недоношенных детей . В исследованиях, проведенных нами ранее показано, что частота выявления энтеробактерий (.) в фекалиях у детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) и гестационным возрастом 22-27 и 28-31 недели на 5-7 сутки жизни составила 50% и 25% случаев, соответственно; к 30 суткам жизни - 48% и 55,6% и по достижению возраста доношенных новорожденных (постконцептуальный возраст - ПКВ) - 62% и 45,5%. На 5-7 сутки жизни большинство детей обеих групп получали грудное молоко (70% и 66,6%), на 30 сутки - 52% и 60,7% и по достижению ПКВ - 24,2% и 31,8% (Шамова К.П., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Устьянцева Л.С. Характер микробной колонизации и дисбиотические нарушения у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела в динамике постнатального периода / Современные проблемы науки, технологий, инновационной деятельности Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции. В 4-х частях. Под общей редакцией Е.П. Ткачевой. (Белгород, 31 августа 2017 года) С.42-45).
K. pneumoniae
В другом исследовании установлено, что частота выявления  в фекалиях у детей с ЭНМТ, развивших впоследствии бронхо-легочную дисплазиюв возрасте 1 месяца жизни у новорожденных 22-27 и 28-31 недели гестационного возраста составила 8,57% и 10%, соответственно, по достижению ПКВ - 6,9% и 3,4% (р>0,05 во всех случаях) (Устьянцева Л.С., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Шакирова К.П., Рюмин В.Е. Становление микробиоценоза и локального иммунитета кишечника детей с экстремально низкой массой тела, сформировавших бронхолегочную дисплазию //Тенденции развития науки и образования. - 2020 г. - №67, Часть 1 Изд. НИЦ «Л-Журнал», - С.121-126 doi: 10.18411/lj-11-2020-31 idsp: ljournal-11-2020-31).
Отсутствие математического моделирования снижает эффективность приведенных выше факторов риска.
K. pneumoniae
Задача изобретения заключается в разработке способа прогнозирования риска колонизации кишечника  у недоношенных детей в неонатальном периоде, на основании определения в сыворотке пуповинной крови уровня абсолютного количества лейкоцитов и относительного числа активированных моноцитов (CD14+HLA-DR+ и CD14+CD64+), отражающих состояние моноцитарно-макрофагального звена иммунитета при рождении.
K. pneumoniae
Технический результат: заявляемый способ малоинвазивен (пуповинная кровь), позволяет прогнозировать риск колонизации кишечника  у недоношенных новорожденных в первые сутки жизни и выделить группу недоношенных высокого риска для проведения опережающей терапии.
K. pneumoniae
Указанный технический результат достигается тем, что заявляется способ прогнозирования риска колонизации кишечника  у недоношенных новорожденных на основании лабораторных данных с использованием метода математического моделирования, отличающийся тем, что в пуповинной крови ребенка определяют абсолютное количество лейкоцитов и процентное содержание активированных CD14+HLA-DR+ и CD14+CD64+ моноцитов методом проточной цитометрии с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
1
2
3
PI = 9,78-0,054×Х-0,056×Х-0,041×Х-47,684, где:
9,78 - константа;
1
9
Х - абсолютное количество лейкоцитов, 10/л;
2
Х - процентное содержание активированных CD14+HLA-DR+ моноцитов, %;
3
Х - процентное содержание активированных CD14+CD64+ моноцитов, %;
K. pneumoniae
при PI более 0 прогнозируют высокий риск колонизации кишечника  у недоношенных новорожденных в неонатальном периоде, а при PI менее 0 делают заключение о низком риске колонизации кишечника этим микроорганизмом.
Способ осуществляют следующим образом: забор венозной крови из вены пуповины производят в пробирку (с ЭДТА) для определения абсолютного количества лейкоцитов, процентного содержания CD14+HLA-DR+ и CD14+CD64+ моноцитов в плазме крови методом проточной цитофлюорометрии.
Иммунoфенoтипирование моноцитов осуществляют с использованием метода прoточной лазерной цитофлуориметрии на анализаторе «FACS Calibur» фирмы «Becton Dickinson» (США) с использованием наборов моноклональных антител того же производителя, конъюгированных с флюоросцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (PE).
Для достижения поставленной цели проведено обследование 64 недоношенных детей, которые были подразделены на две группы:
K. pneumoniae
1 группа - новорожденные с выявленной, при бактериологическом исследовании фекалий в течение неонатального периода (n=26);
K. pneumoniae
2 группа - дети с отрицательным результатом на  (n=38).
