БИОРЕАКТОР ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, ПРЕИМУЩЕСТВЕННО ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ

Полезная модель относится к аппаратурному оснащению процессов культивирования эукариотических клеток и микроорганизмов и может быть использована, например, в производстве клеточной ткани животных и противовирусных вакцин, реализации микробиологических процессов, протекающих в жидкофазных, твердофазных и перфузионных условиях, а также в научной и учебной практике.
Эукариотические клетки во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток, так как они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению, вызываемому кавитацией жидкой среды, ударами мешалок, отбойников и пузырьками газов. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов, особенно на конструкцию устройств для аэрации и перемешивания рабочих сред, которые в процессе культивирования не должны оказывать разрушающего воздействия на морфологическую структуру клеток.
Известны «Биореакторы для культур клеток», фирмы Bioengineering. Биореакторы оснащены разными устройствами аэрации и перемешивания рабочих сред, работа которых позволяет культивировать клетки животных в суспензионной культуре. Биореакторы опубликованы на сайте www.bio-rus.ru. bioengineering@yandex.ru.
«Клеточный биореактор» представляет собой емкость с мешалкой, сконструированную для культивирования клеток животных. Он доступен в пилотном и производственном масштабе (общим объемом до 2000 л). Для минимизации стресса при ранении, перемешивание осуществляется лопастной мешалкой морского типа. Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой, а также непрерывным благодаря наличию тензодатчиков. Биореактор используется для культивирования взвеси клеток или клеток, иммобилизованных на микроносителях. Для задержания биомассы при непрерывном культивировании используют роторные или спиральные фильтры.
Культивирование животных клеток в суспензионной культуре не лишено многих недостатков, например:
- культивирование клеток сопровождается малой скоростью роста при низкой концентрации клеток, что требует применения дополнительных устройств, для выделения клеточной массы из отработанной жидкости и утилизацию больших объемов фильтрата содержащего, как неиспользованные дорогие компоненты питательной среды, так и токсичные метаболиты, что существенно повышает себестоимость целевых продуктов;
- для выделения выращенной биомассы из отработанной жидкости, в биореакторе применяют роторные или спиральные фильтры, что повышает опасность бактериального загрязнения получаемых продуктов;
- клетки после фильтрации необходимо очищать от низкомолекулярных веществ, а фильтры подвергать тщательной промывке и стерилизации для инактивации патогенных микроорганизмов, что также повышает себестоимость целевых продуктов и способствует загрязнению окружающей среды производственными отходами;
- использование микроносителей при культивировании опорозависимых клеток в суспензионной культуре не только усложняет технологию выделения целевых продуктов, но и существенно снижает асептическую надежность производственного процесса.
«Мембранный биореактор» снабжен внутренней и внешней камерами, разделенными диализной мембраной. Мембрана обеспечивает безпузырьковую аэрацию и задержание биомассы при непрерывном культивировании клеток. С помощью мембраны токсические, низкомолекулярные метаболиты удаляются, а высокомолекулярные соединения удерживаются во внутренней камере. Перемешивание в каждой камере осуществляется мешалкой. Питательная среда и воздух поставляются во внешнюю камеру. Биореактор может использоваться для выращивания клеток животных, как в суспензии, так и закрепленных на микроносителях.
В мембранном биореакторе, для концентрирования клеток, вместо роторных и спиральных фильтров, используют диализную мембрану. Мембрана в процессе культивирования неподвижна и подвержена закреплению растущих клеток на ее поверхности. При толщине слоя клеточной биомассы более 1 мм клетки, соприкасающиеся с мембраной, имеют лимит по углеводному питанию, а клетки приповерхностного слоя - лимит по питающим газам, что существенно снижает производительность биореактора и качество продуктов ферментации. Для перемешивания клеточных суспензий в ферментационной камере применяют мешалку, работа которой сопровождается ударными нагрузками на клетки, что ограничивает использование биологических продуцентов и исключает культивирование эукариотических клеток.
«Эрлифтный биореактор» (SU 1302691, публ. 28.02.1994) в котором перемешивание осуществляют потоком воздуха, а не лопастью мешалки, что создает условия для эффективного массопереноса и щадящих сил рассечения. Для управления циркуляцией жидкости используют вытяжную трубу, направляющую поток пузырьков по центру. Конструкция биореактора имеет широкую верхнюю часть, действующую как сепаратор газов. Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой или непрерывным. Эрлифтные биоректоры используются для культивирования суспензий клеток, включая клетки насекомых.
