СИСТЕМА ИНКАПСУЛИРОВАНИЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПРОБИОТИКОВ ВО ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ
ENCAPSULATION SYSTEM FOR PROTECTION OF PROBIOTICS DURING PROCESSING

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[001] Эта заявка заявляет приоритет относительно Заявки на патент США с порядковым номером 13/088165, поданной 15 апреля 2011 года, которая включена здесь в ее полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[002] Данное изобретение относится к области доставки конкретных ингредиентов поставщику в съедобных продуктах, более конкретно, инкапсулированных питательных веществ, таких как пробиотические бактерии, в съедобных продуктах (например, напитках в виде соков, сухих концентратах для производства напитков, готовых для питья жидких композициях, сиропах, порошках, легких закусках, пудингах и т.д.).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[003] Пробиотические бактерии (называемые здесь в некоторых случаях пробиотиками) являются живыми бактериальными микробами, которые благоприятно влияют на здоровье и питание индивидуумов стимуляцией более здоровой микрофлоры в кишечнике хозяина. Эти варианты микрофлоры зависят от веществ, которые предоставляются им из пищевого рациона организма-хозяина. Пробиотики обычно колонизируются в толстой кишке и могут выполнять любую или обе по меньшей мере из двух главных ролей: они могут дополнять природную флору желудочно-кишечного тракта дополнительными бактериями, и они могут быть эффективными в лечении ряда состояний здоровья, включающих в себя, но неограничивающихся ими, (1) облегчение кишечных нарушений (например, констипации (запора) и диареи, вызываемых инфекцией патогенными организмами, антибиотиками, химиотерапией и т.д.); (2) стимуляцию и модуляцию иммунной системы; (3) противоопухолевые эффекты, происходящие из инактивации или ингибирования канцерогенными соединениями, присутствующими в желудочно-кишечном тракте, уменьшением кишечных бактериальных ферментативных активностей (например, O-глюкуронидазы, азоредуктазы, нитроредуктазы и т.д.); (4) уменьшенное продуцирование токсичных конечных продуктов (например, аммиака, фенолов, других белковых метаболитов, о которых известно, что они влияют на цирроз печени, и т.д.); (5) уменьшение холестерина сыворотки и артериального давления; (6) поддержание целостности слизистой оболочки; (7) ослабление симптомов непереносимости лактозы; и/или (8) предотвращение вагинита.
[004] Потенциальные механизмы антипатогенных эффектов пробиотических бактерий осуществляются через уменьшение рН просвета посредством продуцирования жирных кислот с короткой цепью, таких как уксусная кислота, молочная кислота или пропионовая кислота, делающих жизненно важные нутриенты недоступными для патогенов, изменяющих окислительно-восстановительный потенциал среды, продуцирующих пероксид водорода или продуцирующих бактериоцины или другие ингибиторные вещества (Kailasapathy and Chin, 2000). В недавние годы конкретные живые микробные ингредиенты продуктов питания и их влияния на здоровье человека исследовались как в пищевых матриксах, так и в виде отдельных или смешанных культуральных препаратах. Вследствие их признаваемых преимуществ для здоровья, пробиотические бактерии увеличивающимся образом включали в ферментируемые молочные продукты. Пробиотики включали в ферментированные молочные продукты, йогурты, мягкий, полутвердый и твердый сыр, мороженое и замороженные ферментированные молочные продукты. Некоторые из наиболее обычных типов пробиотических бактерий включают в себя Lactobacillus и Bifidobacteria (Axelsson, 1993; Holzapfel et al, 2001).
9
10
[005] Способность пробиотических микроорганизмов выживать и размножаться в хозяине в сильной степени влияет на их пробиотические преимущества. Эти бактерии должны быть метаболически стабильными и активными в этом продукте, выживать в прохождении через верхний пищеварительный тракт в больших количествах и иметь благоприятные эффекты в кишечнике хозяина. (Gilliland, 1989). Типичным стандартом для любого пищевого продукта, продаваемого с притязанием на пользу для здоровья от добавления пробиотиков, является то, что этот продукт содержит по меньшей мере 10-10 колониеобразующих единиц (КОЕ) жизнеспособных пробиотических бактерий на порцию. Пробиотики являются чувствительными к различным условиям окружающей среды обычно лишены способности выживать в течение продолжительных периодов времени в пищевых продуктах с “высоким содержанием кислоты” и продуктах в виде напитка (например, свежих цитрусовых плодах, соках плодов цитрусовых, пищевых продуктах, содержащих соки плодов цитрусовых, томатном соусе и т.д.). Например, в натуральных плодово-ягодных напитках пробиотики являются чувствительными к многочисленным условиям окружающей среды, включающим в себя, например, низкий рН, высокое содержание кислоты, высокую активность воды, тепло, воздух, свет и неотъемлемое присутствие полифенолов, обнаруживаемых в плодово-ягодных соках, или другие влияния окружающей среды. Таким образом, эта жизнеспособность (измеряемая в колониеобразующих единицах или КОЕ, и следовательно, эффективность съедобных продуктов, дополненных пробиотиками, в желудочно-кишечном тракте может быть существенно уменьшенной.
[006] Если съедобная композиция имеет рН менее 7, она считается кислотной. Кислоты, присутствующие в съедобной композиции (например, пищевом продукте или напитке), вносят вклад в уровень рН. Чем больше присутствует кислоты, тем ниже будет вероятный уровень рН. Обычно считается, что высококислотные съедобные композиции имеют природный рН 4,6 или более низкий. Например, одним из преобладающих нутриентов в плодах цитрусовых является кислота, например, аскорбиновая кислота (витамин С), и уровень рН апельсинового сока находится около 3,8. Известно, что кислотные среды денатурируют жизнеспособные белки, необходимые для роста бактериальных организмов. Таким образом, эти организмы умирают в кислотных условиях. Многие желаемые пробиотики растут лучше всего при величинах рН около 7,0. Термины "содержание кислоты" и "степень кислотности" могут отличаться между собой. Содержание кислоты является мерой того, как много кислоты присутствует на единицу объема съедобной композиции. Степенью кислотности является фактическая величина рН или напитка. Высокое содержание кислоты дает более низкую величину рН, тогда как низкое содержание кислоты приводит к более высокой величине рН.
[007] Нагревание (например, в форме пастеризации) используется рутинным образом для убивания микробов, которые могут присутствовать в пищевых продуктах. Обычно, чем более холодным может поддерживаться продукт, тем больше выживание пробиотиков. Солнечный свет или искусственный свет может также убивать по меньшей мере некоторые пробиотики. Некоторые длины волн УФ-света являются особенно вредными. Вследствие чувствительности пробиотиков, влияния окружающей среды, такие как высокое ингибирование, высокие уровни кислорода, влага и прямой свет, могут приводить к напиткам, содержащим эти организмы, имеющим короткий срок годности при хранении. Результатом является продукт с неподходящим сроком годности при хранении, т.е. продукт, уменьшенное количество пробиотических клеток которого определяет конец срока годности при хранении, приводящий к более высоким расходам и увеличенным отходам.
[008] Способы инкапсулирования, такие как микроинкапсулирование, были исследованы для применения для усиления обработки, хранения и стабильности к перевариванию чувствительных материалов, таких как пробиотические бактерии, делая возможной стабилизацию временного и нацеленного высвобождения ингредиентов. Микроинкапсулирование было определено как технология упаковки твердых, жидких или газообразных материалов в миниатюрных, заделанных капсулах, которые могут высвобождать их содержимое при регулируемых скоростях под влиянием специфических условий (Anal and Stevens, 2005; Anal et al., 2006). Микроинкапсулирование использовали для увеличения обработки, хранения и стабильности к перевариванию чувствительных материалов, таких как пробиотические бактерии. Эта технология позволяет материалам иметь покрытие или быть заключенными в матриксе с созданием барьера для окружающей среды, который впоследствии деградируется для высвобождения корового (сердцевинного) материала. Композиция (состав) микрокапсул может подвергаться манипуляции для улучшения стабильности и создания возможности деградации при специфических условиях (Anal and Singh, 2007). Таким образом, задачей микроинкапсулирования пробиотических бактерий является предотвращение разрушения во время обработки и хранения и предотвращение деградации желудочной кислотой, протеолитическими ферментами и солями желчных кислот перед выделением в ободочную кишку.
[009] До сих пор, исследование инкапсулирования пробиотиков концентрировалось в основном на поддержании жизнеспособности клеток пробиотических бактерий при низком рН и высоких концентрациях желчи, а также во время распылительной сушки, лиофильной сушки и хранении. Многие исследования концентрировались на технологиях микроинкапсулирования и манипуляции параметров инкапсулирования, таких как типы материалов покрытия и их концентрации, и использовании множественных слоев покрытия. Мало усилий прилагалось к улучшению жизнеспособности пробиотиков при высоких температурах добавлением термопротекторов, однако было обнаружено, что жизнеспособность является незначительной со многими штаммами. Таким образом, по-видимому, нет доступных коммерческих пробиотических продуктов, которые являются стабильными при высокой температуре. Кроме того, прежние способы инкапсулирования требовали применения эмульсий типа вода-в-масле или масло-в-воде, множественных стадий реакций, множественных покрытий или оболочек для инкапсулирования или их комбинаций.
[010] Потребители демонстрируют непрерывный интерес в съедобных продуктах, таких как готовые для питья напитки или пищевые продукты, обогащенные ингредиентами, которые, как считается, обеспечивают преимущества для здоровья. Было бы желательным обеспечение пробиотиков или других нутриентов в стабильной форме для применения в съедобных продуктах таким образом, что эти ингредиенты могли бы противостоять некоторым условиям процесса, связанным с обработкой (например, смешиванию, гомогенизации, пастеризации и т.д.) этих съедобных продуктов, но все еще быть доступными в качестве нутриента в желудочно-кишечном тракте, как только этот пищевой продукт или напиток потребляется индивидуумом.
[011] Различные документы, включающие в себя, например, публикации и патенты, цитируются во всем этом описании. Все такие документы включены тем самым посредством ссылки. Цитирование любого конкретного документа не должно рассматриваться как признание того, что он является прототипом настоящего изобретения. В том случае, если любое значение или определение термина в этом письменном документе противоречит какому-либо значению или определению этого термина в документе, включенном посредством ссылки, руководящим должно быть значение или определение, подразумеваемое термином или отнесенное к термину в этом письменном документе.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[012] Следующее описание представляет упрощенную сущность аспектов продуктов настоящего изобретения, композиций и способов, описанных здесь. Сущность изобретения не является обширным исчерпывающим обзором и не предназначена для идентификации всех или только ключевых или критических элементов или для описания объема продуктов, композиций и способов, охватываемых формулой изобретения. Следующая сущность изобретения представляет только некоторые концепции и аспекты этого описания в упрощенной форме в качестве прелюдии к более подробному описанию, обеспеченному ниже, определенных примерных и неограничивающих вариантов настоящего изобретения.
3
[013] В первом аспекте настоящее изобретение относится к являющемуся напитком продукту, содержащему по меньшей мере одну водную жидкость, и капсулы, содержащие желатинированную смесь альгината и белкового изолята сыворотки, и пробиотические бактерии, заключенные в этой желатинированной смеси. Капсулы имеют средний размер частицы между 1 микроном и 1000 микронами (мкм) в диаметре. Пробиотические бактерии необязательно включают в себя Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. или смеси любых из них. Захваченные пробиотические бактерии подвергают тепловой стабилизации, в которой подвергание продукта в виде напитка температуре до 92 градусов Цельсия в течение до 5 секунд приводит к уменьшению жизнеспособных клеток пробиотических бактерий между 0 и 1×10 КОЕ/грамм капсул.
[014] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу образования инкапсулированных пробиотиков, предусматривающему смешивание водного раствора, содержащего альгинат натрия и денатурированный белок, с суспензией активных пробиотических клеток в 0,1% пептонной воде, для образования первой смеси, объединение первой смеси с водным раствором хлорида кальция для инициации холодного желатинирования альгината натрия и денатурированного белка с образованием второй смеси; и пропускание второй смеси через отверстие, имеющее диаметр менее 1000 мкм, для образования гранул, имеющих средний размер частиц менее 1000 мкм в диаметре, где полученные не имеющие покрытия гранулы содержат желатинированную смесь альгината и денатурированного белка и пробиотические бактерии, захваченные в желатинированной смеси. В некоторых вариантах осуществления отношение белка к альгинату находится между 1:1 и 9:1.
[015] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к пищевому продукту, содержащему инкапсулированные пробиотические бактерии. Инкапсулированные пробиотические бактерии обеспечены капсулами, содержащими желатинированную смесь альгината и денатурированного белкового изолята сыворотки, и пробиотическими бактериями, захваченными в желатинированной смеси. Капсулы имеют средний размер частиц между 1 мкм и 1000 мкм в диаметре.
[016] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу образования инкапсулированных пробиотиков, предусматривающему по существу обеспечение смеси, содержащей альгинат натрия, денатурированный белок и активные пробиотические клетки, и объединение смеси с двухвалентным катионом для инициации холодного желатинирования альгината натрия и денатурированного белка, где полученные капсулы содержат желатинированную смесь альгината и денатуированного белка и пробиотические бактерии, захваченные в желатинированной смеси. Массовое отношение белка к альгинату равно от 1:1 до 9,1.
[017] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения не имеющих покрытия желатинированных гранул, предусматривающему смешивание водного раствора, содержащего альгинат натрия и денатурированный белок, с суспензией активных пробиотических клеток в 0,1% пептонной воде, объединение первой смеси с двухвалентным катионом для инициации холодного желатинирования альгината натрия и денатурированного белка с образованием второй смеси и пропускание второй смеси через отверстие, имеющее диаметр менее 1000 мкм, с образованием гранул, имеющих средний размер частиц менее 1000 мкм, где полученные капсулы содержат желатинированную смесь альгината и денатурированного белка и пробиотические бактерии, захваченные в желатинированной смеси. Массовое отношение белка к альгинату равно от 1:1 до 9:1.
[018] В шестом аспекте настоящее изобретение относится к капсулам, образованным способом смешивания водного раствора, содержащего альгинат натрия и денатурированный белок, с активными пробиотическими клетками с образованием первой смеси, объединения первой смеси с водным раствором хлорида кальция для инициации холодного желатинирования альгината натрия и денатурированного белка с образованием второй смеси и пропускания второй смеси через отверстие с образованием капсул, имеющих средний размер частиц между 1 мкм и 1000 мкм в диаметре. Полученные капсулы содержат желатинированную смесь альгината и денатурированного белка и пробиотические бактерии, захваченные в желатинированной смеси. Кроме того, этот способ приводит к капсулам, в которых белок не является значимо ковалентно связанным с альгинатом. Массовое отношение белка к альгинату равно от 1:1 до 9:1.
[019] В некоторых примерных вариантах осуществления пищевые продукты или напитки дополнительно включают в себя один или несколько ингредиентов, подходящих для применения в таких съедобных продуктах, включающих в себя, например, один или несколько дополнительных ингредиентов, описанных ниже. Все проценты, цитируемые в данном описании, раскрытии и прилагаемой формуле изобретения, являются массовыми процентами полностью сформованного пищевого продукта или напитка, если нет других указаний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[020] Более полное понимание настоящего изобретения и его преимуществ может быть достигнуто со ссылкой на следующее описание с учетом сопутствующих фигур, в которых одни и те же номера позиций указывают одинаковые признаки, и где:
[021] Фиг.1A показывает изображение цифрового оптического микроскопа капсулы чистого сывороточного белка.
[022] Фиг.1В показывает изображение цифрового оптического микроскопа капсулы 75:25 белкового изолята сыворотки к альгинату.
[023] Фиг.2A показывает изображение сканирующего электронного микроскопа капсулы лиофилизированного чистого белкового изолята сыворотки.
[024] Фиг.2В показывает изображение сканирующего электронного микроскопа капсулы 50:50 лиофилизированного белкового изолята сыворотки к альгинату.
[025] Фиг.2C показывает изображение сканирующего электронного микроскопа пор на поверхности капсулы чистого белкового изолята сыворотки.
[026] Фиг.2D показывает изображение сканирующего электронного микроскопа клеток L. acidophilus на поверхности капсулы термально денатурированного белкового изолята сыворотки.
[027] Фиг.3 изображает деградацию капсул в имитированной желудочной жидкости и имитированной кишечной жидкости.
[028] Фиг.4А изображает фотографию высушенных микрокапсул сывороточного белка-альгината.
[029] Фиг.4B изображает фотографию микрокапсул сывороточного белка-альгината, инкубированных в имитированных желудочных жидкостях в течение двух часов.
[030] Фиг.4C изображает фотографию микрокапсул сывороточного белка-альгината, инкубированных в имитированных желудочных жидкостях в течение двух часов.
[031] Фиг.4D изображает фотографию микрокапсул сывороточного белка-альгината, инкубированных в имитированных желудочных жидкостях в течение восьми часов.
[032] Фиг.5 изображает график нагрузка-время капсул во время сжатия высоты капсулы.
[033] Фиг.6 изображает максимальный график нагрузки капсул при 50% сжатии общей высоты этих капсул.
[034] Фиг.7 изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных клеток L. acidophilus после инкубирования в имитированной желудочной жидкости и пепсине в течение 120 минут.
[035] Фиг.8 изображает график количеств жизнеспособных клеток из микроинкапсулированных клеток L. acidophilus после инкубирования в имитированной желудочной жидкости и пепсине в течение 120 минут.
[036] Фиг.9 изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных клеток из инкапсулированных клеток L. acidophilus в дистиллированной воде при 37, 50, 60 или 80 градусах Цельсия.
[037] Фиг.10А изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток L. acidophilus после инкубирования в фосфатном буфере с рН 7.
[038] Фиг.10B изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток Bifidobacterium lactis после инкубирования в фосфатном буфере с рН 7.
[039] Фиг.11 изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток L. casei после тепловой обработки при 50 градусах Цельсия.
[040] Фиг.12 изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток L. casei после тепловой обработки при 60, 70 и 80 градусах Цельсия.
[041] Фиг.13A изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток L. casei после кислотной обработки при рН 3,8 и 4,1.
[042] Фиг.13B изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток Bifidobacterium lactis после кислотной обработки при pH 3,8 и 4,1.
[043] Фиг.14A изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток L. casei после тепловой обработки при 92 градусах Цельсия в течение четырех секунд, при рН 3,5.
[044] Фиг.14B изображает график количеств жизнеспособных клеток из свободных и инкапсулированных клеток Bifidobacterium lactis после тепловой обработки при 92 градусах Цельсия в течение четырех секунд, при рН 3,5.
[045] Фиг.15 изображает фотографию Inotech Encapsulator IE-50R.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[046] В следующем описании различных вариантов осуществления делается ссылка на сопутствующие фигуры, которые образуют его часть и в которых показаны посредством иллюстрации различные варианты осуществления, в которых могут быть использованы на практике один или несколько аспектов настоящего изобретения. Для удобства, различными вариантами, обсуждаемыми ниже, являются композиции, продукты, способы и т.п. Должно быть понятно, что могут быть использованы другие варианты осуществления и могут быть произведены структурные и функциональные модификации без отклонения от объема данного описания.
[047] Здесь делаются ссылки на товарные названия для компонентов, включающих в себя различные ингредиенты, подходящие для применения в примерных напитках, композициях и способах, описанных здесь. Авторы настоящего изобретения не имеют в виду ограничение материалами, имеющими определенное товарное название. Эквивалентные материалы (например, материалы, полученные из другого источника под отличающимся названием или ссылочным номером), относительно материалов, на которые делаются ссылки здесь с использованием товарного названия, могут быть заменены и использованы в описаниях здесь.
[048] Аспекты настоящего изобретения относятся к применению биополимеров пищевой категории в качестве подходящих инкапсулирующих агентов для пробиотических бактерий. Такие аспекты обеспечивают систему биополимеров пищевой категории, которая инкапсулирует и стабилизирует пробиотические бактерии в температурных и желудочных условиях, а также делает возможной доставку пробиотических бактерий в нижний желудочно-кишечный тракт. В некоторых аспектах настоящего изобретения клетки Lactobacillus и Bifidobacterium инкапсулируют в смесях термически денатурированного белкового изолята сыворотки в комбинации с альгинатом. Различные комбинации биополимеров исследовались для получения крепких и высокожелаемых капсул. Согласно некоторым вариантам осуществления, капсулы готовят с использованием экструзионного способа инкапсулирования, способного защищать бактериальные клетки при температурных и желудочно-кишечных условиях. Кроме того, сенсорные оценки апельсинового сока и виноградного сока, обогащенных инкапсулированными клетками пробиотических бактерий, не обнаруживают значимого воздействия на вкус, обеспечиваемый инкапсулированными пробиотическими бактериями.
