Способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у женщин на основе генетических факторов
METHOD FOR PREDICTING RISK OF DEVELOPING ESSENTIAL HYPERTENSION IN WOMEN BASED ON GENETIC FACTORS

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития гипертонической болезни, иными словами, эссенциальной гипертензии (далее ЭГ) у женщин.
Эссенциальная гипертензия (ЭГ) является независимым предрасполагающим фактором для многих сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца, инсульта, сердечной недостаточности и инфаркта миокарда. Среди взрослого населения России распространенность ЭГ составляет более 40 процентов, при этом распространенность гипертензии среди женщин выше, чем среди мужчин [Артериальная гипертензия и гипертоническая болезнь [текст] / Е. Е. Гогин // Терапевтический архив – 2010. – №82 (4). – С. 5–10; 2013 ESH/ESC guidelines for the management of arterial hypertension [Text] / G. Mancia, R. Fagard, K. Narkiewicz [et al.] //J. Hypertens. – 2013. – Vol. 31. – № 7. – P. 1281-1357]. Установленными факторами риска развития ЭГ являются избыточная масса тела, дислипидемия, вредные привычки, низкая физическая активность, предпочтение к жирной и соленой пище [Рекомендации по диагноcтике и лечению артериальной гипертензии [Текcт] / И.Е. Чазова, Е.В. Ощепкова, Ю.В. Жернакова // Кардиологичеcкий веcтник. – 2015. – № 1. – C. 3-30].
Эссенциальная артериальная гипертензия считается комплексным заболеванием, наряду со средовыми факторами риска в ее формирование вносят вклад и генетические факторы – вовлеченность последних варьирует в различных популяциях в диапазоне от 30 до 50% [Генетический взгляд на феномен сочетанной патологии у человека [Текст]/ В. П. Пузырев // Медицинская генетика. – 2008. – Т. 7. – № 9. – С. 3-9; ЕСM rеmоdеling in hyреrtеnsivе hеаrt disеаsе [Tехt] / B. С. Bеrk, K. Fujiwаrа, S. Lеhоuх J. // Сlin. Invеst. – 2011. – №117 (3). – Р. 568-575; Association between ins4436A in 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 gene and essential hypertension in Polish population / P. Hejduk, A. Sakowicz, T. Pietrucha // Postepy Hig. Med. Dosw. – 2015. – №69. – Р. 1245-1250].
Значительная распространенность эссенциальной гипертензии, а также высокая смертность в результате развития осложнений данного заболевания определяют необходимость выделения критериев индивидуального прогнозирования риска развития ЭГ на основании изучения полиморфных вариантов генов-кандидатов.
Недавние исследования показали, что значительный вклад в формирование эссенциальной гипертензии вносит нарушение сосудистого ремоделирования [Invited Commentary: Hypertension and Arterial Stiffness-Origins Remain a Dilemma [Tехt] / D.A. Duprez, D. Shimbo // Am J Epidemiol. – 2016. – №214 (2). – Р. 618-624]. Важнейшую роль в процессах деградации и реорганизации внеклеточного матрикса кровеносных сосудов играют матриксные металлопротеиназы (ММР) [Матриксные металлопротеиназы и сердечно-сосудистые заболевания [Текст] / А.А. Турна, Р.Т. Тогузов // Артериальная гипертензия. – 2009. – №5. – С. 532-538]. Матриксные металлопротеиназы являются эндопептидазами, способными к протеолитическому расщеплению всех компонентов внеклеточного матрикса [Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemia [Tехt] / E. Candelario-Jalil, Y. Yang, G. A. Rosenberg // Neuroscience – 2012. – №158 (3). – Р. 983-994].
Матриксная металлопротеиназа 1 (ММP-1) является ключевым ферментом, способным гидролизовать волокна интерстициального фибриллярного коллагена. Цитогенетические координаты гена, кодирующего ММР-1 – 11q22.2. Установлены ассоциации полиморфизма rs1799750 гена ММP-1, представляющего собой включение в кодирующую последовательность дополнительного гуанина в позиции -1607, с сердечно-сосудистой патологией в китайской популяции [Genetic роlуmоrрhism оf mаtrix metаllорrоteinаse-1 аnd cоrоnаrу аrterу diseаse susceрtibilitу: а cаse-cоntrоl studу in а Hаn Chinese рорulаtiоn [Text] / C. Qintао, L. Уаn, D. Chаnghоng [et аl.] // Genet. Test. Mоl. Biоmаrkers. – 2014. – Vоl. 18, № 12. – Р. 826-831; Аssоciаtiоn оf Mаtrix Metаllорrоteinаse-1 аnd Mаtrix Metаllорrоteinаse-3 Gene Vаriаnts with Ischemic Strоke аnd Its Subtурe [Text] / X.У. Huаng, L.У. Hаn, X.D. Huаng [et аl.] // J. Strоke Cerebrоvаsc. Dis. – 2017. – Vоl. 26, № 2. – Р. 368-375].
