СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И РАЗДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ
METHOD OF CONCENTRATION AND SEPARATION OF FLAVONOIDS

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для концентрирования и разделения флавоноидов (ФЛ), таких как кверцетин, (+)-катехин, нарингин, для последующего определения в растительных образцах, фармацевтических препаратах.
2
Концентрирование и разделение флавоноидов осуществляют сорбционно-хроматографическим методом с использованием в качестве сорбентов мезопористых материалов типа МСМ-41. По своей химической природе мезопористый материал типа МСМ-41 идентичен силикагелю, но имеет большие значения удельной площади поверхности (более 1000 м/г), узкое распределение пор по размерам (2-10 нм) гексагональной структуры, что позволяет использовать данный материал в качестве сорбента. МСМ-41, а также модифицированные органосиланами композиты на его основе могут быть использованы в качестве альтернативы силикагелю и другим сорбентам в хроматографических процессах и для сорбционного концентрирования и выделения полифенольных веществ.
Для выделения аналита из смеси с помощью мезопористых сорбентов используют колонки, которые предварительно заполняют материалом типа МСМ-41 или модифицированным триметилхлорсиланом композитом на его основе. Высота слоя сорбента 1,5-2,0 см. Диаметр колонки 1,2 см.
Согласно литературным данным для идентификации, разделения и определения флавоноидов применяют, в основном, обращенно-фазовый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии.
18
18
Для выделения и концентрирования на стадии пробоподготовки используют силикагели, модифицированные гидрофобными алкильными группами (например, C) и полимерные сорбенты [Дмитриенко С.Г., Кудринская В.А., Апяри В.В. Методы выделения и концентрирования и определения кверцетина / Журнал аналитической химии. 2012. Т. 67, №64. с. 340-353, Карцова Л.А. Алексеева А.В. Хроматографические и электрофоретические методы определения полифенольных соединений / Журнал аналитической химии. - 2008. - №11. - С. 1126-1136, Шафигулин Р.В., Комиссарова Н.В., Родина Т.А., Буланова А.В. Хроматографическое и препаративное разделение флавоноидов, содержащихся в чае // Сборник статей «Хроматография на благо России». - М.: «Граница». 2007. С. 348-356, Темердардашев З.А., Фролова Н.А., Колычев И.А. Определение фенольных соединений в лекарственных растениях методом обращенно-фазовой ВЭЖХ / Журнал аналитической химии. 2011. Т. 66, №4. С.417-424]. Степень извлечения кверцетина с использованием сорбента С достигает более 90%. Однако в литературе отсутствуют данные по изучению возможностей выделения флавоноидов из неводных растворов при комнатной температуре, а также не приведены количественные характеристики процесса разделения и концентрирования.
HCl
Известен способ, в котором для группового динамического сорбционного концентрирования флавоноидов (рутин, морин, нарингенин, хризин) использовали концентрирующую микроколонку (30×4 мм), заполненную 0,055 г сверхсшитого полистирола (ССПС, патроны Диапак П-3, ЗАО «БиоХимМак», Россия). Сорбцию проводили из водных растворов ФЛ. Перед использованием колонку промывали 0,1 М раствором соляной кислоты (c=0,1 М). Определение флавоноидов проводили методом ВЭЖХ [С.Г. Дмитриенко, А.В. Степанова, В.А. Кудринская, В.В. Апяри. Особенности разделения флавоноидов методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии на колонке Luna 5u С18(2)/ ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2012. Т. 53. №6. С. 369-373]. Установлено, что в выбранных условиях рутин сорбируется на 90±4%, а остальные ФЛ - на 95-99%.
Известен способ, в котором разделение флавоноидов осуществляли на сорбентах с молекулярными отпечатками кверцетина на основе полимера, содержащего акриламид и ЭГДМА. Полимеризацию смеси, содержащей ацетон в качестве растворителя, проводили в течение 24 ч при 60°С. Сорбцию проводили в течение 1 ч. При этом был получен полимер, характеризующийся следующими факторами разделения: кверцетин/рутин (30), кверцетин/нарингенин (1), кверцетин/нарингин (18), кверцетин/морин (7), кверцетин/хризин (0,8). Импринтинг-фактор был равен 6 [Кудринская В.А., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. Синтез и исследование сорбционных свойств полимеров с молекулярными отпечатками кверцетина// Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2009. Т. 50. №3. С. 156-163].
