Структурные переходы зелёного флуоресцентного белка (sfGFP) под действием гуанидинтиоцианата

Олеся В. Степаненко, Ольга В. Степаненко, И. М. Кузнецова,

В. В. Верхуша, К. К. Туроверов

СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ ЗЕЛЁНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА (sfGFP) ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГУАНИДИНТИОЦИАНАТА*

Введение. Флуоресцентные белки (FPs) и их улучшенные мутантные формы с чрезвычайно разнообразными спектральными свойствами нашли широкое применение в клеточной биологии в качестве биологических маркеров [1—4]. Флуоресцентные белки значительно облегчили изучение генной активации, локализации и динамики белков, отдельных органелл и целых клеток [5, 6]. На основе FPs созданы многочисленные биосенсоры, чувствительные к изменению среды (рН, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация ионов) [7—11]. Конструкции на основе FPs и явления безызлу-чательного переноса энергии позволяют изучать белок-белковое взаимодействие [1, 12]. Фотоактивируемые флуоресцентные белки, чьи спектральные свойства изменяются при облучении светом, обеспечивают изображения биологических объектов с разрешением, превосходящим дифракционный предел [3]. Недавно созданные FPs, спектры флуоресценции которых простираются в дальнекрасную и инфракрасную область, и FPs, характеризующиеся большим стоксовым сдвигом, позволяют осуществлять прижизненную визуализацию биологических процессов [13, 14].

Уникальной особенностью всех FPs является их способность формировать хромофор из собственных аминокислот в положении 65-67 без участия каких-либо кофакторов или ферментов [15]. Жёсткая структура в-бочонка, окружающего хромофор, выполняет многочисленные функции [2, 16]. Синтез хромофора FPs происходит лишь после того, как сформирована нативная пространственная структура вокруг хромофор-образующих аминокислот и правильным образом расположены аминокислоты, катализирующие и направляющие синтез хромофора. Огромное разнообразие спектральных свойств FPs определяется не только химическим различием структур хромофора, но и его взаимодействием с аминокислотами микроокружения. Структура в-бочонка защищает хромофор от воздействия среды и ограничивает подвижность хромофора, предотвращая его безызлучательную дезактивацию.

Следует заметить, что исследование сворачивания-разворачивания большинства FPs осложняется необратимостью процессов денатурации из-за агрегации белка. Белок sfGFP (super folder GFP) не агрегирует при денатурации и способен к рефолдингу [17]. Процессы разворачивания-сворачивания sfGFP под действием химического дена-туранта изучались с использованием ряда физико-химических методов: абсорбционной спектроскопии, собственной флуоресценции, флуоресценции зелёного хромофора и гель-хроматографии.

Материал и методика. Плазмида pET-28a (+)-sfGFP, кодирующая ген зелёного флуоресцентного белка sfGFP [17], была сконструирована согласно описанной ранее методике [18]. Плазмиду использовали для трансфекции клеток Escherichia coli BL21 (DE3) (Invitrogen, США). Экспрессию sfGFP в Escherichia coli индуцировали 0,5 мМ IPTG (Fluka, Швейцария). Наращивание клеточной массы проводили в течение

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (контракт 02.740,11.5141) и гранта Президента РФ (MK-1181.2010.4).

© Олеся В. Степаненко, Ольга В. Степаненко, И. М. Кузнецова, В. В. Верхуша, К. К. Туроверов, 2011

24 ч при 25 °С. Белок очищали с помощью Ni-агарозы (GE Healthcare, Швеция). Чистота образцов обеспечивалась при помощи SDS-электрофореза. Молекулярную массу выделенных белков контролировали с помощью SDS-электрофореза, используя набор стандартных белков (GE Healthcare, Швеция) в качестве маркеров. Препараты гуа-нидинтиоционата (GTC) (Fluka, Швейцария) применяли без дополнительной очистки. Концентрация белка составляла 0,15 мг/мл. Измерения проводили в буферном растворе 50 мМ TrisHCl pH = 8,0.

