СПОСОБ ОЦЕНКИ ВОЗДЕЙСТВИЯ СВЕТА, ГЕНЕРИРУЕМОГО СВЕТОДИОДНЫМИ ИСТОЧНИКАМИ ОСВЕЩЕНИЯ, НА ФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
METHOD FOR ASSESSING EXPOSURE OF FUNCTIONS OF NEUTROPHIL GRANULOCYTES OF PERIPHERAL BLOOD TO LIGHT GENERATED BY LIGHT DIODE LIGHT SOURCES

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованиям нейтрофилов крови при действии факторов различной природы, и может быть использован для оценки влияния света, генерируемого светодиодными источниками освещения, на клеточные факторы врожденного иммунитета.
В настоящее время для оценки влияния света, генерируемого светодиодными источниками, используется анализ функций зрительного анализатора, который позволяет не только диагностировать патофизиологические процессы органа зрения, но и предложить решение гигиенических проблем, связанных с использованием осветительных приборов [Кучма В.Р. Гигиенические основы использования светодиодов в системах искусственного освещения / В.Р. Кучма, Л.М. Текшева // М.: - ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, 2013. - 246 С.].
С обнаружением нового типа фоторецепторов в глазу и фотоакцепторов у нейтрофилов, появилось понимание невизуального биологического влияния света на организм [Брейнард Г.К. Восприятие света как стимула незрительных реакций человека / Г.К. Брейнард, И. Провенсио // Светотехника. - 2008. - №1. - С.6-12.]. При попадании света в клетки-рецепторы начинается сложная химическая реакция (с участием фотопигмента меланопсина) с продуцированном электрических импульсов. Эти клетки имеют тесные связи с двумя образованиями в мозгу: супрахиазматическими клетками (SCN) и с эпифизом, регулирующим секрецию определенных гормонов в организме [Brainard G.C. Photoreception for regulation of melatonin and the circadian system in humans / G.C. Brainard // Fifth International LRO Lighting research symposium, Orlando. 2002. - С.23-26].
В сетчатке глаза световые волны определенной длины превращаются в энергию нервного импульса, которая передается по зрительному нерву в верхнюю часть спинного и в затылочную долю головного мозга, влияя на основные центры управления организмом, расположенные в головном мозге, в том числе на деятельность врожденных иммунных механизмов регуляции, осуществляемых нейтрофилами - клетками, имеющими рецепторы, специфичными к восприятию кванта света [Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин; УрО РАН. - Екатеринбург, 2001. - 258 С.; Гизингер О. А., Исследовательские подходы в области безопасности освещения в условиях мегаполиса / О.А. Гизингер, М.В. Осиков, О.Р. Бокова, и др. // Полупроводниковая светотехника. - 2013. - Т.1, №21. - С.60-61].
Способ оценки биологических эффектов действия искусственных источников света имеет важное значение для определения риска возникновения, как патологии органа зрения, так и системных патологических процессов [Биске К. Субъективные оценки цветопередачи в зависимости от спектра излучения источников света / К. Биске, К. Вандаал, К. Юнгнич // Светотехника. - 2007. - №5. - С.14-17]. Однако используемый в качестве монометодики способ оценки действия света на организм имеет определенные недостатки. В частности, использование человека как объекта исследования, а также дискомфорт, создаваемый для обследуемых при проведении эксперимента, приводящий к субъективной оценке результатов при проведении исследований in vivo, приводит к снижению валидности (достоверности) получаемых результатов.
Используется также биохимическая оценка влияния света, генерируемая различными искусственными носителями, в том числе и светодиодными, позволяющая выявлять возможные эндокринные нарушения [Анисимов В.Н. Эпифиз, биоритмы и старение организма / В.Н. Анисимов // Успехи физиологических наук. - 2008. - Т.39. - №4. - С.52-60]. Однако чувствительность и специфичность такого способа не может быть очень высокой из-за вариабельности биохимических показателей, отсутствия строгих критериев включения и исключения испытуемых из обследования, высокой стоимости химических реактивов, человеческих трудозатрат.
