СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТИЛМЕТАКРИЛАТА
METHOD FOR PRODUCING METHYL METHACRYLATE

Область техники, к которой относится изобретение
3
12
Настоящее изобретение относится к способу получения метилметакрилата. Конкретно, изобретение относится к способу получения метилметакрилата посредством ферментации с получением сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Метилметакрилат (MMA) представляет собой важный для химической промышленности мономер. Основным применением MMA является получение пластиков для различных применений; однако MMA также можно использовать в костном цементе для применения в ортопедической хирургии. Наиболее значимое применение полимеризации представляет собой отливка, формование или экструзия полиметилметакрилата (PMMA) с получением пластиков с высокой оптической прозрачностью. Общемировое потребление PMMA оценивается как приблизительно 2,1 миллионов тонн в гон.
2
4
В настоящее время MMA получают исключительно химическими способами и современные способы получения MMA включают способ с ацетонциангидрином (ACH) и другие способы, начиная с различных предшественников C-C. Один из наиболее эффективных способов получения MMA представляет собой "альфа-способ", которым MMA получают из сложного эфира, метилпропионата, посредством безводной реакции с формальдегидом. При альфа-способе метилпропионат получают посредством карбонилнилирования этилена. Это этиленовое сырье получают из ископаемых видов топлива. По сравнению с другими общепринятыми способами получения MMA альфа-способ обеспечивает множество преимуществ. Эти преимущества включают сокращение использования опасных химических веществ, более высокую селективность продуктов и сниженную зависимость от получаемого из сырой нефти сырья. Однако цены на сырье связаны со стоимостью бензина. Поэтому желательна разработка альтернативного способа производства ММА, преодолевающего эти недостатки.
Микроорганизмы можно использовать для производства ценных химических веществ путем ферментации, а не путем химического синтеза. Технология рекомбинантных ДНК и синтетическая метаболическая инженерия таких микроорганизмов позволили реконструировать метаболические пути продукции конкретных химических веществ. В последнее время разрабатывается несколько устойчивых маршрутов биопродукции акрилатов. Как правило, эти способы сфокусированы на получении акрилатов из возобновляемого сырья посредством микробиологической ферментации. Однако накопление этих продуктов при ферментации, как правило, токсично для биокатализаторов, ингибируя рост клеток и/или приводя к гибели клеток. В частности, алкилметакрилаты более высокого порядка (например, такие как бутилметакрилат (BMA)) проявляют даже более высокую степень токсичности в отношении биокатализаторов, чем низшие алкилметакрилаты, такие как MMA. Ввиду этого и приведенных недостатков, ассоциированных с современными химическими способами получения MMA, выгодным могло бы являться предоставление биологического или частично биологического способа получения MMA.
Целью настоящего изобретения является устранение или уменьшение одного или нескольких из указанных выше недостатков, предоставление улучшенного способа получения MMA и/или предоставление улучшенного биологического или частично биологического способа получения MMA.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения MMA и частично основано на исследованиях авторов изобретения, в которых они неожиданно показали возможность эффективного получения MMA посредством ферментации, при которой происходит продукция сложных эфиров метакриловой кислоты более высокого порядка, несмотря на свойственную им токсичность, которые указанные метакрилаты более высокого порядка проявляют в отношении микроорганизмов. Также неожиданно выявлено, что способ по настоящему изобретению обеспечивает увеличенную по сравнению с прямым получением MMA скорость реакции для сложных эфиров более высокого порядка.
В первом аспекте настоящего изобретения предоставлен способ получения метилметакрилата (MMA). Способ включает этапы:
3
12
a) получения микроорганизмов в ферментационной среде в условиях, в которых указанные микроорганизмы продуцируют сложный C-C-эфир метакриловой кислоты;
3
12
b) получения органической фазы в контакте с ферментационной средой, где указанная органическая фаза содержит сложный C-C-эфир метакриловой кислоты в более высокой концентрации, чем концентрация в ферментационной среде;
3
12
c) удаление органической фазы, содержащей указанный сложный C-C-эфир метакриловой кислоты, из контакта с ферментационной средой; и
3
12
d) переэтерификации выделенного сложного C-C-эфира метакриловой кислоты с метанолом, необязательно после отделения от органической фазы, с получением метилметакрилата.
Сложные C
-C
-эфиры метакриловой кислоты
3
12
3
12
В первом аспекте настоящего изобретения получают сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты посредством микроорганизмов в ферментационной среде.
3
12
3
12
3
12
3
12
трет
Под термином сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты, как правило, понимают метакрилат, содержащий C-C-алкильную, гидроксиалкильную, алкенильную, алкиларильную или алкениларильную группу, включая их структурные изомеры. C-C группа может быть циклической, ациклической или частично циклической, неразветвленной или разветвленной, алифатической, ароматической или частично ароматической/алифатической. Предпочтительно, сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты по настоящему изобретению могут включать, например, н-пропил-, изопропил-, изобутил-, н-бутил-, -бутил-, изопентил-, гексил-, циклогексил-, 2-этилгексил-, децил-, додецил-, гидроксиэтил-, гидроксипропил-, изоборнил-, аллил или циннамилметакрилат.
3
12
3
12
3
8
Предпочтительно сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты представляют собой C-C-алкилметакрилаты, более предпочтительно, C-C-алкилметакрилаты например, н-пропил-, изопропил-, изобутил-, н-бутил-, изопентил-, гексил-, циклогексил-, гептил-, октил-, 2-этилгексил-, децил- или додецилметакрилат.
Предпочтительно, гидроксиалкилметакрилаты представляют собой гидроксиэтил- или гидроксипропилметакрилат.
3
12
3
12
В определенных вариантах осуществления сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты представляют собой C-C-алкениларилметакрилаты, например, циннамилметакрилат.
3
12
3
6
3
6
Более предпочтительно C-C-алкилметакрилаты представляют собой C-C-алкилметакрилаты, такие как пропил-, бутил- или гексилметакрилаты, включая, например, их структурные изомеры. Более предпочтительно, C-C-алкилметакрилаты представляют собой пропил- или бутилметакрилаты, в частности, изопропил- или н-бутилметакрилат.
Микроорганизмы
Микроорганизмы по настоящему изобретению можно выбирать из природных микроорганизмов дикого типа или неприродных рекомбинантных микроорганизмов, например, бактерий, архей, дрожжей, грибов, водорослей или любой из множества других микроорганизмов, применимых для способов ферментации.
Escherichia
Enterobacter
Pantoea
Klebsiella
Serratia
Erwinia
Salmonella
Morganella
Brevibacterium
Corynebacterium
Microbacterium
Alicyclobacillus
Bacillus
Hydrogenobacter
Methanococcus
Acetobacter
Acinetobacter
Agrobacterium
Axorhizobium
Azotobacter
Anaplasma
Bacteroides
Bartonella
Bordetella
Borrelia
Brucella
Burkholderia
Calymmatobacterium
Campylobacter
Chlamydia
Chlamydophila
Clostridium
Coxiella
Ehrlichia
Enterococcus
Francisella
Fusobacterium
Gardnerella
Haemophilus
Helicobacter
Kelbsiella
Methanobacterium
Micrococcus
Moraxella
Mycobacterium
Mycoplasma
Neisseria
Pasteurella
Peptostreptococcus
Porphyromonas
Prevotella
Pseudomonas
Rhizobium
Rickettsia
Rochalimaea
Rothia
Shigella
Staphylococcus
Stenotrophomonas
Streptococcus
Treponema
Vibrio
Wolbachia
Yersinia
В определенных вариантах осуществления изобретения микроорганизмы представляют собой бактерии. Примеры подходящих бактерий включают энтеробактерии, принадлежащие протеобактериям родов , , , , , , ,  или т.п., так называемые коринеформные бактерии, принадлежащие родам ,  или , и бактерии принадлежащие родам , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,  или т.п.
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Anaerobiospirillum succiniciproducens
Actinobacillus succinogenes
Mannheimia succiniciproducens
Rhizobium etli
Bacillus subtilis
Corynebacterium glutamicum
Gluconobacter oxydans
Zymomonas mobilis
Lactococcus lactis
Lactobacillus plantarum
Streptomyces coelicolor
Clostridium acetobutylicum
Pseudomonas fluorescens
Hydrogenobacter thermophilus
Methanococcus jannaschii
Pseudomonas putida
Иллюстративные бактерии включают виды, выбранные из , , , , , , , , , , , , , , , ,  и .
Escherichia, Corynebacterium или Pseudomonas
Escherichia coli
Corynebacterium glutamicum
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas putida
Предпочтительно бактерии представляют собой бактерии родов . Предпочтительно бактерии представляют собой , ,  или .
Saccharomyces
Schizosaccharomyces
Candida
Kluyveromyces
Aspergillus
Pichia
Crytpococcus
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces marxianus
Aspergillus terreus
Aspergillus niger
Pichia pastoris
Иллюстративные дрожжи или грибы включают дрожжи и грибы, принадлежащие родам , , , , , ,  или т.п. Иллюстративные виды дрожжей или грибов включают виды, выбранные из , , , , , ,  или т.п.
3
12
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения микроорганизмы можно генетически модифицировать с получением более сложного C-C-эфира метакриловой кислоты, чем у дикого типа.
3
12
3
12
3
12
Увеличение продукции сложного C-C-эфира метакриловой кислоты по сравнению с микроорганизмом дикого типа может включать внесение модификаций в существующие клеточные метаболические процессы, нуклеиновые кислоты и/или белки с применение различных способов генетической инженерии, известных в данной области. Увеличение продукции сложного C-C-эфира метакриловой кислоты также может включать модификацию микроорганизмов с экспрессией одного или нескольких гетерологичных для этих микроорганизмов генов. Они могут включать гены, кодирующие ферменты требуемого метаболического пути до сложного C-C-эфира метакриловой кислоты от углеродного сырья, или могут включать другие вспомогательные гены, которые действуют, прямо или косвенно способствуя функционированию и экспрессии ферментов в таких путях.
3
12
Таким образом, микроорганизмы по настоящему изобретению можно модифицировать с увеличением продукции сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты.
3
12
3
12
3
12
Микроорганизмы могут нести модификации, которые снижают или устраняют активность фермента, катализирующего синтез соединения, отличного от сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты, конкурируя за те же субстраты и/или промежуточные соединения. Альтернативно или дополнительно, микроорганизмы, используемые в способе по настоящему изобретению, могут нести модификации, которые снижают или устраняют активность фермента, метаболизирующего сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты или метаболизирующего промежуточные соединение в пути продукции сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты.
Альтернативно или дополнительно, микроорганизмы, используемые в способе по настоящему изобретению, могут нести модификации, которые снижают или устраняют активность белков, вовлеченных в другие клеточные функции, которые удаляют промежуточные соединения. Примеры таких других клеточных функций могут включать механизмы хранения, такого как хранения в вакуолях (например, в дрожжах) или других внутриклеточных тельцах, способных к хранению метаболитов (например, бактериальных микрокомпартментах), бактериальную периплазму или механизмы транспорта, такие как трансмембранные наносы или порины, способные к выведению метаболитов.
Альтернативно или дополнительно, микроорганизмы, используемые в способе по настоящему изобретению, могут нести модификации для снижения или устранения активности фермента или белка, участвующего в клеточной функции, которая:
3
12
(i) выводит вещества из путей продукции сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты; и/или
3
12
(ii) метаболизирует сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты.
Альтернативно или дополнительно, микроорганизмы, используемые в способе по настоящему изобретению, могут нести модификации которые приводят к микроорганизму, являющемуся более устойчивому к условиям ферментации, условиям реакции или другим встречающимся в способе по настоящему изобретению стрессовым воздействиям.
3
12
3
12
3
12
3
12
Увеличение продукции сложного C-C-эфира метакриловой кислоты может включать отбор микроорганизмов, которые адаптированы к получению больших количеств сложного C-C-эфира метакриловой кислоты по сравнению с микроорганизм дикого типа. В контексте настоящего изобретения, термин "адаптирован", когда его используют в отношении микроорганизма, означает генетически модифицированный или сконструированный организм, или мутантный штамм организма, который, например, отобран на основе того, что он экспрессирует один или несколько ферментов, приводящих к увеличенной продукции сложного C-C-эфира метакриловой кислоты в природных условиях. Такие модификации могут включать любую из указанных выше модификаций, которые могут увеличивать продукцию сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты.
in vitro
Для снижения или устранения активности указанных выше ферментов или белков в гены указанных выше ферментов или белков посредством общепринятых случайного или сайт-специфического мутагенеза или способов генетической инженерии можно вносить мутации, снижающие или устраняющие внутриклеточную активность этих ферментов или белков. Примеры мутагенеза могут включать, например, рентгеновское облучение или облучение ультрафиолетом, обработку мутагеном, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, сайт-специфический или случайный мутагенез  посредством высокоточной или вносящей ошибки полимеразной цепной реакции, соответственно, и т.д. Участок на гене, где вносят мутацию, может представлять собой кодирующую область, кодирующую фермент или белок или область контроля экспрессии, такую как промотор. Примеры способов генетической инженерии могут включать генетическую рекомбинацию, трансдукцию, слияние клеток и нокаут генов.
Снижение или устранение внутриклеточной активности требуемого фермента или белка и степень снижения можно подтверждать, определяя активность фермента или белка в клеточном экстракте или в его очищенной фракции, получаемых из штамма-кандидата, и сравнивая ее с активностью штамма дикого типа, или определяя формирование требуемого продукта целыми клетками.
