Фосфатидная кислота осуществляет транспорт ионов Ca 2+ и Mg 2+ через мембраны растительных клеток

2007

ВЕС'ГНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 3. Вып. 1

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1

О. В. Воронина, О. В.Танкелюн, Я. Мартинец, С. С. Медведем*

ФОСФАТИДНАЯ КИСЛОТА ОСУЩЕСТВЛЯЕТ ТРАНСПОРТ ИОНОВ СА2+ И Мв2+ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

Одной из проблем в биологии на сегодняшний день является изучение механизмов реагирования организмов на действие экстремальных факторов. Под действием различных стрессовых факторов в клетке включаются сигнальные системы [6,8]. Так, например, повышение концентрации ионов кальция в цитозоле является одной из наиболее ранних ответных реакций на инициирование патогенами и на механическое повреждение. Эта кальциевая вспышка носит переходящий характер. Ее восходящая ветвь вызвана открыванием кальциевых каналов, расположенных на плазмалемме, вакуолярном тонопласте и в мембранах эндоплазматического ретикулума [6]. Не исключено также включение других механизмов, таких как действие ионофоров.

С другой стороны, под влиянием патогенов, элиситоров, при абиотическом стрессе в клетке происходит активация фосфолипазы Д, которая участвует в запуске фосфати-датной сигнальной системы. При этом происходит освобождение из фосфолипидов плаз-малеммы фосфатидной кислоты (ФК) [8, 17]. Фосфатидная кислота является посредником в фосфатидатной сигнальной системе. Механизмы передачи сигналов с участием ФК в растительной клетке изучены недостаточно. Полагают, что ФК способна вызывать связывание с плазмалеммой и повышение активности ряда ферментов, например, таких как НАДФН-оксидазы, киназ МАРК-каскада, участвующих в трансдукции этиленового сигнала, кальций-зависимых протеинкиназ (СБРК) [15, 22].

В последнее время ФК рассматривают также как вторичный мессенджер липидной природы, который участвует в передаче сигналов в растительной клетке о повреждении, водном, солевом и окислительном стрессах, в процессах полярного роста, осмотического изменения объема замыкающих клеток устьиц [8, 14, 16, 17, 26]. Уровень ФК в клетках-мишенях временно повышается под действием патогенов, элиситоров, АБК и этилена [4, 16,19,25,27]. Изменение уровня ФК оказывает влияние на физические свойства мембран и их способность образовывать везикулы. Тем самым ФК может влиять на везикулярный транспорт в процессах экзо- и эндопитоза [4].

Имеются данные о том, что ФК обладает способностью транспортировать ионы Са2+ через мембраны мышечных и нервных клеток [5, 20, 21]. У растений на замыкающих клетках устьиц выявлено, что при передаче сигнала АБК изменение активности фосфолипазы Д (ФлД) сопровождается повышением уровня ионов Са2+ в цитоплазме [12].

*Ра6ота выполнена при финансовой поддержке ШТАБ (грант 01-0602), РФФИ (гранта № 05-04-49619), «Университеты России» 07.01.329.

© О. В. Воронина, О. В. Танкелюн, Я. Мартинец, С. С. Медведев, 2006

Можно предположить, что изменения уровня ФК как продукта активности ФлД и уровня ионов Са2+ являются последовательными в едином сигнальном пути.

Задача настоящей работы заключалась в анализе ионофорных функций ФК как одного из механизмов транспорта ионов Са2+ и Mg2+ через мембраны растительных клеток.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служили 4-суточные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.), гибрид F1 Нарт 150. В работе были использованы отрезки корней и колеоптилей с удаленными апексами длиной 20 и 10 мм соответственно.

Везикулярные мембранные препараты плазмалеммы и эндомембран получали с использованием методов дифференциального центрифугирования с последующим разделением общей мик-росомальной фракции в двухфазной водно-полимерной системе декстран-полиэтиленгликоль (при выделении плазмалеммы) [13] и в градиенте плотности сахарозы (при выделении фракции эндомембран, включающей тонопласт и эндоплазматический ретикулум) [1].

