НАБОР РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ВИДА YERSINIA PESTIS АНТИЧНОГО БИОВАРА ОСНОВНОГО ПОДВИДА И АЛТАЙСКОГО БИОВАРА ЦЕНТРАЛЬНОАЗИАТСКОГО ПОДВИДА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОБРАЗЦАХ
SET OF RECOMBINANT FLUORESCENT STRAINS OF YERSINIA PESTIS BACTERIA OF MAIN SUBSPECIES BIOVAR AND THE ALTAI BIOVAR OF THE CENTRAL ASIATIC SUBSPECIES FOR INDICATION OF PLAGUE AGENT IN EXPERIMENTAL SAMPLES

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к конструированию рекомбинантных штаммов Yersinia pestis, продуцирующих флуоресцентные белки. Оно может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях Роспотребнадзора для изучения механизмов персистенции возбудителя чумы во внешней среде в экспериментально смоделированных условиях, механизмов пато- и иммуногенеза чумы.
Чума входит в перечень наиболее актуальных угроз в мире, реализация которых способна привести к возникновению чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения, имеющих международное значение [1]. В настоящее время активность природных очагов чумы проявляется на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды. В 2010-2019 гг. эпидемические проявления чумы в мире зарегистрированы на территории многих государств, в том числе: в Африке - в Республике Мадагаскар, Демократической Республике Конго, Республике Уганда, Объединенной Республике Танзания; в Южной Америке - в Республике Перу, в Многонациональном Государстве Боливия; в Северной Америке - в США; в Азии - в Китайской Народной Республике, Монгольской Народной Республике, Российской Федерации, Киргизской Республике [2, 3].
На территории Российской Федерации и сопредельных государств находится 45 природных очагов чумы, расположенных в различных географических зонах [4]. В Российской Федерации в 2010-2019 гг. эпизоотическая активность была зарегистрирована в Горно-Алтайском высокогорном, Тувинском горном, Прикаспийском песчаном, Восточно-Кавказском высокогорном природных очагах. [5]. В 2014-2016 произошли три случая заражения чумой человека на территории Р. Алтай, РФ [6]. В Горно-Алтайском высокогорном очаге одновременно распространены штаммы двух подвидов возбудителя чумы: основного (античный биовар) - Y. pestis subspecies pestis biovar antiqua и центральноазиатского (алтайский биовар) - Y. pestis subspecies central asiatica biovar altaica подвидов. Штаммы античного биовара основного подвида высоко вирулентны, вызывают вспышки и эпидемии чумы. Именно они послужили причиной заражения чумой людей в Горно-Алтайском высокогорном очаге в 2014-2016 гг. Случаи чумы, вызванные у людей штаммами алтайского биовара центральноазиатского подвида, не зарегистрированы.
Чума - особо опасная инфекционная природно-очаговая болезнь с преимущественно трансмиссивным механизмом передачи инфекции [7]. Чума проявляется тяжелой интоксикацией, поражением кожи, лимфатических узлов, легких и других органов и протекает с исключительно тяжелым состоянием. Высокая контагиозность и тяжесть болезни, часто возникающие эпидемиологические осложнения на фоне постоянного проявления эпизоотической активности в очагах, большое число природных очагов чумы на разных континентах, опасность быстрого распространения в условиях возрастающих международных торгово-экономических и культурных связей диктуют необходимость проведения исследований, направленных на комплексное и всестороннее изучение возбудителя чумы.
Многие стороны сложной экологии возбудителя чумы в природных биоценозах остаются малоисследованными, в том числе и механизмы сохранения во внешней среде. Все больше доказательств получает гипотеза персистенции возбудителя чумы в членах почвенных биоценозов природных очагов чумы - в простейших и других массовых видах почв нор грызунов. Это объясняет выделение большого числа культур чумного микроба после длительного отсутствия активности очагов и взрывной характер начала эпизоотий, на обширных пространствах очагов чумы [8]. Экспериментально показана возможность сохранения Y. pestis в цистах Hartmannella rhysodes и Acanthamoeba castellanii [9, 10]. Однако необходимы дальнейшие исследования для выявления природных резервуаров чумы во внешней среде. Установление таких резервуаров длительного сохранения Y. pestis в природных биоценозах будет способствовать оптимизации комплекса проводимых профилактических мер и эпидемиологического мониторинга природных очагов чумы.
