КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ЛИГАНД CD40L, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
MAMMALIAN CELLS EXPRESSING CD40L LIGAND AND THEIR APPLICATION

Данная патентная заявка относится к области культивирования B-клеток. В ней описана система культивирования для стимуляции и экспансии кроличьих и человеческих антителосекретирующих клеток, например, активированных B-клеток, плазмобластов и B-клеток, выделенных из организмов иммунизированных кроликов или излечившихся от заболевания людей, в присутствии кроличьих или человеческих фидерных клеток, экспрессирующих CD40L.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно, что человеческие B-клетки, плазмобласты и плазматические клетки различных биологических видов трудно поддаются культивированию in vitro. На практике это затруднение обычно преодолевают, создавая иммортализованные линии B-клеток путем слияния первичных B-клеток с партнером для получения гибридом или путем иммортализации. У кроликов также были получены клетки плазмоцитомы - партнер по слиянию для получения гибридом (Spieker-Polet, Н., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 9348-9352), но гибридомная методика неэффективна для клеток кроликов. Для длительного поддержания кроличьих B-клеток в культуре in vitro необходимы основные активирующие стимулы и факторы, усиливающие жизнеспособность. Для этого используют различные соединения, такие как интерлейкин (IL, от англ. interleukin)-2, IL-4, IL-10 и другие (см., например, Zubler, R., et al., Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363 и J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183).
Физиологическая активация B-клеток происходит при встрече со специфическим антигеном и дополнительной активации, например, опосредованной через путь CD40/CD40L (обзор Neron, S., et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. 59 (2011) 25-40) и/или цитокинами и/или факторами роста природного происхождения, например, производимыми дендритными клетками или Т-клетками.
В системах in vitro взаимодействие CD40/CD40L можно смоделировать при совместном культивировании с клетками тимомы EL4-B5 или добавлении растворимых или иммобилизованных антител, направленных против CD40 или CD40L. Системы, в которых используется клеточная подложка, недостаточно эффективны, их применение описано только в сочетании с дополнительными стимулами, например, с применением различных фидерных смесей (таких как смесь, предложенная Zubler; IL-4, IL-10 и т.д.) (Zubler, R., см. выше) или культурального супернатанта тимоцитов (TSN, от англ. thymocyte supernatant).
Weitkamp, J-H., et al., (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237) описали создание рекомбинантных человеческих моноклональных антител к ротавирусу, которые производят одиночные антиген-специфические B-клетки, отобранные с использованием флуоресцентных вирусоподобных частиц. Способ получения множества изолированных антител, распознающих множество антигенов, описан в US 2006/0051348. В WO 2008/144763 и WO 2008/045140 описаны антитела, направленные против IL-6, и их применение, а также способ культивирования для получения клональной популяции антиген-специфических B-клеток, соответственно. Способ культивирования для получения клональной популяции антиген-специфических B-клеток описан в US 2007/0269868. Masri, et al. (Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106) описали клонирование и экспрессию в E. coli функционального Fab фрагмента, направленного против токсина сибирской язвы, полученного из одного лимфоцита человека. Способ получения библиотек иммуноглобулинов описан в WO 2007/031550.
В WO 2009/10515 описан способ создания гибридных клеток, экспрессирующих необходимые антитела. Высокоаффинные антитела, нейтрализующие энтеротоксин В стафилококка, описаны в WO 2008/085878. Amanna I.J., и Slifka М.К. предложили количественное определение редких популяций B-клеток памяти с применением двух независимых и дополняющих друг друга подходов (J. Immunol. Meth. 317 (2006) 175-185). В WO 2011/052545 описан способ получения популяции антиген-специфических B-клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном документе описан новый способ быстрого, эффективного и воспроизводимого получения кроличьих (или человеческих) антител, в котором взяты за основу кроличьи (или человеческие) B-клетки, включающий по меньшей мере один этап культивирования.
В данном документе также описана фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование кроличьих B-клеток.
В данном документе также описана фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование человеческих B-клеток.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии/совместно с IL-2 и IL-21. В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика, представляют собой клетки яичников китайского хомячка (CHO, от англ. Chinese hamster ovary) или клетки почки новорожденного хомячка (BHK, от англ. baby hamster kidney).
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, в присутствии/совместно с IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека, представляют собой клетки BHK или клетки CHO.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.
Один аспект данного описания представляет собой способ получения кроличьих антител, включающий этап культивирования антителосекретирующих кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости с получением кроличьего антитела.
В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика, представляют собой клетки CHO или клетки BHK.
Один аспект данного описания представляет собой способ получения кроличьего антитела, включающий этап культивирования одной или нескольких антителосекретирующих кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии/совместно с IL-2 и IL-21 и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости с получением кроличьего антитела.
В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика, представляют собой клетки CHO или клетки BHK.
В одном воплощении в начале культивирования добавляют IL-2 и IL-21.
В одном воплощении IL-2 и IL-21 добавляют исключительно в начале культивирования.
В одном воплощении кроличьи B-клетки представляют собой наивные или незрелые кроличьи B-клетки.
+
В одном воплощении B-клетки представляют собой lgG-положительные B-клетки (lgG). lgG-положительные B-клетки имеют на своей поверхности маркер IgG, который можно детектировать и присоединять к нему метку.
Один аспект данного описания представляет собой способ получения человеческих антител, включающий этап культивирования антителосекретирующих человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости, с получением человеческого антитела.
В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека, представляют собой клетки BHK или клетки CHO.
Один аспект данного описания представляет собой способ получения человеческого антитела, включающий этап культивирования антителосекретирующих человеческих B-клеток, и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, в присутствии/совместно с IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости с получением человеческого антитела.
В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, используемые при культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.
В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека, представляют собой клетки BHK или клетки CHO.
В одном воплощении интерлейкины добавляют в начале культивирования.
В одном воплощении интерлейкины добавляют исключительно в начале культивирования.
В одном воплощении человеческие B-клетки представляют собой зрелые человеческие B-клетки.
+
В одном воплощении B-клетки представляют собой lgG-положительные B-клетки (lgG). lgG-положительные B-клетки имеют на своей поверхности маркер IgG, который можно детектировать и присоединять к нему метку.
Один аспект данного описания представляет собой набор, содержащий клетки CHO, экспрессирующие CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21.
Один аспект данного описания представляет собой набор, содержащий клетки BHK, экспрессирующие CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении набор содержит IL-2 и IL-21.
В одном воплощении набор содержит IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины представляют собой человеческие интерлейкины.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования B-клеток, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии IL-2 или IL-21.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования B-клеток, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии IL-2 и IL-21.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток, включающий совместное культивирование кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO или клетки BHK.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования B-клеток, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток, включающий совместное культивирование человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки BHK или клетки CHO.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, применяемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.
Один аспект данного описания представляет собой способ культивирования B-клеток, секретирующих ингибирующие T-клетки соединения, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L.
Один аспект данного описания представляет собой способ культивирования антителосекретирующих B-клеток, включающий в следующем порядке:
i) первое совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора митоза, и
ii) последующее второе совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора продукции антитела.
В одном воплощении первое и второе совместное культивирование осуществляют в том же сосуде для культивирования.
В одном воплощении способ культивирования антителосекретирующих B-клеток включает совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в котором вначале в среду для культивирования добавляют стимулятор митоза, а затем в среду для культивирования добавляют стимулятор продукции антитела.
В одном воплощении стимулятор продукции антитела добавляют по меньшей мере через один час после добавления стимулятора митоза. В одном воплощении стимулятор продукции антитела добавляют через один-три дня после добавления в среду для культивирования стимулятора митоза.
В одном воплощении стимулятор митоза выбран из группы, включающей CD40- и взаимодействующие с CD40L соединения, ICOS- (от англ. inducible T-cell costimulator, индуцибельный ко-стимулятор T-клеток) и взаимодействующие с ICOS-L (от англ. ICOS ligand, лиганд ICOS) соединения, APRIL (от англ. а proliferation-inducing ligand, индуцирующий пролиферацию лиганд), BAFF (B-cell activating factor, активирующий B-клетки фактор), CR2 (от англ. complement receptor type 2, рецептор комплемента 2 типа), CXCL (от англ. chemokine (СХС motif) ligand, хемокиновый лиганд с мотивом CXC) 9, CXCL12 (SDF-1 (от англ. stromal cell-derived factor-1, фактор стромальных клеток 1 типа), CXCL13, CXCL16, Flt-3L (от англ. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand, лиганд Fms-подобной тирозинкиназы), интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-7, интерлейкин-10, интерлейкин-14, интерлейкин-21, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus Aureus Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR, от англ. Toll-like receptors), такие как липополисахарид (LPS, от англ. lipopolysaccharide), различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG (от англ. cytosine phosphate-guanine, цитозинфосфат-гуанин) или резиквимод (R-848), TSLP (от англ. thymic stromal lymphopoietin, лимфопоэтин из стромы тимуса), фактор некроза опухоли (TNF, от англ. tumor necrosis factor) альфа, интерфероны I типа (например, IFN (от англ. interferon) α/β) и интерфероны II типа (например, IFNγ). Активацию B-клеток можно также вызывать при помощи антител, направленных против IgG, CD20 и/или CD27 антител.
В одном воплощении стимулятор продукции антител выбран из группы, включающей CD40- и взаимодействующие с CD40L соединения, ICOS- и взаимодействующие с ICOS-L соединения, APRIL, BAFF, CR2, CXCL9, CXCL12 (SDF-1), CXCL13, CXCL16, Flt-3L, интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-9, интерлейкин-10, интерлейкин-13, интерлейкин-21, интерлейкин-33, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus Aureus Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды TLR, такие как LPS, различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG или резиквимод (R-848), TSLP, фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β), интерфероны II типа (например, IFNγ). Кроме того, стимуляцию B-клеток можно осуществлять при помощи антител, направленных против IgG, CD20 и/или CD27 антител.
В одном воплощении стимулятор митоза добавляют в начале первого совместного культивирования.
В одном воплощении стимулятор митоза добавляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после начала первого совместного культивирования.
В одном воплощении стимулятор продукции антител добавляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после добавления стимулятора митоза.
В одном воплощении каждое совместное культивирование осуществляют в течение 5-14 дней.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в течение общего периода от 5 до 21 дня. В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в течение общего периода от 6 до 14 дней.
В одном воплощении стимулятор митоза удаляют до начала второго совместного культивирования. В одном воплощении удаление осуществляют путем замены надосадочной культуральной жидкости и/или отмывания клеток нейтральной средой.
Один аспект данного описания представляет собой способ получения антитела, которое специфически связывается с антигеном, включающий следующие этапы:
a) совместное культивирование пулированных или одиночных антителосекретирующих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L,
b) выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, и выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, которое специфически связывается с антигеном,
c) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, выделенную на этапе (b), или ее вариант, кодирующий гуманизированную версию вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи, в составе одной или нескольких экспрессионных кассет,
d) выделение антитела из клетки или культуральной среды с получением антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии стимулятора митоза и/или стимулятора продукции антитела.
В одном воплощении способ включает следующие этапы:
a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) B-клеток (полученных из крови экспериментального животного или человека),
b) окрашивание клеток, входящих в популяцию B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),
c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),
d) культивирование одиночных B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, и возможно IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6,
e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду отдельными B-клетками,
f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,
i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом, получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении способ включает следующие этапы:
a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) кроличьих B-клеток,
b) окрашивание клеток, входящих в популяцию кроличьих B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),
c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции кроличьих B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции кроличьих B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),
d) культивирование осажденных кроличьих B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, и IL-2 и IL-21,
e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду кроличьими B-клетками,
f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,
i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении способ включает следующие этапы:
a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) человеческих B-клеток,
b) окрашивание клеток, входящих в популяцию человеческих B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),
c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции человеческих B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции человеческих B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),
d) культивирование осажденных человеческих B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6,
е) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду человеческими B-клетками,
f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеотидной последовательности и таким образом получение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклинального антитела,
g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,
i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, являются человеческими интерлейкинами.
