СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УНИЧТОЖЕНИЯ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК И ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ, АССОЦИИРОВАННЫХ СО СТАРЕНИЕМ
METHODS AND COMPOSITIONS FOR DESTROYING AGING CELLS AND FOR TREATING DISEASES AND DISORDERS ASSOCIATED WITH AGING

ДЕКЛАРАЦИЯ ГОСУДАРСТВЕННОГО ИНТЕРЕСА
Настоящее изобретение было создано при поддержке правительства на основании грантов № AG009909, AG017242, AG41122 и AG046061, выделенных Национальными институтами здравоохранения. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.
ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, связанных с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате вместо бумажной копии и, следовательно, включен в данную заявку посредством отсылки. Наименование этого текстового файла, содержащего перечень последовательностей, - 200201_419WO_SEQUENCE_LISTING.txt. Объем этого текстового файла составляет 5.2 Кб, он был создан 27 января 2015 г. и был представлен в электронном виде посредством системы EFS-Web.
Область техники
Данная изобретение в общем относится к способам лечения и профилактики заболеваний и расстройств, ассоциированных со стареющими клетками.
Описание предшествующего уровня техники
Стареющие клетки накапливаются в тканях и органах субъектов по мере того, как эти субъекты стареют и приобретают патологии, связанные с возрастом. Полагают, что стареющие клетки являются важными для ингибирования пролиферации дисфункциональных или поврежденных клеток и, в особенности, для ограничения развития злокачественных болезней (см., например, Campisi, Curr. Opin. Genet. Dev. 21: 107-12 (2011); Campisi, Trends Cell. Biol. 11: S27-31 (2001); Prieur et al., Curr. Opin. Cell Biol. 20: 150-55 (2008)); тем не менее наличие стареющих клеток в организме субъекта может способствовать старению и появлению дисфункций, связанных с возрастом (см., например, Campisi, Cell 120: 513-22 (2005)). С учетом того, что стареющие клетки причинно-следственно участвуют в некоторых аспектах ухудшения здоровья, связанного со старением, могут способствовать развитию некоторых заболеваний и образуются в результате необходимых для сохранения жизни химиотерапевтических и радиационных способов лечения, наличие стареющих клеток может оказывать неблагоприятное действие на миллионы пациентов во всем мире. Однако идентификация и развитие способов лечения таких заболеваний и состояний путем селективного устранения стареющих клеток происходили с трудом. Данная заявка предусматривает достижение указанных целей и преимуществ, связанных с этим.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение предусматривает способы лечения заболеваний, ассоциированных со старением, путем введения сенолитического агента. Далее более подробно будут описаны некоторые варианты настоящего изобретения. Как описано в данной заявке, сенолитический агент вводят в течение достаточного периода времени и в количестве, которое достаточно для селективного уничтожения (киллинга, цитолиза) стареющих (сенесцентных) клеток. Предусмотрены также способы селективного уничтожения стареющих клеток у субъекта, у которого наблюдается заболевание или расстройство, ассоциированные со старением, которые согласно некоторым вариантом не являются раковыми клетками, при этом такие сенолитические агенты, описанные в данной заявке, вводятся субъекту, нуждающемуся в этом, в соответствии со способами введения, описанными в данной заявке.
Согласно одному из вариантов предусмотрен способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированных со старением, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества сенолитического агента с малыми молекулами (низкомолекулярного сенолитического агента), который селективно вызывает гибель стареющих клеток среди нестареющих клеток; при этом заболевание или расстройство, ассоциированные со старением, не являются раковым заболеванием, при этом сенолитический агент вводится во время по меньшей мере двух циклов лечения, и каждый цикл лечения независимо представляет собой курс лечения, длящийся от 1 дня до 3 мес., с последующим перерывом введения лекарства в течение по меньшей мере 2 нед.; при условии, что, если сенолитический агент представляет собой ингибитор MDM2, этот ингибитор MDM2 вводится как единственный терапевтический агент и каждый курс лечения проводится в течение по меньшей мере 5 дней, в течение которых ингибитор MDM2 вводится в течение по меньшей мере 5 дней. Согласно некоторым вариантам изобретения сенолитический агент выбран из ингибитора MDM2; ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-xL; и Akt-специфического ингибитора. Согласно конкретному варианту этот ингибитор MDM2 является цис-имидазолиновым соединением, спиро-оксиндоловьм соединением или бензодиазепиновым соединением. Согласно конкретному варианту цис-имидазолин представляет собой нутлин. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент является ингибитором MDM2 и представляет собой нутлин-3а или RG-1172. Согласно еще одному конкретному варианту нутлин представляет собой нутлин-3а. Согласно одному из конкретных вариантов цис-имидазолиновое соединение представляет собой RG-7112, RG7388, RO5503781 или дигидроимидазотиазоловое соединение. Согласно еще одному конкретному варианту дигидроимидазотиазоловое соединение представляет собой DS-3032b. Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор MDM2 является спиро-оксиндоловым соединением, выбранным из MI-63, MI-126, MI-122, MI-142, MI-147, MI-18, MI-219, MI-220, MI-221, MI-773 и 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-она. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой сердеметан, пиперидиноновое соединение, CGM097 или ингибитор MDM2, который также является ингибитором MDMX и который выбран из RO-2443 и RO-5963. Согласно еще одному конкретному варианту пиперидиноновое соединение представляет собой АМ-8553. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой ингибитор BCL-2/BCL-xL; ингибитор BCL-2/BCL-xL/BCL-w или селективный ингибитор BCL-xL. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент является ингибитором одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере Bcl-xL и выбран из АВТ-263, АВТ-737, WEHI-539 и А-1155463. Согласно другому конкретному варианту селективный ингибитор BCL-xL представляет собой бензотиазолгидразоновое соединение, аминопиридиновое соединение, бензимидазольное соединение, тетрагидрохинолиновое соединение или феноксильное соединение. Согласно еще одному конкретному варианту бензотиазолгидразоновое соединение представляет собой WEHI-539. Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой А-1155463, АВТ-263 или АВТ-737. Согласно другому конкретному варианту ингибитор Akt является MK-2206. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент представляет собой ингибитор MDM2 или ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, при этом такой ингибитор является ингибитором по меньшей мере BCL-xL и является цитотоксическим по отношению к раковым клеткам, при этом общая доза сенолитического агента, вводимого во время каждого цикла лечения, является количеством, не эффективным для лечения рака. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент представляет собой ингибитор MDM2 или ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, при этом такой ингибитор является ингибитором по меньшей мере BCL-xL и является цитотоксическим по отношению к раковым клеткам, при этом сенолитический агент вводится во время двух или более циклов лечения и общая доза сенолитического агента, вводимого во время двух или более циклов лечения, представляет собой количество, которое меньше количества, эффективного для лечения рака. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой нутлин-3а; RG-7112; RG7388; RO5503781; DS-3032b; MI-63; MI-126; MI-122; MI-142; MI-147; MI-18; MI-219; MI-220; MI-221; MI-773 и 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-он; сердеметан; АМ-8553; CGM097; или ингибитор MDM2, который является также ингибитором MDMX и который выбран из RO-2443 и RO-5963. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой АВТ-263, АВТ-737, А-1155463 или WEHI-539. Согласно другому варианту субъект болен раковым заболеванием, и заболевание или расстройство, ассоциированные со старением, приводит к появлению побочного эффекта, вызванного химиотерапией, или побочного эффекта, вызванного радиотерапией, при этом сенолитический агент вводится субъекту в течение одного или более дней, начиная с по меньшей мере шестого дня после цикла химиотерапии или радиотерапии и не одновременно с проведением химиотерапии или радиотерапии и сенолитический агент не является химиотерапевтическим агентом для лечения рака, и сенолитический агент представляет собой малую молекулу и выбран из ингибитора MDM2; ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем ингибитор является ингибитором по меньшей мере BCL-xL, выбранным из ингибитора BCL-2/BCL-xL; ингибитора BCL-2/BCL-xL/BCL-w и селективного ингибитора BCL-xL; Akt-специфического ингибитора. Согласно другому конкретному варианту побочный эффект, вызванный применением химиотерапии, выбран из желудочно-кишечной токсичности, периферической нейропатии, утомляемости, чувства общего недомогания, низкой физической активности, гематологической токсичности, гепатотоксичности, алопеции, боли, воспаления слизистой оболочки, задержки жидкости и дерматологической токсичности. Согласно другому конкретному варианту побочный эффект, вызванный применением химиотерапии, представляет собой утомляемость. Согласно другому конкретному варианту побочный эффект, вызванный применением химиотерапии, представляет собой кардиотоксичность. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированные со старением, представляет собой остеоартрит, атеросклероз, хроническую обструктивную болезнь легких или идиопатический легочный фиброз. Согласно еще одному конкретному варианту введение сенолитического агента состоит из трех или более циклов лечения. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится в течение одного дня, двух дней, трех дней или четырех дней, при условии, что сенолитический агент не является ингибитором MDM2. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится как единственное терапевтическое средство.
Согласно другому варианту предусмотрен способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, которое не является раковым заболеванием, включающий введение субъекту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества низкомолекулярного сенолитического агента, которое приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, и этот агент является цитотоксическим по отношению к раковым клеткам, при этом сенолитический агент вводится как единственное терапевтическое средство в течение по меньшей мере одного цикла лечения, и цикл лечения является курсом лечения с последующим "отдыхом от лекарства"; и общая доза сенолитического агента, вводимого во время курса лечения, меньше, чем количество, являющееся эффективным для лечения рака, причем сенолитический агент представляет собой (а) ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который является ингибитором по меньшей мере Bcl-xL; (б) ингибитором MDM2; или (в) Akt-специфическим ингибитором. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент вводится во время двух или более циклов лечения, при этом общая доза сенолитического агента, вводимого во время двух или более циклов лечения, представляет собой количество, которое меньше, чем количество, эффективное для лечения ракового заболевания.
й
й
Согласно другим конкретным вариантам способов, описанных выше и далее, каждый курс лечения длится не более, чем (а) один месяц или (б) не более, чем два месяца, или (в) не более, чем три месяца. Согласно конкретному варианту каждый курс лечения продолжается не более, чем (а) 5 дней, (б) 7 дней, (в) 10 дней, (г) 14 дней или (д) 21 день. Согласно конкретному варианту сенолитический агент вводится каждый 2 день или каждый 3 день каждого курса лечения. Согласно конкретному варианту каждый курс лечения продолжается один день, два дня, три дня или четыре дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно во время каждого курса лечения. Согласно другому конкретному варианту период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере две недели, по меньшей мере один месяц, по меньшей мере два месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев или по меньшей мере 1 год. Согласно другому конкретному варианту курс лечения проводится один раз. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой сердечно-сосудистое заболевание, выбранное из атеросклероза, стенокардии, аритмии, кардиомиопатии, застойной недостаточности кровообращения, коронарной недостаточности, заболеваний сонной артерии, эндокардита, тромбоза коронарных артерий, инфаркта миокарда, гипертонии, аневризмы аорты, диастолической дисфункции сердца, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, пролапса митрального клапана, болезни периферических сосудов, стрессоустойчивости сердечно-сосудистой системы, фиброза миокарда, аневризмы сосудов головного мозга и инсульта. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой воспалительное или аутоиммунное заболевание или расстройство, выбранное из остеоартрита, остеопороза, воспаления слизистой оболочки полости рта, воспаления кишечника, кифоза и грыжи межпозвоночного диска. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, деменции, умеренных когнитивных нарушений и дисфункции мотонейронов. Согласно еще одному конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой метаболическое заболевание, выбранное из диабета, диабетической язвы, метаболического синдрома и ожирения. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой легочное заболевание, выбранное из фиброза легкого, хронической обструктивной болезни легких, астмы, кистозного фиброза, эмфиземы, бронхоэктаза и потери функции легких, вызванной старением. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой глазное заболевание или нарушение зрения, выбранное из макулярной дегенерации, глаукомы, катаракты, старческой дальнозоркости и потери зрения. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой расстройство, вызванное старением, выбранное из заболеваний почек, почечной недостаточности, дряхлости, потери слуха, мышечного утомления, кожных заболеваний, раневого дефекта кожного покрова, фиброза печени, фиброза поджелудочной железы, фиброза слизистой оболочки полости рта и саркопении. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство представляет собой дерматологическое заболевание или расстройство, выбранное из экземы, псориаза, гиперпигментации, невуса, мимолетной сыпи, атопического дерматита, крапивной лихорадки, болезней или расстройств, связанных с чувствительностью к свету или солнечной геродермии, морщин; прурита (зуда); дисестезии; экзематозного высыпания; эозинофильного дерматита; реактивного нейтрофильного дерматита; пемфигуса (пузырчатки); пемфигоида; иммунобуллезного дерматита; фиброгистокистозного разрастания клеток кожи; лимфом кожи и кожной красной волчанки. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз; остеоартрит; легочный фиброз; гипертонию или хроническую обструктивную болезнь легких. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится непосредственно в орган или ткань, которые содержат стареющие клетки. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент комбинируется с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтически приемлемой композиции для обеспечения пролонгированного высвобождения сенолитического агента. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится по схеме болюс плюс инфузия. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой остеоартрит и сенолитический агент вводится непосредственно в сустав, пораженный остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится внутрисуставно в сустав, пораженный остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится топически, трансдермально или внутрикожно. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой остеоартрит и сенолитический агент индуцирует образование коллагена типа II в суставе. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой остеоартрит и сенолитический агент ингибирует эрозию слоя протеогликана в суставе. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой остеоартрит и сенолитический агент ингибирует эрозию костей в суставе. Согласно другому конкретному варианту фиброз легких представляет собой идиопатический фиброз легких. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент снижает количество фиброзной легочной ткани в легком. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится через нос, путем ингаляции, в трахеи или путем интубации. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент повышает стабильность атеросклеротической бляшки. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент ингибирует образование атеросклеротической бляшки в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент снижает содержание липидов в атеросклеротической бляшке в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент повышает толщину фиброзного утолщения бляшки. Согласно другому конкретному варианту стареющие клетки представляют собой стареющие преадипоциты, стареющие эндотелиальные клетки, стареющие фибробласты, стареющие нейроны, стареющие эпителиальные клетки, стареющие мезенхимальные клетки, стареющие клетки гладких мышц, стареющие макрофаги или стареющие хондроциты. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 20% стареющих клеток и не более 5% нестареющих клеток в органе или ткани, содержащих стареющие клетки, ассоциированные с заболеванием или расстройством, вызванным старением. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 25% стареющих клеток в органе или ткани, содержащих стареющие клетки, ассоциированные с заболеванием или расстройством, вызванным старением.
Согласно одному из вариантов предусмотрен способ лечения остеоартрита у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества низкомолекулярного сенолитического агента, который селективно приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, причем (а) сенолитический агент вводят во время по меньшей мере двух циклов лечения и каждый цикл лечения независимо включает курс лечения в течение периода от 1 дня до 3 месяцев с последующим "отдыхом от лекарства"; и период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере две недели; или (б) сенолитический агент вводят непосредственно в сустав, пораженный остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент индуцирует образование коллагена типа II в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент ингибирует эрозию слоя протеогликана в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент ингибирует эрозию кости в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно одному из вариантов предусмотрен также способ индуцирования образования коллагена типа II, включающий введение субъекту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества сенолитического агента, который селективно вызывает гибель стареющих клеток среди нестареющих клеток, при этом (а) сенолитический агент вводят во время по меньшей мере двух циклов лечения и каждый цикл лечения независимо включает курс лечения в течение периода от 1 дня до 3 месяцев с последующим "отдыхом от лекарства"; и период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере две недели; или б) сенолитический агент вводят непосредственно в сустав, пораженный остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводят внутрисуставно. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводят топически, чрескожно или внутрикожно. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится по схеме болюс плюс инфузия (путем болюсной инфузии). Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент комбинируют с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтически приемлемой композиции для обеспечения пролонгированного высвобождения сенолитического агента. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент ингибирует эрозию слоя протеогликана в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент ингибирует эрозию костей в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 20% стареющих клеток и не более 5% нестареющих клеток в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 25% стареющих клеток в суставе, пораженном остеоартритом.
Согласно одному из вариантов предусмотрен способ лечения легочного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества низкомолекулярного сенолитического агента, который селективно приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, причем сенолитический агент вводится как единственное терапевтическое средство (проводится монотерапия) во время по меньшей мере двух циклов лечения, при этом каждый цикл лечения независимо включает курс лечения в течение периода от 1 дня до 3 месяцев с последующим "отдыхом от лекарства"; и период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере две недели. Согласно другому конкретному варианту предусмотрен способ лечения легочного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества низкомолекулярного сенолитического агента, который селективно приводит к гибели стареющих клеток, при этом сенолитический агент вводят в течение по меньшей мере двух циклов лечения, каждый цикл лечения включает курс лечения и период "отдыха от лекарства", причем этот период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере 2 месяца. Согласно другому конкретному варианту легочное заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой легочный фиброз. Согласно другому конкретному варианту легочный фиброз представляет собой идиопатический легочный фиброз. Согласно другому конкретному варианту легочное заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ, COPD). Согласно другому конкретному варианту легочное заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, выбрано из потери функции легких, вызванной старением, кистозного фиброза, эмфиземы, бронхоэктаза и астмы. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится непосредственно в пораженную легочную ткань, которая содержит стареющие клетки. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится через нос, путем ингаляции, в трахеи или путем интубации. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится по схеме болюс плюс инфузия. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент комбинируется с по меньшей мере одним фармацевтическим эксципиентом с образованием фармацевтической композиции, которая обеспечивает пролонгированное высвобождение сенолитического агента. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 20% стареющих клеток и к гибели не более 5% нестареющих клеток в легком субъекта. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 25% стареющих клеток в легком субъекта.
Согласно одному из вариантов предусмотрен способ лечения сердечно-сосудистого заболевания или расстройства, вызванного атеросклерозом или ассоциированного с ним, у субъекта, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества низкомолекулярного сенолитического агента, который селективно приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, при этом сенолитический агент вводится во время по меньшей мере двух циклов лечения и каждый цикл лечения независимо включает курс лечения в течение периода от 1 дня до 3 месяцев с последующим "отдыхом от лекарства"; и период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере две недели. Согласно конкретному варианту у субъекта наблюдается атеросклероз, болезнь периферических сосудов, застойная сердечная недостаточность, гипертония или заболевание коронарных артерий. Согласно другому конкретному варианту сердечно-сосудистое заболевание или расстройство представляет собой атеросклероз. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент повышает стабильность атеросклеротической бляшки. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент снижает содержание липидов в атеросклеротической бляшке в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент повышает размер фиброзного утолщения бляшки. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент ингибирует образование атеросклеротической бляшки в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту вероятность возникновения инфаркта миокарда, ангины, инсульта, тромбоза сонной артерии или тромбоза коронарных артерий уменьшается. В соответствии с другим вариантом предусмотрен также способ повышения стабильности атеросклеротической бляшки, находящейся в кровеносном сосуде субъекта, включающий введение такому субъекту терапевтически эффективного количества низкомолекулярного сенолитического агента, который селективно приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, при этом сенолитический агент вводится во время по меньшей мере двух циклов лечения и каждый цикл лечения независимо включает курс лечения в течение периода от 1 дня до 3 месяцев с последующим "отдыхом от лекарства"; причем период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере две недели. Согласно конкретному варианту у такого субъекта наблюдается сердечно-сосудистое заболевание, выбранное из атеросклероза, застойной сердечной недостаточности, болезни периферических сосудов, гипертонии или заболевания коронарных артерий. Согласно другому конкретному варианту сердечно-сосудистым заболеванием или расстройством является атеросклероз. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент снижает содержание липидов в атеросклеротической бляшке в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент увеличивает размер фиброзного утолщения бляшки. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент ингибирует образование атеросклеротической бляшки в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент снижает количество атеросклеротических бляшек в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводят парентерально или перорально. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводят непосредственно в артерию, в которой находятся стареющие клетки. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводят по схеме болюс плюс инфузия. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент комбинируется с по меньшей мере одним фармацевтическим эксципиентом с образованием фармацевтической композиции, которая обеспечивает пролонгированное высвобождение сенолитического агента. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 20% стареющих клеток и к гибели не более 5% нестареющих клеток в артериосклеротической артерии субъекта. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 25% стареющих клеток в артериосклеротической артерии субъекта.
й
й
Согласно некоторым вариантам способов, описанных выше и далее в данной заявке, курс лечения продолжается не более одного месяца или не более двух месяцев. Согласно другому конкретному варианту курс лечения длится (а) не более 5 дней, (б) не более 7 дней, (в) не более 10 дней, (г) не более 14 дней или (д) не более 21 дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится каждый 2 день или каждый 3 день курса лечения. Согласно другому конкретному варианту курс лечения длится один день, два дня, три дня или четыре дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно во время каждого курса лечения. Согласно другому конкретному варианту период "отдыха от лекарства" длится (а) по меньшей мере один месяц, (б) по меньшей мере два месяца, (в) по меньшей мере 3 месяца, (г) по меньшей мере 6 месяцев, (д) по меньшей мере 9 месяцев или (е) по меньшей мере 1 год. Согласно другому конкретному варианту курс лечения проводится один раз. Согласно другому конкретному варианту курс лечения длится один день и период "отдыха от лекарства" длится от 0.5 до 12 месяцев. Согласно другому конкретному варианту, когда вводится ингибитор MDM2, курс лечения проводится в течение по меньшей мере 5 дней. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится как единственное терапевтическое средство. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится во время трех или более циклов лечения.
Согласно некоторым вариантам, относящимся к способам, описанным выше и далее в данной заявке, сенолитический агент выбран из ингибитора MDM2; ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-xL; и Akt-специфического ингибитора. Согласно конкретному варианту этот ингибитор MDM2 является цис-имидазолиновым соединением, спиро-оксиндоловым соединением или бензодиазепиновьм соединением. Согласно конкретному варианту цис-имидазолин представляет собой нутлин. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент является ингибитором MDM2 и представляет собой нутлин-3а или RG-1172. Согласно еще одному конкретному варианту нутлин представляет собой нутлин-3а. Согласно одному из конкретных вариантов цис-имидазолиновое соединение представляет собой RG-7112, RG7388, RO5503781 или дигидроимидазотиазоловое соединение. Согласно еще одному конкретному варианту дигидроимидазотиазоловое соединение представляет собой DS-3032b. Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор MDM2 является спиро-оксиндоловым соединением, выбранным из MI-63, MI-126, MI-122, MI-142, MI-147, MI-18, MI-219, MI-220, MI-221, MI-773 и 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-она. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой сердеметан; пиперидиноновое соединение; CGM097 или ингибитор MDM2, который также является ингибитором MDMX и который выбран из RO-2443 и RO-5963. Согласно еще одному конкретному варианту пиперидиноновое соединение представляет собой АМ-8553. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой ингибитор BCL-2/BCL-xL; ингибитор BCL-2/BCL-xL/BCL-w или селективный ингибитор BCL-xL. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент является ингибитором одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере Bcl-xL и выбран из АВТ-263, АВТ-737, WEHI-539 и А-1155463. Согласно другому конкретному варианту селективный ингибитор BCL-xL представляет собой бензотиазолгидразоновое соединение, аминопиридиновое соединение, бензимидазольное соединение, тетрагидрохинолиновое соединение или феноксильное соединение. Согласно еще одному конкретному варианту бензотиазолгидразоновое соединение представляет собой WEHI-539. Согласно еще одному конкретному варианту одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой А-1155463, АВТ-263 или АВТ-737. Согласно другому конкретному варианту ингибитор Akt является MK-2206. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент представляет собой ингибитор MDM2 или ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, при этом такой ингибитор является ингибитором по меньшей мере BCL-xL и является цитотоксическим по отношению к раковым клеткам, общая доза сенолитического агента, вводимого во время каждого цикла лечения, является количеством, не эффективным для лечения рака. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент представляет собой ингибитор MDM2 или ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, при этом такой ингибитор является ингибитором по меньшей мере BCL-xL и является цитотоксическим по отношению к раковым клеткам, при этом сенолитический агент вводится во время двух или более циклов лечения и общая доза сенолитического агента, вводимого во время двух или более циклов лечения, представляет собой количество, которое меньше количества, которое является эффективным для лечения рака. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой нутлин-3а; RG-7112; RG7388; RO5503781; DS-3032b; MI-63; MI-126; MI-122; MI-142; MI-147; MI-18; MI-219; MI-220; MI-221; MI-773; и 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-он; сердеметан; АМ-8553; CGM097; или ингибитор MDM2, который является также ингибитором MDMX и который выбран из RO-2443 и RO-5963. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой АВТ-263, АВТ-737, А-1155463 или WEHI-539.
й
й
Согласно другому варианту настоящее изобретение предусматривает также способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, включающий введение такому субъекту сенолитического агента, который представляет собой малую молекулу ингибитора MDM2, который приводит селективно к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, при этом сенолитический агент вводится как единственное терапевтическое средство, причем сенолитический агент вводится во время по меньшей мере двух циклов лечения и каждый цикл лечения независимо включает курс лечения с последующим периодом "отдыха от лекарства". При этом курс лечения длится по меньшей мере 5 дней и не более трех месяцев, во время этого курса лечения вводится ингибитор MDM2 в течение по меньшей мере 5 дней, и заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, не является раковым заболеванием. Согласно конкретному варианту курс лечения длится по меньшей мере 9 дней. Согласно другому конкретному варианту курс лечения длится не более одного месяца или не более двух месяцев. Согласно другому конкретному варианту курс лечения продолжается не более 10, 14 дней или 21 дня. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 вводится ежедневно. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 вводится каждый 2 день или каждый 3 день курса лечения. Согласно другому конкретному варианту период "отдыха от лекарства" длится по меньшей мере две недели, по меньшей мере один месяц, по меньшей мере два месяца, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев или по меньшей мере 1 год. Согласно другому конкретному варианту введение сенолитического агента субъекту проводится в течение трех или более циклов лечения. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой цис-имидазолиновое соединение, спиро-оксииндоловое соединение или бенздиазепиновое соединение. Согласно другому конкретному варианту цис-имидазолиновое соединение представляет собой нутлин. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент является ингибитором MDM2 и представляет собой нутлин-3а или RG-1172. Согласно еще одному конкретному варианту нутлин представляет собой нутлин-3а. Согласно одному из конкретных вариантов цис-имидазолиновое соединение представляет собой RG-7112, RG7388, RO5503781 или дигидроимидазотиазоловое соединение. Согласно еще одному конкретному варианту дигидроимидазотиазоловое соединение представляет собой DS-3032b. Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор MDM2 является спиро-оксиндоловым соединением, выбранным из MI-63, MI-126, MI-122, MI-142, MI-147, MI-18, MI-219, MI-220, MI-221, MI-773 и 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-она. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой сердеметан; пиперидиноновое соединение; CGM097; или ингибитор MDM2, который также является ингибитором MDMX и который выбран из RO-2443 и RO-5963 или CGM097. Согласно другому варианту пиперидоновое соединение представляет собой АМ-8553. Согласно другому конкретному варианту описанный способ включает введение субъекту низкомолекулярного ингибитора одного или более из сигнальных метаболических путей mTOR, NFκB, PI3-k и AKT. Согласно другому конкретному варианту этот способ включает также введение субъекту Akt-специфического ингибитора. Согласно другому конкретному варианту при осуществлении этого способа вводят ингибитор AKT, представляющий собой MK-2206.
Согласно одному из вариантов предусмотрен также способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, включающий введение субъекту сенолитического агента, который представляет собой малую молекулу ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, при этом ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-XL, и сенолитический агент селективно приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, причем сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух циклов лечения, и каждый цикл лечения независимо включает курс лечения, который проводится в течение периода от 1 дня до 3 месяцев с последующим периодом "отдыха от лекарства", длящимся в течение по меньшей мере 2 недель, при этом заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, не является раковым заболеванием. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой ингибитор BCL-2/BCL-xL; ингибитор BCL-2/BCL-xL/BCL-w или селективный ингибитор BCL-xL. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой бензотиазолгидразоновое соединение, аминопиридиновое соединение, бензимидазольное соединение, тетрагидрохинолиновое соединение или феноксильное соединение. Согласно еще одному конкретному варианту бензотиазолгидразоновое соединение представляет собой WEHI-539. Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой А-1155463, АВТ-263 или АВТ-737. Согласно еще одному конкретному варианту описанный способ включает также введение субъекту низкомолекулярного ингибитора метаболических путей одного или более из mTOR, NFκB, PI3-k и AKT. Согласно еще одному конкретному варианту этот способ включает также введение субъекту Akt-специфического ингибитора. Согласно еще одному конкретному варианту этот способ включает также применение ингибитора AKT, представляющего собой MK-2206.
Согласно одному из вариантов предусмотрен также способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, включающий введение этому субъекту сенолитического агента, представляющего собой малую молекул специфического ингибитора AKT, при этом сенолитический агент селективно приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, и этот сенолитический агент вводится как единственное терапевтическое средство в течение по меньшей мере двух циклов лечения, каждый цикл лечения независимо включает курс лечения, который проводится в течение периода от 1 дня до 3 месяцев с последующим периодом "отдыха от лекарства", длящимся в течение по меньшей мере 2 недель, причем заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, не является раковым заболеванием. Согласно другому конкретному варианту ингибитор AKT представляет собой MK-2206. Согласно другому конкретному варианту этот способ включает также введение субъекту низкомолекулярного ингибитора сигнальных метаболических путей одного или более из mTOR, NFκB и PI3-k.
й
й
Согласно другим конкретным вариантам способов, описанных выше в данной заявке, курс лечения длится не более одного месяца или не более двух месяцев. Согласно другому конкретному варианту курс лечения продолжается (а) не более 5 дней, (б) длится не более 7 дней, (в) длится не более 10 дней, (г) длится не более 14 дней или (д) длится не более 21 дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится каждый 2 день или каждый 3 день курса лечения. Согласно другому конкретному варианту каждый курс лечения продолжается один день, два дня, три дня или четыре дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится во время курса лечения ежедневно. Согласно другому конкретному варианту период "отдыха от лекарства" продолжается в течение по меньшей мере две недель, одного месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, или по меньшей мере 1 года. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент, вводимый субъекту, применяется в течение трех или более циклов лечения. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится как единственное терапевтическое средство. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением представляет собой сердечно-сосудистое заболевание, выбранное из атеросклероза, стенокардии, аритмии, кардиомиопатии, застойной сердечной недостаточности, болезни коронарных артерий, болезни сонной артерии, эндокардита, коронарного тромбоза, инфаркта миокарда, гипертонии, аневризмы аорты, диастолической дисфункции сердца, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, пролапса митрального клапана, болезни периферических сосудов, нарушения стрессоустойчивости сердечно-сосудистой системы, фиброза миокарда, аневризмы сосудов головного мозга и инсульта. Согласно другому конкретному варианту субъект страдает от сердечно-сосудистого заболевания, выбранного из атеросклероза, застойной сердечной недостаточности, болезни периферических сосудов, гипертонии или болезни коронарных артерий. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой воспалительное или аутоиммунное заболевание или расстройство, выбранное из остеоартрита, остеопороза, мукозита слизистой оболочки ротовой полости, воспалительного заболевания кишечника, кифоза и грыжи межпозвоночного диска. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, деменции, умеренных когнитивных нарушений и дисфункции мотонейронов. Согласно еще одному конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой метаболическое заболевание, выбранное из диабета, диабетической язвы, метаболического синдрома и ожирения. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой легочное заболевание, выбранное из идиопатического фиброза легкого, хронической обструктивной болезни легких, астмы, кистозного фиброза, эмфиземы, бронхоэктаза и потери функции легких, вызванной старением. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой глазное заболевание или нарушение зрения, выбранное из макулярной дегенерации, глаукомы, катаракты и потери зрения. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой расстройство, вызванное старением, выбранное из заболеваний почек, почечной недостаточности, дряхлости, потери слуха, мышечного утомления, кожных заболеваний, раневого дефекта кожного покрова, фиброза печени, фиброза поджелудочной железы, фиброза слизистой оболочки полости рта и саркопении. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство представляет собой дерматологическое заболевание или расстройство, выбранное из экземы, псориаза, гиперпигментации, невуса, мимолетной сыпи, атопического дерматита, крапивной лихорадки, болезней или расстройств, связанных с чувствительностью к свету или солнечной геродермией, морщин; прурита (зуда); дисестезии; экзематозного высыпания; эозинофильного дерматита; реактивного нейтрофильного дерматита; пемфигуса (пузырчатки); пемфигоида; иммунобуллезного дерматита; фиброгистокистозного разрастания клеток кожи; лимфом кожи и кожной красной волчанки. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз; остеоартрит; идиопатический легочный фиброз или хроническую обструктивную болезнь легких. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится непосредственно в орган или ткань, которые содержат стареющие клетки. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой остеоартрит, и сенолитический агент вводится непосредственно в сустав, пораженный остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится внутрисуставно в сустав, пораженный остеоартритом. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится топически, трансдермально или внутрикожно. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой остеоартрит, и сенолитический агент индуцирует образование коллагена типа II в суставе. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой остеоартрит, и сенолитический агент ингибирует эрозию слоя протеогликана в суставе. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой идиопатический легочный фиброз, и сенолитический агент уменьшает количество фиброзной легочной ткани в легком. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится интраназально, путем ингаляции, в трахеи или путем интубации. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент комбинируется с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтически приемлемой композиции для обеспечения пролонгированного высвобождения сенолитического агента. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится по схеме болюс плюс инфузия. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент повышает стабильность атеросклеротической бляшки. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент ингибирует образование атеросклеротической бляшки в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент снижает содержание липидов в атеросклеротической бляшке в кровеносном сосуде субъекта. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом сенолитический агент повышает размер фиброзного утолщения бляшки. Согласно другому конкретному варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой атеросклероз, при этом вероятность возникновения инфаркта миокарда, стенокардии, инсульта, тромбоза сонной артерии или тромбоза коронарных артерий уменьшается. Согласно другому конкретному варианту стареющие клетки представляют собой стареющие преадипоциты, стареющие эндотелиальные клетки, стареющие фибробласты, стареющие нейроны, стареющие эпителиальные клетки, стареющие мезенхимальные клетки, стареющие клетки гладких мышц, стареющие макрофаги или стареющие хондроциты. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 20% стареющих клеток и не более 5% нестареющих клеток. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент приводит к гибели по меньшей мере 25% стареющих клеток.
Согласно одному из вариантов данное изобретение предусматривает способ ингибирования метастазирования у субъекта, больного раковым заболеванием, включающий введение этому субъекту одного низкомолекулярного сенолитического агента, который селективно приводит к гибели стареющих клеток среди нестареющих клеток, причем сенолитический агент вводится этому субъекту в один или более дней, начиная с по меньшей мере шестого дня после цикла проведения химиотерапии и не одновременно с химиотерапией, и сенолитический агент не является химиотерапевтическим агентом для лечения рака и при этом сенолитический агент выбран из ингибитора MDM2; ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем ингибитор является ингибитором по меньшей мере BCL-xL, выбранным из ингибитора BCL-2/BCL-xL; ингибитора BCL-2/BCL-xL/BCL-w и селективного ингибитора BCL-xL и Akt-специфического ингибитора. Согласно конкретному варианту метастазы представляют собой метастазы меланомы, рака простаты, рака яичка, рака молочной железы, рака мозга, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака щитовидной железы, рака желудка, рака легкого, рака яичника, метастазы саркомы Капоши, рака кожи, почечно-клеточного рака, рака головы и шеи, рака горла, сквамозно-клеточной карциномы, рака мочевого пузыря, остеосаркомы, рака шейки матки, рака эндометрия, рака пищевода, рака печени или рака почки. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 вводится субъекту в течение трех или более циклов лечения. Согласно конкретному варианту этот ингибитор MDM2 является цис-имидазолиновым соединением, спиро-оксиндоловым соединением или бензодиазепиновым соединением. Согласно конкретному варианту цис-имидазолин представляет собой нутлин. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент является ингибитором MDM2 и представляет собой нутлин-3а или RG-1172. Согласно еще одному конкретному варианту нутлин представляет собой нутлин-3а. Согласно одному из конкретных вариантов цис-имидазолиновое соединение представляет собой RG-7112, RG7388, RO5503781 или дигидроимидазотиазоловое соединение. Согласно еще одному конкретному варианту дигидроимидазотиазоловое соединение представляет собой DS-3032b. Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор MDM2 является спиро-оксиндоловым соединением, выбранным из MI-63, Ml-126, MI-122, MI-142, MI-147, MI-18, MI-219, MI-220, MI-221, MI-773 и 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-она. Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой сердеметан; пиперидиноновое соединение; CGM097 или ингибитор MDM2, который также является ингибитором MDMX и который выбран из RO-2443 и RO-5963. Согласно еще одному конкретному варианту пиперидиноновое соединение представляет собой АМ-8553. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой ингибитор BCL-2/BCL-xL; ингибитор BCL-2/BCL-xL/BCL-w или селективный ингибитор BCL-xL. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент является ингибитором одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере Bcl-xL и выбран из АВТ-263, АВТ-737, WEHI-539 и А-1155463. Согласно другому конкретному варианту селективный ингибитор BCL-xL представляет собой бензотиазолгидразоновое соединение, аминопиридиновое соединение, бензимидазольное соединение, тетрагидрохинолиновое соединение или феноксильное соединение. Согласно еще одному конкретному варианту бензотиазолгидразоновое соединение представляет собой WEHI-539. Согласно еще одному конкретному варианту одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой А-1155463, АВТ-263 или АВТ-737. Согласно другому конкретному варианту ингибитор Akt является MK-2206.
Согласно другому варианту предусмотрен способ идентификации сенолитического агента, включающий (а) индуцирование старения клеток для обеспечения стареющих клеток; (б) контактирование образца стареющих клеток с агентом-кандидатом и контактирование образца контрольных нестареющих клеток с агентом-кандидатом; (в) определение уровня выживаемости стареющих клеток и уровня выживаемости нестареющих клеток, при этом если уровень выживаемости стареющих клеток меньше, чем уровень выживаемости нестареющих клеток, агент-кандидат является сенолитическим агентом (сенолитиком). Согласно конкретному варианту этот способ включает также контактирование сенолитического агента, идентифицированного на стадии (в), с клетками, способными к продуцированию коллагена, и определение уровня коллагена, продуцированного этими клетками, тем самым идентифицируется сенолитический агент для лечения остеоартрита. Согласно конкретному варианту клетки, способные продуцировать коллаген, представляют собой хондроциты. Согласно конкретному варианту полученный коллаген является коллагеном типа II. Согласно другому конкретному варианту этот способ включает также введение сенолитического агента животному, не являющемуся человеком, у которого есть остеоартритические повреждения сустава, и определение одного или более показателя из (а) уровня стареющих клеток в суставе; (б) физической функции животного; (в) уровня одного или более маркеров воспаления; (г) гистологии сустава и (е) уровня образовавшегося коллагена типа II, при этом определяют терапевтическую эффективность сенолитического агента, когда у животного, подвергшегося лечению, по сравнению с животным, не получившим дозу сенолитического агента, наблюдают одну или более следующих характеристик: (i) снижение количества стареющих клеток в суставе у животного, подвергшегося лечению, (ii) улучшенную физическую функцию животного, подвергшегося лечению, (iii) снижение уровня одного или более маркеров воспаления у животного, подвергшегося лечению, (iv) повышенную гистологическую норму в суставе у животного, подвергшегося лечению и (v) повышенный уровень коллагена типа II у животного, подвергшегося лечению. Согласно конкретному варианту этот способ включает также введение сенолитического агента животному, не являющемуся человеком, применяемому в качестве модели атеросклероза, у которого имеются атеросклеротические бляшки, и определение одного или более показателей из (а) уровня одного или более маркеров воспаления и (б) количества атеросклеротических бляшек, при этом определяют терапевтическую эффективность сенолитического агента, когда у животного, подвергшегося лечению, по сравнению с животным, не получившим сенолитического агента, наблюдают одну или более следующих характеристик: (i) снижение уровня одного или более маркеров воспаления у животного, подвергшегося лечению, и (ii) снижение количества атеросклеротических бляшек у животного, подвергшегося лечению, тем самым идентифицируется сенолитический агент для лечения атеросклероза. Согласно другому конкретному варианту этот способ включает также введение сенолитического агента животному, не являющемуся человеком, применяемому в качестве модели легочного заболевания, у которого имеется фибротическая легочная ткань, и определение одного или более следующих показателей: (а) уровня одного или более маркеров и (б) количества фибротической легочной ткани, тем самым определяют терапевтическую эффективность сенолитического агента, когда у животного, подвергшегося лечению, по сравнению с животным, не получившим сенолитического агента, наблюдают одну или более следующих характеристик: (i) снижение уровня одного или более маркеров воспаления у животного, подвергшегося лечению, и (ii) уменьшение количества фибротической легочной ткани у животного, подвергшегося лечению, тем самым идентифицируется сенолитический агент для лечения легочного заболевания, ассоциированного со старением. Согласно другому конкретному варианту предусмотрен способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, включающий: (а) детектирование количества стареющих клеток у этого субъекта; и (б) введение такому субъекту сенолитического агента, который селективно вызывает гибель стареющих клеток, при этом сенолитический агент выбран из низкомолекулярного соединения (малой молекулы) и выбран из ингибитора MDM2, Akt-специфического ингибитора, ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-xL. Согласно конкретному варианту этот способ включает также применение в качестве ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 ингибитора Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w, ингибитора Bcl-2/Bcl-xL, ингибитора Bcl-xL/Bcl-w или селективного ингибитора Bcl-xL.
Согласно другим конкретным вариантам предусмотрен способ лечения, снижения вероятности возникновения или задержки начала развития заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, у которого есть это заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, или у которого наблюдается по меньшей мере один фактор предрасположенности к развитию заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, включающий введение этому субъекту сенолитического агента, который меняет или один или оба из сигнального пути процесса выживаемости клеток и метаболического пути воспаления в стареющей клетке, ускоряя при этом гибель стареющей клетки, при условии, что, если такой субъект болен раковым заболеванием, применение сенолитического агента не является первичной терапией для лечения рака, причем сенолитический агент вводится один раз каждые 0.5-12 месяцев, и заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой сердечнососудистое заболевание или расстройство, воспалительное заболевание или расстройство, легочное заболевание или расстройство, неврологическое заболевание или расстройство, побочный эффект от применения химиотерапии, побочный эффект от применения радиотерапии, или метастазирование. Согласно другому конкретному варианту предусмотрен способ лечения, снижения вероятности возникновения или задержки начала развития заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, у субъекта, у которого есть заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, или у которого наблюдается по меньшей мере один фактор предрасположенности к развитию заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, включающий введение этому субъекту сенолитического агента, который меняет или один или оба из сигнального пути процесса выживаемости клеток и метаболического пути воспаления в стареющей клетке, ускоряя при этом гибель стареющей клетки, при этом сенолитический агент вводится один раз каждые 4-12 месяцев.
Данное изобретение предусматривает также применение сенолитических агентов, описанных в данной заявке. Согласно одному из вариантов предусмотрено применение сенолитического агента для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, при этом терапевтически эффективное количество низкомолекулярного сенолитического агента (с малыми молекулами), которое приводит к селективной гибели стареющих клеток, подходит для введения во время по меньшей мере двух курсов лечения, причем каждый цикл лечения независимо включает курс лечения, продолжающийся от 1 дня до 3 месяцев с последующим "отдыхом от лекарства" в течение по меньшей мере 2 недель, при условии, что сенолитический агент представляет собой ингибитор MDM2, и ингибитор MDM2 вводится в качестве единственного терапевтического средства, и каждый курс лечения длится по меньшей мере 5 дней, когда ингибитор MDM2 вводится в течение по меньшей мере 5 дней, а заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, не является раковым заболеванием. Сенолитические агенты, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для изготовления лекарственного препарата для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, как описано в данной заявке.
Далее будут описаны некоторые конкретные детали для того, чтобы обеспечить полное понимание различных вариантов изобретения. Однако специалист в данной области знает, что настоящее изобретение можно осуществить без этих подробностей. В других случаях хорошо известные структуры не показаны и не описаны подробно, чтобы избежать ненужной перегрузки описания вариантов изобретения. Если из контекста не следует иное, в тексте описания и в формуле изобретения, которая приведена далее, термин "содержать" и его производные, такие как "содержит" и "содержащий," следует считать открытыми, неограничительными формами, то есть, как "включающий, но не ограничивающий". Кроме того, термин "содержащий" (и родственные термины, такие как "содержать" или "содержит", или "имеющий" или "включающий") не следует понимать, как исключающие того, что согласно другим некоторым вариантам, например, в случае варианта соединения, композиции, метода или способа, или т.п., описанных в данной заявке, эти варианты могут "состоять из" или "по существу состоять из" описанных признаков. Заголовки разделов, приведенные только для удобства, не интерпретируют объем или значение заявленных вариантов.
Ссылки по всему описанию на "один из вариантов" или "вариант" означают, что конкретные признак, структура или характеристика, описанные в связи с эти вариантом, включены по меньшей мере в один вариант. Таким образом, фразы "согласно одному из вариантов" или "согласно варианту" в различных местах данного описания не обязательно относятся к одному и тому же варианту. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут комбинироваться любым подходящим образом в одном или более вариантах.
Кроме того, используемые в данной заявке термины в единственном числе, включают множественное число, если из контекста не следует иное. Так, например, ссылка на "животное, не являющееся человеком" может относиться к одному или более животным, не являющимся людьми, или к совокупности таких животных, и ссылка на "клетку" или "определенную клетку" включает ссылку на одну или более клеток и их эквиваленты (например, множество клеток), известных специалисту в данной области, и т.д. Когда указано или заявлено, что стадии способа проводят в конкретном порядке, описание первой стадии, происходящей (или осуществляемой) "до" (то есть перед) второй стадии, то это имеет то же самое значение, которое относится к случаю, когда вторая стадия происходит (или осуществляется) "после" первой стадии. Термин "примерно (около)", когда он относится к величине или численному интервалу, означает, что эта величина или численный интервал указаны приблизительно вследствие вариабельности экспериментов (или вследствие статистической ошибки опыта), и, таким образом, указанные величина или численный интервал могут меняться между 1% и 15% от указанных величины или численного интервала. Например, указание на применение "примерно X" будет охватывать +/- 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% и 15% от величины X. Следует также отметить, что термин "или" обычно включает "и/или", если из контекста явно не следует иное. Термин "по меньшей мере один", например, когда он относится к по меньшей мере одному соединению или к по меньшей мере одной композиции, имеет то же значение и его следует понимать, как термин "один (одна) или более."
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1 представлена схема, отражающая сроки и способы лечения при помощи нутлина-3а (Nut) в случае (1) клеток, старение которых вызвано применением облучения, (Sen(IR)); (2) клеток, старение которых вызвано лечением с применением доксорубицина, (Sen(Doxo)) и (3) нестареющих клеток (Non Sen).
Фигуры 2A-D показывают влияние нутлина-3а на выживаемость фибробластов, старение которых вызвано облучением. Фигура 2А иллюстрирует действие нутлина-3а в концентрации 0, 2.5 или 10 мкМ после 9 дней (D9) обработки облученных (IR) стареющих фибробластов крайней плоти (Sen(IR)HCA2). На Фигуре 2В показано количество выживших облученных клеток BJ (Sen(IR)BJ) после проведения обработки нутлином-3а в показанной концентрации. На Фигуре 2С показано количество выживших облученных легочных фибробластов (Sen(IR)IMR90)) и на Фигуре 2D показано количество выживших облученных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) после проведения обработки нутлином-3а.
Фигуры 3А-В показывают влияние нутлина-3а на выживаемость клеток, старение которых вызвано лечением доксорубицином. На клетки НСА2 действовали нутлином-3а в течение 9 дней (D9), а на эндотелиальные клетки аорты действовали нутлином-3а в течение 11 дней (D11) и затем определяли процент выживаемости. На Фигуре 3А показано влияние нутлина-3а на обработанные доксорубицином (Doxo) стареющие фибробласты крайней плоти (НСА2). На Фигуре 3В показано влияние нутлина-3а на обработанные доксорубицином (Doxo) стареющие эндотелиальные клетки аорты (Endo Aort) (Фигура 3В).
Фигуры 4А-С отражают рост количества нестареющих фибробластов, обработанных нутлином-3а. Клетки обрабатывали нутлином-3а в течение 9 дней и определяли рост количества клеток (D9). Нутлин-3а является нетоксичным в отношении нестареющих фибробластов крайней плоти (Non Sen НСА2), как показано на Фигуре 4А, нетоксичным в отношении нестареющих легочных фибробластов (Non Sen IMR90), как показано на Фигуре 4В, и нетоксичным в отношении мышиных эмбриональных фибробластов (Non Sen MEFs), как показано на Фигуре 4С.
Фигуры 5А-В иллюстрируют рост количества нестареющих эндотелиальных клеток аорты и нестареющих преадипоцитов, обработанных нутлином-3а. На клетки действовали нутлином-3а в течение 11 дней и определяли рост в процентах (D11). Фигурые 5А и 5В показывают, что нутлин-3а является нетоксичным в отношении нестареющих эндотелиальных клеток аорты (Non Sen Endo Aort) и в отношении нестареющих преадипоцитов (Non Sen Pread), соответственно.
На Фигуре 6 представлена схема, отражающая сроки лечения и результаты анализа изображений p16-3MR мышей, обработанных нутлином-3а. На 35 день мышей умерщвляли и собирали жир и кожу для РНК, легкие тоже собирали и быстро замораживали для проведения иммуномикроскопии. РНК анализировали для определения экспрессии факторов SASP (mmp3, IL-6) и маркеров старения (р21, р16 и р53). Замороженную легочную ткань анализировали на маркер повреждения ДНК (γН2АХ).
ARF
На Фигуре 7 показано схематическое изображение трансгенной вставки p16-3MR. 3MR (репортерный тримодальный белок) представляет собой слитый белок, содержащий функциональные домены синтетической люциферазы (LUC) Renilla, мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) и процессированной (усеченной) тимидинкиназы (tTK) вируса простого герпеса (HSV)-1, который предусматривает уничтожение стареющих клеток с использованием ганцикловира (GCV). кДНК 3MR был включен (инсерцирован) в рамку считывания при помощи р16 в экзоне 2, что привело к созданию слитого белка, содержащего первые 62 аминокислоты р16, но не включающего полноразмерный белок р16 дикого типа. Инсерция кДНК 3MR привела также к введению стоп-кодона в рамку считывания p19 в экзоне 2.
Фигура 8 иллюстрирует уменьшение интенсивности люминесценции в случае старения мышей, вызванного обработкой доксорубицином. Самкам мышей линии С57/В16 p16-3MR вводили доксорубицин (DOXO). Интенсивность люминесценции измеряли через 10 дней и использовали в качестве исходной величины для каждой мыши (100%-ная интенсивность). Нутлин-3а (NUT) вводили интраперитонеально каждый день, начиная от дня 10 до дня 24 после обработки доксорубицином (N=9). Затем измеряли интенсивность люминесценции в дни 7, 14, 21, 28, 35 после введения нутлина-3а и рассчитывали конечные величины как % от исходной величины. Контрольным животным (DOXO) вводили равный объем PBS (N=3).
INK4a
Фигуры 9А-Е показывают уровень мРНК эндогенных mmp-3, IL-6, р21, р1 и р53 в коже и жире животных после введения одного доксорубицина (DOXO) или доксорубицина плюс нутлин-3а (DOXO + NUT). Эти величины представляют кратное увеличение индукции конкретной мРНК по сравнению с контрольными мышами. Фигура 9А: р21; Фигура 9В: p16 (р16); Фигура 9С: р53; Фигура 9D: mmp-3 и Фигура 9Е: IL-6. Данные были получены для мышей, которым вводили доксорубицин (Doxo N=3) и доксорубицин плюс нутлин-3а (Doxo + Nutlin N=6).
Фигуры 10А-В отражают данные, показывающие, что нутлин-3а снижает количество клеток с поврежденной после введения доксорубицина ДНК. Фигура 10А показывает результаты иммунофлуресцентной микроскопии срезов долей легкого от мышей, которым вводили доксорубицин (DOXO) (левая панель) и доксорубицин плюс нутлин-3а (DOXO + NUTLIN), выявленные в результате связывания с первичным поликлональным антителом кролика, специфическим против γН2АХ, последующей инкубации со вторым кроличьим антителом и контр-окрашивания с помощью DAPI. На Фигуре 10В показано количество положительных клеток по данным иммунофлуресцентной микроскопии, рассчитанное и представленное как количество в процентах от общего числа клеток. Данные были получены от мышей, которым вводили доксорубицин (Doxo N=3) и доксорубицин + нутлин-3а (Doxo-Nutlin N=3).
Фигура 11 показывает, что введение нутлина-3а привело к снижению интенсивности наработки (SA) β-галактозидазы (β-gal), связанной со старением, при анализе биоптатов жировой ткани от животных, которым вводили вначале доксорубицин. Доксорубицин вводили самкам мышей линии C57/BL6 p16-3MR. Части животных, получивших доксорубицин, вводили нутлин-3а (NUT) или PBS (DOXO) ежедневно от дня 10 до дня 24 после лечения доксорубицином. Через 3 нед. после лечения нутлином-3а мышей умерщвляли, сразу же фиксировали биоптаты жировой ткани и окрашивали их раствором, содержащим X-Gal. Интактных животных использовали в качестве отрицательного контроля (CTRL).
На Фигурах 12А-12С показана детекция продуцирования IL-6 в ядрах нестареющих (NS) клеток и облученных (IR) стареющих клеток, обработанных нутлином-3а. Клетки первичных человеческих фибробластов (IMR90) подвергали облучению на день 6 и обрабатывали 10 мкМ нутлина-3а или DMSO (контроль растворителем) в среде, начиная от дня 0 до дня 9. Клетки культивировали в течение дополнительных 6 дней в среде без нутлина-3а или DMSO (день 12 и день 15). Наличие IL-6 выявляли с помощью антитела к IL-6 в ядре клетки на день 9 и день 12. Количество IL-6 в положительных ядрах каждой из облученных клеток, обработанных нутлином-3а, и в клетках, обработанных DMSO, показано на Фигуре 12А. Интенсивность иммунофлуоресценции клеток, экспрессирующих IL-6, выявленных при помощи антитела к IL-6, показана на Фигуре 12В. Фигура 12С иллюстрирует относительный уровень секреции IL-6 в стареющих клетках, обработанных нутлином-3а (Sen (IR) Nut3a 10 мкМ) или носителем (Sen (IR) DMSO) в дни 9, 12 и 15 (D9, D12, D15, соответственно). Показано кратное увеличение по сравнению с нестареющими клетками (Fold NS, по оси у).
Фигуры 13A-13F иллюстрируют уровень белков, ассоциированных со старением (р21, р16 и IL-1a) и факторов SASP (CXCL-1, IL-6 и IL-8), экспрессированных нестареющими (NS) клетками и облученными стареющими клетками, обработанными нутлином-3а. Клетки IMR90 облучали в день - 6 и обрабатывали 10 мкМ нутлина-3а или DMSO (носителем, контрольные образцы) в среде, с дня 0 до дня 9. Клетки культивировали в течение 6 дней (день 12 и день 15) в среде без нутлина-3а или DMSO, меняя среду на день 12. Проводили количественную ПЦР, и детектировали уровень экспрессии р21 (Фигура 13А, р21/актин, ось у в логарифмической шкале); р16 (Фигура 13В); IL-1a (Фигура 13С); CXCL-1 (Фигура 13D); IL-6 (Фигура 13Е); и IL-8 (Фигура 13F) нестареющими клетками (NS (то есть на день -7)) и на день 9 (d9) и день 12 (d12) экспрессированных стареющими клетками, обработанными нутлином-3а (Sen (IR) Nut3A) или носителем (Sen (IR) DMSO). Показаны данные, касающиеся экспрессии актина.
Фигура 14 представляет результаты метода иммуноблоттинга по определению степени продуцирования белков в стареющих клетках, обработанных нутлином-3а. Клетки IMR90 облучали в день - 6 и обрабатывали нутлином-3а или DMSO (носителем, контрольные образцы) в среде с дня 0 до дня 9. Клетки культивировали в течение 6 дней (день 12 и день 15) в среде без нутлина-3а или DMSO, меняя среду на день 12. Определяли содержание каждого белка, используя коммерчески доступные антитела. Приведены данные для нестареющих клеток (NS) и для стареющих клеток в дни 9, 12 и 15 (Xd9, Xd12 и Xd15, соответственно), культивированных в 10 мкМ нутлина-3а (+) или носителя (-).
На Фигуре 15 показан примерный протокол лечения стареющих (облученных клеток) и нестареющих (необлученных клеток) по результатам определения количества клеток.
На Фигуре 16 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-263 ("Navi") на нестареющие клетки IMR90 (Non Sen IMR90).
На Фигуре 17 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-263 ("Navi") на стареющие клетки IMR90 (Sen IMR90).
На Фигуре 18 показан примерный протокол обработки стареющих (облученных клеток) и нестареющих (необлученных клеток) по результатам анализа определения жизнеспособности клеток (CellTiter-Glo (CTG)).
На Фигуре 19 приведен график, показывающий действие обработки на нестареющие и стареющие клетки при помощи АВТ-263 ("Navi").
На Фигуре 20 приведен график, показывающий действие обработки АВТ-263 на нестареющие и стареющие эпителиальные клетки почки.
На Фигуре 21 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-263 на нестареющие и стареющие фибробласты крайней плоти (клетки НСА2).
На Фигуре 22 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-263 на нестареющие и стареющие легочные фибробласты (клетки IMR90).
На Фигуре 23 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-263 на нестареющие и стареющие преадипоциты.
На Фигуре 24 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-263 на нестареющие и стареющие фибробласты эмбриона мыши (MEF).
На Фигуре 25 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-263 на нестареющие и стареющие гладкомышечные клетки (Smth Mscl).
На Фигуре 26 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-199 на нестареющие и стареющие клетки IMR90.
На Фигуре 27 приведен график, показывающий действие обработки при помощи АВТ-199 на нестареющие и стареющие клетки IMR90.
На Фигуре 28 приведен график, показывающий действие обработки при помощи обатоклакса (Obatoclax) на нестареющие и стареющие клетки IMR90.
