Биохимические и биофизические особенности изучения нуклеотидной последовательности LTR-области BLV

УДК 636.2:619:616.155.392

Ключевые слова: BLV, генотипирование, ПДРФ-анализ, LTR-область, медоты типирования BLV, олигонуклеотид-ные праймеры BLV

Key words: BLV genotyping, RFLP analysis, LTR-area, BLV typing methods, BLV oligonucleotide primers Батенёва Н. В., Смирнов П. Н., Хрипко Ю. И.

БИОХИМИЧЕСКИЕ И БИОФИЗИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗУЧЕНИЯ нуклеотидной последовательности LTR-ОБЛАСТИ BLV

BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL FEATURES OF STUDY NUCLEOTIDE SEQUENCE

OF LTR REGION OF BLV

ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» Адрес: 630039, Россия, г. Новосибирск, ул. Добролюбова, д. 160

Novosibirsk State Agrarian University Address: 630039, Russia, Novosibirsk, Dobrolubov street, 160

Батенёва Наталья Владимировна, к. б. н., зав. лабораторией энзимного анализа и ДНК-технологий

Bateneva Natalia V., PhD in Biological Sciences, Head of Molecular Diagnostics Laboratories Смирнов Павел Николаевич, д. в. н., проф., заслуженный деятель науки РФ, зав. каф. физиологии и биохимии человека и животных Smirnov Pavel N., Doctor of Veterinary Medicine, Professor, Honored Scientist of the Russian Federation, Head of the Dept. of Physiology and Biochemistry of Humans and Animals Хрипко Юрий Иванович, вед. инженер-биотехнолог лаборатории энзимного анализа и ДНК-технологий Khripko Yuriy I., Leading Biotechnology Engineer of Molecular Diagnostics Laboratories

Аннотация. Целью наших исследований стал поиск олигонуклеотидных праймеров фланкирующих LTR-область. До настоящего времени в единичных работах встречаются подобные исследования. Сложность подбора праймеров заключается в особенности нуклеотидной последовательности данного участка. Начало данной области состоит из большого количества аденина и тимина, в то время как окончание - гуанина и цитозина, что предполагает различие в температуре отжига праймеров в 6-8 °С в зависимости от выбранного участка. Мы проанализировали последовательности LTR-области 11 изолятов BLV, в том числе циркулирующих на поголовье скота на территории Российской Федерации. Подобрали наиболее специфичные и чувствительные праймеры, фланкирующие наиболее вариабельный участок LTR-области. Решили проблему с выбором участка генома провируса, максимально приблизив температурные профили каждого праймера. Результаты полученных нами исследований позволят использовать новые подходы в типировании провируса BLV в зависимости от «агрессивности» вируса.

Summary. The purpose of this study was to search the oligonucleotide primers flanking the LTR-region. So far, just a few articles have been dedicated to such research. The complexity of primers selection is connected with the features of nucleotide sequence of the site. The beginning of this area consists of a large quantity of adenine and thymine, while the end contains guanine and cytosine, which implies the difference between the primers annealing temperature of 6-8 °C depending on the selected area. We analyzed the sequences of LTR-region of 11 BLV isolates, including those circulating in the cattle stock in the territory of the Russian Federation. We selected the most specific and sensitive primers flanking the most variable site in LTR-region. We solved the problem of selecting the site of provirus genome making temperature profiles of each primer similar as much as possible. The results of our studies will enable the researchers to use new approaches to typing of BLV provirus depending on the "aggressiveness" of the virus.

Введение

С каждым годом появляется все больше публикаций, посвященных проблеме борьбы с лейкозом крупного рогатого скота. Некоторые авторы изучают эпизоотические особенности вируса, другие - структурные. Однако проблема до настоящего времени остается более чем актуальной во всем мире [1-10].

Часто в оздоровленных ранее хозяйствах, племенных комплексах появляются

новые вспышки инфекции. Данный факт интересует ученых во всем мире. Некоторые из них высказывают гипотезу о том, что вирус ВЦУ находится в организме во временном «резервуаре», которым являются клетки крови, за исключением лимфоцитов [5-7, 9]. Другие авторы утверждают, что на реализацию лейкозогенных потенций (тип течения) оказывают влияние структурные изменения ВЦУ [1-2, 10].