Спектры поглощения регистрировали с использованием спектрофотометра EPS-3T (Hitachi, Япония). Измерения выполняли в микрокюветах (101,016-QS 5x5 мм2; Hellma, Германия) при комнатной температуре.

Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметра “Cary Eclipse” (Varian, Австралия) и спектрофлуориметра собственного изготовления для определения анизотропии флуоресценции [19]. Триптофановую флуоресценцию регистрировали при возбуждении светом с длиной волны 297 нм. Флуоресценцию хромофора sfGFP возбуждали при длине волны 365 и 470 нм и регистрировали при 510 нм. Для характеристики положения и формы спектров флуоресценции использовали параметр A = I320/I365 (I320 и /зб5 — интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 и 365 нм соответственно; см. [21]). Спектры флуоресценции и параметр A корректировали на спектральную чувствительность установки. Анизотропию флуоресценции определяли, используя соотношение r = (Iy — GIy )/(Iy + 2GIy), где Iy и Iy — вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом; G — коэффициент, характеризующий различие чувствительности установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету: G = IH/Ijj , ^рег. = 365 нм. Кинетические эксперименты проведены с использованием микрокювет (FLR 10 x 10 мм2; Varian, Австралия), перевод белка в растворы различной концентрации GTC и GdnHCl выполнялся путём ручного смешивания раствора белка высокой концентрации с буфером, содержащим необходимую концентрацию денатуранта. «Мёртвое время» для подобного рода экспериментов не превышает 4 с [21]. Зависимости различных флуоресцентных характеристик sfGFP от концентрации GTC измеряли после инкубации белка в растворах GTC соответствующей концентрации при 23 °С в течение 2, 24, 45, 69, 95 ч.

Гель-хроматография sfGFP при денатурации под действием GTC выполнена на колонке Superdex75 PC 3.2/30 (GE Healthcare, Швеция) с использованием системы AKTApurifier (GE Healthcare, Швеция). Белок перед измерением инкубировали в присутствии соответствующей концентрации GTC в течение 24 ч. Колонку уравновешивали буфером, содержащим GTC в той же концентрации. Гидродинамические размеры sfGFP оценивали по изменению положения пика элюции. В области перехода определяли значение объёма элюции, усреднённое по всем существующим конформациям белка: V = fKVK + fUKVUK, где VK и VMK — объём элюции компактных и денатурированных молекул; fK и fмк — доли компактных и денатурированных молекул, рассчитанные на основании площадей под пиками элюции соответствующих состояний белка.

Результаты. Квазиравновесные зависимости различных характеристик триптофа-новой флуоресценции (интенсивности флуоресценции при фиксированной длине волны регистрации, параметра A = I320/I365 и анизотропии флуоресценции; Хвозб. = 297 нм) и интенсивности флуоресценции зелёного хромофора sfGFP при двух значениях длины волны возбуждения (365 и 470 нм; Хрег. = 510 нм) от концентрации гуанидинтиоциана-та (GTC), измеренные после инкубации нативного белка в растворе денатурирующего агента соответствующей концентрации в течение от 1 ч до 94 ч, представлены на

^ТС], м

^ТС], М

5

5

а-

£

-е

к

5

С

С

£

С

(Г

5

£

с

2

о

тГ

Рис. 1. Структурные переходы sfGFP под действием 0X0: регистрируемые характеристики: интенсивность флуоресценции при длине волн регистрации 320 нм (а) и 365 нм (б), параметр А = 1з2о/1збб (б), анизотропия флуоресценции при длине волн возбуждения и регистрации 297 и 365 нм (г), интенсивность флуоресценции хромофора при длине волны регистрации 510 нм и длине волн возбуждения 365 нм (д) и 470 нм (е); кружки и квадраты соответствуют процессам денатурации и ренатурации; измерения были выполнены через 1 ч (закрытые символы) и 24 ч (открытые символы) инкубации белка в присутствии заданной концентрации денатуранта; при денатурации sfGFP измерения также выполнены через 45 ч (треугольники), 69 ч (перевёрнутые треугольники) и 94 ч (крестики) инкубации белка в присутствии заданной концентрации денатуранта

рис. 1. Квазиравновесие устанавливается при инкубации белка в растворах СТС в течение 24 ч, тогда как в растворах гуанидингидрохлорида (С^НС1) для этого требуется несколько дней [22, 23]. При дальнейшем увеличении времени инкубации белка в присутствии СТС значения регистрируемых параметров остаются постоянными, по крайней мере, в течение 4 сут.