Из уровня техники известен способ изучения воздействия света путем проведения анализа умственной работоспособности и утомляемости, светового и цветового восприятия с применением психологического тестирования. При этом психологическое тестирование может установить лишь нервно-психическое состояние обследуемых [Кришталь B.C. Влияние цветности освещения на психофизиологическое состояние человека / B.C. Кришталь, Ф.П. Говоров // Свiтлотехнiка та електроенергетика. - №5. - 2005. - С.20-24]. Вместе с тем значения отдельно взятых параметров, полученных по результатам тестирования, анкетирования либо комплекса тестирование и анкетирование, не всегда отражают истинное состояние влияния искусственного света на все органы и системы человека, что связано с многообразием системных и локальных дисфункций, возникающих на фоне длительного воздействия искусственного света [Долгушин И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, УрО РАН. - Екатеринбург, 2001. - 258 С.].
Известен способ прогнозирования риска возникновения патологии сердечно-сосудистой системы при воздействии освещения, генерируемого светодиодами или иными искусственными источниками освещения по оценке степени вариабельности сердечного ритма и анализе вегетативного показателя ритма сердца [Кудряшов Е.А. Применение вариабельности сердечного ритма для оценки организма и прогноза заболеваний / Е.А. Кудряшов, Л.М. Лавров // Нижегородский медицинский журнал. - №5. - 2008. - С.52-60]. Данный способ используется в медицине, но имеет ограниченное применение, вследствие сложного дорогостоящего оборудования.
Существуют способы, позволяющие при помощи анкетирования оценить влияние света на психосоматическое состояние обследуемых, однако при их использовании также не исключено влияние субъективных эндогенных и экзогенных факторов, влияющих на результаты исследования [Кучма В.Р. Гигиенические основы использования светодиодов в системах искусственного освещения / В.Р. Кучма, Л.М. Текшева // М.: - ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, 2013. - 246 с.]. Поскольку значения, полученные при данных методах исследований могут быть ошибочными, например при проведении анкетирования или анализе биохимических показателей крови, что наиболее точным отражением выраженности действия света, генерируемого светодиодными носителями, может стать изучение действия света на модели клеток имеющих фоторецепторы для квантов света [Козель А.И. Механизм действия лазерного излучения на тканевом и клеточном уровне / А.И. Козель, Г.К. Попов // Вести. РАМП. - 2000. - №2. - С.41-43.; Karu, T.I. Photobiological fundamentals of low-level laser therapy / T.I. Karu // IEEE J. Quant. Elect. - 1987. - Vol.QE-23. - P.1703-1717].
Известен способ оценки эффективности дезинтоксикационной терапии при воздействии токсинов различной природы [патент РФ №2334989 «Способ оценки эффективности дезинтоксикационной терапии при воздействии токсинов различной природы», МПК G01N 33/68, опубл. 27.09.2008 - прототип]. Данный способ применяется в медицине, в частности при исследованиях нейтрофилов крови при действии токсинов различной природы, но имеет ограниченное применение, вследствие трудностей изучения ферментных систем нейтрофилов in vivo, дороговизны трудозатрат при проведении методики и невозможности его широкого использования в лабораториях.
В основу изобретения положена задача, заключающаяся в создании способа, позволяющего статистически грамотно оценить воздействие света, генерируемого светодиодными источниками освещения на нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров.
Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки воздействия света, генерируемого светодиодными источниками освещения на функции нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров, согласно изобретению оценку эффективности и биобезопасности светодиодных излучений оптического диапазона проводят на культуре нейтрофильных гранулоцитов-клеток иммунной системы, максимально быстро реагирующих на любые экзогенные воздействия, причем воздействуют светом, генерируемым светодиодами с цветовой температурой 4500K в диапазоне длин волн 320-400 нм в течение трех различных временных интервалов, затем регистрируют повышение или понижение фагоцитарной, лизосомальной, НСТ-редуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов более чем на 15% от референсных значений, по изменению функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов делают вывод о биологических эффектах воздействия светодиодного освещения на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов.
