ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ РОСТА ГЕПАТОЦИТОВ
HUMANISED MONOCLONAL ANTIBODIES TO HEPATOCYTE GROWTH FACTOR

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка является непредварительной заявкой USSN 60/788243, поданной 1 апреля 2006 года, которая включена в качестве ссылки в полном объеме для любых целей.
УКАЗАНИЕ НА ЗАИНТЕРЕСОВАННОСТЬ ПРАВИТЕЛЬСТВА
Работа, описанная в этой заявке, была частично финансирована по Гранту 2R44CA101283-02 Национальным Институтом здоровья. Правительство США имеет определенные права на данное изобретение.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится главным образом к сочетанию технологий моноклональных антител (mAb) и рекомбинантных ДНК для разработки новых биологических препаратов и, более конкретно, например, для получения гуманизированных моноклональных антител, которые связывают и нейтрализуют фактор роста гепатоцитов.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Фактор роста гепатоцитов человека (HGF) представляет собой многофункциональный гетеродимерный полипептид, продуцируемый мезенхимными клетками. Было показано, что HGF стимулирует ангиогенез, морфогенез и мотогенез, а также рост и распределение различных типов клеток (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier and Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). Плейотропные виды активности HGF опосредуются его рецептором, трансмембранной тирозинкиназой, кодируемой протоонкогеном cMet. Было показано, что в дополнение к регуляции множества нормальных клеточных функций HGF и его рецептор c-Met вовлечены в инициацию, инвазию и метастазирование опухолей (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996; Comoglio и Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). HGF/cMet коэкспрессируются, часто сверхэкспрессируются, на различных солидных опухолях, включая опухоли, образованные из ткани легкого, толстого кишечника, прямой кишки, желудка, почки, яичника, кожи, множественной миеломы и щитовидной железы (Prat et al., Int. J. Cancer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002). HGF действует в качестве аутокринного (Rong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :4731, 1994; Koochekpour et al., Cancer Res. 57:5391, 1997) и паракринного фактора роста (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) и антиапоптотического регулятора (Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001) для этих опухолей.
-10
-9
HGF представляет собой белок массой 102 кДа со сходством последовательности и структуры с плазминогеном и другими ферментами свертывания крови (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993). HGF человека синтезируется в качестве предшественника из 728 аминокислот (препроHGF), который подвергается внутриклеточному расщеплению до неактивной одноцепочечной формы (проHGF) (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127:1783, 1994). При внеклеточной секреции проHGF расщепляется с образованием биологически активной связанной дисульфидной связью гетеродимерной молекулы, состоящей из α-субъединицы и β-субъединицы (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11:4825, 1992). α-Субъединица содержит 440 остатков (69 кДа с гликозилированием), состоящих из N-концевого шпилечного домена и четырех kringle-доменов. β-Субъединица содержит 234 остатка (34 кДа) и обладает подобным сериновой протеазе доменом, который лишен протеолитической активности. HGF имеет два уникальных клеточно-специфичных участков связывания: высокоаффинный (Kd = 2 × 10 M) участок связывания для рецептора cMet и низкоаффинный (Kd = 10 M) участок связывания для гепаринсульфатных протеогликанов (HSPG), которые находятся на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе (Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem., 272:9457, 1997).
Рецептор cMet является членом IV класса семейства белковых тирозинкиназных рецепторов. Полноразмерный ген cMet был клонирован и идентифицирован в качестве протоонкогена cMet (Cooper et al., Nature 311:29, 1984; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987). NK2 (белок, охватывающий N-конец и первые два kringle-домена α-субъединицы) является достаточным для связывания с cMet и активации каскада передачи сигнала для подвижности, однако для митогенного ответа требуется полноразмерный белок (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993). HSPG связывается с HGF посредством взаимодействия с N-концом HGF.
Было описано, что HGF/cMet играют важную роль в нескольких аспектах развития злокачественной опухоли, таких как инициация, инвазия и метастазирование опухоли, регуляция апоптоза и ангиогенеза. Было исследовано несколько различных подходов для получения эффективной молекулы-антагониста: укороченные белки HGF, такие как NK1 (N-концевой домен плюс kringle-домен 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2 (N-концевой домен плюс kringle-домены 1 и 2; Chan et al., Science 254:1382, 1991) и NK4 (N-концевой домен плюс четыре kringle-домена; Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000), mAb против cMet (Dodge, Master's Thesis, San Francisco State University, 1998) и mAb против HGF (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки).
in vitro
NK1 и NK2 могут эффективно конкурировать за связывание HGF с его рецептором, однако было описано, что они обладают частичными агонистическими видами активности  (Cioce et al., J. Biol. Chem. 271 :13110, 1996; Schwall et al., J. Cell Biol. 133:709, 1996), а не чисто антагонистическими видами активности, как желательно. Позднее Kuba et al., Cancer Res. 60:6737, 2000, описали, что NK4 может частично ингибировать первичный рост и метастазирование опухоли LLC легкого в модели на голых мышах (nude) при постоянной инфузии NK4. Однако тот факт, что NK4 необходимо вводить постоянно для достижения частичного ингибирования первичных опухолей, указывает на потенциально короткое время полужизни молекулы NK4 и/или отсутствие эффективности.
in vitro
in vivo
Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7443, 2001, описали, что введение коктейля из трех mAb против HGF, которые были выбраны по их способности ингибировать активность HGF в отношении распространения , было способно ингибировать рост опухолей человека в модели ксенотрансплантации на мышах nude. Они предположили, что для ингибирования видов биологической активности HGF  необходимо три mAb, распознающих три различных участка связывания на HGF: два mAb ингибировали связывание HGF с cMet, и одно mAb ингибировало связывание HGF с гепарином.
,
Недавно были описаны mAb человека, которые отдельно связывают и нейтрализуют HGF и которые разработаны с использованием технологии трансгенных мышей (Burgess et al., WO 2005/017107 A2 и Burgess et al., Cancer Res 66:1721, 2006, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок для любых целей). Однако из них по меньшей мере mAb 2.12.1, которое, очевидно, являлось наиболее эффективным в моделях ксенотрансплантатов опухолей, тем не менее, не ингибировало ангиогенез. Было разработано mAb мыши L2G7, которое нейтрализует все тестированные виды биологической активности HGF, включая ангиогенез (патентная заявка USSN 10/917915, поданная 13 августа 2004 года, и Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок для любых целей).
in vitro
in vivo
Таким образом, существует необходимость в гуманизированном моноклональном антителе, которое блокирует биологическую активность HGF  и . Настоящее изобретение удовлетворяет этой и другим потребностям.
