ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОПОЛИСАХАРИДОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В ПЫЛИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
IMMUNOENZYME TEST SYSTEM FOR QUANTITATION OF MYCOPOLYSACCHARIDES AND DERIVATIVES IN AMBIENT DUST

Изобретение относится к области биотехнологии и экологии, в частности к тест-системам для определения содержания микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду, в  окружающей среде, в том числе в пыли помещений, и может быть использовано для оценки пирогенности объектов окружающей среды при проведении экологического мониторинга жилых и производственных помещений.
Оценка пирогенности помещений в настоящее время рассматривается с точки зрения влияния ее факторов на провоцирование разных типов иммунологических реакций макроорганизма. В частности известно, что микополисахариды обладают конъюгатными свойствами в определенных условиях в отношении воздействия истинных аллергенов на организм человека. Поэтому определение количества таких пирогенов, как различные производные клеточных стенок плесневых и дрожжевых грибов в окружающей среде становится актуальным для людей с генетической предрасположенностью к гиперчувствительности.
Значительная часть полисахаридов клеточной стенки плесневых и дрожжевых грибов представлена разветвленными и линейными бета(1-3)-глюканами. Соответственно в пыли помещений могут встречаться различные микополисахариды и их производные, причем разной массы.
В настоящее время известно несколько коммерческих наборов для выявления природных разветвленных (1-3)-бета-D-глюканов, базирующихся на реакции коагуляции при активации каскада ферментов, выделенных из амебоцитов мечехвостов Limulus. Это тест-системы BETA-Glucan Test Maruha (MARUHA, Япония); BETA-Glucan Test Wako (WAKO, Япония); FUNGITEC G Test (FUNGITEC-G, Япония); FUNGITEC G Test MK (FUNGITEC-MK, Япония); Fungitell (МА, США); GLUCATELL (CAPE COD, США).
Недостатком данных коммерческих тест-систем является необходимость использования апирогенных расходных материалов и реагентов, приготовленных с использованием апирогенной воды, что значительно усложняет проведение анализов. Также некоторые из названных тест-систем доступны только в стране производителя.
Известен диагностический набор для обнаружения микополисахаридов в исследуемых образцах, в том числе образцах домашней пыли, содержащий моноклональные антитела А10А и В3В, специфичные к линейным бета-(1-3) глюканам и разветвленным бета(1-3)(1-6)- глюканам грибов рода Candida и Cryptococcus neoformans. Моноклональные антитела предназначены для постановки иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализов (WO2004036222, С07К16/14, опубл. 29.04. 2004).
Недостатком аналога является узкая специфичность моноклональных антител, обнаруживающих перекрестное связывание с микополисахаридами грибов только рода Candida и вида Cryptococcus neoformans.
Известен диагностический набор для определения наличия микополисахаридов в клинических образцах, содержащий бета-(1-3)-глюкансвязывающий агент, выбранный из группы гликосфинголипидов, включающей лактизил церамид (LacCer), галактозил церамид (GalCer), глоботриозил церамид и асиалоганглиозид-GM1, и антитела к природному водорастворимому бета-(1-3)-глюкану. Предпочтительно бета-(1-3)- глюкансвязывающий агент прикреплен к твердой фазе (WO9931510, G01N33/566, опубл. 24.06. 1999).
Существенным недостатком известного диагностического набора является сложность процесса пробоподготовки, что снижает эффективность использования набора при скрининговых исследованиях.
Наиболее близким аналогом является иммуноферментная (ИФА) тест-система для определения микополисахаридов в пыли окружающей среды, содержащая иммунологический планшет с иммобилизованным в лунках ламинарином, калибраторы, содержащие растворы ламинарина, поликлональную кроличью антисыворотку, содержащую антитела к конъюгату ламинарина с бычьим сывороточным альбумином, меченые пероксидазой антивидовые антитела лошади против иммуноглобулинов кролика, раствор для промывания планшетов, раствор для разведения поликлональной антисыворотки; раствор для разведения конъюгата антивидовых антител, раствор ортофенилендиамина в качестве хромогена, перекись водорода и стоп-реагент - 2 н.  раствор HCl (Douwes J., Doekes G., Montijn R., Heederik D., Brunekreef B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8795207?ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum // Appl. Environ. Microbiol, 1996. V.62. P.3176-3182).
