Анализ генетического разнообразия декоративных пород кур на основе микроса-теллитных маркеров

УДК 636.5.082.12

анализ генетического разнообразия декоративных пород кур на основе микросателлитных маркеров

1И.П. НОВГОРОДОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

1Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАН, директор 1Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории

2В.И. ФИСИНИН, академик РАН, директор всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132,Российская Федерация

2Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства, ул. Птицеград-ская, 10, Сергиев-Посад, Московская обл., 141311, Российская Федерация

Резюме. Изучен аллелофонд 11-и декоративных пород кур и построены их генетические профили с использованием 16-и микросателлитных локусов. Материалом для исследований служили образцы пера кур (n=330) следующих пород: султанка (СУЛ), бентамка (БЕН), курчавые (КУР), шабо (Ш), ушанка (УШ), ушанка лохмоногая (УШ_Л), падуан голубой (ПАД_Г), падуан золотисто-пятнистый (ПАД_ЗП), шелковистые серые (ШЕЛ_С), шелковистые палевые (ШЕЛ_П) и шелковистые белые (ШЕЛ_Б), представленных в генофондном стаде ВНИ-ТИП. Анализ генетического разнообразия пород проводили с использованием полиморфизма вариабельных участков генома - микросателлитов по двум мультилокусным системам (GAL-1 и GAL-2). Мультиплексный анализ осуществляли с использованием генетического анализатора ABI 3130X1. Расчет популяционно-генетических параметров проводили с помощью программного обеспечения GenA^x(ver. 6.4.1), PAST, Structure (v.2.3.1). Среднее число аллелей (Na) на локус по породам со -ставило 5,2аллелей. Степень наблюдаемой гетерозиготности у изучаемых популяций варьировала от 14,8 (ПАД_Г) до 41,9% (УШ) и в среднем была равна 29,9%. Коэффициент инбридинга

Fis изменялся в зависимости от породы от 35,6 (УШ) до 75,3% (ПАД_Г). Анализ ДНК-профилей кур показал, что они служат источником уникальных аллелей, отсутствующих в современных популяциях. В двух породах (КУР и шЕл_С) из 11-и не было выявлено приватных аллелей. В то время как у остальных птиц их количество изменялось от 1 (СУЛ) до 12 (Уш). Кластерный анализ декоративных пород кур позволил определить структуру исследуемых птиц (при К=7), а также выявить генетическое родство между ними. Микросателлитные профили можно широко использовать при изучении генетических характеристик в птицеводстве, в том числе в качестве инструмента для контроля и установления породной принадлежности, а также подтверждения чистопородности.

Ключевые слова: генетическое разнообразие, декоративные породы кур, полиморфизм, микросателлитные маркеры, аллели. Для цитирования: Анализ генетического разнообразия декоративных пород кур на основе микросателлитных маркеров / И.П. Новгородова, Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, В.И. Фисинин //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. №1. С. 69-71.

За последние несколько десятилетий с использованием молекулярных маркеров в животноводстве был достигнут большой прогресс в вопросах генетики. Следует отметить, что микросателлитным маркерам отводится фундаментальная роль среди большого разнообразия методов молекулярных исследований [1, 2]. Молекулярно-генетические методы, основанные на полиморфизме ДНК, определили свое ключевое место среди других методов молекулярной генетики не только в животноводстве, но и в птицеводстве [3,4].

На основании исследований многих ученых [5, 6, 7] был сделан вывод о том, что микросателлитные маркеры - это полезный инструмент в вопросах генетики и селекции птицеводства. Их использовали в исследованиях для оценки генетического разнообразия внутри и между породами кур [8, 9, 10].

