СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ УГРОЖАЮЩЕГО ПРЕРЫВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ
METHOD OF EARLY DIAGNOSTIC OF THREATENING ABORTION

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для ранней диагностики невынашивания беременности в первом и/или втором триместре беременности.
Среди важнейших проблем практического акушерства одно из первых мест занимает невынашивание беременности, составляющее 20% среди всех случаев беременности (15% самопроизвольные выкидыши и 5% преждевременные роды), причем этот показатель не имеет тенденции к снижению, несмотря на многочисленные и эффективные методы диагностики и лечения, разработанные в последние годы (В.М.Сидельникова, 2007).
По данным М.И.Базина, А.Т.Егоровой, А.И.Панова (2004) невынашиванием беременности принято считать самопроизвольное прерывание беременности в различные сроки от зачатия до 37 недель, считая с 1-го дня последней менструации. В настоящее время невынашивание беременности представляет собой полиэтиологический комплекс, в развитии которого принимают участие важнейшие системы организма женщины (Т.А.Старостина и соавт., 2002; Г.Б.Бапаева, Н.М.Мамедалиева, 2005; В.И.Кулаков, 2006). Крайне важной для разработки оптимальной тактики ведения беременной является оценка факторов риска спорадического прерывания и невынашивания беременности. В структуре привычных потерь беременности выделяют и генетические, анатомические, эндокринные, иммунологические, аутоиммунные и инфекционные факторы (О.Ф.Серова, 2000).
Следовательно, медицинская и социальная значимость проблемы невынашивания беременности, влияние ее на репродуктивное здоровье женщин ставит научные исследования в этой области в ряд важнейших задач современной фундаментальной и клинической медицины (А.Д.Макацария, 2005). Таким образом, все это определяет необходимость поиска новых путей решения проблемы ПНБ. Особое значение здесь имеют прогнозирование и доклиническая диагностика угрозы прерывания беременности, направленные на сохранение и полноценное течение беременности, и должны они осуществляться еще до ее наступления.
К известным на сегодняшний день инструментальным методам исследования невынашивания беременности относятся метод ЭКГ, метод Кирлиана, ультразвуковой диагностики и допплерометрии.
Известны способы диагностики угрозы прерывания беременности в I триместре по определению в крови и моче концентраций специфических белковых гормонов беременности - хорионического гонадотропина (ХГ) и плацентарного лактогена, а также стероидных гормонов - прогестерона и эстрадиола или их метаболитов (И.А.Сила с соавт., 1972, В.П.Карнушин с соавт., 1977, С.Н.Хейфец, 1978, М.В.Федорова с соавт., 1984). Характерными признаками угрожающего самоаборта при этом являются снижение содержания ХГ, плацентарного лактогена, а также смещение соотношения "прогестерон - эстрадиол" в сторону относительного преобладания последнего. Общим недостатком этих методов можно считать их неспецифичность и трудоемкость выполнения.
На протяжении последних десятилетий внимание ученых привлекли так называемые специфические белки беременности, имеющие плацентарное и эндометриальное происхождение. Возросший интерес к этим энзимам связан с попыткой использовать их выявление в сыворотке крови матери для прогноза осложнений беременности, нарушений фертильности женщин и мужчин (Л.В.Посисеева, 1991, Н.М.Побединский с соавт., 1997). Наиболее изученными из синтезируемых плацентой белков являются плацентоспецифический альфа-1-микроглобулин (ПАМГ-1), ассоциированный с беременностью протеин А (РАРР-А), трофобластический бета-1-гликопротеин (ТБГ). Отражением благополучия беременности является постепенное увеличение концентрации ПАМГ-1 в сыворотке крови беременной от момента оплодотворения вплоть до 27-29 недель, тогда как при угрозе выкидыша в I триместре уровень ПАМГ-1 в крови снижается, а особенно значительно - непосредственно накануне самоаборта (С.В.Назимова с соавт., 1990).
Установлено, что в процессе роста беременности концентрация РАРР-А удваивается каждые 1-3 недели, а при угрозе прерывания наблюдается достоверное снижение уровня РАРР-А в крови (Westergaard JG et al., 1990). В то же время некоторые авторы указывают на то, что биологическая природа и функции этого белка не известны (А.П.Милованов с соавт., 1999). Ряд авторов указывают на тот факт, что частота ошибочных результатов составляет 7-25%.
Известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности (УПБ) в ранние сроки путем определения в периферической крови концентрации фактора угнетающего миграцию лейкоцитов до и после однократной иммунизации донорскими лейкоцитами (патент РФ 2014598, 1994).
Недостатками являются техническая сложность выполнения, а также невозможность динамического наблюдения за состоянием беременности с помощью этого метода.
Известен способ прогнозирования исхода беременности, включающий стимуляцию беременной подкожным введением суспензии донорских лимфоцитов (патент РФ 2033608, 1995). Недостатками метода являются длительность выполнения и инвазивность.
Определение активности мембраносвязанных ферментов плаценты, в особенности общей щелочной фосфатазы (ОЩФ) и ее термостабильного компонента (ТЩФ), также используется в качестве диагностического критерия угрозы прерывания беременности I триместра (В.Г.Анастасьева, 1997). Вычисляют плацентарный индекс - отношение ТЩФ к ОЩФ, выраженное в процентах. У пациенток с угрозой самопроизвольного выкидыша в I и II триместрах беременности чаще всего наблюдается повышение удельного веса ТЩФ по отношению к ОЩФ, в результате чего плацентарный индекс увеличивается (от 50 до 75% и выше). Недостатками являются сложность выполнения и дороговизна метода.
Известен способ ранней диагностики прерывания беременности путем определения в периферической крови относительного содержания нейтрофилов, имеющих на своей поверхности структуры, реагирующие строфобластическим Х-гликопротеидом (патент РФ 2077729, 1997). К недостаткам метода относятся его трудоемкость и неспецифичность.
Известен способ диагностики угрозы прерывания беременности в I триместре по определению содержания периферических Т-лимфоцитов до и после инкубации с АНГО (патент РФ 2077727, 1997). Недостатки метода: неспецифичность, низкая точность.
Известен способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем ранних сроков путем определения в сперме мужа ПАМГ-2. Уменьшение ПАМГ-2 ниже 8 мкг/мл указывает на риск самопроизвольного выкидыша в сроки до 12 недель (патент РФ 2103686, 1998). Недостатком метода является сложность выполнения.
Известен способ доклинического прогнозирования невынашивания беременности путем определения в плазме крови содержания фибрин-мономерных комплексов. По их величине прогнозируют прерывание беременности в I, II или III триместрах (патент РФ 2123698, 1998). К недостаткам метода относится его неспецифичность.
Известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности по определению концентрации эстриола, плацентарного лактогена и интерлейкина (ИЛ)-6 в сыворотке крови (патент РФ №2285926, 2006). Недостатком данного способа является его трудоемкость.
Данный способ избран прототипом заявляемого изобретения.
Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.
Задача изобретения: разработка специфичного способа диагностики невынашивания на доклинической стадии в 1-2 триместрах беременности с целью назначения своевременных и адекватных лечебных мероприятий.
Поставленная задача решается тем, что в 1-2 триместре беременности определяют в сыворотке крови беременной уровень фактора роста плаценты (ФРП) и сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) и при условии, когда уровень ФРП 101,0 пг/мл и ниже, а уровень СЭФР превышает 10,0 пг/мл диагностируют УПБ на доклинической стадии.
Новый технический результат состоит в том, что данный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью. Предложенный метод исследования позволяет с высокой точностью осуществлять раннюю диагностику угрожающего прерывания беременности и осуществить выбор адекватной акушерской тактики ведения пациенток с выявленной патологией.
Чувствительность метода 97%.
Специфичность метода 86%.
Точность 89,5%.
Достоверность (p<0,05).
Факторы роста - биологически активные соединения, стимулирующие или ингибирующие деление и дифференцировку различных клеток и являющиеся основными источниками митогенного сигнала клетки (А.В.Орлов и соавт., 2003). Система факторов роста включает полипептидные ростовые факторы, специфические клеточные рецепторы, связывающие белки, регулирующие количество факторов роста, действующих на клетки мишени (S.W.Kauma., 2000).
Биологический ответ клетки на действие того или иного фактора роста зависит от типа клетки и различного рода влияний, которые оказываются на клетку. Эффект, получаемый при одновременном действии нескольких факторов роста, может быть отличным от действия нескольких факторов роста (И.А.Крукиер и соавт., 2001; И.В.Маркарьян и соавт., 2005).