СУЩНОСТЬ ЗАЯВЛЕННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления данное изобретение относится к гуманизированному нейтрализующему mAb против фактора роста гепатоцитов человека (HGF). MAb ингибирует по меньшей мере один и предпочтительно несколько или все виды биологической активности HGF, включая связывание с его рецептором cMet, индукцию распространения клеток, таких как клетки почки собаки Madin-Darby, индукцию пролиферации эпителиальных клеток легкого норки Mv 1 Lu, и/или гепатоцитов, и/или HUVEC и стимуляцию ангиогенеза. Предпочтительное гуманизированное mAb против HGF ингибирует, наиболее предпочтительно полностью ингибирует рост ксенотрансплантата опухоли человека в мыши. В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное mAb представляет собой гуманизированное mAb L2G7. В особенно предпочтительном варианте осуществления вариабельные области тяжелой и легкой цепей mAb имеют последовательности, представленные на строках, обозначенных HuL2G7 на фиг.2A и фиг.2B соответственно или последовательностями, которые по меньшей мере на 90% или более идентичны им. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу (mAb), которое связывает и нейтрализует фактор роста гепатоцитов человека (HGF), при этом гуманизированное антитело содержит гуманизированные тяжелую и легкую цепи. Гуманизированная тяжелая цепь содержит CDR из L2G7 и каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи человека, при условии, что по меньшей мере одно положение каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи человека, выбранное из группы, состоящей из Н29, Н30, Н48, Н66, Н67, Н71, Н94, занимает аминокислота, занимающая соответствующее положение в тяжелой цепи L2G7. Гуманизированная легкая цепь содержит CDR из L2G7 и каркасный участок вариабельной области легкой цепи человека, при условии, что по меньшей мере одно положение, выбранное из группы, состоящей из L3 и L60, занято аминокислотой, занимающей соответствующее положение в легкой цепи L2G7.
Также предусмотрены клеточные линии, продуцирующие такие гуманизированные антитела. В другом варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая гуманизированное mAb L2G7. В третьем варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят пациенту (как правило, пациенту-человеку) для лечения злокачественной опухоли или другого заболевания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. Аминокислотные последовательности зрелых вариабельных областей тяжелой цепи (A) (SEQ ID NO: 2) и легкой цепи (В) (SEQ ID NO: 3) L2G7, транслированные с клонированных кДНК. CDR подчеркнуты. Используется система нумерации Kabat.
Фигура 2. Показаны аминокислотные последовательности зрелых вариабельных областей тяжелой цепи (A) (SEQ ID NO: 5) и легкой цепи (В) (SEQ ID NO: 8) HuL2G7, выровненные с L2G7 (SEQ ID NO: 4 и 7) и акцепторными V-областями (SEQ ID NO: 6 и 9). CDR подчеркнуты в последовательностях L2G7, и аминокислоты, замещенные аминокислотами L2G7, подчеркнуты в последовательностях HuL2G7, при этом исходная аминокислота Н1Е подчеркнута двойной линией. Используется система нумерации Kabat.
к
Фигура 3. Аминокислотные последовательности полной тяжелой цепи (A) (SEQ ID NO: 10) и легкой цепи (В) (SEQ ID NO: 11) HuL2G7. Первые аминокислоты зрелых тяжелой и легкой цепей (т.е. после отщепления сигнальных последовательностей) подчеркнуты двойной линией и обозначены номером 1; эти аминокислоты также являются первыми аминокислотами зрелых V-областей. В тяжелой цепи первые аминокислоты областей СН1, шарнирной области, СН2 и СН3 подчеркнуты, и в легкой цепи первая аминокислота участка Сподчеркнута.
Фигура 4. Конкурентный анализ связывания HuL2G7, ChL2G7 и L2G7 с HGF.
Фигура 5. Относительная способность HuL2G7, ChL2G7 и L2G7 блокировать связывание HGF с Met.
Фигура 6. Относительная способность HuL2G7 и L2G7 ингибировать индуцируемую HGF пролиферацию клеток Mv 1 Lu.
Фигура 7. Эффект лечения mAb HuL2G7 или L2G7 или контроля в виде PBS на рост подкожных ксенотрансплантатов U87 в группах мышей NIH III Beige/Nude. Стрелками указано начало инъекций, и планками погрешностей показаны стандартные ошибки среднего значения (s.e.m). Символы для L2G7 и HuL2G7 накладываются, и их нельзя отличить на фигуре.
Фигура 8. Эффект четырех различных уровней доз HuL2G7 на рост подкожных трансплантатов U87 в группах мышей NIH III Beige/Nude. Стрелкой указано начало инъекций, и планками погрешностей указано s.e.m.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Это изобретение относится к гуманизированным нейтрализующим моноклональным антителам против HGF, фармацевтическим композициям, содержащим их, и к способам их применения для лечения заболевания.
1. Антитела
Антитела представляют собой очень крупные комплексные молекулы (молекулярная масса ~150000 или приблизительно 1320 аминокислот) со сложной внутренней структурой. Природная молекула антитела содержит две идентичных пары полипептидных цепей, при этом каждая из цепей обладает одной легкой цепью и одной тяжелой цепью; таким образом, фундаментальная структурная единица антитела представляет собой тетрамер. Каждая легкая цепь и тяжелая цепь в свою очередь состоит из двух областей: вариабельной области ("V"), вовлеченной в связывание антигена-мишени, и константной области ("C"), которая взаимодействует с другими компонентами иммунной системы. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей сворачиваются вместе в 3-мерном пространстве с образованием вариабельной области, которая связывает антиген (например, рецептор на поверхности клетки). В каждой вариабельной области легкой или тяжелой цепи существует три коротких сегмента (со средней длиной 10 аминокислот), называемых определяющими комплементарность областями ("CDR"). Шесть CDR в вариабельном домене антитела (три из легкой цепи и три из тяжелой цепи) сворачиваются вместе в 3-D-пространстве с образованием истинного антигенсвязывающего участка антитела, который захватывает антиген-мишень. Положение и длина CDR точно определены. См. Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987, которые включены в настоящий документ в качестве ссылок. Часть вариабельной области, не находящуюся в CDR, называют каркасным участком, который образует окружение для CDR. В каждой цепи три CDR разделены четырьмя участками каркасных участков в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Аминокислоты из вариабельных областей зрелой тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов обозначены Hx и Lx соответственно, где x представляет собой число, означающее положение аминокислоты в соответствии со схемой Kabat, представленной в цитируемой публикации. У Kabat приводится множество аминокислотных последовательностей для антител каждой подгруппы и указаны наиболее часто встречающиеся аминокислоты для каждого положения остатка в этой подгруппе, с образованием консенсусной последовательности. Kabat использует способ присвоения номера остатка каждой аминокислоте в приведенной последовательности, и этот способ присвоения номеров остатков стал стандартным в данной области. Схема Kabat распространяется и на другие, не включенные в его перечень, антитела путем выравнивания представляющего интерес антитела с одной из консенсусных последовательностей, указанных у Kabat, на основе консервативных аминокислот. Применение системы нумерации Kabat дает возможность легко идентифицировать аминокислоты в эквивалентных положениях в различных антителах. Например, аминокислота в положении L50 антитела человека занимает положение, эквивалентное положению аминокислоты L50 антитела мыши. Более того, любые две последовательности антител можно однозначно выравнивать, например для определения процентной идентичности, с использованием системы нумерации Kabat, так что каждая аминокислота в одной последовательности антитела выравнивается с аминокислотой другой последовательности с тем же номером, указанным у Kabat. После выравнивания область представляющего интерес антитела (например, полной зрелой вариабельной области тяжелой или легкой цепи) сравнивают с той же областью эталонного антитела, процентная идентичность последовательностей между областями представляющего интерес и эталонного антитела представляет собой количество положений, занятых одинаковыми аминокислотами в областях как представляющего интерес, так и эталонного антитела, деленное на общее количество выровненных положений двух областей, без подсчета разрывов, умноженное на 100 для преобразования в процентное количество.
