Характеристика протективного антигенного комплекса из Francisella tularensis subsp. Novicida

БИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ

Пробл. особо опасных инф. 2017; 2:63-66. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-63-66

УДК 616.98:579.841.95

Е.м.кузнецова, о.А.Волох, н.Г.Авдеева, Ю.и.самохвалова

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА ИЗ FRANCISELLA TULARENSIS SUBSP. NOVICIDA

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация

F. tularensis subsp. novicida, ранее рассматриваемый как представитель отдельного вида, был причислен к разновидностям F. tularensis относительно недавно на основании сравнительного анализа 16S-рибосомальной РНК франциселл. Подвид subsp. novicida может вызывать заболевания у людей только со сниженным иммунным статусом и обладает сниженной вирулентностью для кроликов. Несмотря на это, установлена высокая степень гомологии нуклеотидной последовательности внутривидовых таксонов F. tularensis. цель исследования: выделение протективного поверхностного антигенного комплекса из клеток F. tularensis subsp. novicida Utah 112 (ATTC 15 482) и изучение его свойств. материалы и методы. Концентрацию белков, углеводов, липидов в антигенном препарате определяли общепринятыми колориметрическими методами, SDS-PAGE проводили по методу U.Laemmli, а иммуноблоттинг - по методу H.Towbin. Для очистки препарата и определения его молекулярной массы применяли колоночную хроматографию, для определения иммунохимической активности - иммунофер-ментный анализ. Иммуногенность полученного препарата изучали на беспородных белых мышах, рассчитывая LD50 и ED50 по методу Кербера. результаты и выводы. В результате нашей работы был проведен сравнительный анализ физико-химических, антигенных и биохимических особенностей протективного антигенного комплекса из клеток F. tularensis Utah 112 по сравнению с аналогичным антигенным комплексом из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Препарат испытан на протективность при заражении иммунизированных белых мышей вирулентным штаммом F. tularensis 503/840. Показаны отличия полученного препарата по структуре и составу от аналогичного антигена из вакцинного штамма-продуцента, а также снижение его иммунохимической и про-тективной активностей.

Ключевые слова: Francisella tularensis, подвиды возбудителя туляремии, антигены, иммуногенность, протективность.

Корреспондирующий автор: Кузнецова Екатерина Михайловна, e-mail: rusrapi@microbe.ru.

E.M.Kuznetsova, O.A.Volokh, N.G.Avdeeva, Yu.I.Samokhvalova

Characteristics of the Protective Antigen Complex Obtained from Francisella tularensis ssp. novicida

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation

F. tularensis ssp. novicida, considered earlier as a representative of a separate species, has been recently classed among F. tularensis variety, based on the results of comparative analysis of 16S-ribosomal RNA. Subspecies novicida can cause disease only in immunocompromised humans and is low virulent for rabbits. Despite this, high rate of homology of the nucleotide sequence of F. tularensis intraspecific taxon is established. Objective of the study is to obtain protective surface antigen complex from F. tularensis ssp. novicida Utah 112 (ATTC 15 482) cells and investigate its properties. Materials and methods. Protein, carbohydrate, and lipid content of the antigen preparation was measured using conventional colorimetric methods, SDS-PAGE was conducted according to U.Laemmli, and immunoblotting - to H.Towbin. For purification and molecular mass determination column chromatography was applied. Immune-chromatographic activity was analyzed by immune-enzyme assay. Immunogenicity of the produced preparation was tested on scrub white mice, with LD50 and ED50 calculated according to Karber's method. Results and conclusions. Carried out has been comparative analysis of physical-chemical, antigenic and bio-chemical peculiarities of the protective antigen complex obtained from F. tularensis Utah 112 cells and equivalent antigen complex obtained from the vaccine strain - F. tularensis 15 NIIEG. Protectivity of the preparation has been tested through inoculation of the immunized white mice with virulent F. tularensis 503/840 strain. Demonstrated have been distinctive features of the new preparation, by structure and composition, as compared to similar antigen from the vaccine producer strain, as well as the slowdown of its immunochemical and protective activities.