Остаются невыясненными многие особенности пато- и иммуногенеза при чуме. В настоящее время проводятся разносторонние мультидисциплинарные исследования, направленные на системное понимание механизмов взаимодействия возбудителя чумы с макроорганизмом млекопитающих, а также на разработку эффективных чумных вакцин. До конца не выявлены многие молекулярные основы способности возбудителя чумы противодействовать системам врожденного иммунитета макроорганизма, внутриклеточного выживания и размножения в макрофагах и нейтрофилах, а также другие механизмы противодействия этого патогена [11, 12].
Существенный вклад в изучение закономерностей взаимодействия возбудителя чумы с микро- и макроорганизмами, в системное понимание молекулярных основ пато- и иммуногенеза чумы может внести создание набора штаммов Y. pestis разных подвидов с различной вирулентностью за счет маркирования штаммов Y. pestis легко детектируемыми признаками. Наличие таких штаммов облегчит выявление и определение локализации Y. pestis в клетках простейших и образцах тканей млекопитающих, а также проведение дифференциации чумного микроба от посторонней микрофлоры в со-культурах с микроорганизмами и посевах экспериментальных образцов. В качестве прижизненных меток микроорганизмов в последнее время широко используют флуоресцентные белки, гены которых с помощью специальных генно-инженерных технологий вводят в состав генома бактерий. Применяемые флуоресцентные белки обладают низкой токсичностью, высокой стабильностью и не влияют на процессы жизнедеятельности полученных рекомбинантных бактерий. Доступны коммерческие генетические конструкции с генами флуоресцентных белков с различными спектральными характеристиками, которые позволяют конструировать рекомбинантные флуоресцентные штаммы бактерий с флуоресценцией в разных диапазонах спектра. В состав генетических векторов с генами белков флуоресценции включены также гены анти-биотикорезистентности, что обеспечивает селекцию рекомбинантных флуоресцентных штаммов и упрощает процесс их выделения из со-культур с микроорганизмами, из посевов органов и тканей экспериментальных животных. Введение генов флуоресцентных белков в состав генома бактерии с помощью плазмидного вектора имеет ряд преимуществ. Плазмидные векторы обладают высокой копийностью в рекомбинантных штаммах микроорганизмов, следствием которой является высокий уровень экспрессии флуоресцентных белков, усиление яркости свечения в заданной области спектра и насыщенности цвета при наблюдении невооруженным глазом. Существует большое разнообразие флуоресцентных белков, испускающих энергию во всех диапазонах видимой области спектра, доступных исследователям. Преимуществами зеленого белка TurboGFP являются наличие яркой флуоресценции, быстрое созревание в широком диапазоне температур, рН-стабильность и фотостабильность [13]. Представителем группы дальне-красных флуоресцентных белков является Katushka2S, который по сравнению с многими другими белками красного спектра обладает наибольшей яркостью, более быстрым созреванием и лучшим соотношением сигнал-шум. Не наблюдается никаких цитотоксических эффектов или видимой агрегации белка в сконструированных штаммах [14]. Таким образом, создание рекомбинантных штаммов возбудителя чумы, экс-прессирующих флуоресцентные белки TurboGFP и Katushka2S, и получение набора флуоресцентных штаммов Y. pestis разных подвидов оптимизирует и существенно упростит проведение исследований по изучению особенностей пато- и иммуногенеза чумы, выяснению механизмов персистенции возбудителя во внешней среде.
Сведения о запатентованных флуоресцентных штаммах Y. pestis отсутствуют. В зарубежных литературных источниках имеются данные об использовании флуоресцентных белков в экспериментах по изучению патогенеза чумы, в то время как в отечественной литературе сведения по использованию флуоресцентных штаммов Y. pestis отсутствуют. С. Forde et al. (2004) количественно оценивали синтез факторов вирулентности возбудителя чумы, используя набор плазмид, в каждой из которых экспрессия флуоресцентного белка GFP находилась под контролем одного из промоторов YOP белков, входящих в систему секреции 3 типа - обязательного фактора вирулентности возбудителя чумы [15]. В работе S. Su et al. (2014) гены белков GFP и RFP встраивали непосредственно в хромосому штамма Y. pestis CO92 для обеспечения легко детектируемых маркерных признаков при исследовании патогенетических процессов [16].
