Роль гена транскрипционного фактора Sp4 в генезе наследственного синдрома слабости синусового узла

© ЧЕРНОВА А.А., НИКУЛИНА С.Ю., ШУЛЬМАН В.А., ВОЕВОДА М.И., МАКСИМОВ В. Н., КАЗАРИНОВА Ю.Л.

РОЛЬ ГЕНА ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА 8Р4 В ГЕНЕ-ЗЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО СИНДРОМА СЛАБОСТИ СИНУСОВОГО

УЗЛА

А.А. Чернова, С.Ю. Никулина, В.А. Шульман, М.И. Воевода, В.Н. Максимов, Ю.Л. Казаринова

Красноярская государственная медицинская академия им. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И. П. Артюхов; ГУ НИИ терапии СО

РАМН г. Новосибирск, директор - д. м. н., проф. М. И. Воевода.

Резюме. В настоящей работе впервые на клинико-генетическом материале выявлены ассоциации наследственного синдрома слабости синусового узла (СССУ) с полиморфизмом гена транскрипционного фактора (ТФ) БР4 человека, являющегося гомологом гена транскрипционного фактора мышей Ш1Ъ.

Ключевые слова: синдром слабости синусового узла, полиморфизм, ген транскрипционного фактора БР4.

Электрофизиологические свойства проводящей системы сердца определяется работой ионных каналов кардиомиоцитов и их gap-соединений. Изменения структуры генов, которые определяют форму, строение, белковую последовательность этих соединений, могут приводить как к структурным, так и к функциональным нарушениям межклеточных соединений и клеточных мембран.

В настоящее время выделяют 3 вида межклеточных соединений: адгезивные контакты, механически скрепляющие клетки, замыкающие контакты -препятствующие прохождению молекул и проводящие щелевые контакты, пропускающие молекулы.

Щелевые контакты, взаимодействуя между собой, образуют на клеточной мембране так называемые <^ар»-соединения. Это специализированные

мембранные структуры, состоящие из межклеточных каналов, соединяющих соседние клетки и образующих химические и электрические межклеточные связи. Каждое gap-соединение представлено коннексонами, в состав которых входит 6 коннексинов.

Белки - коннексины - молекулы гексагональной конструкции, специализированные мембранные структуры, осуществляющие передачу импульса между кардиомиоцитами. На проводимость влияют ионы кальция и водорода, отвечающие за вольтаж клеток; фосфорилирование коннексинов и состав поверхностных клеточных жирных кислот [11]. Общая длина gap - соединений на поверхности кардиомиоцита в области синусового узла в сумме в 25 раз меньше, чем в миокарде желудочков [15]. Сердечная ткань с высокой проводимостью, например, работающий миокард предсердий, желудочков и особенно волокна Гиса - Пуркинье, богата многочисленными gap - соединениями. Клетки с медленным проведением импульсов, такие как миокардио-циты синусового и атриовентрикулярного узлов, содержат меньшее количество щелевых контактов и меньшего размера [3, 6, 14, 15].

Патогенетическим звеном нарушения внутрисердечной проводимости является изменение структуры или снижение количества белков -коннексинов [7].

Многобразие коннексинов придает специфические свойства межклеточным контактам для контроля потока молекулярной информации и определяет свойства проводящей системы сердца в норме и в патологии.

В настоящее время известно около 13 видов коннексинов, различающихся по молекулярному весу, структурным и функциональным особенностям. В кардиомиоцитах человека преобладают 3 типа gap - соединений, сформированные из коннексина 40 - в системе Гиса - Пуркинье [4], коннек-синов 43 и 45 - в предсердиях.

Структура гена белка - коннексина определяется действием ТФ. Типичный ТФ содержит ДНК - связывающий домен, специфичным образом

распознающий цис - элементы (отдельные сайты связывания ТФ), и активационный домен, необходимый для запуска транскрипции.

Общеизвестно, что закладка, развитие и анатомия проводящей системы сердца аналогичны у всех млекопитающих. Человеческим гомологом гена ТФ HF-1b мышей является транскрипционный фактор SP4. При проведении эксперимента на мышах с введением инактивирующей мутации в ген ТФ HF-1b выявлено достоверное увеличение смертности животных от желудочковых тахиаритмий и развитие атриовентрикулярных блокад при отсутствии морфологических изменений в сердце.

ТФ SP4 картирован Kalff-Suske et al. в 1995 году на 7 хромосоме [12]. Белок SP4 состоит из 784 аминокислотных остатков, имеет вес 82025 Дальтон и экспрессируется в миокарде предсердий, нервной системе и скелетных мышцах.

Ishimaru N. et al. изучали регуляцию гена нейротропина - 3 с помощью транскрипционных факторов SP1 и SP4 в нейронах [10].

Lerner L. E. et al. выявили, что транскрипционный фактор SP4 экспрессируется в ретинальной ткани глаза, активирует транскрипцию гена, отвечающего за фоторецепцию [13].

Song J. et al. в 2001 г. исследовал особенности строения транскрипционного фактора SP4 у мышей, распознал его роль в росте, жизнеспособности и фертильности мышей [16].

