СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К СИНТЕТИЧЕСКИМ БЕТА-1,6-ГЛЮКОЗАМИНОЛИГОСАХАРИДАМ
METHODS AND COMPOSITIONS DESCRIBED AS SYNTHETIC BETA-1,6-GLUCOSAMINOLIGOSACCHARIDES

Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительных заявок на патенты США 61/135493 и 61/208155, поданных 21 июля 2008 года и 20 февраля 2009 года, соответственно, все содержание которых включено в настоящую заявку путем ссылки.
Правительственная поддержка
Настоящее изобретение было частично поддержано грантом Национального Института Здравоохранения США RO1A1046706. Правительство США обладает правами на изобретение.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к композициям и способам, относящимся к синтетическим олиго-β-(1→6)-2-амино-2-дезокси-D-глюкопиранозидам, которые в настоящей заявке взаимозаменяемо упоминаются как олиго-β-(1→6)-D-глюкозамины или олигоглюкозамины.
Уровень техники
Staphylococci)
Стафилококки (представляют собой грамположительные бактерии, которые обычно населяют и колонизируют кожу и слизистые оболочки человека. Если кожа или слизистая оболочка повреждаются при хирургической операции или другой травме, то стафилококки могут получить доступ к внутренним тканям, что приводит к развитию инфекции. Если стафилококки пролиферируют локально или попадают в лимфатическую или кровеносную систему, то могут развиваться тяжелые инфекционные осложнения, связанные со стафилококковой бактериемией. Указанные осложнения включают септический шок, эндокардит, артрит, остеомиелит, пневмонию и абсцессы в различных органах.
Staphylococcus aureus
S.aureus
. S.aureus
S.aureus
Стафилококки включают как коагулаза-положительные организмы, которые продуцируют свободную коагулазу, так и коагулаза-отрицательные организмы, которые не продуцируют свободную коагулазу. Золотистый стафилококк () является наиболее распространенной коагулаза-положительной формой стафилококков.  обычно вызывает инфекцию в локальном участке, экстраваскулярно или интраваскулярно, которая, в конечном счете, может привести к бактериемии также является основной причиной острого остеомиелита и вызывает инфекционные стафилококковые пневмонии. Кроме того,  является причиной приблизительно 1-9% случаев бактериального менингита и 10-15% абсцессов мозга.
S.epidermidis
S.saprophyticus
S.hominis
S.warneri
S.haemolyticus
S.saprophiticus
S.cohnii
S.xylosus
S.simulans
S.capitis
S.epidermidis
S.epidermidis
Существует по меньшей мере тридцать один известный вид коагулаза-отрицательных стафилококков, включая , , , , , , , ,  и .  является наиболее частым инфекционным агентом, связанным с внутривенными катетерами, и наиболее часто выделяется при первичных госпитальных бактериемиях.  также связан с эндокардитом искусственного клапана.
S.aureus
S.aureus
S.aureus
Стафилококк также является распространенным источником бактериальной инфекции у животных. Например, стафилококковый мастит является обычной проблемой у жвачных животных, таких как рогатый скот, овцы и козы. Болезнь обычно лечат антибиотиками с целью устранить инфекцию, однако подобная терапия является дорогостоящей процедурой и в то же время приводит к потере производства молока. Наиболее эффективными вакцинами, известными на настоящее время, являются живые, интактные вакцины , которые вводят подкожно. Однако введение живых вакцин связано с риском инфекции. По этой причине многие исследователи пытались получить инактивированные вакцины  и/или выделить капсулярные полисахариды или компоненты клеточной стенки, которые будут вызывать иммунитет к .
Соединения-носители иногда применяются в вакцинах для усиления иммунного ответа на антиген. Например, носитель в некоторых вакцинах может применяться для стимуляции хелперных T-клеток в ответ на антигенную молекулу. Антигенные молекулы, которые являются природными веществами или фрагментами природных веществ, в некоторых случаях менее удобны и с меньшей легкостью поддаются манипуляциям и/или конъюгированию с другими соединениями, такими как, например, соединения-носители, и это может уменьшать терапевтический эффект таких вакцин.
Сущность изобретения
Изобретение относится к новым способам и соединениям для получения антигенных композиций, таких как, но ими не ограничиваясь, вакцины. В частности, изобретение относится к новым способам модификации олигосахаридных антигенов. Указанные способы включают контролируемый синтез олигосахарида, (a) состоящего из моносахаридных мономеров в определенном порядке и (b) конъюгированного с соединением-носителем. Полученные в результате конъюгаты способны лучше стимулировать (либо посредством индукции, либо усиления) иммунный ответ в отношении целевого микробного полисахаридного антигена. Как описано в настоящей заявке, такие иммунные ответы полезны при лечении и/или профилактике различных инфекций, включая, но ими не ограничиваясь, стафилококковые инфекции.
Различные аспекты изобретения относятся к конкретным линкерам (или сшивающим агентам, или спейсерам, или сшивающим реагентам, причем указанные термины взаимозаменяемо используются в настоящей заявке), а также к их применению в синтезе конъюгатов. Особый интерес представляют конъюгаты олигосахаридов и различных соединений-носителей. Указанные олигосахариды включают олиго-β-(1→6)-D-глюкозамин (связанный глюкозамин, как указано в настоящей заявке), который состоит из глюкозаминовых мономеров, соединенных друг с другом β-(1→6) связью. Один или несколько различных мономеров, которые составляют связанный глюкозамин, могут быть N-ацетилированы. Таким образом, мономерами могут быть D-глюкозаминовые или N-ацетил-D-глюкозаминовые мономеры, при этом связанный глюкозамин может включать определенную последовательность из одного или обоих типов данных мономеров (или моносахаридов, поскольку указанные термины используются в настоящей заявке взаимозаменяемо). Олигоглюкозамины по изобретению также включают спейсеры, которые имеют тиолсодержащие группы на своих "восстанавливающих" концах. Спейсер используется для связывания олигоглюкозаминов с носителями. Носители могут состоять из аминокислот (например, пептиды или белки), хотя они не ограничиваются этим.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к соединению формулы I:
Формула I
где X является любым атомом или группой, Y является защитной группой серы и n больше 1. В одном варианте осуществления Y является ацильной группой. В другом варианте осуществления Y является ацетильной группой, при этом соединение имеет структуру формулы II:
Формула II
где Ac является ацетильной группой.
В другом варианте осуществления соединение является активированным сложным эфиром формулы I. В другом варианте осуществления соединение является циано, азидо или галогенпроизводным активированного сложного эфира формулы I. В другом варианте осуществления соединение имеет структуру формулы III:
Формула III
где Ac является ацетильной группой, и соединение называется N-гидроксисукцинимидил-4-ацетилсульфанилбутиратом. В другом варианте осуществления соединение имеет структуру формулы IV:
Формула IV
где Ac является ацетильной группой, и соединение называется N-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутиратом.
В другом аспекте изобретение относится к способу синтеза N-гидроксисукцинимидил-4-ацетилсульфанилбутирата (формула III), включающему реакцию 4-ацетилсульфанилмасляной кислоты (формула V):
Формула V
3
с N-гидроксисукцинимидилтрифторацетатом (CFCOOSu) с получением N-гидроксисукцинимидил-4-ацетилсульфанилбутирата (формула III).
В другом аспекте изобретение относится к способу синтеза N-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутирата (IV), включающему реакцию 4-ацетилсульфанилмасляной кислоты (формула V):
Формула V
3
с N-нитрофенилтрифторацетатом (CFCOOpNp) с получением N-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутирата (формула IV).
В другом аспекте изобретение относится к способу синтеза олигосахарида, конъюгированного с носителем, включающему реакцию олигосахарида (a) во-первых, с соединением, имеющим структуру формулы Va или Vb:
где m является числом, выбранным из 1-10, p является числом, выбранным из 1-20, а R представляет собой H или алкильную группу, (b) во-вторых, с соединением формулы I, II, III или IV и (c) в-третьих, с носителем, где олигосахарид представляет собой β-1-6 связанный глюкозамин.
В еще одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей олигосахарид, несущий O-связанный линкер, где линкер включает:
Формула VI
В одном варианте осуществления олигосахарид представляет собой β-1-6 связанный глюкозамин. В другом варианте осуществления длина олигосахарида составляет 2-20 мономеров. В другом варианте осуществления длина олигонуклеотида составляет 5-11 мономеров. В еще одном варианте осуществления длина олигосахарида составляет 7, 9 или 11 мономеров.
В одном варианте осуществления олигосахарид ацетилирован на 0% или ацетилирован на 100%. В другом варианте осуществления олигосахарид ацетилирован на 0-40%.
В еще одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей конъюгат олигосахарид-носитель, содержащий олигосахарид, конъюгированный с носителем через линкер, который представляет собой:
Формула VIIIa
Формула VIIIb
где линкер является O-связанным с олигосахаридом и N-связанным с носителем.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу синтеза конъюгата олигосахарид-носитель, включающему реакцию олигосахарида, конъюгированного с линкером формулы IXa или IXb:
Формула IXa
Формула IXb,
с носителем, имеющим аминогруппу, модифицированную в результате реакции с соединением формулы:
Формула X
с получением олигосахарида, конъюгированного с соединением-носителем через линкер, имеющий структуру формулы VIIIa или VIIIb.
В одном варианте осуществления носитель является пептидом. В другом варианте осуществления носитель является белком. Примером носителя является столбнячный анатоксин.
В одном варианте осуществления олигосахарид представляет собой β-1-6 связанный глюкозамин.
В одном варианте осуществления композиция имеет соотношение олигосахарида к носителю 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1 или 100:1.
В некоторых вариантах осуществления длина олигосахарида составляет 2-20 мономеров, 5-11 мономеров или 5, 7, 9 или 11 мономеров.
В одном варианте осуществления олигосахарид ацетилирован на 100%. В другом варианте осуществления олигосахарид ацетилирован на 0%. В еще одном варианте осуществления олигосахарид ацетилирован на 0-40%.
В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или антибактериальное средство.
В другом аспекте изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа у субъекта, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, конъюгата олигосахарид-носитель, описанного выше, или конъюгата олигосахарид-носитель, синтезированного способом, описанным выше, в количестве, эффективном для стимуляции иммунного ответа у субъекта.
В одном варианте осуществления субъект является человеком. В другом варианте осуществления субъект не является человеком.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает выделение антител или антителопродуцирующих клеток у субъекта.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту адъюванта. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту антибактериального средства.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики инфекции у субъекта, включающему введение субъекту, имеющему инфекцию или подверженному риску ее развития, эффективного для индукции иммунного ответа количества конъюгата олигосахарид-носитель, описанного выше, или конъюгата олигосахарид-носитель, синтезированного способом, описанным выше, где инфекция вызвана видом бактерии, которая продуцирует или способна продуцировать PNAG.
Staphylococcus
Staphylococcus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus
Staphylococcus
В одном варианте осуществления инфекция является инфекцией. В соответствующем варианте осуществления инфекция является инфекцией. В другом соответствующем варианте осуществления инфекцияявляется инфекцией. В одном варианте осуществления субъект подвергается риску воздействия . В другом варианте осуществления субъект подвергся воздействию .
