ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО АТРОФИЧЕСКОГО РИНИТА И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ ИНАКТИВИРОВАННАЯ, СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ
VACCINE AGAINST INFECTIOUS ATROPHIC RHINITIS AND PASTERELLOSIS IN PIGS INACTIVATED, METHOD FOR ITS PREPARATION

Группа изобретений относится к области ветеринарии, ветеринарной микробиологии и биотехнологии, и может быть использована ветеринарными специалистами на свинокомплексах для специфической профилактики инфекционных патологий, вызванных бактериями видов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida (инфекционный атрофический ринит и пастереллез свиней).
Респираторные заболевания свиней являются одной из основных причин гибели и выбраковки животных в свиноводческой отрасли всего мира [Sorensen, V., Jorsal, S.E., Mousing, J., 2006. Diseases of the respiratory system. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., d'Allaire, S., Taylor, D.J. (Eds.), Diseases of Swine, ninth ed. Blackwell Publishing, IA, USA, pp. 161-194]. Респираторные заболевания у поросят могут быть вызваны вирусными и бактериальными инфекционными агентами, и протекать как в виде моноинфекций, так и их ассоциаций. Течение инфекций может осложняться определенными предрасполагающими факторами, провоцирующими снижение естественной резистентности организма к возбудителю. К таким заболеваниям следует отнести инфекционный атрофический ринит и пастереллез свиней, возбудителями которых являются Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida. Обозначенные микроорганизмы могут являться как первичными этиологическими агентами, так и вторичными. Следует отметить, что оба названных вида бактерий могут не иметь какой-либо определенной этиологической роли, так как некоторые штаммы, не обладающие патогенными свойствами (не способными вызвать заболевание) [Brockmeier, S.L., 2004. Prior infection with Bordetella bronchiseptica increases nasal colonization by Haemophilus parasuis in swine. Veterinary Microbiology 99, 75-78].
Инфекционный атрофический ринит свиней (ИАР) - широкораспространенное заболевание, характеризующееся деформацией, скручиванием или укорочением носа в результате атрофии его костных структур. Согласно общепринятым данным, в развитии заболевания участвуют токсигенные штаммы Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida [de Jong, M.F., 1999. Progressive and nonprogressive atrophic rhinitis. In: Straw, B.E., D'Allaire, S., Mengeling, W.L., Taylor, D.J. (Eds.), Diseases of Swine. 8th ed. Iowa State University Press, Ames, IA, pp. 355-384].
При эпизоотическом обследовании неблагополучных по респираторным заболеваниям свиноводческих предприятий из различных регионов РФ, было установлено, что инцидентность выделения Bordetella bronchiseptica из легких и верхних дыхательных путей животных находится в диапазоне 5-30%. Наряду с Bordetella bronchiseptica, в 15-40% случаев обнаруживается Pasteurella multocida (по состоянию на 2020 год), что влечет за собой необходимость их сочетанной специфической профилактики.
В соответствии с актуальной таксономией род Bordetella имеет шестнадцать видов: В. ansorpii, В. avium, В. bronchialis, В. bronchiseptica, В. flabilis, В. hinzii, В. holmesii, В. muralis, В. parapertussis, В. pertussis, В. petrii, В. pseudohinzii, В. sputigena, В. trematum, В. tumbae, В. tumulicola [https://lpsn.dsmz.de/genus/bordetella].
В соответствии с актуальной таксономией род Pasteurella состоит из тринадцати видов: P. aerogenes, P. bettyae, P. caballi, P. caecimuris, P. canis, P. dagmatis, P. langaaensis, Р. mairii, P. multocida, P. oralis, P. skyensis, P. stomatis, P. testudinis [https://lpsn.dsmz.de/genus/pasteurella].
Bordetella bronchiseptica - не спорообразующая грамотрицательная коккоподобная палочка размером 0,2-0,5×1,0-2,0 мкм, вирулентные штаммы образуют микрокапсулу. В мазках клетки располагаются одиночно, парно, редко - короткими цепочками. Культуры возбудителя является оксидазо- и каталазоположительными, обладают подвижностью. Культивируется при температуре 36-37°С. Оптимум значения рН составляет 7,2-7,6. Растет как на обычных питательных средах - МПБ, МП А и др., так и на элективных средах - казеиново-угольный агар (КУА), агар Мак-Конки, среда Гартоха и др., образуя через 24-48 ч небольшие серо-белые, блестящие колонии с ровными краями диаметром 1-2 мм, при росте на кровяном агаре выражена зона β-гемолиза [Belhart, K., Gutierrez, М. de la P., Zacca, F., Ambrosis, N., Cartelle Gestal, M., Taylor, D., …  (2019). Bordetella bronchiseptica diguanylate cyclase BdcA regulates motility and is important for the establishment of respiratory infection in mice. Journal of Bacteriology.doi:10.1128/jb.00011-19; Kadlec, K., & Schwarz, S. (2018). Antimicrobial Resistance in Bordetella bronchiseptica. Microbiology Spectrum, 6(4). doi: 10.1128/microbiolspec.arba-0024-2017].
Pasteurella multocida - представляют собой сферические, овальные или палочковидные клетки размером 0,3-1,0×1,0-2,0 мкм. При просмотре мазков из тканей животных, а также первичных культур, полученных из патологического материала, часто P. multocida проявляют биполярное окрашивание и располагаются поодиночке, парами или короткими цепочками. При последующих пересевах культуры Pasteurella теряют биполярность и становятся похожи на коккобациллы и палочками с капсулами. На МПА пастереллы могут образовывать три типа колоний: колонии с гладкой поверхностью (S-колонии), колонии с шероховатой поверхностью (R-колонии) и мукоидные колонии (М-колонии) [Капустин, А.В. Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей / А.В. Капустин, А.И. Лаишевцев, И.Ю. Ездакова, В.Н. Скворцов., Т.В. Степанова, М.И. Гулюкин // Москва, 2016].
Антигенная структура О-антигена клеточной стенки Bordetella bronchiseptica характеризуется несколькими типами, которые указаны в таблице 1.
Родовым антигеном является фактор 7, видовым фактором является антиген 12, типовыми факторами определены - 8, 9, 10, 11, 13. Реакцию агглютинации на стекле ставят с адсорбированными видовыми факторными сыворотками, используя 48-часовые культуры. Используя иные факторные сыворотки, можно определить серотип [Литусов Н.В. Возбудители коклюша и паракоклюша. Иллюстрированное учебно-методическое пособие. - Екатеринбург: Изд-во УГМА, 2013. - 32 с.].
В Российской Федерации наиболее распространены три типа Pasteurella multocida: А, В и D. Тип А чаще всего вызывает пастереллезную инфекцию птиц, кроликов и пушных зверей, а также способствует развитию подострого или хронического течения энзоотической пневмонии у телят и поросят; тип В вызывает геморрагическую септицемию крупного рогатого скота и диких жвачных животных; тип D - пастереллез свиней. Изоляты P. multocida типов Е и F на территории РФ не распространены, при этом являются возбудителями геморрагической септицемии крупного рогатого скота и диких жвачных животных в ряде зарубежных стран.
Подробная этиологическая значимость серотипов пастерелл по классификации Картера-Хедлестоуна приведена в таблице №2.
Клинические признаки бордетеллеза, вызванного В. Bronchiseptica, варьируются от легкой степени, сопровождающейся лихорадкой, кашлем, чиханием, оттоком из конъюнктивы и опухшими лимфатическими узлами, до тяжелой пневмонии, сопровождающейся одышкой, цианозом и смертью. В. bronchiseptica также вызывает первичную пневмонию у новорожденных поросят и вторичную пневмонию у взрослых свиней [Ga Young Park, Hye Min Lee, Hyun Jin Yu, Jee Soo Son, Sang Joon Park, Kyoung Seob Song // Bordetella bronchiseptica bacteriophage suppresses B. bronchiseptica induced inflammation in swine nasal turbinate cells // 4 Received: 5 September 2018 / Accepted: 16 October 2018].
При вскрытии трупов свиней типичных и четких патологоанатомических изменений во внутренних органах не отмечается, за исключением носовой полости. При продольном распиле черепа обнаруживаются скопление слизисто-гнойного экссудата, частичная или полная атрофия верхних и нижних носовых раковин, истончение решетчатой кости. Некротические изменения в слизистой носовой полости встречаются редко [Временная инструкция о мероприятиях по борьбе с инфекционным атрофическим ринитом свиней, Утверждена Государственной инспекцией по ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 6 сентября 1960 года с изменениями, внесенными 20 января 1961 года]. При микроскопическом исследовании фиксируют слизистую нейтрофильную инфильтрацию, потерю ресничек, эпителиальную метаплазию и резорбцию костной ткани с замещением ее фиброзной тканью. Легочные поражения включают нейтрофильную инфильтрацию дыхательных путей, некроз альвеол и кровеносных сосудов, кровоизлияния и, в конечном счете, обширный фиброз [Brockmeier S.L., Register K.В., Magyar Т., Lax A. J., Pullinger G.D., Kunkle R.A. Role of the dermonecrotic toxin of Bordetella bronchiseptica in the pathogenesis of respiratory disease in swine. Infect. Immun. 2002; 70:481-490. doi: 10.1128/IAI.70.2.481-490.2002].