Gollner H. et al. описали комплекс гомозиготных генотипов у мышей с неполной мутацией в гене транскрипционного фактора SP4 [5].

Hagen G. et al. выявили отличия транскрипционного фактора SP4 от SP1 и SP3 [8], так же нашли сайт узнавания транскрипционного фактора SP4, выполнили секвенирование SP3 и SP4 [9].

В целом результаты проведённых наблюдений по исследованию полиморфизмов гена транскрипционного фактора SP4 выявляют определенные ассоциации с рядом заболеваний различных органов и систем, но работы по ассоциации данного гена с СССУ не проводились.

Цель исследования. Выявить частоты генотипов и аллелей по полиморфизму гена ТФ БР4 у больных СССУ, их родственников I, II, III степени родства и лиц контрольной группы.

Материалы и методы

Настоящее исследование было проспективным. Из базы данных кафедры терапии №1 г. Красноярска были отобраны 29 семей, имеющих первичный, наследственный СССУ. Среди пробандов было 20 женщин и 9 мужчин, средний возраст составил 58 ± 0,15 лет. Среди родственников I, II и III степени родства было 65 мужчин и 68 женщин, средний возраст 39 ± 0,13 лет.

Всем пробандам и их родственникам I, II, III степени родства было проведено клинико-инструментальное исследование: клинический осмотр, электрокардиография, велоэргометрия, холтеровское мониторирование ЭКГ, атропино-вая проба, электрофизиологическое исследование (чреспищеводная стимуляция левого предсердия до и после медикаментозной вегетативной блокады), эхокар-диоскопия, кардиоритмография.

Молекулярно-генетическое исследование больных СССУ и их родственников I, II и III степени родства выполнялось в лаборатории медицинской генетики ГУ НИИ терапии СО РАМН города Новосибирска, были взяты образцы крови 109 человек, 16 пробандов и 34 их родственника I, II и III степени родства с наследственным СССУ, подтвержденным с помощью чреспи-щеводной стимуляции левого предсердия (ЧПСЛП), и 59 их здоровых родственников I, II, III степени родства.

Группа контроля представлена популяционной выборкой из 196 человек в возрасте 25-64 года - жителей Октябрьского района г. Новосибирска, обследованных в рамках программы ВОЗ < МОНИКА» (1994 г).

На момент исследования было известно 10 ОНП маркеров в этом гене, локализованных в интронах (некодируемых областях). В результате для дальнейших исследований был выбран олигонуклеотидный полиморфный маркер (ОНП) гена БР4 - КСЫ БКР гб 1011168, расположенный в пятом ин-троне - замена А на Т в позиции 80807.

Экстракция ДНК из крови осуществлялась методом фенол-хлороформной экстракции [1, 2].

Для анализа полиморфизма этого ОНП маркера была разработана методика генотипирования на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции. В реакции использовались следующие олигонуклеотидные праймеры: 1) 5’-aaatgaggacaatgaaaagcaca-3’-прямой (A) 2) 5’-

gcctaagctgctactatttcagtg3’- обратный (A - com) 3) 5’-catttctcaattgcctgctataga-3’ -обратный (T) 4) 5’-actgttgccctttgttgcca-3’ -прямой (T - com). Праймеры 1 и 2 используются для амплификации аллеля А80807 и праймеры 3 и 4 - аллеля Т80807. Оба аллеля амплифицируются одновременно в одной реакционной смеси. В случае гомозигот детектируется продукт размером 275 н.п. для аллельного варианта A и 171 н.п. - для T. Гетерозиготный генотип идентифицируется по одновременному наличию продуктов обоих размеров. ПЦР-продукт, получаемый с пары праймеров 2 и 4, имеет размер 400 п.н. и детектируется при всех аллельных вариантах.

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере типа "IBM PC" с использованием пакета программ "SPSS-11.5". Первым этапом определяли частоты аллелей и генотипов изучаемых генов-кандидатов.

Соответствие распределения аллелей и генотипов равновесию Харди-Вайнберга, сравнительный анализ частот генотипов вышеперечисленных генов с контрольной группой выполнялось с использованием критерия %2, двустороннего критерия Фишера.

Результаты и обсуждение

По полиморфизму A44G гена ТФ SP4 нами прогенотипировано 50 больных с СССУ, 59 их здоровых родственников I, II и III степени родства и 196 лиц контрольной группы.

По результатам аллель-специфической полимеразной цепной реакции выявлены 3 вида генотипов ТФ SP4 у больных СССУ, их здоровых родствен-

ников и лиц контрольной группы: А 80807 А - гомозиготный дикий, А 80807 Т - гетерозиготный, Т 80807 Т - гомозиготный мутантный.

%

СССУ

Рис. 1. Частота встречаемости генотипов гена транскрипционного фактора БР4 у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы.

Обнаружено (рис.1) достоверное преобладание гомозиготного мутантного генотипа Т80807Т у больных СССУ (34%) по сравнению с их здоровыми родственниками (8,5%) и лицами контрольной группы (18%).

