ОБРАЗОВАНИЕ НОКАУТНЫХ ПЕРВИЧНЫХ И РАЗМНОЖЕННЫХ NK-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВ CAS9

1. Способ генетической модификации NK-клетки, включающий:
а) получение направляющей РНК (гРНК), специфичной для целевой последовательности ДНК; и
б) введение путем электропорации в целевую NK-клетку комплекса рибонуклеопротеина (RNP), содержащего эндонуклеазу CRISPR/Cas класса 2 (Cas9), связанную в комплекс с соответствующей CRISPR/Cas направляющей РНК, гибридизующей целевую последовательность внутри геномной ДНК NK-клетки.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что геном NK-клетки модифицируют путем вставки или делеции одной или более пар оснований, путем вставки фрагмента гетерологичной ДНК (например, донорного полинуклеотида), путем делеции фрагмента эндогенной ДНК, путем инверсии или транслокации фрагмента эндогенной ДНК, или их комбинации.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что NK-клетки представляют собой первичные или размноженные NK-клетки.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что первичные NK-клетки инкубируют в течение 2, 3 или 4 дней в присутствии IL-2 до проведения электропорации.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что первичные NK-клетки размножают в течение 4 дней в присутствии облученных питающих клеток до проведения электропорации.
6. Способ по п. 1, дополнительно включающий размножение модифицированных NK-клеток с облученными питающими клетками, экспрессирующими mbIL-21, после проведения электропорации.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает образование комплекса RNP путем разбавления 36 мкМ cas9 в растворе 200 мкМ крРНК и ТrасеrРНК.
8. NK-клетка, модифицированная способом по п. 1.
9. Генетически модифицированная NK-клетка, содержащая нокаут гена, кодирующего трансформирующий фактор роста-β рецептор 2 (TGFBR2) или гипоксантин фосфорибозилтрансферазу 1 (HPRT1).
10. Способ адоптивного переноса сконструированных NK-клеток субъекту, нуждающемуся в этом, включающий:
а) получение целевой NK-клетки, подлежащей модификации;
б) получение гРНК, специфичной для целевой последовательности ДНК;
в) введение путем электропорации в целевую NK-клетку комплекса RNP, содержащего эндонуклеазу CRISPR/Cas (Cas9) класса 2, связанную в комплекс с соответствующей CRISPR/Cas направляющей РНК, гибридизующейся с целевой последовательностью внутри геномной ДНК целевой NK-клетки, с образованием сконструированной NK-клетки; и
г) перенос сконструированной NK-клетки в организм субъекта.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что субъект страдает от рака.
12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетка представляет собой первичную NK-клетку, модифицированную ex vivo, и перенесенную субъекту после модификации.
13. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетка представляет собой аутологичную NK-клетку.
14. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетку получают из аллогенного донорского источника.
15. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетку размножают при помощи облученных питающих клеток, экспрессирующих mbIL-21, до введения субъекту.
16. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетку размножают в организме субъекта после переноса NK-клеток субъекту посредством введения IL-21 или облученных питающих клеток, экспрессирующих mbIL-21.
17. Способ по п. 10, отличающийся тем, что комплекс RNP нацелен на ген TGFBR2 или HPRT1.
18. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту NK-клеток, модифицированых таким образом, что они содержат нокаут TGFBR2 гена.