В одном воплощении пул клеток включает приблизительно от 10 B-клеток приблизительно до 1000000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно от 500 B-клеток приблизительно до 100000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно 500 B-клеток.
Один аспект данного описания представляет собой способ получения антитела, которые специфически связывается с антигеном, включающий следующие этапы:
a) совместное культивирование пула антителосекретирующих кроличьих B-клеток или одиночных антителосекретирующих кроличьих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также с IL-2 и IL-21,
b) выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи и выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, которое специфически связывается с антигеном,
c) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, выделенную на этапе b), или ее варианта, кодирующего гуманизированную версию вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи, в составе одной или нескольких экспрессионных кассет,
d) выделение антитела из клетки или культуральной среды и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии стимулятора митоза и/или стимулятора продукции антитела.
В одном воплощении способ включает следующие этапы:
a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) кроличьих B-клеток,
b) окрашивание клеток, входящих в популяцию B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),
c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),
d) культивирование отдельных B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, и возможно IL-2 и IL-21,
e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду отдельными B-клетками,
f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, или ее варианта, кодирующего гуманизированную версию вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,
i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении способ включает следующие этапы:
a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) кроличьих B-клеток,
b) окрашивание клеток, входящих в популяцию кроличьих B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),
c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции кроличьих B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции кроличьих B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),
d) культивирование осажденных кроличьих B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21,
e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду кроличьими B-клетками,
f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,
i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении пул клеток содержит приблизительно от 10 B-клеток приблизительно до 1000000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно от 500 B-клеток приблизительно до 100000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно 500 B-клеток.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, для совместного культивирования антителосекретирующих кроличьих B-клеток.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO.
В одном воплощении CD40L кролика имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, для совместного культивирования антителосекретирующих человеческих B-клеток.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки BHK.
В одном воплощении CD40L человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02.
Один аспект данного описания представляет собой применение SAC для совместного культивирования антителосекретирующих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 для совместного культивирования кроличьих B-клеток.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 для совместного культивирования человеческих B-клеток.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, используемые для совместного культивирования, представляют собой человеческие интерлейкины.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных кроличьих B-клеток или пула кроличьих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении всех аспектов данного описания IL-2 представляет собой либо человеческий IL-2, либо мышиный IL-2, a IL-21 представляет собой либо человеческий IL-21, либо мышиный IL-21.
Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных человеческих B-клеток или пула человеческих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 при совместном культивировании кроличьих B-клеток для улучшения роста клеток.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 при совместном культивировании человеческих B-клеток для улучшения роста клеток.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.
Один аспект данного описания представляет собой способ улучшения роста кроличьих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных кроличьих B-клеток или пула кроличьих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении всех аспектов данного описания IL-2 представляет собой либо человеческий IL-2, либо мышиный IL-2, a IL-21 представляет собой либо человеческий IL-21, либо мышиный IL-21.
Один аспект данного описания представляет собой способ улучшения роста человеческих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных человеческих В- клеток или пула человеческих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.
В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.
Подробное описание изобретения
Объектом данного описания является способный найти широкое применение способ быстрого, эффективного и воспроизводимого получения кроличьих (или человеческих) антител, в котором за основу взяты кроличьи (или человеческие) B-клетки, включающий по меньшей мере один этап культивирования.
Обнаружили, что добавление клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 может улучшить пролиферативные свойства кроличьих B-клеток, т.е. кроличьи B-клетки, в виде одиночных или пулированных клеток, могут расти и достигать высокой плотности клеток быстрее, чем в отсутствие клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21. Таким образом, за короткое время можно добиться высокой плотности кроличьих B-клеток и, соответственно, высоких концентраций IgG в культуральной надосадочной жидкости.
Одним аспектом данного описания являются клетки ОНО, экспрессирующие CD40L кролика.
Одним аспектом данного описания является применение клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика, совместно с IL-2 и IL-21 для совместного культивирования кроличьих B-клеток.
Одним аспектом данного описания является искусственная фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, или другими фидерными клетками для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование B-клеток.
Одним аспектом данного описания являются клетки BHK, экспрессирующие CD40L человека.
Одним аспектом данного описания является применение клеток BHK, экспрессирующих CD40L человека, вместе с IL-2 и/или IL-21 для совместного культивирования человеческих B-клеток.
Одним аспектом данного описания является искусственная фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками BHK, экспрессирующими CD40L человека, или другими фидерными клетками для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование B-клеток.
Способы и методы, известные специалистам в данной области техники, которые могут найти применение в осуществлении данного изобретения, описаны, например, Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).
Определения
"Акцепторные каркасные участки человеческого происхождения" в данном описании представляют собой каркасные участки, содержащие аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL, от англ. variable light) или каркасные участки вариабельного домена тяжелой цепи (VH, от англ. variable heavy), полученные на основе каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных каркасных участков человеческого происхождения, определение которым приведено ниже. Акцепторные каркасные последовательности, "полученные на основе" каркасной последовательности иммуноглобулина человека или консенсусных каркасных участков человека, могут иметь ту же аминокислотную последовательность или иметь аминокислотные замены. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен равно 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях акцепторная последовательность каркасных участков VL идентична последовательности каркасных участков VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасных участков человеческого происхождения.
Антитело, "подвергнутое аффинному созреванию", обозначает антитело, имеющее одну или несколько модификаций в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR, от англ. hypervariable regions) по сравнению с материнским антителом, не имеющим таких модификаций, указанные модификации приводят к повышению аффинности антитела к антигену.
Термин "аминокислота" в данном описании обозначает группу карбокси-альфа-аминокислот, которые непосредственно или в форме предшественника могут кодироваться нуклеиновой кислотой. Индивидуальные аминокислоты кодируются нуклеиновыми кислотами, содержащими три нуклеотида, так называемыми кодонами или триплетами оснований. Каждая аминокислота кодируется по меньшей мере одним кодоном. Кодирование одной и той же аминокислоты разными кодонами известно как "вырожденность генетического кода". Термин "аминокислота" в данном описании обозначает карбокси-альфа-аминокислоты естественного происхождения и включает аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: A), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, C), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, H), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Термин "антитело" в данном документе используется в широком смысле и охватывает антитела с различной структурой, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность, но не ограничивается ими.
2
"Фрагмент антитела" обозначает молекулу, отличную от интактного антитела, содержащую часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, связывающимся с интактным антителом. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.
Термин "химерное" антитело обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или биологического вида, тогда как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или биологического вида.
1
2
3
4
1
2
"Класс" антитела обозначает тип константного домена или константного участка его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.
Термин "клон" обозначает популяцию делящихся и антителосекретирующих B-клеток, берущих начало/происходящих от единственной B-клетки. Таким образом, B-клеточный клон продуцирует моноклональное антитело.
Термин "экспрессия" в данном документе обозначает процесс транскрипции и/или трансляции, происходящий внутри клетки. Интенсивность транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, в клетке можно определить по количеству соответствующей мРНК, присутствующей в клетке. Например, можно провести количественное определение мРНК, транскрибированной с последовательности, представляющей интерес, при помощи ОТ-ПЦР (полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) или нозерн-гибридизации (см. Sam brook, et al., 1989, выше). Количественное определение полипептидов, кодируемых нуклеиновой кислотой, представляющей интерес, можно выполнять различными способами, например, при помощи ИФА, путем определения биологической активности полипептида, или при помощи анализов, которые не зависят от такой активности, например, Вестерн-блоттинга или радиоимуноанализа, с использованием иммуноглобулинов, распознающих и связывающихся с полипептидом (см. Sambrook, et al., 1989, выше).
"Экспрессионная кассета" обозначает конструкцию, которая содержит необходимые регуляторные элементы, такие как промотор и сайт полиаденилирования, для экспрессии в клетке по меньшей мере содержащейся в ней нуклеиновой кислоты.
Экспрессия гена может быть транзиторной или стабильной. Полипептиды, представляющие интерес, как правило являются секретируемыми полипептидами и, следовательно, содержат N-концевой участок (известный также как сигнальная последовательность), необходимый для транспорта/секреции полипептида через клеточную стенку во внеклеточную среду. Как правило, сигнальная последовательность может происходить из любого гена, кодирующего секретируемый полипептид. Если используют гетерологичную сигнальную последовательность, предпочтительно, чтобы она распознавалась и подвергалась процессингу (т.е. расщеплялась сигнальной пептидазой) в клетке-хозяине. Например, для секреции в дрожжевых клетках нативную сигнальную последовательность гетерологичного гена, подлежащего экспрессии, можно заменить гомологичной сигнальной последовательностью гена секретируемого пептида дрожжей, такой как сигнальная последовательность инвертазы дрожжей, лидерная последовательность альфа-фактора (включая лидерные последовательности α-факторов Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia и Hansenula, второй из них описан в US 5,010,182), сигнальная последовательность кислой фосфатазы или сигнальная последовательность глюкоамилазы C. albicans (ЕР 0362179). В клетках млекопитающих экспрессия нативной сигнальной последовательности белка, представляющего интерес, является удовлетворительной, хотя могут применяться и другие сигнальные последовательности млекопитающих, такие как сигнальные последовательности секретируемых полипептидов тех же самых или родственных биологических видов, например, иммуноглобулинов человека или мыши, а также сигнальные последовательности вирусных секретируемых полипептидов, например, сигнальная последовательность гликопротеина D вируса простого герпеса. Фрагмент ДНК, кодирующий такой пресегмент, лигирован в рамке считывания, т.е. функционально связан с фрагментом ДНК, кодирующим полипептид, представляющий интерес.
Термин "экспериментальное животное" обозначает отличного от человека животного. В одном воплощении экспериментальное животное выбрано из крысы, мыши, хомяка, кролика, верблюда, ламы, отличных от человека приматов, овцы, собаки, коровы, курицы, амфибий, акул и рептилий. В одном воплощении экспериментальное животное является млекопитающим.
Термин "Fc-фрагмент" здесь используется для обозначения C-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащего по меньшей мере часть константного участка. Термин включает Fc-фрагменты с нативной последовательностью и варианты Fc-фрагментов. В одном воплощении Fc-фрагмент тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. При этом, C-концевой лизин (Lys447) Fc фрагмента может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков Fc-фрагмента или константного участка соответствует системе нумерации EU, также носящей название «EU index», согласно описанию Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3.
Термин "фидерная смесь" обозначает комбинацию различных добавок, таких как ростовые факторы, цитокины и/или другие белки, способствующие активации и/или выживаемости B-клеток и/или секреции антител. Фидерная смесь может быть фидерной смесью естественного происхождения, например, полученной из культурального супернатанта тимоцитов (TSN), которая представляет собой комбинацию цитокинов неопределенного состава, или фидерная смесь может быть искусственной фидерной смесью, например, содержащей смесь IL-21 и/или IL-2 и/или IL-6.
"Каркасные участки" или "FR" (от англ. framework regions) обозначают остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из 4 FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL), как правило, располагаются в следующей последовательности: FR1-H1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термин "клетка" или "клетка-хозяин" обозначает клетку, которая трансфецирована или может быть трансфецирована нуклеиновой кислотой, например, кодирующей гетерологичный полипептид. Термин „клетка" охватывает как прокариотические клетки, которые используют для репликации плазмид, так и эукариотические клетки, которые используют для экспрессии нуклеиновой кислоты и продукции кодируемого полипептида. В одном воплощении эукариотические клетки представляют собой клетки млекопитающих. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO, возможно клетки CHO K1 (ATCC CCL-61 или DSM ACC 110), или клетки CHO DG44 (также обозначаемые CHO-DHFR[-], DSM ACC 126), или клетки CHO XL99, клетки CHO-Т (см., например, Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963), или клетки CHO-S, или клетки Super-CHO (Рак, S.C.O., et al. Cytotechnol. 22 (1996) 139-146). Если эти клетки не адаптированы для роста в бессывороточной среде или в суспензии, перед применением в данном способе необходимо осуществить такую адаптацию. В данном документе выражение "клетка" охватывает клетки, которые испытывают воздействие, а также их потомков. Так, термины "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают клетки, которые испытывают первичное воздействие, и полученные из них культуры, независимо от числа пассажей или пересевов. Следует понимать, что все потомки могут не быть абсолютно идентичными по содержанию ДНК, вследствие неслучайных или случайных мутаций. Термины также охватывают варианты потомков, обладающие такой же функцией или биологической активностью, которая была определена при скрининге у исходно трансформированной клетки.