Бактериологическое исследование фекалий проводилось в соответствии с нормативными актами (приказ № 535 от 22.04.85 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», приказ Минздрава России №646н от 18 мая 2021 г «Об утверждении правил проведения лабораторных исследований»).
K. pneumoniae
5
Диагностически значимым в развитии инфекционной диареи считали выделение  из фекалий в количестве ≥10КОЕ/гр при исключении роли патогенных бактерий и ротавирусов.
Срок гестации детей на момент рождения составлял 25-36 недель. При формировании групп учитывали сопоставимость детей по гестационному возрасту, основным, конкурирующим и сопутствующим заболеваниям. Бактериологический посев фекалийосуществлялся на 5-7 и 30 сутки жизни.
Методом пошагового дискриминантного анализа с исключением переменных определены наиболее значимые иммунологические параметры, определяющие функциональную активность моноцитарно-макрофагального звена врожденного иммунитета (таблица 1).
Таблица 1
Показатели
Уилкса лямбда
Частная лямбда
F-исключения
p-уровень значимости
Толерантность
1-толерантность (R-квадрат)
СD14+CD11b+%
0,767331
0,746221
20,40509
0,000030
0,956096
0,043904
СD14+HA-DR%
0,622333
0,920085
5,21139
0,025997
0,927960
0,072040
Лейкоциты, 10<sup>9</sup>/л
0,597641
0,958099
2,62404
0,110501
0,904547
0,095452
Количество шагов-3
Число переменных в модели: 3
Лямбда Уилкса: ,57260 прибл. F (3,6) = 14,928 p < ,0000
С помощью, выявленных показателей была разработана математическая модель
K. pneumoniae
прогнозирования риска колонизации кишечника  в неонатальном периоде, заключающаяся в определении прогностического индекса (PI) по формуле:
1
2
3
PI = 9,78-Х×0,054-Х×0,056-Х×0,10,
где:
9,78 - константа,
1
9
Х - абсолютное количество лейкоцитов, 10/л;
2
Х - процентное содержание CD14+HLA-DR+ моноцитов, %;
3
Х - процентное содержание CD14+CD64+ моноцитов, %;
K. pneumoniae
При PI более 0 прогнозируют высокий риск колонизации кишечника в неонатальном периоде, а при PI менее 0 делают заключение о низком риске колонизации данным микроорганизмом кишечника недоношенных детей
Чувствительность предлагаемого способа составляет 76,93%, специфичность - 89,47%. Эффективность способа - 84,38%.
Клинические примеры.
Пример 1.
Enterobacter spp.
9
Новорожденная девочка В., родилась у 27-летней первородящей женщины, беременность протекала на фоне истмико-цервикальной недостаточности, хронической внутриматочной инфекции (в соскобе цервикального канала обнаружены ), маловодия. Длительный безводный период, преждевременные оперативные роды в сроке гестации 29 недель. Масса тела при рождении составила 1060 г, длина 35 см, оценка по шкале Апгар 5/7 баллов. Диагноз при рождении: респираторный дистресс-синдром, инфекция специфическая для перинатального периода, неуточненная (МКБ-10 код 39.9.). Показатели пуповинной крови при рождении: лейкоциты - 3,65 10/л, CD14+HLA-DR+ моноциты - 46,0%, CD14+СD+64+ моноциты - 34,0%.
По формуле определили значение прогностического индекса:
K. pneumoniae
PI = 9,78-3,65×0,054-46,0×0,056-34×0,10 = 3,607, что больше 0 и свидетельствует о высоком риске колонизации кишечника  в неонатальном периоде.
K. pneumoniae
7
При бактериологическом исследовании кала  в количестве 10КОЕ/г была обнаружена на 30 сутки жизни.
Пример 2.
9
Новорожденная девочка М., родилась у 37-летней повторнородящей женщины, беременность протекала на фоне субкомпенсированной плацентарной недостаточности, артериальной гипертензии 3 степени, гестационного сахарного диабета. При бактериологическом исследовании цервикального канала микрофлора не обнаружена. Преждевременные оперативные роды в сроке гестации 32 недель. Масса тела при рождении составила 870 г, длина 34 см, оценка по шкале Апгар 5/7 баллов. Диагноз при рождении: субкортикальная ишемия. Показатели пуповинной крови при рождении: лейкоциты - 3,4 10/л, CD14+HLA-DR+ моноциты - 51,0%, CD14+СD+64+ моноциты - 62,0%.
