Механизм действия макролидного антибиотика филипина на клеточные и липидные мембраны

Механизм действия макролидного антибиотика филипина на клеточные и липидные мембраны

А. А. САМЕДОВА, Х. М. КАСУМОВ

Институт ботаники Национальной академии наук Азербайджана, Баку

Mechanism of Action of Macrolide Antibiotic Filipin on Cell and Lipid Membranes

A. A. SAMEDOVA, KH. M. KASUMOV

Institute of Botany, Azerbaijan National Academy of Sciences, Baku

В данном обзоре изложены результаты по исследованию механизма действия макролидного пентаенового антибиотика филипина на клеточные и бислойные липидные мембраны (БЛМ). Экспериментально подтверждена «стериновая гипотеза» механизма действия филипина. Изучено гемолитическое и генетико-цитологическое действие филипина, изложены данные действия филипина на вирусные инфекции и на болезни, вызываемые прионовыми белками. Представлены данные исследования механизма действия филипина на БЛМ. При малых концентрациях филипина (1 • 1O-8 М) в водном солевом растворе на мембранах с холестерином обнаружены одиночные ионные каналы с проводимостью 15—2O пСм, что примерно в 3—4 раза превышает проводимость амфотерициновых каналов. Обнаружены комбинированные каналы филипина и амфотерицина В, проводимость которых составляет 25—3O пСм, что в 1,5—2 раза выше «чистых» филипиновых каналов и примерно в 5 раз выше «чистых» амфотерициновых каналов. Избирательная проницаемость филипиновых каналов преимущественно катионная.

Ключевые слова: полиеновые антибиотики, филипин, бислойные липидные мембраны, ионные каналы, филипин-холесте-риновые комплексы, мембранная проницаемость.

The review deals with investigation of the mechanism of action of macrolide pentaene antibiotic filipin on cell and bilayer lipid membranes (BLM). The sterol hypothesis of the filipin mechanism of action is confirmed experimentally. The hemolytic and genetico-cytological action of filipin, its action on virus infection and prion protein-associated diseases are discussed. The data on the mechanism of filipin action on BLM are presented. Filipin single ionic channels with conductance of 15—20 pS that is 3—4 times higher than that of the amphotericin channels were detected on cholesterol-containing membranes in filipin low concentration (1 • 10-8 M) aqueous salt solution. Combined ionic channels of filipin and amphotericin B with conductance of 25—30 pS, that is 1.5—2 time lower than that of the clean filipin channels and 5 times higher that of the clean amphotericin B channels were also detected. The selectivity of filipin channels is mainly cationic. The potential of the penetrating ion on 10-fold gradient is +18 mV. The practical aspects of filipin application in biology, medicine and pharmacology are indicated.

Key words: polyene antibiotics, filipin, bilayer lipid membranes, ionic channels, filipin-cholesterol complexes, membrane permeability.

Введение

Полиеновые антибиотики (ПА) являются самыми эффективными соединениями при лечении грибковых инфекций [1]. Использование ПА в медицинской практике базируется на детальном изучении молекулярно-биологических механизмов их взаимодействия с клеткой. В настоящее время известно более 200 представителей класса ПА, многие из которых (нистатин, амфотерицин В, микогептин, леворин и др.) широко применяются в практической медицине для лечения инфекционных заболеваний. Установлено, что ПА обладают мембранотропным действием. Они взаимодействуют со стеринами, лока© А. А. Самедова, X. М. Касумов, 2009

Адрес для корреспонденции: Баку Л2-1073, Патамдартское шоссе, 40. Институт ботаники Национальной академии наук Азербайджанской республики

лизованными в цитоплазматических мембранах клеток и БЛМ, образуя в них каналы, проницаемые для ионов и органических соединений [2]. Однако молекулярные аспекты взаимодействия ПА с мембранами до сих пор остаются открытыми. Исследуя свойства одиночных ионных каналов на липидных мембранах при добавлении ПА с различной структурой молекул, удалось установить связь между структурой и функцией молекул полиенов в мембранах. В этом отношении особый интерес представляет электрически нейтральный пентаеновый антибиотик филипин. Филипин был впервые выделен G. B. Whitfield и соавт. в 1955 г. [3] из почвенных актиномицетов Streptomyces filipensis, откуда и произошло название данного антибиотика. Позже было установлено, что филипин проявляет антигрибковую активность и в химическом отношении был

идентифицирован как антибиотик, относящийся к классу полиеновых макролидных антибиотиков [4]. В химической структуре филипина имеется 5 двойных связей, а также определённое число гидроксильных, карбонильных и метальных групп (рис. 1, табл. 1) Филипин представляет собой комплекс из 4 компонентов — филипина I (4%), филипина II (25%), филипина III (53%) и филипина IV(18%) [5]. Основным компонентом является филипин III, структура которого была установлена O. Ceder, R. Ryhage [5]. Филипин I содержит на две гидроксильные группы меньше. Исследование филипина II с помощью масс-спектроскопии и ядерного магнитного резонанса показало, что он представляет собой окисленную (1'-дезокси) форму филипина III. Филипин IV является изомером филипина

III и по всей вероятности представляет собой эпимерную субстанцию филипина III. На рис. 1 показано номенклатурное обозначение и химическая структура филипина.

Данная работа посвящена изучению механизма действия основного компонента пентаенового антибиотика филипина III на клеточные и липидные мембраны. В дальнейшем изложении экспериментальных данных филипин III будет обозначаться как филипин. В статье рассматриваются различные аспекты изучения механизма действия филипина.

