Выделение и культивирование миофибробластов печени крыс методом эксплантации

Выделение и культивирование миофибробластов печени крыс методом эксплантации

О. Миянович 1, А.К. Шафигуллина 2, А.А. Ризванов 1, А.П. Киясов 12

1 Казанский (Приволжский) Федеральный университет, Казань

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань

Isolation and cultivation of myofibroblasts from rats' liver using explantation method

О. Mijanovic 1, А.К. Shafigullina 2, А.А. Rizvanov1, A.P. Kiasov1-2

1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan

2 Kazan Sate Medical University, Kazan

При развитии фиброза печени источником соединительной ткани являются миофибробласты, происходящие из двух популяций клеток печени: звёздчатых клеток печени и портальных фибробластов. Маркёром миофибробластов является экспрессия а-гладкомышечного актина (а^МА). Отличительным признаком миофибробластов, происходящих из звёздчатых клеток печени, является сохранение экспрессии маркёра звёздчатых клеток — десмина. Процесс активации, пролиферации и трансдифференцировки клеток в миофибробласты находится в тесной зависимости от активности транскрипционного фактора NF-kB и его ингибитора 1кВа. Целью нашей работы было получение культуры миофибробластов печени, изучение их происхождения, фенотипа, связи экспрессии ^-кВ и 1кВа с процессами активации и трансдифференцировки звёздчатых клеток печени в миофибробласты. Для этого методом эксплантации мы выделили гетерогенную популяцию клеток печени крысы. Практически все полученные нами клетки экспрессировали десмин и а^МА. На основании этого мы предполагаем, что полученная нами культура миофибробластов являлась производной звёздчатых клеток печени, а единичные десмин-отрицательные клетки — производными портальных фибробластов. Таким образом, звёздчатые клетки печени обладают большим потенциалом к активации, росту, пролиферации и трансдифференцировке в миофибробласты по сравнению с портальными фибробластами. Подтверждением активированного состояния клеток явилась устойчивая экспрессия NF-kB и его ингибитора 1кВа во всех клетках на протяжении всего эксперимента.

Ключевые слова: звёздчатые клетки печени, портальные фибробласты, транскрипционный фактор ^-кВ, десмин, а-гладкомышечный актин, ингибитор 1кВа.

Звёздчатые клетки печени (ЗКП, клетки Ито, или перисинусоидальные клетки печени) — одна из самых малоисследованных популяций клеток в печени млекопитающих. Доказано, что они играют ключевую роль в обмене и накоплении витамина А, гистогенезе и регенерации печени [1, 2]. Вследствие их высокой биосинтетической активности и способности транс-дифференцироваться в миофибробласты, которые синтезируют макромолекулы межклеточного матрикса соединительной ткани, ЗКП считали главными «виновниками» развития цирроза и фиброза печени [3]. Однако в последнее время появляется всё больше данных о том, что, помимо ЗКП, источником миофибробластов могут являться фибробласты портальных трактов, или портальные фибробласты (ПФ). Таким образом, на сегодняшний день обе эти популяции клеток, ЗКП и ПФ, рассматриваются как

e-mail: kiassov@mail.ru

During liver fibrosis development connective tissue is produced by myofibroblasts that could originate from two hepatic populations: hepatic stellate cells and portal fibroblasts. A marker of myofibroblasts is the expression of a-smooth muscle actin (a-SMA). Distinctive feature of myofibroblasts, derived from hepatic stellate cells, is the preservation of the hepatic stellate cells marker expression — desmin. The processes of activation, proliferation and cells trans-differentiation into myofibroblasts are closely related to the activity of transcription factor NF-kB and its inhibitor IkBa. The aim of our work was to obtain a culture of hepatic myofibrobasts, to study their origin, phenotype, relations between NF-kB and IkBa expression and the processes of activation and cells trans-differentiation into myofibroblasts. For this purpose we isolated heterogeneous population of cells from rat liver by the method of explantation. Almost all the cells had desmin and a-SMA expression. On this basis, we suppose that these myofibroblasts were hepatic stellate cells derivatives, and singular desmin-negative cells originated from portal fibroblasts. Thus, hepatic stellate cells have major potential to activation, growth, proliferation and transdifferentiation into myofibroblasts in comparison to portal fibroblasts. Activated state of the cells was confirmed by stable expression of NF-kB and its inhibitor IkBa in all the cells throughout the whole experiment.

