ПОЛИПЕПТИДЫ
POLYPEPTIDES

Область техники
Настоящее изобретение относится к полипептиду и молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептиды. Изобретение также относится к смеси полипептидов и смеси молекул нуклеиновой кислоты. Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей такой полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты или их смесь. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, включающим введение пациенту полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты или смеси.
Уровень техники
Злокачественным новообразованием является заболевание, отличающееся новым и аномальным ростом клеток индивидуума. Злокачественное новообразование развивается в результате многоступенчатого процесса, включающего несколько мутационных событий, позволяющих развиваться злокачественным клеткам, иначе говоря, клеткам, демонстрирующим свойства инвазии и метастазирования. Как правило, существуют два класса генов, в которых могут происходить мутации, приводящие к возникновению злокачественного новообразования: онкогены и гены опухолевых супрессоров. Активация онкогенов приводит к возникновению новых свойств клеток, таких как сверхактивный рост и деление, защита от программируемой гибели клеток, несоответствие нормальным границам тканей и способность адаптироваться к условиям в различных тканях. Можно инактивировать гены опухолевых супрессоров, делая возможной потерю нормальных функций клетки, таких как точная репликация ДНК, контроль клеточного цикла, ориентация и адгезия в тканях и взаимодействие с защитными клетками иммунной системы.
Предлагают различные подходы в лечении и профилактике злокачественного новообразования. Одним из подходов является использование антигенных пептидов, содержащих фрагменты опухолеспецифичных антигенов. При введении индивидууму такие антигенные пептиды вызывают ограниченный MHC класса I или класса II Т-клеточный ответ против клеток, экспрессирующих опухолеспецифичные антигены.
Следует отметить, что для возникновения такого Т-клеточного ответа антигенный полипептид должен быть представлен на молекуле MHC. Существует широкий диапазон вариабельности молекул MHC в популяциях человека. В частности, различные индивидуумы имеют различные аллели HLA, обладающие различной аффинностью связывания полипептидов в зависимости от аминокислотной последовательности полипептидов. Таким образом, индивидуум с одним конкретным аллелем HLA может иметь молекулы MHC, которые будут связывать полипептид с конкретной последовательностью, в то время как другие индивидуумы без этого аллеля HLA будут иметь молекулы MHC, не способные связывать и представлять полипептид (или по меньшей мере их молекулы MHC будут иметь очень низкую аффинность к полипептиду и, таким образом, представлять его на относительно низком уровне).
Кроме того, предлагают предоставлять вакцину, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такой антигенный пептид. Такая вакцина действует по схожему принципу, за исключением того, что после введения вакцины нуждающемуся в лечении индивидууму молекула нуклеиновой кислоты транскрибируется (если она является молекулой ДНК) и транслируется для синтеза пептида, который затем может связывать и представлять молекула MHC, как описано выше.
Теломераза является ферментом, обладающим функцией репликации 3'-конца теломерных областей линейных цепей ДНК в эукариотических клетках, т.к. в норме фермент ДНК-полимераза не может удлинять эти области. Фермент теломераза содержит субъединицу теломеразной обратной транскриптазы ("TERT" или "hTERT" у людей) и теломеразную РНК. Для удлинения 3'-конца цепи ДНК субъединица теломеразной обратной транскриптазы добавляет повторяющуюся последовательность на 3'-конец хромосом в эукариотических клетках посредством использования теломеразной РНК в качестве матрицы.
Наблюдали, что фермент теломераза активируется в подавляющем большинстве опухолей человека. Полагают, что это происходит по причине того, что без экспрессии фермента теломеразы теломеры клеток постепенно утрачиваются, и с каждым циклом деления целостность хромосом снижается, что в конечном итоге приводит к апоптозу клеток. Таким образом, экспрессия фермента теломеразы, как правило, является необходимой для развития злокачественных клеток, т.к. без такой экспрессии, как правило, программируемая гибель клеток будет происходить по умолчанию. В свете роли активации теломеразы в злокачественном новообразовании теломеразу расценивают как опухолеспецифичный антиген и, таким образом, как потенциальную мишень для терапии злокачественных новообразований.
В WO03/038047 описывают пептид, обозначаемый как T672, который, как сообщают, вызывает пролиферативный Т-клеточный ответ клеток здоровых доноров. Также описывают другие различные пептиды hTERT, но их не подвергали каким-либо экспериментальным тестам.
В WO00/02581 описывают полипептиды теломеразы, вызывающие ограниченный MHC класса I и/или класса II Т-клеточный ответ. В Великобритании один из описываемых полипептидов (имеющий аминокислотную последовательность EARPALLTSRLRFIPK, также известный как GV1001) подвергают клиническому испытанию фазы III (Telo Vac) в качестве вакцинотерапии на пациентах с раком поджелудочной железы.
В WO02/094312 описывают конкретные полипептиды, получаемые из hTERT.
В Liu JP et al., (2009 Telomerase in cancer immunotherapy Biochim Biophys Acta. Sep 12) проводят обзор 26 пептидов hTERT, которые, как показано, вызывают существенные иммунные ответы на hTERT-положительные опухолевые клетки.
Также для лечения пациентов с метастазирующим раком предстательной железы ранее использовали дендритные клетки, трансфицированные мРНК hTERT (Su et al., 2005, Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate antigen-specific CD8+ и CD4+ Т-cell responses in patients with metastatic prostate cancer. J Immunol. 174(6):3798-807). Su et al. демонстрировали успешное получение hTERT-специфичных Т-клеточных ответов, измеряемых по секретирующим ИФНγ CD8+ T-клеткам и CTL-опосредованной гибели мишеней hTERT. У четырех пациентов развивался частичный клинический ответ. Однако в этом исследовании не охарактеризовывали эпитопы hTERT.
Всегда существует потребность в дополнительных антигенных полипептидах (и молекулах нуклеиновой кислоты, кодирующих такие полипептиды) для лечения злокачественного новообразования, таких как полипептиды, вызывающие более эффективный иммунный ответ у индивидуумов, и/или полипептиды, представляемые аллелями HLA, присутствующими в большей части популяции.
Настоящее изобретение предназначено для решения одной или нескольких из указанных выше проблем.
Сущность изобретения
Первый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, содержащему последовательность, выбранную из:
i) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 7, 8 или 9;
ii) последовательности иммуногенного фрагмента i), содержащей по меньшей мере восемь аминокислот, где иммуногенный фрагмент не является одним из SEQ ID NO: 6 или 11-16; или
iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с i) или ii),
где полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину и где полипептид не содержит последовательность SEQ ID NO: 10 или 56.
Предпочтительно, полипептид не содержит последовательность любой SEQ ID NO: 46, 57 или 59-62 и не состоит из последовательности SEQ ID NO: 58.
Полипептид выделяют, иначе говоря, он не образует часть белка (hTERT), в котором находится в природе.
Полипептид способен вызывать Т-клеточный ответ у здорового пациента с аллелем HLA, подходящим для представления полипептида.
Условно, последовательность полипептида по первому аспекту настоящего изобретения определяют как последовательность, выбранную из:
i) SEQ ID NO: 1;
ii) последовательности иммуногенного фрагмента i), содержащего по меньшей мере восемь аминокислот, где иммуногенный фрагмент не является одним из SEQ ID NO: 6, 11-16 или 56; и
iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с i) или ii),
где полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину.
Иначе говоря, полипептид может содержать последовательность SEQ ID NO: 1, которая включает последовательности SEQ ID NO: 2 и 3 и не должна являться дополнением к последовательностям SEQ ID NO: 2 и 3.
Предпочтительно, полипептид не состоит из последовательности SEQ ID NO: 58.
Предпочтительно, иммуногенный фрагмент имеет последовательность любой из SEQ ID NO: 17-40.
Предпочтительно, полипептид составляет 80, 50, 30, 20 или 11 или менее аминокислот в длину.
Второй аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид по изобретению.
Молекулу нуклеиновой кислоты выделяют, иначе говоря, она не образует часть гена (гена теломеразы), в котором находится в природе.
Третий аспект настоящего изобретения относится к смеси полипептидов, содержащих по меньшей мере два различных полипептида, содержащих последовательности, выбранные из группы, состоящей из:
i) SEQ ID NO: 2-7;
ii) последовательности иммуногенного фрагмента i), содержащего по меньшей мере восемь аминокислот; и
iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с i) или ii),
где каждый полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину. Предпочтительно по меньшей мере два указанных полипептида отличаются в том смысле, что определяемая в i) последовательность отличается для каждого полипептида.
Условно, последовательность по меньшей мере одного из полипептидов определяют как содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9 или 10;
ii) последовательности иммуногенного фрагмента i), содержащей по меньшей мере восемь аминокислот; и
iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с i) или ii),
где полипептиды составляют менее 100 аминокислот в длину. Например, один из полипептидов может содержать последовательность SEQ ID NO: 1, которая включает SEQ ID NO: 2 и 3 и не должна являться дополнением к последовательности SEQ ID NO: 2 и 3.
