Способ и устройство для получения гормонального концентрата из мочи
METHOD AND DEVICE FOR PRODUCING HORMONAL CONCENTRATE FROM URINE

Настоящее изобретение относится к способу и устройству для получения гормонального концентрата из биологического сырья в качестве исходного материала, пригодного для создания фармацевтических препаратов, которые в виде биологического активного компонента содержат натуральную смесь конъюгированных гормонов.
Прикладные технологии занимают важное место среди основных направлений биотехнологии и напрямую связаны с результатами внедрения передовых решений в различные отрасли народного хозяйства, в том числе медицину и ветеринарию, косметическую и пищевую промышленности и пр.
Одной из наиболее актуальных биотехнологических тематик является гормональная, включающая оптимизацию уже известных технологий и разработку принципиально новых решений получения, очистки и применения гормональных препаратов из сырья растительного или биологического происхождения.
В этой связи разработка новых подходов, основанных на внедрении новых технологий, приводящих к существенному улучшению качественных и количественных характеристик конечного продукта, который может быть в дальнейшем использован для получения индивидуальных гормонов, способствует прогрессу в этом направлении.
Предлагаемое изобретение связано с принципиально новым подходом к выделению гормональных веществ путем преимущественного применения физических способов концентрирования и очистки гормональных смесей для последующего использования при выделении индивидуальных препаратов.
Целью предлагаемого изобретения является существенное повышение качества предварительной очистки биологического исходного продукта - мочи, а также существенное повышение качества и эффективности технологического процесса получения из нее гормонального концентрата для последующего применения.
Цель предлагаемого изобретения достигается за счет применения разработанного способа и устройства для получения гормонального концентрата путем использования физических принципов для выделения гормонального концентрата из мочи.
Из существующего в настоящее время уровня техники известно содержание в моче чрезвычайно широкого спектра биологически активных веществ. Некоторые из них успешно используются в медицине и косметологии, прежде всего, как гормональные препараты.
Большинство известных способов получения гормонов основано на применении мочи животных или человека, в качестве наиболее биологически совместимого исходного продукта.
Практически все способы выделения гормонов требуют предварительной очистки сырья и их концентрации.
Подавляющее большинство известных способов выделения гормонов, используют технические средства, причем в большинстве своем разнообразные хроматографические с применением гелей или адсорбентов, а также ультрафильтрацию, центрифугирование и пр.
В зависимости от поставленных целей при выделении гормональных веществ, приоритет применения того или иного технического средства остается выбором исполнителя, однако общая тенденция к использованию их в технологическом процессе имеет общие критерии, прежде всего такие как: безопасность и чистота конечного продукта, максимально возможная производительность и минимализация этапов технологического процесса, доступность технических средств и комплектующих, а также экономическая эффективность и себестоимость конечного продукта.
Большая часть известных способов разработана с учетом выделения преимущественно стероидных гормонов, как наиболее востребованных в современной медицине и косметологии, а также в силу достаточно больших возможностей получения исходного продукта, в том числе мочи.
Классификация стероидных гормонов выделяет две основные группы, которые отличаются по источнику их происхождения: гормоны коркового слоя надпочечников - кортикостероиды и гормоны половых желез - гонадостероиды. В свою очередь, кортикостероиды также разделяются на две подгруппы. Одна из них представлена глюкокортикоидами, такими как: кортизон, кортизол, деоксикортизол.
Вторую подгруппу составляют минералокортикоиды, такие как: дезоксикортикостерон, кортикостерон, альдостерон.
Гонадостероиды представлены тремя подгруппами, среди которых выделены гестогены, такие как: прегненолон, прогестерон, аллопрегненолон. Вторую подгруппу составляют андрогены: андростендиол, тестестерон, дегидротестестерон. Третью подгруппу представляют эстрогены: эстрон, эстрадиол, эстриол. Кроме этого, к стероидам относят соединения растительного происхождения, обладающие ценными фармакологическими свойствами: стероидные алкалоиды, гликозиды дигиталиса (сердечные гликозиды) и стероидные сапонины (24).
Источником сырья для выделения стероидов являются многочисленные и разнообразные продукты биологического и растительного происхождения. Наиболее часто стероиды выделяют из спинного мозга и желчи крупного рогатого скота, животных жиров, из щелочного гидролизата дрожжей, растительных масел и отходов целлюлозно-бумажной промышленности (8).
Несмотря на то, что в настоящее время разработан полный синтез основных стероидных гормонов, востребованный спрос природных гормонов остается чрезвычайно высоким. С этим связаны и определяются интенсивные поиски способов оптимизации получения природных гормонов из растительного и биологического сырья. С этих позиций, моча представляет идеальный, наиболее доступный и постоянно возобновляемый источник практически всех гормонов животного происхождения.
В моче содержится природная смесь гормонов, в частности стероидных гормонов, которая представлена преимущественно в конъюгированной форме, например, в виде натриевой соли полуэфира серной кислоты. Содержание конъюгированных гормонов (рассчитываемое для сульфата эстрогенов) может составлять от 0,3 до 1 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. Известны способы выделения стероидных гормонов из растительного сырья. Один из них известен как способ получения экдистероидов (Патент РФ №2063763) (8), который заключается в экстракции сырья 70%-ным этанолом, удалении из первичного экстракта сопутствующих веществ рядом последовательных жидкофазных экстракций, очистке полученного продукта колоночной адсорбционной хроматографией на оксиде алюминия и последующей его кристаллизации. Недостатками указанного способа являются использование значительных объемов этанола на первой стадии экстракции, больших объемов органических растворителей в последующих многократных жидкостно-жидкостных экстракциях, многостадийность и длительность процесса.
Известен способ получения α-экдизона описанный в патенте RU 2246966 (18) путем экстрагирования растительного сырья вида Serratulacoronata, заключающийся в том, что выжимают и отфильтровывают сок из свежесобранных в фазу бутонизации листьев растения Serratulacoronata, концентрируют и экстрагируют его этилацетатом, экстракт упаривают, охлаждают, фильтруют смесь кристаллов 20-гидроксиэкдизона и α-экдизона, с последующим растворением в ацетоне и добавлением фосфорно-молибденовой кислоты, полученную смесь 2,3:20,22-диацетонида 20-гидроксиэкдизона и 2,3-ацетонида α-экдизона разделяют колоночной хроматографией, выделенный 2,3-ацетонид α-экдизонагидролизуют, реакционную смесь экстрагируют, экстракт упаривают и выделяют кристаллы α-экдизона путем хроматографирования на колонке. Недостатками указанного способа являются использование 12 операций, в том числе операций жидкостно-жидкостной экстракции, которые требуют многократности их повторения и минимум трехкратного объема экстрагента к экстрагируемому объему на каждой операции экстракции, длительность, трудоемкость и многостадийность процесса, а также значительная энергоемкость способа вследствие трех операций выпарки и длительности работы вакуумно-циркуляционной установки.
Известно выделение из мочи иммунологически активного вещества из мочи млекопитающих, в том числе и человека, обладающего биологической активностью сывороточного тимического фактора (Патент РФ 2139065)(12). Согласно описания мочу, содержащую сывороточный тимический фактор, обрабатывают с применением различных технических средств, в частности хроматографические колонки, лиофильную сушку, для чего последовательно хроматографируют на колонке 2,5×30 см с Toyoperl HW-40 гелем, уравновешенным 0,2 М NaCl, материал в области 80-100 мл элюаталиофилизируют, хроматографируют на колонке 1×100 см с Toyoperl HW-40 гелем, уравновешенным 0,2 М NaCl, материал в области 35-40 мл элюталиофилизируют и обессоливают на сефадексе G-15, отбирая конечный продукт в области мол .м 6000-1000 Дальтон.
Известен способ получение сырца гонадотропина хорионического, патент РФ 2071334 (14), согласно которому мочу беременных женщин со сроком беременности 8-12 недель осветляют, пропуская через микрофильтрационные мембраны с размером пор 0,22-0,5 мкм. Осветленное сырье концентрируют на ультрафильтрационном модуле с полыми волокнами с пределом отсечения 10-70 кДальтон. Полученный концентрат отмывают от мочевины и солей дистиллированной водой при рН 5,8-7,0. В концентрате доводят рН до 3,8-4,2 и выделяют осадок, содержащий гонадотропин хорионический, добавлением избытка ацетона. Для переосаждения активного осадка, содержащего гонадотропин хорионический, осадок растворяют в 5-10% аммонийно-ацетатном буфере, содержащем 50-70% этилового спирта. Осаждение целевого продукта осуществляется повышением концентрации этанола до 90-92%. Активность полученного продукта составляет 1500-2000 ед/мг, выход 85,7-90%.
В технологическом процессе вышеописанного способа применяются процедуры осветления на микрофильтрационных мембранах и концентрация на ультрафильтрационном модуле с последующим поэтапным последовательным осаждением ацетоном и этиловым спиртом.
Недостатки способа: низкая производительность при микрофильтрации и концентрации на ультрафильтрационном модуле, существенно ограничивающие возможности промышленного производства. При этом осветление не приводит к удалению мочевины и мочевых солей, что приводит к необходимости дополнительной процедуры отмывки концентрата дистиллированной водой.
Известна группа патентов, описывающих сходные способы выделения эстрогенов, основанных на применении методов жидкостно-жидкостной экстракции (патент RU 2308955 (11), патент RU 2329818 (6), патент RU 2351607 (10).