Key words: hepatic stellate cells, portal fibroblasts, transcription factor NF-kB, desmin, a-SMA, inhibitor IkBa.

источник миофибробластов и соединительной ткани при фиброзе печени [4]. Общепринятым маркёром миофибробластов является a-гладкомышечный актин (a-SMA). Отличительным признаком миофибробластов, происходящих из ЗКП, является сохранение в цитоскелете миофибробластов десмина — одного из компонентов цитоскелета ЗКП.

Процесс активации, трансформации клеток в мио-фибробласты, а также защиты клеток от апоптоза регулируется транскрипционным фактором NF-kB. Предполагают, что ингибирование данного фактора позволит запустить апоптоз активированных ЗКП и ПФ и предотвратить последующее отложение миофи-бробластами соединительной ткани в печени [5, 6].

Миофибробласты в условиях in vitro можно получить при культивировании ЗКП. При этом трансформация ЗКП в миофибробласты происходит на

5—7 сут. культивирования. Общепринятый метод выделения ЗКП — коллагеназо-проназная перфузия печени с последующим разделением в градиенте плотности гистоденза — позволяет получить не все клетки, а лишь часть клеточной популяции, в цитоплазме которых есть жировые капли с витамином А [7]. Методов же выделения ЗКП, не содержащих в своей цитоплазме витамина А и находящихся на стадии миофибробластов, не разработано. Мы предполагаем, что методом получения миофибробластов для моделирования активации ЗКП и ПФ может быть эксплантационная культура, в которой клетки с высокой биосинтетической активностью мигрируют из кусочков тканей in vitro с образованием монослой-ной культуры [8].

Исходя из этого, целью нашей работы было получение культуры миофибробластов печени методом эксплантации, изучение происхождения и фенотипа миофибробластов, связи экспрессии NF-kB и IkBa с процессами активации и трансдифференцировки клеток в миофибробласты.

Материал и методы

Проводили эксплантацию печени здоровых четырёхдневных новорожденных крысят (Rattus norvegicus, линия Wistar, Питомник лабораторных

Антитела, использованные в работе

животных «ПУЩИНО»). Удаляли капсулу, в каждой доле печени выделяли краевую, среднюю части и область ворот. Далее каждую часть измельчали стерильным скальпелем и кусочки органа помещали в 6- и 12-луночные планшеты, культивировали с питательной средой DMEM (Dulbecco's modified essential meidium, ПанЭко) с добавлением смеси пенициллин-стрептомицина (ПанЭко), 10% сыворотки крови плодов коровы (ПанЭко) в инкубаторе при 37оС во влажной атмосфере с содержанием 5% СО2. На 3 сут. кусочки печени убирали, фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов было проведено методом меченых полимеров (Novolink, США) с применением антител к десмину и a-SMA (Dako, США). Фенотип клеток изучали методом имму-ноцитохимического окрашивания с антителами, приведёнными в таблице. Анализ препаратов проводили на микроскопе AxioOberver.ZI (Carl Zeiss, Германия). Подтверждение экспрессии a-SMA, NF-kB и IkBa было проведено методом иммуноблот-тинга. Для этого в лунке геля наносили лизат клеток собранных на 3, 5, 7 и 12 сут. В качестве контроля при иммуноблоттинге использовали антитела к ß-актину. Визуализацию иммунного преципитата

Антиген Фирма-производитель, номер каталога, разведение

Десмин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мышечных клеток, маркёр звёздчатых клеток печени Dako, M076001, 1:30

a-SMA - альфа-гладкомышечный актин, маркёр миофибробластов, гладкомышечных клеток Dako, M0851, 1:50

C-kit (CD117) - рецептор к фактору стволовых клеток, маркёр стволовых и прогениторных клеток Novocastra, NCL-L-CD117, 1:400

Цитокератин 18 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (гепатоциты, холангиоциты) Dako, M7010, 1:20

Цитокератин 19 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (холангиоциты, гепатобласты, овальные клетки) Dako, M0888, 1:20

