УЛУЧШЕННАЯ СПЕЙСЕРНАЯ МЕМБРАНА ДЛЯ ФЕРМЕНТНОГО ДАТЧИКА IN VIVO
IMPROVED SPACER MEMBRANE FOR ENZYME SENSOR IN VIVO

Настоящее изобретение относится к электродной системе, предназначенной для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, которая содержит электрод с иммобилизованными молекулами фермента и улучшенный диффузионный барьер, контролирующий диффузию аналита из окружающей электродную систему общей воды организма к молекулам фермента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к электродной системе, предназначенной для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, которая содержит электрод с иммобилизованными молекулами фермента, необязательно диффузионный барьер, контролирующий диффузию аналита из внешней среды, окружающей электродную систему, и улучшенную спейсерную мембрану, которая образует по меньшей мере часть наружного слоя электродной системы.
Датчики, содержащие имплантируемые или встраиваемые электродные системы, облегчают измерения важных с физиологической точки зрения аналитов, таких, например, как лактат или глюкоза, в организме пациента. Рабочие электроды систем такого типа имеют электропроводящие ферментные слои, в которых связаны молекулы фермента, высвобождающие носители заряда посредством каталитического превращения молекул аналита. В процессе этого генерируется электрический ток, представляющий собой измеряемый сигнал, амплитуда которого коррелирует с концентрацией аналита.
Такие электродные системы описаны, например, в WO 2007/147475 и WO 2010/028708, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Рабочие электроды электродной системы снабжают диффузионным барьером, который контролирует диффузию подлежащего измерению аналита из общей воды организма или ткани, окружающей электродную систему, к молекулам фермента, иммобилизованным в ферментном слое. В WO 2010/028708 описан диффузионный барьер электродной системы, представляющий собой твердый раствор по меньшей мере двух различных полимеров, предпочтительно акрилатов. Полимеры могут представлять собой сополимеры, например, сополимеры метилметакрилата и гидроксиэтилметакрилата или сополимеры бутилметакрилата и гидроксиэтилметакрилата.
В WO 2007/147475 описан диффузионный барьер, который состоит из полимера, имеющего цвиттер-ионную структуру. Примером такого полимера является поли(2-метакрилоксиэтилфосфорилхолин-со-н-бутилметакрилат). Цвиттер-ионный полимер можно смешивать с другим полимером, например, полиуретаном.
Однако применение смесей полимеров или сополимеров имеет недостатки, заключающиеся в том, что получение смеси и нанесение ее на датчик является сложным и может оказаться проблематичным. Как правило, предназначенные для смешения полимеры растворяют по отдельности и затем полученные растворы смешивают в требуемом соотношении. Однако это может приводить к осаждению одного из компонентов и, следовательно, к технологическим проблемам, например, при осуществлении процесса распыления. Повышенные сложности возникают в том случае, когда смеси содержат полимер, обладающий ионными характеристиками, т.е. в том случае, когда один из предназначенных для смешения полимеров содержит мономер, имеющий анионные или катионные группы. При этом присутствие таких заряженных групп оказывает сильное воздействие на растворимость, затрудняя поиск растворителя, пригодного и для заряженного полимера, и для незаряженного полимера.
В WO 2006/058779 описан датчик на ферментной основе, имеющий объединенный диффузионный и ферментный слой, который содержит по меньшей мере один полимерный материал и частицы, несущие фермент, где частицы диспегированы в полимерном материале. Полимер может содержать последовательности как гидрофильных, так и гидрофобных полимерных цепей, например, полимер может представлять собой сополимер простого полиэфира и полиуретана, характеризующийся высоким или низким поглощением воды. Применение в качестве диффузионного слоя блок-сополимеров, имеющих по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, не заявлено.
В ЕР-А-2163190 описана электродная система, предназначенная для измерения концентрации аналита in vivo, содержащая противоэлектрод с электрическим проводником и рабочий электрод с электрическим проводником, на котором находится ферментный слой, содержащий иммобилизованные молекулы фермента. Диффузионный барьер контролирует диффузию аналита из окружающей общей воды организма к молекулам фермента. Диффузионный барьер может содержать гидрофилизованные полиуретаны, которые можно получать путем поликонденсации 4,4'-метилен-бис-(циклогексилизоцианата) и смеси диолов, которые могут представлять собой полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль. На гидрофильный полиуретановый слой можно наносить покрытие, представляющее собой спейсер, например, сополимер бутилметакрилата и 2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина. Применение в качестве диффузионного слоя блок-сополимеров, имеющих по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, не заявлено. Не заявлено также применение гидрофильного сополимера (мет)акриловых мономеров, содержащего более 50 мол.% гидрофильных мономеров.
При создании настоящего изобретения была поставлена задача разработать диффузионный барьер на электродной системе ферментного датчика in vivo, который обладает требуемыми физико-химическими характеристиками и который легко изготавливать.
Эта задача решается с помощью диффузионного барьера, состоящего из единственного блок-сополимера, который имеет по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок. Гидрофильные и гидрофобные блоки ковалентно связаны друг с другом. Предпочтительно блоки представляют собой блоки (мет)акрилатного полимера.
Диффузионный барьер на основе блок-сополимера обладает очень высокими физико-химическими характеристиками, такими как:
(I) проницаемость диффузионного барьера для подлежащего определению аналита,
(II) характеристики проницаемости диффузионного барьера, пригодные для кратковременного режима работы (смачиваемость) и продолжительного режима работы (дрейф датчика) электрода,
(III) механическая гибкость диффузионного барьера, позволяющая изготавливать предназначенные для работы in vivo датчики с удлиненными несколькими электродами,
(IV) эффективное включение ионных групп в диффузионный слой, т.е. плотность катионных или анионных зарядов в полимере можно эффективно регулировать, это имеет значение для отталкивания или притягивания заряженных аналитов, и/или контроля клеточной адгезии, например, моноцитов из окружающей общей воды организма или ткани.
Объектом настоящего изобретения является электродная система, предназначенная для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, содержащая электрод с иммобилизованными молекулами фермента и диффузионный барьер, который контролирует диффузию аналита из окружающей электродную систему среды к молекулам фермента, отличающаяся тем, что диффузионный барьер содержит блок-сополимер, имеющий по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок.
Предпочтительно диффузионный барьер содержит единственный блок-сополимер, т.е. блок-сополимер только одного типа, имеющий по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, т.е. не содержит другие полимеры или сополимеры. Более предпочтительно, диффузионный барьер состоит из единственного блок-сополимера, имеющего по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок.
Электродную систему, предлагаемую в настоящем изобретении, можно встраивать или имплантировать в организм, например, в организм млекопитающего, например, в организм человека. Электродную систему адаптируют для измерения требуемого аналита в общей воде организма и/или ткани организма, например во внеклеточном пространстве (интерстиции), в кровеносных или лимфатических сосудах, или в трансклеточном пространстве.
Встроенная или имплантированная электродная система пригодна для кратковременного применения, например, в течение 3-14 дней, или для длительного применения, например, в течение 6-12 месяцев. В течение периода времени, когда указанная система встроена или имплантирована, можно осуществлять определение требуемого аналита путем непрерывных или периодических измерений.
Электронная система, предлагаемая в изобретении, предпочтительно представляет собой часть ферментного нежидкостного (ENF) датчика, посредством которого определяют ферментативное превращение аналита. Предпочтительно датчик содержит рабочий электрод с иммобилизованными молекулами фермента, предназначенными для превращения аналита, в результате которого генерируется электрический сигнал. Ферменты могут присутствовать в слое, покрывающем электрод. Кроме того, могут присутствовать медиаторы окисления-восстановления (редокс-медиаторы) и/или электрокатализаторы, а также проводящие частицы и порообразователи. Такой тип электродов описан, например, в WO 2007/147475, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Область рабочего электрода представляет собой чувствительную область датчика. Указанная чувствительная область снабжена диффузионным барьером, который контролирует диффузию аналита из внешней среды, например, из общей воды организма и/или ткани, окружающей электродную систему, к молекулам фермента. Диффузионный барьер может представлять собой, например, наложенный на слой фермента слой покрытия, т.е. слой, который не содержит фермент. Однако для формирования диффузионного барьера допустимо также встраивать контролирующие диффузию частицы в ферментный слой. Например, можно заполнять поры в ферментном слое полимером, контролирующим диффузию молекул аналита. Толщина диффузионного барьера, как правило, составляет примерно 2-20 мкм, например, примерно 2-15 мкм или примерно 5-20 мкм, прежде всего, примерно 5-10 мкм или примерно 10-15 мкм (в сухом состоянии).