E.coli
Y.pestis
Y.entercolitica
Y.pseudotuberculosis
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Actinobacillus pleuropneumoniae
Bordetella pertussis
B.parapertussis
B.bronchiseptica
Acinetobacter
Burkholderia
Burkholderia cenocepacia
Stenatrophomonas maltophilia
Shigella
Klebsiella
Klebsiella pneumoniae
В других вариантах осуществления инфекция является инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, например, , инфекцией, инфекцией или инфекцией, такой как .
В некоторых вариантах осуществления конъюгат олигосахарид-носитель вводят с адъювантом и/или антибактериальным средством.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения антител, включающему введение субъекту эффективного для продукции антител, специфичных к нативному PNAG, количества конъюгата олигосахарид-носитель, описанного выше, или конъюгата олигосахарид-носитель, синтезированного способом, описанным выше, и выделение антитела у субъекта.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения моноклональных антител, включающему введение субъекту эффективного для продукции антител, специфичных к нативному PNAG, количества конъюгата олигосахарид-носитель, описанного выше, или конъюгата олигосахарид-носитель, синтезированного способом, описанным выше, сбор антителопродуцирующих клеток у субъекта, слияние антителопродуцирующих клеток, полученных у субъекта, с клетками миеломы и сбор антитела, продуцируемого из слитого субклона.
В одном варианте осуществления антитела являются поликлональными антителами. В одном варианте осуществления субъектом является кролик. В другом варианте осуществления субъектом является человек.
Следует понимать, что все комбинации предыдущих принципов и дополнительных принципов, описываемых более подробно ниже (при условии, что такие понятия не являются взаимно исключающими), рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в настоящей заявке. В частности, все комбинации заявленных объектов, приведенных в конце настоящего описания, рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в настоящей заявке. Необходимо также понимать, что терминология, прямо применяемая в настоящей заявке, которая также может присутствовать в любом описании, включенном путем ссылки, должна соответствовать значению, наиболее соответствующему конкретным принципам, раскрытым в настоящей заявке.
Краткое описание фигур
2
S.aureus
Фиг.1A и B представляют собой графики, на которых показано связывание антисывороток, индуцированных против неацетилированного нонаглюкозамина (9GlcNH), с PNAG (A) или dPNAG (B) из .
S.aureus
Фиг.2A и B представляют собой графики, на которых показано связывание антисывороток, индуцированных против полностью ацетилированного нонаглюкозамина (9GlcNAc), с PNAG или dPNAG из .
2
2
Фиг.3A и B представляют собой графики, на которых показано связывание антисывороток, индуцированных против конъюгированного 9GlcNAc или 9GlcNH, с 11GlcNAc или 11GlcNH.
S.aureus
2
Фиг.4 представляет собой график, на котором показана гибель бактерий  штамма MN8 под действием антисывороток, индуцированных у двух кроликов, один из которых получал конъюгат 9GlcNH-TT, а второй получал конъюгат 9GlcNAc-TT, при этом антисыворотку забирали через 2 недели после последней инъекции вакцины.
S.aureus
2
Фиг.5 представляет собой график, на котором показана гибель бактерий  штамма MN8 под действием антисывороток, индуцированных у двух кроликов, один из которых получал конъюгат 9GlcNH-TT, а второй получал конъюгат 9GlcNAc-TT, при этом антисыворотку забирали через 4 недели после последней инъекции вакцины, а также, для сравнения, показана гибель тех же бактерий под действием антисыворотки, индуцированной к конъюгированной вакцине, состоящей из молекулы dPNAG (примерно 100 кДа), конъюгированной со столбнячным анатоксином (TT) и далее обозначенной (051).
S.aureus
2
2
Фиг.6-8 представляют собой графики, на которых сравнивается гибель штаммов  (фиг.6 и 8, LAC (NT, USA300); фиг.7, SF8300 (NT, USA300)) под действием антисывороток кролика (забор 1) к полностью ацетилированному или неацетилированному 9-меру олигоглюкозамину (9GlcNH), конъюгированному с TT (9GlcNH-TT). Для сравнения показана гибель тех же бактерий под действием антисыворотки, индуцированной к конъюгированной вакцине, состоящей из молекулы dPNAG (примерно 100 кДа), конъюгированной со столбнячным анатоксином (TT) и далее обозначенной (051).
S.aureus
Фиг.9-16 представляют собой графики, на которых сравнивается гибель штаммов  (фиг.9, MN8 (капсулярный полисахарид (CP) 8); фиг.10, LAC (нетипируемый (NT), USA300)); фиг.11, SF8300 (NT, USA300)); фиг.12, Newman (CP5); фиг.13, PS80; фиг.14, Reynolds (CP5); фиг.15, Reynolds (нетипируемый); фиг.16, Reynolds (CP8)) под действием антисыворотки кролика (обозначенной "забор 2") к полностью ацетилированному или неацетилированному 9-меру олигоглюкозамину, конъюгированному с TT. Для сравнения показана гибель тех же бактерий под действием антисыворотки, индуцированной к конъюгированной вакцине, состоящей из молекулы dPNAG (примерно 100 кДа), конъюгированной со столбнячным анатоксином (TT) и далее обозначенной (051).
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
2
Фиг.16A представляет собой график, на котором показана гибель двух PNAG-положительных ( J и  P), но не PNAG-отрицательного ( H), штаммов  под действием антисывороток кролика к 9GlcNH-TT, полученных через 6 недель после последней иммунизации.
in vivo
S.aureus
S.aureus
2
4
5
6
Фиг.17, 18 и 19 представляют собой графики, на которых показаны результаты исследования , которое относится к профилактике кожного абсцесса, вызванного инфекцией , после иммунизации антисывороткой, индуцированной против неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT (9GlcNH-TT, забор 2), и введенной мышам за 24 часа до заражения 2×10 (фиг.18), 2×10 (фиг.19) или 2×10 (фиг.20) КОЕ штамма  LAC.
На фиг.20 показано обобщение результатов, представленных на фиг.17-19.
in vivo
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
ica
S.aureus
ica
6
6
6
6
Фиг.21, 22 и 23 представляют собой графики, на которых показаны результаты исследований, которые относятся к профилактике кожного абсцесса, вызванного инфекцией , после иммунизации антисывороткой, индуцированной против неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина и введенной мышам до заражения 1×10 КОЕ  MN8 (фиг.21), 4×10 КОЕ  Newman (фиг.22) и 4×10 КОЕ  NewmanΔ и 1,5×10 КОЕ  MN8Δ (фиг.23).
Подробное описание изобретения
de novo
Изобретение в целом относится к синтезу и применению олигосахаридного конъюгата. Изобретение относится к способам синтеза и композициям, применяемым в них для получения новых композиций. Указанные способы синтеза облегчают модификацию олигосахарида или полисахарида, которая была бы невозможна при использовании природных полисахаридных антигенов.
in vivo
Изобретение относится, среди прочего, к способам получения олиго-β-(1→6)-D-глюкозаминолигосахаридов или полисахаридов, имеющих определенный порядок мономеров, способам конъюгирования таких олигосахаридов или полисахаридов с линкерами для последующего конъюгирования с соединениями-носителями, способам получения конъюгатов олигосахарид-носитель или конъюгатов полисахарид-носитель, а также композициям указанных различных соединений. Изобретение также относится к различным новым линкерам, которые неожиданно являются более полезными, чем ранее известные линкеры, в указанных способах получения. Полученный в результате конъюгат олигосахарид-носитель является пригодным для стимуляции иммунного ответа  у человека и субъектов, не являющихся человеком, включая получение антител непосредственно к олигосахаридам и к соответствующим природным антигенам PNAG и dPNAG.
S.aureus
S.epidermis
1
Антигены PNAG и dPNAG более подробно описаны в опубликованной заявке PCT WO 2004/043405. В кратком изложении, PNAG относится к поли-N-ацетилглюкозамину, который является поверхностным полисахаридом, продуцируемым различными видами бактерий, включая, но ими не ограничиваясь, стафилококки, такие как  и . PNAG существует в природе как в высоко, так и в недостаточно ацетилированных формах. "Высокоацетилированная" форма PNAG представляет собой PNAG, имеющий более 50% ацетатного замещения. Недостаточно ацетилированные формы PNAG (именуемые в настоящей заявке как dPNAG) могут иметь 0-40% ацетилирования. (См. формулу VII, где R обозначает положение ацетильной группы, если таковая присутствует). Нативный PNAG представляет собой смесь форм PNAG с различными степенями ацетилирования. Нативный PNAG может включать dPNAG в смеси с ацетилированными в более высокой степени формами PNAG. PNAG или dPNAG могут состоять из сотен или тысяч, или большего количества глюкозаминовых звеньев (или мономеров).
in vivo
Олигосахариды по изобретению, как предполагается, имитируют области PNAG или dPNAG. Таким образом, в случае применения , конъюгат олигосахарид-носитель индуцирует иммунные ответы, направленные к областям олигосахарида, которые являются подобными или идентичными PNAG и/или dPNAG, и поэтому такие иммунные ответы эффективны против таких видов бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать PNAG и/или dPNAG.
В некоторых аспектах изобретения олигосахариды состоят только из D-глюкозаминовых или только из N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньев, или из обоих типов указанных мономеров в определенном отношении и порядке. Отношение и порядок служат для имитации, в некоторых вариантах осуществления, отношений и порядков, присутствующих в нативном PNAG. Олигосахариды подвергают манипуляциям согласно изобретению для включения спейсера (или линкера, поскольку данные термины используются в настоящей заявке взаимозаменяемо), содержащего тиольные группы на своем конце (например, на восстанавливающем конце).
Получение олигосахаридов, содержащих аминогруппы, таких как связанные глюкозаминолигосахариды (или олигоглюкозамины, поскольку данные термины используются в настоящей заявке взаимозаменяемо), подходящих для конъюгирования с одним или несколькими носителями, является затруднительным в данной области. Частично это обусловлено тем, что стереоспецифичный синтез связанного глюкозамина требует использования участвующих, но временных, ацильных N-защитных групп (так называемых "участвующих" групп) в гликозильных донорах для образования необходимой β-гликозидной связи между мономерами. N-фталоильная, N-трихлорэтоксикарбонильная и некоторые другие группы подходят в качестве участвующих групп. Некоторые другие участвующие группы, однако менее подходящие, включают N-ацетильные участвующие группы, которые присутствуют в некоторых олигосахаридах, рассматриваемых в рамках изобретения. В качестве примера, N-ацетилированные гликозильные доноры обладают низкой реакционной способностью и дают только скромные выходы продуктов гликозилирования. Кроме того, присутствие N-ацетильных групп в гликозильном доноре усложняет реакцию гликозилирования вследствие образования оксазолина в качестве промежуточного продукта, миграции N-ацетильных групп и других нежелательных химических реакций.
В отношении связанных глюкозаминов, их структура, а более конкретно, количество аминогрупп, которые они содержат, требует введения линкера перед полным освобождением аминогрупп. Удаление вышеуказанной временной N-защитной группы с получением свободного олигосахарида проводят в основных условиях. Наиболее эффективным реагентом для удаления N-фталоильной участвующей группы является гидразингидрат в кипящем этаноле. Указанный реагент также эффективно удаляет O-ацильные защитные группы, включая ацетильные и бензоильные группы, которые могут содержаться в целевом олигосахариде.
