Зависимость лимфогенного метастазирования от морфологического строения опухоли при кишечном и диффузном типах рака желудка*

Клинические исследования и опыт в онкологии

© М.В. Завьялова, В.М. Перельмутер, И.В. Степанов, С.Г. Афанасьев, 2012

УДК 616.33-006.6-033.2

зависимость лимфогенного метастазирования от морфологического строения опухоли при кишечном и диффузном типах рака желудка*

М.В. Завьялова1,2, В.М. перельмутер1,2, и.В. степанов1, с.Г. Афанасьев2

the lymphogenic metastasis dependence from morphological type of tumor in patients with intestinal and diffuse types of stomach cancer

M.V. Zavyalova, V.M. Perelmuter, I.V. Stepanov, S.G. Afanasyev

1 Сибирский государственный медицинский университет, Томск

2 НИИ онкологии СО РАМН, Томск

реферат. Изучалась связь между параметрами, характеризующими инвазивные свойства и пролиферативную активность опухолевых клеток, и лимфогенным метастазированием. Исследование проведено на операционном материале 65 больных кишечным и 42 больных диффузным типом рака желудка, T N M0 стадии, получивших хирургическое лечение. Способность к инвазии оценивалась с помощью двух критериев: глубины прорастания стенки желудка и ретракции стро-мы (наличие щелевидной полости) вокруг железистоподобных, трабекулярных, солидных структур и дискретных групп опухолевых клеток. Иммуногистохимическое исследование выполнялось по стандартной методике. Обнаружено, что при кишечном типе рака желудка глубина инвазии дискретными группами в наибольшей степени опухолевых клеток связана с частотой лимфогенного метастазирования, а отчетливая ретракция вокруг этих же элементов — с количеством пораженных лимфатических узлов. При диффузном типе рака желудка подобная связь не обнаружена. Кроме того, показано, что как при кишечном, так и при диффузном типе рака желудка по мере увеличения глубины инвазии опухолью в толщу стенки желудка снижается доля клеток, экспрессирующих Ю67. В случаях развития лимфогенных метастазов изучаемый параметр, напротив, повышался.

Ключевые слова: рак желудка, ретракция стромы опухоли, пролиферативная активность, инвазия, лимфогенное мета-стазирование.

Abstract. We have studied relation between parameters that characterize invasive properties and proliferative activity of tumor cells and lymphogenic metastatic spread. The research work was made on the operational material of 65 patients with intestinal type of gastric carcinoma and 42 patients with diffuse type of gastric carcinoma, stages were T1—4N0—3M0. The ability for invasive spread was evaluated with 2 criterias: the depth of gastric wall intergrowth and stroma retraction between adenomatous, trabecular, solid structures and descreet groups of tumor cells. Immunohistochemistry was performed by standard method. We have found that in case of intestinal type of gastric carcinoma the depth of invasion depends on lymphogenic metastatic spread frequency. In case of diffuse type of gastric carcinoma such dependence was not revealed. Besides that, we have found that in case of intestinal as well as diffuse types of gastric carcinoma the portion of cells that express Ki67 decrease with the increasing of the level of depth of tumor invasion into the gastric wall. In case of appearance of lymphogenic metastases this parameter increased.

Key words: gastric cancer, proliferative activity, lymphogenicmeatstases.

На сегодняшний день наиболее используемыми морфологическими факторами прогноза при раке

* Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 02.740.11.0769 от 12 апреля 2010 г. Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг.

желудка (РЖ) являются степень дифференцирования и глубина инвазии первичной опухоли [1]. Считается, что большое значение для течения этого заболевания имеет гистологический тип по классификации, предложенной P. Lauren (1965), на основании которой выделяют диффузный и кишечный варианты РЖ [12].

Имеются сведения о том, что опухоли диффузного типа склонны к более глубокой инвазии в стенки желудка и характеризуются низкими показателями общей выживаемости [2, 3]. В литературе в последнее время утверждается, что одним из важнейших факторов, определяющих прогноз при раке желудка, является уровень лимфогенного распространения. Чаще всего уровень опухолевой инфильтрации и степень дифференцирования напрямую коррелируют с объемом поражения регионарных лимфоузлов [4, 15].

