Исследование механизмов адаптации дрозофилы к бензотриазолу

УДК 575.826

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ ДРОЗОФИЛЫ К БЕНЗОТРИАЗОЛУ

© 2006 Е С. Селезнева

Самарский государственный университет

Исследованы механизмы адаптации дрозофилы к воздействию полулетальными дозами бензо-триазола. Обнаружено, что бензотриазол индуцирует доминантные и рецессивные летальные мутации как в нетоксичной дозе (0,1 мг/мл), так и в дозе LD50. При постоянном воздействии бензо-триазолом в дозе LD50 в течение 5 поколений наблюдалось достоверное снижение смертности на всех стадиях онтогенеза и восстановление плодовитости. Эксперименты по длительной и кратковременной преадаптации нетоксичной дозой к последующему мутагенному действию дозой LD50 выявили различия в мутагенном ответе у различных полов дрозофилы. Показано, что возникновение адаптации к исследованному ксенобиотику, связано с селекцией организмов по высоко активным генам резистентности в период гаметогенеза.

Засорение окружающей среды геноток-сическими соединениями приводит к изменению состава экосистем. Это связано с двумя параллельно идущими процессами: вымиранием чувствительных к данному токсиканту организмов и отбором высоко адаптивных форм к данному ксенобиотику. Оба эти процесса относятся к организмам как внутри каждого вида, так и к различным видам. Результатом этого является обеднение экосистем и усиление их неустойчивости к действию антропогенных факторов.

Гибель от воздействия токсиканта может происходить разными путями:

- гибель молоди;

- снижение иммунитета;

- нарушение процессов роста;

- изменение поведения;

- нарушение полового созревания и как следствие последнего рост абортов, рождение нежизнеспособных детей, аномалии полового поведения и т.п.

Селекция на устойчивость к какому-либо токсиканту приводит к резкому снижению генетического разнообразия, вследствие повышения частоты гомозигот по аллелям устойчивости. А между тем устойчивость к токсикантам не гарантирует высокой плодовитости. Было показано, что особи устойчивые к ядохимикатам имеют хуцшие темпы роста, меньшую плодовитость и меньшую продолжительность жизни [12].

Особую тревогу вызывают соединения, хронически воздействующие на живые организмы вследствие их широкого использования в хозяйственной деятельности и в связи с этим с постоянным поступлением в окружающую среду. К такому роду ксенобиотикам относится бензотриазол, который используется в фотографии, шинной промышленности, как антикоррозийное средство и входит в состав многих комплексных гербицидов [2].

Ранее была показана высокая токсичность бензотриазола как для млекопитающих, так и для некоторых членистоногих. Так вдыхание паров бензотриазола приводило у крыс к поражению центральной нервной системы, печени, органов кроветворения, а при поступлении бен-зотриазола перорально с водой и пищей вызывало развитие различных злокачественных опухолей [5, 10]. Для дрозофилы была доказана мутагенность бензотриазола [4].

Поэтому интересно проанализировать в модельных экспериментах возможность адаптации к такому соединению, которое помимо токсичности, способно индуцировать мутации. Целью данного исследования явился анализ способности Drosophila melanogaster адаптироваться к воздействию на нее бензотриазолом.

Материал и методы исследования

Объектом исследования служили 3-4 дневные имаго дикой линии СаПюп^

Drosophila melanogaster. Бензотриазол использовали в виде водных растворов двух концентраций: 0,01 мг/мл - нетоксичная для имаго дрозофилы доза, 8,66 мг/мл - LD50 для самок и 6,64 мг/мл - LD50 для самцов. Время воздействия - 1 сутки.

Способность бензотриазола индуцировать доминантные летальные мутации определяли по методу Белоконь [3].

При анализе воздействия бензотриазола на самок использовали 900 девственных самок, которых предварительно в течение суток затравливали бензотриазолом в дозе LD50 и в течение суток скрещивали с 500 интактными самцами. В течение 10 часов производили сбор яиц, помещая в популяционный ящик для скрещивания, через каждые два часа чашки Петри со стандартным кормом [9]. Подсчитывали, число отложенных яиц и число вылупившихся личинок. Выживших личинок отбирали и помещали в сахарные стаканчики для анализа числа куколок и числа имаго.

