Оценка мутагенной активности новых вспомогательных фармацевтических веществ на млекопитающих

УДК 575.224.46

ОЦЕНКА МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Стрижельчик Н.Г.

Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина

РЕЗЮМЕ

Исследовали потенциальную мутагенную активность новых вспомогательных фармацевтических веществ (эмульгаторов, загустителей таблеток) — натрий-карбоксиметилкрахмала и натрий-карбоксиметилцеллюлозы на млекопитающих в опытах in vivo. Установлено, что при внутрижелудочном введении изучаемые вещества не индуцируют хромосомные аберрации в клетках костного мозга и доминантные летальные мутации в половых клетках самцов мышей. Полученные результаты обсуждаются в отношении возможности применения изучаемых веществ в фармацевтической промышленности.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: мутагенность, вспомогательные фармацевтические вещества, хромосомные аберрации, доминантные летальные мутации

ВВЕДЕНИЕ

За последние десятилетия исследования в области химического мутагенеза получили большое развитие. Это связано, с одной стороны, с внедрением огромного количества различных химических веществ во все сферы жизнедеятельности человека, требующих генетического контроля, с другой стороны, научными достижениями, связанными с созданием и использованием новых тест-систем, позволяющих провести более полную оценку как самих мутагенов, так и их метаболитов [1, 2].

Особое место в жизнедеятельности человека занимают такие широко распространенные вещества, как лекарственные препараты, число которых постоянно увеличивается. Мутагенность многих из них установлена на разных генетических объектах [3, 4]. В широком ассортименте лекарственных средств значительное место занимают вспомогательные фармацевтические вещества. Тенденция к увеличению их количества связана с тем, что вспомогательные фармацевтические вещества влияют не только на физико-химические свойства, а и на терапевтический эффект лекарств. В то же время мутагенность (канцерогенность) лекарственных препаратов может зависеть от разновидности и качества используемых вспомогательных веществ. В связи с этим одним из основных требований, предъявляемых к таким соединениям, является безопасность для человека в применяемых дозах.

Целью данной работы являлось изучение потенциальной мутагенной активности новых вспомогательных фармацевтических

веществ — натрий-карбоксиметил-крахмала и натрий-карбоксиметилцеллюлозы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились на мышах. Вспомогательные фармацевтические вещества натрий-карбоксиметилкрахмал и натрий-карбоксиметилцеллюлоза вводились внутри-желудочно однократно в дозе 60 мг/кг. Для оценки цитогенетического эффекта веществ использовали метод учета аберраций хромосом в клетках костного мозга. В этой серии опытов исследуемые вещества вводились самцам мышей линии С57ВУ6. Экспозиция препаратов составляла 6, 24 и 48 часов. За два часа до забоя животных вну-трибрюшинно вводили колхицин (0,025% р-р по 0,01 мл на 1 г массы). Фиксацию и приготовление препаратов хромосом осуществляли по стандартной методике [5, 6].

Для оценки эффекта в половых клетках использовали метод учета доминантных летальных мутаций. Препараты вводились самцам мышей-гибридов первого поколения ^ CBA x C57BI/6. Сразу после прекращения введения препаратов самцы подсаживались к интактным виргинным самкам в соотношении 1:3. Смену самок проводили еженедельно в течение 3-х недель. Отсаженных самок анализировали на 15-17 день беременности. Учитывали следующие показатели: число беременных самок, процент фертильности, число мертвых и живых эмбрионов (ЖЭ, МЭ), доимплантационную и постим-плантационную гибель эмбрионов. Основным показателем частоты доминантных летальных мутаций (ДЛМ) служил уровень постимплантационных потерь.

Для оценки статистической значимости сравниваемых значений в опытных и контрольных вариантах использовали критерий хи-квадрат [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты влияния натрий-карбоксиме-тилкрахмала и натрий-карбоксиметилцеллю-

лозы на клетки костного мозга мышей представлены в таблицах 1 и 2. Изучение 600 метафаз контрольной группы позволило выявить в сумме 1,3 ± 0,34% аномальных клеток. Типы аберраций были представлены одиночными фрагментами (0,8%). Ахроматические пробелы в число аберраций не входили, а учитывались отдельно (0,5%).