3
12
3
12
in vivo
Предпочтительно один или несколько микроорганизмы экспрессируют один или несколько ферментов, необходимых для катализа продукции сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты, предпочтительно C-C-алкилметакрилатов. Предпочтительно, соответствующий этап(ы) и любые дополнительные ферментативные этапы проводят , в одном или нескольких микроорганизмах.
Один или несколько микроорганизмов могут экспрессировать один или несколько ферментов в природе, или для экспрессии одного или нескольких ферментов их можно подвергать генетической инженерии, или они могут экспрессировать комбинацию ферментов дикого типа или генетически сконструированных ферментов. Такой подвергнутый генетической инженерии организм можно описать как рекомбинантный организм.
Один или несколько микроорганизмов могут экспрессировать один или несколько ферментов эндогенно или гетерологично, или могут экспрессировать комбинацию эндогенных и гетерологичных ферментов.
В контексте настоящего изобретения, термин "рекомбинантный организм" означает генетически модифицированный или подвергнутый генетической инженерии организм, содержащий генетический материал, который искусственно сконструирован и встроен в этот организм. Генетический материал может содержать эндогенные или гетерологичные нуклеинов кислоты, которые могут быть дополнительно генетически модифицированы или нет.
В контексте настоящего изобретения, термин "эндогенный" означает полученный у организма того же вида.
В контексте настоящего изобретения, термин "гетерологичный" означает полученный у организма другого вида.
3
12
3
12
Один или несколько генов, которые можно экспрессировать в микроорганизме так, что он становится модифицированным с продукцией сложного C-C-эфира метакриловой кислоты, предпочтительно C-C-алкилметакрилата, включают гены, кодирующие любой из указанных ниже ферментов.
В определенных вариантах осуществления микроорганизм может экспрессировать один или несколько ферментов, которые могут преобразовывать изобутирил-КоА в метакрилил-КоА, например, оксидазу, дегидрогеназу или оксидоредуктазу.
Arabidopsis thaliana
Arthrobacter nicotianae
Vigna radiata
Candida
Candida tropicalis
Arabidopsis thaliana
Оксидаза может представлять собой оксидазу, действующую на связи CH-CH, с номером EC 1,3.x.x, более предпочтительно оксидазу, действующую на связи CH-CH с использованием кислорода в качестве акцептора электронов, с номером EC EC 1.3.3.x. Еще более предпочтительно, оксидаза представляет собой ацил-КоА-оксидазу, соответственно, с номером EC EC 1.3.3.6. Более предпочтительно ацил-КоА-оксидаза выбрана из любых из приводимых ниже ферментов: ACX4 , короткоцепочечная ацил-КоА-оксидаза , пероксисомальная ацил-КоА-оксидаза , ацил-КоА-оксидаза вида  и ацил-КоА-оксидаза 4 . Наиболее предпочтительно ацил-КоА-оксидаза представляет собой ACX4 .
Pseudomonas putida
Homo sapiens
Arabidopsis thaliana
Оксидоредуктаза может представлять собой оксидоредуктазу с номером EC из группы 1.X.X.X. Предпочтительно, оксидоредуктаза представляет собой оксидоредуктазу, действующую на группу CH-CH доноров электронов, соответственно, с номером EC из группы 1.3.X.X. Более предпочтительно, оксидоредуктаза, действующая на группу CH-CH доноров представляет собой FAD-зависимую оксидоредуктазу, еще более предпочтительно оксидоредуктаза представляет собой КоА-дегидрогеназу с номером EC из группы 1.3.8.X. Еще более предпочтительно оксидоредуктаза представляет собой короткоцепочечную ацил-КоА-дегидрогеназу, соответственно, с номером EC из группы 1.3.8.1, изовалерил-КоА-дегидрогеназу, соответственно, с номером EC из группы 1.3.8.4, 2-метилацил-КоА-дегидрогеназу ацилов с разветвленной цепью, соответственно, с номером EC из группы 1.3.8.5 или ацил-КоА-дегидрогеназу, соответственно, с номером EC из группы 1.3.8.-, такую как изобутирил-КоА-дегидрогеназа. Наиболее предпочтительно оксидоредуктаза выбрана из любых из приводимых ниже ферментов: ацил-КоА-дегидрогеназа ацилов с короткой/разветвленной цепью , изобутирил-КоА-дегидрогеназу  и изовалерил-КоА-дегидрогеназу .
Как правило, КоА-дегидрогеназные ферменты требуют ассоциированной системы транспорта электронов для сцепления окисления субстрата с восстановлением убихинона, который затем регенерирует. Такая система транспорта электронов состоит из электронопереносящего флавопротеина (ETF) и оксидоредуктазы электронопереносящего флавопротеина:убихинона (ETFQO). ETF должен быть совместим с ацил-КоА-дегидрогеназным ферментом и ETFQO. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, где используют ацил-КоА-дегидрогеназу, предпочтительно используют одну из приводимых ниже систем регенерации:
Pseudomonas putida
• микроорганизм-хозяин, экспрессирующий эндогенную КоА-дегидрогеназу с активностью в отношении изобутирил-КоА и ассоциированную с ней систему транспорта электронов, так как в случае, например, ;
Homo sapiens
Pseudomonas putida
Paracoccus denitrificans
Arabidopsis thaliana
Escherichia coli
• микроорганизм-хозяин, экспрессирующий гетерологичный КоА-дегидрогеназный фермент вместе с белками системы транспорта электронов того же организма, что и гетерологичная КоА-дегидрогеназа. Например, КоА-дегидрогеназа и компоненты системы транспорта электронов , ,  или , где все экспрессируют в  (или другом организме-хозяине); или
Homo sapiens
Sus scrofa
Rhodobacter sphaeroides
A. thaliana
R. sphaeroides
A. thaliana
R. sphaeroides
P. denitrificans
Paracoccus denitrificans
H. sapiens
• микроорганизм-хозяин, экспрессирующий гетерологичный КоА-дегидрогеназный фермент вместе с компонентами системы транспорта электронов, также из других микроорганизмов, где эти компоненты совместимы друг с другом и с КоА-дегидрогеназой. Например, КоА-дегидрогеназа  совместима с электронопереносящим флавопротеином , который в свою очередь совместим с оксидоредуктазой электронопереносящего флавопротеина:убихинона . Альтернативно, так как у оксидоредуктазы ETF:убихинон  выявлена хорошая гомология последовательности с оксидоредуктазой ETF:убихинона , изовалерил-КоА-дегидрогеназа и ETF  могут формировать функциональную систему с оксидоредуктазой ETF:убихинона  для окисления изобутирил-КоА. Наконец, вследствие сходства ETF  с ETF человека и свиньи теоретически рассчитано, что ETF и оксидоредуктаза ETF:убихинона  совместимы с изобутирил-КоА-дегидрогеназой другого источника, такого как изобутирил-КоА-дегидрогеназа  или ее гомологи из других организмов.
3
12
В определенных вариантах осуществления микроорганизм может экспрессировать один или несколько ферментов, которые могут преобразовывать метакрилил-КоА в сложный C-C-эфир метакриловой кислоты, например, алкогольацилтрансферазу.
3
12
3
8
втор
трет
Предпочтительно, алкогольацилтрансфераза действует в присутствии спирта, более предпочтительно C-C-спирта, наиболее предпочтительно, C-C-спирта, еще более предпочтительно в присутствии пропанола или бутанол, таких как, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, -бутанол, -бутанол, пентанолы, гексанолы, гептанолы или октанолы. Наиболее предпочтительно, алкогольацилтрансфераза действует в присутствии изопропанола или н-бутанола.
Под термином спирт в настоящем документе подразумевают молекулы, содержащие гидроксильную группу (группу -OH) и способные к формированию сложноэфирной группы с метакрилатом.
Zingiberales
Rosales
Ericales
Cucurbitales
Brassicales
Laurales
Musaceae
Rosaceae
Ericaceae
Actinidiaceae
Cucurbitaceae
Caricaceae
Lauraceae
Musa
Fragaria
Malus
Prunus
Pyrus
Vaccinium
Actinidia
Cucumis
Carica
Persea
Prunus mume
Pyrus communis
Предпочтительно алкогольацилтрансферазу получают из растительного источника, более предпочтительно из растения, принадлежащего любому порядку, выбранному из группы, состоящей из , , , ,  и ; еще более предпочтительно, растения, принадлежащего любому семейству, выбранному из группы, состоящей из , , , , ,  и ; еще более предпочтительно, растения, принадлежащего любому роду, выбранному из группы, состоящей из , , , , , , , ,  и ; еще более предпочтительно, растение представляет собой любое растение, выбранное из группы, состоящей из банана, клубники, яблока, , , черники, киви, дыни, папайя и авокадо. Наиболее предпочтительно, алкогольацилтрансферазу получают из фруктового источника, такого как яблоко, дыня или томатного источника, соответственно, яблочного источника.
3
12
Arabidopsis thaliana
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения микроорганизм может экспрессировать оксидазу и алкогольацилтрансферазу для преобразования изобутирил-КоА в сложный C-C-эфир метакриловой кислоты. Подходящие оксидазы и алкогольацилтрансферазы указаны выше. Особенно предпочтительно, если оксидаза представляет собой ACX4 .
P. putida
Bacillus subtilis
P. aeuruginosa
A. thaliana
Streptomyces coelicolor
Thermus thermophilus
В определенных вариантах осуществления микроорганизм может экспрессировать один или несколько ферментов, которые могут преобразовывать 2-кетоизовалериановую кислоту в изобутирил-КоА. В определенных вариантах осуществления один или несколько ферментов могут представлять собой ферментный комплекс, такой как ферментный комплекс дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью, состоящий из компонента альфа-субъединицы, компонента липоамидацилтрансферазы и компонента липоамиддегидрогеназа. Наиболее предпочтительно, дегидрогеназа выбрана из любого из приводимых ниже ферментов: дегидрогеназа кетокислот с разветвленной цепью (BCKD) , BCKD , BCKD , BCKD , BCKD  и BCKD .
Pyrococcus furiosis
Pyrococcus
Thermococcus
Thermococcus litoralis
Thermococcus profundus
Methanobacterium thermoautotrophicum
Альтернативно, преобразование 2-кетоизовалериановой кислоты в изобутирил-КоА может катализировать оксидоредуктазный фермент, соответственно, с номером EC из группы 1.X.X.X, предпочтительно оксидоредуктаза, действующая на альдегидную или оксогруппу доноров, соответственно, с номером EC из группы 1,2.X.X, более предпочтительно оксидоредуктазный фермент, действующий на альдегидную или оксогруппу доноров, с использованием железо-серного белка в качестве акцептора электронов, соответственно, с номером EC из группы 1.2.7.X, наиболее предпочтительно 2-кетоизовалератферредоксинредуктаза (также известная как кетовалинферредоксиноксидоредуктаза), соответственно, с номером EC из группы 1.2.7.7, которая представляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц альфа, бета, гамма и дельта. Примеры таких ферментов представляют собой 2-кетоизовалератферредоксинредуктазу ; 2-кетоизовалератферредоксинредуктазу видов ; 2-кетоизовалератферредоксинредуктазу видов ; 2-кетоизовалератферредоксинредуктазу ; 2-кетоизовалератферредоксинредуктазу  и 2-кетоизовалератферредоксинредуктазу .
Pseudomonas chlororaphis
Paecilomyces varioti
Альтернативно, микроорганизм может экспрессировать один или несколько ферментов, которые могут преобразовывать изомасляную кислоту в изобутирил-КоА, например, лигазу. Лигаза соответственно, находится в группе с номерами EC 6.X.X.X, предпочтительно представляет собой формирующую связь углерод-сера лигазу с номером EC из группы 6.2.X.X, более предпочтительно формирующую связь кислотный остаток-тиол лигазу с номером EC из группы 6.2.1.X, более предпочтительно формирующую GDP, АДФ или АМФ лигазу, такую как формирующую АМФ ацетат-КоА-лигазу, соответственно, с номером EC из группы 6.2.1.1, бутират-КоА-лигазу, соответственно, с номером EC из группы 6.2.1.2, карбоксилат-КоА-лигазу, соответственно, с номером EC из группы 6.2.1.10, формирующую АДФ ацетат-КоА-лигазу, соответственно, с номером EC из группы 6.2.1.13, пропионат-КоА-лигазу, соответственно, с номером EC из группы 6.2.1.17 или ацил-тиол-лигазу в группе с номерами EC 6.2.1.-. Наиболее предпочтительно лигаза выбрана из любой из приводимых ниже ферментов: AcsA , бутирил-КоА-синтетазы , бутирил-КоА-синтетазы митохондрий сердца быка.
Альтернативно, микроорганизм может экспрессировать один или несколько ферментов, которые могут преобразовывать изобутират в изобутирил-КоА. Например, изобутират можно преобразовывать в изобутирилфосфат посредством киназного фермента, а изобутирилфосфат можно преобразовывать в изобутирил-КоА посредством трансферазного фермента.
Spirochete MA-2
C. butyricum
Предпочтительно изобутират преобразуют в изобутирилфосфат посредством киназного фермента, соответственно, с номером EC из группы EC 2.X.X.X, предпочтительно с номерами EC 2.7.X.X, более предпочтительно с номером EC из группы EC 2.7.2.X, наиболее предпочтительно ацетаткиназы, соответственно, с номером EC из группы 2.7.2.1, формиаткиназы с номером EC 2.7.2.6, бутираткиназы с номером EC 2.7.2.7, киназы жирных кислот с разветвленными цепями с номером EC 2.7.2.14 или пропионаткиназы с номером EC 2.7.2.15. Наиболее предпочтительно киназа выбрана из любого из приводимых ниже ферментов: киназы жирных кислот с разветвленными цепями , бутираткиназы .