В качестве примера одного из них, можно привести «Способ выделения обедненной неконьюгированными липофильными соединениями природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов». Патент RU 2329818 (6).
Для этого водную исходную фазу выбирают из группы, включающей: водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл; водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл; концентрат жидкой мочи, полученный путем сгущения; и концентрированный ретентат мочи. Любую из указанных водных фаз подвергают жидкостно-жидкостной экстракции. Полученный согласно описанию способа, предварительно очищенный концентрат мочи имел коэффициент концентрации до 1:10. В частности указывается, что концентраты можно также перед их переработкой предлагаемым в изобретении способом подвергать дополнительному концентрированию известным методом, например, перегонкой, для получения таким путем концентрата, практически не содержащего органический растворитель. Также в описании, в частности, указывается, что использование технически средств, в частности, мембранного фильтра с размерами пор, лежащими в нанометровом диапазоне, обеспечивает получение ретентата мочи жеребых кобыл с повышенной концентрацией содержащихся эстрогенов практически без их потери, при одновременном удалении из нее до 50 мас.% низкомолекулярных компонентов.
Следует учесть, что при осуществлении описанных выше известных методов жидкостно-жидкостной экстракции приходится сталкиваться со множеством проблем, таких как интенсивное пенообразование, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Обычно экстракцию требуется проводить в несколько стадий, что приводит к потере эстрогенных компонентов и лишь неполному их выделению из мочи. Помимо этого для проведения этих методов экстракции требуются большие объемы отчасти вредных для здоровья растворителей. Кроме того, в указанных выше патентных публикациях не содержится никакой информации о содержании в получаемых продуктах неконъюгированных липофильных компонентов, или же неконъюгированных, прежде всего андростановых и прегнановых стероидов, ни об отделении этих компонентов. Описания этих способов не позволяют сделать заключение об их реальной эффективности в отношении выхода или чистоты получаемых экстрактов и влияния нежелательных с токсикологической точки зрения растворителей.
Аналогом предлагаемого нами изобретения является описанный в патенте RU 2277241 С2 (1) способ и устройство для накопления (концентрирования) и стабилизации конъюгированных эстрогенов из кобыльей мочи. Автором предлагается способ и устройство для накопления и стабилизации конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл на твердых носителях с целью получения исходного материала, пригодного для получения фармацевтических препаратов, которые в качестве действующего компонента содержат натуральную смесь конъюгированных эстрогенов.
В качестве устройства предложен патрон, заполненный постоянно находящимся в жидкости адсорбентом, пригодным для адсорбции содержащейся в моче смеси конъюгированных эстрогенов. Согласно описанию, мочу, из которой необязательно удалены слизь и твердые вещества, или сгущенный концентрат этой мочи или полученный путем фильтрации этой мочи через мембранный фильтр сгущенный ретентат (вещество, не прошедшее через мембранный фильтр), вводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в моче смеси конъюгированных эстрогенов количеством семиполярной полимерной адсорбирующей смолы и насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов семиполярную полимерную адсорбирующую смолу отделяют от остальной мочи;
б) насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов семиполярную полимерную адсорбирующую смолу промывают промывочной жидкостью со значением рН, установленным по меньшей мере на 12,0, прежде всего на 12,5-14,0;
в) промытую адсорбирующую смолу вводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной ею смеси конъюгированных эстрогенов количеством элюента, который представляет собой смешивающийся с водой органический растворитель из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, либо смесь из смешивающегося с водой органического растворителя и необязательно подщелаченной воды, и содержащий природную смесь конъюгированных эстрогенов элюат отделяют от адсорбирующей смолы.
Недостатки данного патента заключаются в том, что основываясь на известных свойствах применяемых в изобретении адсорбентов, можно с уверенностью считать, что в патроне для накопления и хранения снабженного тем или иным адсорбентом происходит неселективное накопление (концентрирование) смеси большинства присутствующих в моче гормонов, в том числе и эстрогенов. При этом, для их выделения из патрона нужно применить не менее 5 кратные объемы элюента (соотношение объем адсорбента/объем элюента), что в конечном итоге приводит к тому, что вместо концентрата на выходе из патрона реально получают разведенный раствор смеси гормонов, который необходимо в дальнейшем вновь концентрировать.
Важно отметить, что все перечисленные выше аналоги, обобщают и применяют уже известные технологические решения и технические средства, такие как ультрафильтрацию, использование ионообменных смол и адсорбентов, осаждение различными осадителями, например кетонами, спиртами и пр., которые не являются селективными по отношению к конкретному гормону, а конечный продукт представляет смесь практически всех гормонов мочи, в той или иной пропорции, в зависимости от применяемого способа.
При этом, не умаляя значимости попыток улучшения качественных и количественных характеристик конечного продукта, независимо от названия способа, каким хотят представить его авторы (например, способ получения эстрогенов, или способ получения гонадротропина и пр.,) во всех случаях применения вышеперечисленных неселективных способов для выделения гормональных препаратов, следует понимать, что речь идет о концентрированном растворе или концентрате смеси гормонов, в лучшем случае, с преобладанием того или иного гормона.
Существующие в настоящее время химические и термические методы концентрирования биоорганических продуктов имеют целый ряд недостатков, которые способствуют деструкции нестойких соединений, конденсации и полимеризации веществ и пр. В связи с этим актуальна разработка альтернативных способов концентрирования, не ведущих к изменению качественного и количественного состава конечного продукта. Одним из перспективных направлений является способ концентрирования вымораживанием, который основан на том, что при замерзании воды до образования льда - твердой фазы, растворенные компоненты остаются и концентрируются в жидкой фазе (5, 19, 23).
Успешное развитие технических средств охлаждения сделали целесообразным их применение в пищевой промышленности для концентрирования фруктовых соков, пива, различных экстрактов (9), а также в биотехнологических производствах, как предварительного этапа концентрирования биологически активных веществ для их последующего индивидуального выделения.
Физико-химические основы концентрирования вымораживанием основаны на кристаллизации, в процессе которой основная часть находящейся в растворе воды при охлаждении превращается в лед, а оставшийся концентрат, имеющий более высокий удельный вес, отделяется под действием образованного льда. Установлено, что в процессе кристаллизации образуются участки особых микрообразований, в центре которых находятся преимущественно, молекулы чистой воды, а на периферии насыщенный раствор присутствующих компонентов. Поскольку в процессе охлаждения вначале замерзает чистая вода, образующиеся кристаллы льда вытесняют и тем самым концентрируют растворенные компоненты (20, 21, 30).
При медленном и плавном процессе кристаллизации вектор силы также плавно будет отталкивать от себя концентрат, однако при быстром замораживании процесс кристаллизации принимает хаотический характер, что приводит к исчезновению направленности вектора силы и образованию многочисленных автономных очагов кристаллизации внутри льда, делающих невозможным избирательное удаление из него концентрата. Таким образом, очевидным условием получения и отделения концентрата ото льда является максимально возможное сочетание оптимальной скорости и температуры охлаждения исходного раствора, а также создание направленности и сохранение вектора силы в течение всего технологического процесса его получения(16). Установлено, что условия образования и рост кристаллов зависят от нескольких факторов, таких как: степень переохлаждения воды ниже температуры ее кристаллизации, числом центров кристаллизации, динамическим состоянием воды, ее чистотой и отводом теплоты при кристаллизации (26). Практические выводы заключаются в том, что чем выше степень переохлаждения воды, и чем больше возникает центров кристаллизации, тем интенсивнее идет процесс замораживания и концентрирования. (20)
В работах (9) представлены результаты исследований влияния охлаждения на получение концентрата сока и виноматериала. При вымораживании сока получен концентрат, имеющий большую плотность, и ярко выраженный сортовой аромат. Показано, что после вымораживания концентрация Сахаров в соке повышается более чем в три раза, наряду с ростом концентрации титруемых кислот, как в соке, так и в виноматериале. Процесс вымораживания виноматериала сопровождается трехкратным повышением содержания этанола, метанола и уксусной кислоты. Доля эфирорастворимых соединений возрастает с 0,56% до 1,2%. Однако как и при вымораживании сока, часть экстрактивных веществ виноматериала остается в составе льда. Аналогичные выводы приведены в публикации (7), где показано, что при замораживании концентрированных растворов происходит захват льдом части вещества, о чем свидетельствует мутный, непрозрачный лед.
При изучении факторов, влияющих на степень извлечения органических соединений вымораживанием установлена зависимость величины конечного объема концентрата, который для выполнения условий эксперимента не мог быть менее 30 мл независимо от величины начального объема, варьируемого от 100 до 400 мл что, по мнению автора, объясняется механическим фактором, связанным с ухудшением перемешивания раствора (31).
Известно, что водные растворы при замораживании образуют две основные фазы. Изучение условий образования таких фаз имеет большое значение для оценки их взаимодействий в растворах при охлаждении (28). Известно, что в зависимости от соотношения между скоростью охлаждения раствора и скоростью кристаллизации воды в присутствии различных компонентов при замораживании могут образовываться кристаллы льда, аморфная фаза или же их смесь (24). К факторам, непосредственно влияющим на процесс замораживания относят: температурный режим, находящийся в зависимости от скорости охлаждения, концентрация исходного раствора, конечный объем концентрата, концентрация неорганических ионов в растворе, рН водного раствора (27, 29). Экспериментально подтвержденная и рекомендованная предпочтительная температура для замораживания с целью концентрации находится в интервале от -10°С до -12°С. Дополнительно к этому, нами проведены экспериментальные работы, которые позволили найти оптимальные размеры устройств для замораживания водных растворов с целью выделения органического концентрата, а также оптимальные соотношения внутреннего рабочего объема с их высотой и внутренним радиусом.
