СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОВИРУСА, ХАРАКТЕРИЗУЮЩЕГОСЯ СНИЖЕННЫМ КОЭФФИЦИЕНТОМ СООТНОШЕНИЯ ФИЗИЧЕСКИХ И ИНФЕКЦИОННЫХ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ, И ГЕННО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ТАКИМ СПОСОБОМ
METHOD FOR MAKING RECOMBINANT ADENOVIRUS PREPARATION CHARACTERISED BY LOWER RATIO OF PHYSICAL AND INFECTIOUS VIRAL PARTICLES, AND GENETICALLY THERAPEUTIC DRUG PREPARATION PRODUCED BY SUCH METHOD

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины, в частности генотерапии раковых заболеваний, и обеспечивает способ наработки рекомбинантного аденовируса, который может быть использован для доставки генов целевых продуктов, обладающих терапевтическим эффектом, в пораженные клетки больного.
Уровень техники
Солидные (твердые) опухоли составляют почти 90% всех онкологических заболеваний. Одним из потенциально перспективных способов лечения таких опухолей является генотерапия. Наиболее эффективные методики генотерапии основаны на доставке в пораженные клетки больного терапевтических генов с помощью Ад-вирусов, называемых Ад-вирусными векторами. Рекомбинантные репликативно-дефектные аденовирусы по сравнению с другими векторными системами отличаются высокой эффективностью экспрессии трансгена в различных типах клеток, безопасностью вектора для человека и животных, накоплением рекомбинантных вирусов в клетках-продуцентах в высоком титре (N.E.Altaras et al., Production and formylation of adenovirus vectors, Adv. Biochem Engin/biotecnology (2005), 99, 193-260), большой пакующей емкостью вектора (Black J.L., Genome projects and gene therapy: gateways to next generation biological weapons // Milit. Med. - 2003. - Vol.108, №11. - P.864-871). Для применения в генной терапии на сегодняшний день в качестве векторов использовали два аденовирусных серотипа - 2 и 5. Они хорошо приспособлены в случае использования в генотерапии in vivo, поскольку дают высокие титры вирусных частиц. Аденовирусы способны реплицироваться и в делящихся и в неделящихся клетках. Они не интегрируют в геном клеток-хозяев и остаются эпихромосомными. Это уменьшает опасность инсерционного мутагенеза (Roemer К., Friedmann Т., Concepts and strategies for human gene therapy. Eur.J.Biochem., (1992) 268, 211-225; Mulligan R.C. The basic science of gene therapy. Science, (1993), 260, 926-931, Crystal R.G., Transfer of Genes to Humans: Early Lessons and Obstacles to Success. Science, (1995), 270, 404-410) (см. табл.1):
Кроме того, Ад-вирусы обладают высокой степенью тропизма по отношению к клеткам опухолей, что позволяет избирательно инфицировать только раковые клетки, снижая токсический эффект генотерапии. Уже получены данные о терапевтических препаратах, созданных на основе Ад-вирусов. Так, препарат Гендицин, несущий ген белка - супрессора роста опухолей (р53), применяется для лечения плоскоклеточной эпидермоидной карциномы и других твердых опухолей (Zhaohui Peng, Current Status of Gendicine in China: Recombinant Human Ad-p53 Agent for Treatment of Cancers, Human gene therapy 2005, 16, 1016-1027; M.Lusky, Human Gene Therapy, 2005, 16, 281-291).
Создание генетической конструкции на основе аденовируса серотипа 5 (Ад5) имеет ряд практических преимуществ. Обладая избирательной способностью инфицировать клетки злокачественных опухолей, рекомбинант Ад5 не способен реплицироваться в клетках-мишенях, что позволяет пролонгированно экспрессировать ген-вставку целевого продукта, обладающего терапевтическим эффектом. Кроме того, инъекция препарата в организм не создает возможной патогенной угрозы для здоровых клеток, а также не угрожает здоровью персонала, принимающего участие в производстве фармпрепарата.
