СОСТАВ ПРЕПАРАТА НЕЙРЕГУЛИНА
COMPOSITION OF NEUREGULIN PREPARATION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001]
В целом, изобретение относится к фармацевтическим препаратам для лечения сердечно-сосудистого заболевания, например, сердечной недостаточности. В частности, настоящее изобретение относится к составу препаратов нейрегулина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Сердечная недостаточность поражает приблизительно пять миллионов американцев, и более чем 550000 новых пациентов ставят диагноз этого состояния каждый год. Существующая в настоящее время медикаментозная терапия сердечной недостаточности направлена, главным образом, на ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (ACE), являющиеся вазодилататорами, заставляющими кровеносные сосуды расширяться, понижая кровяное давление и нагрузку на сердце. Хотя процентная доля снижения смертности является значимой, фактическое снижение смертности с использованием ингибиторов ACE в среднем составляет лишь 3-4%, и существует несколько потенциальных побочных эффектов. Дополнительные ограничения связаны с другими вариантами профилактики или лечения сердечной недостаточности. Например, трансплантация сердца, безусловно, является более дорогостоящей и инвазивной, чем медикаментозное лечение, и она дополнительно ограничена доступностью донорских сердец. Использование механических устройств, таких как бивентрикулярные электрокардиостимуляторы, аналогично, является инвазивным и дорогостоящим. Таким образом, существует потребность в новых способах терапии с учетом недостатков существующих способов терапии.
[0003]
in vivo
Один новый многообещающий способ терапии включает введение нейрегулина (далее в настоящем описании обозначаемого как "NRG") пациенту, страдающему или имеющему риск развития сердечной недостаточности. NRG, семейство EGF-подобных факторов роста, включает семейство структурно родственных факторов роста и дифференцировки, включающих NRG1, NRG2, NRG3 и NRG4 и их изоформы, участвующих в ряде биологических ответов: стимуляции дифференцировки злокачественных клеток молочной железы и секреции белков молока; индукции дифференцировки клеток нервного гребня в шванновские клетки; стимуляции синтеза клетками скелетных мышц рецепторов ацетилхолина и стимуляции выживаемости клеток миокарда и синтеза ДНК. Исследования  на эмбрионах мышей, гомозиготных по воздействию на ген нейрегулина, с тяжелыми дефектами образования трабекул желудочков и развития дорсальных корешковых ганглий свидетельствуют о том, что нейрегулин важен для развития сердца и нервной системы.
[0004]
NRG связываются с семейством рецепторов EGF, включающим EGFR, ErbB2, ErbB3 и ErbB4, каждый из которых играет важную роль во множестве клеточных функций, включая рост, дифференцировку и выживаемость клеток. Они являются протеиновыми тирозинкиназными рецепторами, состоящими из внеклеточного связывающего лиганд домена, трансмембранного киназного домена и цитоплазматического тирозинкиназного домена. После связывания NRG с внеклеточным доменом ErbB3 или ErbB4 он индуцирует конформационное изменение, приводящие к образованию гетеродимера между ErbB3, ErbB4 и ErbB2 или образованию гомодимера между самими ErbB4, что приводит к фосфорилированию C-концевого домена рецептора внутри клеточной мембраны. Затем фосфорилированный внутриклеточный домен связывается с дополнительными сигнальными белками внутри клетки, активирующими соответствующий нижележащий путь передачи сигнала AKT или ERK и индуцирующими серию клеточных реакций, таких как стимуляция или подавление пролиферации клеток, дифференцировки клеток, апоптоза клеток, миграции клеток или адгезии клеток. Среди этих рецепторов, ErbB2 и ErbB4, в основном, экспрессируются в сердце.
[0005]
.
Показано, что EGF-подобные домены NRG-1, имеющие диапазон размеров от 50 до 64 аминокислот, являются достаточными для связывания и активации этих рецепторов. Предыдущие исследования показали, что нейрегулин-1β (NRG-1β) может связываться непосредственно с ErbB3 и ErbB4 с высокой аффинностью. Орфанный рецептор ErbB2 может образовывать гетеродимер с ErbB3 и ErbB4 с более высокой аффинностью, чем гомодимер ErbB3 или ErbB4.Исследование развития нервной системы показало, что для образования симпатической нервной системы необходима интактная система передачи сигнала NRG-1β, ErbB2 и ErbB3. Направленное разрушение NRG-1β или ErbB2 или ErbB4 приводит к эмбриональной гибели по причине дефектов развития сердца. Недавние исследования также показали роль NRG-1β, ErbB2 и ErbB4 в развитии сердечно-сосудистой системы, а также в поддержании нормального функционирования сердца у взрослых. Показано, что NRG-1β повышает организацию саркомеров в кардиомиоцитах взрослых. Введение рекомбинантного EGF-подобного домена NRG-1β значительно улучшает или защищает от ухудшения функционирования миокарда в различных моделях сердечной недостаточности на животных, а также в клинических испытаниях. Эти результаты делают NRG-1 многообещающим в качестве терапевтического соединения широкого спектра или ведущего соединения в случае сердечной недостаточности по причине множества распространенных заболеваний. Главным образом, фармацевтические составы белков предназначены для введения в форме инъекций. Однако, общеизвестно, что существуют некоторые активные белки, имеющие проблемы со стабильностью. Таким образом, в этой области существует потребность в разработке стабильного фармацевтического состава, содержащего NRG
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006]
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу нейрегулина (NRG), содержащему: (a) полипептид NRG; (b) буферные средства, где указанный состав имеет pH 3-7. В некоторых вариантах осуществления состав NRG дополнительно содержит: (c) стабилизатор. В некоторых вариантах осуществления состав NRG дополнительно содержит: (d) соль. В некоторых вариантах осуществления состав является жидким составом. В некоторых вариантах осуществления состав является лиофилизированным составом.
[0007]
Полипептид NRG в составах, представленных в настоящем описании, выбран из группы, состоящей из: a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2; b) полипептида, содержащего EGF-подобный домен NRG; c) биологически активного аналога, фрагмента или варианта полипептида a); d) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, приведенным в SEQ ID NO: 1; e) биологически активного аналога, фрагмента или варианта полипептида d); и f) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с полинуклеотидом, приведенным в SEQ ID NO: 1, в условиях гибридизации умеренной строгости. В некоторых вариантах осуществления полипептид NRG является полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления концентрация полипептида NRG находится в диапазоне от приблизительно 0,01 г/л до приблизительно 1 г/л. В дополнительных вариантах осуществления полипептид NRG в составах по изобретению, является полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, в концентрации приблизительно 0,25 г/л.
[0008]
В некоторых вариантах осуществления составы по изобретению содержат pH-буферное средство. В родственных вариантах осуществления pH-буферное средство находится в диапазоне от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 500 мМ. Буферное средство выбрано из группы, состоящей из цитрата, фосфата, ацетата, гистидина, глицина, бикарбоната, HEPES, Трис, разбавленной HCl, разбавленного NaOH или комбинаций этих средств. В одном из вариантов осуществления буферное средство в составе по изобретению является фосфатом. В некоторых вариантах осуществления состав по изобретению имеет pH приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления состав по изобретению имеет pH приблизительно 3,4.
[0009]
В некоторых вариантах осуществления составы по изобретению содержат стабилизатор. В дополнительных вариантах осуществления составы по изобретению находятся в концентрации от приблизительно 0,1 г/л до приблизительно 200 г/л. В дополнительных вариантах осуществления стабилизатор выбран из группы, состоящей из маннита, сорбита, ксилита, сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы, глюкозы, рафинозы, целлобиозы, генциобиозы, изомальтозы, арабинозы, глюкозамина, фруктозы, сывороточного альбумина человека и комбинации этих стабилизаторов. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор является сывороточным альбумином человека в концентрации приблизительно 2 г/л.
[0010]
В дополнительных вариантах осуществления составы по изобретению содержат соль. В некоторых вариантах осуществления соль находится в диапазоне концентраций от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ. В конкретном варианте осуществления соль является хлоридом натрия. В родственном варианте осуществления концентрация соли в составе по изобретению составляет приблизительно 150 мМ.
[0011]
В некоторых вариантах осуществления полипептид NRG в составе по изобретению состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2; где буферное средство является фосфатом в концентрации 10 мМ, и где pH составляет приблизительно 6,0.
[0012]
В некоторых вариантах осуществления полипептид NRG в составе по изобретению является полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, в концентрации приблизительно 0,25 г/л, буферное средство является фосфатом в концентрации приблизительно 10 мМ, указанный pH составляет приблизительно 6,0, стабилизатор является сывороточным альбумином человека в концентрации приблизительно 2 г/л, и соль является хлоридом натрия в концентрации приблизительно 150 мМ.
[0013]
В некоторых вариантах осуществления состав по изобретению является жидким фармацевтическим составом. В дополнительных вариантах осуществления полипептид NRG в жидком фармацевтическом составе NRG по изобретению является полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, в концентрации приблизительно 0,25 г/л, буферное средство является фосфатом в концентрации приблизительно 10 мМ, указанный pH составляет приблизительно 3,4.
[0014]
В некоторых вариантах осуществления состав по изобретению является лиофилизированным фармацевтическим составом NRG, полученным посредством лиофилизации любого из указанных выше составов с добавлением эксципиента. В некоторых вариантах осуществления эксципиент выбран из группы, состоящей из сывороточного альбумина человека, маннита, глицина, полиэтиленгликоля и комбинаций этих эксципиентов. В конкретном варианте осуществления эксципиент является маннитом. В родственных вариантах осуществления эксципиент находится в концентрации от приблизительно 0,1 г/л до приблизительно 200 г/л после ресуспендирования приблизительно 60 мг состава с 1 мл раствора для ресуспендирования. В конкретном варианте осуществления маннит находится в концентрации приблизительно 50 г/л после ресуспендирования приблизительно 60 мг состава с 1 мл раствора для ресуспендирования.
[0015]
В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к лиофилизированному фармацевтическому составу нейрегулина (NRG), содержащему: (a) полипептид NRG; (b) буферное средство и (c) эксципиент. В дополнительных вариантах осуществления лиофилизированный фармацевтический состав дополнительно содержит стабилизатор. В дополнительных вариантах осуществления лиофилизированный фармацевтический состав дополнительно содержит соль.