Растительную ткань (из расчета 6 г на вариант) растирали в ступке при температуре 5 °С в 12 мл среды, содержащей 50 мМ Трис-HCI буфера ( рН 7.8), 0.25 М сахарозы (корни) или 0.4 М сахарозы (наземные части растений), 5 мМ ЭДТА, 15 мМ аскорбиновой кислоты. Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 8000 g и 13000 g 5 и 10 мин соответственно. Общую микросо-мальную фракцию получали при центрифугировании супернатанта при 95 000 g 1 ч.

Для получения фракции эндомебран осадок ресуспендировали с помощью стеклянного гомогенизатора в среде: 5 мМ Трис-Mes (рН 7.2), 0.25 М сахароза, 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ). Суспензию наслаивали на 2-слойный градиент плотности сахарозы (1.05 и 1.12 г/с.м3), приготовленный на буферном растворе, содержащем 5 мМ Трис-Mes (рН 7.2), 1 мМ ДТТ и центрифугировали при 95 000 g 2 ч. С границы слоев сахарозы с помощью пастеровской пипетки собирали фракцию эндомембран, включающую фрагменты тонопласта и эндоплазматического ретикулума. Мембранный препарат разбавляли раствором 0.3 М сахарозы в 5 мМ Трис-Mes -буфере (рН 7.2) с 1 мМ ДТТ и осаждали при 95 000 g 1 ч.

Для получения фракции плазмалеммы микросомальный осадок ресуспендировали в 5 мл среды, содержащей 0.33 М сахарозы, 3 мМ КС], 5 мМ КН2РОуКОН-буфер (рН 7.8). Его объединяли с фазовой системой, включающей декстран Т500, полиэтилен гликолем (ПЭГ) 3350, 5 мМ КН2Р04/К0Н (рН 7.8), 3 мМ КС1, 0.33 М сахарозы (конечная концентрация декстрана и ПЭГ после смешивания всех компонентов составляла 6,2%). Разделение фаз достигалось центрифугированием 5 мин при 1500 g. Верхнюю фазу, обогащенную ПЭГ и содержащую фрагменты плазматической мембраны, отделяли и смешивали с новой порцией декстрановой фазы. Очистку фракции плазмалеммы проводили два раза. После очистки верхнюю фазу смешивали с 3 объемами среды: 0.3 М сахароза, 10 мМ Трис-Mes (рН 7.2) 1 мМ ДТТ. Плазматические мембраны осаждали центрифугированием при 95 000 g 1 ч.

Транспорт кальция в везикулярных фракциях изучали спектрофлуорометрически с использованием специфического Са- чувствительного зонда индо-1 и Ca2"(Mg2i)-4yBCTBm^ibHoro зонда хлортет-рациклина (ХТЦ).

Зонд индо-1 загружали во внутреннее пространство везикул при помощи осмотического шока [1]. Осадки плазмалеммы и эндомембран ресуспендировали в среде следующего состава: 10 мкМ индо-1, 100 мкМ ЭГГА, 150 мМ K2S04, 150 мМ сахарозы, 2 мМ Трис-Mes (рН 8.0), 1 мМ ДТТ; затем переосаждали и ресуспендировали в 200 мкл той же среды, но без зонда и ЭГТА. Мембранный препарат (10-20 мкг белка) с загруженным зондом вносили в инкубационную среду следующего состава: 150 мМ Na2S04, 150 мМ сахарозы, 2 мМ Трис-Mes (рН 7.2), 200 мкМ ЭГТА. Интенсивность флуоресценции индо-1 (длина волны возбуждения 334 нм, флуоресценции 405 нм) регистрировали с использованием флуоресцентного спектрофотометра и программы Сагу Eclipse (Австралия, 2000 г.).

Концентрацию ионов Са2^ в инкубационной среде рассчитывали по компьютерной программе WinMaxc [18]. Концентрации ионов Са2" внутри везикул [Са]вга рассчитывали по величине флуоресцентных ответов индо-1 по формуле:

[Ca\erKd{F-Fm J/CF^-f). где Kd - константа диссоциации комплекса индо-1- Са (230 нМ), Fmin и Fmax - минимальные и

максимальные флуоресцентные ответы индо-1, полученные при калибровке; F - величина флуоресцентного ответа в эксперименте [23].

