АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ 2-ГО СЕРОТИПА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ
ATTENUATED STRAIN OF SEROTYPE 2 AFRICAN SWINE FEVER VIRUS FOR DEVELOPING DIAGNOSTIC AND VACCINE PREPARATIONS

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению аттенуированного штамма КК-262/С вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских и диагностических центрах при проведении вирусологических, молекулярно-генетических исследований и разработке диагностических и вакцинных препаратов при АЧС.
С этой целью используют вирулентные и аттенуированные штаммы вируса АЧС, размножающиеся в первичных культурах клеток костного мозга свиней (KMC) и лейкоцитов свиней (ЛС), а также в перевиваемых культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения (1).
С использованием реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд), предложенной для серологического типирования штаммов, установлено 8 серотипов вируса АЧС, отличающихся между собой в иммунной пробе, что обуславливает необходимость получения аттенуированных штаммов для каждой иммуногруппы (2).
За рубежом получены и охарактеризованы аттенуированные штаммы и варианты вируса АЧС: Хинде-169, Катанга-105, Мадейра-105 1-го серотипа и др., которые выращивают в первичных культурах клеток KMC или ЛС. Указанные штаммы характеризуются высокими реактогенностью и виремией, осложнениями, низкой иммуногенностью, что затрудняет их использование при разработке вакцинных препаратов.
Для устранения указанных недостатков используют перемежающиеся пассажи вируса в первичных и перевиваемых культурах клеток, методы селекции, основанные на иммуносорбции и отборе термочувствительных клонов и др. Полученные штаммы Катанга-350, ЛС-72, Кимаки-155 и др. характеризовались умеренной реактогенностью и виремией и защищали 60-70% иммунизированных животных на 21 сутки после контрольного заражения (КЗ) гомологичным вирулентным вирусом (3).
Наиболее близким аналогом предполагаемого изобретения является селекционированный во ВНИИВВиМ штамм КК-202, используемый для получения вируссодержащего сырья, который типируется в РЗГАд специфической референс-сывороткой 2-го иммуносеротпа, а по результатам генотипирования отнесен ко 2 генотипу.
3
3
50
50
Получение вируссодержащего сырья в стационарном монослое первичной культуры клеток KMC. С этой целью культуру клеток, выращенную в матрасах вместимостью 1,0 или 1,5 дм, заражают штаммом КК-202 в дозе 0,01-0,001 ГАЕ/клетку. В качестве ростовой среды при выращивании вируса применяют среду 0,1% ГЛА или Игла MEM с 8,0-10,0% сыворотки крови свиней. Культивирование вируса проводят в течение 5-7 сут при температуре (37,0±0,5)°С. Титр вируса в вируссодержащем сырье составляет не менее 6,5-7,0 lg ГАЕ/см.
Этот штамм обладает высокой реактогенностью, низкой иммуногенностью и наличием осложнений (угнетение, высокая температурная реакция и виремия, кровоизлияния в паренхиматозных органах и др.) у привитых животных, а также невозможностью использования роллерной технологии при получении вируссодержащего сырья, как более технологичной.
В перевиваемых линиях клеток почки и тестикул поросенка (ПП-66б, ППК, РК-15, ПТП) вирус не размножается.
Штамм КК-262/С 2-го серотипа вируса АЧС получен путем адаптации к культуре клеток ППК-66б штамма КК-202 в течение 50 пассажей и последующей селекции вируса методом предельных разведений в этой культуре клеток и культуре клеток KMC.
Штамм КК-262/С 2-го серотипа депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, инв. №1831.
Аттенуированный штамм КК-262/С вируса АЧС обладает следующими свойствами.
50
3
Культуральные свойства. Размножается в перевиваемой культуре клеток ППК-66б, выращенной стационарным (матрасы) или роллерным способом (роллерные бутыли) с характерными для вируса АЧС цитоплазматическими изменениями с последующей деструкцией монослоя. При этом он сохраняет способность размножаться в культуре клеток KMC и ЛС, вызывая в них выраженную гемадсорбцию и последующий лизис клеток, что дает возможность использовать эти культуры клеток для определения инфекционной активности вируса. Титр вируса, выращенного в культуре клеток ППК-66б при стационарном и роллерном способах культивирования, достигает 7,0-7,5 lg ГАЕ/см.
Антигенные свойства. При внутримышечном введении свиньям штамм вызывает образование комплемент связывающих, преципитирующих и ЗГАд-антител.
7,0
7,5
50
Безвредность. Безвреден для свиней при внутримышечном введении в максимальной (10-10ГАЕ) дозе. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) является не патогенным.
