АНТИРАДИКАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПОЛИФЕНОЛОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ИОНАМИ АЛЮМИНИЯ

УДК 577.352

АНТИРАДИКАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПОЛИФЕНОЛОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ИОНАМИ АЛЮМИНИЯ

Е. А. Ягольник, Ю. С. Тараховский, Ю. А. Ким

Исследованы процессы комплексообразования растительных полифенолов (кверцетин, катехин, таксифолин) с ионами алюминия и их антирадикальная активность. Показано, что липофильность комплексов зависит от соотношения компонентов и может возрастать при образовании комплексов с молярным соотношением А13+ : флавоноид = 1:1, тогда как комплексы с соотношением 2:1 наиболее эффективно замедляют процессы перекисного окисления липидов, регистрируемого по содержанию малонового диальдегида, а также способны наиболее активно восстанавливать хромоген-радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил. Таким образом, стехиометрия комплексов флавоноидов с алюминием, образующихся в водном растворе, может отличаться от стехиометрии комплексов, наиболее эффективно защищающих мембраны от пере-кисного окисления.

Ключевые слова: растительные полифенолы, кверцетин, катехин, таксифо-лин, антиоксидантная активность, комплексы флавоноидов с ионами алюминия.

Введение

Известно, что многие растительные полифенолы обладают мощным антирадикальным действием [1-3]. Способность флавоноидов образовывать комплексы с металлами имеет большое значение для защиты организма от окислительного стресса и вносит существенный вклад в профилактику и лечение различных заболеваний с участием флавоноидов. Среди инициаторов перекисного окисления в организме человека наиболее типичными являются катионы алюминия. Их повреждающее действие связано с образованием гидроксильных радикалов, например, в реакции Фентона [4]. Указанное повреждающее действие может существенно снижаться в результате образования их комплексов с различными полифенолами, например, флавоноидами [5]. Комплексы флавоноидов с ионами алюминия могут иметь различную стехиометрию. Предполагается, что кверцетин может образовывать комплексы с различным соотношением алюминий : кверцетин [6, 7]. При этом липофильность комплексов может значительно варьировать. Недавно нами было показано, что комплексы с большим содержанием флавоноида (железо : флавоноид < 1) более липофильны, чем свободный флавоноид, тогда как комплексы с большим содержанием железа (железо : флавоноид > 1) более водорастворимы. Поэтому стехиометрия образующихся комплексов определяет характер их взаимодействия с фосфолипидным бислоем и может влиять на различные физические свойства бислоя. Представляет также большой интерес исследование

влияния стехиометрии комплексов на их антиоксидантные свойства и способность к защите фосфолипидного бислоя от перекисного окисления.

Материалы и методы

В работе использовали фосфолипид азолектин (Sigma, США), флавоноиды - кверцетин, таксифолин и (+)-катехин (Sigma-Aldrich, США), Трис-HCl (Serva, Германия), диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma, США), AlCl3 х 6H2O (ч.д.а., Россия), 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) (Serva, Германия), TEMPOL (Институт органической химии СО РАН).

Для приготовления липосом липид растворяли в хлороформе и высушивали в струе аргона до образования пленки на стенках круглодонной колбы. Полное удаление растворителя осуществляли в течение 12 ч под вакуумом. Затем липид гидратировали водным раствором 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4), приготовленным на деионизованной воде (Milli-Q, Arium, Германия), встряхиванием на механическом шейкере при температуре 35°C.

Катехин и таксифолин растворяли в 70% этаноле, маточный раствор кверцетина готовили в ДМСО. Конечная концентрация растворителей флавоноидов в суспензии липосом была не выше 0,1%.

