Половые особенности морфологии некоторых структур мозга и содержания в них стероидных гормонов в процессе обучения условному рефлексу старых крыс.

ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ СТРУКТУР МОЗГА И СОДЕРЖАНИЯ В НИХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ПРОЦЕССЕ ОБУЧЕНИЯ УСЛОВНОМУ РЕФЛЕКСУ СТАРЫХ КРЫС

В.А. Сашков1, Н.Б. Сельверова2 Институт возрастной физиологии РАО, Москва

Исследована динамика морфологии гипоталамуса, гиппокампа, миндалины, поясной извилины и лобной коры, а также содержание в них стероидных гормонов в процессе формирования условного рефлекса в водном лабиринте Морриса у старых крыс. Обнаружена секс-диморфная организация взаимосвязей уровня обученности крыс в инволюционном периоде развития с содержанием кортикостерона, тестостерона и эстрадиола в лимбических отделах мозга. Проведенный корреляционный и морфологический анализ подтверждает представления об избирательном вовлечении стероидных гормонов и отдельных структур мозга в реализации процессов обучения и памяти у старых крыс.

Ключевые слова: возраст, обучение, условные рефлексы, головной мозг, стероидные гормоны, крысы

The paper studies morphological changes in hypothalamus, hippocampus, amygdala, cingular girus and frontal cortex, as well as concentration of steroid hormones therein, during conditional learning of old rats in Morris’s water labyrinth. The experiment revealed sex-dependent interconnection between reflex formation level and concentration of corticosterone, testosterone, estradiol in brain limbic structures of rats in involution period of development. The correlation and morphological analyses performed confirm the hypothesis of selective involvement of steroid hormones and separate brain structures in the learning processes and memory in old rats.

Процесс старения сопровождается изменением гормонального баланса и реорганизацией функциональных систем мозга, обеспечивающих приспособительное поведение, процессы обучения и памяти. При этом изменение содержания и соотношения стероидных гормонов в инволюционном периоде развития определенным образом влияет на морфологию и функции нервной ткани, может являться причиной дисфункций регуляторных систем мозга и как следствие - изменений в поведении, обучении и хранении энграм памяти [10]. Рецепторы к кортикостероидам, андрогенам и эстрогенам обильно присутствуют в гиппокампе, гипоталамусе, миндалине и неокортексе [13] - структурах, вовлеченных в формирование вегетативных и информационных компонентов условного рефлекса. Не исключается также возможность образования стероидных гормонов клеточными элемен-

Контакты: 1 В.А. Сашков, ст.научн.сотр.лаборатории возрастной физиологии; E-mail: SASHKOV@mail.ru

2 Н.Б. Сельверова, зав. лаборатории возрастной физиологии

тами самого мозга и их вовлечение в реализацию высших функций мозга. Подтверждение этих предположений требует постановки специальных экспериментов на лабораторных животных. В связи с этим целью данной работы явилось выяснение особенностей морфологии и уровня стероидных гормонов в гипоталамусе, гиппокампе, миндалине, поясной извилине и лобной коре в процессе формирования условного рефлекса у самцов и самок крыс в инволюционном периоде развития. Выбор данных структур мозга для биохимического и морфологического анализа основан на том, что именно эти области мозга вовлечены в контроль регуляции поведения, обучения и памяти [5].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 60 белых крысах линии Вистар в возрасте 1,5-2 лет после рождения, полученных из питомника «Столбовая».

Условные рефлексы вырабатывали в водном лабиринте Морриса [11] в течение 5 дней по 5 попыток в день. Установка для тестирования представляет собой бассейн диаметром 145 и высотой 50 см, заполняемый водой (24-26 °С) на глубину 26 см. Устойчивую платформу для избегания (14 Х 14 см) помещали в центр одного из четырех условных секторов бассейна. Поверхность платформы была на 3 см ниже поверхности воды. Выпущенная в воду крыса, плавая в бассейне, должна была найти скрытую под водой платформу и взобраться на нее. Если животное не избегало воды в течение 2 мин, эксперимент автоматически прерывался и крысу вынимали из бассейна. Интервал между попытками составлял 30-60 мин. При этом определяли латентный период избегания воды и процент обученности.

