СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ
METHOD FOR PRESERVING THE AMNIOTIC MEMBRANE

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для консервации донорской амниотической мембраны, предназначенной для трансплантации при выполнении офтальмохирургических вмешательств.
Известен способ консервации донорской амниотической оболочки, полученной после освобождения ткани от сгустков крови и хориона, включающий разделение ее на сегменты 28-30 мм, замораживание при температуре минус 40°С, лиофилизацию до остаточной влажности 2-5%, дальнейшую стерилизацию (γ-излучение в дозе 25 кГр) и упаковывание [Федорова Е.А., Слонимский А.Ю., Батманов Ю.Е. Способ консервации амниотической мембраны // Патент RU 2267922 от 20.01.2006]. Заявленный срок хранения трансплантата 1,5 года. Перед употреблением законсервированную таким образом амниотическую мембрану регидратируют в стерильном физрастворе или растворе антибиотика в течение 40-60 мин. Лиофильная (сублимационная) сушка является одним из методов сохранения нативных свойств биологических материалов. Однако существует мнение, что замораживание биотканей, в частности амниотической мембраны, не желательно. С тем, чтобы избежать заморозки амниона применяют его высушивание над силикагелем. Кроме этого для проведения лиофилизации требуется специальное и дорогостоящее оборудование, а для достаточно продолжительной (40-60 мин) регидратации материала перед его применением используется физраствор, тогда как более физиологичным аналогом последнего является, например, раствор Рингера.
Известен метод консервации, включающий очистку плаценты от кровяных сгустков в 0,9% растворе натрия хлорида, отделение амниона от хориона, обработку выделенной амниотической оболочки 0,02% раствором хлоргексидина в течение 10 минут, раствором гентамицина (40 мг/мл) и амфотерицина В (2,5 мг/мл) продолжительностью 10 минут. Трансплантат погружают на 20 мин в глицерол, фиксируют на металлической рамке и сушат над силикагелем в течение 18-24 часов. Хранится такая мембрана в стерильной упаковке при комнатных условиях до 1,5 лет [Милюдин Е.С., Золотарев А.В., Волова Л.Т. Способ консервации амниотической мембраны // Патент RU 2214091 от 20.10.2003]. Данный способ заготовки материала не предполагает его дополнительную стерилизацию, выполнение которой желательно, особенно для предложенных авторами комнатных температурных условий хранения. Кроме этого данный способ консервации биоматериала может быть сопряжен с существенным снижением сохранности клеток амниотической мембраны [Меликова Т.П. Амниотическая мембрана и ее применение в офтальмологии // Oftalmologiya. 2010; 3:115-122].
Наиболее близким аналогом изобретения является метод консервации J. Kim и S. Tseng, при котором плацента очищается, промывается стерильным физраствором, затем в растворе антибиотиков: 100 мг/мл неомицина, 50 мг/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 2,5 мг/мл амфотерицина. Амнион укладывается на нитроцеллюлозную бумагу, которую разрезают на диски удобного размера. Хранят в среде Игла и глицерина (1:1) при температуре минус 70°С. Срок хранения 2 года [Kim J., Tseng S. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severly damaged rabbit corneas // Cornea. 1995; 14:473-484]. Низкие температуры являются хорошим вариантом сохранения нативных свойств амниотической мембраны, однако следует отметить, что в данном случае хранение биоткани будет осуществляться в водном растворе, состоящем на 50% из среды Игла и на 50% из глицерина. Температура замерзания такого раствора глицерина составит минус 23°С [Справочник химика 21, https://chem21.info/index/]. При этом амниотическая мембрана, как и водный раствор для ее хранения будут находиться в замороженном состоянии. В последующем перед началом работы с биоматериалом потребуется нежелательный этап его разморозки, что может привести к утрате ряда нативных свойств амниона.
Задачей изобретения является повышение эффективности консервации амниотической мембраны.
Технический результат - улучшение функционального качества биоматериала за счет сохранения его нативных свойств.