В работе J.A. Benavides-Montano и V. Vadyvaloo (2017) для изучения выживания клеток возбудителя чумы в амебах A. castellanii использовался рекомбинантный флуоресцентный штамм на основе Y. pestis KIM5 с введенной плазмидой pMMB207gfp3.1, кодирующей синтез белка GFP, и мутанты этого штамма [17]. В аналогичной работе D.W. Markman et al. (2018) в целях изучения локализации Y. pestis в ультраструктуре клеток амеб применяли штамм Y. pestis CO92 с плазмидой pGFPuv, кодирующей флуоресцентный белок GFP и устойчивость к ампициллину [18]. Однако для конструирования меченых штаммов в обеих работах были использованы изоляты Y. pestis основного подвида, принадлежащие к средневековому и восточному биоварам, в то время как для отечественных исследований наибольшую актуальность имеет создание флуоресцентных рекомбинантов античного биовара основного подвида, этиологического агента эпидемических осложнений на территории Горно-Алтайского высокогорного очага, а также алтайского биовара центральноазиатского подвида из этого же очага.
Сведения о конструировании рекомбинантных штаммов Y. pestis античного биовара основного подвида и алтайского биовара центрально-азиатского подвида, несущих плазмиды с генами флуоресцентных белков (в том числе TurboGFP и Katushka2S), в литературе отсутствуют.
Задачей настоящего изобретения является получение набора флуоресцентных штаммов Y. pestis античного биовара основного подвида и алтайского биовара центральноазиатского подвида, несущих рекомбинантные плазмиды pTurboGFP-B и pKatushka2S-B с последовательностями генов флуоресцентных белков TurboGFP и Katushka2S, для изучения механизмов персистенции возбудителя во внешней среде в экспериментально смоделированных условиях, механизмов пато- и иммуногенеза чумы.
Технический результат изобретения заключается в обеспечении быстрой и надежной индикации чумного микроба в экспериментальных образцах в процессе изучения механизмов персистенции возбудителя во внешней среде в экспериментально смоделированных условиях, механизмов пато- и иммуногенеза чумы за счет визуализации клеток сконструированных рекомбинантных штаммов Y. pestis античного биовара основного подвида и алтайского биовара центральноазиатского подвида, несущих плазмиды pTurboGFP-B и pKatushka2S-B с генами флуоресцентных белков, по наличию специфического флуоресцентного свечения в заданной области.
Для достижения указанного технического результата предложен набор штаммов в который входят сконструированные рекомбинантные штаммы Y. pestis КМ2083 (pTurboGFP-B), Y. pestis KM2084 (pKatushka2S-B), Y. pestis KM2048 (pTurboGFP-B) античного биовара основного подвида; а также штаммы Y. pestis КМ2081 (pTurboGFP-B), Y. pestis KM2082 (pKatushka2S-B) алтайского биовара центральноазиатского подвида с генами флуоресцентных белков TurboGFP и Katushka2S, обеспечивающие визуализацию возбудителя чумы при изучении взаимодействия с микро- и макроорганизмами.
