Рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, способ его получения и применения
RECOMBINANT PROTEIN GBD-SSTAD-SSTAD, A METHOD FOR PRODUCTION AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии, иммунологии, микробиологии. Конкретно изобретение относится к рекомбинантному белку GBD-SSTad-SSTad и способу его получения на глюкане, включающему связывание белка GBD-SSTad-SSTad в составе клеточных экстрактов штамма Е. coli BL21 [pGBD-SSTad-SSTad] с альфа-гликансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации, последующую отмывку от не связавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта. Изобретение также относится к иммуногенной композиции и набору, содержащему указанный пептид. Изобретение также касается использования полученного белка для увеличения количества созревающих фолликул и улучшению качественных показателей спермы. Данный технический результат - увеличения количества созревающих фолликул и улучшению качественных показателей спермы основан на использовании пептида KNFFWKTFTS, который входит в состав рекомбинантного белка, способного индуцировать аутоантитела к соматостатину. Таким образом, изобретение может применяться для лечения мужского и женского бесплодия.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В организме человека фолликулогенез начинается, когда некоторые покоящиеся фолликулы покидают овариальный резерв, чтобы войти в растущую фазу. Активация покоящихся фолликулов остается недостаточно изученным процессом, однако современные данные литературы указывают на существование спектра взаимосвязанных причин, регулирующих динамику баланса многочисленных факторов активации и подавления развития фолликулов. Регуляция молекулярных механизмов контроля активации покоящихся фолликулов может иметь значительные перспективы клинического применения для процесса мобилизации покоящихся фолликул у пациенток, страдающих бесплодием из-за дисфункции яичников. В последнее время все больший интерес специалистов вызывает соматостатин, оказывающий системное ингибирующее воздействие на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую систему (Gougeon et al., 2010, Endocrinology. 151(3): 1299-309).
Механизмы, регулирующие инициирование роста фолликулов, остаются недостаточно изученными. Кит-лиганд (KL) является первым из обнаруженных белков, который вызывает инициирование фолликулярного роста. Это основано на анализе фенотипа яичника у животных, несущего спонтанные инактивирующие мутации KL (Huang et al., 1993, Dev. Biol, 157:100-109) и экспериментальные исследования (Yoshida et al., 1997, Dev. Biol. 184:122-137; Parrott et al., 1999; Endocrinology 140:4262-4271). Противоположное, ингибирующее действие на инициацию роста фолликул, вызывает пептидный гормон соматостатин (SST). SST оказывает сильное ингибирующее действие на ряд гормонов (соматотропин, тиреотропный гормон, инсулин, глюкагон, гастрин, пепсин), инициирует угнетение секреции ферментов желудка, поджелудочной железы, тонкого отдела кишечника, замедление моторики желудочно-кишечного тракта и эвакуации его содержимого. Существуют данные, свидетельствующие, что мишенью SST является также гипоталамо-гипофизарно-яичниковая система (Gougeon et al., 2010, Endocnnojogy 151 (3): 1299-309).
SST представляет собой циклический U-образный пептид, присутствующий в двух формах в организме (14 SST-14 аминокислот и SST-28-28 аминокислот). Биологическая активность этих двух форм SST идентична. Форма SST-14 является преобладающей в центральной нервной системе, ингибируя секрецию соматотропными клетками переднего гипофиза гормона роста. Форма SST-28 предпочтительно присутствует в желудке и поджелудочной железе. Биологическая активность SST реализуется с помощью нескольких мембранных рецепторов в сочетании с белком G, 5 подтипов которого были охарактеризованы, а именно подтипы SSTR1-SSTR5 (Reubi, 1987, Cancer Res. 47: 551-558; Resine et al., 1995, Endocrin Reviews 16: 427-442; Lamberts et al., 1991, Endocrin Reviews 12:450-482).
Наличие SST в яичнике было обнаружено у нескольких видов млекопитающих, включая свиней (Mori et al., 1984, Acta Endocrinol. (Copenh.) 106 (2):254-259), крыс (McNeill et al., 1987, Am. J Anat. 179 (3): 269-76) и человека (Hoist et al, 1994, Hum. Reprod. 9 (8):1448-1451). Рецепторы к SST были идентифицированы в яичниках крысы (Lidor et al., 1998, Gynecol. Endocrinol. 12 (2):97-101), а также в яичнике человека, в частности подтипы 1, 2А и 5 (Strauss et al., 2003, Hum. Reprod. 18(1):495-507). Таким образом, есть основания полагать, что в яичниках всех видов млекопитающих содержится SST и рецепторы к нему. В уровне технике имеются данные, позволяющие предположить наличие SST и рецепторов к нему в яичниках птиц (RU 2337708, RU 2526571, Кудрявец Н.И., 2018, Горки БГСХА, Биологические особенности птиц разных видов).
Экспериментальные данные показывают, что SST может играть роль в поддержании фолликулов в стадии покоя. SST представляет собой пептид, имеющий хорошо известный эффект в эндокринных тканях: он ингибирует образование цАМФ (Ben-Shlomo et al., 2007, I Drugs. 10(12):885-95), а также ингибирует продукцию KL клетками Sertoli (аналогично клеткам гранулезы) в яичнике самцов свиней. У крыс при введении SST in vivo уменьшается количество преовулятивных фолликулов яичников (Nestorovic et al., 2004, Gen Physiol Biophvs. 23(3):375-80), a in vitro SST ингибирует продуцирование FSH-стимулированной ароматазы и прогестерона клетками гранулезы (Andreani et al., 1995, Hum Reprod. 10(8): 1968-73). В клетках гранулы яичников свиней SST ингибирует стимулированное лютеинизирующим гормоном (LH) и форсколином продуцирование цАМФ (Rajkumar et al., 1992 J Endocrinol. 134(2):297-306) и может ингибировать ядерное созревание периваскулярных ооцитов.
SST также играет ключевую роль в контроле пролиферации мужских половых клеток. SST рецепторы (SSTR) SSTR3, SSTR4 и SSTR5 хорошо выражены в нормальной тестикулярной ткани человека, в то время как SSTR1 и SSTR2, как правило, отсутствуют. В семенниках крыс рецепторы SSTR1, SSTR 2 и SSTR 3 были определены, главным образом, в сперматоцитах. Кроме того, интенсивное накопление мРНК SSTR1-3 наблюдается в круглых сперматидах на стадиях образования I-VII и драматически снижается на стадии IX, когда круглые сперматиды уже начинают свои изменения. Все это указывает на прямое участие SST и его рецепторов в сперматогенезе млекопитающих. В уровне технике имеются данные, позволяющие предположить участие SST и рецепторов к нему в сперматогенезе птиц (RU 2337708, RU 2526571, Кудрявец Н.И., 2018, Горки БГСХА, Биологические особенности птиц разных видов).
Вышеприведенные факты убедительно свидетельствуют, что SST является одним из факторов, поддерживающим стадии покоя фолликул и сперматид. Ингибируя образование цАМФ клетками гранулезы, SST может ингибировать продукцию KL. Следовательно, антагонисты SSTR или антитела, связывающие и нейтрализующие активность SST, могут стимулировать переход фолликулов и сперматидов в фазу роста.
Первый подход был реализован в целом ряде работ и патентов A. Gougeon с соавторами (Gougeon, 2011, Gynecol Obstet Fertil. 39(9):511-3; Gougeon et al., 2010, Endocrinology 151(3): 1299-309; Gougeon and Loumaye, EP 20040791488 08.10.2004; Gougeon, US 20070155659 A1 5.7.2007; Tranand and Gotteland, EP 2835136 A1 11.02.2015), в которых было описано использование аналога-антагониста SST для приготовления лекарственного средства, предназначенного для ускорения начала роста покоящихся фолликулов. Авторами были разработаны аналоги-антагонисты SST, представляющие собой циклические или нециклические полипептиды, имеющие высокое сродство к рецептору SST и ингибирующие функциональную активность SST14 или SST28, такую как ингибирование секреции гормона роста соматотропными клетками гипофиза и/или ингибирование in vitro пролиферации клеток аденомы гипофиза. Большинство аналогов-антагонистов SST имели высокое сродство ко всем или, по меньшей мере, к 2 или 3 подтипам рецепторов SST или большее сродство по меньшей мере к одному из подтипов 1, 2, 3, 4 и 5 (например, к подтипу 2). Под аналогом-агонистом SST в опубликованных патентах подразумевается соединение, для которого эффективная доза DE50 составляет 1 мкМ или ниже для по меньшей мере одного из подтипов рецепторов соматостатина. В неонатальном мышином яичнике антагонист рецептора SST вызывал снижение процента первичных фолликулов и увеличение процента первичных и вторичных фолликулов (Gougeon et al., 2010, Endocrinology. 151(3):1299-309).
Gougeon US 20070155659 A1 5.7.2007 обнаружил, что SST и его аналоги способны влиять на переход фолликулов от стадии покоя к стадии роста. Автором продемонстрировано применение SST или аналога-агониста SST для получения лекарственного средства, которое предназначено для того, чтобы уменьшить или ингибировать начало роста фолликулов, находящихся в стадии покоя. Использование же аналога-антагониста SST наоборот ускоряло начало роста покоящихся фолликулов. Таким образом, впервые было показано что, используя модифицированные производные SST, можно непосредственно влиять на рост фолликулов, ускоряя или замедляя их развитие. Для каждой мыши, один яичник, культивировали в культуральной среде (контроль), а другой яичник культивировали в присутствии SST, либо KL или антагониста SST - BIM-23627. После этого яичники гистологически оценивали на содержание примордиальных, первичных и вторичных фолликулов. Было показано, что KL и BIM-23627 вызвали снижение процентного содержания примордиальных фолликулов и увеличили процентное содержание первичных и вторичных фолликулов в сравнении с аналогичными показателями в контрольных яичниках мышей.
Авторы патента предполагают использовать аналоги-антагонисты SST применительно к in vitro или in vivo оплодотворению животных с высокой рыночной стоимостью. Такие животными, в частности, могут быть лошадьми, жвачными животными, овцами или козами; они также могут быть животными трансгенного происхождения. Основные преимущества разработанной технологии авторы видят в возможности приготовления лекарственного средства, основанного на аналоге-антагонисте SST, для того, чтобы активизировать покоящиеся фолликулы яичникового резерва животных и инициировать ростовую фазу. Введение такого лекарственного средства животным в течение 1-12 месяцев повышает количество фолликулов, находящихся в фазе роста, которые можно стимулировать при стандартных способах лечения, для достижения стадии преовуляторных фолликулов. Аналогичные данные были получены в патенте Tran and Gotteland ЕР 2835136 А1 11.02.2015.