Диффузионный барьер электродной системы, предлагаемой в настоящем изобретении, содержит блок-сополимер, предпочтительно единственный блок-сополимер, имеющий по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок. Блок-сополимер может содержать чередующуюся последовательность блоков, т.е. гидрофильный блок связан с гидрофобным блоком. Гидрофильные и гидрофобные блоки ковалентно связаны друг с другом в молекуле полимера. Средняя молекулярная масса полимера (в единицах массы), как правило, составляет 20-70 кДа, предпочтительно 25-60 кДа, более предпочтительно 30-50 кДа. Молярное соотношение гидрофильной и гидрофобной частей в блок-сополимере, как правило, находится в диапазоне от примерно 75% (гидрофильная) : 25% (гидрофобная) до примерно 25% (гидрофильная) : 75% (гидрофобная), в диапазоне от примерно 65% (гидрофильная) : 35% (гидрофобная) до примерно 35% (гидрофильная) : 65% (гидрофобная) или в диапазоне от примерно 60% (гидрофильная) : 40% (гидрофобная) до примерно 40% (гидрофильная) : 60% (гидрофобная).
Гидрофильный блок блок-сополимера состоит по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% и предпочтительно полностью из гидрофильных мономерных звеньев. Как правило, он состоит из 50-400, например, из 50-200 или из 150-300, предпочтительно из 100-150 или из 200-250 мономерных молекул. Гидрофобный блок блок-сополимера состоит по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% и предпочтительно полностью из гидрофобных мономерных звеньев. Как правило, он состоит из 50-300, например, из 50-200 или из 150-250, предпочтительно из 80-150 или 170-200 мономерных звеньев.
Гидрофильные блоки и/или гидрофобные блоки предпочтительно состоят из звеньев на основе (мет)акрила. Более предпочтительно как гидрофильные блоки, так и гидрофобные блоки состоят из мономерных звеньев на основе (мет)акрила.
3
2
5
2
3
2
5
Гидрофильные мономерные звенья гидрофильного блока предпочтительно выбирают из гидрофильных сложных (мет)акриловых эфиров, т.е. сложных эфиров с полярной группой, т.е. группой ОН, ОСН или ОСН в спиртовом фрагменте сложного эфира, гидрофильных (мет)акриламидов с амидной (NH) или N-алкил- или N,N-диалкиламидной группой, где алкильная группа содержит 1-3 атома С и необязательно гидрофильные группы, такие как ОН, ОСН или ОСН, и пригодных (мет)акриловых звеньев, несущих заряженную, например, анионную или катионную группу, таких как акриловая кислота (акрилат) или метакриловая кислота (метакрилат). Кроме того, можно применять комбинации мономерных звеньев.
Конкретные примеры предпочтительных мономерных звеньев для гидрофильного блока выбирают из:
2-гидроксиэтилакрилата,
2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА),
2-метоксиэтилакрилата,
2-метоксиэтилметакрилата,
2-этоксиэтилакрилата,
2-этоксиэтилметакрилата,
2- или 3-гидроксипропилакрилата,
2- или 3-гидроксипропилметакрилата (2- или 3-ГПМА),
2- или 3-метоксипропилакрилата,
2- или 3-метоксипропилметакрилата,
2- или 3-этоксипропилакрилата,
2- или 3-этоксипропилметакрилата,
1- или 2-глицерилакрилата,
1- или 2-глицерилметакрилата,
акриламида,
метакриламида,
N-алкил- или N,N-диалкилакриламида и
N-алкил- или N,N-диалкилметиламида, где алкил содержит 1-3 атома С, например, представляет собой метил, этил или пропил,
акриловой кислоты (акрилата),
метакриловой кислоты (метакрилата)
и их комбинаций.
Предпочтительными гидрофильными мономерами являются 2-гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА) и/или 2- или 3-гидроксипропилметакрилат (2-или 3-ГПМА). Более предпочтительно гидрофильный блок состоит по меньшей мере из двух различных гидрофильных мономерных звеньев. Например, он может представлять собой статистический сополимер, состоящий по меньшей мере из двух различных гидрофильных мономерных звеньев, таких как ГЭМА и 2-ГПМА.
Для введения в мономер ионных групп можно встраивать в гидрофильный блок заряженные мономерные звенья, такие как акриловая кислота (акрилат) и/или метакриловая кислота (метакрилат). Так, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофильный блок может состоять по меньшей мере из одного неионного гидрофильного мономерного звена (такого, например, как описанное выше) и по меньшей мере из одного ионного гидрофильного мономерного звена, где ионное мономерное звено присутствует в молярном количестве, предпочтительно составляющем 1-20 мол.%. В том случае, когда гидрофильный блок содержит ионное мономерное звено, такое как акриловая кислота или метакриловая кислота, то сополимеризацию предпочтительно осуществляют с гидрофильным мономером, выбранным из группы (мет)акриламидов, прежде всего N,N-диалкилакрил- или метакриламидов.
Гидрофобные мономерные звенья гидрофобного блока предпочтительно выбирают из гидрофобных акриловых и/или метакриловых звеньев, мономерных звеньев на основе стирола или их комбинаций. Предпочтительно гидрофобные мономерные звенья выбирают из гидрофобных сложных (мет)акриловых эфиров, например, сложных эфиров, которые содержат спиртовый фрагмент, включающий 1-3 атома С, и не содержат гидрофильную группу.
Конкретные примеры мономерных звеньев для гидрофобного блока выбирают из:
метилакрилата,
метилметакрилата (ММА),
этилакрилата
этилметакрилата (ЭМА),
н-пропилакрилата или изопропилакрилата,
н-пропилметакрилата или изопропилметакрилата,
н-бутилакрилата,
н-бутилметакрилата (БМА),
неопентилакрилата,
неопентилметакрилата
и их комбинаций.
Гидрофобный блок предпочтительно содержит по меньшей мере два различных гидрофобных мономерных звена, которые присутствуют, например, в виде статистического сополимера. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок содержит метилметакрилат (ММА) и н-бутилметакрилат (БМА). В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок представляет собой статистический сополимер ММА и БМА. Молярное соотношение ММА и БМА предпочтительно составляет от примерно 60% (ММА) : 40% (БМА) до примерно 40% (ММА) : 60% (БМА), например, примерно 50% (ММА) : 50% (БМА). Температура стеклования гидрофобного блока предпочтительно составляет 100°С или менее, 90°С или менее, или 80°С или менее, например, примерно 40-80°С. В альтернативном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок может состоять из стироловых звеньев, например, из полистирола, имеющего температуру стеклования примерно 95°С.
Блок-сополимеры, применяемые согласно настоящему изобретению, можно изготавливать известными методами (Böker и др., Macromolecules 34, 2001, сс. 7477-7488).
Блок-сополимеры можно наносить на электродную систему с использованием общепринятых методов, например, путем приготовления раствора блок-сополимера в пригодном растворителе или смеси растворителей, например, в простом эфире, который наносят на предварительно изготовленную электродную систему и затем сушат.
2
4
2
4
При контакте блок-сополимера с водой он характеризуется поглощением воды, которое составляет предпочтительно примерно 15-30 мас.% (в пересчете на массу полимера в сухом состоянии) при температуре 37°С и рН 7,4 (водный фосфатный буфер: 10 мМ KHPO, 10 мМ NaHPO и 147 мМ NaCl).
Помимо блок-сополимера диффузионный барьер может содержать также другие компоненты, прежде всего неполимерные компоненты, которые могут быть диспергированы и/или растворены в полимере. К указанным другим компонентам относятся пластификаторы, прежде всего биосовместимые пластификаторы, такие как три-(2-этилгексил)тримеллитат и/или глицерин.
eff
-10
2
-10
2
-9
2
-7
-8
2
Диффузионный барьер, предлагаемый в изобретении, характеризуется высоким эффективным коэффициентом диффузии D для глюкозы, который предпочтительно составляет ≥10 см/с, более предпочтительно ≥5⋅10 см/с, и еще более предпочтительно ≥10 см/с, например, вплоть до 10 или 10 см/с при температуре 37°С и рН 7,4. Эффективный коэффициент диффузии предпочтительно определяют методом, описанным в примере 4, согласно уравнению:
eff
m
m
-8
D=SE/F⋅L⋅5182⋅10,
m
m
m
m
в котором SE обозначает чувствительность рабочего электрода, F обозначает площадь рабочего электрода и L обозначает толщину слоя диффузионного барьера. Величины SE и L можно определять согласно методу, описанному в примерах.
Электродную систему, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, т.е. после встраивания или имплантации в организм. Аналит может представлять собой любую молекулу или ион, присутствующий в ткани или в общей воде организма, например, кислород, диоксид углерода, соли (катионы или анионы), жиры или жировые компоненты, углеводы или углеводные компоненты, белки или белковые компоненты, или другие типы биомолекул. Наиболее предпочтительным является определение аналитов, которые могут эффективно перемещаться между общей водой организма, например, кровью, и тканью, таких как кислород, диоксид углерода, катионы натрия, анионы хлора, глюкоза, мочевина, глицерин, лактат и пируват.
