TCh (Testis Capra hircus) - перевиваемая монослойная сублиния клеток тестикул месячного козлёнка, предназначенная для репродукции вирусов оспы, чумы мелких жвачных животных и заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов
TCh (TESTIS CAPRA hircus), TRANSPLANTABLE MONOLAYER SUBLINE OF TESTICLE CELLS OF A MONTH-OLD GOATLING INTENDED FOR REPRODUCTION OF SMALLPOX VIRUSES, PLAGUE OF SMALL RUMINANTS AND INFECTIOUS BOVINE NODULAR DERMATITIS, AS WELL AS FOR MAKING DIAGNOSTIC AND PREVENTIVE VETERINARY BIOPREPARATIONS

Изобретение относится к области биотехнологии, цитологии и вирусологии и касается получения и описания основных характеристик деривата (сублинии) клеточной линии из тестикул месячного козленка (Testis Capra hircus) - TCh, предназначенной для стабильной и технологичной репродукции вирусов оспы, чумы мелких жвачных и заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота при получении вирусного материала, применяемого для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных препаратов, а также для вирусовыделения.
Постоянные (перевиваемые) клеточные линии (ПЛК) из органов мелких жвачных (овца, коза) практически отсутствуют в вирусологической практике и очень редко используются в крупномасштабном культивировании вирусов и изготовлении специфических ветеринарных препаратов. Известны следующие линии из органов близких видов копытных животных:
1. ПСГК-30 - перевиваемая монослойная линия почки сибирского горного козерога (Capra sibirica), полученная в НИСХИ (п.Гвардейский) [1];
2. CG-91 (КГ-91) - перевиваемая монослойная линия гонад козы, полученная в ФГУ «ВНИИЗЖ» [2];
3. ЯДК-04 - перевиваемая монослойная сублиния гонад козы, полученная в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из CG-91 (КГ-91) (наиболее близкий прототип) [3].
Используемые перевиваемые клеточные линии различаются по морфологии, кариологии, ростовым свойствам, особенностям культивирования, способам поддержания и чувствительности к вирусам.
Характеристика сублинии ПСГК-30 перевиваемой монослойной линии почки сибирского горного козерога
Клеточная линия ПСГК-30 (почка сибирского горного козерога) обладает высокой репродуктивной активностью, чувствительна ко всем штаммам вируса ящура, классической чумы свиней, катаральной лихорадки овец (КЛО) и к вирусу болезни Тешена (ВБТ). По генетическим признакам (морфология хромосом и маркерные хромосомы), она является трансформированной, в сторону гиперплоидии, культурой свиного происхождения. Клеточная линия ПСГК-30 довольно толерантна к условиям культивирования, кратность ее рассева может достигать 1:18, но она не обладает необходимой чувствительностью к вирусам оспы, чумы мелких жвачных и заразному узелковому дерматиту КРС.
Характеристика перевиваемой линии клеток гонад козы CG-91 (КГ-91)
Единственная постоянная клеточная линия, произошедшая от гонад козы (Capra hircus) CG-91, была получена во ВНИИЗЖ в 1990 году, патент на изобретение РФ №2061753 от 1996 г. [2]. Клеточная линия довольно сложна в культивировании и имеет кратность рассева не больше чем 1:2 и 1:3. На тот период CG-91 была по своему уникальна - единственная постоянная клеточная линия козьего происхождения не имеющая аналогов в России и в других странах мира. Она имеет модальный класс 59 хромосом. Клеточная линия CG-91 стабилизировалась как перевиваемая при длительном культивировании на среде DMEM. В качестве добавок используют 10% сыворотки КРС разного происхождения, в том числе и фетальной. Морфологические особенности перевиваемой линии клеток CG-91, состоят из преобладающих веретенообразных клеток с небольшим количеством эпителеподобных и фибробастоподобных. При пересеве, под воздействием диспергирующего раствора, веретенообразные клетки начинают сокращаться до фибробластоподобного и сферического состояния, при этом до 20% из клеток гибнет (Фиг. 1). Для смягчения процесса трипсинизации, в диспергирующий раствор добавляют 0,5% раствора глюкозы. Оставшиеся при пересеве живые клетки репарируются в процессе седиментации и адгезии на субстрат и формируют конфлюэнтный монослой за 3-4 суток. Полученная клеточная линия чувствительна к вирусу ящура типов: А, О, С, Азия-1 и к вирусу африканской чумы лошадей.
Характеристика перевиваемой сублинии клеток гонад козы ЯДК-04
Перевиваемая сублиния клеток ЯДК-04 (прототип) была получена из перевиваемой клеточной линии CG-91, путем направленной селекции с целью повышения биомассы клеток и чувствительности к вирусам животных. Селекция проводилась методом предельного разведения клеточной суспензии при пересеве в пристеночных условиях с применением среды Игла и 0,25% гидролизата лактальбумина (ГЛА).
