Способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов
METHOD FOR IDENTIFYING PROMISING PROBIOTIC STRAINS FROM NATURAL MEDIA

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам выявления и селекции штаммов микроорганизмов, и может быть использовано для получения новых видов пробиотических препаратов.
Пробиотики - живые микроорганизмы, приносящие пользу организму хозяина при введении в адекватных количествах. Основными функциями пробиотиков являются: поддержка колонизационной резистентности, метаболизм пищевых субстратов и утилизация конечных метаболитов, продукция субстратов, необходимых для макроорганизма, а также регуляция местного и адаптивного иммунного ответа.
Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Escherichia
Saccharomyces
К пробиотикам, в частности, относятся бактерии родов  и грибы рода .
В основе колонизационной резистентности лежит способность пробиотических штаммов предотвращать колонизацию желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микроорганизмами вследствие конкуренции за питательные вещества, а также путём синтеза ряда антибактериальных метаболитов, активных в отношении патогенных бактерий. Пробиотики метаболизируют компоненты пищи и некоторые другие субстанции, за счет наличия специфических ферментов, отсутствующих у организма-хозяина.
Пробиотические штаммы осуществляют синтез большого числа важнейших метаболитов, которые участвуют в поддержании гомеостаза макроорганизма. К таким метаболитам относятся короткоцепочечные жирные кислоты, поддерживающие регуляцию энергетического гомеостаза, а также служащие сигнальными молекулами для клеток иммунной системы, определяя их дифференцировку и противовоспалительную активность. Пробиотические микроорганизмы продуцируют медиаторы – допамин, норадреналин, серотонин, гамма-аминомасляную кислоту и гистамин. Кроме того, пробиотики синтезируют незаменимые для макроорганизма метаболиты: триптофан и витамины группы В.
Метаболиты пробиотических бактерий взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками и участвуют в регуляции местного и системного иммунного ответа.
Для расширения спектра пробиотических микроорганизмов, для поиска новых, эффективных штаммов, способных оказать значительное положительное влияние на организм хозяина, необходимы способы и методы, позволяющие выделить и идентифицировать микроорганизмы, обладающие необходимыми свойствами и отвечающие требованиям, предъявляемым к пробиотическим препаратам.
Известны способы решающие аналогичные задачи в иных направлениях. Так в (патенте  RU 2624667C1, B09C1/10, опуб. 05.07.2017) «Способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремедиации» описан способ выделения штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти, включающий стадии селекции и выделения чистой культуры, оценки выделенных штаммов. Известно изобретение (по патенту RU 2241745 С2, C12N1/26, B09C1/10, опубл. 10.12.2004) «Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов». Сущностью является способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что селекцию начинают на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведут при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней. Известен способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов (RU 2352630 C1, C121/10,C12N1/26, опубл. 20.04.2009), отличающийся тем, что после выделения проводят активацию микроорганизмов с помощью стимуляторов. Известен способ (патент RU 2133775 С1, C12Q1/04,C12N1/04, опубл. 27.07.1999) выделения штаммов-деструкторов, обладающих полисубстратной специфичностью, техническим результатом которого является возможность отбора наиболее ценных штаммов микроорганизмов. Известны способы получения аутопробиотиков, из фекальных масс организма-хозяина (патент RU 2580002 С1, C12N1/20, A61K35/74, C12R1/07, опубл. 10.04.2016) «Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии» и (патент RU 2139070 С1, A61K35/74, C12N1/20, опубл. 10.10.1999) «Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы». Сущность данных способов заключается в выделении и накоплении пробиотически активных штаммов из фекалий.
Однако данные способы не позволяют получить новые штаммы, отсутствующие у данного хозяина, и провести оценку выделенных микроорганизмов по важным признакам и свойствам, обуславливающим их пробиотическое действие.
В целях достижения заявленного результата была разработана методика отбора и селекции пробиотических микроорганизмов, за счет того, что включает их скрининг на ДНК-протекторную и антиоксидантную активность, и позволяющая выявлять наиболее перспективные штаммы, потенциально обладающие значительным потенциалом системных положительных эффектов в организме хозяина.
Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов, включающий отбор проб с субстратов, выделение и очистку штаммов микроорганизмов, при этом после выделения проводят исследование безопасности и свойств микроорганизмов, обусловливающих их потенциальное пробиотическое действие;
-  проверяются антиоксидантные свойства микроорганизмов, и отбираются штаммы обладающие антиоксидантной активностью выше 40%;
- проверяются ДНК-протекторные свойства микроорганизмов, и отбираются штаммы обладающие ДНК-протекторной активностью выше 40%.