На кривой /320 от концентрации СТС, измеренной после 24 ч инкубации эЮРР в растворах денатуранта, можно выделить две подобласти, в которых изменения данного параметра существенно различаются. При небольших концентрациях денатурирующего агента (до 0,1-0,2М СТС) с ростом концентрации СТС наблюдается резкое уменьшение /320. Дальнейшее изменение /320 в области концентраций более 0,9—1,0М СТС (рис. 1, а) имеет сигмоидальный характер. На денатурационных кривых интенсивности

Длина волны, нм

Рис. 2. Изменение спектров поглощения sfGFP в видимой области при денатурации под действием ОТО: стрелками показано направление изменения двух пиков поглощения при увеличении концентрации дена-туранта; вставка — зависимости изменения интенсивности поглощения при 390 нм (квадраты) и 490 нм (кружки) от концентрации GTC

триптофановой флуоресценции /365 и интенсивности флуоресценции зелёного хромофора, измеренной при возбуждении светом с длиной волны 365 (/.36(5) и 470 нм (/510), также наблюдаются первоначальный резкий спад и последующее сигмоидальное изменение регистрируемого параметра.

Зависимости параметра А и анизотропии флуоресценции вЮЕР от концентрации СТС, измеренные при денатурации белка, имеют сигмоидальный характер. Значения этих параметров изменяются лишь незначительно с ростом концентрации СТС до 1,0М. Дальнейшее увеличение концентрации денатурирующего агента приводит к уменьшению значения обоих параметров белка до значений, характерных для полностью развёрнутого белка.

Процесс ренатурации вЮЕР был охарактеризован путём измерения стационарных зависимостей различных характеристик триптофановой флуоресценции и флуоресценции хромофора через 24 ч после перевода белка из 2,2М СТС в раствор с меньшим содержанием денатурирующего агента. Показано, что при переводе денатурированного эЮЕР в растворы с небольшой концентрацией СТС (0,22М СТС) наблюдается восстановление всех регистрируемых параметров белка до уровня, характерного для нативного белка. В области 0,5-0,8М СТС на кривых параметра А и анизотропии флуоресценции, измеренных при ренатурации вЮЕР из полностью развёрнутого состояния, наблюдается плато. Кроме того, наблюдается гистерезис кривых, измеренных при денатурации и ренатурации вЮЕР.

На рис. 2 представлены спектры поглощения вЮЕР, измеренные через 24 ч после перевода белка в раствор СТС соответствующей концентрации. Спектр поглощения нативного эЮЕР имеет выраженную полосу в ближней УФ-области спектра, обусловленную поглощением ароматических остатков белка, и полосу поглощения в видимой области спектра с максимумом при 485 нм и плечом при 390 нм, обусловленную поглощением хромофора в анионной и нейтральной форме соответственно. Увеличение концентрации СТС в растворах белка приводит к существенному изменению полосы поглощения в видимой области вЮЕР. Под действием небольших концентраций денатурирующего агента (примерно до 0,2М СТС) происходит резкое уменьшение интенсивности пика поглощения с максимумом при 485 нм и одновременное значительное

^ТС], м

[GTC], М

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Рис. 3. Квазиравновесные зависимости интенсивности флуоресценции хромофора sfGFP при возбуждении в области поглощения нейтральной (а) и анионной (б) форм хромофора: интенсивность флуоресценции скорректирована с учётом изменения оптической плотности хромофора в нейтральной и анионной форме в присутствии денатурирующего агента соответствующей концентрации; длина волны регистрации — 510 нм; кружки и квадраты соответствуют процессам денатурации и ренатурации

увеличение интенсивности пика поглощения с максимумом при 390 нм (см. рис. 2, вставка) . Дальнейшее изменение интенсивности обоих пиков можно описать сигмоидальной зависимостью. При переводе белка в раствор, содержащий GTC в концентрации более 1,3М, также наблюдается коротковолновый сдвиг пика поглощения при 485 нм.