Из доступной нам технической литературы известен целый ряд патентов, связанных с получением концентрата при вымораживании.
Так, известен патент RU 2060774 C1 (13), предназначенный к использованию для удаления воды из растворов методом вымораживания, предпочтительно в производстве концентрированных соков. Сущность изобретения: в водный раствор вводят жидкость с температурой кипения при атмосферном давлении ниже 0°С, выбранную из группы инертных газов, азота, закиси азота и их смесей. При этом происходит испарение жидкости и образование кристаллов льда, отделяемых от концентрата.
Недостатки: способ не предназначен для применения в фармацевтической промышленности.
Известен способ автоматизации технологических процессов при вымораживания жидких продуктов путем автоматического управления процессом вымораживания влаги в двухступенчатой вымораживающей установке, предусматривающий изменение температуры и расхода хладагента в кристаллизаторах установки, расхода, температуры и времени пребывания исходного продукта в кристаллизаторах, расхода охлаждающей воды, мощности регулируемых приводов компрессоров холодильной машины и приводов барабанов кристаллизаторов воздействием на частоту вращения барабана и на расходы хладагента, охлаждающей воды, исходного продукта и воды, полученной при плавлении вымороженного льда, исходный продукт предварительно подают на охлаждение в рекуперационный теплообменник, омываемый пресной водой, образующейся при плавлении вымороженного льда, а затем в рекуперационный холодильник, омываемый сконцентрированным продуктом, измеряют расход и содержание сухих веществ в исходном продукте на входе в первый кристаллизатор, текущее значение расхода и содержания сухих веществ в сконцентрированном продукте на выходе из каждого кристаллизатора, время пребывания продукта в каждом кристаллизаторе, и по этим данным корректируют температуру кипения хладагента во внутренней полости барабана кристаллизатора и частоту его вращения путем изменения мощностей регулируемых приводов компрессоров и приводов барабанов кристаллизаторов в зависимости от электропроводности вымороженного льда, а также изменения расхода воды, подаваемой в дополнительный конденсатор, количество которой зависит от текущих значений температуры и расхода пресной воды на выходе из плавителей, а также от измеренных значений содержания сухих веществ в исходном продукте и времени пребывания в вымораживающей установке и количества вымороженного слоя льда, в соответствии с которым устанавливают частоту вращения барабана кристаллизатора, при этом предварительное охлаждение исходного продукта производится за счет рекуперации теплоты пресной воды, полученной в результате плавления льда и за счет рекуперации теплоты сконцентрированного продукта, а плавление вымороженного льда производится за счет теплоты хладагента, нагнетаемого компрессором холодильной машины при одновременном охлаждении и конденсации хладагента в зоне плавления, причем уменьшают температуру кипения хладагента во внутренней полости барабанов кристаллизаторов при отклонении содержания сухих веществ в концентрируемом продукте на выходе из кристаллизаторов от заданного значения в сторону увеличения и увеличивают температуру кипения хладагента при отклонении содержания сухих веществ в концентрируемом продукте от заданного значения в сторону уменьшения (Патент 2235581) (2).
Способ предназначен для автоматического управления в двухступенчатой установке вымораживания с технологическим процессом, пригодным для применения в химической, микробиологической, пищевой промышленности, а также на предприятиях агропромышленного комплекса. Технические параметры этого процесса не предусматривают его применение в биотехнологическом производстве.
Известен патент RU 2294644 С1 (15), в котором описано применение гранулированной двуокиси углерода для кристаллизации воды в проходящем растворе, служащим исходным для получения концентрата. При этом, диспергированный продукт кристаллизуется на гранулы двуокиси углерода, имеющие температуру -78°С. Для отделения кристаллов льда авторы предлагают использовать центрифугирование, прессы, промывочные колонны.
Недостатками предложенного способа являются сложность и энергозатратность технологического процесса, а также потери концентрата, остающегося в кристаллах льда на гранулах. Все это усложняет технологический процесс и, в конечном итоге, снижает эффективность получения конечного продукта. Для эффективной реализации способа нужны большие количества исходного продукта, в частности растительного сырья, что вряд ли применимо для существенно меньших количеств продукта биологического происхождения. Способ не предусматривает его применение в фармацевтической промышленности для выделения биологически активных веществ. При этом способом не предусмотрено дальнейшее использование жидкости после размораживания кристаллов и смыве с гранул, что еще больше снижает его экономическую составляющую.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является патент RU 2491976 (22), принятый нами за прототип, в котором описывается способ концентрирования растворов вымораживанием, включающий кристаллизацию раствора с последующим отделением концентрата от кристаллов растворителя. В вымораживаемом растворе, имеющем температуру не ниже температуры ликвидуса, направление кристаллизации ведут: если плотность концентрированного раствора меньше плотности исходного раствора, то преимущественно противоположно силе гравитации; если плотность концентрированного раствора больше плотности исходного раствора, то преимущественно сонаправленно силе гравитации. Устройство концентрирования растворов вымораживанием содержит поглотитель теплоты кристаллизации раствора, теплоизолятор, предотвращающий влияние окружающей среды на вымораживание раствора, приспособления для компенсации теплового расширения веществ и удаления концентрированного раствора. В устройстве концентрирования растворов вымораживанием поглотитель теплоты кристаллизации растворов устанавливается относительно вымораживаемого раствора в пространстве в соответствии со способом концентрирования растворов.
Недостатком способа является его зависимость от состава исходного раствора, которая проявляется в необходимости изменения направления кристаллизации, что в свою очередь требует применения двух конструктивно различных устройств, что существенно снижает его экономические преимущества. Помимо этого конструкция самого устройства достаточно сложна при эксплуатации. Еще одним недостатком описанного выше способа является то, что в нем не предусмотрен динамический контроль технологического процесса техническими средствами, в результате чего затруднено определение срока окончания цикла вымораживания и степени концентрирования конечного продукта, а сам технологический процесс выполняется в ручном режиме.
Исходя из известных теоретически и экспериментально доказанных технических решений, определяющих основные параметры процесса концентрационного замораживания водных растворов органических и неорганических веществ с учетом факторов, влияющих на этот процесс, а также результатов наших исследований, нами разработан заявляемый способ и устройство для получения гормонального концентрата из мочи человека и млекопитающих. С этих позиций, заявляемый способ и устройство для получения гормонального концентрата из мочи основано на применении физических принципов, которые существенно превосходит установленные аналоги по большинству основных показателей, не неся при этом, присущие им недостатки.
Способ получения гормонального концентрата разработан на основе концентрирования растворов путем удаления из них замороженного растворителя. Принцип способа получения гормонального концентрата и работы устройства заключается в том, что при постепенном охлаждении мочи, образующийся лед выталкивает органические и неорганические компоненты мочи из свой структуры, которые образуют их концентрат. При направленном охлаждении например, от периферии к центру, концентрат формируется в одном заданном месте, конкретно в центре, откуда он может быть избирательно удален.
Способ заключается в следующем. В качестве исходного раствора, содержащего смесь природных гормонов, используется моча человека или млекопитающих, которая предварительно очищается от основной массы мочевых солей, денатурированных белков, слизи, макромолекулярных образований по способу, описанному в патенте RU 2621311(4). В основе этого способа лежит эффект криоагрегации, который проявляется при охлаждении мочи до предпочтительной температуры -2°С, без образования льда. При этой температуре наблюдается максимально возможное образование криоагрегатов, состоящих из мочевых солей, белков, вовлекающих в свой состав также и крупные макромолекулярные образования, включающие слизь, бактерии, форменные элементы. В результате этого процесса, моча в значительной степени очищается от вышеописанных примесей, что повышает эффективность последующих этапов очистки и получения непосредственно гормонального концентрата.
В соответствии с заявляемым способом, предварительно очищенная криоагрегацией и охлажденная до -2°С моча, к которой также предварительно добавлены микрочастицы активированного угля с размером предпочтительно, 500 микрон в количестве предпочтительно, 200 мг/л, поступает в заявляемое устройство, снабженное охлаждающим элементом, в котором охлаждается до предпочтительной температуры -10°С. Охлаждение мочи проводится в горизонтальном направлении и от периферии к центру в постоянно контролируемом режиме, не превышающем установленную температуру -10°С. Образующиеся в процессе охлаждения кристаллы льда вытесняют органические и неорганические жидкие компоненты также от периферии к центру, которые попадают и накапливаются в концентраторе, имеющему трубчатую цилиндрическую форму, установленному в центре емкости устройства. В микропроцессор блока управления предварительно вводят ограничения на: температуру охлаждающей жидкости, температуру разогрева стенки корпуса устройства, исходный уровень жидкости внутри корпуса, оптическую плотность гормонального концентрата, а также управление включения и выключения электромагнитных клапанов. Накопление концентрата, имеющего темно-коричневый цвет контролируется фотооптическим блоком, установленным в верхней части концентратора, который после достижения установленной величины оптической плотности гормонального концентрата подает сигнал на внешне установленный блок управления для прекращения рабочего цикла. Автоматически включающийся электромагнитный клапан открывает выводной горизонтальный отвод устройства, через который гормональный концентрат выводится из концентратора во внешне установленный накопитель, представляющий емкость, объем которой превышает объем концентрата в соотношении от 4:1 до 6:1, предпочтительно 5:1. Для дополнительной очистки гормонального концентрата от сопутствующих примесей, в накопитель перед подачей гормонального концентрата вносят порошкообразный гидроксид натрия в соотношении 0,5 г. на 100 мл объема гормонального концентрата.
