Антиоксидантная и мембраностабилизирущая активность комплексного гепатозащитного растительного средства «Гепатон»

УДК 615.32.-092:616.61

С.В. Лемза, Т.А. Ажунова, С.М. Николаев

АНТИОКСИДАНТНАЯ И МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЩАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСНОГО ГЕПАТОЗАЩИТНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА «ГЕПАТОН»

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ

В опытах in vitro установлена мембраностабилизирующая и антиоксидантная активность комплексного гепатозащитного растительного средства «Гепатон». Показано, что испытуемое средство ингибирует, процессы, свободнорадикального окисления биомакромолекул, повышает активность ферментов антиоксидантной защиты.

Ключевые слова: «Гепатон», перекисный гемолиз эритроцитов, перекисное окисление липидов, ферменты антиоксидантной защиты

ANTIOXIDATIVE AND MEMBRANE STABILIZING ACTIVITY OF MULTICOMPONENT HEPATOPROTECTIVE PLANT REMEDY «HEPATON»

S.V. Lemza, T.A. Azhunova, S.M. Nikolaev

Institute of General and Experimental Biology, SB RAS, Ulan-Ude

Membrane stabilizing and antioxidative activity of «Hepaton» — a complex plant hepatoprotective remedy, has been established, in vitro experiments. The remedy under study was shown to inhibit the free radical oxidation of biomacromolecules and increase the activity of antioxidative enzymes.

Key words: «Hepaton», red cells peroxidative hemolysis, lipid peroxidation, antioxidative enzymes

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время накопилось достаточно сведений о том, что практически во всех живых организмах в процессы жизнедеятельности включаются окислительно-восстановительные реакции. При этом образуются активированные производные молекулярного кислорода, которые участвуют в реакциях свободнорадикального окисления, в том числе и перекисного окисления липидов (ПОЛ). Избыточное накопление активных форм кислорода приводит к нарушению физиологического функционирования систем антиоксидантной защиты, что вызывает повреждение и химическую модификацию биомакромолекул и приводит к развитию дисфункции клеток и тканей организма [1]. Активные формы кислорода повреждают различные белки и ферменты, что нарушает биокаталити-ческие процессы; влияют на генетический аппарат клетки, деструктурируют ДНК и нарушают ее синтез. Однако одними из самых чувствительных к действию свободнорадикальных форм компонентов клетки являются входящие в состав фосфолипидов клеточных и субклеточных мембран ненасыщенные жирные кислоты. Взаимодействие свободных радикалов с полиненасыщенными жирными кислотами приводит к цепным реакциям, известным как переокисление липидов ненасыщенных жирных кислот [8]. Для уменьшения окислительного стресса используют природные и синтетические антиоксиданты различной химической структуры. Соответственно, это определяет как величину антиоксидантного эффекта, так и мишени действия антиоксидантов при коррекции антиокислительного стресса [4]. Такая взаимосвязь может оказаться полезной при разработке новых

антиоксидантных лекарственных препаратов. По наличию в структуре молекул определенных функциональных групп, связанных с антиоксидантным эффектом, антиоксиданты можно сгруппировать в пять основных категорий: доноры протона (фла-воноиды, фенолокислоты, тиолы, аскорбиновая кислота); полиены (ретиноиды, каротиноиды); катализаторы (супероксиддисмутаза); ловушки радикалов (фенил-трет-бутилнитрон); комплексоо-бразователи (этилендиаминтетрауксусная кислота, карнозин, изоникотиноильные соединения и др.) [6]. При повреждении печени выявляется высокая активность перекисного окисления липидов (ПОЛ), резко снижается функциональная состоятельность ферментной антиоксидантной защитной системы (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза, восстановленный глутатион), возникает своеобразный «антиоксидантный» голод в организме, благодаря которому поддерживается высокая интенсивность свободнорадикальных процессов.

В этой связи перспективным направлением представляется разработка гепатозащитных лекарственных средств, предупреждающих окислительное повреждение мембранного аппарата гепатоцитов.

Цель работы — определение антиоксидантной и мембраностабилизирующей активности комплексного растительного средства «Гепатон».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН на основе прописей тибетской медицины разработано и получено гепатопротекторное средство, (условное название «Гепатон»), состоящее из экстрактов сухих цветков ромашки аптечной (Matricaria recutita L.), листьев мяты перечной (Mentha

piperitaL.), плодов шиповника (Rosasp., плодов боярышника (Crataegus sp.), травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), корней солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch.), корневищ и корней девясила высокого (Inula helenium L.) в соотношениях 10:10:30: 20: 10: 10:10 соответственно.