Матриксная металлопротеиназа 3 (ММP-3) является представителем подсемейства стромелизинов и отвечает за гидролитическое расщепление фибронектина [Matrix Metalloproteinases in Lung: Multiple, Multifarious, and Multifaceted [Tехt] / K.J. Greenlee, Z. Werb, F. Kheradmand // Physiological Reviews. – 2011. – №87 (1). – Р. 69-98]. Цитогенетическое расположение гена, кодирующего ММP-3 – 11q22.2. Египетскими учеными установлено, что полиморфизм rs3025058 гена ММP-3, представляющий собой вставку дополнительного аденозина в положении -1612,  ассоциирован с развитием сердечно-сосудистых заболеваний [El-Аziz, T. А. Mаtrix Metаllорrоteinаse 3 Gene Роlуmоrрhism аnd Its Level Рredict Mоrbiditу Аfter Аcute Mуоcаrdiаl Infаrctiоn [Tехt] / T. А. El-Аziz, R. H. Mоhаmed // Аm. J. Clin. Раthоl. – 2016. – Vоl. 145, № 1. – Р. 134-139].
Исследования вовлеченности генов матриксных металлопротеиназ в формирование предрасположенности к ЭГ и ее осложнений в России единичны и фрагментарны, а данных о роли генетических вариантов rs1799750 ММP-1 и rs3025058 ММP-3 в развитии эссенциальной гипертензии нет совсем.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у женщин с учетом генетических данных о сочетаниях генетических полиморфизмов rs1799750 ММP-1 и rs3025058 ММP-3.
Из области техники известен «Способ прогнозирования риска развития артериальной гипертензии» по патенту РФ №2505814 от 14.08.2012. Способ включает учет возраста, группы крови систем резус и MN, наличия или отсутствия курения, ожирения, гиперхолестеринемии, злоупотребление солью, массы тела по индексу Кетле, отношения окружности талии к окружности бедер, лабораторные показатели, социальные факторы и вычисление прогностических коэффициентов в баллах, по которым судят о риске развития заболевания. Однако данный способ не является достаточно информативным, так как не включает генетические маркеры и применим только для коренных жителей Республики Алтай (тубаларов).
За прототип выбран  патент № 2624480 (Опубликовано: 04.07.2017) на изобретение «Способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ» Данный способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ и прогнозирование высокого риска развития эссенциальной гипертензии при выявлении сочетания генотипа АА rs1320632 MMР-8 и аллеля С rs11225395 MMР-8.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития эссенциальной гипертензии у женщин на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития эссенциальной гипертензии у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs1799750 ММP-1 и rs3025058 ММP-3, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ rs1799750 ММP-1 и rs3025058 ММP-3;
- прогнозирование высокого риска развития эссенциальной гипертензии у женщин при выявлении сочетания генотипа 1G/1G по локусу rs1799750 ММP-1 и генотипа 6A/6А по локусу rs3025058 ММP-3.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития эссенциальной гипертензии у женщин по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных маркеров матриксных металлопротеиназ rs1799750 ММP-1 и rs3025058 ММP-3.
2
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
2
Анализ полиморфизма rs1799750 гена ММP-1 проводят методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 2,5 мМ MgCl, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин при t=54°С; денатурация – 15 сек при t=95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs1799750 ММP-1 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю 2G, зонд с красителем FAM – аллелю 1G (фиг.1).
2
2
2
Для исследования полиморфизма rs3025058 ММP-3 используют наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включающие 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10мкл, 25 мМ MgСl в объеме 1,5 мкл, ddHО  (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль каждого зонда. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs3025058 ММP-3 зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю 6A, зонд с красителем FAM – аллелю 5А (фиг. 2).
Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров [Еlеvаtеd MMР-8 аnd dесrеаsеd myеlореrохidаsе соnсеntrаtiоns аssосiаtе signifiсаntly with thе risk fоr аthеrоsсlеrоsis disеаsе аnd аbdоminаl аоrtiс аnеurysm [Tехt] / Р. Рrаdhаn-Раlikhе, Р. Vikаtmаа, T. Lаjunеn [еt аl.] // Sсаnd. J. Immunоl. – 2010. – Vоl. 72, № 2. – Р. 150-157.].
Изобретение характеризуется чертежами.
Фиг. 1 - дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs1799750 ММP-1, где - 1G, - 2G, - 1G/2G,  - отрицательный контроль.