Коммерчески доступные линкеры, которые использовали для присоединения аминосодержащих лигандов к белкам, представляли собой пентафторфенил-S-ацетилтиогликолят (химическая структура 8, показанная в примерах) и N-гидроксисукцинимидил-3-ацетилсульфанилпропионат (химическая структура 12, показанная в примерах). Указанные сшивающие реагенты могут быть использованы для введения в олигосахарид тиольной группы; однако, как более подробно описано в примерах, оба реагента нестабильны в условиях удаления фталоильных групп. В примере 5 показано, что линкер на основе тиогликолевой кислоты подвергается окислительной перегруппировке, а в примере 6 показано, что производное 3-меркаптопропионовой кислоты дает сложную смесь побочных продуктов. Оба преобразования приводят к потере необходимой тиольной функциональной группы.
Таким образом, изобретение частично основано на открытии и применении класса линкеров, которые являются эффективными и превосходят ранее известные линкеры при конъюгировании олигосахаридов (включая их аминосодержащие варианты) с носителем, таким как белок. Данный класс линкеров определяется как производные ω-ацетилсульфанилкарбоновой кислоты формулы I (где n>1).
Формула I
Данный класс линкеров обеспечивает эффективное N-ацилирование в процессе присоединения к олигосахариду. Линкером может быть активированный сложный эфир формулы I или его циано, азидо или галогенпроизводное. Линкером может быть другое производное формулы I, если такое производное является активным в качестве ацилирующего агента и, таким образом, подходит для присоединения к олигосахаридам по настоящему изобретению. Y представляет собой временную защитную группу атомов серы, которая известна в данной области и которая включает ацильные и ацетильные группы. Удаление группы Y освобождает SH группу, которая необходима для присоединения олигосахарида к носителю. X представляет собой любую уходящую группу, которая обеспечивает необходимую ацилирующую способность соединению формулы I.
Следует понимать, что любой из классов линкеров, предоставляемых изобретением, может быть использован для конъюгирования олигосахаридов с соединениями-носителями.
В качестве примера, один класс линкеров может включать структуру формулы II (где n>1):
Формула II
В качестве другого примера, другой класс линкеров может включать N-гидроксисукцинимидильные производные. Примером такого линкера, описанного в примерах 1 и 3, является N-гидроксисукцинимидил-4-ацетилсульфанилбутират (соединение 2 на схеме 1, примеры 1 и 3). Данный линкер имеет следующую структуру формулы III:
Формула III
Данный линкер стабилен в условиях полного снятия защитных групп углеводов, таких олигосахариды и полисахариды.
Другим примером активированного сложного эфира является N-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутират (соединение 3, примеры 2 и 3). Данное соединение имеет следующую структуру формулы IV:
Формула IV
(N-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутират).
Изобретение относится к способу синтеза N-гидроксисукцинимидил-4-ацетилсульфанилбутирата (формула III). Указанный способ включает реакцию 4-ацетилсульфанилмасляной кислоты (формула V):
Формула V
3
с N-гидроксисукцинимидилтрифторацетатом (CFCOOSu) с получением N-гидроксисукцинимидил-4-ацетилсульфанилбутирата (формула III).
Изобретение дополнительно относится к способу синтеза N-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутирата (формула IV). Указанный способ включает реакцию 4-ацетилсульфанилмасляной кислоты (формула V):
Формула V
3
с N-нитрофенилтрифторацетатом (CFCOOpNp) с получением N-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутирата (формула IV).
Указанные способы синтеза более подробно описаны в примерах.
Изобретение также относится к композициям, содержащим олигосахарид, включающий линкер, конъюгированный с О1-атомом глюкозаминового звена на "восстанавливающем конце" олигосахарида. Указанный О1-конъюгированный линкер используется для присоединения SH-содержащего линкера посредством реакции с соединением формулы I. О1-конъюгированный линкер имеет структуру формулы Va (ниже), содержащую аминоалкильные группы и где m может изменяться от 1 до 10, а R может представлять собой H или простую алкильную группу (например, метильную или этильную группу). Альтернативно, О1-конъюгированный линкер может иметь структуру формулы Vb (ниже), где p может изменяться от 1 до 20, а R является таким же, как в формуле Va.
Конъюгаты олигосахаридов по настоящему изобретению, таким образом, могут быть синтезированы путем сочетания соединений формулы Va или Vb с соединением формулы I. Преобразование и последующее удаление временной S-защитной группы (пример 8) или восстановление соответствующего промежуточного дисульфида (пример 7) приводят к получению конечной связывающей группы, используемой при конъюгировании олигосахаридов с соединением-носителем. Такие конечные связывающие группы описаны в примерах 7 и 8 и имеют структуру формулы VI:
Формула VI.
Олигосахарид может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 моносахаридных мономеров. В некоторых важных вариантах осуществления олигосахарид содержит 5 или более мономеров, включая 5, 7, 9 или 11 мономеров. В некоторых вариантах осуществления олигосахарид содержит 2-20 мономеров или 3-20 мономеров, или 4-20 мономеров, или 5-20 мономеров.
В некоторых важных вариантах осуществления мономером является глюкозамин, а олигосахаридом является связанный глюкозамин. Структура глюкозаминового мономера (присутствующего в связанном глюкозамине) является следующей:
Формула VII
1
1
3
где R представляет собой H в случае глюкозаминовых звеньев со "свободной" аминогруппой или R представляет собой ацетильную группу (COCH) в случае N-ацетилированных глюкозаминовых звеньев. Указанные звенья связаны через β-(1→6)-связи. Может быть связано любое число глюкозаминовых звеньев, включая 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50 или более звеньев, вплоть до 100 звеньев (замещенных ацетильными группами или незамещенных).
1
Степень N-ацетилирования в соединениях формулы VII может изменяться. Она может варьировать от 0-50% N-ацетилирования (т.е. 0-50% R являются ацетильными группами), включая 0-40% N-ацетилирование. В некоторых вариантах осуществления β-(1→6) связанный глюкозамин является N-ацетилированным менее чем на 50%, менее чем на 40%, менее чем на 30%, менее чем на 20%, менее чем на 10% или менее чем на 5%. В некоторых важных вариантах осуществления уровень N-ацетилирования и положение ацетильных групп в олигосахариде известны исходя из способа синтеза. Таким образом, олигосахарид может быть синтезирован с упорядоченным расположением глюкозаминовых звеньев, содержащих или не содержащих N-ацетильные группы. В примерах предложены способы получения олигосахаридов, имеющих определенные и упорядоченные ацетильные замещения. Кроме того, может быть приведена ссылка на Gening et al. Carbohydrate Research 2007 342:567-575, Gening et al. Russian J Bioorganic Chem 2006 32(4):389-399, Yang and Du Carbohydrate Research 2003 338:495-502, Yang et al. Carbohydrate Research 2003 338:1313-1318, and Fridman et al. Organic Letters 2002 4(2):281-283.
Изобретение также относится к композиции, содержащей конъюгат олигосахарид-носитель, включающий олигосахарид, конъюгированный с соединением-носителем через линкер формулы VIIIa или VIIIb.
Формула VIIIa
Формула VIIIb
где линкер является O-связанным с олигосахаридом и N-связанным с соединением-носителем.
Изобретение дополнительно относится к способу синтеза конъюгата олигосахарид-носитель путем реакции конъюгатов олигосахарида, содержащих линкеры с концевыми SH-группами, такие как линкеры, которые имеют структуры формулы IXa или IXb:
Формула IXa
Формула IXb
(в случае соединений из примеров 7 и 8)
с соединением-носителем, в котором концевые аминогруппы модифицированы путем присоединения соединения формулы X:
Формула X
с получением олигосахарида, конъюгированного с соединением-носителем через линкер, имеющий структуру формулы VIIIa или VIIIb.
2
В некоторых вариантах осуществления линкер формулы VIIIa или VIIIb связан через свою концевую CH-группу с О1-атомом глюкозаминового звена на "восстанавливающем конце" олигосахарида. Такую связь называют O-связью, а олигосахарид именуют как O-связанный с линкером.
В некоторых вариантах осуществления линкер формулы VIIIa или VIIIb связан через концевую группу CO с аминогруппой в соединении-носителе амидной связью. Такую связь называют N-связью, а носитель именуют как N-связанный с линкером.
nd
При получении конъюгатов носителя, содержащего аминогруппу, и олигоглюкозаминов, имеющих линкер с концевой SH-группой, как описано выше и в примерах 8 и 9, можно использовать реагент SBAP. Однако в изобретении рассматривают использование других реагентов, подходящих для связывания носителя, содержащего аминогруппу, и олигосахаридов с концевой SH-группой (в частности, как описано G. Hermanson "Bioconjugate Techniques", 2 Edition, Academic Press, 2008).
Соединение-носитель
"Соединение-носитель" (или носитель, поскольку данные термины используются в настоящей заявке взаимозаменяемо), используемое в настоящей заявке, представляет собой соединение, которое конъюгировано с олигосахаридом при помощи линкера по изобретению. Как правило, соединением-носителем является такое соединение, которое усиливает иммунный ответ против олигосахаридного лиганда.
salmonella
hemophilus
hemophilus
Escherichia coli
Соединения-носители включают, но не ограничиваются ими, белки, пептиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты или другие полимеры, липиды и малые олигомерные молекулы, особенно дендримеры. В некоторых вариантах осуществления соединение-носитель может быть природным или может быть получено из природного вещества. Белки включают, например, белки плазмы крови, такие как сывороточный альбумин, иммуноглобулины, аполипопротеины и трансферрин; бактериальные полипептиды, такие как столбнячный анатоксин (TT), TRPLE, β-галактозидазу, полипептиды, такие как белок gD герпеса, аллергены, токсоид дифтерии, флагеллин , пилин , мембранные белки15 кДа, 28-30 кДа и 40 кДа , термолабильный энтеротоксин ltb , токсин холеры, а также вирусные белки, включая VP ротавируса и белки f и g респираторно-синцитиального вируса. Носители, применимые в изобретении, включают любой белок, который безопасен для введения млекопитающим и который необязательно является иммунологически эффективным белком-носителем. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления соединение-носитель может само по себе быть иммуногенным. Примеры включают соединения, которые были использованы в вакцинах или в качестве вакцин против видов бактерий, таких как, но ими не ограничиваясь, виды, перечисленные в настоящей заявке.
Соединения-носители, которые особенно пригодны для иммунизации, включают белки, такие как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор трипсина соевых бобов. Аналогичным образом может быть использовано любое другое соединение, которое является иммуногенным в видах иммунизируемого животного.
Как показано в примерах, соотношение олигосахарида к носителю в конъюгате олигосахарид-носитель по изобретению может изменяться. Например, конъюгат олигосахарид-носитель может иметь соотношение олигосахарида к носителю 1:1, по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 3:1, по меньшей мере 4:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 6:1, по меньшей мере 7:1, по меньшей мере 8:1, по меньшей мере 9:1 или по меньшей мере 10:1. В других вариантах осуществления соотношение может составлять по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 30:1, по меньшей мере 40:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 60:1, по меньшей мере 70:1, по меньшей мере 80:1, по меньшей мере 90:1 или более, например, вплоть до 100:1 или 700:1, в зависимости от способности соединения-носителя к присоединению олигосахаридных лигандов. В качестве примера, конъюгат, который имеет соотношение олигосахарида к носителю по меньшей мере 3:1, является конъюгатом, в котором по меньшей мере три олигосахаридные молекулы присоединены к одному соединению-носителю.