Интактные животные, а также крысы спустя 5 дней после выработки условного рефлекса подвергались гильотинированию. После этого происходил забор стекающей крови и выделение гипоталамуса, гиппокампа, миндалины, поясной извилины и лобной коры на холоде. Часть образцов мозга подвергалась гомогенизации. Затем пробы крови и мозга центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант замораживали и сохраняли при Ь = -30°С для последующего определения уровней тестостерона и эстрадиола методом ИФА с использованием наборов фирмы DRG (США). Вторая часть образцов мозга фиксировалась в 10% растворе формалина для последующей морфологической оценки указанных структур мозга [3, 4]. Для этого был использован микротом «ТЕХНОМ МЗП-1003» и замораживающее устройство «ТЕХНОМ ОМТ 0228». Срезы наклеивались на стекла и окрашивались гематоксилин-эозином без депарафинирования. Окрашенные срезы заключались в бальзам и высушивались. Изучение срезов проводили под микроскопом с фиксацией обнаруженных изменений путем получения фотографий с помощью комплекса визуализации изображения на основе цифровой фотокамеры.

Полученные данные были обработаны с использованием статистической программы SPSS (13.00). Оценка достоверности различий осуществлялась с использованием Ь-критерия Стьюдента (р<0,05). Для выявления зависимости уровня обученности с содержанием кортикостерона, тестостерона и эстрадиола в лимбических структурах мозга в процессе обучения условному рефлексу старых крыс применялся корреляционный анализ по методу Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Условнорефлекторная деятельность

Обучение условной реакции в водном лабиринте Морриса показало, что самцы старых крыс на пятый день тестируемого периода достигают 91,7±4,06 %-ного уровня обученности, а величины латентных периодов нахождения животными скрытой платформы снижаются до 15-13 с (рис. 1). На протяжении всех пяти дней тестирования у этих животных выявлено постепенное повышение уровня обученности и снижение латентных периодов избегания воды.

Самки старых крыс обучаются условному рефлексу в водном лабиринте Морриса быстрее по сравнению с самцами. Это проявляется прогрессивным повышением уровня обученности и снижением латентных периодов нахождения скрытой платформы. К четвертому дню формирования условнорефлекторного навыка они не допускают ошибок в поиске платформы и достигают 100%-ного уровня обученности. При этом они имеют достоверно более низкие значения латентных периодов избегания воды по сравнению с самцами (рис. 1).

Стероидные гормоны в мозге

Определение концентрации кортикостерона у крыс в возрасте 1,5-2 лет позволило выявить, что до обучения условному рефлексу его значения в плазме крови, гиппокампе, миндалине и поясной извилине достоверно выше у самок по сравнению с самцами (рис. 2). В процессе обучения условному рефлексу в водном лабиринте Морриса содержание кортикостерона у старых крыс обоего пола достоверно снижается во всех изученных структурах мозга. Однако его уровень в плазме крови у самцов крыс в возрасте 1,5-2 лет в процессе выработки условной реакции избегания воды достоверно не изменяется по сравнению с контролем и снижается у старых самок (рис. 2). При этом в процессе формирования условного рефлекса уровень кор-тикостерона имеет более высокие значения у самок в гиппокампе, миндалине, поясной извилине и лобной коре, а его значения в плазме крови и гипоталамусе, напротив, ниже у старых самок, чем у самцов этого возраста (рис. 2).

Содержание тестостерона во всех изученных структурах мозга достоверно выше у самцов старых крыс по сравнению с самками не только в группе контроля, но и в процессе обучения условному рефлексу (рис. 3). В процессе формирования условной реакции избегания воды у старых крыс обоего пола содержание тестостерона в гипоталамусе, гиппокампе, миндалине, поясной извилине и лобной коре достоверно увеличивается. Однако его плазменный уровень при обучении условному рефлексу у самцов крыс в возрасте 1,5-2 лет практически не изменяется, достоверно возрастая у самок (рис. 3).

Определение концентрации эстрадиола показало, что его значения у самок контрольной группы достоверно выше, чем у самцов, в плазме крови и миндалине. Однако уровень эстрадиола в гипоталамусе, гиппокампе, поясной извилине и лобной коре, напротив, достоверно выше у самцов старых крыс по сравнению с самками этого возраста (рис. 4). В процессе формирования условного рефлекса в водном лабиринте Морриса содержание эстрадиола у самцов старых крыс повышается в гипоталамусе, миндалине и лобной коре, снижаясь в гиппокампе и

Уровень обученности

100 80 60 40 20 О

1 2 3 4 5

Латентные периоды избегания

День 1

£ .

День 2

- -ж. .

1 2 3 4 5

День 3

День 4

День 5

Рис. 1. Половые особенности уровня обученности и величин латентных периодов избегания у старых крыс в процессе обучения условному рефлексу в водном

лабиринте Морриса.

Примечание: сплошной линией обозначены показатели самцов, пунктирной - самок.