Генно-модифицированные (рекомбинантные) аденовирусы могут быть использованы для эффективного переноса терапевтического или маркерного-репортерного трансгена в клетки разнообразных типов. Получение и культивация репликативно-дефектных Ад-векторов осуществляется в специальных генетически модифицированных клеточных линиях. Такие клетки млекопитающих, как HeLa, СНО, W138, ВНК, COS-7, HepG2, 3Т3 RIN, MDCK и А549 используют для наращивания репликативно-компетентной формы Ад, а после соответственной генной модификации для наращивания репликативно-дефектной формы Ад.
Самой распространенной клеточной линией для наращивания рекомбинантного репликативно-дефектного Ад является линия НЕК 293, полученная из клеток эмбриональной почки человека, в геном которой был интегрирован фрагмент ДНК Ад5, способный экспрессировать белок Е1а и Е1в, кодирующий вирусную репликацию (Graham, F.L, Smiley, J., Russel, W.C, Nairn, R.; Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5; J.Gen.Virol. (l977) 36:59-74). В качестве клеток-хозяев для репликативно-дефектных аденовирусов также могут быть использованы и клеточные линии PER.C6, 911, или IT293SF.
В настоящее время наряду с другими вирусами для генной терапии используются и рекомбинантные аденовирусы 2 и 5 типов (Ad2 и Ad5 соответственно), которые вызывают респираторные заболевания человека. И Ad2, и Ad5 оба принадлежат к подклассу аденовирусов, которые не связаны с малигнизацией тканей человека. Доказано, что недавно разработанный гибридный аденовирусный вектор Ad5/F35 весьма перспективен для разработки генно-терапевтических препаратов и для смежных областей науки (P.Yotnda, Н.Onishi, НЕ.Heslop, DM.Shayakhmetov, A.Lieber, МК. Brenner, and. A.Davis. Highly efficient transduction of primitive hematopoietic stem cells by modified Adenovirus. Hum Gene Ther. 2001 Apr 10; 12 (6): 659-70.)
14
Рекомбинантные аденовирусы обладают способностью обеспечивать исключительно высокий уровень доставки трансгенов. Действенность доставки терапевтического трансгена этой системой для восстановления нарушенного генетического равновесия была продемонстрирована на животных моделях разнообразных генетических расстройств (Y. Watanabe, "Serial Inbreeding of Rabbits with Hereditary Hyperlipidemia (WHHL-Rabbit)", Atherosclerosis, 36:261-268 (1980); K.Tanzawa et al, "WHHL-Rabbit: A Low Density Lipoprotein Receptor-Deficient Animal Model for Familial Hypercholesterolemia", FEBS Letters, 118(l):81-84 (1980); J. Goldstein et al, "Defective Lipoprotein Receptors and Atherosclerosis-Lessons from an Animal Counterpart of Familial Hypercholesterolemia", New Engl. J. Med., 309 (5): 288-296 (Aug. 4, 1983); S.Ishibashi et al, "Massive Xanthomatosis and Atherosclerosis in Cholesterol-fed Low Density Lipoprotein Receptor-negative Mice", J. Clin. Invest., 93: 1885-1893 (May, 1994). Действительно, дефектный по репликации аденовирус, кодирующий к-ДНК для трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR), недавно был разрешен для применения против муковисцидоза как результат по меньшей мере двух клинических испытаний (J. Wilson, "Cystic Fibrosis-Vehicles for Gene Therapy", Nature, 365: 691-692 (Oct. 21, 1993). M.Horwitz, "Adenoviridae and Their Replication", 2d edition, ed. B.N.Fields, Raven Press, Ltd., New York, Chapter 60, pp.1679-1721 (1990) показали терапевтическую эффективность генной терапии, основанной на аденовирусной доставке, на модели рака в мышах (ретинобластома). Потребность в аденовирусных векторах клинического качества резко растет вместе с расширением клинических испытаний. Оценка годового спроса на аденовирусные векторы при проведении клинических испытаний на 300 пациентах может достигать приблизительно 6×10БОЕ (бляшкообразующих единиц).
