ТВЕРДАЯ ПОВЯЗКА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТРАВМИРОВАННОЙ ТКАНИ
HARD BANDAGE FOR TREATMENT OF INJURED TISSUE

Область техники
Настоящее изобретение относится к твердой повязке для лечения травмированной ткани у млекопитающего, такого как человек.
Предшествующий уровень техники
Материалы и методы, применяемые для остановки кровотечения при догоспитальном уходе (применение марлевых повязок, прямого давления и турникетов), к сожалению, почти не изменились за последние 2000 лет. См. L. Zimmerman et al., Great Ideas in the History of Surgery (San Francisco, Cal.if.: Norman Publishing; 1993), 31. Даже в опытных руках эти материалы и методы не всегда эффективны, и возникновение сильного и опасного для жизни кровотечения из ран на открытых участках не является столь уж редким явлением (см. J. M. Rocko et al., J. Trauma 22:635 (1982)).
Данные по смертности во Вьетнаме показали, что 10% из всех смертей во время боевых действий было вызвано не останавливаемым кровотечением в конечностях. См. руководство для пользователя SAS/STAT, 4th ed. (Cary, N.C.: SAS Institute Inc; 1990). Примерно до одной трети смертей от сильного кровотечения во время войны во Вьетнаме можно было бы избежать, если бы в это время существовали эффективные методы прекращения кровотечения в полевых условиях. См. руководство для пользователя SAS/STAT, 4th ed. (Cary, N.C.: SAS Institute Inc; 1990).
Хотя статистика по смертности от травм, полученных гражданскими лицами, не дает точного числа случаев догоспитальной смерти от кровотечения в области конечностей, однако сообщаемые случаи и невероятные истории, рассказанные людьми, указывают на то, что такие события имели место. См. J. M. Rocko et al. Эти данные позволяют предположить, что значительному увеличению выживаемости может способствовать догоспитальное применение простого и эффективного метода прекращения кровотечения.
В настоящее время применяется ряд более новых гемостатических средств, которые были разработаны для решения проблем, связанных с дефицитом традиционных марлевых повязок. Такими гемостатическими средствами являются:

• Микропористые полисахаридные частицы (TraumaDEX, Medafor Inc., Minneapolis, MN);
• Цеолит (QuikClot, Z-Medica Corp, Wal.lington, CT);
TM
• Ацетилированный поли-N-ацетилглюказамин (Rapid Deployment Hemostat (RDH), Marine Polymer Technologies, Danvers, MA);
• Хитозан (повязка HemCon, HemCon Medical Technologies Inc., Portland OR);
• Жидкие фибриновые герметики (Tisseel VH, Baxter, Deerfield, EL);
• Человеческий фибриноген и тромбин на основе лошадиного коллагена (TachoComb-S, Hafslund Nycomed Pharma, Linz, Austria);
TM
• Микродисперсная окисленная целлюлоза (m*doc, Alltracel Group, Dublin, Ireland);
TM
• Пропилгаллат (Hemostatin, Analytical Control Systems Inc., Fishers, IN);
TM
• Эпсилон-аминокапроновая кислота и тромбин (пластырь Hemarrest, Clarion Pharmaceuticals, Inc);
• Очищенный коллаген бычьего кориума (бинты Avitene (нетканый материал или микрофибриллярный коллагеновый гемостат, Avitene Microfibrillar Collagen Hemostat (MCH), Davol, Inc., Cranston, RI);
• Препарат, регулирующий окисление регенерированной целлюлозы (Surgicel, Ethicon Inc., Somerville, NJ);
• Сульфат алюминия с этилцеллюлозным покрытием (Sorbastace Microcaps, Hemostace, LLC, New Orleans, LA);
• Микропористый гидрогель-образующий полиакриламид (BioHemostat, Hemodyne, Inc., Richmond VA); и
• Рекомбинантный активированный фактор VII (NovoSeven, NovoNordisk Inc., Princeton, NJ).
Применение указанных средств на животных с моделями травматических повреждений и/или на войне имело различную степень успеха.
TM
Одним из таких средств является гемостатическое средство на основе крахмала, имеющееся в продаже под торговым знаком TraumaDEX. Этот продукт содержит микропористые полисахаридные частицы, которые вливают непосредственно в рану или выливают на рану. Гемостатическое действие этих частиц, очевидно, обусловлено абсорбцией воды из крови и плазмы раны и приводит к аккумуляции и концентрированию факторов свертывания крови и тромбоцитов. Однако в двух исследованиях на модели смертельной раны в области паха это средство не давало какого-либо значительного эффекта по сравнению со стандартными марлевыми повязками. См. публикацию McManus et al., Business Briefing: Emergency Medical. Review 2005, pp. 76-79 (имеющуюся в настоящее время на сайте www.touchbriefings.com/pdf/ 1334/Wedmore.pdf).
TM
TM
in vivo
Другим средством, состоящим из частиц, является порошок QuickClot, а именно гранулированное гемостатическое средство цеолит, которое вливают непосредственно в рану или выливают на рану. Гемостатическое действие этих цеолитных частиц, очевидно, обусловлено абсорбцией жидкости и приводит к аккумуляции и концентрированию факторов свертывания крови и тромбоцитов. Хотя это средство оказалось эффективным в некоторых исследованиях на животных, однако проблема, связанная с экзотермическим процессом абсорбции жидкости этими частицами, остается нерешенной. Некоторые исследования показали, что эта реакция протекает при температуре выше 143°С in vitro и при температуре выше 50°С , что вполне достаточно для возникновения ожогов третьей степени. (См. McManus et al., Business Briefing: Emergency Medical Review 2005, at 77). Было также обнаружено, что экзотермическая реакция, продуцируемая QuikClot, приводит к общему и гистологическому изменению ткани неизвестной клинической значимости. Acheson et al., J. Trauma 59:865-874 (2005).
ТМ
TM
ТМ
Гемостатическое действие гемостата быстрого действия, в отличие от средств, состоящих из частиц (Rapid Deployment Hemostat), очевидно, обусловлено агрегацией эритроцитов, активацией тромбоцитов, активацией каскада реакции свертывания крови и локальным сужением сосудов. Гемостат быстрого действия представляет собой полученную из водорослей повязку, состоящую из поли-N-ацетил-глюкозамина. Хотя первоначальная модель этой повязки позволяла эффективно снижать небольшое кровотечение, однако для снижения потери крови у свиней с моделью повреждения аорты и печени, к этой повязке необходимо было добавить марлевую основу. См. McManus et al., Business Briefing: Emergency Medical. Review 2005, at 78.
TM
TM
Другой повязкой на основе поли-N-ацетилглюкозамина является повязка, изготовленная на основе хитозана HemCon, которая представляет собой повязку на основе осушенного вымораживанием хитозана, специально изготовленную для оптимизации плотности мукоадгезивной поверхности и структурной целостности хитозана в месте образования раны. Повязка, изготовленная на основе хитозана HemCon очевидно обладает гемостатическим действием, главным образом, благодаря ее прилипанию к ране, хотя имеются данные, позволяющие предположить, что такая повязка может также улучшать функцию тромбоцитов и усиливать включение эритроцитов в сгусток, который они образуют на ране. Было показано, что такая повязка улучшает гемостаз и снижает потерю крови у некоторых животных с моделью артериального кровотечения, однако между этими повязками не наблюдалось заметного различия, включая некоторые недостатки, обусловленные неадекватным прилипанием бинта к ране. См. McManus et al., Business Briefing: Emergency Medical. Review 2005, at 79.
Жидкие фибриновые герметики, такие как Tisseel V.H., были использованы в течение многих лет в операционных в качестве вспомогательного средства для прекращения кровотечения. См. L. Garza et al., J. Trauma 30:512-513 (1990); H. B. Kram et al., J. Trauma 30:97-101(1990); M.G. Ochsner et al., J. Trauma 30:884-887 (1990); T. L. Matthew et al., Ann. Thorac. Surg. 50:40-44 (1990); H. Jakob et al., J. Vase. Surg., 1:171-180 (1984). Первое упоминание о тканевом клее, используемом для гемостаза, датируется 1909 годом. См. Current Trends in Surgical Tissue Adhesives: Proceedings of the First International Symposium on Surgical Adhesives, M. J. MacPhee et al., eds. (Lancaster, Pa.: Technomic Publishing Co; 1995). Жидкие фибриновые герметики обычно состоят из фибриногена и тромбина, но могут также содержать фактор Xlll/XIIIa, либо в качестве побочного продукта очистки фибриногена, либо в качестве дополнительного ингредиента (поэтому, в некоторых случаях, в фибриновом герметике не должен обязательно присутствовать фактор XIII/фактор XIIIa, поскольку для индуцирования образования фибрина достаточно лишь эндогенного присутствия фактора XIII/XIIIa или другой трансаминазы). Однако оказалось, что эти фибриновые герметики, полученные в виде жидкости, не могут быть использованы для лечения ран, полученных на войне.
TM
TM
Сухие повязки на основе фибриногена-тромбина, имеющие коллагеновый носитель (например, TachoComb, TachoComb H и TachoSil, поставляемые компанией Hafslund Nycomed Pharma, Linz, Austria), также применяются в операционных во многих европейских странах. См. U. Schiele et al., Clin. Material.s 9:169-177 (1992). Хотя для изготовления повязок на основе фибриногена-тромбина не требуется предварительного смешивания, необходимого при использовании жидких фибриновых герметиков, однако их применение в отдельных случаях ограничено из-за необходимости их хранения при 4°С и предварительного смачивания в физиологическом растворе перед нанесением на рану. Эти повязки также не эффективны при высоком давлении и при большом объеме кровотечения. См., Sondeen et al., Trauma 54:280-285 (2003).
Сухая повязка на основе фибриногена/тромбина, применяемая для лечения травмированной ткани, также поставляется организацией Американского красного креста (ARC). Как описано в патенте США No. 6762336, рассматриваемая там повязка состоит из материала-основы и множества слоев, где внешние два слоя содержат фибриноген (но не тромбин), а внутренний слой содержит тромбин и хлорид кальция (но не фибриноген). Хотя эта повязка обнаруживала высокую эффективность у некоторых животных с моделями кровотечения, однако она оказалась хрупкой, неэластичной и имела тенденцию к разрыву при ее наложении. См. McManus et al., Business Briefing: Emergency Medical. Review 2005, at 78.; Kheirabadi et al., J. Trauma 59:25-35 (2005).
Было также предложено использовать и другие повязки на основе фибриногена/тромбина. Так, например, в патенте США No. 4683142 описан ресорбционный листовой материал для закрытия и залечивания ран, который состоит из гликопротеинового матрикса, такого как коллаген, содержащего белки свертывания крови, такие как фибриноген и тромбин. В патенте США No. 5702715 описан армированный биологический герметик, состоящий из отдельных слоев фибриногена и тромбина, где по меньшей мере один из этих слоев также содержит армирующий наполнитель, такой как ПЭГ, ПВП, BSA, маннит, Фиколл, декстран, миоинозит или хлорат натрия. В патенте США No. 6056970 описаны повязки, состоящие из биологически абсорбируемого полимера, такого как гиалуроновая кислота или карбоксиметилцеллюлоза, и гемостатической композиции, состоящей из порошкообразного тромбина и/или порошкообразного фибриногена. В патенте США № 7189410 описана повязка, состоящая из нанесенного на нее материала-основы, а именно: (i) частиц фибриногена; (ii) частиц тромбина; и (iii) хлорида кальция. В публикации заявки на патент США No. 2006/0155234 Al описана повязка, состоящая из материала-основы и множества фибриногеновых слоев, между которыми расположены дискретные участки тромбина. До настоящего времени ни одна из этих повязок не была разрешена к применению и не была допущена к промышленному изготовлению.
Кроме того, предпринятые ранее попытки получить твердые повязки на основе фибриногена/тромбина всегда сталкивались с определенными трудностями, а именно со значительным ухудшением свойства, которое делает эти ингредиенты желательными для лечения ран, то есть присущей им способности быстро реагировать в водных условиях с образованием фибрина. Присутствие фактора XIII дает смесь, которая затем обеспечивает превращение фибрина Ia в перекрестно связанный фибрин II.
Общий процесс свертывания крови у человека проиллюстрирован на фигуре 1. Как показано на этой фигуре, превращение фибриногена в фибрин I приводит к расщеплению двух небольших пептидов (A и B), состоящих из альфа (α) и бета (β)-цепей фибриногена, соответственно. Эти небольшие пептиды трудно поддаются детекции и прямому мониторингу, однако снижение молекулярной массы альфа- и бета-цепей, в результате такого расщепления, может наблюдаться с помощью гель-электрофореза. Аналогичным образом, превращение фибрина I в перекрестно-связанный фибрин II может быть установлено по исчезновению на гелях мономера гамма (γ)-цепи фибриногена (поскольку он превращается в γ-γ-димеры под действием фактора XIII на мономеры γ-цепи).
TM
TM
Во избежание преждевременной реакции предшествующие попытки изготовить твердые повязки на основе фибриногена/тромбина были направлены на разделение компонентов фибриногена и тромбина, насколько это возможно, для предотвращения образования слишком большого количества фибрина еще до применения данной повязки. Так, например, повязки на основе фибриногена-тромбина, имеющие коллагеновую подложку (например, TachoComb, TachoComb H и TachoSil), поставляемую компанией Hafslund Nycomed Pharma, получают путем суспендирования частиц фибриногена и тромбина в безводной жидкости с последующим напылением полученной суспензии на коллагеновую основу. Безводная среда, в отличие от водной среды, используется для предупреждения избыточного взаимодействия фибриногена и тромбина.