Так, при совместных исследованиях группы ученых (Италии, Польши, Аргентины) были получены результаты: ученые сообщили, что на агрессивность вируса и тип течения инфекции оказывают влияние нуклеотидные замены в геноме вируса, которые находятся в CRE-области (являются транскрипционными активаторами GACGTCA, TGACG, GCA, TGACCTCA). Именно эти замены являются идентичными для BLV и HTLV провирусов и приводят к изменению поведения вируса, за исключением «TGACCTCA» замены в последовательности «TGACGTCA». Замена вышеуказанного нуклеотида в последовательности на соответствующий в последовательности HTLV препятствует репликации вируса в естественных условиях [5, 10].

В трудах ряда ученых опубликованы последовательности олигонуклеотидных прай-меров, фланкирующих более обширный участок провируса BLV [3, 8, 10], однако захватывающие дополнительно еще более 500 bp, что в итоге приводит к невосприимчивости праймеров (снижению чувствительности) к некоторым субтипам провируса, в связи с чем возникла необходимость в конструировании более чувствительных прай-меров [1].

Материалы и методы

Объектом исследования являлся крупный рогатый скот Динского района Краснодарского края. Материалом послужили пробы крови. Забор крови осуществляли при помощи стерильных вакуумных пробирок. В дальнейшем из крови выделяли ДНК с использованием наборов AmpliSens согласно инструкции к наборам. Полимеразную цепную реакцию ставили в 25 мкл реакционной смеси: буфер (х10) - 5 мкл, смесь dNTP - 1 мкл, Pr1 - 1,5 мкл, Pr2 - 1,5 мкл, ДНК - 1 мкл, Taq-полимераза - 0,5 мкл, SG - 0,5 мкл, ТЕ-буфер - до 25 мкл. Олигонуклеотидные прай-меры: 5' CAGAATTGGTTGCTAGCGGG 3'; 5'- CCA GAA GCG TTC TCC TCC TG -3'

Температурный профиль: 2 min - 95 °C; (30 s - 95 °C; 30 s - 64 °C; 30 s - 72 °C) -40 циклов; 3 min - 72 °C.

Результаты исследований

Мы проанализировали наиболее вариабельные участки типов и некоторых субтипов BLV, исключили их из областей, фланкируемых праймерами. При помощи программы oligo (NBCI) подобрали последовательность праймеров, в дальнейшем изменяли участки, фланкируемые праймера вручную, анализируя последовательность по составу. Подобрали наиболее сопоставимые по температуре отжига олигонуклеотиды.

Результатом нашего поиска стали следующие последовательности: 5' CAGAATTGGTTGCTAGCGGG 3'; 5'- CCA GAA GCG TTC TCC TCC TG -3', адаптировали по температурно-временным параметрам (рис. 1). Температуру отжига подбирали в соответствии с нуклеотидным составом последовательности, для расчета температуры использовали приложение из базы NBCI. В дальнейшем для более точного выбора температурно-временных параметров ставили реакцию с применением температурного градиента от 59 °С до 73 °С.

Температурный профиль:

Temp Time Gradient [°C]

95 °C 2 min

95 °C 30 s

66 °C 30 s 14 °C

72 °C 30 s

72 °C 10 min

4 °C pause

S-U3HU5 3-UÎRUS

I II III

'-1-'

TRE

Рис. 1. Схема участка провируса BLV, фланкируемого олигонуклеотидными праймерами.

Поставили 3 реакции PCR с использованием красителя SuberGreen. После получения данных определили температуру плавления праймеров, которая составила 64 °C. Поставили контрольную реакцию с исполь-

зованием профиля с рассчитанной температурой (рис. 2).

Температурный профиль: 2 min - 95 °C; (30 s - 95 °C; 30 s - 64 °C; 30 s - 72 °C) -40 циклов; 3 min - 72 °C.

IIS

I »TS

J

0.25

Рис. 2. График накопления копий провируса BLV с использованием праймеров, фланкирующих LTR-область (329 пн).

Далее опытным путем подбирали оптимальное соотношение концентрации праймеров к концентрации ДНК. Для этого поставили реакцию на четырех образцах в двух повторах с начальной концентрацией ДНК 50 нм, далее титровали в 10 раз. Визуально оценили графики выхода продуктов амплификации (рис. 3). Поставили контрольную реакцию с рассчитанной температурой плавления и соотношением праймера к ДНК.

krhltr

l/f~ 1 L^ L 7-

. / / A

// / / S/

// 1 1 / /

ТУ y ! / /

А / ! V

1 !

