АНГИОПОЭТИН-2-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ
ANGIOPOIETIN-2-SPECIFIC COUPLING AGENTS

Эта заявка является частичным продолжением Заявки на патент США с номером 10/269805, поданной 10 октября 2002 года, и РСТ Заявки с номером РСТ/US02/32613, поданной 11 октября 2002 года, по которой испрашивается приоритет Предварительной заявки на патент США с регистрационным номером 60/328604, поданной 11 октября 2001 года, все из которых включены здесь в качестве ссылки. По этой заявке также испрашивается приоритет Предварительной заявки на патент США с регистрационным номером 60/620161, поданной 19 октября 2004 года, и Заявки США с номером 10/982440, поданной 4 ноября 2004 года, которые включены здесь в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к специфическим связывающим агентам, которые распознают ангиопоэтин-2 (Ang-2) и связываются с ним. Более конкретно, данное изобретение относится к получению, диагностическому применению и терапевтическому применению моноклональных и поликлональных антител и их фрагментов, которые специфически связывают Ang-2.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ангиогенез, образование новых кровеносных сосудов из существующих сосудов, является важным для многих физиологических и патологических процессов. Обычно, ангиогенез жестко регулируется про- и антиангиогенными факторами, но в случае таких заболеваний, как рак, глазные неоваскулярные заболевания, артрит и псориаз, этот процесс может проходить в искаженном виде. Folkman, J. Nat. Med., 1:27-31 (1995).
Имеется ряд заболеваний, о которых известно, что они связаны с неправильно регулируемым или нежелательным ангиогенезом. Такие заболевания включают, но не ограничиваются ими, глазную неоваскуляризацию, такую как ретинопатии (в том числе диабетическую ретинопатию), связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна, псориаз, геманглиобластому, гемангиому, артериосклероз, воспалительное заболевание, такое как ревматоидное или ревматическое воспалительное заболевание, в частности, артрит (в том числе ревматоидный артрит) или другие хронические воспалительные нарушения, такие как хроническая астма, артериальный или пост-трансплантационный атеросклероз, эндометриоз, и неопластические заболевания, например, так называемые солидные опухоли и жидкостные (или гемопоэтические) опухоли (такие как лейкозы и лимфомы). Специалистам в данной области будут известны другие заболевания, связанные с нежелательным ангиогенезом.
et al.
Cell
87
et al.
Cytogenet Cell Genet
84
et al.
Investigative Ophthalmology & Visual Science
42
et al.
Current Biology
8
et al.
Proc Natl Acad Sci USA
95
et al.
Science
277
et al.
Lab Invest
79
et al.
Nature
375
et al.
Circulation
98
et al.
Cell
87
et al.
Science
282
et al.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA
96
et al.
J Biol Chem
273
Хотя предполагалось, что многие системы трансдукции сигналов участвуют в регуляции ангиогенеза, одна из наиболее хорошо охарактеризованных и наиболее селективных систем эндотелиальных клеток включает рецепторную тирозинкиназу Tie-2 (обозначаемую “Tie-2” или “Tie-2R” (также обозначаемую “ORK”); мышиную Tie-2 также обозначаемую “tek”) и ее лиганды, ангиопоэтины (Gale, N.W. and Yancopoulos, G.D., Genes Dev. 13:1055-1066 (1999)). Имеются 4 известных ангиопоэтина: ангиопоэтин-1 (“Ang-1”) - ангиопоэтин-4 (“Ang-4”). Эти ангиопоэтины обозначают также «Tie-2-лигандами». (Davis, S., , , :1161-1169 (1996); Grosios, K., , , :118-120 (1999); Holash, J., , , :1617-1625 (1999); Koblizek, T. I., , , :529-532 (1998); Lin, P., , , :8829-8834 (1998); Maisonpierre, P. C., , , :55-60 (1997); Papapetropoulos, A., , , :213-223 (1999); Sato, T. N., , , :70-74 (1998); Shyu, K. G., , , :2081-2087 (1998); Suri, C., , , :1171-1180 (1996); Suri, C., , , :468-471 (1998); Valenzuela, D. M., , , :1904-1909 (1999); Witzenbichler, B., , , :18514-18521 (1998)). В то время как связывание Ang-1 с Tie-2 стимулирует фосфорилирование рецептора в культивируемых эндотелиальных клетках, наблюдали, что Ang-2 является как агонистом, так и антагонистом фосфорилирования рецептора Tie-2 (Davis, S., et al., (1996), выше; Maisonpierre, P.C. et al., (1997), выше; Kim, I., J.H. Kim, et al., Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular research 49(3): 659-70 (2001)).
Фенотипы мышей с нокаутом Tie-2 и Ang-1 являются сходными и предполагают, что Ang-1-стимулируемое фосфорилирование Tie-2 опосредует ремоделирование и стабилизацию сосудов in utero посредством поддержания адгезии эндотелиальных клеток - поддерживающих клеток (Dumont, D.J., et al., Genes & Development, 8:1897-1909 (1994); Sato, T.N., et al., Nature, 376:70-74 (1995); Suri, C., et al., (1996), выше). Считается, что роль Ang-1 в стабилизации сосудов сохраняется у взрослых людей, где он экспрессируется широко и конститутивно (Hanahan, D., Science, 277:48-50 (1997); Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159:391-400 (1999)). В противоположность этому, экспрессия Ang-2 прежде всего ограничивается местами ремоделирования сосудов, где он, как считают, блокирует функцию Ang-1, индуцируя посредством этого состояние васкулярной пластичности, благоприятной для ангиогенеза (Hanahan, D., выше; Holash, J., et al., Science, 284:1994-1998 (1999); Maisonpierre, P.C., et al., (1997), выше).
et al.
American Journal of Pathology
155
et al.,
Cancer Research
61
et al.
Investigative Ophthalmology & Visual Science
42
et al.
supra
et al.
Journal of Investigative Dermatology
116
et al.
Investigative Ophthalmology & Visual Science
40
et al.
American Journal of Pathology
153
et al.
J Clin Invest
103
et al.
International Journal of Oncology,
15
et al.
Journal of Periodontal Research
35
et al.
Многочисленные опубликованные исследования целенаправленно демонстрировали сосудоселективную экспрессию Ang-2 в патологических состояниях, связанных с ангиогенезом. Эти патологические состояния включают, например, псориаз, дегенерацию желтого пятна и рак (Bunone, G., , , :1967-1976 (1999); Etoh, T., , :2145-2153 (2001); Hangai, M., , , :1617-1625 (2001); Holash, J., , (1999) ; Kuroda, K., , , :713-720 (2001); Otani, A., , , :1912-1920 (1999); Stratmann, A., , , :1459-1466 (1998); Tanaka, S., , , :34-345 (1999); Yoshida, Y., , :1221-1225 (1999); Yuan, K., , , :165-171 (2000); Zagzag, D., , (1999), выше). Большинство из этих исследований фокусировались на раке, причем многие типы опухолей, по-видимому, обнаруживают васкулярную экспрессию Ang-2. В противоположность его экспрессии в патологическом ангиогенезе, экспрессия Ang-2 в нормальных тканях является чрезвычайно ограниченной (Maisonpierre, P.C., et al., (1997), выше, Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498 (1999)). У здорового взрослого человека этими тремя основными участками ангиогенеза являются яичник, плацента и матка; они являются первичными тканями в нормальных (т.е. не в раковых) тканях, в которых была детектирована мРНК Ang-2.
Некоторые функциональные исследования предполагают, что Ang-2 может участвовать в опухолевом ангиогенезе. Ahmad et al. (Cancer Res., 61:1255-1259 (2001)) описывают сверхэкспрессию Ang-2 и показывают, что она, предположительно, связана с увеличением роста опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата. См. также Etoh et al., выше, и Tanaka et al., выше, где представлен результат, предположительно, связывающий сверхэкспрессию Ang-2 с гиперваскулярностью опухоли. Однако, в противоположность этому, Yu et al., (Am. J. Path., 158:563-570 (2001)) сообщают данные, показывающие, что сверхэкспрессия Ang-2 в клетках карциномы легких Lewis и карциномы молочной железы ТА3, по-видимому, пролонгировали выживание мышей, инъецированных соответствующими трансфектантами.
В последние несколько лет различные публикации предлагали Ang-1, Ang-2 и/или Tie-2 в качестве возможной мишени для противораковой терапии. Например, каждый из Патентов США с номерами 6166185, 5650490 и 5814464 описывает концепцию антител против Tie-2-лигандов и антител против Tie-2-рецепторов. Lin et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8829-8834 (1998)) мышам инъецировали аденовирус, экспрессирующий растворимый Tie-2; этот растворимый Tie-2 предположительно уменьшал количество и размер опухолей, развитых у мышей. В родственном исследовании Lin et al. (J. Clin. Invest., 100:2072-2078 (1997)) крысам инъецировали растворимую форму Tie-2; это соединение предположительно уменьшало размер опухоли у крыс. Siemeister et al. (Cancer Res., 59:3185-3189 (1999)) генерировали клеточные линии меланомы человека, экспрессирующие внеклеточный домен Tie-2, инъецировали эти клеточные линии голым мышам и сделали вывод, что растворимый Tie-2 предположительно приводил к «значимому ингибированию» роста опухолей и ангиогенеза опухолей. Ввиду этой информации и вследствие того, что как Ang-1, так и Ang-2 связываются с Tie-2, из этих исследований неясно, может ли Ang-1, Ang-2 или Tie-2 быть привлекательной мишенью для противораковой терапии.
Слияние некоторых пептидов со стабильным белком плазмы, таким как константная область Ig, для улучшения полупериода существования в организме этих молекул было описано, например, в Публикации РСТ WO 00/24782, опубликованной 4 мая 2000 года.
Это слияние белка или его фрагмента со стабильным белком плазмы, таким как константная область Ig, для улучшения полупериода существования в организме этих молекул было много раз описано (см., например, Патент США 5480981; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, (1995); Fisher et al., N. Engl. J. Med., 334:1697-1702, (1996); Van Zee, K. et al., J. Immunol., 156:2221-2230, (1996); Патент США 5808029, выданный 15 сентября 1998; Capon et al., Nature, 337:525-531, (1989); Harvill et al., Immunotech., 1:95-105, (1995); WO 97/23614, опубликованный 3 июля 1997 года; РСТ/US 97/23183, поданный 11 декабря 1997 года; Linsley, J. Exp. Med., 174:561-569, (1991); WO 95/21258, опубликованный 10 августа 1995 года).
Эффективная анти-Ang-2-терапия может быть полезной для огромного числа раковых пациентов, так как большинству солидных опухолей требуется неоваскуляризация для роста за пределы 1-2 миллиметров в диаметре. Такая терапия может иметь широкую применимость также и в других связанных с ангиогенезом заболеваниях, таких как ретинопатии, артрит и псориаз.
Имеется не получившая развития потребность в идентификации новых агентов, которые специфически распознают и связывают Ang-2. Такие агенты могли бы быть применимы для диагностического скрининга и терапевтического вмешательства в патологические состояния, которые связаны с активностью Ang-2.
Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение специфических связывающих Ang-2 агентов, которые модулируют активность Ang-2.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение обеспечивает антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит вариабельный район тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из: 526 HC (SEQ ID NO: 1); 528 HC (SEQ ID NO: 3); 531 HC (SEQ ID NO: 5); 533 HC (SEQ ID NO: 7); 535 HC (SEQ ID NO: 9); 536 HC (SEQ ID NO: 11); 537 HC (SEQ ID NO: 13); 540 HC (SEQ ID NO: 15); 543 HC (SEQ ID NO: 17); 544 HC (SEQ ID NO: 19); 545 HC (SEQ ID NO: 21); 546 HC (SEQ ID NO: 23); 551 HC (SEQ ID NO: 25); 553 HC (SEQ ID NO: 27); 555 HC (SEQ ID NO: 29); 558 HC (SEQ ID NO: 31); 559 HC (SEQ ID NO: 33); 565 HC (SEQ ID NO: 35); F1-C6 HC (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 HC (SEQ ID NO: 39); FD-B2 HC (SEQ ID NO: 41); FE-B7 HC (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45); FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC (SEQ ID NO: 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); IK-2E2 HC (SEQ ID NO: 59); IP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61); и его антигенсвязывающие фрагменты; а указанная легкая цепь содержит вариабельный район легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из: 526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа (SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210); 543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа (SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа (SEQ ID NO: 28); 555 каппа (SEQ ID NO: 30); 558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36); FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа (SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7 каппа (SEQ ID NO: 56); IP-2C11 каппа (SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда (SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8); 535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14); 540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда (SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда (SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда (SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда (SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда (SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда (SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда (SEQ ID NO: 58); IK-2E2 лямбда (SEQ ID NO: 60); и его антигенсвязывающие фрагменты.
Данное изобретение обеспечивает также специфический агент связывания, содержащий по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 60, и его фрагменты.
Должно быть понятно, что специфическим связывающим агентом может быть, например, антитело, такое как поликлональное, моноклональное, химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело. Антителом может быть также одноцепочечное антитело. Кроме того, данное изобретение относится к гибридоме, которая продуцирует моноклональное антитело по данному изобретению.
Должно быть понятно, что данное изобретение относится к конъюгатам, описанным здесь. Конъюгатом может быть, например, специфический связывающий агент (такой как антитело) согласно изобретению.
Кроме того, данное изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим специфические связывающие агенты (такие как антитело) согласно изобретению, а также к вектору, содержащему такую молекулу нуклеиновой кислоты, а также к клетке-хозяину, содержащей вектор.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ получения специфического связывающего агента, предусматривающий: (а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей специфический связывающий агент по п. 1; (b) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине и (с) выделение указанного специфического связывающего агента. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, предусматривающий: (а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело в соответствии с данным изобретением; (b) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине и (с) выделение указанного связывающего агента.
Кроме того, данное изобретение относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающего введением терапевтически эффективного количества специфического связывающего агента в соответствии с данным изобретением. Данное изобретение обеспечивает также способ лечения рака у млекопитающего введением терапевтически эффективного количества специфического связывающего агента в соответствии с данным изобретением.
Данное изобретение относится также к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с данным изобретением. Кроме того, обеспечивает также способ лечения рака у млекопитающего, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с данным изобретением.
Должно быть понятно, что данное изобретение относится, кроме того, к фармацевтическим композициям, содержащим специфический связывающий агент в соответствии с данным изобретением и фармацевтически приемлемый агент для приготовления композиции. Фармацевтическая композиция может содержать антитело в соответствии с данным изобретением и фармацевтически приемлемый агент для приготовления композиции.
Данное изобретение обеспечивает способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2 введением одного или нескольких специфических связывающих агентов данного изобретения. Данное изобретение обеспечивает также способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2 введением антитела согласно изобретению.
Кроме того, данное изобретение относится к способу модуляции по меньшей мере одного свойства из васкулярной проницаемости или утечки плазмы у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества специфического связывающего агента в соответствии с данным изобретением. Данное изобретение относится также к способу лечения по меньшей мере одного заболевания из глазного неоваскулярного заболевания, ожирения, гемангиобластомы, гемангиомы, артериосклероза, воспалительного заболевания, воспалительных нарушений, атеросклероза, эндометриоза, неопластического заболевания, связанного с костями заболевания или псориаза у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества специфического связывающего агента в соответствии с данным изобретением.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ модуляции по меньшей мере одного свойства из васкулярной проницаемости или утечки плазмы у млекопитающего, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с данным изобретением. Данное изобретение относится также к способу лечения по меньшей мере одного заболевания из глазного неоваскулярного заболевания, ожирения, гемангиобластомы, гемангиомы, артериосклероза, воспалительного заболевания, воспалительных нарушений, атеросклероза, эндометриоза, неопластического заболевания, связанного с костями заболевания или псориаза у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с данным изобретением.
Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества специфического связывающего агента в соответствии с данным изобретением и химиотерапевтического агента. Специалистам в данной области должно быть понятно, что специфический связывающий агент и химиотерапевтический агент не должны обязательно вводиться одновременно.
Данное изобретение относится также к способу лечения рака у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества антитела в соответствии с данным изобретением и химиотерапевтического агента. Антитело и химиотерапевтический агент не должны обязательно вводиться одновременно.
Данное изобретение обеспечивает также специфический связывающий агент, содержащий определяющий комплементарность район 1 (CDR 1) любой из следующих последовательностей: 526 HC (SEQ ID NO: 1); 528 HC (SEQ ID NO: 3); 531 HC (SEQ ID NO: 5); 533 HC (SEQ ID NO: 7); 535 HC (SEQ ID NO: 9); 536 HC (SEQ ID NO: 11); 537 HC (SEQ ID NO: 13); 540 HC (SEQ ID NO: 15); 543 HC (SEQ ID NO: 17); 544 HC (SEQ ID NO: 19); 545 HC (SEQ ID NO: 21); 546 HC (SEQ ID NO: 23); 551 HC (SEQ ID NO: 25); 553 HC (SEQ ID NO: 27); 555 HC (SEQ ID NO: 29); 558 HC (SEQ ID NO: 31); 559 HC (SEQ ID NO: 33); 565 HC (SEQ ID NO: 35); F1-C6 HC (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 HC (SEQ ID NO: 39); FD-B2 HC (SEQ ID NO: 41); FE-B7 HC (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45); FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC (SEQ ID NO: 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); IK-2E2 HC (SEQ ID NO: 59); IP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61); 526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа (SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210); 543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа (SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа (SEQ ID NO: 28); 555 каппа (SEQ ID NO: 30); 558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36); FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа (SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7 каппа (SEQ ID NO: 56); IP-2C11 каппа (SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда (SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8); 535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14); 540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда (SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда (SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда (SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда (SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда (SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда (SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда (SEQ ID NO: 58) и IK-2E2 лямбда (SEQ ID NO: 60).
Данное изобретение обеспечивает также специфический связывающий агент, содержащий определяющий комплементарность район 2 (CDR 2) любой из следующих последовательностей: 526 HC (SEQ ID NO: 1); 528 HC (SEQ ID NO: 3); 531 HC (SEQ ID NO: 5); 533 HC (SEQ ID NO: 7); 535 HC (SEQ ID NO: 9); 536 HC (SEQ ID NO: 11); 537 HC (SEQ ID NO: 13); 540 HC (SEQ ID NO: 15); 543 HC (SEQ ID NO: 17); 544 HC (SEQ ID NO: 19); 545 HC (SEQ ID NO: 21); 546 HC (SEQ ID NO: 23); 551 HC (SEQ ID NO: 25); 553 HC (SEQ ID NO: 27); 555 HC (SEQ ID NO: 29); 558 HC (SEQ ID NO: 31); 559 HC (SEQ ID NO: 33); 565 HC (SEQ ID NO: 35); F1-C6 HC (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 HC (SEQ ID NO: 39); FD-B2 HC (SEQ ID NO: 41); FE-B7 HC (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45); FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC (SEQ ID NO: 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); IK-2E2 HC (SEQ ID NO: 59); IP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61); 526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа (SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210); 543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа (SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа (SEQ ID NO: 28); 555 каппа (SEQ ID NO: 30); 558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36); FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа (SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7 каппа (SEQ ID NO: 56); IP-2C11 каппа (SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда (SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8); 535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14); 540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда (SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда (SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда (SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда (SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда (SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда (SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда (SEQ ID NO: 58) и IK-2E2 лямбда (SEQ ID NO: 60).
Данное изобретение обеспечивает также специфический связывающий агент, содержащий определяющий комплементарность район 3 (CDR 3) любой из следующих последовательностей: 526 HC (SEQ ID NO: 1); 528 HC (SEQ ID NO: 3); 531 HC (SEQ ID NO: 5); 533 HC (SEQ ID NO: 7); 535 HC (SEQ ID NO: 9); 536 HC (SEQ ID NO: 11); 537 HC (SEQ ID NO: 13); 540 HC (SEQ ID NO: 15); 543 HC (SEQ ID NO: 17); 544 HC (SEQ ID NO: 19); 545 HC (SEQ ID NO: 21); 546 HC (SEQ ID NO: 23); 551 HC (SEQ ID NO: 25); 553 HC (SEQ ID NO: 27); 555 HC (SEQ ID NO: 29); 558 HC (SEQ ID NO: 31); 559 HC (SEQ ID NO: 33); 565 HC (SEQ ID NO: 35); F1-C6 HC (SEQ ID NO: 37); FB1-A7 HC (SEQ ID NO: 39); FD-B2 HC (SEQ ID NO: 41); FE-B7 HC (SEQ ID NO: 43); FJ-G11 HC (SEQ ID NO: 45); FK-E3 HC (SEQ ID NO: 47); G1D4 HC (SEQ ID NO: 49); GC1E8 HC (SEQ ID NO: 51); H1C12 HC (SEQ ID NO: 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID NO: 55); IF-1C10 HC (SEQ ID NO: 57); IK-2E2 HC (SEQ ID NO: 59); IP-2C11 HC (SEQ ID NO: 61); 526 каппа (SEQ ID NO: 2); 536 (THW) каппа (SEQ ID NO: 12); 536 (LQT) каппа (SEQ ID NO: 210) 543 каппа (SEQ ID NO: 18); 544 каппа (SEQ ID NO: 20); 551 каппа (SEQ ID NO: 26); 553 каппа (SEQ ID NO: 28); 555 каппа (SEQ ID NO: 30); 558 каппа (SEQ ID NO: 32); 565 каппа (SEQ ID NO: 36); FE-B7 каппа (SEQ ID NO: 44); FJ-G11 каппа (SEQ ID NO: 46); FK-E3 каппа (SEQ ID NO: 48); IA1-1E7 каппа (SEQ ID NO: 56); IP-2C11 каппа (SEQ ID NO: 62); 528 лямбда (SEQ ID NO: 4); 531 лямбда (SEQ ID NO: 6); 533 лямбда (SEQ ID NO: 8); 535 лямбда (SEQ ID NO: 10); 537 лямбда (SEQ ID NO: 14); 540 лямбда (SEQ ID NO: 16); 545 лямбда (SEQ ID NO: 22); 546 лямбда (SEQ ID NO: 24); 559 лямбда (SEQ ID NO: 34); F1-C6 лямбда (SEQ ID NO: 38); FB1-A7 лямбда (SEQ ID NO: 40); FD-B2 лямбда (SEQ ID NO: 42); G1D4 лямбда (SEQ ID NO: 50); GC1E8 лямбда (SEQ ID NO: 52); H1C12 лямбда (SEQ ID NO: 54); IF-1C10 лямбда (SEQ ID NO: 58) и IK-2E2 лямбда (SEQ ID NO: 60).
Кроме того, данное изобретение обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую специфический связывающий агент в соответствии с данным изобретением.
Кроме того, данное изобретение относится к способу детектирования уровня ангиопоэтина-2 в биологической пробе (а) контактированием специфического связывающего агента согласно изобретению с пробой и (b) определением степени связывания специфического связывающего агента с пробой. Данное изобретение относится также к способу детектирования уровня ангиопоэтина-2 в биологической пробе (а) контактированием антитела согласно изобретению с пробой и (b) определением степени связывания антитела с пробой.
Данное изобретение относится также к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или композиции, описанных здесь. Данное изобретение относится также к способу модуляции ангиогенеза у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или композиции, описанных здесь. Данное изобретение относится также к способу ингибирования роста опухоли, характеризующейся нежелательным ангиогенезом, у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или композиции, описанных здесь. Кроме того, данное изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающего, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или композиции, описанных здесь, и химиотерапевтического агента. В предпочтительном варианте осуществления, этим химиотерапевтическим агентом является по меньшей мере один из 5-FU, СРТ-11 и Таксотер. Однако должно быть понятно, что могут быть использованы и другие подходящие химиотерапевтические агенты и другие противораковые терапии.
Будет понятно, что специфические связывающие агенты данного изобретения могут быть использованы для лечения ряда заболеваний, связанных с нерегулируемым или нежелательным ангиогенезом. Такие заболевания включают, но не ограничиваются ими, глазную неоваскуляризацию, такую как ретинопатия (в том числе диабетическую ретинопатию и связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна), псориаз, гемангиобластому, гемангиому, артериосклероз, воспалительное заболевание, такое как ревматоидное или ревматическое воспалительное заболевание, в частности, артрит (в том числе ревматоидный артрит), или другие хронические воспалительные нарушения, такие как хроническая астма, артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз, и неопластические заболевания, например, так называемые солидные опухоли и жидкостные опухоли (такие как лейкозы). Специалистам в данной области будут очевидными дополнительные заболевания, которые можно лечить введением специфических связывающих агентов. Такие дополнительные заболевания включают, но не ограничиваются ими, ожирение, васкулярную проницаемость, утечку плазмы и связанные с костями нарушения, в том числе остеопороз. Таким образом, кроме того, данное изобретение относится к способам лечения этих заболеваний, связанных с нерегулируемым или нежелательным ангиогенезом.
Другие варианты осуществления этого изобретения будут очевидными из представленного здесь описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 изображает график размера опухоли (y-ось) в зависимости от времени (х-ось) в несущих опухоль мышах, которых обрабатывали либо анти-Ang-2-антителом (клон 533, 537 или 544) согласно изобретению, либо контрольным антителом, либо забуференным фосфатом солевым раствором (PBS). Подробности описаны в Примерах.
Фигуры 2а, 2в и 2с изображают результаты картирования эпитопов (OD 370) для полноразмерного Ang-2 человека (hAng-2), относительно N-конца hAng-2 и С-конца hAng-2, соответственно, для пептидных антител TN8-Con4-C, L1-7-N и 12-9-3-С в соответствии с данным изобретением, а также для контрольного пептидного антитела, Tie2-Fc, С2В8 или 5В12. Подробности описаны в Примерах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заголовки разделов используют здесь только для организационных целей, и они не должны пониматься как ограничивающие каким-либо образом описанный предмет изобретения.
Для получения рекомбинантной молекулы ДНК, белка и антитела, а также для культуры ткани и трансформации клеток могут быть использованы стандартные способы. Ферментативные реакции и способы очистки обычно выполняют в соответствии с описаниями изготовителя или, как обычно выполняют в данной области с использованием общепринятых процедур, таких как процедуры, описанные в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)), или как описано здесь. Если нет особых определений, используемая номенклатура и лабораторные процедуры и способы аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, являются хорошо известными и обычно используемыми в данной области. Стандартные способы могут быть использованы для химических синтезов, химических анализов, фармацевтического приготовления, получения готовых форм и доставки, а также лечения пациентов.
Определения
В контексте данного изобретения, следующие термины, если нет других указаний, должны пониматься, как имеющие следующие значения.
Термин «Ang-2» относится к полипептиду, представленному на фигуре 6 Патента США № 6166185 (“Tie-2-лиганд-2”), или его фрагментам, а также родственным полипептидам, которые включают аллельные варианты, сплайсинговые варианты, производные, варианты, имеющие замены, делеции и/или инсерции, слитые пептиды и полипептиды и межвидовые гомологи. Полипептид Ang-2 может включать или может не включать дополнительные концевые остатки, например, лидерные последовательности, нацеливающие последовательности, аминоконцевой метионин, аминоконцевые остатки метионина и лизина и/или метку или последовательности слитых белков, в зависимости от способа их приготовления.
Термин «биологически активный» в применении относительно Ang-2 или Ang-2-специфического связывающего агента относится к пептиду или полипептиду, имеющему по меньшей мере одну характеристику активности Ang-2 или Ang-2-специфического связывающего агента. Специфический связывающий Ang-2 агент может иметь агонистическую, антагонистическую или нейтрализующую или блокирующую активность в отношении по меньшей мере одной биологической активности Ang-2.
Термин «специфический связывающий агент» относится к молекуле, предпочтительно белковой молекуле, которая связывает Ang-2 (и его варианты и производные, определенные здесь) с более высокой аффинностью, чем другие ангиопоэтины. Специфическим связывающим агентом может быть белок, пептид, нуклеиновая кислота, углевод, липид или соединение с малой молекулярной массой, которое связывается преимущественно с Ang-2. В предпочтительном варианте осуществления, специфическим связывающим агентом в соответствии с данным изобретением является антитело, такое как поликлональное антитело, моноклональное антитело (mAb), химерное антитело, CDR-трансплантированное антитело, мультиспецифическое антитело, биспецифическое антитело, каталитическое антитело, гуманизированное антитело, антитело человека, идиотипическое (анти-Id) антитело и антитела, которые могут быть мечеными, в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, варианты или производные, либо по отдельности, либо в комбинации с другими аминокислотными последовательностями, обеспеченные известными способами. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, ферментативное расщепление, химическое расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные способы. Анти-Ang-2-специфические связывающие агенты данного изобретения способны связывать части Ang-2, которые модулируют, например, ингибируют или стимулируют, биологическую активность Ang-2 и/или другие Ang-2-ассоциированные активности.
Термин «поликлональное антитело» относится к гетерогенной смеси антител, которые распознают различные эпитопы на одном и том же антигене и связываются с ними. Поликлональные антитела могут быть получены из неочищенных препаратов сыворотки или могут быть очищены с использованием, например, антиген-аффинной хроматографии или Белок А/Белок G-аффинной хроматографии.
Термин «моноклональные антитела» относится к скоплению антител, кодируемых одной и той же молекулой нуклеиновой кислоты, которые необязательно продуцируются единственной гибридомой или другой клеточной линией или трансгенным животным, так что каждое моноклональное антитело будет обычно распознавать один и тот же эпитоп на антигене. Термин «моноклональное» не ограничивается каким-либо конкретным способом для получения антитела и не является термином, ограничивающимся антителами, продуцируемыми в конкретном виде, например, мыши, крысе и т.д.
Термин «химерные антитела» относится к антителам, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующей последовательности в антителе, полученном из конкретного вида или принадлежащем к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остаток этой цепи (этих цепей) является идентичным или гомологичным соответствующей последовательности в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител. Включены также фрагменты таких антител, которые проявляют желаемую биологическую активность (т.е. способность специфически связывать Ang-2). См. Патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 81:6851-6855 (1985).
Термин «CDR-трансплантированное антитело» относится к антителу, в котором CDR из одного антитела конкретного вида или изотипа рекомбинантно встроено в каркас другого антитела того же самого или другого вида или изотипа.
Термин «мультиспецифическое антитело» относится к антителу, имеющему вариабельные области, которые распознают более чем один эпитоп на одном или нескольких антигенах. Подклассом этого типа антитела является «биспецифическое антитело», которое узнает два разных эпитопа на одном и том же или различных антигенах.
«Каталитические антитела» обозначают антитела, в которых одна или несколько цитотоксических или более часто одна или несколько биологически активных частей молекул присоединены к нацеливающему связывающему агенту.
Термин «гуманизированное антитело» относится к конкретному типу CDR-трансплантированного антитела, в котором каркасная область антитела получена из человека, но каждый CDR заменен CDR, полученным из другого вида, например, мышиным CDR. Термин «CDR» определен ниже.
Термин «полностью человеческое» антитело обозначает антитело, в котором как CDR, так и каркасная область происходят из одной или нескольких ДНК-молекул человека.
Термин «антиидиотипическое» антитело обозначает любое антитело, которое специфически связывается с другим антителом, которое распознает антиген. Получение антиидиотипических антител может выполняться любым из описанных здесь способов получения Ang-2-специфических антител, за исключением того, что эти антитела получают, например, иммунизацией животного Ang-2-специфическим антителом или его Ang-2-связывающим фрагментом, а не самим Ang-2-полипептидом или его фрагментом.
Термин «варианты» включает в данном контексте те полипептиды, в которых аминокислотные остатки встроены в природную (или по меньшей мере известную) аминокислотную последовательность связывающего агента, делетированы из этой аминокислотной последовательности или заменены в этой аминокислотной последовательности. Варианты данного изобретения включают слитые белки, описанные ниже.
«Производные» включают связывающие агенты, которые были химически модифицированы некоторым образом, отличающиеся от вариантов с инсерцией, делецией или заменой.
«Специфически связывает Ang-2» обозначает способность специфического связывающего агента (такого как антитело или его фрагмент) согласно изобретению распознавать и связывать зрелый, полноразмерный или имеющий частичную длину полипептид Ang-2, или его ортолог, так что его аффинность (определенная, например, при помощи анализов ELISA или BIAcore, описанных здесь) или способность нейтрализации (определенная, например, анализами нейтрализации ELISA, описанными здесь, или сходными анализами) является по меньшей мере в 10 раз более высокой, но необязательно в 50 раз более высокой, в 100, 250 или 500 раз более высокой, или даже по меньшей мере в 1000 раз более высокой, чем аффинность или способность нейтрализации специфического связывающего агента в отношении любого другого ангиопоэтина или другого пептида или полипептида.
Термин «антигенсвязывающий домен» или «антигенсвязывающая область» относится к той части специфического связывающего агента (такого как молекула антитела), которая содержит аминокислотные остатки (или другие части молекулы) специфического связывающего агента, которые взаимодействуют с антигеном и придают этому связывающему агенту его специфичность и аффинность в отношении этого антигена. В антителе антигенсвязывающий домен обычно называют «определяющей комплементарность областью, или CDR».