Экспериментальные данные

Стериновая гипотеза механизма действия филипина. Имеется ряд доказательств в пользу стери-нового механизма действия ПА. Показано, что клетки Mycoplasma gallisepticum, для роста которых необходимы стерины, в течение пяти дней не повреждаются филипином на среде, не содержащей стеринов, тогда как при наличии стеринов рост быстро подавляется [6]. Клетки Mycoplasma laid-lawii растут на средах, не содержащих стерины, но при добавлении их к среде начинают поглощать стерины. Рост этого организма при добавлении холестерина подавляется филипином, а без стеринов подавления роста клеток не происходит [4]. Клетки Acholeplasma laidlawii чувствительны к филипи-ну, нистатину и этрускомицину, если они выращиваются на среде с холестерином, холестанолом, эргостерином [7]. В липосомах, содержащих холестерин, не наблюдается ультраструктурных изменений под действием гидрированного филипина

— производного филипина без двойных связей [8]. Таблица 1. Характеристика филипина III

Рис. 1. Химическая структура филипина.

Цитохимическим методом и методом замораживания-скалывания с помощью филипина определено содержание холестерина в фокальных затемнениях и мулыиламеллярных тельцах хрусталика человека [9]. Фотофизическим методом показано образование в мембранах агрегатов филипина в комплексе с эргостерином [10].

В отличие от филипина ни один из других исследованных полиенов не образовывал подобных «ниш» в мембранах эритроцитов и в липосомах, приготовленных из лецитина с холестерином. Филипин-холестериновые комплексы образуются в мембранах эозинофильных клеток [11], в клетках эпителия щитовидной железы мышей [12], в мембранах ресничного эпителия моллюсков [13], в ядерных мембранах клеток асцитной карциномы Эрлиха [14]. Образование комплексов имело место в синаптических мембранах фоторецепторных клеток [15], в плазматических мембранах клеток эпидермиса некоторых животных [16], в трубочках аппарата Гольджи [17], в плазматических мембранах почечных клеток [18].

Филипин-стериновые комплексы были обнаружены в плазматических мембранах жгутиковых одноклеточных патогенных организмов Trypanosoma brucei gambiense [19], в мембранах сперматозоидов мышей [20], в сперме золотистого хомячка [21]. Филипин-холестериновые комплексы видны в форме ниш размером 25—30 нм в плазматических мембранах фолликулярных клеток мышей, клетках поджелудочной железы, однако в мембранах гладкого эндоплазматичес-кого ретикулума, в ядре и в аппарате Гольджи

Химическое название

Классификационное название и номер 48O-49-9

Химическая формула Молекулярная масса

[3R-[3R*(R*),4S*,6S*,8S*,10R*,12R*,14R*,16S*,17E,19E,21E,23E,25E, 27S*,28R*]]-4,6,8,10,12,14,16,27-Oкmaгuдpoкcu-3-(1-гuдpoкcuлгeкcuл)-17,28-дuмemuлoкc aцuклooкmoзa-17,19,21,23,25-neнmaeн2-oдuн Оксациклооктозан; 14-Деоксилагозин;

15-Деоксилагозин; Филимарисин C35H58O11

б54,83

лить изредка обнаруживаются филипин-стери-новые комплексы [12, 17]. Филипин связывается с некоторыми компонентами сыворотки питательной среды и при низких концентрациях слабо замедляет рост клеток. Более высокая концентрация филипина подавляет рост клеток в случае добавления сыворотки в среду, если она до этого там отсутствовала. Степень подавления роста зависит от времени инкубации филипина. Культуры клеток при высокой концентрации антибиотика показали, что видимые изменения подавления роста связаны с образованием фи-липинорезистентной популяции клеток. Было также отмечено, что клетки, которые изначально быстро разрушались филипином и дигитони-ном, после инкубации в питательной среде без стеринов при температуре от 25° до 37°C в течение нескольких часов, теряли чувствительность к действию этих веществ. Такой эффект позволяет сохранять клетки при 2°C. Результаты показали, что в резистентных клетках Mycoplasma laid-lawii мембранные стерины менее чувствительны к действию филипина [4]. Согласно данным, полученным с помощью атомно-силового микроскопа, филипин способствует образованию кластеров в плоских фосфолипидных мембранах [22]. Филипин-стериновые комплексы были обнаружены в самых разнообразных клеточных структурах: в плазматических мембранах клеток гладких мышц [23], плазматических мембранах трипаносомы — представителя патогенных одноклеточных организмов [19], в синаптических мембранах фоторецепторов [15]. Исследована чувствительность филипина к растительным стеринам. Так, например, взаимодействие филипина с отдельными растительными стеринами или их комплексом (стигмастерин, ситостерин, кам-постерин и 24-метилполлистенол), включёнными в большие униламеллярные везикулы соевых бобов, было исследовано методами кругового дихроизма. Методом кругового дихроизма показано наличие филипин-стериновых комплексов в случае, когда везикулы содержали стигмастерин, ситостерин и/или кампостерин, которые находились в среде с низким содержанием филипина (молярное соотношение филипин/стерин меньше 1) [24].

Для проверки стериновой гипотезы все 4 компонента филипина тестировали на липосомаль-ных мембранах. Филипин III разрушает липосо-мы с холестерином. Филипин II разрушает липосомы независимо от содержания или отсутствия в них холестерина. Филипин I и филипин

IV не обладают повреждающим действием на искусственные мембраны. Фосфолипиды (сфинго-миелин > кардиолипин >> фосфатидилэтанола-мин) также взаимодействуют с компонентами филипинового комплекса [25].