300

200

100

**/*

Контроль до обучения УР

Через 5 дней после обучения УР

400

300

200

100

п.

Контроль до обучения УР

Через 5 дней после обучения УР

Г иппокамп

400

300

200

100

Контроль до обучения УР

Через 5 дней после обучения УР

400

300

200

100

Миндалина

Контроль до обучения УР

Через 5 дней после обучения УР

400 300 200 100 0 -

Поясная извилина

Контроль до обучения УР

Через 5 дней после обучения УР

Лобная кора

400

300

200

* 100 -

Контроль до обучения УР

Через 5 дней после обучения УР

Рис. 2. Особенности уровня кортикостерона в плазме крови и в различных структурах мозга у старых самцов и самок крыс в процессе формирования условного рефлекса в водном лабиринте Морриса.

Примечание: по оси абсцисс - стадия эксперимента,

по оси ординат - уровень кортикостерона в плазме крови (нг/мл) и в различных структурах мозга (мкг/г);

столбцами белого цвета обозначен уровень кортикостерона у самцов, серыми - у самок;

* - р<0,05 по сравнению с самцами,

** - р<0,05 по сравнению с этапом обучения условному рефлексу;

УР - условная реакция.

0,6

ОД

0,2

0

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

0,6

0,4

ОД

о

Гиппокамп

Миндалина

0,6

0,4 - **

** * 0,2

1—1 **/* и 0 **/*

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

Поясная извилина

0,6

0,4

0,2

0

Лобная кора

**/*

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

Рис. 3. Особенности уровня тестостерона в плазме крови и в различных структурах мозга у старых самцов и самок крыс в процессе формирования условного рефлекса в водном лабиринте Морриса.

Примечание: по оси абсцисс - стадия эксперимента,

по оси ординат - уровень тестостерона в плазме крови (нг/мл) и в различных структурах мозга (мкг/г);

столбцами белого цвета обозначен уровень тестостерона у самцов, серыми - у самок;

* - р<0,05 по сравнению с самцами,

** - р<0,05 по сравнению этапом обучения условному рефлексу;

УР - условная реакция.

Плазма крови **/*

Контроль до обучения УР

Через 5 дней после обучения УР

20 - **

10 - **/*

—1 0 1 1 1

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

40 30 -20 10 -

Гиппокамп

**/*

П-П

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

Миндалина

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

Поясная извилина

**

**/* *

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения

Лобная кора

зо 20 -

Контроль до обучения УР Через 5 дней после обучения УР

Рис. 4. Особенности уровня эстрадиола в плазме крови и в различных структурах мозга у старых самцов и самок крыс в процессе формирования условного рефлекса

в водном лабиринте Морриса.

Примечание: по оси абсцисс - стадия эксперимента,

по оси ординат - уровень эстрадиола в плазме крови (пг/мл) и в различных структурах мозга (нг/г);

столбцами белого цвета обозначен уровень эстрадиола у самцов, серыми - у самок;

* - р<0,05 по сравнению с самцами,

** - р<0,05 по сравнению с этапом обучения условному рефлексу;

УР - условная реакция.

поясной извилине. У самок крыс при обучении условной реакции избегания воды уровень эстрадиола снижается в поясной извилине, но повышается в плазме крови, гипоталамусе, гиппокампе, миндалине и лобной коре. При этом выработка условного рефлекса сопровождается достоверно более высокими значениями исследуемого показателя в плазме крови, миндалине, гиппокампе и поясной извилине у самок старых крыс по сравнению с самцами. В гипоталамусе уровень эстрадиола у самок ниже, чем у самцов (рис. 4).

Морфологический контроль лимбических структур мозга

Осуществление морфологического контроля лимбических структур мозга у интактных крыс в возрасте 1,5-2 лет позволило выявить, что клеточные элементы гипоталамуса, миндалины, поясной извилины и лобной коры у крыс обоего пола не имеют каких-либо выраженных изменений. Однако срезы гиппокампа отличаются гиперемией кровеносных сосудов, а у самцов старых крыс выявлено также интенсивное окрашивание ядер нейронов по сравнению с самками (рис. 5).

В процессе формирования условной реакции избегания воды у самцов крыс в возрасте 1,5-2 лет гиперемия выявлена уже не только в гиппокампе, но и в гипоталамусе, миндалине и поясной извилине. У самок этого возраста гипоталамус также отличается кровенаполнением крупных сосудов и вместе с гиппокампом -интенсивным окрашиванием ядер клеток. На срезах миндалины обученных самок выявлено умеренное расширение миелиновых оболочек. Срезы лобной коры у животных обоего пола, а также поясной извилины самок не имеют выраженных особенностей по сравнению с контролем (рис. 6).