Электродная система содержит фермент, иммобилизованный на электроде. Фермент пригоден для определения требуемого аналита. Предпочтительно фермент обладает способностью осуществлять каталитическое превращение аналита и тем самым генерировать электрический сигнал, который можно обнаруживать электрическим проводником рабочего электрода. Фермент, предназначенный для измерения аналита, предпочтительно представляет собой оксидазу, например, глюкозооксидазу или лактатоксидазу, или дегидрогеназу, например, глюкозодегидрогеназу или лактатдегидрогеназу. Помимо фермента ферментный слой может содержать также электрокатализатор или редокс-медиатор, который способствует переносу электронов к проводящим компонентам рабочего электрода, например, частицы графита. Пригодными электрокатализаторами являются оксиды металлов, такие как диоксид марганца, или металлорганические соединения, такие как фталоцианин кобальта. В предпочтительном варианте осуществления изобретения редокс-медиатор обладает способностью расщеплять пероксид водорода, тем самым препятствуя истощению кислорода в среде, окружающей рабочий электрод. В различных вариантах осуществления изобретения редокс-медиатор может быть ковалентно связан с ферментом и благодаря этому осуществлять непосредственно перенос электронов к рабочему электроду. Пригодными редокс-медиаторами для непосредственного переноса электронов являются простетические группы, такие как пирролохинолинхинон (ПХХ), флавинадениндинуклеотид (ФАД) или другие известные простетические группы. Ферменты, иммобилизованные на электродах, представляют собой, например, ферменты, описанные в WO 2007/147475, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения электродная система содержит противоэлектрод с электрическим проводником и рабочий электрод с электрическим проводником, на котором расположены ферментный слой и диффузионный барьер. Ферментный слой предпочтительно располагают на проводнике в форме нескольких полей на расстоянии друг от друга, составляющем, например, по меньшей мере 0,3 мм или по меньшей мере 0,5 мм. Индивидуальные поля рабочего электрода могут образовывать ряды индивидуальных рабочих электродов. На расположенные между указанными полями области проводника рабочего электрода можно наносить покрытие в виде изолирующего слоя. Посредством размещения полей ферментного слоя поверх окон в электроизолирующем слое можно улучшать соотношение сигнала к шуму. Такое расположение описано в WO 2010/028708, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Электродная система, предлагаемая в изобретении, может дополнительно содержать референс-электрод, который обладает способностью поставлять референс-потенциал для рабочего электрода, например, референс-электрод из Ag/Ag-Cl. Кроме того, электродная система, предлагаемая в изобретении, может иметь дополнительные противоэлектроды и/или рабочие электроды.
Электродная система может представлять собой часть датчика, например, будучи присоединенной к стабилизатору напряжения и усилителю для усиления измеряемых электродной системой сигналов. Датчик предпочтительно представляет собой ферментный нежидкостной (ENF) датчик, более предпочтительно электрохимический ENF-датчик. Электроды электродной системы можно располагать на субстрате, на котором находится стабилизатор напряжения, или их можно присоединять к схемной плате, на которой находится стабилизатор напряжения.
Следующим объектом изобретения является применение блок-сополимера, содержащего по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, в качестве диффузионного барьера для несущего фермент электрода. Блок-сополимер предпочтительно представляет собой, как описано выше, например, единственный блок-сополимер. Диффузионный барьер и несущий фермент электрод также предпочтительно представляют собой описанные выше элементы.
Дополнительные подробности и преимущества изобретения пояснены с помощью представленных в качестве примеров вариантов осуществления изобретения со ссылкой на прилагаемые чертежи.
На чертежах показано:
на фиг. 1 - пример варианта осуществления электродной системы, предлагаемой в изобретении;
на фиг. 2 - более подробное изображение конструкции, представленной на фиг. 1;
на фиг. 3 - еще одно более подробное изображение конструкции, представленной на фиг. 1;
на фиг. 4 - сечение по линии разреза СС конструкции, представленной на фиг. 2;
на фиг. 5 - чувствительность (с указанием стандартных отклонений) четырех глюкозных датчиков (при концентрации глюкозы 10 мМ), обеспечиваемая при использовании различных блок-сополимеров (В, Е, Г, Б) в качестве барьерных слоев;
на фиг. 6 - дрейф датчика для четырех глюкозных датчиков, обеспечиваемый при использовании различных блок-сополимеров (А, В, Г, Е) в качестве барьерных слоев;
на фиг. 7 - проводимость блок-сополимера А в зависимости от времени; (2 эксперимента).
на фиг. 8 - проводимость блок-сополимера F в зависимости от времени; (3 эксперимента).
на фиг. 9 - проводимость блок-сополимера Н в зависимости от времени при толщине слоя 2,77 мкм или 4,43 мкм соответственно;
на фиг. 10 - адгезия фибриногена к различным полимерам спейсерной мембраны in-vitro (Adapt и Eudragit E100) по сравнению с адгезией к пластине без покрытия (контроль).
на фиг. 11 - экспрессия поверхностного белка CD54 клетками линии ТНР-1 после инкубации с датчиками, покрытых спейсерной мембраной (Adapt и Lipidure СМ5206), или без покрытия (контроль представляет собой необработанные клетки);
на фиг. 12а и 12б - секреция цитокина IL-8 и МСР-1 соответственно клетками линии ТНР-1 после инкубации с датчиками, покрытыми спейсерной мембраной (Adapt и Lipidure СМ5206), или без покрытия (контроль представляет собой необработанные клетки);
на фиг. 13 - секреция цитокина IL-8 ТНР-1 клетками линии ТНР-1 после инкубации с планшетами для тканевых культур, покрытых спейсерной мембраной (Adapt, Lipidure СМ5206 и Eudragit E100), или без покрытия (полистирол), и с дополнительным слоем фибриногена;
на фиг. 14 - гемолиз после инкубации с датчиками, покрытыми спейсерной мембраной (Adapt и Lipidure СМ5206), или без покрытия по сравнению со спейсерным полимером Adapt без датчика (отрицательный контроль представляет собой только инкубационную среду; положительный контроль обозначает 100%-ный осмотический лизис).
На фиг. 1 представлен в качестве примера вариант осуществления электродной системы, предназначенной для встраивания в ткань организма человека или животного, например в кожу или подкожную жировую ткань. Увеличенное подробное изображение области А представлено на фиг. 2, увеличенное подробное изображение области Б представлено на фиг. 3. На фиг. 4 представлен соответствующий вид сечения вдоль линии разреза СС, показанной на фиг. 2.
Представленная электродная система имеет рабочий электрод 1, противоэлектрод 2 и референс-электрод 3. Электрические проводники электродов 1а, 2а, 3а размещены в форме металлических токопроводящих дорожек, предпочтительно изготовленных из палладия или золота, на субстрате 4. В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения субстрат 4 представляет собой гибкую пластиковую пластину, например, сделанную из сложного полиэфира. Субстрат 4 имеет толщину менее 0,5 мм, например от 100 до 300 мкм, следовательно, он легко поддается изгибу и поэтому после его встраивания может адаптироваться к перемещениям окружающих тканей организма. Субстрат 4 имеет узкий стержень, позволяющий вводить его в ткань организма пациента, и широкую головку для присоединения к электронной системе, расположенной вне организма. Стержень субстрата 4 предпочтительно имеет длину, равную по меньшей мере 1 см, прежде всего от 2 до 5 см.
В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения одна часть измерительного устройства, а именно, головка субстрата, при его применении выступает из тела пациента. Однако в альтернативном варианте можно также имплантировать измерительное устройство целиком и передавать измеряемые данные беспроводным путем в приемник, размещенный вне тела.
Рабочий электрод 1 несет ферментный слой 5, который содержит иммобилизованные молекулы фермента, требуемые для каталитического превращения аналита. Ферментный слой 5 можно наносить, например, в форме отвердевающей пасты, содержащей углеродные частицы, полимерный связующий агент, редокс-медиатор или электрокатализатор и молекулы фермента. Подробное описание получения ферментного слоя 5 указанного типа изложено, например, в WO 2007/147475, на которую сделана ссылка в указанном контексте.
В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения ферментный слой 5 нанесен на проводник 1а рабочего электрода 1 не непрерывно, а в форме индивидуальных полей, размещенных на некотором расстоянии друг от друга. Индивидуальные поля ферментного слоя 5 в представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения расположены в виде рядов.
На проводнике 1а рабочего электрода 1 имеются узкие области между полями ферментного слоя, которые особенно четко видны на фиг. 2. Контур проводника 2а противоэлектрода 2 отслеживает контур проводника 1а рабочего электрода 1. Такой подход приводит к интеркалирующему или переплетенному взаимному расположению рабочего электрода 1 и противоэлектрода 2, что является выгодным, поскольку обеспечивает короткие токопроводящие дорожки и низкую плотность тока.
Для увеличения эффективной поверхности на противоэлектрод 2 можно наносить пористый электропроводящий слой 6, который размещают в форме индивидуальных полей на проводнике 2а противоэлектрода 2. Подобно ферментному слою 5 рабочего электрода 1, указанный слой 6 можно наносить в форме отвердевающей пасты, содержащей углеродные частицы и полимерный связующий агент. Поля слоя 6 предпочтительно имеют такие же размеры, что и поля ферментного слоя 5, хотя это не является обязательным. Однако так же, как и в предыдущем варианте, следует принимать меры по увеличению поверхности противоэлектрода, и можно создавать противоэлектрод 2 с линейной электропроводящей дорожкой без какого-либо покрытия или с покрытием из описанного блок-сополимера и необязательно спейсер.