При изучении данных по аллелям гена ТФ БР4 достоверных различий между больными с СССУ, их здоровыми родственниками и лицами контрольной группы зарегистрировано не было.

Таким образом, носители гомозиготного мутантного генотипа Т80807Т гена транскрипционного фактора БР4 имеют более высокий риск развития наследственного синдрома слабости синусового узла по сравнению

с их здоровыми родственниками. Так как анализируемый олигонуклеотид-ный маркер расположен в интроне - некодируемой части гена, наблюдаемая ассоциация является, вероятнее всего, результатом собственного воздействия данного полиморфизма на экспрессию гена, или\и его сцеплением с влияющими на этот процесс аллелями других вариабельных участков гена.

THE ROLE OF TRANSCRIPTION FACTOR GENE SP 4 IN GENESIS OF HEREDITARY SICK SINUS SYNDROME A.A. Chernova, S.YU. Nikulina, V.A. Shulman, M.I. Voevoda, V.N. Maksimova, YU.L. Kazarinova Krasnoyarsk state medical academy named in honour of V.F. Vojno-

Yasenetskij

The associations of hereditary sick sinus syndrome with polymorphism of transcription factor gene SP4 (homologue of transcription factor gene of mice HF1b) were revealed on clinical and genetic materials for the first time in this study.

Литература

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М. Мир. - 19S4. - С. 357.

2. Смит К., Калко С., Кантор Ч. Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК /Анализ генома/. Под ред. К. Дейвиса, пер. с англ. - М: Мир, - 199G. - С. 5S-94.

3. Daniel T., D. Carling. Functional analysis of mutations in the Y2 subunit of AMP-activated protein kinase associated with cardiac hypertrophy and Wolff- Parkinson-White syndrome // J. Biol. Chem. - 2GG2. - Vol. 277. - P. 51G17-51G24.

4. Firouzi M., Ramanna H., Kok B. et al. Association of Human Connexin4G Gene Polymorphisms With Atrial Vulnerability as a Risk Factor for Idiopathic Atrial Fibrillation // Circulation Research. - 2GG4. - Vol.95. - P. 29

5. Gollner H., Bouwman P., Mangold M. et al. Complex phenotype of mice homozygous for a null mutation in the Sp4 transcription factor gene. //

Genes Cells. - 2GG1. -Vol. 6. - P. 6S9-97

6. Gourdie R.G, Severs N.H., Green C.R. et al. The spatial distribution and relative abundance of gap- junctional connexin-4G and connexin-43 correlate to functional properties of components of the cardiac atrioventricular conduction system // J. Cell Sci. - 1993. - Vol. 1G5. - P. 9S5-991.

7. Gutstein D.E., Morley G.E., Tamaddon Y.et al. Conduction slowing and sudden arrhythmic death in mice with cardiac-restricted inactivation of con-nexin-43 // Circ. Res. - 2GG1. - Vol. SS. - P. 333.

S. Hagen G., Dennig J., Preiss M. et al. Functional analyses of the transcription factor Sp4 reveal properties distinct from Sp1 and Sp3 // J. Biol. Chem. -1995. - Vol. 27G. -P. 249S9-24994.

9. Hagen G., Muller S., Beato M. et al.Cloning by recognition site screening of two novel GT box binding proteins: a family of Sp1 related genes // Nucleic Acids Res. - 1992. - Vol. 2G. - P. 5519-5525.

10.Ishimaru N., Tabuchi A., Hara D. et al. Regulation of neurotrophin-3 gene transcription by Sp3 and Sp4 in neurons // J Neurochem. - 2007. -Vol. 100. - P. 520-531.

11.Jongsma H.J., Wilders R. Gap junctions in cardiovascular disease // Circ. Res. - 2000. - Vol. 86. - P. 1193.

12.Kalff-Suske M., Kunz J., Grzeschik K. et al. Human Sp4 transcription factor gene (SP4) maps to chromosome 7p15 // Genomics. - 1995. - Vol. 26. -P.631-633.

13.Lerner L. E., Peng G. H., Gribanova Y. E. Sp4 is expressed in retinal neurons, activates transcription of photoreceptor-specific genes, and synergizes with Crx // J Biol Chem. - 2005. - Vol.27. - P. 20642-50.

14.Nguyen-Tran V.T.D., Kubalak S.W., Minamisawa S. et al. A noval genetic pathway for sudden cardiac death nia defects in the transition between ventricular and conduction system cell lineages // Cell. - 2000. - Vol. 102. - P. 671-682.

15.Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N. et al. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure // Science. - 1998. -V.280. -P.750-752.

16.Song J., Mangold M., Suske G. et al. Characterization and promoter analysis of the mouse gene for transcription factor Sp4 // Gene. - 2001. -Vol. 7. -P.19-27

17.Van der Welden H. M. W. et al. Gap junctional remodeling in relation to stabilization of atrial fibrillation in the goat // Cardiovasc. Res. - 2000. -Vol. 46. - P. 476-486.