Молекулярно-генетическое типирование Helicobacter pylori: прикладные аспекты диагностики и лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки

3-е МЕСТО В КОНКУРСЕ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ НОГР ЗА 2008 г.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ HELICOBACTER PYLORI: ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ

Барышникова Н.В.

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И.И. Мечникова

Барышникова Наталья Владимировна

195067 Санкт-Петербург, пр. Маршала Блюхера, 61-1-89

Тел.: 8 (921) 301 3307

РЕЗЮМЕ

В данной статье изучены генетические особенности Helicobacter pylori у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, а также проведена сравнительная оценка генетических особенностей данного микроорганизма при различных Helicobacter pylori-позитивных состояниях. В статье обоснована необходимость проведения генетического типирования Helicobacter pylori для выявления потенциальной вирулентности микроорганизма, устойчивости штамма к кларитромицину, что позволяет определять прогноз течения заболевания и осуществлять индивидуальный подбор терапии.

SUMMARY

In this article genetic features of Helicobacter pylori in duodenal ulcer patients are studied, also a comparative estimation of this microorganism's genetic features is made in various Helicobacter pylori-positive conditions. In the article necessity of carrying out genetic typing of Helicobacter pylori for revealing potential microorganism virulence, strain resistance to claritromycin is proved that allows to define a forecast of a current of disease and to carry out individual selection of a therapy.

ВВЕДЕНИЕ

Основы инфекционной теории развития заболеваний гастродуоденальной зоны были заложены Уоренном и Маршаллом в 1983 году с момента открытия патогенетической роли Helicobacter pylori в развитии хронического гастрита [1] и язвенной болезни [2; 3]. На сегодняшний день доказано, что персистенция инфекции Н. pylori в организме человека может являться одним из пусковых факторов в возникновении MALT-лимфомы, предраковых изменений верхних отделов желудочно-кишечного тракта (атрофия, кишечная метаплазия) и рака желудка [4; 5]. На протяжении более 20 лет данный микроорганизм интенсивно изучается учеными во всем мире, созданы европейская и российская группы по изучению Н. pylori, однако до сих пор некоторые вопросы не решены до конца и носят дискуссионный характер. Существуют определенные сложности в диагностике данного возбудителя, до сих пор не разработан «золотой стандарт» диагностики. Вместе с тем эффективность эрадикаци-

онной терапии в России в основном ниже (30-60%) по сравнению с допустимым порогом, когда эффективность эрадикации должна быть выше 80% [6; 7].

Использование самых современных методов диагностики Н. pylori подразумевает применение методов молекулярно-генетического типирования микроорганизма с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эффективность и достоверность результатов данного метода высока, так как для идентификации Н. pylori достаточно единичных микроорганизмов или даже фрагментов микробных клеток, поскольку выявление возбудителя осуществляется на уровне ДНК. Детекция Н. pylori проходит посредством определения гена уреазы, который присутствует у всех штаммов данного микроорганизма. Вместе с тем с помощью ПЦР можно не только диагностировать отсутствие или наличие микроба, но и проводить более глубокий генетический анализ с детекцией генов острова патогенности Н. pylori, кодирующих синтез факторов патогенности микроорганизма, например cagA, vacA, а также определять наличие генов, кодирующих развитие устойчивос-

о

Рис. 1. Сравнительная характеристика особенностей cag статуса H. pylori у больных ЯБДК, ХГД и здоровых добровольцев, инфицированных H. pylori: по оси абсцисс — гены группы cag острова патогенности H. pylori; по оси ординат — частота встречаемости генов, %

* — р < 0,05.

ти к кларитромицину и метронидазолу. Последнее особенно актуально в связи с тем, что определение чувствительности Н. pylori к антибиотикам бактериологическим методом очень сложно и трудоемко.