2
Из патента РФ 2491989 [МПК B01J 20/282, С07В 39/04, опубл. 29.03.2012], взятого за прототип, известен способ получения мезопористого сорбента для сорбционного концентрирования кверцитина и (+)-кахетина, включающий приготовление реакционной смеси на основе Ludox-HS-40, CTABr, NaOH, HO дистиллированной, кверцетина (или (+)-катехина), дальнейшую гидротермальную обработку, промывание водой дистиллированной и смесью 96%-ного этанола с нитратом аммония, высушивание и кальцинирование при 550°С в течение 2 ч.
Изобретение обеспечивает получение мезопористых материалов типа МСМ-41, которые могут быть использованы как носители в хроматографии, а также для сорбционного концентрирования витаминов, относящихся к группе флавоноидов. Однако способ является достаточно длительным (гидротермальная обработка происходит в течение 144 ч).
Задачей данного изобретения является разработка нового эффективного способа извлечения и концентрирования кверцетина, (+)-катехина, нарингина из растворов сорбционно-хроматографическим.
Технический результат заключается в повышении степени извлечения, концентрирования, разделения флавоноидов на мезопористом сорбенте.
-4
3
-4
3
-4
3
3
2
5
2
Технический результат достигается тем, что в способе концентрирования и разделения флавоноидов, включающем сорбционно-хроматографическое извлечение пропусканием раствора флавоноидов через мезопористый сорбент типа МСМ-41, полученный из реакционной смеси источника кремния, цетилтриметиламмоний бромида (CTABr) и дистиллированной воды и прошедший гидротермальную обработку, фильтрование полученной смеси, экстракцию темплата, высушивание и кальцинирование, отличающийся тем, что используются ацетонитрильные растворы флавонидов: кверцетин с концентрацией с=1⋅10 моль/дм, нарингин - с=1⋅10 моль/дм, (+)-катехин - с=1⋅10 моль/дм, при этом в качестве источника кремния использован тетраэтоксисилан (TEOS), реакционная смесь дополнительно содержит аммиак и этиловый спирт при мольном соотношении 1 TEOS:0,2 CTABr:22 NH:50 СНОН:475 HO, обработку сорбента производят при температуре 130°С в течение 2 ч, полученный сорбент дополнительно модифицируют триметилхлорсиланом при комнатной температуре в течение десяти часов при постоянном перемешивании, в качестве растворителя используют трихлорметан.
Решение задачи достигается тем, что концентрирование и разделение флавоноидов происходит из ацетонитрильных растворов на предварительно модифицированном триметилхлорсиланом наностркуктурированном мезопористом материале МСМ-41.
На фиг. 1 приведена Таблица 1 коэффициентов концентрирования флавоноидов кремнийсодержащими материалами.
3
На фиг. 2 приведены выходные кривые сорбции нарингина (1) и кверцетина (2) на МСМ-41 из ацетонитрильных растворов их смеси (U=0.2 см/мин, m=0.35 г).
3
На фиг. 3 приведены выходные кривые сорбции (+)-катехина (1) и кверцетина (2) на МСМ-41 из ацетонитрильных растворов их смеси (U=0.2 см/мин, m=0.35 г).
3
На фиг. 4 приведены выходные кривые сорбции нарингина (1) и кверцетина (2) на MMet из ацетонитрильных растворов их смеси (U=0.2 см/мин, m=0.35 г).
3
На фиг. 5 приведены выходные кривые сорбции (+)-катехина (1) и кверцетина (2) на MMet из ацетонитрильных растворов их смеси (U=0.2 см/мин, m=0.35 г).
На фиг. 6 приведена Таблица 2 значений разрешения хроматографических зон (Rs) бинарных смесей флавоноидов при их сорбции различными сорбентами.