Таблица. Статистический анализ вариабельности 16-и MC кур

Число Покус аллелей на локус СУП БЕН КУР Ш УШ УШ_П ПАД_Г ПАД_ЗП ШЕПС ШЕП_П ШЕПБ

MCW0111 11 4 5 4 5 7 б 4 б 7 б 7

MCW0067 12 5 9 l б б 9 3 8 б 5 8

LEI0094 16 2 4 4 9 б 5 4 10 5 4 5

MCW0123 13 3 4 2 5 5 8 2 б 3 3 2

MCW0081 14 4 4 3 б l 4 5 8 б 4 7

MCW0069 11 4 б 5 б 5 б 7 б 4 б 8

MCW0104 1l 5 3 3 8 4 4 4 9 7 б б

MCW0183 15 2 5 11 8 4 5 8 8 10 10 б

MCW0295 15 1 б l 8 4 3 2 11 8 2 4

ADL0112 8 3 5 5 2 б 4 4 б 4 3 4

MCW0037 5 1 2 4 3 4 5 4 3 4 2 2

MCW0034 18 б l l l 9 8 б 8 9 7 б

ADL0268 11 4 8 б б 4 5 4 б б 4 4

MCW0222 10 3 4 5 5 3 4 3 5 4 3 5

MCW0014 16 3 4 4 5 4 б 3 5 5 4 5

LEI0074 12 2 4 l 5 4 б 7 8 7 б 7

Nal 3,25 5,00 5,25 5,88 5,13 5,50 4,38 7,06 5,94 4,69 5,38

ошибка ±0,3l ±0,4l ±0,5l ±0,48 ±0,41 ±0,43 ±0,46 ±0,53 ±0,51 ±0,54 ±0,48

Ho 0,204± 0,2ll 0,315 0,298 0,419 0,308 0,148 0,335 0,306 0,348 0,335

ошибка 0,09 ±0,08 ±0,09 ±0,08 ±0,10 ±0,09 ±0,06 ±0,07 ±0,09 ±0,10 ±0,10

He 0,561± 0,669* 0,638* 0,695* 0,651* 0,671* 0,598* 0,746* 0,655* 0,593 0,610*

ошибка 0,06 ±0,03 ±0,04 ±0,02 ±0,03 ±0,03 ±0,04 ±0,02 ±0,05 ±0,06 ±0,05

Fis 0,636 0,586 0,506 0,571 0,356 0,541 0,753 0,551 0,533 0,413 0,451

'Na - среднее число аллелей, Ho - наблюдаемая гетерозиготность, Не - ожидаемая гетерозиготность, Fis - коэффициент инбридинга. *р>0,05

Цель наших исследований заключалась в анализе генетического разнообразия декоративных пород кур на основе микросателлитных маркеров (МС) для изучения аллелофон-да птиц и построения их генетических профилей.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили на 11-и декоративных породах кур: султанка (СУЛ), бентамка (БЕН), курчавые (КУР), шабо (Ш), ушанка (УШ), ушанка лохмоногоая (УШ_Л) падуан голубой (ПАД_Г), па-дуан золотисто-пятнистый (ПАД_ЗП), шелковистая серая (ШЕЛ_С), палевая (ШЕЛ_П) и белая (ШЕЛ_Б). Изучаемые породы интересны тем, что представлены птицами как отечественной, так и зарубежной (Англия, Индия, Япония) селекции, которые относятся к генетически отдаленными популяциями. Материалом для исследований служили образцы пера (пульпы) кур (n=330), разводимых в гено-фондном стаде ВНИТИП. Пульпу отбирали у птиц в пробирки с 96 %-ным раствором этилового спирта и хранили при -20 °С до использования.

ДНК выделяли с использованием набора реагентов DiatomTM DNA Prep100 согласно рекомендациям фирм-производителей. Анализ ДНК и постановку ПЦР проводили согласно методическим рекомендациям [11].

Мультиплексный анализ исследуемых популяций птиц и определение их микросателлитного профиля осуществляли по 16-и МС с использованием электро-форетического разделения фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза на приборе ABI 3130X1. Для идентификации аллелей исследованных локусов МС использовали программу GeneMapper version 4.0. Статистическую обработку данных выполняли по стандартным методикам [12, 13] с использованием программного обеспечения GenAtex (ver. 6.4.1), PAST, Structure (v.2.3.1).

результаты и обсуждение. У кур исследуемых пород выявлено 204 аллели по 16 локусам. Следует отметить, что число аллелей на локус в зависимости от популяции варьировало от 1 в локусах MCW0037 и

MCW0295 у СУЛ до 11 в MCW0183 у КУР и MCW0295 у ПАД_ЗП (см. табл.).

В четырех исследуемых породах был отмечен полиморфизм по 16 МС, в остальных - в 12-15 локусах с частотой встречаемости от 1,7 до 100,0%.

Среднее число аллелей (Na) на локус в зависимости от группы изменялось. Наименьшая величина этого показателя (3,25) выявлена у птиц СУЛ, наибольшая (7,06) - у ПАД_ЗП. В среднем по породам число аллелей составило 5,2. При этом среднее число эффективных аллелей (Ne) варьировало от 2,4 (СУЛ) до 4,3 (ПАД_ЗП), а в среднем по породам составляло 3,3 аллеля на локус.

Минимальные величины наблюдаемой гетерозигот-ности (Но) были выявлены у ПАД_Г (14,8%), максимальные - у УШ (41,9%). Ожидаемая гетерозиготность (Не) варьировала незначительно в пределах от 56,1 (СУЛ) до 74,6% (ПАД_ЗП). Коэффициент инбридинга (Fis) колебался от 35,6 (УШ) до 75,3% (ПАД_Г). Относительно низкие величины Fis наблюдали в популяциях ШЕЛ_П и ШЕЛ_Б (41,3 и 45,1 % соответственно), более высокие - у птиц СУЛ (63,6%). Установленные параметры коэффициента Fis свидетельствуют о высокой степени инбридинга.

