КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛИ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TUMOUR

Родственная заявка
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной патентной заявке США № 61/330698 от 3 мая 2010 г., полное описание которой включено в настоящий документ посредством данной ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям веществ, пригодных для диагностики и лечения опухолей млекопитающих, и к способам применения этих композиций веществ для вышеуказанных целей.
Уровень техники
Злокачественные (раковые) опухоли являются второй по значимости причиной смертности в США после сердечно-сосудистых заболеваний (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). Рак характеризуется увеличением количества аномальных, или неопластических, клеток, происходящих из нормальной ткани, которые пролиферируют, образуя опухолевую массу, инвазией прилежащих тканей этими неопластическими опухолевыми клетками и образованием злокачественных клеток, которые с течением времени распространяются по кровеносной или лимфатической системе в региональные лимфатические узлы и в удаленные органы в ходе способа, называемого метастазированием. В злокачественном состоянии клетка пролиферирует при условиях, в которых не происходит роста нормальных клеток. Рак проявляется в разнообразных формах, характеризующихся различной степенью инвазионной способности и агрессивности.
Пытаясь обнаружить эффективные клеточные мишени для диагностики и терапии рака, исследователи преследуют цели идентификации трансмембранных или иным образом ассоциированных с мембраной полипептидов, специфически экспрессирующихся на поверхности одного или более конкретного(ых) вида(ов) раковых клеток по сравнению с одной или более нормальной(ых) нераковой(ых) клеткой(ми). Часто такие ассоциированные с мембраной полипептиды в большем количестве экспрессируются на поверхности раковых клеток по сравнению с поверхностью нераковых клеток. Идентификация таких антигенных полипептидов, ассоциированных с поверхностью раковых клеток, дает возможность специфического адресного разрушения раковых клеток за счет терапии, основанной на использовании антител. В этом отношении следует отметить, что терапия, основанная на использовании антител, продемонстрировала высокую эффективность при лечении некоторых видов рака. Например, герцептин (HERCEPTIN) и ритуксан (RITUXAN) (производимые Genentech Inc., Южный Сан-Франциско, штат Калифорния, США) представляют собой антитела, успешно применяемые для лечения рака молочной железы и неходжкинской лимфомы, соответственно. Конкретнее, HERCEPTIN представляет собой гуманизированные моноклональные антитела, получаемые за счет использования рекомбинантной ДНК, которые селективно связываются с внеклеточным доменом протоонкогена - рецептора-2 эпидермального фактора роста человека (HER2). Сверхэкспрессия белка HER2 наблюдается при 25-30% случаев первичного рака молочной железы. RITUXAN представляет собой рекомбинантные химерные моноклональные антитела мыши/человека против антигена CD20, находящегося на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов. Оба этих антитела рекомбинантно продуцируют в клетках CHO.
Несмотря на вышеописанные достижения терапии рака млекопитающих, существует значительная потребность в дополнительных диагностических и терапевтических агентах, способных обнаруживать наличие опухоли в организме млекопитающего и эффективно подавлять рост неопластических клеток, соответственно. В связи с этим, целью данного изобретения является идентификация полипептидов, ассоциированных с клеточной мембраной, которые в большем количестве экспрессируются на раковой(ых) клетке(ах) одного или более видов по сравнению с нормальными клетками или другими раковыми клетками, и использование таких полипептидов и нуклеиновых кислот, кодирующих их, для получения композиций веществ, пригодных для лечения и диагностического обнаружения рака у млекопитающих.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном патентном описании авторы изобретения впервые описывают идентификацию клеточных полипептидов (и нуклеиновых кислот, кодирующих их, или фрагментов этих соединений), экспрессирующихся в большей степени на поверхности одного или более типов раковых клеток по сравнению с поверхностью одного или более типов нормальных нераковых клеток. Эти полипептиды в настоящем документе называют опухолеассоциированными антигенными полипептидами-мишенями (Tumor-associated Antigenic Target, "TAT"-полипептидами); ожидается, что они могут служить эффективными мишенями для терапии и диагностики рака у млекопитающих.
В связи с этим, в одном из вариантов воплощения настоящего изобретения изобретение представляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую нуклеотидной последовательностью, кодирующей опухолеассоциированный антигенный полипептид-мишень или его фрагмент ("TAT"-полипептид).
В некоторых аспектах выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью нуклеотидной последовательности, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью нуклеотидной последовательности с (a) молекулой ДНК, кодирующей полноразмерный TAT-полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, как описано здесь, аминокислотную последовательность TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, внеклеточный домен трансмембранного TAT-полипептида, содержащий или не содержащий сигнальный пептид, как описано здесь, или любой другой конкретно определенный фрагмент аминокислотной последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь, либо (б) последовательностью, комплементарной молекуле ДНК согласно (a).
В других аспектах выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью нуклеотидной последовательности, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью нуклеотидной последовательности с (a) молекулой ДНК, включающей кодирующую последовательность кДНК полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь, кодирующую последовательность TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, кодирующую последовательность внеклеточного домена трансмембранного TAT-полипептида, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, как описано здесь, или кодирующую последовательность любого другого конкретно определенного фрагмента аминокислотной последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь, либо (б) последовательностью, комплементарной молекуле ДНК согласно (a).
Еще один аспект изобретения представляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую TAT-полипептид с либо удаленным, либо инактивированным трансмембранным доменом, или комплементарную такой кодирующей нуклеотидной последовательности, причем трансмембранный(е) домен(ы) такого(их) полипептида(ов) соответствует(ют) описанию здесь. Таким образом, настоящее изобретение рассматривает растворимые внеклеточные домены TAT-полипептидов, описанных здесь.
В других аспектах настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с (a) нуклеотидной последовательностью, кодирующей полноразмерный TAT-полипептид, обладающий полноразмерной аминокислотной последовательностью, как описано здесь, аминокислотную последовательность TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, внеклеточный домен трансмембранного TAT-полипептида, содержащий или не содержащий сигнальный пептид, как описано здесь, или любой другой конкретно определенный фрагмент аминокислотной последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь, либо (б) последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности согласно (a). В связи с этим, вариант воплощения настоящего изобретения относится к фрагментам полноразмерной кодирующей последовательности TAT-полипептида или комплементарной ей последовательности, как описано здесь, которые могут находить применение, например, в качестве гибридизационных зондов, используемых, например, в качестве диагностических зондов, ПЦР-праймеров, антисмысловых олигонуклеотидных зондов, или к кодирующим фрагментам полноразмерного TAT-полипептида, которые необязательно могут кодировать полипептид, содержащий сайт связывания антител против TAT-полипептида. Такие фрагменты нуклеиновых кислот обычно обладают длиной по меньшей мере приблизительно 5 нуклеотидов, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов в длину, причем в этом контексте термин "приблизительно" означает указанную длину нуклеотидной последовательности плюс-минус 10% этой указанной длины. Кроме того, такие фрагменты нуклеиновых кислот обычно содержат последовательные нуклеотиды, происходящие из полноразмерной кодирующей последовательности TAT-полипептида или комплементарной ей последовательности. Отмечено, что новые фрагменты нуклеотидной последовательности, кодирующей TAT-полипептид, или ее комплементарной последовательности, можно определить в рабочем порядке путем выравнивания нуклеотидной последовательности, кодирующей TAT-полипептид, с другими известными нуклеотидными последовательностями с помощью любой из общеизвестных программ выравнивания последовательностей, и определения того, какой(ие) фрагмент(ы) нуклеотидной последовательности, кодирующей TAT-полипептид, или комплементарной ей последовательности, являются новыми. Все из таких новых фрагментов нуклеотидных последовательностей, кодирующих TAT-полипептиды, или последовательностей, комплементарных им, рассматриваются здесь. Кроме того, рассматриваются фрагменты TAT-полипептидов, кодируемые этими фрагментами нуклеотидных молекул, предпочтительно, фрагменты TAT-полипептидов, включающие сайт связывания антител против TAT.
В еще одном варианте воплощения изобретение представляет выделенные TAT-полипептиды, кодируемые любой из вышеуказанных выделенных нуклеотидных последовательностей.
В некоторых аспектах изобретение относится к выделенному TAT-полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с полноразмерным TAT-полипептидом, обладающим полноразмерной аминокислотной последовательностью, как описано здесь, аминокислотной последовательностью TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, внеклеточным доменом белка трансмембранного TAT-полипептида, содержащим или не содержащим сигнальный пептид, как описано здесь, аминокислотной последовательностью, кодируемой любой из нуклеотидных последовательностей, описанных здесь, или любым другим конкретно определенным фрагментом аминокислотной последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь.
В других дополнительных аспектах изобретение относится к выделенному TAT-полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, гибридизующейся с последовательностью, комплементарной последовательности молекулы ДНК, кодирующей (а) TAT-полипептид, обладающий полноразмерной аминокислотной последовательностью, как описано здесь, (б) аминокислотную последовательность TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, (в) внеклеточный домен белка трансмембранного TAT-полипептида, содержащий или не содержащий сигнальный пептид, как описано здесь, (г) аминокислотную последовательность, кодируемую любой из нуклеотидных последовательностей, описанных здесь, или (е) любой другой конкретно определенный фрагмент аминокислотной последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь.
В определенном аспекте изобретение представляет выделенный TAT-полипептид без N-концевой сигнальной последовательности и/или без инициирующего метионина, кодируемый нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную выше. Здесь также описаны способы для получения указанных соединений, причем указанные способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, содержащий соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, при условиях, подходящих для экспрессии TAT-полипептида и выделения TAT-полипептида из культуры клеток.
Еще один из аспектов настоящего изобретения представляет выделенный TAT-полипептид, в котором трансмембранный домен либо удален, либо инактивирован. Здесь также описаны способы для получения указанных соединений, причем указанные способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, содержащий соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, при условиях, подходящих для экспрессии TAT-полипептида и выделения TAT-полипептида из культуры клеток.
В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения изобретение представляет вектор, включающий ДНК, кодирующую любой из полипептидов, описанных здесь. Кроме того, представлена клетка-хозяин, включающая любой из таких векторов. Например, клетки-хозяева могут представлять собой клетки CHO, клетки E. coli или клетки дрожжей. Кроме того, представлен способ для получения любого из описанных здесь полипептидов, включающий культивирование клеток-хозяев при условиях, подходящих для экспрессии желательного полипептида, и выделение желательного полипептида из культуры клеток.
В других вариантах воплощения изобретение представляет выделенные химерные полипептиды, включающие любой из описанных здесь TAT-полипептидов, объединенный с гетерологичным (не TAT) полипептидом. Примеры таких химерных молекул включают любой из описанных здесь TAT-полипептидов, объединенный с гетерологичным полипептидом, например, маркерной последовательностью эпитопа или Fc-областью иммуноглобулина.
В еще одном варианте воплощения изобретение представляет антитело, которое связывается, предпочтительно специфически, с любым из полипептидов, описанных выше или ниже. В необязательном случае антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, конкурентно ингибирующее связывание антитела против TAT-полипептида с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению можно необязательно конъюгировать с агентом, подавляющим рост, или цитотоксическим агентом, таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотиком, радиоактивным изотопом, нуклеолитическим ферментом или подобными агентами. Антитела по настоящему изобретению можно необязательно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках; в предпочтительном случае они подавляют рост или пролиферацию или индуцируют гибель клетки, с которой они связываются. Для диагностических целей антитела по настоящему изобретению можно метить обнаруживаемой меткой, прикреплять к твердому носителю и т.п.
В еще одном аспекте изобретение представляет биспецифическое антитело, способное связываться с первой клеткой, экспрессирующей TAT-полипептид, и со второй клеткой, экспрессирующей клеточный поверхностный антиген-мишень. В одном из вариантов воплощения вторая клетка представляет собой Т-клетку. В одном из вариантов воплощения клеточный поверхностный антиген-мишень представляет собой CD3.
В других вариантах воплощения настоящего изобретения изобретение представляет векторы, включающие ДНК, кодирующую любое из антител, описанных здесь. Кроме того, представлена клетка-хозяин, включающая любой из таких векторов. Например, клетки-хозяева могут представлять собой клетки CHO, клетки E. coli или клетки дрожжей. Кроме того, представлен способ для получения любого из описанных здесь антител, включающий культивирование клеток-хозяев при условиях, подходящих для экспрессии желательного антитела и выделения желательного антитела из культуры клеток.
В других вариантах воплощения изобретение относится к композиции веществ, включающей TAT-полипептид, как описано здесь, химерный TAT-полипептид, как описано здесь, или антитело против TAT-полипептида, как описано здесь, в комбинации с носителем. В необязательном случае носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель.
В еще одном варианте воплощения изобретение относится к изделию, включающему контейнер и композицию веществ, содержащуюся в контейнере, причем композиция веществ может включать TAT-полипептид, как описано здесь, химерный TAT-полипептид, как описано здесь, или антитела против TAT-полипептида, как описано здесь. В необязательном случае изделие также может включать этикетку, прикрепленную к контейнеру, или вкладыш в упаковку, вложенный в контейнер, которые относятся к применению композиции веществ для терапии или диагностического обнаружения опухоли.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к использованию TAT-полипептида, как описано здесь, химерного TAT-полипептида, как описано здесь, или антител против TAT-полипептида, как описано здесь, для изготовления медикамента, пригодного для лечения состояния, поддающегося воздействию TAT-полипептида, химерного TAT-полипептида или антител против TAT-полипептида.
Другие варианты воплощения настоящего изобретения относятся к любому выделенному антителу, включающему одну или более из последовательностей CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 или CDR-H3, описанных здесь, или к любому антителу, связывающемуся с тем же эпитопом, что и любое из таких антител.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу ингибирования роста клетки, экспрессирующей TAT-полипептид, причем указанный способ включает взаимодействие клетки с антителом, связывающимся с TAT-полипептидом, и связывание антитела с TAT-полипептидом вызывает ингибирование роста клетки, экспрессирующей TAT-полипептид. В предпочтительных вариантах воплощения клетка является раковой клеткой, а связывание антитела с TAT-полипептидом вызывает гибель клетки, экспрессирующей TAT-полипептид. В необязательном случае антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно конъюгировать с агентом, подавляющим рост, или цитотоксическим агентом, таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотиком, радиоактивным изотопом, нуклеолитическим ферментом или подобными агентами. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу лечения млекопитающего, организм которого содержит раковую опухоль, включающую клетки, экспрессирующие TAT-полипептид, причем указанный способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела, связывающегося с TAT-полипептидом, что приводит к лечению опухоли. В необязательном случае антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно конъюгировать с агентом, подавляющим рост, или цитотоксическим агентом, таким как токсин, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотиком, радиоактивным изотопом, нуклеолитическим ферментом или подобными агентами. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу определения присутствия TAT-полипептида в образце, предположительно содержащем TAT-полипептид, причем указанный способ включает воздействие антител, связывающихся с TAT-полипептидом, на образец, и определение связывания антител с TAT-полипептидом в образце, причем наличие такого связывания является признаком присутствия TAT-полипептида в образце. В необязательном случае образец может содержать клетки (которые могут являться раковыми клетками), предположительно экспрессирующие TAT-полипептид. Антитела, используемые в способе по настоящему изобретению, можно метить обнаруживаемой меткой, прикреплять к твердому носителю и т.п.
Другой вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу диагностики наличия опухоли в организме млекопитающего, включающему обнаружение уровня экспрессии гена, кодирующего TAT-полипептид (а) в тестируемом образце клеток ткани, полученном от указанного млекопитающего, и (б) в контрольном образце известных нормальных нераковых клеток этой же ткани, происхождения или типа, причем повышенный уровень экспрессии TAT-полипептида в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом является признаком наличия опухоли в организме млекопитающего, от которого получен тестируемый образец.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу диагностики наличия опухоли в организме млекопитающего, включающий (а) взаимодействие тестируемого образца, содержащего клетки ткани, полученные от млекопитающего, с антителами, связывающимися с TAT-полипептидом, и (б) обнаружение образования комплекса антител и TAT-полипептида в тестируемом образце, причем образование комплекса является признаком наличия опухоли в организме млекопитающего. В необязательном случае используемые антитела являются мечеными обнаруживаемой меткой, прикрепленными к твердому носителю и т.п., и/или тестируемый образец клеток ткани получен от особи, в организме которой предположительно находится раковая опухоль.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток, ассоциированного с измененной, предпочтительно повышенной, экспрессией или активностью TAT-полипептида, включающему введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антагониста TAT-полипептида. В предпочтительном случае расстройство пролиферации клеток представляет собой рак, а антагонист TAT-полипептида представляет собой антитело или антисмысловой олигонуклеотид против TAT-полипептида. Эффективное лечение или предотвращение расстройства пролиферации клеток может являться результатом прямого уничтожения или ингибирования роста клеток, экспрессирующих TAT-полипептид, или антагонизма активности TAT-полипептида, стимулирующей клеточный рост.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу связывания антител с клеткой, экспрессирующей TAT-полипептид, причем указанный способ включает взаимодействие клетки, экспрессирующей TAT-полипептид, с указанными антителами при условиях, подходящих для связывания антител с указанным TAT-полипептидом, и обеспечение их связывания друг с другом. В предпочтительных вариантах воплощения антитело метят молекулой или соединением, пригодным для качественного и/или количественного определения положения и/или количества связывания антител с клеткой.
Другие варианты воплощения настоящего изобретения относятся к использованию TAT-полипептида, нуклеиновой кислоты, кодирующей TAT-полипептид, или вектора или клетки-хозяина, содержащих эту нуклеиновую кислоту, или антител против TAT-полипептида, для изготовления медикамента, пригодного для (i) лечения или диагностического обнаружения рака или опухоли или (ii) лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу ингибирования роста раковой клетки, причем рост указанной раковой клетки по меньшей мере частично зависит от стимулирующего рост действия TAT-полипептида (причем TAT-полипептид может экспрессироваться самой раковой клеткой или клеткой, продуцирующей полипептид(ы), оказывающие стимулирующее рост действие на раковые клетки), причем указанный способ включает взаимодействие TAT-полипептида с антителом, связывающимся с TAT-полипептидом, тем самым оказывая антагонистическое действие на стимулирующую рост активность TAT-полипептида и, в свою очередь, подавляя рост раковой клетки. В предпочтительном случае рост раковой клетки полностью подавляется. В еще более предпочтительном случае связывание антитела с TAT-полипептидом вызывает гибель раковой клетки. В необязательном случае антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно конъюгировать с агентом, подавляющим рост, или цитотоксическим агентом, например, токсином, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотиком, радиоактивным изотопом, нуклеолитическим ферментом или подобными агентами. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках.
Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу лечения опухоли в организме млекопитающего, причем рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от стимулирующего рост действия TAT-полипептида, причем указанный способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества антител, связывающихся с TAT-полипептидом, за счет чего достигается антагонистическое действие на стимулирующую рост активность указанного TAT-полипептида и эффективное лечение опухоли. В необязательном случае антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно конъюгировать с агентом, подавляющим рост, или цитотоксическим агентом, например, токсином, включая, например, майтанзиноид или калихеамицин, антибиотиком, радиоактивным изотопом, нуклеолитическим ферментом или подобными агентами. Антитела, используемые в способах по настоящему изобретению, можно необязательно продуцировать в клетках CHO или бактериальных клетках.
В других вариантах воплощения изобретение относится к следующему набору потенциальных пунктов формулы изобретения этой или будущих заявок:
1. Выделенная нуклеиновая кислота, обладающая нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью нуклеотидной последовательности с (а) молекулой ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, (б) молекулой ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, без связанного с ней сигнального пептида, (в) молекулой ДНК, кодирующей внеклеточный домен полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) молекулой ДНК, кодирующей внеклеточный домен полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1, (е) полноразмерной кодирующей последовательностью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1 или (ж) последовательностью, комплементарной (a), (б), (в), (г), (д) или (е).
2. Выделенная нуклеиновая кислота, обладающая (а) нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, (б) нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, без связанного с ней сигнального пептида, (в) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1, (е) полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1 или (ж) последовательностью, комплементарной (a), (б), (в), (г), (д) или (е).
3. Выделенная нуклеиновая кислота, гибридизующаяся с (а) нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность, представленной как SEQ ID NO:2, (б) нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, без связанного с ней сигнального пептида, (в) нуклеиновой кислотой, кодирующей внеклеточный домен полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) нуклеиновой кислотой, кодирующей внеклеточный домен полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1, (е) полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1 или (ж) последовательностью, комплементарной (a), (б), (в), (г), (д) или (е).
4. Нуклеиновая кислота по п.3, отличающаяся тем, что гибридизация происходит при жестких условиях.
5. Нуклеиновая кислота по п.3, отличающаяся тем, что ее длина составляет по меньшей мере 5 нуклеотидов.
6. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1, 2 или 3.
7. Экспрессирующий вектор по п.6, отличающийся тем, что указанная нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной вектором.
8. Клетка-хозяин, включающая экспрессирующий вектор по п.7.
9. Клетка-хозяин по п.8, отличающаяся тем, что является клеткой CHO, клеткой E. coli или дрожжевой клеткой
10. Способ для получения полипептида, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8 при условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, и выделение желательного полипептида из культуры клеток.
11. Выделенный полипептид, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
12. Выделенный полипептид, обладающий (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
13. Химерный полипептид, отличающийся тем, что содержит полипептид по п.11 или 12, объединенный с гетерологичным полипептидом.
14. Химерный полипептид по п.13, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полипептид представляет собой маркерную последовательность эпитопа или Fc-область иммуноглобулина.
15. Выделенное антитело, связывающееся с полипептидом, характеризующимся по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
16. Выделенное антитело, связывающееся с полипептидом, обладающим (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
17. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что является моноклональным антителом.
18. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что является фрагментом антитела.
19. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что является химерным или гуманизированным антителом.
20. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что конъюгируется с агентом, подавляющим рост.
21. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что конъюгируется с цитотоксическим агентом.
22. Антитело по п.21, отличающееся тем, что указанный цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
23. Антитело по п.21, отличающееся тем, что цитотоксический агент представляет собой токсин.
24. Антитело по п.23, отличающееся тем, что токсин выбирают из группы, состоящей из майтанзиноида и калихеамицина.
25. Антитело по п.23, отличающееся тем, что токсин представляет собой майтанзиноид.
26. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что продуцировано бактериями.
27. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что продуцировано клетками CHO.
28. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что вызывает гибель клетки, с которой оно связывается.
29. Антитело по п.15 или 16, отличающееся тем, что мечено обнаруживаемой меткой.
30. Выделенная нуклеиновая кислота, обладающая нуклеотидной последовательностью, кодирующей антитело по п.15 или 16.
31. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.30, функционально связанную с регуляторными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной вектором.
32. Клетка-хозяин, включающая экспрессирующий вектор по п.31.
33. Клетка-хозяин по п.32, отличающаяся тем, что является клеткой CHO, клеткой E. coli или дрожжевой клеткой.
34. Способ продуцирования антител, включающий культивирование клетки-хозяина по п.32 при условиях, подходящих для экспрессии указанных антител, и выделение желательных антител из культуры клеток.
35. Композиция веществ, включающая (а) полипептид по п.11, (б) полипептид по п.12, (с) химерный полипептид по п.13, (г) антитело по п.15 или (е) антитело по п.16, в комбинации с носителем.
36. Композиция веществ по п.35, отличающаяся тем, что указанный носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель.
37. Изделие, включающее (а) контейнер; и (б) композицию веществ по п.35, содержащуюся в контейнере.
38. Изделие по п.37, отличающееся тем, что дополнительно включает этикетку, прикрепленную к указанному контейнеру, или вкладыш в упаковку, вложенный в указанный контейнер, которые относятся к применению указанной композиции веществ для терапии или диагностического обнаружения рака.
39. Способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей белок, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленнымм как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, причем указанный способ включает взаимодействие указанной клетки с антителом, связывающимся с указанным белком, а связывание указанного антитела с указанным белком вызывает ингибирование роста указанной клетки.
40. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанное антитело является моноклональным антителом.
41. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанное антитело является фрагментом антитела.
42. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанное антитело является химерным или гуманизированным антителом.
43. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с агентом, подавляющим рост.
44. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.
45. Способ по п.44, отличающийся тем, что указанный цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
46. Способ по п.44, отличающийся тем, что цитотоксический агент представляет собой токсин.
47. Способ по п.46, отличающийся тем, что токсин выбирают из группы, состоящей из майтанзиноида и калихеамицина.
48. Способ по п.46, отличающийся тем, что токсин представляет собой майтанзиноид.
49. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется бактериями.
50. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется клетками CHO.
51. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанная клетка является раковой клеткой.
52. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанную раковую клетку в дальнейшем подвергают воздействию радиации или химиотерапевтического агента.
53. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанную раковую клетку выбирают из группы, состоящей из клетки рака молочной железы, клетки рака ободочной и прямой кишки, клетки рака легких, клетки рака яичников, клетки рака центральной нервной системы, клетки рака печени, клетки рака мочевого пузыря, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака шейки матки, клетки рака предстательной железы, клетки меланомы и клетки лейкоза.
54. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанный белок в большем количестве экспрессируется указанной раковой клеткой по сравнению с нормальной клеткой, происходящей из той же ткани.
55. Способ по п.39, отличающийся тем, что вызывает гибель указанной клетки.
56. Способ по п.39, отличающийся тем, что указанный белок обладает (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
57. Способ лечения млекопитающего, имеющего раковую опухоль, включающую клетки, экспрессирующие белок, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1; или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, причем указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антител, связывающихся с указанным белком, за счет чего достигается эффективное лечение указанного млекопитающего.
58. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанное антитело является моноклональным антителом.
59. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанное антитело является фрагментом антитела.
60. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанное антитело является химерным или гуманизированным антителом.
61. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с агентом, подавляющим рост.
62. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.
63. Способ по п.62, отличающийся тем, что указанный цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
64. Способ по п.62, отличающийся тем, что цитотоксический агент представляет собой токсин.
65. Способ по п.64, отличающийся тем, что токсин выбирают из группы, состоящей из майтанзиноида и калихеамицина.
66. Способ по п.64, отличающийся тем, что токсин представляет собой майтанзиноид.
67. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется бактериями.
68. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется клетками CHO.
69. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанную опухоль в дальнейшем подвергают воздействию радиации или химиотерапевтического агента.
70. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, рак яичников, рак центральной нервной системы, рак печени, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы или рак шейки матки.
71. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанный белок в большем количестве экспрессируется раковыми клетками указанной опухоли по сравнению с нормальной клеткой, происходящей из той же ткани.
72. Способ по п.57, отличающийся тем, что указанный белок обладает (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
73. Способ определения присутствия белка в образце, предположительно содержащем указанный белок, причем указанный белок характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, причем указанный способ включает воздействие на указанный образец антител, связывающихся с указанным белком, и определение связывания указанных антител с указанным белком в указанном образце, причем связывание антител с указанным белком является признаком присутствия указанного белка в указанном образце.
74. Способ по п.73, отличающийся тем, что указанный образец содержит клетку, предположительно экспрессирующую указанный белок.
75. Способ по п.74, отличающийся тем, что указанная клетка является раковой клеткой.
76. Способ по п.73, отличающийся тем, что указанное антитело мечено обнаруживаемой меткой.
77. Способ по п.73, отличающийся тем, что указанный белок обладает (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
78. Способ диагностики наличия опухоли в организме млекопитающего, включающий определение уровня экспрессии гена, кодирующего белок, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1 в тестируемом образце клеток ткани, полученных от указанного млекопитающего, и в контрольном образце известных нормальных клеток, происходящих из той же ткани, причем повышенный уровень экспрессии указанного белка в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом является признаком наличия опухоли в организме млекопитающего, от которого получен тестируемый образец.
79. Способ по п.78, отличающийся тем, что этап определения уровня экспрессии гена, кодирующего указанный белок, включает использование олигонуклеотида в ходе гибридизации in situ или анализа ПЦР с обратной транскрипцией.
80. Способ по п.78, отличающийся тем, что этап определения уровня экспрессии гена, кодирующего указанный белок, включает использование антител в ходе иммуногистохимического анализа или вестерн-блоттинга.
81. Способ по п.78, отличающийся тем, что указанный белок обладает (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
82. Способ диагностики наличия опухоли в организме млекопитающего, включающий взаимодействие тестируемого образца клеток ткани, полученного от указанного млекопитающего, с антителами, связывающимися с белком, характеризующимся по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, и обнаружение образования комплекса между указанным антителом и указанным белком в тестируемом образце, причем образование комплекса является признаком наличия опухоли в организме указанного млекопитающего.
83. Способ по п.82, отличающийся тем, что указанное антитело мечено обнаруживаемой меткой.
84. Способ по п.82, отличающийся тем, что тестируемый образец клеток ткани получен от особи, в организме которой предположительно находится раковая опухоль.
85. Способ по п.82, отличающийся тем, что указанный белок обладает (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
86. Способ лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток, ассоциированного с повышенной экспрессией или активностью белка, характеризующегося по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1; или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антагониста указанного белка, за счет чего достигается эффективное лечение или предотвращение указанного расстройства пролиферации клеток.
87. Способ по п.86, отличающийся тем, что указанное расстройство пролиферации клеток представляет собой рак.
88. Способ по п.86, отличающийся тем, что указанный антагонист является антителом или антисмысловым олигонуклеотидом против TAT-полипептида.
89. Способ связывания антитела с клеткой, экспрессирующей белок, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, причем указанный способ включает взаимодействие указанной клетки с антителом, связывающимися с указанным белком, и обеспечение связывания антитела с указанным белком, за счет чего происходит связывание указанного антитела с указанной клеткой.
90. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанное антитело является моноклональным антителом.
91. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанное антитело является фрагментом антитела.
92. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанное антитело является химерным или гуманизированным антителом.
93. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с агентом, подавляющим рост.
94. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.
95. Способ по п.94, отличающийся тем, что указанный цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
96. Способ по п.94, отличающийся тем, что цитотоксический агент представляет собой токсин.
97. Способ по п.96, отличающийся тем, что токсин выбирают из группы, состоящей из майтанзиноида и калихеамицина.
98. Способ по п.96, отличающийся тем, что токсин представляет собой майтанзиноид.
99. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется бактериями.
100. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется клетками CHO.
101. Способ по п.89, отличающийся тем, что указанная клетка является раковой клеткой.
102. Способ по п.101, отличающийся тем, что указанную раковую клетку в дальнейшем подвергают воздействию радиации или химиотерапевтического агента.
103. Способ по п.101, отличающийся тем, что указанную раковую клетку выбирают из группы, состоящей из клетки рака молочной железы, клетки рака ободочной и прямой кишки, клетки рака легких, клетки рака яичников, клетки рака центральной нервной системы, клетки рака печени, клетки рака мочевого пузыря, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака предстательной железы, клетки рака шейки матки, клетки меланомы и клетки лейкоза.
104. Способ по п.103, отличающийся тем, что указанный белок в большем количестве экспрессируется указанной раковой клеткой по сравнению с нормальной клеткой, происходящей из той же ткани.
105. Способ по п.89, вызывающий гибель указанной клетки.
106. Использование нуклеиновой кислоты по любому из п.п. 1-5 или 30 для изготовления медикамента для терапевтического лечения или диагностического обнаружения рака.
107. Использование нуклеиновой кислоты по любому из п.п. 1-5 или 30 для изготовления медикамента для лечения опухоли.
108. Использование нуклеиновой кислоты по любому из п.п. 1-5 или 30 для изготовления медикамента для лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
109. Использование экспрессирующего вектора по любому из п.п. 6, 7 или 31 для изготовления медикамента для лечения или диагностического обнаружения рака.
110. Использование экспрессирующего вектора по любому из п.п. 6, 7 или 31 для изготовления медикамента для лечения опухоли.
111. Использование экспрессирующего вектора по любому из п.п. 6, 7 или 31 для изготовления медикамента для лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
112. Использование клетки-хозяина по любому из п.п. 8, 9, 32 или 33 для изготовления медикамента для терапевтического лечения или диагностического обнаружения рака.
113. Использование клетки-хозяина по любому из п.п. 8, 9, 32 или 33 для изготовления медикамента для лечения опухоли.
114. Использование клетки-хозяина по любому из п.п. 8, 9, 32 или 33 для изготовления медикамента для лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
115. Использование полипептида по любому из п.п. 11-14 для изготовления медикамента для терапевтического лечения или диагностического обнаружения рака.
116. Использование полипептида по любому из п.п. 11-14 для изготовления медикамента для лечения опухоли.
117. Использование полипептида по любому из п.п. 11-14 для изготовления медикамента для лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
118. Использование антител по любому из п.п. 15-29 для изготовления медикамента для терапевтического лечения или диагностического обнаружения рака.
119. Использование антител по любому из п.п. 15-29 для изготовления медикамента для лечения опухоли.
120. Использование антител по любому из п.п. 15-29 для изготовления медикамента для лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
121. Использование композиции веществ по любому из п.п. 35-36 для изготовления медикамента для терапевтического лечения или диагностического обнаружения рака.
122. Использование композиции веществ по любому из п.п. 35-36 для изготовления медикамента для лечения опухоли.
123. Использование композиции веществ по любому из п.п. 35-36 для изготовления медикамента для лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
124. Использование изделия по любому из п.п. 37-38 для изготовления медикамента для терапевтического лечения или диагностического обнаружения рака.
125. Использование изделия по любому из п.п. 37-38 для изготовления медикамента для лечения опухоли.
126. Использование изделия по любому из п.п. 37-38 для изготовления медикамента для лечения или предотвращения расстройства пролиферации клеток.
127. Способ ингибирования роста клетки, причем рост указанной клетки по меньшей мере частично зависит от стимулирующего рост действия белка, характеризующегося по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, причем указанный способ включает взаимодействие указанного белка с антителом, связывающимся с указанным белком, за счет чего достигается ингибирование роста указанной клетки.
128. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанная клетка является раковой клеткой.
129. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанный белок экспрессируется указанной клеткой.
130. Способ по п.127, отличающийся тем, что связывание указанного антитела с указанным белком оказывает антагонистическое действие на стимулирующую рост клеток активность указанного белка.
131. Способ по п.127, отличающийся тем, что связывание указанного антитела с указанным белком вызывает гибель указанной клетки.
132. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанное антитело является моноклональным антителом.
133. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанное антитело является фрагментом антитела.
134. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанное антитело является химерным или гуманизированным антителом.
135. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с агентом, подавляющим рост.
136. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.
137. Способ по п.136, отличающийся тем, что указанный цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
138. Способ по п.136, отличающийся тем, что цитотоксический агент представляет собой токсин.
139. Способ по п.138, отличающийся тем, что токсин выбирают из группы, состоящей из майтанзиноида и калихеамицина.
140. Способ по п.138, отличающийся тем, что токсин представляет собой майтанзиноид.
141. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется бактериями.
142. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется клетками CHO.
143. Способ по п.127, отличающийся тем, что указанный белок обладает (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
144. Способ терапевтического лечения опухоли в организме млекопитающего, причем рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от стимулирующего рост действия белка, характеризующегося по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с (а) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, (б) полипептидом, представленным как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (в) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанным с ним сигнальным пептидом, (г) внеклеточным доменом полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанного с ним сигнального пептида, (д) полипептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) полипептидом, кодируемым полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1, причем указанный способ включает взаимодействие указанного белка с антителом, связывающимся с указанным белком, за счет чего достигается эффективное лечение указанной опухоли.
145. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанный белок экспрессируется клетками указанной опухоли.
146. Способ по п.144, отличающийся тем, что связывание указанного антитела с указанным белком оказывает антагонистическое действие на стимулирующую рост клеток активность указанного белка.
147. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанное антитело является моноклональным антителом.
148. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанное антитело является фрагментом антитела.
149. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанное антитело является химерным или гуманизированным антителом.
150. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с агентом, подавляющим рост.
151. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом.
152. Способ по п.151, отличающийся тем, что указанный цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
153. Способ по п.151, отличающийся тем, что цитотоксический агент представляет собой токсин.
154. Способ по п.153, отличающийся тем, что токсин выбирают из группы, состоящей из майтанзиноида и калихеамицина.
155. Способ по п.153, отличающийся тем, что токсин представляет собой майтанзиноид.
156. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется бактериями.
157. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанное антитело продуцируется клетками CHO.
158. Способ по п.144, отличающийся тем, что указанный белок обладает (а) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, (б) аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (в) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, со связанной с ней последовательностью сигнального пептида, (г) аминокислотной последовательностью внеклеточного домена полипептида, представленного как SEQ ID NO:2, без связанной с ней последовательности сигнального пептида, (д) аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1 или (е) аминокислотной последовательностью, кодируемой полноразмерной кодирующей областью нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
159. Выделенное антитело, связывающееся с тем же эпитопом, с которым связывается антитело по любому из п.п. 15-29.
160. Антитело по п.159, являющееся моноклональным антителом.
161. Антитело по п.159, являющееся фрагментом антитела.
162. Антитело по п.159, являющееся химерным или гуманизированным антителом.
163. Антитело по п.159, конъюгированное с агентом, подавляющим рост.
164. Антитело по п.159, конъюгированное с цитотоксическим агентом.
165. Антитело по п.164, отличающееся тем, что указанный цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из токсинов, антибиотиков, радиоактивных изотопов и нуклеолитических ферментов.
166. Антитело по п.164, отличающееся тем, что цитотоксический агент представляет собой токсин.
167. Антитело по п.166, отличающееся тем, что токсин выбирают из группы, состоящей из майтанзиноида и калихеамицина.
168. Антитело по п.166, отличающееся тем, что токсин представляет собой майтанзиноид.
169. Антитело по п.159, продуцированное бактериями.
170. Антитело по п.159, продуцированное клетками CHO.
171. Антитело по п.159, вызывающее гибель клетки, с которой оно связывается.
172. Антитело по п.159, меченое обнаруживаемой меткой.
173. Антитело по п.159, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере один из гипервариабельных участков любого из антител по п.п. 15-29.
174. Клетка гибридомы, продуцирующая моноклональные антитела, связывающиеся с TAT-полипептидом.
175. Способ идентификации антитела, связывающегося с эпитопом, с которым связывается любое антитело по п.п. 15-29, отличающийся тем, что включает определение способности тестируемого антитела блокировать связывание любого антитела по п.п. 15-29, причем способность указанного тестируемого антитела блокировать связывание указанного любого антитела по п.п. 15-29 с TAT-полипептидом по меньшей мере на 40% при равных концентрациях антител является признаком способности указанного антитела блокировать эпитоп, с которым связывается указанное любое антитело по п.п. 15-29.
Другие предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения будут очевидны для специалиста в данной области при чтении настоящей заявки.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) кДНК TAT425, где SEQ ID NO:1 представляет собой клон, обозначаемый здесь как “DNA340411".
На Фигуре 2 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2), происходящая от кодирующей последовательности SEQ ID NO:1, показанной на Фигуре 1.
На Фигуре 3 показаны полные вариабельные аминокислотные последовательности легких цепей следующих антител: 2E4.6.1 и 4D11.17.2 (SEQ ID NO:3), 13H2.28.2 (SEQ ID NO:4) и 14E7.17.1 (SEQ ID NO:5).
На Фигуре 4 показаны полные вариабельные аминокислотные последовательности тяжелых цепей следующих антител: 2E4.6.1 (SEQ ID NO:6), 4D11.17.2 (SEQ ID NO:7), 13H2.28.2 (SEQ ID NO:8) и 14E7.17.1 (SEQ ID NO:9).
На Фигуре 5 показаны различные последовательности CDR-L1 (SEQ ID NOS:10-12) выбранных антител против TAT425.
На Фигуре 6 показаны различные последовательности CDR-L2 (SEQ ID NOS:13-15) выбранных антител против TAT425.
На Фигуре 7 показаны различные последовательности CDR-L3 (SEQ ID NOS:16-18) выбранных антител против TAT425.
На Фигуре 8 показаны различные последовательности CDR-H1 (SEQ ID NOS:19-22) выбранных антител против TAT425.
На Фигуре 9 показаны различные последовательности CDR-H2 (SEQ ID NOS:23-26) выбранных антител против TAT425.
На Фигуре 10 показаны различные последовательности CDR-H3 (SEQ ID NOS:27-30) выбранных антител против TAT425.
