МИКРОФЛЮИДНАЯ ЯЧЕЙКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСЛОВИЙ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ ИЗ ХАРАКТЕРИСТИК МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

Область техники
Полезная модель относится к устройствам для определения условий кристаллизации белковых макромолекул и может быть использовано для получения белковых кристаллов с целью определения структуры белковых молекул, имеющих промышленное и медицинское значение.
Уровень техники
Кристаллизация белков в настоящее время производится в широких масштабах в связи необходимостью определения структуры белков для дальнейшего их использования в биологии и медицине.
Получение кристаллических образцов для определения особенностей структуры представляет процесс, занимающий много времени и требующий большого количества материала.
В тоже время современные методы с использованием синхротронных источников позволяют определять структуры молекул даже таких сложных как молекулы белков на кристаллах микронных размеров.
Общим принципом кристаллизации макромолекул из растворов является снижение их растворимости до достижения пересыщения за счет варьирования таких параметров как рН, температура, концентрация осадителей и пр. Процесс кристаллизации представляет собой сложную самостоятельную задачу и до сих пор в большей степени является эмпирической и наименее прогнозируемой стадией структурного исследования. Подбор условий кристаллизации происходит методом проб и ошибок за счет перебора всевозможных условий (различные концентрации белка, осадителя, различные типы буферов и осадителей, температура и др.).
Т.к. процесс экспрессии белков является трудоемким и дорогостоящим процессом, то существенным является возможность поиска условий кристаллизации с использованием минимального количества белка.
Такую возможность дают микрофлюидные устройства.
Микрофлюидные устройства и системы на их основе находят широкое применение при подготовке и анализе жидких проб в биологии, фармакологии и медицине. Интеграция в них специальных функциональных элементов позволяет создавать новые аналитические системы, платформы и приборы с уникальными техническими и эксплуатационными характеристиками для исследования биологических проб.
Известно микрофлюидное устройство для проведения гибридизации малых количеств нуклеиновых кислот в циркулирующем потоке (патент на полезную модель РФ 137822), включающее микроканалы для ввода и вывода раствора олигонуклеотидов, гибридизационную камеру, на внутренних стенках которой нанесен массив олигонуклеотидных зондов, и насосную камеру, одной из стенок которой является тонкий слой эластичного полимера, прилегающий к пьезоэлектрической пластинке, с нанесенными двумя электродами, одним из которых является упругая металлическая мембрана, жестко скрепленная с пластинкой, при этом гибридизационная и насосная камеры находятся в единой полимерной матрице и соединены двумя микроканалами через клапаны, пропускающие жидкость последовательно через обе камеры только в одном направлении.
Известно микрофлюидное устройство для кристаллизации белков в условиях невесомости (патент на изобретение РФ 2522613), содержащее емкости с растворами различных белков и осадителей, попарно подключенные через отдельные каналы, в которых установлены микрозатворы, к кристаллизационным камерам, при этом, названные каналы подключены к одному трубчатому элементу, внутри которого формируют отдельные кристаллизационные камеры для каждого из белков, один конец трубчатого элемента соединен через микрозатвор с микронасосом, подающим из резервуара в полость трубчатого элемента рабочую среду, служащую для разделения полостей кристаллизационных камер, а другой конец трубчатого элемента соединен со сборником рабочей среды, причем для подачи растворов белков и осадителей через отдельные каналы в кристаллизационные камеры применяют отдельные микронасосы, функционирующие по индивидуальным программам.
Устройство позволяет проводить эксперименты как по подбору условий кристаллизации, так и по кристаллизации различных белков в одном канале - благодаря конструкции с параллельными и независимыми друг от друга микронасосами. При работе с устройством возможно без дополнительных действий по перемещению кристаллов сразу отправлять их на последующие исследования.
Недостатком данного устройства является сложность конструкции и снижение надежности в результате наличия большого количества отдельных трубчатых элементов, в которых формируются отдельные кристаллизационные камеры.
В работе (Takahito Tokuhisa, Masashi Kawasaki, David isailus, Masamichi Yuda, Tadashi Matsunaga, and Atsushi Arakaki опубликованной в журнале Crystal. Growth&Design., 2015, 75 (9), pp 4549-4555) описано микрофлюидное устройство для выращивания кристаллов белков, представляющее собой микрочип с разветвленными каналами куда заливается кристаллизационный раствор. Чип скреплен с полупроводниковым холодильником, поддерживающим нужную температуру и монтируется на столик оптического микроскопа с поомщью которого фиксируются появляющиеся кристаллы искомого вещества.
