Способ прогнозирования неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона
METHOD FOR PREDICTION OF NON-DEVELOPING PREGNANCY IN NORMAL EMBRYO KARYOTYPE

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается способа прогнозирования неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе (хромосомном наборе) эмбриона.
Неразвивающаяся беременность - это не только медицинская, но и социально-демографическая проблема. В 80-90% случаев неразвивающаяся беременность происходит в 1 триместре, и в 50-60% случаев ее причиной является наличие хромосомных аномалий у эмбриона [4]. Однако в 40-50% случаев потеря беременности происходит несмотря на нормальный кариотип эмбриона, то есть является предотвратимой. При своевременном прогнозировании потери беременности с генетически полноценным эмбрионом, возможно раннее начало профилактических мероприятий, пролонгирование беременности и рождение здорового ребенка.
Несмотря на большое число исследований, вопрос об этиологии, патогенезе и прогнозировании невынашивания беременности находится в стадии научного поиска [4, 26].
Установить истинную причину «замершей» беременности удается не всегда. Наиболее часто в качестве основных причин неразвивающейся беременности рассматривают хромосомные аномалии эмбриона, анатомические дефекты (пороки развития матки), инфекционные заболевания, гормональные нарушения [1, 4, 7, 12, 15, 16, 26]. По данным Сидельниковой В.М. все факторы можно разделить на социально-биологические (возраст матери, условия труда, наличие профессиональных вредностей, характер отношений между супругами, наличие стрессовых ситуаций, вредных привычек, влияние климатических зон и т.д.) и медицинские (генетические, эндокринологические, инфекционные, иммунологические, анатомические) [16].
В последние годы в генезе невынашивания беременности отмечено возрастание роли «мужского» фактора. В нескольких научных публикациях показано, что в парах, у которых в анамнезе были потери беременности, обязательно следует учитывать качество спермы, профессиональные вредности и образ жизни супруга [19, 22, 25, 27].
Ряд авторов говорит о возможной генетической предрасположенности к невынашиванию беременности у женщины. Чаще всего в этом аспекте изучаются гены тромбофилии, гены фолатного метаболизма, а также гены-регуляторы сосудистого тонуса. На фенотипическом уровне реализация генетических факторов часто приводит к формированию неблагоприятного гиперкоагуляционного фона, повышенной концентрации токсичных продуктов, патологии эндотелиальных клеток. Учитывая сложность метаболических систем, определяющих гармоничное взаимодействие матери и плода, функциональная ослабленность многих генов реализуется в процессе беременности [2, 3].
В данный момент известен целый ряд полиморфизмов генов, ассоциированных с потерей плода на разных сроках беременности. Предполагается, что при тромбофилии нарушаются процессы адекватной имплантации оплодотворенной яйцеклетки, трансформации спиральных артерий и плацентации [2, 14].
Ген РАН расположен на 7 хромосоме. У гомозигот по аллелю 4G (генотип 4G/4G) повышение концентрации ингибитора активатора плазминогена-1 в плазме крови приводит к повышению риска тромбообразования, а при беременности - к увеличению риска невынашивания вследствие десинхронизации процессов фибринолиза и фибринообразования [8].
Ген MTHFR расположен на коротком плече первой хромосомы. Отмечается повышение частоты встречаемости аллеля 677Т у женщин с невынашиванием беременности [20, 23, 24, 28]. Ген MTHFR кодирует фермент метионинтетрагидрофолат редуктазу, которая является основным ферментом фолатного цикла. Снижение активности этого фермента из-за носительства полиморфного варианта гена MTHFR может приводить к нарушению пути реметилирования гомоцистеина (перехода гомоцистеина в метионин), к гипергомоцистеинемии и повреждению эндотелия.
Ген MTRR расположен на 5 хромосоме. Полиморфизм MTRR A66G в 4 раза снижает активность фермента метионинсинтазы редуктазы, что может приводить к развитию патологии, связанной с накоплением гомоцистеина в плазме [21].
