Идентификация возбудителей бронхолегочных заболеваний у детей методом полимеразной цепной реакции

нормотермия и в 1,5 раза субфебрильная температура. В 5 раз чаще при микоплазменных пневмониях вне вспышки регистрировали ринит (табл. 5). В остальных случаях клиника была сходной и различия носили недостоверный характер (наличие субфебрилитета, сухого, приступообразного кашля, слабости, недомогания было характерно для обеих групп).

Заключение

Для пневмоний микоплазменной этиологии характерна преимущественная заболеваемость детей школьного возраста, более легкое течение на фоне длительного малопродуктивного кашля, неэффективность лечения антибиотиками группы пенициллина. Лабораторно признаки активности воспалительного процесса выявлены значительно реже, чем при типичных бактериальных пневмониях. Рентгенологически инфильтрация при микоплазменной пневмонии имеет очаговый характер и в большинстве случаев на контрольной рентгенограмме имеет быстрое обратное развитие. Особенностью является длительное сохра-

нение реакции со стороны корня легкого. Микоплаз-менные пневмонии, наблюдаемые во время вспышки, имеют более выраженную клиническую картину, чем во вневспышечный период; чаще протекают с фебрильной температурой на фоне малопродуктивного сильного кашля и фарингита.

Литература

1. О состоянии здоровья детей в Российской Федерации: Доклад Минздрава РФ. М., 2003. 96 с.

2. Смертность населения Российской Федерации за 2002 г.: Доклад Минздрава РФ. М.: 2003. 188 с.

3. Вишнякова Л.А., Никитина М.А., Петрова С.И. и др. // Пульмонология. 2005. №3. С. 43-47.

4. Лыкова Е. А., Бокова А.Г., Бондаренко В.М. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 2000. №9. С. 13-19.

5. Самсыгина Г.А., Охлопкова К.А., Суслова

О.В. // Антибиотики и химиотерапия. 2000. №11. С. 29-30.

6. Таточенко В.К. //Лечащий врач. 2002. №10. С. 56-60.

УДК 616.24 - 002.153.2

М.А. Власова, О.И. Морозова, О.В. Островская, Е.С. Шульгина,

Н.В. Морозова, М.В. Козлов

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ДЕТЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; Дальневосточный государственный медицинский университет, г. Хабаровск

Среди этиологических агентов бронхолегочных заболеваний у детей наиболее часто встречаются пневмококк — Streptococcus pneumoniae, гемофиль-ная палочка — Haemophilus influenzae, грамотрица-тельный диплококк — Moraxella catarrhalis, стафилококки — Staphylococcus aureus и др. Наиболее существенная роль, по мнению большинства исследователей, отводится пневмококку, частота выявления которого колеблется от 45,0 до 75,0% в различных воз-/жстных группах [1, 4, 5]. Этиологический спектр пневмотропных возбудителей в последнее время меняется, возрастает роль атипичных возбудителей, та-

ких как Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae [2, 3].

Достоверным для этиологической диагностики считается высев возбудителя из внутренних сред и полостей организма: кровь при бактериемии, плевральный экссудат, пунктат легкого [4]. Эти травматичные методы применяются редко.

Целью исследования было оценить методом ПЦР частоту выявления различных пневмотропных возбудителей в мазках из ротоглотки, в мокроте и бронхоальвеолярном лаваже при наиболее часто встречающихся бронхолегочных заболеваниях у детей.

Материалы и методы

Обследовано 170 детей с бронхолегочными заболеваниями в возрасте с 2 до 14 лет. Контрольную группу составили 94 здоровых ребенка из детских садов и школ г. Хабаровска такого же возраста.

Методом ПЦР исследованы мазки из ротоглотки, мокрота и бронхоальвеолярные лаважи. Для выявления фрагмента генома пневмотропных возбудителей использовали диагностические наборы НПФ “Литех”, ООО “Изоген” (Москва). В каждом клиническом образце определяли наличие ДНК S. pneumoniae, Н. influenzae, М. catarrhalis, М. pneumoniae, Chi. pneumoniae, S. agalactiae, E. faecium, E. faecalis. Учет результатов осуществляли методом электрофореза в 2,0% агарозном геле с регистрацией и документированием видеосистемой ”Gel-Imager” (“Петротерм”, Россия).