! ('

! 1/

,/ /

О 2 4 6 8 10 12 ¡4 15 IB го 22 24 26 2В 30 32 34 36 30 40 42 44 46 48 50 52 54

Рис. 3. График зависимости накопления копий провируса BLV от цикла амплификации при титровании в 10 раз.

Заключение

Данные олигонуклетидные праймеры можно использовать как для диагности-

ки BLV, так и с целью получения участков провируса для дальнейшего изучения структурных особенностей методами ПДРФ анализа или секвинирования. Использование короткого участка прови-русного генома является экономически более целесообразным методом изучения структурных особенностей BLV разных изолятов.

Список сокращений:

BLV - вирус лейкоза крупного рогатого скота;

HTLV - Т-лиффотропный вирус человека;

dNTP - дезоксинуклеозид трифосфат;

SG - краситель SYBR Green;

GLHA - полиморфизм длин рестрикци-онных фрагментов

Список литературы

1. Грачева, Н. В. Генотипическое разнообразие BLV по gag и env генам у крупного рогатого скота разных пород : дис. ... канд. биол. наук / Грачева Н. В. ; Институт Экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 2010. - 107 с.

2. Дробот, Е. В. Результаты изучения генотипиче-ского разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления : автореф. дис. ... канд. дис. / Дробот Е. В. - Новосибирск, 2007.

3. Петропавловский, М. В. Региональная мо-лекулярно-генетическая структура вируса лейкоза крупного рогатого скота / М. В. Петропавловский, И. М. Донник // Ветеринария Кубани. - 2010. -№ 3. - С. 12-13.

4. Garcia-Etxebarria, K. Evolutionary history of bovine endogenous retroviruses in the bovidae family BMC / K. Garcia-Etxebarria, B. M. Jugo // Evolutionary Biology. - 2013. - Т. 13. - № 1. - P. 256.

5. Gillet, N. Mechanism of leukomogenesis induced by bovine leukemia virus: prospect for novel anti-retroviral therapies in human / N. Gillet, A. Florins, M. Boxus, C. Burteau, A. Nigro, et al. // Retrovirology. - 2008. - 4: 18. doi: 10.1186/1742-4690-4-18

6. King, AMQ. Virus Taxonomy: classification and nomenclature ofviruses: Ninth Report of the ICTV / AMQ King, J Adams, EB Carstens, EJ Lefkowitz. - Amsterdam : Elsevier/Academic Press, 2012. - 1344 p.

7. Rates of CTL killing in persistent viral infection in vivo / M. Elemans, B. Asquith, A. Florins, L. Willems // PLoS Computational Biology. - 2014. - Т. 10. - № 4. -С. e1003534.

8. Rodriguez, S. M. Preventive and therapeutic strategies for BLV: lessons for HTLV / S. M. Rodriguez, N. Gillet, F. Boulanger, L. Willems, A. Florins, A. de Brogniez, M. T. San-

chez-Alcaraz, M. Boxus, G. Gutiérrez, K. Trono, I. Alvarez, L. Vagnoni // Viruses. - 2011. - T. 3. - №° 7. - P. 1210-1248.

9. Rice, NR. Expression of the bovine leukemia virus X region in virus infected cells / NR Rice, SL Simek, GC Dubois, SD Showalter, RV Gilden, RM Stephens // J Virol. - 1987. - 61. - P. 1577-1585.

10. The molecular characterization of bovine leukemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impact on phylogeny / M. Rola-Luszczak, A. Pluta, M. Olech, J. Kuzmak, I. Donnik, M. Petropavlovskiy, A. Gerilovych, I. Vinogradova, B. Choudhury // PLoS ONE. - 2013. - T. 8. -№ 3. - C. e58705.

Ветеринарное Дерматологическое Общество стран СНГ Российский ветеринарный журнал Журнал JSAP /Российское издание

Уважаемые коллеги!

Представляем вашему вниманию Российскую версию официального издания Европейского Общества Ветеринарной Дерматологии, Американской Академии Ветеринарной Дерматологии, Всемирной Ассоциации Ветеринарной Дерматологии -журнал «Veterinary Dermatology».

Главный редактор российского издания - Дипломант Европейского колледжа Ветеринарной Дерматологии, Президент Ветеринарного Дерматологического Общества стран СНГ, Заведующая дерматологическим отделением сети клиник «Белый клык» Кузнецова Е. С.

E-mail: info@logospress.ru Тел/факс: (495) 220-4816, 689-0575

„цШНИЕИДИКИс

РВЖ

Veterinary Dermatology