Подробное описание изобретения
I. Определения
Термины "TAT-полипептид" и "TAT", используемые здесь и сопровождаемые располагающимися непосредственно после них численными обозначениями, относятся к различным полипептидам, причем полное обозначение (т.е. TAT/число) относится к конкретным полипептидным последовательностям, как описано здесь. Термины "полипептид TAT/число" и "TAT/число", где термин "число" представлен в виде конкретного численного обозначения, используемые здесь, охватывают полипептиды, варианты полипептидов с нативными последовательностями и фрагменты полипептидов и вариантов полипептидов с нативными последовательностями (определения которых приведены здесь далее). TAT-полипептиды, описанные здесь, можно выделить из различных источников, например, тканей человека или другого источника, или изготовить с помощью рекомбинантных способов или способов синтеза. Термин "TAT-полипептид" относится к каждому из отдельных полипептидов TAT/число, описанных здесь. Все описания в настоящей заявке, относящиеся к "TAT-полипептиду", относятся к каждому из полипептидов по отдельности, а также совместно. Например, описания изготовления TAT-полипептидов, их очистки, их модификации, образования антител к ним или против них, образования TAT-связывающих олигопептидов к ним или против них, образования TAT-связывающих органических молекул к ним или против них, их введения, композиций, содержащих TAT-полипептиды, лечения заболеваний TAT-полипептидами и т.д. относятся к каждому из полипептидов по изобретению по отдельности. Термин "TAT-полипептид" также включает варианты полипептидов TAT/число, описанных здесь. В одном из вариантов воплощения последовательность полипептида TAT211 показана как SEQ ID NO:2.
"TAT-полипептид с нативной последовательностью" включает полипептид, обладающий той же аминокислотной последовательностью, что и соответствующий TAT-полипептид, происходящий из естественных источников. Такой TAT-полипептид с нативной последовательностью можно выделить из естественных источников или получить рекомбинантным или синтетическим путем. Термин "TAT-полипептид с нативной последовательностью", в частности, охватывает природные укороченные или секретируемые формы конкретного TAT-полипептида (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты полипептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения TAT-полипептиды с нативными последовательностями, описанные здесь, представляют собой зрелые или полноразмерные полипептиды с нативными последовательностями, включающие полноразмерные аминокислотные последовательности, показанные на прилагаемых фигурах. Инициирующие и стоп-кодоны (если они обозначены) показаны на фигурах полужирным подчеркнутым шрифтом. Нуклеотидные остатки, обозначенные как “N” или "X" на соответствующих фигурах, представляют собой любой нуклеотидный остаток. В то же время, хотя показано, что TAT-полипептиды, описанные на прилагаемых фигурах, начинаются с остатков метионина, обозначаемых на фигурах в настоящем документе в положении 1 аминокислотной последовательности, использование в качестве инициирующего аминокислотного остатка для TAT-полипептидов других остатков метионина, расположенных на фигурах выше или ниже положения 1 аминокислотной последовательности, является допустимым и возможным.
"Внеклеточный домен" или "ВКД" TAT-полипептида относится к форме TAT-полипептида, практически лишенной трансмембранного и цитоплазматического доменов. Обычно в составе ВКД TAT-полипептида содержится менее 1% таких трансмембранного и/или цитоплазматического доменов, а предпочтительно - менее 0,5% таких доменов. Следует понимать, что любой трансмембранный домен, идентифицированный для TAT-полипептидов по настоящему изобретению, идентифицирован в соответствии с критериями, общепринятыми в данной области техники для идентификации гидрофобных доменов этого типа. Точные границы трансмембранного домена могут меняться, но, в наиболее вероятном случае, не выходят за пределы 5 аминокислот с каждого конца исходно идентифицированного здесь домена. Поэтому в необязательном случае внеклеточный домен TAT-полипептида может содержать приблизительно 5 или менее аминокислот трансмембранного домена/внеклеточного домена с каждой стороны границы, как идентифицировано в примерах или заявке, и такие полипептиды, включающие или не включающие связанный с ними сигнальный пептид, и кодирующие их нуклеиновые кислоты рассматриваются в настоящем изобретении.
Приблизительное положение "сигнальных пептидов" различных TAT-полипептидов, описанных здесь, может быть показано в настоящем патентном описании и/или на прилагаемых фигурах. В то же время следует отметить, что C-концевая граница сигнального пептида может изменяться, но в наиболее вероятном случае смещается не более чем на 5 аминокислот с каждой стороны С-концевой границы сигнального пептида, как исходно идентифицировано здесь, причем C-концевая граница сигнального пептида может быть идентифицирована в соответствии с критериями, общепринятыми в данной области техники для идентификации элементов аминокислотных последовательностей этого типа (например, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) и von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Кроме того, следует понимать, что в некоторых случаях отщепление сигнальной последовательности от секретируемого полипептида может быть не полностью однородным, что приводит к появлению более одной секретируемой разновидности. Эти зрелые полипептиды, от которых сигнальный пептид отщеплен в пределах не более чем 5 аминокислот с каждой стороны С-концевой границы сигнального пептида, как идентифицировано здесь, и кодирующие их полинуклеотиды рассматриваются в настоящем изобретении.
"Вариант TAT-полипептида" означает TAT-полипептид, предпочтительно активный TAT-полипептид, как описано здесь, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью полноразмерного TAT-полипептида с нативной последовательностью, как описано здесь, последовательностью TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, внеклеточным доменом TAT-полипептида, содержащим или не содержащим сигнальный пептид, как описано здесь, или любым другим фрагментом последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь (например, фрагментом, кодируемым нуклеиновой кислотой, представляющей лишь часть полной кодирующей последовательности полноразмерного TAT-полипептида). Такие варианты TAT-полипептида включают, например, TAT-полипептиды, в которых добавлены или удалены один или более аминокислотных остатков с N- или C-конца полноразмерной нативной аминокислотной последовательности. Обычно вариант TAT-полипептида характеризуется по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99% идентичностью аминокислотной последовательности с последовательностью полноразмерного TAT-полипептида с нативной последовательностью, как описано здесь, последовательностью TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, внеклеточным доменом TAT-полипептида, содержащим или не содержащим сигнальный пептид, как описано здесь, или любым другим конкретно определенным фрагментом последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь. Обычно длина вариантов TAT-полипептидов составляет по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 аминокислот или более. В необязательном случае варианты TAT-полипептидов содержат не более одной консервативной аминокислотной замены по сравнению с нативной последовательностью TAT-полипептида, в альтернативном случае - не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен по сравнению с нативной последовательностью TAT-полипептида.
"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к последовательностям TAT-полипептидов, идентифицированных здесь, определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в конкретной последовательности TAT-полипептида после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внедрения разрывов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, без учета консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществить различными способами, известными специалистам в данной области, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры измерения выравнивания, включая алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В то же время для целей настоящей заявки значения % идентичности аминокислотной последовательности получали с помощью компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2, причем полный исходный код программы ALIGN-2 представлен в патенте США № 7160985, включенном в настоящий документ посредством ссылки. Автором компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2 является Genentech, Inc., а ее исходный код был подан с пользовательской документацией в Бюро по охране авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где зарегистрирован под номером регистрации авторских прав США TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна через Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, штат Калифорния, США, или может быть скомпилирована из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует компилировать для использования в операционной системе UNIX, предпочтительно digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.
В ситуациях, когда ALIGN-2 используют для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности A с, по сравнению с или против данной аминокислотной последовательности B (что можно иначе сформулировать так, что данная аминокислотная последовательность A характеризуется или включает определенный % идентичности аминокислотной последовательности с, по сравнению с или против данной аминокислотной последовательности B) рассчитывают как:
100-кратное отношение X/Y,
где X - количество аминокислотных остатков, определенных программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании A и B как идентичные совпадения, а Y - общее количество аминокислотных остатков в B. Следует принимать во внимание, что если длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности A по сравнению с B не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности B по сравнению с A.
"Вариант TAT-полинуклеотида" или "вариант нуклеотидной последовательности TAT" означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TAT-полипептид, предпочтительно активный TAT-полипептид, как описано здесь, и характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80% идентичности нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полноразмерный TAT-полипептид с нативной последовательностью, как описано здесь, последовательность полноразмерного TAT-полипептида с нативной последовательностью без сигнального пептида, как описано здесь, внеклеточный домен TAT-полипептида, содержащий или не содержащий сигнальный пептид, как описано здесь, или любой другой фрагмент последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь (например, фрагмент, кодируемый нуклеиновой кислотой, представляющей лишь часть полной кодирующей последовательности полноразмерного TAT-полипептида). Обычно вариант TAT-полинуклеотида характеризуется по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью нуклеотидной последовательности, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99% идентичностью нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность полноразмерного TAT-полипептида с нативной последовательностью, как описано здесь, последовательность TAT-полипептида без сигнального пептида, как описано здесь, внеклеточный домен TAT-полипептида, содержащий или не содержащий сигнальную последовательность, как описано здесь, или любой другой фрагмент последовательности полноразмерного TAT-полипептида, как описано здесь. Варианты не включают нативную нуклеотидную последовательность.
Обычно варианты TAT-полинуклеотидов обладают длиной по меньшей мере приблизительно 5 нуклеотидов, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов, причем в этом контексте термин "приблизительно" означает указанную длину нуклеотидной последовательности плюс-минус 10% этой указанной длины.
"Процент (%) идентичности нуклеотидной последовательности" по отношению к нуклеотидным последовательностям, кодирующим TAT, идентифицированным здесь, определяют как процентное содержание нуклеотидов в последовательности-кандидате, идентичных нуклеотидам в исследуемой нуклеотидной последовательности TAT после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внедрения разрывов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процентной идентичности нуклеотидных последовательностей можно осуществить различными способами, известными специалистам, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). В то же время для целей настоящей заявки значения % идентичности нуклеотидной последовательности получали с помощью компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2, причем полный исходный код программы ALIGN-2 представлен в патенте США № 7160985, включенном в настоящий документ посредством ссылки. Автором компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2 является Genentech, Inc., а ее исходный код был подан с пользовательской документацией в Бюро по охране авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где зарегистрирован под номером регистрации авторских прав США TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна через Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, штат Калифорния, США, или может быть скомпилирована из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует компилировать для использования в операционной системе UNIX, предпочтительно digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.
В ситуациях, когда ALIGN-2 используют для сравнения нуклеотидных последовательностей, % идентичности нуклеотидной последовательности данной нуклеотидной последовательности С с, по сравнению с или против данной нуклеотидной последовательности D (что можно иначе сформулировать так, что данная нуклеотидная последовательность С характеризуется или включает определенный % идентичности нуклеотидной последовательности с, по сравнению с или против данной нуклеотидной последовательности D) рассчитывают как:
100-кратное отношение W/Z,
где W - количество нуклеотидов, определенных программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании C и D как идентичные совпадения, а Z - общее количество нуклеотидов в D. Следует принимать во внимание, что если длина нуклеотидной последовательности С не равна длине нуклеотидной последовательности D, % идентичности нуклеотидной последовательности С по сравнению с D не будет равен % идентичности нуклеотидной последовательности D по сравнению с C.
В других вариантах воплощения варианты TAT-полинуклеотидов представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие TAT-полипептид и способные гибридизоваться, предпочтительно при жестких условиях гибридизации и отмывки, с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полноразмерный TAT-полипептид, как описано здесь. Варианты TAT-полипептидов могут представлять собой полипептиды, кодируемые вариантами TAT-полинуклеотидов.
Термин "полноразмерная кодирующая область" по отношению к нуклеиновой кислоте, кодирующей TAT-полипептид, относится к последовательности нуклеотидов, кодирующей полноразмерный TAT-полипептид по изобретению (которая часто приведена от инициирующего до стоп-кодона включительно на прилагаемых фигурах). Термин "полноразмерная кодирующая область" по отношению к нуклеиновой кислоте, депонированной в ATCC, относится к фрагменту кДНК, кодирующему TAT-полипептид и встроенному в вектор, депонированный в ATCC (который часто приведен от инициирующего до стоп-кодона включительно на прилагаемых фигурах).
Термин "выделенный" при использовании для описания различных TAT-полипептидов, описанных здесь, означает полипептид, идентифицированный и отделенный и/или очищенный от компонента своего природного окружения. Загрязняющие компоненты природного окружения представляют собой материалы, которые обычно мешают диагностическому или терапевтическому использованию полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковоподобные или небелковоподобные растворенные вещества. В предпочтительных вариантах воплощения полипептид очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвенатора с вращающимся стаканом, или (2) до гомогенности, определяемой при электрофорезе в ДСН-ПААГ при невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с помощью окрашивания Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенный полипептид включает полипептид in situ в составе рекомбинантных клеток, при условии отсутствия по меньшей мере одного компонента природного окружения TAT-полипептида. В то же время выделенный полипептид обычно получают с использованием по меньшей мере одного этапа очистки.
"Выделенная" нуклеиновая кислота, кодирующая TAT-полипептид или другой полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, идентифицированную и отделенную от по меньшей мере одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, отличается по форме или окружению от молекул, встречающихся в естественных условиях. Поэтому выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды, отличаются от специфических молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, в том виде, как они существуют в естественных клетках. В то же время, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид и содержащиеся в клетках, обычно экспрессирующих указанный полипептид, где, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты располагается на хромосоме в положении, отличающемся от положения в естественных клетках.
Термин "регуляторные последовательности" относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной с ними кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Регуляторные последовательности, подходящие для прокариот, например, включают промотор, необязательно - последовательность оператора, и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", если она вступает в функциональное взаимодействие с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предшествующей последовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию этой последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что это облегчает трансляцию. В общем случае "функционально связанные" означает, что связанные последовательности ДНК непрерывны, а в случае секреторного лидера, непрерывны и в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть непрерывными. Связывание выполняют путем лигирования по подходящим сайтам рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, в соответствии с общепринятой практикой используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
"Жесткость" реакций гибридизации может легко определить специалист; обычно она представляет собой эмпирически рассчитываемый показатель, зависящий от длины зонда, температуры отмывки и концентрации соли. В общем случае, более длинные зонды требуют более высоких температур для надлежащего отжига, в то время как для более коротких зондов необходимы более низкие температуры. В общем случае гибридизация зависит от способности денатурированной ДНК к повторному отжигу, если комплементарные цепи присутствуют в среде, температура которой ниже температуры их плавления. Чем выше степень желательной гомологии между зондом и гибридизуемой последовательностью, тем выше относительная температура, которую можно использовать. В результате из этого следует, что более высокие относительные температуры создают тенденцию к ужесточению условий реакции, в то время как более низкие температуры смягчают их. Дополнительные подробности и пояснения относительно жесткости реакций гибридизации см. в монографии Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Жесткие условия" или "условия высокой жесткости", как определены здесь, можно описать следующим образом: (1) использование низкой ионной силы и высокой температуры отмывки, например, 0,015 M хлорида натрия/0,0015 M цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°C; (2) использование в способе гибридизации денатурирующего агента, например, формамида, например, 50% (об/об) формамида с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фиколом/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) гибридизацию в течение ночи в растворе, содержащем 50% формамид, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 x раствор Денхардта, ДНК молок лосося, обработанную ультразвуком (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% декстрансульфат при 42°C, с 10-минутной отмывкой при 42°C в 0,2 x SSC (растворе хлорида натрия/цитрата натрия) с последующей 10-минутной отмывкой при условиях высокой жесткости в растворе, состоящем из 0,1 x SSC с ЭДТА при 55°C.
"Умеренно жесткие условия" можно определить согласно описанию в монографии Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989; они включают использование менее жестких раствора для отмывки и условий гибридизации (например, температуры, ионной силы и % ДСН), чем вышеописанные. Примером умеренно жестких условий является гибридизация с инкубированием в течение ночи при 37°C в растворе, содержащем: 20% формамид, 5 x SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрата натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5 x раствор Денхардта, 10% декстрансульфат и 20 мг/мл денатурированной ДНК молок лосося, с последующей отмывкой фильтров в 1 x SSC при приблизительно 37-50°C. Специалистам в данной области известны способы коррекции температуры, ионной силы и т.д. при необходимости их приведения в соответствие с длиной зонда и т.п.
Термин "меченый эпитопом" здесь относится к химерному полипептиду, включающему TAT-полипептид или антитело против TAT, объединенные с "маркерным полипептидом". Маркерный полипептид содержит достаточно остатков, чтобы обеспечить образование эпитопа, против которого можно получить антитела, однако является достаточно коротким для того, чтобы не создавать помех активности полипептида, с которым он объединен. В предпочтительном случае маркерный полипептид также является достаточно уникальным, чтобы указанное антитело практически не вступало в перекрестные реакции с другими эпитопами. В общем случае подходящие маркерные полипептиды содержат по меньшей мере шесть аминокислотных остатков и обычно - приблизительно от 8 до 50 аминокислотных остатков (предпочтительно - приблизительно от 10 до 20 аминокислотных остатков).
"Активный" или "активность" для целей настоящего документа относится к форме(ам) TAT-полипептида, сохраняющим биологическую и/или иммунологическую активность нативного или природного TAT, причем "биологическая" активность относится к биологической функции (ингибирующей или стимулирующей) нативного или природного TAT, отличающейся от способности индуцировать продукцию антител против антигенного эпитопа, присущей нативному или природному TAT, а "иммунологическая" активность относится к способности индуцировать продукцию антител против антигенного эпитопа, присущей нативному или природному TAT.
Термин "антагонист" используется в наиболее широком смысле и включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативного TAT-полипептида, описанную здесь. Аналогично, термин "агонист" используется в наиболее широком смысле и включает любую молекулу, которая имитирует биологическую активность нативного TAT-полипептида, описанную здесь. Подходящие молекулы агонистов или антагонистов, в частности, включают агонистические или антагонистические антитела или фрагменты антител, фрагменты вариантов аминокислотных последовательностей нативных TAT-полипептидов, пептиды, антисмысловые олигонуклеотиды, низкомолекулярные органические соединения и т.д. Способы идентификации агонистов или антагонистов TAT-полипептида могут включать взаимодействие TAT-полипептида с молекулой-кандидатом в агонисты или антагонисты и измерение обнаруживаемых изменений одной или более биологических активностей, в норме ассоциированных с TAT-полипептидом.
Термины "лечить" или "лечение", или "облегчение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предохранительным мерам, причем их целью является предотвращение или замедление (ослабление) целевого патологического состояния или расстройства. "Те, кто нуждается в лечении", включают лиц, которые уже страдают расстройством, а также лиц, склонных к расстройствам, или лиц, у которых это расстройство следует предотвратить. Субъект или млекопитающее успешно "лечат" от рака, экспрессирующего TAT-полипептид, если после приема терапевтического количества антител против TAT, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы согласно настоящему изобретению пациент демонстрирует наблюдаемое и/или измеряемое снижение или отсутствие одного или более из следующих: снижение количества раковых клеток или отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование (т.е. до некоторой степени замедление, а предпочтительно - остановку) инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая метастазирование рака в мягкие ткани и кости; ингибирование (т.е. до некоторой степени замедление, а предпочтительно - остановку) метастазирования опухоли; ингибирование роста опухоли до некоторой степени; и/или облегчение до некоторой степени одного или более симптомов, ассоциированных с конкретным типом рака; пониженную заболеваемость и смертность, и повышение качества жизни. В тех случаях, когда антитело против TAT или TAT-связывающий олигопептид могут предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, они могут быть цитостатическими и/или цитотоксическими. Пациент также может ощущать ослабление этих признаков или симптомов.
Вышеупомянутые параметры оценки успешности лечения и улучшения состояния при заболевании легко измерить с помощью распространенных процедур, известных врачу. Эффективность при терапии рака можно измерить, например, путем оценки времени до прогрессирования заболевания (TTP) и/или определения скорости ответа (RR). Метастазирование можно определить путем определения стадии заболевания и путем сканирования костей и тестирования уровня кальция и других ферментов для определения метастазирования в кости. Для отслеживания метастазов в полости таза и лимфоузлах в этой области также можно применять компьютерную томографию. Для отслеживания метастазов в легких и печени используют рентгенографию грудной клетки и измерение уровней ферментов печени с помощью известных способов, соответственно. Другие распространенные способы мониторинга заболеваний включают трансректальное ультразвуковое исследование (TRUS) и трансректальную пункционную биопсию (TRNB).
"Длительное" введение относится к введению агента(ов) в непрерывном режиме в противоположность однократному режиму, так что начальное терапевтическое действие (активность) поддерживается в течение длительного периода времени. "Дробное" введение представляет собой лечение, выполняемое не в последовательном порядке без перерыва, а являющееся циклическим по своей природе.
"Млекопитающее" для целей лечения, облегчения симптомов или диагностики рака относится к любому животному, относящемуся к млекопитающим, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных, содержащихся в зоопарках, используемых в спортивных целях, и содержащихся в домашних условиях, например, собакам, кошкам, крупному рогатому скоту, лошадям, овцам, свиньям, козам, кроликам и т.д. Предпочтительно, млекопитающее является человеком.
Введение "в комбинации с" одним или более дополнительным терапевтическим агентом включает одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке.
"Носители", как используется здесь, включают фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, являющиеся нетоксическими для клетки или млекопитающего, на которого они действуют в используемых дозах и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферные вещества, например, фосфат, цитрат и другие органические соли; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярный (содержащий менее 10 остатков) полипептид; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; сахароспирты, например, маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, например, натрия; и/или неионогенные ПАВ, например, TWEEN, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и плюроники (PLURONICS).
Под "твердой фазой" или "твердым носителем" понимают неводный материал, к которому может происходить адгезия или присоединение антитела, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы по настоящему изобретению. Примеры твердых фаз, охватываемых настоящей заявкой, включают фазы, частично или полностью состоящие из стекла (например, стекло с контролируемым размером пор), полисахариды (например, агарозу), полиакриламиды, полистирол, поливиниловый спирт и силиконы. В некоторых вариантах воплощения, в зависимости от контекста, твердая фаза может включать лунку аналитического планшета; в других она представляет собой колонку для очистки (например, колонку для аффинной хроматографии). Этот термин также включает неоднородную твердую фазу из отдельных частиц, например, фазы, описанные в патенте США № 4275149.
"Липосома" представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов различных типов, фосфолипидов и/или поверхностно-активных веществ, пригодных для доставки лекарственного средства (например, TAT-полипептида, антитела против него или TAT-связывающего олигопептида) в организм млекопитающего. Компоненты липосомы упорядочены в виде бислойной структуры, аналогичной липидной конструкции биологических мембран.
"Небольшая" молекула или "небольшая" органическая молекула, согласно определению здесь, обладает молекулярной массой менее приблизительно 500 дальтон.
"Эффективное количество" полипептида, антител, TAT-связывающего олигопептида, TAT-связывающей органической молекулы или их агониста или антагониста, как описано здесь, представляет собой количество, достаточное для осуществления специально оговоренной цели. "Эффективное количество" можно определить эмпирически и в рабочем порядке, в зависимости от поставленной цели.
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству антител, полипептида, TAT-связывающего олигопептида, TAT-связывающей органической молекулы или другого лекарственного средства, эффективного при "лечении" заболевания или расстройства у субъекта или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снизить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли; подавить (т.е. до некоторой степени замедлить, а предпочтительно - остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; подавить (т.е. до некоторой степени замедлить, а предпочтительно - остановить) метастазирование опухоли; до некоторой степени подавить рост опухоли; и/или до некоторой степени облегчить один или несколько симптомов, ассоциированных с раком. См. определение термина "лечение", приведенное здесь. В тех случаях, когда лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим.
"Количество, подавляющее рост" антитела против TAT, TAT-полипептида, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы представляет собой количество, способное подавлять рост клетки, особенно опухолевой, например, раковой клетки in vitro или in vivo. "Количество, подавляющее рост" антитела против TAT, TAT-полипептида, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы для ингибирования роста злокачественных клеток можно определить эмпирически и в рабочем порядке.
"Цитотоксическое количество" антитела против TAT, TAT-полипептида, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы представляет собой количество, способное вызывать разрушение клетки, особенно опухолевой, например, раковой клетки in vitro или in vivo. "Цитотоксическое количество" антитела против TAT, TAT-полипептида, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы для ингибирования роста злокачественных клеток можно определить эмпирически и в рабочем порядке.
Термин "антитело" используют в его наиболее широком смысле; в частности, он охватывает одиночные моноклональные антитела против TAT (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела), композиции антител против TAT с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела против TAT и фрагменты антител против TAT (см. ниже) при условии, что они проявляют желательную биологическую или иммунологическую активность. Термин "иммуноглобулин" (Ig) используют здесь на равных основаниях с термином "антитело".
"Выделенное антитело" представляет собой антитело, идентифицированное и отделенное и/или очищенное от компонента своего природного окружения. Загрязняющие компоненты природного окружения представляют собой материалы, которые обычно мешают диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковоподобные или небелковоподобные растворенные вещества. В предпочтительных вариантах воплощения антитело очищают (1) до более чем 95 масс.% антитела в соответствии с определением по Лоури, и более предпочтительно - до более чем 99 масс.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности, определяемой при электрофорезе в ДСН-ПААГ при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с помощью окрашивания Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в составе рекомбинантных клеток, при условии отсутствия по меньшей мере одного компонента природного окружения антитела. В то же время выделенное антитело обычно получают с использованием по меньшей мере одного этапа очистки.
Стандартное 4-цепочечное антитело представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (IgM-антитело состоит из 5 стандартных гетеротетрамерных единиц наряду с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и, таким образом, содержит 10 сайтов связывания антигена, в то время как секретируемые IgA-антитела могут полимеризоваться, образуя поливалентные ассоциации, содержащие 2-5 стандартных 4-цепочечных единиц наряду с J-цепью). В случае IgG 4-цепочечная единица обычно имеет молекулярную массу около 150000 дальтон. Каждая L-цепь соединяется с H-цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, в то время как две H-цепи соединяются друг с другом посредством одной или нескольких дисульфидных связей, в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая H- и L-цепь также содержит регулярно расположенные дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая H-цепь содержит на N-конце вариабельный домен (VH), за которым в α и γ-цепях следуют три константных домена (CH), а в μ и ε-изотипах - четыре CH-домена. Каждая L-цепь на N-конце несет вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL) на другом конце. VL выровнен с VH, а CL - с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют связующее звено между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей. Соединение VH и VL в единое целое образует единичный сайт связывания с антигеном. Информацию о структуре и свойствах различных классов антител см., например, в Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 и Chapter 6.
L-цепь любого вида позвоночных на основе аминокислотной последовательности ее константного домена можно отнести к одному из двух обособленных типов, называемых каппа и лямбда. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей (CH) иммуноглобулины можно отнести к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM несут тяжелые цепи, обозначаемые как α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Кроме того, классы γ и α подразделяют на подклассы на основе сравнительно небольших различий в последовательности и функциях CH; например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
Термин "вариабельный" относится к тому, что последовательности определенных сегментов вариабельного домена различаются от антитела к антителу в широких пределах. V-домен опосредует связывание с антигеном и определяет специфичность конкретного антитела к конкретному антигену. В то же время, вариабельность неравномерно распределена на протяжении 110 аминокислот вариабельного домена. Напротив, V-области состоят из относительно невариабельных фрагментов из 15-30 аминокислотных остатков, называемых каркасными участками (FR) и разделенных более короткими крайне вариабельными областями, называемыми "гипервариабельными участками", длина каждого из которых составляет 9-12 аминокислот. Вариабельные домены природных легких и тяжелых цепей содержат четыре FR, преимущественно принимающих конфигурацию β-листа и соединенных тремя гипервариабельными участками, образующими петли, соединяющие структуры β-типа, а в некоторых случаях - являющиеся их частью. Гипервариабельные участки каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости от FR и, вместе с гипервариабельными участками другой цепи, участвуют в образовании антиген-связывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не вовлечены напрямую в связывание антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, например, участие антитела в антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC).
Термин "моноклональное антитело" в настоящем описании относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени однородных антител, т.е. отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением мутаций, происходящих по естественным причинам, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, поскольку они направлены против одиночной антигенной детерминанты. Кроме того, по сравнению с препаратами поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты антигена. Кроме специфичности, моноклональные антитела обладают преимуществом, заключающимся в том, что их можно синтезировать в виде, не загрязненном другими антителами. Определение "моноклональное" не должно расцениваться как необходимость получения антител с помощью какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением, можно изготовить с помощью гибридомной методологии, впервые описанной в работе Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), либо с помощью технологии рекомбинантных ДНК в бактериальных, эукариотических животных и растительных клетках (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также можно выделить из фаговой библиотеки антител с помощью методик, описанных, например, в публикациях Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
Моноклональные антитела в настоящем описании включают "химерные" антитела, в которых фрагмент тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных из организмов конкретной видовой принадлежности, или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из организмов другой видовой принадлежности, или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они обладают желательной биологической активностью (см. патент США № 4816567 и статью Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Рассматриваемые здесь химерные антитела включают "приматизированные" антитела, включающие антиген-связывающие последовательности вариабельного домена, происходящего из антитела примата, не являющегося человеком (например, мартышковых, человекообразных обезьян и т.д.) и последовательности константной области человека.
“Интактным” антителом является антитело, включающее сайт связывания с антигеном, а также CL и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, константные домены человека с нативной последовательностью) или аминокислотную последовательность их вариантов. В предпочтительном случае интактное антитело обладает одной или более эффекторной функцией.
"Фрагменты антитела" содержат фрагмент интактного антитела, предпочтительно сайт связывания с антигеном или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (см. патент США № 5641870, Пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител и полиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител.
Папаиновый гидролиз антител позволяет получить два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, названных "Fab"-фрагментами, и "Fc"-фрагмент, указывающий на хорошую способность к кристаллизации. Fab-фрагмент состоит из полноразмерной L-цепи вместе с вариабельной областью домена H-цепи (VH) и первым константным доменом одной из тяжелых цепей (CH1). Каждый Fab-фрагмент является моновалентным по отношению к связыванию с антигеном, т.е. содержит единственный сайт связывания с антигеном. Обработка антител пепсином позволяет выделить одиночный крупный F(ab')2-фрагмент, который приблизительно соответствует двум Fab-фрагментам с бивалентной антигенсвязывающей активностью, соединенным дисульфидной связью, и сохраняет способность к перекрестному связыванию антигена. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что несут несколько дополнительных остатков на C-конце CH1-домена, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем документе представляет собой обозначение Fab', в котором остаток(ки) цистеина в константных доменах несет(ут) свободную тиоловую группу. Фрагменты антител F(ab')2 исходно получали в виде пар Fab'-фрагментов, между которыми расположены шарнирные остатки цистеина. Кроме того, известны другие варианты химического соединения фрагментов антител.
Fc-фрагмент включает С-концевые фрагменты обеих H-цепей, соединенные друг с другом дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются последовательностями Fc-области, которая также является фрагментом, распознаваемым Fc-рецепторами (FcR), встречающимися на некоторых типах клеток.
"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный сайт распознавания и связывания антигена. Этот фрагмент состоит из димера вариабельных доменов одной тяжелой и одной легкой цепей, жестко связанных посредством нековалентных связей. При укладке этих двух доменов наружу выступают шесть гипервариабельных петель (по три петли из H- и L-цепи), аминокислотные участки которых участвуют в связывании с антигеном и придают антителу специфичность по отношению к связыванию антигена. В то же время, даже одиночный вариабельный домен (или половина Fv-фрагмента, включающая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью по сравнению с полноразмерным сайтом связывания.
"Одноцепочечные Fv", также сокращенно обозначаемые как "sFv" или "scFv" представляют собой фрагменты антител, включающие домены VH и VL, соединенные в составе одиночной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид sFv также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, позволяющий sFv формировать структуру, желательную для связывания с антигеном. Обзор sFv описан Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, ниже.
Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител, полученным путем конструирования sFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (около 5-10 остатков) между доменами VH и VL, благодаря чему достигается межцепочечное, а не внутрицепочечное сопряжение V-доменов, приводящее к образованию бивалентного фрагмента, т.е. фрагмента, несущего два сайта связывания с антигеном. Биспецифические антитела представляют собой гетеродимеры двух "скрещенных" sFv-фрагментов, в которых VH- и VL-домены двух антител присутствуют на различных полипептидных цепях. Более полное описание диател приведено, например, в источниках EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
"Гуманизированные" формы антител нечеловеческого происхождения (например, антител грызунов) представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, происходящую от антитела нечеловеческого происхождения. В большинстве случаев, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитела реципиента), в которых остатки из гипервариабельного участка реципиента замещены остатками из гипервариабельного участка антитела нечеловеческого происхождения (антитела донора), например, антитела мыши, крысы, кролика или примата, не являющегося человеком, обладающими желательной специфичностью, аффинностью и емкостью антител. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) иммуноглобулина человека замещают соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не присутствующие в антителах реципиента или в антителах донора. Эти модификации вносят для дальнейшей оптимизации функционирования антител. В общем случае гуманизированные антитела содержат практически все из по меньшей мере одного, а обычно - двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют аналогичным участкам из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или практически все FR-области соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированные антитела также необязательно содержат по меньшей мере фрагмент константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно происходящий из иммуноглобулина человека. Более подробное описание см. в публикациях Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
"Видоспецифичное антитело", например, антитело млекопитающего против IgE человека, представляет собой антитело, обладающее усиленным сродством связывания к антигену млекопитающих одного вида по сравнению с гомологом этого антигена у млекопитающих другого вида. В норме видоспецифичное антитело “специфически связывается” с антигеном человека (т.е. обладает значением сродства связывания (Kd) не более чем приблизительно 1 х 10-7 M, предпочтительно не более чем приблизительно 1 х 10-8 и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1 х 10-9 M), но обладает по меньшей мере приблизительно в 50 раз или по меньшей мере приблизительно в 500 раз или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз более слабым сродством связывания к гомологу этого антигена у млекопитающего другого вида, не являющегося человеком, чем сродство связывания этого антитела с антигеном человека. Видоспецифичное антитело может являться антителом любого из различных типов, определение которых приведено выше, но предпочтительно представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека.
Термины "нумерация остатков вариабельного домена по Кабату" или "нумерация положений аминокислот по Кабату" и их модификации относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой или легкой цепи в составе антител в работе Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). При использовании этой системы нумерации реальная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорачиванию или инсерции в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать единичную аминокислотную инсерцию (остаток 52a по Кабату) после остатка 52 H2 и внедренные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т.д. по Кабату) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Кабату можно определить для данного антитела путем его выравнивания по областям гомологии последовательности этого антитела со "стандартной" последовательностью, пронумерованной по Кабату.
Фраза "практически аналогичный" или "практически такой же", как используется здесь, означает достаточно высокую степень сходства двух численных значений (одно из которых обычно связано с антителом по изобретению, а другое - с эталонным антителом/антителом для сравнения) для того, чтобы специалист в данной области мог считать различие между этими двумя значениями небольшим или не имеющим биологического значения и/или статистической значимости в контексте биологической характеристики, измеряемой посредством указанных значений (например, значений Kd). Различие между указанными двумя значениями предпочтительно менее приблизительно 50%, предпочтительно менее приблизительно 40%, предпочтительно менее приблизительно 30%, предпочтительно менее приблизительно 20%, предпочтительно менее приблизительно 10% от значения для эталонного антитела/антитела для сравнения.
"Сродство связывания" в общем случае относится к силе суммы нековалентных взаимодействий между одиночным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, как используется здесь, "сродство связывания" относится к присущему молекуле сродству связывания, отражающему взаимодействие между членами пары связывающихся компонентов (например, антителом и антигеном) при их соотношении 1:1. Сродство молекулы X к ее партнеру Y в целом можно выразить константой диссоциации (Kd). Сродство можно измерить с помощью общепринятых в данной области техники способов, включая способы, описанные в настоящем документе. Антитела с низким сродством в общем случае связывают антиген медленнее и имеют склонность к более легкой диссоциации, в то время как антитела с высоким сродством в общем случае связывают антиген быстрее и имеют склонность к более длительному времени связывания. В данной области техники известны различные способы измерения сродства связывания, любой из которых можно использовать для целей настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные варианты воплощения описаны далее.
В одном из вариантов воплощения "Kd" или "значение Kd", согласно настоящему изобретению, измеряют с помощью анализа связывания антигена, меченного радиоактивной меткой (РИА), выполняемого с использованием Fab-варианта исследуемого антитела и его антигена, как описано в методике следующего анализа, измеряющего сродство связывания Fab с антигеном в растворе путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией антигена, меченного 125I, при титровании набором концентраций немеченного антигена с последующим захватом связанного антигена планшетом, покрытым антителами против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Для стабилизации условий анализа титрационные микропланшеты (Dynex) покрывали в течение ночи 5 мкг/мл антителами для захвата Fab (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (pH 9,6), а затем блокировали 2% (масс/об) раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение двух - пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) смешивали 100 пМ или 26 пМ [125I]-антигена с последовательно разбавленными растворами исследуемых Fab (например, в соответствии с оценкой антител Fab-12 против фактора роста эндотелия сосудов в работе Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем исследуемые Fab инкубировали в течение ночи; в то же время, инкубирование могло продолжаться в течение более длительного периода (например, 65 часов) для гарантии достижения равновесия. Затем смесь переносили на планшет для захвата и инкубировали при комнатной температуре (например, в течение часа). Затем удаляли раствор и промывали планшет восемь раз 0,1% Tween-20 в PBS. После высушивания планшетов добавляли 150 мкл сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard) на лунку и производили подсчет планшетов на гамма-счетчике Topcount gamma counter (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, обеспечивавшие связывание, меньшее или равное 20% от максимального, отбирали для использования в конкурентном анализе связывания. Согласно еще одному варианту воплощения, Kd или значение Kd измеряли за счет анализа поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройств BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США) при 25°C, используя чипы CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). Вкратце, чипы биосенсора с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активировали N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разбавляли 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и вводили при скорости потока 5 мкл/минуту, достигая приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После введения антигена вводили 1 М раствор этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений вводили двукратные последовательные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C и скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и диссоциации (koff) рассчитывали с помощью простейшей модели связывания Ленгмюра при соотношении один к одному (программное обеспечение BIAcore Evaluation Software версии 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограммы ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Если скорость ассоциации согласно вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса превышает 106 M-1 С-1, то ее можно определить с помощью методики гашения флуоресценции, измеряющей увеличение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C для 20 нМ раствора антител против антигена (в форме Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных на спектрометре, например, на спектрофотометре с устройством остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометре SLM-Aminco 8000-серий (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.
"Скорость ассоциации" или "kon" согласно настоящему изобретению также можно измерить с помощью вышеописанной методики поверхностного плазмонного резонанса, используя BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США) при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). Вкратце, чипы биосенсора с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активировали N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разбавляли 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и вводили при скорости потока 5 мкл/минуту, достигая приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. Затем вводили 1 М раствор этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений вводили двукратные последовательные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C и скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и диссоциации (koff) рассчитывали с помощью простейшей модели связывания Ленгмюра при соотношении один к одному (программное обеспечение BIAcore Evaluation Software версии 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограммы ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. В то же время, если скорость ассоциации согласно вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса превышает 106 M-1 С-1, то ее предпочтительно определять с помощью методики гашения флуоресценции, измеряющей увеличение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C для 20 нМ раствора антител против антигена (в форме Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных на спектрометре, например, на спектрофотометре с устройством остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометре SLM-Aminco 8000-серий (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой. "Kd" или "значение Kd", согласно настоящему изобретению, в одном из вариантов воплощения измеряют с помощью анализа связывания антигена, меченного радиоактивной меткой (РИА) выполняемого с использованием Fab-варианта антитела и молекулы антигена, как описано в методике следующего анализа, измеряющего сродство связывания Fab с антигеном в растворе путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией антигена, меченного 125I, при титровании набором концентраций немеченного антигена, с последующим захватом связанного антигена планшетом, покрытым антителами против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Для стабилизации условий анализа титрационные микропланшеты (Dynex) покрывали в течение ночи 5 мкг/мл антителами для захвата Fab (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (pH 9,6), а затем блокировали 2% (масс/об) раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение двух - пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) смешивали 100 пМ или 26 пМ [125I]-антигена с последовательно разбавленными растворами исследуемых Fab (в соответствии с оценкой антител Fab-12 против фактора роста эндотелия сосудов в работе Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем исследуемые Fab инкубировали в течение ночи; в то же время, инкубирование могло продолжаться в течение более длительного периода (например, 65 часов) для гарантии достижения равновесия. Затем смесь переносили на планшет для захвата и инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Затем удаляли раствор и промывали планшет восемь раз 0,1% Tween-20 в PBS. После высушивания планшетов добавляли 150 мкл сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard) на лунку и производили подсчет планшетов на гамма-счетчике Topcount gamma counter (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, обеспечивавшие связывание, меньшее или равное 20% от максимального, отбирали для использования в конкурентном анализе связывания. Согласно еще одному варианту воплощения, Kd или значение Kd измеряли за счет анализа поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройств BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США) при 25°C, используя чипы CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). Вкратце, чипы биосенсора с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активировали N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разбавляли 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и вводили при скорости потока 5 мкл/минуту, достигая приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После введения антигена вводили 1 М раствор этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений вводили двукратные последовательные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25ºC и скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и диссоциации (koff) рассчитывали с помощью простейшей модели связывания Ленгмюра при соотношении один к одному (программное обеспечение BIAcore Evaluation Software версии 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограммы ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Если скорость ассоциации согласно вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса превышает 106 M-1 С-1, то ее можно определить с помощью методики гашения флуоресценции, измеряющей увеличение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C для 20 нМ раствора антител против антигена (в форме Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных на спектрометре, например, на спектрофотометре с устройством остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометре SLM-Aminco 8000-серий (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.