10
Для конструирования рекомбинантных флуоресцентных штаммов использованы штаммы античного биовара основного подвида - Y. pestis 367 (выделен в 2016 г.), Y. pestis 216 (выделен в 2017 г.), и алтайского биовара центральноазиатского подвида - Y. pestis И-3531 (выделен в 2009 г.). Для получения клеток, обладающих зеленой флуоресценцией, в качестве вектора использовали плазмиду pTurboGFP-B (4103 п.н., Евроген, Россия), кодирующую зеленый флуоресцентный белок TurboGFP с максимумом возбуждения/испускания белка 482/502 нм. Векторная плазмида содержит точку начала репликации плазмиды ColEl и ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Вектор pKatushka2S-B (4138 п.н., Евроген, Россия) имеет аналогичную структуру, однако вместо гена синтеза белка GFP, содержит ген красного флуоресцентного белка Katushka2S с максимумом возбуждения/испускания белка 588/633 нм. Процедуру трансформации клеток штаммов Y. pestis плазмидами pTurboGFP-B и pKatushka2S-B проводили по инструкции производителя. Компетентные клетки получали по оптимизированной нами методике. Трансформацию клеток штаммов Y. pestis выполняли методом электропорации. Для этого к 50 мкл свежеприготовленных компетентных клеток в концентрации 10 КОЕ/мл добавляли 1 мкг ДНК векторной плазмиды pTurboGFP или pKatushka2S-B (Евроген, Россия) в концентрации 500 нг/мкл. Электропорацию осуществляли при напряжении 3 кВ, фиксированной емкости 25 мкФ, сопротивлении 200 Ом. Сразу после проведения электропорации клетки смешивали с питательной средой S.O.C. (Invitrogen, США) и выдерживали при 28°C в течение 1 часа. Клетки высевали на пластинки агара LB с 50 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 28°C в течение 48 часов. Выросшие колонии проверяли на наличие плазмид при просмотре колоний с использованием источника УФ-света и по методу С. Kado, S. Liu (1981) [19].
Полученные рекомбинантные флуоресцентные штаммы Y. pestis депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий на базе ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора с присвоением следующих номеров:
КМ2083 - производный штамма Y. pestis 216, выделен в 2017 г. от серого сурка (Marmota baibacina) в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы, относится к античному биовару основного подвида, трансформирован плазмидой pTurboGFP-B, вследствие чего рекомбинантным штаммом приобретена способность к продуцированию флуоресцентного белка TurboGFP и β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину;
КМ2084 - производный штамма Y. pestis 216, выделен в 2017 г. от серого сурка (Marmota baibacina) в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы, относится к античному биовару основного подвида, трансформирован плазмидой pKatushka2S-B, вследствие чего рекомбинантным штаммом приобретена способность к продуцированию флуоресцентного белка pKatushka2S и β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину;
КМ2048 - производный штамма Y. pestis 367, выделен в 2016 г. от серого сурка (Marmota baibacina) в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы, относится к античному биовару основного подвида, трансформирован плазмидой pTurboGFP-B, вследствие чего рекомбинантным штаммом приобретена способность к продуцированию флуоресцентного белка TurboGFP и β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину;
КМ2081 - производный штамма Y. pestis И-3531, выделен в 2009 г. от блохи Amphalius runatus с шерсти пищухи монгольской (Ochotona pallasi) в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы, относится к алтайскому биовару центральноазиатского подвида, трансформирован плазмидой pTurboGFP-B, вследствие чего рекомбинантным штаммом приобретена способность к продуцированию флуоресцентного белка TurboGFP и β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину;
КМ2082 - производный штамма Y. pestis И-3531, выделен в 2009 г. от блохи Amphalius runatus с шерсти пищухи монгольской (Ochotona pallasi) в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы, относится к алтайскому биовару центральноазиатского подвида, трансформирован плазмидой pKatushka2S-B, вследствие чего рекомбинантным штаммом приобретена способность к продуцированию флуоресцентного белка Katushka2S и β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.
Все полученные рекомбинантные флуоресцентные штаммы Y. pestis имеют такие же свойства, что исходные реципиентные штаммы. По культурально-морфологическим свойствам это грамотрицательные биполярные палочки, в жидких питательных средах обладают агглютинативным ростом, на плотных питательных средах формируют колонии желто-зеленого или красного цвета (в зависимости от включенной в состав плазмиды), структура и форма колоний не отличается от исходных штаммов. Рекомбинантные флуоресцентные штаммы сохраняют биохимические свойства исходных штаммов Y. pestis, чувствительность к бактериофагам в диагностическом титре - псевдотуберкулезному, чумному Покровской и Л413"С". Сконструированные флуоресцентные штаммы Y. pestis античного биовара основного подвида, как и реципиентные штаммы, обладают универсальной вирулентностью для лабораторных животных (морские свинки, белые мыши), а штаммы алтайского биовара центральноазиатского подвида, как и исходные штаммы, проявляют высокую вирулентность в отношении белых мышей.