При производстве лекарственного препарата на основе Ад5 значительное внимание уделяется качеству и безопасности лекарственных препаратов на основе аденовирусов. Одним из важнейших показателей препарата является отношение содержания общего количества вирусных частиц (в.ч.) к инфекционным, бляшкообразующим единицам (БОЕ). По рекомендации FDA США этот коэффициент не должен быть выше 30 (Bauer et al., 2002, In Curiel DT, Douglas JT (eds) Adenoviral vector for gene therapy, Academic, New York, p.615). Наличие высокого титра балластной популяции дефектных в.ч. приводит к высокой иммуногенности препарата, что приводит к быстрому достижению максимально допустимого порога вирус-нейтрализующих антител.
До настоящего времени самым распространенным способом наращивания рекомбинантного аденовируса в лабораторных условиях и на производстве пилотного уровня при производстве опытных партий препарата для доклинических и клинических испытаний являлся способ с использованием пластиковых культуральных матрасов и чашек Петри (Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology, Washington C.Winn, Elmer W.Koneman, 2006, 1377).
Способ предусматривает следующие стадии:
C1. Культивация клеток-хозяев для заражения вирусом
2
2
2
2
2
2
Для этого суспензию клеток-хозяев высевают в матрас площадью 162 см с добавлением 25 мл питательной среды DMEM и 10% сыворотки крови. Культуру клеток инкубируют в CO-инкубаторе в течение 48 часов до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 90-100%. После завершения инкубации полученную клеточную суспензию разливают в 3 культуральных матраса площадью 162 см по 1 мл клеток в каждый матрас и по 25 мл культуральной среды DMEM. Клетки культивируют в CO-инкубаторе в течение 48 часов до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 90-100%. Истощенную среду удаляют с помощью вакуума. Полученные клеточные суспензии высевают на 9 матрасов площадью 162 см. Культуру клеток в 9 матрасах инкубируют в CO-инкубаторе в течение 48 часов до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 90-100%. Полученные клеточные суспензии высевают на 9 матрасов и на 18 матрасов и инкубируют 48 часов до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 90-100% и 70-80% соответственно.
18 матрасов с конфлюэнтностью клеток 70-80% используют для вирусного инфицирования. Остальные 9 матрасов с конфлюэнтностью 100% оставляют для поддержания культуры с целью последующего наращивания Ад5.
C2. Получение Ад5 вирусной затравки
2
Клеточную культуру 18 матрасов с конфлюэнтностью 70-80% инфицируют начальной вирусной затравкой из мастер-банка с известным вирусным титром. Культуральные матрасы с инфицированной культурой клеток инкубируют в CO-инкубаторе 36-48 часов. Истощенную культуральную среду каждого матраса используют для суспендирования культуры Ад5 с помощью пипетки.
C3. Культивация инфицированной культуры клеток
2
2
2
Каждый из 9 матрасов площадью 162 см, полученых на стадии 1, рассевают на две чашки Петри площадью 150 см. В каждую культуральную емкость добавляют по 25 мл питательной среды DMEM, содержащей 10% сыворотки, и инкубируют в CO-инкубаторе в течение 36-48 часов при температуре 37°C. Полученные культуры клеток на 18 чашках Петри с конфлюэнтностью клеток 70-80% используют для инфицирования вирусной затравкой (с.2), а культуру клеток 9 матрасов с конфлюэнтностью 90-100% оставляют для поддержания культуры с целью последующего наращивания Ад5.
Также известны и другие способы наращивания аденовируса с использованием биореакторов, роллерных установок, клеточных фабрик. Однако использование этих способов не является эффективным, т.к. они маломощны и требует значительных временных затрат (чашки, матрасы) или являются пространственно и технологически громоздкими (биореакторы, клеточные фабрики) для производства среднего, пилотного уровня производства опытных партий препаратов.