В одном из вариантов воплощения "скорость ассоциации" или "kon" согласно настоящему изобретению измеряли с помощью вышеописанной методики поверхностного плазмонного резонанса, используя BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США) при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). Вкратце, чипы биосенсора с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активировали N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разбавляли 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и вводили при скорости потока 5 мкл/минуту, достигая приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. Затем вводили 1 М раствор этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений вводили двукратные последовательные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25ºC и скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и диссоциации (koff) рассчитывали с помощью простейшей модели связывания Ленгмюра при соотношении один к одному (программное обеспечение BIAcore Evaluation Software версии 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограммы ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывали как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. В то же время, если скорость ассоциации согласно вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса превышает 106 M-1 С-1, то ее предпочтительно определять с помощью методики гашения флуоресценции, измеряющей увеличение или снижение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C для 20 нМ раствора антител против антигена (в форме Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных на спектрометре, например, на спектрофотометре с устройством остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометре SLM-Aminco 8000-серий (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.
Фраза "значительно пониженный" или "в значительной степени отличающийся", как используется здесь, означает достаточно высокую степень различия двух численных значений (одно из которых обычно связано с антителом по изобретению, а другое - с эталонным антителом/антителом для сравнения) для того, чтобы специалист в данной области мог считать различие между этими двумя значениями статистически значимым в контексте биологической характеристики, измеряемой посредством указанных значений (например, значений Kd, ответа HAMA). Различие между указанными двумя значениями предпочтительно более приблизительно 10%, предпочтительно более приблизительно 20%, предпочтительно более приблизительно 30%, предпочтительно более приблизительно 40%, предпочтительно более приблизительно 50% от значения для эталонного антитела/антитела для сравнения.
"Антиген" представляет собой заранее определенный антиген, с которым может селективно связываться антитело. Антиген-мишень может являться полипептидом, углеводом, нуклеиновой кислотой, липидом, гаптеном или другим природным или синтетическим соединением. В предпочтительном случае антиген-мишень представляет собой полипептид. "Акцепторный каркас человека" для целей настоящей заявки представляет собой каркас, включающий аминокислотную последовательность VL- или VH-каркаса, являющуюся производным каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека. Акцепторный каркас человека, "являющийся производным" каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, может включать совпадающую с ними аминокислотную последовательность или может содержать заранее существовавшие изменения аминокислотной последовательности. Если имеют место заранее существовавшие изменения аминокислот, предпочтительно не более 5, и предпочтительно 4 или менее, либо 3 или менее, имеют место заранее существовавшие изменения аминокислот. Если заранее существовавшие изменения аминокислот имеют место в VH, эти изменения предпочтительно присутствуют только по трем, двум или одному из положений 71H, 73H и 78H; например, аминокислотные остатки в этих положениях могут представлять собой 71A, 73T и/или 78A. В одном из вариантов воплощения последовательность VL-акцепторного каркаса человека идентична последовательности VL-каркаса иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека.
Антитела по настоящему изобретению могут обладать способностью конкурировать за связывание с тем же эпитопом, который связывается со вторым антителом. Считается, что моноклональные антитела совместно используют "один и тот же эпитоп", если каждое из них блокирует связывание другого на 40% или более при одинаковой концентрации антител в ходе стандартного анализа конкурентного связывания антител in vitro.
"Консенсусный каркас человека" является каркасом, представляющим наиболее распространенный аминокислотный остаток в выборке VL- или VH-каркасных последовательностей иммуноглобулина человека. В общем случае выборку VL- или VH-последовательностей иммуноглобулина человека создают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. В общем случае подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу по Kabat et al. В одном из вариантов воплощения, для VL, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу каппа I по Kabat et al. В одном из вариантов воплощения, для VH, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу III по Kabat et al.
"Консенсусный каркас VH подгруппы III" включает консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей, входящих в состав подгруппы III вариабельных областей тяжелых цепей по Kabat et al.
"Консенсусный каркас VL подгруппы I" включает консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей, входящих в состав подгруппы каппа I вариабельных областей легких цепей по Kabat et al.
"Немодифицированный каркас человека" представляет собой каркас человека, аминокислотная последовательность которого совпадает с акцепторным каркасом человека, например, не содержит аминокислотных(ой) замен(ы), не характерных для акцепторного каркаса человека.
"Модифицированная гипервариабельная область" для целей настоящей заявки представляет собой гипервариабельную область, включающую одну или более (например, от одной до приблизительно 16) аминокислотных(ую) замен(у).
"Немодифицированная гипервариабельная область" для целей настоящей заявки представляет собой гипервариабельную область, аминокислотная последовательность которой совпадает с последовательностью, характерной для антитела нечеловеческого происхождения, производной которого она является, т.е. область, не содержащую одну или более аминокислотных замен.
Термин "гипервариабельная область", "HVR", "HV" или “CDR”, используемый здесь, относится к областям вариабельного домена антитела, последовательность которых является гипервариабельной и/или образует петли с определенной структурой. В общем случае антитела включают шесть гипервариабельных областей, три из которых расположены в VH (H1, H2, H3), а три - в VL (L1, L2, L3). Используется ряд описаний гипервариабельных областей, охватываемых настоящей заявкой. Понятие "Области, определяющие комплементарность" по Кабату (CDR) основано на вариабельности последовательности и используется наиболее часто (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Chothia ссылается вместо этого на расположение структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Понятие "контактных" гипервариабельных областей основано на анализе доступных кристаллических структур комплексов. Остатки, входящие в каждую из этих гипервариабельных областей, отмечены ниже. Если не указано иное, используется нумерация по Кабату. В общем случае гипервариабельные области располагаются следующим образом: аминокислоты 24-34 (HVR-L1), аминокислоты 49-56 (HVR-L2), аминокислоты 89-97 (HVR-L3), аминокислоты 26-35A (HVR-H1), аминокислоты 49-65 (HVR-H2) и аминокислоты 93-102 (HVR-H3).
Гипервариабельные области также могут включать следующие "расширенные гипервариабельные области": аминокислоты 24-36 (L1) и аминокислоты 46-56 (L2) в составе VL. Остатки вариабельного домена для каждого из этих определений нумеровали по Kabat et al., выше.
"Каркасные" или "FR" остатки представляют собой остатки вариабельного домена, не являющиеся остатками гипервариабельных областей, как определено выше.
"Антитело человека" представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого в организме человека, и/или изготавливаемого с помощью любой методики получения антител человека, описанной здесь. Из этого определения антитела человека, в частности, исключено гуманизированное антитело, содержащее антиген-связывающие остатки нечеловеческого происхождения.
Антитело "созревшей аффинности" представляет собой антитело, содержащее одну или более модификаций в одном или более CDR, приводящие к усилению сродства антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, не содержащим указанной(ых) модификации(й). Предпочтительные антитела созревшей аффинности обладают наномолярными или даже пикомолярными значениями сродства к антигену-мишени. Антитела созревшей аффинности получают с помощью известных в данной области техники процедур. В работе Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описано созревание аффинности путем перетасовки VH- и VL-доменов. Неспецифический мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан в работах: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
"Блокирующее" антитело или "антагонистическое" антитело представляет собой антитело, подавляющее или блокирующее биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Предпочтительные блокирующие антитело или антагонистические антитела в значительной степени или полностью подавляют биологическую активность антигена.
"TAT-связывающий олигопептид" представляет собой олигопептид, связывающийся, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь. TAT-связывающий олигопептид можно химически синтезировать с помощью известной методологии синтеза олигопептидов, или получить и очистить с помощью рекомбинантной технологии. Обычно длина вариантов TAT-полипептидов составляет по меньшей мере приблизительно 5 аминокислот, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или более, причем такие олигопептиды способны связываться, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь. TAT-связывающие олигопептиды можно идентифицировать без излишних экспериментов, используя общеизвестные методики. В этой связи следует отметить, что методики скрининга библиотек олигопептидов с целью поиска олигопептидов, способных специфически связываться с полипептидной мишенью, широко известны в данной области техники (см., например, патенты США №№ 5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; публикации PCT №№ WO 84/03506 и WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, и Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
"TAT-связывающая органическая молекула" представляет собой органическую молекулу, не являющуюся олигопептидом или антителом, как определено здесь, которая связывается, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь. TAT-связывающие органические молекулы можно идентифицировать и химически синтезировать с использованием известной методологии (см., например, публикации PCT №№ WO00/00823 и WO00/39585). Размер TAT-связывающих органических молекул обычно менее приблизительно 2000 дальтон, в альтернативном случае менее приблизительно 1500, 750, 500, 250 или 200 дальтон, причем такие органические молекулы, способные связываться, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь, можно идентифицировать без излишних экспериментов с помощью общеизвестных методик. В этой связи следует отметить, что методики скрининга библиотек органических молекул с целью поиска молекул, способных специфически связываться с полипептидной мишенью, широко известны в данной области техники (см., например, публикации PCT №№ WO00/00823 и WO00/39585).
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Антитело, олигопептид или другая органическая молекула, "связывающаяся" с интересующим исследователя антигеном, например, с полипептидным антигеном-мишенью, ассоциированным с опухолью, представляет собой агент, связывающий антиген с достаточным сродством, так что указанные антитело, олигопептид или другая органическая молекула могут использоваться в качестве диагностического и/или терапевтического агента при адресном воздействии на клетку или ткань, экспрессирующую антиген, и не проявляют значительной склонности вступать в перекрестные реакции с другими белками. В таких вариантах воплощения степень связывания антитела, олигопептида или другой органической молекулы с "нецелевым" белком составляет менее приблизительно 10% от связывания антитела, олигопептида или другой органической молекулы с их специфическим белком-мишенью согласно определению с помощью анализа на основе флуоресцентной сортировки клеток (FACS) или радиоиммунопреципитации (РИА). По отношению к связыванию антитела, олигопептида или другой органической молекулы с молекулой-мишенью, термин "специфическое связывание" или "специфически связывается с" или "специфичен к" определенному полипептиду или эпитопу в составе конкретной полипептидной мишени означает связывание, измеримо отличающееся от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание можно измерить, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием с контрольной молекулой, которая в общем случае представляет собой молекулу с аналогичной структурой, не обладающей связывающей активностью. Например, специфическое связывание можно определить за счет конкуренции с контрольной молекулой, аналогичной мишени, например, избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание определяют, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Термин "специфическое связывание" или "специфически связывается с" или "специфичен к" определенному полипептиду или эпитопу в составе конкретной полипептидной мишени, как используется здесь, может демонстрироваться, например, молекулой, обладающей Kd, равной по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10 M, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10M или более. В одном из вариантов воплощения термин "специфическое связывание" относится к связыванию, при котором молекула связывается с определенным полипептидом или эпитопом в составе определенного полипептида и практически не связывается с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.
Антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которая "подавляет рост опухолевых клеток, экспрессирующих TAT-полипептид" или "подавляющее рост" антитело, олигопептид или другая органическая молекула представляют собой агент, приводящий к измеримому ингибированию роста раковых клеток, экспрессирующих или сверхэкспрессирующих соответствующий TAT-полипептид. TAT-полипептид может представлять собой трансмембранный полипептид, экспрессируемый на поверхности раковой клетки, или полипептид, продуцируемый и секретируемый раковой клеткой. Предпочтительные подавляющие рост антитела, олигопептиды или органические молекулы подавляют рост TAT-экспрессирующих опухолевых клеток более чем на 20%, предпочтительно от приблизительно 20% до приблизительно 50%, еще более предпочтительно - более чем на 50% (например, от приблизительно 50% до приблизительно 100%) по сравнению с соответствующим контролем, которым обычно являются опухолевые клетки, не обработанные антителом, олигопептидом или другой тестируемой органической молекулой. В одном из вариантов воплощения ингибирование роста можно измерить при концентрации антител от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мкг/мл или от приблизительно 0,5 нМ до 200 нМ в культуре клеток, причем ингибирование роста определяют спустя 1-10 суток после воздействия антител на опухолевые клетки. Ингибирование роста опухолевых клеток in vivo можно определить различными способами, как описано ниже в разделе Экспериментальные Примеры. Антитело является подавляющим рост in vivo, если введение антитела против TAT в концентрации от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мкг/кг массы тела приводит к сокращению размера опухоли или снижению пролиферации опухолевых клеток в течение периода от приблизительно 5 суток до 3 месяцев после первого введения антитела, предпочтительно в течение периода от 5 до 30 суток.
Антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которая "индуцирует апоптоз", представляет собой агент, индуцирующий программированную гибель клетки, что определяют по связыванию аннексина V, фрагментации ДНК, сокращению размеров клетки, набуханию эндоплазматического ретикулума, фрагментации клетки и/или образованию мембранных везикул (называемых апоптотическими телами). Клетка обычно представляет собой клетку, сверхэкспрессирующую TAT-полипептид. В предпочтительном случае клетка представляет собой клетку опухоли, например, предстательной железы, молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, легких, почек, толстой кишки, мочевого пузыря. Доступны различные способы оценки клеточных событий, ассоциированных с апоптозом. Например, транслокацию фосфатидилсерина (PS) можно измерить по связыванию аннексина; фрагментацию ДНК можно оценить за счет электрофоретического расщепления ДНК; а конденсацию ядра/хроматина наряду с фрагментацией ДНК можно оценить по любому увеличению количества гиподиплоидных клеток. В предпочтительном случае антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которая индуцирует апоптоз, представляет собой агент, приводящий к приблизительно 2-50-кратной, предпочтительно к приблизительно 5-50-кратной и наиболее предпочтительно - к приблизительно 10-50-кратной индукции связывания аннексина по сравнению с необработанными клетками в ходе анализа связывания аннексина.
“Эффекторные функции” антитела относятся к его биологической активности, относимой на счет Fc-участка (последовательности природного Fc-участка или аминокислотной последовательности мутантного Fc-участка) антитела, и меняются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание с C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; ингибирование регуляции рецепторов поверхности клетки (например, рецептора B-клеток); и активацию B-клеток.
"Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" или ADCC относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемые Ig связываются с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на некоторых цитотоксических клетках (например, естественных киллерах (NK-клетках), нейтрофилах и макрофагах), позволяя этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с клетками-мишенями, несущими антигены, и, как следствие, уничтожать эти клетки-мишени с помощью цитотоксинов. Антитела "вооружают" (сенсибилизируют) цитотоксические клетки и абсолютно необходимы для такого уничтожения. Основные опосредующие ADCC клетки - NK-клетки - экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на поверхности гемопоэтических клеток кратко изложена в Таблице 3 на странице 464 работы Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Для оценки ADCC-активности молекулы, представляющей интерес, можно выполнить анализ ADCC in vitro, например, согласно описанию в патентах США № 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеары периферической крови (PBMC) и естественные киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнения, ADCC-активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, на животной модели, например, согласно описанию в публикации Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998).
Термин "Fc-рецептор" или "FcR" описывает рецептор, связывающийся с Fc-участком антитела. Предпочтительный FcR представляет собой нативную последовательность FcR человека. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой рецептор, связывающийся с антителом IgG (гамма-рецептор), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы этих рецепторов, подвергшиеся альтернативным вариантам сплайсинга. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые обладают аналогичными аминокислотными последовательностями, различающимися главным образом в области цитоплазматических доменов. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM). (см. обзор M. in Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Обзор FcR приведен в работах Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, включая рецепторы, которые будут идентифицированы в будущем, входят в рамки термина "FcR" в настоящем документе. Этот термин также включает неонатальный рецептор FcRn, который отвечает за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, экспрессирующие один или несколько FcR и выполняющие эффекторные функции. Предпочтительно, эти клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, опосредующих ADCC, включают мононуклеары периферической крови (PBMC), естественные киллеры (NK), моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы, причем предпочтительными являются PBMC и NK-клетки. Эффекторные клетки можно выделить из естественного источника, например, из крови.
"Комплементзависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Классический путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), связанными с распознаваемым ими антигеном. Для оценки активации комплемента можно выполнить CDC-тест, например, согласно описанию в публикации Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Термины "рак" и "злокачественный" относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, обычно характеризующееся нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфонеоплазию. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легких, включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевыделительных путей, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак ободочной и прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, гипернефрому или рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатокарциному, карциному анального канала, карциному полового члена, меланому, множественную миелому и B-клеточную лимфому, рак головного мозга, а также рак головы и шеи и ассоциированные метастазы.
Термины "расстройство пролиферации клеток" и "пролиферативное расстройство" относятся к расстройствам, ассоциированным с некоторой степенью аномальной пролиферации клеток. В одном варианте воплощения расстройство пролиферации клеток представляет собой рак.
"Опухоль", как используется здесь, относится к росту и пролиферации всех неопластических клеток, как злокачественных, так и доброкачественных, и всех предраковых и раковых клеток и тканей.
Антитело, олигопептид или другая органическая молекула, которая "индуцирует гибель клетки", представляет собой агент, превращающий жизнеспособную клетку в нежизнеспособную. Клетка представляет собой клетку, экспрессирующую TAT-полипептид, предпочтительно клетку, сверхэкспрессирующую TAT-полипептид, по сравнению с нормальной клеткой из того же типа ткани. TAT-полипептид может представлять собой трансмембранный полипептид, экспрессируемый на поверхности раковой клетки, или полипептид, продуцируемый и секретируемый раковой клеткой. В предпочтительном случае клетка представляет собой раковую клетку, например, молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнных желез, легких, почек, толстой кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы или мочевого пузыря. Гибель клеток in vitro можно определить в отсутствие комплемента и эффекторных клеток иммунной системы для различения гибели клеток, вызванной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичностью (CDC). Таким образом, анализ гибели клеток можно осуществить, используя сыворотку, инактивированную нагреванием (т.е. в отсутствие комплемента) и в отсутствие эффекторных клеток иммунной системы. Для определения того, способно ли антитело, олигопептид или другая органическая молекула индуцировать гибель клеток, оценивают потерю целостности мембраны по поглощению иодида пропидия (PI), трипанового синего (см. Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) или 7AAD по сравнению с необработанными клетками. Предпочтительные антитела, олигопептиды или другие органические молекулы, индуцирующие гибель клеток, представляют собой агенты, индуцирующие поглощение PI в анализе поглощения PI в клетках BT474.
"TAT-экспрессирующая клетка" представляет собой клетку, экспрессирующую эндогенный или трансфицированный TAT-полипептид на поверхности клетки или в секретируемой форме. "TAT-экспрессирующий рак" представляет собой рак, включающий клетки, на поверхности которых присутствует TAT-полипептид или которые продуцируют и секретируют TAT-полипептид. "TAT-экспрессирующий рак" необязательно продуцирует достаточный уровень TAT-полипептида на поверхности своих клеток, чтобы антитело, олигопептид или другая органическая молекула против TAT могла связаться с ними и оказывать терапевтическое действие по отношению к раку. В еще одном варианте воплощения "TAT-экспрессирующий рак" необязательно продуцирует и секретирует достаточный уровень TAT-полипептида, чтобы антитело, олигопептид против TAT или другая органическая молекула-антагонист могла связаться с ним и оказывать терапевтическое действие по отношению к раку. В связи с вышесказанным, указанный антагонист может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, снижающий, подавляющий или предотвращающий продукцию и секрецию секретируемого TAT-полипептида опухолевыми клетками. Рак, который "сверхэкспрессирует" TAT-полипептид, представляет собой рак, на поверхности клеток которого присутствует значительно более высокий уровень TAT-полипептида, или который продуцирует и секретирует значительно более высокий уровень TAT-полипептида по сравнению с нераковой клеткой из того же типа ткани. Такая сверхэкспрессия может вызываться амплификацией гена или повышенной транскрипцией или трансляцией. Сверхэкспрессию TAT-полипептида можно определить в ходе диагностического или прогностического анализа путем оценки повышенного уровня TAT-белка, присутствующего на поверхности клетки или секретируемого клеткой (например, с помощью иммуногистохимического анализа, используя антитела против TAT, полученные против выделенного TAT-полипептида, который можно получить с помощью технологии рекомбинантных ДНК из выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей TAT-полипептид; FACS-анализа и т.д.). В качестве альтернативы или дополнения можно измерить уровни нуклеиновой кислоты или мРНК, кодирующей TAT-полипептид, в клетке, например, с помощью флуоресцентной гибридизации in situ, используя нуклеотидный зонд, соответствующий нуклеиновой кислоте, кодирующей TAT, или комплементарной ей последовательности; (FISH; см. WO98/45479, опубликованную в октябре 1998 г.), саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг или методики полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, количественную ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Кроме того, можно исследовать сверхэкспрессию TAT-полипептида путем измерения слущивающихся антигенов в биологической жидкости, например, сыворотке, например, используя виды анализа на основе антител (см. также, например, патент США № 4933294, поданный 12 июня 1990 г.; WO91/05264, опубликованную 18 апреля 1991 г.; патент США 5401638, поданный 28 марта 1995 г.; и Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Кроме вышеуказанных анализов, для специалиста в данной области доступны различные анализы in vivo. Например, можно воздействовать на клетки в организме пациента антителами, необязательно меченными обнаруживаемой меткой, например, радиоактивным изотопом, и оценить связывание антител с клетками в организме пациента, например, с помощью внешнего сканирования радиоактивности или анализа биоптата, полученного от пациента, ранее подвергнутого воздействию антител.
Как используется здесь, термин "иммуноадгезин" обозначает антителоподобные молекулы, объединяющие специфичность связывания гетерологичного белка (адгезина) с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. В структурном отношении иммуноадгезины включают гибридный белок из аминокислотной последовательности с желательной специфичностью связывания, отличающейся от сайтов распознавания и связывания антигена в составе антитела (т.е. являющейся "гетерологичной") и последовательности константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере сайт связывания рецептора или лиганда. Последовательность константного домена иммуноглобулина в составе иммуноадгезина можно получить из любого иммуноглобулина, например, подтипов IgG-1, IgG-2, IgG-3 или IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM.
Слово "метка", используемое здесь, относится к обнаруживаемому соединению или композиции, конъюгированной напрямую или непрямым образом с антителом, олигопептидом или другой органической молекулой с целью получения "меченого" антитела, олигопептида или другой органической молекулы. Метка может быть обнаруживаемой сама по себе (например, радиоизотопные или флуоресцентные метки) или, в случае ферментных меток, может катализировать химическую модификацию субстратного соединения или композиции, которая является обнаруживаемой.
Термин "цитотоксический агент", как используется здесь, относится к веществу, подавляющему или предотвращающему функцию клеток и/или вызывающему разрушение клеток. Подразумевается, что этот термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты, ферменты и их фрагменты, например, нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, например, низкомолекулярные токсины или токсины с ферментативной активностью бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже. Другие цитотоксические агенты описаны ниже. Туморицидные агенты вызывают разрушение опухолевых клеток.
"Химиотерапевтический агент" представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, например, тиотепа и циклофосфамид Цитоксан; алкилсульфонаты, например, бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, например, бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, Маринол); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (Гикамтин), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOSAR), ацетилкамптотецин, скополетин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; аналоги азотистого иприта, например, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; производные нитрозомочевины, например, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, например, энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, а в частности, калихеамицин гамма1I и калихеамицин омегаI1 (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин, а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотики-хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин Адриамицин (включая морфолиндоксорубицин, цианморфолиндоксорубицин, 2-пирролиндоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, например, митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, например, метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, например, деноптерин, метотрексан, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, например, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, например, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергические средства, например, аминоглютетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, например, фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и анзамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Юджин, штат Орегон, США); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (Элдезин, FILDESIN); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел Таксол (Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, штат Нью-Джерси, США); не содержащий кремофора АбраксанTM, сконструированный на основе альбумина препарат наночастиц паклитаксела (American Pharmaceuticals Partners, Шаумбург, штат Иллинойс, США) и доцетаксел Таксотер (Rhône-Poulenc Rorer, Антони, Франция); хлоранбуцил; гемцитабин (Гемзар); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (Велбан); платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (Онковин); оксалиплатин; лейкововин; винорелбин (Навельбин); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДМФО); ретиноиды, например, ретиноевую кислоту; капецитабин (Кселода); фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные всех вышеуказанных соединений; а также комбинации двух или более вышеуказанных соединений, например, СНОР (аббревиатура, означающая комбинированную терапию циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном) и FOLFOX (аббревиатура, означающая курс лечения оксалиплатином (ЭлоксатинTM) в комбинации с 5-FU и лейкововином.
В это определение также входят противогормональные агенты, регулирующие, снижающие, блокирующие или подавляющие действие гормонов, которые могут стимулировать рост рака, и часто применяющиеся в форме системного или общего лечения. Они могут сами являться гормонами. Их примеры включают антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен Нолвадекс), ралоксифен Эвиста, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен Фарестон; антипрогестероны; ингибиторы рецепторов эстрогенов (ERD); агенты, подавляющие или выключающие функции яичников, например, агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH), например, Люпрон и лейпролида ацетат Элигард, гозерелина ацетат, бузерелина ацетат и триптерелин; другие антиандрогены, например, флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, регулирующий образование эстрогенов в надпочечниках, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат Мегейс, экземестан Аромазин, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR, летрозол Фемара и анастрозол Аримидекс. Кроме того, такое определение химиотерапевтических агентов включает бифосфонаты, например, клодронат (например, Бонефос или OSTAC), этидронат Дидрокал, NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат Зомета, алендронат Фосамакс, памидронат Аредиа, тилудронат Скелид или ризедронат Актонель, а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, олигонуклеотиды, подавляющие экспрессию генов сигнальных путей, участвующих в нежелательной пролиферации клеток, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, например, вакцину THERATOPE и генотерапевтические вакцины, например вакцину Алловектин, вакцину LEUVECTIN и вакцину VAXID; ингибитор топоизомеразы 1 Луртотекан; антагонист рилизинг-гормона гонадотропина Абареликс; лапатиниба дитозилат (двойной низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназ ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016) и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные всех вышеуказанных соединений.
Термин "агент, подавляющий рост", используемый здесь, относится к соединению или соединениям, подавляющим рост клетки, в особенности TAT-экспрессирующей раковой клетки in vitro или in vivo. Таким образом, агент, подавляющий рост, может представлять собой агент, существенно снижающий процент TAT-экспрессирующих клеток в фазе S. Примеры агентов, подавляющих рост, включают агенты, блокирующие ход клеточного цикла (в фазе, не являющейся фазой S), например, агенты, индуцирующие угнетение фаз G1 и M. Классические блокаторы фазы M включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, например, доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Агенты, угнетающие фазу G1, также распространяют действие на угнетение фазы S, например, ДНК-алкилирующие агенты, например, тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительная информация содержится в главе 1 книги The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., озаглавленной "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", авторами которой являются Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно на с. 13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые лекарственные средства, получаемые из тиса. Доцетаксел (Таксотер, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из тиса ягодного, является полусинтетическим аналогом паклитаксела (Таксол, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел стимулируют сборку микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки за счет предотвращения деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза в клетках.
"Доксорубицин" представляет собой антрациклиновый антибиотик. Полное химическое название доксорубицина - (8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридеокси-α-L-ликсогексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион.
Термин "цитокин" является общим названием для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток и действующих на другую клетку как межклеточные медиаторы. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные полипептидные гормоны. В число цитокинов входят гормон роста, например, гормон роста человека, N-метионил-производное гормона роста человека и бычий гормон роста, паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, например, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропин (ТТГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ); фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; факторы некроза опухолей α и β; мюллерова ингибирующая субстанция; пептид мыши, связанный с гонадотропином; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, например, ФРН-β; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие ростовые факторы (ТГФ), например, ТГФ-α и ТГФ-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, например, интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (КСФ), например, макрофагальный КСФ (МКСФ); гранулоцитарно-макрофагальный КСФ (ГМКСФ); и гранулоцитарный КСФ (ГКСФ); интерлейкины (IL), например, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; фактор некроза опухолей, например, ФНО-α или ФНО-β; и другие полипептидные факторы, включая LIF и лиганд Kit (KL). Как используется здесь, термин "цитокин" включает белки из природных источников или культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты нативных последовательностей цитокинов.
Термин "вкладыш в упаковку" относится к инструкциям, в обычном порядке вкладываемым в упаковки терапевтических продуктов для продажи, содержащие информацию о показаниях, использовании, дозировке, приеме, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся использования таких терапевтических продуктов.
II. Композиции и способы согласно изобретению
A. Антитела против TAT
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение представляет антитела против TAT, которые могут находить применение в качестве терапевтических и/или диагностических агентов. Типичные антитела включают поликлональные, моноклональные, гуманизированные, биспецифические и гетероконъюгатные антитела.
1. Поликлональные антитела
Образование поликлональных антител у животных предпочтительно индуцируют путем множественных подкожных (п/к) или внутрибрюшинных (в/б) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может быть полезно конъюгировать рассматриваемый антиген (в особенности при использовании синтетических пептидов) с белком, являющимся иммуногенным для иммунизируемого вида. Например, антиген можно конъюгировать с гемоцианином лимфы улитки (keyhole limpet hemocyanin, KLH), сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина сои с помощью бифункционального или модифицирующего агента, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидного эфира (конъюгирование через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl2 или R1N=C=NR, где R и R1 представляют собой различные алкильные группы.
Животных иммунизируют антигеном, иммуногенными конъюгатами или их производными путем объединения, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и внутридермального введения раствора в различные участки тела. Спустя месяц животных стимулируют путем подкожных инъекций пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда в количестве от 1/5 до 1/10 от исходного в различные участки тела. Спустя интервал времени от семи до 14 суток у животных производят пробоотбор крови и анализируют титр антител в сыворотке. Животных стимулируют до достижения постоянного уровня титра. Конъюгаты также можно получить в культуре рекомбинантных клеток в виде гибридных белков. Кроме того, для усиления иммунного ответа можно использовать агенты, вызывающие агрегацию, например, алюминиевые квасцы.
2. Моноклональные антитела
Моноклональные антитела можно получить с помощью гибридомной технологии, впервые описанной в работе Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), либо с помощью технологии рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).
В соответствии с технологией гибридом, мышь или другое подходящее животное-носитель, например, хомячка, иммунизируют в соответствии с вышеприведенным описанием с целью выделения лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, используемым для иммунизации. В качестве альтернативы, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. После иммунизации выделяют лимфоциты, а затем сливают их с клетками миеломной линии с помощью подходящего агента, вызывающего слияние клеток, например, полиэтиленгликоля, получая клетку гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp,59-103 (Academic Press, 1986)).
Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, предпочтительно содержащей одно или несколько веществ, подавляющих рост или выживание негибридных исходных миеломных клеток (также называемых сливающимися клетками). Например, если исходные клетки миеломы дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (HGPRT или ГГФТ), селективная культуральная среда для гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые предотвращают рост ГГФТ-дефектных клеток.
Предпочтительные сливающиеся миеломные клетки, которые способны к эффективному слиянию, поддерживают стабильно высокий уровень продукции антител и чувствительны к селективным средам, осуществляющим селекцию против неслившихся исходных клеток. Предпочтительными миеломными клеточными линиями являются миеломные линии мышей, например, линии, происходящие от опухолей мышей MOPC-21 и MPC-11 и доступные для приобретения в Центре распространения клеток института Солка, Сан-Диего, Калифорния, США, и клетки SP-2 и их производные, например, клетки X63-Ag8-653, доступные для приобретения в Американской коллекции типовых культур, Манассас, штат Виргиния, США. Кроме того, описано использование линий клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, анализируют на продукцию моноклональных антител против заданного антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных клетками гибридомы, определяют с помощью иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, например, радиоиммуноанализа (РИА) или твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Сродство связывания моноклональных антител можно определить, например, с помощью анализа Скэтчарда, описанного в работе Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
После того, как установлено, что клетки гибридомы продуцируют антитела, обладающие желательной специфичностью, сродством и/или активностью, клоны можно субклонировать, используя способ серийных разведений, и вырастить с помощью стандартных способов (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp,59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие для этих целей культуральные среды включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы можно вырастить in vivo в организме животного в виде асцитной опухоли, например, путем внутрибрюшинной инъекции клеток в организм мыши.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, отделяют от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью стандартных процедур очистки антител, например, аффинной хроматографии (например, используя белок А или белок G-сефарозу) или ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатите, гель-электрофореза, диализа и т.д.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать с помощью стандартных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Предпочтительным источником такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения эту ДНК можно поместить в экспрессионные векторы, которыми затем можно трансфицировать клетки-носители, например, клетки E. coli, клетки обезьян линии COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или миеломные клетки, которые при других условиях не продуцируют белки антител, с целью синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-носителях. Обзорные статьи, посвященные рекомбинантной экспрессии ДНК, кодирующей антитела, в бактериях, включают публикации Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Plückthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).
В других вариантах воплощения моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделить из фаговых библиотек антител, полученных с использованием методик, описанных в статье McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описали выделение антител мыши и человека, соответственно, с использованием фаговых библиотек. Следующие публикации описывают получение высокоаффинных (в диапазоне нМ) антител человека путем комбинирования цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторную инфекцию и рекомбинацию in vivo в качестве стратегий конструирования очень крупных фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методики являются жизнеспособной альтернативой традиционным гибридомным методикам выделения моноклональных антител.
ДНК, кодирующую антитела, можно модифицировать с целью продукции химерных или гибридных полипептидов-антител, например, путем подстановки последовательностей константных доменов тяжелой и легкой цепей человека (CH и CL) вместо гомологичных последовательностей мыши (патент США № 4816567; и Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), или объединения кодирующей последовательности иммуноглобулина со всеми фрагментами кодирующей последовательности полипептида, не являющегося иммуноглобулином (гетерологичного полипептида). Последовательности полипептидов, не являющихся иммуноглобулинами, можно подставлять вместо константных доменов антитела, или вариабельных доменов одного из сайтов связывания с антигеном в составе антитела с целью создания химерного бивалентного антитела, включающего сайт связывания, обладающий специфичностью к антигену, и еще один сайт связывания, обладающий специфичностью к другому антигену.
3. Антитела человека и гуманизированные антитела
Антитела против TAT в соответствии с изобретением также могут включать гуманизированные антитела или антитела человека. Гуманизированные формы антител нечеловеческого происхождения (например, мыши) представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (например, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие последовательности антител), содержащие минимальное количество последовательностей, происходящих из иммуноглобулинов нечеловеческого происхождения. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (антитела реципиента), в которых остатки из гипервариабельной области (CDR) реципиента замещены остатками из CDR антитела нечеловеческого происхождения (антитела донора), например, антитела мыши, крысы или кролика, обладающими желательной специфичностью, сродством и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv иммуноглобулина человека замещают соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, не встречающиеся ни в антителах реципиента, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасного участка. В общем случае гуманизированные антитела содержат практически все из по меньшей мере одного, а обычно - двух вариабельных доменов, в которых все или практически все CDR-участки соответствуют аналогичным участкам из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или практически все FR-области, соответствующие консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. В оптимальном случае гуманизированные антитела также включают по меньшей мере фрагмент константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Широко известны способы гуманизирования антител нечеловеческого происхождения. В общем случае гуманизированное антитело несет один или несколько аминокислотных остатков, внедренных в него из источника нечеловеческого происхождения. Эти аминокислотные остатки нечеловеческого происхождения часто называют "импортными" остатками, которые обычно взяты из "импортного" вариабельного домена. Гуманизацию в принципе можно выполнить в соответствии со способом, описанным Winter и соавторами [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], или путем подстановки CDR или последовательностей CDR грызунов вместо соответствующих последовательностей антитела человека. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), в которых фрагмент, существенно меньший по сравнению с интактным вариабельным доменом человека, замещен соответствующей последовательностью нечеловеческого происхождения. Фактически, гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки в CDR-участках и, возможно, некоторые остатки в FR-участках заменены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов.
Выбор вариабельных доменов как легких, так и тяжелых цепей человека для использования при изготовлении гуманизированных антител очень важен для снижения антигенности и ответа HAMA (антител человека против антител мыши), если антитело предназначено для лечения людей. Согласно так называемому способу "наилучшего соответствия", последовательность вариабельного домена антитела грызуна сравнивают с полной библиотекой известных последовательностей вариабельных доменов человека. Идентифицируют последовательность V-домена человека, наиболее близкую к аналогичной последовательности грызуна, и используют каркасную область человека (FR) в ее пределах в составе гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В еще одном способе используют определенную каркасную область, происходящую от консенсусной последовательности всех антител человека, относящихся к определенной подгруппе легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркасный участок можно использовать в составе нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
Кроме того, важно, чтобы при гуманизации сохранялось высокое сродство связывания антител к антигену и другие выгодные биологические свойства. Для достижения этой цели в соответствии с предпочтительным способом гуманизированные антитела получают с помощью анализа исходных последовательностей и различных воображаемых гуманизированных продуктов, используя трехмерные модели исходной и гуманизированной последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и известны специалистам. Доступны компьютерные программы, иллюстрирующие и отображающие трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Исследование этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков при функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. установить остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с антигеном. Таким образом можно выбрать и комбинировать остатки в FR-участках импортируемой последовательности и последовательности-реципиенте, обеспечивая желательные характеристики антитела, например, повышенную аффинность к антигену(ам)-мишени(ям). В общем случае, остатки гипервариабельных областей напрямую и в наиболее значительной степени влияют на связывание с антигеном.
Рассматриваются различные формы гуманизированного антитела против TAT. Например, гуманизированное антитело может представлять собой фрагмент антитела, например, Fab, который необязательно конъюгируют с одним или более цитотоксическим(х) агентом(в), получая иммуноконъюгат. В качестве альтернативы, гуманизированное антитело может представлять собой интактное антитело, например, интактное антитело IgG1.
В качестве альтернативы гуманизации можно получить антитела человека. Например, в настоящее время возможно получить трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации способны продуцировать полный репертуар антител человека при отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция гена J-области тяжелых цепей антитела (JH) у химерных и мутантных зародышевых линий мышей приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулинов из зародышевой линии человека в мышей таких мутантных зародышевых линий приведет к продукции антител человека после антигенной стимуляции. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); патенты США №№ 5545806, 5569825, 5591669 (принадлежащие GenPharm); 5545807; и WO 97/17852.
В качестве альтернативы для получения антител человека и фрагментов антител in vitro на основе репертуара генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина неиммунизированных доноров можно использовать технологию фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]). Согласно этой методике гены V-доменов антител клонируют внутри рамки считывания гена основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, например, M13 или fd, и выставляют на поверхности фаговой частицы в качестве функциональных фрагментов антител. Поскольку нитевидные частицы содержат одноцепочечную ДНК-копию генома фага, селекция на основе функциональных свойств антитела также приводит к селекции гена, кодирующего антитело, обладающее указанными свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства B-клетки. Фаговый дисплей можно осуществлять в различных форматах, обзор которых приведен, например, в статье Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея можно использовать несколько источников сегментов V-гена. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили ряд различных антител против оксазолона из небольшой комбинаторной библиотеки случайных V-генов, происходящих из селезенки иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуар V-генов иммунизированных доноров-людей и выделить антитела к ряду разнообразных антигенов (включая аутоантигены) в основном следуя методикам, описанным в работе Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Кроме того, см. патенты США №№ 5565332 and 5573905.
Как обсуждается здесь, антитела человека можно также получить с помощью B-клеток, активированных in vitro (см. патенты США 5567610 и 5229275).
4. Фрагменты антител
При некоторых обстоятельствах выгоднее использовать фрагменты антител, а не целые антитела. Меньший размер фрагментов дает возможность их быстрого выведения и может приводить к улучшенному доступу к солидным опухолям.