Применимость
in vitro
in vivo
Staphylococcus
Staphylococcus
Staphylococcus
Staphylococcus
Staphylococcus
Композиции по изобретению имеют ряд  и  применений. Например, композиции по изобретению пригодны для продуцирования гуморального иммунного ответа, например, в качестве вакцины для активной иммунизации людей и животных, с целью профилактики инфекции, вызываемой видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, ; в качестве вакцины для иммунизации людей или животных с целью получения антител против dPNAG, которые можно вводить другим людям или животным для профилактики или лечения инфекций, вызванных видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, ; в качестве антигена для скрининга биологических агентов, таких как моноклональные антитела, способные предотвращать инфекцию, вызываемую видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, , библиотеки генов, вовлеченных в продукцию антител, или пептиды-миметики; в качестве диагностического реагента для диагностики инфекций, вызываемых видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, ; и в качестве диагностического реагента для определения иммунологического статуса людей или животных в отношении их восприимчивости к инфекциям, вызываемым видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, .
Лечение и профилактика инфекций
Staphylococcus
Изобретение относится к способу лечения или профилактики инфекции, вызываемой видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, , у субъекта, включающему введение субъекту, имеющему или подверженному риску развития такой инфекции, эффективного для индукции иммунного ответа количества конъюгата олигосахарид-носитель согласно изобретению.
Staphylococcus
Другой аспект изобретения относится к способу оценки способности конъюгата по изобретению защищать от инфекции, вызываемой видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, , у субъекта. Способ включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, где конъюгат индуцирует активный иммунитет, контакт субъекта с видами бактерий, которые продуцируют или способны продуцировать нативный PNAG, и тестирование на присутствие указанных видов бактерий у субъекта.
Субъектом может быть субъект, который подвергается риску контакта с видами бактерий, или субъект, который подвергался контакту с видами бактерий. Конъюгат может быть введен в композиции вместе с другими агентами, такими как, но ими не ограничиваясь, один или несколько адъювантов, и/или с одним или несколькими антибактериальными средствами и т.д.
Staphylococcus
Staphylococcus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
E.coli
Y.pestis
Y.entercolitica
Y.pseudotuberculosis
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Actinobacillus pleuropneumoniae
Bordetella pertussis
B.parapertussis
B.bronchiseptica
Acinetobacter
Acinetibacter
Burkholderia
Burkholderia
Stenatrophomonas maltophilia
Shigella
Klebsiella
Инфекция может быть инфекцией . Инфекция может быть инфекцией, инфекцией , но это не столь ограничено. Инфекция может быть инфекцией, инфекцией , инфекцией, инфекцией, инфекцией , инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, инфекцией, включая инфекцию, вызванную комплексом организмов , инфекцией , включая инфекцию, вызванную комплексом организмов , инфекцией , инфекцией (различные виды) и инфекцией (различные виды).
Антитела, полученные согласно изобретению, также могут быть использованы для профилактики или лечения инфекции, вызываемой любым инфекционным или патогенным микроорганизмом, который продуцирует молекулу, которая реагирует с антителами, индуцированными при иммунном ответе против конъюгата олигосахарид-носитель.
Staphylococcus
"Эффективное для индукции иммунного ответа (например, антител) количество", используемое в настоящей заявке, представляет собой количество, которое является достаточным, чтобы (i) содействовать субъекту в выработке его собственной иммунной защиты, например, путем индукции выработки антител у субъекта, индукции выработки клеток памяти и, возможно, реакции цитотоксических лимфоцитов и т.д., и/или (ii) препятствовать развитию инфекции у субъекта, который подвергается контакту с инфекционным или патогенным микроорганизмом, который продуцирует или способен продуцировать PNAG, включая, но этим не ограничиваясь, .
Staphylococcus
S.aureus
S.epidermidis
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эффективным для стимуляции иммунного ответа количеством вакцины является такое количество вакцины, которое обеспечивает индукцию выработки антител, которые являются перекрестно-реактивными в отношении по меньшей мере двух видов , например,  и .
Средний специалист в данной области техники может оценить, является ли количество достаточным, чтобы индуцировать активный иммунитет стандартными методами, известными из уровня техники. Например, способность специфического конъюгата вызывать продукцию антитела у млекопитающего может быть оценена путем скрининга антител у мыши или другого субъекта с использованием конъюгатов или их соответствующих олигосахаридов.
Субъекты, используемые в настоящей заявке, включают человека и не относящихся к человеку субъектов. Не относящиеся к человеку субъекты включают, но не ограничиваются ими, домашних животных, таких как собаки, кошки, хорьки, птицы и т.п., сельскохозяйственных животных, таких как коровы, свиньи, козы, овцы, лошади, куры и т.п., животных, содержащихся в зоопарках, таких как жирафы, львы, тигры, слоны, медведи и т.п., лабораторных животных, таких как мыши, крысы, кролики и т.п. Субъект может быть человеком в возрасте более 60 лет. Субъект может быть здоровым субъектом.
S.aureus
S.epidermidis
S.epidermidis
Субъекты, подвергаемые лечению согласно изобретению, включают госпитализированных пациентов с повышенным риском развития стафилококковой инфекции в результате контакта с бактериями в больничной среде. Группы особенно высокого риска развития инфекции, вызванной , включают, например, пациентов с заболеваниями почек при диализе, а также лиц, подвергающихся хирургической операции высокого риска. Группы высокого риска развития инфекции, вызванной , также включают, например, пациентов с имплантированными медицинскими устройствами, такими как внутривенные катетеры (например, центральные катетеры) или протезы (например, протезы бедра или колена), поскольку клинические изоляты часто характеризуются высокой адгезией к пластмассовым поверхностям. В некоторых вариантах осуществления субъектом является субъект, получивший медицинское имплантированное устройство, а в других вариантах осуществления субъектом является субъект, который не получал медицинское имплантированное устройство, но планирует получить его в перспективе. Субъекты с высоким риском развития инфекции  также включают, например, недоношенных новорожденных и пациентов, подвергающихся химиотерапии. Дополнительно субъекты, подвергаемые лечению согласно изобретению, включают госпитализированных пациентов или лиц в привычной социальной среде, заболевших и подверженных риску развития инфекций, вызываемых микроорганизмами, которые продуцируют или способны продуцировать PNAG, в результате контакта с бактериями в больничной среде или в привычной социальной среде.
Индукция иммунного ответа и выработка антител
Изобретение дополнительно относится к способам стимуляции иммунного ответа у субъекта, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, конъюгата олигосахарид-носитель согласно изобретению в количестве, эффективном для стимуляции иммунного ответа у субъекта. Иммунный ответ может быть антигенспецифичным иммунным ответом. Он может быть клеточным и/или гуморальным иммунным ответом. Например, иммунный ответ может приводить к продукции антител и/или антителопродуцирующих клеток.
"Пассивный иммунитет", используемый в настоящей заявке, включает введение субъекту антител, полученных у другого субъекта (включая субъектов одного и различных видов), при этом антитела прикрепляются к поверхности бактерий и вызывают фагоцитоз бактерий.
Staphylococcus aureus
Антитела, полученные с использованием конъюгатов по изобретению, могут быть введены любому субъекту с риском развития инфекции, вызванной видом, который продуцирует PNAG, или видом, который продуцирует другую молекулу, которая реагирует с антителами, вызывая пассивный иммунитет, и, в некоторых вариантах осуществления, могут особенно подходить для субъектов, неспособных к индукции активного иммунитета. Поскольку вакцинация антигеном может не быть полностью эффективна у субъектов высокого риска с иммунной недостаточностью, указанным субъектам может подойти терапия препаратами антител, индуцированных против конъюгата олигосахарид-носитель согласно изобретению, в целях профилактики или лечения инфекции, такой как инфекции, вызванные . Субъект, неспособный к индукции иммунного ответа, является субъектом с иммунной недостаточностью (например, пациентом, проходящим курс химиотерапии, пациентом со СПИДом и т.д.) или субъектом, у которого еще не развилась иммунная система (например, недоношенным новорожденным).
Staphylococcus
Таким образом, изобретение относится к способу получения антител, включающему введение субъекту эффективного количества для выработки антител, специфичных к молекуле PNAG, экспрессируемой организмом, таким как , с использованием конъюгата олигосахарид-носитель согласно изобретению, и выделение антител у субъекта. Антитела могут быть поликлональными антителами. Антитела могут быть дополнительно модифицированы.
Изобретение дополнительно относится к способу получения моноклональных антител, включающему введение субъекту эффективного количества для выработки антител, специфичных к молекуле PNAG, с использованием конъюгата олигосахарид-носитель согласно изобретению, сбор антителопродуцирующих клеток из любой ткани, содержащей такие клетки, такой как селезенка или кровь, у субъекта, слияние антителопродуцирующих клеток, полученных у субъекта, с клетками миеломы и выделение антитела, продуцируемого слитым субклоном.
2
Изобретение рассматривает получение различных антител, специфичных к олиго-β-(1→6)-D-глюкозаминам по настоящему изобретению. Они включают химерные антитела, такие как гуманизированные антитела и фрагменты антител, а также интактные моноклональные и поликлональные антитела. "Гуманизированное моноклональное антитело", используемое в настоящей заявке, является моноклональным антителом человека или его функционально активным фрагментом, содержащим по меньшей мере человеческие константные области и антигенсвязывающую область (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, или 1 или 2 вариабельные области, или фрагменты Fab, или F(ab)) от видов, не относящихся к человеку. Гуманизированные моноклональные антитела, например, могут быть сконструированы путем замены не-CDR участка антитела млекопитающего, не являющегося человеком, подобными областями человеческих антител с сохранением эпитопной специфичности исходного антитела. Например, не относящиеся к человеку CDR и, необязательно, некоторые каркасные области могут быть ковалентно присоединены к областям FR и/или Fc/pFc' человека для получения функционального антитела. В заявке на европейский патент 0239400, полное содержание которой настоящим включено путем ссылки, приведено примерное описание получения и применения гуманизированных моноклональных антител, в которых по меньшей мере CDR-часть антитела мыши (или другого млекопитающего, не являющегося человеком) включена в гуманизированное антитело. В США существуют предприятия, коммерчески синтезирующие гуманизированные антитела из определенных областей мышиных антител, такие как Protein Design Labs (Mountain View California), Abgenix и Medarex.
Интактное гуманизированное моноклональное антитело в выделенной форме или в фармацевтическом препарате особенно подходит для некоторых аспектов изобретения. Гуманизированные антитела обладают особой клинической ценностью, поскольку они не вызывают у человека иммунный ответ против самого антитела. В одном предпочтительном варианте осуществления CDR мыши трансплантируют в каркасную область антитела человека с получением "гуманизированного антитела". См., например, L. Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988); M. S. Neuberger et al., Nature 314, 268 (1985) и EPA 0239400 (опубликована 30 сентября 1987 года).
J.Immunol.
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications
J.
Immunol.,
Моноклональные антитела человека могут быть получены любым из способов, известных в данной области, таких как раскрытые в патенте США № 5567610, выданном Borrebaeck et al., патенте США № 565354, выданном Ostberg, патенте США № 5571893, выданном Baker et al, Kozber,  133: 3001 (1984), Brodeur, et al., , p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, New York, 1987) и Boerner et al.,  147: 86-95 (1991).
