СПОСОБ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК ОТ АПОПТОЗА
METHOD FOR CELL PROTECTION AGAINST APOPTOSIS

Известны способы защиты клеток от апоптоза при активации антиоксидантной активности путем определения роста общего содержания SH-групп белков [Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes / B.R. Burchill, J.M. Oliver, C.B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P.439-447], но данная методика не позволяет оценить уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность защиты клеток от апоптоза. Известен также способ косвенного определения содержания восстановленного глутатиона по активности глутатионпероксидазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах. / Под ред. А.И. Карпищенко - Т. 2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет с высокой точностью оценить уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность защиты клеток от апоптоза. Известен также способ косвенного определения концентрации восстановленного глутатиона по активности глутатионредуктазы [Медицинские лабораторные технологии: в 2-х томах / Под ред. А. И. Карпищенко - Т.2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет достоверно в любой ситуации оценить с высокой точностью уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность защиты клеток от апоптоза
Известен также способ определения антиоксидантной активности как защиты клеток от апоптоза по содержанию восстановленного глутатиона, предложенный М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39], основанный на взаимодействии восстановленного глутатиона (GSH) с 5,5′-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ). При этом образуется окисленный глутатион (GSSG), который затем восстанавливается и вновь взаимодействует с ДТНБ. Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа защиты лимфоциты от апоптоза.
Указанная цель достигается тем, что дополнительно в инкубационную среду, содержащую лимфоциты, вводится 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновая кислота в конечной концентрации 3,0 ммоль и 0,1 ммоль соответственно. без которых невозможна последующая защита клеток от апоптоза
Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат. Только комплексное внесение в инкубационную смесь 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты в минимальной концентрации 3,0 мМ и 0,1 мМ соответственно позволяет повысить защиту клеток от апоптоза, а именно оценить защиту клеток от апоптоза как эффективную при росте белково-связанного глутатиона на 18% и более и восстановленного глутатиона на 25% и более.
·
·
2+
3+
·
-
2+
2
2
<mrow><mi>H</mi><mi>O</mi><mi>C</mi><mi>l</mi><mo>+</mo><msubsup><mi>O</mi><mn>2</mn><mo>•</mo></msubsup><msup><mrow /><mo>−</mo></msup><mo>→</mo><mmultiscripts><mi>O</mi><mprescripts /><none /><mo>•</mo></mmultiscripts><mi>H</mi><mo>+</mo><mi>C</mi><msup><mi>l</mi><mo>−</mo></msup><mo>+</mo><msub><mi>O</mi><mn>2</mn></msub><mo>;</mo></mrow>
Антиоксидантная система направлена на эффективную нейтрализацию гидроксирадикалов и снижение токсичной для организма гидроперекиси. Гидроксильный радикал (OH) участвует в микробицидном и цитотоксическом действии нейтрофилов, моноцитов и Т-лимфоцитов [Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и соавт. - М.: Слово. - 2006. - 556 с. ]. Есть два основных механизма синтеза OH нейтрофилами: первый - образование из пероксида водорода в присутствии металлов переменной валентности в так называемой «реакции Фентона»: Fe+HO→Fe+OH+OH [Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак // Биохимия. - 2001. - Т.66, вып.5. - С.592-609], второй - в ходе ряда реакций с участием гипогалоидов:
или взаимодействие гипохлорита с ионами Fe [Spin trapping evidence for myeloperoxidase-dependent hydroxyl radical formation by human neutrophils and monocytes // C.L. Ramos, S. Pou, B.Е. Britigan et al. // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol.267. - P.8307-8312; Candeias, L. P. Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous add with ferrocyanide, a model iron (D) complex / L.P. Candeias, М.R.L. Stratford, P. Wardman // Free Radical Res. - 1994. - Vol.20. - P.241-249]. Следовательно, если в клетке нет металлов переменной валентности в свободном состоянии, для нее реакция Фентона и подобные реакции не будут опасными [Hampton М.В. Inside the Neutrophil Phagosome: Oxidants, Myeloperoxidase, and Bacterial Killing / М.B. Hampton, A.J. Kettle, C.C. Winterboum // Blood. - 1998. - Vol.92, №9. - P.3007-3017].
