СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАПСУЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ РИФАМИЦИНОВОГО РЯДА
METHOD OF OBTAINING CAPSULATED FORM OF ANTITUBERCULOSIS MEDICATIONS OF RIFAMPICIN SERIES

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу получения липосомальной формы противотуберкулезных препаратов для лечения туберкулеза.
Для лечения туберкулеза разработана схема терапии, включающая как минимум несколько препаратов. Полусинтетический антибиотик рифампицин (РМ) и его более современный аналог рифабутин (РБ) являются препаратами первого ряда при лечении туберкулеза.
Механизм действия антибиотиков рифамицинового ряда (РМ и РБ) обусловлен их способностью связываться с β-субъединицей бактериальной РНК полимеразы и тем самым подавлять процесс транскрипции в Mycobacterium tuberculosis. Необходимым условием успешной реализации такого механизма является проникновение антибиотика в инфицированный макрофаг.
Однако оба препарата (РМ и РБ) имеют серьезные недостатки. Они мало растворимы в воде (1 мг/мл и 0,01 мг/мл соответственно) и при длительном приеме оказывают выраженный гепатотоксический эффект. Поэтому желательна такая лекарственная форма для антибиотиков, которая бы повысила их содержание в водной фазе. Для этого антибиотики заключают в частицы из природных фосфолипидов (липосомы), либо в наночастицы из биодеградируемых синтетических полимеров. Важным преимуществом липосомных препаратов и полимерных частиц, которые имеют размер от 0,2 до 0,5 мкм, перед традиционными лекарственными формами является их способность взаимодействовать с макрофагами путем эндоцитоза. Эта особенность чрезвычайно важна при лечении туберкулеза, т.к. М. tuberculosis размножаются в основном в макрофагах. Таким образом, с помощью капсулированной формы антибиотиков может быть осуществлена направленная доставка лекарственного препарата в макрофаг, к месту размножения микобактерий.
Следует учесть, что при введении в кровеносное русло капсулированной формы препарата происходит его сильное разбавление, которое приводит к десорбции препарата с поверхности липосом или наночастиц и выходу его из внутреннего водного пространства липосом наружу по градиенту концентраций. Поэтому для противотуберкулезного препарата важным является не столько общее содержание действующего вещества в составе капсулированной формы, сколько количество (процент) его включения в сами капсулы, будь это липосомы или наночастицы, которые затем захватываются макрофагами.
Известно несколько композиций для РМ и РБ, каждый из которых встроен в полимерные наночастицы размером 0,2-0,4 мкм.
Известен способ получения композиции с РБ, включающий раздельное смешение рифабутина с целевыми добавками и наполнителем и другой части рифабутина с недостающим количеством наполнителя, последующее их смешение, опудривание магнием стеариновокислым и капсулирование (Патент RU 2320337, МПК А61К 31/395, А61К 9/48, опубл. 27/03/2008).
Однако в данном исследовании нет сведений о растворимости данного препарата в водной фазе после растворения капсулы.
Известны способы получения композиций (Патент RU 2337711, МПК А61К 47/48, А61К 31/438, опубл. 10/11/2008; Патент ЕА 200801388 А1, МПК А61К 31/438; А61К 9/16; опубл. 28/08/2009, Патент WO 2009002227 А1, МПК А61 К9/395; А61К 31/10 опубл. 31/12/2008), представляющие собой наночастицы из полимеров молочной кислоты и сополимеров молочной и гликолевой кислот с включенным в них РБ. Частицы имели небольшой размер (0.2-0.4 мкм) и высокий процент включения антибиотика.
Однако в данных работах не изучалась кинетика выхода РБ из частиц при попадании в водную среду и содержание антибиотика, который остается в частицах после сильного разбавления.
Известен также способ получения препарата РМ, содержащего 1-22% рифампина (синоним - рифампицин) в липосомальной форме, состоящего из 1-27% лецитина, 1-18% холестерола и 70-100% дистиллированной воды (CN 1319395, МПК А61К 9/127; А61К 31/496, опубл. 31/10/2001).
В данном исследовании также не было определено включение антибиотика в липосомы.
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу получения капсулированной формы РМ является способ получения липосомальной формы РМ, включающий приготовление раствора РМ вместе с фосфолипидами в органическом растворителе, удаление растворителя до получения тонкой пленки, которую диспергируют в водной среде до получения суспензии мультиламелярных везикул с заключенным в них РМ. Полученную суспензию гомогенизируют при высоком давлении или продавливают через фильтр до получения липосом размером 0,1-0,5 мкм. В качестве фосфолипидов берут смесь, содержащую, мас.%: фосфатидилхолина 70-80, остальное - смесь любых других липидов яичного желтка, и/или сои, и/или крупного рогатого скота. Раствор РМ совместно с фосфолипидами готовят при соотношении рифампицин: фосфолипиды, равном 1:3-15 (Патент РФ 2223764, МПК А61К 31/496, А61К 9/127, опубл. 20/02/2004).
