Способ определения концентрации противовирусных препаратов в биоматериалах лабораторных животных
METHOD FOR DETERMINING CONCENTRATION OF ANTIVIRAL DRUGS IN BIOMATERIALS OF LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к медицине, биологии и фармакологии, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения концентрации и фармакокинетических показателей противовирусных веществ в биоматериалах лабораторных животных при проведении научно-исследовательских работ, связанных с поиском и разработкой новых эффективных и биодоступных противовирусных препаратов.
При проведении доклинических и клинических исследований для изучения фармакокинетики и определения концентрации существующих и разрабатываемых лекарственных препаратов в биоматериалах животных и человека используются различные методы (физико-химические, иммунологические, микробиологические и другие) [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р.У. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005, 832 с.; Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012, 944 с.]. В некоторых случаях проведение физических и химических анализов бывает достаточно для полной характеристики свойств препаратов. Однако физические и химические показатели не всегда в полной мере отражают терапевтическое действие лекарственного средства. В подобных случаях необходимо определение его специфической биологической активности при помощи непосредственного исследования в биологических системах [Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание, том I. Москва, 2018, 1814 с.]. Так, в ГФXIV представлены многие методы биологического анализа in vitro и in vivo, например, биологические испытания инсулина, гистамина и сердечных гликозидов, определение антимикробной активности антибиотиков (ОФС.1.2.4.0010.18) и антимикробных консервантов (ОФС.1.2.4.0011.15), определение содержания витаминов микробиологическим методом (ОФС.1.2.4.0012.15) и другие [Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание, том I. - Москва, 2018. - 1814 с.]. При этом в доступной научно-методической литературе не описаны методы определения количества противовирусных веществ с использованием вирусологических исследований.
Вместе с тем, физико-химические методы количественного определения (концентрации) химических соединений, например, ПК-спектрометрия (ОФС.1.2.1.1.0002.15), ЯМР-спектроскопия (ОФС.1.2.1.1.0007.15), масс-спектрометрия (ОФС.1.2.1.1.0008.15), ВЭЖХ (ОФС.1.2.1.2.0005.15) и другие [Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание, том I. - Москва, 2018. - 1814 с.] в биоматериалах лабораторных животных проблематично использовать в научно-исследовательских вирусологических работах, связанных с широким скринингом и выбором эффективных противовирусных препаратов. Это обусловлено тем, что для проведения таких анализов требуются значительные финансовые и материальные затраты, дорогостоящее высокотехнологичное оборудование, разработка индивидуальных методов идентификации каждого химического соединения и высококвалифицированный персонал специализированных физико-химических учреждений.
В связи с этим представляется актуальной разработка нового, доступного для вирусологических лабораторий, статистически обоснованного биологического метода определения концентрации химических препаратов, обладающих противовирусной активностью, в биоматериалах лабораторных животных (и человека) для использования в научных, доклинических (и клинических) исследованиях.
Предшествующий уровень техники
Известно, что для определения концентрации фармакологических средств в биоматериале могут быть использованы различные методы (физико-химические, иммунологические, микробиологические и др.), обеспечивающие возможность уверенного слежения за общей концентрацией (суммарный уровень свободного и связанного макромолекулами) фармакологического средства при выбранных условиях фармакокинетического эксперимента, в частности его длительности, и отвечающие общим требованиям избирательности, точности, воспроизводимости. В тех случаях, когда фармакологическое средство связывается макромолекулами крови, процессы связывания должны быть изучены in vitro методами равновесного диализа или ультрафильтрации с использованием аналитических процедур, перечисленных выше. При этом показатели связывания следует оценивать при концентрациях фармакологического средства, которые отражают диапазон изменения его уровней in vivo.
В тех случаях, когда в биоматериале наряду с неизмененным фармакологическим средством присутствуют продукты его биотрансформации, а суммарная кумулятивная экскреция неизмененного фармакологического средства значительно ниже дозы, необходимо количественное определение метаболитов. Вместе с тем детальное изучение кинетики образования и элиминации метаболита(ов) требуется только при условии существенного вклада метаболического превращения фармакологического средства в его элиминацию, особенно, когда метаболит обладает биологической активностью. Если вследствие пресистемной элиминации фармакологического средства оно подвергается метаболическому превращению и не обнаруживается в крови в неизмененном состоянии и (или) не обладает биологической активностью (пролекарство), необходимо определять концентрацию именно метаболита(ов) [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012, 944 с.].
Известно определение концентрации лекарственных антимикробных препаратов в биоматериалах, в частности в плазме крови, лабораторных животных используют хроматографический метод [Коломиец Л.Н., Волков А.А., Якубов Э.С. Хроматография на благо России. М.: Граница, 2007, 688 с.].
Так, например, для количественного определения Рифампицина в плазме крови кроликов использовали хроматографический метод [Ким M.E., Мурзагулова К.Б. Исследование фармакокинетики и относительной биодоступности препарата РИЗЭФ-Д 60/30 таблетки диспергируемые // Журнал Фундаментальные исследования. 2014, №9 (часть 4), С. 794-798]. Анализ Рифампицина проводили на жидкостном хроматографе «Agilent 1100» с УФ-детектором и компьютером с соответствующим пакетом программ для обсчета хроматограмм. Условия хроматографирования: аналитическая колонка - «Zorbax Bonus-RP», Agilent (150'4,6 мм; 5 мкм); подвижная фаза 0,01 М раствор аммония фосфата двузамещенного - ацетонитрил (50:50), профильтрованная через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и дегазированная на ультразвуковой бане; скорость потока элюента - 1,0 мл/мин; детектирование при длине волны 215 нм; температура колонки +35°С.
Для экстракции Рифампицина из плазмы крови в экстракционную пробирку, содержащую 1 мл плазмы крови, добавляли 5,0 мл смеси пентан : дихлорметан (1:1), встряхивали на шейкере и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносили в выпарительную колбу. Органическую фракцию выпаривали досуха на роторном испарителе в токе азота. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы и по 50 мкл аликвоты вводили в петлю инжектора. Процент извлечения Рифампицина из плазмы крови составил в среднем 83,9±7,5%. Количественное определение Рифампицина проводили методом абсолютной калибровки. Установлено, что в диапазоне концентраций 5-40 мкг/мл калибровочная кривая линейна. Стандартная кривая Рифампицина описывалась уравнением у=34,033х-85,17 (R2=0,9997), где у - площадь хроматографического пика рифампицина; х - концентрация в мкг/мл. Минимальная обнаруживаемая концентрация составила 25 нг/мл. Относительная ошибка метода для концентрации 5 мкг/мл не превышала 29,76% [Белоусов Ю.Б., Гуревич К.Г. Клиническая фармакокинетика. М.: Литтерра, 2005, 288 с.].
В настоящее время в практике количественного определения содержания лекарственных веществ в биологических субстратах все большее применение находят так называемые «гибридные» методы. Под этим подразумевается сочетание масс-спектрометрии с хроматографическими методами разделения.
Уже давно масс-спектрометр рассматривают как отличный детектор для газовой хроматографии. Как в газовом хроматографе, так и в масс-спектрометре определяемые вещества находятся в газовой фазе, что, несомненно, способствует сочленению обеих приборных систем, а получаемые с помощью каждого из них аналитические данные просты для понимания и использования. Когда эти два прибора напрямую соединяют в единую хроматомасс-спектрометрическую систему (GC-MS), возможности такой системы не просто равны сумме возможностей каждого прибора; аналитические возможности увеличиваются экспоненциально.