8
9
9
[049] Срок годности при хранении напитка, содержащего пробиотики, может быть определен как продолжительность времени, во время которого он сохраняет по меньшей мере определенную концентрацию или уровень жизнеспособных пробиотиков, например, по меньшей мере 1,0×10 КОЕ/единицу объема или массы, или в некоторых случаях по меньшей мере 5,0×10 КОЕ/единицу объема или массы. Этой единицей объема или массы могут быть миллилитры (мл), граммы (г), унции (унц.) и т.д. Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения, обеспечены съедобные продукты, содержащие инкапсулированные жизнеспособные пробиотические бактерии в количестве по меньшей мере 1,0×10 КОЕ/порцию, например, на порцию 8 унций или на порцию 240 мл.
8
9
6
[050] Термостабильность инкапсулированных пробиотических бактерий может быть определена как продолжительность времени при температуре выше комнатной температуры, при которой они сохраняют по меньшей мере определенные концентрацию или уровень жизнеспособных пробиотиков, например, по меньшей мере 1,0×10 КОЕ/единицу объема или массы, или в некоторых случаях по меньшей мере 5,0×10 КОЕ/единицу объема или массы. Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения, обеспечены съедобные продукты, содержащие инкапсулированные жизнеспособные пробиотические бактерии в количестве по меньшей мере 1,0×10на порцию. Температура выше температуры окружающей среды, при которой инкапсулированные пробиотические бактерии, такие как съедобный продукт, содержащий пробиотические бактерии, могут быть подвергнуты, равны 28-95 градусам Цельсия, например, 30 градусам Цельсия или 35 градусам Цельсия, или 40 градусам Цельсия, или 45 градусам Цельсия, или 50 градусам Цельсия, или 55 градусам Цельсия, или 60 градусам Цельсия, или 65 градусам Цельсия, или 70 градусам Цельсия, или 75 градусам Цельсия, или 80 градусам Цельсия, или 85 градусам Цельсия, или 90 градусам Цельсия, или 92 градусам Цельсия, причем любая из этих температур может отражать конечную точку в диапазоне. Продолжительность времени подвергания температуре выше температуры окружающей среды включает в себя время от 3 секунд до часа, например, 4 секунды или 5 секунд, или 10 секунд или 20 секунд, или 30 секунд, или 45 секунд, или 1 минуту, или три минуты, или пять минут, или семь минут, или десять минут, или пятнадцать минут, или двадцать минут, или двадцать пять минут, или тридцать минут, или сорок пять минут, или 1 час, причем любой из этих периодов времени может отражать конечную точку в диапазоне. Обычно, чем выше температура, тем короче продолжительность времени, при котором этот пробиотик будет успешно защищен термически.
9
12
10
6
4
3
3
3
2
[051] Некоторые примерные и неограничивающие варианты съедобного продукта или композиций, описанных здесь, могут поддерживать высокие степени жизнеспособности пробиотических бактерий и таким образом выживать при подвергании повышенным температурам, таким как, например, и без ограничения, термическая обработка во время приготовления съедобного продукта, разрушение нежелательных микробов в съедобном продукте, или их комбинаций. Примерные продукты в виде напитка или композиции из исходного диапазона концентраций 1,0×10-1,0×10 КОЕ/грамм капсул, например, 1,0×10 КОЕ/грамм капсул, способны доставлять по меньшей мере 1,0×10 КОЕ/грамм капсул после подвергания повышенным температурам. Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий после подвергания повышенной температуре составляет 0-1,0×10 КОЕ/грамм капсул или 0-5,0×10 КОЕ/грамм капсул, или 0-1,0×10 КОЕ/грамм капсул, или 0-5,0×10 КОЕ/грамм капсул, или 0-1,0×10 КОЕ/грамм капсул, или 0-50 КОЕ/грамм капсул, или 0-10 КОЕ/грамм капсул.
9
12
10
9
3
6
12
[052] Некоторые примерные и неограничивающие варианты съедобных продуктов или композиций, описанных здесь, могут поддерживать высокие степени жизнеспособности пробиотических бактерий и таким образом достигать продолжительного срока годности при хранении. Примерные продукты в виде напитка или композиции их исходного диапазона концентраций 1,0×10-1,0×10 КОЕ/порция, например, 1,0×10 КОЕ/порция, способны доставлять по меньшей мере 1,0×10 КОЕ бактерий на 12 жидких унций напитка, например, при употреблении даже после 45 дней при хранении в темноте или в других случаях при УФ-защищенных условиях при температуре 35°F (2°С) после розлива. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления по меньшей мере половина первоначальной концентрации жизнеспособных пробиотических бактерий остается после 45 дней, или 63 дней, или даже 70 дней, при хранении в темноте или в других случаях при УФ-защищенных условиях при температуре 35°F (2°С) после розлива. Согласно примерным аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в кислотном соке, имеющем рН 3,75 и хранящемся в условиях окружающей среды, составляет 0-1,0×10 КОЕ/грамм капсул после десяти недель хранения при 35°F (2°С) после розлива, т.е. 1,0×10-1,0×10 КОЕ/грамм капсул.
[053] Кроме того, рН съедобного продукта в соответствии с аспектами настоящего изобретения может влиять на жизнеспособность пробиотических бактерий, причем более низкие величины рН уменьшают жизнеспособность пробиотических бактерий. Например, согласно примерным аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных инкапсулированных пробиотических бактерий в кислотном соке, имеющем рН 2,75 и хранящемся в условиях окружающей среды, составляет 0-100 КОЕ/грамм капсул после двух недель хранения. В отличие от этого, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в кислотном соке, имеющем рН 3,5 и хранящемся в условиях окружающей среды, составляет 0-100 КОЕ/грамм капсул после восьми недель хранения.
[054] В данном контексте и в прилагаемой формуле изобретения термин "пробиотики", "пробиотический микроорганизм" или "пробиотическая биомасса" понимаются как включающие в себя любые микроорганизмы, содержимое клеток или метаболиты из микроорганизмов, имеющие благоприятные действия в отношении их хозяина. Таким образом, могут быть включены дрожжи, плесени и бактерии. В некоторых примерных вариантах осуществления могут быть использованы пробиотические бактериальные штаммы Bifidobacterium в продуктах в виде напитка, композициях и способах, описанных здесь, включающие в себя, например, B. breve, B. animalis (lactis), B. longum, B. bifidum, B. adolescentis, B. thermophiium и B. infantis. Могут быть также использованы пробиотические бактериальные штаммы рода Lactobacillus, включающие в себя, например, L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, L, paracasei, L. johnsonii, L. reuteri и L. plantarum, L. lactis, L. bulgaricus.
[055] EP 0862863 перечисляет некоторые примеры известных в настоящее время пробиотиков. Например, штаммы Lactobacillus plantarum (Lp299), Bifidobacterium lactis (UNO 19) или Bifidobacterium lactis (BB-12) могут быть использованы в некоторых нелимитирующих примерах съедобных продуктов и композиций, описанных здесь. Селекция (отбор) различных пробиотических штаммов предоставляется Christian Hansen BioSystems A/S (CHL), 10-12 Boge All, P.O Box 407, DK-2970 Horsholm, Denmark. Квалифицированный в данной области специалист будет способен, на основе этого описания, отобрать подходящие дополнительные или альтернативные штаммы пробиотических бактерий для применения в различных вариантах описанных здесь продуктов в виде напитка и композиций.
[056] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления съедобные продукты или композиции могут содержать бактерии из множественных видов. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления, когда в композиции присутствуют две бактерии, этими бактериями могут быть, например, B. animalis (lactis) и L. rhamnosus. Отношение одного бактериального вида к другому может широко варьироваться. Это отношение может быть равно приблизительно 0,00000001 к 1, приблизительно 0,0000001 к 1, приблизительно 0,000001 к 1, приблизительно 0,00001 к 1, приблизительно 0,0001 к 1, приблизительно 0,001 к 1, приблизительно 0,01 к 1, приблизительно 0,1 к 1 или приблизительно 1 к 1.
[057] Количества жизнеспособных бактерий часто выражается в виде КОЕ, или колониеобразующих единиц (KOE). Одна колония образуется единственной жизнеспособной бактерией, когда эти бактерии высевают в виде подходящего разведения для образования отдельных колоний. Имеется стандартный способ, известный микробиологам. Обычно это количество выражается в виде количества КОЕ в мерах для жидкостей, например, миллилитрах (мл), жидких унциях (fl. oz) и т.д. или в мерах для твердых веществ, например, граммах (г). Регламентирование США 21 CFR 101.9(b)(5)(viii) определяет жидкую унцию как точно 30 мл. Для получения благоприятных эффектов пробиотических бактерий необходимы достаточные количества жизнеспособных бактерий. Часто бактерии упакованы при определенном уровне жизнеспособных бактерий; однако, перед употреблением, эти уровни могут уменьшаться, предотвращая тем самым получение благоприятной дозы бактерий пользователем. Действительно, Национальный Центр для Дополнительной и Альтернативной Медицины (NCCAM) идентифицировал несколько проблем, связанных с качеством пробиотических продуктов, включающих в себя: жизнеспособность этих бактерий в продукте, типы и титр бактерий в этом продукте и стабильность при хранении. Смотрите NCCAM, "BACKGROUNDER: Biologically Based Practices: An Overview" (октябрь 2004). Этот документ может быть найден в web-сайте Национальный Центр для Дополнительной и Альтернативной Медицины (NCCAM).
[058] Бактерии, подходящие для определенных примерных и неограничивающих примеров продуктов в виде напитка, композиций и способов, описанных здесь, могут быть получены различными способами, известными в данной области, включающими, например, выращивание на средах, содержащих казеин. Необязательно, эти бактерии могут выращиваться без казеина, с обеспечением полностью не содержащего молочные продукты бактериального препарата. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления, эти бактерии могут храниться посредством охлаждения, замораживания или лиофилизации без уменьшения жизнеспособности ниже желаемого уровня. Согласно одному аспекту, эти бактерии замораживают и затем оттаивают перед инкапсулированием. Согласно некоторым аспектам, эти бактерии лиофилизируют и затем измеряют, смешивают и регидратируют в 0,10% пептонной воде перед инкапсулированием.
[059] Клетки жизнеспособных пробиотических бактерий инкапсулируют в соответствии с вариантами настоящего изобретения, в пищевых биополимерных капсулах, таких как гранулы или микрокапсулы. В данном контексте, термин "капсула" относится по существу к полностью замкнутой частице. Эта замкнутая частица может содержать материал наружной оболочки, который является тем же самым материалом, который находится внутри, или отличающимся материалом. Например, и без ограничения, капсула может содержать одну или несколько наружных твердых оболочек, окружающих жидкую внутреннюю сторону, или одну или несколько твердых наружных оболочек, окружающих твердую внутреннюю сторону. Согласно аспектам настоящего изобретения, материал как наружной оболочки, так и внутренней оболочки содержит сеть, содержащую по меньшей мере два биополимера, которые являются пересыпанными, перекрестно-связанными биополимерами или их комбинациями. Например, согласно некоторым аспектам настоящего изобретения, обеспечена капсула, содержащая наружную оболочку и внутренний материал, содержащий те же самые биополимеры, где различием между этой наружной оболочкой и внутренним материалом является степень перекрестного связывания по меньшей мере одного из этих биополимеров, так что плотная полимеризация на поверхности этой капсулы образует наружную оболочку. В противоположность этому, степень полимеризации материала внутренней стороны является такой, что она содержит пространство между отдельными полимерными тяжами. Когда эта капсула состоит из материала, присутствующего в форме, которая является твердой как во внутренней части, так и в наружной оболочке этой капсулы, она может называться здесь "гранулой".
[060] Размер этих капсул (или гранул) согласно изобретению варьируется в зависимости от процесса, используемого для приготовления этих капсул, и находится в диапазоне, содержащем частицы со средним размером частиц между 1 мкм и 3000 мкм в диаметре. Обычно комбинирование источника двухвалентного катиона с альгинатом с использованием капельного способа приводит к капсулам при верхнем конце этого диапазона, например, между 1500 мкм в диаметре и 3000 мкм в диаметре. Этот средний размер частиц этих капсул может регулироваться с использованием способов и устройств, известных квалифицированным в данной области специалистам, таких как, например, и без ограничения, распыление или экструзия. Например, как только в капсуле началось желатинирование, эта смесь может пропускаться через отверстия в экструзионном устройстве, такие как одна или несколько форсунок, с образованием посредством этого капсул или гранул, содержащих приблизительно такой же самый диаметр, что и диаметр отверстия, через которое проходила эта смесь.
[061] В данном контексте термин "микрокапсула" относится к капсуле (или грануле), имеющей средний размер частиц между 1 мкм и 1000 мкм в диаметре, например, между 1 мкм и 900 мкм в диаметре или между 1 мкм и 800 мкм в диаметре, или между 1 мкм и 700 мкм в диаметре, или между 1 мкм и 600 мкм в диаметре, или между 1 мкм и 500 мкм в диаметре, или между 1 мкм и 400 мкм в диаметре, или между 1 мкм и 300 мкм в диаметре, или между 1 мкм и 200 мкм в диаметре, или между 1 мкм и 100 мкм в диаметре, или между 100 мкм и 600 мкм в диаметре, или между 200 мкм и 600 мкм в диаметре, или между 400 мкм и 600 мкм в диаметре, или между 300 мкм и 500 мкм в диаметре. Капсулы, включающие в себя гранулы и микрокапсулы, имеют любую форму, образованную во время желатинирования биополимерами, например, и без ограничения, сферическую, яйцеобразную, цилиндрическую и т.п.
[062] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения используемые биополимеры включают в себя, например, и без ограничения, белки, полисахариды и их комбинации. Может быть использован любой подходящий полисахарид, как известно в данной области, такой как, например, и без ограничения, пектин, каррагенан, альгинат, ксантановая камедь, модифицированные целлюлозы, например, карбоксиметилцеллюлоза, аравийская камедь, камедь гхатти, камедь карайи, трагакантовая камедь, камедь рожкового дерева, гуаровая камедь, камедь семян подорожника, камедь семян айвы, камедь лиственницы (арабиногалактаны), страктановая камедь, агар, фурцелларан (сульфатированный полисахарид), модифицированные крахмалы, геллановая камедь, фукоидан и т.п.
[063] Может быть использован любой подходящий источник белка, как известно в данной области, включающий в себя, например, белковый изолят сыворотки, белковый изолят казеина, белковый изолят молока, пептиды белка, гидролизаты белка, белок риса, белок пшеницы, растительные белки, соевый белок, пептиды соевого белка, гидролизаты соевого белка, яичный белок, белки бобовых, белки из древесных орехов, белки из земляного ореха, белок зеин кукурузы и т.п. Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения, этот белок денатурируют для улучшения способности этого белка смешиваться или купажироваться с полисахаридами с уменьшением трехмерного размера отдельных белков. Денатурация может выполняться любым подходящим известным способом, известным квалифицированным в данной области специалистам, например, без ограничения, термическими способами. Например, подвергание водного раствора белкового изолята сыворотки температурам между приблизительно 65 градусами Цельсия и приблизительно 95 градусами Цельсия в течение времени 5-40 минут будет частично или полностью денатурировать белковый изолят сыворотки.
2+
2+
2+
2+
[064] В одном варианте осуществления настоящего изобретения два или более биополимеров используют для образования капсул для инкапсулирования жизнеспособных клеток пробиотических бактерий. Биополимеры альгината и белка, например, альгината натрия и белкового изолята сыворотки, успешно комбинируют с образованием капсул, содержащих пробиотические бактерии. Альгинат является анионным полисахаридом, который обычно доступен в виде натриевой или калиевой соли (т.е. альгината натрия или альгината калия). При подвергании воздействию на альгинат двухвалентными катионами, такими как Ca, альгинат подвергается желатинированию с образованием гелевой капсулы (или гранулы). Кроме того, процесс денатурации белка экспонирует реактивные группы и этот денатурированный белок подвергается также желатинированию при экспонировании двухвалентным катионам. Затем смесь двух или более биополимеров, например, альгината и денатурированного белка, которую подвергают воздействию двухвалентных катионовам, может образовывать множество капсул, содержащих желатинированную смесь альгината и денатурированного белка. Пробиотические бактерии, присутствующие в смеси биополимеров, становятся захваченными в желатинированной смеси. Может быть использован любой подходящий двухвалентный катион, известный квалифицированным в данной области специалистам, в частности, двухвалентные катионы, одобренные для включения в съедобные продукты, такие как, например, Ca, Mg или Fe.
[065] Поскольку альгинат и денатурированный белок подвергаются желатинированию, имеется некоторое переплетение альгината и белка; однако, этот денатурированный белок по существу не реагирует химически с альгинатом с образованием ковалентных связей с альгинатным полимером. В данном контексте "по существу не реагировал химически" определяют как "являлся не реагирующим на 90-100%". Однако при низких величинах рН альгинат и денатурированный белок может образовывать со временем комплексы альгината и белка.
[066] Можно включать дополнительные вещества в капсулу обеспечением раствора или дисперсии альгината, белка и одного или нескольких других веществ, перед подверганием воздействию двухвалентных катионов. После желатинирования одно или несколько других веществ становятся фиксированными (т.е. захваченными) в этой капсуле в виде заполнения внутренней стороны, как части желатинированной структуры, или их комбинации. Согласно аспектам настоящего изобретения, один или несколько типов клеток пробиотических бактерий включают в водный раствор с альгинатом и денатурированным белком перед желатинированием.
[067] Неожиданно, желатинированные капсулы, содержащие смесь полисахарида и белка, обеспечивают успешную защиту жизнеспособных пробиотических бактерий после подвергания воздействию условий обработки, таких как, например, повышенная температура и увеличенное давление, и подвергания воздействию кислотных условий, таких как имитированная желудочная жидкость, но также высвобождение пробиотических бактерий после подвергания воздействию щелочных условий, таких как имитированная кишечная жидкость. Было обнаружено, что капсулы, имеющие массовое отношение белка к полисахариду от 1,1 до 4,1, обеспечивают такую защиту для пробиотических бактерий. В отличие от таких комбинаций, капсулы, содержащие либо 100% белок, либо 100% полисахарид, не были способны защищать пробиотические бактерии от повышенной температуры или кислотных условий. Согласно аспектам настоящего изобретения, массовое отношение белка (например, денатурированного белкового изолята сыворотки) к полисахариду (например, альгинату натрия) равно 1:1-4:1, или 1:1-9:1, или 1:1-8:1, или 1:1-7:1, или 1:1-6:1, или 1:1-5:1, или 2:1-3:1, или 5:1, или 4,5:1, или 4:1, или 3,5:1, или 3:1, или 2,5:1, или 2:1, или 1,5:1, или 1:1.
[068] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения обеспечен способ получения инкапсулированных пробиотических бактерий, предусматривающий смешивание водного раствора альгината натрия с водным раствором денатурированного белка и суспендирование активных пробиотических клеток в 0,1% пептонной воде с образованием первой смеси. В данном контексте термин "пептон" относится к одному или нескольким водорастворимых производных белков, которые получают через частичный гидролиз белка кислотой или ферментом. Пептон обычно используют в культуральных средах в бактериологии, и обычно он известен специалистам с обычной квалификацией в данной области. В данном контексте, термин "0,1% пептонная вода" относится к водному раствору, содержащему 0,1 масс.% пептон. Необязательно, первую смесь ингубируют на водяной бане при температуре между 36 и 46 градусами Цельсия в течение по меньшей мере 5 минут, например, от 5 до 20 минут. В альтернативных вариациях вариантов, способ получения инкапсулированных пробиотических бактерий предусматривает обеспечение первой водной смеси, содержащей альгинат натрия (или другой биополимер), денатурированный белок и активные пробиотические клетки. Этот способ предусматривает объединение первой смеси (или первого водного раствора) с водным раствором, содержащим один или несколько двухвалентных катионов для инициации холодного желатинирования альгината натрия и денатурированного белка с образованием второй смеси, и пропускание этой второй смеси через отверстие, например, отверстие, имеющее диаметр менее 1000 мкм, с образованием капсул, имеющих средний размер частиц между 1 мкм и 1000 мкм в диаметре. Этот двухвалентный катион включает в себя любой подходящий двухвалентный катион, например, хлорид кальция, который может присутствовать при любой подходящей концентрации хлорида кальция, такой как приблизительно 4 масс.% на объем хлорида кальция.