Недостатком этого способа является то, что содержание РМ в составе липосом не определяли, а способ получения липосом очень трудоемок и содержит такие энергоемкие операции, как выпаривание органического растворителя и использование специального оборудования для гомогенизации и продавливания МЛВ.
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу получения капсулированной формы РБ является способ получения композиции РБ в липосомах из индивидуального фосфатидилхолина сои и его смеси с другими липидами. Способ заключается в получении липидной пленки, содержащей антибиотик, путем выпаривания органического растворителя из раствора липидов с антибиотиком, диспергировании липидной пленки, в малом объеме водной фазы, затем полученные МЛВ разбавляли в большом объеме водной фазы и центрифугировали. Супернатант продавливали через фильтр с определенным размером пор и получали одноламеллярные везикулы, в которых определяли включение РБ по его содержанию во фракции липосом, которые были отделены от несвязавшегося РБ методом гель-фильтрации. Включение РБ рассчитывали как отношение включенного в липосомы РБ к фосфолипидам липосом, в которых он находился (Gaspar М.М., Neves S., Portaels F., Pedrosa J., Silva M.Т., Cruz M.E. Therapeutic efficacy of liposomal rifabutin in a Mycobacterium avium model of infection // Antimicrob. Agents Chemother. 2000, Vol.44, No.9, pp.2424-2430).
Недостатком этого способа является то, что предложенный расчет показателя включения антибиотика не предполагает возможности достоверно оценить соотношение липосом, содержащих РБ и «пустых» липосом, а способ получения липосом очень трудоемок и содержит такие энергозатратные операции, как выпаривание органического растворителя, центрифугирование и продавливание МЛВ.
Техническим результатом изобретения является разработка технологичного и экономически выгодного способа получения липосомальных форм противотуберкулезных препаратов РМ и РБ, без применения токсичных органических растворителей, а также энергозатратных стадий их удаления.
Указанный технический результат достигается за счет того, что в предложенном нами способе получают липосомы малого размера (не более 0,5 мкм), содержащих РМ или РБ, включенных в липосомы в высокой концентрации.
Антибиотик растворяют в изотоническом растворе со значением pH среды 2-3, а затем на поверхность данного раствора наслаивают порошок смеси липидов, содержащей 50-70% гликосфинголипидов, 30-50% фосфолипидов и 3% холестерина и триацилглицеридов, далее диспергируют при слабом перемешивании при комнатной температуре, доводят pH дисперсии до нейтрального значения добавлением основания, дисперсию нагревают в течение 10-40 мин при температуре 60-70°С с последующей оценкой степени включения антибиотика методом спектрофотометрии после проведения гель-фильтрации.
Для получения липосом используют смесь липидов следующего состава:
- гликосфинголипиды 60%;
- фосфолипиды - 37%;
- холестерин и триацилглицериды - 3%.
В качестве гликолипидов берут смесь цереброзидов и цереброзидсульфатов природного или синтетического происхождения в любых соотношениях.
Денситометрическим анализом ТСХ был определен качественный и количественный состав фосфолипидов препарата. Установили, что в исходном препарате из фосфолипидов присутствуют фосфатидилсерин - 28%; фосфатидилэтаноламин - 8% и следовые количества фосфатидилхолина и сфингомиелина (СМ). Фракция гликосфинголипидов состоит в основном из цереброзидов (Ц - 46%) и цереброзидсульфатов (ЦС - 14%).
Морфология частиц была исследована методом электронной микроскопии. Также оценку размера частиц получали из данных турбидиметрического анализа.
Оптимизацию условий получения липосом с РМ или с РБ проводили, варьируя температуру получения липосом из длинных полунанотрубок от 40 до 80°С. При температуре ниже 55°С наблюдали исходные полунанотрубки, как это показано на фиг.1. Выше 80°С из полунанотрубок образуются сферические частицы (фиг.2), но в этих условиях повышается индекс окисленности липидов от 0.2 до 1.0, что говорит о том, что идет окисление и деградация липидов. Таким образом, диапазон температур находится от 55 до 70°С.
Для получения липосом с РМ или с РБ используют разные соотношения ГСЛ и ФЛ при постоянной концентрации РМ или РБ, равной 5 мг/мл. Для отделения антибиотика, включенного в липосомы, от антибиотика в растворе использовали микроколонку с сорбентом Sephadex G-25. Повышение содержания ФЛ в смеси ГСЛ/ФЛ уменьшает включение антибиотиков в липосомы, так же как и повышение общей концентрации смеси липидов выше 15 мг/мл.