"Человеческое антитело" представляет собой антитело, аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме или в клетках человека или полученного из источника, не относящегося к человеку, но задействующего репертуар антител человека или иные последовательности, кодирующие антитела человека. Данное определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированные антитела, содержащие антиген-связывающие остатки, не являющиеся человеческими.
"Консенсусные каркасные участки человеческого происхождения" являются каркасными участками, представленными наиболее часто встречающимися аминокислотными остатками в наборе последовательностей каркасных участков VL или VH иммуноглобулинов человека. Как правило, последовательности VL или VH иммуноглобулинов человека выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу согласно описанию Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении подгруппой для VL является подгруппа каппа I, согласно Kabat et al., см выше. В одном воплощении подгруппой для VH является подгруппа III, согласно Kabat et al., см выше.
"Гуманизированное" антитело обозначает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки гипервариабельных участков, не являющиеся человеческими, и аминокислотные остатки каркасных участков человека. В определенных воплощениях гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные участки (например, CDR, от англ. complementarity determining regions) соответствуют участкам антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все каркасные участки соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, антитела не являющегося человеческим, обозначает антитело, прошедшее гуманизацию.
Термин "гипервариабельный участок" или "HVR" в данном документе обозначает каждый из участков вариабельного домена антитела, имеющих гипервариабельную последовательность и/или формирующих петли определенной структуры ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные состоящие из четырех цепей антитела имеют 6 HVR; три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). Как правило, HVR содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или "участков, определяющих комплементарность" (CDR), последние характеризуются наибольшей вариабельностью последовательности и/или задействованы в распознавании антигена. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли находятся между аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) находятся между аминокислотными остатками 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 31-35 В в H1, 50-65 в H2 и 95-102 в H3 (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3.) Как правило, CDR содержат аминокислотные остатки, образующие гипервариабельные петли, за исключением CDR1 в составе VH. CDR также включают "остатки, определяющие специфичность", или "SDR" (от англ. specificity determining regions) которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR находятся в составе участков CDR, обозначаемых «укороченными CDR», или a-CDR (от англ. abbreviated-CDRs). Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) образованы аминокислотными остатками в положениях 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35 В в H1, 50-58 в H2 и 95-102 в H3 (см. Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иначе, гипервариабельные остатки и иные остатки вариабельного домена (например, остатки FR) в данном документе пронумерованы в соответствии с Kabat et al., см. выше.
Термин "мечение" обозначает наличие или отсутствие поверхностного маркера, который можно детектировать путем добавления специфически связывающегося и меченого антитела, распознающего поверхностный маркер. Таким образом, о наличии поверхностного маркера, например, в случае флуоресцентной метки свидетельствует возникновение флуоресценции, тогда как об отсутствии поверхностного маркера свидетельствует отсутствие флуоресценции после инкубации с соответствующим специфически связывающимся и меченым антителом, распознающим поверхностный маркер.
Термин "моноклональное антитело" в данном документе используется для обозначения антитела, полученного из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, возникающие естественным путем или в ходе получения препарата моноклонального антитела, при этом подобные варианты, как правило, присутствуют в минорном количестве. В противоположность препаратам поликлональных антител, обычно содержащим различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Таким образом, определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела определенным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, в том числе могут быть произведены с помощью различных технологий, включая гибридомную технологию, технологию рекомбинантной ДНК, технологию фагового дисплея и технологии с использованием трансгенных животных, имеющих все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть; данные способы и другие приведенные в качестве примера способы производства моноклональных антител описаны в данном документе.
"Нативные антитела" обозначают молекулы иммуноглобулинов, возникающие естественным образом и имеющим различные структуры. Например, нативные антитела класса IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами весом приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидной связью. В направлении от N- к C-концу каждой тяжелой цепи расположен вариабельный участок (VH), также обозначаемый вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (CH1, CH2 и CH3). Аналогично, в направлении от N- к C-концу каждой легкой цепи расположен вариабельный участок (VL), также обозначаемый вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым расположен константный легкий домен (CL). Легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена.
Термины "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновой кислоты" в данной заявке используются взаимозаменяемо и обозначают полимерную молекулу, состоящую из отдельных нуклеотидов (также называемых основаниями) a, c, g и t (или и в РНК), например, ДНК, РНК или их модификации. Эти полинуклеотидные молекулы могут быть полинуклеотидными молекулами природного происхождения или искусственными полинуклеотидными молекулами или комбинацией одной или нескольких полинуклеотидных молекул природного происхождения с одной или несколькими искусственными полинуклеотидными молекулами. Это определение также охватывает полинуклеотидные молекулы природного происхождения, в которых один или несколько нуклеотидов замещены (например, путем мутагенеза), удалены или добавлены. Нуклеиновая кислота может быть выделенной или интегрированной в другую нуклеиновую кислоту, например, в составе экспрессионной кассеты, плазмиды или хромосомы клетки-хозяина. Нуклеиновая кислота характеризуется своей нуклеотидной последовательностью, состоящей из отдельных нуклеотидов.
Специалисту в данной области хорошо известны процедуры и способы для конвертации аминокислотной последовательности, например, полипептида, в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей данную аминокислотную последовательность. Таким образом, нуклеиновая кислота характеризуется своей нуклеотидной последовательностью, состоящей из отдельных нуклеотидов, а также аминокислотной последовательностью кодируемого ей полипептида.
-7
-8
-13
-9
-13
-6
-6
Термин "специфически связывающийся" и его грамматические формы обозначают, что антитело связывается со своей мишенью с константой диссоциации (Kd) равной 10 М или менее, в одном воплощении от 10 М до 10 М, в следующем воплощении от 10 М до 10 М. Термин также используют, чтобы указать, что антитело не связывается специфически с другими присутствующими биомолекулами, т.е. оно связывается с другими биомолекулами с константой диссоциации (Kd), равной 10 М или более, в одном воплощении от 10 М до 1 М.
"Трансфецирующий вектор" представляет собой нуклеиновую кислоту (также обозначаемую молекулой нуклеиновой кислоты), обеспечивающую все необходимые элементы для экспрессии в клетке-хозяине кодирующих нуклеиновых кислот/структурных генов, входящих в состав трансфецирующего вектора. Трансфецирующий вектор содержит сегмент, обеспечивающий репликацию плазмид в прокариотических клетках, например, E. coli, который в свою очередь содержит сайт инициации репликации прокариотической клетки и нуклеиновую кислоту, обеспечивающую резистентность к селективному агенту для прокариотических клеток; кроме того трансфецирующий вектор содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, обеспечивающих резистентность к селективному агенту для эукариотических клеток, и одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, представляющий интерес. Предпочтительными являются нуклеиновые кислоты, обеспечивающие резистентность к селективному агенту, и нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид, представляющий интерес, каждая из которых помещена в экспрессионную кассету, причем каждая экспрессионная кассета содержит промотор, кодирующую нуклеиновую кислоту и терминатор транскрипции, включающий сигнал полиаденилирования. Экспрессия гена, как правило, находится под контролем промотора, в этом случае структурный ген называют "функционально связанным" с промотором. Аналогично, регуляторный элемент и коровый промотор являются функционально связанными, если регуляторный элемент изменяет активность корового промотора.
Термин "вариабельный участок" или "вариабельный домен" обозначает домен легкой или тяжелой цепи антитела, задействованный в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела, как правило, имеют одинаковую структуру, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Единственного VH или VL домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Более того, антитела, связывающие конкретный антиген, могут быть выделены при помощи VH или VL домена антитела, связывающего этот же антиген, при скрининге библиотеки на комплементарные VL или VH домены, соответственно. См., например, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628).
Термин "вектор", используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной передавать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, инкорпорированный в состав генома клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе обозначаются "экспрессирующие векторы".
Термин "молодое животное" обозначает животного, у которого не наступила половая зрелость. Например, молодой хомяк имеет возраст менее 6 недель, в частности, менее 4 недель. Например, молодая мышь имеет возраст менее 8 недель, в частности, менее 5 недель.
Иммунизация
В описанных в данном документе способах можно использовать B-клетки, полученные, например, у мыши, крысы, хомячка, кролика или человека.
В одном воплощении мышь представляет собой мышь линии NMRI или мышь линии balb/c.
В одном воплощении хомячок выбран из серого хомячка (Cricetulus migratorius), китайского хомячка (Cricetulus griseus) и сирийского хомячка (Mesocricetulus auratus). В одном воплощении хомячок представляет собой серого хомячка.
В одном воплощении B-клетка представляет собой B-клетку кролика. В одном воплощении кролик выбран из кроликов породы новозеландская белая (NZW, от англ. New Zealand White), кроликов ZIKA (Zimmermann kaninchen), кроликов мутантной линии Alicia, кроликов мутантной линии basilea, трансгенных кроликов с локусами иммуноглобулинов человека, кроликов с выключенным геном IgM и особей, полученных при их скрещивании. В одном воплощении B-клетки кролика получены у иммунизированного кролика или кролика, вакцинированного против специфического антигена.
В одном воплощении B-клетка представляет собой человеческую B-клетку. В одном воплощении человеческая B-клетка получена у невакцинированного здорового человека или у человека, вакцинированного против специфического антигена, или у человека, имеющего заболевание, или у человека, излечившегося от заболевания. Вакцинацией может считаться введение специфической вакцины человеку или излечение от определенного заболевания.
Источники и выделение B-клеток
В крови иммунизированного экспериментального животного или вакцинированного человека присутствует большое количество антителопродуцирующих B-клеток. Выделенные B-клетки секретируют антитела, которые практически не имеют идентичных или перекрывающихся аминокислотных последовательностей в составе CDR и, следовательно, характеризуются огромным разнообразием.
В одном воплощении B-клетки экспериментального животного, например, полученные из крови экспериментального животного, или клетки человека, получают в период времени от 4 до 15 дней после иммунизации или самой последней реиммунизации.
В одном воплощении B-клетки получают в период времени от 4 до 9 дней после иммунизации или самой последней реиммунизации.
Данный временной промежуток обеспечивает удобство применения способа, описанного в данной заявке. Полагают, что в этот период времени B-клетки, производящие антитела с наиболее высокой аффинностью, мигрируют из селезенки в кровь (см. например, Paus, D., et al., JEM 203 (2006) 1081-1091; Smith, K.G.S., et al., The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006; Wrammert, J., et al., Nature 453 (2008) 667-672).
Этапы селекции перед совместным культивированием
B-клетки, продуцирующие антитела, которые специфически связываются с антигеном, можно выделить путем обогащения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Так, в одном воплощении всех способов данного описания B-клетку получают из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) или пул B-клеток выделяют путем обогащения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).
Популяцию клеток можно обеднять или обогащать клетками, не продуцирующими антитело, связывающееся с антигеном, представляющим интерес, так же, как и клетками, продуцирующими антитело, связывающееся с антигеном, представляющим интерес, путем отрицательной и положительной селекции. Для этого используют связывающий партнер, иммобилизованный на поверхности, а клеточная популяция обогащается связывающимися с ним клетками, если в дальнейшем используют связанные клетки, или клеточная популяция обедняется, если в дальнейшем используют клетки, остающиеся в растворе.
Способ, описанный в данной заявке, в одном воплощении включает этап отбора, на котором B-клетки, продуцирующие специфические антитела, отбирают используя маркеры, присутствующие на клеточной поверхности, и сортировку/гейтирование клеток с возбуждением флуоресценции. В одном воплощении сортингу/обогащению/селекции подвергают зрелые B-клетки. Для селекции B-клеток различных видов экспериментальных животных можно использовать различные маркеры клеточной поверхности.