Нами неожиданно установлено, что при добавлении гидроксида натрия к гормональному концентрату в вышеописанных предпочтительных количествах, наблюдается быстрое образование преципитата и его выпадение в виде осадка, исследования состава которого показали присутствие преимущественно гликозаминогликанов и протеогликанов. Эти исследования согласуются с данными (патент РФ 2401838)(17) и нашими исследованиями, (патент РФ 2621311)(4), в которых описано применение гидроксида натрия для выделения гликозаминогликанов и протеогликанов в процессе получения из них препаратов.
Согласно заявляемому способу применение гидроксида натрия преследует две цели. Одна из них следующая. Выше приведенные ссылки указывают на применение гидроксида натрия для осаждения гликозаминогликанов и протеогликанов из сырья животного происхождения в целях получения высокоочищенных препаратов этих веществ. Однако нами не найдена техническая информация о применении гидроксида натрия для очищения гормонального концентрата, полученного из мочи или других биологически активных растворов с целью их очистки от примеси гликозаминогликанов и протеогликанов. Эти высокомолекулярные вещества являются нежелательными компонентами, поскольку их присутствие существенно снижает эффективность использования гормонального концентрата для получения высокоочищенных гормональных препаратов и в любом случае требует применения дополнительных способов очистки. Автор заявляемого способа обнаружил, что используя водный раствор 0,5М гидроксида натрия, можно успешно удалять протеогликаны и гликозаминогликаны из гормонального концентрата, полученного из мочи с целью его дополнительной очистки.
Нами экспериментально доказано присутствие в гормональном концентрате гликозаминогликанов и протеогликанов в концентрации, превышающей их уровень в исходный моче, в среднем, в 2 раза. Так, при исходных значениях 0,120±0,01 мг/мл исходной мочи, определяемых карбазоловым методом, в гормональном концентрате содержание общих гликозаминогликанов и протеогликанов составило 0,256±0,012 мг/мл (р<0,05, n=10). После применения гидроксида натрия протеогликаны и гликозаминогликаны в гормональном концентрате не определялись.
Технический результат достигается тем, что после добавления гормонального концентрата, находящийся в накопителе порошкообразный гидроксид натрия растворяется в течение 20-30 секунд, и при этом одновременно наблюдается нарастающее помутнение раствора с последующим образованием крупнодисперсного преципитата, состоящего преимущественно из гликозаминогликанов и протеогликанов, выпадающего в течение 5-6 минут в осадок. В последующие 5-6 минут осадок уплотняется и при соотношении объем концентрата/объем осадка предпочтительно, 10:1, гормональный концентрат отделяется от осадка и используется по назначению.
Нами проведено исследования веса сухого остатка в гормональном концентрате до и после применения гидроксида натрия для удаления гликозаминогликанов и протеогликанов. Для приготовления сухого остатка, полученный на заявляемом устройстве гормональный концентрат, разделялся на два образца, один из них контрольный, без применения гидроксида натрия, а второй образец был смешан с порошкообразным гидроксидом натрия в соотношении 0,5 г на 100 мл объема гормонального концентрата. После размешивания в течение 10 секунд, раствор гормонального концентрата оставляли на 10 минут при комнатной температуре до полного выпадения и уплотнения осадка. Надосадочную жидкость, представляющую гормональный концентрат без протеогликана и гликозаминогликана отделяли от осадка. Оба образца сушились в сушильном шкафу при 100°С в течение 18 ч для полного удаления влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка проводилось на цифровых весах (GF-400, фирма "A&D Corp., Тайвань"). В итоге из 100 мл гормонального концентрата контрольного образца после сушки было получено 1,246 гр сухого вещества, что составляет в процентном соотношении - 1,246%. Итоговое взвешивание сухого остатка из 100 мл гормонального концентрата после обработки гидроксидом натрия и последующего удаления протеогликанов и гликозаминогликанов установило вес сухого остатка равный 0,788 гр., что составляет в процентном отношении 0,788%. Сопоставление результатов взвешивания сухого остатка и их интерпретация свидетельствует о существенно снижении веса сухого остатка, практически на 36%, что является убедительным доказательством эффективности применения гидроксида натрия для дополнительной очистки гормонального концентрата от нежелательных компонентов, в частности от протеогликанов и гликозаминогликанов.
Изучение гормональной активности, на примере эстрадиола и кортизола, в гормональном концентрате после применения гидроксида натрия (с предшествующей исследованию нейтрализацией гидроксида натрия эквивалентным количеством лимонной кислоты) не выявило статистически достоверных различий как в первые часы после отделения гормонального концентрата от осадка, так и в последующий период наблюдения, который уже превысил 2 года.
Вторая цель применения гидроксида натрия, заключается в том, что гидроксид натрия оказывает мощное бактерицидное действие практически на всю бактериальную флору, а также вирусы, в том числе: вирусного гепатита, ВИЧ, и др. В проведенных нами бактериологических исследованиях для изучения эффективности применения гидроксида натрия в качестве консерванта, ни в одном случае не выявлено наличия бактериальной микрофлоры как в первые часы после отделения гормонального концентрата от осадка, так и в последующий период наблюдения, который уже превысил 2 года. Таким образом, применение гидроксида натрия для стерилизации конечного продукта, а также в качестве консерванта для продолжительного хранения, имеет доказанную технически и экономически обоснованную эффективность и из-за простоты и надежности его применения, а также низкой себестоимости и доступности самого гидроксида натрия.
Технический результат реализации способа достигается тем, что предварительно очищенная и охлажденная до -2°С моча, к которой также предварительно добавлены микрочастицы активированного угля с размером предпочтительно, 500 микрон в количестве предпочтительно, 200 мг/л, после открытия электромагнитного клапана, установленного на вводном горизонтальном отводе, поступает через коннектор, который установлен на внешней стороне дна корпуса, в емкость корпуса и заливается до требуемого объема, ограниченного настройкой датчика уровня. После срабатывания датчика уровня сигнал от него подается на внешне установленный блок управления, из которого подается сигнал на выключение (закрытие) электромагнитного клапана на вводном горизонтальном отводе. Одновременно с этим, включается фотооптический блок, направляющий во внешне установленный блок управления сигнал, значения которого принимаются за исходные для контроля состояния жидкости внутри концентратора. Также одновременно с этим включается внешне установленный блок охлаждения, который после включения запускает процесс охлаждения, заключающийся в том, что в трубчатый спиралевидный охлаждающий элемент начинает поступать в проточном режиме охлаждающая жидкость с предпочтительной температурой -10°С. Это позволяет достигнуть требуемого эффекта путем направленного к центру плавного охлаждения жидкости, сопровождающегося также направленным образованием льда от периферии к центру. При этом формирующийся гормональный концентрат постепенно выталкивается образованным льдом от периферии к центру и, конечном итоге, проходит через дренажные отверстия в концентратор, откуда после срабатывания фотооптического блока и открытия электромагнитного клапана на выводном горизонтальном отводе, поступает во внешне установленный накопитель для дополнительного очищения гормонального концентрата от примеси протеогликанов и гликозаминогликанов. Процесс дополнительного очищения состоит в том, что гормональный концентрат поступает во внешне установленный накопитель, представляющий емкость, объем которой превышает объем концентрата в соотношении от 4:1 до 6:1, предпочтительно 5:1, куда перед подачей гормонального концентрата, в качестве осадителя и консерванта предварительно вносят предпочтительно, порошкообразный гидроксид натрия в соотношении 0,5 г:100 мл объема гормонального концентрата, после чего в накопитель заливается гормональный концентрат в указанном выше объемном соотношении, который осторожно перемешивается в течение предпочтительно, не более 10 сек, и выдерживается при комнатной температуре в течение 8-12 мин, предпочтительно, 10 мин, с последующим отделением осадка, состоящего преимущественно из гликозаминогликанов и протеогликанов, от гормонального концентрата который используется в качестве конечного продукта для последующего применения.
Существенными отличительными признаками заявляемого способа получения гормонального концентрата из мочи от известных аналогов и прототипа являются следующие.
1. Существенным отличительным признаком заявляемого способа является применение предварительного охлаждения исходной мочи до температуры -2°С для ее очищения на основе способа криоагрегации, позволяющего удалить основную массу мочевых солей, денатурированных белков, слизи, макромолекулярных образований, таких как форменные элементы, бактерии и макроагрегаты. Этот способ ранее не использовался в качестве предварительной очистки мочи для получения из нее гормонального концентрата, и его применение заявляемом способе дает возможность существенно повысить эффективность последующего процесса вымораживания для получения гормонального концентрата.
2. Существенным отличительным признаком заявляемого способа является применение микрочастиц активированного угля с предпочтительным размером 500 микрон и предпочтительной концентрацией 200 мг/л мочи для стабилизации процесса направленной кристаллизации воды при охлаждении мочи при -10°С, что препятствует хаотическому образованию дентритов. Использование микрочастиц активированного угля для этих целей ранее не описано, и их применение способствует существенному повышению стабильности параметров процесса направленной концентрации при охлаждении, что позволяет существенно повысить эффективность вымораживания для получения гормонального концентрата.
