Вклад кировских микробиологов в разработку производства пенициллина и стрептомицина (к 70-летию создания технологии глубинного получения первых отечественных антибиотиков)

Вклад кировских микробиологов в разработку производства пенициллина и стрептомицина

М. К. БАКУЛИН, А. С. ТУМАНОВ, В. М. БАКУЛИН, В. Б. КАЛИНИНСКИЙ

Вятский государственный университет, Киров

Contribution of Microbiologists of Kirov City to Development of Penicillin and Streptomycin Production Processes

M. K. BAKULIN, A. S. TUMANOV, V. M. BAKULIN, V. B. KALININSKY

Vyatka State University, Kirov

Статья приурочена к 70-летию разработки технологии глубинного получения первых отечественных антибиотиков и представляет обзор данных литературы о вкладе кировских микробиологов, главным образом сотрудников НИИ эпидемиологии и гигиены Красной Армии (ныне — филиал федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации», г. Киров), в разработку производства пенициллина и стрептомицина.

Ключевые слова: обзор литературы, антибиотики, пенициллин, стрептомицин, глубинное культивирование.

The publication Is concerned with development of the technological processes for submered production of the first domestic antibiotics 70 years age. The literature data on the contribution of the microbiologists of the Kirov City and mainly the workers of the Red Army Research Institute of Epidemiology and Hygiene (nowadays Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Kirov), to development of the manufacture processes for production of penicillin and streptomycin are reviewed.

Key words: literature review, antibiotics, penicillin, streptomycin, submerged cultivation.

Первые научные данные по антибактериальной активности микромицетов рода Pénicillium были опубликованы в 1871—1872 гг. по результатам экспериментальных исследований двумя российскими учеными В. А. Манас-сеиным и А. Г. Полотебновым, которые, будучи в научной командировке в Вене, совместно работали в микологической лаборатории Д. Виз-нера и изучали микроскопические грибки рода Penicillium (главным образом P.glaucum и P.crus-taceum), описали их культурально-морфологи-ческие и другие основные свойства, в том числе — противобактериальные [1, 2]. Спустя более полувека профессор бактериологии Лондонского университета англичанин А. Флеминг сделал эпохальное открытие (удостоен Нобелевской премии в 1945 году) антибактериальных свойств микромицета, идентифицированного позднее как P.notatum, назвав выделяемое микромицетом вещество пенициллином, отмечая, что «...это может быть эффективный анти-

© Коллектив авторов, 2014

Адрес для корреспонденции: Е-та11:тИеуо1и@таИ.ги

септик для подавления чувствительных к пенициллину микробов..» [3]. Спустя два года А. Флеминг пишет, что «...вполне вероятно, что он (пенициллин) или вещество сходной природы может быть использовано при обработке септических ран.», не ссылаясь на работы А. Г. Полотебного, показавшего лечебное действие пеницилл на гнойные раны за шестьдесят лет до данной публикации [4]. Следует отметить, что сам термин «антибиотики» предложил в 1942 году С. Ваксман — ученый российского происхождения (родился под Киевом и окончил с отличием Одесскую гимназию), эмигрировавший из России в США и возглавивший в 1940 году Рутгеровский университет в Нью-Брунсвике, работая в котором участвовал в разработке актиномицина, стрептомицина, нео-мицина и других антибиотиков (удостоен Нобелевской премии в 1952 году) [5].

После публикаций А. Флеминга работы по изучению свойств пенициллина длительное время не выходили за рамки лабораторий и только с 1940 года появляется ряд публикаций группы ученых Оксфордского университета о возможности

выращивания P.notatum на синтетических средах, способам выделения, очистки и концентрации и получения пенициллина [6—9].

Полученные блестящие результаты при применении пенициллина с лечебной и профилактической целью, послужили толчком к развертыванию массового производства пенициллина. Востребованность в этом лечебном препарате была колоссальна. Она диктовалась потоками раненых с театров боевых действий второй мировой войны и требованиями военной медицины иметь на своем вооружении препарат, позволяющий максимально сохранить человеческие жизни и сократить срок пребывания больных и раненых в госпиталях [10].

Отсутствие экономической и технической возможности наладить в тот период производство пенициллина в Англии, крупные центры которой подвергались постоянным бомбардировкам, заставили разработчиков пенициллина во главе с профессором Г. В. Флори переехать в США, где работы были продолжены на более высоком научном и промышленном уровне при интенсивной финансировании государством. Как сообщал американский журнал медицинской ассоциации в редакционной статье, было создано и расширено производство на базе ряда крупнейших фармацевтических фирм (Merck, Pfizer, Abbott и др.), ставших пионерами в деле налаживания выпуска пенициллина, к деятельности которых были привлечены десятки более мелких предприятий, получивших для этих целей миллионные субсидии правительства США [11].