[0016]
В конкретном варианте осуществления лиофилизированный фармацевтический состав по изобретению содержит (a) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, (b) фосфат в качестве буферного средства, (c) маннит в качестве эксципиента, (d) сывороточный альбумин человека в качестве стабилизатора и (e) хлорид натрия в качестве соли, где после ресуспендирования приблизительно 60 мг состава с 1 мл раствора для ресуспендирования (a) находится в концентрации приблизительно 0,25 г/л; (b) находится в концентрации приблизительно 10 мМ, и где pH составляет приблизительно 6; (c) находится в концентрации приблизительно 50 г/л, (d) находится в концентрации приблизительно 2 г/л, и (e) находится в концентрации приблизительно 150 мМ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0017]
Фигура 1: Типичные хроматограммы рекомбинантного нейрегулина-1 человека (rhNRG-1), дилюента и стандартного раствора, полученного в концентрации 0,25 мг/мл в дилюенте.
[0018]
Фигура 2: Типичная хроматограмма SDS-PAGE для pH от 3 до 10.
[0019]
Фигура 3: Результаты для профилей концентрация-время при pH от 3 до 8 при 40°C.
[0020]
Фигура 4: Результаты для профилей концентрация-время при pH от 2,3 до 4,3 при 40°C.
[0021]
Фигура 5: Результаты для профилей концентрация-время при pH при 2,3 до 4,3 при 50°C.
[0022]
Фигура 6: Результаты для профилей концентрация-время при pH от 3 до 8 при 60°.C
[0023]
Фигура 7: Результаты для профилей концентрация-время при pH 2,3 до 4,3 и хранении при 60°C
[0024]
Фигура 8: Результаты для профилей pH-скорость деградации (угловой коэффициент) при pH от 3 до 8
[0025]
Фигура 9: Результаты для профилей pH-скорость деградации (угловой коэффициент) при pH от 2,3 до 4,3
[0026]
Фигура 10: Результаты для профилей pH-скорость деградации (угловой коэффициент) при pH в диапазоне от 2,3 до 8
[0027]
Фигура 11: Графическое представление отношения pH и прогнозируемого срока годности T(90)
[0028]
Фигура 12: Типичные хроматограммы для pH 3 от до 8 и хранении при 40°C в течение 77 часов.
[0029]
Фигура 13: Типичные хроматограммы для pH от 2,3 до 3,8.
[0030]
2
2
2
2
2
2
2
2
Фигура 14: Типичные хроматограммы подвергнутых стрессу растворов (сверху вниз: стандартный 0,255 мг/мл, HO через 20 минут, HO через 2 часа и 25 минут, HO через 4 часа и 30 минут, HO через 7 часов и 7 минут)
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0031]
Настоящее изобретение частично основано на том открытии, что конкретные фармацевтические составы нейрегулина достигают удивительной и неожиданной стабильности полипептида нейрегулина. В связи с этим, обнаружено, что можно достигать неожиданного улучшения стабильности, адаптируя более низкий pH для состава нейрегулина по изобретению. Хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать любые способы, схожие или эквивалентные описываемым в настоящем описании, далее описывают предпочтительные способы и материалы.
[0032]
Как применяют в настоящем описании и формуле изобретения, форма в единственном числе включает формы во множественном числе, если контекст четко не указывает на иное. Таким образом, например, ссылка на "буферное средство" включает смесь двух или более буферных средств и т.п.
[0033]
Термин "приблизительно", в частности, по отношению к указанному количеству предназначен для включения отклонений в плюс или минус десять процентов.
[0034]
Как применяют в настоящей заявке, включая формулу изобретения, формы в единственном числе включают формы во множественном числе, если контекст четко не указывает на иное, и их используют взаимозаменяемо с "по меньшей мере один" и "один или несколько".
[0035]
Как применяют в настоящем описании, термины "содержат", "содержащий", "включает", "включая" и любые их варианты предназначены, чтобы охватить неисключающее включение, таким образом, что способ, изделие, характеризуемое способом его получения, или композиция по изобретению, содержащая или включающая элемент или список элементов, не включают только эти элементы, а могут включать другие элементы, не указанные конкретно или свойственные такому способу, изделию, характеризуемому способом его получения, или композиции по изобретению.
[0036]
Как применяют в настоящем описании, термин "полипептид" относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, структурных вариантов, родственных природных структурных вариантов и их синтетических неприродных аналогов, соединенных пептидными связями. Синтетические полипептиды получают, например, с использованием автоматизированного полипептидного синтезатора. Термин "белок", как правило, относится к большим полипептидам. Термин "пептид", как правило, относится к коротким полипептидам.
[0037]
Как применяют в настоящем описании, термин "белок" является синонимом термина "полипептид" или "пептид", если контекст четко не указывает на иное.
[0038]
Как применяют в настоящем описании, термин "фрагмент" полипептида предназначен для обозначения любой части полипептида или белка, меньшего, чем полноразмерный полипептид или продукт экспрессии белка.
[0039]
Как применяют в настоящем описании, термин "аналог" относится к любым двум или более полипептидам, по существу, схожим по структуре и имеющим одинаковую биологическую активность, но которые могут иметь различные степени активности, к целой молекуле или ее фрагменту. Аналоги отличаются по композиции их аминокислотных последовательностей с учетом одной или нескольких мутаций, включающих замену, делецию, инсерцию и/или добавление одной или нескольких аминокислот вместо других аминокислот. Замены могут являться консервативными или неконсервативными на основе физико-химического или функционального родства замененной аминокислоты и заменяющей ее аминокислоты.
[0040]
in vivo
Как применяют в настоящем описании, термин "вариант" относится к полипептиду, белку или его аналогу, модифицированному так, что он содержит дополнительные химические остатки, в норме не являющиеся частью молекулы. Такие остатки могут модулировать растворимость, абсорбцию, биологическое время полужизни молекулы и т.д. Альтернативно, остатки могут снижать токсичность молекулы и устранять или снижать любой нежелательный побочный эффект молекулы и т.д. Остатки, способные опосредовать такие эффекты, описывают в Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Способ присоединения таких остатков к молекуле хорошо известен в этой области. В качестве неограничивающего примера, в одном из аспектов вариантом является фактор свертываемости крови, имеющий химическую модификацию, придающую белку большее время полужизни . В различных аспектах полипептиды модифицируют посредством гликозилирования, пегилирования и/или полисиалирования.
[0041]
Специалист в этой области легко может получать полинуклеотиды, кодирующие фрагменты, варианты и аналоги, так, что они кодируют биологически активные фрагменты, варианты или аналоги природной молекулы, обладающие той же или схожей биологической активностью, что и природная молекула. В различных аспектах эти полинуклеотиды получают способами ПЦР, расщеплением/лигированием кодирующей молекулы ДНК и т.п. Таким образом, специалист в этой области способен осуществлять изменения одного основания в цепи ДНК для получения измененного кодона и миссенс-мутации известным в этой области способом, включая, в качестве неограничивающих примеров, сайт-специфичный мутагенез. Как применяют в настоящем описании, фраза "условия гибридизации умеренной строгости" означает, например, гибридизацию при 42°C в 50% формамиде и промывку при 60°C в 0,1-кратном SSC, 0,1% SDS. Специалистам в этой области понятно, что изменения этих условий осуществляют с учетом длины и содержаний оснований GC в последовательностях, подлежащих гибридизации. Formulas standard в этой области подходят для определения точных условий гибридизации. См. Sambrook et al., 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
[0042]
Как применяют в настоящем описании, термин "сердечная недостаточность" означает аномалию функционирования сердца, когда сердце не перекачивает кровь со скоростью, необходимой для требований метаболизирующих тканей. Сердечная недостаточность включает широкий диапазон заболеваний, таких как застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, тахиаритмия, семейная гипертрофическая кардиомиопатия, ишемическая болезнь сердца, идиопатическая дилатационная кардиомиопатия, миокардит и т.п. Сердечную недостаточность может вызывать любое количество факторов, включая, в качестве неограничивающих примеров, ишемические, врожденные, ревматические, вирусные, токсические или идиопатические формы. Хроническая гипертрофия сердца является существенным болезненным состоянием, являющимся предшественником застойной сердечной недостаточности и остановки сердца.
[0043]
th
Как применяют в настоящем описании, "нейрегулин" или "NRG", используемый в настоящем изобретении, относится к белкам или пептидам, которые могут связывать и активировать ErbB2, ErbB3, ErbB4 или его гомодимер или гетеродимер, включая, в качестве неограничивающих примеров, все изоформы нейрегулина, EGF-домен нейрегулина в отдельности, полипептиды, содержащие EGF-подобный домен нейрегулина, мутанты или производные нейрегулина и любой тип нейрегулин-подобных продуктов генов, также активирующих указанные выше рецепторы, как подробно описано выше. Нейрегулин также включает белки NRG-1, NRG-2, NRG-3 и NRG-4, пептиды, фрагменты и соединения, имитирующие активности нейрегулина. Нейрегулин, используемый в настоящем изобретении, может активировать указанные выше рецепторы ErbB и модулировать их биологические реакции, например, стимулировать синтез рецепторов ацетилхолина в клетке скелетной мышцы; и/или улучшать дифференцировку, выживание и синтез ДНК в кардиомиоцитах. Нейрегулин также включает варианты с консервативными аминокислотными заменами, по существу, не изменяющими их биологическую активность. Подходящие консервативные замены аминокислот известны специалистам в этой области, и их можно осуществлять, как правило, без изменения биологической активности полученной молекулы. Специалистам в этой области известно, что, в основном, одиночные замены аминокислот в необязательных областях полипептида, по существу, не изменяют биологическую активность (см., например, Watson et al., Molecular biology of the Gene, 4 Edition, 1987, Benjamin Cummings, p.224). В предпочтительных вариантах осуществления нейрегулин, используемый в настоящем изобретении, относится к белкам или пептидам, которые могут связываться и активировать гетеродимеры ErbB2/ErbB4 или ErbB2/ErbB3, в качестве неограничивающих примеров, пептиды, включая фрагмент 177-237 изоформы NRG-1 β2, содержащей EGF-подобный домен. Аминокислотная последовательность фрагмента состоит из: SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ (SEQ ID NO:2).