Путем мечения нецелевых клеточных популяций и неспецифически связывающихся лимфоцитов, можно избирательно элиминировать эти клетки. На данном этапе элиминации, как правило, достигается неполная элиминация. Несмотря на то, что элиминация не является количественной, она облегчает флуоресцентное мечение оставшихся клеток, за счет уменьшения или минимизации количества интерферирующих клеток.
+
+
+
+
+
+
+
Используя различные поверхностные маркеры, можно осуществлять мечение различных клеточных популяций, например, CD3-клетои (T-клеток), CD19-клеток (общей популяции B-клеток), IgM-клеток (зрелых наивных B-клеток), IgG-клеток (зрелых B-клеток), CD38-клеток (например, плазмобластов) и lgGCD38-клеток (пре-плазматических клеток).
+
В способах, описанных в данной заявке, можно использовать иммунофлуоресцентное мечение для селекции зрелых IgG-B-клеток, таких как B-клетки памяти, плазмобласты и плазматические клетки.
Для селекции или обогащения B-клетками осуществляют мечение клеток одной, двумя или тремя метками.
Необходимо провести мечение таким образом, чтобы во всей популяции мечеными оказались приблизительно от 0,1% до 2,5% клеток.
В одном воплощении селекцию B-клеток осуществляют путем мечения поверхностных молекул, присутствующих у 0,1%-2,5% B-клеток в популяции. В одном воплощении селекцию B-клеток осуществляют путем мечения поверхностных молекул, присутствующих у 0,3%-1,5% B-клеток в популяции. В одном воплощении селекцию B-клеток осуществляют путем мечения поверхностных молекул, присутствующих у 0,5%-1% B-клеток в популяции.
Осаждение одиночных клеток
Способы, описанные в данной заявке, в одном воплощении включают этап осаждения B-клеток, составляющих популяцию B-клеток, в виде одиночных клеток.
В одном воплощении осаждение одиночных клеток осуществляют при помощи сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS, от англ. fluorescence activated cell sorting).
В одном воплощении специфически меченные B-клетки осаждают в виде одиночных клеток. В одном воплощении мечение представляет собой мечение маркеров клеточной поверхности антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой.
В одном воплощении способов, описанных в данной заявке, предложены моноклональные антитела.
В одном воплощении всех способов, описанных в данной заявке, B-клетки представляют собой зрелые B-клетки и зрелые B-клетки осаждают в виде одиночных клеток.
Иммунофлуоресцентное мечение, используемое для B-клеток, полученных из крови экспериментального животного, можно также использовать для мечения B-клеток, полученных из селезенки и других органов иммунной системы экспериментального животного, такого как мышь, крыса, хомячок или кролик.
Осаждение множества клеток
Способы, описанные в данной заявке, в одном воплощении включают этап осаждения пула B-клеток. Все B-клетки данного пула B-клеток осаждают в лунки после выделения из периферической крови при помощи аффинных магнитных гранул или метода FACS.
В одном воплощении осаждают приблизительно 500 B-клеток.
В одном воплощении осаждают приблизительно 2500 B-клеток.
Общее количество осажденных B-клеток, например, человеческих B-клеток, может быть увеличено до 90000 B-клеток на один эксперимент или более.
Совместное культивирование
В данном документе описано совместное культивирование антителопродуцирующих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, таких как клетки CHO или клетки BHK.
Так, в одном воплощении всех способов по данному описанию B-клетки, в виде пула B-клеток или одиночных B-клеток, культивируют вместе с клетками CHO, экспрессирующими CD40L, в присутствии IL-2 и IL-21 или фидерной смеси.
Уже приблизительно через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15 или 21 день, в частности через 3, 4 или 5 дней (пул приблизительно из 2500 B-клеток) или в частности через 6, 7 или 8 дней (одиночные B-клетки или пул приблизительно из 500 B-клеток) совместного культивирования в надосадочной жидкости можно получить достаточное количество молекул антител. При получении такого количества антител можно провести различные анализы для характеризации антител, например, более подробно исследовать специфичность связывания. Лучшая характеризация антител на такой ранней фазе скрининга / селекции позволяет сократить требуемое количество выделений нуклеиновых кислот и реакций секвенирования.
В одном воплощении всех способов по данному описанию осуществляют совместное культивирование антителопродуцирующих B-клеток и клеток CHO, экспрессирующих CD40L, в присутствии фидерной смеси.
Фидерная смесь может представлять собой фидерную смесь естественного происхождения или искусственную фидерную смесь.
Фидерная смесь естественного происхождения представляет собой, например, культуральный супернатант тимоцитов (TSN). Она содержит необходимые растворимые факторы, но является гетерогенным реагентом, компоненты которого не охарактеризованы надлежащим образом, и различается от животного к животному.
Искусственная фидерная смесь также называется "фидерная смесь Zubler". Она содержит определенную комбинацию мышиных цитокинов (2 нг/мл IL-10, 50 нг/мл IL-2, 10 нг/мл IL-10 и 2 нг/мл TNFα).
В одном воплощении всех способов по данному описанию фидерная смесь представляет собой культуральный супернатант тимоцитов. В одном воплощении B-клетки не являются человеческими B-клетками.
В одном воплощении культуральный супернатант тимоцитов получают при культивировании тимоцитов вилочковой железы соответствующего молодого животного. Использование вилочковой железы молодых животных предпочтительнее по сравнению с выделением тимоцитов из крови взрослых животных.
В одном воплощении культуральный супернатант тимоцитов получают при культивировании T-клеток человека, полученных из крови человека.
Как правило, до и после этапа совместного культивирования B-клеток с клетками CHO, экспрессирующими CD40L, в способах по данному описанию может присутствовать несколько дополнительных этапов.
Обнаружили, что совместное культивирование с клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 и SAC можно использовать для активации ранних (незрелых) кроличьих B-клеток. Эти B-клетки не экспрессируют CD138.
В одном воплощении всех способов по данному описанию совместное культивирование антителопродуцирующих B-клеток и клеток CHO, экспрессирующих CD40L, осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21. В одном воплощении B-клетки представляют собой кроличьи B-клетки, a CD40L представляет собой CD40L кролика. В одном воплощении культуральная среда по существу не содержит IL-4, т.е. IL-4 не добавляют в культуральную среду. В одном воплощении IL-2 и IL-21 добавляют в начале культивирования вместе с культуральной средой.
В одном воплощении всех способов по данному описанию совместное культивирование антителопродуцирующих кроличьих B-клеток и клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика, осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21, причем культуральная среда по существу не содержит IL-4, и при этом IL-2 и IL-21 добавляют в начале культивирования вместе с культуральной средой.
Обнаружили, что применение системы совместного культивирования, содержащей B-клетки, клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L, а также IL-2 и IL-21, улучшает пролиферацию B-клеток, т.е. B-клетки делятся быстрее, и за более короткий срок можно добиться более высокой плотности клеток и титра антител в культуральной надосадочной жидкости, соответственно, по сравнению с системой, не содержащей один, два или все из IL-2, IL-21 и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L.
Было также обнаружено, что для кроличьих B-клеток особенно подходит система совместного культивирования, содержащая клетки CHO, экспрессирующие CD40L кролика, человеческий или мышиный IL-2 и человеческий или мышиный IL-21.
Характеризация совместно культивируемых клеток по продукции IqG
Для (качественного и количественного) определения секретируемого при совместном культивировании IgG, как правило можно использовать любые методы, известные специалистам в данной области, например, ИФА. В одном воплощении всех способов по данному описанию используют ИФА. Для определения уровня человеческих IgG использовали мультиплексную технологию анализа Cytometric Bead Array (СВА) (разработанную BD Biosciences).
На основании результатов исследования можно выделить, т.е. отобрать клон B-клеток.
Характеризация совместно культивируемых клеток по увеличению их численности и пролиферации
3H
Для (качественной и количественной) оценки численности клеток можно оценивать пролиферацию или жизнеспособность совместно культивируемых B-клеток с использованием различных методов (доступного для приобретения набора для определения клеточной активности "cell titer glow" (CTG, Promega), метода разведения CFSE (от англ. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, сукцинимидильный эфир карбоксифлуоресцеина диацетата), по включению тимидина или с помощью регистрации изображений культивируемых клеток).
Выделение мРНК. клонирование и секвенирование
Клон B-клеток, продуцирующий антитела в высоком титре, является источником такого количества мРНК, кодирующей (когнатные, т.е. происходящие из одной и той же антителопродуцирующей клетки) вариабельные участки легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, которое позволяет использовать вырожденные праймеры ПЦР и избежать необходимости использования высокоспецифичных праймеров ПЦР. Кроме того, сокращается необходимое количество циклов ПЦР. Так, в одном воплощении в ПЦР с обратной транскрипцией используют вырожденный праймер для вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи.
Из B-клеток можно выделить общую мРНК и методом обратной транскрипции получить кДНК. Нуклеиновую кислоту, кодирующую когнатные VH-и VL-участки, можно амплифицировать с использованием соответствующего праймера.
В одном воплощении всех способов по данному описанию на основе амплифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен, получают аминокислотную последовательность. Точные границы участка нуклеиновой кислоты, кодирующего вариабельный домен, устанавливают по границам аминокислотных последовательностей между EVQL/QVQL и VSS (VH-участок), а также DIVM/DIQM и KLEIK (VL-участок).
Описано в данной заявке
В данной заявке описана совместная стимуляция антителосекретирующих B-клеток, (i) опосредованная через путь CD40/CD40L (CD154) с использованием облученных фидерных клеток млекопитающих, например, клеток CHO (яичников китайского хомячка) или клеток BHK (почки новорожденного хомячка), трансфецированных CD40L, например, кроличьего происхождения или человеческого происхождения, (ii) с добавлением в культуральную среду отдельных цитокинов или фидерной смеси, содержащей, например, человеческие или мышиные интерлейкины 2 (IL-2) и 21 (IL-21), и/или убитые нагреванием фиксированные формалином частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus A strain Cowan 1 particles).
Аспекты и воплощения данного изобретения
Один аспект данного изобретения представляет собой способ получения антитела, включающий этап совместного культивирования кроличьих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21.
Совместное культивирование кроличьих B-клеток (одиночных клеток или пула клеток) с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, например, презентирующими его на клеточной поверхности, в присутствии IL-2 и IL-21 представляет собой быстрый, эффективный и воспроизводимый способ получения кроличьих или человеческих антител, в котором взяты за основу кроличьи B-клетки.
В одном воплощении кроличьи B-клетки представляют собой наивные B-клетки кролика или незрелые B-клетки кролика.
+
В одном воплощении B-клетки кролика представляют собой lgG B-клетки.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2. В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2.
В одном воплощении IL-21 представляет собой человеческий IL-21. В одном воплощении IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2, a IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2, и IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2, и IL-21 представляет собой человеческий IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2, a IL-21 представляет собой человеческий IL-21.
В одном воплощении культивирование осуществляют в отсутствие IL-4. В одном воплощении культуральная среда не содержит IL-4.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки яичников китайского хомячка.
В одном воплощении CD40L кролика имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01.
В одном воплощении кроличьи B-клетки получают через промежуток времени от 4 до 9 дней после последней иммунизации или реиммунизации кролика антигеном.
В одном воплощении способ также включает один или несколько следующих этапов:
- обеспечение B-клеток у иммунизированного кролика, и/или
- осаждение одиночных B-клеток, и/или
- совместное культивирование B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, и/или
- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены кроличьего антитела, из совместно культивируемых кроличьих B-клеток, и/или
- гуманизацию вариабельных доменов кроличьего антитела, и/или
- культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные домены антитела, и выделение антитела из клеток или культуральной среды.
Один аспект данного описания представляет собой способ продукции антитела, включающий этап совместного культивирования человеческих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека.