Корреляционные связи содержания стероидных гормонов в мозге с уровнем обученности старых крыс

Изучение взаимосвязи уровня обученности с содержанием стероидных гормонов в лимбических структурах мозга у старых крыс обоего пола. Так, в процессе формирования условного рефлекса в водном лабиринте Морриса у 1,5-2-годова-лых самцов крыс выявлена зависимость уровня обученности от содержания кор-тикостерона в гипоталамусе (г = -0,55) и лобной коре (г = -0,79) и тестостерона в гипоталамусе (г = 0,6). У самок крыс в возрасте 1,5-2 лет после рождения при обучении условной реакции избегания воды не выявлено взаимосвязи уровня обученности с содержанием нейроактивных стероидов в мозге по сравнению с самцами этого возраста.

Таким образом, результаты проведенных исследований указывают на замедление процессов формирования условной реакции избегания воды у самцов крыс в инволюционном периоде развития по сравнению с самками этого возраста. Это может быть связано как с изменением гормонального баланса в процессе старения, так и с изменением активности нейромедиаторных систем мозга, оптимальное состояние которых необходимо для эффективного осуществления условнорефлекторной деятельности и механизмов памяти [2].

Выявленное нами повышение значений тестостерона в гипоталамусе, гиппокампе, миндалине, поясной извилине и лобной коре при его неизменном плазмен-

Рис. 5. Половые особенности морфологии некоторых структур мозга у старых

интактных крыс.

Гиппокамп - самцы

Гиппокамп - самки

У *« * -Г' * * ’(

Миндалина - самцы

*- 4

і * • ‘>

4 /»* *: .

• » ,

% * V

Миндалина - самки

Поясная извилина - самцы

- . ь Ш-* ,  4 . " ’  /* -. . * . 1- ^ г'. Ц ^ ч *

т * Ч

г ^ «ч - ку ' ; Л'.' «.*-*. 1

' V* *  ^ * *

г ‘ * * т * «

ль- ^ ^ + 4 ' *"* "*

Поясная извилина - самки

Рис. 6. Половые особенности морфологии некоторых структур мозга у старых крыс в процессе формирования условного рефлекса в водном лабиринте Морриса.

ном уровне, как у самцов, так и у самок старых крыс в процессе формирования условного рефлекса указывает на возможность образования этого стероида в мозге. Полученные данные вполне соответствует результатам предыдущих исследований, согласно которым гиппокампальные пирамидальные нейроны, в частности, имеют все необходимые механизмы для синтеза тестостерона и ряда других нейроактивных стероидов [12].

Описанные изменения в динамике мозговых уровней стероидных гормонов коррелируют с уровнем обученности у самцов старых крыс. При этом повышение содержания тестостерона в гипоталамусе при обучении условному рефлексу избегания воды положительно коррелирует с уровнем обученности, а достоверное снижение концентрации кортикостерона в гипоталамусе и лобной коре в процессе формирования временной связи разнонаправленно взаимосвязано с количеством правильных ответов у этих животных.

Полученные нами данные не только подтверждают возможность образования тестостерона в мозге, но их указывает на избирательное и секс-диморфное вовлечение стероидных гормонов в процессы обучения и памяти у старых крыс. Эти факты соответствуют результатам предыдущих исследований, согласно которым гомеостаз глюкокортикоидов в мозге необходим для оптимальной организации процессов поведения, обучения и памяти [6], а увеличение их уровня у стареющих крыс сопровождается нарушением формирования временных связей и консолидации памяти [7].

Изменение уровня и соотношения половых стероидов в процессе старения также отражается на процессах организации условнорефлекторной деятельности. Возрастное снижение уровня андрогенов у самцов старых крыс приводит к существенной потере синапсов в гиппокампе и вызывает изменения нейротрансмиссии в лобной коре, сопровождаясь нарушениями условнорефлекторной деятельности [8]. Эти факты вполне соответствуют результатам настоящего исследования, указывающего на замедление процессов формирования условного рефлекса в водном лабиринте Морриса у самцов старых крыс. Предполагается, что половые гормоны обеспечивают оптимальную нейрохимическую среду, модулируя процессы обучения и памяти [9].