Моноклональные антитело (mAb) представляет собой один молекулярный тип антитела и, таким образом, не включает в себя поликлональные антитела, получаемые путем инъекции животному (такому как грызуны, кролик или коза) антигена и извлечением сыворотки из организма животного. Гуманизированное антитело представляет собой полученное способами генетической инженерии (моноклональное) антитело, в котором CDR из мышиного антитела ("донорного антитела", которое также может представлять собой антитело крысы, хомяка или другого сходного вида) пересаживают в человеческое антитело ("акцепторное антитело"). Также гуманизированные антитела можно получать менее чем с полными CDR из мышиного антитела (например, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002). Наиболее часто в гуманизированное антитело из донорного антитела также переносят первую гипервариабельную петлю H1 тяжелой цепи, определяемую Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой антитело, имеющее CDR из донорного антитела и каркасные участки вариабельных областей и константные области из антител человека. Акцепторные каркасные участки легкой и тяжелой цепей могут быть из одинаковых или различных антител человека, и каждое из них может представлять собой составную структуру из двух или более каркасных участков антитела человека; или, альтернативно, они могут представлять собой консенсусную последовательность каркасных участков человека (например, подгруппа антител человека, как определено выше у Kabat et al., в цитируемой публикации), т.е. последовательность, имеющую наиболее часто встречающуюся аминокислоту в группе в каждом положении. Кроме того, для сохранения высокой аффинности связывания можно использовать по меньшей мере один из двух дополнительных структурных элементов. См., Queen et al., патенты США No. 5530101 и 5585089, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки, в которых представлены подробные инструкции для конструирования гуманизированных антител.
В первом структурном элементе каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела выбирают так, чтобы она обладала высокой идентичностью последовательности (по меньшей мере 65%) с каркасным участком вариабельной области тяжелой цепи донорного антитела, посредством выбора пригодным образом акцепторного антитела среди множества известных антител человека. Во втором структурном элементе при конструировании гуманизированного антитела выбранные аминокислоты в каркасном участке акцепторного антитела человека (вне CDR) заменяют соответствующими аминокислотами из донорного антитела, в соответствии с указанными правилами. Конкретно, аминокислоты, подлежащие замене в каркасном участке, как правило, выбирают, исходя из их способности взаимодействовать с CDR. Например, замененные аминокислоты в гуманизированном антителе могут быть соседними с CDR в последовательности донорного антитела, или они могут находиться в пределах 4-6 ангстрем от CDR, при определении в 3-мерном пространстве.
С другой стороны, поскольку гуманизированные mAb должны быть образованы не-человеческим донорным mAb, гуманизированные mAb, по существу не включают в себя человеческих mAb, полученных путем выделения нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области, из человека и их селекции с использованием способов фагового дисплея (см., например, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/001047; Winter, WO 92/20791; и Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998) или с использованием трансгенных мышей (см., например, Lonberg et al., WO 93/12227; Kucherlapati WO91/10741, и Burgess et al. WO 2005/027107 A2).
Эпитоп mAb представляет собой область в соответствующем ей антигене, с которым связывается mAb. Два антитела связываются с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом, если каждое из них полностью ингибирует (блокирует) связывание другого с антигеном. Таким образом, 1x, 5x, 10x, 20x или 100x избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75%, 90% или даже 99%, при измерении в конкурентном анализе связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Альтернативно, два антитела обладают одним эпитопом, если все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или предотвращают связывание одного антитела, снижают или предотвращают связывание другого. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если мутации некоторых аминокислот, которые снижают или предотвращают связывание антитела, снижают или предотвращают связывание другого.
2. Гуманизированные нейтрализующие антитела против HGF
Говорят, что моноклональное антитело (mAb), которое связывает HGF (т.е. mAb против HGF), нейтрализует HGF или является нейтрализующим, если связывание частично или полностью ингибирует один или несколько видов биологической активности HGF (т.е. когда mAb используют в качестве единственного средства). К биологическим свойствам HGF, которые может ингибировать нейтрализующее антитело, относятся способность HGF связываться с его рецептором cMet, вызывать распространение определенных клеточных линий, таких как клетки почки собаки Madin-Darby (MDCK); стимулировать пролиферацию (т.е. быть митогон для) определенных видов клеток, включая гепатоциты, эпителиальные клетки легкого норки Mv 1 Lu и различные опухолевые клетки человека; или стимулировать ангиогенез, например, при измерении посредством стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток сосудов пуповины человека (HUVEC) или образования сосудов или посредством индукции кровеносных сосудов при нанесении на хориоаллантоисную мембрану куриного эмбриона (CAM). Антитела согласно изобретению предпочтительно связываются с HGF человека, т.е. с белком, кодируемым последовательностью GenBank с регистрационным номером D90334.
a
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
Гуманизированное нейтрализующее mAb согласно изобретению в концентрации, например, 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 или 50 мкг/мл будет ингибировать биологическую функцию HGF (например, стимуляцию пролиферации или рассеивания) приблизительно по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 90% или 95% или даже 99% и наиболее предпочтительно приблизительно на 100% (по существу полностью) при анализе способами, описанными в примерах или известными в данной области. Как правило, степень ингибирования измеряют, когда количество используемого HGF является достаточным только для полной стимуляции биологической активности или составляет 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3 или 10 мкг/мл. Предпочтительно, по меньшей мере 25%, 50%, 75%, 90% или 95% или по существу полного ингибирования будут достигать, когда молярное соотношение антитела и HGF составляет 0,1x, 0,5x, 1x, 2x, 3x, 5x или 10x. Наиболее предпочтительно, mAb будет нейтрализовывать не только один, а несколько видов биологической активности, приведенных выше; для целей, представленных в настоящем документе, mAb против HGF, которое нейтрализует все виды биологической активности HGF, будет называться "полностью нейтрализующим", и такие mAb являются наиболее предпочтительными. MAb согласно изобретению предпочтительно специфически связывается с HGF, т.е. они не будут связывать или будут связывать только в значительно меньшей степени, белки, которые сходны с HGF, такие как фактор роста фибробластов (FGF) и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). MAb согласно изобретению, как правило, обладают аффинностью связывания (K) с HGF по меньшей мере 10 M, а предпочтительно 10 M или выше и наиболее предпочтительно 10 M или выше или даже 10 M или выше.
2
Гуманизированные mAb согласно изобретению включают в себя антитела против HGF в их природной тетрамерной форме (2 легких цепи и 2 тяжелых цепи), и они могут представлять собой любой из известных изотипов IgG, IgA, IgM, IgD и IgE и их субтипов, т.е. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, и могут содержать легкую цепь каппа и лямбда. Также mAb согласно изобретению включают в себя фрагменты антител, такие как Fv, Fab и F(ab'); бифункциональные гибридные антитела (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987), одноцепочечные антитела (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); и антитела с измененными константными областями (см., например, патент США No. 5624821). Источником CDR в mAb может быть животное (например, мышь, крыса, хомяк или курица), или его можно получать, используя способы генетической инженерии. mAb крысы получают стандартными способами, хорошо известными в данной области, включая множественную иммунизацию посредством HGF в пригодном адъюванте внутрибрюшинно, внутривенно или в подушку лапы, с последующим извлечением клеток селезенки или лимфатических узлов и слиянием с пригодной иммортализованной клеточной линией и с последующей селекцией гибридом, которые продуцируют антитело, связывающееся с HGF.