Этап совместного культивирования человеческих B-клеток (одиночных клеток или пула клеток) с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, например, презентирующими его на клеточной поверхности, представляет собой эффективный и воспроизводимый способ получения человеческих антител, в котором взяты за основу человеческие B-клетки.
В одном воплощении человеческие B-клетки получают из крови человека.
+
В одном воплощении кроличьи B-клетки представляют собой lgG B-клетки.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки почки новорожденного хомячка.
В одном воплощении при совместном культивировании добавляют IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2.
В одном воплощении IL-21 представляет собой человеческий IL-21.
В одном воплощении IL-6 представляет собой человеческий IL-6.
В одном воплощении культивирование осуществляют в отсутствие IL-4. В одном воплощении культуральная среда не содержит IL-4.
В одном воплощении CD40L человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02.
В одном воплощении B-клетки получают через промежуток времени от 4 до 9 дней после иммунизации человека антигеном или вакциной.
В одном воплощении способ также включает один или несколько следующих этапов:
- обеспечение B-клеток из крови иммунизированного или вакцинированного или имеющего заболевание или излечившегося от заболевания человека, и/или
- осаждение одиночных B-клеток, и/или
- совместное культивирование B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, и/или
- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены человеческого антитела, из совместно культивируемых человеческих B-клеток, и/или
- культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные домены человеческого антитела, и возможно, нуклеиновую кислоту, кодирующую константный участок человеческого антитела, и выделение антитела из клеток или культуральной жидкости.
Один аспект данного описания представляет собой применение IL-2 и IL-21 для совместного культивирования B-клеток с фидерными клетками.
Добавление IL-2 и IL-21 при совместном культивировании B-клеток с фидерными клетками обеспечивает высокоэффективную стимуляцию B-клеток и улучшает показатели роста, например, улучшает скорость роста и/или секрецию антитела.
В одном воплощении фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L.
В одном воплощении B-клетки представляют собой кроличьи B-клетки, а фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки яичников китайского хомячка.
Один аспект данного описания представляет собой применение IL-2 и/или IL-21 для совместного культивирования B-клеток с фидерными клетками.
Добавление IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 при совместном культивировании B-клеток с различными фидерными клетками обеспечивает высокоэффективную стимуляцию B-клеток и улучшает показатели роста, например, улучшает скорость роста и/или секрецию антитела.
В одном воплощении фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L.
В одном воплощении B-клетки представляют собой человеческие B-клетки, а фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки почки новорожденного хомячка.
Один аспект данного описания представляет собой способ продукции антитела, включающий этап совместного культивирования B-клеток с фидерными клетками, а также IL-2 и IL-21.
В одном воплощении фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L.
В одном воплощении B-клетки представляют собой кроличьи B-клетки, а фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки яичников китайского хомячка.
Один аспект данного описания представляет собой способ продукции антитела, включающий этап совместного культивирования B-клеток с фидерными клетками, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
В одном воплощении фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L.
В одном воплощении B-клетки представляют собой человеческие B-клетки, а фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки почки новорожденного хомячка.
Один аспект данного описания представляет собой набор, содержащий клетки CHO, экспрессирующие CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21.
Один аспект данного описания представляет собой набор, содержащий клетки BHK, экспрессирующие CD40L человека, а также IL-2 или IL-21 или IL-6 или их комбинацию.
Один аспект данного описания представляет собой способ культивирования B-клеток, секретирующих антитело, которое специфически связывается с поверхностным антигеном Т-клеток и опосредует передачу ингибирующего сигнала в Т-клетки, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии IL-2 или IL-21 или того и другого.
Данная система совместного культивирования может найти применение для амплификации B-клеток, секретирующих ингибирующее T-клетки соединение, взяв за основу одиночные или пулированные B-клетки, когда использование фидерных клеток, происходящих из T-клеток, например, клеток тимомы, невозможно, поскольку секреция ингибирующего T-клетки соединения будет уменьшать или устранять влияние фидерных клеток.
Клетки CHO, экспрессирующие CD40L, описанные в данной заявке, можно применять для получения антител, специфических к T-клеткам. Применение фидерной системы, включающей T-клетки или содержащей T-клеточные антигены, например, линии клеток тимомы EL4-B5, невозможно, поскольку продуцируемые B-клетками антитела, специфические к T-клеткам, будут отрицательно влиять на культуральную систему. Для культивирования (В) клеток, секретирующих антитело, специфическое к Т-клеткам, оптимальной будет искусственная независимая от T-клеток система, такая как описанная в данной заявке.
В одном воплощении антиген не является CD40L.
В одном воплощении соединение, ингибирующее T-клетки, представляет собой антитело, специфически связывающееся с поверхностным антигеном T-клеток.
В одном воплощении B-клетки представляют собой кроличьи B-клетки, а фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки яичников китайского хомячка.
В одном воплощении при совместном культивировании добавляют IL-2 и IL-21.
В одном воплощении B-клетки представляют собой человеческие B-клетки, а фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки почки новорожденного хомячка.
В одном воплощении при совместном культивировании добавляют IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
Один аспект данного описания представляет собой способ культивирования антителосекретирующих B-клеток, включающий в следующем порядке:
i) первое совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора митоза, и
ii) последующее второе совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора продукции антитела.
При поэтапном культивировании B-клеток вначале в присутствии стимулятора митоза, а затем в присутствии стимулятора продукции антитела совместное культивирование B-клеток подразделяют на первую фазу, на которой нарабатывают B-клетки, и вторую фазу, на которой индуцируют секрецию антитела.
В одном воплощении первое и второе совместное культивирование осуществляют в том же сосуде для культивирования.
В одном воплощении способ культивирования антителосекретирующих B-клеток включает совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, при этом в среду для культивирования вначале добавляют стимулятор митоза, а затем в среду для культивирования добавляют стимулятор продукции антитела.
В одном воплощении стимулятор продукции антитела добавляют по меньшей мере через один час после добавления стимулятора митоза. В одном воплощении стимулятор продукции антитела добавляют через один-три дня после добавления в среду для культивирования стимулятора митоза.
В одном воплощении стимулятор митоза выбран из группы, включающей и соединения, взаимодействующие с CD40 и CD40L, соединения, взаимодействующие с ICOS и ICOS-L, APRIL, BAFF, CR2, CXCL9, CXCL12 (SDF-1), CXCL13, CXCL16, Flt-3L, интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-7, интерлейкин-10, интерлейкин-14, интерлейкин-21, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus Aureus Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды TLR, такие как LPS, различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG или резиквимод (R-848), TSLP, фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β), интерфероны II типа (например, IFNγ), образующие поперечные сшивки антитела к IgG, образующие поперечные сшивки антитела к CD20 и образующие поперечные сшивки антитела к CD27.
В одном воплощении стимулятор продукции антитела выбран из группы, включающей соединения, взаимодействующие с CD40 и CD40L, соединения, взаимодействующие с ICOS и ICOS-L, APRIL, BAFF, CR2, CXCL9, CXCL12 (SDF-1), CXCL13, CXCL16, Flt-3L, интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-9, интерлейкин-10, интерлейкин-13, интерлейкин-21, интерлейкин-33, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды TLR, такие как LPS, различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG или резиквимод (R-848), TSLP, фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β), интерфероны II типа (например, IFNγ), образующие поперечные сшивки антитела к IgG, образующие поперечные сшивки антитела к CD20 и образующие поперечные сшивки антитела к CD27. В одном воплощении стимулятор митоза добавляют в начале первого совместного культивирования.
В одном воплощении стимулятор митоза добавляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после начала первого совместного культивирования.
В одном воплощении стимулятор продукции антитела добавляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после добавления стимулятора митоза.
В одном воплощении каждое совместное культивирование занимает от 5 до 14 дней.
В одном воплощении культивирование осуществляют в течение общего периода от 5 до 21 дня. В одном воплощении культивирование осуществляют в течение общего периода от 6 до 14 дней.
В одном воплощении стимулятор митоза удаляют до начала второго совместного культивирования. В одном воплощении удаление осуществляют путем замены культуральной надосадочной жидкости или отмывания клеток нейтральной средой.
Один аспект данного описания представляет собой способ получения антитела, которое специфически связывается с антигеном, включающий следующие этапы:
a) совместное культивирование пула или одиночных антителосекретирующих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L,
b) культивирование клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные участки антитела, секретируемого B-клетками, совместно культивируемыми на этапе а), или ее вариант в составе одной или нескольких экспрессионных кассет,
с) выделение антитела из клеток или культуральной среды, и таким образом, получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии стимулятора митоза и/или стимулятора продукции антитела.
В одном воплощении первое и/или второе совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2. В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2.
В одном воплощении IL-21 представляет собой человеческий IL-21. В одном воплощении IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2, a IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2, и IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2, и IL-21 представляет собой человеческий IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2, a IL-21 представляет собой человеческий IL-21.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в отсутствие IL-4. В одном воплощении культуральная среда не содержит IL-4.
Одно воплощение включает совместное культивирование
i) первое совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора митоза, и
ii) последующее второе совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора продукции антитела.
Одно воплощение способа включает следующий этап:
а) выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, и выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении способ включает следующие этапы:
a) обеспечение популяции антителосекретирующих (зрелых) B-клеток,
b) окрашивание клеток, входящих в популяцию B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем,
c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции B-клеток в индивидуальные контейнеры,
d) культивирование одиночных B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L и IL-2 и IL-21,
e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду отдельными B-клетками,
f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,
i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и, таким образом, получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
В одном воплощении B-клетки получают из крови животного или человека.
В одном воплощении окрашивание осуществляют с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей.
В одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета.
В одном воплощении клетки представляют собой клетки млекопитающих. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO или клетки BHK или клетки NS0 или клетки Sp2/0.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 для совместного культивирования антителосекретирующих кроличьих B-клеток.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2. В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2.
В одном воплощении IL-21 представляет собой человеческий IL-21. В одном воплощении IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2, a IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2, и IL-21 представляет собой мышиный IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой человеческий IL-2, и IL-21 представляет собой человеческий IL-21.
В одном воплощении IL-2 представляет собой мышиный IL-2, a IL-21 представляет собой человеческий IL-21.
В одном воплощении культивирование осуществляют в отсутствие IL-4. В одном воплощении культуральная среда не содержит IL-4.
В одном воплощении CD40L кролика имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01.
Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, вместе с IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 для совместного культивирования антителосекретирующих человеческих B-клеток.
В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки BHK.
В одном воплощении CD40L человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02.
Один аспект данного описания представляет собой применение SAC для совместного культивирования антителосекретирующих B-клеток.
В одном воплощении совместное культивирование осуществляют с использованием клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L и/или IL-2.
Следующие примеры и графические материалы и последовательности дают возможность лучше понять настоящее изобретение, объем которого ограничен прилагаемой формулой. Следует понимать, что указанные методики могут быть модифицированы, но при этом суть изобретения сохранится.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 Пролиферация B-клеток после совместного культивирования 2500 выделенных кроличьих B-клеток и 5000 γ-облученных клеток CHO или клеток EL4-B5, экспрессирующих CD40L, в течение 7 дней.
Фиг. 2 Изображения, наблюдаемые в микроскопе при совместном культивировании B-клеток и фидерных клеток в присутствии или в отсутствие различных стимулов через 6 дней совместного культивирования: а) клетки EL4-B5 и смесь, предложенная Zubler, b) клетки CHO, экспрессирующие rbCD40L, и человеческий IL-21, с) клетки CHO, экспрессирующие rbCD40L, и человеческий IL-2, d) клетки CHO дикого типа и человеческий IL-21 и человеческий IL-2, е) клетки CHO, экспрессирующие rbCD40L, и человеческий IL-21 и человеческий IL-2, f) клетки CHO, экспрессирующие rbCD40L, и человеческий IL-21 и человеческий IL-2 и SAC.