2+
+
В клетках предусмотрен ряд защитных реакций по блокированию свободных ионов Fe и Cu. Например, активированные клетки синтезируют лактоферрин, связывающий свободное железо и переводящий его в каталитически неактивную форму, а также продуцируют высокие концентрации таурина, конъюгирующего с гипохлоритом и защищающего клетку от его токсичных эффектов [Taurine chloramines, a product of activated netrophils, inhibits in vitro the genetation of nitric oxide and other macrofage inflammatory mediators / J. Marcinkiewiez, A. Grabowska, J. Bereta et al. // J. Leukocyte Biol. - 1995. - Vol.58. - P.667-674].
•
•
•
•
<mrow><msubsup><mi>O</mi><mn>2</mn><mrow><msup><mo>•</mo><mo>−</mo></msup></mrow></msubsup></mrow>
Образование OH показано в ходе микросомального окисления, окисления арахидоновой кислоты, в реакциях с флавиновыми ферментами, убихиноном, пероксинитритом. В ряде исследований клеток in vitro получены свидетельства продукции ОН данными клетками [Hydroxylation of salicylate by activated neutrophils / W.B. Davis, B.S. Mohammed, D.C. Mays et al. // Biochem Pharmacol. - 1989. - Vol.38. - P.4013-4019]. Однако изучение этих реакций зачастую основывалось на использовании ингибиторов и измерении уровня вторичных продуктов. Следовательно, реакции, приписанные OH, могли быть вызваны другими оксидантами, в частности
или гипохлорной кислотой [Do human neutrophils form hydroxyl radical. Evaluation of an unresolved controversy / M.S. Cohen, B.E. Britigan, D.J. Hassett et al. // Free Radic Biol Med. - 1988. - Vol.5. - P.81-90]. Ряд авторов считает, что in vitro за счет реакции Фентона клетки производят незначительные количества OH [Rosen, G.M. Free radicals and phagocytic cells / G.M. Rosen, S. Pou, C.L. Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol.9. - P.200-211].
•
•
•
2+
2
2
Генерация OH стимулированными клетками в очаге воспаления может существенно лимитироваться отсутствием в среде ионов железа. Исследование реакции Фентона в клетках выявило, что блокирование ионов железа лактоферрином ингибирует непосредственно саму реакцию [Rosen, G. M. Free radicals and phagocytic cells / G.M. Rosen, S. Pou, C.L. Ramos // FASEB J. - 1995. - Vol.9. - P.200-211], а утилизация HO миелопероксидазой ограничивает реакцию, даже если железо доступно [Winterboum, С.С. Myeloperoxidase as an effective inhibitor of hydroxyl radical production: Implications for the oxidative reactions of neutrophils / C.C. Winterboum // J. Clin. Invest. - 1986. - Vol.78. - P.545-557]. Хотя большинство биологических форм железа каталитически неактивно, показана способность клеток к продукции OH в присутствии трансферрина, подверженного протеолитической деградации [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / M.S. Cohen, B.E. Britigan, Y.S. Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol.163. - 819-826], или железа в составе Pseudomonas aeruginosa, содержащего сидерофор пиохелин [Possible role of bacterial siderophores in inflammation-Iron bound to the pseudomonas siderophore pyochelin can function as a hydroxyl radical catalyst / T.J. Coffman, C.D. Cox, B.L. Edeker et al. / J. Clin. Invest. - 1990. - Vol.86. - P.1030-1038]. Однако M.S. Cohen и соавторы обнаружили, что внутриклеточное железо не всегда доступно: в их экспериментах повышенного образования радикала OH не отмечалось, даже если клетки поглощали Staphylococcus aureus, который был преинкубирован с Fe [Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / M.S. Cohen, B.E. Britigan, Y.S. Chai et al. // J. Infect Dis. - 1991. - Vol.163. - 819-826].
<mrow><msubsup><mi>O</mi><mn>2</mn><mrow><msup><mo>•</mo><mo>−</mo></msup></mrow></msubsup></mrow>
•
•
•
-
2
С помощью чувствительных спиновых меток обнаружена наработка гидроксил-радикала клетки in vitro в результате реакции HOCl и
, причем преобразованию в OH подверглась очень небольшая часть использованного клетками кислорода [Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophilderived species superoxide and hypochlorous acid / L.P. Candeias, K.B. Patel, M.R.L. Stratford et al. // FEBS Lett. - 1993. - Vol.333. - P.151-159]. Вопрос о том, достаточно ли такого количества OH, чтобы играть существенную роль в цитотоксичности, до сих пор остается открытым. Здесь необходимо учитывать, что гораздо большей бактерицидной способностью OH обладает в присутствии Cl [Radiation induced generation of chlorine derivatives in NO-saturated phosphate buffered saline: Toxic effects on Escherichia coli cells / G. Czapski, S. Goldstein, N. Andom et al. // Free Radic. Biol. Med. - 1992. - Vol.12. - P.353-361], вероятно, вследствие реакции между ними с образованием гипохлорита [Bactericidal potency of hydroxyl radical in physiological environments / R.G. Wolcott, B.S. Franks, D.M. Hannum et al. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol.269. - P.9721-9734].