Набор сконструированных рекомбинантных флуоресцентных штаммов Y. pestis используют следующим образом. Штаммы Y. pestis античного биовара основного подвида - КМ2083, КМ2084, КМ2048 и алтайского биовара центральноазиатского подвида - КМ2081, КМ2082 культивируют в течение 48 часов при температуре 28°C. Полученные культуры проверяют на наличие флуоресценции в зеленом или дальне-красном спектре и устойчивости к антибиотику ампициллину (500 Ед/мл). Штаммы античного биовара основного подвида обладают высокой вирулентностью, в то время как штаммы алтайского биовара центральноазиатского подвида имеют избирательную вирулентность (вирулентны для мелких грызунов и зайцеообразных). Набор выращенных культур флуоресцентных штаммов Y. pestis разных подвидов используют для сравнительного анализа взаимодействия штаммов возбудителя чумы с разной вирулентностью с макроорганизмами различных хозяев и массовых членов почвенных биоценозов природных очагов чумы.
Сущность изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Использование рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2048 (pTurboGFP-B) античного биовара основного подвида в изучении взаимодействия с простейшими и с макроорганизмом млекопитающих.
4
6
Для совместного культивирования штамма Y. pestis КМ2048 и простейших используют аксенические культуры акантамеб A. castellanii, выделенные на эпизоотических участках Горно-Алтайского высокогорного очага чумы. Штамм амеб культивируют в жидкой питательной среде PYG при 28°C, добиваясь перехода амеб из неактивных инцистированных форм в состояние активных трофозоитов, а затем очищают трехкратным промыванием в буферном солевом растворе АВ и центрифугированием в течение 15 мин на скорости 4000 RPM. Конечная концентрация амеб составляет от 1×10 до 1×10 кл./мл.
9
Рекомбинантный флуоресцентный штамм Y. pestis КМ2048 античного биовара основного подвида выращивают на пластинках агаровой среды LB (рН 7,2) с добавлением 500 Ед/мл ампициллина при 28°C в течение 18 ч. Делают взвесь клеток штамма в буфере АВ в концентрации 1⋅10 кл./мл. Культуры акантамеб и Y. pestis КМ2048 в соотношении 1/10 сокультивируют в течение 21 дня в буфере АВ с добавлением 500 Ед/мл ампициллина. Совместное культивирование возбудителя чумы и амеб проводят в климатической камере KBF 720 (Binder, Германия) при постоянной температуре 22°C и влажности 60%. По прошествии 21 суток материал отбирают для учета результата методом микроскопии. Просмотр образцов проводят с использованием микроскопа Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Германия) в УФ-свете с набором фильтров 38 (Carl Zeiss, Германия, возбуждение - 470/40 нм, эмиссия - 525/50 нм), регистрацию изображения осуществляют с помощью цифровой камеры Axiocam 503 Color (Carl Zeiss, Германия).
По результатам эксперимента устанавливают, что рекомбинантный штамм Y. pestis КМ2048 античного биовара основного подвида сохраняется в клетках акантамеб при температуре 22°C и влажности 60% в течение всего срока эксперимента (21 день). При этом клетки рекомбинантного штамма четко визуализируются во внутриклеточном матриксе клеток простейших в области эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в трофозоитах и по краю клеточной стенки внутри цист в виде яркоокрашенных палочек зеленого цвета типичной для возбудителя чумы формы.
3
4
Для установления возможности использования полученного рекомбинантного флуоресцентного штамма в исследованиях, связанных с изучением механизмов пато- и иммуногенеза чумы, проводилось заражение лабораторных животных. Эксперимент по заражению лабораторных белых мышей проводят согласно требованиям по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях. Заражение биомоделей - белых мышей штаммом Y. pestis КМ2048 античного биовара основного подвида проводят подкожно в дозах 1×10 и 1×10 КОЕ/мл. Павших грызунов вскрывают, делают отпечатки органов и посевы отпечатков органов на плотные среды. Мазки-отпечатки и посевы просматривают в люминесцентном микроскопе (Axio Imager Z2, Carl Zeiss) при увеличении ×1500. Флуоресцирующие клетки штамма Y. pestis КМ2048 высевают из всех органов (регионарные лимфоузлы, печень, селезенка) и крови. Наибольшую обсемененность наблюдают в печени и селезенке. В мазках-отпечатках органов обнаруживают клетки Y. pestis, обладающие зеленой флуоресценцией. Фоновое свечение в мазках отсутствует, клетки штамма визуализируются в виде ярко-зеленых палочек. Делается вывод о высокой вирулентности рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2048 античного биовара основного подвида и его эффективности в изучении взаимодействия с макроорганизмом хозяина.
