Способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте
METHOD FOR CORRECTION OF CEREBRAL ISCHEMIA WITH RAPITALAM SUBSTANCE IN EXPERIMENTS

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и неврологии.
2+
По известным литературным источникам - увеличение концентрации внутриклеточного Са является результатом избыточного накопления глутамата во внеклеточном пространстве. Гибель нейронов происходит после последовательности биохимических реакций, которая получила название эксайтотоксичности. За этим следует дисбаланс между глутаматергическим возбуждением и ГАМК-эргическим торможением. В результате несвоевременной активации тормозных механизмов продолжается накопление внеклеточного глутамата, гибель нейронов, что приводит к более тяжелым проявлениям ишемии головного мозга [Domin H, Przykaza L, Jantas D, Kozniewska E, Boguszewski PM, Smialowska M (2016) Neuroprotective potential of the group III mGlu receptor agonist ACPT-I in animal models of ischemic stroke: In vitro and in vivo studies. Neuropharmacology 102: 276-294].
Наиболее вероятными механизмами нейропротекции являются ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, что в свою очередь защищает от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и снижение воспалительных эффектов [Avdeeva NV, Sidorova SA, Gudyrev OS, Osipova OA, Golubev IV (2019) Mechanism of neuroprotective effect of mGluR4 agonists. Research Results in Pharmacology 5(2): 43-47].
Предполагается, что препараты, влияющие на mGluR4 рецепторы, имеют потенциал при лечении болезни Паркинсона, аутизма и мозжечковой атаксии [Power EM, Empson RM (2014) Functional contributions of glutamate transporters at the parallel fibre to Purkinje neuron synapse-relevance for the progression of cerebellar ataxia. Cerebellum and Ataxias 1: 3]. В галоперидоловой и резерпиновой моделях паркинсонизма введение агонистов mGluR4 приводило к уменьшению симптомов [Niswender CM, Conn PJ (2010) Metabotropic glutamate receptors: physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 50: 295-322].
Актуальным является поиск высокоэффективных препаратов для лечения ишемии головного мозга [Спасов A.A., Федорчук В.Ю., Гурова Н.A. и др. Методологический подход для изучения нейропротекторной активности в эксперименте. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2014; 4: 39-45]. Перспективным представляется исследование субстанции рапиталама для коррекции ишемии головного мозга в эксперименте в лечебных целях, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов. Рапиталам представляет собой N-[(4-chlorophenyl)methyl]-1,6-dihydro-4-methoxy-1-(2-methylphenyl)-6-oxo-3-pyridazinecarboxamide, С20Н18ClN3O3 [Авдеева, Н.В. Исследование некоторых аспектов мутагенного действия фармацевтической субстанции лекарственного средства - Рапиталам. Авдеева Н.В., Корокин М.В., Покровский М.В. Современные проблемы науки и образования. 2017. № 3. С. 136].
Известен способ коррекции тремора в эксперименте (патент на изобретение RU 2678977, публ.05.02.2019), включающий однократное ежедневное внутрижелудочное введение крысам корригирующего агента в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней, а в последний день эксперимента однократное внутрибрюшинное введение оксотреморина в дозе 1,5 мг/кг в объёме 0,5 мл/кг через 30 минут после введения корригирующего агента. При этом в качестве корригирующего агента используют субстанцию лекарственного средства Рапиталам, который является модулятором mGluR4 рецепторов. Изобретение приводит к выраженной коррекции оксотреморин-индуцированного тремора, подтверждаемой длительностью латентного периода и тремора, суммарной оценкой выраженности тремора в баллах и процентом животных с тремором в группе, с учетом его длительности.
В данном изобретении отсутствует информация о возможности коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте.
Известен способ профилактики церебральной ишемии (патент на изобретение RU 2696203, публ.31.07.2019), включающий воспроизведение четырехсосудистой модели патологии и введение крысам-самцам линии Wistar 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг, который вводят однократно за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно через зонд в качестве прекондиционирующего агента, а через 60 минут проводят моделирование церебральной ишемии путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий.
