ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА YERSINIA
DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC NUTRIENT MEDIUM FOR IDENTIFICATION OF YERSINIA BACTERIUM

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и касается выделения и идентификации возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза (К. pseudotuberculosis и Y. enterocolytica).
Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз являются инфекционными заболеваниями, вызываемыми Yersinia spp., передающимися алиментарным путем и характеризующиеся полиморфизмом клинических проявлений и многообразием клинических форм. На территории Российской Федерации и в мире ежегодно регистрируются групповые и спорадические случаи иерсиниозов, возникающие в детских дошкольных учреждениях, школах, интернатах, в загородных детских коллективах, воинских частях, на предприятиях и в учебных заведениях, объединенных единым источником питания.
Наиболее достоверный результат, подтверждающий диагноз, получают микробиологическим выделением иерсиний из патологического материала («золотой стандарт» диагностики). Однако изоляция и идентификация иерсиний связаны с определенными трудностями и прежде всего с длительностью процесса. Это обуславливает необходимость совершенствовать методы выделения и идентификации У. pseudotuberculosis и Y. enterocolytica путем создания эффективных дифференциально-диагностических питательных сред.
Схема микробиологического выделения иерсиний, принятая в настоящее время, состоит из последовательных этапов: обогащения, первичного посева на чашки Петри с питательными средами (типа сред Серова, №67, Эндо, Левина, Мориса и др.), вторичный отсев с твердых питательных сред на пробирки с одной из  дифференциальных сред, содержащих мочевину, в виде скошенного столбика (Клиглера, Олькеницкого и др.). На этих средах иерсинии растут в виде матового сухого налета на скошенной поверхности и по ходу укола по всей высоте столбика с разложением мочевины и образования щелочи (столбик через 24 часа инкубации приобретает малиновый цвет). Выделенные культуры в дальнейшем используются для дальнейшей идентификации на биохимических тестах и серологическом тепированию (рис.1).
Известны питательные среды для диагностики бактерий рода YERSINIA.
1)Дифференциально-диагностическая комбинированная питательная среда для выделения иерсиний (СБТС), выпускаемая ГосНИИ прикладной микробиологии (Оболенск, Московская обл.).
Состав среды: питательный агар рН 7,8; для культивирования микроорганизмов - 35,0 г
желчь очищенная - 6,0 г
глюкоза- 10, 0 г
мочевина-5,0 г
бромтимоловый синий воднорастворимый - 0,128 г
двузамещенный фосфорнокислый калий (КзНРОд) - 1,0 г.
Способ приготовления: компоненты вносят в 1,0 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят 5 мин на медленном огне. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр, вновь кипятят 1-2 мин, охлаждают до 45-50°С и разливают в чашки Петри. Хранят среду в течение 7-10 дней при 4-7°С.
2) Среда с мочевиной по Преусу (в модификации ЦНИИВС им. И.И. Мечникова) с индикатором бромтимоловым синим и по Кристенсену с индикатором бромфеноловым красным.
Использование указанных сред сделало более надежным определение уреазной активности бактерий, для чего параллельно с посевом в комбинированную среду делают посев в пробирку со средой Кристенсена (Преуса).
3) Среда Кристенсена с мочевиной, состав:
Раствор I. Пептон - 1,0 г
Натрий хлористый - 5,0 г
Глюкоза - 1,0 г
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0 г
Феноловый красный (раствор 1:500) - 6,0 мл
Мочевина - 20,0 г
Дистиллированная вода- 100,0 мл
Раствор II.
Агар-агар- 15,0 г
Дистиллированная вода - 900,0 мл
Стерилизуют при 0,5 атм 15 минут.
Приготовление. К охлажденному до 50-55°С раствору II добавляют 100 мл раствора I, перемешивают, разливают асептически в стерильные пробирки, среду охлаждают в наклонном положении для получения столбика и косяка. Готовая среда желтого цвета.
Ход исследования.
Делают массивный посев по всей поверхности косяка. Инкубируют при 37°С.  Проводят учет через 2, 4, 6 часов и на следующий день. В отдельных случаях при отрицательных результатах наблюдают до 4-7 дней (возможны замедленные реакции). Положительный результат - красное окрашивание.
Однако использование дополнительных сред с мочевиной удлиняет выявление и идентификацию иерсиний еще на 1-2 суток.