При получении липосом используют содержание РМ или РБ в изотоническом растворе от 1 до 5 мг/мл. Повышение исходной концентрации антибиотика приводит к тому, что их содержание в липосомах увеличивается. Но при повышении концентрации антибиотика до 10 мг/мл образуется осадок, который не диспергируется смесью липидов.
При получении липосом варьируют концентрацию смеси ГСЛ/ФЛ (3:2) в исходной дисперсии от 15 до 40 мг/мл. Увеличение концентрации липидов выше 40 мг/мл приводило к уменьшению включения антибиотиков. Возможно, это происходило потому, что в этих условиях нет полного перехода полунанотрубок в сферические частицы, что следует из данных по размеру частиц.
Наилучший результат получения капсулированной формы антибиотиков РМ и РБ по предложенному способу описан в примере 1.
Пример 1
Сначала в раствор 0,9% NaCl добавляют 0,01 М HCl так, что pH раствора становится 3,0 или ниже. В этот раствор добавляют РМ или РБ так, чтобы достичь конечной концентрации антибиотиков 5 мг/мл. Далее на поверхность раствора наслаивают порошок смеси липидов и диспергируют при слабом перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 30 мин. Используемая смесь гликосфинголипидов и фосфолипидов (ГСЛ/ФЛ) при соотношении 3:2 при таком способе диспергирования образует в водных растворах протяженные структуры диаметром 200 нм и длиной более микрона. Они имеют вид желоба и их называют полунанотрубками (фиг.1). Полученную дисперсию доводят раствором основания до pH 6,0-7,0 и нагревают в течение 10 мин при температуре 60°С. При этом происходит превращение полунанотрубок в сферические наночастицы - липосомы (фиг.2). Получают гомогенную эмульсию липосом, имеющих размер не более 0,5 мкм и содержащих высокий процент антибиотиков РМ или РБ после сильного разбавления препарата в ходе проведения процесса гель-фильтрации.
-1
-1
-1
-1
Оценку степени включения антибиотика в липосомы осуществляют спектрофотометрически, основываясь на зависимости светопоглощения при определенных длинах волн от концентрации, которая подчиняется закону Ламберта-Бугера-Бера в интересующем диапазоне концентраций. В частности, содержание РМ можно определить из величины светопоглощения при длине волны 475 нм, принимая молекулярный показатель поглощения равным 15300 л·моль·см. Содержание РБ вычисляют по светопоглощению раствора при длине волны 500 нм (молекулярный показатель поглощения принимается равным 3100 л·моль·см).
Для определения количества (процента) включения РМ или РБ в липосомы методом гель-фильтрации отделяют липосомы, содержащие противотуберкулезные препараты, от их водных форм. Для этого липосомальные препараты антибиотиков наносят на колонку, заполненную Sephadex G-25, и проводят элюцию физиологическим раствором или трис-буфером.
В первых фракциях, собранных с колонки, содержались липосомы с включенным лекарственным препаратом и липосомы, не содержащие препарат («пустые» липосомы), а затем следовали фракции, в которых находился свободный лекарственный препарат, не включенный в липосомы. Содержание обоих компонентов (липосом и антибиотика) определяли методом спектрофотометрии. Наличие липосом подтверждали, фиксируя мутность инкубационной среды при 780 нм. Для определения количества антибиотиков, связанных с липосомами, производили их разрушение детергентом, для чего к 3 мл липосом добавляли 0,2 мл 5,4%-ного раствора дезоксихолата натрия.
Примеры 2-6
Гомогенные эмульсии липосом, включающие РМ и РБ, получали аналогично примеру 1, их характеристики, такие как соотношение антибиотик:липосомы и оценка эффективности включения антибиотиков в липосомы, приведены в таблице.
Таблица
Характеристики липосом, содержащих РМ или РБ, из смеси ГСЛ/ФЛ, полученных при разных условиях
Липидный компонент
Исходная конц-я антибиотика мг/мл
Липиды мг/мл
Эффективность включения. РМ, %
Эффективность включения. РБ, %
Размер частиц, нм
ГСЛ/ФЛ (1:2)
5
15
17
10
325
ГСЛ/ФЛ (1:1)
5
15
25
20
370
ГСЛ/ФЛ (3:2)
1
15
15
23
250
ГСЛ/ФЛ (3:2)
5
15
30
33
250
ГСЛ/ФЛ (3:2)
10осадок
15
-
-
-
ГСЛ/ФЛ (3:2)
5
40
25
28
Выше 1 мкм