Для получения фрагментов антител разработаны различные методики. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического гидролиза интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако в настоящее время эти фрагменты можно получать напрямую с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагменты антител Fab, Fv и ScFv можно экспрессировать и секретировать с помощью E. coli, таким образом обеспечивая легкое получение больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител можно выделить из фаговых библиотек антител, обсуждавшихся выше. В качестве альтернативы фрагменты Fab'-SH можно напрямую выделить из E. coli и химически объединить, образуя фрагменты F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Согласно еще одному подходу фрагменты F(ab')2 можно напрямую выделить из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагмент Fab и F(ab')2 с повышенным периодом полужизни in vivo, включающий остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации, описан в патенте США № 5869046. Другие методики получения фрагментов антител очевидны для специалиста. В других вариантах воплощения выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185; патент США № 5571894; и патент США № 5587458. Fv и sFv являются единственными разновидностями с интактными сайтами связывания, лишенные константных областей; таким образом, они характеризуются пониженным неспецифическим связыванием при использовании in vivo. Можно сконструировать гибридные sFv-белки, располагая эффекторный белок на амино- или карбо-конце sFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. Фрагмент антитела также может представлять собой “линейное антитело”, например, как описано в патенте США 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
5. Биспецифические антитела
Биспецифические антитела представляют собой антитела, специфически связывающиеся с по меньшей мере двумя различными эпитопами. Типичные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами TAT-белка, как описано здесь. Другие биспецифичные антитела могут объединять сайт связывания TAT с сайтом связывания другого белка. В качестве альтернативы, возможна комбинация плеча против TAT с плечом, связывающим молекулу-активатор сигнального каскада на лейкоците, например, молекулу T-клеточного рецептора (например, CD3), (см., например, Baeuerle, et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 11(1):22-30 (2009)), или Fc-рецептор IgG (FcγR), например, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), позволяющая сфокусировать и локализовать защитные клеточные механизмы на TAT-экспрессирующих клетках. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов в области клеток, экспрессирующих TAT. Указанные антитела содержат плечо, связывающее TAT, и плечо, связывающее цитотоксический агент (например, сапорин, анти-интерферон-α, алкалоид барвинка, цепь А рицина, метотрексат или радиоактивный изотопный гаптен). Биспецифические антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab')2).
В WO 96/16673 описано биспецифическое антитело против ErbB2/против FcγRIII, а в патенте США № 5837234 описано биспецифическое антитело против ErbB2/против FcγRI. Биспецифическое антитело против ErbB2/Fcα показано в WO98/02463. В патентах США №№ 5821337 и 6407213 описаны биспецифические антитела против ErbB2/против CD3. Описаны дополнительные биспецифические антитела, связывающие эпитоп антигена CD3 и второй эпитоп. См., например, патенты США №№ 5078998 (против CD3/антигена опухолевых клеток); 5601819 (против CD3/IL-2R; против CD3/CD28; против CD3/CD45); 6129914 (против CD3/антигена злокачественных B-клеток); 7112324 (против CD3/CD19); 6723538 (против CD3/CCR5); 7235641 (против CD3/EpCAM); 7262276 (против CD3/антигена рака яичника); и 5731168 (против CD3/CD4IgG).
Известны способы изготовления биспецифических антител. Традиционная продукция полноразмерных биспецифических антител основана на совместной экспрессии двух пар, состоящих из тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, причем эти две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Вследствие случайного выбора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) потенциально продуцируют смесь 10 различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифической структурой. Очистка соответствующего антитела, обычно выполняемая с помощью аффинной хроматографии, весьма трудоемка, а выход продукта низок. Аналогичные процедуры описаны в WO 93/08829 и статье Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
В соответствии с другим подходом, вариабельные домены антител с желательной специфичностью связывания (сайты связывания антитело-антиген) объединяют с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов в составе гибридного белка. Этот гибрид предпочтительно содержит константный домен тяжелой цепи Ig, включая по меньшей мере шарнирный фрагмент, участки CH2 и CH3. Предпочтительным является наличие по меньшей мере в одном из гибридов первого константного участка тяжелой цепи (CH1), содержащего сайт, необходимый для связывания с легкой цепью. ДНК, кодирующие гибриды тяжелых цепей иммуноглобулинов, и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, внедряют в отдельные экспрессионные векторы и совместно трансфицируют в подходящую клетку-носитель. Этот подход обеспечивает более выраженную гибкость подгонки взаимного соотношения этих трех полипептидных фрагментов в вариантах реализации, если неравные соотношения этих трех полипептидных цепей, используемых при конструировании, обеспечивают оптимальный выход желательного биспецифического антитела. В то же время возможно внедрить кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в единый экспрессионный вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высокому выходу продукта или если эти соотношения не оказывают существенного влияния на выход желательной комбинации цепей.
В предпочтительном варианте реализации этого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина на одном плече, несущей одну область специфического связывания, и гибридной пары тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (обеспечивающей вторую область специфического связывания) на другом плече. Обнаружено, что такая асимметричная структура облегчает отделение желательного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку наличие легкой цепи иммуноглобулина только на одной половине этой биспецифической молекулы обеспечивает легкий способ разделения. Этот подход описан в WO 94/04690. Дальнейшие подробности получения биспецифических антител см., например, в публикации Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
В соответствии с еще одним подходом, описанным в патенте США № 5731168, можно сконструировать область контакта между двумя молекулами антител, обеспечивая максимальное увеличение процентного соотношения гетеродимеров, выделяемых из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительно, область контакта содержит по меньшей мере фрагмент CH3-домена. Согласно этому способу, одну или несколько аминокислот с небольшими боковыми цепями на поверхности контакта первой молекулы антитела заменяют аминокислотами с более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). На поверхности контакта другой молекулы антитела создают компенсаторные “полости” такого же или сходного размера путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями аминокислотами с меньшими боковыми цепями (например, аланином или треонином). Этот подход обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера по сравнению с нежелательными конечными продуктами, например, гомодимерами.
Биспецифические антитела включают перекрестно сшитые или "гетероконъюгатные" антитела. Например, одно из антител в составе гетероконъюгата может быть сопряжено с авидином, а другое - с биотином. Такие антитела были предложены, например, для адресного воздействия клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089). Гетероконъюгантные антитела можно получить с помощью любого удобного способа перекрестного сшивания. Подходящие перекрестно сшивающие агенты широко известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980 вместе с рядом методик поперечного сшивания.
Кроме того, в литературе описаны методики получения биспецифических антител из фрагментов антител. Например, биспецифические антитела можно получить с помощью химического связывания. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) описывает процедуру, согласно которой интактные антитела протеолитически расщепляют, получая F(ab')2-фрагменты. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиоловыми группами - арсенита натрия - с целью стабилизации соседних дитиоловых групп и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab'-фрагменты затем превращают в производные тионитробензоата (TNB). Одно из производных Fab'-TNB затем вновь преобразуют в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламина и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB, образуя биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела можно использовать в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.
Последние достижения облегчили прямую очистку фрагментов Fab’-SH из культуры E. coli, которые можно подвергнуть химическому соединению, формируя биспецифические антитела. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) описывает получение молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела F(ab')2. Каждый Fab'-фрагмент отдельно выделяли из культуры E. coli и подвергали направленному химическому соединению in vitro, формируя биспецифическое антитело. Биспецифическое антитело, полученное таким образом, было способно связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, и нормальными T-клетками человека, а также переключать литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека по отношению к опухолям молочной железы человека. Кроме того, описаны различные методики изготовления и выделения биспецифических фрагментов антител напрямую из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела можно получить, используя лейциновые "молнии". Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды-лейциновые "молнии" из белков Fos и Jun соединили с Fab'-фрагментами двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали по шарнирному участку, получая мономеры, и затем вновь окисляли, получая гетеродимеры антител. Этот способ также можно использовать для продукции гомодимеров антител. Технология "диател", описанная в публикации Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), представляет альтернативный механизм изготовления биспецифических фрагментов антител. Фрагменты, содержащие VH, соединяют с VL с помощью короткого линкера, который не допускает сопряжения между двумя доменами на одной и той же цепи. Соответственно, стимулируют сопряжение VH и VL-доменов одного фрагмента с комплементарными VL и VH-доменами другого фрагмента, тем самым формируя два сайта связывания с антигеном. Кроме того, описана еще одна стратегия изготовления биспецифических фрагментов антител путем использования одноцепочечных Fv (sFv)-димеров. См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Рассматриваются антитела с более чем двумя валентностями. Например, можно получить триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
6. Гетероконъюгатные антитела
Гетероконъюгатные антитела также рассматриваются в рамках настоящего изобретения. Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно соединенных антител. Такие антитела были предложены, например, для адресного воздействия клеток иммунной системы на нежелательные клетки [патент США № 4676980] и для лечения ВИЧ-инфекции [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Предполагают, что антитела можно получить in vitro с помощью известных способов химического синтеза белков, включая способы, использующие перекрестно сшивающие агенты. Например, иммунотоксины можно сконструировать с помощью реакции тиольно-дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих для этой цели реагентов включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат, а также реагенты, описанные, например, в патенте США № 4676980.
7. Поливалентные антитела
Поливалентное антитело может интернализироваться (и/или катаболизироваться) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело, быстрее, чем бивалентное антитело. Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой поливалентные антитела (не принадлежащие к классу IgM) с тремя или более сайтами связывания антигена (например, тетравалентные антитела), которые легко получить рекомбинантной экспрессией нуклеиновых кислот, кодирующих полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может включать домен димеризации и три или более сайта связывания с антигеном. Предпочтительный домен димеризации включает (или состоит из) Fc-область или область шарнира. При этом сценарии антитело включает Fc-область и три или более сайта связывания с антигеном с N-стороны от Fc-области. Предпочтительные поливалентные антитела здесь включают (или состоят из) от трех до восьми, но предпочтительно четыре, сайта связывания с антигеном. Поливалентное антитело включает по меньшей мере одну полипептидную цепь (а предпочтительно - две полипептидных цепи), причем указанная(ые) полипептидная(ые) цепь(и) включает(ют) два или более вариабельных домена. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может(гут) включать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 - первый вариабельный домен, VD2 - второй вариабельный домен, Fc - она полипептидная цепь Fc-области, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, а n равно 0 или 1. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может(гут) включать: VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-цепь Fc-области; или VH-CH1-VH-CH1-цепь Fc-области. Кроме того, поливалентное антитело здесь предпочтительно включает по меньшей мере два (а предпочтительно - четыре) полипептида вариабельных доменов легких цепей. Поливалентное антитело здесь может, например, включать от приблизительно двух до приблизительно восьми полипептидов вариабельных доменов легких цепей. Полипептиды вариабельных доменов легких цепей, рассматриваемые здесь, включают вариабельный домен легкой цепи и, необязательно, также включают CL-домен.
8. Конструирование эффекторной функции
Может быть желательна модификация эффекторной функции антитела согласно изобретению, например, усиление антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) антитела. Такую модификацию можно осуществить путем внедрения одной или более аминокислотных замен в Fc-область антитела. В качестве альтернативы или дополнения в Fc-область можно внедрить остаток(ки) цистеина, тем самым обеспечивая образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Гомодимерное антитело, полученное таким образом, может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной способностью вызывать комплемент-опосредованное уничтожение клеток и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с усиленной противоопухолевой активностью также можно изготовить, используя гетеробифункциональные перекрестно связывающие агенты, как описано в Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). В качестве альтернативы можно сконструировать антитело, содержащее двойные Fc-области и, возможно, вследствие этого обладающее усиленной способностью вызывать комплементзависимый лизис и ADCC. См. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке можно встроить в антитело (в особенности в фрагмент антитела) эпитоп связывания рецептора реутилизации, как описано, например, в патенте США 5739277. Как используется здесь, термин "эпитоп связывания рецептора реутилизации" относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), ответственному за увеличение периода полужизни молекулы IgG в сыворотке in vivo.
9. Иммуноконъюгаты
Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам, включающим антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, например, химиотерапевтическим агентом, агентом, подавляющим рост, токсином (например, токсином бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, обладающим ферментативной активностью, или его фрагментами) или радиоактивным изотопом (т.е. радиоконъюгатам).
Химиотерапевтические агенты, пригодные для получения таких иммуноконъюгатов, описаны выше. Токсины, обладающие ферментативной активностью, и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модессина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для получения радиоконъюгированных антител доступны разнообразные радионуклиды. Примеры включают 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 186Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического агента изготавливают, используя разнообразные бифункциональные белок-связывающие агенты, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипимидат HCL), активные эфиры (например, дисукцинимидилсуберат), альдегиды (например, глутаральдегид), бис-азидосоединения (например, бис-(p-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(p-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (например, толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получить, как описано в работе Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). 1-Изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA), меченая углеродом-14, представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгирования радионуклеотида с антителом. См. WO94/11026.
Конъюгаты антитела с одним или несколькими низкомолекулярными токсинами, например, калихеамицином, майтанзиноидами, трихотеном и CC1065 и производными этих токсинов, обладающими активностью токсина, также рассматриваются здесь.
Майтанзин и майтанзиноиды
В одном из предпочтительных вариантов воплощения антитело против TAT (полноразмерное или фрагменты) по изобретению конъюгируют с одной или более молекул майтанзиноида.
Майтанзиноиды представляют собой ингибиторы митоза, подавляющие полимеризацию тубулина. Майтанзин впервые выделили из восточноафриканского кустарника Maytenus serrata (патент США № 3896111). Затем было обнаружено, что некоторые микроорганизмы также продуцируют майтанзиноиды, например, майтанзинол и C-3 эфиры майтанзинола (патент США № 4151042). Синтетический майтанзинол и его производные и аналоги описаны, например, в патентах США №№ 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; и 4371533, патентные описания которых в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки.
Конъюгаты майтанзиноид-антитело
В ходе попытки улучшения их терапевтического индекса майтанзин и майтанзиноиды конъюгируют с антителами, специфически связывающимися с антигенами опухолевых клеток. Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, и их терапевтическое применение описано, например, в патентах США №№ 5208020, 5416064 и европейском патенте EP 0 425 235 B1, патентные описания которых в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки. В статье Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) описаны иммуноконъюгаты, включающие майтанзиноид, обозначенный как DM1, связанный с моноклональным антителом C242 против рака ободочной и прямой кишки человека. Обнаружено, что указанный конъюгат обладал высокой цитотоксичностью по отношению к культивированным клеткам рака толстой кишки и демонстрировал противоопухолевую активность при анализе роста опухоли in vivo. В статье Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) описаны иммуноконъюгаты, в которых майтанзиноид конъюгирован через дисульфидный линкер с антителом мыши A7, связывающим антиген линии клеток рака толстой кишки человека, или с другим моноклональным антителом мыши TA.1, связывающим онкоген HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.1-майтанзиноид проверяли in vitro на линии клеток рака молочной железы человека SK-BR-3, экспрессирующей 3 х 105 поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Степень цитотоксичности конъюгата лекарственного средства была аналогична таковой свободного лекарственного средства - майтанзиноида; ее можно было повысить за счет увеличения количества молекул майтанзиноида на молекулу антитела. Конъюгат A7-майтанзиноид демонстрировал низкую системную цитотоксичность на мышах.
Конъюгаты "антитело против TAT-полипептида - майтанзиноид" (иммуноконъюгаты)
Конъюгаты "антитело против TAT - майтанзиноид" получали путем химического связывания антитела против TAT с молекулой майтанзиноида без существенного уменьшения биологической активности антитела или молекулы майтанзиноида. Показано, что в среднем 3-4 молекулы майтанзиноида, конъюгированные с молекулой антитела, эффективно усиливают цитотоксичность в отношении клеток-мишеней без отрицательного влияния на функционирование или растворимость антитела, хотя следовало ожидать, что даже одна молекула токсина/антитела должна усиливать цитотоксичность по сравнению с использованием неконъюгированного антитела. Майтанзиноиды хорошо известны в данной области техники и могут быть синтезированы с помощью известных методик или выделены из природных источников. Подходящие майтанзиноиды описаны, например, в патенте США № 5208020 и в других патентах и непатентных публикациях, упомянутых выше. Предпочтительные майтанзиноиды представляют собой майтанзинол и аналоги майтанзинола, модифицированные по ароматическому кольцу или другим положениям в составе молекулы майтанзинола, например, различные сложные эфиры майтанзинола.
В данной области техники известно большое количество связывающих групп для изготовления конъюгатов антитело-майтанзиноид, включая, например, группы, описанные в патенте США № 5208020 или патенте EP 0425235B1, статье Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) и патентной заявке США № 10/960602, поданной 8 октября 2004 г., патентные описания которых в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки. Конъюгаты антитело-майтанзиноид, включающие линкерный компонент SMCC, можно изготовить, как описано в патентной заявке США № 10/960602, поданной 8 октября 2004 г. Связывающие группы включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, группы, поддающиеся воздействию кислот, света, пептидаз или эстераз, как описано в вышеуказанных патентах, предпочтительными являются дисульфидные и тиоэфирные группы. В настоящем документе описаны и проиллюстрированы дополнительные связывающие группы.
Конъюгаты антитела и майтанзиноида можно изготовить, используя разнообразные бифункциональные белок-связывающие агенты, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипимидат HCL), активные эфиры (например, дисукцинимидилсуберат), альдегиды (например, глутаральдегид), бис-азидосоединения (например, бис-(p-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(p-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (например, толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Особенно предпочтительными связывающие агенты, образующие дисульфидные связи, включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP).
Линкер можно присоединить к молекуле майтанзиноида по различным положениям, в зависимости от типа связи. Например, эфирную связь можно сформировать за счет реакции с гидроксильной группой с помощью традиционных методик связывания. Реакция может идти по C-3-положению, содержащему гидроксильную группу, C-14-положению, модифицированному гидроксиметилом, C-15-положению, модифицированному гидроксильной группой, и C-20-положению, содержащему гидроксильную группу. В предпочтительном варианте воплощения связь образуется по С-3-положению майтанзинола или аналога майтанзинола.
Ауристатины и доластатины
В некоторых вариантах воплощения иммуноконъюгат включает антитело по изобретению, конъюгированное с доластатинами или пептидными аналогами и производными доластатина - ауристатинами (патенты США №№ 5635483; 5780588). Показано, что доластатины и ауристатины наносят помехи в развитие микротрубочек, гидролиз ГТФ и деление ядра и клетки (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) и обладают противораковой (US 5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Молекулу лекарственного средства - доластатина или ауристатина можно присоединить к антителу через N- (амино) конец или C- (карбоксильный) конец молекулы пептидного лекарственного средства (WO 02/088172).
Типичные варианты воплощения ауристатинов включают молекулы лекарственного средства монометилауристатина DE и DF (т.е., MMAE и MMAF), связанные по N-концу и описанные в работе "Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623", представленной 28 марта 2004 г., описание которой в явном виде полностью включено посредством ссылки.
Обычно молекулы лекарственных средств на основе пептидов можно изготовить за счет формирования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или фрагментами пептида. Такие пептидные связи можно получить, например, согласно способу синтеза в жидкой фазе (см. E. Schröder and K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), хорошо известному в области химии пептидов. Молекулы лекарственных средств - ауристатинов/доластатинов можно изготовить согласно способам, описанным в: US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; и Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784.
Калихеамицин
Еще один интересующий исследователей иммуноконъюгат включает антитело против TAT, конъюгированное с одной или более молекул калихеамицина. Антибиотики семейства калихеамицинов способны образовывать разрывы в двуцепочечной ДНК в субпикомолярных концентрациях. Описание получения конъюгатов семейства калихеамицина см. в патентах США 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (которые принадлежат American Cyanamid Company). Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются, γ1I, α2I, α3I, N-ацетил-γ1I, PSAG и θI1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и вышеупомянутые патенты США, принадлежащие American Cyanamid). Еще одно противоопухолевое лекарственное средство, которое можно включать в состав конъюгатов, представляет собой QFA, являющееся антифолатом. Как калихеамицин, так и QFA действуют внутри клетки и плохо проходят через плазматическую мембрану. Таким образом, поглощение этих агентов клеткой за счет антителоопосредованной интернализации значительно усиливает их цитотоксическое действие.
Другие цитотоксические агенты
Другие противоопухолевые агенты, которые можно конъюгировать с антителами против TAT по изобретению, включают бис-хлорэтилнитрозомочевину (BCNU), стрептозоицин, винкристин и 5-фторурацил, семейство агентов, совместно известных как комплекс LL-E33288, описанный в патентах США 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США 5877296).
Токсины, обладающие ферментативной активностью, и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модессина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованный 28 октября 1993 г.
Кроме того, в настоящем изобретении рассматриваются иммуноконъюгаты, образованные антителом и соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, например, дезоксирибонуклеазой; ДНКазой).
Для селективного разрушения опухоли антитело может включать высокорадиоактивный атом. Для получения радиоконъюгированных антител против TAT доступны разнообразные радиоактивные изотопы. Примеры включают At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu. Если конъюгат используют для диагностики, он может включать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, tc99m или I123, или спиновую метку для ЯМР-томографии (также известной как магниторезонансная визуализация, mri), например, вышеупомянутый иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Радиоактивные или другие метки можно встраивать в конъюгат различными способами. Например, пептид можно получить путем биосинтеза или химического синтеза аминокислот, используя подходящие предшественники аминокислот, содержащие, например, фтор-19 вместо водорода. Такие метки, как tc99m или I123, Re186, Re188 и In111 можно присоединить к пептиду через остаток цистеина. Иттрий-90 можно присоединить через остаток лизина. Методику IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) можно использовать для встраивания иода-123. В монографии "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) подробно описаны другие способы.
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента можно изготовить, используя разнообразные бифункциональные белок-связывающие агенты, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипимидат HCL), активные эфиры (например, дисукцинимидилсуберат), альдегиды (например, глутаральдегид), бис-азидосоединения (например, бис-(p-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(p-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (например, толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получить, как описано в работе Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). 1-Изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA), меченая углеродом-14, представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгирования радионуклеотида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может представлять собой "гидролизуемый линкер", облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать линкер, поддающийся воздействию кислот, пептидазоселективный линкер, линкер, поддающийся воздействию света, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); патент США № 5208020).
В качестве соединений в соответствии с настоящим изобретением явным образом рассматривают, но не ограничиваются этим, ADC, полученным с помощью перекрестно связывающих реагентов. BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), доступные для приобретения (например, в Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, штат Иллинойс, США). См. страницы 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
В качестве альтернативы можно изготовить гибридный белок, включающий антитело против TAT и цитотоксический агент, например, с помощью рекомбинантных методик или синтеза пептидов. Участок ДНК может включать соответствующие области, кодирующие две части указанного конъюгата, либо примыкающие друг к другу, либо разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, не нарушающий желательных свойств конъюгата.
В еще одном из вариантов воплощения антитело можно конъюгировать с "рецептором" (например, стрептавидином) для предварительного адресного воздействия на опухоль при введении конъюгата антитело-рецептор пациенту с последующим удалением несвязавшегося конъюгата из циркуляторного русла с помощью очищающего агента и введением "лиганда" (например, авидина), конъюгированного с цитотоксическим агентом (например, радионуклеотидом).
10. Иммунолипосомы
Антитела против TAT, описанные здесь, также можно представлять в виде иммунолипосом. "Липосома" представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов различных типов, фосфолипидов и/или поверхностно-активных веществ, пригодных для доставки лекарственного средства в организм млекопитающего. Компоненты липосомы упорядочены в виде бислойной структуры, аналогичной липидной конструкции биологических мембран. Липосомы, содержащие антитела, изготавливают согласно способам, известным в данной области техники, например, как описано в работах Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); патентах США №№ 4485045 and 4544545; и WO97/38731, опубликованной 23 октября 1997 г. Липосомы с повышенным временем циркуляции описаны в патенте США № 5013556.
В частности, пригодные для использования липосомы можно получить с помощью обращенно-фазного выпаривания с липидной композицией, включающей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-модифицированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ПЭ). Липосомы продавливают через фильтры с определенным размером пор, получая липосомы желательного диаметра. Fab'-фрагменты антител по настоящему изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано в Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) через реакцию обмена дисульфидных связей. Химиотерапевтический агент предпочтительно содержится внутри липосом. См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).
B. TAT-связывающие олигопептиды
TAT-связывающие олигопептиды по настоящему изобретению представляют собой олигопептиды, связывающиеся, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь. TAT-связывающий олигопептид можно химически синтезировать с помощью известной методологии синтеза олигопептидов или получить и очистить с помощью рекомбинантной технологии. Обычно длина вариантов TAT-полипептидов составляет по меньшей мере приблизительно 5 аминокислот, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот или более, причем такие олигопептиды способны связываться, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь. TAT-связывающие олигопептиды можно идентифицировать без излишних экспериментов, используя общеизвестные методики. В этой связи следует отметить, что методики скрининга библиотек олигопептидов с целью поиска олигопептидов, способных специфически связываться с полипептидной мишенью, широко известны в данной области техники (см., например, патенты США №№ 5556762, 5750373, 4708871, 4833092, 5223409, 5403484, 5571689, 5663143; публикации PCT №№ WO 84/03506 и WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, и Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
В связи с этим бактериофаговый (фаговый) дисплей является одной из хорошо известных методик, позволяющей выполнять скрининг больших библиотек олигопептидов с целью идентификации члена(ов) этих библиотек, способных специфически связываться с полипептидной мишенью. Фаговый дисплей представляет собой методику, посредством которой варианты полипептидов выставляют на поверхности частиц бактериофага в виде гибридных белков с белком оболочки (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). Преимущество фагового дисплея заключается в том факте, что с его помощью можно быстро и эффективно отсортировать крупные библиотеки селективно рандомизированных вариантов белка (или случайным образом клонированных кДНК) на присутствие последовательностей, связывающихся с молекулой-мишенью с высоким сродством. Фаговый дисплей пептидных (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) или белковых (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) библиотек используют для скрининга миллионов полипептидов или олигопептидов на наличие молекул со специфическими связывающими свойствами (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). Для сортировки фаговых библиотек случайных мутантов требуются стратегия конструирования и размножения большого количества вариантов, процедура аффинной очистки с помощью рецептора-мишени и средства оценки результатов усовершенствования связывания. Патенты США №№ 5223409, 5403484, 5571689 и 5663143.
Хотя в большинстве методик фагового дисплея используют нитевидные фаги, также известны системы фагового дисплея на основе лямбдоидных фагов (WO 95/34683; U.S. 5627024), фага T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) и фага T7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5766905).
В настоящее время разработано большое количество других усовершенствований и модификаций основной концепции фагового дисплея. Эти усовершенствования усиливают способность систем дисплея к скринингу пептидных библиотек на связывание с выбранными молекулами-мишенями и к экспонированию функциональных белков с возможностью скрининга этих белков на желательные свойства. Для реакций фагового дисплея разработаны устройства для комбинаторных реакций (WO 98/14277), а для анализа и управления биологическими взаимодействиями (WO 98/20169; WO 98/20159) и свойствами пространственно ограниченных спиральных пептидов (WO 98/20036) используют библиотеки фагового дисплея. В WO 97/35196 описан способ выделения аффинного лиганда, согласно которому для селективного выделения лигандов связывания библиотеку фагового дисплея подвергают взаимодействию с раствором, в котором лиганд связывается с молекулой-мишенью, и другим раствором, в котором аффинный лиганд не связывается с молекулой-мишенью. В WO 97/46251 описан способ биопэннинга случайной библиотеки фагового дисплея с аффинно очищенным антителом и выделения связавшегося фага с последующим способом микропэннинга с помощью микропланшетов для выделения фага, связавшегося с высоким сродством. Кроме того, сообщают об использовании белка А Staphlylococcus aureus в качестве маркера сродства (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). В WO 97/47314 описано использование библиотек с исключением субстрата для различения специфичности ферментов с помощью комбинаторной библиотеки, которая может являться библиотекой фагового дисплея. Способ скрининга ферментов, подходящих для использования в чистящих средствах с помощью фагового дисплея, описан в WO 97/09446. Дополнительные способы селекции белков со специфическим связыванием описаны в патентах США №№ 5498538, 5432018 и WO 98/15833.
Кроме того, способы получения библиотек пептидов и скрининга этих библиотек описаны в патентах США №№ 5723286, 5432018, 5580717, 5427908, 5498530, 5770434, 5734018, 5698426, 5763192 и 5723323.
C. TAT-связывающие органические молекулы
TAT-связывающие органические молекулы представляют собой органические молекулы, не являющиеся олигопептидами или антителами, как определено здесь, которые связываются, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь. TAT-связывающие органические молекулы можно идентифицировать и химически синтезировать с использованием известной методологии (см., например, публикации PCT №№ WO00/00823 и WO00/39585). Размер TAT-связывающих органических молекул обычно менее приблизительно 2000 дальтон, в альтернативном случае менее приблизительно 1500, 750, 500, 250 или 200 дальтон, причем такие органические молекулы, способные связываться, предпочтительно специфически, с TAT-полипептидом, описанным здесь, можно идентифицировать без излишних экспериментов с помощью общеизвестных методик. В этой связи следует отметить, что методики скрининга библиотек органических молекул с целью поиска молекул, способных специфически связываться с полипептидной мишенью, широко известны в данной области техники (см., например, публикации PCT №№ WO00/00823 и WO00/39585). TAT-связывающие органические молекулы могут, например, представлять собой альдегиды, кетоны, оксимы, гидразоны, семикарбазоны, карбазиды, первичные амины, вторичные амины, третичные амины, N-замещенные гидразины, гидразиды, спирты, простые эфиры, тиолы, тиоэфиры, дисульфиды, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, аналоги мочевины, карбаматы, карбонаты, кетали, тиокетали, ацетали, тиоацетали, арилгалиды, арилсульфонаты, алкилгалиды, алкилсульфонаты, ароматические соединения, гетероциклические соединения, аналоги анилина, алкены, алкины, диолы, аминоспирты, оксазолидины, оксазолины, тиазолидины, тиазолины, енамины, сульфонамиды, эпоксиды, азиридины, изоцианаты, сульфонилхлориды, диазосоединения, хлорангидриды и т.п.
D. Скрининг на присутствие антител против TAT, TAT-связывающих олигопептидов и TAT-связывающих органических молекул с желательными свойствами
Выше описаны методики получения антител, олигопептидов и органических молекул, связывающихся с TAT-полипептидами. Кроме того, при желании можно выделить антитела, олигопептиды или другие органические молекулы с определенными биологическими характеристиками.
Оценку подавляющего рост действия антител, олигопептидов и органических молекул против TAT согласно изобретению можно выполнить с помощью известных в данной области техники способов, например, используя клетки, экспрессирующие TAT-полипептид эндогенно или посредством трансфекции гена TAT. Например, соответствующие линии опухолевых клеток или TAT-трансфицированные клетки можно обработать моноклональными антителами, олигопептидом или другой органической молекулой против TAT в различных концентрациях в течение нескольких суток (например, 2-7 суток) и окрасить кристалл-виолетом или MTT или анализировать с помощью некоторых других колориметрических анализов. Другой способ измерения пролиферации заключается в сравнении поглощения 3H-тимидина клетками, обработанными в присутствии или в отсутствии антитела против TAT, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы по изобретению. После обработки клетки собирают и подсчитывают количество радиоактивности, встроившейся в ДНК, на сцинтилляционном счетчике. Подходящие положительные контроли включают обработку выделенной линии клеток антителами, заведомо подавляющими рост этой линии клеток. Ингибирование роста опухолевых клеток in vivo можно определить различными способами, известными в данной области техники. В предпочтительном случае опухолевая клетка представляет собой клетку, сверхэкспрессирующую TAT-полипептид. Предпочтительно, антитело против TAT, TAT-связывающий олигопептид или TAT-связывающая органическая молекула подавляют пролиферацию TAT-экспрессирующих опухолевых клеток in vitro или in vivo приблизительно на 25-100% по сравнению с необработанной линией клеток, более предпочтительно - приблизительно на 30-100%, и еще более предпочтительно - приблизительно на 50-100% или 70-100%, в одном из вариантом воплощения, при концентрации антител приблизительно от 0,5 до 30 мкг/мл. Ингибирование роста можно измерить при концентрации антител от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мкг/мл или от приблизительно 0,5 нМ до 200 нМ в культуре клеток, причем ингибирование роста определяют спустя 1-10 суток после воздействия антител на опухолевые клетки. Антитело является подавляющим рост in vivo, если введение антитела против TAT в концентрации от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мкг/кг массы тела приводит к сокращению размера опухоли или снижению пролиферации опухолевых клеток в течение периода от приблизительно 5 суток до 3 месяцев после первого введения антитела, предпочтительно в течение периода от 5 до 30 суток.
Для выбора антитела против TAT, TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы, индуцирующих гибель клеток, можно оценить потерю целостности мембраны, как указано, например, по поглощению иодида пропидия (PI), трипанового синего или 7AAD по сравнению с контролем. Анализ поглощения PI можно выполнить в отсутствие комплемента и эффекторных клеток иммунной системы. Опухолевые клетки, экспрессирующие TAT-полипептид, инкубируют с чистой средой или со средой, содержащей соответствующее антитело против TAT (например, в концентрации приблизительно 10 мкг/мл), TAT-связывающего олигопептида или TAT-связывающей органической молекулы. Клетки инкубируют в течение 3 суток. После каждой обработки клетки промывают и аликвоты суспензии клеток помещают в 35-мм 12×75 пробирки с красителем (1 мл на пробирку, 3 пробирки на обрабатываемую группу) для удаления сгустков клеток. Затем в пробирки вносят PI (10 мкг/мл). Образцы можно анализировать с помощью проточного цитометра FACSCAN и программного обеспечения FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Указанные антитела против TAT, TAT-связывающие олигопептиды или TAT-связывающие органические молекулы, вызывающие статистически значимую гибель клеток согласно определению по поглощению PI можно отселектировать как антитела против TAT, TAT-связывающие олигопептиды или TAT-связывающие органические молекулы, вызывающие гибель клеток.
Для скрининга на наличие антител, олигопептидов или других органических молекул, связывающихся с эпитопом в составе TAT-полипептида, связываемого исследуемым антителом, можно выполнить обычный анализ перекрестного блокирования, например, как описано в пособии Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Этот анализ можно использовать для определения того, связывается ли тестируемое антитело, олигопептид или другая органическая молекула с тем же сайтом или эпитопом, что и известное антитело против TAT. В качестве альтернативы или дополнения можно выполнить картирование эпитопов с помощью способов, известных в данной области техники. Например, для идентификации контактирующих остатков можно смутировать последовательность антитела, например, путем сканирования аланином. Мутантное антитело вначале тестируют на связывание с поликлональным антителом для гарантии правильной сборки. Согласно другому способу, пептиды, соответствующие различным областям TAT-полипептида, можно использовать в конкурентном анализе с тестируемым антителом и антителом с характерным или известным эпитопом.
E. Антителозависимая терапия с использованием пролекарств, опосредованная ферментом (ADEPT)
Антитела в соответствии с настоящим изобретением также можно использовать в ADEPT путем конъюгирования антитела с ферментом, активирующим пролекарство, который превращает пролекарство (например, пептидный химиотерапевтический агент, см. WO81/01145) в активное противоопухолевое лекарство. См., например, WO 88/07378 и патент США № 4975278.
Ферментативный компонент иммуноконъюгата, пригодный для использования в ADEPT, включает любой фермент, способный воздействовать на пролекарство, переводя его в более активную цитотоксическую форму.
Ферменты, пригодные для реализации способа в соответствии с настоящим изобретением, включают щелочную фосфатазу, пригодную для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные молекулы лекарств; арилсульфатазу, пригодную для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные молекулы лекарств; цитозиндезаминазу, пригодную для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противоопухолевое лекарство 5-фторурацил; протеазы, например, протеазу Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (например, катепсины B и L), пригодные для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные молекулы лекарств; D-аланилкарбоксипептидазы, пригодные для превращения пролекарств, содержащих D-аминокислотные замены; углеводрасщепляющие ферменты, например, β-галактозидазу и нейраминидазу, пригодные для превращения гликозилированных пролекарств в свободные молекулы лекарств; β-лактамазу, пригодную для превращения пролекарств, модифицированных β-лактамными группами, в свободные молекулы лекарств; и пенициллинамидазы, например, амидазу пенициллина V или амидазу пенициллина G, пригодные для превращения пролекарств, модифицированных по атомам аминного азота феноксиацетильной или фенилацетильной группами, соответственно, в свободные молекулы лекарств, но не ограничиваются ими. В качестве альтернативы, для превращения пролекарств в соответствии с изобретением в свободные молекулы активных лекарств можно использовать антитела, обладающие ферментативной активностью, также известные как "абзимы" (см., например, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). В соответствии с описанием в настоящем документе можно получить конъюгаты антитело-абзим для доставки абзима к популяции опухолевых клеток.
Ферменты в соответствии с настоящим изобретением можно ковалентно связать с антителами против TAT с помощью широко известных методик, например, использования гетеробифункциональных перекрестно сшивающих реагентов, обсуждавшихся выше. В качестве альтернативы с помощью технологий рекомбинантных ДНК, широко известных в данной области, можно сконструировать гибридные белки, включающие по меньшей мере антигенсвязывающий участок антитела в соответствии с изобретением, присоединенный к по меньшей мере функционально активному фрагменту фермента в соответствии с изобретением (см., например, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).
F. Полноразмерные TAT-полипептиды
Настоящее изобретение также представляет вновь идентифицированные и выделенные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, в рамках настоящей заявки называемые TAT-полипептидами. В частности, выделены и идентифицированы кДНК (фрагменты и полноразмерные), кодирующие TAT-полипептиды, подробнее описанные ниже в разделе Примеры.
Как описано ниже в разделе Примеры, различные клоны кДНК депонированы в АТСС. Специалист может легко определить фактические нуклеотидные последовательности этих клонов путем секвенирования депонированного клона с помощью общепринятых в данной области техники способов. Рассчитанные аминокислотные последовательности можно определить на основе нуклеотидной последовательности в рабочем порядке. Для TAT-полипептидов и кодирующих их нуклеиновых кислот, описанных здесь, авторы настоящей заявки идентифицировали вероятную рамку считывания, наилучшим образом определяемую на основе информации о последовательности, доступной на тот момент времени.
G. Варианты антител против TAT и TAT-полипептидов
Кроме антител против TAT и полноцепочечных TAT-полипептидов с нативной последовательностью, описанных здесь, рассматривается возможность получения вариантов антитела против TAT и TAT-полипептидов. Варианты антител против TAT и TAT-полипептидов можно получить путем внедрения соответствующих нуклеотидных замен в кодирующую ДНК и/или путем синтеза желательного антитела или полипептида. Специалист должен принимать во внимание, что аминокислотные замены могут изменять посттрансляционную обработку антитела против TAT или TAT-полипептида, например, менять количество или положение сайтов гликозилирования или изменять характеристики прикрепления к мембране.
Модификации антител против TAT или TAT-полипептидов, описанных здесь, можно осуществить, например, с помощью любой установленной методики и руководства по внесению консервативных и неконсервативных замен, например, в патенте США № 5364934. Модификации могут представлять собой замену, делецию или инсерцию в одном или более кодонов, кодирующих антитело или полипептид, что приводит к изменению аминокислотной последовательности по сравнению с нативной последовательностью антитела или полипептида. В необязательном случае модификацию осуществляют путем замены по меньшей мере одной аминокислоты на любую другую аминокислоту в одном или более доменах антитела против TAT или TAT-полипептида. Указания по определению того, какой аминокислотный остаток можно вставить, заменить или удалить без неблагоприятного влияния на желательную активность, можно получить путем сравнивания последовательности антитела против TAT или TAT-полипептида с последовательностью известной молекулы гомологичного белка и минимизации количества изменений аминокислотной последовательности в областях высокой гомологии. Аминокислотные замены могут возникать в результате замены одной аминокислоты на другую, обладающую аналогичными структурными и/или химическими свойствами, например, замены лейцина на серин, т.е. консервативных аминокислотных замен. Инсерции и делеции необязательно могут охватывать диапазон приблизительно от 1 до 5 аминокислот. Допустимые модификации можно определить путем систематического внесения инсерций, делеций или замен аминокислот в последовательность и тестирования полученных вариантов на активность, проявляемую полноразмерной или зрелой нативной последовательностью.
В настоящей заявке представлены фрагменты антитела против TAT и TAT-полипептида. Такие фрагменты могут быть обрезаны по N- или C-концу или характеризоваться отсутствием остатков внутри последовательности, например, по сравнению с полноразмерным нативным антителом или белком. В некоторых фрагментах отсутствуют аминокислотные остатки, не являющиеся необходимыми для желательной биологической активности антитела против TAT или TAT-полипептида.
Фрагменты антитела против TAT или TAT-полипептида можно получить с помощью любой из ряда общепринятых методик. Желательные пептидные фрагменты можно синтезировать химически. Альтернативный подход включает получение фрагментов антитела или полипептида путем ферментативного гидролиза, например, обработки белка ферментом, заведомо расщепляющим белки по сайтам с определенными аминокислотными остатками, или путем гидролиза ДНК соответствующими ферментами рестрикции и выделения желательного фрагмента. Еще одна подходящая методика включает выделение и амплификацию фрагмента ДНК, кодирующего желательный фрагмент антитела или полипептида, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Олигонуклеотиды, задающие желательные концы фрагмента ДНК, используют в качестве 5'- или 3'-праймеров для ПЦР. Предпочтительно, фрагменты антитела против TAT и TAT-полипептида обладают по меньшей мере одной биологической и/или иммунологической активностью нативного антитела против TAT или TAT-полипептида, описанных здесь.
В определенных вариантах воплощения интересующие исследователя консервативные замены показаны в Таблице 6 под заголовком предпочтительных замен. Если такая замена приводит к изменению биологической активности, то вносят более значительные изменения, обозначенные как типичные замены в Таблице 1, или описанные ниже по отношению к классам аминокислот, и выполняют скрининг продуктов.