Пример 2. Использование рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2083 (pTurboGFP-B) античного биовара основного подвида в изучении взаимодействия с простейшими и с макроорганизмом млекопитающих.
Изучение взаимодействия с простейшими проводят аналогично примеру 1. В результате проведенных исследований устанавливают, что рекомбинантный штамм Y. pestis КМ2083 античного биовара основного подвида сохраняется в клетках амеб при температуре 22°C и влажности 60% в течение всего срока эксперимента (21 день). Клетки рекомбинантного штамма четко визуализируются в фиксированных препаратах аналогично примеру 1. Сравнение результатов совместного культивирования штаммов, принадлежащих к одной филогенетической группе, но выделенных в разные временные промежутки, позволяет выявить общие закономерности сохранения штаммов античного биовара в клетках простейших.
3
4
Исследование взаимодействия рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2083 с макроорганизмом млекопитающих проводят аналогично примеру 1. Заражение белых мышей штаммом Y. pestis КМ2083 античного биовара основного подвида проводят подкожно в дозах 1×10 и 1×10 КОЕ/мл. В мазках-отпечатках и посевах всех органов павших белых мышей визуализируются клетки Y. pestis аналогично примеру 1. Делается вывод о вирулентности рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2083 античного биовара основного подвида для белых мышей.
Пример 3. Использование рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2084 (pKatushka2S-B) античного биовара основного подвида в изучении взаимодействия с простейшими и с макроорганизмом млекопитающих.
Исследование проводят аналогично примеру 1. Образцы просматривают под микроскопом в УФ-свете с использованием набора фильтров 63 НЕ (Carl Zeiss, Германия, возбуждение - 572/25 нм, эмиссия - 629/62 нм). В результате проведенных исследований устанавливают, что рекомбинантный штамм Y. pestis КМ2084 античного биовара основного подвида сохраняется в клетках амеб при температуре 22°C и влажности 60% в течение всего срока эксперимента (21 день). Клетки рекомбинантного штамма в просматриваемых препаратах представлены во внутриклеточном матриксе клеток простейших в ЭПР в трофозоитах и по краю клеточной стенки внутри цист в виде биполяров типичной для Y. pestis формы с характерной красной флуоресценцией.
3
4
Исследование взаимодействия рекомбинантного флуоресцентного штамма с макроорганизмом млекопитающих проводят аналогично примеру 1. Заражение лабораторных мышей штаммом Y. pestis КМ2084 античного биовара основного подвида проводят подкожно в дозах 1×10 и 1×10 КОЕ/мл. В мазках-отпечатках и посевах всех органов павших белых мышей (регионарные лимфоузлы, печень, селезенка, кровь) обнаруживают клетки Y. pestis, обладающие флуоресценцией в дальне-красном спектре. Делается вывод о вирулентности рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2084 античного биовара основного подвида для белых мышей.
Пример 4. Использование рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2081 (pTurboGFP-B) алтайского биовара центральноазиатского подвида в изучении взаимодействия с простейшими и с макроорганизмом млекопитающих.
Исследование проводят аналогично примеру 1. Для совместного культивирования штамма Y. pestis КМ2081 и простейших используют аксенические культуры акантамеб А. castellanii, выделенные на эпизоотических участках Горно-Алтайского высокогорного очага чумы с циркуляцией алтайского биовара центральноазиатского подвида. В результате проведенных исследований устанавливают, что рекомбинантный штамм Y. pestis КМ2081 алтайского биовара центральноазиатского подвида сохраняется в клетках А. castellanii при температуре 22°C и влажности 60% в течение всего срока эксперимента (21 день). Клетки рекомбинантного штамма четко визуализируются в фиксированных препаратах аналогично примеру 1.