+
Фиг. 3 Отсортированные человеческие lgG B-клетки памяти в количестве 750 клеток на лунку культивировали совместно с 5000 γ-облученными клетками BHK, экспрессирующими CD40L, и указанными фидерными смесями. Показана пролиферация выделенных человеческих B-клеток памяти через 8 дней.
Фиг. 4 Пролиферация выделенных интактных человеческих В-клеток. После выделения МКПК пулированные человеческие B-клетки в количестве 90000 на лунку культивировали совместно с γ-облученными клетками BHK, экспрессирующими CD40L, и указанными фидерными смесями. Показана пролиферация (абсолютное количество клеток) через 7 дней.
+
Фиг. 5 Точечные диаграммы, показывающие разведение CFSE как показатель пролиферации, по результатам FACS-анализа. Показано окрашивание CFSE (ось X) гейтированных CD19 B-клеток (ось Y).
Фиг. 6 Кластеры B-клеток (культивируемых в отсутствие фидерных клеток) через 3 дня инкубации. Наблюдаемые в микроскопе изображения человеческих B-клеток, культивируемых в течение 3 дней отдельно (a) или в присутствии человеческого IL-2 (b) или IL-2 и SAC (c).
+
Фиг. 7 Отсортированные кроличьи IgG B-клетки в количестве 500 клеток на лунку культивировали совместно с 10000 γ-облученных клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21 различного происхождения и их комбинаций. Показан титр антител через 7 дней в культуральной надосадочной жидкости (медиана); 1: мышиный IL-2, 2: человеческий IL-2, 3: мышиный IL-21, 4: человеческий IL-21, 5: человеческий IL-2 и человеческий IL-21, 6: человеческий IL-2 и мышиный IL-21, 7: мышиный IL-2 и человеческий IL-21, 8: мышиный IL-2 и мышиный IL-21; ось y: IgG кролика [мкг/мл].
Фиг. 8 Результаты исследования жизнеспособности при помощи тест-системы Cell Titer Glo после совместного культивирования согласно Фиг. 7.
+
Фиг. 9 Отсортированные размороженные кроличьи lgG B-клетки в количестве 500 клеток на лунку культивировали совместно с 10000 γ-облученных клеток CHO-K1 (ниже предела обнаружения) или с 10000 γ-облученных клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21 различного происхождения и их комбинаций. Показан титр антител через 7 дней в культуральной надосадочной жидкости (медиана); 1: мышиный IL-2, 2: человеческий IL-2, 3: мышиный IL-21, 4: человеческий IL-21, 5: человеческий IL-2 и человеческий IL-21, 6: человеческий IL-2 и мышиный IL-21, 7: мышиный IL-2 и человеческий IL-21, 8: мышиный IL-2 и мышиный IL-21; ось у: IgG кролика [мкг/мл].
Фиг. 10 Результаты исследования жизнеспособности с помощью тест-системы Cell Titer Glo после совместного культивирования согласно Фиг. 9.
+
Фиг. 11 Отсортированные кроличьи lgG B-клетки в количестве 500 клеток на лунку культивировали совместно с 10000 γ-облученных клеток CHO-K1 (правые столбики; не отображены, поскольку количество находится ниже предела обнаружения) или с 10000 γ-облученных клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика (левые столбики), в присутствии IL-2 и IL-21 различного происхождения и их комбинаций. Показан титр антител через 7 дней в культуральной надосадочной жидкости (среднее).
Фиг. 12 Результаты исследования жизнеспособности с помощью тест-системы Cell Titer Glo после совместного культивирования согласно Фиг. 11.
Фиг. 13 Изображения, наблюдаемые в микроскопе, при совместном культивировании B-клеток и фидерных клеток согласно Примеру 14 при низкой плотности B-клеток (500 B-клеток).
+
Фиг. 14 Отсортированные кроличьи lgG B-клетки в количестве 2500 клеток на лунку культивировали совместно с 10000 γ-облученных клеток CHO-K1 (правые столбики) или с 10000 γ-облученных клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика (левые столбики), а также IL-2 и IL-21 различного происхождения и их комбинациями. Показаны титры антител через 7 дней в культуральной надосадочной жидкости (среднее).
Описание последовательностей
SEQ ID NO: 01 аминокислотная последовательность CD40L кролика
SEQ ID NO: 02 аминокислотная последовательность CD40L человека
SEQ ID NO: 03 аминокислотная последовательность CD40L мыши
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Материалы и методы
Технология рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные способы, описанные Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителя.
Определение последовательности ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования двуцепочечной матрицы, секвенирование выполнялось компанией SequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany).
Анализ последовательности ДНК и белковой последовательности и обработка результатов секвенирования
Для получения, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрирования последовательностей использовали пакет программ GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) вариант 10.2 и программу Vector NTI Advance suite вариант 8.0, разработанную компанией Infomax.
Синтез генов
Необходимые генные сегменты, кодирующие кДНК CD40L кролика, были синтезированы в компании Geneart GmbH (Regensburg, Germany). Генные сегменты фланкированы уникальными сайтами расщепления рестрикционными эндонуклеазами для облегчения экспрессии клонируемых конструкций, согласно описанию ниже. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов верифицировали путем секвенирования ДНК.
Цитокины
Смесь Zubler: 2 нг/мг IL-1β, 50 нг/мл мышиного IL-2, 10 нг/мл мышиного IL-10 и 2 нг/мл мышиного TNFα (конечные концентрации)
Цитокины, протестированные при разработке цитокинового коктейля определенного состава (приведены конечные концентрации, если не указано иначе):
Фенотипирование/сортировка антител
антитело козы к Fc-фрагменту IgG кролика, AbDSerotec STAR121F
антитело крысы к CD138 кролика, Roche GlycArt AG
моноклональное антитело к CD40 человека (clone Mab89), Beckman Coulter IM1374
антитела к CD40L человека/мыши (перекрестно реагирующие с CD40L кролика):
антитело осла к IgG козы, конъюгированное с Alexa 488, Molecular Probes
A11055
Разное
Микрогранулы, конъюгированные с антителом против FITC, Miltenyi Biotec #130-048-701
набор для отрицательной селекции B-клеток человека, Invitrogen #113.13D
набор Nucleofector Т, Lonza VCA-1002
набор СВА для определения общего IgG, BD Biosciences #558679
Животные
Кровь забирали у новозеландских белых кроликов дикого типа. Животных содержали в соответствии с правилами институционального комитета по содержанию и использованию животных и ассоциации по оценке и аккредитации лабораторий, содержащих животных (Германия, Европа).
Иммобилизация антигенов на поверхности планшетов
Стерильные покрытые стрептавидином 6-луночные планшеты (для клеточных культур) инкубировали с биотинилированными антигенами в концентрации 0,5-1 мкг/мл в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа. В стерильные 6-луночные планшеты для клеточных культур вносили небиотинилированный белковый антиген в концентрации 2 мкг/мл в карбонатном буфере (0,1 М бикарбонат натрия, 34 мМ карбонат натрия, pH 9,55) в течение ночи при 4°C.
Перед использованием планшеты трижды промывали стерильным PBS.
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК кролика
Для выделения МКПК кролика цельную кровь, стабилизированную ЭДТА, разводили в два раза 1xPBS перед центрифугированием в градиенте плотности реагента для выделения лимфоцитов из периферической крови млекопитающих Lympholyte mammal (Cedarlane Laboratories) или реагента Ficoll Paque Plus (GE Healthcare, cat. #17-1440-03). МКПК дважды отмывали перед окрашиванием антителами.
Среда для клеток EL4-B5
RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Germany) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, Logan, UT, USA), 2 мМ глутамина, 1% раствора пенициллина/стрептомицина (РАА, Pasching, Austria), 2 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (PAN Biotech, Aidenbach, Germany) и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола (Gibco, Paisley, Scotland)
Элиминация макрофагов/моноцитов
6
Стерильные 6-луночные планшеты (для клеточных культур) использовали для элиминации макрофагов и моноцитов за счет неспецифической адгезии. Каждую лунку заполняли не более чем 4 мл среды и вносили до 6×10 мононуклеарных клеток периферической крови иммунизированных кроликов и оставляли в течение 1 часа при 37°C в инкубаторе для связывания. 50% клеток супернатанта использовали для этапа сортировки; оставшиеся 50% клеток оставляли на льду до иммунофлуоресцентного окрашивания.
Обогащение B-клеток с использованием белкового антигена
6
6-луночные культуральные планшеты, покрытые белковым антигеном, засевали клетками в количестве до 6×10 клеток в 4 мл среды и оставляли в течение 1 часа при 37°C в инкубаторе для связывания. После этапа обогащения с использованием белкового антигена неприкрепившиеся клетки удаляли, осторожно промывая лунки 1-2 раза 1×PBS. Оставшиеся прилипшими клетки трипсинизировали в течение 10 мин при 37°C в инкубаторе и затем дважды промывали средой. Клетки оставляли на льду до иммунофлуоресцентного окрашивания.
Иммунофлуоресцентное окрашивание и проточная цитометрия (сортировка и анализ)
Для сортировки одиночных клеток использовали конъюгированное с FITC антитело к IgG кролика производства AbD Serotec (STAR121F, Дюссельдорф, Германия).
Для поверхностного окрашивания клетки инкубировали с меченным FITC антителом к IgG кролика при оптимальном разведении в PBS в течение 30 мин при помешивании при 4°C в темноте. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли путем аспирации. МКПК подвергали двум циклам центрифугирования и отмывки ледяным PBS. Наконец, МКПК ресуспендировали в ледяном PBS и немедленно анализировали методом FACS. Перед выполнением FACS-анализа добавляли пропидий иодид в концентрации 5 мкг/мл (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) для того, чтобы отделить мертвые клетки от живых. В других экспериментах окрашенные клетки осаждали поодиночке с использованием технологии FACS.
Для сбора и анализа данных использовали прибор FACS Aria производства Becton Dickinson, оборудованный компьютером и программным обеспечением FACSDiva (BD Biosciences, USA).
Исследование пролиферации
a) Исследование жизнеспособности с использованием набора Cell Titer Glo (CTG)
Набор для определения жизнеспособности CTG (Promega; #G7571) использовали согласно инструкциям производителя.
3
b) Исследование включения H тимидина
3
3
Через 6 дней инкубации добавляли H-тимидин (0,5 мкКи/лунку) и инкубировали еще в течение 16 часов. Включение H-тимидина в ходе клеточной пролиферации определяли при помощи сцинтилляционного счетчика клеток для счета в микропланшетах (Wallac).
c) Микроскопия
Для регистрации изображений, наблюдаемых в микроскопе, использовали фазово-контрастный микроскоп компании Leica (Leica DM IL), оборудованный камерой высокого разрешения (Leica DFC290 HD).
d) Анализ активации B-клеток при помощи окрашивания CFSE.
7
+
Выделенные B-клетки отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS). До 1×10 клеток ресуспендировали в 1 мл не содержащего белков PBS и инкубировали с CFSE (#C34554, Invitrogen/Molecular Probes) от 3 до 10 минут в конечной концентрации 2,5 мкМ при 37°C. Включение CFSE останавливали, добавляя избыточное количество среды, содержащей FCS. После тщательного отмывания в большом количестве среды, содержащей FCS, B-клетки использовали в экспериментах для совместного культивирования. Пролиферацию гейтированных CD19 (B-)клеток анализировали по разведению CFSE через определенные интервалы времени методом проточной цитометрии (канал FL-1).
Культивирование B-клеток
4
2
Культивирование B-клеток осуществляли способом, аналогичным, описанному Zubler, et al. (см., например, Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363; J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183). Вкратце, отсортированные одиночные B-клетки культивировали в 96-луночных планшетах, содержащих 210 мкл/лунку среды EL4 B5 с клетками золотистого стафилококка Pansorbin Cells (1:20000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland), 5% культуральным супернатантом тимоцитов кролика и гамма-облученными клетками тимомы мыши EL4-B5 (2×10/лунку) в течение 7 дней при 37°C в инкубаторе с содержанием 5% CO в атмосфере. Культуральный супернатант B-клеток отбирали для проведения скрининга, а клетки немедленно собирали для установления последовательности генов, кодирующих вариабельные домены, или замораживали при -80°C в 100 мкл буфера RLT (Qiagen, Hilden, Germany).