Фигура 29А и Фигура 29В: На Фигуре 29А приведен график, показывающий действие обработки на нестареющие и стареющие клетки IMR90 при помощи АВТ-263 (Navi) в комбинации с 10 нм MK-2206. Фигура 29В иллюстрирует выживаемость (в %) нестареющих клеток IMR90 (IMR90 NS) и стареющих клеток IMR90 (IMR90 Sen(IR)), обработанных одним MK-2206.
Фигуры 30А-В иллюстрируют действие WEHI-539 на выживаемость (в %) стареющих облученных легочных фибробластов (Sen(IR)IMR90)) (Фиг. 30А) и выживаемость облученных клеток почки (Sen(IR)) (Фиг. 30В). NS = нестареющие клетки, которые не подвергали облучению.
Фигура 31 показывает, что в присутствии ингибитора каспазы (ингибитор пан-каспазы, Q-VD-OPh) сенолитическая активность WEHI-539 ингибируется. Левая часть Фигуры 31 иллюстрирует действие WEHI-539 на гибель стареющих клеток (IMR90 Sen(IR)). Данные показывают, что в рамке отражено уничтожение стареющих клеток в присутствии WEHI-539 в концентрациях 1.67 мкМ и 5 мкМ, который действовал на нестареющие клетки (NS) и стареющие клетки (Sen (IR)) в присутствии и в отсутствие Q-VC-OPh. Количество выживших нестареющих и стареющих клеток (в %) в присутствии и в отсутствие ингибитора пан-каспазы (Q-VD на Фигуре) показано справа в нижней части Фигуры.
На Фигуре 32 показано влияние специфических молекул шРНК на выживаемость стареющих клеток. Стареющие и нестареющие клетки IMR90 были трансдуцированы лентивирусными векторами, содержащими молекулы кшРНК (короткой шпилечной РНК), специфические к полинуклеотидам, кодирующим каждый из белков BCL-2, BCL-xL и BCL-w. Показано отношение степени выживаемости стареющих клеток к степени выживаемости нестареющих клеток для каждой шРНК. Каждый столбик отражает среднее значение трех измерений. Последовательности кшРНК, введенных в клетки, представлены слева направо следующим образом: BCL-2: SEQ ID NO: 1, 3, 3, 5; BCL-XL: SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13; BCL-w: SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21; два нетрансдуцированных образца (NT).
Фигура 33 иллюстрирует влияние АВТ-737 на жизнеспособность нестареющих легочных фибробластов (клетки IMR90) (IMR90 NS) и нестареющих легочных фибробластов (клетки IMR90) (IMR90 Sen(IR)).
Фигура 34 показывает, что наличие ингибитора каспазы (ингибитора пан-каспазы, Q-VD-OPh) сенолитическая активность АВТ-263 ингибируется. Слева на Фигуре 34 показано влияние АВТ-263 на киллинг стареющих клеток (IMR90 Sen(IR)). Нестареющие клетки (NS) и стареющие клетки (Sen (IR)) подвергали действию АВТ-263 при концентрациях 0.33 мкМ и 1 мкМ в присутствии и в отсутствие ингибитора пан-каспазы, Q-VC-OPh. Количество выживших нестареющих и стареющих клеток (в %) в присутствии и в отсутствие ингибитора пан-каспазы (Q-VD на Фигуре) показано справа в нижней части Фигуры.
На Фигуре 35 представлены результаты исследования по оценке эффективности удаления стареющих клеток при обработке нутлином-3а из организма мышей линии C57BL6/J или при введении GCV из организма мышей линии 3MR с целью ингибирования признаков и развития остеоартрита. Первая группа животных (мыши 16 × C57BL6/J; 1 × 3MR) являлась контрольной группой животных с разрывом передней крестообразной связки (ACL), которые подверглись хирургическому вмешательству для разреза ACL (ACL хирургия или хирургия при остеоартрите (ОА)) на одной задней конечности для индуцирования остеоартрита. Животным первой группы вводили интраартикулярно инъекции носителя (10 мкл) каждый день в течение 5 дней в течение 2 недели после хирургического вмешательства и проводили необязательный второй цикл лечения в течение 4 недели после хирургического вмешательства, параллельно с лечением испытуемых животных при помощи GCV. Животные второй группы (мыши 3 × 3MR) также подвергались хирургическому вмешательству (ACL) и им вводили интраартикулярно инъекции GCV (2.5 мкг/сустав) один раз в день в течение 5 дней во время 2 недели после хирургического вмешательства и проводили необязательный второй цикл лечения во время 4 недели после хирургического вмешательства. Животные третьей группы (мыши 12 × C57BL6/J) также подвергались хирургическому вмешательству (ACL) и им вводили интраартикулярно инъекции нутлина-3A (5.8 мкг/сустав) один раз в день в течение 2 недель, начиная с 3 недели после хирургического вмешательства. Четвертая группа животных представляла собой вторую контрольную группу животных с имитированным хирургическим вмешательством, которые не имели разрезанной ACL и получали интраартикулярные инъекции носителя (10 мкл) два раза в день в течение 5 дней второй недели после хирургического вмешательства и им проводили необязательный второй цикл лечения в течение 4 недели после хирургического вмешательства, параллельно с лечением испытуемых мышей 3MR при помощи GCV. Этот дизайн исследования может быть адаптирован для других сенолитических агентов в отношении дозируемого количества и схемы дозирования (например, количества дней).
Фигура 36 иллюстрирует продолжительность исследования, описанного на Фигуре 35.
Фигуры 37А-С иллюстрируют уровень белков, ассоциированных со старением, (р16) и факторов SASP (IL-6 и ММР13), экспрессированных клетками из суставов мышей, которым делали операцию, вызывающую остеоартрит (ОА хирургия), из суставов мышей, которым делали операцию и вводили нутлин-3A (Nutlin-3А), из суставов мышей, которым делали имитированную (фиктивную) операцию, и из суставов контрольных мышей, которым не делали операцию (контроль). Проводили количественную ПЦР (PCR) и определяли уровни экспрессии р16 (Фигура 37А); IL-6 (Фигура 37В) и ММР13 (Фигура 37С) в клетках из суставов мышей с ОА хирургией, мышей с ОА хирургией, получивших нутлин-3A, мышей с имитированной операцией и контрольных мышей (без операции). Приведены данные относительно экспрессии актина. Полученные данные показывают, что обработка нутлином-3A выводит стареющие клетки из сустава.
Фигура 38 показывает продуцирование коллагена типа 2, экспрессированного клетками из суставов мышей, которым делали операцию, вызывающую остеоартрит (ОА хирургия), из суставов мышей, которым делали операцию и вводили нутлин-3A (Nutlin-3А), из суставов мышей, которым делали имитированную операцию, и из суставов контрольных мышей, которым не делали операцию (контроль). Проводили количественную ПЦР (PCR) и определяли уровни экспрессии р16 (Фигура 37А); IL-6 (Фигура 37В) и ММР13 (Фигура 37С) в клетках из суставов мышей с ОА хирургией, мышей с ОА хирургией, получивших нутлин-3A, мышей с имитированной операцией и контрольных мышей (без операции). Приведены данные относительно экспрессии актина. Полученные данные показывают, что обработка нутлином-3A обусловливает продуцирование коллагена ab initio в суставах, пораженных остеоартритом ОА.
Фигура 39 иллюстрирует результаты проверки функции конечностей (лап) через 4 недели после оперативного вмешательства ОА с помощью теста с нагрузкой на лапу, чтобы определить, какую лапу мыши предпочитали. Мыши передвигались внутри камеры, ставя одну заднюю лапу на каждую чашу весов. Вес, приходящийся на каждую заднюю лапу, измеряли в течение 3 секунд. Для каждого животного в каждой временной точке делали по меньшей мере 3 отдельных измерения, результаты выражали в виде процентов от веса, приходящегося на оперированную лапу, в сравнении с контралатеральной (противоположной) неоперированной лапой
На Фигуре 40 показаны результаты теста с нагрузкой на лапу, показанного на Фигуре 39. Непролеченные мыши, которые перенесли операцию, вызывающую остеоартрит, оперированной задней лапе предпочитали неоперированную заднюю лапу (Δ). Освобождение от стареющих клеток с помощью нутлина-3A подавляет этот эффект у мышей, которые перенесли хирургическое вмешательство ().
На Фигуре 41 показаны результаты теста "горячая пластина", чтобы показать чувствительность и реакцию на болевой раздражитель через 4 недели после операции, (ОА хирургия). Мышей помещали на горячую пластину при 55°С. Когда мышей помещают на горячую поверхность пластины, они поднимают лапы и лижут их (реакция лизания лапы), так как достигнут болевой порог. Скрытый период для реакции задней лапы (реакция лизания лапы) регистрировали как время реакции (в секундах) Данные показывают, что обработка нутлином-3A снижает время реакции у прооперированных мышей () по сравнению со здоровыми мышами, у которых не было хирургических изменений ().
Фигура 42 отражает результаты гистопатологии для животных, которым не проводили операцию (мыши С57В)); животных, которым проводили операцию, вызвавшую остеоартрит и получивших носитель (ОА хирургия (3MR)); и животных, которым проводили ОА хирургию и вводили нутлин-3а (ОА хирургия + Nutlin-3а). Стрелки показывают наличие целых и разрушенных слоев протеогликанов в суставе.
-/-
-/-
-/-
Схематическое изображение двух мышиных моделей атеросклероза для LDLRтрансгенных мышей, которых держали на диете с высоким содержанием жира (HFD), представлены на Фигурах 43А-В. Исследование, показанное на Фигуре 43А, показывает степень, до которой клиренс стареющих клеток из бляшек у LDLR мышей, которым вводили сенолитический агент (например, нутлин-3а), снижает "бляшечную нагрузку". Исследование, показанное на Фигуре 43В, показывает степень, до которой клиренс стареющих клеток из бляшек после введения ганцикловира у LDLR /3MR двойных трансгенных мышей улучшает предсуществующее атерогенное заболевание.
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Фигуры 44A-D показывают графики, отражающие уровни липидов в плазме (крови) определяли у LDLR мышей, которые получали HFD, после одного цикла введения нутлина-3а или носителя. На Фигуре 44А показан уровень общего холестерина у LDLR мышей, получавших нутлин-3а, по сравнению с LDLR, которым давали не-HFD (нормальный корм). На Фигуре 44В показан уровень HDL у мышей LDLR, которые получали носитель или нутлин-3а, по сравнению с LDLR, которым давали не-HFD. На Фигуре 44С показан уровень триглицеридов у мышей LDLR, которые получали носитель или нутлин-3а по сравнению с LDLR, которым давали не-HFD. На Фигуре 44D показан уровень vLDL/LDL/IDL у мышей LDLR, которые получали носитель или нутлин-3а по сравнению с LDLR, которым давали не-HFD.
-/-
-/-
Фигуры 45A-D иллюстрируют результаты RT-PCR (ПЦР с обратной транскриптазой) по определению содержания факторов SASP и маркеров старения в дугах аорты у LDLR мышей, получавших HFD, после одного курса лечения нутлином-3а или носителем. На Фигуре 45А показана дуга аорты (в прямоугольнике). На Фигурах 45В-С показаны уровни экспрессии факторов SASP и маркеров старения, нормализованных по GAPDH и выраженных как кратность изменения по сравнению с LDLR мышами-ровесниками (подобранными по возрасту), которые получали носитель и сидели на нормальной диете. На Фигуре 45D показаны данные, приведенные на Фигурах 45В-С, в цифровом виде.
-/-
-/-
Фигуры 46А-С иллюстрируют результаты RT-PCR (ПЦР с обратной транскриптазой) по определению содержания факторов SASP и маркеров старения в дугах аорты у LDLR мышей, получавших HFD, после двух курсов введения нутлина-3а или носителя. На Фигурах 46А-В показаны уровни экспрессии факторов SASP и маркеров старения, нормализованных по GAPDH и выраженных как кратность изменения по сравнению с LDLR мышами-ровесниками, которые получали носитель и сидели на нормальной диете. На Фигуре 45С показаны данные, приведенные на Фигурах 45А-В, в цифровом виде.
-/-
На Фигурах 47А-С показаны результаты окрашивания бляшек в аорте у LDLRмышей, которым давали корм HFD, после трех циклов введения нутлина-3A или носителя. На Фигуре 47А показана аорта. На Фигуре 47В показана площадь поверхности аорты, покрытой бляшками (в %). На Фигуре 47С показано окрашивание аорты суданом IV для визуализации бляшек, и поверхность, покрытая липидными бляшками, выраженная в процентах от общей площади поверхности аорты в каждом образце.
-/-
На Фигурах 48А-В приведено число тромбоцитов (Фигура 48А) и лимфоцитов (Фигура 48В) у мышей LDLR, которым давали корм HFD после трех циклов введения нутлина-3а или носителя.
-/-
Фигуры 49А-В показаны результаты определения массы и композиции телесного жира в жировой/нежировой ткани (%), соответственно, для LDLR мышей, которым давали HFD корм, после трех циклов введения нутлина-3а или носителя.
-/-
-/-
На Фигуре 50 приведен график, показывающий влияние клиренса стареющих клеток с помощью ганцикловира для LDLR и LDLR/3MR мышей, которым давали корм HFD, выраженного в % % (поверхности) аорты, покрытой бляшками.
-/-
-/-
На Фигуре 51 приведен график, показывающий влияние клиренса стареющих клеток с помощью ганцикловира для LDLR и LDLR/3MR мышей, которым давали корм HFD, выраженного как площадь поперечного сечения аорты, покрытой бляшками.
На Фигуре 52 показано влияние клиренса стареющих клеток на устойчивость к кардиострессу со старением. В возрасте 12 месяцев INK-ATTAC мышам на смешанном FVB × 129Sv/E × C57BL/6 или на чистом C57BL/6 генетическом фоне три раза в неделю вводили инъекции АР20187 (0.2 мг/кг группе смешанных мышей и 2 мг/кг чистым мышам C57BL/6, соответственно). В возрасте 18 месяцев для субпопуляций самцов и самок из каждой группы проводили кардиологический стресс-тест и фиксировали время до остановки сердца. Контрольная группа получала инъекции носителя.
На Фигуре 53 показаны результаты RT-PCR по определению экспрессии Sur2a у самок трансгенных мышей INK-ATTAC, описанных на Фигуре 52.
-/-
-/-
-/-
-/-
Фигуры 54А-С показывают результаты окрашивания бляшек в аорте для двойных трансгенных мышей LDLR/3MR и контрольных мышей LDLR, получавших корм HFD после введения ганцикловира в течение 100 дней. На Фигурах 54А-В показано окрашивание суданом IV аорты для визуализации бляшек у контрольных мышей LDLR и мышей LDLR/3MR, соответственно. На Фигуре 54С показана площадь поверхности аорты в % %, покрытой бляшками, по результатам окрашивания суданом IV.
-/-
-/-
-/-
-/-
На Фигурах 55A-D приведены результаты морфологического анализа бляшек у двойных трансгенных мышей LDLR/3MR и контрольных мышей LDLR, получавших корм HFD, после введения ганцикловира в течение 100 дней. На Фигурах 55А и С показано окрашивание аорты для визуализации бляшек у контрольных мышей LDLR и мышей LDLR/3MR, соответственно. Бляшки, показанные в кружочках, собирали и разрезали в поперечном направлении и окрашивали для характеристики архитектуры атеросклеротических бляшек (Фигуры 55В и D). Знак "#" показывает наличие жира, локализованного на наружной поверхности аорты.
Фигура 56 показывает, что кристаллы SA-β-GAL локализуются на содержащих липиды пенистых клетках атеросклеротической артерии у мыши, получавшей корм с высоким содержанием жира. Пенистая клетка макрофага показана белой пунктирной линией, с ней рядом расположена пенистая гладкомышечная клетка. Левая, находящаяся в прямоугольнике часть пенистой клетки макрофага увеличена и показана в верхней правой части Фигуры, иллюстрируя лизосомы с кристаллами SA-β-GAL. Находящаяся в прямоугольнике часть пенистой гладкомышечной клетки увеличена и показана внизу в правой части указанной Фигуры.
Фигура 57 показывает пенистую клетку макрофага атеросклеротической артерии у мыши, получавшей корм с высоким содержанием жира. Содержащие липиды лизосомы, включающие кристаллы SA-β-GAL, отмечены стрелками. Фигура 58 показывает, что кристаллы SA-β-GAL локализуются в лизосомах гладкомышечных клеток в атеросклеротической артерии мыши, получавшей корм с высоким содержанием жира. Находящаяся в прямоугольнике нижняя левая часть Фигуры увеличена и показана во вставке в верхней левой части.
2
Фигура 59 отражает влияние клиренса стареющих клеток на насыщение периферических капилляров кислородом (SpO) у мышей, которым вводили блеомицин.
Фигуры 60А-С иллюстрируют влияние клиренса стареющих клеток после введения ганцикловира на функцию легкого у мышей 3MR, которым ввели блеомицин (bleo). Фигура 60А показывает влияние введения ганцикловира на эластичность легкого у мышей 3MR, которым ввели блеомицин. Фигура 60В показывает влияние введения ганцикловира на динамическую растяжимость легкого у мышей 3MR, которым ввели блеомицин. Фигура 60С показывает влияние введения ганцикловира на статическую растяжимость легкого у мышей 3MR, которым ввели блеомицин.
2
Фигура 61 отражает влияние клиренса стареющих клеток на насыщение периферических капилляров кислородом (SpO) у мышей, после действия дыма от сигарет (CS) в течение 2 месяцев и 4 месяцев. АР = АР20187; GAN = ганцикловир; Navi = навитоклакс (АВТ-263) и нутлин = нутлин-3а.
Фигура 62 иллюстрирует влияние RG-7112 (структура показана в верхней части Фигуры 62) на выживаемость стареющих облученных фибробластов легкого на примере клеток IMR90 ((IMR90)Sen(IR)) и нестареющих клеток IMR90, которые не подвергались облучению (IMR90 NS) после трех дней лечения (внизу слева) и после шести дней лечения посредством RG-7112 (внизу справа).
Фигуры 63А-В показывают, что паклитаксел индуцирует старение мышей р16-3MR. Группе мышей (n=4) вводили паклитаксел или носитель с дозой 20 мг/кг три раза каждые два дня. Уровень люминесценции у мышей, которым вводили паклитаксел, показан на Фигуре 63А. Уровень мРНК в коже определяли для каждого из целевых генов: р16, трансгена 3MR и IL-6 у животных, которым вводили паклитаксел, как показано на Фигуре 63В.
Фигура 64 показывает влияние АВТ-263 на мышей, которым сначала вводили паклитаксел. Схематически эксперимент, проведенный на мышах 3MR показан в правой частим этой Фигуры. Мышам вначале вводили паклитаксел с последующим введением или носителя, ганцикловира (GCV) или АВТ-263. Измеряли число оборотов колеса для каждой группы мышей (n=4), которой вводили паклитаксел + носитель (pacli + vehicle); паклитаксел + ганцикловир (pacli + gcv); паклитаксел + АВТ-263 (pacli + АВТ-263); и для контрольных животных, которым не вводили паклитаксел (см. график в левой части Фигуры 64).
На Фигуре 65 показан уровень старения, индуцированного в группах мышей р16-3MR (n=4), которых лечили химиотерапевтическими лекарствами: талидомидом (100 мг/кг; 7 ежедневных инъекций); ромидепсином (1 мг/кг; 3 инъекции); помалидомидом (5 мг/кг; 7 ежедневных инъекций); леналидомидом (50 мг/кг; 7 ежедневных инъекций); 5-азацитидином (5 мг/кг; 3 инъекции) и доксорубицином (10 мг/кг; 2-4 инъекции в течение недели). Измеряли уровень люминесценции у животных, которым ввели лекарства.
Фигура 66 показывает результаты проведения иммуноблоттинга различных клеточных белков в стареющих и нестареющих абдоминальных подкожных преадипоцитах человека. Старение индуцировали, как описано в Примере 28. Лизаты были приготовлены в нескольких временных точках после индуцирования старения, и уровень каждого белка определяли в лизатах через 24 ч и в дни 3, 5, 8, 11, 15, 20 и 25 (D3, D5, D8, D11, D15, D20 и D25).
Фигура 67 показывает, что у группы мышей p16-3MR (n=6), получавших корм с высоким содержанием жира (большое содержание жира) в течение четырех месяцев, наблюдалось повышенное количество стареющих клеток по сравнению с мышами, которые питались нормальным кормом (n=6).
Фигура 68 иллюстрирует уменьшение стареющих клеток в адипозной (жировой) ткани мышей p16-3MR, получавших корм с высоким содержанием жира (большое содержание жира) в течение четырех месяцев и получавших затем ганцикловир, по сравнению с мышами, получавшими носитель. Наличие стареющих клеток в периренальной, эпидимальной, (Epi) или ингвальной (Ing) адипозных тканях было выявлено путем окрашивания SA-β-Gal.
Фигуры 69А-С показывают влияние лечения ганцикловиром на переносимость глюкозы мышами р16-3MR, получавшими корм с высоким содержанием жира. В момент времени 0 вводили болюс глюкозы и осуществляли мониторинг содержания глюкозы в крови в течение периода до 2 ч для определения эффективности утилизации глюкозы (Фигура 69А). Этот показатель выражается как площадь под кривой (AUC), большое значение AUC свидетельствует о непереносимости глюкозы. Результаты теста на переносимость глюкозы (GTT) (AUC's) для мышей, которых лечили ганцикловиром, показаны на Фигуре 69В. Содержание гемоглобина A1c показано на Фигуре 69С. n=9; ANOVA.
Фигуры 70А-70В показывают чувствительность к инсулину (тест на переносимость инсулина (ITT)) у мышей p16-3MR, получавших корм с высоким содержанием жира, после введения ганцикловира. Содержание глюкозы в крови измеряли в моменты 0, 14, 30, 60 и 120 минут после введения болюса глюкозы в момент времени 0 (см. Фигуру 70А). При введении ганцикловира мышам дикого типа изменения переносимости инсулина не наблюдалось (см. Фигуру 70В).
Фигура 71 иллюстрирует влияние А-1155463 на выживаемость стареющих клеток (облученных легочных фибробластов (Sen(IR)IMR90)) и выживаемость нестареющих клеток IMR90 (Sen(IR)). NS = нестареющие клетки, которые не подвергались облучению.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Старение является фактором риска возникновения большинства хронических заболеваний, потери трудоспособности и ухудшения здоровья. Стареющие клетки, которые являются клетками репликативного старения, аккумулируются с возрастом и могут вносить частичный или значительный вклад в ухудшение состояния клеток и тканей, которое лежит в основе старения и заболеваний, связанных с возрастом. Клетки могут также становиться стареющими после воздействия климатического, химического или биологического факторов, или в результате заболеваний. Данное изобретение предусматривает способы и агенты для селективного уничтожения стареющих клеток, которые ассоциируются с многочисленными патологиями и заболеваниями, включая патологии и заболевания, связанные со старением. Как описано в данной заявке, заболевания или расстройства, ассоциированные со старением клеток, можно лечить или предотвращать (то есть уменьшать вероятность возникновения или развития) путем введения по меньшей мере одного сенолитического агента. Заболевания или расстройства, ассоциированные со старением клеток, подвергающиеся лечению или профилактике, включают сердечно-сосудистое заболевание или расстройство, воспалительное заболевание или расстройство, легочное заболевание или расстройство, неврологическое заболевание или расстройство, дерматологическое заболевание или расстройство, побочный эффект от применения химиотерапии, побочный эффект от применения радиотерапии или метастазирование, или метаболическое заболевание, все из которых описаны более подробно в данной заявке. Согласно некоторым вариантам заболевания или расстройства, ассоциированные со старением клеток, подвергающиеся лечению или профилактике, включают, например, идиопатический легочный фиброз (IPF), хроническую обструктивную болезнь легких (COPD, ХОБЛ), остеоартрит и сердечнососудистое заболевание или расстройство, ассоциированное с атеросклерозом, такое как атеросклероз. Согласно некоторым вариантам заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, не является раковым заболеванием. Как описано более подробно в данной заявке, сенолитические агенты включают, например, ингибиторы MDM2 (например, нутлин-3а, RG-7112); ингибиторы одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, которые ингибируют функцию по меньшей мере антиапоптотического белка BCL-xL (например, АВТ-263, АВТ-737, WEHI-539, А-1155463); и Akt-специфические ингибиторы (например, MK-2206).
Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, являются достаточными для уничтожения значительного количества стареющих клеток. Даже хотя клетки продолжают становиться стареющими у субъекта, подвергающегося лечению, установление старения, такого как показанное наличием секреторного фенотипа, ассоциированного со старением (SASP), возникает через несколько дней (см., например, Laberge et al., Aging Cell 11: 569-78 (2012); Coppe et al., PLoS Biol 6: 2853-68 (2008); Coppe et al. PLoS One 5: 39188 (2010); Rodier et al., Nat. Cell Biol. 11: 973-979; Freund et al., EMBO J. 30: 1536-1548 (2011)). Следовательно, применение сенолитических агентов, описанных в данной заявке, дает преимущество, заключающееся в том, что эти агенты могут вводиться не так часто, с перерывами и/или с меньшей дозой, чем многие терапевтические агенты, обычно используемые для лечения этих заболеваний и расстройств. Способы, описанные в данной заявке, предусматривают применение таких агентов в качестве сенолитических агентов, которые могут вводиться не так часто, с перерывами и/или с меньшей дозой, чем многие терапевтические агенты, обычно используемые для лечения раковых и других заболеваний.
СЕНОЛИТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ
Сенолитический агент, используемый согласно данному изобретению, представляет собой агент, который "селективно" (предпочтительно или в большей степени) разрушает, уничтожает, удаляет стареющие клетки или облегчает их селективную деструкцию. Другими словами, сенолитический агент разрушает или уничтожает стареющую клетку биологически, клинически и/или статистически значимым образом по сравнению с его способностью разрушать или уничтожать нестареющую клетку. Сенолитический агент используется в количестве и в течение промежутка времени, достаточных для селективного уничтожения стареющей клетки, но не достаточных для уничтожения (разрушения, гибели) нестареющей клетки биологически, клинически и/или статистически значимым образом. Согласно некоторым вариантам сенолитические агенты, описанные в данной заявке, изменяют по меньшей мере один сигнальный путь таким образом, который индуцирует (инициирует, стимулирует, запускает, активирует, активирует) гибель и приводит к (то есть вызывает, ведет к) гибели стареющей клетки. Сенолитический агент может менять, например, или один или оба пути из сигнального пути выживаемости клеток (например, сигнального пути Akt) или воспалительного сигнального пути, например, вызывая антагонизм белка внутри сигнального пути выживаемости клеток и/или воспалительного сигнального пути в стареющей клетке.
Не основываясь на какой-либо конкретной теории, можно предположить, что механизм, по которому ингибиторы и антагонисты, описанные в данной заявке, селективно уничтожают стареющие клетки, состоит в индуцировании (активировании, стимулировании, устранении ингибирования) апоптотического пути, который приводит к гибели клеток. Нестареющие клетки могут быть пролиферирующими клетками или могут быть покоящимися клетками. В некоторых случаях воздействие сенолитического агента, применяемого в способах, описанных в данной заявке, на нестареющие клетки может временно снизить способность нестареющих клеток к пролиферации; однако, апоптотический путь не индуцируется, и нестареющая клетка не разрушается.
Некоторые сенолитические агенты, которые могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке, были описаны как пригодные для лечения ракового заболевания; однако, при осуществлении способов лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, сенолитические агенты вводятся таким образом, который считается отличающимся и, вероятно, неэффективным при лечении ракового заболевания. Способ, используемый для лечения заболевания или расстройства при помощи сенолитического агента, описанного в данной заявке, может включать введение одной или более сниженных дневных доз, сниженной кумулятивной дозы в течение одного цикла лечения, или сниженной кумулятивной дозы агента в течение многих циклов лечения по сравнению с дозой агента, требующейся для лечения ракового заболевания; следовательно, уменьшается вероятность возникновения одного или более неблагоприятных эффектов (то есть побочных эффектов), которые связаны с лечением субъекта по схеме лечения, оптимизированной для лечения ракового заболевания. В противоположность этому, сенолитический агент, описанный в данной заявке, может вводиться с меньшей дозой, чем дозы, описанные в предшествующем уровне техники, или таким способом, который приводит к селективному уничтожению стареющих клеток (например, при периодическом дозировании). Согласно некоторым вариантам сенолитические агенты, описанные в данной заявке, могут вводиться с меньшей кумулятивной дозой во время курса лечения или цикла лечения, которая, вероятно, будет недостаточно цитотоксической по отношению к раковым клеткам для эффективного лечения рака. Другими словами, в соответствии со способами, описанными в данной заявке, сенолитический агент не используется таким образом, который был бы понятен специалисту в данной области, в качестве первичной терапии для лечения рака, причем такой агент вводится в отдельности или вместе с одним или более дополнительными химиотерапевтическими агентами или радиотерапией для лечения рака. Даже если агент, используемый в способах, описанных в данной заявке, не применяется таким образом, что это достаточно для осуществления первичной терапии, способы и комбинации сенолитических агентов, описанных в данной заявке, могут быть использованы таким образом (например, проводится короткий курс терапии), который полезен для ингибирования метастазирования. Термин "первичная терапия для ракового заболевания", используемый в данной заявке, означает, что агент, который может применяться в отдельности или вместе с одним или более другими агентами, предназначен или известен для эффективного лечения рака. Как это установлено специалистом в области медицины или онкологии, протоколы введения агента для лечения рака были разработаны для достижения релевантных ожидаемых результатов. Для дальнейшего снижения токсичности сенолитический агент можно вводить в месте, ближайшем к стареющим клеткам или контактирующем со стареющими клетками (не опухолевыми клетками). Локализованная доставка сенолитических агентов описана далее более подробно.
Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, изменяют (то есть вмешиваются, влияют) один или более путей клеточной сигнализации, которые активируются во время процесса старения клетки. Сенолитические агенты могут менять или сигнальный путь выживаемости клеток (например, сигнальный путь Akt) или воспалительный сигнальный путь, или оба этих пути в стареющей клетке. Активация некоторых клеточных сигнальных путей во время старения снижает или ингибирует способность клетки к индуцированию и в конечном счете способность подвергаться апоптозу. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно предположить, что механизм, по котором сенолитический агент селективно уничтожает стареющие клетки заключается в индуцировании (активации, стимулировании, устранении ингибирования) апоптотического пути, который приводит к гибели клеток. Сенолитический агент может менять один или более сигнальных путей в стареющей клетке путем взаимодействия с одним, двумя или более целевыми белками в одном или более сигнальных путях, что приводит к устранению или уменьшению подавления гибели клетки, например, апоптотического пути. Контактирование сенолитического агента со стареющей клеткой или его воздействие на стареющую клетку для изменения одного, двух или более клеточных сигнальных путей в стареющей клетке может восстановить клеточные механизмы и сигнальные пути для инициирования апоптоза. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент представляет собой агент, который меняет сигнальный путь в стареющей клетке, что в свою очередь ингибирует секрецию и/или экспрессию одного или более генных продуктов, важных для выживаемости стареющей клетки. Сенолитический агент может ингибировать биологическую активность генного продукта(-ов), важного (важных) для выживаемости стареющей клетки. Альтернативно, снижение или восстановление уровня генного продукта(-ов) в стареющей клетке может менять биологическую активность другого клеточного компонента, который запускает, инициирует, активирует или стимулирует апоптотический путь или устраняет, или уменьшает подавление апоптотического пути. Как описано в данной заявке, сенолитические агенты представляют собой биологически активные агенты и способны к селективному уничтожению стареющих клеток в отсутствие связывания или сопряжения с цитотоксическим веществом (например, токсином или цитотоксическим пептидом, или цитотоксической нуклеиновой кислотой). Сенолитические агенты также являются активными в процессе селективной гибели стареющих клеток в отсутствие связывания или сопряжения с целевым веществом (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом; пептидом, связывающим клетку), которое селективно связывается со стареющими клетками.
Могут различаться два альтернативных процесса гибели клеток, апоптоз и некроз. Термин "апоптоз" впервые был использован Kerr и его коллегами (Br. J. Cancer 26: 239-57 (1972)) для описания явления как вида гибели клеток, морфологически отличающегося от коагуляционного некроза. Апоптоз обычно характеризуется округлением клетки, конденсацией хроматина (пикнозом), ядерной фрагментацией (кариорексисом) и поглощением соседних клеток (см., например, Kroemer et al., Cell Death Differ. 16: 3-11 (2009)). Были разработаны несколько методов молекулярного анализа, которые использовали в уровне техники; однако, морфологические изменения, которые выявляются при помощи света и электронной микроскопии, в уровне техники рассматривались как оптимальные методики для дифференциации двух различных процессов гибели клеток (см., например, Kroemer et al., supra). Были также охарактеризованы альтернативные процессы гибели клеток, такие как независимая от каспаз апоптозоподобная запрограммированная гибель клеток (PCD), аутофагия, некрозоподобная PCD и митотическая гибель (см., например, Golstein, Biochem. Sci. 32: 37-43 (2007); Leist et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 589-98 (2001)). См. также, например, Caruso et al., Rare Tumors 5(2): 68-71 (2013); опубликована он-лайн, 7 июня 2013 г doi: 10.3081/rt.2013.e18. Методики и методы, обычно используемые в уровне техники, и описанные в данной заявке (например, TUNEL), могут быть использованы для демонстрации того, что апоптотическая гибель клеток возникает при контакте с сенолитическими агентами, описанными в данной заявке.
Согласно некоторым вариантам сенолитический агент, используемый в способах, описанных в данной заявке, представляет собой соединение с малыми молекулами (низкомолекулярное соединение). Эти сенолитические агенты, которые имеют малые молекулы, можно также назвать сенолитическими соединениями. Согласно некоторым вариантам, сенолитические агенты, которые имеют малые молекулы, включают агенты, которые активированы или являются пролекарствами и которые превращаются в активную форму под действием ферментов внутри клетки. Согласно другому конкретному варианту ферменты, которые превращают пролекарство в активную сенолитическую форму, являются ферментами, которые экспрессированы с более высоким уровнем в стареющих клетках, чем в нестареющих клетках.
Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, которые могут менять по меньшей мере один сигнальный путь, включают агент, который ингибирует активность по меньшей мере одного из целевых белков сигнального пути. Сенолитический агент может быть специфическим ингибитором одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, при этом этот ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-xL (например, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w; селективный ингибитор Bcl-xL; ингибитор Bcl-xL/Bcl-w); специфический ингибитор киназы Akt; или ингибитор MDM2. Согласно некоторым вариантам соединения, такие как кверцетин (и его аналоги), энзастаурин и дасатиниб, исключаются и не являются соединениями, которые используются в способах и композициях, описанных в данной заявке. Согласно другим конкретным вариантам способы включают применение по меньшей мере двух сенолитических агентов, при этом по меньшей мере один сенолитический агент и второй сенолитический агент каждый по-разному и независимо меняют идя один, или оба сигнальных путей, пути выживаемости клеток и воспалительного сигнального пути в стареющей клетке.
Малые молекулы
5
4
3
Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, которые могут быть использованы в способах лечения или профилактики заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, включают малые органические молекулы (низкомолекулярные соединения). Малые органические молекулы (называемые также малыми молекулами или соединениями с малыми молекулами) имеют молекулярную массу менее 10 Дальтон, менее 10 Дальтон или менее 10 Дальтон. Согласно некоторым вариантам низкомолекулярный сенолитический агент (малые молекулы) отвечает по меньшей мере трем из следующих критериев: (1) не более 5 доноров водородной связи (общее количество связей азот-водород и кислород-водород; (2) не более 10 акцепторов водородной связи (все атомы азота или кислорода); (3) молекулярная масса менее 500 Дальтон; (4) логарифм log P коэффициента распределения октанол-вода не более 5.
Ингибиторы MDM2
Согласно некоторым вариантам сенолитический агент может быть ингибитором MDM2. Ингибитор MDM2 (белок мышиный двойной мелкий 2), который может быть использован в способах селективного уничтожения стареющих клеток и лечения или профилактики (то есть сокращения и уменьшения вероятности возникновения и развития) заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, может представлять собой соединение с малыми молекулами, которое принадлежит к любому из следующих классов соединений, например, он может представлять собой цис-имидазолиновое соединение, спиро-оксииндоловое соединение, бенздиазепин, пиперидиноновое соединение, триптамин и CGM097 и родственные аналоги. Согласно некоторым вариантам ингибитор MDM2 также способен к связыванию с MDMX (белком мышиным двойным мелким X, который также известен как HDMX у людей) или к ингибированию активности MDMX. Человеческий гомолог MDM2 в уровне техники называется HDM2 (белок человеческий двойной мелкий 2). Следовательно, когда субъект подвергается лечению с применением способов, описанных в данной заявке, соединения, описанные в данной заявке как ингибиторы MDM2, ингибируют также связывание HDM2 с одним или более его лигандами.
В уровне техники MDM2 описан как Е3 убиквитинлигаза, которая может промотировать образование опухоли путем целевого воздействия на белки-супрессоры опухолевого роста, такие как р53, для протеасомальной деградации при помощи 26S протеасомы (см., например, Haupt et al. Nature 387: 296-299 1997; Honda et al., FEBS Lett 420; 25-27 (1997); Kubbutat et al., Nature 387: 299-303 (1997)). MDM2 также воздействует на белок р53 путем прямого связывания с N-концевым фрагментом р53, что ингибирует активацию транскрипционных функций р53 (см., например, Momand et al., Cell 69: 1237-1245 (1992); Oliner et al., Nature 362: 857-860 (1993)). MDM2 в свою очередь регулируется р53; ответные элементы р53 находятся в промоторе гена Mdm2 (см., например, Barak et al., ЕМВО J 12: 461-68 (1993)); Juven et al., Oncogene 8: 3411-16 (1993)); Perry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11623-27 (1993)). Существование этой петли отрицательной обратной связи между р53 и Mdm2 было подтверждено при изучении отдельных клеток (см., например, Lahav, Exp. Med. Biol. 641: 28-38 (2008)). См. также Manfredi, Genes & Development 24: 1580-89(2010).
В ряде сообщений описаны несколько видов активности и биологические функции MDM2. Эти виды активности включают следующее: он действует как Е3 убиквитинлигаза в отношении себя и ARRB1; допускает экспорт 53 из ядра; промотирует зависимую от протеасомы и не зависимую от убиквитина деградацию белка RB1 ретинобластомы; ингибирует DAXX-опосредованный апоптоз путем индуцирования его убиквитинации и деградации; является компонентом комплекса TRIM28/KAP1-MDM2-p53, участвующего в стабилизации р53; является компонентом комплекса TRIM28/KAP1-ERBB4-MDM2, который соединяет фактор роста и сигнальные пути в ответ на повреждение ДНК; опосредует убиквитинацию и последующую протеасомную деградацию DYRK2 в ядре; обеспечивает убиквитинацию IGF1R и SNAI1 и стимулирует их протеасомную деградацию. Сообщалось также, что MDM2 индуцирует моноубиквитинацию фактора транскрипции FOXO4 (см., например, Brenkman et al., PLOS One 3(7): e2819, doi:10.1371/joumal.pone.0002819). Ингибиторы MDM2, описанные в данной заявке, могут разрушать взаимодействие между MDM2 и любым одним или несколькими вышеупомянутыми клеточными компонентами.
Согласно одному из вариантов соединение, используемое в способах, которые описаны в данной заявке, представляет собой низкомолекулярный ингибитор, цис-имидазолин, включающий соединения, называемые в уровне техники нутлинами. Подобно другим ингибиторам MDM2, описанным в данной заявке, нутлины представляют собой ингибиторы цис-имидазолины с малыми молекулами, обеспечивающие взаимодействие между MDM2 и р53 (см. Vassilev et al., Science 303 (5659): 844-48 (2004)). Примеры цис-имидазолинов, которые могут быть использованы в способах селективного уничтожения стареющих клеток и лечения или профилактики (то есть сокращения или уменьшения вероятности возникновения и развития) заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, описаны в патентах США №№6,734,302; 6,617,346; 7,705,007 и в опубликованных заявках США на патент №№2005/0282803; 2007/0129416; 2013/0225603. Согласно некоторым вариантам при осуществлении способов, описанных в данной заявке, используют нутлин, называемый нутлином-1; или нутлин, называемый нутлином-2; или нутлин, называемый нутлином-3 (см. регистрационные номера CAS №675576-98-4 и №548472-68-0). Активный энантиомер нутлина-3 (4-[[4S,5R)-4,5-бис(4-хлорфенил)-4,5-дигидро-2-[4-метокси-2-(1-метилэтокси)фенил]-1Н-имидазол-1-ил]карбонил]-2-пиперазинонон) в уровне техники называется нутлином-3а. Согласно некоторым вариантам способы, описанные в данной заявке, предусматривают использование нутлина-3а для селективного уничтожения стареющих клеток.
В предшествующем уровне техники нутлин-3 описан как негенотоксический активатор сигнального пути р53, и активация р53 регулируется геном белка мышиного двойного мелкого 2 (MDM2). Белок MDM2 является Е3 убиквитинлигазой и регулирует период полужизни р53 путем убиквитин-зависимой деградации. Нутлин-3а изучали при проведении доклинических исследований (например, в случае педиатрического рака) и клинических исследований при лечении некоторых раковых заболеваний (например, ретинобластомы). К настоящему времени in vitro исследования и доклинические исследования с применением нутлина-3 позволили предположить, что это соединение оказывает различное биологическое действие на функцию клеток, на которые оно воздействовало. Например, по имеющимся сведениям, нутлин-3 повышает уровень апоптоза раковых клеток в гематологических злокачественных опухолях, включая В-клеточные злокачественные опухоли (см., например, Zauli et al., Clin. Cancer Res. 17: 762-70 (2011; он-лайн публикация, 24 ноября 2010 г. и ссылки, приведенные в ней) и в комбинации с другими химиотерапевтическими лекарствами, такими как дасатиниб, обеспечивает синергический цитотоксический эффект (см., например, Zauli et al., supra).
Другим примером цис-имидазолина с малыми молекулами, пригодного для селективного уничтожения стареющих клеток, является RG-7112 (Roche) (регистрационный номер CAS: 939981-39-2; название по номенклатуре IUPAC: ((4S,5R)-2-(4-(трет.бутил)-2-этоксифенил)-4,5-бис(4-хлорфенил)-4,5-диметил-4,5-дигидро-1Н-имидазол-1-ил)(4-(3-(метилсульфонил)пропил)типеразин-1-ил)метанон. См. патент США №7,851,626; Tovar et al., Cancer Res. 72: 2587-97 (2013).
Согласно другому конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой цис-имидазолин, называемый RG7338 (Roche) (название по номенклатуре IPUAC: 4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-хлор-2-фторфенил)-4-(4-хлор-2-фторфенил)-4-циано-5-неопентилпирролидин-2-карбоксамидо)-3-метоксибензойная кислота) (регистрационный номер CAS: 1229705-06-9); Ding et al., J. Med. Chem. 56(14): 5979-83. Doi: 10.1021/jm400487c. Epub 2013 Jul 16; Zhao et al., J. Med. Chem. 56(13): 5553-61 (2013) doi: 10.1021/jm4005708. Epub 2013 Jun 20). Еще одним примером нутлинового соединения является RO5503781. Другие активные цис-имидазолины с малыми молекулами включают дигидроимидазолтиазолы (например, DS-3032b; Daiichi Sankyo), описанный Miyazaki, (см., например, Miyazaki et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 23(3): 728-32 (2013) doi: 10.1016/j.bmcl.2012.11.091. Epub 2012 Dec 1; Miyazaki et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 22(20): 6338-42 (2012) doi: 10.1016/j.bmcl.2012.08.086. Epub 2012 Aug 30; международную заявку № WO 2009/151069 (2009)).
Согласно другим вариантам цис-имидазолин, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, представляет собой дигидроимидазолтиазоловое соединение.
Согласно другим вариантам ингибитор MDM2 с малыми молекулами представляет собой спиро-оксиндольное соединение. См., например, соединения, описанные в публикациях Ding et al., J. Am. Chem. Soc. 2005; 127: 10130-31; Shangary et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 3933-38; Shangary et al., Mol Cancer Ther 2008; 7: 1533-42; Shangary et al., Mol Cancer Ther 2008; 7: 1533-42; Hardcastle et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 15: 1515-20 (2005); Hardcastle et al., J. Med. Chem. 49(21): 6209-21 (2006); Watson et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 21(19): 5916-9 (2011) doi: 10.1016/j.bmcl.2011.07.084. Epub 2011 Aug 9. Другими примерами спиро-оксиндольных соединений, представляющих собой ингибиторы MDM2, являются MI-63, MI-126; MI-122, MI-142, MI-147, MI-18, MI-219, MI-220, MI-221 и MI-773. Еще одним спиро-оксиндольным соединением является 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-он. Другое соединение называется MI888 (see, e.g., Zhao et al., J. Med. Chem. 56(13): 5553-61 (2013); международная заявка № WO 2012/065022).
Согласно другим вариантам ингибитор MDM2 с малыми молекулами, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, представляет собой бензодиазепиндион (см., например, Grasberger et al., J. Med. Chem. 2005; 48: 909-12; Parks et al., Bioorg. Med. Chem. Lett 2005; 15: 765-70; Raboisson et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 15: 1857-61 (2005); Koblish et al., Mol. Cancer Ther. 5: 160-69 (2006)). Бензодиазепиндионы, которые могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке, включают 1,4-бензодиазепин-2,5-дионы. Примеры бензодиазепиндионов включают 5-[(3S)-3-(4-хлорфенил)-4-[(R)-1-(4-хлорфенил)этил]-2,5-диоксо-7-фенил-1,4-диазепин-1-ил]валериановую кислоту и 5-[(3S)-7-(2-бромфенил)-3-(4-хлорфенил)-4-[(R)-1-(4-хлорфенил)этил]-2,5-диоксо-1,4-диазепин-1-ил]валериановую кислоту (см., например, Raboisson et al., supra). Другие бензодиазепиндионы в уровне техники называются TDP521252 (название по номенклатуре IUPAC: 5-[(3S)-3-(4-хлорфенил)-4-[(1R)-1-(4-хлорфенил)этил]-7-этинил-2,5-диоксо-3Н-1,4-бензодиазепин-1-ил]пентановая кислота) и TDP665759 (название по номенклатуре IUPAC: (3S)-4-[(1R)-1-(2-амино-4-хлорфенил)этил]-3-(4-хлорфенил)-7-йод-1-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил]-3Н-1,4-бензодиазепин-2,5-дион) (см., например, Parks et al., supra; Koblish et al., supra) (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ).
Согласно еще одному варианту ингибитор MDM2 с малыми молекулами представляет собой терфенил (см., например, Yin et al., Angew. Chem. In.t Ed. Engl. 2005; 44: 2704-707; Chen et al., Mol. Cancer Ther. 2005; 4: 1019-25). Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор MDM2 с малыми молекулами, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, представляет собой хилинол (см., например, Lu et al., J Med Chem 2006; 49: 3759-62). Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой халькон (см., например, Stoll et al., Biochemistry 2001; 40: 336-44). Согласно еще одному конкретному варианту ингибитор MDM2 представляет собой сульфонамид (например, NSC279287) (см., например, Galatin et al., J. Med. Chem. 2004; 47: 4163-65).
Согласно другим вариантам соединение, которое может быть использовано в способах, описанных в данной заявке, представляет собой триптамин, такой как сердеметан (JNJ-26854165; химическое название: N1-(2-(1Н-индол-3-ил)этил)-N4-(пиридин-4-ил)бензол-1,4-диамин; CAS №881202-45-5) (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ). Сердеметан является производным триптамина, которое активирует р53 и действует как антагонист убиквитинлигазы HDM2 (см., например, Chargari et al., Cancer Lett. 312(2): 209-18 (2011) doi: 10.1016/j.canlet.2011.08.011. Epub 2011 Aug 22; Kojima et al., Mol. Cancer Ther. 9: 2545-57 (2010); Yuan et al., J. Hematol. Oncol. 4: 16 (2011)).
Согласно другим конкретным вариантам ингибиторы MDM2 с малыми молекулами, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, включают соединения, описанные в Rew et al., J. Med. Chem. 55: 4936-54 (2012); Gonzalez-Lopez de Turiso et al., J. Med. Chem. 56: 4053-70 (2013); Sun et al., J. Med. Chem. 57: 1454-72 (2014); Gonzalez et al., J. Med. Chem. 2014 Mar 4 [формат Epub до публикации]; Gonzalez et al., J. Med. Chem. 2014 Mar 6 [формат Epub до публикации].
Согласно другим конкретным вариантам ингибитор MDM2 является пиперидиноновым соединением. Примером такого активного ингибитора MDM2 является АМ-8553 ({(3R,5R,6S)-5-(3-хлорфенил)-6-(4-хлорфенил)-1-[(2S,3S)-2-гидрокси-3-пентанил]-3-метил-2-оксо-3-пиперидинил}уксусная кислота; CAS №1352064-70-0) (Amgen, Thousand Oaks, California).
Согласно другим конкретным вариантам ингибитором MDM2 с малыми молекулами, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, является пиперидин (Merck, Whitehouse Station, NJ) (см., например, международную заявку № WO 2011/046771). Согласно другим вариантам ингибитором MDM2 с малыми молекулами, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, является имидазолиндоловое соединение (Novartis) (см., например, международную заявку № WO 2008/119741).
Примерами соединений, которые связываются с MDM2 и с MDMX и которые могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке, являются RO-2443 и RO-5963 ((Z)-2-(4-((6-хлор-7-метил-1Н-индол-3-ил)метилен)-2,5-диоксоимидазолин-1-ил)-2-(3,4-дифторфенил)-N-(1,3-дигидроксипропан-2-ил)ацетамид) (см., например. Graves et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 11788-93 (2012); см., также, например, Zhao et al., 2013, BioDiscovery, supra).
Согласно другому конкретному варианту еще одним ингибитором MDM2, описанным в уровне техники, является CGM097, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, для селективного уничтожения стареющих клеток и для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением.
Ингибиторы членов семейства антиапоптотических белков BCL-2
Согласно некоторым вариантам сенолитический агент может быть ингибитором одного или более белков семейства BCL-2. Согласно конкретным вариантам по меньшей мере один сенолитический агент выбран из ингибиторов одного или более антиапоптотических белков семейства BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-xL. Ингибиторы антиапоптотических белков семейства BCL-2 меняют по меньшей мере один сигнальный путь выживаемости клеток. Активация апоптоза может возникать через внешний путь активации, запускаемый путем активации рецепторов клеточной гибели на поверхности клеток, или через внутренний путь, запускаемый внутриклеточными сигналами или различными внутриклеточными стрессами. Этот внутренний путь, известный также как стрессовый путь или митохондриальный сигнальный путь, в основном регулируется членами семейства BCL-2, класса ключевых регуляторов активации каспаз, состоящего из антиапоптотических (способствующих выживаемости) белков, содержащих домен ВН1-ВН4 (BCL-2 (то есть белок BCL-2, являющийся членом семейства антиапоптотических белков семейства BCL-2), BCL-xL, BCL-w, A1, MCL-1 и BCL-B); проапоптотических белков, содержащих домены ВН1, ВН2 и ВН3 (ВАХ, BAK и BOK); и проапоптотических белков семейства ВН3-only (BIK, BAD, BID, BIM, BMF, HRK, NOXA и PUMA) (см., например, Cory et al., Nature Reviews Cancer 2: 647-56 (2002); Cory et al., Cancer Cell 8: 5-6 (2005); Adams et al., Oncogene 26: 1324-1337 (2007)). Антиапоптотические белки семейства BCL-2 блокируют активацию проапоптотических мультидоменных белков ВАХ и BAK (см., например, Adams et al., Oncogene 26: 1324-37 (2007)). Хотя точный механизм регуляции апоптоза неизвестен, предполагают, что белки ВН3-only, высвободившиеся под действием внутриклеточных стрессовых сигналов, связываются с антиапоптотическими BCL-2-подобными белками посредством ВН3 "лиганда" "рецептора" ВН3 по бороздкам, образованным участками ВН1-3 на поверхности антиапоптотических белков, тем самым нейтрализуя антиапоптотические белки (см., например, Letai et al., Cancer Cell 2: 183-92 (2002); Adams et al., Oncogene, supra). ВАХ и BAK затем могут образовывать олигомеры в митохондриальных мембранах, что приводит к получению проницаемых мембран, высвобождению цитохрома С, к активации каспазы и в конце концов к апоптозу (см., например, Adams et al., Oncogene, supra).
Используемый в данной заявке член семейства BCL-2, который ингибируется агентами, описанными в данной заявке, способствует выживаемости и является членом (антиапоптотического) семейства белков. Сенолитические агенты, используемые в способах по изобретению, ингибируют одну или более функций антиапоптотического белка BCL-2, BCL-xL (который может также называться в данной заявке и в уровне техники как Bcl-xL, BCL-XL, Bcl-xl, или Bcl-XL). Согласно некоторым вариантам в добавление к ингибированию функции BCL-xL такой ингибитор может также взаимодействовать с BCL-2 и/или ингибировать одну или более функций BCL-2 (то есть это ингибиторы BCL-xL/BCL-2). Согласно еще одному варианту сенолитические агенты, используемые в способах по изобретению, классифицируются как ингибиторы каждого из BCL-xL и BCL-w (то есть это ингибиторы BCL-xL/BCL-w). Согласно другому конкретному варианту сенолитические агенты, используемые в способах по изобретению, которые ингибируют BCL-xL, могут также взаимодействовать с BCL-2 и/или ингибировать одну или более функций BCL-2 (то есть белка the BCL-2) и BCL-w (то есть это ингибиторы BCL-xL/BCL-2/BCL-w), тем самым вызывая селективную (избирательную) гибель стареющих клеток. Согласно некоторым вариантам ингибитор антиапоптотического белка BCL-2 участвует во взаимодействии между антиапоптотическим белком, членом семейства BCL-2 (которое включает по меньшей мере BCL-xL) и одним или более лигандами или рецепторами, с которыми будет связываться член семейства антиапоптотических белков BCL-2 в отсутствие ингибитора. Согласно другим конкретным вариантам ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере BCL-xL, специфически связывается только с одним или более из BCL-xL, BCL-2, BCL-w, но не с другими членами семейства антиапоптотических белков BCL-2, такими как Mcl-1 и BCL2A1.
Согласно еще одному варианту сенолитический агент, используемый в способах, описанных в данной заявке, представляет собой селективный ингибитор BCL-xL и ингибирует одну или более функций BCL-xL. Такие сенолитические агенты, которые являются селективными ингибиторами BCL-xL, не ингибируют функцию одного или более других антиапоптотических белков семейства BCL-2 биологически или статистически значимым образом. BCL-xL можно также назвать в данной заявке и в уровне техники BCL2L1, BCL2-подобным белком 1, BCLX, BCL2L, BCLxL или BCL-X. Согласно одному из вариантов селективные ингибиторы BCL-xL изменяют (например, снижают, ингибируют, подавляют) одну или более функций BCL-xL, но не ингибируют в значительной степени одну или более функций других белков семейства BCL-2 (например, BCL-2 или BCL-w). Согласно некоторым вариантам селективный ингибитор BCL-xL вмешивается в процесс взаимодействия между BCL-xL и одним или более лигандами или рецепторами, с которыми будет связываться член семейства антиапоптотических белков BCL-2 в отсутствие ингибитора. Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент, который ингибирует одну или более функций BCL-xL, селективно связывается с человеческим BCL-xL, но не с другими белками семейства BCL-2, которые приводят к селективной гибели стареющих клеток.
2+
BCL-xL является членом семейства антиапоптотических белков BCL-2. BCL-xL также играет важную роль во взаимодействии между аутофагией и апоптозом (см., например, Zhou et al., FEBS J. 278: 403-13 (2011)). Оказалось, что BCL-xL играет роль в реакциях биоэнергетического метаболизма, включая митохондриальное продуцирование АТФ (АТР), в переносе Са и в ацетилировании белков, а также в нескольких других клеточных и организменных процессах, таких как митоз, агрегация тромбоцитов и эффективность синаптической передачи (см., например, Michels et al., International Journal of Cell Biology, vol. 2013, Article ID 705294, 10 pages, 2013. doi: 10.1155/2013/705294). Согласно некоторым вариантам ингибиторы BCL-xL, описанные в данной заявке, могут нарушить взаимодействие между BCL-xL и любым одним или несколькими из упомянутых выше белков ВН3-only для промотирования апоптоза в клетках.
Согласно некоторым вариантам ингибитор BCL-xL является селективным ингибитором, это означает, что он предпочтительно связывается с BCL-xL среди других членов семейства антиапоптотических белков BCL2 (например, BCL-2, MCL-1, BCL-w, BCL-b, и BFL-1/A1). Согласно некоторым вариантам селективный ингибитор BCL-XL проявляет по меньшей мере 5-кратную, 10-кратную, 50-кратную, 100-кратную, 1000-кратную, 10000-кратную, 20000-кратную или 30000-кратную селективность при связывании белка BCL-XL или нуклеиновой кислоты по сравнению с белком BCL-2 или нуклеиновой кислотой. Согласно некоторым вариантам селективный ингибитор BCL-XL проявляет по меньшей мере 5-кратную, 10-кратную, 50-кратную, 100-кратную, 1000-кратную, 10000-кратную, 20000-кратную или 30000-кратную селективность при связывании белка BCL-XL или нуклеиновой кислоты по сравнению с белком MCL-1 или нуклеиновой кислотой. Согласно некоторым вариантам селективный ингибитор BCL-XL проявляет по меньшей мере 5-кратную, 10-кратную, 50-кратную, 100-кратную, 1000-кратную, 10000-кратную, 20000-кратную или 30000-кратную селективность при связывании белка BCL-XL или нуклеиновой кислоты по сравнению с белком BCL-w или нуклеиновой кислотой. Согласно некоторым вариантам селективный ингибитор BCL-XL проявляет по меньшей мере 5-кратную, 10-кратную, 50-кратную, 100-кратную, 1000-кратную, 10000-кратную, 20000-кратную или 30000-кратную селективность при связывании белка BCL-XL или нуклеиновой кислоты по сравнению с белком BCL-B или нуклеиновой кислотой. Согласно некоторым вариантам селективный ингибитор BCL-XL проявляет по меньшей мере 5-кратную, 10-кратную, 50-кратную, 100-кратную, 1000-кратную, 10000-кратную, 20000-кратную или 30000-кратную селективность при связывании белка BCL-XL или нуклеиновой кислоты по сравнению с белком А1 или нуклеиновой кислотой. Как описано в данной заявке, согласно некоторым вариантам ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-xL (например, селективный ингибитор BCL-xL), но не связывает заметно MCL-1 или BCL2A1.
i
i
50
50
d
0
d
Способы измерения связывающей способности (аффинности связывания) ингибитора BCL-xL с белками семейства BCL-2 известны из предшествующего уровня техники. Например, связывающая способность ингибитора BCL-x может быть определена с использованием метода, основанного на конкуренции поляризации флуоресценции, согласно которому флуоресцентный пептидный домен белка BAK белка ВН3 инкубируют вместе с белком BCL-xL (или другим белком семейства BCL-2) в присутствии или в отсутствие увеличивающихся концентраций ингибитора BCL-XL, как описано ранее (см., например, опубликованную заявку США на патент №20140005190; Park et al., Cancer Res. 73: 5485-96 (2013); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 7124-9 (2000); Zhang et al., Anal. Biochem. 307: 70-5 (2002); Bruncko et al., J. Med. Chem. 50: 641-62 (2007)). Степень ингибирования может быть определена по уравнению: 1-[(величина mP негативного контроля)/интервал)]×100%. Константа ингибирования (K) определяется по формуле K=[I]/([L]/K+[P]/K+1), как описано в публикации Bruncko et al., J. Med. Chem. 50: 641-62 (2007) (см. также Wang, FEBS Lett. 360: 111-114 (1995)).