Clostridium acetobutylicum
Bacillus subtilis
Corynebacterium glutamicum
Thermotoga maritima
Clostridium kluyveri
Clostridium
Clostridium pasteurianum
Clostridium beijerinckii
Предпочтительно изобутирилфосфат преобразуют в изобутирил-КоА под действием трансферазного фермента с номером EC из группы 2.X.X.X, более предпочтительно под действием ацилтрансферазы с номером EC из группы 2.3.X.X, еще более предпочтительно под действием ацилтрансферазы, переносящей группы, отличающиеся от аминоацильных групп, с номером EC из группы 2.3.1.X. Еще более предпочтительно фосфатацетилтрансфераза или фосфатбутирилтрансферазы, с номером EC из групп 2.3.1.8 и 2.3.1.19, соответственно. Более предпочтительно трансфераза представляет собой фосфатбутирилтрансферазу  ATCC824 или фосфатацетилтрансферазы , ATCC13032 ,  и . Другие источники этих ферментов включают другие анаэробные бактерии, особенно виды , такие как  или .
P. chloraphis
Микроорганизм может экспрессировать один или несколько ферментов, которые могут преобразовывать изомасляную кислоту в изобутирил-КоА, например, синтетазный фермент, предпочтительно изобутирил-КоА-синтетазу, наиболее предпочтительно изобутирил-КоА-синтетазу (AcsA)  B23.
Необязательно, микроорганизм может экспрессировать любую комбинацию описанных выше ферментов.
Escherichia coli
Homo sapiens
Propionibacterium fredenreichii
Methylobacterium extorquens
Shigella flexneri
Salmonella enterica
Yersinia frederiksenii
Propionibacterium acnes
Rattus norvegicus
Caenorhabditis elegans
Bacillus cereus
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter baylyi
Acinetobacter
Clostridium kluyveri
Pseudomonas
Thermus thermophilus
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas putida
Oryctolagus cuniculus
Clostridium acetobutylicum
Leuconostoc mesenteroides
Eubacterium barkeri
Bacteroides capillosus
Anaerotruncus colihominis
Natranaerobius thermophilus
Campylobacter jejuni
Arabidopsis thaliana
Corynebacterium glutamicum
Sus scrofa
Bacillus subtilus
Pseudomonas fluorescens
Serratia marcescens
Streptomyces coelicolor
Methylibium petroleiphilum
Streptomyces cinnamonensis
Streptomyces avermitilis
Archaeoglobus fulgidus
Haloarcula marismortui
Pyrobaculum aerophilum
Saccharomyces cerevisiae
Clostridium cochlearium
Clostridium tetanomorphum
Clostridium tetani
Citrobacter amalonaticus
Ralstonia eutropha
Mus musculus
Bos taurus
Fusobacterium nucleatum
Morganella morganii
Clostridium pasteurianum
Rhodobacter sphaeroides
Xanthobacter autotrophicus
Clostridium propionicum
Megasphaera elsdenii
Aspergillus terreus
Candida
Sulfolobus tokodaii
Metallosphaera sedula
Chloroflexus aurantiacus
Clostridium saccharoperbutylacetonicum
Acidaminococcus fermentans
Helicobacter pylori
Источники нуклеиновых кислот для генов, кодирующих белки, в частности, ферменты, экспрессируемые микроорганизмами по настоящему изобретению, могут включать, например, любые виды, где кодируемый продукт гена способен катализировать указанную реакцию. Такие виды включают прокариотические и эукариотические организмы, включающие в качестве неограничивающих примеров, бактерии, включая архебактерии и эубактерии, и эукариоты, включая дрожжи, растения, насекомые, животное и млекопитающее, включая человека. Иллюстративные виды для таких источников включают, например, , , , , , , , , , , , , , виды , , виды , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , а также другие иллюстративные виды, описываемые в настоящем документе или доступные в качестве организмов-источников для соответствующих генов.
3
12
Способы конструирования и тестирования экспрессии белков у неприродного продуцирующего сложный C-C-эфир метакриловой кислоты микроорганизма можно проводить, например, рекомбинантными способами и способами детекции, хорошо известными в данной области. Описания таких способов можно найти, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999).
3
12
Экзогенные последовательности нуклеиновых кислот, включенные в путь продукции сложного C-C-эфира метакриловой кислоты или промежуточного соединение при его формировании, можно вносить в клетку микроорганизма стабильно или транзиторно способами, хорошо известными в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров, конъюгацию, электропорацию, химическую трансформацию, трансдукцию, трансфекцию и трансформация ультразвуком.
Bacillus subtilis
Примеры способов трансформации могут включать обработку реципиентных клеток микроорганизмов хлоридом кальция с увеличением проницаемости для ДНК, и получение компетентных клеток из клеток, находящихся в фазе роста, с последующей трансформацией ДНК. Альтернативно, также можно использовать способ преобразования клеток-реципиентов ДНК в протопласты или сферопласты, которые могут легко захватывать рекомбинантную ДНК, с последующим введением рекомбинантной ДНК в клетки, который, как известно, применим для , актиномицет и дрожжей. Кроме того, трансформацию микроорганизмов также можно проводить посредством электропорации. Такие способы хорошо известны в данной области.
E. coli
E. coli
Некоторые последовательности нуклеиновых кислот в генах или кДНК нуклеиновых кислот эукариотических организмов для экзогенной экспрессии в  или других клетках прокариотических микроорганизмов могут кодировать направляющие сигналы, такие как N-концевой митохондриальный или другой направляющий сигнал, который, при желании, перед трансформацией в клетки прокариотических микроорганизмов можно удалять. Например, удаление митохондриальной лидерной последовательности приводит к увеличенной экспрессии в  (Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005). Для экзогенной экспрессии в дрожжах или других клетках эукариотических микроорганизмов гены можно экспрессировать в цитозоле, без добавления лидерной последовательности, или можно направлять в митохондрии или другие органеллы, или направлять для секреции, добавляя подходящую направляющую последовательность, такую как митохондриальный направляющий или секреторный сигналы, подходящие для направления в органеллу. Таким образом, следует понимать, что в экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты для придания требуемых свойств можно проводить требуемые модификации с последовательность нуклеиновой кислоты с удалением или включением направляющей последовательности. Кроме того, для достижения оптимизированной экспрессии белков в микроорганизмах кодоны генов хорошо известными в данной области способами можно подвергать оптимизации.
Как проиллюстрировано в настоящем документе, можно конструировать, экспрессирующий вектор или экспрессирующие векторы, содержащие одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих ферменты путей биосинтеза, функционально связанные с последовательностями контроля экспрессии, функциональными в этих микроорганизмах. Экспрессирующие векторы, подходящие для применения в микроорганизмах по изобретению, включают, например, плазмиды, космиды, фаговые векторы, вирусные векторы, эписомы и искусственные хромосомы, включая векторы и селективные последовательности или маркеры, пригодные для стабильной интеграции в хромосому хозяина.
Кроме того, экспрессирующие векторы могут содержать один или несколько генов селективных маркеров и подходящие последовательности контроля экспрессии. Также можно включать гены селективных маркеров, которые, например, обеспечивают устойчивость к антибиотикам или токсинам, дополняют ауксотрофный дефицит, или обеспечивают критически важные питательные вещества, отсутствующие в средах для культивирования. Последовательности контроля экспрессии могут включать конститутивные, индуцибельные или репрессируемые промоторы, энхансеры транскрипции, терминаторы транскрипции, сигналы трансляции и т.п., которые хорошо известны в данной области. Когда необходимо коэкспрессировать две или более экзогенные кодирующие последовательности нуклеиновых кислот, обе последовательности нуклеиновых кислот можно встраивать, например, в один экспрессирующий вектор или в разные экспрессирующие векторы. Для экспрессии в одном векторе кодирующие нуклеиновые кислоты можно функционально связывать с одной общей последовательностью контроля экспрессии или связывать с различными последовательностями контроля экспрессии, такими как индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. В определенных вариантах осуществления вектор может содержать два или более промоторов для коэкспрессии нескольких генов или оперонов. В определенных вариантах осуществления гены/опероны можно экспрессировать в одном или нескольких различных векторах с одним или несколькими соответствующими промоторами.
Enterobacteriaceae
E. coli
Pichia pastoris
Saccharomyces cerevisiae
Вектор, используемые для трансформации может представлять собой вектор, автономно реплицирующийся в клетке микроорганизма. Примеры векторов, автономно реплицирующихся у бактерий , таких как , могут включать плазмидные векторы pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29, pET20b(+), pET28b(+) (векторы pET доступны в Novagen), pLysS, (векторы pHSG и pSTV доступны в Takara Bio Inc.), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (векторы pMW доступны в Nippon Gene Co., Ltd.) и т.д. и их производные. Кроме того, векторы для коринеформных бактерий могут включать pAM330 (патент Японии, опубликованный под № 58-67699), pHM1519 (патент Японии, опубликованный под № 58-77895), pSFK6 (патент Японии, опубликованный под № 2000-262288), pVK7 (USP2003-0175912A), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (патент Японии, опубликованный под № 58-192900), pCG1 (патент Японии, опубликованный под № 57-134500), pCG2 (патент Японии, опубликованный под № 58-35197), pCG4, pCG11 (патент Японии, опубликованный под № 57-183799), pHK4 (патент Японии, опубликованный под № 5-7491) и т.д. Кроме того, векторы для дрожжей могут включать плазмиды дрожжей, например, такие как pD902 или pD905 для  или pD1201, pD1204, pD1205, pD1207, pD1211, pD1214 pD1215, pD1217, pD1218, pD1221, pD1224, pD1225, pD1227, pD1231, pD1234, pD1235, pD1237 для . Также гены хорошо известными способами можно интегрировать в хромосому хозяина, (например, Datensko and Wanner (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645)).
Увеличение активности фермента может включать увеличение экспрессии гена-мишени посредством замены регулирующей экспрессию последовательности гена-мишени, такой как промотор на геномной ДНК или плазмида с промотором, с соответствующей силой. Например, как часто используемые промоторы известны промотор thr, промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор pL, промотор tac, и т.д. Примеры промоторов с высокой активностью экспрессии в микроорганизмах, таких как бактерии, могут включать промоторы гена фактора элонгации Tu (EF-Tu), tuf, промоторы генов, которые кодируют кошаперонин GroES/EL, тиоредоксинредуктазу, фосфоглицератмутазу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и т.п. (WO2006/028063, EP1697525). Примеры сильных промоторов и способы оценки силы промоторов хорошо известны в данной области.
Escherichia coli
Pantoea ananatis
Кроме того, также возможно заменять несколько нуклеотидов в области промотора гена так, что промотор приобретает соответствующую силу, как описано в WO 2000/18935. Замену регулирующей экспрессию последовательности можно проводить, например, таким же образом, как при замене генов с использованием температурочувствительных плазмид. Примеры векторов с температурочувствительным участком начала репликации, которые можно использовать для  или , могут включать, например, плазмиду pMAN997, описанную в международной публикации WO 1999/03988, ее производные и т.д. Кроме того, замену регулирующей экспрессию последовательности также можно проводить способами, в которых используют линейную ДНК, такими как способ, называемый "направляемая Red интеграция", с использованием рекомбиназы Red λ-фага (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645), где в способе скомбинирован способ интеграции под контролем Red и система эксцизии λ-фага (Cho, E. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184:5200-5203) (WO2005/010175) и т.д. Модификацию регулирующей экспрессию последовательности можно комбинировать с увеличением числа копий гена.
Кроме того, известно, что замена нескольких нуклеотидов в спейсере между участком связывания рибосомы (RBS) и стартовым кодоном и, в частности, последовательности, расположенные непосредственно перед стартовым кодоном, сильно влияют на трансляцию иРНК. Посредством модификации этих последовательностей можно улучшать трансляцию.
Когда в указанные выше плазмиду или хромосому встраивают ген-мишень, для экспрессии гена можно использовать любой промотор, если выбран промотор, который функционирует в используемых микроорганизмах. Промотор может представлять собой нативный промотор гена или модифицированный промотор. Экспрессию гена также можно контролировать посредством подходящего выбора промотора, который эффективно функционирует в выбранном микроорганизме(ах), или посредством сближения областей -35 и -10 промотора, близких с консенсусной последовательностью.
Трансформацию, трансдукцию, конъюгацию или встраивание в хромосому экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот, включенных в путь метаболизма или синтеза можно подтверждать способами, хорошо известными в данной области. Такие способы включают, например, экстракцию плазмидной или хромосомной ДНК с последующими полимеразной цепной амплификацией конкретных последовательностей-мишеней или рестрикционным картированием, дополнительным анализом нуклеиновых кислот, таким как "нозерн"-блот, или амплификация посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) иРНК, или электрофорез в полиакриламидном геле, или определения ферментативной активности, или иммуноблоттинг для продуктов экспрессии генов, или другие подходящие способы анализа для тестирования экспрессии введенной последовательности нуклеиновой кислоты или соответствующего ей продукта гена. Специалистам в данной области понятно, что экзогенная нуклеинов кислота экспрессирована в достаточном для получения требуемого продукта гена количество, и также понятно, что способами хорошо известными в данной области уровни экспрессии можно оптимизировать с получением достаточного уровня экспрессии.