Результаты исследования

Для оценки информативности и значимости исследования слизистой ротоглотки методом ПЦР проведено обследование задней стенки глотки с учетом возраста у 94 здоровых детей. Выявлена высокая обсемененность слизистой у здоровых детей S. pneumoniae (92,6±2,7%),

Н. influenzae (70,2+4,7%), средняя — М. catarrhalis (38,3±5,0%) и низкая — М. pneumoniae (2,1±1,5%), S. agalactiae (3,2±1,8%), Е. faecium (1,06±1,06%). Chi. pneumoniae и Е. faecalis в ротоглотке здоровых детей не выявлены. М. pneumoniae обнаружена в 2 случаях в груп-

Таблица 1

Результаты обследования методом ПЦР детей группы контроля в зависимости от возраста

Примечания. * — S.pn — Streptococcus pneumoniae; H.in — Haemophilias influenzae; C.pn — Chlamydophila pneumoniae; M.pn — Mycoplasma pneumoniae; M.ca — Moraxella catarrhalis; S.ag — Streptococcus agalactiae; E.fam — Enterococcus faecium; E.fal — f'n! pmcoccus faecalis.

Резюме

Методом полимеразной цепной реакции определяли инфицированность пневмотропными возбудителями ротоглотки, мокроты и бронхоальвеолярных смывов у 170 детей с бронхолегочными заболеваниями и 94 здоровых детей в возрасте от 2 до 12 лет. Показана высокая обсемененность зева здоровых детей S.pneumoniae (92,6%),

H.influenzae (70,2%), низкая — М.pneumoniae (2,1%). У здоровых детей в зеве не были выявлены Chi.pneumoniae и Enterococcus. При бронхолегочных заболеваниях частота обнаружения S.pneumoniae и H.influenzae в зеве снижалась до 61,8-76,4%, выявление М.pneumoniae увеличивалось до 22,2%, в мокроте и бронхоальвеолярных смывах индикация S.pneumoniae, H.influenzae, М.pneumoniae, Chi.pneumoniae составила 40,0; 28,8; 17,0;

I,8% соответственно.

М.A. Vlasova, O.I. Morozova, O.V. Ostrovskaya,

E.S. Shulgina, N.V. Morozova, M.V. Kozlov

BRONCHI-PULMONARY DISORDERS MICROBE

AGENTS IDENTIFICATION IN CHILDREN BY POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD

Khabarovsk affiliate of the Far-Eastern research center of respiratory pathology and physiology, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences - Mother and child care institute, Far-Eastern state medical university.

Summary

By polymerase chain reaction method ,170 children with bronchi-pulmonary disorders and 94 healthy children aged 2-12 years were examined. Pneumotropic agents were detected in the throat, phlegm and bronchi-alveolar lavage fluid. High levels of pharynx infection contamination in healthy children revealed S.pneumoniae (92,6%), H.influenzae (70,2%), M.pneumoniae (2,1%). Chi.pneumoniae and Enterococcus were not revealed in healthy children. In the group of patients with bronchi-pulmonary disorders the frequency of S.pneumoniae and H.influenzae detection decreased to 76, 4-61, 8%. M.pneuminiae detection increased up to 22,2%. Identification of S.pneumoniae, H.influenzae, M.pneumoniae and Chi.pneumoniae in phlegm and bronchi-alveolar lavage fluid was 40,0; 28,8; 17,0 and 1,8% respectively.

пе детей до 3 лет, S. agalactiae — в 3 случаях и Е. faecium — в 1 случае у детей 4-5 лет, посещающих детский сад. Наиболее низкая колонизация ротоглотки была в группе здоровых детей 7-11 лет (табл. 1).