В качестве объекта исследования была использована 1% суспензия отмытых эритроцитов донорской крови. Мембраностабилизирующую активность «Ге-патона» оценивали по степени гемолиза эритроцитов, который вызывали реактивом Фентона (перекисный гемолиз) и добавлением воды дистиллированной (осмотический гемолиз) [3]. Для изучения влияния «Гепатона» на активность ферментов антиоксидант-ной защиты и энергетического обмена применялись биотест-системы с использованием ферментов глута-тионредуктазы (ГР), каталазы (КАТ), глутионперокси-дазы (ГП), а также пируваткиназы (ПК) [7]. Испытуемое средство в пробу добавляли в концентрациях 5, 10, 50 и 100 мкг/мл. Исследование влияния «Гепатона» на кинетику Fe2+-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) проводилось с использованием 1% суспензии липосом яичного желтка, получаемой по методу [2].

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами вариационной статистики с использованием параметрического критерия Стъюдента. Различия между опытными и контрольными группами считали достоверными при Р< 0,05 [5].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании мембраностабилизирующей активности «Гепатона» установлено, что данное средство предупреждает гемолиз эритроцитов донорской крови. Как следует из данных, приве-

денных в таблице 1, «Гепатон» в указанных концентрациях оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие, о чем свидетельствовали уменьшение степени перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов.

Наиболее высокая мембраностабилизирующая активность «гепатона» отмечалась при использовании его в дозе 50 мг/мл; в этом случае перекисный гемолиз эритроцитов уменьшался в 2,2 раза по сравнению с контролем. «Гепатон» в концентрациях 50 и 100 мг/мл заметно уменьшал осмотический гемолиз эритроцитов.

Использование ферментативных тест-систем in vitro показало, что «гепатон» в исследованных концентрациях обладает широкой биологической активностью, стимулируя активность отдельных ферментов антиоксидантной защиты и энергетического обмена (табл. 2). Так процент стимуляции глутатионпероксидазной активности под влиянием испытуемого средства в концентрациях от 5,0 до 100,0 мкг/мл составлял соответственно 53, 73, 40 и 33 % по сравнению с контрольной пробой без добавления испытуемого средства. Более выраженный активирующий эффект установлен в отношении пируваткиназы: ее активность под влиянием «ге-патона« в концентрациях 10,0 и 50,0 мкг/мл увеличивалась соответственно на 31 и 34 % по сравнению с контрольной пробой. При этом показано, что на активность глутатионредуктазы и каталазы испытуемое средство в указанных концентрациях и условиях существенного влияния не оказывало.

Таким образом, одновременное увеличение глутатионпероксидазной и пируваткиназной активности свидетельствует о наличии у испытуемого средства антиоксидантной активности и способности к стимуляции энергетических процессов.

Таблица 1

Влияние «Гепатона» на перекисный и осмотический гемолиз эритроцитов

Условия опыта Доза, мг/мл Перекисный гемолиз, % Осмотический гемолиз, %

Контроль (гемолиз) - 0,84 ± 0,02 0,82 ± 0,03

25 0,51 ± 0,02* 0,79 ± 0,04

Опыт (гемолиз+ «гепатон») 50 0,38 ± 0,03* 0,59 ± 0,02*

100 0,71 ± 0,03* 0,66 ± 0,04*

Примечание: * - здесь и далее разница достоверна по сравнению с показателями в контроле при Р < 0,05.

Таблица 2

Влияние «Гепатона» на скорость ферментативных реакций

Условия опыта Концентрация, мкг/мл Скорость реакции, мкмоль/мг мин

ГР КАТ ГП ПК

Контроль - 13,4 ± 0,17 10,7 ± 0,91 1,5 ± 0,03 3,8 ± 0,30

«Гепатон» 5,0 13,4 ± 1,05 10,6 ± 0,72 2,3 ± 0,32* 4,5 ± 0,35

- « - 10,0 13,5 ± 0,38 9,6 ± 0,47 2,6 ± 0,12* 5,0 ± 0,38*

- « - 50,0 15,1 ± 0,09 9,9 ± 0,62 2,1 ± 0,19* 5,1 ± 0,30*

- « - 100,0 14,7 ± 0,39 9,7 ± 0,61 2,1 ± 0,10* 2,7 ± 0,24

- « - 1000,0 14,5 ± 0,40 9,2 ± 0,19 2,0 ± 0,15 1,5 ± 0,09

Таблица 3

Влияние «Гепатона» на параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции суспензии липосом

Условия опыта Концентрация, мг/мл Показатели

I б.в., усл. ед. 8, усл. ед.

