СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КЛАПАНОВ
METHODS FOR DIAGNOSING OF CHRONIC VALVE DISEASE

Перекрестные ссылки на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США №61/655704, поданной 5 июня 2010, раскрытие которой включено в настоящей заявке посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится в целом к способам диагностики хронического заболевания клапанов, и в частности, к способам диагностики хронического заболевания клапанов путем анализа метаболитов, связанных с хроническим заболеванием клапанов.
Уровень техники
Патология сердца является одним из наиболее распространенных болезней у животных, включая таких животных, как собаки. Примерно 11% собак страдают патологией сердца, у 95% из них болезнь проявляется во взрослом возрасте. У одной трети собак в возрасте 10 лет или более отмечается хроническое заболевание клапанов (ХЗК). ХЗК характеризуется прогрессирующей дегенерацией и деформацией атриовентрикулярных клапанов, чаще всего митральных клапанов, что приводит к ранней недостаточности митрального клапана. Это в свою очередь приводит к появлению систолического шума в сердце из-за митральной регургитации, в то время как неадекватное закрытие митрального клапана вызывает обратный кровоток в левое предсердие. У больных собак в итоге развивается левая предсердно-желудочковая объемная перегрузка, отек легких, дилатация предсердий, и суправентрикулярная аритмия.
Хотя возможно хирургическое или медикаментозное лечение пораженных клапанов, лица, ухаживающие за животными, и врачи предпочитают диетическое вмешательство. Обязательными являются раннее выявление и лечение. Однако выявление может быть затруднено из-за отсутствия симптомов.
Биомаркеры, связанные с конкретным заболеванием или состоянием, пригодны для выявления такого заболевания или состояния, когда у животного проявляются минимальные симптомы, или не проявляется симптомов; или для диагностики такого заболевания или состояния. Во многих случаях метаболиты являются пригодными биомаркерами. Однако в настоящее время неизвестны биомаркеры, пригодные в качестве диагностических агентов для оценки хронического заболевания клапанов у животных. Таким образом, имеется потребность в биомаркерах, пригодных для диагностики хронического заболевания клапанов у животных. Такие биомаркеры позволят лицам, осуществляющим уход за животными, или врачам обеспечить наиболее подходящий и эффективный уровень лечения, например, позволяющий избежать операции, когда это возможно. Такое лечение позволит повысить качество жизни животного.
Раскрытие изобретения
Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение способов диагностики хронического заболевания клапанов у животных.
Эти и другие задачи решаются с применением способов диагностики хронического заболевания клапанов у животного, включающих получение биологического образца у животного; анализ образца на присутствие одного или нескольких метаболитов, связанных с хроническим заболеванием клапанов; сравнение количества каждого такого метаболита, идентифицированного в образце, с соответствующим количеством того же самого метаболита, присутствующего в образце одного или нескольких сравниваемых контрольных животных, не страдающих хроническим заболеванием клапанов; и применение указанного сравнения для диагностики хронического заболевания клапанов у животного, если количество метаболитов, найденных в образце животного, больше или меньше количества тех же самых метаболитов, присутствующих в образце контрольного животного, в зависимости от конкретного метаболита и того, повышается ли или понижается ли, как известно, количество такого метаболита в образце у животных, страдающих хроническим заболеванием клапанов.
Другие и дополнительные задачи, характеристики и преимущества настоящего изобретения легко понятны специалистам в данной области техники.
Осуществление изобретения
Определения
Термин «животное» означает любое животное, подверженное или страдающее хроническим заболеванием клапанов.
Термин «метаболит» или «биомаркер» означает малые молекулы, уровни или интенсивность которых измеряют в биологическом образце, которые можно применять в качестве маркеров для диагностики патологического состояния.
Термин «сравниваемое контрольное животное» означает животное того же самого вида и типа, или одно и то же животное, которое исследуют два раза независимо.
Термин «диагностика» означает определение того, болеет ли животное, или прогнозирование того, подвержено ли животное развитию хронического заболевания клапанов.
