СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К Mycobacterium leprae
METHOD FOR Mycobacterium leprae ANTIBODY TEST

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для определения антител к Mycobaterium leprae (M.leprae).
Из практики медицины известен способ определения антител к M.leprae с применением твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), где в качестве тест-антигена используются водорастворимые белки микобактерий из лепром человека (Alonso S.M., Mangiaterra M.L., Szarfman A. La reaccion de immunoperoxidasias indirecta aplicata a la lepra humana // Medicina (Argent). - 1978. - Vol.38. - N 63. - P.541-544.)
Способ позволяет обнаруживать антитела к M.leprae и осуществлять контроль динамики гуморального иммунного ответа у больных лепрой.
Недостатком способа является сложность его осуществления, заключающаяся в необходимости использования специальных методов выделения и очистки антигена M.leprae из кожных биоптатов больных лепрой людей с использованием лабораторного оборудования, травматичность метода получения антигенного материала. Кроме этого, необходимо учитывать, что даже при распространенных процессах концентрации M.leprae в кожных лепромах больных лепроматозной лепрой для получения антигенного препарата недостаточно, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.
Из практики медицины известен также способ определения антител к M.leprae, состоящий в обнаружении антител к M.leprae в сыворотке крови человека экспресс-методом на основе микротитрационного варианта реакции латекс-агглютинации с использованием в качестве антигенного диагно-стикума полиакролеиновых латексных частиц (диаметр 1,4 мкм), модифицированных β-(3-aminoprolm 3,6-di-O-methylglucopiranozide) - синтетическим аналогом специфического углеводного эпитопа M.leprae - фенольного глико-липида-1(ФГЛ-1). (Дячина М.Н., Лукин Ю.В., Зубов В.П., Бовин Н.В. Микротитрационный вариант реакции латекс-агглютинации в диагностике лепры // Клин. лабор. диагностика.- М., Медицина, 1995. - №2. - С.24-26). Использование известного способа позволяет выявлять антитела к M.leprae в сыворотках крови больных лепрой. Уровни антител коррелируют со степенью активности лепрозного процесса.
Недостатком известного способа является сложность его осуществления, заключающаяся в том, что данная тест-система выявляет антитела лишь к ФГЛ-1, а антитела к данному антигену быстро исчезают под влиянием специфического лечения и через 1-1,5 года после начала химиотерапии их определение становится невозможным, в то время как у большинства больных лепрой в эти сроки отмечается присутствие M.leprae в коже и выявляются антитела в сыворотке крови к другим антигенным компонентам M.leprae. К недостаткам способа также относится длительность проведения данного способа (учет результатов через 2 часа) и необходимость использования планшетов для иммунологических реакций. Получение синтетического антигена требует специальных методических приемов и персонала соответствующей квалификации, что не дает возможность получить технический результат - упрощение способа.
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения антител к M.leprae методом ИФА, которым в сыворотке крови определяют антитела к M.leprae с помощью Dis-BSA, который является полусинтетическим аналогом специфического углеводного эпитопа M.leprae - фенольного глико-липида-1 (ФГЛ-1) методом твердофазного ИФА (Cho S.N., Fujiwara Т., Hunter S.W., Rea Т.Н., Gelber R.H., Brennan P.J. Use of an artifical antigen containing the 3,6-di-O-methyl-β-O-glycopyranosyl epitope for the serodiagnosis of leprosy // J. Infect. Dis, 1984. - Vol.140. - P.311-322). Способ позволяет выявлять в сыворотках крови больных лепрой антитела к видоспецифическому антигену M.leprae - ФГЛ-1. Уровень антител коррелирует с клиническими проявлениями болезни.