По формуле определили значение прогностического индекса:
K. pneumoniae
PI = 9,78-3,4×0,054-51,0×0,056-62×0,10 = 0,504, что больше 0 и свидетельствует о высоком риске колонизации кишечника  в неонатальном периоде.
K. pneumoniae
7
При бактериологическом исследовании фекалий  10КОЕ/г была обнаружена на 5-7 сутки жизни.
Пример 3.
9
Новорожденный мальчик К., родился у 34-летней повторнородящей женщины, беременность протекала на гестационного сахарного диабета. Преждевременные оперативные роды в сроке гестации 36 недель. Масса тела при рождении составила 2420 г, длина 46 см, оценка по шкале Апгар 5/7 баллов. Диагноз при рождении: респираторный дистресс-синдром. Показатели пуповинной крови при рождении: лейкоциты - 1,18 10/л, CD14+HLA-DR+ моноциты - 73%, CD14+СD+64+ моноциты - 21%.
По формуле определили значение прогностического индекса:
K. pneumoniae
PI = 9,78-1,18×0,054-73,0×0,056-21×0,10 = 3,528, что больше 0 и свидетельствует о высоком риске колонизации кишечника  в неонатальном периоде.
K. pneumoniae
7
При бактериологическом исследовании фекалийй  10КОЕ/г была обнаружена на 5-7 сутки жизни.
Пример 4.
9
Новорожденная девочка Л., родилась у 37-летней повторнородящей женщины. Беременность протекала на фоне тромбофилии, субкомпенсированной плацентарной недостаточности, хронической внутриматочной инфекции (в соскобе цервикального канала обнаружен вирус простого герпеса). Преждевременные оперативные роды в сроке гестации 28 недель. Масса тела при рождении составила 1150 г, длина 40 см, оценка по шкале Апгар 4/6 баллов. Диагноз при рождении: респираторный дистресс-синдром, внутрижелудочковое кровоизлияние 2 степени. Показатели пуповинной крови при рождении: лейкоциты - 11,2 10/л, CD14+HLA-DR+ моноциты - 58%, CD14+СD+64+ моноциты - 73%.
По формуле определили значение прогностического индекса:
K. pneumoniae
PI = 9,78-11,2×0,054-58,0×0,056-73×0,10= -1,372, что менее 0 и свидетельствует о низком риске колонизации кишечника  в неонатальном периоде.
E. coli
K. pneumoniae
4
При бактериологическом исследовании фекалий на 5-7 жизни выявлена  в количестве 10 КОЕ/г,  не обнаружена. На 30 сутки жизни микрофлора в фекалияхне выделена.
Пример 5.
9
Новорожденный мальчик С., родился у 29 летней повторнородящей женщины, соматически отягощенной пиелонефритом. Беременность протекала на фоне преэклампсии, истмико-цервикальной недостаточности, маловодия. При посеве из цервикального канала, микрофлора не выявлена. Преждевременные оперативные роды в сроке гестации 35 недель. Масса тела при рождении составила 2300 г, длина 44 см, оценка по шкале Апгар 6/7 баллов. Диагноз при рождении: перивентрикулярная ишемия. Показатели пуповинной крови при рождении: лейкоциты - 6,2×10/л, CD14+HLA-DR+ моноциты - 57%, CD14+СD+64+ моноциты - 71%.
По формуле определили значение прогностического индекса:
K. pneumoniae
PI = 9,78-6,2×0,054-57,0×0,056-71,0×0,10= -0,847, что менее 0 и свидетельствует о низком риске колонизации кишечника  в неонатальном периоде.
Enterobacter aerogenes
K. pneumoniae
7
При бактериологическом исследовании фекалий на 5-7 и 30 сутки жизни выявлена  10 КОЕ/г,  не обнаружена.
K. pneumoniae
Таким образом, раннее прогнозирование риска колонизации кишечника предлагаемым способом позволяет в первые сутки жизни определиться с тактикой антибактериальной терапии.
K. pneumoniae
Заявляемый способ прогнозирования риска колонизации кишечника у новорожденных в сравнении с существующими имеет следующие преимущества: способ малоинвазивен (пуповинная кровь), позволяет прогнозировать риск колонизации кишечника в первые сутки жизни.