Ранее не культивируемые и малоизвестные бактерии, выделенные из мокроты и слюны при заболеваниях дыхательной системы

Микробиология

Ранее не культивируемые и малоизвестные бактерии, выделенные из мокроты и слюны при заболеваниях дыхательной системы

Г.В. Тец, К.М. Кардава, Е.И. Смирнова, Т.А. Карамян, Д.В. Михайлова, Д.С. Викина, М.Ф. Вечерковская, В.В. Тец

Изучали состав бактерий в мокроте, полученной от больных с пневмонией, муковисцидозом, хронической об-структивной болезнью легких, а также в слюне пациентов без патологии дыхательной системы. Результаты исследования позволяют сделать заключение, что бактерии, которые могут участвовать в патогенезе заболеваний дыхательной системы, изучены недостаточно. Выявление большого числа малоизвестных спорообразующих бактерий указывает на опасность их сохранения во внешней среде, в том числе в условиях стационара. Множественная антибиотикоустойчивость свидетельствует о персистенции этих микробов у больных на фоне антимикробной терапии.

Ключевые слова: бактериальные споры, антибиотикоустойчивость, дыхательная система, неизвестные бактерии, муковисцидоз, хроническая обструктивная болезнь легких, пневмония.

Введение

С появлением новых генетических методов изучения состава микробиоты и материала, находящегося в очаге инфекции, было обнаружено большое количество ранее неизвестных бактерий [1]. Полученные таким образом данные стимулировали поиск новых методов выделения бактерий, которые считаются пока не культивируемыми, оценки их роли в жизни человека и возможного участия в патологических процессах. Очевидно, что выделение чистых культур

ФГБОУ ВО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" МЗ РФ.

Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории иммунологии Научно-исследовательского центра.

Кристина Малдесовна Кардава - ст. лаборант кафедры микробиологии и вирусологии.

Екатерина Игоревна Смирнова - ассистент кафедры микробиологии и вирусологии.

Тамара Артуровна Карамян - ст. лаборант кафедры микробиологии и вирусологии, ординатор кафедры пропедевтики стоматологических заболеваний. Дарья Владимировна Михайлова - ассистент кафедры микробиологии и вирусологии.

Дарья Сергеевна Викина - врач-ординатор кафедры микробиологии и вирусологии.

Мария Федоровна Вечерковская - канд. мед. наук, ассистент кафедры микробиологии и вирусологии. Виктор Вениаминович Тец - докт. мед. наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии. Контактная информация: Тец Виктор Вениаминович, vtetzv@yahoo.com

таких бактерий и изучение их свойств откроют новые возможности в диагностике и лечении многих заболеваний.

Инфекции дыхательной системы вызываются различными видами неродственных микроорганизмов. Вместе с тем разнообразие заболеваний дыхательной системы и возможность попадания бактерий как из воздуха, так и из ротовой полости, а также недостаточная эффективность терапии позволяют предположить, что среди возбудителей имеются ранее неизвестные бактерии, свойства которых пока не учитываются при диагностике, профилактике и лечении.

В связи с изложенным целью работы было выявление малоизвестных бактерий в материале, полученном от больных с патологией дыхательной системы.

Материал и методы

Материал для исследования - мокрота пациентов с патологией дыхательной системы и слюна пациентов без патологии. Время между забором материала и включением его в исследование не превышало 4 ч.

Питательные среды: среда в составе тест-системы "ВыборАнтибиотика" ("Новые Антибиотики", Россия), агар Мюллера-Хинтона (bioMerieux, Франция).