Указанная задача решается за счет того, что в заявляемом способе биологическая оценка действия света, генерируемого светодиодными источниками освещения, происходит в более короткие сроки с полноценным клиническим и функциональным результатом, исключая прямое участие человека как модели для проведения эксперимента.
Применение способа не требует дорогостоящей аппаратуры, дефицитных химических реактивов, способ доступен в практике санитарно-гигиенических служб, особенно важен при оценке биобезопасности новых, внедряемых в цветосветовую среду светодиодных источников, расширяет информацию о биологических эффектах света оптического диапазона.
Заявляемый способ позволяет объективно оценивать действия физических факторов на организм человека при использовании моделей клеточных культур нейтрофильных гранулоцитов. Ранее с помощью анализа клеточных культур проводилась оценка влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы периферической крови доноров и секретов урогенитального тракта в условиях эксперимента [Гизингер, О.А. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы периферической крови доноров в условиях эксперимента / О.А. Гизингер, К.Г. Ишпахтина, О.Л. Колесников // Иммунология. - 2009. - Т.30, №5. - С.263-267].
3
3
6
2
Для решения вышеуказанной задачи была исследована функциональная активность нейтрофилов клинически здоровых людей - добровольцев в возрасте от 18 до 22 лет. Для выделения нейтрофилов кровь забирали из локтевой вены в объеме 10 мл с антикоагулянтом гепарином в количестве 50 ЕД/мл. Для выделения чистой фракции нейтрофилов 2 мл крови смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлористого), наслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла («Pharmacia», Швеция) и верографина («Spofa», Чехия), плотность верхнего слоя 1,075-1,077 г/см, нижнего - 1,093-1,095 г/см и центрифугировали 40 мин при 1500 оборотах в минуту. Кольцо нейтрофилов собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, отмывали от градиента стерильным раствором Хенкса путем центрифугирования при 1500 оборотах в минуту дважды по 7 минут, доводили до концентрации 5×10клеток/мл, случайным образом делили на 4 группы, на которые в течение 10, 20 и 30 мин при температуре 37°С в диапазоне длин волн 320-400 нм, цветовой температуре 4000-4500K при интенсивности действия светового потока 0,03 Вт/м воздействовали различными искусственными источниками света: группа 1 (контрольная) - пробы находились при естественном освещении; группа 2 - на пробы воздействовали светом, генерируемым лампами накаливания; группа 3 - на пробы воздействовали светом, генерируемым люминесцентными лампами; группа 4 - на пробы воздействовали светом, генерируемым светодиодами. Опытные и контрольные пробы, содержащие суспензию нейтрофилов, во время облучения находились в специально оборудованных для проведения эксперимента термостатах. Световое поле было конфигурировано таким образом, чтобы в любой точке суспензии нейтрофилов отклонение плотности светового потока составляло не более 10% от заданных параметров излучения. Полученные результаты были подвергнуты статистической с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки. О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали значимыми при р≤0,05.