3. Существенным отличительным признаком заявляемого способа является доказанный эффект очищения гормонального концентрата от значительной части нежелательных компонентов мочи, который сопутствует процессу кристаллизации льда при вымораживании, что позволяет существенно повысить качество и степень концентрации гормонального концентрата на выходе из устройства.
4. Существенным отличительным признаком заявляемого способа является применение гидроксида натрия в качестве осадителя для дополнительной очистки гормонального концентрата от группы нежелательных высокомолекулярных компонентов мочи, таких как протеогликаны и гликозаминогликаны, которые практически полностью удаляются. В заявляемом способе впервые описана возможность применении гидроксида натрия для очищения гормонального концентрата, полученного из мочи или других биологически активных растворов с целью очистки от примеси гликозаминогликанов и протеогликанов. Это дает возможность существенно повысить качество конечного продукта и избежать процедур дополнительной очистки от этих веществ на последующих этапах выделения индивидуальных гормонов.
5. Существенным отличительным признаком заявляемого способа является применение гидроксида натрия как консерванта, поскольку он ранее не применялся для стерилизации гормонального концентрата, однако его использование дает возможность полностью устранить развитие бактериальной кантаминации при хранении или транспортировке, и одновременно сохранить биологическую активность индивидуальных гормонов в гормональном концентрате. Эти выводы имеют доказанную технически и экономически обоснованную эффективность и из-за простоты и надежности его применения, а также низкой себестоимости и доступности самого гидроксида натрия.
Состав устройства для получения гормонального концентрата из мочи Устройство для получения гормонального концентрата, включает корпус 1, цилиндрической формы, с внутренним объемом, составляющим не менее 500 мл и не более 1500 мл, предпочтительно 1000 мл, выполненный предпочтительно, из нержавеющей стали, закрытый внешней крышкой 2 с внешней теплоизоляцией, с дном 3 конусообразной формы, в центре которого с наружной стороны установлен коннектор 4 с не менее чем с двумя горизонтальными отводами, один из которых, вводной горизонтальный отвод 5, предназначен для ввода жидкости во внутренний объем корпуса 1, а второй, выводной горизонтальный отвод 6, предназначен для вывода гормонального концентрата, причем на конце вводного горизонтального отвода 5 установлен нормально закрытый электромагнитный клапан 7, а на конце выводного горизонтального отвода 6 установлен нормально закрытый электромагнитный клапан 8, и помимо этого, на наружной стороне стенки корпуса установлен охладительный трубчатый элемент 9 спиралевидной формы, соединенный с внешне установленным автономным охладителем, снабженным микросхемой для регулирования параметров охлаждения, а между спиралью трубчатого элемента 9 на наружной стенке корпуса 1, а также на горизонтальных отводах 5 и 6 установлен нагревательный элемент 10 пластинчатой формы, соединенный с внешне расположенным источником электропитания, снабженным микросхемой для регулирования температурных параметров подогрева стенки корпуса 1, а в центре корпуса 1 установлен параллельно его вертикальной оси свободно передвигаемый концентратор 11 трубчатой формы, предназначенный для сбора гормонального концентрата, выполненный, предпочтительно из нержавеющей стали, на стенках которого на всем протяжении имеются сквозные дренажные отверстия 12, причем на концентраторе 11 установлены, по меньшей мере, четыре направляющие пластины 13 расположенные симметрично друг другу, вертикально и параллельно оси концентратора так, что внутренний край каждой направляющей пластины на всем протяжении прочно соединен с наружной стенкой концентратора 11, не закрывая при этом просвета дренажных отверстий 12 концентратора 11, а наружный противоположный край каждой направляющей пластины 13 на всем протяжении свободно примыкает к внутренней стенке корпуса 1, дополнительно к этому, на нижней части концентратора 11 имеется опорная пластина 14 кольцевидной формы, расположенная перпендикулярно его вертикальной оси, так же снабженная на всем протяжении сквозными отверстиями 15, при этом в центре верхней трети концентратора 11 установлен фотооптический блок 16, снабженный источником света и фотоэлементом, герметично защищеным от жидкости, и дополнительно к этому, в верхней части концентратора 11 установлен датчик уровня 17, а снизу на наружной стороне дна корпуса 1 установлен датчик температуры 18. Чертеж заявляемого устройства представлен на Фиг. 3.
Конкретный технический результат реализации работы заявляемого устройства раскрывается тем, что на предварительном этапе моча проходит процесс криоагрегации, описанный в патенте РФ №2621311 (4), который заключается в том, что при ее охлаждении до -2°С происходит выпадение мочевых солей, крупномолекулярных образований, бактерий, слизи, форменных элементов. Очищенная таким способом моча после открытия электромагнитного клапана 7, установленного на вводном горизонтальном отводе 5, поступает через штуцер 3, который установлен снаружи на дне 2 корпуса 1, закрытого предварительно внешней крышкой 2, в емкость корпуса 1 и заливается до требуемого объема, ограниченного настройкой датчика уровня 16. В микропроцессор внешне установленного блока управления предварительно вводят ограничения на: температуру охлаждающей жидкости, температуру разогрева стенки корпуса устройства, исходный уровень жидкости внутри корпуса, оптическую плотность гормонального концентрата. После срабатывания датчика уровня сигнал от него подается на внешне установленный блок управления, из которого подается сигнал на выключение (закрытие) электромагнитного клапана 7 на вводном горизонтальном отводе 5. Одновременно с этим, включается фотооптический блок 15, направляющий во внешне установленный блок управления сигнал, значения которого принимаются за исходные для контроля состояния жидкости внутри концентратора 11. Также одновременно с этим включается внешне установленный блок охлаждения, который после включения запускает процесс охлаждения, заключающийся в том, что в трубчатый спиралевидный охлаждающий элемент 9 начинает поступать в проточном режиме охлаждающая жидкость со скоростью 3 литра/мин и с предпочтительной температурой, ограниченной диапазоном не менее -8°С и не более -12°С, наиболее предпочтительной температурой -10°С.
Экспериментально установлено, что при температуре охлаждающей жидкости менее -8°С скорость охлаждения мочи невысока, что сказывается на увеличении времени производственного цикла, и снижении эффективности. Напротив, повышение скорости охлаждения за счет снижения температуры до 12°С и ниже приводит к нежелательному быстрому замерзанию жидкости на всем объеме корпуса. При наиболее предпочтительной температуре -10°С достигается требуемый эффект направленного от периферии к центру плавного и контролируемого охлаждения жидкости, сопровождающийся также направленным горизонтально и перпендикулярно к вертикальной оси корпуса и концентратора образованием льда. При этом формирующийся гормональный концентрат постепенно выталкивается образованным льдом от периферии к центру и, конечном итоге, проходит через дренажные отверстия 12 в концентратор 11.
Экспериментально установлено, что оптимальный одноразовый объем мочи для получения гормонального концентрата находится в интервале от 500 мл до 1500 мл, предпочтительно 1000 мл. Это связано с тем, что на практике одноразовый объем индивидуальной мочи у животных составляет, в среднем 1 литр. У человека одноразовый объем индивидуальной мочи составляет, в среднем, 300 мл, допуская смешивание с одним или двумя дополнительными объемами его же индивидуальной мочи во временном диапазоне, ограниченном не более 6 часов. Эти ограничения связаны с необходимостью минимализировать влияние микробной кантаминации при экспозиции мочи.
Также экспериментально установлено, что быстрое снижение температуры охлаждения приводит к нарушению направленности охлаждения, в результате чего, градиент концентрации размывается и жидкость с более высоким неорганическим и органическим составом не разделяется и замерзает на всем объеме емкости без фокусируемой концентрации.
Экспериментально установлено, что оптимальное соотношение внутреннего рабочего объема корпуса 1 и внутреннего рабочего объема концентратора 11 находятся в интервале от 40:1 до 60:1, предпочтительно 50:1. Это связано с экспериментальными наблюдениями, которые установили, что при выбранном внутреннем объеме корпуса 1 в 1000 мл, во внутреннем рабочем объеме Указанные параметры предпочтительны в силу необходимости плавного и постепенного снижения температуры жидкости внутри емкости с целью ее направленного охлаждения от периферии к центру. Таким образом наиболее предпочтительной для охлаждения является температура -10°С, при которой достигается требуемый эффект направленного к центру охлаждения жидкости, сопровождающийся также направленным образованием льда от периферии к центру. При этом формирующийся концентрат постепенно выталкивается образованным льдом от периферии к центру и, конечном итоге, проходит через дренажные отверстия 12 в концентратора 11.
При внутреннем рабочем объеме концентратора 11 свыше 20 мл, концентрации жидкости уменьшается, а при внутреннем рабочем объеме концентратора 11 менее 20 мл, образованный снаружи коллектора гормональный концентрат, остается за его пределами, в силу несоответствия и ограниченности объема концентратора 11.
В процессе экспериментального подбора параметров охлаждения установлено, что скорость образования льда прогрессивно снижается по мере удаления от охлаждаемых стенок корпуса, в связи с чем, при выбранном внутреннем объеме корпуса 1 в 1000 мл, предпочтительные величины внутреннего радиуса корпуса 1 находятся в интервале не менее 40 мм и не более 60 мм, однако наиболее предпочтительным представляется внутренний радиус 50 мм.