Цель работы — оценить возможности молекулярно-генетического метода для диагностики и выбора тактики лечения Н. pylori-ассоциированной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) на примере пациентов Санкт-Петербурга.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под наблюдением находился 91 человек. Все обследуемые были разделены на три группы: в 1-ю группу вошли 38 пациентов с ЯБДК, во 2-ю группу — 39 пациентов с хроническим гастродуоденитом (ХГД), 3-ю группу (группа контроля) составили 14 практически здоровых добровольцев, инфицированных Н. pylori. Всем обследуемым проводилась фиброгастродуоде-носкопия с взятием биоптатов из антрального отдела желудка для верификации Н. pylori с помощью быстрого уреазного теста и проведения ПЦР с детекцией генов острова патогенности Н. pylori: ureC, cagA, cagC, cag£, cagH, что выполнялось на базе научно-исследовательской лаборатории «Диагностика». Для исследования нами были выбраны гены группы cag (citotoxin associated genes), так как они кодируют синтез наиболее агрессивных факторов патогенности Н. pylori — цитотоксинов. Кроме того, у пациентов с ЯБДК с помощью ПЦР проводилось определение генов устойчивости к кларитромицину (А2143С, A2142G, Т2717С).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При анализе особенностей cag-статуса Н. pylori у больных ЯБДК, ХГД и здоровых добровольцев, инфицированных к pylori, было выявлено, что

у пациентов с ЯБДК частота встречаемости всех исследуемых генов группы cag острова патогенности Н. pylori была достоверно выше, чем у больных с ХГД и здоровых добровольцев. В свою очередь, у больных ХГД частота встречаемости большинства исследуемых генов cagA, cagC, cagH была достоверно выше, чем у здоровых добровольцев (рис. 1).

Известно, что увеличение количества генов острова патогенности Н. pylori сопровождается повышением вирулентности микроорганизма. В связи с этим важным явилось определение частоты встречаемости различных комбинаций генов группы cag, а не только оценка наличия или отсутствия отдельных генов острова патогенности Н. pylori. При анализе полученных результатов установлено, что совокупность генов группы cag достоверно чаще встречается при язвенной болезни, тогда как у здоровых добровольцев преобладают штаммы Н. pylori, содержащие только ген уреазы. Пациенты с ХГД занимают промежуточное положение (рис. 2).

Обращало на себя внимание, что у пациентов с ЯБДК в ряде случаев не определялся ген уреазы (ureQ, тогда как у этих же пациентов результаты анализа в отношении гена cagA были положительными (рис. 3).

Установленный факт может свидетельствовать о том, что изучаемый микроорганизм обладает чрезвычайно высокой генетической изменчивостью. Кроме того, на основании данного факта можно сделать вывод, что при проведении молекулярно-генетической диагностики хеликобактериоза необходима детекция не одного, а двух и более генов Н. pylori для получения максимально точного и достоверного результата.

£ё

X а Ш ЕЕ

X Є

>iL

х Е Зс

И і/ о

Ч с

О >

2

и

а

>

V

X

а

80

60

40

20

^8тЗ-

42.9*

8.7*

7.1*

24.4

29.1

7.7 87 7.1

24.4

2.3

20.4

ureC сад

игеС сад

ureC сад

ureCcag

ureC сад

ЯБДК  ХГД  Здоровые добровольцы

Рис. 2. Частота встречаемости комбинаций генов Н. pylori ureC и группы cagу больных ЯБДК, ХГД и здоровых добровольцев, инфицированных Н. pylori:

По оси абсцисс — комбинации генов: ureC cag(4) — наличие гена ureC и всех четырех исследуемых генов группы cag; ureC cag(3) — наличие гена ureC и каких-либо трех исследуемых генов группы cag; ureC cag(2) — наличие гена ureC и каких-либо двух исследуемых генов группы cag; ureC cag(l) — наличие гена ureC и какого-либо одного исследуемого гена группы cag; ureC cag(O) — наличие гена ureC при отсутствии всех исследуемых генов группы cag.

По оси ординат — частота встречаемости комбинаций генов, %

* — р < 0,05.

Использование антибиотиков в целях эради-кации зачастую приводит к развитию вторичной устойчивости H. pylori к антибактериальным препаратам. Согласно постулатам 3-го Маастрихтского соглашения, эталонной по-прежнему остается схема терапии 1-й линии, включающая ингибитор протонной помпы, амоксициллин, кларитромицин. Следовательно, определение чувствительности H. pylori к кларитромицину является актуальным для индивидуального подбора терапии, а использование для этой цели молекулярно-генетического метода позволяет ускорить и упростить диагностическую процедуру по сравнению с бактериологическим методом. Полученные нами результаты свидетельствуют о крайне высокой устойчивости H. pylori к кларитро-мицину у пациентов Санкт-Петербурга (рис. 4).