В описываемой работе устройство было успешно использовано для получения кристаллов инсулина, но отмечается его пригодность для получения кристаллов белков.
Недостатком такого устройства является необходимость предварительного определения концентрационно-температурной фазовой диаграммы. Кроме того, решая проблему малого расхода дефицитных веществ данное устройство в случае использования для белков не решает проблему быстрого поиска условий кристаллизации из-за очень низких скоростей роста белковых кристаллов ввиду чего, время, которое требуется для большинства белков до появления кристалла, занимает от нескольких дней до нескольких месяцев.
Указанный недостаток частично решается в микрофлюидном устройстве для предварительной подготовки растворов для последующего анализа с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) синхротронного источника (Nhat Pham et al., Coupling high throughput microfluidics and Small-Angle X-ray Scattering to study protein crystallization from solution, «Analytical chemistry", 2017, 89(4), pp.2282-2287), в котором микрочип, изготовлен из боросиликатного стекла, стенки которого обработаны силиконовым маслом, чтобы предотвратить адсорбцию компонентов белковых растворов на стенках капилляров чипа. В чипе приготавливается раствор определенного состава, который затем подается в измерительный капилляр синхротронной станции малоуглового рассеяния. Растворы менялись по заранее заданной программе и в итоге проводился комплекс измерений кривых малоуглового рассеяния при различных значениях концентрации белков. Таким образом, можно найти оптимальные смеси для выращивания кристаллов белков по характеристикам малоуглового рентгеновского рассеяния, что дает большой выигрыш во времени.
Недостатком указанного микрофлюидного устройства является невозможность прямого измерения характеристик малоуглового рентгеновского рассеяния непосредственно на мирофлюидной ячейке, что требует сложной системы синхронизации работы микрофлюидной ячейки и станции малоуглового рентгеновского рассеяния. Кроме того, закрытость ячейки не гарантирует от загрязнения продуктами предыдущих экспериментов.
Технической проблемой, решаемой полезной моделью является улучшение in situ-исследований кристаллизации белков методом малоуглового рентгеновского рассеяния.
Раскрытие сущности полезной модели
Техническим результатом полезной модели является возможность быстрого определения оптимальных условий кристаллизации белков.
Для достижения технического результата предложена микрофлюидная ячейка для определения условий кристаллизации белков по характеристикам малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, содержащая корпус, с центрально расположенным отверстием, в котором сформирована кристаллизационная камера, соединенная микроканалами с отверстиями для ввода и вывода растворов белков, на внешних сторонах которой установлены окна из материала, прозрачного для рентгеновского и оптического излучения.
Кроме того:
окна изготовлены из слюды или кварцевого стекла;
корпус состоит из трех термически спаянных пластин, изготовленных из полиметилметакрилата.
Краткое описание чертежей
На рисунках представлены схема (фиг. 1), а также 3-х мерное изображение (фиг. 2) микрофлюидной ячейки для определения условий кристаллизации белков из характеристик малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, где:
1 - отверстие для ввода образца;
2 - отверстие для вывода образца;
3 - окна;
4 - кристаллизационная камера;
5 - микроканалы;
6 - корпус микрофлюидной ячейки.
На фиг. 3 показано поглощение рентгеновского излучения окнами из слюды и из кварца.
На фиг. 4, 5 приведены экспериментальные кривые интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния, полученные в отсутствии ячейки (показаны серым цветом) и в присутствии пустой микрофлюидной ячейки (показаны черным цветом) с толщинами окон 100 и 60 мкм и энергиями 8 и 12,5 кэВ соответственно.
На фиг. 6 показано сопоставление экспериментальных кривых малоуглового рентгеновского рассеяния, полученных от раствора лизоцима с концентрацией 40 мг/мл и раствором лизоцима (40 мг/мл) с добавлением осадителя NaCl (25 мг/мл).
На фиг. 7 представлены экспериментальные кривые малоуглового рентгеновского рассеяния от раствора лизоцима с осадителем в капиллярах (на станциях «ДИКСИ» и ВМ-29) и в микрофлюидной ячейке на станции «ДИКСИ», при одинаковых концентрациях белка и осадителя.
Осуществление полезной модели
Корпус 6 ячейки сформирован из трех пластин из полиметилметакрилата (ПММА) и имеет линейные размеры 24×24 мм и толщину 1 мм. В нем сформирована кристаллизационная камера 4 для анализа растворов белков, а также микрофлюидные каналы 5 для ввода/вывода растворов в/из объема кристаллизационной камеры 4. Ключевым элементом ячейки являются прозрачные для оптического и рентгеновского излучения окна 3, которые монтируются в специальные гнезда корпуса 6 ячейки. Стоит так же отметить, что важной конструкционной особенностью является потенциальная возможность смены окон 3 в ячейке.