Таким образом, микробиологическая идентификация иерсиний занимает 5 суток, что неприемлемо долго для принятия клинического. Кроме того, значительно возрастает себестоимость бактериологического исследования.
В качестве прототипа заявитель выбрал  хорошо известную и широко используемую 3-сахарную среду Олькеницкого и ее модификацию. Использование этой питательной среды регламентировано соответствующими методическими документами (Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий. Инструкция, утв. МЗ СССР 30.10.1990 г.,№15-6/42; Профилактика иерсиниоза. Санитарно-эпидемиологические правила, СП 3 3.1.7.2617-10, утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 26.04.2010 г.,№37; Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Методические указания. МУ 3.1.12438-2009).
Состав среды Олькеницкого в классическом и модифицированном вариантах прописан в Приказе МЗ СССР №535-84 г.(табл.1)
Таблица 1Состав среды Олькеницкого в классическом и модифицированном вариантах
Ингредиенты
Классический
Модифицированный
Питательный агар, рН 7,2-7,4, мл
1000
Лактоза, г
1,0
Сахароза, г
10,0
10,0
Глюкоза, г
1,0
1,1
Мочевина, г
10,0
10,0
Натрий тиосульфат (гипосульфит), г
0,3
1,0
Аммоний-железо (II) сульфат (Соль Мора)
0,2
0,2
Феноловый красный, 0,4% водн.р-р, мл
4,0
Среда Гиса с лактозой и индик. (ВР), г
45,0
Дистиллированная вода, мл
до 1000,0
Среду стерилизуют при 0,5 атм 20 минут или текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Среду охлаждают в скошенном положении для получения столбика высотой 2,5 см и косяка длиной 4 см. Готовая среда бледно-розового цвета.
Ход исследования
Сеют штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Инкубируют при 37°С 18-24 часа. Кислотообразование вызывает появление желтой окраски, разложение мочевины (увеличение рН) - покраснение.
Недостатком является то, что основное предназначение данной среды -идентификация бактерий семейства Enterobacteriacea, которое включает 12 родов и более 300 видов микроорганизмов. Следовательно, среда Олькеницкого не решает задачу дифференциально-диагностического выделения бактерий рода Yersinia, (рис.2).
Задачей данного изобретения является создание простой дифференциально- диагностической питательной среды с высокой разрешающей способностью, которая позволяет определить принадлежность выделенной культуры к роду Yersinia без использования дополнительных сред, в результате происходит значительное сокращение сроков исследования.
Поставленная задача решается путем приготовления дифференциально-диагностической питательной среды для идентификации бактерий рода Yersinia, содержащей микробиологический агар (сухой), лактозу, глюкозу, мочевину,  краситель феноловый красный и дистиллированную воду, согласно изобретению питательная среда  дополнительно содержит краситель метиленовый синий и хлористый кальций при следующем соотношении компонентов, г/100 мл:
Сухой агар-3,0
Лактоза - 1,0
Глюкоза -0,15
Мочевина - 0,3
Хлористый кальций - 0,2
Феноловый красный (1% спиртовый р-р) - 0,2 мл
Метиленовый синий (1% спиртовый р-р) - 0,1 мл
Дистиллированная вода - до 100 мл
рН - 7,0-7,2.
В качестве растворителя для красителей феноловый красный и метиленовый синий используют этиловый спирт.
При разработке предлагаемой питательной среды учтены и использованы биохимические  особенности рода Yersinia и отдельных видов этого рода.
Одновременное использование в составе заявляемой питательной среды спиртового раствора метиленового синего и  фенолового красного позволяет получить специфическое окрашивание (столбик малиновый, скошенная часть фиолетовая) характерное исключительно для бактерий рода Yersinia. Следовательно, предлагаемая питательная среда может рассматриваться как простая, а также их биохимические свойства.
Композиция из двух красителей - дифференциально-диагностическая среда с высокой разрешающей способностью для бактерий рода Yersinia
Введение в питательную среду хлористого кальция, не являющегося компонентом питания иерсений, обеспечивает ее изотоничность, предохраняя бактериальные клетки от осмотического шока.
При этом существенными признаками предлагаемого предложения следует считать качественный и количественный состав питательной среды, с высокой разрешающей способностью, т.к. величины содержания компонентов в заявляемой питательной среде являются оптимальными и обусловливают относительную сбалансированность стоимости среды с ее ростовыми характеристиками. Под понятием высокая разрешающая способность питательной среды  заявитель подразумевает возможность выделения бактерий рода Yersinia в ходе одного посева на заявляемую питательную среду без использования дополнительных тестов, в результате чего сроки исследования сокращаются до 18-24 часов.