2
Наиболее оптимальным способом наращивания Ад в условиях производства среднего уровня может считаться способ настоящего изобретения с использованием многоуровневых культуральных матрасов Гиперфласк (HyperFlask, Corning (США, Кат. №10010). Эти матрасы были успешно использованы в случае наращивания лентивируса (ЛВ) с помощью непосредственной трансфекции ДНК ЛВ вектора, вспомогательной упаковки и ДНК плазмиды-коверта в культуру клеток 293Т (CRL-11268), HOS (CRL-1543) и HeLa (CCL-2) (R.H.Kutner et al., Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography, BMC Biotechnology 2009, 9:10). В результате осуществления заявленного способа получают большой объем (550 мл) супернатанта с высоким титром ЛВ вектора, отличающийся на порядок по сравнению с использованием чашек площадью 150 см. Однако в этой работе речь идет только о трансфекционных вирусных единицах, причем соотношение инфекционных и неинфекционных вирусных единиц, которое является важным показателем качества получаемого препарата, не указано.
Раскрытие изобретения
В основе настоящего изобретения лежит тот неожиданно обнаруженный изобретателями факт, что использование многоуровневых культуральных матрасов HYPERFlask для выращивания культуры клеток-хозяев и последующего выращивания рекомбинантного аденовируса позволяет не только интенсифицировать получение противоопухолевого генно-терапевтического лекарственного препарата на основе рекомбинантного аденовируса, но и значительно сократить время и пространственные ресурсы, требующиеся для производства и хранения вирусного затравочного материала. Время, затраченное при наращивании вируса в HYPERFlask на стадиях рассевания клеточной культуры под заражение, получения вирусной затравки, инфицирования аденовирусом и получения инфицированного клеточного материала, сокращается как минимум в 5 раз по сравнению с наращиванием Ад5 на эквивалентной площади культуральных чашек и матрасов. Пространственные ресурсы тем самым увеличиваются в 5 раз.
Кроме того, было неожиданно обнаружено, что использование многоуровневых культуральных матрасов HYPERFlask приводит к снижению популяции дефектных аденовирусных частиц, что проявляется в снижении соотношения физических и инфекционных вирусных частиц. Поскольку данный коэффициент отражает уровень иммуногенности лекарственного препарата, то его снижение приводит к повышению качества лекарственного препарата и его эффективности.
Предложенный способ наработки аденовируса является идеальным на стадии получения опытных образцов лекарственных препаратов для доклинических и клинических испытаний.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу наращивания рекомбинантного аденовируса, включающему следующие стадии:
a) выращивание культуры клеток-хозяев в культуральной среде;
b) получение рабочего банка затравки рекомбинантного аденовируса посредством инфицирования культуры клеток-хозяев, полученных на стадии a), рекомбинантным аденовирусом из мастер-банка с последующим культивированием инфицированной культуры клеток-хозяев;
c) инфицирование культуры клеток-хозяев, выращенной, как описано на стадии а), вирусной затравкой, полученной на стадии b);
d) культивирование инфицированной культуры клеток-хозяев;
e) сбор инфицированных клеток, полученных на стадии d), характеризующийся тем, что все стадии культивирования культуры клеток-хозяев осуществляют в многоуровневых культуральных матрасах HYPERFlask.
В одном из воплощений способ настоящего изобретения дополнительно включает выделение и очистку вируса из собранных инфицированных клеток. В одном из предпочтительных воплощений очистку проводят путем центрифугирования в градиенте плотности CsCl. В следующем предпочтительном воплощении очистку проводят путем тангенциальной ультрафильтрации - анионообменной хроматографии.
В еще одном из воплощений способа настоящего изобретения рекомбинантным аденовирусом является аденовирус, полученный на основе аденовируса серотипа 5 (Ад5).
В следующем из воплощений способа настоящего изобретения рекомбинантный аденовирус экспрессирует ген тимидин-киназы вируса простого герпеса 1-типа, р53, α-интерферона, β-интерферона, или зеленого флюоресцентного белка (GFP), и др.