Таблица 1

Частота и типы аберраций хромосом, индуцированных в клетках костного мозга

мышей новым студнеобразующим веществом натрий-карбоксиметилкрахмалом

Ва- До- Экс- Про- Коли-

ри- за по- ана- чес-тво

ан- пре- зи- ли- метафаз

ты па- ция зиро- с абер- Типы абер

опы рата пре- вано ра-

тов в пара- ме- циями,

мг/к та в тафаз % ± т

г час.

Оди- Об

ноч- ме-

ные ны

фраг-

менты

Опы 60 6 600 0.5 ± 0.5 0

т 60 24 600 0.22 0.8 0

60 48 600 0.8 ± 0.15 0.6 ± 0.20 0.6 0

Кон- трол ь — — 600 0.8 ± 0.18 0.8 0

Значение

Хи- квад рат Р

0.52 0.0 0.11 > 0.05 > 0.05 > 0.05

— —

Пар-

ные

фраг-

мен-

ты

Про

бе-

лы,

%

0

0

0

0.8

0.6

0.8

0.5

Таблица 2

Частота и типы аберраций хромосом, индуцированных в клетках костного мозга

мышей новым студнеобразующим веществом натрий-карбоксиметилцеллюлозой

Ва- До- Экс- Про- Коли-

ри- за по- ана- чес-тво

ан- пре- зи- ли- метафаз

ты па- ция зиро- с абер- Типы абер

опы рата пре- вано ра-

тов в пара- ме- циями,

мг/к та в тафаз % ± т

г час.

Оди- Об

ноч- ме-

ные ны

фраг-

менты

Опы 60 6 600 0.6 ± 0.6 0

т 60 24 600 0.20 1.0 0

60 48 600 1.0 ± 0.25 0.8 ± 0.15 0.8 0

Кон- трол ь — — 600 0.8 ± 0.18 0.8 0

Значение

Хи- квад рат Р

0.11 0.09 0.00 > 0.05 > 0.05 > 0.05

— —

Пар-

ные

фраг-

мен-

ты

Про

-бе-

лы,

%

0

0

0

1.0

0.8

0.6

0.5

Цитогенетический анализ влияния на-трий-карбоксиметилкрахмала на клетки костного мозга мышей показал, что процент

аномальных клеток при изучении 1800 метафаз составил: экспозиция 6 часов — 1,3 ± 0,36%, экспозиция 24 и 48 часов — 1,4 ±

0

0

0,22%. Типы аберраций были представлены одиночными фрагментами. Наблюдались ахроматические пробелы. Парные фрагменты и аберрации обменного типа не выявлены. Статистический анализ результатов не показал достоверных различий между частотой возникновения аберрантных метафаз в контрольных и опытных вариантах при всех сроках экспозиции натрий-карбоксиметил-крахмала (Р> 0,05).

Аналогичные данные получены при оценке воздействия натрий-карбоксиметилцел-люлозы. Цитогенетический анализ 1800 метафаз позволил установить, что при экспозиции 6 часов процент аномальных клеток был равен 1,6 ± 0,20 %, 24 часа — 1,8 ± 0,42

% и 48 часов — 1,4 ± 0,22 %. Типы аберраций, как и в контрольных вариантах, были представлены одиночными фрагментами, отмечены ахроматические пробелы (см. табл. 2). Сравнение полученных результатов с контрольными значениями не выявило статистически значимых различий между частотой возникновения аберрантных метафаз при всех экспозициях препарата (Р > 0,05).

В таблицах 3 и 4 отражены результаты экспериментальных исследований влияния натрий-карбоксиметилкрахмала и натрий-карбокси-метилцеллюлозы на половые клетки самцов мышей. В этой серии исследований было проанализировано более 400 самок мышей и 2600 эмбрионов.