Предпочтительно, по меньшей мере два различных полипептида включают смесь полипептидов, выбранную из группы, состоящей из:
i) смесь: полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот; полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 7 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот; и полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 9 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот;
ii) смесь: полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот; полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 8 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот; и полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 9 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот; и
iii) смесь: полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот; полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 8 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот; и полипептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 10 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности с этой последовательностью, или ее иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь аминокислот,
где каждый полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину.
Предпочтительно, упомянутый выше или каждый иммуногенный фрагмент имеет последовательность любой из SEQ ID NO: 17-40.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к смеси молекул нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере две различные молекулы нуклеиновой кислоты, состоящие из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) SEQ ID NO: 2-7;
ii) последовательности иммуногенного фрагмента i), содержащей по меньшей мере восемь аминокислот; и
iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с i) или ii),
где полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину.
Предпочтительно, по меньшей мере две указанные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются в том смысле, что определяемая в i) последовательность отличается для каждой молекулы нуклеиновой кислоты.
Предпочтительно, по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты определяют как состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9 или 10;
ii) последовательности иммуногенного фрагмента i), содержащей по меньшей мере восемь аминокислот; и
iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с i) или ii),
где полипептиды составляют менее 100 аминокислот в длину. Например, молекула нуклеиновой кислоты может состоять из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий SEQ ID NO: 1, включающую SEQ ID NO: 2 и 3, и полипептид не должен дополнительно содержать последовательность SEQ ID NO: 2 и 3.
Предпочтительно, по меньшей мере две различные молекулы нуклеиновой кислоты включают смесь молекул нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:
i) смеси: молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 1, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот; молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 7, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот; и молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 9, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот;
ii) смеси: молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 1, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот; молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 8, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот; и молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 9, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот; и
iii) смеси: молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 1, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот; молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 8, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот; и молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий первичную последовательность SEQ ID NO: 10, или вторичную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с первичной последовательностью, или иммуногенный фрагмент первичной последовательности, или вторичную последовательность, содержащую по меньшей мере восемь аминокислот, где каждый полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину.
Условно, упомянутый выше или каждый иммуногенный фрагмент имеет последовательность любой из SEQ ID NO: 17-40.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, смесь полипептидов по изобретению или смесь молекул нуклеиновой кислоты по изобретению и фармацевтически приемлемый адъювант, дилюент или эксципиент и необязательно другой терапевтический ингредиент.
Предпочтительно, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, смесь полипептидов или смесь молекул нуклеиновой кислоты присутствуют в количестве от 50 до 200 мкг.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или профилактики злокачественного новообразования у пациента, включающему введение пациенту полипептида по изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, смеси полипептидов по изобретению, смеси молекул нуклеиновой кислоты по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.
Седьмой аспект настоящего изобретения относится к полипептиду по изобретению, молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению, смеси полипептидов по изобретению, смеси молекул нуклеиновой кислоты по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для использования в медицине.
Предпочтительно, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, смесь полипептидов, смесь молекул нуклеиновой кислоты или фармацевтическая композиция предназначены для использования в лечении или профилактике злокачественного новообразования.
Восьмой аспект настоящего изобретения относится к использованию полипептида по изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, смеси полипептидов по изобретению, смеси молекул нуклеиновой кислоты по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для производства лекарственного средства для лечения или профилактики злокачественного новообразования.
Термины "полипептид", "пептид" и "белок" в настоящем описании взаимозаменяемо используют в отношении полимера аминокислотных остатков. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются модифицированными остатками или неприродными остатками, такими как искусственная химическая имитация соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам.
Как применяют в настоящем описании, термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и имитациям аминокислот, обладающим функцией, схожей с природными аминокислотами. Природные аминокислоты являются аминокислотами, кодируемыми генетическим кодом, а также модифицированными после трансляции в клетках (например, гидроксипролином, гамма-карбоксиглутаматом и O-фосфосерином). Фраза "аналог аминокислоты" относится к соединениям, имеющим ту же основную химическую структуру (альфа-углеродная связь с водородом, карбоксильная группа, аминогруппа и R-группа), что и природная аминокислота, но имеющим модифицированную R-группу или модифицированные основные цепи (например, гомосерин, норлейцин, метионин-сульфоксид, метилметионинсульфоний). Фраза "имитация аминокислоты" относится к химическим соединениям, имеющим отличающуюся от природных аминокислот структуру, но схожие с ними функции.
Как применяют в настоящем описании, термин "фрагмент" в отношении полипептида означает последовательную серию аминокислот, образующих часть полипептида. "Иммуногенный фрагмент" полипептида является фрагментом, как определено ранее, способным при введении индивидууму вызывать иммунный ответ, такой как Т-клеточный ответ.
В настоящем описании термины "ген", "полинуклеотиды" и "молекулы нуклеиновой кислоты" используют взаимозаменяемо в отношении полимера из множества нуклеотидов. Молекулы нуклеиновой кислоты могут содержать природные нуклеиновые кислоты или могут содержать искусственные нуклеиновые кислоты, такие как пептидно-нуклеиновые кислоты, морфолин и замкнутая нуклеиновая кислота, а также гликолевая нуклеиновая кислота и треозная нуклеиновая кислота.
Как применяют в настоящем описании, термин "нуклеотид" относится к природным нуклеотидам и синтетическим аналогам нуклеотидов, распознаваемым клеточными ферментами.
Как применяют в настоящем описании, термин "лечение" относится к любому частичному или полному лечению и включает: ингибирование заболевания или симптома, т.е. прекращение его развития; и ослабление заболевания или симптома, т.е. вызывание ремиссии заболевания или симптома.
В настоящем описании процентную долю "идентичности" между двумя последовательностями определяют с использованием алгоритма BLASTP версии 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, и David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST и PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) с использованием параметров по умолчанию. В частности, алгоритм BLAST доступен в интернете с использованием URL http://www. ncbi. nlm. nih.gov/blast/.
Краткое описание чертежей
3
Фигура 1 представляет собой гистограмму, на которой представлены hTERT-Т-клеточные ответы, определяемые у пациента с раком поджелудочной железы, вакцинированного ДК, трансфицированными мРНК hTERT. В образцах из различных временных точек на всем протяжении режима вакцинации определяли Т-клеточные ответы на 24 перекрывающихся 15-мерных пептида hTERT. Пролиферацию в ответ на нагруженные пептидами PBMC измеряли введением H-тимидина. Индекс стимуляции >2 рассматривали как иммунный ответ.
Фигура 2 представляет собой серию диаграмм, на которой представлено определение hTERT-специфичных HLA-A2-ограниченных CD8+ T-клеток у вакцинированных пациентов со злокачественными новообразованиями посредством проточной цитометрии. PBMC окрашивали непосредственно после выделения без предварительной стимуляции антигеном. Показано окрашивание с использованием пентамера в клетках, делящих сигнал на CD8+ CD3+ клетки. Фоновое окрашивание показано на графике с неродственным пентамером (ВИЧ-пептидом), на графиках hTERT-пентамеров показано окрашивание для двух новых пептидов hTERT у пациента с раком поджелудочной железы (A) (пептид, обозначаемый как 720GLL, соответствует SEQ ID NO: 3; пептид, обозначаемый как 728RLT, соответствует SEQ ID NO: 6) и третьего hTERT-пептида, определяемого у пациента с раком легких (B) (пептид, обозначаемый как 613RPA, соответствует SEQ ID NO: 5), последний в двух различных временных точках с разницей в пять лет. Анализировали 45000 CD8+ T-клеток.
Фигура 3 представляет собой график, на котором представлена T-клеточная пролиферация в ответ на пептид GV1001 (SEQ ID NO: 10), 663-677 (15-мерный) (SEQ ID NO: 2) и 660-689 (30-мерный) (SEQ ID NO: 1). Индекс стимуляции является мерой того, во сколько раз пептидспецифичная пролиферация превышает фон.
Фигура 4 представляет собой график, на котором представлены результаты определения CD4+ T-клеточных клонов, демонстрирующих пептидспецифичную пролиферацию в ответ на повышение концентраций пептида. Значение выше 2 рассматривают как положительный ответ.
Фигура 5 представляет собой график, на котором представлены результаты определения CD8+ T-лимфоцитов, специфичных для 9- или 10-мерных пептидов SEQ ID NO: 3, 4 и 6, непосредственно в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) из образцов крови пациентов. Пептид 615-624 (SEQ ID NO: 4) не тестировали на двух последних пациентах. Пациенты являлись HLA-A2-положительными. Фоновое окрашивание с использованием неродственного пентамера составляло <0,05%.
Фигура 6 представляет собой график, на котором представлены результаты определения CD8+ T-лимфоцитов, специфичных для 9-мерного пептида 613-621 (SEQ ID NO: 5), у пациента с раком легких, находящегося в полной ремиссии в течение нескольких лет после вакцинации GV1001 (SEQ ID NO: 10). Пациент является HLA-B7-положительным. Пациента последовательно вакцинировали каждые 6 месяцев, и через шесть лет после того, как пациент достиг полной ремиссии, все еще можно определять стабильную популяцию CD8+ T-клеток, специфичных для пептида hTERT 613-621. В некоторых временных точках определяли вторую минорную популяцию CTL, специфичную для другого эпитопа CTL, 672-681 (SEQ ID. NO. 25).