[0044]
Как применяют в настоящем описании, "подобный эпидермальному фактору роста домен" или "EGF-подобный домен" относится к полипептидному мотиву, кодируемому геном нейрегулина, связывающемуся и активирующему ErbB2, ErbB3, ErbB4 или его гомодимер или гетеродимер и имеющему структурное родство с доменом, связывающимся с рецептором EGF, как описано в WO 00/64400, Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); патентах США №№ 5530109 и 5716930; Hijazi et al., Int. J. Oncol., 13:1061-1067 (1998); Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997); Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997); Higashiyama et al., J. Biochem., 122:675-680 (1997); и WO 97/09425, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. В определенных вариантах осуществления EGF-подобный домен связывается и активирует гетеродимеры ErbB2/ErbB4 или ErbB2/ErbB3. В определенных вариантах осуществления EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена NRG-1. В некоторых вариантах осуществления EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 177-226, 177-237 или 177-240 NRG-1. В определенных вариантах осуществления EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена NRG-2. В определенных вариантах осуществления EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена NRG-3. В определенных вариантах осуществления EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена NRG-4. В определенных вариантах осуществления EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro, как описано в патенте США № 5834229.
[0045]
Настоящее изобретение относится к составам NRG, приводящим к получению высокостабильных фармацевтических композиций. Стабильные фармацевтические композиции применимы в качестве терапевтических средств в лечении индивидуумов, страдающих или имеющих риск развития сердечной недостаточности.
[0046]
Один из вариантов осуществления относится к фармацевтическому составу NRG, содержащему: (a) белок или полипептид NRG; (b) одно или несколько буферных средств; белок или полипептид NRG, выбранный из группы, состоящей из: a) белка или полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2; b) белка NRG, содержащего EGF-подобный домен NRG; c) биологически активного аналога, фрагмента или варианта полипептида a); d) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, приведенным в SEQ ID NO: 1; e) биологически активного аналога, фрагмента или варианта полипептида d); и f) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с полинуклеотидом, приведенным в SEQ ID NO: 1, в условиях гибридизации умеренной строгости; концентрация белка или полипептида NRG находится в диапазоне от приблизительно 0,01 г/л до приблизительно 1 г/л; в некоторых предпочтительных вариантах осуществления концентрация находится в диапазоне от приблизительно 0,01 г/л до приблизительно 0,8 г/л, от приблизительно 0,01 г/л до приблизительно 0,6 г/л, от приблизительно 0,01 г/л до приблизительно 0,4 г/л, от приблизительно 0,01 г/л до приблизительно 0,2 г/л. В дополнительных вариантах осуществления белок или полипептид NRG может составлять приблизительно 1,0 г/л, приблизительно 0,90 г/л, приблизительно 0,80 г/л, приблизительно 0,70 г/л, приблизительно 0,60 г/л, приблизительно 0,50 г/л, приблизительно 0,45 г/л, приблизительно 0,40 г/л, приблизительно 0,35 г/л, приблизительно 0,30 г/л, приблизительно 0,25 г/л, приблизительно 0,20 г/л, приблизительно 0,15 г/л, приблизительно 0,10 г/л, приблизительно 0,05 г/л или менее.
[0047]
В одном из предпочтительных вариантов осуществления белок или полипептид NRG находится в концентрации 0,25 г/л; буферное средство является pH-буферным средством в диапазоне от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 500 мМ, и указанный pH находится в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 12,0; буферное средство выбрано из группы, состоящей из цитрата, фосфата, ацетата, гистидина, глицина, бикарбоната, HEPES, Трис, разбавленной HCl, разбавленного NaOH и комбинаций этих средств. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления pH находится в диапазоне от приблизительно 3,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 2,3 до 3,8. В некоторых вариантах осуществления значение pH составляет приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9 или приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9 или приблизительно 6,0. В одном из предпочтительных вариантов осуществления буферное средство является фосфатом, значение pH составляет приблизительно 6. В одном из предпочтительных вариантов осуществления буферное средство является фосфатом, значение pH составляет от приблизительно 3 до приблизительно 4. В другом предпочтительном варианте осуществления буферное средство является фосфатом, значение pH составляет приблизительно 3,4.
[0048]
В одном конкретном варианте осуществления изобретения состав NRG содержит полипептид NRG, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2; буферное средство является фосфатом, и pH составляет приблизительно 6,0. В одном конкретном варианте осуществления изобретения состав NRG содержит полипептид NRG, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2; буферное средство является фосфатом, и pH составляет приблизительно 3,4.
[0049]
Другой вариант осуществления относится к стабильному фармацевтическому составу NRG, содержащему: (a) белок или полипептид NRG; (b) одно или несколько буферных средств; и (c) один или несколько стабилизаторов; стабилизаторы выбраны из группы, состоящей из маннита, сорбита, ксилита, сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы, глюкозы, рафинозы, целлобиозы, генциобиозы, изомальтозы, арабинозы, глюкозамина, фруктозы, сывороточного альбумина человека и комбинаций этих стабилизаторов; стабилизаторы находятся в концентрации от приблизительно 0,1 г/л до приблизительно 200 г/л. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления стабилизатор является маннитом в концентрации приблизительно 50 г/л. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления стабилизатор является сывороточным альбумином человека в концентрации от приблизительно 2 г/л до приблизительно 8 г/л.
[0050]
В одном конкретном варианте осуществления изобретения, состав NRG содержит полипептид NRG, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2; буферное средство является фосфатом в концентрации приблизительно 10 мМ при pH приблизительно 6,0; стабилизатор является сывороточным альбумином человека в концентрации приблизительно 2 г/л.
[0051]
Другой вариант осуществления относится к стабильному фармацевтическому составу NRG, содержащему: (a) белок или полипептид NRG; (b) одно или несколько буферных средств; и (c) один или несколько эксципиентов; один или несколько эксципиентов выбраны из группы, состоящей из сывороточного альбумина человека, маннита, глицина, полиэтиленгликоля и комбинаций этих эксципиентов; один или несколько эксципиентов находятся в концентрации от приблизительно 0,1 г/л до приблизительно 200 г/л. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эксципиент является сывороточным альбумином человека в концентрации от приблизительно 2 г/л до приблизительно 8 г/л. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эксципиент является маннитом в концентрации приблизительно 50 г/л.
[0052]
Другой вариант осуществления относится к стабильному фармацевтическому составу NRG, содержащему: (a) белок или полипептид NRG; (b) одно или несколько буферных средств; (c) один или несколько стабилизаторов и (d) один или несколько эксципиентов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления стабилизатор является сывороточным альбумином человека. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эксципиент является маннитом.
[0053]
Другой вариант осуществления относится к стабильному фармацевтическому составу NRG, содержащему: (a) белок или полипептид NRG; (b) одно или несколько буферных средств; (c) один или несколько стабилизаторов; (d) один или несколько эксципиентов и (e) одну или несколько солей.
[0054]
В некоторых вариантах осуществления состав по изобретению является лиофилизированным фармацевтическим составом, полученным посредством лиофилизации любого из указанных выше составов с добавлением эксципиента. В некоторых вариантах осуществления эксципиент выбран из группы, состоящей из сывороточного альбумина человека, маннита, глицина, полиэтиленгликоля и комбинаций этих эксципиентов. В конкретном варианте осуществления эксципиент является маннитом.
[0055]
В других вариантах осуществления лиофилизированный фармацевтический состав нейрегулина содержит: (a) белок или полипептид NRG; (b) одно или несколько буферных средств; (c) один или несколько эксципиентов; (d) один или несколько стабилизаторов и (e) одну или несколько солей, где после ресуспендирования приблизительно 60 мг состава с 1 мл раствора для ресуспендирования (a) находится в концентрации приблизительно от 0,01 г/л до 1 г/л; (b) находится в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 500 мМ, и где pH составляет от приблизительно 3 до приблизительно 7; (c) находится в концентрации от приблизительно 0,1 г/л до приблизительно 200 г/л, (d) находится в концентрации от приблизительно 0,1 г/л до приблизительно 200 г/л, и (e) находится в концентрации от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ.
[0056]
В одном конкретном варианте осуществления лиофилизированный фармацевтический состав по изобретению содержит (a) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, (b) фосфат в качестве буферного средства, (c) маннит в качестве эксципиента, (d) сывороточный альбумин человека в качестве стабилизатора, и (e) хлорид натрия в качестве соли, где после ресуспендирования приблизительно 60 мг состава с 1 мл раствора для ресуспендирования, (a) находится в концентрации приблизительно 0,25 г/л; (b) находится в концентрации приблизительно 10 мМ, и где pH составляет приблизительно 6; (c) находится в концентрации приблизительно 50 г/л, (d) находится в концентрации приблизительно 2 г/л, и (e) находится в концентрации приблизительно 150 мМ.
[0057]
Лиофилизация
[0058]
В одном из аспектов составы, содержащие полипептид NRG по изобретению, можно получать в виде лиофилизированного фармацевтического состава посредством лиофилизации. Лиофилизацию осуществляют способами, распространенными в этой области, и их следует оптимизировать для разрабатываемой композиции [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].
[0059]
В одном из аспектов цикл лиофилизации состоит из трех этапов: замораживания, первичной сушки и вторичной сушки [A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]. На этапе замораживания раствор охлаждают для инициации образования льда. Кроме того, на этом этапе индуцируют кристаллизацию объемообразующего средства. Лед сублимируют на этапе первичной сушки, осуществляемой посредством снижения давления в камере ниже давления пара льда с использованием вакуума и использования тепла для стимуляции сублимации. В конечном итоге, адсорбированную или связавшуюся воду удаляют на этапе вторичной сушки под сниженным давлением в камере и при повышенной температуре. Этим способом получают материал, известный как лиофилизированная таблетка. Затем таблетку можно восстанавливать стерильной водой или подходящим дилюентом для инъекций.