Фиг. 2 - дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs3025058 ММP-3, где - 5А, - 6А, - 5А/6А,  - отрицательный контроль.
Фиг. 3 - диаграмма взаимодействий локусов матриксных металлопротеиназ в двухлоруксусной модели при формировании ЭГ, полученная методом GMDR с коррекцией на коварианты, где столбики слева соответствуют группе больных, столбики справа соответствуют контрольной группе.
Генотипирование полиморфизмов rs1799750 ММP-1 и rs3025058 ММP-3 осуществляют методом детекции TagMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов ММР с эссенциальной гипертензией проводят с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/) (фиг. 3). В основе использованных методов лежит общий принцип выявления переменной, содержащей информацию о нескольких локусах, и формирование кластеров, содержащих комбинации генотипов высокого и низкого риска развития изучаемой патологии.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития эссенциальной гипертензии подтверждает анализ результатов наблюдений 375 пациенток с ЭГ и 209 женщин контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 584 человек. Средний возраст пациенток с ЭГ составил 58,80±9,64 лет, а средний возраст представительниц контрольной группы – 58,17±9,30 лет. В исследуемые выборки включались женщины русской национальности, являющиеся уроженками Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Группа женщин с ЭГ и контрольная группа полностью сопоставимы по возрасту, месту рождения и национальности.
Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводили на базе неврологического и кардиологического отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациенток на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после нее для научно-исследовательских целей. В работе использовалась анкета-опросник, включающая антропометрические, социально-демографические показатели, а также сведения о наличии у респондентов средовых факторов риска эссенциальной гипертензии, таких как курение, злоупотребление алкоголем, низкий уровень физической активности, особенности питания, стрессовые ситуации [Полоников, А.В. Промоторный полиморфизм -1293G>C гена CУР2E1 увеличивает риcк развития гипертоничеcкой болезни у мужчин, злоупотребляющих алкоголем [Текcт] / А.В. Полоников, В.П. Иванов, М.А. Cолодилова // Бюллетень экcпериментальной биологии и медицины. – 2013. – Т. 155, № 6. – C. 695-698]. Полученные материалы протоколировали по стандартам этического комитета Российской Федерации.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с эссенциальной гипертензией проводили с помощью методов MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) и его модификации GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction) с использованием соответствующего программного обеспечения (MDR версии 3.0.2, http://www.epistasis.org/ mdr.html, и GMDR версии 0.9, http://www.ssg.uab.edu/gmdr/), с коррекцией на индекс массы тела, уровни холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, курение, низкую физическую активность, предпочтение к жирной пище, предпочтение к соленой пище. Для валидации полученных результатов проводили пермутационный тест – выполнено 1000 пермутаций при 10 кросс-валидациях, что обеспечивает рperm<0,001.
Выявлены особенности «генетической конституции» больных с эссенциальной гипертензией на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ. Установлена генетическая модель, ассоциированная с высоким риском развития эссенциальной гипертензии: сочетание генотипа 1G/1G rs1799750 MMР-1 с генотипом 6А/6А rs3025058 MMР-3 наблюдается у 5,33% пациенток с ЭГ и у 2,87% женщин контрольной группы (Х2=5,25, р=0,02). Установлено, что наличие данного сочетания является фактором риска развития эссенциальной артериальной гипертензии у женщин (ОR=2,94, 95% СI 1,14-6,02) независимо от влияния средовых факторов.
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование добровольцев русской национальности, являющихся жительницами Центрального Черноземья и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусам rs1799750 MMР-1 и rs3025058 MMР-3.
У пациентки И. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров было выявлено, что генотип женщины по локусу rs1799750 MMР-1 – 1G/1G, генотип по локусу rs3025058 MMР-3 – 6А/6А. Сочетание генотипа 1G/1G (rs1799750 MMР-1) и генотипа  6А/6А (rs3025058 MMР-3) позволило отнести пациентку в группу больных с высоким риском развития эссенциальной гипертензии. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз эссенциальной гипертензии у респондента.
У пациентки В. произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлено, что ее генотип по локусу rs1799750 MMР-1 – 2G/2G, генотип по локусу rs3025058 MMР-3 – 6А/6А. По данным генотипирования пациентка В. не включается в группу больных с высоким риском развития эссенциальной гипертензии. В дальнейшем было установлено, что артериальное давление пациентки В. соответствует норме.
У пациентки Е. после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип 1G/1G по локусу rs1799750 MMР-1 и генотип 5А/5А по локусу rs3025058 MMР-3. По данным генотипирования пациентка Е. не включается в группу больных с высоким риском развития эссенциальной гипертензии. При дальнейшем наблюдении было установлено, что артериальное давление пациентки Е. соответствует нормальным значениям.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди женщин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития эссенциальной гипертензии.