Таблица 1
Исходный Типичные
Предпочтительные
Остаток Замены
Замены
Ala (A) Val; Leu; Ile
Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N) Gln; His; Asp; Lys; Arg
Gln
Asp (D) Glu; Asn
Glu
Cys (С) Ser, Ala
Ser
Gln (Q) Asn; Glu
Asn
Glu (E) Asp, Gln
Asp
Gly (G) Pro; Ala
Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Leu
норлейцин
Leu (L) норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Leu
Pro (P) Ala
Ala
Ser (S) Thr
Thr
Thr (T) Val; Ser
Ser
Trp (W) Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин
Leu
Существенные модификации функциональной или иммунологической идентичности антитела против TAT или TAT-полипептида осуществляют путем выбора замен, значительно отличающихся по действию на (а) структуру полипептидного каркаса в области замены, например, конформацию листа или спирали, (б) заряд или гидрофобность молекулы в сайте-мишени или (с) размер боковой цепи. Природные остатки подразделяют на группы на основе общих свойств боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены приводят к замене члена одного из этих классов на член другого класса. Такие замены остатков также можно внести в сайты консервативной замены или, более предпочтительно, в остальные (неконсервативные) сайты.
Указанные модификации можно осуществить с помощью известных в данной области техники способов, например, олигонуклеотид-опосредованного (сайт-специфического) мутагенеза, сканирования аланином и ПЦР-мутагенеза. Сайт-специфический мутагенез [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], кассетный мутагенез [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], рестрикционный мутагенез [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] или другие известные методики можно осуществить, используя клонированную ДНК, для получения ДНК вариантов антитела против TAT или TAT-полипептида.
Для идентификации одной или более аминокислот на протяжении непрерывной последовательности можно использовать анализ сканирования аминокислот. Предпочтительные аминокислоты для сканирования представляют собой относительно небольшие нейтральные аминокислоты. Такие аминокислоты включают аланин, глицин, серин и цистеин. В этой группе предпочтительным обычно является аланин, поскольку он не несет боковой цепи при бета-атоме углерода и с меньшей вероятностью влияет на конформацию основной цепи варианта [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Кроме того, аланин обычно является предпочтительным, поскольку он представляет собой наиболее распространенную аминокислоту. Кроме того, он часто встречается как в глубине пространственной структуры молекулы, так и на ее поверхности [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Если замена на аланин не приводит к получению удовлетворительного количества вариантов, можно использовать изостерическую аминокислоту.
Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела против TAT или TAT-полипептида, также можно заменить, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения неправильного перекрестного связывания. И наоборот, в антитело против TAT или TAT-полипептид можно добавить цистеиновую(ые) связь(и) для улучшения его стабильности (в частности, когда антитело представляет фрагмент антитела, например, Fv-фрагмент).
Особенно предпочтительный тип вариантов, полученных путем замены, включает замену одного или более остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). В общем случае полученный(е) вариант(ы), выбираемые для дальнейшей разработки, обладают улучшенными биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом, из которого они получены. Подходящий способ получения таких вариантов путем замены включает созревание аффинности с помощью фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) мутируют, получая все возможные аминокислотные замены по каждому сайту. Варианты антитела, полученные таким образом, одновалентно экспонируют на поверхности частиц нитевидных фагов в виде гибридных белков с продуктами гена III M13, упакованных в каждую частицу. Затем выполняют скрининг вариантов, подвергнутых фаговому дисплею, на их биологическую активность (например, связывающую активность), как описано здесь. Для идентификации сайтов гипервариабельной области, являющихся кандидатами для модификации, выполняют мутагенез путем сканирования аланином, идентифицируя остатки гипервариабельной области, вносящие значительный вклад в связывание антигена. В качестве альтернативы или дополнения может быть выгодно анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и TAT-полипептидом человека. Такие контактные остатки и соседние с ними остатки являются кандидатами для замены в соответствии с методиками, разработанными здесь. После получения таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу, как описано здесь, и отбирают антитела с лучшими свойствами для дальнейшей разработки с помощью одного или более соответствующих анализов.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотные последовательности вариантов антитела против TAT, получают с помощью различных способов, известных в данной области техники. Эти способы включают выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотной последовательности), или получение путем олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-специфического) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной вариантной или невариантной версии антитела против TAT, но не ограничиваются ими.
H. Модификации антител против TAT и TAT-полипептидов
Ковалентные модификации антител против TAT и TAT-полипептидов находятся в рамках настоящего изобретения. Один из типов ковалентной модификации включает реакцию аминокислотных остатков-мишеней антитела против TAT или TAT-полипептида с органическим модифицирующим агентом, способным вступать в реакцию с выбранными боковыми цепями N- или C-концевых остатков антитела против TAT или TAT-полипептида. Модификация бифункциональными агентами пригодна, например, для перекрестного связывания антитела против TAT или TAT-полипептида с водонерастворимым веществом носителя или поверхностью, используемой в способе очистки антител против TAT, и наоборот. Распространенные перекрестно связывающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, эфиры N-гидроксисукцинимида, например, эфиры с 4-азидсалициловой кислотой, гомобифункциональные имдоэфиры, включая дисукцинимидильные эфиры, например, 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), бифункциональные малеимиды, например, бис-N-малеимид-1,8-октан и такие агенты, как метил-3-[(p-азидфенил)дитио]пропиоимидат.
Другие модификации включают дезамидирование глутаминильных и аспарагинильных остатков в глутамильные и аспартильные остатки, соответственно, гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование α-аминогрупп лизина, аргинина и боковых цепей гистидина [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], ацетилирование N-концевой аминогруппы и амидирование C-концевой карбоксильной группы.
Другой тип ковалентной модификации антитела против TAT или TAT-полипептида, входящий в рамки настоящего изобретения, включает модификацию нативной картины гликозилирования антитела или полипептида. Подразумевается, что в настоящем документе "модификация нативной картины гликозилирования" означает делецию одной или более углеводных групп, встречающихся в нативной последовательности антитела против TAT или TAT-полипептида (путем удаления расположенного под ней сайта гликозилирования или удаления гликозилирования химическими и/или ферментативными средствами), и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, не присутствующих в нативной последовательности антитела против TAT или TAT-полипептида. Кроме того, в эту фразу входят качественные модификации гликозилирования нативных белков, включая изменение природы и соотношения различных присутствующих углеводных групп.
Гликозилирование антител и других полипептидов обычно является N-связанным или O-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X - любая аминокислота, кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров - N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы - к гидроксиаминокислоте, чаще всего - серину или треонину, хотя также могут использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайта гликозилирования в антитело против TAT или TAT-полипептид удобно осуществлять путем модификации аминокислотной последовательности, таким образом, чтобы она содержала одну или более из вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Модификацию также можно осуществить путем добавления или замены одного или более остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела против TAT или TAT-полипептида (для сайтов О-связанного гликозилирования). Аминокислотную последовательность антитела против TAT или TAT-полипептида необязательно можно модифицировать за счет изменений на уровне ДНК, в частности, мутируя ДНК, кодирующую антитело против TAT или TAT-полипептид по заранее выбранным основаниям, получая кодоны, транслируемые в желательные аминокислоты.
Другие средства увеличения количества углеводных групп в составе антитела против TAT или TAT-полипептида заключаются в химическом или ферментативном присоединении гликозидов к полипептиду. Такие способы описаны, например, в WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987 г., и в статье Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
Удаление углеводных групп, присутствующих в составе антитела против TAT или TAT-полипептида, можно осуществить химически или ферментативно или путем мутации, заменяющей кодоны, кодирующие аминокислотные остатки, которые служат мишенями гликозилирования. Методики химического дегликозилирования известны в данной области и описаны, например, в Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) и в Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Ферментативное отщепление углеводных групп от полипептидов можно осуществить за счет использования различных эндо- и экзогликозидаз, как описано в Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Еще один тип ковалентной модификации антитела против TAT или TAT-полипептида включает связывание антитела или полипептида с одним из различных небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, в соответствии с методиками, описанными в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Антитело или полипептид можно включить в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или межфазной полимеризации (например, микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и полиметилметакрилата, соответственно), в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).
Антитело против TAT или TAT-полипептид согласно настоящему изобретению также можно модифицировать, формируя химерные молекулы, включающие антитело против TAT или TAT-полипептид, объединенные с еще одним гетерологичным полипептидом или аминокислотной последовательностью.
В одном из вариантов воплощения такая химерная молекула включает гибрид антитела против TAT или TAT-полипептида с маркерным полипептидом, обеспечивающий эпитоп, с которым может селективно связываться антитело против маркера. Эпитопный маркер обычно располагают на N- или C-конце антитела против TAT или TAT-полипептида. Присутствие таких форм антитела против TAT или TAT-полипептида, содержащих эпитопный маркер, можно обнаружить, используя антитело против маркерного полипептида. Кроме того, внедрение эпитопного маркера дает возможность легкой очистки антитела против TAT или TAT-полипептида путем аффинной очистки с использованием антитела против маркера или аффинной матрицы другого типа, связывающейся с эпитопным маркером. Широко известны различные маркерные полипептиды и соответствующие им антитела. Их примеры включают полигистидиновые (poly-his) или полигистидинглициновые (poly-his-gly) маркеры; маркерный полипептид вируса гриппа flu HA и антитела к нему 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; маркер c-myc и антитела к нему 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; и маркер гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса и антитела к нему [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Другие маркерные полипептиды включают Flag-пептид [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; пептид эпитопа KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид эпитопа α-тубулина [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; и пептидный маркер белка гена 10 фага T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
В альтернативном варианте воплощения химерная молекула может включать гибрид антитела против TAT или TAT-полипептида с иммуноглобулином или определенной областью иммуноглобулина. Для бивалентной формы химерной молекулы (также называемой "иммуноадгезином") такой гибрид может включать Fc-область молекулы IgG. Гибриды с Ig предпочтительно включают замену растворимой (с удаленным или инактивированным трансмембранным доменом) формы антитела против TAT или TAT-полипептида вместо по меньшей мере одной вариабельной области молекулы Ig. В особенно предпочтительном варианте воплощения гибриды с иммуноглобулином включают шарнир, CH2 и CH3 либо шарнир, СН1, СН2 и СН3-области молекулы IgG1. Получение гибридов с иммуноглобулинами см. также в патенте США № 5428130, поданном 27 июня 1995 г.
I. Изготовление антител против TAT и TAT-полипептидов
Описание, приведенное ниже, относится главным образом к получению антител против TAT или TAT-полипептидов путем культивирования клеток трансформированных или трансфицированных вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против TAT или TAT-полипептид. Разумеется, предусмотрено, что для изготовления антител против TAT или TAT-полипептидов можно использовать альтернативные способы, хорошо известные в данной области техники. Например, соответствующую аминокислотную последовательность или ее фрагменты можно получить путем прямого синтеза пептидов с помощью твердофазной технологии [см., например, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. Синтез белков in vitro можно осуществлять вручную или автоматически. Автоматический синтез можно осуществить, например, с помощью синтезатора пептидов Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Фостер-Сити, штат Калифорния, США), используя инструкции изготовителя. Различные фрагменты антитела против TAT или TAT-полипептида можно раздельно синтезировать химическим путем и объединить с помощью химических или ферментативных способов, получая желательное антитело против TAT или TAT-полипептид.
1. Выделение ДНК, кодирующей антитело против TAT или TAT-полипептид
ДНК, кодирующую антитело против TAT или TAT-полипептид, можно получить из библиотеки кДНК, изготовленной из ткани, которая, как считается, содержит мРНК антитела против TAT или TAT-полипептида и экспрессирует его в обнаруживаемых количествах. Соответственно, ДНК антитела против TAT или TAT-полипептида человека можно получить из библиотеки кДНК, изготовленной из ткани человека. Ген, кодирующий антитело против TAT или TAT-полипептид, также можно получить из геномной библиотеки или с помощью известных процедур синтеза (например, автоматического синтеза нуклеиновых кислот).
Можно выполнить скрининг библиотек, используя зонды (например, олигонуклеотиды длиной по меньшей мере приблизительно 20-80 оснований), сконструированные для идентификации интересующего гена или белка, кодируемого им. Скрининг кДНК или геномной библиотеки с помощью выбранного зонда можно осуществить согласно стандартной процедуре, например, описанной в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Альтернативные средства для выделения гена, кодирующего антитело против TAT или TAT-полипептид, заключается в использовании методологии ПЦР [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Широко известны методики скрининга библиотек кДНК. Последовательности олигонуклеотидов, выбранные в качестве зондов, должны иметь достаточную длину и быть достаточно однозначно идентифицируемыми для минимизации ложноположительных результатов. Олигонуклеотиды предпочтительно метят, например, таким образом, чтобы их можно было обнаружить при гибридизации с ДНК библиотеки, подвергаемой скринингу. Способы мечения хорошо известны в данной области техники и включают использование радиоактивных меток, например, 32P-меченого АТФ, биотинилирование или мечение ферментной меткой. Условия гибридизации, включая условия умеренной и высокой жесткости, представлены в Sambrook et al., supra.
Последовательности, идентифицированные с помощью таких способов скрининга библиотек, можно сравнивать и выравнивать с другими известными последовательностями, депонированными и доступными в общедоступных базах данных, например, GenBank, или других частных базах данных последовательностей. Идентичность последовательности (на уровне аминокислот или нуклеотидов) в пределах заданных областей молекулы или на протяжении полноразмерной последовательности можно определить с помощью способов, известных в данной области техники и описанных здесь.
Нуклеиновые кислоты, содержащие кодирующие последовательности белков, можно получить путем скрининга выбранных библиотек кДНК или геномных библиотек, вначале используя предсказанную аминокислотную последовательность, описанную здесь, и, при необходимости, с помощью общепринятых процедур удлинения затравки, описанных в Sambrook et al., supra, для обнаружения предшественников и интермедиатов способинга мРНК, которые могли не подвергаться обратной транскрипции в кДНК.
2. Выбор и трансформация клеток-хозяев
Клетки-хозяева трансфицируют или трансформируют векторами для экспрессии или клонирования, описанными здесь для получения антитела против TAT или TAT-полипептида, и культивируют в традиционных питательных средах, модифицированных по необходимости для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих требуемые последовательности. Специалист может выбрать условия культивирования, например, среды, температуру, рН и т.п., не выполняя лишних экспериментов. В общем случае принципы, протоколы и практические методики для максимизации продуктивности культур клеток можно найти в источниках Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, Ed. (IRL Press, 1991) и Sambrook et al., supra.
Специалистам известны способы трансфекции эукариотических клеток и трансформации прокариотических клеток, например, трансформация с использованием CaCl2, CaPO4, липосомоопосредованная трансфекция и электропорация. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию выполняют с помощью стандартных методик, подходящих для таких клеток. Обработку кальцием, использующую хлорид кальция, описанную в Sambrook et al., supra, или электропорацию обычно используют для прокариот. Инфекцию Agrobacterium tumefaciens используют для трансформации некоторых растительных клеток, как описано в Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) и в WO 89/05859, опубликованной 29 июня 1989 г. Для клеток млекопитающих, не имеющих клеточной стенки, можно использовать способ кальций-фосфатной преципитации согласно Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Основные аспекты систем трансфекции клеток-хозяев млекопитающих описаны в патенте США № 4399216. Трансформацию дрожжей обычно осуществляют согласно способу Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). В то же время можно использовать другие способы внедрения ДНК в клетки, например, внутриядерную микроинъекцию, электропорацию, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками или использование поликатионов, например, полибрена, полиорнитина. Различные методики трансформации клеток млекопитающих см. в Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) и Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, описанных здесь, включают клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот. Подходящие прокариоты включают эубактерии, например, грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, например, E. coli, но не ограничиваются ими. Общедоступны различные штаммы E. coli, например, штамм E. coli K12 MM294 (ATCC 31446); E. coli X1776 (ATCC 31537); штамм E. coli W3110 (ATCC 27325) и K5 772 (ATCC 53635). Другие подходящие прокариотические клетки-хозяева включают Enterobacteriaceae, например, Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также бациллы, например, B. subtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41P, описанный в DD 266710, опубликованной 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, например, P. aeruginosa, и Streptomyces. Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими. Штамм W3110 является особенно предпочтительным хозяином или исходным штаммом, поскольку он является распространенным штаммом-хозяином для ферментации продуктов рекомбинантной ДНК. Предпочтительно, клетка-хозяин секретирует минимальные количества протеолитических ферментов. Например, штамм W3110 можно модифицировать, вызывая генетическую мутацию в генах, кодирующих эндогенные белки хозяина; примеры таких хозяев включают штамм E. coli W3110 1A2, обладающий полным генотипом tonA; штамм E. coli W3110 9E4, обладающий полным генотипом tonA ptr3; штамм E. coli W3110 27C7 (ATCC 55244), обладающий полным генотипом tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr; штамм E. coli W3110 37D6, обладающий полным генотипом tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; штамм E. coli W3110 40B4, представляющий собой штамм 37D6, несущий делецию degP, обуславливающую потерю устойчивости к канамицину; и штамм E. coli, содержащий мутантную периплазматическую протеазу, описанную в патенте США № 4946783, опубликованный 7 августа 1990 г. В качестве альтернативы можно использовать способы клонирования in vitro, например, ПЦР или другие полимеразные реакции нуклеиновых кислот.
Полноразмерное антитело, фрагменты антител и гибридные белки, содержащие антитела, можно продуцировать в бактериях, в частности, при отсутствии необходимости гликозилирования и сохранения эффекторных функций Fc, например, при конъюгировании терапевтического антитела с цитотоксическим агентом (например, токсином) и если иммуноконъюгат сам по себе эффективно разрушает опухолевые клетки. Полноразмерные антитела обладают более длительным периодом полужизни в циркуляторном русле. Продукция в E. coli является более быстрым и экономически выгодным способом. Экспрессию фрагментов антител и полипептидов в бактериях см, например, в патентах США 5648237 (Carter et. al.), 5789199 (Joly et al.) и 5840523 (Simmons et al.), в которых описаны область инициации трансляции (TIR) и сигнальные последовательности для оптимизации экспрессии и секреции; эти патенты включены в настоящий документ в качестве ссылок. После экспрессии антитело выделяют из клеточной массы E. coli в растворимую фракцию; его можно очистить, например, с помощью колонки с белком А или G в зависимости от его изотипа. Конечную очистку можно выполнить аналогично способу очистки антитела, экспрессируемого, например, в клетках CHO.
Кроме прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело против TAT или TAT-полипептид, являются эукариотические микроорганизмы, например, мицелиальные грибы или дрожжи. Широко используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином является Saccharomyces cerevisiae. Другие примеры включают Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139383, опубликованный 2 мая 1985 г.); клетки-хозяева Kluyveromyces (патент США № 4943529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), например, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans и K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, например, Schwanniomyces occidentalis (EP 394538, опубликованный 31 октября 1990 г.); и мицелиальные грибы, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, опубликованная 10 января 1991 г.) и клетки-хозяева Aspergillus, например, A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) и A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Для целей настоящего изобретения можно использовать метилотрофные дрожжи, включая дрожжи, способные расти на метаноле, выбранные из группы родов, состоящей из Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis и Rhodotorula, но не ограничиваясь ими. Список конкретных видов, являющихся типичными представителями этого класса дрожжей, содержится в C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела против TAT или TAT-полипептида происходят от многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки насекомых, например, Drosophila S2 и Spodoptera Sf9, а также клетки растений, например, культуры клеток хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петунии, помидора и табака. Идентифицированы многочисленные штаммы и варианты бакуловирусов и соответствующие клетки-хозяева восприимчивых к ним таких насекомых, как Spodoptera frugiperda (гусеница совки), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая муха) и Bombyx mori. Общедоступен ряд вирусных штаммов для трансфекции, например, варианта L-1 Autographa californica NPV и штамма Bm-5 Bombyx mori NPV; такие вирусы можно использовать в качестве вируса по настоящему изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В то же время наибольший интерес вызывают клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (тканевой культуре) стало повседневной процедурой. Примеры используемых линий клеток-хозяев млекопитающих представляют собой линию клеток почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию эмбриональной почки человека (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензии, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки рака шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными векторами для экспрессии или клонирования с целью продукции антитела против TAT или TAT-полипептида и культивируют в традиционных питательных средах, модифицированных по необходимости для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих требуемые последовательности.
3. Выбор и использование реплицируемого вектора
Нуклеиновую кислоту (например, кДНК или геномную ДНК), кодирующую антитело против TAT или TAT-полипептид, можно вставить в реплицируемый вектор для клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. Общедоступны различные векторы. Вектор может быть, например, в форме плазмиды, космиды, вирусной частицы или фага. Подходящие нуклеотидные последовательности можно вставить в вектор с помощью различных процедур. В большинстве случаев ДНК вставляют в подходящий(е) сайт(ы) эндонуклеаз рестрикции с помощью методик, известных в данной области. Компоненты вектора обычно включают одну или несколько сигнальных последовательностей, сайт инициации репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и терминатор транскрипции, но не ограничиваются ими. Для конструирования подходящих векторов, содержащих один или несколько из этих компонентов, используют стандартные методики лигирования, известные специалистам.
TAT можно рекомбинантно получать не только напрямую, но и в качестве гибридного полипептида с гетерологичным полипептидом, который может представлять собой сигнальную последовательность или другой полипептид, содержащий специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. В общем случае сигнальная последовательность может представлять собой компонент вектора или фрагмент ДНК, кодирующей антитело против TAT или TAT-полипептид, вставленный в вектор. Сигнальная последовательность может представлять собой сигнальную последовательность прокариот, выбранную, например, из группы лидеров щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах сигнальная последовательность может представлять собой, например, лидер инвертазы дрожжей, лидер альфа-фактора (включая лидеры α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces, последний из которых описан в патенте США № 5010182) или лидер кислой фосфатазы, лидер глюкоамилазы C. albicans (EP 362179, опубликованный 4 апреля 1990 г.), или сигнальную последовательность, описанную в WO 90/13646, опубликованной 15 ноября 1990 г. При экспрессии в клетках млекопитающих для прямой секреции белка можно использовать сигнальные последовательности млекопитающих, например, сигнальные последовательности секретируемых полипептидов того же или родственных видов, а также вирусные секреторные лидеры.
Векторы для экспрессии и клонирования содержат последовательность нуклеиновой кислоты, обеспечивающую репликацию вектора в одной или более выбранных клетках-хозяевах. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Сайт инициации репликации плазмиды pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, сайт инициации репликации плазмиды 2μ подходит для дрожжей, а сайты инициации репликации различных вирусов (SV40, полиомы, аденовируса, ВЗВ или BPV) можно использовать в векторах для клонирования в клетках млекопитающих.
Векторы для экспрессии и клонирования обычно содержат ген для селекции, также называемый селектируемым маркером. Типичные гены для селекции кодируют белки, которые (a) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (б) восполняют ауксотрофную недостаточность или (в) поставляют критические питательные вещества, недоступные в сложных средах, например, ген, кодирующий рацемазу D-аланина бацилл.
Примеры подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих представляют собой маркеры, дающие возможность идентификации клеток, способных воспринимать нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против TAT или TAT-полипептид, например, дигидрофолатредуктазу (DHFR) или тимидинкиназу. Соответствующая клетка-хозяин для использования DHFR дикого типа представляет собой линию клеток CHO, дефицитную по активности DHFR, подготовленную и размноженную, как описано в Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Подходящий ген для селекции для использования в дрожжах представляет собой ген trp1, присутствующий в плазмиде дрожжей YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. Ген trp1 представляет собой селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, не обладающего способностью расти на триптофане, например, ATCC No. 44076 или PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Векторы для экспрессии и клонирования обычно содержат промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против TAT или TAT-полипептид, для управления синтезом мРНК. Хорошо известны промоторы, распознаваемые различными потенциальными клетками-хозяевами. Промоторы, подходящие для использования в хозяевах-прокариотах, включают β-лактамазную и лактозную промоторные системы [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], промоторную систему щелочной фосфатазы, триптофановую (trp) промоторную систему [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36776] и гибридные промоторы, например, tac-промотор [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Промоторы для использования в бактериальных системах также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей антитело против TAT или TAT-полипептид.
Примеры подходящих последовательностей промоторов для использования в дрожжевых клетках включают промоторы 3-фосфоглицераткиназы [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] или других ферментов гликолиза [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], например, енолазы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкозо-6-фосфатизомеразы, 3-фосфоглицератмутазы, пируваткиназы, триозофосфатизомеразы, фосфоглюкозоизомеразы и глюкокиназы.
Другие промоторы дрожжей, являющиеся индуцибельными промоторами, обладающими дополнительными преимуществами транскрипции, контролируемой условиями роста, представляют собой промоторные области алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, катаболических ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Дополнительное описание подходящих векторов и промоторов для экспрессии в дрожжах приведено в EP 73657.
Транскрипцию антитела против TAT или TAT-полипептида с векторов в клетках млекопитающих контролируют, например, промоторами, полученными из геномов таких вирусов, как вирус полиомы, вирус оспы кур (UK 2211504, опубликованный 5 июля 1989 г.), аденовирус (например, аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита B и вирус обезьян 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора актина или промотора иммуноглобулина, и из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Транскрипцию ДНК, кодирующей антитело против TAT или TAT-полипептид, в высших эукариотах можно усилить путем инсерции энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК длиной от приблизительно 10 до 300 п.о., которые действуют на промотор, усиливая транскрипцию с него. В настоящее время известны многие энхансерные последовательности генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). В то же время обычно используют энхансеры вирусов эукариотических клеток. Примеры включают энхансер поздней стороны от сайта инициации репликации (на расстоянии 100-270 п.о.) SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер поздней стороны от сайта инициации репликации вируса полиомы и энхансер аденовируса. Энхансер можно внедрить в вектор в положении с 5' или 3'-стороны от кодирующей последовательности антитела против TAT или TAT-полипептида, однако предпочтительно - в положении с 5'-стороны от промотора.
Векторы для экспрессии, используемые в клетках-хозяевах эукариот (дрожжей, грибов, растений, животных, человека или ядросодержащих клетках других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации, транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны в 5'- и, изредка, в 3'-нетранслируемых областях эукариотической или вирусной ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело против TAT или TAT-полипептид.
Другие способы, векторы и клетки-хозяева, которые можно адаптировать к синтезу антитела против TAT или TAT-полипептида в культуре рекомбинантных клеток позвоночных, описаны в Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117060; и EP 117058.
4. Культивирование клеток-хозяев
Клетки-хозяева, используемые для продукции антитела против TAT или TAT-полипептида согласно изобретению можно культивировать в различных средах. Доступные для приобретения среды, например, среда Хэма F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла, модифицированная по Дульбекко ((DMEM), Sigma) подходят для культивирования клеток-хозяев. Кроме того, в качестве культуральной среды для культивирования клеток-хозяев можно использовать любую из сред, описанных в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem,102:255 (1980), патентах США №№ 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или патенте США Re. 30985. В любую из этих сред при необходимости можно добавлять гормоны и/или другие факторы роста (например, инсулин, трансферрин или эпидермальный ростовой фактор), соли (например, хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферы (например, HEPES), нуклеотиды (например, аденозин и тимидин), антибиотики (например, лекарственное средство Гентамицин™), микроэлементы (определяемые как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях, находящихся в микромолярном диапазоне) и глюкозу или эквивалентный источник энергии. Кроме того, в среду можно включать любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известных специалистам в данной области. Такие условия культивирования, как температура, рН и т.п., совпадают с условиями, использованными ранее при культивировании клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и очевидны для специалиста в данной области.
5. Обнаружение амплификации/экспрессии гена
Амплификацию и/или экспрессию гена можно измерить в образце напрямую, например, с помощью традиционного саузерн-блоттинга, нозерн-блоттинга для количественной оценки транскрипции мРНК [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], дот-блоттинга (анализ ДНК) или гибридизации in situ, используя зонды на основе последовательностей, представленных здесь, меченные соответствующим образом. В качестве альтернативы можно использовать антитела, способные распознавать специфические двуцепочечные структуры, включая двуцепочечные структуры ДНК, РНК и гибридные двуцепочечные структуры ДНК-РНК или двуцепочечные структуры ДНК-белок. Антитела, в свою очередь, можно метить и выполнять анализ, при котором двуцепочечная структура связана с поверхностью, так что после формирования двуцепочечной структуры на поверхности можно обнаружить присутствие антитела, связанного с двуцепочечной структурой.
В качестве альтернативы экспрессию гена можно измерить с помощью иммунологических методик, например, иммуногистохимическое окрашивание клеток или срезов тканей и анализ культуры клеток или биологических жидкостей для прямой количественной оценки экспрессии продукта гена. Антитела, которые можно использовать для иммуногистохимического окрашивания и/или анализа образцов жидкости, могут быть моноклональными или поликлональными, и их можно получить в клетках любого млекопитающего. Антитела можно получить против TAT-полипептида с нативной последовательностью или против синтетического пептида на основе последовательностей ДНК, представленных здесь, или против экзогенной последовательности, объединенной с ДНК TAT и кодирующей специфический эпитоп антитела.
6. Очистка антитела против TAT и TAT-полипептида
Формы антитела против TAT и TAT-полипептида можно выделить из культуральной среды или лизата клеток-носителей. Если белок является мембраносвязанным, его можно отделить от мембраны с помощью раствора подходящего детергента (например, Triton X-100) или путем ферментативного гидролиза. Клетки, использованные для экспрессии антитела против TAT и TAT-полипептида, можно разрушить с помощью различных физических или химических средств, например, циклического замораживания-размораживания, ультразвукового, механического разрушения или с использованием агентов, лизирующих клетки.
Может быть желательно очистить антитело против TAT и TAT-полипептид от белков или полипептидов рекомбинантной клетки. Типичными примерами процедур очистки являются следующие процедуры: фракционирование на ионообменной колонке; преципитация с этанолом; обращенно-фазная ВЭЖХ; хроматография на диоксиде кремния или катионообменной смоле, например, ДЭАЭ; хроматофокусирование; электрофорез в ДСН-ПААГ; преципитация с сульфатом аммония; гель-фильтрации с использованием колонок с, например, Sephadex G-75; и колонок с белок А-сефарозой для удаления таких примесей, как IgG; и использование металлохелатных колонок для связывания форм антител против TAT и TAT-полипептида, маркированных эпитопом. Можно использовать различные способы очистки белка, известные в данной области техники и описанные, например, в Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Выбор этапа(ов) очистки зависит, например, от природы используемого способа продуцирования и конкретных продуцируемых антител против TAT или TAT-полипептида.
При использовании рекомбинантных методик антитело можно продуцировать внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или напрямую секретировать в среду. Если антитело продуцируют внутриклеточно, на первом этапе удаляют обломки частиц, клетки-хозяева или лизированные фрагменты, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) описывает процедуру выделения антител, секретируемых в периплазматическое пространство E. coli. Вкратце, массу клеток размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), ЭДТА и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение приблизительно 30 мин. Фрагменты клеток можно удалить центрифугированием. Если антитело секретируется в среду, надосадочную жидкость из таких систем экспрессии обычно сначала концентрируют с помощью доступных для приобретения фильтров для концентрирования белка, например, установок ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. Для ингибирования протеолиза на любом из предыдущих этапов можно включать ингибитор протеаз, например, PMSF, а для предотвращения роста случайных контаминантов можно добавлять антибиотики.
Композицию антител, полученную из клеток, можно очистить с помощью, например, хроматографии на гидроксиапатите, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, причем аффинная хроматография является предпочтительной методикой очистки. Возможность использования белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в составе антитела. Белок A можно использовать для очистки антител, основанных на тяжелых цепях γ1, γ2 или γ4 человека (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Белок G рекомендуется для всех изотипов мыши и для γ3 человека (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Матрикс, к которому присоединяют аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, однако также доступны и другие матриксы. Механически устойчивые матриксы, например, стекло с контролируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол дает возможность достижения более высоких скоростей потока и более короткого времени обработки, чем при использовании агарозы. Если антитело включает CH3-домен, для очистки можно использовать смолу Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Филлипсбург, штат Нью-Джерси, США). Кроме того, в зависимости от антитела, подлежащего очистке, доступны другие методики очистки белка, например, фракционирование на ионообменной колонке, преципитация с этанолом, обращенно-фазная ВЭЖХ, хроматография на гепарин-сефарозе™, хроматография на анионно- или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ и преципитация с сульфатом аммония.
В соответствии с любым(и) предварительным(и) этапом(ами) очистки смесь, содержащую интересующие исследователя антитела и загрязняющие примеси, можно подвергать гидрофобной хроматографии при низких рН, используя буфер для элюции с рН в диапазоне приблизительно 2,5-4,5, предпочтительно выполняемой при низких концентрациях солей (например, приблизительно 0-0,25 М соли).
J. Фармацевтические составы
Терапевтические составы антител против TAT, TAT-связывающих олигопептидов, TAT-связывающих органических молекул и/или TAT-полипептид, используемые в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела, полипептида, олигопептида или органической молекулы, обладающей желательной степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизованных составов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают буферные вещества, например, ацетат, Трис, фосфат, цитрат и другие органические соли; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, например, метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; регуляторы тоничности, например, трегалозу и хлорид натрия; сахара, например, сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; поверхностно-активное вещество, например, полисорбат; солеобразующие противоионы, например, натрия; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные ПАВ, например, TWEEN, плюроники (PLURONICS) или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Антитело предпочтительно содержится в диапазоне концентраций 5-200 мг/мл, предпочтительно в диапазоне 10-100 мг/мл.
Составы, описанные здесь, также могут содержать более одного активного соединения, если это необходимо для лечения конкретных показаний, предпочтительно, соединения с взаимодополняющими активностями, не оказывающие нежелательного действия друг на друга. Например, в дополнение к антителу против TAT, TAT-связывающему олигопептиду или TAT-связывающей органической молекуле может быть желательно включать в состав дополнительное антитело, например, второе антитело против TAT, связывающееся с другим эпитопом TAT-полипептида, или антитело к какой-либо другой мишени, например, фактору роста, действующее на рост рака конкретного типа. В качестве альтернативы или дополнения композиция также может содержать химиотерапевтический агент, цитотоксический агент, цитокин, агент, подавляющий рост, противогормональный агент и/или кардиозащитный агент. Такие молекулы присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для поставленной цели.
Активные ингредиенты можно включить в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980).
Можно изготовить препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело и присутствующие в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриксов замедленного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, например, LUPRON DEPOT (микросферы для инъекций, содержащие сополимер молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролидацетат) и поли-D-(-)-3-гидроксимаслянную кислоту.
Составы для введения in vivo должны быть стерильны. Это легко осуществить путем фильтрации через стерильные мембраны для фильтрации.
K. Диагностика и лечение с помощью антител против TAT, TAT-связывающих олигопептидов и TAT-связывающих органических молекул
Для определения экспрессии TAT в раковой опухоли доступны различные диагностические анализы. В одном из вариантов воплощения сверхэкспрессию TAT-полипептида можно анализировать с помощью иммуногистохимии (IHC). Залитые парафином срезы тканей биоптата опухоли можно подвергать IHC-анализу, принимая следующие критерии интенсивности окрашивания TAT-белка:
оценка 0 - окрашивание не наблюдается или наблюдается окрашивание мембран менее чем у 10% опухолевых клеток.
Оценка 1+ - обнаруживается слабое или едва заметное окрашивание мембран у более чем 10% опухолевых клеток. Мембрана клеток окрашивается лишь частично.
Оценка 2+ - наблюдается окрашивание мембран от слабого до умеренного у более чем 10% опухолевых клеток.
Оценка 3+ - наблюдается окрашивание мембран от умеренного до сильного у более чем 10% опухолевых клеток.
Опухоли, получившие оценки экспрессии TAT-полипептида 0 или 1+, можно характеризовать как не сверхэкспрессирующие TAT, в то время как опухоли с оценками 2+ или 3+ можно характеризовать как сверхэкспрессирующие TAT.
В качестве альтернативы или дополнения фиксированные формалином и залитые парафином ткани опухоли можно подвергать FISH-анализу, например, INFORM (продается у Ventana, штат Аризона) или PATHVISION (Vysis, штат Иллинойс) с целью определения степени (при ее наличии) сверхэкспрессии TAT в опухоли.
Оценку сверхэкспрессии или амплификации TAT можно выполнить с помощью диагностического анализа in vivo, например, путем введения молекулы (например, антитела, олигопептида или органической молекулы), связывающей молекулу, подлежащую обнаружению и маркированной обнаруживаемой меткой (например, радиоактивным изотопом или флуоресцентной меткой) и внешнего сканирования пациента для определения локализации метки.
Как описано выше, антитела, олигопептиды и органические молекулы против TAT согласно изобретению могут находить различное нетерапевтическое применение. Антитела, олигопептиды и органические молекулы против TAT согласно настоящему изобретению можно использовать для диагностики и определения стадии раковых опухолей, экспрессирующих TAT-полипептид (например, при радиоинтраскопии). Антитела, олигопептиды и органические молекулы против TAT согласно настоящему изобретению также можно использовать для очистки и иммунопреципитации TAT-полипептида из клеток, для обнаружения и подсчета TAT-полипептида in vitro, например, с помощью твердофазного ИФА или вестерн-блоттинга, для уничтожения и удаления TAT-экспрессирующих клеток из популяции смешанных клеток в качестве этапа очистки других клеток.
В настоящее время в зависимости от стадии рака лечение рака включает один из следующих видов терапии или их комбинацию: хирургическую операцию для удаления раковой ткани, лучевую терапию и химиотерапию. Терапия с использованием антитела, олигопептида или органической молекулы против TAT может быть особенно желательна для пожилых пациентов, плохо переносящих токсичность и побочные эффекты химиотерапии, и при метастазировании, когда польза от лучевой терапии ограничена. Адресное воздействие антител, олигопептидов и органических молекул против TAT согласно изобретению на опухоль можно использовать для облегчения состояния при раковых опухолях, экспрессирующих TAT, после начальной диагностики заболевания или во время рецидива. Для терапевтического применения антитела, олигопептиды или органические молекулы против TAT можно использовать поодиночке или при комбинированной терапии с, например, гормонами, антиангиогенными средствами или радиоактивно мечеными соединениями или с хирургической операцией, криотерапией и/или лучевой терапией. Антитела, олигопептиды или органические молекулы против TAT можно вводить во взаимодействии с другими формами общепринятой терапии, либо последовательно с, перед или после общепринятых терапевтических средств. Химиотерапевтические лекарственные средства, например, Таксотер (доцетаксел), Таксол (паклитаксел), эстрамустин и митоксантрон используют для лечения рака, например, у пациентов с небольшой степенью риска. При настоящем способе согласно изобретению для лечения рака или облегчения состояния при раке раковым пациентам можно вводить антитела, олигопептиды или органические молекулы против TAT во взаимодействии с лечением с помощью одного или более вышеописанных химиотерапевтических агентов. В частности, рассматривается комбинированная терапия паклитакселом и его модифицированными производными (см., например, EP0600517). Антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT можно вводить с терапевтически эффективной дозой химиотерапевтического агента. В еще одном варианте воплощения антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT можно вводить во взаимодействии с химиотерапией для повышения активности и эффективности химиотерапевтического агента, например, паклитаксела. В Physicians’ Desk Reference (PDR) описаны дозировки этих агентов, используемые для лечения различных видов рака. Режим дозирования и дозировки вышеуказанных химиотерапевтических лекарственных средств, являющиеся терапевтически эффективными, зависят от конкретного типа рака, подвергаемого лечению, степени развития заболевания и других факторов, известных врачам-специалистам, которые может определить врач.
В одном из конкретных вариантов воплощения пациенту вводят конъюгат, включающий антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT, конъюгированные с цитотоксическим агентом. Предпочтительно, иммуноконъюгат, связанный с TAT-белком, поглощается клеткой, что приводит к повышенной терапевтической эффективности иммуноконъюгата при уничтожении раковых клеток, с которыми он связывается. В предпочтительном варианте воплощения цитотоксический агент оказывает адресное воздействие или вносит помехи в функционирование нуклеиновых кислот в раковой клетке. Примеры таких цитотоксических агентов описаны выше и включают майтанзиноиды, калихеамицины, рибонуклеазы и ДНК-эндонуклеазы.
Антитела, олигопептиды и органические молекулы против TAT или их конъюгаты с токсином вводят пациенту-человеку в соответствии с известными способами, например, внутривенным введением, например, в виде болюса или путем непрерывного вливания в течение некоторого периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным путем. Предпочтительным является внутривенное или подкожное введение антитела, олигопептида или органической молекулы.
С введением антитела, олигопептиды или органические молекулы против TAT можно комбинировать другие схемы лечения. Комбинированное введение включает совместное введение при использовании раздельных препаратов или единого фармацевтического состава и последовательное введение в любом порядке, причем предпочтительно, чтобы существовал период времени, когда оба (или все) активные агенты одновременно проявляют свою биологическую активность. В предпочтительном случае такая комбинированная терапия приводит к синергическому терапевтическому эффекту.