[0060]
Цикл лиофилизации не только определяет конечное физическое состояние эксципиентов, но также влияет и на другие параметры, такие как время восстановления, внешний вид, стабильность и конечное содержание влаги. Структура композиции в замороженном состоянии подвергается нескольким переходам (например, стеклованию, увлажнению и кристаллизации), происходящим при конкретных температурах, и структуру можно использовать для понимания и оптимизации способа лиофилизации. Из температуры стеклования (Tg и/или Tg') можно получать информацию о физическом состоянии раствора, и ее можно определять посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Tg и Tg' являются важными параметрами, которые необходимо учитывать при дизайне цикла лиофилизации. Например, Tg' важна для первичной сушки. Кроме того, в высушенном состоянии из температуры стеклования получают информацию о температуре хранения конечного продукта.
[0061]
Буферы и буферные средства
[0062]
Как применяют в настоящем описании, термин "буфер" или "буферное средство" включает средства или комбинации средств, поддерживающих pH раствора в приемлемом диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 9,0. Подходящими буферами являются те, которые не являются реакционно-способными в отношении других ингредиентов и присутствуют в количествах, достаточных для обеспечения желаемой степени забуферивания pH.
[0063]
Как правило, наблюдают, что стабильность фармакологически активного состава белка является максимальной в узком диапазоне pH. Этот диапазон pH оптимальной стабильности необходимо идентифицировать на ранних этапах предварительных исследований компонентов лекарственной формы. В этом отношении применимо несколько подходов, таких как ускоренные исследования стабильности и исследования калориметрического скрининга (Remmele R. L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). После завершения состава белок необходимо производить и поддерживать на всем протяжении его срока годности. Таким образом, буферные средства почти всегда используют для контроля pH в составе.
[0064]
Буферная емкость буферного средства является максимальной при pH, равном pKa, и снижается с повышением pH или уменьшается при удалении от этого значения. Девяносто процентов буферной емкости приходится на одну единицу pH его pKa. Буферная емкость также повышается пропорционально повышению концентрации буфера.
[0065]
При выборе буфера необходимо учитывать несколько факторов. Первое и главное, буферное средство и его концентрацию необходимо определять на основе его pKa и желаемого pH состава. В равной степени важным является обеспечение того, чтобы буфер являлся совместимым с белком и другими эксципиентами в составе и не катализировал какие-либо реакции деградации. Третьим важным учитываемым аспектом является ощущение жжения и раздражения, которое может вызывать буфер после введения. Например, известно, что цитрат вызывает жжение после инъецирования (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). Потенциал жжения и раздражения выше у лекарственных средств, вводимых подкожным (SC) или внутримышечным (IM) путями, где раствор лекарственного средства остается на месте в течение относительно более долгого периода времени, чем при введении IV путем, когда состав быстро растворяется в крови после введения. В случае составов, вводимых посредством прямой IV инфузии, необходимо контролировать общее количество буфера (и любого другого компонента состава). Необходимо быть особенно осторожным в отношении ионов калия, вводимых в форме буфера фосфата калия, который может вызывать сердечно-сосудистые эффекты у пациента (Hollander-Rodriguez J C, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).
[0066]
Необходимо дополнительно учитывать буферы для лиофилизированных составов. Некоторые общепринятые буферы, такие как ацетат и имидазол, могут сублимироваться или испаряться в течение лиофилизации, таким образом, сдвигая pH состава в течение лиофилизации или после восстановления.
[0067]
Буферную систему, присутствующую в композициях, выбирают как физиологически совместимую и поддерживающую желаемый pH фармацевтического состава. В одном из вариантов осуществления pH раствора составляет от pH 2,0 до pH 12,0. Например, pH раствора может составлять, например, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 или 12,0.
[0068]
pH-буферное соединение может присутствовать в любом количестве, подходящем для поддержания pH состава на заранее определенном уровне. В одном из вариантов осуществления концентрация pH-буфера составляет от 0,1 мМ до 500 мМ. Например, предполагают, что pH-буферное средство составляет по меньшей мере 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 или 500 мМ.
[0069]
Неограничивающие примеры pH-буферных средств, используемых для забуферивания состава, как представлено в настоящем описании, включают органические кислоты, глицин, гистидин, глутамат, сукцинат, фосфат, ацетат, цитрат, Трис, HEPES, и аминокислоты или смеси аминокислот, включая, в качестве неограничивающих примеров, аспартат, гистидин и глицин. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения буферное средство является фосфатом.
[0070]
Стабилизаторы и объемообразующие средства
[0071]
В одном из аспектов фармацевтических составов по изобретению для предотвращения или снижения вызываемой хранением агрегации и химической деградации добавляют стабилизатор (или комбинацию стабилизаторов). Мутный или непрозрачный раствор после восстановления свидетельствует о том, что белок подвергается преципитации или, по меньшей мере, агрегации. Термин "стабилизатор" означает эксципиент, способный предотвращать агрегацию или физическую деградацию, включая химическую деградацию (например, аутолиз, деамидирование, окисление и т.д.) в водном состоянии. Предполагаемые стабилизаторы включают, в качестве неограничивающих примеров, сахарозу, трегалозу, маннозу, мальтозу, лактозу, глюкозу, рафинозу, целлобиозу, генциобиозу, изомальтозу, арабинозу, глюкозамин, фруктозу, маннит, сорбит, глицин, аргинин HCL, поли-гидроксидные соединения, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, N-метилпирролидон, целлюлоза и гиалуроновая кислота [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]. В составы по настоящему изобретению стабилизатор включают в концентрации приблизительно 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, или 200 г/л. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве стабилизатора используют маннит.
[0072]
При желании, составы также включают соответствующие количества объемообразующих и регулирующих осмолярность средств. Объемообразующие средства включают, в качестве неограничивающих примеров, маннит, глицин, сахарозу, полимеры, такие как декстран, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза, лактоза, сорбит, трегалоза или ксилит.
[0073]
Составы и эксципиенты
[0074]
Эксципиенты являются добавками, придающими или повышающими стабильность и доставку лекарственного продукта (например, белка). Независимо от причины их включения, эксципиенты являются неотъемлемым компонентом состава и, таким образом, должны быть безопасными и хорошо переносимыми пациентами. В случае белковых лекарственных средств, выбор эксципиентов является особенно важным, т.к. они могут влиять на эффективность и иммуногенность лекарственного средства. Таким образом, белковые составы необходимо разрабатывать с соответствующим выбором эксципиентов, обеспечивающих подходящую стабильность, безопасность и конкурентоспособность.
[0075]
Принципиальной задачей в разработке составов белков является стабилизация продукта против стрессов, связанных с производством, транспортировкой и хранением. Ролью эксципиентов в составе является обеспечение стабилизации против этих стрессов. Эксципиенты также используют для снижения вязкости составов с высокой концентрацией белка, чтобы сделать возможной их доставку и повышать удобство для пациента. В основном, эксципиенты можно классифицировать с учетом механизмов, посредством которых они стабилизируют белки против различных химических и физических стрессов. Некоторые эксципиенты используют для снижения эффектов конкретного стресса или регуляции конкретной восприимчивости конкретного белка к воздействию. Другие эксципиенты имеют более общие эффекты в отношении физической и ковалентной стабильностей белков. Эксципиенты, представленные в настоящем описании, упорядочены по их химическому типу или их функциональной роли в составах. Краткое описание механизмов стабилизации представлено в обсуждении каждого типа эксципиента.
[0076]
Количество или диапазон эксципиента можно включать в любой конкретный состав для получения биофармацевтического состава по изобретению, стимулирующего сохранение стабильности биофармацевтического средства (например, белка). Например, количество и тип соли, подлежащей включению в биофармацевтический состав по изобретению, выбирают с учетом желаемой осмоляльности (т.е. изотонический, гипотонический или гипертонический) конечного раствора, а также количеств и осмоляльности других компонентов, подлежащих включению в состав.
[0077]
Кроме того, если конкретный эксципиент указывают в молярной концентрации, специалистам в этой области понятно, что также подразумевают эквивалентный процент (%) масс./об. (например, (граммы вещества в образце раствора/мл раствора)×100%) раствора.
[0078]
Концентрации эксципиентов, представленных в настоящем описании, зависят друг от друга в конкретном составе. В качестве примера, можно снижать концентрацию объемообразующего средства, если, например, присутствует высокая концентрация белка, или если, например, присутствует высокая концентрация стабилизатора. Для поддержания изотоничности конкретного состава, в котором отсутствует объемообразующее средство, будут корректировать концентрацию стабилизатора (т.е. будут использовать "регулирующее тоничность" количество стабилизатора). Эксципиенты включают, в качестве неограничивающих примеров, сывороточный альбумин человека, маннит, глицин, полиэтиленгликоль и комбинации этих эксципиентов.
[0079]
Соли
[0080]
Соли часто добавляют для повышения ионной силы состава, которая может быть важной для растворимости белка, физической стабильности и изотоничности. Соли могут влиять на физическую стабильность белков множеством способов. Ионы могут стабилизировать нативное состояние белков, связываясь с заряженными остатками на поверхности белка. Альтернативно, соли могут стабилизировать денатурированное состояние, связываясь с пептидными группами вдоль остова белка (--CONH--). Соли также могут стабилизировать нативную конформацию белка, экранируя электростатическое отталкивание между остатками в молекуле белка. Соли в белковых составах также могут экранировать электростатическое притяжение между молекулами белка, которое может приводить к агрегации и нерастворимости белка. В представленных составах концентрация соли составляет приблизительно 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 и 500 мМ.
[0081]
Способы получения
[0082]
Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения фармацевтических составов.
[0083]
Способы по настоящему изобретению дополнительно включают один или несколько из следующих этапов: добавление стабилизатора, как представлено в настоящем описании, в указанную смесь перед лиофилизацией, добавление по меньшей мере одного средства, выбранного из объемообразующего средства, средства, регулирующего осмолярность, и эксципиента, каждый из которых, как представлено в настоящем описании, добавляют в указанную смесь перед лиофилизацией.