В отношении локализации в мембранах фи-липин-холестериновых комплексов рассмотрены две модели: одна предполагает параллельное, а другая — расположение филипина по отношению к плоскости мембраны. Методы кругового дихроизма, флюоресцентной анизотропии и др. позволяют изучить ориентацию филипина в модельных мембранах, в состав которых входит 1-пальмитойл-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфохо-лин (ПОФХ) и 1,2-дипальмитойл-сн-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ) с холестерином и без холестерина. Ориентацию филипина при добавлении или без холестерина определяли на модельных мембранах в гель-кристаллической фазе. В случае, когда содержание холестерина в ДПФХ-бис-лоях составляет 33%, филипин располагался перпендикулярно поверхности мембраны. При отсутствии холестерина филипин равномерно распределялся в липидном матриксе. В жидкокристаллической фазе в бислоях из ПОФХ филипин располагался перпендикулярно поверхности мембраны, в составе которой отсутствовал холестерин [26, 27].

Обработка мембраны метил-в-циклодекстри-ном и добавление филипина позволили изучить роль холестерина в ориентации антигена на поверхности мембраны личинки плоских червей Schistosome mansoni и S.haematobium [28].

Филипин-холестериновые комплексы были обнаружены в плазматических мембранах астро-цитомы кошки в нормальном и ишемическом состоянии. При этом в образцах астроглиальной плазмолеммы, обработанных филипином, спустя 1 час после церебральной ишемии, наблюдалось снижение уровня холестерина на 80% [29, 30]. Таким образом, наличие стерина в клеточной мембране является необходимым условием для проявления активности филипина.

Определение одержания xoAecmepurn в 6uoao-гических и бucлoйныx мембранах мemoдoм флyo-ресценции. Филипин может быть использован для обнаружения стеринов в мембранах растительных клеток. В отличие от амфотерицина В, филипин, так же как и нистатин, не подавляет активность фотосистемы I в хлоропластах маиса. Чувствительность субклеточных органоидов к филипину может зависеть от стеринового состава мембран. Взаимодействие филипина со стеринами зависит от функциональной группы в Соположении и алифатической цепочки стеринов [31]. Флуоресцентным методом можно определить специфичность взаимодействия филипина с холестерином и получить существенную информацию о структуре филипин-холестерино-вых комплексов в мембране [32, 33]. Было показано, что, в отличие от нистатина и амфотерицина В, филипин дает сильную флуоресценцию с максимумом при 480 нм, положе-

ние которого не зависит от полярности среды [34]. Интенсивность флуоресценции филипина увеличивается с уменьшением полярности среды, но при этом максимум спектра не сдвигается. В исследованиях, проведённых Б. 8сЬгоеёег с со-авт. [32], введение холестерина в водный раствор филипина приводит к уменьшению квантового выхода флуоресценции на 25%. При этом происходит специфическое связывание молекул филипина с холестерином в стехиометрическом соотношении 1:1. Однако при наличии другого ПА пимарицина после введения холестерина наблюдается увеличение квантового выхода почти в 80 раз. Такое изменение интенсивности флуоресценции в ответ на введение холестерина может быть связано с различной физической природой взаимодействия ПА с холестерином. Под действием филипина изменение интенсивности флуоресценции наблюдается также и в том случае, если в среде присутствуют липосомы, полученные из лецитина и липидных фрагментов саркоплаз-матического ретикулума, в составе которых находится холестерин. Удаление холестерина приводило к значительному уменьшению величины максимума флуоресценции [35]. Детально было изучено тушение флуоресценции филипина, индуцированного нитроксид-замещёнными жирными кислотами и производными холестерина в липосомах, приготовленных из дипалмитоилфо-сфатидилхолина. При взаимодействии с липосо-мами филипин в основном локализуется в гидрофобной части мембран. При 3% молярной концентрации филипина он находится в водной среде преимущественно в агрегатном состоянии и в таком состоянии он взаимодействует с липо-сомальным холестерином в стехиометрическом соотношении 1:1 [34].

Гемолитическое действие филипина. Эритроциты млекопитающих представляют собой классическую модель для изучения биологического действия мембранотропных соединений, поскольку метаболические процессы, протекающие в них, очень слабы, а свойства мембран хорошо изучены. Эффективность действия ПА зависит от температуры, времени инкубации и вида эритроцитов, состава среды и других условий эксперимента. Гемолитический эффект 20 ПА изучен на мышиных эритроцитах, где было показано, что самым активным из них был филипин, который превышал по этому показателю эт-рускомицин, кандицидин и аэрофунгин [36]. Филипин обладает сильным гемолитическим действием на эритроциты человека и свиньи, и менее зависим от состава и свойств эритроцитар-ной мембраны [37]. Однако степень гемолиза эритроцитов при добавлении амфотерицина В и нистатина находится в сильной зависимости от вида эритроцитарной мембраны млекопитаю-

