СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ ПАЛЬМИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ГОМОГЕНАТЕ ПЛАЦЕНТЫ БЕРЕМЕННЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ОБОСТРЕНИЕ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
METHOD FOR ASSESSING INDUCING ACTION OF CYTOMEGALOVIRAL INFECTION ON PALMITIC ACID IN PERIPHERAL BLOOD AND PLACENTAL HOMOGENATE OF PREGNANT WOMEN SUFFERED IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRUS INFECTION

1. Цель исследования - оценить характер влияния цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации на содержание пальмитиновой кислоты в периферической крови и синцитиотрофобласте плаценты, приводящей к увеличению числа ядер в состоянии апоптоза
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа определения повышения содержания пальмитиновой кислоты, способствующей увеличению числа ядер в состоянии апоптоза ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, приводящей к угрозе формирования фетоплацентарной системы и развития плода
3. Раскрытие изобретения
Особая роль жирных кислот принадлежит в процессах, ответственных за формирование различных систем органов, так как они являются основными структурными компонентами клеток, что особенно важно для развивающегося плода [1, 3]. Пальмитиновая кислота, наряду с углеводами, является основным энергетическим соединением, необходимым как для депонирования в тканях, так и в качестве энергетического субстрата для окислительных процессов [7, 13]. При этом пальмитиновая кислота единственная, которую клетки организма синтезируют из ацетата, пирувата, лактата, лейцина и глюкозы при действии мультиферментного комплекса - синтазы жирных кислот [3]. Апоптоз считается жизненно важным компонентом различных процессов, в том числе нормального клеточного цикла, правильного развития и функционирования иммунной системы, эмбрионального развития и химико-индуцированной гибели клеток. Нарушение процесса апоптоза (его активация или угнетение) является фактором развития патологии беременности [2]. Избыток в организме пальмитиновой кислоты инициирует апоптоз в различных типах клеток [8, 11, 12], в том числе в плаценте, что, в свою очередь, нарушает функцию последней.
4. Новая техническая задача
Определение изменения содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови и гомогенате плаценты, свидетельствующее об увеличении числа ядер в состоянии апоптоза при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью оценки угрозы формирования фетоплацентарной системы и развития плода.
5. Прототипом исследования явились работы зарубежных и отечественных авторов, в которых представлены данные об индуцированной гибели клеток, вызванной избыточным содержанием пальмитиновой кислоты в панкреатических клетках [10], гепатоцитах [4, 14], клетках почечных и проксимальных канальцев [9]. Эти данные получены либо в эксперименте (на изолированных клетках, инкубируемых пальмитиновой кислотой), либо при других патологических состояниях вне беременности.
В отличие от вышеописанных прототипов в данном исследовании имеются существенные различия: 1) объектом исследования является периферическая кровь беременной на третьем триместре гестации, 2) изучалось содержание пальмитиновой кислоты в гомогенате плаценты роженицы, 3) в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты подсчитывалось количество ядер в состоянии апоптоза.
6.Осуществление изобретения
6.1. Обследованы 25 пациенток 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 20 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса, IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №226.
6.2. Верификация цитомегаловируса, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами иммуноферментного анализа на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК ЦМВ методами ПНР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
6.3. Содержание пальмитиновой кислоты в периферической крови у беременной на третьем триместре гестации, а также в гомогенате плаценты рожениц определяли методом газожидкостной хроматографии. Кровь забирают из локтевой вены утром, натощак в пробирку с 0,5 мл антикоагулянта.
6.4. Липиды из периферической крови и гомогената плаценты экстрагировали по методу Folch [6] смесью хлороформ - метанол (2:1). Полученный экстракт упаривали в токе воздуха досуха. К экстракту липидов добавляли порциями 5 мл ацетона и оставляли на ночь при t 3-5°С. Полученный осадок центрифугировали и проводили метилирование жирных кислот [5].
6.5. Полученный метиловый эфир пальмитиновой кислоты анализировали на газовом хроматографе «Кристалл 2000 м» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Обсчет и идентификацию пиков выполняли с помощью программно-аппаратного комплекса Хроматэк Аналитик 2,5 по временам удерживания с использованием стандартов фирмы «Supelco» (США). Количественный расчет хроматограмм проводили методом внутренней нормализации путем определения площадей пиков анализируемых компонентов и их доли (в относительных %) в общей сумме площадей пиков метилированных продуктов высших жирных кислот.