Качественный анализ показал, что десятиминутное воздействие света, генерируемого как светодиодными источниками, так и лампами накаливания на взвесь нейтрофильных гранулоцитов не привело к достоверным изменениям их лизосомальной и фагоцитарной активности, кислородзависимого метаболизма, функционального резерва (р>0,05). НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов в спонтанном режиме возрастала после воздействия света люминисцентных ламп по сравнению с естественным и светодиодным освещением (р=0,05). Результаты влияния различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 10 минут), (М±m)
Показатели функциональной активности нейтрофилов
Действие на нейтрофилы естественного освещения
Действие на нейтрофилы светом, генерируемым лампами накаливания
Действие на нейтрофилы светом, генерируемыми люминесцентными лампами
Действие на нейтрофилы светом, генерируемым светодиодами
люминесценция лизосом, у.е
305,81±14,1
302,91±14,31
306,81±13,92
304,91±14,7
активность лизосом, %
93,79±1,22
94,72±1,22
94,71±1,22
95,79±1,19
НСТ- спонтанный, % клеток
36,59±1,51
35,59±1,51
37,05±1,51
37,09±1,51
НСТ спонтанный, у.е./клетку
0,41±0,05
0,45±0,03
0,47±0,03
0,47±0,03
НСТ-индуциров., % клеток
60,24±1,41
63,66±1,62
67,47±1,54*†
60,67±1,47
НСТ-индуциров. у.е./клетку
0,69±0,03
0,74±0,033
0,76±0,032
0,81±0,030
функциональный резерв нейтрофилов
2,33±0,13
2,54±0,14
2,61±0,13
2,66±0,13
активность фагоцитоза, % клеток
57,13±1,50
60,49±1,60
62,21±1,57
64,01±1,34
интенсивность фагоцитоза, у.е./клетку
1,81±0,12
1,83±0,17
1,84±0,12
1,84±0,09
Примечание: * - различие по показателям функциональной активности находящихся при естественном освещении и облученных искусственным светом нейтрофилов in vitro недостоверно, р≥0,05. † - различие по показателям функциональной активности нейтрофилов in vitro между группами при воздействии света, генерируемого лампами накаливания и генерируемого светодиодами недостоверно, р>0,05.
Анализ данных, полученных после изучения лизосомальной, фагоцитарной активности и биоцидных возможностей нейтрофилов в НСТ-тесте, функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов после 20-минутного воздействия также выявил различия в показателях лизосомальной и фагоцитарной активности, освещенных естественным светом лампами накаливания и светодиодными источниками (р>0,05). После воздействия света люминесцентных ламп резко увеличивалось количество активных клеток в спонтанном НСТ-тесте (р=0,05) по сравнению с естественным освещением и освещением светом, генерируемым светодиодами, усиливался их фагоцитоз и секреторная активность.
Полученные результаты свидетельствуют о выраженном иммуностимулирующем влиянии света, генерируемого люминесцентными лампами, тогда как лампы накаливания и светодиодные носители генерируют свет, не вызывающий выраженных иммунологических изменений нейтрофильных гранулоцитов. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 20 минут), (М±m)
Показатели функциональной активности нейтрофилов
Действие на нейтрофилы естественного освещения
Действие на нейтрофилы светом, генерируемым лампами накаливания
Действие на нейтрофилы светом, генерируемыми люминесцентными лампами
Действие на нейтрофилы светом, генерируемым светодиодами
люминесценция лизосом, у.е
285,81±15,19
281,91±12,00
387,81±12,92*
299,91±11,71**
активность лизосом, %
83,22±1,22
84,77±1,00
94,91±0,22*
85,69±1,09**
НСТ-спонтанный, % клеток
26,49±1,51
25,00±1,33
45,05±1,22*
26,09±1,09**
НСТ спонтанный, у.е./клетку
0,37±0,05
0,41±0,034
0,59±0,03*
0,40±0,026**
НСТ-индуциров., % клеток
60,00±1,56
61,22±1,22
71,47±1,00*
61,67±1,33**
НСТ-индуциров. у.е./клетку
0,59±0,03
0,54±0,033
0,96±0,032*
0,51±0,013**
функциональный резерв нейтрофилов
2,00±0,13
2,04±0,14
2,91±0,13*
2,06±0,09**
активность фагоцитоза, % клеток
47,13±1,36
50,49±1,44
71,21±1,67*
50,01±1,24**
интенсивность фагоцитоза, у.е./клетку
1,61±0,12
1,63±0,67
1,94±0,42*
1,64±0,29**
Примечание: * - различие по показателям функциональной активности находящихся при естественном освещении и облученных искусственным светом нейтрофилов in vitro достоверно, р<0,05, ** - различие по показателям функциональной активности нейтрофилов, облученных светом, генерируемым люминесцентными лампами и светодиодами, находящихся при различие по показателям функциональной активности нейтрофилов in vitro между группами при воздействии света, генерируемого лампами накаливания и генерируемого светодиодами недостоверно, р>0,05.