В связи с этим у данной категории больных необходимо либо проводить типирование Н. pylori с детекцией генов, кодирующих устойчивость к кла-ритромицину, либо избегать назначения кларитро-мицина в схемах антихеликобактерной терапии в 1-й линии, заменяя его другими антибактериальными препаратами, препаратами коллоидного субцитрата висмута, дополнением стандартных схем антихеликобактерной терапии пробиотиками [8], в том числе в группах пациентов с высоковирулентными штаммами Н. pylori.

ВЫВОДЫ

Молекулярно-генетическое типирование на сегодняшний день является одним из наиболее быстрых,

100

80

%

60

40

20

60

40

чувствительные устойчивые штаммы Н. pylori штаммы Н. pylori

і

Рис. З. Частота встречаемости генов ureC и cagA H. pylori у больных ЯБДК в Cанкт-Петербурге: по оси абсцисс — гены H. pylori; по оси ординат — частота встречаемости генов, %

Рис. 4. Устойчивость Helicobacter pylori к действию кла-ритромицина у больных ЯБДК в Cанкт-Петербурге: по оси абсцисс — штаммы H. pylori; по оси ординат — частота встречаемости штаммов, %

информативных и точных методов диагностики инфекции Н. pylori. Преимущество этого метода заключается в возможности оценки генетических особенностей микроорганизма при минимальном количестве генетического материала. Генетические характеристики Н. pylori и функции отдельных генов данного микроорганизма в настоящее время интенсивно изучаются. Во многих исследованиях установлено, что гены группы cag являются наиболее важными в формировании патогенности Н. pylori. В результате проведенной нами работы установлено, что у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки выявляются более патогенные штаммы Н. pylori, чем у больных хроническим гастродуоденитом здоровых добровольцев; наиболее часто выявляемые гены острова патогенности Hp в Санкт-Петербурге: при хроническом гастродуодените — cagA и cagH, при язвенной болезни — cagA и cagE; отсутствие гена ureCу ряда пациентов в Санкт-Петербурге может объясняться высокой

изменчивостью H. pylori. Следовательно, при проведении ПЦР оптимальной является детекция как гена ureC, так и гена cagA для улучшения диагностики инфекции.

Совершенствование методов молекулярно-генетической идентификации H. pylori является необходимым условием оптимизации подходов к комплексной диагностике и дифференцированной терапии H. pylori-ассоциированных заболеваний. Вместе с тем является целесообразным определять не только наличие или отсутствие микроорганизма, но и проводить его молекулярно-генетическое типирование, в частности определение cag-статуса и чувствительности к кларитромицину, для определения прогноза течения заболевания, последующего назначения оптимальной терапии и определения тактики ведения больных с заболеваниями, ассоциированными с H. pylori.

X

X а U Е Т £ >i£ х I

1 С И іf а

N С 0>

S

и

a

>

V

X

О

ЛИТЕРАТУРА

1. Warren J.R., Marshall B.J. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in chronic gastritis // Lancet. — 1983. — Vol. 1. — P. 1273-1275.

2. ГригорьевП.Я.,Яковенко А.В. Клиническая гастроэнтерология. — М.: Мед. информагентство, 2001. — 704 с.

3. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. — М.: ИД Медпрактика, 2003. — 412 с.

4. Montalban C., ManzanalA., Boixeda D. etal. Treatment of low-grade gastric MALT lymphoma with Helicobacter pylori eradication. Follow-up of the histological and molecular response // Med. Clin. (Bare), 1998. — Vol. 110, № 2. — P. 41-44.

5. Chuan Z., Nobutaka Y., Wu Y.-L. et al. Helicobacter pylori infection, glandular atrophy and intestinal metaplasia in superficial gastritis, gastric erosion, erosive gastritis, gastric ulcer and early gastric cancer // World J. Gastroenterol. — 2005. — Vol. 11, № 6. — P. 791-796.

6. Жебрун А.Б., Александрова B.A., Гончарова Л.Б. и др. Диагностика, профилактика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori-инфекцией: Пособие для врачей. — СПб., 2002. — 44 с.

7. Maastricht-3 Guidelines for Helicobacter pylori infection // 13th United European Gastroenterology Week. — Copenhagen, 200S.

S. Оиманенков В.И., Захарова H.B., Боваева Д.И. и др. CagA-статус Helicobacter pylori и эффективность эрадикационной терапии // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. — 2004. — № 1. — С. 11.