В короткий срок лабораторные технологии поверхностного выращивания гриба-продуцента пенициллина, не позволявшие обеспечить пенициллином потребности армий воюющих стран, был заменены разработанными промышленными технологиями глубинного культивирования продуцента, разработаны технологические этапы производства, спроектированы и запущены мощные предприятия по выпуску пенициллина. R. D. Coghill писал по этому поводу: «Редко случается, чтобы какой-нибудь предмет вызывал такой интерес для научного и светского мира, как пенициллин.... Продукт скромной плесени, с которой всего несколько лет назад стремились скорее бороться, чем культивировать её, он чудесно оделся в одежду заводов стоимостью в 20 миллионов долларов...» [12]. Вместо кустарных производств, которые были созданы в 1942 году, в 1944 вырастают большие промышленные предприятия, механизированные по последнему слову техники, был введён в строй крупнейший в мире (по тем временам) завод в Перр-От с производительностью около 500 кг готового сухого пенициллина, а всего в это время в северной Америке был создан 21 завод, которые позволили снизить

в короткий срок стоимость 100 тыс. ОЕ (оксфордских единиц) пенициллина с 20,0 до 3,5 долларов и обеспечить США выпуск 90% всей мировой продукции пенициллина [13].

В 1942 году в Москве были получены из Лондона короткие секретные донесения от Н. И. Гра-щенко о результативности работ по пенициллину [цит по 14]. И с этого времени ситуация с работами по пенициллину в какой то мере повторяет историю работ по созданию ядерного оружия в СССР. В области создания антибиотиков «Курчатовым» 3. В. Ермольева, обладавшая необычайно широким кругозором, стажировавшаяся в Институте Пастера в Париже и в институте Коха в Берлине, которая в течение 15 лет до начала отечественных работ по пенициллину занималась изучением разных антибактериальных агентов [15]. С октября 1942 года она возглавила в Советском Союзе разработку проблемы, связанной с получением пенициллина. Многие вопросы по данной проблеме были решены в руководимой ею экспериментально-производственной лаборатории биохимии микробов Всесоюзного института экспериментальной медицины (ВИЭМ), в частности сотрудниками этой лаборатории был выделен первый отечественный штамм-продуцент (Р.сттЫит) пенициллина и получены первые партии отечественного препарата — крусто-зина, изучены его свойства, показана высокая терапевтическая эффективность [16, 17].

В 1942—1943 годах пенициллин в СССР производили в ограниченных количествах поверхностным способом, что не позволяло наладить массовый выпуск отечественного пенициллина и сдерживало широкое использование антибиотика на фронте. Масштабирование производства отечественного пенициллина существенно тормозилось отсутствием собственной технологии и возможности использовать опыт американской промышленности вследствие засекреченности технологических процессов производства в США и нежеланием предоставить или продать Советскому Союзу научно-техническую документацию на производство этого антибиотика.

Исходя из практической важности пенициллина для нужд фронта, была создана и направлена в США делегация из ведущих специалистов страны для приобретения лицензии на производство препарата. В результате переговоров за лицензию была запрошена очень высокая (по тем временам) цена — 10 млн долларов [10]. Было решено купить её. Однако когда советская делегация готова была подписать соглашение, её членам сообщили, что цена будет не 10, а 20 млн долларов, т. е. американцы запросили за лицензию сумму, равную стоимости всех построенных в США к концу 1944 г. предприятий по производству пенициллина. В результате обсуждения этого вопроса в Правитель-

стве было решено заплатить и эту сумму и закупить лицензию. Однако вновь последовали отказ на продажу нам лицензии и новое повышение цены на неё. Как вспоминал заместитель Министра медицинской промышленности А. Г. Натрадзе: «Когда комиссия вернулась, мы уже имели отработанный метод глубинного выращивания грибка. Таким образом, мы, независимо от того, что делалось за рубежом, сами своими силами создали у себя с помощью наших ученых глубинный метод.» [цит. по 10].

