ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

1. Новый способ получения капсульного полисахарида Neisseria meningitides с высоким выходом и высокой чистоты, включающий следующие стадии: (а) приготовление водной ферментационной питательной среды, содержащей казаминокислоту; (b) инокуляцию ферментационной питательной среды с бактериями Neisseria meningitides X, имеющей оптическую плотность от 0,8 до 1,2; (с) непрерывную экспоненциальную подпитку с помощью раствора питательной среды со скоростью добавления, колеблющейся между 10 и 60 мл/ч/1.5 л, начиная с оптической плотности OD между 3 и 4; (d) инкубирование инокулированной ферментационной питательной среды в контролируемых условиях рН, температуры и процента растворенного кислорода; (е) сбор клеток капсульного сахарида, полученного на стадии (d), когда оптическая плотность при 590 нм составляет менее 60% от наивысшего значения OD культуры; (f) очистки капсульного сахарида, полученного на стадии (е); (g) необязательное концентрирование очищенного капсульного полисахарида, полученного на стадии (f); и
отличающийся тем, что очищенный полисахарид получают с выходом от 300 до 550 м, средней молекулярной массой от 400 до 550 кДа, выходом на стадии очистки от 60% до 65 и содержанием менее 0,5% белков/пептидов, менее 0,5% нуклеиновых кислот и менее чем 5 EU/мкг эндотоксинов.
2. Способ получения капсульного полисахарида Neisseria meningitides по п. 1, в котором:
(a) указанный капсульный полисахарид продуцирует бактерии, относящиеся к серогруппе X;
(b) указанный капсульный полисахарид продуцирует бактерии, выбранные из N.meningitidis X штаммов М8210, М9601,М9591, М9592, М9554,М2526,247Х и 5967(ST 750);
(c) указанная ферментационная питательная среда включает в себя, г/л:
(i) Казаминокислота
5-20
Хлорид аммония
0,14-0,19
Декстроза
10-11
Хлорид натрия
5,8-6,0
Сульфат калия
0,9-1,0
Двухосновный фосфат калия
3,8-4,0
Глутаминовая кислота
4,8-5,0
L-Аргинин
0,2-0,3
L-Серина
0,4-0,5
L –Цистеин
0.24-0.25
Хлорид магния
0,18-0,19
Хлорид кальция
0,02
Сульфат железа
0,002
таким образом, что концентрация компонентов в среде может изменяться в пределах ±10% или
(ii) Казаминокислота
5-10
Хлорид аммония
0,14-0,17
Декстроза
10-11
Хлорид натрия
5,8-6,0
Сульфат калия
9,0-1,0
Двухосновный фосфат калия
3,8-4,0
Глутаминовая кислота
4,8-5,0
L- Аргинин
0,2-0,3
L-Серин
0,4-0,5
L –Цистеин
0,24-0,25
Хлорид магния
0.18-0,19
Хлорид кальции
0,02
Сульфат железа
0,002
таким образом, что концентрация компонентов в среде может изменяться в пределах ±10%
(d) указанная инокуляция ферментационной питательной среды происходит с помощью семенного инокулята, имеющего оптическую плотность от 0.8 до 1;
(e) указанная непрерывная экспоненциальная подпитка начинается с инициирующего добавления семян со скоростью 10 мл/ч/1.5 л до тех пор пока значение OD при 590 нм не будет между 3 и 4, которая градиентно увеличивается до 30 мл/ч/1.5 л, до тех пор, пока OD культуры не станет наивысшей, и затем поддерживается при 60 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока OD культуры не достигнет 50% от наивысшего значения OD, после чего культура может быть собрана;
(f) указанный раствор для подпитки включает, г/л:
Декстроза
72-76
Глутамат натрия
38-42
L-Аргинин
2.8-3.2
L-Серин
2,8-3,2
L-Цистеин
1,9-2,1
Хлорид магния
1,9-2,0
Хлорид кальция
0,13-0,15
Сульфат железа
0,02
таким образом, что концентрация компонентов в питательном растворе может изменяться в пределах ±10%
(g) указанное инкубирование осуществляют:
(i) при температуре от 36 до 37°С, при значении рН 7-7.2, от 350 до 500 об/мин, с процентом растворенного кислорода от 15 до 25%, с газовым потоком от 1 до 1.5, воздухом от 0 до 100% и кислородом от 0 до 100% в течение от 7 до 10 ч или
(ii) при температуре 36°С, при значении рН 7.2,при перемешивании приблизительно 400 об/мин, с процентом растворенного кислорода 25%, с газовым потоком от 1 до 1.5,
(iv) содержание воздуха от 0 до 100% и кислорода от 0 до 100% в течение от 8 до 9 ч;
(h) указанная инактивация осуществляется с использованием 1%-ного формальдегида в течение от 1 до 2 ч при температуре 37°С с последующим инкубированием при 10°С в течение 30 мин.