PNAS USA
Nature
Year in Immunol.,
В дополнение к стандартным способам получения моноклональных антител человека, такие антитела могут быть также получены путем иммунизации трансгенных животных, способных продуцировать антитела человека (например, Jakobovits et al., , 90: 2551 (1993), Jakobovits et al, , 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al.,  7:33 (1993) и патент США № 5569825, выданный Lonberg).
Антитела человека могут быть также получены путем выделения антителопродуцирующих лимфоцитов из крови или других тканей людей. Указанные лимфоциты могут быть обработаны с получением клеток, которые растут сами по себе в лаборатории при соответствующих условиях культивирования. Клеточные культуры могут быть подвергнуты скринингу на предмет продуцирования антитела против конъюгата по изобретению, а затем клонированы. Клональные культуры могут быть использованы для получения моноклональных антител человека, или генетические элементы, кодирующие вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепи антитела, могут быть клонированы и встроены в нуклеиновокислотные векторы с целью продукции антитела различных типов.
2
H
J. Nucl. Med
Фрагменты антител также включены в объем изобретения. Известные функционально активные фрагменты антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты антител F(ab'), Fab, Fv и Fd. Указанные фрагменты, которые не содержат Fc-фрагмент интактного антитела, быстрее выводятся из кровотока и могут иметь менее неспецифичное тканевое связывание, чем интактное антитело (Wahl et al, . 24:316-325 (1983)). Например, одноцепочечные антитела могут быть сконструированы в соответствии со способами, описанными в патенте США № 4946778 (Ladner et al.). Такие одноцепочечные антитела включают вариабельные области легкой и тяжелой цепей, соединенные гибким линкером. Способы получения однодоменного антитела ("Fd"), которое содержит один выделенный домен вариабельной области тяжелой цепи, также были описаны (см., например, публикацию Ward et al., Nature 341:644-646 (1989), в которой описан способ скрининга, позволяющий идентифицировать вариабельную область тяжелой цепи антитела (V однодоменное антитело), обладающую достаточной аффинностью к своему эпитопу-мишени, с которым она связывается в выделенной форме). Способы создания рекомбинантных Fv-фрагментов на основе известных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела известны в данной области и были описаны, например, в патенте США № 4462334 (Moore et al.). Другие ссылки, описывающие применение и получение фрагментов антител, включают, например, Fab-фрагменты (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)), Fv-фрагменты (Hochman et al, Biochemistry 12: 1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15: 1591 (1976); патент США № 4355023 (Ehrilch et al.)) и части молекул антител (патент США № 4470925 (Audilore-Hargreaves)). Таким образом, специалисты, квалифицированные в данной области, могут сконструировать фрагменты антител из различных частей интактных антител без нарушения специфичности антител.
Композиции и фармацевтические препараты
Композиции по изобретению, включающие, например, конъюгат олигосахарид-носитель по изобретению, могут быть составлены вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в настоящей заявке, означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые являются подходящими для введения человеку или другому животному. В настоящем изобретении термин "носитель" означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный компонент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также могут быть смешаны с конъюгатами, а также друг с другом таким способом, чтобы отсутствовало какое-либо взаимодействие, которое могло бы существенно снизить необходимую фармацевтическую эффективность.
in vivo
in vivo
Таким образом, композиция по настоящему изобретению может рассматриваться как фармацевтический препарат. Она может быть использована , но ее использование не ограничивается этим. В случае использования , ее можно использовать у человека или не являющихся человеком субъектов в терапевтических, профилактических или исследовательских целях. В качестве примера, композиции можно использовать для получения антител и/или антителопродуцирующих клеток у не являющихся человеком субъектов, таких как мыши, кролики и другие подходящие животные-хозяева.
Таким образом, изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим любой из вышеописанных конъюгатов олигосахарид-носитель, который может быть использован в качестве вакцины. Указанные препараты могут содержать конъюгаты в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа, такого как антигенспецифичный иммунный ответ. Указанные препараты могут содержать другие составляющие или компоненты, такие как, но ими не ограничиваясь, адъюванты и антибактериальные средства. Такие препараты обычно могут содержать фармацевтически приемлемые концентрации соли, буферных агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и, необязательно, другие терапевтические компоненты.
Подходящие среды-носители для приготовления вакцины включают забуференный фосфатом натрия солевой раствор (pH 7,4) или 0,125М гель фосфата алюминия, суспендированный в забуференном фосфатом натрия солевом растворе при pH 6, а также другие стандартные среды. Как правило, вакцины содержат от приблизительно 5 до приблизительно 100 мкг, а предпочтительно приблизительно 10-50 мкг антигена, индуцирующего эффективные уровни антитела у теплокровных млекопитающих.
Mycobacterium tuberculosis
Адъювант представляет собой любое вещество, которое включают в композицию или вводят (одновременно или иначе) вместе с антигеном, который потенцирует иммунный ответ против антигена у субъекта. Адъюванты включают, но не ограничиваются ими, соединения алюминия, например, гели, гидроксид алюминия и фосфат алюминия, а также полный или неполный адъювант Фрейнда (например, в котором антиген включен в водную фазу стабилизированной эмульсии вода в парафиновом масле). Парафиновое масло может быть заменено различными типами масел, например, скваленом или арахисовым маслом. Другие материалы с адъювантными свойствами включают БЦЖ (аттенуированную ), фосфат кальция, левамизол, изопринозин, полианионы (например, поли A:U), лентинан, токсин коклюша, липид A, сапонины, QS-21 и пептиды, например, мурамил-дипептид, а также иммуностимулирующие олигонуклеотиды, такие как CpG-олигонуклеотиды. Соли редкоземельных металлов, например, лантана и церия, также могут быть использованы в качестве адъювантов. Количество адъювантов зависит от субъекта и конкретного используемого антигена и может быть легко определено специалистом, квалифицированным в данной области, без проведения излишних экспериментов.
Антибактериальное средство является средством, которое убивает бактерии (например, путем лизиса) или предотвращает их деление. Применение антибиотиков при лечении бактериальной инфекции является стандартным. Антибактериальные средства включают пенициллин G, пенициллин V, ампициллин, амоксициллин, бакампициллин, циклациллин, эпициллин, гетациллин, пивампициллин, метициллин, нафциллин, оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксациллин, карбенициллин, тикарциллин, азлоциллин, мезлоциллин, пиперациллин, амдиноциллин, цефалексин, цефрадин, цефадоксил, цефаклор, цефазолин, цефуроксима аксетил, цефамандол, цефоницид, цефокситин, цефотаксим, цефтизоксим, цефменоксин, цефтриаксон, моксалактам, цефотетан, цефоперазон, цефтазидим, имипенем, клавуланат, тиментин, сульбактам, неомицин, эритромицин, метронидазол, хлорамфеникол, клиндамицин, линкомицин, ванкомицин, триметоприм-сульфаметоксазол, аминогликозиды, хинолоны, тетрациклины и рифампин. (См. Goodman and Gilman's, Pharmacological Basics of Therapeutics, 8th Ed., 1993, McGraw Hill Inc.).
Конъюгаты могут быть ковалентно или нековалентно связаны с другими молекулами, включая, но ими не ограничиваясь, детектируемые метки, такие как радиоактивные метки, флуорофоры, ферменты и т.п.
Композиции, подходящие для парентерального введения, обычно включают стерильный водный препарат, который может быть изотоническим по отношению к крови реципиента. Приемлемые носители и растворители, которые могут быть использованы, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные, жидкие масла обычно используются в качестве растворителя или суспензионной среды. С этой целью можно использовать любое смешанное жидкое масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, находят применение для приготовления растворов для инъекций. Композиции-носители, подходящие для подкожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного и т.д. введения могут быть найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Препараты по изобретению вводят в эффективных количествах. Эффективное количество, как описано выше, в некоторых случаях является таким количеством, которое само по себе или вместе с последующими дозами индуцирует активный или пассивный иммунитет в зависимости от субъекта. Считается, что эффективными будут дозы в пределах от 1 нанограмма/килограмм до 100 миллиграммов/килограмм, в зависимости от способа введения. Предпочтительным диапазоном, как предполагают, является диапазон от 500 нанограммов до 500 микрограммов/килограмм и наиболее предпочтительно от 1 микрограмма до 100 микрограммов/килограмм. Абсолютное количество обычно зависит от различных факторов, включая, выполняется ли введение субъекту с высоким риском, пока не инфицированному бактериями, или субъекту, уже имеющему инфекцию, сопутствующую терапию, количество доз и параметры отдельного пациента, включая возраст, физическое состояние, рост и вес. Указанные факторы известны специалистам в данной области и могут быть учтены с помощью не более чем стандартных экспериментов. Как правило, предпочтительно, чтобы использовалась максимальная доза, то есть наиболее высокая безопасная доза согласно тщательному медицинскому обследованию.
Предполагаются многократные дозы композиций по изобретению. Обычно схемы иммунизации включают введение высокой дозы антигена, с последующим введением более низких доз антигена по истечении периода ожидания продолжительностью несколько недель. Последующие дозы можно вводить так же. Схема дозирования при пассивной иммунизации может сильно отличаться, включая более частое введение при необходимости. Можно использовать любой режим, который приводит к усиленному иммунному ответу против бактериальной инфекции и/или последующей защите от инфекции. Требуемые временные интервалы для доставки многократных доз конкретного конъюгата могут быть определены специалистом в данной области с использованием не более чем стандартного эксперимента.
Доступны различные пути введения. Конкретный выбранный способ зависит, конечно, от конкретного выбираемого конъюгата, конкретного подвергаемого лечению состояния, а также от дозировки, требуемой для терапевтической эффективности. Способы по настоящему изобретению, как правило, могут быть осуществлены с использованием любого способа введения, который является приемлемым с медицинской точки зрения, что означает любой способ, который обеспечивает эффективные уровни иммунного ответа, не вызывая клинически неприемлемых, неблагоприятных эффектов. Предпочтительными способами введения являются парентеральные пути. Термин "парентеральный" включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную и внутригрудинную инъекцию или инфузию. Другие пути включают, но не ограничиваются ими, пероральный, назальный, кожный, подъязычный и местный.
Следующие примеры включены в целях пояснения и не должны ограничивать объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Аспекты изобретения далее иллюстрируются следующими неограничивающими примерами. Данные примеры иллюстрируют, среди прочего, как получить олиго-β-(1→6)-D-глюкозаминолигосахариды и как конъюгировать такие олигосахариды с носителями, такими как белки-носители. Подобные конъюгаты могут быть использованы, среди прочего, в качестве вакцин.
Пример 1. Синтез N-гидроксисукцинимидил-4-ацетилсульфанилбутирата 2
Схема 1
3
. Синтез сшивающего реагента 2. a: CFCOOSu, пиридин.