Высота корпуса устройства имеет нижний порог, ограниченный минимальной величиной в 127 мм, что связано с возможностью перелива из корпуса при использовании более одного литра мочи при внутреннем рабочем объеме емкости корпуса, рассчитанном на 1 л. Верхний предел высоты не ограничен, но предпочтительно составляет не более 150 мм, однако наиболее предпочтительной является высота 140 мм.
При необходимости одноразового использования более одного литра мочи высота стенки корпуса увеличивается на 80 мм кратно каждому литру мочи. Предпочтительная максимальная высота стенки корпуса не более 1000 мм. В этом случае корпус устройства представляет собой колонну, с крышкой сверху и дном снизу. Сделанный и апробированный макетный образец колонны с такой высотой показал, что большие размеры высоты колонны свыше 1000 мм затрудняют ее технологическое обслуживания, прежде всего, из-за неудобств с извлечением концентратора со льдом после завершения цикла охлаждения.
При увеличении высоты корпуса свыше 140 мм, на каждые последующие 80 мм, с наружной стенки корпуса устройства устанавливаются дополнительно отдельные спиралевидные трубчатые охладительные элементы, в количестве, кратном каждому добавленному объему мочи. Это обусловлено тем, что рассчитанная экспериментально площадь охлаждения наружной стенки корпуса устройства находится в прямой зависимости от объема и скорости охлаждающей жидкости. При заявленной оптимальной температуре охлаждения до -10С, при предпочтительной высоте корпуса 140 мм, температура охлаждающей жидкости на входе и выходе отличается на 2,3С -2,6С. Установлено, что указанные различия температуры, связанные с теплопотерей при охлаждении 1 литра мочи, постоянны и на их основании рассчитано время одного цикла охлаждения. При увеличении объема охлаждаемой мочи, требуется существенно увеличить скорость прохождения теплоносителя и одновременно понизить его температуру, что технически менее выгодно, чем добавление дополнительного охладительного элемента с контролируемой оптимальной температурой -10С. Это техническое решение становится еще более предпочтительным при увеличении одноразово обрабатываемого объема мочи свыше 2 л, но не более 10 л.
По мере накопления концентрированной жидкости внутри концентратора, ее цвет изменяется от светло-желтого до темно-коричневого и при достижения требуемых значений оптической плотности жидкости, установленных экспериментально, фотооптический блок подает сигнал на завершение ее охлаждения, который сопровождается выключением блока охлаждения, включением (открытием) электромагнитного клапана на выводном горизонтальном отводе, и сливом гормонального концентрата во внешний накопитель для дальнейшего применения. После слива гормонального концентрата в течение 30 сек, которые установлены экспериментально и требуются для полного его слива, включается нагревательный элемент, нагревающий стенку корпуса и горизонтальные отводы, в интервале 20°С-30°С, предпочтительно 25°С. Указанные значения интервала нагревания выбраны экспериментально и обусловлены тем, что при меньших значениях нагрева корпуса, увеличивается время технологического процесса, а увеличение температуры свыше 30°С приводит к перегреву жидкости, что нецелесообразно в силу того, что данная жидкость используется для параллельного технологического процесса. Поэтому температура 25°С наиболее предпочтительна для этого этапа. Процесс нагревания корпуса регулируется датчиком температуры, установленным на наружной стороне дна, который подает сигнал на отключение нагревания при достижении требуемой температуры. Кратковременное нагревание применяется только для того, чтобы пристеночный лед, образованный при охлаждении, разморозился до жидкости, что позволяет извлечь оставшийся компактный объем замороженной в виде льда мочи из емкости корпуса для проведения следующего цикла с новой порцией мочи. При извлечении замороженной мочи, опорная пластина, установленная в нижней части концентратора, действует как поршень, способствует полному удалению льда из корпуса, при этом через отверстия на опорной пластине остаток гормонального концентрата проходит на дно корпуса и в дальнейшем удаляется или смешивается с новой порцией мочи в следующем цикле.
Среднее время одного цикла обработки 1000 мл мочи составляет, в среднем 90 мин, и с выходом, в среднем 18 мл гормонального концентрата.
Автоматизация процесса получения гормонального концентрата осуществляется за счет того, что:
1. Применяют внешне установленный блок управления с микропроцессором.
2. Применяют установленные на устройстве: датчик исходного уровня жидкости для вымораживания внутри корпуса, датчик температуры разогрева стенки корпуса устройства, датчик контроля оптической плотности гормонального концентрата.
3. Применяют установленные на горизонтальных отводах устройства электромагнитные клапаны, один из которых предназначен для подачи исходной мочи, а второй для вывода полученного гормонального концентрата.
4. В микропроцессор внешне установленного блока управления предварительно вводят ограничения на: температуру охлаждающей жидкости, температуру разогрева стенки корпуса устройства, исходный уровень жидкости внутри корпуса, оптическую плотность гормонального концентрата.
5. В программу внешне установленного блока управления введена функция отключения охлаждения при отсутствии изменений нарастания сигнала от фотооптического блока в течение 60 секунд.
6. Трубчатый спиралевидный охлаждающий элемент устройство подключен к внешне установленному блоку охлаждения, который обеспечивает контроль подачи охлажденной до -10°С жидкости (на основе полиэтиленгликоля м.в. 10000), со скоростью предпочтительно, 3 литра/мин. и контроль заданных параметров охлаждения.
С применением вышеописанного устройства из 1 литра исходного продукта (мочи после предшествующей обработки на предыдущих этапах) получено 19 мл гормонального концентрата, что определено внутренним объемом концентратора. Соотношение внутреннего объема концентратора к внутреннему объему корпуса составляет 100:1,9. Значения соотношения внутренних рабочих объемов корпуса и концентратора подобраны экспериментально и реализованы на том основании, что внутренний рабочий объем корпуса в 1000 мл наиболее подходит для работы с порциями мочи также в 1000 мл. Это связано, прежде всего с требованиями к безопасности сырья, поскольку бракование одной порции сырья не сможет отразиться на качестве всей его партии. Важным моментом является то, что при уменьшении внутреннего объема концентратора ниже приведенного в заявляемом устройстве, приводит к потере гормонального концентрата за его пределами с наружной стороны, а больший объем концентратора способствует уменьшению концентрации самого гормонального концентрата.
Проведенные исследования состава и свойств гормонального концентрата и жидкости после изъятия гормонального концентрата (ЖПИГК) следующее.
Материалы и методы исследований.
Исследована моча 10 практически здоровых женщин в возрасте 17-30 лет. Забор мочи проводился утром, натощак, в середине второй фазы менструального цикла.
Исследования проводились на действующем опытном образце заявляемого устройства с соблюдением всех заявляемых параметров его работы.
В образцах ЖПИГК и самого гормонального концентрата исследованы следующие показатели: цвет, оптическая плотность, удельный вес, сухой остаток. В сухом остатке определяли его вес, содержание зольного и белкового компонентов, общих липидов и углеводов.
Помимо этого анализировалось содержание высокополимерных компонентов мочи, таких как протеогликаны и гликозаминогликаны карбазоловым методом. Исследования основных, количественно превалирующих гормонов, проводили на ИФА анализаторе Multiskan FC, "Thermo Scientific".
Концентрацию эстрадиола (Е2) определяли с помощью набора «Эстрадиол-ИФА», "Хема-Хема-Medica". Результат выражали в пг/мл.
Концентрацию прогестерона, тестостерона и кортизола определяли с помощью наборов «Диагностические системы», Н.Новгород, РФ. Результаты исследования прогестерона и тестостерона выражали в нмоль/л, кортизола в мкг/сутки.
Полученные показатели обработаны методом вариационной статистики с определением среднего арифметического значения (М) и стандартной ошибки среднего арифметического (m). Средние величины сравнивали с использованием U-критерия Манна-Уитни и W-критерия Вилкоксона. Различия двух сравниваемых величин считали достоверным, если вероятность их тождества была менее 5% (р<0,05). (3)
Изучение динамики охлаждения показало, что процесс направленного постепенного плавного охлаждения мочи приводит к появлению гормонального концентрата, который четко виден и определяется техническими средствами. На Фиг. 1 показаны образцы гормонального концентрата (1.1) и ЖПИГК (1.2). Как видно, цвет гормонального концентрата темно-коричневый, в то время как ЖПИГК светлая, слегка мутная.
Оптическая плотность гормонального концентрата (в % от исходного) возрастала до 92%. Результаты измерения оптической плотности гормонального концентрата в концентраторе заявляемого устройства при охлаждении до -10°С представлены на таблице 1 и Фиг. 2.
Как видно из представленных данных в первые 30 минут после начала охлаждения изменения оптической плотности незначимы, однако начиная с 50 минуты вплоть до 70 минуты, значения оптической плотности резко нарастают, и также резко замедляются после 70 минуты. Выявленные закономерности в динамике изменения оптической плотности гормонального концентрата обусловлены его накоплением в концентраторе. При этом, спад накопления после 70 минуты свидетельствует о завершении образования льда во всем объеме корпуса устройства. Основываясь на этих результатах было установлено оптимальное время длительности охлаждения, которое составило 90 минут. Дальнейшее продолжение охлаждения нецелесообразно из-за завершения процесса замораживания всей массы мочи и, соответственно, образования максимально возможного окончательного объема гормонального концентрата.