Человеческие B-клетки культивировали аналогичным способом. Фидерные клетки, экспрессирующие CD40L человека (клетки BHK), использовали для совместного культивирования с использованием указанных фидерных смесей.
Пример 1
Создание плазмид, экспрессирующих полноразмерный CD40L кролика
Аминокислотная последовательность гена CD40L кролика находится в базе данных GenBank под регистрационным номером XP_002720374 (SEQ ID NO: 01).
Последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК) восстанавливали по кодируемой ей аминокислотной последовательности.
Плазмида 7111
Генный сегмент, кодирующий синтезированную кДНК CD40L кролика клонировали в вектор, экспрессирующий кДНК. В данном экспрессирующем векторе экспрессия находится под контролем укороченного предраннего энхансера и промотора цитомегаловируса человека (HCMV, от англ. human cytomegalovirus) без интрона A, в вектор встроены 5'-нетранслируемый участок (UTR, от англ. untranslated region) тяжелой цепи иммуноглобулина человека, содержащий интрон A с донорными и акцепторными сайтами сплайсинга, ген полноразмерного CD40L кролика с его сигнальной якорной последовательностью и сильный сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. Экспрессионная плазмида также содержала сайт инициации репликации и ген β-лактамазы из вектора pUC18 для амплификации плазмиды в Escherichia coli.
Плазмида 7112
Плазмида 7112 была сконструирована аналогично плазмиде 7111, но дополнительно содержала ген резистентности к гигромицину для получения/селекции стабильно трансфецированных клеточных линий млекопитающих.
Пример 2
Получение клеток CHO-K1, экспрессирующих CD40L кролика
Согласно инструкциям производителя клетки CHO-K1 (АТСС CCL-61) трансфецировали плазмидой, кодирующей CD40L кролика (#7112) (например, используя метод липофекции или набор Nucleofector kit T (Lonza, ранее Amaxa, VCA-1002) и программу Nucleofector U-17). После трансфекции клетки культивировали в 6-луночных планшетах в течение 24 часов перед добавлением 0,5 мг/мл гигромицина для создания селективного давления. Через две недели после трансфекции в среду добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки (об/об). После этапа экспансии и селекции в течение пяти недель трансфецированные клетки анализировали на приборе FACS Aria с использованием поликлонального перекрестно реагирующего первичного антитела козы к CD40L мыши (R&D Systems; AF1163) и вторичного антитела к IgG козы (Alexa488-labeled; Molecular Probes; #A11055). Клетки с наибольшей средней интенсивностью флуоресценции (5% популяции) использовали для сортировки одиночных клеток в круглодонные 96-луночные планшеты. После дополнительной экспансии в течение двух недель клоны анализировали методом FACS для определения уровня экспрессии CD40L кролика.
Клетки BHK, экспрессирующие CD40L человека, были получены аналогичным образом.
Пример 3
Облучение фидерных клеток в целях совместного культивирования
Клоны CHO, стабильно экспрессирующие CD40L кролика, выращивали при селективном давлении (0,5 мг/мл гигромицина) в среде CHO rbCD40L и хранили в жидком азоте до последующего использования.
6
4
За два пассажа до использования клеток в качестве стимуляторов для сортированных кроличьих B-клеток из среды удаляли гигромицин и за день до начала совместного культивирования среду заменяли на среду для кроличьих B-клеток. Клетки собирали и доводили концентрацию клеток до 1×10/мл перед γ-облучением в дозе 50 Гр. Затем 1×10 клеток высаживали в круглодонные 96 луночные планшеты в объеме 100 мкл на лунку, центрифугировали в течение 1 мин при 500 g и инкубировали в течение ночи при 37°C.
Пример 4
Процедура выделения первичных антителосекретирующих клеток (АСК) из периферической крови кролика
Для выделения кроличьих B-клеток использовали цельную кровь неиммунизированных белых новозеландских кроликов.
+
+
В некоторых подходах на первом этапе выделяли популяцию лимфоцитов путем центрифугирования в градиенте плотности растворов Lympholyte (Biozol; #CL5120) или Ficoll Paque Plus (GE Healthcare, cat. #17-1440-03). На втором этапе лимфоциты кролика инкубировали с меченным FITC антителом, специфическим к IgG кролика (в конечной концентрации 10 мкг/мл; STAR121F; Serotec). Затем FITC клетки (клетки rblgG) очищали с использованием микрогранул, конъюгированных с антителами к FITC (#130-048-701; Miltenyi Biotec) (осаждение пула клеток).
+
В других подходах ("осаждение одиночных клеток"), FITC клетки отбирали при помощи технологии FACS (см. Материалы и методы).
Пример 5
Разработка системы совместного культивирования
Как правило, в предварительных экспериментах стимулирующие клетки и кроличьи B-клетки совместно культивировали в соотношении 2:1.
2
Одиночные кроличьи B-клетки сортировали в приготовленные планшеты, содержащие стимулирующие клетки, используя FACS Aria, как описано в Примере 4. Для совместного культивирования одиночных B-клеток помещали одну кроличью B-клетку на монослой 10000 облученных фидерных клеток. В указанных случаях добавляли фидерную смесь (например, стандартными добавками были IL-21 в концентрации 25 нг/мл, IL-2 в концентрации 50 Ед/мл и SAC в разведении 1:10000) в 100 мкл среды для B-клеток и культуры оставляли расти в течение 6 дней при 37°C и 5% CO.
Пример 6
Оценка продукции антител при помощи ИФА, специфического в отношении IgG
После совместного культивирования 150 мкл культурального супернатанта переносили для последующего определения IgG кролика. Выращенные кроличьи B-клетки хранили в жидком азоте в 96-луночном формате, добавляя эмбриональную телячью сыворотку и DMSO.
Как вариант, длительность инкубации увеличивали до 11-14 дней. В этом случае добавляли 150 мкл свежеприготовленной среды для B-клеток кролика с фидерной смесью и SAC, а в супернатанте вновь определяли концентрацию IgG кролика.
Пример 7
+
Культивирование IgG B-клеток кролика
+
Отсортированные одиночные lgG B-клетки кролика культивировали либо вместе с клетками тимомы мыши линии EL4-B5 и культуральным супернатантом тимоцитов кролика (TSN) и SAC, либо в присутствии линии клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика (10000 клеток/лунку; с добавлением или без добавления SAC) в течение 1 недели. TSN заменяли рекомбинантными цитокинами IL-2 и IL-21.
+
Через 6 дней выполняли ИФА, специфический к IgG кролика, и вычисляли количество лунок, позитивных в отношении lgG кролика (в процентах от общего количества лунок) (определение продуктивности rblgG).
Результаты:
+
Количество лунок, позитивных в отношении lgG кролика, выраженное в процентах, было выше при совместном культивировании с клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, и смесью IL-2 и IL-21 (7,1% против 6,7% при совместном культивировании с клетками EL4-B5). Разница увеличивалась при добавлении SAC к клеткам CHO, экспрессирующим CD40L кролика (17,9% против 6,7%). Аналогичные результаты были получены с использованием кроличьих B-клеток из разных раундов иммунизации различными антигенами, как показано в следующей Таблице.
+
+
При совместном культивировании двойных позитивных lgGCD138 отсортированных B-клеток в системе rbCD40L с добавлением цитокинов и SAC не наблюдалось образования клонов B-клеток, продуцирующих IgG. Совместное культивирование с клетками EL4-B5 (включая TSN и SAC) приводило к образованию клонов B-клеток и продукции IgG, как показано в следующей Таблице (22,2% в сравнении с отсутствием значимой наблюдаемой пролиферации и 6,0%).
Пример 8
Искусственная система культивирования кроличьих B-клеток
+
Кроличьи lgG B-клетки в количестве 2500 клеток/лунку культивировали совместно с облученными клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика или клетками EL4-B5 (по 5000 в каждом случае) без добавления TSN. Помимо совместного культивирования в отсутствие каких-либо добавок, сравнивали эффект рекомбинантного человеческого IL-2 и смеси Zubler. Через 7 дней совместного культивирования определяли пролиферацию B-клеток с использованием набора CTG, как описано ранее. Совместное культивирование с использованием клеток rbCD40L вызывало пролиферацию B-клеток (см. следующие ниже Таблицу и Фиг. 1). Следует отметить, что добавление IL-2 усиливало пролиферацию больше, чем добавление т.н. смеси Zubler.
Кроличьи B-клетки в количестве 500 клеток на лунку культивировали в соотношении 1:10 с указанными фидерными клетками и активаторами (см. Таблицу ниже). Через 7 дней культивирования кроличьих B-клеток вместе с клетками CHO, экспрессирующими rbCD40L, наблюдалось улучшение клеточной пролиферации по сравнению с клетками, не экспрессирующими CD40L (определение методом CTG).
Пролиферативный эффект обнаруживался в присутствии фидерных клеток, экспрессирующих rbCD40L. В целом, добавление рекомбинантного IL-2 и IL-21 усиливало рост клеток. В этих условиях добавление SAC не вызывало дальнейшего улучшения. Напротив, в других условиях добавление SAC незначительно улучшало пролиферацию. В отличие от этого, ни IL-2, ни IL-21, ни их сочетание не улучшало результатов совместного культивирования с клетками EL4-B5. Репрезентативные лунки показаны на Фиг. 2, максимальная пролиферация и клеточная плотность наблюдались при совместном культивировании с клетками rbCD40L (и указанными цитокинами/смесями). В том же эксперименте с использованием тех же самых систем совместного культивирования через 7 дней наблюдалось усиление продукции IgG кролика. Эффект наблюдался в присутствии клеток, экспрессирующих rbCD40L, а также при добавлении IL-21 или комбинации IL-2/21 (см. Таблицу ниже).
+
+
В двух отдельных экспериментах отсортированные одиночные и пулированные кроличьи B-клетки культивировали совместно с клетками EL4-B5 или клетками, экспрессирующими rbCD40L, в присутствии TSN и SAC, а также IL-2/IL-6/IL-21 в различных комбинациях. Результаты показаны в следующей ниже Таблице (подсчитывали количество лунок, в которых определялся продуцируемый IgG кролика). Комбинация фидерных клеток, экспрессирующих rbCD40L, с TSN и SAC не вызывала выработку IgG, сопоставимую с системой EL4-B5. С другой стороны, при совместном культивировании кроличьих B-клеток с клетками, экспрессирующими rbCD40L, и комбинацией указанных цитокинов, таких как (hu) IL-2 и IL-21 продукция IgG существенно возрастала (показано процентное содержание или количество lgG лунок). При добавлении только SAC и стимулирующих клеток rbCD40L позитивные IgG лунки не детектировались. Добавление SAC усиливало ответ в виде продукции IgG фидерной системой rbCD40L с добавлением IL-2/21 (см. следующие ниже Таблицы).
Пример 9
Система для получения антител, ингибирующих T клетки
В ответ на иммунизацию антигеном, специфическим для T-клеток, вырабатывается пул антител, которые не только связываются с заданным антигеном, но также могут обладать потенциальным агонистическим эффектом. Если полученное антитело отрицательно воздействует на биологическую активность T-клеток, оно также будет отрицательно воздействовать на фидерную систему в случае, если система культивирования основана на использовании T-клеток (например, линия клеток тимомы EL4-B5).
Отсортированные одиночные B-клетки, например, кроличьи или человеческие, совместно культивировали либо с фидерными клетками EL4-B5, либо с клетками, экспрессирующими CD40L (см., например, Пример 5). Таким образом, отсортированные одиночные B-клетки получены от животных, иммунизированных антигеном Т-клеток.
Отсортированные одиночные B-клетки культивировали вместе с указанными фидерными смесями. Приблизительно через 7 дней совместного культивирования определяли количество клонов B-клеток, а в культуральной надосадочной жидкости определяли содержание IgG (как описано в Материалах и Методах и в Примере 6).