Были предложены и альтернативные способы, каждый из которых был аналогичным образом разработан для содержания, по возможности, фибриногена и тромбина отдельно друг от друга. Так, например, твердая повязка на основе фибриногена/тромбина, описанная в патенте США No. 7189410, была изготовлена путем смешивания порошкообразного фибриногена и порошкообразного тромбина в отсутствие любого растворителя с последующим нанесением сухой порошкообразной смеси на клейкую поверхность материала-основы. Твердые повязки на основе фибриногена/тромбина, описанные в патенте США № 6762336 и в публикации заявки на патент США 2006/0155234 Al, содержат отдельные и дискретные слои фибриногена или тромбина, каждый из которых, по существу, отделен друг от друга. Однако такие подходы не были полностью успешными.
Для обеспечения хорошего функционирования твердая повязка на основе фибриногена/тромбина должна удовлетворять нескольким критериям. Во-первых, фибриноген и тромбин должны успешно взаимодействовать с образованием сгустка, и чем больше этот сгусток будет прилипать к ране, тем эффективнее будет действовать данная повязка. Грубо говоря, такая повязка должна иметь высокую степень целостности, поскольку потеря активных ингредиентов из-за растрескивания, расслоения и т.п. будет в конечном счете приводить к снижению эффективности, а поэтому такая повязка будет пользоваться меньшим спросом у потребителя. Сообщалось, что известные твердые повязки на основе фибриногена/тромбина не обладают одним или более из указанных свойств.
Кроме того, повязка должна быть гомогенной, поскольку, для гарантии ее успешного применения, вся ее площадь должна функционировать одинаково эффективно. Такая повязка должна также быстро гидратироваться без каких-либо значительных или специальных усилий. Обычно, предпочтительными являются относительно плоские повязки, и желательно, чтобы такая повязка, если это возможно, не имела закрученную или неровную неплоскую структуру (такие свойства препятствуют эффективному применению этих повязок, а в некоторых случаях могут ухудшать их функции). Другим наиболее предпочтительным свойством повязки является ее эластичность, которая улучшает свойства повязки и охватывает большее число форм и участков ран, которые могут быть эффективно обработаны. Хотя известные твердые повязки на основе фибриногена/тромбина, при их гидратации, могут стать эластичными, однако перед гидратированием они не обладают влажностью, достаточной для сообщения им такой эластичности. См., например, Sondeen et al., J. Trauma 54:280-285 (2003); Holcomb et al.;. J. Trauma, 55: 518-526; McManus & Wedmore, Emergency Medicine Review, pp.76-79, 2005.
Количество фибрина, присутствующего в повязке перед ее применением, а в частности нерастворимого перекрестно-связанного фибрина II, должно быть относительно небольшим. Этот факт имеет важное значение по нескольким причинам. Во-первых, присутствие нерастворимого фибрина в процессе изготовления повязки обычно снижает ее качество, то есть может нарушать ее целостность, приводить к потере гомогенности и затруднять/замедлять гидратацию. Такие последствия обычно могут быть обнаружены визуально самим специалистом.
Так, например, присутствие предварительно образованного фибрина в твердой повязке, изготовленной на основе фибриногена/тромбина, может быть визуально обнаружено по изменениям внешнего вида гомогенной поверхности. В частности, грубая или комковатая на вид повязка часто сигнализирует о том, что в ней присутствует значительная масса фибрина, который образуется в процессе ее изготовления и, вероятно, будет оказывать негативное воздействие на дальнейшие ее свойства. Твердые, гладкие и глянцевые «слои» на поверхности твердых повязок также являются признаком присутствия фибрина, который будет замедлять (или даже блокировать) гидратацию во время применения данной повязки. Другим признаком образования значительного количества фибрина в процессе изготовления твердой повязки является ее чрезмерное закручивание. После добавления воды или водного раствора повязки, имеющие чрезмерное содержание фибрина, медленно гидратируются, и для инициации такой гидратации часто может оказаться необходимым специальное нанесение жидкости, иногда путем механического пропитывания поверхности. Кроме того, после гидратирования повязки, имеющие значительное количество предварительно образованного фибрина, обычно имеют крапчатый и явно неоднородный внешний вид.
Количество предварительно образованного фибрина может быть также оценено с помощью различных биохимических анализов, таких как метод, описанный в публикации заявки на патент США № 2006/0155234 Al. В соответствии с этим анализом превращение γ-цепей фибриногена в перекрестно связанные γ-γ-димеры используется как показатель присутствия фибрина (число γ-цепей, превращенных в γ-γ-димер, является показателем количества продуцируемого фибрина).
С помощью других анализов могут быть оценены изменения других компонентов цепей фибриногена, такие как превращение Аα-цепи в свободную α-цепь и фибринопептид А или превращение Вβ-цепи в свободную β-цепь и фибринопептид В. Наблюдение таких изменений может быть проведено с помощью гель-электрофореза аналогично наблюдению превращения γ-цепи в γ-γ-цепь, как описано в публикации заявки на патент США № 2006/0155234 Al. Интересно отметить, что в публикации заявки на патент США 2006/0155234 Al сообщалось об относительно высоких уровнях γ-γ-димеризации (до 10%), что указывает на то, что данные повязки, перед их применением, содержали значительное количество фибрина. Такое наблюдение может быть объяснено расслоением и/или растрескиванием, обнаруживаемым у некоторых из этих повязок.
in vivo
Для эффективного функционирования твердых повязок на основе фибриногена/тромбина, их гидратация обычно должна завершаться через несколько секунд и для такой гидратации, на повязку лишь требуется нанесение воды (или некоторого количества водного раствора). Таким раствором может быть кровь или другая физиологическая жидкость, вытекающая из участка поражения, на который накладывают повязку, либо такой раствор может быть взят из какого-либо внешнего источника, такого как физиологический раствор или другая физиологически приемлемая водная жидкость, наносимая на повязку во время обработки раны. Чем больше время гидратации, которое обычно составляет более 5 секунд, тем ниже эффективность повязки, поскольку части повязки могут терять или отталкивать жидкости, которые будут свободно растекаться с последующим образованием достаточного количества перекрестно связанного фибрина. Учитывая потенциально опасные последствия постоянного кровотечения, следует отметить, что любое замедление гидратации повязки в процессе ее применения является крайне нежелательным. Кроме того, эффективность повязок с избыточным содержанием фибрина обычно является низкой, на что указывает снижение показателей, полученных с помощью описанных здесь EVPA и анализов на адгезию, а также данных, полученных в процессе проведения  тестов и клинического применения.
В соответствии с этим, необходимость изготовления твердой повязки, которая может быть использована для лечения травмированной ткани, а в частности раны, полученной на войне, остается актуальной.
Описание сущности изобретения
Поэтому задачей настоящего изобретения является изготовление твердой повязки, которая может быть использована для лечения травмированной ткани млекопитающего, а в частности раны, полученной в результате травматического поражения. Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа лечения травмированной ткани млекопитающего, а в частности ткани человека. Другие задачи, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного нижеприведенного описания предпочтительных вариантов изобретения, а в частности из описания настоящего изобретения, и/или они могут быть очевидны в процессе практического осуществления настоящего изобретения. Эти задачи и преимущества могут быть решены и достигнуты с применением композиций и способов, описанных в данной заявке, а в частности в нижеследующей формуле изобретения.
В соответствии с этими и другими задачами, в первом своем варианте, настоящее изобретение относится к твердой повязке для лечения травмированной ткани у млекопитающего, где указанная повязка включает по меньшей мере один гемостатический слой, состоящий в основном из фибриногенового компонента и активатора фибриногена, где указанный(ые) гемостатический(ие) слой(и) был(и) получен(ы) путем литья или образован(ы) из одного водного раствора, содержащего фибриногеновый компонент и активатор фибриногена.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к твердой повязке для лечения травмированной ткани у млекопитающего, где указанная повязка содержит по меньшей мере один гемостатический слой, состоящий в основном из фибриногенового компонента и активатора фибриногена, где указанный(ые) гемостатический(ие) слой(и) был(и) получен(ны) путем литья или в виде отдельного изделия.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения травмированной ткани с применением твердой повязки, содержащей по меньшей мере один гемостатический слой, состоящий в основном из фибриногенового компонента и активатора фибриногена, где указанный(ые) гемостатический(ие) слой(и) был(и) получен(ы) путем литья или образован(ы) из одного водного раствора, содержащего фибриногеновый компонент и активатор фибриногена.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения травмированной ткани с применением твердой повязки, содержащей по меньшей мере один гемостатический слой, состоящий по существу из фибриногенового компонента и активатора фибриногена, где указанный(ые) гемостатический(ие) слой(и) был(и) получен(ы) путем литья или в виде отдельного изделия.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к композиции, по существу, состоящей из смеси фибриногенового компонента, активатора фибриногена и воды, где указанная композиция хранится в замороженном виде и является стабильной при пониженной температуре в течение по меньшей мере 24 часов.
Следует отметить, что представленное выше описание и нижеследующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения приводится лишь для иллюстрации и лучшего понимания, а также для более подробного объяснения вариантов осуществления заявленного изобретения приводится в прилагаемой формуле изобретения, которые не должны рассматриваться как его ограничение.
Краткое описание графического материала
На фигуре 1 представлена схема каскада реакций свертывания крови у человека, имеющаяся на web-сайте ERL (www.enzymeresearch.co.uk/coag.htm).
ex vivo
На фигуре 2 представлена диаграмма протокола описанного здесь анализа, проводимого путем артериотомии свиней .
На фигурах 3А-3С приводятся графики, на которых представлены результаты, полученные, как описано в примере 1.
На фигуре 4А и на фигуре 4В приводятся графики, на которых представлены результаты EVPA и анализа на адгезию повязок, изготовленных как описано в примерах 6-12.
На фигурах 5А и 5В представлены графики, на которых указаны технологические свойства замороженных композиций, которые хранились при -80°С, как описано в примере 13.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Все используемые здесь технические и научные термины, если это не оговорено особо, употребляются в настоящей заявке в своем общепринятом смысле, известном специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Все упомянутые здесь патенты и публикации вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Используемый здесь термин «пациент» означает индивидуум, такой как человек или животное, нуждающиеся в медицинском уходе и/или лечении.
Используемый здесь термин «рана» означает любое поражение любой ткани пациента, которое приводит к потере крови из-за кровотечения и/или к потере любой другой физиологической жидкости из организма пациента. Тканью может быть внутренняя ткань, например ткань органа или кровеносного сосуда, или внешняя ткань, например ткань кожи. Потеря крови может быть внутренней, например в результате поражения органа, либо внешней, например в результате разрыва органа. Рана может присутствовать в мягкой ткани, такой как орган, или в жесткой ткани, такой как кость. Поражение может быть вызвано действием любого агента или источника, включая травматическое повреждение, инфекцию или хирургическое вмешательство.
Используемый здесь термин «ресорбируемый материал» означает материал, разлагаемый спонтанно и/или в организме млекопитающего на компоненты, которые потребляются этим организмом или элиминируются, не оказывая какого-либо значительного влияния на заживление раны и/или на регенерацию ткани и не вызывая при этом каких-либо значительных нарушений метаболизма.
Используемый здесь термин «стабильность» означает сохранение свойств материала, определяющих его активность и/или функцию.
Используемый здесь термин «подходящий» относится к материалу, который не оказывает какого-либо негативного воздействия на стабильность повязок или любых их компонентов.
Используемый здесь термин «связывающий агент» означает соединение или смесь соединений, которые улучшают адгезию и/или когезию компонентов гемостатического(их) слоя(ев) указанных повязок.
Используемый здесь термин «солюбилизирующий агент» означает соединение или смесь соединений, которые улучшают растворение белка или белков в водном растворителе.
Используемый здесь термин «наполнитель» означает соединение или смесь соединений, которые придают гемостатическому(им) слою(ям) повязки нужный объем и/или пористость.
Используемый здесь термин «антиадгезив» означает соединение или смесь соединений, которые облегчают удаление повязки из промышленной пресс-формы.
Используемый здесь термин «вспенивающий агент» означает соединение или смесь соединений, которые образуют газ при гидратации в подходящих условиях.
Используемый здесь термин «твердый» относится к повязке, которая, по существу, не изменяет свою конфигурацию или форму при ее наложении на жесткую поверхность, то есть на рану лицевой стороной вниз, и последующем хранении в течение 24 часов при комнатной температуре.
Используемый здесь термин «замороженный» относится к композиции, которая при ее наложении на жесткую поверхность, то есть на рану лицевой стороной вниз, и при последующем выдерживании в течение 24 часов при -40°С, по существу, не изменяет свою конфигурацию или форму и которая при ее наложении на жесткую поверхность, то есть на рану лицевой стороной вниз, и при последующем выдерживании при комнатной температуре в течение 24 часов, по существу, изменяет свою конфигурацию или форму. Таким образом, в контексте настоящего изобретения «твердая» повязка не является «замороженной», а «замороженная» композиция не является «твердой».