При сравнении результатов исследования ротоглотки методом ПЦР у здоровых и детей с воспалительными бронхолегочными заболеваниями оказалось, что инфицированность слизистой ротоглотки S. pneumoniae и Н. influenzae у заболевших достоверно ниже, чем у здоровых детей, а частота выявления М. pneumoniae выше (р<0,05) (табл. 2).

Полученные нами данные коррелируют с результатами изучения микрофлоры слизистой ротоглотки бактериологическими методами (Л.В. Колотилова и соавт., 1985). Выявление S. pneumoniae, Н. influenzae и М. catarrhalis в слизистой ротоглотки не может явиться доказательством их этиологической роли в связи с высокой степенью бактерионосительства.

Показатель исследований Возраст, лет

2-3, п-12 4-5, п-42 6-7, п=19 7-11, п=21 Всего, п=94

S.pn* абс. 12 39 19 17 87

°/ /о 100,0 92,8 100,0 80,9 92,6±2,7

H.in абс. 10 28 17 11 66

% 83,3 66,6 89,5 52,4 70,2±4,7

C.pn абс. 0 0 0 0 0

% 0 0 0 0 0+4,1

M.pn абс. 2 0 0 0 2

°/ /О 16,6 0 0 0 2,1±1,5

M.ca абс. 7 16 10 3 36

°/ /о 58,3 38,1 52,6 14,3 38,3±5,0

S.ag абс. 0 3 0 0 3

°/ /о 0 7,1 0 0 3,2±1,8

E.fam абс. 0 1 0 0 1

% 0 2,4 0 0 1,1±1,0

E.fal абс. 0 0 0 0 0

% 0 0 0 0 0+4,1

Таблица 2

Индикация пневмотропных возбудителей в ротоглотке у детей с бронхолегочными заболеваниями и здоровых

Возбудитель Бронхолегочные заболевания,* n=55 Здоровые дети, n“94 p 1 2 3

S.pneumoniae 76,36±5,73 92,55±2,70 <0,05

If.influenzae 61,81 ±6,55 70,21 ±4,72 <0,05

M.catarrhalis 38,18±6,55 38,29±5,01 >0,05

М. pneumoniae 27,27±6,00 2,13± 1,49 <0,001

S.agalactiae 3,64±2,53 3,19±1,81 >0,05

Chl.pneumoniae 0+6,78 0+4,08 >0,05

E.faecalis 0+6,78 0+4,08 >0,05

E.faecium 1,82+1,80 1,06+1,06 >0,05

Примечание.* — группу составили дети с различными бронхолегочными заболеваниями: бронхиальной астмой, рецидивирующим бронхитом, острой пневмонией, бронхолегочной дисплазией.

Частота выявления возбудителей воспалительных неспецифических заболеваний легких у детей от 1 года до 14 лет в лаваже и мокроте

Возбудитель Рецидиви- рующий бронхит, n=18 Острая пневмония, n=118 Бронхоле- гочная дисплазия, n=34 Всего, n-170

S.pneumoniae 12 66,7 + 11,4 40 33,9 ±04,4 16 47,1 ±8,6 68 40,0 ±3,7

H.influenzae 9 50,0 ±12,1 29 24,6 ±4,0 11 32,4 ±8,04 49 28,8 ±3,5

M.catarrhalis 3 16,7 +9,0 15 12,7 ±3,6 4 11,8 ±5,5 22 12,9 ±2,5

S.agalactiae 1 5,5 ±5,5 1 0,85 ±0,85 0 0 ±10,5 2 1,2 ±0,8

Enterococcus 0 0 ±7,1 0 0 +6,6 - - 0 0 ±5,2

Chl.pneumoniae 1 5,5 ±5,5 1 0,85 ±0,85 1 2,9 ±2,9 3 1,8 ±1,8

M.pneumoniae 0 0 + 18,2 27 22,9 ±3,9 2 5,9 ±4,0 29 17,0 ±1,6

Возможно, диагностическим и прогностическим показателем явится введение в медицинскую практику определение интенсивности обсеменения этими микроорганизмами ротоглотки с помощью количественного метода ПЦР, который в настоящее время широ-