Технический результат заключается в поиске новых, эффективных штаммов, способных оказать значительное положительное влияние на организм хозяина, и позволяет выделить и идентифицировать микроорганизмы, обладающие необходимыми свойствами и отвечающие требованиям, предъявляемым к пробиотическим препаратам, а также проводить более эффективный скрининг за счет учета прогностически информативных параметров выработки низкомолекулярных метаболитов, обеспечивающих пробиотические свойства анализируемых штаммов.
Сущность способа состоит в следующем:
Проводится сбор материала, включая помет, содержимое слепой кишки, образцы подстилки.
Lactobacillus
Полученные образцы высеваются на твёрдых питательных средах и очищаются до отдельных штаммов методом истощающего штриха. Для чего пробы тщательно перемешиваются, затем из каждой отбирается две навески по 10 г. Для выделения  используют среду MRS (ЛенРеактив) с добавлением сорбиновой кислоты. Молочнокислые бактерии инкубируют в анаэробных условиях, при следующем составе газовой среды: 95% N2, 4% СО2, 1% О2.
Выделенные штаммы проверяются на безопасность, на отсутствие гемолитической активности, чувствительность к антибиотикам, и мутагенность. Для определения гемолитической активности штаммы высевают на кровяной агар и инкубируют при температуре 42°С в течение 48 часов. Гемолитическую активность оценивают по наличию и ширине зоны лизиса.
Для определения чувствительности к антибиотикам штаммы засевают газоном на соответствующие твёрдые питательные среды. Далее на них же помещают стандартные диски с антибиотиками: амоксициллином, ципрофлоксацином, цефтриаксоном, азитромицином, карбопенемом, эритромицином, тетрациклином, гентамицином, по 4 диска на одну чашку в 2х повторностях. Штаммы инкубируют при 42°С в анаэробных условиях, результат учитывают через 48 часов.
E.coli
Photorhabdus luminescens
Е. coli
У штаммов, прошедших тесты на антибиотико-чувствительность и гемолитическую активность, исследуют антиоксидантные и генопротекторные свойства с помощью lux-биосенсоров. В качестве биосенсоров применяли рекомбинантные штаммы  MG1655 (pKatG-lux) и MG1655 (pRecA-lux), содержащие плазмиды с опероном luxCDABE фотобактерии , поставленным под контроль соответствующих промоторов . Данный оперон содержит гены люциферазы и их регуляторы и обеспечивает биолюминесценцию, используемую в данном тесте в качестве репортерной функции. Биосенсоры с плазмидой pKatG реагируют на наличие в среде окислителей, в частности, перекиси водорода. Биосенсоры с плазмидой pRecA реагируют на наличие в клетке факторов, вызывающих повреждение ДНК.
Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37ºС до ранней или средней логарифмической фазы. Ночную культуру разбавляли свежей средой до плотности 0,01 - 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅107 - 3⋅106 клеток/мл). Измерения плотности проводились при помощи денситометра DEN-1B («Biosan»). Затем суспензию подращивали до ранней логарифмической фазы. Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносили в стерильные ячейки (находящиеся в стрипах планшета) и добавляли в них по 10 мкл тестируемого препарата (кроме контрольных ячеек). В контрольные ячейки добавляли 10 мкл деионизированной воды.
После обработки планшет с пробами помещали в люминометр, при температуре 30°С и измеряли изменения интенсивности биолюминесценции.
s
Фактор индукции SOS ответа/окислительного стресса/повреждения ДНК (I) вычисляют по формуле:
(1) ,
k
где: L – интенсивность люминесценции контрольной пробы (в условных единицах);
e
L– интенсивность люминесценции опытной пробы (в условных единицах).
e
k
Признаком статистической значимости эффекта SOS-индукции считали статистически значимое превышение Lнад L, оцениваемое по t-критерию.
Показатель протекторной активности (А, %) вычисляют по формуле:
(2)
a
где: I – фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием в присутствии ингибитора.
p
I- фактор индукции SOS-ответа ципрофлоксацином.
Среднее квадратичное отклонение факторов индукции S вычисляют по формуле:
(3)
e
k
где индексы  и  относятся к опыту и контролю, соответственно.
Штаммы проявившие генопротекторные и антиоксидантные свойства отбирают для дальнейшей работы, и исследуют на пригодность к использованию в производственных целях. Определяют скорость роста, устойчивость к температурам и рН, скорость утилизации субстрата. Скорость роста оценивают по времени появления мутности суспензии клеток 0,5 по Макфаланду.
Проводя селекцию наиболее перспективных штаммов, безопасных и обладающих наиболее выраженной антиоксидантной и антимутагенной  активностью, а так же высокой скоростью роста и утилизацией субстрата, получают штаммы максимально подходящие для производства пробиотических препаратов.