Однако данная закономерность не всегда прослеживается в реальной клинической ситуации. В частности, по данным ряда авторов, в 5—21% случаев наблюдаются лимфогенное метастазирование при раннем раке желудка, особенно при плоском и изъязвленном типах роста [5, 9]. Это диктует необходимость поиска дополнительных морфологических критериев, которые позволят более точно прогнозировать риск развития лимфогенных метастазов и течение заболевания.

Обсуждается информативность оценки такого морфологического параметра, как перифокальная ретракция стромы в новообразовании. В ряде исследований этот параметр предлагают как признак, указывающий на микроинвазию при серозных опухолях яичников, высокую вероятность лимфогенного мета-стазирования и неблагоприятного прогноза при раке молочной железы и пищевода [7, 11]. Представляется интересным оценить значимость таких параметров инвазии, как глубина прорастания и ретракция стромы для развития лимфогенного метастазирования при разных типах рака желудка.

Кроме того, имеющиеся на сегодняшний день литературные данные свидетельствуют о том, что высокие уровни экспрессии маркеров клеточной пролиферации Ki67 и PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), которые являются ядерными антигенами, связаны со всеми фазами клеточного цикла, кроме G0 [10], и могут быть сопряжены не только с гистологическим типом рака желудка по классификации Lauren, но и со степенью злокачественности опухоли, ее размером и поражением регионарных лимфатических узлов. Так, в ряде исследований было показано, что повышение уровня экспрессии Ki67 коррелирует с наличием метастазов в лимфатических узлах. Для PCNA такой связи обнаружено не было, однако экспрессия данного ядерного антигена была связана с глубиной инвазии опухоли [6, 14, 16]. Вместе с тем, несмотря на достаточное число исследований, посвященных про-лиферативной активности, в литературе отсутствуют

указания об изучении данного параметра в зависимости от детального морфологического строения опухоли и локализации тех или иных опухолевых структур в разных слоях стенки желудка.

Цель исследования — изучить значимость глубины прорастания опухоли, перифокальной ретракции стромы и пролиферационной активности клеток опухоли при кишечном и диффузном типе рака желудка, а также оценить их значение для прогноза лимфогенного метастазирования.

Материал и методы

Изучался операционный материал 90 больных раком желудка в стадии T1—3N0—2M0. Средний возраст больных составил (58,2±10,5) года. Мужчин в исследовании было 53%, женщин — 47%. Больные не получали неоадъювантную терапию. При хирургическом лечении 51 (57%) больному была проведена субтотальная дистальная резекция желудка, 33 (37%) — гастрэктомия, 1 (1%) — проксимальная резекция желудка, 3 (3%) — паллиативная субтотальная резекция желудка, 1 (1%) — панкреато-дуоденальная резекция, 1 (1%) — операция Льюиса. Морфологическому исследованию подвергалась ткань первичной опухоли и удаленные лимфатические узлы.

При гистологическом исследовании ткани первичной опухоли в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, определялся гистологический тип рака желудка — кишечный (рис. 1) или диффузный (рис. 2) (Lauren P., 1965). В паренхиматозном компоненте опухолей выделялись железистоподобные, трабеку-лярные, солидные структуры и дискретно расположенные группы опухолевых клеток. Вблизи каждого типа опухолевых структур оценивалась выраженность ретракции стромы, т.е. наличие щелевидной полости вокруг опухолевых структур. При этом отмечали два варианта.

В первом случае ретракция отсутствовала или была слабо выражена (рис. 3). Во втором случае опухоли имели умеренно или резко выраженную ретракцию стромы (рис. 4). Определялась глубина инвазии слоев стенки желудка разными типами опухолевых структур. В изучаемых структурах паренхиматозного компонента опухоли подсчитывался процент клеток с митотическими фигурами (на 100 клеток при увеличении микроскопа х400). В регионарных лимфатических узлах отмечали наличие метастатического поражения. Иммуногистохимическое исследование выполнялось по стандартной методике. Для изучения

рис. 1. Кишечный тип рака желудка. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х100

рис. 2. Диффузный тип рака желудка. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х200

Рис. 3. Дискретно расположенные мелкие группы опухолевых клеток при раке желудка кишечного типа. Ретракция стромы вокруг одной из групп опухолевых клеток

•«1е5

Ч 1

* *

С*

,'ё >4 • .. . 4 • •

V • '

Г!*.