Зонд ХТЦ (70 мкМ) вносили непосредственно в среду инкубации (состав указан выше). Изменения флуоресценции ХТЦ регистрировали при длине волны возбуждения - 470 нм, флуоресценции - 521 нм с помощью флуоресцентного спектрофотометра и программы Сагу Eclipse (Австралия, 2000 г.).

Содержание белка в мембранных препаратах определяли по методу Bradford [10].

Препарат ФК растворяли в смеси хлороформ/метанол (2:1), упаривали под струей азота, затем добавляли бидистиллированную воду и проводили обработку ультразвуком с использованием Bioblock 72442 scientific vibra cell (USA) до образования прозрачной эмульсии.

Реактивы: ЭГТА, Mes, аскорбиновая кислота, индо-1, натриевые соли фосфатидной кислоты, А-23187, декстран Т500, полиэтиленгликоль 3350 - («Sigma» США), Трис, ДТТ («Reanal», Венгрия), сахароза, ХТЦ, ЭДТА и другие реактивы российского производства («Реахим») (квалификации х. ч.).

Для каждого представленного варианта проведено не менее пяти независимых экспериментов. На рисунках изображены характерные кривые изменения флуоресценции зондов, а также приведены средние арифметические значения. В работе обсуждаются только результаты, достоверные при р> 95%.

Результаты и обсуждение. ФК является одним из ключевых метаболитов липидно-го обмена. Основной способ ее биосинтеза - последовательное ацилирование глицерофосфата и дигидроксиацетонфосфага [9, 24]. ФК также является продуктом активности фосфолипазы Д, катализирующей гидролиз фосфолипидов мембран, таких как фос-фатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. ФК может образовываться при фосфорилировании диацилглицерида - одного из продуктов фосфолипазы С (ФлС) [16, 24]. Образующиеся молекулы ФК будут иметь различный жирнокислотный состав, поскольку субстратами для липаз служат разные фосфолипиды.

Анализу подвергали везикулы плазмалеммы и эндомембран, обладающие низкой пассивной проницаемостью для ионов кальция, что позволяло регистрировать потоки ионов Са2+. Целостность мембранных везикул и их проницаемость для ионов кальция проверяли по отработанной ранее схеме [7].

Зонд индо-1, загруженный в везикулы, позволял регистрировать изменения концентрации ионов Са2+ внутри везикул. Из рисунка 1 (А, Б) видно, что ФК (выделенная из яичного желтка), добавленная в инкубационную среду, не оказывала влияния на изменение интенсивности флуоресценции зонда индо-1 внутри везикул плазмалеммы или эндомембран. Однако если добавить ионы Са2+ (5-100 мкМ), то наблюдается усиление флуоресценции зонда индо-1. Это свидетельствует о поступлении ионов Са2+ внутрь везикул плазмалеммы или эндомембран. Аналогичные результаты были получены в опытах с везикулами плазмалеммы и эндомембран, выделенных из колеопти-лей проростков кукурузы. При изменении порядка обработки везикул - вначале в среду вносились ионы кальция, а затем ФК - также наблюдалось увеличение флуоресценции зонда, загруженного внутрь везикул рис. 1 (В, Г). Флуоресцентные эффекты зонда индо-1 усиливались при увеличении концентрации Са2+ (5-500 мкМ) в инкубационной среде. Полученные результаты указывают на то, что ФК инициировала поступление ионов Са2+ внутрь везикул плазмалеммы или эндомембран но градиенту концентрации, т. е. функционировала, как кальциевый ионофор.

Хорошо известно, что все фосфолипиды, в том числе и ФК, в водном растворе способны самопроизвольно агрегировать, образуя липидные мицеллы [2]. Не исключено, что в экспериментах индукция кальциевой проницаемости происходит за.счет встраивания мицелл ФК в мембранные везикулы плазмалеммы и эндомембран.

О 5 10 15 О 5 10 15

Время, мин Время, мин

Рис. 1. Влияние ФК на кальциевую проницаемость везикул плазмалеммы (ПМ) (Л, В) и эндо-мембран (ЭМ) (Б. Г), загруженных зондом индо-1, из корней проростков кукурузы. Л, Б - в инкубационную среду, содержащую везикулы, вначале вносили ФК, а затем ионы Са2+; В, Г - обработка везикул ФК проводилась после внесения в среду ионов Са~\

^утШМт *— са 50цм

ЙОД ,— хтц \

ПМ

2 3

Время, мин

Рис. 2. Индукция кальциевой проницаемости ФК в везикулах плазмалеммы (ПМ), выделенных из корней проростков кукурузы, регистрируемая с помощью флуоресцентного зонда ХТЦ.