ко не применяется из-за его высокой стоимости. В то же время, выявление в слизистой ротоглотки таких инфекционных агентов, как М. pneumoniae, Chi. pneumoniae, Е. faecalis, Е. Faecium, должно явиться

Таблица 4

Этиологическая структура воспалительных бронхолегочных заболеваний у детей по исследованиям лаважа и мокроты методом ПЦР

Возбудители Рецидивирующий бронхит, n-18 Острая пневмония, n-118 Бронхолегочная дисплазия, n-34

Моноинфекция

S.pneumoniae 3/ 16,7±9,0 16/ 13,55±3,2 10/ 29,4±7,8

Н. influenzae 3/ 16,7±9,0 10/ 8,5±2,6 3/ 8,8+4,8

M.catarrhalis 1/ 5,5±5,5 9/ 7,6±2,4 3/ 8,8+4,8

S.agalactiae 0/ 0±18,2 0/0±3,3 0/ 0±10,5

M.pneumoniae 0/ 0±18,2 17/ 14,4±3,2 0/ 0±10,5

Chl.pneumoniae 0/ 0±18,2 1/ 0,85±0,85 1/ 2,9±2,9

Всего 7/38,8± 11,9 53/ 44,9±4,6 17/ 50,0±8,6

Ассоциация возбудителей

M.pneumoniae ± S.pneumoniae 0/ 0± 18,2 3/ 2,5±1,4 0/ 0± 10,5

M.pneumoniae ± H. influenzae 0/ 0± 18,2 1/ 0,85±0,85 2/ 5,3+3,6

S.pneumoniae + H.influenzae 4/ 22,2+10,1 11/ 9,3±2,7 3/ 8,8+4,8

S.pneumoniae + M.catarrhalis 1/ 5,5±5,5 2/ 1,7± 1,2 1/ 2,9±2,9

Chl.pneumoniae + S.pneumoniae 1/ 5,5±5,5 0/ 0±3,3 0/ 0±10,5

ll.influenzae + M.catarrhalis 0/ 0±18,2 1/ 0,85±0,85 0/ 0±10,5

S.pneumoniae + S.agalactiae 1/ 5,5±5,5 0/ 0±3,3 0/ 0± 10,5

S.pneumoniae + ll.influenzae + M.catarrhalis 1/ 5,5±5,5 2/ 1,7± 1,2 2/ 5,3±3,6

M.pneumoniae + S.pneumoniae + H. influenzae 0/ 0+18,2 4/ 3,4±1,7 0/ 0±10,5

Chl.pneumoniae + M.pneumonie + S.pneumoniae 0/ 0± 18,2 1/ 0,85±0,85 0/ 0± 10,5

S.pneumoniae + S.agalactiae ± H.infiuenzae ± M.catarrhalis 0/ 0± 18,2 1/ 0,85±0,85 0/ 0± 10,5

Bcero 8/ 44,4±11,7 2В/ 22,0+3,8 8/ 44,4±11,7

Исследование мокроты детей с диагнозом “острая пневмония” методом ПЦР

Показатель исследования Период исследования

декабрь 2004, п=12 февраль 2005, п-19 март 2005, п=24

М.рп абс. 2 3 0

°/ /О 16,6 15,8 0

Str.pn абс. 10 13 2

°/ /о 83,3 68,4 8,3

H.inf абс. 4 8 5

% 33,3 42,1 20,8

М.cat абс. 0 0 10

% 0 0 41,6

Отрицат. рез-тат абс. 2 4 12

% 16,6 21,1 50,0

сигналом для целенаправленного клинического изучения и возможного подтверждения этиологической роли этих возбудителей.