Значимым представителем в этиологической структуре инфекционного атрофического ринита является вид Pasteurella multocida, имеющий обширную зону распространения и высокую эпизоотическую значимость. Как правило, заболевание воспроизводится только тогда, когда В. bronchiseptica ассоциируется с P. multocida.
Спорадическую заболеваемость пастереллезом чаще вызывают у свиней - Р. multocida типов А и D. Для свиней характерно три формы течения заболевания - сверхострая, острая и хроническая. Сверхострое течение заболевания характеризуется лихорадкой 41°С и выше, сердечной недостаточностью, брадикардией, снижением дыхательных движений, фарингитом и отеками в межчелюстной области и шеи. За ушами животного появляется покраснение и синюшность. Также изменение цвета наблюдается на поверхности вентральной стенки живота. Смерть при данной форме течения наступает от асфиксии в течение 24-48 часов.
Острое течение характеризуется грудной и легочной формой болезни. Наблюдается фиброзная пневмония, сильный кашель с мокротой и одышкой, с отделяемым слизисто-гнойного характера, часто с примесью кровяных прожилок. Также заболевание дополнительно проявляется поражением пищеварительной системы, в виде диспепсии и цианозом видимых слизистых оболочек с последующим переходом к диффузному помутнению роговицы глаза. Финал развития болезни проявляется ослаблением сердечной функции с образованием на коже гиперемированных пятен. Смерть также наступает от асфиксии на 5 - 8 день после заражения.
В случае слабой патогенности штамма P. Multocida, заболевание из острой формы переходит в хроническую. Клиническая картина сглажена по сравнению с острым течением, но можно отметить наличие постоянного кашля, нарастание слабости и кахексии. Свиньи могут как погибнуть в течении 3-6 недель, так и выздороветь, но с сохранением носительства болезни [Капустин, А.В. Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей / А.В. Капустин, А.И. Лаишевцев, И.Ю. Ездакова, В.Н. Скворцов., Т.В. Степанова, М.И. Гулюкин // Москва, 2016 г.].
Основными патологоанатомическими изменениями при пастереллезе свиней являются: серозно-студенистый отек подчелюстного пространства переходящий на шею, подгрудок, глотку и гортань, кроме того отек охватывает конечности животного; на серозных и слизистых оболочках наблюдаются кровоизлияния, паренхиматозная и интрацеллюлярная ткань легких находится в состоянии серозного воспаления; крупозное воспаления легких; серозно-фибринозный плеврит; бронхиальные лимфатические узлы гиперемированы и увеличены в размерах; просвет бронхов и бронхиол содержит слизисто-гнойный или фибринозный экссудат; кровоизлияния обнаруживаются в паренхиматозных органах, а также на слизистых оболочках мочевого пузыря, желудка, кишечника; печень содержит рассеянные некротические фокусы серого цвета; под капсулой почек выявляются анемические участки с точечными кровоизлияниями в центре; брюшная полость содержит серозный экссудат с возможными примесями крови [Капустин, А.В. Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей / А.В. Капустин, А.И. Лаишевцев, И.Ю. Ездакова, В.Н. Скворцов., Т.В. Степанова, М.И. Гулюкин // Москва, 2016.].
Гистопатологические признаки у свиней также включают фиброзное замещение костных пластинок вентральных раковин с различной степенью воспалительных и репаративньгх изменений [Magyar Т., Donko Т., Repa I. & Kovacs M. (2013). Regeneration of toxigenic Pasteurella multocida induced severe turbinate atrophy in pigs detected by computed tomography. BMC Vet. Res., 9, 222].
Уровень техники
Специфическая профилактика инфекционных болезней свиней является наиболее эффективным средством предотвращения случаев массового заболевания и гибели животных.
В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы следующие ветеринарные препараты для профилактики инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней:
Препараты для свиней:
2
10
10
9
8
- Вакцина против респираторных болезней свиней поливалентная инактивированная PEC-ВАК - производства "АО КОМИФАРМ", Южная Корея. Препарат предназначен для профилактики инфекционных респираторных болезней свиней (атрофического ринита, пастереллеза, актинобациллезной плевропневмонии свиней, гемофилезного полисерозита и микоплазмоза (возбудитель Mycoplasma hyopneumoniae). Одна иммунизирующая доза вакцины (2 см) содержит: инактивированные микробные клетки штаммов бордетелл Bordetella bronchiseptica; пастерелл Pasteurella multocida тип D и тип А - не менее 1,5×10 КОЕ; актинобацилл Actinobacillus pleuropneumoniae серотипов 5 и 2 - не менее 1,0×10 КОЕ; гемофилл Haemophilus parasuis, серотипов 4 и 5 - не менее 4×10 КОЕ каждого и микоплазм Mycoplasma hyopneumoniae - не менее 2×10 КОЕ, а также дермонекротический токсин (cDNT) токсигенных штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida тип D - не менее 500 мкг каждого; белок клеточных стенок (ОМР) токсигенных штаммов Actinobacillus pleuropneumoniae серотипов 5 и 2 - не менее 10 мкг каждого [https://galen.vetrf.ru/files/2b539f17-6d85-4de4-9a66-1b513d127c9c].
3
- Вакцина для профилактики пневмонии свиней инактивированная Полиплевросин АРХ IM - производства АО БИОВЕТА, Чешская республика. Препарат предназначен для профилактики пневмонии свиней, вызываемой Actinobacillus pleuropneumoniae сероваров 2 и 9, Pasteurella multocida А и D, Bordetella bronchiseptica. В одной дозе вакцине (1,0 см) содержатся инактивированные бактериальные клетки Actinobacillus pleuropneumoniae сероваров 2 и 9, Pasteurella multocida сероваров А и D, Bordetella bronchiseptica, токсоиды Арх I, АРХ II, Арх III, а также вспомогательные вещества - масляный адъювант, формалин - 3,8 мг, тиомерсал - 0,2 мг [https://galen.vetrf.ru/files/12efe1dc-f1a0-4b13-a7eb-6c99746fbf3e].
3
10
10
- Вакцина против инфекционного атрофического ринита свиней инактивированная РиниПиг - производства "Dae Sung Microbiological Labs.", Республика Корея. Препарат предназначен для профилактики инфекционного атрофического ринита у свиней в угрожаемых и неблагополучных свиноводческих хозяйствах. Одна иммунизирующая доза вакцины (2 см) содержит инактивированные бактериальные клетки бордетелл Bordetella bronchiseptica (штамм Bb1 DS) - не менее 6×10 КОЕ и пастерелл Pasteurella multocida (штамм тип D DS) - не менее 1,4×10 КОЕ, а также неочищенный дермонекротоксины Bordetella bronchiseptica (штамм Bb1 DS) - не менее 0,5 мг и Pasteurella multocida (штамм тип D DS) - не менее 0,5 мг, инактивированные формалином - не более 0,25%, с добавлением в качестве консерванта тиомерсала - не более 0,01% и адъюванта мелкодисперсной водомасляной эмульсии «Монтанид ИМС 1313» - 10% [https://galen.vetrf.ru/files/8787ccc5-a881-49d7-91ba-cad05c6edae7].
10
- Вакцина против атрофического ринита свиней инактивированная РИНИСЕНГ - производства "Laboratories Hipra, S.A.", Испания. Одна прививная доза вакцины (2 мл) содержит инактивированные бактерии Bordetella bronchiseptica (штамм 833CER) - не менее 2×10 микробных клеток, что соответствует 9,8 BbCC Log и токсин рекомбинантного типа D Pasteurella multocida (PMTr) - не менее 110 мкг, индуцирующего >1 MED63 с добавлением в качестве консерванта формальдегида (0,8 мг/доза и адъюванта: гидрата окиси алюминия (6,4 мг/доза) [https://galen.vetrf.ru/files/ae008d0e-7f59-4ce2-bae2-b2c378b6ba57].