Питательную среду готовят следующим образом.
Сухие ингредиенты среды растворяют в дистиллированной воде в любой последовательности. После растворения агара смесь нагревают до кипения и добавляют индикаторы (феноловый красный и метиленовый синий). Устанавливают рН среды в пределах 7,0-7,2 и разливают по пробиркам по 5-6 мл, стерилизуют автоклавированием 15 мин под давлением 0,5 атм.
В горячем виде среда имеет грязно-зеленый цвет, а сразу после автоклавирования приобретает желто-оранжевую окраску в результате восстановления метиленового синего.
Пробирки со средой осторожно встряхивают и устанавливают в наклонном положении под углом 45° (для получения скашивания, оставляя  вертикальный столбик высотой 1,5-2,0 см и косую поверхность 4-5 см). При остывании среды она вновь приобретает грязно-зеленную окраску вследствие окисления индикатора атмосферным кислородом.
Застывшая питательная среда должна в течение 2-3 дней «дозреть» - приобрести однотонную равномерную окраску, что свидетельствует об окислении индикатора по всей глубине среды.
Посев материала проводят по всей скошенной поверхности (косяку) и последующим уколом в столбик среды.
При культивировании на данной среде через сутки различные представители семейства Enterobacteriaceae вызывают характерные изменения в окраске предлагаемой среды (табл.2).
Таблица 2Изменения предлагаемой питательной среды при культивировании бактерий семейства Enterobacteriaceae
Бактерии
Столбик
Скошенная часть
Характер роста на косяке
Наличие газа
Шигеллы
Зеленый
Фиолетовый
Нежный, с синим оттенком
Нет
Сальмонеллы
Желтый
Фиолетовый
Пышный, с белесым оттенком
Есть
Эшерихия 0<sub>124</sub>
Желтый
Фиолетовый
Пышный, с белесым оттенком
Есть
Эшерихии
Желтый
Зеленый
Пышный, с белесым или зеленым
Есть
оттенком
Протей
Малиновый
Фиолетовый
Сливной, с сиреневым оттенком
Есть*
Иерсинии
Малиновый
Фиолетовый
Сливной, с сиреневым оттенком
Нет
Примечание: *) - по ходу укола.
Иерсинии ферментируют глюкозу с образованием кислоты (облигатный признак для всех представителей семейства Enterobacteriaceae) расщепляют мочевину и восстанавливают метиленовый синий индикатор. Однако конечные химические и окислительно-восстановительные сдвиги в столбике и на скошенной поверхности среды (косяке) существенно различаются по окраске. В столбике происходит увеличение значения рН за счет ощелачивания среды (результат расщепления мочевины), в результате чего восстановленный метиленовый синий индикатор обесцвечивается. При этом столбик окрашивается феноловым красным индикатором в малиновый цвет (рис.3).
Следовательно, предлагаемая питательная среда может рассматриваться как дифференциально-диагностическая. На скошенной части столбика также происходит расщепление (гидролиз) мочевины и, следовательно, ощелачивание среды. Феноловый красный индикатор окрашивается в малиновый цвет, который, смешиваясь с метиленовым синим, дает интенсивно-фиолетовую окраску среды.
Таким образом, различные представители бактерий семейства Enterobacterioceae, имеющие разные биохимические свойства по отношению к лактозе, глюкозе, мочевине и метиленовому синему, изменяют цвет среды при различных значениях рН. Иерсинии дают четкую картину, как правило, уже через 18-24 часа, а другие представители семейства вызывают характерные изменения среды и в более короткие сроки.
Заявляемая питательная среда соответствует критериям изобретения:
«новизна» - в заявляемой питательной среде одновременно используют два индикатора феноловый красный и метиленовый синий, которые усиливают дифференциально-диагностические свойства среды и при наложении друг на друга дают малиновый и фиолетовый цвет, что и позволяет дифференцировать бактерии иерсинии от различных представителей бактерий семейства Enterobacterioceae);
«изобретательский уровень» из определенного заявителем уровня техники не выявлена известность одновременного использования двух красителей для диагностики бактерий иерсинии.
«промышленная применимость» - данная питательная среда проста в исполнении и может быть использована как для научно-исследовательских целей, так и для диагностики заболевания в лечебных учреждениях.