Фигура 7 представляет собой график, на котором представлен Т-клеточный ответ на библиотеку перекрывающихся пептидов hTERT у пациента с меланомой после вакцинации GV1001 (SEQ ID NO: 10).
Фигура 8 представляет собой график, на котором представлен Т-клеточный ответ на библиотеку перекрывающихся пептидов hTERT у пациента с раком легких после вакцинации GV1001 (SEQ ID NO: 10).
Фигура 9 представляет собой график, на котором представлен Т-клеточный ответ на библиотеку перекрывающихся пептидов hTERT у пациента с раком толстого кишечника после вакцинации GV1001 (SEQ ID NO: 10).
Фигура 10 представляет собой график, на котором представлен Т-клеточный ответ на библиотеку перекрывающихся пептидов hTERT у пациента с второй меланомой после вакцинации GV1001 (SEQ ID NO: 10).
Фигура 11 представляет собой график, на котором представлен Т-клеточный ответ на библиотеку перекрывающихся пептидов hTERT у пациента с раком поджелудочной железы после вакцинации ДК, трансфицированными мРНК hTERT. Представленные результаты являются результатами для того же пациента, что и на фигуре 1.
Фигура 12 представляет собой график, на котором представлен Т-клеточный ответ на библиотеку перекрывающихся пептидов hTERT у пациента с раком легких после вакцинации ДК, трансфицированными мРНК hTERT.
Фигура 13 представляет собой график, на котором представлен спонтанный Т-клеточный ответ на библиотеку перекрывающихся пептидов hTERT у невакцинированного третьего пациента с меланомой.
Фигура 14 представляет собой график, на котором представлена сумма результатов на фигурах 7-13 для выбранных пептидов hTERT.
Фигура 15 представляет собой график, на котором представлены Т-клеточные ответы на выбранные пептиды hTERT у четырех пациентов с раком легких.
Фигура 16 представляет собой график, на котором представлены Т-клеточные ответы на выбранные пептиды hTERT у шести пациентов с меланомой.
Фигура 17 является диаграммой рассеяния, на которой представлено количество месяцев периода дожития для каждого пациента по отношению к количеству пептидов, индуцирующих иммунный ответ.
Фигура 18 представляет собой график, на котором представлен период дожития для различных пациентов, тестируемых и разделенных на две группы в зависимости от их иммунных ответов на пептидные последовательности, по отношению к пептидам hTERT. Отвечающих на 0-1 пептид в дополнение к GV1001 помещали в одну группу, и отвечающих на 2 или более пептидов помещали в другую группу. Период дожития анализировали для двух групп с использованием t-критерия для независимых выборок. Предварительный тест на равенство периодов дожития свидетельствует о том, что период дожития в двух группах существенно отличается. Таким образом, использовали двухвыборочный t-критерий, не допускающий равного периода дожития. С использованием t-критерия с неодинаковой дисперсией получали t(6,1)=-3,22, p=0,018. Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения WINKS SDA (Texasoft, Cedar Hill, TX.). Статистические решения принимали при p=0,05. Для этих данных средний (SD) период дожития для группы отвечающих на 0-1 пептид составляет 10,7(3,9455), N=10, и средний (SD) период дожития для группы отвечающих на >2 пептида составляет 51,5714(33,3909), N=7.
Подробное описание изобретения
В общих чертах, изобретение относится к полипептиду белка теломеразы, содержащему последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 7, 8 и 9, где полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину и не содержит последовательность полипептида GV1001 (т.е. SEQ ID NO: 10), SEQ ID NO: 56 (описываемую Schroers et al., 2002), любую из SEQ ID NO: 46, 57 или 59-61 (описываемые в WO03/038047) или SEQ ID NO: 62 (описываемую в WO00/02581). Полипептид также не состоит из последовательности SEQ ID NO: 58 (описываемой в WO03/038047).
Особенно предпочтительные полипептиды содержат последовательность SEQ ID NO: 1 (включающую последовательности SEQ ID NO: 2 и 3), SEQ ID NO: 6 (включающую последовательности SEQ ID NO: 8 и 9) и SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды состоят из последовательностей, приведенных в одной из SEQ ID NO: 1-9. В других вариантах осуществления полипептиды содержат одну из последовательностей, приведенных в одной из SEQ ID NO: 1-9, и любые дополнительные аминокислоты на N- и/или C-конце отличаются от присутствующих в природном ферменте теломераза.
Другие варианты осуществления относятся к иммуногенным фрагментам указанного выше полипептида, содержащим по меньшей мере восемь аминокислот, и где фрагменты не являются ни любыми из полипептидов SEQ ID NO: 6 или 11-16, ни фрагментами полипептидов с последовательностью SEQ ID NO: 56. Примеры иммуногенных фрагментов включают приведенные в SEQ ID NO: 17-40, для которых прогнозируют, что они имеют аффинность связывания для молекул MHC конкретных аллелей HLA класса I. Следует отметить, что все полипептиды SEQ ID NO: 17-40 являются иммуногенными фрагментами полипептида SEQ ID NO: 1.
Последовательность фермента теломеразы человека (hTERT) приводят в GenBank под инвентарным номером AF015950. Следует отметить, что каждая из SEQ ID NO: 1-9 присутствует среди аминокислот в положениях 660-705 фермента теломераза. Это соответствует активному центру субъединицы теломеразной обратной транскриптазы человека. Полагают, что, если однажды возник иммунный ответ на эпитопы в этой области субъединицы обратной транскриптазы, любые клетки в опухоли, в которых мутировала часть гена теломеразы, кодирующая эту область, и которые, таким образом, могут избегать иммунного ответа, также будут иметь нарушенную ферментативную активность кодируемого белка теломеразы. Таким образом, при воздействии на эту область фермента теломераза будет менее вероятным то, что колонии злокачественных клеток будут выживать посредством мутации в гене теломеразы.
В некоторых вариантах осуществления множество полипептидов, как определено выше, ковалентно связывают друг с другом для образования большого полипептида или даже циклического полипептида.
Описываемые выше варианты осуществления изобретения относятся к полипептиду одной последовательности. Однако другие варианты осуществления относятся к смеси полипептидов, где смесь содержит по меньшей мере два различных полипептида, содержащих последовательности SEQ ID NO: 2-7. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит иммуногенные фрагменты указанных полипептидов, где иммуногенные фрагменты содержат по меньшей мере восемь аминокислот. Полипептиды составляют менее 100 аминокислот в длину.
Особенно предпочтительно, полипептиды в смеси содержат последовательности SEQ ID NO: 1, 7, 8 или 9. Особенно предпочтительно, полипептиды в смеси содержат последовательности SEQ ID NO: 1, 7 и 9; SEQ ID NO: 1, 8 и 9; или SEQ ID NO: 1, 8 и 10. Таким образом, в объем изобретения входит то, что один из полипептидов в смеси содержит последовательность SEQ ID NO: 10 (т.е. последовательность пептида, обозначаемого как GV1001). Предпочтительно, иммуногенные фрагменты представляют собой SEQ ID NO: 17-40.
Предпочтительно, по меньшей мере два полипептида отличаются в том смысле, что они основаны на различных последовательностях, выбранных из SEQ ID NO: 1-10.
Особенно предпочтительно, в смеси полипептидов полипептиды в смеси способны быть связанными молекулами MHC нескольких аллелей HLA. Например, в одном из вариантов осуществления смесь содержит первый полипептид, способный быть связанным молекулами MHC аллеля HLA-A*0201, и второй полипептид, способный быть связанным молекулами MHC аллеля HLA-A-A*03. Также следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления смесь содержит более двух полипептидов с различными последовательностями (например, 3, 4 или 5 полипептидов).
В дополнительных вариантах осуществления упомянутый выше или каждый предоставляемый полипептид не имеет точной идентичности последовательности с одним из указанных выше полипептидов. Вместо этого полипептид имеет по меньшей мере 80% идентичности последовательности с приведенным выше полипептидом. Особенно предпочтительно, последовательность имеет по меньшей мере 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с приведенными выше. Также предпочтительно, любое добавление или замена в аминокислотной последовательности приводит к сохранению свойств исходной боковой цепи аминокислоты. Иначе говоря, замена или модификация является "консервативной".
Таблицы консервативных замен с указанием функционально схожих аминокислот хорошо известны в этой области. Примерами свойств боковых цепей аминокислот являются гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) аминокислоты и боковые цепи со следующими функциональными группами или общими характеристиками: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковая цепь, содержащая гидроксильную группу (S, T, Y); боковая цепь, содержащая атом серы (C, M); боковая цепь, содержащая карбоксильную или амидную группу (D, N, E, Q); боковая цепь, содержащая основание (R, K, H); и боковая цепь, содержащая ароматическую группу (H, F, Y, W). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, представляющие собой консервативные замены друг для друга (см., например, Creighton, Proteins (1984)):
1) Аланин (A), глицин (G);
2) Аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);
3) Аспарагин (N), глутамин (Q)
4) Аргинин (R), лизин (K)
5) Изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);
6) Фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);
7) Серин (S), треонин (T); и
8) Цистеин (C), метионин (M).