- Вакцина против респираторных болезней свиней поливалентная инактивированная Донобан-10 - производства "KBNP, INC.", республика Корея. Препарат предназначен для профилактической иммунизации свиней против атрофического ринита, пастереллеза, актинобациллезной плевропневмонии, гемофилезного полисерозита, стрептококкоза и инфекции, вызванной Mycoplasma hyopneumoniae. Вакцина изготовлена из инактивированных бактериальных клеток бордетелл Bordetella bronchiseptica (штамм ARDNT /SB-11), пастерелл Pasteurella multocida тип А (штамм NSPA /SB-40) и Pasteurella multocida тип D (штамм NSA2 / SB-03) и Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 5 (штамм NSA5 /SB-04), микоплазм Mycoplasma hyopneumoniae (штамм NSM /SB-34), стрептококков Streptococcus suis тип 2 (штамм NSS2 /SB-50), штаммов гемофилл Haemophilus parasuis серотип 1 (штамм NSH1 /SB-30), Haemophilus parasuis серотип 4 (штамм NSH4 /SB-31) и Haemophilus parasuis серотип 5 (штамм NSH5 /SB-32), а также дермонекротического токсина (cDNT) Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida тип D; белка клеточных стенок (ОМР) Pasteurella multocida тип A; Actinobacillus pleuropneumonia серотип 2 и 5, инактивированных формалином (в концентрации 0,2%), с добавлением в качестве консерванта тиомерсала (0,01%), адъювантов: гидрата окиси алюминия (20%) и IMS 1313 (10%) до 2 мл [https://galen.vetrf.ru/files/eee032b2-42b6-4e97-bdf6-201942a9cf33].
Недостатком данных препаратов стоит считать то, что все они иностранного производства, в то время как предлагаемое изобретение - отечественная разработка, что в полной мере соответствует принципам политики импортозамещения. Кроме того, во вновь предложенном препарате, используются новые эпизоотические штаммы бордетелл и пастерелл, выделенные на территории Российской Федерации, что положительно будет сказываться на эффективности препарата, так как они наиболее гомологичны штаммам возбудителей, циркулирующих на свиноводческих комплексах страны.
- Вакцина ассоциированная против пастереллеза и сальмонеллеза свиней инактивированная эмульсионная - производства ФГБУ "ВНИИЗЖ", г. Владимир. Препарат предназначен для профилактики пастереллеза и сальмонеллеза свиней. Вакцина изготовлена из культур штаммов Pasteurella multocida №1231 (серогруппы А) и №9 (серогруппа D); Salmonella choleraesuis №370 и Salmonella typhimurium №371 инактивированных формальдегидом, с добавлением адъюванта - Montanide ISA 70 (70%) [https://galen.vetrf.ru/files/52806702-4530-4839-b198-81cf2eb9a2b9].
- Вакцина против актинобациллярной плевропневмонии и пастереллеза свиней инактивированная эмульгированная "Аптовак" - производства "Biowet Pulawy", Польша. Вакцина изготовлена из штаммов Actinobacillus pleuropneumoniae серотипы 2 и 6, а также Pasteurella multocida типа D; с добавлением субстрата БХИ (сердечно-мозговой бульон, вода для инъекций) - до 2 мл, формальдегид - 1 мг, гидрата окиси алюминия - 0,1 мл, минерального масла Emulsigen - 0,2 мл на дозу [https://galen.vetrf.ru/files/aa9cccef-237c-465e-a2e2-ee9c7514c2d8].
3
- Вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ассоциированная (инактивированная) - производства ФКП "Армавирская биофабрика", Краснодарский край. В 1 см (0,2 коммерческие дозы) вакцины содержится не менее 2 млрд, микробных клеток Salmonella choleraesuis №370, 6 млрд, микробных клеток Pasteurella multocida №656 и по 0,4 млрд, микробных клеток каждого штамма Streptococcus faecalis №356, №13, №345, «Соколово» и «Константиновский» [https://galen.vetrf.ru/files/83ebe0d8-8f4b-45b4-8ec2-ef35dfcf3b0f].
- Вакцина ассоциированная против пастереллеза, сальмонеллеза и гемофилезного полисерозита свиней инактивированная эмульсионная - производства ФГБУ "ВНИИЗЖ", г. Владимир. Вакцина изготовлена из культур штаммов Pasteurella multocida №1231 (серогруппы А) и №9 (серогруппа D); Salmonella choleraesuis №370 и Salmonella typhimurium №371 инактивированных формальдегидом, с добавлением адъюванта -Montanide ISA 70 (70%) [https://galen.vetrf.ru/files/6d74d410-5279-4a54-bb17-bf5eded44ff7].
- Вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят инактивированная "Суигард" - производства ФКП "Ставропольская биофабрика", г. Ставрополь. Используется для профилактики сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции свиней в неблагополучных по данным болезням хозяйствах. Вакцина состоит из культуры бактерий Salmonella choleraesuis №370, Pasteurella multocida №656, Streptococcus faecalis №13, 345, "Соколово", "Константиновский", инактивированные формальдегидом с добавлением адъюванта [https://galen.vetrf.ru/files/1a8724e5-5fa6-4eeb-bf82-83dc81af60d3].
- Вакцина против пастереллеза овец и свиней инактивированная "Пастос" - производства ФКП "Ставропольская биофабрика", Ставрополь. Вакцина содержит смесь штаммов бактерий Pasteurella multocida (серогруппа В) №796, №116, №656, №877, инактивированные формалином и преципитированные алюмокалиевыми квасцами [https://galen.vetrf.ru/files/181d850a-648c-4978-b4ee-2be706d30cd7].
Вакцина ассоциированная против пастереллеза, гемофилезного полисерозита и актинобациллезной плевропневмонии свиней "ВЕРРЕС-ПГА" - производства ООО "Ветбиохим", г. Москва. Вакцина изготовлена из суспензии клеток бактерий Pasteurella multocida серогрупп А и D, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumonia© серотипов 2 и 5, инактивированных формалином (в концентрации 0,3%) и адсорбированных гелевым адъювантом в количестве 15% от объема вакцины [https://galen.vetrf.ru/files/b80d939d-8015-4eca-8938-bb06b942274a].
- Вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза поросят "ВЕРРЕС-СПС" - производства ООО "Ветбиохим", г. Москва. Вакцина изготовлена из производственных штаммов Salmonella choleraesuis №370 и typhimurium №371, Pasteurella multocida тип A №1231 и тип D - «Т-80», Streptococcus серогруппы С штамм П 2082 и Streptococcus suis серогруппы R штамм Касли, инактивированных формалином (в концентрации 0,3%) и адсорбированных на геле гидроокиси алюминия (20%) [https://galen.vetrf.ru/files/ca86831a-8b5c-416e-be11-9baf9e1b623b].
3
- Вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза поросят - производства ФКП "Армавирская биофабрика", Краснодарский край. Вакцина изготовлена из культур штаммов Salmonella choleraesuis №370, Salmonella typhimurium №371, Pasteurella multocida №1231, Pasteurella multocida №796, Pasteurella multocida № T-80, сероваров А, В, Д, Streptococcus zooepidemicus № П-2082 серогруппы С и Streptococcus suis type II №«Касли» серогруппы R, инактивированных формалином (0,3% по объему), с добавлением в качестве адъюванта геля гидрата окиси алюминия (30% по объему). В 1 см (0,2 коммерческие дозы) вакцины содержится не менее 2 млрд, микробных клеток сальмонелл, 6 млрд, пастерелл и 2 млрд, стрептококков [https://galen.vetrf.ru/files/c37b737d-29ef-4cec-a604-283c46b214ef].
Недостатком обозначенных препаратов является отсутствие в их составе антигенов В. bronchiseptica, несмотря на наличие в них антигенов P. multocida, что говорит о возможности использования данных средств для иммунизации животных против пастереллеза, но не против атрофического ринита.
Помимо зарегистрированных на территории РФ коммерческих препаратов известны следующие разработки:
- Вакцина ассоциированная инактивированная гидроокисьалюминиевая против инфекционной пневмонии и сальмонеллеза свиней и способ ее изготовления [патент RU 2246316 С1 опубл. 2005.02.20]. Согласно изобретению вакцина содержит бактериальную массу Pasteurella multocida серовариантов А, В и D, Haemophilus pleuropneumoniae серогрупп 1 и 2 и стрептококков серогрупп С и R, а также лизат-антигены сальмонелл Salmonella choleraesuis штамм №370 и Salmonella typhimurium штамм №415, смешанных в определенной концентрации. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, обеспечивает надежную защиту свиней от инфекционной пневмонии бактериальной этиологии и сальмонеллеза.
- Живая аттенуированная бактерия Pasteurella multocida, вакцина на ее основе, способ получения вакцины и применения этой бактерии для получения вакцины для защиты животных или человека [патент RU 2415926 С2 опубл. 2011.04.10]. Живая аттенуированная бактерия Pasteurella multocida модифицирована внесением мутации в ген Orf-15. Мутация представляет собой инсерцию и/или делецию в гене Orf-15. В результате модификации бактерия не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15, что приводит к ее аттенуации. Раскрыто также использование такой бактерии для создания на ее основе вакцины для защиты человека или животных от инфицирования бактерий Pasteurella multocida или патогенных эффектов инфекции.