Агенты (например, селективные ингибиторы BCL-xL, ингибиторы BCL-xL/BCL-2, BCL-xL/BCL-2/BCL-w, ингибиторы BCL-xL/BCL-w), используемые в способах, описанных в данной заявке, селективно уничтожающие стареющие клетки, включают, например, низкомолекулярные соединения (малые молекулы).
Согласно конкретным вариантам ингибитор BCL-xL представляет собой низкомолекулярное соединение, которое относится к одному из следующих классов соединений, например, к бензотиазолгидразонам, аминопиридинам, бензимидазолам, тетрагидрохинолинам и феноксильным соединениям и к их родственным аналогам.
Согласно одному из вариантов селективный ингибитор BCL-xL, применяемый в способах, описанных в данной заявке, является бензотиазолгидразоном с малыми молекулами. Бензотиазолгидразоны включают WEHI-539 (5-[3-[4-(аминометил)фенокси]пропил]-2-[(8Е)-8-(1,3-бензотиазол-2-илгидразинилиден)-6,7-дигидро-5Н-нафталин-2-ил]-1,3-тиазол-4-карбоновую кислоту), пептидный миметик ВН3, который селективно нацелен на BCL-xL (см., например, Lessene et al., Nature Chemical Biology 9: 390-397 (2013)). Согласно некоторым вариантам в способах, описанных в данной заявке, для селективного уничтожения стареющих клеток используется WEHI-539.
Согласно другим вариантам селективный ингибитор BCL-xL представляет собой аминопиридиновое соединение. Аминопиридин, который может быть использован в качестве селективного ингибитора BCL-xL, может быть BXI-61 (3-[(9-амино-7-этоксиакридин-3-ил)диазенил]пиридин-2,6-диамином) (см., например. Park et al., Cancer Res. 73: 5485-96 (2013); опубликованную заявку США на патент №2009-0118135). Согласно некоторым вариантам способы, описанные в данной заявке, предусматривают использование BXI-61 для селективного уничтожения стареющих клеток.
Согласно другим вариантам селективный ингибитор BCL-xL, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, является бензимидазольным соединением. Примером бензимидазольного соединения, которое может быть использовано в качестве селективного ингибитора BCL-XL в способах, описанных в данной заявке, является BXI-72 (2'-(4-гидроксифенил)-5-(4-метил-1-пиперазинил)-2,5'-ди-(1H-бензимидазола) тригидрохлорид) (см., например, Park et al., supra). Согласно некоторым вариантам способы, описанные в данной заявке, предусматривают использование BXI-72 для селективного уничтожения стареющих клеток.
Согласно еще одному варианту селективный ингибитор BCL-xL представляет собой тетрагидрохинолиновое соединение (см., например, опубликованную заявку США на патент №2014-0005190). Примеры тетрагидрохинолинов, которые могут быть использованы в качестве селективного ингибитора BCL-xL в способах, описанных в данной заявке, приведены в Таблице 1 опубликованной заявки США на патент №2014-0005190 и описаны в данной заявке. Другие ингибиторы кроме BCL-xL, описанные в данной заявке, могут ингибировать другие члены семейства белков BCL-2 (например, BCL-2)
Согласно другим вариантам селективный ингибитор BCL-xL представляет собой феноксильное соединение. Примером феноксильного соединения, которое может быть использовано в качестве селективного ингибитора BCL-XL является 2[[3-(2,3-дихлорфенокси)пропил]амино]этанол (2,3-DCPE) (см. Wu et al., Cancer Res. 64: 1110-1113 (2004)). Согласно некоторым вариантам способы, описанные в данной заявке, предусматривают использование 2,3-DCPE для селективного уничтожения стареющих клеток.
Согласно другому варианту ингибитор члена семейства антиапоптотических белков Bcl-2, который ингибирует по меньшей мере BCL-xL, описан в патенте США №8,232,273. Согласно конкретному варианту таким ингибитором является селективный ингибитор BCL-xL, обозначаемый как А-1155463 (см., например, Тао et al., ACS Med. Chem. Lett., 2014, 5(10): 1088-1093).
Согласно другим вариантам сенолитический агент ингибирует другие члены семейства BCL-2 в добавление к BCL-xL. Например, способы, описанные в данной заявке, предусматривают использование ингибиторов BCL-xL/BCL-2, ингибиторов BCL-xL/BCL-2/BCL-w и ингибиторов BCL-xL/BCL-w и их аналогов. Согласно некоторым вариантам такие ингибиторы включают соединения, которые ингибируют BCL-2 и BCL-xL, и могут также ингибировать BCL-w. Примеры этих ингибиторов включают:
АВТ-263 (4-[4-[[2-(4-хлорфенил)-5,5-диметилциклогексен-1-ил]метил]пиперазин-1-ил]-N-[4-[[(2R)-4-морфолин-4-ил-1-фенилсульфанилбутан-2-ил]амино]-3-(трифторметилсульфонил)фенил]сульфонилбензамид или по номенклатуре IUPAC, (R)-4-(4-((4'-хлор-4,4-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-[1,1'-бифенил]-2-ил)метил)пиперазин-1-ил)-N-((4-((4-морфолино-1-(фенилтио)бутан-2-ил)амино)-3-((трифторметил)сульфонил)фенил)сульфонил)бензамид) (см., например. Park et al., 2008, J. Med. Chem. 51: 6902; Tse et al., Cancer Res., 2008, 68: 3421; международную заявку WO 2009/155386; патенты США №№7390799, 7709467, 7906505, 8624027) и АВТ-737 (4-[4-[(4'-хлор[1,1'-бифенил]-2-ил)метил]-1-пиперазинил]-N-[[4-[[(1R)-3-(диметиламино)-1-[(фенилтио)метил]пропил]амино]-3-нитрофенил]сульфонил]бензамид, бензамид, 4-[4-[(4'-хлор[1,1'-бифенил]-2-ил)метил]-1-пиперазинил]-N-[[4-[[(1R)-3-(диметиламиноо)-1-[(фенилтио)метил]пропил]амино]-3-нитрофенил]сульфонил]-или 4-[4-[[2-(4-хлорфенил)фенил]метил]пиперазин-1-ил]-N-[4-[[(2R)-4-(диметиламино)-1-фенилсульфанилбутан-2-ил]амино]-3-нитрофенил]сульфонилбензамид) (см., например, Oltersdorf et al.. Nature, 2005, 435: 677; патент США №7973161; патент США №7642260). Согласно другим вариантам ингибиторантиапоптотическаого белка BCL-2 представляет собой хиназолиновое соединение, хиназолинсульфонамид (см., например, Sleebs et al., 2011, J. Med. Chem. 54: 1914). Согласно другому варианту ингибитор антиапоптотического белка BCL-2 представляет собой низкомолекулярное соединение, как описанов публикации Zhou et al., J. Med. Chem., 2012, 55: 4664 (см., например. Соединение 21 (R)-4-(4-хлорфенил)-3-(3-(4-(4-(4-((4-(диметиламино)-1-(фенилтио)бутан-2-ил)амино)-3-нитрофенилсульфонамидо)фенил)пиперазин-1-ил)фенил)-5-этил-1-метил-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота) и Zhou et al., J. Med. Chem., 2012, 55: 6149 (см., например. Соединение 14 (R)-5-(4-хлорфенил)-4-(3-(4-(4-(4-((4-(диметиламино)-1-(фенилтио)бутан-2-ил)амино)-3-нитрофенилсульфонамидо)фенил)пиперазин-1-ил)фенил)-1-этил-2-метил-1Н-пиррол-3-карбоновая кислота; Соединение 15 (R)-5-(4-хлорфенил)-4-(3-(4-(4-(4-((4-(диметиламино)-1-(фенилтио)бутан-2-ил)амино)-3-нитрофенилсульфонамидо)фенил)пиперазин-1-ил)фенил)-1-изопропил-2-метил-1Н-пиррол-3-карбоновая кислота). Согласно другим вариантам ингибитор антиапоптотического белка BCL-2 представляет собой ингибитор BCL-2/BCL-xL, такой как ВМ-1074 (см., например, Aguilar et al., 2013, J. Med. Chem. 56: 3048); BM-957 (см., например, Chen et al., 2012, J. Med. Chem. 55: 8502); BM-1197 (см., например, Bai et al., PLoS One 2014 Jun 5; 9(6): e99404. Doi: 10.1371/joumal.pone.009904); заявку США на патент №2014/0199234; N-ацилсульфонамиды (см., например, международную заявку № WO 2002/024636, международную заявку № WO 2005/049593, международную заявку № WO 2005/049594, патенты США №№7767684, 7906505). Согласно еще одному варианту ингибитор антиапоптотического белка BCL-2 представляет собой низкомолекулярное макроциклическое соединение (см., например, международную заявку № WO 2006/127364, патент США №7777076). Согласно еще одному варианту ингибитор антиапоптотического белка BCL-2 представляет собой изоксазолидиновое соединение (см., например, международную заявку № WO 2008/060569, патенты США №№7851637, 7842815).
Согласно некоторым вариантам сенолитическое соединение представляет собой ингибитор Bcl-2, Bcl-w и Bcl-xL, такой как АВТ-263 или АВТ-737. Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент представляет собой соединение или фармацевтически приемлемую соль, стереомер, таутомер или пролекарство, как показано ниже, что отражает структуру АВТ-263. АВТ-263 в уровне техники известен так же, как навитоклакс (Navitoclax).
Ингибиторы киназы Akt
Согласно некоторым вариантам сенолитический агент является ингибитором киназы Akt. Например, сенолитический агент может быть низкомолекулярным соединением и его аналогами, которые ингибируют Akt. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент является соединением, которое селективно ингибирует Akt1, Akt2, and Akt3 среди других протеинкиназ.
Ингибиторы Akt (которые можно также называть ингибиторами киназы Akt или ингибиторами киназы AKT) могут быть разделены на шесть основных классов на основе механизмов их действия (см., например, Bhutani et al., Infectious Agents and Cancer 2013, 8:49 doi:10.1186/1750-9378-8-49). В уровне техники Akt называют также протеинкиназой В (PKB). Первый класс содержит АТФ конкурентные АТФ-ингибиторы Akt и включает такие соединения как ССТ128930 и GDC-0068, которые ингибируют Akt2 и Akt1. Эта категория включает также ингибиторы киназы пан-Akt, такие как GSK2110183 (афуресертиб), GSK690693 и АТ7867. Второй класс содержит ингибиторы Akt на основе липидов, которые ингибируют образование PIP3, вызванное PI3K. Этот механизм используется аналогами фосфатидилинозитола, такими как ингибиторы Akt Calbiochem I, II и III или другие ингибиторы PI3K, такие как РХ-866. Эта категория включает также такие соединения как перифосин (Perifosine) (KRX-0401) (Aeterna Zentaris/Keryx). Третий класс содержит группу соединений, называемых псевдосубстратными ингибиторами. Они включают такие соединения как AKTide-2T и FOXO3 гибрид. Четвертый класс состоит из аллостерических ингибиторов домена киназы AKT и включают такие соединения как MK-2206(8-[4-(1-аминоциклобутил)фенил]-9-фенил-2Н-[1,2,4]триазоло[3,4-f][1,6]нафтиридин-3-она дигидрохлорид) (Merck & Со.) (см., например, патент США №7576209). Пятый класс состоит из антител и включает такие соединения, как GST-анти-Akt1-MTS. Последний класс содержит соединения, которые взаимодействуют с доменом РН в составе Akt, и включает трицирибин (Triciribine) и РХ-316. Другие соединения, описанные в уровне техники, которые действуют как ингибиторы AKT, включают, например, GSK-2141795 (GlaxoSmithKline), VQD-002, милтефосин, AZD5363, GDC-0068 и API-1. Методы определения активности ингибиторов AKT широко используются специалистами в данной области.
Согласно конкретному варианту сенолитический агент представляет собой соединение, которое является ингибитором киназы Akt, который имеет структуру, показанную ниже, (он называется в данной заявке и в уровне техники MK-2206), 8-[4-(1-аминоциклобутил)фенил]-9-фенил-2Н-[1,2,4]триазоло[3,4-f][1,6]нафтиридин-3-он;) или его фармацевтически приемлемая соль, стереомер, таутомер или пролекарство. Ниже показана его дигидрохлоридная соль.
Согласно некоторым вариантам по меньшей мере один сенолитический агент может вводиться вместе с одним другим сенолитическим агентом, при этом эти два сенолитических агента действуют аддитивно или синергически в процессе уничтожения стареющих клеток. Согласно конкретным вариантам предусмотрены способы применения сенолитического агента, который или изменяет сигнальный путь выживаемости клеток или воспалительный сигнальный путь, или изменяет эти оба пути в стареющей клетке. Согласно другому конкретному варианту эти способы включают применение по меньшей мере двух сенолитических агентов, причем по меньшей мере первый сенолитический агент и второй сенолитический агент каждый по-разному и независимо меняют или один, или оба из сигнального пути выживаемости клеток или воспалительного сигнального пути в стареющей клетке. Для удобства, когда два или более сенолитических агентов, как описано в данной заявке, применяются в комбинации, один сенолитический агент называется первым сенолитическим агентом, другой сенолитический агент называется вторым сенолитическим агентом и т.д. Согласно некоторым другим вариантам способы, описанные в данной заявке, включают введение по меньшей мере трех сенолитических агентов (первого сенолитического агента, второго сенолитического агента и третьего сенолитического агента). Числительные первый, второй, третий и т.д. в этом контексте используются только для удобства и не описывают порядок введения, предпочтение или уровень сенолитической активности или другой параметр, если только ясно не следует иное. Согласно конкретным вариантам, когда при осуществлении способов, описанных в данной заявке, используются два или более сенолитических агентов, каждый сенолитический агент является низкомолекулярным (содержит малые молекулы). Согласно другим конкретным вариантам способы, описанные в данной заявке, включают введение по меньшей мере трех сенолитических агентов (первого сенолитического агента, второго сенолитического агента и третьего сенолитического агента). Согласно некоторым вариантам применение по меньшей мере двух сенолитических агентов приводит к значительному увеличению гибели стареющих клеток по сравнению с применением каждого сенолитического агента в отдельности. Согласно другим конкретным вариантам применение по меньшей мере двух сенолитических агентов приводит к значительному увеличению гибели стареющих клеток по сравнению с применением каждого сенолитического агента в отдельности и этот эффект может быть аддитивным или синергическим. Согласно некоторым вариантам по меньшей мере два сенолитических агента являются разными и выбраны из ингибитора одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, причем такой ингибитор ингибирует по меньшей мере BCL-xL (например, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL, селективный ингибитор Bcl-xL или ингибитор Bcl-xL/Bcl-w); специфического ингибитора киназы Akt; ингибитора MDM2. Согласно одному конкретному варианту, когда по меньшей мере один сенолитический агент, вводимый субъекту, который нуждается в этом, является ингибитором одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере BCL-XL (например, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL, селективный ингибитор Bcl-xL или ингибитор Bcl-xL/Bcl-w), вводится второй сенолитический агент. Согласно другим конкретным вариантам один из двух сенолитических агентов представляет собой ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере BCL-XL и второй сенолитический агент является ингибитором MDM2. Согласно другим конкретным вариантам, когда по меньшей мере один сенолитический агент, вводимый субъекту, который нуждается в этом, является селективным ингибитором Bcl-xL, вводится второй сенолитический агент. Согласно другим конкретным вариантам, когда по меньшей мере один сенолитический агент, вводимый субъекту, который нуждается в этом, является ингибитором MDM2, вводится второй сенолитический агент. Согласно другим конкретным вариантам, когда по меньшей мере один сенолитический агент, вводимый субъекту, который нуждается в этом, является ингибитором киназы Akt, вводится второй сенолитический агент. Согласно конкретному варианту, когда ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере BCL-xL, он используется в отдельности или в комбинации с другим сенолитическим агентом, который также является ингибитором одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере BCL-xL, или является другим сенолитическим агентом, описанным в данной заявке. Согласно конкретным вариантам ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере BCL-xL, комбинируется с ингибитором киназы Akt. В качестве неограничивающего примера можно указать, что, например, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w АВТ-263 можно использовать в комбинации с ингибитором киназы Akt (например, MK2206).
Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент, ингибитор MDM2, используемый в способах, описанных в данной заявке, в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным сенолитическим агентом (который для удобства можно назвать вторым сенолитическим агентом), может представлять собой другой ингибитор MDM2 или может быть сенолитическим агентом, который не является ингибитором MDM2. Согласно одному из вариантов ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере Bcl-xL, используется в комбинации с ингибитором AKT. Согласно другому конкретному варианту ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2 представляет собой АВТ-263, АВТ-737 или WEHI-539 и ингибитор киназы AKT представляет собой MK-2206.
Согласно некоторым другим вариантам способы, описанные в данной заявке, включают введение по меньшей мере трех сенолитических агентов (первого сенолитического агента, второго сенолитического агента и третьего сенолитического агента).
Ингибиторы сигнальных путей mTOR, NFκB и PI3-k: Низкомолекулярное соединение (малая молекула), которое может быть использовано вместе с сенолитическим агентом, описанным в данной заявке, при осуществлении способов селективного уничтожения стареющих клеток и лечения заболевания или расстройства, связанного со старением, может быть соединением с малыми молекулами, которое ингибирует один или более из сигнальных путей mTOR, NFκB и PI3-k. Как описано в данной заявке, предусмотрены также способы селективного уничтожения стареющих клеток и лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, причем эти способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, по меньшей мере одного сенолитического агента, и эти способы могут также включать введение ингибитора одного или более сигнальных путей mTOR, NFκB и PI3-k. Ингибиторы этих сигнальных путей известны из предшествующего уровня техники.
Примеры ингибиторов сигнального пути mTOR включают сиролимус, темсиролимус, эверолимус, ридафоролимус, 32-дезоксирапамицин, зотаролимус, РР242, INK128, РР30, Torini, Ku-0063794, WAY-600, WYE-687 и WYE-354. Ингибиторы сигнального пути NFκ включают, например, устранение активности NFκB посредством ТРСА-1 (ингибитор IKK2); BAY 11-7082 (ингибитор IKK, селективный в незначительной степени к IKK1 и IKK2); и MLN4924 (ингибитора NEDD8-фермента активации (NAE)); и MG132.
Примеры ингибиторов сигнального пути PI3-k, которые могут также ингибировать сигнальные пути mTOR или AKT, включают перифосин (KRX-0401), иделалисиб, РХ-866, IPI-145, BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR 1201, SF1126, INK1117, GDC-0941, BKM120, XL147 (SAR245408), XL765 (SAR245409), паломид 529 (Palomid 529), GSK1059615, GSK690693, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477, CUDC-907, AEZS-136, BYL719, BKM120, GDC-0980, GDC-0032 и MK2206.
Малые молекулы - соли и общие методы синтеза.
th
Малые молекулы, описанные в качестве сенолитических агентов, включают физиологически приемлемые соли (то есть фармацевтически приемлемые соли), гидраты, сольваты, полиморфы, метаболиты и пролекарства сенолитических агентов. Дальнейшая информация о метаболизме может быть получена в монографии Pharmacological Basis of Therapeutics, 9 Edition, McGraw-Hill (1996). Метаболиты соединений, описанных в данной заявке, могут быть идентифицированы или путем введения соединений хозяину и анализа образцов ткани хозяина, или путем инкубации соединений с гепатическими клетками in vitro и анализа полученных соединений. Оба метода хорошо известны из уровня техники.
Соединения, описанные в данной заявке, обычно могут быть использованы в виде свободной кислоты или свободного основания. Альтернативно, эти соединения могут быть использованы в виде солей их присоединения к кислотам или основаниям. Соли присоединения к кислотам могут быть получены в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники, и могут быть образованы при взаимодействии с органическими или неорганическими кислотами. Подходящие органические кислоты включают (но без ограничения) малеиновую, фумаровую, бензойную, аскорбиновую, янтарную, метансульфоновую, уксусную, щавелевую, пропионовую, винную, салициловую, лимонную, глюконовую, молочную, миндальную, коричную, аспартовую, стеариновую, пальмитиновую, гликолевую, глутаминовую, малоновую и бензолсульфоновую кислоты. Подходящие неорганические кислоты включают (но без ограничения) соляную, бромистоводородную, серную, фосфорную и азотную кислоты. Соли присоединения к основаниям могут быть получены в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники, и могут быть образованы при взаимодействии с органическими или неорганическими основаниями. Соли присоединения включают соединения, в которых противоион является катионом. Подходящие неорганические основания включают (но без ограничения) гидроксосоль или другую соль натрия, калия, лития, аммония, кальция, бария, магния, железа, цинка, меди, марганца, алюминия и т.п., и органические основания, такие как замещенные соли аммония (например, дибензиламмония, бензиламмония, 2-гидроксиэтиламмония). Другие соли включают соединения, в которых противоион является анионом, например, адипинат, альгинат, аскорбат, а спартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфосульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат, ундеканоат и валерат. Таким образом, термин "фармацевтически приемлемая соль" соединений, описанных в данной заявке, охватывает любую и все фармацевтически подходящие формы солей.
Соединения иногда могут быть изображены в виде анионных соединений. Средний специалист в данной области знает, что такие соединения существуют с эквимолярным отношением катиона. Например, соединения, описанные в данной заявке, могут существовать в полностью протонированной форме или в форме соли, например, соли натрия, калия, аммония, или в комбинации с любым неорганическим основанием, как описано выше. Когда в формуле изображено более одного анионного фрагмента, каждый анионный фрагмент может независимо существовать как или протонированная форма, или как солевая форма. Согласно некоторым конкретным вариантам соединения, описанные в данной заявке, существуют в виде натриевых солей. Согласно другим конкретным вариантам соединения, описанные в данной заявке, существуют в виде натриевых солей. Согласно другим конкретным вариантам соединения, описанные в данной заявке, существуют в виде калиевых солей. Кроме того, некоторые из кристаллических форм любого соединения, описанного в данной заявке, могут быть в виде полиморфных форм, которые также заявлены и охвачены настоящим изобретением. Кроме того, некоторые из соединений могут образовывать сольваты с водой и с органическими растворителями. Сольваты описанных соединений часто получаются в процессе кристаллизации. Используемый в данной заявке термин "сольват" относится к агрегату, который включает одну или более молекул любого из описанных в данной заявке соединений и одну или более молекул растворителя. Растворителем может быть вода, в этом случае сольват является гидратом. Альтернативно, растворитель может быть органическим. Таким образом, описанные в данной заявке соединения могут быть в виде гидратов, включая моногидрат, дигидрат, гемигидрат, сесквигидрат, тригидрат, тетрагидрат и т.п., а также соответствующих сольватированных форм. Некоторые из этих соединений могут представлять собой истинные сольваты, в то время как в других случаях некоторые соединения могут просто удерживать воду или смесь воды и приобретенного растворителя.
В общем, соединения, используемые в способах, описанных в данной заявке, могут быть получены в соответствии с методами органического синтеза, известными специалистам в данной области, исходя из коммерчески доступных химических соединений и/или из соединений, описанных в химической литературе. Конкретные и аналогичные реагенты могут быть также найдены при использовании индексов известных химических соединений, подготовленных Американской службой рефератов химических веществ (Chemical Abstract Service of the American Chemical Society), которые доступны большой части публики и университетским библиотекам, а также в базах данных он-лайн (можно обратиться в American Chemical Society, Washington, D.C.). Химические соединения, которые известны, но не являются коммерчески доступными в каталогах, могут быть получены в компаниях, осуществляющих синтез по заказу, такие компании (например, перечисленные выше) обеспечивают синтез под заказ. Описание способов получения и выбора фармацевтических солей, предусмотренных данным изобретением, можно найти в публикации Р.Н. Stahl & С.G. Wermuth "Handbook of Pharmaceutical Salts," Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002. Описание способов, известных среднему специалисту в данной области, можно найти в различных справочниках и базах данных. Подходящие справочники и монографии содержат подробное описание синтеза реагентов, используемых при получении соединений, описанных в данной заявке, или включают ссылки на публикации, которые содержат описание способов синтеза.
Методы анализа и идентификации сенолитических агентов описаны далее в данной заявке более подробно. Кроме того, при идентификации и выборе низкомолекулярных соединений (малых молекул) в качестве сенолитических агентов специалист в данной области медицинской химии может также учитывать другие свойства малой молекулы, такие как растворимость, биодоступность, фармакокинетика, правило пяти Липинского и т.п.
Полипептиды, антитела и нуклеиновые кислоты
Согласно другим некоторым вариантам сенолитический агент может быть полипептидом, пептидом, антителом, антигенсвязывающим фрагментом антитела (то есть пептидами и полипептидами, содержащими по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (CDR)), пептителом, рекомбинантным вирусным вектором или нуклеиновой кислотой. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, миРНК (siRNA), кшРНК (shRNA) или пептид. Например, сенолитические агенты, такие как полипептиды, антитела, нуклеиновые кислоты и т.п., включают, например, ингибиторы MDM2, BCL-2 ингибиторы белков семейства BCL-2 или ингибиторы киназы Akt. Согласно другим вариантам полипептиды, пептиды, антитела (включая их антигенсвязывающие фрагменты), которые специфически связываются с лигандом или целевым белком малой молекулы сенолитического агента, описанного в данной заявке, могут быть использованы при проведении анализов и осуществлении методов оценки или мониторинга применения низкомолекулярного сенолитического агента (малой молекулы).
Полинуклеотид или олигонуклеотид, который специфически гибридизуется с частью мРНК, которая кодирует целевой белок (например, Bcl-xL, Bcl-2, Bcl-w, MDM2, Akt) клетки, являющейся стареющей или являющейся клеткой в микроокружении заболевания, индуцирует старение клетки по возрасту, вследствие биологического повреждения (то есть повреждения клетки) при медицинской терапии или вследствие негативного воздействия окружающей среды. Согласно другим вариантам целевой белок может представлять собой лиганд или белок по ходу транскрипции или против хода транскрипции в сигнальном пути выживаемости клеток или воспалительном сигнальном пути, или апоптотическом пути. Полинуклеотиды и олигонуклеотиды могут быть комплементарными по меньшей мере части нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой белок (например, короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, антисмыслового олигонуклеотида, рибозима или пептидной нуклеиновой кислоты), которая может быть использована для изменения экспрессии гена и/или белка. Эти полинуклеотиды, которые специфически связываются с молекулами нуклеиновой кислоты или гибридизуются специфически с молекулами нуклеиновой кислоты, которая кодирует целевой полипептид, могут быть получены с использованием нуклеотидных последовательностей, доступных в уровне техники. Согласно другому варианту для изменения экспрессии генов или белка можно также использовать нуклеиновые кислоты, такие как аптамеры, которые не являются сиквенс-специфичными.
Антисмысловые полинуклеотиды связываются с нуклеиновыми кислотами, такими как мРНК или ДНК, сиквенс-специфичным образом. Идентификация олигонуклеотидов и рибозимов для применения в качестве сенолитических агентов и идентификация ДНК, кодирующей целевые гены для нацеленной доставки, включают методы, хорошо известные из уровня техники. Например, хорошо известны желаемые свойства, величины длины и другие характеристики таких олигонуклеотидов. Антисмысловая технология может быть использована для регулирования экспрессии генов посредством интерференции со связыванием полимераз, транскрипционных факторов или других регуляторных молекул (см., например, Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)).
Короткие интерферирующие РНК могут быть использованы для модулирования (снижения или ингибирования) экспрессии гена, кодирующего целевой полипептид, представляющий интерес (см., например, примеры в данной заявке). Малые молекулы нуклеиновой кислоты, такой как короткая интерферирующая РНК (киРНК), микро-РНК (миРНК) и короткая шпилечная РНК (кшРНК), могут быть использованы molecules в соответствии со способами, описанными в данной заявке, для модулирования экспрессии целевого белка. Полинуклеотид киРНК предпочтительно содержит двунитевую РНК (днРНК), но может содержать однонитевую PHКRNA (см., например, Martinez et al., Cell 110: 563-74 (2002)). Полинуклеотид киРНК может содержать другие полимеры природного происхождения, рекомбинантные или синтетические однонитевые или двунитевые полимеры нуклеотидов (рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды или комбинацию обоих нуклеотидов) и/или нуклеотидные аналоги, например, предусмотренные в данной заявке и известные или используемые специалистами в данной области.
Термин "киРНК" относится к двунитевой интерферирующей РНК, если не следует иное. Обычно киРНК является двунитевой нуклеиновой кислотой, содержащей две нуклеотидных нити, причем каждая нить содержит от примерно 19 до примерно 28 нуклеотидов (то есть примерно 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 нуклеотидов). Согласно некоторым вариантам каждая нить состоит из 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеотидов. Согласно другим вариантам киРНК содержит две нуклеотидных нити, причем каждая нить включает примерно 15, 16, 17 или 18 нуклеотидов. Согласно другим конкретным вариантам одна нить двунитевой киРНК содержит по меньшей мере на два нуклеотида больше, например, одна нить может иметь два "липких" конца (таких как ТТ) на одном конце, обычно на 3'-конце.
Молекулы короткой шпилечной РНК содержат и смысловые и антисмысловые нити интерферирующей РНК в "петле на стебле" или в шпилечной структуре (например, шРНК (shRNA)). Шпилечная РНК может быть экспрессирована из вектора ДНК, в котором олигонуклеотиды ДНК, кодирующие смысловую нить интерферирующей РНК, связаны с олигонуклеотидами ДНК, кодирующими обратную антисмысловую нить комплементарной интерферирующей РНК при помощи короткого спейсера. Если это необходимо, могут быть добавлены 3'-концевые T's и сайты рестрикции, образующие нуклеотид. Полученный транскрипт РНК конъюгирует "в себе" с образованием "петли на стебле".
Кроме киРНК с RISC (индуцированным РНК комплексом сацленсинга) и молчащими генами могут взаимодействовать другие интерферирующие РНК и РНК-подобные кислоты, такие как короткие шпилечные РНК (кшPHК(shRNAs)), однонитевые кшРНК, микроРНК (miRNAs) и субстратныее 27-звенные дуплексы. Такие РНК-подобные молекулы могут содержать один или более химически модифицированных нуклеотидов, один или более не нуклеотидов, один или более дезоксирибонуклеотидов и/или один или более нефосфодиэфирных связей. РНК или РНК-подобные молекулы, которые могут взаимодействовать с RISC и участвовать в изменениях, связанных с RISC в процессе экспрессии генов, в данной заявке называются "интерферирующими РНК" или "молекулами интерферирующей РНК." Однонитевая интерферирующая РНК в некоторых случаях влияет на сайленсинг мРНК, но менее эффективно, чем двунитевая РНК.
Специалисту в данной области известно также, что молекулы РНК, такие как киРНК, миРНК, кшРНК, могут быть химически модифицированы для придания повышенной стабильности к деградации нуклеазами при одновременном сохранении способности связываться с целевыми молекулами нуклеиновых кислот, которые могут находиться в клетках. РНК может быть модифицирована в любом положении молекулы до тех пор, пока модифицированная РНК связывается с целевой последовательностью, представляющей интерес, и остается стойкой к деградации ферментами. Модификация в киРНК может быть по нуклеотидному основанию, по рибозе или фосфату. Например, может быть модифицировано 2'-положение рибозы, такая модификация может быть осуществлена при использовании любого из различных методов, применяемых в уровне техники. РНК может быть химически модифицирована путем добавления галоида, такого как фтор. Другие химические группы, которые могут быть использованы для модификации молекул РНК, включают метальную, метоксиэтильную и пропильную группы (см., например, патент США №8,675,704).
Согласно конкретному варианту полинуклеотид или олигонуклеотид (в том числе кшРНК) могут быть доставлены посредством рекомбинантного вектора, в который были введены полинуклеотид или олигонуклеотид, представляющие интерес. Согласно другим вариантам рекомбинантный вирусный вектор может представлять собой рекомбинантный вектор для экспрессии, в который вставлена полинуклеотидная последовательность, которая кодирует антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, полипептид или пептид, который ингибирует белок сигнального пути выживаемости клеток или воспалительного сигнального пути, включая белки, описанные в данной заявке, такие как Bcl-xL, Bcl-2, Bcl-w, MDM2 и Akt, причем кодирующая последовательность функционально связана с одной или более регуляторными последовательностями для экспрессии полипептида, антитела, антигенсвязывающего фрагмента или пептида. Рекомбинантный вектор или рекомбинантный вектор для экспрессии может быть вирусным рекомбинантным вектором или вирусным рекомбинантным вектором для экспрессии. Примеры вирусных векторов включают, без ограничения, геном лентивирусного вектора, геном поксвирусного вектора, геном вектора на основе вируса осповакцины, геном аденовирусного вектора, геном вектора аденоассоциированного вируса, геном вектора герпес-вируса и геном вектора альфа-вируса. Вирусный вектор может быть живым, ослабленным, условно-репликационным или дефектным по репликации и обычно непатогенным (дефектным), репликационно-компетентным вирусным вектором. Способы и методики конструирования и получения таких вирусных векторов хорошо известны и обычно используются специалистами в данной области.
Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, представляет собой антисмысловой олигонуклеотид. Неограничивающим примером конкретных антисмысловых олигонуклеотидов BCL-xL, которые могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке, являются олигонуклеотиды, описанные ранее (см, например, международную заявку WO 00/66724; Xu et al., Intl. J. Cancer 94: 268-74 (2001); Olie et al., J. Invest. Dermatol. 118: 505-512 (2002); и Wacheck et al., Br. J. Cancer 89: 1352-1357 (2003)).
Согласно некоторым вариантам сенолитический агент, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, представляет собой пептид. Примером селективного ингибитора BCL-xL согласно некоторым вариантам является пептидный ВН3-миметик. Примеры таких пептидных ВН3-миметиков включают описанные ранее пептиды (см, например, Kutzki et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 11838-39 (2002); Yin et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 22: 1375-79 (2004); Matsumura et al., FASEB J. 7: 2201 (2010)).
Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, не включает полинуклеотид или его фрагмент, который кодирует экзонуклеазу, EXO1, или вектор (включая вирусный вектор), который включает полинуклеотид, который кодирует фермент EXO1 enzyme (то есть полинуклеотид, кодирующий фермент EXO1, фрагмент этого полинуклеотида или вектор, содержащий такой полинуклеотид, исключается). Сенолитический агент, который может быть использован в способах, описанных в данной заявке, не включает также полипептид фермента EXO1 (то есть фермент EXO1 исключается) или его биологически активный пептидный или полипептидный фрагмент. Кроме того, такие молекулы не являются ингибиторами одного или обоих путей из сигнального пути выживаемости клеток или воспалительного сигнального пути, вместо этого EXO1 кодирует 5'-3'-экзонуклеазу, которая вызывает деградацию дефектных по кэппингу теломеров (см., например, международную заявку WO 2006/018632).
2
Сенолитический агент, описанный в данной заявке, может быть полипептидом, который представляет собой антитело или его антигенсвязывающим фрагментом. Антигенсвязывающий агент может быть F(ab'), Fab, Fab', Fv, и Fd и включает также пептид или полипептид, который содержит по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (CDR). Антитело может быть The antibody may be an интернализированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который интернализирован стареющей клеткой путем взаимодействия с целевым белком.
Свойства антитела, обеспечивающие связывание с распознанным антигеном, обычно могут быть определены и оценены методам, которые могут быть легко осуществлены средними специалистами в данной области (см., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Используемое антитело называется "иммуноспецифическим", "специфическим к" или "специфически связывающим" антиген, если оно заметно реагирует с полипептидом. Аффинность фрагментов связывания антител и их антигенсвязывающих фрагментов может быть легко определена обычными методами, например методами, описанными Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51: 660 (1949)) и методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR; BIAcore™, Biosensor, Piscataway, NJ).
Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Вариабельная область или одна или более областей, определяющих комплементарность (CDRs) могут быть идентифицированы и выделены из антигенсвязывающего фрагмента или библиотек пептидов. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть рекомбинантными и/или получены с применением рекомбинантной технологии. Антитело может принадлежать к классу иммуноглобулинов, например к IgG, IgE, IgM, IgD или IgA, и может быть получено или взято от животного, например, от домашней птицы (например, курицы) и млекопитающих, которые включают, но без ограничения, мышь, крысу, хомячка, кролика или другого грызуна, корову, лошадь, овцу, козу, верблюда, человека или другого примата. При использовании для людей антитела или их антигенсвязывающие фрагменты обычно являются человеческими, гуманизированными или химерными для снижения иммунологического ответа субъекта на пептидные или полипептидные последовательности нечеловеческого происхождения.
2
Антитело может быть моноклональным антителом, которое является человеческим, гуманизированным, химерным, биспецифическим или антигенсвязывающим фрагментом (например, F(ab'), Fab, Fab', Fv или Fd), полученным из него. Антигенсвязывающий фрагмент может также быть любым синтетическим или генетически сконструированным белком (см., например, Hayden et al., Curr Opin. Immunol. 9: 201-12 (1997); Coloma et al., Nat. Biotechnol. 15: 159-63 (1997); патент США №5,910 573); Holliger et al., Cancer Immunol. Immunother. 45: 128-30 (1997); Drakeman et al., Expert Opin. Investig. Drugs 6: 1169-78 (1997); Koelemij et al., J. Immunother. 22: 514-24 (1999); Marvin et al., Acta Pharmacol. Sin. 26: 649-58 (2005); Das et al., Methods Mol. Med. 109: 329-46 (2005); международные заявки на патент №№ PCT/US91/08694 и PCT/US91/04666) или из библиотеки фаговых дисплеев (см., например, Scott et al., Science 249: 386 (1990); Devlin et al., Science 249: 404 (1990); Cwiria et al., Science 276: 1696-99 (1997); патенты США №№5,223,409; 5,733,731; 5,498,530; 5,432,018; 5,338,665; 1994; патент США №5,922,545; международные заявки WO 96/40987 и WO 98/15833). Пептид, который является минимально распознаваемой единицей, или CDR (то есть одной или несколькими из трех CDRs, находящихся в вариабельной области тяжелой цепи и/или одной из трех CDRs, находящихся в вариабельной области легкой цепи), может быть идентифицирован посредством компьютерного моделирования, которое может быть использовано для сравнения и предсказания пептидной последовательности, которая будет специфически связываться с целевым белком, представляющим интерес (см., например, Bradley et al., Science 309: 1868 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310: 638 (2005)). Подходящие методы конструирования гуманизированных антител описаны в уровне техники (см., например, Jones et al., Nature 321: 522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-27 (1988; Padlan et al., FASEB 9: 133-39 (1995); Chothia et al., Nature, 342: 377-83 (1989)).
СТАРЕЮЩИЕ КЛЕТКИ
Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, могут быть использованы для селективного уничтожения или разрушения стареющей клетки клинически значимым или биологически значимым образом. Как обсуждается подробно в данной заявке, один или более сенолитических агентов используются в таком количестве и в течение такого времени, которые являются достаточными для селективной гибели установленных стареющих клеток, но недостаточными для уничтожения (разрушения, гибели) нестареющей клетки клинически значимым или биологически значимым образом. Сенолитические агенты могут уничтожать один или более видов стареющих клеток (например, стареющие преадипоциты, стареющие эндотелиальные клетки, стареющие фибробласты, стареющие преадипоциты стареющие нейроны, стареющие эпителиальные клетки, стареющие мезенхимальные клетки, стареющие гладкомышечные клетки, стареющие макрофаги или стареющие хондроциты).
Стареющая клетка может обладать одной или несколькими следующими семью характеристиками. (1) Связанный со старением арест роста является по существу постоянным и не может быть устранен известными физиологическими стимулами. (2) Стареющие клетки увеличиваются в размере, иногда в более чем в два раза по сравнению с размером непостаревших аналогов. (3) Стареющие клетки экспрессируют β-галактозидазу, ассоциированную со старением (SA-β-gal), что частично отражает увеличение массы лизосом. (4) Большинство стареющих клеток экспрессирует p16INK4a, который обычно не экспрессируется молчащими (покоящимися) или окончательно дифференцированными клетками. (5) Клетки, которые стареют в присутствии передачи сигналов DDR, обнаруживают постоянные ядерные фокусы, называемые сегментами ДНК с изменениями хроматина, усиливающими старение (DNA-SCARS). Эти фокусы содержат активированные с помощью DDR белки и отличаются от временных повреждающих фокусов. DNA-SCARS включают нефункциональные теломеры или дисфункцией теломер-индуцированные фокусы (TIF). (6) Стареющие клетки экспрессируют и могут секретировать молекулы, ассоциированные со старением, которые в некоторых случаях могут наблюдаться в присутствии персистирующих сигналов DDR, которые в некоторых случаях могут зависеть от персистирующих сигналов DDR для их экспрессии. (7) Ядро стареющих клеток теряет структурные белки, такие как ламин В1 или хроматин-ассоциированные белки, такие как гистоны и HMGB1. См., например, Freund et al., Mol. Biol. Cell 23: 2066-75 (2012); Davalos et al., J. Cell Biol. 201: 613-29 (2013); Ivanov et al., J. Cell Biol. DOI: 10.1083/jcb.201212110, page 1-15; опубликовано он-лайн 01 июля 2013 г; Funayama et al., J. Cell Biol. 175: 869-80 (2006)).
Стареющие клетки и молекулы, ассоциированные со старением, могут быть детектированы с помощью способов и методик, описанных в уровне техники. Например, наличие стареющих клеток в тканях можно анализировать гистохимическими или иммуногистохимическими методами, которые выявляют маркер старения, SA-бета-галактозидазу (SA-βgal) (см., например, Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9363-9367 (1995)). Наличие полипептида р16, ассоциированного со стареющими клетками, можно определить любым из многочисленных методов иммунохимии, применяемых на практике, таким как метод иммуноблотинга. Экспрессия мРНК р16 в клетке может быть измерена различными методами, применяемыми в уровне техники, включая количественный анализ ПЦР. Наличие и количество полипептидов, ассоциированных со стареющими клетками (например, полипептидов SASP) могут быть определены методами автоматизированного анализа с высокой пропускной способностью, таким как автоматизированный метод Luminex, описанный в уровне техники (см., например, Сорре et al., PLoSBiol 6: 2853-68 (2008)).
2
2
Наличие стареющих клеток можно также определить путем детектирования молекул, ассоциированных со стареющими клетками, которые включают факторы роста, протеазы, цитокин (например, воспалительные цитокины), хемокины, метаболиты, связанные с клетками, реакционноспособные кислородсодержащие вещества (например, HO), и другие молекулы, которые стимулируют воспаление и/или другие биологические эффекты или реакции, которые могут промотировать или усиливать заболевания субъекта. Молекулы, ассоциированные со стареющими клетками, включают молекулы, описанные в уровне техники как содержащие секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP, то есть который включает секретированные факторы, которые могут образовывать провоспалительный фенотип стареющей клетки), секретом, вызывающий старение, и секреторную программу повреждения ДНК (DDSP). Эти группы молекул, ассоциированных со стареющими клетками, как описано в уровне техники, содержат общие молекулы и не описываются как при отдельные различные группы молекул. Молекулы, ассоциированные со стареющими клетками, включают некоторые экспрессированные и секретированные факторы роста, протеазы, цитокины и другие факторы, которые обладают сильно выраженным аутокринным и паракринным действием (см., например, Сорре et al., supra; Coppe et al. J. Biol. Chem. 281: 29568-74 (2006); Coppe et al. PLoS One 5: 39188 (2010); Krtolica et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 12072-77 (2001); Parrinello et al., J. Cell Sci. 118: 485-96 (2005). ЕСМ-ассоциированные факторы включают воспалительные белки и медиаторы ЕСМ-ремоделирования (ремоделирования внеклеточного матрикса), которые в значительной степени индуцированы в стареющих клетках (см., например, Kuilman et al., Nature Reviews 9: 81-94 (2009)). Другие молекулы, ассоциированные со стареющими клетками, включают внеклеточные полипептиды (белки), которые описаны совместно как секреторная программа повреждения ДНК (DDSP) (см., например, Sun et al., Nature Medicine 18: 1359-1368 (2012)). Белки, ассоциированные со стареющими клетками, включают также белки клеточной поверхности (или рецепторы), которые экспрессированы на поверхности стареющих клеток, которые включают белки, которые содержатся в меньшем определяемом количестве или не содержаться на поверхности нестареющей клетки.
Молекулы, ассоциированные со стареющими клетками, включают секретированные факторы, которые могут образовывать провоспалительный фенотип стареющей клетки (например, SASP). Эти факторы включают, без ограничения, GM-CSF, GROα, GROα,β,γ, IGFBP-7, IL-1α, IL-6, IL-7, IL-8, MCP-1, MCP-2, MIP-1α, MMP-1, MMP-10, MMP-3, амфирегулин, ENA-78, Eotaxin-3, GCP-2, GITR, HGF, ICAM-1, IGFBP-2, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, IL-13, IL-1β, MCP-4, MIF, MIP-3α, MMP-12, MMP-13, MMP-14, NAP2, онкостатин М, остеопротегерин, PIGF, RANTES, sgp130, TIMP-2, TRAIL-R3, Acrp30, ангиогенин, Axl, bFGF, BLC, BTC, CTACK, EGF-R, Fas, FGF-7, G-CSF, GDNF, HCC-4, I-309, IFN-γ, IGFBP-1, IGFBP-3, IL-1 R1, IL-11, IL-15, IL-2R-α, IL-6R, I-TAC, лептин, LIF, MMP-2, MSP-a, PAI-1, PAI-2, PDGF-BB, SCF, SDF-1, sTNF RI, sTNF RII, тромбопоэтин, TIMP-1, tPA, uPA, uPAR, VEGF, MCP-3, IGF-1, TGF-β3, MIP-1-delta, IL-4, FGF-7, PDGF-BB, IL-16, BMP-4, MDC, MCP-4, IL-10, TIMP-1, Fit-3 Ligand, ICAM-1, Axl, CNTF, INF-γ, EGF, BMP-6. Дополнительные идентифицированные факторы, которые включают факторы, иногда описанные в уровне техники в качестве секретома, вызывающего старение (SMS), причем некоторые из них включены в перечень SASP-полипептидов, включают, без ограничения, IGF1, IGF2 и IGF2R, IGFBP3, IDFBP5, IGFBP7, РА11, TGF-β, WNT2, IL-1α, IL-6, IL-8 и CXCR2-связывающие хемокины. Молекулы, ассоциированные со стареющими клетками, включают, также без ограничения, факторы, описанные в публикации Sun et al., Nature Medicine, supra, и например, включают генные продукты, ММР1, WNT16B, SFRP2, ММР12, SPINK1, ММР10, ENPP5, EREG, BMP6, ANGPTL4, CSGALNACT, CCL26, AREG, ANGPT1, CCK, THBD, CXCL14, NOV, GAL, NPPC, FAM150B, CST1, GDNF, MUCL1, NPTX2, TMEM155, EDN1, PSG9, ADAMTS3, CD24, PPBP, CXCL3, MMP3, CST2, PSG8, PCOLCE2. PSG7, TNFSF15, C17orf67, CALCA, FGF18, IL8, BMP2, MATN3, TFP1, SERPINI1, TNFRSF25 и IL23A. Белки, ассоциированные со стареющими клетками, включают также белки клеточной поверхности (или рецепторы), которые экспрессированы на поверхности стареющих клеток, которые включают белки, которые содержатся в меньшем определяемом количестве или не содержаться на поверхности нестареющей клетки.
Согласно некоторым вариантам сенолитические агенты, которые селективно уничтожают по меньшей мере стареющие преадипоциты, могут быть подходящими для лечения диабета (особенно диабета типа II), метаболического синдрома или ожирения. Согласно другим вариантам сенолитические агенты способны селективно уничтожать по меньшей мере стареющие эндотелиальные клетки, стареющие гладкомышечные клетки и/или стареющие макрофаги. Такие сенолитические агенты пригодны для лечения сердечно-сосудистого заболевания (например, атеросклероза). Согласно другим конкретным вариантам сенолитические агенты способны селективно уничтожать по меньшей мере стареющие фибробласты. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитические агенты способны селективно уничтожать по меньшей мере стареющие нейроны, включая нейроны, продуцирующие дофамин. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитические агенты способны селективно уничтожать по меньшей мере стареющие ретинальные пигментированные эпителиальные клетки или другие стареющие эпителиальные клетки (например, стареющие эпителиальные клетки легкого или стареющие эпителиальные клетки почки). Селективная гибель по меньшей мере стареющих эпителиальных клеток легкого может быть полезна для лечения легочных заболеваний, таких как хроническая обструктивная болезнь легких или идиопатический легочный фиброз. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитические агенты способны селективно уничтожать по меньшей мере стареющие иммунные клетки (такие как стареющие макрофаги). Согласно еще одному конкретному варианту сенолитические агенты способны селективно уничтожать по меньшей мере стареющие хондроциты, что может быть полезно для лечения воспалительного нарушения, такого как остеоартрит.
СПОСОБЫ СЕЛЕКТИВНОГО УНИЧТОЖЕНИЯ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК
Данное изобретение предусматривает способы селективного уничтожения стареющих клеток и лечения или профилактики (уменьшения вероятности возникновения) заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, как описано в данной заявке. Как описано в данной заявке, эти сенолитические агенты вводятся таким образом, который будет считаться неэффективным при лечении ракового заболевания. Поскольку способ, используемый для лечения заболевания, ассоциированного со старением, при помощи сенолитического агента, описанного в данной заявке, включает введение одной или более уменьшенной ежедневной дозы, уменьшенной кумулятивной дозы во время одного терапевтического цикла или уменьшенной кумулятивной дозы сенолитического агента (например, ингибитора MDM2; ингибитора по меньшей мере одного члена семейства апоптотических белков Bcl-2, который ингибирует по меньшей мере Bcl-xL; ингибитора киназы Akt) в течение нескольких терапевтических циклов по сравнению с количеством, которое требуется для раковой терапии, уменьшается вероятность появления одного или более неблагоприятных эффектов (то есть побочных эффектов), причем эти неблагоприятные эффекты связаны с лечением субъекта в соответствии со схемой лечения, оптимизированной для лечения ракового заболевания.
Схема лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, включает введение сенолитического агента в течение промежутка времени и в количестве, достаточных для селективного уничтожения стареющих клеток, причем сенолитический агент вводится во время цикла лечения, который включает курс лечения с последующим периодом "отдыха от лекарства". Курс введения относится в данной заявке к временной рамке, в течение которой одна или более доз сенолитического агента вводится в один или более дней. Временную рамку в данной заявке можно также назвать "окном" лечения.
Согласно одному из вариантов данное изобретение предусматривает способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, которое не является раковым заболеванием, этот способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, низкомолекулярного сенолитического агента (малой молекулы), который селективно уничтожает стареющие клетки, и лечение проводится циклом. Согласно конкретному варианту такие способы включают введение сенолитического агента во время по меньшей мере двух циклов лечения. Согласно конкретному варианту период "отдыха от лекарства" может длиться по меньшей мере примерно две недели или по меньшей мере от примерно 0.5-12 месяцев, например, примерно один месяц, по меньшей мере примерно 2 месяца, по меньшей мере примерно 3 месяца, по меньшей мере примерно 4 месяца, по меньшей мере примерно 5 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 7 месяцев, по меньшей мере примерно 8 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 10 месяцев, по меньшей мере примерно 11 месяцев или по меньшей мере примерно 12 месяцев (то есть 1 год). Согласно другим конкретным вариантам период "отдыха от лекарства" продолжается от 1 до 2 лет или от 2 до 3 лет или больше. Согласно некоторым вариантам каждый курс лечения длится не более примерно 1 месяца, не более примерно 2 месяцев или не более примерно 3 месяцев; или не более, чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 26, 27, 28, 29, 30 дней или 31 день.
й
й
Согласно некоторым вариантам "окно" лечения (то есть курс лечения) длится только один день. Согласно некоторым вариантам один курс лечения продолжается не более, чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 27, 28, 29, 30 дней или 31 день. Во время такого курса лечения сенолитический агент может вводиться по меньшей мере в течение 2 дней (то есть двух дней или более) при переменном количестве дней, в которые этот агент не вводится между по меньшей мере двумя днями введения. Иначе говоря, в случае курса лечения, когда сенолитический агент вводится в течение двух или более дней, курс лечения может включать один или более интервалов в один или более дней, когда сенолитический агент не вводится. Например, (без ограничения), когда сенолитический агент вводится в течение двух или более дней во время курса лечения, не превышая 21 день, этот агент может вводиться в течение любого количества дней между 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 27, 28, 29, 30 днями или 31 днем. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент вводится субъекту во время курса лечения из 3 дней или более, и этот агент может вводиться каждый 2 день (то есть каждый другой день). Согласно некоторым другим вариантам, когда сенолитический агент вводится субъекту во время курса лечения из 4 дней или более, этот агент может вводиться каждый 3 день (то есть каждый следующий третий день). Согласно одному из вариантов сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух дней (то есть двух или более дней) во время курса лечения, который длится по меньшей мере 2 дня и не более примерно 21 дней (то есть примерно 2-21 день); по меньшей мере 2 дня и не более примерно 14 дней (то есть примерно 2-14 дней); по меньшей мере 2 дня и не более примерно 10 дней (то есть примерно 2-10 дней); или по меньшей мере 2 дня и не более примерно 9 дней (то есть примерно 2-9 дней); или по меньшей мере 2 дня и не более примерно 8 дней (то есть примерно 2-8 дней). Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух дней (то есть двух или более дней) во время курса лечения, который длится по меньшей мере 2 дня и не более примерно 7 дней (то есть примерно 2-7 дней); по меньшей мере 2 дня и не более примерно 6 дней (то есть примерно 2-6 дней); или по меньшей мере 2 дня и не более примерно 5 дней (то есть примерно 2-5 дней) или по меньшей мере 2 дня и не более примерно 4 дней (то есть примерно 2-4 дней). Согласно еще одному варианту окно лечения продолжается по меньшей мере 2 дня и не более примерно 3 дней (то есть примерно 2-3 дня); или не более примерно 2 дней. Согласно некоторым конкретным вариантам курс лечения длится не более 3 дней. Согласно другим вариантам курс лечения длится не более 5 дней. Согласно другим конкретным вариантам курс лечения длится не более 7 дней, 10 дней или 14 дней или 21 дня. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух дней (то есть 2 или более дней) во время окна лечения, которое длится по меньшей мере 2 дня и не более примерно 11 дней (то есть 2-11 дней); или сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух дней (то есть 2 или более дней) во время окна лечения, которое длится по меньшей мере 2 дня и не более примерно 12 дней (то есть 2-12 дней); или сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух дней (то есть 2 или более дней) во время окна лечения, которое длится по меньшей мере 2 дня и не более примерно 13 дней (то есть 2-13 дней); или сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух дней (то есть 2 или более дней) во время окна лечения, которое длится по меньшей мере 2 дня и не более примерно 15 дней (то есть 2-15 дней); или сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере двух дней (то есть 2 или более дней) во время окна лечения, которое длится по меньшей мере 2 дня и не более примерно 16 дней, 17 дней, 18 дней, 19 дней или 20 дней (то есть 2-16, 2-17, 2-18, 2-19, 2-20 дней, соответственно). Согласно другим вариантам сенолитический агент может вводиться в течение по меньшей мере 3 дней во время курса лечения, длящегося по меньшей мере 3 дня и не более, чем любое количество дней между 3 и 21 днями; или может вводиться в течение по меньшей мере 4 дней во время курса лечения, длящегося по меньшей мере 4 дня и не более, чем любое количество дней между 4 и 21 днями; или может вводиться в течение по меньшей мере 5 дней во время курса лечения, длящегося по меньшей мере 5 дней и не более, чем любое количество дней между 5 и 21 днями; или может вводиться в течение по меньшей мере 6 дней во время курса лечения, длящегося по меньшей мере 6 дней и не более, чем любое количество дней между 6 и 21 днями; или может вводиться в течение по меньшей мере 7 дней во время курса лечения, длящегося по меньшей мере 7 дней и не более, чем любое количество дней между 7 и 21 днями; или может вводиться в течение по меньшей мере 8 или 9 дней в течение курса лечения из по меньшей мере 8 или 9 дней, соответственно, и не более, чем любое количество дней между 8 или 9 днем, соответственно, и 21 днем; или может вводиться в течение по меньшей мере 10 дней во время курса лечения из по меньшей мере 10 дней и не более, чем любое количество дней между 10 и 21 днями; или может вводиться в течение по меньшей мере 14 дней в течение курса лечения из по меньшей мере 14 дней и не более, чем любое количество дней между 14 и 21 днями; или может вводиться в течение по меньшей мере 11 или 12 дней в течение курса лечения из по меньшей мере 11 или 12 дней, соответственно, и не более, чем любое количество дней между 11 или 12 днем, соответственно, и 21 днем; или может вводиться в течение по меньшей мере 15 или 16 дней в течение курса лечения из по меньшей мере 15 или 16 дней, соответственно, и не более, чем любое количество дней между 15 или 16 днем, соответственно, и 21 днем. В качестве дополнительного примера можно указать, что, когда курс лечения длится не более 14 дней, сенолитический агент может вводиться в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 дней во время окна лечения, длящегося в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 дней, соответственно, и не более 14 дней. Когда курс лечения продолжается не более 10 дней, сенолитический агент может вводиться в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней во время окна лечения, длящегося в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, соответственно, и не более 10 дней. Подобным образом, когда курс лечения длится не более 7 дней, сенолитический агент может вводиться в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней во время окна лечения, длящегося в течение по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, соответственно, и не более 7 дней. Согласно еще одному примеру, когда курс лечения длится не более 5 дней, сенолитический агент может вводиться в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 дней во время окна лечения, длящегося в течение по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 дней, соответственно, и не более 5 дней.