Key words: Francisella tularensis, subspecies of tularemia agent, antigens, immunogenicity, protectivity.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Ekaterina M. Kuznetsova, e-mail: rusrapi@microbe.ru.

Citation: Kuznetsova E.M., Volokh O.A., Avdeeva N.G., Samokhvalova Yu.I. Characteristics of the Protective Antigen Complex Obtained from Francisella tularensis ssp. novicida. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 2:63-66. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-2-63-66

Согласно современной классификации род Francisella представлен видами Francisella tularensis, Francisella philomiragia, Francisella hispaniensis, Francisella halioticida и Francisella noatunensis (или pascida) [5, 9, 11]. На основании различий в географическом распространении, вирулентности, биохи-

мических свойствах бактерии вида Е tularensis подразделяются на четыре подвида: subsp. ЫШгсШа, subsp. tularensis (син. пеагсЫса), subsp. mediaasiatica и subsp. novicida [4, 5, 11]. Е. tularensis subsp. novicida, ранее рассматриваемый как представитель отдельного вида, был причислен к подвидам Е. tularensis

относительно недавно на основании результатов сравнительного анализа 16S-рибосомальной РНК франциселл [11]. На сегодняшний день отнесение F. novicida к подвиду F. tularensis subsp. novicida все еще остается предметом споров и обсуждений [12].

Согласно литературным данным, в отличие от высоковирулентных подвидов F. tularensis subsp. hol-arctica и tularensis, subsp. novicida может вызывать заболевания у людей только со сниженным иммунным статусом и обладает сниженной вирулентностью для кроликов (LD50>106 м.к.) [7, 12]. Несмотря на это, установлена высокая степень гомологии нуклеотидной последовательности (~97 %) внутривидовых таксонов F. tularensis [12]. По структуре ЛПС F. tularensis subsp. novicida отличается от лпс представителей других подвидов по составу двух сахаров в О-антигене, присутствием в коре дополнительной а-глюкозы, а в ли-пиде А наличием галактозамина [10].

Низкая вирулентность и инфекционность туля-ремийного микроба подвида новицида, его высокая генетическая идентичность с высоковирулентными штаммами F. tularensis, способность вызывать заболевание у лабораторных животных указывают на возможность его использования в качестве штамма-продуцента при получении иммунологически активных поверхностых антигенов туляремийного микроба и их комплексов. В связи с этим, целью данной работы явилось выделение протективного поверхностного антигенного комплекса (пАк) из штамма F. tularensis subsp. novicida Utah112 и изучение его свойств в сравнении с препаратом пАк из вакцинного штамма F. tu-larensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ (ПАК-15).

Материалы и методы

В работе использовали типовой штамм F. tularensis subsp. novicida Utah112 (ATTC 15 482), полученный из государственной коллекциии патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Препарат пАк получали из биомассы 48-часовой агаровой культуры, инактивированной фенолом по методике, отработанной для вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ [2].

Анализ химического состава антигенных препаратов проводили колориметрическими методами: концентрацию белка определяли по Лоури при длине волны 750 нм [13] с применением набора реактивов «Bio-Rad DC Protein Assay» (США). Углеводы регистрировали по реакции с тимоловым реактивом при длине волны 509 нм. Количество липидов определяли бихроматным методом при длине волны 650 нм [8].

Колоночную хроматографию проводили на хроматографе низкого давления Biologic LP фирмы «Bio-RAD» (США). Колонку (120^1 см, носитель Sephacryl S-300) предварительно калибровали с использованием набора маркеров молекулярного веса от 29 до 669 кДа («Sigma», США). В качестве элюи-рующего буфера использовали 10 мМ Na-фосфатный буферный раствор, рН 7,0. На колонку наносили

0,5 мл образца в концентрации 10 мг/мл по сухому весу, скорость элюции составила 0,4 мл/мин.