9
9
3
3
3
3
- Вакцина против пастереллеза свиней [заявка на изобретение RU 94023126 А1 опубл. 1997.04.10]. Вакцина против пастереллеза свиней включает инактивированные формалином антигены P. multocida серологического варианта А - штамм ДЕП-8683, серологического варианта В - штамм ДЕП-В681, серологического варианта Д - штамм ДЕП-Т80 и адъювант, состоящий из минерального масла и ланолина. Все штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветпрепаратов. Концентрация каждого из штаммов, входящих в вакцину, составляет 3,0⋅10 - 4,8⋅10микробных клеток/см. Вакцину вводят внутримышечно свиноматкам независимо от возраста однократно за 4 - 5 недель до опроса в дозе 5,0 см, поросятам - двукратно до 60-дневного возраста по 2 см, старше 60-дневного возраста по 3 см. Применение вакцины профилактирует гемосептицемию пастереллезной этиологии, снижает заболеваемость пневмониями на 50-80%, способствует увеличению среднесуточных привесов на 20,0-30,0 г. Предложенная вакцина найдет широкое применение в неблагополучных по пастереллезу свиноводческих хозяйствах.
- Вакцина против пастереллеза животных [патент RU 2311199 С1 опубл. 2006.07.06]. Вакцина включает инактивированную баксуспензию Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и адъювант. При этом в качестве P. multocida серологических вариантов А, В, D используют P. multocida серологических вариантов А, В, D с активностью растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации как 1:256-4096, 1:512-8192, 1:256-4096, соответственно, при следующем соотношении компонентов, мас. %: Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D, взятых в массовых соотношениях 1:(0,8-1,2):(0,8-1,2) - 45-55, адъювант - остальное. Вакцина имеет высокую активность и длительный срок хранения.
- Вакцина против пастереллеза животных [патент RU 2414929 С1 опубл. 2011.03.27]. Вакцина включает инактивированную баксуспензию Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и адъювант. Вакцина дополнительно содержит инактивированную баксуспензию Pasteurella haemolytica с активностью растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации 1:32-64, а в качестве адъюванта - адъювант ISA-70VG при следующем соотношении компонентов, мас. %: инактивированная баксуспензия Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и инактивированная баксуспензия Pasteurella haemolytica, взятые в массовых соотношениях 1:(0,8-1,2):(0,8-1,2):(0,8-1,2)-45-55, адъювант ISA-70VG - остальное. Вакцина имеет высокую иммунологическую активность и длительный срок хранения.
Значимым недостатком приведенных изобретений является ограниченный антигенный состав в отношении возбудителей этиологии атрофического ринита. Препараты не содержат в своем составе антигенов Bordetella bronchiseptica.
- Recombinant vaccine for preventing and treating porcine atrophic rhinitis (Рекомбинантная вакцина для профилактики и лечения атрофического ринита свиней) [патент KR 100841207 В1 опубл. 2018.06.24]. Пептидная вакцина с использованием белка внешней мембраны H(OmpH) Pasteurella multocida предназначена для подготовки вакцины, которая показывает отличную активность и применима в организме различными путями. Вакцина для профилактики и лечения свиного атрофического ринита состоит из общего или части рекомбинантного белка внешней мембраны Н штамма Pasteurella multocida (D:4), экспрессируемого из рекомбинантного вектора экспрессии, включая ген, имеющий по крайней мере одну последовательность кодирующую общий или часть OmpH штамма Pasteurella multocida (D:4) или фармацевтически приемлемого носителя. Недостатком данного изобретения, по отношению к вновь предлагаемому, является антигенный состав, не позволяющий полноценно профилактировать инфекционный атрофический ринит и пастереллез свиней. Так, в состав вакцины входит только Pasteurella multocida типа D, но не тип А, а также отсутствует Bordetella bronchiseptica.
- Killed vaccine for infectious porcine atrophic rhinitis and process for preparing the same (Убитая вакцина против инфекционного атрофического ринита свиней и способ ее получения) [патент US 3873691 А опубл. 25.03.1975]. Убитая вакцина против инфекционного атрофического ринита свиней, которая готовится из I фазы Bordetella bronchiseptica, которая представляет собой грамотрицательный микроб, обладающий антигеном K и антигеном, способным обеспечивать мышей протективной защитой против внутримозгового заражения. Для этой фазы свойственна кокковидная и коккобацилярная морфологическая форма, имеющая капсулу и/или оболочку, но не имеющая жгутики. Недостатком данного изобретения, по отношению к вновь предлагаемому, является неполноценный антигенный состав для специфической профилактики ИАР свиней. В состав вакцины входит только Bordetella bronchiseptica., но не Pasteurella multocida тип А и тип D, которые играет важную роль в патогенезе заболевания.
Помимо вакцин известны следующие способы их получения:
- Способ приготовления противопастереллезной вакцины [авторское свидетельство SU 1839092 А1 опубл. 1993.12.20]. Суть данного изобретения сводится к повышению иммуногенности препаратов, снижения их вязкости и реактогенности. Поставленная задача решается за счет использования определенного соотношения масляной основы - полиэтилсилоксановая жидкость, и эмульгатора, во время компоновки серии препарата. Недостатком предложенного способа стоит считать последовательность его реализации, так согласно изобретению, концентрация водородных ионов определяется непосредственно после окончания культивирования пастерелл, а не контролируется во время его проведения. В случае поддержания определенного значения уровня рН во время культивирования, удается получить большую концентрацию бактериальных клеток, чем в неконтролируемых условиях. Следующим недостатком приведенного способа стоит считать то, что инактивация проводиться после концентрирования антигенов, а не до. Концентрирование не инактивированной культуральной жидкости имеет свои риски, в частности - контаминация оборудования, риски инфицирования человека, риски попадания не инактивированных клеток пастерелл и ее токсинов в канализацию, риски контаминации антигенного сырья, и т.д.
- Способ изготовления вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц [патент RU 2129015 С1 опубл. 1999.04.20]. Недостатком данного способа является большой расход питательных сред при проведении непрерывно-проточного культивирования пастерелл. Помимо этого, в данной разработке отсутствует этап концентрирования пастереллезных антигенов, необходимый для получения инактивированных вакцин, в следствии чего в препарат с необходимыми бактериальными антигенами попадают белки питательной среды. В случае перорального или аэрозольного использования живых пастереллезных вакцин, наличие в них балластных остатков питательных сред, чаще всего не способствует каким-либо реактогенным реакциям. В случае же инъекционного использования данных препаратов, содержащих остатки питательных веществ, это может сказаться как на безвредности, так и на уровне антигенного ответа, поскольку вещества, входящие в состав питательных сред - белки, на которые будут образовываться антитела.
- Способ изготовления вакцин против пастереллеза животных и птиц [патент RU 2129440 С1 опубл. 1999.04.27]. Данный способ ориентирован на использование сухого белкового гидролизата из отходов мясного производства, с целью замены полноценного пищевого мясного сырья. Недостатком такого способа стоит считать то, что для культивирования штаммов пастерелл рекомендуется конкретная среда, в то время как существует ряд питательных сред, обладающих лучшими ростообеспечивающими свойствами, например, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон, эугоник бульон и т.д. Кроме того, питательную среду, изготовленную из отходов мясного производства, сложнее стандартизировать, чем изготовленную из стандартного сырья.
- Способ изготовления формол-квасцовой вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и свиней [авторское свидетельство SU 94044 А1 опубл. 1952.01.01]. Недостатком приведенного способа является, то, что он не может быть реализован в современных условиях промышленного производства биопрепаратов, в соответствии с требованиями надлежащих производственных практик, GMP (англ. Goodmanufacturing practice). В соответствии с требованиями GMP состав препарата не может меняться от серии к серии, ввиду чего использование 7-8 культур пастерелл для производства формол-квасцовой вакцины является недопустимым, так как рецептура должна быть точной. Кроме того, недостатком приведенного препарата является ограниченная продолжительность иммунитета - 5-6 месяцев.
- Глубинный способ изготовления вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и свиней в танкере [авторское свидетельство SU 127365 А1 опубл. 1960.10.10]. Недостатком данного изобретения является его несоответствие требованиям GMP. Так стандартизовать производство биопрепаратов, антигены которых были получены при совместном культивировании, нельзя.
- Способ получения вакцины против пастереллеза животных [патент RU 2405567 С1 опубл. 2010.12.10]; а также - Способ получения вакцины против пастереллеза животных [патент RU 2310473 С1 опубл. 2007.11.20]. Недостатком предложенных композиций и способов их получения является излишний антигенный состав, для разных видов животных. Применение препарата, изготовленного предложенным способом для свиней, не является обоснованным, ввиду того что нет доказательной базы подверженности свиней заболеванию Mannheimia haemolytica.