В 1943 г. Фармакологический комитет принимает по докладу 3. В. Ермольевой решение о разрешении медицинского применения пенициллина и, одновременно с направлением делегации в США для приобретения лицензии на его производство, перед кировским НИИ эпидемиологии и гигиены Красной Армии (НИИЭГ Красной Армии, ныне филиал федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации», г. Киров) была поставлена задача: срочно отработать технологию и наладить массовое производство пенициллина для нужд фронта [10].

Уже в 1944 году кировские микробиологи направили в госпитали фронтового подчинения первые партии пенициллина. На первом этапе исследований была применена разработанная 3. В. Ермольевой технология, основанная на использовании поверхностного способа выращивания культур гриба в матрацах. Данный способ не мог обеспечить колоссальные потребности в препарате. Поэтому при создании метода большеобъёмного производства антибиотика специалистами института было уделено разработке метода глубинного культивирования продуцента пенициллина, который был создан и использовался кировскими микробиологами для вакцинного производства с 1935 г.

В итоге интенсивной работы коллектива микробиологов НИИЭГ Красной Армии уже в 1944 году была разработана технология промышленного производства пенициллина глубинным способом, которая была сразу же передана в гражданские институты и предприятия Министерства здравоохранения и пищевой промышленности. Результаты этих исследований описаны в 1946 г. в диссертационной работе М. Н. Бакиной [18]. Приехавший в 1944 году в Москву профессор Г. В. Флори был весьма удивлен практическими достижениями советских исследователей и результатами сравнения эффективности советского и американского препаратов.

Из большого числа исследованных в НИИЭГ Красной Армии штаммов микромицетов рода Penicillium в качестве основного производственного штамма было рекомендовано применять

P.chrysogenum 23248, который по своей активности превосходил американский штамм-продуцент.

Микробиологами и технологами института была разработана система методов, позволяющая надежно сохранять в течение длительного времени производственные штаммы микроорганизмов рода Penicillium без присущей им диссоциации и снижения продукции антибиотика, а также осуществлять постоянный контроль кондиционности производственных штаммов. В ходе разработки оптимальных условий глубинного выращивания плесневых грибов использовались методы и аппаратура, созданные ранее в НИИЭГ. Глубинное выращивание проводили в специальных аппаратах-культиваторах системы НИИЭГ конструкции инженера-подполковника А. В. Крутикова, которые позволяли производить выращивание продуцента в глубине питательной среды при постоянной аэрации с соблюдением условий полной асептики. Аппараты готовились из металла, имели постоянный обогрев, позволяющий точно поддерживать необходимую температуру — 23±1°С, и обеспечивали возможность легко, не нарушая стерильности, отбирать пробы для определения нарастания концентрации пенициллина. Для снабжения растущих культур кислородом на дне аппаратов устанавливались барботеры, через которые подавался стерильный воздух.

В ходе исследований было показано, что форма барботеров оказывала существенное влияние на выход антибиотика. Экспериментальным путём была обоснована целесообразность использования секторных барботеров. Воздух, подаваемый в аппараты, стерилизовали пропусканием через специальные ватные фильтры, подачу воздуха и скорость аэрации регулировали путём создания в аппаратах разрежения (оптимальная скорость аэрации составляла 1 л воздуха на 1 л среды). Жидкую питательную среду готовили непосредственно в аппарате, стерилизовали под давлением и охлаждали холодной водой, циркулирующей в рубашке аппарата. Для обеспечения максимального выхода пенициллина при глубинном выращивании продуцента важную роль играет используемая питательная среда. Экспериментальными исследованиями было установлено, что из всего многообразия известных к тому времени сред наиболее оптимальной для этой цели оказалась усовершенствованная среда Чапек-Докса с дрожжевой водой и лактозой, при рН 4,5—4,7.

Для приготовления посевного материала использовали двухсуточную аэрированную культуру в количестве 7,5% к общему количеству засеваемой среды. Предотвращение образования пены в процессе аэрации культуры гриба-продуцента достигалось применением молока (0,5% от объёма питательной среды). В качестве защитного

компонента от посторонней микрофлоры использовали борную кислоту.

Созданная технология глубинного получения пенициллина обеспечивала накопление антибиотика в среднем в количестве до 256 оксфордских единиц (ОЕ) в 1 см3 культуральной жидкости при снижении потерь пенициллина в процессе ферментации до 3,5%. Продолжительность культивирования составляла 6—8 суток. 3а кратчайший срок (2 месяца) специалистами института было выпущено 10 тонн нативного пенициллина.

