Взаимосвязь между генетическим полиморфизмом Toll-like рецепторов 4-го типа, степенью ответа на эндотоксин кишечной палочки и некоторыми иммунологическими показателями у больных сахарным диабетом 2-го типа

Оригинальные исследования /Original Researches/

IEJ

СУЛЬСКАЯ Ю.В.

Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, кафедра внутренней медицины № 2, г. Симферополь

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ГЕНЕТИЧЕСКИМ ПОЛИМОРФИЗМОМ

TOLL-LIKE РЕЦЕПТОРОВ 4-го ТИПА, СТЕПЕНЬЮ ОТВЕТА НА ЭНДОТОКСИН КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И НЕКОТОРЫМИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-го ТИПА

Резюме. При обследовании 60 больных сахарным диабетом 2-го типа была установлена взаимосвязь между генетическим полиморфизмом Asp299Gly гена Toll-like рецептора 4-го типа, степенью ответа на эндотоксин кишечной палочки и показателями антиэндотоксинового иммунитета, показателями неспецифической защиты организма и маркерами системного воспаления. Было выявлено, что больные сахарным диабетом 2-го типа, нормо- и гиперреспондеры с генотипом, содержащим аллель G, более склонны к развитию антиэндотоксиновой агрессии и, как следствие, к более тяжелому течению сахарного диабета 2-го типа.

Ключевые слова: сахарный диабет, генетический полиморфизм, антиэндотоксиновый иммунитет.

Введение

В настоящее время изучение полиморфизма генов регуляторных молекул воспаления приобретает особую актуальность. Знание их роли в патогенезе многих заболеваний наряду с достижениями современной ге-номики позволяет, с одной стороны, прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее протекания, с другой стороны, подобрать специфическую терапию, включая средства иммунокоррекции, для конкретного пациента [1, 2].

Сахарный диабет (СД) 2-го типа является важной медицинской и социальной проблемой. Это обусловлено как его значительной распространенностью, так и достаточно серьезным прогнозом заболевания с развитием тяжелых инвалидизирующих осложнений [3]. Более чем 300 млн человек, или 8,2 % взрослого населения мира, на данный момент имеют риск развития СД. Ежегодно из-за причин, связанных с развитием и прогрессированием СД, умирает около 3,8 млн человек [4].

Однако патогенез СД 2-го типа и эффективные способы лечения во всем мире остаются до конца не изученными.

Целью нашего исследования явилось изучение взаимосвязи генетического полиморфизма Toll-like рецепторов 4-го типа (TLR4), степени ответа на эндотоксин кишечной палочки (ЭТ) и различных иммуно-

логических показателей у больных сахарным диабетом 2-го типа.

Материалы и методы

Для достижения поставленной цели нами была обследована группа из 60 больных СД 2-го типа и 23 человека контрольной группы.

Всем больным проводились стандартные клинико-инструментальные обследования, а также определялось содержание антиэндотоксиновых антител класса А (анти-ЭТ-IgA), С-реактивного белка (СРБ) в плазме крови и содержание секреторного иммуноглобулина класса А (sIgA) и антиэндотоксинового секреторного иммуноглобулина класса А (анти-ЭТ-sIgA) в слюне данных больных методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) с использованием протоколов, разработанных в лаборатории клинической иммунологии Крымского государственного медицинского университета. Определение эндотоксин-связывающих рецепторов на моноцитах и гранулоцитах периферической крови и фагоцитарной активности гранулоцитов периферической крови проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии [5—8]. У всех больных в результате бактериологического обследования установлен дисбактериоз кишечника И—Ш степени (ДК), по классификации О.Я. Бабак, И.Е. Куш-нир (1998) [9].

Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный номер MS0011) ДНПП ТОВ «Альфа», г. Донецк.

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе распространенности полиморфизма Asp299Gly было установлено, что генотип GG имеют 6,67 % больных, что достоверно отличается от группы контроля (р < 0,05). Гетерозиготный вариант данного гена характерен для 10,0 % больных, гомозиготы с аллелем А встречаются у 83,33 % больных, что не отличается от группы контроля (табл. 1). Таким образом, к развитию СД 2-го типа более предрасположены лица, имеющие в генотипе аллель G.

Была также изучена взаимосвязь между генетическим полиморфизмом Asp299Gly TLR4 и степенью ответа на ЭТ у больных СД 2-го типа. В результате проведенного исследования было выявлено, что все гипореспондеры имели генотип АА, в то время как среди нормо- и ги-перреспондеров было выявлено 14,63 % больных с генотипом AG, 9,76 % больных с генотипом GG, остальные (75,61 %) — с генотипом АА (табл. 2).