Основным критерием отбора материалов окон 3 ячейки является требование малого поглощения рентгеновского излучения и минимального фона рассеяния в измеряемом диапазоне углов. В качестве окон 3 были использованы тонкие пластины из слюды толщиной 30-60 мкм и из кварцевого стекла, с толщинами 100, 60 и 30 мкм соответственно.
Кристаллизационная камера 4, в которой находится анализируемый раствор, имеет размеры 3×3 мм, что позволяет минимизировать расход раствора белка и при этом осуществлять сканирование коллимированным пучком по всему объему ячейки. Микрофлюидные каналы 5 ввода/вывода анализируемых растворов имеют геометрический размер 250×300 мкм, что позволяет производить быструю смену анализируемых растворов с минимальным количеством вещества, остающегося в микроканалах. Подвод жидкостей к микрофлюидной ячейке осуществляется по термопластиковым трубкам с внутренним диаметром 200 мкм (на фиг. 1 не показаны). Для подачи жидкостей используются шприцевые насосы (на фиг. 1 не показаны). Переключение между подачей в ячейку растворов белка и дистиллированной воды для ее промывки после проведения анализа происходит посредством двухходового крана.
18
Изготовление микрофлюидной ячейки. При изготовлении микрофлюидной ячейки использовался предыдущий опыт создания подобных устройств, описанный в (журнал «Медицинская физика» №4 2013 г. «Применение микрофлюидной технологии для синтеза радиофармпрепаратов, меченных F», М.Л. Занавескин, А.А. Миронова, A.M. Попов, Д.А. Мамичев, Н.С. Марченков, Н.А. Банникова, Н.В. Марченко Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Курчатовский НБИКС-Центр, Москва).
Для предварительной очистки поверхности, две пластины из полиметилметакрилата (ПММА) и кварцевые окна 3 промываются изопропиловым спиртом, а затем подвергаются ультразвуковой обработке в деионизированной воде (см. фиг. 2). После этого пластины и окна 3 высушиваются в потоке сухого азота. Далее в третьей пластине из ПММА формируется кристаллизационная камера 4 и микроканалы 5 с помощью импульсного инфракрасного лазера (λ=10,4 мкм) с номинальной мощностью 50 Вт. В процессе лазерной абляции происходит локальное удаление материала из области, в которой находится сфокусированное лазерное излучение, в результате чего формируются элементы микрофлюидной ячейки. Посредством выбора параметров лазера регулируется глубина и ширина получаемого в ПММА реза (канала). После формирования в пластине ПММА всех элементов микрофлюидной ячейки осуществляется полировка полученной заготовки на шлифовально-полировальной машине с помощью мелкодисперсного абразива. Далее пластина из ПММА подвергается ультразвуковой обработке в деионизированной воде для очистки поверхности после полировки. На завершающем этапе формирования корпуса 6 микрофлюидной ячейки производится совмещение окон 3 и пластин из ПММА и их последующая термическая спайка при температуре 121°С под давлением 1500 мбар в течение 15-30 минут.
Методика измерений малоуглового рентгеновского рассеяния.
Предварительные испытания проводились с незаполненной ячейкой на лабораторной установке «АМУР-К» (ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, Москва, Россия) с однокоординатным позиционно-чувствительным детектором ОД3М при фиксированной длине волны излучения равной 0,1542 нм (CuKα линия острофокусной трубки, монохроматор из пиролитического графита) и коллимационной системой Кратки. Сечение рентгеновского пучка составляло 0,2×8 мм, область углов рассеяния соответствовала диапазону значений модуля вектора рассеяния:
-1
0,1<s<10,0 нм ( 2θ - угол рассеяния)
Образцы помещали в вакуумную камеру. Расстояние образец-детектор составляло 700 мм. Время измерений одного образца составляло 10 мин. Экспериментальные данные были нормированы на интенсивность падающего пучка, после чего в них вводилась поправка на коллимационные искажения.
Эксперименты на малоугловой станции ВМ-29 (ESRF, Гренобль, Франция) проводили с использованием двумерного пиксельного детектора PILATUS 2М (Dectris, Швейцария) на длине волны рентгеновского излучения 0,1 нм и 0,15 нм.