Термин «эпитоп» обозначает часть любой молекулы, способной быть распознаваемой и быть связанной специфическим связывающим агентом, например, антителом, в одной или нескольких антигенсвязывающих областях агента. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как, например, боковые цепи аминокислот или углеводов, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитопы в данном контексте могут быть смежными или несмежными. Кроме того, эпитопы могут быть миметическими в том смысле, что они содержат трехмерную структуру, которая идентична эпитопу, использованному для генерирования антитела, но все-таки не содержит ни один из аминокислотных остатков или содержит только некоторые из аминокислотных остатков, обнаруживаемых в Ang-2, используемом для стимуляции иммунной реакции в виде антител.
Термин «ингибирующий и/или нейтрализующий эпитоп» обозначает эпитоп, который при связывании специфическим связывающим агентом, таким как антитело, приводит к потере (или по меньшей мере уменьшению) биологической активности молекулы, клетки или организма, содержащих такой эпитоп, in vivo, in vitro или in situ. В контексте данного изобретения, нейтрализующий эпитоп локализован на биологически активном районе Ang-2 или связан с биологически активным районом Ang-2. Альтернативно, термин «активирующий эпитоп» обозначает эпитоп, который при связывании специфическим связывающим агентом, таким как антитело, приводит к активации или по меньшей мере поддержанию биологически активной конформации Ang-2.
2
Термин «фрагмент антитела» относится к пептиду или полипептиду, который содержит меньше, чем полное, интактное антитело. Полные антитела содержат две функционально независимые части или два фрагмента: антигенсвязывающий фрагмент, известный как «Fab», и карбокси-концевой кристаллизуемый фрагмент, известный как «Fc»-фрагмент. Fab-фрагмент включает первый константный домен, состоящий как из тяжелой, так и из легкой цепи (СН1 и CL1) вместе с вариабельными районами как из тяжелой, так и из легкой цепи, которые связывают специфический антиген. Каждый из вариабельных районов тяжелой и легкой цепи включает три определяющих комплементарность района (CDR) и аминокислотные остатки каркасной области, которые разделяют отдельные CDR. Fc-область содержит второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН2 и СН3) и участвует в эффекторных функциях, таких как активация комплемента и атака фагоцитарными клетками. В некоторых антителах районы Fc и Fab разделены «шарнирной областью» антитела и, в зависимости от того, как протеолитически расщепляется полноразмерное антитело, шарнирная область может быть связана либо с Fab-, либо с Fc-фрагментом. Например, расщепление антитела протеазой папаином в шарнирной области связано с получением Fc-фрагмента, тогда как расщепление протеазой пепсином обеспечивает фрагмент, в котором шарнирная область связана с обоими Fab-фрагментами одновременно. Поскольку два Fab-фрагмента фактически ковалентно связаны после расщепления пепсином, полученный фрагмент называют F(ab')-фрагментом.
Fc-домен может иметь относительно продолжительный полупериод существования в сыворотке, в то время как Fab является короткоживущим (Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)). При экспрессии в виде части слитого белка Fc-домен может обеспечивать более продолжительный полупериод существования в сыворотке или включать такие функции, как связывание Fc-рецептора, связывание Белка А, фиксация комплемента и, возможно, даже плацентарный перенос в белок, с которым он слит. Fc-домен может быть природным Fc-доменом или может быть изменен для улучшения некоторых качеств, таких как терапевтические качества или время циркуляции в кровотоке.
Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к части легкой и/или тяжелой цепей антитела, обычно включающей приблизительно аминоконцевые 120-130 аминокислот в тяжелой цепи и приблизительно 100-110 аминоконцевых аминокислот в легкой цепи. Вариабельные области обычно сильно различаются по аминокислотной последовательности даже среди антител одного и того же вида. Вариабельная область антитела обычно определяет связывание и специфичность каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Вариабельность в последовательности сконцентрирована в районах, называемых определяющими комплементарность районами (CDR), тогда как более высококонсервативные районы в вариабельном домене называют каркасными районами (FR). CDR легкой и тяжелой цепей содержат в себе аминокислоты, которые являются в значительной степени ответственными за прямое взаимодействие антитела с антигеном, однако аминокислоты в FR могут в значительной степени влиять на связывание/узнавание антигена, как обсуждается здесь ниже.
Термин «легкая цепь» при ссылке на антитело в собирательном значении относится к двум различным типам, называемым каппа (K) или лямбда (L) на основе аминокислотной последовательности константных доменов.
1
2
3
4
Термин «тяжелая цепь» при ссылке на антитело собирательно относится к пяти различным типам, называемым альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, на основе аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. Комбинация тяжелой и легкой цепей может давать пять известных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, в том числе четыре известных подкласса IgG, обозначаемых как IgG, IgG, IgG и IgG.
Термин «природный» при использовании в связи с биологическими материалами, такими как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к материалам, которые обнаружены в природе и не модифицированы человеком.
Термин «выделенный» при использовании в отношении Ang-2 или в отношении специфического связывающего Ang-2 агента относится к соединению, которое не содержит по меньшей мере одного загрязняющего полипептида или соединения, которое обнаруживается в его природном окружении, и предпочтительно по существу не содержит любые другие загрязняющие полипептиды млекопитающих, которые могли бы препятствовать его терапевтическому или диагностическому применению.
Термин «зрелый» при использовании в отношении Ang-2 и анти-Ang-2-антитела или в отношении любого другого белкового специфического связывающего Ang-2 агента относится к пептиду или полипептиду, лишенному лидерной или сигнальной последовательности. При экспрессии связывающего агента согласно изобретению, например, в прокариотической клетке-хозяине, «зрелый» пептид или полипептид может также включать дополнительные аминокислотные остатки (но все еще не иметь лидерной последовательности), такие как аминоконцевой метионин, или один или несколько остатков метионина и лизина. Пептид или полипептид, полученный таким образом, может быть использован с этими дополнительными аминокислотными остатками или без этих дополнительных аминокислотных остатков, которые были удалены.
Термин «эффективное количество» и «терапевтически эффективное количество» при использовании в отношении специфического связывающего Ang-2 агента обозначает количество специфического связывающего агента, которое является полезным или необходимым для поддержания наблюдаемого изменения в уровне одной или нескольких биологических активностей Ang-2. Этим изменением может быть либо увеличение, либо уменьшение уровня активности Ang-2. Предпочтительно, этим изменением является уменьшение активности Ang-2.
Специфические связывающие агенты и антитела
В данном контексте, термин «специфический связывающий агент» обозначает молекулу, которая специфически распознает и связывает Ang-2, как описано здесь. Подходящие специфические связывающие агенты включают, но не ограничиваются ими, антитела и их производные, полипептиды и малые молекулы. Подходящие специфические связывающие агенты могут быть получены с использованием известных в данной области способов. Пример специфического связывающего агента полипептида Ang-2 данного изобретения способен связывать определенную часть полипептида Ang-2 и предпочтительно модулировать активность или функцию полипептида Ang-2.
Специфические связывающие агенты, такие как антитела и фрагменты антител, которые специфически связывают полипептиды Ang-2, находятся в рамках данного изобретения. Эти антитела могут быть поликлональными, в том числе моноспецифическими поликлональными, моноклональными (mAb), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, например, CDR-трансплантированными, человеческими, одноцепочечными, каталитическими, мультиспецифическими и/или биспецифическими, а также их фрагментами, вариантами и/или производными.
Поликлональные антитела, направленные на полипептид Ang-2, обычно получают в животных (например, кроликах, хомячках, козах, овцах, лошадях, свиньях, крысах, песчанках, морских свинках, мышах или любом другом подходящем млекопитающем, а также других видах, не являющихся млекопитающими) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций полипептида Ang-2 или его фрагмента с адъювантом или без адъюванта. Такие адъюванты включают, но не ограничиваются ими, полный и неполный адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы типа плуроников, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин фиссуреллы и динитрофенол. BCG (бациллы Calmette-Guerin) и Corinebacterium parvum являются потенциально применимыми адъювантами человека. Может быть полезным конъюгирование антигенного полипептида с белком-носителем, который является иммуногенным в подлежащем иммунизации виде, таким как гемоцианин фиссуреллы, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор трипсина сои. Для усиления иммунной реакции используют также агрегирующие агенты, например, квасцы. После иммунизации из животных извлекали кровь и сыворотку анализировали для определения титра антител против полипептида Ang-2, который мог быть определен с использованием анализов, описанных здесь в разделе «Примеры». Поликлональные антитела могут быть использованы в сыворотках, в которых они были детектированы, или могут быть очищены из этих сывороток с использованием, например, антиген-аффинной хроматографии или Белок А или G-аффинной хроматографии.
Моноклональные антитела, направленные против полипептидов Ang-2, могут быть получены с использованием, например, но без ограничения, традиционного «гибридомного» способа или более нового способа «фагового дисплея». Например, моноклональные антитела согласно изобретению могут быть получены гибридомным способом, описанным в Kohler et al., Nature 256:495 (1975); гибридомным способом В-клеток человека (Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 80: 2026-2030 (1983); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)) и EBV-гибридомным способом (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, New York N.Y., pp. 77-96, (1985)). Данное изобретение обеспечивает также гибридомные клеточные линии, которые продуцируют моноклональные антитела, реактивные с полипептидами Ang-2.
При использовании гибридомного способа могут быть использованы миеломные клеточные линии. Такие клеточные линии, пригодные для применения в продуцирующих гибридому процедурах слияния, предпочтительно являются не продуцирующими антитела линиями, имеют высокую эффективность слияния и дефициты ферментов, которые делают их неспособными к росту в определенных селективных средах, которые поддерживают рост только желаемых слитых клеток (гибридом). Например, клеточными линиями, используемыми в мышиных слияниях, являются Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 и S194/5XXO Bul; клеточными линиями, используемыми в крысиных слияниях, являются R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F и 4B210. Другими клеточными линиями, используемыми для клеточных слияний, являются U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 и UC729-6. Гибридомы и другие клеточные линии, которые продуцируют моноклональные антитела, рассматриваются как являющиеся новыми композициями данного изобретения.
Метод фагового дисплея может быть также использован для генерирования моноклональных антител из любого вида. Предпочтительно, этот метод используют для получения полностью человеческих моноклональных антител, в котором полинуклеотид, кодирующий единственный Fab или Fv-фрагмент антител, экспрессируется на поверхности фаговой частицы (Hoogenboom et al., J Mol Biol 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); см. также Патент США № 5885793)). Каждый фаг может быть «подвергнут скринингу» с использованием анализов связывания, описанных здесь, для идентификации фрагментов антител, имеющих аффинность в отношении Ang-2. Таким образом, эти процессы имитируют иммунный отбор через дисплей (представление) репертуаров (спектров) фрагментов антител на поверхности нитевидного бактериофага и последующий отбор фага по его связыванию с Ang-2. Одна подобная процедура описана в Заявке РСТ с номером РСТ/US98/17364, поданной от имени Adams et al., которая описывает выделение высокоаффинных и функциональных фрагментов агонистических антител для MPL- и msk-рецепторов с использованием такого подхода. В этом подходе полный репертуар (спектр) генов антитела человека может быть создан клонированием природно реаранжированных V-генов человека из лимфоцитов периферической крови, как описано ранее (Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 87: 8095-8099 (1990)).
После идентификации полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют каждую цепь полноразмерного моноклонального антитела или Fab- или Fv-фрагменты этого изобретения, клетки-хозяева, эукариотические или прокариотические, могут быть использованы для экспрессии полинуклеотидов моноклонального антитела с использованием рекомбинантных способов, хорошо известных и в заведенном порядке практикуемых в данной области. Альтернативно, получают трансгенных животных, в которых полинуклеотид, кодирующий желаемый специфический связывающий агент, введен в геном реципиентного животного, такого как, например, мышь, кролик, коза или корова, таким образом, что создается возможность экспрессии полинуклеотидных молекул, кодирующих моноклональное антитело или другой специфический связывающий агент. В одном аспекте, полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело или другой специфический связывающий агент, могут быть лигированы с регуляторными последовательностями, специфическими для молочной железы, и эти химерные полинуклеотиды могут быть введены в зародышевую линию животного-мишени. Затем полученное трансгенное животное продуцирует желаемое антитело в его молоке (Pollock et al., J Immunol Meth 231:147-157 (1999); Little et al., Immunol Today 8:364-370 (2000)). Кроме того, могут быть использованы растения для экспрессии и получения Ang-2-специфических связывающих агентов, таких как моноклональные антитела, трансфекцией подходящих растений полинуклеотидами, кодирующими эти моноклональные антитела или другие специфические связывающие агенты.
В другом варианте осуществления данного изобретения, моноклональное или поликлональное антитело или его фрагмент, который получен от отличного от человека вида, может быть «гуманизированным» или «химеризованным». Способы гуманизации антител не человека хорошо известны в данной области (см. патенты США с номерами 5859205, 5585089 и 5693762). Гуманизацию выполняют, например, с использованием способов, описанных в данной области (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), заменой по меньшей мере части, например, определяющих комплементарность районов (CDR) грызуна соответствующими районами антитела человека. Данное изобретение обеспечивает также варианты и производные этих антител человека, как обсуждается здесь и хорошо известно в данной области.
В это изобретение включены также полностью человеческие антитела, которые связывают полипептиды Ang-2, а также их фрагменты, варианты и/или производные. Такие антитела могут быть получены с использованием описанного выше способа фагового дисплея. Альтернативно, для генерирования таких антител могут быть использованы трансгенные животные (например, мыши), которые способны продуцировать репертуар (спектр) антител человека в отсутствие продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. Это может быть выполнено иммунизацией животного Ang-2-антигеном или его фрагментами, где эти Ang-2-фрагменты имеют аминокислотную последовательность, которая является уникальной для Ang-2. Такие иммуногены могут быть необязательно конъюгированы с носителем. См., например, Jakobovits et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno, 7: 33 (1993). В одном способе таких трансгенных животных получают выведением из строя эндогенных локусов, кодирующих в них тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина, и встраиванием в их геном локусов, кодирующих белки тяжелой и легкой цепей человека. Затем частично модифицированные животные, которые являются животными, имеющими менее, чем полный комплемент этих модификаций, подвергают кроссбридингу с получением животного, имеющего все желаемые модификации иммунной системы. При введении иммуногена эти трансгенные животные способны продуцировать антитела с вариабельными областями человека, включающими аминокислотные последовательности человека (а не мышиные), которые являются иммуноспецифическими в отношении желаемых антигенов. См. Заявки РСТ с номерами РСТ/US96/05928 и РСТ/US93/06926. Дополнительные способы описаны в Патенте США № 5545807, Заявках РСТ с номерами РСТ/US91/245, РСТ/GB89/01207 и в ЕР 546073В1 и ЕР 546073А1. Антитела человека могут быть также получены экспрессией рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или экспрессией в гибридомных клетках, как описано здесь.
Трансгеноз (перенос генов) достигается рядом различных способов. См., например, Bruggeman et al., Immunol Today 17:391-7 (1996). В одном подходе конструируют минилокус, так что сегменты генов в форме зародышевой линии искусственно сближают друг с другом. Вследствие ограничений размера (т.е. обычно при размере, меньшем, чем 30 т.п.н.) полученный минилокус будет содержать ограниченное число различных генных сегментов, но все еще будет способен продуцировать большой репертуар (спектр) антител. Минилокусы, содержащие только ДНК-последовательности человека, в том числе промоторы и энхансеры, являются полностью функциональными в трансгенных мышах.
Когда желательным является большее количество генных сегментов в трансгенном животном, используют дрожжевые искусственные хромосомы (YAC). YAC могут быть в диапазоне от нескольких сотен т.п.н. до 1 м.п.н. и их вводят в геном мыши (или другого подходящего животного) посредством микроинъекции непосредственно в яйцеклетку или посредством переноса YAC в линии эмбриональных стволовых (ES) клеток. Обычно YAC переносят в ES-клетки липофекцией очищенной ДНК или слиянием дрожжевых сферопластов, причем очищенную ДНК переносят в мицеллах, а слияние проводят по протоколам, сходным с протоколом слияния гибридом. Отбор желаемых ES-клеток после переноса ДНК выполняют с использованием включения на YAC любого из селектируемых маркеров, известных в данной области.
В качестве альтернативы, используют векторы бактериофага Р1, которые размножают в бактериальном хозяине E. coli. Хотя эти векторы обычно несут меньше инсертированной ДНК, чем YAC, эти клоны легко растут с достаточно высоким выходом для возможности прямой микроинъекции в яйцеклетку мыши. Было показано, что использование смеси различных векторов Р1 приводит к высоким уровням гомологичной рекомбинации.
После идентификации подходящей трансгенной мыши (или другого подходящего животного) с использованием способов, известных в данной области, для детектирования сывороточных уровней циркулирующего антитела (например, ELISA), трансгенное животное скрещивают с мышью, в которой был разрушен эндогенный локус Ig. В результате получают потомство, в котором по существу все В-клетки экспрессируют антитела человека.
В качестве еще одной альтернативы полный локус Ig животного заменяют локусом Ig человека, причем полученное животное экспрессирует только антитела человека. В другом подходе части локуса животного заменяют специфическими и соответствующими областями в локусе человека. В некоторых случаях животные, полученные в результате этой процедуры, могут экспрессировать химерные антитела, в противоположность полностью человеческим антителам, в зависимости от характера замены в Ig-локусе мыши.
Антитела человека могут быть также получены подверганием спленоцитов человека (В- или Т-клеток) действию антигена in vitro и затем воссозданием подвергнутых действию антигена клеток в мышах с ослабленным иммунитетом, например, SCID или nod/SCID. См. Brams et al., J Immunol, 160: 2051-2058 (1998); Carballido et al., Nat Med, 6: 103-106 (2000). В одном подходе прививка фетальной ткани человека мыши SCID (SCID-hu) приводит к долгосрочному гемопоэзу и развитию Т-клеток человека (McCune et al., Science 241:1532-1639) (1988); Ifversen et al., Sem Immunol 8:243-248 (1996)). Любая гуморальная иммунная реакция в этих химерных мышах полностью зависит от одновременного развития Т-клеток в этих животных (Martensson et al., Immunol 83:1271-179 (1994)). В альтернативном подходе лимфоциты периферической крови человека трансплантируют внутрибрюшинно (или иным способом) в мышей SCID (Mosier et al., Nature 335:256-259 (1988)). При обработке трансплантированных клеток праймирующим агентом, таким как стафилококковый энтеротоксин А (SEA) (Martensson et al., Immunol 84: 224-230 (1995)), или моноклональными антителами против CD40 человека (Murphy et al., Blood 86:1946-1953 (1995)), детектируют более высокие уровни продуцирования В-клеток.
H
Альтернативно, полностью синтетический репертуар (спектр) тяжелых цепей человека создают из неаранжированных сегментов V-гена сборкой каждого V-сегмента с D-сегментами случайных нуклеотидов вместе с J-сегментом человека (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992)). Подобным образом, репертуар (спектр) легких цепей конструируют объединением каждого V-сегмента человека с J-сегментом (Griffiths et al., EMBO J 13:3245-3260 (1994)). Нуклеотиды, кодирующие полное антитело (т.е. как тяжелую, так и легкую цепи), связывают в виде одноцепочечного Fv-фрагмента, и этот полинуклеотид лигируют с полинуклеотидом, кодирующим минорный белок оболочки нитевидного фага. При экспрессии этого слитого белка на поверхности фага полинуклеотид, кодирующий специфическое антитело, идентифицируют отбором с использованием иммобилизованного антигена.
Еще в одном подходе фрагменты антител собирают в виде двух Fab-фрагментов слиянием одной цепи с белком фага и секрецией другой в бактериальную периплазму (Hoogenboom et al., Nucl Acids Res 19:4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 88:7978-7982 (1991)).
Крупномасштабное производство химерных, гуманизированных, CDR-трансплантированных и полностью человеческих антител или их фрагментов выполняют обычно рекомбинантными способами. Полинуклеотидная молекула или полинуклеотидные молекулы, кодирующие тяжелую и легкую цепи каждого антитела или их фрагменты, могут быть введены в клетки-хозяева и экспрессированы с использованием описанных здесь материалов и процедур. В предпочтительном варианте осуществления, эти антитела получают в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клетки СНО. Подробности такого получения описаны ниже.
Партнеры слияния специфических связывающих агентов
В дополнительном варианте осуществления изобретения, полипептиды, содержащие вариабельные домены аминокислотной последовательности антител Ang-2, такие как вариабельная область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, или вариабельная область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, могут быть слиты на N-конце или на С-конце с одним или несколькими доменами Fc-района IgG человека. При конструировании вместе с терапевтическим белком, таким как Fab Ang-2-специфического антитела, Fc-домен может обеспечивать более продолжительный полупериод существования или включать такие функции, как связывание Fc-рецептора, связывание Белка А, фиксация комплемента и, возможно, даже плацентарный перенос (Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989)).
В одном примере шарнирная область, СН2- и СН3-районы антитела могут быть слиты либо на N-конце, либо на С-конце полипептидов специфического связывающего агента, такого как анти-Ang-2-Fab- или Fv-фрагмент (полученного, например, из библиотеки фагового дисплея) с использованием способов, известных специалисту в данной области. Полученный слитый белок может быть очищен с использованием Белок А- или Белок G-аффинной колонки. Было обнаружено, что пептиды и белки, слитые с Fc-районом, проявляют существенно более высокий полупериод существования in vivo, чем неслитая копия. Слияние с Fc-районом делает также возможной димеризацию/мультимеризацию слитого полипептида. Fc-район может быть природным Fc-районом или может быть изменен для улучшения определенных качеств, таких как терапевтические качества, время циркуляции, уменьшение проблем агрегации и т.д. Другие примеры, известные в данной области, включают примеры, в которых Fc-район, который может происходить от человека или другого вида или может быть синтетическим, сливают с N-концом CD30L, для лечения болезни Ходжкина, анапластической лимфомы и Т-клеточного лейкоза (Патент США № 5480981), Fc-район сливают с TNF-рецептором для лечения септического шока (Fisher et al., N Engl J Med, 334: 1697-1702 (1996) и Fc-район сливают с Cd4-рецептором для лечения СПИДа (Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)).
Каталитические антитела являются другим типом слитой молекулы и включают антитела, в которых одна или несколько цитотоксических или более часто одна или несколько биологически активных частей молекул присоединены к специфическому связывающему агенту. См., например (Rader et al., Chem Eur J 12:2091-2095 (2000)). Цитотоксические агенты этого типа улучшают опосредованную антителом цитотоксичность и включают такие части молекул, как цитокины, которые прямо или опосредованно стимулируют смерть клеток, радиоизотопы, химиотерапевтические лекарственные средства (в том числе пролекарства), бактериальные токсины (например, экзотоксин pseudomonas, дифтерийный токсин и т.д.), токсины растений (например, рицин, гелонин и т.д.), химические конъюгаты (например, майтансиноидные токсины, калехаемицин и т.д.), радиоконъюгаты, конъюгаты с ферментами (конъюгат с РНКазой, терапия с использованием конъюгата направленный на антитело фермент/пролекарство (ADEPT))), и т.п. В одном аспекте цитотоксический агент может быть «присоединен» к одному компоненту биспецифического или мультиспецифического антитела связыванием этого агента с одним из сайтов раслознавания альтернативных антигенов на антителе. В качестве альтернативы, белковые цитотоксины могут экспрессироваться в виде слитых белков со специфическим связывающим агентом после лигирования полинуклеотида, кодирующего этот токсин, с полинуклеотидом, кодирующим связывающий агент. В другом альтернативном способе специфический связывающий агент может быть модифицирован ковалентно для включения в него желаемого цитотоксина.
Примерами таких слитых белков являются иммуногенные полипептиды, белки с продолжительными полупериодами существования в кровотоке, такие как константные области иммуноглобулинов, маркерные белки, белки или полипептиды, которые облегчают очистку полипептида желаемого специфического связывающего агента, и полипептидные последовательности, которые стимулируют образование мультимерных белков (такие как мотивы лейциновой молнии, которые применимы в образовании/улучшении стабильности димеров).
Этот тип инсерционного варианта обычно имеет полную нативную молекулу или существенную часть нативной молекулы, связанную на N-конце или С-конце, с полным вторым полипептидом или частью второго полипептида. Например, слитые белки обычно используют лидерные последовательности из другого вида для создания возможности рекомбинантной экспрессии белка в гетерологичном хозяине. Другой полезный слитый белок включает добавление иммунологически активного домена, такого как эпитоп антитела, для облегчения очистки слитого белка. Включение сайта расщепления на границе слияния или вблизи границы слияния будет облегчать удаление постороннего полипептида после очистки. Другие полезные слияния включают связывание функциональных доменов, таких как активные сайты из ферментов, доменов гликозилирования, сигналов клеточного нацеливания или трансмембранных районов.
Имеются различные коммерчески доступные системы экспрессии слитых белков, которые могут быть использованы в данном изобретении. Особенно применимые системы включают, но не ограничиваются ими, систему глутатион-S-трансферазы (GST) (Pharmacia), систему мальтозосвязывающего белка (NEB, Beverly, MA), систему FLAG (IBI, New Haven, CT) и систему 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Эти системы способны продуцировать рекомбинантные полипептиды, несущие только небольшое количество дополнительных аминокислот, которые имеют малую вероятность влияния на антигенную способность рекомбинантного полипептида. Например, как система FLAG, так и система 6xHis добавляют только короткие последовательности, причем известно, что обе они являются слабоантигенными и не оказывают нежелательного влияния на укладку полипептида в его природную конформацию. Другим N-концевым слиянием, которое рассматривается в качестве применимого, является слияние дипептида Met-Lys на N-концевом участке белка или пептидов. Такое слияние может производить выгодные увеличения экспрессии или активности белка.
Особенно применимой слитой конструкцией может быть конструкция, в которой пептид специфического связывающего агента слит с гаптеном для усиления иммуногенности слитой конструкции специфического связывающего агента, которая применима, например, в получении антиидиотипических антител согласно изобретению. Такие слитые конструкции для увеличения иммуногенности хорошо известны специалистам в данной области, например, слияние специфического связывающего агента с хелперным антигеном, таким как hsp70 или пептидными последовательностями, например, из цепи дифтерийного токсина или цитокина, такого как IL-2, будет применимо в индукции иммунной реакции. В других вариантах осуществления, может быть создана слитая конструкция, которая будет усиливать нацеливание композиций антигенсвязывающего агента на специфический сайт или на специфическую клетку.
Рассматриваются также другие слитые конструкции, включающие гетерологичные полипептиды с желаемыми свойствами, например, константную область Ig для пролонгирования полупериода существования в сыворотке или антитело или его фрагмент для нацеливания. Другие слитые системы продуцируют полипептидные гибриды, где желательно вырезание партнера слияния из желаемого полипептида. В одном варианте осуществления, партнер слияния связан с рекомбинантным полипептидом специфического связывающего агента пептидной последовательностью, содержащей специфическую последовательность узнавания для протеазы. Примерами подходящих последовательностей являются последовательности, узнаваемые протеазой вируса гравировки табака (Life Technologies, Gaithersburg, MD), или фактором Ха (New England Biolabs, Beverly, MA).
Данное изобретение обеспечивает также слитые полипептиды, содержащие весь вариабельный домен или часть вариабельного домена Ang-2-антитела, например, вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, или вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, в комбинации с укороченным тканевым фактором (tTF), васкулярным нацеливающим агентом, состоящим из укороченной формы индуцирующего коагуляцию белка человека, который действует в качестве агента свертывания кровеносных сосудов опухоли. Слияние tTF с анти-Ang-2-антителом или его фрагментами может облегчать доставку анти-Ang-2-антитела к клеткам-мишеням.
Варианты специфических связывающих агентов
Варианты специфических связывающих агентов данного изобретения включают инсерционные, делеционные варианты и/или варианты с заменами. В одном аспекте этого изобретения обеспечены инсерционные варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков дополняют аминокислотную последовательность специфического связывающего агента. Инсерции могут быть расположены на любом или на обоих концах этого белка или могут быть помещены во внутренних районах аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на любом или на обоих концах могут включать, например, слитые белки или белки, включающие аминокислотные «таги» или метки. Инсерционные варианты включают полипептиды специфического связывающего агента, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавлены к аминокислотной последовательности специфического связывающего агента или его фрагмента.
-1
-2
-1
Вариантные продукты данного изобретения включают также зрелые продукты специфического связывающего агента. Такие продукты специфического связывающего агента имеют удаленные лидерные или сигнальные последовательности, однако полученный белок имеет дополнительные аминоконцевые остатки в сравнении с полипептидом Ang-2 дикого типа. Дополнительные аминоконцевые остатки могут быть получены из другого белка или могут включать один или несколько остатков, которые не идентифицируются как полученные из конкретного белка. Рассматриваются продукты специфического связывающего агента с дополнительным остатком метионина в положении 1 (Met-специфический связывающий агент), как и продукты специфического связывающего агента с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и -1 (Met-Lys-специфический связывающий агент). Варианты специфических связывающих агентов, имеющие дополнительные остатки Met, Met-Lys, Lys (или один или несколько основных остатков в целом), особенно применимы для усиленного продуцирования рекомбинантного белка в бактериальных клетках-хозяевах.
Данное изобретение включает также варианты специфического связывающего агента, имеющие дополнительные аминокислотные остатки, которые получают, используя специфические системы экспрессии. Например, использование коммерчески доступных векторов, которые экспрессируют желаемый полипептид в виде части продукта слияния с глутатион-S-трансферазой (GST), обеспечивает желаемый полипептид, имеющий дополнительный остаток глицина в положении аминокислоты -1 после отщепления GST-компонента от желаемого полипептида. Варианты, которые происходят из экспрессии в других векторных системах, также рассматриваются, в том числе варианты, в которых полигистидиновые метки включены в аминокислотную последовательность, обычно на карбокси- и/или аминоконце последовательности.
Инсерционные варианты включают также слитые белки, описанные выше, в которых амино- и/или карбоксиконцы полипептида специфического связывающего агента слиты с другим полипептидом, его фрагментом или аминокислотными последовательностями, которые обычно не распознаются в качестве части любой конкретной последовательности.
В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает делеционные варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков в полипептиде специфического связывающего агента удалены. Делеции могут быть выполнены на одном или обоих концах полипептида специфического связывающего агента или удалением одного или нескольких остатков внутри аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Делеционные варианты обязательно включают все фрагменты полипептида специфического связывающего агента.
2
Фрагменты антитела включают части антитела, которые связываются с эпитопом на антигенном полипептиде. Примеры таких фрагментов включают Fab- и F(ab')-фрагменты, генерируемые, например, ферментативным или химическим расщеплением полноразмерных антител. Другие связывающие фрагменты включают фрагменты, генерируемые способами рекомбинантных ДНК, такими как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вариабельные области антитела. Данное изобретение включает также полипептидные фрагменты Ang-2-связывающего агента, причем фрагменты сохраняют способность специфически связывать полипептид Ang-2. Фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 или более последовательных аминокислот пептида или полипептида данного изобретения, включены в данное изобретение. Предпочтительные полипептидные фрагменты проявляют иммунологические свойства, уникальные или специфические в отношении антигенсвязывающего агента по изобретению. Фрагменты согласно изобретению, имеющие желаемые иммунологические свойства, могут быть получены любыми способами, хорошо известными и обычно практикуемыми в данной области.
Еще в одном аспекте, данное изобретение обеспечивает варианты специфических связывающих агентов с заменами согласно изобретению. Варианты с заменами обычно рассматриваются как «сходные» с исходным полипептидом или как имеющие определенную «процентную идентичность» с исходным полипептидом, и включают полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептида удалены и заменены альтернативными остатками. В одном аспекте эти замены являются консервативными по природе, однако, данное изобретение включает также замены, которые являются неконсервативными.
et al.
SIAM J. Applied Math.
Идентичность и сходство родственных полипептидов может быть легко рассчитано известными способами. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. и Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991) и Carillo , , 48:1073 (1988).
Предпочтительные способы для определения родства или процентной идентичности двух полипептидов разработаны для получения наибольшего совпадения между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в публично доступных компьютерных программах. Предпочтительные способы компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются ими, пакет программ GCG, в том числе GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). Программа BLASTX публично доступна из Национального Центра Информации по Биотехнологии (NCBI) и других источников (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., выше (1990)). Для определения идентичности может быть также использован хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.
Некоторые схемы выравнивания для совмещения двух аминокислотных последовательностей могут приводить к совпадению только в коротком районе этих двух последовательностей, и этот небольшой выравненный район может иметь очень высокую идентичность последовательности, даже если нет значимого родства между этими двумя полноразмерными последовательностями. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, выбранный способ выравнивания (программа GAP) будет приводить к выравниванию, которое простирается по меньшей мере на десять процентов полной длины сравниваемого полипептида-мишени, т.е. по меньшей мере 40 смежных аминокислот, где сравнивают последовательности по меньшей мере 400 аминокислот, 30 смежных аминокислот, где сравнивают последовательности по меньшей мере 300 - приблизительно 400 аминокислот, по меньшей мере 20 смежных аминокислот, где сравнивают последовательности 200 - приблизительно 300 аминокислот, и по меньшей мере 10 смежных аминокислот, где сравнивают последовательности приблизительно 100 - 200 аминокислот.