[069] Полученные капсулы содержат желатинированную смесь альгината и денатурированного белка и содержат пробиотические бактерии, захваченные в желатинированной смеси. Согласно аспектам настоящего изобретения, способ дополнительно предусматривает отверждение капсул в растворе хлорида кальция в течение по меньшей мере пятнадцати минут, с последующим промыванием отвержденных капсул водой. В альтернативных вариантах осуществления, капсулы не подвергают отверждению, но промывают водой после изготовления.
[070] Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения, капсулы, содержащие пробиотические бактерии, могут быть получены с использованием единой водной реакции желатинирования биополимера, при помощи которой смесь альгината и белка желатинируется после контакта с двухвалентными катионами. Что находится в противоречии с более усложненными способами инкапсулирования, в которых готовят эмульсии (например, эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле), наружную поверхность этих капсул подвергают химической реакции, одно или несколько защитных покрытий или оболочек наносят на наружную поверхность этих капсул или их комбинацию. Капсулы настоящего изобретения обеспечивают защиту от условий окружающей среды, как описано выше, без необходимости модификации наружной поверхности химической реакцией или добавления покрытий или оболочек на этих капсулах.
[071] Во время образования капсул необязательно используют экструзию, в которой отверстие, через которое проходит вторая смесь, содержит форсунку. Во время экструзионных способов смесь заставляют проходить через экструзионную форсунку с использованием давления во время процесса желатинирования. Один примерный экструзионный прибор обсуждается в примерах ниже, и он находится в рамках квалификации в этой области для выбора подходящего экструзионного прибора. Согласно примерным аспектам, капсулы, приготовленные этим способом, имеют средний размер частиц между 1 мкм и 500 мкм в диаметре или между 1 мкм и 300 мкм в диаметре, например, 250 мкм в диаметре. Обычно капсулы, имеющие диаметр 500 мкм или менее, изготавливают с использованием экструзии второй смеси.
[072] Кроме того, предполагается, что инкапсулированные пробиотические бактерии, согласно аспектам настоящего изобретения, не будут влиять на желаемые физические свойства съедобного продукта. Например, предполагается, что эти капсулы не будут влиять на приемлемое разжевывание или физические и химические взаимодействия с полостью рта или влиять на вкус конечного продукта. Согласно аспектам настоящего изобретения, средний размер частиц этих капсул должен быть достаточно малым, чтобы не увеличивать вязкость съедобного продукта или обеспечивать заметное изменение во вкусе этого съедобного продукта.
9
10
[073] В некоторых вариантах осуществления, денатурированный белок содержит денатурированный белковый изолят сыворотки. Капсулы необязательно содержат массовое отношение денатурированного белка к альгинату в диапазоне 1:1-9:1, или в диапазоне 1:1-4:1, или в диапазоне 2:1-3:1. Согласно аспектам настоящего изобретения, капсулы содержат по меньшей мере 1×10 КОЕ/грамм капсул пробиотических бактерий в момент изготовления например, по меньшей мере 1×10 КОЕ/грамм капсул пробиотических бактерий в момент изготовления.
10
9
[074] В вариантах настоящего изобретения, капсулы, содержащие активные пробиотические бактерии, добавляют к съедобному продукту и этот съедобный продукт упаковывают, для последующего возможного употребления индивидуумом. Количество капсул, включаемых в съедобный продукт, варьируется в зависимости от нагрузки жизнеспособных пробиотиков в капсулах. В аспектах настоящего изобретения съедобный продукт содержит между 0,05 грамм и 10,0 грамм капсул на единицу меры продукта (например, жидкую унцию или грамм продукта) или между 0,1 грамм и 8 грамм капсул на единицу меры продукта, или между 0,1 г и 5 грамм капсул на меру продукта, или между 0,1 грамм и 3 грамм капсул на единицу продукта или между 0,1 and 1 грамм капсул на единицу продукта. Как обсуждалось выше, типичным количеством жизнеспособных пробиотических бактерий на съедобных продуктах является по меньшей мере 1×10 КОЕ/порцию продукта. Определение подходящего количества капсул для включения в конкретный продукт для обеспечения по меньшей мере 1×10 КОЕ/порцию продукта будет находиться в рамках способности специалиста, квалифицированного в данной области, после прочтения данного описания.
[075] Конкретное количество капсул добавляют, например, к являющемуся напитком продукту (например, готовому к потреблению продукту, порошкообразному напитку, порошкообразному концентрату напитка и т.д.) к пудингу, легкой закуске или другому съедобному продукту, известному в этой области. Согласно одному аспекту, продукт в виде напитка содержит по меньшей мере одну водную жидкость и капсулы, содержащие желатинированный альгинат и имеющие денатурированный белковый изолят сыворотки и пробиотические бактерии, захваченные в желатинированной смеси альгината и денатурированного белка. Необязательно, капсулы имеют средний размер частиц между 1 микрон (мкм) и 1000 микронов в диаметре. Водная жидкость содержит любую подходящую жидкость для продуктов в виде напитка, известную в данной области, например, без ограничения, воду, насыщенную диоксидом углерода воду (газированную воду) плодово-ягодный сок, овощной сок, гидратированные напитки, смузи, чай, кофе, молочные продукты, такие как молоко, и их комбинации. Например, этот продукт в виде напитка необязательно содержит плодово-ягодный напиток.
9
[076] Термин "срок годности при хранении" относится здесь к периоду времени после упаковки съедобного продукта, который удовлетворяет применимым критериям для продажи и потребления, включающему в себя по меньшей мере одну необходимую минимальную концентрацию пробиотиков. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления срок годности при хранении является продолжительностью времени, в течение которого продукт удовлетворяет таким критериям и является в других отношениях подходящим для употребления при герметической упаковке сосудов PET на 12 жидких унций и хранении в темноте или в других случаях при УФ-защищенных условиях при температуре приблизительно 35°F (2°С), включающих в себя непрерывное присутствие жизнеспособных пробиотиков при уровне по меньшей мере 1,0×10 КОЕ/12 жидких унций съедобного продукта. Должно быть понятно, что описанные здесь съедобные продукты и композиции могут храниться и упаковываться в любых подходящих контейнерах, включающих в себя, например, контейнеры любой желаемой формы, изготовленные из любого подходящего материала (любых подходящих материалов). Предыдущее определение срока годности при хранении приведено здесь для удобной ссылки и удобного объяснения улучшенного срока годности при хранении, обеспечиваемого некоторыми или всеми вариантами описанных здесь продуктов и композиций. Лицам с обычной квалификацией в данной области будет понятно из этого описания, что соответствующий или сравнимый улучшенный срок годности при хранении будет достигаться в некоторых или всех вариантах осуществления также при другой продолжительности или других условиях хранения, например, при других температурах, в контейнерах из других подходящих материалов или размеров и т.д., при достижении все еще сходных результатов.
9
10
[077] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления съедобные продукты или композиции, описанные здесь, обнаруживают признак, что после 45 дней хранения в темноте или, в других случаях, в УФ-защищенных условиях при охлаждающих температурах (например, 35°F (2°С)) после приготовления напитка, количество бактерий, содержащихся в напитке, имеет величину в пределах от приблизительно 1,0×10 КОЕ/12 жидких унций до приблизительно 5,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка.
[078] Должно быть понятно, что термин "приблизительно", используемый здесь и в подобных употреблениях в этом описании и в прилагаемой формуле изобретения, для учета обычной неточности и вариабельности в измерении и т.п.
9
10
9
10
9
10
9
10
[079] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления продукты в виде напитка или композиции, описанные здесь, обнаруживают признак, что после 45 дней хранения в темноте или, в других случаях, в УФ-защищенных условиях при охлаждающих температурах (например, 35°F (2°С)) после приготовления продукта, количество бактерий, содержащихся в этом являющемся напитком продукте, равно от приблизительно 1,0×10 КОЕ/12 жидких унций до приблизительно 5,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка и в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 2,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка до приблизительно 5,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка, и в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 3,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка до приблизительно 5,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка, и в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 4,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка до приблизительно 5,0×10 КОЕ/12 жидких унций напитка.
9
9
12
[080] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления обеспечена композиция продукта в виде напитка, которая содержит по меньшей мере один плодово-ягодный сок и капсулы, содержащие пробиотические бактерии в концентрации по меньшей мере 1,0×10 КОЕ/12 жидких унций, например, от 1,0×10 до 1,0×10 КОЕ/12 жидких унций, где композиция напитка имеет рН самое большее 4,5 и уровень кислоты между 0,5% и 1,0%. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления такие композиции продукта в виде напитка имеют по меньшей мере на 10% бóльшую концентрацию пробиотиков, например, концентрацию пробиотиков, которая является по меньшей мере на 20% большей, по меньшей мере на 25% большей, по меньшей мере на 50% большей, по меньшей мере на 75% большей или даже по меньшей мере на 90% большей, чем концентрация, которая была бы для той же самой композиции, содержащей свободные клетки пробиотических бактерий, при тестировании после 45 дней в герметически заделанных сосудах PET на 12 жидких унций, хранимых в темноте или, в других случаях, в УФ-защищенных условиях при 35°F (2°С). В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления композиции продукта в виде напитка имеют по меньшей мере на 10% бóльшую концентрацию пробиотиков, например, концентрацию пробиотиков, которая является по меньшей мере на 20% большей, по меньшей мере на 25% большей, по меньшей мере на 50% большей, по меньшей мере на 75% большей или даже по меньшей мере на 90% большей, чем концентрация, которая была бы для той же самой композиции, содержащей свободные клетки пробиотических бактерий, при тестировании после 63 дней в герметически заделанных сосудах PET на 12 жидких унций, хранимых в темноте или, в других случаях, в УФ-защищенных условиях при 35°F (2°С). В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления композиции продукта в виде напитка имеют по меньшей мере на 10% бóльшую концентрацию пробиотиков, например, концентрацию пробиотиков, которая является по меньшей мере на 20% большей, по меньшей мере на 25% большей, по меньшей мере на 50% большей, по меньшей мере на 75% большей или даже по меньшей мере на 90% большей, чем концентрация, которая была бы для той же самой композиции, содержащей свободные клетки пробиотических бактерий, при тестировании после 70 дней в герметически заделанных сосудах PET на 12 жидких унций, хранимых в темноте или, в других случаях, в УФ-защищенных условиях при 35°F (2°С).
[081] По меньшей мере в одном примерном способе приготовления этого продукта в виде напитка или композиции, описанных здесь, способ предусматривает смешивание вместе ряда ингредиентов для образования первой смеси, все или несколько из которых необязательно предварительно объединяются в любом порядке. Эти ингредиенты включают в себя по меньшей мере одну жидкость и капсулы, содержащие пробиотические бактерии. В некоторых примерных вариантах осуществления продукты в виде напитка дополнительно включают в себя один или несколько ингредиентов напитка, подходящих для использования в таких продуктах в виде напитка, включающих в себя, например, один или несколько дополнительных ингредиентов напитков, описанных ниже. Первую смесь необязательно нагревают для пастеризации смеси перед добавлением капсул, содержащих пробиотические бактерии. Капсулы могут вводиться в первую смесь либо после, например, немедленно после стадии пастеризации, либо после, например, немедленно после упаковки напитка. Продукт в виде напитка может быть упакован в бутыли, картонные коробки или контейнеры, например, стерилизованные контейнеры на одну порцию или на множество порций. Обычно такие контейнеры имеют размер приблизительно 4 жидких унций - 16 жидких унций, например, 6 жидких унций, 8 жидких унций или 12 жидких унций. Контейнеры могут быть герметизированы подходящими способами, известными в данной области. Герметизированные контейнеры могут транспортироваться или храниться при температурах окружающей среды или, необязательно, при охлаждении. Охлаждающие температуры обычно имеют диапазон приблизительно 32-50°F (0-10°C). Часто температура охлаждения равна приблизительно 35-43°F (2-6°C).
[082] Плодово-ягодный сок (плодово-ягодные соки), используемый в аспектах настоящего изобретения, может быть в любой из различных форм, включающих в себя, например, липиды, концентраты, экстракты, пюре, пасты, пульпы и т.д. Подходящие комбинации плодово-ягодных соков для напитков и композиций, описанных здесь, включают в себя, например, смесь любого одного или нескольких соков из винограда, клюквы, яблока, апельсина, манго, ананаса и кокосового ореха. Бактериальные виды, которые обнаруживают превосходное выживание в напитках, содержащих эти смеси, включают в себя, например, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. или смеси любого из них.
[083] Смешивание должно выполняться таким образом, что капсулы не разрушаются. Миксер (миксеры) могут быть выбраны для конкретного применения на основе, по меньшей мере частично, типа и количества используемых ингредиентов, количества продукта, который должен быть получен, и скорости потока. Обычно может быть использован коммерчески доступный миксер, такой как миксеры, доступные из Invensys APV of Getzville, NY или Silverson Machines, Inc. of East Longmeadow, MA.
[084] Продукт в виде напитка или композиция может гомогенизироваться и/или пастеризоваться. Напитки могут, кроме того, дополнительно или в последующей стадии обрабатываться после добавления инкапсулированных пробиотических бактерий. Последующая обработка может также включать в себя, например, охлаждение раствора продукта и розлив в контейнер для упаковки и перевозки. Последующая обработка может также включать в себя деаэрацию пищевого продукта до <4,0 м.д. кислорода, предпочтительно <2,0 м.д. и более предпочтительно <1,0 м.д. кислорода. Однако деаэрация и другие задачи последующей обработки могут проводиться перед последующей обработкой, перед пастеризацией, перед смешиванием с капсулами и/или одновременно с добавлением капсул. Кроме того, головное пространство инертного газа (например азота) может поддерживаться во время промежуточной обработки этого продукта и конечной упаковки. Дополнительно/альтернативно, в конечном упаковывании мог бы использоваться кислородный барьер и/или поглотители кислорода.
[085] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления, этот напиток или эта композиция содержит сок (соки) не из концентрата (NFC) и/или из концентрата (FC). Соки, подходящие для применения в некоторых или во всех описанных здесь продуктах в виде напитков и композиций, включают в себя, например, соки из плодово-ягодных или овощных источников. Некоторые примерные и неограничивающие примеры таких напитков или композиций включают в себя один или несколько цитрусовых соков, например, апельсиновый сок не из концентрата (NFC). Другие типы плодово-ягодных или овощных соков включают в себя, но не ограничиваются ими, соки плодов цитрусовых (например, апельсина, грейпфрута, лимона, лайма, тангерина (мандарина, тангело), абрикоса, яблока, комквата, манго, груши, персика, ананаса, папайи, страстоцвета съедобного, винограда, земляники, малины, клюквы, смородины, фасоли, черники, ежевики, акаи, личи (китайской сливы), киви, граната, дыни, аронии (рябины черноплодной), томата, сельдерея, тыквы, лука, кресса водяного (жерухи), огурца, моркови, петрушки, свеклы, ревеня, спаржи, картофеля, репы, брюквы и комбинации любых из них. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления напиток или композиция содержит плодово-ягодный сок (например апельсиновый сок или сок другого цитруса) в количестве от приблизительно 5% до приблизительно 100% по массе напитка, например, приблизительно 10% - приблизительно 100% по массе, приблизительно 10% - приблизительно 90% по массе, приблизительно 10% - приблизительно 75% по массе, приблизительно 15% - приблизительно 50% по массе или приблизительно 20% - приблизительно 30% по массе.
[086] В некоторых примерных вариантах осуществления напиток или композиция могут включать в себя растительный (овощной) компонент, в том числе, но не только, овощные соки, экстракты, порошки, кожуру плодов, кожицу плодов, помол, корни, пульпы, гомогенизированные пульпы, пюре или их комбинации. Овощной компонент может быть использован в напитке или композиции в любом подходящем количестве или в любой подходящей концентрации, эффективных для получения желаемого уровня вкуса. При включении в эту смесь, отношение плодово-ягодного сока к овощному соку может варьироваться, в зависимости от способа, в котором смешиваются овощной и плодово-ягодный соки, и/или напитка, который должен быть получен. Отношение плодово-ягодного сока к овощному соку будет варьироваться в зависимости от конкретного использования и может включать в себя, например, отношения от 0:100 до 100:0, например, 2:1, 3:1 или 3:2. В некоторых примерных вариантах осуществления смесь плодово-ягодного сока и овощного сока содержит приблизительно 80-60% плодово-ягодного сока и приблизительно 20-40% овощного сока. В некоторых примерных вариантах осуществления отношение плодово-ягодного сока к овощному соку равно приблизительно 80:20; однако в этом описании обсуждаются и другие соотношения.
[087] Примерные продукты в виде напитка включают в себя, но не ограничиваются ими, любой ингредиент или любую комбинацию ингредиентов, или любое вещество или любую комбинацию веществ которые могут быть использованы или приготовлены для применения в виде напитка для млекопитающего, и включают в себя, но не ограничиваются ими, готовые для питья жидкие композиции, сухие концентраты для производства напитков сиропы, порошки и т.п. Примерные продукты в виде напитка включают в себя, но не ограничиваются ими, газированные или негазированные напитки, сиропы для газированных напитков (fountain-напитки), замороженные готовые для питья напитки, замороженные газированные напитки, сухие концентраты для производства напитков, порошкообразные концентраты, кофейные напитки, чайные напитки, молочные напитки, ароматизированные водные напитки, водные напитки с интенсификатором вкуса и аромата, плодово-ягодные соки, смузи, плодово-ягодные ароматизированные напитки, напитки на натуральном плодово-ягодном соке, напитки для спорта, соевые напитки, гидратированные напитки, энергетические напитки, обогащенные/интенсифицированные водные напитки, овощные напитки, напитки на основе зерна, солодовые напитки, ферментированные напитки, йогуртовые напитки, кефир, алкогольные напитки и смеси любых их них. Продукты в виде напитка дополнительно включают в себя, например, полностью калорийные напитки и напитки с уменьшенными калориями (например, легкие, диетические, 0-калорийные) напитки. Продукты в виде напитка включают в себя применение в бутылях, консервных банках и картонных упаковках и применение в виде сиропов для газированной воды.
[088] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления, описанных здесь, в качестве контейнеров для напитков используют бутыли из PET (полиэтилентерефталата), которые могут содержать 12 жидких унций. Способы консервирования напитков, подходящие по меньшей мере для некоторых примерных вариантов продуктов в виде напитка, описанными здесь, включают в себя, например, стадии асептического упаковывания и/или тепловой обработки и/или термической переработки, например, туннельную пастеризацию, горячий розлив, холодный розлив, охлаждение и т.д. Такие стадии могут быть использованы для уменьшения роста дрожжей, плесени и микробов в продуктах в виде напитка. Например, патент США № 4830862, выданный Braun et al., описывает применение пастеризации в получении плодово-ягодных напитков, а также применение подходящих консервантов в газированных напитках. Обычно тепловая обработка включает в себя способы горячего розлива, обычно с использованием высоких температур в течение короткого времени, например, 190°F (87,8°C) в течение 10 секунд или приблизительно 92°C в течение 4 секунд, способы туннельной пастеризации, обычно использующие более низкие температуры в течение более продолжительного времени, например, приблизительно 160°F (71,1°C) в течение 10-15 минут, и способы автоклавирования, обычно использующие, например, приблизительно 250°F (121°C) в течение 3-5 минут при повышенном давлении, например, при давлении выше 1 атмосферы. Многие продукты холодного розлива должны также охлаждаться для гарантии адекватного срока хранения. Температурами холодного розлива являются температуры, которые находятся ниже диапазона горячего розлива, причем некоторые способы требуют температур, немного превышающих комнатную температуру, приблизительно при 45°F (7,2°C), и приблизительно при 150°-160°F (65,5-71,1°C). Холодный розлив традиционно использовался для молока и различных других молочных продуктов, игристой воды и игристых вин, пива и соков. Изготовители соков обычно объединяют холодный розлив и комбинации пастеризации в комбинации с охлаждающим розливом и хранением. Разливаемые при охлаждении соки, продаваемые в охлажденном состоянии, обычно упаковывают в пластиковые бутыли или в картонные коробки с остроконечным верхом.