- Способ изготовления вакцинного препарата против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц [патент RU 2173560 С1 опубл. 2001.09.20]. Недостатком данного метода является культивирование микроорганизмов в среде на основе дорогостоящего и дефицитного пищевого белка - мясного гидролизата по Хоттингеру; препараты, изготовленные с применением этого гидролизата, не обладают достаточной стабильностью, нестандартны, себестоимость их производства высокая.
- Способ получения инактивированной вакцины против инфекционного атрофического ринита свиней [патент SU 403134 А1 опубл. 1973.10.19]. Недостатком приведенного изобретения является ограниченный антигенный состав в отношении возбудителей этиологии атрофического ринита. Способ получения вакцины не содержит технологию получения антигенов Pasteurella multocida.
Согласно вышеприведенным характеристикам, на существующие и/или ранее используемые на территории РФ вакцины, препарат Донобан-10 - вакцина против респираторных болезней свиней поливалентная инактивированная [ссылка в сети [http://www.kbnp.net/_mobile/sub02_1_l.html?number=721&xcode=&mcode=02&scode=01&page=2] является наиболее близким аналогом (прототипом), предлагаемой вакцине. Вакцина изготовлена из инактивированных бактериальных клеток бордетелл Bordetella bronchiseptica (штамм ARDNT /SB-11), пастерелл Pasteurella multocida тип А (штамм NSPA /SB-40) и Pasteurella multocida тип D (штамм NSA2 / SB-03) и Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 5 (штамм NSA5 /SB-04), микоплазм Mycoplasma hyopneumoniae (штамм NSM /SB-34), стрептококков Streptococcus suis тип 2 (штамм NSS2 /SB-50), штаммов гемофилл Haemophilus parasuis серотип 1 (штамм NSH1 /SB-ЗО), Haemophilus parasuis серотип 4 (штамм NSH4 /SB-31) и Haemophilus parasuis серотип 5 (штамм NSH5 /SB-32), а также дермонекротического токсина (cDNT) Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida тип D; белка клеточных стенок (ОМР) Pasteurella multocida тип А; Actinobacillus pleuropneumonia серотип 2 и 5, инактивированных формалином (в концентрации 0,2%), с добавлением в качестве консерванта тиомерсала (0,01%), адъювантов: гидрата окиси алюминия (20%) и IMS 1313 (10%) до 2 мл.
9
9
9
8
9
9
Одна иммунизирующая доза вакцины (2 мл) содержит: инактивированные микробные клетки штаммов Bordetella bronchiseptica - не менее 4*10 КОЕ, пастерелл Pasteurella multocida тип А и D - не менее 2*10 КОЕ каждого, актинобацилл Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 2 и 5 - не менее 2*10 КОЕ, микоплазм Mycoplasma hyopneumoniae - не менее 2*10 КОЕ, стрептококков Streptococcus suis, тип 2 - не менее 42*10 КОЕ, гемофилл Haemophilus parasuis, серотипов 1, 4, 5 - не менее 2*10 КОЕ каждого, а также дермонекротический токсин (cDNT) токсигенных штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida тип D - не менее 400 мкг, белок клеточных стенок (ОМР) токсигенных штаммов Pasteurella multocida тип А - не менее 60 мкг, Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 2 и 5 - не менее 20 мкг каждого. Вакцина вызывает формирование иммунного ответа к возбудителям респираторных болезней свиней (атрофического ринита, пастереллеза, актинобациллезной плевропневмонии, гемофилезного полисерозита, стрептококкоза и инфекции, вызванной Mycoplasma hyopneumoniae), через 21 день после двукратного применения, продолжительностью 6 месяцев.
Способ получения инактивированной вакцины против инфекционного атрофического ринита свиней [патент SU 403134 А1 опубл. 1973.10.19], является наиболее близким прототипом для вновь предлагаемого изобретения. Недостатком прототипа стоит считать, тот факт, что способ ориентирован на получение препарата из антигенов Bordetella bronchiseptica, и не раскрывает сущность и особенностей получения ассоциированных средств против ИАР с учетом всех антигенов, необходимых для полноценной иммунопрофилактики животных, в частности Pasteurella multocida.
Технической проблемой, на решение которой направлена данная группа изобретений, является необходимость создания безопасной поливалентной вакцины против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней, на основе сбалансированного антигенного состава, содержащего наиболее распространенные на территории РФ серотипы бактерий видов Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida и необходимость в расширении арсенала инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционного ринита и пастереллеза свиней.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом предлагаемой группы изобретений является повышение стабильности, безопасности, антигенной и иммуногенной активности вакцины, обеспечивающих продолжительный и напряженный иммунитет у вакцинированных свиней против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза, расширении арсенала поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней свиней, создание вакцины с повышенной стабильностью, антигенной и иммуногенной активностью, расширении подходов и способов изготовления поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней свиней.
Вакцина против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней инактивированная
3
Вакцина против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней содержит в своем составе следующие компоненты из расчета на 2 см препарата (иммунизирующая доза): инактивированный формалином штамм Bordetella bronchiseptica В-1341 - 6 млрд. мкр. кл.; Pasteurella multocida В-1308 тип D - 3 млрд. мкр. кл.; Pasteurella multocida В-1303 тип А - 3 млрд. мкр. кл., а также фармацевтически приемлемые целевые добавки.
В качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок вакцина, помимо антигенов, содержит:
- Инактивант, необходимый для инактивации антигенов и их токсинов. Для этого использован формалин из расчета 0,3% к объему бульонной культуры, содержащий не менее 37% формальдегида;
- Консервант, необходимый для производства многодозовых фасовок препарата. В качестве стандартного консерванта используется водный раствор мертиолята натрия 10%, вводимый в препарат из расчета 1:10000 (1 часть мертиолята натрия и 10000 частей готового препарат);
- Разбавитель, необходимый для разведения концентрированного бактериального антигена до требуемой концентрации и 100%-ного объема компонуемой серии препарата (согласно 61-ФЗ "Об обращении лекарственных средств", серия лекарственного средства это количество лекарственного средства, произведенное в результате одного технологического цикла его производителем). В качестве стандартных растворителей могут быть использованы - стерильный физиологический раствор, стерильный PBS - фосфатно буферный солевой раствор, вода для инъекций;
- Адъювант, необходимый для осаждения бактериальных компонентов в вакцине и для неспецифического усиления иммунного ответа к антигенам. В качестве целевой добавки предлагаемая вакцинная композиция может содержать ГОА (гидроокись алюминия 3% раствор) в количестве 10% от объема серии препарата; масляный адъювант (например, Montanide ISA 50, Montanide ISA 61, Montanide ISA 70) в количестве 50% от объема серии препарата и т.д.; Карбомер 971р 2%-ный раствор в PBS в количестве 10% от объема серии препарата;
- Дополнительно, с целью нормализации уровня водородных ионов в препарате, необходимо использование 10% гидроксида натрия (едкого натра). Оптимальным уровнем рН препарата стоит считать 7,2-7,6 для варианта вакцины, выполненной на ГОА и Карбомере 971р. Уровень рН препарата, выполненного на масляном адъюванте, дополнительно не регулируется.
В зависимости от используемого адъюванта, внешний вид вакцины может иметь следующие вариации:
- При использовании ГОА и карбомера 971р - по внешнему виду вакцина представляет собой суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
- При использовании масляных адъювантов - по внешнему виду вакцина представляет собой эмульсию белого цвета, иногда с желтоватым оттенком. При длительном хранении возможно незначительное расслоение препарата, которое при встряхивании переходит в первоначальное состояние гомогенной эмульсии.
Срок годности вакцины - 12 месяцев с даты выпуска, при соблюдении соответствующих условий хранения при температуре 2-8°С.
Вакцина предназначена для профилактики инфекционного атрофического ринита и пастереллеза у свиней. Вакцину вводят супоросным свиноматкам не позднее 14 дней до опороса. Вакцина вызывает формирование иммунитета к Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida тип А и D через 14 дней после повторного введения, который сохраняется не менее 6 месяцев. Колостральный иммунитет у поросят, полученного от иммунизированных животных, сохраняется до 20 дней.
Входящие в состав вакцины бактериальные штаммы Bordetella bronchiseptica В-1341 и Pasteurella multocida В-1308 тип D являются новыми производственными культурами и впервые используются в составе вакцинных препаратов для широкого применения. Ранее, на этапе доклинических и клинических испытаний, была подтверждена пригодность данных культур для использования в качестве производственных штаммов микроорганизмов. Штамм Pasteurella multocida В-1303 известен из патента на изобретение № RU 2744744 С1 опубл. 15.03.2021.
