Способ количественного определения N-дифенилнитрозамина в мясных пробах пищевой продукции методом хромато-масс-спектрометрии
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF N-DIPHENYLNITROSAMINE IN MEAT SAMPLES OF FOOD PRODUCTION BY METHOD OF CHROMATOGRAPHY-MASS-SPECTROMETRY

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности, к санитарной токсикологии и может быть использовано для количественного определения N-дифенилнитрозамина в продуктах питания, а именно, в мясных продуктах, в мясных продуктах для детского питания (в консервах из мяса, консервах мясорастительных) и пр.
Нитрозамины обладают широким спектром токсического действия на организм человека. В первую очередь, их токсичность направлена на печень и почки, в результате чего происходит нарушение их функции и некрозы. При хранении пищевых продуктов происходит существенное повышение концентрации некоторых аминов, что может служить признаком их порчи. В связи с вышеизложенным, для решения проблемы канцерогенной безопасности пищи, необходимо усовершенствовать пищевые технологии, предупреждающие образование канцерогенных нитрозаминов в продуктах питания, особенно, детских, а также обеспечить их надежный контроль.
Известно, что, например, мясные консервы для детского питания представляют собой измельченное в различной степени мясо (говядину, свинину, баранину, телятину, мясо ягненка, кур, индеек и др.), к которому может быть добавлен соответствующий мясной бульон, смесь сливочного и растительного масла. Жировой компонент растительных консервов с мясом представлен растительными маслами, чаще всего кукурузным, соевым или смесью растительных масел, обеспечивающими обогащение консервов незаменимыми полиненасыщенными жирными кислотами (линолевой и линоленовой).
Из уровня техники известен способ хроматографического определения летучих аминов и нитрозаминов в пищевых продуктах (Авт. св. СССР №1259187), включающий экстракцию их, отгонку растворителя, растворение остатка в соляной кислоте, деление на нескольких аликвотных частей, при этом обрабатывают их, кроме одной, щелочью до рН 8-14, упаривают досуха и растворяют с последующим использованием раствора необработанной части в качестве анализируемого, а растворов щелочных частей - в качестве стандартных после добавления к ним стандартных соединений.
Однако, при упаривании пробы возможны потери нитрозаминов, т.к. они являются высоколетучими соединениями, что существенно будет влиять на надежность и точность получаемого результата.
Кроме того, указанным способом невозможно определить N-дифенилнитрозамин.
-7
В статье (http://www.medved.kiev.ua/arh_nutr/art_2004/n04_2_12.htm) «К вопросу об определении n-нитрозаминов в пищевых продуктах», авторы: О.С. Зульфигаров, В.В. Юрченко и др., Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя, Киев, Украина, также указано на то, что первым этапом определения нитрозаминов является их выделение из анализируемых продуктов. Невысокие температуры кипения (меньше 200°С) и достаточная термическая стабильность нитрозаминов обусловили возможность применения для их выделения отгонки с водяным паром. Простота в исполнении, универсальность по отношению к самым разным пищевым продуктам, в том числе, и мясным, полнота извлечения обусловили наиболее широкое применение этого подхода. Затем из водных отгонов нитрозамины выделяют методом экстракции, наилучшим экстрагентом для этого оказался хлористый метилен, который и находит наибольшее применение. Данная схема выделения эффективна как для жидких проб, так и для твердых. Далее рекомендуется проводить дериватизацию соответствующих вторичных аминов 4-нитрофенилдиазонием. Полученные при этом производные достаточно гидрофобны и легко могут быть сконцентрированы, а затем разделены методом обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность данного известного метода заключается в том, что неподвижная фаза - это неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18 и др.) фаза; подвижная фаза - полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.) фаза. Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы.) Поскольку нитрофенилтриазены хорошо окрашены, чувствительность их детектирования на обычных, наиболее распространенных фотометрических детекторах, достаточно высока и составляет 2⋅10 моль/л.
