Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний
METHOD FOR SIMULTANEOUS DIAGNOSIS OF HEREDITARY DISEASES

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к молекулярно-генетическим методам одновременной диагностики наследственных заболеваний, наиболее часто встречаемых заболеваний среди якутов: 3М синдрома, SOPH синдрома, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии, тирозинемии 1А типа и наследственной глухоты.
Данные проведенных многолетних медико-генетических исследований в области наследственных болезней населения Республики Саха (Якутия) показали на накопление мажорных мутаций, характерных для якутской этнической группы, во много раз превышающие частоты в мировых популяциях. Эти исследования дополнены демографическими сведениями, свидетельствующими о достаточно высоком уровне изоляции, что обуславливает высокую гомогенность популяции (см. Респираторный дистресс-синдром у новорожденных - новый клинический признак у якутских больных с 3-М синдромом? / Н.Р. Максимова, А.Н. Ноговицына, А.Л. Сухомясова, В.А. Аргунов // Педиатрия. - 2009. - №3, Т. 87. - С. 53-57; Пузырев. В.П. Наследственные болезни у якутов / В.П. Пузырев, Н.Р. Максимова // Генетика. - 2008. - №10. - С. 1308-1314; Сухомясова, А.Л. Аутосомно-доминантная миотоническая дистрофия в Республике Саха (Якутия): автореф. дис. … канд. мед. наук: 03.00.15 / Айталина Лукична Сухомясова. - Томск, 2005. - 22 с.).
В таблице 1 приведены частоты наследственных болезней в популяциях по всему миру, где показано, что распространенность заболеваний варьируется в зависимости от популяции. Например, в популяции якутской этнической группы частоты носительства врожденной глухоты 1А типа, 3М синдрома, SOPH синдрома, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии достаточно велики, что свидетельствует об острой проблеме выявления носительства данных заболеваний у здорового населения для снижения генетического груза населения Республики Саха (Якутия).
Известно, что 3М синдром (OMIM 273750) - наследственный синдром низкорослости, среди населения России найден только в популяционной выборке у якутов (см. Клиническая характеристика синдрома 3-М у якутских пациентов и подходы к ДНК-диагностики в Республике Саха (Якутия) / Н.Р. Максимова, А.Н. Ноговицына, И.А. Николаева [и др.] // Медицинская генетика. - 2007. - №12, Т. 6. - С. 35-38). Аутосомно-рецессивный тип наследования. Ген CUL7 состоит из 26 экзонов и кодирует белок Cullin 7. Мутация - 4582insT.
SOPH синдром (OMIM 614800) - синдром низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов. Вызывается мутацией в гене NBAS (5741 G→А) (в результате аминокислотной замены R1914H).
Наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия (OMIM 250800) - наследственное аутосомно-рецессивное заболевание, проявляющееся цианозом кожных покровов и слизистых, одышкой, головной болью, умственной отсталостью. Вызвано мутацией гена диафоразы (DIA1), с. 806 С→Т, приводящей к замене Pro269Leu фермента NADH-цитохром-b5-редуктазы.
Тирозинемия 1А типа (OMIM 276700) - заболевание аминокислотного обмена (аминоацидопатия), обусловленное недостаточностью фумарилацетоацитат гидролазы, приводящей к тяжелой патологии печени и почек. Заболевание вызвано мутацией в 13 экзоне гена FAH, замена 1090 G>C, приводящей к замене Glu 364Gln в гомозиготном состоянии.
Несиндромальная глухота 1А типа (OMIM 220290) - врожденная глухота, генетической причиной которой является мутация IVS1+1G>A в гене GJB2, локализованном в хромосомной области 13q11-q13 и кодирующий коннексин 26 (Сх26).
Наследственные заболевания не излечимы и единственным способом снижения частоты данных заболеваний является их профилактика. Для осуществления их диагностики на практике в настоящее время используются методы ДНК-диагностики, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР-ПДРФ. К сожалению, современные методы рутинной ДНК-диагностики не позволяют широко их внедрить в программы скрининга населения из-за сложности, дороговизны и длительности выполнения анализов.