Референс-электрод 3 размещают между проводником 1а рабочего электрода 1 и проводником 2а противоэлектрода 2. Референс-электрод, представленный на фиг. 3, состоит из проводника 3а, на котором размещено поле 3б из электропроводящей пасты серебро/хлорид серебра.
На фиг. 4 представлено схематическое изображение сечения вдоль линии разреза СС, указанной на фиг. 2. Линия разреза СС проходит через одно из ферментных полей 5 рабочего электрода 1 и между полями проводящего слоя 6 противоэлектрода 2. Между полями ферментного слоя 5 на проводник 1а рабочего электрода 1 можно наносить покрытие из электроизолирующего слоя 7, так же, как и на проводник 2а противоэлектрода 2, между областями проводящих слоев 6, для того чтобы предупреждать создающие помехи реакции, которые в противном случае могут катализироваться металлом электропроводящих дорожек 1а, 2а. Следовательно, поля ферментного слоя 5 размещают в окнах в изолирующем слое 7. Аналогично этому поля проводящего слоя 6 на противоэлектроде 2 можно также помещать поверх окон в изолирующем слое 7.
На ферментный слой 5 наносят покрытие из покрывающего слоя 8, которое обладает диффузионным сопротивлением для подлежащего анализу аналита и следовательно действует в качестве диффузионного барьера. Диффузионный барьер 8 состоит из единственного сополимера, описанного выше, с чередующимися гидрофильными и гидрофобными блоками.
Предпочтительно толщина покрывающего слоя 8 составляет, например, от 3 до 30 мкм, прежде всего примерно 5-10 мкм или примерно 10-15 мкм. Благодаря своему диффузионному сопротивлению покрывающий слой 8 позволяет меньшему количеству молекул аналита достигать ферментного слоя 5 в единицу времени. Таким образом, покрывающий слой 8 снижает скорость, с которой происходит превращение молекул аналита, и, следовательно, противодействует истощению концентрации аналита в среде, окружающей рабочий электрод.
Покрывающий слой 8 непрерывно простирается практически по всей площади проводника 1а рабочего электрода 1. На покрывающий слой 8 можно помещать биосовместимую мембрану в качестве спейсера 9, который устанавливает минимальное расстояние между ферментным слоем 5 и клетками окружающей ткани организма. Преимущество такого подхода состоит в том, что он позволяет создать резервуар для молекул аналита, из которого молекулы аналита могут поступать в соответствующее поле ферментного слоя 5 в случае кратковременного нарушения жидкостного обмена в среде, окружающей поле ферментного слоя 5. Если обмен общей воды организма в среде, окружающей электродную систему, кратковременно нарушается или даже прекращается, то молекулы аналита, запасенные в спейсере 9, продолжают диффундировать к ферментному слою 5 рабочего электрода 1, где происходит их превращение. Таким образом, спейсер 9 обеспечивает то, что заметное истощение концентрации аналита и соответствующее искажение результатов измерений происходит только по истечении существенно более длительного периода времени. В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения мембрана, образующая спейсер 9, покрывает также противоэлектрод 2 и референс-электрод 3.
Спейсерная мембрана 9 может, например, представлять собой диализирующую мембрану. В контексте настоящего изобретения под диализирующей мембраной понимают мембрану, которая не проницаема для молекул, размер которых превышает определенный максимальный размер. Диализирующую мембрану можно изготавливать заранее с помощью отдельного процесса производства, и затем ее можно накладывать при изготовлении электродной системы. Максимальный размер молекул, для которых диализирующая мембрана является проницаемой, выбирают таким образом, чтобы она могла пропускать молекулы аналита, удерживая при этом более крупные молекулы.
В альтернативном варианте вместо диализирующей мембраны на электродную систему можно наносить в качестве спейсерной мембраны 9 покрытие, изготовленное из обладающего высокой проницаемостью для аналита и воды полимера, например, на основе полиуретана или акрилата.
Предпочтительно спейсер изготавливают из сополимера (мет)акрилатов. Предпочтительно спейсерная мембрана состоит из сополимера по меньшей мере 2 или 3 (мет)акрилатов. Более предпочтительно спейсерная мембрана содержит более 50 мол.%, по меньшей мере 60 мол.% или по меньшей мере 70 мол.% гидрофильных мономерных звеньев, например, ГЭМА и/или 2-ГПМА, и вплоть до 40 мол.% или вплоть до 30 мол.% гидрофобных звеньев, например, БМА и/или ММА. Спейсер может представлять собой статистический или блок-сополимер. Наиболее предпочтительная спейсерная мембрана содержит ММА или БМА в качестве гидрофобных фрагментов и 2-ГЭМА и/или 2-ГПМА в качестве гидрофильных фрагментов. Предпочтительно на долю гидрофильных мономеров ГЭМА и/или ГПМА приходится от 80 мол.% до 85 мол.%, а на долю гидрофобных компонентов ММА и/или БМА приходится от 15 мол.% до 20 мол.%.
Наиболее предпочтительную спейсерную мембрану, предлагаемую в изобретении, изготавливают из сополимера Adapt (фирма BioInteractions Ltd, Ридинг, Великобритания). Adapt содержит БМА в качестве гидрофобного фрагмента и 2-ГЭМА и 2-ГПМА в качестве гидрофильных фрагментов, при этом на долю гидрофильных мономеров 2-ГЭМА приходится примерно 80 мол.%.
Спейсерная мембрана обладает очень высокой проницаемостью для аналита, т.е. это существенно снижает чувствительность на единицу площади рабочего электрода, например, на 20% или менее, или на 5% или менее, при толщине слоя менее чем примерно 20 мкм, предпочтительно менее чем примерно 5 мкм. Наиболее предпочтительная толщина спейсерной мембраны составляет от примерно 1 до примерно 3 мкм.
Ферментный слой 5 электродной системы может содержать в качестве каталитического редокс-медиатора частицы оксида металла, предпочтительно частицы диоксида марганца. Диоксид марганца осуществляет каталитическое превращение образующегося пероксида водорода, например, при ферментативном окислении глюкозы и других биоаналитов. В процессе расщепления пероксида водорода частицы диоксида марганца переносят электроны к проводящим компонентам рабочего электрода 1, например, к графитовым частицам, присутствующим в ферментном слое 5. Каталитическое расщепление пероксида водорода противодействует любому снижению концентрации кислорода в ферментном слое 5. Преимуществом является то, что в этом случае конверсия подлежащего обнаружению аналита в ферментном слое 5 не должна ограничиваться местной концентрацией кислорода. Таким образом, применение каталитического редокс-медиатора препятствует искажению результата измерения, обусловленному снижением концентрации кислорода. Другое преимущество каталитического редокс-медиатора заключается в том, что он препятствует образованию повреждающих клетку концентраций пероксида водорода.
Предпочтительный представленный в настоящем описании полимер, образующий спейсерную мембрану, можно применять в качестве наружного покрытия для диффузионного барьера, предлагаемого в настоящем изобретении, а также в качестве наружного покрытия электродной системы в целом, прежде всего электродной системы, предназначенной для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, которая содержит электрод с иммобилизованными молекулами фермента и диффузионный барьер, контролирующий диффузию аналита из окружающей электродную систему среды к молекулам фермента. Так, спейсерную мембрану можно размещать на диффузионном барьере, однако спейсерную мембрану можно размещать также непосредственно на ферментном слое. В указанном последнем случае спейсерная мембрана может функционировать также в качестве самого диффузионного барьера и замедлять диффузию молекул аналита к ферментному слою.
Когда электродную систему, предлагаемую в изобретении, встраивают или имплантируют в организм, то спейсерная мембрана представляет собой поверхность раздела между имплантированным датчиком и окружающей общей водой организма или тканью. Следовательно, спейсерная мембрана, предлагаемая в изобретении, должна быть механически прочной, чтобы при воздействии общей воды организма или ткани, она не деформировалась или не отсоединялась от датчика. Для этой цели необходимо ограничивать поглощение воды сополимером, образующим спейсерную мембрану, и связанное с этим набухание сополимера, несмотря на присущую сополимеру гидрофильность.
Предпочтительно относительное поглощение воды сополимером спейсерной мембраны не должно превышать 50 мас.%, предпочтительно 40 мас.%, более предпочтительно 30 мас.%, в пересчете на общее содержание сополимера. В контексте настоящего изобретения измерение относительного поглощения воды осуществляют, подвергая сухой сополимер воздействию в течение 48 ч при температуре 37°С избытка фосфатного буфера (рН 7,4). Относительное поглощение воды (WU%) предпочтительно определяют согласно уравнению:
2
1
1
WU%=(m-m)/m×100,
1
2
в котором m и m обозначают массу сухого сополимера и массу сополимера после гидратации, проведенной в указанных выше условиях, соответственно.