В случае курса лечения из трех или более дней дозы сенолитического агента могут вводиться в течение меньшего количества дней, чем общее количество дней в течение конкретного окна лечения. Например, (без ограничения), когда курс лечения состоит из не более 7, 10, 14 дней или 21 дня, количество дней, в течение которых сенолитический агент может вводиться, является любым количеством дней между 2 днями и 7, 10, 14 или 21 днем, соответственно, с любым интервалом, который подходит для любого заболевания, подвергающегося лечению, когда вводится сенолитический агент, при этом состояние здоровья пациента и другие релевантные факторы будут обсуждаться более подробно ниже. Специалист в данной области может легко оценить, что, когда сенолитический агент вводится в течение двух или более дней во время окна лечения, доставка этого агента может осуществляться в течение минимального количества дней окна лечения, максимального количества дней окна лечения, или в течение любого количества дней между минимальным и максимальным количествами дней.
Согласно некоторым конкретным вариантам курс лечения составляет один день или курс лечения не превышает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, что является примером курса, во время которого сенолитический агент вводится в течение двух или более дней в течение курса лечения, не превышающего (то есть длящегося не более, чем) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, соответственно. Согласно некоторым другим вариантам курс лечения длится примерно 2 недели (примерно 14 дней или 0.5 мес.), примерно 3 недели (примерно 21 день), примерно 4 недели (примерно один месяц), примерно 5 недель, примерно 6 недель (примерно 1.5 месяца), примерно 2 месяца (или примерно 60 дней), или примерно 3 месяца (или примерно 90 дней). Согласно конкретному варианту курс лечения является курсом с одной ежедневной дозой сенолитического агента. Согласно другим вариантам во время любого курса лечения дневная доза сенолитического агента может вводиться однократно или эта доза может быть разделена на 2, 3, 4 или 5 частей, обеспечивающих общую дневную дозу этого агента.
Как описано в данной заявке, согласно некоторым конкретным вариантам во время окна лечения, когда сенолитический агент вводится в течение двух или более дней, курс лечения может включать один или более интервалов в один или более дней, когда сенолитический агент не вводится. Согласно одному неограничивающему примеру, когда окно лечения длится между двумя и семью днями, первая доза может вводиться в первый день окна лечения, вторая доза может вводиться на третий день курса, и третья доза может вводиться на седьмой день окна лечения. Специалисту в данной области известно, что схема лечения с изменяющимися дозами может быть использована во время конкретного окна лечения. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится ежедневно в каждый последовательный день для продолжения курса лечения. Дневная доза может вводиться в виде однократной дозы или эта доза может быть разделена на 2, 3, 4 или 5 частей, обеспечивающих общую дневную дозу этого агента.
Согласно некоторым вариантам курс лечения включает такой промежуток времени, во время которого сенолитический агент вводится ежедневно. Согласно одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 2 дней. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 3 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 4 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 5 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 6 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 7 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 8 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 9 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 10 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 11 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 12 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 13 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 14 дней. Окно лечения (то есть курс) для каждого из приведенных выше примеров длится не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14 дней, соответственно.
й
й
й
й
й
й
й
й
Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится каждый 2 день (то есть каждый другой день) в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится каждый 3 день (то есть один день этот агент вводится и затем в течение двух дней наступает перерыв) в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент может вводиться каждый 2 - 3 день во время окна лечения, которое длится 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней. Согласно другим вариантам сенолитический агент может вводиться каждый 4 день во время окна лечения, которое длится 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней; или каждый 5 день во время курса лечения, который длится 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней. Специалист в данной области легко может определить минимальное количество дней окна лечения, когда сенолитический агент вводится каждый 6, 7 и т.д. день во время окна лечения в течение определенного количества дней, как описано в данной заявке.
й
й
Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно в течение промежутка времени, составляющего более 14 дней, и может вводиться в течение по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или по меньшей мере в течение 21 дня. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно в каждый из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый второй день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый третий день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый второй-третий день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день. Согласно другим вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый 4 день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день; или каждый 5 день во время курса лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день.
й
й
Специалист в данной области легко может определить минимальное количество дней окна лечения, когда сенолитический агент вводится каждый 6, 7 и т.д. день во время окна лечения в течение определенного количества дней, как описано в данной заявке.
й
й
й
й
Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно в течение более 14 дней и может вводиться в течение по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или по меньшей мере в течение 21 дня. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно в каждый из 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый второй день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый третий день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый второй-третий день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день. Согласно другим вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый 4 день во время окна лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день; или каждый 5 день во время курса лечения, которое составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или 21 день. Специалист в данной области легко может определить минимальное количество дней окна лечения, когда сенолитический агент вводится каждый 6, 7 и т.д. день во время окна лечения в течение определенного количества дней, как описано в данной заявке.
й
й
й
й
Согласно некоторому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно в течение промежутка времени, составляющего более 14 дней или 21 дня и может вводиться в течение курсы лечения, который длится примерно один месяц, примерно два месяца или примерно три месяца. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно в течение каждого одного месяца, двух месяцев или трех месяцев курса лечения. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться каждый второй день в течение курса лечения, который длится примерно один месяц, примерно два месяца или примерно три месяца. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться каждый третий день в течение курса лечения, который длится примерно один месяц, примерно два месяца или примерно три месяца. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый второй-третий день в течение курса лечения, который длится примерно один месяц, примерно два месяца или примерно три месяца. Согласно другим вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно каждый 4 день во время курса лечения, который длится примерно один месяц, примерно два месяца или примерно три месяца; или каждый 5 день во время курса лечения, который длится примерно один месяц, примерно два месяца или примерно три месяца. Специалист в данной области легко может определить минимальное количество дней окна лечения, когда сенолитический агент вводится каждый 6, 7 и т.д. день во время окна лечения в течение определенного количества дней, как описано в данной заявке.
й
й
й
й
й
В качестве неограничивающего примера можно выбрать более продолжительный курс лечения субъекта с уменьшающейся дневной дозой. Согласно другим конкретным вариантам, без ограничения, состояние или степень серьезности заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, или другой клинический фактор могут показывать, что более продолжительный курс лечения может обеспечить клинический благоприятный результат. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент может вводиться ежедневно или, возможно, каждый другой день (каждый 2 день) или каждый 3 день, или дольше (то есть каждый 4 день, 5 день, 6 день) во время курса лечения, составляющего примерно 1-2 недели (например, примерно 5-14 дней), примерно 1-3 нед. (например, примерно 5-21 день), примерно 1-4 недели (например, примерно 5-28 дней, примерно 5-36 дней или примерно 5-42 дня, 7-14 дней, 7-21 день, 7-28 дней, 7-36 дней или 7-42 дня; или 9-14 дней, 9-21 день, 9-28 дней, 9-36 дней или 9-42 дня). Согласно другим конкретным вариантам курс лечения продолжается примерно 1-3 месяца. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение по меньшей мере пяти дней, и согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 5-14 дней. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере семи дней, например, в течение 7-14, 7-21, 7-28 дней, 7-36 дней или 7-42 дней. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере девяти дней, например, в течение 9-14 дней, 9-21 дня, 9-28 дней, 9-36 дней или 9-42 дней.
Даже хотя, как обсуждалось в данной заявке выше, курс лечения, включающий введение сенолитического агента обеспечивает достижение клинического преимущества, согласно некоторым другим вариантам курс лечения повторяется с перерывом между курсами лечения, когда сенолитический агент не вводится (то есть с интервалом без лечения, "отдыхом" от лекарства). Курс лечения, как описано в уровне техники и в данной заявке, включает цикл лечения с последующим периодом без лечения. Если это необходимо, курс лечения повторяется. Например, курс лечения можно повторять по меньшей мере один раз, по меньшей мере два раза, по меньшей мере три раза, по меньшей мере четыре раза, по меньшей мере пять раз или чаще, если это необходимо. Согласно некоторым конкретным вариантам цикл лечения повторяют один раз (то есть введение сенолитического агента включает 2 цикла лечения). Согласно другим конкретным вариантам цикл лечения повторяют два раза или повторяют 3 или более раз. Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществляют один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более циклов лечения сенолитическим агентом. Согласно конкретным вариантам курс лечения или цикл лечения можно повторять, например, когда заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, возвращается, или, когда симптомы или остаточные явления заболевания или расстройства значительно уменьшились при проведении одного курса лечения, как описано выше, снова усилились или выявляются, или, когда симптомы или остаточные явления заболевания или расстройства обострились, курс лечения можно повторить. Согласно другим вариантам, когда сенолитический агент вводится субъекту для профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения или развития) или для задержки начала, прогрессирования или увеличения степени серьезности заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, субъект может получать сенолитический агент в течение двух или более циклов лечения. Соответственно, согласно некоторым вариантам один цикл лечения сопровождается следующим циклом лечения. Каждый курс лечения или цикл лечения, или каждый курс из двух или более циклов лечения обычно являются одинаковыми в смысле продолжительности и дозирования сенолитического агента. Согласно другим вариантам продолжительность и схему дозирования сенолитического агента во время каждого курса цикла лечения может регулировать специалист в данной области медицины в зависимости от, например, конкретного заболевания или расстройства, подвергающегося лечению, вводимого сенолитического агента, состояния здоровья пациента и других релевантных факторов, которые обсуждаются в данной заявке более подробно. Соответственно, курс лечения второго или любого последующего цикла лечения может быть сокращен или удлинен так, как это полагается с медицинской точки зрения или целесообразно. Другими словами, как это очевидно для специалиста в данной области, каждый курс лечения двух или более циклов лечения является независимым и одним и тем же или отличающимся от другого, и каждый период без лечения каждого цикла лечения является независимым и одним и тем же или отличающимся от другого.
й
й
й
Как описано в данной заявке, каждый курс лечения в цикле лечения отделен промежутком времени в днях, неделях или месяцах, когда не проводится лечение сенолитическим агентом (то есть интервалом времени без лечения или периодом "отдыха" от лекарства; называемым в данной заявке периодом без лечения). Период без лечения (например, в днях, неделях или месяцах) между одним курсом лечения и последующим курсом лечения обычно длится дольше, чем самый длинный интервал времени (то есть количество дней) между любыми двумя днями введения лекарства во время курса лечения. Например, если курс лечения длится более 14 дней и агент вводится каждый второй день во время этого курса лечения, период времени без лечения между двумя курсами лечения продолжается более 2 дней, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней или примерно 3 недели, примерно 4 недели, примерно 6 недель или примерно 2 месяца или дольше, как описано в данной заявке. Согласно конкретным вариантам период времени без лечения между двумя курсами лечения продолжается примерно 5 дней, примерно 1 неделю, примерно 2 недели, примерно 3 недели, примерно 1 месяц, примерно 6 недель, примерно 2 месяца (8 недель), примерно 3 месяца, примерно 4 месяца, примерно 5 месяцев, примерно 6 месяцев, примерно 7 месяцев, примерно 8 месяцев, примерно 9 месяцев, примерно 10 месяцев, примерно 11 месяцев, примерно 12 месяцев (примерно 1 год), примерно 18 месяцев (примерно 1.5 года) или дольше. Согласно некоторым конкретным вариантам период времени без лечения между двумя курсами лечения продолжается примерно 2 года или примерно 3 года. Согласно некоторым конкретным вариантам период времени без лечения длится по меньшей мере примерно 14 дней, по меньшей мере примерно 21 день, по меньшей мере примерно 1 месяц, по меньшей мере примерно 2 месяца, по меньшей мере примерно 3 месяца, по меньшей мере примерно 4 месяца, по меньшей мере примерно 5 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев или по меньшей мере примерно 1 год. Согласно некоторым вариантам курс лечения (независимо от того, каков интервал между введениями лекарства - каждый день, каждый второй день, каждый 3 день или другое количество дней, как описано выше (например, 1-14 дней, 2-14 дней, 2-21 день или 1-21 день)) продолжается примерно каждые 14 дней (то есть примерно каждый 2 недели) (то есть 14 дней проходят без лечения сенолитическим агентом), примерно каждые 21 день (то есть примерно каждые 3 недели), примерно каждые 28 дней (то есть примерно каждые 4 недели), примерно каждый месяц, примерно каждые 36 дней, примерно каждые 42 дня, примерно каждые 54 дня, примерно каждые 60 дней или примерно каждый месяц (примерно каждые 30 дней), примерно каждые два месяца (примерно каждые 60 дней), примерно каждый квартал (примерно каждые 90 дней) или примерно полгода (примерно каждые 180 дней). Согласно некоторым другим вариантам курс лечения (например, без ограничения, введение осуществляется по меньшей мере один день или по меньшей мере два дня во время курса, который длится примерно 2-21 день, примерно 2-14 дней, примерно 5-14 дней, примерно 7-14 дней, примерно 9-14 дней, примерно 5-21 день, примерно 7-21 день, примерно 9-21 день) проводится каждые 28 дней, каждые 36 дней, каждые 42 дня, каждые 54 дня, каждые 60 дней или каждый месяц (примерно каждые 30 дней), каждые два месяца (примерно каждые 60 дней), каждый квартал (примерно каждые 90 дней) или полгода (примерно каждые 180 дней) или примерно каждый год (примерно 12 месяцев). Согласно другим вариантам курс лечения (например, без ограничения, длящийся примерно 5-28 дней, примерно 7-28 дней или примерно 9-28 дней, независимо от того, каков интервал между введениями лекарства - каждый день, каждый второй день, каждый 3 день или другое количество дней, как описано выше), приводится каждые 36 дней, 42 дня, 54 дня, 60 дней или каждый месяц (примерно каждые 30 дней), каждые два месяца (примерно каждые 60 дней), каждый квартал (примерно каждые 90 дней) или полгода (примерно каждые 180 дней). Согласно другим конкретным вариантам курс лечения (например, в течение примерно 5-36 дней, 7-36 дней или 9-36 дней, независимо от того, каков интервал между введениями лекарства - каждый день, каждый второй день, каждый 3 день или другое количество дней, как описано выше), проводится каждые 42 дня, 54 дня, 60 дней или каждый месяц (примерно каждые 30 дней), каждые два месяца (примерно каждые 60 дней), каждый квартал (примерно каждые 90 дней) или полгода (примерно каждые 180 дней) или примерно каждый год (примерно 12 месяцев).
й
Согласно конкретному варианту курс лечения продолжается один день и период времени без лечения длится по меньшей мере примерно 14 дней, примерно 21 день, примерно 1 месяц, примерно 2 месяца (8 недель), примерно 3 месяца, примерно 4 месяца, примерно 5 месяцев, примерно 6 месяцев, примерно 7 месяцев, примерно 8 месяцев, примерно 9 месяцев, примерно 10 месяцев, примерно 11 месяцев, примерно 12 месяцев (примерно 1 год), примерно 18 месяцев (примерно 1.5 года) или дольше. Согласно некоторым другим вариантам курс лечения продолжается по меньшей мере два дня или по меньшей мере три дня и не более 10 дней, и период времени без лечения длится по меньшей мере примерно 14 дней, примерно 21 день, примерно 1 месяц, примерно 2 месяца (8 недель), примерно 3 месяца, примерно 4 месяца, примерно 5 месяцев, примерно 6 месяцев, примерно 7 месяцев, примерно 8 месяцев, примерно 9 месяцев, примерно 10 месяцев, примерно 11 месяцев, примерно 12 месяцев (примерно 1 год), примерно 18 месяцев (примерно 1.5 года) или дольше. Согласно другому варианту курс лечения продолжается по меньшей мере три дня и не более 10 дней, не более 14 дней или не более 21 дня, и период времени без лечения длится по меньшей мере примерно 14 дней, примерно 21 день, примерно 1 месяц, примерно 2 месяца (8 недель), примерно 3 месяца, примерно 4 месяца, примерно 5 месяцев, примерно 6 месяцев, примерно 7 месяцев, примерно 8 месяцев, примерно 9 месяцев, примерно 10 месяцев, примерно 11 месяцев, примерно 12 месяцев (примерно 1 год), примерно 18 месяцев (примерно 1.5 года) или дольше. Согласно другому варианту курс лечения (например, в течение примерно 5-42, 7-42 или 9-42 дней, независимо от того, каков интервал между введениями лекарства -каждый день, каждый второй день, каждый 3 день или другое количество дней) проводится каждые 42 дня, 60 дней или каждый месяц (примерно каждые 30 дней), каждые два месяца (примерно каждые 60 дней), каждый квартал (примерно каждые 90 дней), или полгода (примерно каждые 180 дней) или примерно каждый год (примерно 12 месяцев).
Согласно конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 5-14 дней, каждые 14 дней (примерно каждые 2 недели) или каждые 21-42 дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 5-14 дней ежеквартально. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 5-14 дней каждые 21-42 дня. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 7-14 дней ежеквартально. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно каждые 21-42 дня в течение 5-14 дней. Согласно еще одному конкретному варианту сенолитический агент вводится ежедневно в течение 9-14 дней каждые 21-42 дня или каждые 9-14 дней ежеквартально. Согласно другим вариантам период времени без лечения между курсами лечения может меняться. Например, без ограничения, период времени без лечения может составлять 14 дней после первого курса лечения и может длиться 21 день или больше после второго, третьего или четвертого (или более) курса лечения. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится субъекту, который нуждается в этом, один раз каждые 0.5-12 месяцев. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вводится субъекту, который нуждается в этом, один раз каждые 4-12 месяцев.
Согласно другим вариантам сенолитический агент вводится субъекту для уменьшения вероятности или риска того, что у субъекта разовьется конкретное заболевание или появится один или более симптомов заболевания или расстройства, ассоциированного со старением. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент вводится в один или более дней (например, в течение любого количества последовательных дней между (включая) 2-3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20 и 2-21 днями) каждые 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. Согласно конкретному варианту сенолитический агент вводится в течение одного или более дней (например, в течение любого количества последовательных дней между 1-9 днями, включая эти дни) каждые 5 или 6 месяцев.
Не ограничиваясь какой-либо теорией, можно полагать, что периодическое введение сенолитического агента приводит к гибели вновь образовавшихся клеток и тем самым уменьшает (сокращает, снижает) общее количество стареющих клеток, накапливающихся в организме субъекта. Согласно другому варианту общее количество стареющих клеток, накапливающихся в организме субъекта, снижается или ингибируется при введении сенолитического агента один или два раза еженедельно или в соответствии с любым из других курсов лечения, описанных выше в данной заявке. Общая дневная доза сенолитического агента может быть доставлена в виде однократной дозы или в виде многократных доз каждый день введения агента. Согласно некоторым конкретным вариантам, когда вводятся многократные дозы сенолитического агента, доза сенолитического агента, вводимого в один день, может быть меньше, чем дневная доза, вводимая в случае, когда предполагают провести только один курс лечения.
Согласно некоторым вариантам предусмотрен способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, малой молекулы сенолитического агента (с малой молекулярной массой), который селективно уничтожает стареющие клетки; причем заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, не является раком и сенолитический агент вводится в течение одного или двух циклов лечения, обычно двух циклов лечения. Согласно некоторым конкретным вариантам период времени без лечения длится по меньшей мере 2 недели и каждый курс лечения продолжается не дольше 3 месяцев.
Данное изобретение предусматривает также способы селективного уничтожения стареющей клетки, включающие контактирование стареющей клетки с сенолитическим агентом, описанным в данной заявке (то есть облегчение взаимодействия или некоторым образом обеспечение взаимодействия стареющей клетки и сенолитического агента) в условиях и в течение времени, достаточных для уничтожения стареющей клетки. Согласно таким вариантам сенолитический агент селективно уничтожает стареющие клетки среди нестареющих клеток (то есть сенолитический агент селективно уничтожает стареющие клетки по сравнению с гибелью нестареющих клеток). Согласно некоторым вариантам стареющая клетка, которая должна погибнуть, находится в организме субъекта (например, человека или животного, не являющегося человеком). Сенолитический(-ие) агент(-ы) могут вводиться субъекту с применением циклов лечения, курсов лечения и периодов времени без лечения, описанных выше.
Согласно конкретным вариантам для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, субъекту вводится один (то есть единственный) сенолитический агент. Согласно некоторым вариантам введение единственного сенолитического агента может быть достаточным и клинически благоприятным для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением. Соответственно, согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент применяется в качестве монотерапии и является единственным (то есть всего лишь одним) активным агентом, вводимым субъекту для лечения заболевания или расстройства. Лекарственные препараты, которые не обязательно исключаются при лечении субъекта, когда сенолитический агент применяется в качестве монотерапии, включают, но без ограничения, препараты для других целей, таких как паллиативная помощь или успокоение (например, аспирин, ацетаминофен, ибупрофен или предписанные болеутоляющие средства, локальные препараты для снятия зуда), или для лечения другого заболевания или состояния, особенно если другие препараты не являются сенолитическими агентами, например, лекарства для снижения уровня холестерина, статины, препараты для увлажнения глаз и другие препараты, известные специалисту в данной области медицины.
Согласно конкретным вариантам, если сенолитический агент представляет собой ингибитор MDM2, этот ингибитор MDM2 вводится как монотерапия (то есть в качестве всего лишь одного активного терапевтического агента), и каждый курс лечения составляет по меньшей мере 5 дней, причем во время этого курса лечения ингибитор MDM2 вводится в течение по меньшей мере 5 дней. Согласно некоторым другим вариантам ингибитор MDM2 вводится в течение по меньшей мере 9 дней. Согласно другим конкретным вариантам ингибитор MDM2 представляет собой нутлин-3а.
Схемы применения, курсы лечения и циклы лечения могут быть пересмотрены и изменены или приспособлены, продолжены или прерваны, как это определяет специалист в данной области, в зависимости от восприимчивости субъекта к сенолитическому агенту, стадии заболевания, общего состояния здоровья субъекта и других факторов, которые описаны в данной заявке и в уровне техники.
Как описано в данной заявке, некоторые сенолитические агенты, которые могут быть использованы в способах, описанных в данной заявке, были описаны как полезные или потенциально полезные при лечении ракового заболевания; однако, в соответствии с вариантами способов лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, сенолитические агенты вводятся таким образом, который рассматривается как отличающийся от и, вероятно, неэффективный для лечения рака. Соответственно, способы, описанные в данной заявке, могут использоваться для лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, но нет данных, что они используются также для проведения первичной терапии (в отдельности или вместе в другим химиотерапевтическим агентом или радиотерапией) для лечения ракового заболевания. Согласно одному из вариантов способ, используемый для лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, при помощи сенолитического агента, может включать введение уменьшенной дневной дозы по сравнению с дневной дозой агента, которая требуется для лечения рака. Согласно другому варианту способ, используемый для лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, при помощи сенолитического агента, описанного в данной заявке, может включать применение уменьшенной кумулятивной дозы в течение одного цикла лечения по сравнению с кумулятивной дозой агента, которая требуется для лечения рака. Согласно еще одному варианту такой способ, используемый для лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, при помощи сенолитического агента, описанного в данной заявке, может включать применение уменьшенной кумулятивной дозы агента, вводимого в течение нескольких циклов лечения, по сравнению с дозой агента, которая требуется для нескольких циклов лечения ракового заболевания.
Например, согласно некоторым вариантам, когда сенолитический агент может быть цитотоксическим по отношению к раковым клеткам и может быть использован в онкологии способом, подходящим для лечения рака (например, ингибитор MDM2, в том числе, нутлин-3а, RG-7112) или ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере Bcl-xL (например, АВТ-263, АВТ-737, WEHI-539, А-1155463)), способы лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, включают введение сенолитического агента во время одного или двух циклов лечения, и общая доза сенолитического агента, вводимого во время каждого курса лечения, каждого цикла лечения и/или кумулятивно в течение двух или более циклов лечения представляет собой количество, являющееся эффективным для лечения ракового заболевания. Количество такого сенолитического агента, вводимого субъекту в течение данного периода времени (например, одной недели, двух недель, одного месяца, шести месяцев, одного года) для лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, может составлять, например, примерно 20-5000-кратное уменьшение общего количества по сравнению с общим количеством того же агента, вводимого субъекту, который получает субъект для лечения ракового заболевания. Кратное уменьшение количества (то есть меньшее количество) сенолитического агента, вводимого во время данного периода времени (то есть количества дней, месяцев, лет) для лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, может представлять собой примерно 20-кратное уменьшение, примерно 25-кратное уменьшение, примерно 30-кратное уменьшение, примерно 40-кратное уменьшение, примерно 50-кратное уменьшение, примерно 60-кратное уменьшение, примерно 70-кратное уменьшение, примерно 75-кратное уменьшение, примерно 100-кратное уменьшение, примерно 125-кратное уменьшение, примерно 150-кратное уменьшение, примерно 175-кратное уменьшение, примерно 200-кратное уменьшение, примерно 300-кратное уменьшение, примерно 400-кратное уменьшение, примерно 500-кратное уменьшение, примерно 750-кратное уменьшение, примерно 1000-кратное уменьшение, примерно 1250-кратное уменьшение, примерно 1500-кратное уменьшение, примерно 1750-кратное уменьшение, примерно 2000-кратное уменьшение, примерно 2250-кратное уменьшение, примерно 2500-кратное уменьшение, примерно 2750-кратное уменьшение, примерно 3000-кратное уменьшение, примерно 3250-кратное уменьшение, примерно 3500-кратное уменьшение, примерно 3750-кратное уменьшение, примерно 3000-кратное уменьшение (это повтор), примерно 3500-кратное уменьшение (это повтор), примерно 4000-кратное уменьшение, примерно 4500-кратное уменьшение или примерно 5000-кратное уменьшение по сравнению с количеством того же агента, вводимого субъекту для лечения ракового заболевания в течение такого же периода времени. Более низкая доза, требующаяся для лечения заболевания или состояния, ассоциированного со старением, может также применяться по схеме такого введения. Например, когда сенолитический агент используется для лечения легочного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением (например, ХОБЛ, ИЛФ (IPF)), сенолитический агент может быть доставлен непосредственно в легкие (например, путем ингаляции, интубации, интраназально или интратрахеально), и требуется более низкая доза в день и/или на курс лечения, чем в случае, если такой агент вводится перорально. Далее, например, когда сенолитический агент используется для лечения остеоартрита или дерматологического заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, сенолитический агент может быть доставлен непосредственно в сустав, пораженный остеоартритом (например, внутрисуставно, интрадермально, топически, трансдермально) или в кожу (например, топически, подкожно, интрадермально, трансдермально), соответственно, с более низкой дозой в день и/или на курс лечения, чем в случае, если такой агент вводится перорально. Когда сенолитический агент доставляется перорально, доза сенолитического агента в день может быть тем же самым количеством, которое вводится пациенту для лечения ракового заболевания; однако, количество агента, которое доставляется в течение курса лечения или цикла лечения, значительно меньше, чем количество, вводимое субъекту, который получает соответствующее количество этого агента для лечения рака.
Согласно некоторым вариантам способы, описанные в данной заявке, включают использование сенолитического агента в количестве, которое уменьшено по сравнению с количеством, которое может быть доставлено систематически (соматически), например, перорально или внутривенно субъекту, который получает сенолитический агент для лечения ракового заболевания. Согласно некоторым конкретным вариантам способы лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, путем селективного уничтожения стареющих клеток включают введение сенолитического агента с дозой, которая составляет по меньшей мере 10% (то есть одну десятую), по меньшей мере 20% (одну пятую), 25% (одну четвертую), 30% - 33% (примерно одну третью), 40% (две пятых) или по меньшей мере 50% (половину) дозы, которая вводится субъекту, больному раковым заболеванием, для уничтожения раковых клеток во время курса лечения, цикла лечения или двух или более циклов лечения, которые составляют протокол раковой терапии (например, схему лечения). Согласно другим конкретным вариантам доза сенолитического(-их) агента(-ов), применяемая в способах, описанных в данной заявке, составляет по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% от дозы, которая вводится субъекту, больному раковым заболеванием. Схема лечения, включающая дозу сенолитического агента, график и метод введения, которая может быть использована для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, также является режимом, не являющимся цитотоксическим в значительной степени по отношению к нестареющим клеткам.
Согласно некоторым вариантам способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, которое не является раковым заболеванием, включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества сенолитического агента с малыми молекулами, который селективно уничтожает стареющие клетки (то есть селективно уничтожает стареющие клетки среди нестареющих клеток или по сравнению с нестареющими клетками) и является цитотоксическим по отношению к раковым клеткам, при этом сенолитический агент вводится во время по меньшей мере одного цикла лечения, который включает курс лечения с последующим периодом времени без лечения. Общая доза сенолитического агента, вводимая во время курса лечения, и/или общая доза сенолитического агента, вводимая во время цикла лечения, и/или общая доза сенолитического агента, вводимая во время двух или более циклов лечения, составляет количество, которое меньше, чем количество, эффективное для раковой терапии. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент представляет собой ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков BCL-2, который ингибирует по меньшей мере Bcl-xL; ингибитор MDM2; специфический ингибитор Akt. Примеры этих ингибиторов описаны в данной заявке. Согласно некоторым другим вариантам сенолитический агент вводится в качестве единственного средства и является единственным активным сенолитическим агентом, вводимым субъекту для лечения заболевания или расстройства. Количество дней в курсе лечения и в интервале лечения описаны в данной заявке подробно.
Согласно одному из вариантов предусмотрен способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, когда заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, не является раковым заболеванием, этот способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, сенолитического агента или сенолитического агента с малыми молекулами, который селективно уничтожает стареющие клетки, введение которого производится в течение короткого периода (то есть периода, меньшего того, который может быть использован при введении конкретного агента для лечения рака), например, составляющего один день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней или 15 дней. Согласно этим конкретным вариантам этот курс лечения в течение любого количества дней между 1-15 днями является единственным курсом лечения и не повторяется. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент вводится в течение 16 дней, 17 дней, 18 дней, 19 дней, 20 дней, 21 дня, 22 дней, 23 дней, 24 дней, 25 дней, 26 дней, 27 дней, 28 дней, 29 дней, 30 дней или 31 дня, которые составляют единственный курс лечения и этот курс не повторяется.
Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент представляет собой АВТ-263 (навитоклакс). Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится во время окна лечения, составляющего 21 день. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 7 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 13 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 8 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 12 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 9 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 11 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 10 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 10 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 11 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 9 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 12 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 8 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 13 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 14 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 6 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 15 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 5 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 16 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 4 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 17 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 3 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 18 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 2 дней с последующим периодом без лечения, составляющим 19 дней. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 1 дня с последующим периодом без лечения, составляющим 20 дней.
Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150-325 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150-300 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150-275 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150-250 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150-225 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150-200 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150-175 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равной примерно 150 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равно примерно 125 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равно примерно 100 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равно примерно 75 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равно примерно 50 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 21 дня с дозой равно примерно 25 мг.
Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150-325 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150-300 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150-275 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150-250 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150-225 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150-200 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150-175 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 150 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равной примерно 125 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равно примерно 100 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равно примерно 75 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равно примерно 50 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 14 дней с дозой равно примерно 25 мг.
Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150-325 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150-300 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150-275 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150-250 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150-225 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150-200 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150-175 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равной примерно 150 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равно примерно 125 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равно примерно 100 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равно примерно 75 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равно примерно 50 мг. Согласно некоторым вариантам навитоклакс вводится ежедневно в течение 7 дней с дозой равно примерно 25 мг.
Согласно некоторым вариантам сенолитический агент представляет собой нутлин-3а. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение окна лечения, составляющего 28 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 10 дней с последующим перерывом в течение 18 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 9 дней с последующим перерывом в течение 19 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 8 дней с последующим перерывом в течение 20 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 7 дней с последующим перерывом в течение 21 дня. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 6 дней с последующим перерывом в течение 22 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 5 дней с последующим перерывом в течение 23 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 4 дней с последующим перерывом в течение 24 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 3 дней с последующим перерывом в течение 25 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 2 дней с последующим перерывом в течение 26 дней. Согласно некоторым вариантам нутлин-3а вводится в течение 1 дня с последующим перерывом в течение 27 дней.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 20 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 19 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 18 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 17 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 16 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 15 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 14 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 13 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 12 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 11 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 10 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 9 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 8 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 7 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 6 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 5 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 4 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 3 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 2 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерн 120 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 0.75 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 0.5 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 0.25 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 0.1 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится ежедневно в течение 10 дней с дозой равной примерно 0.01 мг/м. Согласно некоторым конкретным вариантам нутлин-3а вводится в течение 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 или в течение 14 дней с дозами, описанными выше.
Заболевания или расстройства, ассоциированные со старением
Данное изобретение предусматривает способы лечения состояний, заболеваний или расстройств, относящихся к клеточному старению, ассоциированных с клеточным старением или вызванных клеточным старением, включая связанные с возрастом заболевания и расстройства, у субъекта, нуждающегося в этом. Заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, в данной заявке может также называться заболеванием или расстройством, ассоциированным со стареющими клетками. Заболевания или расстройства, ассоциированные со старением, включают, например, сердечно-сосудистые заболевания и расстройства, воспалительные заболевания и расстройства, аутоиммунные заболевания и расстройства, легочные заболевания и расстройства, глазные заболевания и расстройства, метаболические заболевания и расстройства, неврологические заболевания и расстройства (например, нейродегенеративные заболевания и расстройства); связанные с возрастом заболевания и расстройства, вызванные старением; состояние кожи; связанные с возрастом заболевания; дерматологические заболевания и расстройства и заболевания, связанные с пересадкой трансплантатов. Характерным признаком старения является постепенная потеря функции или дегенерация, которая имеет место на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровне. Дегенерация, связанная со старением, приводит к возникновению признанных патологий, таких как саркопения, атеросклероз и сердечная недостаточность, остеопороз, легочная недостаточность, почечная недостаточность, нейродегенерация (включая макулярную дегенерацию, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона) и многие другие. Хотя различные виды млекопитающих различаются по своей восприимчивости к конкретной, связанной с возрастом патологии, все вместе, патологии, связанные со старением, обычно приводят к приблизительно экспоненциальной кинетике, начиная с примерно средней точки продолжительности жизни, специфической для возраста (например, для людей это возраст, составляющий 50-60 лет) (см., например, Campisi, Annu. Rev. Physiol. 75: 685-705 (2013); Naylor et al., Clin. Pharmacol. Ther. 93: 105-16 (2013)).
Примеры состояний, расстройств или заболеваний, ассоциированных со старением, которые можно лечить путем введения любого одного из сенолитических агентов, описанных в данной заявке, в соответствии со способами, описанными в данной заявке, включают когнитивные расстройства (например, умеренные когнитивные нарушения (MCI), болезнь Альцгеймера и другие виды деменции; болезнь Хантингтона); сердечнососудистое заболевание (например, атеросклероз, диастолическую дисфункцию сердца, аневризму аорты, стенокардию, аритмию, кардиомиопатию, застойную сердечную недостаточность, болезнь коронарных артерий, инфаркт миокарда, эндокардит, гипертония, заболевание сонных артерий, заболевания периферических сосудов, стрессоустойчивость сердечно-сосудистой системы, фиброз миокарда); метаболические заболевания и нарушения (например, ожирение, диабет, метаболический синдром); нарушения и расстройства двигательных функций (например, болезнь Паркинсона, дисфункцию двигательных нейронов (MND); болезнь Хантингтона); цереброваскулярное заболевание; эмфизему; остеоартрит; доброкачественную гипертрофию предстательной железы; легочные заболевания (например, идиопатический легочный фиброз, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ, COPD), эмфизему, обструктивный бронхиолит, астму); воспалительные/аутоиммунные заболевания и расстройства (например, остеоартрит, экзема, псориаз, остеопороз, мукозит, расстройства и заболевания, связанные с пересадкой трансплантатов); офтальмологические расстройства или заболевания (например, связанную со старением макулярную дегенерацию, катаракты, глаукому, потерю зрения, старческую дальнозоркость); диабетическую язву; метастазирование; побочные эффекты после химиотерапии, побочные эффекты после радиотерапии; заболевания и расстройства, связанные со старением (например, кифоз, почечную дисфункцию, дряхлость, облысение, потерю слуха, мышечную усталость, состояние кожи, саркопению и грыжу межпозвоночного диска) и другие заболевания и расстройства, связанные со старением, которые вызваны старением (например, заболевания/расстройства, возникающие после облучения, химиотерапии, в результате курения, потребления очень жирной/высокосахаристой пищи и воздействия факторов окружающей среды); заживление ран; невус; фибротические заболевания и расстройства (например, кистозный фиброз, фиброз почки, фиброз печени, легочный фиброз, подслизистый фиброз полости рта, фиброз миокарда и фиброз поджелудочной железы). Согласно некоторым вариантам любое одно или более заболеваний или расстройств, описанных в данной заявке выше, может быть исключено.
Согласно конкретному варианту предусмотрены способы лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных со старением, путем уничтожения стареющих клеток (то есть выявленных стареющих клеток), ассоциированных с заболеванием или расстройством у субъекта, который болен этим заболеванием или расстройством, путем введения сенолитического агента, при этом это заболевание или расстройство представляет собой остеоартрит; идиопатический легочный фиброз; хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ, COPD) или атеросклероз.
Субъекты (то есть пациенты, индивидуумы (люди или животные, не являющиеся людьми)), которые могут получить пользу от применения способов, описанных в данной заявке, включающих введение сенолитического агента, включают также тех больных, которые страдают от ракового заболевания. Субъект, подвергающийся лечению такими способами, может находиться в состоянии частичной или полной ремиссии (называемой также ремиссией рака). Как подробно описано в данной заявке, сенолитические агенты, применяемые в способах селективного уничтожения стареющих клеток, не предназначены для использования при лечении рака, а именно, таким способом, который обеспечивает гибель или разрушение раковых клеток статистически значимым образом. Следовательно, способы, описанные в данной заявке, не охватывают применение сенолитических агентов в таком способе, который будет рассматриваться как первичная терапия для лечения рака. Даже хотя сенолитический агент, в отдельности или вместе с другим химиотерапевтическим или радиотерапевтическим агентом, не используется в способе, который является достаточным, чтобы рассматриваться как первичная раковая терапия, способы и сенолитические агенты, описанные в данной заявке, можно использовать таким образом (например, в течение короткого курса терапии), который подходит для ингибирования метастаз. Согласно другим вариантам субъект, которого нужно лечить сенолитическим агентом, не должен болеть раком (а именно, у субъекта не должно быть диагностировано специалистом в области медицины раковое заболевание).
Сердечно-сосудистые заболевания и расстройства. Согласно другому варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, подвергающееся лечению способами, описанными в данной заявке, представляет собой сердечно-сосудистое заболевание. Сердечно-сосудистое заболевание может быть одним или более заболеваниями, выбранными из стенокардии, аритмии, атеросклероза, кардиомиопатии, застойной сердечной недостаточности, заболевания коронарных артерий (CAD), заболевания сонных артерий, эндокардита, сердечного приступа (коронарного тромбоза, инфаркта миокарда [MI]), высокого кровяного давления/гипертонии, аневризмы аорты, аневризмы сосудов головного мозга, фиброза миокарда, диастолической дисфункции сердца, гиперхолестеринемии/гиперлипидемии, пролапса митрального клапана, заболевания периферических сосудов (например, заболевания периферических артерий (PAD)), стрессоустойчивости сердечно-сосудистой системы и инсульта.
Согласно некоторым вариантам предусмотрены способы лечения сердечнососудистого заболевания, ассоциированного со старением, которое связано с атеросклерозом или вызвано атеросклерозом (то есть отвердением артерий). Сердечнососудистое заболевание может быть любым одним или несколькими заболеваниями из атеросклероза (например, заболевания коронарных артерий (CAD) и заболевания сонных артерий); стенокардии, застойной сердечной недостаточности и заболевания периферических сосудов (например, заболевания периферических артерий (PAD)). Способы лечения сердечно-сосудистого заболевания, которое связано с атеросклерозом или вызвано атеросклерозом, могут уменьшить вероятность возникновения высокого кровяного давления/гипертонии, ангины, инсульта и сердечного приступа (то есть коронарного тромбоза, инфаркта миокарда (MI)). Согласно некоторым вариантам предусмотрены способы стабилизации атеросклеротической(-их) бляшки(-ек) в кровеносном сосуде (например, в артерии) субъекта с уменьшением при этом вероятности возникновения или с задержкой возникновения тромботического, абсолютно нежелательного явления, такого как инсульт или MI. Согласно некоторым вариантам эти способы, включающие введение сенолитического агента снижают (то есть вызывают уменьшение) содержание липидов атеросклеротической бляшки в кровеносном сосуде (например, в артерии) субъекта и/или повышают величину фиброзного утолщения (толщину "фибриновой шапочки") (то есть вызывают увеличение размера этого утолщения, способствуют его возникновению или ускоряют появление фиброзного утолщения, "фибриновой шапочки").
Атеросклероз характеризуется наличием очаговых интимальных бляшек (атером), которые возникают в просвете средних и больших артерий; эти бляшки содержат липиды, воспалительные клетки, гладкомышечные клетки и соединительную тканы. Атеросклероз может влиять на большие и средние артерии, включая коронарные, сонные и церебральные артерии, аорту и ее разветвления и магистральные артерии конечностей. Атеросклероз характеризуется наличием очаговых интимальных бляшек (атером), которые возникают в просвете средних и больших артерий; эти бляшки содержат липиды, воспалительные клетки, гладкомышечные клетки и соединительную тканы. Согласно одному из вариантов предусмотрены способы ингибирования образования атеросклеротических бляшек (или сокращения, уменьшения, обеспечения уменьшения образования атеросклеротических бляшек) путем введения сенолитического агента. Согласно другим вариантам предусмотрены способы снижения (уменьшения) количества (то есть уровня) бляшек. Уменьшение количества бляшек в кровеносном сосуде (например, в артерии) можно определить, например, по уменьшению площади поверхности бляшки или по уменьшению объема или степени (например, в процентах) окклюзии кровеносного сосуда (например, артерии), которые могут быть определены методом ангиографии или другими методами визуализации, используемыми в области лечения сердечно-сосудистой системы. Данное изобретение предусматривает также способы повышения стабильности (или нормализации, ускорения возникновения стабильности) атеросклеротических бляшек, которые находятся в одном или более кровеносных сосудах (например, в одной или нескольких артериях) субъекта, при этом такие способы включают введение этому субъекту любого из сенолитических агентов, описанных в данной заявке.
Атеросклероз часто называют "отвердением" или обрастанием артерий, он вызван образованием множества атером в артериях. Атеросклероз (называемый также в данной заявке и в уровне техники атеросклеротическим поражением сосудов или ASVD) является формой артериосклероза, при которой стенка артерии утолщается. Развиваются симптомы заболевания, когда рост или разрыв бляшек снижает ток крови или же мешает току крови; эти симптомы очень зависят от того, какая артерия поражена. Атеросклеротические бляшки могут быть стабильными и нестабильными. Стабильные бляшки регрессируют, остаются статическими или медленно растут, иногда в течение нескольких декад, пока они не начнут вызывать стеноз или окклюзию. Нестабильные бляшки подвержены спонтанной эрозии, покрываются трещинами или разрываются, вызывая острый тромбоз, окклюзию и инфаркт задолго до того, как они вызовут значительный гемодинамический стеноз. Большинство медицинских случаев происходит при наличии нестабильных бляшек, которые по результатам ангиографии не кажутся опасными, таким образом, стабилизация бляшек может служить способом снижения заболеваемости и смертности. Разрушение или эрозия бляшек может привести к крупным сердечно-сосудистым явлениям, например, к острому коронарному синдрому и инсульту (см., например, Du et al., BMC Cardiovascular Disorders 14: 83 (2014); Grimm et al., Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance 14: 80 (2012)). Было обнаружено, что разорванные бляшки содержат большее количество липидов, макрофагов и имеют более тонкое утолщение, чем интактные бляшки (см., например, Felton et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17: 1337-45 (1997)).
Атеросклероз представляет собой синдром, поражающий артериальные кровеносные сосуды, в значительной степени из-за хронического воспалительного ответа белых кровяных телец в стенках артерий. Это явление ускоряется липопротеинами низкой плотности (LDL, белками плазмы крови, которые несут холестерин и триглицериды) в отсутствие адекватного удаления жиров и макрофагов и холестерина из макрофагов под действием функциональных липопротеинов высокой плотности (HDL). Самое раннее видимое повреждение, вызванное атеросклерозом, представляет собой "жировую прожилку," которая является накоплением нагруженных липидами пенистых клеток в интимальном слое артерии. Отличительным признаком атеросклероза является атеросклеротическая бляшка, которая представляет собой развитие жировой прослойки и содержит три основных компонента: липиды (например, холестерин и триглицериды); воспалительные клетки и гладкомышечные клетки; и основное вещество соединительно-тканных клеток, которое может содержать тромбы на различных стадиях организации и отложения кальция. Внутри самой старой бляшки на внешней оболочке можно обнаружить кальций и другие кристаллические компоненты (например, микрокальцификаты) из погибших клеток. Микрокальцификация и свойства, относящиеся к ней, как полагают, влияют на нестабильность бляшек за счет увеличения стресса от бляшек (см., например, Bluestein et al., J. Biomech. 41(5): 1111-18 (2008); Cilia et al., Journal of Engineering in Medicine 227: 588-99 (2013)). Жировые прослойки снижают эластичность стенок артерий, но могут не влиять на ток крови годами, так как мышечная стенка артерий за счет увеличения размещается в местах расположения бляшек. Богатые липидами атеромы характеризуются повышенным риском разрыва бляшек и тромбоза (см., например, Felton et al., supra; Fuster et al., J. Am. Coll. Cardiol. 46: 1209-18 (2005)). Имеются сообщения, что из всех компонентов бляшек липидное ядро характеризуется самой высокой тромбогенной активностью (см., например, Fernandez-Ortiz et al., J. Am. Coll. Cardiol. 23: 1562-69 (1994)). В случае развившейся болезни крупных артерий жесткость стенки впоследствии может также повышать пульсовое кровяное давление.
Нестабильная атероматозная бляшка, которая может вызвать тромботическое событие (нарушение мозгового кровообращения или MI), иногда описывается как большой мягкий липидный пул, покрытый тонким фиброзным утолщением (см., например, Li et al., Stroke 37: 1195-99 (2006); Trivedi et al., Neuroradiology 46: 738-43 (2004)). Характерным признаком развившейся атеросклеротической бляшки является нерегулярное утолщение артериальной интимы, вызванное воспалительными клетками, внеклеточным липидом (атеромой) и фиброзной тканью (склероз) (см., например, Newby et al., Cardiovasc. Res. 345-60 (1999)). Полагают, что фиброзное утолщение возникает вследствие миграции и пролиферации гладкомышечных клеток сосудов и накопления матрикса (см., например, Ross, Nature 362: 801-809 (1993); Sullivan et al., J. Angiology at dx.doi.org/10.1155/2013/592815 (2013)). Тонкое (слабое) фиброзное утолщение вносит свой вклад в нестабильность атеросклеротической бляшки и в повышенный риск разрыва (см., например, Li et al., supra).
В атеросклеротической бляшке могут быть обнаружены как провоспалительные макрофаги (M1), так и антивоспалительные макрофаги (М2). Вклад обоих типов в нестабильность бляшек является предметом активного исследования, результаты которого позволяют предположить, что повышенный уровень M1 по сравнению с М2 коррелирует с повышенной нестабильностью бляшки (см., например, Medbury et al., Int. Angiol. 32: 74-84 (2013); Lee et al., Am. J. Clin. Pathol. 139: 317-22 (2013); Martinet et al., Cir. Res. 751-53 (2007)).
Субъектов, страдающих от сердечно-сосудистого заболевания, можно идентифицировать, используя стандартные диагностические методы, известные в области сердечно-сосудистых заболеваний. Обычно диагноз атеросклероза и другого сердечнососудистого заболевания основан на рассмотрении симптомов (например, боли или давления в груди (стенокардия), онемения или слабости в ногах или руках, затруднения речи или спутанной речи, опущения (птоза) мускулов на лице, боли в ногах, высокого кровяного давления, почечной недостаточности и/или эректильной дисфункции), медицинской истории и/или данных физического обследования пациента. Диагноз может быть подтвержден ангиографией, ультразвуковым исследованием или другими методами. Субъекты, рискующие заболеть сердечно-сосудистым заболеванием, включают тех, кто имеет любой один или более факторов предрасположенности, таких как отягощенный семейный анамнез, и другие факторы риска (а именно, факторы предрасположенности), такие как высокое кровяное давление, дислипидемия, высокое содержание холестерина, диабет, ожирение и курение, сидячий образ жизни и наличие гипертонии. Согласно некоторым вариантам сердечно-сосудистое заболевание/расстройство, ассоциированное со стареющими клетками, представляет собой атеросклероз.
Эффективность одного или более сенолитических агентов при лечении или профилактике (то есть сокращении или уменьшении вероятности развития или возникновения) сердечно-сосудистого заболевания (например, атеросклероза) может легко определить специалист в области медицины и клинических исследований. Один или любая комбинация диагностических методов, включая физическое обследование, оценку и мониторинг клинических симптомов, проведение аналитических тестов и методов, описанных в данной заявке и осуществленных на практике (например, ангиографии, электрокардиографии, проверка стрессоустойчивости, нестрессовый тест), могут быть использованы для мониторинга состояния здоровья субъекта. Результаты лечения при помощи сенолитического агента или фармацевтической композиции, его содержащей, могут быть проанализированы известными методами, такими как сравнение симптомов пациентов, страдающих от сердечно-сосудистого заболевания или рискующих заболеть сердечно-сосудистым заболеванием, которые подверглись лечению, с симптомами пациентов, которые не подвергались лечению или которые получали плацебо.
Воспалительные и аутоиммунные заболевания и расстройства. Согласно некоторым вариантам заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой воспалительное заболевание или расстройство, такое как, например, остеоартрит, который можно лечить или предотвратить (то есть уменьшить вероятность его возникновения) с применением способов, описанных в данной заявке, которые включают введение сенолитического агента. Другие воспалительные или аутоиммунные заболевания, которые можно лечить путем введения сенолитического агента, такого как ингибиторы и антагонисты, описанные в данной заявке, включают остеопороз, псориаз, мукозит полости рта, ревматоидный артрит, воспаление кишечника, экзему, кифоз, грыжу межпозвоночного диска и легочные заболевания, ХОБЛ (COPD) и идиопатический легочный фиброз (ИЛФ).
Дегенеративное заболевание сустава характеризуется фибрилляцией хряща сустава на участках сильного механического стресса, костного склероза и утолщения синовиального слоя и суставной капсулы. Фибрилляция представляет собой локальную дезорганизацию поверхности, включающую расслоение поверхностных слоев хряща. На ранних стадиях расслоение тангенциально поверхности хряща по осям преобладающих пучков коллагена. Коллаген в хряще становится дезорганизованным, и протеогликаны исчезают с поверхности хряща. В отсутствие защитного или смазывающего действия протеогликанов в суставе коллагеновые волокна становятся восприимчивыми к деградации и следует механическая деструкция. Факторы предрасположенности к развитию остеоартрита включают увеличение возраста, ожирение, прежнее повреждение сустава, перегрузку сустава, слабые бедренные мускулы и генетику. Эти факторы являются распространенной причиной хронического ограничения дееспособности пожилых людей. Симптомы остеоартрита включают воспаленные или окоченевшие суставы, особенно бедренные, коленные и поясничные, после отсутствия активности или перегрузки; окоченелость после отдыха, которая исчезает при движении, и боль, которая усиливается после физических упражнений или к концу дня. Остеоартрит может также поражать шею, мелкие суставы пальцев, основание большого пальца, локоть и большой палец.
Считается, что хроническое воспаление является основным возрастным фактором, который способствует развитию остеоартрита. В сочетании со старением перегрузка суставов и ожирение ускоряют развитие остеоартрита.
Неожиданно оказалось, что путем селективного уничтожения стареющих клеток сенолитический агент предотвращает (то есть снижает вероятность возникновения), уменьшает или ингибирует потерю или эрозию слоев протеогликанов в суставе, уменьшает воспаление в пораженном суставе и ускоряет (то есть стимулирует, способствует, индуцирует) продуцирование коллагена (например, коллагена типа 2). Удаление стареющих клеток вызывает снижение количества (то есть уровня) воспалительных цитокинов, например, IL-6, образующихся в суставе, и воспаление уменьшается. Данное изобретение предусматривает способы лечения остеоартрита за счет селективного уничтожения стареющих клеток в области сустава субъекта, пораженного остеоартритом, и/или индуцирования образования коллагена (например, коллагена типа 2) в области сустава субъекта, нуждающегося в этом, путем введения данному субъекту по меньшей мере одного сенолитического агента (который может быть соединен с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтической композиции). Сенолитический агент может быть также использован для снижения (ингибирования, уменьшения) образования металлопротеиназы 13 (ММР-13), которая разрушает тканы сустава, и для восстановления слоя протеогликанов или ингибирования потери и/или разрушения слоя протеогликанов. Таким образом, лечение при помощи сенолитического агента также предотвращает (то есть снижает вероятность возникновения), ингибирует или уменьшает эрозию, или замедляет (то есть уменьшает скорость) эрозий костей. Как описано подробно в данной заявке, согласно некоторым вариантам сенолитический агент вводится непосредственно в сустав, пораженный остеоартритом, (например, внутрисуставно, топически, трансдермально, интрадермально или путем подкожной доставки). Лечение сенолитическим агентом также может восстанавливать, увеличивать прочность сустава или ингибировать ухудшение прочности сустава. Кроме того, способы, включающие введение сенолитического агента, могут уменьшить болевые ощущения в суставе и, следовательно, полезно для устранения боли в суставах, пораженных остеоартритом.
Эффективность одного или более сенолитических агентов при лечении или предотвращении (профилактике) остеоартрита у субъекта и при мониторинге состояния субъекта, который получает один или более сенолитических агентов, легко может быть определена специалистом в области медицины и клинических исследований. Один метод диагностики или комбинация этих методов, включая физическое обследование (такое как определение чувствительности, степени распухания или красноты пораженного сустава), оценку и мониторинг клинических симптомов (таких как боль, ригидность, подвижность), и проведение аналитических тестов и способов, описанных в данной заявке и осуществляемых на практике (например, определение уровня воспалительных цитокинов или хемокинов; получение рентгеновских снимков для определения потери хряща, как показывает сужение пространства между костями в суставе; исследование с помощью магнитного резонанса (MRI), позволяющее получить подробное изображение кости и мягких тканей, включая хрящевую ткань), могут быть использованы для мониторинга состояния здоровья субъекта. Эффекты лечения при помощи одного или более сенолитических агентов могут быть проанализированы путем сравнения симптомов пациентов, страдающих от воспалительного заболевания или расстройства, такого как остеоартрит, или рискующих им заболеть, которые подвергались лечению, с симптомами тех пациентов, которые не получили такого лечения или которые принимали плацебо.
Согласно некоторым вариантам сенолитические агенты могут быть использованы для лечения и/или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения) ревматоидного артрита (RA). Ревматоидный артрит (RA) характеризует дисрегуляция врожденного или адаптивного иммунного ответа, которая является аутоиммунным заболеванием, вероятность возникновения которого возрастает с возрастом. Ревматоидный артрит представляет собой хроническое воспалительное заболевание, которое обычно поражает мелкие суставы рук и ступней. С учетом того, что остеоартрит возникает, по меньшей мере частично, от истирания сустава, можно сказать, что ревматоидный артрит поражает выстилку суставов, приводя к болезненному распуханию, которое может привести к эрозиям костей и деформации сустава. RA иногда может также поражать другие органы, такие как кожа, глаза, легкие и кровеносные сосуды. RA может развиться в любом возрасте; однако, RA обычно возникает после 40 лет. Это заболевание распространено в большей степени среди женщин. Согласно некоторым вариантам способов, описанных в данной заявке, RA исключается из числа заболевания, которые можно лечить.
H/H
Хроническое воспаление может также являться одной из причин других возрастных заболеваний и расстройств, таких как кифоз и остеопороз. Кифоз представляет собой сильное искривление позвоночника и часто наблюдается при нормальном и преждевременном старении (см., например, Katzman et al. (2010) J. Orthop. Sports Phys. Ther. 40: 352-360). Возрастной кифоз часто развивается после того, как остеопороз ослабит позвоночник до такой степени, что позвонки трескаются и сжимаются. Некоторые виды кифоза поражают детей и подростков. Сильный кифоз может поражать легкие, нервы и другие ткани и органы, вызывая боль и другие проблемы. Кифоз связан с клеточным старением. Характеристика способности сенолитического агента применяться для лечения кифоза может быть определена на доклинических животных моделях, использованных в уровне техники. Например, у мышей линии TTD может развиться кифоз (см., например, de Boer et al. (2002) Science 296: 1276-1279); другие мыши, которые могут быть использованы, включают мышей линии BubR1, которые, как известно, также могут быть поражены кифозом (см., например, Baker et al. (2011) Nature 479: 232-36). Возникновение кифоза со временем определяется визуально. Количество стареющих клеток, снизившееся со временем под действием сенолитического агента, может быть определено путем обнаружения наличия одного или более маркеров, ассоциированных со стареющими клетками, например, путем окрашивания SA-β-Gal.
Остеопороз представляет собой прогрессирующее заболевание костей, которое характеризуется снижением костной массы и ее плотности, что может привести к повышенному риску перелома. Минеральная плотность костей (BMD) уменьшается, микроархитектура костей ухудшается, и количество и разнообразие белков в кости изменяется. Обычно остеопороз диагностируют путем обследования минеральной плотности кости. Женщины постклимактерического периода или женщины, у которых наблюдается пониженное содержание эстрогена, наиболее подвержены риску. Хотя в группе риска находятся мужчины и женщины старше 75 лет, остеопороз развивается в два раза чаще у женщин, чем у мужчин. Количество стареющих клеток, снизившееся при лечении сенолитическим агентом, может быть определено путем выявления наличия одного или более маркеров, ассоциированных со стареющими клетками, например, путем окрашивания SA-β-Gal.