Проведенные исследования позволили выявить приватные аллели в 14-и из 16-и локусов. Сравнительно высокую степень полиморфизма наблюдали в 8-и МС с числом аллелей от 3 до 11. В популяции СУЛ отмечен один приватный аллель в локусе MCW0034, у птиц пород КУР и ШЕЛ_С приватных аллелей не выявлено. Наибольшее количество специфичных аллелей обнаружено у пород Ш (5 аллелей), ПАД_ЗП (7 аллелей), УШ_Л (8 аллелей) и УШ (12 аллелей). Это указывает на относительную обособленность пород и ограниченный обмен генами между ними.

Структуру изучаемых пород кур как индивидиумов при К=2-11 (данные не представлены) оценивали в STRUC-

рисунок. Филогенетическое дерево, основанное на генетических дистанциях (по Nei, 1983). 70 _ Достижения науки и техники АПК. 2016. Т 30. № 1

TURE [14]. Анализ был проведен с целью определения возможного присутствия подструктур в популяциях.

По результатам кластерного анализа генетически сам остоятел ьными м ожно сч итать птиц пород СУЛ, БЕН, КУР и Ш, а также куры шелковистой популяции (ШЕЛ_С, ШЕЛ_П и ШЕЛ_Б), которые находились в соответствующих подструктурах. Следует также отметить, что у отдельных популяций наблюдалась мозаичность кластеров с некоторым перекрытием других пород. Это можно объяснить их генетическим сходством между собой.

Дендрограмма, иллюстрирующая генетические связи между исследуемыми породными группами кур по M. Nei [15] на основе матрицы генетических расстояний (см. рисунок), свидетельствует о том, что генетические дистанции между декоративными породами кур достаточно существенны.

Исследуемые популяции птиц можно разделить на два основных кластера. Один из них обособлен и пред-

ставлен птицами популяций КУР и УШ. Второй кластер разделен на два подкластера, имеющий несколько ответвлений и немного отдаленную от всех пород ветку, представленную курами Ш и УШ_Л.

выводы. Результаты наших исследований подтвердили высокий полиморфизм отобранных микро-сателлитных маркеров, используемых при исследовании генетического разнообразия декоративных пород кур. У изучаемых популяций птиц наблюдаемая гетерозиготность (Но) колебалась от 14,8 до 41,9%, а максимальные значения коэффициента инбридинга достигали 75,3%. Кластерный анализ, основанный на МС, позволил выявить генетически схожие породы декоративных кур. Практически для всех исследуемых птиц были выявлены породоспецифичные аллели. Наличие приватных аллелей МС указывает на обособленность популяций и как следствие, необходимость сохранения чистопородных особей.

Литература.

1. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics / A. Vignal, D. Milan, M. Sancristobal, A. Eggen // Genet. Sel. Evol. 2002. No 34. Рр. 275-305.

2. Молекулярно-генетический анализ кур при использовании микросателлитных локусов/И.П. Новгородова, Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, В.И. Фисинин// Естественные и математические науки в современном мире. Уфа: ИЦРОН, 2014. С. 18-22.

3. Genetic characterization among Fayomi breed using microsatellite markers/K. Roushdy, T.M.A. Tantawi, S.A. Swefy, E.O.H. Saifelnasr//Egypt. Poult. Sci. 2008. V.28(IV). Рр. 1287-1301.

4. Genetic analysis of local Vietnamese chickens provides evidence of gene flow from wild to domestic populations / С. Berthouly, G. Leroy, T.N. Van, H.H. Thanh, B. Bed'Hom, B. Trong Nguyen et al. //BMC Genetics. 2009. No 10. Рр. 1-8.

5. A first-generation microsatellite linkage map of the Japanese quail / B.B. Kayang, A. Vignal, M. Inoue-Murayama, M. Miwa, J.L. Monvoisin, S. Ito//Anim. Genetics, 2004. V.35. Рр. 195-200.

6. Construction of a genetic linkage map of Japanese quail (Coturnix japonica) based on AFLP and microsatellite markers / S. Kikuchi, D. Fujima, S. Sasazaki, S. Tsuji, M. Mizutani, A. Fujiwara, H. Mannen//Anim. Genet., 2005. V.36. Рр. 227-231.

7. Genetic diversity and population structure of locally adapted South African chicken lines: Implications for conservation [Text] / E. van Marle-Koster, C.A. Hefer, L.H. Nel and M.A.M. Groenen // South African J. of Anim. Scien., 2008. No 38 (4). Рр. 271-281.