Ген NOS3 кодирует фермент NO-синтазу 3-го типа, отвечающий за синтез оксида азота клетками эндотелия. Существуют данные, что полиморфизмы этого гена играют роль при привычном невынашивании беременности, особенно, в сочетании с другими неблагоприятными полиморфизмами (например, в генах тромбофилии и фолатного цикла) [18, 29, 30].
Разработка новых методов прогнозирования невынашивания беременности является своевременной и актуальной. При этом необходимо учитывать клинико-анамнестические параметры как самой женщины, так и ее партнера. Именно подобные математические модели, учитывающие множественные факторы риска, могут быть эффективными для прогнозирования неразвивающейся беременности. Аналогами прогнозирования аномалий родовой деятельности явились:
1. Способ прогнозирования невынашивания первой половины беременности (пат. РФ №2566728, 2015). Пациенткам проводят генотипирование: анализ полиморфизма rs-4680 гена СОМТ.
Недостатки метода: способ прогнозирования основан лишь на частоте встречаемости полиморфных вариантов одного единственного гена (СОМТ), не учитывается влияние других возможных факторов риска, что снижаетне чувствительность и специфичность способа.
2. Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации (пат. РФ №2627472, 2017).
В сыворотке крови беременных в 1 триместре (в сроке 6-11 недель) определяют уровень цитокина IL-288.
Недостатки метода: оценка риска проводится уже при беременности, причем в 6-11 недель (тогда как большинство потерь беременности в 1 триместре происходит в 6-7 недель), прогноз невынашивания беременности основывается только на одном показателе.
3. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности (пат. РФ №2689165, 2019). В 6-10 недель беременности в эпителиальных клетках цервикального канала определяется экспрессия TLR2, TLR10 и IDO методом ПНР и оценивается возраст менархе.
Недостатки метода: риск неразвивающейся беременности оценивается не при преконцепционной подготовке, а уже при наступившей беременности. В формулу изобретения включены параметры, для которых F-критерий <3,84, а р>0,05, то есть не доказано наличие дискриминирующих особенностей этих переменных.
4. Способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре беременности (пат. РФ №2341800, 2008). В первом триместре беременности в сыворотке крови определяют уровень субстанции Р и фактор некроза опухоли α.
Недостатки метода: не указана эффективность способа, способ используется уже при наступившей беременности, а не при преконцепционной подготовке.
5. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности (пат. РФ №26560694, 2015). Оцениваются такие показатели как иммуноглобулины М и G к цитомегаловирусу, морфологический элемент «токсические бляшки» в сыворотке крови, уровень малонового диальдегида в менструальных выделениях, показатель уровня карбонильных групп белков в менструальных выделениях.
Недостатки метода: способ оценивает риск неразвивающейся беременности в целом, не дифференцируя неразвивающуюся беременность связанную с ХА у эмбриона и неразвивающуюся беременность, при которой кариотип эмбриона в норме. При этом методы лечения и профилактики данной патологии должны быть совершенно различны в зависимости от того, нормальный хромосомный набор у эмбриона, либо присутствуют ХА, несовместимые с живорождением.
Прототипом предлагаемого метода является описанный в литературе способ определения наследственной предрасположенности к привычному невынашиванию беременности, при котором проводят генотипирование полиморфных вариантов FXIII, AGT, eNOS, PLA1/A2, GPIIIa, FVII, для каждого из полиморфизмов определены коэффициенты значимости (пат. РФ №2532367, 2014). Недостатки метода: оценка риска основана только на выявлении генетических полиморфизмов, без учета других показателей состояния здоровья женщины, не указаны чувствительность и специфичность способа. Кроме того, в предложенной формуле используются показатели только состояния здоровья женщины, не учитывается мужской фактор невынашивания беременности.
В нашем изобретении мы прогнозируем риск неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона, и при этом используем анамнестические, молекулярно-генетические и лабораторные параметры как женщины, планирующей беременность, так и мужчины - ее партнера.
Поставленная задача - разработка способа прогнозирования неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона при преконцепционной подготовке.
Технический результат - Повышение эффективности прогнозирования неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона, а так же удобство исполнения.