По той же причине, что и ВЭЖХ все больше вытесняет газовую хроматографию из фармацевтического анализа, так и в гибридных подходах сочетание жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS) становится преобладающим методом анализа биологических образцов. Дело в том, что LC-MS позволяет анализировать нелетучие и термонестабильные вещества. Вопросы количественного определения лекарственных веществ методом ВЭЖХ достаточно хорошо освещены в отечественных изданиях [Мирошниченко И.И., Тюляев И.И., Зуев А.П. Биодоступность лекарственных средств. М.: Грамотей. 2003. 112 с.; Писарев В.В., Смирнова Л.Б., Москалева Н.Е. и др. Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием // Клин. Фармакокин. 2004, №1, С. 23-26].
К сожалению, вещество-кандидат (ВК) с хорошей активностью in vitro не всегда проявляет активность in vivo, в случае если вещество не обладает достаточной биодоступностью и приемлемой длительностью действия. Множество потенциально активных веществ приходится выбраковывать из-за нежелательных фармакокинетических характеристик, таких как слишком большой или, напротив, слишком короткий период полувыведения, плохое всасывание из ЖКТ или же интенсивный метаболизм при первичном прохождении через печень. Масс-спектрометрия является мощным орудием идентификации и количественного определения органических соединений. Это приводит к некоему пренебрежению к выработке оптимальных условий хроматографического разделения и/или пробообработки. На самом деле, ионная супрессия, cross-talk и матричная интерференция значительно снижаются при адекватно разработанной методике ВЭЖХ. Однако попытки использовать тандемную масс-спектрометрию для определения содержания препарата в биопробах без сочленения с хроматографической системой были неудачными [Lim С.-K., Lord G. Current developments in LC-MS for pharmaceutical analysis // Biol. Pharm. Bull. 2002, Vol. 25, №5, Р. 547-557].
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ определения концентрации химических соединений в органах и тканях лабораторных животных методом LC-MS/MS (тандемной масс-спектрометрии - MS/MS и жидкостной хроматографии - LS) [Chen Ya., Amantana A., Tyavanagimatt Sh. et al. Comparison of the Safety and Pharmacokinetics of ST-246 after IV Infusion or Oral Administration in Mice, Rabbits and Monkeys // PLoS One. 2011, Vol. 6, №8, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023237; Мазурков О.Ю., Шишкина Л.И., Бормотов Н.И. и др. Оценка абсолютной биодоступности химической субстанции противооспенного препарата НИОХ-14 в экспериментах на мышах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020, Т. 170, №8, С. 173-177. Doi: http://iramn.ru/journals/bbm/2020/8/5903/] с использованием жидкостного хроматографа Agilent-1200 (Agilent Technologies, США) и масс-спектрометра Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies, США).
Известно, что ST-246 и НИОХ-14 не растворяются в водных средах [Yang G., Pevear D.C., Davies М.Н. et al. An Orally Bioavailable Antipoxvirus Compound (ST-246) Inhibits Extracellular Virus Formation and Protects Mice from Lethal orthopoxvirus Challenge // J. Virol. 2005, Vol. 79, №20, P. 13139-13149; Мазурков О.Ю., Шишкина Л.Н., Бормотов Н.И и др. Оценка абсолютной биодоступности химической субстанции противооспенного препарата НИОХ-14 в экспериментах на мышах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020, Т. 170, №8, С. 173-177. Doi: http://iramn.ru/journals/bbm/2020/8/5903/]. Было обнаружено, что в растворителях, используемых для масс-спектрометрии, и в организме животных НИОХ-14 превращается в свой активный метаболит, которым является ST-246. При этом вторичным (неактивным) метаболитом НИОХ-14 и ST-246 является метаболит К (4-трифторметилбензойная кислота). В данной работе показатели концентрации и фармакокинетики вторичного метаболита К в крови мышей не приведены по причине их неинформативности для оценки абсолютной биодоступности НИОХ-14 и ST-246 [Мазурков О.Ю., Шишкина Л.Н., Бормотов Н.И. и др. Оценка абсолютной биодоступности химической субстанции противооспенного препарата НИОХ-14 в экспериментах на мышах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020, Т. 170, №8, С. 173-177. Doi: http://iramn.ru/journals/bbm/2020/8/5903/].
2,6
8,10
Для построения калибровочных кривых при добавлении к сыворотке крови НИОХ-14 и ST-246 растворяли в 10% ДМСО в ацетонитриле. В масс-спектре соединению НИОХ-14 соответствует пик с 393 m/z, ST-246 - 375 m/z, внутреннему стандарту N-98 - 337 m/z (где m/z - это отношение массы и заряда молекулы). В исследуемых образцах сыворотки крови не удается зарегистрировать пик с 393 m/z, соответствующий НИОХ-14. N-98 (2-гидрокси-N-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]додец-11-ен-4-ил}-5-метилбензамид) близок по структуре НИОХ-14, но сохраняет стабильность в данных условиях калибровки. В данном примере измерения проводили в режиме MRM (multiple reaction monitoring) с регистрацией переходов от иона предшественника к определенному иону-продукту: ST-246 375→283 m/z, N-98 337→245 m/z. На основании калибровочной зависимости в режиме MRM измеряли концентрацию активного метаболита НИОХ-14 (т.е. ST-246) в сыворотке крови мышей (в нг/мл или мкг/мл) в разные сроки после однократного перорального введения субстанции НИОХ-14 в дозе 50 мкг/г массы [Мазурков О.Ю., Шишкина Л.Н., Бормотов Н.И. и др. Оценка абсолютной биодоступности химической субстанции противооспенного препарата НИОХ-14 в экспериментах на мышах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020, Т. 170, №8, С. 173-177. Doi: http://iramn.ru/journals/bbm/2020/8/5903/].
Однако приведенный выше прототип имеет существенные недостатки. Во-первых, для определения концентрации химических соединений методом LC-MS/MS (тандемной масс-спектрометрии - MS/MS и жидкостной хроматографии - LS) требуется использование дорогостоящего, сложного в эксплуатации, высокотехнологичного оборудования, в частности, жидкостного хроматографа Agilent-1200 (Agilent Technologies, США) и масс-спектрометра Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies, США), имеющегося только в специализированных оснащенных подразделениях, в частности, в Центре масс-спектрометрического анализа ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН). Во-вторых, количественное определение вещества в образце методом масс-спектрометрии возможно при использовании внутренних стандартов или построении калибровочных зависимостей, или при комбинации этих способов. При количественном определении внутренний стандарт добавляется в одинаковом количестве в каждую калибровочную точку и каждый исследуемый образец. Расчет концентрации определяемого вещества основан на соотношении площадей пиков ионной плотности вещества и внутреннего стандарта, по которому также предварительно строят калибровочную зависимость концентрации от данного соотношения. В-третьих, измерения проводят в режиме MRM (multiple reaction monitoring) для ионов предшественников с m/z 375 (ST-246), и 337 (внутренний стандарт N-98) и соответствующим им ионов продуктов, регистрируемых на детекторе с m/z 283, 188, 96 (ST-246), 245, 188, 111 (внутренний стандарт N-98). Из них были выбраны переходы с наибольшим сигналом, которые используются для количественного определения. Таким образом, регистрируются два перехода для количественного определения 375→283 (ST-246), 337→245 (N-98). Находят пики ионной плотности, соответствующей данной массе иона-продукта и задают границы пика. Для исключения ошибки измерения, зависимой от прибора, каждую точку регистрируют, как минимум дважды, полученные значения усредняют.Задавая концентрации растворов, рассчитанные при их приготовлении, строят отношение интенсивности сигнала ионной плотности к концентрации. Полученную калибровочную зависимость используют для расчета концентраций ST-246 в анализируемых образцах. Таким образом, при определении концентрации химического препарата в образцах методом LC-MS/MS требуется использование сложного, дорогостоящего, высокотехнологичного оборудования и проведения сложных, дорогостоящих, многоэтапных процедур для расчета концентрации в нг/мл или мкг/мл образца.
Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение способа определения концентрации противовирусных препаратов в биоматериалах лабораторных животных и использование менее сложных и дорогих технических средств для реализации указанного способа.
50
50
50
50
50
50
Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения концентрации противовирусных препаратов в биоматериалах лабораторных животных, включающем подготовку и анализ биоматериала из органов или тканей лабораторных животных, получавших указанные противовирусные препараты, с использованием приборных анализаторов, согласно изобретения, в 96-луночных планшетах получают монослои чувствительных к вирусу перевиваемых культур клеток и готовят раствор противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл) и исследуемый биоматериал в виде гомогената органов или сыворотки крови лабораторных животных, получавших этот противовирусный препарат, с неизвестной концентрацией (Сх, в мкг/мл), которая является искомой; готовят последовательные кратные разведения указанного раствора противовирусного препарата и исследуемого биоматериала в питательной среде, которые последовательно вносят равными объемами (мл) в ряды лунок 96-луночных планшетов с мо-нослями клеток; далее в несколько рядов лунок вносят вирус в дозе, вызывающей 100%-й цитопатический эффект в контроле вируса и используют для оценки противовирусной активности раствора противовирусного препарата и исследуемого биоматериала; в такое же число рядов лунок на планшете вносят питательную среду без вируса и используют для оценки цитотоксичности раствора противовирусного препарата и исследуемого биоматериала; в ряды лунок с контролем вируса вносят вирус в дозе, вызывающей 100%-й цитопатический эффект, и питательную среду, а в ряды лунок с контролем клеток вносят только питательную среду; при этом во всех рядах лунок планшетов с монослоем клеток находится одинаковый суммарный объем культуральной жидкости (0,2 мл); все планшеты с монослоями клеток выдерживают в термостате при температуре +37°С в течение времени, достаточном для развития 100%-го цитопатического эффекта в контроле вируса; далее в каждую лунку планшетов добавляют раствор витального красителя - нейтрального красного, инкубируют в течение времени, достаточном для его поглощения оставшимися жизнеспособными клетками; после удаления непоглощенного красителя путем промывания лунок планшетов физиологическим раствором в них вносят раствор, лизирующий клетки; во всех лунках измеряют оптическую плотность перешедшего в раствор красителя для оценки цитотоксичности и противовирусной активности раствора противовирусного препарата и исследуемого биоматериала с использованием планшетного ридера в качестве приборного анализатора при длине волны 490 нм; результаты измерения оптической плотности в зависимости от концентрации присутствующего в лунках препарата представляют в виде диаграмм в полулогарифмической системе координат, на которых по оси абсцисс в логарифмической шкале измерения приведены объемы (в мл) раствора противовирусного препарата и исследуемого биоматериала, находящиеся в последовательных рядах лунок планшетов, а по оси ординат в линейной шкале измерения - оптическая плотность раствора красителя в лунках планшетов; далее с использованием компьютерной программы SoftMaxPro-4.0 рассчитывают 50%-ю цитотоксическую концентрацию (ТС, в мл) и 50%-ю вирус-ингибирующую концентрацию (IC, в мл) раствора противовирусного препарата и исследуемого биоматериала в лунках планшетов, где: ТС - это концентрация препарата в питательной среде, при которой разрушаются 50% клеток в неинфицированном монослое, a IC - это концентрация препарата в питательной среде, при которой не разрушаются и остаются жизнеспособными 50% клеток в инфицированном монослое; при этом для раствора противовирусного препарата, приготовленного с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл), IC определены в виде Vb (в мл), а для исследуемого биоматериала с неизвестной искомой концентрацией (Сх, в мкг/мл) IC определены в виде Vx (в мл); в результате на основании известной концентрации Cb раствора противовирусного препарата и полученных показателей Vb раствора противовирусного препарата и Vx исследуемого биоматериала рассчитывают искомую концентрацию препарата Сх в исследуемом биоматериале лабораторных животных по формуле: Сх (мкг/мл) = Cb (мкг/мл) × Vb (мл) : Vx (мл).
50
2,4
В качестве питательной среды для приготовления кратных разведений раствора противовирусного препарата и исследуемого биоматериала используют питательную среду DMEM без сыворотки; для приготовления вируссодержащей жидкости используют штамм вируса гриппа (ВГ) A/turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 (H5N1) в концентрации 7,5-8,5 lg ТЦД/мл или вирус осповакцины (ВОВ, штамм Копенгаген) в концентрации 5,7-6,7 lg БОЕ/мл; для получения монослоя клеток в лунках планшетов используют культуру клеток MDCK или культуру клеток Vero для культивирования их в среде DMEM с 2% эмбриональной сывороткой (ЭС) крупного рогатого скота; в качестве противовирусного препарата в отношении ВГ A(H5N1) в культуре клеток MDCK используют Озельтамивира фосфат (субстанция Тамифлю), а в отношении ВОВ в культуре клеток Vero используют химическое соединение 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (НИОХ-14); в качестве раствора, лизирующего клетки, используют смесь 0,01 М однозамещенного фосфорнокислого аммония рН 3,5 и этилового спирта в соотношении 1:1.
50
50
50
50
50
50
50
-4
-5
-5
Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг. 1 и 2. На фиг. 1 приведены диаграммы цитотоксичности раствора Озельтамивира (круги, ТС>0,05 мл) и гомогената легких (ромбы, ТС>0,05 мл), противовирусной активности в отношении ВГ A(H5N1) раствора Озельтамивира (квадраты, IC=2,5×10 мл) и 10%-го гомогената легких (треугольники, IC=0,017 мл) в культуре клеток MDCK (программа SoftMax 4.0). На фиг. 2 приведены диаграммы цитотоксичности (круги, ТС>0,05 мл) и противовирусной активности в отношении BOB (VV) раствора НИОХ-14 (квадраты, IC=1,59×10 мл) и объединенной сыворотки крови мышей через 1 час после п/о введения ЛФ препарата НИОХ-14 (треугольники, IC=7,48×10 мл) в культуре клеток Vero (программа SoftMax 4.0).
Ниже приведены примеры 1-2 конкретного выполнения заявляемого способа.
Пример 1. Способ определения концентрации Озельтамивира в гомогенатах легких у мышей, получавших этот препарат
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали штамм вируса гриппа (ВГ) A/turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 (H5N1), полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
50
ВГ нарабатывали в культуре клеток MDCK. Концентрацию (титр) ВГ в образцах определяли при их титровании в культуре клеток MDCK [Virology Methods Mannual / Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro. Academic Press. 1996, 374 с.; Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1976, 598 с.]. Концентрация ВГ в образцах составляла 7,5-8,5 lg ТЦД/мл (десятичных логарифмов тканевый цитопатических доз в 1 мл). Вируссодержащий материал был расфасован в индивидуальные пробирки и хранился при температуре минус 80°С. Разведение ВГ осуществляли в среде DMEM без сыворотки.
2
5
Клеточная культура. Для культивирования и определения титра ВГ использовали культуру клеток MDCK (эпителиоподобные клетки из почки самки кокер-спаниеля), полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки культивировали при 37°С и 5% СО в 96-луночных культуральных планшетах до формирования полного монослоя в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки (ЭС) («HyClone», США), 40 ед./мл гентамицина сульфата и 2,5 ед./мл амфотерицина В (ООО «БиолоТ», Россия). Суспензию клеток MDCK вносили в лунки 96-луночных планшетов в объеме 100 мкл с концентрацией 10 кл./мл среды. После получения монослоя клеток MDCK питательную среду из лунок планшетов с ВГ A/turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 (H5N1) удаляли и заменяли на равное количество такой же среды с 2% ЭС.