[0084]
Стандартной практикой восстановления лиофилизированного материала является добавление объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (WFI) (как правило, эквивалентно объему, удаленному при лиофилизации), хотя разбавленные растворы антибактериальных средств иногда используют в получении фармацевтических средств для парентерального введения [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Таким образом, представлены способы получения восстановленных композиций NRG, включающие этап добавления дилюента в лиофилизированную композицию NRG по изобретению.
[0085]
Лиофилизированный материал можно восстанавливать в виде водного раствора. Множество водных носителей, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многократного использования или вода с подходящими количествами поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, содержащая активное соединение в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензий). В различных аспектах такими эксципиентами являются суспендирующие средства, в качестве неограничивающих примеров, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и гуммиарабик; диспергирующими средствами или увлажнителями являются природный фосфатид, в качестве неограничивающих примеров, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, в качестве неограничивающих примеров, полиоксиэтилен стеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, в качестве неограничивающих примеров, гептадекаэтил-еноксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот, и гекситолом, таким как полиоксиэтиленсорбит моноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридами гекситолов, в качестве неограничивающих примеров, полиэтиленсорбита моноолеата. В различных аспектах водные суспензии также содержат один или несколько консервантов, в качестве неограничивающих примеров, этил или n-пропил, p-гидроксибензоат.
[0086]
Введение
[0087]
Для введения композиций человеку или тестовым животным в одном из аспектов композиции содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Фразы "фармацевтически" или "фармакологически" приемлемый относятся к молекулярным веществам и композициям, являющимся стабильными, ингибирующим деградацию белка, такую как агрегация и образование продуктов расщепления, и, кроме того, не вызывающим аллергические или другие побочные реакции при введении путями, хорошо известными в этой области, как описано ниже. "Фармацевтически приемлемые носители" включают любые и все клинически применимые растворители, диспергирующие средства, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие абсорбцию и т.п., включая средства, описываемые выше.
[0088]
Как применяют в настоящем описании, термин "раствор для ресуспендирования" относится к растворам, например, стерильной воде DI или физиологическому раствору, который можно использовать в клинических условиях, не вызывая какую-либо аллергическую реакцию или любые другие побочные реакции.
[0089]
Фармацевтические составы вводят перорально, местно, трансдермально, парентерально, с помощью спрея для ингаляций, вагинально, ректально или посредством внутричерепной инъекции. Как применяют в настоящем описании, термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, интрацистернальную инъекцию или инфузионные способы. Также предусмотрено введение посредством внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, внутригрудной, интраперитонеальной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в конкретном месте. Как правило, композиции, по существу, не содержат пирогены, а также другие примеси, которые могут навредить реципиенту.
[0090]
Однократное или многократные введения композиций осуществляют с использованием уровней доз и профиля, выбранного лечащим врачом. В случае профилактики или лечения заболевания подходящая доза зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, как определено выше, тяжести и течения заболевания, вводят ли лекарственное средство в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, анамнеза пациента и ответа на лекарственное средство и выбора лечащего врача.
[0091]
Наборы
[0092]
В качестве дополнительного аспекта изобретение включает наборы, содержащие одну или несколько лиофилизированных композиций, упакованных способом, облегчающим их применение для введения индивидуумам. В одном из вариантов осуществления такой набор включает фармацевтический состав, представленный в настоящем описании (например, композицию, содержащую терапевтический белок или пептид), упакованный в контейнер, такой как запаянная бутыль или сосуд с ярлыком, прикрепленным к контейнеру или включенному в упаковку, в которым описывают применение соединения или композиции в практическом осуществлении способа. В одном из вариантов осуществления набор содержит первый контейнер, содержащий композицию терапевтического белка или пептида, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый раствор для восстановления композиции. В одном из аспектов фармацевтический состав упаковывают в стандартную лекарственную форму. Набор может дополнительно включать устройство, подходящее для введения фармацевтического состава конкретным путем введения. Предпочтительно, набор содержит ярлык, в котором описывают применение фармацевтических составов.
[0093]
Дозировки
[0094]
Режим дозирования, включенный в способ лечения состояния, представленного в настоящем описании, лечащий врач будет определять с учетом различных факторов, модифицирующих действие лекарственных средств, например, возраста, состояния, массы тела, пола и питания пациента, тяжести какой-либо инфекции, времени введения и других клинических факторов.
[0095]
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое общепринято понимает специалист в области, к которой принадлежит изобретение. Если определение, изложенное в этом разделе, отличается или иным образом противоречит определению, изложенному в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, включенных в настоящее описание в качестве ссылки, определение, изложенное в этом разделе, обладает приоритетом относительно определения, включенного в настоящее описание в качестве ссылки.
[0096]
Из изложенного выше описания очевидно, что можно осуществлять варианты и модификации изобретения, представленного в настоящем описании, для его адаптации к различному применению и условиям. Такие варианты осуществления также входят в объем следующей формулы изобретения.
[0097]
Перечисление перечня элементов в любом определении параметра в настоящем описании включает определения этого параметра как любого отдельного элемента или комбинации (или подкомбинации) указанных элементов. Перечисление вариантов осуществления в настоящем описании включает этот вариант осуществления как любой отдельный вариант осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
[0098]
Все патенты и публикации, упомянутые в этом описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждый независимый патент и публикация были конкретно и отдельно указаны как включенные в качестве ссылки.
[0099]
Следующие примеры представлены в иллюстративных целях, а не в качестве ограничения.
ПРИМЕРЫ
[00100]
Изобретение проиллюстрировано с помощью следующих примеров, не предназначенных для какого-либо его ограничения. Как применяют в настоящем описании, термин "rhNRG-1", используемый в примерах, относится к белкам или пептидам, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
[00101]
Пример 1: Профилирование pH-стабильность в случае rhNRG-1
[00102]
1. Цели эксперимента
[00103]
1.1 Получение профиля pH-стабильность rhNRG-1 в буферах с различным pH (pH от 3 до 10) посредством электрофореза в ПААГ в присутствие SDS
[00104]
1.2 Получение профиля pH-стабильность rhNRG-1 в буферах с различным pH (pH от 3 до 8) и воде DI посредством RP-ВЭЖХ
[00105]
1.3 Учитывая результаты п. 1,2, получение профиля pH стабильность для узкого рабочего диапазона pH (pH от 2,3 до 4,3)
[00106]
1.4 Учитывая исследование стабильности в узком диапазоне pH, определение оптимального pH для состава rhNRG-1
[00107]
2. Экспериментальный способ
[00108]
2.1 Разработка способа RP-ВЭЖХ для определения чистоты лекарственного вещества rhNRG-1.
[00109]
Таблица 1Условия способа
Система ВЭЖХ
Agilent 1050
Колонка
Phenomenex Jupiter, 5 мкм 4,6×250 мм, 5 мкм, 300 <img file="00000001.jpg" he="4" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" /> (PN 00G-4167-E0)
Подвижная фаза (MP)
MP A: 0,1% TFA в ацетонитриле и MP B: 0,1% TFA в воде (обе MP фильтровали через фильтр 0,45 мкм и дегазировали)
Градиент
Время (минуты)
% MP A
% MP B
0
0
100
10
20
80
40
32
68
45
100
0
50
0
100
60
0
100
Скорость потока
1,0 мл/мин
Длина волны детекции
Ультрафиолет (УФ): 214 нм
Температура колонки
30°C
Температура образца
5°C
Объем инъекции
80 мкл
время хроматографирования
60 мин
Стандарт ВЭЖХ и дилюент образца ("дилюент")
Вода DI
[00110]
RhNRG-1, партию 201204001, содержащую 1,24 мг/мл rhNRG-1, 20 мМ фосфатный буфер и 0,5M NaCl, pH 5,5 ("API") использовали для получения стандартного раствора для всех анализов ВЭЖХ.
[00111]
Типичные хроматограммы дилюента rhNRG-1 и стандартного раствора, полученного в концентрации 0,25 мг/мл в дилюенте, представлены на фигуре 1 (вверху и внизу, соответственно).
[00112]
Таблица 2Точность<b></b>способа, оцениваемая посредством инъецирования стандарта в концентрации 0,25 мг/мл шесть раз
STD 0,25 мг/мл
Площадь пика
Инъекция №1
9929
Инъекция №2
9901
Инъекция №3
9819
Инъекция №4
9924
Инъекция №5
9781
Инъекция №6
9663
Среднее
9874
RSD*
0,4
*RSD для полученных площадей пиков составляло 0,4. Это находится в пределах приемлемых критериев точности <2,0.
[00113]
2.2 Получение буферов с pH от 3 до 10
[00114]
В пластиковую пробирку емкостью 15 мл добавляют API и воду DI или новый буфер. Смешивают в раствор, содержащий 0,25 мг/мл rhNRG-1, 10 мМ новый буфер, 4 мМ фосфат (из API) и 0,1M NaCl (из API).
[00115]
Таблица 3Конечный pH и новый буфер
pH (исходный)
Новый буфер
3,19
Фосфат натрия
4,17
Ацетат натрия
5,08
Ацетат натрия
5,47
Гистидин
6,02
Цитрат натрия
7,00
Фосфат натрия
8,07
Бикарбонат натрия
9,02
Глицин и разбавленный Гидроксид натрия
10,05
Глицин и разбавленный Гидроксид натрия
5,63
Без добавления нового буфера, pH не корректировали
[00116]
Таблица 4Каждый раствор, запаянный в стеклянные сосуды и подвергаемый хранению
Температура хранения
Количество сосудов
2-8°C
2
40°C
3
60°C
3
[00117]
2.3 Определение чистоты посредством электрофореза в ПААГ в присутствие SDS
[00118]
В случае 40°C осуществляли тест посредством электрофореза в ПААГ в присутствие SDS после 10 дней. Обесцвечивание I (45% воды, 45% метанола, 10% уксусной кислоты, свежеполученный); 0,1% кумасси синего; фильтрующий гель (12%-15%) используют для разделения отдельных полипептидов на отдельные полосы.
[00119]
2.4 Определение раствора посредством RP-ВЭЖХ
[00120]
В случае 60°C удаляют 150 мкл и тестируют посредством ВЭЖХ через 0, 7,5, 24, 48, 65 и 77 ч.