При анализе способности бензотриазо-ла индуцировать доминантные летальные мутации у самцов, затравливали 900 самцов, выживших - затем скрещивали с 500 интак-тными самками, и затем анализировали, как описано выше эмбриональную, личиночную гибель и гибель на стадии куколок.

Вылетевших имаго первого поколения ^1) опять подвергали воздействию бензотриазола в дозе LD50, после чего анализировали число отложенных яиц, эмбриональную, личиночную гибель, а также гибель в процессе метаморфоза на стадии куколки по методике, описанной выше. Затем подсчитывали число доминантных леталей [3]. Таким образом, было проанализировано 4 поколения. С помощью однофакторного дисперсионного анализа [7] выясняли достоверность отличий в плодовитости, эмбриональной, личиночной и ку-колочной гибели, числом доминантных лета-лей, между поколениями и контролем.

Для анализа способности дрозофилы адаптироваться к генотоксичности бензотриазола были проведены две серии экспериментов.

1 серия.

Интактных самок и самцов рассаживали в сахарные стаканчики, где в стандартный

корм был добавлен бензотриазол в таком количестве, что его концентрация составила 0,01 мг/мл. Таким образом, с откладки яиц и до вылета имаго Drosophila проводила свою жизнь в контакте с бензотриазолом. Вылетевших имаго (отдельно девственных самок и девственных самцов) в течение суток подвергали воздействию бензотриазола в дозе LD50 и затем по описанной выше методике анализировали плодовитость эмбриональную, личиночную и куколочную гибель и число доминантных леталей.

2 серия.

Интактных и девственных самок и самцов отдельно подвергали в течение суток воздействию бензотриазолом в концентрации 0,01 мг/мл. Через сутки имаго вторично подвергали воздействию бензотриазола но в дозе LD50. Затем анализировали плодовитость, гибель на разных стадиях онтогенеза и число индуцированных доминантных леталей.

Способность безотриазола индуцировать рецессивные летальные мутации в Х-хромосоме самцов оценивали с помощью стандартного метода Меллер-5 [8].

Достоверность различий между опытом и контролем оценивали с помощью критерия Стьюдента, однофакторного и двухфакторно-го дисперсионного анализов [7].

Результаты и их обсуждение

Результаты анализа способности бензо-триазола индуцировать доминантные летальные мутации у имаго дрозофилы в максимально нетоксичной дозе (0,01 мг/мл) и в дозе LD50 представлен в табл. 1.

Как видно из представленных результатов бензотриазол даже в нетоксичной дозе индуцировал достоверно различное число доминантных леталей у самок и самцов (р<0,01). Различия в чувствительности к мутагенному действию у самок и самцов, как в нетоксичной дозе, так и в дозе LD50 определяется тем, что на стадии имаго половые клетки у разных полов находятся на разных стадиях развития: у самцов - это зрелые сперматозоиды, а у самок - ооциты [6].

Проведенные эксперименты показали, что бензотриазол способен индуцировать не

Таблица 1. Индукция бензотриазолом доминантных летальных мутаций

Концентрации Процент доминантных летальных мутаций у

самок самцов

0 1,5 ± 0,09 1,1 ± 0,6

0,01 мг/мл 13,2 ± 0,03 7,7 ± 0,07

доза ЬБ50 24,2 ± 0,3 12,3 ± 0,5

Таблица 2. Индукция бензотриазолом рецессивных леталей у самцов дрозофилы

Концентрации бензотриазола Процент рецессивных леталей

0 0,01 ± 0,01

0,01 мг/мл 0,16 ± 0,28

LD50 4,91 ± 0,3

только доминантные, но рецессивные летали (табл. 2).

Из полученных результатов видно, что бензотриазол проявляет мутагенную активность как в дозе LD50, так и в нетоксичной дозе и, следовательно, это должно так или иначе отражаться на способности дрозофилы адаптироваться к данному веществу.

Чтобы определить способность дрозофилы адаптироваться к воздействию бензо-триазола, мы подвергали кратковременному (суточному) воздействию имаго самок и самцов в течение 5 поколений.