Изучение удельного веса образцов гормонального концентрата и ЖПИГК показало, что удельный вес гормонального концентрата составляет, в среднем, 1033,8±3,7, при значениях исходной мочи, в среднем 1010,9±4,8 (р<0,05). Удельный вес ЖПИГК составил, в среднем, 1001,5±2,3 и был существенно ниже как исходной мочи, так и гормонального концентрата (n=10, р<0,05).
Для получения сухого остатка полученный на заявляемом устройстве гормональный концентрат и исходная моча сушились в сушильном шкафу при 100°С в течение 18 часов для полного удаления влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка проводилось на цифровых весах (GF-400, фирма "A&D .Тайвань"). В итоге из 100 мл гормонального концентрата после сушки было получено 1,251 гр. сухого вещества, что составляет в процентном соотношении - 1,25%. Итоговое взвешивание сухого остатка из 100 мл исходной мочи установило 1,116 гр. сухого остатка, что составляет в процентном отношении 1,2%. Сопоставление результатов взвешивания сухого остатка и их интерпретация доказывает следующее. Исходя из того, что для получения 100 мл гормонального концентрата требуется 5 л исходной мочи, то соответственно общее содержание сухого остатка необходимо учитывать также из расчета на 5 л исходной мочи. Таким образом, в пересчете на сопоставимые значения в 1 л, вес сухого остатка в гормональном концентрате составляет не 1,2%, а в 5 раз меньше, т.е. соответствует 0,24 гр. В этом случае, при сравнении с весом сухого остатка исходной мочи, также в пересчете на 1 л, вес ее сухого остатка составляет 11 гр, что более чем в 45,8 раз больше веса сухого остатка гормонального концентрата, полученного из 1 литра мочи. В конечном итоге, проведенные расчеты показывают, что процесс вымораживания в заявляемом устройстве приводит к образованию гормонального концентрата с одновременным существенным, практически 46 кратным снижением доли веществ, составляющих компоненты сухого остатка. Т.е. процесс вымораживания в заявляемом устройстве выполняет дополнительную функцию очистки гормонального концентрата от сопутствующих нежелательных компонентов, повышая качество и степень его очистки.
Результаты изучение веса и состава сухого остатка в исходной моче, прошедшей предварительно процесс вымораживания (после предварительной криоагрегации) и гормонального концентрата, полученного с применением заявляемого способа и устройства обобщены и представлены в таблице 2.
Исследования показали, что в процессе вымораживания (криоконцентрации) образуется две основные фракции. Одна из них, в виде замерзшей жидкости, после размораживания представляет ЖПИГК, преобладает по объему, слабо окрашена, практически свободна от основных стероидных гормонов, в частности, кортизола и эстрогенов. Вторая фракция жидкая - гормональный концентрат.
Основное количество, гормональных веществ, составляющих от 80% до 90% от их общего содержания в исходной моче, находится в гормональном концентрате, отличающегося цветом, в частности, от желтого до темно-коричневых оттенков и его насыщенностью. Исследования показали, что у человека, соотношение - объем гормонального концентрата/объем ЖПИГК находится в интервале 1:4-1:60, составляя, в среднем 1:50. Проведенные исследования содержания 4 различных стероидных гормонов в исходной моче, а также в гормональном концентрате и ЖПИГК показали существенные различия. Результаты представлены в таблице 3.
Как видно из представленных в таблице 3 данных, уровень эстрадола в гормональном концентрате (полученном из обычной мочи) превысил 90000 пг/мл и при исходных значениях 5805,1±324.4 пг/мл был практически в 15 раз выше показателей в исходной моче и 42 раза выше, чем в ЖПИГК.
Аналогично этому, из представленных в таблице 3 данных видно, что уровень кортизола при исходных значениях 430,9±26,4 мкг/сутки, в гормональном концентрате превысил 8000 мкг/сутки и был практически в 60 раз выше значений ЖПИГК.
Результаты исследования содержания других гормонов, таких как: тестостерон и прогестерон показали, что их концентрация в гормональном концентрате также существенно выше таковой, определяемой в исходной моче и ЖПИГК, причем эти изменения происходят после применения заявляемого способа и заявляемого устройства.
Дополнительные сведения, доказывающие эффективность предлагаемого устройства представлены в таблице 4.
Проведенные исследования содержания различных стероидных гормонов подтверждают существенные преимущества предлагаемого способа и устройства для получения гормонального концентрата, перед уже известными аналогами, поскольку высокие значения коэффициента концентрации и содержания гормонов в конечном продукте недостижимы при применении известных ранее способов.
Устройство работает следующим образом
Предварительно обработанная моча, после открытия электромагнитного клапана 7, установленном на горизонтальном отводе 5, поступает через коннектор 4, установленном на дне 3 корпуса 1 в емкость корпуса 1 после предварительного закрытия корпуса 1 внешней крышкой 2, и заливается до требуемого объема, ограниченного настройкой датчика уровня 16. После срабатывания датчика уровня 16 сигнал от него подается на внешне установленный блок управления, из которого подается сигнал на выключение (закрытие) электромагнитного клапана 7 на горизонтальном отводе 5. Одновременно с этим, включается фотооптический блок 15, направляющий во внешне установленный блок управления сигнал, значения которого принимаются за исходные для контроля состояния жидкости внутри концентратора 11. Также одновременно с этим включается внешне установленный блок охлаждения, который после включения запускает процесс охлаждения, заключающийся в том, что в трубчатый спиралевидный охлаждающий элемент 9 начинает поступать в проточном режиме охлаждающая жидкость с температурой -10°С. Формирующийся гормональный концентрат проходит через дренажные отверстия 12 в концентратор 11. По мере его накопления внутри концентратора 11, фотооптический блок 15 подает сигнал на завершение охлаждения, который сопровождается выключением блока охлаждения, включением (открытием) электромагнитного клапана 8 на горизонтальном отводе 6, и сливом гормонального концентрата в накопитель для дальнейшего применения. После слива гормонального концентрата, включается нагревательный элемент 10, который кратковременно нагревает стенку корпуса 1, предпочтительно, до 25°С для размораживания пристеночного льда. Процесс нагревания корпуса 1 регулируется датчиком температуры 17, установленным на наружной стороне дна 3, который подает сигнал на отключение нагревания при достижении требуемой температуры. При извлечении замороженной мочи, опорная пластина 13, установленная в нижней части свободно перемещаемого концентратора 11, способствует полному удалению льда из корпуса 1, при этом через отверстия 14, на опорной пластине остаток гормонального концентрата проходит на дно 3 корпуса 1 и в дальнейшем удаляется или смешивается с новой порцией мочи в следующем цикле.
Существенными отличительными признаками заявляемого устройства, от известных аналогов и прототипа, позволяющими решить поставленные задачи, являются следующие.
1. Существенным отличительным признаком заявляемого устройства является применение установленного с наружной стороны корпуса спиралевидного трубчатого охлаждающего элемента, который создает направленное горизонтально и перпендикулярно от периферии к центру, контролируемое охлаждение исходного продукта до предпочтительной температуры -10°С для плавного и равномерного образования льда.
2. Существенным отличительным признаком заявляемого устройства является применение установленного с наружной стороны корпуса и на горизонтальных отводах нагревательного элемента, который дает возможность кратковременного разогрева стенки корпуса и горизонтальных отводов для беспрепятственного удаления льда из устройства после каждого цикла, а также для размораживания образованного в процессе охлаждения в горизонтальных отводах льда для беспрепятственного выведения гормонального концентрата из устройства после завершения цикла.
3. Существенным отличительным признаком заявляемого устройства является применение в центре корпуса устройства концентратора для накопления гормонального концентрата, что позволяет сразу получить гормональный концентрат.
4. Существенным отличительным признаком заявляемого устройства является применение направляющих пластин установленных в концентраторе, которые позволяют создать, по меньшей мере, четыре независимых сектора концентрации в направлении от периферии к центру, что повышает равномерность охлаждения, ее направленность, и положительно отражается на стабильности, воспроизводимости и эффективности способа получения гормонального концентрата.
5. Существенным отличительным признаком заявляемого устройства является автоматизация его работы за счет применения применение технических средств контроля и управления процесса получения гормонального концентрата, таких как внешне установленный блок управления с микропроцессором, электромагнитные клапаны, датчики температуры, уровня жидкости, фотооптического блока, которые позволяют полностью автоматизировать цикл получения гормонального концентрата, и в комплексе представляют устройство модульного типа, которое при необходимости может быть интегрировано в единую технологическую линию с несколькими подобными устройствами, а также функционально расширено для одноразовой обработки до 10 кратно большего объема исходной мочи.
Преимущества заявляемого устройства
1. Не требует применения дорогостоящего хроматографического оборудования, гельфильтрации, ультрафильтрации, центрифугирования, ионообменных смол или других адсорбентов, отличающиеся существенной дороговизной, с одной стороны, и существенно меньшими объемами конечного продукта, с другой стороны.
2. Для получения гормонального концентрата требуется только 1 этап.
3. Возможность непрерывной работы в течение 24 часов.
4. Простота оборудования и надежность регулирования параметров процесса получения гормонального концентрата, а также воспроизводимость процесса.
5. Существенно лучшие показатели скорость/объем/качество.
6. Полная автоматизация производственного цикла.