ь

% *

0 с ^Щ^ШшШШ *

К.

4 •

У» V

б

* V 0 А .'¿Л * д * " • »'V

г*У

9М,

«г

»л

у

• V* • ' ") Л 'о г

мг * ¿Н'

£ * п v.- • у." * * ' ниш ^ т • " л ^ • 1я1

рис. 4. Отчетливая ретракция вокруг группы опухолевых клеток при раке желудка кишечного типа

пролиферативной активности клеток новообразования использовались антитела фирмы «Dako» к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные). При кишечном типе рака желудка оценивали процент клеток, экспрессирующих Ki67, отдельно в железистоподобных, криброзных структурах новообразования и в дискретных мелких группах опухолевых клеток. Подсчет проводили раздельно в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки органа. При диффузном типе рака изучали уровень экспресии Ki67 в мелких дискретных группах опухолевых клеток, находящихся на разной глубине инвазии.

Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью пакета программ «Statists 6.0 for Windows».

результаты и их обсуждение

При гистологическом исследовании препаратов первичной опухоли у 51 (57%) больного был выявлен кишечный тип рака желудка, у 39 (43%) — диф-

фузный. Случаи, относящиеся по гистологическому строению к «смешанному» или «неопределенному» типам, были исключены из исследования. Глубина инвазии при кишечном и диффузном типах рака желудка не различалась (р=0,88). Одинаковой оказалась и частота лимфогенного метастазирования при изучаемых типах рака желудка — 64 и 56% соответственно (р=0,22).

В группе больных с кишечным типом рака желудка частота лимфогенного метастазирования коррелировала с глубиной инвазии опухоли (х2=19,7; р=0,00005). При этом отмечено, что из всех опухолевых структур только глубина прорастания стенки желудка дискретными опухолевыми клетками была связана с частотой лимфогенного метастазирования (таблица).

В случаях с локализацией дискретных клеток опухоли в подслизистой основе лимфогенные метастазы не определялись, при инвазии в мышечный слой метастатическое поражение лимфатических узлов наблюдалось в 41%, а при инвазии до серозного слоя — в 85% случаев (х2=14,4; р=0,0007). При диффузном типе

Зависимость лимфогенного метастазирования при кишечном и диффузном типах рака желудка от глубины инвазии различными типами опухолевых структур

Глубина опухолевой Кишечный тип Диффузный тип

Тип структур инвазии в стенку N0 N N„ N

желудка + +

Железисто- Подслизистый слой 2/3

подобные Мышечный слой 9/15

Серозная оболочка 4/25

Х2=9,4; р=0,01 Х2=1,8; р=0,39

Криброзные Подслизистый слой 1/1 (100%) 0/1 (0%) — —

Мышечный слой 3/11

Серозная оболочка 1/10 (10%) 9/10 (90%) — —

Х2=4,4; р=0,11

Солидные Подслизистый слой 0/1

Мышечный слой 2/4

Серозная оболочка 2/9

Х2=1,5; р=0,48 Х2=4,2; р=0,12

Трабекулярные Подслизистый слой — — — —

Мышечный слой 1/6

Серозная оболочка 0/3

Х2=0,56; р=0,45 Х2=1,3; р=0,25

Группы опухолевых Подслизистый слой 3/3

клеток Мышечный слой 10/17

Серозная оболочка 4/27

Х2=14,4; р=0,0007 Х2=3,7; р=0,15

Перстневидные Подслизистый слой 1/1

опухолевые клетки Мышечный слой 2/3

Серозная оболочка 0/2

Х2=3,3; р=0,19 Х2=1,3; р=0,52

поволжский

ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК

рака желудка частота лимфогенного метастазирования не была связана ни с уровнем инвазии опухоли (Х2=2,1; р=0,34), ни с глубиной прорастания стенки желудка любыми структурами, включая дискретные клетки (х2=3,7; р=0,15). Сопоставление степени инвазии опухоли с количеством пораженных метастазами лимфоузлов не выявило какой-либо связи ни у больных с кишечным, ни у пациентов с диффузным типом рака желудка (F=1,39; р=0,25 и F=0,06; р=0,81 соответственно).

