Влияние мезенхималыных стромалыных клеток и мобилизации стволовых клеток костного мозга на развитие нефросклероза

Влияние мезенхималычых стромалычых клеток и мобилизации стволовых клеток костного мозга на развитие нефросклероза

С.Н. Белогородцев 1, Я.Ш. Шварц 2, ПН. Филимонов 3, Г.В. Селедцова 1

1 Учреждение РАМН НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск

2 ГУ НИИ Терапии СО РАМН, Новосибирск

3 ФГУ Новосибирский НИИ Туберкулеза МЗСР РФ, Новосибирск

The effect of mesenchymal stromal cells and the mobilization of stem cells in bone marrow on the development of nephrosclerosis

S.N. Belogorodtsev 1, Ya.S. Schvarz 3, P.N. Filimonov 3, G.V. Seledtsova 1 1 State Research Institute of Clinical Immunology Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk 3 State Scientific-Research Institute of Therapy Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk 3 Novosibirsk Research Institute of Tuberculosis, Novosibirsk

В экспериментах на мышах в модели хронического рабдо-миолизного поражения почек исследовалось влияние трансплантации сингенных мультипатентных мезенхимальных стро-мальных клеток (ММСК) и мобилизации гемопоэтических клеток костного мозга (КМ] на течение нефропатии. Показано, что оба этих воздействия улучшают экскреторную функцию почек и препятствуют фибросклеротической трансформации почечной ткани. В то же время, трансплантация ММСК практически не влияет на выраженность мононуклеарной инфильтрации почек и на цилиндрообразование, но супрессирует системные провоспалительные реакции. Мобилизация КМ значительно увеличивает моноцитарную инфильтрацию и образование цилиндров, но практически не влияет на провоспа-лительную реактивность иммунной системы. Сделан вывод о высокой перспективности обоих подходов для разработки новых методов лечения хронических прогрессивных нефропатий.

Ключевые слова: нефросклероз, мезенхимальные стро-мальные клетки, мобилизация костного мозга.

The effects of autologous mesenchymal stromal cell (MSG1 transplantation and of bone marrow (BM] hematopoietic cells mobilization on the course of rhabdomyolysis-induced nephropathy in mice were studied. Both MSC transplantation and mobilization of hematopoietic BM cells were demonstrated to improve function and to inhibit fibrotic transformation of the kidney. At the same time MSC transplantation had no impact on the levels of mononuclear infiltration and on the casts formation, but decreased systemic proinflammatory responsiveness. Mobilization of BM hematopoietic cells, on the contrary, enhanced the levels of mononuclear infiltration and casts formation in renal tissue, but did not alter the systemic proinflammatory responsiveness. Both MSC transplantation and BM hematopoietic cells mobilization were concluded to be the most promising approaches to the development of novel therapeutic methods to treat progressive nephropathy.

Key words: nehprosclerosis, mesenchymal stromal cell, hematopoietic cell mobilization.

Нефросклероз (НС) является универсальным и необратимым морфологическим признаком разнообразных хронических поражений почек, во многом определяющим прогноз и исход заболевания [1, 2]. Участие в развитии НС большого количества этиологических и патогенетических факторов, разнообразие молекулярных механизмов, часто на фоне продолжающегося воздействия патогена, приводит к низкой эффективности лекарственной терапии [2—5]. В связи с этим, продолжаются исследования, направленные на разработку качественно новых подходов к лечению склеро-зирующих заболеваний почек, в том числе с использованием методов клеточных биотехнологий.

Трансплантация мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга оказывает положительное воздействие на функцию и морфологию почек в экспериментальных моделях острой почечной недостаточности [6—10]. В отношении хронического поражения почек мнения об эффектах трансплантации ММСК не столь однозначны. Некоторые авторы полагают, что за счет выработки гепатоцитарного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста 1, эпидер-мального фактора роста и пр. [8—10], а также, возможно, непосредственного хоуминга и трансдифференцировки в тубулярные эпителиоциты [7, 11, 12], можно объяс-

e-mail: S.Belogorodtsev@mail.ru

нить благоприятное действие ММСК на регенерацию почки. Другие исследователи подчеркивают возможность ММСК трансдифференцироваться в миофибробласты, вырабатывать профиброзные факторы роста и потенцировать склеротические процессы в почке [3, 13].