Схожие результаты наблюдались у макак резус при использовании антагониста SST PGL1001 (Ting et al., 2019, J Assist. Reprod. Genet. 36(2):229-239). Систематическое ведение PGL1001 не влияло на общее состояние здоровья животных, продолжительность менструального цикла или уровни циркулирующих гормонов яичников по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе. Лечение PGL1001 увеличило окружность яичника, а также скорость оплодотворения ооцитов по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе животных при введении плацебо.
Однако предложенная технология имеет целый ряд ограничений при использовании, поскольку требует систематического применения дорогостоящих производных антагонистов SST на протяжении многих месяцев. Снизить концентрацию SST в крови животных и уменьшить связывание с рецепторами гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы можно, не только используя аналоги-антагонисты, но и с помощью технологии нейтрализации активности SST с помощью аутоантител.
Иммунная система организма помимо защитной функции осуществляет регуляторные функции в отношении клеточной пролиферации и других генетически детерминированных функций собственных клеток, путем создания специфических аутоантител к биологически активным соединениям организма (Полетаев А.Б. и др., 2002, Медицина: 168-172). Аутоантигены, в отличие от антигенов, это собственные белки, белковые комплексы или компоненты клеток организма, становящимися частично чужеродными под действием различных повреждающих факторов и инфекционных агентов или в результате целенаправленного нарушения естественной иммунологической толерантности, которая в данном случае достигается введением специальным образом сформулированного эндогенного антигена. Выработку данных антител можно индуцировать методом инверсной иммунорегуляции. Метод инверсной иммунорегуляции заключается в индукции аутоантител к эндогенным биологически активным соединениям посредством введения последних в виде ковалентных конъюгатов с антигенами-носителями, в результате чего долговременно и целенаправленно изменяются физиологические функции в организме. Термин был предложен И.П. Ашмариным (Ашмарин и др., 1989, Бюл. экспер. биол. мед 12: 695-697). В зарубежной литературе для описания подобного состояния применяется термин аутоантигенность (Poletaev et al., 2012, Pathophysiology 19 (3): 221-31).
Антитела к эндогенным биологически активным соединениям, в частности гормонам, могут связывать и снижать концентрацию, а также биологическую активность соответствующих соединений ( 2003, Autoimmunity 36:183-189). Следствиями такого состояния являются плавные изменения ряда физиологических и биохимических процессов, с которыми прямо или косвенно сопряжен гормональный регулятор. В данном случае молекула, содержащая SST целиком или какой-либо фрагмент SST, выступает в роли иммуногена (аутоантигена, индуцирующего иммунный ответ), вызывающего выработку организмом антител против данного эндогенного фактора. Данные антитела будут связывать эндогенный SST, то есть являться аутоантителами, что позволит снизить его концентрацию в крови, а соответственно предотвратить взаимодействие со специфическими рецепторами и ослабить его физиологическое воздействие на организм.
В США, Канаде, Великобритании и России более тридцати лет назад были выполнены отдельные работы по активной иммунизации животных (крупный рогатый скот, овцы, свиньи) против соматостатина-14 (Spencer, 1984, J R Soc Med. 77(6):496-500). Автор исследования отмечает, что по динамике увеличения массы тела, в одинаковых условиях содержания иммунизированные животные превосходили контрольных особей на 15-20%, при этом в крови обнаруживалось повышенное содержание эндогенного соматотропного гормона. В дальнейшем были проведены эксперименты с разными видами животных. Активная иммунизация животных белками, полученными в результате ковалентной конъюгации синтетического SST с белками-носителями, приводила к повышению уровней концентрации гормона роста (Spencer et al., 1986, Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 85(3):553-6.), инсулинового ростового фактора (Dubreuil et al., 1991, Domest Anim Endocrinol. 8(2):307-21), гастрина (Westbrook et al., 1998, Am J Physiol. 274(4):751-6) и других функционально связанных с соматостатином биологически активных соединений. Результатом активной антисоматостатиновой иммунизации являлось увеличение массы тела животных на 8-17%.
Метод соматостатиновой иммунонейтрализации лишен многих недостатков, возникающих при использовании анаболических гормонов или рекомбинантного соматотропина. Механизм действия соматостатиновой иммунонейтрализации основан на временном связывании эндогенного SST специфическими антителами и увеличении в организме животного концентрации эндогенного соматотропного гормона в физиологических пределах. Однако широкое применение метода активной иммунизации животных против эндогенного SST-14 длительное время было невозможно вследствие его высокой стоимости, поскольку основным путем получения пептида являлся химический синтез, что экономически не позволяло реализовать данный подход на практике. Небольшие размеры SST-14 не позволяют осуществить его прямой микробный синтез с помощью технологии рекомбинантной ДНК, описано несколько способов его синтеза в форме химерных белков с последующим выделением целевого продукта, не давших удовлетворительных результатов (Itakura et al., 1977, Science 198(4321): 1056-63; Nespovitaya et al., 2014, Protein Expr Purif. 99:78-86; Maicas et al., 2013, Mol Biotechnol. 55(2):150-158).
Луниным В.Г. с соавторами патент RU 2 031 121 СТ был разработан инъекционный препарат для повышения мясной и молочной продуктивности сельскохозяйственных животных и птиц на основе химерного белка с водонерастворимой ферментативно неактивной хлорамфениколацетилтрансферазой (Сат) без 10 С-терминальных аминокислот, аминокислотным спейсером и SST-14 с последовательностью аминокислот AGCKNFFWKTFTSC (Сом) в масляном растворе с добавками.
Лунин В.Г. с соавторами получили патент RU 2561467 на «Способ получения препарата для повышения мясной и молочной продуктивности сельскохозяйственных животных (варианты) и препарат, полученный на его основе». Юдин СМ. с соавторами обнаружили, что разработанный ранее препарат Сат-Сом на основе рекомбинантного SST улучшает также репродуктивные способности, способствуя повышению спермопродукции самцов сельскохозяйственных животных, петухов и человека (патентная заявка RU(11) 2493873(13) С1 Юдин С.М. с соавторами «Инъекционный препарат для повышения спермопродукции у производителей сельскохозяйственных животных и петухов и способ его применения»; патент РФ на изобретение №2 526 571, Юдин С.М. и Юдина Т.И. "Инъекционный препарат для повышения спермопродукции человека и способ его применения"). Оба изобретения предназначены для повышения репродуктивной способности организма, позволяют увеличить объем эякулята и повысить некоторые качественные характеристики спермы. Инъекционный препарат применяли петухам, сельскохозяйственным животным и человеку по достижении физиологической зрелости из расчета 50-200 мкг химерного белка Сат-Сом на 1 кг живой массы тела. Изобретения позволяют повысить спермопродукцию: увеличить объем эякулята и снизить брак спермы по биологическим показателям у производителей сельскохозяйственных животных, петухов и человека путем использования препарата для инъекций. Дальнейшие исследования, проведенные заявителями, показали, что иммунизация соматостатин содержащим препаратом Сат-Сом самок крыс приводит к увеличению размера яичника, а также к увеличению первичных и вторичных фолликул в яичнике животных (Юдин С.М. и др., 2017; Влияние соматостатин содержащего средства на фолликулогенез. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 16(2):26-33).
Однако технология очистки этого соматостатин содержащего белка Сат-Сом не позволяет полностью освободиться от некоторых бактериальных белков, липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента, что не соответствует современным биотехнологическим стандартам качества иммунобиологических препаратов. Является также большой проблемой формирование SST правильной нативной U-образной структуры с формированием цистеинового мостика между цистеинами в третьем и четырнадцатом положении (фиг. 1).
Для преодоления возникших технологических проблем был разработан новый соматостатин содержащий рекомбинантный белок, состоящий из глюкансвязывающего домена (GBD), разделяющего спейсера (sp) и двух укороченных вариантов SST с последовательностью KNFFWKTFTS и получившей название антигенной детерминанты соматостатина (SSTad): GBD-sp-SSTad-sp-SSTad.
Пептид с последовательностью KNFFWKTFTS известен из US 4261885. Однако в данном документе речь идет о подавлении пролиферации клеток аденомы гипофиза. Следовательно, специалист не мог усмотреть связь между указанным пептидом и назначением, по которому используется настоящее изобретение, а тем более техническим результатом, достигаемым при реализации изобретения. Выше было сказано, что маленькие размеры соматостатина-14 являются проблемой микробного синтеза, что не позволяло специалисту искать пути наработки, связанные с еще большим уменьшением размера пептида. При этом предположить, что именно фрагмент соматостатина из указанных 10 аминокислот покажет себя в качестве действенного средства для повышения фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птицы и человека.
В отличие от технологии, разработанной Geugeon et al., которая требует систематического применения дорогостоящих производных SST аналогов-антагонистов на протяжении многих месяцев, данная технология позволяет снизить концентрацию SST в крови животных и уменьшить связывание SST с рецепторами после двух-трех иммунизаций препаратом рекомбинантного соматостатин содержащего белка и формирования оптимального титра нейтрализации аутоантител.
Цель настоящего изобретения заключается в разработке метода стимуляции иммуногенной соматостатин содержащей композицией фолликуло- и спермогенеза у человека, млекопитающих, животных и птиц за счет связывания эндогенного SST, увеличения активности половых гормонов в сыворотке крови и индукции комплексных перестроек адаптивного генеза, выражающихся в структурных преобразованиях органов репродуктивной системы, и направленных на стимуляцию воспроизводительного потенциала млекопитающих животных, птиц и человека, при использовании препарата для инъекций, соответствующего требованиям к анализу фармацевтических субстанций с использованием разрешенных адъювантов, позволяющего осуществлять инъекции без болезненных ощущений.
Исходя из поставленной цели, задача настоящего изобретения состоит в создании рекомбинантного иммунологически активного соматостатин содержащего белка, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении SST как антигена, который может быть использован для стимуляции фолликуло- и спермогенеза млекопитающих животных, птиц и человека, за счет индукции синтеза специфических аутоантител к SST, блокировании его действия. Другая задача изобретения заключается в реализации препарата на основе указанного белка и в создании способа использования этого препарата, решающего проблему получения в организме аутоантител к SST, приводящих к повышению концентрации половых гормонов и усилении активности фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птиц и человека, при условии систематического применения препарата. Следует отметить, что аминокислотная последовательность SST идентична как у человека, так и у всех млекопитающих животных и птиц. Вследствие этого разработанный препарат является универсальным средством для повышения фолликуло- и спермогенеза у человека, млекопитающих животных и птиц.