2
Применяя прием предельного разведения при пересеве клеточной линии, удалось на 36 пассаже увеличить продуктивность сублинии до 100 млн клеток с культурального флакона площадью 300 см. Морфология клеток и монослоя - с преобладанием веретенообразных клеток. Модальный класс более вариабелен и составляет 57-59 хромосом (Фиг. 2, 3).
50
50
50
3
3
3
В результате проведенной селекции расширился список вирусов, которые активно репродуцируются на этой сублинии, титр вирусов достигает: для вируса болезни Ауески (ВБА) - 8,0-8,75 lg ТЦД/см, для вируса оспы овец (ОО) - 5,5-6,0 lg ТЦД/см, для пневмовируса - 5,0-5,25 lg ТЦД/см[13].
Оба (CG-91, ЯДК-04) трофоварианта клеток гонад козы являются диплоидными культурами с минимальными трансформациями в кариотипе и морфологии клеток, у которых кратность рассева не превышает 1:3. Недостатком данных сублиний является то, что они периодически проявляют депрессивную ростовую активность, что требует проводить смену ростовых ингридиентов и/или возобновление культивирования клеток из криобанка. Масштабирование этих трофовариантов, для получения специфических вакцинных препаратов сопровождается значительными материальными и трудовыми затратами.
В связи с этим целесообразно получить альтернативную сублинию клеток козы, позволяющую удовлетворить нужды производственного процесса, путем повышения и стабильности кратности рассева (1:4, 1:6) и надежной репродукции вирусов оспы мелких жвачных животных (ВОМЖЖ), чумы мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) и заразного узелкового дерматита КРС (ЗУД КРС).
Задачей данного изобретения являлось получение новой высокопродуктивной, стабильной перевиваемой монослойной сублинии клеток, позволяющей по сравнению с прототипными вариантами повысить кратность рассева культуры предназначенной для репродукции вирусов оспы мелких жвачных, чумы мелких жвачных и заразного узелкового дерматита КРС, для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.
Данная задача решена благодаря созданию перевиваемой монослойной сублинии клеток тестикул месячного козленка - TCh, предназначенной для репродукции вирусов оспы, чумы мелких жвачных и заразного узелкового дерматита КРС, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.
Полученная сублиния клеток тестикул одномесячного козленка - TCh характеризуется высокой пролиферативной активностью, значительно большей кратностью рассева, в сравнении с аналоговыми прототипными сублиниями, с последующим полноценным формированием монослоя, пригодного для репродукции вирусов. Кратность рассева в сосудах разной площади достигает 1:6, 1:8, 1:18.
Сведения о результатах культивирования вирусов чумы мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) и заразного узелкового дерматита КРС (ЗУД КРС) на прототипных линиях клеток не обнаружены.
50
50
3
3
С помощью заявленной сублинии клеток - TCh для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов возможно получать антигенный материал вирусов оспы, чумы мелких жвачных и заразного узелкового дерматита КРС с титрами 5,0-5,5 lg ТЦД/см, 5,33-5,89 lg ТЦД/см, 5,25-5,33 lg ТЦД5о/см3 соответственно.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена следующими графическими материалами:
Фиг. 1 - Морфология ПЛК CG-91 и ЯДК-04 до селекции.
Фиг. 2 - Кариограмма ПЛК CG-91 и ЯДК-04 до селекции.
Фиг. 3 - Метафазная пластинка ПЛК CG-91 и ЯДК-04 до селекции.
Фиг. 4 - Морфология ПЛК TCh культивируемой на фетальной сыворотке.
Фиг. 5 - Морфология ПЛК TCh адгезия.
Фиг. 6 - Морфология ПЛК TCh, 24 часа.
Фиг. 7 - Метафазная пластинка TCh после селекции - 50 пассаж.
Фиг. 8 - Кариограмма ПЛК TCh после селекции - 50 пассаж.
Фиг. 9 - Морфология ПЛК TCh (70 пассаж) через 48 часов.
Фиг. 10 - Метафазная пластинка ПЛК TCh (70 пассаж).
Фиг. 11 - Кариограмма ПЛК TCh (70 пассаж).
Фиг. 12 - Процентное содержание метацентрических хромосом в ПЛК TCh с разным количеством метацентриков.
Фиг. 13 - ЦПД вируса ЗУД КРС на TCh.
Фиг. 14 - ЦПД вируса оспы мелких жвачных животных на TCh.
Фиг. 15 - ЦПД вируса ЧМЖЖ на TCh.
Заявляемые преимущества изобретения обусловлены генетическими характеристиками созданной сублинии клеток TCh, которая была получена в процессе культивирования ЯДК-04 с сывороткой крови крупного рогатого скота (КРС) обработанной лантаноидами, полученными из горной породы Шунгит по запатентованной технологии [4], а также подбором ростовой среды оригинального состава.
Данная клеточная линия является оптимальной системой для испытания качества новых серий сывороток крови КРС, так как чувствительна к любым отклонениям в их составе, происходящими в цикле изготовления данного препарата.