Это изобретение относится к гуманизированным формам mAb L2G7 мыши. Последовательности зрелых вариабельных областей тяжелой и легкой цепей mAb L2G7 мыши представлены на фиг.1A и 1B соответственно. Таким образом, гуманизированные формы mAb L2G7 включают в себя большинство или все аминокислоты CDR из этих последовательностей в каркасных участках вариабельной области человека (включая каркасные участки человека с единичной, составной или консенсусной последовательностью). Например, некоторые гуманизированные антитела включают в себя три интактных CDR из тяжелой цепи L2G7 и три интактных CDR из легкой цепи. Другие гуманизированные антитела включают в себя по меньшей мере один интактный CDR из тяжелой цепи L2G7 и по меньшей мере один интактный CDR из легкой цепи L2G7. Некоторые гуманизированные антитела включают в себя по меньшей мере один CDR, в котором источником некоторых остатков является соответствующий CDR L2G7, и источником других является CDR антитела человека, предпочтительно того же антитела человека, которое является источником каркасного участка вариабельной области, содержащего CDR.
В некоторых гуманизированных антителах согласно изобретению по меньшей мере 1, 3, 5 или все положения, выбранные из группы H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, L3 и L60, заняты аминокислотой, представленной в соответствующем положении в нумерации Kabat в антителе L2G7 мыши. В акцепторных каркасных участках вариабельной области человека, используемых в примерах, все из этих положений заняты аминокислотными остатками человека, отличающимися от аминокислоты, представленной в соответствующем положении в антителе L2G7 мыши. Таким образом, замещение всех или большинства положений, выбранных из данной группы, является предпочтительным. Если используют другие каркасные участки вариабельной области человека, некоторые из положений могут быть заняты аминокислотами, которые являются одинаковыми в каркасном участке вариабельной области человека и антитела L2G7 мыши. Таким образом, в таких положениях замещение не проводят, но его можно проводить в других положениях, отличающихся между каркасным участком вариабельной области человека и антителом L2G7 мыши в соответствиями с правилами Queen, US 5530101 и US 5585089. Независимо от выбора каркасного участка вариабельной области человека замена других аминокислот, помимо аминокислот, указанных в приведенной выше группе, также является возможной, как рассмотрено ниже. Однако, как правило, ни каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи, ни каркасный участок вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела не включают более десяти или двенадцати замен, что приводит к остаткам, не представленным в акцепторном каркасном участке вариабельной области человека (включая консесусные каркасные участки вариабельных областей человека и составные каркасные участки вариабельных областей человека, как рассмотрено выше).
Любые константные области, представленные в гуманизированных антителах согласно изобретению, являются человеческими или по существу человеческими, имеющими не более десяти и предпочтительно две или несколько замен относительно природной константной области человека. Некоторые замены являются преимущественными в отношении повышения времени полужизни антитела и/или его аффинности к FcγRn, как рассмотрено ниже. Другие замены, как правило, консервативные замены, как рассмотрено ниже, обладают нейтральным эффектом.
Иллюстративные гуманизированные формы L2G7 включают в себя зрелые вариабельные области тяжелой и легкой цепей, имеющие последовательности, показанные на фиг. 2A и 2B соответственно. Другие предпочтительные формы гуманизированного L2G7 включают в себя зрелые вариабельные области тяжелой и легкой цепей, имеющие последовательности, по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичные этим последовательностям (при выравнивании в соответствии с нумерацией Kabat, выше), и/или отличаются от них на небольшое количество (как правило, включающее не более 5 или 10 аминокислот) функционально несущественных замен, делеций и/или вставок. Например, первая аминокислота тяжелой цепи может представлять собой либо Glu, либо Gln. Замены, как правило, являются консервативными, т.е. заменами аминокислот аминокислотами, которые являются химически сходными. В целях классификации аминокислотных замен в качестве консервативных или неконсервативных аминокислоты можно группировать следующим образом: Группа I (гидрофобные боковые цепи): Met, Ala, Val, Leu, Ile; Группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): Cys, Ser, Thr; Группа III (кислые боковые цепи): Asp, Glu; Группа IV (основные боковые цепи): Asn, Gln, His, Lys, Arg; Группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): Gly, Pro; и Группа VI (ароматические боковые цепи): Trp, Tyr, Phe. Консервативные замены представляют собой замены, которые вовлекают замены между аминокислотами в одной и той же группе. Предпочтительно избегают замен, связанных с V-областями на фиг. 2A и 2B, в положениях H29, H30, H48, H66, H67, H71, H94, L3 и L60, где аминокислоты из L2G7 мыши были включены вследствие взаимодействия этих положений с CDR, как рассмотрено в примерах. Замены предпочтительно встречаются в положениях каркасного участка вариабельной области, но они также встречаются и в областях CDR. Если область CDR замещена, предпочтительной является замена аминокислоты мыши аминокислотой соответствующего положения (нумерация Kabat) в антителе человека, предпочтительно в том же антителе человека, которое является источником акцепторных каркасных участков вариабельных областей.
Как правило, гуманизированные mAb L2G7 относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 с легкой цепью каппа. mAb IgG1, имеющее вариабельные области, представленные на фиг. 2A и 2B соответственно, комбинированные с полной константной областью человека гамма-1 и каппа, обозначаются HuL2G7. Полные тяжелая и легкая цепи HuL2G7 представлены соответственно, на фиг. 3A и 3B. Только зрелые части этих последовательностей, начинающиеся в положениях, указанных номером 1, в действительности являются частью HuL2G7, поскольку предшествующие сигнальные пептиды отщепляются до или в процессе секреции антитела.
Варианты HuL2G7, сохраняющие сходные с HuL2G7 характеристики связывания, можно получать путем мутагенеза с последующей массовой селекцией с использованием способов фагового дисплея, рассмотренных выше. Варианты исходно отбирают по специфическому связыванию с HGF, необязательно конкурентному с HuL2G7 или L2G7 мыши. Затем варианты, обладающие такими же или сходными характеристиками связывания, как и приведенное в качестве примера антитело, можно функционально тестировать.
Предпочтительные mAb L2G7 являются нейтрализующими или полностью нейтрализующими для HGF, как определено выше. Предпочтительно, для некоторых, большинства или всех определенных биологических свойств HGF (например, связывания с Met, стимуляции пролиферации клеток Mv 1 Lu или HUVEC) нейтрализующая активность гуманизированного mAb отличается в пределах 3 раз, более предпочтительно в пределах 2 раз или 1,5 раз и наиболее предпочтительно не отличается (т.е. находится в пределах экспериментальной ошибки) от нейтрализующей активности самого L2G7. Значит, для достижения той же степени ингибирования биологического свойства (например, при измерении посредством IC50) требуется не более чем 3-кратное, 2-кратное, 1,5-кратное или такое же количество гуманизированного mAb относительно L2G7. Предпочтительно аффинность к HGF гуманизированных mAb также отличается в пределах 3 раз, 2 раз или по существу не отличается от аффинности L2G7. Аналогично, в моделях ксенотрансплантации на мышах (например, с использованием клеточной линии глиомы человека, такой как U87) гуманизированные mAb предпочтительно ингибируют рост опухоли в пределах 3 раз, 2 раз или неотличимо от mAb L2G7 мыши. В действительности предпочтительно, чтобы доза только в 40, 20 или даже 10 мкг гуманизированного mAb, вводимого два раза в неделю, полностью ингибировала рост ксенотрансплантатов опухоли U87.