щих [37]. Гемолитическое действие филипина можно снять ионами кальция, анионами фосфата, но не сульфата [37]. Состав среды инкубации оказывает существенное действие на скорость гемолиза эритроцитов, индуцированного поли-енами. Было показано, что кинетическая кривая гемолиза эритроцитов сдвигалась в сторону больших концентраций амфотерицина В, филипина, этрускомицина и других ПА [38]. Индуцированный полиенами гемолиз эритроцитов полностью снимался с возрастанием молекулярного веса неэлектролитов и полностью подавлялся высокомолекулярными декстранами. Полученные результаты показывают, что неэлектролиты с небольшим молекулярным весом способны проникать в клетки через ПА-индуцированные водные поры. Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными на БЛМ [39, 40]. Лити-ческое действие амфотерицина В и нистатина на протопласты грибов и эритроциты млекопитающих подавляется в растворе изотонической сахарозы, но однако при этих же условиях и при очень низких концентрациях не удается подавить литическое действие филипина [41]. Объяснение этого явления состоит в том, что нистатин и амфотерицин В образуют в мембранах «поры», через которые слабо проникают молекулы сахарозы, тогда как филипин сильнее повреждает мембрану и, тем самым, образует большие по размеру «поры», через которые способны проникать молекулы сахарозы. Эти результаты подтверждают данные, полученные методом негативного контрастирования, которые показали, что филипин образует в мембране водные поры размером 80—100 А, в то время как нистатин, амфотерицин В и пимарицин создают в мембранах водные поры сравнительно меньших размеров. На электронно-микроскопических картинах мембран, обработанных филипином, эритроцитов крысы и человека, показаны многочисленные «ниши», которые могут быть причиной лизиса этих клеток [41]. «Ниши» в мембранах представлены в виде темных пятен в диаметре от 80 до 150 А, окружённых светлым кольцом. Образование «ниш» происходит только при наличии холестерина в мембранах. При изучении электронно-микроскопических картин мембран липосом, содержащих холестерин, обработанных филипином и другими ПА, можно было видеть изменение их ультраструктуры. Этот метод основан на изучении поверхности скола быстро замороженных суспензий мембран. При этом в плоскости скола могут оказаться как гидрофобные, так и гидрофильные области мембран, недоступные для прямого наблюдения любым другим электронно-микроскопическим методом. С помощью метода замораживания-скалывания А. Г Уегкіеі) и соавт. [42] показали, что филипин вызывает образова-

ние агрегатов диаметром 150—250 А в мембранах эритроцитов крыс, холестеринсодержащих мембранах клеток Acholeplasma laidlawii и в липосо-мах, полученных из яичного лецитина с холестерином. Не наблюдалось изменений на сколотой поверхности при отсутствии холестерина.

Изучена гемолитическая активность 4 компонентов филипина и получен следующий ряд активности: филипин II > филипин III >> филипин I > филипин IV, что соответствует их биологической активности. Сравнительный анализ действия ам-фотерицина В, нистатина и филипина на гемолитическую активность эритроцитов человека и свиньи показал, что механизм филипин-индуцированного гемолиза не отличается от других ПА [37].

Иccлeдoванue механизма дей^вия филипина на БЛМ. Возможность использования БЛМ для изучения механизма действия полиенов была впервые показана H. van Zutphen и соавт. [43]. Филипин в концентрации 4 • 10-5 М уменьшал время жизни (устойчивость) мембран, содержащих эк-вимолярное количество лецитина и холестерина, до 5 мин, хотя не влиял на время жизни мембран, лишённых холестерина (б0 мин) [43]. Было высказано предположение о том, что взаимодействие филипина с холестерином приводит не к порообразованию, а к разрыву клеточных мембран [44]. Стехиометрия взаимодействия филипина с холестерином и образование комплекса фили-пин-холестерин такова, что на одну молекулу филипина приходится одна молекула холестерина. Согласно данному предположению, холестерин гидрофобно взаимодействует с системой двойных связей молекулы филипина внутри бислоя. Возможны два способа ориентации комплекса филипин-холестерин в мембране. Согласно первому способу, гидроксильные группы филипина могут располагаться на мембрановодной поверхности, а система двойных связей молекулы филипина, взаимодействуя с холестерином, располагаться параллельно плоскости бислоя. Согласно второму способу, комплекс филипин-холестерин может располагаться перпендикулярно к поверхности бислоя [44]. При этом гидрофильная сторона молекулы филипина оказывается в гидрофобной части мембраны и взаимодействует с гидрофильной стороной второго комплекса, образуя регулярный ряд комплексов филипин-хо-лестерин. Отсутствие заряженных групп в молекуле филипина дает возможность латеральному перемещению всех комплексов внутри мембраны [44], что является причиной разрыва мембран. Однако при детальном исследовании этого антибиотика удалось показать, что мембраны, обработанные филипином, остаются достаточно стабильными примерно в течение 2 часов при значении мембранного потенциала 200 мВ [45]. При концентрации филипина 2 • 10-<s М с обеих

Рис. 2. Кинетика проводимости липидных мембран при добавлении филипина в концентрации 1*10-6 М.

Состав мембраны - фосфолипид: холестерин 2:1 в весовом соотношении. 2М КСІ, рН 7,0, t = 22°С. Потенциал на мембране 200 мВ [45].

сторон мембраны он увеличивает проводимость мембран на много порядков [45, 46]. Филипин не увеличивает проводимость мембран при введении его в концентрации 4М0-5 М с одной стороны мембраны. Нарастание проводимости мембран сопровождается суперпозицией дискретных уровней проводимости [46].

Исследована кинетика проводимости и избирательная проницаемость мембран при добавлении пентаенового антибиотика филипина. Для филипина выявлена монотонная кинетика увеличения проводимости мембран с выходом на стационарный уровень проводимости без последующей её инактивации [45]. На рис. 2 показана типичная кинетика нарастания проводимости мембран, модифицированной филипином. Увеличение проводимости зависит от типа ионов в растворе и не зависит от величины мембранного потенциала. Возрастание тока мембраны сопровождается последовательными скачкообразными изменениями проводимости. Наблюдалось также нарастание проводимости при добавлении филипина по одну сторону мембраны, а по другую сторону — нистатина А1 или амфотерицина В.