Многочисленными исследованиями роли неспецифического иммуновоспалительного ответа в остром поражении почек показана способность рекрутированных в орган клеток иммунной системы генерировать активные формы кислорода и азота, секретировать провоспалительные медиаторы и цитокины, лизосо-мальные гидролазы и пр., тем самым вызывая вторичную альтерацию и деструкцию почечной паренхимы [ 14—17]. Однако на фоне текущего склеротического процесса выход в межклеточный матрикс активных металлопротеиназ может замедлять депонирование коллагена в интерстиции [3, 18]. В этих условиях влияние ММСК, обладающих иммуномодулирющими свойствами [19, 20], остается в значительной степени невыясненным.

Мобилизация костного мозга (КМ) приводит к выходу в периферическую кровь, кроме стволовых клеток, большого количества клеток-предшественниц лимфоци-тарного и миелоидного ростков [21—23]. Поступая в очаг «хронического воспаления», клетки специфической

+

и неспецифической иммунной системы способствуют альтерации и могут препятствовать развитию фиброза.

Но все эти теоретические соображения нуждаются в экспериментальном подтверждении. В связи с этим, в настоящем исследовании мы изучили влияние трансплантации аутогенных МСК и мобилизации КМ на функцию почек и развитие склеротических процессов на модели хронического поражения почек.

Материал и методы

Исследование было проведено на 36 линейных мышах C57BI/6 возрастом 3^4 мес. и весом 18^20 г. Хроническое поражение почек индуцировали трехкратным внутримышечным введением 50% глицерола в дозе 4,6 мг/кг с интервалом в 7 сут. Получаемый при этом рабдомиолиз оказывает смешанное (ишемичес-кое, токсическое, ретенционное) воздействие на почки, с преимущественным поражением эпителия проксимальных канальцев [24—26]. В предварительных экспериментах мы показали, что подобное воздействие вызывает стойкое, хотя и незначительное, повышение уровня мочевины в сыворотке крови и разрастание соединительной ткани, преимущественно в интерсти-ции. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 1977 года).

ММСК получали из костного мозга сингенных мышей путем адгезии к культуральному пластику [6—8]. Костный мозг, полученный из бедренных и больше-берцовых костей, суспендировали в RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, США) с 10% инактивированной сыворотки плодов коров (HyClone, Н. Зеландия). Строму костного мозга разрушали механическим способом стеклянным гомогенизатором, дважды отмывали и помещали в культуральные чашки (Corning, USA) в полной среде на основе RPMI 1640. Неприлипающую фракцию клеток костного мозга удаляли при сменах культуральной среды, начиная с 3-х сут. МСК имели классический фибробластоподобный фенотип и образовывали сплошной монослой к 4 нед. культивирования. Снятие ММСК проводили 0,25% раствором версен-трипсина (БиолотТ, Россия), дважды отмывали от культуральной среды и ресуспендировали в физиологическом растворе. Внутривенное введение клеток осуществляли в ретроорбитальный синус в количестве 1 млн на мышь в 200 мкл физиологического раствора на 26 сут. эксперимента (через 12 сут. после последней инъекции глицерола).

Мобилизацию клеток костного мозга осуществляли с 26-х сут. эксперимента в течение 7 сут. В первые 5 сут. ежедневно подкожно вводили 20 ЕД GM-CSF и 2 ЕД эритропоэтина (Sigma-Aldrich, USA), затем 2 сут. — 2 ЕД эритропоэтина [21, 22].

В качестве контроля использовали группу мышей, которым вместо глицерола аналогичным образом вводили физиологический раствор.

Выведение мышей всех групп проводили путем дислокации шейных позвонков на 38-е сут. эксперимента. Функцию почек оценивали по уровню мочевины сыворотки крови.