Преимущество вышеупомянутого решения заключается в возможности приготовления лекарственного средства, основанного на аутоантигене SST, для ускорения начала роста покоящихся фолликулов. В среднем, одна супружеская пара из шести, желающих завести ребенка, испытывает трудности с его зачатием. Хотя существует много причин, обусловливающих полиэтиологичность этого недуга, для лечения бесплодия человека были разработаны и обычно используются два метода лечения, названные «деторождением с медицинской помощью», которые призваны индуцировать одновременный рост нескольких преовуляторных фолликулов. Это позволяет получить несколько зрелых ооцитов и, тем самым, несколько эмбрионов и, таким образом, повысить шанс зачатия. Упомянутое достигается введением одного или более лекарственных средств, стимулирующих секрецию гонадотропинов FSH (фолликулостимулирующего гормона) и LH гипофизом, таких как антиэстроген (например, кломифена цитрат или тамоксифен) или ингибитор ароматазы (например, летрозол, анастразол или эксеместан). Одновременный рост нескольких преовуляторных фолликулов также может быть индуцирован введением препарата человеческого FSH (экстрактивного или рекомбинантного) в сочетании с LH или без такового. Когда фолликулы достигают преовуляторного размера, в зависимости от причины стерильности, выбирают один из двух методов лечения (вид терапии). Первый заключается во внутриматочном оплодотворении (IUI), а второй - в удалении ооцитов из яичника посредством аспирации фолликулов (от 5 до 15 ооцитов) и оплодотворении в лаборатории (in vitro) либо с помощью простой совместной инкубации ооцитов со спермой партнера (IVF), либо микроинъекции сперматозоида непосредственно в ооцит (ICSI). Требуется обязательно получить несколько зрелых ооцитов, чтобы оптимизировать частоту удачных процедур (частоту наступления беременности) при данном лечении; однако у некоторых женщин, несмотря на адекватную стимуляцию яичников, количество полученных ооцитов низкое или даже равно одному. Слабая реакция на стимулирующее лечение является результатом ограниченного числа растущих фолликулов, которые присутствуют в яичниках данных пациенток. Следовательно, возможность активизировать фолликулы яичникового резерва и заставить их вступить в фазу роста является значительным лечебным преимуществом. Преимущество этого решения заключается, прежде всего, в возможности использования аутоантигена SST в лечении женского бесплодия.
Другим объектом настоящего изобретения является применение аутоантигена SST для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для того, чтобы ускорить начало роста покоящихся фолликулов у особей женского пола, у которых не наступила менопауза, и сперматоцитов у особей мужского пола. Введение такого лекарственного средства повышает у особей женского пола количество фолликулов, находящихся в фазе роста, которые можно стимулировать при стандартных способах лечения, чтобы достичь стадии преовуляторных фолликулов и количество сперматид и сперматозоидов у особей мужского пола. В начале 20 века нормой считалась концентрация 60-100 млн сперматозоидов в 1 мл эякулята (Macomber and Sanders, 1929, N Engl J. Mod. 200:981), в дальнейшем нижняя граница концентрации сперматозоидов в эякуляте, условно разделяющая нормоспермию и олигозооспермию, была снижена сначала до 40 млн/мл, затем до 20 млн/мл (Mac Leod and Gold, 1951, J. Urol. 66:436 442). В соответствии с новейшими рекомендациями ВОЗ 2010 года нормой была признана концентрация 15 млн сперматозоидов в 1 миллилитре эякулята. Продолжающееся по невыясненным причинам снижение активности сперматогенеза настоятельно требует его стимуляции не только при патологиях, но и при нормальной, согласно критериям ВОЗ 2010 года, продукции половых клеток (World Health Organization. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 2010).
Согласно настоящему изобретению фармацевтический препарат, содержащий антигенную детерминанту SST, может вводиться парентеральным путем (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно) или чрезкожным путем. Подкожный путь предпочтителен, потому что он позволяет доставлять эффективные концентрации активного компонента к дендритным клеткам и макрофагам. Из используемой антигенной детерминанты SST в составе рекомбинантного белка с разрешенными адъювантами и необходимыми наполнителями готовится лекарственная форма, чтобы сделать возможным введение эффективным и воспроизводимым для каждого пути введения.
Доза препарата по настоящему изобретению, предназначенная для лечения вышеупомянутых болезней или расстройств и количество вакцинаций, может меняться в зависимости от способа введения, возраста и массы тела пациента, так же как от состояния пациента. Окончательное решение принимается лечащим врачом или ветеринаром.
Согласно результатам настоящего изобретения, заявители обнаружили, что за счет индукции синтеза специфических аутоантител к антигенной детерминанте SST удается подавлять ответы рецепторов SST. Это приводит к фармакологическому воздействию на овариальный резерв - ускорение начала роста покоящихся фолликул, что вызывает снижение процентного содержания примордиальных фолликулов и увеличивает процентное содержания первичных и вторичных фолликулов в сравнении с аналогичными показателями в контрольных группах животных, а также к увеличению спермогенеза у млекопитающих животных, птиц и человека.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает новое применение пептида, антигенной детерминанты соматостатина KNFFWKTFTS и его аналогов в составе слитных рекомбинантных белков, которые имеют возможность ускорить фолликуло- и спермогенез у млекопитающих животных, птиц и человека.
В первом аспекте изобретение относится к рекомбинантному белку GBD-SSTad-SSTad с молекулярной массой 39,5 кДа, включающий 2 фрагмента белка SST с последовательностью SEQ ID NO 1, Гли-Сер спейсер с последовательностью SEQ ID NO 2 или с последовательностью SEQ ID NO 3, альфа-глюкансвязывающего домен гена из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 4, кодируемый последовательностью нуклеотидов гена GBD-SSTad-SSTad SEQ ID NO 5.
Во втором аспекте изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad на глюкане, включающему: связывание белка GBD-SSTad-SSTad в составе клеточных экстрактов штамма E. coli BL21 [pGBD-SSTad-SSTad] с альфа-гликансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации, последующую отмывку от не связавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.
В третьем аспекте изобретение относится фармацевтической композиции, представляющей собой инъекционный препарат для усиления фолликуло- и спермогенеза млекопитающих животных, птицы и человека, содержащий рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad и приемлемый для инъекционного использования адъювант.
В четвертом аспекте изобретение обеспечивает способ повышения фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птицы и человека, включающий проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, в дозе 5-200 мкг указанного белка на один килограмм массы тела млекопитающего животного или птицы.
Кроме того, изобретение может относиться к фармацевтической упаковке или набору, содержащему одну или несколько емкостей, заполненных рекомбинантным белком по изобретению, с антигенной детерминантой соматостатина KNFFWKTFTS в составе слитных рекомбинантных белков.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к соединению с антигенной детерминантой соматостатина KNFFWKTFTS в составе слитных рекомбинантных белков, которые используются для ускорения начала роста покоящихся фолликулов, фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птиц и человека для лечения и профилактики бесплодия.
В предпочтительном варианте реализации изобретение относится к соединению с антигенной детерминантой соматостатина KNFFWKTFTS в составе слитных рекомбинантных белков для ускорения начала роста покоящихся фолликулов, фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птиц и человека, для лечения и профилактики бесплодия, когда ее активный компонент вводят млекопитающим животным, птице или человеку.
В более предпочтительном варианте реализации изобретение относится к соединению с антигенной детерминантой соматостатина KNFFWKTFTS в составе слитных рекомбинантных белков, для ускорения начала роста покоящихся фолликулов, фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птиц и человека для лечения и профилактики бесплодия, проходящих вспомогательное репродуктивное лечение.
Настоящее изобретение предлагает создание иммуногенной композиции соединения с антигенной детерминантой соматостатина KNFFWKTFTS и его аналогов и способы лечения бесплодия у пациентов (млекопитающих животных, птиц и человека), нуждающихся в таком лечении.
В одном варианте осуществления изобретения предложены новые полипептиды и полинуклеотиды, которые их кодируют, включая полипептид SSTad, слитые с белком носителем через функционально оптимизированный спейсер. Слитные полипептиды предлагаемого изобретения обеспечивают данную разработку высокоэффективными и недорогими материалами для применения при лечении бесплодия. Особую роль в данном изобретении, нераскрытую в приведенных аналогах, играет белок носитель (GBD), который выполняет целый ряд функций: белка-носителя для защиты низкомолекулярной SSTad от протеаз, аффинного домена для очистки слитного белка на полисахаридном сорбенте и иммобилизующего домена на высокомолекулярном полисахариде для укрупнения антигена и повышения его иммуногенности.
Используемые спейсерные последовательности оптимизированы по длине и составу для обеспечения эффективной экспрессии SSTad слитного с белком носителем у различных микроорганизмов, в частности у Е. coli. Новые спейсерные последовательности обеспечивают повышенную устойчивость к протеазам и оптимальное воздействие SSTad на иммунную систему пациента. Они способствуют формированию нативной U-образной структуры SSTad, которую имеет SST между двумя цистеинами, а также экспонируют ее в слитном белке наружу, формируя тем самым иммунодоминантный эпитоп.
В другом варианте реализации данного изобретения предложены новые адъювантные композиции, применяемые при лечении пациентов с бесплодием. В одном конкретном варианте применения соединение с SSTad можно комбинировать с новыми адъювантами и использовать при лечении бесплодия или состояний, связанных с дефицитом яйцеклеток, или состояний, таких как дефицит спермы у особей мужского пола или с целью профилактики этих заболеваний. Адъюванты в данном документе предназначены для оптимального использования у млекопитающих животных, птиц и, в частности, у человека. Адъюванты в настоящем документе обеспечивают повышенную иммуногенность антигена, что позволяет включать в вакцины меньшие количества антигена и получать более высокие титры специфических антител к SST.
В еще одном варианте реализации изобретения представлены фармакологические композиции, которые приводят к возникновению иммуногенности в отношении SSTad, что инициирует появление специфических антител, связыванию SST антителами и к снижению его содержания в крови. Таким образом, устраняется ингибирование, которое SST оказывает на высвобождение и созревание фолликул, а также на спермогенез. Варианты состава вакцины в данном изобретении оптимизированы как для безопасности, так и для целевого эффекта: достижения высокой иммуногенности конструкции с SSTad в безопасных и высокоэффективных адъювантных композициях. Вакцины по настоящему изобретению требуют меньших количеств антигена (по сравнению с концентрацией антигена в традиционных субъединичных вакцинах), имеют увеличенный срок хранения и более низкую стоимость.