При анализе данных, полученных после 30-минутного воздействия света, генерируемого различными источниками на функциональную активность нейтрофилов, также не выявлено статистически значимых различий по показателям активности и интенсивности лизосомального аппарата нейтрофилов, фагоцитарной способности между лампами накаливания, светодиодами и естественным освещением. Отмечены значимые изменения активности нейтрофилов в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте, их фагоцитарной функции у клеток, облученных светом, генерируемым люминесцентными лампами по сравнению с результатами, полученными при естественном освещении клеточной взвеси, воздействии лампами накаливания и светодиодами. Результаты исследования влияния различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 30 минут), (М±m)
Показатели функциональной активности нейтрофилов
Действие на нейтрофилы естественного освещения
Действие на нейтрофилы светом, генерируемым лампами накаливания
Действие на нейтрофилы светом, генерируемыми люминесцентными лампами
Действие на нейтрофилы светом, генерируемым светодиодами
люминесценция лизосом, у.е
280,81±14,19
277,91±12,99
377,81±12,00*
280,91±11,98**
активность лизосом, %
80,22±1,02
81,77±1,12
92,91±0,22*
83,69±1,13**
НСТ-спонтанный, % клеток
22,09±1,51
23,00±1,11
46,05±1,09*
24,09±1,12**
НСТ- спонтанный, у.е./клетку
0,27±0,02
0,26±0,004
0,47±0,03*
0,28±0,016**
НСТ-индуциров., % клеток
50,00±1,16
51,22±1,13
76,47±1,20*
53,67±1,00**
НСТ-индуциров., у.е./клетку
0,59±0,03
0,54±0,011
0,76±0,02*
0,51±0,01**
функциональный резерв нейтрофилов
2,10±0,13
2,04±0,14
2,89±0,13*
2,06±0,19**
активность фагоцитоза, % клеток
27,13±1,36
30,49±1,44
41,21±1,67*
30,01±1,24**
интенсивность фагоцитоза, у.е./клетку
1,61±0,12
1,63±0,67
1,44±0,42*
1,64±0,29**
Примечание: * - различие по показателям функциональной активности находящихся при естественном освещении и облученных искусственным светом нейтрофилов in vitro достоверно, р<0,05, ** - различие по показателям функциональной активности нейтрофилов, облученных светом, генерируемым люминесцентными лампами и светодиодами, находящихся при различие по показателям функциональной активности нейтросфилов in vitro между группами при воздействии света, генерируемого лампами накаливания и генерируемого светодиодами недостоверно, р>0,05.
2
Таким образом, воздействие света, генерируемого лампами накаливания, светодиодными источниками света в пределах световой температуры 4000-4500K, с интенсивностью светового воздействия 0,03 Вт/м в диапазоне длин волн 320-400 нм в течение 10-30 минут не приводит к статистически значимому изменению функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из периферической крови клинически здоровых людей-добровольцев при сравнении с естественным освещением. Воздействие на нейтрофилы света люминесцентных ламп приводит к активации кислородзависимого метаболизма и фагоцитарной активности по показателям активности НСТ-теста.
Применение способа оценки воздействия света, генерируемого светодиодными и иными искусственными источниками на функции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови позволяет решить проблему лабораторного контроля эффективности и биобезопасности искусственных источников света, генерируемых лампами накаливания, люминесцентными лампами и светодиодами.
Предлагаемый способ отличается от существующих тем, что, используя культуру клеток врожденного иммунитета, имеющих фоточувствительные рецепторы, есть возможность более качественно, без использования человека как объекта при проведении исследований, в in vitro условиях лаборатории оценить биобезопасность искусственных источников света, спрогнозировать возможные риски, возникающие при использовании люминесцентных ламп, светодиодов и ламп накаливания при создании цветосветовой среды обитания человека. Ввиду дешевизны метода и простоты выполнения указанный способ оценки доступен большинству санитарно-гигиенических, иммунологических и микробиологических лабораторий.
Заявляемый способ может найти широкое применение в иммунологии, при проведении санитарно-гигиенической оценки освещенности, что свидетельствует о его соответствии критерию "промышленная применимость".