Гуманизированные mAb можно экспрессировать множеством известных в данной области способов. Например, сначала можно синтезировать гены, кодирующие их V-области легкой и тяжелой цепи, из перекрывающихся олигонуклеотидов или посредством мутагенеза с помощью ПЦР ранее полученного варианта требуемого гена. Вследствие вырожденности генетического кода каждую аминокислотную последовательность антитела кодирует несколько последовательностей ДНК. Все последовательности ДНК, кодирующие антитела, описанные в этой заявке, прямо относятся к этому изобретению. Однако после получения гены, кодирующие легкую и тяжелую цепи гуманизированного mAb, встраивают совместно с C-областями в экспрессирующие векторы (например, коммерчески доступные от Invitrogen), которые обеспечивают требуемые регуляторные участки, например, промоторы, энхансеры, участки полиA и т.д. Применение промотора-энхансера CMV является предпочтительным. Гены для C-участков в настоящее время широко доступны или их можно легко клонировать посредством ПЦР из антителопродуцирующих клеток человека. Гены легкой и тяжелой цепей можно встраивать совместно в один вектор, или их можно встраивать в различные векторы. Затем экспрессирующие векторы можно трансфицировать с использованием различных известных в данной области способов, таких как липофекция или электропорация, в различные клеточные линии млекопитающих, такие как CHO или 293, или непродуцирующие миеломы, включая Sp2/0 и NSO, и клетки, экспрессирующие антитела, выбранные методом селекции на соответствующем антибиотике. См., например, патент США No. 5530101. Большие количества антитела можно получать путем выращивания клеток в коммерчески доступных биореакторах.
После экспрессии гуманизированные mAb согласно изобретению можно очищать в соответствии со стандартными в данной области способами, такими как микрофильтрация, ультрафильтрация, аффинная хроматография с белком A или G, гель-фильтрация, анионообменная хроматография, катионообменная хроматография и/или другие формы аффинной хроматографии на основе органических красителей и пр. По существу чистые антитела с гомогенностью по меньшей мере приблизительно 90 или 95% являются предпочтительными, и антитела с гомогенностью 98% или 99% или более являются наиболее предпочтительными для фармацевтического применения.
3. Терапевтические способы
th
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему гуманизированные антитела, описанные в настоящем документе. Фармацевтические составы антител содержат mAb в физиологически приемлемом носителе, необязательно с эксципиентами или стабилизаторами, в форме лиофилизированных или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат или ацетат, при pH, как правило, от 5,0 до 8,0, наиболее часто от 6,0 до 7,0; соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия и т.д., для обеспечения изотоничности; антиоксиданты, консерванты, низкомолекулярные полипептиды, белки, гидрофильные полимеры, такие как полисорбат 80, аминокислоты, углеводы, хелатирующие агенты, сахара и другие стандартные ингредиенты, известные специалистам в данной области (см. Remington's Pharmaceutical Science 16 edition, Osol, A. Ed. 1980). Как правило, mAb представлено в концентрации 1-100 мг/мл, например 10 мг/мл.
2
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения пациента с использованием гуманизированного mAb против HGF, такого как гуманизированное L2G7, например, HuL2G7, в составе фармацевтической композиции. MAb, полученное в составе фармацевтической композиции, можно вводить пациенту любым пригодным способом, особенно парентерально путем внутривенной инфузии или болюсной инъекции, внутримышечно или подкожно. Внутривенную инфузию можно проводить в течение 15 минут, однако чаще в течение 30 минут или более 1, 2 или даже 3 часов. Также mAb можно инъецировать непосредственно в область локализации заболевания (например, опухоль) или инкапсулировать в носители, такие как липосомы. Вводимая доза является достаточной для смягчения состояния, подлежащего лечению ("терапевтически эффективная доза"), и, вероятно, будет составлять от 0,1 до 5 мг/кг массы тела, например, 1, 2, 3 или 4 мг/кг, однако она может составлять до 10 мг/кг или даже 15 или 20 мг/кг. Также можно вводить фиксированную единичную дозу, например, 50, 100, 200, 500 или 1000 мг, или доза может быть основана на площади поверхности тела пациента, например, 100 мг/м. Как правило, для лечения злокачественной опухоли вводят между 1 и 8 дозами (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8), однако можно вводить 10, 20 или более доз. MAb можно вводить каждый день, два раза в неделю, раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц или с некоторым другим интервалом, в зависимости, например, от времени полужизни mAb, в течение 1 недели, 2 недель, 4 недель, 8 недель, 3-6 месяцев или более. Также возможны повторные курсы лечения, как в случае длительного введения.
Заболевания, особенно чувствительные к терапии гуманизированными mAb против HGF согласно изобретению, например, HuL2G7, включают в себя солидные опухоли, для которых, как полагают, требуется ангиогенез или которые ассоциированы с повышенными уровнями HGF, например, рак яичника, рак молочной железы, рак легкого (мелкоклеточный или немелкоклеточный), рак толстого кишечника, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак печени, опухоли головы и шеи, меланому и саркомы детей или взрослых и опухоли мозга. Действительно, способы согласно изобретению, особенно системное введение гуманизированного L2G7 mAb, являются особенно применимыми для лечения опухолей мозга, включая менингиомы; глиомы, включая эпендимомы, олигодендроглиомы, и все типы астроцитом (низкодифференцированную, анапластическую и мультиформную глиобластому или простую глиобластому); медуллобластомы, ганглиоглиомы, шванномы, хондромы; и опухоли головного мозга, главным образом детские, включая эмбриональные нейроэктодермальные опухоли. Как первичные опухоли головного мозга (т.е. возникающие в головном мозге), так и вторичные или метастатические опухоли мозга можно лечить способами согласно изобретению. Другие заболевания, пригодные для лечения способами согласно изобретению, представляют собой заболевания, ассоциированные с нежелательным ангиогенезом, такие как диабетическая ретинопатия, связанная со старением дегенерация желтого пятна, ревматоидный артрит и псориаз.
TM
TM
В особенно предпочтительном варианте осуществления гуманизированное mAb против HGF, например, HuL2G7, вводят совместно (т.е. до, в процессе или после) с другой терапией злокачественной опухоли. Например, mAb можно вводить совместно с любым одним или несколькими химиотерапевтическими лекарственными средствами, известными специалистам в области онкологии, например, алкилирующими средствами, такими как кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, карбоплатин, оксиплатин, прокарбазин и циклофосфамид; антиметаболитами, такими как фторурацил, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, метотрексат и гидроксимочевина; природными продуктами, включая алкалоиды растений, и антибиотиками, такими как блеомицин, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, этопозид, митомицин, митоксантрон, винбластин, винкристин и таксол (паклитаксел) или сходные соединения, такие как Taxotere; средствами, одобреннными конкретно для опухолей головного мозга, включая темозоломид и Gliadel, облатки, содержащие кармустин; и другими лекарственными средствами, включающими иринотекан и Gleevec и все одобренные и экспериментальные противоопухолевые средства, перечисленные в WO 2005/017107 A2 (которая включена в настоящий документ в качестве ссылки). Другие средства, с которыми можно вводить гуманизированное mAb против HGF, включают в себя биологические препараты, такие как моноклональные антитела, включая Herceptin против антигена HER2, Avastin против VEGF или антитела к рецептору EGF, а также низкомолекулярные антиангиогенные лекарственные средства или антагонисты рецептора EGF. Кроме того, гуманизированное mAb против HGF можно применять совместно с лучевой терапией или хирургической операцией.