Пример 1
Проведен отбор подстилки и помета у следующих групп птиц:
1. яичный кросс Хайсекс-браун, клеточное содержание, корм: стандартная кормосмесь; ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», х. Гуляй-Борисовка Зерноградского района РО;
2. яичный кросс Хайсекс-браун, клеточное содержание, корм: стандартная кормосмесь; ОАО «Птицефабрика Белокалитвинская», п. Сосны Белокалитвинского района РО;
3. бройлеры напольного содержания, кросс Кобб, корм: полнорационный комбикорм; птицефабрика «Донецкий бройлер» (ИП Строителев О.Н.), г. Донецк, РО;
4. бройлеры клеточного содержания, кросс Кобб, корм: полнорационный комбикорм; учхоз ДГТУ, РО;
5. яичный кросс Хайсекс-браун, свободновыгульное содержание, корм: комбикорм ПК-1-2; личное подсобное хозяйство, п. Персиановский Октябрьского района РО;
6. яичная порода полосато-пестрый леггорн, свободновыгульное содержание, корм: полнорационный комбикорм с добавками в виде овощей до 20% рациона, личное подсобное хозяйство, с. Раздольное, Краснодарский край;
7. яичный кросс Хайсекс-браун, свободновыгульное содержание, корм: комбикорм «Мегамикс» с добавками в виде овощей до 10% рациона; личное подсобное хозяйство, г. Ростов-на-Дону.
Все группы не получали каких-либо пре- или пробиотических добавок ни в виде корма, ни в виде препаратов для подстилки. Также все группы не получали антибиотиков минимум за полгода до начала исследований.
Для отбора выбирали свежий помёт, полученный от нескольких, не менее 5-6 здоровых птиц. Отобранный помёт в количестве 30-40 г. помещали в стерильные пластиковые контейнеры. Все пробы охлаждали до температуры +4°С и в течение 24 часов доставляли в лабораторию. В процессе транспортировки обеспечивали поддержание температурного режима +4 - +8°С.
Из проб было отобрано 38 штаммов молочнокислых бактерий, которые представлены в Таблице 1.
Определение видовой принадлежности штаммов было проведено методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Исследование проводили на приборе Microflex LT instrument (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Германия) с использованием программного обеспечения Biotyper (version 3.0) (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Германия).
Таблица 1.
Отобранные штаммы молочнокислых бактерий, их источник и КОЕ/г лактобактерий в источнике.
Источник
Количество Lactobacillus, КОЕ/г
Выделенные штаммы
клеточное содержание, бройлеры, птицефабрика «Донецкий бройлер»
8,0±0,5·108
<i>L. johnsonii</i> KL18
свободновыгульное содержание, личное хозяйство, с. Раздольное
4,0±0,5·108
<i>L. johnsonii </i>KL20, KL21 <i>L</i>. <i>gasseri</i> KL22, <i>L. salivarius</i> KL23, KL24, <i>L. johnsonii</i> KL25, <i>L. johnsonii </i>KL26, <i>L. salivarius</i> KL27, <i>L. johnsonii</i> KL28, <i>L. reuteri </i>KL29
клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», х. Гуляй-Борисовка Зерноградского района РО
3,1±0,1·108
L. <i>frumenti</i> KL31, KL32, <i>L. reuteri</i> KL33, <i>L. gasseri</i> KL34, <i>L. johnsonii </i>KL36, <i>L. salivarius</i> KL37, <i>L.</i><i>frumenti</i> KL39
клеточное содержание, несушки, ОАО «Птицефабрика Белокалитвинская», п. Сосны Белокалитвинского района РО
5,1±0,4·106
<i>L. crispatus </i>KL41
напольное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, РО
1,2±0,2·109
<i>L. salivarius</i> KL61, <i>L. crispatus</i> KL62, <i>L. johnsonii</i> KL63, L. <i>crispatus</i> KL64, L. <i>salivarius</i> KL65, L. <i>crispatus</i> KL66, L. <i>coryniformis</i> KL67
личное подсобное хозяйство, п. Персиановский Октябрьского района РО
4,4±1,2·108
L. <i>crispatus</i> KL71, <i>L. crispatus</i> KL72, L. <i>kitasatonis</i> KL73, L. <i>curvatus</i> KL74, L. <i>reuteri</i> KL75, L. <i>reuteri</i> KL76, L. <i>kitasatonis</i> KL77,
свободновыгульное содержание (РнД), личное подсобное хозяйство, г. Ростов-на-Дону
1,1±0,04·109
L. <i>reuteri</i> KL81, L. <i>crispatus</i> KL82, <i>L. reuteri</i> KL83, <i>L. coryniformis</i> KL84, L. <i>frumenti</i> KL85, L. <i>frumenti</i> KL86, L. <i>crispatus</i> KL87
Все выделенные штаммы проверили на безопасность по следующим параметрам: гемолитическая активность, антибиотикорезистентность, мутагенность. Анализ гемолитической активности при посеве на кровяной агар показал, что из 38 штаммов ни один не обладает такой активностью.