Недостатком ближайшего аналога является использование гетерогенных полисахаридных материалов с трудноконтролируемым содержанием бета-глюканового компонента, что значительно снижает чувствительность и специфичность данной тест-системы.
Задачей изобретения является разработка высокоспецифичной и чувствительной ИФА тест-системы для количественного определения микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→>3)-D-глюкозиду, пригодной для оценки пирогенности пыли производственных и жилых помещений и контроля эффективности элиминационных мероприятий.
Технический результат изобретения заключается в повышении специфичности и чувствительности анализа за счет достоверного выявления микополисахаридов и их производных, имеющих в своем составе участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду, причем являющихся водорастворимыми соединениями, и обеспечении возможности одновременно исследовать большое количество образцов.
Технический результат достигается тем, что в качестве покровного антигена твердофазного иммуносорбента и иммуногена для получения специфической поликлональной антисыворотки используется конъюгат синтетического нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, в качестве калибраторов используют синтетический линейный нона-β-(1→3)-D-глюкозид, представляющий собой структуру, одинаковую с некоторыми участками молекул микополисахаридов и их производных. Кроме того, использование калибраторов стандартного состава обеспечивает точность построения калибровочных кривых, что позволяет повысить точность расчета концентрации микополисахаридов и их производных в исследуемых образцах.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Тест-система для количественного определения микополисахаридов и их производных методом ингибиторного твердофазного иммуноферментного анализа содержит:
1. Иммуносорбент - планшет разборный из 12 восьмилуночных стрипов с иммобилизованным в лунках конъюгатом синтетического линейного  нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, готовый к употреблению;
2. Шесть калибраторов, содержащих растворы синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида в концентрациях 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25 и 50 мкг /мл, жидкие, готовые к употреблению;
3. Специфическая поликлональная кроличья антисыворотка, содержащая антитела класса G к конъюгату синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином, лиофилизированная;
4. Конъюгат - конъюгат антивидовых антител против IgG (H+L) кролика с пероксидазой из хрена, жидкий 50-кратный концентрат;
5. Концентрат раствора для промывания планшетов - 25-кратный 0,1М фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05% Tween-20 (ФСБ - Т);
6. Раствор для разведения поликлональной антисыворотки (РРПА), жидкий, готовый к употреблению;
7. Раствор для разведения конъюгата (РРК), жидкий, готовый к употреблению;
8. Хромоген - однокомпонентный раствор тетраметилбензидин (производства США), жидкий, готовый к употреблению;
9. Стоп-реагент - 5%-ный раствор серной кислоты, жидкий, готовый к употреблению.
10. 2 пленки для заклеивания планшета.
11. 2 пластиковые ванночки для реагентов.
12. 16 наконечников для автоматической пипетки.
13. Инструкция по применению.
Калибраторы представляют собой стандартные растворы, содержащие синтетический линейный  нона-β-(1→3)-D-глюкозид в концентрациях 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл и 0 мкг/мл. В отличие от природных гетерогенных полисахаридных материалов, применяемых в известных аналогах, использование в качестве калибратора индивидуального синтетического олигосахарида позволяет строго стандартизовать калибраторы, что обеспечивает повышение точности расчета количественного содержания микополисахаридов и их производных в исследуемых образцах.
Поликлональная антисыворотка (ПА) содержит специфические антитела класса G к конъюгату синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином и получена путем иммунизации кроликов нона-β-(1→3)-D-глюкозидом, конъюгированным с носителем - бычьим сывороточным альбумином. Для повышения качества ПА и устранения неспецифических антител к носителю, антисыворотку истощают бычьим сывороточным альбумином в соотношении 1:1 (мкл:мг).
В качестве конъюгата антивидовых антител используют антитела против иммуноглобулина G кролика, меченные пероксидазой из хрена, в частности коммерческий препарат «Антитела диагностические против IgG(H+L) кролика, меченные пероксидазой.», произведенный предприятием по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.
Принцип определения микополисахаридов и их производных с помощью предлагаемой тест-системы основан на проведении ингибиторного ИФА, в ходе которого известный избыток специфической поликлональной кроличьей антисыворотки взаимодействует в лунках стрипов планшета с аликвотами препаратов, содержащих природные микополисахариды и их производные или синтетический линейный нона-β-(1→3)-D-глюкозид (исследуемая проба или калибратор) и иммобилизованным покровным антигеном, в результате чего  происходит образование комплекса «антиген-антитело» в растворе и на твердой фазе. После удаления несвязавшихся с твердой фазой компонентов реакционной смеси и добавления в лунки планшета антивидовых антител против кроличьих IgG, меченных пероксидазой, происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс на твердой фазе. В результате реакции с раствором хромогена образуется окрашенный продукт, интенсивность окраски которого обратно-пропорциональна концентрации микополисахаридов и их производных в анализируемом образце. После построения калибровочной кривой  расчетным путем определяют концентрацию микополисахаридов и их производных в анализируемых образцах.