Препарат. В рамках данной работы было проведено исследование противовирусной активности Озельтамивира в отношении ВГ A(H5N1) in vitro. Для исследования использовали Озельтамивира фосфат (субстанция Тамифлю) производства MSN Pharmachem Private Limited (Индия).
Животные. В исследованиях использовали мышей аутбредной популяции ICR (обоего пола, массой 13-15 г), полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Перевод с английского. Washington, D.C.: National Academy Press, 1996, 138 с.]. Все исследования и манипуляции с животными были проведены на основании одобрения биоэтического протокола экспериментов на лабораторных животных №01-02.2018 от 26 февраля 2018 года, выданного биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Введение противовирусного препарата животным. Озельтамивира фосфат (субстанция Тамифлю) вводили мышам перорально с помощью одноканальной автоматической пипетки (Ленпипет, Россия) с наконечником по 25 мкг/г массы мыши в объеме 0,2 мл/мышь два раза в день в течение 6 сут.
Через 6 сут после начала введения препарата мышей эвтаназировали посредством цервикальной дислокации, извлекали легкие и готовили 10%-е гомогенаты с использованием раствора Хенкса. Из 10%-х гомогенатов были приготовлены 10 последовательных 3-кратных разведений для определения концентрации препарата с помощью колориметрического метода.
Определение цитотоксичности и противовирусной активности раствора Озельтамивира in vitro в заявленном способе
Для оценки цитотоксичности и противовирусной активности препарата в отношении ВГ готовили раствор Озельтамивира фосфата с известной концентрацией, равной 40 мкг/мл, в питательной среде DMEM без сыворотки. Далее из этого раствора готовили 10 последовательных 3-кратных разведений начиная с 40 мкг/мл (40; 13,3; 4,4; 1,5; 0,5; 0,16; 0,05; 0,02; 0,006; 0,002 мкг/мл), в питательной среде DMEM без сыворотки. Каждое разведение последовательно вносили в ряды лунок 96-луночных планшетов в объеме 0,05 мл, в результате получали 6 рядов лунок с десятью 3-кратными разведениями препарата. Из них 3 ряда использовали для оценки его противовирусной активности, в эти лунки вносили по 0,05 мл вируссодержащей жидкости; а 3 оставшихся ряда использовали для оценки цитотоксичности препарата, в эти лунки вносили 0,05 мл питательной среды. В лунки с контролем вируса вносили 0,05 мл вируса и 0,05 мл питательной среды, а в лунки с контролем клеток не вносили ни раствор противовирусного препарата, ни вирус, а вместо них вносили по 0,1 мл питательной среды.
-4
-4
-5
-5
-6
-6
Таким образом, общий объем жидкости в каждой лунке составлял 0,2 мл. При этом в лунках начальная концентрация препарата, взятого из раствора Озельтамивира с известной концентрацией (40 мкг/мл), была равна 10 мкг/мл и далее соответственно понижалась с 3-кратным шагом (10; 3,3; 1,1; 0,4; 0,13; 0,04; 0,013; 0,004; 0,0013; 0,0004 мкг/мл). Следует отметить, что объемы препарата в лунках, выраженные в мл от его исходного раствора, были следующими: 0,05; 0,016; 0,0056; 0,0019; 6,17×10; 2,06×10; 6,86×10; 2,29×10; 7,62×10; 2,54×10 мл. Это учитывали в дальнейших расчетах (см. Результаты исследования).
Для оценки противовирусной активности противовирусного препарата использовали ВГ в дозе, вызывающей 100%-й цитопатический эффект в лунках с монослоем клеток без противовирусного препарата. Вирус культивировали в монослое клеток в течение 3 суток, потом в питательную среду добавляли раствор витального красителя нейтрального красного. В течение 1,5 часов краситель поглощался живыми клетками, теми, что не погибли от воздействия вируса или токсического действия препарата. После окрашивания клеток питательную среду удаляли из лунок планшетов и лунки двукратно промывали физиологическим раствором, для удаления непоглощенного красителя. В промытые лунки вносили лизирующий раствор: 0,01 М однозамещенный фосфорнокислый аммоний рН 3,5 и этиловый спирт в соотношении 1:1. В этом растворе мембраны клеток разрушаются, и краситель переходит в раствор. По интенсивности полученной окраски - оптической плотности (ОП) судили о количестве жизнеспособных клеток в лунке, которое позволяет оценить цитотоксичность и противовирусную активность препарата.
50
50
50
50
Измерение ОП производили на планшетном ридере Е-max фирмы Molecular Devices (США) при длине волны 490 нм. Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат. При этом по оси абсцисс приведено содержание препарата (в мкг/мл или в мл) в лунках планшета в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат - оптическая плотность в линейной шкале измерения (в ед. ОП). При помощи компьютерной программы SoftMaxPro-4.0 по показателям ОП рассчитывали 50%-ю цитотоксическую концентрацию (ТС, в мкг/мл или в мл) и 50%-ю вирус-ингибирующую концентрацию (IC, в мкг/мл или в мл) препарата. ТС - это концентрация препарата в питательной среде, при которой разрушаются (теряют жизнеспособность) 50% клеток в неинфицированном монослое. IC - это концентрация препарата в питательной среде, при которой не разрушаются (остаются жизнеспособными) 50% клеток в инфицированном монослое.
Определение концентрации Озельтамивира в гомогенате легких мышей, получавших этот противовирусный препарат, в заявленном способе. Готовили 10%-е гомогенаты легких, полученных от мышей, которым перорально (п/о) вводили препарат Озельтамивир. Далее из этих гомогенатов были приготовлены 10 последовательных 3-кратных разведений для определения концентрации противовирусного препарата с помощью колориметрического метода. Разведения гомогенатов легких мышей готовили в питательной среде DMEM без сыворотки. Каждое разведение последовательно вносили в ряды лунок 96-луночных планшетов в объеме 0,05 мл, в результате получали по 6 рядов лунок с десятью 3-кратными разведениями гомогената легких. Из них 3 ряда использовали для оценки противовирусной активности гомогената легких, в эти лунки вносили по 0,05 мл вируссодержащей жидкости; а 3 оставшихся ряда использовали для оценки цитотоксичности гомогената, в эти лунки вносили 0,05 мл питательной среды. В лунки с контролем вируса вносили 0,05 мл вируса и 0,05 мл питательной среды. В лунки с контролем клеток не вносили ни гомогенат легких, ни вирус, а вместо них вносили по 0,1 мл питательной среды.
-4
-4
-5
-5
-6
-6
Таким образом, общий объем жидкости в каждой лунке составлял 0,2 мл. Следует подчеркнуть, что объемы гомогената в лунках, выраженные в мл от исходного 10% гомогената, были следующими: 0,05; 0,016; 0,0056; 0,0019; 6,17×10; 2,06×10; 6,86×10; 2,29×10; 7,62×10; 2,54×10 мл. Это учитывали в дальнейших расчетах (см. Результаты исследования). При этом концентрация Озельтамивира в приготовленном растворе была равна 40 мкг/мл, тогда как его концентрация в 10%-м гомогенате легких неизвестна, т.е. равна X мкг/мл.
Для оценки противовирусной активности исследуемого гомогената легких использовали ВГ так же, как описано выше для раствора Озельтамивира.
Измерение ОП в лунках с разведениями гомогената легких мышей, получавших Озельтамивир, производили так же, как описано выше для разведений раствора Озельтамивира.