В своем первом предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к твердой повязке для лечения травмированной ткани у пациента, где указанная повязка содержит гемостатический слой, состоящий из фибриногенного компонента и активатора фибриногена, где указанный(ые) гемостатический(ие) слой(и) получают путем литья или изготавливают из одного водного раствора, содержащего фибриногеновый компонент и активатор фибриногена.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к твердой повязке для лечения травмированной ткани у пациента, где указанная повязка содержит гемостатический слой, состоящий из фибриногенного компонента и активатора фибриногена, где указанный(ые) гемостатический(ие) слой(и) получают путем литья или в виде отдельного изделия.
Используемый здесь термин «по существу, состоящий из» означает, что только фибриногеновый компонент и активатор фибриногена являются необходимыми и основными ингредиентами гемостатического(их) слоя(ев) твердой повязки, применяемой для лечения травмированной ткани. В соответствии с этим, гемостатический слой, помимо фибриногенового компонента и активатора фибриногена, которые являются необходимыми для данного конкретного применения, может содержать и другие ингредиенты, однако эти другие ингредиенты не являются необходимыми для функционирования твердой повязки в нормальных условиях, то есть эти другие ингредиенты не являются необходимыми для осуществления реакции фибриногенового компонента и активатора фибриногена и для образования определенного количества фибрина, достаточного для уменьшения кровотечения и/или истечения физиологической жидкости травмированной ткани при накладывании данной повязки на эту ткань в соответствующих условиях применения. Однако, если условия применения в данной конкретной ситуации являются нестандартными, то есть, например, если пациент страдает гемофилией, обусловленной дефицитом фактора XIII, то к гемостатическому(им) слою(ям) могут быть добавлены соответствующие дополнительные компоненты, такие как фактор XIII/XIIIa или некоторые другие трансаминазы, не выходящие за рамки существа изобретения. Аналогичным образом, твердая повязка согласно изобретению может содержать один или несколько указанных гемостатических слоев, а также один или несколько других слоев, таких как один или несколько слоев-носителей (например, материала-основы или внутреннего материала-носителя) и антиадгезивных слоев.
В других своих предпочтительных вариантах, настоящее изобретение относится к способам лечения поврежденной ткани у млекопитающего, где указанные способы включают наложение твердой повязки согласно изобретению на поврежденную ткань и приложения достаточного давления на эту повязку в течение определенного периода времени, достаточного для образования фибрина и, тем самым, для уменьшения потери крови и/или другой физиологической жидкости, выделяющейся из раны.
В других своих предпочтительных вариантах, настоящее изобретение относится к композициям, состоящим, по существу, из смеси фибриногенового компонента, активатора фибриногена и воды, где указанные композиции являются замороженными и стабильными при пониженной температуре в течение по меньшей мере 24 часов. Такие композиции являются особенно подходящими для получения гематостатического(их) слоя(ев) твердых повязок согласно изобретению.
В соответствии с некоторыми вариантами настоящего изобретения, гемостатический(ие) слой(и) твердой повязки формуют или отливают в пресс-форме в виде отдельного изделия. В соответствии с некоторыми другими вариантами настоящего изобретения, гемостатический слой получают в виде одного источника или формуют из одного источника, например, водного раствора, содержащего смесь фибриногена и активатора фибриногена. В каждом из этих вариантов согласно изобретению, гемостатический(ие) слой(и), предпочтительно, является(ются) в основном, гомогенным(и).
В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами изобретения, гемостатический(ие) слой(и) твердой повязки может(могут) также содержать связывающий агент, облегчающий или улучшающий адгезию одного слоя с другим слоем и/или с любым слоем-носителем. Иллюстративными примерами подходящих связывающих агентов являются, но не ограничивается ими, сахароза; маннит; сорбит; желатин; гиалурон и его производные, такие как гиалуроновая кислота; мальтоза; повидон; крахмал; хитозан и его производные, и производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза, а также смеси двух или более таких компонентов.
ТМ
Гемостатический(ие) слой(и) твердой повязки может (могут) также, но необязательно, содержать один или несколько подходящих наполнителей, таких как сахароза; лактоза; мальтоза; шелк; фибрин; коллаген; альбумин; полисорбат (твин); хитин; хитозан и его производные (например, NOCC-хитозан); альгиновая кислота и ее соли; целлюлоза и ее производные; протеогликаны; гиалурон и его производные, такие как гиалуроновая кислота; полимеры гликолевой кислоты; полимеры молочной кислоты; сополимеры гликолевой кислоты/молочной кислоты и смеси двух или более таких компонентов.
ТМ
TM
Гемостатический слой твердой повязки может также, но необязательно, содержать один или несколько подходящих солюбилизирующих агентов, таких как сахароза; декстроза; манноза; трегалоза; маннит; сорбит; альбумин; гиалурон и его производные, такие как гиалуроновая кислота; сорбат; полисорбат (твин); сорбитан (SPAN) и смеси двух или более таких компонентов.
Гемостатический слой твердой повязки может также, но необязательно, содержать один или несколько подходящих вспенивающих агентов, таких как смесь физиологически приемлемой кислоты (например, лимонной или уксусной кислоты) и физиологически приемлемого основания (например, бикарбоната натрия или карбоната кальция). Другими подходящими вспенивающими агентами являются, но не ограничивается ими, сухие частицы, содержащие сжатый воздух, такие как частицы сахара, содержащие двуокись углерода (см., например, патент США No. 3012893), или другие физиологически приемлемые газы (например, азот или аргон) и фармакологически приемлемые пероксиды. Такой вспенивающий агент может быть введен в водную смесь фибриногенового компонента и активатора фибриногена, или он может быть введен в водный раствор фибриногенового компонента и/или в водный раствор активатора фибриногена с последующим смешиванием.
Гемостатический(е) слой(и) твердой повязки может (могут) также, но необязательно, содержать подходящий источник ионов кальция, такой как хлорид кальция, и/или фибриновый перекрестно-сшивающий агент, такой как трансаминаза (например, фактор XIII/XIIIa) или глутаральдегид.
Гемостатический слой твердой повязки предпочтительно получают путем смешивания водных растворов фибриногенового компонента и активатора фибриногена в условиях, позволяющих минимизировать активацию фибриногенового компонента под действием активатора фибриногена. Затем смесь водных растворов подвергают такой процедуре, как лиофилизация или сушка вымораживанием для снижения содержания влаги до желаемого уровня, то есть до уровня, при котором повязка становится твердой, а поэтому при ее наложении на рану лицевой стороной вниз она, по существу, не изменяет свою конфигурацию или форму при комнатной температуре в течение 24 часов. Могут быть также проведены аналогичные процедуры, позволяющие достичь таких же результатов, например сушка, сушка распылением, сушка в вакууме и стеклование.
Используемый здесь термин «содержание влаги» означает количество свободной воды в данной повязке. Термин «свободная вода» означает воду, которая не связана или не образует комплексов с одним или несколькими не жидкими компонентами в данной повязке. Указанное здесь «содержание влаги» означает уровни, определенные методами, по существу, аналогичными методам, разрешенным Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA), модифицированным методом Карла Фишера (Meyer and Boyd, Analytical. Chem., 31:215-219, 1959; May et al. J. Biol. Standardization, 10:249-259, 1982; Centers for Biologies Evaluation and Research, FDA, Docket No. 89D-0140, 83-93; 1990) или с помощью ИК-спектроскопии в ближнем диапазоне спектра. Подходящее содержание влаги для данной конкретной твердой повязки может быть определено эмпирически самим специалистом в зависимости от цели ее применения.
Так, например, в некоторых вариантах изобретения повышенное содержание влаги ассоциируется с большей эластичностью твердых повязок. Так, например, в твердых повязках, накладываемых на раны конечностей, может оказаться предпочтительным содержание влаги по меньшей мере 6%, а более предпочтительно в пределах от 6% до 44%.
Аналогичным образом, в других вариантах изобретения, более низкое содержание влаги ассоциируется с более жесткими твердыми повязками. Таким образом, в твердых повязках, накладываемых на плоские раны, такие как раны брюшины или грудной клетки, может оказаться предпочтительным содержание влаги менее чем 6%, а более предпочтительно в пределах от 1% до 6%.
В соответствии с этим, иллюстративными примерами подходящего содержания влаги для твердых повязок являются, но не ограничиваются ими, нижеследующие значения: (для каждого значения отклонение ±0,9%): менее чем 53%; менее чем 44%; менее чем 28%; менее чем 24%; менее чем 16%; менее чем 12%; менее чем 6%; менее чем 5%; менее чем 4%; менее чем 3%; менее чем 2,5%; менее чем 2%; менее чем 1,4%; от 0 до 12%, не включая верхний предел; от 0 до 6%; от 0 до 4%; от 0 до 3%; от 0 до 2%; от 0 до 1%; от 1 до 16%; от 1 до 11%; от 1 до 8%; от 1 до 6%; от 1 до 4%; от 1 до 3%; от 1 до 2%; и от 2 до 4%.
Фибриногеновый компонент в гемостатическом(их) слое(ях) твердых повязок может представлять собой любой подходящий фибриноген, известный и доступный специалистам в данной области. Фибриногеновый компонент может также представлять собой функциональное производное или метаболит фибриногена, такие как α-, β- и/или γ-цепи фибриногена, растворимый фибрин I или фибрин II, или смесь из двух или более таких компонентов. Конкретный фибриноген (или его функциональное производное или метаболит) для конкретного применения может быть выбран эмпирически самим специалистом. Используемый здесь термин «фибриноген» включает смеси фибриногена и небольших количеств фактора XIII/фактора XIIIa или некоторых других таких трансаминаз. Указанные небольшие количества, в основном, известны специалистам, поскольку они обычно присутствуют в фибриногене млекопитающих после очистки такого фибриногена в соответствии с методами и процедурами, известными и доступными специалистам, и такие количества обычно составляют от 0,1 до 20 единиц/мл.
Предпочтительным фибриногеном, используемым в качестве фибриногенового компонента твердой повязки, является очищенный фибриноген, подходящий для введения млекопитающему. Обычно такой фибриноген является частью смеси белков человеческой плазмы, включающей фактор XIII/XIIIa, очищенной до соответствующего уровня и не содержащей вирусов. Предпочтительный водный раствор фибриногена, используемый для изготовления твердой повязки, содержит примерно 37,5 мг/мл фибриногена при pH примерно 7,4±0,1. Подходящий фибриноген, используемый в качестве фибриногенового компонента и описанный в литературе, например в патенте США № 5716645, и аналогичные материалы являются коммерчески доступными, например, они могут быть взяты из лабораторий Sigma-Aldrich, Enzyme Research Laboratories, Haematologic Technologies and Aniara.
2
Предпочтительно, фибриногеновый компонент присутствует в количестве примерно от 1,5 до 13,0 мг (±0,9 мг) фибриногена на квадратный сантиметр твердой повязки, а более предпочтительно примерно от 3,0 до 13,0 мг/см. Однако, в зависимости от конкретного применения твердой повязки, такое количество может быть повышенным или пониженным. Так, например, в соответствии с некоторыми вариантами изобретения, где желательно увеличение адгезии, фибриногеновый компонент присутствует в количестве примерно от 11,0 до 13,0 мг (±0,9 мг) фибриногена на квадратный сантиметр твердой повязки. Аналогичным образом, в некоторых вариантах изобретения, относящихся к применению аппаратов низкого давления, могут быть использованы более низкие уровни фибриногенового компонента.
Bothrops jararacussu
Активаторами фибриногена, используемыми в гемостатическом(их) слое(ях) твердой повязки, могут быть любые вещества или смесь веществ, которые, как известно специалистам, превращают фибриноген в фибрин. Иллюстративными примерами подходящих активаторов фибриногена являются, но не ограничивается ими, тромбины, такие как человеческий тромбин или бычий тромбин, и протромбины, такие как человеческий протромбин, или концентрат протромбинового комплекса (смесь факторов II, VII, IX и X); змеиный яд, такой как батроксобин, рептилаза (смесь батроксобина и фактора XIIIa), ботромбин, калобин, фиброзим и ферменты, выделенные из яда ; и смеси любых двух или более таких компонентов. См., например, Dascombe et al., Thromb. Haemost. 78:947-51 (1997); Hahn et al., J. Biochem. (Tokyo) 119:835-43 (1996); Fortova et al., J. Chromatogr. S. Biomed. Appl. 694:49-53 (1997); и Andriao-Escarso et al., Toxicon. 35: 1043-52 (1997).
Предпочтительным активатором фибриногена является тромбин. Более предпочтительным активатором фибриногена является тромбин млекопитающих, хотя в некоторых случаях могут быть также использованы птичий и/или рыбий тромбин. Хотя в твердой повязке может быть использован любой подходящий тромбин млекопитающего, однако тромбином, используемым в гемостатическом слое, предпочтительно, является лиофилизованная смесь белков человеческой плазмы, которые имели достаточную степень очистки и были подвергнуты противовирусной обработке, достаточной для применения твердой повязки в конкретных условиях. Подходящий тромбин может быть закуплен в лабораториях, таких как Sigma-Aldrich, Enzyme Research Laboratories, Haematologic Technologies and Biomol International. Особенно предпочтительный водный раствор тромбина, используемый для изготовления твердой повязки, содержит тромбин в количестве примерно от 10 до 2000±50 Международных единиц/мл, а более предпочтительно в количестве 25±2,5 Международных единиц/мл. Другими компонентами могут быть альбумин (обычно примерно 0,1 мг/мл) и глицин (обычно примерно 100 мМ±0,1 мМ). pH такого особенно предпочтительного водного раствора тромбина, в основном, составляет 6,5-7,8, а предпочтительно 7,4±0,1, хотя приемлемым может быть pH в пределах 5,5-8,5.