Например, с использованием компьютерного алгоритма GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) два полипептида, для которых должна быть определена процентная идентичность, выравнивают для оптимального совпадения их соответствующих аминокислот («совпадающего расстояния», определяемого этим алгоритмом). В некоторых вариантах осуществления, штраф за открывание гэпа (который обычно рассчитывают как 3Х средней диагонали; «средняя диагональ» является средней диагональю используемой матрицы сравнения; «диагональ» является баллом или числом, приписываемым каждому точному совпадению аминокислот конкретной матрицей сравнения) и штраф за удлинение гэпа (который обычно равен 1/10 штрафа за открывание гэпа), а также матрицу сравнения, такую как РАМ 250 или BLOSUM 62, используют вместе с этим алгоритмом. В некоторых вариантах осуществления, этим алгоритмом используется также стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) вместо матрицы сравнения РАМ 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992) вместо матрицы сравнения BLOSUM 62).
В некоторых вариантах осуществления, параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают следующее:
Алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970);
Матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., выше (1992);
Штраф за гэп: 12
Штраф за длину гэпа: 4
Порог сходства: 0
Программа GAP может быть применима с указанными выше параметрами. В некоторых вариантах осуществления, вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнений полипептидов (вместе с отсутствием штрафа за концевые гэпы) с использованием алгоритма GAP.
В некоторых вариантах осуществления, параметры для сравнений последовательностей полинуклеотидных молекул включают следующее:
Алгоритм: Needleman et al., выше (1970);
Матрица сравнения: совпадения = +10, отсутствие совпадения = 0
Штраф за гэп: 50
Штраф за длину гэпа: 3
Программа GAP может быть применима с указанными выше параметрами. Вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнений полинуклеотидных молекул.
Могут быть использованы другие примеры алгоритмов, штрафы за открывание гэпа, штрафы за удлинение гэпа, матрицы сравнения, пороги сходства и т.д., в том числе представленные в Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997. Конкретные варианты выбора, которые должны быть сделаны, будут очевидными специалистам в данной области и будут зависеть от конкретного сравнения, которое должно быть сделано, например, ДНК с ДНК, белка с белком, белка с ДНК; и, кроме того, от того, является ли это сравнение сравнением между конкретными парами последовательностей (в этом случае обычно являются предпочтительными GAP или BestFit) или сравнением между одной последовательностью и последовательностями большой базы данных (в этом случае предпочтительными являются FASTA или BLASTA).
nd
В данном контексте, двадцать обычных аминокислот и их сокращения соответствуют общепринятому применению. См. руководство Immunology-A Synthesis (2 Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), включенное здесь в качестве ссылки для любой цели.
1
2
3
3
2
1
Аминокислоты могут иметь либо L-, либо D-стереохимию (за исключением Gly, который не является ни L, ни D), и полипептиды и композиции данного изобретения могут содержать комбинацию стереохимий. Однако предпочтительной является L-стереохимия. Данное изобретение обеспечивает также обращенные молекулы, в которых последовательность от аминоконца к карбоксиконцу этих аминокислот является обращенной. Например, обращением молекулы, имеющей нормальную последовательность Х-Х-Х, было бы Х-Х-Х. Данное изобретение обеспечивает также ретрообращенные молекулы, в которых, как указано выше, последовательность от амино-конца к карбокси-концу является обращенной и остатки, которые обычно являются энантиомерами “L”, изменены на стереоизомерную форму “D”.
Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати общепринятых аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α-, α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие необычные аминокислоты, могут быть также подходящими компонентами для полипептидов согласно изобретению. Примеры необычных аминокислот включают, без ограничения: аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бета-аминопропионовую кислоту, аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокапроевую кислоту, аминогептановую кислоту, аминоизомасляную кислоту, аминопимелиновую кислоту, диаминомасляную кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, диаминопропионовую кислоту, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилглицин, саркозин, N-метилизолейцин, N-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин, 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, δ-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и аминокислоты (например, 4-гидроксипролин).
Подобным образом, если нет других указаний, левым концом одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей является 5'-конец; левое направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей называют 5'-направлением. Направление 5'-3'-присоединения полученных РНК-транскриптов называют направлением транскрипции; районы последовательности на цепи ДНК, имеющие ту же самую последовательность, что и РНК, которые находятся 5' (слева) относительно 5'-конца РНК-транскрипта, называют «последовательностями против хода транскрипции» («апстрим»); районы последовательности на цепи ДНК, имеющие ту же самую последовательность, что и РНК, которые находятся 3' (справа) относительно 3'-конца РНК-транскрипта, называют «последовательностями по ходу транскрипции» («даунстрим»).
Консервативные аминокислотные замены могут включать неприродные аминокислотные остатки, которые обычно включены химическим пептидным синтезом, а не синтезом в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислотных частей молекулы.
Природные остатки могут быть разделены на классы на основе общих свойств боковых цепей:
1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) кислотные: Asp, Glu;
4) основные: His, Lys, Arg;
5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и
6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Например, неконсервативные замены могут осуществлять замену члена одного из этих классов членом из другого класса. Такие замененные остатки могут быть введены в районы антитела человека, которые являются гомологичными с антителами не человека, или в негомологичные районы этой молекулы.
При выполнении таких изменений, согласно некоторым вариантам осуществления, может учитываться гидропатический индекс (индекс гидрофобности) аминокислот. Каждой аминокислоте был приписан гидропатический индекс на основе ее характеристик гидрофобности и заряда. Эти индексы являются следующими: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).
Важность гидропатического индекса аминокислот в придании интерактивной биологической функции белку признается в данной области. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Известно, что некоторые аминокислоты могут заменять другие аминокислоты, имеющие сходный гидропатический индекс или балл, и все еще сохранять сходную биологическую активность. В выполнении изменений на основе гидропатического индекса, в некоторых вариантах осуществления, включают замену аминокислот, гидропатические индексы которых находятся в пределах ±2. В некоторых вариантах осуществления включают замены, которые находятся в пределах ±1, и в некоторых вариантах осуществления включают замены в пределах ±0,5.
В данной области считается также, что замена подобных аминокислот может быть выполнена эффективно на основе гидрофильности, в частности, когда создаваемый посредством этого биологически функциональный белок или пептид предназначен для использования в иммунологических вариантах, как это имеет место в данном случае. В некоторых вариантах осуществления наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, создаваемая гидрофильностью его смежных аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическим свойством белка.
Следующие величины гидрофильности были приписаны указанным аминокислотным остаткам: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 ± 1); глутамат (+3,0 ± 1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5 ± 1); аланин (-0,5); гистидин (-0,05); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). В выполнении изменений на основе сходных величин гидрофильности, в некоторых вариантах осуществления, включают замену аминокислот, величины гидрофильности которых находятся в пределах ±2, в некоторых вариантах осуществления включают замены, которые находятся в пределах ±1, и в некоторых вариантах осуществления включают замены в пределах ±0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основе гидрофильности. Эти районы также называют «районами внутренней части эпитопа».
Примеры аминокислотных замен представлены в таблице 1.
Таблица 1Аминокислотные замены
Исходные остатки
Примерные замены
Предпочтительные замены
Ala
Val, Leu, Ile
Val
Arg
Lys, Gln, Asn
Lys
Asn
Gln, Glu, Asp
Gln
Asp
GLU, Gln, Asn
Glu
Cys
Ser, Ala
Ser
Gln
Asn, Glu, Asp
Asn
Glu
Asp, Asn, Gln
Asp
Gly
Pro, Ala
Ala
His
Asn, Gln, Lys, Arg
Arg
Ile
Leu, Val, Met, Ala,Phe, норлейцин
Leu
Leu
Норлейцин, Ile,Val, Met, Ala, Phe
Ile
Lys
Arg, 1,4-диаминомасляная кислота, Gln, Asn
Arg
Met
Leu, Phe, Ile
Leu
Phe
Leu, Val, Ile, Ala,Tyr
Leu
Pro
Ala
Gly
Ser
Thr, Ala, CYS
Thr
Thr
Ser
Ser
Trp
Tyr, Phe
Tyr
Tyr
TrP, Phe, Thr, Ser
Phe
Val
Ile, Met, Leu, Phe,Ala, норлейцин
Leu
Специалист в данной области будет способен определить подходящие варианты полипептида, представленные здесь, с использованием хорошо известных способов. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может идентифицировать подходящие участки молекулы, которые могут быть изменены без разрушения активности посредством нацеливания на районы, о которых известно, что они не являются важными для активности. В некоторых вариантах осуществления можно идентифицировать остатки и части молекул, которые являются консервативными среди сходных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления даже участки, которые могут быть важными для биологической активности или для структуры, могут быть подвергнуты консервативным аминокислотным заменам без разрушения биологической активности или без нежелательного влияния на структуру полипептида.
Кроме того, специалист в данной области может просмотреть исследования по структуре-функции, идентифицирующие остатки в сходных полипептидах, которые являются важными для активности или структуры. Ввиду такого сравнения можно предсказать важность аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются важными для активности или структуры в сходных белках. Специалист в данной области может выбрать химически сходные аминокислотные замены для таких предсказанных важных аминокислотных остатков.
Специалист в данной области может также анализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность относительно этой структуры в сходных полипептидах. Ввиду такой информации, специалист в данной области может предсказывать выравнивание аминокислотных остатков антитела в отношении его трехмерной структуры. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может предпочесть не производить радикальных изменений в отношении аминокислотных остатков, которые, как предсказано, находятся на поверхности этого белка, так как такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Кроме того, специалист в данной области может генерировать тест-варианты, содержащие единственную аминокислотную замену в каждом желаемом аминокислотном остатке. Затем эти варианты могут быть подвергнуты скринингу с использованием анализов активности, известных в данной области. Такие варианты могли бы быть использованы для сбора информации о подходящих вариантах. Например, если обнаруживают, что изменение в отношении конкретного аминокислотного остатка приводило к нарушенной, нежелательно уменьшенной или неподходящей активности, можно избежать такого изменения. Другими словами, на основе информации, собранной из таких рутинных экспериментов, специалист в данной области может легко определить аминокислоты, в которых следует избегать дополнительных замен, либо отдельно, либо в комбинации с другими мутациями.
Ряд научных публикаций были посвящены предсказанию вторичной структуры. См. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 и Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Кроме того, в настоящее время доступны компьютерные программы для помощи в предсказании вторичной структуры. Один способ предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность последовательности, большую чем 30%, или сходство, большее чем 40%, часто имеют сходные структурные топологии. Недавний рост структурной базы данных белков (PDB) обеспечил повышенную предсказуемость вторичной структуры, в том числе потенциального количества складок в структуре полипептида или белка. См. Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Было сделано предположение (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)), что имеется ограниченное количество складок в конкретном полипептиде или белке и что после разрешения критического количества структур структурное предсказание станет разительно более точным.
Curr. Opin. Struct. Biol.
et al.
Structure
et al., Science
et al.
Meth. Enzym
et al.
Proc. Nat. Acad. Sci.
Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают “threading” (способ замены боковых цепей одного белка боковыми цепями другого белка при сохранении константной конформации основной цепи) (Jones, D., , 7(3):377-87 (1997); Sippl , , 4(1):15-19 (1996)), "profile analysis" (Bowie , 253:164-170 (1991); Gribskov , ., 183:146-159 (1990); Gribskov , , 84(13):4355-4358 (1987)) и «эволюционное связывание» (см. Holm, выше (1999) и Bennet, выше (1997)).
В некоторых вариантах осуществления варианты антител включают гликозилированные варианты, в которых количество и/или тип сайтов гликозилирования были изменены в сравнении с аминокислотными последовательностями исходного полипептида. В некоторых вариантах осуществления варианты белка содержат большее или меньшее количество N-связанных сайтов гликозилирования, чем нативный белок. N-связанный сайт гликозилирования характеризуется последовательностью: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где аминокислотный остаток, обозначенный Х, может быть любым аминокислотным остатком, за исключением пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности обеспечивает новый сайт для добавления N-связанной углеводной цепи. Альтернативно, замены, которые элиминируют эту последовательность, будут удалять существующую N-связанную углеводную цепь. Обеспечена также реаранжировка N-связанных углеводных цепей, в которых один или несколько N-связанных сайтов гликозилирования (обычно сайтов гликозилирования, которые являются природными) элиминированы и созданы один или несколько новых N-связанных сайтов. Дополнительные предпочтительные варианты антител включают цистеиновые варианты, в которых один или несколько остатков цистеина делетированы из исходной аминокислотной последовательности или заменены другой аминокислотой (например, серином) в сравнении с исходной аминокислотной последовательностью. Цистеиновые варианты могут быть применимы, когда антитела должны быть подвергнуты рефолдингу в биологически активную конформацию, например, после удаления нерастворимых тел включения. Цистеиновые варианты обычно имеют меньше остатков цистеина, чем природный белок, и обычно имеют четное число остатков цистеина для минимизации взаимодействий, происходящих из не спаренных цистеинов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аминокислотные замены являются заменами, которые: (1) уменьшают чувствительность к протеолизу, (2) уменьшают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинность связывания в отношении образования белковых комплексов, (4) изменяют аффинности связывания и/или (5) придают или модифицируют другие функциональные свойства таких полипептидов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления единственные или множественные замены аминокислот (в некоторых вариантах осуществления, консервативные замены аминокислот) могут быть получены в природной последовательности (в некоторых вариантах осуществления, в части полипептида, находящейся вне образующих домен (домены) межмолекулярных контактов). В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена обычно по существу не может изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, аминокислотная замена не должна стремиться разрывать спираль, которая встречается в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной последовательности, которая характеризует эту исходную последовательность). Примеры признанных в данной области вторичной и третичной структур полипептида описаны в Proteins, Structures and Molecular Pinciples (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); и Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
Молекулы специфического связывающего агента этого изобретения, которые являются полипептидными или пептидными вариантами с заменами, могут иметь до приблизительно 10-12 процентов замененной исходной аминокислотной последовательности. Для вариантов антител тяжелая цепь может иметь 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещенную аминокислоту, тогда как легкая цепь может иметь 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещенную аминокислоту.
Производные специфических связывающих агентов
Данное изобретение обеспечивает также производные полипептидов специфического связывающего агента. Производные включают полипептиды специфического связывающего агента, несущие модификации, иные, чем инсерция, делеция или замена аминокислотных остатков. Предпочтительно, эти модификации являются ковалентными по природе и включают, например, образование химической связи с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими частями молекул. Производные данного изобретения могут быть приготовлены для увеличения полупериода существования в кровотоке полипептида специфического связывающего агента или могут быть предназначены для улучшения нацеливающей способности этого полипептида на желаемые клетки, ткани или органы.
Данное изобретение дополнительно включает производные связывающие агенты, ковалентно модифицированные для включения одного или нескольких водорастворимых полимерных присоединений, таких как полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, как описано в Патентах США с номерами 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. Другие применимые полимеры, известные в данной области, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) / поливиниловый спирт, а также смеси этих полимеров. Особенно предпочтительными являются продукты специфического связывающего агента, ковалентно модифицированные субъединицами полиэтиленгликоля (ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть связаны в специфических положениях, например, на аминоконце продуктов специфического связывающего агента, или присоединены случайным образом к одной или нескольким боковым цепям полипептида. Использование ПЭГ для улучшения терапевтической способности в отношении специфического связывающего агента, и для гуманизированных антител, в частности, описано в Патенте США 6133426, выданном Gonzales et al. 17 октября 2000 года.
Сайты-мишени для мутагенеза антител
Определенные стратегии могут быть использованы для манипулирования свойствами, присущими Ang-2-специфическому антителу, такими как аффинность этого антитела в отношении его мишени. Эти стратегии включают применение сайт-направленного или случайного мутагенеза полинуклеотидной молекулы, кодирующей антитело, для генерирования вариантов антитела с последующей стадией скрининга, предназначенной для извлечения вариантов антител, которые проявляют желаемое изменение, например, увеличенную или уменьшенную аффинность.
Аминокислотными остатками, наиболее обычно являющимися мишенями в мутагенных стратегиях, являются аминокислотные остатки в CDR. Как описано выше, эти области содержат остатки, которые фактически взаимодействуют с Ang-2 и другими аминокислотами, влияющими на пространственное размещение этих остатков. Однако было также показано, что аминокислоты в каркасных областях вариабельных доменов вне CDR-районов существенно способствуют антигенсвязывающим свойствам этого антитела и могут служить мишенями для манипулирования такими свойствами. См. Hudson, Curr Opin Biotech, 9:395-402 (1999) и ссылки в этой работе.
Менее и более эффективно скринируемые библиотеки вариантов антител могут быть получены рестрикцией случайного или сайт-направленного мутагенеза сайтами в CDR, которые соответствуют участкам, склонным к «гипермутации» во время соматического процесса созревания аффинности. См. Chowdhury and Pastan, Nature Biotech, 17: 568-572 (1990) и ссылки в этой работе. Типы элементов ДНК, о которых известно, что они определяют сайты гипермутаций таким образом, включают прямые и инвертированные повторы, определенные консенсусные последовательности, вторичные структуры и палиндромы. Консенсусные ДНК-последовательности включают последовательность из четырех оснований пурин-G-пиримидин-А/Т (т.е. А или G - G - C или Т - А или Т) и кодон серина AGY (где Y может быть С или Т).
Таким образом, один вариант данного изобретения включает мутагенные стратегии с задачей увеличения аффинности антитела в отношении его мишени. Эти стратегии включают мутагенез всей вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, мутагенез только CDR-районов, мутагенез консенсусных сайтов гипермутации в CDR, мутагенез каркасных областей или комбинацию этих подходов («мутагенез» в данном контексте мог бы быть случайным или сайт-направленным). Окончательное описание CDR-районов и идентификация остатков, содержащих сайт связывания антитела, могут быть выполнены посредством раскрытия структуры рассматриваемого антитела и комплекса антитело-лиганд, при помощи способов, известных специалистам в данной области, таких как рентгеновская кристаллография, и могут быть использованы, хотя и не окончательно, для приблизительного определения CDR-районов. Примеры таких обычно известных способов включают определения Kabat, Chothia, AbM и контактные определения.
Определение Kabat основано на вариабельности последовательности и является наиболее часто используемым определением для предсказания CDR-районов. (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 28: 214-8 (2000)). Определение Chothia основано на определении местоположения структурных районов петель (Chothia et al., Mol Biol, 196:901-17(1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)). Определение AbM является компромиссом между определением Kabat и Chothia. AbM является интегральным комплектом программ для моделирования структуры антитела, производимым Oxford Molecular Group (Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:9268-9272 (1989); Rees et al., ABM™, a computer program for modeling variable regions of antibodies, Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.). Комплект AbM моделирует третичную структуру антитела из первичного секвенирования с использованием комбинации известных баз данных и способов ab initio. Недавно введено дополнительное определение, известное как контактное определение (MacCallum et al., J Mol Biol, 5:732-45 (1996)). Это определение основано на анализе доступных комплексных кристаллических структур.
По соглашению, CDR-районы в тяжелой цепи обычно называют Н1, Н2 и Н3, и они нумеруются последовательно от аминоконца к карбоксиконцу. CDR-районы в легкой цепи обычно называют L1, L2 и L3, и они нумеруются последовательно от аминоконца к карбоксиконцу.
CDR-Н1 имеет длину приблизительно 10-12 остатков и обычно начинается через 4 остатка после Cys в соответствии с определениями Chothia и AbM или обычно на 5 остатков позднее в соответствии с определением Kabat. За Н1 обычно следует Trp, обычно TRP-Val, но также Trp-Ile или Trp-Ala. Длина Н1 равна приблизительно 10-12 остаткам в соответствии с определением AbM, тогда как определение Chothia включает последние 4 остатка.
CDR-Н2 начинается через 15 остатков после конца Н1 в соответствии с определениями Kabat и AbM. Остатками, предшествующими Н2, обычно являются Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, но имеется ряд вариаций. За Н2 обычно следуют аминокислотная последовательность Lys/Arg/-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Согласно определению Kabat, длина Н2 равна приблизительно 16-19 остаткам, тогда как определение AbM предсказывает, что эта длина обычно равна 9-12 остаткам.
CDR-Н3 обычно начинается через 33 остатка после конца Н22, и ему обычно предшествуют аминокислотная последовательность (обычно Cys-Ala-Arg). За Н3 обычно следует эта аминокислотная последовательность-Gly. Длина Н3 может быть любой в пределах 3-25 остатков.
CDR-L1 обычно начинается при остатке 24 и обычно следует за Cys. Остатком после CDR-L1 всегда является Trp, и он обычно будет началом последовательности Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln или Trp-Tyr-Leu. Длина CDR-L1 равна приблизительно 10-17 остаткам. CDR-L1-мишень для антител данного изобретения точно следует этой картине, причем за остатком Cys следуют 15 аминокислот и затем Trp-Tyr-Gln.
CDR-L2 начинается приблизительно через 16 остатков после конца L1. Он обычно следует за остатками Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys или Ile-Phe. Длина CDR-L2 равна приблизительно 7 остаткам.
CDR-L3 обычно начинается через 33 остатка после конца L2, и обычно он следует после Cys. За L3 обычно следует аминокислотная последовательность Phe-Gly-XXX-Gly. Длина L3 равна приблизительно 7-11 остаткам.
В данной области описаны различные способы для модификации антител. Например, Патент США 5530101 (Queen et al., июнь 25, 1996) описывает способы получения гуманизированных антител, в которых последовательность каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина на 65-95% идентична последовательности каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи донорского иммуноглобулина. Каждая цепь гуманизированного иммуноглобулина будет обычно содержать, наряду с CDR, аминокислоты из каркаса донорского иммуноглобулина, которые, например, способны взаимодействовать с CDR для влияния на активность связывания, например, одну или несколько аминокислот, которые являются непосредственно смежными с CDR в донорском иммуноглобулине, или аминокислоты, находящиеся в пределах приблизительно 3 ангстрем, как предсказано молекулярным моделированием. Тяжелая и легкая цепи, каждая, могут быть легко сконструированы с использованием любого одного или всех из различных критериев положений. При объединении в интактное антитело гуманизированные иммуноглобулины по данному изобретению будут по существу неиммуногенными у людей и будет сохранять по существу ту же самую аффинность, что и донорский иммуноглобулин, в отношении этого антигена, такого как белок или другое соединение, содержащее эпитоп. См. также родственные способы в патенте США 5693761, выданном Quinn et al. 2 декабря 1997 года (“Полинуклеотиды, кодирующие улучшенные гуманизированные иммуноглобулины”); Патент США 5693762, выданный Quinn, et al. 2 декабря 1997 года (“Улучшенные иммуноглобулины”); Патент США 5585089, выданный Quinn, et al. 17 декабря 1996 года (“Улучшенные иммуноглобулины”).
В одном примере Патент США 5565332, выданный Hoogenboom 15 октября 1996 года («Получение химерных антител - комбинированный подход»), описывает способы получения антител и фрагментов антител, которые имеют такую же специфичность связывания, что и исходное антитело, но которые имеют увеличенные характеристики, свойственные антителам человека. Гуманизированные антитела получают перетасовкой цепи, с использованием, например, технологии фагового дисплея, и полипептид, содержащий вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела не человека, специфический в отношении представляющего интерес антитела, объединяют с репертуаром комплементарных вариабельных доменов (легкой или тяжелой цепи). Гибридные спаривания, которые являются специфическими в отношении представляющего интерес антигена, идентифицируют и цепи антител человека из выбранных спариваний комбинируют со спектром комплементарных вариабельных доменов (тяжелой или легкой цепи) человека. В другом варианте осуществления, компонент CDR из антитела не человека объединяют с репертуаром частей компонентов CDR из антител человека. Из полученной библиотеки димеров полипептидов антител отбирают гибриды и используют их во второй стадии гуманизирующей перетасовки. Альтернативно, эту вторую стадию пропускают, если данный гибрид имеет уже достаточно «человеческий характер» для использования в терапии. Способы модификации для увеличения человеческого характера антител также описаны. См. также Winter, FEBS Letts 430:92-92 (1998).
В другом примере Патент США 6054297, выданный Carter et al. 25 апреля 2000 года, описывает способ получения гуманизированных антител заменой аминокислотной последовательности CDR соответствующей аминокислотной последовательностью CDR человека и/или заменой аминокислотной последовательности FR соответствующими аминокислотными последовательностями FR человека.
В качестве другого примера Патент США 5766886, выданный Studnicka et al., выданный 16 июня 1998 года («Модифицированные вариабельные домены антител»), описывает способы идентификации аминокислотных остатков вариабельного домена антител, которые могут быть модифицированы без уменьшения нативной аффинности антигенсвязывающего домена при уменьшении его иммуногенности в отношении гетерологичных видов, и способы получения этих модифицированных вариабельных доменов, которые применимы для введения гетерологичным видам. См. также Патент США 5869619, выданный Studnicka 9 февраля 1999 года.
Как обсуждалось, модификация антитела любым из способов, известных в данной области, обычно предназначена для получения увеличенной связывающей аффинности в отношении антигена и/или уменьшения иммуногенности этого антитела в реципиенте. В одном подходе гуманизированные антитела могут быть модифицированы для устранения сайтов гликозилирования для увеличения аффинности этого антитела в отношении его родственного антигена (Co et al., Mol Immunol 30:1361-1367 (1993)). Такие способы, как «реконструирование», «гиперхимеризация» и «облицовка/реконструирование поверхности», давали гуманизированные антитела с более высоким терапевтическим потенциалом. (Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol 81:105 (1998); Roguska et al., Prot Engineer 9:895-904 (1996)). См. также Патент США 6072035, выданный Hardman et al., 6 июня 2000 года, который описывает способы реконструирования (инженерии) антител. Хотя эти способы уменьшают иммуногенность антител вследствие уменьшения чужеродных остатков, они не предотвращают антиидиотипические и антиаллотипические реакции после повторного введения этих антител. Альтернативы этим способам уменьшения иммуногенности описаны в Gilliland et al., J Immunol 62(6): 3663-71 (1999).
Во многих случаях гуманизация антител приводит к потере антигенсвязывающей способности. Поэтому предпочтительно «обратно мутировать» гуманизированное антитело для включения одного или нескольких аминокислотных остатков, обнаруживаемых в исходном антителе (наиболее часто антителе грызуна) в попытке восстановления аффинности связывания этого антитела. См., например, Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999).
Непептидные аналоги специфических связывающих агентов/белковые миметики
Кроме того, рассматриваются также непептидные аналоги пептидов специфического связывающего агента, которые обеспечивают стабилизированную структуру или уменьшенную биодеградацию. Миметические аналоги пептидов специфического связывающего агента могут быть получены на основе выбранного ингибирующего пептида заменой одного или нескольких остатков непептидными частями молекулы. Предпочтительно, эти непептидные части молекулы позволяют этому пептиду сохранять его природную конформацию или стабилизировать предпочтительную, например, биоактивную конформацию, которая сохраняет способность распознавать и связывать Ang-2. В одном аспекте, полученный аналог/миметик проявляет увеличенную аффинность связывания в отношении Ang-2. Один пример способов получения непептидных миметических аналогов из пептидов специфического связывающего агента описан в Nachman et al., Regul Pept 57:359-370 (1995). Если желательно, пептиды специфического связывающего агента данного изобретения могут быть модифицированы, например, гликозилированием, амидированием, карбоксилированием или фосфорилированием или созданием кислотно-аддитивных солей, амидов, сложных эфиров, в частности, С-концевых эфиров, и N-ацилпроизводных пептидов данного изобретения. Пептиды специфического связывающего агента могут быть также модифицированы для создания пептидных производных образованием ковалентных или нековалентных комплексов с другими частями молекулы. Ковалентно связанные комплексы могут быть получены связыванием химических частей молекул с функциональными группами на боковых цепях аминокислот пептидов специфического связывающего агента или на N- или С-конце.
В частности, понятно, что пептиды специфического связывающего агента могут быть конъюгированы с репортерной группой, в том числе, но не только, радиоактивной меткой, флуоресцентной меткой, ферментом (например, ферментом, который катализирует колориметрическую или флуорометрическую реакцию), субстратом, твердым матриксом или носителем (например, биотином или авидином). Таким образом, данное изобретение обеспечивает молекулу, содержащую молекулу антитела, причем эта молекула предпочтительно дополнительно содержит репортерную группу, выбранную из группы, состоящей из радиоактивной метки, флуоресцентной метки, фермента, субстрата, твердого матрикса и носителя. Такие метки хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам, например, рассматриваются, в частности, биотиновые метки. Применение таких меток хорошо известно квалифицированным в данной области специалистам и описано, например, в Патенте США 3817837; Патенте США 3850752; Патенте США 3996345 и Патенте США 4277437. Другие метки, которые будут применимы, включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные метки, флуоресцентные метки и хемилюминесцентные метки. Патенты США, касающиеся применения таких меток, включают, например, Патент США № 3817837; Патент США № 3850752; Патент США № 3939350 и Патент США № 3996345. Любой из пептидов данного изобретения может содержать одну, две или более любых из этих меток.
Способы приготовления специфических связывающих агентов
d
Специфические связывающие агенты данного изобретения, которые являются белками, могут быть получены химическим синтезом в растворе или на твердой подложке в соответствии с общепринятыми способами. Существующим ограничением для твердофазного синтеза является синтез пептидов с длиной 85-100 аминокислот. Однако способы химического синтеза часто могут быть использованы для химического лигирования ряда пептидов меньшего размера для генерирования полноразмерных полипептидов. Различные автоматизированные синтезаторы являются коммерчески доступными и могут быть использованы в соответствии с известными протоколами. См., например, Stewart and Young, Solid Pase Peptide Synthesis, 2. ed., Pierce Chemical Co., (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232:341-347, (1986); и Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987); и Патент США № 5424398), включенные здесь в качестве ссылки.
Способы твердофазного пептидного синтеза используют сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий 0,1-1,0 мМ амины на грамм полимера. Эти способы пептидного синтеза используют в качестве защиты альфа-аминогрупп бутилоксикарбонил (t-BOC) или 9-флуоренилметилоксикарбонил (FMOC). Оба способа включают ступенчатые синтезы, посредством которых отдельную аминокислоту добавляют на каждой стадии, начиная от С-конца этого пептида (см. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9). По завершении химического синтеза синтетический пептид может быть освобожден от блокирующих аминокислоты групп tBoc или FMOC и отщеплен от полимера обработкой кислотой при пониженной температуре (например, жидкой HF-10% анизолом в течение приблизительно 0,25 - приблизительно 1 ч при 0°С). После упаривания реагентов пептиды специфического связывающего агента экстрагируют из полимера 1% раствором уксусной кислоты и затем лиофилизируют с получением неочищенного материала. Он может быть обычно очищен такими способами, как гель-фильтрация на Сефадексе G-15 с использованием 5% уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация подходящих фракций колонки будет давать гомогенный пептид специфического связывающего агента или производные пептида, которые могут быть затем охарактеризованы такими стандартными способами, как аминокислотный анализ, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, спектроскопия поглощения в ультрафиолете, молекулярное вращение, растворимость и определение количества твердофазной деградацией Эдмана.
Химический синтез анти-Ang-2-антител, их производных, вариантов и фрагментов, а также других Ang-2-связывающих агентов на основе белка позволяет включать в этот агент неприродные аминокислоты.
Способы рекомбинантных ДНК являются удобными способами получения полноразмерных антител и других больших белковых агентов специфического связывающего агента данного изобретения или их фрагментов. кДНК-молекула, кодирующая это антитело или фрагмент, может быть инсертирована в экспрессирующий вектор, который, в свою очередь, может быть встроен в клетку-хозяина для продуцирования этого антитела или фрагмента. Понятно, что кДНК, кодирующая такие антитела, может быть модифицирована для изменения от “первоначальной» ДНК (транслированной из мРНК) для обеспечения вырожденности кодонов или для обеспечения возможности использования предпочтения (преференции) кодонов в различных клетках-хозяевах.
Обычно молекула ДНК, кодирующая антитело, может быть получена с использованием процедур, описанных здесь в Примерах. Когда желательным является получение Fab-молекул или CDR, которые относятся к первоначальной молекуле антитела, можно подвергнуть скринингу подходящую библиотеку (библиотеку фагового дисплея; библиотеку лимфоцитов и т.д.) с использованием стандартных способов для идентификации и клонирования родственных Fab/CDR. Зонды, используемые для такого скрининга, могут быть полноразмерными или укороченными Fab-зондами, кодирующими Fab-часть первоначального антитела, или другими подходящими зондами. При использовании ДНК-фрагментов в качестве зондов типичными условиями гибридизации являются условия, представленные в Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press (1994)). После гибридизации зондированный блот может быть промыт при подходящей строгости, в зависимости от таких факторов, как размер зонда, ожидаемая гомология зонда относительно клона, тип библиотеки, подвергнутой скринингу, и количество клонов, подвергаемых скринингу. Примерами высокой строгости являются 0,1 SSC и 0,1% ДСН при температуре 50-65°С.
Различные системы экспрессии вектор/хозяин могут быть использованы для содержания и экспрессии полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептиды специфического связывающего агента данного изобретения. Эти системы включают, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидные или космидные экспрессирующие векторы ДНК; дрожжи, трансформированные дрожжевыми экспрессионными векторами; системы клеток насекомых, инфицированные вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирусными); системы клеток растений, трансфицированные вирусными экспрессионными векторами (например, вирусом мозаичной болезни цветной капусты CaMV; вирусом мозаичной болезни табака, TMV) или трансформированные бактериальными экспрессионными векторами (например, Ti или плазмидой pBR322); или системы клеток животных.