•
Гидроксильный радикал представляет собой один из наиболее реакционно-способных окислителей и может взаимодействовать почти с любой молекулой клетки. Он модифицирует дезоксирибозу и азотистые основания ДНК, окисляет молекулы белков, углеводов и липидов. Особенно активно OH в ходе реакций перекисного окисления липидов атакует фосфолипиды, содержащие в жирнокислотных радикалах ненасыщенные связи, что ведет к образованию гидроперекисей [Дубинина E.E. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты / E.E. Дубинина. -СПб.: Медицинская пресса, 2006. - 400 с.; Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / E.Б. Меньшикова, В.3. Ланкин, Н.К. Зенков и соавт. - M.: Слово. - 2006. - 556 с. ]. Основным компонентом антиокидантной системы является восстановленная форма глутатиона.
Глутатион - трипептид(L-γ-глутамил-L-цистеилглицин) с молекулярной массой 307 Da занимает особое место среди SH-содержащих соединений. Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от ферментативной деградации. В организме глутатион присутствует в двух формах: окисленной - GSSG и восстановленной - GSH, причем содержание GSH в клетках на несколько порядков выше, чем GSSG [Колесниченко Л.С., 1989; Wu G. et al., 2004; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. По данным Р. Pietarinen-Runtti et al. (2000), концентрация GSH в клетках составляет около 5 нмоль/мг белка. Содержание глутатиона в сыворотке крови здоровых людей незначительно, поэтому клетки основную потребность в GSH обеспечивают путем нематричного синтеза [Wu G. et al., 2004] в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеин-синтетазой (КФ 6.3.2.2) и глутатион-синтетазой (КФ 6.3.2.3) [Кулинский В.И., 1990; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. Лимитирующим звеном синтеза является образование γ-глутамилцистеина, зависящее от наличия L-цистеина и его способности окисляться в L-цистин [Зенков Н.К. и соавт., 2001]. В то же время недостаточность глутатион-синтетазы способствует развитию окислительных повреждений в нейтрофилах [Spielberg S.P. et al., 1979].
•
Глутатион при физиологических значениях pH имеет две анионные карбоксигруппы, положительно заряженную аминогруппу и SH-группу цистеинового остатка, которая придает GSH свойства восстановителя и способность быстро обезвреживать свободные радикалы и АФК [Day R.M., 2005; Zhu Y., 2007; Circu C.L. et al., 2009]. Глутатин является типичным тиолом и, участвуя в одноэлектронных восстановительных реакциях, становится GS, который димеризуется до GSSG, легко реагирующего со свободными SH-группами. Второй тип окислительно-восстановительных превращений с участием GSH - это реакции тиолдисульфидного обмена, которые известны как основной путь образования смешанных дисульфидов глутатиона с белками (белок-SSG) и играют роль в регуляции биологических процессов [Chai Y.C. et al., 1994]. В реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление глутатиона с образованием интермедиата, который реагирует со второй молекулой GSH (получение GSSG) или иной молекулой (синтез смешанного дисульфида) [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].
GSH является стабилизатором мембран [Биленко М.В, 1989; Udupi V., 1992; Trudel S. et al., 2009]. Он защищает клеточные структуры от высокотоксичного OCI - [Carr A.C., Wmterboum С.С., 1997], при этом GSH превращается в глутатион-сульфонамид и дегидроглутатион [Harwood D.T. et al., 2006]. Связывая NO, глутатион образует токсичные для клетки нитрозильные комплексы. Мононитрозоглутатион может активировать апоптоз [Turpaev K.T. et al., 1997].