8. Microsatellite genetic differentia-tion analysis of two local chicken breeds compared with foreign Hy-line strain / Kh. Roushdy, A. Zein El-Dein, M.M. Fathi, U.M. Ali and H.M. Assy // Inter. J. of Poul. Sci. 2008. No 7. Рр. 1045-1053. doi:10.3923/ ijps.2008.1045.1053

9. Genetic diversity of ten Egyptian chicken strains using 29 microsatellite markers / M. Eltanany, U. Philipp, S. Weigend and

0. Distl//Anim. Genetics. 2011. No 42. Рр. 666-669. doi:10.1111/j.1365-2052.2011.02185.x

10. Новгородова И.П., Фисинин В.И., Зиновьева Н.А. Оценка генетического разннобразия в птицеводстве // Проблемы биологии продуктивных животных. 2011. №1. С. 48-51.

11. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве / Н.А. Зиновьева, А.Н. Попов, Л.К. Эрнст, Н.С. Марзанов, В.В. Бочкарев, Н.И. Стрекозов, Г. Брем// Дубровицы: ВИЖ, 1998. 47с.

12. Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г.Н. Генетика с основами биометрии. М.: Колос, 1983. 400 с.

13. Вейр Б. Анализ генетических данных. М.: Мир, 1995. 400 с.

14. Pritchard J.K., Stephens M., Donnely P.J. Inference of population structure using multilocus genotype data // Genetics. 2000. No 155. Рр. 945-959.

15. Nei M., Tajima F., Tateno Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data // J. Mol. Evol., 1983. No 19. Рр. 153-170.

ANALYSIS OF GENETIC DIVERSITY OF DECORATIVE BREEDS OF CHICKENS BASED

ON MICROSATELLITE MARKERS

1.P. Novgorodova1, N.A.Zinovieva1, E.A.Gladyr1, V.I.Fisinin2

'All-Russian Research Institute of Animal Husbandry named after academy member L.K.Ernst, Dubrovitsy, 60, Podolskiy r-n,Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation

2All-Russian Research and Technological Institute of Poultry Husbandry, ul. Ptizegradskaya, 10, Sergiev-Posad, Moskovskaya obl., 141311, Russian Federation

Summary. We studied the allele pool of 11 decorative chicken breeds and obtained their genetic profiles using 16 microsatellite loci. The study material was represented by feathers of chicken (n = 330) of the following breeds: Sultanka (SUL), Bantams (BEN), Kurchavye (KUR), Shabot (SH), Ushanka (USH), Ushanka Lokhmonogaya (USH_L), Padovana Blue (PAD_B), Padovana Golden-Spotted (PAD_GS), Silky Gray (S_G), Silky Fawn (S_F) and Silky White (S_W) from genetic herds of the All-Russian Research and Technological Institute of Poultry Breeding. We analyzed the genetic diversity of breeds by studying polymorphism of the variable regions of genome-microsatellites (MS). For this purpose, we applied two multilocus systems GAL-1 and GAL-2. Multiplex analysis was carried out by ABI genetic analyzer 3130X1. The calculation of population-genetic parameters was performed using the software GenAlex (ver. 6.4.1), PAST, Structure (v.2.3.1). The average number of alleles (Na) per locus was 5.2 alleles. The degree of observed heterozygosity ranged from 14.8 (PAD_B) to 41.9% (USH) with mean value of 29.9%. The coefficient of inbreeding Fis varied from 35.6 (USH) to 75.3% (PAD_B). Analyzing DNA profiles, we found out that studied chickens were carriers of unique alleles that were not detected in modern populations. There were no private alleles in two breeds (KUR and S_G). At the same time the number of private alleles in other breeds varied from 1 (SUL) to 12 (USH). Cluster analysis of decorative chicken breeds enabled to determine the structure of the investigated birds (К = 7), and to identify genetic relationship between them. Microsatellite profiles can be used in order to study genetic characteristics in poultry breeding, including controlling and confirming the breed assignment and genuineness.

Key words: genetic diversity, decorative breeds of chickens, polymorphism, microsatellite markers, alleles.

Author Details: I.P. Novgorodova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow (e-mail: novg-inna2005@yandex.ru); N.A. Zinovieva, member of the RAS, director; E.A. Gladyr, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory; V.I. Fisinin, member of the RAS, director. For citation: Novgorodova I.P., Zinovieva N.A., Gladyr E.A., Fisinin V.I. Analysis of Genetic Diversity of Decorative Breeds of Chickens Based on Microsatellite Markers. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2016. V.30. No 1. Pp. 69-71 (In Russ.).