Клетки млекопитающих, которые применимы в рекомбинантных получениях белка специфического связывающего агента, включают, но не ограничиваются ими, клетки VERO, клетки HeLa, клеточные линии Китайского хомячка (СНО), клетки COS (например, COS-7), клетки W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 и 293, а также гибридомные клеточные линии, описанные здесь. Клетки млекопитающих являются предпочтительными для получения тех специфических связывающих агентов, таких как антитела и фрагменты антител, которые обычно являются гликозилированными и требуют правильной укладки для активности. Предпочтительные клетки млекопитающих включают клетки СНО, гибридомные клетки и миелоидные клетки.
Некоторые примерные протоколы для рекомбинантной экспрессии белков специфического связывающего агента описаны здесь ниже.
Термин «экспрессирующий вектор» относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору для экспрессии полипептида из ДНК (РНК)-последовательности. Экспрессирующий вектор может содержать транскрипционную единицу, содержащую упорядоченную структуру (1) генетического элемента или элементов, имеющих регуляторную роль в экспрессии гена, например, промоторов или энхансеров, (2) структуру или последовательность, которая кодирует связывающий агент, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) подходящие последовательности инициации и терминации транскрипции. Структурные единицы, предназначенные для применения в дрожжевых или эукариотических системах экспрессии, предпочтительно включают лидерную последовательность, делающую возможной внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином. Альтернативно, когда рекомбинантный белок специфического связывающего агента экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать в себя аминоконцевой остаток метионина. Этот остаток может отщепляться или может не отщепляться от экспрессируемого рекомбинантного белка для обеспечения конечного продукта специфического связывающего агента.
Например, специфические связывающие агенты могут рекомбинантно экспрессироваться в дрожжах с использованием коммерчески доступной системы экспрессии, например, системы экспрессии Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), в соответствии с инрструкциями изготовителя. Эта система может быть основана на пре-про-альфа-последовательности для управления секрецией, но транскрипция этого инсерта запускается промотором алкогольоксидазы (АОХ1) после индукции метанолом.
Секретированный пептид специфического связывающего агента очищают из среды для выращивания дрожжей, например, способами, используемыми для очистки пептида из супернатантов бактериальных клеток и клеток млекопитающих.
Альтернативно, кДНК, кодирующая пептид специфического связывающего агента, может быть клонирована в бакуловирусный экспрессионыый вектор pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Этот вектор может быть использован в соответствии с инструкциями изготовителя (PharMingen) для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda в не содержащей белка sF9 среде и для получения рекомбинантного белка. Белок специфического связывающего агента может быть очищен и сконцентрирован из этой среды с использованием гепарин-сефарозной колонки (Pharmacia).
Альтернативно, этот пептид может быть экспрессирован в системе насекомых. Системы насекомых для экспрессии белков хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. В одной такой системе вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) может быть использован в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в личинках Trichoplusia. Кодирующая последовательность пептида специфического связывающего агента может быть клонирована в несущественный район этого вируса, такой как ген полиэдрина, и помещена под контроль промотора полиэдрина. Успешная инсерция этого пептида специфического связывающего агента будет делать ген полиэдрина неактивным и давать рекомбинантный вирус, лишенный белка оболочки. Эти рекомбинантные вирусы могут быть использованы для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda или личинок Trichoplusia, в которых экспрессируется пептид (Smith et al., J Virol 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 91: 3224-7 (1994)).
В другом примере ДНК-последовательность, кодирующая пептид специфического связывающего агента, может быть амплифицирована при помощи ПЦР и клонирована в подходящий вектор, например, pGEX-3X (Pharmacia). Вектор pGEX сконструирован для продуцирования слитого белка, содержащего глутатион-S-трансферазу (GST), кодируемую этим вектором, и белка специфического связывающего агента, кодируемого ДНК-фрагментом, встроенным в сайт клонирования вектора. Праймеры для этой ПЦР могут быть получены таким образом, что они включают, например, подходящий сайт расщепления. Когда слитую часть специфического связывающего агента используют только для облегчения экспрессии или она иным образом является нежелательной в виде присоединения к представляющему интерес белку, рекомбинантный слитый белок специфического связывающего агента может быть затем отщеплен от GST-части слитого белка. Конструкцию pGEX-3X/пептид специфического связывающего агента трансформируют в клетки E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA) и отдельные трансформанты выделяют и выращивают. Плазмидная ДНК из отдельных трансформантов может быть очищена и частично секвенирована с использованием автоматического секвенатора для подтверждения присутствия желаемого кодирующего специфический связывающий агент инсерта нуклеиновой кислоты в правильной ориентации.
Экспрессия полинуклеотидов, кодирующих анти-Ang-2-антитела и их фрагменты, с использованием описанных выше рекомбинантных систем может приводить к получению антител или их фрагментов, которые должны быть подвергнуты «рефолдингу» (для правильного создания различных дисульфидных мостиков), чтобы быть биологически активными. Типичные процедуры рефолдинга для таких антител представлены здесь в Примерах и в следующем разделе.
++
++
Специфические связывающие агенты, полученные в бактериальных клетках, могут быть продуцированы в виде нерастворимого тела включения в бактериях и могут быть очищены следующим образом. Клетки-хозяева могут быть умерщвлены центрифугированием; промыты в 0,15 М NaCl, 10 мМ Трисе, рН 8, 1 М ЭДТА и обработаны 0,1 мг/мл лизоцима (Sigma, St. Louis, MO) в течение 15 минут при комнатной температуре. Этот лизат может быть осветлен обработкой ультразвуком, и остатки клеток могут быть осаждены центрифугированием в течение 10 минут при 12000×g. Осадок, содержащий специфический связывающий агент, может быть ресуспендирован в 50 мМ Трисе, рН 8, и 10 мМ ЭДТА, нанесен на 50% глицерин и центрифугирован в течение 30 минут при 6000×g. Осадок может быть ресуспендирован в стандартном забуференном фосфатом солевом растворе (PBS), не содержащем Mg и Ca. Специфический связывающий агент может быть дополнительно очищен фракционированием ресуспендированного осадка в денатурирующем ДСН-полиакриламидном геле (Sambrook et al., выше). Этот гель может быть пропитан 0,4 М KCl для визуализации белка, который может быть вырезан и подвергнут электроэлюции в буфере для разделения в геле, не содержащем ДСН. Если GST-слитый белок продуцируется в бактериях, в виде растворимого белка, он может быть очищен с использованием Модуля GST-очистки (Pharmacia).
Системы-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантного белка хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Штаммы клеток-хозяев могут быть отобраны на конкретную способность процессировать экспрессируемый белок или продуцировать определенные посттрансляционные модификации, которые будут полезными в обеспечении активности белка. Такие модификации этого полипептида включают, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. Различные клетки-хозяева, такие как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38, а также гибридомные клеточные линии и т.п. имеют специфический клеточный аппарат и характерные механизмы для таких посттрансляционных активностей и могут быть выбраны для гарантии правильной модификации и правильного процессинга введенного чужеродного белка.
Ряд систем отбора могут быть использованы для извлечения клеток, которые были трансформированы для получения рекомбинантного белка. Такие системы отбора включают, но не ограничиваются ими, гены тимидинкиназы HSV, гены гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы, в клетках tk, hgprt или aprt, соответственно. Устойчивость к антиметаболитам может быть использована как основа отбора на DHFR, который придает устойчивость к метотрексату; gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте; neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G418 и придает устойчивость к хлорсульфурону; и hygro, который придает устойчивость к гигромицину. Дополнительные селектируемые гены, которые могут быть применимы, включают trpB, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина. Маркеры, которые дают визуальное указание для идентификации трансформантов, включают антицианы, β-глюкуронидазу и ее субстрат, GUS, и люциферазу и ее субстрат, люциферин.
Очистка и рефолдинг специфических связывающих агентов
В некоторых случаях специфические связывающие агенты, продуцируемые с использованием процедур, описанных выше, могут нуждаться в «рефолдинге» и окислении в правильную третичную структуру и генерировании дисульфидных связей, чтобы быть биологически активными. Рефолдинг может выполняться с использованием ряда процедур, хорошо известных в данной области. Такие способы включают, например, подвергание действию солюбилизированного полипептидного агента до рН обычно более 7 в присутствии хаотропного агента. Выбор хаотропа сходен с выбором, используемым для солюбилизации тел включения, однако хаотроп используют обычно при более низкой концентрации. Примером хаотропного агента является гуанидин. В большинстве случаев раствор для рефолдинга/окисления будет также содержать восстанавливающий агент и его окисленную форму в конкретном соотношении для генерирования конкретного окислительно-восстановительного потенциала, который сделает возможной перетасовку дисульфидов для образования цистеиновых мостиков. Некоторые обычно используемые окислительно-восстановительные пары включают цистеин/цистамин, глутатион/дитиобис(GSH), хлорид двухвалентной меди, дитиотреитол ДТТ/дитиан ДДТ и 2-меркаптоэтанол (bME)/дитио-bME. Во многих случаях может быть использован сорастворитель для увеличения эффективности рефолдинга. Обычно используемые сорастворители включают глицерин, полиэтиленгликоль различных молекулярных масс и аргинин.
Желательной будет очистка белков специфических связывающих агентов или их вариантов согласно изобретению. Способы очистки белка хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Эти способы включают, на одном уровне, грубое фракционирование полипептидных и неполипептидных фракцией. После отделения полипептида специфического связывающего агента от других белков представляющий интерес полипептид может быть дополнительно очищен с использованием хроматографических и электрофоретических способов для получения частичной или полной очистки (или очистки до гомогенности). Аналитическими способами, пригодными, в частности, для получения чистого пептида специфического связывающего агента, являются ионообменная хроматография; электрофорез в полиакриламидном геле; изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективным способом очистки белков является жидкостная экспресс-хроматография белков или даже ВЖХ.
Некоторые аспекты данного изобретения касаются очистки и, в конкретных вариантах осуществления, существенной очистки кодируемого белка или пептида специфического связывающего агента. Термин «очищенный белок или пептид специфического связывающего агента» относится в данном контексте к композиции, отделяемой от других компонентов, в которых белок или пептид специфического связывающего агента очищен до любой степени относительно природно-получаемого состояния. Таким образом, термин белок или пептид специфического связывающего агента относится также к специфическому связывающему белку или пептиду, не содержащему среды, в которой он присутствует в природе.
Обычно, термин «очищенный» будет относиться к композиции специфического связывающего агента, которая была подвергнута фракционированию для удаления различных других компонентов и которая по существу сохраняет проявляемую ею биологическую активность. При использовании термина «по существу очищенная» этот термин будет относиться к композиции специфического связывающего агента, в которой белок или пептид этого специфического связывающего агента образует основной компонент этой композиции, например, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более белков в этой композиции.
Различные способы для количественного определения степени очистки специфического связывающего агента будут известны квалифицированному в данной области специалисту в свете данного описания. Они включают, например, определение удельной активности связывания или оценку количества полипептидов специфического связывающего агента во фракции с использованием электрофореза с ДСН-ПААГ. Предпочтительным способом оценки чистоты фракции специфического связывающего агента является расчет активности связывания фракции в сравнении с активностью связывания исходного экстракта и, таким образом, расчет степени очистки, оцениваемой здесь «числом х-кратной очистки», где х равно этому числу. Фактические единицы, используемые для представления величины активности связывания, будут, конечно, зависеть от конкретного способа анализа, выбранного для прослеживания очистки, и от того, проявляет ли белок или пептид специфического связывающего агента детектируемую связывающую активность.
Различные способы, подходящие для использования в очистке белка специфического связывающего агента, будут хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Они включают, например, осаждение сульфатом аммония, ПЭГ, антителами (иммунопреципитацию) и т.п. или денатурацию нагреванием с последующим центрифугированием; стадии хроматографии, такие как аффинная хроматография (например, Белок А-Сефароза), ионообменная хроматография; гель-фильтрация, хроматография с обращенной фазой, гидроксиапатитная и аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование; гель-электрофорез; и комбинации таких и других способов. Как известно в данной области, считается, что порядок проведения различных стадий очистки может быть изменен или что определенные стадии могут быть опущены, но при этом этот способ все еще является пригодным для получения по существу очищенного специфического связывающего агента.
Не существует общего требования, заключающегося в том, что этот специфический связывающий агент всегда должен быть обеспечен в его наиболее очищенном состоянии. Действительно, предполагается, что менее, чем по существу очищенные, продукты специфического связывающего агента будут иметь применение в некоторых вариантах осуществления изобретения. Частичная очистка может быть выполнена с использованием меньших стадий очистки в комбинации стадий или с использованием других форм той же самой общей схемы очистки. Например, понятно, что катионообменная колоночная хроматография, выполняемая с использованием ВЖХ-прибора, будет обычно приводить к большей «х-кратной» очистке, чем тот же самый способ, использующий систему хроматографии низкого давления. Способы, обнаруживающие более низкую степень относительной очистки, могут иметь преимущества в общем выходе белкового продукта специфического связывающего агента или в поддержании связывающей активности экспрессируемого белка специфического связывающего агента.
Известно, что миграция полипептида может варьироваться, иногда значительно, в зависимости от разных условий электрофореза в ДСН/ПААГ (Capaldi et al., Biochem Biophys Res Comm, 76: 425 (1977)). Таким образом, будет понятно, что при различающихся условиях электрофореза, средние молекулярные массы очищенных или частично очищенных продуктов специфического связывающего агента могут варьироваться.
Анализы связывания
Иммунологические анализы связывания обычно используют захватывающий агент для специфического связывания и часто иммобилизации анализируемого антигена-мишени. Захватывающий агент является частью молекулы, которая специфически связывается с аналитом. В одном варианте осуществления, захватывающим агентом является антитело или его фрагмент, который специфически связывает Ang-2. Эти иммунологические анализы связывания хорошо известны в данной области (см. Asai, ed., Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)).
Иммунологические анализы связывания часто используют метящий агент, который будет сигнализировать о существовании связанного комплекса, образованного захватывающим агентом и антигеном. Этим метящим агентом может быть одна из молекул, составляющих этот связанный комплекс: т.е. им может быть меченый специфический связывающий агент или меченое антитело против специфического связывающего агента. Альтернативно, этим метящим агентом может быть третья молекула, обычно другое антитело, которое связывается со связанным комплексом, метящим агентом может быть, например, антитело против специфического связывающего агента, несущего метку. Это второе антитело, специфическое в отношении связанного комплекса, может не иметь метки, но может быть связано с четвертой молекулой, специфической в отношении вида антител, членом которого является это второе антитело. Например, это второе антитело может быть модифицировано детектируемой частью молекулы, такой как биотин, которая затем может быть связана четвертой молекулой, такой как меченый ферментом стрептавидин. Другие белки, способные специфически связывать константные области иммуноглобулина, такие как белок А или белок G, также могут быть использованы в качестве метящего агента. Эти связывающие белки являются обычными компонентами клеточных стенок стрептококковых бактерий и проявляют сильную неиммуногенную реактивность с константными областями иммуноглобулина из различных видов (см., в общем виде, Akerstrom, J Immunol, 135:2589-2542 (1985); и Chaubert, Mod Pathol, 10:585-591 (1997)).
Во всех этих анализах могут требоваться стадии инкубирования и/или промывок после каждой комбинации реагентов. Стадии инкубирования могут варьироваться от приблизительно 5 секунд до нескольких часов, предпочтительно от приблизительно 5 минут до приблизительно 24 часов. Однако время инкубирования будет зависеть от формата анализа, аналита, объема раствора, концентраций и т.п. Обычно эти анализы будут проводиться при температуре окружающей среды, хотя они могут проводиться на протяжении большого диапазона температур.
А. Неконкурентные анализы связывания:
Иммунологические анализы связывания могут быть анализами неконкурентного типа. Эти анализы имеют некоторое количество захватывающего аналита, которое может быть измерено. Например, в одном предпочтительном «сэндвич»-анализе захватывающий агент (антитело) может быть связан непосредственно с твердым субстратом, где он может быть иммобилизован. Затем эти иммобилизованные антитела захватывают антиген (связываются с ним), присутствующий в данной тест-пробе. Затем иммобилизованный таким образом белок связывают с метящим агентом, таким как второе антитело, имеющее метку. В другом предпочтительном «сэндвич»-анализе это второе антитело не имеет метки, но может быть связано с меченым антителом, специфическим в отношении антител вида, из которого происходит это второе антитело. Это второе антитело может быть также модифицировано детектируемой частью молекулы, такой как биотин, с которой может специфически связываться третья меченая молекула, например, стрептавидин. (См. руководство Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), включенное здесь в качестве ссылки).
В. Конкурентные анализы связывания:
Иммунологические анализы связывания могут быть анализами конкурентного типа. Количество аналита, присутствующее в пробе, измеряют непосредственно измерением количества добавленного аналита, вытесненного или конкурентно удаленного из захватывающего агента аналитом, присутствующим в этой пробе. В одном предпочтительном конкурентном анализе связывания известное количество аналита, обычно меченого, добавляют к пробе и затем эту пробу контактируют с антителом (захватывающим агентом). Количество меченого аналита, связанного с антителом, является обратно пропорциональным концентрации аналита, присутствующего в пробе. (См. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Ch 14, pp. 579-583, выше).
В другом предпочтительном конкурентном анализе связывания антитело иммобилизовано на твердом субстрате. Количество белка, связанного с этим антителом, может быть определено либо измерением количества белка, присутствующего в комплексе белок/антитело, либо альтернативно измерением количества оставшегося не образовавшего комплекс белка. (См. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Ch 14, выше).
Еще в одном предпочтительном конкурентном анализе связывания используют ингибирование гаптеном. Здесь, известный аналит иммобилизуют на твердом субстрате. Известное количество антитела добавляют к пробе и эту пробу контактируют с иммобилизованным аналитом. Количество антитела, связанного с иммобилизованным аналитом, является обратно пропорциональным количеству аналита, присутствующего в пробе. Количество иммобилизованного антитела может быть детектировано детектированием либо иммобилизованной фракции антитела, либо фракции, которая остается в растворе. Детектирование может быть прямым, когда антитело метят, или непрямым, посредством последующего добавления меченой части молекулы, которая специфически связывается с этим антителом, как описано выше.
Использование конкурентных анализов связывания:
С.
Конкурентные анализы связывания могут быть использованы для определений перекрестной реактивности, чтобы специалист мог определить, является ли белковый или ферментный комплекс, который узнается специфическим связывающим агентом данного изобретения, желаемым белком, а не перекрестно-реагирующей молекулой, или определить, является ли это антитело специфическим в отношении данного антигена, и не связывает ли оно нежелательные антигены. В анализах этого типа антиген может быть иммобилизован на твердом носителе и неизвестную смесь белков добавляют к этому анализу, которая будет конкурировать со связыванием специфических связывающих агентов с этим иммобилизованным белком. Конкурирующая молекула связывает также один или несколько антигенов, неродственных в отношении данного антигена. Способность этих белков конкурировать со связыванием специфических связывающих агентов-антител с иммобилизованным антигеном сравнивают со связыванием того же белка, который был иммобилизован на твердом носителе, для определения перекрестной реактивности этой белковой смеси.
Другие анализы связывания:
D.
Данное изобретение обеспечивает также способы Вестерн-блоттинга для детектирования или количественного определения присутствия Ang-2 в пробе. Этот способ обычно предусматривает разделение белков пробы гель-электрофорезом на основе молекулярной массы и перенесение этих белков на подходящую твердую подложку, такую как нитроцеллюлозный фильтр, найлоновый фильтр или дериватизованный найлоновый фильтр. Эту пробу инкубируют с антителами или их фрагментами, которые специфически связывают Ang-2, и полученный комплекс детектируют. Эти антитела могут быть непосредственно мечеными или альтернативно могут быть затем детектированы с использованием меченых антител, которые специфически связываются с этим антителом.
Анализы связывания для детектирования тех Ang-2 специфических связывающих агентов, которые разрушают связывание Ang-2 с его рецептором, представлены здесь в Примерах.
Диагностические анализы
Антитела или их фрагменты данного изобретения применимы для диагностики состояний или заболеваний, характеризуемых экспрессией Ang-2 или субъединиц, или в анализах для мониторинга пациентов, проходящих лечение индукторами Ang-2, его фрагментами, агонистами или ингибиторами активности Ang-2. Диагностические анализы для Ang-2 включают способы, использующие специфический связывающий агент и метку для детектирования Ang-2 в жидкостях тела или экстрактах клеток или тканей человека. Специфические связывающие агенты данного изобретения могут быть использованы с модификацией или без модификации. В предпочтительном диагностическом анализе специфические связывающие агенты будут помечены присоединением, например, метки или репортерной молекулы. Известно большое разнообразие меток и репортерных молекул, некоторые из которых уже были описаны здесь. В частности, данное изобретение применимо для диагностики заболевания человека.
В данной области известны различные протоколы для измерения белков Ang-2 с использованием поликлональных или моноклональных антител, специфических в отношении соответствующего белка. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) и клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS). Двухсайтный иммуноанализ на основе моноклональных антител, использующий моноклональные антитела, реактивные с двумя неинтерферирующими эпитопами на Ang-2, являются предпочтительным, но может быть использован конкурентный анализ связывания. Эти анализы описаны, например, в Maddox et al., J Exp Med, 158:1211 (1983).
Для обеспечения базы для диагностики, обычно устанавливают нормальные или стандартные величины для экспрессии Ang-2 человека. Это определение может быть выполнено объединением жидкостей тела или экстрактов клеток из нормальных субъектов, предпочтительно человека, со специфическим связывающим агентом, например, антителом, к Ang-2, в условиях, подходящих для образования комплекса, которые хорошо известны в данной области. Величина стандартного образования комплекса может быть определена количественно сравнением связывания специфических связывающих агентов с известными количествами белка Ang-2, как с контрольными пробами, так и с пробами имеющих заболевание субъектов. Затем стандартные величины, полученные из нормальных проб, могут быть сравнены с величинами, полученными из проб из субъектов, потенциально пораженных заболеванием. Отклонение между стандартными величинами и величинами этих субъектов предполагает роль Ang-2 в этом патологическом состоянии.
3
14
32
35
125
Для диагностических применений, в некоторых вариантах осуществления, специфические связывающие агенты обычно метят детектируемой частью молекулы. Этой детектируемой частью молекулы может быть любая часть молекулы, которая способна продуцировать, прямо или непрямо, детектируемый сигнал. Например, детектируемой частью молекулы может быть радиоизотоп, такой как Н, С, Р, S или I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцеинизотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или пероксидаза хрена (Bayer et al., Meth Enz, 184: 138-163, (1990)).
Заболевания
Данное изобретение обеспечивает специфический связывающий агент, который связывается с Ang-2, который применим для лечения заболеваний и патологических состояний человека. Агенты, которые модулируют Ang-2-связывающую активность или другую клеточную активность, могут быть использованы в комбинации с другими терапевтическими агентами для усиления их терапевтических действий или уменьшения потенциальных побочных действий заболевания.
В одном аспекте, данное изобретение обеспечивает реагенты и способы, применимые для лечения заболеваний и состояний, характеризуемых нежелательными или отклоняющимися от нормы уровнями активности Ang-2 в клетке. Эти заболевания включают карциномы и другие гиперпролиферативные состояния, такие как гиперплазия, псориаз, контактный дерматит, иммунологические нарушения и бесплодие.
Данное изобретение обеспечивает также способы лечения рака у животного, в том числе у человека, предусматривающие введение этому животному эффективного количества специфического связывающего агента, которое ингибирует или уменьшает активность Ang-2. Кроме того, данное изобретение относится к способам ингибирования роста раковых клеток, в том числе процессов клеточной пролиферации, инвазивности и метастазирования, в биологических системах. Способы включают применение соединения данного изобретения в качестве ингибитора роста раковых клеток. Предпочтительно, эти способы применяют для ингибирования или уменьшения роста раковых клеток, инвазивности, метастазирования или встречаемости опухолей у живых животных, таких как млекопитающие. Способы данного изобретения легко адаптируемы также для применения в системах анализов, например, в анализе роста раковых клеток и их свойств, а также в идентификации соединений, которые влияют на рост раковых клеток.
Карциномы, которые могжно лечить способами данного изобретения, предпочтительно встречаются у млекопитающих. Млекопитающие включают, например, людей и других приматов, а также любимых или домашних животных, таких как собаки и кошки, лабораторных животных, таких как крысы, мыши и кролики, и сельскохозяйственных животных, таких как лошади, свиньи, овцы и крупный рогатый скот.
Опухоли или неоплазмы включают рост клеток тканей, в которых размножение этих клеток является неконтролируемым и прогрессирующим. В некоторых случаях этот рост является доброкачественным, но в других случаях он является злокачественным и может приводить к смерти организма. Злокачественные неоплазмы или карциномы отличаются от доброкачественного роста тем, что, наряду с проявлением агрессивной клеточной пролиферации, они могут внедряться в окружающие ткани и метастазировать. Кроме того, злокачественные неоплазмы характеризуются тем, что они обнаруживают большую потерю дифференцировки (большую дедифференцировку) и их организации относительно друг друга и их окружающих тканей. Это свойство называют также «анаплазией».
Неоплазмы, которые можно лечить согласно изобретению, включают также солидные опухоли, т.е. карциномы и саркомы. Карциномы включают злокачественные неоплазмы, происходящие из эпителиальных клеток, которые инфильтрируют (инвазируют) окружающие ткани и приводят к возникновению метастазов. Аденокарциномы являются карциномами, происходящими из гландулярной (железистой) ткани, или карциномами, которые образуют гландулярные структуры. Другая широкая категория раков включает саркомы, которые являются опухолями, клетки которых погружены в фибриллярное или гомогенное вещество, подобное эмбриональной соединительной ткани. Данное изобретение позволяет также лечить рак миелоидной или лимфоидной систем, в том числе лейкозы, лимфомы и другие типы рака, которые обычно не представлены в виде опухолевой массы, а распределены в сосудистой или лимфоретикулярной системах.
Типы раковых или опухолевых клеток, поддающиеся лечению в соответствии с данным изобретением, включают, например, продуцирующую АСТН (адренокортикотропный гормон) опухоль, острый лимфоцитарный лейкоз, острый нелимфоцитарный лейкоз, рак коры надпочечников, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, колоректальный рак, кожную Т-клеточную лимфому, рак эндометрия, эзофагеальный рак, саркому Юинга, рак желчного пузыря, рак ворсистых клеток (ретикулоэндотелиоз), рак головы и шеи, лимфому Ходжкина, саркому Капоши, рак почки, рак печени, рак легкого (мелкоклеточный и немелкоклеточный), злокачественный перитонеальный выпот, злокачественный плевральный выпот, меланому, мезотелиому, множественную миелому, нейробластому, глиому, неходжкинскую лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак яичника (половых клеток), саркому поджелудочной железы, рак полового члена, рак предстательной железы, ретинобластому, рак кожи, саркому мягких тканей, плоскоклеточные карциномы, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, трофобластные неоплазмы, рак матки, рак вагины, рак вульвы и опухоль Вильмса.
Данное изобретение конкретно иллюстрировано здесь со ссылкой на лечение некоторых типов экспериментально определенных карцином. В этих иллюстративных лечениях использовали стандартные существующие в данной области модели in vitro и in vivo. Эти способы могут быть использованы для идентификации агентов, которые, согласно ожиданию, могут быть эффективными в программах лечения in vivo. Однако будет понятно, что способ согласно изобретению не ограничивается лечением этих типов опухолей, а распространяется на любую солидную опухоль, образующуюся из любой системы органов. Типы раков, инвазивность и метастазирование которых ассоциировано с экспрессией или активностью Ang-2, особенно чувствительны к ингибированию или даже индуцируются к регрессу с помощью этого изобретения.
Данное изобретение может также практиковаться включением в комбинации со специфическим связывающим агентом данного изобретения, таким как антитело, другого противоракового химиотерапевтического агента, такого как общепринятый химиотерапевтический агент. Эта комбинация специфического связывающего агента с такими другими агентами может потенцировать химиотерапевтический протокол. Многочисленные химиотерапевтические протоколы будут известны квалифицированному в данной области специалисту в качестве протоколов, которые могут быть включены в способ по изобретению. Может быть использован любой химиотерапевтический агент, в том числе алкилирующие агенты, антиметаболиты, гормоны и антагонисты, радиоизотопы, а также природные продукты. Например, соединение по изобретению может вводиться с антибиотиками, такими как доксорубицин и другие аналоги антрациклина, азотными аналогами иприта, такими как циклофосфамид, аналогами пиримидинов, такими как 5-фторурацил, цисплатином, гидроксимочевиной, таксолом и его природными и синтетическими производными, и т.п. В качестве другого примера, в случае смешанных опухолей, таких как аденокарцинома молочной железы, где эти опухоли включают гонадотропин-зависимые и гонадотропин-независимые клетки, это соединение может вводиться вместе с лейпролидом или госерелином (синтетическими пептидными аналогами LH-RH). Другие противоопухолевые протоколы включают применение соединения тетрациклина с другим способом воздействия, например, хирургией, облучением и т.д., также называемыми здесь «вспомогательными противоопухолевыми способами воздействия». Таким образом, способ данного изобретения может быть использован с такими общепринятыми схемами с преимуществом уменьшения побочных действий и усиления эффективности.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает композиции и способы, применимые для лечения большого разнообразия раковых заболеваний, включающих солидные опухоли и лейкозы. Типы раковых заболеваний, которые могут лечиться, включают, но не ограничиваются ими: аденокарциному молочной железы, предстательной железы и ободочной кишки; все формы бронхогенной карциномы легкого; миелоид; меланому; гепатому; нейробластому; папиллому; апудому; хористому; бранхиому; злокачественный карциноидный синдром; карциноидное сердечное заболевание; карциному (например, Уолкера, базально-клеточную карциному, карциному Брауна-Пирса, проточную карциному, опухоль Эрлиха, карциному Кребса 2, карциному из клеток Меркеля, мукоидную карциному, немелкоклеточный рак легкого, овсяно-клеточную карциному, папиллярную карциному, скриррозную (фиброзную) карциному, бронхиолярную, бронхиогенную, плоскоклеточную карциному и переходно-клеточную карциному; болезнь Ходжкина; иммунопролиферативную мелкоклеточную карциному; неходжкинскую лимфому; плазмацитому; ретикулоэндотелиоз; меланому; хондробластому; хондрому; хондросаркому; фиброму; фибросаркому; гигантоклеточные опухоли; гистиоцитому; липому; липосаркому; мезотелиому; миксому; миксосаркому; остеому; остеосаркому; хордому; краниофарингиому; дисгерминому; гамартому; мезенхимому; мезонефрому; миосаркому; амелобластому; цементому; одонтому; тератому; тимотому; тофобластную опухоль. Кроме того, можно лечить следующие типы рака: аденома; холангиома; холестеатома; цилиндрома; цистаденокарцинома; цистаденома; гранулезоклеточная опухоль; андробластома; гепатома; гидраденома; инсулома; опухоль из клеток Лейдига; папиллома; опухоль их клеток Сертоли; текома; лейомиома; лейомиосаркома; миобластома; миома; миосаркома; рабдомиома; рабдомиосаркома; эпендимома; ганглионеврома; глиома; медуллобластома; менингиома; неврилеммома; нейробластома; нейроэпителиома; нейрофиброма; неврома; параганглиома; нехромаффинная параганглиома; ангиокератома; ангиолимфоидная гиперплазия с эозинофилией; склерозирующая ангиома; ангиоматоз; гломангиома; гемангиоэндотелиома; гемангиома; гемангиоперицитома; гемангиосаркома; лимфангиома; лимфангиомиома; лимфангиосаркома; пинеалома; карциносаркома; хондросаркома; листовидная цистосаркома; фибросаркома; гемангиосаркома; лейомиосаркома; лейкосаркома; липосаркома; лимфангиосаркома; миосаркома; миксосаркома; рак яичника; рабдомиосааркома; саркома; неоплазмы; нейрофиброматоз и дисплазия шейки матки.
Другой аспект данного изобретения состоит в применении материалов и способов данного изобретения для предотвращения и/или лечения любого гиперпролиферативного состояния кожи, в том числе псориаза и контактного дерматита или других гиперпролифепративных заболеваний. Было показано, что пациенты с псориазом и контактным дерматитом имели повышенную активность Ang-2 в их повреждениях (Ogoshi et al., J. Inv. Dermatol., 110:818-23 (1998)). Предпочтительно, специфические связывающие агенты, специфические в отношении Ang-2, будут применяться в комбинации с другими фармацевтическими агентами для лечения людей, которые проявляют эти клинические симптомы. Специфические связывающие агенты могут доставляться с использованием любого из различных носителей посредством способов введения, описанных здесь, и других способов, которые хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам.
Другие аспекты данного изобретения включают лечение различных ретинопатий (в том числе диабетической ретинопатии и связанной с возрастом дегенерации желтого пятна), в которых участвует ангиогенез, а также нарушений/заболеваний женских половых путей, таких как эндометриоз, фиброиды матки и другие подобные состояния, связанные с нарушенной функцией пролиферации сосудов (в том числе эндометриального микроваскулярного роста) во время женского репродуктивного цикла.
Еще один аспект данного изобретения относится к лечению отклоняющегося от нормы роста сосудов, включающего церебральные артерио-венозные мальформации (AVM), повреждение и репарацию желудочно-кишечной слизистой оболочки, изъязвление гастродуоденальной слизистой оболочки у пациентов с анамнезом заболевания с пептическими язвами, включающими ишемию, происходящую из инсульта, широкий спектр васкулярных нарушений в заболевании печени и портальную гипертензию у пациентов с непеченочной портальной гипертензией.