При создании настоящего изобретения было установлено, что предпочтительная спейсерная мембрана, изготовленная из сополимера Adapt, поглощает в течение 48 ч при 37°С 33±1,8 мас.% фосфатного буфера (рН 7,4) в пересчете на ее собственную массу. В тех же самых условиях мембрана из полимера Lipidure СМ5206 (фирма NOF Corporation, Япония) поглощает 157±9,7 мас.% фосфатного буфера в пересчете на ее собственную массу. Более низкое поглощение воды полимером является преимуществом, поскольку повышает механическую стабильность спейсерной мембраны, предлагаемой в настоящем изобретении. В отличие от этого, Lipidure СМ5206 характеризуется более высоким поглощением воды и набухает до состояния гидрогеля, который является более хрупким, легко деформируемым или отделяющимся, прежде всего в тех случаях, когда он нанесен на электродную систему ферментного датчика для измерений in vivo.
Кроме того, в процессе встраивания и применения электродной системы спейсер находится в непосредственном контакте с тканью и/или общей водой организма, такой как интерстициальная жидкость или кровь, которая содержит биомолекулы, такие как белки и клетки. Предпочтительно спейсерная мембрана должна защищать встроенный и имплантированный датчик в ткани и/или общей воде организма и тем самым минимизировать тканевую реакцию организма на имплантат. Действительно, реакции организма на имплантированный материал известны под названием «реакция на чужеродные тела» («foreign body response» (FBR)). С помощью FBR организм старается разрушить имплантат или, если это оказывается невозможным, создать капсулу, отделяющую его от окружающей ткани (гранулема инородного тела). Первая стадии FBR-реакции заключается в связывании белков (например, фибриногена, альбумина, иммуноглобулина, комплемента) с поверхностью указанного выше материала, т.е. имплантата. На этой белковой оболочке присутствуют сайты связывания для рецепторов иммунных клеток. Например, фибриноген содержит структурный мотив, который связывается с рецептором моноцитов МАС-1. Когда фибриноген связывается с поверхностью имплантата, то он изменяет свою конформацию и экспонирует сайт связывания для МАС-1. После этого происходит рекрутинг к имплантату и активация иммунных клеток, таких как моноциты, секретирующих ферменты и радикалы, атакующие имплантат. Кроме того, иммунные клетки секретируют растворимые факторы, т.е. цитокины, вызывающие рекрутинг и активацию других иммунных клеток, усиливая тем самым иммунный ответ. Если имплантат не может быть удален, то клетки соединительной ткани и белки формируют фиброзную капсулу. Однако эта капсула представляет собой диффузионный барьер для аналитов, препятствующий достижению ими датчика. В совокупности, описанные выше явления, связанные с реакцией на чужеродное тело, по-видимому, оказывают негативное воздействие на функцию электродной системы in vivo и на срок ее службы.
Таким образом, улучшенная спейсерная мембрана на электродной системе ферментного датчика, предназначенного для измерений in vivo, обеспечивает снижение тканевой реакции на имплантат и ингибирует формирование капсулы, отделяющей датчик от окружающей ткани и общей воды организма.
Таким образом, следующая задача настоящего изобретения заключалась в том, чтобы создать электродную систему для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, содержащую электрод с иммобилизованными молекулами фермента и предпочтительно диффузионный барьер, который контролирует диффузию аналита из внешней среды, окружающей электродную систему, к молекулам фермента, отличающуюся тем, что спейсерная мембрана образует по меньшей мере часть наружного слоя электродной системы, где спейсерная мембрана содержит гидрофильный сополимер акриловых и/или метакриловых мономеров, где полимер содержит более 50 мол.% гидрофильных мономеров.
Как указано выше, спейсерная мембрана, предлагаемая в изобретении должна обладать ограниченной белоксвязывающей способностью для защиты электродной системы датчика от адсорбции белков, которые могут запускать клеточный иммунный ответ и могут ограничивать или оказывать неблагоприятное воздействие на ее функционирование in vivo. В примерах 5 и 6 продемонстрировано, что предпочтительная спейсерная мембрана, предлагаемая в изобретении, характеризуется незначительным связыванием с фибриногеном и препятствует конформационному изменению фибриногена, которое может приводить к экспонированию связывающего МАС-1 мотива для моноцитов. Предпочтительно материал спейсерной мембраны, представляющий собой сополимер, не активирует сами иммунные клетки. В примере 6 оказалось возможным продемонстрировать, что сополимер спейсерной мембраны, предлагаемый в изобретении, позволяет ослаблять активацию иммунных клеток, вызываемую имплантированным датчиком. Кроме того, предпочтительно спейсерная мембрана состоит из биосовместимого материала, прежде всего совместимого с общей водой организма, например, с кровью. В примере 7 продемонстрировано, что образующий спейсерную мембрану сополимер, предлагаемый в настоящем изобретении, обладает способностью предупреждать гемолиз и активацию системы комплемента имплантированным датчиком. Таким образом, преимуществом спейсерной мембраны, предлагаемой в изобретении, является то, что она не только характеризуется высокой механической стабильностью, но также обладает оптимальными свойствами биосовместимости, что является неожиданным следствием низкого поглощения воды при смачивании.
В настоящем описании представлены отличительные признаки указанного варианта осуществления изобретения, касающиеся структуры электродной системы, аналита и молекул фермента. Диффузионный барьер предпочтительно представляет собой барьер, представленный в настоящем описании, однако он может иметь также другой состав или может отсутствовать. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения диффузионный барьер предпочтительно содержит блок-сополимер, имеющий, как описано выше, по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения диффузионный барьер содержит гидрофильные полиуретаны. Гидрофильные полиуретаны, применяемые в качестве диффузионной мембраны, можно получать посредством аддитивной полимеризации (поли)диизоцианата, предпочтительно 4-4-метилен-бис(циклогексилизоцианата), с многоатомным спиртом, предпочтительно смесью диолов.
Компонентами смеси диолов предпочтительно являются полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полипропиленгликоль (ППГ), и алифатические диолы, такие как этиленгликоль. Предпочтительно гидрофильный полиуретан содержит 45-55 мол.%, предпочтительно 50 мол.% изоцианата и 25-35 мол.%, предпочтительно 30 мол.% этиленгликоля. Затем степень гидрофилизации регулируют путем выбора соотношения ПЭГ и ППГ. Предпочтительно, полиуретан содержит 2-3 мол.%, более предпочтительно 2,5 мол.% ПЭГ и 17-18 мол.%, предпочтительно 17,5 мол.% ППГ. Для повышения гидрофильности полиуретана можно увеличивать относительное содержание ПЭГ, например, до 4,5-5,5 мол.%, предпочтительно до 5 мол.% ПЭГ, для получения полиуретана с очень большой гидрофильностью. Для оптимизации свойств диффузионного барьера можно также смешивать различные гидрофильные варианты полиуретанов.
Предпочтительными акриловыми и метакриловыми мономерами сополимера спейсерной мембраны, являются мономеры, указанные в настоящем описании.
3
2
5
2
3
2
5
Гидрофильные мономерные звенья предпочтительно выбирают из гидрофильных сложных (мет)акриловых эфиров, т.е. сложных эфиров, имеющих полярную группу, т.е. группу ОН, ОСН или ОСН в спиртовом фрагменте сложного эфира, гидрофильных (мет)акриламидов, имеющих амидную (NH) или N-алкил- или N,N-диалкиламидную группу, где алкильная группа содержит 1-3 атома С и необязательно гидрофильные группы, такие как ОН, ОСН или ОСН, и пригодных (мет)акриловых звеньев, имеющих заряженную, например, анионную или катионную группу, таких как акриловая кислота (акрилат) или метакриловая кислота (метакрилат). Кроме того, можно применять комбинации мономерных звеньев.
Конкретные примеры предпочтительных мономерных звеньев для гидрофильного блока выбирают из:
2-гидроксиэтилакрилата,
2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА),
2-метоксиэтилакрилата,
2-метоксиэтилметакрилата,
2-этоксиэтилакрилата,
2-этоксиэтилметакрилата,
2- или 3-гидроксипропилакрилата,
2- или 3-гидроксипропилметакрилата (2- или 3-ГПМА),
2- или 3-метоксипропилакрилата,
2- или 3-метоксипропилметакрилата,
2- или 3-этоксипропилакрилата,
2- или 3-этоксипропилметакрилата,
1- или 2-глицерилакрилата,
1- или 2-глицерилметакрилата,
акриламида,
метакриламида,
N-алкил- или N,N-диалкилакриламида и
N-алкил- или N,N-диалкилметиламида, где алкил содержит 1-3 атома С, например, представляет собой метил, этил или пропил,
акриловой кислоты (акрилат),
метакриловой кислоты (метакрилат)
и их комбинаций.