Недостатками способа являются:
- сложность осуществления органического синтеза искусственного антигена Dis-BSA, поскольку требуется специальное оснащение и персонал соответствующей квалификации;
- ограниченные возможности тест-системы, связанные с выявлением антител лишь к ФГЛ-1, а антитела к данному антигену быстро исчезают под влиянием специфического лечения, через 1-1,5 года после начала химиотерапии они не определяются, в то время как у большинства больных лепрой в эти сроки отмечается присутствие M.leprae в коже и выявляются антитела в сыворотке крови к другим антигенным компонентам M.leprae;
- постановка ИФА осуществляется в течение 22-24 часов;
- необходимость наличия сложного специального оборудования;
- невозможность применения в полевых условиях.
Перечисленные недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.
Известный способ принят авторами в качестве прототипа. Сходство предлагаемого способа с известным заключается в том, что они оба относятся к медицине, а именно к лепрологии, и основаны на выявлении в сыворотках крови антител к M.leprae.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения антител к M.leprae, основанного на упрощенном определении специфических антител к M.leprae в сыворотках крови, позволяющего сократить время постановки анализа и проводить исследования в полевых условиях.
Сущность предлагаемого изобретения выражена совокупностью существенных признаков, обеспечивающих достижение положительного результата.
Поставленная задача в изобретении достигается тем, что для определения специфических антител к Mycobaterium leprae в реакции латекс-агглютинации используют тест-антиген в концентрации 28 мкг/мл для сенсибилизации 1,4% суспензии полистироловых латексных частиц с аминогруппами 2 мг-экв/мл, диаметром 0,62 мкм в течение 8 часов при комнатной температуре и 18 часов при температуре 8ºС, полученный ультразвуковой дезинтеграцией при 18 кГц в течение 30 минут из культивируемых в условиях термостата на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37ºС Mycobaterium lufu (M.lufu). Штамм M.lufu предоставлен в 1981 году НИИ по изучению лепры проф. J.K.Seydel (ФРГ).
Применение M.lufu в качестве тест-антигена в реакции латекс-агглютинации является существенным отличием в подходе к определению антител к M.leprae и именно это отличие позволило получить положительный технический результат в виде упрощения способа. Кроме того, предлагаемый способ позволяет отказаться от использования сложной аппаратуры и дорогостоящих реактивов, а также привлечения квалифицированного персонала, владеющего методами органического синтеза веществ. Способ легко выполним в полевых условиях, позволяет сократить сроки визуального учета результатов до 20-30 минут.
Одной из основных задач современной лепрологии является разработка тестов, позволяющих диагностировать заболевание на ранней стадии его развития, когда клинические проявления слабо выражены или отсутствуют, осуществлять контроль за качеством проводимой терапии, а также выявлять группы риска заболевания среди лиц, находящихся в тесном семейном контакте с больными лепрой или проживающих в эндемических по лепре районах. Однако до настоящего времени не существует сертифицированных тест-систем, позволяющих осуществлять серологическую диагностику лепры. Диагностика лепры осуществляется комплексно на основании клинических проявлений заболевания и оценки гистологической картины кожных поражений.
Существующие тест-системы не используются для постановки диагноза лепры, а применяются лишь для оценки эффективности проводимой специфической терапии и доклинического определения возникновения рецидивов заболевания у больных лепрой. Это связано с тем, что не только у больных лепрой, но и у доноров крови определяются антитела к антигенам M.leprae. У доноров крови они определяются как к комплексным антигенам (соникатам M.leprae, M.lufu), так и к специфическим антигенам - фенольному гликолипиду-1 (ФГЛ-1) и его синтетическому аналогу - Dis-BSA. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для получения тест-антигена используют штамм M.lufu. Культивирование M.lufu проводят в условиях термостата на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 суток при температуре 37ºC. Бактериальную массу со среды снимают бактериологической петлей и переносят в пробирку с дистиллированной водой, тщательно перемешивают пипетированием для получения гомогенной взвеси. Микобактерии подвергают ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) в течение 30 минут при частоте 18 кГц. Суспензию разрушенных микобактерий центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Надосадочную жидкость собирают и используют в качестве сенситина латексных частиц. Концентрация белка по Лоури (Low-ry O.H., Rosebrough N.J., Fair L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.l93, №1. - Р.265-275) в ультразвуковом дезинтеграте M.lufu - 200 мкг/мл.