3
4
Исследование проводят аналогично примеру 1. Заражение биомоделей - белых мышей штаммом Y. pestis КМ2081 алтайского биовара центральноазиатского подвида проводят подкожно в дозах 1×10 и 1×10 КОЕ/мл. В мазках-отпечатках и посевах всех органов павших белых мышей (регионарные лимфоузлы, печень, селезенка, кровь) обнаруживают клетки Y. pestis, обладающие зеленой флуоресценцией. Делается вывод о вирулентности рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2081 алтайского биовара центральноазиатского подвида для белых мышей.
Пример 5. Использование рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2082 (pKatushka2S-B) алтайского биовара центральноазиатского подвида в изучении взаимодействия с простейшими и с макроорганизмом млекопитающих.
Исследование проводят аналогично примеру 1. Образцы просматривают под микроскопом в УФ-свете с использованием набора фильтров 63 НЕ (Carl Zeiss, Германия, возбуждение - 572/25 нм, эмиссия - 629/62 нм). В результате проведенных исследований устанавливают, что рекомбинантный штамм Y. pestis КМ2082 алтайского биовара центральноазиатского подвида сохраняется в клетках амеб при температуре 22°C и влажности 60% в течение всего срока эксперимента (21 день). Клетки рекомбинантного штамма в просматриваемых препаратах представлены во внутриклеточном матриксе клеток простейших в ЭПР в трофозоитах и по краю клеточной стенки внутри цист в виде биполяров типичной для Y. pestis формы с характерной красной флуоресценцией.
3
4
Исследование проводят аналогично примеру 1. Заражение биомоделей - белых мышей штаммом Y. pestis КМ2082 алтайского биовара центральноазиатского подвида проводят подкожно в дозах 1×10 и 1×10 КОЕ/мл. В мазках-отпечатках и посевах всех органов павших белых мышей (регионарные лимфоузлы, печень, селезенка, кровь) обнаруживают клетки Y. pestis, обладающие флуоресценцией в дальне-красном спектре. Делается вывод о вирулентности рекомбинантного флуоресцентного штамма Y. pestis КМ2082 алтайского биовара центральноазиатского подвида для белых мышей.
На основе сравнительного анализа данных исследований, проведенных в примерах №1-5 с использованием набора сконструированных флуоресцентных штаммов Y. pestis устанавливают, что штаммы Y. pestis античного биовара основного подвида и алтайского биовара центральноазиатского подвида способны сохраняться в клетках амеб A. castellanii из почв Горно-Алтайского высокогорного очага.
Важным преимуществом использования сконструированных флуоресцентных штаммов Y. pestis при изучении взаимодействия с макроорганизмом хозяина является наличие у них устойчивости к антибиотику ампициллину, что позволяет проводить их селекцию от посторонней микрофлоры в органах павших животных, а также отсутствие необходимости окрашивания мазков-отпечатков органов люминесцентной видоспецифической сывороткой.
Таким образом, сконструированный набор рекомбинантных флуоресцентных штаммов Y. pestis античного биовара основного подвида и алтайского биовара основного подвида обеспечивает быструю и надежную индикацию возбудителя чумы в исследуемых образцах по наличию специфического свечения в заданной области спектра за счет экспрессии генов флуоресцентных белков TurboGFP и Katushka2S, введенных в составе векторных плазмид, при изучении механизмов персистенции возбудителя во внешней среде в экспериментально смоделированных условиях, механизмов пато- и иммуногенеза чумы.
Литература
1. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д., Федоров Ю.М. Стратегия борьбы с инфекционными болезнями и санитарная охрана территорий в современных условиях. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2006. - №2. - С. 5-9.
2. WHO. Weekly Epidemiological record. №25. 2019. 94. P. 289-292. URL: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/l0665/32548l/WER9425-en-fr.pdf?ua=1 (дата обращения 20.02.2020).
3. ProMed. URL: http https://promedmail.org/ (дата обращения 20.02.2020).
4. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири /Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко и проф. В.В. Кутырева. - М.: Медицина, 2004. - 191 с.