Способ основан на сборе анамнеза и выявлении факторов риска при преконцепционной подготовке, молекулярно-генетическом исследовании (анализ полиморфизмов РАН -675 5G/4G, MTHFR С677Т, MTRR A66G, NOS3 С-786Т у пациентки, планирующей беременность) и анализе спермограммы партнера с последующим подсчетом прогностического индекса. В предлагаемом способе прогнозирования неразвивающейся беременности впервые в акушерстве использованы данные как женщины, так и мужчины, планирующих деторождение, впервые рассчитывается риск неразвивающейся беременности именно с нормальным кариотипом эмбриона, впервые используются молекулярно-генетические показатели в сочетании с анамнестическими параметрами. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ осуществляется следующим способом:
При преконцепционной подготовке проводится сбор анамнеза - для расчета прогностического индекса необходима информация о наличии бесплодия в анамнезе у пациентки и о наличии аденомиоза (эндометриоза матки).
Далее пациентке проводится анализ уровня тромбоцитов и молекулярно-генетическое исследование - анализ полиморфизмов РАН -675 5G/4G, MTHFR С677Т, MTRR A66G, NOS3 С-786Т. Материалом для исследования служит венозная и периферическая кровь, полученная из локтевой вены или пальца пациента стандартизированным способом, в количестве 5 мл. Полученный материал подвергается ПЦР-амплификации в режиме реального времени с использованием реагентов и протоколов фирмы НПО «ДНК-Технология» (РФ) на приборе ДТ-96 той же фирмы.
Для подготовки к сбору эякулята для анализа спермограммы партнера рекомендовалось половое воздержание в течение 2-5 дней. Сбор эякулята осуществлялся после мочеиспускания путем мастурбации в стерильный контейнер, избегая касания стенок и крышки контейнера руками.
Исследование проводили в соответствии с Руководством ВОЗ по исследованию эякулята. После разжижения проводили подсчет количества сперматозоидов, их концентрацию и подвижность с помощью сперманализатора Biola SCA, морфологию сперматозоидов и количество лейкоцитов (сегментоядерных нейтрофилов) определяли при 100х увеличении микроскопа в окрашенных препаратах. Образцы с концентрацией сперматозоидов более 14 млн/мл, прогрессивной подвижностью более 32% и/или общей подвижностью более 40%, количеством лейкоцитов менее 1 млн/мл, соответствовали критериям нормозооспермии.
Дискриминантные переменные для оценки риска неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона представлены в таблице 1. Всем пациенткам с неразвивающейся беременностью проведено цитогенетическое исследование абортивного материала, в группу исследования включались только пациентки, у которых был определен нормальный кариотип эмбриона.
Использовался пошаговый дискриминантный анализ, основанный на минимизации коэффициента Уилькса (λ) после включения в уравнение регрессии каждого нового предиктора. В уравнение регрессии включались предикторы для которых значение F (F-статистика) было >3,84. Переменные, для которых р было >0,05 были исключены из анализа.
Результаты пошагового включения переменных в разделяющие функции представлены в таблице 2.
Сущность способа заключается в определении прогностического индекса Z по формуле:
1
2
3
4
5
6
7
8
Z=1,8Х+1,8Х+0,008Х+0,ЗХ+Х+1,7Х+1,2Х-1,7Х-2,79,
1
где X - наличие бесплодия в анамнезе (да - 1, нет - 0);
2
Х - наличие аденомиоза (да - 1, нет - 0);
3
9
Х - число тромбоцитов, х10/л;
4
Х - генотип РАН -675 5G/4G (5G5G - -1, 5G4G - 0,4G4G - 1);
5
Х - генотип MTHFR С677Т (СС - -1, СТ - 0, ТТ - 4);
6
Х - генотип MTRR A66G (АА - 0, AG - 0, GG - 1);
7
Х - генотип NOS3 С-786Т (СС - 0, СТ - 0, ТТ - 1);
8
Х - нормозооспермия у партнера (да - 1, нет - 0).
При Z>0 - высокий риск неразвивающейся беременности при наличии эмбриона с нормальным кариотипом, Z<0 - низкий риск.