Все используемые в рамках изобретения штаммы бактерий депонированы во Всероссийской коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ Федеральный научный центр - всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук. Все культуры идентифицированы на базе лаборатории микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Характеристика производственных штаммов Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida
1) Производственный штамм Bordetella bronchiseptica №134-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1341
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактериальные агенты вида Bordetella bronchiseptica относятся к четвертой группе опасности.
Дата, источник и место выделения: из легких свиньи. Свиноводческое предприятие Свердловской области. 2018 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микологии и антибиотиков им. А.Х. Саркисова ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные палочки средним размером 0,2-0,5*1,0-2,0 мкм, в мазках расположены одиночно, иногда парами, спор не образуют, но образует микрокапсулу. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуральные особенности: на среде Борде-Жангу микроорганизм формирует гладкие, выпуклые, жемчужные, блестящие колонии. Может демонстрировать слабый гемолиз на кровяных средах (основа колумбийского агара, МПА с добавлением 10% дефибринированной крови барана). Диапазон роста 25-42°С, но оптимальная температуры культивирования 37°С. Строгий аэроб. На агаре МакКонки микроорганизм формирует красноватые колонии с небольшим обесцвеченным ореолом вокруг них. Пигмента не образует ни на одной из сред. При росте на среде Бордетел-агар колонии округлые, выпуклые, гладкие, блестящие с ровными краями, кремового цвета, имеют мягкую, маслянистую консистенцию и легко снимаются. Сроки появления колоний - через 18-24 часа. Диаметр колоний - 0,5-1 мм.
Биохимические свойства: свойственны для Bordetella bronchiseptica: аргинин -; алифатический тиол -; триглицерид+; ρ-нитрофенил-фосфат+; р-нитрофенил-п-ацетил - b, d-глюкозаминид+; ρ-нитрофенил - а, d-глюкозид+; ρ-нитрофенил - b, d-глюкозид+; ρ-нитрофенил b, d-галактозида+; уреаза+; глюкоза+; ксилоза -; маннитол -; лактоза -; сукроза -; мальтоза -; эскулин -; малонат -; сукцинат -; глицерол -; инозитол -; сорбитол -; трегалоза -; пролин-b- нафтиламид+; пирролидин- b-нафтиламид+; g -глутамил-b-нафтиламид+; триптофан-b-нафтиламид+; п-бензил-аргинин-b-нафтиламид+; триптофан -; нитрат натрия+; каталаза+; оксидаза+; цитрат+; индол -.
50
7
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 4,6×10 мкр. кл. Гибель животных наступает не позднее 24 часов после заражения.
Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных средах, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д., а также на плотных питательных средах: кровяном агаре, МПА, Бордетел-агар, Борде-Жангу с добавлением 10% дефибринированной крови барана.
2) Производственный штамм Pasteurella multocida №1042-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1303
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии вида Pasteurella multocida относятся к третьей группе опасности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшей овцы. Овцеводческое предприятие Курской области. 2018 г.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, часто овоидные палочки, располагаются изолированно, иногда парами и реже цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуральные особенности: образуют в бульоне Хоттингера равномерное помутнение среды; на агаре Хоттингера в чашках Петри через 18-24 часа культивирования - мелкие, круглые, выпуклые, полупрозрачные, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии - «S»-форма. На ПЖА - рост по уколу.
Биохимические свойства: свойственны для Pasteurella multocida. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, галактозу, манит, сорбит. Не ферментирует дульцит, арабинозу, мальтозу, раффинозу, лактозу. Оксидазо, - и каталазоположительная культура. Не свертывают молоко и не разжижают желатин. Образуют индол и сероводород.
Серологические свойства: тип А.
50
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 20±4 мкр. кл. для белых мышей, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера с добавлением 5%-10% стерильной дефибринированной крови барана, М-144 (HiMedia) при рН-7,2 с температурой 37°С в течении 18-24 часов.
3) Производственный штамм Pasteurella multocida №820-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В -1308
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии вида Pasteurella multocida относятся к третьей группе опасности.
Дата, источник и место выделения: из легких павшего поросенка. Белгородская область, 2018 год.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, часто овоидные палочки, располагаются изолированно, иногда парами и реже цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы отсутствуют.
Культуральные особенности: образуют в бульоне Хоттингера равномерное помутнение среды; на агаре Хоттингера в чашках Петри через 18-24 часа культивирования - мелкие, круглые, выпуклые, полупрозрачные, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии - «S»-форма. На ПЖА - рост по уколу.
Биохимические свойства: свойственны для Pasteurella multocida. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, галактозу, манит, сорбит. Не ферментирует дульцит, арабинозу, мальтозу, раффинозу, лактозу. Оксидазо, - и каталазоположительная культура. Не свертывают молоко и не разжижают желатин. Образуют индол и сероводород.
Серологические свойства: тип D.
50
7
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 5,8*10 мкр. кл. для белых мышей, при внутрибрюшинном заражении.
Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера с добавлением 5%-10% стерильной дефибринированной крови барана, М-144 (HiMedia) при рН-7,2 с температурой 37°С в течении 18-24 часов.
Способ получения вакцины против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней.
Получение заявляемого препарата подразумевает реализацию следующих последовательных этапов:
1) Культивирование производственных штаммов глубинным методом;
2) Инактивацию культуральной жидкости;
3) Концентрирование антигенов;
4) Определение полноты инактивации антигенов;
5) Составление серии вакцины;
6) Контроль стерильности вакцины;
7) Оценка безвредности вакцины.
Для глубинного культивирования бактерий видов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida при производстве вакцины, могут быть использованы триптиказо-соевый бульон, триптон-соевый бульон, эугоник бульон, сердечно-мозговой бульон, бульон Хоттингера, и иные среды, обладающие необходимыми ростобеспечивающими свойствами.
В заявляемом способе используются следующие производственные штаммы микроорганизмов: Bordetella bronchiseptica В-1341; Pasteurella multocida В-1303 тип А; Pasteurella multocida В-1308 тип D.
Последовательность подготовки маточной расплодки штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida из MSB (Master Seed Bacteria - главного посевного материала):
- в первый день проводится подготовка первой генерации производственных штаммов путем ресуспензирования лиофилизированной культуры MSB в пробирке с последующим посевом на питательный агар. Подготовка каждого штамма проводится по отдельности. Культивирование первой генерации продолжается в течение 24-36 часов в аэробных условиях при температуре 37°С;
- через 24-36 часов проводится контроль первой генерации на типичность культуры по морфологическим, тинкториальным и ростовым свойствам, а также на отсутствие посторонней микрофлоры, как на чашке Петри, так и в пробирке. В случае соответствия первой генерации всем обозначенным свойствам, проводится получение второй генерации. Для этого отдельные колонии с чашки Петри засеваются в пробирки со свежей питательной средой. Полученные посевы культивируют в течении 24-36 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Для получения максимального накопления бактериальных клеток в бульонной среде, пробирки размещают на шейкере при постоянном помешивании;
- на третий - четвертый день проводится контроль второй генерации на типичность культуры по морфологическим, тинкториальным и ростовым свойствам, а также на отсутствие посторонней микрофлоры, как на чашке Петри, так и в пробирке. В случае соответствия второй генерации всем обозначенным свойствам, проводится получение третьей генерации. Для этого, бульонную культуру из пробирок пересевают во флаконы со свежей питательной средой (не менее 100 мл). Полученные посевы культивируют в течении 24-36 часов в аэробных условиях при температуре 37°С. Для получения максимального накопления бактериальных клеток в бульонной среде, флаконы размещают на шейкере, при 50-150 оборотах в минуту, для постоянного помешивания;
- на четвертый-пятый день, после предварительного контроля расплодки, проводится пересев всего объема флакона в бутыли с питательной средой, которые в последующем будут использоваться для засева в реакторы. Маточную культуру готовят из расчета 10% к объему питательной среды в реакторе. Культивирование проводят в течении 24-36 часов в аэробных условиях при температуре 37°С;
- на пятый-шестой день, производится непосредственное культивирование производственных штаммов в реакторе. Культивирование штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida производят при значении рН среды 7,2-7,8, при температурном режиме 37°С.
Для поддержания необходимого уровня питательных веществ в среде проводится добавление 40%-ного раствора глюкозы из расчета 0,5-1 литр глюкозы, на 100 литров питательной среды 1 раз в час, в зависимости от интенсивности роста культуры. Уровень рН во время культивирования поддерживается 10%-ным раствором щелочи (NaOH).
Каждый штамм микроорганизмов культивируют отдельно.