[00121]
В случае 40°C удаляют 150 мкл и тестируют посредством ВЭЖХ через 28,5, 49 и 77 ч.
[00122]
Препарат для исследования узкого диапазона pH (pH от 2,3 до 4,3):
[00123]
В пластиковую пробирку добавляют API и воду DI. Смешивают в раствор, содержащий 0,25 мг/мл rhNRG-1, 4 мМ фосфат (из API) и 0,1 M NaCl (из API). Корректируют pH с использованием разбавленной HCl. После достижения первой цели приблизительно 8 мл переносят в отдельную пластиковую пробирку, продолжают титровать до достижения следующей цели и собирают приблизительно 8 мл от каждой цели (т.е. 4,29, 3,90, 3,78, 3,47, 3,36, 3,17, 3,02, 2,85, 2,58, 2,37 и 2,33). В случае каждого pH переносят в стеклянные сосуды, всего 5 сосудов на каждый уровень. По одному сосуду помещают при 2-8, 25, 40, 50 и 60°C.
[00124]
В случае 60°C удаляют 200 мкл и тестируют посредством ВЭЖХ через 0, 3,7, 4,7 и 5,7 дней.
[00125]
В случае 50°C удаляют 200 мкл и тестируют посредством ВЭЖХ через 0, 4,7 и 11 дней.
[00126]
В случае 40°C удаляют 200 мкл и тестируют посредством ВЭЖХ через 0, 5,7, 7 и 11 дней.
[00127]
Получают профиль узкий диапазон pH-скорость (стабильность) при каждой температуре.
[00128]
Получают уравнение Аррениуса и прогнозируют срок годности при 5°C.
[00129]
3. Результаты и выводы
[00130]
Типичные хроматограммы SDS-PAGE для pH от 3 до 10 представлены на фигуре 2.
[00131]
Исходная концентрация и после-стрессовая концентрация rhNRG-1, измеряемая способом RP-ВЭЖХ, приведены ниже:
[00132]
Таблица 5Результаты для pH от 3 до 8 при 40°C
pH
Исходная конц. (мг/мл)
28,5 ч(% исходной конц.)
49 ч(% исходной конц.)
77 ч(% исходной конц.)
3,19
0,241
97
97
96
4,17
0,247
97
97
93
5,08
0,242
94
94
86
6,02
0,251
94
94
86
7,00
0,251
92
87
82
8,07
0,253
89
83
68
5,63
0,251
92
91
38
[00133]
Таблица 6Результаты для pH от 3 до 8 при 60°C
pH
Исходная конц. (мг/мл)
7,5 ч (% исходной конц.)
24 ч (% исходной конц.)
48 ч (% исходной конц.)
65 ч (% исходной конц.)
77 ч (% исходной конц.)
3,19
0,241
98
93
89
82
72
4,17
0,247
99
93
91
84
78
5,08
0,242
98
92
93
82
82
5,47
0,248
95
92
86
79
79
6,02
0,251
95
88
85
72
72
7,00
0,251
90
76
65
NT
NT
8,07
0,253
68
4
NT
NT
NT
5,63
0,251
95
84
82
69
64
NT: не тестировали.
[00134]
Таблица 7Результаты для pH от 2,3 до 4,3 при 40°C
pH
Исходная конц. (мг/мл)
5,7 дней(% исходной конц.)
7 дней(% исходной конц.)
11 дней(% исходной конц.)
4,29
0,235
Все хроматограммы для pH 3,8 при 40°C демонстрировали совместно элюируемые пики; невозможно интегрировать отдельные пики
3,90
0,230
101
96
88
3,36
0,230
101
97
90
3,02
0,236
99
94
88
2,58
0,238
96
89
83
2,37
0,241
90
83
77
[00135]
Таблица 8Результаты для pH от 2,3 до 4,3 при 50°C
pH
Исходная конц. (мг/мл)
5,7 дней(% исходной конц.)
7 дней(% исходной конц.)
11 дней(% исходной конц.)
4,29
0,235
100
NA
78
3,90
0,230
102
88
79
3,36
0,230
99
85
76
3,02
0,236
95
79
70
2,58
0,238
90
54
35
2,37
0,241
82
53
36
NA: нет данных
[00136]
Таблица 9Результаты для pH от 2,3 до 4,3 при 60°C
pH
Исходная конц. (мг/мл)
3,7 дней(% исходной конц.)
4,7 дней(% исходной конц.)
5,7 дней(% исходной конц.)
4,29
0,235
80
NA
72
3,90
0,230
83
81
73
3,36
0,230
77
69
63
3,02
0,236
70
68
0
2,58
0,238
62
60
55
2,37
0,241
55
57
43
NA: нет данных
[00137]
Профили концентрация-время при pH от 3 до 8 при 40°C представлены на фигуре 3.
[00138]
Профили концентрация-время при pH от 2,3 до 4,3 при 40°C представлены на фигуре 4.
[00139]
Профили концентрация-время при pH от 2,3 до 4,3 при 50°C представлены на фигуре 5.
[00140]
Профили концентрация-время при pH от 3 до 8 при 60°C представлены на фигуре 6.
[00141]
Профили концентрация-время при pH от 2,3 до 4,3 при хранении при 60°C представлены на фигуре 7.
[00142]
Для каждого профиля концентрация-время осуществляли линейный регрессионный анализ и угловой коэффициент уравнения регрессии использовали для представления скорости деградации в мг/мл/ч с учетом кинетики нулевого порядка.
[00143]
Профили pH-скорость деградации (угловой коэффициент) для pH от 3 до 8 представлены на фигуре 8.
[00144]
Профили pH-скорость деградации (угловой коэффициент) для pH от 2,3 до 4,3 представлены на фигуре 9.
[00145]
Профили pH-скорость деградации (угловой коэффициент) для pH в диапазоне от 2,3 до 8 представлены на фигуре 10.
[00146]
При каждом pH (от 3 до 8) и температуре предполагаемая скорость деградации и T90 (время до деградации 10% от исходной концентрации или 0,025 мг/мл) представлены ниже (таблица 10):
pH
40°C
60°C
Скорость деградации(мг/мл/ч)
T90(день)
Скорость деградации(мг/мл/ч)
T90(день)
3,19
0,0001
10,4
0,0006
1,7
4,17
0,0002
5,2
0,0006
1,7
5,08
0,0004
2,6
0,0006
1,7
5,47
-
-
0,0007
1,5
6,02
0,0004
2,6
0,0009
1,2
7,00
0,0006
1,7
0,0015
0,7
8,07
0,001
1,0
0,0061
0,2
5,63
0,0019
0,5
0,001
1,0
[00147]
Используя данные для 40, 50 и 60°C для каждого pH (от 2,3 до 3,9), график Аррениуса использовали для прогнозирования срока годности при 5°C для каждого уровня pH. Значения T90, вычисленные из графиков Аррениуса, представлены ниже (таблица 11):
pH
T90 (дни)
T90 (месяцы)
2,37
166
6
2,58
317
11
3,02
612
20
3,36
1092
36
3,90
239
8
[00148]
Фигура 11 является графическим представлением pH относительно прогнозируемого срока годности T(90).
[00149]
Хроматограммы для pH от 3 до 8 при хранении при 40°C в течение 77 часов представлены на фигуре 12.
[00150]
Хроматограммы для pH от 2,3 до 3,8 представлены на фигуре 13.
[00151]
Выводы:
1. Стабильность rhNRG-1 в растворе сильно зависит от pH, rhNRG-1 является более стабильным в кислом растворе (pH от 3,0 до 7,0), чем в основном растворе (pH от 8,0 до 10,0).
2. Лучшую стабильность rhNRG-1 наблюдали при наименьшем pH (3,2).
3. При более низком pH T90 приблизительно в 2 раза выше, чем при pH 4,2, или приблизительно в 20 раз выше, чем в исходном буфере (т.е. pH 5,5). Таким образом, можно ожидать значительное улучшение стабильности посредством адаптации более низкого pH для раствора rhNRG-1.
4. Исследование узкого диапазона pH показало лучшую стабильность при pH 3,4 (±0,2).
[00152]
Пример 2: Исследование форсированной деградации
[00153]
1. Цель эксперимента
[00154]
Исследование стабильности rhNRG-1
[00155]
2. Экспериментальный способ
[00156]
Раствор API подвергали форсированной деградации следующим образом (таблица 12):
Условие
Препарат
Окисление
1:1:3 (об./об./v) смесь 1,24 мг/мл раствора API с 0,3% H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> и водой DI (конечная концентрация H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> составляет 0,06%), хранящаяся при RT в течение приблизительно 0,3, 2, 4 и 7 часов
Дневной свет
1,24 мг/мл раствор API, разбавленный в 5 раз водой DI, подвергнутый прямому дневному свету при RT в течение приблизительно 1 и 4 дней
[0126]
Образцы, собранные в моменты времени, анализировали посредством RP-ВЭЖХ.
3. Результаты и выводы
[00157]
Таблица 13Результаты окисления
Окисление
Конц. rhNRG-1 (мг/мл)
0,3 часов
0,24
2,4 часов
0,15
4,5 часов
0,10
7,1 часов
0,07
2
2
2
2
2
2
2
2
Типичные хроматограммы подвергнутых стрессу растворов представлены на фигуре 14 (сверху вниз: стандартный 0,255 мг/мл, HO после 20 минут, HO после 2 часов и 25 минут, HO после 4 часов и 30 минут, HO после 7 часов и 7 минут)
[00158]
Выводы:
[00159]
1. rhNRG-1 является высокочувствительным к пероксиду и склонным к окислению.
[00160]
2. Необходимо учитывать использование антиоксидантов и стабилизаторов в составе для повышения стабильности.