В некоторых вариантах осуществления изменяют последовательность упомянутого выше или каждого полипептида для изменения (например, повышения) аффинности связывания полипептида с молекулой MHC конкретного аллеля HLA. В других вариантах осуществления в дополнение к приведенным выше аминокислотам полипептид содержит дополнительные аминокислоты на своем N- и/или C-конце. Такие дополнительные аминокислоты также можно использовать для изменения (например, повышения) аффинности связывания полипептида с молекулой MHC.
Необходимо, чтобы упомянутый выше или каждый полипептид (в частности, полипептид, последовательность которого изменяли, как указано выше) мог индуцировать цитотоксический T-лимфоцитарный ("CTL") ответ. Иначе говоря, полипептид должен являться способным стимулировать CTL, когда антигенпредставляющие клетки (например, дендритные клетки) представляют полипептид.
51
Подтверждение индуцибельности CTL можно осуществлять стимуляцией антигенпредставляющих клеток, несущих антигены MHC человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов или дендритных клеток), или более конкретно - дендритных клеток, получаемых из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимуляции полипептидами смешиванием с CD8+ Т-клетками и затем измерением ИФНγ, продуцируемого и высвобождаемого CTL в ответ на клетки-мишени. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, получаемых для экспрессии антигена HLA человека (например, описываемых в BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 61(8): 764-79, 2000 Aug, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Например, клетки-мишени можно метить радиоактивной меткой Cr и вычислять цитотоксическую активность из радиоактивности, испускаемой клетками-мишенями. Альтернативно, индуцибельность CTL можно определять измерением ИФНγ, продуцируемого и высвобождаемого CTL в присутствие антигенпредставляющих клеток, несущих иммобилизованные пептиды, и визуализацией зоны ингибирования на среде с использованием моноклональных антител против ИФНγ.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения упомянутый выше или каждый полипептид связывают с другими веществами, сохраняя их способность индуцировать ответ CTL. Такие другие вещества включают липиды, сахар и сахарные цепи, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.п. В определенных вариантах осуществления полипептид содержит модификации, например гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование.
В некоторых вариантах осуществления упомянутый выше или каждый полипептид получают общепринятыми способами, известными в этой области. Альтернативно, полипептид является фрагментом белка теломеразы, получаемым расщеплением, например, с использованием бромциана и последующей очисткой. Также можно использовать ферментативное расщепление. В дополнительных вариантах осуществления полипептид находится в форме рекомбинантного экспрессируемого полипептида. Например, получают подходящий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид в экспрессируемой форме (например, ниже регуляторной последовательности, соответствующей последовательности промотора), и трансформируют в подходящую клетку-хозяина. Затем клетку-хозяина культивируют для получения интересующего полипептида. В других вариантах осуществления полипептид получают in vitro с использованием систем трансляции in vitro.
Альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, как указано выше.
Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к смеси молекул нуклеиновой кислоты, где смесь содержит по меньшей мере две различные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид последовательности SEQ ID NO: 2-7. В альтернативных вариантах осуществления полипептид является фрагментом одной из SEQ ID NO: 2-7, содержащим по меньшей мере восемь аминокислот. В альтернативных вариантах осуществления последовательность полипептида не идентична указанной выше, но вместо этого обладает по меньшей мере 80% идентичности с этими последовательностями. В любом случае полипептид составляет менее 100 аминокислот в длину. Предпочтительно, кодируемый полипептид содержит последовательность SEQ ID NO: 1, 7, 8 или 9, особенно предпочтительно кодируемые полипептиды в смеси содержат последовательности SEQ ID NO: 1, 7 и 9; SEQ ID NO: 1, 8 и 9 или SEQ ID NO: 1, 8 и 10. В некоторых вариантах осуществления один кодируемый полипептид, таким образом, содержит последовательность SEQ ID NO: 10 (т.е. последовательность пептида GV1001). Также предпочтительно кодируемые иммуногенные фрагменты представляют собой последовательности SEQ ID NO: 17-40. Предпочтительно по меньшей мере две молекулы нуклеиновой кислоты отличаются в том смысле, что основаны на различных последовательностях, выбранных из SEQ ID NO: 1-10.
Следует отметить, что по причине вырожденности генетического кода молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие конкретный полипептид, могут иметь диапазон полинуклеотидных последовательностей. Например, все из кодонов GCA, GCC, GCG и GCT кодируют аминокислоту аланин.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут являться ДНК, или РНК, или их производными.
Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к фармацевтической композиции, содержащей полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты или смесь полипептидов или молекул нуклеиновой кислоты, как описано выше. Кроме того, фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый адъювант, дилюент или эксципиент. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит смесь полипептида по изобретению и молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению.
Примеры адъювантов включают полный или неполный адъювант Фрейнда, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, токсин холеры и токсин сальмонеллы. Особенно предпочтительным адъювантом является ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). Примеры дилюентов и эксципиентов включают стерильную воду, физиологический раствор, культуральную жидкость и фосфатный буфер.
В определенных вариантах осуществления полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты соединяют с иммуногенным носителем. Примеры иммуногенных носителей включают гемоцианин фиссуреллы, бычий сывороточный альбумин, овальбумин и куриный иммуноглобулин.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция также содержит дополнительный терапевтический ингредиент. Примеры дополнительных терапевтических ингредиентов включают интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-12 (ИЛ-12), дополнительный полипептид теломеразы (иначе говоря, полипептид фермента теломеразы помимо описываемого выше) хемотерапевтические средства, обезболивающие средства, противовоспалительные средства и другие противоопухолевые средства.
Некоторые варианты осуществления относятся к содержащей полипептид фармацевтической композиции в форме липопептидного конъюгата, о котором известно, что он индуцирует высокоаффинный цитотоксический Т-клеточный ответ (Deres, 1989, Nature 342).
Дополнительные сведения о дополнительных компонентах фармацевтической композиции можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA.
При использовании нуждающемуся в лечении пациенту вводят полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, смесь пептидов, смесь молекул нуклеиновой кислоты или фармацевтическую композицию, как описано выше (далее в настоящем описании "лекарственное средство"). Альтернативно, препарат вводят индивидууму до возникновения каких-либо симптомов злокачественного новообразования для обеспечения защитного иммунитета к злокачественному новообразованию.
В вариантах осуществления, в которых лекарственное средство содержит полипептид, полипептид подвергается эндоцитозу антигенпредставляющими клетками, может подвергаться процессингу антигена, и затем его представляют на поверхности клетки в комплексе с молекулой MHC класса I или класса II. Посредством взаимодействия с T-клеточными рецепторами на поверхности T-клеток возникает CD4+ или CD8+ Т-клеточный ответ. В вариантах осуществления, в которых лекарственное средство содержит молекулу нуклеиновой кислоты, молекула нуклеиновой кислоты также подвергается эндоцитозу и затем транскрибируется (если молекула нуклеиновой кислоты является ДНК), и кодируемый полипептид синтезируется эндогенными клеточными путями. Затем кодируемый полипептид подвергается процессингу и представлению на молекуле MHC для развития Т-клеточного ответа, как описано выше. Таким образом, лекарственное средство можно использовать в качестве вакцины для вызывания CD4+ или CD8+ T-клеточного иммунитета.
В принципе, можно использовать любой способ введения лекарственного средства, но инъекция является особенно предпочтительной. Например, лекарственное средство можно инъецировать непосредственно в опухоль пациента. Однако если подвергаемое лечению злокачественное новообразование находится в носу или ротовой полости пациента, то в некоторых вариантах осуществления лекарственное средство вводят посредством спрея и ингаляции.
Подходящая дозировка лекарственного средства составляет 50-200 мкг, хотя иногда могут потребоваться дозировки, выходящие за пределы этого диапазона (например, 1-500 мкг). Дозировка от 100 до 150 мкг особенно предпочтительна. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство вводят пациенту еженедельно или ежемесячно. В определенных вариантах осуществления следуют "агрессивной" схеме лечения, включающей три введения лекарственного средства в первую неделю лечения, затем еженедельные введения в течение месяца, затем ежемесячные введения в течение шести месяцев с последующим однократным введением каждые шесть месяцев.
В принципе, лекарственное средство может принимать пациент, страдающий любым типом злокачественного новообразования, при котором активирован ген теломеразы. Такие злокачественные новообразования включают, в качестве неограничивающих примеров, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак легких, злокачественную меланому, лейкозы, лимфомы, рак яичников, рак шейки матки и холангиокарциномы. Как отмечалось ранее, фермент теломераза экспрессируется в подавляющем большинстве злокачественных новообразований, поэтому эффективность лекарственного средства по настоящему изобретению не ограничена любым конкретным типом злокачественного новообразования.