Следует учитывать, что изменение интенсивности пиков поглощения хромофора sfGFP под действием GTC оказывает влияние на вид зависимости интенсивности флуоресценции хромофора при возбуждении на длине волны 365 и 470 нм от концентрации денатурирующего агента. Поэтому эти зависимости были скорректированы с учётом изменения оптической плотности хромофора в нейтральной и анионной форме в присутствии денатурирующего агента соответствующей концентрации (рис. 3). Представленные в таком виде зависимости интенсивности зелёной флуоресценции отражают изменение квантового выхода флуоресценции хромофора при денатурации белка. В области небольших концентраций GTC характер изменения приведённой интенсивности флуоресценции хромофора sfGFP при двух значениях длины волн возбуждения различается. При возбуждении светом с длиной волны 365 нм интенсивность флуоресценции зелёного хромофора существенно уменьшается (до 13 % от интенсивности нативного белка), тогда как при длине волны возбуждения 470 нм интенсивность флуоресценции хромофора увеличивается только на 20 % по сравнению с интенсивностью нативного белка.

Использование метода гельфильтрации, дающего информацию об изменении формы белка, позволило более полно охарактеризовать процессы денатурации sfGFP под действием GTC. Полученные с использованием колонки 8иреМех75 РС 3.2/30 профили элюции sfGFP представлены на вставке рис. 4. Нативный белок сходит с колонки одним пиком. При умеренных концентрациях GTC (вплоть до 1,0М GTC) в профилях элюции sfGFP наблюдается единственный пик, отвечающий компактным молекулам. Положение этого пика практически совпадает с положением пика элюции нативного белка. При концентрации денатурирующего агента более 1,0М появляется второй пик, отвечающий состоянию белка с менее компактной структурой. Интенсивность второго пика увеличивается с ростом концентрации GTC и при достижении концентрации порядка 2,0М GTC в профиле элюции белка остаётся только второй пик, отвечающий

^ТС], м

Рис. 4. Изменение формы sfGFP при денатурации под действием GTC: зависимости изменения положения пиков, отвечающих компактным (кружки) и денатурированным (квадраты) молекулам и усреднённого по всем конформациям белка объёма элюции (треугольники); данные получены в результате анализа профилей элюции sfGFP (вставка); данные получены с использованием колонки Supeгdex75 PC 3.2/30; растворы нативного sfGFP предварительно инкубировали в присутствии GTC соответствующей концентрации (цифры возле кривых) в течение 24 ч; приготовленный таким образом образец (10 мкл) загружали на колонку, уравновешенную в буфере, содержащем такую же концентрацию денатурирующего агента; скорость элюции

составляла 0,05 мл/мин

менее компактному состоянию белка. Показано, что зависимость объёма элюции от концентрации GTC имеет локальный минимум при 0,1М GTC. На основании представленных данных рассчитаны значения усреднённого объёма элюции sfGFP, характеризующего гидродинамические размеры молекулы, усреднённые по всем конформациям белка. Зависимость усреднённого объёма элюции sfGFP от концентрации GTC имеет сигмоидальный вид (см. рис. 4). Переход от более компактных к менее компактным молекулам происходит в области концентраций денатурирующего агента 1,0-2М GTC.