6.6. Количество ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, находящихся в состоянии апоптоза, определяли на парафиновых срезах по метке концов фрагментов ДНК по ISEL-методу (in situ end-labeling). Подсчет проводили на 2000 ядер.
1
2
6.7. Статистический анализ и обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistika 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном интервале 95% и числе степеней свободы F=n+n-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовских распределений применяли непараметрические критерии Колмагорова-Смирнова и Манна-Уитни.
7. Полученные данные
В процессе исследования получены следующие результаты. У беременных, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 отмечается повышение содержания пальмитиновой кислоты в периферической крови женщин до 30,30±0,27% (контроль - 24,30±0,30%), в гомогенате плаценты до 34,50±0,46% (контроль - 30,10±0,33%) и увеличивается число ядер в состоянии апоптоза в синцитиотрофобласте плаценты до 3,50±0,02% (контроль - 1,20±0,009%). Таким образом, повышение концентрации пальмитиновой кислоты в периферической крови и гомогенате плаценты при нарастании титра антител класса G к ЦМВ 1:1600 указывает на увеличение числа ядер в состоянии апоптоза, приводящего к угрозе формирования фетоплацентарной системы и развития плода.
Литература
1. Захарова И.Н., Суркова Е.Н. Роль полиненасыщенных жирных кислот в формировании здоровья детей // Педиатрия. 2009. Т. 88, №6. С. 84-91.
2. Севрук О.В. Апоптоз - участник патологических процессов в организме человека (обзор литературы) // Репрод. здоровье в Беларуси. 2010. №3. С. 139-151.
3. Сидельникова В.М. Применение омега-3 полиненасыщенных жирных кислот для профилактики и комплексного лечения тромбофилических нарушений при беременности // Рус. мед. журнал. 2008. Т. 16, №6. С. 1-6.
4. Стороженко Г.В., Бабенко Н.А. Влияние пальмитиновой кислоты на содержание кардиолипина и фосфатидной кислоты в изолированных гепатоцитах крыс. Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. 2010. Вып. 11, №905. С. 32-36.
5. Carren J.P., Dubacy J.P-J. Adaptation of a micro-seale metod to the micro-seale for fatty acid methyl trausestenif: cation of biological lipid extracts // Chromatography. 1978. Vol. 151. P. 384-390.
6. Folch J., Lees M., Sloane G.H. A simple metod for the isolation and purification of total lipids from animals tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226. P. 497-509.
7. Herrera Ε. Implications of dietary fatty acid during pregnancy on placental, fetal and postnatal development: a review // Placenta. 2002. №23. P. 9-19.
8. Saturated free fatty acid release and intracellular ceramide generation during apoptosis induction are closely related processes / M. Iturralde, S. Games, J. Pardo [et al.] // Biochem. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1634. P. 40-51.
9. α-Linolenic acid protects renal cells against palmitic acid lipotoxicity via inhibition of endoplasmic reticulum stress / E. Katsoulieris, J. Mabley, M. Samai // Europen Journal of Pharmacology. 2009. №623. З. 107-112.
10. Palmitate induced lipoapoptosis of exocrine pancreas AR42J cell / Z. Landau, E. Forti, M. Alcaly [et al.] // Apoptosis. 2006. Vol. 11(5). P. 717-724.
11. Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome С release in palmitate-induced cardiomyocyte apoptosis / D.B. Ostander, G.C. Sparagna, Amoscato A.A. [et al.] // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 38061-38067.
12. Fatty acid-induced apoptosis in neonatal cardiomycytes: redox signaling / G.C. Sparagna, D.L. Hickson-Bick, L.M. Buja [et al.] // Antioxid. Redox Signal. 2001. Vol. 3, №1. P. 71-79.
13. Springer M., Dordrecht L. Fatty acid-binding protein: fuel metabolism // Molecular and cellular biochemistry. 2007. Vol. 299, №1-2. P. 75-84.
14. Palmitic and linoleic acids induce ER stress and apoptosis in hematoma cell / Y. Zhang, X. Rongliang, Z. Zhang [et al.] // Lipid in Health and Disease. 2012. Vol. 11, №1. P. 145-149.