Морфологические изменения почечной ткани оценивали полуколичественно, преимущественно в кортикальной зоне. Для этого на гистологических срезах толщиной 5^7 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли выраженность мононуклеарной инфильтрации (по 4-балльной шкале: 0 — отсутству-

ет, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — значительная) и образование цилиндров (по 3-балльной шкале: 0 — отсутствуют, 1 — умеренное количество, 2 — большое количество). Выраженность фиброзирования в гломе-рулярном и интерстициальном компартментах оценивали на срезах, окрашенных сириусом красным, с использованием 4-балльной шкалы (0 — количество коллагена визуально соответствует нормальной почке, 1 — в склеротическую трансформацию вовлечено до 10 % почечной ткани/клубочков, 2 — до 25%, 3 — до 50% и более). Препараты исследовали двойным слепым методом (при морфологической оценке и статистической обработке не имели информации о группе животных и способе воздействия), оценивали не менее 10 полей зрения, выбранных случайным образом, при увеличении х400. Результаты подсчитывали как среднее значение исследуемого показателя в каждой экспериментальной группе.

Провоспалительную коммитированность иммунной системы оценивали по продукции окиси азота (N0) перитонеальными макрофагами [26, 27]. Для этого использовали клетки перитонеального лаважа. Макрофаги выделяли путем прилипания к пластику при культивировании в 24-луночном планшете в бессывороточной среде RPMI 1640 в течение 24 ч. После удаления неадгезировавшихся клеток, макрофаги дополнительно культивировали еще 48 ч в присутствии или без добавления 100 нг/мл ЛПС. Продукцию N0 оценивали по аккумуляции нитритов в культуральной среде колориметрическим методом с использованием реактива Гриеса. Последний готовили ex tempore, смешивая равные объемы 1 % сульфаниламида в 30% уксусной кислоте и 0,1% N-(1-нафтил)этилендиамид дигидрохлорида в 60% уксусной кислоте. Культураль-ную среду от каждого образца смешивали в равных объемах с реактивом Гриеса в 96-луночном планшете, светопоглощение при длине волны 570 нм оценивали с помощью микропланшетного ридера LB 941 TriStar. Концентрацию нитритов вычисляли с использованием стандартной калибровочной кривой.

Результаты представлены в виде среднего арифметического и его стандартного отклонения. В связи с отсутствием нормального распределения (тест Колмогорова — Смирнова), различия в группах определяли с использованием критерия Манна — Уитни, и считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

В группе с глицерол-индуцированным рабдомиоли-зом на 38-е сут. эксперимента отмечалось повышение уровня мочевины сыворотки крови (7,86+0,6 против 6,1+1,0 мМоль/л у интактных мышей, р<0,05). В группах животных, которым выполняли трансплантацию МСК (Гл + ММСК), либо мобилизацию КМ

(Гл + КМ), содержание мочевины сыворотки было на

++

мМоль/л соответственно) и отличалось (р<0,05) от этого показателя группы с глицеролом (Гл) (рис. 1).

Полученные результаты по исследованию нарушений функции почек подтвердились данными гистологического исследования. Трехкратное внутримышечное введение глицерола вызывало выраженные фиброзные измененияв межканальцевом интерстиции и в пери-васкулярных зонах. Отмечены также признаки гломе-рулосклероза (рис. 2Б) в части клубочков. В группах животных, которым выполняли трансплантацию ММСК, либо мобилизацию КМ, наблюдали качественно иную

оригинальные исследования

картину (рис. 2В и 2Г): избыточный коллагеногенез был слабо выражен и локализовался преимущественно в перитубулярной зоне; в целом гистологическая картина была сходна с таковой у интактных мышей (рис. 2А).