Вертикальный электрофорез в полиакрила-мидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили по методу Laemmli в трис-глициновом буфере (рН 8,3) на приборе «Mini-Protean II» фирмы «Bio-Rad» (США), используя 12,5 % разделяющий и 4 % концентрирующий гели. Нагрузка на гелевую дорожку составляла 20-40 мкг антигена по сухому весу. Для обнаружения белков в SDS-PAGE использовали окраску Кумасси синим R-250 (ДиаэМ, Германия), для выявления полисахаридов гели окрашивали азотнокислым серебром с помощью набора реактивов фирмы «Bio-Rad Silver Stain» (США). Определение молекулярной массы фракций протеинов проводили по калибровочному графику зависимости логарифмов молекулярной массы от величины относительного пробега [6] с набором калибровочных белков фирмы «Fermentas» (США). Электрофоретический перенос белковых фракций из полисахаридного геля на нитроцеллю-лозную мембрану проводили по методу Towbin в трис-глициновом буфере (рН 8,3) на приборе «Mini Trans-Blot» фирмы «Bio-Rad» (США). При постановке иммуноблоттинга в качестве специфических антител использовали экспериментальные поли-клональные кроличьи антитела к пАк в разведении 1:100, а в качестве конъюгата - антикроличьи антитела, меченные пероксидазой (производства ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН).

для определения иммунохимической активности препарата протективного антигенного комплекса применяли иммуноферментный анализ (иФА) и дот-иммуноанализ (диА) с экспериментальными поли-клональными антителами к пАк туляремийного микроба в разведении 1/1000 и 1/100 соответственно.

Иммуногенность полученных препаратов оценивали на модели беспородных белых мышей (19±1 г). Среднюю заражающую дозу (LD50) вирулентного штамма F. tularensis subsp. holarctica 503/840 и среднюю иммунизирующую дозу (ED50) антигенных препаратов рассчитывали по методу кербера. работу с животными проводили по стандартным методикам [7]. Статистическую обработку данных проводили по критерию Стьюдента, доверительный интервал устанавливали при вероятности 95 %.

Результаты и обсуждение

Ранее нами показано, что ПАК-15 представляет собой антиген сложной химической природы, в состав которого входят белки, липиды и углеводы в соотношении 3:1:1 [3]. При получении препарата ПАК из штамма F. tularensis subsp. novicida Utah112 отмечено снижение изоточки его выделения с 4,3 до 3,8. Биохимический анализ препарата ПАК из F. tularensis subsp. novicida Utah112 (ПАК-Utah) показал, что по составу он отличается от ПАК-15. В частности, отмечено преобладание углеводной части

БИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ

состав и иммунохимические свойства препаратов пак, полученных из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 нииЭГ и subsp. novicida Utah 112 (м±шЦ

Препараты ПАК Химический состав, % Активность, нг/мл

Белки Углеводы Липиды ДИА ИФА

ПАК-15 63,1±3,9 10,9±1,6 23,0±2,4 20,0±6,9 0,6±0,4 ПАК-Utah 45,5±4,1 26,5±1,2 24,5±3,1 99,3±8,3 2,0±0,9

на (70±3) % и снижение иммунохимической активности в ИФА и ДИА в 5 раз (таблица). Учитывая полученные данные, можно отметить, что иммуно-химическая активность препаратов ПАК связана с содержанием в них белка. Коэффициент корреляции Пирсона равен единице [1].

Электрофоретический белковый профиль ПАК-Utah отличался от ПАК-15 наличием субъединиц с молекулярной массой более 110 кДа (не активных в иммуноблоттинге) и отсутствием иммунореактив-ных белков в диапазоне от 50 до 90 кДа. Окраска электрофореграммы азотнокислым серебром показала наличие в препаратах ПАК-Utah и ПАК-15 компонентов липополисахаридной природы, представленных липидом А и боковыми цепями (рис. 1).

Установлено, что ПАК-15 хроматографически гомогенен, представлен одним мажорным пиком с молекулярной массой около 280 кДа. Профиль препарата ПАК-Utah имел два пика с молекулярными массами около 280 и 160 кДа, что свидетельствует о двухкомпонентном составе препарата из F. tularensis subsp. novicida (рис. 2).