В одном из предпочтительных воплощений в качестве клеток-хозяев используют клетки линии НЕК293. В более предпочтительном воплощении выращивание клеток-хозяев на стадии а) включает следующие стадии: выращивание клеток в культуральной среде до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 100%; суспендирование клеток в культуральной среде в присутствии трипсина-ЭДТА; инокуляцию свежей культуральной среды полученной суспензией и выращивание клеток до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 100%; суспендирование клеток в культуральной среде в присутствии трипсина-ЭДТА; инокуляцию свежей культуральной среды полученной суспензией и выращивание клеток до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 70%.
В еще одном из более предпочтительных воплощений получение вирусной затравки на стадии b) включает следующие стадии: инфицирование клеток, полученных, как описано в п.6, рекомбинантным Ад5, и культивирование инфицированной культуры клеток; сбор инфицированных клеток с их последующим лизисом посредством замораживания-оттаивания.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к препарату рекомбинантного аденовируса, полученному способом настоящего изобретения. В одном из предпочтительных воплощений рекомбинантный аденовирус представляет собой рекомбинантный Ад5. В еще одном из предпочтительных воплощений рекомбинантный аденовирус является аденовирусом, экспрессирующим ген тимидин-киназы вируса простого герпеса 1-типа, р53, α-интерферона, β-интерферона, или зеленого флюоресцентного белка (GFP), и др.
Осуществление изобретения
Заявленный способ является универсальным и может быть использован как для наращивания репликативно-компетентных, так и репликативно-дефектных Ад. Наращивание Ад может осуществляться в любых подходящих линиях клеток, позволяющих осуществлять полноценную репликацию Ад. Конкретный серотип, к которому относится культивируемый аденовирус, не имеет существенного значения, однако с точки зрения практического применения полученного аденовируса в качестве лекарственного препарата способ настоящего изобретения предпочтительно применяется для выращивания аденовирусов 2 и 5 серотипов.
Примером репликативно-компетентного вируса может служить такой вирус, как, например, ONYX-015 (М.Sunamura et al, Restricted replication-competent adenovirus: a novel strategy for cancer gene therapy, International Journal of Clinical Oncology, 2000, 147-152). Терапевтическое действие этого рекомбинантного вируса основано на том, что он обладает уникальной способностью реплицироваться только в клетках с дефицитом экспрессии гена, кодирующего онко-супрессор р 53. Активный протеин р53 тормозит рост и индуцирует апоптоз клетки в ответ на повреждение клеточной ДНК. Поскольку ONYX-015 имеет частичную делецию в области репликативного гена Е1В, то наращивание вируса осуществляют также в клеточной линии НЕК293 (Giuseppe Portella et al., ONYX-015, an E1B Gene-Defective Adenovirus, Induces Cell Death in Human Anaplastic Thyroid Carcinoma Cell Lines, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism Vol.87, No. 6 2525-2531).
Получение культуры репликативно-дефектного Ад5 или Ад2 вируса с высоким содержанием инфекционных вирусных частиц может осуществляться при инфицировании культуры клеток, такой как, например, НЕК-293, PER.C6, 911 и IT293SF.
Наиболее предпочтительными клетками-хозяевами при наращивании репликативно-дефектного Ад5 являются клетки линии НЕК-293. Это связано с тем, что в геноме клеточной линии НЕК-293 содержится стабильная интегрированная копия гена Е1, кодирующего два Е1 белка: Ela and Elb, кодирующие вирусную репликацию (Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C. and Nairn, R. (1977) J. Gen. Virol. 36: 59-74).