Уровень мочевины сыворотки крови

6-- -- --

-5 5 ^

.0

§ 42 3 -2 1 -

О 1---,---,---,---,

Инт Гл Гл+ММСК Гл+МобКМ

Группы

Рис. 1. Уровень мочевины сыворотки крови мышей на 38-е сут: Инт - контрольная группа; Гл - группа с глицерол-индуцированным рабдомиолизом; Гп+ММСК - группа опыта с трансплантацией ММСК; Гп+МобКМ - группа опыта с мобилизацией костного мозга

При изучении характера распределения и клеточного состава инфильтратов почечной ткани, а также ка-нальцевых повреждений выявлено следующее (рис. 3). В группе с трехкратным внутримышечным введением глицерола на 38-е сут. отмечалась умеренная диффузная и очаговая мононуклеарная инфильтрация интерстиция почек. Гранулоцитов на этом сроке эксперимента практически не наблюдалось. Канальцевые повреждения у животных всех групп были представлены практически исключительно плотными цилиндрами в просветах части собирательных трубочек, дистрофические изменения эпителия были минимальными и не различались между группами. Трансплантация ММСК не влияла на инфильтрацию и цилиндрообразование: их выраженность была выше, чем у интактных мышей, но не отличалась от группы рабдомиолизного контроля. В то же время в группе с мобилизацией КМ обнаружена значительная очаговая инфильтрация, преимущественно в интерстиции коркового слоя почки. Соответственно, больше было и количество цилиндров.

О функциональном состоянии иммунной системы судили по спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции окиси азота перитонеальными макрофагами (рис. 4). Было установлено, что в контрольной (бесклеточной) инкубационной среде уровень нитритов был недетектируемым, а уровень спонтанной генерации N0 перитонеальными макрофагами во всех группах животных был на низком уровне (от 4,9 до 10,5) и статистически не различался между группами.

Рис. 2. Фиброзные изменения в почках:

А - интактный контроль; Б - рабдомиолиз; В - рабдомиолиз + трансплантация ММСК; Г - рабдомиолиз + мобилизация КМ. Окраска пикросириусом красным. Ув. х400

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 2, 2010

Оригинальные исследован

Уровни

инфильтрации и цилиндрообразования

Инфильтрация  Цилиццрообразование

1,5 1

0,5 0

П ГТН

Инт

Гл Гл+ММСК Гл+МобКМ

Группы

Рис, 3, Выраженность мононуклеарной инфильтрации почечной ткани и цилиндрообразования на 38-е сут. эксперимента

Продукция окиси азота перитонеальными макрофагами

120

к от 100

те

лк 80

н

л м 60

о 40

кг

м 20

0

а

Инт

Гл Гл+ММСК Гл+МобКМ

Группы

без Л ПС по Л ПС

Рис. 4. Продукция оксида азота перитонеальными макрофагами

Стимуляция макрофагов ЛПС приводила к росту продукции N0 в группах интактных мышей и мышей с рабдомиолизом до 79,6 мкг/5х105 клеток и 87,3 мкг/ 5x105 клеток соответственно, причем разница между этими группами не значима. Трансплантация ММСК вызывала снижение ЛПС-стимулированной продукции N0 в 2,5 раза по сравнению с интактным контролем и в 2,7 раза по сравнению с рабдомиолиз-контролем (р<0,05).

В то же время ЛПС-стимулированная генерация N0 в группе с мобилизацией КМ не отличалась от таковой в обеих контрольных группах.

Обсуждение

В настоящей работе продемонстрировано, что и трансплантация ММСК, и мобилизации КМ в модели хронической глицерол-идуцированной рабдомиолизной нефропатии вызывают улучшение функции почек и отчетливое уменьшение фиброзных изменений. Принципиально данное явление можно объяснить двумя различными механизмами — хоумингом и трансдиффе-ренцировкой введенных клеток, либо цитокин-опосре-дованным влиянием на микроокружение в ткани почки. В отношении хоуминга ММСК в поврежденные ткани и их последующей трансдифференцировки в последнее время высказывается много сомнений [6, 8—10]. Но именно на модели рабдомиолизного поражения с использованием различных меток были получены отчет-

ливые доказательства возможности такого явления [11]. В моделях ишемии-реперфузии и токсического воздействия на почку трансплантированные ММСК появлялись в почке только транзиторно в первые часы после введения [6, 10]. Тем не менее, трансплантация ММСК оказывала отчетливое положительное влияние как на морфологию, так и на функцию почек. При более детальном изучении в этих исследованиях было обнаружено усиление пролиферативной активности и уменьшение апоптоза резидентных тубулярных эпите-лиоцитов, что нашло свое объяснение в активной продукции ММСК факторов роста и цитокинов с проли-феративным, антиапоптотическим и ангио-васкулоген-ным действием.