Основным недостатком способа является то, что в нем описана только профилактика церебральной ишемии путем прекондиционирования 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином на крысах линии Wistar и нет данных по коррекции 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином ишемических повреждений головного мозга после моделирования патологии (посткондиционирование), что гораздо чаще встречается в практике. Помимо этого, не приведены данные по применению 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина для лечения церебральной ишемии.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, обладающего направленным действием на mGluR4 рецепторы, основанным на ингибировании продукции глутамата в черной субстанции, которая в свою очередь защищает от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и снижении воспалительных эффектов [Avdeeva NV, Sidorova SA, Gudyrev OS, Osipova OA, Golubev IV (2019) Mechanism of neuroprotective effect of mGluR4 agonists. Research Results in Pharmacology 5(2): 43-47].
Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ коррекции ишемии головного мозга субстанцией рапиталама в эксперименте, включающий воспроизведение четырехсосудистой модели ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий и введение крысам-самцам линии Wistar фармакологического агента, причем в качестве фармакологического агента используют субстанцию рапиталама в дозе 10 мг/кг, вводимую внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно внутрибрюшинно в течение 14 суток суммарно.
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что:
- в качестве церебропротектора с лечебной целью вводят субстанцию рапиталама, являющегося модулятором mGluR4 рецепторов.
- эффективность субстанции оценивается всесторонне: исследуются неврологический дефицит животного, поведенческие реакции, уровень двух специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE.
- с помощью электроэнцефалографии (ЭЭГ) производится контроль правильно выполненной модели патологии.
- способ приводит к выраженной коррекции ишемических повреждений головного мозга в эксперименте на крысах-самцах линии Wistar при выбранном режиме введения субстанции рапиталама.
Способ обеспечивает выраженную коррекцию ишемии головного мозга путем направленного действия рапиталама на mGluR4 рецепторы, в результате чего происходит ингибирование продукции глутамата в черной субстанции, защита от глутамат-опосредованной эксайтотоксичности и угнетение воспалительных эффектов.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Эксперимент выполнен на 40 половозрелых самцах крыс линии Wistar 5-6-месячного возраста массой 180-210 г. Содержание животных соответствовало всем правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований на территории РФ. Животные содержались в стандартных условиях, соответствующих санитарным правилам (№ 1045-73), утвержденным МЗ СССР 06.04.73 г. по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009. Вивисекцию проводили по этическим принципам обращения с лабораторными животными «European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No.123».
В эксперимент вошло 4 группы крыс: 1) интактные (n=10), 2) ложнооперированные (n=10), 3) с тотальной церебральной ишемией (n=10), 4) с тотальной церебральной ишемией и введением рапиталама в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования церебральной ишемии ежедневно в течение 14 суток (n=10).
Наркотизацию животных выполняли внутрибрюшинным введением золетила 60 мг/кг и хлоралгидрата 150 мг/кг.
Все эксперименты были выполнены в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств при нарушениях мозгового кровообращения. В работе была использована модель патологии, при которой осуществляли временную окклюзию двух общих сонных артерий на 4 минуты, с предварительной коагуляцией двух вертебральных артерий. Оценка адекватности выполнения окклюзии артерий, кровоснабжающих мозг, осуществлялась с помощью регистрации электрической активности головного мозга животного на приборе Biopac Systems Inc. MP150 EEG100C [Tadalafil as an agent of pharmacological preconditioning in ischemic - reperfusion brain injury / Martynova O.V. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. - 2017. - Vol.3, №3. - Р. 20-36].
Метод осуществляли при помощи программы AcqKnowledge 4.2. Критерием правильно выполненной методики являлось уменьшение амплитуды ЭЭГ.
Протокол исследования включал следующие этапы: моделирование ишемии головного мозга; оценку ЭЭГ животного; оценку поведенческих реакций (до моделирования патологии и на 2, 7 и 14 сут. после моделирования патологии); неврологического дефицита на 1, 3, 7 и 14 сут после моделирования патологии; определение уровня S100b и NSE на 3 сутки после моделирования патологии.
О выраженности церебропротекторного эффекта судили по тяжести неврологического дефицита, поведенческого статуса, уровню специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE.