Контагиозность и реверсибельность. Вирус не передается при совместном содержании от привитых интактным свиньям.
Не восстанавливает вирулентные свойства после пяти последовательных внутримышечных пассажей на свиньях.
6,0
7,5
50
Реактогенность. Слабореактогенен для свиней при внутримышечном введении. У отдельных свиней, привитых в дозе 10-10 ГАЕ, может вызывать в течение 3-5 суток повышение температуры тела до 40,6-40,9°С.
6,0
7,5
50
Иммуногенные свойства. После внутримышечного введения в дозе 10-10 ГАЕ вызывает защиту свиней против гомологичного вирулентного референс-штамма К-49 на 21 сутки после прививки в течение не менее 4-х месяцев.
Основные биологические свойства штаммов КК-262/С и КК-202 вируса АЧС приведены в табл.1
Таблица 1
Сравнительные характеристики штаммов КК-262/С и КК-202 вируса АЧС
Штамм вируса АЧС
Накопление в культурах клеток (lg ГАЕ<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
Уровень виремии (lg ГАЕ<sub>50</sub>//см<sup>3)</sup>
Реактогенность
Реакция на прививку
Защита от КЗ на 21 сутки (%)
KMC
ППК-66б
Т°С
Длительность (сут)
КК-262/С
7,25±0,11
7,5±0,11
4,0-4,5
Слабореактогенен
40.6-40,9
3-5
80-85
КК-202
7,00±0,18
Не размножается
5,0-5,75
Реактогенен
40,9-41.7
6-11
65-70
Как видно из таблицы, аттенуированный штамм КК-262/С вируса АЧС превосходит по основным биологическим показателям штамм КК-202 этого серотипа.
Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Вирус не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и другими микроорганизмами.
Стабильность генетических и иммунобиологических признаков. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 20 пассажей культивирования в культуре клеток ППК-66б и KMC (срок наблюдения).
Способ, срок хранения, периодичность пассажей. Штамм КК-262/С хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°С и «освежают» пассированием в культурах клеток ППК-66б или KMC один раз в 10 лет.
Для подтверждения преимущества настоящего изобретения приведены примеры конкретного его исполнения.
Пример 1. Адаптация вируса АЧС к перевиваемой культуре клеток ППК-66б
50
50
3
3
Адаптацию вируса к культуре клеток проводили путем инокуляции ее аттенуированным штаммом КК-202, выращенным в первичной культуре клеток KMC (первый пассаж), а в последующих пассажах материалом предыдущего. Инфицированную культуру клеток, выращенную в матрасах, инкубировали при (37,0±0,5)°С в течение 6-9 суток. О размножении вируса в клетках судили по проявлению цитопатического действия. На уровне 6-8-х пассажей специфическую дегенерацию у инфицированных клеток (30,0-40,0) % отмечали на 4-5 сутки, титр вируса на 8-9 сутки выращивания составлял 5,5-6,0 lg ТЦД/см. Репродукция вируса в последующих пассажах характеризовалась специфическими дегенеративными изменениями, появление которых отмечали на 3-4 сутки, и накопление вируса на 6-7 сутки составило 7,0-7,5 lg ТЦД/см.
Пример 2. Культивирование штамма КК-262/С вируса АЧС в перевиваемой культуре клеток ППК-66б роллерным способом
В результате выполненных исследований были отработаны оптимальные параметры роллерного способа культивирования штамма, которыми являлись:
50/кл
- множественность заражения 0,1-0,01 ГАЕ;
- содержание сыворотки крови свиней в среде 0,1 ГЛА или Игла-МЕМ 8-10,0%;
- скорость вращения роллерных бутылей 12-16 об/ч;
- рН среды 7,2-7,4;
- длительность культивирования 6-7 суток;
- температурный режим (37,0±0,5)°С;
3
- объем заполнения роллерных трехлитровых бутылей 0,3-0,5 дм.
50
3
Данные режимы культивирования позволяли получать вируссодержащий материал с активностью 7,0-7,5 lg ГАЕ/см. Результаты наработки вирусного сырья 3 опытных серий на основе штамма КК-262/С вируса АЧС представлены в табл.2.
Таблица 2
Характеристика вируссодержащего сырья, полученного в культуре клеток ППК-66б.