50
На основании разработанного алгоритма при известных показателях противовирусной активности для раствора Озельтамивира с известной концентрацией была рассчитана концентрация Озельтамивира в гомогенате легких мышей, получавших Озельтамивир. Если при построении диаграмм противовирусной активности препарата по оси абсцисс в логарифмической шкале измерения представлены объемы (в мл) и определены IC (в мл) для раствора Озельтамивира (Vb) с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл) и гомогената легких (Vx) в лунках планшетов (0,2 мл), то искомая концентрация противовирусного препарата в гомогенате легких (Сх, в мкг/мл) была рассчитана на основании известной концентрации Cb раствора Озельтамивира, Vb и Vx по формуле: Сх (мкг/мл) = Cb (мкг/мл) × Vb (мл) : Vx (мл).
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика. 1976, 598 с.] с помощью пакета прикладных компьютерных программ "Statistica 6,0" (StatSoft Inc. 1984-2001) [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера. 2006, 312 с.].
Практические результаты использования заявленного способа определения концентрации препарата в гомогенатах легких у мышей, получавших Озельтамивир
50
50
50
50
50
50
-4
На фиг. 1 представлены диаграммы, характеризующие противовирусную активность раствора Озельтамивира с известной концентрацией, и объединенного гомогената легких, полученного от 6 мышей, после перорального введения Озельтамивира в течение 6 суток. С использованием разработанного алгоритма на основе известных показателей противовирусной активности раствора Озельтамивира с известной концентрацией была рассчитана концентрация препарата в гомогенате легких этих животных. В указанных диаграммах на фиг. 1 приведены цитотоксичности раствора Озельтамивира с известной концентрацией (круги, ТС>0,05 мл) и гомогената легких с искомой концентрацией препарата (ромбы, ТС>0,05 мл), противовирусной активности в отношении ВГ A(H5N1) раствора Озельтамивира с известной концентрацией (квадраты, IC=2,5×10 мл) и 10%-го гомогената легких с искомой концентрацией препарата (треугольники, IC=0,017 мл) в культуре клеток MDCK (программа SoftMax 4.0). По оси абсцисс - объем в лунках планшетов раствора препарата с известной концентрацией и 10%-го гомогената легких с искомой концентрацией препарата представлен в логарифмической шкале измерения (в мл); по оси ординат - оптическая плотность (в ед. OD); на диаграммах - М (среднее значение OD) для n=3 (число лунок для каждого разведения раствора препарата с известной концентрацией и гомогената легких с искомой концентрацией препарата) при определении показателей ТС и IC.
-4
-4
-5
-5
-6
-6
Использовано 10 объемов с последовательным 3-кратным разведением (справа налево): 0,05; 0,016; 0,0056; 0,0019; 6,17×10; 2,06×10; 6,86×10; 2,29×10; 7,62×10; 2,54×10 мл от исходного раствора препарата с известной концентрацией и 10%-го гомогената легких с искомой концентрацией препарата. Концентрация Озельтамивира в приготовленном растворе равна 40 мкг/мл. Концентрация Озельтамивира в 10%-м гомогенате легких неизвестна, т.е. равна X мкг/мл.
50
Расчет показателя цитотоксичности (TC) раствора Озельтамивира с известной концентрацией и гомогената легких с искомой концентрацией препарата (фиг. 1)
50
50
Как видно из диаграмм (фиг. 1), показатель цитотоксичности (ТС, в мл) раствора Озельтамивира и 10%-го гомогената легких не достигался (ТС>0,05 мл раствора Озельтамивира и 10%-го гомогената легких в 0,2 мл культуральной среды в лунке).
50
Цитотоксичность (ТС) раствора Озельтамивира:
1) 0,05 мл исходного раствора Озельтамивира находилось в 0,2 мл культуральной среды в лунке планшета;
2) концентрация исходного раствора препарата = 40 мкг/мл;
3) значит, в 0,05 мл исходного раствора Озельтамивира содержалось 40 мкг/мл × 0,05 мл = 2 мкг;
4) получилось, что 2 мкг Озельтамивира находилось в 0,2 мл культуральной среды в лунке планшета;
5) следовательно, концентрация препарата в культуральной среде в лунке, где находилось 0,05 мл исходного раствора Озельтамивира, равна 2 мкг : 0,2 мл = 10 мкг/мл.
50
Таким образом, показатель цитотоксичности Озельтамивира ТС>10 мкг/мл в условиях данного эксперимента.
50
Расчет показателя противовирусной активности (IC с учетом Vb) раствора Озельтамивира с известной концентрацией (фиг. 1)
50
-4
Как видно из диаграммы (фиг. 1), показатель противовирусной активности (IC в мл) для раствора Озельтамивира с концентрацией 40 мкг/мл достигался при Vb=2,5×10 мл его исходного раствора.
50
Противовирусная активность (IC с учетом Vb) раствора Озельтамивира:
50
-4
1) при достижении IC в 0,2 мл культуральной среды находился Vb=2,5×10 мл исходного раствора Озельтамивира;
2) известно, что концентрация исходного раствора Озельтамивира Cb=40 мкг/мл;
-4
-4
3) значит, в Vb=2,5×10 мл исходного раствора содержалось 40 мкг/мл × 2,5×10 мл = 0,01 мкг Озельтамивира;
50
4) получилось, что при достижении IC количество Озельтамивира в 0,2 мл культуральной среды в лунке планшета равно 0,01 мкг;
50
5) следовательно, при использовании раствора Озельтамивира с известной концентрацией IC=0,01 мкг : 0,2 мл = 0,05 мкг/мл в культуральной среде в лунке.
50
-4
Таким образом, при IC=0,05 мкг/мл в 0,2 мл культуральной среды в лунке находилось 0,01 мкг Озельтамивира, содержащихся в Vb=2,5×10 мл исходного раствора Озельтамивира с концентрацией 40 мкг/мл.
50
Отсюда следует, что для достижения IC=0,05 мкг/мл в 0,2 мл культуральной среды в лунке должно находиться 0,01 мкг Озельтамивира в объеме Vx мл 10%-го гомогената легких с неизвестной (искомой) концентрацией препарата.
50
Расчет концентрации Озельтамивира в 10%-м гомогенате легких с учетом показателя противовирусной активности (IC в виде Vb) раствора Озельтамивира с известной концентрацией (фиг. 1)
50
Как видно из диаграммы (фиг. 1), показатель противовирусной активности (IC в мл) для гомогената легких достигался при Vx=0,017 мл исходного 10%-го гомогената легких с концентрацией Озельтамивира, равной X мкг/мл.
50
Противовирусная активность (IC с учетом Vx) 10%-го гомогената легких:
50
1) при достижении IC в 0,2 мл культуральной среды находился Vx=0,017 мл исходного 10%-го гомогената легких;
50
2) для достижения IC=0,05 мкг/мл в 0,2 мл культуральной среды в лунке должно быть 0,01 мкг Озельтамивира в Vx=0,017 мл исходного 10%-го гомогената легких;
3) следовательно, согласно расчетам концентрация Озельтамивира в исходном 10%-м гомогенате легких должна быть равна Сх=0,01 мкг : 0,017 мл = 0,59 мкг/мл;
4) соответственно в ткани легких у мышей концентрация Озельтамивира будет в 10 раз больше, т.е. 5,9 мкг/мл.
Таким образом, был разработан и апробирован алгоритм, по которому с учетом известных показателей для раствора Озельтамивира была рассчитана его концентрация в 10%-м гомогенате легких у мышей, получавших этот препарат.