Следует отметить, что один или несколько генов, кодирующих ферменты, которые можно экспрессировать в микроорганизмах по изобретению, также включают гены, кодирующие варианты указанных ферментов, например, варианты ферментов, которые включают замены, делеции, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в полипептидной последовательности, где указанный полипептид сохраняет активность немодифицированного фермента. Такие варианты ферментов также включают варианты ферментов, которые обладают сниженной по сравнению с немодифицированным ферментом и ферментами с модифицированным аллостерическим контролем ферментативной активностью.
3
12
Дополнительные способы придания или усиления способности продуцировать сложный C-C-эфир метакриловой кислоты и/или его промежуточные соединения могут включать придание устойчивости к супрессорам/ингибиторам, придание чувствительности к активаторам или устранение необходимости аллостерической активации ферментов другими соединениями.
Экстракция растворителями
3
12
3
12
В способе по настоящему изобретению в контакте с ферментационной средой предоставлена органическая фаза, где органическая фаза содержит сложный C-C-эфир метакриловой кислоты, предпочтительно C-C-алкилметакрилат в более высокой концентрации, чем концентрация в ферментационной среде.
3
12
3
12
Продукция сложного C-C-эфира метакриловой кислоты, такого как бутилметакрилат, дает преимущество разделения фаз с ферментационной средой при высоких концентрациях по мере достижения предела растворимости. Таким образом, если титр сложного C-C-эфира метакриловой кислоты в ферментационной среде является достаточно высоким, необходимость в дополнительной растворителе для экстракции может быть сведена на нет и тогда сложный эфир формирует свою собственную органическую фазу.
3
12
Предпочтительно титр сложного C-C-эфира метакриловой кислоты в ферментационной среде составляет по меньшей мере 5 мг/л. Например, 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155 мг/л. Более предпочтительно титр составляет более 160 мг/л, 180 мг/л, 200 мг/л, 220 мг/л или 240 мг/л.
3
12
3
12
В предпочтительных вариантах осуществления титр сложного C-C-эфира метакриловой кислоты в ферментационной среде находится на пределе растворимости для ферментационной среды так, что сложный C-C-эфир метакриловой кислоты отделяется с формированием органической фазы, с которой она контактирует.
3
12
В определенных вариантах осуществления, когда сложный C-C-эфир метакриловой кислоты представляет собой бутилметакрилат, особенно предпочтительно, чтобы титр бутилметакрилата в ферментационной среде составлял по меньшей мере 120, 130, 140, 150 или 200 мг/л. Даже более предпочтительным является титр бутилметакрилата на пределе растворимости в ферментационной среде, приблизительно 220 мг/л. При такой концентрации необходимость в дополнительном экстракционном растворителе можно свести на нет.
3
12
3
12
3
12
Таким образом, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения органическая фаза, указанная на этапе b), может быть обеспечена сложным C-C-эфиром метакриловой кислоты, продуцируемым микроорганизмом. Альтернативно, в определенных вариантах осуществления органическая фаза, указанная на этапе b), может содержать внешний органический растворитель в контакте (например, добавленным) с ферментационной средой до, в течение или после ферментации. Например, органический растворитель можно добавлять к ферментационной среде в виде слоя (например, слоя над ферментационной средой) до, в течение или после ферментации. Предпочтительно внешний органический растворитель эффективен для экстракции сложного C-C-эфира метакриловой кислоты из ферментационной среды при контакте между ними, чтобы как правило, содержать указанный сложный C-C-эфир метакриловой кислоты.
В определенных вариантах осуществления, в которых с ферментационной средой приводят в контакт внешний органический растворитель, органическая фаза предпочтительно составляет менее 50% общего объема среды (т.е. общего объема ферментационной среды и органической фазы). Более предпочтительно, в этом случае органическая фаза составляет менее 40%, 30% или 20% общего объема среды.
3
12
В определенных вариантах осуществления, в которых органическая фаза, указанная на этапе b), обеспечена по существу сложным C-C-эфиром метакриловой кислоты, продуцируемым микроорганизмом, органическая фаза составляет менее 20% общего объема среды (т.е. общего объема ферментационной среды и органической фазы). Более предпочтительно, в этом случае органическая фаза составляет менее 10% или 5% общего объема среды.
В определенных вариантах осуществления органический растворитель является биосовместимым, т.е. не является высокотоксичным для микроорганизмов.
o/w
o/w
o/w
o/w
В определенных вариантах осуществления значение logP органического растворителя является большим или равным 3,0. Более предпочтительно, значение logP органического растворителя является большим или равным 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 или 4,0. logP определен как логарифм коэффициента распределения конкретного растворителя между стандартизированной смесью 1-октанола и воды 1:1. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что с увеличением значения logP происходит снижение итоговой токсичности для микроорганизма. Особенно предпочтительными растворителями являются алканы более высокого порядка от C6 и выше, которые могут являться неразветвленными или разветвленными, циклические алканы от C7 и выше и ароматические соединения, в частности, бензол, замещенный одним или несколькими заместителями от C3 и вышеe, в частности, алкильными заместителями, которые могут являться неразветвленными или разветвленными.
В определенных вариантах осуществления органический растворитель выбран из группы, состоящей из трибутирина, изопропилбензола, н-пропилбензола, циклогептана, гексана, гептана, циклооктана, изооктана, 1,4-диизопропилбензола, октана, нонана, декана, ундекана или додекана и их смесей.
Органический растворитель также может представлять собой ионную жидкость. В таких вариантах осуществления органический растворитель выбран из группы, состоящей из бис(2-этилгексил)фосфата тригексил(тетрадецил)фосфиния, дицианамида тригексил(тетрадецил)фосфиния, бис(трифторметан)сульфонимида тригексил(тетрадецил)фосфиния, ацесульфама тригексил(тетрадецил)фосфиния, сахарината тригексил(тетрадецил)фосфиния, салицилата тригексил(тетрадецил)фосфиния, трифторметансульфоната тригексил(тетрадецил)фосфиния, бис(2,4,4-триметилпентил)фосфината тригексил(тетрадецил)фосфиния, дицианамида тригексил(тетрадецил)фосфиния, октаноата тригексил(тетрадецил)фосфиния, цикламата тригексил(тетрадецил)фосфиния, бис(трифторметан)сульфонимида трибутил(октил)фосфиния, салицилата трибутил(октил)фосфиния, трифторметансульфоната трибутил(октил)фосфиния, ацесульфама трибутил(октил)фосфиния, сахарината трибутил(октил)фосфиний, бис(трифторметан)сульфонимида трибутил(октил)фосфиния, бис(трифторметан)сульфонимид трибутил(метил)аммония или ацесульфама тетраоктиламмония или их смесей.
Способ по настоящему изобретению включает удаление органической фазы из контакта с ферментационной средой. Как понятно специалисту фраза "удаление органической фазы" не обязательно означает, что удаляют всю органическую фазу. Хотя на этапе c) можно удалить всю органическую фазу (или большинство органической фазы), следует понимать, что за один раз можно удалить только часть органической фазы. В непрерывном способе органическую фазу можно удалять непрерывно в равновесии с продукцией сложного эфира в ферментационной среде.
В определенных вариантах осуществления удаление органической фазы на этапе c) способа по настоящему изобретению может являться непрерывным, т.е. его можно проводить на всем протяжении способа. Альтернативно, удаление органической фазы может являться дискретным т.е. его можно проводить в определенные моменты в течение способа.
3
12
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения способ может дополнительно включать очистку сложного C-C-эфира метакриловой кислоты в органической фазе (например, удаленной органической фазе), например, посредством возгонки.
Переэтерификация
3
12
Настоящее изобретение относится к переэтерификации сложного C-C-эфира метакриловой кислоты с получением метилметакрилата.
Реакцию переэтерификации на этапе d) по настоящему изобретению проводят в присутствии метанола и катализатора.
В определенных вариантах осуществления переэтерификацию проводят в присутствии катализатора. Можно использовать любой подходящий катализатор, например, кислотный или основной катализатор или биокатализатор, например, фермент, такой как липаза.
Катализатор может представлять собой гомогенный или гетерогенный катализатор. В одном из вариантов осуществления катализатор можно растворять в жидкой реакционной фазе. Однако катализатор можно суспендировать на твердой подложке над которой может проходить реакционная фаза. В этом случае реакционная фаза предпочтительно находится в жидкой, более предпочтительно, в водной фазе. Предпочтительно катализатор является гомогенным.
Как понятно специалисту, гомогенный катализатор представляет собой катализатор, который находится в той же фазе, что и реагенты, тогда как гетерогенный катализатор представляет собой катализатор, находящийся в фазе, отличной от фазы, в которой находятся реагенты.
Предпочтительно катализатор представляет собой катализатор в виде основной соли. Предпочтительно, основный катализатор содержит оксид, гидроксид, карбонат, ацетат (этаноат), алкоксид, гидрокарбонат или соль разлагаемой ди- или трикарбоновой кислоты металла, или четвертичное аммонийное соединение любого из указанного выше; более предпочтительно оксид, гидроксид, карбонат, ацетат, алкоксид, гидрокарбонат или соль ди- или трикарбоновой кислоты или метакриловой кислоты металла группы I или группы II. Основной катализатор также может содержать один или несколько аминов. Наиболее предпочтительно, катализатор представляет собой гидроксид или алкоксид металла группы I или группы II.
2
2
2
2
4
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
3
3
3
3
4
2
3
3
3
3
3
3
3
2
3
2
3
2
3
2
4
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
6
4
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
2
2
2
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Предпочтительно, катализатор выбран из одного или нескольких из приводимого ниже: LiOH, NaOH, KOH, Mg(OH), Ca(OH), Ba(OH), CsOH, Sr(OH), RbOH, NHOH, LiCO, NaCO, KCO, RbCO, CsCO, MgCO, CaCO, SrCO, BaCO, (NH)CO, LiHCO, NaHCO, KHCO, RbHCO, CsHCO, Mg(HCO), Ca(HCO), Sr(HCO), Ba(HCO), NHHCO, LiO, NaO, KO, RbO, CsO, MgO, CaO, SrO, BaO, Li(OR), Na(OR), K(OR), Rb(OR), Cs(OR), Mg(OR), Ca(OR), Sr(OR), Ba(OR), NH4(OR), где R представляет собой любую C-C разветвленную, неразветвленную или циклическую алкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими функциональными группами; NH(RCO), Li(RCO), Na(RCO), K(RCO), Rb(RCO), Cs(RCO), Mg(RCO), Ca(RCO), Sr(RCO) или Ba(RCO), где RCO представляет собой ацетат; (NH)(CORCO), Li(CORCO), Na(CORCO), K(CORCO), Rb(CORCO), Cs(CORCO), Mg(CORCO), Ca(CORCO), Sr(CORCO), Ba(CORCO), (NH)(CORCO), где CORCO представляет собой оксалат; метиламин, этиламин, пропиламин, бутиламин, пентиламин, гексиламин, циклогексиламин, анилин; RNOH где R представляет собой метил, этил, пропил, бутил; диазабициклоундецен и диазабициклононан.
2
2
2
2
4
2
2
2
2
1
6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Более предпочтительно, катализатор выбран из одного или нескольких из приводимого ниже: LiOH, NaOH, KOH, Mg(OH), Ca(OH), Ba(OH), CsOH, Sr(OH), RbOH, NHOH, Li(OR), Na(OR), K(OR), Rb(OR), Cs(OR), Mg(OR), Ca(OR), Sr(OR), Ba(OR), NH4(OR), где R представляет собой любую C-C разветвленную, неразветвленную или циклическую алкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими функциональными группами; диазабициклоундецен и диазабициклононан.
1
1
1
1
1
1
Наиболее предпочтительно, катализатор выбран из одного или нескольких из приводимого ниже: LiOH, NaOH, KOH, RbOH, CsOH, Li(OR), Na(OR), K(OR), Rb(OR), Cs(OR), где R представляет собой метильную группу; диазабициклоундецен и диазабициклононан.
Предпочтительные катализаторы включают основные соли металлов группы I и группы II, например, соли лития, натрия, калия, рубидия, цезия, франция, бериллия, магния, кальция, стронция, бария или радия. Особенно предпочтительны соли лития, натрия, калия, рубидия, цезия или франция (т.е. металлов группы I).
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения катализатор содержит метоксиды или гидроксиды металлов группы I, например, метоксид натрия, метоксид лития, метоксид калия, гидроксид натрия, гидроксид лития или гидроксид калия.
В особенно предпочтительных вариантах осуществления катализатор представляет собой метоксид металла группы I или группы II, предпочтительно метоксид металла группы I. Авторами изобретения показано, что метоксиды металлов группы I, в частности, метоксид лития, являются особенно эффективными, так как эти катализаторы не инактивируются так быстро, как другие катализаторы, и, таким образом, их можно использовать в непрерывном способе (в дополнение к периодическим реакциям).
3
12
3
12
В определенных вариантах осуществления сложный C-C-эфир метакриловой кислоты находится в органической фаза, удаляемой на этапе c) по настоящему изобретению, и изобретение включает переэтерификацию сложного C-C-эфира метакриловой кислоты. Переэтерификацию на этапе d) можно проводить одновременно с удалением органической фазы на этапе c) или после него.
В определенных вариантах осуществления реакцию переэтерификации проводят в условиях, где молярный % воды относительно катализатора составляет меньше или равно 500%, 400%, 300%, 200% или 100%. Предпочтительно, молярный % воды относительно катализатора составляет меньше или равно 90%, 80%, 70% или 60%. Более предпочтительно молярный % воды относительно катализатора составляет меньше или равно 50%, 40%, 30%, 35%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Предпочтительно реакцию переэтерификации проводят в отсутствие воды.
