Роль цитокинов в редокс-зависимой регуляции апоптоза

Роль цитокинов в редокс-зависимой регуляции апоптоза

Чечина О.Е., Биктасова А.К., Сазонова Е.В., Жукова О.Б., Прохоренко Т.С., Крат И.В., Часовских Н.Ю., Новицкий В.В., Рязанцева Н.В.

The role of cytokines in redox-dependent regulation of apoptosis

Chechina O.Ye., Biktasova A.K., Sazonova Ye.V., Zhukova O.B., Prokhorenko T.S., Krat I.V., Chasovskikh N.Yu., Novitsky V.V., Ryazantseva N. V.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

© Чечина О.Е., Биктасова А.К., Сазонова Е.В. и др.

Проведено исследование влияния рекомбинантной формы фактора некроза опухоли а, интерлейкина-2 и интерлейкина-4 in vitro на апоптоз лимфоцитов. Установлено, что проапоптотический эффект данных ци-токинов является дозозависимым и реализуется при участии активных форм кислорода и митохондрий.

Ключевые слова: лимфоцит, цитокины, апоптоз, активные формы кислорода, митохондрия.

Research of influence of recombinant tumor necrosis factor alpha, interleukin-2 and interleukin- 4 in vitro on the apoptosis of lymphocytes is performed. It is revealed that a proapoptotic effect of these cytokines is dose-dependent and is realized with the assistance of reactive oxygen species and mitochondrias.

Key words: lymphocyte, cytokines, apoptosis, reactive oxygen species, mitochondria.

УДК 616-091.818:576.5

Введение

Цитокины представляют собой биологически активные пептиды, оказывающие плейотропные эффекты на различные типы клеток, главным образом участвуя в поддержании тканевого го-меостаза путем формирования и регуляции защитных реакций организма [6]. Одним из механизмов реализации данных биологических функций цитокинов является поддержание численности иммунных клеток путем модуляции программы их апоптотической гибели [ю]. Следует отметить, что влияние обозначенных регуляторов апоптоза на клетки неоднозначно: для одних клеток они выступают в роли индукторов, для других — в роли ингибиторов апоптоза. Характер ответа клетки на действие того или иного цито-кина, вероятно, зависит от его концентрации, а также от микроокружения или особенностей

самой клетки-мишени, в первую очередь ее ги-стогенетического происхождения, стадии диф-ференцировки, состояния внутриклеточных сигнальных систем [4, 7, 12].

Регуляция апоптоза на молекулярном уровне осуществляется за счет самых разнообразных факторов, обладающих активирующим либо, напротив, ингибирующим влиянием на данный процесс [6]. Существенную роль в системе контроля программированной клеточной гибели играют активные формы кислорода (АФК), осуществляющие регуляцию редокс-состояния клетки и выступающие на разных уровнях сигнальных путей в качестве мессенджеров апо-птогенного стимула [8]. Баланс между окисленными и восстановленными молекулами является важным механизмом модуляции клеточной активности. Накопление в клетке сильных окислителей ведет к повышению проницаемости

митохондриальной мембраны [2]. Митохондрии играют одну из ключевых ролей в развитии и регуляции апоптотической программы. На этих органеллах сосредоточено большое количество сигнальных путей, которые образуют достаточно сложную систему взаимовлияний в клетке [9, и, 13]. В матриксе и межмембранном пространстве митохондрий присутствует большое количество таких веществ, как апопто-зиндуцирующий фактор, цитохром с, прокаспазы-2, -3, -9, способные прямо или косвенно индуцировать многочисленные изменения, характерные для апоптоза [2].

Накопленные в настоящее время сведения о цитокинопосредованной гибели клеток в малой степени отражают связь данного пути апо-птоза с действием активных форм кислорода. Исследования, направленные на выяснение участия АФК в реализации цитокинопосредованного апоптоза, позволяют приблизиться к раскрытию механизмов, протекающих в клетках на фоне цитокинового дисбаланса.

В этой связи целью настоящего исследования явилась оценка роли цитокинов в редокс-зависимой регуляции апоптоза лимфоцитов.