Кроме того, может быть желательно комбинировать введение антитела или антител, олигопептидов или органических молекул против TAT с введением антитела против другого опухолевого антигена, ассоциированного с определенным видом рака.
В еще одном варианте воплощения способы лечения согласно настоящему изобретению включают комбинированное введение антитела (или антител), олигопептидов и органических молекул против TAT и одного или более химиотерапевтических агентов или агентов, подавляющих рост, включая совместное введение коктейлей из различных химиотерапевтических агентов. Химиотерапевтические агенты включают эстрамустина фосфат, преднимустин, цисплатин, 5-фторурацил, мелфалан, циклофосфамид, гидроксимочевину и таксаны (например, паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Препараты и расписание дозировок таких химиотерапевтических агентов можно использовать согласно инструкциям изготовителя или согласно эмпирическому определению, выполненному специалистом. Препараты и расписание дозировок таких химиотерапевтических агентов также описаны в Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).
Антитело, олигопептид или органическую молекулу можно комбинировать с противогормональным соединением, например, антиэстрогенным соединением, например, тамоксифеном; антипрогестероном, например, онапристоном (см. EP 616 812) или антиандрогеном, например, флутамидом, в дозах, известных для этих молекул. Если рак, подвергаемый лечению, является андрогензависимым раком, пациента вначале можно подвергнуть антиандрогенной терапии, а после того, как рак станет независимым от андрогенов, пациенту можно вводить антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT (и, необязательно, другие агенты, описанные здесь).
Иногда может быть выгодным, кроме того, совместное введение пациенту кардиозащитного средства (для предотвращения или снижения дисфункции миокарда, связанной с терапией) или одного или более цитокинов. В дополнение к вышеописанным курсам лечения, пациента можно подвергнуть хирургическому удалению раковых клеток и/или лучевой терапии до, одновременно с или после терапии с помощью антитела, олигопептида или органической молекулы. Подходящие дозировки любого из вышеуказанных совместно вводимых агентов совпадают с дозировками, используемыми в настоящее время, и могут быть снижены вследствие комбинированного действия (синергии) агента и антитела, олигопептида или органической молекулы против TAT.
Для предотвращения или лечения заболевания врач может выбрать дозировку и способ введения согласно известным критериям. Соответствующая дозировка антитела, олигопептида или органической молекулы зависит от типа заболевания, подвергаемого лечению, как установлено выше, тяжести и развития заболевания, от того, в профилактических или терапевтических целях вводят антитело, олигопептид или органическую молекулу, предыдущей терапии, истории болезни пациента и реакции на антитело, олигопептид или органическую молекулу, и усмотрения лечащего врача. Антитело, олигопептид или органическую молекулу вводят пациенту однократно или в ходе серии сеансов лечения. В предпочтительном случае антитело, олигопептид или органическую молекулу вводят путем внутривенного вливания или подкожной инъекции. В зависимости от типа и тяжести заболевания вероятная начальная дозировка антитела для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг массы тела (например, приблизительно 0,1-15 мг/кг/дозу), например, путем одного или более раздельных введений или путем непрерывного вливания. Схема дозирования может включать введение начальной нагрузочной дозы, приблизительно равной 4 мг/кг с последующим еженедельным введением поддерживающей дозы, равной приблизительно 2 мг/кг антитела против TAT. В то же время можно использовать другие схемы дозирования. Типичная ежедневная доза может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. При повторных введениях в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение поддерживают до желательного ингибирования симптомов заболевания. Ход терапии легко отслеживать с помощью общепринятых способов и анализов на основе критериев, известных врачам или другим специалистам.
Кроме введения белка антитела пациенту, настоящая заявка рассматривает введение антитела путем генной терапии. Такое введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, входит в рамки выражения "введение терапевтически эффективного количества антитела". См., например, WO96/07321, опубликованную 14 марта 1996 г, касающуюся использования генной терапии для получения внутриклеточных антител.
Существуют два основных подхода к помещению нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в составе вектора) в клетки пациента; in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту вводят непосредственно в организм пациента, обычно в область, где требуется это антитело. Для лечения ex vivo выделяют клетки пациента, внедряют нуклеиновую кислоту в эти выделенные клетки и вводят модифицированные клетки пациенту напрямую или, например, в капсулированном состоянии в пористые мембраны, имплантируемые в организм пациента (см., например, патенты США №№ 4892538 и 5283187). Существуют различные методики внедрения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Эти методики изменяются в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культуру клеток in vitro или в клетки предполагаемого хозяина in vivo. Методики, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro включают использование липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, использование ДЭАЭ-декстрана, способ кальций-фосфатной преципитации и т.д. Вектор, обычно используемый для доставки гена ex vivo, представляет собой ретровирусный вектор.
В настоящее время предпочтительные методики переноса нуклеиновой кислоты in vivo включают трансфекцию вирусными векторами (например, аденовирусом, вирусом простого герпеса I или аденоассоциированным вирусом) и системы на основе липидов (липиды, пригодные для липидопосредованного переноса гена, представляют собой, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol. Обзор известных в настоящее время протоколов маркировки генов и генной терапии см. в работе Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Кроме того, см. WO 93/25673 и ссылки, цитируемые в ней.
Антитела против TAT согласно изобретению могут быть в различных формах, входящих в рамки определения "антитела" здесь. Так, антитела включают полноразмерное или интактное антитело, фрагменты антител, антитело с нативной последовательностью или варианты его аминокислотной последовательности, гуманизированные, химерные или гибридные антитела, иммуноконъюгаты и их функциональные фрагменты. В гибридных антителах последовательность антитела объединена с последовательностью гетерологичного полипептида. Антитела можно модифицировать по Fc-области, обеспечивая желательные эффекторные функции. Как подробнее обсуждается в разделах настоящего документа, за счет соответствующей Fc-области неконъюгированное антитело, связанное с поверхностью клеток, может индуцировать цитотоксичность, например, путем антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или путем вовлечения комплемента в комплементзависимую цитотоксичность, или по некоторым другим механизмам. В качестве альтернативы, если необходимо устранить или снизить эффекторную функцию, минимизируя побочные эффекты или осложнения терапии, можно использовать некоторые другие Fc-области.
В одном из вариантов воплощения антитело конкурирует за связывание или связывается фактически с тем же эпитопом, что и антитела согласно изобретению. Также рассматриваются антитела, обладающие биологическими характеристиками настоящих антител против TAT по изобретению, в особенности включая адресное воздействие на опухоль in vivo и подавление пролиферации любых клеток или цитотоксические характеристики.
Способы получения вышеупомянутых антител подробно описаны здесь.
Настоящие антитела, олигопептиды и органические молекулы против TAT можно использовать для лечения раковых опухолей, экспрессирующих TAT, или для облегчения одного или более симптомов рака у млекопитающих. Такие виды рака включают рак предстательной железы, рак мочевыделительных путей, рек легкого, рак молочной железы, рак толстой кишки и рак яичника, конкретнее, аденокарциному предстательной железы, почечноклеточные карциномы, аденокарциномы ободочной и прямой кишки, аденокарциномы легких, плоскоклеточные карциномы легкого и мезотелиому плевры. Рак включает метастазы любого из вышеупомянутых видов рака. Антитело, олигопептид или органическая молекула способны связываться по меньшей мере с фрагментом раковой клетки, экспрессирующей полипептид в организме млекопитающего. В предпочтительном варианте воплощения антитело, олигопептид или органическая молекула эффективно разрушают или уничтожают TAT-экспрессирующие клетки опухоли или подавляют рост таких клеток опухоли in vitro или in vivo после связывания с TAT-полипептидом на поверхности клетки. Такое антитело включает неконъюгированное антитело против TAT. Неконъюгированные антитела, обладающие цитотоксическими или подавляющими рост клеток свойствами, можно в дальнейшем связать с цитотоксическим агентом, делая его еще более мощным агентом для разрушения клеток опухоли. Антителу против TAT можно придать цитотоксические свойства, например, путем конъюгирования антитела с цитотоксическим агентом, образуя иммуноконъюгат, описанный здесь. Цитотоксический агент или агент, подавляющий рост, предпочтительно представляют собой низкомолекулярное соединение. Предпочтительными являются такие токсины, как калихеамицин или майтанзиноид или их аналоги и производные.
Настоящее изобретение представляет композицию, содержащую антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT согласно изобретению и носитель. С целью лечения рака композиции можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении, причем указанные композиции могут содержать одно или более антител против TAT, присутствующие в виде иммуноконъюгата или неконъюгированного антитела. В другом варианте воплощения композиции могут включать указанные антитела, олигопептиды или органические молекулы в комбинации с другими терапевтическими агентами, например, цитотоксическими или подавляющими рост агентами, включая химиотерапевтические агенты. Настоящее изобретение также представляет составы, содержащие антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов воплощения препарат представляет собой терапевтический состав, включающий фармацевтически приемлемый носитель.
Другой аспект изобретения представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела против TAT. Включены нуклеиновые кислоты, кодирующие H и L-цепи, особенно остатки гипервариабельных областей, цепи, кодирующие антитело с нативной последовательностью, а также варианты, модификации и гуманизированные версии антитела.
Изобретение, кроме того, представляет способы лечения рака, экспрессирующего TAT-полипептид, или облегчения одного или более симптомов рака у млекопитающих, включающие введение терапевтически эффективного количества антитела, олигопептида или органической молекулы против TAT в организм млекопитающего. Терапевтические антитело, олигопептид или органическую молекулу можно вводить пациенту кратковременно (остро) или хронически или дискретно, как указано врачом. Кроме того, представлены способы ингибирования роста и уничтожения клетки, экспрессирующей TAT-полипептид.
Изобретение также представляет наборы и изделия, включающие по меньшей мере одно антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT. Наборы, содержащие антитела, олигопептиды или органические молекулы, находят применение, например, в анализе уничтожения клеток, при очистке или иммунопреципитации TAT-полипептида из клеток. Например, для выделения и очистки TAT набор может содержать антитело, олигопептид или органическую молекулу, связанную с гранулами (например, гранулами сефарозы). Могут быть представлены наборы, содержащие антитела, олигопептиды или органические молекулы для обнаружения и подсчета TAT in vitro, например, с помощью твердофазного ИФА или вестерн-блоттинга. Такие антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT, используемые для обнаружения, могут содержать метку, например, флуоресцентную или радиоактивную метку.
L. Изделия и наборы
Еще один вариант воплощения изобретения представляет собой изделие, содержащее материалы для лечения рака, экспрессирующего TAT. Изделие включает контейнер и этикетку или вкладыш в упаковку, вложенный или связанный с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры можно сформировать из различных материалов, например, из стекла или пластика. Контейнер содержит композицию, эффективно лечащую раковое состояние, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенного введения или флакон, содержащий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один агент в составе композиции представляет собой антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT согласно изобретению. Этикетка или вкладыш в упаковку указывают, что композицию используют для лечения рака. Этикетка или вкладыш в упаковку также содержат инструкции по введению композиции антитела, олигопептида или органической молекулы раковому пациенту. Кроме того, изделие может содержать второй контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатический буфер для инъекций (BWFI), физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно также может содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Кроме того, представлены наборы, пригодные для различных целей, например, для анализов уничтожения клеток, экспресссирующих TAT, для очистки и иммунопреципитации TAT-полипептида из клеток. Для выделения и очистки TAT-полипептида набор может содержать антитело, олигопептид или органическую молекулу, связанную с гранулами (например, гранулами сефарозы). Могут быть представлены наборы, содержащие антитела, олигопептиды или органические молекулы для обнаружения и подсчета TAT-полипептида in vitro, например, с помощью твердофазного ИФА или вестерн-блоттинга. Как и изделие, набор включает контейнер и этикетку или вкладыш в упаковку, вложенный или связанный с контейнером. Контейнер содержит композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело, олигопептид или органическую молекулу против TAT согласно изобретению. Можно включать дополнительные контейнеры, содержащие, например, разбавители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или вкладыш в упаковку могут представлять описание композиции, а также инструкции для предполагаемого использования in vitro или диагностического применения.
M. Применение TAT-полипептидов и нуклеиновых кислот, кодирующих TAT-полипептид
Нуклеотидные последовательности (или комплементарные им цепи), кодирующие TAT-полипептиды, находят разнообразное применение в области молекулярной биологии, включая использование в качестве зондов для гибридизации, в картировании хромосом и генов и при получении антисмысловых РНК и ДНК-зондов. Нуклеиновую кислоту, кодирующую TAT, также можно использовать для получения TAT-полипептидов с помощью рекомбинантных методик, описанных здесь, причем указанные TAT-полипептиды могут находить применение, например, при изготовлении антител против TAT, как описано здесь.
Полноразмерный ген TAT с нативной последовательностью или его фрагменты можно использовать в качестве зондов для гибридизации с библиотекой кДНК для выделения полноразмерной кДНК TAT или других кДНК (например, кодирующих природные варианты TAT или TAT других видов), обладающих достаточной идентичностью последовательности с нативной последовательностью TAT, описанной здесь. Необязательно длина зондов составляет от приблизительно 20 до приблизительно 50 оснований. Зонды для гибридизации могут происходить из по меньшей мере частично новых областей полноразмерной нативной нуклеотидной последовательности, причем указанные области можно определить без лишних экспериментов, или из геномных последовательностей, включая промоторы, энхансерные элементы и интроны нативной последовательности TAT. Например, способ скрининга включает выделение кодирующей области гена TAT с помощью известной последовательности ДНК для синтеза выбранного зонда длиной приблизительно 40 оснований. Зонды для гибридизации можно метить различными метками, включая радионуклеотиды, например, 32P или 35S, или ферментными метками, например, щелочной фосфатазой, сопряженной с зондом через авидин/биотиновую систему сопряжения. Меченые зонды, обладающие последовательностью, комплементарной последовательности гена TAT согласно настоящему изобретению, можно использовать для скрининга библиотек кДНК человека, геномной ДНК или мРНК для определения того, с какими членами таких библиотек гибридизуется зонд. Методики гибридизации более подробно описаны ниже в разделе Примеры. Маркерные экспрессируемые последовательности (EST), описанные в настоящей заявке, аналогичным образом можно использовать в качестве зондов с помощью способов, описанных здесь.
Другие пригодные для использования фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие TAT, включают антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды, включающие последовательность одноцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), способную связываться с мишенью - последовательностями мРНК TAT (смысловой) или ДНК TAT (антисмысловой). Смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению включают фрагмент кодирующей области ДНК TAT. Такой фрагмент обычно включает по меньшей мере приблизительно 14 нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 14 до 30 нуклеотидов. Возможность получения антисмыслового или смыслового олигонуклеотида на основе последовательности кДНК, кодирующей данный белок, описана в, например, Stein and Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) и van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).
Связывание антисмыслового или смыслового олигонуклеотида с последовательностями-мишенями нуклеиновой кислоты приводит к образованию двуцепочечных структур, блокирующих транскрипцию или трансляцию последовательности-мишени одним из нескольких способов, включая усиленное разрушение двуцепочечных структур, преждевременную терминацию транскрипции или трансляции или другим образом. Такие способы входят в рамки настоящего изобретения. Таким образом, антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для блокирования экспрессии TAT-белков, причем указанные TAT-белки могут играть роль в возникновении рака у млекопитающих. Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды также включают олигонуклеотиды с модифицированными сахар-фосфодиэфирными каркасами (или содержащие связи с другими углеводами, например, как описано в WO 91/06629), причем эти связи с углеводами являются устойчивыми к действию эндогенных нуклеаз. Такие олигонуклеотиды с устойчивыми связями с углеводами стабильны in vivo (т.е. устойчивы к ферментативному разрушению), но сохраняют специфичность последовательности и способны связываться с нуклеотидными последовательностями-мишенями.
Предпочтительные для антисмыслового связывания сайты в составе гена включают область, включающую кодон инициации трансляции/стартовый кодон (5'-AUG/5'-ATG) или кодон терминации/стоп-кодон (5'-UAA, 5'-UAG и 5-UGA/5'-TAA, 5'-TAG и 5'-TGA) открытой рамки считывания (ORF) гена. Эти области относятся к фрагменту мРНК гена, охватывающему от приблизительно 25 до приблизительно 50 непрерывных нуклеотидов в любом направлении (т.е., 5' или 3') от кодона инициации трансляции или терминации. Другие предпочтительные для антисмыслового связывания области включают: интроны; экзоны; сайты соединения интрон-экзон; открытую рамку считывания (ORF) или "кодирующую область", представляющую собой область между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции; 5'-кэп мРНК, включающий N7-метилированный остаток гуанозина, соединенный с 5'-концевым остатком мРНК через 5'-5' трифосфатную связь и включает структуру 5'-кэпа саму по себе, а также первые 50 нуклеотидов, примыкающих к кэпу; 5'-нетранслируемую область (5'UTR), фрагмент мРНК, расположенный в 5'-направлении от кодона инициации трансляции и, таким образом, включающий нуклеотиды между 5'-кэпом и кодоном инициации трансляции мРНК или соответствующими нуклеотидами гена; и 3'-нетранслируемую область (3'UTR), фрагмент мРНК, расположенный в 3'-направлении от кодона инициации трансляции и, таким образом, включающий нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3'-концом мРНК или соответствующими нуклеотидами гена.
Конкретные примеры предпочтительных антисмысловых соединений, пригодных для ингибирования экспрессии TAT-белков, включают олигонуклеотиды, содержащие модифицированные каркасы или межнуклеотидные связи неприродного происхождения. Олигонуклеотиды с модифицированными каркасами включают олигонуклеотиды, сохраняющие атом фосфора в каркасе и олигонуклеотиды, каркас которых не содержит атома фосфора. Для целей настоящего патентного описания и как иногда упоминается в данной области техники, модифицированные олигонуклеотиды, межнуклеозидный каркас которых не содержит атома фосфора, можно также рассматривать как олигонуклеозиды. Примеры модифицированных олигонуклеотидных каркасов включают, например, фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфодитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метилированные и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты, 5'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионфосфорамидаты, тионалкилфосфонаты, тионалкилфосфотриэфиры, селенфосфаты и боранфосфонаты, несущие нормальные 3'-5' связи, их аналоги с 2'-5'-связями, а также перечисленные соединения с обратной полярностью, где одна или более из межнуклеотидных связей представляет собой связь 3'-3', 5'-5' или 2'-2'. Предпочтительные олигонуклеотиды, обладающие обратной полярностью, включают одиночную 3'-3' связь при 3'-концевой межнуклеотидной связи, т.е. одиночный инвертированный нуклеозидный остаток, который может быть лишен основания (нуклеиновое основание отсутствует или вместо него присутствует гидроксильная группа). Кроме того, включены соединения в форме различных солей, смешанных солей и свободных кислот. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении фосфорсодержащих связей, включают патенты США №№ 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5194599; 5565555; 5527899; 5721218; 5672697 и 5625050, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими.
Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные каркасы, не содержащие атомов фосфора обладают каркасами, образованными короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, межнуклеозидными смешанными связями, включающими гетероатом и алкил или циклоалкил, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают соединения с морфолиновыми связями (частично образованными из углеводного фрагмента нуклеозида); силоксановыми каркасами; сульфидными, сульфоксидными и сульфоновыми каркасами; формацетильными и тиоформацетильными каркасами; метиленформацетильными и тиоформацетильными каркасами; рибоацетильными каркасами; алкенсодержащими каркасами; сульфаматными каркасами; метилениминовыми и метиленгидразиновыми каркасами; сульфонатными и сульфонамидными каркасами; амидными каркасами; и другие соединения, содержащие смешанные фрагменты из N, O, S и CH2-компонентов. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении таких олигонуклеозидов, включают патенты США №№ 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; 5792608; 5646269 и 5677439, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими.
В других предпочтительных антисмысловых олигонуклеотидах и сахар, и межнуклеозидная связь, т.е. каркас нуклеотида, замещены новыми группами. Основания сохраняют способность к гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью. Одно из таких олигомерных соединений, имитирующее олигонуклеотид и демонстрирующее превосходные гибридизационные свойства, называется пептидной нуклеиновой кислотой (ПНК). В ПНК-соединениях углеводный каркас олигонуклеотида замещен амидсодержащим каркасом, в частности, аминоэтилглициновым каркасом. Нуклеиновые основания сохраняются и напрямую связываются с аза-атомами азота амидных фрагментов каркаса. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении ПНК-соединений включают патенты США №№ 5539082; 5714331; и 5719262, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими. Дополнительная информация о ПНК-соединениях находится в статье Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Предпочтительные антисмысловые олигонуклеотиды включают фосфортиоатные каркасы и/или гетероатомсодержащие каркасы, в частности, -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [известный как метиленовый (метилиминовый) или MMI-каркас], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- и -O-N(CH3)-CH2-CH2- [причем нативный фосфодиэфирный каркас представляет собой -O-P-O-CH2-], описанные в вышеупомянутом патенте США № 5489677, и амидные каркасы согласно вышеупомянутому патенту США № 5602240. Кроме того, предпочтительными являются антисмысловые олигонуклеотиды с морфолиновыми каркасными структурами согласно вышеупомянутому патенту США № 5034506.
Модифицированные олигонуклеотиды также могут содержать одну или более замещенных углеводных групп. Предпочтительные олигонуклеотиды включают одну из следующих групп по 2'-положению: OH; F; O-алкил, S-алкил или N-алкил; O-алкенил, S-алкенил или N-алкенил; O-алкинил, S-алкинил или N-алкинил; или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил или алкинил могут представлять собой замещенные или незамещенные C1-C10 алкил или C2-C10 алкенил и алкинил. Особенно предпочтительны O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, где n и m равны от 1 до приблизительно 10. Другие предпочтительные антисмысловые олигонуклеотиды включают одну из следующих групп по 2'-положению: C1-C10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аралкил, O-алкарил или O-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалирующее соединение, группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида и другие заместители, обладающие аналогичными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-O-CH2CH2OCH3, также известную как 2'-O-(2-метоксиэтил) или 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) т.е. алкоксиалкоксигруппу. Другая предпочтительная модификация включает 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. O(CH2)2ON(CH3)2-группу, также известную как 2'-DMAOE, как описано в разделе Примеры здесь, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известную в данной области техники как 2'-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е., 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2).
Другая предпочтительная модификация включает закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), в которых 2'-гидроксильная группа связана с 3' или 4'-атомом углерода углеводного кольца, тем самым образуя бициклическую углеводную группу. Эта связь предпочтительно представляет собой метиленовую (-CH2-)n группу, соединяющую 2'-атом кислорода и 4'-атом углерода, где n равно 1 или 2. LNA и их получение описаны в WO 98/39352 и WO 99/14226.
Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси (2'-O-CH3), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2 NH2), 2'-аллил (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-аллил (2'-O-CH2-CH=CH2) и 2'-фтор (2'-F). 2'-модификация может находиться в арабино- (верхнем) или рибо- (нижнем) положении. Предпочтительной 2'-арабиномодификацией является 2'-F. Аналогичные модификации можно получить по другим положениям в составе олигонуклеотида, в частности, 3'-положению в составе углевода 3'-концевого нуклеотида или в 2'-5'-связанных олигонуклеотидах и по 5'-положению 5'-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды также могут содержать имитаторы углеводов, например, циклобутиловые группы вместо пентофуранозильного углевода. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении таких модифицированных углеводных структур, включают патенты США №№ 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 5792747; и 5700920, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими.
Олигонуклеотиды также могут включать модификации или замены по нуклеиновому основанию (часто называемому в данной области техники просто "основанием"). Как используется здесь, "немодифицированные" или "природные" нуклеиновые основания включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеиновые основания включают другие синтетические и природные нуклеиновые основания, например, 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил (-C=C-CH3 или -CH2-C=CH) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Другие модифицированные нуклеиновые основания включают трициклические пиримидины, например, феноксазиновый цитидин (1H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3H)-он), фенотиазиновый цитидин (1H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензотиазин-2(3H)-он), "струбцины", например, модифицированный феноксазиновый цитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-H-пиримидо[5,4-b][1,4]бензоксазин-2(3H)-он), карбазольный цитидин (2H-пиримидо[4,5-b]индол-2-он), пиридоиндольный цитидин (H-пиридо[3',2':4,5]пиррол[2,3-d]пиримидин-2-он). Модифицированные нуклеиновые основания также включают основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание замещено другими гетероциклами, например, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Другие нуклеиновые основания включают основания, описанные в патенте США № 3687808, основания, описанные в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, и основания, описанные в Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Некоторые из этих нуклеотидных оснований особенно полезны для усиления сродства связывания олигомерных соединений согласно изобретению. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и О-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Показано, что 5-метилцитозиновые замены повышают стабильность двуцепочечной нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2 градуса C (Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и являются предпочтительными заменами по основанию, особенно в комбинации с 2'-O-метоксиэтильными модификациями углевода. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении модифицированных нуклеиновых оснований, включают патент США № 3687808, а также патенты США №№ 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5645985; 5830653; 5763588; 6005096; 5681941 и 5750692, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими.
Другие модификации антисмысловых олигонуклеотидов включают химическую связь с олигонуклеотидом одной или более групп или конъюгатов, усиливающих активность олигонуклеотида, его распределение в клетке или поглощение клеткой. Соединения согласно изобретению могут содержать группы конъюгатов, ковалентно связанные с функциональными группами, например, первичными или вторичными гидроксильными группами. Группы конъюгатов согласно изобретению включают интеркалирующие соединения, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, полиэфиры, группы, усиливающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, усиливающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типичные группы конъюгатов включают производные холестерина, липиды, катионные липиды, фосфолипиды, катионные фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Группы, усиливающие фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, усиливающие поглощение олигомера, повышающие устойчивость олигомера к разрушению и/или усиливающие специфическую гибридизацию с РНК. Группы, усиливающие фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, усиливающие поглощение олигомера, его распределение, метаболизм или выведение. Группы конъюгатов включают липидные группы, например, группу холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), холевую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний-1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-H-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитильную группу (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) или октадециламиновую или гексиламинокарбонилоксихолестериновую группу, но не ограничиваются ими. Олигонуклеотиды по изобретению также можно конъюгировать с активными лекарственными соединениями, например, аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трииодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензтиадиазидом, хлортиазидом, диазепином, индометацином, барбитуратом, цефалоспорином, лекарственным сульфамидным препаратом, антидиабетическим средством, антибактериальным средством или антибиотиком. Конъюгаты олигонуклеотид-лекарственное средство и их изготовление описаны в патентной заявке США № 09/334130 (поданной 15 июня 1999 г.) и патентах США №№ 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717; 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241; 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.
Однотипная модификация данного соединения по всем положениям не является необходимой; фактически, в одно соединение или даже в одиночный нуклеозид в составе олигонуклеотида можно внести более одной из вышеупомянутых модификаций. Настоящее изобретение также включает антисмысловые соединения, представляющие собой химерные соединения. "Химерные" антисмысловые соединения или "химеры" в контексте настоящего изобретения представляют собой антисмысловые соединения, в частности, олигонуклеотиды, содержащие две или более химически различающихся области, каждая из которых состоит по меньшей мере из одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Эти олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область, в которой олигонуклеотид модифицирован таким образом, что это придает ему устойчивость к разрушению нуклеазами, повышенное поглощение клетками и/или повышенное сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Дополнительная область олигонуклеотида может служить субстратом для ферментов, способных расщеплять РНК:ДНК- или РНК:РНК-гибриды. Например, РНКаза H представляет собой клеточную эндонуклеазу, расщепляющую цепь РНК в составе двуцепочечной структуры РНК:ДНК. Активация РНКазы Н, таким образом, приводит к расщеплению РНК-мишени, тем самым значительно усиливая эффективность ингибирования экспрессии генов олигонуклеотидом. Таким образом, при использовании химерных олигонуклеотидов часто можно получить сопоставимые результаты за счет применения более коротких олигонуклеотидов по сравнению с фосфортиоатными дезоксиолигонуклеотидами, гибридизующихся с той же областью-мишенью. Химерные антисмысловые соединения согласно изобретению можно получить в виде составных структур двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или имитаторов олигонуклеотидов, как описано выше. Предпочтительные химерные антисмысловые олигонуклеотиды включают по меньшей мере один 2'-модифицированный углевод (предпочтительно 2'-O-(CH2)2-O-CH3) на 3'-конце, придающий устойчивость к нуклеазам, и область, содержащую по меньшей мере 4 непрерывных 2'-H углевода, придающих чувствительность к активности РНКазы H. Такие соединения также называют в данной области техники гибридами или олигонуклеотидами с пропусками. Предпочтительные олигонуклеотиды с пропусками включают область 2'-модифицированных углеводов (предпочтительно 2'-O-(CH2)2-O-CH3) на 3'-конце и на 5'-конце, отделенную по меньшей мере одной областью, содержащей по меньшей мере 4 непрерывных 2'-H углевода, и предпочтительно включают фосфортиоатные связи в составе каркаса. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении таких гибридных структур, включают патенты США №№ 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; и 5700922, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими.
Антисмысловые соединения, использованные в соответствии с изобретением, можно изготовить в рабочем порядке с помощью общеизвестной методики твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продают несколько компаний-разработчиков, включая, например, Applied Biosystems (Фостер-Сити, штат Калифорния, США). В качестве дополнения или альтернативы можно использовать любые другие средства для такого синтеза, известные в данной области. Широко известны примеры использования аналогичных методик для изготовления олигонуклеотидов, например, фосфотиоатов и алкилированных производных. Соединения согласно изобретению также можно смешивать, капсулировать, конъюгировать или иным образом связывать с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами, мишенями которых являются рецепторы, препаратами для перорального, ректального, местного и другого применения, для содействия способам поглощения, распределения и/или всасывания. Типичные патенты США, содержащие информацию о получении таких составов, содействующих поглощению, распределению и/или всасыванию, включают патенты США №№ 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543158; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки, но не ограничиваются ими.
Другие примеры смысловых или антисмысловых олигонуклеотидов включают олигонуклеотиды, ковалентно связанные с органическими группами, например, описанными в WO 90/10048, и другими группами, повышающими сродство олигонуклеотида к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, например, поли-(L-лизином). Более того, к смысловым или антисмысловым олигонуклеотидам можно присоединять интеркалирующие агенты, например, эллиптицин, и алкилирующие агенты или металлсодержащие комплексы с целью модификации специфичности связывания антисмыслового или смыслового олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью-мишенью.
Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды можно внедрять в клетку, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, с помощью любого способа переноса генов, включая, например, CaPO4-опосредованную трансфекцию ДНК, электропорацию, или векторы для переноса генов, например, вирус Эпштейна-Барра. Согласно предпочтительной процедуре антисмысловой или смысловой олигонуклеотид встраивают в подходящий ретровирусный вектор. Клетка, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, вступает в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором in vivo или ex vivo. Подходящие ретровирусные векторы включают векторы, происходящие от ретровируса мыши M-MuLV, N2 (ретровируса, происходящего от M-MuLV), или двукопийные векторы, обозначаемые как DCT5A, DCT5B и DCT5C (см. WO 90/13641), но не ограничиваются ими.
Смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды также можно внедрить в клетку, содержащую нуклеотидную последовательность-мишень, путем формирования конъюгата с лиганд-связывающей молекулой, как описано в WO 91/04753. Подходящие лиганд-связывающие молекулы включают рецепторы поверхности клеток, факторы роста, другие цитокины или другие лиганды, связывающиеся с рецепторами поверхности клеток, но не ограничиваются ими. Предпочтительно, конъюгация с лиганд-связывающей молекулой не вносит существенных помех в способность лиганд-связывающей молекулы связываться с соответствующей молекулой или рецептором и не блокирует проникновение смыслового или антисмыслового олигонуклеотида или его конъюгированной версии в клетку.
В качестве альтернативы, смысловой или антисмысловой олигонуклеотид можно внедрить в клетку, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, путем формирования комплекса олигонуклеотид-липид, как описано в WO 90/10448. Комплекс смыслового или антисмыслового олигонуклеотида с липидом предпочтительно диссоциирует в клетке под действием эндогенной липазы.
Обычно смысловые или антисмысловые молекулы РНК или ДНК обладают длиной по меньшей мере приблизительно 5 нуклеотидов, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов, причем в этом контексте термин "приблизительно" означает указанную длину нуклеотидной последовательности плюс-минус 10% этой указанной длины.
Указанные зонды также можно использовать в ПЦР-методиках для получения пула последовательностей для идентификации близкородственных TAT-кодирующих последовательностей.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие TAT, также можно использовать для конструирования гибридизационных зондов для картирования гена, кодирующего TAT, и для генетического анализа лиц с генетическими расстройствами. Нуклеотидные последовательности, представленные здесь, можно картировать на хромосоме и специфических областях хромосомы с помощью известных методик, например, гибридизации in situ, анализа связывания с известными хромосомными маркерами и гибридизационного скрининга библиотек.
Если кодирующие последовательности TAT кодируют белок, связывающийся с другим белком (например, если TAT является рецептором), TAT можно использовать в анализах для идентификации других белков или молекул, участвующих в связывающем взаимодействии. С помощью таких способов можно идентифицировать ингибиторы связывающего взаимодействия рецептор/лиганд. Белки, участвующие в таком связывающем взаимодействии, также можно использовать для скрининга пептидов или низкомолекулярных соединений - ингибиторов или агонистов связывающего взаимодействия. Кроме того, TAT-рецептор можно использовать для выделения соответствующего(их) лиганда(ов). Можно разработать анализы для скрининга с целью поиска соединений, имитирующих биологическую активность нативного TAT или рецептора для TAT. Такие анализы для скрининга включают анализы, совместимые с высокопроизводительным скринингом химических библиотек, что делает их особенно подходящими для идентификации низкомолекулярных соединений - кандидатов в лекарства. Рассматриваемые низкомолекулярные соединения включают синтетические органические или неорганические соединения. Указанный анализ можно выполнить в различных форматах, включая анализ белок-белкового связывания, анализы биохимического скрининга, иммуноанализ и анализ на основе клеток, которые подробно описаны в данной области техники.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие TAT или его модифицированные формы, также можно использовать для получения трансгенных животных или животных с "нокаутом", которых, в свою очередь, можно использовать для разработки и скрининга терапевтических реагентов. Трансгенное животное (например, мышь или крыса) представляет собой животное, клетки которого содержат трансген, который внедрен в указанное животное или предка указанного животного до рождения, например, на стадии эмбриона. Трансген представляет собой ДНК, встроенную в геном клетки, из которой развивается трансгенное животное. В одном из вариантов воплощения кДНК, кодирующую TAT, можно использовать для клонирования геномной ДНК, кодирующей TAT в соответствии с установленными методиками и геномными последовательностями, используемыми для получения трансгенных животных, содержащих клетки, экспрессирующие ДНК, кодирующую TAT. Способы получения трансгенных животных, в частности, таких животных, как мыши или крысы, стало общепринятой процедурой в данной области техники и описано, например, в патентах США №№ 4736866 и 4870009. Обычно определенную клетку подвергают адресному воздействию для внедрения TAT-трансгена с помощью тканеспецифичных энхансеров. Трансгенных животных, включающих копию трансгена, кодирующего TAT, внедренную в клетку зародышевой линии животного на эмбриональной стадии, можно использовать для проверки действия повышенной экспрессии ДНК, кодирующей TAT. Таких животных можно использовать в качестве животных для испытания реагентов, предположительно придающих протекторное действие от, например, патологических состояний, связанных с его сверхэкспрессией. В соответствии с аспектом настоящего изобретения животное лечат указанным реагентом, и снижение частоты возникновения патологического состояния по сравнению с необработанными животными, несущими трансген, указывает на потенциальное терапевтическое вмешательство в патологическое состояние.
В качестве альтернативы можно использовать гомологи TAT нечеловеческого происхождения для конструирования животного с "нокаутом" TAT, у которого ген, кодирующий TAT, несет дефект или модификацию в результате гомологичной рекомбинации между эндогенным геном, кодирующим TAT, и модифицированной геномной ДНК, кодирующей TAT, внедренной в эмбриональную стволовую клетку животного. Например, кДНК, кодирующую TAT, можно использовать для клонирования геномной ДНК, кодирующей TAT, в соответствии с установленными методиками. Фрагмент геномной ДНК, кодирующий TAT, можно делетировать или заменить другим геном, например, геном, кодирующим селектируемый маркер, который можно использовать для отслеживания внедрения. Обычно в вектор включают несколько тысяч п.о. немодифицированной фланкирующей ДНК (как с 5'-, так и с 3'-конца) [см., например, описание гомологичных рекомбинантных векторов в Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)]. Вектор внедряют в клетку эмбриональной стволовой линии (например, с помощью электропорации) и отбирают клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация внедренной ДНК и эндогенной ДНК [см., например, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Затем отобранные клетки вводят в бластоцисту животного (например, мыши или крысы), формируя агрегированную химеру [см., например, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Затем химерный эмбрион можно имплантировать в подходящую псевдобеременную самку животного, где из эмбриона развивается животное с "нокаутом". Потомство, зародышевые клетки которого содержат гомологично рекомбинированную ДНК, можно идентифицировать с помощью стандартных методик и использовать для выведения животных, все клетки которых содержат гомологично рекомбинированную ДНК. Животных с нокаутом можно характеризовать, например, по их устойчивости к некоторым патологическим состояниям и по развитию у них патологического состояния, вызванного отсутствием TAT-полипептида.
Нуклеиновую кислоту, кодирующую TAT-полипептид, также можно использовать в генной терапии. При применении для генной терапии гены внедряют в клетки, добиваясь синтеза терапевтически эффективного генетического продукта in vivo, например, с целью замены дефектного гена. "Генная терапия" включает как общепринятую генную терапию, при которой после однократного лечения достигается длительный эффект, так и введение генотерапевтических агентов, включающее однократное или повторное введения терапевтически эффективных ДНК или мРНК. Антисмысловые РНК и ДНК можно использовать в качестве терапевтических агентов для блокирования экспрессии некоторых генов in vivo. Показано, что короткие антисмысловые олигонуклеотиды можно импортировать в клетки, где они действуют как ингибиторы, несмотря на их низкую внутриклеточную концентрацию, вызванную ограниченным поглощением их клеточной мембраной. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Олигонуклеотиды можно модифицировать, усиливая их поглощение, например, путем замены их отрицательно заряженных фосфодиэфирных групп незаряженными группами.
Существуют различные методики внедрения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Эти методики изменяются в зависимости от того, переносят ли нуклеиновую кислоту в культуру клеток in vitro или в клетки предполагаемого хозяина in vivo. Методики, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro включают использование липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, использование ДЭАЭ-декстрана, способ кальций-фосфатной преципитации и т.д. Предпочтительные в настоящее время методики переноса генов включают трансфекцию вирусными (обычно ретровирусными) векторами и трансфекцию, опосредованную липосомами и белком вирусной оболочки (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). В некоторых ситуациях желательно снабдить источник нуклеиновой кислоты агентом, адресно воздействующим на клетку-мишень, например, антителом, специфическим к мембранному белку поверхности клетки, лигандом для рецептора клетки-мишени и т.д. При использовании липосом для адресного воздействия и/или облегчения поглощения можно использовать мембранный белок поверхности клетки, ассоциированный с эндоцитозом, например, белки капсида или их фрагменты, тропные к клеткам определенного типа, антитела к белкам, подвергаемым интернализации в ходе цикла, белки, адресно воздействующие на внутриклеточную локализацию и увеличивающие период полужизни внутри клетки. Методики рецептор-опосредованного эндоцитоза описаны, например, в работах Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Обзор протоколов маркировки генов и генной терапии см. в работе Anderson et al., Science 256:808-813 (1992).
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие TAT-полипептиды и их фрагменты, описанные здесь, можно использовать для идентификации хромосом. В этой связи, существует постоянная потребность в идентификации новых хромосомных маркеров, поскольку в настоящее время доступно относительно небольшое количество реагентов для маркирования хромосом на основе фактических данных об их последовательности. Каждую молекулу TAT-нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно использовать в качестве хромосомного маркера.
Молекулы TAT-полипептидов и нуклеиновых кислот по настоящему изобретению также можно использовать в диагностических целях для типирования тканей, поскольку TAT-полипептиды по настоящему изобретению могут по-разному экспрессироваться в одной ткани по сравнению с другой, предпочтительно в больной ткани по сравнению со здоровой тканью того же типа. Молекулы TAT-нуклеиновых кислот найдут применение при получении зондов для ПЦР, нозерн-анализа, саузерн-анализа и вестерн-анализа.