Микроскопия. Мазки окрашивали по Граму, микроскоп Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия),

http://atm-press.ru

Практическая пульмонология | 2016 | № 3

67

Микробиология

Таблица 1. Неизвестные и малоизвестные бактерии, выделенные из мокроты и слюны обследованных

Патология Бактерии Краткая характеристика

Пневмония Brachybacterium muris Грамположительные аэробные коккобациллы

Муковисцидоз Achromobacter xylosoxidans Грамотрицательные аэробные палочки

Bacillus sonorensis Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

Bacillus licheniformis Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

Paenibacillus glucanolyticus Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

Chryseobacterium spp. Грамотрицательные палочки

ХОБЛ Lactobacillus paracasei Грамположительные палочки

Streptococcus agalactiae Грамположительные кокки

Bacillus farraginis Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

Bacillus fordii Грамположительные спорообразующие палочки

Bacillus oleronius Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

Virgibacillus spp. Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

Bacillus smithii Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

Слюна пациентов без инфекций дыхательной системы Oceanobacillus caeni Грамположительные аэробные спорообразующие палочки

объективы A-Plan 100х/1.25, окуляр 10х (Carl Zeiss, Германия).

Определение биохимической активности проводили с помощью автоматического анализатора Vitek 2 (bioMerieux, Франция).

Белковый состав определяли на спектрометре Bruker (Bruker Corporation, США).

Анализ последовательности нуклеотидов гена 16S рибосомальной РНК выполняли с использованием универсальных бактериальных праймеров 27f и 1492r.

Антибиотики: препараты, входящие в состав тест-системы "ВыборАнтибиотика": амоксицил-лин/клавуланат, азитромицин, цефтриаксон, левофлоксацин, меропенем, линезолид, амика-цин, ванкомицин, клиндамицин, рифампицин. Диски с антибиотиками (Bio-Rad, США).

Результаты и обсуждение

Материал для исследования был получен у больных с различными заболеваниями дыхательной системы: у 5 человек имел место му-ковисцидоз, у 6 - хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), у 4 - пневмония. Одним из направлений поиска ранее неизвестных бактерий является их выращивание на среде системы "ВыборАнтибиотика" с последующим разделением смешанных микробных сообществ [2]. Хотя тест-система предназначена для выбора антибиотиков, давшие на ней рост микроорганизмы могут служить исходным материалом для выделения малоизвестных бактерий, не дающих рост на обычных питательных средах. Из многочисленных смешанных сообществ, давших рост на среде в системе "ВыборАнтибиотика", было изолировано и получено в виде чистых культур

более 100 различных грамотрицательных и грам-положительных бактерий. Большая часть из них была представлена различными видами известных возбудителей заболеваний дыхательной системы: Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Haemophilus spp., Klebsiella spp., Corynebacterium spp., Actinomyces spp. и Stenotrophomonas spp. Среди полученных чистых культур были выявлены ранее неизвестные и малоизвестные бактерии, которые практически не описаны как возбудители заболеваний дыхательной системы (табл. 1).

Результаты идентификации изолированных штаммов, полученные разными методами, совпадали не полностью. В связи с этим основная идентификация была проведена по результатам изучения последовательности генов 16S рибосомальной РНК и состава белков, полученного при масс-спектрометрии. При этом данные изучения биохимической активности иногда указывали на принадлежность бактерий к другому виду или даже роду. Такие различия определяются прежде всего недостаточной изученностью этих бактерий и ограниченными возможностями набора признаков, оцениваемых стандартными автоматическими анализаторами.

Большая часть выделенных нами малоизвестных бактерий не описана ранее как возбудители заболеваний дыхательной системы человека. Только некоторые из них были идентифицированы как возбудители заболеваний людей. Так, для Lactobacillus, близкородственных L. paracasei, описан один случай аспирационной пневмонии у иммунодефицитной больной [3]. С бациллами вида Bacillus oleronius связывают заболевание кожи - розацеа [4]. Описан случай эндокардита,

Практическая пульмонология | 2016 | № 3

http://atm-press.ru

68

Микробиология

Таблица 2. Чувствительность выделенных бактерий к антибиотикам

Бактерия Антибиотики

амоксициллин азитромицин ванкомицин гентамицин клиндамицин левофлоксацин цефазолин

