Распределение признаков деградации углеводородов среди гетеротрофной микрофлоры, выделенной из почвы и нефтешламов

УДК 579.266:574

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИЗНАКОВ ДЕГРАДАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ СРЕДИ ГЕТЕРОТРОФНОЙ МИКРОФЛОРЫ, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ

ПОЧВЫ И НЕФТЕШЛАМОВ

Мельников Д.А. - аспирант Карасева Э.В. - к. б. н., профессор

Кубанский государственный университет

В работе изучалась способность к росту гетеротрофных бактерий на н-алканах и ароматических углеводородах. Установили, что разнообразие спектров потребляемых углеводородов (коэффициент Евклидова разнообразия) у микрофлоры почвы, не загрязненной нефтепродуктами, практически не отличается от микрофлоры грунта в процессе микробиологической очистки. Тот же показатель разнообразия спектров потребляемых углеводородов равняется нулю у микрофлоры нефтешламов до обработки.

Известно, что черноземные почвы отличаются высокой концентрацией микроорганизмов [1], нефтешламы также характеризуются присутствием в них гетеротрофных микроорганизмов [2]. Очевидно, что при исследовании процесса биодеградации нефтепродуктов в различных объектах необходимо изучение разнообразия трофических возможностей у гетеротрофной микрофлоры по отношению к индивидуальным углеводородам -компонентам поллютантов. Это поможет понять принципы функционирования углеводородокисляющих сообществ.

Целью данной работы стала оценка и сравнение разнообразия спектров потребляемых углеводородов у микроорганизмов, выделенных из нефтешламов, почвы и грунта на завершающем этапе биоремедиации. В

своем исследовании мы стремились выделить как можно больше изолятов гетеротрофных бактерий с учетом концентрации бактерий в высеве и исследовать спектр потребляемых углеводородов у выделяемой микрофлоры. На основании полученных данных выделили минимальную группу углеводородов, которая позволяет оценить углеводородокисляющую направленность штамма.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Микроорганизмы выделяли из чистой почвы (чернозема), нефтешлама на завершающей стадии детоксикации и двух образцов нефтешламов, не подвергавшихся очистке. Нефтешлам №1 представлял собой твердую черную массу, концентрация нефтепродуктов 345 г/кг, срок хранения более 40 лет, отобран из амбара накопителя. Нефтешлам №2 отобран из нефтеловушки, он содержал нефтяные отходы, полученные при зачистке резервуаров. Концентрация нефтепродуктов в данном образце составила 340 г/кг.

Нефтешлам на завершающем этапе очистки (в дальнейшем грунт) отобран с площадки биологической очистки нефтешлама, обрабатываемого по технологии центра "Биотехнология" КубГУ. К моменту отбора пробы он представлял собой грунт с остаточным содержанием углеводородов - 34,8 г/кг. Принципы технологии детоксикации описаны в работе [3]. В очищаемый шлам в процессе биоремедиации вносили биогенные элементы, структурирующие вещества, регулировали водный режим.

Содержание нефтепродуктов в нефтешламах определяли флюориметрически на "Флюорат 02-3М" по стандартной методике согласно ПНДФ 16.1.21-98 КХА почв МВИ массовой доли нефтепродуктов в пробах почв на анализаторе жидкости "Флюорат 02".

Выделение и количественный учет микроорганизмов проводили методом кратных разведений почвы (нефтешлама, грунта), суспендированной

в физиологическом растворе. Четыре грамма почвы (нефтешлама, грунта) разводили в 40 мл физиологического раствора. Далее по стандартной методике производили десятикратные разведения, а начиная с четвертого разведения для нефтешламов (грунта) и с пятого для почвы - двукратные разведения. Соответственно посевы (0,1 мл почвенной суспензии) производили из последнего десятикратного разведения и двух первых двукратных разведений на стандартный питательный агар для гетеротрофных микроорганизмов. Такой способ разведений дал возможность выделить в чистой культуре оптимальное количество изолятов для дальнейших исследований.

