ОПОСРЕДОВАННОЕ НУКЛЕАЗОЙ НАЦЕЛИВАНИЕ С БОЛЬШИМИ НАЦЕЛИВАЮЩИМИ ВЕКТОРАМИ

1. Способ модификации целевого геномного локуса в клетке млекопитающего, содержащий:
(a) введение в клетку млекопитающего:
(i) нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и
(ii) большого нацеливающего вектора (LTVEC), содержащего нуклеотидную вставку, фланкированную вышележащим гомологичным плечом и нижележащим гомологичным плечом; и
(b) отбор целевой клетки млекопитающего, содержащей нуклеотидную вставку в целевом геномном локусе.
2. Способ по п. 1, в котором клетка млекопитающего представляет собой плюрипотентную клетку.
3. Способ по п. 1, в «котором клетка млекопитающего представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (iPS) клетку.
4. Способ по п. 2, в котором плюрипотентная клетка представляет собой мышиную эмбриональную стволовую (ES) клетку.
5. Способ по п. 2, в котором плюрипотентная клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
6. Способ по п. 2, в котором плюрипотентная клетка представляет собой нейрональную стволовую клетку.
7. Способ по п. 1, в котором клетка млекопитающего представляет собой фибробласт человека.
8. Способ по п. 1, в котором клетка млекопитающего представляет собой человеческую клетку, выделенную из пациента, имеющего заболевание, и в котором человеческая клетка содержит в геноме по меньшей мере один аллель заболевания человека.
9. Способ по п. 8, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус заменяет в геноме по меньшей мере один аллель заболевания человека.
10. Способ по п. 1, в котором комбинированное применение LTVEC с нуклеазным агентом приводит к повышенной эффективности нацеливания по сравнению с применением только LTVEC.
11. Способ по п. 10, в котором эффективность нацеливания LTVEC увеличивается по меньшей мере в два раза по сравнению с применением только LTVEC.
12. Способ по п. 1, в котором нуклеазный агент представляет собой экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу, и в котором нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, активным в клетке млекопитающего.
13. Способ по п. 1, в котором нуклеазный агент представляет собой мРНК, кодирующую нуклеазу.
14. Способ по п. 12, в котором нуклеаза представляет собой цинковопальцевую нуклеазу (ZFN).
15. Способ по п. 12, в котором нуклеаза представляет собой эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN).
16. Способ по п. 12, в котором нуклеаза представляет собой мегануклеазу.
17. Способ по п. 1, в котором целевая последовательность из нуклеазного агента находится в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или области энхансера в целевом геномном локусе.
18. Способ по п. 1, в котором общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н.
19. Способ по п. 1, в котором длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 300 т.н.
20. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит кассету селекции.
21. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит репортерный ген.
22. Способ по п. 1, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к делеции эндогенного гена в целевом геномном локусе.
23. Способ по п. 1, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к добавлению экзогенной последовательности в целевом геномном локусе.
24. Способ по п. 1, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к нокауту, нокину, точечной мутации, замене домена, замене экзона, замене интрона, замене регуляторной последовательности, замене гена или их комбинации.
25. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека.
26. Способ по п. 25, в котором нуклеотидная вставка содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина.
27. Способ по п. 26, в котором последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацию.
H
H
H
28. Способ по п. 26, в котором нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C1, шарнирной области, C2, C3 и их комбинации.
29. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ или κ человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.
30. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ или κ человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.
31. Способ по п. 1, в котором стадию селекции (b) осуществляют с помощью анализа определения модификации аллеля (MOA).
32. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность, гомологичную нуклеотидной последовательности в геноме клетки млекопитающего.
33. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность, ортологичную нуклеотидной последовательности в геноме клетки млекопитающего.
34. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность из другого вида.
35. Способ по п. 1, в котором целевая клетка млекопитающего содержит в своем геноме нуклеотидную вставку, длина которой составляет от около 5 т.н. до около 300 т.н.
36. Способ модификации целевого геномного локуса млекопитающего с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации (BHR) в прокариотической клетке, содержащий:
(а) введение в прокариотическую клетку, содержащую целевой геномный локус млекопитающего:
(i) нацеливающего вектора, содержащего нуклеотидную вставку, фланкированную первым вышележащим гомологичным плечом и первым нижележащим гомологичным плечом; и
(ii) нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и
(b) отбор целевой прокариотической клетки, содержащей нуклеотидную вставку,
где целевой геномный локус присутствует в большом нацеливающем векторе (LTVEC), содержащем второе вышележащее гомологичное плечо и второе нижележащее гомологичное плечо, и
где прокариотическая клетка способна экспрессировать рекомбиназу, которая опосредует BHR.
37. Способ по п. 36, в котором млекопитающее является человеком.
38. Способ по п. 36, в котором млекопитающее представляет собой грызуна.
39. Способ по п. 38, в котором грызун представляет собой мышь, крысу или хомяка.
40. Способ по п. 36, в котором комбинированное применение нацеливающего вектора с нуклеазным агентом приводит к повышенной эффективности нацеливания по сравнению с применением только нацеливающего вектора.
41. Способ по п. 40, в котором эффективность нацеливания повышается по меньшей мере в два раза по сравнению с применением только нацеливающего вектора.
42. Способ по п. 36, в котором прокариотическая клетка представляет собой способный к рекомбинации штамм E.coli.
43. Способ по п. 36, в котором прокариотическая клетка содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбиназу.
44. Способ по п. 36, в котором прокариотическая клетка не содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбиназу, и нуклеиновая кислота, которая кодирует рекомбиназу, вводится в прокариотическую клетку.
45. Способ по п. 36, в котором нуклеазный агент представляет собой экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу, и в котором нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, активным в прокариотической клетке.
46. Способ по п. 36, в котором нуклеазный агент представляет собой мРНК, кодирующую нуклеазу.
47. Способ по п. 45, в котором нуклеаза представляет собой цинковопальцевую нуклеазу (ZFN).
48. Способ по п. 45, в котором нуклеаза представляет собой эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN).
49. Способ по п. 45, в котором нуклеаза представляет собой мегануклеазу.
50. Способ по п. 36, в котором целевая последовательность нуклеазного агента находится в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или области энхансера в целевом геномном локусе.
51. Способ по п. 36, в котором общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н.
52. Способ по п. 36, в котором длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 300 т.н.
53. Способ по п. 36, в котором нуклеотидная вставка содержит кассету селекции.
54. Способ по п. 36, в котором нуклеотидная вставка содержит репортерный ген.
55. Способ по п. 36, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к делеции эндогенного гена в целевом геномном локусе.
56. Способ по п. 36, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к добавлению экзогенной последовательности в целевом геномном локусе.
57. Способ по п. 36, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к нокауту, нокину, точечной мутации, замене домена, замене экзона, замене интрона, замене регуляторной последовательности, замене гена или их комбинации.
58. Способ по п. 36, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека.
59. Способ по п. 58, в котором нуклеотидная вставка содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина.
60. Способ по п. 59, в котором последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацию.
H
H
H
61. Способ по п. 59, в котором нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C1, шарнирной области, C2, C3 и их комбинации.
62. Способ по п. 36, в котором нуклеотидная вставка содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ или κ человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.
63. Способ по п. 36, в котором нуклеотидная вставка содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ или κ человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.
64. Способ по п. 36, в котором стадию отбора (b) осуществляют с помощью анализа определения модификации аллеля (MOA).