Девственные 5-дневные самки и самцы (по 1500 особей) по отдельности контактировали с бензотриазолом в дозе LD50, нанесенным на желатину Затем выживших скрещивали между собой для получения следующего поколения. Из следующего поколения

отбирали девственных самок и самцов и когда они достигали возраста 5 дней, их подвергали воздействию бензотриазола в дозе LD50 и так до F5. Результаты эксперимента представлены на рис. 1

Из представленных результатов видно, что, наиная со второго поколения ^2), наблюдается достоверное снижение (р<0,01) смертности. В F5 бензотриазол в дозе LD50, рассчитанной для F1, вызывает только3-5% гибель имаго, достоверно не отличающуюся от контроля.

Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, достоверное (р<0,01) снижение смертности в ряду поколений и достоверное различие в смертности между полами после воздействия исследуемым соединением.

Основными составляющими состояния

я ^

ю я и н

я ^

я о а я

60 50 40 30 20 10

21 самки Э самцы

а к*

"1 г§

я

гТЧ5! X ж "г

F0 F1 F2 F3 F4 F5

поколоения

0

Рис. 1. Гибель имаго дрозофилы в ряду поколений при действии на них бензотриазолом в дозе LD50

1,2 1

0,8

I

1 0,6

X

Л

§ 0,4 Й

И 0,2

1 плодовитость

F0

F1

F2 F3 поколения

F4

F5

Рис. 2. Изменение плодовитости в ряду поколений подвергщихся кратковременному воздействию

бензотриазола в дозе LD50

<8 о о о

X

Л

и О С н X (О

я о а с

40 35 30 25 20 15 10 5 0

—+-% л.г --% к.г

+ \

/ ^п

А ........ —| 1 1 1 1 1 п

F0

F1

F2

F3

F4

F5

поколения

Рис. 3. Изменение личиночной гибели (% л.г.) и гибели на стадии метамофоза (% к.г.) при кратковременном воздействии бензотриазолом в каждом поколении в дозе LD50

адаптированности являются не только выживаемость, но плодовитость [1]. Для оценки плодовитости мы воспользовались величиной относительной плодовитости, для чего плодовитость каждого поколения делили на плодовитость Б0 (контроль).

Самая низкая плодовитость наблюдается в Б1, при первом воздействии исследуемым ксенобиотиком в дозе LD50 (рис. 2). Затем в следующих поколениях наблюдался достоверный рост плодовитости ф<0,001), тем не менее, даже в пятом поколении плодовитость была достоверно ниже, чем в контроле. Анализ суммарной гибели в личиночный период жизни и в период метаморфоза представлен на рис. 3.

Итак, в после воздействия на имаго токсикантом в дозе LD50 наблюдалась гибель их потомства, как на личиночной стадии, так и на стадии куколки. В следующих поколениях, по-видимому, появились особи адаптированные к бензотриазолу, что выражается в снижении гибели, как личинок, так и куколок. Проведенный однофакторный дисперсионный анализ показал, что из поколения в поколение растет выживаемость на всех стадиях онтогенеза ф<0,001).

Существует два возможных механизма возникновения адаптаций такого рода: 1) возникновение мутантов, устойчивых к действию бензотриазола, а в дальнейшем накопление их числа селективным воздействием

0

Таблица 3. Способность бензотриазола индуцировать доминантные и рецессивные летальные мутации

Способ воздействия Процент доминантных Процент рецессивных

леталей леталей

у самок у самцов у самцов

Воздействие на имаго, онтогенез 3,4 5,8 0,12

которых прошел на среде с бензотриазолом (0,01 мг/мл) дозой LD50

Воздействие на имаго 9 12,4 4,6

преадаптированных в течение суток бензотриазолом (0,01 мг/мл) дозой LD50

бензотриазола в следующих поколениях, 2) селекция уже существующих адаптан-тов, у которых быстро активируются гены резистентности, среди имаго Drosophila melanogaster дикой линии Canton- S.

Для проверки этих возможных путей возникновения адаптацтий были проведены эксперименты по преадаптации к токсиканту его нетоксичными дозами. В первой серии экспериментов интактные имаго откладывали яйца в течение суток на корм, в состав которого входил бензотриазол в дозе 0,01 мг/ мл. Вылетевших имаго теститровали на устойчивость к генотоксичности бензотриазо-лав дозе LD50, то есть определяли число возникших рецессивных и доминантных летальных мутаций. Во второй серии экспериментов интактные имаго в течение суток получали апельсиновый сок с растворенным в нем бензотриазолом в дозе 0,001 мг/мл, через сутки этих имаго обрабатывали бензотразолом в дозе LD50, а затем подсчитывали число индуцированных доминантых и рецессивных ле-талей. Результаты суммированы в табл. 3.