Таблица 3

Показатели доминантных летальных мутаций у самцов мышей при воздействии

натрий-карбоксиметилкрахмала

Стадии сперматогенеза Варианты опытов Фер- тиль- ность, % На 1 беременную самку Постимплан-тац. смертн.

ЖЭ МЭ

Зрелые спермии Контроль Опыт 82.2 84.4 8.72 8.42 0.45 0.47 0.0500 0.0532

Поздние сперматиды Контроль Опыт 80.0 82.2 7.52 6.67 0.38 0.35 0.0491 0.0500

Ранние сперматиды Контроль Опыт 84.4 86.6 7.81 7.07 0.42 0.35 0.0511 0.0482

Таблица 4

Показатели доминантных летальных мутаций у самцов мышей при воздействии

натрий-ка рбоксиметилцеллюлозы

Стадии сперматогенеза Варианты опытов Фер- тиль- ность, % На 1 беременную самку Постимплан-тац. смертн.

ЖЭ МЭ

Зрелые спермии Контроль Опыт 82.2 77.7 8.72 7.88 0.45 0.42 0.500 0.052

Поздние сперматиды Контроль Опыт 80.0 75.5 7.52 6.85 0.38 0.32 0.0491 0.0450

Ранние сперматиды Контроль Опыт 8.44 80.0 7.81 7.16 0.42 0.33 0.0511 0.0444

В контрольных вариантах частота доминантных летальных мутаций составляла: на 1-й неделе скрещивания - 5,0 ± 0,62%, на 2-й

- 4,9 ± 0,98%, на 3-й - 5,1 ± 0,49%.

При воздействии натрий-карбоксиметил-крахмала процент беременных самок на разных сроках скрещивания достоверно не отличался от контроля. Не отмечено снижения числа живых эмбрионов и увеличения числа мертвых эмбрионов на одну беременную самку. Частота доминантных летальных мутаций на 1-й неделе скрещивания составила

— 5,3 ± 0,61%, на 2-й неделе — 5,0 ± 0,62%, на 3-й неделе — 4,8 ± 0,45% (см. табл. 3).

Статистический анализ результатов не показал достоверных различий между частотой возникновения доминантных летальных мутаций в контрольных и опытных вариантах (Р > 0,05).

Аналогичные результаты были получены при воздействии натрий-карбоксиметил-целлюлозы. Не отмечено снижения процента фертильности и уменьшения числа живых эмбрионов, а также увеличения числа мертвых эмбрионов на одну беременную самку по отношению к контролю. Частота доминантных летальных мутаций равнялась: на

1-й неделе скрещивания — 5,2 ± 0,64%, на

2-й неделе — 4,5 ± 0,44%, на 3-й неделе —

4,4 ± 0,23% (см. табл. 4). Достоверные различия между контрольными и опытными вариантами не установлены (Р > 0,05).

Представленные в работе результаты и проведенные ранее исследования [8-10] свидетельствуют о том, что новые вспомогательные вещества натрий-карбоксиметил-крахмал и натрий-карбоксиметилцеллюлоза не являются мутагенами — не вызывают индукции генных мутаций и хромосомных аберраций у разных генетических объектов.

Так, в тесте Эймса-Salmonella/ микросомы изучаемые вещества не были мутагенны для Salmonella typhimurium штаммов ТА 98 и ТА 100 — в дозах 0,1-1000,0 мкг/мл не вызывали достоверного повышения генных мутаций как в условиях без метаболической активации, так и с метаболической активацией фракцией S-9 печени крыс [8].

В исследованиях на Drosophila melano-gaster натрий-карбоксиметилкрахмал и на-трий-карбо-ксиметилцеллюлоза не вызывали повышения частоты доминантных летальных мутаций в зрелых сперматозоидах при затравке взрослых самцов [9, 10].

В представленных в настоящей работе исследованиях изучаемые вещества не были

ЛИТЕРАТУРА

1. Рапопорт И. А. // Проблемы химического мутагенеза. - М.: Медицина, 1970. - с. 249-2бб.