Другой аспект данного изобретения является предотвращением раковых заболеваний, с использованием композиций и способов, обеспеченных данным изобретением. Такие реагенты будут включать специфические связывающие агенты против Ang-2.
Фармацевтические композици
Фармацевтические композиции Ang-2-специфических связывающих агентов находятся в рамках данного изобретения. Фармацевтические композиции, содержащие антитела, подробно описаны, например, в Патенте США 6171586, выданном Lam et al., 9 января 2001 года. Такие композиции содержат терапевтически или профилактически эффективное количество специфического связывающего агента, такого как антитело или его фрагмент, вариант, производное или слияние, описанные здесь, в смеси с фармацевтически приемлемым агентом. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтические композиции содержат антагонистические специфические связывающие агенты, которые модулируют частично или полностью по меньшей мере одну биологическую активность Ang-2, в смеси с фармацевтически приемлемым агентом. Обычно, эти специфические связывающие агенты будут достаточно очищенными для введения животному.
th
Эти фармацевтические композиции могут содержать необходимые для приготовления материалы для модификации, поддержания или консервирования, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, абсорбции или проникновения этой композиции. Подходящие материалы для приготовления композиции включают, но не ограничиваются ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); антимикробные вещества; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как боратный, бикарбонатный, Трис-HCl, цитратный, фосфатный или буфер с другими органическими кислотами); объемные агенты (такие как маннит или глицин), хелатообразующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красящие агенты; ароматизирующие агенты и разбавители; эмульгирующие агенты; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимерозал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахароспирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (такие как плуроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); усиливающие стабильность агенты (сахароза или сорбит); усиливающие тоничность агенты (такие как галогениды щелочных металлов (предпочтительно хлорид натрия или калия, маннит сорбит); доставляющие носители; разбавители; эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).
Оптимальная фармацевтическая композиция будет определяться квалифицированным в данной области специалистом в зависимости, например, от предполагаемого способа введения, формата доставки и желаемой дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, выше. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo специфического связывающего агента.
Первичный наполнитель или носитель в фармацевтической композиции может быть либо водным, либо неводным по природе. Например, подходящим наполнителем или носителем может быть вода для инъекции, физиологический солевой раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, возможно, дополненная другими материалами, обычными в композициях для парентерального введения. Дополнительными примерами наполнителей являются нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Другие примерные фармацевтические композиции содержат Трис-буфер приблизительно рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер приблизительно 4,0-5,5, которые могут дополнительно включать сорбит или его подходящий заменитель. В одном варианте осуществления данного изобретения, композиции связывающего агента могут быть приготовлены для хранения смешиванием выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с оптимальными агентами для приготовления композиций (Remington's Pharmaceutical Sciences, выше) в форме лиофилизированного фильтровального осадка или водного раствора. Кроме того, продукт связывающего агента может быть приготовлен в виде лиофилизата с использованием подходящих эксципиентов, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции могут быть выбраны для парентеральной доставки. Альтернативно, эти композиции могут быть выбраны для ингаляции или для энтеральной доставки, такой как пероральная, ушная, глазная, ректальная или вагинальная доставка. Приготовление таких фармацевтически приемлемых композиций находится в рамках квалификации в данной области.
Компоненты композиции присутствуют в концентрациях, которые являются приемлемыми для конкретного участка введения. Например, буферы используют для поддержания композиции при физиологическом рН или слегка более низком рН, обычно в диапазоне рН приблизительно 5 - приблизительно 8.
При рассмотрении парентерального введения терапевтические композиции для применения в этом изобретении могут быть в форме апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, содержащего желаемый специфический связывающий агент в фармацевтически приемлемом носителе. Особенно подходящим наполнителем для парентерального инъекционного раствора является стерильная дистиллированная вода, в которой связывающий агент приготовлен в виде стерильного, изотонического раствора, подходящим образом консервированного. В другом приготовлении может участвовать готовая форма желаемой молекулы с агентом, такая как инъецируемые микросферы, биологически разлагаемые частицы, полимерные соединения (полимолочная кислота, полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которая обеспечивает контролируемое или пролонгированное высвобождение продукта, который может затем доставляться посредством инъекции депо. Может быть также использована гиалуроновая кислота, и это может приводить к усилению стойкой продолжительности в циркуляции. Другие подходящие средства для введения желаемой молекулы включают имплантируемые устройства для доставки лекарственных средств.
В другом аспекте, фармацевтические композиции, подходящие для парентеральной доставки, могут быть приготовлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологически забуференный солевой раствор. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть приготовлены в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или наполнители включают жирные масла (масла с высоким содержанием жира), такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды, или липосомы. Для доставки могут быть также использованы нелипидные поликатионные аминополимеры. Необязательно, эта суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты для увеличения растворимости этих соединений и создания возможности приготовления высококонцентрированных растворов.
В другом варианте осуществления, фармацевтическая композиция может быть приготовлена для ингаляции. Например, связывающий агент может быть приготовлен в виде сухого порошка для ингаляции. Растворы для ингаляции полипептида или нуклеиновой кислоты могут быть также приготовлены с пропеллентом для аэрозольной доставки. Еще в одном варианте осуществления, растворы могут быть распыленными. Кроме того, легочное введение описано в Заявке РСТ с номером РСТ/US94/001875, которая описывает легочную доставку химически модифицированных белков.
Также предполагается, что определенные готовые формы могут вводиться перорально. В одном варианте осуществления данного изобретения, молекулы связывающего агента, которые вводят таким образом, могут быть приготовлены с наполнителями или без наполнителей, обычно используемых в компаундировании твердых дозированных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, может быть изготовлена капсула для высвобождения активной части композиции в тот момент в желудочно-кишечном тракте, когда биодоступность является максимизированной, а пре-системная деградация является минимизированной. Могут быть включены дополнительные агенты для облегчения абсорбции молекулы связывающего агента. Могут быть также использованы разбавители, ароматизирующие агенты, низкоплавящиеся воски, растительные масла, смазывающие агенты, суспендирующие агенты, дезинтегрирующие таблетку агенты и связывающие вещества.
Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть также приготовлены с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области, в дозах, подходящих для перорального введения. Такие носители позволяют готовить фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п., для приема внутрь пациентом.
Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены объединением активных соединений с твердым эксципиентом и переработкой полученной смеси в гранулы (необязательно после измельчения) с получением сердцевинных частей таблеток или драже. Если желательно, могут быть добавлены подходящие вспомогательные вещества. Подходящие эксципиенты включают углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит и сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натрий-карбоксиметилцеллюлоза; смолы, в том числе аравийская и трагакантовая; и белки, такие как желатин и коллаген. Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие или солюбилизирующие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар и альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.
Сердцевинные части драже могут быть использованы вместе с подходящими покрытиями, такими как концентрированные растворы сахаров, которые могут также содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, карбополовый гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лаков и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут добавляться к покрытиям таблеток и драже для идентификации продукта или для характеристики количества активного соединения, т.е. дозы.
Фармацевтические препараты, которые могут быть использованы перорально, могут также включать «пуш-фит»-капсулы (с плотной посадкой половинок капсул), изготовленные из желатина, а также мягкие, запаянные капсулы, изготовленные из желатина и покрытия, такого как глицерин или сорбит. Пуш-фит-капсулы могут содержать активное вещество, смешанное с наполнителями или связывающими агентами, такими как лактоза или крахмалы, смазывающие вещества, такие как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторы. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкость или жидкий полиэтиленгликоль, со стабилизаторами или без стабилизаторов.
Другая фармацевтическая композиция может включать эффективное количество связывающего агента в смеси с нетоксичными эксципиентами, которые пригодны для изготовления таблеток. Растворением этих таблеток в стерильной воде или другом подходящем наполнителе могут быть приготовлены растворы в унифицированной дозированной форме. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза, или фосфат кальция; или связывающие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Дополнительные фармацевтические композиции будут очевидными квалифицированным в данной области специалистам, в том числе композиции, включающие молекулы связывающего агента в композиции с задержанной или контролируемой доставкой. Способы изготовления различных других средств пролонгированной или контролируемой доставки, таких как липосомные носители, биологически деградируемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекции веществ замедленного связывания, также известны квалифицированным в данной области специалистам. См., например, РСТ/US93/00829, который описывает контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. Дополнительные примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые полимерные матриксы в форме сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Матриксы замедленного высвобождения могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (US 3773919, ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman et al., Diopolymers, 22:547-556 (1983), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al.,J Biomed Mater Res, 15:167-277, (1981)) и (Langer et al., Chem Tech, 12:98-105 (1982)), этиленвинилацетат (Langer et al., выше) или поли-D(-)-3-гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988).
Композиции пролонгированного действия также включают липосомы, которые могут быть изготовлены любым из нескольких способов, известных в данной области. См., например, Eppstein et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36676; EP 88046; EP 143949.
Фармацевтическая композиция для использования во введении in vivo обычно должна быть стерильной. Это может выполняться фильтрованием через мембраны стерильного фильтрования. Если композиция является лиофилизированной, стерилизация с использованием этого способа может проводиться либо до, либо после лиофилизации и воссоздания. Композиции для парентерального введения могут храниться в лиофилизированной форме или в растворе. Кроме того, парентеральные композиции обычно помещают в контейнер, имеющий стерильное отверстие доступа, например, мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции.
После приготовления фармацевтической композиции она может храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие препараты могут храниться либо в готовой для применения форме, либо в форме (например, лиофилизированной), требующей воссоздания перед введением.
В конкретном варианте осуществления, данное изобретение относится к наборам для получения единицы однократной дозы введения. Каждый из этих наборов содержит как первый контейнер, имеющий высушенный белок, так и второй контейнер, имеющий водную композицию. В объем этого изобретения включены также наборы, содержащие одно- и мультикамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы для жидкости и лиошприцы).
Эффективное количество фармацевтической композиции, которое должно использоваться терапевтически, будет зависеть, например, от терапевтического контекста и терапевтических целей. Таким образом, квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что подходящие для лечения уровни доз будут зависеть, частично, от доставляемой молекулы, показания, для которого используют данную молекулу связывающего агента, способа введения и размера (массы тела, поверхности тела или размера органа) и состояния (возраста и общего здоровья) данного пациента. Таким образом, клиницист может изменять дозу и модифицировать способ введения для получения оптимального терапевтического эффекта. Обычная доза может быть в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг - приблизительно 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. В других вариантах осуществления, эта доза может быть в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг - приблизительно 100 мг/кг или 1 мг/кг - приблизительно 100 мг/кг или 5 мг/кг - приблизительно 100 мг/кг.
Для любого соединения, терапевтически эффективная доза может быть приближенно оценена первоначально либо в анализах на культуре клеток, либо в моделях животных, таких как мыши, крысы, кролики, собаки или свиньи. Модель животного может быть также использована для определения подходящего диапазона концентраций и способа введения. Затем такую информацию используют для определения применимых доз и способов введения у людей.
Точную дозу определяют в свете факторов, связанных с субъектом, требующим лечения. Дозу и введение корректируют для обеспечения достаточных уровней активного соединения или для поддержания желаемого эффекта. Факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают тяжесть состояния болезни, общее здоровье субъекта, возраст, массу и пол субъекта, время и частоту введения, комбинацию (комбинации) лекарственных средств, чувствительность реакции и реакцию на терапию. Длительно действующие фармацевтические композиции могут вводиться каждые 3-4 дня, каждую неделю или каждые две недели, в зависимости от полупериода существования и скорости клиренса конкретной композиции.
Частота введения доз будет зависеть от фармакокинетических параметров молекулы связывающего агента в используемой композиции. Обычно, композицию вводят, пока не достигается доза, которая дает желаемый эффект. Таким образом, эту композицию можно вводить в виде единственной дозы или в виде множественных доз (при одной и той же или при различных концентрациях) на протяжении времени или в виде непрерывного вливания. Дополнительное улучшение подходящей дозы выполняют рутинным образом. Подходящие дозы могут быть получены с использованием полученных данных доза-ответ.
Способ введения фармацевтической композиции согласуется с известными способами, например, пероральным, посредством инъекции внутривенным, внутрибрюшинным, интрацеребральным (интрапаренхимальным), интрацеребровентрикулярным, внутримышечным, интраокулярным, интраартериальным, интрапортальным способами, введением в повреждение, интрамедуллярным, интратекальным (внутриоболочечным), интравентрикулярным, трансдермальным, внутрибрюшинным, интраназальным, энтеральным, местным, сублингвальным, уретральным, вагинальным или ректальным способом, посредством систем пролонгированного действия или имплантируемых устройств. Если желательно, эти композиции могут вводиться болюсной инъекцией или непрерывно инфузией или при помощи имплантированного устройства.
Альтернативно или дополнительно эта композиция может вводиться локально имплантацией мембраны, губки или другого подходящего материала, на который была абсорбирована или инкапсулирована желаемая молекула. При использовании имплантируемого устройства это устройство может быть имплантировано в любые подходящие ткань или орган, и доставка желаемой молекулы может осуществляться посредством диффузии, болюса с таймингом высвобождения или непрерывным введением.
В некоторых случаях может быть желательным использование фармацевтической композиции ex vivo. В таких случаях клетки, ткани или органы, которые были извлечены из пациента, подвергают действию этих фармацевтических композиций, после чего эти клетки, ткани и/или органы имплантируют затем обратно в пациента.
В других случаях, связывающий агент, который является полипептидом, может быть доставлен имплантацией определенных клеток, которые были сконструированы генетически, с использованием способов, таких как способы, описанные здесь, для экспрессии и секреции этого полипептида. Такие клетки могут происходить из животных или человека и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. Необязательно, эти клетки могут быть иммортализованы. Для уменьшения шанса иммунологической реакции эти клетки могут быть инкапсулированы во избежание инфильтрации окружающих тканей. Инкапсулированные материалы обычно являются биосовместимыми, полупроницаемыми полимерными ограждениями или мембранами, которые делают возможным высвобождение белкового продукта (белковых продуктов), но предотвращают деструкцию этих клеток иммунной системой человека или другими вредными факторами из окружающих тканей.
Комбинированная терапия
Специфические связывающие агенты данного изобретения могут быть использованы в комбинации с другим терапевтическим средством в лечении Ang-2-патологий. Эти другие терапевтические средства включают, например, лучевую обработку, химиотерапию и нацеленные терапии, описанные здесь ниже. Дополнительные комбинированные терапии, конкретно не перечисленные здесь, находятся также в объеме данного изобретения.
Таким образом, данное изобретение включает введение одного или нескольких специфических связывающих агентов данного изобретения, вводимых одному и тому же пациенту в комбинации с одним или несколькими дополнительно подходящими агентами, каждый из которых вводят в соответствии со схемой, подходящей для данного медикамента. Это введение включает совместное введение специфического связывающего агента данного изобретения и одного или нескольких подходящих агентов. В данном контексте, термины «вводимый совместно» и «совместное введение» включают по существу одновременное введение одного или нескольких специфических связывающих агентов в соответствии с данным изобретением и одного или нескольких дополнительно подходящих агентов.
В данном контексте, термин «несовместное» введение включает введение одного или нескольких специфических связывающих агентов в соответствии с данным изобретением и одного или нескольких дополнительно подходящих агентов в разных временных точках, в любом порядке, независимо от того перекрываются они или нет. Это включает, но не ограничивается этим, последовательное лечение (например, предварительное введение перед введением основного компонента, введение после основного компонента или перекрывающееся лечение) компонентами этой комбинации, а также схемы, в которых эти лекарственные средства чередуются, или введение одного компонента долгосрочно, а другого компонента периодически. Компоненты могут вводиться в одной и той же композиции или в раздельных композициях и одним и тем же или различными способами введения.
В некоторых вариантах осуществления, комбинированная терапия включает специфический связывающий агент, способный связывать Ang-2, в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным антиангиогенным агентом. Эти агенты включают, но не ограничиваются ими, полученные in vitro синтетически химические композиции, антитела, антигенсвязывающие районы, радионуклиды и их комбинации и конъюгаты. В некоторых вариантах осуществления, агент может действовать в качестве агониста, антагониста, аллостерического модулятора или токсина. В некоторых вариантах осуществления, агент может действовать как ингибитор или стимулятор его мишени (например, активации или ингибирования рецептора или фермента) и посредством этого стимулировать смерть клеток или остановку роста клеток.
Химиотерапевтическое лечение может использовать противоопухолевые агенты, например, алкилирующие агенты, включающие в себя: азотные аналоги иприта, такие как меклоретамин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан и хлорамбуцил; нитрозомочевины, такие как кармустин (BCNU), ломустин (CCNU) и семустин (метил-CCNU); этиленимины/метилмеламин, такие как триэтиленмеламин (ТЕМ), триэтилен, тиофосфорамид (тиотепа), гексаметилмеламин (НММ, алтретамин); алкилсульфонаты, такие как бусульфан; триазины, такие как дакарбазин (DTIC); антиметаболиты, включающие аналоги фолиевой кислоты, такие как метотрексат и триметрексат, аналоги пиримидина, такие как 5-фторурацил, фтордезоксиуридин, гемцитабин, цитозинарабинозид (AraC, цитарабин), 5-азацитидин, 2,2'-дифтордезоксицитидин, аналоги пурина, такие как 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, азатиоприн, 2'-дезоксикоформицин (пентостатин), эритрогидроксинониладенин (EHNA), флударабина фосфат и 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-CdA); природные продукты, включающие антимитотические лекарственные средства, такие как паклитаксел, винкаалкалоиды, в том числе винбластин (VLB), винкристин и винорелбин, таксотере, эстрамустин и эстрамустина фосфат; пиподофилотоксины, такие как этопозид и тенипозид; антибиотики, такие как актиномицин D, дауномицин (рибидомицин), доксорубицин, митоксантрон, идарубицин, блеомицины, пликамицин (митрамицин), митомицин С и актиномицин; ферменты, такие как L-аспарагиназа; модификаторы биологических реакций, такие как интерферон-альфа, IL-2 G-CSF и GM-CSF; разнообразные агенты, включающие координационные комплексы платины, такие как цисплатин и карбоплатин, антрацендионы, такие как митоксантрон, замещенная мочевина, такая как гидроксимочевина, производные метилгидразина, в том числе N-метилгидразин (MIH) и прокарбазин, адренокортикальные супрессоры, такие как митотан (o,p'-DDD) и аминоглутетимид; гормоны и антагонисты, в том числе адренокортикостероидные антагонисты, такие как преднизон и эквиваленты, дексаметазон и аминоглутетимид; прогестин, такой как гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат и мегестрола ацетат; эстроген, такой как диэтилстильбестрол и эквиваленты этинилэстрадиола; антиэстроген, такой как тамоксифен; андрогены, в том числе тестостерона пропионат и флуоксиместерон/эквиваленты; антиандрогены, такие как флутамид, аналоги гонадотропинвысвобождающего гормона и лейпролид; и нестероидные антиандрогены, такие как флутамид.
Противораковые терапевтические агенты, которые могут вводиться с Ang-2-специфическим связывающим агентом, также включают, но не ограничиваются ими, нацеленные терапевтические средства, описанные здесь. Примеры нацеленных терапевтических средств включают, но не ограничиваются ими, применение терапевтических антител. Примеры терапевтических антител включают, но не ограничиваются ими, мышиные, мышь-человек-химерные, CDR-трансплантированные, гуманизированные и полностью человеческие антитела и синтетические антитела, в том числе, но не только, антитела, выбранные посредством скрининга библиотек антител. Примерные антитела включают, но не ограничиваются ими, антитела, которые связываются с белками клеточной поверхности Her2, CDC20, CDC33, муцин-подобный гликопротеин и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), присутствующие на опухолевых клетках и необязательно индуцирующие цитостатическое и/или цитотоксичное действие на опухолевые клетки, обнаруживающие эти белки на их поверхности. Примеры антител включают также HERCEPTINE™ (трастуцумаб), который может быть использован для лечения рака молочной железы и других форм рака, и RITUXAN™ (ритуксимаб), ZEVALIN™ (ибритумомаб тиуксетан), GLEEVEC™ и LYMPHOCIDE™ (эпратуцумаб), которые могут быть использованы для лечения неходжкинской лимфомы и других форм рака. Некоторые примеры антител включают также ERBITUX™ (IMC-C225); IRESSA™ (эртинолиб); BEXXAR™ (иод-131-тоситумомаб); ингибиторы KDR (рецептора киназного домена); анти-VEGF-антитела и антагонисты (например, AVASTIN™ и VEGAF-TRAP); анти-VEGF-рецептор-антитела и антигенсвязывающие районы; анти-Ang-1-антитела и антигенсвязывающие районы; антитела к Tie-2 и другим Ang-1- и Ang-2-рецепторам; Tie-2-лиганды; антитела против ингибиторов Tie-2-киназы и Campath (алемтуцумаб). В некоторых вариантах осуществления, агенты противораковой терапии являются полипептидами, которые селективно индуцируют апоптоз в опухолевых клетках, в том числе, но не только TNF-родственные полипептиды, такие как TRAIL (апоптоз-индуцирующий лиганд TNF-рецептора).
В некоторых вариантах осуществления, используют агенты раковой терапии, о которых известно, что они являются антиангиогенными. Некоторые такие агенты включают, но не ограничиваются ими, IL-8, Campath™, В-FGF; антагонисты FGF; антагонисты Tek (Ceretti et al., Публикация США № 2003/0162712; Ceretti et al., Патент США № 6413932 и Ceretti et al., Патент США № 6521424, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки для любой цели); анти-TWEAK-агенты (которые включают, но не ограничиваются ими, антитела и антигенсвязывающие районы); антагонисты растворимого рецептора TWEAK (Wiley, Патент США № 6727225); дезинтегрины ADAM (или их домены для противодействия связывания интегрина с его лигандами (Fanslow et al., Публикация США № 2002/0042368); анти-eph-рецептор- и анти-ephrin-антитела; антигенсвязывающие районы или антагонисты (Патенты США №№ 5981245, 5728813, 5969110, 6596852, 6232447, 6057124 и члены семейства патентов-аналогов); анти-VEGF-агенты, такие как описанные здесь (например, антитела или антигенсвязывающие районы, которые специфически связывают VEGF, или растворимые VEGF-рецепторы или их лигандсвязывающие районы), такие как AVASTIN™ или VEGF-TRAP™ и анти-VEGF-рецептор-агенты (например, антитела или антигенсвязывающие районы, которые специфически связываются с ними), ингибирующие EGFR агенты (например, антитела или антигенсвязывающие районы, которые специфически связываются с ними), IRESSA™ (гефитиниб), TARCEVA™ (эрлотиниб), анти-Ang-1- и анти-Ang-2-агенты (например, антитела или антигенсвязывающие районы, специфически связывающиеся с ними или с их рецепторами, например, Tie-2/TEK) и ингибирующие анти-Tie-2-киназа-агенты (например, антитела или антигенсвязывающие районы, которые специфически связывают и ингибируют активность факторов роста, такие как антагонисты фактора роста гепатоцитов (HGF, также известного как Scatter Factor) и антитела или антигенсвязывающие районы, которые специфически связывают его рецептор “c-met”; анти-PDGF-BB-антагонисты; антитела и антигенсвязывающие районы против PDGF-BB-лигандов; и ингибиторы PDGFR-киназы.
В некоторых вариантах осуществления, агентами раковой терапии являются ингибиторы ангиогенеза. Некоторые подобные ингибиторы включают, но не ограничиваются ими, SD-7784 (Pfizer, USA); циленгитид (Merck KGaA, Germany, EPO 770622); пегатаниб октанатрий (Gilead Sciences, USA); Альфастатин (BioActa, UK); M-PGA (Celgene, USA, US 5712291); иломастат (Arriva, USA, US 5892112); семаксаниб (Pfizer, USA, US 5792783); ваталаниб (Novartis, Switzerland); 2-метоксиэстрадиол (EntreMed, USA); TLC ELL-12 (Elan, Ireland); анекортава ацетат (Alcon, USA); альфа-D148 Mab (Amgen, USA); CEP-7055 (Cephalon, USA); анти-Vn Mab (Crucell, Netherlands) DAC:антиангиогенный (ConjuChem, Canada); Ангиоцидин (InKine Pharmaceutical, USA); KM-2550 (Kyowa Hakko, Japan); SU-0879 (Pfizer, USA); CGP-79787 (Novartis, Switzerland, EP 970070); ARGENT-технологию, (Ariad, USA); YIGSR-Stealth, (Johnson & Johnson, USA); фрагмент фибриногена-Е, (BioActa, UK); ингибитор ангиогенеза, (Trigen, UK); TBC-1635, (Encysive Pharmaceuticals, USA); SC-236, (Pfizer, USA); ABT-567, (Abbott, USA); Метастатин, (EntreMed, USA); ингибитор ангиогенеза, (Tripep, Sweden); маспин, (Sosei, Japan); 2-метоксиэстрадиол, (Oncology Sciences Corporation, USA); ER-68203-00, (IVAX, USA); Benefin, (Lane Labs, USA); Tz-93, (Tsumura, Japan); TAN-1120, (Takeda, Japan); FR-111142, (Fujisawa, Japan, JP 02233610); фактор тромбоцитов 4, (RepliGen, USA, EP 407122); антагонист васкулярного эндотелиального фактора роста, (Borean, Denmark); противораковый терапевтический агент, (University of South Carolina, USA); бевацицумаб (pINN), (Genentech, USA); ингибиторы ангиогенеза, (SUGEN, USA); XL 784, (Exelixis, USA); XL 647, (Exelixis, USA); MAb, альфа5бета3 интегрин, вторая генерация, (Applied Molecular Evolution, USA and MedImmune, USA); агент генной терапии, ретинопатия, (Oxford BioMedica, UK); энзастаурина гидрохлорид (USAN), (Lilly, USA); CEP 7055, (Cephalon, USA and Sanofi-Synthelabo, France); BC 1, (Genoa Institute of Cancer Research, Italy); ингибитор ангиогенеза, (Alchemia, Australia); антагонист VEGF, (Regeneron, USA); полученный из rBPI 21 и BPI антиангиогенный агент, (XOMA, USA); PI 88, (Progen, Australia); циленгитид (pINN), (Merck KGaA; Munich Technical University, Germany, Scripps Clinic and Research Foundation, USA); цетуксимаб (INN), (Aventis, France); AVE 8062, (Ajinomoto, Japan); AS 1404, (Cancer Research Laboratory, New Zealand); SG 292 (Telios, USA); эндостатин, (Boston Childrens Hospital, USA); ATN 161, (Attenuon, USA); АНГИОСТАТИН, (Boston Childrens Hospital, USA); 2-метоксиэстрадиол, (Boston Childrens Hospital, USA); ZD 6474, (AstraZeneca, UK); ZD 6126, (Angiogene Pharmaceuticals, UK); PPI 2458, (Praecis, USA); AZD 9935, (AstraZeneca, UK); AZD 2171, (AstraZeneca, UK); ваталаниб (pINN), (Novartis, Switzerland and Schering AG, Germany); ингибиторы пути тканевого фактора, (EntreMed, USA); пегаптаниб (Pinn), (Gilead Sciences, USA); ксанторризол, (Yonsei University, South Korea); вакцину, на основе гена, VEGF-2, (Scripps Clinic and Research Foundation, USA); SPV5.2, (Supratek, Canada); SDX 103, (University of California at San Diego, USA); PX 478, (ProlX, USA); МЕТАСТАТИН, (EntreMed, USA); тропонин I, (Harvard University, USA); SU 6668, (SUGEN, USA); OXI 4503, (OXiGENE, USA); o-гуанидины, (Dimensional Pharmaceuticals, USA); мотупорамин C, (British Columbia University, Canada); CDP 791, (Celltech Group, UK); атипримод (pINN), (GlaxoSmithKline, UK); E 7820, (Eisai, Japan); CYC 381, (Harvard University, USA); AE 941, (Aeterna, Canada); вакцину, ангиогенез, (EntreMed, USA); ингибитор активатора плазминогена урокиназного типа, (Dendreon, USA); оглуфанид (pINN), (Melmotte, USA); ингибиторы HIF-1alfa, (Xenova, UK); CEP 5214, (Cephalon, USA); BAY RES 2622, (Bayer, Germany); Ангиоцидин, (InKine, USA); A6, (Angstrom, USA); KR 31372, (Korea Research Institute of Chemical Technology, South Korea); GW 2286, (GlaxoSmithKline, UK); EHT 0101, (ExonHit, France); CP 868596, (Pfizer, USA); CP 564959, (OSI, USA); CP 547632, (Pfizer, USA); 786034, (GlaxoSmithKline, UK); KRN 633, (Kirin Brewery, Japan); систему доставки лекарственного средства, внутриглазную, 2-метоксиэстрадиол, (EntreMed, USA); ангинекс, (Maastricht University, Netherlands, and Minnesota University, USA); ABT 510, (Abbott, USA); AAL 993, (Novartis, Switzerland); VEGI, (ProteomTech, USA); ингибиторы фактора некроза опухолей альфа, (National Institute on Aging, USA); SU 11248, (Pfizer, USA and SUGEN USA); ABT 518, (Abbott, USA); YH16, (Yantai Rongchang, China); S-3APG, (Boston Childrens Hospital, USA and EntreMed, USA); MAb, KDR, (ImClone Systems, USA); MAb, альфа5 бета1, (Protein Design, USA); ингибитор киназы KDR, (Celltech Group, UK, and Johnson & Johnson, USA); GFB 116, (South Florida University, USA and Yale University, USA); CS 706, (Sankyo, Japan); пролекарство комбретастатин A4, (Arizona State University, USA); хондроитиназу AC, (IBEX, Canada); BAY RES 2690, (Bayer, Germany); AGM 1470, (Harvard University, USA, Takeda, Japan, and TAP, USA); AG 13925, (Agouron, USA); тетратиомолебдат, (University of Michigan, USA); GCS 100, (Wayne State University, USA) CV 247, (Ivy Medical, UK); CKD 732, (Chong Kun Dang, South Korea); MAb, васкулярный эндотелиальный фактор роста, (Xenova, UK); ирзогладин (INN), (Nippon Shinyaku, Japan); RG 13577, (Aventis, France); WX 360, (Wilex, Germany); скваламин (pINN), (Genaera, USA); RPI 4610, (Sirna, USA); противораковый терапевтический агент, (Marinova, Australia); ингибиторы гепараназы, (InSight, Israel); KL 3106, (Kolon, South Korea); Хонокиол, (Emory University, USA); ZK CDK, (Schering AG, Germany); ZK Angio, (Schering AG, Germany); ZK 229561, (Novartis, Switzerland, and Schering AG, Germany); XMP 300, (XOMA, USA); VGA 1102, (Taisho, Japan); модуляторы рецептора VEGF, (Pharmacopeia, USA); антагонисты VE-кадгерина-2, (ImClone Systems, USA); Vasostatin, (National Institutes of Health, USA); вакцину, Flk-1, (ImClone Systems, USA); TZ 93, (Tsumura, Japan); TumStatin, (Beth Israel Hospital, USA); укороченный растворимый FLT 1 (рецептор 1 васкулярного эндотелиального фактора роста), (Merck & Co, USA); Tie-2-лиганды, (Regeneron, USA); ингибитор тромбоспондина 1, (Allegheny Health, Education and Research Foundation, USA); 4-(5-(4-хлорфенил)-3-(трифторметил)-1H-пиразол-1-ил)-2-бензолсульфонамид; Arriva; и C-Met. AVE 8062 (моногидрохлорид (2S)-2-амино-3-гидрокси-N-[2-метокси-5-[(1Z)-2-(3,4,5-триметоксифенил)этенил]фенил]пропанамида); метелимумаб (pINN) (иммуноглобулин G4, анти-(трансформирующий фактор роста бета 1 человека (гамма.4-цепь моноклонального САТ 192 человека)), дисульфид с димером каппа-цепи моноклонального САТ 192 человека); лиганд Flt3; лиганд CD40; интерлейкин-2; интерлейкин-12; лиганд 4-1BB; анти-4-1BB-антитела; TNF-антагонисты и антагонисты TNF-рецептора в том числе TNFR/Fc, TWEAK-антагонисты и TWEAK-R-антагонисты в том числе TWEAK-R/Fc; TRAIL; VEGF-антагонисты, включающие анти-VEGF антитела; антагонисты VEGF-рецептора (в том числе VEGF-R1 и VEGF-R2, также известные как Flt1 и Flk1 или KDR); антагонисты CD148 (также известные как DEP-1, ECRTP и PTPRJ, см. статью Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2135-45 (1999), тем самым включенную здесь в качестве ссылки для любой цели); ингибитор тромбоспондина 1 и ингибиторы одного или обоих из Tie-2 или лигандов Tie-2 (таких как Ang-2). Ряд ингибиторов Ang-2 известны в данной области, в том числе некоторые анти-Ang-2 антитела, описанные в опубликованном Патенте США № 20030124129 (соответствующем Заявке PCT № WO03/030833), и Патенте США № 6166185, содержания которых включены здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Дополнительно Ang-2 пептидные антитела также известны в данной области и могут быть найдены, например, в опубликованной патентной Заевке США № 20030229023 (соответствующей Заявке № WO 03/057134) и опублекованной патентной Заевке США № 20030236193, содержания которых включены здесь в качестве ссылки в полном объеме.