<mrow><msubsup><mi>O</mi><mn>2</mn><mrow><msup><mo>•</mo><mo>−</mo></msup></mrow></msubsup></mrow>
2
2
12
•
Не всегда восстановительного потенциала GSH достаточно для полной нейтрализации прооксидантов. Существует мнение, что взаимодействие GSH с органическими радикалами эффективно только в условиях удаления
, поэтому глутатион образует с супероксиддисмутазой своеобразную антиоксидантную систему, ибо в противном случае развиваются реакции образования HO и GS [Ланкин В.З. и соавт., 1997; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В сочетании с витамином B глутатион, а также N-ацетилцистеин, могут потенцировать прооксидантное и цитотоксическое действие на клетку [Соловьева М.Е. и соавт., 2007].
2
2
Основной антиоксидантный эффект GSH реализует посредством участия в работе ферментов. Глутатион выступает донором водорода при восстановлении НО и перекисей липидов глутатион-пероксидазами и глутатион-S-трансферазами (ГТ) [Hirayama К., 1989; Sies H. et al., 1997; Кулинский В.И., 1990; Hayes J.D. et al., 2005; Зенков Н.К. и соавт., 2009; Liu G. et al., 2010]. Высокая активность глутатион-редуктазы и накопление GSH оказывает протекторный эффект в отношении альвеолярных макрофагов, инкубируемых с прооксидантами in vitro [Pietarinen P.К., 1995] и других клеток.
С изменением окислительно-восстановительного баланса сопряжено большое количество реакций, поэтому поддержание оптимального редокс-состояния цитозоля выступает важным условием нормальной жизнедеятельности клеток. Высокая концентрация глутатиона в цитоплазме, его редокс-активность и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают систему GSH/GSSG важнейшим внутриклеточным редокс-буфером [Reed M.C. et al., 2008]. Концентрация GSH в клетке в 500-1000 раз превышает уровень НАДФН и других внутриклеточных редокс-систем, поэтому изменения соотношения GSH/GSSG прямо отражают изменения редокс-статуса клетки [Кулинский В.И., 2007; Asian M., Canatan D., 2008; Reed M.C., 2008]. Считают, что буферная емкость системы глутатиона защищает репликативную систему клетки, а дефицит GSH приводит к снижению синтеза ДНК и белков [Poot M., 1991; Ланкин В.З., 1997; Day R.M., Suzuki Y.J., 2005; Liu G. et al., 2010], а затем и к апоптозу.
К природным антиоксидантам относят также аскорбиновую кислоту, которая играет важную роль в развитии окислительного стресса в организме.
Аскорбиновая кислота реализует свое антиоксидантное действие в плазме, межклеточной жидкости и на внеклеточном уровне. В организме человека аскорбиновая кислота преимущественно представлена в L-форме. Стрессовые ситуации увеличивают количество метаболитов витамина С в виде дегидроаскорбиновой кислоты.
Аскорбиновая кислота и дегидроаскорбиновая кислота играют активную роль в нескольких процессах, включая защиту от инфекции, повышении иммунности, в процессах заживления ран, а также принимая участие в образовании антистрессовых гормонов. Аскорбат является кофактором дофамин-β-гидроксилазы, которая катализирует синтез норадреналина и других катехоламинов. Аскорбиновая кислота является восстановителем для L-пролингидроксилазы, которая необходима для синтеза коллагена и соединительной ткани в целом. В организме с участием аскорбиновой кислоты происходит регенерация α-токоферола из токофероксильного радикала. Окислительный стресс коррелирует с ухудшением секреции инсулина, а терапия аскорбиновой кислотой прерывает повреждающее действие свободных радикалов, уменьшает степень проявления инсулиновой резистентности [М.И. Балаболкин и соавт., 2003]. Ионы аскорбата являются одним из активных элементов системы антиоксидантной защиты, предохраняя липиды от окисления их пероксидными радикалами. Антиоксидантный эффект аскорбата проявляется при достаточном количестве других антиоксидантов, таких как α-токоферол и глутатион. Глутатион восстанавливает дегидроаскорбиновую кислоту прямым и неферментативным путем до аскорбиновой кислоты. Эта реакция является одним из основных механизмов антиоксидантной системы, часто описываемых как восстановительные циклы - глутатион/глутатиондисульфид и аскорбиновая/дегидроаскорбиновая кислота. При этом клетки периферических тканей поглощают экзогенную дегидроаскорбиновую кислоту и в присутствии глутатиона конвертируют ее в цитоплазме в аскорбиновую кислоту. Восстановление глутатиондисульфида в глутатион катализируется глутатион редуктазой и требует участия NADPH в качестве кофактора. Недостаточность глутатиона снижает содержание аскорбиновой кислоты в тканях и одновременно повышает концентрацию дегидроаскорбиновой кислоты.