Совместное культивирование можно осуществлять с (отсортированными одиночными или пулированными) B-клетками, полученными от человека, животного дикого типа или трансгенного животного после иммунизации антигенами, например, известными своими суппрессивными свойствами в отношении Т-клеток.
Пример 10
Разработка системы последовательного культивирования B-клеток
Отсортированные одиночные B-клетки, полученные у иммунизированных млекопитающих, культивировали совместно с облученными клетками, экспрессирующими CD40L. На первой фазе культивирования добавляли различные митогенные факторы (например, цитокины) (см. перечень ниже) и совместное культивирование продолжали в присутствии митогенных факторов на протяжении от 1 до 14 дней. После окончания первой фазы культивирования митогенные факторы удаляли из культуральной среды (путем замены культуральной среды на среду, не содержащую митогенных факторов, и/или отмывания клеток или путем диализа или центрифугирования/оседания) и культивирование продолжали в присутствии стимулятора продукции антитела (см. перечень ниже). Концентрацию IgG в культуральной надосадочной жидкости определяли на второй фазе культивирования через 3 или 5 или 7 или 21 день совместного культивирования.
Стимулятор митоза может быть выбран из группы, включающей взаимодействующие с CD40 и CD40L соединения, взаимодействующие с ICOS и ICOS-L соединения, APRIL, BAFF, CR2, CXCL9, CXCL12 (SDF-1), CXCL13, CXCL16, Flt-3L, интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-7, интерлейкин-10, интерлейкин-14, интерлейкин-21, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus Aureus Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды TLR, такие как LPS, различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG или резиквимод (R-848), TSLP, фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β) и интерфероны II типа (например, IFNγ), образующие перекрестные сшивки антитела к IgG, образующие перекрестные сшивки антитела к CD20 и образующие перекрестные сшивки антитела к CD27.
Стимулятор продукции антител может быть выбран из группы, включающей взаимодействующие с CD40 и CD40L соединения, взаимодействующие с ICOS и ICOS-L соединения, APRIL, BAFF, CR2, CXCL9, CXCL12 (SDF-1), CXCL13, CXCL16, Flt-3L, интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-9, интерлейкин-10, интерлейкин-13, интерлейкин-21, интерлейкин-33, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus Aureus Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды TLR, такие как LPS, различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG или резиквимод (R-848), TSLP, фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β), интерфероны II типа (например, IFNγ), образующие перекрестные сшивки антитела к IgG, образующие перекрестные сшивки антитела к CD20 и образующие перекрестные сшивки антитела к CD27.
Пример 11
Система совместного культивирования для получения человеческих антител
Влияние различных цитокинов, способствующее пролиферации человеческих B-клеток в присутствии клеток BHK, экспрессирующих CD40L человека, исследовали, как описано в Примерах выше.
5
Выделенные с использованием фиколла МКПК (2×10) высаживали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 8 дней в присутствии указанных активаторов. Как вариант, добавляли антитела к CD3/CD28 для поликлональной активации T-клеток. Как видно из следующей ниже Таблицы, рекомбинантный человеческий IL-21 вызывал максимальную продукцию IgG (независимо от дополнительной активации T-клеток).
+
Выделенные человеческие периферические IgG B-клетки (750 на лунку и 2500 на лунку, соответственно) культивировали совместно с γ-облученными клетками BHK, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии различных активаторов (см. Таблицу ниже и Фиг. 3).
+
+
Следует отметить, что выделенные lgG B-клетки памяти (выделенные с использованием набора MACS #130-094-350), так же как и lgG B-клетки (выделенные прямым методом с использованием микрогранул, конъюгированных с антителами к IgG (набор MACS #130-047-501) отвечали на различные активаторы аналогичным образом. Добавление IL-21 отдельно (или в комбинации) улучшало пролиферативный ответ через 8 дней совместного культивирования. Ко-стимуляция IL-2, IL-6 или их комбинацией не усиливала эффект, так же как и добавление SAC.
Продукцию IgG исследовали в надосадочной жидкости. В следующей ниже Таблице показано, что добавление IL-21 и его комбинаций улучшало продукцию IgG при совместном культивировании с клетками BHK, экспрессирующими huCD40L.
Кроме того, оценивали пролиферацию интактных выделенных человеческих B-клеток. B-клетки выделяли из МКПК с использованием набора Dynal Kit 113.13D (Invitrogen), подсчитывали и культивировали меченные CFSE B-клетки в количестве 90000 на лунку совместно с γ-облученными клетками BHK, экспрессирующими CD40L человека (CFSE-негативными). Результаты приведены в следующей ниже Таблице и на Фиг. 4.
Абсолютное количество клеток увеличивалось при добавлении только IL-21 или IL-2/IL-21 или IL-21/IL-6/IL-21.
+
На репрезентативных точечных диаграммах показано разведение CFSE, которое оценивали методом FACS, как показатель пролиферации (см. Фиг. 5): добавление IL-21 или комбинации IL-21 с IL-2 и IL-2/-6 усиливало пролиферацию B-клеток (показаны гейтированные CD19 клетки).
Интактные человеческие наивные B-клетки, лишенные активированных B-клеток, Т-клеток, NK-клеток, моноцитов, макрофагов, гранулоцитов, тромбоцитов, плазматических клеток и эритроцитов (Dynal kit, Invitrogen, #113.13D), использовали для совместного культивирования с γ-облученными клетками BHK, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии различных дополнительных активаторов. Пролиферация B-клеток, которые исходно вносили в количестве 50000 клеток/лунку, показана в Таблице ниже.
Добавление IL-21 (отдельно или в комбинации с IL-2 и/или IL-6) улучшало пролиферацию B-клеток.
Пример 12
Система культивирования B-клеток с использованием SAC
4
Выделенные человеческие B-клетки (5×10 клеток/лунку, выделенные из наивных МКПК человека с использованием набора для отрицательной селекции B-клеток (#113.13D, Invitrogen)) культивировали в круглодонных 96-луночных планшетах и инкубировали в течение 6 дней в присутствии указанных добавок перед определением пролиферации (методом CTG) или продукции IgG человека (ИФА). Результаты приведены в следующей ниже Таблице.
Следует отметить, что SAC в комбинации с IL-2 и в меньшей степени комбинация IL-2 и IL-6 улучшала пролиферацию B-клеток и продукцию IgG. Репрезентативные кластеры B-клеток через 3 дня инкубации показаны на Фиг. 6.
При использовании пула очищенных периферических кроличьих B-клеток добавление SAC усиливало пролиферацию B-клеток (см. следующие Таблицы).
Добавление SAC также усиливало продукцию IgG культивируемыми B-клетками (количество lgG-положительных лунок и/или секрецию IgG).
Пример 13
Совместное культивирование кроличьих B-клеток
+
Кроличьи IgG B-клетки в количестве 500 клеток/лунку культивировали совместно с γ-облученными клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, или γ-облученными клетками CHO-K1 (по 10000 в каждом случае) без добавления TSN. Помимо совместного культивирования в отсутствие каких-либо добавок, сравнивали эффект рекомбинантного человеческого IL-2, рекомбинантного мышиного IL-2, рекомбинантного человеческого IL-21, рекомбинантного мышиного IL-21 и их комбинаций. Через 7 дней совместного культивирования в супернатанте B-клеток определяли титр антител при помощи ИФА, как описано ранее. Совместное культивирование с использованием клеток rbCD40L в присутствии IL-2 и IL-21 вызывало пролиферацию B-клеток и секрецию антитела (см. Фиг. 7 и 8).
Пример 14
Совместное культивирование кроличьих B-клеток
+
B-клетки, выделенные из замороженных и размороженных кроличьих IgG МКПК, в количестве 500 клеток на лунку культивировали совместно с γ-облученными клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, или с γ-облученными клетками CHO-K1 (по 10000 в каждом случае) без добавления TSN. Помимо совместного культивирования в отсутствие каких-либо добавок сравнивали эффект рекомбинантного человеческого IL-2, рекомбинантного мышиного IL-2, рекомбинантного человеческого IL-21, рекомбинантного мышиного IL-21 и их комбинаций. Через 7 дней совместного культивирования в супернатанте B-клеток определяли титр антител при помощи ИФА, как описано ранее. Совместное культивирование с использованием клеток rbCD40L в присутствии IL-2 и IL-21 вызывало пролиферацию B-клеток и секрецию антитела (см. Фиг. 9 и 10).
Пример 15
Искусственная система культивирования кроличьих B-клеток
Низкая плотность B-клеток:
+
Кроличьи IgG B-клетки в количестве 500 клеток/лунку (полученные у кроликов NZW) культивировали совместно с γ-облученными клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, или с γ-облученными клетками CHO-K1 (по 10000 в каждом случае) без добавления TSN. Помимо совместного культивирования в отсутствие каких-либо добавок сравнивали эффект рекомбинантного человеческого IL-2, рекомбинантного мышиного IL-2, рекомбинантного человеческого IL-21, рекомбинантного мышиного IL-21 и их комбинаций. Через 7 дней совместного культивирования в супернатанте B-клеток определяли титр антител при помощи ИФА, как описано ранее. Совместное культивирование с использованием клеток rbCD40L в присутствии IL-2 и IL-21 вызывало пролиферацию B-клеток и секрецию антитела (см. Фиг. 11 и 12).
Высокая плотность B-клеток:
+
Кроличьи lgG B-клетки в количестве 2500 клеток/лунку (полученные у тех же кроликов NZW, что и в предыдущем эксперименте с низкой плотностью) культивировали совместно с γ-облученными клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, или с γ-облученными клетками CHO-K1 (по 10000 в каждом случае) без добавления TSN. Помимо совместного культивирования в отсутствие каких-либо добавок сравнивали эффект рекомбинантного человеческого IL-2, рекомбинантного мышиного IL-2, рекомбинантного человеческого IL-21, рекомбинантного мышиного IL-21 и их комбинации. Через 7 дней совместного культивирования в супернатанте B-клеток определяли титр антител при помощи ИФА, как описано ранее. Совместное культивирование с использованием клеток rbCD40L в присутствии IL-2 и IL-21 вызывало пролиферацию B-клеток и секрецию антитела (см. Фиг. 14).
Пример 16
Кинетический анализ искусственной системы культивирования B-клеток
+
+
Кроличьи IgG клетки выделяли из МКПК цельной крови кроликов NZW путем обогащения с помощью магнитной сепарации, как описано в Примере 4. Кроличьи B-клетки в количестве 500 клеток на лунку культивировали в соотношении 1:20 с γ-облученными фидерными клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, или с контрольными γ-облученными фидерными клетками CHO-K1 (по 10000 в каждом случае; полученными, как описано в Примерах 1-3) в присутствии или в отсутствие IL-2, IL-21 или комбинации IL-2 и IL-21 (одинакового или различного происхождения, например, мышиного и человеческого). Через 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 дней культивирования (d1-d7) у кроличьих B-клеток, культивируемых совместно с клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, оценивали продукцию IgG кролика в супернатанте и клеточную пролиферацию. Эти результаты сравнивали с данными, полученными при культивировании совместно с фидерными клетками, не экспрессирующими CD40L, и/или в отсутствие дополнительных экзогенных активаторов (тех же самых интерлейкинов в отдельном виде или в комбинации). Кинетику роста и пролиферации определяли методом CTG и микроскопии (см. выше).
Интерлейкины применяли/использовали в следующих конечных концентрациях:
- мышиный IL-2 в концентрации 50 Ед/мл (Roche Diagnostics GmbH, кат. #11271164001)
- человеческий IL-2 в концентрации 50 Ед/мл (Roche Diagnostics GmbH, кат. #11147528001)
50
- человеческий IL-21 в диапазоне от 1 до 3 концентраций ED, (полумаксимальных эффективных концентраций), что составляло 10-100 нг/мл, в зависимости от партии IL-21 (eBioscience, кат. #14-8219)
- мышиный IL-21 в концентрации 100 нг/мл (R&D Systems, кат. #594-ML).