Нужно отметить, что использование фетальной сыворотки (при культивировании клеток гонад козы приводит к постепенному снижению пролиферации и деградации клеток монослоя (Фиг. 4). Это проявление начинается с преобладания фибробластоподобных клеток со значительными тонкими цитоплазматическими выростами, монослой не уплотняется, уменьшается количество митозов и, происходит постепенная элиминация культуры в пассажах.
В тоже время сыворотка крови КРС обработанная лантаноидами, после специальной очистки и фильтрации, обладает стабильными физико-химическими признаками и стабильными ростовыми свойствами при длительном пассировании культуры клеток гонад козы.
Применяемая сыворотка, полученная новым способом, отличается повышенной прозрачностью, наблюдается отсутствие флокуляции (выпадение осадка) сывороточных белков при замораживании-оттаивании и хранении при температуре минус 20°С. Количество общего белка (в частности альбумина), при обработке лантаноидами, практически не изменяется и зависит в основном от качества исходного материала. В тоже время, в процессе изготовления сыворотки крови, из исходного материала спонтанно удаляются ДНК- и РНК-содержащие контаминанты: вирусы, бактерии, продукты их распада, что способствовало уменьшению общего количества эндотоксинов.
Трансформирующий эффект при селекции ЯДК-04 в новую клеточную линию TCh проявился благодаря наличию в шунгите высокоактивных трех-четырех валентных катионов группы лантана, которые обладают высокой антиоксидантной активностью (табл.1). Антиоксидантные свойства сыворотки при культивировании ПЛК TCh, в свою очередь, индуцируют репарационные и трансформирующие воздействия на морфологию и кариотип клеток.
Наряду с применяемой новой сывороткой крови, была подобрана оригинальная ростовая среда для культивирования, которая состояла из двух компонентов: среда ПСП - питательная среда пристеночная (аналог классической MEM) и среда 199 (или DMEM/F-12) в пропорции 1:3. Для активного роста полученной ПЛК TCh необходимо присутствие как заменимых так не незаменимых аминокислот, таких как пролин, глицин, которые содержаться в среде 199, ПСП и в сыворотке крови КРС.
Позитивный эффект от длительного применения выбранной сыворотки проявлялся, вначале, в стабилизации пролиферации клеток на уровне кратности рассева 1:4. При этом, популяция клеток стабильно активно адгезировалась после трипсинизации и криоконсервирования на субстрат и, начинала активно редуплицироваться, при этом происходило значительное уплотнение монослоя (Фиг. 5), что свидетельствовало о контактной стимуляции пролиферации.
Очень важным показателем стабилизации новой перевиваемой линии клеток - TCh, стала возможность длительного, последовательного пассирования линии без появления дегенеративных изменений в клетках и монослое. Отпала необходимость в частых разморозках новых флаконов из криобанка и получение новых расплодок после 10-11 пассажей, что позволяет максимально долго пассировать ПЛК TCh без криопаузы (т.е. без криоконсервирования).
При добавлении в систему для выращивания культуры клеток 10% сыворотки крови обработанной лантаноидами при температуре 37°С популяция сублинии восстанавливается из минимального количества клеток. В таких условиях за 96 часов проходит восстановление полноценного монослоя клеток.
2
Как было отмечено выше, при использовании сыворотки крови, обработанной лантаноидами, стабилизированы условия пересева ПЛК TCh без дегенеративных изменений в пассажах. Было проведено 44 пассажа без этапа криоконсервирования, после чего было зафиксировано значительное изменение в морфологии клеток монослоя (Фиг. 6, 9). Отмечено преобладание эпителиоподобных клеток (70-80%) при наличии веретенообразных и фибробластоподобных, которые присутствовали в первые сутки культивирования. Через 48-72 часа монослой уплотнялся эпителиоподобными клетками, намечалась тенденция наслоения клеток (Фиг. 9). Продуктивность клеток при снятии их трипсин-версеном не превышала 120 млн. с площади 300 см. Сферические клетки достигали размера в 15-16 микрометров. В этот период увеличена кратность рассева до 1:6, со стабильными результатами при формировании полноценного монослоя и с последующей активной репродукцией вирусов оспы, чумы мелких жвачных и заразного узелкового дерматита КРС.
При проведении кариологических исследований выяснено, что происходит трансформация кариотипа ПЛК TCh по двум направлениям: гиперплоидизация и формирование метацентрических хромосом. Эти два процесса происходили параллельно. Определение кариотипа на 44-50 пассажах выявило преобладание тетраплоидных популяций с наличием 1-3 метацентрических хромосом (Фиг 7, 8).
Дальнейшее пассирование клеток без криопаузы и изучение цитоморфологии показало, что начиная с 66 пассажа морфология клеток не изменилась, а в кариотипе стабилизировалась гиперплоидная популяция с 82 хромосомами и с 2-4 метацентрическими хромосомами (Фиг. 10-12). Преобладали популяции с 2 метацетрическими хромосомами - до 48% (Фиг. 12).