Определение коэффициента распределения флавоноидов в системе октанол-вода. Относительная гидрофобность вещества является характеристикой относительной интенсивности взаимодействия вещества с водной средой. Для количественной оценки этой характеристики в литературе часто используют величину изменения свободной энергии при переносе вещества из воды в органический растворитель [12]. Для определения этой величины широко применяется метод распределения веществ в двухфазных водно-органических системах, и в качестве относительной гидрофобности используют значение логарифма коэффициента распределения вещества в системе [13, 14]. По определению, коэффициент распределения вещества в водно-органической системе Р = Сорг /Сводн, где Сорг и Сводн - равновесные концентрации распределяемого вещества в органической и водной фазах системы. Следует отметить, что при определении величины Р необходимо учитывать возможность образования агрегатов распределяемого вещества, а также его способность диссоциировать.

Для определения коэффициента распределения флавоноидов и их комплексов с ионами алюминия в системе октанол-вода использовали деионизованную воду (Milli-Q, Arium 611VF, Германия), на которой готовили 10 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,4). Исходные растворы флавоноидов готовили в буфере, насыщенном октанолом, и взбалтывали на качалке с добавлением октанола, насыщенного буфером при их соотношении 1:1. После инкубации в течение 5-6 ч добавляли раствор AlCl3 х 6H2O известной концентрации, перемешивали на вортексе 30 мин.

После встряхивания водную фазу отделяли от органической центрифугированием в течение 15 мин при 1500 g на центрифуге Centrifuge 5414 (Eppendorf, Германия). Концентрацию флавоноидов и их комплексов с ионами алюминия после распределения определяли с помощью УФ-спектроскопии в каждой из фаз.

Спектрофотометрическое определение стехиометрии комплексов флавоноид-А13+. Для спектрального анализа использовали метод титрования раствора флавоноидов возрастающими концентрациями AlCl3 х 6H2O, как это было описано ранее [8, 15]. Максимум адсорбции комплекса флавоноид-алюминий (D) измерялся в серии растворов, содержащих 10 мкМ флавоноида и AlCl3 х 6H2O в концентрациях, варьирующих в пределах 1-40 мкМ. На графике, показывающем зависимость величины D от концентрации добавленных катионов алюминия, полученные в эксперименте точки можно аппроксимировать двумя прямыми линиями, точка пересечения которых позволяет определить искомую стехиометрию. Все спектральные измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-VIS 1800.

Измерение антирадикальной активности флавоноидов и их комплексов с AlCl3 х 6H2O по восстановлению ДФПГ. Стабильный хромоген-радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) широко используется для исследования суммарной концентрации антирадикальных антиоксидантов в различных объектах [9, 14]. Антирадикальную активность флавоноидов и их комплексов с AlCl3 х 6H2O оценивали по уменьшению сигнала ЭПР от стабильных радикалов ДФПГ, встроенных в фосфолипидные бислои моноламеллярных липосом из ДМФХ, при добавлении к ним соответствующих реагентов. Встраивание проводили двумя способами: 1) 10 мкл 1 мМ раствора ДФПГ в метаноле добавляли к 100 мкл раствора липосом и встряхивали; 2) 10 мкл 1 мМ раствора ДФПГ наносили на стенки центрифужной пробирки для Centrifuge 5414 (Eppendorf, Германия) и высушивали струей аргона. Затем в пробирку добавляли 200 мкл раствора липосом и инкубировали 1 ч при встряхивании. Измерения спектров ЭПР проводили на спектрометре EMX-6 (Bruker, Германия). Кварцевый капилляр внутренним диаметром 1 мм с образцом помещался в термостатируемый при 26 °С резонатор ER4102ST. Спектры регистрировали с амплитудой модуляции магнитного поля 4 Гс, при СВЧ 9,47 ГГц и микроволновой мощности 20 мВт. Количество встроившегося в мембраны радикала определяли путем сравнения вторых интегралов спектров ДФПГ и 10-5 М раствора стабильного радикала TEMPOL в воде, измеренных в идентичных условиях. Концентрация липидов в образце составляла 10 мг/мл, концентрация радикала - 3,25х10-5М.