3
12
Авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что при уменьшении количества воды, присутствующей при реакции переэтерификации, преобразование сложного C-C-эфира метакриловой кислоты, в частности, бутилметакрилата, в метилметакрилат возрастает. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения перед переэтерификацией на этапе d) для уменьшения количества воды, присутствующей при реакции переэтерификации (например, в форме водной ферментационной среды), производят дополнительную очистку (или обезвоживание) органической фазы.
Таким образом, в определенных вариантах осуществления способ включает этап очистки (или обезвоживания) органической фазы, необязательно перед переэтерификацией на этапе d). Необязательно, очистку или сушку проводят посредством возгонки.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает e) очистку MMA от среды, в которой проводят реакцию переэтерификации. Такую очистку можно проводить, например, посредством возгонки.
Ферментация и ферментационная среда
3
12
В настоящем изобретении микроорганизмы предоставлены в ферментационной среде в условиях, в которых указанный микроорганизм продуцируют сложный C-C-эфир метакриловой кислоты.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает культивирование микроорганизма в указанной ферментационной среде. Культивирование или выращивание, соответственно, требует наличия углеродного сырья, из которого микроорганизм может получать энергию и расти. Таким образом, микроорганизмы предпочтительно культивируют на углеродном сырье.
Ферментационная среда может представлять собой окружающую среду, которая окружает микроорганизмы. Предпочтительно в среде присутствует углеродное сырье, необязательно растворенное или суспендированное в среде, барботируеое через среду и/или смешанное со средой. Таким образом, предпочтительно, среда содержит микроорганизмы и углеродное сырье вместе с любыми буферами и солями.
3
12
Ферментационная среда может представлять собой любую коммерчески доступную среду, подходящую для потребностей микроорганизма. Ферментационная среда соответственно, содержит углеродное сырье и источник азота, а также дополнительные соединения необходимые для роста микроорганизмов и/или формирования сложного C-C-эфира метакриловой кислоты.
Примеры подходящего углеродного сырья, известные в данной области, включают глюкозу, мальтозу, мальтодекстрины, сахарозу, гидролизованный крахмал, крахмал, лигнин, ароматические вещества, синтетический газ или кго компоненты, метан, этан, пропан, бутан, мелассы и масла. Предпочтительно углеродное сырье получают из биомассы. Также можно использовать смеси, а также отходы, такие как муниципальные отходы, пищевые отходы и лигноцеллюлозные отходы переработки пищевых продуктов, лесохозяйства или сельского хозяйства.
Примеры подходящих источников азота, известные в данной области, включают соевую муку, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, аммиак, аммонийные соли, нитратные соли, мочевину, газообразный азот или другие источники азота.
Примеры дополнительных соединений, которые могут требоваться для роста микроорганизмов (и, таким образом, могут присутствовать в ферментационной среде), включают антибиотики, противогрибковые препараты, антиоксиданты, буферы, фосфаты, сульфаты, магниевые соли, микроэлементы и/или витамины.
3
12
3
12
Дополнительные соединения, требуемые для роста микроорганизмов и/или получения сложного C-C-эфира метакриловой кислоты, такие как фосфаты, сульфаты или микроэлементы, можно добавлять в количествах, которые могут варьировать для разных классов микроорганизмов, т.е. для грибов, дрожжей и бактерий. Кроме того, количество дополнительных соединений для добавления может определять то, какие пути используют для формирования сложного C-C-эфира метакриловой кислоты.
Количество углеродного сырья и источника азота для добавления в среду может варьировать в зависимости от потребностей микроорганизмов и/или длительности культивирования микроорганизмов. Отношение углеродного сырья к источнику азота в среде для культивирования может в значительной степени варьировать.
Как правило, количество каждого компонента ферментационной среды, необходимого для роста микроорганизма определяют, измеряя выход после роста на питательном вещества и дополнительно оценивают относительно количества углеродного сырья, использованного в способе культивирования, так как количество формируемой биомассы преимущественно определяется используемым количеством углеродного сырья и ограничениями питательных веществ вводимыми при любом режиме питания.
5
6
5
6
В определенных вариантах осуществления, где углеродное сырье получают из биомассы, биомасса предпочтительно содержит высокое количество углеводов. Особенно предпочтительны углеводы, которые являются источниками C- или C-сахаров, газов на основе углерода или ароматических веществ, предпочтительно C- или C-сахара, более предпочтительно глюкоза, в качестве неограничивающих примеров, такие как крахмал, лигнин, целлюлоза, гликоген, арабиноксилан, хитин или пектин.
Альтернативно биомасса может содержать высокое количество жиров, особенно предпочтительны жиры или масла, которые являются источниками глицерина и жирных кислот, конкретно триглицериды. Подходящие триглицериды включают любое масло или жир, которые легкодоступны из растительного или животного источника. Примеры таких масел и жиров включают пальмовое масло, льняное масло, рапсовое масло, сало, масло, жир сельди, кокосовое масло, растительное масло, подсолнечное масло, касторовое масло, соевое масло, оливковое масло, масло какао, гхи, ворвань и т.д.
Биомасса может состоять из одного или нескольких различных источников биомассы. Примеры подходящих источников биомассы включают первичную древесину, используемую в качестве источника энергии сельскохозяйственную культуру, сельскохозяйственные отходы, пищевые отходы, муниципальные отходы и промышленные отходы или побочные продукты.
Источники биомассы, являющиеся первичной древесиной, в качестве неограничивающих примеров могут включать древесные стружки, кору, обломки, дрова, древесные опилки, древесные гранулы или брикеты.
Источники биомассы, являющиеся используемыми в качестве источника энергии сельскохозяйственными культурами, в качестве неограничивающих примеров могут включать поросль или лесной массив с коротким оборотом рубки, недревесные травы, такие как мискантус, конопля, прутьевидное просо, тростник или рожь, сельскохозяйственные культуры, такие как сахар, крахмал или масличные культуры или водные растения, такие как микро- или макроводоросли и сорные травы.
Сельскохозяйственные остатки в качестве неограничивающих примеров могут включать шелуху, солому, кукурузную солому, муку, зерно, куриный помет, навоз, жидкий навоз, синтетический газ или силос.
Пищевые отходы в качестве неограничивающих примеров могут включать кожуру/кожу, раковины, шелуху, сердцевину, семечки/косточки, несъедобные части животных или рыб, мякоть после экстракции сока и масла, пивные дробины или хмель после пивоварения, кухонные отходы, сало, или масла, или жиры.
Промышленные отходы в качестве неограничивающих примеров могут включать необработанную древесину, включая гранулы, обработанную древесину, сланцевые газы, древесные композитные материалы, включая MDF/OSD, древесно-слоистые структуры, бумажная масса/измельченная бумага/мусор, ткани, включая волокно/пряжу/сбросы или осадки сточных вод.
Микроорганизмы можно культивировать в виде периодической культуры, периодической культуры с подпиткой, стационарной культуры с подпиткой, повторной стационарной культуры с подпиткой или процесса с непрерывным культивированием.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Процесс культивирования предпочтительно проводят в промышленном масштабе. Следует понимать, что процесс в промышленном масштабе включает процесс культивирования в одном или нескольких ферментерах с объемом, составляющим ≥0,01 м, предпочтительно ≥0,1 м, предпочтительно ≥0,5 м, предпочтительно ≥5 м, предпочтительно ≥10 м, более предпочтительно ≥25 м, более предпочтительно ≥50 м, более предпочтительно ≥100 м, наиболее предпочтительно ≥200 м.
3
12
В определенных вариантах осуществления культивирование проводят в биореакторе. Как правило, под биореактором понимают контейнер, в котором проводят культивирование микроорганизмов в промышленности. Биореакторы могут быть любого размера, количества и формы, и могут содержать входные отверстия для подачи питательных веществ, дополнительных соединений для роста, свежей среды, углеродного сырья, добавочных газов, в качестве неограничивающих примеров, таких как, воздух, азот, кислород или диоксид углерода. Также биореакторы могут содержать выходные отверстия для удаления объемов среды для культивирования для сбора сложного C-C-эфира метакриловой кислоты из ферментационной среды. Также биореактор может содержать выходное отверстие для забора образцов культуры.
Как правило, биореактор, можно конфигурировать для смешивания ферментационной среды, например, посредством перемешивания, качания, трясения, переворачивания, барботирования газа через культуру и т.д. Альтернативно, некоторые непрерывные культуры не требуют перемешивания, например, системы с микрореакторами с использованием системы с поршневым потоком. Биореакторы широко распространены и хорошо известны в данной области, и их примеры можно найти в стандартных руководствах, таких как "Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology", Section Edition (1989) Authors: Wulf Cruegar and ANnelise Crueger, translated by Thomas D. Brock Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.
Описанные и проиллюстрированные варианты осуществления следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие по своему характеру, при этом следует понимать, что представлены и описаны только предпочтительные варианты осуществления и что защищаемыми являются все изменения и модификации, которые входят в объем изобретения, как определено в формуле изобретения.
Следует понимать, что хотя использование в описании таких слов, как "предпочтительный", "предпочтительно", "предпочтителен" или "более предпочтительный" позволяет предполагать, что описанная таким образом характеристика является требуемой, она, однако, может не являться обязательной, а варианты осуществления с отсутствием такой характеристики можно рассматривать, как входящие в объем изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения. В отношении формулы изобретения следует понимать, что когда характеристика указана в единственном числе или перед характеристикой используют такие слова как "по меньшей мере один", цели ограничить в пункт формулы изобретения только одной такой характеристикой нет, если только в этом пункте формулы изобретения конкретно не указано обратное.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение дополнительно описано на основании приводимых ниже фигур, на которых представлена:
Фигура 1:
Arabidopsis thaliana
E. coli
Структура плазмиды pMMA121 для экспрессии белка ACX4  в .
Фигура 2:
Arabidopsis thaliana
E. coli
Получение метакрилил-КоА из изобутирил-КоА с использованием белка ACX4 , продуцируемого рекомбинантными .
Фигура 3:
E. coli
Arabidopsis thaliana
Анализ SDS-PAGE фракций рекомбинантных , содержащих белок ACX4 .
Фигура 4:
Arabidopsis thaliana
Pseudomonas aeruginosa
E. coli
Структура плазмид pWA008, pMMA133 и pMMA134 для экспрессии of AAT яблок (MpAAT1), ACX4  и bkdA1, bkdA2, bkdB и IpdV: комплекса генов BCKAD из штамма PA01  в рекомбинантных .
Фигура 5:
E. coli
Получение бутилметакрилата из 2-кетоизовалерата и бутанола посредством анализа ВЭЖХ образца культуры рекомбинантных , экспрессирующих плазмиду pMMA134. , 2-кетоизовалерат (2-OIV); , изомасляная кислота (IBA); , бутилметакрилат (BMA); и ˣ, метакриловая кислота (MAA).
Фигура 6:
Преобразование н-BMA в MMA в зависимости от температуры реакции с использованием метоксида натрия в качестве катализатора.
Фигура 7:
Преобразование н-BMA в MMA в зависимости от температуры реакции с использованием гидроксида лития в качестве катализатора.
Фигура 8:
Преобразование н-BMA в MMA в зависимости от времени при определенной температуре реакции с использованием гидроксида лития в качестве катализатора.
Фигура 9:
Изменение в преобразовании н-BMA в MMA со временем в реакции, катализируемой метоксидом лития.
Фигура 10:
График преобразования в MMA в зависимости от времени для реакции переэтерификации н-BMA при добавлении дополнительного метанола и н-BMA после исходной реакции переэтерификации, катализируемой LiOH и LiOMe.
Фигура 11:
График преобразования в MMA в зависимости от времени для переэтерификации н-BMA с увеличением содержания воды.
3
12
3
12
Авторы настоящего изобретения провели обширное тестирование для определения того как можно эффективно получать MMA с использованием микроорганизмов. В частности, несмотря на обширные эксперименты, авторы настоящего изобретения разработали способ получения MMA с этапом, на котором получают сложный C-C-эфир метакриловой кислоты посредством ферментации. Авторы настоящего изобретения неожиданно смогли разработать такой способ, несмотря на токсичность таких сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты для микроорганизмов, из-за которой ранее получение такого способа считали невозможным.
Общие материалы и методы
Рост и поддержание культуры
Микроорганизмы
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Штаммы  и  хранили в исходных 16% растворах глицерина при -80°C. Рабочие культуры получали на агарозных чашках.
Получение среды Luria Bertani (LB) и агара
Каждый раз, когда указана среда LB, использовали среду Luria Bertani с высоким содержанием солей (Melford) (25 г/л). Среду LB получали, растворяя пептон из казеинового гидролизата (10 г), дрожжевой экстракт (5 г) и хлорид натрия (10 г) в 1 литре воды. Смесь стерилизовали посредством автоклавирования при 126°C в течение 15 минут, а затем оставляли охлаждать до комнатной температуры. Жидкую среду LB хранили в запечатанных стерильных флаконах Duran в течение одной недели при комнатной температуре. Чашки с агарозной средой LB получали с использованием среды LB с высоким содержанием солей (25 г/л) и агара (20 г/л). Смесь среды LB и агара стерилизовали посредством автоклавирования и позволяли охлаждаться в 50°C водяной бане с последующим разливанием асептическим способом в стерильных чашки Петри. Чашки хранили две недели при 4°C.