NF-kBp65 - ядерный фактор «каппа-би», универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла Santa Cruse, sc:372, иммуноцитохимия 1:50, иммуноблоттинг 1:500

IkBa - ингибиторный белок ядерного фактора NF-kB Santa Cruse, sc:371, 1:50

MMP-9 - Матричная металлопротеиназа 9, один из ферментов, участвующих в ремоделинге структур внеклеточного матрикса Abcam, ab:7299, 1:50

MMP-3 - деградирует коллаген типа II, III, IV, IX и X, протеогликаны, фибронектин, ламинин и эластин. Кроме того, MMP-3 также может активировать другие MMP, такие как MMP-1, MMP-7, и ММП-9 Santa Cruse, sc:6839, 1:50

Каспаза-7 - играет центральную роль в реализации клеточного апоптоза Santa Cruse,sc:6138, 1:50

Альбумин-маркёр дифференцированных гепатоцитов Santa Cruse,sc:50536, 1:50

a-фетопротеин - секреторный протеин гепатобластов Santa Cruse,sc:8108, 1:50

CD45 - маркёр клеток крови (лейкоцитов) Santa Cruse,sc:25590 1:50

р-актин-участие в клеточной подвижности, её структуре и целостности Sigma Aldrich, Mab-A2228, 1:2000

проводили с помощью набора для хемилюминес-центной детекции белка Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Bio-Sciences AB, #RPN2232). Детекцию люминесценции проводили на приборе ChemiDoc™ XRS + System (Bio-Rad, Сингапур).

Результаты и обсуждение

На 3 сут. мы наблюдали миграцию клеток из культивируемых кусочков печени (рис. 1А). При этом отличий между ростом клеток из различных участков печени отмечено не было. Морфология клеток напоминала морфологию ЗКП и миофиброблас-тов — крупные клетки с многочисленными отростками (рис. 1Б) Фенотип полученных клеток исследовали на 3, 5, 7 и 12 сут. методом иммуноцитохимическо-го окрашивания на десмин, a-SMA, С-kit, СК-18 (Е),

Рис. 1. Культуры клеток из фрагментов печени крысы: А - в процессе выделения клеток из фрагментов печени, 3 сут.; Б - монослой миофибробластов, 12 сут. культивирования; В - экспрессия десмина, 3 сут.;

Г -экспрессия a-SMA, 7 сут.; Д - экспрессия с-КИ,

7 сут.; Е -экспрессия цитокератина-18, 7 сут.;

Ё -экспрессия ^-кВ, изоформа р65, 12 сут.;

Ж -экспрессия 1кВа, 7 сут. Ув.: А, Б х 10;

В-Ж х40; Е х20

СК-19 ,^-кВ, ІкВа, Сй45, альбумин, а-фетопротеин, каспазу-7, матричную металлопротеиназу-3 и матричную металлопротеиназу-9. При исследовании фенотипа была показана устойчивая экспрессия маркёра ЗКП крыс десмина (рис. 1В) на всех сроках эксперимента, что позволяет нам предположить, что мигрировавшие клетки были преимущественно ЗКП, лишь единичные десмин-отрицательные клетки могли быть ПФ. Динамика экспрессии а^МА постепенно нарастала, что свидетельствовало о постепенной трансформации выделенных клеток в миофибробла-сты (рис. 1Г). На всех сроках была отмечена высокая экспрессия С-кії — маркёра прогениторных и стволовых клеток (рис. 1Д). Экспрессии цитокератина 18 (рис. 1Е) не было выявлено, что позволяет утверждать, что полученные клетки были не эпителиального происхождения. О высокой активности клеток можно было судить по иммуноцитохимическому окрашиванию культуры клеток антителами к ^-кВ (рис. 1Ё) и ІкВа (рис. 1Ж), для которых были отмечены устойчивый ядерный и цитоплазматический паттерн экспрессии во всех клетках и на протяжении всего эксперимента. Экспрессия преимущественно в ядре указывает на постоянную активацию траскрипционого фактора. Экспрессии маркёра гемопоэтических клеток Сй45 выявлено не было, что свидетельствовало об отсутствии клеток крови в исследуемой культуре. Отсутствие экспрессии альбумина и а-фетопротеина было показателем того, что полученные клетки не были зрелыми гепатоцитами. Отсутствие экспрессии матриксной металлопротеиназы-3 и каспазы-7 свидетельствовало о том, что клетки активно пролиферировали и не вступили в апоптоз. Подтверждение экспрессии белков NF-kB, ІкВа и а^МА проводили с помощью иммуноблоттинга (рис. 2). Наблюдалось снижение уровня экспрессии NF-kB и ІкВа на 12 сут. культвирования. В то же время наблюдалось увеличение уровня экспрессии а^МА, что свидетельствует о трансдифференцировке клеток в миофибробласты.