Лечение (например, стандартная химиотерапия), включающее гуманизированное антитело mAb против HGF, например, HuL2G7, может повышать среднюю выживаемость без прогрессирования или общую выживаемость пациентов с этими опухолями (например, яичника, молочной железы, легкого, поджелудочной железы, головного мозга и толстого кишечника, особенно в случае рецидивирующих или рефрактерных) по меньшей мере на 30% или 40%, предпочтительно на 50%, 60% и до 70% или даже до 100% или более по сравнению с тем же лечением (например, химиотерапевтическим), но без mAb против HGF. Дополнительно или альтернативно, лечение (например, путем стандартной химиотерапии), включающее mAb против HGF, может повысить показатель полного ответа, показатель частичного ответа или показатель объективного ответа (полный + частичный) пациентов с указанными опухолями (например, яичника, молочной железы, легкого, поджелудочной железы, головного мозга и толстого кишечника, особенно в случае рецидивирующих или рефрактерных) по меньшей мере на 30% или 40%, предпочтительно на 50%, 60% и до 70% или даже до 100% по сравнению с тем же лечением (например, методами химиотерапии), но без mAb против HGF. Для опухолей мозга, таких как глиобластомы, лечение гуманизированным mAb против HGF, отдельно или в сочетании с другими средствами, предпочтительно обеспечивает частичный, полный или объективный показатель ответа по меньшей мере в 5% или 10%, более предпочтительно в 20%, или 25%, или 30% и наиболее предпочтительно в 40%, 50% или более.
Главным образом при клиническом испытании (например, испытании II фазы, II/III фазы или III фазы) вышеупомянутые повышения средней выживаемости без прогрессирования и/или показателя ответа у пациентов, которых лечили стандартной терапией плюс гуманизированное mAb против hHGF, например, HuL2G7, относительно контрольной группы пациентов, которым проводили стандартную терапию отдельно (или плюс плацебо), являются статистически значимыми, например, при уровне p = 0,05, или 0,01, или даже 0,001. Показатели полного и частичного ответов определяют с помощью объективных критериев, обычно используемых в клинических испытаниях при злокачественной опухоли, например, приведенных или одобренных Национальным Институтом Рака и/или ФДА.
4. Другие способы
Гуманизированные mAb против HGF согласно изобретению также находят применение в диагностических, прогностических и лабораторных способах. Их можно применять для определения уровня HGF в опухоли или в кровотоке пациента с опухолью и, таким образом, для следования и регулирования лечения опухоли. Например, опухоль, ассоциированная с высокими уровнями HGF, может быть особенно чувствительной к лечению гуманизированным mAb против HGF. В конкретных вариантах осуществления mAb можно применять в методе ELISA или радиоиммунного анализа для определения уровня HGF, например, в образце биоптата опухоли, или в сыворотке, или супернатанте среды секретирующих HGF клеток в клеточной культуре. Для различных способов анализа mAb против HGF можно метить флуоресцентными молекулами, меченными спиновой меткой молекулами, ферментами или радиоизотопами, и можно предоставлять в виде набора со всеми необходимыми реагентами для проведения анализа HGF. В других способах применения mAb против HGF применяют для очистки HGF, например, посредством аффинной хроматографии.
ПРИМЕРЫ
1. Конструирование гуманизированного антитела L2G7
6
γ2a
κ
Получение mAb против HGF мыши, L2G7, которое нейтрализует все тестируемые виды биологической активности HGF, уже описано (Kim et al., US 20050019327, поданная 13 августа, 2004, и Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006). Первой стадией гуманизации L2G7 было клонирование его генов легкой и тяжелой цепей, которое проводили по существу в соответствии со способом Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992. Вкратце, РНК получали из 10 гибридомных клеток L2G7 (IgG2a, κ) с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen), с последующим синтезом первой цепи кДНК со случайными праймерами с использованием набора из Stratagene и добавлением dG-хвостов посредством терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (Promega). V-области тяжелой и легкой цепей соответственно амплифицировали с кДНК с помощью праймера, отжигающегося с dG-хвостом, и праймера, отжигающегося с N-концевой областью C, для тяжелой цепи и праймера, отжигающагося с N-концевой областью C, для легкой цепи, с использованием полимеразы с высокой точностью AccuPrime Pfx (Invitrogen). Полосы соответствующего размера очищали из геля из реакционных смесей ПЦР и секвенировали или клонировали, а затем секвенировали с использованием способов дидезокси-терминации с помощью автоматизированного секвенатора. Для тяжелой цепи была выявлена единичная последовательность кДНК, которая показана после трансляции на фиг.1A. Было выявлено две различных, по-видимому, неаберрантных последовательности кДНК легкой цепи последовательности, однако секвенирование аминокислот N-конца выделенной легкой цепи L2G7 выявило только одну из этих цепей, транслированная аминокислотная последовательность которой показана на фиг.1B.
κ
γ1
L
H
Для экспрессии химерной формы L2G7 и позднее гуманизированного mAb экспрессирующие векторы, сходные с векторами pVk и pVg1, описанными у Co et al., J. Immunol. 148:1149, 1992, которые содержат гены C и C человека, конструировали из коммерчески доступных векторов и фрагментов ДНК. Однако вектор легкой цепи имел селективный маркер hyg вместо gpt, и вектор тяжелой цепи имел селективный маркер neo вместо Dhfr. Клонированные гены V и V субклонировали в пригодные участки этих векторов с получением экспрессирующих плазмид для генов тяжелой и легкой цепей химерного mAb L2G7 (chL2G7). MAb chL2G7 было получено, и было показано, что оно связывается с HGF, так же как и L2G7, показывая, что были клонированы правильные легкая и тяжелая цепи.