При недостатке α-токоферола и глутатиона может превалировать прооксидантный эффект аскорбата и его метаболитов. Прооксидантный эффект аскорбиновой кислоты может наблюдаться не только при недостатке α-токоферола и глутатиона, но и при применении высоких доз аскорбиновой кислоты. Избежать прооксидантного эффекта аскорбиновой кислоты можно в случае создания адекватного внутриклеточного уровня восстановленного глутатиона.
Исходя из вышесказанного, целесообразно использовать в эксперименте комплексное применение аскорбата с протектором SH-групп, а именно 1,4-дитиоэритритолом. Для проникновения внутрь клетки пассивным транспортом происходит превращение аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту, затем последняя подвергается обратимому превращению в аскорбиновую кислоту при участии восстановленного глутатиона. Следовательно, комплексная модернизация способа-прототипа позволяет повысить точность защиты клеток от апоптоза.
Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа: дополнительное добавление в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты в низкой концентрации для последующего определения белково-связанного и восстановленного глутатиона.
Роль антиоксидантной системы клетки заключается в снижении токсического эффекта свободных радикалов, в том числе и гидроперекисей липидов.
Антиоксидантную защиту обеспечивает широкий круг веществ, различных по происхождению, физико-химической природе и механизмам действия. Общим их свойством, по определению J.M. Gutteridge (1992), является способность, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживать или ингибировать его окисление. Постоянное образование прооксидантов должно быть уравновешено их инактивацией, поэтому для поддержания гомеостаза необходима адекватная ситуации непрерывная регенерация антиоксидантной способности клеток [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Blokhina О. et al., 2003].
•
<mrow><msubsup><mi>O</mi><mn>2</mn><mrow><msup><mo>•</mo><mo>−</mo></msup></mrow></msubsup></mrow>
Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время не существует, хотя ряд авторов [Dimascio Р., 1990; Kaira V. et al., 2001; Зайцев В.Г. и соавт., 2003] выделяет два класса: превентивные, снижающие скорость инициации цепной реакции окисления, и гасящие (прерывающие цепь), препятствующие развитию цепной реакции. К превентивным относят каталазу и пероксидазы, разрушающие ROOH, а также агенты, образующие хелатные комплексы с металлами переменной валентности, к прерывающим цепь - фенолы, ароматические амины. В условиях in vivo главными гасящими антиоксидантами являются: витамин Е, нейтрализующий ROO в липидной фазе мембран [Jore D. et al., 1990; Hong J.H. et al., 2004], фермент СОД, улавливающий
в водной фазе клетки [Fridovich L, 1989; Dimascio Р., 1990; Ciurca D., 1992], и церулоплазмин - белок острой фазы, выполняющий антирадикальную функцию в крови [Maridund S.L., 1987; Atanasiu R.L. et al.,1998].
Более известно деление антиоксидантов на ферменты и соединения неферментативной природы. Последние в определенных концентрациях всегда присутствуют в липидной фазе мембран и водных средах организма и расходуются первыми при устранении проявлений окислительного стресса [Droge W., 2002; Blokhina O., 2003]. Ферменты наиболее активно присоединяется к антиоксидантной защите (АОЗ) после включения механизмов индукции [Лущак В.И., 2001]. При возникновении окислительного стресса (ОС) расход антиоксидантов возрастает и меняется экспрессия генов, кодирующих белковые компоненты АОЗ [Дубинина Е.Е., 2006]. Между ферментами и неферментативными элементами АОЗ существует равновесие, причем последние при ряде патологических состояний организма могут выступать в качестве прооксидантов [Зенков Н.К. и др., 2001].
Главную роль среди неферментавных антиоксидантных систем защиты отводят глутатиону.
Функционирование клеток связано с уровнем белково-связанного глутатиона. Определение белково-связанного глутатиона основано на способности боргидрата натрия (NaBH4) высвобождать из связи с белками глутатион, который при взаимодействии с ДТНБ образует окрашенное соединение, а именно тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм [Burchill B.R. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes [Text] / B.R. Burchill, J.M. Oliver, C.B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P.439-447].
В настоящее время крайне важно определить уровень белково-связанного глутатиона для защиты клеток от апоптоза.