В группе 1Б показатель Z в среднем составил 1,29(-0,03-3,59), в группе 2 - -1,52(-2,54-0,75). Различия статистически значимы (р=0,0000). Графически значение расчетного показателя Z в исследуемых группах представлено на Фиг. 1.
Чувствительность и специфичность классифицирующей модели была оценена при помощи ROC-анализа. По результатам построения ROC-кривой показатель AUC составил 0,834±0,038, ДИ 95% 0,759-0,909 при р=0,0000, что соответствовало высокому качеству модели. На Фиг. 2 представлена ROC-кривая модели прогнозирования неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона.
Для оценки эффективности разработанного правила прогноза проведена его проверка на экзаменационной выборке, подобранной методом «скользящего» подбора. В результате проведенного анализа установлено, что чувствительность решающего правила составила 78,9%, специфичность 88,9%, эффективность 86%.
Примеры практического использования заявляемого способа.
9
Пример 1. Пациентка А., 33 года, обратилась с целью преконцепционной подготовки. Наследственность не отягощена, соматический анамнез не отягощен. Пациентка наблюдается у гинеколога с диагнозом «Бесплодие в браке 4 года, первичное, неясного генеза», других гинекологических заболеваний нет, готовится к программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), в программе ЭКО планирует проведение предимплантационного генетического тестирования (ПГТ), и желает оценить риск неразвивающейся беременности при нормальном хромосомном наборе у эмбриона. Пациентке проведен анализ генетических полиморфизмов. Получены следующие результаты: MTHFR С677Т: СТ; MTRR A66G: GA; РАН -675 5G/4G: 5G4G; NOS3 Т-786С: ТТ. Сдан анализ коагулограммы, результаты в норме, уровень тромбоцитов 198х10/л. Супругу пациентки проведен анализ спермограммы: концентрация сперматозоидов 78 млн/мл, общее количество - 225 млн, прогрессивно подвижных - 44%, количество сперматозоидов с нормальной морфологией - 6%, заключение: нормозооспермия.
При расчете индекс Z=-1,1 - низкий риск неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона.
В программе ЭКО после ПГТ проведен перенос 1 эмбриона, кариотип эмбриона нормальный, наступила одноплодная беременность. В сроке беременности 40-41 неделя родилась живая доношенная девочка, с весом 3250 грамм.
9
Пример 2. Пациентка М., 26 лет. обратилась с целью преконцепционной подготовки. У сестры пациентки - привычное невынашивание беременности. Гинекологической и экстрагенитальной патологии не выявлено. Пациентке проведен анализ генетических полиморфизмов. Получены следующие результаты: MTHFR С677Т: СС; MTRR A66G: GA; РАН -675 5G/4G: 5G4G; NOS3 Т-786С: ТС.Сдан анализ коагулограммы, результаты в норме, уровень тромбоцитов 287x10/л. Супругу пациентки проведен анализ спермограммы: концентрация сперматозоидов 45 млн/мл, общее количество - 112,5 млн, прогрессивно подвижных - 25%, количество сперматозоидов с нормальной морфологией - 11%, заключение: астенозооспермия.
Проведен расчет индекса Z для оценки риска неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона. Индекс Z=-1,79, низкий риск неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона.
Рекомендована стандартная преконцепционная подготовка, прием фолиевой кислоты обоим супругам 400 мкг/сут. Через 3 месяца наступила беременность, которая завершилась срочными родами в 39-40 недель рождением живой доношенной девочки.
Пример 3. Пациентка Н., 25 лет, с неразвивающейся беременностью в анамнезе обратилась с целью преконцепционной подготовки. При неразвивающейся беременности исследование кариотипа эмбриона не проведено. Гинекологической и экстрагенитальной патологии не выявлено.
9
Пациентке проведен анализ генетических полиморфизмов. Получены следующие результаты: MTHFR С677Т: ТТ; MTRR A66G: GA; РАН -675 5G/4G: 5G4G; NOS3 Т-786С: СС.Сдан анализ коагулограммы, результаты в норме, уровень тромбоцитов 380x10/л. Супругу пациентки проведен анализ спермограммы: концентрация сперматозоидов 58 млн/мл, общее количество - 197 млн, прогрессивно подвижных - 14%, количество сперматозоидов с нормальной морфологией - 3%, заключение: астенотератозооспермия.