2. Худолей В.В. В кн. Выявление мутагенности химических канцерогенов и первичная профилактика рака, теоретические и практические аспекты // Первичная профилактика рака (под ред. Н.Н. Блохина), - М.: Медицина, 198б. - с. 41-47.

3. Журков В.С. // Генетика, 1975. - № 11. - с. 14б-149.

4. Рапопорт И. А., Филиппова Л.М., Журков В.С. // Генетика, 1971. - Т. VII, № 7. - с.

8-12.

5. Бочков Н.П., Шрам Р.Н., Кулешов Н.П., и др. // Генетика, 1975. - Т. XI, № 10. - с. 15б-172.

6. Методические рекомендации по оценке мутагенных свойств фармакологических средств // М.: Медицина. 1994. - 40 с.

7. Гублер Е.В., Генкин А. А..// М.: Медицина, 1971. - с. 21-25, 53-5б.

8. Стрижельчик Н.Г., Кульшин В.Е.// Цитология и генетика, 1994. - № 2. - с. 91-93.

9. Стрижельчик Н. Г. // Вестник проблем современной медицины, УАННП, Харьков, 1995. - №12. - с. 99-101.

10.Новик И.И., Стрижельчик Н.Г. // Вестник проблем современной медицины, УАННП, Харьков, 1995. - № 12. - с. 105-107.

мутагенны для соматических и половых клеток млекопитающих — не индуцировали аберраций хромосом в клетках костного мозга и доминантных летальных мутаций в половых клетках самцов мышей на постмейо-тических стадиях сперматогенеза. Следовательно, новые вспомогательные фармацевтические вещества не проявляли активности на трех генетических объектах в системах in vitro и in vivo (микроорганизмы, насекомые, млекопитающие).

Следует отметить, что в исследованиях на млекопитающих, согласно рекомендациям ВОЗ и принципам, применяемым для оценки фармацевтических средств, изучаемые соединения тестировались в дозе, суточной рекомендованной для человека и увеличенной в 100 раз [5].

Таким образом, учитывая все вышесказанное, в соответствии с общими принципами экстраполяции данных, принятыми в области генетической токсикологии [б], следует заключить, что изучаемые вещества — натрий-карбоксиметилкрахмал и натрий-карбоксиметилцеллюлоза в качестве вспомогательных фармацевтических веществ не представляют мутагенной опасности.

ОЦІНКА МУТАГЕННОЇ АКТИВНОСТІ НОВИХ ДОПОМІЖНИХ ФАРМАЦЕВТИЧНИХ РЕЧОВИН НА ТВАРИНАХ

Стрижельчик Н.Г.

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

РЕЗЮМЕ

Вивчали потенційну мутагенну активність нових допоміжних фармацевтичних речовин (емульгаторів, загустювачів таблеток) — натрій-карбоксіметілкрохмалю та на-трій-карбоксіметіл-целлюлози на тваринах у дослідах in vivo. При внутрішньошлун-ковому введенні досліджувані речовини не викликають хромосомні аберрації у клі-

тинах кісткового мозку та домінантні мутації в статевих клітинах самців мишей. Одержані результати обговорюються у відношенні можливості застосування досліджу-ванних речовин у фармацевтичній промисловості.

КЛЮЧЕВІ СЛОВА: мутагенність, допоміжні фармацевтичні речовини, хромосомні аберрації, домінантні летальні мутації

THE MUTAGENIC TESTS OF NEW AUXILARY FARMACEUTICAL SUBSTANCIES FOR MAMMALIANS

Strygelchyk N.G.

Kharkov National V.N. Karazin University

SUMMARY

The potential mutagenic effects of new auxilary farmaceutical substancies (emulgators) was investigated. Under per os injection the substancies not induced the chromosomal aberrations in the narrow cells and dominant lethal mutations in male gametes of mouse. The results are discussed in connection to using at investigated substancies in pharmacology.

KEY WORDS: mutagenic, auxilary farmaceutical substances, chromosomal aberrations, dominant lethal mutations