Achromobacter xylosoxidans R R - R R R R

Bacillus fordii R R R S S R R

Bacillus farraginis S R R S R R R

Bacillus licheniformis R R R S R R R

Bacillus oleronius S R R S S R S

Bacillus sonorensis R R R S S R R

Bacillus smithii R S R R R R S

Brachybacterium muris S S S S S R S

Lactobacillus paracasei R R R R R R R

Oceanobacillus caeni R R S S R R R

Paenibacillus glucanolyticus S S S R R S R

Streptococcus agalactiae R R S R S R R

Virgibacillus spp. S R R S R R R

Обозначения: R - резистентность, S - чувствительность.

вызванного РаешЬасИи glucanolyticus [5]. Также один случай бактериемии описан для недавно открытых бактерий рода Chryseobacterium [6]. Остальные малоизученные бактерии, выделенные и идентифицированные нами, ранее не обнаруживались в микробиоте и патологическом материале людей с заболеваниями дыхательной системы.

Обращает на себя внимание большое количество малоизвестных спорообразующих бактерий, выделенных у больных из мокроты. В последние годы открыто много новых, неизвестных ранее аэробных спорообразующих бактерий в окружающей среде и в микробиоте человека [7]. Изучение спорообразующих бактерий стало актуальной проблемой практической медицины, поскольку заболевания, вызванные такими бактериями, требуют специальных методов профилактики и лечения. Значительная устойчивость бактериальных спор к температуре, действию ультрафиолета, кислорода обусловливает необходимость тщательного подбора антисептиков и дезинфектантов [8]. При проведении антимикробной терапии необходимо помнить, что лечебные препараты действуют только на вегетативные формы и неактивны по отношению к спорам. Именно устойчивость бактериальных спор к антибиотикам может определять хроническое, рецидивирующее течение заболеваний, вызванных спорообразующими бактериями. При исследовании чувствительности к антибиотикам выделенных нами бактерий было установлено, что большинство из них обладают множественной устойчивостью к различным лекарственным препаратам (табл. 2).

Наибольшая чувствительность к антибиотикам зарегистрирована у Brachybacterium muris, выделенного из мокроты больного внебольнич-ной пневмонией. Можно предполагать, что этот условно-патогенный микроб не находился в условиях антибиотикотерапии. Самым устойчивым является Lactobacillus paracasei, который оказался резистентным ко всем препаратам. Интересно, что представители этого вида используются в качестве лекарственного средства [3]. Все изолированные нами спорообразующие бактерии родов Bacillus, Paenibacillus, Oceanobacillus и Virgibacillus обладали множественной устойчивостью к антибиотикам. Эти бактерии изолированы из мокроты больных муковисцидозом, ХОБЛ, и только Oceanobacillus caeni - из слюны человека без очевидной патологии дыхательной системы. Таким образом, мы можем считать, что в дыхательной системе при различных заболеваниях присутствуют спорообразующие бактерии, имеющие множественную устойчивость к антибиотикам, что свидетельствует об их персистен-ции в организме человека на фоне различной противомикробной терапии.

Полученные результаты позволяют сделать заключение о существовании большого числа малоизвестных бактерий в патологическом материале при заболеваниях дыхательной системы. Обращает на себя внимание, что значительная часть из них являются спорообразующими бактериями. Наличие у них устойчивости к различным антибиотикам указывает на существование серьезной проблемы, на которую ранее практически не обращали внимания. Спорообразование

http://atm-press.ru

Практическая пульмонология | 2016 | № 3

69

обеспечивает длительное пребывание и сохранение жизнеспособности в окружающей среде, а также повышенную устойчивость к антисептикам и дезинфектантам.

Следует учитывать, что бактерии, хорошо сохраняющиеся во внешней среде, особенно опасны в качестве потенциальных возбудителей внутрибольничных инфекций. Выявление большого количества малоизвестных спорообразую-щих бактерий при муковисцидозе и ХОБЛ, имеющих множественную антибиотикоустой-чивость, свидетельствует о том, что требуются дополнительные исследования роли этих микроорганизмов в патогенезе заболеваний дыхательной системы.