Рецепторы факторов роста расположены на поверхности наружной мембраны клеток. Они представлены классом белков с тирозинкиназной активностью, и взаимодействие факторов роста со специфическим рецептором вызывает изменение его конфигурации и активацию, что служит пусковым сигналом для реализации митогенного эффекта (А.В.Орлов и соавт., 2005; S.Fang et al., 2005).
Факторы роста играют важную роль в эмбриогенезе, в частности в процессах дифференцировки эмбриональных тканей (С.Simon et al., 2000). Показано, что ингибирующее вещество, вызывающее регрессию мюллерова протока, имеет структурное и функциональное сходство с трансформирующим фактором роста.
Одним из важнейших регуляторов ангиогенеза у развивающегося эмбриона признан сосудисто-эндотелиальным фактором роста - СЭФР, и его важная роль проявляется как при физиологическом ангиогенезе, так и при патологическом (G.Meduri et al., 2000). Он экспрессируется клетками железистого эпителия стромы эндометрия в ответ на воздействие эстрадиола (Орлов В.И. и соавт., 2002).
Доказано, что ангиогенез при беременности в эндометрии регулируется СЭФР (ТА.Патсаев, 2005). Уменьшение продукции СЭФР приводит к нарушению сосудистого развития плаценты, следствием чего является локальная ишемия плаценты и развитие акушерских осложнений.
Также доказана антиапоптическая функция СЭФР для клеток образовавшихся сосудов (Б.П.Копнин, 2001). Снижение СЭФР обусловливает апоптоз эндотелия, который приводит к обструкции просвета и регрессии сосуда. Мощными стимуляторами экспрессии СЭФР являются гипоксия, интерлейкины, эпидермальный фактор роста (Орлов А.В. и соавт., 2003). Установлено, что только до 10 недель беременности отмечается рост данного фактора роста при физиологически протекающей беременности.
Нами выявлено значительное увеличение концентрации СЭФР в группе женщин с угрозой прерывания беременности. Повышение уровня СЭФР уже в I триместре беременности, учитывая вышеизложенное, было предложено в качестве скринингового маркера, предупреждающего о формировании акушерской патологии с возможным манифестом в более поздние сроки беременности.
В периферической крови фактор роста плаценты (ФРП) является маркером внутриутробных процессов плацентации, становления и развития плацентарного кровообращения. При изучении уровня ФРП на протяжении всего периода гестации выявлен резкий его подъем к концу I и началу II триместра с пиком его уровня в начале третьего триместра беременности (В.А.Бурлев и соавт., 2000).
Изучив содержание ФРП в I, II и III триместрах, у пациенток с физиологическим течением беременности и с угрозой невынашивания мы установили в наших исследованиях, что при угрозе прерывания беременности отмечается снижение ФРП в 3 раза.
Другими словами, в случаях, когда акушерская патология проявляет себя в конце беременности, еще в ранние сроки она может заявить о себе существенным снижением уровня ФРП в сыворотке крови беременной. Совершенно очевидно, что его снижение может служить маркером осложненного течения беременности.
В то же время отсутствие в доступной литературе систематизированных сведений о роли факторов роста в формировании акушерских осложнений в ранние сроки беременности, возможностях диагностики, профилактики и главное этиотропной терапии выявленных нарушений обосновали необходимость изучения некоторых звеньев патогенеза с целью выработки диагностических критериев развития акушерской патологии.
Следует отметить, что достоверное повышение концентрации в сыворотке крови СЭФР, при одновременном снижении уровня ФРП при угрозе прерывания беременности, может быть использовано как скрининговый маркер невынашивания беременности, задолго до клинической манифестации.
Способ осуществляют следующим образом.
У беременной женщины утром натощак из локтевой вены забирают кровь (желательно самотеком в пластиковую или силиконированную пробирку), затем стандартным методом получают сыворотку крови.
Забор материала для исследования проводят в одно и то же время суток, а ультразвуковое и допплерометрические исследования - на одном и том же аппарате. Наши исследования осуществлялись с разрешения локального комитета по медицинской этике.
Уровень фактора роста плаценты (ФРП) в сыворотке крови определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы R&D System (USA). Промывочный буфер, растворы стандартов, субстратный раствор готовят согласно инструкции к набору. Во все лунки планшета, покрытые мышиными моноклональными антителами к ФРП человека, вносят 100 мкл рабочего буфера. В лунку-бланк вносят 100 мкл раствора для разведения стандартов, в лунки для построения стандартной кривой вносят по 100 мкл приготовленных стандартных проб, в остальные лунки - по 100 мкл исследуемых проб. Накрывают планшет пленкой и инкубируют 2 часа при комнатной температуре.