Предпочтительными гидрофильными мономерами являются 2-гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА) и/или 2- или 3-гидроксипропилметакрилат (2- или 3-ГПМА).
Гидрофобные мономерные звенья предпочтительно выбирают из гидрофобных акриловых и/или метакриловых звеньев или их комбинаций. Предпочтительно гидрофобные мономерные звенья выбирают из гидрофобных сложных (мет)акриловых эфиров, например, сложных эфиров, имеющих спиртовой фрагмент, содержащий 1-3 атома С и не содержащий гидрофильную группу.
Конкретные примеры мономерных звеньев для гидрофобного блока выбирают из:
метилакрилата,
метилметакрилата (ММА),
этилакрилата,
этилметакрилата (ЭМА),
н-пропилакрилата или изопропилакрилата,
н-пропилметакрилата или изопропилметакрилата,
н-бутилакрилата,
н-бутилметакрилата (БМА),
неопентилакрилата,
неопентилметакрилата
и их комбинаций.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок содержит метилметакрилат (ММА) и н-бутилметакрилат (БМА).
Наружная спейсерная мембрана предпочтительно покрывает по меньшей мере часть рабочего электрода, содержащую молекулы фермента, и необязательно также другие части, например, противоэлектрод. Спейсерная мембрана покрывает также референс-электрод, если он присутствует. Спейсерная мембрана предпочтительно покрывает всю имплантированную поверхность электродной системы. Спейсерная мембрана предпочтительно покрывает рабочий электрод, необязательно противоэлектрод и референс-электрод, если он присутствует, в форме непрерывного слоя.
Электродная система, содержащая улучшенную спейсерную мембрану, предлагаемую в изобретении, может представлять собой часть датчика, например, будучи присоединенной к стабилизатору напряжения и усилителю для усиления измеряемых электродной системой сигналов. Датчик предпочтительно представляет собой ферментный нежидкостной (ENF) датчик, более предпочтительно электрохимический ENF-датчик. Электроды электродной системы можно размещать на субстрате, на котором расположен стабилизатор напряжения, или присоединять к схемной плате, на которой находится стабилизатор напряжения. Предпочтительно датчик предназначен для измерения глюкозы.
Следующий объект изобретения относится к применению гидрофильного сополимера акриловых и/или метакриловых мономеров, где в гидрофильном сополимере на долю гидрофильных мономеров приходится более 50 мол.%, в качестве спейсерной мембраны для ферментного электрода. Гидрофильный сополимер предпочтительно представляет собой сополимер, представленный выше в настоящем описании. Предпочтительно спейсерную мембрану применяют для минимизации реакции на чужеродное тело (FRB), вызываемой против ферментного электрода при его встраивании или имплантации в организм.
Пример 1. Проницаемость ферментного нежидкостного (ENF) глюкозного датчика с распределенными электродами, предназначенного для чрескожной имплантации, который имеет диффузионный слой, состоящий из единственного блок-сополимера
Датчик создавали на предварительно изготовленной структуре палладиевого полоскового проводника, расположенной на субстрате из сложного полиэфира, толщиной 250 мкм. Рабочий электрод (WE) и противоэлектрод (СЕ) размещали в определенном порядке (как продемонстрировано на фиг. 1-2).
Поля СЕ печатали с использованием углеродной пасты, оставшуюся часть полоскового проводника изолировали. Поля WE печатали с использованием смеси сшитой глюкозооксидазы (фермент), проводящей полимерной пасты и электрокатализатора, в данном случае оксида марганца(IV) (фирма Technipur). И в этом случае также изолировали оставшиеся дорожки на полосковом проводнике. Референс-электрод (RE) состоял из Ag/AgCl-пасты. Электроды покрывали примерно 1 см стержня датчика.
WE-поля покрывали диффузионным слоем из блок-сополимера, состоящего из ГЭМА-блока и БМА-блока. Толщина слоя составляла 7 мкм.
Были изготовлены четыре партии датчиков, каждый из которых был снабжен диффузионным слоем из конкретного блок-сополимера (см. представленный ниже перечень). Все блок-сополимеры получали от фирмы Polymer Source, Монреаль, и они указаны в представленной ниже таблице 1.
Соответствующий блок-сополимер растворяли в органическом растворителе (концентрация 25%) и наносили в виде покрытия на датчики. После сушки с помощью ленточных сушилок (2 мин, 30-50°С), проводили тестирование in vitro датчиков с нанесенным покрытием в растворах глюкозы с различными концентрациями. Измерения проводили с использованием 10 датчиков из каждой партии, представлявших собой случайную выборку. Для определения чувствительности in vitro рассчитывали сигнал в виде разницы токов, измеренных при концентрации глюкозы 10 мМ и 0 мМ, который затем делили на 10 мМ (см. пример 4).
Все датчики работали при напряжении поляризации 350 мВ относительно Ag/AgCl, измеряемую температуру поддерживали на постоянном уровне 37°С. Датчики, применявшиеся для этой серии измерений, не содержали спейсер, описанный в WO 2010/028708, что, однако, не приводило к каким-либо различиям с точки зрения уровня тестируемых сигналов. На фиг. 5 представлены данные о чувствительности датчиков с указанием стандартных отклонений для четырех различных диффузионных слоев.
Касательно блок-сополимеров С, D и F, обнаружена выраженная связь между чувствительностью in vitro и молярным соотношением между гидрофобным блоком и гидрофильным блоком. Общие длины цепей сополимеров были почти идентичными, при этом чувствительность возрастала при увеличении содержания гидрофильного блока (ГЭМА).
Исключением являлись датчики, которые имели диффузионный слой из блок-сополимера В. Даже хотя соотношение гидрофобных и гидрофильных блоков в полимере В было примерно таким же, что и в полимере F, чувствительность и, следовательно, проницаемость для глюкозы, снижались. Эмпирически можно считать, что в случае полимера В общая длина цепи - соответствующая молекулярной массе (всей) молекулы сополимера - является настолько большой, что это приводит к снижению проницаемости слоя. Это можно обнаружить также при сравнении определяемого гравиметрическим методом поглощения воды блок-сополимером В и остальными полимерами. Полимер В характеризовался поглощением воды, составляющим 10,6% ± 1,5% (мас.% в пересчете на массу полимера в сухом состоянии). Соответствующие величины для полимера С составляют 15,6% ± 0,0%, для полимера F - 16,5±3,1% и для полимера D - 27% ± 1,7%.
Пример 2. Механическая гибкость диффузионного слоя глюкозного ENF-датчика
ст
ст
Датчик изготавливали согласно методу, описанному в WO 2010/028708, однако он имел диффузионный слой, предлагаемый в настоящем изобретении. Предполагалось, что температура стеклования (Т) является косвенным параметром, характеризующим механическую гибкость. Кроме того, предполагалось, что температура стеклования, которая может быть установлена для гидрофобного блока, определяет механическую гибкость при применении in vivo. Следует иметь в виду, что для одного блок-сополимера могут быть идентифицированы несколько величин Т, которые соответствуют количеству блоков.
На датчики наносили покрытия с помощью тех же самых электродных паст, которые описаны в примере 1. После этого на некоторые датчики наносили покрытие из сополимера, выбранного из ММА-ГЭМА (производство фирмы Polymer Source, Монреаль). Указанный полимер (обозначенный как Д) имел общую молекулярную массу 41 кДа, молярное соотношение ММА (гидрофобный блок) и ГЭМА составляло 60%:40%. Температура стеклования гидрофобного блока составляла 111°С по данным измерений методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) при скорости нагрева 10°С/мин.
ст
ст
Кроме этого, были изготовлены другие датчики с диффузионным слоем из блок-сополимера, предлагаемого в изобретении (обозначенный как А). Гидрофобный блок указанного сополимера А содержал ММА и БМА в равных молярных количествах в виде рандомизированной последовательности. И в этом случае также молярное соотношение гидрофобной части и гидрофильной части составляло 60%:40%. Молекулярная масса была равна 36 кДа. Величина Т гидрофобного блока снижалась до 73°С вследствие наличия рандомизированной последовательности ММА и БМА (Т примерно 45°С).
Оба диффузионных слоя создавали с использованием соответствующего раствора (25%) сополимеров в простом эфире и сушили согласно процедуре, описанной в примере 1. Толщина диффузионных слоев составляла 7 мкм. Затем наносили спейсерный слой путем погружения в покрытие и сушили в течение 24 ч при комнатной температуре. Спейсерный слой состоял из Lipidure СМ 5206 (производство фирмы NOF, Япония).
ст
После эксплантации из ткани на датчиках, имевших диффузионный слой из сополимера Д, обнаружены спорадические трещины в диффузионном слое. Это рассматривается как результат воздействия механической нагрузки. В отличие от этого, на датчиках, имевших диффузионный слой из сополимера А, не было обнаружено никаких трещин под воздействием идентичной нагрузки. По-видимому, это обусловлено снижением Т, что повышает механическую стабильность сополимера. В этом случае физическая смесь двух сополимеров, описанная в WO 2010/028708, более не требовалась.