Нами были изучены некоторые иммунологические показатели у больных со сниженным ответом на ЭТ, а также у нормо- и гиперреспондеров с генотипом АА и с генотипом, содержащим аллель G.

Нами было изучено состояние специфического гуморального (анти-ЭТ-IgA) и местного иммунитета (sIgA и анти-ЭТ-sIgA).

Как показано в табл. 3, уровень анти-ЭТ-IgA достоверно повышен как в группе гипореспондеров, так и в группе нормо- и гиперреспондеров с различными генотипами по сравнению с группой контроля. Однако уровень анти-ЭТ-IgA в группе нормо- и гиперреспондеров с ге-

Оригинальные исследования /Original Researches/

нотипами G достоверно не отличался от группы гипореспондеров и был в 1,56 раза ниже, чем в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом АА. Таким образом, наиболее высокий уровень анти-ЭТ-IgA наблюдался в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом АА.

Уровень анти-ЭТ-sIgА также был повышен во всех группах наблюдения по сравнению с группой контроля. Уровень данного показателя достоверно не отличался в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом G по сравнению с группой гипореспондеров, в то время как по сравнению с группой нормо- и гиперреспондеров с генотипом АА уровень анти-ЭТ-sIgА достоверно ниже в 1,66 раза. Таким образом, наиболее высокий уровень анти-ЭТ-sIgA наблюдался в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом АА.

Уровень sIgА достоверно выше как в группе гипоре-спондеров, так и в группе нормо- и гиперреспондеров с различными генотипами по сравнению с группой контроля. Достоверных различий между группами сравнения выявлено не было (р > 0,05).

Для оценки степени выраженности воспалительного ответа при поступлении эндотоксина кишечной палочки в организм у больных СД 2-го типа нами был изучен уровень СРБ как одного из важнейших маркеров системного воспалительного ответа.

Было выявлено достоверное повышение уровня СРБ до 40,64 ± 3,34 и 48,65 ± 4,88 мкг/мл соответственно в группе нормо- и гиперреспондеров и до 38,98 ± 2,29 мкг/мл в группе гипореспондеров по сравнению с группой контроля. Однако в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом, содержащим аллель G, уровень СРБ был в 1,2 раза выше, чем в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом АА и в 1,25 раза выше, чем в группе гипореспондеров, что может свидетельствовать о более выраженном воспалительном ответе в данной группе больных СД 2-го типа (табл. 4).

Таблица 1. Частота полиморфизма Asp299Gly TLR4 в контрольной группе и среди больных сахарным диабетом 2-го типа

Генотип, аллель Контрольная группа, %

GG 0,0 (0) 6,67 (4)*

AG 4,35

AA 95,65

G 2,18 11,67*

A 97,82 88,33

Примечание: * — достоверность различий по сравнению с группой контроля (p < 0,05).

Таблица 2. Частота полиморфизма Asp299Gly TLR4 в зависимости от степени ответа на ЭТ

Генотип, аллель Гипореспондеры, %

GG 0,0

AG 0,0

AA 100,0

Оригинальные исследования /Original Researches/

iE!

Как показано в табл. 5, при анализе уровня экспрессии CD14 на моноцитах и гранулоцитах было выявлено увеличение количества CD14 рецепторов на моноцитах у больных нормо- и гиперреспондеров с генотипом, содержащим аллель G, до 22,12 ± 2,6 усл.ед. (р < 0,05). Количество CD14 рецепторов на моноцитах и гранулоцитах у нормо- и гиперреспондеров с генотипом АА достоверно не отличалось от группы контроля. В группе гипореспон-деров отмечалось снижение количества данных рецепторов как на моноцитах — до 15,42 ± 1,71 усл.ед., так и

на гранулоцитах — до 0,75 ± 0,02 усл.ед. по сравнению с группой контроля (р < 0,05).

При анализе экспрессии ЭТ^ на моноцитах и гра-нулоцитах достоверных отличий между нормо- и ги-перреспондерами с различными генотипами и группой контроля выявлено не было (р < 0,05). В группе гипо-респондеров отмечалось достоверное снижение количества ЭТ^ на моноцитах — до 1,8 ± 0,12 усл.ед. и на гранулоцитах — до 1,19 ± 0,04 усл.ед. по сравнению с группой контроля (табл. 5).

