НОВЫЙ ШТАММ - ПРОДУЦЕНТ ВАНКОМИЦИНА AMYCOLATOPSIS JAPONICA
NEW STRAIN PRODUCING VANCOMYCIN AMYCOLATOPSIS JAPONICA

НОВЫЙ ШТАММ ПРОДУЦЕНТ ВАНКОМИЦИНА
AMYCOLATOPSIS JAPONICA
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается штамма-продуцента антибиотика ванкомицина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ванкомицин представляет собой трициклический гликозилированный нерибосомный пептидный антибиотик с разветвленной цепью и часто используется для профилактики и лечения инфекций, вызванных различными грамположительными бактериями.
С.difficile
В настоящее время ванкомицин используется для лечения инфекций, вызванных грамположительными микроорганизмами, резистентными к β-лактамным антибиотикам, а также при повышенной чувствительности или непереносимости β-лактамных соединений; псевдомембранозных колитов и энтероколитов, не поддающихся лечению метронидазолом; -ассоциированной диареи; для профилактики эндокардитов; для лечения инфекций костей и суставов, в том числе остеомиелитов; для противоинфекционной профилактики в травматологии при искусственном протезировании суставов; для лечения сепсиса, менингита, пневмоний, абсцессов легких, а также при некоторых заболеваниях кожи (Белоусов Д.Ю., и др., Сравнительная характеристика препаратов ванкомицина, зарегистрированных в РФ // Качественная Клиническая Практика.- 2009.- 4).
Amycolatopsis orientalis
Amycolatopsis orientalis (
Amycolatopsis orientalis
Основными продуцентами антибиотика ванкомицина является (P. Naga Padma; A. Bhaskar Rao; J. S. Yadav; Gopal Reddy. Optimization of fermentation conditions for production of glycopeptide antibiotic vancomycin by Amycolatopsis orientalis.- 2002.- 102-103(1-6), 395–405.). Из уровня техники также известны штамм продуцент ванкомицина CN101608209, 23.12.2009), выбранный авторами изобретения в качестве прототипа, и мутантные штаммы-продуценты ванкомицина, например, штамм  BNG 607 (регистрационный номер KCCM-10293) (KR20200091580, опубл. 31.07.2020).
Amycolatopsis
Amycolatopsis
Следует отметить, что род бактерий  представляет особый интерес, так как его представители образуют антибиотики различного химического строения. Род  ранее широко использовался как один из наиболее эффективных источников продуцентов вторичных метаболитов, обладающих антибактериальными, противогрибковыми или противовирусными свойствами, и сегодня продолжает оставаться в центре внимания при поиске новых лекарственных средств (Kisil O.V. et al., Looking Back to Amycolatopsis: History of the Antibiotic Discovery and Future Prospects // Antibiotics (Basel).- 2021 Oct 15.-10(10):1254).
Amycolatopsis japonicum
Amycolatopsis japonicum
Группой исследователей был описан штамм продуцент этилендиаминдиянтарной кислоты, который депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур под номером DSM 44213 (M.Goodfellow, et al,  sp. nov., an Actinomycete producing (S,S)-N,N'-ethylenediaminedisuccinic acid // Syst. and Appld. Microbiol.- 1997.- V. 20, I. 1, P. 78-84).
A.japonicum
A. japonicum
Долгое время у бактерий вида  не было выделено никаких биоактивных вторичных метаболитов. Однако ученым удалось идентифицировать и активировать новый кластер генов гликопептидов типа III у , кодирующий продукцию ристомицина А (Spohn M, et al. Overproduction of Ristomycin A by activation of a silent gene cluster in Amycolatopsis japonicum MG417-CF17// Antimicrob Agents Chemother.- 2014.- ;58(10):6185-96).
Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления ванкомицина известные ранее штаммы.
Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности штамма-продуцента ванкомицина, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика ванкомицина, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В процессе индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора из штамма дикого типа, выделенного из образца дерново–подзолистой почвы (Мордовия) был получен высокопродуктивный штамм VAN 20-12, продуцирующий антибиотик ванкомицин.
Для повышения секреции ванкомицина штамм дикого типа подвергался индуцированному мутагенезу в результате воздействия на него ультрафиолета при низких температурах. Полученному высокопродуктивному штамму был присвоен внутренний номер VAN 20-12.
Далее штамм VAN 20-12 был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рДНК.
Amycolatopsis japonica.
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм оказался наиболее близок к виду
Amycolatopsis japonica
Полученный новый штамм  депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2182.
Amycolatopsis japonica
Amycolatopsis japonica
Amycolatopsis japonica
Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент ванкомицина  VKPM Ac-2182. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма  VKPM Ac-2182 для получения антибиотика ванкомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения антибиотика ванкомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма  VKPM Ac-2182 и выделение ванкомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой (фиг.1).
ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
Термин «антибиотик» включает в себя любую молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.
Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.
Amycolatopsis japonica
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток  VKPM Ac-2182, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты).
Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика ванкомицина).
Amycolatopsis japonica
Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика ванкомицина, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма  VKPM Ac-2182 в условиях биореактора, выраженному в граммах ванкомицина на литр культуральной жидкости.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1.
На фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Amycolatopsis japonica VKPM Ac-2182 и наработки ванкомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Amycolatopsis japonica
Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент ванкомицина - штамм  депонированный в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2182.