Известен способ выявления мутаций в гене GJB2, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты (см. RU №2317547, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68, опубл. 20.02.2008), включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацию одновременно трех участков гена GJB2 в смеси трех пар последовательностей олигонуклеотидов: (35delG) (F) 5' cttttccagagcaaaccgccc 3', (R) 5' tgctggtggagtgtttgttcac 3'; (167delT) (F) 5' atgagcaggccgactttgtctg 3' (R) 5' gtgggagatggggaagtagtga 3'; (235delC) (F) 5' acgatcactacttccccatctc 3'; (R) 5' actaggagcgctggcgtggac 3', фланкирующих области с возможным содержанием мутаций 35delC.
Способ диагностики 3М синдрома в якутской популяции методом ПЦР (см. RU №2315310, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68, опубл. 20.01.2008) предусматривает использование оригинальных праймеров для выявления мутации 4582 insT (Arg 1528 Ser) в гене Куллин 7 (CUL7), характерной для якутской популяции, с последующим проведением ПДРФ-анализа и использованием рестриктазы Hinfl.
Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина человека (см. RU №2458131, МПК C12N 15/11, C12Q 1/68, C12N 15/12, C12N 15/55, опубл. 10.08.2012), которая представляет собой биочип для детекции мутаций и полиморфизмов генов. При этом тест-система представлена набором олигонуклеотидов, позволяющих выявлять точковые мутации в генах FAN SERPINA1, которые вызывают соответственно тирозинемию 1 типа и недостаточность альфа-1-антитрипсина.
Кроме того, известен способ диагностики мутации Pro269Leu (С. 806 С-Т) в гене DIA1, ответственной за развитие метгемоглобинемии I типа методом лигазной реакции (см. заявку RU №2007143468, МПК C12Q 1/68, C12Q 1/48, опубл. 10.06.2009).
Недостатком известных решений является то, что они позволяют проводить диагностику лишь на единичные заболевания по отдельности, при этом достаточно трудоемкие, требуют больших затрат на реактивы и расходные материалы, кроме того, характерны длительной продолжительностью времени для проведения анализа, в особенности тех способов, которые основаны на методе ПЦР-ПДРФ, и, как результат, достаточно труднодоступны для широкого круга населения, для скрининга популяций и всех желающих.
По данным анализа литературных источников и проведенного патентного поиска, способов одновременной диагностики частых наследственных заболеваний, мутаций (4582insT, 5741G/A, P269L, IVS1+1G>A, 1090G>C): 3M синдрома, SOPH синдрома, тирозинемии 1 типа, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа, наследственной несиндромальной глухоты 1А типа с использованием способов на основе биочипов не выявлено из уровня техники.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, является создание способа одновременной диагностики наследственных заболеваний, наиболее часто встречаемых заболеваний среди якутской популяции, такие, как 3М синдром, SOPH синдром, наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия, тирозинемия 1А типа и наследственная глухота.
Технический результат, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в создании биочипа и способа его использования для исследования ДНК человека на наличие мутаций, позволяющего диагностировать наследственные заболевания в кратчайшие сроки и, тем самым, повышающего общедоступность диагностических работ для населения.
Для решения поставленной задачи способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями для детекции точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH, и GJB2, вызывающих, соответственно, 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа, наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, включает следующие стадии:
1) проведение двухстадийной мультиплексной ПЦР с использованием специфичных для каждого участка генов праймеров и флуоресцентно меченых праймеров для второй стадии ПЦР;
2) проведение реакции гибридизации полученных продуктов ПЦР;
3) обработку результатов анализов с помощью сканера для регистрации флуоресцентных сигналов с гибридизованных на биочипе ампликонов;
4) интерпретация результатов.
При этом набор праймеров для первой стадии амплификации участков генов CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2 составляют олигонуклеотиды: для 3М синдрома (F) 5' CCCTCAGCTTGCAGGTACGTCTGA 3', (R) 5' AAGGATATCCAGGAGGTATGCACT 3'; для SOPH синдрома (F) 5' TTGTTCTAACTCATTAACACTTGCTGAAT 3', (R) 5' TCTTGAGCTTCGTCTTCTGAGTTTCTT 3'; для наследственной несиндромальной глухоты 1А типа (F) 5' CAGGACCCGCCTAGGAGCGCAGGA 3', (R) 5' GCCGGGCAACCGCTCTGGGTCTC 3'; для наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа (F) 5' CCACACGTCAGCTTACCTGGTCTCTC 3', (R) 5' CGTGCCCGGCCCTCAGAAGACGAAGC 3'; для тирозинемии 1 типа (F) 5' GGAGCCAGAAAACTTCGGCTCCATG 3', (R) 5' CCTCACCTGTTATGATGACTTCATC 3'.