Настоящее изобретение направлено на лечение бесплодия у человека и других позвоночных. К ним относятся млекопитающие животные и птицы, нуждающиеся в восстановлении количества созревающих фолликул и качества спермы.
Следующие определения приведены для облегчения понимания определенных терминов, часто используемых в данном изобретении, и не предназначены для ограничения объема настоящего раскрытия.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
«Пациент» относится к позвоночному теплокровному животному, обычно млекопитающему или птице, нуждающемуся в композиции и/или способе предлагаемых в настоящем изобретении, например, человеку (женщине), нуждающейся в восстановлении или увеличении количества созревающих яйцеклеток или человеку (мужчине), нуждающемуся в восстановлении или увеличении продукции и качества спермы.
«Лечение» относится к улучшению состояния пациента по сравнению с необработанным пациентом в относительно идентичной или исходной ситуации. Лечение обычно указывает на то, что желаемый фармакологический и/или физиологический эффект был достигнут с использованием композиций и способов ее применения, предлагаемых в настоящем изобретении. Лечение может включать профилактическое применение результатов изобретения.
Используемый здесь термин «лечение бесплодия» относится к лечению заболевания или состояния, связанного со здоровьем женской репродуктивной системы, выбранных из группы, включающей отказ яичников, преждевременную овариальную недостаточность, бесплодие, ановуляцию, бесплодие, характеризующееся «плохой ответной реакцией яичников» на терапию гонадотропином, задержку полового созревания, бесплодие, связанное с повышенными уровнями FSH, предварительная обработка ЭКО и APT (вспомогательная репродуктивная технология), спонтанная преждевременная овариальная недостаточность (ранняя менопауза), поликистозная болезнь яичников (уменьшение количества растущих фолликулов) и низкий ответ (плохой ответчик)на КОС (контролируемая стимуляция яичников).
Термин «лечение бесплодия» относящийся к лечению заболеваний, связанных со здоровьем мужской репродуктивной системы, выбранным из группы паренхиматозного бесплодия, связанного с плотностью и подвижностью сперматозоидов ниже нормы, к секреторным нарушениям сперматогенеза, первичной или вторичной его недостаточностью.
Термин «овариальный резерв» или «овариальный фолликулярный резерв» используется для описания количества оставшихся первичных фолликулов в яичниках.
Термин «примордиальные покоящиеся фолликулы» используется для описания спящих фолликулов или изначальных фолликулов из овариального резерва. Настоящее изобретение также относится к композиции и/или способу, предлагаемому в настоящем изобретении для его использования для ускорения созревания фолликулов из фолликулярного резерва в лечении бесплодия.
«Первичный фолликул (проснувшийся)» - округлое образование в яичнике млекопитающих, состоящее из ооцита первого порядка, окруженного блестящей оболочкой, несколькими слоями кубических фолликулярных клеток и соединительнотканной текой. Первичный фолликул в три-четыре раза больше примордиального.
«Вторичный фолликул» в десять раз больше примордиального. Вокруг яйцеклетки образуется полость с фолликулярной жидкостью, которая достигает в диаметре 2,5 сантиметра. Фолликулярные клетки образуют собственную усложненную, двуслойную структуру.
«Аминокислота» относится к любой из двадцати встречающихся в природе протеиногенных аминокислот, а также к любым модифицированным аминокислотам.
«Белок» и «пептид» используются для обозначения аминокислотного полимера или набора из двух или более взаимодействующих, или связанных аминокислотных полимеров.
«Антигенная детерминанта», или «эпитоп» (англ. epitope) - часть макромолекулы антигена, которая распознается иммунной системой (антителами, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами). Часть антитела, распознающая эпитоп, называется паратопом. Хотя обычно эпитопы относятся к чужеродным для данного организма молекулам (белкам, гликопротеинам, полисахаридам и др.), участки собственных молекул, распознаваемые иммунной системой, также называются эпитопами. Большинство эпитопов, распознаваемых антителами или В-клетками, представляют собой трехмерные структуры на поверхности молекул антигенов (конформационные эпитопы), которые точно совпадают по форме и пространственному расположению электрических зарядов и водородных связей с соответствующими паратопами антител.
«Выделение» относится к полинуклеотиду или полипептиду, который был отделен или извлечен по меньшей мере из продуктов разрушения клетки штамма-продуцента. Очистка полипептида от загрязняющих компонентов клетки и полипептидов может быть осуществлена с помощью любого набора хорошо известных методов, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, анионную или катионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия и аффинную хроматографию.
«Антитело» относится к Y-образной молекуле, имеющей пару антигенсвязывающих сайтов, шарнирную область и константную область.
«Вакцина» относится к любой композиции, которая может стимулировать иммунную систему вакцинированного субъекта к выработке антител к SST для целей, описанных в настоящем документе.
Соматостатин
SST представляет собой пептидный гормон, который ингибирует, среди прочего, высвобождение гормона роста из передней доли гипофиза. SST регулирует различные эндокринные функции посредством взаимодействия с рецепторами SST, связанными с G-белком, на эндокринных клетках-мишенях. SST выделяется из участков гипоталамуса, желудка, кишечника и поджелудочной железы. Контроль уровня SST у пациентов представляет интерес для повышения продуктивности млекопитающих животных и птиц, изменения пищевого поведения и увеличения фолликуло- и спермогенеза. Воздействие SST на половую систему описывает данное изобретение.
В исследованиях продуктивность млекопитающих животных была оптимизирована за счет вакцинации SST. В целом, у сельскохозяйственных животных, иммунизированных SST, прирост веса составлял 8-17%, аппетит снижался на 9%, а эффективность использования пищи увеличивалась на 11%. Животные, иммунизированные SST, а также их потомство имели правильные пропорции, и распределение веса животных между мышцами, костями и жиром такое же, как у контрольных животных (Reichlin, 1987, Lab Clin Med. 109(3):320-326). Таким образом, эти исследования показывают, что индукция аутоиммунитета к SST у целевого животного может обеспечить безопасные и эффективные результаты.
Известно, что SST оказывает ингибирующее действие на большое количество гормонов, участвующих в росте, усвоении пищи животными и регуляции половой системы. Как ранее описано в патенте США No. 6,316,004 и заявке на патент США Сер. №12/195979, SST и слитные варианты SST могут использоваться для иммунизации животных для увеличения суточной массы и, где это необходимо, для производства молока. Эти процедуры иммунизации были выполнены с традиционными адъювантами. Также иммунизация SST использовалась для лечения состояния дефицита эндогенного гормона роста (Haffer ЕР 2291194 В1). Иммунизация SSTad не использовалась ранее для лечения бесплодия.
Авторы настоящего изобретения получили неожиданный и воспроизводимый результат, демонстрирующий, что модифицированный антиген SST, иммуногенная композиции с SSTad и вакцинация может быть использована для лечения заболеваний или физиологических состояний пациента и, в частности, лечения и профилактики бесплодия.
Преимущества
Варианты настоящего изобретения обеспечивают основанные на SSTad способах лечения и профилактики бесплодия у позвоночных и, в частности, у млекопитающих и птиц. Типичные варианты реализации изобретения направлены на лечение людей, млекопитающих животных и птиц. Людей и других млекопитающих и птиц обрабатывают вакцинами данного изобретения (см. ниже) для ограничения или ингибирования воздействия эндогенного SST на половую систему. Вакцины в данном изобретении будут приводить к дополнительному фолликуло- и спермогенезу. Вакцины с SSTad и адъювантами оптимизированы для использования у позвоночных и, в частности, для лечения заболеваний людей, вызывающих бесплодие. Поскольку SST является высоко консервативным гормоном у позвоночных, варианты реализации настоящего изобретения полезны для вызывания иммунного ответа у всех целевых позвоночных, вакцинированных с использованием способов и композиций, описанных в данном изобретении. Значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что у вакцинированных пациентов может проходить от нескольких недель до нескольких месяцев между бустерными иммунизациями, что позволяет иммунной системе пациента связывать SST, снижать его концентрацию и/или выводить его из организма в течение длительного времени.
Технические аспекты настоящего изобретения облегчают все этапы производства и применения вакцины на основе SSTad, обеспечивая простую и эффективную технологию получения субстанции SSTad и создания высоко иммуногенной композиции для применения в профилактике и лечении бесплодия. Это соединение для иммунизации на основе SSTad было оптимизировано как по экспрессии в клетках продуцента, по технологии очистки и формирования нативной конформации SST, так и по формулированию иммуногенной композиции.
Во всех вариантах генно-инженерных конструкций SSTad экспрессируется в виде кодон-оптимизированного химерного белка-носителя, спейсера и SSTad. Белок-носитель за счет связывания с полисахаридными сорбентами обеспечивает простую и эффективную технологию очистки от других бактериальных белков, липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента. Антигены на основе SSTad данного изобретения за счет связывания белка-носителя с высокополимерными растворимыми полисахаридами обеспечивает формирование молекулярных комплексов большего размера (20-40 нм), обеспечивающих иммуногенность и устойчивость к деградации протеазами. Таким образом, SSTad по настоящему изобретению присутствует в составе иммуногенной композиции в тканях у пациента более продолжительное время, вызывая большее воздействие на иммунную систему пациента. Как будет более подробно описано ниже, настоящее изобретение также обеспечивает максимизированный иммунный ответ за счет оптимизированных адъювантов.
Новые варианты вакцин для использования при лечении бесплодия
Соматостатин имеет две активные формы, которые продуцируются альтернативным расщеплением пропептида - соматостатин-28 и соматостатин-14. Однако аминокислотная последовательность тетрадекапептида, которая связывается с рецепторами SST представляет собой более короткие пептиды KNFFWKTFTS (SEQ ID NO: 1), NFFWKTFT, FFWKTF и FWKT, что подтверждено многочисленными синтетическими аналогами SST (Heidarpour et al.,2019, J Res Med Sci. 26:24-29). FWKT является ключевой последовательностью, необходимой для специфического связывания с рецептором. Следовательно, FWKT является минимальным ключевым эпитопом для нейтрализации взаимодействия SST с рецептором антителами. Однако с помощью технологии рекомбинантных белков очень сложно воспроизвести U-образную конформацию такого короткого пептида (фиг. 2).