Первая серия экспериментов показала, что при длительном воздействии ксенобиотика в нетоксичной дозе достоверно снижается мутагенное действие (p<0,01) его в дозе LD50 (табл. 1,2). То есть можно говорить об активации генетических механизмов скрытой резистентности [11]. Так, для других насекомых было показано, что постоянное действие пестицидами приводит к селекции генов резистентности и за короткое время популяция насыщается ими [13]. Мы также это отмечали, обнаружив рост плодовитости из поколения в поколение при разовом воздействии

бензотриазолом в каждом поколении. Проведенная серия экспериментов ничего не говорила о механизмах преадаптации, так как мы не могли отвернуть гипотезу о возникновении мутантов устойчивых к бензотриазолу.

Во второй серии экспериментов, когда преадаптация была проведена кратковременным воздействием (суточное воздействие на имаго), обнаружили, что уменьшение процента доминантных леталей наблюдалась только у самок. Интересно отметить, что частота возникновения как доминантных, так и рецессивных летальных мутаций у самцов не отличалась в этом эксперименте от такового при однократном воздействии бензотриазо-ла в дозе LD50 (табл.1, 2).

Различие в реакции особей женского и мужского пола связано с особенностями созревания половых продуктов. Так, воздействие малыми дозами на самок дрозофилы, у которых половые продукты - ооциты I порядка, активирует систему генов резистентности, в результате чего часть поврежденных хромосом направляется в полярные тельца. У самцов половые продукты представлены зрелыми сперматозоидами [6]. Гены резистентности не работают, результатом этого является отсутствие преадаптации; проверить последнее предположение возможно только в случае использования азолов, не являющихся агонистами пуринов, например имидазол, триазол, чему и будут посвящены следующие исследования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. М.: Мир. 1988. Т.3.

2. Бадюгин С.М. Токсикология синтетических ядов. Казань: Медицина, 1974.

3. Белоконь Е.М. Генетический эксперимент в исследованиях на дрозофиле. Львов: Выша школа, Изд. Львовского ун-та, 1979.

4. Вакулко О.П., Пурыгин П.П., Селезнева Е.С., Иванов И.П. Исследование мутагенной активности некоторых веществ группы -тиокарбонилбензотриазо-ла. Тез. докл. обл. научно-техн. конф. "60-летию СССР - ударный труд, знание, инициативу и творчество молодых". Куйбышев, 1983.

5. Васильева И.И. Токсикология новых химических веществ и гигиене труда при их производстве и применении / Гиг. труда. 1970. №3.

6. Захваткин Ю.А. Курс общей энтомологии. М.: Колос, 2001.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая шко-

ла, 1990.

8. Медведев Н.И. Практическая генетика. М: Наука, 1968.

9. Проблемы генетики в исследованиях на дрозофиле. Под ред. В.В. Хвостовой, Л.И. Корочкина, М.Д. Голубовского. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1977.

10. Прозоровский В.Б. Токсикология новых химических веществ //Фармакол. и токси-кол. 1962. №1.

11. Crow J.F. Geneties of insect resistence to chemicals // Am.Rev.Entomology. 1957. V21.

12.Fox G.A. Tinkering with the Tinkerer: Pollution versus Evolution. Enviromental Health Perspecnives. 1995. V.103.

13. Meller G. Selection for DDT resistence in inbred, laboratory and wild stocrs of Drosophila melanogaster // J. Ecol. Entomol. 1959. V.23.

THE DROSOPHILA ADAPTATION MECHANISMS TO BENZOTRIASOLE

© 2006 E.S. Selezneva

Samara State University

The Drosophila adaptation mechanisms to sub-lethal benzotriasole doses are investigates. It is showed that benzotriasole induces dominant and recessive lethal mutations both in non-toxic dose (0,1 mg/ml) and LD50 dose. Under constant benzotriasole action in LD50 dose during 5 generations the mortality decrease in all ontogenesis stages and fertility rehabilitation. The experiments on prolonged and short pre-adaptation to non-toxic dose to mutagen action of LD50 dose showed the difference in mutagen answer of Drosophila males and females. It is showed that adaptation appearance to tested xenobiotic is connected with organisms selection on highly active resistance during gametogenesis period