В качестве тестируемого материала могут быть исследованы образцы пыли жилых и производственных помещений, постельных принадлежностей, мягкой мебели, мягких игрушек.
Набор реагентов в предлагаемой тест-системе рассчитан на проведение  одновременно 48 анализов при исследовании анализируемых образцов в дублях, включая постановку калибраторов. Компоновка набора допускает возможность дробного использования реагентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления материала для исследования.
Тест-система по изобретению характеризуется хорошей воспроизводимостью и достоверностью результатов (коэффициент вариации не более 8%).
Чувствительность тест-системы составляет не менее 2,0 мкг/ мл синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида.
Специфичность определения микополисахаридов и их производных  составляет 95,63-98,4% . На большом количестве экспериментов подтверждено, что тест-система позволяет выявить в очень низких концентрациях водорастворимые микополисахариды и их производные, содержащие в своем составе участки (структуры), аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду.
Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Приготовление компонентов тест-системы
Приготовление компонентов предлагаемой ИФА-тест-системы осуществляется следующим образом.
1. Получение иммуносорбента
Берут стандартные 96-луночные (12 восьмилуночных стрипов) плоскодонные разборные планшеты для иммуноферментного анализа (фирмы“Costar”, США, кат. № 2592). Берут конъюгат синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином в количестве 1 мкг и растворяют его в 1 мл карбонат-бикарбонатного буфера (0,05 М, рН 9,4). Полученный раствор конъюгата вносят по 100 мкл в  каждую лунку планшета. Далее планшеты инкубируют сначала при температуре 37°Св течение 1 ч, а затем при 4°С в течение 16 ч. По окончании инкубации удаляют жидкость из лунок. Далее планшеты высушивают при 37°С до полного высыхания, упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно под вакуумом и используют при комплектовании набора компонентов тест-системы.
2. Приготовление калибраторов
Калибраторы (50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 и 0 мкг/мл) готовят путем растворения соответствующих навесок синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида в 1 мл 0,1М фосфатно-солевого буфера (рН 7,2 ±2), содержащего 0,05% Tween-20 и 0,016 г/л метиленового зеленого (кат. № М7766 Sigma, США). Далее калибраторы разливают в пробирки и используют при комплектовании тест-системы.
3. Получение специфической поликлональной антисыворотки
Специфическую поликлональную антисыворотку получают иммунизацией кроликов синтетическим линейным нона-β-(1→3)-D-глюкозидом, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином.
Для этого животным подкожно вводят сначала 2,5 мг конъюгата в 1 мл физиологического раствора в присутствии 0,4 мл полного адьюванта Фрейнда, а затем через 28 дней - 1 мг конъюгата в 500 мкл физиологического раствора.
Через 10 дней после последнего введения у животных берут кровь из ушной вены и инкубируют ее при температуре 37°С в течение 30 мин, а затем при температуре 4°С в течение 1 ч. Далее кровь центрифугируют 10 мин при 2 000 об/мин и отбирают специфическую поликлональную  антисыворотку.
Полученную специфическую поликлональную антисыворотку помещают в пластиковую пробирку в количестве 10 мкл, прибавляют 200 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 50 мг/мл, лиофильно высушивают и используют при комплектовании тест-системы.
4. Приготовление концентрата фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т) для промывания планшетов (25-кратный концентрат)
Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т) готовят путем растворения 70 г натрия двузамещенного фосфата натрия кристаллогидрата, 5 г однозамещенного фосфата калия, 5 г хлористого калия, 200 г хлористого натрия в 1 л дистиллированной воды, прибавления 0,05 % (V/V) Tween-20 и доведения рН раствора до 7,2±2. Разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.
5. Приготовление раствора для разведения поликлональной антисыворотки (РРПА).
РРПА готовят путем прибавления к 10 мл рабочего раствора ФСБ-Т 80 мкл раствора бриллиантового зеленого (кат. № В6756 Sigma, США) с концентрацией 2 г/л. Разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.