Предлагаемый способ консервации донорской амниотической мембраны выполняют следующим образом. Производят забор фрагмента плаценты в роддоме в стерильных условиях после кесарева сечения у беременных женщин, обследованных на гепатит В и С, ВИЧ и сифилис. Обработку донорской ткани осуществляют в условиях стерильного бокса под ламинарным потоком. В период не более 3-х часов после забора плацентарную ткань отмывают раствором Рингера, производят отделение амниона от хориона. Выделенную амниотическую мембрану отмывают от следов крови раствором Рингера, погружают в раствор Рингера, содержащий натрия оксибутирата 100 мг/мл на 10 минут. Затем помещают на 10 минут в 0,01% раствор хлоргексидина в физрастворе, после на 30 минут в раствор антибиотиков в физрастворе, содержащий 0,25 мг/мл амфотерицина В, 0,1 мг/мл ципрофлоксацина и 0,25 мг/мл цефтриаксона. Далее амниотическую мембрану помещают на 30 мин в стерильный раствор, содержащий глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО) в соотношении 4:1, а также натрия оксибутирата 10 мг/мл. После этого мембрану размещают (расправляют) на простерилизованной бумаге для выпекания и после удаления излишков раствора глицерина разрезают вместе с бумагой на диски требуемого размера (например, 20×20 мм). После отделения от бумаги амниотическую мембрану упаковывают во флаконы с раствором, содержащим глицерин с диметилсульфоксид в соотношении 4:1, а также 10 мг/мл натрия оксибутирата. Флаконы с мембраной стерилизуют ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад на установке Со. Выполняют микробиологические исследования готовых образцов материала. Хранение амниотической мембраны осуществляется при температуре минус 12-18°С. Срок хранения консервированной ткани составляет 2 года.
Существенными отличительными признаками способа являются:
- Для отмывания амниотической мембраны используется более физиологичный раствор Рингера, который способен эффективно возмещать потери экстрацеллюлярной, внутриклеточной жидкости и основных электролитов натрия, калия, кальция, хлоридов, в частности в изолированных тканях.
- Натрия оксибутират вводится в состав раствора для повышения антигипоксической сопротивляемости и метаболической устойчивости трансплантата. Показано, что сохранение кислорода в донорских тканях является важным аспектом обеспечения их жизнестойкости [Подопригора Р.Н. Методы консервации донорского материала // Вестник ОГУ. дек. 2004; 100-103].
Для обработки материала используют концентрацию хлоргексидина 0,01%; препарат разводится физраствором. При этом удаляются следы кальция нежелательные при дальнейшем использовании цефтриаксона.
- Используют раствор антибиотиков содержащий 0,25 мг/мл амфотерицина В, 0,1 мг/мл ципрофлоксацина и 0,25 мг/мл цефтриаксона, разведенный физраствором, воздействующий на грамположительную, грамотрицательную, анаэробную патогенную флору, оказывающий фунгицидное действие.
- Раствор амфотерицина В имеет ярко выраженный желто-оранжевый цвет. Предлагаемая доза (0,25 мг/мл) препарата позволяет сохранить его противогрибковую эффективность и исключить цитотоксическое действие на амнион; при этом достигается полное растворение антибиотика. После завершения обработки последний легко удаляется с поверхности амниотической мембраны, не окрашивая ее в бледно-желтый цвет. Тогда как в более высоких концентрациях растворимость амфотерицина В снижается, вместе с этим препарат заметно окрашивает амниотическую мембрану, придавая ей желтоватый оттенок.
- ДМСО вносится в состав раствора с глицерином в качестве криопротектора для обеспечения жизнеспособности клеток и биоткани. При этом образующийся раствор 75% глицерина имеет температуру замерзания минус 29,8°С, что не приводит к замораживанию, как раствора глицерина, так и биоматериала, который хранится при минус 12 - 18°С.
- Нарезка деликатной невысушенной амниотической мембраны имеет определенные сложности: ее необходимо фиксировать на рабочей поверхности, при контакте с которой возможны гибель клеток и вероятность биологического загрязнения биоткани. Для нарезки невысушенной тонкой амниотической мембраны используется простерилизованная бумага для выпекания, в отличие от известного применения нитроцеллюлозной бумаги, работа с которой часто затрудняет отделение трансплантата от ее поверхности. При необходимости (в случае применения другой технологии обработки материала) амнион можно сушить над силикагелем с использованием бумаги для выпекания, избегая способа сушки на металлической рамке.