Твердая повязка, помимо гемостатического(их) слоя(ев), может также, но необязательно, содержать один или несколько слоев-носителей. Используемый здесь термин «слой-носитель» означает материал, который поддерживает или улучшает структурную целостность твердой повязки и/или фибринового сгустка, образующегося при наложении такой повязки на травмированную ткань.
В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами изобретения, слой-носитель на одной стороне повязки, противоположной стороне, накладываемой на рану, содержит материал-основу. Такой материал-основа может быть закреплен физиологически приемлемым клеем, либо он может быть самонаклеивающимся (например, за счет достаточного статического заряда поверхности). Такой материал-основа может содержать один или несколько ресорбируемых материалов или один или несколько нересорбируемых материалов или их смесей. Предпочтительным материалом-основой является один ресорбируемый материал.
В настоящем изобретении может быть использован любой подходящий ресорбируемый материал, известный и доступный специалистам. Так, например, ресорбируемым материалом может быть белковое вещество, такие как шелк, фибрин, кератин, коллаген и/или желатин. Альтернативным ресорбируемым материалом может быть углеводное вещество, такое как альгинаты, хитин, целлюлоза, протеогликаны (например, поли-N-ацетилглюкозамин), полимеры гликолевой кислоты, полимеры молочной кислоты или сополимеры гликолевой кислоты/молочной кислоты. Ресорбируемый материал может также содержать смесь белковых веществ или смесь углеводных веществ, или смесь белковых веществ и углеводных веществ. Конкретный(ые) ресорбируемый(ые) материал(ы) может (могут) быть выбран(ы) эмпирически самим специалистом в данной области в зависимости от цели применения твердой повязки.
TM
TM
В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами изобретения, ресорбируемым материалом является углеводное вещество. Иллюстративными примерами особенно предпочтительных ресорбируемых материалов являются, но не ограничиваются ими, материалы, имеющиеся в продаже под торговыми знаками VICRYL (сополимер гликолевой кислоты/молочной кислоты) и DEXON (полимер гликолевой кислоты).
В качестве материала-основы может быть использован любой подходящий нересорбируемый материал, известный и доступный специалистам. Иллюстративными примерами подходящих нересорбируемых материалов являются, но не ограничиваются ими, пластики, силиконовые полимеры, бумага и продукты из бумаги, латекс, марля и т.п.
В соответствии с другими предпочтительными вариантами изобретения, слой-носитель содержит внутренний материал-носитель. Такой внутренний материал-носитель предпочтительно полностью содержится в гемостатическом слое твердой повязки, хотя, в соответствии с некоторыми вариантами изобретения, он может находиться между двумя смежными гемостатическими слоями. Как и в случае материала-основы, внутренний материал-носитель может представлять собой ресорбируемый материал или нересорбируемый материал или их смеси, такие как смесь из двух или более ресорбируемых материалов или смесь из двух или более нересорбируемых материалов, или смесь ресорбируемого(ых) материала(ов) и нересорбируемого(ых) материала(ов).
В соответствии с другими предпочтительными вариантами изобретения, слой-носитель может содержать материал-носитель на лицевой стороне, то есть на той стороне повязки, которая накладывается на рану. Как и в случае материала-основы и внутреннего материала-носителя, лицевой материал-носитель может представлять собой ресорбируемый материал или нересорбируемый материал или их смеси, такие как смесь из двух или более ресорбируемых материалов или смесь из двух или более нересорбируемых материалов, или смесь ресорбируемого(ых) материала(ов) и нересорбируемого(ых) материала(ов).
В соответствии с другими предпочтительными вариантами изобретения, твердая повязка, помимо гемостатического(их) слоя(ев), содержит материал-основу и внутренний материал-носитель, то есть твердая повязка, помимо гемостатического(их) слоя(ев), содержит два слоя-носителя. В соответствии с другими предпочтительными вариантами изобретения, твердая повязка, помимо гемостатического(их) слоя(ев), содержит лицевой материал-носитель и внутренний материал-носитель. В соответствии с другими предпочтительными вариантами изобретения, твердая повязка, помимо гемостатического(их) слоя(ев) содержит материал-основу, лицевой материал-носитель и внутренний материал-носитель.
В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, а в частности, в случае, если твердую повязку изготавливают с использованием пресс-формы, такие твердые повязки, помимо гемостатического(их) слоя(ев) и слоя(ев)-носителя, могут также, но необязательно, содержать антиадгезивный слой. Используемый здесь термин «антиадгезивный слой» означает слой, содержащий один или несколько агентов (антиадгезивов), которые стимулируют или облегчают удаление твердой повязки из пресс-формы, в которой ее изготавливают. Таким предпочтительным агентом является сахароза, а другими подходящими антиадгезивами являются желатин; гиалурон и его производные, включая гиалуроновую кислоту; маннит; сорбит; и глюкоза. Альтернативно, в указанном гемостатическом слое могут присутствовать один или несколько таких антиадгезивов.
Различные слои повязок согласно изобретению могут быть прикреплены друг к другу подходящими методами, известными и доступными специалистам. Так, например, физиологически приемлемый адгезив может быть нанесен на материал-основу (если он присутствует), а затем к этому материалу может (могут) быть прикреплен(ы) гемостатический(е) слой(и).
В некоторых вариантах изобретения, физиологически приемлемый адгезив должен иметь такой предел прочности при сдвиге и/или такую структуру, чтобы материал-основа мог быть отделен от фибринового сгустка, образованного гемостатическим слоем после наложения повязки на поврежденную ткань. В других вариантах изобретения, физиологически приемлемый адгезив должен иметь такой предел прочности при сдвиге и/или такую структуру, чтобы материал-основа не мог быть отделен от фибринового сгустка после наложения повязки на поврежденную ткань.
Подходящие фибриногены и подходящие активаторы фибриногена для гемостатического(их) слоя(ев) твердой повязки могут быть получены из любого соответствующего источника, известного и доступного специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, коммерческие фирмы-поставщики, такие как Sigma-Aldrich и Enzyme Research Laboratories; путем экстракции и очистки из человеческой плазмы или плазмы млекопитающих любыми методами, известными и доступными специалистам; из супернатантов или паст, полученных из плазмы или рекомбинантных тканевых культур, вирусов, дрожжей, бактерий или т.п., содержащих ген, который экспрессирует белок человеческой плазмы или плазмы млекопитающих и который был введен стандартными методами рекомбинантных ДНК, и/или из физиологических жидкостей (например, крови, молока, лимфы, мочи или т.п.) трансгенных млекопитающих (например, коз, овец, коров), содержащих ген, который был введен стандартными трансгенными методами и который экспрессирует нужный фибриноген и/или нужный активатор фибриногена.
В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами изобретения, указанным активатором фибриногена является фибриноген млекопитающих, такой как коровий фибриноген, свиной фибриноген, овечий фибриноген, лошадиный фибриноген, козий фибриноген, кошачий фибриноген, собачий фибриноген, мышиный фибриноген и человеческий фибриноген. В соответствии с другими вариантами изобретения, указанным фибриногеном является птичий фибриноген или рыбий фибриноген. В соответствии с любым из этих вариантов, указанный фибриноген может представлять собой рекомбинантно продуцированный фибриноген или трансгенный фибриноген.
В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами изобретения, указанным активатором фибриногена является тромбин млекопитающих, такой как коровий тромбин, свиной тромбин, овечий тромбин, лошадиный тромбин, козий тромбин, кошачий тромбин, собачий тромбин, мышиный тромбин и человеческий тромбин. В соответствии с другими вариантами изобретения, указанным тромбином является птичий тромбин или рыбий тромбин. В соответствии с любым из этих вариантов, указанный тромбин может представлять собой рекомбинантно продуцированный тромбин или трансгенный тромбин.
В качестве общего замечания следует отметить, что фибриноген и/или активатор фибриногена, используемые в твердой повязке, должны иметь чистоту, которая, как известно среднему специалисту в данной области, будет придавать белку (белкам) оптимальную эффективность и стабильность. Фибриноген и/или активатор фибриногена, предпочтительно, обрабатывают путем проведения множества стадий очистки, таких как преципитация, концентрирование, диафильтрация и аффинная хроматография (а предпочтительно, иммуноаффинная хроматография) для удаления веществ, вызывающих фрагментацию, активацию и/или разложение фибриногена и/или активатора фибриногена в процессе изготовления, хранения и/или применения твердой повязки. Иллюстративными примерами таких веществ, которые предпочтительно удаляют путем очистки, являются белковые примеси, такие как ингибитор интер-альфа-трипсина и пре-альфа-трипсина; небелковые примеси, такие как липиды; и смеси белковых и небелковых примесей, такие как липопротеины.
Активатор фибриногена используется в твердой повязке в количестве, предпочтительно, выбранном с точки зрения оптимизации эффективности и стабильности повязки. Концентрация такого активатора фибриногена, подходящая для конкретного применения твердой повязки, может быть определена эмпирически самим специалистом. В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами изобретения, в случае, если активатором фибриногена является человеческий тромбин, то количество используемого человеческого тромбина составляет от 2,50 единиц/мг фибриногенового компонента до 0,025 единиц/мг фибриногена (все величины имеют отклонения ± 0,009). В других своих предпочтительных вариантах, настоящее изобретение относится к аналогичным твердым повязкам, в которых количество тромбина составляет от 0,250 единиц/мг фибриногена до 0,062 единиц/мг фибриногена, и к твердым повязкам, в которых количество тромбина составляет от 0,125 единиц/мг фибриногена до 0,080 единиц/мг фибриногена.
Во время использования твердой повязки фибриноген и активатор фибриногена, при наложении повязки на травмированную ткань, предпочтительно, активируются эндогенными физиологическими жидкостями пациента, выходящими из кровоточащей раны. Альтернативно, в тех случаях, когда истечение жидкости из раны является недостаточным для адекватной гидратации слоев белка, фибриногеновый компонент и/или тромбин могут быть активированы подходящей физиологически приемлемой жидкостью, необязательно содержащей любые необходимые кофакторы и/или ферменты, до или во время наложения повязки на рану.
2
В некоторых вариантах изобретения, гемостатический(е) слой(и) может (могут) также содержать одну или несколько добавок, таких как факторы роста, лекарственные средства, поликлональные и моноклональные антитела, и другие соединения. Иллюстративными примерами таких добавок являются, но не ограничиваются ими, ингибиторы фибринолиза, такие как апротонин, транэксамовая кислота и эпсилон-амино-капроновая кислота; антибиотики, такие как тетрациклин и ципрофлоксацин, амоксицилин и метронидазол; антикоагулянты, такие как активированный белок C, гепарин, простациклины, простагландины (в частности, (PGI), лейкотриены, антитромбин III, АДФаза и активатор плазминогена; стероиды, такие как дексаметазон, ингибиторы простациклина, простагландинов, лейкотриенов и/или кининов, используемые для ингибирования воспаления; середчно-сосудистые лекарственные средства, такие как блокаторы кальциевых каналов, вазодилататоры и сосудосуживающие средства; хемоаттрактанты; местные анестетики, такие как бупивакаин; и антипролиферативные/противоопухолевые лекарственные средства, такие как 5-фторурацил (5-FU), таксол и/или таксотер; антивирусные средства, такие как ганцикловир, зидовудин, амантидин, видарабин, рибаравин, трифлуридин, ацикловир, дидезоксиуридин и антитела против вирусных компонентов или генных продуктов; цитокины, такие как альфа-, бета- или гамма-интерферон, фактор некроза опухоли -альфа или -бета и интерлейкины; колониестимулирующие факторы; эритропоэтин; противогрибковые средства, такие как дифлукан, кетаконизол и нистатин; антипаразитарные средства, такие как пентамидин; противовоспалительные средства, такие как альфа-1-антитрипсин и альфа-1-антихимотрипсин; анестетики, такие как бупивакаин; аналгетики; антисептики; гормоны; витамины и другие питательные добавки; гликопротеины; фибронектин; пептиды и белки; углеводы (простые и/или сложные); протеогликаны; антиангиогенины; антигены; липиды или липосомы; олигонуклеотиды (смысловые и/или антисмысловые ДНК и/или РНК) и реагенты для генотерапии. В других вариантах изобретения, слой-основа и/или внутренний слой-носитель, если они присутствуют, могут содержать одну или несколько добавок. В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами изобретения, терапевтическая добавка присутствует в количестве, превышающем количество, являющееся предельным для ее растворимости в фибрине.
Нижеследующие примеры представлены лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. Для каждого специалиста в данной области очевидно, что в способ согласно изобретению могут быть включены различные модификации и варианты, не выходящие за рамки существа и объема изобретения. Таким образом, считается, что настоящее изобретение охватывает все модификации и варианты при условии, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения и ее эквиваленты.