Значительный вклад внесли специалисты НИ-ИЭГ в технологию выделения и очистки пенициллина. Было установлено, что мицелий гриба-продуцента содержит эндотоксин, растворимый только в некоторых органических растворителях. Для предупреждения возможности перехода эндотоксина в готовый продукт в процессе очистки пенициллина рекомендовано использовать фильтрацию культуральной жидкости через фильтр -пресс 3ейца для освобождения от элементов гриба. В ходе экспериментальных исследований была создана технология очистки и концентрирования нативного пенициллина до 16—20 тыс. ОЕ/мл с помощью усовершенствованного учеными НИИ-ЭГ метода с использованием бисульфита натрия и органических растворителей (амилацетат, хлороформ). В результате этого обеспечивалась возможность получения сухого порошкообразного готового препарата пенициллина в количестве 65% от нативного, содержащего 800—1300 ОЕ/мг, не вызывающего побочных эффектов и легко переносимого больными при парентеральном введении в больших дозах.

В результате комплексных исследований, проведённых специалистами НИИЭГ, была осуществлена разработка глубинного метода производства пенициллина, охватывающая практически все важнейшие вопросы, в том числе: выбор производственного штамма, его поддержание и воспроизводство, технологию получения натив-ного пенициллина в аппаратах-культиваторах специальной конструкции, оптимизацию питательной среды и условий выделения и очистки антибиотика, что обеспечило возможность резкого повышения объёмов производства пенициллина, удешевления стоимости антибиотика и улучшения качества готового препарата. По завершению исследований усовершенствованная технология и соответствующая документация в полном объёме были переданы в гражданское здравоохранение для промышленного освоения.

Следует отметить, что эффективность данной работы явилась следствием того, что военные микробиологи использовали богатый опыт, накопленный в стране и за рубежом, а также в институте. Постоянным консультантом исследований была профессор 3. В. Ермольева, которая неодно-

кратно приезжала в институт и находилась в курсе проводившихся работ, что обеспечило возможность последующего быстрого внедрения результатов исследований в практику.

Опыт, приобретённый в ходе разработки технологии глубинного производства пенициллина, послужил основой создания в НИИЭГ Красной Армии в 1945—1947 гг. способа получения отечественного стрептомицина. Военными микробиологами были разработаны питательные среды для культивирования Actinomyces (Streptomyces) griseus и биосинтеза стрептомицина поверхностными и глубинными культурами, методы очистки антибиотика и его получения в сухом виде, а также контроля качества готового препарата. Данная технология обеспечивала возможность получения стрептомицина в производственных условиях с выходом готового продукта в количестве 30% от нативного с содержанием в сухом препарате до 700 мкг стрептомицина основания в 1 мг.

Одновременно с решением технологических задач в опытах на животных и добровольцах были отработаны профилактические и терапевтические дозы стрептомицина, рациональные лекарственные формы и схемы его применения при таких заболеваниях, как чума, дизентерия, дифтерия. Стрептомицин, полученный по разработанной глубинной технологии, был успешно использован советскими медиками при ликвидации эпидемии чумы в Маньчжурии в 1948 г. Разработки сотрудников НИИЭГ Красной Армии были в последующем переданы в Минздрав СССР для промышленного освоения.

Вклад кировских микробиологов в разработку технологии производства пенициллина и стрептомицина был высоко оценен руководством страны. В 1948 г. за решение этой проблемы лауреатами Сталинской премии стали Н. Ф. Копылов, Н. Н. Гинсбург, М. М. Файбич, А. С. Гру-денков, М. В. Алтухов, И. В. Птушкин, П. Ф. Романов, правительственные награды получили Г. А. Радовицкий, А. А. Свиридов, Р. Ф. Карне-ев, Н. И. Николаев, М. Н. Бакина [10].

Продолжают исследования по совершенствованию технологий получения антибиотиков и современное поколение кировских микробиологов. Одним из результативных направлений поиска стало использование при глубинном культивировании продуцентов антибиотиков перфтороргани-ческих соединений (ПФОС) с газотранспортной функцией производства ОАО Кирово-Чепецкого химкомбината им. Б. П. Константинова [19—24]. Жидкие ПФОС обладают рядом уникальных свойств: выраженной способностью растворять газы (до 50 об. % кислорода и до 200 об. % углекислого газа) и модифицировать мембраны клеток, облегчая тем самым транспорт веществ через них, что позволило использовать их в медицине в

составе кровезаменителей, в том числе отечественного перфторана. Проведя аналогию снабжения организма человека газами и продуктами питания посредством крови и глубинной культуры микроорганизмов в ферментёре посредством

ЛИТЕРАТУРА

1. Манассеин В. А. Об отношении бактерий к зеленому кистевику (Penicilliumglaucum L.K.S. и Penicillium crustaceum F.R.S.) и о влиянии некоторых средств на развитие этого последнего. Воен мед журн 1871; 112: 9—10: 29—138.