Иной характер имела связь лимфогенного метастазирования с выраженностью ретракции стромы вокруг опухолевых элементов. При сопоставлении частоты выраженной ретракции с показателями лимфогенного метастазирования у пациентов с кишечным типом рака желудка оказалось, что связь с характером лимфогенного метастазирования отмечена в опухолях с ретракцией вблизи дискретно расположенных мелких групп клеток. Выявлено, что частота ретракции стромы вблизи данного типа структур паренхиматозного компонента опухоли при обоих гистотипах рака желудка была одинакова. При кишечном типе ретракция была обнаружена в 13 из 30 (43,0%) случаев, в которых обнаруживались дискретно расположенные клетки, при диффузном — в 9 из 22 (41,0%) наблюдений. В то же время на уровне отчетливой тенденции выявлены различия в частоте встречаемости случаев с выраженной ретракцией: при кишечном типе рака желудка в 5 (17%) случаях из 30, при диффузном — в 1 (4,5%) из 22 (р=0,076).

В случаях, когда ретракция вблизи групп опухолевых клеток была отчетливой, отмечалось метастатическое поражение большего числа лимфатических узлов (10,0±6,7) в сравнении со случаями, когда ретракция отсутствовала или была слабо выраженной (4,4±3,1) (F=8,4; р=0,007). Следует отметить, что при поражении большого количества лимфатических узлов выраженная ретракция стромы сочеталась с глубокой инвазией мышечного слоя с выходом на серозную оболочку. Несмотря на отчетливую статистически значимую зависимость выраженности лимфогенного метастазирования от перифокальной ретракции стромы вокруг групп опухолевых клеток, этот признак не был связан с частотой лимфогенного метастазирования (х2=0,07; р=0,93).

Анализ пролиферативной активности (Ki67) в зависимости от морфологического строения и типа опухоли выявил ряд существенных отличий, связанных с глубиной инвазии. При кишечном типе рака желудка уровень экспресии Ki67 был значимо ниже

[(4,8±3,3)%] в клетках, формирующих железистопо-добные структуры, располагающиеся в серозной оболочке, по сравнению с экспрессией в подобного рода структурах, находящихся в слизистой оболочке [(33,7±22,7)%; р=0,02]. Аналогичная закономерность прослеживалась и в отношении экспрессии №67 в клетках, формирующих криброзные структуры. Уровень экспресии №67 в этих структурах в серозной оболочке был меньшим [(12,7±15,6)%], по сравнению с этим показателем в структурах, обнаруживаемых в слизистом слое [(48,4±27,2)%; р=0,009]. При кишечном типе рака желудка пролиферативная активность в дискретно расположенных группах опухолевых клеток не была существенно связана с глубиной их инвазии в стенки органа, но отличалась от таковой в железистоподобных структурах. Так, уровень экспрессии К167 в группах опухолевых клеток, выявляющихся в слизистой оболочке, составил (19,5±18,7)%, а в железистоподобных структурах на этой же глубине инвазии — (33,7±22,7)% (р=0,09). При диффузном типе рака уровень экспрессии К167 в мелких группах опухолевых клеток, находящихся в серозной оболочке, был существенно ниже [(3,2±1,6)%] по сравнению с этим показателем в аналогичных структурах, но располагающихся в слизистой оболочке [(24,5±27,9)%; р=0,07].