[089] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления, описанных здесь, продукты в виде напитка включают в себя, например, готовые для питья жидкие композиции, сухие концентраты для производства напитков и т.п. По меньшей мере некоторые примерные варианты продуктов в виде напитка готовят с начальным объемом сока или сухого концентрата сока, к которым добавляют дополнительные ингредиенты. Напитки с полной крепостью могут быть образованы из концентрата напитка добавлением дополнительных объемов воды и/или других растворителей к этому концентрату. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления описанных здесь напитков и композиций, этот растворитель может включать в себя, например, воду, этанол, глицерин, пропиленгликоль, бензиловый спирт, изопропанол, триацетин или смеси любых из них. В некоторых других вариантах осуществления продукт в виде напитка полной крепости готовят непосредственно без образования концентрата и последующего разведения.
[090] Термины "концентрат напитка" и "сироп" используется взаимозаменяемо во всем этом описании. По меньшей мере некоторые варианты рассматриваемых продуктов в виде напитка готовят с начальным объемом воды, к которому добавляют дополнительные ингредиенты напитка. Продукты в виде напитка полной крепости могут быть образованы из концентрата напитка добавлением дополнительных объемов воды к концентрату (также известным как разведение). Обычно, например, напитки полной крепости могут быть приготовлены из концентратов объединением 1 части концентрата с приблизительно 3-приблизительно 7 частями воды. В некоторых примерных вариантах осуществления напиток полной крепости готовят объединением 1 части концентрата с 5 частями воды. В некоторых других вариантах осуществления, напиток полной крепости получают непосредственно без образования концентрата и последующего разведения.
[091] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления продукт в виде напитка содержит сок с добавленной водой. В приготовлении некоторых примерных вариантах продуктов и композиций напитков, описанных здесь, может быть использована вода стандартного для напитков качества, чтобы не было вредного влияния на продукт напитка или на вкус, запах или вид композиции напитка. Вода обычно будет прозрачной, с низкой щелочностью и приемлемым микробиологическим качеством на основе промышленных и правительственных стандартов, применимых во время получения продукта или композиции напитка. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления воду добавляют при уровне от приблизительно 0% до приблизительно 90% по массе напитка, например, приблизительно 15% - приблизительно 80% по массе, приблизительно 40% - приблизительно 70% по массе или приблизительно 50% - приблизительно 60% по массе. В некоторых примерных вариантах осуществления, водой, используемой в напитках и концентратах, описанных здесь, является "обработанная вода", где этот термин относится к воде, которая была обработана для удаления по существу всего минерального содержимого этой воды перед необязательным дополнением любых из описанных здесь компонентов, как описано в патенте США № 7052725. Способы получения обработанной воды известны специалистам с обычной квалификацией в данной области и включают в себя деионизацию, дистилляцию и фильтрование и обратный осмос ("R-O"), среди прочего. Термины "обработанная вода", "очищенная вода", “деминерализованная вода", дистиллированная вода" и "R-0 вода" понимаются как являющиеся в основном синонимами в этом обсуждении, относящимися к воде, из которой было удалено по существу все минеральное содержимое, обычно содержащее не более чем приблизительно 500 м.д. всех растворенных твердых веществ, например, не более чем приблизительно 250 м.д.
[092] Различные подслащивающие вещества могут быть включены в эту композицию напитков или композиций, описанных здесь. Подслащивающие вещества являются съедобными потребительскими веществами, подходящими для потребления и для использования в напитках. Термин "съедобные потребительские продукты" обозначает пищевой продукт или напиток или ингредиент пищевого продукта или напитка для употребления человеком или животным. Подходящие подслащивающие вещества или подслащивающие агенты, используемые в некоторых примерных вариантах, описанных здесь, включают в себя смеси непищевых продукты и натуральный ингредиент напитка или добавку (или смеси любых из них), которые обеспечивают сладость этому напитку, т.е. которые воспринимаются как сладкие вкусовым восприятием. Восприятие вкусовых веществ и подслащивающих агентов может зависеть до некоторой степени от взаимоотношения элементов. Вкус и сладость могут также восприниматься раздельно, т.е. вкус и сладость могут как зависеть друг от друга, так и быть независимыми друг от друга. Например, при использовании большого количества вкусового агента может легко восприниматься малое количество подслащивающего агента и vice versa. Таким образом, относящаяся к полости рта и к запаху взаимосвязь между вкусовым агентом и подслащивающим агентом может включать в себя взаимосвязь элементов.
[093] Подслащивающие вещества, подходящие для применения в различных примерных и неограничивающих вариантах описанных здесь напитков и композиций, включают в себя природные подслащивающие вещества. Подходящие подслащивающие вещества и комбинации подслащивающих веществ выбирают на желаемые питательные характеристики, вкусовые характеристики, разжевывание и другие органолептические факторы продукта в виде напитка или композиции. Природные подслащивающие вещества, подходящие для по меньшей мере некоторых примерных вариантов, включают в себя, но не ограничиваются ими, эритрит, тагатозу, сорбит, маннит, ксилит, мальтозу, рамнозу, трегалозу, глициризин, малит, лактозу, Lo Han Guo ("LHG"), ребаудиозид, стевиолгликозид, экстракт Stevia rebaudiana, ксилозу, арабинозу, изомальт, лактит, мальцит и рибозу, белковые подслащивающие вещества (например, тауматин, монеллин, браззеин, монатин и т.д.), и т.п. или их комбинации. Натуральные ненутритивные подслащивающие вещества, подходящие для некоторых или всех вариантов продуктов в виде напитков или композиций, описанных здесь, включают в себя, но не ограничиваются ими, ребаудиозид (например, ребаудиозид концентрата сока или порошок ребаудиозида, имеющие содержание ребадиозида от приблизительно 0,005% до приблизительно 99%, например, от приблизительно 0,005% до приблизительно 1,0%), другие стевиолгликозиды (например, стевиолгликозид концентрата сока или порошок стевиолгликозида, имеющие содержание стевиозида от приблизительно 0,005% до приблизительно 99%, например, от приблизительно 0,005% до приблизительно 1,0%), экстракт Stevia rebaudiana, Lo Han Guo (например, LHG концентрата сока или порошок LHG, имеющие содержание могрозида V от приблизительно 0,005% до приблизительно 99%), монатин, глициризин, тауматин, монеллин, браззеин и т.п. или смеси любых двух или более из них. Кроме того, в некоторых примерных и неограничивающих примерах описанных выше продуктов в виде напитков и композиций, комбинации одного или нескольких природных подслащивающих веществ используют для обеспечения сладости и других аспектов желаемых вкусовой характеристики и питательной характеристики. Должно быть понятно, что некоторые такие подслащивающие вещества будут в добавление, либо вместо этого действовать в качестве тастантов (модификатороы вкуса), маскируя агенты и т.п. в различных вариантах продуктов в виде напитка или композиций, описанных здесь, например, при использовании в количествах, которые ниже его (их) порога восприятия сладости в рассматриваемых продукте в виде напитка или композиции.
[094] Некоторые примерные и неограничивающие варианты продуктов в виде напитков и композиций, описанные здесь, включают в себя природные непищевые подслащивающие вещества, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, ребаудиозид A, ребаудиозид B, ребаудиозид C, ребаудиозид D, ребаудиозид E, стевиолбиозид, стевиозид, дулкозид A, другие стевиолгликозиды, экстракт Stevia rebaudiana, Lo Han Guo (например, концентрат сока LHG, порошок LHG или моглозид V), трауматин, монеллин, браззеин, монатин, и т.п. или смеси любых двух или более из них. При использовании, например, LHG, он может иметь содержание могрозида V от приблизительно 0,005% до приблизительно 99%. Необязательно, подслащивающее вещество или компонент подслащивающего вещества может включать в себя эритрит, тагатозу или смесь этих двух агентов. Непищевые подслащивающие вещества с высокой эффективностью обычно используют на уровне миллиграммов на жидкую унцию напитка, в зависимости от различных факторов, например, их подслащивающей силы, любых применяемых регулируемых пищевых продуктов страны, в которой продается этот продукт в виде напитка, желаемого уровня сладости этого продукта в виде напитка и т.д. Специалисты, квалифицированные в данной области, при условии преимуществ этого описания, будут способны выбрать подходящие дополнительные или альтернативные подслащивающие вещества для применения в различных вариантах описанных здесь продуктов в виде напитков и композиций.
[095] Как упоминалось выше, по меньшей мере некоторые примерные варианты продуктов в виде напитков и композиций, описанных здесь, могут использовать стевиолгликозид, ребаудиозид, экстракт Stevia rebaudiana или родственные соединения для подслащивания. Stevia (например, Stevia rebaudiana Bertoni) является растением со сладким вкусом с листьями, содержащими комплексную смесь природных сладких дитерпенгликозидов. Подслащивающие вещества могут быть получены, например, экстракцией или различными другими способами, известными в данной области. Обычно обнаруживается, что подслащивающие соединения включают в себя, например, стевиозид, стевиорибозид, ребаудиозид (в том числе ребаудиозид, например, ребаудиозид A, ребаудиозид B, ребаудиозид C, ребаудиозид D и ребаудиозид E) и дулкозид A. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления подслащивающее вещество из Stevia включают в продукт в виде напитка в количестве между приблизительно 0,005-1,00% по массе, например, между приблизительно 0,05-1,0% или между приблизительно 0,5-1,0%.
[096] Подслащивающее вещество Lo Han Guo, которое имеет различные правописания и произношения и является здесь сокращаемым в некоторых случаях как LHG, может быть получено из плода растения семейства Cucurbitaceae, подсемейства Jollifieae, суб-подсемейства Thladianthinae, рода Siraitia. LHG часто получают из рода/вида S. grosvenorii, S. siamensis, S. silomaradjae, S. sikkimensis, S. africana, S. borneensis и S. taiwaniana. Подходящий плод включать в себя плод рода/вида S. grosvenorii, который часто называют плодом Luo Han Guo. LHG содержит тритерпенгликозиды или могрозиды, составляющие части которых могут быть использованы в качестве подслащивающих веществ LHG. Lo Han Guo является эффективным подслащивающим агентом, который может быть обеспечен в виде природного пищевого или природного непищевого подслащивающего вещества. Например, концентрат сока Lo Han Guo может быть пищевым подслащиваемым веществом, а порошок Lo Han Guo может быть непищевым подслащиваемым веществом. В некоторых примерных и неограничивающих вариантах, Luo Han Guo может быть использован в виде сока или концентрата сока, порошка и т.д. Сок LHG может включать в себя по меньшей мере приблизительно 0,1% (например, от 0,1% до приблизительно 15%), могрозиды (например, могрозид V, могрозид IV, 11-оксомогрозид V), сиаменозид и смеси любых их них. В некоторых примерных вариантах, Могрозид V, полученный из LHG, может быть использован в качестве природного непищевого подслащивающего вещества. LHG может быть получен, например, как обсуждается в патенте США № 5411755. Подслащивающие вещества из других плодов, овощей или растений могут быть использованы в качестве природных или переработанных подслащивающих веществ или усилителей сладости в некоторых примерных вариантах продуктов в виде напитков и композиций, описанных здесь.
[097] В данном контексте "непищевое подслащивающее вещество" является подслащивающим веществом, которое не обеспечивает значимого калорийного содержания в типичных количествах применения, т.е. является веществом, которое дает менее 5 калорий на порцию 8 унций напитка для достижения эквивалента сладости 10 Brix сахара. Обычно таблицы Brix используются в производящей напитки промышленности для определения содержания сахара в конкретной композиции. Уровень Brix (брикс, содержания сухих веществ по ареометру Брикса) может измеряться с использованием любого подходящего способа, такого как способ с использованием рефрактометра, гидрометра и т.п. Измерение Brix (брикса) определяет отношение сахара к воде и не учитывает удельный вес композиции. В данном контексте, "продукт в виде напитка с уменьшенными калориями" обозначает продукт в виде напитка, имеющий по меньшей мере 25%-ное уменьшение в калориях на порцию напитка 8 унций в сравнении с версией с полным количеством калорий, обычно ранее продаваемой версией с полным количеством калорий. В данном контексте, "легкий продукт в виде напитка" обозначает напиток, имеющий по меньшей мере на 1/3 меньше калорий на порцию напитка 8 унций в сравнении с версией с полным количеством калорий, обычно ранее продаваемой версией с полным количеством калорий. В данном контексте, "низкокалорийный продукт в виде напитка" имеет менее 40 калорий на порцию 8 унций напитка. В некоторых примерных вариантах, продукт в виде напитка или композиция, описанные здесь, являются легким апельсиновым соком, имеющим приблизительно 50 калорий на порцию 8 унций.
[098] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах осуществления к продуктам в виде напитков и композиций, описанным здесь, могут быть добавлены дополнительные ингредиенты. Дополнительные ингредиенты могут также называться как пищевые ингредиенты или ингредиенты для напитков и включают в себя, но не ограничиваются ими, подкислители, красители, ароматизаторы (отдушки), минералы, витамины, плодово-ягодные соки, плодовые привкусы или другие плодово-ягодные продукты, другие модификаторы вкуса (например, тастанты, маскирующие агенты и т.п.), усилители вкуса, буферные агенты (например, соли натрия и калия лимонной, винной, молочной кислот и т.п.), консерванты (например, бензоаты, сорбаты и т.п.), соли, загустители и противовспенивающие агенты, любые из которых обычно могут добавляться отдельно или в комбинации с различными продуктами-напитками или композициями для варьирования вкуса, разжевывания, питательных характеристик и т.д. Газирование в форме диоксида углерода может добавляться для выделения газа в виде пузырьков. Необязательно, может быть добавлен кофеин. Дополнительные и альтернативные подходящие ингредиенты будут известными специалистам с квалификацией в данной области при условии преимущества этого описания.
[099] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты в виде напитков и композиций, описанные здесь, содержат подкислитель в качестве дополнительного ингредиента напитка. Подходящие подкислители включают в себя, но не ограничиваются ими, органические кислоты, бензоат натрия, бисульфаты металлов и т.п. или их комбинации. Органические кислоты, используемые в некоторых примерных и неограничивающих вариантах продуктов в виде напитков и композиций, описанных здесь, могут служить одной или нескольким дополнительным функциям, включающим в себя, например, предоставление кислотности вкусу продукта в виде напитка или композиции, усиление вкусовых качеств, увеличение эффекта утоления жажды, действие в качестве легкого консерванта и т.д. Примерные органические кислоты включают в себя, но не ограничиваются ими, лимонную кислоту, яблочную кислоту, аскорбиновую кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, адипиновую кислоту, фумаровую кислоту, глюконовую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту и т.п. или их комбинации. Другие подходящие кислоты известны и будут очевидными специалистам, квалифицированным в данной области, с учетом преимущества этого описания. Конкретная выбранная кислота или конкретные выбранные кислоты будут зависеть, отчасти, от других ингредиентов, желаемого срока годности при хранении продукта в виде напитка или композиции, а также от действий на продукт в виде напитка или композиции уровня рН, титруемой кислотности, вкуса и т.п. Специалисты с квалификацией в данной области будут способны, с учетом преимущества этого описания, выбрать подходящую кислоту или комбинацию кислот и количество кислот, необходимое для компонента подкислителя любого конкретного варианта продуктов в виде напитка или композиций, описанных здесь. Например, некоторые варианты продукта в виде напитка или композиции могут включать в себя одну или несколько органических кислот в количестве от приблизительно 0,1% до приблизительно 1,0% по массе продукта в виде напитка, например, приблизительно 0,2% - приблизительно 0,7% по массе, или приблизительно 0,3% - приблизительно 0,6%, или приблизительно 0,7% - приблизительно 0,8% по массе.
[100] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты и композиции напитков, описанные здесь, содержат краситель в качестве дополнительного ингредиента напитка. В данном контексте, "краситель" предназначен для обозначения любого соединения, которое придает цвет, и включает в себя, но не ограничиваются ими, природный пигмент, синтетический пигмент, цветовую добавку и т.п. или смеси любых из них. Могут быть использованы как природные, так и искусственные красители. Один или несколько красителей FD&C (например, желтый № 5, синий № 2, красный № 40, и т.д.) и/или лаки FD&C могут быть использованы для красящих растворов, пищевых продуктов и продуктов в виде напитков или композиций, описанных здесь. Примерные лаковые красители включают в себя, но не ограничиваются ими, FDA-одобренный Лак (например, Лак красный № 40, желтый № 6, синий № 1 и т.п. или смеси любых из них. Дополнительно, могут быть использованы смесь красителей FD&C или лак красителя FD&C в комбинации с другими общепринятыми пищевыми продуктами и пищевыми красителями. Примеры других подходящих красящих агентов включают в себя, но не ограничиваются ими, природные агенты, плодово-ягодные и овощные соки и/или порошки, карамельный кулер, рибофлавин, каротиноиды (например, бета-каротин), куркуму, ликопины, и т.п. или их комбинации. Точное количество используемого красителя будет варьироваться в зависимости от используемых агентов и интенсивности, желаемой в готовом продукте. Обычно, если краситель присутствует, он должен присутствовать на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% или от приблизительно 0,004% до приблизительно 0,1%, по массе или объему продукта в виде напитка или композиции. Дополнительные и альтернативные красители и их соответствующие требуемые количества будут известны квалифицированным в данной области специалистам при условии преимущества этого описания.
[101] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах описанные здесь продукты и композиции напитков содержат ароматизатор в качестве дополнительного ингредиента напитка. Ароматизаторы включают в себя, например, плодово-ягодные ароматизаторы, ботанические ароматизаторы, пряные ароматизаторы, вкусовые модификаторы и т.п. Ароматизаторы могут быть в форме экстракта, эфирного масла, живицы (эфирного масла, полученного способом экстракции), концентрата плодово-ягодного сока, bottler's base, или других форм, известных в данной области. В некоторых примерных вариантах пряные или другие ароматизаторы улучшают аромат сока или комбинации соков. Примерные ароматизаторы, подходящие для использования, включают в себя вкус ореха кола, вкус чая, вкус цитруса, ягодный вкус, пряный вкус и т.п. или их комбинации. В некоторых примерных вариантах, описанных здесь, ароматизатор может присутствовать в концентрации от приблизительно 0% до приблизительно 0,400% по массе конечного пищевого продукта или продукта в виде напитка. (например, от приблизительно 0,050% до приблизительно 0,200%, от приблизительно 0,080% до приблизительно 0,150%, от приблизительно 0,090% до приблизительно 0,120% по массе). Дополнительные и альтернативные подходящие ароматизаторы и их соответствующие требуемые количества будут известны квалифицированным в данной области специалистам при условии преимущества этого описания.