При малых концентрациях филипина в водном солевом растворе (1М0-8 М) на мембранах с холестерином были обнаружены одиночные ионные каналы с проводимостью 15-20 пСм, что примерно в 3—4 раза превышает проводимость амфотерициновых каналов. Экспериментальная запись одиночных филипиновых каналов приведена на рис. 3 [45]. Из рис. 3 видно, что филипи-новые каналы, как и амфотерициновые, имеют два основных состояния: проводящее и непрово-

Рис. 3. Одиночные филипиновые каналы в фосфо-липидных мембранах.

Состав мембраны - фосфолипид:холестерин 20:1 в весовом соотношении. 2М КС1, рН 7,0, 1=22°С. Потенциал на мембране 200 мВ. Концентрация филипина -2*10-8 М [45].

дящее. За время жизни канала в мембране видны редкие кратковременные переходы из проводящего в непроводящее состояние. При дальнейшем исследовании филипина оказалось, что если с одной стороны мембраны добавить филипин, а по другую сторону амфотерицин В или нистатин в одинаковых для всех антибиотиков концентрациях (1Ч0-6 М), то наблюдается взаимодействие между антибиотиками и увеличение интегральной проводимости мембран. Резко уменьшив концентрацию антибиотиков, удалось экспериментально обнаружить работу комбинированных каналов, запись которой показана на рис. 4. Проводимость комбинированных каналов филипина и амфотерицина В составляет 25—30 пСм, что в 1,5—2 раза выше «чистых» филипиновых каналов и, примерно, в 5 раз выше «чистых» амфотерициновых каналов. Избирательная проницаемость филипиновых каналов преимущественно катионная. В ответ на создание 10-кратного градиента КС1 на мембране наблюдается разность потенциалов величиной + 18±2 мВ. При наличии филипина не наблюдается реверсии мембранного потенциала. Значения потенциала на градиент проникающего иона при различных ПА показаны в табл. 2, где отражены стационарные значения мембранного потенциала.

Рис. 4. Комбинированные каналы, образованные в липидных мембранах при одинаковых концентрациях филипина и амфотерицина В (2*10-8 М), введенные по разные стороны мембраны.

Состав мембраны - фосфолипид:холестерин 20:1 в весовом соотношении.2М КС1, рН 7,0, 1=22°С. Потенциал на мембране 200 мВ. Концентрация филипина - 2*10-8 М [45].

Генетико-цитологическое исследование филипина. Изучено действие филипина на сукцинат-цитохром С-редуктазу (фермент, содержащий остатки янтарной кислоты) митохондрий печени крыс и грибов Ыеигозрога. Показано, что и в данном случае присутствие стерина является необходимым условием для связывания ПА с клеточными мембранами. Митохондрии ШигоБрога, содержащие эргостерин, хотя и в меньшем количестве, чем микросомальные фракции мембран митохондрий печени крыс, оказались чувствительны к филипину. Состав липидов в мембранах митохондрий может быть важнейшим фактором для проявления филипиновой чувствительности [47]. ПА влияют на активность связанных с мембраной ферментов. Так, при концентрации филипина выше 0,2 мМ на 1 мг белка, наблюдается ингибирование АТФ-азной активности [48]. Ингибирование активности мембранных ферментов вызвано либо нарушением связи между холестерином и фосфолипидом, либо нарушением ассоциации фермента с мембранными липидами [48]. Показано, что филипин активирует латентную К+-АТФ-азу [49, 50]. Обогащенные №+/К+-АТФ-азой микросомы солевых желез уток, выдерживаемых на высокосолевой диете, в основном ориентированы так, что субстрат недоступен активному центру фермента и основная часть К+-

Таблица 5. Значение мембранного потенциала на градиент проникающего иона (100:10 мМ КСІ) при добавлении различных ПА [45]

Антибиотик Концентрация, М Фосфолипид: холестерин (по весу) Избирательность, мВ

Ауренин 10-5 2:1 -17±1

Флавумицин А 2Ч0-5 2:1 -35±2

Флавумицин В 3-10-5 2:1 -35±2

Ганибаллицин-ЛИА-0323 2Ч0-7 2:1 +24±2

Пимарицин 2Ч0-6 2:1 -40±2

Фунгихромин 2Ч0-7 2:1 -24±2

Перимицин 1,5Ч0-6 2:1 +48±2

Нистатин А1 2Ч0-5 2:1 -31±2

Нистатин А2 1,5Ч0-5 2:1 -12±1

Нистатин А3 2Ч0-5 2:1 -12±1

Нистатин В 2Ч0-5 2:1 -47±3

Филипин 2Ч0-5 2:1 + 18±2

О

АТФ-азы является латентной. Исследования показали, что при соотношении филипин/холесте-рин > 2 в микросомальных фракциях происходит активация латентной Ма+/К+-АТФ-азы. Процесс активации сопровождается увеличением мембранной проницаемости без разрушения структуры везикулярной мембраны. Увеличение концентрации филипина в холестерин-содержа-щих липидных везикулах (соотношение фили-пин/холестерин=10) приводит к увеличению количества филипин-холестериновых комплексов и к активному латеральному смещению комплексов, что в итоге приводит к равномерному перераспределению их в мембране. При соотношении филипин/холестерин > 2 в зависимости от температуры происходит ингибирование №+/К+-АТФ-азы [50]. Из одноклеточного организма инфузории-туфельки были выделены 4 мутанта, резистентных к амфотерицину В, и 2 мутанта, резистентных к филипину [51]. Мутантные клетки китайского хомячка, лишенные гена болезни Не-емана-Пика — гена МРС1, отличаются, по-видимому, малым содержанием или полным отсутствием холестерина в плазматических мембранах [52]. Вероятно, в клетках, содержащих холестерин, филипин образует комплексы со стерином, которые локализуются в больших количествах во внутриклеточных пулах [52].