Следует отметить, что, в зависимости от класса вызываемого T-лимфоцитарного ответа, предпочтительными являются полипептиды различной длины. Более конкретно, для возникновения CD8+ Т-клеточного ответа полипептид должен быть представлен на молекулах MHC класса I, как правило, связывающих только полипептиды от 8 до 10 аминокислотных остатков в длину. С другой стороны, для возникновения CD4+ Т-клеточного ответа необходимо, чтобы полипептид, представляемый на молекуле MHC класса II, для которой полипептиды, как правило, могут являться более длинными, составлял, как правило, от 15 до 24 аминокислотных остатков в длину. Следует отметить, что некоторые полипептиды по настоящему изобретению (например, полипептид SEQ ID NO: 1) являются более длинными, чем вмещаемые молекулой MHC класса I или класса II в норме. Например, группами, работающими с HPV и вакцинацией при раке шейки матки, показано, что пептиды этой длины индуцируют более сильные иммунные ответы (Welters et al., 2008). Не желая быть связанными теорией, полагают, что такие полипептиды после их введения пациенту подвергаются эндоцитозу клетками, подвергаются протеолитической деградации в протеасомах и затем представлению на молекуле MHC класса I или класса II. Таким образом, такие полипептиды могут вызывать ограниченный MHC класса I и/или MHC класса II Т-клеточный ответ. Также следует отметить, что более длинные полипептиды сохраняются в существующем виде внутри пациента в течение более длительного периода времени, чем более короткие полипептиды, и, таким образом, существует более длительный период времени, в течение которого они могут вызывать иммунный ответ. Это особенно важно в отношении тех полипептидов, которые обладают относительно низкой аффинностью связывания MHC.
Также следует отметить, что фермент теломераза является "собственным белком", иначе говоря, фермент является природным белком в организме человека. Таким образом, у индивидуумов, как правило, в некоторой степени развивается иммунологическая толерантность к полипептидам фермента теломеразы посредством процесса, при котором T-клетки, активные в отношении таких полипептидов, разрушаются в тимусе индивидуума при развитии T-клеток. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения желательными являются полипептиды по настоящему изобретению с относительно низкой аффинностью связывания MHC. Причина состоит в том, что полипептиды с более низкой аффинностью связывания MHC будут подвергаться воздействию созревающих T-клеток в меньшей степени, и, таким образом, менее вероятно, что все T-клетки индивидуума, активные в отношении полипептида, будут удалены из репертуара T-клеток индивидуума. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептиды с относительно низкой аффинность связывания MHC способны легче преодолевать иммунологическую толерантность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения введение одного из полипептидов по изобретению приводит к "рассеиванию эпитопов", в результате чего возникает иммунный ответ на другие полипептиды белка теломеразы, примыкающие к вводимому полипептиду в белке теломеразы.
Примеры
Пример 1
Охарактеризовывали эпитопы hTERT, распознаваемые T-клетками пациента после вакцинации ДК, трансфицированными hTERT. Вакцинация приводила к разнообразному и обширному иммунному ответу, включающему CD4+ Th-клетки и CD8+ T-клетки. Считают, что этот ответ ответственен за регрессию опухоли и длительный период дожития, наблюдаемый у пациента.
Материалы и способы
Пациент
Женщину 62 лет с рецидивирующей протоковой аденокарциномой поджелудочной железы вакцинировали дендритными клетками, нагруженными мРНК hTERT, на основе программы по предоставлению еще неутвержденных лекарственных средств неизлечимо больным пациентам. Лечение одобрено Norwegian Medicines Agency и Regional Committee for Medical Research Ethics. Его осуществляли в соответствии с Хельсинкской декларацией, разработанной Всемирной медицинской ассоциацией. От пациентки получали письменное информированное согласие.
Получение трансфицированных мРНК ДК
2
ДК получали, как описано ранее (Kyte et al., 2006 и Mu LJ et al., 2003). В кратком изложении, моноциты, получаемые из продукта лейкофереза, культивировали в течение 5 дней с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) и интерлейкином-4 (ИЛ-4). Получаемые незрелые ДК трансфицировали мРНК hTERT посредством электропорации с использованием прямоугольного сигнала (Kyte et al., 2006, Saeboe-Larssen S et al., 2002) и затем культивировали в течение 2 дней с цитокинами, способствующими созреванию (интерлейкином-1β (ИЛ-1β), интерлейкином-6 (ИЛ-6), фактором некроза опухоли α (TNFα) и простагландином E (PGE2)). Для получения соответствующих контрольных ДК фракцию ДК ложно-трансфицировали, т.е. подвергали электропорации без мРНК. Фенотип ДК оценивали посредством проточной цитометрии, как описано ранее (Kyte et al., 2006). ДК имели фенотип зрелых ДК, экспрессирующих HLA класса II, CD86 и CD83, но без CD1. Жизнеспособность ДК составляла >85%, как оценивали окрашиванием трипановым синим.
Второй и третьей партиями вакцины являлись ДК, полученные по укороченной схеме (Alldawi et al., 2005, Tanaka et al., 2006, Ho et al., 2006). Моноциты культивировали в течение 2 дней с ГМ-КСФ и ИЛ-4, затем они созревали в течение 1 дня тем же образом, что и общепринятые ДК, до электропорации. Затем ДК оставляли в течение ночи до замораживания.
Вакцина
6
Вакцина состояла из 5×10 аутологичных полученных из моноцитов дендритных клеток, нагруженных мРНК hTERT. Пациентка получала 4 еженедельные инъекции с последующими ежемесячными вторичными инъекциями.
Клинический мониторинг
Регистрировали побочные эффекты и классифицировали по Общим критериям токсичности Национального института рака, как описано ранее (Kyte et al., 2006 Gene therapy). Наблюдали только незначительные побочные эффекты без связанной с лечением токсичности III-IV степени. Существующий ответ опухоли оценивали посредством клинического обследования и компьютерной томографии до начала вакцинации и каждые 3 месяца в течение вакцинации. Ответ опухоли классифицировали по Критериям оценки ответа солидных опухолей на терапию (RECIST) (Therasse P et al., 2000).
DTH
Иммуномониторинг
3
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) получали перед четырьмя стандартными вакцинациями, после 5 недель и после 12 недель. Также PBMC получали перед каждой ежемесячной вторичной вакцинацией. PBMC выделяли и замораживали, как описано ранее (Kyte et al., 2005). Размороженные PBMC однократно стимулировали tDC in vitro (не mockDC) и культивировали, а затем тестировали в анализе T-клеточной пролиферации (H-тимидин), как описано ранее (Kyte et al., 2006). T-клетки тестировали в трех повторениях. Использовали облученные tDC и ложно-трансфицированные контрольные ДК (mockDC) или PBMC с пептидом hTERT или без него в качестве АПК. Включали отрицательные контроли только с T-клетками.
PBMC из различных временных точек стимулировали библиотекой перекрывающихся 15-мерных пептидов hTERT или 30-мерным пептидом hTERT, все из ProImmune, и затем тестировали в анализе пролиферации, как указано выше, с использованием облученных PBMC в качестве АПК, как описано в (Bernhardt et al., 2006).
Проточная цитометрия
Окрашивание с использованием пентамера осуществляли на свежих или замороженных PBMC пациента. Фикоэритрин-конъюгированные пентамеры производили в ProImmune, и их тестировали на неспецифическое окрашивание на HLA-A2-положительных T-клеточных линиях, специфичных для пептида NLVPMTATV вируса хориоменингита (CMV). Использовали рабочую концентрацию по инструкциям производителя. В качестве отрицательного контроля использовали пентамер с пептидом ВИЧ SLYNTVATL-A*0201. Клетки окрашивали с использованием пентамера в течение 10 мин при комнатной температуре (RT), промывали в буфере для окрашивания, состоящего из фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,1% сывороточного альбумина человека (HSA) и 0,1% азида натрия. Затем клетки окрашивали с использованием anti-CD4-флуоресцеинизотиоцианата (FITC), anti-CD19-FITC (eBioscience), anti-CD8-PerCP и anti-CD3-Pacific Blue (PB) (eBioscience) в течение 15 мин при комнатной температуре, однократно промывали буфером для окрашивания и ресуспендировали в том же буфере перед исследованием. Для внутриклеточного окрашивания 12-дневные стимулированные пептидом T-клетки стимулировали в течение ночи в присутствие брефелдина A (BD Bioscience) при 10 мкг/мл и BD Golgistop (BD Biosciences) в разведении 1/1000 с аутологичными трансформированными вирусом Эпштейна-Барр B-лимфобластными клеточными линиями (EBV-LCL), нагруженными пептидом при соотношении Т-клетки-мишень 5:1. Ненагруженные пептидом клетки-мишени и T-клетки отдельно использовали в качестве отрицательных контролей. Затем клетки окрашивали на CD3 (eBioscience), CD4, CD8, ИФН (eBioscience), ИЛ-2 и TNFα с использованием набора BD Cytofix/Cytoperm по инструкциям производителя. В конце клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания, содержащем 1% параформальдегид. Все антитела и все реагенты для внутриклеточного окрашивания с использованием цитокинов получали от BD Pharmingen, кроме указанных исключений. С использованием проточного цитометра BD LSR II получали 250000 лимфоцитов на образец и анализировали данные с использованием программного обеспечения FlowJo (Treestar Inc., Ashland, OR, USA).
Результаты
Пациентка перенесла стабилизацию заболевания при лечении гемцитабином, но после 5 месяцев лечение приостанавливали по причине побочных эффектов. Затем ей в качестве альтернативного лечения предлагали вакцинацию ДК. После 18 месяцев вакцинации она перенесла полную ремиссию, сохранявшуюся после 30 месяцев после вакцинации (44 месяца от постановки диагноза). Пациентке проводили повторную диагностику, и ее обследовал независимый патолог, подтверждавший диагноз протоковой аденокарциномы.