Это позволяет определять нитрозамины в пищевых продуктах при их содержании на порядок ниже ПДК.
Важным обстоятельством является возможность применения данной известной методики для определения соответствующих вторичных аминов. Однако и этот способ не лишен недостатков, т.к.
1. много операций подготовки пробы к химическому анализу - перегонка с водяным паром затем экстракция органическим растворителем и получение производных нитрозаминов (дериватизация). Возможны большие потери целевых аналитов на этапах пробоподготовки, если нитрозамины в пробе содержатся в ультрамикроконцентрациях. Как результат, достаточно сложно получить достоверные данные по количественному содержанию нитрозаминов в пробе.
2. длительность проведения в серийных исследованиях, соэкстрагирование большого количества мешающих веществ, невысокая эффективность извлечения.
3. нет упоминания о том, что этим способом можно определить количество N-дифенилнитрозамина.
Госкомсанэпиднадзором России в 1993 г. была утверждена методика МУК 4.4.1.011-93 «Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Методические указания по методам контроля. - М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1993. - 16 с, согласно которой проводят пробоподготовку, при этом к пробе (в т.ч. мясной) добавляют сульфат натрия и сульфат алюминия в массовом соотношении 1:1, далее подкисляют до рН 3 сульфаминовой и серной кислотой, добавляют гексановый раствор нитрозодипропиламина, далее производят дистилляцию путем перегонки с помощью водяного пара с получением дистиллята пробы. Дистиллят переносят в делительную воронку и нитрозамины экстрагируют свежеперегнанным хлористым метиленом 4-5 раз по 15 мл. Объединенные хлорметиленовые экстракты высушивают прокаленным сульфатом магния, отфильтровывают, осушитель промывают небольшим объемом хлористого метилена, объединенные фильтраты помещают в круглодонную колбу на 100-150 мл, снабжают дефлегматором (или воздушным холодильником), помещают в водяную баню и упаривают хлористый метилен до 5-7 мл выдерживанием при температуре бани 55-65°С. Выполняют определение N-нитрозаминов с помощью газохроматографического анализа.
Однако указанная Методика МУК 4.4.1.011-93. позволяет выполнять либо полуколичественный анализ (флуориметрический метод), либо количественное определение модифицированных нитрозаминов с помощью хемилюминисцентного (термоэнергетического) детектора. При выполнении процедуры дериватизации возможны потери целевых аналитов, если матрица обладает сорбционными свойствами, что существенно будет влиять на надежность и точность определения.
Кроме того, эта известная Методика отличается многостадийностью их хроматографического разделения и при этом обеспечивается лишь полуколичественное определение нитрозаминов, нижний предел определения составляет 1 мкг/кг продукта.
Кроме того, в ней нет упоминания о том, что этим способом можно определить N-дифенилнитрозамин.
Таким образом, из уровня техники не выявлены известные источники информации, в которых было бы описание способа количественного определения N-дифенилнитрозамина в мясных продуктах методом хромато-масс-спектрометрии, потому выбрать наиболее близкий аналог не представляется возможным.
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом заключается в обеспечении точности и достоверности количественного определения N-дифенилнитрозамина методом хромато-масс-спектрометрии, за счет высокой полноты его извлечения из пробы и за счет применение в последующем системы твердофазной экстракции на этапе пробоподготовки.