50
Показано, что если при построении диаграмм противовирусной активности препарата по оси абсцисс в логарифмической шкале измерения представлены объемы (в мл) и определены IC (в мл) для раствора Озельтамивира (Vb) с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл) и гомогената легких (Vx) в лунках планшетов (в 0,2 мл), то искомая концентрация противовирусного препарата в гомогенате легких (Сх, в мкг/мл) была рассчитана на основании известной концентрации Cb раствора Озельтамивира, Vb и Vx по формуле:
Сх (мкг/мл) = Cb (мкг/мл) × Vb (мл) : Vx (мл).
То есть в соответствии с этой формулой в 10%-м гомогенате легких:
-4
Сх (мкг/мл) = 40 (мкг/мл) × 2,5×10 (мл) : 0,017 (мл) = 0,59 (мкг/мл).
Пример 2. Способ определения концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в сыворотке крови мышей, получавших препарат НИОХ-14
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали вирус осповакцины (ВОВ, штамм Копенгаген), полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (п. Кольцово, Новосибирская обл.). Вирус культивировали в культуре клеток Vero в среде DMEM с 2% эмбриональной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота. Концентрацию вируса в культуральной жидкости определяли методом бляшек путем титрования в культуре клеток Vero, рассчитывали и выражали в lg БОЕ/мл (десятичных логарифмах бляшкообразующих единиц в 1 мл) [Virology Methods Mannual. Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro. Academic Press. 1996, 374 с.]. Концентрация вируса в использованных в работе образцах составляла 5,7-6,7 lg БОЕ/мл. Наработанные и использованные в работе серии вируса с указанным титром хранили при минус 70°С. Разведение вируса готовили в среде DMEM с 2% ЭС.
Клеточная культура. В работе использовали перевиваемую культуру клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки), полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (п. Кольцово, Новосибирская обл., Россия) в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия). Клетки выращивали в среде DMEM в присутствии 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («HyClone», США) с добавлением гента-мицина (40 МЕ/мл) и амфотерицина В (5 мкг/мл). В качестве поддерживающей среды при культивировании ВОВ использовали ту же среду, но с добавлением 2% сыворотки.
2,4
Препараты. В данной работе исследовали показатели противовирусной активности химического соединения НИОХ-14 (7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновая кислота), синтезированного в ФГБУН НИОХ СО РАН (г. Новосибирск, Россия), в отношении ВОВ в культуре клеток, для оценки концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в образцах с помощью колориметрического метода.
При определении концентрации противовирусного вещества в гомогенатах легких у мышей, получавших препарат НИОХ-14, методом тандемной масс-спектрометрии в качестве активного метаболита НИОХ-14 использовали химическое соединение с установленной антиортопоксвирусной активностью ST-246 (4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этеноциклопроп[f]изоиндол-2(1Н)-ил)-бензамид), синтезированное в ФГБУН НИОХ СО РАН (г. Новосибирск, Россия) для исследовательских целей по описанной методике [Bailey T.R., Rippin S.R., Opsitnick Е. et al. N-(3,3а,4,4a,5,5a,6,6a-Octahydro-1,3-dioxo-4,6-ethenocycloprop[ƒ]isoindol-2-(1H)-yl)carboxamides: identification of novel orthopoxvirus egress inhibitors. J. Med. Chem. 2007. 50(7): 1442-1444].
В экспериментах на лабораторных мышах использовали лекарственную форму (ЛФ) препарата НИОХ-14, полученную в АО «СЦФБ» (г. Новосибирск, Россия), в твердых желатиновых капсулах, содержащих химическое соединение НИОХ-14, микрокристаллическую целлюлозу, моногидрат лактозы, стеарат магния, аэросил, крахмал картофельный, хлорид натрия и компоненты капсулы (желатин медицинский, титана диоксид Е 171, азорубин Е 122, желтый хинолиновый Е 104).
Животные. В исследованиях использовали мышей аутбредной популяции ICR (обоего пола, массой 18-20 г), полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. До начала и в ходе эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении, на сбалансированном пищевом рационе со свободным доступом к воде в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных [Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Перевод с английского. Washington, D.C.: National Academy Press; 1996. 138 с.]. Все исследования и манипуляции с животными были проведены на основании одобрения протокола-заявки на работу с лабораторными животными № ГНЦ ВБ «Вектор»/06-11.2018 от 16 ноября 2018 года, выданного биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Введение мышам суспензии ЛФ препарата НИОХ-14 с капсулой
Суспензию ЛФ препарата НИОХ-14 с капсулой вводили мышам однократно перорально (п/о) с помощью одноканальной автоматической пипетки (Ленпипет, Россия) с наконечником в дозе 50 мкг/г в 0,2 мл раствора метил-целлюлозы (0,75%) с твином-80 (1%). Раствор для получения суспензии ЛФ препарата НИОХ-14 был подобран с учетом рекомендаций по исследованию фармакокинетики субстанции и ЛФ препарата ST-246 [SIGA Technologies, Inc. FDA advisory committee briefing document. Tecovirimat for the treatment of smallpox Disease. Antimicrobial Division Advisory Committee Meeting, May 1, 2018. URL: https://www.fda.gov/media/112808/download].
Через 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18 и 24 ч после введения препарата по 6 мышей эвтаназировали посредством цервикальной дислокации, производили забор крови и получали сыворотку.
Полученную сыворотку крови использовали для определения концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) с помощью заявляемого способа в клеточной культуре Vero, инфицированной ВОВ.
Кроме того, в полученной сыворотке крови мышей определяли концентрацию активного метаболита НИОХ-14 (т.е. ST-246, в который превращается НИОХ-14 в организме животных) методом LC-MS/MS (тандемной масс-спектрометрии - MS/MS и жидкостной хроматографии - LC) в Центре масс-спектрометрического анализа ФГБУН ИХБФМ СО РАН. Этот метод использовали для сравнения показателей концентраций противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита), полученных двумя способами: с помощью заявляемого способа в клеточной культуре Vero, инфицированной ВОВ, и с помощью LC-MS/MS метода, в сыворотке крови мышей после п/о введения ЛФ препарата НИОХ-14.
Определение концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в сыворотке крови мышей заявленным способом. Для оценки цитотоксичности и противовирусной активности в отношении ВОВ сначала 20 мг химического соединения НИОХ-14 растворяли в 1 мл диметилсульфоксида. Затем готовили раствор НИОХ-14 с известной концентрацией 40 мкг/мл в сыворотке крови интактных мышей. Далее из этого раствора готовили 10 последовательных 3-кратных разведений, начиная с 40 мкг/мл (40; 13,3; 4,4; 1,5; 0,5; 0,16; 0,05; 0,02; 0,006; 0,002 мкг/мл), в питательной среде DMEM без сыворотки. Каждое разведение последовательно вносили в ряды лунок 96-луночных планшетов в объеме 0,05 мл, в результате получали 6 рядов лунок с десятью 3-кратными разведениями препарата. Из них 3 ряда использовали для оценки его противовирусной активности, в эти лунки вносили по 0,05 мл вируссодержащей жидкости; а 3 оставшихся ряда использовали для оценки цитотоксичности препарата, в эти лунки вносили 0,05 мл питательной среды. В лунки с контролем клеток не вносили ни раствор противовирусного препарата, ни вирус, а вместо них вносили по 0,1 мл питательной среды.