Получение среды дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YEPD) и агара
Среду дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YEPD) и агарозные чашки получали, растворяя дрожжевой экстракт (3 г), солодовый экстракт (3 г), пептон из сои (5 г) и глюкозу (10 г) в дистиллированной воде (1 л). Если получали агарозные чашки, добавляли агар (15 г). Смесь автоклавировали при 126°C в течение 15 минут, а затем позволяли охлаждаться до 60°C с последующим разливанием асептическим способом в стерильные чашки Петри. Чашки хранили в течение двух недель при 4°C. Жидкую среду YEPD хранили в течение одной недели при комнатной температуре.
4
2
2
2
4
2
4
6
7
24
2
4
2
2
2
2
4
4
4
2
Среду с минимальным содержанием солей (MSX) получали тремя частями; MSA, MSB и микроэлементы Вишняк. Раствор микроэлементов Вишняк (1 л) получали смешивая динатриевую соль ЭДТА (50 г) с водой (800 мл), проводя растворение, добавляя гранулы KOH (2-3 за один раз). Затем добавляли химические препараты в следующем порядке: ZnSO (2,2 г), CaCl (5,54 г), MnCl⋅4HO (5,06 г), FeSO⋅7HO (5 г), (NH)MoO⋅4HO (1,1 г), CuSO⋅5HO (1,57 г) и CoCl⋅6HO (1,61 г). pH раствора доводили до 6 с использованием KOH (1 M), затем доводили до 1 л с использованием воды. Раствор хранили в течение шести месяцев при 4°C. MSA получали, растворяя KHPO (6 г) и микроэлементы Вишняк (2 мл в воде (660 мл). PH раствора доводили до 7 с использованием KOH (1 M). Затем раствор водой доводили до 760 мл. MSB получали, растворяя NHCl (3 г) и MgSO⋅7HO (0,4 г) в воде (200 мл). Исходный раствор глюкозы (12,5%) также получали, растворяя D-глюкозу (12,5 г) в воде (100 мл). MSA, MSB и глюкозу (40 мл) раздельно автоклавировали при 126°C в течение 15 минут, затем асептически комбинировали после охлаждения, pH конечного раствора составлял 6,8. Раствор хранили в течение одной недели при комнатной температуре.
Культивирование микроорганизмов в жидкой среде
Общая часть
E. coli
S. cerevisiae
E. coli
S. cerevisiae
600
Из исходных растворов в глицерине  и  штрихом наносили на стерильные агарозные чашки с использованием четырех одноразовых инокуляционных петель. Инокулированные чашки помещали в инкубатор на ночь при 37 или 30°C для  и , соответственно. В стерильную колбу Эрленмейера, снабженную пенополиуретановой затычкой и покрытую алюминиевой фольгой, асептическим способом добавляли соответствующее количество стерильных сред LB, YEPD или MSX (25 мл среды в 100 мл колбу и 50 мл среды в 250 мл колбу). Для инокуляции из агарозной чашки с чашки с использованием инокуляционной петли забирали хорошо изолированную колонию. Колонию переносили в предварительно проавтоклавированную колбу, содержащую соответствующую среду. Пробку колба помещали обратно и колбу инкубировали в орбитальном инкубаторе при 30 или 37°C, 200 об./мин. для соответствующего микроорганизма. После достижения значения OD≈0,8 из ночной культуры отбирали аликвоту инокулята с использованием стерильной пипетки и переносили в предварительно проавтоклавированную колбу. Тип колбы и объемы, необходимые на этом этапе культивирования являлись специфичными для каждого теста и указаны в каждом из соответствующих разделов этой главы. Этот способ использовали для начальной инокуляции всех культур для тестов роста и токсичности, проводимых на протяжении всей этой работы.
Конкретные скорости роста культур рассчитывали на экспоненциальной фазе роста с использованием уравнения ln Nt/N0=μt, где Nt представляет собой произвольные единицы светорассеяния на момент времени t (час), а μ представляет собой скорость роста (час-1). Скорости роста немного варьировали в зависимости от типа среды для выращивания, а также между разными тестами, таким образом, все результаты тестов приведены в виде процентных значений от контроля, проводимого вместе с каждым конкретным тестом.
Тесты по ингибированию - культуры во встряхиваемых колбах
E. coli
S. cerevisiae
E. coli
S. cerevisiae
E. coli
S. cerevisiae
600
Тесты токсичности сложных эфиров метакриловой кислоты, вследствие их летучести и способности разрушать пластиковые лунки планшета, проводили в стерильной 40 мл закрываемых тефлоном стеклянных флаконах. В каждый флакон асептическим способом добавляли соответствующую среду из сред LB или MSX для  и YEPD for . Затем среду инокулировали ночной культурой  или  (100 мкл). Затем один флакон оставляли содержащим только эти компоненты в качестве контрольного теста, а в остальные три флакона добавляли требуемый сложный эфир метакриловой кислоты. Затем четыре флаконы на каждый сложный эфир метакриловой кислоты переносили в орбитальный инкубатор, установленный на 30 или 37°C, 250 об./мин., для  или , соответственно. Из водной фазы среды образец отбирали каждые 30 минут первоначально, и каждые 10 мин после вхождения клеток в экспоненциальную фазу роста, и снова каждые 30 мин после достижения стационарной фазы, с получением кривой роста. Образцы отбирали через тефлоновые крышки с использованием стерильного стеклянного шприца и иглы, а значения OD регистрировали с использованием спектрофотометра с регистрацией в УФ/видимом свете, разводя образцы до соответствующего интервала детекции.
Таблица праймеров и последовательностей
REF
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРАЙМЕРА (от 5' к 3')
SEQ ID
BCKAD.F
GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG
1
BCKAD.R
CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC
2
AAT.F
AGGAGATATACCATGAAAAGCTTTTCTGTACTC
3
AAT.R
AGCAGCCGGATCCCCTGCAGGACTAGTTTACTGGCTGGTGCTAC
4
ACX4.F
CACCAGCCAGTAAGCTAGCAAGGAGATATACCATGGCTG
5
ACX4.R
TCCCCTGCAGGACTAGTTTACAGGCGAGAACGGGTAG
6
Таблица плазмид
ОБОЗНАЧЕНИЕ ПЛАЗМИДЫ
ИСТОЧНИК
ОПИСАНИЕ
pET16b (Sse)
Эта работа
Экспрессирующий вектор pET16b с модифицированным участком рестрикции <i>Sse</i>8387I.
pMMA121
Эта работа
Экспрессирующий вектор pET16b (Sse), содержащий между своими участками рестрикции <i>Xba</i>I и <i>Sse</i>8387I ген ACX4 <i>A. thaliana</i>, оптимизированный для экспрессии в pET16b (Sse).
pWA008
Эта работа
Экспрессирующий вектор pET16b(Sse), содержащий оперон, кодирующий комплекс BCKAD штамма PA01 <i>P. aeruginosa</i>, встроенный между его участками рестрикции <i>Nco</i>I и <i>Sse</i>8387I.
pAAT212
Эта работа
Экспрессирующий вектор pET(Sse), содержащий ген AAT яблока, оптимизированный для экспрессии в pET16b (Sse), встроенный между его участками рестрикции <i>Nco</i>I и <i>Sse</i>8387I
pMMA133
Эта работа
Плазмида pAAT212, дополнительно содержащая ген ACX4 <i>A. thaliana</i>, оптимизированный для экспрессии в векторе pET16b (Sse), встроенный между участком рестрикции <i>Spe</i>I и геном AAT.
pMMA134
Эта работа
Плазмиды pMMA133 и pWA008, лигированные друг с другом и содержащие ген ACX4 <i>A. thaliana</i>, оптимизированный для экспрессии в векторе pET16b (Sse), ген AAT яблока, оптимизированный для экспрессии в векторе pET16b (Sse), и комплекс BCKAD штамма PA01 <i>P. aeruginosa</i>, встроенный между участками рестрикции <i>Xba</i>I и <i>Sse</i>8387I.
Аналитические способы
Концентрация биомассы
2
Измерения оптической плотности (OD) проводили при 600 нм на спектрофотометре Agilent 8453 с использованием полистироловых кювет (длина пути 10 мм). Образцы (1 мл) для анализа переносили в кюветы и измеряли OD. Когда данные находились вне диапазона 0-0,8, образцы разбавляли 1 к 10 в dHO до попадания в требуемы диапазон.
Газовая хроматография
Образцы после экспериментов по экстракции BMA/MMA анализировали с использованием газовой хроматографии в следующих рабочих условиях:
<b>Колонка</b>
Agilent HP-5MS (325°C макс.)
<b>Размеры колонки</b>
30 m × 0,25 мм × 0,25 мкм номинал
<b>Газ</b>
Гелий
<b>Скорость потока He</b>
1,00 мл мин<sup>-1</sup>
<b>Детектор</b>
FID
<b>Температура печи</b>
55°C
<b>Изменение температуры печи</b>
<b>°C/мин</b>
<b>Следующ. °C</b>
<b>Удержание мин</b>
<b>Время прохода</b>
<b>Исходно</b>
55
3,5
3,5
<b>Изменение температуры 1</b>
30
180
1
8,67
Образцы после экспериментов по переэтерификации анализировали с использованием газовой хроматографии в следующих рабочих условиях:
<b>Колонка</b>
RTX-1701 (из Thames Restek)
<b>Размеры колонки</b>
62 m × 0,32 мм × 1,0 мкм номинал
<b>Газ</b>
Водород
<b>Скорость потока H</b><sub><b>2</b></sub>
2,01 мл мин<sup>-1</sup>
<b>Детектор</b>
FID
<b>Температура печи</b>
60°C
<b>Изменение температуры печи</b>
<b>°C/мин</b>
<b>Следующ. °C</b>
<b>Hold мин</b>
<b>Время прохода</b>
<b>Исходно</b>
60
10
10
<b>Изменение температуры 1</b>
10
180
2
24
<b>Изменение температуры 2</b>
20
220
6
32
Примеры
Токсичность сложных эфиров метакриловой кислоты более высокого порядка для
и
E. coli
S. cerevisiae
3
12
E. coli
S. cerevisiae
Авторы настоящего изобретения исследовали токсичность сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты для микроорганизмов, в частности, для штамма MG1655  и штамма DSM70449 .
E. coli
S. cerevisiae
Конкретно, исследовали относительные токсичности метилметакрилата (MMA), изопропилметакрилата (iPMA) и бутилметакрилата (BMA), выращивая MG1655  и DSM70449  в средах LB и YEPD, соответственно, в присутствии различных концентраций сложных эфиров метакриловой кислоты.
50
600
Конечные концентрации биомассы регистрировали через 72 часа и использовали для расчета ингибирующей концентрация (IC) для каждого сложного эфира. Она представляет собой концентрацию сложного эфира, которая наполовину снижает максимальную оптическую плотность (MaxOD) по сравнению с ростом в отсутствие сложного эфира (см. таблицу 1).
<b>Диапазон IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (г/л)</b>
<b>Сложный эфир метакриловой кислоты</b>
<b>logP</b><sub><b>o/w</b></sub>
<b></b><b><i>S. cerevisiae</i></b><b></b>
<b></b><b><i>E. coli</i></b><b></b>
MMA
0,95
0,73-1,45
3,19-4,25
iPMA
1,81
0,66-0,99
1,18-1,77
BMA
2,57
0,04-0,07
0,07-0,11
Таблица 1:
50
E. coli
S. cerevisiae
Рассчитанные значения IC для сложных эфиров метакриловой кислоты в отношении  и , выращиваемых в комплексных средах.
E. coli
50
Токсичности MMA, iPMA и BMA в отношении  также определяли, когда клетки выращивали в среде MSX. Конечные концентрации биомассы использовали для расчета ингибирующей концентрации (IC) для каждого сложного эфира (cм. таблицу 2).
<b>Сложный эфир метакриловой кислоты</b>
<b>logP</b><sub><b>o/w</b></sub>
<b>Диапазон IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (г/л)</b>
MMA
0,95
3,19-4,25
iPMA
1,81
1,18-1,77
BMA
2,57
0,07-0,11
Таблица 2:
50
E. coli
Рассчитанные значения IC для сложных эфиров метакриловой кислоты в отношении , выращиваемой в среде MSX.
E. coli
S. cerevisiae
Все тестируемые сложные эфиры были токсичны в отношении  и  (таблицы 1 и 2). Однако в присутствии BMA показана значимо увеличенная токсичность по сравнению со сложными эфирами метакриловой кислоты с более короткими цепями, делая использование ферментации с получением этого сложного эфира сложной вследствие токсичности, проявляемой в отношении микроорганизмов.
Получение бутилметакрилата из 2-кетоизовалерата посредством рекомбинантных
Escherichia coli
3
12
E. coli
Затем авторы настоящего изобретения провели эксперименты по определению возможности продукции сложных C-C-эфиров метакриловой кислоты, например, бутилметакрилата, микроорганизмами, такими как .
Arabadopsis thaliana
E. coli
Nhe
Sse
Xba
Sse
E. coli
E. coli
У гена ACX4  оптимизировали кодоны для , его синтезировали и клонировали в вектор pET16b (Sse). Этот ген расщепляли 1/8387I и лигировали в pET16b(Sse), расщепленную 1/8387I. Полученную плазмиду, pMMA121 (см. фигуру 1), вносили в BL21(DE3) , и рекомбинантную  (BL21(DE3)/pMMA121) культивировали, как указано далее.