Индикатор ионов Са2+ - ХТЦ отличается от других зондов тем, что с его помощью измеряют не свободные, а связанные с клеточными органеллами ионы кальция [3,5]. Флуоресценция этого хелатора двухвалентных катионов существенно возрастает при увеличении уровня ионов, ассоциированных с мембранами, т. е. при образовании тройного комплекса кальций-ХТЦ-мембрана. Причем с помощью ХТЦ измеряют кальций, связанный не с мембранными белками, а находящийся в липидной фазе в равновесии с водной фазой. Регистрируя флуоресценцию образующегося комплекса, можно оценивать интенсивность потока ионов кальция через мембраны.

На рис. 2 показан результат эксперимента, в котором действие ФК на кальциевую проницаемость везикул плазмалеммы оценивалось с помощью флуоресцентного зонда ХТЦ. Можно видеть, что внесение ионов Са2+ и ФК в инкубационную среду, содержащую везикулы плазмалеммы, а также ХТЦ, вызывало усиление флуоресценции зонда.

Если ФК способна переносить ионы кальция через мембраны, т. е. обладает функцией кальциевого ионофора, то она может участвовать в системе кальциевой сигнализации, инициируя транспорт ионов Са2+ по градиенту концентрации в цитоплазму, и тем самым активируя Са-регулируемые процессы.

Я 25

и

щ

\о

ФК

Рис. 3. Влияние различных ФК на транспорт ионов Са2+ через мембраны везикул плазмалеммы (ПМ) и эндомембран (ЭМ).

Для регистрации транспорта ионов использовали зонд индо-1.

В описанных выше экспериментах использовали фосфатидную кислоту, экстрагированную из яичного желтка, и, предположительно, содержащую насыщенную и ненасыщенную жирные кислоты.

В экспериментах величины флуоресцентных ответов зависели от количества мембранного препарата, концентрации ионов кальция и ФК в инкубационной среде. Величина флуоресцентного ответа может зависеть не только от названных факторов, но и от степени насыщенности жирных кислот (ЖК), входящих в состав ФК. Поэтому в после-

дующих анализах было использовано несколько ФК, отличных по жирнокислотному составу. Анализировали три фосфатидные кислоты; 1) ФК, выделенную из яичного желтка, в состав которой входят насыщенная и ненасыщенная ЖК; 2) ФК, содержащая две пальмитиновые ЖК; 3) ФК, содержащую олеиновые ЖК. На рис. 3 показаны различия в изменениях флуоресценции зонда индо-1, свидетельствующие о поступлении ионов кальция внутрь везикул, как плазмалеммы, так и эндомембран при использовании различных форм ФК.

На везикулах, полученных из плазмалеммы, наибольший флуоресцентный ответ зонда наблюдался при добавлении ФК (содержащей олеиновые ЖК) в инкубационную среду с ионами Са2+. На везикулах эндомембран эффект оказывала как ФК (содержащая олеиновые ЖК), так и ФК (содержащая пальмитиновые ЖК).

Следует отметить, что условия проведения экспериментов соответствуют оптимальным условиям рН цитоплазмы (рН 7.2). Из литературных данных известно, что действие полярных фосфолипидов, к которым относится фосфатидная кислота [2], зависит от рН среды. Таким образом, было рассмотрено влияние ФК, как Са2+ ионофора, при различных значениях рН инкубационной среды. Для более точного определения потоков ионов Са2+ с помощью ФК внутрь везикул при изменении рН среды использовали зонд ХТЦ. Изменение флуоресценции зонда ХТЦ, в отличие от зонда индо-1, не зависит от изменений рН инкубационной среды.

о

о. 5

\о

К

50

45

40-!

35

30

л 2 25-ь >

Эо 20 -а

3 15 х

£ ю

5 -

ФК

пФК

нФК

60

50

40

5 хЗ 30

20

10

х

5

рН 8,0

рН 7,0

рН 6,0

Рис. 4. Индукция потоков ионов Са2+ с помощью ФК внутрь везикул плазмалеммы (ГШ) (Л) и эндомембран (ЭМ) (Б) при различных значениях рН инкубационной среды.