(i) указанный сбор клеток осуществляют путем
(i) центрифугирования при 14500 g в течение 45 мин, чтобы удалить все остатки клеток;
(ii) полученный супернатант фильтруют до 0.2 мкм с последующей 100 кДа диафильтрацией и концентрируют с водой для инъекций (WFI);
и (j) указанный процесс осуществляют в культуральной системе с непрерывной подпиткой.
3. Способ по п. 1, где стадия (f) включает:
(a) удаление белковых и эндотоксиновых загрязнений с использованием анионного детергента в концентрации от 1 до 1.2% в комбинации с хелатирующим агентом в концентрации от 1.5 до 3 мМ и спиртом в концентрации от 40 до 50%;
(b) добавление ацетата натрия в концентрации от 4 до 6% для удаления нуклеиновых кислот;
(c) добавление катионного детергента в концентрации от 3 до 4% для связывания полисахарида и примесей;
(d) осаждение полисахарида из катионного комплекса детергент - полисахарид, используя хлорид натрия в концентрации 0.05 М в присутствии 96%-ного спирта;
(e) удаление белковых и нуклеиновокислых примесей путем промывания осадка с помощью 45% спирта в присутствии хлорида натрия в концентрации 0.4 М;
(f) селективное осаждение полисахарида с использованием 96%-ного спирта;
(g) растворение полисахарида в воде для инъекций (WFI) и проведение фильтрации с тангенциальным потоком; и
отличающийся тем, что в указанном процессе очистки не используют какую либо хроматография.
4. Способ по п. 3, где очистка включает следующие стадии:
(a) удаление белковых и эндотоксиновых загрязнений с использованием дезоксихолата в концентрации 1% в комбинации с этилендиаминтетрауксусной кислотой в концентрации 2 мМ и спиртом в концентрации 40%;
(b) добавление от 4 до 6% ацетата натрия для удаления нуклеиновых кислот;
(c) добавление цетилтриметиламмонийбромида в концентрации от 3 до 4% для связывания полисахарида и примесей;
(d) осаждение полисахарида из комплекса цетилтриметиламмонийбромид-полисахарид с использованием хлорида натрия в концентрации 0.05М в присутствии 96%-ного этанола;
(е) удаление белковых и нуклеиновокислых примесей путем промывания осадка с помощью этанола в концентрации 45% в присутствии хлорида натрия в концентрации 0.4 М;
(f) селективное осаждение полисахарида с использованием 96%-ного этанола;
(g) растворение полисахарида в воде для инъекций (WFI) и проведение фильтрации с тангенциальным потоком;
отличающийся тем, что в указанном процессе очистки не используют какую-либо хроматографию.
5. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию (h), где очищенный N.meningitidis X полисахарид доводят до среднего размера между 100 и 150 кДа путем использования системы для разрушения клеток высокого давления.
6. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию (i), где указанный полисахарид уменьшенного размера конъюгируют с белком-носителем с образованием конъюгата белок - сахарид.
7. Способ по п. 6, где указанный N. meningitidis X сахарид конъюгируют с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С ТТ, белка D, ОМРС и пневмолизина.