Сопоставление параметров пролиферационной активности с лимфогенным метастазированием позволило выявить ряд закономерностей. При наличии лимфогенных метастазов процент клеток, экспрес-сирующих К167, выше в сравнении со случаями, где отсутствовала лимфогенная диссеминация. Важно отметить, что данная зависимость при кишечном типе рака желудка прослеживалась лишь в отношении клеток, формирующих криброзные структуры, располагающиеся в слизистой оболочке стенки желудка, — 21,1±12,7 и 4,5±3,3 соответственно (р=0,04). При диффузном типе новообразования при наличии лимфогенных метастазов отмечался более высокий уровень экспрессии К167 в дискретных группах опухолевых клеток, расположенных в слизистой оболочке, по сравнению со случаями, когда лимфатические узлы были интактными — 33,0±30,4 и 7,5±10,5 р=0,07).

Таким образом, инвазивные свойства опухолевых клеток, оцениваемые по глубине прорастания и наличию ретракции стромы, имеют неодинаковую связь с лимфогенным метастазированием при раке желудка кишечного и диффузного типов. Наиболее информативной является оценка этих параметров относительно дискретных групп клеток при кишечном

типе рака желудка. Глубина прорастания и феномен ретракции, отражающие инвазивную способность дискретных клеток аденокарциномы желудка кишечного типа, связаны первый с частотой лимфогенного метастазирования, второй — с его выраженностью.

Аналогичная закономерность обнаружена при оценке взаимосвязи пролиферативной активности с глубиной инвазии опухоли. По мере увеличения глубины прорастания стенки желудка наблюдалось снижение процента экспрессии К167 опухолевыми клетками. При кишечном типе рака желудка наиболее отчетливо это проявлялось в железистоподобных и криброзных структурах, а при диффузном типе — в дискретных группах опухолевых клеток. Как при кишечном, так и при диффузном типе рака желудка отмечалась связь пролиферативной активности опухолевых клеток с развитием лимфогенного метастазирования. В случаях с наличием лимфогенной диссеминации опухоль характеризовалась более высокой пролиферативной активностью в слизистом слое желудка.

Снижение пролиферативной активности опухолевых клеток в железистоподобных и криброзных структурах при кишечном типе рака и в дискретных группах опухолевых клеток при диффузном, по-видимому, отражает явление эпителиально-мезенхимального перехода, одним из ключевых факторов которого является ТСР-В. Известно, что трансформирующий фактор роста ТСР-р увеличивает метастатический и инвазивный потенциал раковых клеток желудка, повышая их способность изменяться и проникать через барьеры базальной мембраны, а также увеличивая адгезивную и двигательную активность опухолевых клеток [8, 13]. Помимо указанных эффектов данного ростового фактора одним из важных его свойств является способность снижать пролиферацию клеток. Исходя из этого, можно полагать, что опухолевые элементы, находящиеся в более глубоких отделах стенки желудка, пребывают в более продвинутой фазе эпителиально-мезенхимального перехода.

Данные о более высокой частоте лимфогенного метастазирования при выраженной пролиферативной активности опухолевых элементов в слизистом слое стенки желудка можно объяснить тем, что, достигнув лимфатического узла и претерпев обратный процесс мезенхимально-эпителиального перехода, интенсивно пролиферирующие клетки скорее превращаются из микрометастаза в «макрометастаз», диагностируемый клинико-инструментальными методами.

Выявленные отличия пролиферативной активности клеток новообразования, связанные с глубиной инвазии стенки желудка, могут являться основой для проведения фундаментальных исследований механизма инвазивного роста при раке желудка. Неодинаковая направленность изменений пролиферативной активности при инвазивном росте и лимфогенном метастазировании может явиться дополнительным фактором, указывающим на независимость развития разных форм опухолевой прогрессии.

Литература

1. Давыдов, М.и. Факторы риска лимфогенного метастазирования раннего рака желудка / М.И. Давыдов, И.Н. Тур-кин, В.В. Мочальникова // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. — Ташкент, 2008. — С. 286.

2. Джураев, М.Д. Рецидив рака желудка: современное состояние проблемы / М.Д. Джураев, М.Ш. Худайбердиева, Д.М. Эгамбердиев // Сибирский онкологический журнал. — 2009. — № 3. — С. 60—62.