Для оценки способности к росту на различных углеводородах производили посев чистых культур штрихом на плотную минеральную среду с углеводородами. Состав плотной минеральной среды: нитрат калия - 4,0 г, однозамещенный фосфат калия - 0,6 г, двузамещенный фосфат натрия (двенадцативодный) - 1,4 г, сульфат магния - 0,8 г, агар - 20 г, вода (водопр.) до 1 л. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали индивидуальные н-алканы ряда гексан - октадекан, бензол (Benz) и его производные - 1,2,4-триметилбензол (псевдокумол - Psk), бутилбензол (b-Benz), о-ксилол (o-Xyl), толуол (Tol). Также производили посевы выделенной микрофлоры на минеральную среду с хлороформенным экстрактом соответствующего объекта (нефтешламы и грунт). Так как чистая почва не содержала нефтепродукты, микроорганизмы, выделенные из нее, культивировали на минеральной среде с сырой нефтью, взятой в качестве модельного поллютанта. Все субстраты вносили в расплавленную среду в концентрации 0,2 % (об). Чашки с легкими углеводородами (н-алканы ряда гексан - додекан, бензол и его производные) помещали в закрытый эксикатор, на дно которого наливали 10 мл углеводорода. Нафтид

нефтешлама вносили в плотную минеральную среду в бензольной эмульсии. Расплавленную среду нагревали и выдерживали в течение одного часа на кипящей водяной бане в вытяжном шкафу для удаления растворителя и периодически встряхивали. В результате получали дисперсию нефтепродукта в плотной минеральной среде. Культивировали при комнатной температуре в течение 7 суток. Учитывали результаты по системе "+" (наличие роста) и "-" (отсутствие роста).

Для группировки признаков деградации углеводородов в зависимости от качественных особенностей спектра потребляемых углеводородов использовали многомерное шкалирование, модуль (PROXSCAL, порядковая модель с разрешением связанных наблюдений) программы SPSS 11.5 for Windows. В качестве дистанции между объектами использовали Евклидову меру для бинарных данных.

Для измерения взаимосвязи между количеством деградируемых углеводородов и способностью к росту на поллютанте использовали тест хи-квадрат и коэффициент неопределенности в качестве меры связи. Анализ провели в программе SPSS 11.5 for Windows.

Для измерения разнообразия выделенной микрофлоры с учетом степени сходства индивидуальных характеристик роста штаммов на различных углеводородах использовали коэффициент Евклидова разнообразия (EDC - Euclidean diversity coefficient) [4]. Формула коэффициента Евклидова разнообразия:

H (P) =1 ЕЕ PiPA

где р - доли /-того и 7-того фенотипа, dij - дистанция между /-тым и 7-тым фенотипом, измеряемая как

ё1 ,

где £у - мера сходства между фенотипами. В данном исследовании

использовали следующую меру сходства: отношение количества

совпадающих признаков у пары штаммов к общему количеству признаков -

а + ё

£ = ---------

11 а + Ь + с + ё ,

где в стандартной нотации для бинарных данных а (1,1), Ь (1,0), с (0,1), ё (0,0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для выделения чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов и оценки роли гетеротрофных микроорганизмов в процессах деградации углеводородов проводили исследование содержания микрофлоры данной группы в чистой почве, двух образцах нефтешлама и образца грунта на завершающем этапе биоремедиации, содержащего остаточный нафтид нефтешлама. Изоляты, выделенные из разных объектов, приведены в таблице 1. Для микрофлоры, выделенной из нефтешлама №1 и №2, было характерно отсутствие углеводородокисляющих микроорганизмов в исследуемом разведении. Микрофлора, выделенная из почвы и грунта, характеризовалась значительно большей долей изолятов, способных расти на углеводородах. Среди 85 изолятов, выделенных из грунта, было обнаружено 47 фенотипов, которые различались по спектру потребляемых углеводородов. Таблица 1 - Распределение изолятов, выделенных из чернозема, и

нефтешламов в зависимости от разведения и среды выделения

Объект Разведение 1 Разведение 2 Разведение 3

Почва 35 23 11

Нефтешлам №1 20 0 0

Нефтешлам №2 19 0 0

Грунт 39 31 15

Примечание: для нефтешламов и грунта разведение 1 - в 105 раз, разведение 2 - в 2 х 105 раз, разведение 3 - в 4 х 105 раз, для почвы разведение 1, 2 и 3, соответственно, в 106, 2х 106, 4х 106 раз.

Из 69 изолятов, выделенных из почвы, было описано 35 фенотипов, отличающихся по спектру потребляемых углеводородов. Среди микроорганизмов, выделенных из почвы, 17,4 % были способны

утилизировать сырую нефть, а среди выделенных из грунта 38,8 % поддерживали рост на остаточном нафтиде данного грунта. Такое распределение можно объяснить тем, что почва не была загрязнена нефтью, а грунт содержал собственно тот нафтид, на котором испытывали рост выделяемых микроорганизмов. Тем не менее можно признать значительной долю нефтеокисляющих микроорганизмов, присутствующих в чистой почве.