Данные проведенных нами морфологических исследований подтверждают гипотезу секс-диморфного вовлечения лимбических структур мозга в процессы обучения и памяти у старых крыс. Так, у самцов инволюционном периоде развития активация гипоталамуса, гиппокампа, миндалины и поясной извилины и их вовлечение в процессы формирования условного рефлекса осуществляется за счет повышенного регионального кровообращения. У самок этого возраста, по сравнению с самцами, при обучении условной реакции избегания воды выявлено расширение миелиновых оболочек миндалины и интенсивное окрашивание ядер нейронов гиппокампа, указывая на активацию проводниковых и ядерных процессов в нейронах этих мозговых образованиях. Приведенные данные свидетельствуют, что механизмы активации отдельных структур мозга и их вовлечение в процессы формирования временных связей имеют секс-диморфную организацию. При этом важным звеном в организации адаптивного поведения и формирования времен-

ных связей является оптимальное функциональное состояние взаимодействующих нервных центров и нейроэндокринных механизмов регуляции [1].

ВЫВОДЫ

1. У самцов крыс в инволюционном периоде развития выявлено замедление процессов формирования условной реакции избегания воды по сравнению с самками этого возраста.

2. Увеличение содержания тестостерона во всех изученных структурах мозга (гипоталамус, гиппокамп, миндалина, поясная извилина, лобная кора) у старых крыс обоего пола при его неизменном плазменном уровне в процессе обучения условному рефлексу свидетельствует о возможности его образования в мозге.

3. Получены новые данные, свидетельствующие о существовании корреляционных связей отрицательной направленности между уровнем обученности самцов старых крыс с содержанием кортикостерона в гипоталамусе и лобной коре, а также положительной корреляции числа правильных ответов со значениями тестостерона в гипоталамусе.

4. У самцов старых крыс активация гипоталамуса, гиппокампа, миндалины и поясной извилины и их вовлечение в процессы обучения и памяти осуществляется преимущественно за счет повышенного наполнения кровеносных сосудов. Самки этого возраста по сравнению с самцами при обучении условному рефлексу отличаются активацией проводниковых процессов в миндалине и ядерных процессов в гиппокампе.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Котляр Б.И. Электрофизиологическое исследование формирования временной связи на системном и нейронном уровнях. // Автореф. д-ра биол. наук. -М. -1971. -30 с.

2. Раевский В.В. Онтогенез медиаторных систем мозга. // Автореф. д-ра биол. наук. -М. -1988. -35 с.

3. Тимченко, Л.Д. Основы микроскопической техники для биолога: Учебное пособие / Л.Д. Тимченко, В.Н. Вакулин - Ставрополь: Изд - во СГУ, 2005. - 164 с.

4. Сулейманов, С.М. Методы морфологических исследований (методическое пособие) / С.М. Сулейманов, П.А. Паршин, Ю.П. Жарова, и др. - Воронеж, 2000.

5. Хамильтон Л.У. Основы анатомии лимбической системы крысы. М.: Изд-во МГУ, 1984. 184 с.

6. De Kloet E.R., Rots N.Y., Cools A.R. Brain-corticosteroid hormone dialogue: slow and persistent. // Cell. Mol. -1996. -V. 16. -P. 345-356.

7. Hibberd C., Yau J.L.W., Seckl J.R. Glucocorticoids and the ageing hippocampus. // J. Anat. -2000. -V. 197. -P. 553-562.

8. Janowsky J.S. The role of androgens in cognition and brain aging in men. // Neuroscience. -2006. -V. 138. -№ 3. -P. 1015-1020.

9. Jorge J.C., Ve^zquez K.T., Ramos-Ortolaza D.L., Lorenzini I., Marrero J., Mal-donado-Vlaar C.S. A Testosterone Metabolite Is Rewarding to Ovariec-tomized Female Rats. // Behavioral Neuroscience. -2005. -V. 119. -№ 5. -P. 1222-1226.

10. Kolata O.B. Sex hormones and brain development. // Science. -1979. -V. 205. -№ 4410. -P. 985-987.

11. Morris RJ. Development of water-mare procedure for studying spatial learning in the rat. // Methods. -1984. -V. 11. -P. 47-60.

12.Mukai H., Takata N., Ishii H.T., Tanabe N., Hojo Y., Furukawa A., Kimoto T., Kawato S. Hippocampal synthesis of estrogens and androgens which are paracrine modulators of synaptic plasticity: synaptocrinology. // Neuroscience. -2006. -V. 138. -№ 3. -P. 757-764.

13. Rupprecht R. Neuroactive steroids: mechanisms of action and neuro-psychopharmacological properties. - Psychopharmacology. - Volume 28. - Issue 2. -2003. - P. 139-168.