6. Приготовление раствора для разведения конъюгата антител диагностических, меченных пероксидазой (РРК)
РРК готовят путем прибавления к 10 мл ФСБ-Т 80 мкл раствора метиленового голубого (кат. № М9140 Sigma, США) с концентрацией 2 г/л. Разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.
7. Приготовление стоп-реагента
Стоп-реагент готовят путем прибавления к 95 мл дистиллированной воды 5 мл концентрированной серной кислоты. Полученный раствор разливают во флаконы и используют при комплектовании тест-системы.
8. Приготовление раствора хромогена
В качестве раствора хромогена используют коммерческий однокомпонентный раствор тетраметилбензидина (ТМБ) производства США.
Пример 2. Сбор образцов пыли
Для анализа собирают пыль с помощью пылесоса. Для этого в разъеме металлических трубок пылесоса зажимают стерильный фильтр - кусок хлопчато-бумажной ткани размером примерно 10×10 см. Диаметр отверстий между волокнами ткани должен быть не более 0,1 мм.
Пыль собирают с площади поверхности не менее 0,5×0,5 м в течение 1,5-2 мин, причем в случае определения концентрации микополисахаридов и их производных в матраце, подушках, одеялах, коврах, мягкой мебели желательно обработать разные стороны и места объектов. Объем собранной пыли должен быть не менее 1 чайной ложки. Пыль вместе с фильтром помещают в пластиковый пакет и снабжают этикеткой. Хранить образцы пыли следует при температуре -20°С.
Пример 3. Приготовление проб для проведения анализа
Взвешивают 10 мг пыли, помещают в пробирку типа «Eppendorf», прибавляют 1 мл рабочего раствора ФСБ-Т, перемешивают. Пробирку тщательно закрывают при помощи парафильма. Пробирку помещают в плоскотельный термостат. Суспензию нагревают в течение 60 мин при температуре 95°С. Необходимо следить, чтобы крышка пробирки не открывалась при нагревании. После охлаждения до комнатной температуры, центрифугируют 5 мин (1500 об/мин). Надосадочную жидкость используют в качестве пробы при проведении ИФА.
Пример 4. Применение тест-системы для проведения анализа
Калибраторы, РРПА, РРК, раствор хромогена и стоп- реагент готовы к применению. Рабочие растворы поликлональной антисыворотки, конъюгата и раствора для промывания планшетов готовят перед проведением анализа.
А. Подготовка рабочих растворов для проведения анализа:
А1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т для промывания планшетов.
Отбирают 25 мл концентрата раствора, переносят в чистую мерную емкость, доводят объем дистиллированной водой до метки 600 мл и перемешивают. В случае обнаружения осадка в концентрате флакон выдерживают при температуре от 35 до 37°C до полного растворения осадка.
Приготовленный рабочий раствор ФСБ-Т хранят не более 24 ч при температуре 4-8°C .
А2. Приготовление рабочего разведения поликлональной антисыворотки (ПА).
В пробирку с лиофилизированной ПА вносят 5 мл РРПА, перемешивают до полного растворения.
Рабочий раствор ПА хранят не более 2 недель при температуре 4-8°C.
А3. Приготовление рабочего разведения конъюгата антивидовых антител против кроличьих IgG с пероксидазой из хрена.
В пробирку с 2 мл РКК вносят 10 мкл конъюгата (в расчете на 2 стрипа) или во флакон с 12 мл РКК помещают весь объем (60 мкл) конъюгата (в расчете на 12 стрипов).
Рабочий раствор конъюгата хранят не более 2 ч при температуре 4-8°C.
Б. Проведение ингибиторного иммуноферментного анализа (ИФА).
В случае дробного использования тест-системы отбирают необходимое количество стрипов. Остальные стрипы помещают обратно в пакет и хранят в плотно закрытом пакете при температуре 4-8°C.
Во все лунки вносят по 245 мкл рабочего раствора ФСБ-Т. Выдерживают при комнатной температуре 1-2 мин. Удаляют из лунок жидкость стряхиванием и постукиванием по разложенной на твердой поверхности фильтровальной бумаге.