Контроль - 7,1 ± 0,49 0,94 ± 0,072

Опыт (Гепатон) 0,05 4,2 ± 0,32* 0,71 ± 0,025*

0,10 3,8 ± 0,18* 0,63 ± 0,036*

0,20 3,3 ± 0,15* 0,52 ± 0,037*

Как следует из данных, приведенных в таблице 3, «Гепатон» в исследованных концентрациях оказывает существенное ингибирующее влияние на кинетику Бе2+-индуцированной хемилюминесценции липосом, о чем свидетельствовало уменьшение амплитуды «быстрой вспышки» и снижение скорости ХЛ. Так, при внесении в инкубационную среду испытуемого средства в концентрации 0,05 мг/мл отмечалось уменьшение показателя I б.в. в 1,7 раза, а также снижение скорости ХЛ на 25 % по сравнению с аналогичными показателями контрольных проб. При увеличении концентрации фитоэкстракта выраженность ингибирования ХЛ повышалась: при внесении «Гепатона» в концентрациях 0,10 и 0,20 мг/мл амплитуда «быстрой вспышки» уменьшалась в 1,9 и 2,2 раза по сравнению с контролем. Скорость ХЛ при внесении «Гепатона» в концентрации 0,10 мг/мл снижалась в 1,5 раза, а при его использовании в концентрации равной 0,20 мг/мл — в 1,8 раза. При определении антиоксидантной активности (АОА) «Гепатона» установлено, что его антиоксидантная активность равнялась 18,70 (г/л)-1, что свидетельствует о достаточно выраженной АОА испытуемого средства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, «Гепатон», проявляющий антиоксидантную активность и повышая активность антиокислительной защиты организма, является протектором функциональной активности мембран клеток и субклеточных структур (проницаемость, биоэнергетика, функционирование нуклеиновых кислот, синтез белка и др.). Можно предположить, что «Гепатон», содержащий в своем составе важнейшие биологически активные вещества фенольной природы, может регулировать гомеостаз в организме путем ингибирования патогенного действия свободных радикалов, а при образовании высоких концентраций активных форм кислорода необходим для профилактики и лечения многих заболеваний, сопровождающихся оксидативным стрессом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антиоксидантная активность лекарственных субстанций и биологически активных веществ / Азам Нисрин, О.А. Горошко, В.П. Пахомов и др. // Традиционная медицина. — 2009. — № 1. — С. 35-38.

2. Влияние антиоксидантов на быструю вспышку Ре2+-индуцированной хемилюминесценции / П.В. Сергеев, А.Г. Белых, С.А. Чукаев и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1992. - № 2. - С. 60-62.

3. Влияние эномеланина на гемолиз эритроцитов, вызываемый свободнорадикальными реакциями и другими факторами / И.Е. Ковалев, Н.П. Данилова, С.А. Андронати, Ю.Л. Жеребин // Фармакология и токсикология. - 1986. - № 4. -С. 89-91.

4. Зайцев В.Г. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия / В.Г. Зайцев, О.В. Островский, В.И. Закревский // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003. - № 4. - С. 66-70.

5. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М., 1990. - 352 с.

6. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, В.З. Ланкин и др. - Новосибирск, 2008. - 284 с.

7. Применение специфических ферментных биотест-систем in vitro для выявления целевой биологической активности фармакологически активных веществ / М.С. Бродова, М.Ф. Минеева, Н.Б. Дороничева и др. // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2004. - № 1-2. -С. 24-30.

8. Сейфула Р.Д. Антиоксиданты / Р.Д. Сейфу-ла, Е.А. Рожкова, Е.К. Ким // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - № 3. -С. 60-64.

Сведения об авторах

Лемза Сергей Васильевич - Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии, кандидат биологических наук. 670042, г Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6. р.т. 43-34-63.

Ажунова Татьяна Александровна - Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии, доктор биологических наук. 670042, г Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6. р.т. 43-34-63.

Николаев Сергей Матвеевич - Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, заведующий Отделом биологически активных веществ, доктор медицинских наук, профессор. 670047, г. Улан-Удэ, ул Сахьяновой, 6. р.т. 43-34-63.