Примеры
ex vivo
in vivo
Способность повязки заживлять пораженные кровеносные сосуды определяли  в тесте на эффективность путем артериотомии свиной артерии (EVPA), который был впервые описан в патенте США № 6762336. В тесте EVPA на эффективность оценивают способность повязки прекращать поток физиологической жидкости через отверстие в артерии свиньи. Было показано, что процедура, описанная в патенте США № 6762336, может быть использована для оценки гемостатических повязок, но эта процедура не может быть точно и успешно воспроизведена . Более конкретно, для проведения процедуры, описанной в патенте США № 6762336, требуется температура 37°С, тогда как в реальных условиях раны обычно имеют меньшую температуру. Такая более низкая температура может значительно снижать скорость образования фибрина и ухудшать гемостатическую эффективность у людей с травмами. См., например, Acheson et al., J. Trauma 59:865-874 (2005). Тест, описанный в патенте США 6762336, также не требует очень плотного прилипания повязки к поврежденной ткани. Один из недостатков этого теста заключается в том, что в данной повязке фибрин образуется, но сама повязка плотно не прилипает к ткани, а поэтому фибрин не детектируется в этом тесте. Кроме того, в этой процедуре, в процессе лечения некоторых пациентов с травмами, прилагаемое давление может быть избыточным (200 мм рт.ст). Общий вывод, который можно сделать в результате проведения различных тестов на животных, а обычно на мелких животных (таких как крысы и кролики), заключается в том, что для точного предсказания эффективности повязки у крупных животных должны быть проведены испытания на крупных животных с реальными травмами и в клинических условиях.
ex vivo
Для минимизации количества времени и числа исследуемых животных, необходимых для осуществления настоящего изобретения, была разработана усовершенствованная процедура тестирования . Для осуществления такой процедуры основные условия теста для оценки эффективности повязки были изменены, и жесткость параметров тестирования была увеличена, включая проведение теста при более низкой температуре (то есть при 29-33°С, вместо 37°С), что более соответствует реальным физиологическим условиям, то есть при фактической температуре раны (Acheson et al., J. Trauma 59:865-874 (2005)), при более высоком давлении (то есть 250 мм рт. ст., вместо 200 мм рт.ст.), при более длительном времени проведения теста (3 минуты вместо 2 минут) и при более обширных артериальных повреждениях (см. патент США No. 6762336, где описано использование игл для пункций калибра 18, тогда как в пересмотренном варианте используют проколы размером от 2,8 мм до 4 мм×6 мм).
ex vivo
in vivo
Кроме того, был разработан новый тест для прямого измерения степени прилипания повязки к пораженной ткани. Оба эти теста были гораздо более точными, а поэтому они имеют значительные преимущества по сравнению с предыдущим тестом  и могут заменить многие тесты  на эффективность.
Ниже приводится список акронимов, используемых в примерах:
ТМ
CFB: Полный фибриногеновый буфер (100 мМ хлорида натрия, 1,1 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса, 10 мМ цитрата натрия, 1,5% сахарозы, альбумин человеческой сыворотки (80 мг/г общего белка) и твин 80 (животного происхождения) 15 мг/г общего белка)
CTB: Полный тромбиновый буфер (150 мМ хлорида натрия, 40 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса и 100 мМ L-лизина с добавлением 100 мкг/мл HSA)
ERL: Лаборатория по исследованию ферментов
ex vivo
EVPA: Артериотомия свиней
FD: Гемостатическая повязка согласно изобретению
HSA: Альбумин человеческой сыворотки
HD: Гемостатическая повязка типа «сэндвич», изготовленная на основе фибринового герметика, как описано в патенте США No. 6762336
IFB: Неполный фибриногеновый буфер: CFB - без HSA и твина
PETG: Модифицированный гликолем полиэтилентетрафталат
PPG (ППГ): Полипропилен
PVC (ПВХ): Поливинилхлорид
TRIS (трис): трисгидроксиметиламинометан (2-амино-2-гидроксиметил-l,3-пропандиол)
Пример 1
TM
TM
2
TM
Материал-основу (DEXON) разрезали и отдельно помещали в каждую пресс-форму из PETG размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Фибриноген (Enzyme Research Laboratories) приготавливали в CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрации фибриногена доводили до 37,5, 31,7, 25,9, 20,16, 14,4, 8,64 и 4,3 мг/мл. При заливке 2 мл фибриногена в пресс-формы получали дозы фибриногена 13, 11, 9, 7, 5, 3 или 1,5 мг/см. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы при смешивании с растворами фибриногена, как описано ниже, можно было получить раствор комбинации тромбина и фибриногена, содержащий 0,1 единиц/мг фибриногена. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на медную пластину, которую затем ставили поверх сухого льда. Автоматический дозатор наполняли фибриногеном, а второй автоматический дозатор наполняли тромбином. Два миллилитра фибриногена и 300 микролитров тромбина одновременно разливали на каждую пресс-форму. После заполнения пресс-форм их оставляли для замораживания, а затем возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа. Затем замороженные повязки помещали в предварительно охлажденный лиофилизатор Genesis (Virtis, Gardiner, NY). Затем камеру герметично закрывали и создавали температурное равновесие. После этого из камеры откачивали воздух и повязки лиофилизовали путем проведения первого и второго цикла сушки.
Повязки вынимали из лиофилизатора, помещали в герметично закрывающиеся мешочки из фольги и хранили при комнатной температуре до тестирования. Затем повязки оценивали с помощью EVPA, анализа на адгезию и анализа на удерживание массы.
Результаты представлены в нижеследующей таблице и в виде графического материала на фигурах 3A-3C.
Группа
EVPAпрошедшие тест/общее число
Прилипаниев тесте на отслаивание
Прилипание, ст.отк.
Удерживание массы (среднее)(г)
Удерживание массы, ст.от.
13 мг/см<sup>2</sup>
6/6
4,0
0,0
198,0
12,6
11 мг/см<sup>2</sup>
6/6
3,8
0,4
163
48,5
9 мг/см<sup>2</sup>
5/6
3,0
0,0
88
20,0
7 мг/см<sup>2</sup>
6/6
3,2
0,4
93
17,6
7 мг/см<sup>2</sup>
5/6
3,0
0,0
94,7
8,2
5 мг/см<sup>2</sup>
5/5
2,8
0,4
76
34,2
3 мг/см<sup>2</sup>
5/5
2,4
0,5
48
27,4
1,5 мг/см<sup>2</sup>
0/6
0,1
0,2
4,7
11,4
Пример 2
Монолитные повязки изготавливали следующим образом: материал-основу разрезали и отдельно помещали в каждую пресс-форму из PETG размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С.
Для всех повязок, фибриноген ERL, партия 3114, приготавливали в CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы концентрация фибриногена составляла 0,1 единиц/мг, а концентрация тромбина составляла 25 единиц/мл. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на медную пластину, которую затем ставили поверх сухого льда. Один автоматический дозатор наполняли фибриногеном, а второй автоматический дозатор наполняли тромбином. В каждую пресс-форму одновременно закапывали 2 мл фибриногена и 300 микролитров тромбина. После заполнения пресс-форм, их возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего помещали в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано выше. После завершения этой процедуры повязки хранили в мешочках из фольги, пропускающих небольшое количество влаги и содержащих 5 граммов осушителя.
Трехслойные повязки изготавливали как описано ранее с применением материалов, описанных выше. После этого повязки помещали в условия с относительной влажностью 100% при 37°С на различные периоды времени для повышения относительного содержания влаги до нужных уровней. Повязки оценивали визуально, а также анализировали их на технологические и другие физические свойства. После проведения такой оценки образец каждой повязки тестировали для определения содержания в них влаги. Остальные повязки тестировали на их свойства с помощью EVPA, анализа на адгезию и анализа на удерживание массы.
Результаты:
Результаты этих анализов представлены в нижеследующих таблицах:
Таблица 1Технологические данные для твердых повязок согласно изобретению
Время обработки в условиях 100% влажности при 37°С (минуты)
% Влажности
EVPA#прошедшие тест/общее число
Прилипание в тесте на отслаивание(± ср.кв.от)
Удерживание массы, (г)(среднее ± ср.кв.от)
0
2,5
2/2
4,0±0
148±28,3
1
5,8
2/2
3,5±0,71
123±7,1
15
16
2/2
2,5±0,71
108±14,1
45
24
2/2
4,0±0
168±0
60
28
2/2
4,0±0
273±7,1
225
44
2/2
2±0
58±14,1
1200
52
ND
ND
ND
Таблица 2Технологические данные для трехслойных повязок согласно изобретению
Время обработки в условиях 100% влажности при 37°С (минуты)
% Влажности
EVPA#прошедшие тест/общее число
Прилипание в тесте на отслаивание
Удерживание массы, (г)(среднее)
0
3
1/1
2,0
78
15
22
1/1
2,0
78
60
33,7
0/1
0,5
28
Таблица 3Целостность и технологические свойства твердых повязок согласно изобретению
Перед гидратацией
Во время гидратации
После гидратации
Время обработки в условиях 100% влажности при 37°С (минуты)
Внешний вид поверхности
Закручивание
Целост-ность
Эластич-ность
Скорость гидратации
Усилие, требуемое для гидратации
Внешнийвид
0
Нормальный (гладкий, не имеет вид «кожи»)
Нет
Превос-ходная (отсутствие трещин или отслаи-вания)
Нет
Нормальная
Не требуется
Нормальный
1
″
″
″
Да
″
″
″
15
″
″
″
″
″
″
″
45
″
″
″
″
″
″
″
60
″
небольшое
″
″
″
″
″
225
″
Да
″
″
″
″
″
1200
″
Самозакру-чивание
″
″
n/d
n/d
Крапчатая и комковатая
Таблица 4Целостность и технологические свойства трехслойных повязок
Перед гидратацией
Во время гидратации
После гидратации
Время обработки в условиях 100% влажности при 37°С (минуты)
Внешний вид поверхности
Закручи-вание
Целост-ность
Эластич-ность
Скорость гидратации
Усилие, требуемое для гидрата-ции
Внешний вид
0
Нормальный
Нет
Хорошая;небольшое расслаива-ние
Нет
Нормаль-ная
Не требуется
Нормальный
15
Неправильной формы
Нет
″
Да
Низкая
Не требуется
Крапчатая
60
Вид кожи
Да
″
Да
Оченьнизкая
Требуется
Очень крапчатая и комковатая
Выводы
Монолитные повязки были наиболее функциональными при очень высоких уровнях влажности. Было обнаружено, что полная функциональность сохраняется при влажности до 28%. При повышении уровня влажности до 44% повязки все еще являются функциональными, однако степень их активности немного снижается. Некоторые функции также сохраняются при еще более высоких уровнях влажности. Исходные повязки, при содержании влаги 2,5%, были не эластичными, но обладали всеми другими нужными свойствами, включая соответствующий внешний вид, плоскую поверхность, целостность, быструю и легкую гидратацию и гладкую форму после гидратации. После повышения содержания влаги до 5,8% монолитные повязки становились эластичными и сохраняли свою функциональность и нужные свойства. Эти повязки сохраняли свою эластичность и при этом не закручивались или не теряли свою целостность или внешний вид, то есть не образовывали избыточное количество фибрина перед гидратацией.
Эти повязки отличались от трехслойных повязок, которые начинали терять свои желаемые свойства после добавления влаги, и полностью их теряли, когда уровень влажности повышался до 33%.
Пример 3
Для изготовления повязок с использованием материала-основы такой материал-основу разрезали и помещали в каждую пресс-форму из PETG размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Для изготовления повязок без материала-основы пресс-формы из PETG размером 2,4×2,4 см помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С.
Для всех повязок фибриноген ERL, партия 3114, приготавливали в CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4 ± 0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы концентрация фибриногена составляла 0,1 единиц/мг, а концентрация тромбина составляла 25 единиц/мл. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на медную пластину, которую затем ставили поверх сухого льда. Один автоматический дозатор наполняли фибриногеном, а второй автоматический дозатор наполняли тромбином. В каждую пресс-форму одновременно закапывали 2 мл фибриногена и 300 микролитров тромбина. После заполнения пресс-форм их возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего помещали в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано ниже.
Обе группы повязок тестировали с помощью EVPA-анализа. Кроме того, группу повязок, которая имела материал-основу, также тестировали с помощью анализа на адгезию и анализа на удерживание массы.
Результаты
Группа
EVPA #прошедшие тест/общее число
Прилипание в тесте на отслаивание
Прилипание, ст.отк.
Удерживание массы (среднее)(г)
Удерживание массы, ст.от.
Основа
6/6
3,7
0,5
153
37,3
Без основы
9/12
Выводы:
Повязки, изготовленные с использованием материала-основы, обладали хорошими свойствами, причем все эти повязки прошли EVPA-тест и имели высокие показатели в анализах на адгезию и удерживание массы. Повязки, изготовленные без материала-основы, были не такими эффективными в EVPA-анализе, однако неожиданно было обнаружено, что 75% из них все же прошли EVPA-тест. Другие тесты для повязок без основы не могли быть проведены. Тот факт, что повязки, изготовленные без основы, проходили EVPA-тест, указывал на то, что эти повязки могут быть эффективными для лечения поражений артерий и даже еще более эффективными для лечения поражений вен и небольших сосудов.