Известен также биореактор эрлифтного типа (RU 1000769 U1 публ. 27.12.2010) содержащий цилиндрическую емкость, установленную вертикально и пневматическое перемешивающее устройство эрлифтного типа, представляющее собой кооксиально установленную внутри емкости трубу.
Наиболее близким к заявляемому биореактору для культивирования клеток является эрлифтный биореактор, принятый за прототип, описанный в разделе «статьи» www.bio-rus.ru. bioengineering@yandex.ru. в котором для осуществления безпузырьковой аэрации рабочей жидкости, используют аэратор из силиконовых газопроницаемых трубок, что частично соответствует условиям культивирования эукариотических клеток.
Известный биореактор содержит биореакторную емкость с теплообменной рубашкой и герметизируемую крышкой; аэратор, из силиконовых газопроницаемых трубок( на фиг.не показан, но описан в тексте как вариант исполнения); штуцеры для ввода питающих и отвода отработанных газов в атмосферу через бактериальные фильтры; штуцер для ввода питательной среды; штуцер для слива продуктов ферментации.
В процессе культивирования клеток, аэрирующие газы, в виде мельчайших пузырьков, просачиваются через поры силиконовой резины и потребляются растущей культурой клеток, а отработанные газы отводятся в атмосферу через бактериальный фильтр.
Существенным недостатком биореактора с безпузырьковой аэрацией, является низкая производительность. Это объясняется тем, что расход аэрирующих газов, протекающих через поры силиконовой трубки, соизмерим с потреблением газа клетками, в связи с чем, рабочая жидкость не перемешивается, что приводит к снижению качества продуктов культивирования и производительности биореактора. При организации непрерывного процесса в таких условиях, в рабочей жидкости происходит накопление токсичных метаболитов, так как в оптимальных условиях культивирования находятся только клетки, размещенные в тонком слое вокруг поверхности силиконовых трубок, а клетки удаленные от поверхности трубок подвержены автолизу за счет лимита кислорода и разбалансированности состава питательной среды.
Отсутствие принудительного перемешивания рабочей жидкости, существенно ограничивает функциональные возможности, сферу применения и масштабирование биореактора.
Технический результат изобретения заключается в оптимизации условий аэрации и перемешивания рабочих сред при отсутствии застойных зон и травмирования клеток, а также в расширении функциональных возможностей биореактора за счет обеспечения оптимальных условий культивирования свободных и опорозависимых эукариотических и прокариотических клеток, грибов и микроорганизмов.
Технический результат достигается тем, что в биореакторе для культивирования клеток, включающим биореакторную емкость с теплообменной рубашкой и загрузочным люком; аэратор, состоящий из газопроницаемых трубок, расположенных внутри емкости; штуцеры и трубопроводы для подачи и отвода рабочих газов и жидкостей; бактериальные фильтры питающих и отработанных газов, подключенные к соответствующим трубопроводу и штуцеру, биореакторная емкость выполнена в виде горизонтально расположенной трубы, торцевые отверстия которой герметизированы загрузочным люком и технологическим фланцем, газопроницаемые трубки аэратора выполнены уплощенными, равномерно распределены в рабочем объеме биореакторной емкости и сообщены с коллектором газов, вход/выход которого сообщен трубопроводом с управляемым клапаном с последовательно соединенными бактериальным фильтром питающих газов, насосом для наддува газопроницаемых трубок и камерой для приготовления смеси питающих газов, а также сообщен трубопроводом через другой управляемый клапан со штуцером отвода рабочих газов из биореакторной емкости, а штуцеры для подачи и отвода рабочих газов и жидкостей закреплены на технологическом фланце и подключены к соответствующим трубопроводам, приэтом управляемые клапаны соединены с прибором управления;
а также тем, что газопроницаемые трубки аэратора изготовлены из физиологически инертного каучука СКТН-Ф;
2
а также тем, что в качестве камеры для приготовления смеси питающих газов используют СO - икубатор.
