Исследование тепловой денатурации зелёного флуоресцентного белка методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии

Сер. 4. 2009. Вып. 3

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

УДК 577.322

Т. Н. Мельник, Е. В. Солоненко, Т. В. Поварницына, Б. С. Мельник

ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВОЙ ДЕНАТУРАЦИИ ЗЕЛЁНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОКАЛОРИМЕТРИИ *

Введение. Традиционно метод микрокалориметрии используют для исследования белков, плавление которых проходит равновесно и обратимо. Для таких исследований разработаны математические методы, позволяющие из экспериментальных кривых теплопоглощения получать важные термодинамические параметры [1]. Однако многочисленные исследования показывают, что во многих случаях, при калориметрических измерениях практически невозможно добиться равновесных условий. Для таких случаев, математические методы анализа кривых плавления начали разрабатывать сравнительно недавно [2-6]. Оказалось, что при необратимом или неравновесном плавлении белка из пика теплопоглощения можно рассчитать энергию активации и константы скоростей разворачивания белка, что позволяет использовать этот метод для получения информации о переходных состояниях белка.

В данной работе методом сканирующей микрокалориметрии исследуется неравновесное плавление сус1е-3 мутанта зелёного флуоресцентного белка (GFP) из Aequorea victoria [7, 8]. Далее в тексте под GFP мы будем подразумевать именно сус1е-3 мутант этого белка. Белок выделялся согласно методике, описанной в работе [9].

GFP - растворимый глобулярный белок, который представляет собой бета-бочонок, внутри которого проходит альфа-спираль, в середине которой автокаталитически образуется хромофор. На сегодняшний день существует множество работ, в которых GFP используется как биосенсор, позволяющий контролировать белок-белковые взаимодействия, котрансляционное сворачивание, локализацию различных структур в клетке. Однако очень мало работ, в которых исследуется стабильность и сворачивание самого GFP. Этот белок оказался довольно сложным объектом для таких исследований. Исследования осложняются тем, что формирование и разрушение его нативной структуры in vitro проходит в несколько довольно длительных стадий, в процессе которых белок не стабилен и подвержен агрегации [9]. По оценкам некоторых авторов, разрушение нативной структуры GFP может длиться до нескольких недель [10]. При разворачивании GFP, вызванном скачком pH, наблюдают четыре медленные стадии [11], при разворачивании гуанидин гидрохлоридом - две стадии [9] или четыре, в случае более стабильного мутантного белка superfolder GFP [12]. Все эти исследования проводились оптическими методами, такими как флуоресценция триптофановых остатков, флуоресценция хромофора GFP, круговой дихроизм. Эти методы позволяют измерить кинетики сворачивания - разворачивания, рассчитать константы скоростей, но, к сожалению, не дают информации о структурных особенностях промежуточных и активированных состояний и, соответственно, о «важности» каждой из стадий в процессе

* Работа поддержана грантом РФФИ № 07-04-01271а, программой «Научные школы», программой МКБ РАН и выполнена в Институте белка РАН (г. Пущино Московская обл.).

© Т. Н. Мельник, Е. В. Солоненко, Т. В. Поварницына, Б. С. Мельник, 2009

0,5 ¿ft^ 1,0  A

i 60

20

80

0

330

335

340

345

350

355

360

T, K

Рис. 1. Зависимости избыточной молярной теплоёмкости от температуры для GFP, измеренные при трёх скоростях сканирования при pH = 6,2:

скорости указаны на рисунке; символами показаны экспериментальные данные, линиями — рассчитанные с использованием двухстадийной необратимой модели денатурации (1,0, 0,5, 0,25 град/мин); аппроксимация экспериментальных кривых позволила рассчитать энергии активации Eai = 315 ± 4 кДж/моль, Ea2 = 438 ± 2 кДж/моль и температурные параметры T£ = 366 ± 0,2 K, T2; = 364 ± 0,1 K

сворачивания - разворачивания белка. В этой работе тепловая денатурация GFP исследована с помощью метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.

Калориметрическое плавление GFP. Чтобы воспользоваться калориметрическим подходом для измерения констант скоростей разворачивания белка, необходимо убедиться, что его плавление в выбранных нами условиях проходит неравновесно. Затем выбрать модель плавления, которая хорошо описывает экспериментальные данные.