BL(DE3/)pET16b (контрольный вектор) или BL21(DE3)/pMMA121 инокулировали в среду LB, дополненную ампициллином (0,1 мг/мл), и выращивали в течение ночи в тестовой пробирке при 37°C. Аликвоту ночной культуры переносили в 100 мл той же среды в колбе и перемешивали при 37°C в течение 2-3 часов. В колбу добавляли IPTG (конечная концентрация 1 мМ) и культуру инкубировали с перемешиванием при 20°C в течение ночи.
E. coli
Клетки собирали посредством центрифугирования и суспендировали в 0,1 M натрий-фосфатном буфере (pH 7,0), затем разрушали обработкой ультразвуком. Разрушенные клетки  центрифугировали с получением фракций супернатанта и осадка и контрольный вектор и клетки, содержащие pMMA121, анализировали на ACO- (ацил-КоА-оксидазную) активность (см. фигуру 2) и экспрессию белка ACX4 посредством SDS-PAGE (см. фигуру 3).
На фигуре 2 представлено наличие в буфере только IBA-КоА, наличие IBA-КоА и небольшого количества КоА в образце, содержащем клетки, содержащие только неизмененную плазмиду pET16b, и наличие MAA-КоА, намного меньше IBA-КоА и неизвестного соединения в образце, содержащем клетки, содержащие плазмиду pMMA121. Таким образом, во фракции супернатанта BL21(DE3)/pMMA121 детектировали высокую ACO-активность, указанную продукцией метакрилил-КоА, демонстрирующую, что белок массой 40 кДа, детектированный на SDS-PAGE фигуры 3 представляет собой белок ACX4. SDS-PAGE демонстрирует на дорожке 1 - SF (растворимую фракцию) BL21/pET16b (вектора); на дорожке 2 - SF BL21/pMMA121; на дорожке 3 - IF (нерастворимую фракцию) BL21/pET16b; на дорожке 4 - IF BL21/pMMA121 и на дорожка 5 - маркер молекулярной массы. В области 40 кДа полосы (выделенные черными рамками) наблюдали только в дорожках BL21/pMMA121, но не в дорожках BL21/pET16b (вектора).
Pseudomonas aeruginosa
BspH
Sse
Nco
Sse
BamH
Sse
Гены комплекса BCKAD клонировали из штамма PA01  указанным далее образом. Фрагмент ДНК, содержащий весь генный оперон, кодирующий гены комплекса BCKAD получали посредством ПЦР с праймерами BCKAD.F и BCKAD.R с использованием в качестве матрицы геномной ДНК. Полученный фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами I и 8387I и встраивали в вектор pET16b(Sse) между участками рестрикции 1/8387I (участок  pET16b преобразовывали в участок 8387I). Полученную плазмиду назвали pWA008 (см. фигуру 4).
A. thaliana
Nco
Sse
Spe
Плазмиду для экспрессии AAT яблока и ACX4  конструировали указанным далее образом. Фрагменты ДНК, содержащие гены AAT или ACX4, амплифицировали посредством ПЦР с праймерами AAT.F и AAT.R или ACX4.F и ACX4.R с использованием в качестве матрицы плазмиды, содержащие гены AAT или pMMA121 с оптимизированными кодонами, соответственно. Вектор pET(Sse) расщепляли рестрикционными ферментами I и 8387I и лигировали с фрагментом ДНК, содержащим ген AAT, используя набор для клонирования In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). Полученную плазмидау, pAAT212, расщепляли рестрикционным ферментом I и лигировали с фрагментом ДНК, содержащим ген ACX4, используя для клонирования In-Fusion HD Cloning Kit. Полученная плазмида, pMMA133, содержала гены AAT и ACX4 под контролем промотора T7 (см. фигуру 4).
Spe
Sse
Xba
Sse
E. coli
Плазмиду, экспрессирующую BCKAD, AAT и ACX4, конструировали указанным далее способом. Плазмиду pMMA133 расщепляли рестрикционными ферментами I и 83877I и получали линеаризованный фрагмент ДНК. Плазмиду pWA008 расщепляли рестрикционными ферментами I и 8387I и выделяли фрагмент длиной 5,0 т.п.н., содержащий гены комплекса BCKAD. Оба фрагмента лигировали с использованием набора для лигирования ДНК "Mighty Mix" (производимого Takara Bio Inc.). Полученную плазмиду pMMA134 (фигура 4) вносили в  BL21(DE3) для экспериментов по продукции бутилметакрилата.
E. coli
650
BL21(DE3)/pMMA134 культивировали по существу таким же способом, как описано выше в отношении экспрессии ACX4. Клетки собирали посредством центрифуги, отмывали 0,1 M натрий-фосфатным буфером (pH 7,0) и суспендировали в том же буфере с получением клеточной суспензии. С использованием этой клеточной суспензии получали приблизительно 1 мл реакционного раствора для покоящихся клеток в каждом флаконе, который содержал 40 мМ 2-кетоизовалерат (2-оксоизовалерат), 60 мМ бутанол, 0,05 M натрий-фосфатный буфер (pH 7,0) и клетки (OD=12,5). Реакции проводили при 30°C, 180 об./мин. в течение периодов от 3 до 44 час и во флаконы добавляли 1 мл ацетонитрила и хорошо смешивали с остановкой реакции. После фильтрации с использованием шприцевого фильтра DISMIC/с диаметром отверстия 0,45 микрон (производимого ADVANTEC), проводили анализ посредством ВЭЖХ на колонке ODS. Условия ВЭЖХ являлись следующими: Устройство: Waters 2695, колонка: CAPCELL PAK C18 UG120, 2,0 mml.C. × 250 мм, подвижная фаза: 0,1% фосфорная кислота/65% метанол, количество потока: 0,25 мл/мин, время прохода: 12 мин, температура колонки: 35°C и детекция: УФ 210 нм.
На фигуре 5 представлена концентрация приводимых ниже химических веществ в зависимости от времени ферментации: , 2-кетоизовалерат (2-OIV); , изомасляная кислота (IBA); , бутилметакрилат (BMA) и ˣ, метакриловая кислота (MAA). По мере падения концентрации сырья с 2-кетоизовалератом (2-оксоизовалератом), возрастает продукция промежуточного соединения в пути изомасляной кислоты, а также продукция конечного сложноэфирного продукта бутилметакрилата.
in vivo
E. coli
3
12
Этот пример демонстрирует осуществимую  продукцию сложного C-C-эфира метакриловой кислоты, в частности, бутилметакрилата, из биохимического промежуточного соединения 2-кетоизовалерата (2-оксоизовалерата), которое получают непосредственно из глюкозы и реагента бутанола, который представляет собой обычное промышленное сырье. Продукция бутилметакрилата показана на промышленно применимых уровнях посредством культивирования клеток рекомбинантных , экспрессирующих оперон BCKAD для преобразования 2-кетоизовалерата в изобутирил-КоА, ACX4 для преобразования изобутирил-КоА в метакрилил-КоА и AAT для преобразования метакрилил-КоА в бутилметакрилат посредством реакции с бутанолом.
Экстракция BMA в органические растворители
Escherichia coli
3
12
После приведенного выше исследования, продемонстрировавшего получение бутилметакрилата из 2-кетоизовалерата посредством рекомбинантных , авторы настоящего изобретения провели значительное экспериментирование для исследования экстракции сложного C-C-эфира метакриловой кислоты, например, BMA, из ферментационной среды.
E. coli
Escherichia coli
В кратком изложении, выращивали пять встряхиваемых культур в колбах, содержащих вариант штамма , сходный со штаммом, используемым в примере выше, продемонстрировавшем продукцию бутилметакрилата из 2-кетоизовалерата посредством рекомбинантных . Собирали биомассу из каждой колбы и проводили раздельную биотрансформацию. Уровни BMA и MMA в додекане после экстракции растворителем количественно определяли посредством газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором (GC-FID).
600
600
В 1 л разделенной перегородками встряхиваемой колбе в течение 16,33 часов выращивали стартовую культуру в 200 мл среды LB, содержащей 200 мкг/мл ампициллина. Культуру снова разводили до OD 0,2 в 5 1 л разделенных перегородками встряхиваемых колбах, содержащих по 300 мл свежей среды LB, и оставляли для роста при 30°C и 250 об./мин. в течение 23,35 часов. Затем собирали биомассу посредством центрифугирования при 5000 об./мин. и 4°C в течение 15 минут. Каждый клеточный осадок отмывали 100 мМ фосфатом натрия (pH 6,7) и этапам центрифугирования повторяли. Биомассу ресуспендировали в требуемом объеме среды для биотрансформации до достижения OD 25.
Реакции биотрансформации проводили в 5×250 мл закрытых флаконах Шотта при 30°C и 180 об./мин. в течение 24 часов. Условия для каждой биотрансформации приведены в таблице 3 ниже.
<b>№ биотрансф.</b>
<b>Субстрат/добавленный внешний стандарт</b>
<b>Концентрация натрий-фосфатного буфера (pH 6,7)</b>
1
40 мМ 2-кетоизовалерат60 мМ 1-бутанол
2
0,28 мМ BMA (40 мг/л)
3
0,40 мМ MMA (40 мг/л)
4
0,70 мМ BMA (100 мг/л)
5
1 мМ MMA (100 мг/л)
Таблица 3:
Условия биотрансформации
Образцы отбирали для анализа GC-FID в моменты времени 5 час и 24 час. В каждый из этих моментом времени отбирали 5 мл образца и переносили в 15 мл пробирку Falcon. В дополнение к додекану (1 мл) добавляли ацетонитрил (5 мл). Смесь энергично встряхивали при >800 об./мин. в течение 10 минут с последующим центрифугированием при 3900 об./мин. и 20°C в течение 20 минут. Затем из органической и водной фаз отбирали 500 мкл образца, фильтровали через 0,45 мкм фильтр и перед инъекцией вносили во флакон для газовой хроматографии с крышкой.
Количественное определение уровней BMA и MMA в образцах после биотрансформации проводили с использованием калибровочной культуры с внешним стандартом, получаемым приготовлением волюметрических исходных растворов BMA и MMA известной концентрации.
Результаты экспериментов по экстракции приведены в таблице 4 ниже:
<b>№ биотрансф.</b>
<b>Временная точка для образца</b>
<b>Количество MMAЮ, добавленной в момент t=0 мин</b>
<b>Количество BMA, добавленной в момент t=0 мин</b>
<b>Общий наблюдаемый BMA</b>
<b>Общий наблюдаемый MMA</b>
<b>Количество, экстрагированное в додекан</b>
<b>Количество, оставшееся в воде</b>
h
мг/л
мг/л
мг/л
мг/л
мг/л
%
мг/л
%
1
5
-
-
138
-
54,1
39,2
83,9
60,8
24
-
-
102,4
-
47,5
46,4
54,9
53,6
2
5
-
40
37,1
-
11,1
29,9
26,0
70
24
-
40
26,3
-
6,0
22,8
20,3
77,2
3
5
40
-
-
41,7
3,2
7,7
38,5
92,3
24
40
-
-
28,9
3,4
11,8
25,5
88,2
4
5
-
100
72,8
-
26,5
36,4
46,3
63,6
24
-
100
52,3
-
20,3
38,8
32,0
61,2
5
5
100
-
-
81,0
7,8
9,6
73,2
90,4
24
100
-
-
49,3
6,4
13,0
42,9
87,0
Таблица 4
: Массовый баланс и эффективность экстракции MMA и BMA в додекан.
Авторы изобретения продемонстрировали, что эффективность экстракции BMA в додекан является стабильно большей по сравнению с MMA. Например, сравнение биотрансформаций 2 и 3 продемонстрировала в 2,7× большую эффективность экстракции BMA по сравнению с MMA, а сравнение биотрансформаций 4 и 5 продемонстрировало в 3,3× большую эффективность экстракции BMA по сравнению с MMA. Во всех образцах среднее количество экстракции BMA в додекан составляло приблизительно 35,6% по сравнению с 10,5% MMA.
Получение MMA из BMA посредством переэтерификации
В способе по настоящему изобретению BMA, полученный посредством ферментации, переэтерифицируют с получением MMA. Авторы изобретения провели исследования с определением возможности разработки эффективного способа переэтерификации с высокой конверсией и селективностью реакции.
В реакциях переэтерификации для проведения реакции часто используют катализатор. Такие катализаторы могут представлять собой, например, кислотные катализаторы, основные катализаторы или биокатализаторы. Для проведения переэтерификации MMA в метакрилаты с большей молекулярной массой использовали ряд гомо- и гетерогенных катализаторов. Однако обратную реакцию не исследовали.
Провели ряд экспериментов по переэтерификации с использованием н-BMA, метанола и диапазона катализаторов.
Эксперименты по переэтерификации проводили в трехгорлых колбах Шленка в атмосфере инертного азота. Температуры реакции определяли помещением термопары в реакционный раствор. Как правило, в течение реакции отбирали ряд реакционных образцов. Однако, если конечный экспериментальный образец демонстрировал отсутствие реакции, более ранние образцы не анализировали.
Уровни преобразования BMA в MMA с использованием бутоксида титана, бутоксида циркония, ацетилацетоната циркония, гетерогенного комплексного соединения алкила с металлом (цезий на диоксиде кремния), Amberlyst 15-H (функционализированной сульфоновой кислотой полистироловой смолы) были низкими (от 0 до 20%). Однако уровень преобразования с использованием метоксида натрия, метоксида лития и гидроксида лития являлся намного большим, как отражено ниже.