В настоящее время в лабораторной практике наиболее распространен способ защиты клеток от апоптоза и переокисления с помощью определения концентрации белково-связанного и восстановленного глутатиона.
Концентрацию гидроксирадикалов определяют методом, предложенным Thom S.R., Elbuken M.E., 1991]. Метод основан на разрушении модельного субстрата 2-дезокси-D-рибозы гидроксильным радикалом, образуемым опсонизированными лимфоцитами.
Содержание восстановленного глутатиона определяют методом, предложенным М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Kojima S. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39]. Принцип метода основан на взаимодействии GSH с 5,5′-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) с образованием тио-2-нитробензойной кислоты, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. При этом образуется GSSG, который восстанавливается глутатионредуктазой до GSH и вновь взаимодействует с ДТНБ. Скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию общего глутатиона. Для определения содержания GSSG пробы прединкубируются с блокатором SH-групп 2-винилпиридином («Wako», Япония), который необратимо связывает GSH, и, следовательно, скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию GSSG.
Лизат клеток готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы.
Концентрацию белка в клетках определяют методом [A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. Biochem. - 1976. - Vol.7, №1, 2. - P.248-254], основанным на взаимодействии Кумасси голубого G-250 с остатками аргинина и лизина в белках. Свободный краситель красного цвета (максимум поглощения - 495 нм) при образовании комплекса с белком переходит в синюю форму (максимум поглощения - 595 нм).
3
4
2
К 0,1 мл лизата клеток добавляют 1,0 мл раствора Кумасси голубого (100 мг красителя, 50 мл 96° этанола, 100 мл 85% HPO, HO до 1,0 л), перемешивают, инкубируют 3 мин при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность проб (длина волны 595 нм) против контроля, содержащего 0,1 мл воды и 1,0 мл раствора Кумасси голубого. Содержание белка рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по разведениям стандартного раствора альбумина (1,0 мг/мл) и выражают в мг/мл.
В настоящее время крайне важно для защиты клеток от апоптоза и переокисления оценить концентрацию различных форм глутатиона после стимуляции антиоксидантной активности низкими концентрациями 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты. Для решения этой задачи предложен новый способ защиты клеток от апоптоза после дополнительного добавления в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты в конечной концентрации 3,0 мМ и 0,1 мМ соответственно.
Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способа защиты клеток от апоптоза, а также для защиты клеток от токсического действия активных форм кислорода.
Популярность указанного выше способа обоснована его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов, лежащих в основе определения концентрации гидроксильных радикалов в среде инкубации лимфоцитов.
Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявленной совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научной медицинской литературы. Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для повышения точности защиты клеток от апоптоза при различных заболевания. Таким образом, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентеоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Метод основан на определении концентрации белок-связанного и восстановленного глутатиона.
Способ осуществляется следующим образом поэтапно.
1. Выделение культуры клеток линии Jurkat.
4
-4
2
Культивирование и исследование клеток на апоптоз проводилось в луночных планшетах (2,0×10 клеток на лунку) в питательной среде RPMI-1640 при инкубации 48 часов, температуре 37°С и 5% содержанием СО с добавлением минимальной концентрации индуктора апоптоза - синтетического глюкокортикоида дексаметазона ("KRCA", Словения), составлявшем 10 моль/мл. Затем проводилась оценка количества апоптотических клеток с использованием FITC - меченного аннексина V и пропидиума йодида (PI) методом проточной лазерной цитометрии, а также порводилось определение жизнеспособности клеток по включению трипанового синего. В контроле количество клеток в апоптозе составило 7,06 (6,00-8,71)%, а после инкубации 28,2 (25,1-31,4)% (четырехкратное увеличение)
2. Количественное определение численности жизнеспособных клеток с помощью окраски трипановым синим («Serva»,США) микроскопическим методом. Клетки ресуспендируют в 1 мл клеточной взвеси. Отбирают 100 мкл ресуспендированной клеточной суспензии и добавляют 100 мкл 0,1% раствора трипанового синего на физ. растворе, хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева. Предварительно к камере притирают покровное стекло так, чтобы появлялись радужные, ньютоновые кольца (только при этих условиях соблюдался правильный объем камеры). Каплю клеточной взвеси с красителем вносят под притертое покровное стекло. Подсчет клеток производят в 5-ти больших квадратах по диагонали камеры Горяеева. Расчет жизнеспособных клеток по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет, производят по формуле:
6
А×10=(число клеток)/4
где А - клеточность лимфоцитов крови.