Обсуждение. Характер денатурационных кривых различных параметров трип-тофановой флуоресценции, флуоресценции хромофора, пиков поглощения хромофора в анионной и нейтральной формах и усреднённого объёма элюции sfGFP позволяет выделить две подобласти концентраций GTC (менее 0,1-0,2М и более 0,9-1,0М), в которых влияние данного денатурирующего агента на структуру sfGFP существенно различается. Очевидно, что в области концентраций выше 0,9-1,0М GTC происходит разрушение нативной глобулярной структуры белка, которое сопровождается синхронным изменением всех регистрируемых характеристик sfGFP: интенсивности триптофановой флуоресценции, параметра А, анизотропии флуоресценции, интенсивности флуоресценции

зелёного хромофора и гидродинамических размеров белка. Измерения спектров поглощения sfGFP в видимой области, наблюдаемые при инкубации белка в присутствии больших концентраций GTC, также согласуются с разрушением структуры белка. Действительно, коротковолновый сдвиг спектра поглощения анионной формы хромофора зелёных флуоресцентных белков связывают с дестабилизацией возбуждённого состояния анионного хромофора при денатурации белка [24, 25].

Процесс денатурации sfGFP является обратимым, при уменьшении концентрации денатуранта наблюдается восстановление всех регистрируемых параметров белка до уровня, характерного для нативного белка. Предполагается, что гистерезис денатура-ционных кривых, измеренных при денатурации и ренатурации зелёного флуоресцентного белка, связан с наличием зрелого хромофора в денатурированном белке и необходимостью упаковки в-бочонка вокруг него [34]. Действительно, для мутантных форм зелёного флуоресцентного белка, в которых хромофор не образуется, явление гистерезиса не наблюдается. Особенностью процесса ренатурации sfGFP является также наличие плато в области 0,5-0,8М GTC на кривых параметра А и анизотропии флуоресценции. При этом интенсивность флуоресценции хромофора sfGFP в этой области концентраций денатурирующего агента, измеренная при ренатурации белка, совпадает со значением этого параметра, измеренным при денатурации белка. Методом молекулярно динамической симуляции недавно было показано, что образование практически полностью сформированного в-бочонка вокруг хромофора при ренатурации происходит быстро, весь процесс лимитируется поиском необходимой конформации хромофора [35]. И на последних этапах происходит доупаковка некоторых участков в-ветвей и аминокислотных остатков, расположенных в «верхней» крышке в-бочонка [35, 36]. Следует заметить, что Тгр 57 расположен как раз рядом с такими участками в-ветвей. Вероятно, что при ренатурации sfGFP происходит накопление состояний белка, в которых некоторые участки полипептидной цепи вокруг Тгр 57 не структурированы, в то время как структура вокруг хромофора в основном сформирована.

В области концентраций GTC до 0,1-0,2М наблюдается несколько эффектов: резкое уменьшение таких параметров, как интенсивность триптофановой флуоресценции и флуоресценции зелёного хромофора, существенное изменение соотношения интенсивностей пиков поглощения анионной и нейтральной форм хромофора sfGFP, что свидетельствует о сдвиге равновесия между молекулами белка, содержащими хромофор в нейтральной и анионной форме. При этом в области концентраций до 1,0М GTC наблюдается изобестическая точка между пиками, обусловленными поглощением хромофора sfGFP в анионной и нейтральной формах. Наличие изобестической точки свидетельствует о том, что денатурант в данном диапазоне концентраций не влияет на спектры поглощения анионной и нейтральной форм хромофора sfGFP, изменяется лишь соотношение этих форм. В то же время небольшие концентрации денатуран-та оказывают существенное влияние на квантовый выход флуоресценции хромофора.

Как известно, переход нейтрального хромофора в возбуждённое состояние сопровождается его депротонированием и образованием возбуждённого состояния I*, в котором анионная форма хромофора не находится в равновесии с его микроокружением. Излучение из состояния I* приводит к формированию спектра флуоресценции, сходного по форме и положению в шкале длины волны со спектром флуоресценции, зарегистрированным при возбуждении анионной формы белка, так как оба возбуждённых состояния имеют близкие уровни энергии [26]. Возможно, значительное уменьшение квантового выхода флуоресценции при возбуждении в области поглощения нейтрального хромофора связано с ингибированием переноса протона при добавлении небольших

концентраций GTC. Существенных изменений структуры sfGFP в этой области концентраций GTC не зарегистрировано, что подтверждается лишь минорными изменениями параметра A и анизотропии флуоресценции. Данные гельфильтрации свидетельствуют о незначительном разрыхлении структуры белка под действием небольших концентраций GTC (0,1—0,2М). Мы полагаем, что данные эффекты могут быть вызваны локальными изменениями структуры sfGFP.