При расчете индекс Z=5,45 - высокий риск неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона.
Учитывая высокое значение индекса Z можно предположить, что при первой беременности у эмбриона был нормальный кариотип, и теоретически потеря беременности была предотвратимой.
При преконцепционной подготовке пациентке рекомендован прием дипиридамола 75 мг 2 раза в сутки (с целью снижения уровня тромбоцитов, коррекции микроциркуляции), поливитамины, содержащие метилфолат (учитывая полиморфизмы в генах фолатного метаболизма). Супругу пациентки рекомендована консультация андролога, по возможности - коррекция показателей спермограммы.
Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования эффективный, удобен в исполнении, обеспечивает быстрое получение необходимой информации. Способ дает возможность выявления беременных группы риска по неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона, оптимизировать преконцепционную подготовку и своевременно начать сохраняющую терапию. В случае, если у пациентки уже случилась неразвивающаяся беременность, и не было проведено кариотипирование эмбриона, также возможен расчет прогностического Z. И если Z<0, риск неразвивающейся беременности при нормальном кариотипе эмбриона наличия хромосомных аномалий у эмбриона, а если Z>0 - высока вероятность, что кариотип эмбриона при неразвивающейся беременности был нормальным, и в будущем возможна повторная потеря беременности - требуется подробное обследование пациентки.
Использованная литература:
1. Акушерство: нац. рук. / под ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского и др.. Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2017. 1200 с.
2. Андреева М.Д., Капанадзе Д.Л., Самбурова Н.В. Акушерские и перинатальные исходы у пациенток с синдромом потери плода в анамнезе, генетическими и приобретенными формами тромбофилии. Акушерство, гинекология и репродукция. 2014; 8(4): 54-55
3. Баранов B.C. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины / под ред. В.С. Баранова. СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. 528 с.
4. Выкидыш в ранние сроки беременности: диагностика и тактика ведения. Клинические рекомендации. Москва. 2016.
5. Ганковская Л.В., Свитич О.А., Доброхотова Ю.Э., Бахарева И.В., Ритчер О.В., Малушенко С.В. Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации. Патент RU 2627472 С1, дата регистрации 04.07.2016, опубл. 08.08.2017.
6. Демидова Е.М., Садекова О.Н., Самоходская Л.М., Ткачук В.А., Яровая Е.Б. Способ определения наследственной предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности. Патент RU 2532367 С2, дата регистрации 18.10.2012, опубл. 10.11.2014
7. Доброхотова Ю.Э., Мандрыкина Ж.А., Нариманова М.Р. Несостоявшийся выкидыш. Причины и возможности реабилитации. Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2016; 16(4): 85-90.
8. Кирющенков П.А., Ходжаева З.С., Тетруашвили Н.К., Донников А.Е., Белоусов Д.М., Андамова Е.В., и др. Значение полиморфизма ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (SERPINE1: 5G>4G) при отслойках хориона и плаценты на ранних сроках беременности. Акушерство и гинекология. 2012; 5: 34-37.
9. Кудрявцева Е.В., Ковалев В.В. «Тромбофилии в акушерстве: от генотипа к фенотипу»: учебное пособие для врачей. Екатеринбург: УГМУ. 2019
10. Лебедева О.П., Козаренко О.Н., Пахомов С.П., Жукова И.О., Дюмина Ю.В., Саушкина Т.И. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности. Патент RU 2689165 С1, дата регистрации 22.11.2018, опубл. 24.05.2019.
11. Левченко М.В., Орлов В.И. Способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре беременности. Патент RU 2341800 С1, дата регистрации 24.08.2007, опубл. 20.12.2008.
12. Макаров И.О., Шешукова Н.А., Овсянникова Т.В. Особености прегравидарной подготовки у женщин с инфекционым генезом невынашивания беременности. Акушерство, гинекология и репродукция. - 2011; 1: 5-7.