Оснащение биореактора эффективным универсальным устройством для аэрации и перемешивания рабочих сред, выполненным из уплощенных, эластичных, газопроницаемых инертных трубок, соединенных с коллектором, и обеспечение принудительного наддува этих трубок за счет применения насоса для подачи газовой смеси, обеспечивает в процессах культивирования биологических продуцентов щадящее воздействие на морфологическую структуру клеток, сохранение физических межклеточных связей, эффективное снабжение клеток питающими газами и вымывание продуктов метаболизма из клеточного окружения.
Применении биореакторной емкости, выполненной в виде горизонтально расположенной трубы, позволяет существенно увеличить площадь поверхностного контакта рабочей среды с питающим газом, снизить вредное влияние давления гидростатического столба рабочей среды на морфологическую структуру клеток и расширить сферу использования биореакторной емкости для реализации жидкофазных, твердофазных и перфузионных условий культивирования биологических продуцентов.
Предложенное техническое решение биореактора обеспечивает асептическую надежность и экономичность биореактора, из-за отсутствия в конструкции вращающихся мешалок и дисперсионных аэраторов с избыточным потреблением газов, а также расширении сферы применения биореактора, обеспечивающего оптимальные условия культивирования свободных и опорозависимых эукариотических и прокариотических клеток, грибов и микроорганизмов с высокой производительностью и качеством получаемых продуктов.
На фиг.1, представлена схема «Биореактор для культивирования клеток».
Биореактор, представленный на фиг.1, содержит биореакторную емкость 1, выполненную в виде горизонтально расположенной трубы, торцевые отверстия которой герметизированы загрузочным люком 2 и технологическим фланцем 3; установленную на емкости 1 теплообменную рубашку 4; бактериальный фильтр 5 отработанных газов; аэратор из силиконовых уплощенных газопроницаемых трубок 6, равномерно расположенных внутри емкости и соединенных с коллектор 7 газов; бактериальный фильтр 8 питающих газов; насос 9 для наддува газопроницаемых трубок; камеру 10, для приготовления смеси питающих газов; трубопроводы 11; управляемые клапаны 12, 13; штуцеры 14 для отвода рабочих газов из полости емкости 1; штуцер 15 для слива продуктов культивирования; штуцер 16 для ввода в биореакторную емкость 1 питательной среды; прибор 17 управления клапанами.
Вход коллектора 7 через трубопровод 11, управляемый клапан 13, бактериальный фильтр 8 и насос 9 сообщен с камерой 10, а также через управляемый клапан 12 сообщен со штуцером 14. Бактериальный фильтр 5 отработанных газов соединен с другим штуцером 14. Прибор управления клапанами 17 соединен с управляемыми клапанами 14-16. Штуцеры для подключения рабочих газов и жидкостей закреплены на технологическом фланце и подключены к сетевым трубопроводам.
Газопроницаемые трубки аэратора изготовлены, например, из физиологически инертного силиконового каучука СКТН-Ф.
2
В качестве камеры для приготовления смеси питающих газов используют, например, СO- инкубатор;
На заявляемом биореакторе возможно проведение, по меньшей мере, двух видов процессов, таких как суспензионное культивирование и твердофазное культивирование При суспензионном культивировании, в биореакторную емкость 1, вносят заданные объемы питательной среды и посевных клеток, в камере 10 готовят смесь газов заданного состава, а на приборе 17 управления задают частоту открытия и закрытия клапанов 12 и 13. В процессе культивирования, открывается клапан 13 и питающий газ из камеры 10, посредством насоса 9, через фильтр 8, по трубопроводу 11, поступает в коллектор 7, в котором распределяется по уплощенным газопроницаемым трубкам аэратора 6. При наддуве газами, уплощенные трубки 6 раздуваются, поверхность газопроницаемых трубок 6 покрывается сплошным слоем мельчайших пузырьков газов, обеспечивая эффективное растворение газов в рабочей суспензии. Одновременно, раздутие газопроницаемых трубок 6 обеспечивает перемещение суспензии по поверхности газопроницаемых трубок аэратора 6. В процессе обтекания суспензией газопроницаемых трубок 6 суспензия принудительно перемешивается в щадящих условиях, не допуская повреждений морфологической структуры клеток. Далее, клапан 13 закрывается и открывается клапан 12. Надутые газопроницаемые трубки 6, принимают исходную уплощенную форму, а питающий газ, находящийся в трубках 6, по трубопроводу, через клапан 12, штуцер 14, биореакторную емкость 1 и фильтр 4 отводится в атмосферу. Протекая через биореакторную емкость 1, питающий газ контактирует с суспензией клеток по всей площади фазового раздела (газ-жидкость), вытесняет отработанные газы из газовой полости биореакторной емкости, что препятствует накоплению токсичных газов - отходов дыхания клеток и оптимизирует аэрацию растущих клеток в приповерхностном слое рабочей суспензии. Переключение клапанов 12 и 13 осуществляет прибором 17 управления клапанами непрерывно с заданной частотой, что позволяет управлять процессами аэрации и перемешивания суспензий в широком диапазоне.