Полученная клеточная сублиния TCh (Testis Capra hircus) депонирована 23 апреля 2019 г. в Институте цитологии РАН «Специализированная коллекция культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных»». Линии клеток присвоен номер: №РККК(П) 796 Д.
Перевиваемая линия клеток CG-91 получена в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 1994 году из субкультуры гонад домашней козы на 70 пассаже, далее путем длительной селекции данной культуры клеток в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2006 году была получена клеточная сублиния ЯДК-04, из которой при длительном субкультивировании с сывороткой крови КРС, обработанной лантаноидами получена новая сублиния клеток TCh.
Способы и условия культивирования клеточной сублинии TCh.
Монослойное пристеночное культивирование перевиваемой клеточной линии TCh осуществляется двумя способами: на стационарных горизонтальных поверхностях (в культуральных матрасах) и во вращающихся сосудах (роллерах).
2
2
2
2
Монослойное культивирование в стационарных условиях, при температуре (37±0,5)°С, наиболее востребованный способ для производства культуральных вакцин и при вирусологических исследованиях. ПЛК TCh выращивается в культуральных флаконах площадью 300 см, 175 см, 75 см, 25 см. При необходимости клеточную линию можно использовать в реакциях микронейтрализации на плашках разной площади.
3
3
Последовательное пассирование начинается с разморозки ампулы объемом суспензии 5 см и с концентрацией клеток 5-7 млн/см. Для полученной сублинии TCh нет необходимости смены среды через сутки. Уже через 72 часа клеточная культура формирует полноценный монослой, который можно рассевать в кратности 1:6. Для серийного пассирования используется питательна среда ПСП+199 в соотношении 1:3 с добавлением 10% сыворотки крови КРС обработанной лантаноидами.
При последовательном пассировании, цикл которого равняется 72-96 часов, формируется плотный монослой с частичным наслоением эпителиоподобных и сферических клеток.
Активная пролиферация ПЛК TCh находится в диапазоне рН ростовой питательной среды от 7,3 до 6,8. Закисление ростовой питательной среды ниже 6,8 служит признаком истощения ингредиентов и необходимости пересева или смены среды. Допустимая кратность рассева для получения полноценного монослоя в стационарных условиях показана в таблице 2
2
2
2
Роллерное культивирование перевиваемой линии клеток TCh проводят стационарным способом. При использовании вышеуказанных условий и применяемых компонентов, проводят рассев клеток со стационарных культуральных флаконов площадью 300 см на роллеры площадью 850 см и 1700 см. Кратность рассева при этом может достигать 1:6-1:18 (Табл. 2). Культура, выращенная роллерным способом особенно востребована при получении суспензии вируса чумы мелких жвачных животных.
Закономерности роста перевиваемой линии клеток TCh Полученная сублиния монослойных клеток TCh обладает отличительными характеристиками, как при пересеве, так и в росте клеток монослоя:
- при пересеве с применением смеси трипсин-версена до 20% клеток находятся в стадии апоптоза (окрашивание трипановым синим);
3
- посевная концентрация колеблется от 0,05 до 0,1 млн/см;
2
- продуктивность достигает 100-130 млн. клеток с культурального сосуда площадью 300 см;
- кратность рассева, в зависимости от применяемой культуральной посуды, составляет 1:6-1:18;
- оптимальное значение рН среды при культивировании 7,3-6,8;
- количество пассажей, без криопаузы, достигает более 100. Кариологическая и морфологическая характеристика клеток сублинии TCh.
При кариологическом исследовании установлено, что первоначально трипсинизировались клетки яичников козленка (), у которых мелкая мужская половая Y-хромосома элиминировалась еще на стадии получения перевиваемой линии клеток CG-91 (Фиг. 3). В дальнейшем этот хромосомный элемент ни в одной сублинии не обнаруживался.
Монослойная сублиния клеток TCh состоит из преобладающих эпителиоподобных клеток, веретенообразные и фибробластоподобные клетки в меньшем количестве концентрируются на подложке между основной популяцией.
Длительное культивирование с сывороткой, обработанной лантаноидами привело к значительной трансформации кариотипа.
Кариологическое исследование сублинии клеток TCh проводили с применением метода Moorhead и др. [5]. После получения препарата с метафазными пластинками, производилось фотографирование 100 метафазных пластинок, их подсчет и составление кариограммы. По результатам исследования выяснили, что сублиния клеток TCh образует гетерогенную по кариологическим признакам популяцию клеток, в основном гиперплоидных. Представленная сублиния клеток TCh отличается от прототипа по кариологическим показателям. Модальный класс клеток на 50 последовательном пассаже составил 117 хромосом - 14%, околотетраплоидная популяция составила 70%, околодиплоидная - 29%. Вариабельность кариотипа 57-122 хромосомы. На 66 пассаже появилась новая популяция с преобладанием клеток с модальным классом 82 хромосомы - 24%. На этом кариологическом уровне сублиния стабилизировалась. Также стабилизировалось количество метацентрических хромосом, которые были в каждой метафазной пластинке в количестве от 2 до 4. Пролиферативная активность двух полученных популяций была одинакова высокой, и пригодной для культивирования в производственных масштабах.