^исок литературы

1. Тец Г.В., Викина Д.С., Вечерковская М.Ф., Доморад А.А., Харламова В.В., Тец В.В. Неизвестные условно-патогенные бактерии представители микрофлоры человека как возможные возбудители пневмонии. Атмосфера. Пульмонология и аллергология 2013; 1: 32-34.

2. Тец Г.В., Смирнова Е.И., Кардава К.М., Викина Д.С., Заславская Н.В., Тец В.В. Выбор антибиотиков при смешанных инфекциях у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких. Практическая пульмонология 2015; 4: 39-41.

3. Doern C.D., Nguyen S.T., Afolabi F., Burnham C.A. Probiotic-associated aspiration pneumonia due to Lactobacillus rhamno-sus. J Clin Microbiol 2014; 52(8): 3124-3126.

4. McMahob F., Gallagher C., Clynes M., O'Sullivan F., Kavan-agh K. Analysis of the role of Bacillus oleronius proteins in the induction of tissue damage and inflammation in ocular rosa-cea. J Am Acad Dermatol 2015; 72(5 Suppl. 1): AB271.

5. Ferrand J., Hadou T., Selton-Suty C., Goehringer F., Sadoul N., Alauzet C., Lozniewski A. Cardiac device-related endocarditis caused by Paenibacillus glucanolyticus. J Clin Microbiol 2013; 51(10): 3439-3442.

6. Chou D.W., Wu S.L., Lee C.T., Tai F.T., Yu W.L. Clinical characteristics, antimicrobial susceptibilities, and outcomes of patients with Chryseobacterium indologenes bacteremia in an intensive care unit. Jpn J Infect Dis 2011; 64(6): 520-524.

7. Hoyles L., Honda H., Logan N.A., Halket G., La Ragione R.M., McCartney A.L. Recognition of greater diversity of Bacillus species and related bacteria in human faeces. Res Microbiol 2012; 163(1): 3-13.

8. Тец Г.В., Тец В.В., Артеменко Н.К. Спорообразующие бактерии - возбудители заболеваний дыхательной системы и предотвращение их распространения в стационаре. Практическая пульмонология 2015; 1: 43-45.

Previously Non-cultivated and Little-known Bacteria Isolated from Sputum and Saliva of Patients with Respiratory Diseases

G.V. Tets, K.M. Kardava, E.I. Smirnova, T.A. Karamyan,

D.V. Mikhailova, D.S. Vikina, M.F. Vecherkovskaya, and V.V. Tets

The study was aimed to identify bacterial composition of sputum in patients with pneumonia, cystic fibrosis, COPD and saliva in patients without respiratory diseases. The results showed that bacteria involved in pathogenesis of respiratory diseases were not investigated well. Isolated little-known spore-forming bacteria could be preserved in ambient environment, including in hospitals. Multiple antimicrobial resistance indicates persistence of bacteria in patients receiving antibiotics.

Key words: bacterial spores, antimicrobial resistance, respiratory system, little-known bacteria, cystic fibrosis, COPD, pneumonia.

ШШ дело

шг

шрммнш |П1Ш 1Ш1И PNHNV

J

Продолжается подписка на научно-працтичесций журнал

"Лечебное дело" -

ПЕРИОДИЧЕСКОЕ УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ РНИМУ ИМ. Н.И. ПИРОГОВД

Журнал входит в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства "Роспечать" - 480 руб., на один номер - 240 руб. Подписной индекс 20832.

Подписку можно оформить в любом отделении связи России и СНГ. Редакционную подписку на любой журнал издательства "Атмосфера" можно оформить на сайте http://atm-press.ru или по телефону: (495) 730-63-51

Практическая пульмонология | 2016 | № 3 http://atm-press.ru

70