МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК), СОДЕРЖАЩАЯ СИММЕТРИЧНЫЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ИНВЕРТИРОВАННЫЕ КОНЦЕВЫЕ ПОВТОРЫ

1. Невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектор), причем указанный зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя фланкирующими последовательностями симметричных инвертированных концевых повторов (симметричных ITR), при этом указанные симметричные ITR не являются ITR дикого типа и каждый фланкирующий ITR содержит одинаковую симметричную модификацию.
2. ЗкДНК-вектор по п. 1, отличающийся тем, что указанные последовательности симметричных ITR являются синтетическими.
3. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1 и 2, отличающийся тем, что указанные ITR выбраны из любых перечисленных в таблице 4.
4. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что каждый из указанных симметричных ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой по меньшей мере в одной из областей ITR выбранных из А, А', В, В', С, С', D и D'.
5. ЗкДНК-вектор по п. 4, отличающийся тем, что указанная делеция, инсерция и/или замена приводит к делеции всей структуры «петля-на-стебле» или ее части, обычно образуемой областями А, А', В, В' С или С'.
6. ЗкДНК-вектор по п. 4 или 5, отличающийся тем, что симметричный ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции всей структуры «петля-на-стебле» или ее части, обычно образуемой областями В и В'.
7. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 4-6, отличающийся тем, что симметричный ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции всей структуры «петля-на-стебле» или ее части, обычно образуемой областями С и С'.
8. ЗкДНК-вектор по п. 6 или 7, отличающийся тем, что симметричный ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции части структуры «петля-на-стебле», обычно образуемой областями В и В', и/или части структуры «петля-на-стебле», обычно образуемой областями С и С.
9. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что симметричный ITR содержит единственную структуру «петля-на-стебле» в области, которая обычно содержит первую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями В и В', и вторую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями С и С'.
10. ЗкДНК-вектор по п. 9, отличающийся тем, что симметричный ITR содержит единственный стебель и две петли в области, которая обычно содержит первую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями В и В', и вторую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями С и С'.
11. ЗкДНК-вектор по п. 9 или 10, отличающийся тем, что симметричный ITR содержит единственный стебель и единственную петлю в области, которая обычно содержит первую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями В и В', и вторую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями С и С'.
12. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанные симметричные ITR представляют собой модифицированные AAV2ITR, содержащие последовательности нуклеотидов, выбранные из: ITR на фиг. 7А-22В или в таблице 4 в настоящем документе, и ITR последовательности которых по меньшей мере на 95% идентичны ITR приведенным в таблице 4 или представленным на фиг. 7А-22В.
13. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что вся гетерологичная нуклеотидная последовательность или ее часть находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя.
14. Невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектор), причем указанный зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя фланкирующие последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), при этом вся гетерологичная нуклеотидная последовательность или ее часть находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя.
15. ЗкДНК-вектор по п. 14, отличающийся тем, что указанные последовательности WT-ITR представляют собой симметричные последовательности WT-ITR или по существу симметричные последовательности WT-ITR.
16. ЗкДНК-вектор по п. 14 или 15, отличающийся тем, что указанные последовательности WT-ITR выбраны из любых комбинаций WT-ITR приведенных в таблице 1.
17. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что последовательность фланкирующего WT-ITR по меньшей мере на 95% идентична ITR, приведенным в таблице 1 или таблице 2, и все замены представляют собой консервативные замены нуклеиновых кислот, не влияющие на структуру WT-ITR.
18. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 13-17, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один регуляторный переключатель выбран из любых регуляторных переключателей или из комбинации регуляторных переключателей, перечисленных в таблице 5, или в разделе с названием «Регуляторные переключатели» в настоящем документе.
19. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор при расщеплении рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализе путем нативного и денатурирующего гель- электрофореза демонстрирует характерные полосы линейной и непрерывной ДНК по сравнению с контрольной линейной и прерывистой ДНК.
20. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что указанные последовательности ITR основаны на последовательностях из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV).
21. ЗкДНК-вектор по п. 20, отличающийся тем, что указанные ITR основаны на последовательностях из аденоассоциированного вируса (AAV).