Определение концентрации веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой. Определение концентрации в суспензии

липосом проводили по апробированной методике с некоторыми модификациями. К 0,5 мл суспензии многослойных липосом из азолектина (2,5 мг/мл в среде 10 мМ Трис-НС1, рН 7,4) добавляли 0,5 мл 0,92 М трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ тиобарбитуровой кислоты, нагревали 15 мин на кипящей водяной бане, центрифугировали 30 мин при 16000 g, после чего надосадочную жидкость фотометрировали на длинах волн 532 нм и 580 нм против соответствующим образом обработанной контрольной пробы (вода). Исследуемые флавоноиды и их комплексы с А1С13 х 6Н20 добавляли в липосомы, которые затем подвергали спонтанному окислению, инкубируя пробы при 37 °С в течение 24 ч. Содержание малонового диальдегида (МДА) рассчитывали по формуле:

С = (О532 - А80) х V / VL х 8 х I где О - оптическое поглощение при соответствующих длинах волн; Vt -объем тиобарбитуровой кислоты; VL - объем липидной инкубационной среды; 8 - молярный коэффициент поглощения МДА (1,55 х 105 М-1см-1); I = 1 см.

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием программного пакета Statistica 6.0 с расчетом значения выборочного среднего М и стандартной ошибки т. Достоверность различий между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считались достоверными прир < 0,05.

Обсуждение результатов

Титрование возрастающими концентрациями А1С13 х 6Н20 (рис. 3) позволяет определить стехиометрию комплексов. При добавлении алюминия (III) к раствору флавоноида комплекс образуется менее чем за минуту. При анализе стехиометрии комплекса с кверцетином удобно использовать максимум поглощения при 425 нм. Зависимость величины адсорбции при 425 нм от концентрации добавленного алюминия (III) может быть аппроксимирована двумя прямыми, имеющими точку пересечения при концентрации алюминия 10 мкМ (рис. 1а). Учитывая, что концентрация кверцетина также была равна 10 мкМ, мы определяем стехиометрию комплекса алюминия-кверцетин как 1:1. Эта величина отличается от полученной ранее стехиометрии комплекса, содержащего двухвалентное железо [2, 5]. На рис.1б показан пример изменения формы спектров кверцетина при добавлении алюминия (III) в возрастающих концентрациях. Видно, что максимум поглощения свободного кверцетина, регистрируемый при 372 нм (спектр 1), при образовании комплекса сдвигается к 425 нм (спектр 4).

Рис. 1. Определение стехиометрии комплексов алюминий-кверцетин посредством титрования. (а) - Зависимость величины поглощения в

области 425 нм от количества добавленного алюминия

Измерение липофильности комплексов в системе октанол-вода показывает (рис. 2), что при избытке флавоноида липофильность комплекса падает, тогда как в комплексе с соотношением алюминий : кверцетин = 1:1 липофильность несколько возрастает, что отличает комплексы кверцетина с алюминием (III) от ранее исследованных комплексов с железом (III). Нам не удалось провести измерения липофильности при больших количествах алюминия (III), поскольку в области раздела фаз образовывался слой крупных нерастворимых частиц комплекса, что препятствовало проведению измерений.

Способность флавоноидов препятствовать процессам перекисного окисления липидов широко известна. Одним из индикаторов перекисного окисления является малоновый диальдегид, который образуется в результате окисления ненасыщенных углеводородных цепей липидов. Кверцетин или катехин снижают содержание МДА в суспензии липосом из азолектина (рис. 3). В присутствии алюминия (III) концентрация МДА может уменьшаться еще сильнее. Наименьшее ее значение наблюдалось при соотношении флавоноид : алюминий = 2:1. При добавлении больших количеств алюминия (III) антиоксидантные свойства флавоноидов ослабевали, а при пятикратном избытке алюминия (III) наблюдалось ускорение перекисного окисления, что свидетельствует о появлении свободных катионов алюминия (III), обладающих прооксидантным действием.