Согласно другим вариантам воспалительное/аутоиммунное заболевание, которое можно лечить или предотвращать (то есть уменьшать вероятность возникновения) при помощи сенолитических агентов, описанных в данной заявке, включает синдром раздраженного кишечника (IBS) и воспалительные заболевания кишечника, такие как язвенный колит и болезнь Крона. Воспалительное заболевание кишечника (IBD) включает хроническое воспаление всего или части пищеварительного тракта. Кроме угрожающих жизни осложнений, возникающих в результате IBD, это заболевание может быть болезненным и подрывающим силы. Язвенный колит представляет собой воспалительное заболевание кишечника, которое вызывает длительное воспаление части пищеварительного тракта. С течением времени, скорее, чем внезапно, обычно развиваются симптомы. Язвенный колит обычно поражает только внутреннюю выстилку толстой кишки (ободочной кишки) и прямой кишки. Болезнь Крона представляет собой воспалительное заболевание кишечника, которое вызывает воспаление в любом месте выстилки пищеварительного тракта и часто распространяется глубоко в пораженных тканях. Это может привести к появлению боли в области живота, сильной диарее и истощению. Воспаление, вызванное болезнью Крона, может затронуть различные области пищеварительного тракта. Диагностика и мониторинг состояния указанных болезней осуществляется в соответствии с методами и диагностическими тестами, которые широко применяются в уровне техники, включая анализ крови, колоноскопию, гибкую сигмоидоскопию, постановку бариевой клизмы, КТ-исследование, ЯМР-томографию (MRI), эндоскопию и томографию тонкой кишки.
Согласно другим вариантам способы, описанные в данной заявке, могут подходить для лечения субъекта, у которого наблюдается грыжа межпозвоночных дисков. Субъекты с грыжей межпозвоночного диска характеризуются наличием повышенного количества стареющих клеток в крови и в стенках сосудов (см., например, Roberts et al. (2006) Eur. Spine J. 15 Suppl. 3: S312-316). Симптомы грыжи межпозвоночного диска могут включать боль, онемение или покалывание в руке или ноге. Повышенные уровни провоспалительных молекул и матриксных металлопротеаз также обнаруживаются при старении и дегенерации ткани межпозвоночного диска, что позволяет судить о роли стареющих клеток (см., например, Chang-Qing et al. (2007) Ageing Res. Rev. 6: 247-61). Для характеристики эффективности сенолитического агента при лечении грыжи межпозвоночного диска могут быть использованы животные модели; дегенерация межпозвоночного диска у мышей индуцируется сдавливанием и оценивается прочностью диска (см., например, Lotz et al. (1998) Spine (Philadelphia Pa. 1976), 23: 2493-506).
Другие воспалительные или аутоиммунные заболевания, которые можно лечить или подвергать профилактике (то есть уменьшению вероятности развития) при помощи сенолитического агента, включают экземы, псориаз, остеопороз и легочные заболевания (например, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ, COPD), идиопатический легочный фиброз (IPF), астму), воспалительное заболевание кишечника и мукозит (включая мукозит полости рта, который в некоторых случаях вызывается облучением). Путем применения сенолитического агента можно также лечить некоторые виды фиброза или фибротических состояний органов, такие как фиброз почки, фиброз печени, фиброз поджелудочной железы, фиброз сердца, заживление ран и фиброз подслизистой оболочки полости рта.
Согласно некоторым вариантам заболевание, ассоциированное со старением, представляет собой воспалительное заболевание кожи, такое как, но без ограничения, псориаз и экзема, которые можно лечить или подвергать профилактике (то есть уменьшению вероятности развития) согласно способам, описанным в данной заявке, которые включают введение сенолитического агента. Псориаз характеризуется аномально избыточным и быстрым ростом эпидермального слоя кожи. Диагноз наличия псориаза обычно основывается на обследовании внешнего вида кожи. Характеристики кожи, типичные для псориаза, представляют собой отрубевидные красные пятна, папулы или бляшки кожи, которые могут быть болезненными и могут чесаться. При псориазе наблюдается кожная и системная чрезмерная экспрессия различных провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, ключевой компонент SASP. Экзема является воспалением кожи, которое характеризуется появлением красноты, разбуханием поверхности кожи, зудом и сухостью, коркообразованием, чешуйчатостью, вздутием, растрескиванием, образованием мокнущих участков и кровотечением. Эффективность сенолитических агентов для лечения псориаза и экземы и мониторинг состояния субъекта, который получает такой сенолитический агент, может быть легко определена специалистом в области медицины или клинических исследований. Один метод диагностики или любая комбинация таких методов включает физическое обследование (например, внешнего вида кожи), оценку мониторинга клинических симптомов (таких как зуд, распухание и боль), и проведение аналитических тестов и методов, описанных в данной заявке и осуществленных на практике в уровне техники (например, определение уровня провоспалительных цитокинов).
Другие иммунные нарушения и состояния, которые можно лечить или подвергать профилактике (то есть уменьшению вероятности развития) при помощи сенолитического агента, включают состояния, появляющиеся в результате иммунного ответа хозяина на трансплантацию органов (например, трансплантацию почки, костного мозга, печени, легкого или сердца), такое как отторжение трансплантированного органа. Сенолитический агент может быть использован для лечения или уменьшения вероятности возникновения болезни "трансплантат против хозяина".
Легочные заболевания или расстройства
Согласно одному из вариантов данное изобретение предусматривает способы лечения и профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения) заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, которое представляет собой легочное заболевание или расстройство, путем уничтожения стареющих клеток (то есть установленного количества клеток), ассоциированных с заболеванием или расстройством у субъекта, путем введения сенолитического агента. Легочные заболевания и расстройства, ассоциированные со старением, включают, например, идиопатический легочный фиброз (IPF), хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ, COPD), астму, кистозный фиброз, бронхоэктаз и эмфизему.
ХОБЛ представляет собой легочное заболевание, определяемое устойчиво ограниченным потоком воздуха, возникающим вследствие разрыва легочной ткани (эмфиземы) и дисфункции малых дыхательных путей (обструктивного бронхиолита). Первичные симптомы COPD включают нехватку воздуха, свистящее дыхание, сдавленность в груди, постоянный кашель и избыточное отделение мокроты. Эластаза нейтрофилов у курильщиков сигарет и макрофаги разрушают внеклеточный матрикс альвеолярных структур, что приводит к возникновению увеличенных воздушных полостей и потере дыхательной емкости (см., например, Shapiro et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 32, 367-372 (2005)). COPD чаще всего вызывается курением (включая курение сигарет, сигар, пассивное курение, курение трубки), воздействием, связанным с родом занятий (например, воздействием пыли, дыма или паров), и загрязнением окружающей среды в течение десятилетий, которые вызывают старение, являющееся фактором риска развития ХОБЛ.
Процессы, участвующие в возникновении повреждения легких, включают, например, окислительный стресс, вызываемый высокими концентрациями свободных радикалов в табачном дыме; высвобождением цитокинов вследствие воспалительной реакции на раздражители в дыхательных путях и повреждением антипротеазных ферментов при воздействии табачного дыма и свободных радикалов, что приводит к повреждению легких протеазами. Генетическая восприимчивость также может способствовать развитию заболевания. У примерно 1% людей с ХОБЛ заболевание развивается от генетического нарушения, которое вызывает низкое продуцирование альфа-1-антитрипсина в печени. Этот фермент обычно секретируется в поток крови для защиты легких.
Легочный фиброз представляет собой хроническое и прогрессирующее заболевание легких, характеризующееся повышением жесткости и образованием рубцов в легком, что может привести к нарушению дыхания, раку легких и сердечной недостаточности. Фиброз ассоциируется с восстановлением эпителия. Фибробласты активируются, продуцирование внеклеточных матриксных белков увеличивается, и трансдифференцировка для сокращения миофибробластов способствует закрытию раны. Временный матрикс закупоривает поврежденный эпителий и обеспечивает каркас для миграции клеток эпителия, вовлекая эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ). Потеря крови, связанная с повреждением эпителия, индуцирует активацию тромбоцитов, образование факторов роста и острый воспалительный ответ. Обычно эпителиальный барьер заживает и воспалительный ответ прекращается. Однако в случае фиброза ответ фибробластов продолжается, приводя к появлению незаживших ран. Образование фибробластных очагов является признаком заболевания, отражая локализацию продолжающегося фиброгенеза. Как показывает название, этиология IPF неизвестна. Предполагается участие клеточного старения в IPF на основании наблюдений, что вероятность возникновения заболевания возрастает с возрастом и, что легочная ткань у пациентов с IPF обогащается SA-β-Gal-положительными клетками и содержит повышенные уровни маркера старения р21 (см., например, Minagawa et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 300: L391-L401 (2011); см. также, например, Naylor et al., supra). Короткие теломеры являются фактором риска, общим для IPF и клеточного старения (см., например. Alder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 13051-56 (2008)). He ограничиваясь какой-либо одной теорией, можно предположить, что участие клеточного старения в IPF подтверждается сообщением, что компоненты SASP стареющих клеток, такие как IL-6, IL-8 и IL-1β, промотируют дифференцировку фибробластов в миофибробласты и эпителиально-мезенхимальный переход, что приводит к масштабному ремоделированию внеклеточного матрикса альвеолярных и интерстициальных пространств (см., например, Minagawa et al., supra).
Субъекты, рискующие заболеть легочным фиброзом, включают тех субъектов, которые подвергаются воздействию загрязнений в окружающей среде или загрязнений, связанных с родом занятий, причем эти заболевания включают асбестоз и силикоз; тех, кто курит сигареты, тех, кто страдает некоторыми типичными заболеваниями соединительных тканей, такими как ревматоидный артрит, SLE (системной эриматозной волчанкой) и склеродермией, тех, кто имеет другие заболевания, которые затрагивают соединительную тканы, такие как саркоидоз и грануломатоз Вегенера; тех, кто болеет инфекционными заболеваниям, тех, кто принимает некоторые медикаменты (например, амиодарон, блеомицин, бусульфан, метотрексат и нитрофурантоин), тех, кто подвергался лучевой терапии в области груди, и тех, у которых член семьи болен легочным фиброзом.
Симптомы ХОБЛ могут включать любой из следующих симптомов: одышку, особенно во время физической деятельности; свистящее дыхание; сдавленность в груди; необходимость прежде всего прочищать горло утром из-за избытка слизи в легких; хронический кашель, который приводит к образованию мокроты, которая может быть прозрачной, белой, желтой и зеленоватой; синева вокруг губ и синева ногтевого ложа (цианоз); частые инфекции дыхательного тракта; отсутствие энергии; ненамеренная потеря веса (наблюдаемая на поздних стадиях заболевания). У субъектов с ХОБЛ может наблюдаться обострение болезни, когда симптомы усиливаются и остаются устойчивыми в течение нескольких дней и дольше. Симптомы легочного фиброза известны в уровне техники и включают одышку, особенно во время физической деятельности; частый сухой, кашель; быстрое поверхностное дыхание; постепенную ненамеренную потерю веса; усталость; боль в суставах и мускулах и "барабанные палочки" (расширение и округление кончиков пальцев на руках или стопах).
Субъекты, страдающие от ХОБЛ или легочного фиброза, могут быть идентифицированы с применением стандартных методов диагностики, обычно используемых в уровне техники. Мониторинг действия одного или более сенолитических агентов, введенных субъекту, у которого есть легочное заболевание или который рискует заболеть легочным заболеванием, осуществляется методами, которые обычно применяются для диагностики. Обычно можно осуществить один или более следующих тестов: физическое обследование, изучение медицинской истории, изучение медицинской истории членов семьи пациента, рентгеновское обследование грудной клетки, проверка работы легких (такая как спирометрия), анализ крови (например, измерение артериального давления, анализ газов артериальной крови), бронхоальвеолярный лаваж, биопсия легкого, КТ исследование и нагрузочная проба.
Другие легочные заболевания или расстройства, которые можно лечить путем использования сенолитических агентов, включают, например, эмфизему, астму, бронхоэктаз и кистозный фиброз (см., например, Fischer et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304(6): L3 94-400 (2013)). Эти заболевания также могут обостряться при курении табака (включая курение сигарет, курение сигар, пассивное курение, курение трубки), воздействие загрязнений по роду занятий (например, воздействие пыли, дыма или паров), при инфекции и/или действии загрязнений, которые вызывают старение клеток и способствуют тем самым воспалению. Эмфизема иногда рассматривается, как подгруппа ХОБЛ.
Бронхоэктаз является результатом повреждения дыхательных путей, которое вызывает их расширение и избыточную подвижность, а также образование рубцов. Бронхоэктаз обычно вызывается медицинским состоянием, которое повреждает стенки дыхательных путей или ингибирует очищение слизи из дыхательных путей. Примеры таких состояний включают кистозный фиброз и первичную цилиарную дискинезию (PCD). Когда задета только одна часть легкого, заболевание может быть вызвано скорее блокадой, чем медицинским состоянием.
Способы лечения или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения) легочного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, описанные в данной заявке, могут быть использованы для лечения субъекта, который стареет и страдает от потери (или дегенерации) функции легких (то есть снижающейся или ухудшенной функции легких по сравнению с более молодым субъектом) и/или дегенерации легочной ткани. Респираторная система с возрастом подвергается различным анатомическим, физиологическим и иммунологическим изменениям. Структурные изменения включают деформацию стенки грудной клетки и грудного отдела позвоночника, которая может повредить эластичность всей системы дыхания, что приводит к увеличенным усилиям при дыхании. Респираторная система подвергается различным анатомическим, физиологическим и иммунологическим изменениям с возрастом. Увеличенное содержание нейтрофилов и меньшее количество макрофагов может быть обнаружено в бронхоальвеолярном лаваже (BAL) пожилых людей по сравнению с более молодыми взрослыми людьми. Устойчивое неспецифическое воспаление в нижних дыхательных путях может вызвать протеолитическое и опосредованное окислителями повреждение матрикса легких, приводящее к потере альвеолярной единицы легких и к ухудшенному газообмену через альвеолярную мембрану, заметную со старением. Длительное воспаление нижних дыхательных путей может вызвать предрасположенность пожилых людей к повышенной восприимчивости к токсичному окружению и ускоренное ухудшение функции легких. (См., например, Sharma et al., Clinical Interventions in Aging 1: 253-60 (2006)). Окислительный стресс осложняет воспаление во время старения (см., например, Brod, Inflamm. Re.s 2000; 49: 561-570; Hendel et al., Cell Death and Differentiation (2010) 17: 596-606). Изменение в окислительном балансе и увеличенный окислительный стресс во время старения ускоряют экспрессию цитокинов, хемокинов и адгезивных молекул и ферментов (см., например, Chung et al., Ageing Res. Rev. 2009; 8: 18-30). Конститутивная активация и рекрутмент макрофагов, Т-клеток и тучных клеток высвобождают протеазы, приводя к деградации внеклеточной матрицы, гибели клеток, ремоделированию и другим событиям, которые могут вызвать повреждение тканей и органов во время хронического воспаления (см., например, Demedts et al., Respir. Res. 2006; 7: 53-63). При введении сенолитического агента стареющему субъекту (который включает взрослого среднего возраста, который является асимптоматическим), ухудшение легочной функции может быть замедлено или ингибировано путем уничтожения и удаления стареющих клеток из дыхательных путей.
2
2
Эффективность сенолитического агента может быть легко определена специалистом в области медицины и клинических исследований. Один метод диагностики или любая комбинация таких методов, включающая физическое обследование, оценку и мониторинг клинических симптомов, поведение аналитических тестов и осуществление методов, описанных в данной заявке, могут быть использованы для мониторинга состояния здоровья субъекта. Эффекты лечения при помощи одного или более сенолитических агентов или фармацевтической композиции, содержащей этот агент, могут быть проанализированы путем сравнения симптомов пациентов, страдающих от легочного заболевания или расстройства или рискующих им заболеть, которые подвергались лечению, с симптомами тех пациентов, которые не получили такого лечения или которые принимали плацебо. Кроме того, можно осуществить методы и методики, которые оценивают механическое функционирование легкого, например, методы, которые позволяют измерить легочную емкость, эластичность и гиперчувствительность дыхательных путей. Для измерения функции легких и для мониторинга функции легких во время лечения можно получать любую из многочисленных характеристик, резервный объем выдоха (ERV), жизненную форсированную емкость легких (FVC), объем форсированного выдоха (FEV) (например, FEV в одну секунду, FEV1), отношение FEV1/FEV, среднюю объемную скорость выдоха на уровне 25-75% от жизненной форсированной емкости легких и максимальную волевую вентиляцию легких (MVV), максимальную скорость выдоха (PEF), объем максимального спокойного выдоха (SVC). Общий объем легких включает полную емкость легких (TLC), жизненную емкость легких (VC), остаточный объем легких (RV) и функциональную остаточную емкость (FRC). Газообмен через альвеолярную капиллярную мембрану может быть измерен с использованием диффузионной емкости монооксида углерода (DLCO). Может быть также измерено насыщение периферических капилляров кислородом (SpO); нормальный уровень кислорода обычно составляет от 95% до 100%. Величина SpO ниже 90% предполагает наличие у субъекта гипоксемии. Величины ниже 80% считаются критическими и требующими вмешательства для поддержания функции мозга и для того, чтобы избежать остановки сердца и дыхания.
Неврологические заболевания и расстройства. Заболевания и расстройства, ассоциированные со старением, которые можно лечить путем введения сенолитического агента, описанного в данной заявке, включают неврологические заболевания или расстройства. Такие заболевания или расстройства, ассоциированные со старением, включают болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера (и другие виды деменции), дисфункцию двигательных нейронов (MND), умеренные когнитивные нарушения (MCI), болезнь Хантингтона и глазные заболевания или расстройства, такие как возрастная макулярная дегенерация. Другие глазные заболевания, которые связаны со старением, включают глаукому, потерю зрения, старческую дальнозоркость и катаракту.
Болезнь Паркинсона (PD) это второе по счету наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание. Оно представляет собой инвалидизирующее состояние мозга, характеризующееся замедленным движением (брадикинезией), тремором, ригидностью и на последних стадиях потерей равновесия. Многие из этих симптомов обусловлены гибелью центральных нейронов в мозгу, которая приводит к дефициту дофамина. Это заболевание характеризуется нейродегенерацией, такой как гибель примерно 50-70% дофаминергических нейронов в компактной части черного вещества, большой дефицит дофамина в стриатуме и/или наличие внутри цитоплазматических включений (телец Леви), которые состоят в основном из альфа-синуклеина и убиквитина. Болезнь Паркинсона характеризуется также нарушением опорно-двигательного аппарата, например, тремором, ригидностью, брадикинезией и/или постуральной неустойчивостью. Субъекты, рискующие заболеть болезнью Паркинсона, включают тех, у которых члены семьи страдали от этой болезни и тех, кто был подвержен воздействию пестицидов (например, ротенона или параквата), гербицидов (например, агента Оранж) или тяжелых металлов. Полагают, что старение нейронов, продуцирующих дофамин, участвует в наблюдаемой гибели клеток при болезни Паркинсона из-за продуцирования реакционноспособных кислородсодержащих веществ (см., например, Cohen et al., J. Neural Transm. Suppl. 19: 89-103 (1983)); следовательно, способы и сенолитические агенты, описанные в данной заявке, подходят для лечения и профилактики болезни Паркинсона.
Способы детекции, мониторинга или количественного определения степени развития нейродегенеративных дефектов и/или недостатка движения при болезни Паркинсона известны из уровня техники, например, гистологические исследования, биохимические исследования и оценка поведенческих характеристик (см., например, опубликованную заявку США на патент №2012/0005765). Симптомы болезни Паркинсона также известны из уровня техники и включают, но без ограничения, затруднения при начале и окончании ходьбы, прерывистое ригидное движение, мышечную атрофию, дрожь (тремор) и изменения частоты ударов сердца, но нормальные рефлексы, брадикинезию и постуральную неустойчивость. Все больше нарастает понимание того, что люди, у которых диагностирована болезнь Паркинсона, могут иметь ухудшение познавательных способностей, включая умеренные когнитивные нарушения помимо физических симптомов.
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой нейродегенеративное заболевание, при котором наблюдается медленно прогрессирующее ухудшение умственных способностей с потерей памяти, дезориентацией и спутанностью, приводящее к глубокой деменции (слабоумию). Возраст является единственным абсолютным фактором предрасположенности к развитию болезни Альцгеймера, которая является основной причиной деменции у пожилых людей (см., например, Hebert, et al., Arch. Neural. 60: 1119-1122 (2003)). Ранние клинические симптомы показывают сильное сходство с умеренными когнитивными нарушениями (см. ниже). По мере прогрессирования болезни появляются помутнение сознания, спутанность, изменения в поведении, дезориентация и затруднения в ходьбе и глотании.
Болезнь Альцгеймера характеризуется наличием нейрофибриллярных клубков и амилоидными (старческими) бляшками в гистологических препаратах. Болезнь в основном затрагивает лимбические и кортикальные системы мозга. Аргирофильные бляшки, содержащие амилоидогенный фрагмент Аβ белка-предшественника амилоида (АРР) рассеяны в церебральном кортексе и гиппокампе. Нейрофибриллярные клубки обнаруживаются в пирамидальных нейронах, в основном расположенных в неокортексе, гиппокампе и в базальном ядре Мейнерта. Наблюдаются также и другие изменения, такие как грануловакуолярная дегенерация в пирамидальных клетках гиппокампа и гибель нейронов и глиоз в зоне кортекса и гиппокампа. Субъекты, рискующие заболеть болезнью Альцгеймера, включают пожилых людей и тех, у которых члены семьи страдали от этой болезни, людей с генетическим риском (например, с генами АроЕ4) или детерминированными мутациями генов (например, АРР, PS1 или PS2) и тех, у кого была травма головы или сердечно-сосудистые заболевания (например, высокое кровяное давление, порок сердца, инсульт, диабет, высокое содержание холестерина).
11
19
Для оценки фенотипа болезни Альцгеймера, для подбора терапевтических агентов и проведения лечения известен ряд анализов поведенческих характеристик и гистопатологических препаратов. Гистологические анализы обычно проводятся postmortem (после смерти). Гистологические анализы уровня отложений Аβ могут быть проведены с использованием окрашивания тиофлавином-S, конго красным или связывания Аβ (например, антителами 4G8, 10D5 или 6Е10) для визуализации отложений Аβ на поверхности разреза ткани мозга (см., например, Holcomb et al., 1998, Nat. Med. 4: 97-100; Borchelt et al., 1997, Neuron 19: 939-945; Dickson et al., 1988, Am. J. Path. 132: 86-101). In vivo методы визуализации отложений Аβ у трансгенных мышей были также описаны. BSB ((транс, транс)-1-бром-2,5-бис-(3-гидроксикарбонил-4-гидрокси)стирилбензол) и PET детектор C-меченого аналога флуоресцентной краски тиофлавина Т (Pittsburgh Compound-B) (PIB) связывается с бета-амилоидными (Аβ) бляшками (см., например, Skovronsky et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 7609-7614; Klunk et al., 2004, Ann. Neurol. 55: 306-319). F-содержащее амилоидофильное соединение типа конго красного, FSB ((Е,Е)-1-фтор-2,5-бис-(3-гидроксикарбонил-4-гидрокси)стирилбезол), позволяет получить визуализацию Аβ бляшек методом MRI (см., например, Higuchi et al., 2005, Nature Neurosci. 8: 527-533). Амилоидные бляшки, радиомеченые и модифицированные путресцином, отлагаются in vivo в мышиной модели болезни Альцгеймера (см., например, Wengenack et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 868-872).
Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), экспрессирующийся астроцитами, является маркером астроглиальной активации и глиоза во время нейродегенерации. Аβ бляшки ассоциируются с GFAP-положительно активированными астроцитами и могут быть визуализированы путем окрашивания GFAP (см., например, Nagele et al. 2004, Neurobiol. Aging 25: 663-674; Mandybur et al., 1990, Neurology 40: 635-639; Liang et al., 2010, J. Biol. Chem. 285: 27737-27744). Нейрофибриллярные клубки можно идентифицировать с помощью иммуногистохимии с использованием флуоресцентной микроскопии с тиофлавином-S и серебряной краской Gallyas (см., например, Gotz et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 529-534; патент США №6,664,443). Для изучения дегенерации нейронов могут быть использованы окрашивание аксонов с последующей электронной микроскопией и изучение аксонального транспорта (см., например, Ishihara et al., 1999, Neuron 24: 751-762).
Субъекты, страдающие от болезни Альцгеймера, могут быть идентифицированы с применением стандартных диагностических методов, известных из уровня техники. В общем, диагноз болезни Альцгеймера основывается на симптомах (например, прогрессирующего ухудшения памяти, постепенного отказа от обычной деятельности, апатии, возбуждения или раздражительности, агрессии, беспокойства, расстройства сна, дисфории, искаженного движения, расторможенности, социальной самоизоляции, плохого аппетита, галлюцинаций, деменции), медицинской истории, нейропсихологических тестах, неврологическом и/или физическом обследовании пациента. Можно провести испытания цереброспинальной жидкости на наличие различных белков, которые ассоциированы с патологией Альцгеймера, включая тау-белок, амилоидный бета-пептид и AD7C-NTP. На ранних стадиях семейной болезни Альцгеймера (eFAD), аутосомно-доминантного генетического заболевания, доступно также генетическое тестирование. Клиническое генетическое тестирование доступно для субъектов с симптомами AD и находящихся в группе риска членов семей пациентов с ранним началом заболевания. В США могут быть протестированы мутации PS2 и АРР в клинической или одобренной правительством лаборатории под эгидой Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical Laboratory Improvement Amendments). Доступным является также тест по выявлению мутаций PS1 (Elan Pharmaceuticals).
Эффективность одного или более сенолитических агентов, описанных в данной заявке, и мониторинг состояния субъекта, который получает один или более сенолитических агентов, могут быть легко определены специалистом в области медицины и клинических исследований. Один диагностический способ или комбинация этих способов, включая физическое обследование и мониторинг клинических симптомов, проведение аналитических тестов и способы, описанные в данной заявке, могут быть использованы для мониторинга состояния здоровья субъекта. Эффекты от введения одного или более сенолитических агентов могут быть проанализированы с применением известных методов, таких как сравнение симптомов у пациентов, страдающих или рискующих заболеть болезнью Альцгеймера, которые подверглись лечению, с симптомами пациентов, не прошедших лечения или принимавших плацебо.
Умеренные когнитивные нарушения (MCI). MCI представляют собой синдром поражения головного мозга, включающий начало и эволюцию когнитивных нарушений кроме тех, которые ожидаются с возрастом, и в зависимости от образования субъекта, но которые не являются достаточно значительными для нарушения повседневной деятельности этого субъекта. MCI является аспектом когнитивного старения, которое считается переходным состоянием между нормальным старением и деменцией, в которую оно может превратиться (см. Pepeu, Dialogues in Clinical Neuroscience 6: 369-377, 2004). MCI, которые вначале затрагивают память, известны как "амнестические MCI". Человек с амнестическими MCI может начать забывать важную информацию, которую он или она раньше легко вспоминали, например, недавние события. "Амнестические MCI" часто наблюдаются как продромальный период болезни Альцгеймера. MCI, которые поражают мыслительные способности, отличающиеся от памяти, известны как "неамнестические MCI." Этот тип MCI поражает мыслительные способности, такие как способность к принятию здравых решений, к суждению о времени и шагах, необходимых для решения сложной задачи или для визуального восприятия. Считается, что у субъектов с неамнестическими MCI эти нарушения часто превращаются в другие виды деменции (например, деменции с тельцами Леви).
Специалисты в области медицины все чаще осознают, что люди, у которых была диагностирована болезнь Паркинсона, могут иметь MCI в дополнение к наличию физических симптомов. Недавние исследования показали, что у 20-30% людей с болезнью Паркинсона наблюдаются MCI, и их MCI являются неамнестическими. У пациентов с болезнью Паркинсона и с MCI иногда развивается резко выраженная деменция (болезнь Паркинсона с деменцией).
Методы обнаружения, мониторинга, количественного определения или оценки нейропатологических дефектов, ассоциированных с MCI известны из уровня техники, они включают морфологические анализы функции астроцитов, анализы высвобождения ацетилхолина, окрашивания серебром для оценки нейродегенерации и PiB - PET изображений для выявления отложений амилоидных бляшек (см., например, опубликованную заявку США №2012/0071468; Pepeu, 2004, supra). Методы обнаружения, мониторинга, количественного определения или оценки поведенческих дефектов, связанных с MCI, также известны из уровня техники, они включают применение радиального лабиринта с шестью коридорами, выбор по признаку отличия от образца, задачу определения аллоцентрического места в водяном лабиринте, тест в лабиринте Морриса, зрительно-пространственные задачи и задачи с задержанной реакцией и задачи с новыми запахами (см. id.).
Дисфункция двигательных нейронов (мотонейронов) (MND). MND представляет собой группу прогрессирующих неврологических нарушений, которые разрушают двигательные нейроны, клетки, которые регулируют неотъемлемую произвольную активность, такую как разговор, ходьба, дыхание и глотание. Они классифицируются в соответствии с тем, какие нейроны, верхние двигательные нейроны, нижние двигательные нейроны или и те, и другие, затрагивает дегенерация. Примеры MNDs включают, но без ограничения, боковой амиотрофический склероз (ALS), известный также как болезнь Лу Герига, прогрессирующий бульбарный паралич, псевдобульбарный паралич, первичный латеральный склероз, прогрессирующую мышечную атрофию, болезнь нижних мотонейронов и спинальную мышечную атрофию (SMA) (например, SMA1, называемую также болезнью Верднига-Гоффмана, SMA2, SMA3, называемые также болезнями Кугельберга-Веландера и болезнь Кеннеди), пост-полиомиелитный синдром и наследственную спастическую параплегию. У взрослых наиболее распространенной MND является боковой амиотрофический склероз (ALS), который поражает и верхние, и нижние двигательные нейроны. Он может поражать руки, ноги или лицевые мускулы. Первичный латеральный склероз является болезнью верхних двигательных нейронов, в то время как прогрессирующая мышечная атрофия поражает только нижние двигательные нейроны в спинном мозге. При прогрессирующем бульбарном параличе больше всего поражаются самые нижние двигательные нейроны ствола мозга, что вызывает неразборчивую речь и затруднения при жевании и проглатывании. Существуют почти всегда умеренные аномальные признаки заболевания на ногах и руках. Пациенты с MND проявляют фенотип болезни Паркинсона (например, у них наблюдаются тремор, ригидность, брадикинезия и/или постуральная нестабильность). Методы выявления, мониторинга или количественного определения локомоторных и/или других дефектов, связанных с болезнями Паркинсона, такими как MND, известны из уровня техники (см., например, опубликованную заявку США №20120005765).
Методы выявления, мониторинга или количественного определения двигательных и гистопатологических дефектов, ассоциированных с MND, известны из уровня техники, они включают гистопатологические, биохимические и электрофизические исследования и анализ двигательной активности (см., например. Rich et al., J Neurophysiol 88: 3293-3304, 2002; Appel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 647-51, 1991). С гистопатологической точки зрения MNDs характеризуются гибелью двигательных нейронов, прогрессирующим накоплением стойких к воздействию детергентов агрегатов, содержащих SOD1 и убиквитин, и аберрантных нейрофиламентов в дегенерирующих двигательных нейронах. Кроме того, реакционноспособные астроглия и микроглия часто детектируются в больной ткани. Пациенты с MND характеризуются дефицитом одного или более движений, включая мышечную слабость и изнурение, неконтролируемые подергивания, спастичность, медленные требующие усилий движения и гиперактивные сухожильные рефлексы.
Глазные заболевания и расстройства: Согласно некоторым вариантам заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой глазную болезнь, расстройство или состояние, например, дальнозоркость, макулярную дегенерацию или катаракту. Согласно некоторым другим вариантам заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой глаукому. Макулярная дегенерация является нейродегенеративным заболеванием, которое вызывает потерю фоторецепторных клеток в центральной части сетчатки, называемой макулой. Макулярная дегенерация обычно классифицируется на два типа: сухую форму и мокрую форму. Сухая форма распространена больше, чем мокрая форма, примерно у 90% пациентов со старческой макулярной дегенерацией (ARMD или AMD) диагностируется сухая форма. Мокрая форма этого заболевания обычно приводит к более серьезной потере зрения. Хотя точные причины возрастной макулярной дегенерации все еще неизвестны, количество эпителиальных стареющих пигментированных клеток сетчатки (RPE) с возрастом растет. Возраст и некоторые генетические факторы, а также окружающая среда являются факторами риска развития ARMD (см., например, Lyengar et al., Am. J. Hum. Genet. 74: 20-39 (2004) (Epub 2003 December 19); Kenealy et al., Mol. Vis. 10: 57-61 (2004); Gorin et al., Mol. Vis. 5: 29 (1999)). Предрасполагающие факторы окружающей среды включают недостаток потребления омега-3 жирных кислот (см., например, Christen et al., Arch. Ophthalmol. 129: 921-29 (2011)); действие эстрогенов (см., например, Feshanich et al., Arch. Ophthalmol. 126(4): 519-24) (2008)); и повышенное содержание витамина D в сыворотке (см., например, Millen, et al., Arch. Ophthalmol. 129(4): 481-89 (2011)). Генетические факторы предрасположенности включают пониженное содержание дайсера 1 (фермента, участвующего в образовании зрелых микроРНК) в глазах пациентов с сухой формой AMD, уменьшение микроРНК влияет на профиль стареющих клеток, и исчезновение дайсера 1 вызывает преждевременное старение (см., например, Mudhasani J. Cell.Biol. (2008)).
Сухая форма ARMD ассоциирована с атрофией слоя RPE, которая вызывает потерю фоторецепторных клеток. Сухая форма ARMD может возникнуть в результате старения и истончения макулярных тканей и отложения пигмента в макуле. Оказалось, что старение ингибирует как репликацию, так и миграцию RPE (слоя пигментного эпителия), приводя к постоянной деплеции RPE в макуле пациентов с сухой формой AMD (см., например, Iriyama et al., J. Biol. Chem. 283: 11947-953 (2008)). При мокрой форме ARMD под сетчаткой образуются новые кровеносные сосуды и просочившиеся кровь и жидкость. Эта аномальная хориоидальная неоваскуляризация вызывает гибель клеток сетчатки, образуя белые пятна в области центрального зрения. Различные формы макулярной дегенерации могут развиваться и у более молодых пациентов. Не связанная с возрастом этиология может быть связана с наследственностью, наличием диабета, недостатком питания, повреждением головы, инфекцией и другими факторами.
Ухудшение остроты зрения, замеченное пациентом или офтальмологом во время рутинной проверки зрения, может быть первым индикатором макулярной дегенерации. Образование экссудатов или "друз" под мембраной Бруха макулы часто представляет собой первый физический признак развития макулярной дегенерации. Симптомы включают искажение прямых линий и в некоторых случаях центр зрения оказывается более искаженным, чем остальная часть; темная расплывчатая область или "белая тьма" появляется в центре зрения; и/или восприятие цвета меняется или уменьшается. Диагностирование и мониторинг субъекта с макулярной дегенерацией могут быть осуществлены специалистом в области офтальмологии в соответствии с принятыми в этой области осмотрами состояния глаз и сообщениями субъекта о появлении симптомов.
Старческая дальнозоркость представляет собой возрастное состояние, при котором глаз проявляет прогрессирующую снижающуюся способность фокусироваться на близлежащих объектах, так как скорость и амплитуда аккомодации нормального глаза снижается с возрастом. Потеря эластичности кристаллической линзы и потеря сократительной способности ресничных (цилиарных) мышц считаются ее причиной (см., например, Heys et al., 2004, Mol. Vis. 10: 956-63; Petrash, 2013, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54: ORSF54-ORSF59). Возрастные изменения механических свойств передней капсулы хрусталика и задней капсулы хрусталика дают возможность предположить, что механическая прочность задней капсулы хрусталика снижается с возрастом значительно (см., например, Krag et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44: 691-96 (2003); Krag et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38: 357-63 (1997)).
Слоистая структура капсулы также меняется и может привести, по меньшей мере частично, к изменению в составе ткани (см., например, Krag et al., 1997, supra, и ссылки, содержащиеся в этой публикации). Основным компонентом структуры капсулы хрусталика является базальная мембрана коллагена типа IV, которая организована с образованием трехмерной молекулярной сетки (см., например, Cummings et al., Connect. Tissue Res. 55: 8-12 (2014); Veis et al., Coll. Relat. Res. 1981; 1: 269-86). Коллаген типа IV состоит из шести гомологичных α-цепей (α1-6), которые соединяются в гетеротримерные протомеры коллагена типа IV, каждый из которых включает специфическую комбинацию цепей α112, α345 или α556 (см., например, Khoshnoodi et al., Microsc. Res. Tech. 2008; 71: 357-70). Протомеры имеют структурное сходство с трехспиральным доменом коллагена с тройной пептидной последовательностью Gly-X-Y (Timpl et al., Eur. J. Biochem. 1979; 95: 255-263), заканчиваясь глобулярным С-концевым участком, завершающимся доменом не коллагена 1 (NC1). N-концы состоят из спирального домена, называемого 7S-доменом (см., например, Risteli et al., Eur. J. Biochem. 1980; 108: 239-250), который также участвует во взаимодействиях протомер-протомер.
В результате проведенного исследования предположили, что коллаген типа IV влияет на клеточную функцию, которая определяется по положению базальных мембран под эпителиальными слоями и полученные данные подтверждают роль коллагена типа IV в стабилизации тканей (см., например, Cummings et al., supra). В последующие годы после удаления катаракты развивается помутнение задней капсулы хрусталика (РСО) как осложнение примерно у 20-40% пациентов (см., например, Awasthi et al., Arch. Ophthalmol. 2009; 127: 555-62). РСО возникает от пролиферации и активности остаточных эпителиальных клеток хрусталика вдоль задней капсулы в ответ на заживление раны (см., например, Awasthi et al., Arch. Ophthalmol. 2009; 127: 555-62). Факторы роста, такие как фактор роста фибробластов, трансформирующий фактор роста β, эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста и интерлейкины IL-1 и IL-6 могут также ускорять миграцию эпителиальных клеток (см., например, Awasthi et al., supra; Raj et al., supra). Как обсуждалось в данной заявке, продуцирование этих факторов и цитокинов стареющими клетками вносит свой вклад в SASP. В противоположность этому in vitro исследования показывают, что коллаген типа IV ускоряет прилипание эпителиальных клеток хрусталика (см., например, Olivero et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993; 34: 2825-34). Адгезия коллагена типа IV, фибронектина и ламинина к внутриглазному хрусталику ингибирует миграцию клеток и может уменьшить риск РСО (см., например, Raj et al., Int. J. Biomed. Sci. 2007; 3: 237-50).
He ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно сказать, что селективная гибель стареющих клеток при помощи сенолитических агентов, описанных в данной заявке, может замедлить или воспрепятствовать (отложить, ингибировать, замедлить) дезорганизацию сетки коллагена типа IV. Исчезновение стареющих клеток и исчезновение при этом воспалительного действия SASP может уменьшать или ингибировать миграцию эпителиальных клеток и может также отсрочить (подавить) начало старческой дальнозоркости или уменьшить или замедлить прогрессирование этого состояния (такого как медленное превращение слабого состояния в умеренное или затем серьезное). Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, могут также быть полезными после хирургического удаления катаракты для уменьшения вероятности возникновения РСО.
Хотя при исследовании людей не были получены прямые доказательства участия клеточного старения в развитии катаракты, у гипоморфных мышей линии BubR1 развиваются задние субкапсулярные катаракты с двух сторон на ранних стадиях жизни, и можно предположить, что старение может играть роль (см., например, Baker et al., Nat. Cell Biol. 10: 825-36 (2008)). Катаракты представляют собой помутнение хрусталика глаза, вызывающее расфокусированное зрение, и, если их оставлять без лечения, это может привести к слепоте. Хирургическое вмешательство является эффективным и широко применяемым при удалении катаракт. Введение одного или более сенолитических агентов, описанных в данной заявке, может привести к уменьшению вероятности возникновения катаракты или может замедлить или ингибировать прогрессирование катаракты. Наличие и опасность развития катаракты можно отслеживать путем проверки зрения с использованием методов, обычно осуществляемых специалистом в области офтальмологии.
Согласно некоторым вариантам по меньшей мере один сенолитический агент, который селективно уничтожает стареющие клетки, может быть введен субъекту, который находится в группе риска развития дальнозоркости, катаракт или макулярной дегенерации. Лечение сенолитическим агентом можно начинать, когда человеку исполнилось по меньшей мере 40 лет, для задержки или ингибирования начала, или развития катаракты, дальнозоркости и макулярной дегенерации. Поскольку почти все люди страдают от дальнозоркости, согласно некоторым вариантам сенолитический агент может быть введен субъекту способом, описанным в данной заявке, после того, как этот субъект достигнет возраста в 40 лет для задержки или ингибирования начала, или развития дальнозоркости.
Согласно некоторым вариантам заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой глаукому. "Глаукома" является широким термином для описания группы заболеваний, которые вызывают потерю визуального поля, часто без любого другого превалирующего симптома. Отсутствие симптомов часто приводит к запоздалому диагнозу глаукомы до достижения конечных стадий болезни. Даже если субъекты, страдающие от глаукомы, не становятся слепыми, их зрение часто сильно ухудшается. В нормальном состоянии прозрачная жидкость течет в переднюю часть глаза, называемую передней камерой. У субъектов, которые страдают от глаукомы с широко открытым углом, эта жидкость просачивается слишком медленно, приводя к появлению повышенного давления в глазу. Если оставить глаукому без лечения, это высокое давление впоследствии повреждает оптический нерв и может привести к полной слепоте. Потеря периферического зрения вызывается гибелью ганглиозных клеток в сетчатке. Ганглиозные клетки представляют собой специфический тип проекционного нейрона, который соединяет глаз с мозгом. Когда клеточная сетка, требующаяся для вытекания жидкости, была подвергнута окрашиванию SA-β-Gal, наблюдалось четырехкратное увеличение старения у пациентов с глаукомой (см., например, Liton et al., Exp. Gerontol. 40: 745-748 (2005)).
Для мониторинга эффекта от терапии при ингибировании развития глаукомы, наиболее распространенным методом является стандартная автоматизированная периметрия (определение визуального поля). Кроме того, были созданы несколько алгоритмов для выявления развития глаукомы (см., например, Wesselink et al., Arch. Ophthalmol. 127(3): 270-274 (2009) и ссылки в этой публикации). Дополнительные методы включают гониоскопию (проверку трабекулярной сети и угла, где жидкость вытекает из глаза); методы получения изображения, например, метод сканирующей лазерной томографии (например, HRT3), лазерной поляриметрии (например, GDX), и оптической когерентной томографии глаза; офтальмоскопию и измерения с использованием пахиметра, которые позволяют определить центральную толщину роговицы.
Метаболическое заболевание или расстройство. Заболевания или расстройства, ассоциированные со старением, подвергающиеся лечению при помощи сенолитического агента, включают метаболическое заболевание или расстройство. Такие заболевания, ассоциированные со стареющими клетками, включают диабет, метаболический синдром, диабетические язвы и ожирение.
Диабет характеризуется высоким содержанием глюкозы в крови, вызванным дефектами в продуцировании инсулина, действии инсулина или и тем, и другим. Подавляющее большинство (90-95%) всех диагностированных случаев диабета у взрослых являются диабетом 2 типа, характеризующимся постепенно нарастающим недостатком продуцирования инсулина поджелудочной железой. Диабет является основной причиной почечной недостаточности, нетравматической ампутации нижних конечностей и новых случаев слепоты среди взрослых в США. Диабет является главной причиной порока сердца и инсульта и седьмой по счету причиной смертности в США (см., например, Centers for Disease Control and Prevention, National diabetes fact sheet: national estimates and general information on diabetes and pre-diabetes in the United States, 2011 ("Справочный материал по диабету (Diabetes fact sheet")). Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, можно использовать для лечения диабета 2 типа, особенно возрастного диабета, диабета 2 типа, связанного с нарушением питания и ожирением.
Участие стареющих клеток в метаболическом заболевании, таком как ожирение и диабет 2 типа, является, как предположили, ответом на повреждение или метаболическую дисфункцию (см., например, Tchkonia et al., Aging Cell 9: 667-684 (2010)). Жировая тканы ожиревших мышей показала индуцирование маркеров старения SA-β-Gal, p53 и р21 (см., например, Tchkonia et al., supra; Minamino et al., Nat. Med. 15: 1082-1087 (2009)). Сопутствующая повышающая регуляция провоспалительных цитокинов, таких как фактора некроза опухолей α и Ссl2/МСР1, наблюдалась в той же самой жировой ткани (см., например, Minamino et al., supra). Индуцирование стареющих клеток при ожирении потенциально имеет клинические последствия, так как воспалительные компоненты SASP также могут вносить свой вклад в развитие диабета 2 типа (см., например, Tchkonia et al., supra). Похожий паттерн повышающей регуляции маркеров старения и компонентов SASP связан с диабетом и у мышей, и у людей (см., например, Minamino et al., supra). Соответственно, способы, описанные в данной заявке, которые включают введение сенолитического агента, могут подходить для лечения и профилактики диабета 2 типа, а также ожирения и метаболического синдрома. Не основываясь на какой-либо конкретной теории, можно считать, что контакт стареющих преадипоцитов с сенолитическим агентом, приводящий к гибели стареющих преадипоцитов, может обеспечить клинические и лечебно-профилактические преимущества субъекту, у которого наблюдаются любой тип диабета, ожирение или метаболический синдром.
Субъекты, страдающие от диабета 2 типа, могут быть проидентифицированы с использованием стандартных методов диагностики, известных в области диабета 2 типа. В общем, диагностика диабета 2 типа основана на анализе симптомов (например, повышенной жажды и частого мочеиспускания, повышенного чувства голода, потери веса, утомляемости, расплывчатого зрения, медленного заживления ран или частых инфекций, и/или наличия участков потемневшей кожи), анализе медицинской истории или физическом обследовании пациента. Субъекты, рискующие заболеть диабетом, включают тех, у кого были случаи диабета 2 типа в семье и тех, кто характеризуется другими факторами риска, такими как лишний вес, распределение жировых отложений, отсутствие активности, происхождение, возраст, преддиабетическое состояние и/или гестационный диабет.
Эффективность действия сенолитического агента может быть легко определена специалистом в области медицины и клинических исследований. Один диагностический метод или комбинация таких методов, включая физическое обследование, оценку и мониторинг клинических симптомов и проведение аналитических тестов и осуществление способов, описанных в данной заявке, могут быть использованы для мониторинга состояния здоровья субъекта. Субъект, который получает один или более сенолитических агентов, описанных в данной заявке, для лечения или профилактики диабета, может контролироваться, например, путем определения переносимости глюкозы и инсулина, расхода энергии, анализа состава тела, жировой ткани, скелетных мышц и степени воспаления печени и/или липотоксичности (запасов липидов в мышцах и печени при получении изображений vivo и изображений мышц, печени, костного мозга и аккумуляции панкреатического β-клеточного липида и степени воспаления при помощи гистологии). Другие характерные признаки или фенотипы диабета 2 типа известны и могут быть оценены, как описано в данной заявке, с использованием других способов и методик, которые известны и применяются на практике.
Ожирение и расстройства, связанные с ожирением, представляют собой состояния субъектов, у которых масса тела заметно больше, чем идеальная масса для их веса и строения. Индекс массы тела (BMI) является показателем, используемым для определения избытка веса, который рассчитывается, исходя из роста и веса субъекта. Человек считается имеющим излишний вес, когда он имеет BMI, составляющий 25-29; субъект считается ожиревшим, когда BMI равен 30-39, и субъект считается страдающим от ожирения, когда BMI ≥40. Соответственно, термины "ожирение" и "связанный с ожирением" относятся к людям с индексом массы тела более 30, более 35 или более 40. Категория ожирения, не характеризуемая BMI, называется в уровне техники "абдоминальным ожирением", которое относится к избытку жира в области живота, который является важным фактором здоровья, даже независимо от BMI. Самое простое и чаще всего используемое измерение при абдоминальном ожирении относится к объему талии. Вообще абдоминальное ожирение у женщин определяется как объем талии равный 35 дюймам или более, у мужчин - как объем талии равный 40 дюймам или более. Более сложные методы определения ожирения требуют специального оборудования, например, при магнитно-резонансной томографии или двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии.
Состояние или нарушение, ассоциированное с диабетом и старением, представляет собой диабетическую язву (то есть диабетическую рану). Язва является разрушением кожного покрова, которое может расширяться, затрагивая подкожную ткань или даже мышцу или кость. Эти повреждения возникают, в частности, на нижних конечностях. Пациенты с диабетической венозной язвой характеризуются наличием ускоренного клеточного старения на участках хронических ран (см., например, Stanley et al. (2001) J. Vas. Surg. 33: 1206-1211). На участках с хроническими ранами, такими как диабетические язвы, наблюдается также хроническое воспаление (см., например, Goren et al. (2006) Am. J. Pathol. 7, 168: 65-77; Seitz et al. (2010) Exp. Diabetes Res. 2010: 476969), это позволяет предположить, что провоспалительный цитокиновый фенотип стареющих клеток играет свою роль в патологии.
Субъекты с диабетом 2 типа или рискующие заболеть диабетом 2 типа, могут иметь метаболический синдром. Метаболический синдром у людей обычно ассоциируется с ожирением и характеризуется одной или несколькими сердечно-сосудистыми заболеваниями, стеатозом печени, гиперлипидемией, диабетом и резистентностью к инсулину. Субъект с метаболическим синдромом может быть с кластером метаболических расстройств или аномалий, которые могут включать, например, одно или более заболеваний из гипертонии, диабета 2 типа, гиперлипидемии, дислипидемии (например, гипертриглицеридемия, гиперхолестеринемия), резистентность к инсулину, стеатоз печени (стеатогепатит), гипертонию, атеросклероз и другие метаболические расстройства.
Ренальная (почечная) дисфункция.
Нефрологические патологии, такие как гломерулярные болезни, наблюдаются у пожилых людей. Гломерулонефрит характеризуется воспалением почки и экспрессией двух белков, IL1α и IL1β (см., например, Niemir et аl. (1997) Kidney Int. 52: 393-403). IL1α и IL1β рассматриваются как исходные регуляторы SASP (см., например, Сорре et аl. (2008) PLoS. Biol. 6: 2853-68). Гломерулярная болезнь ассоциируется с увеличенным количеством стареющих клеток, особенно в фибротических почках с фибротическими изменениями (см., например, Sis et аl. (2007) Kidney Int. 71: 218-226).
Дерматологическое заболевание или расстройство. Заболевания или расстройства, ассоциированные со старением, подлежащие лечению сенолитическим агентом, описанным в данной заявке, включают дерматологические заболевания или расстройства. Такие заболевания или расстройства, ассоциированные со стареющими клетками, включают псориаз и экзему, которые также являются воспалительными болезнями, обсуждавшимися подробно выше. Другие дерматологические заболевания или расстройства, которые ассоциированы со старением, включают наличие морщин (возрастных морщин); прурит (связанный с диабетом и старением); дизестезию (побочный эффект после химиотерапии, который связан с диабетом и рассеянным склерозом); псориаз (как уже отмечено) и наличие других шелушащихся папул, например, эритродермия, красный плоский лишай и лихеноидный дерматоз; атопический дерматит (форма экземы, ассоциированная с воспалением); экзематозные высыпания (часто наблюдаемые у возрастных пациентов и связанные с побочными эффектами действия некоторых лекарств). Другие дерматологические заболевания или расстройства, которые ассоциированы со старением, включают эозинофильный дерматит (связанный с некоторыми видами гематологических проявлений рака); реактивный нейтрофильный дерматит (ассоциированный с основными заболеваниями, такими как синдром воспаленного кишечника); пемфигус (аутоиммунное заболевание, при котором образуются антитела против десмоглеина); пемфигоид и другие иммунобуллезные дерматиты (аутоиммунное образование пузырей); пролиферацию кожных клеток, которая связана со старением, и кожные лимфомы, которые распространены у стареющих субъектов. Другое дерматологическое заболевание, которое можно лечить согласно способам, описанным в данной заявке, представляет собой кожную красную волчанку, которая является симптомом эриматозной волчанки. Позднее возникновение волчанки может быть связан со сниженной (то есть ослабленной) функцией Т-клеток и В-клеток и цитокинов (иммуностарение), ассоциированной со старением.
Метастазирование. Согласно конкретному варианту изобретение предусматривает способы лечения или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения или развития) заболевания, ассоциированного со стареющими клетками (или расстройства или состояния), которое представляет собой метастазирование. Сенолитические агенты, описанные в данной заявке, могут также быть использованы для лечения или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения или развития) метастазирования (а именно, распространения и рассеивания раковых или опухолевых клеток) из одного органа или одной ткани в другие орган или ткань в организме.
Заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, включает метастазирование, и субъект, больной раком, может извлечь пользу от введения сенолитического агента при ингибировании метастазирования, как описано в данной заявке. Такой сенолитический агент, будучи введенным субъекту, больному раковым заболеванием, согласно описанным в данной заявке способам может ингибировать пролиферацию опухолевых клеток. Метастазирование опухолевых клеток возникает, когда раковые клетки (то есть опухолевые клетки) распространяются от анатомического места их происхождения и начинают колонизацию других областей в организме субъекта. Пролиферация опухолевых клеток может быть определена по размеру опухоли, который может быть измерен различными способами, известными специалисту в данной области, например, методами PET (ПЭТ) - позитронно-эмиссионной томографии, MRI (магнитно-резонансной томографии, CAT (компьютерно-аксиальной томографии), исследования образцов, полученных при биопсии. Эффект терапевтического агента в отношении пролиферации опухолевых клеток можно также оценить путем анализа дифференцировки опухолевых клеток.
Используемые в данной заявке и в уровне техники термины "рак" или "опухоль" являются клинически описательными терминами, которые охватывают заболевания, обычно характеризующиеся аномальной клеточной пролиферацией. Термин "рак" обычно используется для описания злокачественной опухоли или болезненного состояния, появляющегося при наличии опухоли. Альтернативно, аномальный рост в уровне техники может называться неопластическим образованием (неоплазмой). Термин "образование опухоли" в отношении к состоянию ткани обычно относится к любому аномальному росту ткани, который характеризуется, по меньшей мере частично избыточной и аномальной пролиферацией клеток. Опухоль может быть метастатической и способной к распространению от анатомического места ее происхождения и к колонизации других участков в организме субъекта. Рак может включать солидную опухоль или опухоль "жидкой" консистенции (например, лейкоз и другие раки крови).
Клетки начинают стареть при проведении раковой терапии, такой как облучение и применение некоторых химиотерапевтических лекарств. Наличие стареющих клеток вызывает секрецию воспалительных молекул (см. описание стареющих клеток в данной заявке), промотирует развитие опухолей, которое может включать промотирование роста опухоли и увеличение размера опухоли, промотирование метастазирования и изменение дифференцировки. Когда стареющие клетки разрушаются, развитие опухоли в значительной степени ингибируется, что приводит к опухоли меньшего размера с небольшим или незаметным ростом метастазов (см., например, международную заявку № WO 2013/090645).
й
й
Согласно одному из вариантов настоящее изобретение предусматривает профилактику (то есть уменьшение вероятности возникновения), ингибирование или замедление метастазирования у субъекта, у которого выявлен рак, путем введения сенолитического агента, как описано в данной заявке. Согласно конкретному варианту сенолитический агент вводится в течение одного или более дней окна лечения (то есть курса лечения) и не более 7 дней или 14 дней. Согласно другим вариантам курс лечения длится не более, чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или не более 21 дня. Согласно другим вариантам курс лечения длится один день. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент вводится в течение двух или более дней окна лечения, длящегося не более 7 дней или 14 дней, в течение 3 или более дней окна лечения, продолжающегося не более 7 дней или 14 дней; в течение 4 или более дней окна лечения, продолжающегося не более 7 дней или 14 дней; в течение 5 или более дней окна лечения, продолжающегося не более 7 дней или 14 дней; в течение 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней окна лечения, продолжающегося не более 7 дней или 14 дней. Согласно некоторым вариантам, когда субъекту сенолитический агент вводится в течение окна лечения, длящегося 3 дня или более, этот агент может вводиться каждый 2 день (то есть каждый другой день). Согласно некоторым другим вариантам, когда субъекту сенолитический агент вводится в течение окна лечения, длящегося 4 дня или более, этот агент может вводиться каждый 3 день (то есть каждый другой третий день).
Поскольку клетки могут образовываться в процессе старения при раковой терапии, такой как облучение и применение некоторых химиотералевтических лекарств (например, доксорубицина, паклитаксела, гемцитабина, помалидомида, леналидомида), сенолитический агент, описанный в данной заявке, может вводиться после проведения химиотерапии или облучения для уничтожения (или облегчения гибели) этих стареющих клеток. Как обсуждается в данной заявке и известно из уровня техники, установление факта старения, например, выявленного по наличию секреторного фенотипа, ассоциированного со старением (SASP), продолжается несколько дней; следовательно, введение сенолитического агента для уничтожения стареющих клеток и уменьшения при этом вероятности возникновения метастазирования начинается, когда было выявлено старение. Как обсуждается в данной заявке, для введения сенолитического агента в способах, описанных в данной заявке, для лечения или профилактики (уменьшения вероятности возникновения или уменьшения степени серьезности) побочного эффекта при проведении химиотерапии или облучения можно применять следующие курсы лечения.