Видовая принадлежность клеток сублинии TCh
Культура идентифицирована как ткань тестикул козленка (Capra hircus L.), с помощью кариологического анализа и дифференциального С-окрашивания хромосом [6].
Криоконсервирование и жизнеспособность клеток сублинии TCh после размораживания
3
3
Криоконсервирование клеточной линии TCh проводили в стеклянных ампулах или криопробирках емкостью 5 см. Оптимальная концентрация замораживаемых клеток составляет 5-7 млн/см живых клеток (неокрашенных трипановым синим). Для замораживания используется ростовая среда с добавлением 10% диметилсульфоксида и 20% сыворотки крови КРС обработанной лантаноидами. От комнатной температуры до минус 70°С суспензию клеток охлаждают со скоростью 2°С/мин, до температуры минус 150°С-10°С/мин, затем ампулы помещают в жидкий азот (минус 196°С) на длительное хранение. Размораживание проводят на водяной бане при температуре 36°С, при интенсивном перемешивании, до полного исчезновения кристаллической фазы. Выживаемость после оттаивания достигает 90-95%. Как было отмечено выше, после инокуляции размороженной суспензии в культуральный флакон со средой, реабилитация культуры происходит без задержки пролиферации. Способ получения сублинии клеток TCh
В качестве исходного материала использовали монослойную перевиваемую линию клеток гонад домашней козы ЯДК-04, полученную в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2006 году. Данная клеточная сублиния была не стабильна в кратности рассева, которая колебалась от 1:2 до 1:4. Вследствие нестабильной продуктивности, данная линия использовалась только в получении небольших партий вирусных суспензий при производстве вакцин против болезни Ауески и оспы овец.
При включении в культуральную технологию сыворотки, обработанной лантаноидами, в культуре клеток ЯДК-04 появились признаки стабилизации пролиферации перевиваемой линии. Проводилось последовательное длительное пассирование клеточной культуры с циклом 72-96 часов без криопаузы.
Последовательные длительные пересевы ЯДК-04 без криопаузы проводились в стандартных условиях с 10% сывороткой крови КРС обработанной лантаноидами. К 44 пассажу стала изменяться морфология клеток: стали преобладать эпителиоподобные клетки, которые уплотнялись к концу логарифмической фазы роста. Были проведены кариологические исследования на 44 и 50 пассажах. При этом обнаружены значительные перестройки в кариотипе (Фиг. 7, 10), при этом преобладали популяции с гиперплоидным набором хромосом и присутствием 2-4 метацентрических элементов. Кратность рассева увеличилась стабильно до 1:6 и более.
Стабильность культивирования - более 50 пассажей без криопаузы, увеличение кратности рассева, морфологические и кариологические изменения свидетельствуют о получении новой стабильной сублинии тестикул козленка, которую назвали TCh - Testis Capra hircus.
За 2 года, полученная сублиния прошла более 70 последовательных пассажей, без признаков дегенерации и со стабильными культуральными параметрами.
Клеточная сублиния прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности».
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Влияние сыворотки, обработанной лантаноидами на ростовые свойства культуры.
Использование в селективных манипуляциях сыворотки крови КРС, обработанной лантаноидами, при длительном пассировании сублинии ЯДК-04 минуя криопаузу привело к значительным цитоморфологическим и генетическим изменениям, которые позволили выделить ее в новую высокопродуктивную сублинию клеток TCh при сохранении чувствительности ко многим вирусам (вирусу оспы мелких жвачных, вирусу чумы мелких жвачных, вирусу заразного узелкового дерматита КРС).
Сыворотка крови КРС обработанная лантаноидами содержит микроэлементы группы лантана с высокой антиоксидантной активностью - +3, +4 (табл. 1). Сыворотка не содержит латентных геномов вирусов и эндотоксины, при этом сохраняются все ростовые и адгезивные свойства для стимуляции пролиферации клеток.
Сыворотка обработанная лантаноидами по своим ростовым адгезивным свойствам для многих культур является стабилизирующим фактором культивирования, в случае с монослойными сублиниями произошедших из гонад тестикул домашней козы является незаменимым стабильным компонентом наработки клеточного материала.
Пример 2. Морфологические исследования клеток сублинии TCh в сравнении с прототипной су 6 линией ЯДК-04.