Для всех данных была применена описательная статистика. Полученные данные проверены на нормальность распределения. С помощью критерия Шапиро-Уилка определяли тип распределения. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (m). В случаях ненормального распределения были рассчитаны медиана (Me) и квартильный размах (QR). Межгрупповые различия анализировались параметрическими (t-критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами, в зависимости от типа распределения. Различия были определены при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполнен с помощью программного обеспечения Statistica 10.0.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Для оценки неврологического статуса крыс использовали несколько методов:
1. Балльную шкалу оценки инсульта McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной, результаты которой представлены в таблице 1. Внутри группы крыс с признаками неврологического дефицита подразделяли на животных с легкой, средней и тяжелой симптоматикой неврологического дефицита. Если у животного присутствовало несколько признаков неврологического дефицита, то баллы суммировали. За контроль принимали данные, полученные от животных с тотальной ишемией головного мозга. При оценке выраженности неврологического дефицита по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной на первые сутки после моделирования патологии в контрольной группе наблюдался неврологический дефицит средней степени тяжести (2,73 ± 0,14 балла). У животных регистрировались вялость и замедленность движений, тремор, наличие полуптозов и птозов глаз, слабость конечностей, манежные движения, паралич задней левой лапы. В группе с введением субстанции рапиталама на первые сутки после моделирования ишемии выявлено достоверно более низкое значение неврологического дефицита, чем в контрольной группе (p<0,05). В группе с введением субстанции рапиталама на 3 сутки значение достоверно отличалось от контрольной группы (p<0,05). В контрольной группе на 7 и 14 сутки сохранялся паралич задней левой конечности и полуптоз, птоз правого глаза. В группе с введением рапиталама на 7 и 14 сутки сохранялся лишь полуптоз правого глаза. Активность животных нарастала более стремительно в группе с рапиталамом.
Таблица 1
Влияние субстанции рапиталама на динамику тяжести неврологических нарушений по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте, баллы (М±m; n=10)
<b>Период</b>
<b>Группы</b>
<b>Интактные</b>
<b>Ложнооперированные</b>
<b>Контроль</b>
<b>Коррекция рапиталамом,</b><b>10 мг/кг</b>
1 сут
0
0
2,73±0,14
1,53±0,26*
3 сут
0
0
1,28±0,19
0,88±0,35*
7 сут
0
0
0,85±0,30
0,68±0,26
14 сут
0
0
0,51±0,24
0,36±0,22
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
При анализе поведенческих реакций крыс с введением рапиталама в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) выявлено, что животные ведут себя активнее, чем крысы контрольной группы. Уже на 2 сутки эксперимента в группе с введением рапиталама наблюдается статистически значимые изменения следующих параметров: снижение времени пребывания в тёмном рукаве ПКЛ, увеличение времени пребывания животных в светлом рукаве ПКЛ, увеличение количества стоек. Количество свешиваний в ПКЛ достоверно увеличивалось на 2 сутки эксперимента в группах с введением рапиталама в дозе 10 мг/кг по сравнению со значениями контрольной группы (р<0,05). На 7-е и 14-е сутки наблюдается статистически значимое улучшение всех изучаемых параметров в группе с рапиталамом по сравнению с контрольной группой (р<0,05) (таблица 2).
Таблица 2
Влияние субстанции рапиталама на поведенческую активность животных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (М±m; n=10)
<b>Критерий</b>
<b>Период</b>
<b>Группы</b>
<b>Интактные</b>
<b>Ложнооперированные</b>
<b>Контроль</b>
<b>Коррекция рапиталамом,</b><b>10 мг/кг</b>
<b>Темный  рукав, </b><b><i>t</i></b>
2 сут.
153,2±2,0
154,1±2,2
169,4±1,5
158,6±1,7*
7 сут.
153,2±1,8
153,6±1,7
165,6±2,4
155,8±2,4*
14 сут.
154,5±1,8
155,5±2,0
164,8±2,6
158,6±1,7*
<b>Светлый рукав, </b><b><i>t</i></b>
2 сут.
23,8±1,7
24,1±1,5
11,6±1,7
18,2±0,8*
7 сут.