Для второй стадии полимеразной цепной реакции праймерами являются олигонуклеотиды: для 3М синдрома (F) 5' CCCTCAGCTTGCAGGTACGTCTGA 3', (R) 5' Cy5-TCTCCACTGAGTGAGTGATCAGCAT 3'; для SOPH синдрома (F) 5' TTGTTCTAACTCATTAACACTTGCTGAA 3', (R) 5' Cy5-GTCTTAATAGCCTTTCT 3'; для наследственной несиндромальной глухоты 1А типа (F) 5' CCGCGCTTCCTCCCGACGCAG 3', (R) 5' Cy5-GCCGGGCAACCGCTCTGGGTCTC 3'; для наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа (F) 5' TTCGTGAATGAGGAGATGATCCGGG 3', (R) 5' Cy5-GGGAAGGCAGGCGTACTGGATCATG 3'; для тирозинемии 1 типа (F) 5' GGAGCCAGAAAACTTCGGCTCCATG 3', (R) 5' Cy5-CAGCAGAAACTTCCTGGTCTGACCAT 3'.
2
2
Кроме того, на этапе гибридизации полученных продуктов полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными мишенями на биочипе, используется биочип, мишенями для иммобилизации на котором являются олигонуклеотиды: 5' NH-CGTCTCAAAAGAAAAAAAAAAAGGTA 3', 5' NH-
2
2
2
2
2
2
2
2
CGTCTCAAAAGTAAAAAAAAAAAGGTA 3'; 5' NH-TGGAAGCCCGTAAAGAG 3', 5' NH-TGGAAGCCCATAAAGAG 3'; 5' NH-AGGAGGAGCCGCTGGTGCTG 3', 5' NH-AGGAGGAGCTGCTGGTGCTG 3'; 5' NH-GCTCCATGTTGGAACTGTCGTGG 3', 5' NH-GCTCCATGTTGCAACTGTCGTGG 3'; 5' NH-CCCGACGCAGGTGAGCCCGC 3', 5' NH-CCCGACGCAGATGAGCCCGC 3'.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность признаков изобретения обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение молекулярно-генетического способа одновременной диагностики наследственных заболеваний, наиболее часто встречаемых заболеваний среди якутов.
Основной отличительной особенностью заявленного решения является использование биочипа, на поверхности которого иммобилизованы олигонуклеотиды, которые позволяют одномоментно диагностировать пять наследственных заболеваний, характерных для якутской популяции: 3М синдром, SOPH синдром, наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия, тирозинемия 1А типа и врожденной глухоты.
Состав мутаций, выявляемых с помощью биочипа, оптимизирован и строго специфичен для этнических групп населяющих Россию на протяжении долгого времени. Таким образом, эффективность и информативность генетической диагностики наследственных заболеваний с применением данного биочипа гораздо выше, чем с применением имеющихся аналогов.
Учитывая недостатки классических методов диагностики данных заболеваний в настоящее время, существует потребность в разработке быстрого, легкого в исполнении и экономически эффективного метода ДНК-диагностики, для осуществления которого не требуется дорогостоящего оборудования, но при этом позволяющего проводить диагностику с высокой чувствительностью и специфичностью.
В настоящем техническом решении предложено использование биочипа для ДНК-диагностики частых наследственных заболеваний - 3М синдрома, SOPH синдрома, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии, тирозинемии 1А типа, и врожденной глухоты.
В ходе исследований было установлено, что именно с отбором исследуемых мутаций связана эффективность и информативность диагностики на конкретной территории, которые увеличиваются за счет того, что для диагностики взяты самые распространенные и специфичные для этой территории мутации.
Преимуществами настоящего решения являются: высокая чувствительность и специфичность, значительная быстрота и легкость исполнения диагностики, не требуемая высококвалифицированного специально обученного персонала и дорогостоящего оборудования, относительно низкая себестоимость одного анализа (на одну мутацию), возможность использования, как для диагностики взрослых индивидуумов, так и в пренатальном скрининге.
При этом существует возможность выявить носительство мутации, как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии.
Данный способ включает в себя несколько аспектов:
1) набор праймеров для амплификации участков генов Cul7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию, тирозинемию 1А типа, врожденную глухоту, соответственно. Последовательности праймеров изложены в таблицах 2а и 2б.