Действие филипина на вирусные инфекции и на болезни, вызываемые прионовыми белками. Исследовано взаимодействие филипина с мембранным холестерином вируса везикулярного стоматита, вируса гриппа и вируса лейкемии Раушера [53]. Филипин, в отличие от амфотери-цина В, обладает характерным действием на оболочку вирионов вируса везикулярного стоматита. Морфологические изменения, вызванные филипином, на вирионах гриппа и лейкемии Раушера отличаются от вирионов везикулярного стоматита. Инфекционность вирионов везикулярного стоматита после обработки филипином уменьшается в 500 раз, тогда как вирионы гриппа оказываются очень устойчивыми к действию филипина. После внедрения филипина в вирионы ни белки, ни липиды не высвобождаются из вириона. В клеточных мембранах асцитной карциномы Эрлиха после обработки филипином при 4°С были обнаружены филипин-стериновые комплексы в виде кластеров, которые неравномерно распределены в мембране. Однако эти комплексы равномерно распределены в клеточных мембранах асцитной карциномы Эрлиха при 28°С. Отсюда следует, что при низкой температуре происходит агрегация молекул и неравномерное распределение филипин-стериновых комплексов в плазматической мембране. Комплексы заметны в большом количестве только в наружной (цитоплаз-

матической), но не во внутренней (нуклеоплаз-матической), мембране ядерной оболочки [53].

В последние годы появляется все больше работ, касающихся лечения трансмиссивных при-оновых инфекций или, иначе, трансмиссивной губчатой энцефалопатии. Нормальный прионо-вый белок (РгР-8еп), связанный с мембранами, превращается в патологическую изомерную форму (РгР-ге8), что вызывает заболевание под названием трансмиссивной губчатой энцефалопатии. Образование ПА-филипинового комплекса ограничивает процесс эндоцитоза нормального при-онового белка (РгР-8еп) и одновременно уменьшает количество этого белка в мембранах, что показано на культуре клеток нейробластомы. При прионовых инфекциях филипин может служить потенциальным ингибитором образования патологического белка РгР-ге8 в инфицированных клетках нейробластомы [54].

Обсуждение

Использование ПА в практической медицине как противогрибковых антибиотиков основывается на изучении молекулярно-биологических свойств этих антибиотиков в клеточных и бислойных мембранах. ПА, являясь мембраноактивными соединениями, увеличивают ионную проводимость мембран, однако вопрос о механизме биологической активности многих полиенов остается до конца нерешенным.

Среди полиенов особый интерес представляет нейтральный антибиотик филипин, который в малых концентрациях увеличивает проводимость клеточных и бислойных мембран. В основе механизма действия филипина лежит взаимодействие со стеринами, локализованными в цитоплазматических мембранах клеток и БЛМ, которое приводит к образованию в них каналов молекулярных размеров, проницаемые для ионов и органических соединений. Для филипина выявлена монотонная кинетика увеличения проводимости мембран с выходом на стационарный уровень проводимости без последующей ее инактивации. Филипин-стериновые комплексы были обнаружены в плазматических мембранах различных клеток. Исследования, проведённые на липидных мембранах, показали, что проводимость одиночных филипиновых ионных каналов составляет 15—20 пСм, а комбинированных каналов (филипин-амфотерицин В) 25—30 пСм. Избирательная проницаемость филипиновых каналов преимущественно катионная и величина мембранного потенциала на десятикратный градиент проникающего иона составляет +18 мВ.

Показано, что механизм филипин-индуциро-ванного гемолиза эритроцитов не отличается от других ПА.

Генетико-цитологические исследования выявили резистентность генетических мутантов по отношению к амфотерицину В и филипину. Показано, что филипин втрое активирует латентную К+-АТФ-азу.

Филипин, в отличие от амфотерицина В, обладает характерным действием на оболочку вири-онов везикулярного стоматита. Филипин может служить потенциальным ингибитором образования патологического белка при хронически инфицированных клетках нейробластомы в случае транмиссивных прионовых инфекций.

Заключение

Анализируя вышеизложенные данные, можно сформулировать определенные концепции от-

носительно механизма действия полиенового антибиотика филипина:

— филипин является мембраноактивным соединением, индуцирующим ионную проводимость клеточных и бимолекулярных мембран, содержащих стерины;

— обнаружены одиночные ионные каналы филипина в бислойных липидных мембранах с проводимостью 15—20 пСм, а также комбинированные ионные каналы филипина и амфотерицина В с проводимостью 25—30 пСм;

— выявлена резистентность мутантных клеток к филипину.

ЛИТЕРАТУРА

1. Zotchev S. B. Polyene macrolide antibiotics and their applications in human therapy. Curr Med Chem 2003; 10: 211—223.

2. Ibragimova V, Alieva I., Kasumov Kh., Khutorsky V. Transient permeability induced by alkyl derivatives of amphotericin B in lipid membranes. Biochim Biophys Acta 2006; 1758: 29—37.

3. Whitfield G. B, Brock T. D., Ammann A. et al. Filipin, an antifungal antibiotic: isolation and properties. J Am Chem Soc 1955; 77: 4799—4801.