-4
-4
-5
-5
-6
-6
Таким образом, общий объем жидкости в каждой лунке составлял 0,2 мл. При этом в лунках начальная концентрация препарата, взятого из раствора НИОХ-14 с известной концентрацией (40 мкг/мл), была равна 10 мкг/мл и далее соответственно понижалась с 3-кратным шагом (10; 3,3; 1,1; 0,4; 0,13; 0,04; 0,013; 0,004; 0,0013; 0,0004 мкг/мл). Следует отметить, что для раствора НИОХ-14 с известной концентрацией объемы в лунках, выраженные в мл от его исходного раствора, были следующими: 0,05; 0,016; 0,0056; 0,0019; 6,17×10; 2,06×10; 6,86×10; 2,29×10; 7,62×10; 2,54×10 мл. Это учитывали в дальнейших расчетах (см. Результаты исследования).
Из сыворотки крови, полученной от мышей, которым вводили ЛФ препарата НИОХ-14, готовили 10 последовательных 3-кратных разведений для определения концентрации противовирусного вещества с помощью заявляемого способа. Разведения сыворотки крови мышей готовили в питательной среде DMEM. Каждое разведение последовательно вносили в ряды лунок 96-луночных планшетов в объеме 0,05 мл, в результате получали по 6 рядов лунок с десятью 3-кратными разведениями сыворотки крови. Из них 3 ряда использовали для оценки противовирусной активности сыворотки крови, в эти лунки вносили по 0,05 мл вируссодержащей жидкости; а 3 оставшихся ряда использовали для оценки цитотоксичности сыворотки крови, в эти лунки вносили 0,05 мл питательной среды. В лунки с контролем вируса вносили 0,05 мл вируса и 0,05 мл питательной среды. В лунки с контролем клеток не вносили ни сыворотку крови, ни вирус, а вместо них вносили по 0,1 мл питательной среды.
-4
-4
-5
-5
-6
-6
Таким образом, общий объем жидкости в каждой лунке составлял 0,2 мл. Следует отметить, что объемы сыворотки крови в лунках, выраженные в мл от исходной сыворотки крови, были следующими: 0,05; 0,016; 0,0056; 0,0019; 6,17×10; 2,06×10; 6,86×10; 2,29×10; 7,62×10; 2,54×10 мл. Это учитывали в дальнейших расчетах (см. Результаты исследования). При этом концентрация химического соединения НИОХ-14 в исходном растворе с известной концентрацией была равна 40 мкг/мл, тогда как концентрация противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в исходной сыворотке крови неизвестна, т.е. равна X мкг/мл.
Для оценки противовирусной активности раствора НИОХ-14 и сыворотки крови мышей использовали ВОВ в дозе, вызывающей 100%-й цитопатический эффект в лунках с монослоем клеток в контроле вируса. Вирус культивировали в монослое клеток в течение 4 суток, потом в питательную среду добавляли раствор витального красителя нейтрального красного. В течение 1,5 часов краситель поглощался живыми клетками, теми, что не погибли от воздействия вируса или токсического действия препарата. После окрашивания клеток питательную среду удаляли из лунок планшетов и лунки двукратно промывали физиологическим раствором, для удаления непоглощенного красителя. В промытые лунки вносили лизирующий раствор: 0,01 М одноза-мещенный фосфорнокислый аммоний рН 3,5 и этиловый спирт в соотношении 1:1. В этом растворе мембраны клеток разрушаются, и краситель переходит в раствор. По интенсивности полученной окраски - оптической плотности (ОП) судили о количестве жизнеспособных клеток в лунке, которое позволяет оценить цитотоксичность и противовирусную активность препарата.
50
50
50
50
Измерение оптической плотности (ОП) производили на планшетном ридере Е-max фирмы Molecular Devices (США) при длине волны 490 нм. Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представлены в полулогарифмической системе координат. При этом по оси абсцисс приведено содержание препарата (в мкг/мл или в мл) в лунках планшета в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат - оптическая плотность в линейной шкале измерения (в ед. ОП). При помощи компьютерной программы SoftMaxPro-4.0 по показателям ОП рассчитывали 50%-ю цитотоксическую концентрацию (ТС, в мкг/мл или в мл) и 50%-ю вирус-ингибирующую концентрацию (IC, в мкг/мл или в мл) препарата. ТС - это концентрация препарата в питательной среде, при которой разрушаются (теряют жизнеспособность) 50% клеток в неинфицированном монослое. IC - это концентрация препарата в питательной среде, при которой не разрушаются (остаются жизнеспособными) 50% клеток в инфицированном монослое.
50
С использованием разработанного алгоритма при известных показателях противовирусной активности для раствора НИОХ-14 с известной концентрацией была рассчитана концентрация противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в сыворотке крови мышей, получавших ЛФ препарата НИОХ-14. Если при построении диаграмм противовирусной активности препарата по оси абсцисс в логарифмической шкале измерения представлены объемы (в мл) и определены IC (в мл) для раствора НИОХ-14 (Vb) с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл) и сыворотки крови (Vx) в лунках планшетов (в 0,2 мл), то искомая концентрация противовирусного вещества в сыворотке крови мышей (Сх, в мкг/мл) была рассчитана на основании известной концентрации Cb раствора НИОХ-14, Vb и Vx по формуле: Сх (мкг/мл) = Cb (мкг/мл) × Vb (мл) : Vx (мл).
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика. 1976, 598 с.] с помощью пакета прикладных компьютерных программ "Statistica 6,0" (StatSoft Inc. 1984-2001) [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера. 2006, 312 с.].
Практические результаты использования заявленного способа определения концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в сыворотке крови мышей, получавших ЛФ препарата НИОХ-14
В данном разделе приведен иллюстрированных пример расчета концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) с помощью колориметрического метода в сыворотке крови мышей через 1 час после однократного п/о введения суспензии ЛФ препарата НИОХ-14 с капсулой (фиг. 2).
50
50
50
50
50
-5
-5
На фиг. 2 представлены диаграммы, характеризующие противовирусную активность раствора НИОХ-14 с известной концентрацией и объединенной сыворотки крови, полученной от 6 мышей, через 1 час после однократного перорального (п/о) введения ЛФ препарата НИОХ-14. С использованием разработанного алгоритма на основе известных показателей противовирусной активности раствора НИОХ-14 с известной концентрацией препарата была рассчитана концентрация противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в объединенной сыворотке крови мышей через 1 час после п/о введения ЛФ препарата НИОХ-14. В указанных диаграммах на фиг. 2 приведены цитотоксичности (круги, ТС>0,05 мл) и противовирусной активности в отношении BOB (VV) раствора НИОХ-14 с известной концентрацией (квадраты, IC=1,59×10 мл) и объединенной сыворотки крови мышей через 1 час после п/о введения ЛФ препарата НИОХ-14 (треугольники, IC=7,48×10 мл) в культуре клеток Vero (программа SoftMax 4.0). По оси абсцисс - объем в лунках планшетов исходного раствора препарата с известной концентрацией и сыворотки крови с искомой концентрацией препарата представлен в логарифмической шкале измерения (в мл); по оси ординат - оптическая плотность (в ед. OD); на диаграммах - М (среднее значение OD) для n=3 (число лунок для каждого разведения раствора препарата с известной концентрацией и сыворотки крови с искомой концентрацией препарата) при определении показателей ТС и IC.
-4
-4
-5
-5
-6
-6
Использовано 10 объемов с последовательным 3-кратным разведением (справа налево): 0,05; 0,016; 0,0056; 0,0019; 6,17×10; 2,06×10; 6,86×10; 2,29×10; 7,62×10; 2,54×10 мл от исходного раствора препарата с известной концентрацией и сыворотки крови с искомой концентрацией препарата). Концентрация НИОХ-14 в приготовленном растворе равна 40 мкг/мл. Концентрация противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в исходной сыворотке крови неизвестна, т.е. равна X мкг/мл.