N
N
N
Некоторые агенты раковой терапии включают, но не ограничиваются ими: талидомид и аналоги талидомида (N-(2,6-диоксо-3-пиперидил)фталамид); текогалан-натрий (сульфатированный полисахарид пептидогликан); TAN 1120 (8-ацетил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-10-[[октагидро-5-гидрокси-2-(2-гидроксипропил)-4,10-диметилпирано[3,4-d]-1,3,6-диоксазоцин-8-ил]окси]-5,12-нафтацендион); сурадиста (тетранатриевая соль 7,7'-[карбонилбис[имино(1-метил-1H-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1H-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]бис-1,3-нафталиндисульфоновой кислоты); SU 302; SU 301; SU 1498 ((E)-2-циано-3-[4-гидрокси-3,5-бис(1-метилэтил)фенил]-N-(3-фенилпропил)-2-пропенамид); SU 1433 (4-(6,7-диметил-2-хиноксалинил)-1,2-бензолдиол); ST 1514; SR 25989; растворимый Tie-2; производные SERM, Pharmos; семаксаниб (pINN)(3-[(3,5-диметил-1H-пиррол-2-ил)метилен]-1,3-дигидро-2H-индол-2-он); S 836; RG 8803; RESTIN; R 440 (3-(1-метил-1H-индол-3-ил)-4-(1-метил-6-нитро-1H-индол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион); R 123942 (1-[6-(1,2,4-тиадиазол-5-ил)-3-пиридазинил]-N-[3-(трифторметил)фенил]-4-пиперидинамин); ингибитор пролилгидроксилазы; progression elevated genes; приномастат (INN) ((S)-2,2-диметил-4-[[п-(4-пиридилокси)фенил]сульфонил]-3-тиоморфолинкарбогидроксамовая кислота); NV 1030; NM 3 (8-гидрокси-6-метокси-альфа-метил-1-оксо-1H-2-бензопиран-3-уксусная кислота); NF 681; NF 050; MIG; METH 2; METH 1; манассантин B (альфа-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-диметоксифенил)-2-гидрокси-1-метилэтокси]-3-метоксифенил]тетрагидро-3,4-диметил-2-фуранил]-2-метоксифенокси]этил]-1,3-бензодиоксол-5-метанол); моноклональное антитело против KDR; моноклональное антитело против интегрина альфа5бета3; LY 290293 (2-амино-4-(3-пиридинил)-4H-нафто[1,2-b]пиран-3-карбонитрил); KP 0201448; KM 2550; интегрин-специфические пептиды; INGN 401; GYKI 66475; GYKI 66462; гринстатин (101-354-плазминоген (человека)); агент генотерапии для ревматоидного артрита, рака предстательной железы, рака яичника, глиомы, эндостатина, колоректального рака, ATF BTPI, генов антиангиогенеза, ингибитора ангиогенеза или ангиогенеза; ингибитор гелатиназы, FR 111142 (5-метокси-4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2.5]окт-6-иловый эфир 4,5-дигидрокси-2-гексеновой кислоты); форфенимекс (pINN) (S)-альфа-амино-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)бензолуксусная кислота); антагонист фибронектина (1-ацетил-L-пролил-L-гистидил-L-серил-L-цистеинил-L-аспартамид); ингибитор рецептора фактора роста фибробластов; антагонист фактора роста фибробластов FCE 27164 (гексанатриевая соль 7,7'-[карбонилбис[имино(1-метил-1H-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1H-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]бис-1,3,5-нафталинтрисульфоновой кислоты); FCE 26752 (8,8'-[карбонилбис[имино(1-метил-1H-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1H-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]бис-1,3,6-нафталинтрисульфоновая кислота); эндотелиальный активирующий моноциты полипептид II; антисмысловой олигонуклеотид VEGFR; антиангиогенные и трофические факторы; ангиостатический агент ANCHOR; эндостатин; ангиогенный белок Del-1; CT 3577; контортростатин; CM 101; хондроитиназу AC; CDP 845; КанСтатин; BST 2002; BST 2001; BLS 0597; BIBF 1000; ARRESTIN; апомигрен (коллаген XV 1304-1388-type (предшественник альфа 1-цепи гена COL15A1 человека)); ангиоингибин; aaATIII; A 36; 9-альфа-фтормедроксипрогестерона ацетат ((6-альфа)-17-(ацептилокси)-9-фтор-6-метил-прегн-4-ен-3,20-дион); 2-метил-2-фталимидиноглутаровую кислоту (2-(1,3-дигидро-1-оксо-2H-изоиндол-2-ил)-2-метилпентандиовая кислота); меченое иттрием 90 моноклональное антитело BC-1; Семанаксиб (3-(4,5-диметилпиррол-2-илметилен)индолин-2-он) (C15 H14 N2 O); PI 88 (сульфат фосфоманнопентаозы); Алвоцидиб (2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-(3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил)-цис-(-)-4H-1-бензопиран-4-он) (C21 H20 Cl N O5); E 7820; SU 11248 (2-диэтиламиноэтил)амид) 5-[3-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-(3Z)-илиденметил]-2,4-диметил-1H-пиррол-3-карбоновой кислоты) (C22 H27 F N4 O2); Скваламин (Холестан-7,24-диол, 3-[[3-[(4-аминобутил)аминопропил]амино]-, 24-(гидросульфат), (3.бета.,5.альфа.,7.альфа.)-) (C34 H65 N3 O5 S); Eriochrome Black T; AGM 1470 (Карбаминовая кислота, (хлорацетил)-, 5-метокси-4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2,5]окт-6-иловый эфир, [3R-[3-альфа, 4-альфа(2R, 3R), 5-бета, 6-бета]]) (C19 H28 Cl N O6); AZD 9935; BIBF 1000; AZD 2171; ABT 828; KS-интерлейкин-2; Утероглобин; A 6; NSC 639366 (1-[3-(диэтиламино)-2-гидроксипропиламино]-4-(оксиран-2-илметиламино)антрахинона фумарат) (C24 H29 N3 O4. C4 H4 O4); ISV 616; анти-ED-B-слитые белки; HUI 77; Тропонин I; моноклональное антитело BC-1; SPV 5.2; ER 68203; CKD 731 (3R,4S,5S,6R)-4-[2(R)-метил-3(R)-3(R)-(3-метил-2-бутенил)оксиран-2-ил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]окт-6-иловый эфир 3-(3,4,5-триметоксифенил)-2(E)-пропеновой кислоты) (C28 H38 O8); IMC-1C11; aaATIII; SC 7; CM 101; Ангиокол; Kringle 5; CKD 732 (3-[4-[2-(диметиламино)этокси]фенил]-2(E)-пропеновая кислота)(C29 H41 N O6); U 995; Канстатин; SQ 885; CT 2584 (1-[11-(додециламино)-10-гидроксиундецил]-3,7-диметилксантин)(C30 H55 N5 O3); Салмозин; EMAP II; TX 1920 (1-(4-метилпиперазино)-2-(2-нитро-1H-1-имидазоил)-1-этанон) (C10 H15 N5 O3); ингибитор альфа-v бета-x; CHIR 11509 (N-(1-пропинил)глицил-[N-(2-нафтил)]глицил-[N-(карбамоилметил)]глицин-бис(4-метоксифенил)метиламид)(C36 H37 N5 O6); BST 2002; BST 2001; B 0829; FR 111142; (3R,4S,5S,6R)-4-[1(R),2(R)-эпокси-1,5-диметил-4-гексенил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]октан-6-иловый эфир 4,5-дигидрокси-2(E)-гексеновой кислоты (C22 H34 O7); и ингибиторы киназ, в том числе, но не только N-(4-хлорфенил)-4-(4-пиридинилметил)-1-фталазинамин; 4-[4-[[[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]амино]карбонил]амино]фенокси]-N-метил-2-пиридинкарбоксамид; N-[2-(диэтиламино)этил]-5-[(5-фтор-1,2-дигидро-2-окссо-3H-индол-3-илиден)метил]-2,4-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамид; 3-[(4-бром-2,6-дифторфенил)метокси]-5-[[[[4-(1-пирролидинил)бутил]амино]карбонил]амино]-4-изотиазолкарбоксамид; N-(4-бром-2-фторфенил)-6-метокси-7-[(1-метил-4-пиперидинил)метокси]-4-хиназолинамин 3-[5,6,7,13-тетрагидро-9-[(1-метилэтокси)метил]-5-оксо-12H-индено[2,1-a]пирроло[3,4-c]карбазол-12-ил]пропиловый эфир N,N-диметилглицина; N-[5-[[[5-(1,1-диметилэтил)-2-оксазолил]метил]тио]-2-тиазолил]-4-пиперидинкарбоксамид; -[3-хлор-4-[(3-фторфенил)метокси]фенил]-6-[5-[[[2-(метилсульфонил)этил]амино]метил]-2-фуранил]-4-хиназолинамин; 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамид; -(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хинахолинамин; -(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин; N-(3-((((2R)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((3-(1,3-оксазол-5-yl)фенил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-(((4-фторфенил)метил)амино)-N-(3-((((2R)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N-[3-(азетидин-3-илметокси)-5-трифторметилфенил]-2-(4-фторбензиламино)никотинамид; 6-фтор-N-(4-(1-метилэтил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилэтил)амино)-N-(3-(((2S)-2-пирролидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-(1,1-диметилэтил)-1H-пиразол-5-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3,3-диметил-2,3-дигидро-1-бензофуран-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-((((2S)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилметил)амино)-N-(3-((2-(1-пирролидинил)этил)окси)-4-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3,3-диметил-2,3-дигидро-1H-индол-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(4-(пентафторэтил)-3-(((2S)-2-пирролидинилметил)окси)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-((3-азетидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-(4-пиперидинилокси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((2-(3-пиридинил)этил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(4,4-диметил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1H-индазол-6-иламино)никотинамид; 2-(1H-индазол-6-иламино)-N-[3-(1-метилпирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилфенил]никотинамид; N-[1-(2-диметиламиноацетил)-3,3-диметил-2,3-дигидро-1H-индол-6-ил]-2-(1H-индазол-6-иламино)никотинамид; 2-(1H-индазол-6-иламино)-N-[3-(пирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилфенил]никотинамид; N-(1-ацетил-3,3-диметил-2,3-дигидро-1H-индол-6-ил)-2-(1H-индазол-6-иламино)никотинамид; N-(4,4-диметил-1-оксо-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1H-индазол-6-иламино)никотинамид; N-[4-(трет-бутил)-3-(3-пиперидилпропил)фенил][2-(1H-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид; N-[5-(трет-бутил)изоксазол-3-ил][2-(1H-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид; и N-[4-(трет-бутил)фенил][2-(1H-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид, и ингибиторы киназ, описанные в Патентах США с номерами 6258812; 6235764; 6630500; 6515004; 6713485; 5521184; 5770599; 5747498; 5990141; U.S. Publication No. US20030105091; и Patent Cooperation Treaty publication nos. WO01/37820; WO01/32651; WO02/68406; WO02/66470; WO02/55501; WO04/05279; WO04/07481; WO04/07458; WO04/09784; WO02/59110; WO99/45009; WO98/35958; WO00/59509; WO99/61422; WO00/12089 и WO00/02871, причем каждая из этих публикаций включена здесь в качестве ссылки для любой цели.
Комбинированная терапия с факторами роста может включать цитокины, лимфокины, факторы роста или другие гемопоэтические факторы, такие как M-CSF, G-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, тромбопоэтин, фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Другие композиции могут включать известные ангиопоэтины, например, Ang-1, -2, -3, -4, -Y, и/или Ang-подобный полипептид человека, и/или васкулярный эндотелиальнрый фактор роста (VEGF). Факторы роста включают ангиогенин, костный морфогенетический белок-1, костный морфогенетический белок-2, костный морфогенетический белок-3, костный морфогенетический белок-4, костный морфогенетический белок-5, костный морфогенетический белок-6, костный морфогенетический белок-7, костный морфогенетический белок-8, костный морфогенетический белок-9, костный морфогенетический белок-10, костный морфогенетический белок-11, костный морфогенетический белок-12, костный морфогенетический белок-13, костный морфогенетический белок-14, костный морфогенетический белок-15, костный морфогенетический белок-IA, костный морфогенетический белок-IB, полученный из головного мозга нейротрофический фактор, цилиарный нейротрофический фактор, рецептор цилиарного нейротрофического фактора, индуцируемый цитокинами хемотаксический фактор-1 нейтрофилов, индуцируемый цитокинами хемотаксический фактор-2 нейтрофилов, фактор роста эндотелиальных клеток, эндотелин-1, эпидермальный фактор роста, полученный из эпителия аттрактант нейтрофилов, фибробластный фактор роста-4, фибробластный фактор роста-5, фибробластный фактор роста-6, фибробластный фактор роста-7, фибробластный фактор роста-8, фибробластный фактор роста-8b, фибробластный фактор роста-8с, фибробластный фактор роста-9, фибробластный фактор роста-10, фибробластный фактор роста кислотный, фибробластный фактор роста основный, рецептор-1 полученного из линии глиальных клеток нейротрофического фактора, рецептор-2 полученного из линии глиальных клеток нейротрофического фактора, связанный с ростом белок, связанный с ростом белок-2, связанный с ростом белок-2, связанный с ростом белок-3, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, гепатоцитарный фактор роста, инсулин-подобный фактор роста I, рецептор инсулин-подобного фактора роста, инсулин-подобный фактор роста II, связывающий белок инсулин-подобного фактора роста, фактор роста кератиноцитов, ингибирующий лейкоз фактор, рецептор-1 ингибирующего лейкоз фактора, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейротрофин-3, нейротрофин-4, фактор роста плаценты, фактор роста плаценты-2, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарный фактор роста, А-цепь тромбоцитарного фактора роста, полученный из тромбоцитов фактор роста АА, полученный из тромбоцитов фактор роста АВ, В-цепь полученного из тромбоцитов фактора В, полученный из тромбоцитов фактор роста ВВ, рецептор-1 полученного из тромбоцитов фактора роста, рецептор-2 полученного из тромбоцитов фактора роста, фактор стимуляции роста пре-В-клеток, фактор стволовых клеток, рецептор фактора стволовых клеток, трансформирующий фактор роста 1, трансформирующий фактор роста 2, трансформирующий фактор роста 3, трансформирующий фактор роста 1.2, трансформирующий фактор роста 4, трансформирующий фактор роста 5, латентный трансформирующий фактор роста 1, связывающий белок I трансформирующего фактора роста 1, связывающий белок II трансформирующего фактора роста 1, связывающий белок III трансформирующего фактора роста 1, рецептор типа I фактора некроза опухолей (TNF-R1), рецептор типа II фактора некроза опухолей (TNF-R2), рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, васкулярный эндотелиальный фактор роста и химерные белки и их биологически или иммунологически активные фрагменты.
Понятно, что специфические связывающие агенты данного изобретения могут вводиться с одним или несколькими противовоспалительными агентами. В данном контексте, термин «противовоспалительный агент» относится обычно к любому агенту, который уменьшает воспаление или отек у пациента. Здесь перечисляется ряд примерных противовоспалительных агентов, но должно быть понятно, что могут быть дополнительные подходящие противовоспалительные агенты, не перечисленные здесь, но включенные в объем данного изобретения.
Противовоспалительным агентом может быть, например, соединение, которое ингибирует взаимодействие воспалительных цитокинов с их рецепторами. Примеры ингибиторов цитокинов, применимых в комбинации со специфическими связывающими агентами данного изобретения, включают, например, антагонисты (такие как антитела) TGF-β, а также антагонисты (такие как антитела), направленные против интерлейкинов, участвующих в воспалении. Такие интерлейкины описаны здесь и предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17 и IL-18. См. Feghali, et al., Frontiers in Biosci., 2:12-26 (1997).
Специфические связывающие агенты данного изобретения могут также вводиться в комбинации с ингибиторами протеинкиназы А типа 1 для усиления пролиферации Т-клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов, которые получают антиретровирусную терапию.
Факторы роста нервов (NGF) также могут быть объединены со специфическими связывающими агентами данного изобретения для лечения некоторых состояний. Такие состояния включают нейродегенеративные заболевания, повреждение спинного мозга и рассеянный склероз. Другими состояниями, которые можно лечить этой комбинацией, являются глаукома и диабет.
Предпочтительная комбинированная терапия относится к специфическому связывающему агенту данного изобретения, вводимому пациенту в комбинации с одним или несколькими подходящими ингибиторами IL-1. Ингибиторы IL-1 включают, но не ограничиваются ими, рецепторсвязывающие пептидные фрагменты IL-1, антитела, направленные против IL-1 или IL-1-бета или рецептора типа I IL-1, и рекомбинантные белки, содержащие полные рецепторы или их части для IL-1 или их модифицированные варианты, в том числе генетически модифицированные мутеины, мультимерные формы и формы пролонгированного высвобождения. Специфические антагонисты включают IL-1ra-полипептиды, ингибиторы IL-1-бета-превращающего фермента (ICE), антитела к рецептору IL-1 антагонистического типа I, IL-связывающие формы рецептора IL-1 типа I и рецептора IL-1 типа II, антитела к IL-1, в том числе IL-1 альфа и IL-1 бета и другие члены семейства IL-1, и лекарственное средство, известное как IL-1 Trap (Regeneron). Полипептиды IL-1ra включают формы IL-ra, описанные в Патенте США № 5075222, и модифицированные формы и варианты, в том числе формы и варианты, описанные в Патенте США 5922573, WO 91/17184, WO 92 16221 и WO 96 09323. Ингибиторы превращающего IL-1 бета фермента (ICE) включают пептидильные и низкомолекулярные ингибиторы ICE, в том числе такие, какие описаны в Патентных Заявках РСТ WO 91/15577; WO 93/05071; WO 93/09135; WO 93/14777 и WO 93/16710; и Европейской публикации Заявке на патент 0547699. Непептидильные соединения включают соединения, описанные в Заявке на патент РСТ WO 95/26958, Патенте США № 5552400, Патенте США № 6121266 и Dolle et al., J. Med. Chem., 39, pp. 2438-2440 (1996). Дополнительные ингибиторы ICE описаны в Патентах США с номерами 6162790, 6204261, 6136787, 6103711, 6025147, 6008217, 5973111, 5874424, 5847135, 5843904, 5756466, 5656627, 5716929. IL-1-связывающие формы IL-1-рецептора Типа I и IL-1-рецептора Типа II описаны в Патентах США с номерами 4968607, 4968607, 5081228, Re 35450, 5319071 и 5350683. Другие подходящие антагонисты IL-1 включают, но не ограничиваются ими, пептиды, полученные из IL-1, которые способны связываться конкурентно с рецептором передачи сигнала IL-1, IL-1 R типа I. Дополнительное руководство в отношении определенных антагонистов IL-1 (и других цитокинов) может быть найдено в Патенте США № 6472179.
1
Кроме того, подходящими являются ингибиторы TNF, и они включают, но не ограничиваются ими, рецепторсвязывающие пептидные фрагменты TNFα, антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы, которые ингибируют продуцирование TNFα, антитела, направленные против TNFα, и рекомбинантные белки, содержащие полные рецепторы или части рецепторов для TNFα или их модифицированные варианты, в том числе их модифицированные варианты, в том числе генетически модифицированные мутеины, мультимерные формы и формы пролонгированного высвобождения. Применимы также ТАСЕ (ингибиторы фермента, превращающего фактор некроза-α), такие как TAPI (Immunex Corp.) и GW-3333X (Glaxo Wellcome Inc.). Подходящими являются также молекулы, которые ингибируют образование комплекса IgA-αАТ, например, пептиды, описанные в ЕР 0614464 В, или антитела против этого комплекса. Кроме того, подходящие молекулы включают, но не ограничиваются ими, TNFα-ингибирующие дисахариды, сульфатированные производные глюкозамина или другие подобные углеводы, описанные в Патенте США № 6020323. Дополнительные подходящие молекулы включают пептидные ингибиторы TNFα, описанные в Патентах США с номерами 5641751 и 5519000, и содержащие D-аминокислоты пептиды, описанные в Патенте США № 5753628. Кроме того, подходящими являются также ингибиторы TNFα-превращающего фермента. Кроме того, WO 01/03719 описывает дополнительные агенты, которые могут быть использованы в комбинации в соответствии с данным изобретением.
Дополнительные подходящие соединения включают, но не ограничиваются ими, малые молекулы, такие как талидомид или аналоги талидомида, пентоксифиллин или ингибиторы металлопротеиназ матрикса (ММР) или другие малые молекулы. Подходящие ингибиторы ММР для этой цели включают, например, ингибиторы, описанные в Патентах США с номерами 5883131, 5863949 и 5861510, а также меркаптоалкилпептидилсоединения, описанные в Патенте № 5872146. Другие малые молекулы, способные уменьшать продуцирование TNFα, включают, например, молекулы, описанные в Патентах США с номерами 5508300, 5596013 и 5563143. Дополнительные подходящие малые молекулы включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы ММР, описанные в Патентах США с номерами 5747514 и 5691382, а также производные гидроксамовой кислоты, такие как описанные в Патенте США № 5821262. Дополнительные подходящие молекулы включают, например, малые молекулы, которые ингибируют продуцирование фосфодиэстеразы IV и TNFα, например, замещенные производные оксимов (WO 96/00215), хинолинсульфонамиды (Патент США № 5834485), арилфуранпроизводные (WO 99/18095 и гетеробициклические производные (WO 96/01825); GB 2291422 А). Применимы также производные тиазола, которые ингибируют TNFα и IFNγ (WO 99/15524), а также производные ксантина, которые подавляют TNFα и другие провоспалительные цитокины (см., например, Патенты США с номерами 5118500, 5096906 и 5196430). Дополнительные малые молекулы, применимые для лечения описанных здесь состояний, включают малые молекулы, описанные в Патенте США № 5547979.
Дополнительные примеры лекарственных средств и типов лекарственных средств, которые могут вводиться посредством комбинированной терапии, включают, но не ограничиваются ими, противовирусные агенты, антибиотики, анальгетики (например, ацетаминофен, кодеин, пропоксифена напсилат, оксикодона гидрохлорид, гидрокодона битартрат, трамадол), кортикостероиды, антагонисты воспалительных цитокинов, модифицирующие заболевание противоревматические средства (DMARD), нестероидные противовоспалительные средства (NSAID) и противоревматические лекарственные средства медленного действия (SAARD).
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
Примеры модифицирующих заболевание противоревматических средств (DMARD) включают, но не ограничиваются ими: Rheumatrex (метотрексат); Enbrel (этанерцепт); Remicade (инфликсимаб); Humira (адалимумаб); Segard (афелимумаб); Arava (лефлуномид); Kineret (anakinra); AravaTM (лефлуномид); D-пеницилламин; Миокристин; Плаквенил; Ridaura (ауранофин); Солганол; ленерцепт (Hoffman-La Roche); CDP870 (Celltech); CDP571 (Celltech), а также антитела, описанные в EP 0 516 785 B1, Патенте США № 5656272, EP 0 492 448 A1; онерцепт (Serono; CAS reg. no. 199685-57-9); MRA (Chugai); Imuran (азатиоприн); ингибиторы NEKB; Cytoxan (циклофосфамид); циклоспорин; гидроксихлорокина сульфат; миноциклин; сульфазалазин; и соединения золота, такие как пероральное золото, тиомалат золота-натрия и ауротиоглюкозу.
Кроме того, подходящие молекулы включают, например, растворимые TNFR, полученные из внеклеточных районов молекул рецептора TNFα, других, чем TNFR р55 и р75, таких как, например, TNFR, описанные в WO 99/04001, в том числе TNFR-Ig, полученные из этого TNFR. Дополнительные подходящие ингибиторы TNFα, подходящие для применения здесь, описаны здесь. Они включают применение не только антитела против TNFα и TNFR, но также полученный из TNFα пептид, который может действовать в качестве конкурентного ингибитора TNFα (например, такой, как описанные в Патенте США № 5795859 или Патенте США № 6107273), слитые белки TNFR-IgG, такие как слитый белок, содержащий внеклеточную часть рецептора TNFα р55, растворимый TNFR, другой, чем IgG-слитый белок, или другие молекулы, которые уменьшают эндогенные уровни TNFα, например, ингибиторы TNFα-превращающего фермента (см., например, US 5594106), или малые молекулы или ингибиторы TNFα, некоторые из которых описаны здесь.
Что касается антител к TNF, хотя доза должна в оптимальном случае определяться квалифицированным поставщиком в соответствии с конкретными потребностями предполагаемого пациента, одним примером предпочтительного диапазона доз для антитела против TNFα является диапазон 0,1-20 мг/кг и более предпочтительно 1-10 мг/кг. Другим предпочтительным диапазоном доз для анти-TNFα-антитела является диапазон 0,75-7,5 мг/кг массы тела.
th
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
tm
TM
TM
TM
(
Данное изобретение может также использовать специфический связывающий агент и любое из одного или нескольких из нестероидных противовоспалительных средств (NSAID). NSAID обладают противовоспалительным действием, по меньшей мере частично, в отношении ингибирования синтеза простагландина. Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan 7 Edition (1985). NSAID могут быть подразделены на девять групп: (1) производные салициловой кислоты; (2) производные пропионовой кислоты; (3) производные уксусной кислоты; (4) производные фенамовой кислоты; (5) производные карбоновых кислот; (6) производные масляной кислоты; (7) оксикамы; (8) пиразолы и (9) пиразолоны. Примеры NSAID включают, но не ограничиваются ими: Anaprox, Anaprox DS (напроксен-натрий); Ansaid (флурбипрофен); Arthrotec (диклофенак-натрий + мизопростил); Cataflam/Voltaren (диклофенка-калий); Clinoril (сулиндак); Daypro (оксапрозин); Disalcid (салзолат); Dolobid (дифлунизал); EC Naprosyn (напроксен-натрий); Feldene (пироксикам); Indocin, Indocin SR (индометацин); Lodine, Lodine XL (этодолак); Motrin (ибупрофен); Naprelan (напроксен); Naprosyn (напроксен); Orudis, (кетопрофен); Oruvail (кетопрофен); Relafen (набуметон); Tolectin, (толметин-натрий); Trilisate (холин-магния трисалицилат); Cox-1-ингибиторы; Cox-2-ингибиторы, такие как Vioxx (рофекоксиб); Arcoxia (эторикоксиб), Celebrex (целекоксиб); Mobic™ мелоксикам); Bextra (валдекоксииб), Dynastat (паракоксиб-натрий); Prexige™ (лумиракоксиб) и намбуметон. Дополнительные подходящие NSAID включают, но не ограничиваются ими, следующие: ε-ацетамидкапроевую кислоту, S-аденозилметионин, 3-амино-4-гидроксимасляную кислоту, амиксетрин, анитразафен, бендазак, бендазак-лизинат, бензидамин, бепрозин, броперамол, буколом, буфезолак, ципроквазон, клоксимат, дазидамин, дебоксамет, детомидин, дифенпирамид (difenpiramide), дифенпирамид (difenpyramide), дифисаламин, дитазол, эморфазон, фанетизола мезилат, фенфлумизол, флоктафенин, флумизол, флуниксин, флупроквазон, фопиртолин, фосфозал, гваймезал, гвайазолен, изониксирн, лефетамин-HCl, лефлуномид, лофемизол, лотифазол, лизин-клониксинат, мезеклазон, набуметон, никтиндол, нимесулид, орготеин, орпаноксин, оксацепролм, оксападол, паранилин, перизоксал, перизоксала цитрат, пифоксим, пипроксен, пиразолак, пирфенидон, проквазон, проксазол, тиелавин В, тифламизол, тимегадин, толектин, толпадол, триптамид и другие NSAID, обозначаемые кодовыми номерами компании, такие как 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-бензоил-1-инданкарбоновая кислота), TVX2706, U60257, UR2301 и WY41770. Структурно родственные NSAID, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства в сравнении с NSAID, также включены в эту группу.
Подходящие SAARD или DMARD включают, но не ограничиваются ими: аллокупреид-натрий, ауранофин, ауротиоглюкозу, ауротиогликанид, азатиоприн, бреквинар-натрий, буцилламин, 3-ауротио-2-пропанол-1-сульфонат кальция, хлорамбуцил, хлорохин, клобузарит, купроксолин, циклофосфамид, циклоспорин, дапсон, 15-дезоксиспергуалин, диацереин, глюкозамин, соли золота (например, соль циклохин-золото, тиомалат золота-натрия, тиосульфат золота-натрия), гидроксихлорохин, гидроксимочевину, кебузон, левамизол, лобензарит, мелиттин, 6-меркаптопурин, метотрексат, мизорибин, микофенолят-мофетил, миорал, азотный аналог иприта, D-пеницилламин, пиридинолимидазолы, такие как SKNF86002 и SB203580, рапамицин, тиолы, тимопоэтин и винкристин. Предполагается, что структурно родственные SAARD или DMARD, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Ингибиторы киназ в каскадах передачи сигнала также являются подходящими агентами для комбинации со специфическими связывающими агентами этого изобретения. Они включают, но не ограничиваются ими, агенты, которые способны ингибировать Р-38 (также известную как “RK” или “SARK-2”), Lee et al., Nature, 372:739 (1994). Р-38 описана как серин/треонинкиназа (см. Han et al., Biochimica Biophysica Acta, 1265:224-227 (1995). Было показано, что ингибиторы Р-38 вмешиваются между внеклеточным стимулом и секрецией IL-1 и TNFα из клетки, и это вмешательство включает блокирование трансдукции сигнала посредством ингибирования киназы, которая находится в этом пути передачи сигнала.
Кроме того, подходящими являются также ингибиторы МК2 и ингибиторы tpl-2. Кроме того, подходящими являются также ингибиторы Т-клеток, в том числе, например, ctla-4, CsA, Fk-506, OX40, OX40R-Fc, антитело OX40, лиганд ОХ40, антитело против лиганда ОХ40, lck и ZAP70. Подходящими являются также ретиноиды, в том числе пероральные ретиноиды, а также антагонисты TGF-β.
Кроме того, подходящие агенты для комбинации со специфическими связывающими агентами данного изобретения, включают, например, любое из одного или нескольких производных салициловой кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Такие производные салициловой кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают: ацетаминозалол, алоксиприн, аспирин, бенорилат, бромосалигенин, ацетилсалицилат кальция, холин-магния трисалицилат-дифлузинал, этерзалат, фендозал, гентизиновую кислоту, гликоля салицилат, имидазола салицилат, лизина ацетилсалицилат, мезаламин, морфолина салицилат, 1-нафтилсалицилат, олсалазин, парсаламид, фенилацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламид О-уксусной кислоты, салсалазат и сульфасалазин. Предполагается, что структурно родственные производные салициловой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, включены в эту группу. Кроме того, подходящие агенты включают, например, производные пропионовой кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Такие производные пропионовой кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают: алминопрофен, беноксапрофен, буклоксиновую кислоту, карпрофен, дексиндопрофен, фенопрофен, флуноксапрофен, флупрофен, флурбипрофен, фурклопрофен, ибупрофен, ибупрофен-алюминий, ибопроксам, индопрофен, изопрофен, кетопрофен, локсопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пикетопрофен, пимепрофен, пирпрофен, пранопрофен, протизиновую кислоту, пиридоксипрофен, супрофен, тиапрофеновую кислоту и тиоксапрофен. Предполагается, что структурно родственные производные салициловой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, включены в эту группу. Кроме того, подходящие агенты включают, например, производные уксусной кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Такие производные уксусной кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают: ацеметацин, алклофенак, амфенак, буфексамак, цинметацин, клопирак, делметацин, диклофенак-натрий, этодолак, фелбинак, фенклофенак, фенклорак, фенклозовую кислоту, фентиазак, фурофенак, глюкаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксепак, лоназолак, метиазиновую кислоту, оксаметацин, оксипинак, пиметацин, проглуметацин, сулиндак, талметацин, тиарамид, тиопинак, толметин, зидометацин и зомепирак. Предполагается, что структурно родственные производные уксусной кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, включены в эту группу. Кроме того, подходящие агенты включают, например, производные фенамовой кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Эти производные фенамовой кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают: энфенамовую кислоту, этофенамид, флуфенамовую кислоту, изониксин, меклофенамовую кислоту, меклофенамат натрия, медофенамовую кислоту, мефенамовую кислоту, нифлумовую кислоту, талнифлумат, терофенамат, толфенамовую кислоту и уфенамат. Предполагается, что структурно родственные производные фенамовой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, включены в эту группу.