6
6
Медиана периода дожития для пациентов с неоперабельным раком поджелудочной железы составляет 8-10 месяцев, что в этом случае было значительно превышено. Первая партия вакцины состояла из 5×10 общепринятых ДК (Kyte et al., 2006), и пациенту вводили 15 вакцин. С учетом демонстрации иммунного ответа на вакцину и стабильного заболевания получали новые партии вакцины, и партии 2 и 3 являлись "быстрыми" ДК, вводили вакцины 10 и 17, соответственно, из 5×10 ДК, нагруженных мРНК hTERT.
Пролиферативный Т-клеточный ответ на вакцину ДК можно измерять in vitro через 3 месяца после вакцинации и стабилизировать с 6 месяца. Задокументировав наличие иммунного ответа на трансфицированные hTERT ДК, желательно исследовать то, какие эпитопы hTERT ответственны за индукцию иммунного ответа. Это тестировали измерением T-клеточной пролиферации в ответ на библиотеку пептидов hTERT (фигура 1) и окрашиванием PBMC с использованием пентамера ex vivo.
Пролиферативные Т-клеточные ответы определяли для шести 15-мерных пептидов hTERT из библиотеки перекрывающихся пептидов и 30-мерного пептида hTERT. Наличие hTERT-пентамер-положительных CD8+ T-клеток определяли до и после вакцинации с процентными долями в диапазоне от 0,15% до 1,25% в нестимулированных PBMC. Показано, что популяция 1,25% CD8+ T-клеток является пентамер-положительной в свежих PBMC через 24 месяца после вакцинации (фигура 2A) и повышается до приблизительно 3% после стимуляции пептидом in vitro (данные не представлены).
После одного цикла стимуляции in vitro с использованием 30-мерного пептида hTERT, содержащего по меньшей мере два T-хелперных эпитопа, а также эпитопы CTL в 720GLL-пентамере, мы смогли определить небольшую популяцию многофункциональных CD4+ T-клеток, секретирующих ИФНγ, ИЛ-4 и (TNFα) в ответ на аутологичные EBV-трансформированные B-клетки, нагруженные тем же пептидом. Не наблюдали отличий в популяции CD8+ T-клеток после стимуляции нагруженными пептидом клетками-мишенями по сравнению с клетками, стимулированными ненагруженными пептидом мишенями (данные не представлены). Наблюдаемые высокие фоновые уровни ИЛ-2 могут быть связаны с некоторой стимуляцией, вызываемой трансформированной B-клеточной линией, которая может экспрессировать hTERT. К сожалению, по причине ограниченного количества T-клеток в каждом эксперименте невозможно проводить дополнительные функциональные анализы.
Обсуждение
В этом примере описывают пациентку с раком поджелудочной железы с необычным течением заболевания после лечения химиотерапией и вакцинацией аутологичными ДК, трансфицированными мРНК hTERT.
Описываемая пациентка прожила более 4 лет с рецидивирующей аденокарциномой поджелудочной железы после радикального хирургического вмешательства. Для подтверждения правильности исходного диагноза первичную опухоль подвергали повторной диагностике, проводимой независимым патологом.
После радикального хирургического вмешательства в январе 2006 у пациентки произошел рецидив в декабре 2006 с увеличением лимфоузлов, локализованных в воротах печени, truncus iliacus и в ретроперитонеальном пространстве, как определено посредством КТ.
Пациентка хорошо отвечала на химиотерапию, и при КТ-сканировании обнаруживали уменьшение размеров опухоли. Однако после 5 месяцев химиотерапии у пациентки развивались тяжелые побочные эффекты, и лечение останавливали.
В этих клинических условиях пациентке предлагали лечение вакцинацией аутологичными ДК, нагруженными мРНК hTERT, на основе программы по предоставлению еще неутвержденных лекарственных средств неизлечимо больным пациентам для укрепления положительного воздействия химиотерапии.
Примечательно, что вместо развития прогрессирующего заболевания после завершенной химиотерапии достигали долговременной стабилизации заболевания и потенциально полной ремиссии. При двух последовательных ПЭТ-сканированиях с интервалом 6 месяцев выявляли метаболически "молчащую" ткань опухоли в участке поджелудочной железы и метастатических повреждений. Эти любопытные данные свидетельствуют о том, что используемая иммунотерапевтическая стратегия индуцировала клинически значимый иммунный ответ у этой пациентки. Таким образом, необходимо задокументировать и тщательно изучать иммунный ответ на hTERT у пациентки. Кроме того, т.к. полностью отсутствует подробная информация об иммунном ответе на hTERT из исследований с использованием полноразмерной мРНК hTERT для вакцинации, важно идентифицировать клинически значимые эпитопы hTERT для разработки следующего поколения вакцин hTERT.
Наблюдали высокую частоту CD8+ T-клеток, связывающих пентамеры, с новыми эпитопами CTL. Эти два эпитопа являлись HLA-A*0201-ограниченными, и ранее их не описывали. Примечательно, что 9-мерный эпитоп (720GLL, SEQ ID NO: 3) включен в 15-мерный пептид (720, PGLLGASVLGLDDIH - SEQ ID NO: 55) той же длины, что и пептид R672 (SEQ ID NO: 56), описываемый ранее Schroers et al., 2002, но со сдвигом одной аминокислоты к C-концу hTERT. Таким образом, возможно, что те же аминокислотные остатки в обоих 15-мерных пептидах отвечают за Т-клеточный ответ. Важно, что тот же 15-мерный пептид (720) также распознается T-клетками от описываемой пациентки в анализах пролиферации, свидетельствуя о том, что этот пептидный фрагмент hTERT может вызывать и CD4+, и CD8+ Т-клеточный ответ у этой пациентки. Кроме того, пять других 15-мерных пептидов распознаются T-клетками от этого пациента. Три из этих пептида ранее не описывали. В своей совокупности эти результаты демонстрируют, что вакцина индуцировала Т-клеточные ответы на по меньшей мере 10 различных эпитопов hTERT у этой пациентки. Количество эпитопов может являться значительно большим, т.к. использовали только ограниченное количество пептидов из библиотеки перекрывающихся пептидов, не покрывающей целую последовательность, а также несколько пентамеров, ограниченных представляемыми HLA-A*0201 пептидами.
Это свидетельствует о том, что не существует обширной толерантности к пептидам hTERT и что стратегия вакцинации с использованием трансфицированных мРНК hTERT ДК обладает высоким потенциалом.
Указанные выше результаты также демонстрируют, что T-клетки от этой пациентки, способные распознавать 30-мерный пептид hTERT, включающий два 15-мерных и один 9-мерный пептид, продуцируют три Th1-ассоциированных цитокина одновременно. Ранее демонстрировали, что этот тип многофункциональности придает лучшую защиту от инфекции. Darrah et al., 2007 показали, что степень защиты от инфекции Leishmania major у вакцинированных мышей можно прогнозировать по частоте CD4+ T-клеток, одновременно продуцирующих интерферон-γ (ИФНγ, интерлейкин-2 и (TNFα)).
Весьма необычное клиническое течение заболевания у этой пациентки свидетельствует о том, что вакцинация и получаемый иммунный ответ могут оказывать влияние на опухоль и метастазы. Это весьма вероятно, т.к. показано, что обширный и сложный иммунный ответ на hTERT вызван вакциной ДК мРНК hTERT. В результате иммунологическая атака на оставшиеся опухолевые клетки может включать непосредственное уничтожение опухолевых клеток hTERT-специфичными CTL, продукция цитокинов T-хелперными клетками (ИФНγ, ФНО) действует на злокачественные клетки, и опухолевую строму, и новообразованные сосуды опухоли, и на усиление непрерывных спонтанных иммунных ответов на другие опухолевые антигены, присутствующие в аденокарциноме. Это может происходить, когда hTERT-специфичные Th-клетки сталкиваются с MHC класса II-положительными антигенпредставляющими клетками, поглотившими опухолевые антигены in situ или в дренирующих опухоль лимфоузлах.