1
2
Chem. Europ. J
1
13
3
2
3
2
2
2
3
2
2
2
2
3
3
К раствору кислоты  (Hogg, J. Heather; Ollmann, Ian R.; Wetterholm, Anders; Andberg, Martina Blomster; Haeggstroem, Jesper; et al.; .; EN; 4; 9; 1998; 1698-1713) (237 мг, 1,46 ммоль) и N-гидроксисукцинимидилтрифторацетата (431 мг, 2,02 ммоль) в дихлорметане (4 мл) добавляли пиридин (355 мкл, 4,4 ммоль) и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь разбавляли дихлорметаном (50 мл) и промывали ледяной 1М HCl и водой, а затем концентрировали. После очистки остатка методом колоночной хроматографии на силикагеле (толуол-этилацетат 9:1) получали активный сложный эфир  (359 мг, 95%) в виде бесцветного сиропа. Данные H ЯМР (300 МГц, CDCl), δ 2,00 (м, 2H, β-CH), 2,33 (с, 3H, CHCOS), 2,68 (т, 2H, J 7,4 Гц, γ-CH), 2,81 (с, 4H, 2 CH сукцинимида), 2,96 (т, 2H, J 7,1 Гц, α-CH). Данные C ЯМР (62,9 МГц, CDCl): δ 24,7 (β-CH), 25,6 (CH сукцинимида), 27,9 (γ-CH), 29,7 (α-CH), 30,7 (CHCOS), 168,0 (CO-ON), 169,2 (CO сукцинимида), 195,4 (CHCOS).
Пример 2. Синтез 4-нитрофенил-4-ацетилсульфанилбутирата 3
Схема 2
3
3
. Синтез сшивающего реагента 3. a: CFCOOpNp, EtN.
1
2
3
Chem. Europ. J
1
13
3
2
3
2
2
3
2
2
3
2
3
К раствору кислоты  (233 мг, 1,44 ммоль) (Hogg, J. Heather; Ollmann, Ian R.; Wetterholm, Anders; Andberg, Martina Blomster; Haeggstroem, Jesper; et al.; .; EN; 4; 9; 1998; 1698-1713) и 4-нитрофенилтрифторацетата (470 мг, 2 ммоль) в дихлорметане добавляли триэтиламин (400 мкл, 2,88 ммоль) и перемешивали раствор в течение 2 ч при комнатной температуре. Смесь обрабатывали, как описано для , и активный сложный эфир  (385 мг, 94%) выделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (толуол-этилацетат 92:8). Данные H ЯМР (300 МГц, CDCl), δ 2,03 (м, 2H, β-CH), 2,36 (с, 3H, CHCOS), 2,68 (т, 2H, J 7,2 Гц, γ-CH), 3,01 (т, 2H, J 7,1 Гц, α-CH), 7,28, 8,26 (2 д, 4H, ароматические). Данные C ЯМР (62,9 МГц, CDCl): δ 24,7 (β-CH), 28,0 (γ-CH), 30,7 (CHCOS), 32,7 (α-CH), 122,5, 125,2, 145,3, 155,3 (ароматический C), 170,4 (COO), 195,5 (CHCOS).
Пример 3. Синтез лигандов 6 и 7 с использованием сшивающего реагента 2 или 3
Схема 3
2
2
3
2
2
2
4
2
3
2
2
·
. Синтез лигандов. a: 1) H, Pd(OH)/C, MeOH/ТГФ 2) 2 или 3, EtN, CHCl; b: NHHO, EtOH, Δ; c: DTT, NaHCO, AcO, MeOH/HO.
4
2
5
Staphylococcus aureus
Carbohydr
Res
2
2
2
2
2
3
2
3
2
2
3
2
3
2
2
3
2
1
13
Нонасахарид  (M.L. Gening, Y.E. Tsvetkov, G.B. Pier, N.E. Nifantiev, «Synthesis of oligo-β(1→6)-glucosamines corresponding to the fragments of the surface polysaccharide of » . . 342 (2007), 567-575) (110 мг, 0,023 ммоль) растворяли в смеси MeOH (3 мл), ТГФ (6 мл) и 1M HCl (0,2 мл) и добавляли Pd(OH)/C (110 мг). Полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 1 ч. Катализатор отфильтровывали и выпаривали растворители. Остаток растворяли в смеси CHCl (2 мл) и ДМФА (1 мл), а затем добавляли линкерный реагент  (12 мг, 0,046 ммоль, раствор в 1 мл CHCl) и EtN (100 мкл). Через 30 минут смесь разбавляли толуолом, концентрировали и подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (толуол/MeCO, 4:1), получая соединение  (98 мг, 98%) в виде бесцветной пены. Введение линкера подтверждали по присутствию его характеристических сигналов в спектрах ЯМР защищенного углеводного лиганда. Данные H ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 1,88 (м, 2H, β-CH), 2,21 (т, 2H, J 7,2 Гц, γ-CH), 2,31 (с, 3H, CHCOS), 2,88 (т, 2H, J 7,1 Гц, α-CH). Данные C ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 25,7 (β-CH), 28,5 (α-CH), 30,6 (CHCOS), 35,1 (γ-CH).
5
·
6
2
4
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
61
114
10
38
13
1
13
3+
3+
Смесь защищенного нонасахарида  (95 мг, 0,02 ммоль), EtOH (5 мл) и NHHO (0,5 мл) перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 1 ч, а затем концентрировали и подвергали гель-проникающей хроматографии (TSK гель Toyopearl HW 40S, 2,5×40 см) в водной 0,1М AcOH с получением нонасахарида  (28 мг, 86%). Непосредственно после гель-хроматографии может быть получено SH-производное, которое детектировали с помощью масс-спектрометрии, однако после хранения в растворе оно преобразуется в соответствующий дисульфид, как было подтверждено экспериментом C ЯМР. Данные H ЯМР (500 МГц, DO): δ 1,95 (м, 2H, β-CH), 2,32 (т, 2H, J 7,2 Гц, γ-CHSH), 2,71 (т, 2H, J 7,1 Гц, α-CH). Данные C ЯМР (125 МГц, DO): δ 29,7 (β-CH), 35,8 (γ-CHSH), 38,5 (α-CH), 42,1 (γ-CHSS). Масс-спектры: вычислено для CHNOS 543,234 [M+3H], экспериментально 543,243 [M+3H].
6
7
3
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
81
134
10
48
1
13
2+
2+
C
Нонасахарид  (15 мг) растворяли в смеси вода/MeOH (2 мл, 1:1 об./об.) и добавляли дитиотреитол (15 мг) и NaHCO (20 мг). Полученную смесь перемешивали в течение 5 минут, а затем добавляли уксусный ангидрид (100 мкл) и продолжали перемешивание в течение 30 минут перед выпариванием растворителей. Продукт очищали методом гель-проникающей хроматографии (TSK гель Toyopearl HW 40S, 2,5×40 см) в водной 0,1М AcOH, получая ацетилированный продукт  (15 мг, 95%). Данные Η ЯМР (500 МГц, DO): δ 1,75 (м, 2H, β-CH), 2,11 (т, 2H, J 7,2 Гц, γ-CH), 2,43 (с, 3H, CHCOS), 2,75 (т, 2H, J 7,2 Гц, α-CH). Данные C ЯМР (125 МГц, DO): δ 25,7 (β-CH), 28,5 (α-CH), 30,6 (HCOS), 35,1 (γ-CH). Масс-спектры: вычислено для CHNOS 1024,418 [M+2H], экспериментально 1024,427 [M+2H].
Пример 4. Синтез защищенного лиганда 5 с использованием сшивающего реагента 3
4
3
5
2
2
2
2
2
3
2
Нонасахарид  (60 мг, 0,013 ммоль) растворяли в смеси MeOH (1,5 мл), ТГФ (3 мл) и 1M HCl (0,1 мл) и добавляли Pd(OH)/C (60 мг). Полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 1 ч. Катализатор отфильтровывали и выпаривали растворители. Остаток растворяли в смеси CHCl (2 мл) и ДМФА (1 мл), а затем добавляли линкерный реагент  (20 мг, 0,07 ммоль, раствор в 1 мл CHCl) и EtN (50 мкл). Через 20 ч смесь разбавляли толуолом, концентрировали и подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (толуол/MeCO, 4:1), получая соединение  (37 мг, 68%) в виде бесцветной пены.
Пример 5. Исследование применимости сшивающего реагента 8 при получении лигандов для последующего конъюгирования с белком
Схема 4
2
2
3
2
2
2
4
2
·
. Синтез лигандов. a: 1) H, Pd(OH)/C, MeOH/ТГФ 2) 8, EtN, CHCl; b: NHHO, EtOH, Δ.
9
8
10
Staphylococcus aureus
Carbohydr. Res
2
2
2
2
2
3
2
3
3
2
3
3
2
1
13
Пентасахарид  (150 мг, 0,026 ммоль) (M.L. Gening, Y.E. Tsvetkov, G.B. Pier, N.E. Nifantiev, «Synthesis of oligo-β(l→6)-glucosamines corresponding to the fragments of the surface polysaccharide of » . 342 (2007), 567-575) растворяли в смеси MeOH (1,5 мл), ТГФ (3 мл) и 1M HCl (0,1 мл) и добавляли Pd(OH)/C (150 мг). Полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 1 ч. Катализатор отфильтровывали и выпаривали растворители. Остаток растворяли в смеси CHCl (2 мл) и ДМФА (1 мл), а затем добавляли линкерный реагент  (30 мг, 0,1 ммоль, раствор в 0,1 мл CHCl) и EtN (50 мкл). Через 1 ч смесь разбавляли толуолом, концентрировали и подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (толуол/MeCO, 4:1) с получением соединения  (132 мг, 89%) в виде бесцветной пены. Данные H ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 2,38 (с, 3H, CHCOS), 3,53 (с, 2H, CHS); данные C ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 30,2 (CHCOS), 32,9 (CHS).
10
·
11
2
4
2
2
2
2
35
67
8
22
1
13
+
+
C
Смесь защищенного пентасахарида  (100 мг, 0,017 ммоль), EtOH (5 мл) и NHHO (0,5 мл) перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 1 ч, а затем концентрировали и подвергали гель-проникающей хроматографии (TSK гель Toyopearl HW 40S, 2,5×40 см) в водной 0,1 M AcOH, получая пентасахарид  (32 мг, 93%). Данные Η ЯМР (500 МГц, DO): δ 7,17 (с, 1 H, CH=N); данные C ЯМР (125 МГц, DO): δ 134,6 (C=N-NH), 167,4 ((O)-CH=N). Масс-спектры: вычислено для CHNO 951,438 [M+H], экспериментально 951,448 [M+H].
Пример 6. Исследование применимости сшивающего реагента 12 при получении лигандов для последующего конъюгирования с белком
Схема 5
2
2
3
2
2
2
4
2
·
. Синтез лигандов. a: 1) H, Pd(OH)/C, MeOH/ТГФ 2) 12, EtN, CHCl; b: NHHO, EtOH, Δ.