2
2
Авторами настоящего изобретения было продемонстрировано, что наращивание АВ в клеточной культуре НЕК 293 с использованием многоуровневых клеточных фабрик (HyperFlask, #10010, Corning) позволяет значительно увеличить производительность получения АВ. Авторы настоящего изобретения показали, что если клетки-хозяева НЕК 293 наращивать и рассевать в многоуровневых культуральных матрасах под заражение АВ, то выход лекарственного препарата в единицу времени можно увеличить как минимум в 5 раз. Интенсификация наращивания АВ достигалась за счет сокращения времени и пространственных ресурсов на стадиях рассевания клеточной культуры под заражение, заражения АВ и на стадии получения клеточного материала, инфицированного вирусом. Также было выявлено 10-кратное улучшение качества и 2-кратное увеличение количества вирусного затравочного материала, полученного в результате культивирования АВ в многоуровневых культуральных матрасах, по сравнению с традиционными методами наращивания АВ в лабораторных условиях. Это позволило значительно сократить время и пространственные ресурсы на производство и хранение вирусного затравочного материала. Кроме того, было выявлено снижение популяции дефектных АВ частиц, что отразилось на снижении коэффициента соотношения физических и инфекционных вирусных частиц. Поскольку данный коэффициент отражает уровень иммуногенности лекарственного препарата, то его снижение приводит к повышению качества лекарственного препарата и его эффективности. Указанный способ дает возможность интенсифицировать процесс наработки клеточного материала, инфицированного рекомбинантным АВ, который в очищенной форме и будучи заключенным в фармацевтическую композицию может быть использован в генной терапии для трансформации гиперпролиферативных клеток млекопитающих, терапии рака, ингибировании пролиферации опухоли у животных и человека, для снижения пролиферации опухолевых клеток. Заявленный способ характеризуется тем, что инфицирование адгезионной культуры клеток НЕК 293 рекомбинантным репликативно-дефектным Ад5 осуществляется при использовании многоуровневых культуральных матрасов HYPERFlask (Corning). Общая площадь HYPERFlask равна 1700 см, что эквивалентно одиннадцати культуральным чашкам площадью 150 см. HYPERFlask состоит из десяти соединенных между собой ростовых мембран, обработанных соответствующим образом для улучшения клеточной адгезии. Все десять мембран обладают свойствами, обеспечивающими проникновение кислорода внутрь HYPERFlask и вывод углекислого газа таким образом, что все ростовые поверхности внутри HYPERFlask имеют эффективный доступ к газообмену.
Готовый препарат рАд5 может быть получен с использованием разнообразных способов очистки, которые хорошо известны специалистам в данной области. В качестве примера готовый препарат может быть получен с помощью центрифугирования в градиенте CsCl с последующим диализом против буфера, подходящего для последующих хранения и инъекций (например, 10 мМ Трис, pH 8,0-8,5, 10% глицерин или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с глицерином), или с использованием ультрафильтрации, ионообменной хроматографии и диализа.
Следующие далее примеры раскрывают наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения и приведены исключительно с целью лучшего пояснения его сущности. Специалисту в данной области будет понятно, что можно осуществить множество модификаций как в отношении используемых средств и материалов, так и в отношении используемых способов без отступления за рамки изобретения.
Пример 1. Выращивание культуры рекомбинантного Ад5
7
1. 560 мл ростовой среды DMEM, содержащей 7% сыворотки крови, 146 мг глютамина, 25000 ед. пенициллина, 25000 ед. стрептомицина, 25 мл 7,5% бикарбоната натрия и 4×10 клеток линии НЕК293, помещают в HYPERFlask (Cat. #10010, Corning, США) и культивируют 48 часов до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 100%.
2. Клеточную суспензию получают путем смывания клеточного монослоя 100 мл раствора трипсина-ЭДТА и 50 мл ростовой среды DMEM, приготовленной как описано выше в п.1.
7
3. К 510 мл ростовой среды DMEM, приготовленной как описано в п.1, добавляют 50 мл клеточной суспензии, полученной как описано выше в п.2, содержащей 4×10 клеток. Полученную клеточную суспензию помещают в HYPERFlask и культивируют 48 часов до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 100%.