3
2
5
2
Сорбенты типа МСМ-41 предварительно получают методом жидкокристаллического темплатирования. Мольное соотношение компонентов для синтеза 1.0TEOS:0.2CTABr:21.0NH:50.0CHOH:475.0HO. Модифицирование производят триметилхлорсиланом. Для осуществления модификации сорбент был предварительно фракционирован (0.1÷0.25 мм) и активирован при 130°С в течение двух часов. Далее МСМ-41 помещали в колбу, куда приливали триметилхлорсилан (модификатор). В качестве растворителя использовался трихлорметан. Модификацию осуществляли при комнатной температуре в течение десяти часов при постоянном перемешивании.
Применение мезопористых наноструктурированных материалов типа МСМ-41 в качестве сорбентов позволяет добиться увеличения коэффициентов концентрирования веществ по сравнению с силикагелем. Модификация триметилхлорсиланом мезопористого материала типа МСМ-41 в свою очередь способствует увеличению коэффициентов концентрирования. В таблице 1 приведены данные о коэффициентах концентрирования кверцетина, нарингина и (+)-катехина.
Пример 1
-4
3
-4
3
Силикагель (ООО «ИМИД» г. Краснодар) помещают в хроматографическую колонку. Диаметр колонки 1.2 см. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный раствор кверцетина (c=1⋅10 моль/дм). Исходные растворы с концентрацией 1⋅10 моль/дм готовили по навескам.
Пример 2
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 получают по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают кверцетина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 3
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 модифицируют триметилхлорсиланом по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный раствор кверцетина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 4
-4
3
Силикагель (ООО «ИМИД» г. Краснодар) помещают в хроматографическую колонку. Диаметр колонки 1.2 см. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный раствор нарингина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 5
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 получают по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают нарингина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 6
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 модифицируют триметилхлорсиланом по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный раствор нарингина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 7
-4
3
Силикагель (ООО «ИМИД», г. Краснодар) помещают в хроматографическую колонку. Диаметр колонки 1.2 см. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный раствор (+)-катехина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 8
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 получают по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают (+)-катехина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 9
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 модифицируют триметилхлорсиланом по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный раствор (+)-катехина (с=1⋅10 моль/дм).
Пример 10
-4
3
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 получают по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный бинарный раствор кверцетина (с=1⋅10 моль/дм) и нарингина (с=1⋅10 моль/дм). Выходные кривые сорбции представлены на фиг. 3.
Пример 11
-4
3
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 получают по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный бинарный раствор кверцетина (с=1⋅10 моль/дм) и (+)-катехина (с=4⋅10 моль/дм). Выходные кривые сорбции представлены на фиг. 4.
Пример 12
-4
3
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 модифицируют триметилхлорсиланом по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный бинарный раствор кверцетина (с=1⋅10 моль/дм) и нарингина (с=1⋅10 моль/дм). Выходные кривые сорбции представлены на фиг. 5.
Пример 13
-4
3
-4
3
Сорбент типа МСМ-41 модифицируют триметилхлорсиланом по методике, описанной выше. Сорбентом заполняются колонки. Высота слоя сорбента 1.5-2.0 см. Диаметр колонки 1.2 см. Через колонку пропускают ацетонитрильный бинарный раствор кверцетина (с=1⋅10 моль/дм) и и (+)-катехина (с=4⋅10 моль/дм). Выходные кривые сорбции представлены на фиг. 6.
Для количественного описания разделения компонентов рассчитано разрешение хроматографических зон (таблица 2) с применением выражения, характеризующего разрешение двух хроматографических зон:
0
1
2
3
3
где  и  - объем раствора, пропущенного до с/с=0.5 наиболее и наименее сорбируемого компонента, соответственно, дм; W и W - ширина хроматографической зоны (ширина пика у основания при переходе к дифференциальной зависимости), дм.
При использовании исследуемых сорбентов при разделении агликонов - кверцетина и (+)-катехина наблюдается увеличение разрешения при использовании модифицированного материала (МСМ-41<MMet), что свидетельствует о перспективности применения высокоупорядоченных мезопористых материалов не только для извлечения и концентрирования агликонов флавоноидов, но и их эффективного разделения.