H
κ
H
L
Для конструирования гуманизированного mAb L2G7 в основном следовали способам Queen et al., патенты США No. 5530101 и 5585089. Базу данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) последовательностей антител человека сканировали, и последовательность V AAC18323 и последовательность V BAC01726 человека были соответственно выбраны в качестве акцепторных последовательностей для последовательностей V и V L2G7, поскольку они обладают особенно высокой гомологией каркасного участка (т.е. идентичностью последовательностей) с ними. Компьютерную программу, Deep View Swiss-Pdb Viewer, доступную во всемирной сети (http://www.expasy.org/spdbv/), использовали для конструирования молекулярной модели вариабельного домена L2G7, который использовали для определения положения аминокислот в каркасном участке L2G7, которые расположены достаточно близко к CDR, чтобы потенциально взаимодействовать с ними. Для конструирования вариабельных областей тяжелой и легкой цепей L2G7, CDR из mAb L2G7 сначала концептуально пересаживали в акцепторные каркасные участки. В положениях каркасных участков, где компьютерная модель предполагала значительный контакт с CDR, которые могут быть необходимы для поддержания конформации CDR, аминокислоты из мышиного антитела заменяли исходными аминокислотами каркасного участка человека. Для гуманизированного mAb L2G7, обозначаемого HuL2G7, это проводили в остатках 29, 30 (в гипервариабельной петле H1 Chothia), 48, 66, 67, 71 и 94 тяжелой цепи и в остатках 3 и 60 легкой цепи, с использованием нумерации Kabat. Кроме того, 1 аминокислоту тяжелой цепи заменяли на E (Glu), поскольку эта аминокислота с меньшей вероятностью, чем Q (Gln), образует производное в белке антитела. Последовательности V-области тяжелой и легкой цепей HuL2G7, выровненные относительно соответствующих участков L2G7 и акцепторных V-областей, показаны на фиг. 2A и 2B, где CDR и замещенные аминокислоты выделены цветом.
Также это изобретение относится к вариантам гуманизированных mAb L2G7, зрелые вариабельные области тяжелой и легкой цепей которых отличаются от последовательностей HuL2G7 на небольшое количество (например, как правило, не более 1, 2, 3, 5 или 10) замен, делеций или вставок, как правило, в каркасном участке, но возможно и в CDR. В частности, только часть описанных выше замен можно проводить в акцепторных каркасных участках или можно проводить дополнительную замену(ы), например, аминокислоту 69F VH L2G7 можно заменять акцепторной аминокислотой 69M. С другой стороны, аминокислота 1E VH может представлять собой Q. Действительно, многие из остатков каркасного участка, не контактирующие с CDR в HuL2G7, могут включать замены аминокислот из соответствующих положений L2G7 или других мышиных или человеческих антител, и также замену допускают даже многие потенциальные контактирующие с CDR остатки или даже аминокислоты в CDR.
Наиболее часто замены, проводимые в последовательностях вариантов гуманизированного L2G7, являются консервативными в отношении заменяемых аминокислот HuL2G7. Предпочтительно, замены в HuL2G7 (как консервативные, так и неконсервативные) не обладают существенным эффектом на аффинность связывания или эффективность гуманизированного mAb, т.е. его способность нейтрализовывать виды биологической активности HGF (например, эффективность в некоторых или всех из анализов, описанных в настоящем документе, варианта гуманизированного mAb L2G7 является по существу такой же, т.е. в пределах экспериментальной ошибки, как и эффективность HuL2G7). Предпочтительно зрелые последовательности V-области тяжелой и легкой цепи варианта по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичны соответствующим зрелым V-областям легкой и тяжелой цепей HuL2G7. Альтернативно, другие вариабельные области антитела человека с высокой идентичностью последовательностей вариабельным областям L2G7 также пригодны для предоставления каркасного участка гуманизированного антитела, особенно V-областей каппа подгруппы I человека и V-областей тяжелой цепи подгруппы I человека или консенсусных последовательностей этих подгрупп.
Иллюстративное mAb HuL2G7, описанное в примерах ниже, имеет константные области κ и γ1 человека и, таким образом, представляет собой IgG1: полные последовательности генов тяжелой и легкой цепей HuL2G7, включая сигнальные пептиды, показаны на фиг. 3A и фиг. 3B. (Безусловно, сигнальные пептиды отщепляются и не являются частью HuL2G7.) Однако понятно, что mAb IgG1 других аллотипов (IgG1, κ) охватываются обозначением HuL2G7. Гуманизированные mAb других изотипов (например, IgG2, IgG3 и IgG4) можно получать комбинированием вариабельных областей HuL2G7 с соответствующими константными областями человека. Замены можно производить в константных областях HuL2G7 для снижения или повышения эффекторной функции, такой как опосредуемая комплементом цитотоксичность или ADCC (см., например, Winter et al., патент США No. 5624821; Tso et al., патент США No. 5834597; и Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), или для продления времени полужизни у человека (см., например, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Конкретно, но не ограничиваясь этим, HuL2G7, обладающее мутациями в константной области IgG на Gln в положении 250 и/или на Leu в положении 428, представляют собой варианты осуществления настоящего изобретения.
E. coli
После конструирования mAb HuL2G7, т.е. после выбора аминокислотных последовательностей его V-областей легкой и тяжелой цепей (фиг.2 и 3), общепринятыми способами выбирали последовательности ДНК, кодирующие V-области (включая сигнальные пептиды) с помощью генетического кода; последовательности начинались с CTCGAGACCACC (SEQ ID NO: 1) перед инициирующим кодоном ATG для обеспечения участка рестрикции для клонирования и сигнала инициации трансляции Козака. Эти гены синтезировали коммерчески в Genscript Corp.(Piscataway, NJ). Альтернативно для синтеза гена каждой V-области можно использовать способ Со et al., J. Immunol. 148:1149, 1992. Вкратце, синтезируют две пары перекрывающихся олигонуклеотидов на альтернативных цепях (устройство для синтеза ДНК Applied Biosystems), которые все вместе охватывают целый ген. Олигонуклеотиды имеют длину от 110 до 140 оснований с перекрыванием 15 оснований. Двухцепочечные фрагменты ДНК синтезируют с использованием полимеразы Кленова с 5'-пары олигонуклеотидов и отдельно с 3'-пары. 5'-Фрагмент ДНК отщепляют с помощью ферментов рестрикции, расщепляющих на 5'-конце и в центре гена V-области. 3'-Фрагмент ДНК отщепляют посредством ферментов рестрикции, разрезающих в центре и на 3'-конце гена V-области. Каждый отщепленный фрагмент встраивают в пригодный вектор для клонирования и трансформируют в , и ДНК из множества изолятов секвенируют для выявления фрагментов, которые имеют полностью правильные последовательности. Затем для каждого гена проводят лигирование 3 путями для вставки правильных 5'- и 3'-фрагментов в соответствующий экспрессирующий вектор с образованием целого гена, последовательность которого проверяют.
6
Для получения mAb HuL2G7 эпителиальные клетки почки человека 293-F (Invitrogen) культивировали в среде для экспрессии Freestyle 293 (среда FS; Invitrogen) и ресуспендировали в среде FS в количестве 10 клеток/2 мл/макролунку. ДНК экспрессирующих векторов легкой и тяжелой цепей HuL2G7 (1 мкг каждого) инкубировали с 3 мкл Fugene 6 (Roche) в 100 мкл среды FS в течение 30 мин при комнатной температуре (RT); затем смесь добавляли к клеткам. После инкубации в течение 48 ч трансфицированные клетки культивировали в присутствии 1 мг/мл G418 для селекции клеток, экспрессирующих neo, а затем распределяли в 96-луночных планшетах для культивирования тканей (100 мкл/лунку). Приблизительно через 2 недели, когда в лунках, содержащих жизнеспособные клетки, происходило образование монослоя, супернатанты культур из этих лунок тестировали в отношении наличия и количества HuL2G7 посредством ELISA. Трансфицированные клетки могут секретировать неодинаковое количество (дисбаланс) легкой и тяжелой цепей таким образом, чтобы убедиться, что определяется только полный HuL2G7, в ELISA используется козье антитело против Fc человека, в качестве средства для захвата, и биотинилированное антитело против каппа человека, в качестве реагента для детекции. MAb chL2G7 экспрессировали сходным образом. Клоны клеток, экспрессирующих относительно высокие уровни ChL2G7 и HuL2G7 соответственно, размножали и выращивали в среде FS. Антитело очищали из культуральных супернатантов с использованием аффинной хроматографии с белком A и анализировали на предмет чистоты посредством SDS-PAGE.