3. Внесение в инкубационную смесь заявленных добавок.
В культуральную смесь добавляют соединения: 1,4-дитиоэритритол в концентрации 3,0 мМ и аскорбиновую кислоту в конечной концентрации 0,1 мМ.
4. Биохимическое исследование белково-связанного, восстановленного и окисленного глутатиона.
Лизат лимфоцитов готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы. Количество общего глутатиона (GSH и GSSG) определяют в пробе, содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (pH=7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатионредуктазы («Wako», Япония). Окисленный глутатион определяют аналогичным способом в клеточном лизате после предварительной инкубации пробы в течение 30 мин с 10 мМ 2-винилпиридином. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производят с помощью калибровочных графиков, для построения которых используют растворы GSH и GSSG («MP», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ, обработанные аналогично опытным пробам. Концентрацию GSH рассчитывают как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG, выражая результат в нмоль/мг белка.
Определение белково-связанного глутатиона.
4
4
После инкубации в экспериментальных условиях (5% и 20% кислорода) в присутствии или отсутствии NEM, DTE, NAC клетки центрифугируют 5 минут при 4°С и 1500 об/мин для их осаждения. Удаляют супернатант. Добавляют 1 мл охлажденного PBS (pH 7,4). Ресуспендируют на вортексе. Центрифугируют 5 минут при 4°С и 1500 об/мин. Удаляют супернатант. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл 5% сульфосалициловой кислоты для получения клеточного лизата. Центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. 1,0 мл осадка белка инкубируют 1 ч при 50°C с 1,0 мл 1% NaBH. Далее оставшийся белок осаждают добавлением 0,4 мл 30% ТХУ. Пробу инкубируют 15 мин при 50°С. Затем пробу охлаждают 5 мин (0°С). Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант смешивают с 2,5 мл PBS (pH 7,4) и добавляют 2,0 мл ацетона для полного окисления NaBH. Перемешивают. Центрифугировают 10 мин при 3000 об/мин. Удаляют верхнюю фазу. К нижней фазе добавляют равный объем диэтилового эфира (для удаления ТХУ). Перемешивают. Центрифугировают 10 мин при 3000 об/мин. Затем снова удаляют верхнюю фазу. Далее процедуру отмывки пробы от ТХУ с помощью диэтилового эфира производят 4-кратно. Затем отбирают 0,1 мл жидкости (из нижней фазы) и смешивают с 0,4 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH=7,0). В пробу добавляют 0,1 мл 0,4 мг/мл ДТНБ. Пробу спектрофотометрируют при 412 нм против контроля, содержащего воду вместо раствора осажденного белка.
3
-1
-1
Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции 13·10 М см. Результаты определения концентрации белково-связанного глутатиона выражают в нмоль/мг белка.
Оценка способа защиты клеток от апоптоза по способу-прототипу и предлагаемому способу выполнялось 40 раз. Результаты исследования обработаны статистически с использованием пакета программ Stat Soft Statistica 6.0.
При проведении исследования по способу-прототипу уровень восстановленного глутатиона в среде инкубации клеток в норме составил 2.15±0.18 нмоль/мг белка и белково-связанного глутатиона 2.9±0.25 нмоль/мг белка, а при оценке по предлагаемому способу в случае эффективной защиты клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона составил 2.7±0.2 нмоль/мг белка и белково-связанного глутатиона 3.5±0.3 нмоль/мг белка. В случае неэффективной защиты клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона составил 2.27±0.2 нмоль/мг белка и белково-связанного глутатиона 3.0±0.26 нмоль/мг белка (Табл.1). То есть при эффективной защите клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона возрастает на 25% и более, а белково-связанного глутатиона на 18% и более. При неэффективной защите клеток от апоптоза уровень восстановленного глутатиона увеличивается на 6% и менее, а белково-связанного глутатиона на 4% и менее.
Полученные результаты уровня глутатиона в среде инкубации клеток соответствуют данным литературы [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].
Итак, при применении способа-прототипа был получен недостаточно точный результат, не позволивший установить эффективность защиты клеток от апоптоза, что связано с отсутствием биохимической стимуляции процесса, а наиболее эффективным и точным был предлагаемый способ.
При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.