Анализ результатов индикации ДНК-возбудите-лей бронхолегочных заболеваний в бронхоальвеолярных смывах и мокроте у детей с рецидивирующими бронхитами, острыми пневмониями и бронхолегочными дисплазиями показал, что чаще всего выявляли S. pneumoniae (40,0%), Н. influenzae (28,8%), М. catarrhalis (12,9%), соотношение частоты их выявления при бронхитах, острых пневмониях и бронхолегочных дисплазиях было одинаковым — 1 : 0,7 : 0,3 (табл. 3). Из атипичных возбудителей чаще всего выявляли М. pneumoniae (17,0%), причем при рецидивирующих бронхитах М. pneumoniae не определяли, при острых пневмониях в осенне-зимний период показатель индикации М. pneumoniae поднимался до 22,9%, при бронхолегочной дисплазии составил 5,9%. Такие возбудители, как S. agalactiae и Chi. pneumoniae, выявлялись очень редко: 1,2 и 1,8% соответственно. Энтерококки в бронхоальвеолярных смывах и мокроте не выявляли.

Только в 77 случаях из 170 (45,3%) определена моноинфекция (табл. 4). Ассоциативная флора установлена в 42 случаях (24,7%), наиболее часто определяли сочетание S. pneumoniae + Н. influenzae. У 51 ребенка (30,0%) при обследовании мокроты и лава-жа инфекционные агенты не были выявлены.

В целом при исследовании бронхоальвеолярных смывов и мокроты методом ПЦР при рецидивирующих бронхитах пневмотропные возбудители определены в 83,3±8,8%, при острых пневмониях — в 66,9±4,3%, при бронхолегочных дисплазиях — в 73,5±7,5% (различия между этими показателями оказались несущественны, р>0,05).

Установлено изменение спектра пневмотропных микроорганизмов у детей с острыми пневмониями в зависимости от сезона (табл. 5). Если в декабре-феврале 2005 г. в мокроте выявляли S .pneumoniae в 68,4 — 83,3% случаев, Н. influenzae в 33,3—42,1%, M.pneumoniaeB 15,8 — 16,6%, а М. catarrhalis не выявляли, то в марте частота определения S. pneumoniae, Н. influenzae, М. pneumoniae снизилась, но появилась М. catarrhalis — 41,6%, а в 50,0% случаев регистрирован отрицательный результат исследования. Таким образом, спектр пневмотропных возбудителей в весенний период поменялся. Такие возбудители, как Chi. pneumoniae, S. agalactiae, E. foecalis, E. faecium в мокроте выявлены не были.

Выводы

1. Применение метода ПЦР дает возможность более полно изучить спектр пневмотропных возбудителей при бронхолегочных заболеваниях у детей.

2. Учитывая полученные результаты, можно сделать вывод о диагностическом значении выявления М. pneumoniae, Chi. pneumoniae, S. agalactiae и других атипичных возбудителей в слизистой ротоглотки детей с воспалительными бронхолегочными заболеваниями методом ПЦР, о возможности применения этого метода как самого щадящего для обследования детей с целью выявления этиологической роли М. pneumoniae, Chi. pneumoniae, Streptococcus agalactiae, особенно в период подъема заболеваемости острыми пневмониями.

3. В осенне-зимний период в мокроте и бронхоальвеолярном лаваже у детей с бронхолегочными заболеваниями наиболее часто выявляли S. pneumoniae (68,4 — 83,3% ), Н. influenzae (33,3 — 42,1%), М. pneumoniae (15,8 — 16,6%). Весной спектр пневмотропных возбудителей меняется: частота обнаружения S. pneumoniae, Н. influenzae, М. pneumoniae снижается, но увеличивается показатель выявления М.catarrhalis. М. pneumoniae чаще всего выявляется в осенне-зимний период при острых пневмониях.

Литература

1. Аргунова А.Н. [Электронный ресурс] // www.pulmonology.ru/Sod/Tezis-13/part-08.htm/ (02.12.2003).

2. Вишнякова Л.А., Никитина М. А., Петрова С.И. и др. // Пульмонология. 2005. №3. С. 43-47.

3. Лыкова Е.А., Бокова А.Г., Бондаренко В.М. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 2000. №9. С. 13-19.

4. Таточенко В.К. //Лечащий врач. 2002. №10. С. 56-60.

5. Таточенко В.К. Проект клинических реком. “Пневмония у детей” / Под ред. А.А. Баранова. М.: Гэотар-Медиа, 2005. 23 с.