Пример 3. Оптимальная характеристика проницаемости глюкозного ENF-датчика с распределенным электродом и диффузионным слоем, предлагаемым в изобретении
Датчик изготавливали согласно методу, описанному в примере 1, но он имел дополнительный спейсерный слой на всем стержне датчика. Датчики с соответствующим диффузионным слоем изготавливали с использованием сополимеров А, В, Г и Е, описанных в примерах 1 и 2. Для этой цели приготавливали 24%-ный раствор полимера в простом эфире. Каждый раствор наносили на партию датчиков (N=10) и затем сушили в ленточной сушилке. Таким путем получали диффузионные слои толщиной 7 мкм.
После этого на датчики наносили спейсерный слой как описано в примере 2.
Датчик соединяли с измерительной системой на головке датчика, которая передавала измеряемые данные в хранилище данных. Измерения in vitro осуществляли как описано в примере 1, однако период измерений составлял 7 дней. На основе измеренных данных для каждого датчика рассчитывали дрейф чувствительности в течение соответствующего периода. На фиг. 6 представлены величины дрейфа in vitro для каждого варианта датчика, т.е. группы датчиков с одним вариантом диффузионного слоя. Из расчетов исключали начальную фазу измерений, а именно первые 6 ч, так называемую стартовую фазу.
Для всех сополимеров В, Г и Е, содержавших гидрофобный блок БМА, имел место положительный дрейф, т.е. чувствительность возрастала с течением времени. В отличие от этого, сополимер А, имеющий гидрофобный блок из статистического сополимера ММА и БМА, приводил к очень малому отрицательному дрейфу.
Указанные различия можно объяснить длительным ответом проницаемости соответствующих диффузионных слоев, который был измерен в дополнительных экспериментах. На палладиевые датчики без WE-пасты, но с определенной активной поверхностью, т.е. без ферментного слоя, что исключало влияние его свойства набухания на результаты, наносили покрытия с использованием указанных выше растворов полимеров и после сушки измеряли толщину слоя. Затем измеряли проводимость в содержащем натрий и хлор буферном растворе.
На фиг. 7 продемонстрировано, что проводимость сополимера А оставалась практически постоянной после короткой стартовой фазы.
Как можно видеть из данных, представленных на фиг. 8, это не имело места в случае сополимера Е даже в идентичных условиях измерений. В этом случае был выявлен пролонгированный и выраженный ответ проницаемости диффузионного слоя, состоящего из полимера Е, который практически не зависел от толщины слоя. Для сополимера Е, а также для сополимеров В и Г (данные не представлены), имевших гидрофобный блок БМА, имело место повышение проницаемости даже по истечении длительного периода времени. При измерениях это приводило к непрерывному повышению чувствительности, если диффузионный слой наносили на датчик с распределенным ферментным слоем. Это объясняет наблюдаемый положительный дрейф датчика.
ст
ст
ст
Наоборот, для датчика с блок-сополимером А обнаружен незначительный дрейф, что обусловлено очень малым изменением проницаемости при измерении проводимости. Однако сразу после начала измерений (в течение примерно 1 ч после этого), наблюдалось сильное повышение проводимости сополимера А. Таким образом, имел место очень быстрый старт, который заканчивался примерно через 1 ч. За это время диффузионный слой полностью смачивался и прекращалась его структурная реорганизация, обусловленная поглощением воды. Степень структурного изменения, по-видимому, зависит от Т. Возможно, что сополимер, имеющий повышенную Т, подвергается реорганизации, которая является более ограниченной по времени и уровню по сравнению с сополимером, имеющим Т в диапазоне температур окружающей среды.
Кроме того, было установлено, что датчики с сополимером А обладали сравнительно высокой чувствительностью при начале измерений по сравнению с датчиками, имеющими диффузионный слой из сополимера F. Это следовало ожидать, поскольку они имели идентичные относительные соотношения между гидрофобными и гидрофильными блоками. Достигаемая чувствительность, находящаяся в диапазоне от 1 до 1,5 нА/мМ (см. пример 1), считается идеальной. Такая чувствительность также была получена для датчиков, имеющих диффузионный слой, состоящий из сополимера А.
С точки зрения суммы трех физико-химических характеристик, а именно проницаемости, механической стабильности и ответа проницаемости, оптимальный датчик предпочтительно может быть создан с использованием диффузионного слоя из блок-сополимера, имеющего гидрофобный блок, состоящий по меньшей мере из двух различных случайным образом расположенных гидрофобных мономерных звеньев, такого как блок-сополимер А. Ни один из остальных блок-сополимеров, гидрофобные блоки которых состояли только из одного мономерного звена, не обладали с точки зрения всех трех параметров качеством, сравнимым с сополимером А.
Пример 4. Характеризация блок-сополимеров
Создавали имеющий несколько полей датчик (по 10 полей рабочих электродов и противоэлектродов соответственно) для непрерывных измерений глюкозы и осуществляли его характеризацию in vitro.
Датчик снабжали диффузионным слоем, состоящим из блок-сополимера, который содержал гидрофобный блок из статистически сополимеризованных метилметакрилата (ММА) и н-бутилметакрилата (БМА) и гидрофильный блок из 2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА). Указанные полимеры (обозначенные как Ж и З) изготавливали на фирме Polymer Source, Монреаль, и они обладали большей проницаемостью, чем полимер А, описанный в примерах 1-3, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.
В приведенной ниже таблице 2 представлены характеристики сополимеров:
В приведенной выше таблице 2 молекулярные массы Mn каждого блока указаны по отдельности, и они представляют собой средние значения, поскольку, как известно, полимеры характеризуются распределениями длин молекулярных цепей относительно определенного среднего значения. Этот факт относится также и к величинам, выведенным из величин, приведенных в таблице 2.
Указанные температуры стеклования гидрофобного блока находятся в пределах желаемого диапазона, что гарантирует механическую гибкость.
Параметром, имеющим решающее значение с точки зрения проницаемости диффузионного барьера для аналита, является чувствительность на единицу площади рабочего электрода (т.е. геометрической площади). Чувствительность SE рассчитывали для каждого из анализируемых датчиков на основе измерений тока (I) при концентрации глюкозы 10 мМ и 0 мМ в забуференном фосфатом растворе (рН 7,4) в нА/мМ:
SE=[I(10 мМ)-I(0 мМ)]/10.
m
m
На основе индивидуальных измеренных величин (N=8) определяли среднюю чувствительность SE. Полученные величины чувствительности делили на измеренную под микроскопом общую геометрическую площадь F всех пятен рабочего электрода на имеющем несколько полей датчике. Таким путем получали плотность чувствительности SE/F.
Линейность Y полученной в условиях in vitro функциональной кривой является показателем функциональной способности слоя полимерного покрытия на рабочем электроде контролировать диффузию. Ее рассчитывали для каждого из анализируемых датчиков в % на основе измерений тока при концентрациях глюкозы 20 мМ, 10 мМ и 0 мМ:
20 мМ
Y=50⋅[I(20 мМ)-I(0 мМ)]/[I(10 мМ)-I(0 мМ)].
На основе индивидуальных измеренных величин определяли среднюю величину линейности и ее стандартное отклонение (см. таблицу 3).
eff
И, наконец, толщину L слоя диффузионного барьера датчиков определяли путем измерений оптическим методом для каждого из полимеров. Соответствующие средние значения получали для выборки, включающей ≥23 датчиков с покрытием из одного и того же полимера. На основе этих данных можно было рассчитывать эффективный коэффициент диффузии D слоя покрытия:
eff
m
m
-8
D=SE/F⋅L⋅5,182⋅10
2
m
m
в см/с, где SE и L обозначают соответствующие средние величины чувствительности и толщины слоя, a F обозначает общую площадь всех пятен рабочего электрода.
Дрейф датчика рассчитывали на основе результатов повторных стадий измерений in vitro концентрации глюкозы в течение 7 дней. Результаты, полученные для полимера Н, свидетельствующие о практически постоянной проводимости, представлены на фиг. 9.
В приведенной ниже таблице 3 представлены результаты определения функциональных характеристик:
-9
2
Для более гидрофильного полимера Ж (который обладает большей проницаемостью для глюкозы) коэффициент диффузии определяли также с помощью другого метода, а именно, оценивали проникновение глюкозы через полимерную пленку из камеры, содержащей раствор глюкозы, в камеру, в которой находился не содержащий глюкозу буфер. С помощью указанного метода были получены сходные величины коэффициента диффузии (1,17⋅10 см/с).