Номер серии
Культура клеток
Кол-во бутылей
Заражающая доза, ГАЕ <sub>50</sub>/кл
Длительность культивирования (сут)
Объем серии (л)
Титр вируса (lg ГАЕ <sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
1
10
0,1
5
3,0
7,5
2
ППК-66б
10
0,01
6
3,0
7,25
3
10
0,001
8
3,0
7,0
50
3
Как видно из табл.2, активность 3-х серий вируссодержащего сырья, полученного роллерным способом в культуре клеток ППК-66б, составляла 7,0-7,5 lg ГАЕ/см.
Пример 3. Проверка реверсибельности штамма КК-262/С вируса АЧС
50
3
С этой целью проводили 5 пассажей штамма КК-262/С вируса АЧС на восприимчивых животных. При проведении первого пассажа культуральный вирус вводили подсвинку 3-месячного возраста в дозе 7,25 lg ГАЕ внутримышечно в средней трети шеи. На 6-е сутки подсвинка убивали, у него отбирали бронхиальные и предлопаточные лимфоузлы, из которых готовили 10,0% суспензию на физиологическом растворе. Полученный материал дважды промораживали при минус 40,0°C и после осветления (1500 об/мин в течение 15 минут) вводили внутримышечно следующему животному в объеме 1,0 см (второй пассаж). Аналогично проводили последующие пассажи.
У опытных животных отсутствовала клиническая реакция на прививку, а также реакция на месте введения вируса. Подсвинок 5-го пассажа не заболел АЧС в течение 21 суток после введения материала (срок наблюдения). Это указывало на то, что штамм КК-262/С вируса АЧС не реверсибелен.
Пример 4. Проверка иммунобиологических свойств штамма
50
50
Безвредность штамма изучали на 3-х подсвинках 3-4 месячного возраста. Штамм вводили внутримышечно в области средней трети шеи. Двух подсвинков прививали вирусом в дозе 7,5 lg ГАЕ, а одного - в дозе 7,0 lg ГАЕ. В течение 15 суток иммунизированные подсвинки оставались клинически здоровыми. У привитых животных на 7-9 сутки отмечали повышение температуры тела до 40,6-40,7°C в течение 2-3 суток.
50
3
Иммуногенность штамма определяли по результатам контрольного заражения привитых животных гомологичным вирулентным штаммом К-49 в дозе 1000 ГАЕ(LD)/см.
50
С этой целью по 2 подсвинка 3-4-х месячного возраста прививали вирусом в дозе 7,0 и 6,0 ГАЕ соответственно. У привитых животных отмечали повышение температуры до 40.7°C в течение 3 суток.
Через 21 сутки после введения вируса всех привитых животных и одного контрольного заражали гомологичным вирулентным вирусом. Одновременно с этими животными заражали свиней, используемых в опыте по определению безвредности (табл.3).
Таблица 3
Иммунобиологические свойства штамма КК-262/С вируса АЧС
Штамм вируса АЧС
Прививная доза (lg ГАЕ <sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
Кол-во ж-х
Реакция на прививку
Результаты КЗ
Длит. темп. реакции, (сут)
Максм. тем-pa (°C)
Длит. темп. реакции (сут)
Макс, температура (°C)
КК-262/С
7,5
2
3
40,7
3
40.9
7,0
1
2
40.6
5
40,8
7,0
2
3
40.7
4
40,9
6,0
2
2
40,6
3
41,0
Контроль
1
-
-
9
41.8
Контрольный подсвинок погиб на 9-е сутки после заражения с признаками АЧС (температура тела до 41.8°C, синюшность кожных покровов, угнетение, анорексия, диарея, гиперплазия лимфоузлов, увеличение и полнокровие селезенки и др.), тогда как привитые животные оставались клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения.
50
Полученные данные показывают, что адаптированный к перевиваемой культуре клеток ППК-66б штамм КК-262/С создает через 21 сутки у животных, привитых в дозе 6,0-7,0 lg ГАЕ, защиту против вирулентного вируса АЧС. Штамм слабореактогенен, не реверсибелен и безвреден для свиней.
Источники информации
1. В.А.Сергеев. Вирусные вакцины. 1993 г.
2. В.М.Балышев. Иммунобологические и молекулярно-генетические свойства изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных в Российской Федерации. / В.М.Балышев, Ю.Ф.Калантаенко, А.Н.Жуков, С.Ж.Цыбанов, И.М. Калабеков / Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России: материалы Всероссийской научной конференции. - М., 2010. - С.94-98.
3. Черятников Л.Л. Получение аттенуированных вариантов из различных изолятов вируса АЧС и их сравнительная оценка. / Л.Л.Черятников, Ю.И.Петров, Н.И.Митин / Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии 1992. - Ч.1. - С.56.