Для приготовления латекс-диагностикума используют 10% латекс полистироловый с аминогруппами, концентрация аминогрупп - 2,0 мг-экв/мл, диаметр частиц - 0,62 мкм, (000 «Диафарм», г. Санкт-Петербург).
100 мкл 10% латекса помещают в 1 мл глицинового буфера pН 8,8. Глициновый буфер готовят следующим образом: глицин 2 М 46,7 мл + NaOH 1М 10,0 мл + физиологический раствор (pН 7,0-7,2) 56,7 мл. Отмывку латексных частиц проводят глициновым буфером путем трехкратного центрифугирования при 6000 оборотов в минуту в течение 5 минут. К осадку частиц латекса вносят 200 мкл ультразвукового дезинтеграта M.lufu и 0,5 мл глицинового буфера. Полученную смесь латексных частиц суспендируют с антигеном из M.lufu и инкубируют при комнатной температуре в течение 8 часов, затем при температуре 8°C в течение 18 часов. Объем диагностикума доводят до 6 мл глициновым буфером и используют при постановке реакции латекс-аггютинации на предметных стеклах. Постановку осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю (25-30 мкл) исследуемой сыворотки и каплю буфера в качестве отрицательного контроля. В капли на предметном стекле добавляют по капле латекс-диагностикума. Полученную смесь перемешивают встряхиванием (легкое постукивание о край предметного стекла) в течение 1-2 минут. Учет результатов реакции производят через 20-30 минут. За положительный результат принимают пробы сывороток крови, вызывающих агглютинацию сенсибилизированных частиц латекса. Степень агглютинации оценивают по 4-плюсовой системе.
2
2
2
4
Для выполнения иммуноферментного анализа используют антиген Dis-BSA. Антиген Dis-BSA получен из банка ВОЗ по программе «IMMLEP» M.LEPRAE BANK. Постановку ИФА осуществляют на полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа однократного применения («Медполимер», г. Санкт-Петербург, ТУ 64-2-375-86). Лунки полистиролового планшета сенсибилизируют антигеном Dis-BSA в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере pН 9,25±0,25 из расчета 10 мкг/мл в объеме 0,1 мл на 1 лунку (18 часов при +4°C). Затем планшет отмывают 3 раза 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pН 7,3-7,4) с добавлением 0,05% твина-20 и 3 раза дистиллированной водой с помощью автоматического промывателя планшет (ПП2 428, г.Дубна). После этого в лунки планшета заливают по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН 7,3-7,4) и выдерживают 1 час при 37°C. Планшет отмывают, как указано выше. В лунки планшета вносят исследуемые сыворотки больных лепрой, туберкулезом и здоровых доноров. Сыворотки разводят 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН - 7,4) с 0,05% твином-20 до 1:400. Каждый образец сыворотки в объеме 0,1 мл вносят в 2 лунки (в дубле). Отрицательным контролем служат 4 лунки с 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН - 7,4) с 0,05% твином-20. Планшет инкубируют при 37°C 1 час, после чего повторяют процесс отмывки 0,02М фосфатно-солевым буфером с 0,05% твином-20. Затем в каждую лунку добавляют по 0,1 мл конъюгата кроличьих антител к IgG человека, меченых пероксидазой хрена («Mere», Германия) в разведении 1:2000 и инкубируют 1 час при 37°C. После пятикратной отмывки 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pН - 7,4) с 0,05% твином-20 и дистиллированной водой в лунки вносят раствор субстратной смеси - 4 мг ортофенилендимина (ОАО «Шосткинский завод химических реактивов») и 20 мкл 30% HO в 10 мл цитратно-фосфатного буфера рН 5,0. Планшет выдерживают при комнатной температуре в темноте 20 мин, после чего ферментативную реакцию останавливают внесением 0,05 мл 2М HSO.