23,8±1,5
23,4±1,3
12,7±1,0
20,5±1,2*
14 сут.
22,8±1,6
22,2±1,4
13,7±1,3
21,5±1,0*
<b>Стойки, шт.</b>
2 сут.
10,0±0,5
10,4±0,8
4,6±0,33
7,1±0,3*
7 сут.
9,9±0,6
9,2±0,6
5,3±0,2
8,0±0,4*
14 сут.
9,8±0,7
9,4±0,8
5,6±0,3
8,7±0,4*
<b>Свешивания, шт.</b>
2 сут.
4,8±0,4
4,8±0,5
1,5±0,3
2,0±0,2*
7 сут.
4,9±0,2
4,6±0,3
1,7±0,2
2,9±0,3*
14 сут.
5,0±0,5
5,2±0,4
1,8±0,2
3,9±0,5*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
Результаты теста актиметрии представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние субстанции рапиталама на поведенческую активность животных в тесте актиметрии при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (М±m; n=10)
<b>Критерий</b>
<b>Период</b>
<b>Группы</b>
<b>Интактные</b>
<b>Ложнооперированные</b>
<b>Контроль</b>
<b>Коррекция рапиталамом,</b><b>10 мг/кг</b>
<b>Общая активность, у.е.</b>
2 сут.
940,07±25,94
932,11±22,03
410,41±27,9
453,20±18,86
7 сут.
945,83±18,77
941,15±17,01
414,56±25,87
459,69±23,76
14 сут.
943,80±19,6
932,46±13,5
419,9±13,0
490,4±14,2*
<b>Стериотипы движения, у.е.</b>
2 сут.
77,02±2,82
75,05±2,99
29,47±2,75
35,65±3,35*
7 сут.
77,26±1,45
78,56±3,09
30,41±2,28
41,13±3,04*
14 сут.
78,0±2,8
78,9±2,5
30,9±1,8
45,3±2,1*
<b>Макси-мальная скорость, у.е.</b>
2 сут.
43,18±2,18
44,67±3,02
22,25±2,45
26,71±3,34
7 сут.
43,62±2,53
41,32±2,88
22,78±2,39
30,94±2,36*
14 сут.
43,74±1,61
44,05±2,63
22,81±2,04
35,19±2,71*
<b>Общая дистанция, у.е.</b>
2 сут.
2220,4±101,1
2206,8±98,2
772,17±31,01
805,97±23,75
7 сут.
2289,8±120,9
2198,1±114,1
774,0±25,5
846,6±29,7*
14 сут.
2329,9±182,5
2300,3±167,5
780,4±18,4
1671,0±180,7*
<b>Время отдыха, у.е.</b>
2 сут.
89,81±5,39
91,09±6,90
196,39±6,08
157,08±4,73*
7 сут.
89,8±3,5
90,8±3,7
190,3±4,7
149,6±5,6*
14 сут.
89,8±4,0
89,8±4,2
185,0±6,4
120,9±7,2*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
В связи с тем, что оптимальная концентрация S100b и NSE наблюдается во временном промежутке с 24 часов до 72 часов, кровь брали на 3-и сутки после моделирования патологии. Результаты исследования на биохимические маркёры повреждения головного мозга представлены в таблице 4.
Таблица 4
Влияние субстанции рапиталама на концентрацию биохимических маркёров повреждения головного мозга в крови крыс при коррекции ишемии головного мозга в эксперименте (M±m; n=10)
<b>Показатели</b>
<b>Группы</b>
<b>Интактные</b>
<b>Ложнооперированные</b>
<b>Контроль</b>
<b>Коррекция рапиталамом,</b><b>10 мг/кг</b>
<b>S100b мкг/л</b>
0,725±0,17
0,698±0,14
1,981±0,21
0,660±0,07*
<b>NSE нг/мл</b>
0,364±0,10
0,301±0,08
0,541±0,11
0,252±0,04*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.
Таким образом, в предлагаемом способе введение субстанции рапиталама в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования патологии в первый день эксперимента и после моделирования ишемии головного мозга ежедневно в течение 14 суток в лечебных целях приводит к выраженной коррекции ишемии головного мозга.