й
й
Согласно некоторым вариантам, когда химиотерапия или радиотерапия применяются во время курса лечения из по меньшей мере одного дня (то есть проводятся химиотерапия или радиотерапия) с последующими по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 (или примерно двумя неделями), 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 (или примерно 3 неделями) днями или примерно 4 неделями (примерно одним месяцем) без лечения (то есть без проведения химиотерапии или радиотерапии), сенолитический агент вводится в течение одного или более дня во время периода времени без лечения, начиная со второго дня или после второго дня периода без лечения и заканчивая в последний день или перед последним днем периода без лечения. Например, если n обозначает количество дней без лечения, тогда сенолитический агент вводится в течение по меньшей мере одного дня и не дольше, чем в течение n-1 дней периода без лечения. Согласно некоторому конкретному варианту, когда химиотерапия или радиотерапия применяются во время курса лечения из по меньшей мере одного дня периода с лечением (то есть проводятся химиотерапия или радиотерапия) с последующей по меньшей мере одной неделей периода без лечения, сенолитический агент вводится в течение одного или более дней во время периода без лечения, начиная со второго дня или после второго дня периода без лечения и заканчивая в последний день или перед последним днем периода без лечения. Согласно конкретному варианту, когда химиотерапия или радиотерапия применяются во время курса лечения из по меньшей мере одного дня периода с лечением (то есть проводятся химиотерапия или радиотерапия) с последующей по меньшей мере одной неделей периода без лечения, сенолитический агент вводится в течение одного дня, который является шестым днем периода без лечения. Согласно другим конкретным вариантам, когда химиотерапия или радиотерапия применяются во время курса лечения из по меньшей мере одного дня периода с лечением (то есть проводятся химиотерапия или радиотерапия) с последующими по меньшей мере двумя неделями периода без лечения, сенолитический агент вводится, начиная с шестого дня без проведения химиотерапии или радиотерапии и заканчивая в по меньшей мере один день или по меньшей мере два дня до первого дня последующего проведения курса химиотерапии или радиотерапии. Например, если период времени без проведения химиотерапии или радиотерапии составляет две недели, сенолитический агент может быть введен в течение по меньшей мере одного дня и не дольше 7 дней (то есть 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней) периода времени без лечения, начиная с шестого дня после окончания курса химиотерапии или радиотерапии (то есть на шестой день периода времени без проведения химиотерапии или радиотерапии). Когда период времени без проведения химиотерапии или радиотерапии продолжается по меньшей мере три недели, сенолитический агент может быть введен в течение по меньшей мере одного дня и не более, чем в течение 14 дней (то есть 1-14 дней: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней) периода времени без лечения, начиная с шестого дня после окончания курса химиотерапии или радиотерапии. Согласно другим вариантам в зависимости от продолжительности периода без лечения курс лечения сенолитическим агентом составляет по меньшей мере один дней и не более, чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или не более 21 дня (то есть 1-21 день), при условии, что введение сенолитического агента не сопутствует проведению химиотерапии или радиотерапии. Согласно некоторым вариантам курс лечения сенолитическим агентом продолжается один день. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент может быть введен в течение двух или более дней окна лечения, состоящего из не более, чем 14 дней, в течение 3 или более дней окна лечения, состоящего из не более, чем 14 дней; в течение 4 или более дней окна лечения, состоящего из не более, чем 14 дней; в течение 5 или более дней окна лечения, состоящего из не более, чем 14 дней; в течение 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней окна лечения, состоящего из не более, чем 14 дней. Согласно некоторым вариантам, когда по меньшей мере один сенолитический агент вводится субъекту в течение курса лечения, состоящего из 3 дней или более, этот агент может быть введен каждый 2 день (то есть каждый другой день). Согласно некоторым другим вариантам, когда по меньшей мере один сенолитический агент субъекту в течение курса лечения, состоящего из 4 дней или более, этот агент может быть введен каждый 3 день (то есть каждый другой третий день).
й
й
Многие схемы лечения при помощи химиотерапии или радиотерапии включают определенное количество циклов лекарственной терапии, сопровождающейся терапией без введения лекарств или включают определенный период времени, в течение которого проводится химиотерапия или радиотерапия. Такие схемы раковой терапии могут также называться протоколами лечения. Протоколы определяются при проведении клинических испытаний, инструкциями по применению лекарственных препаратов или определяются клиницистами вместе с субъектом, лечение которого проводится. Количество циклов химиотерапии или радиотерапии или общая продолжительность проведения химиотерапии или радиотерапии может меняться в зависимости от реакции пациента на раковую терапию. Продолжительность определенного периода времени такого лечения легко определяется специалистом в области онкологии. Согласно другому варианту лечения метастазирования сенолитический агент может быть введен после завершения курса химиотерапии или радиотерапии. Согласно конкретному варианту сенолитический агент может быть введен после завершения курса химиотерапии или радиотерапии в течение одного или более дней окна лечения (то есть курса лечения сенолитическим агентом), продолжающегося не более 14 дней. Согласно другим вариантам курс лечения сенолитическим агентом длится не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 дней или не более 21 дня. Согласно другим вариантам такой курс лечения продолжается один день. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент вводится в течение двух или более дней окна лечения, продолжающегося не более 14 дней, в течение 3 или более дней окна лечения, продолжающегося не более 14 дней; в течение 4 или более дней окна лечения, продолжающегося не более 14 дней; течение 5 или более дней окна лечения, продолжающегося не более 14 дней; в течение 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней окна лечения, продолжающегося не более 14 дней. Согласно некоторым вариантам, когда по меньшей мере один сенолитический агент вводится субъекту после проведения курса химиотерапии или радиотерапии в течение окна лечения из 3 или более дней, этот агент может вводиться каждый 2 день (то есть каждый второй день). Согласно некоторым другим вариантам, когда по меньшей мере один сенолитический агент вводится субъекту в течение окна лечения из 4 или более дней, этот агент может вводиться каждый 3 день (то есть каждый другой третий день). Согласно одному из вариантов лечение сенолитическим агентом может начинаться по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 день или позже после окончания курса химиотерапии или радиотерапии. Согласно конкретному варианту лечение сенолитическим агентом может начинаться по меньшей мере на 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 день или позже после окончания курса химиотерапии или радиотерапии. Любой дополнительный курс лечения или цикла лечения путем введения сенолитического агента, описанного в данной заявке, может следовать после завершения протокола химиотерапии или радиотерапии для ингибирования метастазирования у субъекта.
Химиотерапия может называться лечением при помощи химиотерапии, химиотерапевтика, химиотерапевтического лекарства. Многие химиотерапевтики представляют собой соединения, называемые низкомолекулярными (малыми) органическими молекулами. Химиотерапия является термином, который используется также для описания комбинации химиотерапевтических лекарств, которые вводятся для лечения конкретного ракового заболевания. Как известно специалисту в данной области, термин химиотерапия может также относиться к комбинации двух и более химиотерапевтических лекарств, которые вводятся скоординировано и которые могут называться применяемыми для комбинированной химиотерапии. В онкологии используются многочисленные химиотерапевтические лекарства, они включают, но без ограничения, алкилирующие агенты, антиметаболиты, антрациклины, растительные алкалоиды и ингибиторы топоизомеразы.
Рак, который может метастазировать, может являться солидной опухолью или может быть опухолью жидкой консистенции (например, при раке крови, например, при лейкозе). Виды раков, которые являются опухолями жидкой консистенции классифицируются как заболевания, которые возникают в крови, костном мозгу и в лимфатических узлах, они включают обычно лейкоз (миелоидный и лимфоцитарный), лимфомы (например, лимфому Ходжкина), и меланомы (в том числе, множественную миелому). Лейкоз включает, например, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML) и лейкоз ворсистых клеток. Раки, которые представляют собой солидные опухоли и развиваются более часто у людей, включают, например, рак простаты, рак яичка, рак молочной железы, рак мозга, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак щитовидной железы, рак желудка, рак легкого, рак яичников, саркому Капоши, рак кожи (включая сквамозноклеточный рак кожи), рак почек, рак головы и шеи, рак горла (гортани), сквамозноклеточные карциномы, которые образуются на влажных выстилках слизистой оболочки носоглотки, полости рта, горла и т.д.), рак мочевого пузыря, остеосаркому (рак кости), рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак печени и рак почки. Согласно некоторым конкретным вариантам заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, которое подвергается лечению или профилактике (когда уменьшается вероятность возникновения или развития) при осуществлении способов, описанных в данной заявке, представляет собой метастазирование меланомы, метастазирование рака простаты, метастазирование рака яичка, метастазирование рака молочной железы, метастазирование рака мозга, метастазирование рака поджелудочной железы, метастазирование рака прямой кишки, метастазирование рака поджелудочной железы, метастазирование рака желудка, метастазирование рака легкого, метастазирование рака яичников, метастазирование саркомы Капоши, метастазирование рака кожи, метастазирование рака почки, метастазирование рака головы и шеи, метастазирование рака гортани, метастазирование сквамозноклеточной карциномы, метастазирование остеосаркомы, метастазирование рака шейки матки, метастазирование рака эндометрия, метастазирование рака пищевода, метастазирование рака печени или метастазирование рака почки.
Способы, описанные в данной заявке, могут использоваться также для ингибирования, замедления или замедления прогрессирования метастатического рака, любого из вида опухолей, описанных в медицине. Виды раков (опухолей) включают следующие заболевания: адренокортикальную карциному, адренокортикальную карциному у детей, СПИД-ассоциированный рак, рак анального канала, рак аппендикса, базальноклеточную карциному, базальноклеточную карциному у детей, рак мочевого пузыря, рак мочевого пузыря у детей, рак кости, опухоль головного мозга, астроцитому в детском возрасте, глиому ствола головного мозга у детей, атипическую тератоидно-рабдоидную опухоль центральной нервной системы у детей, медуллоэпителиому центральной нервной системы у детей, герминогенные опухоли центральной нервной системы у детей, краниофарингиому головного мозга у детей, эпендимому головного мозга у детей, рак молочной железы, бронхиальные опухоли у детей, карциноидную опухоль, карциноидную опухоль у детей, карциноидную опухоль в желудочно-кишечном тракте, карциному неизвестной первичной локализации, карциному неизвестной первичной локализации у детей, кардиальные опухоли у детей, рак шейки матки, рак шейки матки у детей, хордому у детей, хронические миелопролиферативные нарушения, рак прямой кишки, колоректальный рак, колоректальный рак у детей, внепеченочный рак желчных протоков, протоковую карциному in situ (DCIS), рак эндометрия, рак пищевода, рак пищевода у детей, эстезионейробластому у детей, рак глазаг, злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, рак желчного пузыря, рак желудочно-кишечного тракта (желудка), рак желудочно-кишечного тракта (желудка) у детей, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта у детей (GIST), экстракраниальную эмбрионально-клеточную опухоль у детей, внегонадную эмбрионально-клеточную опухоль, гестациозную трофобластическую опухоль, глиому, рак головы и шеи, рак головы и шеи у детей, гепатоклеточный рак (печени), гипофарингеальный (подглоточный) рак, рак почки, рак клеточного эпителия почки, опухоль Вильмса, опухоли почек у детей, лангергансоклеточный гистиоцитоз, рак гортани, рак гортани у детей, лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML), волосатоклеточный лейкоз, рак губы, рак печени (первичный), рак печени у детей (первичный), лобулярную карциному in situ (LCIS), рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, лимфому, СПИД-ассоциированную лимфому, лимфому Беркитта, кожную Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, лимфому не-Ходжкина, первичную лимфому центральной нервной системы (ЦНС), меланому, меланому у детей, внутриглазную (глазную) меланому, карциному Меркеля, злокачественную мезотелиому, злокачественную мезотелиому у детей, метастатический сквамозный рак кожи головы и шеи с неизвестным происхождением, срединную карциному, в развитии которой участвует ген NUT, рак ротовой полости, синдромы множественной эндокринной неоплазии у детей, грибовидный микоз, миелодиспластические синдромы, миелодиспластические новообразования, миелопролиферативные новообразования, множественную миелому, рак носовой полости, носоглоточный рак, носоглоточный рак у детей, нейробластому, рак ротовой полости, рак ротовой полости у детей, рак ротоглотки, рак яичников, рак яичников у детей, рак эпителия яичников, пограничную опухоль яичника, рак поджелудочной железы, рак поджелудочной железы у детей, панкреатические нейроэндокринные опухоли (опухоли из островковых клеток), папилломатоз у детей, параганглиому, рак придаточных пазух носа, рак щитовидной железы, рак полового члена, рак глотки, феохромоцитому, опухоль гипофиза, плазмоклеточную опухоль, плевролегочную бластому у детей, рак простаты, рак заднего прохода, переходно-клеточный рак почечной лоханки, ретинобластому, рак слюнной железы, рак слюнной железы у детей, саркому Эвинга, саркому Капиши, остеосаркому, рабдомиосаркому, рабдомиосаркому у детей, саркому мягких тканей, саркому матки, синдром Сезари, рак кожи у детей, немеланомный рак кожи, рак кишечника, сквамозно-клеточную карциному, сквамозно-клеточную карциному у детей, рак яичка, рак яичка у детей, рак горла, тимому и тимусную карциному, тимому и тимусную карциному у детей, рак щитовидной железы, рак щитовидной железы у детей, переходно-клеточный рак мочеточника, рак мочеиспускательного канала, рак тела матки, рак влагалища, рак вульвы (наружных женских половых органов, макроглобулинемию Вальденштрёма.
Побочные эффекты химиотерапии и радиотерапии. Согласно другому варианту заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, представляет собой побочный химиотерапевтический эффект или побочный эффект радиотерапии. Примеры химиотерапевтических агентов, которые применяются при наличии нераковых стареющих клеток, включают антрациклины (такие как доксорубицин, даунорубицин); таксолы (например, паклитаксел); гемицитабин; помалидомид и леналидомид. Один или более сенолитических агентов, вводимых как описано в данной заявке, могут быть использованы для лечения и/или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения) побочного эффекта химиотерапии или побочного эффекта радиотерапии. Удаление или деструкция стареющих клеток может снизить острую токсичность, включая острую токсичность, вызывающую дисбаланс телесной энергии, при проведении химиотерапии или радиотерапии. Побочные эффекты, заключающиеся в острой токсичности, включают, но без ограничения, желудочно-кишечную токсичность (например, тошноту, рвоту, засорение желудка, анорексию, диарею), периферическую нейропатию, утомляемость, плохое самочувствие, низкую физическую активность, гематологическую токсичность (например, анемию), гепатотоксичность, алопецию (облысение), боль, инфекцию, мукозит, задержку жидкости, дерматологическую токсичность (например, высыпания, дерматит, гиперпигментация, уртикария, фоточувствительность, изменения в ногтевых пластинах), оральный мукозит, проблемы с деснами или с горлом или любой токсический побочный эффект, вызванный проведением химиотерапии или радиотерапии. Например, токсические побочные эффекты, вызванные проведением химиотерапии или радиотерапии (см., например, вебсайт Национального института рака (National Cancer Institute web site), могут быть ослаблены способами, описанными в данной заявке. Соответственно, согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает способы уменьшения интенсивности (ослабления, ингибирования или предотвращения возникновения) острой токсичности или уменьшения степени тяжести токсического побочного эффекта (то есть неблагоприятного побочного эффекта), вызванного проведением химиотерапии или радиотерапии или обоих видов лечения у субъекта, который получает эту терапию, причем такой способ включает введение субъекту агента, который селективно уничтожает, удаляет или разрушает, или облегчает селективное разрушение стареющих клеток. Введение сенолитического агента для лечения или уменьшения вероятности возникновения или уменьшения степени тяжести побочных эффектов химиотерапии или радиотерапии можно осуществлять при применении тех же самых курсов лечения, которые описаны выше, для лечения/профилактики метастазирования. Как в случае лечения/профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения) метастазов, сенолитический агент вводится во время периода времени без химиотерапии или радиотерапии или после проведения химиотерапии или радиотерапии.
Согласно конкретному варианту острая токсичность является острой токсичностью, вызывающей дисбаланс телесной энергии, которая может включать один или более следующих признаков: потерю веса, эндокринное(-ые) изменение(-ия) (например, дисбаланс гормонов, изменение сигнального пути, вызванного гормонами) и изменение(-ия) в составе тела. Согласно некоторым вариантам острая токсичность, вызывающая дисбаланс телесной энергии, относится к сниженной или уменьшенной способности субъекта проявлять физическую активность, о чем свидетельствует сниженный или уменьшенный расход энергии по сравнению с тем расходом, который наблюдался бы у субъекта, который не получил медицинской терапии. Например, такой острый токсический эффект, вызывающий дисбаланс телесной энергии, включает низкую физическую активность. Согласно другим конкретным вариантам дисбаланс телесной энергии выражается в утомляемости или недомогании.
2
Согласно одному из вариантов побочный эффект химиотерапии, подлежащий лечению или предотвращению (то есть уменьшается вероятность его возникновения) посредством сенолитического агента, представляет собой кардиотоксичность. Субъект, больной раковым заболеванием, подвергающийся лечению антрациклином (таким как доксорубицин, даунорубицин) может получать один или более сенолитических агентов, описанных в данной заявке, которые уменьшают, снижают интенсивность или уменьшают кардиотоксичность антрациклина. Как хорошо известно в области медицины, вследствие кардиотоксичности, связанной с антрациклинами, максимальная прижизненная доза, которую субъект может получить, ограничена, даже если рак реагирует на указанное лекарство. Введение одного или более сенолитических агентов может снизить кардиотоксичность таким образом, что можно будет вводить субъекту дополнительные количества антрациклина, что приведет к улучшенному прогнозу протекания ракового заболевания. Согласно одному из вариантов кардиотоксичность возникает при введении антрациклина, такого как доксорубицин. Доксорубицин является антрациклиновым ингибитором топоизомеразы, который одобрен для лечения пациентов, больных раком яичников, после неудачного лечения терапией на основе соединений платины, саркомой Капоши после неудачного лечения при помощи первичной системной химиотерапии или при непереносимости терапии или больных рассеянным склерозом, или больных, имеющих множественную миелому, в комбинации с бортезомибом для лечения пациентов, которые ранее не получали бортезомиб или которых ранее лечили посредством по меньшей мере одного вида терапии. Доксорубицин может вызвать повреждение миокарда, которое может привести к застойной сердечной недостаточности, если общая прижизненная доза для пациента превышает 550 мг/м. Кардиотоксичность может возникнуть даже при применении более низких доз, если пациент проходит курс облучения медиастинальной области или принимает другое кардиотоксическое лекарство. См. вкладыши к упаковкам лекарств (например, DOXIL, ADRIAMYCIN).
Согласно другим вариантам сенолитический агент, описанный в данной заявке, может быть использован при осуществлении способов по изобретению для уменьшения интенсивности хронических или длительных побочных эффектов. Хронические токсические побочные эффекты обычно возникают от множественного воздействия химиотерапии или радиотерапии в течение продолжительного периода времени. Некоторые хронические токсические побочные эффекты появляются после лечения (они называются также поздними токсическими эффектами) и возникают от повреждения органа или системы, вызванного лечением. Дисфункция органов (например, неврологическая, легочная, сердечно-сосудистая и эндокринная дисфункция) наблюдалась у пациентов, которых лечили от рака в детстве (см., например, Hudson et al., JAMA 309: 2371-81 (2013)). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно полагать, что путем разрушения стареющих клеток, в особенности нормальных клеток, старение которых было вызвано химиотерапией или радиотерапией, вероятность возникновения хронического побочного эффекта может быть уменьшена или степень тяжести хронического побочного эффекта может быть уменьшена, или момент начала возникновения хронического побочного эффекта может быть отсрочен. Хронические и/или поздние токсические побочные эффекты, которые появляются у субъектов, которые проходили курс химиотерапии или радиотерапии, включают, например, без ограничения, кардиомиопатию, застойную сердечную недостаточность, воспаление, раннюю менопаузу, остеопороз, бесплодие, ухудшенные когнитивные способности, периферическую нейропатию, вторичные раковые заболевания, катаракты и другие проблемы со зрением, потерю слуха, хроническую усталость, пониженную емкость легких и легочное заболевание.
Кроме того, при уничтожении или удалении стареющих клеток у субъекта, больного раком, путем введения сенолитического агента чувствительность к химиотерапии или радиотерапии может быть увеличена клинически или статистически значимым образом в большей степени, чем при отсутствии введения сенолитического агента. Другими словами, развитие резистентности к химиотерапии или радиотерапии можно ингибировать, когда сенолитический агент вводят субъекту, которого подвергают лечению посредством химиотерапии или радиотерапии.
Возрастные заболевания и расстройства. Сенолитический агент может также применяться для лечения или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения) возрастного заболевания или расстройства, которое развивается как часть естественного процесса старения или возникает, когда субъект подвергается воздействию агента или фактора, вызывающего старение (например, облучения, химиотерапии, курения, пищи с высоким содержанием сахара и жиров, других факторов окружающей среды). Возрастное заболевание или расстройство, или чувствительный к старению признак могут быть связаны с раздражителем, вызывающим старение. Эффективность способа лечения, описанного в данной заявке, может проявляться в уменьшении количества симптомов возрастного заболевания или расстройства, или чувствительного к старению признака, связанных с раздражителем, вызывающим старение, уменьшении интенсивности проявления одного или более симптомов, или в задержке развития возрастного заболевания или расстройства, или признака, связанного с раздражителем, вызывающим старение. Согласно другим конкретным вариантам профилактика возрастного расстройства или признака, связанного с раздражителем, вызывающим старение, относится к профилактике (то есть уменьшения вероятности возникновения) или к задержке начала возрастного расстройства или признака, связанного с раздражителем, вызывающим старение, или повторения одного или более возрастных расстройств или признака, связанного с раздражителем, вызывающим старение. Возрастные заболевания или расстройства включают, например, дисфункцию почек, кифоз, грыжу межпозвоночного диска, слабость, облысение, потерю слуха, потерю остроты зрения (слепоту или ухудшение зрения), мышечную усталость, состояние кожи, невус на коже, диабет, метаболический синдром и саркопению. Потеря зрения относится к отсутствию зрения у ранее зрячего субъекта. Были разработаны различные шкалы для описания степени сохранения зрения и потери зрения, основанные на остроте зрения. Возрастные заболевания или расстройства включают также дерматологические состояния, включающие одно или более следующих состояний: наличие морщин, включая поверхностные тонкие морщинки; гиперпигментацию; шрамы; келоидные рубцы; дерматит; псориаз; экзему (включая себоррейную экзему); розовые угри; витилиго; вульгарный ихтиоз; дерматомиозит и солнечный кератоз.
Слабость была определена как клинически распознаваемое состояние повышенной чувствительности, возникающей от связанного со старением ухудшения резерва и функции многих физиологических систем, которое снижает способность субъекта справляться с каждодневными или критическими факторами, вызывающими стресс. Слабость можно охарактеризовать аномальными энергетическими характеристиками, такими как низкая сила схватывания, низкая энергия, замедленная скорость пробуждения, низкая физическая активность и/или ненамеренная потеря веса. На основании проведенных исследований предположили, что у пациента может быть диагностирована слабость, когда наблюдаются три из пяти указанных выше характеристик (см., например, Fried et al., J. Gerontol. A Biol. Sci. Med, Sci. 2001; 56(3): M146-M156; Xue, Clin. Geriatr. Med. 2011; 27(1): 1-15). Согласно некоторым вариантам старение и заболевания и расстройства, связанные со старением, можно лечить или подвергать профилактике (то есть уменьшению вероятности возникновения) путем введения сенолитического агента. Сенолитический агент может ингибировать старение взрослых стволовых клеток или ингибировать их накопление и гибель или облегчать удаление взрослых стволовых клеток, которые стали стареющими. См., например, публикации Park et al., J. Clin. Invest. 113: 175-79 (2004) и Sousa-Victor, Nature 506: 316-21 (2014), описывающие важность профилактики старения стволовых клеток для поддержания регенеративной способности тканей.
Эффективность сенолитического агента в отношении лечения заболевания и расстройства, ассоциированного со старением, описанного в данной заявке, может быть легко определена специалистом в области медицины и клинических исследований. Один или любая комбинация диагностических методов для конкретной болезни или расстройства, известных специалисту в данной области, включая физическое обследование, самооценку пациента и мониторинг клинических симптомов, проведение аналитических тестов и методов, включая клинические лабораторные тесты, физические тесты и эксплоративную хирургию, могут быть, например, использованы для мониторинга состояния здоровья пациента и эффективности сенолитического агента. Эффективность способов лечения, описанных в данной заявке, может быть проанализирована с применением методов, известных из уровня техники, таких как сравнение симптомов пациентов, страдающих от или рискующих заболеть конкретным заболеванием или расстройством, которые получали фармацевтическую композицию, включающую сенолитический агент, с симптомами тех пациентов, которые не получали сенолитический агент или которые получали плацебо.
Как известно специалисту в области медицины, термины "лечить" и "лечение" относятся к медицинскому консервативному лечению заболевания, расстройства или состояния у субъекта (то есть пациента) (см., например, Stedman's Medical Dictionary). В общем, соответствующие доза и схема лечения обеспечивают введение сенолитического агента в количестве, достаточном для получения терапевтической и/или профилактической пользы. Терапевтическое преимущество для субъектов, которым вводили сенолитический агент, описанный в данной заявке, включает, например, улучшенные клинические результаты, когда целью лечения является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения, связанного с заболеванием, или предотвращение или замедление (уменьшение) возрастания тяжести или уменьшение степени тяжести такого заболевания. Как обсуждалось в данной заявке, эффективность одного или более сенолитических агентов может включать благоприятные или желательные клинические результаты, которые включают, но без ограничения, ослабление выраженности, уменьшение или смягчение симптомов, которые появляются в связи с заболеванием или ассоциированы с заболеванием, подвергающимся лечению; уменьшенную вероятность возникновения симптомов; улучшенное качество жизни; более длительное состояние без заболевания (то есть уменьшение вероятности или распространения симптомов, которые может представить пациент, на основании которых было диагностировано данное заболевание); уменьшение степени серьезности заболевания; стабилизированное (то есть не ухудшающееся) состояние заболевания; задержку или замедление развития заболевания; улучшение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), заметную или незаметную и/или общую выживаемость. Эффективность одного или более сенолитических агентов, описанных в данной заявке, может также означать пролонгированную выживаемость по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если данный субъект не получал сенолитический агент, который селективно уничтожает стареющие клетки.
Введение сенолитического агента, описанного в данной заявке, может увеличить выживаемость по сравнению с ожидаемой выживаемостью, когда субъект не получал лечения. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают тех, у кого уже было указанное заболевание или расстройство, а также субъектов, склонных к развитию этого заболевания или расстройства, или рискующих заболеть этим заболеванием или расстройством, и тех, у которых должна проводиться профилактика этого заболевания или расстройства. Субъект может иметь генетическую предрасположенность к развитию заболевания или расстройства, которое выиграет от удаления стареющих клеток, или может быть в таком возрасте, когда прием сенолитического агента будет давать клиническое преимущество, заключающееся в задержке развития или уменьшения интенсивности заболевания, включая возрастное заболевание или расстройство.
Согласно другому варианту предусмотрен способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, который включает также идентификацию субъекта, который получит пользу от лечения при помощи сенолитического агента, описанного в данной заявке (то есть фенотипическое индивидуализированное лечение). Этот способ включает первую детекцию уровня стареющих клеток в организме субъекта, например, в конкретном органе или ткани субъекта. Биологический образец может быть получен от субъекта, например, образец крови, сыворотки или плазмы, образец, полученный при проведении биопсии, жидкости из организма (например, лаваж легкого, асциты, жидкость от промывания слизистой, синовиальная жидкость, жидкость стекловидного тела, цереброспинальная жидкость (ликвор)), костный мозг, образец лимфатических узлов, кусочек ткани, выращенной вне организма, органная культура или любая другая ткань или клеточный препарат от субъекта. Уровень стареющих клеток может быть определен в соответствии с любым из in vitro анализов или методов, описанных в данной заявке. Например, детекцию стареющих клеток можно осуществить морфологическими методами (например, используя микроскопию); путем продуцирования маркеров старения, таких как ассоциированная со старением β-галактозидаза (SA-β-gal), p16INK4a, p21, PAI-1 или любой один или более факторов SASP (например, IL-6, ММР3). Стареющие клетки и нестареющие клетки биологического образца могут быть также использованы для проведения in vitro клеточного анализа, когда клетки подвергаются воздействию любого из сенолитических агентов, описанных в данной заявке, для определения способности этого агента вызывать гибель стареющих клеток данного субъекта без нежелательной токсичности для нестареющих клеток. В качестве положительного контроля при проведении этих анализов можно применять любой из сенолитических агентов (например, нутлин-3а, RG-7112, АВТ-263, АВТ-737, WEHI-539, А-1155463, MK-2206), описанных в данной заявке. Затем субъект получает соответствующий сенолитический агент, который может быть ингибитором MDM2; ингибитором одного или более членов семейства антиапоптотических белков Bcl-2, который ингибирует по меньшей мере Bcl-xL (например, селективный ингибитор Bcl-xL, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL или Bcl-xL/Bcl-w); или специфическим ингибитором киназы Akt. Кроме того, эти методы могут быть использованы для мониторинга уровня стареющих клеток в организме субъекта до, во время и после лечения сенолитическим агентом. Согласно некоторым вариантам может быть выявлено наличие стареющих клеток (например, путем определения степени экспрессии мРНК маркера стареющих клеток), и соответственно, можно регулировать продолжительность курса лечения и/или периода без лечения.
Субъект, пациент или индивидуум, нуждающийся в лечении при помощи сенолитического агента, описанного в данной заявке, может быть человеком или может быть приматом, не являющимся человеком, или другим животным (например, в ветеринарии), у которого имеются симптомы заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, или кто рискует заболеть заболеванием или расстройством, ассоциированным со старением. Животные, не являющиеся человеком, которых можно лечить, включают млекопитающих, например, приматов (в том числе, мартышек, шимпанзе, горилл и т.п.), грызунов (например, крыс, мышей, карликовых песчанок, хомячков, хорьков, кроликов), зайцеобразных, свиней (например, поросят, миниатюрных свинок), лошадей, собак, кошек, крупный рогатый скот, слонов, медведей и других домашних, сельскохозяйственных животных и животных в зоопарках.
МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ХАРАКТЕРИСТИК И ИДЕНТИФИКАЦИИ СЕНОЛИТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ
Характеристики сенолитического агента могут быть определены с использованием одного или более методов клеточного анализа и одной или более животных моделей, описанных в уровне техники и известных специалисту в данной области. Сенолитический агент представляет собой агент, который селективно уничтожает или разрушает стареющую клетку статистически, клинически или биологически значимым образом. Сенолитический агент может селективно уничтожать один или более видов стареющих клеток (например, стареющие преадипоциты, стареющие эндотелиальные клетки, стареющие фибробласты, стареющие нейроны, стареющие клетки эпителия, стареющие мезенхимальные клетки, стареющие гладкомышечные клетки, стареющие макрофаги или стареющие хондроциты). Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент способен к селективному уничтожению по меньшей мере стареющих фибробластов.
Определение характеристик агента как сенолитического агента можно осуществить с использованием одного или более методов клеточного анализа и одной или более животных моделей, описанных в уровне техники или в данной заявке. Специалисту в данной области хорошо известно, что определение характеристик сенолитического агента и определение степени гибели клеток при помощи этого агента можно осуществить путем сравнения активности испытуемого агента с активностью соответствующих отрицательных контрольных образцов (например, только носителя или разбавителя и/или композиции или соединения, известных из уровня техники, которые не вызывают гибель стареющих клеток) и соответствующих положительных контрольных образцов. In vitro клеточные анализы для определения характеристик сенолитических агентов также включают применение контрольных образцов для определения действия агента на нестареющие клетки (например, покоящиеся клетки или пролиферирующие клетки). Сенолитический агент снижает процент (то есть уменьшает) выживаемости множества стареющих клеток (то есть некоторым образом уменьшает количество жизнеспособных стареющих клеток в организме животного или при проведении клеточного анализа) по сравнению с одним или более отрицательными контрольными образцами. Условия для проведения in vitro анализа включают температуру, применение буферных веществ (включая соли, катионы, среду) и других компонентов, которые сохраняют целостность испытуемого агента и реагентов, используемых для анализа, которые известны специалисту в данной области и/или которые могут быть легко определены.
Источник стареющих клеток для проведения анализа может быть первичной клеточной культурой или адаптированной в культуре клеточной линией, включая, но без ограничения, генетически сконструированные клеточные линии, которые могут содержать хромосомально интегрированные или эписомальные последовательности рекомбинантных нуклеиновых кислот, иммортализованные или способные к иммортализации клеточные линии, гибридные клеточные линии соматических клеток, дифференцированные или способные к дифференцировке клеточные линии, трансформированные клеточные линии и т.п. Согласно конкретному варианту стареющая клетка выделяется из биологического образца, полученного от хозяина или субъекта, который имеет заболевание или расстройство, ассоциированное со старением. Согласно другим вариантам можно использовать нестареющие клетки, которые могут быть получены от субъекта или которые могут быть адаптированной в культуре клеточной линией, и вызывать их старение методами, описанными в данной заявке и в уровне техники, например, путем облучения или действия химиотерапевтического агента (например, доксорубицина). Биологический образец может быть образцом крови, образцом, полученным при проведении биопсии, жидкостями из организма (например, это может быть легочный лаваж, асциты, жидкость после промывки слизистой, синовиальная жидкость), костным мозгом, образцом лимфатических узлов, тканью экспланта, органной культурой или любой другой тканью или клеточным препаратом от субъекта. Образец может представлять собой ткань или клеточный препарат, в которых морфологическая целостность или физическое состояние были нарушены, например, при иссечении, диссоциации, солюбилизации, фракционировании, гомогенизации, биохимической или химической экстракции, пульверизации, лиофилизации, обработке ультразвуком или любым другим образом обработки образца, полученного от субъекта или из биологического источника. Такой субъект может быть человеком или животным.
ink4a
Для определения гибели или удаления стареющих клеток могут быть использованы модели трансгенных животных, описанные в данной заявке или в уровне техники (см., например. Baker et al., supra; Nature, 479: 232-36 (2011); международную заявку № WO/2012/177927; международную заявку № WO 2013/090645). Примеры моделей трансгенных животных содержат трансген, который включает нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает регулируемый клиренс стареющих (например, p16 -положительных стареющих клеток) в качестве положительного контроля. Наличие и количество стареющих клеток у трансгенных животных может быть определено путем измерения содержания детектируемой метки или меток, которые экспрессированы в стареющих клетках животного. Нуклеотидная последовательность трансгенного животного имеет детектируемую метку, например, это может быть один или более красных флуоресцентных белков, зеленый флуоресцентный белок и одна или более люцифераз для детекции клиренса стареющих клеток.
Животные модели, описанные в данной заявке или в уровне техники, включают принятые в области медицины модели для определения эффективности сенолитического агента при лечении и/или профилактике (то есть уменьшении вероятности возникновения) конкретного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, такие как модели атеросклероза, модели остеоартрита, модели ХОБЛ и модели IPF. Как описано в данной заявке, мышиные модели легочного заболевания, такие как модель легочного фиброза, вызванного блеомицином, и модель хронического курения сигарет пригодны для таких заболеваний, как ХОБЛ (COPD) и могут быть использованы на практике специалистом в данной области. Животные модели для определения эффективности сенолитического агента при лечении и/или профилактике (то есть уменьшении вероятности возникновения) побочного эффекта при проведении химиотерапии или радиотерапии или при лечении или профилактике (то есть уменьшении вероятности возникновения) метастазирования описаны в международных заявках №№ WO 2013/090645 и WO 2014/205244, которые полностью включены в данную заявку посредством отсылки. Животные модели для определения эффективности агентов при лечении глазных заболеваний, особенно возрастной макулярной дегенерации также широко используются на практике (см., например, Pennesi et al., Mol. Aspects Med. 33: 487-509 (2012); Zeiss et al., Vet. Pathol. 47: 396-413 (2010); Chavala et al., J. Clin. Invest. 123: 4170-81 (2013)).
Например, но без ограничения, как описано в данной заявке, были созданы животные модели остеоартрита. Остеоартрит может быть индуцирован у животного путем повреждения сустава, например, коленного при хирургическом лечении, частичном или полном, передней крестообразной связки. Животные модели остеоартрита могут быть использованы для оценки эффективности сенолитического агента при лечении и/или профилактике (то есть уменьшении вероятности возникновения) остеоартрита и при уменьшении количества протеогликанов вследствие эрозии, и индуцировании (то есть стимулировании) образования коллагена (такого как коллаген 2 типа), и уменьшении боли у животного, для которого было проведено хирургическое вмешательство при ACL. Может быть осуществлено иммуногистологическое исследование для проверки целостности и состава тканей и клеток в суставе. Можно также использовать иммунохимические методы и/или методы молекулярной биологии, в том числе, анализы для определения содержания воспалительных молекул (например, IL-6) и анализы для определения содержания маркеров старения, как описано выше, с применением методов, описанных в данной заявке, которые могут быть осуществлены специалистом в данной области.
Кроме того, как описано в данной заявке, были созданы животные модели атеросклероза. Атеросклероз может быть индуцирован у животного, например, путем кормления животных пищей с высоким содержанием жиров или путем использования трансгенных животных, которые очень восприимчивы к развитию атеросклероза. Животные модели могут применяться для определения эффективности сенолитического агента при уменьшении количества бляшек или при ингибировании образования бляшек в артерии, пораженной атеросклерозом, при уменьшении содержания липидов в атеросклеротической бляшке (то есть снижения количества липида в бляшке), и при увеличении размера фиброзного утолщения бляшки. Для детекции содержания липида в атеросклеротическом сосуде может быть использовано окрашивание суданом. Иммуногистологические и иммунохимические методы и методы молекулярной биологии (например, для определения содержания воспалительных молекул (например, IL-6) и для определения содержания маркеров старения (как описано выше), могут быть осуществлены, как описано выше и широко используется на практике.
2
Другим примером являются, например, мышиные модели, в которых животных лечат блеомицином, описаны в публикациях Peng et al., PLoS One 2013; 8(4): e59348. doi: 10.1371/joumal.pone.0059348. Epub 2013 Apr 2; Mouratis et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 17: 355-61 (2011)), они используются для определения эффективности агента при лечении ИЛФ (IPF). В случае животных моделей легочного заболевания (например, животной модели с введением блеомицина, животной модели курения или т.п.) можно проводить респираторные измерения для определения эластичности, предрасположенности, статической эластичности и сатурации кислородом периферических капилляров (SpO). Иммуногистологические и иммунохимические методы и методы молекулярной биологии (например, для определения содержания воспалительных молекул (например, IL-6) и для определения содержания маркеров старения, как описано выше), могут быть осуществлены, как описано выше и широко используется на практике.
Определение эффективности сенолитического агента при селективном уничтожении стареющих клеток, как описано в данной заявке на животной модели, можно осуществить с использованием одного или более статистических анализов, с которыми знаком специалист в данной области. Например, методы статистического анализа, в том числе, двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA), может быть использован для определения статистической значимости различия между группами животных, которых лечили испытуемым агентом, и тех, которых не лечили этим агентом (то есть группы отрицательного контроля, которой вводили только носитель и/или несенолитический агент). Статистические пакеты, такие как SPSS, MINITAB, SAS, Statistika, Graphpad, GLIM, Genstat и BMDP, являются легкодоступными и широко используются специалистом в данной области на животных моделях.
Специалисту в данной области известно, что определение характеристик сенолитического агента и определение степени уничтожения стареющих клеток при применении сенолитического агента, можно осуществить путем сравнения активности испытуемого агента с соответствующими отрицательными контрольными образцами (например, только носителем и/или с композицией, агентом или соединением, не вызывающими гибель стареющих клеток) и соответствующими положительными контрольными образцами. In vitro клеточные анализы для определения характеристик указанного агента включают также применение контрольных образцов для определения действия этого агента на нестареющие клетки (например, покоящиеся клетки или пролиферирующие клетки). Подходящий сенолитический агент, который сокращает (то есть снижает) процент выживаемости стареющих клеток (то есть снижает количество жизнеспособных стареющих клеток в организме животного или при проведении клеточного анализа), сравнивается с одним или более отрицательными контрольными образцами. Соответственно, сенолитический агент селективно уничтожает стареющие клетки по сравнению с нестареющими клетками (что можно в данной заявке назвать селективной гибелью стареющих клеток среди нестареющих клеток). Согласно некоторым вариантам (при проведении или in vitro анализа, или in vivo анализа (в случае людей или животных, не являющихся людьми)), по меньшей мере один сенолитический агент уничтожает по меньшей мере 20% стареющих клеток и вызывает гибель не более 5% нестареющих клеток. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент (при проведении или in vitro анализа, или in vivo анализа (в случае людей или животных, не являющихся людьми)), по меньшей мере один сенолитический агент уничтожает по меньшей мере примерно 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65% стареющих клеток и вызывает гибель не более примерно 5% или 10% нестареющих клеток. Согласно другим конкретным вариантам (при проведении или in vitro анализа, или in vivo анализа (в случае людей или животных, не являющихся людьми)), по меньшей мере один сенолитический агент уничтожает по меньшей мере примерно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65% стареющих клеток и вызывает гибель не более примерно 5%, 10% или 15% нестареющих клеток. Согласно другим конкретным вариантам (при проведении или in vitro анализа, или in vivo анализа (в случае людей или животных, не являющихся людьми)), по меньшей мере один сенолитический агент уничтожает по меньшей мере примерно 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65% стареющих клеток и вызывает гибель не более примерно 5%, 10%, 15%, 20% или 25% нестареющих клеток. Согласно другим конкретным вариантам (при проведении или in vitro анализа, или in vivo анализа (в случае людей или животных, не являющихся людьми)), по меньшей мере один сенолитический агент уничтожает по меньшей мере примерно 50%, 55%, 60% или 65% стареющих клеток и вызывает гибель не более примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25% или 30% нестареющих клеток. Другими словами, сенолитический агент характеризуется селективностью, которая по меньшей мере в 5-25, 10-50 или 10-100 (5х - 25х, 10х - 50х или 10х - 100х) превышает селективность уничтожения стареющих клеток по сравнению с нестареющими клетками (например, по меньшей мере в 5х, 10х, 20х, 25х, 30х, 40х. 50х, 60х, 75х, 80х, 90х или 100х раз). В соответствии с конкретными вариантами способов, описанных в данной заявке, для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, доля погибших стареющих клеток может относиться к количеству стареющих клеток, погибших в ткани или в органе, которые включают стареющие клетки, способствуют началу, развитию и/или обострению такого заболевания или расстройства. Например, но без ограничения, ткани головного мозга, ткани и части глаза, легочная ткань, сердечная ткань, артерии, суставы, кожа и мышцы могут включать стареющие клетки, количество которых может уменьшаться, как описано выше, при введении сенолитических агентов, описанных в данной заявке, обеспечивая при этом терапевтический эффект. Более того, селективное удаление по меньшей мере 20% или по меньшей мере 25% стареющих клеток из пораженных ткани или органа может привести к статистически значимому терапевтическому эффекту. Согласно конкретным вариантам, описанным в данной заявке, таким как способ лечения сердечно-сосудистого заболевания или расстройства, ассоциированного с артериосклерозом, таким как атеросклероз, путем введения сенолитического агента (то есть in vivo способам, описанным выше), количество стареющих клеток может относиться к количеству стареющих клеток, погибших в пораженной артерии, содержащей бляшки по сравнению с нестареющими клетками, погибшими в артериальной бляшке. Согласно некоторым конкретным вариантам способов лечения сердечно-сосудистого заболевания такого как атеросклероз, как описано в данной заявке, по меньшей мере один сенолитический агент вызывает гибель по меньшей мере 20% стареющих клеток и вызывает гибель не более 5% нестареющих клеток в артерии. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вызывает гибель по меньшей мере 25% стареющих клеток в артериосклеротической артерии. Согласно другому конкретному варианту способов, описанных в данной заявке, для лечения остеоартрита путем введения сенолитического агента количество стареющих клеток в процентах может относиться к количеству стареющих клеток, погибших в суставе, пораженном остеоартритом в сравнении с нестареющими клетками, погибшими в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно некоторым конкретным вариантам способов лечения остеоартрита, описанных в данной заявке, по меньшей мере один сенолитический агент вызывает гибель по меньшей мере 20% стареющих клеток и гибель не более 5% нестареющих клеток в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент селективно уничтожает по меньшей мере 25% стареющих клеток в суставе, пораженном остеоартритом. Согласно еще одному варианту способов лечения легочного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением (например, ХОБЛ (COPD), ИЛФ (IPF)), путем введения по меньшей мере одного сенолитического агента, количество в процентах погибших стареющих клеток может относиться к количеству стареющих клеток, погибших в пораженной легочной ткани в сравнении с нестареющими клетками, которые погибли в пораженной легочной ткани. Согласно некоторым конкретным вариантам способов лечения легочного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, как описано в данной заявке, сенолитический агент вызывает гибель по меньшей мере 20% стареющих клеток и гибель не более 5% нестареющих клеток в пораженной легочной ткани. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический агент вызывает селективную гибель по меньшей мере 25% стареющих клеток в пораженной легочной ткани.
2
2
Согласно некоторым вариантам данное изобретение предусматривает способы идентификации (то есть скрининга) агентов, которые являются подходящими сенолитическими агентами для лечения или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения) заболевания или расстройства, ассоциированного со старением. Согласно одному из вариантов способ идентификации сенолитического агента для лечения таких заболеваний и расстройств включает индуцирование старения клеток для получения выявленных стареющих клеток. Методы индуцирования старения клеток, описанные в данной заявке и в уровне техники, включают, например, облучение (например, обычно достаточна доза в 10 Гр) или действие химиотерапевтического агента (например, доксорубицина или другого антрациклина). После воздействия такого агента клетки культивируют в течение соответствующего времени и в соответствующих условиях (например, среды, температуры, отношения СО/O, для данного вида клеток или клеточных линий) для осуществления старения. Как обсуждалось в данной заявке, старение клеток можно установить путем определения любого количества характеристик, таких как изменения морфологии (как это, например, показывает микроскопия); продуцирование ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), p16INK4a, р21 и любого одного или нескольких факторов SASP (например, IL-6, ММР3). Затем осуществляют контактирование образца стареющих клеток с агентом-кандидатом (то есть смешивают с ним, соединяют или иным образом осуществляют их взаимодействие). Специалисту в данной области известно, что способ анализа будет включать использование соответствующих контрольных образцов, отрицательных и положительных, или "исторических", или получаемых во время анализа. Например, образец контрольных нестареющих клеток, которые культивировали подобно стареющим клеткам, но не подвергали действию агента, индуцирующего старение, контактирует с агентом-кандидатом. Определяется степень выживаемости стареющих клеток и сравнивается со степенью выживаемости нестареющих клеток. Сенолитический агент идентифицируется, когда степень выживаемости стареющих клеток меньше степени выживаемости нестареющих клеток.
Согласно конкретному варианту описанный выше способ идентификации сенолитического агента может также включать стадии выявления сенолитического агента, пригодного для лечения остеопороза. Этот способ может также включать контактирование идентифицированного сенолитического агента с клетками, способными продуцировать коллаген, и определение количества коллагена, продуцированного этими клетками. Согласно конкретным вариантам клетки представляют собой хондроциты и коллаген является коллагеном типа 2. Этот способ может также включать введение сенолитического агента-кандидата животному, не являющемуся человеком, с повреждениями в суставе, вызванными артритом, и определение одного или более показателей из (а) количества стареющих клеток в суставе; (б) физической функции животного; (в) уровня одного или более маркеров воспаления; (г) гистологии сустава и (д) содержания продуцированного коллагена типа 2, что позволяет оценить терапевтическую эффективность сенолитического агента при сравнении одного или более следующих показателей для животного, подвергшегося лечению, с показателями животного, которого не лечили сенолитическим агентом: (i) степени снижения количества стареющих клеток в суставе пролеченного животного; (ii) улучшенной физической функции пролеченного животного; (iii) степени снижения уровня одного или более маркеров воспаления у пролеченного животного; (iv) степени повышения гистологической нормы в суставе пролеченного животного и (v) степени повышения содержания продуцированного коллагена типа 2 у пролеченного животного. Как описано в данной заявке и в уровне техники, физическую функцию животного можно определить методами оценки чувствительности ноги к индуцированному или естественному остеоартритному состоянию, например, оценки переносимости животным переноса тяжести при пораженной конечности или способности животного передвигаться под действием неприятного раздражителя, такого как тепло или холод. Определение эффективности агента при уничтожении стареющих клеток, как описано в данной заявке, на животной модели можно осуществлять с применением одного или более методов статистического анализа, которые известны специалисту в данной области. Методы статистического анализа, описанные в данной заявке и широко применяемые на практике, можно применять для анализа полученных данных.
Согласно другому конкретному варианту описанный выше способ идентификации сенолитического агента может также включать стадии выявления того, может ли этот сенолитический агент применяться при лечении сердечно-сосудистого заболевания, вызванного или связанного с артериосклерозом. Соответственно, этот способ может также включать введение сенолитического агента-кандидата животному, не являющемуся человеком, в животной модели для определения эффективности агента при уменьшении количества бляшек, при ингибировании образования бляшек в атеросклеротической артерии, при уменьшении содержания липидов в атеросклеротической бляшке (то есть уменьшении, сокращении количества липидов в бляшке) и/или увеличении размера фиброзного утолщения в бляшке. Для обнаружения количества липида в атеросклеротическом сосуде можно использовать окрашивание суданом. Иммуногистологические анализы, анализы для определения содержания воспалительных молекул (например, IL-6) и/или анализы для определения уровня маркеров старения как описано выше, все могут быть проведены в соответствии с методиками, описанными в данной заявке и широко применяемыми на практике. Согласно конкретному варианту методы идентификации сенолитического агента, описанные в данной заявке, могут также включать введение сенолитического агента-кандидата животному, не являющемуся человеком, с атеросклеротическими бляшками и определение одного или более следующих показателей из: (а) количества стареющих клеток в артерии; (б) физической функции животного; (в) уровня одного или более маркеров воспаления; (г) гистологии пораженного(-ых) кровеносного(-ых) сосуда(-ов) (например, артерии); и тем самым определение терапевтической эффективности сенолитического агента, когда у пролеченного животного и у непролеченного сенолитическим агентом животного, которые сравниваются, наблюдаются один или более следующих результатов: (i) уменьшение количества стареющих клеток в артерии у пролеченного животного; (ii) улучшение физической функции у пролеченного животного; (iii) уменьшение уровня одного или более маркеров воспаления у пролеченного животного; (iv) увеличение гистологической нормы в артерии у пролеченного животного. Как описано в данной заявке и в уровне техники, физическую функцию животного можно определить путем измерения физической активности. Методы статистического анализа, описанные в данной заявке и широко применяемые на практике, можно применять для анализа полученных данных.
2
2
Согласно одному из вариантов описанные в данной заявке способы идентификации сенолитического агента могут также включать введение сенолитического агента-кандидата животному, не являющемуся человеком, в животной модели легочного заболевания, такой как модель с применением блеомицина или животная модель курения, и определение одного или более следующих показателей (а) количества стареющих клеток в легком; (б) легочной функции животного; (в) уровня одного или более маркеров воспаления; (г) гистологии легочной ткани, и тем самым определение терапевтической эффективности сенолитического агента, когда у пролеченного животного и у непролеченного сенолитическим агентом животного, которые сравниваются, наблюдаются один или более следующих результатов: (i) уменьшение количества стареющих клеток в легких и в легочной ткани пролеченного животного; (ii) улучшение функции легких у пролеченного животного; (iii) уменьшение уровня одного или более маркеров воспаления у пролеченного животного; и (iv) увеличение гистологической нормы в легочной ткани у пролеченного животного. Можно проводить респираторные измерения для определения эластичности, предрасположенности, статической эластичности и сатурации кислородом периферических капилляров (SpO). Для измерения функции легких можно получать любую из многочисленных характеристик, резервный объем выдоха (ERV), жизненную форсированную емкость легких (FVC), объем форсированного выдоха (FEV) (например, FEV в одну секунду, FEV1), отношение FEV1/FEV, среднюю объемную скорость выдоха на уровне 25-75% от жизненной форсированной емкости легких и максимальную волевую вентиляцию легких (MVV), максимальную скорость выдоха (PEF), объем максимального спокойного выдоха (SVC). Общий объем легких включает полную емкость легких (TLC), жизненную емкость легких (VC), остаточный объем легких (RV) и функциональную остаточную емкость (FRC). Газообмен через альвеолярную капиллярную мембрану может быть измерен с использованием диффузионной емкости монооксида углерода (DLCO). Может быть также измерено насыщение периферических капилляров кислородом (SpO). Методы статистического анализа, описанные в данной заявке и широко применяемые на практике, можно применять для анализа полученных данных.
При проведении in vitro и in vivo анализов (например, на животной модели), описанных в данной заявке, для идентификации и описания сенолитического агента в качестве положительных контрольных соединений можно использовать любой из сенолитических агентов (например, нутлин-3а, RG-7112, ABT-263, ABT-737, WEHI-539, А-1155463, MK-2206), описанных в данной заявке. Условия для проведения in vitro анализа включают температуру, применение буферных веществ (включая соли, катионы. среду) и других компонентов, которые сохраняют целостность испытуемого агента и реагентов, используемых для анализа и которые известны специалисту в данной области и/или которые могут быть легко определены.
Анализы и методики, описанные в данной заявке, можно также применять для проведения токсикологических аналитических методов, методов анализа качества и т.п., которые широко применяются при разработке лекарств и обеспечении качества. В качестве модельных животных для этих методов и целей можно использовать нечеловеческих приматов, собак, грызунов или других животных, подходящих для определения безопасности и эффективности сенолитического агента.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
Данное изобретение предусматривает также фармацевтические композиции, которые содержат сенолитический агент (например, ингибитор MDM2; ингибитор одного или более членов семейства антиапоптотических белков Bcl-2, который ингибирует по меньшей мере Bcl-xL (например селективный ингибитор Bcl-xL, ингибитор Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w, Bcl-2/Bcl-xL или Bcl-xL/Bcl-w) или специфический ингибитор киназы Akt), как описано в данной заявке, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, который может быть также назван фармацевтически подходящим эксципиентом или носителем (то есть нетоксическим веществом, которое не влияет на активность активного ингредиента). Фармацевтическая композиция может быть стерильным водным или неводным раствором, суспензией или эмульсией (например, микроэмульсией). В данной заявке описаны примеры эксципиентов, которые никоим образом не ограничивают изобретение. Эффективное количество или терапевтически эффективное количество относится к количеству одного или более сенолитических агентов, вводимых субъекту или в виде однократной дозы, или в виде части ряда доз, которые эффективны для получения желаемого терапевтического эффекта.
Когда субъекту вводятся два сенолитических агента для лечения заболевания или расстройства, описанного в данной заявке, каждый из сенолитических агентов может входить в состав отдельной фармацевтической композиции. Может быть приготовлен фармацевтический препарат, который содержит каждую из отдельных фармацевтических композиций (которые для удобства можно называть, например, первой фармацевтической композицией и второй фармацевтической композицией, каждая из которых содержит первый и второй сенолитические агенты соответственно). Каждая из фармацевтических композиций в препарате может вводиться в одно и то же время (то есть совместно) и тем же самым путем введения или может вводиться в разное время одним и тем же или разными путями введения. Альтернативно, два или более сенолитических агентов могут входить в одну фармацевтическую композицию.
Согласно другим вариантам субъекту, нуждающемуся в этом, может вводиться комбинация по меньшей мере одного сенолитического агента и по меньшей мере одного ингибитора сигнального пути mTOR, NFκB или PI3-k. Когда при осуществлении способов селективного уничтожения стареющих клеток, описанных в данной заявке, используются вместе по меньшей мере один сенолитический агент и ингибитор одного или более сигнальных путей mTOR, NFκB или PI3-k, каждый из этих агентов может входить в состав одной и той же фармацевтической композиции или в состав отдельных фармацевтических композиций. Может быть приготовлен фармацевтический препарат, который содержит каждую из отдельных фармацевтических композиций, которые для удобства можно называть, например, первой фармацевтической композицией и второй фармацевтической композицией, каждая из которых содержит сенолитический агент и ингибитор одного или более сигнальных путей mTOR, NFκB или PI3-k, соответственно. Каждая из фармацевтических композиций в препарате может вводиться в одно и то же время и тем же самым путем введения или может вводиться в разное время одним и тем же или разными путями введения.
Согласно конкретному варианту субъекту вводится один сенолитический агент и он является единственным (то есть только одним) активным сенолитическим агентом (то есть проводится монотерапия), используемым для лечения состояния или заболевания. Когда сенолитический агент является единственным сенолитическим агентом, применение лекарственных средств для других целей, таких как паллиативные препараты или препараты, которые применяются для комфорта, или препараты для лечения конкретного заболевания или состояния, но не являются сенолитическими агентами, такие как лекарства для снижения содержания холестерина или для смачивания глаз, и другие лекарства, известные специалисту в данной области медицины, не обязательно исключается. Примеры других агентов и лекарственных веществ, которые можно вводить субъектам с легочными болезнями (например, ХОБЛ (COPD)) включают, но без ограничения, бронхорасширяющие средства (например, антихолинергические средства, бета-2 агонисты); препараты для снятия боли, агенты и препараты, которые могут вводиться субъектам с остеоартритом включают гиалуронан, обезболивающие (включая топические препараты) и стероиды. Другие агенты и лекарственные вещества, которые можно вводить субъектам с сердечно-сосудистым заболеванием, включают статины, бета-блокаторы, нитроглицерин и аспирин.
Можно проводить мониторинг состояния здоровья субъектов для определения терапевтической эффективности, используя методы анализов, подходящие для состояния, которое подвергается лечению, известные среднему специалисту в данной области и описанные в данной заявке. Фармакокинетику сенолитического агента (или одного или более его метаболитов), который вводится субъекту, можно отслеживать путем определения содержания сенолитического агента в биологической жидкости, например, в крови, фракции крови (например, в сыворотке), и/или в моче, и/или в другом биологическом образце или в биологической ткани субъекта. Любой метод, применяемый на практике и описанный в данной заявке для детекции такого агента, может быть использован для измерения содержания сенолитического агента во время курса лечения.