13. Макаров О.В., Морозова К.В., Луценко Н.Н., Сальникова Л.Е., Хаджиева М.Б. Способ прогнозирования невынашивания первой половины беременности. Патент RU 2566728 С1, дата регистрации 21.03.2014, опубл. 27.10.2015.
14. Макацария АД., Чевенак Ф.А., Бицадзе В.О. Беременность высокого риска. МИА, М-2015, 848-900.
15. Серов В.Н., Кожин А.А. Эколого-генеративный диссонанс и патофизиологические аспекты нарушений генеративной функции центрального генеза. Акушерство и гинекология. 1988; 8: 12-15.
16. Сидельникова В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием: метод. пособия и клин. протоколы. 3-е изд. - М.: МЕДпресс-информ, 2013. - 224 с.: ил.
17. Тишкова О.Г., Дикарева Л.В., Воронина Л.П. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности. Патент RU 26560694 С1, дата регистрации 08.07.2014, опубл. 20.08.2015.
18. Третьякова Т.Б., Башмакова Н.В., Демченко Н.С. Генетические предикторы акушерских осложнений: межгенные ассоциации. Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2012; 6(5): 23-28.
19. Anifandis G., Bounartzi Т., Messini C.I., Dafopoulos K., Sotiriou S., Messinis I.E. The impact of cigarette smoking and alcohol consumption on sperm parameters and sperm DNA fragmentation (SDF) measured by Halosperm(). Arch Gynecol Obstet. 2014; 290(4): 777-82.
20. Kamali M., Hantoushzadeh S., Boma S. et al. Association between trombophilic genes polymorphisms and recurrent pregnancy loss susceptibility in the Iranian population: a systematic review and meta-analysis. Iran Biomed J. 2017. 222(22): 78-89.
21. Kurzawski M. et al. Association study of folate-related enzymes (MTHFR, MTR, MTRR) genetic variants with non-obstructive male infertility in a Polish population. Genet Mol Biol. 2015; 38(1): 42-47.
22. MacDonald A.A., Herbison G.P., Showell M., Farquhar С.М.. The impact of body mass index on semen parameters and reproductive hormones in human males: a systematic review with meta-analysis. Hum Reprod Update. 2010; 16(3): 293-311.
23. Mehandjiev T.R., Tenno N.M., Nakura Y., Georgiev T.P., Minekawa R., Wakimoto T. et al. Impact of maternal methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism on intervillous and decidual pathology with pregnancy loss. J Obstet Gynaecol Res. 2019; 45(1): 78-85. doi: 10.1111/jog.13798. Epub 2018 Aug 23. PMID: 30136429.
24. Nan Y., Li H. MTHFR genetic polymorphism increases the risk of preterm delivery. Int J Clin Exp Pathol. 2015; 8(6): 7397-402.
25. Pacey A.A. Environmental and lifestyle factors associated with sperm DNA damage. Hum Fertil (Camb). 2010; 13: 189-93.
26. Recurrent pregnancy loss. Guideline of the European Society of Reproducrion and Embryology. 2017.
27. Ruixue W., Hongli Z., Zhihong Z., Rulin D., Dongfeng G., Ruizhi L. The impact of semen quality, occupational exposure to environmental factors and lifestyle on recurrent pregnancy loss. J Assist Reprod Genet. 2013; 30(11): 1513-8.
28. Shi X., Xie X., Jia Y. et al. Maternal genetic polymorphisms and unexplained recurrent miscarriage: a systematic review and meta-analysis. Clin Genet. 2017; 91(2): 265-284.
29. Trifonova E.A., Swarovskaya M.G., Ganzha O.A. et al. The interaction effect of angiogenesis and endothelial dysfunction-related gene variants increases the susceptibility of recurrent pregnancy loss. J Assist Reprod Genet. 2019; 36(4): 717-726.
30. Zhao X., Li Q., Yu F. et al. Gene polymorphism associated with endothelial nitric xide synthase (4VNTR, G894T, C786T) and unexplained recurrent spontaneous abortion risk: A meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2019; 98(4): e14175