Таблица 3. Уровень анти-ЭТ-^А, анти-ЭТ^^А и sIgА у больных сахарным диабетом 2-го типа

Кол-во исследований Анти-ЭТ-IgA, ед.опт.пл. Анти-ЭТ-sIgA, ед.опт.пл. sIgA, мл/л

Нормо- и гиперреспондеры АА 31 0,613 ± 0,110*, ** 0,144 ± 0,020*, ** 245,90 ± 47,57*

Нормо- и гиперреспондеры G 10 0,394 ± 0,140* 0,087 ± 0,040* 191,0 ± 35,6*

Гипореспондеры 19 0,313 ± 0,080* 0,083 ± 0,040* 182,50 ± 40,53*

Группа контроля 23 0,212 ± 0,040 0,044 ± 0,010 135,20 ± 12,71

Примечания: * — достоверность различий по сравнению с группой контроля ф < 0,05); ** — достоверность различий между группами сравнения (p < 0,01).

Таблица 4. Уровень СРБ у больных сахарным диабетом 2-го типа

Группа больных Кол-во исследований СРБ, мкг/мл

Нормо- и гиперреспондеры АА 31 40,64 ± 3,34*

Нормо- и гиперреспондеры G 10 48,65 ± 4,88*

Гипореспондеры 19 38,98 ± 2,29*

Группа контроля 23 12,01 ± 0,83

Примечание: * — достоверность различий по сравнению с группой контроля (p < 0,01).

Таблица 5. Уровень экспрессии ЭТ-R и CD14 на моноцитах и гранулоцитах периферической крови

у больных сахарным диабетом 2-го типа

Группа больных Кол-во исследований ЭТ-R, усл.ед. флуор., моноциты ЭТ-R, усл.ед. флуор., гранулоциты CD14, усл.ед. флуор., моноциты CD14, усл.ед. флуор., гранулоциты

Mе ± m Mе ± m Mе ± m Mе ± m

Нормо- и гиперреспондеры АА 31 2,00 ± 0,24 1,36 ± 0,06 16,24 ± 2,02 0,85 ± 0,06

Нормо- и гиперреспондеры G 10 2,02 ± 0,27 1,39 ± 0,10 22,12 ± 2,60* 0,85 ± 0,12

Гипореспондеры 19 1,80 ± 0,12* 1,19 ± 0,04* 15,42 ± 1,71* 0,75 ± 0,02*

Группа контроля 23 2,22 ± 0,13 1,35 ± 0,05 19,21 ± 1,02 0,87 ± 0,04

Примечание: * — достоверность различий по сравнению с группой контроля (p < 0,05).

Таблица 6. Характеристика неспецифического иммунитета у больных сахарным диабетом 2-го типа

Группа больных Кол-во исследований Фагоцитоз, % клеток Фагоцитоз, интенсивность

Mе ± m Mе ± m

Нормо- и гиперреспондеры АА 31 19,86 ± 1,83* 120,30 ± 2,06*

Нормо- и гиперреспондеры G 10 20,30 ± 3,35* 120,55 ± 3,30*

Гипореспондеры 19 17,80 ± 1,75 115,41 ± 2,13

Группа контроля 23 11,87 ± 1,42 113,11 ± 1,90

Примечания: * — достоверность различий по сравнению с группой контроля (p < 0,01); * — достоверность различий по сравнению с группой контроля (p < 0,05).

iE!

Оригинальные исследования /Original Researches/

Для анализа степени активности неспецифического иммунитета нами были изучены показатели фагоцитоза (процент фагоцитирующих клеток и интенсивность фагоцитоза). У нормо- и гиперреспондеров вне зависимости от генотипа отмечается повышение интенсивности фагоцитоза и увеличение процента фагоцитирующих клеток по сравнению с группой контроля. Между данными группами сравнения достоверных различий выявлено не было (р > 0,05). В группе гипореспондеров данные показатели достоверно не отличаются от группы контроля (р > 0,05). Таким образом, при повышенном и нормальном ответе на ЭТ происходит усиление неспецифической защиты организма, направленной на нейтрализацию ЭТ при его избыточном поступлении в условиях нарушения проницаемости кишечной стенки у больных СД 2-го типа.

Выводы

1. В связи с более выраженным повышением как гуморального, так и местного секреторного антиэндотоксино-вого иммуноглобулина класса А в группе нормо- и гипер-респондеров с генотипом АА можно предположить более выраженную степень защиты организма от отрицательного влияния ЭТ в данной группе по сравнению с гипореспонде-рами и нормо- и гиперреспондерами с генотипом G.

2. Экспрессия CD14 на моноцитах и гранулоцитах периферической крови в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом G повышена, что может свидетельствовать о более высокой чувствительности данной группы больных к избыточному поступлению ЭТ во внутреннюю среду организма больных СД 2-го типа по сравнению с гипореспондерами.

3. Степень воспалительной реакции в группе нормо- и гиперреспондеров с генотипом G выше по сравнению с гипореспондерами и нормо- и гиперреспондерами с генотипом АА.

Сульська Ю.В.