2. Свойства HuL2G7
Для сравнения аффинности связывания HuL2G7 с аффинностью связывания ChL2G7 и L2G7 проводили эксперимент по конкурентному связыванию. На микропланшет для титрования наносили 50 мкл/лунку 2 мкг/мл козьих антител против IgG-Fc человека (GαhIgG-Fc) в PBS в течение ночи при 4°C и блокировали посредством 2% BSA в течение 1 ч при RT. После промывания планшет инкубировали с 50 мкл/лунку mAb ChL2G7 (2 мкг/лунку) в течение 1 ч при RT с последующим промыванием 50 мкл/лунку IgG человека (10 мкг/мл) в течение 1 ч для снижения фона. После промывания лунки планшета инкубировали по отдельности в течение 1 ч с 50 мкл/лунку различных концентраций очищенных HuL2G7, ChL2G7 или L2G7 в качестве конкурента совместно с 50 мкл/лунку HGF-Flag (1 мкг/мл). После промывания планшеты инкубировали с 50 мкл/лунку mAb против Flag HRP-M2 (Invitrogen) и связанные HRP-против-Flag M2 выявляли посредством добавления субстрата тетраметилбензидина. На фиг. 4 показано, что HuL2G7, ChL2G7 и L2G7 по существу хорошо конкурировали с L2G7, связанным с планшетом для связывания с растворимым HGF-Flag, что указывает на то, что эти три mAb обладают очень сходной аффинностью.
Ключевой биологической активностью HGF является способность связываться с его рецептором c Met, так что сравнивали способность mAb HuL2G7, ChL2G7 и L2G7 ингибировать связывание HGF с Met. Met использовали в форме Met-Fc и HGF использовали в форме HGF-Flag, который получали, как описано (патентная заявка USSN 10/917915, поданная 13 августа 2004 года, и Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006). Микропланшет для титрования покрывали 50 мкл/лунку 2 мкг/мл каждого из двух mAb против Met (Galaxy Biotech) в PBS в течение ночи при 4°C (альтернативно можно использовать 2 мкг/мл GαhIgG-Fc) и блокировали 2% BSA в течение 1 ч при RT. После промывания планшетов в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунку Met-Fc (1 мкг/мл) в течение 1 ч при RT, а затем промывали 50 мкл/лунку IgG человека (10 мкг/мл) в течение 1 ч для снижения фона. После промывания планшетов в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунку HGF-Flag (0,5 мкг/мл), преинкубированного с различными концентрациями mAb, в течение 1 ч. После промывания планшеты инкубировали с 50 мкл/лунку mAb против Flag HRP-M2 (Invitrogen) и связавшийся HRP-против-Flag M2 выявляли посредством добавления субстрата, как описано выше. На фиг. 5 показано, что HuL2G7, ChL2G7 и L2G7 блокировали связывание HGF с Met одинаково хорошо, так что эти mAb обладают очень сходной активностью в этом анализе.
4
Другой важной биологической активностью HGF является способность стимулировать пролиферацию определенных клеток, включая эпителиальные клетки легкого норки Mv 1 Lu. Для сравнения способности HuL2G7 и L2G7 нейтрализовывать эту активность HGF клетки Mv 1 Lu (2 × 10 клетки/100 мкл/лунку), выращенные в DMEM, содержащей 10% FCS, ресуспендировали в бессывороточной DMEM и стимулировали 100 мкл/лунку HGF (40 нг/мл) плюс трансформирующий фактор роста-β1 (1 нг/мл, R&D Systems) для снижения фона и различные концентрации HuL2G7, L2G7 или постороннее контрольное антитело человека. Уровень пролиферации клеток определяли путем добавления WST-1 (Roche Applied Science) в течение 14 часов. На фиг.6 показано, что HuL2G7 и L2G7 обладают равной ингибиторной активностью в этом анализе. В целом, HuL2G7 был по меньшей мере настолько же активен, что и L2G7, во всех используемых анализах, и, таким образом, оно является полностью нейтрализующим: в процессе гуманизации не произошло снижения активности L2G7.
in vivo
3. Способность HuL2G7 ингибировать рост опухоли
7
3
2
Уже было показано, что mAb L2G7 способно полностью ингибировать рост ксенотрансплантатов глиомы U87 в моделях на мышах nude (патентная заявка USSN 10/917915, поданная 13 августа 2004 года, и Kim et al. Clin Cancer Res 12:1292, 2006). Для подтверждения того, что HuL2G7 также обладает этой способностью, использовали тот же экспериментальный способ. Вкратце, самкам мышей NIH III Xid/Beige/Nude в возрасте 4-6 недель (Charles River Laboratories) подкожно инъецировали 10 клеток в 0,1 мл PBS в область спины. Когда размер опухоли достигал ~50 мм, мышей случайным образом разделяли на группы (n = 6 на группу) и инъецировали 40 мкг HuL2G7, L2G7 или контрольного PBS внутрибрюшинно два раза в неделю в объеме 0,1 мл PBS. Объемы опухоли определяли каждую неделю посредством измерения двух показателей (длины, a, и ширины, b) и вычисления объема как V = ab/2. На фиг.7 показано, что в этом анализе HuL2G7 и L2G7 ингибировали рост опухоли неотличимо. Для последующего определения способности HuL2G7 ингибировать рост ксенотрансплантатов опухолей использовали четыре различных дозы mAb, 40 мкг, 20 мкг, 10 мкг и 5 мкг в сходных экспериментах. На фиг.8 показано, что даже значительно низкая доза в 10 мкг два раза в неделю была способна полностью ингибировать рост опухоли, в то время как даже более низкая доза в 5 мкг обеспечивала хорошее, но неполное ингибирование. Аналогично, при системном введении HuL2G7 эффективно ингибирует рост внутричерепных ксенотрансплантатов U87.
Несмотря на то, что данное изобретение описано на основании предпочтительных в настоящее время вариантов осуществления, следует понимать, что различные модификации можно проводить в рамках объема данного изобретения.
Все цитируемые публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме для любых целей таким же образом, как если бы каждая отдельная публикация, патент и патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны как включенные в качестве ссылок в полном объеме для любых целей.
Гибридома L2G7 была депонирована 29 апреля 2003 года в Американской коллекции типовых культур, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, под номером ATCC PTA-5162 согласно Будапештскому договору. Этот депонированный образец будет храниться в уполномоченном банке депозитария и будет заменен в случае мутации, нежизнеспособности или разрушения в течение по меньшей мере пяти лет после получения депозитарием последнего запроса на выдачу образца в течение по меньшей мере тридцати лет после даты депонирования или в течение законной длительности связанного патента, в зависимости от того, какой из этих периодов будет длиннее. Все ограничения в доступе общества к этим клеточным линиям будут окончательно устранены после выдачи патента на основе заявки.