Особенности распределения уникальных фенотипов (по признакам роста на углеводородах) среди микроорганизмов, выделенных из разных разведений из почвы и грунта, показали некоторое несовпадение с моделью кратных разведений. В случае почвы из первого разведения (табл. 1) выделено 88,5 % изолятов, уникальных по фенотипу, из второго - 91,3 %, а все изоляты, выделенные из третьего разведения имели уникальные фенотипы. Под уникальным фенотипом подразумевали спектр потребляемых углеводородов, не встретившийся более чем у одного штамма, выделенного со всех трех разведений. Для микрофлоры, выделенной из грунта, наблюдали аналогичную картину: из первого разведения выделено 84,6 % изолятов, уникальных по фенотипу, из второго - 67,7 %, из третьего разведения 80,0 %

изолятов имели уникальные фенотипы. Эти данные позволяют говорить об эффекте разведения, что, впрочем, согласуется с современными представлениями в области почвенной микробиологии [5].

Распределение показателя роста на нефти (нефтешламе) среди изолятов с различным количеством потребляемых углеводородов представлено на рисунке 1 для почвы и рисунке 2 для грунта.

Рисунок 1 - Распределение изолятов, выделенных из почвы, в зависимости от количества потребляемых углеводородов и способности к росту на нефти

Остаточный нафтид -

Остаточный нафтид +

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Количество потребляемых углеводородов

Рисунок 2 - Распределение изолятов, выделенных из грунта, подвергнутого биоремедиации, в зависимости от количества потребляемых углеводородов и способности к росту на

остаточном нафтиде

На основании полученных данных предположили, что чем большее количество углеводородов способен потреблять штамм, тем вероятнее обнаружить способность к росту на нефтепродукте-поллютанте.

Для выяснения такой взаимосвязи применили тест хи-квадрат для таблицы сопряженности, где одна переменная - это способность расти на нафтиде грунта, или нефти в случае почвы, а другая - количество углеводородов, на которых росли штаммы. Силу взаимосвязи оценивали с помощью коэффициента неопределенности, результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Статистические показатели для таблицы сопряженности "рост на нефтепродукте-поллютанте” - "количество потребляемых

углеводородов”

Показатель Почва Грунт

Значение теста хи-квадрат и ^-уровень для таблицы сопряженности: рост на нефтепродукте-поллютанте - количество потребляемых углеводородов 69,0 ф < 0,001) 25,3 ф = 0,046)

Коэффициент неопределенности (переменная "рост на нефтепродукте-поллютанте" зависимая) 1,00 0,25

В обоих случаях получены высокозначимые уровни точности, что позволяет говорить о наличии связи между количеством потребляемых углеводородов и способностью расти на нефтепродукте-поллютанте. Важно отметить, что использованные в данном исследовании углеводороды составляют лишь незначительную часть веществ нефтепродуктов, так как отдельные вещества в составе нефтепродуктов редко имеют массовую долю более 1 %. Максимально возможное значение коэффициента

неопределенности для почвы отражает возможность предсказать рост штамма на данной нефти с максимальной точностью, основываясь на знании спектра потребляемых углеводородов. В случае грунта получено меньшее значение коэффициента неопределенности, и можно предположить, что используемый набор углеводородов недостаточно отражает состав остаточного нафтида. Тем не менее и здесь наличие связи подтверждено достаточно убедительно.

Для отбора штаммов по способности к росту на углеводородах имеет смысл ограничить набор субстратов, на которых проводится исследование способности к росту. Рост на различных углеводородах в исследуемых выборках изолятов был распределен асимметрично. Наиболее часто встречался рост на н-алканах (от 14,5 % до 33,3 % изолятов для почвы и от 9,4 % до 45,9 % изолятов для грунта), значительно реже на ароматических углеводородах (от 0,0 % до 4,3 % изолятов для почвы и от 5,9 % до 9,4 %

изолятов для грунта). Для поиска минимальной группы субстратов, которая позволяла бы оценивать углеводородокисляющую направленность штамма, использовали метод многомерного шкалирования. Результаты для штаммов, выделенных и чернозема и грунта, представлены на рисунках 3 и 4. В процедуре многомерного шкалирования были получены следующие значения "стресса": для почвы 81геББ-1 = 0,090, 81;геББ-11 = 0,195, Б-Б^бб = 0,023, для грунта З1хеББ-1 = 0,079, Б^бб-П = 0,151, Б-Б^бб = 0,010. Такие значения "стрессов" говорят о хорошем качестве отображения взаимосвязей между переменными в пространстве меньшей размерности.