[102] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты в виде напитков и композиций, описанные здесь, содержат желаемое количество одного или нескольких плодово-ягодных ароматизаторов в качестве дополнительного ингредиента напитка. В данном контексте и в прилагаемой формуле изобретения, термин "плодово-ягодный ароматизатор" относится к любой части плода, компоненту плода (например, к кожуре, цедре, мякоти, перикарпу (околоплоднику), пульпе, цветку (например, лепесткам), листу, стеблю, семени и т.п.), из названного плодово-ягодного (FTNF) ароматизатора (например, комбинации фруктовой эссенции, фруктового масла (например, оранжа из названного плодово-ягодного ароматизатора и т.д.), плодово-ягодному экстракту (например, полученному отжимом, абсорбированному, мацерированному, дистиллированному и т.п.), плодово-ягодному маслу (например, эфирному маслу, смешанному эфирному маслу и т.д.), фруктовой эссенции, фруктовому пюре, фруктовому ароматизатору и т.п. или их комбинации, которая может быть добавлена к пищевому продукту или продукту в виде напитка для усиления вкуса (например, для обеспечения и/или усиления одного или нескольких заслуживающих внимания ароматизаторов). Плодово-ягодные ароматизаторы включают в себя, но не ограничиваются ими, ароматизаторы, полученные из апельсина (например, мандарина, апельсина Кровь, апельсина Навель, Валенсия и т.д.), тангерина, тангело, миннеолы, комквата, клементины, грейпфрута, лимона, терпкого лимона, лайма пуммело (грейпфрута), помело (грейпфрута), яблока, винограда, груши, персика, нектарина, абрикоса, сливы, чернослива, граната (черной канадской сливы), ежевики, брусники, малины, земляники, вишни, клюквы, смородины, крыжовника, бойзеновой ягоды, черники, тутовой ягоды, финика, ананаса, банана, папайи, манго, личи, страстоцвета съедобного, кокосового ореха, гуавы, киви, дыни, канталупы, мускатной дыни и т.п. или комбинаций любых из них. (например, с использованием пуансона для фруктов). В некоторых примерных вариантах используют один или несколько ароматизаторов цитрусовых фруктов. Цитрусовый ароматизатор может также включать в себя одну или несколько из частей апельсина, компонент апельсина, экстракт апельсина, эфирное масло апельсина, смешанное эфирное масло апельсина, ароматизатор апельсина, эссенцию апельсина и т.п. или их комбинации. Цитрусовый ароматизатор может также включать в себя одну или несколько частей, компонент, экстракт эфирное масло смешанное эфирное масло, ароматизатор или эссенцию грейпфрута, лимона, лайма, или тангерина, среди прочего. Цитрусовый ароматизатор может также включать в себя химические соединения, экстрагированные из природных источников или полученные синтетически (например, лимонин, октанол и его производные, ацетальдегид, α-пинен, β-пинен, сабинен, мирцен, октаналь, линалол, карен, деканаль, цитраль, синенсаль и т.п.). В некоторых примерных вариантах плодово-ягодный ароматизатор присутствует в количестве от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,005% по массе продукта в виде напитка или композиции, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05% по массе или в количестве от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5% по массе. Дополнительные и альтернативные подходящие плодово-ягодные ароматизаторы и их соответствующие количества будут известны квалифицированным в данной области специалистам при условии преимущества этого описания.
[103] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты в виде напитка и композиций, описанных здесь, включают в себя ботанический ароматизатор в качестве дополнительного ингредиента напитка. В данном контексте и прилагаемой формуле изобретения термин "ботанический ароматизатор" относится к ароматизаторам, происходящим из частей растения, другого чем этот фрукт. Такие ботанические ароматизаторы могут включать в себя ароматизаторы, произведенные из ароматизаторов, полученных из эфирных масел и экстрактов орехов, коры, корней и листьев. Примеры таких ароматизаторов включают в себя, но не ограничиваются ими, ароматизаторы ореха кола, ароматизаторы чая, пряные ароматизаторы и т.п. или смеси любых их них. Дополнительные и альтернативные подходящие ботанические ароматизаторы будут известны квалифицированным в данной области специалистам при условии преимущества этого описания.
[104] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты и композиции напитков, описанных здесь, содержат пряный ароматизатор в качестве ингредиента напитка. Неограничивающие примеры пряных ароматизаторов включают в себя кассию, гвоздику, корицу, перец, имбирь, ваниль, кардамон, кориандр, напиток, ароматизированный сассафросом, женьшень и другие. В некоторых примерных вариантах, описанных здесь, такие пряные или другие ароматизаторы дополняют вкус плодово-ягодного ароматизатора. Дополнительные и альтернативные подходящие пряные ароматизаторы будут известны квалифицированным в данной области специалистам при условии преимущества этого описания.
[105] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты и композиции напитков, описанные здесь, содержат модификатор вкуса в качестве дополнительного ингредиента напитка. Модификаторы вкуса могут обеспечивать их собственный характерный вкус или могут иметь малое влияние или вообще не влиять на вкус сами по себе. Модификаторы вкуса имеют любое одно или несколько свойств уменьшения, маскирования или элиминирования нежелательных вкусовых свойств, или усиления желательных вкусовых свойств, например, контролирования одного или нескольких из сладости, кислого вкуса, горького вкуса, солености, разжевывания или временных вкусовых эффектов. Неограничивающие примеры нежелательных вкусовых характеристик, уменьшаемых модификаторами вкуса, включают в себя один или нескольких остаточных привкусов, металлический остаточный вкус, терпкость (вяжущий вкус), тонкое разжевывание, шероховатость (жесткость), задержанное появление сладости, задержанная сладость, избыточный кислый вкус и другие недостатки. Неограничивающие примеры желательных вкусовых характеристик, усиленных модификаторами вкуса, включают в себя одну или несколько из интенсивности сладости или придания формы и гладкости, среди прочего. Неограничивающие примеры модификаторов вкуса включают в себя, но не ограничиваются ими, органические кислоты (например, лимонную кислоту, яблочную кислоту, аскорбиновую кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, адипиновую кислоту, фумаровую кислоту, глюконовую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, среди прочих), пропиленгликоль, глицерин, этанол, коммерчески доступные продукты (например, природный ароматизатор Symrise™, Sweetness Enhancer Type SWL 196650, Firmenich Natural Flavor (Modulasense™ Type) 560249 T, и Firmenich™ Natural Flavor (Modularome™ Type) 539612 T, и т.д.), и т.п. или их комбинации. Квалифицированные в данной области специалисты будут способны, при условии преимущества настоящего изобретения, выбрать подходящие дополнительные или альтернативные модификаторы вкуса для использования в различных вариантах продуктов и композиций напитков, описанных здесь.
[106] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продуктов и композиций напитков, описанных здесь, один или несколько ароматизаторов могут быть использованы в форме эмульсии. Ароматизирующая эмульсия может быть приготовлена смешиванием некоторых или всех ароматизаторов вместе, необязательно вместе с другими ингредиентами продукта в виде напитка и эмульгирующего агента. Эмульгирующий агент может быть добавлен с ароматизаторами или после того как ароматизаторы смешиваются вместе. В некоторых примерных вариантах эмульгирующий агент является водорастворимым. Примерные и неограничивающие примеры подходящих эмульгирующих агентов включают в себя аравийскую камедь, модифицированный крахмал, карбоксиметилцеллюлозу, трагакантовую камедь, камедь гхатти, другие подходящие камеди и т.д. Дополнительные подходящие эмульгирующие агенты будут очевидными для специалистов квалифицированных в области композиций для напитков, при условии преимущества этого описания. Эмульгатор в примерных вариантах содержит более чем приблизительно 3% по массе смеси ароматизирующего агента и эмульгатора. В некоторых примерных вариантах эмульгатор составляет от приблизительно 5% до приблизительно 30% этой смеси. Квалифицированные в данной области специалисты будут способны, при условии преимущества этого описания, выбрать подходящие количества эмульгатора для применения в различных вариантах продуктов и композиций напитков, описанных здесь.
[107] Агенты массы, которые могут также действовать в качестве агентов мутности, обычно используют для поддержания капель эмульсии диспергированными в напитке. Примеры таких агентов массы включают в себя, но не ограничиваются ими, бромированные растительные масла, этерифицированную канифоль, этерифицированные камеди и т.п. или их комбинации. Обычные коммерчески доступные агенты применимы для использования в продуктах и композициях напитков, описанных здесь. Наряду с агентами массы, эмульгаторы и стабилизаторы эмульсии могут быть использованы для стабилизации капелек эмульсии ароматизаторов. Примеры таких эмульгаторов и стабилизаторов эмульсии включают в себя, но не ограничиваются ими, камеди, пектины, целлюлозу, полисорбаты, сложные эфиры сорбитана, альгинаты пропиленгликоля и т.п. или их комбинации.
2
[108] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитка, описанного здесь, содержит диоксид углерода в качестве дополнительного ингредиента. Диоксид углерода используют для обеспечения выделения газа из жидкости в виде пузырьков (вспенивания) для определенных примерных вариантов продуктов и композиций напитка, описанных здесь. Могут быть использованы любые из способов и любое оборудование для карбонизации, известные в данной области для карбонизации (газирования) напитков. Диоксид углерода может улучшать вкус и вид напитка и может способствовать предохранению чистоты напитка ингибированием и разрушением неприятных (вызывающих возражения) бактерий. В некоторых вариантах, например, продукт или композиция напитка имеет уровень CO до приблизительно 7,0 объемов диоксида углерода. Типичные варианты могут иметь, например, от приблизительно 0,5-5,0 объемов диоксида углерода. В этом контексте и в независимых пунктах формулы изобретения, один объем диоксида углерода определяется как количество диоксида углерода, абсорбированного любым конкретным количеством воды при температуре 60°F (16°C) и атмосферном давлении. Объем газа занимает то же самое пространство, что и вода, посредством которой он абсорбируется. Содержание диоксида углерода может быть выбрано квалифицированным в данной области специалистом на основе желаемого уровня вспенивания и влияния диоксида углерода на вкус или разжевывание этого продукта или композиции напитка.
[109] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитка содержит кофеин в качестве дополнительного ингредиента напитка. Количество добавляемого кофеина определяют посредством желаемых свойств продукта или композиции напитка, в соответствии с любыми регуляторными правилами страны, в которой предполагается сбыт продукта или композиции напитка, и т.д. Кофеин должен быть высокой чистоты, приемлемой для применения в пищевых продуктах и напитках. Кофеин должен быть натуральным (например, из ореха кола, кокосовых орехов, кофе и/или чая) или синтетическим по происхождению. В некоторых вариантах количество кофеина может быть от приблизительно 0,002% до приблизительно 0,05% по массе продукта или композиции напитка. В некоторых вариантах количество кофеина равно от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,02% по массе продукта напитка. В некоторых вариантах кофеин включен при уровне 0,02% или менее по массе продукта напитка. Для концентратов или сиропов уровень кофеина может быть от приблизительно 0,006% до приблизительно 0,15%. Уровни кофеина могут быть более высокими, например, если используют ароматизированные кофе, которые не были декофеинированы, так как эти материалы природно содержат кофеин. Квалифицированные в данной области специалисты будут способны, при условии преимущества этого описания, выбрать подходящие количества кофеина для применения в различных вариантах продуктов и композиций напитков, описанных здесь.
[110] В некоторых примерных вариантах продукты и композиции напитка, описанные здесь, являются природными в том смысле, что они не содержат ничего искусственного или синтетического, что могло бы в норме ожидаться в пищевом продукте. В некоторых примерных вариантах продукты и композиции напитков, описанные здесь, не содержат никаких искусственных подслащивающих веществ. В некоторых примерных вариантах продукты и композиции напитков, описанные здесь, являются природно послащенными природным непищевым подслащивающим веществом. В данном контексте "природный" ингредиент напитка определяется в соответствии со следующими руководящими принципами. Сырые материалы для природного ингредиента существуют или возникают в природе. Биологический синтез, включающий в себя ферментацию и ферменты, может быть использован, но синтез с химическими реагентами не используется. Искусственные красители, консерванты и ароматизаторы не считаются природными ингредиентами. Ингредиенты могут обрабатываться или очищаться посредством указанных способов, например, физических процессов, ферментации, энзимолиза и т.д. Подходящие процессы и способы очистки включают в себя, но не ограничиваются ими, абсорбцию, адсорбцию, аггломерацию, центрифугирование, измельчение, тепловую обработку (например, выпечку, жарение в жире, отваривание, отжаривание и т.д.), охлаждение, разрезание, хроматографию, нанесение покрытия, кристаллизацию, вываривание, высушивание (например, распыление, лиофилизацию, вакуумную сушку и т.д.), выпаривание, дистилляцию, электрофорез, эмульгирование, инкапсулирование, экстракцию, экструзию, фильтрование, ферментацию, размалывание, настаивание, мацерацию, микробиологическое (например, сычужный фермент, ферменты) смешивание, очистка от кожуры, перколяцию, искусственное охлаждение/замораживание, отжимание, замачивание, промывание, нагревание, смешивание, ионообмен, лиофилизацию, осмос, выпадение в осадок, высаливание, сублимацию, обработку ультразвуком, концентрирование, флокуляцию, гомогенизацию, восстановление влагосодержания сухих продуктов или разбавление концентрата до первоначальной плотности, энзимолиз (например, с использованием ферментов, обнаруживаемых в природе) и т.п. или их комбинации. Вспомогательные средства обработки (определяемые в настоящее время как вещества, используемые в изготовлении материалов для усиления привлечения или использования пищевого компонента, включающие в себя осветляющие агенты, катализаторы, флоккулянты, фильтрующие средства и ингибиторы кристаллизации, и т.д. Смотрите 21 CFR § 170.3(o)(24)) рассматриваются как случайные добавки и могут быть использованы при удалении подходящим образом.
[111] В некоторых примерных и неограничивающих вариантов продукты и композиции напитков, описанные здесь, содержат минерал в качестве дополнительного ингредиента напитка. Подходящие минералы включают в себя, но не ограничиваются ими, добавленные кальций, хлорид, хром, калий, магний, фосфор, натрий, серу, кобальт, медь, флор, йод, марганец, молибден, никель, селен, ванадий, цинк, железо и т.п. или их комбинации. Минералы могут быть добавлены в любой форме, совместимой с пищевыми требованиями человека, и могут быть добавлены до любого желаемого уровня. Количества в продукте или композиции напитка могут быть при любом подходящем проценте Reference Daily Intake (RDI). Например, минерал может присутствовать при верхней границе приблизительно: 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или приблизительно 500% RDI. Этот минерал может присутствовать при более низкой границе: 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 150%, 200% или приблизительно 300% RDI. Альтернативно, количество добавленного минерала может быть измерено в международных единицах (IU) или масса/масса (м/м). Должно быть понятно, что термин "добавленный" (например, "добавленный кальций") относится в данном контексте и в прилагаемой формуле изобретения к добавленному компоненту, полученному из внешних источников и не включает в себя компонента, который неотъемлемо присутствует в продукте или композиции напитка. Подходящие добавленные минералы для продуктов и композиции напитков, описанных здесь, могут быть произведены из любого известного или иным образом эффективного источника нутриента, который обеспечивает этот нацеленный минерал отдельно. Например, добавленные источники кальция включают в себя, но не ограничиваются ими, например, цитрат кальция, фосфат кальция, или любой другой источник кальция для применения в продукте или композиции напитка.
1
2
3
6
7
9
12
3
5
6
12
[112] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты и композиции напитков, описанных здесь, содержат витамин в качестве дополнительного ингредиента напитка. Подходящие витамины включают в себя, но не ограничиваются ими, добавленный витамин А (в том числе предшественники витамина А, например бета-каротин), витамин B (т.е. тиамин), витамин B (т.е. рибофлавин), витамин B (т.е. ниацин), витамин B, витамин B (т.е. биотин), витамин B (т.е. фолиевую кислоту), витамин B (т.е. кобаламин), витамин С (т.е. аскорбиновую кислоту), витамин D и витамин E (т.е. токоферолы и токотриенолы) и витамин K и т.п. или их комбинации. Витамины могут быть добавлены в любой форме, совместимой с пищевыми требованиями, и могут быть добавлены до любого желаемого уровня. Количества в продукте или композиции напитка могут находиться при любом подходящем проценте Reference Daily Intake (RDI). Например, витамин может присутствовать при верхней границе приблизительно: 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или приблизительно 500% RDI. Витамин может присутствовать при нижней границе приблизительно: 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 150%, 200% или приблизительно 300% RDI. Альтернативно, количество добавленного витамина может быть измерено в международных единицах (IU) или масса/масса (м/м). Например, порция продукта напитка может содержать 100% RDI каждого из витамина E, витамина B (ниацина), витамина B (пантотеновой кислоты), витамина B и витамина B. Подходящие добавленные витамины для продуктов и композиций напитков, описанных здесь, могут быть получены из известного или другого эффективного пищевого источника, который обеспечивает витамин-мишень, отдельно.
[113] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукты и композиции напитков, описанные здесь, включают в себя гомогенизированную пульпу. Гомогенизированная пульпа усиливает разжевывание продукта или композиции напитка обеспечением увеличенной вязкости. Кроме того, гомогенизированная пульпа обеспечивает добавленный плодово-ягодный ароматизатор (например, апельсиновый ароматизатор из апельсиновой пульпы) и добавленную сладость продукту или композиции напитка. В некоторых примерных вариантах гомогенизированная пульпа содержит пульпу цитруса, например, пульпу апельсина, пульпу грейпфрута, пульпу лимона, пульпу лайма, среди прочего, и смеси любых из них. В этом контексте пульпа цитруса определяется как разорванные мешки сока и сегменты стенок, извлеченные после процесса экстракции цитрусового сока. В этом контексте "гомогенизированная пульпа" определяется как частицы пульпы, суспендированные в водном растворе, которые не отделяются из суспензии. Гомогенизированная пульпа может быть получена различными способами гомогенизации, использующими оборудование, например, блендер или коллоидную мельницу. В некоторых примерных вариантах гомогенизированная пульпа имеет средний размер частиц приблизительно 60 - приблизительно 200 микрон в диаметре, приблизительно 70 - приблизительно 100 микрон или приблизительно 150 - приблизительно 250 микрон; где по меньшей мере 80% этих частиц гомогенизированной пульпы имеют между 50 и 540 микрон в диаметре. В некоторых примерных вариантах продукт или композиция напитка включает в себя гомогенизированную пульпу в количестве от приблизительно 5% до приблизительно 20% по массе продукта или композиции напитка, например, приблизительно 10% - приблизительно 15% по массе.
[114] Необязательно, могут быть добавлены дополнительные ингредиенты, которые известны, или в отношении которых предполагается, что они имеют благоприятные эффекты. Например, продукт или композиция напитка может содержать одно или несколько из следующего: масла (например, omega-3, omega-6 и т.д.), трав и пряностей. Ингредиенты трав и пряностей могут находиться в экстрагированной форме. Любая подходящая трава и пряность, известная в данной области, может быть использована в качестве ингредиента. Примерные травы и пряности, которые могут быть добавлены, включают в себя, но не ограничиваются ими, Kava Kava, St. John's Wort, Saw Palmetto, женьшень и т.п.
[115] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах, описанных здесь, продукты и композиции напитков, описанные здесь, содержат по меньшей мере один буферный агент в качестве дополнительного ингредиента напитка. Буферные агенты обычно используются для регулирования рН. Такие регуляторы рН включают в себя, но не ограничиваются ими, соли натрия и калия лимонной, винной, яблочной, фумаровой, коричной, малеиновой, адипиновой, глутаровой, молочной и янтарной кислоты или их любую комбинацию. Количество включенного буферного агента будет зависеть, конечно, от типа буферных агентов и от степени, до которой должен быть доведен рН. Дополнительные и альтернативные буферные агенты и их соответствующие количества будут известны квалифицированным в данной области специалистам при условии преимущества этого описания.
[116] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитка, описанные здесь, имеют рН с нижней границей приблизительно 2,6, приблизительно 2,75, приблизительно 3,0, приблизительно 3,2, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,75, приблизительно 3,8 или приблизительно 4,0 или верхней границей приблизительно 3.6, приблизительно 3,8, приблизительно 4,0, приблизительно 4,2 или приблизительно 4,5. В некоторых примерных вариантах диапазоном рН является 3,4-4,0. В некоторых примерных вариантах pH равен самое большее 4,5.
[117] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитка, описанные здесь, содержат соль в качестве дополнительного ингредиента. Соли могут действовать в качестве интенсификатора вкуса, и используемое количество будет варьироваться в зависимости от используемой соли и интенсивности, желаемых в конечном продукте. Подходящие примеры включают в себя, но не ограничиваются ими, хлориды щелочных или щелочно-земельных металлов (например, хлорид калия, хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния и т.д.) и т.п. или их комбинации.
[118] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитка, представленные здесь, содержат загуститель в качестве дополнительного ингредиента. Как описано здесь, "загуститель" может включать в себя любой материал, который увеличивает вязкость или увеличивает подобное крему ощущение при разжевывании этого продукта или композиции напитка. Примеры подходящих загустителей для применения в продуктах и композициях напитков, описанных здесь, включают в себя, но не ограничиваются ими, углеводы, белки, жиры, липиды, гидроколлоиды, камеди и т.п. или их комбинации. В некоторых вариантах, этот загуститель может содержать аравийскую камедь, камедь карайи, трагакантовую камедь, камедь гхатти, агаг-агар, гуаровую камедь, камедь рожкового дерева, крахмал или пасту водоросли аморфофаллюс, альгинаты, каррагенаны, пектин, камедь цезальпинии колючей, ксантановую камедь, геллановую камедь, пулулан, курдлан, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозную камедь, желатин, хитозан, мальтодекстрин или их комбинации.