Культурально-морфологические
признаки штамма продуцента ванкомицина:
Аэроб, окраска по Граму – положительная; на плотной среде нижеуказанного состава через 5-12 суток культивирования образует колонии от белого до молочного цвета, конической формы, диаметром 3-5 мм, приподнятые над агаром, с волнистыми краями и неровной поверхностью.
Физико-биохимические:
Хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, арабинозу, инозит, галактозу, манит, глюкозу, умеренно - лактозу, рамнозу, ксилозу, не утилизирует рафинозу. Обладает протеолитической активностью. Восстанавливает нитраты до нитритов.
Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: соевый пептон – 8.0 - 12.0; растворимый крахмал – 7.0 - 9.5; глюкоза – 1.0 - 4.0; агар-агар – 18.0 - 20.0; вода очищенная; рН среды 6.9±0.3.
Условия культивирования для выделения единичных колоний: - 5-12 суток, при температуре 25-34°С.
ПРИМЕРЫ
Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.
Пример 1.
Amycolatopsis japonica
Способ селективного выделения  из образцов почв.
Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы, отобранные в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.
Для выделения штамма дикого типа - продуцента ванкомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики широкого спектра для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.
Посевы инкубировали при температурах 20 - 30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.
Пример 2.
Получение высокопродуктивного штамма-продуцента ванкомицина.
Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов штамма дикого типа был получен новый высокопродуктивный штамм – продуцент ванкомицина VAN 20-12.
o
Для этого проводили облучение УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток штамма дикого типа, размещенного на расстоянии 55 см от лампы в течение 20 минут при температуре 0C. Полученному штамму был присвоен внутренний номер VAN 20-12.
Пример 3.
Идентификация штамма VAN 20-12 до вида с помощью ПЦР-анализа 16sРНК.
Выделение ДНК штамма VAN 20-12 для ПЦР проводилась по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.
Для секвенирования использовались консервативные праймеры для наработки 16S rDNA –
8F – AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
926R - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
Секвенирование проводилось на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:
о
1. 95С - 3мин.
2. 35 циклов
о
95С - 30 сек.
о
57С - 30 сек.
о
72С- 1 мин. 30 сек.
о
3. 72С - 5мин
Для анализа секвенированных последовательностей использовались специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.
Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.
Согласно базе данных GenBank, исследуемый штамм относился к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Actinoplanes.
Последовательности были выровнены в соответствии с последовательностями ближайших видов бактерий, доступными в базе данных GenBank.
Также обработка секвенированных последовательностей проводились при помощи модуля программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в том числе для определения степени филогенетической близости микроорганизмов.
Amycolatopsis japonica.
По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, исследуемый штамм VAN 20-12 был наиболее близок к штаммам вида
Пример 4.
Методика культивирования.
Amycolatopsis japonica
Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры  VKPM Ac-2182 на чашках Петри. Для этого агаризованную среду засеивали исходной посевной культурой, и выдерживали в термостате от 5 до 12 суток, при температуре 25-34°С.
Дальнейшее культивирование осуществляли в качалочных колбах в жидкой среде при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.
Далее нарабатывали посевную культуру в ферментере объемом 15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, также производили непрерывную подачу стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 120-170 часов.
Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика процесс ферментации прекращали.
Пример 5.
Определение содержания ванкомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.
Анализ содержания ванкомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты; подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,1 мл/мин; длина волны детектирования – 254 нм.
Полученные данные представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании
Штамм
Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости±0,5 г/л)
в ферментере объемом 15 литров
в ферментере объемом 100 литров
<i>Amycolatopsis japonica</i>VKPM Ac-2182
14,0613,5612,97
17,4516,5615,85
<i>Amycolatopsis orientalis</i>ВКПМ Aс-1505
9,028,458,95
8,058,958,70
Amycolatopsis orientalis
Также, согласно литературным данным продуктивность мутантного штамма составляла до 8,9 г/л (CN101608209, 23.12.2009).
Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что новый штамм по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика ванкомицина.
Пример 6.
Методика выделения ванкомицина.
Amycolatopsis japonica
После завершения культивирования микроорганизма  VKPM Ac-2182 культуральную жидкость, полученную в процессе глубинного культивирования в биореакторе, подкисляли раствором хлористоводородной кислоты до значений pH ~ 1,8-2,5, далее биомассу отделяли путем двух последовательных этапов центрифугирования. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию дальнейшей очистки, а отработанную биомассу утилизировали.
Супернатант очищали от низкомолекулярных примесей способом диализа через полупроницаемую мембрану после чего пропускали его через адсорбционную колонку. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Затем осуществляли десорбцию колонки водным раствором аммиака с концентрацией 3,3 г/л.
Полученный на предыдущем этапе элюат наносили на колонку с гидрофобным сорбентом НР-20. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Колонку промывали водой очищенной. Элюат собирали и фильтровали.
Полученный раствор снова наносили на колонку с сорбентом НР-20. Колонку промывали водой очищенной. Затем колонку элюировали 50 % водным этанолом с добавлением уксусной кислоты. Контроль осуществляли методом ВЭЖХ/УФ.
Далее элюат фракционировали, фракции анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие ванкомицин с чистотой не менее 92 %, объединяли. Менее чистые фракции подавали на повторную очистку. Очищенный раствор ванкомицина деколоризировали перемешиванием в течение 30 мин. с 0.5 % масс. угля апирогенного. Уголь отделяли фильтрованием через слой силикагеля.
Далее раствор ванкомицина фильтровали и проводили процесс кристаллизации. Полученные кристаллы дополнительно фильтровали.