Для регистрации транспорта ионов использовали зонд ХТЦ.

Сравнение изменений интенсивности флуоресценции зонда ХТЦ при добавлении различных ФК в инкубационную среду различной кислотности с ионами Са2+ показало, что максимальный эффект наблюдался при рН 8.0 (рис. 4). Это было характерно для всех используемых ФК. Таким образом, свойства ФК как ионофора ионов Са2+ зависят от рН. Кроме того, повторился результат, при котором наибольшее влияние на транспорт ионов Са2+ оказывала ФК, в состав которой входили олеиновые ЖК.

Известно, что транспортные функции ФК в мембране определяются ее липофиль-ностью и фосфатной группой с двумя гидроксильными остатками (рК, - 3.5, рК2 - 9.0) [11]. Диссоциация гидроксильных групп ФК и ее способности связываться с ионами зависит от рН, что было показано в экспериментах (см. рис. 4). В условиях рН 8.0 происходила диссоциация обеих гидроксильных групп с образованием двух отрицательных зарядов на остатке фосфорной кислоты. В этом случае ФК присоединяла ионы кальция и переносила их по градиенту концентрации через мембрану. При рН 6.0 наблюдались слабые свечения зонда, что свидетельствовало о частичной диссоциации групп ФК и транспорте ионов Са2+ в небольших количествах.

Физиологическое значение свойства ФК связывать ионы Са2+ может включать два аспекта: во-первых, она обеспечивает повышение проницаемости мембран для ионов Са+2,

А

я я я ж

Щ

я

о и «

8- 2 а

и 7 о о К 2 И

к

о

5 н ж 5

35 п

30 25 20 15 10

ФК

одФК

аФК

рН 8,0

рН 7,0

Б

рН 6,0

8 а я

о Я

о §• §

45

40 35 30

о а

' 3 25

\о

л а 20

§2 15 к я

о

10

рН 8,0

рН 7,0

рН 6,0

Рис. 5. Влияние различных ФК на транспорт ионов М§2+ через мембраны везикул плазма-леммы (ПМ) (А) и эндо-мембран (ЭМ) (Б) при различных значениях рН инкубационной среды. Для регистрации транспорта ионов использовали зонд ХТЦ.

а во-вторых, изменение количества ионов Са2+, связанных с липидами мембран, будет оказывать влияние на мембранные белки [16].

Чтобы проверить специфичность действия ФК, в инкубационную среду вместо ионов кальция добавляли ионы магния (рис. 5). Как.можно видеть на рис. 5, действие ФК в отношении двухвалентных катионов неспецифично. ФК способна транспортировать не только ионы кальция, но и ионы магния. Однако флуоресцентные ответы ХТЦ на ионы Mg2+ в присутствии ФК ниже. Действие ФК, различных по жирнокислотному составу, не одинаково. Четкой зависимости влияния рН среды на свойства ФК транспортировать ионы Mg2+ не наблюдалось.

Таким образом, в опытах, выполненных на везикулах плазмалеммы и эндомембран корней и колеоптилей кукурузы, получены результаты, которые свидетельствуют о способности ФК, отличающихся по жирнокислотному составу, оказывать прямое влияние на уровень ионов Са2+ и Mg2+ в цитоплазме, облегчая его перемещение в цитоплазму из внутриклеточных компартментов и апоПласта по градиенту концентрации.

Авторы выражают благодарность за техническую помощь при проведении ряда экспериментов в ходе выполнения работы А. Ю. Батову (Санкт-Петербургский Государственный Университет) и Ольге Штайнртовой (О. Stainrtova, Институт экспериментальной ботаники АН Чехии).

Summary

Voronina О. V., Tankelyun О. V., Martinecj., Medvedev S. S. Phosphatidic acids can transport Ca2+ ions and Mg2, ions through membranes of plant cells.

The action of phosphatidic acids (PA) with different composition (dioleoyl, dipalmitoyl, from egg yolk) on membrane transport of Ca2+, Mg2+ using vesicles from maize (Zea mays L.) roots and coleoptiles is investigated. PA induced Ca2+ and Mg2+ entry into the vesicles along its concentration gradient. Effects of PAs depended on pH and fatty acid composition of PA.