Как применяется в настоящей заявке, диапазоны указаны условно, чтобы избежать перечисления и описания всякого и каждого значения в пределах диапазона. Может быть выбрано любое подходящее значение в пределах диапазона, где это уместно, такое как верхнее значение, нижнее значение, или предельное значение диапазоне.
Как применяется в настоящей заявке, форма единственного числа слова включает множественное число, и наоборот, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, ссылки на единственное число, как правило, включают ссылки на множественное число соответствующих терминов. Например, ссылка на «способ» включает множество таких «способов». Подобным образом, слова «содержать», «содержит» и «содержащий» должны интерпретироваться как включающие, а не как исключающие. Подобным образом, термины «включать», «включающий» и «или» должны рассматриваться как включающие, если только эта конструкция ясно не запрещена в контексте.
Способы и композиции и другие преимущества, раскрытые в настоящей заявке, не ограничиваются конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными здесь, поскольку, как понятно специалисту в данной области техники, они могут варьировать. Далее, терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена и не ограничивает объем того, что раскрыто или заявлено.
Если не указано иное, все технические и научные термины, термины из области техники, и аббревиатуры, используемые в настоящей заявке, имеют значения, общепринятые для рядового специалиста в области (областях) техники, к которой относится изобретение, или в области (областях), где применяется термин.
Все патенты, заявки на патент, публикации, технические и/или научные статьи, и другие ссылки, цитируемые или упоминаемые в настоящей заявке, включены во всей полноте посредством ссылки до степени, разрешенной законом. Обсуждение таких ссылок предназначено просто для обобщения утверждений, сделанных в них. Не допускается, что любые такие патенты, заявки на патент, публикации или ссылки, или любая их часть, являются основанием, материалом, или предшествующим уровнем техники. Право оспаривать точность и уместность любого утверждения таких патентов, заявок на патент, публикаций и других ссылок в качестве основания, материала или предшествующего уровня техники особо охраняется.
В одном аспекте изобретение обеспечивает способы диагностики хронического заболевания клапанов у животного. Способы включают получение биологического образца у животного; анализ образца на присутствие одного или нескольких метаболитов, связанных с хроническим заболеванием клапанов; сравнение количества каждого такого метаболита, идентифицированного в образце, с соответствующим количеством того же самого метаболита, присутствующего в образце от одного или нескольких сравниваемых контрольных животных, не страдающих хроническим заболеванием клапанов; и применение указанного сравнения для диагностики хронического заболевания клапанов у животного, если метаболиты, найденные в образце животного, находятся в большем или меньшем количестве, чем в образце контрольного животного. Известно, что количество или концентрация некоторых метаболитов в таких образцах повышается у животных, страдающих хроническим заболеванием клапанов, в то время как количество или концентрация некоторых метаболитов в таких образцах снижается у животных, страдающих хроническим заболеванием клапанов. Диагноз может быть выполнен на основе только метаболитов, чье количество, как известно, повышается; только метаболитов, чье количество, как известно, снижается; или их комбинации.
В различных вариантах осуществления способы включают получение биологического образца у животного; анализ наличия в образце двух или более метаболитов, связанных с хроническим заболеванием клапанов; сравнение количества каждого такого метаболита, идентифицированного в образце, с соответствующим количеством того же самого метаболита, присутствующего в образце от одного или нескольких сравниваемых контрольных животных, не страдающих хроническим заболеванием клапанов; и применение указанного сравнения для диагностики хронического заболевания клапанов у животного, если количество каждого метаболита, найденного в образце животного, меньше количества, присутствующего в контрольном образце животного, больше количества, присутствующего в контрольном образце животного, или при их комбинации.
Настоящее изобретение основано на открытии того, что метаболиты из изобретения присутствуют в биологическом образце животного, и что количество метаболитов в образце служит в качестве биохимического индикатора для диагностики хронического заболевания клапанов путем индикации или прогноза порога для хронического заболевания клапанов. Настоящее изобретение обеспечивает выполнение лицами, осуществляющими уход за животными, и ветеринарами или другими врачами, анализов этих «биомаркеров» в образце, и определение того, подвержено ли или страдает ли животное хроническим заболеванием клапанов, и имеется ли необходимость дополнительной диагностики или лечения. При установлении необходимости в дальнейшей диагностике и лечении, обосновываются затраты и риск дополнительной диагностики и лечения.