log Р 2.5 г

Контроль 1:10 1:2 1:1

Рис. 2. Изменение коэффициента распределения кверцетина

Рис. 3. Влияние флавоноидов катехина

Хромоген-радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) широко используется для исследования суммарной концентрации антирадикальных антиоксидантов в различных средах и объектах, включая клеточные мембраны и липосомы. ДФПГ является стабильным липофильным свободным радикалом. Попытки встраивания ДФПГ в липосомы по первому методу (см. материалы и методы) оказались неэффективными и привели к регистрации сигнала ЭПР, аналогичного сигналу в буфере (рис. 4а, 1). Это обменно-суженный сигнал лоренцевой формы, принадлежащий, по-видимому, ДФПГ в форме микрокристаллов, которые образуются при добавлении метанольного раствора радикала к раствору липосом. Спектр ЭПР радикала ДФПГ, встроенного в липосомы по второму методу (рис. 4а, 2), резко отличается от спектра в буфере. Мы интерпретируем наблюдаемый сигнал с частично разрешенной сверхтонкой структурой от двух ядер азота как принадлежащий молекулам ДФПГ, заторможено вращающимся в составе липидной мембраны. При этом радикал не присутствует в водном растворе. При добавлении флавоноидов амплитуда сигнала ДФПГ снижается (рис. 4б), что свидетельствует о восстановлении радикала. Антирадикальная активность флавоноидов возрастает в ряду таксифолин < кверцетин < катехин.

Мы исследовали также зависимость антирадикальной активности комплексов флавоноидов с алюминием (III). Для этого мы использовали кверцетин. В наших измерениях соотношение алюминий : кверцетин менялось в пределах от 0 до 2. Как видно из представленного графика (рис. 4в), при образовании комплексов с алюминием (III) антирадикальная активность кверцетина возрастала, что приводило к уменьшению интенсивности сигнала ДФПГ. Наибольшая антирадикальная активность достигалась при соотношении алюминий : кверцетин = 2:1. Измерения при больших количествах алюминия (III) были затруднены в связи с образованием нерастворимого осадка и поэтому не проводились.

Растворимость флавоноидов в воде и гидрофобных средах, таких как фосфолипидный бислой, имеет большое значение для проявления их лекарственных свойств. Существенные различия могут наблюдаться в антиоксидантной активности флавоноидов в исследованиях на липосомальных моделях биологических мембран и в тканях животных, где доступность этих веществ затруднена [5]. Многое делается для разработки различных транспортных средств, способных облегчать доставку этих веществ к клеткам [7]. Хелатирование металлов также может изменять растворимость флавоноидов в различных средах. Кроме того, способность флавоноидов хелатировать металлы является существенным фактором их антиоксидантного действия [12]. Этот процесс имеет два важных следствия. Во-первых, это приводит к удалению из среды катионов металлов, способных инициировать перекисное окисление. Во-вторых, образующиеся комплексы флавоноидов с металлами проявляют большую

антиоксидантную активность, чем свободные флавоноиды. Это связано со способностью комплексов флавоноидов с катионами алюминия или меди удалять супероксид-анион аналогично ферменту супероксиддисмутазе.

Т-1-1-1-1-1-1-1-г

—I-1-1-1-1-1-1-1-1—

3340 3360 3380 3400 3420

В, Гс

Рис. 4. Спектры ЭПРрадикала ДФПГ. (а) - Радикал находится в буферном растворе -1, в бислое моноламеллярных липосом из ДМФХ - 2. (б) - Влияние различных флавоноидов на спектр ЭПР липосом:

1 - контрольный образец липосом, 10 мг/мл; липосомы после добавления 10-5М таксифолина - 2, кверцетина - 3, катехина - 4; на вставке - амплитуда сигнала в присутствии этих флавоноидов, соответственно. (в) - Влияние комплексов кверцетина с алюминием на ЭПР-сигнал радикала, находящегося в липосомах: 1 - контрольный