Поставленный технический результат достигается предлагаемым Способом количественного определения N-дифенилнитрозамина в мясных пробах пищевой продукции методом хромато-масс-спектрометрии, согласно которому осуществляют пробоподготовку, согласно которой к 5 г мясной пробы добавляют 10 мл метилата калия, причем метилат калия получают предварительно путем смешивания гидроокиси калия с метанолом в массовом соотношении 1:4,9 соответственно; производят последующий нагрев смеси пробы с метилатом калия при температуре 60-70°С в течение 2 часов, затем смешивают ее с 10 мл гексана и подвергают центрифугированию в течение 20 минут при 4500 об/мин, далее отделяют нижний слой и добавляют в него при интенсивном перемешивании воду до объема 45 мл; смесь оставляют на выдержку при температуре 5-7°С в течение 12 часов и затем вновь центрифугируют в течение 20 минут при 4500 об/мин; отделившийся при центрифугировании водный слой подвергают твердофазной экстракции (ТФЭ) на приборе ТФЭ, содержащем угольный картридж, при которой вначале производят промывку хлористым метиленом картриджа прибора ТФЭ, пропускают через него этилацетат с его задержкой в течение 30 сек, далее производят промывку водой; затем загружают ранее полученный водный слой, производят сушку картриджа в течение 20 минут, осуществляют элюирование водного слоя с картриджа хлористым метиленом, затем полученные элюенты анализируют методом хромато-масс-спектрометрии и с помощью градуировочного графика в режиме селективного ионного мониторинга определяют количество N-дифенилнитрозамина в мясной пробе.
При хромато-масс-спектрометрии используют капиллярную колонку серии HP-FFAP 30 m ⋅ 0,250 mm ⋅ 0,250 μm длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,250 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,250 μm.
Указанный технический результат достигается за счет следующего.
Известные приемы и способы пробоподготовки такие как - экстракция пробы мясной пищевой продукции органическим растворителем, дистилляция с перегретым водяным паром, статический и динамический анализ равновесной паровой фазы не позволяют достичь высокой полноты извлечения, а, следовательно, - необходимой точности определений для реальной оценки содержания N-дифенилнитрозамина в пищевых продуктах на уровне гигиенического норматива, указанного в СанПиН 2.3.2. 560-96 на пищевые продукты питания. Вместе с этим следует указать, что даже норматив на N-дифенилнитрозамин отсутствует.
Для устранения влияния матричных эффектов на результаты хромато-масс-спектрометрического определения N-дифенилнитрозамина в предлагаемом способе при пробоподготовке выполняют очистку образцов мясной пищевой продукции от мешающих компонентов и жира реакцией переэтерификации путем алкоголиза (добавление одноатомного алканола - метанола в условиях щелочного катализа в присутствии гидроокиси калия для получения метилата калия), что обеспечивало увеличение полноты и селективности экстракционного извлечения аналита из образца.
Последующий нагрев вышеуказанной смеси пробы и метилата калия при температуре 60-70°С в течение 2 часов и добавление гексана выполняется с целью удаления из мясной пробы эфиров жирных кислот. Следующие операции предлагаемого способа приводят к следующему сценарию:
- нагрев в течение 120 минут при температуре 60-70°С обеспечивает перевод жирных кислот в метиловый эфир;
- добавление гексана, перемешивание и центрифугирование выполняется с целью разделения верхнего гексанового слоя, содержащего эфиры жирных кислот, и нижнего слоя, содержащего N-дифенилнитрозамин, глицерин, метанол.
- добавление воды в нижний слой, содержащий N-дифенилнитрозамин, глицерин, метанол, и выдержка в течение 12 часов необходимы с целью извлечения из смеси N-дифенилнитрозамина в водный слой, а выдержка в холодильнике при температуре 5-7°С необходима для того, что при этих температурах жир застывает и легко отделяется от водного слоя.
- по истечении 12 часов пробирку со смесью центрифугировали при 4500 об/мин в течение 20 минут, с целью удаления остатков мясной пробы из смеси, и водный слой пропускали через угольный картридж автоматической системы твердофазной экстракции.
Благодаря использованию в предлагаемом способе операции твердофазной экстракции (далее - ТФЭ) при заявленных режимах и используемых реагентах также была обеспечена полнота извлечения N-дифенилнитрозамина из мясной пробы.