Переэтерификация н-BMA с метанолом и метоксидом натрия
н-BMA (1 моль, 142,20 г), MeOH (1 моль, 32,04 г), 4-гидрокси-TEMPO (0,1 г) и NaOMe (1,01 г, 18,7 ммоль) добавляли в трехгорлую колбу Шленка объемом 250 мл в атмосфере азота. Одно горло колбы закрывали пробкой, одно горло закрывали пробкой с силиконовым натяжным устройством, которое использовали для помещения термопары в реакционный раствор, а третье горло присоединяли к конденсатору. Температуру исходно поддерживали приблизительно при 20°C в течение часа, а затем каждый час поднимали приблизительно на 10°C до достижения температуры кипячения с обратным холодильником при 88,2°C. В каждой температурной точке отбирали образец и анализировали посредством газовой хроматографии.
Хорошее преобразование н-BMA в MMA (приблизительно 50%; фигура 6) получали с использованием в качестве катализатора метоксида натрия.
Переэтерификация н-BMA с метанолом и гидроксидом лития
н-BMA (1 моль, 142,20 г), MeOH (1 моль, 32,04 г), 4-гидрокси-TEMPO (0,1 г) и LiOH (1,01 г, 42 ммоль) добавляли в трехгорлую колбу Шленка объемом 250 мл в атмосфере азота. Одно горло колбы закрывали пробкой, одно горло закрывали пробкой с силиконовым натяжным устройством, которое использовали для помещения термопары в реакционный раствор, а третье горло присоединяли к конденсатору. Температуру исходно поддерживали приблизительно при 20°C в течение часа, а затем каждый час поднимали приблизительно на 10°C до достижения температуры кипячения с обратным холодильником при 88,2°C. В каждой температурной точке отбирали образец и анализировали посредством газовой хроматографии.
Хорошее преобразование н-BMA в MMA получали с использованием в качестве катализатора гидроксида лития (от 5 до 60%; фигура 7).
Затем проводили повторный эксперимент (с использованием в качестве катализатора гидроксида лития) для определения скорости реакции при температуре кипения реагентов с обратным холодильником.
Гидроксид лития (0,51 г, 21 ммоль) растворяли в метаноле (32,43 г, 1 моль) посредством перемешивания в закрытой колбе Шленка. В трехгорлую колбу Шленка объемом 250 мл в атмосфере азота добавляли н-BMA (142,18 г, 1 моль) и 4-гидрокси-TEMPO (0,1 г) и эту смесь нагревали до 88,2°C, где одно горло было закрыто пробкой, одно - заткнуто, и третье присоединено к конденсатору. Когда достигали кипячения с обратным холодильником и температура стабилизировалась, в реакционную колбу шприцом добавляли катализатор (гидроксид лития) и раствор MeOH. Образец отбирали каждые две минуты в течение первых десяти минут и каждый пять минут в течение часа. Затем образцы анализировали посредством газовой хроматографии. Как представлено на фигуре 8, равновесные отношения н-BMA и MMA достигали после нагревания в течение четыре минут.
Переэтерификация н-BMA с метанолом и метоксидом лития
Метоксид лития (0,79 г, 20,9 ммоль) растворяли в метаноле (32,04 г, 1,00 моль) посредством перемешивания в закрытой колбе. Раствор н-BMA (142,20 г, 1,00 моль) и 4-гидрокси-TEMPO (0,10 г) нагревали в атмосфере азота (91°C). Когда температура стабилизировалась, добавляли катализатор и раствор метанола и достигали кипячения с обратным холодильником (88°C). Образцы отбирали каждые две минуты в течение первых десяти минут и каждые полчаса в течение часа. Эти образцы фильтровали через диоксид кремния и анализировали посредством газовой хроматографии.
Через четыре минуты достигали 53 ± 3% преобразования н-BMA в MMA (фигура 9).
Сравнение LiOH и LiOMe в качестве катализаторов переэтерификации н-BMA в MMA
Также исследовали степень деактивации двух литиевых катализаторов, гидроксида лития и метоксида лития. Это проводили для определения срока службы катализатора.
Это исследовали, проводя реакции переэтерификации н-BMA с метанолом с использованием катализаторов LiOH и LiOMe. Через час кипячения с обратным холодильником в реакцию добавляли дополнительный моль н-BMA и моль метанола, и определяли время преобразования в MMA.
Раствор н-BMA (142,20 г, 1,00 моль), метанола (32,04 г, 1,00 моль) и 4-гидрокси-TEMPO (0,10 г) обрабатывали катализатором и нагревали до кипения с обратным холодильником (87°C) в атмосфере азота. Через час кипячения с обратным холодильником в реакционный раствор дополнительно добавляли н-BMA (142,20 г, 1,00 моль) и метанол (32,04 г, 1,00 моль). Образцы отбирали каждые две минуты в течение первых десяти минут и каждые полчаса в течение часа. Эти образцы фильтровали через диоксид кремния и анализировали посредством газовой хроматографии. Использовали катализаторы LiOH (0,50 г, 20,9 ммоль) и LiOMe (0,79 г, 20,9 ммоль).
После добавления в раствор для реакции переэтерификации, катализируемой LiOH, дополнительного н-BMA и метанола дополнительного увеличения преобразования в MMA наблюдали. Это означает, что весь катализатор был деактивирован водой, формируемой в первой реакции переэтерификации так, что при добавлении свежих реагентов никакой дополнительной реакции не наблюдали (фигура 10). Однако в растворе для переэтерификации, катализируемой LiOMe, при добавлении дополнительных реагентов наблюдали преобразование в MMA, возрастающее до достижения равновесия (фигура 10).
in situ
Эти данные свидетельствуют, что использование LiOH в качестве катализатора может потребовать дополнительного свежего LiOH с течением времени для поддержания реакции. Однако необходимости в таком частом добавлении LiOMe нет и, таким образом, он может больше подходить для непрерывной реакции. Инактивация LiOH, вероятно, происходит вследствие преобразования LiOH в LiMMA; LiOMe не реагирует с метанолом с формированием воды  и, таким образом, не деактивируется так быстро.
Эффект увеличения количества воды в реакции переэтерификации
3
12
В способе по настоящему изобретению реакция ферментация происходит в водном окружении и получаемый, таким образом, сложный C-C-эфир метакриловой кислоты является насыщенным водой. Однако неожиданно вода влияет на реакцию переэтерификации.
Следствие присутствия воды в реакции переэтерификации представлено ниже в отношении добавления возрастающих количеств воды в н-BMA реакции переэтерификации с метанолом. Реакции проводили при температуре кипения с обратным холодильником и контролировали время преобразования MMA. Все проценты воды определяли в виде моль воды относительно моля LiOH (таблица 5).
<b>Номер эксперимента</b>
<b>Масса LiOH (г)</b>
<b>Масса воды (g)</b>
<b>Моль LiOH (ммоль)</b>
<b>Моль воды (ммоль)</b>
<b>моль% H</b><sub><b>2</b></sub><b>O в отношении LiOH</b>
1
0,50
0
20,9
0
0
2
0,50
0,13
20,9
7,18
34,09%
3
0,50
0,53
20,9
29,5
140,29%
4
0,50
2,01
20,9
112
522,98%
Таблица 5
- Добавление воды в реакцию переэтерификации.
Гидроксид лития (0,50 г, 20,9 ммоль) растворяли в метаноле (32,04 г, 1,00 моль) и воде (0,13 г, 71,8 ммоль) посредством перемешивания в закрытой колбе. Раствор н-BMA и 4-гидрокси-TEMPO (0,10 г) нагревали до 90°C в атмосфере азота. Когда температура стабилизировалась добавляли LiOH, метанол и водный раствор и наблюдали температуру кипения с обратным холодильником 86°C. Образцы отбирали каждые две минуты в течение первых десяти минут, а затем через 30 минут и 60 минут. Эти образцы фильтровали через силикагель с последующим анализом посредством газовой хроматографии. Этот способ повторяли с массами воды 0,53 г и 2,01 г.
3
12
3
12
На основании результатов ясно, что увеличение количества воды в реакции снижает преобразование н-BMA в MMA (фигура 11). Эти результаты свидетельствуют, что хотя преобразование сложного C-C-эфира метакриловой кислоты в MMA происходит в присутствии воды, для улучшения преобразования полезным является ограничить присутствие воды. Таким образом, предпочтительным может являться удаление сложного C-C-эфира метакриловой кислоты по настоящему изобретению из водного окружения перед началом реакции переэтерификации.
Биотрансформация
E.coli
Эксперименты по биотрансформации проводили на новом штамме , модифицированном для продукции сложного эфира метакриловой кислоты для сравнения биотрансформации с использованием различных спиртов.
Клетки выращивали в течение ночи в среде LB-Miller (Merck) с ампициллином (200 мкг/мл) в разделенной перегородками встряхиваемой колбе при 30°C и при 250 об./мин.
Полученную культуру центрифугировали и осадок ресуспендировали до OD 50 0,1 M натрий-фосфатным буфером (pH 7). Аликвоту (15 мл) ресуспендированной культуры помещали во флакон Шотта объемом 250 мл и добавляли 15 мл исходного раствора 80 мМ KIV (кетоизовалерата). Это обеспечивало общую OD 25 и конечную концентрация 40 мМ KIV и 0,05 M натрий-фосфатный буфер в объеме 30 мл. Каждый спирт добавляли в чистом виде до конечной концентрации 5 мМ. Инкубацию при биотрансформации проводили во флаконе Шотта при 30°C и 250 об./мин.
Для определения уровней сложного алкилового эфира метакриловой кислоты через 3,5 часа инкубации отбирали образцы для анализа GC-MS.
Отбор образцов проводили, отбирая 0,5 мл образца из бульона для биотрансформации, добавляя 0,5 мл гептана и непрерывно интенсивно перемешивая смесь в течение 5 минут. Затем фазы разделяли посредством микроцентрифугирования (14800 об./мин., 5 минут). 0,2 мл образца полученного гептанового экстракта отбирали и помещали во флакон для GC (содержащий объемную вставку 0,25 мл) и обжимали. Затем образец подвергали GC-MS с использованием газового хроматографа Agilent серии 6890 с масс-селективным детектором Agilent 5973 (одиночный квадруполь). Анализируемые вещества разделяли с использованием колонки ZB-WAXPlus 30 м, внутренним диаметром 250 мкм и толщиной пленки 0,25 мкм с использованием газа-носителя гелия. Конкретные подробности GC приведены в таблице 6, а результаты приведены в таблице 7.
<b>Параметры GC</b>
<b>Тип колонки</b>
ZB-WAXPlus™
<b>Длина колонки</b>
<b>Внутренний диаметр</b>
<b>Толщина пленки</b>
0,25 мкм
<b>Газ-носитель</b>
Гелий
<b>Скорость потока</b>
1 мл мин<sup>-1</sup>
<b>Тип инъекции</b>
Разделение
<b>Коэффициент разделения</b>
50:1
<b>Объем впрыска</b>
1 мкл
<b>Температура входа</b>
250°C
<b>Давление</b>
84,8 кПа
Таблица 6
<b>Таблица 7 Биотрансформация с различными спиртами через 3,5 часов</b>
Концентрация сложного алкилового эфира метакриловой кислоты
3,5 час
Метанол
Бутанол
Пентанол
Гексанол
Гептанол
Октанол
Таблица 7
Выводы
3
12
Эти исследования свидетельствуют, что сложные C-C-эфиры метакриловой кислоты (в частности, н-BMA) можно переэтерифицировать с получением MMA с особенно высокой эффективностью с использованием в качестве катализаторов основных солей металлов группа I и группа II, и такое отсутствие воды приводит к большей эффективности преобразования. Кроме того, показано, что продукция сложных эфиров более высокого порядка происходит при большей скорости, чем у метилметакрилата.
Все характеристики, описанные в этом описании (включая любое из прилагаемой формулы изобретения, реферата и чертежей), и/или все этапы любого описанного таким образом способа, можно объединять в любую комбинацию, кроме комбинаций, где, по меньшей мере, некоторые из таких характеристик и/или этапов являются взаимоисключающими.
Если явно не указано иначе все характеристики, описанные в этом описании (включая любое из прилагаемой формулы изобретения, реферата и чертежей), можно заменять альтернативными характеристиками, служащими той же, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если явно не указано иначе, каждая описанная характеристика, является только одним из примеров из общего ряда эквивалентных или сходных характеристик.
Изобретение не ограничено подробностями, указанных выше вариантов осуществления. Изобретение распространяется на любую новую или любую новую комбинацию характеристик, описанных в этом описании (включая любое из прилагаемой формулы изобретения, реферата и чертежей), или на любой новый или любую новую комбинацию этапов любого раскрытого таким образом способа.
Кроме того, следует понимать, что можно проводить многочисленные модификации описанного выше способа без отклонения от объема изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Lucite International UK Limited
<120>  СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТИЛМЕТАКРИЛАТА
<130>  P33715GB1
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность праймера
<400>  1
ggcctgtcat gagtgattac gagccg                                            26
<210>  2
<211>  32
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность праймера
<400>  2
cggccctgca ggttcgcggg aatcagatgt gc                                     32
<210>  3
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность праймера
<400>  3
aggagatata ccatgaaaag cttttctgta ctc                                    33
<210>  4
<211>  44
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность праймера
<400>  4
agcagccgga tcccctgcag gactagttta ctggctggtg ctac                        44
<210>  5
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность праймера
<400>  5
caccagccag taagctagca aggagatata ccatggctg                              39
<210>  6
<211>  37
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность праймера
<400>  6
tcccctgcag gactagttta caggcgagaa cgggtag                                37
<---