образец липосом, 10мг/мл; 2 - к липосомам добавлено алюминий; липосомы после добавления кверцетина и алюминия (III) в молярных соотношениях алюминий:кверцетин: 10:1 - 3; 2:1 - 4; 1:1 - 5; 1:2 - 6; на вставке - зависимость амплитуды сигнала ЭПР от соотношения

алюм иний:квер цетин

Образование комплексов различных флавоноидов с тяжелыми металлами (Pd, Pt, Gd, La, Nb и др.) повышает не только антиоксидантную, но также антиопухолевую и антибактериальную активность, что открывает новые перспективы использования флавоноидов в медицине [2,5,15]. Представленные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при образовании комплексов флавоноидов с алюминием (III) наблюдается изменение липофильности этих веществ, а также их способности влиять на фазовое поведение липидов. Подобные явления были описаны нами в отношении комплексов флавоноидов с железом (II) [8]. Однако при взаимодействии с железом (II) наибольшей липофильностью обладали комплексы с соотношением железо : флавоноид = 1:2, тогда как в представленной работе при взаимодействии с алюминием (III) наибольшая липофильность наблюдается при соотношении алюминий : флавоноид = 1:1, что соответствует также полученной нами величине стехиометрии связывания кверцетина с алюминием (III) в водных растворах. При избытке алюминия наблюдается и наибольшая антиоксидантная активность, измеряемая по уровню МДА, а также антирадикальная активность, измеряемая по восстановлению ДФПГ. В обоих случаях наибольшей активностью обладали комплексы с соотношением алюминий :флавоноид = 2:1, в то время как в растворе величина соотношения алюминий:флавоноид = 1:1.

На основании полученных данных можно заключить, что в фосфолипидном бислое процессы комплексообразования этих агентов могут отличаться от таковых в водном растворе. Примечательно, что при увеличении содержания в среде таких инициаторов перекисного окисления, как катионы алюминия (III), защитные свойства флавоноидов могут возрастать.

Список литературы

1. Hendrich A. B. Flavonoid-membrane interactions: possible consequences for biological effects of some polyphenolic compounds 1 //Acta Pharmacologica Sinica. 2006. V. 27. №. 1. P. 27-40.

2. Lipophilicity of flavonoid complexes with iron (II) and their interaction with liposomes / Y.A. Kim, Y.S. Tarahovsky, E.A. Yagolnik [et al.] //Biochemical and biophysical research communications. 2013. V. 431. №. 4. P. 680-685.

3. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина / Тараховский Ю.С., Ким, Ю. А., Абдрасилов, Б. С. [и др.] // Пущино: Sуnchrobook, 2013. 310 c.

4. Perron N. R., Brumaghim J. L. A review of the antioxidant mechanisms of polyphenol compounds related to iron binding //Cell biochemistry and biophysics. 2009. V. 53. №. 2. P. 75-100.

5. Calcium-dependent aggregation and fusion of phosphatidylcholine liposomes induced by complexes of flavonoids with divalent iron / Y. S. Tarahovsky, E.A. Yagolnik, E.N. Muzafarov [et al.] //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V. 1818. №. 3. P. 695-702.

6. Copper (II)-Quercetin complexes in aqueous solutions: spectroscopic and kinetic properties / A.Torreggani, M. Tamba, A. Trinchero [et al.] // Journal of Molecular Structure. 2005. V. 744. P. 759-766.

7. Gould K.S., Lister C. Flavonoid functions in plants. // In: Andersen OM, Markham KR, editors. Flavonoids chemistry, biochemistry and applications. Boca Raton, CRC Taylor & Francis Group. 2006. P. 397-441.

8. Flavan-3-ol esters: new agents for exploring modulatory sites on GABA(A) receptors / S. P. Fernandez, N. Karim, K.N. Mewett [et al.] // Br. J. Pharmacol. 2012/ V. 165. № 4. P. 965-977.