В различных вариантах осуществления у одного или нескольких сравниваемых контрольных животных, которые не являются животными, у которых проводят анализ на хроническое заболевание клапанов, и которые, как было установлено, не страдают хроническим заболеванием клапанов, проводят анализ по меньшей мере одного из метаболитов, и результаты таких определений применяют в качестве базового значения для сравнения с результатами от животных, у которых проводят определение одного или нескольких таких метаболитов. В предпочтительных вариантах осуществления базовое значение для этих метаболитов определяют путем анализа большого числа сравниваемых контрольных животных.
В других вариантах осуществления количество по меньшей мере одного из этих метаболитов определяют у животного в различное время на протяжении жизни животного, и результаты используют для определения того, подвержено ли или страдает ли животное хроническим заболеванием клапанов; например, если количество такого по меньшей мере одного из метаболитов повышается или снижается (как свойственно конкретному анализируемому биомаркера, в зависимости от того, повышается или снижается количество такого биомаркера, как известно, у животного, у которого развивается хроническое заболевание клапанов) по мере увеличения возраста животного, то можно признать животное подверженным или страдающим хроническим заболеванием клапанов. В предпочтительных вариантах осуществления животное тестируют периодически, и результаты анализируемых метаболитов регистрируют. Затем, если последующее тестирование показывает, что количество одного или нескольких метаболитов повышается или снижается (как свойственно конкретному анализируемому биомаркеру, в зависимости от того, повышается или снижается количество такого биомаркера, как известно, у животного, у которого развивается хроническое заболевание клапанов) с последнего теста(ов), животное признают подверженным или страдающим хроническим заболеванием клапанов.
Любой биологический образец, содержащий интересующий метаболит(ы), пригоден в настоящем изобретении. Примеры включают кровь (сыворотку/плазму), спинномозговую жидкость (СМЖ), мочу, кал, выдыхаемый воздух, слюну, или биоптат любой ткани, но не ограничиваются ими. В одном варианте осуществления образец является образцом сыворотки. В то время как здесь применяется термин «сыворотка», специалисту в данной области техники понятно, что также можно применять плазму, или цельную кровь или субфракцию цельной крови.
Биологический образец анализируют для определения конкретного метаболита с применением любого подходящего способа, известного в данной области техники для такого метаболита. Например, не желая ограничиваться каким-либо образом, экстракты биологических образцов подлежат анализу по существу на любой платформе для масс-спектрометрии, либо прямым введением, либо после хроматографического разделения. Типичные масс-спектрометры состоят из источника, который ионизирует молекулы в образце, и детектор для определения ионизированных молекул или фрагментов молекул. Не ограничивающие примеры обычных источников включают источники для электрораспылительной ионизации с электронным ударом (ЭРИ), химической ионизации при атмосферном давлении (APCI), фотоионизации при атмосферном давлении (APPI), матрично-активированной лазерной десорбции - ионизации (MALDI), лазерной десорбции - ионизации, усиленной поверхностью (SELDI), и их производных. Обычные системы для массового разделения и детекции могут включать квадруполь, квадрупольную ионную ловушку, линейную ионную ловушку, времяпролетный анализатор (TOF), магнитный сектор, ионно-циклотронный анализатор (FTMS), орбитрап, и их производные и комбинации. Преимуществом FTMS (массовой спектрометрии с преобразованием Фурье) перед другими платформами на основе МС является высокая разрешающая способность, обеспечивающая разделение метаболитов, отличающихся лишь на сотые доли Дальтон, многие из которых не могут быть определены с применением приборов с меньшим разрешением.
В предпочтительных вариантах осуществления биологические образцы анализируют на избранный метаболит (биомаркер) с применением жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС), газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС) или жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с линейной ионной ловушкой, если метод требует высокой пропускной способности.