Пример 4
TM
Для всех повязок фибриноген ERL, партия 3130, приготавливали в CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4 ± 0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы концентрация фибриногена составляла 0,1 единиц/мг, а концентрация тромбина составляла 25 единиц/мл. Для группы, в которой использовали материал-носитель с диспергированным в нем тонко измельченным VICRYL с сетчатой структурой, этот материал-носитель разрезали на куски размером приблизительно 1 × 1 мм и диспергировали в растворе тромбина, а затем этим раствором заполняли пресс-формы. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Были использованы цилиндрические пресс-формы, изготовленные в виде полипропиленовых 10-миллилитровых или 3-миллилитровых шприцов (Becton Dickinson) со сменным люэровским наконечником. Поршни вынимали до отметки 6 мл и 2 мл соответственно. Для изготовления повязок с использованием материала-основы такой материал-основу разрезали, помещали в каждую пресс-форму и поршень продвигали до тех пор, пока этот материал не касался поршня. После проведения этой процедуры пресс-формы ставили в вертикальное положение и обкладывали сухим льдом, оставляя верхнюю поверхность открытой. 1 мл фибриногена и 0,15 мл тромбина (в присутствии или в отсутствие диспергированного в них материала-основы) распределяли по 10-миллилитровым пресс-формам, а 1 мл фибриногена и 0,15 мл тромбина (в присутствии или в отсутствие диспергированного в них материала-носителя) распределяли по 3-миллилитровым пресс-формам и оставляли на 5 минут для замораживания. После этого пресс-формы помещали по меньшей мере на два часа в холодильник при -80°С, а затем помещали в лиофилизатор и лиофилизовали, как описано выше.
После удаления из лиофилизатора обе группы повязок тестировали на их свойства с помощью модифицированного EVPA-анализа. Вкратце, по всей артерии наносили слой пластиковой пены. Такое покрытие имело отверстие, соответствующее отверстию в артерии и в окружающей ткани. На поверхность повязки добавляли теплый физиологический раствор, и пресс-форму сразу вводили через отверстие в пене до поверхности в артерии. Затем поршень опускали вниз и поддерживали рукой в течение 3 минут, после чего эту пресс-форму вытаскивали по мере дальнейшего продвижения поршня. К этому времени артерия сдавливалась, и дальнейший анализ проводили, как описано выше.
Результаты
Материал-носитель
Размер пресс-формы
Результат EVPA (при 250 мм рт.ст.)
Максимальное давление
Отсутствует
10 мл
тест пройден
> 250 мм рт.ст.
Материал-основа DEXON с сетчатой структурой
10 мл
тест пройден
″
″
3 мл
тест пройден
″
Мелкосетчатая основа DEXON (диспергированная)
10 мл
тест пройден
″
″
3 мл
тест не пройден
150 мм рт.ст.
Выводы:
TM
Повязки, которые не включали основу или основу DEXON с сетчатой структурой, обладали хорошими свойствами, и все они проходили EVPA-тест при 250 мм рт.ст. Если материал-носитель диспергировался по всей композиции, то такие повязки также обладали хорошими свойствами, при этом повязки крупного размера (10-миллилитровая пресс-форма) полностью выдерживали давление 250 мм рт.ст., тогда как повязки меньшего размера выдерживали лишь давление 150 мм рт.ст. Это указывает на то, что использование материала-носителя может оказаться необязательным, а при необходимости он может присутствовать на «обратной» стороне повязки либо он может быть диспергирован по всей композиции.
Пример 5
Повязки, содержащие материал-носитель на «обратной» стороне (то есть не на стороне, обращенной к ране), изготавливали сначала путем разрезания сетчатого материала-носителя, а затем помещения его в каждую пресс-форму из PETG размером 10×10 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С.
Повязки, содержащие материал-носитель на «передней» стороне (то есть на стороне, обращенной к ране), изготавливали в пресс-форме без использования какого-либо материала-носителя. Этот носитель с сетчатой структурой помещали поверх повязки сразу после распределения фибриногена и тромбина по пресс-форме (см. ниже), а затем слегка вдавливали его в поверхность и замораживали. Во всех других случаях, повязки изготавливали методом, аналогичным методу, описанному ниже.
Для всех повязок фибриноген ERL, партия 3114, приготавливали в CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы концентрация фибриногена составляла 0,1 единиц/мг, а концентрация тромбина составляла 25 единиц/мл. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Пресс-форму вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую затем ставили поверх сухого льда. Эта алюминиевая пластина имела просверленное в центре отверстие 0,25 дюймов и систему трубок, подсоединенную так, чтобы часть этой системы трубок была соединена с источником подачи вакуума. Пресс-форму центрировали по отверстию в алюминиевой пластине и подавали вакуум. Вакуум использовали в двух целях, а именно для предотвращения перемещения пресс-формы и для сохранения ее плоскости по отношению к плоскости алюминиевой пластины. 35 миллилитров фибриногена и 5,25 миллилитров тромбина помещали в 50-миллилитровую тест-пробирку, а затем ее три раза переворачивали и содержимое выливали в пресс-форму. После заполнения пресс-форм и нанесения материала-носителя, как описано выше, эти пресс-формы возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего их переносили в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано выше.
Обе группы повязок тестировали с помощью EVPA-анализа. Кроме того, группу, которая имела материал-основу, также тестировали с помощью анализа на адгезию и анализа на удерживание массы.
Результаты
Ориентация материала-носителя (с сетчатой структурой)
EVPA#прошедшие тест/общее число
Тест на адгезию, баллы
Прилипание, ст.отк.
Удерживание массы (среднее)(г)
Удерживание массы, ст.от.
Обратная сторона (не обращенная к участку повреждения)
6/6
3,5
0,5
136
49
Передняя строна (непосредственно прилегающая к участку повреждения)
6/6
3,8
0,4
163
32
Выводы:
Повязки, изготовленные с использованием материала-основы, расположенного в любой ориентации, обладали хорошими свойствами, при этом все эти повязки прошли EVPA-тест и имели высокие показатели в анализах на адгезию и удерживание массы. Эти результаты показали, что, при необходимости, материал-носитель может присутствовать на «обратной» стороне повязки или на «передней» стороне повязки.
Пример 6
TM
Материал-носитель (DEXON) помещали в PETG-пресс-форму размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С.
TM
Фибриноген (Enzyme Research Laboratories (ERL), партия 3114) приготавливали в CFB. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл с использованием CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования.
Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали с использованием CFB так, чтобы концентрация фибриногена составляла 12,5 единиц/мл фибриногена (после смешивания), которая соответствовала 3120 единицам/мл тромбина до смешивания. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования.
Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на медную пластину, которую предварительно охлаждали на сухом льду. Один автоматический дозатор наполняли фибриногеном, а второй автоматический дозатор наполняли тромбином. В каждую пресс-форму одновременно закапывали 2 мл фибриногена и 300 микролитров тромбина. После заполнения пресс-форм их возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего помещали в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано ниже, тестировали с помощью EVPA-анализа и анализа, как описано ниже. Результаты представлены на фигурах 4A и 4B.
Пример 7
Материал-носитель помещали в каждую ПВХ-пресс-форму размером 1,5×1,5 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 15 микролитров 2% сахарозы. Второй кусок PETG-пластика помещали сверху на пресс-формы 1,5×1,5 и оставляли. В результате была получена закрытая пресс-форма. Затем пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Фибриноген (ERL, партия 3100) приготавливали в CFB. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл с использованием CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали с использованием CFB так, чтобы фибриноген доставлялся в количестве 2,5, 0,25, 0,1, 0,05, 0,025, 0,016, 0,0125 и 0,01 единиц/мг фибриногена (после смешивания), что соответствует 624, 62,4, 25, 12,5, 6,24, 3,99, 3,12 и 2,5 единиц/мл тромбина до смешивания. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую предварительно охлаждали, помещая на сухой лед. В верхней части пресс-формы делали три отверстия иглой калибра 18. Одно отверстие использовали для инъекции фибриногена, другое отверстие использовали для инъекции тромбина, а третье отверстие служило в качестве вентилятора для выхода воздуха из внутренней части пресс-формы. После этого пипетку заполняли фибриногеном, а вторую пипетку заполняли тромбином. В каждую пресс-форму с помощью этих пипеток одновременно вводили 0,78 мл фибриногена и 0,17 мл тромбина. После заполнения пресс-форм их помещали на 30 секунд в верхнюю часть резервуара с жидким азотом, а затем возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего помещали в лиофилизатор. Затем их лиофилизовали, как описано ниже, и тестировали с помощью EVPA и анализа на адгезию, как описано ниже.
Пример 8
Материал-носитель помещали в ПВХ-пресс-формы размером 2,4 х 2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основу пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Фибриноген (ERL, партия 3100) приготавливали в CFB. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл с использованием CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали с использованием CFB так, чтобы фибриноген доставлялся в количестве 0,125, 0,025, 0,0125, 0,00625 и 0,0031 единиц/мг фибриногена после смешивания, что соответствует 31,2, 6,24, 3,12, 1,56 и 0,78 единиц/мл тромбина до смешивания. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую предварительно охлаждали, помещая на сухой лед. 3-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 18, заполняли 2 мл фибриногена, а второй 1-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 22, заполняли 0,3 мл тромбина. Содержимое обоих шприцов одновременно распределяли по каждой пресс-форме. После заполнения пресс-форм их помещали на 30 секунд над жидким азотом, а затем возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего их переносили в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано ниже, и тестировали с помощью EVPA и анализа на адгезию, как описано ниже.
Пример 9
TM
ТМ
ТМ
Материал-носитель помещали в ПВХ-пресс-формы размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Сосуд, содержащий 3 грамма фибриногена (Sigma Lot# F-3879), вынимали из холодильника, в котором он содержался при -20°С, и оставляли на 18 часов при 4°С. Затем сосуд вынимали из холодильника и оставляли на 60 минут для доведения до комнатной температуры. В этот сосуд добавляли 60 мл воды при 37°С и перемешивали в течение 15 минут при 37°С. После растворения фибриноген диализовали против неполного фибриногенового буфера (IFB, который представляет собой CFB без HSA и твина) в течение 4 часов при комнатной температуре. Через четыре часа добавляли HAS до концентрации 80 мг/г общего белка и твин 80 (животного происхождения) до концентрации 15 мг/г общего белка. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл с использованием CFB. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали с использованием CFB так, чтобы фибриноген доставлялся в количестве 2,5, 0,25, 0,125, 0,083 и 0,0625 единиц/мг фибриногена (после смешивания), что соответствует 624, 62,4, 31,2, 20,8 и 15,6 единиц/мл тромбина до смешивания. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую предварительно охлаждали, помещая на сухой лед. 3-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 18, заполняли 2 мл фибриногена, а второй 1-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 22, заполняли 0,3 мл тромбина. Содержимое обоих шприцов одновременно распределяли по каждой пресс-форме. После заполнения пресс-форм их помещали на 30 секунд поверх жидкого азота, а затем возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего их переносили в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано ниже, и тестировали с помощью EVPA и анализа на адгезию, как описано ниже.
Пример 10
Материал-носитель помещали в ПВХ-пресс-формы размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. Второй кусок PETG-пластика разрезали и помещали сверху на пресс-формы, а затем его закрепляли зажимами, имеющимися на каждом конце пресс-формы, в результате чего получали закрытые пресс-формы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Фибриноген (ERL, партия 3060) приготавливали в CFB. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл с использованием CFB. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали с использованием CFB так, чтобы фибриноген доставлялся в количестве 2,5, 0,25, 0,125, 0,083 и 0,062 единиц/мг фибриногена (после смешивания), что соответствует 624, 62,4, 31,2, 20,8 и 15,6 единиц/мл тромбина (до смешивания). Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую предварительно охлаждали, помещая на сухой лед. 3-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 18, заполняли 2 мл фибриногена, а второй 1-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 22, заполняли 0,3 мл тромбина. Содержимое обоих шприцов одновременно распределяли по каждой пресс-форме. После заполнения пресс-форм их помещали на 30 секунд поверх жидкого азота, а затем возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего их переносили в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано ниже, и тестировали с помощью EVPA и анализа на адгезию, как описано ниже.
Пример 11
TM
ТМ
Материал-носитель помещали в ПВХ-пресс-формы размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. Второй кусок PETG-пластика разрезали и помещали сверху на пресс-формы размером 2,4×2,4 см, а затем его закрепляли зажимами, имеющимися на каждом конце пресс-формы, в результате чего получали закрытые пресс-формы. После этого пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Сосуд, содержащий 3 грамма фибриногена (Sigma Lot# F-3879), вынимали из холодильника, в котором он содержался при -20°С, и оставляли на 18 часов при 4°С. Затем сосуд вынимали из холодильника и оставляли на 60 минут для доведения до комнатной температуры. В этот сосуд добавляли 60 мл воды при 37°С и содержимое перемешивали в течение 15 минут при 37°С. После растворения фибриноген диализовали против IFB. Через четыре часа добавляли HAS до концентрации 80 мг/г общего белка и твин 80 (животного происхождения) до концентрации 15 мг/г общего белка. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл с использованием CFB. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы фибриноген доставлялся в количестве 2,5, 0,25, 0,125, 0,1 и 0,083 единиц/мг фибриногена (после смешивания), что соответствует 624, 62,4, 31,2, 24,96 и 20,79 единиц/мл тромбина (до смешивания). Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую предварительно охлаждали, помещая на сухой лед. 3-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 18, заполняли 2 мл фибриногена, а второй 1-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 22, заполняли 0,3 мл тромбина. Содержимое обоих шприцов одновременно распределяли по каждой пресс-форме. После заполнения пресс-форм их помещали на 30 секунд поверх жидкого азота, а затем возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего их помещали в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано ниже, и тестировали с помощью EVPA и анализа на адгезию, как описано ниже.