2. Полотебнов А. Г. Патологическое значение плесени. Мед вестн 1872; 34-52: 273—459.

3. Fleming A. On the antibacterial action of cultures of Penicillium; with special reference to their use in the isolation of B.influenza. Brit J Exp Path 1929; 10: 226—236

4. Fleming A. Some problems in the use of antiseptics. Brit, Dent, J. 1931; 52: 105—117.

5. Шлегелъ Г. /.История микробиологии: Пер. с нем. М.: Едиториал УРСС. 2006; 229.

6. Abraham E. P., Chain E. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Nature 1940; 146: 837.

7. Abraham E. P. Mode of action of chemotherapeutic agents. Lancet 1941; 2: 762.

8. Abraham E. P., Chain E. Purification and some physical and chemical properties of penicillin with a note on the spectrographic examination of penicillin preparations by E. R. Holiday. Brit J Exp Path 1942; 23: 103— 119.

9. Florey H. W, Jennings M. A. Some biological properties of highly purified penicillin. Brit J Exp Path 1942; 23: 120—123.

10. Василъев H. Т., Пименов E. В., Калининский В. Б., Бакулин М. К. Вклад военных медиков в разработку технологий промышленного производства первых отечественных антибиотиков. Антибиотики и химиотер 1996; 41: 4: 3—6.

11. Appreve expansion of firms for manufacture of penicillin. J Am Med Ass 1943; 123: 2.

12. Coghill R.D. Penicillin. Chem Eng News1944; 22: 8: 588—593.

13. Callaham J. R. Penicillin large-scale production by deep fermentation. Chem Met Eng1944; 51: 4: 94-98; 130—135

аэрируемой жидкой питательной среды, была показана возможность существенного увеличения в присутствии ПФОС выхода биомассы ан-тибиотикопродуцентов разных групп и самих антибиотиков.

14. Навашин С. М. Зинида Виссарионовна Ермольева. М.: 1998; 20.

15. Ермольева З.В. Пенициллин. М.: 1946; 158.

16. Ермольева З. В. Пенициллин и его применение. Совет мед 1944; 7-8: 1-3.

17. Ермольева З. В., Маршак А. Ю., Каплун Т. И., Левитов М. М. Пенициллин и его применение при септических и гнойных осложнениях ранений. Клин мед 1944; 22 : 39—45.

18. Бакина М. Н. Экспериментальная разработка вопросов промышленного производства пенициллина: дис. ... канд. мед. наук. Киров. 1946; 176.

19. Бакулин М. К., Кучеренко А. С., Бакулина Л. В., Шведов В. В. Влияние перфторорганических соединений на рост стрептомицетов и биосинтез ими антибиотика даунорубицина. Антибиотики и химиотер 2003; 48:12: 5—8.

20. Бакулин М. К., Грудцына А. С, Плетнева А. Ю. Интенсификация роста микромицетов рода Penicillium и синтеза ими пенициллина в жидкой среде под влиянием карбогала и перфтордекалина. Ак-туал пробл биол мед экол 2004; 3: 2: 309—310.

21. Бакулин М. К., Плетнева А. Ю, Грудцына А. С. Влияние перфто-рорганических соединений на рост стрептомицетов и биосинтез ими рубомицина Актуал пробл биол мед экол 2004; 3: 2: 310—311.

22. Бакулин М. К., Грудцына А. С, Плетнева А. Ю, Кучеренко А. С., Бакулина Л. В., Шведов В. В. Характеристика антибиотической продуктивности бактерий рода Streptomyces при культивировании в среде с добавлением карбогала и перфторметилдекалина. Биотехнология 2006; 5: 39—44.

23. Бакулин М. К., Дармова С. В., Бакулин В. М., Шведов В. В. Интенсификация биосинтеза даунорубицина и роста Streptomyces pur-purogeniscleroticus под влиянием перфтор-1,3-диметилциклогекса-на. Ветеринар мед 2010; 3—4: 16—19.

24. Бакулин В. М., Мартинсон E. А., Бакулин М. К., Тихонов И. В. Влияние перфтордекалина на рост и антибиотическую активность культур Streptomyces albus и S.rimosus в жидкой среде. Ветеринар мед 2012; 3—4: 15—17.