9. Flavonoids determine the rate of fibrillogenesis and structure of collagen type I fibrils in vitro / Y.A. Kim, Y.S. Tarahovsky, S.G. Gaidin [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. 2017. V. 104. 631-637.

10. Quercetin blocks caveolae-dependent pro-inflammatory responses induced by co-planar PCBs / Y.J. Choi, X. Arzuaga, C. T. Kluemper [et al.] // Environ.Int. 2010. V. 36. № 8. P. 931-934.

11. Cohen G., Riahi Y., Sasson S. Lipid peroxidation of poly-unsaturated fatty acids in normal and obese adipose tissues // Arch.Physiol Biochem. 2011. V. 117. № 3. P. 131-139.

12. Shiga toxin glycosphingolipid receptors in microvascular and macrovascular endothelial cells: differential association with membrane lipid raft microdomains / J. Betz, M. Bielaszewska, A. Thies [et al.] // J.Lipid Res. 2011. V. 52. № 4. P. 618-634.

13. Enhancement of antioxidant and anti-inflammatory activities of bioflavonoid rutin by complexation with transition metals / Afanas'eva, I. B., E. A. Ostrakhovitch, E. V. Mikhal'chik [et al.] // Biochem. Pharmacol. 2001. V. 61. № 6. P. 677-684.

14. Биологическая активность водорастворимых наноструктур дигидрокверцетина с циклодекстринами / В.П. Зинченко, Ю.А. Ким, Ю. С. Тараховский [и др.] // Биофизика. 2011. V. 56. № 3. P. 433-438.

15. Interaction of flavonoids and intestinal facilitated glucose transporters / C.H. Chen, H.J. Hsu, Y.J. Huang [et al.] // Planta Med. 2007. V. 73. № 4, P. 348-354.

Ягольник Елена Андреевна, канд. биол. наук, yea_88@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Тараховский Юрий Семенович, д-р. биол. наук, вед. науч. сотр., taraho va ram bler. ru, Россия, Пущино, Институт теоретической и

экспериментальной биофизики РАН,

Ким Юрий Александрович, д-р. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр., профессор, yuk0K@rambler.ru, Россия, Пущино, Институт биофизики клетки Российской

академии наук Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»

ANTIRADICAL ACTION OF PLANT POLYPHENOLS AND THEIR COMPLEXES WITH ALUMINUM IONS

E. A. Yagolnik, Yu. S. Tarahovsky, Yu. A. Kim

The processes of complexation of plant polyphenols (quercetin, catechin, Taxifolin) with aluminum ions and their antiradical activity were investigated. It is shown that the lipo-philicity of complexes depends on the ratio of components and can increase with the formation of complexes with a molar ratio of Al3+: flavonoid = 1:1, whereas complexes with a ratio of 2:1 most effectively slow down the processes of lipid peroxidation, recorded by the content of Malon dialdehyde, and are also able to most actively restore the Chromogen radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. Thus, the stoichiometry of complexes of flavonoids with aluminum formed in an aqueous solution may differ from the stoichiometry of complexes that most effectively protect membranes from peroxidation.

Key words: plant polyphenols, quercetin, catechin, Taxifolin, antioxidant activity, complexes of flavonoids with aluminum ions.

Yagolnik Elena Andreevna, candidate of biological sciences, yea_88@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,

Tarakhovsky Yuri Semyonovich, doctor of biological sciences, leading researcher, tarahova rambler. ru, Russia, Pushchino, Moscow region, Institute of theoretical and experimental Biophysics RAS,

Kim Yuri Alexandrovich, doctor of physical and mathematical sciences, leading researcher, professor, viikOlai rambler. ru, Russia, Pushchino, Moscow region Institute of cell Biophysics of the Russian Academy of Sciences Federal state budgetary institution of science "Federal research center "Pushchino scientific center for biological research of the Russian Academy of Sciences»