Пример 3: Эффект различных эксципиентов в отношении стабильности составов rhNRG-1
[00161]
1. Цель эксперимента
[00162]
Исследование эффекта различных эксципиентов в отношении стабильности составов rhNRG-1
[00163]
2. Экспериментальный материал
[00164]
2.1 Шестнадцать составов rhNRG-1 указаны в таблице 14
[00165]
2.2 Термостатированный контейнер SHELLAB/Model1535 (компания Sheldon)
[00166]
2.3 ВЭЖХ с помощью Agilent 1200 (компания Agilent)
[00167]
2.4 Гелевая колонка ZORBAX GF-250 (4,6 мм×250 мм)
[00168]
Таблица 14Список тестируемых составов
Эксципиенты
Концентрация (%)
Название образца
Добавляемое количество (мкл)
rhNRG-1 (мкл)
10 мМ pH 6,0 PB (мкл)
Стерильная вода (мкл)
Лактоза (20%)
0,5
A1
25
200
50
725
5
A2
250
500
Трегалоза (40%)
0,5
B1
12,5
737,5
8
B2
200
550
Глюкан (4%)
0,2
C1
50
700
2
C2
500
250
PVP (10%)
0,5
D1
50
700
5
D2
500
250
Аргинин (1M)
50 мМ
E1
50
700
400 мМ
E2
400
350
Сахароза (50%)
0,5
F1
10
740
10
F2
200
550
Маннит (20%)
0,5
G1
25
725
5
G2
250
500
Глицин (2M)
0,1M
H1
50
700
1M
H2
500
250
[00169]
3. Экспериментальный способ
[00170]
3.1 Образцы оставляли при 37°C в течение 5 дней
[00171]
3.2 Тестирование чистоты образцов посредством SEC-ВЭЖХ
[00172]
Подвижная фаза: 0,7 M NaCl, 30 мМ PB(pH7,0)
[00173]
Условия хроматографии ВЭЖХ: скорость потока 0,5 мл/мин, инъецируемое количество 20 мкл, определяемая длина волны 450 нм, время регистрации 20 мин.
[00174]
4. Результаты
[00175]
Анализ осуществляли с помощью способа нормализации площадей, вычисляя чистоту каждого образца. Результаты тестирования четырех составов rhNRG-1 приведены в таблице 15.
[00176]
Таблица 15Чистота тестируемых составов через 5 дней
Стабилизатор или объемообразующее средство
Название образца
Чистота при SEC-ВЭЖХ (%)
Лактоза
A1
99,41
A2
96,79
Трегалоза
B1
99,37
B2
98,00
Глюкан
C1
99,33
C2
85,75
PVP
D1
Нет данных
D2
Нет данных
Аргинин
E1
98,22
E2
91,64
Сахароза
F1
98,70
F2
62,20
Маннит
G1
98,70
G2
98,13
Глицин
H1
98,55
H2
98,63
[00177]
Данные о чистоте составов глюкана (C1 и C2), составов аргинина (E1 и E2) и составов сахарозы (F1 и F2) не схожи. Таким образом, глюкан, аргинин и сахароза не являются хорошими эксципиентами для составов rhNRG-1. PVP (поливинилпирролидон) является объемообразующим средством, и для составов rhNRG-1 с ним не получали данные о чистоте посредством SEC-ВЭЖХ. Результаты показали, что лактоза, трегалоза, маннит и глицин являются предпочтительными эксципиентами для составов rhNRG-1.
[00178]
Пример 4: Эффекты концентрации сывороточного альбумина человека (HSA) в отношении биологической активности составов NRG
[00179]
1. Введение
[00180]
in vitro
Ген HER2/neu кодирует трансмембранный белок p185, являющийся тирозиновой протеинкиназой. Связывание нейрегулина-1 с ErbB3 или ErbB4 индуцирует образование гетеродимера ErbB3-ErbB2 и ErbB4-ErbB2 и активирует кодируемую HER2 тирозиновую протеинкиназу, опосредующую передачу функционального сигнала нейрегулина-1. Учитывая тот факт, что связывание нейрегулина-1 с его рецепторами запускает фосфорилирование белка ErbB2, разрабатывали быстрый, чувствительный способ с высокой производительностью для количественного определения биологической активности рекомбинантного нейрегулина-1.
[00181]
2. Цель эксперимента
[00182]
Исследование эффекта различных концентраций HSA в отношении биологической активности составов NRG
[00183]
3. Экспериментальный материал
[00184]
3.1 Составы rhNRG-1
[00185]
Референсный образец: 0 г/л HSA, 250 мкг/л rhNRG-1, 10 мМ фосфатный буферный реагент,150 мМ NaCl, 50 г/л маннита
[00186]
Тестовый образец A: 0,5 г/л HSA, 250 мкг/л rhNRG-1, 10 мМ фосфатный буферный реагент,150 мМ NaCl, 50 г/л маннита
[00187]
Тестовый образец B: 2 г/л HSA, 250 мкг/л rhNRG-1, 10 мМ фосфатный буферный реагент,150 мМ NaCl, 50 г/л маннита
[00188]
Тестовый образец C: 8 г/л HSA, 250 мкг/л rhNRG-1, 10 мМ фосфатный буферный реагент,150 мМ NaCl, 50 г/л маннита
[00189]
3.2 96-луночный планшет для культивирования клеток (компания Corning); 96-луночный планшет для ELISA Costar.
[00190]
2
3.3 Линию злокачественных клеток молочной железы человека, полученную из U.S. ATCC, культивировали на минимальной среде для культивирования при 37°C и 50% CO.
[00191]
2
3.4 Взвешивание указанного количества DMEM, определение количества для соответствующего объема, добавление 3,7 г/л NaHCO, 0,1 г/л глутамина и 5,5 г/л HEPES.
[00192]
3.5 Минимальная среда для культивирования DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 9 мг/л инсулина, хранящаяся при 4°C.
[00193]
3.6 Стерилизованный PBS (0,01 M, pH 7,4).
[00194]
2+
2+
3.7 0,25% панкреатический фермент, полученный с использованием PBS без Ca и Mg.
[00195]
3.8 Буферный раствор для иммобилизации моноклонального антитела против ErbB2, лосьон. Выбранное моноклональное антитело мыши против внеклеточного функционального домена H4 ErbB2 человека без перекрестной реактивности с ErbB3 и ErbB4. Буферный раствор для иммобилизации; pH 9,6, 0,05 M карбонатный буферный раствор. Лосьон: 0,01 M PBS+0,05% Tween-20.
[00196]
3.9 Моноклональное антитело мыши против фосфорилированной протеазы человека (против P-tyr-HRP), меченое пероксидазой хрена (HRP)
[00197]
2
4
2
2
3.10 Субстрат, субстратный буферный раствор (TMB): 2 мг/мл TMB (полученного с использование абсолютного спирта). Субстратный буфер: 0,2 M лимонная кислота+0,1M NaHPO (pH 5,0). Рабочий субстрат: 9 мл субстратного буферного раствора+1 мл TMB+10 мкл 3% HO (полученного по мере необходимости).
[00198]
2
4
3.11 Терминирующее средство 2 Н HSO.
[00199]
3.12 Раствор для дефрагментации клеток 150 мМ NaCl+50 мМ Hepes+1% Triton-X 100+2 мМ (ортованданат натрия)+0,01% (тиомерсал). Одну таблетка смеси ингибиторов протеаз (Tabletten, Proteasen-Irhibitoren-Cocktail) добавляют в каждые 25 мл до воздействия.
[00200]
4. Экспериментальный способ
[00201]
4.1 Образцы оставляли при 37°C на 4 дня
[00202]
4.2 Инокуляция клеток
[00203]
4
2
Клетки MCF-7 выращивали до указанного количества, промывали стерилизованным раствором PBS, затем расщепляли 0,25% трипсиназы. После подсчета концентрацию клеток регулировали с помощью минимальной среды для культивирования. Клетки добавляли в 96-луночный планшет для клеточных культур, 5×10/лунку, 100 мкл/лунку, и культивировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C и 5% CO.
[00204]
4.3 Выращивание клеток на минимальной среде
[00205]
2
Отсасывали всю среду для культивирования в 96-луночном планшете, промывали каждую лунку прогретым до 37°C PBS, затем добавляли 100 мкл среды для культивирования DMEM (без телячьей сыворотки и без инсулина). Клетки культивировали в течение 24 часов в инкубаторе при 37°C и 5% CO.
[00206]
4.4 Иммобилизация
[00207]
Антитело против внеклеточного функционального домена H4 ErbB2 разбавляли буферным раствором для иммобилизации до 6 мкг/мл, затем добавляли 50 мкл на лунку 96-луночного планшета для ELISA, культивировали в течение ночи (16-18 часов) при 4°C.
[00208]
4.5 Разбавляли контрольный раствор и раствор образца, подлежащий тестированию
[00209]
Контрольный раствор и образец, подлежащий тестированию, разбавляли средой для культивирования DMEM, соответственно (без телячьей сыворотки и без инсулина), до 2 мкг/мл, затем снова 3 раза осуществляли градиентное разведение всего с 9 разведениями.
[00210]
4.6 Фосфорилирование клеток
[00211]
После выращивания клеток на минимальной среде из 96-луночного планшета отсасывали среду для культивирования клеток, добавляли стандартный материал и образец, подлежащий тестированию, 100 мкл на лунку, для каждой концентрации использовали 2 параллельные лунки. Одновременно получали отрицательный контроль (т.е. плацебо-контроль, среду для культивирования DMEM). Реакцию проводили в течение 20 минут при 37°C.
[00212]
4.7 Разрушение клеток
[00213]
Быстро отсасывали образец и один раз промывали PBS, 100 мкл раствора для фрагментации добавляли в каждую лунку, фрагментировали в течение 30 минут в холодильной камере при 4°C. Горизонтально встряхивали в условиях ледяной бани до тех пор, пока все субстрат-зависимые клетки не оседали, 4°C, 15000 об./мин. центрифугировали в течение 15 минут.
[00214]
4.8 Запечатывание планшета для определения ELISA
[00215]
Планшет промывали 5 раз. Получали 5% обезжиренное молоко с промывочным раствором, добавляли 200 мкл в каждую лунку планшета, держали при 37°C в течение 2 часов.
[00216]
4.9 Добавление образца
[00217]
После 3-кратного промывания запечатывали планшет для ELISA, добавляли стандартный раствор для фрагментации клеток и раствор для фрагментации тестируемого образца при 90 мкл на лунку, одновременно получали отрицательный контроль, держали в течение 1 часа при 37°C.