Трансформированный, в результате селекции с применением сыворотки крови КРС обработанной лантаноидами, морфологический статус клеток сублинии TCh значительно отличается по сравнению с сублинией ЯДК-04. При адгезии и в первые сутки культивирования полиморфизм клеток более разнообразен, чем при дальнейшем росте. Присутствуют как эпителиоподобные так и веретенообразные, фибробластопобные клетки с длинными цитоплазматическими выростами. Делящиеся клетки имеют четкую сферическую структуру с четкой структурой проходящего митоза (Фиг. 5). К концу логарифмической фазы роста, количество митозов (со сферическими клетками) уменьшается, преобладают эпителиоподобные клетки, наблюдается тенденция наслоения делящихся клеток над монослоем, которые имеют сферическую структуру. При использовании ПЛК TCh в качестве контроля при изучении ЦПД, без смены среды, наблюдаются изменения морфологии с признаками «старения» клеток и монослоя:
- повышается грануляция цитоплазмы,
- межклеточное пространство уплотняется,
- появляются вакуоли,
- над монослоем локализуется в небольшом количестве клеточный детрит.
Все эти трофические изменения контрольных образцов отличаются от специфического воздействия вирусов (Фиг. 13, 14, 15). Стандартная морфология ПЛК TCh прослеживается на протяжении 50 пассажей непрерывного культивирования без криопаузы (Фиг. 6, 9)
Пример 3. Кариологическое исследование клеток сублинии TCh в сравнении с прототипной линией ЯДК-04.
Кариологическое исследование сублинии клеток TCh в сравнении с прототипной сублинией ЯДК-04 проводили с применением метода Moorhead и др. [5, 6]. После получения препарата с метафазами, производили фотографирование 100 метафазных пластинок, подсчет каждой пластинки и составление кариограммы.
На фиг. 2 показан популяционный состав культуры клеток ЯДК-04 на момент патентования в 1996 г., на фиг. 3 морфология хромосом. Наличие в кариотипе только акроцентрических хромосом, свидетельствует о принадлежности перевиваемых клеток к виду Capra hircus L (домашняя коза).
В процессе пассирования клеток тестикул козленка и получении новой сублинии клеток TCh мы наблюдали эволюцию кариотипа, которая шла в двух направлениях: формирование гиперплоидных популяций и появление метацентрических хромосом. Метацентрические хромосомы формировались путем центрического слияния апикальных концов акроцентрических хромосом [7, 8]. Сформировались 2 популяции клеток: с модальным классом 117 хромосом (14%) и с модальным классом 83 хромосомы (24%) (Фиг. 7, 11). В морфологии кариотипа преобладают акроцентрические хромосомы с 2-4 вновь сформированными метацентриками (Фиг. 7, 10).
Эволюция кариотипа перевиваемой культуры тестикул козы наблюдается впервые. Это явление мы связываем с длительным пассированием ПЛК с добавлением сыворотки крови КРС обработанной лантаноидами, в результате чего повысилась теломеразная активность, которая коррелируется гиперплоидизацией и появлением метацентрических хромосом.
Пример 4. Оценка ростовых свойств клеток сублинии TCh в сравнении с прототипными сублиниями.
Клеточная сублиния TCh полученная в результате длительного пассирования (около 100 пассажей), без криопаузы, с добавлением сыворотки обработанной лантаноидами (более 50 пассажей) значительно отличалась от линии CG-91 и прототипной сублинии ЯДК-04 по пролиферативной активности. Если у ПЛК CG-91 и ЯДК-04 кратность рассева колебалась от 1:2 до 1:4 при нестабильности последовательных пассажей, то у вновь полученной сублинии клеток TCh ростовой потенциал значительно вырос (табл. 2). Как видно из таблицы 2, при культивировании на разных ростовых поверхностях в стационарных условиях и во вращающихся сосудах, кратность рассева достигает 1:6-1:18, с последующим формированием полноценного монослоя пригодного для репродукции вирусов. Интенсивность прироста новой сублинии в 2-3 раза выше, чем у прототипа. Монослой ПЛК TCh формируется даже в случае если в исходном флаконе остается остаточное количество клеток после основного пересева (посев в «пену»). В этом случае конфлюентный монослой формируется за 96-144 часа культивирования.
Стабильная пролиферация ПЛК TCh осуществляется на среде ПСП+199 в соотношении 1:3 с добавлением 10% сыворотки крови КРС обработанной лантаноидами. Среда ПСП (питательная среда пристеночная) по аминокислотному составу это аналог среды MEM (minimal essential medium) на солевом растворе Эрла. Среда 199 готовиться также на солевом растворе Эрла и, вместе с сывороткой крови КРС, является источником незаменимых аминокислот. Оптимальное соотношение питательных сред и сыворотки крови КРС обработанной лантаноидами позволило на настоящий период осуществить более 100 непрерывных пассажей без криопаузы. Наработанный в производственных масштабах, при длительном пассировании, клеточный материал не снижает чувствительности к вирусам чумы и оспы мелких жвачных и к вирусу заразного узелкового дерматита (ЗУД) КРС. Вирусный материал, полученный на ПЛК TCh эффективно и рентабельно может использоваться при изготовлении специфических биопрепаратов (вакцин).
Таким образом, в сравнении с прототипами клетки сублинии TCh при суспензионном выращивании имеют большую кратность прироста до 1:18 с сохранением жизнеспособности клеток на 90-95%.