8. Способ по п. 6, где указанный N.meningitidis X сахарид конъюгируют с белком-носителем через гетеро- или гомобифункциональный линкер с помощью конъюгирования путем химического цианилирования.
9. Способ по п. 8, где указанный цианилирующий реагент выбирают из группы I-циано-4-пирролидинОПиридиния тетрафторбората (СРРТ), 1-циано-имидазола (1-CI), 1-цианобензотриазола (1-СВТ), или 2-цианОПиридазин-3(2Н)она (2-СРО), или их функционального производного, или их модификации.
10. Иммуногенная композиция, полученная по любому из предшествующих пунктов, где конъюгаты сахарида находятся в лиофилизованной форме.
11. Иммуногенная композиция, полученная по любому из предшествующих пунктов, где конъюгаты сахарида находятся в буферизированной жидкой форме.
12. Иммуногенная композиция, полученная по любому из предшествующих пунктов, где один или более конъюгатов N.meningitidis-сахарид необязательно адсорбированы на гидроксид алюминия, фосфат алюминия или смеси обоих или неадсорбированы на адъювант.
+++
13. Иммуногенная композиция по п. 12, включающая стадию добавления соли алюминия в качестве адъюванта в количестве 25-125 мкг Аl на 0.5 мл.
14. Иммуногенная композиция по п. 13, дополнительно содержащая консервант, выбранный из тиомерсала и 2-феноксиэтанола.
15. Иммуногенные лиофилизованные моно- или поливалентные композиции N.meningitidis конъюгированной вакцины, содержащие конъюгат N.meningitidis X полисахарид - белок, полученные по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная вакцина дается как 1, 5 или 10 дозированный состав.
16. Новый способ получения капсульного Neisseria meningitidis X полисахарида с высокими выходами и высокой чистотой за счет использования i) композиции ферментационной среды, содержащей казаминокислоты и хлорид аммония наряду с другими компонентами, ii) непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки и состава питательной среды, которая приводит к задержке фазы замедления роста, iii) оптимальных условий ферментера и iv) улучшенного процесса очистки, лишенного хроматографических методов,
отличающийся тем, что очистка очищенного полисахарида дает выход от 300 до 550 м, средний молекулярный вес от 400 до 550 кДа, содержание менее 0,5% белков/пептидов, менее 0,5% нуклеиновых кислот, менее чем 5 EU/мкг эндотоксинов и извлечение на указанной стадии очистки от 60 до 65%.
17. Новый способ получения капсульного Neisseria meningitidis X полисахарида с высокими выходами и высокой чистотой за счет использования i) композиции ферментационной среды, содержащей казаминокислоту и по крайней мере один дополнительный источник азота, выбранный из соевого пентона и дрожжевого экстракта, ii) непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки и состава питательной среды, что может привести к задержке фазы замедления роста, iii) оптимальных условий ферментера и iv) улучшенного процесса очистки, лишенного хроматографических методов,
отличающийся тем, что очистка очищенного полисахарида дает выход от 300 до 550 м, средний молекулярный вес от 400 до 550 кДа, содержание менее 0,5% белков/пептидов, менее 0,5% нуклеиновых кислот, менее чем 5 EU/мкг эндотоксинов и извлечение на указанной стадии очистки от 60 до 65%.
18. Новый способ получения капсульного Neisseria meningitidis X полисахарида с высокими выходами и высокой чистотой за счет использования i) композиции ферментационной среды, содержащей казаминокислоту, хлорид аммония и, по крайней мере, один дополнительный источник азота, выбранный из соевого пентона и дрожжевого экстракта, ii) непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки и состава питательной среды, что может привести к задержке фазы замедления роста, iii) оптимальных условий ферментера и iv) улучшенного процесса очистки, лишенного хроматографических методов,
отличающийся тем, что очистка очищенного полисахарида дает выход от 300 до 550 м, средний молекулярный вес от 400 до 550 КДа, содержание менее 0,5% белков/пептидов, менее 0,5% нуклеиновых кислот, менее чем 5 EU/мкг эндотоксинов и извлечение на указанной стадии очистки от 60 до 65%.