2) биочип для выявления мутаций в вышеописанных генах, вызывающие соответствующие наследственные заболевания, с иммобилизованными на нем олигонуклеотидными мишенями (маркерами). Последовательности мишеней представлены в таблице 3.
3) тест-система включает набор для проведения двухстадийной мультиплексной ПЦР, в составе которого имеется набор специфичных для каждого участка генов праймеров и флуоресцентно меченых праймеров для второй стадии ПЦР, а также набор для гибридизации, включающий в себя сам биочип с мишенями.
Заявленное изобретение позволяет проводить диагностику одновременно по пяти мутациям (4582insT, 5741G/A, P269L, IVS1+1G>A, 1090G>C) на одном биочипе, позволяя идентифицировать мутацию, как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии, которые наиболее распространены на территории республики Саха (Якутия) среди якутской этнической группы (см. таблицу 4).
Дизайн праймеров тест-системы для осуществления ПЦР проводился, отталкиваясь от решения фланкировать целевые участки генов, где один из праймеров в каждой паре для проведения второй стадии мультиплексной ПЦР являются флуоресцентно мечеными. Праймеры для второй стадии ПЦР подбирались с учетом того, чтобы в конечном результате были получены преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченые продукты, комплементарные мишеням, иммобилизованным на подложке биочипа. Для этого в каждой паре праймер для второй ПЦР, содержащий флуоресцентный краситель добавляется в молярном избытке по отношению ко второму праймеру и выбирается из цепи, последовательность которой комплементарна последовательности мишеней на биочипе. При этом в качестве флуоресцентной метки используется краситель Cy5, относящийся к циановым красителям. Возможно использование также и других, например FAM, HEX, ALEXA и т.д.
В качестве подложки биочипа было принято решение использовать предметное стекло стандартных размеров. Поверхность стекла хорошо поддается химической обработке и модификации реактивными группами для крепления на нем мишеней. Для активации необходимо формирование реактивного альдегидного слоя на поверхности при помощи силановых соединений, которые являются линкерами между неорганической поверхностью и органической структурой реактивных соединений. Ковалентное крепление мишеней выполняется путем формирования оснований Шиффа между амино-модифицированными олигонуклеотидными мишенями и альдегидными группами на поверхности стекла. Печать биочипов выполняется печатающей станцией, например как Piezoarray от Perkin Elmer, бесконтактным способом принтинга.
Мишени подбирались в соответствии с участком ДНК с искомой мутацией, а также с диким типом данного гена.
Диагностика на тест-системе на основе биочипа включает в себе следующие этапы:
1. Отбор проб.
Геномная ДНК выделяется классическим методом хлороформной экстракции из венозной крови, сухой крови на фильтровальной бумаге и буккального соскоба.
2. Проведение амплификации ПЦР, состоящей из двух этапов (стадий): ПЦР1 и ПЦР2. Оба этапа ПЦР являются мультиплексными, с использованием пяти пар праймеров, позволяющих амплифицировать участки ДНК, содержащие сайты мутаций, ответственных за развитие всех пяти заболеваний. Второй этап ПЦР отличается от первого этапа продуктами ассиметричной амплификации, которые должны быть флуоресцентными и одноцепочечными для гибридизации их с мишенями на биочипе.
При этом рекомендуется использовать образцы ДНК с концентрацией 1-300 нг/мкл.
Для каждого образца готовится рабочая смесь, включающая в себя амплификационный буфер, содержащий ПЦР буфер и смесь dNTP, смесь праймеров для ПЦР1, ДНК-полимеразу, тестируемую ДНК для первого этапа, и продукт ПЦР1 для второго этапа. Общий объем смеси должен составлять 25 мкл.
Реакция первого этапа ПЦР проводится по следующей программе:
Программа для второго этапа ПЦР:
3. Проведение реакции гибридизации.
Одноцепочечные, флуоресцентно меченые продукты второго этапа ПЦР наносятся на поверхность биочипа для формирования гибридов специфично связанных водородной связью комплементарных участков ампликона и мишеней на биочипе с использованием гибридизационного буфера в условиях водяной бани при температуре от 40°C до 60°C в течение 1 часа. Осевшие на слайд в процессе гибридизации ампликоны с комплементарной последовательностью, выделяют свечение, которое и являются опорным объектом при регистрации результатов.
