Циклофиллин а как потенциальный маркер рака желудка

ЦИКЛОФИЛЛИН А КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ МАРКЕР РАКА жЕЛУДКА

Е.С. ГРИГОРЬЕВА1, М.А. БУЛДАКОВ1, И.Г СТЕПАНОВ12, М.В. завьялова12, в.в. волкоморов1, с.в. вторушин12

НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск1,

ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Томск2

Актуальность. Циклофилин А является представителем семейства иммунофилинов и играет важную роль в формировании компетентного фолдинга белков, хемотаксисе и сигнальной трансдукции. Некоторое время назад предметом для изучения стала взаимосвязь между экспрессией циклофилина А и опухолевым патогенезом. Уровень синтеза циклофилина А значительно повышается при немелкоклеточном раке легкого, наряду с фактором, ингибирующим миграцию макрофагов (М^). Увеличение экспрессии циклофилина А отмечается также в клеточных линиях опухоли поджелудочной железы в эксперименте. В карциноме эндометрия показано 27-кратное увеличение экспрессии циклофилина А по отношению к нормальной ткани.

Цель исследования. Определить уровень синтеза циклофилина А в опухолевой ткани и нормальной слизистой при раке желудка. Оценить диагностическую и прогностическую ценность циклофилина А как маркера рака желудка. Оценить возможность использования циклофилина А для дифференциальной диагностики диффузного и интестинального типа рака желудка.

Материал и методы. В исследование включены больные раком желудка стадий Т1-4Ы0-2М0 различных гистотипов (диффузного и кишечного). После резекции опухоли при оперативном вмешательстве образцы максимально быстро помещались в жидкий азот и хранились при -80°С. 2D гель-электрофорез образцов проводили согласно методу О’Фаррела, с некоторыми вариациями.

Для сравнения нормального и опухолевого протеомов использовали метод двумерного электрофореза парных образцов опухолевой и нормальной ткани от пациентов с диагнозом рак желудка (РЖ), подтвержденным гистологически. Для изоэлектрического фокусирования на

трубки наносили по 100 мкг суммарного белка. Разделение во втором направлении проводили в градиентном полиакриламидном геле (1022 %) при 25 мА, в течение 16 ч. Гели фиксировали и окрашивали нитратом серебра. Кусочки геля, содержащие белки с повышенной экспрессией в опухолях желудка обрабатывались трипсином методом PMF. Белки идентифицировали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Полученные электрофореграммы нормальной слизистой желудка и опухоли от каждого пациента сравнивали между собой, выявляли пятна, с повышенной интенсивностью в опухоли более чем в 3 раза. Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot в базе данных NCBI с учетом возможности окисления метиониновых остатков кислородом воздуха и модификации цистеиновых остатков акриламидом.

Вестерн-блот анализ. Растворимую фракцию белков разделяли в градиентном полиакриламидном геле (10-22 %), переносили на поливинилдифторидную мембрану (PVDF, Millipore) и инкубировали с коммерческими антителами к циклофилину А (Santa Cruz Biotechnology, Inc).

ПЦР-анализ в режиме реального времени. Образцы опухолевой и нормальной ткани от 18 больных использованы для выделения РНК с целью оценки генной экспрессии циклофилли-на А (тРНК) методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР).

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ). Парафиновые блоки опухолевого материала от 35 пациентов послужили для подтверждения белковой экспрессии in situ и оценки влияния клинико-патологических особенностей злокачественного процесса на экспрессию белка в опухолевых клетках.

Результаты. Выявлен более высокий уро-

вень экспрессии циклофилина A в опухолевой ткани желудка по сравнению с нормальной слизистой в большинстве проанализированных с помощью 2D-анализа парных образцов. Для подтверждения повышенного уровня генной экспрессии циклофиллина у 18 пациентов с раком желудка проведено тестирование тРНК методом ОТ-ПЦР в замороженных парных образцах опухолей и нормальной слизистой. Средний уровень мРНК в опухолях составил 1,7 отн.ед. по сравнению с 1,4 отн.ед. в нормальной ткани (в пересчете на ген-рефери бета-актин), при этом сверхэкспрессия наблюдалась в 70 % образцов опухолей. Средний уровень белка по результатам вестерн-блот анализа (в пересчете на референсный белок бета-актин) составил 14,4 в опухоли и 1,4 в нормальной слизистой, при этом повышенная экспрессия (в 2,0 - 140 раз выше нормы) отмечена у 67 % пациентов. Для подтверждения наличия циклофиллина в клетках опухоли in situ провели ИГХ анализ на срезах тканей из парафиновых блоков 37 пациентов с использованием коммерческих антител. В общей группе больных положительная реакция на циклофиллин выявлена в 38 % случаев, при этом нет окраски в метастатических лимфатических узлах. При разделении пациентов на 2 группы по гистологическому типу опухоли на диффузный и интестинальный был отмечен более высокий процент циклофиллин-положительных образцов по всем 3 видам тестирования в группе диффузного типа: 86 % для мРНК, 63 % для вестерн-блот анализа и 71 % для ИГХ по сравнению с 67, 57, 42 % соответствен-

но для опухолей интестинального типа (р=0,1). Оказалось, что направленность изменений экспрессии циклофиллина в опухоли по сравнению с нормальной тканью (сверхэкспрессия, неизменность или снижение), оцениваемая разными методами, совпадала в 90 % случаев. В общей группе больных не выявлено связи экспрессии мРНК и синтеза белка, а также его детекции в ткани со стадийностью процесса. При диффузном типе РЖ есть определенная зависимость: сверхэкспрессия по результатам всех тестов наблюдается у больных Т3-4 стадии, при интестинальном такой зависимости не найдено.

Выводы. Показана сверхэкспрессия гена ци-клофиллина и уровня белка в опухолях желудка, более выраженная при диффузном гистотипе по сравнению с кишечным. При иммуногистохи-мическом окрашивании реакция в опухолевых клетках была весьма слабой, что может свидетельствовать о недостаточной чувствительности коммерческих антител для детекции белка в ткани в единичных клетках. Это не позволило получить статистически значимых различий его экспрессии в опухолях у больных с диффузным и интестинальным типами РЖ, а также в зависимости от исхода заболевания. Для разработки методов диагностики и прогноза необходимо создание высокочувствительных антител для детекции циклофиллина А.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (08-04-13705-офи_ц) и Международного научно-технического центра (# 3909).

к вопросу о структуре патологических изменений эндометрия по результатам диагностического ВЫСКАБЛИВАНИЯ

В.Н. ГУЛИЕВА, х.т. гоголадзе, н.г. чиковани, а.х. биштави, А.М. ЧАБРОВ, А.Е. ИВАНОВ

Онкологический клинический диспансер № 1, г. Москва,

Кафедра акушерства и гинекологии МПФ IМГМУ им. И.М. Сеченова, г. Москва

Данные о риске прогрессирования гиперпла- отсутствием общепринятой классификации ГЭ

зии эндометрия (ГЭ) в рак эндометрия (РЭ) ва- и значительным числом расхождений в оценке

рьируют в широких пределах. Это обусловлено одних и тех же гистологических препаратов