Исследование устойчивость к антибиотикам выявило устойчивость у четырех штаммов молочнокислых бактерий. Штаммы KL21 и KL24 оказались нечувствительны амоксициллину (отсутствие зоны подавления роста), KL32 продемонстрировал слабую чувствительность к эритромицину (зона отсутствия роста 1 мм), KL87 – отсутствие чувствительности к эритромицину (отсутствие зоны подавления роста). Все четыре штамма исключаются из дальнейших исследований.
Тест на повреждение ДНК с биосенсором pRecA показал отсутствие мутагенной активности у всех выделенных штаммов.
Безопасные штаммы были проанализированы на наличие антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств в тестах с биосенсорами. Результаты исследования отображены на фиг. 1 и фиг. 2.
В качестве пробиотических рассматриваются штаммы, обладающие одновременно выраженной ДНК-протекторной и антиоксидантной активностью. В общей сложности отобрано 11 штаммов, удовлетворяющих следующим критериям: антиоксидантная активность выше 40%, ДНК-протекторная активность также выше 40%. По совокупности антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств для применения в качестве пробиотиков были выбраны следующие штаммы:
Таблица 2
№ штамма
Видовое название
Источник
KB16
<i>Bacillus subtilis</i>
напольное содержание, бройлеры, «Донецкий бройлер», помёт
KB18
<i>Bacillus amyloliquefaciens</i>
напольное содержание, бройлеры, «Донецкий бройлер», помёт
KB41
<i>Bacillus subtilis</i>
клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт
KB44
<i>Bacillus amyloliquefaciens</i>
клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт
KB54
<i>Bacillus amyloliquefaciens</i>
свободновыгульное содержание л/х г. Ростов-на-Дону, помёт
KL31
<i>Limosilactobacillus frumenti</i>
клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт
KL61
<i>Ligilactobacillus salivarius</i>
клеточное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, помёт
KL62
<i>Lactobacillus crispatus</i>
клеточное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, помёт
KL73
<i>Lactobacillus kitasatonis</i>
свободновыгульное содержание, л/х п. Персиановский, помёт
KL82
<i>Lactobacillus crispatus</i>
свободновыгульное содержание, л/х г. Ростов-на-Дону, помёт
Lactobacillus
-3
Антиоксидантная активность выделенных штаммов в целом была выше, чем ДНК-протекторная. Известно, что многие штаммы  обладают высокой антиоксидантной активностью за счёт ферментативных систем замещающих каталазу, способности выделять вторичные метаболиты-антиоксиданты, связывать ионы металлов и т.д. (Wang, 2017). Из 36 исследованных штаммов 21 штамм имел антиоксидантную активность более 60%, из них 16 – более 80%. Для сравнения: антиоксидантная активность α-токоферола в концентрации 0,43 мг/мл (10 М) составляет 36,8%.
Lactobacillus
ДНК-протекторная активность выделенных штаммов сильно разнилась между собой. Так, 12 исследуемых штаммов вообще не имели выраженной ДНК-протекторной активности, 7 – имели слабую активность - менее 20%. С другой стороны, 4 штамма имели очень высокую ДНК-протекторную активность (более 80%). Всё это свидетельствует о том, что представители рода  имеют широкий диапазон свойств, и что первичный скрининг активности клеток по целевым параметрам являются обязательным.
В процессе подбора штаммов-пробиотиков необходимо учитывать также их потенциальные промышленные свойства, в том числе скорость роста и наработки биомассы. 11 безопасных и обладающих пробиотической активностью штаммов были протестированы на скорость роста по времени появления мутности суспензии клеток 0,5 по Макфаланду. Данные представлены в табл. 3.
Таблица 3.
Время достижения суспензией лактобактерий мутности 0,5 по Макфарланду.
Штамм
Время, часы
L. <i>frumenti</i> KL31
24
L. <i>salivarius</i> KL61
24
L. <i>crispatus</i> KL62
24
L. <i>johnsonii</i> KL63
48
L. <i>crispatus</i> KL64
60
L. <i>coryniformis</i> KL67
72
<i>L. crispatus</i> KL72
48
<i>L. kitasatonis</i> KL73
24
<i>L. kitasatonis</i> KL77
36
<i>L. crispatus</i> KL82
24
<i>L. reuteri</i> KL83
72
frumenti
salivarius
crispatus
kitasatonis
L. crispatus
По совокупности свойств штаммов наиболее перспективными для дальнейших исследований и коммерческого использования признаны штаммы L.  KL31, L.  KL61, L.  KL62, L.  KL73,  KL82.