22. ЗкДНК-вектор по п. 21, отличающийся тем, что указанные ITR основаны на последовательностях из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
23. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что указанный вектор находится в наноносителе.
24. ЗкДНК-вектор по п. 23, отличающийся тем, что указанный наноноситель содержит липидную наночастицу (ЛНЧ).
25. ЗкДНК-вектор по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор получен способом, включающим следующие этапы: (а) инкубация популяции клеток насекомых, несущих экспрессионную конструкцию зкДНК в присутствии по меньшей мере одного белка Rep, при этом указанная экспрессионная конструкция зкДНК кодирует указанный зкДНК-вектор, в эффективных условиях и на протяжении времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора в клетках насекомых; и (b) выделение указанного зкДНК-вектора из клеток насекомых.
26. ЗкДНК-вектор по п. 25, отличающийся тем, что указанная экспрессионная конструкция зкДНК выбрана из зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды и зкДНК-бакуловируса.
27. ЗкДНК-вектор по п. 25 или 26, отличающийся тем, что указанная клетка насекомого экспрессирует по меньшей мере один белок Rep.
28. ЗкДНК-вектор по п. 27, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один белок Rep взят из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV).
29. ЗкДНК-вектор по п. 28, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один белок Rep взят из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
30. Экспрессионная конструкция зкДНК, которая кодирует зкДНК-вектор по любому из пп. 1-29.
31. Экспрессионная конструкция зкДНК по п. 30, которая представляет собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду или зкДНК бакуловирус.
32. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионную конструкцию зкДНК по п. 30 или 31.
33. Клетка-хозяин по п. 32, которая экспрессирует по меньшей мере один белок Rep.
34. Клетка-хозяин по п. 33, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один белок Rep взят из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV).
35. Клетка-хозяин по п. 34, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один белок Rep взят из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
36. Клетка-хозяин по любому из пп. 32-35, которая представляет собой клетку насекомого.
37. Клетка-хозяин по п. 36, отличающаяся тем, что указанная клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.
38. Способ получения зкДНК-вектора, включающий (а) инкубацию клетки-хозяина по любому из пп. 32-37 в эффективных условиях и на протяжении времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора; и (b) выделение указанной зкДНК из клеток-хозяев.
39. Способ лечения, предотвращения, облегчения, мониторинга или диагностики заболевания или расстройства у субъекта, при этом указанный способ включает: введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей зкДНК-вектор по любому из пп. 1-29, причем указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность выбрана для лечения, предотвращения, облегчения, диагностики или мониторинга заболевания или расстройства.
40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, при ее транскрипции или трансляции, корректирует аномальное количество эндогенного белка у субъекта.
41. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, при ее транскрипции или трансляции, корректирует аномальную функцию или активность эндогенного белка или пути у субъекта.
42. Способ по любому из пп. 39-41, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует или содержит нуклеотидную молекулу, выбранную из группы, состоящей из РНКи, киРНК, миРНК, днкРНК и антисмыслового олиго- или полинуклеотида.
43. Способ по любому из пп. 39-41, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует белок.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что указанный белок представляет собой маркерный белок (например, репортерный белок).
45. Способ по любому из пп. 39-44, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует агонист или антагонист эндогенного белка или пути, ассоциированного с указанным заболеванием или расстройством.
46. Способ по любому из пп. 39-45, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует антитело.
47. Способ по любому из пп. 39-46, отличающийся тем, что указанное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: метаболического заболевания или расстройства, заболевания или расстройства ЦНС, заболевания или расстройства глаз, заболевания или расстройства крови, заболевания или расстройства печени, иммунного заболевания или расстройства, инфекционного заболевания, заболевания или расстройства мышц, рака; и заболевания или расстройства, основанного на аномальном уровне и/или функции генного продукта.
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанное метаболическое заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из диабета, расстройства лизосомального накопления, мукополисахаридного расстройства, заболевания или нарушения цикла мочевины; и болезни или расстройства накопления гликогена.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанное расстройство лизосомального накопления выбрано из группы, состоящей из болезни Гоше, болезни Помпе, метахроматической лейкодистрофии (MLD), фенилкетонурии (PKU) и болезни Фабри.
50. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанное заболевание или нарушение цикла мочевины представляет собой дефицит орнитинтранскарбамилазы (ОТС).
51. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанное мукополисахаридное расстройство выбрано из группы, состоящей из синдрома Слая, синдрома Гурлер, синдрома Шейе, синдрома Гурлер-Шейе, синдрома Хантера, синдрома Санфилиппо, синдрома Моркио и синдрома Марото-Лами.
52. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанное заболевание или расстройство ЦНС выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Канавана, синдрома Лея, болезни Рефсума, синдрома Туретта, первичного бокового склероза, амиотрофического бокового склероза, прогрессирующей мышечной атрофии, болезни Пика, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, тяжелой миастении, болезни Бинсвангера, травмы, обусловленной повреждением спинного мозга или головы, болезни Тея-Сакса, болезни Леша-Нихена, эпилепсии, церебрального инфаркта, психических расстройств, шизофрении, лекарственной или наркотической зависимости, неврозов, психозов, деменции, паранойи, расстройства дефицита внимания, расстройств сна, болевых расстройств, расстройств пищевого поведения или массы тела, а также рака и опухолей ЦНС.
53. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанное заболевание или расстройство глаз выбрано из группы, состоящей из офтальмологического расстройства, затрагивающего сетчатку, задний путь и/или зрительный нерв.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что указанное офтальмологическое расстройство, затрагивающее сетчатку, задний путь и/или зрительный нерв, выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, макулярной дегенерации, в том числе возрастной макулярной дегенерации, географической атрофии и сосудистой или «влажной» формы макулярной дегенерации, глаукомы, увеита, пигментного ретинита, болезни Штаргардта, врожденного амавроза Лебера (LCA), синдрома Ушера, эластической псевдоксантомы (РХЕ), х-хромосомного пигментного ретинита (XLRP), х-хромосомного расслоения сетчатки (XLRS), хороидеремии, врожденной нейропатии зрительного нерва Лебера (LHON), ахроматопсии, палочко-колбочковой дистрофии, эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, диабетического макулярного отека; и рака и опухолей глаз.
55. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанное заболевание или расстройство крови выбрано из группы, состоящей из гемофилии А, гемофилии В, талассемии, анемии и рака крови.
56. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанное заболевание или расстройство печени выбрано из группы, состоящей из прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза (PFIC) и рака печени, а также опухолей.
57. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанное заболевание или расстройство представляет собой кистозный фиброз.
58. Способ по любому из пп. 39-57, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
59. Способ доставки терапевтического белка субъекту, причем указанный способ включает введение указанному субъекту композиции, содержащей зкДНК-вектор по любому из пп. 1-29, причем указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что указанный терапевтический белок представляет собой терапевтическое антитело.
61. Способ по п. 59, отличающийся тем, что указанный терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фермента, эритропоэтина, ангиостатина, эндостатина, супероксиддисмутазы, глобина, лептина, каталазы, тирозингидроксилазы, цитокина, регулятора трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе (CFTR), пептидного фактора роста и гормона.
62. Набор, содержащий зкДНК-вектор по любому из пп. 1-29 и наноноситель, упакованные в контейнер с вкладышем в упаковку.
63. Набор для получения зкДНК-вектора, причем указанный набор содержит экспрессионную конструкцию, содержащую по меньшей мере один сайт рестрикции для инсерции по меньшей мере одной гетерологичной нуклеотидной последовательности или регуляторного переключателя, или и первого, и второго, причем указанный по меньшей мере один сайт рестрикции, функционально расположенный либо между (i) последовательностями симметричных инвертированных концевых повторов (симметричных ITR), при этом указанные симметричные ITR не являются ITR дикого типа, либо между (ii) двумя последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR).
64. Набор по п. 63, подходящий для получения зкДНК-вектора по любому из пп. 1-21.
65. Набор по п. 63 или 64, дополнительно содержащий популяцию клеток насекомых, которая не содержит последовательностей, кодирующих вирусный капсид, которые в присутствии белка Rep могут индуцировать продуцирование зкДНК-вектора.
66. Набор по любому из пп. 63-65, дополнительно содержащий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере один белок Rep, при этом указанный вектор подходит для экспрессии указанного по меньшей мере одного белка Rep в клетке насекомого.