Инактивацию культуральной жидкости, содержащей клетки Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida, проводят путем добавления формалина (содержащего не менее 37% формальдегида) в объеме 0,3% к объему инактивируемой жидкости, в течении 3 суток, при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
Концентрирование культур проводят центрифугированием при 2-10 тыс. об. мин. в течение 0,5-3 часов или сепарированием при 5-15 тысячах оборотах в зависимости от типа используемого оборудования.
3
3
Полноту инактивации оценивают по отсутствию жизнеспособных клеток в концентрированном антигене и скомпонованном препарате путем посева на ростообеспечивающие питательные среды. Кроме того, оценка полноты инактивации проводится по безвредности инактивированной бактериальной массы для белых мышах массой 16-18 гр. Для этого подопытным животным внутрибрюшинно вводится, предварительно разведенный до 3 млрд. мкр. кл. см, антиген в объеме 0,5 см. Для оценки безвредности каждой серии антигена используется по пять подопытных мышей. Наблюдение за опытными животными продолжается в течение 14 суток. Препарат считается инактивированным в случае отсутствия роста культур Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida и иных микроорганизмов на питательных средах, а также отсутствию каких-либо местных и системных реакций, в том числе гибели, у подопытных животных.
Составление серии вакцины.
Для производства предлагаемой вакцины могут быть использованы различные адъюванты, ввиду этого, этапы составления серии вакцины могут варьировать. Варианты составления серии, приведены ниже. Приведены расчеты производства серии вакцины объемом 300 литров (150 тысяч доз вакцины).
Вариант №1. - компоновка вакцины с использованием гидроокиси алюминия или карбомера 971р.
3
3
В стерильном реакторе проводиться смешивание инактивированных бактериальных антигенов трех производственных культур (в ранее установленной концентрации) с разбавителем, адъювантом (10%) и мертиолятом натрия, таким образом, чтобы концентрация бактериальных антигенов Bordetella bronchiseptica была равной 3 млрд. мкр. кл./см, а концентрация антигенов Pasteurella multocida тип А и D по 1,5 млрд. мкр. кл./см. При постоянном помешивании получают однородную суспензию, устанавливают требуемый уровень водородных ионов (7,2-7,6). Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки приведена в таблице №3.
Вариант №2. - компоновка вакцины с использованием масляного адъюванта (например, Montanide ISA 50, Montanide ISA 61, Montanide ISA 70).
3
3
В стерильном реакторе проводится смешивание инактивированных бактериальных антигенов трех производственных культур в ранее установленной концентрации с разбавителем, адъювантом (50%), и мертиолятом натрия, таким образом, чтобы концентрация бактериальных антигенов Bordetella bronchiseptica была равной 3 млрд. мкр. кл./см, а концентрация антигенов Pasteurella multocida тип А и D по 1,5 млрд. мкр. кл./см. Получение гомогенной эмульсии проводят при помощи диспергирующей машины при 6000-8000 об/мин. Полученная данным образом серия вакцины имеет среднее значение рН - 6,0. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №4.
Контроль стерильности вакцины выполняется в соответствии с ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения».
3
Оценка безвредности вакцины проводится в биопробе на лабораторных белых мышах массой 16-18 гр. при однократном подкожном или внутримышечном введении препарата в дозе 0,5 см. Для оценки безвредности каждой серии вакцины используется по пять подопытных животных. Наблюдение за мышами продолжается в течение 14 суток. Вакцину считают безвредной, если все животные остаются живыми в течении срока наблюдения.
Осуществление изобретения
Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Пример №1. Культивирование штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida глубинным методом.
Культивирование штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida проводили с использованием реактора BIOSTAT-A («Sartorius AG», Германия) на триптон-соевом бульоне, сердечно-мозговом и эугоник бульонах (каждый штамм последовательно культивировался на всех приведенных средах). Подготовка главного посевного материала проводилась по следующей методике: в первый день проводили получение первой генерации производственных штаммов путем ресуспендирования лиофилизированной культуры MSB в пробирке с последующим посевом на питательный агар. Подготовка каждого штамма проводилась по отдельности. Культивирование первой генерации культур продолжалось в течении 20 часов в аэробных условиях при температуре 37°С; на второй день, после подтверждения свойств производственных культур, отдельные колонии с чашек Петри пересевались в пробирки с питательным бульоном (по 10 мл), для последующего культивирования в течении 20 часов в аэробных условиях при температуре 37°С, при постоянном помешивании на шейкере (100 об./мин); на третий день, после контроля свойств выращенных культур, бульонная культура из пробирок пересевалась во флаконы с сердечно-мозговой и/или триптон-соевым бульоном (1 пробирка на 250 мл среды). Полученные посевы культивировали в течении 18 часов в аэробных условиях при температуре 37°С, при постоянном помешивании на шейкере (100 об. /мин); на четвертый день, после предварительного контроля расплодки, производился пересев всего объема флакона в реактор BIOSTAT-A содержащий 5 литров питательной среды. При этом количество матровой расплодки для реакторного культивирования, составляло 10% от 5 л., т.е. 500 мл. Культивирование штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida проводили при значении рН среды 7,2-7,8, при температурном режиме 37°С. Для поддержания необходимого уровня питательных веществ в среде проводилось добавление 40%-ного раствора глюкозы из расчета 10 мл глюкозы, на 1 литр питательной среды 1 раз в час, в зависимости от интенсивности роста культуры. Уровень рН во время культивирования поддерживается 10%-ным раствором щелочи (NaOH).
В результате проведенных культивирований на различных питательных средах, были получены результаты, отраженные в таблице №5.
Отраженные в таблице №5 результаты свидетельствуют о взаимозаменяемости питательных сред для глубинного культивирования штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida.
Во всех случаях бульонные культуры производственных штаммов представляли собой типичные для вида по морфологии клетки, и не содержали посторонней микрофлоры.
Пример №2. Инактивация культуральной жидкости
Инактивацию бульонных культур штаммов Bordetella bronchiseptica и Pasteurella multocida (пример №1) проводили путем добавления к ним формалина (содержащего не менее 37% формальдегида), в количестве 0,3%, от объема культуральной жидкости. Так, внесенный объем формалина в каждую партию культуральной жидкости отражен в таблице №6.
Пример №3. Концентрирование культуральной жидкости
Концентрирование полученной бульонной культуры после инактивации (пример №5) проводили путем центрифугирования на оборудовании MPW-380R в течении 1 часа при 3 тысячах оборотах, RCF - 1861. После центрифугирования и отделения надосадочной жидкости (фугата), бактериальная масса собиралась в отдельную стерильную емкость (флакон) для дальнейшего использования. На данном этапе проводили определение концентрации бактериальной массы и ее объема. Определение концентрации суспензии проводили с использованием стандартов мутности - набор ОСО мутности бактериальных взвесей ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Результаты концентрирования отражены в таблице №7.
Согласно данным, отраженным в таблице J№/, культуральная жидкость оыла сконцентрирована в среднем в 10 раз.
Пример №4. Определение полноты инактивации антигенов
Полноту инактивации антигенов оценивали по отсутствию жизнеспособных клеток в бактериальной массе путем посева образцов на ростобеспечивающие питательные среды в соответствии с ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».
3
3
Также полноту инактивации антигенов оценивали по безвредности инактивированной бактериальной массы на лабораторных мышах массой 16-18 гр. при внутрибрюшинном введении 0,5 см. Перед введением антигена животным, его предварительно разводят до концентрации 3 млрд. мкр. кл. см. Для оценки безвредности каждой серии антигена использовалось по пять подопытных мышей. Все антигены, используемые для компоновки трех серий вакцин, были стерильными и не вызывали гибель лабораторных животных в течении 14 дней наблюдения.
Пример №5. Составление серии №1 вакцины против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней с использованием физиологического раствора в качестве разбавителя и ГОА в качестве адъюванта.
3
3
При составлении серии вакцины, в стерильной емкости проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов трех производственных культур с разбавителем (физиологический раствор), адъювантом (3%-ный раствор гидроокиси алюминия) и консервантом (мертиолят натрия), устанавливая концентрацию бактериальных антигенов Bordetella bronchiseptica - 3 млрд. мкр. кл./см, Pasteurella multocida тип А и D по 1,5 млрд. мкр. кл./см. Компоненты перемешивали до получения однородной суспензии, устанавливали рН серии вакцины на уровне 7,6. Пропись состава вакцины при таком варианте компоновки, приведена в таблице №8. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 1,5 тысячи доз (3 литра препарата).