По окончании инкубации промывают лунки планшета промывочным буфером 4 раза на промывочном устройстве для микропланшетов ELISA WASHER HUMAN (USA). Затем во все лунки вносят по 200 мкл раствора конъюгата поликлональных антител к ФРП человека с пероксидазой хрена. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 2 часов.
Промывают планшет 4 раза промывочным буфером, как описано выше.
Во все лунки вносят по 200 мкл свежеприготовленного раствора субстрата и инкубируют в течение 30 минут, защищая от прямых солнечных лучей. Останавливают цветную реакцию добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Финляндия). В компьютерное обеспечение прибора вводят численные значения ФРП в стандартных растворах и получают после измерения концентрацию ФРП в опытных приборах в пг/мл.
При первичном обследовании уровень ФРП в контрольной группе беременных в 2,5 раза превышал данные в группе с осложненным течением беременности. Динамическое наблюдение за изменением качественного и количественного содержания ФРП в обеих группах выявило увеличение ФРП в контрольной группе в 1,5 раза, в основной группе в 1,2 раза.
Уровень сосудисто-эндотелиального фактора (СЭФР) в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы BIOSOURCE (Belgium).
Серийные разведения стандартов кроличьих антител к СЭФРу человека, конъюгате козьих антикроличьих антител с щелочной фосфатазой приготавливают согласно инструкции к набору.
В лунки планшета добавляют по 100 мкл стандартных растворов, в остальные лунки по 50 мкл рабочего буфера и по 50 мкл исследуемых сывороток. Таким образом, получают двукратное разведение проб. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл разведенных кроличьих антител к СЭФРу человека. Накрывают планшет клейкой лентой и инкубируют в течение 3-х часов при комнатной температуре. По истечении времени инкубации содержимое лунок промывают буфером 5-кратно на вошере.
Во все лунки добавляют по 50 мкл разведенного конъюгата козьих антител к СЭФРу кролика с щелочной фосфатазой, накрывают планшет клейкой лентой и инкубируют 45 минут при комнатной температуре.
Повторяют 5-кратную промывку планшета, как указано выше. Во все лунки вносят по 200 мкл свежеприготовленного по инструкции субстратного раствора и инкубируют в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. Останавливают реакцию 50 мкл 0,5 м серной кислоты.
Измерение оптической плотности раствора в лунках и расчет полученных концентраций СЭФРа в исследуемых сыворотках проводят на фотометре при длине волны 492 нм.
В компьютерное обеспечение прибора вводят значение концентрации СЭФР в стандартных растворах и после измерения получают уровень СЭФР в исследуемых сыворотках. Результаты умножают на фактор разведения (2) и выражают в пг/мл.
Так, при определении уровня СЭФР наиболее высокое содержание в сыворотке крови отмечалось у пациенток с осложненным течением беременности. Концентрация в крови беременных основной группы превышала аналогичный показатель в группе с физиологическим течением в 12,1 раз. В первой половине беременности в связи с незавершенным формированием сосудистой сети трофобласта любой дисбаланс в содержании факторов роста является серьезной угрозой. Полученные данные полностью отражают хаотичность процессов неоангиогенеза у беременных с осложненным течением беременности. Нарушение процессов формирования сосудистой системы плаценты ведет к раннему выкидышу или лежит в основе дальнейшей патологии беременности с манифестацией в более ее поздние сроки.
Клинический пример 1.
Беременная Б-ва Л.И., 23 года. История болезни N 2656/364. Обследование 02.05.2007 г. 16-17 недель беременности. ОАА. Угрожающий поздний с/аборт. Низкая плацентация.
По УЗИ праволатеральное расположение плаценты. При допплерометрическом исследовании выявлены нарушения маточно-плацентарной гемодинамики IA степени: arteria uterina dextra Vs/Vd=2,7>N; arteria uterina sinistra Vs/Vd=3/0>N, arteria umbilicаlis Vs/Vd-2,1-N. При определении концентрации в сыворотке крови факторов роста уровень содержания ФРП составил 100,0 пг/мл, а уровень СЭФР составил 10,8 пг/мл. Выявленное соотношение содержания факторов роста в сопоставлении с данными СЭФР полностью вписывается в рамки предложенного метода диагностики. Угроза прерывания беременности у данной беременной подтверждена при ультразвуковом и допплерометрическом исследовании.