После гибридизации биочип промывается в дистиллированной воде для удаления неспецифично связанных продуктов.
4. Обработка результатов анализа.
Для визуализации гибридов, ампликонов соединенных с пробами на биочипе, необходим сканер для регистрации флуоресцентных сигналов с гибридизованных на биочипе ампликонов, например Scan Ri, Perkin Elmer. Биочип совместим со всеми сканерами для чипов стандартного размера 75×25×1 мм.
5. Интерпретация результатов.
Для анализа результатов используется персональный компьютер с программой, разработанной производителем сканера, с индивидуально заданными параметрами. Основным условием для правильного вывода результата является наличие сигналов в поле дикого типа, что является контролем прохождения всех этапов реакции.
Для снижения вероятности ошибки поле анализа представлено на биочипе в четырех повторах.
Заявленное решение иллюстрируется чертежами, где на фигуре 1 показана схема расположения мишеней на биочипе, а на фигуре 2 - пример результата анализа ДНК с мутантной гомозиготой P269L в гене DIA1.
В схеме мишеней обозначены (см. фиг. 1): 1 - поле, содержащее мишени дикого типа, 2 - поле, содержащее мишени мутантного типа, 3 - контрольная полоса, 4 - 3М синдром, 5 - SOPH синдром, 6 - метгемоглобинемия 1 типа, 7 - глухота, 8 - тирозинемия. При этом все мишени должны быть нанесены в вертикальных дублях. Зоны А1-А5 представляют собой мишени, соответствующие дикому типу генов по исследуемым мутациям. Зоны В1-В5 соответствуют мутантным аллелям. Зона С1-С5 является маркером для позиционирования координатной маски (двумерной координатной сетки, отражающей положение точек на графическом изображении, полученном при сканировании).
Критерием правильности работы тест-системы является наличие сигналов в поле дикого типа, что является контролем прохождения всех этапов реакции. Все сигналы в поле дикого типа должны присутствовать для всех образцов ДНК, за исключением случаев анализа образцов ДНК мутантной гомозиготы. В этом случае в мутантном поле должны светиться точки, отсутствующие в поле дикого типа.
При визуальном анализе должны быть учтены следующие условия:
1) вывод о наличии мутации основывается на сравнении интенсивности сигналов топографически сходных точек в полях А1-А5 и В1-В5. То есть, А1 и B1, А2 и В2, A3 и В3, А4 и В4, А5 и В. Положительным сигналом в «мутантном поле» считается сигнал, интенсивность которого равноценна или отличается от интенсивности топографически соответствующей точки в поле «дикого типа» не более, чем в два раза. При этом возможны следующие варианты результатов (на примере полей А1 и В1):
1. присутствие сигнала в А1 и отсутствие в В1. Вывод: гомозигота - дикий тип по мутации 4582insT в гене CUL7;
2. присутствие сигналов и в А1 и в В1. Вывод: гетерозигота по мутации 4582insT в гене CUL7;
3. отсутствие сигнала в А1 и присутствие в В1. Вывод: гомозигота по мутации 4582insT в гене CUL7.
В случае дикого типа по всем анализируемым мутациям все точки в зоне А1-А5 должны давать положительные сигналы при этом не должно быть положительных сигналов в зоне В1-В5.
2) Если в поле дикого типа отсутствует более одной пары точек, и при этом нет сигнала в поле мутаций, то результаты анализа считаются недействительными для интерпретации. В этом случае рекомендуется повторение ПЦР.
На примере результата анализа ДНК с мутантной гомозиготой P269L в гене DIA1 (см. фиг. 2) в координатах A1, В1 выставлены точки мутаций - 4582insT, CUL7, А2, В2 - мутации 5741G>A, NBAS, A3, В3 - мутации P269L, DIA1, А4, В4 - IVS1+1G>A, GBJ2, А5, В5 - 1090G>C, FAH, в гомозиготном и гетерозиготном состоянии соответственно, полоса С представляет контроль гибридизации. В данном случае визуализируются сигналы в координатах В3, что указывает на мутацию в гомозиготном состоянии.
В виду высокой частоты встречаемости данных наследственных заболеваний исключительно на территории Республики Саха (Якутия) и труднодоступности диагностики их в других регионах России, заявленное решение может быть успешно внедрено в клиническую практику.