Подходящими являются также производные карбоновых кислот, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли, которые могут быть использованы, и они включают: клиданак, дифлунизал, флуфенизал, иноридин, кеторолак и тиноридин. Предполагается, что структурно родственные производные карбоновых кислот, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, включены в эту группу. Кроме того, подходящими являются производные масляной кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Эти производные масляной кислоты, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают: бумадизон, бутибуфен, фенбуфен и ксенбуцин. Предполагается, что структурно родственные производные масляной кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, включены в эту группу. Подходящими являются также оксикамы, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Оксикамы, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают: дроксикам, эноликам, изоксикам, пироксикам, судоксикам, теноксикам и 4-гидрокси-1,2-бензотиазин-1,1-диоксид-4-(N-фенил)карбоксамид. Предполагается, что структурно родственные оксикамы, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, включены в эту группу. Подходящими являются также пиразолы, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Эти пиразолы, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли, которые могут быть использованы, включают: дифенамизол и эпиризол. Предполагается, что структурно родственные пиразолы, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу. Кроме того, подходящими являются также пиразолоны, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли. Эти пиразолоны, сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли, которые могут быть использованы, включают: апазон, азапропазон, бензипиперилон, фепразон, мофебутазон, моразон, оксифенбутазон, фенилбутазон, пипебузон, пропилфеназон, рамифеназон, суксибузон и тиазолинбутазон. Предполагается, что структурно родственные пиразолоны, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли являются также подходящими для лечения TNF-опосредованных заболеваний. Кортикостероиды, сложные эфиры в качестве пролекарств и их фармацевтически приемлемые соли включают гидрокортизон и соединения, которые получены из гидрокортизона, такие как 21-ацетоксипрегненолон, алкломеразон, алгестон, амцинонид, беклометазон, бетаметазон, бетаметазона валерат, будесонид, хлорпреднизон, клобетазол, клобетазола пропионат, клобетазон, клобетазона бутират, клокортолон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакон, дезонид, дезоксимеразон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флуметазона пивалат, флунизолид, флуцинолона ацетонид, флуцинонид, фторцинолона ацетонид, флукортин-бутил, фторкортолон, фторкортолона гексаноат, дифторкортолона валерат, фторметолон, флуперолона ацетат, флупреднидена ацетат, флупреднизолон, флуранденолид, формокортал, галцинонид, галометазон, галопредона ацетат, гидрокортамат, гидрокортизон, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона бутират, гидрокортизона фосфат, гидрокортизона 21-натрий-сукцинат, гидрокортизона тебутат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метилпредниколон, мометазона фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолона 21-диэдриаминоацетат, преднизолона-натрия фосфат, преднизолона-натрия сукцинат, преднизолона-натрия 21-м-сульфобензоат, преднизолона-натрия 21-стеарогликолат, преднизолона тебутат, преднизолона 21-триметилацетат, преднизон, преднивал, преднилиден, преднилидена 21-диэтиламиноацетат, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолона ацетонид, триамцинолона бенетонид и триамцинолона гексатонид. Предполагается, что структурно родственные кортикостероиды, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Противомикробные средства (и сложные эфиры в качестве пролекарств или их фармацевтически приемлемые соли) также пригодны для комбинированного использования, описанного здесь. Подходящие противомикробные средства включают, например, ампициллин, амоксициллин, ауреомицин, бацитрацин, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим, цефахлор, цефалексин, цефрадин, ципрофлоксацин, клавулановую кислоту, клоксациллин, диклоксациллин, эритромицин, флуклоксациллан, гентамицин, грамицидин, метициллан, неомицин, оксациллан, пенициллин и ванкомицин. Предполагается, что структурно родственные противомикробные средства, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Дополнительные подходящие соединения включают, но не ограничиваются ими: BN 50730; тенидап; Е 5531; тиапафант РСА 4248; нимесульфид; панавир; ролипрам; RP 73401; пептид Т; MDL 201 449A; гидрохлорид (1R,3S)-цис-1-[9-(2,6-диаминопуринил)]-3-гидрокси-4-циклопентена; (1R,3S)-транс-1-[9-(2,6-диамино)пурин]-3-ацетоксициклопентан; гидрохлорид (1R,3S)-транс-1-[9-аденил]-3-азидоциклопентана и (1R,3S)-транс-1-[6-гидроксипурин-9-ил]-3-азидоциклопентан.
Было обнаружено, что IL-4 может индуцировать воспалительный эффект в некоторых случаях, таких как астма, в которых сверхэкспрессия IL-4 в легких вызывает гипертрофию эпителиальных клеток и накопление лимфоцитов, эозинофилов и нейтрофилов. Эта реакция является характерным признаком основных симптомов провоспалительной реакции, индуцируемой другими Th2-цитокинами. Таким образом, как отмечалось выше, ингибиторы IL-4 также применимы в соответствии с этим изобретением. Кроме того, должно быть понятно, что некоторые иммуносупрессорные лекарственные средства могут быть также использованы в лечении артрита, в том числе, но не только, ингибиторы iNOS и ингибиторы 5-липоксигеназы.
Было показано, что имбирь имеет некоторые противовоспалительные свойства и, следовательно, пригоден для применения в качестве противовоспалительного агента в соответствии с данным изобретением, как и хондроитин.
В некоторых вариантах осуществления, Ang-2-специфический связывающий агент может вводиться до, совместно или после лечения агентом раковой терапии. Примерные формы рака включают, но не ограничиваются ими, рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиому, плоскоклеточный рак головы и шеи, наследственный или случайный папиллярный рак почки, лейкоз, лимфому, синдром Ли-Фраумени, злокачественную плевральную мезотелиому, меланому, множественную меланому, немелкоклеточная карцинома легкого, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, мелкоклеточная карцинома легкого, синовиальную саркому, рак щитовидной железы и переходно-клеточный рак мочевого пузыря.
В некоторых вариантах осуществления, Ang-2-специфический связывающий агент может быть использован отдельно или по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления, Ang-2-специфический связывающий агент используют вместе с терапевтически эффективным количеством дополнительного терапевтического агента. Примерные терапевтические агенты, которые могут вводиться с Ang-2-специфическим связывающим агентом, включают, но не ограничиваются ими, член семейства гелданамицинов анизамициновых антибиотиков; Pro-HGF; NK2; пептидный ингибитор c-Met; антагонист домена гомологии Src 2 (SH2) Grb2; модулятор Gab1; доминантно-негативный Src; ингибитор von-Hippel-Landau, в том числе, но не только, вортманнин; ингибиторы киназы Р13, другие агенты антирецепторной терапии, анти-EGFR, ингибитор COX-2, Celebrex™, Vioxx™; васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), модулятор VEGF, фибробластный фактор роста (FGF), эпидермальный фактор роста (EGF); модулятор EGF; фактор роста кератиноцитов (KGF), KGF-родственная молекула, модулятор KGF; модулятор металлопротеиназы матрикса (ММР).
В некоторых вариантах осуществления, данное изобретение относится к терапевтическим агентам, содержащим Ang-2-специфический связывающий агент и по меньшей мере один ингибитор сериновой протеазы, и способам лечения с использованием таких терапевтических агентов. В некоторых вариантах осуществления, терапевтический агент содержит Ang-2-специфический связывающий агент и ингибитор сериновой протеазы и по меньшей мере одну дополнительную молекулу, описанную здесь.
В некоторых вариантах осуществления, нарушение баланса протеаза/ингибитор протеазы может приводить к протеаза-опосредованной деструкции ткани, в том числе, но не только, инвазии опухолью нормальной ткани, приводящей к метастазированию.
В некоторых вариантах осуществления, Ang-2-специфический связывающий агент может быть использован по меньшей мере с одним противовоспалительным терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления, Ang-2-специфический связывающий агент может быть использован по меньшей мере с одним терапевтическим агентом в отношении иммунного нарушения. Примеры терапевтических агентов для воспаления и иммунных нарушений включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы циклооксигеназы типа 1 (COX-1) и циклооксигеназы типа 2 (COX-2), низкомолекулярные модуляторы митоген-активируемой протеинкиназы 38 кДа (р38-MARK); низкомолекулярные модуляторы внутриклеточных молекул, участвующих в воспалительных путях, где такие внутриклеточные молекулы включают, но не ограничиваются ими, jnk, IKK, NF-κB, ZAP70 и lck. Некоторые примеры противовоспалительных терапевтических агентов описаны, например, в C.A. Dinarello и L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis. A Primer for Clinicians Third Edition (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA.
В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции будут включать более чем один другой Ang-2-специфический связывающий агент. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции будут включать более чем один Ang-2-специфический связывающий агент, причем эти Ang-2-специфические связывающие агенты связываются с Ang-2 в более чем одном эпитопе.
Иммунотерапевтические средства
Иммунотерапевтические средства обычно основаны на применении иммунных эффекторных клеток и молекул для нацеливания и разрушения раковых клеток. Иммунными эффекторами может быть, например, антитело данного изобретения, которое распознают какой-либо маркер на поверхности клетки-мишени. Это антитело, одно, может служить в качестве эффектора терапии или оно может рекрутировать другие клетки для фактического выполнения убивания клеток. Это антитело может быть также конъюгировано с лекарственным средством или токсином (химиотерапевтическим агентом, радионуклидом, А-цепью рицина, холерным токсином, коклюшным токсином и т.д.) и, следовательно, может служить только в качестве нацеливающего агента.
Согласно данному изобретению, либо антитела, либо конъюгаты антител данного изобретения могут быть нацелены на мутантные формы Ang-2 посредством иммунотерапии. В частности, обсуждается, что композиции антител данного изобретения могут быть использованы в подходе комбинированной терапии вместе с Ang-2-нацеленной терапией.
Пассивная иммунотерапия оказалась особенно эффективной против ряда раковых заболеваний. См., например, WO 98/39027.
Следующие примеры предназначены только для целей иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом данное изобретение.
ПРИМЕР 1
Экспрессия Ang-2 в патологической и нормальной ткани
33
33
Экспрессию Ang-2 исследовали в нормальной и патологичепской ткани с использованием гибридизации in situ. Фрагменты Ang-2-последовательностей человека (Genbank Accession Number: AF004327, нуклеотиды 1274-1726) и мыши (Genbank Accession Number: AF004326, нуклеотиды 1135-1588) амплифицировали ПЦР с обратной транскриптазой из кДНК фетального легкого человека или мыши, клонировали в плазмиду pGEM-T и подтверждали секвенированием. Р-меченые антисмысловые РНК-зонды транскрибировали из линеаризованных плазмидных матриц с использованием Р-UTP и РНК-полимеразы. Блоки фиксированных формальдегидом, залитых в парафин тканей использовали для получения срезов при 5 мкм и срезы собирали на заряженные предметные стекла. Перед гибридизацией in situ ткани обрабатывали для увеличения проницаемости 0,2 М HCl с последующим расщеплением Протеиназой К и ацетилированием триэтаноламином и уксусным ангидридом. Срезы гибридизовали с радиоактивно меченым зондом в течение ночи при 55°С, затем подвергали расщеплению РНКазой и промывке высокой строгости в приблизительно 0,1Х SSC при 55°С. Предметные стекла погружали в эмульсию Kodak NTB2, экспонировали при 4°С в течение 2-3 недель, проявляли и контрастно окрашивали. Срезы исследовали с темным полем и стандартным освещением для возможности одновременной оценки морфологии ткани и сигнала гибридизации.
Результаты показали, что у нормального постнатального человека экспрессия Ang-2 ограничивается небольшим количеством тканей, содержащих ангиогенную сосудистую сеть, таких как яичник, плацента и матка. Экспрессия Ang-2 не была детектирована в сердце, головном мозге, почке, печени, легком, поджелудочной железе, селезенке, мышце, миндалине, вилочковой железе, аппендиксе, лимфатическом узле, желчном пузыре, предстательной железе или яичке нормального взрослого человека. В пятинедельной мыши (но не во взрослых обезьяне или человеке) почки обнаруживали заметную экспрессию Ang-2 в vasa recta. Для определения, была ли эта экспрессия рудиментом эмбрионального развития, этот эксперимент повторяли на почках, полученных из мышей с диапазоном возраста до одного года с использованием мышиного Ang-2-зонда и описанных выше условий. Наблюдали, что экспрессия Ang-2 уменьшалась во время постнатального развития, но все еще была очевидной в почках однолетних мышей.
Экспрессию Ang-2 детектировали также фактически во всех испытанных опухолях, в том числе первичных опухолях человека, таких как рак ободочной кишки (5 случаев), рак молочной железы (10 случаев), рак легкого (8 случаев), глиобластома (1 случай), метастатических опухолях человека, таких как рак молочной железы (2 случая), рак легкого (2 случая) и рак яичника (2 случая), которые метастазировали в головной мозг, и моделях опухолей грызунов, таких как С6 (глиома крысы), НТ29 (рак ободочной кишки человека), Colo-205 (рак ободочной кишки человека), НСТ116 (рак ободочной кишки человека), А431 (эпидермоидный рак человека), А673 (рабдомиосаркома человека), НТ1080 (фибросаркома человека) РС-3 (рак предстательной железы человека), B16F10 (мышиная меланома), MethA (мышиная саркома) и рак легкого Льюиса mets. Кроме того, экспрессию Ang-2 детектировали в новых сосудах, растущих в пробку Матригеля в ответ на VEGF, и в модели мышиной гипоксии ретролетальной фиброплазии (синдрома Терри).
ПРИМЕР 2
Получение рекомбинантного белка mAng-2 и поликлональной анти-Ang-2-антисыворотки кролика
Полноразмерную, His-меченую кДНК мышиного Ang-2 получали при помощи ПЦР (Clontech Advantage PCR Kit, Cat. # K1905-01) из библиотеки кДНК мышиного 15-дневного эмбриона (Marathon-Ready-cDNA, Cat. # 7459-1, Clontech, Inc.) с использованием ПЦР-праймеров для полноразмерного Ang-2 человека. ПЦР-продукт лигировали в вектор экспрессии с промотором CMV и полученную плазмиду трансфицировали в клетки фибросаркомы человека НТ1080 (полученные из АТСС) с использованием реагента для трансфекции FuGENE6 (Roche, Cat. # 1814443). Стабильнрые клоны выделяли отбором с использованием G418. Анти-His-метка-ELISA и Вестерн-блоттинг использовали для скрининга на mAng-2-His-экспрессирующие клоны.
Рекомбинантный полипептид mAng-2 очищали из кондиционированных сред (С.М.) этих клеток. С.М., содержащую mAng-2-His, очищали с использованием двухстадийного хроматографического протокола. Вкратце, эту кондиционированную среду титровали до рН 8,9 добавлением Трис-буфера рН 9,5 до конечной концентрации приблизительно 20 мМ. Кроме того, добавляли детергент CHAPS до конечной концентрации приблизительно 5 мМ. Затем эту С.М. наносили непосредственно на анионообменную колонку Q-сефарозы ff (Pharmacia). Затем эту колонку промывали приблизительно 10 мМ Трисом рН 8,0, содержащим приблизительно 350 мМ NaCl и приблизительно 5 мМ CHAPS.
Элюат из колонки Q-сефарозы доводили до приблизительно 4 мМ имидазола и наносили на аффинную колонку с иммобилизованным металлом (Ni-NTA superflow (Qiagen)). Связанный белок элюировали PBS, содержащим приблизительно 5 мМ CHAPS и приблизительно 100 мМ имидазола. Затем элюат концентрировали до приблизительно 1,0 мг/мл с последующим диализом против PBS. Чистота mAng-2-His была большей чем 90%, при измерении окрашиванием Кумасси после электрофореза в ДСН-ПААГ.
Кроликов иммунизировали приблизительно 0,2 мг mAng-2 на инъекцию для получения антител. Кроликов инъецировали приблизительно 1 мл TiterMax Хантера (Sigma) и mAng-2 при соотношении 1:1. Спустя четыре недели каждый кролик получал вторую инъекцию, или бустер; спустя две недели после этого они получали их следующую бустер-инъекцию, и на 7 неделе брали сыворотки и оценивали на титр против mAng-2. Если сывороточный титр был высоким, продукционные кровоизвлечения по 50 мл выполняли один раз в неделю в течение шести последовательных недель. Однако, если титр сыворотки был низким, кроликам вводили дополнительную бустер-инъекцию и продукционные кровоизвлечения по 50 мл выполняли один раз в неделю в течение шести последовательных недель, начиная с недели 9. После шести последовательных продукционных кровоизвлечений кроликам давали отдыхать в течение шести недель. Если требовались большие количества сывороток, кроликам опять вводили бустер-инъекции спустя один месяц после последнего продукционного забора крови.
С использованием анализа нейтрализации ELISA (описанного ниже) наблюдали, что кроличьи поликлональные анти-mAng-2-антисыворотки от двух кроликов, 5254 и 5255, нейтрализовали взаимодействие mAng-2:Tie-2.
ПРИМЕР 3
Молекулярные анализы для оценки Ang-2-антител
Молекулярные анализы (анализ аффинности ELISA, анализ нейтрализации ELISA и BIAcore) были разработаны для оценки прямого связывания антитела с Ang-2 и родственными членами этого семейства и влияния на взаимодействие Ang-2:Tie-2. Эти анализы in vitro и на основе клеток описаны следующим образом.
А. Анализ аффинности ELISA
Для первоначального скрининга кандидатных анти-Ang-2-антител, использовали очищенный Ang-2 человека (R&D Systems, Inc; номер по каталогу 623-AN; Ang-2 обеспечен в виде смеси 2 укороченных версий) или мышиный полипептид Ang-2 (полученный, как описано выше). Для подтверждающих связывание анализов Ang-2 человека получали из кондиционированных сред клеток 293Т человека, трансфицированных полноразмерной ДНК Ang-2 человека, и культивировали в бессывороточной DMEM, содержащей приблизительно 50 мкг на мл бычьего сывороточного альбумина (БСА).
С использованием микротитрационных планшетов, приблизительно 100 мкл на лунку Ang-2 добавляли в каждую лунку и эти планшеты инкубировали приблизительно 2 часа, после чего эти планшеты промывали забуференным фосфатом солевым раствором (PBS), содержащим приблизительно 0,1% Твина-20, четыре раза. Затем эти планшеты блокировали с использованием приблизительно 250 микролитров на лунку приблизительно 5% БСА в PBS и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно 2 часов. После инкубирования избыточный блокирующий раствор выбрасывали и в каждую лунку добавляли приблизительно 100 микролитров кандидатного анти-Ang-2-антитела в серии разведений, начинающихся при концентрации приблизительно 40 нМ, с последующим серийным разведением в 4 раза в PBS, содержащем приблизительно 1% БСА. Затем эти планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После инкубирования планшеты промывали PBS, содержащим приблизительно 0,1% Твина-20. Промывание повторяли еще четыре раза, после чего добавляли приблизительно 100 микролитров на лунку козьего антитела против IgG(Fc) человека (Pierce Chemical Co., номер по каталогу 31416), предварительно разбавленного 1:5000 в PBS, содержащем 1% БСА (бычий сывороточный альбумин). Планшеты инкубировали в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали пять раз в PBS, содержащем приблизительно 0,1% Твин-20, после чего добавляли приблизительно 100 микролитров на лунку ТМВ-субстрата (систему содержащего 3,3',5,5'-тетраметилбензидин жидкого субстрата; Sigma Chemicals Company, St. Louis, MO, номер по каталогу Т8665) и планшеты инкубировали приблизительно 5-15 минут, пока не развивалась синяя окраска. Затем оптическую плотность считывали в спектрофотометре при приблизительно 370 нм.
В. Анализ нейтрализации ELISA
Микротитрационные планшеты, с которыми был связан полипептид Ang-2 человека, получали, как описано для аффинного анализа ELISA. Кандидатные анти-Ang-2-антител готовили в серийных разведениях, как описано для анализа аффинности ELISA выше, в растворе PBS, содержащем приблизительно 1% БСА и приблизительно 1 нМ Tie-2 (обеспеченный в виде молекулы Tie-2-Fc, где Tie-2-часть содержит только растворимую внеклеточную часть этой молекулы; (R&D Systems, Inc; номер по каталогу 313-TI). После добавления в каждую лунку приблизительно 100 микролитров раствора антитело/Tie-2 эти планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и затем промывали пять раз в PBS, содержащем приблизительно 0,1% Tween-20. После промывания добавляли приблизительно 100 микролитров на лунку анти-Tie-2-антитела (Pharmingen Inc., номер по каталогу 557039) до конечной концентрации приблизительно 1 микрограмм на мл и планшеты инкубировали приблизительно 1 час при комнатной температуре. Затем добавляли приблизительно 100 микролитров козьего антитела против IgG-HRP мыши (Pierce Chemical Co., номер по каталогу 31432) при разведении 1:10000 в PBS, содержащем 1% БСА. Планшеты инкубировали в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре, после чего их промывали пять раз PBS, содержащим приблизительно 0,1% Твина-20. Затем добавляли приблизительно 100 микролитров на лунку ТМВ-субстрата (описанного выше) и давали проявиться окраске. Оптическую плотность считывали в спектрофотометре при 370 нм.
С. Анализ аффинности BIAcore
Анализ аффинности каждого кандидатного анти-Ang-2-антитела выполняли на BIAcore 2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) с PBS и 0,005% поверхностно-активным веществом Р20 (BIAcore, Inc.) в качестве рабочего буфера. Рекомбинантный белок G (Repligen, Needham, MA) иммобилизовали на сенсорном (воспринимающем) «чипе» (Biacore, Inc.) через первичные аминогруппы с использованием набора для связывания аминогрупп (Biacore, Inc.) в соответствии с предложенным изготовителем протоколом.
a
d
D
Анализы связывания проводили присоединением сначала приблизительно 100 Ru каждого кандидатного анти-Ang-2-антитела к иммобилизованному Белку G, после чего различные концентрации (0-100 нМ) huAng-2 или mAng-2 инъецировали на поверхность связанного антитела при скорости тока приблизительно 50 мкл/мин в течение приблизительно 3 минут. Кинетику связывания антитела, включающую k (константу скорости ассоциации), k (константу скорости диссоциации) и K (константу равновесия диссоциации) определяли с использованием компьютерной программы BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.). Более низкие константы равновесия диссоциации указывают на более высокую аффинность антитела в отношении Ang-2.
ПРИМЕР 4
Получение полноразмерных анти-Ang-2-антител при помощи фагового дисплея
Полные анти-Ang-2-антитела человека генерировали пэннингом Fab-библиотеки фагового дисплея Target Quest (Target Quest, Inc.) против Ang-2-полипептида человека (R and D Systems Inc., catalog 623-AN) в соответствии со следующим протоколом.
Ang-2 человека иммобилизовали на поверхности полистироловых магнитных гранул двумя способами: (1) прямым покрытием Ang-2 при 50 мкг/мл при 4°С в течение ночи и (2) непрямым захватыванием Ang-2 козьим анти-Ang-2-антителом при 50 мкг/мл при 4°С в течение ночи. Поверхность гранул блокировали 2% молоком в PBS (MPBS). Фаговую библиотеку Fab человека предварительно отбирали для удаления фаговых клонов, реактивных с непокрытыми магнитными гранулами или козьим анти-Ang-2-антителом. Затем Ang-2-покрытые магнитные гранулы инкубировали с фагом библиотеки при комнатной температуре в течение 1,5 часов. После стадии связывания фага эту поверхность промывали 6 раз MPBS, содержащим приблизительно 0,1% Твин 20 с последующим промыванием 6 раз PBS, содержащим приблизительно 0,1% Твин 20, и затем 2 раза PBS. Связанный фаг элюировали сначала приблизительно 100 мкг/мл Tie-2-Fc человека (R and D Systems, Minneapolis, MN) и затем приблизительно 100 мМ триэтаноламином. Элюированный фаг инфицировали в клетки E. coli TG1, амплифицировали и спасали для следующего раунда скрининга. Давление отбора увеличивали в последующих раундах включением более строгих промывок и уменьшением вводимого фага. После 3 раундов отбора идентифицировали 18 уникальных, Ang-2-связывающих Fab-клонов, фактически все из которых распознавали Ang-2 человека, Ang-2 мыши и Ang-2 крысы при измерении с использованием анализа аффинности ELISA, описанного выше. Приблизительно десять процентов этого фага также связывали Ang-1 человека. Эти клоны превращали в IgG1-антитела, как описано ниже.
3
Для получения дополнительного уникального фага проводили второй раунд скрининга с использованием той же самой библиотеки, но слегка отличающегося протокола. В этом протоколе Ang-2 человека высевали в буфер NaHCO при рН 9,6 в иммунопробирках Nunc maxisorp при приблизительно 4°С в течение ночи. Ang-2 высевали при приблизительно 1,5, 0,74 и 0,3 мкг/мл для раундов пэннинга 1, 2 и 3, соответственно. Поверхность иммунопробирок блокировали с использованием приблизительно 2% молока в PBS (MPBS), перед инкубированием с приблизительно 3 триллионами фаговых частиц (приблизительно 50 копий каждого уникального фага в этой библиотеке) из той же самой библиотеки фагового дисплея, упомянутой выше (Target Quest) в приблизительно 4 мл 2% MPBS. После стадии инкубирования фага поверхность промывали 20 раз PBS с приблизительно 0,1% Твином 20 и затем 20 раз PBS. Связанный фаг элюировали с использованием 1 мкМ hAng-2 или 1 мкМ Tie-2 человека (R and D Systems, описанных выше). Элюированный фаг инфицировали в клетки E. coli TG1 (обеспеченные фаговой библиотекой), амплифицировали и спасали для следующего раунда скрининга. Шестнадцать уникальных, Ang-2-связывающих Fab-клонов идентифицировали ПЦР-амплификацией всех фагов, с которыми связывался hAng-2 или Tie-2, и эти клоны анализировали рестрикционным расщеплением. ДНК каждого клона секвенировали.
Последовательность, кодирующую вариабельную область каждой тяжелой цепи из каждого фага, амплифицировали с комплементарными праймерами. Эти праймеры конструировали таким образом, чтобы включить сайт HindIII, сайт XbaI, последовательность Козака и сигнальную последовательность (транслируемый пептид представляет собой MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC; SEQ ID NO:202) на 5'-конец вариабельной области, тогда как сайт BSMBI добавляли на 3'-конец ПЦР-продукта. В качестве примера, каким образом клонировали тяжелые цепи, матричную ДНК фага для клона 544 (SEQ ID NO:19) амплифицировали с использованием праймеров 2248-21 (GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT CCA GCT GGT GCA G; SEQ ID NO:203), который добавлял последние 7 аминокислот сигнальной последовательности, и 2502-31 (ATT ACG TCT CAC AGT TCG TTT GAT CTC CAC; SEQ ID NO:204), который добавлял сайт BsmBI на этот конец вариабельной области. Полученный продукт амплифицировали с использованием праймеров 2148-98 (CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT; SEQ ID NO:205), который добавлял девять аминокислот к сигнальному пептиду (AQLLGLLLL; SEQ ID NO:206), и затем 2489-36 (CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT CCC CGC TCA GCT CCT GGG; SEQ ID NO:207) и 2502-31. Добавляли праймер 2489-36, от 5' до 3', сайт HindIII, сайт XbaI, последовательность Козака и первые 6 аминокислот сигнальной последовательности. ПЦР-продукты расщепляли XbaI и BsmBI и затем клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающего, содержащий константную область IgG1 человека. Этот вектор содержит промотор SV40 и позволяет DHFR-отбор.
Легкие цепи из каждого фага были легкими цепями класса каппа или лямбда. Для каждой легкой цепи конструировали комплементарные праймеры для добавления, от 5' к 3', сайта HindIII, сайта XbaI, последовательности Козака и сигнальной последовательности (представленные выше). Цепи, которые имели безошибочные кодирующие области, клонировали в виде полноразмерных продуктов. В качестве примера, легкие цепи из фагового клона 536 (SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:210) амплифицировали в виде полноразмерной кодирующей области с использованием праймеров 2627-69 (GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TGA CAT TGT GAT GAC TCA GTC TCC; SEQ ID NO:208), который добавлял последние семь аминокислот сигнальной последовательности, и праймера 2458-54 (CTT GTC GAC TTA TTA ACA CTC TCC CCT GTT G; SEQ ID NO:209), который добавлял сайт SalI после стоп-кодона. Затем этот ПЦР-продукт амплифицировали, как описано выше, с дополнительными 5'-праймерами, 2148-98 и 2489-36, соответственно, в паре с праймером 2458-54, для завершения добавления сигнальной последовательности и сайтов клонирования. Эти полноразмерные легкие цепи клонировали в виде XbaI-SalI-фрагментов в экспрессирующий вектор млекопитающего, описанный выше.
Некоторые лямбда-клоны имели ошибки в их константных областях при сравнении с природной последовательностью константной области человека. Для коррекции этих различий, выполняли перекрывающуюся ПЦР с использованием ДНК, кодирующей точную константную область лямбда, и вариабельной области, полученной из фага. Эти клоны также клонировали в виде XbaI-SalI-фрагментов, как описано выше.
Если вариабельные области каппа клонировали отдельно от их константных областей, добавляли сайт BsmBI к 3'-концу ПЦР-продукта. После расщепления ПЦР-продукта XbaI и BsmBI вариабельную область цепи каппа клонировали в экспрессирующий вектор, содержащий константную область каппа человека.
Спаренные конструкции легкой и тяжелой цепей из каждого конвертированного фага котрансфицировали в клетки СНО с использованием набора для трансфекции с использованием фосфата кальция (Invitrogen Corp.) обычно в соответствии с предлагаемым изготовителем протоколом. Среду заменяли спустя 14-16 часов после трансфекции и клетки пассировали в чашки для культуры ткани для отбора спустя приблизительно 48 часов в соответствии с рекомендациями изготовителя. Трансфицированные клетки выделяли НТ-отбором в течение приблизительно 3 недель, затем колонии трансфицированных клеток СНО трипсинизировали и объединяли в «пул» трансфицированных клеток.
2
7
Кондиционированную среду малого масштаба собирали спустя 48 часов и анализировали на продуцирование антитела анализом Вестерн-блотов с использованием антитела против Fc человека, антитела против цепи каппа человека или антителом против цепи лямбда человека. Затем выбранные популяции клеток пассировали при давлении отбора с использованием стандартного стерильного способа культуры ткани, пока не получали достаточно клеток для засева четырех роллерных флаконов на 850 см 2×10 жизнеспособных клеток и для получения замороженных исходных клеточных линий с использованием ДМСО. После посева эти клетки поддерживали в роллерных флаконах со средой DMEM, содержащей приблизительно 10% сыворотку (Gibco/BRL, Inc.), дополненной глутамином и несущественными аминокислотами. Клетки поддерживали в течение двух-трех дней, пока не достигалась конфлюэнтность клеток приблизительно 80%. В этот момент среду в роллерных флаконах переключали на бессывороточную среду (50% DMEM, 50% F12, Gibco), дополненную глутамином и несущественными аминокислотами. Кондиционированную среду собирали спустя семь дней, причем добавляли свежую бессывороточную среду для одного или двух дополнительных сборов среды.
Антитела очищали Белок G-аффинной хроматографией непосредственно из кондиционированной среды с использованием стандартных протоколов. Элюцию из Белок G-колонки выполняли с использованием буфера с низким рН (приблизительно рН 3), после чего элюированный белок антитела нейтрализовали с использованием 1 М Триса, рН 8,5, и затем концентрировали с использованием центрифужных концентратов с отсечением молекулярной массы 10 кД. Затем исходный материал концентрированного антитела подвергали замене буфера буфером PBS.
Были созданы тридцать одно антитело, и каждое состоит из двух тяжелых цепей и двух легких (каппа или лямбда) цепей, как представлено в таблице 2.
Таблица 2
Тяжелая цепь антитела
Легкая цепь антитела
526 HC*
526 каппа
528 HC*
528 лямбда C1
531 HC*
531 лямбда C3
533 HC*
533 -каппа
535 HC*
535 лямбда C3
536 HC*
536 каппа
537 HC*
537 лямбда C3 (G 107A R)
540 HC*
540 лямбда C3
543 HC*
543 каппа
544 HC*
544 -лямбда C3
545 HC*
545 лямбда C2
546 HC*
546 лямбда C1 (G 107A S, N 112 A, T114 S)
551 HC*
551 каппа
553 HC*
553 каппа
555 HC*
555 каппа
558 HC
558 каппа
559 HC
559 лямбда C1 (N 112 A, T 114 S)
565 HC*
565 каппа
F1-C6 HC
F1-C6 лямбда C2
FB1-A7 HC
FB1-A7 лямбда C2 (G 107A S)
FD-B2 HC
FD-B2 лямбда C3 (G 107A S)
FE-B7 HC
FE-B7 каппа
FJ-G11 HC
FJ-G11 каппа
FK-E3 HC
FK-E3 каппа
G1D4 HC*
G1D4 лямбда C2
GC1E8 HC
GC1E8 лямбда C3 (K 149 R)
H1C12 HC
H1C12 лямбда C2
IA1-1E7 HC
IA1-1E7 каппа
IF-1C10 HC
IF-1C10 лямбда C3 (T 212 A)
IK-2E2 HC
IK-2E2 лямбда C2 (T 212 A)
IP-2C11 HC
IP-2C11 каппа
* Испытывали на связывание с hAng-2, mAng-2 и hAng-1.# Некоторые константные области легкой цепи лямбда являются, по-видимому, химерами из более чем одного гена константной области лямбда зародышевой линии. Ближайший ген константной области лямбда генов клеток зародышевой линии указан вместе с аминокислотами, отличающимися от аминокислот, кодируемых геном клеток зародышевой линии, с нумерацией с использованием системы Kabat.
th
Следующие четыре таблицы представляют последовательности и SEQ ID NO: тяжелой и легкой (каппа и лямбда) цепей 31 анти-Ang-2-антитела, конвертированных из фага в полноразмерные IgG1-антитела. Определяющие комплементарность районы (CDR) этих моноклональных антител были предсказаны с использованием базы данных VBASE, которая использует способ, описанный Kabat et al., in: Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH Publication No. 91-3242; U.S. Dept. Health and Human Services, 5 ed.). Fab-районы сопоставляли с последовательностями в базе данных с ближайшей последовательностью генов зародышевой линии (гаметных клеток) с использованием инструментов, доступных из MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK, и затем визуально сравнивали с такими последовательностями. CDR для каждой вариабельной области (тяжелой или легкой цепи) представлены в Таблице 7.