Учет результатов осуществляется с помощью фотометра иммуноферментного планшетного (ЭФОС 9305 ОАО « МЗ «Сапфир») при длине волны 492 нм.
492
За положительный результат считают образцы сывороток крови, показатель оптической плотности (ОП) которых превышал в 2,1 раза величину оптической плотности отрицательного контроля (0,02 М фосфатно-солевой буфер pН - 7,4 с 0,05% твином-20), и составляет более 0,15.
Изложенная сущность изобретения поясняется таблицами, где представлены результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови больных лепрой, больных туберкулезом и доноров крови.
Таблица 1
Результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови больных лепрой
п/п
№ истории болезни
Диагноз
Латекс-агглютинация (АГ-УЗД M.lufu)
ИФА (АГ-Dis-BSA) ОП<sub>492</sub>
1
2
3
4
5
1
3845
LLs
+
0,80
2
3854
LLs
+
0,34
3
3853
LLs
+
0,26
4
3489
LLs
-
0,58
5
2983
LLs
+
0,31
6
2662
LLs
+
0,35
7
2985
LLs
+
0,64
8
3090
LLp
-
0,44
9
2294
BB
-
0,54
10
3873
LLs
-
0,27
11
3886
LLs
-
0,66
12
1776
LLs
-
0,49
13
3206
LLs
-
0,54
14
3288
LLp
-
0,84
15
2498
I
+
0,26
16
3849
BL
-
0,41
17
3897
BL
+++
1,10
18
3273
LLs
+
1,10
19
1068
LLs
+
0,23
20
3273
LLs
-
0,01
21
2628
LLs
++
0,24
22
2905
BL
-
0,60
23
1664
BL
-
0,20
24
1668
LLs
+
0,29
25
2498
I
+
0,01
26
2978
LL
-
0,18
27
2844
LLs
+
0,18
28
2690
LLp
+
0,40
29
3788
TT
-
0,34
1
2
3
4
5
30
3781
LLs
-
1,10
31
1991
LLs
-
0,56
32
3290
LLs
-
0,88
33
3118
I
-
0,05
34
3876
LLs
++
0,63
35
3213
LLs
-
0,50
36
2556
LLs
-
0,62
37
3828
LLs
-
0,79
38
3645
LL
+
0,43
39
1813
LLs
+
0,12
40
3897
BL
++++
2,18
41
3376
LL
+
0,50
42
1668
LLs
+
0,20
43
3290
LLs
++
0,97
44
3828
LLs
++
0,41
45
1963
BL
++
0,29
46
2905
BL
+
0,34
Примечание: LL - лепроматозный тип лепры; LLp - полярный лепроматозный тип лепры; LLs - субполярная лепроматозная форма лепры; BL - погранично-лепроматозная форма лепры; ВВ - пограничная форма лепры; ТТ- туберкулоидный тип лепры; I - недифференцированная форма лепры.
Из таблицы 1 видно, что у больных лепрой в реакции латекс-агглютинации обнаружены специфические антитела к M.leprae в 25 образцах сывороток крови, что составляет 54,3%. В ИФА специфические антитела к M.leprae выявлены в 42 образцах сывороток крови, что составляет 91,3%.