На рис. 1 показаны кривые плавления GFP. Видно, что положение и форма пика теплопоглощения заметно меняется в зависимости от скорости прогрева. Это, безусловно, свидетельствует о неравновесности процесса плавления белка в диапазоне выбранных нами скоростей прогрева. Существует критерий [2], который позволяет довольно просто проанализировать проходит ли денатурация исследуемого белка по одностадийному механизму или в несколько стадий. Для этого необходимо экспериментальные кривые плавления построить в координатах (ln[vCp/(AH — Q)]; 1/T), где v - скорость прогрева образца в калориметре, Cp - значение избыточной теплоёмкости при данной температуре, AH - энтальпия (рассчитывается как интеграл всей экспериментальной кривой плавления), Q - текущее количество теплоты поглощаемое в процессе денатурации (рассчитывается как интеграл экспериментальной кривой плавления от начала до текущего значения температуры). Если денатурация белка проходит по одностадийному механизму, то построенные в таких координатах экспериментальные кривые теп-лопоглощения не должны зависеть от скорости прогрева в калориметре (т. е. должны совпадать). На рис. 2 кривые плавления GFP, измеренные при трёх скоростях прогрева

(0,25, 0,5, 1,0 град/мин), построены в таких координатах. Видно, что экспериментальные кривые в этих координатах не совпадают. Это означает, что тепловую денатурацию GFP нельзя описать одностадийной моделью. Поэтому необходимо воспользоваться более сложной, как минимум, двухстадийной моделью необратимой денатурации. Схему этой модели можно изобразить следующим образом:

- 10,0 - 9,5 - 9,0

N

II

к2

12

Рис. 2. Зависимость 1/Т  103 от 1п[уСр/(АИ - ф)] для ОРР при трёх скоростях прогрева образца (1,0, 0,5, 0,25 град/мин) при рН = 6,2

где N, 1\, 12 - различные состояния белка; к\ и к2 - константы скоростей, разворачивания белка.

В нескольких работах [5, 6, 13] изучено влияние неравновесности эксперимента на тепловую денатурацию белков. Выявлены основные закономерности, определяющие положение и форму пика теплопоглощения в калориметрических экспериментах. В случае, когда плавление белка может быть представлено как две необратимые стадии, следующие друг за другом, пик теплопоглощения описывается следующим уравнением [3]:

^изб ДЯА С, =-ехр

1 Л , АЯ2А:2

- / к\а1 -|--ехр

V У / V

То )

Т

к2дТ I х

То

¡У А^ехр | ^ ! {к-2 -к^йТ

То То

дТ,

где Т и То - абсолютная температура и температура начала кривой теплопоглощения. ДН и ДН - изменение энтальпии для первой и второй стадий, V = дТ/дЬ - скорость изменения температуры образца в калориметре, к\ и к2 - константы скоростей первой и второй стадий денатурации, которые могут быть выражены через энергии активации каждой стадии (Еа 1, Еа2) следующим образом:

к\ = ехр | — к2 = ехр < —

Еа 1 , (1 1

1Г1 { Т - 7^Г

Еа2 1

и гр* Т 2

где Т* и Т2* - температурные параметры, которые равны температуре, при которой соответствующая константа скорости равна 1 с-1.

Уравнение (2) использовано для аппроксимации экспериментально полученных кривых теплопоглощения, при этом шесть параметров (ДН1, ДН2, Еа1, Еа2, Т* и Т2*) подбирались таким образом, чтобы рассчитанная кривая теплопоглощения наилучшим

О

300

200

348

350

352

354

356

358 Т , К

макс-

Рис. 3. Зависимости энергий активации и энтальпии денатурации от температуры максимума пика теплопоглощения:

прямоугольники — энергия активации первого перехода, треугольники — второго перехода, кружки — энтальпия денатурации; линиями показаны аппроксимации этих зависимостей по методу наименьших квадратов, наклон которых равен скачку теплоёмкости соответствующих состояний

образом совпадала с экспериментальной. Следовательно, после аппроксимации мы получаем кинетическую информацию, а именно энергии активации и температурные параметры Т* двух стадий денатурации белка.

На рис. 1 символами показаны экспериментально полученные зависимости избыточной теплоёмкости от температуры, а линиями - их апроксимация с использованием двухстадийной необратимой модели. Для трёх кривых плавления (при разных скоростях прогрева) проведена совместная аппроксимация. Т. е. энергии активации Еа1, Еа2 и температурные параметры Т*, Т2* (1) и (2) были общими при апроксимации трёх экспериментальных кривых, поскольку каждая из этих кривых отражает переход между одними и теми же состояниями. Видно, что теоретически рассчитанные кривые отлично описывают экспериментальные данные. Таким образом, во-первых, мы определили, что измеренные пики теплопоглощения несут информацию о двух стадиях денатурации GFP и могут быть описаны двухстадийной необратимой моделью денатурации, во-вторых, нам удалось рассчитать два значения энергии активации, что позволяет нам получить структурную информацию о переходных состояниях GFP.