М

5

7

12

х,-ГМА

IkBc

NF-kB

р-актин

Рис. 2. Иммуноблоттинг белков клеточного лизата, полученного из эксплантационных культур клеток на разных сроках культивирования:

М - маркер молекулярного веса белков;

5, 7,12 - продолжительность культивирования клеток in vitro, сут.

При проведении иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов фрагментов печени на 3 сут. после культивирования in vitro мы наблюдали некротические изменения в центре фрагмента, тогда как по периферии ткани было отмечено большое количество десмин-позитивных ЗКП. При окрашивании срезов на a-SMA положительную реакцию демонстрировали только единичные клетки сосудов. Таким образом, при эксплантации клеток печени происходит преимущественно активация и выселение ЗКП, а не ПФ (рис. 3).

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы. Метод эксплантации позволяет получить культуру миофибробластов печени крысы. Наблюдаемый in vitro процесс активации напоминает изменения, происходящие с ЗКП и ПФ в естественных условиях при фиброзе печени [9]. Анализируя фенотип полученных клеток можно утверждать, что полученные миофибробласты являются следствием трансдифференцировки преимущественно ЗКП, а не ПФ. Для полученной культуры миофибробластов была характерна высокая активность транскрипционного фактора NF-kB и его ингибитора IkBa. Таким образом, модель эксплантации клеток печени может быть использована при получении миофибробластов печени для проведения последующих экспериментов по ингибированию NF-kB и исследованию процессов, приводящих к фиброзу печени. Понимание происхождения и биологии мио-фибробластов открывает новые возможности для поиска противофиброзной терапии.

Благодарности

Работа частично поддержана грантом Российского Фонда Фундаментальных Исследований 12-04-97088-р_поволжье_а. Работа частично выполнена на оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

Рис. 3. Печень крысы. Иммуногистохимическая реакция с антителами к десмину на 3 сут. инкубирования in vitro. Ув.: х40

ЛИТЕРАТУРА:

1. Gumerova A., Abdulkhakov S. Cell sources of liver development and regeneration. Saarbrucken: LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH &Co.KG; 2012.

2. Гумерова А.А. Киясов А.П. Могут ли перисинусоидальные клетки быть региональными стволовыми [прогениторными] клетками печени? Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; 5(1): 33-40.

3. Ramadori G., Saile B. Mesenchymal cells in the liver - one cell type or two? Liver 2002; 22(4): 283-94.

4. Iwaisako K., Brenner D.A., Kisseleva T. What's new in liver fibrosis? The origin of myofibroblasts in liver fibrosis. J. Gastroenterol. Hepatol. 2012; 27(Suppl 2): 65-8.

5. Eng F.J., Friedman S.L. Transcriptional regulation in hepatic stellate cells. Semin. Liver Dis. 2001; 21(3): 385-95.

6. Kisseleva T., Brenner D.A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2011; 25(2): 305-17.

7. Knook D.L., Seffelaar A.M., de Leeuw A.M. Fat-storing cells of the rat liver. Their isolation and purification. Exp. Cell Res. 1982; 139(2): 468-71.

8. Bosselut N., Housset C., Marcelo P. et al. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics 2010; 10(5): 1017-28.

9. Knittel T., Kobold D., Saile B. et al. Rat liver myofibroblasts and hepatic stellate cells: different cell populations of the fibroblast lineage with fibrogenic potential. Gastroenterology 1999; 117(5): 1205-21.

Поступила 12.08.2012