4. Weber M. M, Kinsky S. C. Effect of cholesterol on the sensitivity of Mycoplasma laidlawii to the polyene antibiotic filipin. J Bacteriol 1965; 89: 306—312.

5. Ceder O, Ryhage R. The structure of filipin. Acta Chem Scand 1964; 18: 558—561.

6. Lampen J. O, Gill J. W., Arnow P. M., Magana-Plaza L. Inhibition of the pleuropneumonia-like organism Mycoplasma gallisepticum by certain polyene antifungal antibiotics. J Bacteriol. 1963; 86: 945—949.

7. De Kruyff B., Demel R., Van Deenen L. L. M. The effect of cholesterol and epicholesterol incorporation on the permeability and on the phase transition of intact Acholeplasma laidlawii cell membranes and derived liposomes. Biochim Biophys Acta 1972; 255: 331—347.

8. Kinsky S. C., Luse S. A., Zopf D. et al. Interaction of filipin and derivatives with erythrocyte membranes and lipid dispersion: electron microscope observations. Biochim Biophys Acta 1967; 135: 844—861.

9. Van Marle J., Vrensen G. F. J. M. Cholesterol content of focal opacities and multimellar bodies in the human lens: filipin cytochemistry and freeze fracture. Ophthalmic Research 2000; 32: 285—291.

10. Loura L. M, Cactanho M. A. R. B., Fedorov A., Prieto M. A photophysical study of the polyene antibiotic filipin self-aggregation and filipin-ergosterol interaction. Biochim Biophys Acta 2001; 1510: 125—135.

11. Pimenta P. F., De Souza W. Localization of filipin-sterol complexes in cell membranes of eosinophils. Histochemistry 1984; 80: 563—567.

12. Fujita H., Ishimura K., Matsuda H. Freeze-fracture images on filipin-sterol complexes in the thyroid follicle epithelial cell of mice with special regard to absence of cholesterol at the site of micropinocytosis. Ibid 1981; 73: 57-63.

13. Stephens R. E, Good M. J. Filipin-sterol complexes in molluscan gill ciliated epithelial cell membranes: intercalation into ciliary necklaces and induction of gap junctional particle arrays. Cell Tissue Res 1990;

262: 301—306.

14. Kim J., Okada Y. Asymmetric distribution and temperature-dependent clustering of filipin-sterol complexes in the nuclear membrane of Ehrlich ascites tumor cells. Eur J Cell Biol 1983; 29: 244—252.

15. Cooper N. G., McLaughlin B. J. The distribution of filipin-sterol complexes in photoreceptor synaptic membranes. J Comp Neurol 1984; 230: 437—443.

16. Berdan R. C., Shivers R. R. Filipin-cholesterol complexes in plasma membranes and cell junctions of Tenebrio molitor epidermis. Tissue Cell 1985; 17: 177—187.

17. Orci L., Montesano R., Meda P. et al. Heterogeneous distribution of fil-ipin-cholesterol complexes across the cisternae of the Golgi apparatus. Proc Nat Acad Sci 1981; 78: 293-297.

18. Orci L., Brown D., Amherdt M., Perrelet A. Distribution of intramembrane particles and filipin-sterol complexes in plasma membranes of kidney. I. Corpuscle of Malpighi 1982; 46: 545—553.

19. Yoshikawa H., Furuki J., Takahashi Y. et al. Distribution of filipin-sterol complexes in the bloodstream form of Trypanosoma brucei gambiense. J Electron Microscopy 1992; 41: 364—368

20. Toshimori K., Higashi R., Oura C. Distribution of intramembranous particles and filipin-sterol complexes in mouse sperm membranes: polyene antibiotic filipin treatment. Am J Anat 1985; 174: 455—470.

21. Toshimori K., Higashi R., Oura C. Filipin-sterol complexes in golden hamster sperm membranes with special reference to epididymal maturation. Cell Tissue Res 1987; 250: 673—680.

22. Santos N.C., Ter-Ovanesyan E., Zasadzinski J. A. et al. Filipin-induced lesions in planar phospholipid bilayers imaged by atomic force microscopy. Biophys J 1998; 75: 1869—1873.

23. Montesano R. Inhomogeneous distribution of filipin-sterol complexes in smooth muscle cell plasma membrane. Nature 1979; 280: 328—329.

24. Milhaud J., Bolard J., Benveniste P., Hartmann M. A. Interaction of polyene antibiotic filipin with model and natural membranes containing plant sterols. Biochim Biophys Acta 1988; 161: 315—325.

25. Sessa G., Weissman G. Effects of four components of the polyene antibiotic filipin on phospholipid spheruls (liposomes) and erythrocytes. J Lipid Research 1968; 3: 67—70.

26. Lopes S., Goormaghtigh E., Costa C. et al. Filipin orientation revealed by linear dichroism. Implication for a model of action. J Amer Chem Society 2004; 126: 5396—5402.

27. Kitajima Y., Sekiya T., Mori S. et al. Freeze-fracture cytochemical study of membrane systems in human epidermis: using filipin as a probe for cholesterol. J Investigative Dermatology 1985; 84: 149—150.

28. Tallima H., Salah M., El-Ridi R. Methyl-/3-cyclodextrin treatment and filipin staining reveal the role of cholesterol in surface membrane antigen sequestration of Schistosoma mansoni and S.haematobium lung-stage larvae. J. Parasitology 2005; 91: 720—725.