9
12
13
Staphylococcus aureus
Carbohydr. Res
2
2
2
2
2
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
1
13
Пентасахарид  (100 мг, 0,017 ммоль) (M.L. Gening, Y.E. Tsvetkov, G.B. Pier, N.E. Nifantiev, «Synthesis of oligo-β(l→6)-glucosamines corresponding to the fragments of the surface polysaccharide of » . 342 (2007), 567-575) растворяли в смеси MeOH (1,5 мл), ТГФ (3 мл) и 1M HCl (0,1 мл) и добавляли Pd(OH)/C (150 мг). Полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 1 ч. Катализатор отфильтровывали и выпаривали растворители. Остаток растворяли в смеси CHCl (2 мл) и ДМФА (1 мл), а затем добавляли линкерный реагент  (15 мг, 0,061 ммоль, раствор в 0,1 мл CHCl) и EtN (50 мкл). Через 1 ч смесь разбавляли толуолом, концентрировали и подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (толуол/MeCO, 4:1), получая соединение  (87 мг, 85%) в виде бесцветной пены. Данные H ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 2,33 (с, 3H, CHCOS), 2,52 (м, 2H, COCH), 3,15 (т, 2H, J 7,6, CHS); данные C ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 25,2 (CHCOS), 29,2 (COCH), 35,9 (CHS).
13
·
2
4
2
Смесь защищенного пентасахарида  (80 мг, 0,015 ммоль), EtOH (5 мл) и NHHO (0,5 мл) перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 1 ч, а затем концентрировали и подвергали гель-проникающей хроматографии (TSK гель Toyopearl HW 40S, 2,5×40 см) в водной 0,1М AcOH, получая сложную смесь неидентифицированных продуктов.
Пример 7. Получение конъюгата столбнячного анатоксина с лигандом 6 - "TT-9NH
"
2
Схема 6
. Конъюгирование с лигандом 6.
Стадия 1. Модификация белка
. Столбнячный анатоксин (4 мг в 120 мкл, маточный раствор) разбавляли 400 мкл буфера, pH 7,2 (0,1М фосфат натрия, 0,15М NaCl, 10 мМ ЭДТА), добавляли раствор SBAP (2,6 мг) в ДМСО (80 мкл) и выдерживали смесь в течение 2 ч при КТ. Непрореагировавший SBAP удаляли, используя колонку PD-10, в токе буфера pH 8,0 (0,1М фосфат натрия, 0,15М NaCl, 10 мМ ЭДТА) и концентрировали 3,5 мл полученного раствора модифицированного белка до 400 мкл.
Стадия 2. Восстановление дисульфида
6
. Иммобилизованный TCEP гель, восстанавливающий дисульфидную связь (200 мкл 50% суспензии в воде), центрифугировали, избыток воды удаляли и добавляли дисульфид  (1,5 мг в 100 мкл буфера pH 8,0 (0,1М фосфат натрия, 0,15М NaCl, 10 мМ ЭДТА)). После инкубации на роторном штативе при комнатной температуре в течение 45 минут раствор SH-производного отделяли от геля путем центрифугирования, после чего иммобилизованный TCEP промывали тем же буфером с pH 8,0 (3×100 мкл).
Стадия 3. Конъюгирование
2
. Раствор лиганда, полученного на стадии 2 (400 мкл в буфере, pH 8,0) сразу же объединяли с модифицированным белком (400 мкл в буфере, pH 8,0, стадия 1) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день конъюгат отделяли от несвязанных компонентов гель-фильтрацией на колонке с Superose 6 prep-grade. Фракции, содержащие конъюгат TT-9NH, объединяли, концентрировали и хранили замороженными при -20°C.
Химический анализ конъюгата
6
Analytical Biochem
Analytical Biochem
2
. Конъюгат анализировали на содержание олигосахаридов, используя гексозаминовый тест, описанный Смитом и Гилкерсоном (R.L. Smith and E. Gilkerson. 1979 . 98: 478-480), с соединениями  в качестве стандарта и на содержание белка с использованием теста Брэдфорд (M.M. Bradford, 1976, . 72:248-254). Согласно данным анализам конъюгат TT-9NH содержал 74 углеводных лиганда на молекулу белка (x=74).
Пример 8. Получение конъюгата столбнячного анатоксина с лигандом 7 - "TT-9NAC"
Схема 7
. Конъюгирование с лигандом 7.
Стадия 1. Модификация белка
2
. TT модифицировали SBAP, как описано выше для конъюгата TT-9NH.
Стадия 2. Снятие S-ацетильной защиты
7
3
. Нонасахарид  (2,1 мг) растворяли в 200 мкл 7%-ого водного раствора NH, смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем лиофилизировали.
Стадия 3. Конъюгирование.
Лиофилизированный олигосахарид немедленно растворяли в 400 мкл буфера с pH 8,0 (0,1М фосфат натрия, 0,15М NaCl, 10 мМ ЭДТА) и смешивали с 400 мкл TT-модифицированного раствора в том же буфере. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день конъюгат отделяли от несвязанных компонентов гель-фильтрацией на колонке с Superose 6 prep-grade. Фракции, содержащие конъюгат TT-9NAc, объединяли, концентрировали и хранили замороженными при -20°C.
Химический анализ конъюгата
2
. Анализ выполняли таким же способом, как и в случае конъюгата TT-9NH (пример 7), при этом он показал, что конъюгат TT-9NAc содержал углеводные лиганды в количестве 71 на молекулу белка (y=71).
Пример 9. Получение антитела с использованием олигосахаридных конъюгатов
Методы
. Кроликов дважды иммунизировали подкожно 10 мкг полисахарида, эквивалентного нонаглюкозамину (т.е. 9 связанным мономерам), конъюгированному со столбнячным анатоксином (TT), с интервалом в одну неделю, с эквивалентным объемом адъюванта Specol. На третью неделю кроликов иммунизировали три раза (т.е. в понедельник, в среду и в пятницу) 10 мкг PS-эквивалента IV в солевом растворе. После последней иммунизации кролики отдыхали в течение двух недель, при этом кровь забирали каждые две недели. Данные в этом представлении включают результаты первой (забор 1) и второй (забор 2) сыворотки, полученные после иммунизации.
Результаты
2
S.aureus
. На фиг.1A и B приведены данные, относящиеся к связыванию антисывороток, индуцированных против неацетилированного нонаглюкозамина (9GlcNH), по сравнению с PNAG (A) или dPNAG (B) из . Используемый в данном эксперименте dPNAG был ацетилирован приблизительно на 15%. Однако следует понимать, что уровень ацетилирования может варьировать в пределах 0-40%. Данные показывают, что антисыворотки связывались сопоставимо и с PNAG, и с dPNAG.
S.aureus
На фиг.2A и B представлены данные, относящиеся к связыванию антисывороток, индуцированных против полностью ацетилированного нонаглюкозамина (9GlcNAc), по сравнению с PNAG или dPNAG из . Данные показывают, что антисыворотки связывались с высокоацетилированным PNAG лучше, чем с dPNAG.
2
2
2
2
2
На фиг.3A и B показаны данные, относящиеся к связыванию антисывороток, индуцированных против TT-конъюгированного 9GlcNAc или 9GlcNH, по сравнению с неконъюгированным 11GlcNAc или 11GlcNH. Данные показывают, что антисыворотка, индуцированная против ацетилированного 9GlcNAc, связывалась лучше с ацетилированным 11GlcNAc, чем антисыворотка, индуцированная против неацетилированного 9GlcNH. Обратная ситуация имела место при связывании с 9GlcNH, поскольку антисыворотки против конъюгата 9GlcNH-TT находились вне предела измерений при разведениях сыворотки менее чем 6400.
S.aureus
S.aureus
S.aureus
.aureus
S.aureus
S.aureus
2
На фиг.4 и 5 представлены результаты при использовании антисыворотки из забора 1 против  MN8 и двух штаммов USA300. На фиг.4 сравнивается гибель  MN8 (CP8) под действием антисывороток кролика (обозначенных как "забор 1") против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного со столбнячным анатоксином (TT). На фиг.5 сравнивается гибель  MN8 под действием антисывороток кролика (забор 1) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. Антисыворотку против конъюгата dPNAG-TT использовали для сравнения. На фиг.6 сравнивается гибель S LAC (NT, USA300) под действием сывороток кролика (забор 1) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.7 сравнивается гибель  SF8300 (NT, USA300) под действием сывороток кролика (забор 1) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.8 сравнивается гибель  LAC (NT, USA300) под действием сывороток кролика (забор 1) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. Как правило, сыворотка, индуцированная против 9GlcNH-TT, демонстрировала лучшую общую активность, однако в большинстве тестов лишь немного превосходила сыворотку, индуцированную против 9GlcNAc-TT.
На фиг.9-16 показаны данные по гибели, полученные при использовании сывороток из забора 2. Контрольную сыворотку кролика против dPNAG-TT использовали для сравнения на штаммах MN8, SF8300 и LAC. Анти-DPNAG-TT козы использовали для сравнения на Newman (CP5), PS80 (CP8) и изогенных штаммах Reynolds CP5, Reynolds (нетипируемый) и Reynolds CP8.
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
На фиг.9 сравнивается гибель  MN8 (CP8) под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.10 сравнивается гибель  LAC (NT, USA300) под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.11 сравнивается гибель  SF8300 (NT, USA300) под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.12 сравнивается гибель  Newman (CP5) под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.13 сравнивается гибель  PS80 под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.14 сравнивается гибель  Reynolds (CP5) под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.15 сравнивается гибель  Reynolds (нетипируемого) под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT. На фиг.16 сравнивается гибель  Reynolds (CP8) под действием сывороток кролика (забор 2) против полностью ацетилированного или неацетилированного 9-мера олигоглюкозамина, конъюгированного с TT.
2
Как правило, при использовании антисывороток, индуцированных против конъюгатов олигосахаридов, была достигнута более высокая степень гибели, чем при использовании антисыворотки, индуцированной против dPNAG-TT. Гибель штаммов LAC и SF8300 с сыворотками забора 2 была выше, чем с сыворотками забора 1, даже при том, что кривые связывания ELISA были аналогичны. При использовании забора 2 наблюдали большее различие в гибели с использованием антисывороток, индуцированных против 9GlcNH, по сравнению с лизисом с использованием сыворотки, индуцированной против 9GlcNAc.
Пример 10. Антисыворотки кролика и опсоническая гибель E.coli.
E.coli
pga
E. coli
Антитела кролика в антисыворотках кролика после иммунизации (как описано выше) опосредовали опсоническую гибель двух штаммов , которые, как было показано ранее, продуцировали PNAG, но не вызывали гибель третьего штамма, не имеющего -генов, кодирующих ферменты для биосинтеза PNAG в  (фиг.16A).