В обоих случаях почти все признаки были распределены довольно хаотично, только н-алканы ряда тридекан - октадекан и ароматические углеводороды образовали отдельные группы. Это означало, что большинство штаммов имели по данным группам углеводородов похожие ответы, и можно рассматривать данные группы углеводородов как единый показатель (важно подчеркнуть вероятностную суть такого показателя).

Рисунок 3 - Распределение показателей роста на различных

углеводородах, полученное методом многомерного шкалирования, для

штаммов, выделенных из почвы

Рисунок 4 - Распределение показателей роста на различных углеводородах, полученное методом многомерного шкалирования, для штаммов, выделенных из грунта, подвергнутого биоремедиации

Так как н-алканы ряда тридекан - октадекан наименее летучие и нетоксичные среди всех использованных углеводородов (то есть наиболее удобные для исследовательской работы), и рост хотя бы на одном из них был обнаружен практически у всех углеводородокисляющих изолятов, мы попытались выяснить, можно ли использовать показатели роста именно на этих углеводородах для оценки возможности роста штаммов на других углеводородах.

Для определения связи между количеством утилизируемых н-алканов ряда тридекан - октадекан и количеством потребляемых углеводородов (н-алканы ряда гексан - додекан и ароматические углеводороды) использовали коэффициент корреляции рангов Спирмана. Получили следующие значения: Я (почва) = 0,40 ( = 0,001), Я (грунт) = 0,66 ( < 0,001). Такие значения

коэффициента корреляции позволяют сделать вывод о возможности использования н-алканов ряда тридекан - октадекан при первичном скрининге углеводородокисляющей микрофлоры. Отсутствие роста на данных углеводородах позволяет исключить штаммы с заведомо малым спектром потребляемых углеводородов на ранних этапах отбора штаммов.

Для оценки и сравнения разнообразия спектров потребляемых углеводородов у микрофлоры, выделенной из разных источников, было бы логичным использовать какой-либо интегральный показатель. Мы остановили свой выбор на коэффициенте Евклидова разнообразия (ЕБС), так как этот коэффициент слабо зависит от объема исследуемой выборки и позволяет учесть степень различий между объектами, которые характеризуются множеством показателей. Были получены следующие значения: для почвы ББС = 0,12 и для грунта ББС = 0,18 (полученные значения составляют примерно треть от максимально возможных при таких объемах выборок штаммов). ББС для нефтешламов №1 и №2, соответственно, равняется 0,00. Эти данные позволяют утверждать, что по характеристике разнообразия трофических возможностей по отношению к углеводородам у гетеротрофной микрофлоры грунт на завершающем этапе биоремедиации не уступал чистой почве и превосходил нефтешламы до очистки.

Благодарности: математическая обработка результатов сделана при содействии профессора кафедры генетики и микробиологии КубГУ доктора биологических наук Волчкова Ю.А. и кандидата биологических наук, доцента Тюрина В. В.

Список литературы

1. Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во МГУ,

1989. - 206 с.

2. Никитина Е.В. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама - отхода нефтехимического производства / Е.В. Никитина, О.И. Якушева, С. А. Зарипов, Р. А. Галиев, А.В. Гарусов, Р.П. Наумова // Микробиология. -2003. - Том 72. - № 5. - С. 699-706.

3. Рукавцов Б.И. Принципы микробиологической утилизации нефтешламов / Б.И. Рукавцов, Э.В. Карасева, Т.Ю. Нечитайло, И.Е. Гирич, Р.И. Смоляр // Экологические проблемы биодеградации промышленных, строительных материалов и отходов производств: III Всероссийская конференция, сборник материалов. - Пенза, 2000. - С. 129130.

4. Champely Stephane and Chessel Daniel Measuring biological diversity using Euclidean metrics // Environmental and Ecological Statistics. - 2002. - №9. - p. 167-177.

5. Полянская Л.М. Микронавески ризосферной почвы и лабораторные артефакты / Л.М. Полянская, М.Х. Оразова, О. А. Бурканова, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. - 2000. - Том 69. - №4. - С. 581-585.