29. Cuevas P., Gutierrez-Diaz J. A., Reimers D. et al. Intramembranous cytochemistry: a new morphological technique for studying cholesterol in the astrocyte plasma membrane of ischemic brain cells. J

Neurosurgery 1987, 20: 243—248.

30. Clejan S., Bittman R. Rates of amphotericin B and filipin association with sterols. A study of changes in sterol structure and phospholipid composition of vesicles. J Biol Chem 1985; 260: 2884—2889.

31. Kleinschmidt M. G., Chough K. S., Mudd J. B. Effect of filipin on liposomes prepared with different types of steroids. Plant Physiology 1972; 49: 852—856.

32. Schroeder F., Holland J. F., Bieber L. L. Reversible interconversions of sterol-binding and sterol-nonbinding forms of filipin as determinated by fluorometric and light-scattering properties. Biochemistry 1973; 12: 4785—4789.

33. Castanbo M., Prieto M. Fluorescence study of the macrolide pentaene 44.

antibiotic filipin in aqueous solution and in a model system of membranes. Eur J Biochem 1992; 207: 125—134.

34. Castanho M., Prieto M. Filipin fluorescence quenching by spin-labeled probes: studies in aqueous solution and in a membrane model system. 45. Biophysical J 1995; 69: 155—168.

35. Drabikowski W., Lagwinska E., Sarzala M. G. Filipin as a fluorescent 46. probe for the location of cholesterol in the membranes of fragmented sarcoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta 1972; 291: 61—70.

36. Kotler-Brajtburg J., Medoff G., Kobayashi G. et al. Classification of poly- 47.

ene antibiotics according to chemical sructure and biological effects. Antimicrob Agents Chemother 1979; 15: 716—722.

37. Knopik-Skrocka A., Klafaczycka A., Bielawski J. The effect of polyene 48.

antibiotic filipin on pig red blood cells. Cell Mol Biol Lett 2002; 7:

Suppl: 200.

38. Cyлтaнoвa Г. Г., Caмeдoвa А. А., Kacyмoв X. М. Гемолиз эритроци- 49.

тов при комбинированном действии ультразвуковых волн и поли-еновых антибиотиков. Aнтибиотики и химиотер 2007; 52: 9—13. 50

39. Kyрбатв О. Г., Kacyмoв X. М. Гептаеновый ароматический антибиотик леворин и его производные при мышечной деятельности.

Tам же 2004.; 49: 40—46.

40. Ибрaгuмoвa В. X., Алшва И. Н., KacyмoвX. М. Эффект леворина A2, 51.

вводимого с одной стороны липидных мембран. Биол мембраны

2006; 23: 493—502.

41. Kinsky S. C., Demel R. A., Van Deenen L. L. M. Further studies on the 52.

hemolytic action of filipin and derivatives. Biochim Biophys Acta 1967;

135: 835—843.

42. Verkleij A. J., De KruyffB, Gerritsen W. F. et al. Freeze-etch microscopy 53.

of erythrocytes, Acholeplasma laidlawii cells and liposomal membranes

after the action of filipin and amphotericin B. Biochim Biophys Acta 54

1973; 291: 577—581. .

43. Van Zutphen H., Van Deenen L. L. M., Kinsky S. C. The action of polyene antibiotics on bilayer lipid membranes. Biochem Biophys Res Comm 1969; 22: 393—398.

De Kruyff B., Demel R. Polyene antibiotic-sterol interactions in membranes of Acholeplasma laidlawii cells and lecithin liposomes. III. Molecular structure of the polyene-antibiotic-cholesterol complexes. Biochim Biophys Acta 1974; 339: 57—70.

Самедова А. А. Взаимосвязь структуры и функции полиеновых антибиотиков. Канд. дисс: Баку, 1991; 1—97.

Самедова А. А. Действие филипина и индивидуальных компонентов нистатина на проводимость бислойных липидных мембран. Ж. Известия АН Азербайджана, сер Биол науки 1984; 6: 118—121. Kinsky S. C., Gronau G. R., Weber M. M. Interaction of polyene antibiotics with subcellular membrane systems. I. Mitochondria. J Molecular Pharmacol 1965; 1: 190—201.

Соловьева Н. Н., Белоусова И. И., Терешин И. М. Действие полиеновых антибиотиков на активность щелочной фосфатазы мембранной фракции клеток Candida albicans. Биохимия 1977; 42: 277—282. GassnerD., Komnick H. Filipin activation of latent Na/K-ATF-ase. Eur J Cell Biol 1983; 2: 9.

Gassner D., Komnick H. Activation and inhibition of Na/K-ATPase by filipin-cholesterol complexation. A correlative biochemical and ultra-structural study on the microsomal and purified enzyme of the avian salt gland. Z.Naturforsch C. 1983: 38: 7—8: 640—643.

Forte M., Hennessey T., Kung C. Mutations resulting in resistance to polyene antibiotics decrease voltage-sensitive calcium channel activity in Paramecium. J. Neurogenet 1986; 3: 75—85.

Katsumi H., Haruaki N., Yuko S. et al. Isolation of NPC1-deficient chinese hamster ovary cell mutants by gene trap mutagenesis. J Biochem 2001: 129: 875—880.

Janas T., Janas T., Yarus M. Specific RNA binding to ordered phospholipid bilayers. Nucleic Acids Research 2006; 34: 2198—2136. Marella M., Lehman S., Grassi J., Chabry J. Filipin prevents pathological prion protein accumulation by reducing endocytosis and inducing cellular PrP release. British Medical Bulletin 2003; 66: 281—292.

-Q-