Пример 2
6
Для исследования безопасности, переносимости и иммунного ответа до начала нового клинического испытания фазы I/II одного пациента с раком легких IV стадии вакцинировали аутологичными полученными из моноцитов ДК, трансфицированных мРНК, кодирующей hTERT. Сначала пациент получал четыре еженедельные вакцинации с последующими ежемесячными повторными вакцинациями 5×10 ДК, инъецируемых внутрикожно. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) получали перед четырьмя стандартными вакцинациями, после 5 недель, 12 недель и затем ежемесячно. Размороженные PBMC стимулировали in vitro трансфицированными ДК. Анализы T-клеточной пролиферации осуществляли с облученными трансфицированными ДК и ложно-трансфицированными ДК в качестве контролей. Кроме того, hTERT-специфичные CD8+ T-клетки проверяли окрашиванием с использованием пентамера. Пациент хорошо переносил лечение с небольшими побочными эффектами и имел длительный период дожития (72 недели) по сравнению с ожидаемым (12 недель). Пациент демонстрировал специфичную T-клеточную пролиферацию в ответ на нагруженные мРНК ДК in vitro после вакцинации. Стабильные популяции hTERT-специфичных CD8+ T-клеток определяли окрашиванием с использованием пентамера в образцах после вакцинации. Дополнительно тестировали образцы из различных временных точек после вакцинации в сравнении с панелью 24 перекрывающихся пептидов hTERT и определяли Т-клеточные ответы на множество пептидов (фигура 12). Т-клеточные ответы на эти эпитопы также определяли и у невакцинированных пациентов со злокачественными новообразованиями, и у ранее вакцинированных пептидом теломеразы GV1001 (SEQ ID NO: 10) пациентов со злокачественными новообразованиями, что свидетельствует о высокой степени иммуногенности и разнородности HLA. Эти клинические результаты в примерах 1 и 2 показывают, что вакцинация трансфицированными мРНК hTERT ДК является безопасной и способна индуцировать сильные иммунные ответы на некоторые эпитопы теломеразы T-клеток и в CD4+, и в CD8+ T-клетках.
Пример 3
Идентифицировали пептиды фермента теломеразы, подходящие для вызывания Т-клеточных ответов и классифицировали по данным исследований нескольких вакцинированных пациентов (вакцинированных пептидом GV1001 или дендритными клетками, трансфицированными мРНК, кодирующей hTERT) и невакцинированного пациента со злокачественным новообразованием для идентификации пептидов, способных индуцировать применимые противоопухолевые иммунные ответы. Сводная информация о выбранных пациентах, статусе их вакцинации и их клиническом ответе представлена в таблице 9. У одного пациента, вакцинированного GV1001 (SEQ ID NO: 10), Т-клеточный ответ на пептид 660-689 (30-мерный) (SEQ ID NO: 1) являлся даже более сильным, чем на пептид вакцины сам по себе в конкретные временные точки (см. фигуру 3), но также другие пациенты демонстрировали сильные иммунные ответы на этот пептид. Идентифицированные пептиды приведены в таблице 1. Не обнаруживали Т-клеточные ответы на эти пептиды у кого-либо из шести здоровых доноров крови, тестируемых на реактивность.
Также от пациентов получали T-клеточные клоны, специфичные для всех пептидов из 15 или 30 аминокислот, представленных в таблице 1. Показано, что эти клоны распознают природно процессируемые пептиды (данные не представлены) и отвечают на очень низкие концентрации пептидов вплоть до 10 нг/мл (см. фигуру 4), что означает, что они обладают высокой аффинностью для своих мишеней. Это важно для того, чтобы они были способны индуцировать сильный иммунный ответ in vivo, где концентрации пептида являются более низкими.
30-мерный полипептид SEQ ID NO: 1 демонстрировал реактивность почти у всех тестируемых пациентов со злокачественными новообразованиями и, таким образом, по-видимому, является очень иммуногенным. Этот пептид содержит оба мотива, которые могут распознавать CD4+ T-хелперные клетки, как и вакцина GV1001 (SEQ ID NO: 10), а также мотивы, распознаваемые CD8+ цитотоксическими T-лимфоцитами (CTL). Оба эти типа ответов определяли in vitro в T-лимфоцитах от пациентов, стимулированных пептидом.
С использованием меченных флуорохромом реагентов (пентамеров), способных связываться с CD8+ T-лимфоцитами, специфичными для указанных выше 9- или 10-мерных пептидов, определяли наличие этих клеток у многих пациентов со злокачественными новообразованиями, в основном вакцинированных GV1001 (SEQ ID NO: 10). Эти 9- или 10-мерные пептиды распознаются при представлении на молекулах HLA-A2 (фигура 5), присутствующих у приблизительно 50% популяции европеоидов, и на молекулах HLA-B7 (фигура 6), присутствующих у 20% той же популяции, что означает, что вместе они покрывают большую часть популяции европеоидов.
Кроме того, 15- и 30-мерный пептиды, приведенные в таблице 1, демонстрируют реактивность почти у всех тестируемых пациентов, что означает, что они являются разнородными в отношении аллелей HLA класса II, которые их представляют, и что они применимы почти для всей популяции без необходимости скрининга HLA (см. таблицу 2).
Помимо стимуляции реактивности у пациентов, вакцинированных GV1001 (SEQ ID NO: 10), эти пептиды также индуцируют Т-клеточные ответы в клетках от одного пациента с раком легких и одного пациента с раком поджелудочной железы, вакцинированных дендритными клетками, трансфицированными мРНК hTERT. Используемая мРНК не вызывает трансляцию полноразмерного белка hTERT, но перекрывает большую его часть, и указанные в таблице 1 пептиды индуцируют некоторые из наиболее сильных ответов у этих пациентов.
Пример 4
Т-клеточные ответы на библиотеку пептидов hTERT (включая полипептиды из таблицы 1) определяли для T-клеток от 5 пациентов в дополнение к пациентам, описываемым в примерах 1 и 2. Способы являлись теми же, как описано выше в примере 1 или в Bernhardt et al., 2006. Вкратце, PBMC из различных временных точек в течение вакцинации стимулировали библиотекой перекрывающихся пептидов hTERT перед тестированием на специфичные Т-клеточные ответы в анализе пролиферации. Результаты представлены на фигурах 7-13. Полный список пептидов представлен в таблице 3.
На гистограммах на фигурах 7-13 показаны ответы на библиотеку перекрывающихся пептидом hTERT у 7 пациентов (пациентку с раком поджелудочной железы описывали в примере 1).
Пептид 613-627 обладает очень схожей последовательностью с GV1001 (SEQ ID NO: 10), и предполагают, что его распознают те же клетки, распознающие GV1001, но пептид 613-627 не идентичен пептиду вакцины.
Последние два пациента не тестировали на ответы на 30-мерный 660-689 (SEQ ID NO: 1), т.к. этот пептид синтезировали после тестов. Пептид SEQ ID NO: 1 вызывал очень сильные ответы у вакцинированного GV1001 пациента с раком легких. 75% T-клеточных клонов, получаемых из культуры с этим пептидом, являлись специфичными, что свидетельствует о том, что этот клон присутствует у пациента с высокой частотой. Этот пациент с раком легких являлся тем же пациентом, чьи hTERT-специфичные CD8+T-клетки представлены на гистограмме фигуры 6.
Т.к. тестируемых пациентов (за исключением представленного невакцинированного пациента) выбирали по причине необычного течения их заболеваний, определяемые сильные ответы на пептиды, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что эти пептиды являются клинически значимыми эпитопами.
Пример 5
Последовательность полипептида SEQ ID NO: 1 (30-мерный 660-689) анализировали на иммуногенные фрагменты, для которых прогнозировали связывание с различными аллелями HLA класса I (прогноз осуществляли с использованием базы данных SYFPEITHI для лигандов MHC и пептидных мотивов). Результаты представлены в таблице 4.
Пример 6
Осуществляли сравнение исследуемых в примере 4 пациентов. Вкратце, семь пациентов идентифицировали как клинически отвечающих после диагностики злокачественных новообразований и вакцинации вакциной hTERT. Этих пациентов идентифицировали на основании комбинации длительного периода дожития и клинического ответа. Клинический ответ может представлять собой стабильное заболевание (SD), частичный ответ (PR) или полный ответ (CR). Вакцинированным пациентам с меланомой ставили диагноз меланома IV стадии на момент включения в клиническое испытание, но они не имели метастазов в головном мозге. Пациенту с раком легких P5 ставили диагноз неоперабельный рак легких IV стадии, и пациенту с раком толстого кишечника P1 ставили диагноз неоперабельный рак толстого кишечника поздней стадии. Пациент с раком легких P6 являлся пациентом с раком легких IV стадии с ожидаемой продолжительностью жизни 12 недель. Пациент с раком поджелудочной железы P1 имел рецидивирующий неоперабельный рак поджелудочной железы, и его ожидаемая продолжительность жизни составляла 8-10 месяцев. Каждого из четырех пациентов (обозначаемых как меланома P7-P8, рак легких P5 и рак толстого кишечника P1) вакцинировали пептидом GV1001 (SEQ ID NO: 10). Пятого пациента (обозначаемого как рак легких P6) и шестого пациента (обозначаемого как рак поджелудочной железы 1) вакцинировали дендритными клетками, трансфицированными мРНК, кодирующей hTERT. Седьмого пациента, пациента с меланомой P9, не вакцинировали во время исследования, и вместо этого у него развивался спонтанный ответ после развития злокачественного новообразования. (Восьмого и последнего пациента также идентифицировали как клинически отвечающего, но образцы от этого пациента были недоступны для исследования.)
Затем определяли пролиферативные Т-клеточные ответы каждого пациента на серию пептидов, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 5 и графически изображены на фигуре 14, обозначения пептидов на которой представлены в таблице 6 (результаты для пептидов 726 и GV1001 представлены только для сравнения).
Наблюдали, что все пациенты отвечали на GV1001 (т.е. они имели SI>2). По причине высокого фона, вызываемого ауто-MLC у вакцинированных дендритными клетками пациентов (рак легких P7 и рак поджелудочной железы P1), значения SI являлись низкими по сравнению с обнаруживаемыми у других пациентов.