[119] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитка, описанные здесь, содержат противовспенивающий агент в качестве дополнительного ингредиента. Примеры подходящих противовспенивающих агентов для использования в продуктах и композициях напитков, описанных здесь, включают в себя, но не ограничиваются ими, Silicone AF-100 FG (Thompson-Hayward Chemical Co.), 'Trans' Silicone Antifoam Emulsion (Trans-Chemco, Inc.) и 1920 Powdered Antifoam (Dow Corning Chemical). Количество используемого противовспенивающего агента определяют по минимальному количеству, требуемому для предотвращения избыточного пенообразования во время обработки этих продукта или композиции напитка, для предотвращения избыточного пенообразования во время переработки пищевого продукта или напитка, в который включается этот продукт. Дополнительные подходящие противовспенивающие агенты будут очевидными специалистам, квалифицированным в области приготовления напитков, при условии преимущества этого описания.
[120] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитка, описанные здесь, содержат химический ароматизатор в качестве дополнительного ингредиента. В некоторых примерных вариантах, этот химический ароматизатор может включать в себя любое химическое вещество, определенное Flavor and Extract Manufacturers' Association (FEMA) как обычно узнаваемое как безопасное вещество (Generally Recognized As Safe (GRAS). Химическое вещество, обозначаемое как GRAS Ассоциацией FEMA, испытывали с использованием определенных стандартов и считали безопасным для использования человеком. Примерные химические ароматизаторы GRAS включают в себя, но не ограничиваются ими, уксусный альдегид, уксусную кислоту, изоамилацетат, 3-метилбутанол, изоамилбутират, изоамилгексаноат, изоамилизовалерат, бензальдегид, бензойную кислоту, бензилацетат, бензиловый спирт, бензилциннамат, бутилацетат, изобутилацетат, бутанол, изобутанол, бутилбутират, изобутилбутират, бутилизобутират, бутилгексаноат, изобутилпропионат, бутиральдегид, изобутиральдегид, масляную кислоту, изомасляную кислоту, коричный альдегид, коричную кислоту, 2,3-бутандион, этилацетат, этилацетоацетат, этилбензоилацетат, этилбутират, этилизобутират, этилциннамат, этилгептаноат, этилгексаноат, этиллактат, этил-2-метилбутират, этилпропионат, этилпируват, этилвалерат, этилизовалерат, 2-гептанон, гексаналь, гексановую кислоту, гексанол, кетон малины, α-ионон, β-ионон, молочную кисоту, 2-метилбутиральдегид, изовалеральдегид, 2-метилмасляную кислоту, метилциннамат, метил-2-метилбутират, метилпропионат, пропиональдегид, пропановую кислоту, пировиноградную кислоту, валериановую кислоту, изовалериановую кислоту, ванилин, 4-метил-5-гидроксиэтилтиазол, ацетон, гептановую кислоту, 2-метилбутил-2-метилбутират, 2-изопропил-5-метил-2-гексеналь, этил-3-гидроксибутират, 2-метилбутилизовалерат, изоамилизобутират, тиглиновую кислоту, D-2-метилбутилацетат, L-2-метилбутанол, метанол, циклопентадеканон, уксусный ангидрид и другие соединения. Химические ароматизаторы GRAS могут быть экстрагированы из природных источников или получены синтетически. Квалифицированный в данной области специалист будет способен выбирать подходящие синтетические ароматизаторы или комбинации синтетических ароматизаторов, подходящие для применения в продуктах и композициях напитков в соответствии с этим описанием.
[121] В некоторых примерных и неограничивающих вариантах продукт или композиция напитков, описанные здесь, содержит консервант в качестве дополнительного ингредиента. То есть, по меньшей мере некоторые примерные варианты содержат необязательную растворенную систему консервирования. Растворы с рН ниже 4 и особенно рН ниже 3 обычно являются "микростабильными", т.е. они являются резистентными к росту микроорганизмов и, таким образом, являются подходящими для продолжительного хранения перед употреблением без необходимости использования дополнительных консервантов. Однако, если желательно, может быть использована дополнительная система консервирования. При использовании системы консервирования, она может быть добавлена к продукту в виде напитка в любом подходящем времени во время производства, например, в некоторых случаях перед добавлением подслащивающего вещества. В данном контексте термины "система консервирования" или "консерванты" включают в себя все подходящие консерванты, одобренные для применения в пищевых продуктах и композициях напитков, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, без ограничения такие известные химические консерванты, как бензоаты, например, бензоат натрия, кальция и калия, сорбаты, например, сорбат натрия, кальция и калия, цитраты, например, цитрат натрия и калия, полифосфаты, например, гексаметафосфат натрия (SHMP), и их смеси, и антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту, ЭДТА, BHA, BHT, TBHQ, дегидроуксусную кислоту, диметилдикарбонат, этоксихин, гептилпарабен и т.д. Другие подходящие консерванты для применения в продуктах и композициях напитков, описанных здесь, включают в себя природные консерванты, например, низин, коричную кислоту, экстракт выжимок винограда, соль, уксус и т.п. Квалифицированный в данной области специалист, на основе преимущества этого описания, будет способен выбирать подходящие консерванты вкуса или комбинацию консервантов вкуса, подходящие для применения в продуктах и композициях напитков, в соответствии с этим описанием.
[122] Консерванты могут быть использованы в количествах, не превышающих мандатные максимальные уровни согласно соответствующим законам и предписаниям. Уровень используемого обычно консерванта корректируют в соответствии с запланированным рН конечного продукта, а также оцениванием потенциала микробиологической порчи конкретной композиции напитка. Используемый обычно максимальный уровень равен приблизительно 0,05% по массе продукта или композиции напитка. Квалифицированные в данной области специалисты, на основе преимущества этого описания, будет способны выбирать подходящее количество консерванта для продуктов и композиций напитков в соответствии с этим описанием.
[123] Некоторые примерные способы, продукты и композиции напитков в соответствии с этим раскрытием описаны более подробно в примерах, представленных ниже в качестве иллюстрации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
[124] Исследовали применение биополимеров пищевой категории, белкового изолята сыворотки и альгината, в качестве инкапсулированных агентов для пробиотических бактерий. Более конкретно, исследовали два различных соотношения белкового изолята сыворотки и альгината в изготовлении капсул, содержащих пробиотические бактерии, и сравнивали с капсулами, содержащими 100% белковый изолят сыворотки или 100% альгинат.
[125] Белковый изолят сыворотки (Whey Protein Isolate) (приблизительно 60% β-лактоглобулин и 20% α-лактальбумин) поставлялся Fonterra (Palmerston North, New Zealand) и Na-альгинат высокой вязкости (Protonal SF120) поставлялся Hawkins Watts (Auckland, New Zealand). Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 приобретали в Environmental Science and Research (ESR, Wellington, New Zealand) и культивировали в бульоне Lactobacilli MRS broth (Difco, New Zealand) при 37°C при анаэробных условиях (GasPak EZ anaerobe container system, Becton, Dickinson and Company, USA). Активированные культуры получали субкультивированием 2-3 раза в бульоне MRS в течение 24 часов при 37°C перед использованием в экспериментах.
8
[126] Клетки пробиотических бактерий (5,4×10 КОЕ/г), культивируемые в 800 мл бульона MRS, собирали центрифугированием при 8500 об/мин в течение 10 минут при 4°С (Hitachi High Speed Centrifuge, Massey University, Palmerston North). Осадок (приблизительно 5 г) добавляли к стерильной 0,1% пептонной воде (30 мл) и перемешивали для ресуспендирования осадка. Промывочную стадию выполняли дважды при одних и тех же условиях. Окрашивание по Грамму и тесты на каталазу выполняли для подтверждения лактобацилл.
[127] Бактерии точно подсчитывали с использованием чашечного метода подсчета с агаром Lactobacilli MRS Agar (Difco). Капсулы (1 г) расщепляли в 9 мл фосфатного буфера (pH 7,1±0,1) с использованием гомогенизатора в течение периода времени до 30 минут. Это не было необходимым для расщепления свободных клеток. Серии разведений готовили с использованием смесей расщепленные микрокапсулы/фосфатный буфер (или свободных клеток) в стерильной 0,1% пептонной воде (1 мл пробы в 9 мл пептонной воды). Расплавленный MRS-агар добавляли к 1 мл пробы и чашки инкубировали при анаэробных условиях в течение 72 часов при 37°С перед подсчетом колоний.
10
[128] Раствор альгината натрия 1% масса на объем (м/о) готовили в день перед экспериментальной работой и давали ему перемешиваться в течение ночи для полной гидратации. Готовили 12% (м/о) раствор белкового изолята сыворотки (WPI) (1000 мл) и 500 мл нагревали до 90°C в течение 30 минут для гарантии полной денатурации белков перед охлаждением до комнатной температуры. Смеси альгината и WPI готовили в соответствии с планом эксперимента, показанным в таблице 1 ниже, и давали перемешиваться при комнатной температуре в течение двух часов для получения полной дисперсии. К этому раствору добавляли 2,5 мл этой клеточной дисперсии для получения теоретической конечной концентрации клеток 1×10 КОЕ/г и давали перемешиваться в течение дополнительных 30 минут. Затем пробы инкубировали на водяной бане при 44°C±2°C в течение 15 минут.
Таблица 1План эксперимента для оптимизации материалов капсул
Опыт
Концентрация WPI (%)
Концентрация альгината (%)
Стадия денатурации
1
100
0
Тепловая
75
25
Тепловая
3
50
50
Тепловая
4
0
10
-
[129] Получение микрокапсул
[130] Восемь миллилитров 4% м/о раствора хлорида кальция, используемого в качестве коагуляционной жидкости, помещали в химический стакан и перемешивали медленно с использованием магнитной мешалки. Двадцать миллилитров WPI/альгинат/клеточной дисперсии подавали по каплям в эту коагуляционную жидкость. Капсулы отверждали в хлориде кальция в течение 30 минут перед промыванием дважды водой Milli-Q (т.е. очищенной и деионизированной водой), затем хранили в стерильной воде в стерильных контейнерах. Половину этих капсул охлаждали при 4°C±1°C при анаэробных условиях с использованием системы анаэробных контейнеров и половину замораживали при -21°C±1°C в течение ночи перед лиофилизацией в течение 72 часов при 25°C±2°C. Затем лиофилизированные гранулы охлаждали при 4°C±1°C при анаэробных условиях. Все оборудование стерилизовали перед использованием.
[131] Морфология капсул
[132] Морфологию влажных капсул наблюдали под цифровым световым микроскопом. Лиофилизированные гранулы наблюдали также под Сканирующим Электронным Микроскопом (SEM, FEI Quanta 200 Scanning Electron Microscope, USA,). Препаровальную лупу использовали для отбора репрезентативных проб гранул, которые затем монтировали на алюминиевых пеньках с проводящим серебром. Затем пробы покрывали золотом с использованием устройства для ионного напыления и наблюдали под SEM при усиленном напряжении 20 КВ.
Пример 2
[133] Исследования деградации капсул в имитированных желудочных и кишечных условиях
[134] Поведение как высушенных, так и влажных капсул, приготовленных как описано в примере 1, наблюдали в имитированной желудочной жидкости (SGF, pH 2,0), так как ожидали, что процесс высушивания может влиять на размер пор, и другие признаки этих капсул могут влиять на их стабильность в SGF.
[135] Готовили SGF (pH 2±0,1), содержащую 0,2% NaCl, 0,7% HCl и 0,3% пепсин. Приблизительно 1 грамм инкапсулированных клеток добавляли по отдельности в тест-пробирки, содержащие 9 миллилитров SGF. Тест-пробирки инкубировали при 37°C в течение 2 часов при непрерывном перемешивании (150 об/мин) во встряхиваемой водяной бане. Было выбрано двухчасовое время инкубирования для представления среднего времени прохождения через желудок. Массу этих капсул определяли в начале и затем один раз в час до 2 часов. Затем, капсулы удаляли из SGF и помещали в имитированную кишечную жидкость (SIF, pH 7,4±0,1, 37°C) и взвешивали с получасовыми интервалами, пока не наблюдали полную деградацию.
Пример 3
[136] Анализ текстуры
[137] Капсулы примера 1 оценивали на их текстурные характеристики с использованием Texture Analyzer XT-2 (TA XT-2) Plus system (Stable Micro Systems, Surrey, UK). Анализ текстуры проводили с режимами, показанными ниже в таблице 2. Поршень уходил вниз, сохраняя контакт с верхней частью капсул, и выпрямлял эту капсулу при константной скорости 0,2 миллиметров в секунду (мм/с), пока она не достигала 90% ее исходной высоты. Регистрировали силу, проявляемую этой капсулой, как функцию смещения. Обратная скорость этого поршня в его первоначальное положение после сжатия (компрессии) была равна 10 мм/с). Силу, необходимую для деформации, регистрировали как функцию времени до разрушения этой капсулы. Кривую сила-сжатие получали для каждой пробы и хранили в файле для расчета свойств разрушения с использованием программы "XT. RAD Dimension" software, версии 3,7H, из системы Stable Micro System (Surrey, UK). Из каждого измерения определяли стресс (сжатие) и растяжение. Стресс разрушения ассоциирован с первым пиком на графиках, представляющим силу в виде функции смещения. Для капсул, стрессы рассчитывают с учетом площади контакта в виде площади-сферы и с предположением диссипации (рассеяния) внутренней силы гранул во всех направлениях.
Таблица 2Установки анализатора текстуры XT-2 Plus для тестов компрессии (сжатия) капсул
Тип теста
Компрессия
Проба
35 мм цилиндрическая проба
Скорость пре-теста
0,05 мм/с
Скорость теста
0,1 мм/с
Скорость после теста
2 мм/с
Режим растяжения
50%
Сила запуска
0,01 Н
Пример 4
[138] Морфология капсулы
[139] Капсулы, произведенные в примере 1, были преимущественно сферическими или яйцеобразными, как показано на фиг.1. Капсулы, полученные из чистого альгината, имели правильную форму и были сферическими; однако, когда содержание сывороточного белка увеличивается, микрокапсула становится более яйцеобразной и имеющей неправильную форму. Поверхность влажных капсул становится, по-видимому вариабельной, причем чистые капсулы WPI обнаруживают неровную складчатую поверхность, как показано на фиг.1А, и альгинатные гранулы обнаруживают более гладкую поверхность (не показано). Однако способ цифрового микроскопа не смог детектировать другие характеристики поверхности, такие как пористость и углубления. Фиг.1В включает в себя масштабный стержень, имеющий длину 500 мкм, для обеспечения ссылки размера для изображенной капсулы, содержащей массовое отношение белка к альгинату 75:25.
2+
[140] Альгинатные капсулы были белыми и прозрачными, однако, по мере увеличения содержания WPI, эти капсулы прогрессирующим образом становились более белыми и непрозрачными. Без связывания себя теорией, авторы изобретения считают, что это обусловлено увеличением количества сайтов связывания для ионов Ca в результате увеличенного содержания сывороточного белка, приводящим таким образом к более плотной перекрестно-связанной структуре геля.
[141] Сканирующая (растровая) электронная микроскопия
[142] Как видно на фиг.2, обеспечены изображения сканирующего электронного микроскопа (SEM) различных лиофилизированных капсул. Яйцевидная и сферическая конфигурация капсул стала слегка неправильной после лиофилизации, как показано на фиг.2А, который обеспечивает изображение всей капсулы, и на фиг.2В, который обеспечивает изображение капсулы 50:50 WPI:альгинат. Размер микрокапсул варьировался в зависимости от способа денатурации сывороточного белка и содержания сывороточного белка. Было определено, что размер частиц капсул имеет приближенный диаметр 750-1500 мкм (0,75-1,5 мм), и они становились большими по мере увеличения концентрации WPI.
[143] Фотография поверхности варьировалась между капсулами с более грубой поверхностью, наблюдаемой на WPI-капсуле в сравнении с альгинатными капсулами. Фиг.2С показывает высокопористую структуру поверхности лиофилизированных чистых WPI-капсул. Изображения SEM альгинатных капсул при том же самом увеличении не показало такой же самой пористости; однако, предыдущие исследователи документировали присутствие пор на структуре альгинатных капсул (Anal et al, 2003; Anal and Stevens, 2005).
[144] Разрушенные зоны (секции) лиофилизированных капсул показывали структуру капсул, состоящую из твердой передней стенки, покрывающей внутреннюю волокнистую сетку, обнаруживающую высокую пористость (не показано). Захваченные клетки L. acidophilus наблюдались во всех типах капсул и, по видимому, распределение клеток, захваченных в этих капсулах, является более гомогенным с клетками во внутреннем пространстве, чем на поверхности. Фиг.2D показывает на изображении SEM клетки L. acidophilus, наблюдаемые на поверхности лиофилизированной чистой WPI-капсулы.
Пример 5
[145] Исследования деградации капсул в имитированных желудочных и кишечных условиях
[146] Одной задачей вариантов настоящего изобретения было обеспечение капсул, которые являются стабильными в SGF и деградируются на протяжении периода времени в SIF, так что активный инкапсулированный материала может доходить до ободочной кишки. Литература показывает, что среднее время опустошения желудка равно двум часам и что достижение ободочной кишки занимает 3-4 часа после высвобождения в двенадцатиперстную кишку для проглоченных частиц (Anal, 2007).
[147] Для определения скорости, при которой капсулы, изготовленные в соответствии с примером 1, деградируются в желудочно-кишечном тракте, капсулы инкубировали в имитированных желудочных жидкостях при 37°С. Массу этой капсулы прослеживали на протяжении периода четырех часов как в SGF (pH 2,0±0,1), так и в SIF (pH 7,4±0,1). Согласно фиг.3 скорость деградации капсул была более быстрой в SIF, чем в SGF, для капсул, приготовленных с одним альгинатом, 75:25 WPL:альгинат и 50:50 WPL:альгинат. Эти результаты отражают, вероятно, различия в химическом поведении между жидкостями в этих капсулах. Чистые WPI-капсулы быстро деградируются в SGF с приблизительно 95% деградацией после двух часов инкубирования. При уменьшении концентрации WPI и увеличении концентрации альгината, скорость деградации также уменьшается, как показано на фиг.3.
[148] Без желания быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что поведение деградации WPI в SGF в основном обусловлено присутствием пепсина, фермента, обнаруженного в SGF. Пепсин является протеолитическим ферментом, который атакует пептидные связи, вызывая распад белкового изолята сыворотки и, следовательно, структуру капсулы. Сравнительно, 75:25 WPL:альгинатные капсулы и 50:50 WPL:альгинатные капсулы проявляли более медленную скорость деградации в первые шестьдесят минут инкубирования, как показано графиком на фиг.3. Альгинатный компонент этой капсулы может сморщиваться в кислотных условиях для обеспечения эффективного барьера для проникновения пепсина, или потенциально WPI-капсулы могут быть более легкой мишенью для атаки пепсина.
[149] Поведение альгината в кислотных условиях было описано исследователями (George and Abraham, 2006). Величины pKa маннуроновой и гулуроновой кислот, элементарного звена альгината, равны 3,38 и 3,65, соответственно. Эта pKa самого полимера является близкой к pKa для индивидуальных мономеров и варьируется в соответствии с ионной силой растворителя и концентрацией альгината. Однако, наблюдали, что при рН ниже величины pKa, альгинат осаждается, и считается, что это является результатом деполимеризации вследствие катализируемого протоном гидролиза.
[150] Без желания быть связанными теорией, авторы настоящего изобретения считают, что в капсулах, изготовленных как с пищевыми биополимерами белкового изолята сыворотки, так и альгинатом, WPI образует капсулы с гидрофобными боковыми цепями, внедренными в центре капсулы, и гидрофильными боковыми цепями, покрывающими альгинат. Поскольку пепсин преимущественно атакует гидрофобные ароматические аминокислоты, которые внедрены внутрь капсулы, капсулы, содержащие как WPI, так и альгинат, обеспечивают защиту от пепсина для WPI. В противоположность этому, капсулы WPI могут быть представлены в виде более уязвимой мишени для пепсина, и, следовательно, деградация возникает более легко.