Пример 5. Репродукция вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота (ЗУД КРС).
50
50
50
50
50
3
3
3
3
3
При выявлении репродуктивной способности вируса ЗУД КРС в клеточной культуре TCh, для сравнения использовали гомологичные культуры коровьего происхождения: FBN (носовые перегородки КРС), MDBK (почка теленка), Taurus-2 (почка теленка), ПТ (субкультура почки теленка); а так же гетерологичные линии - ПО (почка овцы), SIRC (роговица глаза кролика) и субкультуру ТЯ (теститикулы ягненка). Инфекционную активность полученного вирусного материала определяли методом титрования в 96-луночных культуральных планшетах с использованием суспензии культуры клеток TCh. Учет результатов титрования проводили по цитопатогенному действию вируса в течение 72-120 ч. Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД/см. Результаты представлены в таблице 3. Как видно из таблицы 3 максимальное накопление вируса ЗУД регистрировали на уровне 7-го пассажа в перевиваемой культуре TCh (5,48±0,16 lg ТЦД/см) и субкультуре ТЯ (5,17±0,15 lg ТЦД/см). В культурах клеток FBN и SIRC титр инфекционной активности составил 4,0±0,16 lg ТЦД/см и 4,0±0,12 lg ТЦД/см, соответственно. Культуры клеток MDBK, Taurus-2, ПО и ПТ оказались не чувствительными к вирусу ЗУД КРС, уже начиная с 5 пассажа.
50
50
3
3
Исходя из полученных данных, для определения титра вируса ЗУД в динамике накопления были выбраны две сублинии клеток: TCh (предлагаемое изобретение) и ТЯ - сублиния тестикул ягненка. В таблице 4 представлена результаты по динамике накопления вируса ЗУД КРС в данных культурах клеток. Как видно из таблицы 4 оптимальным временем культивирования вируса ЗУД КРС в предлагаемых культурах клеток являлось 72-96 ч. Титр вируса составил от 5,06±0,18 до 5,00±0,00 lg ТЦД/см (в культуре клеток ТЯ) и от 5,25±0,17 до 5,33±0,14 lg ТЦД/см (в культуре клеток TCh). Как видно по результатам, представленным в таблице - накопление вируса заразного узелкового дерматита на культуру клеток ТЯ через 96 ч. культивирования начинает снижаться, при этом динамика накопления вируса на культуре клеток TCh - остается на стабильном уровне.
Таким образом, показано, что сочетание высокой пролиферативной активности, хорошей чувствительности к вирусу и гетерогенностью происхождения, делает сублинию клеток TCh незаменимой при получении вирусных суспензий для производства специфических вакцинных препаратов против заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота.
Пример 6. Репродукция вируса оспы мелких жвачных (овец и коз) на сублинии клеток TCh.
50
50
50
3
3
3
Для определения инфекционной активности вируса оспы мелких жвачных, проводили титрование десятикратных разведений вируссодержащего материала общепринятым методом в 96-луночных культуральных планшетах с использованием перевиваемых культур клеток - TCh, ПО, СПЭВ и субкультур ПС, ПБ и ТБ. Учет титрования проводили по цитопатогенному действию вируса на 3 пассаже культивирования. Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД/см. Результаты определения инфекционной активности отображены в таблице 5. Максимальное накопление вируса оспы мелких жвачных животных в культурах достигается на 3-й сутки (72 часа) культивирования - 3 пассаж. Максимальные титры инфекционной активности вируса получены на гетерогенной перевиваемой культуре клеток TCh и составляет 5,50±0,18 lg ТЦД/см и на субкультуре ПБ и ТБ - 5,50±0,25 lg ТЦД/см.
Однако на субкультурах ПБ (почка барана) и ТБ (тестикулы барана) кратность рассева этих клеток составляет - 1:2, а к 10 пассажу субкультуры переходят в терминальную стадию - прекращение деления клеток (эффект Хейфлика). В то время как кратность рассева TCh к 10 пассажу увеличивается и составляет 1:6, 1:18.
Таким образом, клетки сублинии TCh, полученной для производства вакцин против оспы мелких жвачных, позволяют проводить репродукцию вируса оспы с равным титром среди культур клеток ПБ и ТБ. Однако кратность рассева намного выше и достигает показателя 1:18. Сочетание высокой пролиферативной активности, хорошей чувствительности к вирусу и гетерогенностью происхождения, делает сублинию клеток TCh незаменимой в производстве специфических вакцинных препаратов против вируса оспы мелких жвачных.
Пример 7. Репродукция вируса чумы мелких жвачных на сублинии клеток TCh.