Пример 1
60
Амниотическая мембрана была законсервирована по предлагаемому способу. Произведен забор фрагмента плаценты в роддоме в стерильных условиях операционной после кесарева сечения у беременной женщины, предварительно обследованной на ВИЧ, гепатит В и С, сифилис. Материал помещали в стерильный контейнер и термосумку, где поддерживалась температура +8+10°С. Через 2 часа после забора в условиях стерильного бокса под ламинарным потоком осуществлена обработка донорской ткани. Плацентарную ткань отмывали раствором Рингера, произвели отделение амниона от хориона. Выделенную амниотическую мембрану отмывали от следов крови раствором Рингера, помещали на 10 минут в оксибутират натрия 100 мг/мл, разведенный раствором Рингера. Затем биоткань переносили на 10 минут в 0,01% хлоргексидин в физрастворе, после на 30 минут в раствор антибиотиков, содержащий 0,25 мг/мл амфотерицина В, 0,1 мг/мл ципрофлоксацина и 0,25 мг/мл цефтриаксона, растворенных в физрастворе. Далее амниотическую мембрану помещали на 30 минут в стерильный раствор, содержащий глицерин и диметилсульфоксид в соотношении 4:1, а также 10 мг/мл натрия оксибутирата. Затем мембрану расправляли на простерилизованной бумаге для выпекания и после удаления излишков раствора глицерина разрезали вместе с бумагой на диски (размером 20×20 мм). После отделения от бумаги амниотическую мембрану упаковывали во флаконы с раствором глицерина с диметилсульфоксид в соотношении 4:1 и 10 мг/мл натрия оксибутирата. Флаконы с амниотической мембраной стерилизовали ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад на установке Со. Готовые образцы материала (4 флакона) переданы на бактериологический анализ. Получен протокол лабораторных испытаний амниотической мембраны № ПР1030 с результатами микробиологических исследований, подтверждающими ее стерильность.
Законсервированная по предлагаемому способу амниотическая мембрана хранилась в течение 3 недель при температуре минус 18°С. Амниотическая мембрана отмывалась от глицерина раствором Рингера и выдерживалась 5 мин в растворе антибиотика (ципрофлоксацин 0,3%). Больной С, 42 года, диагноз: внутренний птеригиум III степени правого глаза. Острота зрения перед хирургическим вмешательством: 0,6. После удаления новообразования роговой оболочки и конъюнктивы правого глаза была проведена трансплантация амниотической мембраны размером 6×6 мм. Эпителизация амниотической мембраны завершилась на 4 сутки после хирургического вмешательства. Послеоперационный период протекал без осложнений. На 4-й день острота зрения - 0,8 без коррекции. Достигнут хороший косметический результат.
Пример 2
Использовали амниотическую мембрану, законсервированную предлагаемым способом. Амниотическая мембрана хранилась в течение 20 месяцев при температуре минус 18°С. Получен протокол микробиологических исследований (№ ПР574), подтверждающий его стерильность. Амниотическая мембрана отмывалась от глицерина раствором Рингера и выдерживалась в течение 5 мин в растворе антибиотика (ципрофлоксацин 0,3%). Больной Т., 49 лет, поступил с диагнозом: эрозия роговицы левого глаза. Острота зрения: 0,01. Было проведено «биопокрытие» раневого участка амниотической мембраной, размером 11×11 мм, которую укладывали на роговицу и фиксировали непрерывным швом 10.0. Послеоперационный период протекал без каких-либо осложнений. На 6-й день после операции острота зрения составила 0,3. Достигнут удовлетворительный косметический и лечебный результат.
Таким образом, применение амниотической мембраны, полученной по предлагаемому способу, позволяет использовать ее в отдаленные сроки после консервации, обеспечивает проведение эффективных хирургических вмешательств с хорошими функциональными результатами за счет сохранения ее нативных свойств.