Следует заметить, что подобное действие малых концентраций GTC на структуру зелёного флуоресцентного белка не является чем-то необычным. Ранее подобные эффекты наблюдали для ряда жёлтых флуоресцентных белков, таких как eYFP [27, 28] и E2GFP [29], в присутствии различных анионов (Cl_, галогенов, нитратов и тиосуль-фатов). В случае eYFP было показано наличие специфического сайта связывания анионов, расположенного вблизи остатка Gln69 и хромофора. Сайт связывания галогенов в белке E2GFP имеет несколько другое положение и находится непосредственно над хромофором, рядом с остатком Tyr203. Как полагают, присутствие отрицательного заряда связанного аниона вблизи хромофора белка приводит к ингибированию образования анионной формы хромофора. Возможно, что в случае sfGFP эффекты, обнаруженные в присутствии предденатурационных концентраций GTC, обусловлены также взаимодействием с белком отрицательных ионов тиоционата. С другой стороны, следует учитывать, что положительно заряженные ионы гуанидина GdnH+ могут оказывать и другое действие на белки. Ранее для ряда белков, таких как креатинкиназа, актин, карбоангидраза, одорант-связывающий белок [21, 30-33], нами было показано, что ионы гуанидина GdnH+ при взаимодействии с отрицательно заряженными карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот и амидными группами глутамина и аспарагина могут приводить к снятию локальных напряжений в белке и стабилизации его структуры либо иметь агрегирующее действие на структуру белка. Поэтому необходимы дальнейшие исследования механизмов, посредством которых предденатурационные концентрации GTC оказывают влияние на структуру sfGFP.

Литература

1. Wang Y., ShyyJ. Y., ChienS. Fluorescence proteins, live-cell imaging, and mechanobiology: seeing is believing // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2008. Vol. 10. P. 1-38.

2. Pakhomov A. A., Martynov V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning // Chem. Biol. 2008. Vol. 15. N 8. P. 755-764.

3. WuB., Piatkevich K. D., Lionnet T. et al. Modern fluorescent proteins and imaging technologies to study gene expression, nuclear localization, and dynamics // Curr. Opin. Cell. Biol. 2011. doi:10,1016/j.ceb.2010,12.004.

4. Frommer W. B., Davidson M. W., Campbell R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38. N 10. P. 2833-2841.

5. Chudakov D. M., MatzM. V., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues // Physiol. Rev. 2010. Vol. 90. N 3. P. 1103-1163.

6. Day R. N., Davidson M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38. N 10. P. 2887-2921.

7. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. Vol. 96. P. 11241-11246.

8. Bizzarri R., Serresi M., LuinS., Beltram F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review // Anal. Bioanal. Chem. 2009. Vol. 393. P. 1107-1122.

9. Hanson G. T., Aggeler R., Oglesbee D. et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 13044-13053.

10. Mizuno T., Murao K., Tanabe Y. et al. Metal-ion-dependent GFP emission in vivo by combining a circularly permutated green fluorescent protein with an engineered metal-ion-binding coiled-coil // J. Am. Chem. Soc. 2007. Vol. 129. P. 11378-11383.

11. SouslovaE. A., Belousov V. V., Lock J. G. et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range // BMC Biotechnol. 2007. Vol. 7. P. 37.

12. Ibraheem A., CampbellR. E. Designs and applications of fluorescent protein-based biosensors // Curr. Opin. Chem. Biol. 2010. Vol. 14. P. 30-36.