2+
[151] С использованием приведенной выше логики, можно было ожидать, что альгинатные капсулы являются наиболее стабильными в SGF; однако, как показано на фиг.3, это поведение не наблюдалось. Однако сжатие этих капсул наблюдалось на протяжении всего эксперимента, но оно происходило вместе с эрозией этой капсулы. Потенциально это обусловлено диссоциацией положительно заряженного альгината от Ca и позволением расщепления этого геля.
[152] Фотография высушенных микрокапсул перед инкубированием в имитированных желудочно-кишечных жидкостях, показано на фиг.4А. Капсулы WPI, 75:25 WPI:альгинатные капсулы и альгинатные капсулы быстро деградировались в SIF со 100% деградацией после тридцати минут. Из этих капсул, 50:50 WPL:альгинат был наиболее стабильным в SIF, с деградацией за девяносто минут. Поскольку панкреатин, протеолитический фермент в кишечной жидкости, не деградирует альгинат, можно было ожидать, что альгинатные капсулы будут набухать и образовывать гидрогель в SIF, приводя к его деградации. Напротив, можно было ожидать, что WPI-капсулы могут быстро деградироваться панкреатином.
[153] Как видно на фиг.4B, 50:50 WPL:альгинат-капсулы были разбухшими и плавающими после инкубирования в SGF в течение двух часов, но оставались интактными. После переноса в кишечную жидкость, эти капсулы начинали дезинтегрироваться, как показано на фиг.4С, который обеспечивает фотографию капсул после инкубирования в течение двух часов. Было обнаружено, что дезинтеграция капсул является рН-зависимой. При низком рН, ионные связи в капсулах сохраняются, так что материалы матрикса гелевых гранул остаются интактными. После переноса в нейтральный рН, анионный альгинат в комплексе Ca-альгинат-WPI может быть вытеснен гидроксильными ионами. Фотография этих капсул после инкубирования в SIF в течение восьми часов, обеспечена на фиг.4D.
Пример 6
[154] Анализ профиля текстуры
[155] Механические свойства капсул определяют деформацию и разрушение капсулы под действием наружной нагрузки. Эти свойства являются важными при рассмотрении защиты и высвобождения материалов на протяжении систем обработки и доставки, когда разрушение может быть или может не быть желательным. В плане переработки пищи, капсулы не должны иметь значительной силы для предотвращения разрушения при подвергании силам трения при их движении через перерабатывающее оборудование. Разрушение могло бы потенциально подвергать инкапсулированные бактерии среде, в которой может возникать деградация и потеря биодоступности.
[156] Существует ограниченное доступное исследование, в отношении свойств WPL:альгинатные капсулы, которое, по-видимому, сфокусировано на способах приготовления и желудочной стабильности этих капсул. В результате, имеются ограниченные данные о механических свойствах капсул. Таким образом, исследовались действия WPI на механическую крепость альгинатных капсул. WPI, альгинатные и WPI:альгинатные капсулы, нагруженные L. acidophilus, получали нанесением в виде капель раствора, содержащего этот биополимер (эти биополимеры) и клетки пробиотических бактерий, в коагулирующей хлорид кальция жидкости. Эта комбинация альгината и термически денатурированного WPI показала высокоэффективные и крепкие капсулы, способных захватывать L. acidophilus.
[157] График зависимости средней силы от времени для сжатия этих капсул показан на фиг.5. Показаны WPI-капсулы, 75:25 WPL:альгинатные и 50:50 WPL:альгинатные капсулы и альгинатные капсулы. WPI-капсулы и альгинатные капсулы обнаруживают большую твердость, чем комбинированные капсулы (т.е. WPL:альгинатные капсулы), как показано более крутым начальным наклоном на графике на фиг.5. Не наблюдали разрушаемости при 50% сжатии, и все тестируемые пробы показали малую величину адгезивности, как очевидно по отрицательным силам на графике.
2+
[158] Со ссылкой теперь на фиг.5 и фиг.6, показана максимальная сила, достигаемая при 50%-ном сжатии общей высоты этих капсул. Десять повторностей измеряли и усредняли для обеспечения результатов для каждого типа капсулы, показанного на Фиг.6. WPI-капсулы были значимо более крепкими, чем остальные капсулы, с максимальной нагрузкой 1,57±0,2 Н. 75:25 WPL:альгинатные капсулы достигали следующей самой высокой нагрузки, 0,99±0,07 Н, которые не были значимо отличающимися от 50:50 WPL:альгинатные капсулы, которые имели максимальную нагрузку 0,91±0,08 N. Самыми слабыми капсулами были альгинатные капсулы, которые имели максимальную нагрузку 0,77±0,08 Н. Таким образом, при увеличении доли WPI имелась тенденция в направлении увеличения нагрузки. Это может быть обусловлено увеличенным количеством сайтов связывания для ионов Ca, с увеличенным содержанием WPI.
[159] В целом, примеры 1-6 показали развитие системы микроинкапсулирования, подходящей для пробиотических бактерий (например, L. acidophilus). Эта система включает в себя комбинации термически денатурированных сывороточных белков и альгината в качестве эффективных материалов для капсул. Было обнаружено, что, например, смеси растворов денатурированного белкового изолята сыворотки в концентрации 12% (м/о) и альгината в концентрации 1% (м/о) в массовых отношениях 3:1 и 1:1, производили эффективные и крепкие микрокапсулы.
Пример 7
[160] В этом примере исследовали стабильность инкапсулированных пробиотических бактерий при желудочно-кишечных условиях и при высоких температурах. Жизнеспособность и биохимическая активность L. acidophilus была хорошо документирована в литературе. L. acidophilus не выживает хорошо при очень низких условиях рН, так как он имеет оптимальный рН 4-5 (Stanton et al., 2003). При прохождении клеток L. acidophilus через желудочно-кишечный тракт они являются чувствительными к повреждению от желудочной кислоты, и, следовательно, меньшие количества могут достигать толстой кишки для колонизации. Таким образом, одним аспектом вариантов настоящего изобретения является обеспечение капсулы, которая является устойчивой к перевариванию в желудке, защищая тем самым жизнеспособные пробиотические бактерии от условий низкого рН, но все еще является чувствительной к деградации в условиях ободочной кишки. Таким образом, тестировали эффективность сконструированных капсул в имитируемых желудочных условиях.
[161] Хотя температурная толерантность L. acidophilus варьируется в зависимости от штамма, оптимальная температура для роста L. acidophilus равна 37°C, причем некоторые штаммы хорошо выживают при 50°C. Выше 50°C, выживаемость клеток быстро уменьшается и летальная температура 60°C цитировалась в литературе. (Kandler and Weiss, 1986). В настоящее время, применение L. acidophilus в пробиотических препаратах ограничивается низкой сопротивляемостью к высокой температуре. В результате, исследовали также эффективность сконструированных капсул в качестве подходящих температурных барьеров.
[162] Жизнеспособность микроинкапсулированных и свободных клеток (L. acidophilus) при имитированных желудочных условиях
[163] Капсулы и имитированная желудочная жидкость (SGF) были изготовлены, как описано в примере 1.
Капсулы промывали в дистиллированной воде и добавляли до 9 мл 0,1% стерильной пептонной воды, затем охлаждали при 4°C±1°C в течение ночи при анаэробных условиях. Свободные клетки помещали в пептонную воду и также охлаждали в течение ночи.
[164] Приблизительно 1 грамм капсул и 1 мл суспензии свободных клеток добавляют по отдельности в тест-пробирки, каждая из которых содержит 9 мл SGF. Свободные клетки использовали в качестве контроля в этом эксперименте. Тест-пробирки покрывали и инкубировали при 37°C в течение двух часов при условиях непрерывного перемешивания во встряхиваемой водяной бане. После одного часа и двух часов инкубирования брали пробы капсул и суспензии свободных клеток в SGF и переваривали на следующий день с использованием гомогенизатора, например, до 30 минут. Затем подсчеты жизнеспособных клеток выполняли с использованием чашечного метода подсчета с розливом.
[165] Жизнеспособность микроинкапсулированных и свободных клеток (L. acidophilus) при тепловой обработке
[166] Для определения действия тепла на жизнеспособность микроинкапсулированных и свободных L. acidophilus, клетки подвергали тепловой обработке в дистиллированной воде (pH 7,0±0,1) в соответствии со способами, описанными Mandal, Puniya and Singh (2006). Конкретно, эти капсулы и свободные клетки подвергали действию температур 50°C, 60°C или 80°C в течение 20 минут. Один грамм капсул и 1 мл свежих клеток помещали в тест-пробирки с 9 мл дистиллированной воды. В конце времени инкубации, клетки удаляли и добавляли к 9 мл 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,1±0,1). Затем этот буфер и дисперсию клеток измельчали в гомогенизаторе, пока не получали гомогенную дисперсию, перед подсчетом жизнеспособных клеток с выполнением подсчета в соответствии с примером 1. Свободные клетки не требовали этой стадии перед подсчетом.
[167] Жизнеспособность микроинкапсулированных и свободных клеток при имитированных желудочных условиях
[168] Свободные клетки
[169] Как показано на фиг.7, жизнеспособные количества свободных (т.е. неинкапсулированных) клеток в имитированной желудочной жидкости (pH 2,0±0,1, 37°C) значимо уменьшались на протяжении инкубационного периода с 6-log-уменьшением от log 9 КОЕ/мл до log 3 КОЕ/мл после 120 минут. Хотя рН-толерантность L. acidophilus варьируется в зависимости от штамма, эти открытия согласуются с тем, что обычно известно о L. acidophilus, и открытиями, сообщенными в других исследованиях. Krasaekoopt et al. (2004) обнаружил, что клетки L. acidophilus разрушались до одной и той же степени с 6-log-уменьшением после 120 минут (pH 1,55, 37°C). Hood and Zottola (1988) сообщали, что жизнеспособность клеток L. acidophilus уменьшалась быстро в растворе с рН 2, без извлечения после 45 минут.
[170] Инкапсулированные клетки
3
[171] Как показано на фиг.8, количества жизнеспособных клеток L. acidophilus, содержащихся в WPI-капсулах или альгинатных капсулах, в имитированной желудочной жидкости с пепсином (pH 2,0±0,1) были заметно более низкими после 120 минут, чем в WPI-альгинатных капсулах. Более конкретно, капсулы, состоящие из 75:25 и 50:50 (WPI:альгинат), были наиболее стабильными капсулами в SGF. Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения, после подвергания жидкости с рН 2,0 в течение 120 минут составляет 0-1,0×10 КОЕ/грамм капсул.
[172] Chen and Subirade (2007), которые исследовали высвобождение рибофлавина из WPI-капсул и альгинатных капсул, позволили предположить, что более быстрое высвобождение рибофлавина из WPI-капсул и альгинатных капсул было обусловлено прямой диффузией из более простых внутренних структур в сравнении с более комплексной структурой WPI/альгинатные капсулы, полученных из эмульсий типа вода-в-масле. Кроме того, литература указывает, что альгинат может образовывать защитный слой на WPI-капсуле в результате взаимодействия между WPI и альгинатом. Химическая реакция трансацилирования между белком и альгинатом (Chen et al., 2006) включает в себя образование амидных связей между белком и альгинатом после добавления подщелачивающего агента (например, гидроксида натрия) в эти капсулы и приводит к образованию мембраны на поверхности капсулы. Такая мембрана может защищать капсулу от деградации от нагрузки, связанной с окружающей средой, например, активности рН и пепсина.
1
[173] Альгинатные капсулы были наименее стабильными в имитированной желудочной жидкости без детектируемых жизнеспособных клеток (<10 КОЕ/г) после 120 минут инкубирования, как показано на фиг.8. Как обсуждалось, предыдущие исследования показали, что альгинатные капсулы являются относительно стабильными в желудочных жидкостях, и, следовательно, низкое количество клеток является, вероятно, результатом пористой структуры этих капсул, позволяющей вхождение SGF в эту капсулу во время инкубирования. В результате этой пористости, площадь поверхности, подвергаемая действию SGF, могла быть достаточно значительной для позволения высвобождения в окружающую среду. Chandramouli et al. (2004) сообщали о полном высвобождении 2400 бактерий L. acidophilus CSCC из 1%-ных альгинатных капсул в пределах 10 минут инкубирования в SGF.
[174] Жизнеспособность микроинкапсулированных и свободных клеток после тепловой обработки
[175] Свободные и инкапсулированные клетки L. acidophilus инкубировали при 37°C, 50°C, 60°C и 80°C в течение 20 минут в дистиллированной воде (pH 7,0). Как показано на фиг.9, малое, но значимое уменьшение количеств жизнеспособных клеток L. acidophilus наблюдали из инкубаций при 37°C до 50°C, когда количества клеток уменьшались от Log 9,00 до Log 8,61 КОЕ/г. Количества жизнеспособных клеток разительно уменьшались до недетектируемых уровней после инкубирования при 60°C и 80°C, что позволяет предположить, что температура 60°C является летальной для L. acidophilus. Эти результаты согласуются с тем, что обычно известно о L. acidophilus, и результатами, сообщенными в литературе. Reinheimer et al. (1995) сообщали, что протеолитические и подкисляющие активности L. acidophilus были высокими при 37°C и 40°C, и все еще снижались до незначительных (не принимаемых в расчет) активностей при обработке клеток при 55°C.
[176] Количество жизнеспособных клеток для WPI-капсул было log 7,11, 6,67, 6,43 и 3,20 КОЕ/г после инкубирования при 37°C, 50°C, 60°C и 80°C, соответственно. Фиг.9 показывает, что не наблюдали значимых различий в количествах жизнеспособных клеток между 37°C, 50°C и 60°C, что позволяет предположить, что WPI-капсулы защищали бактерии от теплового повреждения до 60°C. Однако, после инкубирования при 80°C в течение 20 минут, наблюдали уменьшение приблизительно 3 log в количествах жизнеспособных бактерий. Для 75:25 WPL:альгинат-капсул, количества клеток жизнеспособных бактерий уменьшалось с log 5,89 до log 4,81 КОЕ/г после инкубирования в течение 20 минут при 50°C, как показано на фиг.9. При каждой температуре инкубирования 50°C, 60°C и 80°C, эти капсулы, по-видимому, защищают бактерии от теплового повреждения, как подтверждается незначимыми изменениями количества жизнеспособных клеток, наблюдаемыми между этими тремя температурами: количества жизнеспособных клеток для 50°C, 60°C и 80°C были log 4,81, 4,88 и 4,53 КОЕ/г, соответственно.
4
2
4
3
[177] В соответствии с аспектами настоящего изобретения, это уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания действию температуры до 50°C в течение 20 минут в растворе с рН 7,0, составляет 0-50 КОЕ/г капсул. Сходным образом, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 60 в течение 20 минут в растворе с рН 7,0, составляет 0-1×10 КОЕ/г капсул, предпочтительно 0-1×10 КОЕ/г капсул. Уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 80°C в течение 20 минут в растворе с рН 7,0, составляет 0-1×10 КОЕ/г капсул, предпочтительно 0-1×10 КОЕ/г капсул.
[178] Как видно опять из фиг.9, не наблюдали значимых различий в количествах жизнеспособных клеток между инкубированием при 37°C и 50°C для L. acidophilus, инкапсулированных в альгинатных капсулах, с наблюдаемыми количествами клеток log 6,76 и log 6,46 КОЕ/г. Однако при 60°C и 80°C не детектировали колониеобразующих единиц что позволяет предположить, что тепловая защита не предоставлялась альгинатными капсулами при температуре выше 50°C. Содержащие сывороточный белок капсулы обнаруживали тепловое защитное действие на жизнеспособность клеток L. acidophilus, большее, чем свободные и инкапсулированные в альгинате клетки. Неожиданно, WPI-содержащие капсулы обеспечивали тепловую защиту клеткам бактерий даже до 80°C, с WPI-капсулами, 75:25 WPL:альгинатные капсулы и 50:50 WPL:альгинатные капсулы, продуцируя log уменьшения 4, 2 и 4 КОЕ/г, соответственно. Therefore, 75:25 WPL:альгинатные капсулы были наиболее эффективными в обеспечении теплового барьера инкапсулированному материалу.
[179] Эти эксперименты демонстрируют способность инкапсулированных пробиотических бактерий выживать при тепловых и желудочно-кишечных условиях. Количества жизнеспособных клеток неинкапсулированных пробиотических бактерий легко уменьшаются в суровых условиях, таких как желудочные и тепловые условия, иллюстрируя их чувствительность к кислотному и тепловому стрессу. В отличие от свободных клеток, капсулы, содержащие WPI и альгинат в комбинациях 75:25 75:25 WPL:альгинат и 50:50 WPI:альгинат, обнаруживали защитный эффект на клетках L. acidophilus при температурах до 80°C. Кроме того, при желудочных условиях, эти капсулы обнаруживали значимую защиту бактерий, причем 50:50 WPI:альгинат обеспечивает наибольшую защиту.
Пример 8
[180] В этом примере исследовали стабильность инкапсулированных коммерческих пробиотиков при тепловой обработке в кислотных условиях. Увеличивающийся интерес к пробиотическим бактериям привел к индустриям, фокусирующимся на включении пробиотиков в различные пищевые системы. Однако исследования показали, что бактерии могут не выживать в достаточных количествах при включении их в пищевые продукты. В результате, обеспечение пробиотиков физическим барьером против жестких условий окружающей среды во время производства коммерческих пищевых продуктов приобретает значительный интерес (Kailasapathy, 2002). До сих пор, мало исследований проводили с целью включения пробиотиков в подвергаемые тепловой обработке кислотные пищевые продукты, такие как плодово-ягодный сок.
[181] При развитии различных пищевых продуктов, содержащих пробиотики, некоторые факторы, включающие в себя титруемую кислотность, рН, пероксид водорода, содержание растворимого кислорода, температуру хранения, и виды и штаммы микроорганизмов, могут влиять на жизнеспособность пробиотиков (Anal and Singh, 2007). Как описано ранее, инкапсулированные пробиотические бактерии в WPI-альгинатных гранулах, развитых в этом исследовании, могли бы улучшать жизнеспособность L. acidophilus ATCC 4356 против жестких условий, таких как SGF или высокотемпературная обработка.
[182] Бактериальные штаммы и условия культивирования
[183] Штаммами бактерий, используемыми в этом исследовании, были Lactobacillus casei и Bifidobacterium lactis HN019 (Howaru), которые обеспечивались Christian Hansen (Denmark) и Danisco (USA), соответственно. Бактерии росли в бульоне MRS Lactobacillus (Difco Laboratories, Detroit, Milch.) при 37°C в течение 24 часов при анаэробных условиях (GasPak EZ anaerobe container system, Becton, Dickinson and Company, USA). Перед использованием в этих экспериментах, бактерии субкультивировали по меньшей мере три раза. Количества КОЕ определяли методом чашечного подсчета с культурой соответствующих разведений, как описано в примере 1.
[184] Микроинкапсулирование
[185] Клетки размножали в двух бутылях, содержащих 400 мл бульона MRS, в течение 24 часов при 37°C при анаэробных условиях, собирали центрифугированием при 8500 об/мин при 4°C. и затем суспендировали с 0,1% пептонной водой. Капсулы 75:25 WPI-альгинат готовили асептически с суспензией клеток одной бутыли, как описано в примере 1, за исключением того, что концентрация WPI была 10% (м/о). Другую суспензию клеток использовали для свободных клеток в качестве контрольной пробы.
[186] Выживание свободных и инкапсулированных клеток при тепловой обработке в кислотных условиях
[187] Толерантность инкапсулированных L. casei и B. lactis к тепловой обработке в кислотных условиях определяли инкубированием количества (1 грамм или 1 миллилитр) 75:25 WPI:альгинатные капсулы, содержащих инкапсулированные клетки бактерий и свободные клетки, в 9 мл фосфатного буфера (100 мМ, pH 7,0) или буфера лимонной кислоты (10 мМ, pH 3,5, 3,8 и 4,1) в качестве суспендирующей среды. Условия обработки были следующими:
1) 60°C в течение 5, 10 и 20 минут при рН 7
2) 60°C в течение 5 и 10 минут при рН 3,5
3) 60, 70 и 80°C в течение 5 минут при рН 3,5
4) 65°C в течение 5 минут при рН 3,8 и рН 4,1
5) 92°C в течение 4 секунд при рН 3,5
[188] После этих обработок каждую пробу немедленно охлаждали до комнатной температуры и жизнеспособные клетки считали, как описано в примере 1. Для обработанных кислотой инкапсулированных клеток, эти капсулы переносили в 9 мл фосфатного буфера для деполимеризации и затем переваривали с использованием гомогенизатора в течение периода времени до 30 минут. Затем брали аликвоты этой пробы и подсчитывали количества жизнеспособных клеток.