В каждые 2 параллельные лунки иммуносорбента последовательно вносят  по 50 мкл калибраторов с концентрацией - 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 0 мкг/мл. В последующие лунки вносят по 50 мкл исследуемых проб. Далее во все лунки вносят по 50 мкл рабочего разведения ПА. Стрипы заклеивают пленкой и инкубируют в термостате 40 мин при температуре 37°С. После этого удаляют жидкость из лунок и трижды промывают лунки по 245 мкл рабочего раствора ФСБ-Т. Удаляют из лунок жидкость, как указано выше.
Затем во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Заклеивают стрипы пленкой и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С. Для внесения конъюгата рекомендуется использовать пластиковую ванночку и одноразовые наконечники.
По окончании инкубации удаляют жидкость из лунок, трижды промывают лунки рабочим раствором ФСБ-Т, а затем трижды промывают дистиллированной водой. Удаляют из лунок жидкость, как указано выше.
Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 3-5 мин. Для внесения раствора ТМБ необходимо использовать новую пластиковую ванночку и одноразовые наконечники.
Визуально протекание ферментативной реакции определяется по появлению голубого окрашивания реакционной смеси в лунках, в которые были внесены калибраторы.
Реакцию останавливают путем прибавления во все лунки по 100 мкл  стоп-реагента (при этом цвет реакционной массы в лунках меняется с голубого на желтый).
Измеряют оптическую плотность (ОП) растворов в лунках при длине волны, равной 450 нм, строят концентрационную кривую и по графику определяют концентрацию микополисахаридов и их производных в исследуемой пробе. Далее расчетным путем получают значения количественного содержания микополисахаридов и их производных в образце пыли.
Пример 5. Использование тест-системы для выявления полисахаридов различной природы из разных источников
Для анализа взвешивают по 5 мг полисахаридов, выделенных из пекарских дрожжей (S. cerevisiae) (кат. № G5011 Sigma, США), водорослей (Euglena gracilis) (кат. № 89862 Sigma, США), панциря креветок (хитин) (кат. № С9752 Sigma, США), готовят растворы в ФСБ-Т с концентрацией 1 мг/мл, нагревают, как указано в примере 3, путем разведения готовят растворы с концентрацией 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, которые используют в качестве тестируемых проб при проведении ингибиторного ИФА, как описано в примере 4.
Таблица 1
Определение природных полисахаридов различного происхождения
(в ед. ОП)
Концентрация полисахаридамкг/мл
Величина оптической плотности
Полисахарид из дрожжей
Полисахарид изводорослей
Хитин
10
1,632
1,969
1,916
1
1,874
1,949
1,901
0,1
2,019
1,845
1,925
Отрицательный контроль (PBS)
2,046
Положительный контроль (покровный антиген, 1 мкг/мл)
0,412
Данные табл.1 свидетельствуют о том, что тест-система по изобретению направлена на выявление именно природных бета-глюканов, растворимых в водных растворах и имеющих в своей структуре участки, доступные для иммунохимического связывания с антителами, полученными против иммуногена, т.е. структурно аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду.
Пример 6. Использование тест-системы для количественного определения микополисахаридов и их производных в пыли постельных принадлежностей.
Для анализа собирают с помощью пылесоса пыль с постельных принадлежностей, как указано в примере 2. Приготавливают пробу для анализа, как указано в примере 3.
Постановку реакции ингибиторного ИФА и определение концентрации производных микополисахаридов проводят так, как описано в примере 4.
По построенному калибровочному графику определяют концентрацию микополисахаридов и их производных в пробе в мкг синтетического линейного нона-β-(1→3)-D-глюкозида. Далее расчетным путем получают данные количественного содержания микополисахаридов и их производных в образце пыли в мкг нона-β-(1→3)-D-глюкозида/г пыли. Результаты представлены в табл.2.
Таблица  2
Определение концентрации микополисахаридов и их производных в образцах  пыли.
Объект исследования
Количество производных микополисахаридов (мкг нона-β-(1→3)-D-глюкозида/г пыли)
Ковер
1200
Постельные принадлежности
200
Кресло
470
Мягкая игрушка
650
Полученные данные свидетельствуют, что в образцах пыли присутствуют растворимые производные бета-глюканов, имеющих участки, аналогичные синтетическому линейному нона-β-(1→3)-D-глюкозиду. Таким образом, тест-система позволяет быстро и эффективно определять концентрацию микогенных полисахаридов в различных объектах, с которыми контактирует человек, и может быть использована для проведения экологического мониторинга жилых и производственных помещений с целью количественного определения пирогенной нагрузки пыли окружающей среды при помощи ингибиторного иммуноферментного анализа на твердой фазе.