Настоящее изобретение охватывает способы скрининга соединений с целью идентификации соединений, имитирующих действие TAT-полипептида (агонистов) или предотвращающих действие TAT-полипептида (антагонистов). Анализ скрининга кандидатов в лекарства-антагонисты разработан с целью идентификации соединений, связывающихся или образующих комплекс с TAT-полипептидами, кодируемыми генами, идентифицированными здесь, или иным образом вмешивающихся во взаимодействие кодируемых полипептидов с другими белками клетки, включая, например, ингибирование экспрессии TAT-полипептида клетками. Такие анализы для скрининга включают анализы, совместимые с высокопроизводительным скринингом химических библиотек, что делает их особенно подходящими для идентификации низкомолекулярных соединений - кандидатов в лекарства.
Указанные анализы можно выполнить в различных форматах, включая анализ белок-белкового связывания, анализы биохимического скрининга, иммуноанализ и анализ на основе клеток, которые подробно описаны в данной области техники.
Общей чертой всех анализов для поиска антагонистов является то, что они предусматривают контакт кандидата в лекарство с TAT-полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой, идентифицированной здесь, в условиях и в течение времени, достаточных для взаимодействия этих двух компонентов.
При анализе связывания взаимодействие представляет собой связывание, и образующийся комплекс можно выделить или обнаружить в реакционной смеси. В конкретном варианте воплощения TAT-полипептид, кодируемый геном, идентифицированным здесь, или кандидат в лекарство иммобилизуют на твердой фазе, например, на титрационном микропланшете путем ковалентного или нековалентного присоединения. Нековалентное присоединение в общем случае выполняют путем покрытия твердой поверхности раствором TAT-полипептида и высушивания. В качестве альтернативы для прикрепления иммобилизуемого TAT-полипептида к твердой поверхности можно использовать иммобилизованное антитело, например, моноклональное антитело, специфическое к TAT-полипептиду. Анализ выполняют путем внесения неиммобилизованных компонентов, которые могут быть мечены обнаруживаемой меткой, к иммобилизованному компоненту, например, покрытой поверхности, содержащей прикрепленный компонент. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляют, например, путем отмывки, и обнаруживают комплексы, прикрепленные к твердой поверхности. Если исходно неиммобилизованный компонент несет обнаруживаемую метку, обнаружение метки, иммобилизованной на поверхности, указывает на образование комплекса. Если исходно неиммобилизованный компонент не несет метки, комплексообразование можно обнаружить, например, за счет использования меченого антитела, специфически связывающего иммобилизованный комплекс.
Если соединение-кандидат взаимодействует с определенным TAT-полипептидом, кодируемым геном, идентифицированным здесь, но не связывается с ним, его взаимодействие с этим полипептидом можно анализировать с помощью известных способов обнаружения белок-белковых взаимодействий. Такие анализы включают традиционные подходы, например, перекрестное связывание, совместную иммунопреципитацию и совместную очистку в градиенте или на хроматографических колонках. Кроме того, белок-белковые взаимодействия можно отслеживать, используя генетические системы на основе дрожжей, описанные Fields и соавторами (Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)), как описано в работе Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Многие активаторы транскрипции, например, GAL4 дрожжей, состоят из двух физически разделенных модульных доменов, один из которых действует как ДНК-связывающий домен, а другой функционирует как домен активации транскрипции. Это свойство является преимуществом дрожжевых систем экспрессии, описанных в вышеупомянутых публикациях (обычно называемых "двухгибридными системами"), которые используют два гибридных белка, в одном из которых белок-мишень объединен с ДНК-связывающим доменом GAL4, а в другом активирующие белки-кандидаты объединены с доменом активации. Экспрессия репортерного гена GAL1-lacZ под контролем GAL4-активированного промотора зависит от восстановления активности GAL4 за счет белок-белкового взаимодействия. Колонии, содержащие взаимодействующие полипептиды, обнаруживают с помощью хромогенного субстрата β-галактозидазы. Полный набор (MATCHMAKERTM) для идентификации белок-белковых взаимодействий между двумя определенными белками с помощью двухгибридной методики доступен для приобретения у Clontech. Применение этой системы можно расширить на картирование белковых доменов, участвующих в специфических взаимодействиях белков, а также на точное определение аминокислотных остатков, критичных для указанных взаимодействий.
Соединения, которые создают помехи взаимодействию гена, кодирующего TAT-полипептид, идентифицированного здесь, и других внутри- или внеклеточных компонентов, можно тестировать следующим образом: обычно изготавливают реакционную смесь, содержащую продукт указанного гена и внутри- или внеклеточные компоненты, в условиях и в течение периода времени, дающих возможность взаимодействия и связывания этих двух продуктов. Для тестирования способности соединения-кандидата ингибировать связывание, реакцию проводят при отсутствии и в присутствии тестируемого соединения. Кроме того, в третью реакционную смесь можно внести плацебо в качестве положительного контроля. Связывание (комплексообразование) тестируемого соединения и внутри- или внеклеточного компонента, присутствующих в смеси, отслеживают, как описано выше. Образование комплекса в контрольной(ых) реакции(ях), но не в реакционной смеси, содержащей тестируемое соединение, указывает на то, что тестируемое соединение вносит помехи во взаимодействие тестируемого соединения и его партнера по реакции.
Для анализа антагонистов TAT-полипептид можно добавлять к клетке вместе с соединением, подвергаемым скринингу на определенную активность, и способность указанного соединения ингибировать интересующую исследователя активность в присутствии TAT-полипептида указывает на то, что указанное соединение является антагонистом TAT-полипептида. В качестве альтернативы, антагонисты можно обнаружить путем объединения TAT-полипептида и потенциального антагониста с мембраносвязанными рецепторами TAT-полипептида или рекомбинантными рецепторами при условиях, соответствующих выполнению анализа конкурентного связывания. TAT-полипептид можно метить, например, радиоактивной меткой, так что количество молекул TAT-полипептида, связавшихся с рецептором, можно использовать для определения эффективности потенциального антагониста. Ген, кодирующий рецептор, можно идентифицировать с помощью многочисленных способов, известных специалистам, например, пэннинга лигандов и FACS-сортировки. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991). Предпочтительно, используют экспрессионное клонирование, при котором полиаденилированную РНК получают из клеток, реагирующих на TAT-полипептид, а библиотеку кДНК, созданную из этой РНК, разделяют на пулы и используют для трансфекции COS-клеток или других клеток, не реагирующих на TAT-полипептид. Трансфицированные клетки, выросшие на предметных стеклах, подвергают воздействию меченого TAT-полипептида. TAT-полипептид можно метить различными способами, включая иодирование или встраивание сайта распознавания сайт-специфической протеинкиназы. После фиксации и инкубирования стекла подвергают авторадиографическому анализу. Идентифицируют положительные пулы, получают субпулы и повторно трансфицируют их с помощью способа интерактивного формирования субпулов и повторного скрининга, в конечном итоге получая единственный клон, кодирующий предполагаемый рецептор.
В качестве альтернативного подхода к идентификации рецептора меченый TAT-полипептид можно фотоаффинно связать с мембраной клетки или экстрагировать препараты, экспрессирующие молекулу рецептора. Перекрестно связанный материал разделяют с помощью электрофореза в ПААГ и экспонируют на рентгеновскую пленку. Меченый комплекс, содержащий рецептор, можно вырезать, разделить на пептидные фрагменты и подвергнуть микросеквенированию белков. Аминокислотную последовательность, полученную в результате микросеквенирования, следует использовать для конструирования набора вырожденных олигонуклеотидных зондов для скрининга библиотеки кДНК и идентификации гена, кодирующего предполагаемый рецептор.
В ходе еще одного анализа антагонистов клетки млекопитающих или препараты мембран, экспрессирующие рецептор, следует инкубировать с меченым TAT-полипептидом в присутствии соединения-кандидата. Затем можно измерить способность соединения усиливать или блокировать указанное взаимодействие.
Более конкретные примеры потенциальных антагонистов включают олигонуклеотид, связывающийся с гибридными белками иммуноглобулина и TAT-полипептида, и в частности, антитела, включающие без ограничения поли- и моноклональные антитела и фрагменты антител, одноцепочечные антитела, антиидиотипические антитела и химерные или гуманизированные версии таких антител или фрагментов, а также антитела и фрагменты антител человека. В качестве альтернативы, потенциальный антагонист может представлять собой близкородственный белок, например, мутированную форму TAT-полипептида, распознающую рецептор, но не оказывающую действия на него, тем самым конкурентно ингибируя действие TAT-полипептида.
Еще один потенциальный антагонист TAT-полипептида представляет собой антисмысловой РНК- или ДНК-конструкт, изготовленный по антисмысловой технологии, где, например, антисмысловая молекула РНК или ДНК напрямую блокирует трансляцию мРНК за счет гибридизации с мРНК-мишенью и предотвращения трансляции белка. Антисмысловую технологию можно использовать для управления экспрессией генов за счет формирования тройной спирали или антисмысловых ДНК или РНК, причем эти оба способа основаны на связывании полинуклеотида с ДНК или РНК. Например, 5'-кодирующий фрагмент полинуклеотидной последовательности, кодирующий согласно настоящему описанию зрелый TAT-полипептид, используют для конструирования антисмыслового РНК-олигонуклеотида длиной от приблизительно 10 до 40 пар оснований. ДНК-олигонуклеотид конструируют так, что он является комплементарным области гена, участвующей в транскрипции (тройная спираль - см. Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), тем самым предотвращая транскрипцию и продукцию TAT-полипептида. Антисмысловой РНК-олигонуклеотид гибридизуется с мРНК in vivo и блокирует трансляцию молекулы мРНК в TAT-полипептид (антисмысловая технология - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Вышеописанные олигонуклеотиды также можно доставлять в клетку таким образом, что антисмысловая РНК или ДНК может экспрессироваться in vivo, ингибируя продукцию TAT-полипептида. При использовании антисмысловой ДНК предпочтительны олигонуклеотиды - производные сайта инициации трансляции, например, между положениями приблизительно -10 и +10 нуклеотидной последовательности гена-мишени.
Потенциальные антагонисты включают низкомолекулярные соединения, связывающиеся с активным сайтом, сайтом связывания рецептора или ростовым фактором или другим соответствующим сайтом связывания TAT-полипептида, тем самым блокируя нормальную биологическую активность TAT-полипептида. Примеры низкомолекулярных соединений включают небольшие пептиды или пептидоподобные молекулы, предпочтительно растворимые пептиды, и синтетические непептидные органические или неорганические соединения, но не ограничиваются ими.
Рибозимы представляют собой ферментативные молекулы РНК, способные катализировать специфическое расщепление РНК. Рибозимы действуют за счет специфической к последовательности гибридизации с комплементарной РНК-мишенью с последующим эндонуклеолитическим расщеплением. Специфические сайты расщепления рибозимами в пределах потенциальной РНК-мишени можно идентифицировать с помощью известных методик. Подробности см., например, в Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), и публикации PCT № WO 97/33551 (опубликованной 18 сентября 1997 г.).
Молекулы нуклеиновых кислот для формирования тройной спирали, используемой для ингибирования транскрипции, должны быть одноцепочечными и состоять из дезоксинуклеотидов. Разработана базовая композиция указанных олигонуклеотидов, стимулирующая образование тройной спирали по правилам хугстиновского образования пар, что в общем случае требует наличия фрагментов из пуринов или пиримидинов подходящего размера на одной из цепей двуцепочечной структуры. Подробности см., например, в публикации PCT № WO 97/33551, supra.
Эти низкомолекулярные соединения можно идентифицировать с помощью одного или более анализа скрининга, обсуждавшихся выше, и/или любой другой методики скрининга, известной специалистам в данной области. Выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую TAT-полипептид, можно использовать по настоящему изобретению для рекомбинантной продукции TAT-полипептида с помощью известных в данной области техники методик и как описано выше. В свою очередь, продуцированный TAT-полипептид можно использовать для получения антител против TAT с помощью известных в данной области техники методик и как описано выше.
Антитела, специфически связывающие TAT-полипептид, идентифицированные здесь, а также другие молекулы, идентифицированные с помощью анализов скрининга, описанных выше, можно вводить пациенту для лечения различных расстройств, включая рак, в виде фармацевтических композиций.
Если TAT-полипептид является внутриклеточным, а целые антитела используют в качестве ингибиторов, предпочтительными являются интернализируемые антитела. В то же время для доставки антитела или фрагмента антитела в клетки можно также использовать липофекцию или липосомы. Если используются фрагменты антител, предпочтительным является наименьший ингибиторный фрагмент, специфически связывающийся со связывающим доменом белка-мишени. Например, на основе последовательностей вариабельной области антитела можно сконструировать пептидные молекулы, сохраняющие способность связываться с последовательностью белка-мишени. Такие пептиды можно синтезировать химически и/или продуцировать с помощью технологии рекомбинантных ДНК. См., например, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).
Состав, описанный здесь, также может содержать более одного активного соединения, если это необходимо для лечения конкретных показаний, предпочтительно, соединения с взаимодополняющими активностями, не оказывающие нежелательного действия друг на друга. В качестве альтернативы или дополнения композиция может включать агент, усиливающий ее функции, например, цитотоксический агент, цитокин, химиотерапевтический агент или агент, подавляющий рост. Такие молекулы присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для поставленной цели.
Следующие примеры предназначены лишь для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения рамок изобретения каким-либо образом.
Все патенты и литературные ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок.
ПРИМЕРЫ
Доступные для приобретения реагенты, упоминающиеся в примерах, использовали согласно инструкциям изготовителя, если не указано иное. Источником указанных клеток, идентифицируемых в следующих примерах и на всем протяжении настоящего патентного описания по номеру доступа в АТСС, является Американская коллекция типовых культур, Манассас, штат Виргиния, США.
ПРИМЕР 1: Анализ профиля экспрессии тканей с помощью GeneExpress
Частную базу данных, содержащую информацию об экспрессии генов (GeneExpress, Gene Logic Inc., Гейтерсберг, штат Мэриленд, США) анализировали в ходе попытки идентификации полипептидов (и кодирующих их нуклеиновых кислот), экспрессия которых в значительной степени и на обнаруживаемом уровне активируется в определенной(ых) ткани(ях) опухоли(ей) человека, интересующих исследователя, по сравнению с другой(ими) опухолью(ями) человека и/или нормальными тканями человека. Конкретнее, выполняли анализ базы данных GeneExpress, используя программное обеспечение, доступное у Gene Logic Inc., Гейтерсберг, штат Мэриленд, США и предназначенное для использования с базой данных GeneExpress, или патентованное программное обеспечение, написанное и разработанное Genentech, Inc. для использования с базой данных GeneExpress. Оценку положительных результатов анализа выполняли на основе нескольких критериев, включающих, например, тканеспецифичность, специфичность к опухоли и уровень экспрессии в нормальных основных и/или нормальных пролиферирующих тканях. С помощью этого анализа экспрессии мРНК определили, что мРНК, кодирующая полипептид TAT425, значимо, воспроизводимо и обнаружимо сверхэкспрессируется в опухолях предстательной железы и почек человека по сравнению с соответствующими нормальными тканями предстательной железы и почек человека, соответственно.
ПРИМЕР 2: Количественный анализ экспрессии мРНК TAT
В этом анализе для поиска генов, значимо сверхэкспрессирующихся в раковых опухолях или опухолях по сравнению с другими раковыми опухолями или нормальными нераковыми тканями, использовали анализ 5'-нуклеаз (например, TaqMan) и количественную ПЦР в реальном времени (например, систему обнаружения последовательностей ABI Prizm 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Фостер-Сити, штат Калифорния, США)). Аналитическая 5'-нуклеазная реакция представляет собой методику на основе флуоресцентной ПЦР, использующую 5'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы Taq для отслеживания экспрессии генов в реальном времени. Для получения ампликона, типичного для ПЦР, использовали два олигонуклеотидных праймера (последовательности которых основаны на гене или последовательности EST, интересующей пользователя). Третий олигонуклеотид или зонд конструировали с целью обнаружения нуклеотидной последовательности, расположенной между двумя ПЦР-праймерами. Этот зонд не удлинялся ДНК-полимеразой Taq и был мечен репортерным флуоресцентным красителем и красителем, гасящим флуоресценцию. Индуцированное лазером излучение репортерного красителя гасилось гасящим красителем, если эти два красителя располагались вблизи друг от друга, как на зонде. Во время ПЦР-амплификации ДНК-полимераза Taq расщепляла зонд зависимым от матрицы образом. Полученные фрагменты зонда диссоциировали в раствор, и сигнал высвободившегося репортерного красителя освобождался от гасящего действия второго флуорофора. На каждую вновь синтезированную молекулу высвобождалась одна молекула репортерного красителя, и обнаружение непогашенного репортерного красителя составляло основу количественной интерпретации данных.
5'-нуклеазную процедуру выполняли на устройстве для количественной ПЦР в реальном времени, например, ABI Prism 7700TM Sequence Detection. Система состояла из термоциклера, лазера, прибора с зарядовой связью (ПЗС-камеры) и компьютера. Система амплифицировала образцы в 96-луночном формате на термоциклере. Во время амплификации индуцированный лазером флуоресцентный сигнал собирали в реальном времени с помощью оптоволоконных кабелей со всех 96 лунок и обнаруживали с помощью ПЗС. Система включала программное обеспечение для запуска инструмента и анализа данных.
Исходным материалом для скрининга являлась мРНК, выделенная из различных раковых тканей. Выполняли точную количественную оценку мРНК, например, флуорометрически. В качестве отрицательного контроля выделяли РНК из различных нормальных тканей того же типа, что и тестируемые раковые ткани.
Данные 5'-нуклеазного анализа исходно выражали как Ct, или пороговый цикл. Этот показатель определяли как цикл, во время которого происходило накопление сигнала репортера выше фонового уровня флуоресценции. Значения ΔCt использовали в качестве количественного показателя относительного исходного количества копий определенной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты при сравнении результатов раковой мРНК с результатами нормальной мРНК человека. Поскольку одна единица Ct соответствует 1 циклу ПЦР или приблизительно 2-кратному относительному увеличению по сравнению с нормальным уровнем, две единицы соответствуют 4-кратному относительному увеличению, 3 единицы соответствуют 8-кратному относительному увеличению и так далее, можно количественно измерить кратность относительного увеличения экспрессии мРНК между двумя или более различными образцами. С помощью этой методики идентифицировали, что молекула TAT425 значимо сверхэкспрессируется (т.е. по меньшей мере 2-кратно) в опухолях предстательной железы человека по сравнению с нормальной нераковой тканью предстательной железы человека и, таким образом, представляет хорошую полипептидную мишень для диагностики и терапии рака предстательной железы у млекопитающих.
ПРИМЕР 3: Гибридизация in situ
Гибридизация in situ представляет собой мощную и гибкую методику для обнаружения и локализации последовательностей нуклеиновых кислот внутри клеток или тканевых препаратов. Ее можно использовать, например, для идентификации сайтов экспрессии генов, анализа распределения транскрипции в тканях, идентификации и локализации вирусной инфекции, отслеживания изменений синтеза определенной мРНК и картирования хромосом.
32
32
Гибридизацию in situ выполняли согласно оптимизированной версии протокола Lu and Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), используя полученные с помощью ПЦР P-меченные рибозонды. Вкратце, делали срезы фиксированных формалином и залитых в парафин тканей человека, очищали их от парафина, освобождали от белков в растворе протеиназы K (20 г/мл) в течение 15 минут при 37°C и обрабатывали для гибридизации in situ, как описано Lu and Gillett, supra. P-UTP-меченные антисмысловые рибозонды получали из ПЦР-продукта и гибридизовали при 55°C в течение ночи. Слайды погружали в эмульсию для ядерных треков Kodak NTB2 и экспонировали в течение 4 недель.
32
Синтез P-рибозонда
32
32
2
2
6,0 мкл (125 мКи) P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ки/ммоль) подвергали быстрой вакуумной сушке. В каждую пробирку, содержавшую высушенный P-UTP, наносили следующие ингредиенты: 2,0 мкл 5x буфера для транскрипции, 1,0 мкл DTT (100 мМ), 2,0 мкл смеси NTP (2,5 мМ: 10 мк; по 10 мМ GTP, CTP & ATP + 10 мкл HO), 1,0 мкл UTP (50 мкМ), 1,0 мкл Rnasin, 1,0 мкл матрицы ДНК (1 мкг), 1,0 мкл HO, 1,0 мкл РНК-полимеразы (для продуктов ПЦР обычно T3=AS, T7=S).
Пробирки инкубировали при 37°C в течение 1 ч. Вносили 1,0 мкл ДНКазы RQ1, после чего инкубировали при 37°C в течение 15 минут. Вносили 90 мкл TE (10 мМ Трис pH 7,6/1 мМ ЭДТА pH 8,0) и переносили смесь пипеткой на бумагу DE81. Оставшийся раствор загружали в систему ультрафильтрации Microcon-50 и центрифугировали согласно программе 10 (6 минут). Систему фильтрации переворачивали над второй пробиркой и центрифугировали согласно программе 2 (3 минуты). После конечного центрифугирования вносили 100 мкл TE. 1 мкл конечного продукта переносили пипеткой на бумагу DE81 и подсчитывали в 6 мл Biofluor II.
Зонд разгоняли в геле TBE/мочевина. 1-3 мкл зонда или 5 мкл РНК Mrk III вносили в 3 мкл загрузочного буфера. После нагревания на 95°C термоблоке в течение трех минут зонд немедленно помещали на лед. Лунки геля промывали, загружали образец и разгоняли при 180-250 вольтах в течение 45 минут. Гель заворачивали в саран и экспонировали на пленку XAR с усиливающим экраном в холодильнике при -70°C от одного часа до ночи.
32
P-гибридизация
A. Предобработка замороженных срезов
Слайды удаляли из холодильника, помещали в алюминиевые лотки и размораживали при комнатной температуре в течение 5 минут. Лотки помещали в 55°C инкубатор на пять минут для снижения конденсации. Слайды фиксировали в течение 10 минут в 4% параформальдегиде на льду в вытяжном шкафу и промывали в 0,5 x SSC в течение 5 минут при комнатной температуре (25 мл 20 x SSC + 975 мл SQ H2O). После удаления белков в 0,5 мкг/мл растворе протеиназы K в течение 10 минут при 37°C (12,5 мкл 10 мг/мл рабочего раствора в 250 мл предварительно нагретого буфера с РНКазой, не содержащего РНК) срезы промывали в 0,5 x SSC в течение 10 минут при комнатной температуре. Срезы обезвоживали в 70%, 95%, 100% этаноле по 2 минуты.
B. Предобработка срезов, залитых в парафин
Слайды очищали от парафина, помещали в SQ H2O и дважды промывали в 2 x SSC при комнатной температуре по 5 минут. Срезы освобождали от белков в 20 мкг/мл растворе протеиназы K (500 мкл 10 мг/мл в 250 мл буфера с РНКазой, не содержащего РНК; 37°C, 15 минут) - эмбрион человека, или 8 x растворе протеиназы K (100 мкл в 250 мл буфера с РНКазой, 37°C, 30 минут) - ткани с формалином. Затем выполняли промывку в 0,5 x SSC и обезвоживание, как описано выше.
C. Подготовка к гибридизации
Слайды укладывали в пластмассовую коробку, заполненную фильтровальной бумагой, насыщенной буфером Box (4 x SSC, 50% формамида).
D. Гибридизация
32
Зонд в количестве 1,0×106 имп/мин и 1,0 мкл тРНК (50 мг/мл рабочий раствор) на слайд нагревали при 95°C в течение 3 минут. Слайды охлаждали на льду и вносили 48 мкл буфера для гибридизации на слайд. После встряхивания вносили 50 мкл P смеси к 50 мкл предгибридизационной смеси на слайд. Слайды инкубировали в течение ночи при 55°C.
E. Промывка
Промывку выполняли 2×10 минут в 2xSSC, ЭДТА при комнатной температуре (400 мл 20 x SSC + 16 мл 0,25 M ЭДТА, Vf=4 л), с последующей обработкой РНКазой А при 37°C в течение 30 минут (500 мкл 10 мг/мл в 250 мл буфера с РНКазой = 20 мкг/мл). Слайды промывали 2×10 минут в 2 x SSC, ЭДТА при комнатной температуре. Жесткие условия промывки представляли собой: 2 часа при 55°C, 0,1 x SSC, ЭДТА (20 мл 20 x SSC + 16 мл ЭДТА, Vf=4 л).
F. Олигонуклеотиды
Анализ in situ выполняли с использованием различных последовательностей ДНК, описанных здесь. Олигонуклеотиды, использованные для этих анализов, получали таким образом, что они являлись комплементарными нуклеиновым кислотам (или комплементарным им цепям), как показано на прилагаемых фигурах.
G. Результаты
По отношению к TAT425 наблюдали экспрессию в нормальном эпителии предстательной железы от слабой до умеренной, причем ни одна из других протестированных нормальных тканей не была положительна в отношении его экспрессии. В противоположность этому, 46 из 64 первичных раковых опухолей предстательной железы были положительны в отношении экспрессии, и 6 из 14 метастатических раковых опухолей предстательной железы были положительны в отношении экспрессии.
ПРИМЕР 4: Проверка и анализ дифференциальной экспрессии TAT-полипептида с помощью GEPIS
TAT-полипептиды, которые можно идентифицировать как опухолевые антигены, как описано в одном или более вышеприведенных Примеров, анализировали и проверяли следующим образом. Выполняли поиск по базе данных маркерных экспрессируемых последовательностей (EST) ДНК (LIFESEQ, Incyte Pharmaceuticals, Пало-Альто, штат Калифорния, США), и интересующие EST-последовательности идентифицировали с помощью GEPIS. Определение профиля экспрессии генов in silico (GEPIS) представляет собой биоинформатический инструмент, разработанный в Genentech, Inc., характеризующий интересующие гены по отношению к новым мишеням для терапии рака. Преимущество GEPIS состоит в большом количестве EST-последовательностей и информации в библиотеке для определения профилей экспрессии генов. GEPIS способен определить профиль экспрессии гена на основе его пропорциональной корреляции с его встречаемостью в базах данных EST, и действует за счет жесткой и статистически значимой интеграции реляционной базы данных LIFESEQ EST и патентованной информации. В этом примере GEPIS использовали для идентификации и перекрестной проверки новых опухолевых антигенов, хотя GEPIS можно настроить как для выполнения очень специфических анализов, так и задач широкого скрининга. При начальном скрининге GEPIS использовали для идентификации EST-последовательностей из базы данных LIFESEQ, коррелировавших с экспрессией в определенной интересующей исследователя ткани или тканях (часто опухолевой ткани, интересующей исследователя). EST-последовательности, идентифицированные при этом начальном скрининге (или консенсусные последовательности, полученные при выравнивании множественных родственных и перекрывающихся EST-последовательностей, полученных при начальном скрининге) подвергали скринингу с целью идентификации присутствия по меньшей мере одного трансмембранного домена в кодируемом белке. Наконец, GEPIS использовали для получения полного профиля экспрессии различных интересующих исследователя последовательностей в ткани. С помощью этого типа биоинформатического скрининга идентифицировали, что различные TAT-полипептиды (и кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот) значимо сверхэкспрессируются в определенном типе или типах раковых опухолей по сравнению с другими раковыми опухолями и/или нормальными нераковыми тканями. Оценку результатов GEPIS выполняли на основе нескольких критериев, включающих, например, тканеспецифичность, специфичность к опухоли и уровень экспрессии в нормальных основных и/или нормальных пролиферирующих тканях. С помощью этого анализа подтвердили, что TAT425, как определено с помощью GEPIS, характеризуется высоким уровнем экспрессии и значительной стимуляцией экспрессии в определенных опухолях (например, предстательной железы, почек и поджелудочной железы) по сравнению с соответствующими нормальными тканями. По этой причине полипептид TAT425 представляет собой хорошую полипептидную мишень для диагностики и терапии рака у млекопитающих.
ПРИМЕР 5: Получение антител, связывающихся с полипептидами TAT425
Этот пример иллюстрирует получение моноклональных антител, способных специфически связывать TAT425.
Методики получения моноклональных антител известны в данной области и описаны, например, в работе Goding, supra. Иммуногены, которые можно использовать, включают очищенный TAT, гибридные белки, содержащие TAT, и клетки, экспрессирующие рекомбинантный TAT на поверхности клеток. Специалист может осуществить выбор иммуногена, не выполняя лишних экспериментов.
Мышей, например, Balb/c, иммунизировали TAT-иммуногеном, эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда и вводимым подкожно или внутрибрюшинно в количестве 1-100 микрограммов. В качестве альтернативы иммуноген эмульгировали в адъюванте MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Гамильтон, штат Монтана, США) и вводили в подушечку стопы животного. Иммунизированных мышей стимулировали спустя 10-12 суток дополнительным количеством иммуногена, эмульгированного в выбранном адъюванте. В течение нескольких следующих недель мышей также стимулировали дополнительными инъекциями иммуногена. У мышей периодически отбирали образцы сыворотки путем ретроорбитального отбора крови для проверки с помощью твердофазного ИФА с целью обнаружения антител против TAT.
После обнаружения подходящего титра антител животным, "положительным" в отношении антител, можно было сделать конечную внутривенную инъекцию TAT. Спустя интервал времени от трех до четырех суток мышей умерщвляли и собирали клетки селезенки. Затем клетки селезенки сливали (с помощью 35% полиэтиленгликоля) с клетками выбранной линии миеломы мышей, например, P3X63AgU.1, доступной в ATCC, No. CRL 1597. В результате слияния получали клетки гибридомы, которые затем высевали на 96-луночные планшеты для тканевых культур, содержавшие среду HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для ингибирования пролиферации негибридных клеток, гибридов миеломы и гибридов клеток селезенки.
Выполняли скрининг клеток гибридомы на реактивность против TAT с помощью твердофазного ИФА. Определение "положительных" клеток гибридомы, секретирующих желательные моноклональные антитела против TAT, находится в пределах возможностей специалистов в данной области.
Положительные клетки гибридомы можно внутрибрюшинно ввести мышам Balb/c для получения асцитной жидкости, содержащей моноклональные антитела против TAT. В качестве альтернативы, клетки гибридомы можно вырастить в колбах для тканевой культуры или в роллер-флаконах. Очистку моноклональных антител, продуцированных в асцитной жидкости, можно выполнить путем преципитации с сульфатом аммония с последующей гель-эксклюзионной хроматографией. В качестве альтернативы можно использовать аффинную хроматографию на основе связывания антитела с белком А или белком G.
При использовании еще одной методики мышей Balb/c (Charles River, Холлистер, штат Калифорния, США) или C57BL/6/TAT425.ko (Genentech, Южный Сан-Франциско, штат Калифорния, США) иммунизировали 50 мкг TAT425-кодирующей плазмидной ДНК с или без лиганда mFlt3 (ДНК) и mGM-CSF (ДНК) (Genentech), разбавленной раствором Рингера с лактатом путем гидродинамического введения в хвостовую вену (HTV), как описано ранее (Zhang et al., Hum. Gene Ther. 10:1735 (1999), Liu et al., Gene Ther. 6:1258 (1999), и Herweijer and Wolff, Gene Ther. 10:453 (2003)). Селезенку собирали спустя трое суток после последней HTV-иммунизации. Спленоциты всех мышей, сыворотка которых демонстрировала сильное связывание с клетками 293, сверхэкспрессирующими TAT425 при FACS-анализе, сливали с клетками миеломы мышей X63-Ag8.653 (Американская коллекция типовых культур, Роквилл, штат Мэриленд, США) путем электрослияния (Cytopulse или BTX) и инкубировали при 37°C, 7% CO2 в течение ночи в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM) с добавками 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 4,5 г/л глюкозы, 25 мМ HEPES, 0,15 мг/мл щавелевоуксусной кислоты, 100 мкг/мл пировиноградной кислоты, 0,2 Ед/мл инсулина, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Penicillin-Streptomycin, Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США), NCTC-109 (Lonza), NEAA (Invitrogen), после чего высевали на 96-луночные планшеты с добавками 5,7 мкМ азасерина и 100 мкМ гипоксантина (HA, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США). Скрининг надосадочной жидкости на продукцию IgG выполняли с помощью твердофазного ИФА и FACS через 11 суток после слияния. Гибридомы, секретировавшие IgG, демонстрировавшие сильное специфическое связывание TAT425 при FACS-анализе, размножали и субклонировали согласно методике серийных разведений. Конечные клоны, демонстрировавшие наибольшее связывание при FACS-анализе после второго цикла субклонирования, размножали для крупномасштабной продукции в биореакторах (Integra Biosciences, Кур, Швейцария). Затем очищали надосадочную жидкость с помощью аффинной хроматографии с белком A, как описано ранее (Hongo et al., Hybridoma 19:303 (2000)).
С помощью вышеописанной методики получили различные моноклональные антитела, связывающиеся с нативным полипептидом TAT425. С помощью хорошо известных и используемых в рабочем порядке методик, например, вестерн-блоттинга, твердофазного ИФА, FACS-анализа сортировки клеток, экспрессирующих полипептид TAT425 и/или иммуногистохимического анализа показано, что эти моноклональные антитела связывались с полипептидом TAT425, экспрессированным на поверхности различных клеток (включая клетки 293, сконструированные для экспрессии белка TAT425, клетки LuCAP 77, клетки LuCAP 105, клетки LuCAP 141 и клетки LnCAP-shTAT425). Аминокислотные последовательности, ассоциированные с этими антителами против TAT425, показаны на Фигурах 3-10. Эти антитела найдут применение при диагностике и лечении рака человека, ассоциированного с экспрессией TAT425.
ПРИМЕР 6: Иммуногистохимический анализ
Антитела против TAT425 получили, как описано выше, и выполнили иммуногистохимический анализ, используя приобретенные моноклональные антитела крысы M4I-80 против TAT425 следующим образом. Срезы тканей вначале фиксировали в течение 5 минут в ацетоне/этаноле (в замороженном или залитом парафином виде). Затем срезы промывали PBS и блокировали авидином и биотином (Vector kit) в течение 10 минут с промывкой PBS после каждого этапа. Затем срезы блокировали 10% сывороткой в течение 20 минут и промокали для удаления избытка. Затем на срезы наносили первичные антитела в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 часа и промывали срезы PBS. Затем на срезы наносили биотинилированные вторичные антитела (против первичных антител) на 30 минут и промывали срезы PBS. Затем срезы подвергали воздействию реагентов из набора Vector ABC kit в течение 30 минут и промывали PBS. Срезы подвергали воздействию диаминобензидина (Pierce) в течение 5 минут и затем промывали PBS. Затем срезы контрастировали гематоксилином Мейерса, накрывали покровным стеклом и визуализировали. Иммуногистохимический анализ также можно выполнить, как описано в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 и Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997).
Результаты этих анализов демонстрировали, что обнаруживаемую экспрессию полипептида TAT425 наблюдали в 27 из 29 независимых образцов первичных раковых опухолей предстательной железы человека (24 из которых показывали экспрессию TAT425 от умеренной до высокой) и в 26 из 29 образцов метастатических раковых опухолей предстательной железы (13 из которых показывали экспрессию TAT425 от умеренной до высокой).
ПРИМЕР 7: Анализ конкурентного связывания и картирование эпитопа
6
3
Эпитопы TAT425, с которыми связываются описанные моноклональные антитела, можно определить с помощью стандартного анализа конкурентного связывания (Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)). Исследования перекрестного блокирования антител можно выполнить путем прямой флуоресценции, используя клетки PC3, сконструированные для экспрессии TAT425, с помощью PANDEX™ Screen Machine для количественной оценки флуоресценции. Каждое моноклональное антитело конъюгировали с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) с помощью установленных процедур (Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel and Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Конфлуентные монослои клеток PC3, экспрессирующих TAT425, обрабатывали трипсином, однократно промывали и ресуспендировали при 1,75×10 клеток/мл в холодном PBS, содержащем 0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA) и 0,1% NaN. Для снижения засорения планшетных мембран PANDEX™ вносили латексные частицы (IDC, Портленд, штат Орегон, США) в конечной концентрации 1%. Клетки в суспензии, 20 мкл, и 20 мкл очищенных моноклональных антител (от 100 мкг/мл до 0,1 мкг/мл) вносили в лунки планшета PANDEX™ и инкубировали на льду в течение 30 минут. В каждую лунку вносили заранее разбавленное количество FITC-меченых моноклональных антител в объеме 20 мкл, инкубировали в течение 30 минут, промывали и выполняли количественную оценку флуоресценции с помощью PANDEX™ Screen Machine. Считается, что моноклональные антитела совместно используют "один и тот же эпитоп", если каждое из них блокирует связывание другого на 40% или более по сравнению с контрольным нерелевантным моноклональным антителом при одинаковой концентрации антител. С помощью этого анализа специалист в данной области может идентифицировать другие моноклональные антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и вышеописанные антитела. Кроме того, можно выполнить анализ делеций для идентификации приблизительного расположения антигенных эпитопов в полипептидной последовательности, показанной как SEQ ID NO:2.
В одном из экспериментов продемонстрировано, что моноклональные антитела 2E4.6.1, 4D11.17.2, 13H2.28.2 и 14E7.17.1 против TAT425 не конкурируют за связывание эпитопов друг с другом. В силу этого определили, что каждое из этих четырех антител связывается с независимым неперекрывающимся внеклеточным антигенным эпитопом в составе белка TAT425.
ПРИМЕР 8: Получение антител, связывающихся с TAT425 и конъюгированных с токсином
Использование конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), т.е. иммуноконъюгатов, для локальной доставки цитотоксических или цитостатических агентов, т.е. лекарственных средств, для уничтожения или ингибирования раковых клеток при лечении рака (Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4975278) дает возможность адресной доставки молекулы лекарства в опухоли и его внутриклеточного накопления, причем системное введение указанных неконъюгированных лекарственных агентов может привести к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток, а также для опухолевых клеток, которые желательно уничтожить (Baldwin et al., (1986) Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). Таким образом, желательна максимальная эффективность при минимальной токсичности. Действия по конструированию и очистке ADC фокусируются на селективности моноклональных антител (mAbs), а также на свойствах связывания и высвобождения лекарственных агентов. Сообщалось, что и поликлональные антитела, и моноклональные антитела можно использовать для этой стратегии (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Лекарственные агенты, используемые при этих способах, включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., (1986) supra). Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, например, дифтерийный токсин, растительные токсины, например, рицин, низкомолекулярные токсины, например, гелданамицин (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342).
В конъюгате антитело-лекарственный агент (ADC) по изобретению антитело (Ab) конъюгировано с одной или более молекул лекарственного агента (D), например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 молекул лекарственного агента на антитело через линкер (L). ADC согласно формуле:
Ab-(L-D)p
можно изготовить различными способами, используя реакции органической химии, условия и реагенты, известные специалистам в данной области, включая: (1) реакцию нуклеофильной группы антитела с бивалентным линкерным реагентом для образования Ab-L через ковалентную связь, с последующей реакцией с молекулой лекарственного агента D; и (2) реакцию нуклеофильной группы молекулы лекарственного агента с бивалентным линкерным реагентом для образования D-L через ковалентную связь с последующей реакцией с нуклеофильной группой антитела. Дополнительные способы изготовления ADC описаны здесь.
Линкер может включать один или более линкерных компонентов. Типичные линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропаноил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), p-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 карбоксилат ("SMCC') и N-сукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоат ("SIAB"). Дополнительные линкерные компоненты известны в данной области, и некоторые из них описаны здесь.
В некоторых вариантах воплощения линкер может включать аминокислотные остатки. Типичные аминокислотные линкерные компоненты включают дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Типичные дипептиды включают: валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Типичные трипептиды включают: глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотные остатки, включающие аминокислотный линкерный компонент, включают природные остатки, а также минорные аминокислоты и аналоги аминокислот неприродного происхождения, например, цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты можно сконструировать и оптимизировать по селективности для ферментативного расщепления определенными ферментами, например, опухольассоциированной протеазой, катепсином B, С и D или плазмином.
Примеры нуклеотидных групп антител включают, не ограничиваясь ими: (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковых цепей, например, лизина, (iii) тиоловые группы боковых цепей, например, цистеина, и (iv) гидроксильные или аминогруппы сахара, если антитело является гликозилированным. Аминные, тиоловые, гидроксильные, гидразидные, оксимные, гидразиновые, тиосемикарбазоновые, гидразинкарбоксилатные и арилгидразидные группы являются нуклеофильными и способными реагировать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами линкерных молекул и линкерных реагентов, включающих: (i) активные эфиры, например, NHS-эфиры, HOBt-эфиры, галоформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалиды, например, галоацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы. Некоторые антитела содержат восстанавливаемые межцепочечные дисульфидные связи, т.е. цистеиновые мостики. Антитела можно сделать способными к конъюгации с линкерным реагентом путем обработки восстанавливающим агентом, например, DTT (дитиотрейтол). Каждый цистеиновый мостик, таким образом, теоретически образует две реакционноспособные тиоловые нуклеофильные группы. В антитела можно внедрить дополнительные нуклеофильные группы путем реакции остатков лизина с 2-иминотиоланом (реактив Трота), что приводит к превращению амина в тиол. Реакционноспособные тиоловые группы можно внедрить в антитело (или его фрагмент) путем внедрения одного, двух, трех, четырех или более остатков цистеина (например, получения мутантных антител, включающих один или более аминокислотных остатков цистеина неприродного происхождения.