3. Дмитренко, А.п. Анализ хирургического лечения перст-невидноклеточного рака желудка / А.П. Дмитренко, Л.А. Орловская, Б.А. Чижиков // Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ. — Минск, 2004. — Ч. 2. — С. 141.

4. стилиди, и.с. Современные представления об основных принципах хирургического лечения местно-распространенного рака желудка / И.С. Стилиди, С.Н. Неред // Практическая онкология. — 2009. — Т. 10, № 1. — С. 20—27.

5. чернявский, А.А. Отдаленные результаты расширенной лимфаденэктомии в хирургии рака желудка / А.А. Чернявский, Н.А. Лавров // Вестник хирургической гастроэнтерологии. — 2007. — № 2. — С. 13—23.

6. Al-Moundhri, M.S. The prognostic significance of p53, p27 kip 1, p21 waf1, HER-2/neu, and Ki67 proteins expression in gastric cancer: a clinicopathological and immunohistochemical study of 121 Arab patients / M.S. al-Moundhri, V. Nirmala, I. al-Hadabi [et al.] // J. Surg. Oncol. — 2005. — Vol. 91 (4). — P. 243—252.

7. Bujas, T. Peritumoral Retraction Clefting Correlates with Advanced Stage Squamous Cell Carcinoma of the Esophagus / T. Bujas, I. Pavic, T. Lenicek [et al.] // Pathol. Oncol. Res. — 2008. — Vol. 14 (4). — P. 443—447.

8. Guo, W. Polymorphisms of transforming growth factor-P1 associated with increased risk of gastric cardia adenocarcinoma in north China / W. Guo, Z. Dong, Y. Guo [et al.] // Int. J. Immunogenet. — 2011. — Vol. 38 (3). — P. 215—224.

9. Hiki, Y. Endoscopic Treatment of Early Gastric Cancer / Y. Hiki // Gastric Cancer / Eds. M. Nishi [et al.]. — Springer-Verlag, 1993. — P. 66—87.

10. Holte, H. Prognostic value of lymphoma specific S-phase fraction compared with that of other cell proliferation markers / H. Holte, Z. Suo, E.B. Smeland, S. Kvaloy // Acta Oncol. — 1999. — Vol. 38. — P. 495—503.

поволжский онкологический

ВЕСТНИК

11. Kimberly, L. Extensive Retraction Artifact Correlates With Lymphatic Invasion and Nodal Metastasis and Predicts Poor Outcome in Early Stage Breast Carcinoma / L. Kimberly, J. Lawrence, X. Xu, J. Paul // Am. J. Surg. Pathol. — 2007. — Vol. 31. — Р. 129—140.

12. Lauren, P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal type carcinoma / P . Lauren // Acta Pathol. Microbiol. Scand. — 1965. — Vol. 64 (1). — P. 31—49.

13. Li, T. Correlation of transforming growth factor beta-1 gene polymorphisms C-509T and T869C and the risk of gastric cancer in China / T. Li, B.W. Cao, Y. Dai [et al.] // J. Gastroenterol. Hepatol. — 2008. — Vol. 23 (4). — P. 638—642.

14. Maedera, K. Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative biopsy specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis / K. Maedera, Y. Chung, N. Onoda // Cancer. — 1994. — Vol. 73. — P. 528—533.

15. Sano, T. Gastric cancer surgery: morbidity and mortality results from a prospective randomized controlled trial comparing D2 and extended paraaortic lymphadenectomy — Japan Clinical Oncology Group study 9501 / T. Sano, M. Sasako, S. Yamamoto [et al.] // J. Clin. Oncol. — 2004. — Vol. 22. — P. 2767—2773.

16. Tzanakis, N.E. Prognostic significance of p53 and Ki67 proteins expression in Greek gastric cancer patients / N.E. Tzanakis, G. Peros, P. Karakitsos [et al.] // Acta Chir. Belg. — 2009. — Vol. 109 (5). — P. 606—611.