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой суспензию светло-желтого цвета с серо-белым осадком, разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
Пример №6. Составление серии №2 вакцины против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней с использованием воды для инъекций в качестве разбавителя и карбомера 971Р в качестве адъюванта
3
3
При составлении серии вакцины, в стерильной емкости проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов трех производственных культур с водой для инъекций в качестве разбавителя, 2%-ного раствора карбомера 971Р в качестве адъюванта, и мертиолятом натрия в качестве консерванта, устанавливая концентрацию бактериальных антигенов Bordetella bronchiseptica - 3 млрд. мкр. кл./см, Pasteurella multocida тип А и D по 1,5 млрд. мкр. кл./см. Компоненты перемешивали до получения однородной суспензии, после чего устанавливали рН серии вакцины на уровне 7,6. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №9. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 1,5 тысячи доз (3 литра препарата).
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой суспензию светло-желтого цвета с серо-белым осадком, разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
Пример №7. Составление серии №3 вакцины против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней с использованием фосфатно-буферного раствора в качестве разбавителя и масляного адъюванта Montanide ISA 70 в качестве адъюванта
3
3
В стерильной емкости проводится подготовка предэмульсии. Для этого в смесителе при постоянном помешивании (250 об/мин. в течении 1,5 часов) проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов трех производственных культур на основе PBS - буфера в качестве разбавителя, Montanide ISA 70 в качестве адъюванта, мертиолята натрия в качестве консерванта, таким образом, чтобы получить концентрацию бактериальных антигенов Bordetella bronchiseptica - 3 млрд. мкр. кл./см, Pasteurella multocida тип А и D по 1,5 млрд. мкр. кл./см. Для получения финального варианта вакцины использовали гомогенизатор типа «Silverson L5M-A». Эмульгирование проводится в течении 3 часов при 6 тыс.об/мин. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №10. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 1,5 тысячи доз (3 литров препарата).
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой эмульсию белого цвета, иногда с желтоватым оттенком. При длительном хранении наблюдалось незначительное расслоение препарата, которое при встряхивании переходит в первоначальное состояние гомогенной эмульсии.
Пример №8. Определение стерильности вакцины
3
3
3
Контроль стерильности вакцины проводили согласно ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Так, из трех флаконов каждой серии препарата готовят объединенную пробу, после чего из нее проводят посев на жидкие питательные среды - Сабуро, МПБ и МППБ (среда Китт-Тароцци) и на твердые питательные среды - Сабуро и МПА. На посев из каждого флакона использовалось по три пробирки и две чашки с питательной средой. При посеве на среду Китт-Тароцци высев делали на две пробирки и два флакона. Для выявления аэробных микроорганизмов и факультативно-анаэробных микроорганизмов высевали по 0,5 см посевного материала в одну пробирку и 1-2 см в один флакон, а для выявления анаэробных микроорганизмов - соответственно по 1 и 5 см. Пробирки и флаконы с посевами на всех средах, кроме среды Сабуро, выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С, на среде Сабуро - при температуре (22,5±2,5)°С, в течение 7 сут (для анаэробов - 14 сут). По истечении указанного срока делали пересев, за исключением посевов на МПА. Пересевали пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы также выдерживали 7 сут (для анаэробов - 14 сут). В результате проведенного контроля трех серий препарата была установлена их стерильность. Ни на одной из используемых сред роста посторонней микрофлоры не выявлено.
Пример №9. Оценка безвредности вакцины
Исследование трех серий препарата проводили на белых мышах массой 16-18 гр. Для испытания каждой серии вакцины использовалось по 5 голов мышей, которым внутримышечно вводили по 0,5 мл вакцины. Наблюдение за опытными животными продолжалось в течение 14 суток. Все три серии препарата оказались безвредными, так как не спровоцировали у животных каких-либо местных и системных реакций, в том числе не привели к их гибели.
Пример №10. Определение безопасности экспериментальной вакцины против атрофического ринита и пастереллеза свиней инактивированной для супоросных свиноматок.
3
3
Для проведения опыта было сформировано две группы супоросных свиноматок (за 6 недель до опороса) по 10 голов в каждой. Животным первой группы препарат вводили в рекомендованной дозе 2 см, животных второй группы иммунизировали путем введения удвоенной дозы - 4 см. Все животные были клинически здоровы и предварительно помечены специальными ушными бирками с индивидуальными номерами. Вакцину вводили согласно временной инструкции по применению однократно, внутримышечным способом, с соблюдением правил асептики.
За вакцинированными животными устанавливали наблюдение в течение 10 суток, проводя ежедневно клинический осмотр животных, термометрию, пальпацию места инъекции.
При клиническом осмотре отмечено отсутствие каких-либо системных и местных нежелательных последствий введения препарата: у животных не наблюдалось признаков угнетения, снижения аппетита, адинамии, абортов. При пальпации места инъекции отмечено образование незначительного отека и гиперемия кожи, которые сохранялись у животных в течение 12-24 часов, а затем исчезали самостоятельно. У отдельных животных (~20%) введение препарата в рекомендованной и удвоенной дозах вызывало кратковременное повышение температуры, в среднем на 0,5-0,7°С, и составляло у свиноматок до вакцинации 38,3°С, через 6 часов после вакцинации 38,9°С, что не выходило за пределы физиологической нормы для животных этой возрастной группы. Через 24 часа после инъекции температура тела животных вернулась к первоначальным параметрам.
Проведенный опыт показал, что предлагаемая вакцина безопасна для супоросных свиноматок при однократном внутримышечном введении в рекомендованной и удвоенной дозах.
Пример №11. Определение эффективности экспериментальной вакцины против атрофического ринита и пастереллеза свиней инактивированной (серия вакцины выполнена на основе гидроокиси алюминия).
Для оценки эффективности разработанной вакцины против атрофического ринита и пастереллеза свиней сформировано две группы супоросных свиноматок, одна из которых в количестве 246 голов была иммунизирована ранее применяемым на предприятии препаратом - Вакцина против атрофического ринита свиней инактивированная Порцилис AR-T DF, компании MSD Animal Health. Вторая группа свиноматок в количестве 114 голов, иммунизирована вакциной против атрофического рините свиней инактивированной, разработанной ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
Критерием оценки являлось отсутствие случаев возникновения заболевания у поросят, полученным от иммунизированных свиноматок, атрофическим ринитом, а также выявление случаев нежелательных местных и/или системных реакций у свиноматок на введение препаратов. Условия содержания и кормления подопытных свиноматок были аналогичными. Контрольную (не вакцинированную) группу не использовали во избежание рисков возникновения вспышек заболевания на свиньях.
Иммунизация свиноматок проведена в соответствии с инструкциями по применению препаратов. Вакцины вводили свиноматкам двукратно внутримышечно за ухом с соблюдением правил асептики в дозе 2 мл. Результаты оценки безвредности вакцин представлены в таблице №11.
Как видно из представленных в таблице 11 данных, в подопытных группах не было случаев гибели животных, не зафиксировано случаев заболевания, абортов и рождения поросят в врожденными уродствами, как в экспериментальной группе, иммунизированной разработанной вакциной, так и в группе свиноматок, иммунизированных препаратом сравнения, что свидетельствует о безопасности экспериментальной вакцины.
Оценку эффективности проведенной вакцинации оценивали по сохранности поросят, полученных от свиноматок, вакцинированных экспериментальной вакциной и препаратом сравнения, среднесуточному приросту и средней живой массы поросят при передаче их на откорм в 102 дневном возрасте.
Результаты опыта представлены в таблице №12.
Данные, отраженные в таблице №12, свидетельствуют, что применение экспериментальной вакцины против атрофического ринита и пастереллеза свиней инактивированной обеспечивает 97,16% сохранность поросят, что соизмеримо с этим же показателем в группах животных, иммунизированных препаратом сравнения - 96,96%.
Для подтверждения специфической эффективности вакцины все павшие животные вскрывались с целью установления причин гибели на основании имеющихся патологоанатомических признаков, а также от животных, имевших какие-либо признаки инфекционного заболевания, отбирали материал для бактериологических исследований.
Установлено, что причиной гибели животных в период опыта были травматизм, стрептококкоз, актинобациллезная плевропневмония, а также ряд других причин, встречавшихся в единичных случаях.
В результате проведенных бактериологических исследований возбудители атрофического ринита (пастереллы и бордетеллы) выявлены не были. Случаев клинически выраженного заболевания поросят с поражением костей лицевого отдела черепа в опытных группах не зафиксировано.
Так же получены достоверные данные о влиянии проведенной вакцинации на экономические показатели, в частности среднесуточные привесы у поросят. Так в группе животных, иммунизируемым испытуемым препаратом, среднесуточные привесы составили 0,887, тогда как в группе сравнения 0,854 кг, что на 33 гр меньше при пересчете на каждое животное.
Таким образом, можно утверждать, что разработанная экспериментальная вакцина против атрофического ринита свиней инактивированная обеспечивает надежный уровень защиты у вакцинированного поголовья, что положительно сказывается на ветеринарных и экономических показателях, а также снижает уровень носительства возбудителя.