7
4. К 535 мл ростовой среды DMEM, приготовленной как описано в п.1, добавляют 25 мл клеточной суспензии (п.2), содержащей 3×10 клеток. Полученную клеточную суспензию помещают в HYPERFlask и культивируют 48 часов при температуре 37°C до образования клеточного монослоя с конфлюэнтностью 70%. Данную операцию проводят с использованием параллельно 4 культуральных устройств.
8
9
5. Полученные, как описано выше в п.4, клеточные монослои инфицируют с помощью добавления вирусной затравки (5×10-10 БОЕ) из мастер-банка рекомбинантного Ад5. Для этого питательную среду, в которой росли клетки, сливают из HYPERFlask (п.4) и смешивают с вирусной затравкой. Конечный объем среды и вирусной затравки, составляющий 560 мл, помещают обратно в HYPERFlask, содержащий клеточный монослой.
6. Культивацию АВ в HYPERFlask осуществляют 48-64 часа при температуре 37°C. На этой стадии морфологию инфицированных клеток оценивают визуально.
7. Инфицированные клетки сливают в стерильные емкости, лизируют замораживанием-оттаиванием, хранят при температуре -70°C и используют впоследствии в качестве рабочего банка вирусной затравки для масштабного наращивания рекомбинантного АВ.
8
9
8. Титр полученной затравки (п.7) равен 5×10-10 БОЕ/мл, что на порядок выше, чем титр вирусной затравки, полученной на культуральных матрасах площадью
2
2
162 см. Кроме того, объем полученной затравки (п.7) составляет 560 мл, что в два раза больше, чем объем затравки с 10 культуральных матрасов площадью 162 см.
9. Клеточную культуру, полученную в п.3, рассевают, как описано в п.2, 3, 4, и инфицируют вирусной затравкой (п.7), как описано в п.5.
10. Культивацию Ад5 в HYPERFlask осуществляют 48 часов при температуре 37°C.
11. Инфицированные клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 10 мл буфера, подходящего для дальнейшей очистки, и хранят при -70°C.
Пример 2. Очистка рекомбинантного вируса Ад5
3
12
12
12
Рекомбинантный Ад5 очищают с помощью концентрирования вирионов путем их осаждения на поверхность раствора CsCl плотностью 1,365 г/см, как описано в монографии «Вирусология. Методы», Б.Мейхи, 1988, стр.263, а также с использованием тангенциальной ультрафильтрации и анионообменной хроматографии, как описано в "Methods in molecular biology", M. Le Doux, vol. 434, volume 2, Design and characterisation of gene transfer vectors, p.13-23. Количество физических частиц Ад5 оценивают по величине оптической плотности раствора Ад5 при измерении поглощения при 260 нм, принимая, что 1 ОЕ соответствует 10 вирусных частиц на 1 мл раствора при длине оптического пути 1 см (Maizel J.V.J, et al., 1968, Virology, 36-115).Выход очищенного Ад5 составляет 2×10-5×10 физических частиц с одного культурального устройства HYPERFlask.
Пример 3. Анализ качества полученного препарата вируса Ад5
50
2
Количество инфекционных вирусных частиц оценивали с помощью титрования вируса и расчета логарифма ТЦД, как описано в монографии «Вирусология. Методы», Б.Мейхи, 1988, стр.267, и по методу бляшкообразования, как описано в монографии «Вирусология. Методы», Б.Мейхи, 1988, стр.265. Было обнаружено снижение популяции дефектных Ад5 частиц, что отразилось на снижении коэффициента соотношения физических и инфекционных вирусных частиц с 260 до 54-14 по сравнению с наращиванием Ад5 на культуральных чашках площадью 150 см. Отсутствие популяции дефектных низкомолекулярных Ад5 частиц было отмечено также визуально при центрифугировании в градиенте CsCl.
Пример 4. Показатели эффективности и воспроизводимости способа настоящего изобретения
Результаты нескольких репрезентативных экспериментов, в которых наращивание аденовируса в многоуровневых культуральных матрасах HyperFlask проводили в соответствии со способом настоящего изобретения, представлены в Таблице 2.