С целью активации картриджа системы ТФЭ выполняется кондиционирование органическим растворителем - хлористым метиленом, затем осуществляется загрузка жидкого образца на картридж с помощью азота. Во время этого, на сорбенте адсорбируются аналиты, а матрица идет в слив. На этой стадии сорбент удерживает целевые соединения до этапа элюирования. Мешающие компоненты пробы полностью удаляются на следующей стадии промывки картриджа органическим растворителем - хлористым метиленом.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом по трем этапам:
- пробоподготовка,
- выполнение ТФЭ,
- анализ полученных элюатов хромато-масс-спектрометрическим методом по градуировочному графику в режиме селективного ионного мониторинга.
1. Пробоподготовка.
При открытии, например, мясных консервов берут пробу мясопродукта в количестве 5 г (если мясная проба кусковая, то ее подвергают измельчению).
Указанную пробу смешивают с 10 мл метилата калия. Для получения последнего 6,5 г гидроокиси калия смешивают с 40 мл метанола.
Смесь пробы и метилата калия нагревают при температуре 60-70°С в течение 2 часов. По истечении 2 часов образуется метиловый эфир.
После этого нагрева смесь помещают в центрифужную пробирку объемом 50 мл добавляют 10 мл гексана, перемешивают и центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 минут.
Затем верхний гексановый слой, содержащий эфиры жирных кислот, удаляют дозатором. А в оставшийся нижний водный слой, содержащий N-дифенилнитрозамин, глицерин, метанол, добавляют воду до объема 45 мл, интенсивно встряхивают в течение 10 минут, и смесь оставляют на выдержку при температуре 5-7°С в течение 12 часов.
3
По истечении 12 часов пробирку со смесью центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 минут и водный слой, который будет верхним (а остатки мясной пробы в нижнем слое), пропускают через угольный картридж Coconut 6 см автоматической системы твердофазной экстракции.
2. Выполнение ТФЭ.
3
Вначале производят стадию кондиционирования - активацию угольного картриджа, для чего его промывают хлористым метиленом объемом 2 см.
3
Затем через картридж пропускают растворитель - этилацетат, объемом 2,5 см с задержкой растворителя в течение 30 сек.
3
Для удаления остаточных количеств растворителей угольный картридж промывают водой объемом 2 см.
3
Далее загружают ранее полученный дистиллят пробы - водный слой, объемом 70 см и производят сушку картриджа в течение 20 минут.
3
Осуществляют элюирование дистиллята пробы с картриджа хлористым метиленом объемом 4 см.
3. Анализ полученных элюатов хромато-масс-спектрометрическим методом.
Полученные элюаты анализируют известным хромато-масс-спектрометрическим методом, устанавливая по хроматограммам количественное содержание N-дифенилнитрозамина.
Отработка оптимальных хромато-масс-спектрометрических параметров определения N-дифенилнитрозамина в образцах мясной пробы осуществлялась с использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрии (далее - ГХ/МС) на газовом хроматографе Agilent 7890А (производство США) с масс-селективным детектором 5975С и квадрупольным масс-анализатором. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ.
Для количественного определения содержания N-дифенилнитрозамина выполняли хромато-масс-спектрометрический анализ стандартных растворов и на основе результатов измерений строили градуировочную зависимость в режиме селективного ионного детектирования (SIM) по характеристичным ионам соединения в диапазоне концентраций 0,002-0,016 мг/кг. Для этого в хромато-масс-спектрометрическом анализе в режиме селективного ионного мониторинга строится градуировочный график по выбранным ионам вещества и выполняется количественный анализ в режиме регистрации индивидуальных ионов (Agilent GC/MSD ChemStation - Agilent Technologies: H4043A, том 2, Учебное пособие).
В процессе экспериментальных исследований были изучены следующие капиллярные колонки различной длины и толщины пленки неподвижной фазы: DB-624, HP-FFAP, HP-Plot/U, HP-VOC.