Пример 11. Модели кожного абсцесса на мышах.
in vivo
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
2
2
2
2
2
4
5
6
На фиг.17, 18 и 19 показаны результаты  исследования с использованием модели кожного абсцесса на мышах и заражения штаммом  LAC (USA300). Антисыворотки, индуцированные против 9GlcNH, демонстрировали защитную эффективность против кожнойинфекции, вызываемой  LAC (USA300). В Группе 1 (обозначенной 9GlcNH-TT) вводили 0,2 мл антисыворотки 9GlcNH-TT (забор 2) внутрибрюшинно за 24 часа до заражения. В Группе 2 (обозначенной NRS) вводили 0,2 мл нормальной сыворотки кролика (NRS) за 24 часа до инфекции. Мышей заражали 2×10 КОЕ (фиг.17), 2×10 КОЕ (фиг.19) или 2×10 КОЕ (фиг.20) в 100 мкл подкожной инъекцией (на абсцесс) с гранулами microdex (10 г/мл). Штамм  LAC выращивали в TSB в течение ночи, затем промывали и добавляли к гранулам microdex перед введением. Через 72 часа каждый абсцесс вырезали, ресуспендировали в 1 мл TSB, гомогенизировали, разбавляли, а затем 100 мкл гомогената высевали на чашку с последовательными разведениями. Нижний предел обнаружения составлял 10 КОЕ/абсцесс. На фиг.17, 18 и 19 показано, что количество КОЕ на абсцесс значительно уменьшилось у мышей, получавших антисыворотку 9GlcNH-TT, по сравнению с мышами, получавшими нормальную сыворотку кролика. На фиг.20 суммированы результаты фиг.18-20 и показано, что при каждой дозе  мыши, которым вводили 9GlcNH, были лучше защищены против инфекции .
in vivo
.aureus
6
6
2
На фиг.21 и 22 представлены результаты двух  исследований, в которых использовали ту же модель кожного абсцесса на мышах и методики, описанные в предыдущем параграфе, но для заражения использовали два дополнительных штамма S, MN8 и Newman. Мышей заражали 1×10 КОЕ штамма MN8 (фиг.21) или 4×10 КОЕ штамма Newman (фиг.22) в 100 мкл подкожной инъекцией (на абсцесс) с гранулами microdex (10 г/мл). На фиг.21 и 22 показано, что количество КОЕ на абсцесс значительно уменьшилось у мышей, которым вводили антисыворотку 9GlcNH-TT, по сравнению с мышами, которым вводили нормальную сыворотку кролика.
2
2
S.aureus
ica
ica
ica
S.aureus
На фиг.23 показана неспособность антисыворотки, индуцированной против вакцины конъюгата 9GlcNH-TT, значительно (P>0,05) уменьшать КОЕ/абсцесс штамма  MN8Δ и NewmanΔ. В двух указанных штаммах удален генетический локус , и они больше не могут синтезировать поверхностный полисахарид PNAG. В отсутствие антигена PNAG антитело против олигосахарида 9GlcNH не может обеспечивать защитный иммунитет против кожной инфекции, вызываемой .
Пример 12. Эффективность защиты против перитонита, вызываемого E.coli.
2
2
E.coli
E.coli
E.coli
Эффективность защиты антитела против 9GlcNH-TT тестировали в модели инфекции  с летальным перитонитом. Указанное антитело защищало всех иммунизированных мышей против инфекции, вызываемой двумя PNAG-положительными изолятами  (таблица 1, штаммы UTI J и P), тогда как все контрольные животные, получавшие NRS, не выживали. Против PNAG-отрицательного штамма  H антисыворотка с антителом против 9GlcNH-TT иммунитета не предоставляла.
Таблица 1Эффективность защиты антитела к 9GlcNH<sub>2</sub>-TT против летального перитонита, вызываемого <i>E.coli</i>
Заражение Штамм<i> E.coli</i>
Количество выживших мышей от общего количества
P-значение (точный критерий Фишера)
Анти-9GlcNH<sub>2</sub>-TT
NRS<sup>a</sup>
J(PNAG<sup>+</sup>)
8/8
0/8
0,0002
P(PNAG<sup>+</sup>)
8/8
0/8
0,0002
H(PNAG<sup>-</sup>)
0/8
0/8
1,0
<sup>a </sup>NRS: нормальная сыворотка кролика
Обсуждение результатов
2
2
С использованием полностью неацетилированных, синтетических вакцин конъюгата GlcNH-TT согласно изобретению было установлено, что ацетаты не требуются для создания высоких уровней опсонических и защитных антител у животных, что конъюгирование молекулы размером в пределах до пяти GlcNH-мономеров достаточно для надежного иммунного ответа и что указанные антитела легко связываются с высоко N-ацетилированным PNAG, недостаточно ацетилированным dPNAG и неацетилированными олигосахаридами. Таким образом, данные защитные антитела будут связываться с природными PNAG независимо от их состава, включая их уровень ацетилирования.
2
2
2
Y.pestis
Y.pestis
Y.pestis
Изобретение дополнительно предусматривает производство вакцин, которые содержат множество антигенов, включая неацетилированные олигосахариды по изобретению. Синтез GlcNH-олигомеров с линкером на восстанавливающем конце, содержащим активную сульфгидрильную группу, предполагает, что вакцины, направленные против микроорганизмов, продуцирующих PNAG, могут быть сделаны более эффективными за счет конъюгирования GlcNH-олигосахаридов с микробными белками, которые функционируют в качестве факторов вирулентности и антигенов, используемых для получения вакцин. Например, белок LcrV  является мишенью для защиты против чумы (Garmory et al. Vaccine 22:947-57 (2004); Overheim et al. Infect. Immun. 73:5152-9 (2005); Quenee et al. Infect. Immun. 76:2025-2036 (2008)), однако у штаммов , распространенных в Средней Азии, известны серологические варианты указанного белка (Anisimov et al. Clin. Microbiol. Rev. 17:434-464 (2004)), что может позволить таким штаммам избегать иммунного ответа, вызываемого однокомпонентной LcrV-вакциной. Поскольку PNAG экспрессируется , конъюгирование GlcNH-олигомеров с LcrV может увеличить защитный потенциал противочумной вакцины. Данный подход к производству вакцины привлекателен, поскольку синтетический вариант dPNAG олигосахаридов может быть получен без больших затрат и, что важно, не будет содержать каких-либо нежелательных микробных примесей.
S.aureus
E.col.
В целом, представленные результаты указывают, что низкомолекулярные олигомеры бета(1→6)-связанного глюкозамина, конъюгированные с белком-носителем, могут индуцировать высокие титры опсонического антитела, которое также обеспечивает защиту против экспериментальной кожной инфекции  и летального перитонита, вызываемого
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Хотя в настоящей заявке были описаны и проиллюстрированы некоторые варианты осуществления изобретения, средние специалисты в данной области техники смогут легко предположить различные другие способы и/или структуры для выполнения функции и/или получения результатов, и/или одного или нескольких преимуществ, описанных в настоящей заявке, причем каждое из таких изменений и/или модификаций считают включенным в объем вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей заявке. В более широком смысле, специалисты в данной области техники с легкостью сумеют оценить, что все параметры, измерения, материалы и конфигурации, описанные в настоящей заявке, следует считать примерными и что фактические параметры, измерения, материалы и/или конфигурации будут зависеть от конкретного назначения или назначений, для которых применяются идеи изобретения. Специалисты в данной области техники будут принимать во внимание, или сумеют установить с использованием не более чем стандартных экспериментов, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей заявке. Поэтому следует понимать, что предшествующие варианты осуществления представлены лишь в качестве примера и что, в объеме прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов, варианты осуществления изобретения могут быть осуществлены иным образом, нежели конкретно описано и испрашивается. Варианты осуществления настоящего изобретения направлены на каждый индивидуальный признак, систему, изделие, материал, набор и/или способ, описанный в настоящей заявке. Кроме того, любая комбинация двух или более таких признаков, систем, изделий, материалов, наборов и/или способов, если такие признаки, системы, изделия, материалы, наборы и/или способы не являются взаимно несовместимыми, включены в объем настоящего изобретения.
Все определения, определенные и используемые в настоящей заявке, следует понимать как имеющие преимущество над словарными определениями, определениями в документах, включенных путем ссылки, и/или обычными значениями определенных терминов.
Все ссылки, патенты и заявки на патент, раскрытые в настоящей заявке, включены путем ссылки относительно объекта, в отношении которого они процитированы и который в некоторых случаях может полностью охватывать соответствующий документ.
Формы единственного числа, используемые в описании и в формуле изобретения, если прямо не указано обратное, следует понимать как означающие "по меньшей мере один".
Фразу "и/или", используемую в настоящей заявке в описании и формуле изобретения, следует понимать как означающую "любой из двух или оба" элемента, объединенных таким образом, т.е. элементы, которые в некоторых случаях присутствуют совместно, а в других случаях присутствуют раздельно. Множество элементов, перечисленных с фразой "и/или", необходимо рассматривать таким же способом, т.е. как "один или несколько" элементов, объединенных таким образом. Необязательно могут присутствовать другие элементы помимо элементов, конкретно указанных с условием "и/или", связанных или несвязанных с теми элементами, которые конкретно указаны. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, ссылка на "A и/или B", при использовании в сочетании с неограниченной формулировкой, такой как "включающий", может относиться, в одном варианте осуществления, только к A (необязательно включая элементы кроме B); в другом варианте осуществления только к B (необязательно включая элементы кроме A); в еще одном варианте осуществления и к A, и к B (необязательно включая другие элементы); и т.д.
Как используется в настоящей заявке в описании и в формуле изобретения, "или" следует понимать как имеющее то же значение, что и "и/или", как определено выше. Например, при разделении пунктов в списке, "или" или "и/или" следует интерпретировать как являющиеся включающими, т.е. включающими по меньшей мере одно, но также и включающими более одного, из числа или перечня элементов, и, необязательно, дополнительных не включенных в перечень пунктов. Только термины, явно указанные в обратном смысле, такие как "только один из" или "строго один из", или, при использовании в формуле изобретения, "состоящий из", относятся к включению только одного элемента из числа или перечня элементов. Как правило, термин "или", используемый в настоящей заявке, следует интерпретировать как указывающий исключительные альтернативы (т.е. "один или другой, но не оба"), если ему предшествуют термины исключительного характера, такие как "и тот и другой", "один из", "только один из" или "строго один из". "Состоящий по существу из", в случае использования в формуле изобретения, имеет свое обычное значение, используемое в области патентного права.
Используемую в настоящей заявке в описании и в формуле изобретения фразу "по меньшей мере один", в отношении перечня из одного или нескольких элементов, следует понимать как означающую по меньшей мере один элемент, выбранный из одного или нескольких элементов в перечне элементов, но не обязательно включающий по меньшей мере один из всех без исключения элементов, конкретно перечисленных в перечне элементов, и не исключающий каких-либо комбинаций элементов в перечне элементов. Данное определение также позволяет то, что необязательно могут присутствовать элементы помимо элементов, определенно идентифицированных в рамках перечня элементов, к которым обращена фраза "по меньшей мере один", связанных или не связанных с элементами, которые конкретно указаны. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, "по меньшей мере один из A и B" (или, эквивалентно, "по меньшей мере один из A или B", или, эквивалентно, "по меньшей мере один из A и/или B") может относиться, в одном варианте осуществления, по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один, A, без B (и необязательно включая элементы помимо B); в другом варианте осуществления, по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один, B, без A, (и необязательно включая элементы помимо A); в еще одном варианте осуществления, по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один A, и по меньшей мере к одному, необязательно включая более чем один, B (и необязательно включая другие элементы); и т.д.
Необходимо также понимать, что если явно не указано обратное, в любых способах, заявленных в настоящей заявке, которые включают более чем одну стадию или процесс, порядок стадий или процессов способа не должен обязательно ограничиваться порядком, в котором перечислены стадии или процессы способа.
В пунктах формулы изобретения, так же как и в описании выше, все переходные фразы, такие как "включающий", "несущий", "имеющий", "содержащий", “участвующий” "удерживающий", "сформированный (составленный) из" и т.п., следует понимать как неограниченные, т.е. означающие включение, но не ограничение. Только переходные фразы "состоящий из" и "состоящий по существу из" должны быть ограниченными или полуограниченными переходными фразами, соответственно, как изложено в руководстве по процедуре патентной экспертизы патентного ведомства США, раздел 2111.03.