50
Расчет показателя цитотоксичности (TC) раствора НИОХ-14 с известной концентрацией (фиг. 2)
50
50
Как видно из диаграмм (фиг. 2), показатель цитотоксичности (TC, в мл) раствора НИОХ-14 не достигался (ТС>0,05 мл раствора НИОХ-14 в 0,2 мл культуральной среды в лунке).
50
Цитотоксичность (ТС) раствора НИОХ-14:
1) 0,05 мл исходного раствора НИОХ-14 находилось в 0,2 мл культуральной среды в лунке планшета;
2) концентрация исходного раствора НИОХ-14=40 мкг/мл;
3) значит, в 0,05 мл исходного раствора НИОХ-14 содержалось 40 мкг/мл × 0,05 мл = 2 мкг;
4) получилось, что 2 мкг НИОХ-14 находилось в 0,2 мл культуральной среды в лунке планшета;
5) следовательно, концентрация препарата в культуральной среде в лунке, где находилось 0,05 мл исходного раствора НИОХ-14, была равна 2 мкг : 0,2 мл = 10 мкг/мл.
50
Таким образом, показатель цитотоксичности НИОХ-14 ТС>10 мкг/мл в условиях данного эксперимента.
50
Расчет показателя противовирусной активности (IC с учетом Vb) раствора НИОХ-14 с известной концентрацией (фиг. 2)
50
-5
Как видно из диаграмм (фиг. 2), показатель противовирусной активности (IC в мл) для раствора НИОХ-14 с концентрацией 40 мкг/мл достигался при Vb=1,59×10 мл его исходного раствора.
50
Противовирусная активность (IC с учетом Vb) раствора НИОХ-14:
50
-5
1) при достижении IC в 0,2 мл культуральной среды находился Vb=1,59×10 мл исходного раствора НИОХ-14;
2) известно, что концентрация исходного раствора НИОХ-14 Cb=40 мкг/мл;
-5
-5
3) значит, в Vb=1,59×10 мл исходного раствора НИОХ-14 содержалось 40 мкг/мл × 1,59×10 мл = 0,0006 мкг противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита);
50
4) получилось, что при достижении IC количество противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в 0,2 мл культуральной среды в лунке планшета равно 0,0006 мкг;
50
5) следовательно, при использовании раствора НИОХ-14 с известной концентрацией IC=0,0006 мкг : 0,2 мл=0,003 мкг/мл в культуральной среде в лунке.
50
-5
Таким образом, при IC=0,003 мкг/мл в 0,2 мл культуральной среды в лунке находилось 0,0006 мкг противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита), содержащихся в Vb=1,59×10 мл исходного раствора НИОХ-14 с концентрацией 40 мкг/мл.
50
Отсюда следует, что для достижения IC=0,003 мкг/мл в 0,2 мл культуральной среды в лунке должно находиться 0,0006 мкг противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в объеме Vx мл сыворотки крови с неизвестной (искомой) концентрацией препарата.
50
Расчет концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в сыворотке крови мышей через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14 с учетом показателя противовирусной активности (IC в виде Vb) раствора НИОХ-14 с известной концентрацией (фиг. 2)
50
-5
Как видно из диаграммы (фиг. 2), показатель противовирусной активности (IC, в мл) сыворотки крови мышей с концентрацией противовирусного вещества, равной X мкг/мл, через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14 достигался при Vx=7,48×10 мл исходной сыворотки крови мышей.
50
Противовирусная активность (IC с учетом Vx) сыворотки крови мышей через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14:
50
-5
1) при достижении IC в 0,2 мл культуральной среды находился Vx=7,48×10 мл исходной сыворотки крови мышей через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14;
50
-5
2) для достижения IC=0,003 мкг/мл в 0,2 мл культуральной среды в лунке должно быть 0,0006 мкг противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в Vx=7,48×10 мл исходной сыворотки крови мышей через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14;
-5
3) следовательно, согласно расчетам концентрация противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в сыворотке крови мышей через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14 должна быть равна Сх=0,0006 мкг : 7,48×10 мл = 8,021 мкг/мл.
Таким образом, был разработан и апробирован алгоритм, по которому с учетом известных показателей для основного раствора НИОХ-14 была рассчитана концентрация противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в образце сыворотки крови мышей через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14.
50
Показано, что если при построении диаграмм противовирусной активности препарата по оси абсцисс в логарифмической шкале измерения представлены объемы (в мл) и определены IC (в мл) для раствора НИОХ-14 (Vb) с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл) и сыворотки крови (Vx) в лунках планшетов (в 0,2 мл), то искомая концентрация противовирусного вещества в сыворотке крови мышей (Сх, в мкг/мл) через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14 была рассчитана на основании известной концентрации Cb раствора НИОХ-14, Vb и Vx по формуле:
Сх (мкг/мл) = Cb (мкг/мл) × Vb (мл) : Vx (мл).
То есть в соответствии с этой формулой в сыворотке крови:
Х1ч
-5
-5
С = 40 (мкг/мл) × 1,59×10 (мл) : 7,48×10=8,021 (мкг/мл).
Далее с использованием разработанного алгоритма, показанного на диаграмме противовирусной активности объединенной сыворотки крови мышей через 1 час после введения ЛФ препарата НИОХ-14 (фиг. 2) были рассчитаны концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) с помощью заявленного способа в индивидуальных сыворотках крови мышей через 1, 3, 6, 9, 12 и 24 часа после однократного п/о введения ЛФ препарата НИОХ-14 (табл. 1).
Пример 3. Сравнение концентраций противовирусного вещества (НИОХ-14 или его активного метаболита), полученных с помощью заявленного способа и масс-спектрометрического метода-прототипа, в сыворотке крови мышей
Для сравнения концентраций противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита), полученных с помощью заявляемого способа, определяли концентрации активного метаболита НИОХ-14 (т.е. ST-246, в который превращается НИОХ-14 в организме животных) методом тандемной масс-спектрометрии LC-MS/MS в сыворотке крови мышей в зависимости от времени после однократного п/о введения ЛФ препарата НИОХ-14.
В таблице 1 представлены концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или его активного метаболита ST-246), полученные с помощью заявляемого способа и масс-спектрометрического LC-MS/MS метода, в сыворотке крови мышей в период от 1 часа до 24 часов после однократного п/о введения суспензии ЛФ препарата НИОХ-14 с капсулой.
Как видно из таблицы 1, через 3, 6 и 9 часов после введения ЛФ препарата НИОХ-14 концентрации противовирусного вещества (НИОХ-14 или активного метаболита) в сыворотке крови мышей при ее определении заявленным способом достоверно выше (р≤0,01), чем при использовании LC-MS/MS метода-прототипа определения концентрации активного метаболита НИОХ-14, т.е. ST-246, что может быть обусловлено разными пределами чувствительности их определения заявленным способом (1 нг/мл) и LC-MS/MS методом-прототипом (20 нг/мл). Однако это превышение (в 1,3-1,5 раза) незначительно, тем более что через 1, 12 и 24 часа после введения ЛФ препарата НИОХ-14 величины концентраций противовирусного вещества (НИОХ-14 или его активного метаболита), полученные обоими методами, не отличаются между собой (табл. 1).
Примеры 1-3 подтверждают заявленный технический результат, заключающийся в упрощении заявляемого способа.
Также следует подчеркнуть, что в отличие от метода масс-спектрометрии, разработанный нами способ определения концентрации противовирусных препаратов в биоматериалах лабораторных животных является менее дорогостоящим, не требующим использования сложного, высокотехнологичного оборудования, и более доступным для вирусологических лабораторий, статистически обоснованным биологическим методом при проведении научно-исследовательских работ.