Клинический пример 2
Беременная 3-ва С. В., 28 лет. История болезни N314??. Обследование 04.05.2007 г. 8 недель беременности. ОАА. Угрожающий с/аборт.
По УЗИ амбилатеральное расположение плаценты. При допплерометрическом исследовании нарушений маточно-плацентарной гемодинамики не выявлено: arteria uterina dextra Vs/Vd=2,2-N; arteria uterina sinistra Vs/Vd=2,4-N. При определении концентрации в сыворотке крови факторов роста уровень содержания ФРП составил 102,0 пг/мл, а уровень СЭФР составил 9,5 пг/мл. Выявлен высокий уровень ФРП, при относительно невысоком уровне СЭФР в сыворотке крови и у пациентки отсутствуют признаки угрозы прерывания беременности. Результаты ультразвукового и допплерометрического исследования также подтверждают отсутствие признаков угрозы прерывания беременности.
В ходе проводимого обследования пациенток нами были использованы общепринятые методы: сбор анамнеза, жалобы, лабораторные исследования. При обследовании беременных применялись традиционные методы: общий осмотр, бимануальное исследование, наружное акушерское обследование, измерение высоты состояния дна матки и величины окружности живота по общепринятому протоколу, контроль веса. Для установления срока и оценки состояния беременности пациенткам всех клинических групп проводили ультразвуковое исследование, допплерометрический контроль и факторов роста: фактора роста плаценты (ФРП) и сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР).
Материалом для решения задач, поставленных в рамках проводимой научной работы, послужили результаты обследования беременных со сроком гестации 6-22 недели. Общий объем выборки составил 145 беременных.
В ходе проводимого исследования все беременные были разделены на две клинические группы: I основную группу составили 125 пациенток с патологическим течением беременности в I-II триместрах, проходивших стационарное лечение в условиях отделения патологии беременности с диагнозом: «угроза прерывания беременности» (УПБ). II - контрольную группу составили 20 пациенток с нормальным течением беременности, наблюдавшиеся в системе «Акушерский мониторинг» ФГУ РНИИАП. Угроза прерывания беременности устанавливалась тогда, когда больная предъявляла жалобы на кровянистые выделения из половых путей, боли внизу живота, а при допплерометрическом исследовании выявлялись нарушения маточно-плацентарной гемодинамики или нарушения в артерии пуповины.
Обращают на себя внимание следующие наиболее значимые изменения в содержании СЭФР в сыворотке крови. В группе I (с осложненным течением беременности) уровень СЭФР был выше в 12,1 по сравнению с группой II с физиологическим течением беременности. Анализируя полученные результаты, необходимо отметить, что нарастание уровня сосудисто-эндотелиального фактора роста при осложненном течении беременности (I группа) свидетельствует о вовлечении плацентарных факторов роста в патологический процесс. Неадекватная продукция СЭФР в основной группе (среднее 58,10 пг/мл) свидетельствует о стимулирующей роли СЭФР в процессах ангиогенеза в зоне ишемизации плаценты. Кроме того, высокий уровень СЭФР у беременных в группе с осложненным течением беременности характеризует интенсивную пролиферацию и инвазию трофобласта во время плацентации.
При анализе собственных результатов данных ФРП мы увидели полное отражение теоретической предпосылки. Так, уровень фактора роста плаценты у женщин с физиологическим течением беременности составил в среднем 156,0 пг/мл, что до 2,5 раз было выше этого показателя в I группе. В группе с осложненным течением беременности этот показатель составил 61,92-100,0 пг/мл.
Таким образом, преимущество заявляемого метода состоит в том, что у беременных в 1-2 триместре на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров производится доклиническая диагностика невынашивания беременности с целью раннего назначения адекватной терапии.
В клинической практике это позволит снизить угрозу перинатальных потерь за счет своевременного выявления беременных группы риска по развитию данной патологии и провести раннее профилактическое лечение, которое существенно снизит частоту невынашивания беременности и благоприятно отразится на показателях перинатальной заболеваемости и смертности в условиях обострившейся демографической ситуации.
Возможность одновременной подготовки к исследованию большого количества проб крови и небольшие затраты времени исследования позволяют использовать способ в скрининговых исследованиях.
Данный способ нетравматичен, обладает быстротой исполнения с использованием стандартных тест-систем, что позволяет широко использовать его в практическом здравоохранении.