Пример 7
Исследовали четырех пациентов, являвшихся клинически неотвечающими после постановки диагноза рак легких и вакцинации пептидом GV1001 (SEQ ID NO: 10). Все эти пациенты являлись пациентами с раком легких стадии IV, вакцинированными GV1001. Этих пациентов случайным образом выбирали среди тех пациентов, кто имел иммунный ответ на GV1001, но заболевание все равно прогрессировало и период дожития являлся кратковременным по сравнению с другими пациентами с иммунным ответом на вакцину. Пролиферативные Т-клеточные ответы каждого пациента на серию пептидов определяли тем же способом, что и в примере 1, в одной временной точке. Также представлен максимальный ответ каждого пациента на пептид GV1001 в течение периода исследования, подтверждающий, что каждый пациент иммунологически отвечал на вакцинацию GV1001.
Результаты приведены в таблице 7 и графически представлены на фигуре 15, а обозначения пептидов представлены в таблице 6.
Все четыре пациента демонстрировали очень низкий ответ на пептиды SEQ ID NO: 1, 7, 8 и 9 или его отсутствие.
Пример 8
Исследовали шесть пациентов, являвшихся клинически неотвечающими после постановки диагноза меланома и вакцинации пептидом GV1001 (SEQ ID NO: 10). Все эти пациенты являлись пациентами с меланомой стадии IV, и их включали в то же исследование вакцинации GV1001, что и пациентов с меланомой P7 и P8, имевших короткий период дожития (см. пример 6). Этих пациентов случайным образом выбирали среди тех, кто демонстрировал иммунный ответ на вакцину, но все равно имел короткий период дожития. У пяти пациентов также прогрессировало заболевание, и один пациент, обозначаемый как меланома P3, испытывал некоторую стабилизацию заболевания, но все равно имел короткий период дожития. Пролиферативные Т-клеточные ответы каждого пациента на серию пептидов определяли тем же способом, что и в примере 1, в одной временной точке. Также представлен максимальный ответ каждого пациента на пептид GV1001 в течение периода исследования, подтверждающий, что каждый пациент иммунологически отвечал на вакцинацию GV1001.
Результаты приведены в таблице 8 и графически представлены на фигуре 16, а обозначения пептидов представлены в таблице 6.
Все шесть пациентов демонстрировали очень низкий ответ на пептиды SEQ ID NO: 1, 7, 8 и 9 или его отсутствие.
Заключение примеров 1-8
Сводная информация о пациентах, исследуемых в примерах 1-8, представлена в таблице 9. Все пациенты иммунологически отвечали на пептид GV1001. Пациентов классифицировали как клинически отвечающих или клинические неотвечающих на основании их клинического ответа, включающего стабильное заболевание (SD), регрессию опухоли (PR или CR) и неожиданно длительный период дожития. Клинически отвечающих и клинически неотвечающих выбирали из одних и тех же или схожих исследований вакцинации.
+ означает, что пациент еще жив
PD= Прогрессирующее заболевание
SD = Стабильное заболевание
PR = Частичный ответ
CR = Полный ответ
TTP = Время до прогрессирования
Представленные данные убедительно свидетельствуют о том, что введение индивидуумам любого из пептидов SEQ ID NO: 1-9 будет индуцировать Т-клеточные ответы на вводимый пептид по меньшей мере у некоторых индивидуумов. Наличие Т-клеточных ответов на пептиды SEQ ID NO: 1-9 у пациентов, которым вводили другие пептидные вакцины hTERT или трансфицированные дендритные клетки, демонстрирует, что пептиды SEQ ID NO: 1-9 могут связываться и быть представленными молекулами MHC пациентов и что пациенты в своем репертуаре Т-клеток имеют T-клетки, способные связывать пептиды при представлении. Таким образом, если индивидуумам вводят пептиды SEQ ID NO: 1-9, можно ожидать Т-клеточные ответы на пептиды.
Кроме того, представленные в примерах 6-8 данные демонстрируют, что Т-клеточные ответы на пептиды hTERT SEQ ID NO: 1, 7, 8 и 9, представленные в настоящем описании, связаны с благоприятными клиническими ответами у пациентов с различными формами злокачественного новообразования. У ряда пациентов с коротким периодом дожития, подвергаемых лечению вакциной hTERT тем же способом и отвечающих на эту вакцину, ответы на пептиды hTERT SEQ ID NO: 1, 7, 8 и 9 наблюдали только спорадически. Также необходимо отметить, что у некоторых из этих пациентов с коротким периодом дожития ответ на пептид GV1001 являлся сильным. Мы интерпретируем эти результаты так, что ответ на один пептид (например, GV1001) в отдельности недостаточен для обеспечения клинического ответа/длительного периода дожития, т.к. у большинства пациентов с иммунным ответом на этот пептид период дожития являлся коротким.
Это подтверждено анализом диаграммы рассеяния, представленной на фигуре 17, при сравнении количества пептидов hTERT, в ответ на которые пациенты демонстрировали иммунный ответ, с длительностью периода дожития пациентов. Как можно видеть на фигуре 17, существует четкая корреляция между более длительными периодами дожития и иммунными ответами на большее количество пептидов hTERT.
Кроме того, представленный на фигуре 18 анализ показывает, что пациенты, отвечающие на 2 или более пептида hTERT в дополнение к GV1001, имеют большую длительность периода дожития, что являлось статистически значимым при сравнении с пациентами, демонстрирующими иммунный ответ на 0 или 1 пептидов hTERT в дополнение к GV1001.
Кроме того, представленные в настоящем описании данные представляют убедительные доказательства, указывающие на важную роль пептидов hTERT SEQ ID NO: 1, 7, 8 и 9 в благоприятных иммунных ответах. Таким образом, активная иммунизация этими новыми пептидами должна индуцировать клинически значимые иммунные ответы у большего количества пациентов и, таким образом, приводить к длительному периоду дожития у большей части пациентов, чем достигают вакцинацией пептидом GV1001 в отдельности.
Мы демонстрируем, что ответы на пептиды SEQ ID NO: 1, 7, 8 и 9 естественным образом возникают после вакцинации неродственными пептидами у клинически отвечающих, в отличие от пациентов, не отвечающих клинически хорошо. Считают, что механизмом природной иммунизации является представление этих пептидов антигенпредставляющими клетками, поглощающими погибшие опухолевые клетки, несущие hTERT, и процессирующие белок hTERT посредством своего протеолитического аппарата для получения набора естественным образом процессированных пептидов hTERT, соответствующих пептидам SEQ ID NO: 1, 7, 8 и 9, представленным в настоящем описании. Доказательство того, что многие из тех же пептидов распознаются T-клетками, взятыми от пациентов, иммунизированных трансфицированными мРНК hTERT антигенпредставляющими клетками (дендритными клетками), и что эти пациенты после вакцинации чувствовали себя исключительно хорошо, дополнительно подтверждает это мнение. Усиливая или вызывая эти ответы посредством вакцинации пептидом по настоящему изобретению или смесью таких пептидов, таким образом, уже клинически проверенных, можно индуцировать клинические ответы и длительный период дожития у гораздо большей части пациентов.
Пример 9
Результаты примеров 1-8 также исследовали на предмет наиболее эффективной комбинации пептидов, таким образом, подходящих для комбинирования для получения смеси пептидов. Наблюдали, что пептиды SEQ ID NO: 1, 7 и 9 обладали взаимодополняющими эффектами по следующим причинам.
Связывающие MHC мотивы каждой из SEQ ID NO: 1, 7 и 9 и иммуногенные фрагменты последовательностей представлены в таблице 10.
Как видно из таблицы 10, пептиды SEQ ID NO: 1, 7 и 9 и их иммуногенные фрагменты способны связываться с широким диапазоном молекул HLA, представляющих эпитопы Th или CTL. Таким образом, эти пептиды способны вызывать иммунные ответы в обширной популяции пациентов.
Кроме того, подтверждали иммуногенность пептидов SEQ ID NO: 1, 7 и 9 среди клинически отвечающих пациентов, описываемых в примере 6, и относительно больший иммунный ответ у клинически отвечающих, чем у клинически неотвечающих.
Более конкретно, для пептида SEQ ID NO: 1 наблюдали иммунные ответы у 7/7 клинически отвечающих по сравнению с иммунными ответами у 1/10 клинически неотвечающих. Несколько из отвечающих с длительным периодом дожития также демонстрировали CTL-ответы при анализе с использованием пентамера.
Для пептида SEQ ID NO: 7 наблюдали иммунные ответы у 5/7 клинически отвечающих по сравнению с иммунными ответами у 1/10 клинически неотвечающих.
Для пептида SEQ ID NO: 9 наблюдали иммунные ответы у 3/7 клинически отвечающих по сравнению с иммунными ответами у 0/10 клинически неотвечающих в дополнение к CTL-ответам, показанным с помощью анализа с использованием пентамера у 3 пациентов, один из них являлся дополнительным для 3, демонстрирующих пролиферативные ответы.
Таким образом, этот анализ результатов демонстрирует, что ожидают, что смесь пептидов SEQ ID NO: 1, 7 и 9 будет иметь высокий уровень эффективности в обширной популяции людей.
Ссылки