Все полученные после гель-хроматографии пики препаратов ПАК-15 и ПАК-Utah проанализированы в ДИА и иммуноблоттинге. Для препарата ПАК-15 установлено наличие всех иммунодоминантных белков в основном пике. Активность в ДИА коррелировала с концентрацией белка и составляла в среднем 1/1000 для мажорного пика и 1/10 для минорного.

Тогда как для ПАК-Ц^ состав пиков отличался: в первом были белки более 43 кДа, а во втором - менее 23 кДа. Несмотря на это активность в ДИА в обоих случаях равна 1/100.

Изучение протективных свойств препарата ПАК из подвида новицида проводили на модели белых мышей, которых иммунизировали однократно подкожно с последующим заражением вирулентным штаммом Е. tularensis subsp. ЫЬгсЫса 503/840 на 21-е сутки в дозе 100 м.к. (LD50 1 м.к.). Отмечено, что выживаемость животных при иммунизации препаратом ПАК-была в 2,5 раза ниже по сравнению с препаратом ПАК-15 и составила в среднем 37,5 %. Средняя иммунизирующая доза препарата ПАК-№Л составила 125,9 (66,7-269,4) мкг, тогда как для ПАК-15 ED50 = 3,1 (2,4-11,3) мкг [2]. Патологоанатомическая картина и высевы из органов павших животных на селективные питательные среды указывали на гибель от туляремийной инфекции.

В результате проделанной работы установлены отличия препаратов ПАК-№^ и ПАК-15 по составу белковых субъединиц, количеству углеводов, молекулярной массе, иммунохимической и протективной активности. Отмеченные отличия в протективных свойствах связаны с биохимическими и иммунохи-мическими особенностями ПАК из подвида novicida. Можно предположить, что активность препаратов ПАК связана с его белковыми субъединицами с молекулярными массами в диапазоне от 57 до 85 кДа. сниженная иммунохимическая и протективная активности ПАК-Ц^ делают непригодным использование данного препарата в качестве компонента разрабатываемых препаратов для профилактики и диагностики туляремии.

конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

250—

95—«

72—« 55—,

36— 1 28— <

- »

250—

95— 72— 55—

н

т

_ т*

J

Ml 2 М12 М 1 2

Рис. 1. SDS-PAG-электрофорез и иммуноблоттинг препаратов ПАК, полученных из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и subsp. novicida Utah 112:

А - белковый профиль (окраска Кумасси синим); Б - ЛПС-профиль (окраска азотнокислым серебром); В - иммуноблоттинг с Ig к ПАК-15 препаратов. М - маркеры молекулярной массы 11-250 кДа («Fermentas», США); 1 - ПАК-15; 2 - Пак-Utah

Рис. 2. Гель-хроматография препаратов ПАК, полученных из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и subsp. novicida Utah 112. По оси абсцисс - время элюции, мин; по левой оси ординат - оптическая плотность элюента при 280 нм (A.u.); по правой оси ординат - электропроводность элю-ента mS/cm

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика. М.: Высшая школа;

2. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Шепелев И.А., Авдеева Н.Г., Кравцов А.Л., Никифоров А.К. Иммунобиологические свойства антигенных комплексов туляремийного микроба. Пробл. особо опасных инф. 2011; 3(109):46-9.

3. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелев И.А., Никифоров А.К. Компонентный состав протективного антигенного комплекса туляремийного микроба. Мол. генет., микробиол. и виру-сол. 2012; 3:22-5.

4. Олсуфьев Н.Г., Мещерякова И.С. Дальнейшее изучение внутривидовой таксономии возбудителя туляремии. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981; 10:16-21.

5. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М.: ЗАО «Шико»; 2013. С. 154-90.

6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука; 1981. 288 с.

7. Павлов В.М., Дятлов И.А. Молекулярно-генетические исследования бактерий рода Francisella и их прикладное значение. М.; 2012. 267 с.