7. Возможность применения одновременно нескольких устройств, интегрированных в одну технологическую линию в количестве, обеспечивающим потребности производства.
8. Промышленная технология получения гормонального концентрата.
9. Отсутствие необходимости применения химических реактивов на этапе концентрации и на предшествующих этапах обработки мочи.
10. Возможность применения устройства для лабораторно-аналитических целей.
11. Отсутствие необходимости применения импортного оборудования,
комплектующих, расходных материалов.
12. Возможность применения способа и устройства для других технологических процессов, напротив, требующих предварительного очищения исходного материала от нежелательных компонентов, в частности гормональных компонентов.
Примеры реализации способа и работы устройства
Пример 1.
Исследована и обработана моча практически здоровой женщины Д., 18 лет. Забор мочи проводился утром, натощак (получено 320 мл), а также дважды днем (получено 400 мл). Утренняя моча хранилась до применения при 1°С. Всего получено 720 мл мочи. Женщина находилась в середине второй фазы менструального цикла.
Исследования проводились на действующем опытном образце заявляемого устройства с соблюдением всех заявляемых параметров его работы.
В образцах исходной мочи, ЖПИГК и самого гормонального концентрата исследованы следующие показатели: цвет, оптическая плотность, удельный вес. Помимо этого анализировалось содержание гормонов, а именно: эстрадиола, кортизола, прогестерона и тестостерона.
Изучение динамики охлаждения показало, что процесс направленного постепенного плавного охлаждения мочи приводит к появлению гормонального концентрата темно-коричневого цвета, в то время как ЖПИГК светлая, прозрачная.
Оптическая плотность гормонального концентрата (в % от исходного) составила 98,5%. Изучение удельного веса образцов гормонального концентрата и ЖПИГК показало, что удельный вес гормонального концентрата составил 1030 при значениях исходной мочи 1010. Удельный вес ЖПИГК составил 1001 и был существенно ниже как исходной мочи, так и гормонального концентрата.
Результаты определения содержания стероидных гормонов представлены в таблице 5.
Как видно из данных на таблице 5 содержание всех без исключения исследуемых гормонов в гормональном концентрате было существенно больше по сравнению с исходной мочой.
Пример 2.
Исследована и обработана моча практически здоровой женщины И., 30 лет. Забор мочи проводился утром, натощак (получено 340 мл), а также трижды днем (получено 590 мл). Утренняя моча хранилась до применения при 1°С. Всего получено 930 мл мочи. Женщина находилась в середине второй фазы менструального цикла.
Исследования проводились на действующем опытном образце заявляемого устройства с соблюдением всех заявляемых параметров его работы.
В образцах исходной мочи, ЖПИГК и самого гормонального концентрата исследованы следующие показатели: цвет, оптическая плотность, удельный вес. Помимо этого анализировалось содержание гормонов, а именно: эстрадиола, кортизола, прогестерона и тестостерона.
Изучение образцов до и после работы устройства показало, что процесс направленного постепенного плавного охлаждения мочи приводит к появлению гормонального концентрата темно-коричневого цвета, в то время как ЖПИГК светлая, прозрачная. Оптическая плотность гормонального концентрата (в % от исходного) составила 98,3%.
Изучение удельного веса образцов гормонального концентрата исходной мочи и ЖПИГК показало, что удельный вес гормонального концентрата составил 1036, при значениях исходной мочи 1012. Удельный вес ЖПИГК составил 1002 и был существенно ниже как исходной мочи, так и гормонального концентрата.
Результаты определения содержания стероидных гормонов представлены в таблице 6.
Как видно из данных на таблице 6 содержание всех без исключения исследуемых гормонов в гормональном концентрате было существенно больше по сравнению с исходной мочой.
Литература
1. Ю. Анзорге «Способ и устройство для накопления и стабилизации коньюгированных эстрогенов из кобыльей мочи». Патент RU 2277241 С2, приоритет от 2001.07.26.
2. С.Т. Антипов, В.Ю. Овсянников. «Способ автоматического управления процессом вымораживания влаги в двухступенчатой вымораживающей установке». Патент RU №2235581. Приоритет 2012 г.
3. B.C. Асатиани. Новые методы биохимической фотометрии М.: Наука, 1965. - С. 507-510.
4. Б.И. Асатуров. «Способ получения протеогликана». Патент RU №2621311, приоритет от 9.12.2015.
5. Бондаренко В.Ф., Собина Н.А., Хейфец Л.Я., Слепцов Г.В.
Концентрирование органических примесей из водных растворов методом направленной кристаллизации/. // Проблемы охраны вод. Харьков, 1977. Вып.7. С. 25-29.
6. И. Бан, К.Г. Герлинг, Х-Й. Мюллер, Ш. Вахсманн. «Способ выделения обедненной неконьюгированными липофильными соединениями природной смеси коньюгированных лошадиных эстрогенов». Патент RU 2329818. Приоритет 2003.10.18.
7. А.Б. Бланк, Чепурная В.Г. Кристаллизационное аналитическое концентрирование микрокомпонентов. Концентрирование примесей лития и рубидия при нормальной направленной кристаллизации иодида цезия в водных растворах / / Журн. аналит. химии. 1974. Т. 29, №4. С. 1006-1008.
8. И.В. Галяутдинов, В.Н. Одиноков, У.А. Балтаев, А.З. Халилова, У.М. Джемилев. «Способ получения концентрата экдистероидов и экдистерона из растительного сырья». Патент РФ 2160115. Приоритет от 1998.
9. Г.С. Гусакова, С.Н. Евстафьев. «Концентрирование сока и виноматериала вымораживанием». Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. №2, 2012.
10. Х.-Х. Раше, К. Вильбрандт, З. Баншбах. «Способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов». Патент RU 2351607 С2.
11. Х.-Х. Раше, О. Рупп. «Способ выделения эстрогенов из мочи кобыл». Патент RU 2308955. Приоритет 2001.12.01.
12. С.Н. Москвина, В.Я. Арион, Ю.М. Лопухин. «Способ получения иммунологически активного вещества из мочи млекопитающих, в том числе и человека, обладающего биологической активностью сывороточного тимического фактора». Патент РФ 2139065. Приоритет от 20.10.1997 г.
13. О.И. Квасенков, Г.И. Касьянов, И.И. Квасенков. «Способ концентрирования водных растворов». Патент RU 2060774 C1. Опубликован: 27.05.1996.
14. А.В. Карякин, Е.В. Гамазина, В.Г. Юсупов, Г.Б. Кудашева, Ф. Кулагин. «Способ получения сырца гонадотропина хорионического». Патент РФ 2071334. Приоритет от 11.01.1993.
15. Г.И. Касьянов, Ю.С. Беззаботов, Ю.В. Гордиенко, М.И. Лугинин. «Способ концентрирования жидких пищевых продуктов в непрерывном потоке». Патент RU 2294 644 С1. Приоритет от 2005.06.06.
16. А.Н. Киргинцев, Пыльнева Н.А. Концентрирование примесей при направленной кристаллизации // Журн. аналит. химии. 1968. Т. 23. С. 336.
17. Наруми Масаки, Кудо Йосиаки. «Способ получения протеогликана». Патент РФ 2401839. Приоритет от 2007.02.09.
18. В.Н. Одиноков, И.В. Галяутдинов, Н.А. Веськина, Е.А. Яшина. «Способ получения α-экдизона». Патент RU 2246966. Приоритет 2003.11.04.
19. Л. Пап. Концентрирование вымораживанием. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. 96 с.
20. О.М. Розенталь. Связь структурных свойств ионных растворов с льдообразованием / / Журн.  структ. химии. 1973. Т. 14, №5. С. 797-801.
21. А.А. Русинова, Ю.М. Полежаев, А.И. Матерн. Концентрирование растворов вымораживанием. Аналитика и контроль. №4.1999. С. 4-10.
22. Д.А. Скрипин. «Способ и устройство концентрирования растворов вымораживанием». Патент RU 2491976.
23. А.С. Стадник, Ю.М. Дедков. Вымораживание как метод концентрирования примесей в водах / / Химия и технология воды. 1981. Т. З, №3. С. 227-233.
23. Хайрутдинов Р.Ф., Замараев К.И. Изучение структуры замороженных растворов при помощи парамагнитной метки // Изв. АН. СССР. Сер. хим. 1970. №7. С. 1524-1528.
24. Хефтман Э., Биохимия стероидов, пер. с англ., М., 1972.
25. Gross G.W. The Workman-Reynolds effect and ionic transfer processes at the ice solution interface //J.Geophys. Res. 1965. V. 70, №10. P. 2291-2300.
26. Black A.P., Christman R.F. Chemical characteristics of fulvic acids // J. Amer. Water Works. Assoc. 1963. V. 55, №8. P. 897-912.
27. Kobayashi S., Lee G.F. Freeze concentration of dilute aqueous solutions / / Anal. Chem. 1964. V. 36, №11. P. 2197-2198.
28. Baker R.A. Trace organic contaminant concentration by freezing. I. Low inorganic aqueous solution / / Water Res. 1967. V. 1, №1. P. 61-77.
29. Baker R.A. Trace organic contaminant concentration by freezing. II. Inorganic aqueous solution //Water Res. 1967. V. 1, №1. P. 97-113.
30. Baker R.A. Trace organic contaminant concentration by freezing. III. Jcewashing // WaterRes. 1969. V. 3, №6. P. 717-730.