В условиях реализации непрерывного процесса культивирования клеток, через штуцер 16, в биореакторную емкость 1, подают питательную среду с заданным расходом, которая перемешивается с суспензией при каждом цикле расширения и уплощения газопроницаемых трубок аэратора 6. Штуцер 15, слива продуктов культивирования установлен на уровне погружения надутых газопроницаемых трубок аэратора 6 в суспензию, что позволяет при каждом открытии клапана 13 через штуцер 15 производить дробный слив продуктов культивирования и стабилизировать рабочий уровень суспензии в биореакторной емкости 1.
Созданные условия аэрации и перемешивания суспензии клеток, способствуют сохранению физических межклеточных связей при культивировании эукариотических клеток, обеспечивают максимальное снабжение клеток питающими газами и вымывание продуктов метаболизма из клеточного окружения, что позволяет существенно повысить производительность ферментера и качество целевых продуктов. Биореакторная емкость 1 может быть снабжена разным количеством газопроницаемых трубок аэратора 6. Так, увеличение числа трубок аэратора 6 и уменьшение при этом объема рабочей суспензии в биореакторной емкости 1, позволяет осуществить плавный переход от суспензионного культивирования клеток к перфузионному, характеризующемуся существенным повышением плотности растущих клеток. Клетки в перфузионных условиях культивирования образуют тканевые формы, что существенно расширяет сферу применения продуцирующих культур и биореактора.
При твердофазном культивировании, в биореакторную емкость 1, через открытый люк 2 загружают твердый питательный субстрат. Люк 2 герметизируют, после чего проводят стерилизацию биореактора в заданных условиях температуры, давления и времени. Биореакторную емкость 1 охлаждают посредством теплообменной рубашки 4 до заданной температуры, в питательный субстрат вносят посевную культуру, а на приборе 17 управления задают программу работы клапанов 12-13.
В условиях реализации твердофазного процесса, клапаны 12-13 поочередно открываются и закрываются по заданной программе. Так, при открытии клапана 13, в газопроницаемые силиконовые и уплощенные трубки аэратора 6, из камеры 10, насосом 9, через фильтр 8 по трубопроводу 11 нагнетается питающий газ. Трубки аэратора 6 расширяются, вызывая перемещение питательного субстрата по всей площади трубок аэратора 6. Согласно программе, после открытия клапана 13 и выдержки заданное время, клапан 13 закрывается и открывается клапан 12. Находящийся в трубках аэратора 6 сжатый газ отводится по трубопроводу через клапан 12, штуцер 14, емкость 1 и фильтр 5 в атмосферу, а трубки аэратора 6 восстанавливают исходное уплощенное состояние. При уплощении трубок аэратора 6, вокруг газопроницаемых стенок образуются полости, которые вначале процесса заполняются суспензией посевных клеток. При работе клапанов 12-13, суспензия посевных клеток распределяется по всему объему питательного субстрата, а полости вокруг газопроницаемых трубок заполняются газом. Питательный субстрат, обогащенный посевной культурой клеток, в результате уплощения и раздутия газопроницаемых трубок аэратора 6, приобретает структурированную форму, пронизанную каналами питающего и отработанного газа, что обеспечивает принудительную вентиляцию субстрата по всему объему, при этом, клетки в процессе твердофазного культивирования не испытывают лимита по газовому питанию.
Применение указанной конструкции для управляемой аэрации микроорганизмов в твердофазных процессах способствует активизации биохимических реакций, позволяет, при прочих равных условиях, существенно повысить производительность биореактора и качество получаемых продуктов, а также снизить эксплуатационные затраты.