Последовательность KNFFWKTFTS высококонсервативна среди позвоночных (Lin et al., Comp. 1998, Biochem. Physiol. С. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 119 (3):375-388) и как показано в этом изобретении, оптимальна для формирования специфического иммунного ответа.
Полисахарид-связывающий домен может быть присоединен к SSTad через спейсер переменной длины. Спейсер необходим для обеспечения представления закодированного соматостатина на поверхности белковой молекулы, а также оптимальной презентации иммунной системе пациента. Варианты осуществления спейсера в данном изобретении обеспечивают эффективное формирование U-образной конформации SST, повышенную устойчивость к протеазам и оптимальное воздействие на эпитоп и показали неожиданное улучшение по сравнению с конструкциями, не имеющими спейсерной последовательности и/или других последовательностей, отличных от представленной в настоящем изобретении.
Спейсерные варианты были оптимизированы по длине и составу для обеспечения эффективной экспрессии SSTad слитного с белком носителем у различных микроорганизмов, в частности у E.coli. Как отмечено выше, эти новые спейсерные последовательности обеспечивают повышенную устойчивость к протеазам (таким образом, обеспечивая увеличение продукции антител по сравнению с аналогичными показателями у конструкций, раскрытых в патенте США №6,316,004) и оптимальное воздействие на иммунную систему пациента. Эта комбинация SSTad, присоединенная к полисахарид связывающему домену с помощью оптимально сконфигурированного спейсера, показывает неожиданное улучшение при иммунизации целевых пациентов для увеличения фолликуло- и спермогенеза в сравнении с результатами по иммунизации с применением препарата Сат-Сом. Указанные конструкции предполагается использовать в качестве антигенов с SSTad при лечении бесплодия.
Эти слитные рекомбинантные белки с SSTad демонстрируют высокую стабильность при хранении. Кроме того, антигены на основе SSTad в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения у пациента, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов. Отмечено, что другие полипептиды-носители могут заменять полисахарид-связывающий домен для присоединения к SSTad. Например, SSTad можно комбинировать с KLH, столбнячным токсоидом, CRM 197, хлорамфениколацетилтрансферазой или другими белковыми носителями.
Варианты осуществления изобретения также обеспечивают новые адъювантные композиции для усиления индукции гуморального иммунитета у целевого пациента. Эти адъювантные композиции обеспечивают значительное улучшение по сравнению с традиционными (гидроокись алюминия, масло) для индукции гуморального ответа и безопасны при использовании для человека, млекопитающих животных и птиц. Адъювантные композиции здесь используются с антигенами на основе SSTad для получения вакцин в данном изобретении.
В одном варианте изобретения иммунологический адъювант включает декстран-500 для связывания белка-носителя и формирования высокополимерных растворимых полисахаридами молекулярных комплексов большего размера (20-40 нм), обеспечивающих иммуногенность и устойчивость к деградации протеазами. ДЕАЕ-декстран-500 связывает CpG олигонуклеотиды и обеспечивает их устойчивость к деградации нуклеазами. Более подробно, комплекс готовят с использованием CpG олигонуклеотида 1585 для животных и CpG олигонуклеотида 2216 для человека. CpG олигонуклеотиды получают олигонуклеотидным синтезом. В некоторых вариантах реализации изобретения может быть использован монофосфорил-липид А, мурамилдипептид, полимурамил или другие лиганды толл-подобных рецепторов, но использование CpG олигонуклеотида более предпочтительно при лечении бесплодия. Возможно использование иммуногенной композиции без CpG олигонуклеотида, но для достижения сравнимого результата в лечении бесплодия будет требоваться существенно большие количества слитного белка с SSTad и более продолжительная схема иммунизации. CpG олигонуклеотиды растворяют в физиологическом растворе. Адъювантные композиции объединяют со слитным рекомбинантным белком с SSTad для получения вакцин по изобретению (пример 5).
В еще одном варианте осуществления иммунологический адъювант включает Montanide™ (примеры 6, 7, 8) или гидроокись алюминия (пример 9). Адъюванты объединяют со слитными полипептидами с SSTad для получения вакцин по изобретению. Адъюванты, используемые в настоящем изобретении, безопасны и эффективны для использования на млекопитающих животных, птицах и человеке, в их составе отсутствуют продукты животного происхождения и канцерогенные соединения.
Конкретная комбинация адъювантов и концентрации приведена ниже.
Векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим полинуклеотидные молекулы по изобретению, а также к клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами. Любая из полинуклеотидных молекул по изобретению может быть присоединена к вектору, который обычно включает селектируемый маркер и участок репликации, для соответствующей клетки-продуцента. Клетки-продуценты генетически сконструированы так, чтобы реплицировать эти векторы и, тем самым, экспрессировать белки из данного изобретения. Обычно векторы в предлагаемых примерах включают молекулы полинуклеотидов данного изобретения, функционально связанные с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными последовательностями, такими как последовательности для бактериальных или вирусных клеток-хозяев. Примеры регуляторных последовательностей включают транскрипционные промоторы, операторы, сайты связывания мРНК с рибосомами и соответствующие последовательности, которые контролируют транскрипцию и трансляцию. Нуклеотидные последовательности функционально связаны, когда регуляторные последовательности в данном изобретении функционально относятся к полинуклеотидам, кодирующим слитный полипептид данного изобретения.
Типичные векторы включают плазмиды, дрожжевые челночные векторы, бакуловирус, модифицированный аденовирус и тому подобное. В одном варианте осуществления носитель представляет собой модифицированную плазмиду pET30. Клетки-хозяева для использования в настоящем изобретении включают бактерии, например, E.coli, дрожжи, клетки насекомых SF-9, клетки млекопитающих, растения и тому подобное.
В одном из вариантов реализации регуляторные последовательности включают промотор T7lac, Trp или Т5 для экспрессии слитных белков данного изобретения в клетках E.coli или других клетках прокариотов. Эти регуляторные последовательности известны в данной области и используются в соответствующих и известных условиях. Различные плазмиды данного изобретения были сконструированы для экспрессии слитных белков данного изобретения путем использования регуляторных последовательностей. Предпочтительными являются плазмиды с промотором T7lac.
Клетки-хозяева для экспрессии целевых слитных белков включают прокариотические, дрожжевые и высшие эукариотические клетки. Иллюстративные прокариотические хозяева включают клетки бактерий родов Escherichia, Salmonella и Bacillus, а также родов Pseudomonas и Streptomyces. В типичной реализации клетка-хозяин принадлежит к роду Escherichia и может представлять собой Escherichia coli (E.coli). Как показано в приведенных ниже примерах, конструкции в данном изобретении обеспечивают оптимальную экспрессию SSTad соединенной спейсером с полисахарид-связывающим доменом в различных условиях. Эти конструкции особенно эффективны для экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах и, в частности, в бактериях родов Escherichia.
В одном варианте осуществления клетки E.coli трансформируют плазмидой - рЕТ -содержащей ген слитного белка с SSTad, имеющей подходящие регуляторные последовательности для экспрессии в клетках E.coli. В некоторых случаях ферментация приблизительно десяти литров этих клеток приводит к получению не менее 100 граммов общей биомассы, что в дальнейшем составляет приблизительно 10 граммов общего белка. По окрашиванию серебром и кумасси синим, четвертая часть массы белка является целевым белком.
Очистка слитного белка GBD-SSTad-SSTad
Слитный белок может быть очищен в соответствии с известными технологиями очистки белка, включая, например, лизис бактериальных клеток ферментом лизоцимом, разрушение ДНК на установках типа French-press, ультразвуком или ДНКазой, последующее дифференциальное центрифугирование телец-включения, растворение телец-включения в гуанидинхлориде или мочевине, процедуры рефолдинга, колоночную хроматографию на аффинных и ионобменных колонках и тому подобное.
Аспекты настоящего изобретения включают получение не содержащего эндотоксинов слитного иммуногенного белка. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения слитный белок получают практически в свободном от эндотоксина состоянии. Дополнительная очистка позволяет полностью удалить или снизить концентрацию эндотоксина до приемлемых уровней использования для человека в соответствии со стандартами фармакопеи. Как таковые, некоторые варианты реализации технологии в настоящем документе направлены на получение по существу не содержащих эндотоксинов слитных белков для использования в вакцинах. В некоторых вариантах осуществления уровни эндотоксина находятся на уровне 1 EU/мл или ниже, а в других вариантах осуществления уровни эндотоксина устранены, то есть слитные белки настоящего изобретения по существу не содержат эндотоксинов.
Концентрация очищенного слитного белка изменяется от 1 до 8 мг/мл и, как правило, от 4 до 6 мг/мл. В некоторых случаях по существу свободный от эндотоксина химерный белок вводится в вакцинные композиции в дозе приблизительно (от 1,5 до 5 мг) на 2 мл и более типично в дозе (от 2,0 до 3,5 мг) на 2 мл.
Вакцины
Вакцины в данном изобретении представляют собой комбинации иммунологических адъювантов, как описано здесь, и антигенов, необходимых для профилактики или лечения состояния пациента, связанного с бесплодием.
Фармацевтическая дозировка для воплощения вакцины в данном описании включает 1 -5 мг слитного рекомбинантного белка. Во всех вариантах исполнения вакцина должна быть стерильной, стабильной в условиях производства и хранения. Предотвращение роста числа микроорганизмов может быть достигнуто путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, бензилового спирта, парабенов, хлорбутанола, сорбиновой кислоты, тиомерсала и тому подобного.
Адъюванты по настоящему изобретению комбинируют со слитным полипептидом с SSTad для получения вакцины, полезной для лечения заболеваний и/или состояний, связанных с бесплодием.
Вакцины в данном изобретении обычно включают антиген SSTad в количестве рекомбинантного белка от 1 мг/мл до 10 мг/мл дозы.
Декстран 500 от 1 мг/мл до 10 мг/мл дозы,
ДЕАЕ-декстран 500 от 0,2 мг/мл до 2 мг/мл дозы,
Монофосфорил-липид А, мурамилдипептид и CpG олигонуклеотид 1585 от 0,02 мг/мл до 0,2 мг/мл.
Вакцинные растворы в данном изобретении получают путем смешивания материалов в необходимых количествах и объемах (антиген, адъювант, другие ингредиенты), и финальной стерилизация с помощью ультрафильтрации. Альтернативно, вакцинные растворы в данном изобретении могут быть приготовлены с использованием индивидуально простерилизованных компонентов перед окончательной составлением композиции.