Детальные измерения малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием микрофлюидной ячейки проводились на синхротронной станции «ДИКСИ» Курчатовского источника синхротронного излучения (НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия). Использовалось монохроматизированное излучение на длине волны 0,162 нм (что соответствует энергии излучения 7,65 кэВ). Сигнал регистрировался с помощью двумерного пиксельного детектора PILATUS 1М (Dectris, Швейцария). Усреднение сигнала по радиальному направлению проводилось с помощью программы FIT2D.
Испытания, проведенные на установке «АМУР-К», показали, что окно из слюды 58 мкм дает фон, превышающий рассеяние от кварцевых пластинок в 3-5 раз (фиг. 3). Для окна из кварцевого стекла толщиной 100 мкм фон рассеяния в области малых углов был небольшим, сравнимым с рассеянием от капилляра со стенками 10 мкм и диаметром 1,5 мм, а ослабление рентгеновского сигнала составило 8,2. Для 60 и 30 мкм кварцевых окон происходило ослабление сигнала в 3,5 и 1,5 раза (таблица 1), соответственно, тогда как для окон из слюды толщиной 60 мкм ослабление составило 4,9.
Дальнейшие исследования проводились на ячейках с кварцевыми окнами толщиной 60 мкм, сочетающих хорошие рентгенооптические характеристики с удобством эксплуатации, ввиду более высокой прочности, чем 30 мкм окна.
Результаты измерений на малоугловой станции ВМ-29 (ESRF, Гренобль, Франция), представлены на фиг. 4, 5 и в таблице 1. На фиг. 4, 5 приведены экспериментальные кривые интенсивности малоуглового рентгеновского рассеяния, полученные в отсутствии ячейки (показаны серым цветом) и в присутствии пустой микрофлюидной ячейки (показаны черным цветом) с толщинами окон 100 и 60 мкм, с энергиями 8 и 12,5 кэВ соответственно.
В таблице 1 представлены отношения интенсивности падающего пучка к интенсивности проходящего через микрофлюидную ячейку пучка. Как видно из фиг. 5 и таблицы 1, фон рассеяния в области малых углов оказывается небольшим, а ослабление рентгеновского сигнала не превышает один порядок интенсивности.
Дальнейшие результаты были получены на синхротронной станции «ДИКСИ» Курчатовского источника синхротронного излучения (НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия).
Для определения оптимального положения измерительной ячейки и калибровки измерений проводились предварительные измерения с незаполненной ячейкой. Затем были проведены измерения рассеяния рентгеновского излучения от ячейки, заполненной следующими образцами:
1) дистиллированной водой;
2) раствором лизоцима (с концентрацией 40 мг/мл);
3) раствором лизоцима (40 мг/мл) с добавлением осадителя NaCl (25 мг/мл).
Для получения разностной кривой (белок - буфер), содержащей в себе информацию о структуре белка, использовалась программа PRIMUS.
Сопоставление экспериментальных кривых малоуглового рентгеновского рассеяния показаны на фиг. 6, полученных от раствора лизоцима с концентрацией 40 мг/мл и раствором лизоцима (40 мг/мл) с добавлением осадителя NaCl (25 мг/мл), показывает, что при добавлении осадителя происходит изменение угла наклона кривой в области малых значений обратного вектора рассеяния, советующее изменению взаимодействия характера между молекулами белка от отталкивания к притяжению. Данный результат совпадает с результатами, полученными с использованием стандартных капилляров что подтверждает возможность использования предложенной микрофлюидной ячейки.
На фиг. 7 представлены экспериментальные кривые малоуглового рентгеновского рассеяния от раствора лизоцима с осадителем в капиллярах (на станциях «ДИКСИ» и ВМ-29) и в микрофлюидной ячейке на станции «ДИКСИ», при одинаковых концентрациях белка и осадителя.
Отношение сигнал-шум для данных, полученных при измерениях на «ДИКСИ» в новой ячейке (фиг. 7, кривая 1), оказывается сравнимым с измерениями на стандартном капилляре на «ДИКСИ» (фиг. 7, кривая 2) и немного ниже, чем на ВМ-29 ESRF (фиг. 7, кривая 3) из-за меньшей интенсивности пучка. В то же время, совпадение экспериментальных кривых рассеяния указывает на принципиальную возможность использования описываемой микрофлюидной ячейки для проведения малоугловых измерений.
Таким образом, предложенная микрофлюидная ячейка обеспечивает in situ-исследования условий кристаллизации белков методом малоуглового рентгеновского рассеяния.