Доза сенолитического агента для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со стареющими клетками, может зависеть от состояния субъекта, то есть стадии заболевания, интенсивности симптомов, вызванных этим заболеванием, общего состояния здоровья, а также возраста, пола, веса субъекта и других факторов, очевидных для специалиста в области медицины. Фармацевтические композиции можно вводить способом, подходящим для данного заболевания, подвергающегося лечению, который определяют специалисты в области медицины. В дополнение к факторам, описанным выше в данной заявке, относящимся к применению сенолитического агента для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, можно определять и регулировать продолжительность и частоту введения сенолитического агента при помощи таких факторов, как состояние здоровья пациента, вид и степень серьезности заболевания пациента, конкретная форма активного ингредиента и метод введения. Оптимальные дозы такого агента в общем можно определить, используя экспериментальные модели и/или клинические испытания. Оптимальная доза зависит от массы тела, веса или объема крови субъекта. Обычно предпочтительно применение минимальной дозы, которая достаточна для обеспечения эффективного лечения. Дизайн и схема выполнения доклинических и клинических исследований сенолитического агента (включая его введение для профилактики), описанного в данной заявке, хорошо известны специалисту в данной области. Когда для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, вводятся два или более сенолитических агентов, оптимальные дозы каждого сенолитического агента могут быть различными, такими как дозы, более низкие, чем доза каждого сенолитического агента, вводимого в качестве единственного терапевтического средства. Согласно некоторым конкретным вариантам применение двух сенолитических агентов в комбинации может обеспечить синергический или аддитивный эффект, и каждый агент может применяться в меньшем количестве по сравнению с единственным его введением. Количество сенолитического агента, которое может быть введено в день, может составлять, например, между примерно 0.01 мг/кг и 100 мг/кг (например, между 0.1 и 1 мг/кг, между примерно 1 и 10 мг/кг, между примерно 10 и 50 мг/кг, между примерно 50 и 100 мг/кг веса. Согласно другим вариантам количество сенолитического агента, которое может быть введено в день, может составлять между примерно 0.01 мг/кг и 1000 мг/кг, между примерно 100 и 500 мг/кг или между примерно 500 и 1000 мг/кг веса. Согласно конкретным вариантам общее количество ингибитора MDM2 (например, нутлина-3а), то есть общее количество сенолитического агента, вводимое в течение каждого цикла курса лечения, не превышает 2100 мг/кг; согласно другим вариантам общее количество, вводимое в течение курса лечения, не превышает 1400 мг/кг. Величина оптимальной дозы (в день или во время курса лечения) может быть различной для конкретного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, подвергающегося лечению, и может также отличаться в зависимости от пути введения и схемы лечения.
Фармацевтические композиции, содержащие сенолитический агент, могут готовиться способом, подходящим для метода доставки, обычно применяемым в уровне техники. Композиции могут быть в виде твердых форм (например, таблетки, капсулы), полутвердой формы (например, геля), жидкости или в виде газообразной формы (аэрозоля). Согласно некоторым другим конкретным вариантам сенолитический агент (или фармацевтическая композиция, его содержащая) вводится путем болюсной инфузии. Согласно некоторым вариантам сенолитический агент доставляется путем инфузии, когда сенолитический агент доставляется в орган или ткани, содержащие стареющие клетки, подлежащие уничтожению, через кровеносный сосуд в соответствии с методами, широко применяемыми специалистом в области медицины.
th
st
Фармацевтически приемлемые эксципиенты хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в монографии Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients: A Comprehensive Guide to Uses, Properties, and Safety, 5 Ed., 2006, и в монографии Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, 21 Ed. Mack Pub. Co., Easton, PA (2005)). Примеры фармацевтически приемлемых эксципиентов включают стерильные физиологический раствор и физиологический раствор с фосфатным буфером с физиологическим рН. Фармацевтическая композиция может включать консерванты, стабилизаторы, красители, буферные вещества и т.п. Кроме того, можно использовать антиоксиданты и суспендирующие агенты. В общем, вид эксципиента выбирается на основании метода введения, а также химического состава активного(-ых) ингредиента(-ов). Альтернативно, композиции, описанные в данной заявке, могут быть в виде лиофилизатов. Композиция, описанная в данной заявке, может быть лиофилизирована или получена иначе в виде лиофилизированного продукта при использовании одного или более соответствующих растворов эксципиентов для солюбилизации и/или разбавления агента(-ов), входящих в состав композиции, при введении. Согласно другим вариантам активный агент может быть инкапсулирован в липосомах с использованием технологии, которая известна и применяется на практике. Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент (например, АВТ-263) не вводится в липосомы для применения для стента, который используется для лечения резко, хотя и не полностью, окклюдированных артерий. Фармацевтические композиции могут иметь состав, подходящий для любого способа введения, описанного в данной заявке и в уровне техники.
Фармацевтическая композиция может быть доставлена в организм субъекта, нуждающегося в этом, любым из нескольких способов, известных специалисту в данной области. Например, но без ограничения, композиция может быть доставлена перорально, внутривенно, интраперитонеально, путем инфузии (например, болюсной инфузии), подкожно, энтерально, ректально, интраназально, путем ингаляции, буккально (за щеку), подъязычно, внутримышечно, трансдермально, интрадермально, топически, интраокулярно, интравагинально или интракраниально или с применением комбинации этих способов. Согласно некоторым конкретным вариантам введение дозы, описанной выше, осуществляют внутривенно, интраперитонеально, непосредственно в целевые ткань или орган, или подкожно. Согласно некоторым вариантам метод доставки включает применение стентов, покрытых лекарством или проницаемых стентов, в которых лекарство является сенолитическим агентом. Составы, подходящие для таких способов доставки, описаны более подробно в данной заявке.
Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент (который может быть соединен с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтической композиции) вводится непосредственно в целевую тканы или в целевой орган, содержащие стареющие клетки, которые участвуют в проявлении заболевания или расстройства. Согласно конкретным вариантам при лечении остеоартрита по меньшей мере один сенолитический агент вводится непосредственно в сустав, пораженный остеоартритом (то есть внутрисуставно), субъекту, нуждающемуся в этом. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический(-ие) агент(-ы) вводится (вводятся) в сустав топически, трансдермально, интрадермально или подкожно. Согласно другим конкретным вариантам предусмотрены способы лечения сердечно-сосудистого заболевания или расстройства, ассоциированного с артериосклерозом, например, атеросклерозом, путем введения агента непосредственно в артерию. Согласно другому конкретному варианту сенолитический агент (который может быть соединен с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтической композиции) для лечения легочного заболевания или расстройства, ассоциированного со старением, вводится путем ингаляции, интраназально, путем интубации или, например, в трахеи для обеспечения доставки сенолитического агента непосредственно в пораженную легочную ткань. Например, но без ограничения, сенолитический агент (который может быть соединен с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтической композиции, его содержащей) может быть доставлен в глаз или путем инъекции (например, внутриглазной или интравитреальной (в стекловидное тело)) или путем конъюнктивального нанесения крема, мази, геля или глазных капель под веко. Согласно конкретным вариантам сенолитический агент или фармацевтическая композиция, его содержащая, может быть получена таким образом, чтобы она была формой с пролонгированным высвобождением (называемой также композицией с отсроченным высвобождением, регулируемым высвобождением) или может быть введена путем болюсной инфузии.
Фармацевтическая композиция (например, для перорального введения или для инъекции, инфузии, подкожной доставки, внутримышечной доставки, интраперитонеальной доставки или другого вида доставки) может быть жидкой. Жидкая фармацевтическая композиция может включать, например, один или более следующих ингредиентов: стерильный разбавитель, такой как вода, раствор хлорида натрия, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия, нелетучие масла, которые могут служить растворителем или суспендирующей средой, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты; антиокислители; хелатирующие агенты; буферные вещества и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральная композиция может быть помещена в ампулы, шприцы одноразового применения или флаконы с многократными дозами, изготовленные из стекла или пластика. Предпочтительно применение физиологического раствора, и фармацевтическая композиция для инъекций предпочтительно является стерильной. Согласно другому варианту для лечения глазного состояния или заболевания жидкую фармацевтическую композицию вводят в глаз в виде глазных капель. Жидкую фармацевтическую композицию можно вводить перорально.
В случае оральных составов по меньшей мере один сенолитический агент из описанных в данной заявке, может применяться в отдельности или в комбинации с соответствующими добавками для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул и, если это желательно, в сочетании с разбавителями, буферными агентами, увлажняющими агентами, консервантами, красителями и ароматизирующими агентами. Соединения могут быть соединены с буферным агентом для обеспечения защиты этого соединения от низкого рН в желудочной жидкости и/или может применяться энтеропокрытие. Фармацевтическая композиция, содержащая сенолитический агент, может быть изготовлена для пероральной доставки вместе с ароматизирующим агентом, например, это могут быть жидкая, твердая или полутвердая формы и/или форма с энтеропокрытием.
Фармацевтическая композиция, содержащая любой из сенолитических агентов, описанных в данной заявке, может быть формой с пролонгированным высвобождением (называемым также отсроченным или регулируемым высвобождением). Такие композиции вообще могут быть приготовлены по хорошо известной технологии и могут вводиться, например, путем пероральной, ректальной, интрадермальной или подкожной доставки или путем доставки в целевой участок. Составы с пролонгированным высвобождением могут содержать соединение, диспергированное в носителе и/или могут содержаться в резервуаре, окруженном мембраной, регулирующей скорость высвобождения. Эксципиенты для таких составов являются биосовместимыми и могут также быть биоразлагаемыми; такой состав предпочтительно обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения активного компонента. Количество активного агента, содержащегося в составе с пролонгированным высвобождением, зависит от места введения, скорости и ожидаемого периода высвобождения, а также от природы состояния, заболевания или расстройства, которые подвергаются лечению или профилактике.
Согласно некоторым вариантам фармацевтические композиции, содержащие сенолитический агент, готовятся для трансдермального, интрадермального или топического введения. Композиции можно вводить при помощи шприца, повязки, трансдермального пластыря, вкладки или шприцевилного аппликатора, например, для введения порошка/талька или другого твердого, жидкого вещества, спрея, аэрозоля, мази, пены, крема, геля, пасты. Предпочтительной является форма состава с регулируемым высвобождением или состава с пролонгированным высвобождением, которая вводится топическим путем или путем инъекции непосредственно в участок кожи, расположенный вблизи области, подвергающейся лечению (интрадермально или подкожно). Активные составы можно также доставлять при помощи ионофореза. Для предотвращения роста грибов и других микроорганизмов можно использовать консерванты. Подходящие консерванты, включают, но без ограничения, бензойную кислоту, бутилпарабен, этилпарабен, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия, пропионат натрия, бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, бензиловый спирт, цетилпиридинийхлорид, хлорбутанол, фенол, фенетиловый спирт, тимеросал и их комбинации.
Для топического применения фармацевтические композиции, содержащие сенолитический агент, готовятся в виде эмульсий. Эмульсия может содержать одну жидкость, распределенную в среде другой жидкости. Могут быть эмульсии масло-в воде или вода-в-масле. Или водная, или масляная фазы, или обе фазы могут содержать одно или более поверхностно-активных веществ, эмульгаторов, стабилизаторов эмульсии, буферных веществ и других эксципиентов. Масляная фаза может содержать другие масляные фармацевтически одобренные эксципиенты. Походящие поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения, анионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, катионные поверхностно-активные вещества и амфотерные поверхностно-активные вещества. Композиции для топического нанесения могут также включать по меньшей мере один суспендирующий агент, антиоксидант, хелатирующий агент, мягчитель или увлажнитель.
Мази и кремы могут быть, например, получены на водной или маслянистой основе с добавлением подходящего загустителя и/или гелеобразующих агентов. Лосьоны получают на водной или маслянистой основе, и они в общем также содержат один или более эмульгирующих агентов, стабилизирующих агентов, диспергирующих агентов, суспендирующих агентов, загустителей и ли красителей. Жидкие спреи могут быть доставлены из выдерживающих давление упаковок, например, через специальное отверстие. Эмульсии масло-в воде можно также использовать в композициях, для пластырей, повязок и изделий. Эти системы являются полутвердыми эмульсиями, микроэмульсиями или вспененными эмульсионными системами.
Согласно некоторым вариантам сенолитический(-ые) агент(-ы) может (могут) быть введены в масляные основы или мази с получением полутвердой композиции желательной формы. Кроме сенолитического агента эти полутвердые композиции могут содержать растворенные и/или суспендированные бактерицидные агенты, консерванты и/или буферные системы. Петролатум, который тоже может быть включен, представляет собой любой парафин с вязкостью от вязкости минерального масла, которое включает изобутилен (должно быть полиизобутилен), коллоидный диоксид кремния или соли стеаратов, до вязкости парафиновых восков. В маслянистой системе может быть использована абсорбирующая мазевая основа. Добавки могут включать холестерин, ланолин (производные ланолина, пчелиный воск, алифатические спирты, шерстяной воск, эмульгаторы с низким HLB (гидрофильно-липофильным балансом) и различные ионные и неионные поверхностно-активные вещества, в отдельности или в комбинации.
Трансдермальные или топические составы с регулируемым или пролонгированным высвобождением могут быть получены при добавлении добавок, обеспечивающих пролонгированное высвобождение, таких как полимерные структуры, матрицы, которые доступны. Например, композиции могут вводиться при помощи изделий, полученных экструзией горячего расплава, таких как биоадгезивные пленки, полученные экструзией горячего расплава. Этот состав может включать сшитый состав, содержащий полимерную карбоновую кислоту. Сшивающий агент может содержаться в количестве, которое обеспечивает адекватную адгезию, чтобы система оставалась прикрепленной к поверхности целевых эпителиальных или эндотелиальных клеток в течении времени, достаточного для обеспечения желательного высвобождения соединения.
Вставка, трансдермальный пластырь, повязка или изделие могут включать смесь полимеров или покрытие на основе смеси полимеров, которые обеспечивают высвобождение активных агентов с постоянной скоростью в течение длительного периода времени. Согласно некоторым вариантам изделие, трансдермальный пластырь, вставка включает водорастворимые порообразующие агенты, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ, PEG), которые могут быть смешаны с не растворимыми в воде полимерами для увеличения длительности службы вставки и для пролонгирования высвобождения активных ингредиентов.
Трансдермальные приспособления (вставки, пластыри, повязки) могут также включать не растворимый в воде полимер. Полимеры, регулирующие скорость высвобождения, могут быть полезными для введения в сайты (участки), где изменения величины рН могут быть использованы для влияния на процесс высвобождения. Эти полимеры, регулирующие скорость высвобождения, могут вводиться с использованием непрерывной покрывной пленки во время разбрызгивания и сушки с активным соединением. Согласно одному из вариантов покрытие применяется для нанесения на гранулы, содержащие активные ингредиенты и полученные при сжатии для образования твердой биоразлагаемой вставки.
Полимерный состав может быть также использован для обеспечения регулируемого или пролонгированного высвобождения. Могут применяться биоадгезивные полимеры, известные из уровня техники. Например, гель с пролонгированным высвобождением и активное соединение могут быть введены в полимерную матрицу, например, в матрицу из гидрофобного полимера. Примеры полимерной матрицы включают микрочастицу. Микрочастицы могут быть микросферами, и ядро может быть выполнено из материала, который отличается от полимера оболочки. Альтернативно, полимер можно получить методом полива в виде тонкой пластинки или пленки, порошка, полученного размалыванием или другим стандартным методом или в виде геля, такого как гидрогель. Полимер может находиться в виде покрытия или части повязки, стента, катетера, сосудистого трансплантата или другого приспособления для облегчения доставки сенолитического агента. Матрицы могут быть сформованы при выпаривании растворителя, в процессе сушки распылением, экстракции растворителем и другими методами, известными специалистам.
Согласно некоторым вариантам способа лечения сердечно-сосудистого заболевания, ассоциированного с или вызванного атеросклерозом, описанного в данной заявке, один или более сенолитических агентов могут быть доставлены непосредственно в кровеносный сосуд (например, артерию) при помощи стента. Согласно конкретному варианту стент используется для доставки сенолитического агента в кровеносный сосуд (например, артерию), пораженный атеросклерозом. Обычно стент представляет собой трубчатое металлическое устройство, которое включает тонкий металлический похожий на сетку каркас, который вставлен в сжатой форме и затем расширяется в целевом месте. Стенты предназначены для обеспечения длительного удерживания расширенного сосуда. Известны несколько способов изготовления покрытого лекарством стента или стента с внедренным в него лекарством. Например, сенолитический агент может быть введен в полимерные слои, нанесенные на стент. Может быть использован один вид полимера, и один или более слоев полимера, проницаемого для сенолитического агента, могут быть нанесены на металлический стент с получением стента, покрытого сенолитическим агентом. Сенолитический агент может быть также введен в поры самого металлического стента, который можно также назвать стентом, проницаемым для сенолитического агента или стентом с внедренным в него лекарством. Согласно некоторым конкретным вариантам сенолитический агент может быть введен в липосомы и нанесен на стент, согласно другим конкретным вариантам, например, когда сенолитический агент представляет собой АВТ-263, этот АВТ-263 не вводится в липосомы. Помещение стента в артерию, пораженную атеросклерозом, производится специалистом в области медицины. Стент, покрытый сенолитическим агентом, или стент с внедренным в него лекарством не только расширяет пораженный кровеносный сосуд (например, артерию), но также может быть эффективным для обеспечения одного или нескольких явлений: (1) снижения количества атеросклеротических бляшек, (2) ингибирования образования таких бляшек и (3) повышения стабильности бляшек (например, за счет уменьшения содержания липидов в бляшке и/или увеличения толщины фиброзного утолщения), особенно в отношении бляшки, проксимальной к стенту, покрытому агентом, или стенту с внедренным в него лекарством.
Согласно одному конкретному варианту сенолитический агент, вводимый субъекту, имеющему офтальмологическое заболевание или расстройство, ассоциированное со старением, может быть доставлен интраокулярно или интравитреально. Согласно другим конкретным вариантам сенолитический(-ие) агент(-ы) может быть введен (введены) в глаз в конъюнктивальный мешок путем нанесения сенолитического агента на мукозную мембрану и ткани глазных век, нижнего или верхнего, или обоих век. Любой из этих методов нанесения может представлять собой болюсную инфузию. Согласно другим конкретным вариантам может быть получена фармацевтическая композиция, содержащая любой из сенолитических агентов, описанных в данной заявке, обеспечивающая пролонгированное или замедленное высвобождение (которое может также называться отсроченным или регулируемым высвобождением), такие составы описаны в данной заявке более подробно. Согласно некоторым вариантам предусмотрены способы лечения или профилактики (то есть уменьшения вероятности возникновения; задержки начала или развития, или ингибирования, торможения, замедления или затруднения развития или степени серьезности) глазного заболевания, расстройства или состояния (например, старческой дальнозоркости, катаракт, макулярной дегенерации) для селективного уничтожения стареющих клеток в глазах субъекта и/или индуцирования образования коллагена (такого как коллаген 2 типа) в глазах субъекта, нуждающегося в этом, путем введения по меньшей мере одного сенолитического агента (который может быть соединен с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым эксципиентом с получением фармацевтической композиции) непосредственно в глаз.
В случае фармацевтических композиций, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты, нуклеиновая кислота может находиться в любой из различных систем доставки, известных среднему специалисту в данной области, включая нуклеиновую кислоту и бактериальные, вирусные экспрессионные системы и системы экспрессии млекопитающих, такие как, например, рекомбинантные экспрессионные конструкции, предусмотренные данным изобретением. Методы внедрения ДНК в экспрессионные системы хорошо известны среднему специалисту в данной области. ДНК может также быть "оголенной", как описано, например, в публикации Ulmer et al., Science 259: 1745-49, 1993 и в обзоре Cohen, Science 259: 1691-92, 1993. Поглощение оголенной ДНК может быть усилено путем нанесения ДНК на биоразлагаемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть доставлены в клетку методами, описанными в уровне техники (см., например, Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2: 139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16: 129-40 (1999); Hofland et al., Handb. Exp. Pharmacol. 137: 165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752: 184-92 (2000); патент США №6,395,713; международную заявку № WO 94/02595); Selbo et al., Int. J. Cancer 87: 853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23: 103-12 (2002); опубликованные заявки США на патент №№2001/0007666 и 2003/077829).
Предусмотрены также наборы со стандартными дозами одного или более сенолитических агентов, описанных в данной заявке, обычно эти дозы вводят перорально или путем инъекции. Такие наборы могут включать контейнер, содержащий стандартную дозу, информационный вкладыш, описывающий применение и преимущества лекарств для лечения заболевания, ассоциированного со стареющими клетками, и необязательно приспособление или прибор для доставки композиции.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
IN VITRO КЛЕТОЧНЫЕ АНАЛИЗЫ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НУТЛИНА-3А
Фибробласты крайней плоти линий НСА2 и BJ, легочные фибробласты линии IMR90 и мышиные эмбриональные фибробласты засевали в шестилуночные планшеты и индуцировали их старение под воздействием ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр или обработкой доксорубицином (Doxo) в течение 24 часов. Фенотип старения формировали в течение по меньшей мере 7 дней, после чего проводили подсчет клеток, чтобы определить исходное количество клеток. Затем начинали обработку нутлином-3а, которую проводили по меньшей мере в течение 9 дней. Одну среду или среду с лекарственным средством, в зависимости от конкретного случая, обновляли по меньшей мере через каждые три дня. По окончании времени анализа клетки считали. Для каждого условия клетки засевали в три лунки планшета и считали независимо. Начальное (исходное) число клеток служит в качестве контроля для определения индукции старения по сравнению с числом клеток в последний день без обработки нутлином. Начальное число нестареющих клеток служит в качестве показателя для определения токсичности нутлина-3а. На Фигуре 1 схематически показан дизайн эксперимента.
ый
Фибробласты крайней плоти линий НСА2 и BJ, легочные фибробласты линии IMR90 и мышиные эмбриональные фибробласты подвергали воздействию ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр с целью индуцировать их старение. Через 7 дней после облучения клетки обрабатывали нутлином-3 в различных концентрациях (0, 2.5 мкМ и 10 мкМ) в течение 9 дней, обновляя лекарственное средство через каждые 3 дня. Процент выживаемости (клеток) рассчитывали как [число клеток на 9 день обработки нутлином-3а/исходное число клеток на первый день обработки нутлином-3а]. Результаты, показанные на Фигурах 2A-D, говорят о том, что нутлин-3а снижал жизнестойкость стареющих фибробластов крайней плоти (НСА2 и BJ), легочных фибробластов (IMR90) и мышиных эмбриональных фибробластов (MEF), это значит, что нутлин-3а является сенолитическим агентом.
Фибробласты крайней плоти (НСА2) и стареющие эндотелиальные клетки аорты (Endo Aort) обрабатывали доксорубицином (250 нМ) в течение одного дня (24 часа), чтобы индуцировать старение (см. Фигуру 1). Через восемь дней после обработки доксорубицином начинали обработку нутлином-3а. Клетки НСА2 экспонировали с нутлином-3а в течение 9 дней, а эндотелиальные клетки аорты экспонировали с нутлином-3а в течение 11 дней. Среду, содержащую соединение, или контрольную среду меняли по меньшей мере через каждые 3 дня. Процент выживаемости рассчитывали как [число клеток в последний день обработки нутлином-3а/исходное число клеток на первый день обработки нутлином-3а]. Результаты, показанные на Фигурах 3А-В, говорят о том, что индуцированные доксорубицином стареющие клетки чувствительны к нутлину-3а.
Нестареющие фибробласты крайней плоти (НСА2), легочные фибробласты (IMR90) и мышиные эмбриональные фибробласты (МЕF) обрабатывали нутлином-3а в различных концентрациях (0, 2.5 мкМ и 10 мкМ) в течение 9 дней с целью определения токсичности нутлина-3а. Число клеток считали в начале (NS нач.) и в конце обработки нутлином-3а. Разница между числом клеток, не обработанных нутлином-3а, на 9 день (NS 0) и числом клеток, определенным в день 0 (NS нач.), отражает рост клеток в течение указанного периода времени. Результаты, показанные на Фигурах 4А-С, говорят о том, что обработка нутлином-3а снижает пролиферацию, но является нетоксичной в отношении нестареющих клеток. Обработка нутлином-3а не уменьшала число клеток ниже начального уровня, что указывает на отсутствие токсичности. Снижение наблюдаемой выживаемости от NS 0 до NS 2.5 и от NS 0 до NS 10 отражает снижение роста клеток. Не связывая себя с какой-либо теорией, можно сказать, что нутлин-3а может стабилизировать р53, приводящий к блокировке роста в клеточном цикле.
Нестареющие эндотелиальные клетки аорты (Endo Aort) и преадипоциты (Pread) также обрабатывали нутлином-3а в различных концентрациях (0, 2.5 мкМ и 10 мкМ) в течение 11 дней для оценки токсичности нутлина-3а, как описано выше. Клетки считали в начале в день 0 (NS нач.) и в конце обработки нутлином-3а (NS 0). Разница между числом клеток, не обработанных нутлином-3а, на 11 день (NS 0) и числом клеток вначале (NS нач.) отражает рост клеток в течение указанного периода времени. Результаты, показанные на Фигурах 5А-В, говорят о том, что обработка нутлином-3а не уменьшает число клеток ниже начального уровня, это указывает на отсутствие токсичности. Снижение наблюдаемой выживаемости от NS 0 до NS 2.5 и от NS 0 до NS 10 отражает снижение роста клеток.
ПРИМЕР 2
ЛЕЧЕНИЕ НУТЛИНОМ-3А P16-3MR ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ
Ink4a
Ink4a
ARF
ARF
Ink4a
Ink4a
Ink4a
Способность нутлина-3а удалять стареющие клетки in vivo определяли на трансгенных р16-3MR мышах (см., например, опубликованную Международную заявку № WO 2013/090645). Схематически протокол эксперимента представлен на Фигуре 6. Трансгенная мышь содержит промотор p16, функционально связанный с тримодальным слитым (химерным, гибридным) белком, для детекции стареющих клеток и для селективного удаления стареющих клеток у этих трансгенных мышей, что показано на Фигуре 7. Промотор p16, который является транскрипционно активным в стареющих клетках, но не в нестареющих клетках (см., например, Wang et al., J. Biol. Chem. 276: 48655-61 (2001); Baker et al., Nature 479: 232-36 (2011)), был введен методами генной инженерии (рекомбинантной ДНК) в конструкцию нуклеиновой кислоты. 3MR (репортерный тримодальный белок) представляет собой слитый белок, содержащий функциональные домены синтетической люциферазы (LUC) Renilla, мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) и процессированной (усеченной) тимидинкиназы (tTK) вируса простого герпеса (HSV)-1, который предусматривает киллинг с использованием ганцикловира (GCV) (см., например. Ray et al., Cancer Res. 64: 1323-30 (2004)). кДНК 3MR встраивали в рамке считывания с р16 в экзон 2, создавая слитый белок, содержащий первые 62 аминокислоты белка р16, но не включающий полноразмерный белок р16 дикого типа. Результатом инсерции (включения) кДНК 3MR явилось также присутствие стоп-кодона в рамке считывания p19 в экзоне 2, тем самым также предупреждается экспрессия полноразмерного белка p19 при использовании ВАС. Промотор гена p16 (примерно 100 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.)) вводили 5' нуклеотидной последовательности, кодирующей тримодальный репортерный слитый белок. Или же можно использовать промотор процессированного p16 (см., например, Baker et al., Nature, supra; опубликованную Международную патентную заявку WO 2012/177927; Wang et al., supra). Итак, экспрессия 3MR в стареющих клетках обусловлена только промотором p16. Детектируемые маркеры, LUC и mRFP, предоставляют возможность детектировать стареющие клетки с помощью биолюминесценции и флуоресценции, соответственно. Экспрессия tTK обеспечила селективный цитолиз (киллинг, гибель) стареющих клеток посредством экспозиции с пролекарством ганцикловиром (GCV), который(-ое) превращается в цитотоксическую частицу с помощью tTK. Получали трансгенных животных-основателей с генетическим фоном С57 В16, и проводили их бридинг известными методами с целью введения трансгенов в животных (см., например. Baker et al., Nature 479:232-36 (2011)).
Самок мышей C57/BL6 p16-3MR произвольно делили (рандомизировали) на группы, которые получали доксорубицин + нутлин-3а или только доксорубицин (см. Фигуру 6). Старение инициировали посредством интраперитонеального введения мышам доксорубицина в дозе 10 мг/кг за десять дней до введения нутлина-3а (День - 10). Нутлин-3а (25 мг/кг) вводили интраперитонеально ежедневно начиная с дня 10 до дня 24 после обработки доксорубицином (Группа = 9 мышей). Контрольным мышам (обработанным доксорубицином) вводили инъекции равных объемов PBS (Группа = 3 мыши). Люминесцентную визуализацию (система Xenogen Imaging) осуществляли в День 0 (т.е. через 10 дней после обработки доксорубицином) в качестве базовой (исходной) для каждой мыши (интенсивность 100%).
Люминесцентную визуализацию мышей проводили на 7, 14, 21, 28 и 35 день после начала обработки нутлином - 3. Уменьшение (выхода) люминесценции (L) рассчитывали как: L=(Визуализация после обработки нутлином-3а)/(Исходная визуализация)%. Если L больше или равно 100%, то число стареющих клеток не уменьшилось. Если L меньше 100%, тогда число стареющих клеток уменьшилось. Расчет для каждой мыши делали независимо и из показателя для каждого образца - вычитали фон. Результаты, представленные на Фигуре 8, говорят о том, что обработка нутлином-3а уменьшала (снижала) люминесценцию, ассоциированную со старением, вызванным доксорубицином. Статистически значимое уменьшение люминесценции наблюдали на 14 день, на 28 день и на 35 день у мышей, обработанных нутлином-3а.
Проводили эксперименты по определению влияния обработки нутлином-3а на экспрессию генов, ассоциированных со старением. Группу самок C57/BL6 p16-3MR обрабатывали, как описано выше. Через три недели после окончания обработки нутлином-3а (35 день) мышей, обработанных доксорубицином (контрольных) (N=3), и мышей, обработанных доксорубицином + нутлином-3а (N=6), умерщвляли. Биоптаты кожи и жировой ткани брали для извлечения РНК; биоптаты жировой ткани брали для обнаружения ассоциированной со старением β-галактозидазы; а легкие быстро замораживали в криопротекторной ОСТ среде для приготовления срезов в криостате.
INK4a
РНК анализировали, определяя уровни мРНК эндогенных маркеров старения (р21, p16 (p16) и р53) и SASP факторов (mmp-3 и IL-6) по сравнению с мРНК актина (контроль для количества кДНК), используя Универсальную библиотеку зондов Roche для ПЦР (PCR) анализа в реальном времени. Результаты, представленные на Фигурах 9А-Е, говорят о том, что обработка нутлином-3а снижала экспрессию факторов SASP и маркеров старения, ассоциированных со старением, вызванным доксорубицином. Указанные значения представляют собой кратность индукции соответствующей мРНК по сравнению с необработанными контрольными мышами.
Из замороженной легочной ткани делали срезы толщиной 10 мкМ и окрашивали первичным кроличьим поликлональным антителом к γН2АХ (Novus Biologicals, LLC), которое является маркером двухнитевых разрывов в клетках (повреждения ДНК). Затем срезы окрашивали вторичным козьим антителом к кроличьему иммуноглобулину, окрашенным красителем ALEXA FLUOR (Life Technologies) и контрастно окрашенным 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Life Technologies). Число положительных клеток считали с использованием программы обработки данных визуализации ImageJ (National Institutes of Health (Национальные институты здоровья, см. Internet at imagej.nih.gov/ij/index.html) и выражали в процентах от общего числа клеток. Результаты, представленные на Фигурах 10А-В, показывают, что обработка нутлином-3A снижала число клеток с повреждением ДНК, индуцированным доксорубицином. На Фигуре 10А показано более слабое γН2АХ окрашивание клеток, обработанных доксорубицином + нутлином-3а, по сравнению с клетками, обработанными одним доксорубицином. На Фигуре 10В показано снижение процентного содержания γН2АХ-положительных клеток в клетках, обработанных доксорубицином + нутлином-3а, по сравнению с клетками, обработанными одним доксорубицином.
После проведения биопсии биоптаты сразу же фиксировали в 4% формалине, а затем окрашивали раствором, содержащим X-gal, для обнаружения присутствия ассоциированной со старением β-галактозидазы (β-gal). Биоптаты жировой ткани инкубировали в течение ночи при 37°С в растворе X-gal и фотографировали на следующий день. Биоптаты жировой ткани необработанных животных использовали в качестве отрицательного контроля (CTRL). Результаты, представленные на Фигуре 11, показывают, что обработка нутлином-3а снижала интенсивность ассоциированной со старением β-gal в биоптатах жировой ткани животных с индуцированным доксорубицином старением аналогично биоптатам жировой ткани необработанных контрольных (отрицательных) животных по сравнению с мышами, обработанными одним лишь доксорубицином.
ПРИМЕР 3
ИНГИБИТОР MDM2 УДАЛЯЕТ СТАРЕЮЩИЕ КЛЕТКИ С ВЕРИФИЦИРОВАННЫМ (УСТАНОВЛЕННЫМ) SASP (ФЕНОТИПОМ, АССОЦИИРОВАННЫМ СО СТАРЕНИЕМ)
Старение первичных человеческих фибробластов (IMR90) индуцировали воздействием ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр. Через семь дней после облучения (День 0) клетки обрабатывали нутлином-3а (10 мкМ) или носителем (DMSO) в течение девяти дней (День 9). Лекарство или носитель обновляли (заменяли) каждые три дня. Лекарство/носитель удаляли на 9 День и клетки культивировали еще в течение трех дней (День 12). Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали иммунофлуоресценцией с использованием специфического антитела к IL-6 (R&D, AF-206-NA). Клетки контрастно окрашивали красителем DAPI для ядерной визуализации. Процентное содержание IL-6-положительных клеток представлено на Фигуре 12А. Пример иммунофлуоресценции IL-6-положительных клеток представлен на Фигуре 12В. IL-6 положительные клетки определяли объективным методом, используя программу CellProfiler. Оценивали три различные культуры. Нестареющие клетки не содержали детектируемых IL-6 положительных клеток, тогда как стареющие клетки были примерно на 8% положительными на 9 день после обработки носителем (DMSO) (через 16 дней после облучения). Обработка нутлином-3а снижала процентное содержание IL-6 положительных клеток до уровня ниже 5%. На 12 день, через 3 дня после удаления нутлина-3а и через 19 дней после облучения, содержание IL-6 положительных клеток в контрольной культуре в носителе составляло примерно 9%, а клетки, обработанные нутлином-3а, были положительны к IL-6 менее чем на 1%.
В другом эксперименте старение клеток IMR90 вызывали воздействием излучения (10 Гр). Через семь дней после облучения клетки обрабатывали нутлином-3а (10 мкМ) или носителем (DMSO) в течение девяти дней (День 9). Лекарство или носитель обновляли через каждые три дня. Лекарство/носитель удаляли на 9 День и клетки культивировали еще в течение шести дней. Кондиционированную среду обработанных клеток собирали и проводили количественное определение IL-6 методом ELISA (Perkin Elmer, AL223F). Уровни IL-6 в культуральной среде определяли методом ELISA, используя набор в соответствии с инструкциями производителя (AL223F, Perkin Elmer). Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали иммунофлуоресценцией с использованием специфического антитела к IL-6 (R&D, AF-206-NA). Уровень IL-6, определенный методом ELISA, нормализовали по числу клеток в каждой лунке. Результаты представлены на Фигуре 22С в виде относительного уровня IL-6 в обработанных клетках по сравнению с уровнем в нестареющих клетках (NS). Результаты представлены как среднее для трех различных клеточных образцов.
Уровень IL-6 в стареющих клетках был примерно в 10-40 раз выше уровня IL-6 в нестареющих клетках. Уровень IL-6 в обработанных нутлином-3а стареющих клетках в 5-9 раз выше, чем в клетках, обработанных DMSO. В клетках, выжившие после обработки нутлином-3а, наблюдается более низкая секреция IL-6 и, с помощью экстраполяции, менее выраженный SASP, это говорит о том, что нутлин-3а, предпочтительно, убивает стареющие клетки с точно установленным SASP.
ПРИМЕР 4
ИНГИБИТОР MDM2 УДАЛЯЕТ СТАРЕЮЩИЕ КЛЕТКИ С УСТАНОВЛЕННЫМ SASP: ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА SASP
Старение первичных человеческих фибробластов (IMR90) индуцировали воздействием ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр. Через семь дней после облучения (День 0) клетки обрабатывали нутлином-3а (10 мкМ) или носителем (DMSO) в течение девяти дней (День 9). Лекарство или носитель обновляли (заменяли) каждые три дня. Лекарство/носитель удаляли на 9 День и клетки культивировали еще в течение трех дней (День 12) в среде без лекарства или DMSO. Затем клетки собирали, экстрагировали (извлекали) мРНК и готовили кДНК. Затем осуществляли количественную PCR (ПЦР) (qPCR) с целью обнаружения экспрессии различных генов. Клетки также собирали на 12 День после того, как лекарство/носитель удаляли в течение трех дней. Результаты представлены как среднее для трех образцов. Данные нормализовали по актину и изображали в виде отношения к нестареющим клеткам. Результаты представлены на Фигурах 13A-13F.
Уровень р21 был примерно в 10 раз выше в стареющих клетках и был еще выше (примерно, в 90 раз), когда клетки были обработаны нутлином-3а. Нутлин-3а стабилизирует р53, а р53 представляет собой фактор транскрипции, активирующий экспрессию ингибитора циклин-зависимой киназы р21. На 12 день уровень р21 в DMSO-обработанных клетках был сравним с уровнем на 9 день, который был также сравним с уровнем в клетках, обработанных нутлином-3а на 12 день. Эти результаты означают, что острое (сильное, мгновенное) воздействие нутлина-3а на клетки прекращается после прекращения экспозиции с лекарством. Уровень Р16, другого маркера старения, повышался в облученных клетках и не изменялся в присутствии нутлина-3а. Через три дня после удаления лекарства (12 День) наблюдалось снижение уровня р16. Уровень IL-1а, регулятора SASP, снижался только после удаления нутлина-3а. CXCL-1, IL-6 и IL-8 представляют собой три другие фактора SASP. Уровни всех трех факторов были пониженными в присутствии нутлина-3а и оставались низкими после удаления лекарства. Эти результаты говорят о пониженном уровне р16 в клетках, переживших обработку нутлином-3а, это дает основание предположить, что нутлин-3а, предпочтительно, убивает клетки, в которых высок уровень экспрессии р16. Аналогично, факторы SASP были понижены в выживших клетках, что также дает основание предположить, что нутлин-3а, предпочтительно, убивает клетки с повышенным (сильнее выраженным) SASP.
ПРИМЕР 5
ИНГИБИТОР MDM2 УДАЛЯЕТ СТАРЕЮЩИЕ КЛЕТКИ С ПОВЫШЕННОЙ РЕАКЦИЕЙ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК
Старение первичных человеческих фибробластов (IMR90) индуцировали воздействием излучения с поглощенной дозой 10 Гр. Через семь дней после облучения (День 0) клетки обрабатывали нутлином-3а (10 мкМ) или носителем (DMSO) в течение девяти дней (День 9). Лекарство или носитель обновляли (заменяли) каждые три дня. Лекарство/носитель удаляли на 9 День и клетки культивировали еще в течение шести дней в среде без лекарства или DMSO, заменяя среду каждые три дня. Клетки собирали в День 0 (нестареющие клетки), на 9 День, на 12 День и на 15 День, белок экстрагировали и проводили иммуноблоттинг (Вестерн блот). В каждой временной точке проверяли два образца; результаты для одного образца представлены на Фигуре 14.
Данные показывают, что фосфорилирование киназы ATM ниже в клетках, которые обработаны нутлином-3а, даже когда лекарство удаляли (см. рАТМ S1981). Аналогично, наблюдались снижающиеся уровни фосфорилирования субстрата ATM, H2AX, (см. γН2АХ) после обработки нутлином 3А, а также после удаления лекарства. В стареющих клетках IkBa расщепляется по мере того, как активируется NF-kB путь, что приводит к SASP. Данные показывают, что после удаления лекарства уровень IkBa в клетках, обработанных нутлином-3а, приближается к уровню IkBa в нестареющих клетках. Уровни каждого из MDM2, р53 и р21 были повышены в образцах, обработанных нутлином-3, и снижались, когда лекарство удаляли.
Эти данные также подтверждают, что нутлин-3а предпочтительно убивает клетки с повышенным (более сильно выраженным) SASP. Также вследствие того, что после обработки лекарством в выживших клетках уровень продуцирования активированного ATM понижен, эти данные наводят на мысль, что активируемые повреждением ДНК стареющие клетки представляют собой клетки, чувствительные к нутлину-3а.
ПРИМЕР 6
АНАЛИЗ СЕЛЕКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ АВТ-263 ПО ОТНОШЕНИЮ К СТАРЕЮЩИМ КЛЕТКАМ С ПОМОЩЬЮ ПОДСЧЕТА КЛЕТОК
Для того чтобы проверить, действительно ли АВТ-263 селективно токсичен по отношению к стареющим клеткам по сравнению с нестареющими клетками, проводили подсчет клеток с целью определить выживаемость клеток после обработки с использованием АВТ-263. Общий план (хронология) и методики подсчета клеток показаны на Фиг. 15. Клетки IMR90 (первичные легочные фибробласты человека (IMR90) (IMR-90 (АТСС CCL-186TM, Manassas, Virginia) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение клеток под действием ионизирующего излучения (IR) 10 Гр (День 0). Среду обновляли каждые 3 дня. Фенотип старения формировали в течение 7 дней, после чего проводили подсчет клеток, чтобы определить начальное число клеток. В среду как стареющих клеток (облученных), так и нестареющих клеток (необлученных клеток) вводили 3 мкМ АВТ-263. Для некоторых клеток использовали среду, которая совсем не содержала АВТ-263, в качестве контроля для учета какой бы то ни было АВТ-263 токсичности. Клетки в каждой среде засевали в трех лунках и считали независимо. Клетки считали после выдерживания с АВТ-263 (или контрольной культурой) в течение 24 часов.
На Фиг. 16 показано действие АВТ-263 на нестареющие клетки, определяемое как процент выживаемости клеток через 24 часа. Добавление АВТ-263 к нестареющим клеткам (средний столбец) не уменьшило рост клеток ниже исходного уровня (крайний левый столбец), это указывает на отсутствие токсичности в нестареющих клетках. Клетки, не обработанные с помощью АВТ-263, показаны в качестве контроля (крайний правый столбец).
На Фиг. 17 показано действие АВТ-263 на стареющие клетки, определяемое как процент выживаемости клеток через 24 часа. Добавление АВТ-263 к стареющим клеткам (средний столбец) уменьшило рост клеток ниже исходного уровня (крайний левый столбец). Число клеток, обработанных с помощью АВТ-263, составляли 28% от числа клеток до обработки с помощью АВТ-263. Клетки, не обработанные с помощью АВТ-263, показаны в качестве контроля (крайний правый столбец).
ПРИМЕР 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕЛЕКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ АВТ-263 ПО ОТНОШЕНИЮ К СТАРЕЮЩИМ КЛЕТКАМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА CELLTITER-GLO CELL VIABILITY ASSAY
Для того чтобы проверить, действительно ли АВТ-263 селективно токсичен по отношению к стареющим клеткам по сравнению с нестареющими клетками, проводили анализ жизнеспособности клеток с целью определить выживаемость клеток после обработки с помощью АВТ-263. Общий план (хронология) и методики подсчета клеток показаны на Фиг. 15. Клетки IMR90 (первичные легочные фибробласты человека (IMR90) (IMR-90 (АТСС CCL-186TM, Mannassas, Virginia) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение клеток под действием ионизирующего излучения (IR) 10 Гр (День 0). Среду обновляли каждые 3 дня. Фенотип старения формировали в течение 7 дней, после чего проводили подсчет клеток, чтобы определить начальное число клеток, а затем засевали в 96-луночные планшеты. На 8 день стареющие клетки (облученные) и нестареющие клетки (необлученные клетки) экспонировали с серийными разведениями АВТ-263, эту экспозицию продолжали в течение 3 дней. Интервалы концентраций АВТ-263 составляли от 0.5 нМ до 3 мкМ. Культивирование в различных условиях проводили в тройном повторе.
После трех дней обработки (День 11) анализировали выживаемость клеток с использованием продажного набора CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Анализ позволяет выяснять число жизнеспособных клеток в культуре путем количественного определения присутствующего АТР (АТФ, аденозин трифосфата), который является индикатором метаболически активных клеток.
На Фигуре 19 показаны кривые IC50 для АВТ-263 в стареющих клетках и в нестареющих клетках. Кривая IC50 представляет собой график, показывающий процент выживаемости клеток после обработки с помощью АВТ-263, по определению анализом жизнеспособности клеток. На графике показано действие АВТ-263 в различных концентрациях на выживаемость клеток. Величина IC50 агента АВТ-263 на нестареющих клетках составляла 2.4 мкМ по сравнению с величиной IC50 140 нМ на стареющих клетках, это демонстрирует селективную токсичность АВТ-263 по отношению к стареющим клеткам. Получили расчетную величину терапевтического индекса in vitro, равную 17.
ПРИМЕР 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕЛЕКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ АВТ-263 ПО ОТНОШЕНИЮ К СТАРЕЮЩИМ КЛЕТКАМ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ТИПОВ
Способы, описанные в Примере 7, были повторены на других клеточных штаммах. Клеточные штаммы включали первичные клетки коры почек, АТСС Cat# PCS-400-011 (Фигура 20), фибробласты крайней плоти НСА2 (Фигура 21), первичные эпителиальные клетки малых дыхательных путей, АТСС Cat# PCS-301-010 (легкие) (Фигура 22), пул преадипоцитов, полученный от пациентов (Pread) (Фигура 23), мышиные эмбриональные фибробласты, извлеченные из С57В16 мышей (MEF, МЭФ) (Фигура 24), первичные гладкомышечные клетки коронарных артерий, АТСС Cat# PCS-100-021 (Smth Mscl) (Фигура 25).
Эксперименты на этих других клеточных штаммах осуществляли практически, как описано в Примере 7. Как показано на Фигуре 20, величина IC50 АВТ-263 на нестареющих клетках составляла 430 нМ по сравнению с величиной IC50 25 нМ на стареющих клетках, что демонстрирует селективную токсичность АВТ-263 по отношению к стареющим клеткам в почечных эпителиальных клетках (клетках почечного эпителия).
Как показано на Фигуре 21, АВТ-263 на нестареющих клетках не был токсичен до величины IC50 3 мкМ по сравнению с величиной IC50 410 нМ на стареющих клетках, что демонстрирует селективную токсичность АВТ-263 по отношению к стареющим клеткам в клетках НСА2.
ПРИМЕР 9
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕЛЕКТИВНОЙ ТОКСИЧНОСТИ АВТ-263 И ДРУГИХ BCL-2 ИНГИБИТОРОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К СТАРЕЮЩИМ ПЕРВИЧНЫМ ФИБРОБЛАСТАМ ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА
Для того, чтобы определить, действительно ли другие ингибиторы Bcl-2 демонстрируют селективную токсичность по отношению к стареющим клеткам относительно нестареющих клеток, клетки обрабатывали с помощью АВТ-199 (Selleckem Cat# S8048, Houston, ТХ) или обатоклакса (Selleckem Cat# S1057). АВТ-199 и обатоклакс являются общепризнанными ингибиторами Bcl-2.
Эксперименты по определению эффекта этих других ингибиторов Bcl-2 осуществляли практически, как описано в Примере 7. Клетки экспонировали с АВТ-199 в серийных разведениях в интервале концентраций от 15 нМ до 100 мкМ (Фигуры 26 и 27). Клетки экспонировали с обатоклаксом в интервале концентраций от 1.4 нМ до 9 мкМ (Фигура 28).
Как показано на Фигурах 26-27, величина IC50 для АВТ-199 составляла 6 мкМ - 15.8 мкМ в нестареющих клетках по сравнению с величиной IC50 6.9 мкМ - 12.4 мкМ в стареющих клетках. Как показано на Фигуре 28, величина IC50 для обатоклакса составляла 75 нМ в нестареющих клетках по сравнению с величиной IC50 125 нМ в стареющих клетках. Графики на Фигурах 26-28 демонстрируют неспособность АВТ-199 и обатоклакса селективно воздействовать на стареющие клетки по сравнению с нестареющими клетками.
Соединение, специфическое к Bcl-2А1, также не обладает способностью селективно убивать стареющие клетки. Старение клеток IMR90 вызывали с помощью излучения, как описано в Примере 7. Затем облученные клетки IMR90 и нестареющие клетки IMR90 экспонировали с соединением под названием ML214, которое является специфическим ингибитором Bcl-2А1. Уровень цитолиза (киллинга) стареющих клеток был сравним с уровнем цитолиза нестареющих клеток.
ПРИМЕР 10
СЕЛЕКТИВНАЯ ТОКСИЧНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К СТАРЕЮЩИМ КЛЕТКАМ AKT ИНГИБИТОРА, MK-2206, САМОСТОЯТЕЛЬНО ИЛИ В КОМБИНАЦИИ С АВТ-263
Селективную токсичность АВТ-263 в сочетании с Akt ингибитором MK-2206 по отношению к стареющим клеткам по сравнению с нестареющими клетками мы проверяли на клетках IMR90. Мы повторяли методы, описанные в Примере 7, за исключением того, что в дополнение к серийным разведениям АВТ-263 мы экспонировали клеточные культуры с 10 нМ MK-2206 (Selleckem, Cat# S1078).
На Фигуре 29А представлены графики зависимости от дозы АВТ-263 его действия в комбинации с 10 нМ MK-2206 на стареющие клетки и нестареющие клетки. Величина IC50 для стареющих клеток, обработанных с помощью АВТ-263 + MK-2206, была равна 0.083 мкМ, в то время как величина IC50 для стареющих клеток, обработанных с помощью АВТ-263 + MK-2206, была >3 мкМ, то есть индекс селективности в отношении стареющих клеток равен >36.
Сенолитический эффект одного MK-2206 определяли, экспонируя стареющие клетки IMR90 и нестареющие клетки IMR90 (см. методы в Примере 7) с серийными разведениями MK-2206. Определяли процент выживаемости, результаты представлены на Фигуре 29В.
ПРИМЕР 11
ИССЛЕДОВАНИЕ НА ЖИВОТНЫХ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕНОЛИТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА АВТ-263 НА МЫШАХ
Сенолитический эффект сенолитических агентов, например, АВТ-263, можно оценивать на животных моделях старения. Пример такого исследования на животных приводится в данной заявке. Старение у животных можно вызывать путем введения доксорубицина с последующей обработкой сенолитическим агентом. На 35 день мышей умерщвляли и собирали жировую и кожную ткань для анализа РНК, тогда как легкие собирали и быстро замораживали для анализа с помощью иммуномикроскопии. РНК анализировали на экспрессию факторов SASP (mmp3, IL-6) и маркеров старения (р21, р16 и р53). Замороженную легочную ткань анализировали с целью определения маркера повреждения ДНК (γН2АХ).
ARF
Тестируемые мыши содержат инсерцию трансгена р16-3MR. 3MR (репортерный тримодальный белок) представляет собой слитый белок, содержащий функциональные домены синтетической люциферазы Renilla (LUC), мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) и процессированной (усеченной) тимидинкиназы (tTK) вируса простого герпеса (HSV)-1, который предусматривает киллинг с использованием ганцикловира (GCV). кДНК 3MR встроен в рамке считывания с р16 в экзон 2, создавая слитый белок, содержащий первые 62 аминокислоты белка р16, но не включает полноразмерный белок р16 дикого типа. Инсерция (включение) кДНК 3MR также вводит стоп-кодон в рамке считывания p19 в экзон 2.
Эффект АВТ-263 анализировали по уменьшению интенсивности люминесценции. Самкам мышей С57/В16 p16-3MR вводили доксорубицин. Люминесценцию измеряли через 10 дней и результаты использовали в качестве исходного (фонового) значения для каждой мыши (интенсивность 100%). АВТ-263 вводили интраперитонеально ежедневно, начиная с дня 10 до дня 24 после обработки доксорубицином. Затем измеряли люминесценцию на 7, 14, 21, 28, 35 день после начала введения (обработки) АВТ-263 и конечные значения рассчитывали как % от исходного (фонового) значения. Контрольным животным инъекции (DOXO) вводили с равным объемом PBS.
Строили графики уровней мРНК эндогенных mmp-3, IL-6, р21, р16 и р53 в кожной и жировой ткани животных после обработки одним доксорубицином (DOXO) или доксорубицином плюс АВТ-263. Значения представляют собой -кратную индукцию конкретной РНК по сравнению с необработанными контрольными животными.
Иммунофлуоресцентную микроскопию (анализ) срезов легкого животных, получавших доксорубицин (DOXO) и доксорубицин плюс АВТ-263, можно осуществлять посредством связывания с первичным кроличьим поликлональным антителом, специфическим к γН2АХ, с последующей инкубацией с вторичным козьим антителом к кроличьему иммуноглобулину, а затем контрастно окрашивать с помощью DAPI. Процент положительных клеток рассчитывают с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и выражают как процентное содержание от общего числа клеток. Данные можно получить при использовании мышей, получавших доксорубицин (Doxo), и мышей, получавших доксорубицин + (АВТ-263).
АВТ-263 можно анализировать на пониженную интенсивность ассоциированной со старением (SA) β-галактозидазы (β-gal) биоптатов жировой ткани животных, впервые обработанных доксорубицином. Самок мышей C57/BL6 p16-3MR обрабатывали доксорубицином. Часть обработанных доксорубицином животных получала АВТ-263 или PBS (DOXO) ежедневно со дня 10 до дня 24 после обработки доксорубицином. Через три недели после АВТ-263 обработки мышей умерщвляли и биоптаты жировой ткани сразу же фиксировали и окрашивали раствором, содержащим X-Gal. Необработанных животных использовали в качестве отрицательного контроля (CTRL).
ПРИМЕР 12
IN VITRO КЛЕТОЧНЫЕ АНАЛИЗЫ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ WEHI-539
Клетки линии клеток легочных фибробластов IMR90 (первичные легочные фибробласты человека, АТСС CCL-186TM, Manassas, Virginia) и клетки линии клеток почек (первичные клетки коры почек, АТСС Cat. No. PCS-400-011) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение клеток под действием ионизирующего излучения (IR) 10 Гр. Фенотип старения формировали в течение 7 дней.
После формирования фенотипа старения клетки пересевали в 96-луночные планшеты и стареющие клетки (облученные) и нестареющие клетки (необлученные клетки) экспонировали с трехкратными разведениями WEHI-539 в течение 3 дней. Интервал концентраций WEHI-539 составлял от 0.0075 мкМ до 15 мкМ. Через три дня определяли выживаемость клеток, используя продажную тест-систему (набор) CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Анализ позволяет выяснять число жизнеспособных клеток в культуре путем количественного определения присутствующего АТР (АТФ, аденозин трифосфата), который является индикатором метаболически активных клеток. На Фигуре 30 показана выживаемость клеток IMR90 (см. Фигуру 30А) и выживаемость почечных клеток (см. Фигуру 30В).
ПРИМЕР 13
ОБРАБОТКА P16-3MR ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ С ПОМОЩЬЮ WEHI-539
Ink4a
Ink4a
ARF
ARF
Ink4a
Ink4a
Ink4a
В данном примере описывается животная модель, пригодная для определения способности сенолитического агента селективно уничтожать стареющие клетки in vivo. Способность WEHI-539 или другого сенолитического агента удалять стареющие клетки in vivo определяли на трансгенных р16-3MR мышах (см., например. Международную опубликованную патентную заявку № WO 2013/090645). Эксперимент осуществляли методом, аналогичным методу, схематически изображенному на Фигуре 6. Трансгенная мышь содержит p16 промотор, функционально связанный с тримодальным слитым белком для обнаружения стареющих клеток и для селективного клиренса стареющих клеток у этих трансгенных мышей, что проиллюстрировано на Фигуре 7. Промотор, p16, который является транскрипционно активным в стареющих клетках, но не в нестареющих клетках (см., например, Wang et al., J. Biol. Chem. 276: 48655-61 (2001); Baker et al., Nature 479: 232-36 (2011)), был введен методами генной инженерии (рекомбинантной ДНК) в конструкцию нуклеиновой кислоты. 3MR (тримодальный репортерный белок) представляет собой слитый белок, содержащий функциональные домены синтетической люциферазы Renilla (LUC), мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) и процессированной (усеченной) тимидинкиназы (tTK) вируса простого герпеса (HSV)-1, который предусматривает киллинг при использовании ганцикловира (GCV) (см., например, Ray et al., Cancer Res. 64: 1323-30 (2004)). кДНК 3MR встраивали в рамке считывания с р16 в экзон 2, создавая слитый белок, содержащий первые 62 аминокислоты белка р16, но не полноразмерный белок р16 дикого типа. Результатом инсерции (включения) кДНК 3MR явилось также присутствие стоп-кодона в рамке считывания p19 в экзоне 2, тем самым также предупреждается экспрессия полноразмерного белка p19 при использовании ВАС. Промотор гена p16 (примерно 100 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.)) вводили 5' от нуклеотидной последовательности, кодирующей тримодальный репортерный слитый белок. Или же можно использовать промотор процессированного p16 (см., например, публикацию Baker et al., Nature, supra; опубликованную Международную патентную заявку WO 2012/177927; Wang et al., supra). Итак, экспрессия 3MR в стареющих клетках обусловлена (вызывается) только промотором p16. Детектируемые маркеры, LUC и mRFP, предоставляют возможность детектировать стареющие клетки с помощью биолюминесценции и флуоресценции, соответственно. Экспрессия tTK обеспечила селективный цитолиз (киллинг, гибель) стареющих клеток посредством экспозиции с пролекарством ганцикловиром (GCV), который(-ое) превращается в цитотоксическую частицу с помощью tTK. Получали трансгенных животных-основателей с генетическим фоном С57В16, и проводили их бридинг известными методами с целью введения трансгенов в животных (см., например, Baker et al., Nature 479: 232-36 (2011)).
Для определения сенолитической активности агента, например, такого как WEHI-539, самок мышей C57/BL6 p16-3MR произвольно делили на группы, получавшие доксорубицин + WEHI-539 или только доксорубицин. Старение вызывали с помощью интраперитонеального введения мышам доксорубицина в дозе 10 мг/кг за десять дней до введения WEHI-539 (День -10). WEHI-539 вводили интраперитонеально ежедневно, начиная со дня 10 до дня 24 после обработки доксорубицином (Группа = 9 мышей). Контрольным мышам (обработанным доксорубицином) вводили инъекции равных объемов PBS (Группа = 3 мыши). Люминесцентную визуализацию (система Xenogen Imaging) осуществляли в День 0 (т.е. через 10 дней после обработки доксорубицином) в качестве базовой (исходной, фоновой) для каждой мыши (интенсивность 100%).
Люминесцентную визуализацию мышей проводили на 7, 14, 21, 28 и 35 день после начала обработки с помощью WEHI-539. Уменьшение (выхода) люминесценции (L) рассчитывали как: L=(Визуализация после обработки с помощью WEHI-539)/(Исходная (фоновая) визуализация)%. Если L больше или равно 100%, то число стареющих клеток не уменьшилось. Если L меньше 100%, тогда число стареющих клеток уменьшилось. Расчет для каждой мыши делали независимо и из показателя для каждого образца вычитали фон.