В то время как применение одного из метаболитов достаточно для диагностики хронического заболевания клапанов, применение одного или более, двух или более, трех или более, или четырех или более таких метаболитов охватывается настоящим изобретением, и может быть предпочтительным во многих случаях. Метаболиты могут быть анализированы и использованы для диагноза в любой комбинации.
В некоторых вариантах осуществления диагноз основан на определении количества одного или нескольких метаболитов, выбранных из глутамата, C-гликозилтриптофана, бета-гидроксиизовалерата, окисленного глутатиона, эритроната, N-ацетилнейрамината, лактата, цис-аконитата, сукцинилкарнитина, малата, пентадеканоата (15:0), маргарата (17:0), метилпальмитата (15 или 2), 12-НЕРЕ ((±)-12-гидрокси-5Z, 8Z, 10E, 14Z, 17Z-эйкозапентаеновой кислоты), гексаноилкарнитина, глицерофосфорилхолина, 1-стеароилглицерофосфоинозитола, N6-карбамоилтреониладенозина, цитидина, пантотената, N-гликолилнейрамината, X - 11400, X - 12729, X - 13422, X - 13543, X - 14272, X - 16277, 12-НЕТЕ (12-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты), тромбоксана В2, саркозина (N-метилглицина), бета-гидроксипирувата, серина, треонина, валина, метионина, диметиларгинина (SDMA + ADMA (симметричного + асимметричного диметиларгинина)), гамма-глутамилметионина, глюкозы, 2-гидроксиоктаноата, дезоксикарнитина, 1-пальмитолеоилглицерофосфохолина, 1-олеоилглицерофосфохолина, 2-олеоилглицерофосфохолина, 1-линолеоилглицерофосфохолина, 2-линолеоилглицерофосфохолина, 1-эйкозадиеноилглицерофосфохолина, 1-арахидоноилглицерофосфохолина, 1-докозапентаеноилглицерофосфохолина, 4-гидроксиминдалята, X - 03088, X - 04357, X - 11793, X - 11818, X - 12771, X - 12786, и X - 13494.
В других вариантах осуществления диагноз основан на определении того, увеличено ли количество каждого такого метаболита в образце животного, по сравнению с количеством, присутствующим в образце от контрольного животного, где метаболитами являются глутамат, C-гликозилтриптофан, бета-гидроксиизовалерат, окисленный глутатион, эритронат, N-ацетилнейраминат, лактат, цис-аконитат, сукцинилкарнитин, малат, пентадеканоат (15:0), маргарат (17:0), метилпальмитат (15 или 2), 12-НЕРЕ, гексаноилкарнитин, глицерофосфорилхолин, 1-стеароилглицерофосфоинозитол, N6-карбамоилтреониладенозин, цитидин, пантотенат, N-гликолилнейраминат, X - 11400, X - 12729, X - 13422, X - 13543, X - 14272, X - 16277, 12-НЕТЕ, и тромбоксан В2. В предпочтительном варианте осуществления диагноз основан на определении того, увеличено ли количество каждого такого метаболита в образце животного, по сравнению с количеством, присутствующим в образце контрольного животного, где метаболитами являются окисленный глутатион, N-ацетилнейраминат, лактат, сукцинилкарнитин, гексаноилкарнитин, 12-НЕТЕ, и тромбоксан В2.