2
3
50
50
В ходе исследований проводили адаптацию вируса чумы мелких жвачных (ЧМЖ) к различным культурам клеток и определяли чувствительную и эффективную клеточную систему для его репродукции. В процессе работы были использованы следующие клеточные линии: TCh, ПС, и СПЭВ. Культуры клеток выращивали в пластиковых сосудах площадью 25 см в течение 2-3 суток. Множественность заражения составила 0,1 ТЦД/кл. На каждой клеточной культуре было проведено пять пассажей. На всех пассажных уровнях каждые 24 часа наблюдали проявление ЦПД в клеточном монослое. Сбор вируса производили при 80-90% поражении монослоя клеток. Вируссодержащий материал каждого пассажа титровали в пенициллиновых флаконах на культуре клеток TCh (как в наиболее стабильном трофоварианте), методом последовательных 10-кратных разведений. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД/см.
50
50
3
3
Динамика накопления вируса чумы мелких жвачных животных на различных культурах клеток: TCh (предлагаемое изобретение), ПС и СПЭВ представлена в таблице 6. Уже через 24 часа во всех культурах клеток регистрировали ЦПД вируса, что четко выраженно в клеточной линии TCh (Фиг. 15). Цитопатические проявления вируса ЧМЖ на TCh заключаются в том, что практически все клетки на третьи сутки деадгезируются, мембраны и цитоплазма клеток потеряла первоначальную структуру, при этом произошла частичная агрегация клеток, после чего проводили сбор вируса через замораживание-оттаивание. Далее динамика репродукции вируса была различной. Данные таблицы 6 демонстрируют, что наибольшее накопление вируса на всех пассажных уровнях отмечали в клеточной линии TCh. Титр вируса на 4 сутки (96 часов) достигал 5,89±0,18 lg ТЦД/см. Титр вируса в культурах клеток ПС и СПЭВ был значительно ниже и на 5 сутки составил 3,75±0,25 и 4,33±0,18 lg ТЦД/см, соответственно.
50
3
Результаты, полученные в ходе проведенных исследований, свидетельствуют о том, что оптимальной клеточной линией для репродукции вируса чумы мелких жвачных является перевиваемая клеточная линия TCh. Титр вируса, полученный на этой культуре, стабильно находился на высоком уровне в течение пяти последовательных пассажей и составил 5,08±0,18 lg ТЦД/см, что говорит о возможности его использования в качестве вирусного сырья для масштабного производства ветеринарных биопрепаратов.
Основным преимуществом предлагаемого изобретения является новая высокопродуктивная, перевиваемая монослойная сублиния клеток тестикул козленка (Capra hircus ) - TCh, с высокой кратностью прироста клеток (1:6-1:18), которая предназначена для репродукции вирусов заразного узелкового дерматита (ЗУД КРС), оспы и чумы мелких жвачных с большим накоплением антигена для производства диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «ТСп (Testis Capra hircus) - перевиваемая, монослойная сублиния клеток тестикул месячного козленка, предназначенная для репродукции вирусов оспы, чумы мелких жвачных и заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов»:
1. Каталог.Российская коллекция клеточных культур (РККК). - СПб, 2004,315 с.
2. Патент №2335537, Росийская Федерация., МПК C12N 5/06. Линия клеток яичников козы домашней Capra hircus L. ЯДК-04 для репродукции вирусов животных / Герасимов В.Н., Герасимова Н.И., Дьяконов Л.П., Груздев К.Н., Захаров В.М., Манин Б.Л.; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ», №2006114337/13; заявл.26.04.2006; опубл. 10.10.2008; Бюл. №28.
3. Патент №2664729, Российская Федерация, МПК G01N 33/49. Способ очистки сыворотки крови крупного рогатого скота от контаминирующих агентов / Пономарев А.П., Велик Е.В., Манин Б.Л., Коган М.М.; заявитель и патентообладатель ООО НПП «БИОХИМСЕРВИС». - №2017117994; заяв. 23.05.17; опубл. 22.08.18, Бюл. №24
4. Патент №2061753, Российская федерация., ГГМК C12N 5/06 Штамм культивируемых клеток гонад Capra hircus L. - продуцент вирусов животных/Е.Е.Федорова, Г.А. Худяков, В.Н. Герасимов.; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ», №94028042/13; заявл. 02.08.1994; опубл. 10.06.1996.
5. Moorhead P.S. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral Blood / P.S. Moorhead, P.C. Nowell, W.J Mellman et al. // Exper. Cell. Res. - 1960. - V.20. - P. 613-616. Типы клеточных культур, образование, основные характеристики и изменчивости клеточных культур. Г.Г. Полянская. В сб. Методы культивирования клеток / под ред.: Г.П. Пинаева, - СПб.: Изд-во Политехн, ун-та, 2008, С. 22-40.
6. Б.Л. Манин, Н.В. Коропова, Е.А. Трофимова. Идентификация постоянных клеточных линий животных по кариологическим, морфологическим и культуральным признакам. // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 246-254.
7. Полянская Г.Г. Кариотипическая изменчивость в клеточных линиях и структура кариотипа. Клеточные культуры (информ. бюллетень) 2009, вып. 24:15-24.
8. Мамаева С.Е. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре. Цитология, 1996, 38(8):787-814.