Мы предполагаем, что в наших экспериментах действуют оба этих механизма, однако для проверки данного предположения необходимы дальнейшие исследования. Следует отметить, что показанные в настоящей работе антифиброзные эффекты ММСК свидетельствуют против мнения ряда авторов [3, 13] о возможной серьезной роли трансдифференцировки ММСК в ми-офибробласты при нефропатиях. В этом случае мы бы наблюдали усиление процессов фиброгенеза в почке.

Мнения об эффектах мобилизации КМ еще более противоречивы. В некоторых публикациях обсуждают потенциально благоприятное влияние выхода в кровеносное русло стволовых гемопоэтических клеток и их хоуминга [21, 23]. В других публикациях вероятность трансдифференцировки гемопоэтических клеток в почечные эпителиоциты вызывает еще больше сомнений, чем этот процесс в отношении ММСК. В то же время выход в циркуляцию большого количества гранулоци-тарных и моноцитарных клеток системы кроветворения вызывает потенцирование повреждающего воздействия на почки, что показано на различных моделях острой почечной недостаточности [22]. Изменения цитокинового спектра в ткани почки при мобилизации КМ изучены мало и только в моделях острого поражения. В модели хронического рабдомиолизного поражения почек нами обнаружено благоприятное воздействие мобилизации КМ на функцию и морфологию. Мы склонны объяснять этот феномен не хоумингом и трансдифференцировкой, а скорее усилением локальных провоспалительных реакций и выходом в почечное микроокружение протеолитических ферментов, в том числе металлопротеиназ, деградирующих депозиты коллагена.

Участие иммунной системы в патогенезе хронического поражения почек, с нашей точки зрения, заслуживает особого рассмотрения. Глицерол-индуцированная, а также, в меньшей степени, другие модели острого поражения почек, характеризуются местной неспецифической воспалительной реакцией и системным про-воспалительным ответом [26]. В предварительных экспериментах после однократного внутримышечного введения глицерола и заборе материала в ранние сроки мы обнаруживали выраженную гранулоцитарную инфильтрацию интерстиция почек, вплоть до формирования микроабсцессов. Между тем, участие клеток иммунной системы в патогенезе почечной патологии имеет фазовый характер. В модели, использованной в данной работе, на 38-е сут. эксперимента инфильтрация была выражена умеренно и состояла исключительно из мононуклеаров. На этом фоне трансплантация ММСК не влияла на инфильтрацию, а мобилизация КМ ее значительно усиливала. В то же время, оценка ЛПС-стимулированной продукции N0 перитонеальными

макрофагами показала, что трансплантация ММСК снижает системную провоспалительную реактивность. Это согласуется с литературными данными об имму-носу-прессивном эффекте ММСК [19, 20].

Результаты данной работы позволяют утверждать, что и трансплантация ММСК, и мобилизация КМ —

это крайне перспективные подходы к лечению хронических поражений почек, сопровождающихся нефрос-клерозом. Вместе с тем, очевидно, что необходимы дальнейшие исследования по изучению межклеточных взаимодействий и молекулярных механизмов, лежащих в основе этих эффектов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Chatziantoniou С., Dussaule J-C. Insight into the mechanisms of renal fibrosis: is it possible to achieve regression? Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2005; 289: 227-34.

2. Yu H.T. Progression ofchronic renal failure. Arch. Intern. Med. 2003; 163: 1417-29.

3. Kisseleva Т., Brenner D.A. Mechanisms of fibrogenesis. Exp. Biol. Med. 2008; 233: 109-22.

4. Boor P., Sebekova K., Ostendorf Т., Floege J. Treatment target in renal fibrosis. Nephrol. Dial. Transplant. 2007; 22: 3391-407.