Качественное разделение N-дифенилнитрозоамина с другими N-нитрозоаминами (N-диметилнитрозамин, N-метилэтилнитрозоамин, N-диэтилнитрозоамин, N-пирролидиннитрозоамин, N-морфолиннитрозоамин, N-дибутилнитрозоамин, N-дипропилнитрозоамин, N-пиперидиннитрозоамин) с близкими физико-химическими свойствами было достигнуто на капиллярной колонке серии HP-FFAP 30 m ⋅ 0,250 mm ⋅ 0,250 μm длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,250 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,250 μm. Режимы хромато-масс-спектрометрических параметров представлены в таблице 1.
Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что в режимах 2 и 3 не наблюдалось достаточно эффективного разделения летучих N-нитрозаминов (такие результаты показала хроматограмма). Качественное разделение было достигнуто в режиме 1, который и был выбран для дальнейшей работы.
В качестве доказательства оптимальности этого режима, на рис. 1 приведена хроматограмма стандартного раствора разделения N-дифенилнитрозамина с другими N-нитрозаминами при оптимально подобранных условиях хромато-масс-спектрометрического анализа (режим 1 таблица 1), зарегистрированная по полному ионному току. Аббревиатры, указанные на рис. 1, означают следующее:
N-ДМНА-N - диметилнитрозамин
N-МЕНА - N-метилэтилнитрозамин
N-ДЕНА - N-диэтилнитрозамин
N-ДПНА - N-нитрозо-ди-N-пропиламин
N-ДБНА - N-нитрозо-ди-N-бутиламин
N-ПИПНА - N-нитрозопиперидин
N-ПИРНА - N-нитрозопирролидин
N-MOPHA - N-нитрозоморфолин
N-ДФНА - N-дифенилнитрозамин.
Для выбора оптимальных режимов и используемых реагентов предлагаемого способа были проведены лабораторные исследования по установлению необходимых марок картриджей в приборе ТФЭ, отработаны условия схем элюирования ТФЭ и дистилляции на стандартных образцах N-дифенилнитрозамина, полученных путем построения градуировочной зависимости.
Для построения градуировочной характеристики готовили серию растворов. Для этого применяли стандартные образцы.
3
3
3
3
3
1. Исходный раствор N-дифенилнитрозоамина готовят из смеси N-нитрозоаминов (в эту смесь входят все вышеперечисленные нитрозоамины включая нитрозодифениламин, т.е. всего 9 нитрозоаминов). В мерную колбу вместимостью 25 см дозатором добавляют метиловый спирт в объеме 10 см, вводят микрошприцем 2 мм смеси N-нитрозоаминов (С=2 мг/см). Массовая концентрация N-нитрозоаминов в исходном растворе составляет 0,16 мкг/см. Срок хранения исходного раствора 5 часов.
2. Приготовление градуировочных растворов.
В навеску образца мясных консервов массой 5 г добавляют исходный раствор для градуировки в соответствии с таблицей 2.
3. Построение градуировочной характеристики
Градуировочные характеристики устанавливают на градуировочных растворах N-дифенилнитрозамина методом абсолютной градуировки. Приготовленные растворы хроматографируют на капиллярной колонке. На полученной хроматограмме определяют площади пиков молекулярных ионов компонентов и по средним результатам измерений по 5 концентрациям для градуировки строят градуировочную характеристику. Она выражает зависимость площади пика молекулярного иона N-дифенилнитрозоамина на хроматограмме (мВ - при автоматическом обсчете с использованием программно-аппаратного комплекса) от содержания (нг).
Для получения экстрактов необходимой чистоты для хромато-масс-спектрометрического анализа и установления достаточной степени концентрирования N-дифенилнитрозоамина, были апробированы сменные картриджи прибора ТФЭ, заполненные различными сорбентами, органические растворители для элюирования N-дифенилнитрозоамина с картриджей и изучены условия оптимальной схемы элюирования. Селективность проведения процесса ТФЭ достигнута подбором картриджа с соответствующей фазой.