Пример 5. Связывание белков с материалом спейсерного слоя
Для оценки связывания белков с материалами, из которых изготавливали спейсерный слой, в планшет для инкубации (FluoroNunc Maxisorp, фирма Thermo Scientific) вносили этанольные растворы Adapt™ (фирма Biointeractions Ltd, Ридинг, Великобритания) или Eudragit E100 (фирма Evonik Industries). Eudragit E100 представляет собой катионный сополимер на основе диметиламиноэтилметакрилата, бутилметакрилата и метилметакрилата. Полимеры сушили в течение ночи при 40°С. После этого на материалы для спейсера наносили раствор фибриногена. Раствор содержал фибриноген, полученный из человеческой плазмы, конъюгированный с флуоресцентным красителем Alexa488 (полученный от фирмы Invitrogen). После инкубации в течение 4 ч раствор фибриногена аспирировали и слои спейсера отмывали восемь раз боратным буфером. Количество связанного со спейсером белка анализировали путем измерения интенсивности флуоресценции в планшете для инкубации при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны испускания 528 нм с использованием флуоресцентного ридера (Synergy4, фирма BioTek Instruments). Для построения калибровочной кривой, с помощью которой результаты измерений флуоресценции превращали в количество белка, использовали меченый белок в известных концентрациях (6,25-500 нг).
Как и ожидалось, фибриноген присоединялся к планшету для инкубации, не имеющему покрытия (контроль), было обнаружено 390 нг связанного белка (фиг. 10). Для планшета с покрытием из Eudragit El00 было обнаружено меньшее количество связанного белка, составлявшее 60 нг. На планшете с покрытием из Adapt™ обнаружить связанный белок оказалось почти невозможно. Данные, полученные до осуществления инкубации, были обусловлены фоновой флуоресценцией. Эти результаты убедительно демонстрируют, что поверхности, на которые нанесено покрытие из применяемых для спейсеров материалов, прежде всего те, на которые нанесено покрытие из Adapt™, хорошо защищены от адгезии фибриногена.
Пример 6. Высвобождение цитокинов клетками после контактирования со спейсерным слоем
Датчики изготавливали согласно методу, описанному в примере 2. После этого на датчики наносили спейсерный слой согласно методу, описанному в примере 2. Спейсерный слой создавали из Lipidure СМ 5206 (фирма NOF Corporation, Япония) или его создавали из Adapt™ (фирма Biointeractions Ltd, Ридинг, Великобритания).
Датчики без спейсерного слоя, датчики со спейсерным слоем, изготовленным из Lipidure СМ 5206, или датчики со спейсерным слоем, изготовленным из Adapt™M, инкубировали с моноцитами линии ТНР-1 и анализировали индукцию маркеров воспаления.
Клетки линии ТНР-1 культивировали в присутствии датчиков в течение 24 ч при 37°С. Затем клетки собирали центрифугированием. Супернатант использовали для определения высвобождения цитокинов, в то время как клеточный дебрис ресуспендировали в ЗФР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и использовали для анализа экспрессии белка клеточной поверхности CD54 (известного также ка ICAM-1, биомаркер воспаления). Клетки линии ТНР-1 инкубировали с антителом к CD54, конъюгированным с флуоресцентным красителем фикоэритрином (фирма BD Bioscience). После инкубации в течение 45 мин при 4°С клетки отмывали в ЗФР/1% БСА и определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) от 10000 клеток с использованием проточного цитометра (длина волны возбуждения 532 нм, длина волны испускания 585 нм) (устройство BD FACSArray, фирма BD Bioscience). По сравнению с необработанными ТНР-1-клетками инкубация с датчиками, не имеющими покрытия, приводила к повышению относительного уровня экспрессии CD54 (6-кратная индукция), о чем свидетельствуют высокие значения MFI (фиг. 11). Инкубация клеток с датчиками, имеющими покрытие в виде спейсерных слоев из СМ 5206 или Adapt™, приводила к ослаблению экспрессии CD54 на 45% или 41% соответственно.
Супернатант применяли для определения количества цитокинов интерлейкина-8 (IL-8) и «моноцитарного хемотаксического белка-1» (МСР-1) с помощью иммуноанализа с использованием гранул согласно инструкциям производителя (наборы Flex, фирма BD Bioscience) и последующего анализа методом проточной цитометрии (BD FACSArray, фирма BD Bioscience). Анализ данных осуществляли с использованием программного обеспечения FCAP array, версия 1.0.1 (фирма Soft flow Hungary Ltd.).
По сравнению с необработанными ТНР-1-клетками датчики, не имеющие покрытия, индуцировали сильное высвобождение IL-8 (49 по сравнению с 197 пг/мл) (фиг. 12а) и МСР-1 (6 по сравнению с 48 пг/мл) (фиг. 12б). Высвобождение IL-8 и МСР-1 снижалось в том случае, когда датчики имели покрытие в виде спейсерных слоев из СМ 5206 или Adapt™. Датчики с покрытием из Adapt™ индуцировали высвобождение 100 пг/мл IL-8 и 25 пг/мл МСР-1. Датчики с покрытием из СМ 5206 приводили к секреции 125 пг/мл IL-8 и 18 пг/мл МСР-1.
Взятые в совокупности, эти данные демонстрируют, что спейсерные слои ослабляют индукцию трех хорошо известных биомаркеров воспаления, а именно, CD54, IL-8 и МСР-1.
Для анализа роли адсорбции белка в активации ТНР-1 -клеток на планшеты для культур тканей наносили покрытие из СМ 5206, Adapt™ или Eudragit E100. Затем спейсер инкубировали с человеческим фибриногеном (фирма Sigma-Aldrich). Клетки линии ТНР-1 инкубировали с различными слоями спейсеры + фибриноген. После инкубации в течение 48 ч при 37°С клетки осаждали центрифугированием и анализировали супернатант в отношении высвобождения IL-8. В качестве контроля клетки выращивали в культуральных планшетах без спейсера, но покрытых фибриногеном (материал, из которого сделан планшет, представлял собой полистирол). Как продемонстрировано на фиг. 13, указанные клетки высвобождали 89 пг/мл IL-8. Из клеток, которые культивировали на СМ 5206 + фибриногене или на Adapt™ + фибриногене, высвобождалось 68 или 49 пг/мл соответственно. В отличие от этого, из клеток, выращенных на Eudragit E100 + фибриногене, высвобождалось 206 пг/мл IL-8. Следует отметить, что клетки, выращенные на Eudragit E100 без фибриногенового покрытия, секретировали лишь 59 пг/мл IL-8. Адсорбция фибриногена на полимерной поверхности и конформационные изменения белка могут приводить к экспозиции сайта связывания МАС-1. Клетки линии ТНР-1, активированные посредством связывания MAC-1 с их рецептором, высвобождают цитокины, такие как IL-8, и тем самым запускают воспалительный ответ. Таким образом, спейсерные слои, состоящие из Adapt™ или СМ 5206, позволяют избегать отложения белка и экспозиции структурных мотивов на поверхностях (таких как датчики) и тем самым минимизировать воспалительные реакции против имплантатов.
Пример 7. Ограниченный гемолиз, обусловленный датчиками с нанесенным спейсерным слоем
Датчики изготавливали согласно методу, описанному в примере 2. После этого на датчики наносили спейсерный слой как описано в примере 2. Спейсерный слой создавали с использованием Lipidure СМ 5206 (фирма NOF Corporation, Япония) или Adapt™ (фирма Biointeractions Ltd, Ридинг, Великобритания).
2
Анализировали гемолитическую способность датчиков без спейсерного слоя, датчиков со спейсерным слоем, состоящим из Lipidure СМ 5206, или датчиков со спейсерным слоем, состоящим из Adapt™. Для этой цели датчики с общей площадью поверхности 6 см инкубировали с эритроцитами и затем определяли лизис путем измерения высвобождения гемоглобина в супернатант. Эритроциты выделяли из свежей человеческой крови путем центрифугирования (для того, чтобы избежать коагуляции, добавляли цитрат). Затем их отмывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР) и после этого разводили с помощью ЗФР в соотношении 1:40. Суспензию эритроцитов инкубировали с датчиками в течение 24 ч при 37°С в темноте на вращающейся платформе (350 об/мин). После этого клетки осаждали путем центрифугирования и измеряли содержание гемоглобина в супернатанте спектроскопическим методом путем измерения абсорбции в супернатанте при длине волны 575 нм. Результаты представляли в виде литического индекса (в %), который представляет собой высвобождение гемоглобина в образце, деленное на высвобождение гемоглобина в положительном контроле (т.е. полный осмотический лизис эритроцитов в дистиллированной воде). Результаты представлены на фиг. 14.
Датчики без спейсерного слоя вызывали значительный гемолиз, характеризующийся высоким гемолитическим индексом, равным 47,4%. Покрытие датчиков спейсерным слоем из Lipidure СМ 5206 снижало гемолитическую способность датчиков, что характеризовалось литическим индексом, составлявшим 14,7%. Датчики, покрытые спейсерным слоем из Adapt™, вызывали лишь незначительный гемолиз, характеризовавшийся литическим индексом, составлявшим 7,5%, что находилось в пределах литических индексов, установленных для отрицательного контроля (т.е. когда эритроциты в ЗФР инкубировали в отсутствии какого-либо тестируемого материала) или только Adapt™. Полученные результаты свидетельствуют о защитной функции спейсерного слоя, приводящей к снижению гемолиза.