5. Parmar M.S. Chronic renal disease. BMJ 2002; 325:85-90.

6. Togel F., Hu Z., Weis K. et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2005; 289: 31-42.

7. Morigi M., Imberti В., Zola C. et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. J. Am. Soc. Nephrol. 2004; 15: 1794-804.

8. Bi В., Schmitt R., Israilova H. et al. Stromal cells protect against acute tubular injury via an endocrine effect. J. Am. Soc. Nephrol. 2007; 18: 2486-96.

9. Togel F., Weiss K., Yang Y. et al. Vasculotropic, paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2007; 292: 1626-35.

10. Morigi M., Introna M., Imberti B. et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells accelerate recovery of acute renal injury and prolong survival in mice. Stem Cells 2008; 26: 2075—82.

П.Неггега M.B., Bussolati В., Bruno S. et al. Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means of CD44 following acute tubular injury. Kidney International 2007; 72: 430—41.

12. Poulson R., Alison M.A., Cook T. et al. Bone marrow stem cells contribute to healing of the kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 2003; 14: 48-54.

13. Guo J-K., Schedl A., Krause D.S. Bone marrow transplantation can attenuate the progression of mesangial sclerosis. Stem Cells 2006; 24: 406-15.

14. Burne-Taney M.J., Kofler J., Yokota N. et al. Acute renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cellmediated injury. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2003; 285: 87-94.

15. Rabb H. Immune modulation of acute kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 2006; 17: 604-6.

16. Jo S-K., Sung S-A., Cho W-Y. et al. Macrophages contribute to the initiation of ischemic acute renal failure in rats. Nephrol. Dial. Transplant. 2006; 21: 1231-9.

17. Zager R.A., Johnson A.C.M., Lung S. et al. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2006; 291: 546-56.

18. Catania J.M., Chen G., Parrish A.R. Role of metalloproteinases in renal pathophisiologies. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2007; 292: 905-11.

19. Nauta A.J., Fibbe W.E. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal sells. Blood 2007; 110: 3499-506.

20. Кругляков П.В., Лохматова Е.А., Климович В.Б., Зарицкий А.Ю. Мезенхимальные стволовые клетки и иммунопатологические состояния организма. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2008; 3 С5]: 36-41.

21. Iwasaki М., Adachi Y., Minamino К. et al. Mobilization of bone marrow cells by G-CSF rescues mice from cisplatin-indused renal failure, and M-CSF enhances the effect of G-CSF.J. Am. Soc. Nephrol. 2005: 16: 658-66.

22. Togel F., Isaac J., Westenfelder C. Hematopoietic stem cell mobilization-associated granulocytosis severely worsens acute renal failure. J. Am. Soc. Nephrol. 2004; 15: 1261-7.

23. Stokman G., Leemans J.C., Claessen N., Weening J.J., Florquin S. Hematopoietic stem cell mobilization therapy accelerates recovery of renal function independent of stem cell contribution. J. Am. Soc. Nephrol. 2005; 16: 1684-92.

24. Kurtz T.W., Maletz R.M., Hsu C.H. Renal cortical blood flow in glycerol-induced acute renal failure in the rat. Circ. Res. 1976; 38: 30—35.

25. Lieberthal W., Nigam S.K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2000; 278: 1-12.

26. Zager R.A., Jonson A.C., Lund S. et al. Acute renal failure: determinants and characteristics of injury-induced hyperinflammatory response. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2006; 291: 546-56.

27. Шестобаев Е.Ю., Капля О.А., Зуева Е.П., Разина Т.Г. Функциональная активность перитонеальных макрофагов при развитии карциномы легких Льюс на фоне применения экстракта шлемника байкальского и циклофосфана. Сибирский онкологический журнал 2004; 4: 37-41.

Поступила 25.03.2010

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 2, 2010