5. Попов Н.В., Карнаухов И.Г., Пакскина Н.Д., Поршаков A.M., Куклев Е.В., Иванова А.В., Корзун В.М., Косилко С.А., Зенкевич Е.С., Попов В.П., Лопатин А.А., Аязбаев Т.З., Балахонов С.В., Кутырев В.В. Оценка современной эпидемиологической обстановки в природных очагах чумы мира. Повышение эффективности эпидемиологического надзора в природных очагах чумы Российской Федерации и прогноз их эпизоотической активности на 2019 г. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2019 - №1. - С. 81-88.
6. Обеспечение эпидемиологического благополучия в природных очагах чумы на территории стран СНГ и Монголии в современных условиях / Под ред. Докт. Мед. наук, проф. А.Ю. Поповой, акад. РАН, докт. мед. наук, проф. ВВ. Кутырева. - Ижевск: изд-во ООО «Принт», 2018. - 336 с.
7. Черкасский Б.Л. Особо опасные инфекции: Справочник. - М.: Медицина, 1996. - 160 с.
8. Кутырев В.В., Ерошенко Г.А., Попов Н.В., Видяева Н.А., Коннов Н.П. Молекулярные механизмы взаимодействия возбудителя чумы с беспозвоночными животными // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - Вып. 4. - С. 6-13.
9. Никулынин С.В., Онацкая Т.Г., Луканина Л.М. Изучение ассоциации почвенных амеб Hartmannella rhysodes с бактериями - возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1992. - Вып. 69(9-10). - С. 2-4.
10. Кошель Е.И., Ерошенко Г.А., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Широков А.А., Буров A.M., Кузнецов О.С., Кутырев В.В. Оценка длительности сохранения штаммов Yersinia pestis в клетках почвенных амеб Acanthamoeba sp. в экспериментальных условиях // Проблемы особо опасных инфекций. - 2016. - Вып.2. - С. 69-74.
11. Dudte S.С., Hinnebusch В.J., Shannon J.G. Characterization of Yersinia pestis interactions with human neutrophils in vitro II Front. Cell. Infect. Microbiol. - 2017. - 7:358. - DOI: 10.3389/fcimb.2017.00358.
12. Ke Y., Chen Z., Yang R. Yersinia pestis: mechanisms of entry into and resistance to the host cell // Front. Cell. Infect. Microbiol. - 2013. - 3:106. - DOI: 10.33 89/fcimb.2013.00106.
13. Li В., Shahid R., Peshkepija P., Zimmer M. Water Diffusion In And Out Of The β-Barrel Of GFP and The Fast Maturing Fluorescent Protein, TurboGFP // Chem Phys. - 2012. - Vol. 392(1). - P. 143-148.
14. Luker KE, Pata P, Shemiakina II, Pereverzeva A, Stacer AC, Shcherbo DS, Pletnev VZ, Skolnaja M, Lukyanov KA, Luker GD, Pata I, Chudakov DM. Comparative study reveals better far-red fluorescent protein for whole body imaging // Sci Rep. - 2015. - 5:10332. DOI: 10.1038/srepl0332.
15. Forde C., Rocco J., Fitch J., McCutchen-Maloney S. Real-time characterization of virulence factor expression in Yersinia pestis using a GFP reporter system // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. - Vol.324(2). - P.795-800.
16. Su S., Bangar H., Saldanha R., Pemberton A., Aronow В., Dean G., Lamkin Т., Has-sett D.J. Construction and characterization of stable, constitutively expressed, chromosomal green and red fluorescent transcriptional fusions in the select agents, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei II MicrobiologyOpen. - 2014. - Vol. 3(5). - P. 610-29.
17. , Vadyvaloo V. Yersinia pestis resists predation by Acan-thamoeba castellanii and exhibits prolonged intracellular survival // Appl. Environ. Microbiol. - 2017. - Vol. 83(13) - P. 1-15.
18. Markman D., Antolin M. Bowen R., et al. Yersinia pestis survival and replication in potential ameba reservoir // Emerging Infectious Diseases. - 2018. - Vol. 24(2). - P.294-302.
19. Kado C., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. - 1981. - Vol. 145(3). - P. 1365-73.