Проводили эксперименты по определению влияния обработки с помощью WEHI-539 на экспрессию генов, ассоциированных со старением. Группу самок C57/BL6 p16-3MR обрабатывали, как описано выше. Через три недели после окончания обработки с помощью WEHI-539 (35 день) мышей, обработанных доксорубицином (контрольных) (N=3), и мышей, обработанных доксорубицином + WEHI-539 (N=6), умерщвляли. Биоптаты кожи и жировой ткани брали для извлечения РНК; биоптаты жировой ткани брали для обнаружения ассоциированной со старением β-галактозидазы; а легкие быстро замораживали в криопротекторной ОСТ среде для приготовления срезов в криостате.
Ink4a
РНК анализировали, определяя уровни мРНК эндогенных маркеров старения (р21, p16 (p16) и р53) и SASP факторов (например, mmp-3 и IL-6) по сравнению с мРНК актина (контроль для количества кДНК), используя Универсальную библиотеку зондов Roche для ПЦР (PCR) анализа в реальном времени.
Из замороженной легочной ткани делали срезы толщиной 10 мкМ и окрашивали первичным кроличьим поликлональным антителом к γН2АХ (Novus Biologicals, LLC), которое является маркером двухнитевых разрывов в клетках (повреждения ДНК). Затем срезы окрашивали вторичным козьим антителом к кроличьему иммуноглобулину, окрашенным красителем ALEXA FLUOR (Life Technologies) и контрастно окрашенным 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Life Technologies). Число положительных клеток считали с использованием программы обработки данных визуализации ImageJ (National Institutes of Health (Национальные институты здоровья, см. Internet at imagej.nih.gov/ij/index.html) и выражали в процентах от общего числа клеток.
После взятия биоптаты жировой ткани сразу же фиксировали в 4% формалине, а затем окрашивали раствором, содержащим X-gal, для обнаружения присутствия ассоциированной со старением β-галактозидазы (β-gal). Биоптаты жировой ткани инкубировали в течение ночи при 37°С в растворе X-gal и фотографировали на следующий день. Биоптаты жировой ткани необработанных животных использовали в качестве отрицательного контроля (CTRL).
ПРИМЕР 14
СПОСОБНОСТЬ ИНГИБИТОРА BCL-XL УДАЛЯТЬ СТАРЕЮЩИЕ КЛЕТКИ С ВЕРИФИЦИРОВАННЫМ (УСТАНОВЛЕННЫМ) SASP (ФЕНОТИПОМ, АССОЦИИРОВАННЫМ СО СТАРЕНИЕМ)
В данном примере описывается метод определения действия сенолитического агента на киллинг (цитолиз) стареющих клеток с установленным SASP. Старение первичных человеческих фибробластов (IMR90) индуцировали воздействием ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр. Через семь дней после облучения (День 0) клетки обрабатывали, вводя 10 мкМ ингибитора BCL-XL (например, WEHI-539) или ингибитора BCL-2/BCL-XL или носителя (DMSO) в течение девяти дней (День 9). Лекарство или носитель обновляли (заменяли) каждые три дня. Лекарство/носитель удаляли на 9 День и клетки культивировали еще в течение трех дней (День 12). Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали иммунофлуоресценцией с использованием специфического антитела к IL-6 (R&D, AF-206-NA). Клетки контрастно окрашивали красителем DAPI с целью ядерной визуализации. IL-6 положительные клетки определяли объективным методом, используя программу CellProfiler.
В другом эксперименте старение клеток IMR90 индуцировали с помощью излучения (10 Гр). Через семь дней после облучения клетки обрабатывали сенолитическим агентом (например, ингибитором BCL-XL (например, WEHI-539) или ингибитором BCL-2/BCL-XL; MDM2 ингибитором; Akt ингибитором) или носителем (DMSO) в течение девяти дней (День 9). Лекарство или носитель обновляли (заменяли) каждые три дня. Лекарство/носитель удаляли на 9 День и клетки культивировали еще в течение шести дней. Кондиционированную среду обработанных клеток собирали и проводили количественное определение IL-6 методом ELISA (Perkin Elmer, AL223F). Уровни IL-6 в культуральной среде определяли методом ELISA, используя набор согласно инструкциям производителя (AL223F, Perkin Elmer). Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде и окрашивали иммунофлуоресценцией с использованием специфического антитела к IL-6 (R&D, AF-206-NA). Уровень IL-6, определенный методом ELISA, нормализовали по числу клеток в каждой лунке.
ПРИМЕР 15
СПОСОБНОСТЬ СЕНОЛИТИЧЕСКОГО АГЕНТА УДАЛЯТЬ СТАРЕЮЩИЕ КЛЕТКИ С УСТАНОВЛЕННЫМ SASP: ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА SASP
В данном примере описывается способ определения действия сенолитического агента на экспрессию фактора SASP. Вызывали старение первичных человеческих фибробластов (IMR90) под воздействием излучения с поглощенной дозой 10 Гр. Через семь дней после облучения (День 0) клетки обрабатывали сенолитическим агентом (например, ингибитором BCL-XL (например, WEHI-539) или ингибитором BCL-2/BCL-XL; MDM2 ингибитором; Akt ингибитором) или носителем (DMSO) в течение девяти дней. Лекарство или носитель обновляли (заменяли) каждые три дня. После того, как лекарство/носитель удаляли перед анализом экспрессии фактора SASP на 9 День, клетки культивировали еще в течение трех дней в среде в отсутствие лекарства или DMSO. Затем клетки собирали, экстрагировали мРНК и получали кДНК. Затем проводили количественную ПЦР (qPCR) для обнаружения экспрессии различных генов. Клетки собирали также на 12 день после удаления лекарства/носителя в течение трех дней. Данные нормализовали по актину и изображали в виде отношения к нестареющим клеткам.
ПРИМЕР 16
СПОСОБНОСТЬ СЕНОЛИТИЧЕСКОГО АГЕНТА УДАЛЯТЬ СТАРЕЮЩИЕ КЛЕТКИ С ПОВЫШЕННОЙ РЕАКЦИЕЙ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК
В данном примере описывается метод определения воздействия сенолитического агента на селективный киллинг (цитолиз) стареющих клеток с повышенной реакцией повреждения ДНК. Вызывали старение первичных человеческих фибробластов (IMR90) под воздействием излучения с поглощенной дозой 10 Гр. Через семь дней после облучения (День 0) клетки обрабатывали сенолитическим агентом (например, ингибитором BCL-XL (например, WEHI-539) или ингибитором BCL-2/BCL-XL; MDM2 ингибитором; Akt ингибитором) или носителем (DMSO) в течение девяти дней. Лекарство или носитель обновляли (заменяли) каждые три дня. Лекарство/носитель удаляли на 9 День и клетки культивировали еще в течение шести дней в среде в отсутствие лекарства или DMSO, меняя среду каждые три дня. Клетки собирали в День 0 (нестареющие клетки). День 9, День 12 и День 15, экстрагировали белок и проводили иммуноблоттинг (Вестерн-блот). В каждой временной точке подвергали обработке два образца.
ПРИМЕР 17
СЕЛЕКТИВНЫЙ ИНГИБИТОР BCL-XL ВЫЗЫВАЕТ ГИБЕЛЬ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК ПОСРЕДСТВОМ АПОПТОЗА
Легочные фибробласты клеточной линии IMR90 (первичные легочные фибробласты человека, АТСС CCL-186TM, Manassas, Virginia) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение под воздействием ионизационного излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр, как описано в Примере 12. После осуществления (фиксирования) старения клетки пересевали в 96-луночные планшеты. Общий ингибитор каспаз Q-VD-OPh (20 мкМ) добавляли в лунки, содержащие стареющие клетки (облученные) (IMR90 Sen(IR)), и в лунки, содержащие нестареющие клетки (необлученные клетки) (IMR90 NS). Через четыре часа стареющие клетки и нестареющие клетки подвергали трехдневному воздействию WEHI-539 в концентрации 1.67 или 5 мкМ. По окончании времени анализа проводили подсчет клеток. Для каждого условия клетки засевали в три лунки планшета и считали независимо. Начальное (исходное) число клеток служило в качестве контроля для определения индукции старения по сравнению с подсчетом в последний день без обработки с помощью WEHI-539. Начальное (исходное) число нестареющих клеток служило в качестве показателя для определения токсичности WEHI-539. Выживаемость клеток определяли, используя продажный набор (тест-систему) CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Анализ позволяет выяснять число жизнеспособных клеток в культуре путем количественного определения присутствующего АТР (АТФ, аденозин трифосфата), который является индикатором метаболически активных клеток. На Фигуре 31 (рисунок слева) показано, что WEHI-539 селективно вызывает гибель стареющих клеток (см. Пример 12), и представлены концентрации WEHI-539, применявшиеся в этом эксперименте. В присутствии общего ингибитора каспаз процентное содержание выживших стареющих клеток повышается (Фигура 31, рисунок справа).
ПРИМЕР 18
ЭФФЕКТИВНЫЙ КИЛЛИНГ (ЦИТОЛИЗ) СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК ПОСРЕДСТВОМ ИНГИБИРОВАНИЯ BCL-XL
В данном примере показано, что BCL-XL является членом семейства антиапоптотических белков BCL-2, важным для апоптоза стареющих клеток. Получали короткие шпилечные (кш) РНК (shRNA), содержащие последовательности, специфические для BCL-2, BCL-XL (также называемого BCL2L1) и белка BCL-w (также называемого BCL2L2), и их вводили в лентивирусные векторы. Четыре различных кшРНК (shRNA) для каждого из BCL-XL и BCL-w и три для BCL-2 были синтезированы в Институте Брода Массачусетского технологического института и Гарварда (Broad Institute of MIT and Harvard) (Cambridge, MA). Лентивирусные векторы, содержащие каждую репрезентативную кшРНК (shRNA), получали от компании Sigma Aldrich (St. Louis, МО). Последовательности кшРНК (shRNA) и целевые последовательности представлены в приведенной ниже Таблице. Нуклеотидную последовательность для каждого белка можно легко получить из общедоступных баз данных (см., например, Bcl-xL в GenBank NM_001191.2 и NM_138578.1 (BCL2-подобный 1 (BCL2L1)); Bcl-w в GenBank NM_004050.3 (BCL2-подобный 2 (BCL2L2)); и Bcl-2 в NM_000633.2, NM_000657 (B-клеточная CLL/лимфома 2 (BCL2)).
Образцы стареющих клеток и нестареющих клеток в тройном повторе трансдуцировали с использованием каждого из различных лентивирусных векторов и с использованием двух контрольных векторов в соответствии с методами, применяемыми в данной области техники. Контрольные образцы включали стареющие и нестареющие клетки, которые не были трансдуцированы (NT) с использованием лентивируса. Старение клеток IMR90 индуцировали посредством воздействия ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр, как описано в Примере 12. После формирования фенотипа старения клетки пересевали в 96-луночные планшеты и добавляли кшРНК (shRNA). Через 24 часа shRNA удаляли и среду заменяли. Среду повторно заменяли через 3 дня. После последнего обновления (замены) среды (через 6 дней после удаления shRNA) определяли выживаемость с использованием тест-системы (набора) with CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay.
Затем определяли выживаемость стареющих клеток и нестареющих клеток в тройном повторе для каждой тестируемой shRNA (кшРНК). shRNAs, в том порядке, в котором они перечислены в Таблице, представлены на фигуре слева направо. Вторая и третья последовательности shRNA, специфические для BCL-2, являются идентичными. На Фигуре 32 представлено отношение выживаемости стареющих клеток к выживаемости нестареющих клеток для каждой shRNA. Отношение 1.0 указывает на отсутствие разницы в выживаемости в процентах между стареющими клетками и нестареющими клетками. Введение трех из четырех специфических для BCL-XL молекул shRNA в стареющие клетки привело к значительной гибели стареющих клеток по сравнению со стареющими клетками, в которые были введены shRNAs, специфические для Bcl-w или BCL-2. Данные показывают, что экспрессия BCL-XL играет важную роль в выживаемости стареющих клеток.
ПРИМЕР 19
ЭФФЕКТИВНЫЙ КИЛЛИНГ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК ПОСРЕДСТВОМ ИНГИБИРОВАНИЯ ЧЛЕНОВ СЕМЕЙСТВА АНТИАПОПТОТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ BCL-2
Чтобы определить, являются ли другие ингибиторы Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w селективно токсическими по отношению к стареющим клеткам по сравнению с нестареющими клетками, использовали анализ жизнеспособности клеток для определения выживаемости клеток после обработки с помощью АВТ-737. Общий план (хронология) и методики подсчета клеток показаны на Фигуре 18 и описаны в Примере 7. Клетки IMR90 (первичные легочные фибробласты человека) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение клеток под действием ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр (День 0). Среду обновляли каждые 3 дня. Фенотип старения формировали в течение 7 дней, после чего проводили подсчет клеток, чтобы определить начальное число клеток, а затем засевали в 96-луночные планшеты. На 8 день стареющие клетки (облученные) и нестареющие клетки (необлученные клетки) экспонировали с серийными разведениями АВТ-737 в течение 3 дней. АВТ-737 серийно разводили, начиная с концентрации 50 мкМ. Культивирование в различных условиях проводили в тройном повторе.
После трехдневной обработки (День 11) анализировали выживаемость клеток с использованием тест-системы (набора) CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay. Анализ позволяет выяснять число жизнеспособных клеток в культуре путем количественного определения присутствующего АТР (АТФ, аденозин трифосфата), который является индикатором метаболически активных клеток.
На Фигуре 33 представлены IC50 кривые для АВТ-737 в стареющих клетках и в нестареющих клетках. Кривая IC50 представляет собой график, показывающий процент выживаемости клеток после обработки с помощью АВТ-737, по определению анализом жизнеспособности клеток. На графике показано действие АВТ-737 в различных концентрациях на выживаемость клеток.
ПРИМЕР 20
ИНГИБИТОР BCL-2/BCL-XL/BCL-W ВЫЗЫВАЕТ ГИБЕЛЬ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК ПОСРЕДСТВОМ АПОПТОЗА
Эксперимент, описанный в Примере 17, проводили с целью определить, действительно ли другие ингибиторы одного или более членов BCL-2 семейства антиапоптотических белков вызывают гибель стареющих клеток посредством апоптоза. Легочные фибробласты клеточной линии IMR90 (первичные легочные фибробласты человека, АТСС CCL-186TM, Manassas, Virginia) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение под воздействием ионизационного излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр, как описано в Примере 12. После осуществления (фиксирования) старения клетки пересевали в 96-луночные планшеты. Общий ингибитор каспаз Q-VD-OPh (20 мкМ) добавляли в лунки, содержащие стареющие клетки (облученные) (IMR90 Sen(IR)), и в лунки, содержащие нестареющие клетки (необлученные клетки) (IMR90 NS). Через четыре часа стареющие клетки и нестареющие клетки подвергали трехдневному воздействию АВТ-263 (навитоклакса, Navitoclax) в концентрации 0.33 или 1 мкМ. По окончании времени анализа проводили подсчет клеток. Для каждого условия клетки засевали в три лунки планшета и считали независимо. Начальное (исходное) число клеток служило в качестве контроля для определения индукции старения по сравнению с подсчетом в последний день без обработки с помощью АВТ-263. Начальное (исходное) число нестареющих клеток служило в качестве показателя для определения токсичности АВТ-263. Выживаемость клеток определяли, используя набор (тест-систему) CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Анализ позволяет выяснять число жизнеспособных клеток в культуре путем количественного определения присутствующего АТР (АТФ, аденозин трифосфата), который является индикатором метаболически активных клеток. На Фигуре 34 (верхний график) показано, что АВТ-263 селективно вызывает гибель стареющих клеток, и представлены концентрации АВТ-263, применявшиеся в этом эксперименте. В присутствии общего ингибитора каспаз процентное содержание выживших стареющих клеток повышается (Фигура 34, нижний график).
ПРИМЕР 21
ЭФФЕКТ УДАЛЕНИЯ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК НА ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ ОСТЕОАРТРИТА
Таблица и принципиальная схема дизайна двух исследований на животной модели остеоартрита представлены на Фигурах 35 и 36, соответственно. Были разработаны два варианта исследования по определению эффекта удаления стареющих клеток на животной модели остеоартрита.
е
х
Исследования проводили параллельно. В одном исследовании изучали эффект удаления (исключения) стареющих клеток с помощью ганцикловира (GCV) на 3MR мышах. Мышей подвергали хирургической операции, делая разрез передней крестообразной связки одной задней лапы, чтобы вызвать остеоартрит сустава этой лапы. В течение недели 2 после операции мыши 3MR получали 2.5 мкг GCV в оперированное колено в виде внутрисуставной инъекции qd (ежедневно) в течение 5 дней, плюс повторное (2) лечение (2.5 мкг GCV qd в течение 5 дней) в течение недели 4 после операции. По окончании 4 недель после операции осуществляли контроль прооперированных суставов мышей на наличие стареющих клеток, оценивали функцию, контролировали маркеры воспаления и проводили гистологическое обследование.
х
В параллельном исследовании мышей C57BL/6J подвергали хирургической операции, делая разрез передней крестообразной связки одной задней лапы, чтобы вызвать остеоартрит сустава этой лапы. В течение недели 3 и недели 4 после операции мышам вводили 5.8 мкг нутлина-3А (n=7) в прооперированное колено в виде внутрисуставной инъекции, qod (один раз в два дня) в течение 2 недель. По окончании 4 недель после операции осуществляли контроль прооперированных суставов мышей на наличие стареющих клеток, оценивали функцию, контролировали маркеры воспаления и проводили гистологическое обследование.
В проводимом исследовании участвовали две контрольные группы мышей: одна группа, включающая мышей C57BL/6J или мышей 3MR, которым проводили имитацию операции (фиктивную операцию) (n=3) (т.е. осуществляли хирургическое вмешательство за исключением разрезания ACL) и делали внутрисуставные инъекции носителя параллельно с группой, получавшей GCV; и одна группа, включающая мышей C57BL/6J или мышей 3MR, которые подвергались хирургической операции на ACL и получали внутрисуставные инъекции носителя (n=5) параллельно с группой, получавшей GCV.
РНК из прооперированных суставов мышей, получавших нутлин-3А, анализировали на экспрессию SASP факторов (mmp3, IL-6) и маркеров старения (р16). Проводили qRT-PCR для определения уровней мРНК. Как показано на Фигурах 37А-С, обработка нутлином-3А выводит стареющие клетки из сустава (клиренс стареющих клеток). РНК из оперированных суставов мышей также анализировали на экспрессию коллагена Типа 2 и сравнивали с экспрессией актина в качестве контроля. Как показано на Фигуре 38, обработка нутлином-3А мышей, которые подверглись операции, вызывающей остеоартрит, обусловливает продуцирование коллагена по сравнению с непролеченными мышами.
Функцию конечностей (лап) проверяли через 4 недели после оперативного вмешательства с помощью теста с нагрузкой на лапу, чтобы определить, какую лапу мыши предпочитали (Фигура 39). Перед тем, как проводить измерения, мышей оставляли привыкнуть к камере по меньшей мере 3 раза. Мыши передвигались внутри камеры, ставя одну заднюю лапу на каждую чашу весов. Вес, приходящийся на каждую заднюю лапу, измеряли в течение 3 секунд. Для каждого животного в каждой временной точке делали по меньшей мере 3 отдельных измерения. Результаты выражали в виде процентов от веса, приходящегося на оперированную лапу, в сравнении с контралатеральной (противоположной) неоперированной лапой. Как показано на Фигуре 40, непролеченные мыши, которые перенесли операцию, вызывающую остеоартрит, оперированной задней лапе предпочитали неоперированную заднюю лапу (Δ). Однако, освобождение от стареющих клеток с помощью нутлина-3А подавляет это эффект у мышей, которые перенесли хирургическое вмешательство ().
Функцию конечностей (лап) также оценивали через 4 недели после операции, проводя тест "горячая пластина", чтобы показать чувствительность и реакцию на болевой раздражитель. Коротко говоря, мышей помещали на горячую пластину при 55°С. Когда мышей помещали на горячую поверхность пластины, они поднимали лапы и лизали их (реакция лизания лапы), так как был достигнут болевой порог. Скрытый период для реакции задней лапы (реакция лизания лапы) регистрировали как время реакции. Как показано на Фигуре 41, у непролеченных мышей, которые подверглись операции, вызывающей остеоартрит, наблюдалось повышенное время реакции по сравнению со здоровыми мышами, у которых не было хирургических изменений (). Однако, клиренс стареющих клеток у мышей, которые подверглись операции, вызывающей остеоартрит, нутлином-3А значительно снижал время реакции ().
Гистопатология остеоартрита, вызванного хирургической операцией ACL, показала, что слой протеогликанов был разрушен. Клиренс стареющих клеток с помощью нутлина-3А полностью нейтрализовала этот эффект. Клиренс стареющих клеток у мышей 3MR, пролеченных с помощью GCV, который вызывает гибель стареющих клеток, оказывало такое же воздействие на патофизиологию остеоартрита, что и нутлин-3А. См. Фигуру 42.
ПРИМЕР 22
ЭФФЕКТ УДАЛЕНИЯ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК НА ЖИВОТНЫХ МОДЕЛЯХ АТЕРОСКЛЕРОЗА
-/-
-/-
-/-
Схематическое изображение двух мышиных моделей атеросклероза представлено на Фигурах 43А-В. В исследовании, проиллюстрированном на Фигуре 43А, определяли степень, до которой клиренс стареющих клеток из атеросклеротических бляшек у LDLR мышей с помощью нутлина-3А снижает "бляшечную нагрузку". Две группы LDLRмышей (10 недель), начиная с недели 0 и на всем протяжении исследования, держали на диете с высоким содержанием жира (HFD) (Harlan Teklad TD.88137), 42% калорий в которой составляли калории из жиров. Двум группам LDLR мышей (10 недель) давали нормальный корм (-HFD). Начиная с 0-2 недели, одной группе HFD мышей и -HFD мышей вводили нутлин-3А (25 мг/кг, интраперитонеально). Один цикл лечения (обработки) представлял собой 14 дней лечения (обработки), 14 дней отдыха (лекарственные каникулы). Носитель вводили одной группе HFD мышей и одной группе -HFD мышей. На 4 неделе (временная точка 1) одну группу мышей умерщвляли и использовали для определения присутствия стареющих клеток в бляшках. Для некоторых из оставшихся мышей введение нутлина-3А и носителя повторяли с 4 до 6 недели. На 8 неделе (временная точка 2) мышей умерщвляли и определяли присутствие стареющих клеток в бляшках. Остальных мышей обрабатывали нутлином-3А или носителем с 8 до 10 недели. На 12 неделе (временная точка 3) мышей умерщвляли и определяли уровень бляшек и число стареющих клеток в бляшках.
-/-
Уровни липидов в плазме (крови) определяли у LDLR мышей, которые получали HFD и которым вводили нутлин-3А или носитель во временной точке 1, по сравнению с мышами, которые получали -HFD (n=3 в группе). Плазму брали в середине дня и анализировали липиды и липопротеины в кровотоке. Результаты показаны на Фигурах 44A-D.
-/-
-/-
-/-
По достижении временной точки 1 мышей LDLR, которым давали HFD корм и вводили нутлин-3А или носитель, умерщвляли (n=3, все группы) и дуги аорты иссекали (вырезали) для RT-PCR анализа SASP факторов и маркеров стареющих клеток. Значения нормализовали по GAPDH и выражали как кратность изменения по сравнению с LDLRмышами-ровесниками, которые получали носитель и сидели на нормальной диете. Результаты показывают, что клиренс стареющих клеток с помощью нутлина-3А у мышей LDLR, которым давали HFD, снижал экспрессию некоторых SASP факторов и маркеров стареющих клеток, ММР3, ММР13, PAI1, р21, IGFBP2, IL-1A и IL-1B, после 1 цикла лечения (см. Фигуры 45A-D).
-/-
-/-
-/-
По достижении временной точки 2 мышей LDLR, которым давали корм HFD и вводили нутлин-3А или носитель (n=3, для всех групп), умерщвляли, и дуги аорты иссекали (вырезали) для RT-PCR анализа SASP факторов и маркеров стареющих клеток. Значения нормализовали по GAPDH и выражали как кратность изменения по сравнению с LDLR мышами-ровесниками, которые получали носитель и сидели на нормальной диете. Результаты показывают экспрессию некоторых SASP факторов и маркеров стареющих клеток в дуге аорты у HFD мышей (Фигуры 46А-С). Клиренс стареющих клеток с несколькими циклами введения нутдина-3А у LDLR мышей, которым давали HFD, снижал экспрессию большинства маркеров (Фигуры 46А-В).
-/-
По достижении временной точки 3 мышей LDLR, которым давали корм HFD и вводили нутлин-3А или носитель (n=3, для всех групп), умерщвляли, дуги аорты иссекали (вырезали) и окрашивали суданом IV для обнаружения липида. Анализ композиционного состава тела мышей проводили MRI (МРТ) и клетки циркулирующей крови считали с использованием системы Hemavet. Результаты показывают, что обработка нутлином-3А уменьшает бляшки в нисходящей аорте на ~45% (Фигуры 47А-С). Как показано на Фигурах 48А-В, число тромбоцитов и лимфоцитов у мышей, которым вводили нутлин-3А, эквивалентно числу тромбоцитов и лимфоцитов у мышей, которым вводили носитель. Как показано на Фигурах 49А-В, лечение с помощью нутлина-3А также снижала массу и композицию телесного жира у мышей, которым давали HFD корм.
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
В исследовании, проиллюстрированном на Фигуре 43В, определяли степень, до которой клиренс стареющих клеток у двойных трансгенных мышей LDLR/3MR с помощью ацикловира улучшал состояние (нормализовал, вызывал положительную динамику) при уже имеющемся атерогенном заболевании. Двойных трансгенных LDLR/3MR мышей (10 недель) и трансгенных LDLR мышей (мышей, несущих одну мутацию) (10 недель) держали на высокожирной диете, начиная с Недели 0 вплоть до Недели 12. Ганцикловир вводили обеим группам мышей (25 мг/кг интраперитонеально) от недели 12 до недели 13 и от недели 14 до недели 15. На 16 неделе определяли уровень (размер) бляшки и число стареющих клеток в бляшках. Как показано на Фигуре 50, клиренс стареющих клеток с помощью GCV у двойных трансгенных LDLR/3MR мышей, которым давали HFD (n=10), снижал % (поверхности) аорты, покрытой бляшкой, по сравнению с контрольными LDLR мышами/HFD (n=9). Как показано на Фигуре 51, клиренс стареющих клеток с использованием GCV снижал также площадь поперечного сечения бляшки у LDLR/3MR двойных трансгенных мышей, которым давали HFD (n=3), по сравнению с контрольными LDLR мышами/HFD (n=5).
ПРИМЕР 23
КЛИРЕНС СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК ПОДДЕРЖИВАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ К КАРДИО СТРЕССУ В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ
С целью изучения влияния клиренса стареющих клеток на состояние здоровья и на продолжительность жизни получали группы INK-ATTAC трансгенных мышей на смешанном FVB × 129Sv/E × C57BL/6 или на чистом C57BL/6 генетическом фоне. В возрасте 12 месяцев одной половине мышей из каждой группы три раза в неделю вводили инъекции АР20187, чтобы вызвать апоптоз р16-положительных стареющих клеток (0.2 мг/кг и 2 мг/кг АР20187 для групп смешанных и чистых C57BL/6 мышей, соответственно), тогда как другая половина каждой группы получала носитель. В 18 месяцев для субпопуляций самцов и самок из каждой группы проводили кардиологический стресс-тест, во время которого мышам делали инъекции летальной дозы изопротеренола (680 мг/кг) и фиксировали время до остановки сердца. В то время, как у 18-месячных непролеченных (носитель) мышей систематически наблюдалось заметное ускорение остановки сердца по сравнению в 12-месячными контрольными мышами, у мышей, получавших АР20187, поддерживалась свойственная молодому организму защита сердца (кардиопротекция) против изопротеренола вне зависимости от пола и генетического фона (см. Фигура 52).
Известно, что кардиопротекторные сигнальные пути сообщают резистентность к метаболическим стрессам, например, таким как ишемическая болезнь и хроническая гипоксия (Granfeldt et al., 2009, Cardiovasc. Res. 83: 234-246). Однако активность кардиопротекторных сигнальных путей с возрастом нарушается, при этом снижается функциональные и адаптационные резервные возможности сердца (Ogawa et al., 1992, Circulation 86: 494-503; Wiebe et al., 1998, Clin. J. Sport Med. 8: 272-279). АТР (АТФ)-зависимые K каналы (KATP, КАТФ) играют центральную роль в передаче сигнала по кардиопротекторному сигнальному пути (Gross and Auchampach, 1992, Cardiovasc. Res. 26: 1011-1016). Эти KATP каналы состоят из порообразующей субъединицы Kir6.2/Kir6.1, регуляторной субъединицы Sur2a и дополнительных акцессорных белков. Полагают, что работа KATP каналов с возрастом ухудшается вследствие пониженной экспрессии Sur2a (Du et al., 2006, FASEB J. 20: 1131-1141; Jovanovic and Jovanovic, 2009, Curr. Opin. Pharmacol. 9: 189-193; Ranki et al., 2002, Mech. Ageing Dev. 123: 695-705). Было показано, что повышенная экспрессия Sur2a, либо за счет изменения диеты (Sukhodub et al., 2011, J. Cell. Mol. Med. 15: 1703-1712), либо методами создания трансгенных животных (Sudhir et al., 2011, Biogerentology 12: 147-155), поддерживает резистентность к кардио стрессу у старых мышей. Таким образом, вклад стареющих клеток в связанное со старением снижение экспрессии Sur2a был изучен на 18-месячных мышах, получавших АР20187 и носитель, с использованием ранее описанного кардиологического стресс теста. Действительно, "юношеская" активность 18-месячных самок получавших АР20187, в стресс тесте с изопротеренолом систематически коррелировала с устойчивой экспрессией Sur2a (см. Фигуру 53). Взятые вместе эти эксперименты указывают на то, что присутствие стареющих клеток, появляющихся с возрастом, отрицательно влияет на функцию KATP каналов, а клиренс стареющих клеток представляет собой эффективную терапию, позволяющую противостоять этому истощению функции. Устойчивая сердечная деятельность могла бы способствовать увеличению средней продолжительности жизни, наблюдаемому у пролеченных с помощью АР20187 мышей INK-ATTAC.
ПРИМЕР 24
-/-
КЛИРЕНС СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК УМЕНЬШАЕТ ИНТЕНСИВНОСТЬ СИМПТОМОВ АТЕРОСКЛЕРОЗА У LDLR/3MR МЫШЕЙ
-/-
-/-
-/-
Влияние клиренса стареющих клеток на устойчивость и размер зрелых атеросклеротических бляшек изучали на LDLR/3MR двойных трансгенных мышах. С 10-недельного возраста LDLR/3MR двойных трансгенных мышей (10 недель) и LDLRтрансгенных мышей (контроль) держали на диете с высоким содержанием жира (HFD) (Harlan Teklad TD.88137), 42% калорий в которой составляли калории из жиров, начиная с Недели 0 и вплоть до Недели 12.5, когда мышей перевели на стандартный (нормальный) корм. Обеим группам мышей вводили ганцикловир, начиная с недели 12.5 в течение последующих 100 дней, причем каждый цикл лечения включал введение ганцикловира в течение 5 дней (25 мг/кг интраперитонеально ежедневно) и отдых в течение 14 дней. По окончании периода обработки (лечения) в течение 100 дней мышей умерщвляли, собирали плазму и ткани и количественно характеризовали атеросклероз.
-/-
-/-
-/-
-/-
Нисходящие аорты иссекали и окрашивали суданом IV с целью визуализировать липиды в бляшках. Как показано на Фигурах 54А-В, у получавших ганцикловир LDLR/3MR двойных трансгенных мышей было меньше атеросклеротических бляшек с менее интенсивным окрашиванием, чем у LDLR контрольных мышей, которых держали на HFD диете. Процент (%) площади аорты, покрытой бляшками, как показала измерение площади поверхности, окрашенной суданом IV, также был значительно ниже у получавших ганцикловир LDLR/3MR мышей по сравнению с LDLR контрольными мышами (см. Фигуру 54С).
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Бляшки обработанных ганцикловиром LDLR контрольных мышей и LDLR/3MR мышей (см. обведенные кружком бляшки (овалом) на Фигурах 55А-В, соответственно) собирали, делали срезы и окрашивали, чтобы охарактеризовать общую структуру атеросклеротических бляшек. Значком "#" показан жир, локализованный на внешней стороне аорты (см. Фигуру 55А). Бляшки, помеченные значками "*" и "**" на Фигурах 55А и В, соответственно, показаны в виде окрашенных срезов на Фигурах 55В и D, соответственно. Как проиллюстрировано на Фигурах 55В и D, клиренс стареющих клеток у получавших ганцикловир LDLR/3MR мышей влиял на морфологию бляшек по сравнению с LDLR контрольными мышами. Бляшки, взятые у контрольных мышей, имели поддающиеся распознаванию "липидные скопления (карманы)". В бляшках получавших ганцикловир LDLR/3MR мышей наблюдалась толстая "фибриновая шапочка" и отсутствие липидных карманов. Нарушение или разрыв "шапочки" богатой липидами бляшки является фактором, запускающим коронарные события за счет контакта тромбогенных компонентов бляшки с тромбоцитами и компонентами свертывания крови. Бляшки, которые растут быстрее в результате быстрого отложения липидов и имеют тонкие "фибриновые шапочки", склонны к разрыву. Медленно растущие бляшки со сформировавшимися "фибриновыми шапочками" имеют тенденцию к стабилизации, а не к разрыву. Взятые вместе, эти эксперименты показывают, что удаление стареющих клеток может влиять на структуру атеросклеротических бляшек и оказывает стабилизирующее действие.
Из срезов тканей атеросклеротических аорт готовили препараты и окрашивали их для обнаружения SA-β-GAL. Кристаллы X-GAL локализовались в лизосомах несущих липиды пенистых клеток (пенистых макрофагов) и гладкомышечных пенистых клеток (см. Фигуры 56-58).
ПРИМЕР 25
ЭФФЕКТ КЛИРЕНСА СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК НА МОДЕЛЯХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ
2
2
2
В одном исследовании на животной модели определяли влияние клиренса стареющих клеток у линии трансгенных мышей 3MR с вызванным блеомицином поражением легких. У мышиной модели вызываемого блеомицином идиопатического фиброза легких фиброз легких развивался в течение 7-14 дней после обработки блеомицином (см., например, Limjunyawong et al., 2014, Physiological Reports 2: e00249; Daniels et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1308-1316). Анестезированным 6-8-недельным 3MR мышам вводили блеомицин посредством интратрахеальной аспирации (2.5 Ед/кг блеомицина в 50 мкл PBS) с помощью шприца-микрораспылителя (Penn-Century, Inc.), как описано в публикации Daniels et al. (2004, J. Clin. Invest. 114: 1308-1316). Контрольным мышам вводили физиологический раствор. Через день после введения блеомицина вводили ганцикловир (GCV) (25 мг/кг в PBS). 3MR мышам вводили ганцикловир с помощью интраперитонеальной инъекции в течение 5 дней подряд, затем был отдых в течение 5 дней, а затем второй цикл лечения в течение 5 дней подряд. Не подлежащим лечению мышам вводили равные объемы носителя. На 7, 14 и 21 день после введения блеомицина проверяли функцию легких, проводя мониторинг насыщения кислородом с помощью пульсоксиметра MouseSTAT PhysioSuite (Kent Scientific). Мышей анестезировали изофлураном (1.5%) и фиксировали с помощью зажима для лап. Мониторинг мышей вели в течение 30 секунд и рассчитывали среднее значение насыщения периферической капиллярной крови кислородом (SpO) в течение этого времени. Как показано на Фигуре 59, введение блеомицина резко понизило уровни SpO у получивших его мышей, а удаление стареющих клеток привело к повышению уровней SpO, которые достигли нормального значения на 21 день после введения блеомицина. На 21 день после введения блеомицина у мышей изучали гиперреактивность (гиперчувствительность) дыхательных путей (AHR). AHR мышей количественно определяли провокационной пробой с метахолином, тогда как другие показатели функции легких (легочную механику (механику дыхательных путей), объем легких (легочный объем) и податливость легочной ткани) определяли, используя аппарат для искусственной вентиляции легких (респиратор) SCIREQ flexiVent. У мышей, анестезированных кетамином/ксилазином, делали разрез в трахее (трахеостому) и в эту трахеостому вводили катетер (тупая игла диаметром 19 Fr, с наконечником Люэра), сопротивление дыхательных путей (эластичность) и податливость мышей определяли в начале исследования и в ответ на повышающиеся концентрации метахолина (от 0 до 50 мг/мл в PBS), доставляемого с помощью распыления (AeroNeb), как описано в публикации Aravamudan et al. (Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. (2012) 303: L669-L681). У животных поддерживали температуру 37°С, в то время как панкуроний вызвал паралич мышц; функцию дыхательных путей количественно определяли с помощью аппарата для искусственной вентиляции легких (респиратора) FlexiVent™ и системы легочной механики (SCIREQ, Montreal, Quebec, Canada), которая размещена на Stabile 8. Как показано на Фигуре 60А, у мышей, получавших носитель, введение блеомицина повышало эластичность легких, тогда как лечение ганцикловиром снижало эластичность легких. Как показано на Фигурах 60В-С, введение блеомицина снижало статическую податливость и (динамическую) податливость у мышей, получавших носитель. Клиренс стареющих клеток с помощью ганцикловира у мышей, подвергавшихся воздействию блеомицина, значения податливости заметно улучшались (Фигуры 60В-С). Не являясь статистически значимыми из-за слишком малого размера группы животных, эти результаты говорят о том, что клиренс стареющих клеток с помощью сенолитического агента (нутлина-3А) также снижал эластичность легких и повышал податливость легких у мышей, подвергшихся воздействию блеомицина. Мышей усыпляли с помощью и.п.(интраперитонеальной) инъекции пентобарбитала. Получали жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL, БАЛЖ) и легких и анализировали. Содержание гидроксипролина в легких определяли, как описано в публикации Christensen et al. (1999, Am. J. Pathol. 155: 1773-1779), и проводили количественное гистопатологическое исследование. Из легочной ткани извлекали РНК для количественного определения маркеров стареющих клеток с помощью qRT-PCR у обработанных (пролеченных) и контрольных мышей.
Ink4a
Ink4a
Ink4a
Действие клиренса стареющих клеток на модели IPF вызванного блеомицином поражения легких можно также изучать на INK-ATTAC трансгенных мышах в соответствии с описанным выше дизайном исследования. Трансгенные мыши INK-ATTAC (p16 апоптоз с использованием активации каспазы) содержат FK506-связывающий белок (FKBP)-каспаза 8 (Casp8) слитый полипептид под контролем промотора p16 (см., например. Baker et al., Nature, supra; Международная опубликованная заявка № WO/2012/177927). В присутствии АР20187 синтетическое лекарственное средство индуцирует димеризацию слитого (гибридного, химерного) белка "мембраносвязанный миристоилированный FKBP-Casp8", при этом стареющие клетки, специфически экспрессирующие слитый белок FKBP-Casp8 при посредстве промотора p16, претерпевают запрограммированную клеточную гибель (апоптоз) (см., например, Baker, Nature, supra. Фигура 1 в этой статье).
Во втором исследовании также определяли эффект клиренса стареющих клеток с использованием сенолитического агента на C57BL6/J мышах с поражением легких, вызванным воздействием блеомицина. Блеомицин вводили 6-недельным мышам C57BL6/J, как описано выше. Сенолитический агент вводили в течение первой и третьей недели после обработки блеомицином. Контрольным мышам вводили носитель. Через 21 день после обработки блеомицином изучали клиренс стареющих клеток и функцию легких/гистопатологию.
При исследовании на второй животной модели легочных заболеваний (например, COPD, ХОБЛ, хронической обструктивной болезни легких) мышей подвергали воздействию табачного (сигаретного) дыма. Влияние сенолитического агента на мышей, подвергшихся воздействию дыма, оценивали, изучая клиренс стареющих клеток, функцию легких и гистопатологию.
3
3
Шестинедельных мышей 3MR (n=35) или INK-ATTAC (n=35) постоянно подвергали воздействию сигаретного дыма, генерируемого курительной машиной Teague ТЕ-10 с автоматическим контролем, вырабатывавшей комбинацию побочного и основного сигаретного дыма в камере, которая переносила его в сборную камеру и камеру смешения, где различные количества воздуха смешивались с дымообразующей смесью. Был модифицирован протокол COPD центральной лаборатории COPD в Университете Джона Хопкинса (сайт в Интернете web.jhu.edu/Biswal/exposure_core/copd.html#Cigarette_Smoke) (Rangasamy et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1248-1259; Yao et al., 2012, J. Clin. Invest. 122: 2032-2045). Мыши подвергались воздействию сигаретного дыма в целом 6 часов ежедневно, 5 дней в неделю в течение 6 месяцев. Струи дыма от каждой зажженной сигареты (исследовательские сигареты 3R4F, содержащие 10.9 мг всех твердых частиц (дыма) (ТРМ), 9.4 мг смолы, 0.726 мг никотина и 11.9 мг монооксида углерода на сигарету [University of Kentucky, Lexington, KY]) пускали в течение 2 секунд и один раз каждую минуту всего 8 раз со скоростью струи 1.05 л/мин, для обеспечения стандартной струи 35 см. Работу курительной машины корректировали таким образом, чтобы получить смесь побочной струи дыма (89%) и основной струи дыма (11%) при одновременном горении 2 сигарет. Воздух в курительной камере контролировали с целью определить содержание всех взвешенных частиц (80-120 мг/м) монооксида углерода (350 ppm (м.д., миллионных долей)). Начиная со дня 7, (10) мышам INK-ATTAC и (10) мышам 3MR вводили АР20187 (3х в неделю) или ганцикловир (вводили 5 дней подряд, затем "лекарственные каникулы" (отдых) в течение 16 дней, повторяли до окончания эксперимента), соответственно. Равное число мышей получало соответствующий носитель. Остальных 30 мышей (15 INK-ATTAC и 15 3MR) равномерно делили на три разные экспериментальные группы, в каждую из которых входило по 5 мышей каждой генетически модифицированной линии. Одна группа (n=10) получала нутлин-3А (25 мг/кг в растворе 10% DMSO/3% Tween-20 в PBS, вводили 14 дней подряд, а затем "лекарственные каникулы" в течение 14 дней, повторяли до окончания эксперимента). Одна группа (n=10) получала АВТ-263 (навитоклакс, Navitoclax) (100 мг/кг в растворе 15% DMSO/5% Tween-20, вводили 7 дней подряд, затем "лекарственные каникулы" в течение 14 дней, повторяли до окончания эксперимента), и последняя группа (n=10) получала только носитель, используемый для АВТ-263 (15% DMSO/5% Tween-20), по той же самой схеме, что и АВТ-263. Еще 70 дополнительных животных, не подвергавшихся действию сигаретного дыма, использовали в эксперименте в качестве контрольных.
2
2
После воздействия сигаретного дыма в течение двух месяцев проверяли функцию легких, контролируя насыщение кислородом с помощью пульсоксиметра MouseSTAT PhysioSuite (Kent Scientific). Животных анестезировали изофлураном (1.5%) и фиксировали с помощью зажима для лап. Мониторинг мышей вели в течение 30 секунд и рассчитывали среднее значение насыщения периферической капиллярной крови кислородом (SpO) в течение этого времени. Как показано на Фигуре 61, клиренс стареющих клеток с использованием АР20187, ганцикловира, АВТ-263 (Navi) или нутлина-3А вызывал статистически значимое повышение уровней SpO у мышей после воздействия сигаретного дыма в течение 2 месяцев по сравнению с непролеченными контрольными животными.
По окончании исследования изучали гиперреактивность (гиперчувствительность) дыхательных путей (AHR) мышей к провокационной пробе с метахолином с использованием аппарата для искусственной вентиляции легких (респиратора) SCIREQ flexiVent и системы легочной механики, как описано выше. После измерения AHR мышей умерщвляли с помощью и.п. инъекции пентобарбитала с целью углубленного изучения гистопатологии легких, как описано ранее (Rangasamy et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1248-1259). Коротко говоря, легкие надували, заполняя 0.5% низкоплавкой агарозой при постоянном давлении 25 см. Часть легочной ткани собирали для извлечения (экстракции) РНК и qRT-PCR анализа маркеров старения. Другие части легких фиксировали в 10% буферном формалине и заключали в парафин. Срезы (5 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином. Средний диаметр альвеол, длину альвеол и средние intercepts для линейной регрессии определяли с помощью компьютерной морфометрии с использованием программы Image Pro Plus (Media Cybernetics).
Потенциальный терапевтический эффект клиренса стареющих клеток после полностью развившейся COPD можно оценивать на мышах 3MR или INK-ATTAC. Шестинедельных мышей 3MR или INK-ATTAC постоянно подвергали воздействию сигаретного дыма в течение 6 месяцев, как описано выше. Через 6 месяцев после начала воздействия дыма 3MR или INK-ATTAC мышам вводили ганцикловир (лечение 5 дней подряд, затем в течение 16 дней "лекарственные каникулы") или АР20187 (3х/неделя), соответственно, вплоть до 9 месяцев после начала воздействия дыма, когда проводили изучение клиренса стареющих клеток, функции легких и гистопатологическое исследование.
ПРИМЕР 26
IN VITRO КЛЕТОЧНЫЕ АНАЛИЗЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ MDM2 ИНГИБИТОРА RG-7112
Легочные фибробласты линии IMR90 (первичные легочные фибробласты человека, АТСС CCL-186TM, Manassas, Virginia) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение с использованием ионизирующего излучения (IR) с поглощенной дозой 10 Гр. Фенотип старения формировали в течение по меньшей мере 7 дней.
После формирования фенотипа старения клетки пересевали в 96-луночные планшеты и стареющие клетки (облученные) и нестареющие клетки (необлученные клетки) в течение 3 или 6 дней экспонировали с MDM2 ингибитором RG-7112 (см. структуру на Фигуре 62А), готовя восемь двукратных серийных разведении, начиная со 100 мкМ. Через три дня определяли выживаемость клеток, используя продажный набор CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Анализ позволяет найти число жизнеспособных клеток в культуре путем количественного определения присутствующего АТР (АТФ, аденозин трифосфата), который является индикатором метаболически активных клеток. На Фигуре 62 показана выживаемость клеток IMR90 после экспозиции с RG-7112 в течение трех дней (см. Фигуру 62В) и после шести дней (см. Фигуру 62С).
ПРИМЕР 27
ВЛИЯНИЕ КЛИРЕНСА СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ АВТ-263 НА УМЕНЬШЕНИЕ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ ХИМИОТЕРАПИИ
Способность сенолитического агента, такого как АВТ-263, уменьшать побочные эффекты химиотерапии, например, такие как слабость (вялость, усталость), изучали на p16-3MR трансгенных мышах. Помимо доксорубицина клеточное старение индуцирует также введенный животным паклитаксел. См. описание p16-3MR трансгенной мышиной модели в Примере 2.
Паклитаксел индуцирует старение и SASP у p16-3MR трансгенных мышей. Группам мышей (n=4) три раза каждые два дня вводили 20 мг/кг паклитаксела или носителя. Старение у мышей, получавших паклитаксел, наблюдали с помощью люминесценции (см. Фигуру 63А). Уровень мРНК определяли для каждого из генов-мишеней (целевых генов): р16, 3MR трансгена и IL-6. Как показано на Фигуре 63В, уровни мРНК для каждого из р16, 3MR и IL-6 повышены у мышей, получавших паклитаксел, по сравнению с животными, получавшими носитель.
Принципиальная схема эксперимента представлена на Фигуре 64. В этом эксперименте паклитаксел вводили группам р16-3mr мышей (n=4) три раза, каждые два дня. Через три дня после введения третьей дозы паклитаксела в течение трех дней (дни 1, 2 и 3) интраперитонеально вводили ганцикловир в дозировке 25 мг/кг. АВТ-263 (100 мг/кг) вводили интраперитонеально в течение семи дней после введения паклитаксела. Через два дня после последней дозы АВТ-263 все группы животных помещали в метаболические клетки (Promethion, Sable Systems International, Las Vegas, NV) для мониторинга произвольных упражнений, определяемых числом оборотов колеса (по показаниям счетчика). Через два дня данные собирали и анализировали. Результаты показаны на Фигуре 64 (рисунок слева). Клиренс стареющих клеток с помощью АВТ-263 и ганцикловира позволил восстановить примерно 70% вызванного химиотерапией снижения числа оборотов колеса.
ПРИМЕР 28
ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВА, ВЫЗЫВАЮЩИЕ СТАРЕНИЕ
Для изучения старения, вызванного различными химиотерапевтическими лекарствами, группам р16-3MR животных (n=4) давали талидомид (100 мг/кг; 7 инъекций, ежедневно в течение 7 дней); ромидепсин (1 мг/кг; 3 инъекции); помалидомид (5 мг/кг; 7 инъекций, ежедневно в течение 7 дней); леналидомид (50 мг/кг; 7 инъекций, ежедневно в течение 7 дней); 5-азацитидин (5 мг/кг; 3 инъекции) и сравнивали с доксорубицином (10 мг/кг, 2-4 инъекции в течение 7 дней). Уровень люминесценции у животных, получавших эти лекарства, показан на Фигуре 65. Результатом введения животным помалидомида, леналидомида и доксорубицина было значительное повышение уровней стареющих клеток (р<0.05).
ПРИМЕР 29
МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ, СВЯЗАННЫЕ СО СТАРЕНИЕМ
Протеомные анализы с использованием нано LC MS/MS проводили на лизатах человеческих преадипоцитов абдоминальной подкожной жировой ткани, стареющих или нестареющих. Преадипоциты, один из самых распространенных типов клеток у людей, восприимчивых к старению, извлекали (экстрагировали) из жировых тканей девяти различных здоровых доноров почек для пересадки посредством расщепления коллагеназой. Предварительное согласие доноров было получено. Старение вызывали либо облучением с поглощенной дозой 10 Гр, либо с помощью серийных пассажей. Для идентификации метаболических путей (каскадов реакций), чувствительных к современным лекарствам и способных опосредовать гибель клеток, применяли методы биоинформатики.
Активность ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β gal) использовали для оценки процентного содержания стареющих клеток в облученных культурах клеток. В данном эксперименте для того, чтобы культура считалась стареющей культурой, необходимо, чтобы 75% или более клеток продемонстрировало SA-β gal активность. Собирали как лизаты цельных клеток, так и клеточные супернатанты. Белки разделяли с использованием одномерного ID SDS-PAGE. Сегменты гелей обесцвечивали, восстанавливали, алкилировали и расщепляли трипсином. Экстрагированные пептиды анализировали с помощью нано-LC-MS/MS на масс-спектрометре Thermo Scientific™ Q Exactive. Для идентификации и количественной характеристики белков применяли программу LC Progenesis (Nonlinear Dynamics, UK). Затем, используя эти данные, с помощью программ Ingenuity, Metacore, Cytoscape и другого программного обеспечения проводили анализ метаболических путей (каскадов реакций) и белковых сетей. Среди метаболических путей, меняющихся в процессе старения, были каскады реакций, участвующие в передаче сигнала выживания клеток, и воспалительные метаболические пути. Эти метаболические пути включают по меньшей мере PI3K/AKT, Src-киназный путь передачи сигнала, инсулин/IGF-1 сигнальный путь, р38/MAPK, NF-κВ сигнальный путь, TGFβ сигнальный путь и трансляцию mTOR/белок.
На Фигуре 66 представлен подтверждающий Вестерн-блот (иммуноблот) белков, принимающих участие в данном и родственных каскадах реакций, в различное время (24 час; 3, 6, 8, 11, 15, 20 и 25 дни) после облучения. Фосфорилированные полипептиды в образцах стареющих клеток обнаруживали с использованием антител, меченных пероксидазой хрена (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), специфических к полипептидам, указанным на Фигуре 66. Старение этих клеток полностью формируется между 25 днем и 30 днем.
ПРИМЕР 30
СТАРЕНИЕ, ВЫЗЫВАЕМОЕ ПИЩЕЙ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ЖИРОВ, УМЕНЬШАЕТСЯ С ПОМОЩЬЮ СЕНОЛИТИЧЕСКОГО АГЕНТА У P16-3MR МЫШЕЙ
Группы p16-3MR мышей (n=6) держали на диете с высоким содержанием жиров (60% жира) в течение четырех месяцев или на обычной диете. Присутствие стареющих клеток определяли, измеряя люминесценцию (т.е. р16 положительные клетки). Как показано на Фигуре 67, у животных, которых держали на высокожирной диете, наблюдались повышенные количества стареющих клеток по сравнению с животными, получавшими обычный корм.
Затем животным давали ганцикловир или носитель, чтобы определить, уменьшилось ли число стареющих клеток в жировой ткани после удаления стареющих клеток. Группам животных давали ганцикловир или носитель. Ганцикловир (25 мг/кг) вводили ежедневно в течение пяти дней подряд. Присутствие стареющих клеток в периренальной, эпидидимальной или подкожно-жировой ткани в паховой области детектировали окрашиванием с помощью SA-β-Gal. Данные анализировали методом ANOVA. Результаты представлены на Фигуре 68. Значительное уменьшение количества стареющих клеток наблюдали в эпидидимальной жировой ткани, р=<0.004.
ПРИМЕР 31
КЛИРЕНС СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК ПОВЫШАЕТ ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ГЛЮКОЗЕ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ИНСУЛИНУ
Группам p16-3MR мышей (n=9) в течение четырех месяцев давали высокожирный корм или обычный корм. Затем животным вводили ганцикловир (3 цикла, включающих ежедневное введение 25 мг/кг ганцикловира в течение пяти дней подряд) или носитель. В момент ноль вводили болюс глюкозы и контролировали уровень глюкозы в крови через 20, 30, 60 и 120 минут после доставки глюкозы с целью определить утилизацию глюкозы (см. Фигуру 69А). Ее можно также количественно определить как "площадь под кривой" (AUC) (см. Фигуры 69В и 69С), при этом повышенное значение AUC указывает на нарушение толерантности к глюкозе. Значения AUCs у мышей, получавших ганцикловир, были значительно ниже, чем у их сородичей, получавших носитель, хотя не такой низкий, как у животных, получавших обычный (нормальный) корм. Гемоглобин A1c был ниже у мышей, получавших ганцикловир (см. Фигуру 69С), это говорит о том, что также улучшилось более продолжительное удерживание глюкозы.
Также определяли чувствительность к инсулину (инсулиновый тест толерантности (ITT)). Результаты представлены на Фигуре 70. У мышей, получавших ганцикловир, снижение содержания глюкозы в крови было выше через 0, 14, 30, 60 и 120 минут после введения болюса глюкозы в момент ноль (см. Фигуру 70А), это говорит о том, что клиренс стареющих клеток повышал чувствительность к инсулину. В том случае, когда ганцикловир вводили мышам дикого типа, изменения в инсулиновом тесте толерантности не наблюдалось (см. Фигуру 70В).
Также проверяли изменение массы тела (веса), композиционного состава тела и потребления пища. Введение ганцикловира не изменяло массу тела, композиционный состав тела, который контролировали, определяя процентное содержание жировой ткани, или потребление пищи (измеряемое в граммах в неделю).
ПРИМЕР 32
СЕНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ A BCL-2/BCL-XL ИНГИБИТОРА
Для определения выживаемости клеток после обработки с помощью А-1155463 проводили анализ жизнеспособности клеток. Общий план (хронология) и методы подсчета клеток представлены на Фигуре 18 и описаны в Примере 7. Клетки IMR90 (первичные легочные фибробласты человека) засевали в шестилуночные планшеты и вызывали старение клеток под действием ионизирующего излучения (IR) 10 Гр (День 0). Среду обновляли каждые 3 дня. Фенотип старения формировали в течение 7 дней, после чего проводили подсчет клеток, чтобы определить начальное число клеток, а затем засевали в 96-луночные планшеты. На 8 День стареющие клетки (облученные) и нестареющие клетки (необлученные клетки) экспонировали с серийными разведениями А-1155463, эту экспозицию продолжали в течение 3 дней. Интервалы концентраций АВТ-263 составляли от 0.5 нМ до 3 мкМ. Культивирование в различных условиях проводили в тройном повторе. Проводили анализ на выживаемость клеток с использованием продажного набора CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay. Анализ позволяет выяснять число жизнеспособных клеток в культуре путем количественного определения присутствующего АТР (АТФ, аденозин трифосфата), который является индикатором метаболически активных клеток.
На Фигуре 72 показаны кривые IC50 для А-1155463 в стареющих клетках и в нестареющих клетках. Кривая IC50 представляет собой график, показывающий процент выживаемости клеток после обработки.
Различные варианты, описанные выше, можно комбинировать, получая дополнительные варианты. Все патенты США, заявки на патенты США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты и публикации непатентных материалов, на которые имеются отсылки в данном описании и/или которые перечислены в информационном листке заявки, включая предварительные заявки на патент США регистрационные №№61/932,704, поданную 28 января 2014 года; 61/932,711, поданную 28 января 2014 года; 61/979,911, поданную 15 апреля 2014 года; 62/002,709, поданную 23 мая 2014 года; 62/042,708, поданную 27 августа 2014 года; 62/044,664, поданную 2 сентября 2014 года; 62/057,820, поданную 30 сентября 2014 года; 62/057,825, поданную 30 сентября 2014 года; 62/057,828, поданную 30 сентября 2014 года; 62/061,627, поданную 8 октября 2014 года; и 62/061,629, поданную 8 октября 2014 года, полностью включены в данное изобретение посредством отсылки. Аспекты изобретений можно модифицировать при необходимости использовать замысел различных патентов, заявок и публикаций для создания дополнительных вариантов.
Эти и другие изменения можно ввести в варианты изобретения в свете представленного выше подробного описания. В целом не следует рассматривать термины, используемые в нижеприведенной Формуле изобретения, как ограничивающие Формулу изобретения конкретными вариантами, раскрываемыми в описании и в Формуле изобретения, но следует рассматривать, что изобретение включает все возможные варианты наряду со всеми эквивалентами, на которые такая Формула изобретения имеет право. Соответственно, Формула изобретения не ограничена данным описанием.