Литература

1. Батов А. Ю., Юрконене С. В., Маркова И. В., Мошков А. В., Медведев С. С., Макашов Г. Б. Определение содержания ионов кальция с помощью флуоресцентного зонда индо-1 в везикулах плазмалеммы, выделенных из растительных клеток // Физиология растений. 1995. Т. 42. С. 144— 148. 2. Теннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М., 1997. 3. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М., 1989 4. Кабачев-ская Е. М., Ляхнович Г. В., Волотовский И. Д. Регуляция активности фосфолипазы D в проростках овса светом и фитогормонами // Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 855-859. 5. Левицкий Д. О. Кальций и биологические мембраны. М., 1990.6. Медведев С. С. Кальциевая сигнальная система растений // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 282-305. 7. Медведев С. С., Танкелюн О. В., Батов А. Ю., Воронина О. В., Мартиней Я., Махачкова И. Ионофорные функции фосфатидной кислоты в растительной клетке // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 45-53.8. Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений. М., 2002.9. Athenstaedt К., Daum G. Phosphatidic acid, a key intermediate in lipid metabolism // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 266. P. 1 — 16.10. BradfordM. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P.115-143.11. EiblH., BlumeA. The influence of charge on phosphatidic acid bilayer membranes // Biochem. Biophys. Acta. 1973. Vol. 553. P. 476-488. 12.Jacob Т., Ritchie 5., Assmann S. M., Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in guard cells is mediated by phospholipase D // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1999. Vol.96. P. 12192-12197. 13. Larsson Ch„ Sommarin M., Widell S. Isolation of highly purifed plant plasma membranes and separation of inside-out and right-side out vesicles // Methods in Enzymology. 1994. Vol. 228. P. 451-469.14. LaxaltA. M„ Munnik T. Phospholipid signalling in plant defence // Current Opinion in Plant Biology. 2002. Vol. 5. P. 332-338.15. Lee 5., HirtH., Lee Y. Phosphatidic acid activates a wound-activated МАРК in Glicine

max // Plant.}. 2001. Vol. 26. P. 479-486. 16. Munnik T. Phosphatidic asid: an emerging plant lipid second messenger//Trends in Plant Sci. 2001. Vol. 6. P. 227-233.17. Munnik T.,Irvine R.F., MusgraveA. Phospholipid signalling in plants // Biochem. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1389. P. 222-272. 18. Patton Ch„ Thompson S., Epel D. Some precautions in using chelators to buffer metals in biological solutions /' / Cell Calcium. 2004. Vol. 35. P. 427-431.19. Potocky M„ Elias M., Profotova B„ Novotna Z, Valentova O., Zarsky V. Phosphatidic acid produced by phospholipase D is required for tobacco pollen tube growth // Planta. 2003. Vol. 217. P. 122-130. 20. Putney J. W.Jr, Weiss S. J., Van De Walle C.M., Raymond A. Haddas R. A. Is phosphatidic acid a calcium ionophore under neurohumoral control? // Nature. 1980. Vol. 284, P. 345-347. 21. Salmon D. M., Honeyman T. W. Proposed mechanism of cholinergic action in smooth muscle .//Nature. 1980. Vol. 284. P. 344-345.22. Sang K, Cui D„ WangX. Phospholipase D and phosphatidic acid-mediated generation of superoxide in Arabidopsis // Plant Physiol. 2001. Vol. 126. P. 1449-1458.23. Simpson AAV. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: Basic practical considerations Calcium Signaling Protocols // Methods in Molecul. Biology. Vol. 114. New Jersey, 1999. P. 3-30. 24. Somerville C., Browse J., Jaworski J. G., Ohlrogge J. B. Lipids // Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Ch. 10. 2000. P. 456-527, 25. WangX. Lipid signaling // Current Opinion in Plant Biol. 2004. Vol. 7. P. 329-336. 26. Wang X. Plant phospholipases // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. Vol. 52. P. 211-231. 27. WangX. Phospholipase D in hormonal and stress signaling// Current Opinion in Plant Biol. 2002. Vol. 5. P. 408-414.

Статья принята к печати 2 октября 2006 г.