Для этого апробированы следующие типы картриджей: угольный Coconut 6 мл; заполненные октадецилом Chromabond С18 на 100 и 500 мг; картриджы на полимерной основе Strata на 200 мг. Анализ полученных результатов показал, что на угольном картридже Coconut 6 мл при использовании экспериментальной схемы элюирования (режим 1 таблица 1) полнота извлечения для N-нитрозаминов: N-пирролидиннитрозамина и N-морфолиннитрозамина 100%, полнота извлечения N-дифенилнитрозамина составила 61,17%.
На следующем этапе были проведены исследования по отработке оптимальных условий процесса элюирования N-дифенилнитрозамина с угольного картриджа Coconut 6 мл автоматической системы твердофазной экстракции с применением различных растворителей. Для этого варьировали параметрами: объемами растворителей на стадии кондиционирования, объемами образца на стадии загрузки, временем сушки картриджа, объемом слива.
Отработанная оптимальная схема селективного элюирования включала несколько стадий и характеризуется следующими параметрами:
1. Стадия кондиционирования - активация картриджа хлористым метиленом объемом 2 мл, затем этилацетатом объемом 2,5 мл с задержкой растворителя в течение 30 сек. Для удаления остаточных количеств растворителей картридж промывали водой объемом 2 мл;
2. Стадия адсорбции целевых компонентов на картридже при загрузке пробы объемом 70 мл;
3. Сушка картриджа в течение 20 минут для удаления остаточных количеств образца;
4. Заключительная стадия - элюирование целевых аналитов с картриджа хлористым метиленом объемом 4 мл и продувка автоматической системы азотом в течение 2 минут.
3
3
Стандартный образец (объемом 70 см) пропускали через картридж Coconut 6 см системы твердофазной экстракции по оптимальной схеме элюирования (режим 1 таблица 1).
Следующий этап исследований заключался в экспериментальной отработке условий и параметров подготовки образцов мясной пищевой продукции (например, консервы из мяса, мясорастительные) к химическому анализу N-дифенилнитрозамина.
Для увеличения полноты и селективности экстракционного извлечения N-нитрозодифениламина необходимо удаление жирового компонента. Для этого выполняли реакцию переэтерификации жиров биологического происхождения в метиловые эфиры путем алкоголиза (добавление одноатомного алканола в условиях щелочного катализа) и концентрирования N-нитрозодифениламина на картриджах автоматической системы твердофазной экстракции (ТФЭ).
Экспериментально отработаны условия и подобраны параметры подготовки проб пищевой продукции (консервы из мяса) для хромато-масс-спектрометрического анализа N-нитрозодифениламина. Результаты полноты извлечения N-нитрозодифениламина из образца мясных консервов при добавлении метилата калия объемом 6 и 10 мл представлены в таблицах 3 и 4 соответственно.
В результате щелочного катализа при добавлении к анализируемой пробе мясных консервов 10 мл метилата калия, полнота извлечения N-дифенилнитрозамина составила 99,94%. Потому это количество и рекомендовано при реализации предлагаемого способа.
Исследования стандартных образцов и проб мясной продукции (например, консервы из мяса, мясорастительные продукты) различных производителей на содержание N-дифенилнитрозамина выполняли методом хромато-масс-спектрометрии: газовый хроматограф Agilent 7890А (USA) с масс-селективным детектором 5975С и квадрупольным масс-анализатором. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ. Для исследований использовали капиллярную колонку серии HP-FFAP 30 m ⋅ 0,250 mm ⋅ 0,250 μm длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,250 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,250 μm.
Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества:
- обеспечивает практически полное извлечение N-дифенилнитрозамина из исследуемой пробы (99,94%), что свидетельствует о точности и достоверности предлагаемого способа;
- позволяет значительно снизить нижний предел определения N-дифенилнитрозамина (до 0,002 мг/кг продукта), в то время как в известных способах этот показатель вообще не определялся.