Кримський державний медичний ун'терситет

iM. С.1. Георпевського, кафедра внутршньоi медицини № 2,

м. Смферополь

ВЗАеМОЗВ'ЯЗОК Мiж ГЕНЕТИЧНИМ ПОЛiМОРФiЗМОМ TOLL-LIKE PE^nroPiB 4-го ТИПУ, СТУПЕНЕМ ВДПОВД НА ЕНДОТОКСИН КИШКОВО1 ПАЛИЧКИ ТА ДЕЯКИМИ iМУНОЛОГiЧНИМИ ПОКАЗНИКАМИ У ХВОРИХ НА ЦУКРОВИЙ ДiАБЕТ 2-го ТИПУ

Резюме. При обстежент 60 хворих на цукровий дiабет 2-го типу було встановлено взаемозв'язок мiж генетичним полiморфiзмом Asp299Gly гена Toll-like рецептора 4-го типу, ступенем вщповда на ендотоксин кишково! палички та показниками антиендотоксинового iмунiтету, показниками неспецифiчного захисту органiзму та маркерами системного запалення. Було виявлено, що хворi на цукровий дiабет 2-го типу, нормо- i гiперреспонIдери з генотипом, що мiстить алель G, бшьш схильнi до розвитку антиендотоксиново! агресп i, як наслщок, до бшьш тяжкого перебггу цукрового дiабету 2-го типу.

Ключовi слова: цукровий дiабет, генетичний полiморфiзм, антиендотоксиновий шунггет.

4. Таким образом, можно предположить, что нормо-и гиперреспондеры с генотипом, содержащим аллель G, более предрасположены к развитию антиэндотоксиновой агрессии в условиях хронического воспаления при сахарном диабете 2-го типа и, как следствие, к более тяжелому течению сахарного диабета 2-го типа с быстрым развитием осложнений.

Список литературы

1. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Новый этап развития иммунологии // Природа. — 2006. — № 4.

2. Яковлев М.Ю. Системная эндотоксинемия в физиологии и патологии человека: Автореф. дис... д-ра мед. наук. — М, 1993. — 55 с.

3. Сахарный диабет 2-го типа: два патогенетических дефекта — две мишени для терапевтического воздействия // Здоров'я Украгни. — 2008. — № 20(1).

4. Новые аспекты лечения сахарного диабета 2-го типа // Здоров'я Украти. — 2003. — № 79.

5. Гордieнко А.1., Быоглазов В.О. Споабвизначення антиты до лiпополiсахаридiв грамнегативних бактерт. — Патент. 70193 А Украгна, МК1 7А61К31/01, Заявл. 29.12.2003; Опубл. 15.09.2004, Бюл. № 9.

6. Гордиенко А.И. Новый подход к повышению специфичности определения антител к липополисахаридам грамотрица-тельных бактерий методом твердофазного иммунофермент-ного анализа//Укр. бюхт. журн. — 2004. — № 6. — С. 130-135.

7. Гордиенко А.И., Потапов А.Л., Бабанин А.А., Бако-ва А.А., Химич Н.В. Гуморальный антиэндотоксиновый иммунитет при синдроме хронического копростаза //Iмунологiя та алерголог1я. — 2006. — № 4. — С. 59-63.

8. Гордиенко А.И. Использование твердофазного иммуно-ферментного анализа для определения общего и антиэндоток-синового секреторного IgA человека // Таврический медико-биологический вестник. — 2009. — Т. 12, № 3.

9. Бабак О.Я., Кушнир I.E. Сучасна фармакотератя дисбактерюзу кишечнику: Метод. рекомендаци / 1нститут терапи АМН Украгни. — Харшв, 1998. — 27с.

Получено 27.12.10 D

Sulska Yu.V.

Crimean State Medical University named after

S.I. Georgiyevsky, Department of Internal Medicine № 2,

Simferopol, Ukraine

CORRELATION BETWEEN GENETIC POLYMORPHISM OF TOLL-LIKE RECEPTOR 4, DEGREE OF RESPONSE TO ESCHERICHIA COLI ENDOTOXIN AND SOME IMMUNOLOGICAL PARAMETERS IN PATIENTS WITH DIABETES MELLITUS TYPE 2

Summary. During examination of 60 patients with type 2 diabetes mellitus there was defined the correlation between genetic polymorphism of Toll-like receptors 4 gene Asp299Gly, degree of response to Escherichia coli endotoxin and antiendotoxin immunity parameters, indicators of nonspecific body defense and markers of systemic inflammation. It was found that patients with diabetes mellitus type 2, normal and hyperresponders, who has genotype containing allele G, more disposed to development of antiendotoxin aggression and as a result to more severe course of diabetes mellitus type 2.

Key words: diabetes mellitus, genetic polymorphism, antiendotoxin immunity.