13. Shcherbo D., Shemiakina 1.1., Ryabova A. V. et al. Near-infrared fluorescent proteins // Nat. Methods. 2010. Vol. 7. P. 827-829.

14. Piatkevich K. D., HulitJ., SubachO.M. et al. Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. Vol. 107. P. 5369-5374.

15. HeimR., PrasherD. C., TsienR. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxida-tion of green fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. Vol. 91 P. 12501-12504.

16. Remington S. J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. Vol. 16. P. 714-721.

17. Pedelacq J. D., Cabantous S., Tran T. et al. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein // Nat. Biotechnol. 2006. Vol. 24. P. 79-88.

18. Verkhusha V. V., OtsunaH., Awasaki T. et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 32. P. 29621-29624.

19. Туроверов К. К., Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе // Цитология. 1998. Т. 40. № 8/9. С. 806-817.

20. Turoverov K. K., Kuznetsova I. M. Intrinsic fluorescence of actin // J. Fluorescence. 2003. Vol. 13. P. 41-57.

21. Kuznetsova I. M., Stepanenko O. V., Stepanenko O. V. et al. The place of inactivated actin and its kinetic predecessor in actin folding-unfolding // Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 13127-13132.

22. Stepanenko O. V., Verkhusha V. V., Kazakov V. I. et al. Comparative studies on the structure and stability of fluorescent proteins EGFP, zFP506, mRFP1, “dimer2” and DsRed // Biochemistry. 2004. Vol. 43. N. 47. P. 14913-14923.

23. Stepanenko O. V., Kuznetsova I. M., Verkhusha V. V. et al. Denaturation of proteins with beta-barrel topology induced by guanidine hydrochloride // Spectroscopy-Biomedical Applications. 2010. Vol. 24. N 3-4. P. 367-373.

24. ZimmerM. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior // Chem. Rev. 2002. Vol. 102. P. 759-781.

25. TsienR. Y. The green fluorescent protein // Annu. Rev. Biochem. 1998. Vol. 67. P. 509-544.

26. Weber W., Helms V., McCammon J. A., LanghoffP. W. Shedding light on the dark and

weakly fluorescent states of green fluorescent proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999.

Vol. 96. P. 6177-6182.

27. Wachter R. M., Remington S. J. Sensitivity of the yellow variant of green fluorescent protein to halides and nitrate // Curr. Biol. 1999. Vol. 9. N 17. P. R628-R629.

28. Seward H. E., Bagshaw C. R. The photochemistry of fluorescent proteins: implications for their biological applications // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38. N 10. P. 2842-2851.

29. ArosioD., Garau G., Ricci F. et al. Spectroscopic and structural study of proton and halide ion cooperative binding to gfp // Biophys. J. 2007. Vol. 93. N 1. P. 232-244.

30. BushmarinaN. A., Kuznetsova I. M., Biktashev A. G. et al. Partially folded conformations

in the folding pathway of bovine carbonic anhydrase II: a fluorescence spectroscopic analy-

sis // Chem.Bio.Chem. 2001. Vol. 2. P. 813-821.

31. Kuznetsova I. M., Stepanenko O. V., Turoverov K. K. et al. Unravelling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase // Biochem. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1596. P. 138-155.

32. Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Uversky V. N. Use of the phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the “invisible” intermediates // J. Pro-teome Res. 2004. Vol. 3. P. 485-494.

33. Staiano M., D’AuriaS., Varriale A. et al. Stability and dynamics of the porcine odorant-binding protein // Biochemistry. 2007. Vol. 46. N 39. P. 11120-11127.

34. Andrews B. T., Schoenfish A. R., Roy M. et al. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 373. P. 476-490.

35. Andrews B. T., Gosavi S., Finke J. M. et al. The dual-basin landscape in GFP folding // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. Vol. 105. N 34. P. 12283-12288.

36. Andrews B. T., Roy M., Jennings P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP // J. Mol. Biol. 2009. Vol. 392. N 1. P. 218-227.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.