Вакцины в данном изобретении могут быть приготовлены в виде стерильных лиофильно высушенных препаратов с CpG (пример №5), масляной эмульсии с Montanide™ (примеры №6, 7, 8) или взвеси с гидроокисью алюминия (пример №9). Эти препараты стабильны в условиях производства и хранения. Варианты вакцин в данном изобретении могут дополнительно включать диспергирующие или смачивающие агенты, суспендирующие агенты или другие подобные материалы.
Способ лечения заболеваний пациента
Изобретение обеспечивает вакцины фармацевтического качества, содержащие слитные белки с SSTad и адъюванты по данному изобретению. Такие вакцины могут вводиться пациентам, страдающих бесплодием.
Вакцины данного изобретения предназначены для терапии пациентов с бесплодием. В одном варианте использования вакцины данного изобретению применяли 2 раза, однако количество инъекций может быть увеличено до 3-5 бустеров по усмотрению медицинского специалиста или ветеринарного врача. Типичное количество вакцинного антигена составляет 50-100 мкг/мл слитного рекомбинантного белка на 1 кг веса пациента. Вакцины можно вводить известными способами. В одном из решений вакцина вводится посредством подкожной инъекции (примеры №5, 6, 7, 8). В другом варианте реализации вакцину вводят путем внутримышечной инъекции (пример №9).
За ходом лечения пациентов, получающих вакцинные варианты реализации изобретения, можно следить и обеспечивать дополнительные введения. Повышение уровня гормона роста и антител к SST - все это цели для мониторинга эффективности лечения. На основании наблюдения за отдельными пациентами дополнительные инъекции вакцины могут быть выполнены с использованием большего или меньшего количества антигена SST в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, альтернативные адъювантные комбинации могут использоваться для изменения реакции конкретного пациента на вакцинацию, что определяется медицинскими или ветеринарными врачами.
Варианты реализации предполагаемого лечения могут быть объединены с другими традиционными способами лечения бесплодия. Например, вакцинация, предполагаемая в данном изобретении, может сочетаться с традиционной гормональной терапией.
В целом, описываемое изобретение, будет легче понять, обратившись к следующим примерам, которые представлены в качестве иллюстрации.
ПРИМЕРЫ
Решение задачи по клонированию, наработке и очистке рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad обеспечивается следующими средствами и методами.
Рекомбинантный белок с молекулярной массой 39,5 кДа, включающий 2 фрагмента антигенной детерминанты соматостатина (SSTad) с последовательностью SEQID NO 1, спейсер 1 Гли-Сер с последовательностью SEQID NO 2, спейсер 2 для формирования U-образную конформации SST с последовательностью SEQ ID NO 3, альфа-глюкансвязывающего домен (GBD) гена из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 4. Указанный рекомбинантный белок кодируется последовательностью нуклеотидов гена GBD-SSTad-SSTad SEQ ID NO 5.
Способ получения рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad на глюкане включает:
- выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген GBD-SSTad-SSTad;
- связывание белка GBD-SSTad-SSTad в составе клеточных экстрактов штамма Е. coli BL21 с глюкансодержащем сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;
- последующую отмывку от не связавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.
Рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad включает в себя белковую последовательность глюкансвязывающего домена, определяющего способность данного белка связываться с глюкансодержащем сорбентом, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на глюкане. Иммобилизация на глюкане обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке глюкансвязывающего домена из альфа-глюкансвязывающего домена гена из Streptococcusmutans, который обладает высоким сродством к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений рН 6,0-9,0 и концентраций соли 0-3 М NaCl.
Поскольку в клетках E.coli отсутствуют белки, связывающиеся с альфа-глюканом, то синтезируемый в клетках рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, является единственным белком штамма-продуцента, прочно связывающимся с альфа-глюканом. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата рекомбинантного белка, иммобилизованного на глюкансодержащем сорбенте.
Инъекционный препарат для повышения фолликуло- и спермогенеза млекопитающих животных, птицы и человека, содержит рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, охарактеризованный выше, суспендированный в среде из глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе. Метод повышения фолликуло- и спермогенеза млекопитающих животных, птицы и человека включает: двукратное, с интервалом в 14-20 суток, проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, суспендированный в среде из глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе, в дозе 5-200 мкг указанного белка на один килограмм массы тела пациента.
Таким образом, создан бифункциональный рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, обладающий способностью самопроизвольно связываться с глюкансодержащим сорбентом, формируя высокоиммуногенную композицию в форме полиантигена, индуцировать синтез специфических аутоантител к SST при введении пациентам и, как следствие, стимулировать фолликуло- и спермогенез.
Пример 1. Получение рекомбинантного слитного белка GBD-SSTad-SSTad
На первом этапе осуществляют получение гена антигенной детерминанты соматостатина с последующим его клонированием. Ген SSTad получали химико-ферментативным методом. Был создан олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, оптимизированный для экспрессии в E.coli. Затем осуществляли получение плазмиды GBD-SSTad-SSTad, содержащей последовательности, кодирующие соматостатин, спейсер и глюкансвязывающий домен (GBD).
Пример 2. Получение штамма E.coli - продуцента рекомбинантного антигена соматостатина, соединенного с глюкансвязывающим доменом
Для получения штамма E.coli - продуцента рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad клетки E.coli BL21 трансформировали плазмидой pGBD-SSTad-SSTad. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 часов при температуре 37°C. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма E.coli BL21 [pGBD-SSTad-SSTad] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad массой в 39,5 кДа. Уровень синтеза белков в E.coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка-стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad синтезируется в клетках E.coli в нерастворимой форме в виде телец-включения.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad иммобилизированным на альфа-глюкане
Для получения рекомбинантного белка клеточную культуру штамма E.coli BL21 [pGBD-SSTad-SSTad] выращивали в 1000 мл среды LB (Luria broth) с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5000g в течение 15 минут.
Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000g нерастворимый белок GBD-SSTad-SSTad оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8М мочевине, центрифугировали при 12000g 30 минут и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в четыре раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25°С в течение 2 часов. Центрифугировали при частоте оборотов, равной 8000g, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза. Иммобилизованный на альфа-глюкане антиген GBD-SSTad-SSTad представляет собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты препарата составляла не менее 95%. Консервацию препарата проводили, добавляя бензиловый спирт до конечной концентрации 0,1% (по объему).
Пример 4. Биологическое действие рекомбинантного белков GBD-SSTad-SSTad
В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат содержит рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, лиофильно высушенный с необходимыми вспомогательными веществами и CpG олигонуклеотидом или суспендированный в водно-масляной суспензии Montanide™ (50% по массе) или гидроокиси алюминия, используется путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата дважды с межинъекционным интервалом 20 суток в дозе 5-200 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы. Механизм действия препарата основан на временном блокировании активности эндогенного SST с помощью аутоантител.
Следующие примеры иллюстрируют эффективность применения препарата для усиления активности фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птицы и человека иллюстрируется следующими примерами.
Пример 5.
Для описания действия in vivo инъекционного препарата с антигенной детерминантой SST и установить его влияние на развитие первичного фолликула, заявители патента провели исследования на модели мышей in vivo. Близкое сходство репродуктивной системы, особенно в отношении морфологии яичников, физиологии и эндокринологии яичников грызунов и женщин делает мышь полезной моделью для изучения контроля функции яичников, аневризма плодовитости и овариального резерва (Dixon et al., 2014, J Toxicol Pathol, 27 (3-4 Suppl); Cora et al., 2015, Toxicol Pathol., 43(6):776-793). Согласно результатам вышеуказанного исследования, заявители неожиданным образом обнаружили, что за счет индукции синтеза специфических аутоантител к SST удается подавлять ответы рецепторов SST, что приводит к фармакологическому воздействию на овариальный резерв яичников и как следствие-ускорение начала роста покоящихся фолликул. Этот эффект способствовал увеличению количества первичных и вторичных фолликулов по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе животных.
Биологическая активность полученной иммуногенной композиции была исследована путем подкожных инъекций дважды с интервалом 20 суток в дозе 50 мкг рекомбинантного белка на одно животное. Лиофильно высушенный вакцинный препарат суспендировали в физрастворе и вводили подкожно.
4
3
В таблице 1 представлены результаты иммуноферментного анализа (ИФА) крови в виде титров антител. В данном случае проводилось сравнение полученных титров антител в пробах крови мышей после иммунизации четырьмя композициями вакцин с использованием рекомбинантного GBD-SSTad-SSTad в качестве антигена и различных адъювантов в каждой. Отличаются вакцины отсутствием или использованием молекулярных адъювантов, которыми являлись монофосфорил-липид А, мурамилдипептид и CpG олигонуклеотид 1585. На каждую композицию была выделена группа из 5 мышей. По полученным результатам в каждой группе были выведены среднее значения параметров разведения ИФА (титр). Наибольшее значение, равное 6×10, получено в группе мышей, иммунизированных композицией с использованием CpG олигонуклеотида. Наименьшее значение, равное 2×10, выявлено в группе мышей, иммунизированных композицией с использованием только декстрана. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что наиболее яркий иммунный ответ вызывает композиция с использованием CpG олигонуклеотида в качестве адъюванта.
GBD-SSTad-SSTad - рекомбинантный белок, Декстран 500, ДЕАЕ-Декстран 500, МФЛА - монофосфорил-липид А, МДП - мурамилдипептид, CpG - олигонуклеотид.
Результаты гистологического исследования
Несмотря на различия в значениях параметров разведения ИФА при использовании композиций с разного рода адъювантами, фолликулярный ответ находится примерно на одном уровне во всех группах исследованных мышей.
По результатам гистологического исследования яичников мышей, иммунизированных GBD-SSTad-SSTad исследуемыми ранее композициями, было выявлено значительное увеличение количества фолликулов со среднего значения в контрольной группе, равного 11.1, до 18.8 в группе вакцинированных мышей, что равно 69% прироста. Данный показатель включает общее количество всех фолликулов: от примордиальных до пузырчатых и Граафовых пузырьков и характеризует увеличение скорости их дифференцировки, что может быть расценено как положительный эффект фолликулогенеза.
Увеличилось также общее количество структурно-функциональных элементов со среднего значения 25.8 в контрольной группе до 43.1 в группах после вакцинации. Процент прироста равен 67. В этот показатель включены помимо фолликулов, еще атретические элементы и желтые тела. Последние образуются в лютеиновой фазе после выхода яйцеклетки, в крайне редких случаях имеет место быть лютеинизация неовулировавших фолликулов, соответственно данный показатель можно интерпретировать как количество вышедших зрелых яйцеклеток. В контрольной группе среднее количество желтых тел составило 8.2. В тестовых группах этот показатель равен 13.3 (прирост 62%), что говорит о положительном влиянии иммунонейтрализации эндогенного SST на увеличение выхода яйцеклеток во время овуляции.