Таблица 3Вариабельные области тяжелой цепи
НС (тяжелая цепь) антитела
Последовательность
526 HC(SEQ ID NO: 1)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGPYAYWGQGTLVTVSS
528 HC(SEQ ID NO: 3)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVVGDFDWLSFFDYWGQGTLVTVSS
531 HC(SEQ ID NO: 5)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTNTAYMELTSLTSDDTAVYYCARDREDTAMVFNYWGQGTLVTVSS
533 HC(SEQ ID NO: 7)
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
535 HC(SEQ ID NO: 9)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAFSPFTETDAFDIWGQGTMVTVSS
536 HC(SEQ ID NO: 11)
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
537 HC(SEQ ID NO: 13)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSGLGSEDTAVYYCARGSSDAAVAGMWGQGTLVTVSS
540 HC(SEQ ID NO: 15)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKFTSTAYMELSSLGSEDTAVYYCARAVPGTEDAFDIWGQGTMVTVSS
543 HC(SEQ ID NO: 17)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPYYDFWSGPGGMDVWGQGTTVTVSS
544 HC(SEQ ID NO: 19)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFESGYWGDAFDIWGQGTMVTVSS
545 HC(SEQ ID NO: 21)
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGPVDFDYGDYAIDYWGQGTLVTVSS
546 HC(SEQ ID NO: 23)
EVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETISFSTFSGYFDYWAQGTLVTVSS
551 HC(SEQ ID NO: 25)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYSLDAFDIWGQGTMVTVSS
553 HC(SEQ ID NO: 27)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSGLRSEDTAVYYCARGVDDYGGNSWAFDIWGQGTMVTVSS
555 HC(SEQ ID NO: 29)
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSASDHYYDSSGYYSDAFDIWGQGTMVTVSS
558 HC(SEQ ID NO: 31)
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPGKGLEWIGEINHSGSTNFNPSLKSRITISVDTSNNQFSLKLSSVTAADTAAYYCARGHDWGMGIGGAAYDIWGQGTMVTVSS
559 HC(SEQ ID NO: 33)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTESSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEHGETIYAQKFQGRLTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGVQVTSGYHYFDHWGQGTLVTVSS
565 HC(SEQ ID NO: 35)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSPIYYDILTGIDAFDIWGQGTMVTVSS
F1-C6 HC(SEQ ID NO: 37)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPIPSGWYFDLWGRGTLVTVSS
FB1-A7 HC(SEQ ID NO: 39)
QVQLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGNYYDSSGYGYWGQGTLVTVSS
FD-B2 HC(SEQ ID NO: 41)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDTVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYSDYAVSLRGRITINLDTDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRGGYIDSWGQGTLVTVSS
FE-B7 HC(SEQ ID NO: 43)
EVQLVESGGGLGQPGGSLRLSCAATGFSLDDYEMNWVRQAPGRGLEWVSYIIGSGKTIFYADSVKGRFTISRDNGKNSVYLQMNSLRAEDTAIYYCARGGGSAYYLNTSDIWGQGTMVTVSS
FJ-G11 HC(SEQ ID NO: 45)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDRGIAARSAYYYGMDVWGQGTTVTVSS
FK-E3 HC(SEQ ID NO: 47)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDLNWVRQASGQGLEWMGWMNPTSGNTGYAQKFQGRITMTRNTSISTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDPPSGGWEFDYWGQGTLVTVSS
G1D4 HC(SEQ ID NO: 49)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSHAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSRLEWLLYLDYWGQGTLVTVSS
GC1E8 HC(SEQ ID NO: 51)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMEVRSLRSDDTAVYYCARGGSPYGGYAYPFDYWGQGTLVTVSS
H1C12 HC(SEQ ID NO: 53)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLDYDILTGYGYWGQGTLVTVSS
IA1-1E7 HC(SEQ ID NO: 55)
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPGKGLEWIGEINHSGSTNFNPSLKSRITISVDTSNNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGHDWGMGIGGAAYDIWGQGTMVTVSS
IF-1C10 HC(SEQ ID NO: 57)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFSTYAMTWVRQAPGKGLEWVSVIRSNGGTDYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCMTDYYWGQGTLVTVSS
IK-2E2 HC(SEQ ID NO: 59)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETISFSTFSGYFDYWGQGTLVTVSS
IP-2C11 HC(SEQ ID NO: 61)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKEIAVAGTRYGMDVWGQGTTVTVSS
Таблица 4Вариабельные области цепи каппа
LC (легкая цепь) антитела
Последовательность
526 каппа(SEQ ID NO: 2)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIK
533 каппа(SEQ ID NO: 8)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLNWYLQKPGQSPQILIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPPTFGQGTKLEIK
536 каппа (THW)(SEQ ID NO: 12)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKLEIK
536 каппа (LQT)(SEQ ID NO: 210)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPPTFGQGTKLEIK
543 каппа(SEQ ID NO: 18)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK
551 каппа(SEQ ID NO: 26)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK
553 каппа(SEQ ID NO: 28)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFTGSGSATDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK
555 каппа(SEQ ID NO: 30)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLASNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQTLQIPITFGPGTKVDIK
558 каппа(SEQ ID NO: 32)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAPRLLVYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPRTFGQGTKVEIK
565 каппа(SEQ ID NO: 36)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAPRLLVYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSPRTFGQGTKVEIK
565 каппа (2)(SEQ ID NO: 211)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIFLGSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISKVEADDVGIYYCMQALDTPPTFGPGTKVEIK
FE-B7 каппа(SEQ ID NO: 44)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSKGDNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK
FJ-G11 каппа(SEQ ID NO: 46)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGKTYLDWYLQRPGQSPQLLMYTTSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQATQFPYTFGQGTKLEIK
FK-E3 каппа(SEQ ID NO: 48)
DIVMTQTPLSSTVTLGQPASISCRSSQSLVHEDGNTYLNWLHQRPGQPPRLLIYKISKRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEPEDVGVYYCMQSTRFPRTFGQGTKLEIK
IA1-1E7 каппа(SEQ ID NO: 56)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKAGQAPRLLIYDTSTRATGIADRFSGSGSGTDFTLTISRLEAEDSAVYYCQQYDFSPLTFGGGTKVEIK
IP-2C11 каппа(SEQ ID NO: 62)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISTFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPGRFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCQHRINWPLTFGGGTKVEIK
Таблица 5Вариабельные области цепи лямбда
LC (легкая цепь) антитела
Последовательность
528 лямбда(SEQ ID NO: 4)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGYTYTSWFQQKPGQSPVLVIFQDFKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSTTAVVFGTGTKVTVL
531 лямбда(SEQ ID NO: 6)
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTVSCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAFWVFGGGTKLTVL
535 лямбда(SEQ ID NO: 10)
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSNSNIGNNFVSWYQQLPGTAPKLLVYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAAEVVFGGGTKLTVL
537 лямбда(SEQ ID NO: 14)
QSVLTQPPSVSAAPGQDVTISCSGNNSNIGNNYVSWYQQVPGTAPKLLVYDNHKRPSGISDRFSGSKSDTSATLDITGLQPGDEADYYCGTWDTSLSANWVFGGGTKLTVL
540 лямбда(SEQ ID NO: 16)
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGANYVSWYQQLPGTAPKLLIYNNNKRPSGIPDRFSGSKSDTSATLGITGLQTGDEADYYCGAWDSSLSASWVFGGGTKLTVL
544 лямбда(SEQ ID NO: 20)
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSHVVFGGGTKLTVL
545 лямбда(SEQ ID NO: 22)
QSVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGQSSNIGAGYDVHWYQQFPGRAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQPEDEADYYCQSYDSRLSGSVFGGGTKLTVL
546 лямбда(SEQ ID NO: 24)
QSVLTQPSSVSEAPRQRVTISCSGSASNIGANGVSWYHQVPGKAPRLLLSHDGLVTSGVPDRLSVSKSGTSASLAISGLHSDDEGDYYCAVWDDSLNAVVFGGGTKLTVL
559 лямбда(SEQ ID NO: 34)
QSALTQPPSASGSPGQSITISCTGTNSDIGSYPFVSWYQRHPGKAPKLLIYDVSNRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSFTMNSFVIFGGGTKLTVL
F1-C6 лямбда(SEQ ID NO: 38)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
FB1-A7 лямбда(SEQ ID NO: 40)
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSGGGIGSSFVHWFQQRPGSSPTTVIFDDNQRPTGVPDRFSAAIDTSSSSASLTISGLTAEDEADYYCQSSHSTAVVFGGGTKLTVL
FD-B2 лямбда(SEQ ID NO: 42)
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIATNYVQWYQQRPGSSPATVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDTSSNSASLTISGLTTEDEADYFCQSYGDNNWVFGGGTKLTVL
G1D4 лямбда(SEQ ID NO: 50)
NFMLTQPHSVSESPGKTVIIPCTRSSGSIASNYVQWYQKRPGSAPSIVIYEDKQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYNSRGVMFGGGTKLTVL
GC1E8 лямбда(SEQ ID NO: 52)
NFMLTQPHSVLESAGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGTSPTNVIFEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYFCQSYDSNIWVFGGGTKLTVL
H1C12 лямбда(SEQ ID NO: 54)
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQHLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIAGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSLVFGGGTKLTVL
IF-1C10 лямбда(SEQ ID NO: 58)
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSGGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSTWVFGGGTKLTVL
IK-2E2 лямбда(SEQ ID NO: 60)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWFQQHPGKAPKLMIYKVNNRPSGLSNRFSGSQSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLGFGGGTKLTVL
Таблица 6Константные области (CR) человека
CR (константная область) антитела
Последовательность
Константная область 1 лямбда человека (С1)(SEQ ID NO: 63)
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Константная область 2 лямбда человека (C2)(SEQ ID NO: 64)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Константная область 3 лямбда человека (C3)(SEQ ID NO: 65)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Константная область 7 лямбда человека (C7)(SEQ ID NO: 66)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
Константная область каппа человека(SEQ ID NO: 67)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Константная область IgG1 человека(SEQ ID NO: 68)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Таблица 7Определяющие комплементарность районы (CDR) тяжелых цепей (НС) и легких цепей (LC) анти-Ang-2-антител
CDR 1
CDR 2
CDR 3
Антитело
Остатки
Остатки
Остатки
Ab 526 HC
SYGMH(SEQ ID NO: 69)
AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO: 105)
DLLDYDILTGPYAY(SEQ ID NO: 144)
Ab 526 KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LGSNRAS -(SEQ ID NO: 106)
MQALQTPPT(SEQ ID NO: 145)
Ab 528 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 107)
GVVGDFDWLSFFDY(SEQ ID NO: 146)
Ab 528 LC
SGDKLGYTYTS(SEQ ID NO: 72)
QDFKRPS(SEQ ID NO: 108)
QAWDSTTAVV(SEQ ID NO: 147)
Ab 531 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO: 109)
DREDTAMVFNY(SEQ ID NO: 148)
Ab 531 LC
SGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO: 73)
DNNKRPS(SEQ ID NO: 110)
GTWDSSLSAFWV(SEQ ID NO: 149)
Ab 533 HC
SYGMH(SEQ ID NO: 69)
YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 111)
DLLDYDILTGYGY(SEQ ID NO: 150)
Ab 533 KC
RSSQSLLHSNGYNYLN(SEQ ID NO: 74)
LGSNRAS(SEQ ID NO: 106)
MQGLQTPPT(SEQ ID NO: 151)
Ab 535 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 107)
FSPFTETDAFDI(SEQ ID NO: 152)
Ab 535 LC
SGSNSNIGNNFVS(SEQ ID NO: 75)
DNNKRPS(SEQ ID NO: 110)
GTWDSSLSAAEVV(SEQ ID NO: 153)
Ab 536 HC
SYGMH(SEQ ID NO: 69)
YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 111)
DLLDYDILTGYGY(SEQ ID NO: 150)
Ab 536 (THW) KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LGSNRAS(SEQ ID NO: 106)
MQGTHWPPT(SEQ ID NO: 154)
Ab 536 (LQT) KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LGSNRAS(SEQ ID NO: 106)
MQGLQTPPT(SEQ ID NO: 212)
Ab 537 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO: 109)
GSSDAAVAGM(SEQ ID NO: 155)
Ab 537 LC
SGNNSNIGNNYVS(SEQ ID NO: 76)
DNHKRPS(SEQ ID NO: 112)
GTWDTSLSANWV(SEQ ID NO: 156)
Ab 540 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO: 109)
AVPGTEDAFDI(SEQ ID NO: 157)
Ab 540 LC
SGSSSNIGANYVS(SEQ ID NO: 77)
NNNKRPS(SEQ ID NO: 113)
GAWDSSLSASWV(SEQ ID NO: 158)
Ab 543 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
RIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO: 114)
PYYDFWSGPGGMDV(SEQ ID NO: 159)
Ab 543 KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LGSNRAS(SEQ ID NO: 106)
MQALQTPLT(SEQ ID NO: 160)
Ab 544 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 107)
FESGYWGDAFDI(SEQ ID NO: 161)
Ab 544 LC
SGDALPKQYAY(SEQ ID NO: 78)
KDSERPS(SEQ ID NO: 115)
QSADSSHVV(SEQ ID NO: 162)
Ab 545 HC
SYGMH(SEQ ID NO: 69)
VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO: 116)
GPVDFDYGDYAIDY(SEQ ID NO: 163)
Ab 545 LC
TGQSSNIGAGYDVH(SEQ ID NO: 79)
GNSNRPS(SEQ ID NO: 117)
QSYDSRLSGSV(SEQ ID NO: 164)
Ab 546 HC
SYAMS(SEQ ID NO: 80)
AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO: 105)
ETISFSTFSGYFDY(SEQ ID NO: 165)
Ab 546 LC
SGSASNIGANGVS(SEQ ID NO: 81)
HDGLVTS(SEQ ID NO: 118)
AVWDDSLNAVV(SEQ ID NO: 166)
Ab 551 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 107)
GYDFWSGYSLDAFDI(SEQ ID NO: 167)
Ab 551 KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LGSNRAS(SEQ ID NO: 106)
MQALQTPLT(SEQ ID NO: 160)
Ab 553 HC
SYAMH(SEQ ID NO: 82)
WINAGNGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO: 119)
GVDDYGGNSWAFDI(SEQ ID NO: 168)
Ab 553 KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LGSNRAS(SEQ ID NO: 106)
MQALQTPLT(SEQ ID NO: 160)
Ab 555 HC
SYAMH(SEQ ID NO: 82)
VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO: 116)
SASDHYYDSSGYYSDAFDI(SEQ ID NO: 169)
Ab 555 KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LASNRAS(SEQ ID NO: 120)
MQTLQIPIT(SEQ ID NO: 170)
Ab 558 HC
GYYWS(SEQ ID NO: 83)
EINHSGSTNFNPSLKS(SEQ ID NO: 121)
GHDWGMGIGGAAYDI(SEQ ID NO: 171)
Ab 558 KC
RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO: 84)
AASSRAT(SEQ ID NO: 122)
QHYGSSPRT(SEQ ID NO: 172)
Ab 559 HC
ESSMH(SEQ ID NO: 85)
GFDPEHGETIYAQKFQG(SEQ ID NO: 123)
GVQVTSGYHYFDH(SEQ ID NO: 173)
Ab 559 LC
TGTNSDIGSYPFVS(SEQ ID NO: 86)
DVSNRPS(SEQ ID NO: 124)
SSFTMNSFVI(SEQ ID NO: 174)
Ab 565 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO: 107)
SPIYYDILTGIDAFDI(SEQ ID NO: 175)
Ab 565 KC
RASQSVSSSSLA(SEQ ID NO: 213)
AASSRAT(SEQ ID NO: 214)
QHYGSSPRT(SEQ ID NO: 215)
Ab 565 (2) KC
RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO: 70)
LGSSRAS(SEQ ID NO: 125)
MQALDTPPT(SEQ ID NO: 176)
Ab F1-C6 HC
SYAIS(SEQ ID NO: 71)
RIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO: 114)
DPIPSGWYFDL(SEQ ID NO: 177)
Ab F1-C6 LC
SGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO: 87)
YDDLLPS(SEQ ID NO: 126)
ATWDDSLSGWV(SEQ ID NO: 178)
Ab FB1-A7 HC
SYGMH(SEQ ID NO: 69)
VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO: 127)
EVGNYYDSSGYGY(SEQ ID NO: 179)
Ab FB1-A7 LC
TRSGGGIGSSFVH(SEQ ID NO: 88)
DDNQRPT(SEQ ID NO: 128)
QSSHSTAVV(SEQ ID NO: 180)
Ab FD-B2 HC
SNSAAWN(SEQ ID NO: 89)
RTYYRSKWYSDYAVSLRG(SEQ ID NO: 129)
DRGGYIDS(SEQ ID NO: 181)
Ab FD-B2 LC
TRSSGSIATNYVQ(SEQ ID NO: 90)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 130)
QSYGDNNWV(SEQ ID NO: 182)
Ab FE-B7 HC
DYEMN(SEQ ID NO: 91)
YIIGSGKTIFYADSVKG(SEQ ID NO: 131)
GGGSAYYLNTSDI(SEQ ID NO: 183)
Ab FE-B7 KC
RSSQSLLHSKGDNYLD(SEQ ID NO: 92)
LGSHRAS(SEQ ID NO: 132)
MQALQTPLT(SEQ ID NO: 160)
Ab FJ-G11 HC
SYGIS(SEQ ID NO: 93)
WISAYNGNTNYAQKLQG(SEQ ID NO: 133)
DRGIAARSAYYYGMDV(SEQ ID NO: 184)
Ab FJ-G11 KC
RSSQSLLDSDDGKTYLD(SEQ ID NO: 94)
TTSSRAS(SEQ ID NO: 134)
MQATQFPYT(SEQ ID NO: 185)
Ab FK-E3 HC
SYDLN(SEQ ID NO: 95)
WMNPTSGNTGYAQKFQG(SEQ ID NO: 135)
DPPSGGWEFDY(SEQ ID NO: 186)
Ab FK-E3 KC
RSSQSLVHEDGNTYLN(SEQ ID NO: 96)
KISKRFS(SEQ ID NO: 136)
MQSTRFPRT(SEQ ID NO: 187)
Ab G1D4 HC
SHAIS(SEQ ID NO: 97)
RIIPILGIANYAQKFQG(SEQ ID NO: 114)
SRLEWLLYLDY(SEQ ID NO: 188)
Ab G1D4 LC
TRSSGSIASNYVQ(SEQ ID NO: 98)
EDKQRPS(SEQ ID NO: 137)
QSYNSRGVM(SEQ ID NO: 189)
Ab GC1E8 HC
SYGIS(SEQ ID NO: 93)
WISAYNGNTNYAQKLQG(SEQ ID NO: 133)
GGSPYGGYAYPFDY(SEQ ID NO: 190)
Ab GC1E8 LC
TRSSGSIASNYVQ(SEQ ID NO: 98)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 130)
QSYDSNIWV(SEQ ID NO: 191)
Ab H1C12 HC
SYGMH(SEQ ID NO: 69)
YISSSGSTIYYADSVKG(SEQ ID NO: 111)
DLLDYDILTGYGY(SEQ ID NO: 150)
Ab H1C12 LC
SGSSSNIGNNYVS(SEQ ID NO: 73)
GNTNRPS(SEQ ID NO: 138)
QSYDSSLSGSLV(SEQ ID NO: 192)
Ab IA1-1E7 HC
GYYWS(SEQ ID NO: 83)
EINHSGSTNFNPSLKS(SEQ ID NO: 121)
GHDWGMGIGGAAYDI(SEQ ID NO: 171)
Ab IA1-1E7 KC
RASQSVSSSFLA(SEQ ID NO: 99)
DTSTRAT(SEQ ID NO: 139)
QQYDFSPLT(SEQ ID NO: 193)
Ab IF-1C10 HC
STYAMT(SEQ ID NO: 100)
VIRSNGGTDYADFVKG(SEQ ID NO: 140)
DYY(SEQ ID NO: 194)
Ab IF-1C10 LC
TGSGGSIASNYVQ(SEQ ID NO: 101)
EDNQRPS(SEQ ID NO: 130)
QSYDSSTWV(SEQ ID NO: 195)
Ab IK-2E2 HC
SYAMS(SEQ ID NO: 80)
AISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO: 105)
ETISFSTFSGYFDY(SEQ ID NO: 165)
Ab IK-2E2 LC
TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO: 102)
KVNNRPS(SEQ ID NO: 141)
SSYTSSSTLG(SEQ ID NO: 196)
Ab IP-2C11 HC
SYDIN(SEQ ID NO: 103)
WMNPNSGNTGYAQKFQG(SEQ ID NO: 142)
EIAVAGTRYGMDV(SEQ ID NO: 197)
Ab IP-2C11 KC
RASQSISTFLA(SEQ ID NO: 104)
DASNRAT(SEQ ID NO: 143)
QHRINWPLT(SEQ ID NO: 198)
Семнадцать из этих антител и отрицательный контроль IgG1 (называемый RDB1) испытывали с использованием анализа аффинности и нейтрализации ELISA (как описано в Примере 3 выше), а также анализа нейтрализации BIAcore для определения их аффинности, способности нейтрализации и специфичности. Эти результаты представлены в таблице 8, и они были рассчитаны с использованием стандартных протоколов.
Таблица 8ЕС50 и IC50 анти-Ang-2-антител
hAng-2
mAng-2
hAng-1
Антитело
IC50 (нМ)
EC50 (нМ)
IC50 (нМ)
EC50 (нМ)
IC50 (нМ)
EC50 (нМ)
Ab 536 (THW/LQT смесь)
0,08
0,005
0,05
0,01
114,65
30
Ab 565
0,26
0,26
Нет ингибирования
Ab 546
0,37
1,09
Нет ингибирования
Ab 543
0,51
0,24
Нет ингибирования
Ab 533
0,3
0,08
Нет ингибирования
Ab 537
0,56
0,62
Нет ингибирования
Ab 540
0,70
1,53
Нет ингибирования
Ab 544
0,97
1,82
23,32
Ab 545
1,04
0,02
1,30
0,05
8,31
2
Ab 528
1,37
0,73
Нет ингибирования
Ab G1D4
1,39
0,60
69,48
Ab 551
1,41
2,88
Нет ингибирования
Ab 553
1,47
1,41
Нет ингибирования
Ab 526
1,83
0,27
243,15
Ab 531
2,15
1,67
Нет ингибирования
Ab 555
2,21
1,76
Нет ингибирования
Ab 535
2,81
2,45
Нет ингибирования
RDB1
Нет ингибирования
Нет связывания
Нет ингибирования
Нет связывания
Нет ингибирования
Нет связывания
D
Два антитела, клон 536 и клон 545, оценивали с использованием анализа BIAcore, описанного выше. Связывание антител определяли, как описано выше для анализа BIAcore, причем более низкие K указывают на более высокие аффинности, и результаты представлены в таблице 9.
Таблица 9Аффинности антител для hAng-2 и mAng-2
hAng-2
mAng-2
Ab
K<sub>D</sub> (нМ)
k<sub>a</sub>(1/Мс)
k<sub>d</sub>(1/с)
K<sub>D</sub> (нМ)
k<sub>a</sub>(1/Мс)
k<sub>d</sub>(1/с)
Ab 536 (THW/LQT смесь)
0,12
3,2×10<sup>5</sup>
3,8×10<sup>-5</sup>
0,15
6,2×10<sup>5</sup>
9,5×10<sup>-5</sup>
Ab 545
1,2
3,3×10<sup>5</sup>
3,9×10<sup>-4</sup>
0,9
5,9×10<sup>5</sup>
5,3×10<sup>-4</sup>
Клон 536, анализированный выше, содержал смесь двух вариантов антител, которые показаны в таблице 4 как SEQ ID NO:12 (536 каппа THW) и SEQ ID NO:210 (536 каппа LQT). Эти два варианта 536 разделяли и анализировали отдельно на активность с использованием анализов ELISA и HTRF.
Для анализа ELISA девяностошестилуночные планшеты покрывали рекомбинантными ангиопоэтинами в кондиционированной среде клеток 293Т (DMEM/50 мкг/мл БСА) при 37°С в течение 1 часа. Кондиционированные среды использовали при концентрациях ангиопоэтина, которые давали 80% максимально достижимое связывание с 1 нМ hTie2-Fc ((R&D Systems, catalog # 313-TI). Планшеты промывали PBS/0,1% Твин-20 и затем блокировали в течение 2 часов при комнатной температуре PBS/5% БСА. Ангиопоэтин-нейтрализующие агенты, титрованные от 100 нМ до 0,4 пМ в растворе PBS/1% БСА/1 нМ Tie-2, добавляли в покрытые ангиопоэтином планшеты, которые инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и затем промывали PBS/0,1% Твин-20. Полученное из мышей анти-Tie-2-антитело (BD Pharmingen Inc., catalog # 557039) добавляли в каждый планшет при конечной концентрации 1 мкг/мл (1 час инкубирования при комнатной температуре), после чего планшеты промывали в PBS/0,1% Твин-20. Козье антитело против мышиного IgG-HRP (Pierce, catalog # 31432) добавляли при разведении 1:10000 в PBS/1% БСА (1 час инкубировали при комнатной температуре), после чего планшеты промывали несколько раз PBS/1% Твин-20. Добавляли TMB-субстрат (Sigma, catalog # T8665), измеряли оптическую плотность O.D. 370 нм и степень нейтрализации комплекса ангиопоэтин:Tie-2 определяли сравнением против стандартной кривой Tie-2.
50
Для анализа HTRF девяностошестилуночный микротитрационный «смешанный планшет» готовили добавлением 50 мкл HTRF-буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, 0,1% БСА), содержащего 0,8 нМ Европий-конъюгированный стрептавидин (PERKIN ELMER LIFE SCIENCES INC. Catalog # AD0062) и 4,0 нМ биотинилированный ангиопоэтин 1 человека (R&D Systems) или ангиопоэтин 2 (Amgen Inc.) в каждую лунку. В отдельном микротитрационном планшете ангиопоэтин-нейтрализующие агенты титровали от 400 нМ до 20 нрМ в буфере HTRF и затем 50 мкл каждого серийно разведенного ангиопоэтин-нейтрализующего агента переносили и смешивали со «смешанным планшетом», содержащим стрептавидин-Европий/ангиопоэтин. Затем этот планшет инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение одного часа. Затем, 20 мкл из каждой лунки «смешанного планшета» переносили в «планшет для анализа», содержащий 20 мкл конъюгированного с 10 нМ аллофикоцианином человека Tie-2-Fc человека в HTRF-буфере в каждой из девяноста шести лунок. Этот конечный «планшет для анализа» инкубировали при комнатной температуре при встряхивании в течение двух часов. Конечные концентрации «планшета для анализа» были: 1,0 нМ ангиопоэтин, 5,0 нМ Tie-2-Fc человека и 100 нМ - 5,0 пМ для серийно разведенных ангиопоэтин-нейтрализующих агентов. Планшеты для анализа анализировали с использованием планшет-ридера Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenberg, Germany). Степень нейтрализации комплекса ангиопоэтин:Tie-2 определяли расчетом процентного ингибирования каждого разведения ангиопоэтин-нейтрализующего агента с использованием контроля «без ангиопоэтин-нейтрализующего агента» (представляющего нулевое ингибирование) и контроля «без ангиопоэтина» (представляющего полное ингибирование). Затем рассчитывали величины IC посредством анализа процентного ингибирования с использованием программы GRAFIT 5.0 (Erithacus Software Ltd.).
50
50
Все результаты выражали в виде кривых IC, рассчитанных из проб, которые испытывали в двух повторностях, с использованием приведенной ниже формулы. Результаты IC приводят данные ингибирования к 2-параметрическому уравнению, где низший порог данных был равен 0 (т.е. эти данные корректировали относительно фона), а высший порог данных был равен 100 (т.е. эти данные корректировали по диапазону).
В этом уравнении s обозначает коэффициент наклона. Это уравнение предполагает, что y уменьшается с увеличением х. Это уравнение использовали в программе GRAFIT 5.0 (Erithacus Software Limited).
Эти результаты показаны в таблицах 10 и 11.
Таблица 10IC50-результаты ELISA варианта Ab536
Проба
IC50 Ang1 человека (нМ)
IC50 Ang2 человека (нМ)
IC50 Ang2 мыши (нМ)
Ab536 LQT
>100
0,35
0,10
Ab536 THW
>100
0,31
0,088
Таблица 11IC50-результаты HTRF варианта Ab536
Проба
IC50 Ang1 человека (нМ)
IC50 Ang2 человека (нМ)
Ab536 LQT
>100
0,072
Ab536 THW
>100
0,071
ПРИМЕР 5
Исследования терапевтической эффективности с использованием анти-Ang-2-антител
Фармакокинетику Белок-G-очищенных кроличьих поликлональных анти-Ang-2-антител исследовали в мышах. Двадцать четыре мыши обрабатывали поликлональным кроличьим анти-Ang-2-антителом (1 мг на мышь). Четырех обработанных животных умерщвляли в каждой из следующих временных точек после инъекции антитела: 1 час, 6 часов, 1 день, 3 дня, 7 дней и 14 дней.
Результаты показали, что общий кроличий IgG имел период полувыведения в сыворотке приблизительно 19 дней, тогда как анти-Ang-2-IgG-компонент общего IgG имел период полувыведения в сыворотке приблизительно восемь дней.
Для оценки терапевтической эффективности мышам (10 животных на группу), несущим трансплантаты опухоли А431, вводили 10 доз (приблизительно 10 мг IgG на мышь на одну дозу) внутрибрюшинно Белок-G-очищенного поликлонального анти-Ang-2-антитела в дни 1, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 и 18 после ксенотрансплантации. Размер опухоли измеряли в дни 7, 12, 15, 19 и 21. Массу тела измеряли в дни 0, 7, 15 и 21, и масса тела не изменялась обработкой. Результаты показали, что поликлональное анти-Ang-2-антитело ингибировало рост трансплантата опухоли А431 на приблизительно 50% с р=0,008 относительно контролей неиммунной очищенной поликлональной антисыворотки (10 мг IgG на мышь на дозу) и носителя (PBS) согласно повторяемым измерениям ANOVA.
Для испытания эффективности полных моноклональных анти-Ang-2-антител человека in vivo мышам (10 животных на группу), несущим трансплантаты опухоли А431, вводили внутрибрюшинно клон анти-Ang-2-антитела 533, 537 или 544 или отрицательные контроли PBS или IgG1-каппа человека. Вводили приблизительно 420 мкг белка на мышь для первой дозы, приблизительно 140 мкг белка на мышь для каждой из последующих трех доз и приблизительно 55 мкг белка на мышь для каждой из последующих четырех доз, всего 8 доз на мышь. Объемы опухолей и массы тела регистрировали два раза в неделю. В конце этого исследования животных умерщвляли и их сыворотку собирали для измерения уровня антител при помощи ELISA. Опухоли и панель нормальных тканей собирали из всех групп.
Были обнаружены явные различия в росте опухолей между анти-Ang-2-антитело-обработанными и контрольными группами, как показано на фигуре 1. Все три обработки анти-Ang-2-антителом ингибировали рост опухолей в сравнении с контролями (р < 0,005 против hIgG1-контроля во всех обработках с использованием повторяемого измерения ANOVA для всех 3 антител). В противоположность этому, опухоли в контрольных группах продолжали расти при гораздо большей скорости.
ПРИМЕР 6
Картирование эпитопов
Полноразмерные (аминокислоты 1-495), N-концевые (аминокислоты 1-254) и С-концевые (аминокислоты 255-495) белки Ang-2 (hAng-2) человека клонировали в CMV-запускаемый экспрессирующий вектор млекопитающих с С-концевыми 6×His-метками. Три полученные конструкции и вектор-контроль транзиторно трансфицировали в клетки 293Т. Затем кондиционированные среды собирали из трансфицированных клеток и уровень экспрессии Ang-2 в этих средах определяли анти-6×His-ELISA и Вестерн-блоттингом.
Связывание эпитопа анти-Ang-2-антител и пептидных антител определяли по их способности связывать три версии hAng-2 человека при помощи ELISA в соответствии со следующим протоколом: 96-луночный планшет для анализа высокого связывания покрывали 100 мкл кондиционированной среды на лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Кондиционированную среду аспирировали и планшет блокировали 200 мкл на лунку 5% БСА в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем блокирующий раствор аспирировали. 100 мкл на лунку антитела, пептидного антитела или Tie-2-Fc добавляли при 1 мкг/мл в 1% БСА в PBS и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали 4 раза 200 мкл 0,1% Твина в PBS. Добавляли 100 мкл на лунку HRP-конъюгированного козьего антитела против IgG человека или козьего антитела против IgG мыши и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем эти лунки промывали 200 мкл 0,1% Твина в PBS 4 раза. Затем добавляли 100 мкл на лунку TМВ-субстрата. O.D. регистрировали при 370 нм.
Эти результаты представлены на фигуре 2а, фигуре 2в и фигуре 2с.