3
2
4
3
[189] Как описано на фиг.10, свободные клетки L. casei (смотрите фиг.10A) и B. lactis (смотрите фиг.10B) в фосфатном буфере (рН 7) уменьшались до приблизительно 2 и 3 log КОЕ/мл во время тепловой обработки при 60°C в течение 10 минут, соответственно. Было обнаружено, что выживание инкапсулированных клеток каждого штамма является более высоким, чем свободных клеток, с выживанием приблизительно 1,5 log КОЕ/мл для L. casei и приблизительно 1 log КОЕ/мл для B. lactis. После 20 минут инкубирования при 60°C, жизнеспособность инкапсулированного L. casei была приблизительно на 1 log КОЕ/мл более высокой, чем свободных клеток, но не было различия между инкапсулированными и свободными клетками для B. lactis. В соответствии с аспектами настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 60°C в течение 10 минут в растворе с pH 7,0 содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул, предпочтительно 0-1×10 КОЕ/грамм капсул. Подобным образом, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 60°C в течение периода времени до 20 минут в растворе с рН 7,0 содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул, предпочтительно 0-1×10 КОЕ/грамм капсул.
2
5
3
[190] Как видно на фиг.11, жизнеспособные количества свободных клеток (L. casei) уменьшались, с уменьшением приблизительно 3 log на протяжении тепловой обработки при 60°C в течение 5 минут при подвергании рН 3,5, тогда как уменьшение приблизительно 2 log наблюдали в жизнеспособных клетках, обработанных в нейтральном рН. Этот результат иллюстрирует, что нагревание при условиях кислотного рН может уменьшать жизнеспособность микроорганизма в сравнении с условиями нейтрального рН. Инкапсулированные клетки L. casei приводили к лучшему выживанию (приблизительно на 1 log КОЕ/мл более высокому), чем для свободных клеток при тепловой обработке при 60°C в течение пяти минут при низком рН 3,5. Наблюдали также более высокое выживание инкапсулированных B. lactis при тех же самых условиях (данные не показаны). Однако, микроинкапсулирование не защищало любой тип микроорганизма после тепловой обработки в течение 10 минут при рН 3,5. Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 60°C в течение периода времени 5 минут в растворе с рН 3,5 содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул. Подобным образом, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 60°C в течение периода времени 10 минут в растворе с рН 3,5 содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул. В противоположность этому, согласно аспектам настоящего изобретения уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 60°C в течение периода времени 5 минут в растворе с рН 7,0 содержит 0-50 КОЕ/грамм капсул. Подобным образом, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 60°C в течение периода времени 10 минут в растворе с рН 7,0 содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул.
6
7
7
[191] Как видно на фиг.12, при экспонировании свободных и инкапсулированных клеток L. casei температурам 70°C и 80°C в течение пяти минут при pH 3,5, все свободные клетки были убиты, тогда как так много, как приблизительно log 3,5 инкапсулированных клеток, нагреваемых до 70°C, выживали. Однако эта степень выживания является очень низкой для применения на практике, поскольку съедобные продукты должны содержать по меньшей мере 10-10 КОЕ жизнеспособных пробиотиков для пищевых продуктов, продаваемых с притязанием на улучшение здоровья с использованием пробиотиков. Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 70°C в течение 5 минут в растворе с рН 3,5 содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул.
5
3
2
[192] Как видно на фиг.13, при экспонировании свободных и инкапсулированных клеток L. casei pH 3,8 при 65°C в течение 5 минут, не наблюдали защитного действия в подсчете жизнеспособных клеток (смотрите фиг.13А), но имелось защитное действие инкапсулирования при экспонировании pH 4,1, и жизнеспособное количество инкапсулированных клеток было по меньшей мере на 1,5 log КОЕ/мл более высоким, чем количество свободных клеток. Для B. lactis, жизнеспособность инкапсулированных клеток была более высокой в сравнении со свободными клетками даже при pH 3,8, а также при pH 4,1 (смотрите фиг.13В). При рН 4,1, в сравнении с первоначальными количествами, имелось уменьшение только приблизительно 2 log КОЕ/мл в количествах инкапсулированных клеток B. lactis и уменьшение приблизительно 3,5 log КОЕ/мл в свободных клетках. Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 65°C в течение 5 минут в растворе с рН 3,8 содержит 0-1×10 КОЕ/г капсул, предпочтительно 0-1×10 КОЕ/грамм капсул. Уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 65°C в течение 5 минут в растворе с рН 4,1 содержит 0-5×10 КОЕ/г капсул.
[193] Жизнеспособность инкапсулированных клеток уменьшалась с экспонированием до более продолжительного времени нагревания. После 10 минут тепловой обработки, не было различия между свободными и инкапсулированными клетками (данные не показаны). Не наблюдали также различия между свободными и инкапсулированными клетками обоих штаммов при тепловой обработке при 65°C в течение 5 минут при pH 3,5 (данные не показаны).
2
[194] Как видно на фиг.14, наблюдали более высокое выживание инкапсулированных клеток обоих штаммов Lactobacillus casei (смотрите фиг.14A) и Bifidobacterium lactis (Howaru) (смотрите фиг.14B) при кислотном рН 3,5 при 92°C в течение 4 секунд, которое показывает, что инкапсулированные клетки могут выживать во время коммерческой стерилизации напитков с низким рН. Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания температуре до 92°C в течение 5 секунд в растворе с рН 3,5, содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул.
[195] Действие размера капсулы на жизнеспособность бактерий не исследовали в этом исследовании, но Chandramouli et al. (2004) показали что жизнеспособность инкапсулированных бактерий в имитированных желудочных условиях увеличивалась с увеличением размера капсулы (200-1000 мм). Lee and Heo (2000) сообщали, что выживание бактериальных клеток уменьшалось с уменьшением размера капсулы (диаметры 1-2,6 мм). Sheu and Marshall (1993) показали, что большие диаметры гранул обеспечивали более высокую защиту для Lactobacillus bulgaricus в замороженных десертах.
[196] В этом исследовании были разработаны микрокапсулы пищевой категории, содержащие чувствительные пробиотики, с использованием соотношения масс 75:25 белкового изолята сыворотки и альгината, и было показано, что они являются эффективными в увеличении жизнеспособности пробиотических бактерий в сравнении с неинкапсулированными свободными клетками, экспонированными некоторым тепловым обработкам при низком рН (т.е. 60°C в течение 5 минут при pH 3,5 и 65°C в течение 5 минут при рН 4,1), а также при условии коммерческой стерилизации подвергания температуре 92°C в течение 4 секунд.
Пример 9
[197] Включение инкапсулированных пробиотиков в коммерческие плодово-ягодные соки
[198] Употребление пищевых продуктов и напитков, содержащих пробиотики, является, по-видимому, растущим, глобальным потребительским трендом. (Verbeke, 2005). Например, в Европе большая часть функционального рынка пищевых продуктов содержит пищевые продукты, обогащенные пробиотиками. Обычно используемые виды включают в себя Lactobacillus и Bifidobacterium (Sheehan et al., 2007).
6
-1
[199] Напитки, такие как плодово-ягодные соки, которые употребляются регулярно и имеют установившийся сектор рынка, могут представлять идеальную среду доставки для пробиотиков. Однако, развитие функционального сока, обогащенного пробиотиками, может затрудняться вследствие чувствительности бактерий к кислотным условиям и конкретным компонентам соков. Обычно, минимальный рекомендуемый уровень жизнеспособных пробиотиков, который должен присутствовать в пищевых продуктах для какой-либо пользы для здоровья, может быть приблизительно 10 КОЕ мл в момент употребления (Boylston et al, 2004). Привкусы, обусловливаемые пробиотичсескими культурами в плодово-ягодных соках могут также вызывать у потребителей нелюбовь к этому продукту (Luckow and Delahunty, 2004). Микроинкапсулирование является одним способом, который может быть использован для уменьшения бактериальной чувствительности и нежелательных запахов; однако, имеются некоторые ограничения, такие как размер микрокапсулы, если она подлежит включению в плодово-ягодный сок. Этот размер предпочтительно поддерживается по возможности малым для минимизации эффектов сенсорной текстуры.
[200] В этом примере, L. casei и B. lactis Howaru инкапсулировали с использованием прибора инкапсулятора (Inotech) и добавляли в три вида коммерческих соков: апельсиновый сок, виноградный сок и клюквенный сок. Жизнеспособность свободных клеток в этих соках испытывали каждые две недели в течение 10-недельного полного времени хранения при оптимальной температуре. Сенсорные тесты также проводили с апельсиновым соком и виноградным соком, обогащенными инкапсулированными клетками.
[201] Бактериальные штаммы, условия культивирования и подсчет
[202] Бактериальными штаммами, используемыми в этом исследовании, были Lactobacillus casei и Bifidobacterium lactis HN019 (Howaru), которые были обеспечены Christian Hansen (Denmark) и Danisco (USA), соответственно. Условия культивирования и чашечный подсчет бактерий были такими же, какие описаны в примере 1.
[203] Микроинкапсулирование
[204] Восемь миллилитров свежих клеток размножали в 400 мл бульона в течение 24 часов при 37°C при анаэробных условиях, собирали центрифугированием при 8500 об/мин в течение 10 минут при 4°C и затем суспендировали с 0,1% пептонной водой. 1%-ный м/о альгинат натрия и 10% м/о растворов WPI готовили, как описано в примере 1, за исключением того, что смесь WPI и альгината разводили автоклавированной водой Milli-Q для предотвращения блокирования форсунки (сопла). Капсулы WPI-альгинат готовили асептически с клеточной суспензией в 4% м/о растворе хлорида кальция при помощи Инкапсулятора (IE-50R, Inotech, Switzerland) с форсункой 300 мкм. Скорость вибрации устанавливали при 1800 Гц, электростатическое напряжение было равно 1 кВ и скорость вращения насоса шприца была равна 320. Другую клеточную суспензию использовали для свободных клеток, таких как контрольная проба. Капсулы отверждали в растворе хлорида кальция в течение 30 минут перед промыванием Milli-Q-водой. Затем жизнеспособные клетки капсул определяли с использованием чашечного способа подсчета.
[205] Выживание инкапсулированных клеток в плодово-ягодных соках
[206] Использовали три вида коммерческих плодово-ягодных соков, как показано в таблице 3. Десять граммов инкапсулированных и свободных клеток, соответственно, добавляли к 500 мл каждого сока. Жизнеспособность инкапсулированных и свободных клеток в каждом соке испытывали с использованием способа чашечного подсчета каждые две недели в течение 10-недельного хранения при оптимальной температуре.
[207] Распределение размеров частиц
[208] Эти микрокапсулы анализировали на средний диаметр объемной массы в Malvern Mastersizer 2000 Ver. 5.54 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) с использованием технологии лазерной диффракции.
Таблица 3Коммерческие плодово-ягодные соки
Название продукта
Компания
Ключевые ингредиенты
Brix
рН
Кислотность
Хранение
McCoy Real Dark Grape Juice
Frucor Beverage Ltd., NZ
Восстановленный виноградный сок (100%), ароматизатор, Витамин С
15,1
3,46
9,68
Комнатная температура
Ocean Spray Cranberry Classic
Ocean Spray International Inc. Australia
Концентрированный клюквенный сок (25%), сахар, Витамин С
11,9
2,73
16,50
Комнатная температура
Charles Honest Charles Juice Orange
Trading Company Ltd., Australia and NZ
Отжатый апельсиновый сок, Витамин С
9,9
3,74
7,10
Охлажденный
[209] Сенсорная оценка по способу треугольника
[210] Десять граммов капсул на 500 мл добавляли к виноградному и апельсиновому соку, и шесть членов комиссии по оценке качества пищевых продуктов испытывали их. Количество (10 г) микрокапсул было таким же, что и количество микрокапсул, используемых для испытания лежкоспособности. Две пробы были обычными соками и одна проба была содержащим микрокапсулы соком.
7
8
8
7
[211] Первоначальные количества жизнеспособных клеток каждого сока, обогащенного инкапсулированием, и свободных клеток L. casei были приблизительно 6,44×10 КОЕ/мл и 1,29×10 КОЕ/мл, соответственно (смотрите таблицу 4). Для B. lactis Howaru, первоначальные количества жизнеспособных клеток каждого сока, обогащенного инкапсулированием, и свободных клеток были приблизительно 1,03×10 КОЕ/мл и 6,35×10 КОЕ/мл, соответственно (смотрите таблицу 5).
2
[212] Для виноградного сока McCoy, обогащенного L. casei, хотя количество клеток уменьшалось в этом соке со временем хранения, инкапсулирование этих клеток бактерий обеспечивало некоторый защитный эффект для пробиотических бактерий. Как показано в таблице 4, содержащий микрокапсулы сок обнаруживал более высокие количества клеток (т.е. 6,4 log КОЕ/мл), чем сок, содержащий свободные клетки (т.е. 5,1 log КОЕ/мл) после 10 недель хранения. Однако, что касается B. lactis Howaru, жизнеспособность неожиданно уменьшалась до приблизительно 1 log КОЕ в обоих типах соков после 6-недельного хранения (смотрите таблицу 5). Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания хранению при комнатной температуре (например, приблизительно 22-25°C) в течение периода до 8 недель при рН 3,5 виноградного сока содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул.
2
[213] Клюквенный сок имеет более низкий рН и более высокую активность в сравнении с другими соками и мало выживших свободных клеток, даже после только двух недель хранения. Жизнеспособность микрокапсул также показывала постепенное уменьшение. Было обнаружено, что инкапсулированный B. lactis Howaru (смотрите таблицу 5) является более чувствительным к этому соку в сравнении с инкапсулированным штаммом L. casei (смотрите таблицу 4). Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания хранению при комнатной температуре (например, приблизительно 22-25°C) в течение периода до 2 недель при рН 2,75 клюквенного сока содержит 0-1×10 КОЕ/ грамм капсул.
3
3
2
[214] Что касается охлажденного апельсинового сока, обогащенного L. casei, инкапсулированные и свободные клетки постепенно уменьшались, но все еще сохраняли жизнеспособность выше 5,1 log КОЕ/мл после 10 недель хранения (смотрите таблицу 4). Количество жизнеспособных клеток содержащего микрокапсулы сока является по меньшей мере меньшим, чем содержащего свободные клетки сока: однако, это различие обусловлено только трудностью счета этих клеток вследствие присутствия апельсиновой пульпы. В отличие от этого, для B. lactis Howaru, жизнеспособность в обоих соках не сохраняется, сходно с результатом клюквенного сока (смотрите таблицу 5). Согласно аспектам настоящего изобретения, уменьшение жизнеспособных пробиотических бактерий в капсулах настоящего изобретения после подвергания хранению при температурах 25°F (1,67°C) в течение периода до 10 недель при pH 3,75 апельсиновый сок содержит 0-1×10 КОЕ/грамм капсул, предпочтительно 0-1×10 КОЕ/грамм капсул, предпочтительно 0-1×10 КОЕ/грамм капсул.
[215] Сенсорные оценки с апельсиновым соком, продемонстрировали, что пять из шести членов комиссии по оценке качества пищевых продуктов не детектировали различие между этими двумя типами сока, либо содержащими капсулы, либо не содержащими капсул, возможно, вследствие присутствия апельсиновой пульпы. Кроме того, этот один член, который детектировал это различие, не мог детектировать различное разжевывание. Обычно оценивается, что размер частицы выше 1000 мкм в диаметре вызывает шероховатость в языке, но не детектируется ниже размера 3 мкм. Было обнаружено, что средний размер микрокапсул, используемых в этом примере, равен приблизительно 490 мкм. В сенсорных тестах с виноградным соком, три из шести членов комиссии по оценке качества пищевых продуктов, детектирующие микрокапсулы и ощущающие некоторые малые комки или шероховатость, не детектировали однако какой-либо неприятный вкус.
Таблица 4Количества (log<sub>10</sub>/мл сока) инкапсулированных и свободных клеток (L. casei) в трех типах коммерческого сока на протяжении 10 недель хранения при оптимальной температуре
Недели хранения
Виноградный сок
Клюквенный сок
Апельсиновый сок
Свободная клетка
Гранула
Свободная клетка
Гранула
Свободная клетка
Гранула
0
8,1
7,8
8,1
7,8
8,1
7,8
2
7,7
7,6
<4*
6,2
7,1
5,4
4
6,7
7,3
0
3,2
6,7
6,3
6
6,1
7,1
0
1
6,1
5,7
8
5,5
6,9
0
0,5
6,0
6,0
10
5,1
6,4
0
0,5
5,3
5,1
* ND, вне диапазона разведения
Таблица 5Количества (log<sub>10</sub>/мл сока) инкапсулированных и свободных клеток (B.lactis Howaru) в трех типах коммерческого сока на протяжении 8 недель хранения при оптимальной температуре
Недели хранения
Виноградный сок
Клюквенный сок
Апельсиновый сок
Свободная клетка
Гранула
Свободная клетка
Гранула
Свободная клетка
Гранула
0
7,8
8,0
7,8
8,0
7,8
8,0
2
6,7
6,8
<0*
<2,4*
<3*
4,1
4
5,1
5,6
0
0,6
0
0,4
6
<1*
<1,3*
0
0,5
0
<1*
8
-
-
-
-
-
-
* ND, вне диапазона разведения
[216] Как показано в таблице 4, в виноградном соке, обогащенном L. casei, инкапсулирование обеспечивало защитное действие. Было обнаружено, что в апельсиновом соке, жизнеспособность инкапсулированных и свободных клеток L. casei является сохраненной при около 5,1 log КОЕ/мл после 10 недель хранения, возможно, вследствие низкой температуры хранения и низкой кислотности.
[217] Было обнаружено, что средний диаметр объемной массы этих капсул равен приблизительно 490 мкм. Сенсорные оценки показали, что потребители могут не чувствовать какого-либо различия в апельсиновом соке, обогащенном микрокапсулами, потенциально вследствие присутствия пульпы в апельсиновом соке. Хотя присутствие микрокапсул в виноградном соке могло быть детектировано, эти микрокапсулы могут не обеспечивать какого-либо неприятного вкуса или разжевывания.
[218] Специалистам с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что, для удобства, некоторые ингредиенты описаны здесь в некоторых случаях со ссылкой на первоначальную форму этого ингредиента, в которой его добавляют в продукты, композиции напитков, и способы, описанные здесь. Такая первоначальная форма может отличаться от формы, в которой этот ингредиент обнаруживается в конечном продукте или композиции напитка. Таким образом, например, сахароза и жидкая сахароза могут быть обычно гомогенно растворены и диспергированы в растворе. Подобным образом, другие ингредиенты, идентифицируемые как твердое вещество, концентрат (например, концентрат сока) и т.д., могут быть обычно гомогенно диспергированы по всей композиции, а не оставаться в их первоначальной форме. Таким образом, ссылка на форму ингредиента продукта или композиции должна восприниматься не как ограничение в отношении формы этого ингредиента в этом продукте или композиции, а скорее как подходящий способ описания этого ингредиента как выделенного компонента съедобного продукта или съедобной композиции.
[219] С учетом преимущества приведенного выше раскрытия и описания примерных вариантов, квалифицированным в данной области будет очевидно, что многочисленные альтернативные и различные варианты являются возможными в соответствии с общими принципами настоящего изобретения, описанными здесь. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что все такие разнообразные модификации и альтернативные варианты находятся в пределах подлинных объема и сущности настоящего изобретения. Прилагаемые пункты формулы изобретения предназначены для охвата всех таких модификаций и альтернативных вариантов. Должно быть понятно, что использование неопределенного или определенного артикля (например, "a", "an", "the" и т.д.) в этом документе и последующей формуле изобретения следует традиционному подходу в патентах, обозначая "по меньшей мере один", если только в конкретном случае из контекста не ясно, что этот термин предназначен в этом конкретном случае для обозначения конкретно “один и только один”. Подобным образом, термин "содержащий" является открытым на конце и не исключает дополнительных предметов, признаков, компонентов и т.д.