Атретические элементы образуются на разных стадиях фолликулогенеза, представляют собой не достигшие стадии зрелого Граафового пузырька и претерпевающие изменения деструктивного характера фолликулы. Здесь также прослеживается увеличение количества элементов после иммунонейтрализации с 6.5 в контроле до 11.0 в тестовых группах (прирост 69%) что укладывается в показатель увеличения фолликулов и общего увеличения количества структурно-функциональных элементов яичников.
Близкие значения исследуемых параметров были получены в работах и патентах (Gougeon, 2011, Gynecol Obstet Fertil. 39(9):511-3; Gougeon et al., 2010, Endocrinology 151(3):1299-309; Gougeon and Loumaye EP 20040791488 08.10.2004; Gougeon US 20070155659 A1 5.7.2007; Tran and Gotteland EP2835136A1 11.02.2015) при использовании аналого-антагонистов SST.
Пример 6.
Было проведено исследование препарата GBD-SSTad-SSTad на восстановление половой цикличности и плодовитости молочных коров с гипофункцией яичников.
Одной из причин, сдерживающих максимальную реализацию репродуктивного и продуктивного потенциала высокопродуктивных молочных коров, является послеродовые овариопатии, основной формой которых является гипофункция яичников, характеризующаяся депрессией фолликулогенеза и овуляции. Послеродовая овариальная дисфункция относится к гипоталамо-гипофизарным болезням регуляции, связанным с функциональными сдвигами в нейроэндокринной системе.
Эксперимент проводили на 40 бесплодных коровах с клинически выраженными признаками гипофункции яичников. У животных отмечали стойкую анафродизию (отсутствие возобновления половой цикличности после родов в течение 2.5-3.0 мес). Трансректальное ультразвуковое обследование показало, что яичники уменьшены в размерах, а диаметр растущих фолликулов достигает 6-10 мм.
Опыт был поставлен на 40 коровах, которых распределили на 2 группы по 20 голов в каждой. Животным первой группы инъецировали GBD-SSTad-SSTad в дозе 50 мкг на кг живой массы тела (подбор дозы для крупных животных приведен в примере 3). Рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, суспендированный в среде из альфа-гликана (50% по массе), водно-масляной суспензии Montanide™ (50% по массе) вводили двукратно подкожно с интервалом 20 суток. Особей второй (интактные) группы выбрали в качестве контроля. Наблюдение за ними проводили в течение 3 месяцев.
В течение 3 месяцев у коров контрольной группы плодовитость восстановилась только в 26,7% случаев, при назначении животным препарата с белком GBD-SSTad-SSTad - в 85,7% случаев (табл. 3). Продолжительность бесплодия на одну, включенную в опыт корову, при использовании GBD-SSTad-SSTad снизилась в 1,8 раза.
Таким образом, препарат GBD-SSTad-SSTad при применении коровам с гипофункцией яичников специфически действует на систему гипофиз-гонады, нивелируя послеродовые овариопатии, характеризующаяся депрессией фолликулогенеза и овуляции.
Пример 7.
Эффективность применения препарата для повышения сперматогенеза у производителей сельскохозяйственных животных, находящихся в стадии физиологической зрелости, иллюстрируется следующими примерами. Для подбора оптимального количества препарата (подбор дозы) трем группам животных хряков-производителей крупной белой породы препарат GBD-SSTad-SSTad был введен двукратно с интервалом 20 суток из расчета 25 или 50 или 100 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела. Рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad суспендировали в среде из альфа-гликана (50% по массе), водно-масляной суспензии Montanide™ (50% по массе) вводили подкожно. У хряков-производителей до и после применения препарата установленным порядком осуществляли взятие спермы и определяли объем эякулята, концентрацию сперматозоидов в эякуляте и количество спермодоз. Показатели спермопродукции хряков при применении препарата в дозе 25 мкг на 1 кг живой массы тела приведены в таблице 4. Препарат оказал положительное влияние на спермопродукцию хряков.
Как следует из представленных результатов в таблице 4, препарат GBD-SSTad-SSTad в дозе 25 мкг действующего вещества на килограмм живой массы тела хряков крупной белой породы вызвал незначительное повышение спермопродукции по сравнению с исходными показателями. Объем эякулятов повысился в зависимости от времени контроля этого показателя (30, 60, 90 дней после второй инъекции препарата) на 5,9-8,0%. Концентрация сперматозоидов в эякулятах возросла на 2,8-5,8%, что привело к увеличению количества спермодоз, полученных от одного животного, на 15,4-16,7%.
Показатели спермопродукции хряков крупной белой породы при применении препарата GBD-SSTad-SSTad в дозе 50 мкг рекомбинантного белка на один килограмм живой массы тела приведены в таблице 5.
Как следует из представленных в таблице 5 результатов, введение препарата GBD-SSTad-SSTad в дозе 50 мкг действующего вещества на один килограмм живой массы тела хряков крупной белой породы обусловило значительное повышение спермопродукции по сравнению с исходными показателями. Объем эякулятов животных повысился в зависимости от времени контроля этого показателя (30, 60, 90 дней после второй инъекции препарата) на 13,9-20,0%.
Концентрация сперматозоидов в полученных эякулятах животных возросла на 13,2-15,0%, что привело к увеличению количества спермодоз, полученных от одного животного, на 26,8-35,6%.
Показатели спермопродукции хряков крупной белой породы при применении препарата GBD-SSTad-SSTad в дозе 100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм живой массы тела приведены в таблице 6.
Как следует из представленных в таблице 6 результатов, введение животным препарата GBD-SSTad-SSTad в дозе 100 мкг действующего вещества (рекомбинантного белка) на один килограмм живой массы тела хряков крупной белой породы обусловило повышение спермопродукции по сравнению с исходными показателями. Объем эякулятов животных достоверно повысился в зависимости от времени контроля этого показателя (30, 60, 90 дней после второй инъекции препарата) на 14,8-19,3%. Концентрация сперматозоидов в эякулятах животных возросла на 8,3-10,7%, что привело к увеличению количества спермодоз, полученных от одного животного, на 21,5-33,0%.
Таким образом, проведенные в условиях промышленного свинокомплекса эксперименты по обоснованию наиболее эффективной дозы препарата GBD-SSTad-SSTad показали его фармакологическую активность и перспективность его применения для стимуляции сперматогенеза у хряков-производителей пород крупная белая.
При двукратном применении препарата GBD-SSTad-SSTad 50 и 100 мкг на килограмм массы животного наблюдается примерно одинаковый биологический эффект. Поэтому целесообразным является использование дозы GBD-SSTad-SSTad, равной 50 мкг/килограмм массы животного.
Анализ спермограмм хряков показал повышение сперматогенеза после применения препарата в дозе 50 мкг белка на килограмм живой массы тела (табл. 7). У хряков на протяжении всего периода наблюдений отмечено повышение общего объема эякулятов, концентрации и подвижности сперматозоидов, что привело к достоверному увеличению числа спермодоз на 25,2%, пригодных для осеменения свиноматок и ремонтных свинок по отношению к исходному уровню. В эякулятах животных опытной группы через 60 дней после применения препарата GBD-SSTad-SSTad установили повышение абсолютной выживаемости сперматозоидов к исходному уровню на 10%.
При осеменении свиноматок эякулятами, полученными от производителей, которым применяли препарат GBD-SSTad-SSTad, установили повышение оплодотворяющей способности спермы. В группах свиноматок, осемененных спермой хряков, которым был применен препарат, наблюдали тенденцию к повышению многоплодия, в том числе, увеличение числа живых новорожденных поросят на 10%.
Пример 8.
Препарат быкам-производителям молочной породы, содержащий рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, суспендированный в среде из альфа-гликана (50% по массе), водно-масляной суспензии Montanide™ (50% по массе) вводили двукратно подкожно с интервалом 20 суток из расчета 50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Показатели спермопродукции животных на 30, 60 и 90 сутки после второй инъекции препарата представлены в таблице 8.
Результаты применения препарата GBD-SSTad-SSTad свидетельствуют о его положительном влиянии на спермопродукцию и качество спермы быков. У быков-производителей молочной породы объемы эякулятов в течение срока наблюдения достоверно увеличились на 12%, количество спермодоз, полученных от одного животного, возросло на 40%, при одновременном сокращении процента брака спермы в двое. Концентрация сперматозоидов в эякулятах быков молочной породы в течение срока наблюдения оставалась на одном уровне.
Пример 9.
Эффективность применения препарата GBD-SSTad-SSTad для повышения сперматогенеза у петухов, находящихся в стадии физиологической зрелости, иллюстрируется следующими примером.
Изучение влияния препарата на продуктивные качества петухов производителей (двухлинейный гибрид плимутрок и корниш) проводили на птицеводческих предприятиях.
Препарат применяли в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка GBD-SSTad-SSTad, суспендированный в среде из альфа-гликана, суспензии гидроокиси алюминия, двукратно с интервалом 20 суток из расчета 50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела птиц. У петухов-производителей до и после применения препарата установленным порядком осуществляли взятие образцов спермы и определяли объем эякулята, концентрацию сперматозоидов в эякуляте и количество полученных спермодоз. Показатели спермопродукции у петухов при применении препарата в дозе 50 мкг на 1 кг живой массы тела приведены в таблице 9.
Результаты анализа эксперимента свидетельствуют о стимуляции спермопродукции у петухов-производителей в результате применения препарата. Так объем эякулята, взятый у петухов через 90 суток после первой инъекции, увеличился на 40%. В течение контролируемого периода улучшились качественные показатели взятой спермы по выживаемости сперматозоидов. Результатом применения препарата GBD-SSTad-SSTad на петухах производителях является увеличение количества полученных спермодоз на 40% и снижение процента брака спермы по биологическим показателям.
Приведенные примеры осуществления изобретения не являются исчерпывающими. Возможные иные примеры осуществления, соответствующие объему патентных притязаний.
Однако по существу проведенных исследований и попыток осуществления изобретения настоящие примеры демонстрируют, что существенным признаком изобретения являются новые спейсеры, разработанные специально для решения стоящей задачи - получения высокоиммуногенного белка для поведения эффективной вакцинации в рамках лечения и/или профилактики бесплодия, повышения качества ооцитов и/или спермы.