В одном варианте осуществления диагноз основан на определении того, уменьшено ли количество каждого такого метаболита в образце животного, по сравнению с количеством, присутствующим в образце от контрольного животного, где метаболитами являются саркозин (N-метилглицин), бета-гидроксипируват, серин, треонин, валин, метионин, диметиларгинин (SDMA + ADMA), гамма-глутамилметионин, глюкоза, 2-гидроксиоктаноат, дезоксикарнитин, 1-пальмитолеилглицерофосфохолин, 1-олеоилглицерофосфохолин, 2-олеоилглицерофосфохолин, 1-линолеоилглицерофосфохолин, 2-линолеоилглицерофосфохолин, 1-эйкозадиеноилглицерофосфохолин, 1-арахидоноилглицерофосфохолин, 1-докозапентаеноилглицерофосфохолин, 4-гидроксиминдалят, X - 03088, X - 04357, X - 11793, X - 11818, X - 12771, X - 12786, и X - 13494. В предпочтительном варианте осуществления диагноз основан на определении того, уменьшено ли количество каждого такого метаболита в образце животного, по сравнению с количеством, присутствующим в образце от контрольного животного, где метаболитами являются диметиларгинин (SDMA + ADMA), глюкоза и дезоксикарнитин.
Примеры
Изобретение далее иллюстрировано следующими примерами, хотя необходимо понять, что эти примеры включены просто с целью иллюстрации, и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, если специально не указано иное.
Пример 1
Дизайн исследования. Образцы сыворотки отбирали двух типичных групп собак. В контрольной группе (11) не было выявлено признаков патологии сердца, а друга группа состояла из животных (18) у которых предварительно был поставлен диагноз патологии сердца. Образцы анализировали для получения метаболических профилей, и результатов анализа биомаркеров, показательных для патологии сердца.
Подготовка образцов. Все образцы сохраняли при -80°C до анализа. Процесс подготовки образца осуществляли с применением автоматизированной системы MicroLab STAR (Hamilton Company, Рено, Невада). Стандарты для извлечения добавляли перед первым этапом процесса экстракции с целью контроля качества. Подготовку образцов проводили с применением серий органических или водных экстракций для удаления белковой фракции при обеспечении максимального извлечения малых молекул. Полученный экстракт разделяли на две фракции; одну для анализа посредством жидкостной хроматографии (ЖХ), а другую для анализа посредством газовой хроматографии (ГХ). Образцы помещали на непродолжительное время на TurboVap (Zymark, Claiper Life Science, Хопкинтон, Массачусетс) для удаления органического растворителя. Каждый образец замораживали и сушили под вакуумом. Образцы затем готовили для соответствующего прибора, ЖХ/МС или ГХ/МС.
2
2
Жидкостная хроматография/Масс-спектрометрия (ЖХ/МС, ЖХ/МС): ЖХ/МС часть платформы была основана на Waters ACQUITY UPLC и Thermo-Finnigan LTQ масс-спектрометре (Thermo Fisher Corporation, Уолтхэм, Массачусетс), состоящем из источника электрораспылительной ионизации (ЭРИ) и масс-анализатора с линейной ионной ловушкой (ЛИЛ). Экстракт образца разделяли на две аликвоты, сушили, затем растворяли в кислом или основном ЖХ-совместимом растворителе, каждый из которых содержал 11 или более вводимых стандартов в фиксированных концентрациях. Одну аликвоту анализировали с применением кислых оптимизированных условий для положительных ионов, а другую с применением основных оптимизированных условий для отрицательных ионов. Экстракты, растворенные в кислых условиях, элюировали с применением градиента воды и этанола, содержащий 0,1% муравьиной кислоты, в то время как для основных экстрактов использовали градиент воды и метанола, содержащих 6,5 мМ бикарбонат аммония. МС-анализ чередовали между МС и информационно-зависимыми МС сканированиями с применением динамического исключения.
Газовая хроматография/масс-спектрометрия (ГХ/МС): образцы, предназначенные для ГХ/МС анализа, повторно сушили под вакуумом в течение минимум 24 часов перед дериватизацией под сухим азотом с применением бистриметил-силил-трифторацетамида (БСТФА). ГХ колонка была заполнена 5% фенилом, а подъем температуры составил от 40°C до 300°C в течение периода 16 минут. Образцы анализировали на Thermo-Finnigan Trace DSQ быстро сканирующем одноквадрупольном масс-спектрометре (Thermo Fisher Corporation, Уолтхэм, Массачусетс) с применением ионизации электронным ударом. Прибор ежедневно настраивали и калибровали для массового разрешения и точности массы. Вывод информации из исходных файлов данных осуществляли автоматически, как обсуждается ниже.