Пример 12
Материал-носитель помещали в ПВХ-пресс-формы размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. Второй кусок PETG-пластика разрезали и помещали сверху на пресс-формы, а затем его закрепляли зажимами, имеющимися на каждом конце пресс-формы, в результате чего получали закрытые пресс-формы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С.
TM
ТМ
Сосуд, содержащий 3 грамма фибриногена (Sigma Lot# F-3879), вынимали из холодильника, в котором он содержался при -20°С, и оставляли на 18 часов при 4°С. Затем сосуд оставляли на 60 минут для доведения до комнатной температуры. В этот сосуд добавляли 60 мл воды при 37°С и содержимое перемешивали в течение 20 минут при 37°С. После растворения фибриноген диализовали против IFB. Через четыре часа добавляли альбумин человеческой сыворотки (HAS) до концентрации 80 мг/г общего белка и твин 80 (животного происхождения) до концентрации 15 мг/г общего белка. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл с использованием CFB. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования.
Тромбин приготавливали в CTB. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы фибриноген доставлялся в количестве 2,5, 0,25, 0,125, 0,08 и 0,06 единиц/мг фибриногена (после смешивания), что соответствует 624, 62,4, 31,2, 20,8 и 15,6 единиц/мл тромбина (до смешивания). Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую предварительно охлаждали, помещая на сухой лед. 3-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 18, заполняли 2 мл фибриногена, а второй 1-миллилитровый шприц, снабженный иглой калибра 22, заполняли 0,3 мл тромбина. Содержимое обоих шприцов одновременно распределяли по каждой пресс-форме. После заполнения пресс-форм их помещали на 30 секунд поверх жидкого азота, а затем возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, после чего их помещали в лиофилизатор. Затем повязки лиофилизовали, как описано ниже, и тестировали с помощью EVPA и анализа на адгезию, как описано ниже.
Трехслойные повязки (типа «сэндвич»)
Трехслойные повязки изготавливали методом, описанным в патенте США № 6762336, с использованием тех же самых источников фибриногена и тромбина, которые были использованы для изготовления описанных выше монолитных повязок.
Результаты
Результаты EVPA и анализа на адгезию представлены на фигурах 4A и 4B соответственно.
Выводы (Примеры 6-12):
Повязки, изготовленные с использованием 2,5-0,025 единиц тромбина/мг фибриногена, обладали активностью в обоих анализах, а повязки, изготовленные с использованием большего или меньшего отношения тромбина к фибриногену, не обладали такой активностью. Значительно более высокая активность наблюдалась в пределах 2,5-0,05 единиц тромбина/мг фибриногена. Значительно более улучшенные свойства обнаруживались при 0,25-0,062 единиц тромбина/мг фибриногена, а оптимальные свойства обнаруживались при 0,125-0,08 единиц тромбина/мг фибриногена. Такая повязка отличалась от повязок, изготовленных методом, описанным в патенте США № 6762336, полная эффективность которых достигалась при 12,5 единиц тромбина/мг фибриногена, однако, по мере снижения концентрации тромбина ниже 12,5 единиц/мг фибриногена, их свойства были неприемлемыми, а при концентрации 1,4 единиц тромбина/мг фибриногена, они, по существу, вообще не обладали какой-либо активностью. Такое различие в пределах эффективности и оптимальных уровнях является еще более выраженным, если учесть, что эффективность трехслойных повязок, описанных в патенте США No 6762336, снижалась при использовании меньшего количества тромбина, тогда как описанная здесь повязка обнаруживала повышенную активность в этом интервале величин.
Пример 13
Материал-основу разрезали и помещали в каждую пресс-форму из PETG размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С. Фибриноген (Enzyme Research Laboratories (ERL), партия 3114) приготавливали в CFB. Кроме того, добавляли HSA до 80 мг/г общего белка и твин 80 (животного происхождения) до 15 мг/г общего белка. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл. Этот фибриноген, после его приготовления, помещали на лед до использования. Тромбин приготавливали в 150 мМ хлорида натрия, 40 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса и 100 мМ L-лизина с добавлением альбумина человеческой сыворотки при 100 мкг/мл. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы концентрация фибриногена составляла 0,1 единиц/мг, а концентрация тромбина составляла 25 единиц/мл. Тромбин, после его приготовления, помещали на лед до использования. Температура фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую затем ставили поверх сухого льда. Один автоматический дозатор наполняли фибриногеном, а второй автоматический дозатор наполняли тромбином. В каждую пресс-форму одновременно закапывали 2 мл фибриногена и 300 микролитров тромбина. После заполнения пресс-форм их возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, а затем помещали в лиофилизатор. Одну группу повязок лиофилизовали на день 0, а остальные повязки хранили в замороженном виде при -80°С. Вторую группу повязок лиофилизовали на 7-й день, а третью группу лиофилизовали на 14-й день.
После лиофилизации всех повязок их тестировали с помощью описанного здесь анализа EVPA, анализа на адгезию и анализа на удерживания массы.
Результаты
Дни хранения в замороженном виде до лиофилизации
EVPA#прошедшие тест/общее число
Прилипание в тесте на отслаивание
Прилипание, ст.отк.
Удерживание массы (среднее)(г)
Удерживание массы, ст.от.
0
5/6
3,5
0,5
168,0
63,2
7
6/6
3,8
0,4
164,7
29,4
14
6/6
3,7
0,5
139,7
39,7
Выводы:
Композиции, состоящие из тщательно перемешанного замороженного фибриногена и тромбина, сохраняли свою стабильность и функциональность в течение 7-14 дней, и при этом не было обнаружено какого-либо заметного ухудшения их свойств. Как и ожидалось, увеличение срока хранения давало аналогичные результаты. Полученные результаты графически проиллюстрированы на фигурах 5A и 5B.
Пример 14
Материал-основу разрезали и помещали в каждую пресс-форму из PETG размером 2,4×2,4 см. На поверхность каждого четырехугольного материала-основы пипетировали 25 микролитров 2% сахарозы. После завершения этой процедуры пресс-формы помещали по меньшей мере на 60 минут в холодильник при -80°С.
Повязки группы 1 (без альбумина и без твина 80): Фибриноген (Enzyme Research Laboratories (ERL), партия 3130) приготавливали в 100 мМ хлорида натрия, 1,1 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса, 10 мМ цитрата натрия и 1,5% сахарозы. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл.
Повязки группы 2 (без альбумина, с твином 80): Фибриноген (ERL) приготавливали в 100 мМ хлорида натрия, 1,1 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса, 10 мМ цитрата натрия и 1,5% сахарозы. Затем добавляли твин 80 (животного происхождения) до 15 мг/г общего белка. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл.
Повязки группы 3 (с альбумином, без твина 80): Фибриноген (ERL) приготавливали в 100 мМ хлорида натрия, 1,1 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса, 10 мМ цитрата натрия и 1,5% сахарозы. Затем добавляли HSA до 80 мг/г общего белка. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл.
Повязки группы 4 (с альбумином и с твином 80): Фибриноген (ERL) приготавливали в 100 мМ хлорида натрия, 1,1 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса, 10 мМ цитрата натрия и 1,5% сахарозы (полный фибриногеновый буфер). Кроме того, добавляли HSA до 80 мг/г общего белка и твин 80 (животного происхождения) до 15 мг/г общего белка. Конечный pH фибриногена составлял 7,4±0,1. Концентрацию фибриногена доводили до 37,5 мг/мл.
Растворы фибриногена, после их приготовления, помещали на лед до использования.
Тромбин приготавливали в 150 мМ хлорида натрия, 40 мМ хлорида кальция, 10 мМ триса и 100 мМ L-лизина с добавлением HSA при 100 мкг/мл. Конечный pH тромбина составлял 7,4±0,1. Концентрации тромбина корректировали так, чтобы концентрация фибриногена составляла 0,1 единиц/мг, а концентрация тромбина составляла 25 единиц/мл.
Раствор тромбина, после его приготовления, помещали на лед до использования.
Температура растворов фибриногена и тромбина перед распределением на дозы составляла 4°С±2°С. Затем пресс-формы вынимали из холодильника при -80°С и помещали на алюминиевую пластину, которую ставили на сухой лед. Один автоматический дозатор наполняли раствором фибриногена, а второй автоматический дозатор наполняли раствором тромбина. В каждую пресс-форму одновременно закапывали 2 мл раствора фибриногена и 300 микролитров раствора тромбина. После заполнения пресс-форм их возвращали в холодильник при -80°С по меньшей мере на два часа, а затем помещали в лиофилизатор.
Результаты
Композиция
EVPA #прошедшие тест/общее число
Прилипание
Прилипание, ст.отк.
Сохранение массы (среднее)(г)
Сохранение массы, ст.от.
Без альб. и без твина
0/6
0,8
1,0
24,0
26,3
Без альб., но с твином
3/6
3,3
0,8
114,7
40,8
С альб. но без твина
1/6
1,7
1,0
45,0
39,9
С альб. и с твином
5/6
3,5
0,5
131,3
32,0
Выводы:
Результаты показали, что добавление альбумина улучшает свойства повязок. Добавление твина приводит к еще большему улучшению свойств таких повязок. Комбинация обоих компонентов давала наилучшие свойства.
Анализ свойств с помощью EVPA
Оборудование и поставщики:
TM
• Встроенный трансдуктор высокого давления (Ashcroft Duralife или эквивалент)
TM
• Перистальтический насос (Pharmacia Biotech, Model P-1 или эквивалент)
TM
• Вольтметр (Craftsman Professional Model 82324 или эквивалент)
• Компьютер, снабженный программой для регистрации давления или напряжения
TM
• Система пробирок Tygon (различного размера) с подставкой
TM
• Водяная баня (Baxter Durabath или эквивалент), установленная на 37°С
TM
• Камера для инкубирования (VWR, Model 1400G или эквивалент), установленная на 37°С
• Термометр для мониторинга температур водяной бани и печи
• Набор пинцетов, гемостатов и ножниц
3
3
• 10-см и 20-смшприцы, имеющие отверстие примерно 0,6 см, просверленное в центре, и меньшее по размеру отверстие, просверленное через шприц и поршень. Это отверстие, просверленное на конце шприца, используется для удерживания поршня в нажатом и неподвижном состоянии
• O-кольца (размером 10 и 13)
3
3
• Пластиковые экраны, которыми снабжены 10-см и 20-см шприцы (длиной приблизительно 3,5 см)
TM
• Пипетка P-1000 Pipetman с наконечниками
• Сфигмоманометр с манжетой для новорожденных и с баллоном для подачи давления
• Программируемый логический контроллер (PLC) для регуляции работы насосов и поддержания нужного профиля давления (При желании может быть использован, но необязательно, мануальный контроль)
Материалы и химические соединения
TM
• Нисходящий отдел аорты свиней (Pel-Freez Biologicals, Catalog # 59402-2 или эквивалент)
TM
• Цианоакрилатный клей (Vetbond, 3M или эквивалент)
• Игла(ы) калибра 18
• 0,9% физиологический раствор, 37°С
• Красный пищевой краситель
• Пробойник(и) для биопсии сосудов, 2,8 мм или другого размера
• Пластиковая упаковка
2. Очистка и хранение артерий
1. Артерии хранили при -20°С до использования.
2
2. Артерии оттаивали при 37°С в бане с НО.
3. От внешней поверхности артерии отделяли жир и соединительную ткань.
4. Артерии разрезали на сегменты ~5 см.
5. Артерии могут быть повторно заморожены до -20°С и помещены на хранение до использования.
3. Приготовление артерий для анализа
1. Артерии выворачивали «наизнанку» так, чтобы гладкая внутренняя стенка артерии находилась лицевой частью наружу.
3
3
2. O-кольцо размером 13 надевали на 20-см шприц, или O-кольцо размером 10 надевали на 10-см шприц, имеющий отверстие размером приблизительно 0,6 см (0,25 дюйма), просверленное на одной стороне.
3. Артерию натягивали на шприц, стараясь ее не повредить и, при этом, не допускать слишком свободной ее посадки. Артерия должна быть плотно посажена на шприц. Другое О-кольцо того же размера плавно проскальзывало на дно шприца.
4. Оба O-кольца осторожно надевали на концы артерий. Расстояние между О-кольцами должно составлять по меньшей мере 3,5 см.
5. С помощью лезвия хирургических ножниц осторожно соскабливали поверхность артерий для создания шероховатой поверхности артерии.
6. С использованием иглы калибра 18 в артерии делали отверстие в том месте, где имелось отверстие в цилиндре шприца (см. выше).
7. Наконечник пробойника для биопсии вставляли через отверстие в артерии. Поршень пробойника опускали и делали открытое отверстие в артерии. Эту процедуру повторяли два раза для гарантии того, что отверстие будет открытым и не будет содержать соединительной ткани.