В процессе осуществления изобретения были предприняты попытки получения рекомбинантного белка, содержащего антигенные детерминанты соматостатина, с использованием спейсеров, отличных от имеющих последовательность 2 и 3. Например, были предприняты попытки использовать известный спейсер ProGlySerGlySerGlySerGlySerGlySerAla. Данные попытки как с использованием указанного спейсера в сочетании с одним из спейсеров по изобретению, так и с использованием только указанного спейсера, не привели к формированию правильной трехмерной структуры рекомбинантного белка, что не позволяло решить поставленную задачу. Необходимое назначение не могло быть реализовано, тем более с указанными в данной заявке техническими результатами, что показало важность оптимального подбора спейсера в рекомбинантном белке для решения необходимой задачи. Только разработанные по изобретению спейсеры приводили к формированию U-образной структуры SSTad (идентичной фрагменту соматостатина между двумя цистеинами), а также экспонировании указанную структуру в слитом белке наружу. Таким образом был сформирован иммунодоминантный эпитоп, что привело к получению препарата, вызывающего высокий иммунный ответ соматостатин, на основе рекомбинантного белка. Кроме того, спейсеры по изобретению дают достаточную протеолитическую защиту антигенной детерминанте, что наглядно продемонстрировано примерами. Все эффекты изобретения могут быть достигнуты только с использованием спейсеров по изобретению.
Кроме того, в ходе осуществления изобретения была осознана важность использования именно 2-х антигенных детерминант. Предшествующий уровень техники не мог предполагать использование именно 2-х антигенных детерминант соматостатина, поскольку в предыдущих решениях всегда была использована одна. Такой прием также не известен авторам настоящего изобретения и в отношении других иммуногенных антигенных детерминант, что показывает неординарность и новизну данного подхода. Надо подчеркнуть, что в процессе работы над изобретением был получен рекомбинантный белок, имеющий только одну антигенную детерминанту. Такой рекомбинантный белок не демонстрировал эффекты характерные для заявляемой группы изобретений. Равно как и использование детерминанты, отличной от использованной по заявленному изобретению, не имело успеха в решении поставленных задач.
Суммируя высказанное, можно заключить, что существенными признаками изобретения являются последовательности спейсера 1 и спейсера 2 по изобретению и использование двух антигенных детерминант с последовательностью KNFFWKTFTS для получения рекомбинантного белка с целью лечения и/или профилактики бесплодия, а также повышения фолликуло- и спермогенеза у млекопитающих животных, птицы и человека.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 Цистеиновый мостик между цистеинами в третьем и четырнадцатом положении.
Фиг. 2 U-образная структура соматостатина.
--->
Перечень последовательностей:
SEQ ID NO 1
Последовательности аминокислот антигенной детерминанты соматостатина
<210>     3<211>     11<212>     PRT<213>     Homo sapience
<400>     3
Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser
1               5                  10
SEQ ID NO 2
Последовательность аминокислот спейсера 1
<210>     3<211>     11<212>     PRT<213>     Artifical Sequence
<400>     3
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                  10                  15Ala Gly Gly Gly Gly Ser Arg
20
SEQ ID NO 3
Последовательность аминокислот спейсера 2
<210>     3<211>     11<212>     PRT<213>     Artifical Sequence
Ser Gly Thr Gly Ser Gly Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln Glu Ile Ala
1               5                  10                  15Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Ala Leu Glu Trp Glu Ile Ala Ala Leu
20                  25                  30Glu Gln Gly Gly Pro Gly Thr Gly-Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gly Ala
35                  40                  45Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Lys Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys Asn
50                  55                  60Ala Ala Leu Lys Lys Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Gly Gly Gly Thr
65                   70                  75                  80Gly Ser Gly Thr Arg
SEQ ID NO 4
Последовательность аминокислот альфа-глюкансвязывающего домена из
Streptococcus mutans
<210>     3<211>     11<212>     PRT<213>     Streptococcus mutans
<400>     3
Met Gly Ser Thr Asn Gln Tyr Tyr Gln Leu Ala Asp Gly Lys Tyr Met
1               5                  10                  15Leu Leu Asp Asp Ser Gly Arg Ala Lys Thr Gly Phe Val Leu Gln Asp
20                  25                  30Gly Val Leu Arg Tyr Phe Asp Gln Asn Gly Glu Gln Val Lys Asp Ala
35                  40                  45Ile Ile Val Asp Pro Asp Thr Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asn Ala Thr
50                  55                  60Gln Gly Val Ala Val Lys Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr Gln Gly Asn Trp
65                   70                  75                  80Tyr Leu Thr Asp Ala Asn Tyr Gln Leu Ile Lys Gly Phe Lys Ala Val
85                  90                  95Asp Asp Ser Leu Gln His Phe Asp Glu Val Thr Gly Val Gln Thr Lys
100                 105                 110Asp Ser Ala Leu Ile Ser Ala Gln Gly Lys Val Tyr Gln Phe Asp Asn
115                 120                 125Asn Gly Asn Ala Val Ser Ala Arg
130                 135
SEQ ID NO 5
Последовательность нуклеотидов гена GBD-SSTad-SSTad
CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT AATAGATTCA           60
ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGAA TTCATTAAAG AGGAGAAATT AACT                114
ATG GGC TCC ACC AAT CAA TAT TAT CAA CTT GCC GAT GGC AAA TAT ATG            162
Met Gly Ser Thr Asn Gln Tyr Tyr Gln Leu Ala Asp Gly Lys Tyr Met
1               5                  10                  15
CTT CTT GAT GAT TCC GGC AGG GCC AAA ACC GGC TTT GTT CTT CAA GAT            210
Leu Leu Asp Asp Ser Gly Arg Ala Lys Thr Gly Phe Val Leu Gln Asp
20                  25                  30
GGC GTT CTT AGG TAT TTT GAT CAA AAT GGC GAA CAA GTT AAA GAT GCC            258
Gly Val Leu Arg Tyr Phe Asp Gln Asn Gly Glu Gln Val Lys Asp Ala
35                  40                  45
ATT ATT GTT GAT CCC GAT ACC AAT CTT TCC TAT TAT TTT AAT GCC ACC            306
Ile Ile Val Asp Pro Asp Thr Asn Leu Ser Tyr Tyr Phe Asn Ala Thr     50                  55                  60
CAA GGC GTT GCC GTT AAA AAT GAT TAT TTT GAA TAT CAA GGC AAT TGG            354
Gln Gly Val Ala Val Lys Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr Gln Gly Asn Trp65                   70                  75                  80
TAT CTT ACC GAT GCC AAT TAT CAA CTT ATT AAA GGC TTT AAA GCC GTT            402
Tyr Leu Thr Asp Ala Asn Tyr Gln Leu Ile Lys Gly Phe Lys Ala Val                 85                  90                  95
GAT GAT TCC CTT CAA CAT TTT GAT GAA GTT ACC GGC GTT CAA ACC AAA            450
Asp Asp Ser Leu Gln His Phe Asp Glu Val Thr Gly Val Gln Thr Lys            100                 105                 110
GAT TCC GCC CTT ATT TCC GCC CAA GGC AAA GTT TAT CAA TTT GAT AAT            498
Asp Ser Ala Leu Ile Ser Ala Gln Gly Lys Val Tyr Gln Phe Asp Asn        115                 120                 125
AAT GGC AAT GCC GTT TCC GCC AGG TCC GGC GGC GGC GGC TCC GGC GGC            546
Asn Gly Asn Ala Val Ser Ala Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly    130                 135                 140
GGC GGC TCC GGC GGC GGC GGC TCC GCC GGC GGC GGC GGC TCC AGG TCC            594
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser145                 150                 155                 160
GGC ACC GGC TCC GGC GAA ATT GCC GCC CTT GAA CAA GAA ATT GCC GCC            642
Gly Thr Gly Ser Gly Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln Glu Ile Ala Ala                165                 170                 175
CTT GAA AAA GAA AAT GCC GCC CTT GAA TGG GAA ATT GCC GCC CTT GAA            690
Leu Glu Lys Glu Asn Ala Ala Leu Glu Trp Glu Ile Ala Ala Leu Glu            180                 185                 190
CAA GGC GGC CCC GGC ACC GGC AAA AAT TTT TTT TGG AAA ACC TTT ACC            738
Gln Gly Gly Pro Gly Thr Gly Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr        195                 200                 205
TCC GGC ACC GGC ACC GGC TCC GGC GCC AAA ATT GCC GCC CTT AAA CAA            786
Ser Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gly Ala Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln    210                 215                 220
AAA ATT GCC GCC CTT AAA TAT AAA AAT GCC GCC CTT AAA AAA AAA ATT            834
Lys Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys Asn Ala Ala Leu Lys Lys Lys Ile225                 230                 235                 240
GCC GCC CTT AAA CAA GGC GGC GGC ACC GGC TCC GGC ACC AGG TCC GGC            882
Ala Ala Leu Lys Gln Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Thr Arg Ser Gly                245                 250                 255
ACC GGC TCC GGC GAA ATT GCC GCC CTT GAA CAA GAA ATT GCC GCC CTT            930
Thr Gly Ser Gly Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln Glu Ile Ala Ala Leu            260                 265                 270
GAA AAA GAA AAT GCC GCC CTT GAA TGG GAA ATT GCC GCC CTT GAA CAA            978
Glu Lys Glu Asn Ala Ala Leu Glu Trp Glu Ile Ala Ala Leu Glu Gln        275                 280                 285
GGC GGC CCC GGC ACC GGC AAA AAT TTT TTT TGG AAA ACC TTT ACC TCC            1026
Gly Gly Pro Gly Thr Gly Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser    290                 295                 300
GGC ACC GGC ACC GGC TCC GGC GCC AAA ATT GCC GCC CTT AAA CAA AAA            1074
Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gly Ala Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Lys305                 310                 315                 320
ATT GCC GCC CTT AAA TAT AAA AAT GCC GCC CTT AAA AAA AAA ATT GCC            1122
Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys Asn Ala Ala Leu Lys Lys Lys Ile Ala                325                 330                 335
GCC CTT AAA CAA GGC GGC GGC ACC GGC TCC GGC ACC AGG TCC TAA CCG            1170
Ala Leu Lys Gln Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Thr Arg Ser Stop
340                 345                 350
GACTTCGAAG CGTTCGGTTG GGTCCGGAAT TTCGTATGGC AATGAAAGAC GGTGAGCTGG          1230
TGATATGGGA TAGTGTTCAC                                                      1250
<---