Точное определение массы и МС/МС фрагментация (ЖХ/МС), (ЖХ/МС/МС): ЖХ/МС часть платформы была основана на Waters ACQUITY UPLC и Thermo-Finnigan LTQ масс-спектрометре (Thermo Fisher Corporation, Уолтхэм, Массачусетс), содержащем линейную ионную ловушку (ЛИЛ) на переднем конце и масс-спектрометр с ионным циклотронным резонансом с преобразованием Фурье (FT-ICR) на заднем конце. Для ионов со счетом более 2 миллионов может быть выполнено точное измерение массы. Точные измерения массы можно выполнить на основе родоначального иона, а также его фрагментов. Типичная ошибка массы составила менее 5 ч./млн. Для характеристики ионов со счетом менее двух миллионов требуется больше исследований. Спектры фрагментации (МС/МС), как правило, генерировали информационно-зависимым образом, но если необходимо, можно было применять целевые МС/МС, такие как в случае сигналов низкого уровня.
Биоинформатика: система информатики состоит из четырех основных компонентов, системы управления лабораторной информацией (LIMS), программного обеспечения для извлечения данных и идентификации пиков, средств обработки данных для контроля качества и идентификации соединений, и набора средств для интерпретации информации и визуализации, для применения аналитиками данных. Аппаратные и программные основы этих компонентов информатики построены на локальной вычислительной сети, и сервер базы данных работает с Oracle 10,2,0,1 Enterprise Edition.
LIMS: задачей системы LIMS является обеспечение полностью автоматизированной лаборатории посредством безопасной, простой в применении и высоко специализированной системы. Объем системы LIMS охватывает регистрацию образца, подготовку образца и инструментальный анализ, и отчет и расширенный анализ данных. Все последующие программные системы основаны на структурах данных LIMS. Их модифицировали для трансляции и взаимодействия с извлечением внутренней информации и системами визуализации данных, а также измерительной аппаратурой и программным обеспечением для анализа данных от третьего лица.
Извлечение данных и анализ качества: извлечение данных из файлов исходных данных масс-спектрометрического анализа дало информацию, которую можно загрузить в реляционную базу данных и манипулировать, не прибегая к BLOB («большой блок двоично-кодированных данных объекта») манипуляции. После анализа информации в базе данных были введены подходящие пределы контроля качества. Пики идентифицировали с применением программного обеспечения для интеграции пиков, и составные части хранили в отдельной и специально разработанной структуре комплексных данных.
Идентификация соединений: соединения идентифицировали путем сравнения с записями библиотеки очищенных стандартов или повторяющимися неопознанными объектами. Идентификация известных химических объектов была основана на сравнении с данными метаболомной библиотеки очищенных стандартов. Комбинация хроматографических свойств и масс-спектров дала указания для сочетания со специфическим соединением или изобарическим объектом. Дополнительные объекты могут быть идентифицированы на основании их периодического характера (и хроматографического, и масс-спектрального). Эти соединения могут быть идентифицированы в будущем при наличии совпадения с очищенным стандартом или путем классического структурного анализа.
Результаты. Всего в исследовании было выявлено 506 метаболитов. 320 соединений имели название, и 186 соединений не имели названия. Не имеющие названия соединения представляли собой отдельную молекулу из дискретной молекулярной формулы и структуры, но не совпадали с соединениями, имеющими наименование в настоящее время. Из 506 идентифицированных метаболитов 54 были признаны статистически значимыми (p≤0,05). Статистически значимые метаболиты указаны в таблице 1.
В настоящем описании раскрыты типичные предпочтительные варианты осуществления изобретения. Хотя применяются специфические термины, они используются только в общем и описательном смысле, но не с целью ограничения. Объем изобретения установлен в формуле изобретения. Очевидно, что многие модификации и вариации изобретения возможны в свете вышеприведенных учений. Таким образом, необходимо понять, что в пределах объема формулы изобретения настоящее изобретение может осуществляться на практике иначе, чем это специально описано.