8. Отверстия закрывали слева от коллатеральных артерий. Обычно это делали путем отрезания лоскута от латексных перчаток и приклеивания его поверх отверстия цианоакрилатным клеем. Клей оставляли для отверждения по меньшей мере на 10 минут.
9. Артерию помещали в нагретый контейнер с повышенной влажностью, а затем помещали в камеру для инкубирования. Артерии оставляли для нагревания по меньшей мере на 30 минут.
4. Получение раствора и оборудование
1. Следили за тем, чтобы водяная баня и камера для инкубирования имели температуру 29-33°С.
2. Проверяли, чтобы количество 0,9% физиологического раствора в резервуаре насоса было достаточным для завершения анализов на данный день. При необходимости добавляли дополнительное количество.
3. 0,9% физиологический раствор и 0,9% физиологический раствор с несколькими каплями красного пищевого красителя добавляли в контейнеры в водяной бане так, чтобы растворы нагревались до проведения анализа.
TM
4. Контейнер для нагревания артерий в камере для инкубирования подготавливали путем подсоединения Kim Wipes и добавления небольшого количества воды для поддержания влажности артерий.
5. Пробирки проверяли на наличие пузырьков воздуха. Если эти пузырьки присутствовали, то включали насос и вводили 0,9% физиологический раствор до полного удаления всех пузырьков.
5. Наложение повязки
1. Мешочек с гемостатическими повязками открывали и эти повязки вынимали.
2. Гемостатическую повязку помещали обратной сетчатой стороной вверх на отверстие в артерии.
3. Гемостатическую повязку медленно смачивали определенным количеством физиологического раствора, предназначенного для тестируемого изделия.
2
Примечание: Стандартная (13-15 мг/см фибриногена) гемостатическая повязка размером 2,4×2,4 см должна быть смочена в 800 мкл физиологического раствора или другого заменителя крови. Количество используемого физиологического раствора может быть скорректировано в зависимости от требований конкретно проводимого эксперимента, однако любые модификации должны быть указаны в документах по сбору данных.
Примечание: Гемостатическую повязку необходимо смачивать путем добавления по каплям 0,9% физиологического раствора, нагретого до 29-33°С, или любого заменителя крови, при этом следует следить за тем, чтобы физиологический раствор не стекал с краев. Любые наблюдаемые различия в характере смачивания по сравнению с позитивным контролем должны быть указаны в документах по сбору данных.
4. Защитный экран осторожно помещали на гемостатическую повязку, при этом необходимо следить за тем, чтобы он находился в плоскости между O-кольцами. Затем легким нажимом его ставили на место.
5. Артерию и гемостатическую повязку оборачивали пластиковой пленкой.
6. Надевали манжету для измерения кровяного давления, при этом необходимо, чтобы баллон тонометра находился вблизи от гемостатической повязки.
7. Баллон накачивают до 100-120 мм рт.ст. и следили за давлением, а если оно падало ниже 100 мм рт.ст., баллон снова накачивали. Давление поддерживали в течение 5 минут.
Примечание: Время и давление могут быть изменены в соответствии с условиями эксперимента, при этом отклонения от стандартных условий должны быть указаны в документах по сбору данных.
8. После полимеризации артерию осторожно развертывали и регистрировали состояние гемостатической повязки. Любые отклонения от позитивного контроля должны быть указаны в документах по сбору данных.
Критерии исключения: сетчатая основа должна находиться поверх отверстия в артерии. Если она сдвигается во время полимеризации и не полностью покрывает отверстие, то такая гемостатическая повязка является непригодной.
Процедура испытаний
1. Схема установки экспериментального оборудования
Установка экспериментального оборудования представлена на фигуре 2. Для регистрации (данных манометра) или регуляции давления в системе могут быть использованы некоторые дополнительные не указанные на этой фигуре компоненты.
2. Сборка оборудования и подготовка артерий
Артерию и шприц наполняют красным 0,9% физиологическим раствором, нагретым до 37°С, и при этом следят за тем, чтобы количество пузырьков воздуха в шприце и в артерии было минимальным. Заполнение артерии может быть осуществлено через верхнее отверстие. Артерию и шприц подсоединяют к испытательной установке и следят за тем, чтобы в системе трубок присутствовало, по возможности, как можно меньше пузырьков воздуха. Перистальтический насос должен быть прокалиброван так, чтобы он подавал раствор со скоростью приблизительно 3 мл/мин. ПЛГ (программируемый логический контроллер), если он используется, должен действовать в соответствии с предварительно определенным диапазоном давлений и временем удерживания, подходящим для тестируемого изделия. Если используется мануальный контроль, то профиль время/давление достигается путем ручного включения и выключения насоса и сравнения давления системы, считываемого одним или несколькими компонентами регистрации давления в системе. После завершения испытания гемостатическую повязку субъективно оценивают с точки зрения ее прилипания к артерии и образования пробки в отверстии артерии. Любые отклонения от позитивного контроля должны быть указаны в документах по сбору данных.
Критерий успеха
Считается, что тест был пройден, если гемостатические повязки выдерживали давление в течение 3 минут. Если гемостатическая повязка успешно проходила данный тест, то сбор данных должен быть сразу прекращен, для того чтобы естественное снижение давления, происходящее в артерии после окончания теста, не отражалось на графике. При этом оператор не должен прекращать сбор данных, но эти данные могут быть исключены из файла данных во избежание путаницы между естественным спадом давления, который происходит после проведения испытания, и реальными недостатками данной повязки. Полный период времени испытания, начиная от наложения гемостатической повязки и до завершения испытания, должен соответствовать предварительно установленным критериям. Максимальное давление должно быть зарегистрировано в документе по сбору данных.
Примечание: типичными условиями является давление 250 мм рт.ст. в течение трех минут за одну стадию, но это условие может быть изменено в зависимости от испытуемого изделия. Изменения в проведении стандартной процедуры должны быть указаны в документах по сбору данных.
Критерий неудачи
Считается, что гемостатические повязки не прошли анализ, если в любой период времени проведения испытания наблюдалась утечка физиологического раствора.
Примечание: Структурные нарушения, вызываемые набуханием артерии, могут не учитываться, и испытания могут быть продолжены или начаты снова (при условии, что общее время проведения испытания не выходит за рамки установленного лимита времени).
Если наблюдается утечка, то давление должно быть доведено до ~20 мм рт.ст., а затем сбор данных должен быть прекращен для того, чтобы на графиках можно было легко идентифицировать неблагоприятный исход. Давление, при котором наблюдалась утечка, должно быть зарегистрировано в документах по сбору данных. В случае отказа оборудования в середине эксперимента сбор данных должен быть прекращен, и эти данные могут быть собраны вручную с интервалами в 5 секунд до конца проведения теста или до получения неблагоприятной оценки для данной повязки, даже если это случилось в первый раз. Исходные данные должны быть зарегистрированы на обратной стороне документа по сбору данных, отчетливо помечены и занесены от руки в таблицы.
Критерий исключения
Если общий период тестирования превышает период, максимально допустимый для проведения такой процедуры, то независимо от причины такого превышения, эти результаты должны быть исключены. Если наблюдается утечка из коллатеральных артерий, которая не может быть приостановлена путем заклеивания пластырем или зажатия пальцем, то эти результаты должны быть исключены. Если неудача данного теста обусловлена утечкой у O-колец, то такие результаты должны быть исключены. Если сетчатая основа не полностью покрывает отверстие в артерии, то такие результаты должны быть исключены.
Испытания на адгезию
1. Оборудование и поставщики
Гемостат(ы), свиная артерия и гемостатическая повязка (обычно после завершения EVPA-анализа, хотя такой анализ не является обязательным для осуществления данного анализа на адгезию).
I. Подготовка артерии + повязки
После наложения повязки без проведения EVPA-анализа такая повязка может быть проанализирована в тесте на адгезию и в тесте на ограничение массы (если их проводят). После наложения повязки и последующего проведения EVPA-анализа систему артерий и шприцов медленно отсоединяют от насоса для того, чтобы предотвратить распыление раствора. Нагретый красный физиологический раствор, используемый в EVPA-анализе, оставался в шприце до завершения анализа на адгезию и теста на ограничение массы (если они проводятся).
Проведение анализа на адгезию
1. После подготовки артерии и изготовления повязки (с проведением или без проведения EVPA-анализа) угол сетки осторожно поднимают и к этому углу присоединяют гемостат с известной массой.
Примечание: Если во время проведения EVPA-анализа при наложении повязки (FD) наблюдалась утечка жидкости, то для более точной оценки общей адгезии, тест на адгезию проводят с противоположной стороны гемостатической повязки.
2. Гемостат осторожно отсоединяют и при этом следят за тем, чтобы он не упал или не закручивался. Затем шприц поворачивают так, чтобы гемостат находился возле его верхней части, что позволяет гемостату отделяться от повязки, насколько это возможно. Это обычно происходит за 10 секунд. После прекращения отделения гемостата от повязки оценивают уровень адгезии повязки по следующей шкале оценок:
Оценка технологических параметров повязки
Уровень адгезии
4
90+%
3
75-90%
2
50-75%
1
~50%
0,5
Только пробкаудерживает гемостат
0
Адгезия отсутствует
Критерий исключения
Сетчатая основа должна оставаться на отверстии артерии. Если в процессе полимеризации наблюдаются какие-либо изменения и отверстие покрыто не полностью, то такая гемостатическая повязка является непригодной.
Критерий успеха
Считается, что повязки прошли испытание, если их прилипание по шкале оценок равно 3.
Критерий неудачи
Если повязка не прилипает к артерии после ее наложения и/или до проведения EVPA-анализа, то такому испытанию на адгезию присваивался балл 0, и это означает, что данное испытание не пройдено. Если повязка имеет балл ≤ 2, то считается, что такая повязка не прошла испытание на адгезию.
Анализ на удерживание массы
После начала оценки «в испытании на адгезию», масса гемостата может быть увеличена до тех пор, пока сетчатая основа не начнет полностью отсоединяться от артерии. Затем максимальную массу, которую может выдерживать повязка, регистрируют как показатель количества массы, которое может выдерживать повязка, наложенная на артерию.
Анализ на содержание влаги
Определение содержания влаги осуществляли с использованием системы анализаторов влаги Brinkman Metrohm. Эта система содержит следующие отдельные компоненты: процессор для сбора образцов в печи 774, контроллер 774SC, титрующее устройство 836, 5-миллилитровые- и 50-миллилитровые дозаторы 800 и смеситель 801. Эту систему подсоединяли к компьютеру с программой Brinkman Tiamo для сбора данных, их анализа и хранения. Систему анализаторов влажности устанавливали и запускали в соответствии с рекомендациями и требованиями производителей для измерения содержания влаги в лиофилизованных образцах методом Карла Фишера.
Были введены все компоненты и перед использованием была достигнута рабочая температура. Для калибровки инструмента в качестве стандартов использовали лактозу и воду. После успешной калибровки аппарата образцы получали следующим образом. Куски повязок массой по меньшей мере 30 мг помещали в сосуды и эти сосуды закрывали. Сосуды помещали в процессор для сбора образцов в печи 774 по порядку, а один закрытый пустой сосуд помещали в кондиционированное пространство. Затем данное устройство запускали для определения содержания влаги (остаточной влажности) в контроле и в образцах.
Электрофорез в ПААГ с ДСН
Каждую повязку разрезали на четыре части, приблизительно по 50 мг на каждую часть, а затем каждую часть помещали в 15-миллилитровую коническую пробирку. Для получения контроля (то есть время 0) добавляли 1,0 мл растворяющего раствора Okuda (10 M мочевины, 0,1% додецилсульфата натрия, 0,1% β-меркаптоэтанола). Остальные 3 куска повязки смачивали путем добавления 80 мкл 0,9% физиологического раствора. После этого куски инкубировали при 37°С в течение 2, 5 и 10 минут или более, если это необходимо. Для прекращения реакции в нужное время добавляли 1,0 мл растворяющего раствора Okuda. Затем образцы инкубировали при комнатной температуре в течение ночи, после чего их инкубировали при 70°С в течение 30 минут.
2
2
В целях приготовления образцов для загрузки на гель образцы, которые были предварительно растворены в растворяющем растворе Okuda, добавляли в буфер для образцов так, чтобы 20 мкл-аликвота содержала 10 мкг. В каждый образец добавляли 1 мкл 0,1 M дитиотреитола. 20 мкл каждого разведенного образца загружали на 10 лунок с 8% трис-глициновым гелем (Invitrogen) толщиной 1,0 мм. После этого проводили электрофорез в гелях при 140 вольт до тех пор, пока находящийся на переднем крае краситель не достигал конца геля. Затем гели вынимали и помещали минимум на 1 час в кумасси синий (50% об./об. метанол, 0,25% мас./об. кумасси бриллиантовый голубой, 10% мас./об. уксусная кислота в ddHO) на платформу-шейкер. Затем гель помещали в обесцвечивающий раствор (25% метанол, 10% уксусная кислота, 65% ddHO) на платформу-шейкер до тех пор, пока фон не становился почти бесцветным.
После обесцвечивания гели сканировали, и γ-γ-димерные полосы и Аα- и Вβ-полосы анализировали с помощью компьютерной программы денситометрии Scion для определения уровня наблюдаемого превращения.