Структура переходных состояний СЕР. Убедившись, что, используя двухста-дийную модель денатурации, мы можем достоверно описывать экспериментальные данные и рассчитывать энергии активации GFP, мы использовали калориметрический подход для исследования переходных состояний этого белка. Для этого, мы провели серию плавлений GFP при разных значениях рН со скоростью прогрева 1 К/мин. рН меняли в интервале от 5,6 до 7,3, при этом температура максимума пика плавления менялась от 348,5 до 356,8 К. Пик плавления каждой кривой зависимости избыточной теплоёмкости от температуры мы аппроксимировали, используя уравнение для двухстадий-ной неравновесной модели денатурации (1). В результате из каждой кривой плавления (при разных значениях рН) были рассчитаны две энергии активации и энтальпия

денатурации, которая рассчитывалась как интеграл экспериментальной кривой плавления в диапазоне 320-365 К. На рис. 3 показаны зависимости этих трёх параметров от температуры максимума пика теплопоглощения. Из наклона зависимости энтальпии денатурации от температуры можно рассчитать скачок теплоёмкости при денатурации, он оказался равным 16 ± 4 кДж/моль, а из наклонов зависимости энергий активации от температуры - скачок теплоёмкости двух переходных состояний (2 ± 4 кДж/моль и 11 ± 2 кДж/моль рис. 3). Ранее было показано, что величина скачка теплоёмкости при конформационном переходе коррелирует с изменением экспонированности гидрофобных групп [14]. Таким образом, сравнивая между собой рассчитанные скачки теплоёмкости (наклоны зависимостей на рис. 3), можно сделать следующий вывод. Гидрофобные группы в первом (на пути денатурации) активированном состоянии экспонированы на растворитель почти так же, как и в нативном состоянии GFP (поскольку скачок теплоёмкости практически равен нулю, 2 кДж/моль). Экспонированность на растворитель гидрофобных групп следующего активированного состояния близка к денатурированному состоянию (поскольку скачок теплоёмкости этого состояния 11 ± 2 кДж/моль близок к скачку теплоёмкости денатурации GFP 16 ± 4 кДж/моль).

Заключение. В данной работе методом дифференциальной сканирующей калориметрии исследована тепловая денатурация зелёного флуоресцентного белка. Нам удалось охарактеризовать два переходных состояния на пути разворачивания GFP. Первое из которых по степени гидратации гидрофобных групп мало отличается от нативного состояния, поэтому его структуру, в некотором смысле, можно назвать «сухой расплавленной глобулой», а второе гидратировано практически также как денатурированное состояние GFP.

Литература

1. Privalov P. L., Potekhin S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins // Methods Enzymol. 1986. Vol. 131. P. 4-51.

2. Kurganov B. I., Lyubarev A. E, Sanchez-Ruiz J. M., Shnyrov V. L. Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation // Biophys. Chem. 1997. Vol. 69. P. 125-135.

3. Lyubarev A. E, Kurganov B. I., Burlakova A. A., Orlov V. N. Irreversible thermal denaturation of uridine phosphorylase from Escherichia coli K-12 // Ibid. 1998. Vol. 70. P. 247-257.

4. Lyubarev A. E, Kurganov B. I., Orlov V. N., Zhou H. M. Two-state irreversible thermal denaturation of muscle creatine kinase // Ibid. 1999. Vol. 79. P. 199-204.

5. Potekhin S. A., Kovrigin E. L. Влияние кинетических факторов на тепловую денатурацию и ренатурацию биополимеров // Biofizika. 1998. Vol. 43. P. 223-232.

6. Sanchez-Ruiz J. M., Lopez-Lacomba J. L., Cortijo M., Mateo P. L. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin // Biochemistry. 1988. Vol. 27. P. 1648-1652.

7. Battistutta R., Negro A., Zanotti G. Crystal structure and refolding properties of the mutant F99S/M153T/V163A of the green fluorescent protein // Proteins. 2000. Vol. 41. P. 429-437.

8. Ormo M., Cubitt A. B., Kallio K. et al. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Science. 1996. Vol. 273. P. 1392-1395.

9. Fukuda H., Arai M., Kuwajima K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant // Biochemistry. 2000. Vol. 39. P. 12025-12032.

10. Huang J. R., Craggs T. D., Christodoulou J., Jackson S. E. Stable intermediate states and high energy barriers in the unfolding of GFP //J. Mol. Biol. 2007. Vol. 370. P. 356-371.

11. Enoki S., Saeki K., Maki K., Kuwajima K. Acid denaturation and refolding of green fluorescent protein // Biochemistry. 2004. Vol. 43. P. 14238-14248.

12. Andrews B. T., Schoenfish A. R., Roy M. et al. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore //J. Mol. Biol. 2007. Vol. 373. P. 476-490.

13. Lyubarev A. E, Kurganov B. I., Burlakova A. A., Orlov V. N. Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. II. Полная кинетическая модель Ламри-Эйринга // Biophys. Chem. 1998. Vol. 70. P. 247-257.

14. Privalov P. L., Khechinashvili N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study //J. Mol. Biol. 1974. Vol. 86. P. 665-684.

Принято к публикации 26 декабря 2008 г.