Конъюгаты антитело-лекарственный агент можно также получить путем модификации антитела за счет внедрения электрофильных групп, которые могут реагировать с нуклеофильными заместителями линкерного реагента или лекарства. Углеводы гликозилированных антител можно окислить, например, периодатными окислителями, образуя альдегидные или кетоновые группы, которые могут реагировать с аминной группой линкерного реагента или молекулы лекарства. Полученные группы иминового шиффова основания могут образовывать стабильную связь или восстанавливаться, например, боргидридными реагентами, образуя стабильные аминные связи. В одном из вариантов воплощения реакция углеводного фрагмента гликозилированного антитела с галактозооксидазой или мета-периодатом натрия могла приводить к образованию карбонильных (альдегидных и кетоновых) групп в составе белка, которые могли реагировать с соответствующими группами лекарственного агента (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В еще одном варианте воплощения белки, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могли реагировать с мета-периодатом натрия, что приводило к образованию альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Такие альдегиды могли реагировать с нуклеофилом молекулы лекарственного агента или линкера.
В качестве альтернативы можно изготовить гибридный белок, включающий антитело и цитотоксический агент, например, с помощью рекомбинантных методик или синтеза пептидов. ДНК может включать соответствующие области, кодирующие две части указанного конъюгата, либо примыкающие друг к другу, либо разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, не нарушающий желательных свойств конъюгата.
В еще одном из вариантов воплощения антитело можно конъюгировать с "рецептором" (например, стрептавидином) для предварительного адресного воздействия на опухоль при введении конъюгата антитело-рецептор пациенту с последующим удалением несвязавшегося конъюгата из циркуляторного русла с помощью очищающего агента и введением "лиганда" (например, авидина), конъюгированного с цитотоксическим агентом (например, радионуклеотидом).
Специфические методики получения конъюгатов антитело-лекарственный агент путем связывания токсинов с очищенными антителами хорошо известны и используются в данной области техники в рабочем порядке. Например, конъюгацию очищенного моноклонального антитела с токсином DM1 можно выполнить следующим образом. Очищенное антитело модифицировали N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноатом, внедряя дитиопиридильные группы. Антитело (376,0 мг, 8 мг/мл) в 44,7 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (pH 6,5), содержавшего NaCl (50 мМ) и ЭДТА (1 мМ) обрабатывали SPP (5,3 молярных эквивалента в 2,3 мл этанола). После инкубирования в течение 90 минут в атмосфере аргона при температуре окружающей среды реакционную смесь подвергали гель-фильтрации через колонку с Sephadex G25, уравновешенную 35 мМ цитратом натрия, 154 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТА. Затем собирали и анализировали фракции, содержащие антитело. Антитело-SPP-Py (337,0 мг с высвобождаемыми 2-тиопиридиновыми группами) разбавляли вышеупомянутым 35 мМ натрий-цитратным буфером, pH 6,5, до конечной концентрации 2,5 мг/мл. Затем к раствору антител добавляли DM1 (1,7 эквивалента, 16,1 моль) в 3,0 мМ диметилацетамиде (DMA, 3% об/об в конечной реакционной смеси). Реакция шла при температуре окружающей среды в атмосфере аргона в течение 20 часов. Реакционную смесь загружали в колонку для гель-фильтрации Sephacryl S300 (5,0 см × 90,0 см, 1,77 л), уравновешенную 35 мМ цитрата натрия, 154 мМ NaCl, pH 6,5. Скорость протока составляла 5,0 мл/мин, собрали 65 фракций (по 20,0 мл каждая). Фракции собирали в пул и анализировали, причем количество молекул лекарственного агента DM1, связанных с одной молекулой антитела (p') определяли, измеряя поглощение при 252 нм и 280 нм.
Для иллюстративных целей, конъюгацию очищенного моноклонального антитела с токсином DM1 также можно было выполнить следующим образом. Очищенное антитело модифицировали сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилатом (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc), внедряя SMCC-линкер. Антитело обрабатывали при концентрации 20 мг/мл в 50 мМ фосфате калия/50 мМ хлориде натрия/2 мМ ЭДТА, pH 6,5 7,5-молярным эквивалентом SMCC (20 мМ в ДМСО, 6,7 мг/мл). После перемешивания в течение 2 часов в атмосфере аргона при температуре окружающей среды реакционную смесь подвергали фильтрации через колонку с Sephadex G25, уравновешенную 50 мМ фосфатом калия/50 мМ хлоридом натрия/2 мМ ЭДТА, рН 6,5. Фракции, содержащие антитело, собирали в пул и анализировали. Затем антитело-SMCC разбавляли 50 мМ фосфатом калия/50 мМ хлоридом натрия/2 мМ ЭДТА, pH 6,5, до конечной концентрации 10 мг/мл, и выполняли реакцию с 10 мМ раствором DM1 (принимая 1,7 эквивалента за 5 SMCC/антитело, 7,37 мг/мл) в диметилацетамиде. Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в атмосфере аргона в течение 16,5 часов. Затем реакционную смесь для конъюгации фильтровали через колонку для гель-фильтрации Sephadex G25 (1,5×4,9 см) с 1 x PBS при pH 6,5. Затем измеряли соотношение DM1/антитело (p) по поглощению при 252 нм и 280 нм.
Кроме того, свободный цистеин в составе выбранного антитела можно модифицировать с помощью бис-малеимидного реагента BM(PEO)4 (Pierce Chemical), оставляя непрореагировавшую малеимидогруппу на поверхности антитела. Это можно выполнить путем растворения BM(PEO)4 в смеси 50% этанол/вода до концентрации 10 мМ и внесения его в десятикратном молярном избытке в раствор, содержащий антитело в фосфатном-солевом буфере в концентрации приблизительно 1,6 мг/мл (10 микромоль) и позволяя реакции идти в течение 1 часа. Избыток BM(PEO)4 удаляли гель-фильтрацией в 30 мМ цитрате, pH 6 с 150 мМ NaCl буфера. Приблизительно 10-кратный молярный избыток DM1 растворяли в диметилацетамиде (DMA) и добавляли к интермедиату антитело-BMPEO. Для растворения реагента молекул лекарственного средства также можно использовать диметилформамид (ДМФ). Реакционной смеси позволяли реагировать в течение ночи, после чего выполняли гель-фильтрацию или диализ в PBS для удаления непрореагировавшего лекарственного агента. Гель-фильтрацию на колонках S200 в PBS использовали для удаления высокомолекулярных агрегатов и получения очищенного конъюгата антитело-BMPEO-DM1.
Цитотоксические лекарственные средства обычно конъюгируют с антителами через многочисленные остатки лизина в составе антитела. Также выполняют конъюгацию через тиоловые группы, присутствующие или внедренные в антитело, интересующее исследователя. Например, остатки цистеина внедряли в белки с помощью методик генной инженерии, образуя сайты для ковалентного присоединения лигандов (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; патент США № 6248564). Если в составе интересующего исследователя антитела присутствует свободный остаток цистеина, токсины можно связывать с этим сайтом. Например, линкерные реагенты-лекарства малеимидокапроилмонометилауристатин E (MMAE), т.е. MC-MMAE, малеимидокапроилмонометилауристатин F (MMAF), т.е. MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE или MC-val-cit-PAB-MMAF, растворенные в ДМСО, разбавляли в ацетонитриле и воде при известной концентрации и вносили в охлажденный раствор цистеин-модифицированного антитела в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS). Спустя приблизительно один час вносили избыток малеимида для остановки реакции и кэпирования непрореагировавших тиоловых групп антител. Реакционную смесь концентрировали путем центрифужной ультрафильтрации, антитела, конъюгированные с токсином, очищали и обессоливали путем элюирования через смолу G25 в PBS, фильтровали через 0,2 м фильтры при стерильных условиях и замораживали для хранения.
Кроме того, антитела против TAT согласно изобретению можно конъюгировать с токсинами ауристатином и доластатином (например, MMAE и MMAF), используя следующую методику. Антитело, растворенное в 500 мМ бората натрия и 500 мМ хлорида натрия при рН 8,0 обрабатывали избытком 100 мМ дитиотрейтола (DTT). После инкубирования при 37ºC в течение приблизительно 30 минут буфер обменивали путем элюирования через смолу Sephadex G25 и элюировали PBS с 1 мМ DTPA. Значение тиол/Ab проверяли, определяя концентрацию восстановленного антитела по поглощению при 280 нм, а концентрацию тиола - путем реакции с DTNB (Aldrich, Милуоки, штат Висконсин, США) и определения поглощения при 412 нм. Восстановленное антитело растворяли в PBS, охлажденном на льду.
Линкерный реагент-лекарство, (1) малеимидокапроилмонометилауристатин E (MMAE), т.е. MC-MMAE, (2) MC-MMAF, (3) MC-val-cit-PAB-MMAE или (4) MC-val-cit-PAB-MMAF, растворенные в ДМСО, разбавляли в ацетонитриле и воде при известной концентрации и вносили в охлажденный раствор восстановленного антитела в PBS. Спустя приблизительно один час вносили избыток малеимида для остановки реакции и кэпирования непрореагировавших тиоловых групп антител. Реакционную смесь концентрировали путем центрифужной ультрафильтрации, антитела, конъюгированные с токсином, очищали и обессоливали путем элюирования через смолу G25 в PBS, фильтровали через 0,2 м фильтры при стерильных условиях и замораживали для хранения.
ПРИМЕР 9: Получение и исследование характеристик биспецифических антител к TAT425
Конструкция биспецифического антитела к TAT425, конкретно, биспецифического антитела против CD3/TAT425, описана ниже.
Различные биспецифические антитела "выпуклость-во впадину" описаны ранее. См., например, патенты США № 5731168 и 7183076; Ridgway et al., Prot. Eng. 9:617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997); Merchant et al., Nat. Biotechn. 16:677-681 (1998). В некоторых случаях для максимального увеличения процентного содержания гетеромультимеров, которые можно получить из линии клеток млекопитающих, совместно трансфицированных конструктами для экспрессии, конструировали связующее звено CH3 между компонентами гуманизированного химерного антитела против CD3/CD4-IgG, описанного ранее Chamow et al. J. Immunol. 153:4268 (1994). Как используется здесь, "гетеромультимеры" относится к молекуле, например, биспецифическому антителу, включающей по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, причем аминокислотная последовательность второго полипептида отличается от последовательности первого полипептида по меньшей мере на один аминокислотный остаток.
Как описано в документах, процитированных в предыдущем абзаце, стратегия, используемая для управления образованием гетеромультимера, основана на внедрении одной или более мутации-"выпуклости" в первый полипептид, например, CH3-домен H-цепи одного антитела, а также внедрении одной или более мутации-"впадины" во второй полипептид, например, в CH3-домен H-цепи второго антитела. Мутация-"выпуклость" заменяла небольшую аминокислоту на более крупную, а мутация-"впадина" заменяла крупную аминокислоту на небольшую. Кроме того, в дополнение к мутациям "выпуклость" и "впадина" в пограничную область между двумя полипептидами, например, два CH3-домена, внедряли остатки, содержащие свободные тиоловые группы, которые, как было показано, усиливают образование гетеромультимеров. Описаны различные типичные мутации "выпуклость-во-впадину" и остатки, содержащие свободные тиоловые группы, внедренные в область соприкосновения полипептидов. См., например, патенты США № 5731168 и 7183076; Ridgway et al., Prot. Eng. 9:617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997); Merchant et al., Nat. Biotechn. 16:677-681 (1998).
Для получения биспецифического антитела против CD3/TAT425 выполняли следующие этапы. Конструировали плазмиды для экспрессии в E. coli, кодирующие варианты гуманизированных легких (L) и тяжелых (H) цепей моноклонального антитела мыши UCHT1 против CD3 (патенты США № 5821337 и 6407213; Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217 [1992] и Rodrigues et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 45 [1992]). В данной области техники известны многие плазмиды для экспрессии в E. coli, включая pAK19. Carter et al., Bio/Tehcnology 10:163-167 (1992). Вносили мутацию, внедряющую выпуклость или впадину в домен CH3 (как описано выше) гуманизированной H-цепи против CD3, например, с помощью сайт-специфического мутагенеза. Различные способы сайт-специфического мутагенеза общеизвестны в данной области. См., например, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Кроме того, конструировали плазмиды для экспрессии в E. coli, кодирующие легкую и тяжелую цепи против TAT425, например, легкую и тяжелую цепи против TAT425, описанные здесь. Вносили мутацию, внедряющую соответствующую впадину (если CH3-домен против CD3 содержал мутацию-выпуклость) или соответствующую выпуклость (если CH3-домен против CD3 содержал мутацию-впадину) в CH3-домен (как описано выше) H-цепи против TAT425, например, с помощью сайт-специфического мутагенеза.
Биспецифические антитела против CD3/TAT425 продуцировали, трансформируя соответствующий штамм E. coli, например, 33B6, вышеописанными плазмидами для экспрессии в E. coli с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. См., например, Rodrigues et al., Cancer Res. 55:63-70 (1995). Антитела секретировались трансформированными E. coli, выращенными в 10-л ферментере, как описано ранее. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992). Антитела очищали и анализировали с помощью известных в данной области техники процедур. См., например, Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997).
ПРИМЕР 10: Анализ уничтожения опухолевых клеток in vitro
Клетки млекопитающих, экспрессирующие полипептид TAT425, интересующий исследователя, можно получить с помощью стандартного экспрессирующего вектора и методик клонирования. В качестве альтернативы, многие линии опухолевых клеток, экспрессирующие TAT425, общедоступны, например, в АТСС, и могут быть идентифицированы в рабочем порядке с помощью стандартного твердофазного ИФА или FACS-анализа. Моноклональные антитела против полипептида TAT425 (и их производные, конъюгированные с токсином) можно использовать в анализах для определения способности антитела уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид TAT425 in vitro.
Например, клетки, экспрессирующие полипептид TAT425, интересующий исследователя, получили, как описано выше, и высеяли на 96-луночные чашки. В одном из анализов вносили конъюгат антитело/токсин (или неконъюгированное антитело) при инкубировании клеток на 4 суток. Во втором независимом анализе клетки инкубировали в течение 1 часа с конъюгатом антитело/токсин (или неконъюгированное антитело), а затем промывали и инкубировали при отсутствии конъюгата антитело/токсин в течение 4 суток. Затем измеряли жизнеспособность клеток с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo от Promega (Cat# G7571). В качестве отрицательного контроля использовали необработанные клетки.
ПРИМЕР 11: Использование TAT в качестве зонда для гибридизации
Следующий способ описывает использование нуклеотидной последовательности, кодирующей TAT, в качестве зонда для гибридизации, т.е. для диагностики наличия опухоли в организме млекопитающего.
ДНК, включающую кодирующую последовательность полноразмерного или зрелого TAT, описанную здесь, также можно использовать в качестве зонда для скрининга на гомологичные ДНК (например, кодирующие природные варианты TAT) в библиотеках кДНК тканей человека или геномных библиотеках тканей человека.
o
Гибридизацию и промывку фильтров, содержащих ДНК любой библиотеки, выполняли при следующих условиях высокой жесткости. Гибридизацию зонда на основе TAT, меченого радиоактивной меткой, выполняли в растворе 50% формамида, 5x SSC, 0,1% ДСН, 0,1% пирофосфата натрия, 50 мМ фосфата натрия, pH 6,8, 2x раствора Денхардта и 10% декстрансульфата при 42C в течение 20 часов. Промывку фильтров осуществляли в водном растворе 0,1 x SSC и 0,1% ДСН при 42ºC.
ДНК, обладающие желательной идентичностью последовательности с ДНК, кодирующей полноразмерный TAT с нативной последовательностью, можно было идентифицировать с помощью стандартных методик, известных в данной области техники.
ПРИМЕР 12: Экспрессия TAT в E. coli
Этот пример иллюстрирует получение негликозилированных форм TAT путем рекомбинантной экспрессии в E. coli.
Последовательность ДНК, кодирующую TAT, вначале амплифицировали с помощью выбранных ПЦР-праймеров. Эти праймеры должны были содержать сайты ферментов рестрикции, соответствующие сайтам ферментов рестрикции выбранного экспрессирующего вектора. Можно использовать разнообразные экспрессирующие векторы. Примером подходящего вектора является pBR322 (происходящий из E. coli; см. Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)), содержащий гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Вектор гидролизовали ферментом рестрикции и дефосфорилировали. Затем в вектор лигировали ПЦР-амплифицированные последовательности. Вектор предпочтительно содержал последовательности, кодирующие ген устойчивости к антибиотику, промотор trp, полигистидиновый лидер (включающий первые 6 STII-кодонов, последовательность полигистидина и сайт расщепления энтерокиназой), область, кодирующую TAT, терминатор транскрипции лямбда и ген argU.
Затем смесь для лигирования использовали для трансформации выбранного штамма E. coli с помощью способов, описанных в Sambrook et al., supra. Трансформанты идентифицировали по их способности расти на чашках с LB и отбирали колонии, устойчивые к антибиотику. Плазмидную ДНК можно выделить и подтвердить путем рестрикционного анализа и секвенирования ДНК.
Выбранные клоны можно было выращивать в течение ночи в жидкой культуральной среде, например, LB-среде с добавками антибиотиков. Культуру, выращенную в течение ночи, можно было последовательно использовать для инокуляции более крупномасштабной культуры. Затем клетки росли до желательной оптической плотности, во время которой включался экспрессирующий промотор.
После культивирования клеток в течение нескольких следующих часов клетки можно было собирать центрифугированием. Осадок клеток, полученный центрифугированием, можно было солюбилизировать с помощью различных агентов, известных в данной области техники, а солюбилизированный TAT-белок можно было очистить на металлохелатной колонке при условиях, позволяющих прочное связывание белка.
TAT можно экспрессировать в E. coli в форме, маркированной полигистидином, с помощью следующей процедуры. ДНК, кодирующую TAT, вначале амплифицировали с помощью выбранных ПЦР-праймеров. Эти праймеры должны были содержать сайты ферментов рестрикции, соответствующие сайтам ферментов рестрикции выбранного экспрессирующего вектора, и другие последовательности для эффективной и надежной инициации трансляции, быстрой очистки на металлохелатной колонке и протеолитического удаления энтерокиназой. ПЦР-амплифицированные маркированные полигистидином последовательности лигировали в экспрессирующий вектор, который использовали для трансформации хозяина E. coli, основанного на штамме 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Трансформантов вначале выращивали в LB, содержащей 50 мг/мл карбенициллина при 30°C при встряхивании до достижения ОП 600, равной 3-5. Затем культуры разбавляли в 50-100 раз средой CRAP (полученной путем смешивания 3,57 г (NH4)2SO4, 0,71 г цитрата натрия•2H2O, 1,07 г KCl, 5,36 г дрожжевого экстракта Difco, 5,36 г гидролизата казеина Шеффилда в 500 мл воды, а также 110 мМ MPOS, pH 7,3, 0,55% (масс/об) глюкозы и 7 мМ MgSO4) и растили в течение приблизительно 20-30 часов при 30°C со встряхиванием. Образцы удаляли для подтверждения экспрессии с помощью анализа в ДСН-ПААГ, а объем культуральной среды центрифугировали, осаждая клетки. Осадок клеток замораживали до его очистки и рефолдинга.
Биомассу E. coli от ферментации в объеме 0,5-1 л (6-10 г осадка) ресуспендировали в 10 объемах (масс/об) в буфере, содержащем 7 M гуанидина, 20 мМ Трис, pH 8. Вносили твердый сульфит натрия и тетратионат натрия до конечной концентрации 0,1 М и 0,02 М, соответственно и перемешивали раствор в течение ночи при 4°C. Этот этап приводил к получению денатурированного белка, в котором все остатки цистеина блокированы сульфитом. Раствор центрифугировали при 40000 об/мин в ультрацентрифуге Beckman Ultracentifuge в течение 30 мин. Надосадочную жидкость разбавляли 3-5 объемами буфера для металлохелатной колонки (6 М гуанидина, 20 мМ Трис, рН 7,4) и для очистки фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 микрона. Очищенный экстракт загружали на 5-мл металлохелатной колонки Qiagen Ni-NTA, уравновешенной буфером для металлохелатной колонки. Колонку промывали дополнительным буфером, содержащим 50 мМ имидазола ((Calbiochem, Utrol grade), pH 7,4. Белок элюировали буфером, содержащим 250 мМ имидазола. Фракции, содержавшие желательный белок, собирали в пул и хранили при 4°C. Концентрацию белка оценивали по его поглощению при 280 нм с помощью рассчитанного коэффициента экстинкции на основе ее аминокислотной последовательности.
Рефолдинг белков выполняли путем медленного разбавления в свежеизготовленном буфере для рефолдинга, состоящем из: 20 мМ Трис, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M мочевины, 5 мМ цистеина, 20 мМ глицина и 1 мМ ЭДТА. Объем для рефолдинга выбирали так, чтобы конечная концентрация белка была в 50-100 мкг/мл. Раствор для рефолдинга мягко перемешивали при 4°C в течение 12-36 часов. Реакцию рефолдинга останавливали внесением ТФУК до конечной концентрации 0,4% (pH приблизительно равен 3). Перед дальнейшей очисткой белка раствор фильтровали через 0,22-микронный фильтр и вносили ацетонитрил в конечной концентрации 2-10%. Повторно уложенный белок хроматографировали на обращенно-фазной колонке Poros R1/H, используя мобильный буфер с 0,1% ТФУК, с элюированием в градиенте ацетонитрила от 10% до 80%. Аликвоты фракций с поглощением при A280 анализировали в полиакриламидном геле с ДСН и собирали в пул фракции, содержащие гомогенный повторно уложенный белок. В общем случае правильно уложенные разновидности большинства белков элюировали при наиболее низких концентрациях ацетонитрила, поскольку эти разновидности наиболее компактны в своем гидрофобном окружении, закрытом от взаимодействия с обращенно-фазной смолой. Агрегатные разновидности обычно удаляли при высоких концентрациях ацетонитрила. Кроме отделения неправильно уложенных форм белка от желательной формы, обращенно-фазный этап также удалял эндотоксин из образцов.
Фракции, содержавшие TAT-полипептид с желательной укладкой, объединяли в пул и удаляли ацетонитрил с помощью легкого потока азота, направленного на раствор. Препараты белков изготавливали в 20 мМ Hepes, pH 6,8 с 0,14 M хлорида натрия и 4% маннитом путем диализа или гель-фильтрации с помощью смол G25 Superfine (Pharmacia), уравновешенных буфером для препарата, и стерильно фильтровали.
Некоторые из описанных здесь TAT-полипептидов успешно экспрессировали и очистили с помощью этой методики.
ПРИМЕР 13: Экспрессия TAT в клетках млекопитающих
Этот пример иллюстрирует получение потенциально гликозилированных форм TAT путем рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих.
В качестве экспрессирующего вектора использовали вектор pRK5 (см. EP 307247, опубликованный 15 марта 1989 г.). Необязательно ДНК TAT лигировали в pRK5 с помощью выбранных ферментов рестрикции, давая возможность инсерции ДНК TAT с помощью способов лигирования, описанных в Sambrook et al., supra. Полученный вектор назвали pRK5-TAT.
В одном из вариантов воплощения выбранные клетки-хозяева могут представлять собой клетки 293. Клетки 293 человека (ATCC CCL 1573) выращивали до конфлуентности на планшетах для тканевых культур в таких средах, как DMEM, с добавкой эмбриональной телячьей сыворотки и, необязательно, питательных компонентов и/или антибиотики. Приблизительно 10 мкг ДНК pRK5-TAT смешивали с приблизительно 1 мкг ДНК, кодирующей ген VA RNA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] и растворяли в 500 мкл 1 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,227 M CaCl2. В эту смесь по каплям вносили 500 мкл 50 мМ HEPES (pH 7,35), 280 мМ NaCl, 1,5 мМ NaPO4, и позволяли образоваться осадку в течение 10 минут при 25°C. Осадок ресуспендировали и добавляли к клеткам 293 и позволяли отстояться в течение приблизительно четырех часов при 37°C. Культуральную среду удаляли и вносили 2 мл 20% глицерина в PBS в течение 30 секунд. Затем клетки 293 промывали бессывороточной средой, добавляли свежую среду и инкубировали клетки в течение приблизительно 5 суток.
Спустя приблизительно 24 часа после трансфекции культуральную среду удаляли и заменяли культуральной средой (чистой) или культуральной средой, содержащей 200 мкКи/мл 35S-цистеина и 200 мкКи/мл 35S-метионина. После 12-часового инкубирования кондиционированную среду собирали, концентрировали на центробежном фильтре и загружали в гель с 15% ДСН. Обработанный гель можно было высушить и экспонировать на пленку в течение выбранного времени для выявления присутствия TAT-полипептида. Культуры, содержащие трансфицированные клетки, можно подвергать дальнейшему инкубированию (в бессывороточной среде) и тестировать среду в выбранных биологических анализах.
В альтернативной методике TAT можно временно внедрять в клетки 293 с помощью декстрансульфатного способа, описанного Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Клетки 293 выращивали до максимальной плотности в центрифужной пробирке и вносили 700 мкг ДНК pRK5-TAT. Вначале клетки концентрировали в центрифужной пробирке и промывали PBS. Осадок ДНК-декстран инкубировали с осадком клеток в течение четырех часов. Клетки обрабатывали 20% глицерином в течение 90 секунд, промывали тканевой культуральной средой и повторно вносили в центрифужную пробирку, содержащую тканевую культуральную среду, 5 мкг/мл бычьего инсулина и 0,1 мкг/мл бычьего трансферрина. Спустя приблизительно четверо суток кондиционированную среду центрифугируют и фильтруют для удаления клеток и их фрагментов. Образец, содержащий экспрессированный TAT, можно концентрировать и очищать с помощью любого выбранного способа, например, диализа или хроматографии на колонке.
В еще одном из вариантов воплощения TAT можно было экспрессировать в клетках CHO. pRK5-TAT можно было трансфицировать в клетки CHO с помощью известных реагентов, например, CaPO4 или ДЭАЭ-декстран. Как описано выше, культуру клеток можно инкубировать и заменить среду культуральной средой (чистой) или средой, содержащей радиоактивную метку, например, 35S-метионин. После определения присутствия TAT-полипептида культуральную среду можно заместить бессывороточной средой. Предпочтительно культуры инкубировали в течение приблизительно 6 суток, а затем собирали кондиционированную среду. Среду, содержащую экспрессированный TAT, можно концентрировать и очищать с помощью любого выбранного способа.
TAT, маркированный эпитопным маркером, также можно экспрессировать в клетках-хозяевах CHO. TAT можно субклонировать, не используя вектор pRK5. Субклонированную инсерцию можно подвергать ПЦР для объединения в открытой рамке считывания с выбранным эпитопным маркером, например, полигистидиновым маркером в составе бакуловирусного экспрессирующего вектора. TAT-инсерцию с полигистидиновым маркером можно затем субклонировать в векторе, управляемом SV40 и содержащем селектируемый маркер, например, DHFR, для селекции стабильных клонов. Наконец, клетки CHO можно трансфицировать (как описано выше) вектором, управляемым SV40. Мечение можно выполнять, как описано выше, для проверки экспрессии. Культуральную среду, содержащую экспрессированный TAT, маркированный полигистидином, можно концентрировать и очищать с помощью любого выбранного способа, например, Ni2+-хелатной аффинной хроматографии.
TAT также можно экспрессировать в клетках CHO и/или COS путем процедуры транзиентной экспрессии или в клетках CHO с помощью еще одной процедуры стабильной экспрессии.
Стабильную экспрессию в клетках CHO выполняли с помощью следующей процедуры. Белки экспрессировали в виде IgG-конструкта (иммуноадгезин), в котором кодирующие последовательности растворимых форм (например, внеклеточных доменов) соответствующих белков объединяли с последовательностью константной области IgG1, содержавшей шарнир, домены СН2 и СН2 и/или формы, маркированной полигистидином.
В соответствии с ПЦР-амплификацией соответствующие ДНК субклонировали в экспрессирующем векторе CHO с помощью стандартных методик, описанных в Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Конструкция экспрессирующих векторов CHO содержит совместимые сайты рестрикции, расположенные 5’- и 3’- от интересующей исследователя ДНК, что дает возможность удобного встраивания кДНК. Вектор, осуществляющий экспрессию в клетках CHO, представляет собой вектор, описанный в Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), и использует ранний промотор/энхансер SV40 для управления экспрессией интересующей исследователя кДНК и дигидрофолатредуктазы (DHFR). Экспрессия DHFR позволяет селектировать клоны, стабильно поддерживающие плазмиду после трансфекции.
Двенадцать микрограммов желательной плазмидной ДНК внедряли приблизительно в 10 миллионов клеток CHO с помощью доступных для приобретения реагентов для трансфекции SUPERFECT (Quiagen), DOSPER или FUGENE (Boehringer Mannheim). Клетки растили, как описано в работе Lucas et al., supra. Приблизительно 3×107 клеток замораживали в ампуле для дальнейшего роста и продукции, как описано ниже.
Ампулы, содержащие плазмидную ДНК, размораживали путем помещения в водяную баню и перемешивания на вортексе. Содержимое переносили пипеткой в центрифужную пробирку, содержавшую 10 мл среды, и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 10 мл селективной среды (профильтрованная через мембрану с размером пор 0,2 мкм PS20 с 5% эмбриональной бычьей сыворотки, профильтрованной через мембрану с размером пор 0,2 мкм). Затем помещали аликвоты клеток в 100-мл роллерную колбу, содержащую 90 мл селективной среды. Спустя 1-2 суток клетки переносили в 250-мл роллерную колбу, содержавшую 150 мл селективной ростовой среды, и инкубировали при 37°C. Спустя еще 2-3 суток выполняли посев 3×105 клеток/мл в 250-мл, 500-мл и 2000-мл роллерные колбы. Клеточную среду заменяли свежей средой путем центрифугирования и ресуспендирования в среде для продукции. Хотя можно было использовать любую подходящую CHO-среду, обычно может использоваться среда для продукции, описанная в патенте США № 5122469, поданном 16 июня 1992 г. В 3-л роллерную колбу для продукции засевали 1,2×106 клеток/мл. На 0 сутки определяли количество клеток и рН. На 1 сутки отбирали образец из роллерной колбы и начинали продувку фильтрованным воздухом. На 2 сутки отбирали образец из роллерной колбы, температуру повышали до 33°C и вносили 30 мл 500 г/л глюкозы и 0,6 мл 10% пеногасителя (например, 35% эмульсии полидиметилсилоксана, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Во время продукции при необходимости корректировали рН, поддерживая его в области 7,2. Через 10 суток или после падения жизнеспособности ниже 70% культуру клеток собирали центрифугированием и фильтровали через 0,22-мкм фильтр. Фильтрат хранили при 4°C или немедленно загружали на колонки для очистки.
В случае конструктов, маркированных полигистидином, очистку белка выполняли, используя колонку Ni-NTA (Qiagen). Перед очисткой в кондиционированную среду вносили имидазол в концентрации 5 мМ. Кондиционированную среду закачивали в 6-мл колонку Ni-NTA, уравновешенную 20 мМ Hepes, pH 7,4, содержавшим 0,3 M NaCl и 5 мМ имидазола при скорости потока 4-5 мл/мин при 4°C. После загрузки колонку промывали дополнительным количеством равновесного буфера и элюировали белок равновесным буфером, содержавшим 0,25 М имидазола. Затем белок с высокой степенью очистки обессоливали в буфере для хранения, содержавшем 10 мМ Hepes, 0,14 M NaCl и 4% маннит, pH 6,8, на 25-мл колонке G25 Superfine (Pharmacia) и хранили при -80°C.
Иммуноадгезиновые (Fc-содержащие) конструкты очищали от кондиционированной среды следующим образом. Кондиционированную среду закачивали в 5-мл колонку с белком А (Pharmacia), уравновешенную 20 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6,8. После загрузки колонку тщательно промывали равновесным буфером и выполняли элюирование 100 мМ лимонной кислотой, рН 3,5. Элюированный белок немедленно нейтрализовали, собирая 1-мл фракции в пробирки, содержавшие 275 мкл 1 М Трис-буфера, рН 9. Затем белок с высокой степенью очистки обессоливали в буфере для хранения, как описано выше для белков, маркированных полигистидином. Оценку гомогенности выполняли в ДСН-полиакриламидном геле и с помощью N-терминального секвенирования аминокислотных последовательностей путем расщепления по Эдману.
Некоторые из описанных здесь TAT-полипептидов успешно экспрессировали и очистили с помощью этой методики.
ПРИМЕР 14: Экспрессия TAT в дрожжах
Следующий способ описывает рекомбинантную экспрессию TAT в дрожжах.
Вначале конструировали вектор для экспрессии в дрожжах для внутриклеточной продукции или секреции TAT с промотора ADH2/GAPDH. ДНК, кодирующую TAT, и промотор встраивали в подходящие сайты ферментов рестрикции в выбранной плазмиде для управления внутриклеточной экспрессией TAT. Для секреции ДНК, кодирующую TAT, можно было клонировать в выбранной плазмиде вместе с ДНК, кодирующей промотор ADH2/GAPDH, нативный сигнальный пептид TAT или другой сигнальный пептид млекопитающих или, например, альфа-фактор дрожжей или секреторную сигнальную/лидерную последовательность инвертазы, и последовательности линкеров (при необходимости) для экспрессии TAT.
Затем дрожжевые клетки, например, дрожжевой штамм AB110, можно было трансформировать вышеописанной экспрессирующей плазмидой и культивировать в выбранных ферментационных средах. Надосадочную жидкость культуры трансформированных дрожжей можно было анализировать путем преципитации с 10% трихлоруксусной кислотой и разделения в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием геля красителем Кумасси голубой.
Затем можно было выделить и очистить рекомбинантный TAT путем удаления дрожжевых клеток из ферментационной среды центрифугированием и последующим концентрированием среды с помощью выбранных патронных фильтров. Концентрат, содержавший TAT, можно было подвергать дальнейшей очистке с помощью выбранных смол для колоночной хроматографии.
Некоторые из описанных здесь TAT-полипептидов успешно экспрессировали и очистили с помощью этой методики.
ПРИМЕР 15: Экспрессия TAT в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусами
Следующий способ описывает рекомбинантную экспрессию TAT в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусами.
Последовательность, кодирующую TAT, встраивали выше эпитопного маркера, содержащегося в бакуловирусном экспрессирующем векторе. Такие эпитопные маркеры включают полигистидиновые маркеры и маркеры иммуноглобулинов (подобные Fc-областям IgG). Можно использовать разнообразные плазмиды, включая плазмиды, являющиеся производными доступных для приобретения плазмид, например, pVL1393 (Novagen). Вкратце, последовательность, кодирующую TAT или желательный фрагмент последовательности, кодирующей TAT, например, последовательность, кодирующую внеклеточный домен трансмембранного белка, или последовательность, кодирующую зрелый белок, если белок является внеклеточным, амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймеры, комплементарные 5'- и 3'-областям. 5'-праймер мог включать фланкирующие (выбранные) сайты ферментов рестрикции. Затем продукт расщепляли с помощью указанных выбранных ферментов рестрикции и субклонировали в экспрессирующем векторе.
TM
Рекомбинантный бакуловирус получали путем совместной трансфекции вышеуказанной плазмиды и вирусной ДНК BACULOGOLD (Pharmingen) в клетки Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) с помощью липофектина (доступного для приобретения в GIBCO-BRL). Спустя 4-5 суток инкубирования при 28°C собирали высвободившиеся вирусы и использовали их для дальнейшей амплификации. Вирусную инфекцию и экспрессию белка осуществляли, как описано в работе O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
Затем можно было очистить TAT, маркированный полигистидином, например, Ni2+-хелатной аффинной хроматографией согласно следующему описанию. Экстракты получали из рекомбинантных клеток Sf9, инфицированных вирусом, как описано в статье Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Вкратце, клетки Sf9 промывали, ресуспендировали в буфере для ультразвуковой дезинтеграции (25 мл Hepes, pH 7,9; 12,5 мМ MgCl2; 0,1 мМ ЭДТА; 10% глицерина; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) и дважды обрабатывали ультразвуком в течение 20 секунд на льду. Гомогенаты очищали центрифугированием, надосадочную жидкость 50-кратно разбавляли загрузочным буфером (50 мМ фосфата, 300 мМ NaCl, 10% глицерина, pH 7,8) и фильтровали через 0,45-мкм фильтр. Колонку Ni2+-NTA с агарозой (доступную для приобретения в Qiagen) подготавливали при объеме слоя 5 мл, промывали 25 мл воды и уравновешивали 25 мл загрузочного буфера. Отфильтрованный клеточный экстракт загружали на колонку со скоростью 0,5 мл в минуту. Колонку промывали загрузочным буфером до фонового уровня А280, после чего начинали отбор фракций. Затем колонку промывали вторичным буфером для промывки (50 мМ фосфата; 300 мМ NaCl, 10% глицерина, pH 6,0), который элюировал неспецифически связанный белок. После повторного достижения фонового уровня А280 в колонке создавали градиент имидазола от 0 до 500 мМ во вторичном буфере для промывки. Фракции объемом один миллилитр собирали и анализировали с помощью ДСН-ПААГ и окрашивания серебром или вестерн-блоттинга с Ni2+-NTA, конъюгированного со щелочной фосфатазой (Qiagen). Фракции, содержавшие элюированный TAT, маркированный His10, собирали в пул и диализовали против загрузочного буфера.
В качестве альтернативы очистку IgG-маркированного (или Fc-маркированного) TAT можно было осуществить с помощью известных хроматографических методик, включая, например, колоночную хроматографию с белком А или белком G.
Некоторые из описанных здесь TAT-полипептидов успешно экспрессировали и очистили с помощью этой методики.
ПРИМЕР 16: Очистка TAT-полипептида с помощью специфичных антител
Нативные или рекомбинантные TAT-полипептиды можно было очистить с помощью разнообразных стандартных методик очистки белка. Например, про-TAT-полипептид, зрелый TAT-полипептид или предшественник TAT-полипептида очищали иммуноаффинной хроматографией, используя антитела, специфичные к интересующему исследователя TAT-полипептиду. В общем случае конструировали иммуноаффинную колонку путем ковалентного связывания антител против TAT-полипептида с активированной хроматографической смолой.
Поликлональные иммуноглобулины получали из иммунных сывороток преципитацией с сульфатом аммония или очисткой на иммобилизованном белке А (Pharmacia LKB Biotechnology, Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США). Аналогично, моноклональные антитела получали из асцитной жидкости мыши преципитацией с сульфатом аммония или хроматографией на иммобилизованном белке А. Частично очищенный иммуноглобулин ковалентно присоединяли к хроматографической смоле, например, CnBr-активированной СефарозеTM (Pharmacia LKB Biotechnology). Антитело присоединяли к смоле, смолу блокировали и промывали согласно инструкциям изготовителя.
Такую иммунохроматографическую колонку использовали для очистки TAT-полипептида путем получения фракции из клеток, содержащих TAT-полипептид в растворимой форме. Этот препарат получали путем солюбилизации целых клеток или субклеточной фракции, полученной с помощью дифференциального центрифугирования за счет внесения детергента или с помощью других способов, известных в данной области техники. В качестве альтернативы, растворимый TAT-полипептид, содержащий сигнальную последовательность, можно было секретировать в применимых количествах в среду, в которой росли клетки.
Препарат, содержавший растворимый TAT-полипептид, пропускали через иммуноаффинную колонку и промывали колонку водой при условиях, дававших возможность преимущественного поглощения TAT-полипептида (например, буферы с высокой ионной силой в присутствии детергента). Затем колонку элюировали при условиях, нарушавших связывание антитело/TAT-полипептид (например, буфер с низким рН, например, приблизительно равным рН 2-3, или высокой концентрацией агента, вызывающего диссоциацию, например, мочевины или тиоцианат-иона) и собирали TAT-полипептид.
Вышеприведенное письменное патентное описание считается достаточным для практического воплощения изобретения специалистом в данной области. Рамки настоящего изобретения не должны ограничиваться депонированным конструктом, поскольку депонированный вариант воплощения следует рассматривать как одиночную иллюстрацию определенных аспектов изобретения, и любые функционально эквивалентные конструкты входят в рамки настоящего изобретения. Приобщение к заявке материала, описанного здесь, не является признанием того, что письменное описание, приведенное здесь, является неадекватным для практического осуществления какого-либо аспекта изобретения, включая их лучший вариант, и не должно рассматриваться как ограничивающее рамки формулы изобретения конкретными иллюстрациями, которые он представляет. Фактически, в дополнение к модификациям изобретения, показанным и описанным здесь, для специалистов в данной области техники из вышеприведенного описания очевидны различные модификации изобретения, которые находятся в рамках прилагаемой формулы изобретения.