8. Amenta J. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-bayer chromatography. J. Lipid Res. 1964; 5:270-2.

9. Brevik Q.J., Ottem K.F., Kamaishi T., Watanabe K., Nylund A. Francisella halioticida sp. nov. a pathogen of farmed giant abalone (Haliotis gigantea) in Japan. J. Appl. Microbiol. 2011; 111(5):1044-56. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2011.05133.x.

10. Gunn J.S., Ernst R.K. The structure and function of Francisella lipopolysaccharide. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:20218. DOI: 10.1196/annals.1409.006.

11. Huber B., Escudero R., Busse H.J., Seibold E., Scholz H.C., Anda P., Kampfer P., Splettstoesser W.D. Description of Francisella hispaniensis sp. nov., isolated from human blood, reclassification of Francisella novicida (Larson et al. 1995) Olsufiev et al. 1959 as Francisella tularensis subsp. novicida comb. nov. and emended description of the genus Francisella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010; 60:1887-96. DOl: 10.1099/ijs.0.015941-0.

12. Kingry L.C., Petersen J.M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014; 4:35. DOI: 10.3389/fcimb.2014.00035.

13. Lowry O.H., Rоsebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1):265-75.

References

1. Gmurman V.E. [Theory of Probability and Mathematical Statistics]. M.; 2004. 479 p.

2. Kuznetsova E.M., Volokh O.A., Smol'kova E.A., Shchukovskaya T.N., Shepelev I.A., Avdeeva N.G., Kravtsov A.L., Nikiforov A.K. [Immunobiological properties of Francisella tularensis antigen complexes]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; 3(109):46-9.

3. Kuznetsova E.M., Volokh O.A., Shepelev I.A., Nikiforov A.K. [Blend composition of protective antigen complex of tularemia microbe]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2012; 3:22-5.

4. Olsuf'ev N.G., Meshcheryakova I.S. [Further study of intraspecific taxonomy of tularemia agent]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1981; 10:16-21.

5. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases]. M.: CJSC "Shiko"; 2013. P. 154-90.

6. Osterman L.A. [Methods for Protein and Nucleic Acid Investigation: Electrophoresis and Ultracentrifugation]. M.: "Nauka"; 1981. 288 p.

7. Pavlov V.M., Dyatlov I.A. [Molecular-Genetic Investigations of Francisella Bacteria and Their Applicational Significance]. M.; 2012. 267 p.

8. Amenta J. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-bayer chromatography. J. Lipid Res. 1964; 5:270-2.

9. Brevik Q.J., Ottem K.F., Kamaishi T., Watanabe K., Nylund A. Francisella halioticida sp. nov. a pathogen of farmed giant abalone (Haliotis gigantea) in Japan. J. Appl. Microbiol. 2011; 111(5):1044-56. DOI: 10.1111/ j.1365-2672.2011.05133.x.

10. Gunn J.S., Ernst R.K. The structure and function of Francisella lipopolysaccharide. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:202-18. DOI: 10.1196/ annals.1409.006.

11. Huber B., Escudero R., Busse H.J., Seibold E., Scholz H.C., Anda P., Kampfer P., Splettstoesser W.D. Description of Francisella hispaniensis sp. nov., isolated from human blood, reclassification of Francisella novicida (Larson et al. 1995) Olsufiev et al. 1959 as Francisella tularensis subsp. novi-cida comb. nov. and emended description of the genus Francisella. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010; 60:1887-96. DOI: 10.1099/ijs.0.015941-0.

12. Kingry L.C., Petersen J.M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014; 4:35. DOI: 10.3389/fcimb.2014.00035.

13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1):265-75.

Authors:

Kuznetsova E.M., Volokh O.A., Avdeeva N.G., Samokhvalova Yu.I. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru.

об авторах:

Кузнецова Е.М., Волох О.А., Авдеева Н.Г., Самохвалова Ю.И. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru.

Поступила 01.12.15.