Таблица 2
Эффективность наращивания аденовируса в многоуровневых культуральных матрасах HyperFlask
Заключительная очистка
Название образца
lgТЦД<sub>50</sub>
Способ наращивания
Кол-во БОЕ в мл**
Кол-во* в.ч. в мл
в.ч./БОЕ
Центрифугирование в градиенте CsCl
17.04.09
8
HyperFlask
**
7×10<sup>12</sup>
14
Центрифугирование в градиенте CsCl
24.04.09
8
HyperFlask
**
1×10<sup>13</sup>
20
Хроматография
20.05.09
7
HyperFlask
**
2.7×10<sup>12</sup>
54
Центрифугирование в градиенте CsCl
29.10.08
6
Чашки 150 см<sup>2</sup>
**
1.4×10<sup>12</sup>
280
Хроматография
Контроль **14.01.09
5
Чашки 150 см<sup>2</sup>
5×10<sup>8</sup>
1.3×10<sup>11</sup>
260
Хроматография *** (9.04.08)
09.04.08
4
Чашки 150 см<sup>2</sup>
4×10<sup>7</sup>
-
-
Клеточный лизат (затравка)****
20.05.09
6
HyperFlask
**
-
-
Клеточный лизат (затравка)
03.06.09
5
HyperFlask
**
-
-
Клеточный лизат (затравка)
03.06.09
5
HyperFlask
**
-
-
Клеточный лизат (затравка)
18.04.08
4
Чашки 150 см<sup>2</sup>
**
-
-
Клеточный лизат (затравка)
08.08.08
4
Чашки 150 см<sup>2</sup>
**
-
-
Клеточный лизат (затравка)
20.08.08
4
Чашки 150 см<sup>2</sup>
**
-
-
Клеточный **** лизат
26.06.09
7
HyperFlask
**
-
-
Клеточныйлизат
01.07.09
7
HyperFlask
**
-
-
Клеточныйлизат
08.07.09
7
HyperFlask
**
-
-
Клеточный лизат
29.10.08
6
Чашки 150 см<sup>2</sup>
5×10<sup>9</sup>
-
-
Клеточный лизат
29.10.08
6
Чашки 150 см<sup>2</sup>
2×10<sup>9</sup>
-
-
Клеточный лизат
29.10.08
5
Чашки 150 см<sup>2</sup>
5×10<sup>8</sup>
-
-
* - Общее количество вирусных частиц (в.ч.) определяли в очищенном препарате (центрифугирование в градиенте CsCl или жидкостная хроматография) коэффициента экстинкции - 1,0 ОЕ<sub>260нм</sub>=1,2×10<sup>12</sup> в.ч. на 1 мл при длине с помощью оптического пути 1 см.
** - Для контроля количества инфекционных вирусных частиц в случае определения биологической активности вирусного образца по подсчету lgTЦД<sub>50</sub> использовали стандартный образец с известным количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ).
*** - Частично очищенный препарат.
**** - Клеточный лизат (затравка) для инфицирования клеток получали с помощью суспендирования инфицированных клеток в истощенной ростовой среде (25 мл с 1 матраса площадью 162 см<sup>2</sup> и 50 мл с одной поверхности 170 см<sup>2 </sup>HyperFlask), клеточный лизат для очистки вируса получали с помощью суспендирования одной поверхности 162-170 см<sup>2</sup> в 1 мл PBS в случае центрифугирования в градиенте CsCl или в 1 мл буфера для ресуспендирования в случае хроматографии и ультрафильтрации (5 мМ Трис-НС1, 75 мМ NaCl, 1 мМ MgCl<sub>2</sub>, 5% сахарозы, 1% PS-80, pH 8,0).
Все патенты, публикации, научные статьи и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.
Конкретные терапевтические гены, векторы, культуры клеток, используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. При изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения будут приходить в голову специалистам в данной области и они охватываются рамками данного изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.