Таблица 2
Результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови больных туберкулезом
п/п
№ истории болезни
Диагноз
Латекс-агглютинация (АГ-УЗД M.lufu)
ИФА (АГ-Dis-BSA) ОП<sub>492</sub>
1
2
3
4
5
1
168
инфильтративный туберкулез
+
1,2
2
188
инфильтративный туберкулез
+
0,46
1
2
3
4
5
3
183
инфильтративный туберкулез
-
0,44
4
139
инфильтративный туберкулез
-
0,43
5
97
инфильтративный туберкулез
-
0,95
6
210
инфильтративный туберкулез
-
0,13
7
172
инфильтративный туберкулез
-
0,35
8
135
диссеминированный туберкулез
+
1,16
9
237
диссеминированный туберкулез
-
0,7
10
309
инфильтративный туберкулез
-
0,12
11
913
инфильтративный туберкулез
-
1,15
12
926
цирротический туберкулез
-
0,33
13
941
инфильтративный туберкулез
-
0,2
14
3579
диссеминированный туберкулез
+
0,21
15
341
инфильтративный туберкулез
-
0,6
16
1038
диссеминированный туберкулез
-
0,71
17
798
фиброзно-кавернозный туберкулез
-
0,19
18
503
фиброзно-кавернозный туберкулез
-
0,2
19
712
фиброзно-кавернозный туберкулез
+
0,72
20
1033
хронический сальпингооофорит
-
1,04
21
962
туберкулома
-
0,07
22
5409
инфильтративный туберкулез
-
0,48
23
5463
инфильтративный туберкулез
-
1,0
1
2
3
4
5
24
9455
инфильтративный туберкулез
-
1,99
25
1222
инфильтративный туберкулез
-
0,06
26
4056
диссеминированный туберкулез
-
0,71
27
147
кавернозный туберкулез
-
0,83
28
6463
инфильтративный туберкулез
-
0,4
29
848
инфильтративный туберкулез
-
0,9
30
9445
состояние после резекции по поводу туберкуломы легкого
-
0,07
31
5449
клиническое излечение после перенесенного туберкулеза легких
-
1,05
32
4302
инфильтративный туберкулез
-
0,48
Из таблицы 2 видно, что у больных туберкулезом в реакции латекс-агглютинации обнаружены специфические антитела к M.leprae в 5 образцах сывороток крови, что составляет 15,6%. В ИФА специфические антитела к M.leprae выявлены в образцах сывороток крови от 27 больных туберкулезом, что составляет 84,4%.
Таблица 3
Результаты реакции латекс-агглютинации и твердофазного ИФА сывороток крови доноров
п/п
№ сыворотки
Латекс-агглютинация (АГ-УЗД М.lufu)
ИФА (АГ-Dis-BSA) ОП<sub>492</sub>
1
2
3
4
1
100926
-
0,15
2
200672
-
0,01
3
300520
-
0,67
4
100616
-
1,30
5
400541
-
0,64
1
2
3
4
6
300529
-
0,79
7
203990
-
0,90
8
103819
-
0,80
9
100617
-
0,01
10
400538
-
0,90
11
204002
-
0,48
12
302842
-
0,70
13
370885
-
0,52
14
436166
-
0,13
15
193578
-
0,8
16
290504
-
0,11
17
370878
-
0,45
18
290508
-
0,3
19
125008
-
0,12
20
193551
-
0,63
21
125009
-
0,44
22
290496
-
0,24
23
193564
-
0,14
24
290383
-
0,81
25
193417
-
0,83
26
193412
-
0,38
27
193408
-
0,13
28
290361
-
0,25
29
290372
-
1,09
30
290381
-
0,36
Из таблицы 3 видно, что у доноров крови в реакции латекс-агглютинации специфические антитела к M.leprae не обнаружены. В ИФА специфические антитела к M.leprae выявлены в образцах сывороток крови от 22 доноров крови, что составляет 73,3%.
Приведенные данные показывают, что использование реакции латекс-агглютинации с антигеном из M.lufu дает возможность определять специфические антитела к M.leprae при исследовании сывороток крови больных лепрой, в то время как в сыворотках крови доноров антитела к M.leprae предлагаемым способом не обнаруживаются, в отличие от ИФА, где в качестве сенситина применяется Dis-BSA.
Определение специфических антител к M.leprae у больных туберкулезом с помощью реакции латекс-агглютинации не является свидетельством заболевания лепрой и может быть исключено другими клинико-лабораторными методами обследования.
Таким образом, предлагаемый способ упрощает определение антител к M.leprae по сравнению с прототипом и может быть использован как в стационарных лабораториях, так и в полевых условиях.
Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в ФГБУ «НИИЛ» Минздравсоцразвития России в 2010-2011 годах. Исследованы 46 образцов сывороток крови от 41 больного лепрой, 32 больных туберкулезом (группа сравнения) и 30 доноров крови (контрольная группа).
Ниже приводятся результаты апробации способа.
Пример 1.
Больной М.В.М. (и/б №3897) впервые поступил в ФГБУ «НИИЛ» Минздравсоцразвития России 02.03.2009 года. Диагноз: погранично-лепроматозная форма лепры (BL).
В день обследования 12.09.2011 г. лепрозный процесс на кожном покрове носит активный характер, медленно регрессирует. Инфильтрация на коже груди и живота носит поверхностный характер. На спине и поясничной области инфильтрация кожи более выражена.
Гистологическое исследование кожи: атрофия эпидермиса. В дерме вокруг сосудов и придатков кожи определяются инфильтраты, состоящие в основном из крупновакуолизированных макрофагов и лимфоцитов. Встречаются тучные клетки и полинуклеарные лейкоциты. В цитоплазме отдельных макрофагов обнаружены единичные зернистые M.leprae и кислотоустойчивые зерна. Заключение: регрессирующие инфильтраты погранично-лепроматозной структуры, содержащие единичные M.leprae.
492
492
Серологическое обследование от 12.09.2011 г.№8492 выявило в ИФА наличие антител к специфическому антигену M.leprae - Dis-BSA. Показатели ОП-1,1  (норма ОП до 0,15).
Постановку латекс-агглютинации осуществляют следующим образом:
на предметное стекло наносят каплю (25-30 мкл) исследуемой сыворотки и каплю буфера в качестве отрицательного контроля. В капли на предметном стекле добавляют по капле латекс-диагностикума. Полученную смесь перемешивают встряхиванием (легкое постукивание о край предметного стекла) в течение 1-2 минут. Учет результатов реакции производят через 20-30 минут.
Реакция латекс-агглютинации с тест-антигеном из разрушенных ультразвуком M.lufu положительная (+++).
Таким образом, у 6-го М.В.М. на момент обследования положительные результаты ИФА и латекс-агглютинации на наличие в сыворотке крови антител к M.leprae совпадают.
Пример 2.
Больной М.Б.Н. (и/б №3118) впервые поступил в ФГБУ «НИИЛ» Минздравсоцразвития России 10.06.63 года. Диагноз: недифференцированная форма лепры (I).
В день обследования 22.08.2011 г. Лепрозный процесс в стадии регресса. Кожный покров чист, свободен от активных проявлений лепры. Бактериоскопические исследования с 1964 года отрицательные.
492
492
Серологическое обследование от 22.08.2011 г. № 8469 не выявило в ИФА наличие антител к специфическому антигену M.leprae - Dis-BSA. Показатели ОП-0,05 (норма ОП до 0,15).
Постановку латекс-агглютинации осуществляют аналогично примеру №1. Реакция латекс-агглютинации с тест-антигеном из разрушенных ультразвуком M.lufu отрицательная (-).
Таким образом, у 6-го М.Б.Н. на момент обследования отрицательные результаты ИФА и латекс-агглютинации совпадают и свидетельствуют об отсутствии в сыворотке крови антител к M.leprae.
Предлагаемым способом достигается упрощение определения антител к M.leprae, заключающееся в том, что нет необходимости синтеза искусственного антигена, поскольку используют культивируемые M.lufu для получения тест-антигена; сокращаются сроки с 22-24 часов до 20-30 минут по сравнению с прототипом; устраняется многоэтапность и трудоемкость проведения анализа; для постановки анализа не используется сложное, дорогостоящее оборудование.
Предлагаемый способ может быть рекомендован в качестве дополнительного теста при диагностике лепры для использования в научных и клинических лабораториях противолепрозных учреждений системы здравоохранения, а также при проведении массовых обследований в полевых условиях.