[00218]
4.10 Добавление меченого ферментом антитела
[00219]
Планшет промывали 5 раз, разбавляли меченое ферментом HRP антитело мыши против фосфорилированной тирозиновой протеинкиназы с использованием лосьона 1:500 (определяли с помощью продукта с использованием руководства и по времени использования), в каждую лунку планшета добавляли 100 мкл. Держали в течение 1 часа при 37°C.
[00220]
4.11 Проявление окрашивания субстрата
[00221]
Планшет промывали 5 раз, полученный рабочий раствор субстрата добавляли в 100 мкл на лунку, держали в течение 10 минут при 37°C.
[00222]
4.12 Терминация
[00223]
2
4
2 Н HSO добавляли в 50 мкл на лунку для терминации реакции.
[00224]
4.13 Считывание значения OD
[00225]
Посредством колориметрического анализа с помощью спектрофотометра для ELISA определяли длину волны 450 нм, референсную длину волны 655 нм, регистрировали результаты.
[00226]
5. Результаты
[00227]
Построение графика концентрации рекомбинантного нейрегулина-1 человека относительно значения OD и анализ осуществляли с использованием способа линейной регрессии, посредством которого вычисляли полуэффективную дозу каждого образца, подлежащего тестированию. Результаты тестирования четырех составов rhNRG-1 приведены в таблице 16.
[00228]
Таблица 16Биологическая активность тестовых образцов
Образец
Значение OD<sub>50</sub>
Значение EC<sub>50</sub>
EC<sub>50 </sub>стандартного образца/EC<sub>50 </sub>образца
Специфическая активность (×10<sup>4 </sup>Ед./мг)
Биологическая активность (×10<sup>4 </sup>Ед.)
Референсный образец
0,391
0,0505
-
0,60
0,150
Образец A
0,393
0,0439
1,15
0,69
0,173
Образец B
0,406
0,0217
2,33
1,40
0,35
Образец C
0,424
0,0189
2,67
1,60
0,40
[00229]
Данные о биологической активности образца B и образца C (см. в таблице 16), очевидно, лучше данных для референсного образца и образца A. Результаты свидетельствуют о том, что концентрации HSA 2 г/л (образца B) или 8 г/л (образца C) являются предпочтительными концентрациями для составов rhNRG-1.
[00230]
Пример 5:
Ускоренное и длительное тестирование стабильности
[00231]
1. Цели эксперимента
[00232]
Исследование стабильности конечных лекарственных продуктов rhNRG-1
[00233]
2. Экспериментальный способ
[00234]
Экспериментальный материал: четыре партии конечного лекарственного продукта rhNRG-1 (FDP), произведенных Zensun. FDP rhNRG-1 получали посредством лиофилизации раствора, содержащего приблизительно 250 мкг/л rhNRG-1, приблизительно 10 мМ фосфатный буфер при pH приблизительно 6,0, приблизительно 50 г/л маннита, приблизительно 2 г/л HSA и приблизительно 150 мМ NaCl. После лиофилизации количество продукта в каждом сосуде составляет приблизительно 60 мг.
[00235]
Осуществляли исследования для оценки стабильности конечного лекарственного продукта (FDP) rhNRG-1, хранящегося в рекомендуемых и усиленных условиях хранения, которые можно найти в таблице 17. Образцы растворяли в 1 мл воды при тестировании значения pH, биологической активности и количества rhNRG-1 через тестируемые интервалы.
[00236]
Действующим техническим условием является ≤3,0% остаточной влаги (определяемой с использованием способа Карла Фишера). Серии rhNRG#1, rhNRG#2, rhNRG#3 и rhNRG#4 получали с уровнями влаги 1,49%, 1,51%, 1,62%, и 1,35%, соответственно. Исходя из прошлого опыта в отношении других продуктов со схожими конфигурациями сосуда и пробки, ожидают, что любые серии rhNRG-1, полученные с остаточной влагой приблизительно 1,7%, будут соответствовать установленному пределу ≤3,0% в конце предполагаемого срока годности (т.е. 24 месяцев при предполагаемой температуре хранения 5°C±3°C).
[00237]
Длительные исследования стабильности в рекомендуемых условиях хранения (т.е. 5°C±3°C) и при повышенных температурах (т.е. 25°C±2°C) осуществляли с использованием четырех серий FDP rhNRG-1, произведенных Zensun. В этих исследованиях получали достаточно данных для того, чтобы продемонстрировать стабильность отдельных клинических серий.
[00238]
Таблица 17Условия хранения и интервалы тестирования для каждой партии
Номер партии
Условия хранения
Завершенные интервалы тестирования
rhNRG#1
5°C±3°C
0,3,6,9,12,18,24 месяцев
25°C±2°C
0,1,2,4,6 месяцев
rhNRG#2
5°C±3°C
0,3,6,9,12,18,24 месяцев
25°C±2°C
0,1,2,4,6 месяцев
rhNRG#3
5°C±3°C
0,3,6,9,12,18,24 месяцев
25°C±2°C
0,1,2,4,6 месяцев
rhNRG#4
5°C±3°C
0,3,6,9,12,18,24 месяцев
25°C±2°C
0,1,2,4,6 месяцев
[00239]
3. Результаты и выводы
[00240]
Каждую партию тестировали по пунктам, включающим внешний вид, значение pH, остаточную влагу, биологическую активность и количество rhNRG-1 через интервалы тестирования.
[00241]
Протокол стабильности, включающий описание анализов стабильности и критериев стабильности, можно найти в таблице 18, также содержащей информацию, касающуюся серий FDP rhNRG-1, оцениваемых в исследованиях стабильности.
[00242]
Результаты приведены в таблице 18
[00243]
Таблица 18Результаты тестирования стабильности каждой партии
Пункты тестирования
Условия хранения
Время тестирования (месяцы)
Внешний вид
Значение pH
Остаточная влага
Биологическая активность (Ед.)
Количество rhNRG-1 (мкг)
Критерии приемлемости
Белое рыхлое твердое вещество
6,0±0,5
≤3,0%
3500-10000
225-275
Данные о стабильности для rhNRG#1
5°C±3°C
0
соответствует
5,98
1,49
4286
244
3
соответствует
6,01
1,85
4300
249
6
соответствует
6,02
1,93
4580
241
9
соответствует
6,01
2,15
4475
235
12
соответствует
6,03
2,26
4420
229
18
соответствует
6,04
2,37
4285
232
24
соответствует
6,03
2,62
4315
231
25°C±2°C
1
соответствует
6,01
1,95
4870
242
2
соответствует
6,03
2,13
4650
239
4
соответствует
6,02
2,37
4430
238
6
соответствует
6,03
2,59
4543
234
Данные о стабильности для rhNRG#2
5°C±3°C
0
соответствует
5,89
1,51
4220
247
3
соответствует
5,93
1,63
4040
252
6
соответствует
5,95
1,78
4645
248
9
соответствует
5,98
1,82
4500
237
12
соответствует
6,01
1,95
4450
233
18
соответствует
6,02
2,23
4728
234
24
соответствует
6,03
2,57
4285
232
25°C±2°C
1
соответствует
5,95
1,98
4350
243
2
соответствует
6,01
2,23
4950
242
4
соответствует
6,03
2,35
4575
251
6
соответствует
6,03
2,51
4674
232
Данные о стабильности для rhNRG#3
5°C±3°C
0
соответствует
5,92
1,62
4070
242
3
соответствует
5,97
1,71
4115
245
6
соответствует
5,95
1,82
4573
258
9
соответствует
5,98
1,95
4323
235
12
соответствует
6,01
2,03
4325
243
18
соответствует
6,02
2,25
4239
247
24
соответствует
6,01
2,37
4398
255
25°C±2°C
1
соответствует
5,98
1,83
4125
241
2
соответствует
6,01
1,95
4539
252
4
соответствует
6,01
2,15
4378
245
6
соответствует
6,03
2,22
4585
259
Данные о стабильности для rhNRG#4
5°C±3°C
0
соответствует
6,1
1,35
4797
248
3
соответствует
6,1
1,37
4809
252
6
соответствует
6,2
1,42
4982
253
9
соответствует
6,1
1,57
4756
255
12
соответствует
5,9
1,69
4825
251
18
соответствует
6,2
1,83
4760
250
24
соответствует
6,3
2,12
4506
231
25°C±2°C
1
соответствует
6,1
1,35
4587
249
2
соответствует
6,2
1,65
4621
251
4
соответствует
6,1
1,83
4588
250
6
соответствует
6,3
2,15
4844
253
[00244]
Изменение, наблюдаемое в остаточной влаге для серий rhNRG#1, rhNRG#2, rhNRG#3 и rhNRG#4, остается ниже критерия приемлемости≤3,0% и не влияет на биологическую активность. Не наблюдали изменений в результатах по стабильности для способов качественного анализа (т.е. внешний вид, анализ SDS-PAGE и т.д.) для серий, произведенных пригодными для использования в неклинических и клинических исследованиях. Аналогично, не наблюдали тенденцию к снижению стабильности в анализе общего белка, анализе количества rhNRG-1 при хранении.
[00245]
Эти серии FDP rhNRG-1 сохраняли биологическую активность rhNRG-1 в течение до 24 месяцев хранения при 5°C±3°C. Результаты свидетельствуют о стабильности в условиях хранения при повышенной температуре в течение 6 месяцев, которую можно экстраполировать на срок годности более 2 лет в условиях холодильной камеры.
[00246]
Предлагаемые условия хранения и срок годности
[00247]
Рекомендуемые условия хранения FDP rhNRG-1 представляют собой 5°C±3°C. Таким образом, предлагают предварительный срок годности 24 месяцев для FDP rhNRG-1 при хранении в рекомендуемых условиях хранения. Срок годности для серий FDP rhNRG-1, по-видимому, можно дополнительно увеличивать с учетом дополнительных данных, получаемых для более длительных периодов хранения.
[00248]
Указанные выше примеры включены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема изобретения. Возможно множество вариантов описываемого выше. Т.к. модификации и варианты описываемых выше примеров будут очевидны специалистам в этой области, следует понимать, что настоящее изобретение ограничено исключительно объемом формулы изобретения.