Материал и методы

В эксперименте in vitro использовали лимфоциты, полученные у 24 здоровых доноров (11 мужчин и 13 женщин в возрасте 22—30 лет). Выделенные из венозной крови стандартным методом на градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia,

Швеция) (р = 1,077 г/см3) клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37 °С и 5% СО2 в полной культуральной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 (« Вектор-Бест», г. Новосибирск), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (« Биолот», г. Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина, либо в полной среде с добавлением проапоптотической дозы рекомбинантного фактора некроза опухо-

ли а (рФНО-а). Кроме того, для оценки влияния интерлейкина-2 (ИЛ-2) и -4 (ИЛ-4) на апо-птоз лимфоциты инкубировали в чистой среде

RPMI-1640 или в

среде rpmi-1640 с добавлением проапоптотиче-ской дозы рекомбинантных ИЛ-2 (рИЛ-2) и ИЛ-

4 (рИЛ-4). Для подбора проапоптотической дозы в ходе проведения серии экспериментов в культуральную среду добавляли рФНО-а, рИЛ-2

и рИЛ-4 (Invitrogen, США) в дозах от 0,015 до 1 нг/

мл. Проапоптотический эффект ФНО-а проявлялся, начиная с дозы 0,05 нг/мл, ИЛ-2 — с дозы 0,10 нг/мл, а ИЛ-4 — с дозы 0,15 нг/мл.

После культивирования клетки ресуспенди-ровали в аннексиновом буфере, содержащем аннексин v, меченный флюоресцин изотиоциа-натом (ФИТЦ), и пропидий йодид, инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Epics XL (Beckman Coulter, Швейцария).

Уровень наработки активных форм кислорода

в клетках определяли методом проточной ци-тометрии с помощью красителя с заблокированной флюоресценцией — дихлорфлюоресце-ина диацетата (ДХФ-ДА). После культивирования 90 мкл суспензии клеток в концентрации 2 • 106 клеток на 1 мл переносили в центрифужную пробирку объемом 5 мл для проточного цитометра и добавляли 10 мкл рабочего раствора ДХФ-ДА (Sigma, США). Через 20 мин инкубации при температуре 37 °С в пробу вносили 11 мкл 0,2% ЭДТА на 30 мин при температуре 37 °С, затем центрифугировали 1 мин при 1 500 об/мин и удаляли супернатант. Реакцию останавливали 200 мкл лизирующего раствора

(0,826 г NH4Cl, 0,1 г NaHCO3, 3,7 мг ЭДТА-Na на

100 мл h2o), после чего клетки однократно отмывали и ресуспендировали в 400 мкл фос-фатно-солевого буфера (рн = 7,4). Анализ образцов клеток проводился на проточном цитометре Epics xl с помощью гистограмм fl-1 и соответствующих им окон статистики, содержащих показатели средней геометрической интенсивности свечения меченых клеток.

Регистрацию изменения величины мембранного потенциала митохондрий проводили методом проточной лазерной цитометрии с использованием набора реагентов MitoScreen (BD Pharmigen,

США). Суспензию лимфоцитов, содержащую 1 • 106 клеток, центрифугировали 5 мин при 4003. К клеточному осадку добавляли 0,5 мл раствора

jc-i (5,5',б,б'-тетрахлоро-1,1\з,з'-тетраэтилбензими-дазолилкарбоцианин йодид). Клетки ресуспен-дировали и инкубировали ю—15 мин при температуре 37 °С, затем дважды отмывали буфером. Окрашенные jc-i лимфоциты анализировали на проточном цитометре Epics XL.

Проверку нормальности распределения количественных показателей выполняли с использованием критерия Колмогорова—Смирнова. Для каждого анализируемого показателя вычисляли медиану Me и первый и третий квартили Q—Q3. Для определения достоверности различий между независимыми группами использовался непараметрический двусторонний U-критерий Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

Цитокины считаются наиболее многочисленной группой биологически активных веществ, которые оказывают существенное влияние на процесс пролиферации, дифференцировки и гибели клетки. Выявлена большая группа цитоки-нов (ИЛ-2, -з, -4, -ю, факторы роста), при действии которых запускается эндогенная программа защиты клеток от апоптоза, опосредованная через белки Bcl-2, bci-xl и др. Ряд других цитоки-нов (ФНО, ИЛ-1, -10), напротив, обладают способностью индуцировать апоптоз. Действие цитокинов, вероятно, носит дозозависимый характер, определяется типом клеток-мишеней и их функциональным статусом (степенью диф-ференцировки, функциональной активностью, состоянием рецепторного аппарата клетки). В зависимости от этого одни и те же цитокины могут проявлять про- и антиапоптотический эффекты, что прежде всего характерно для ФНО, ИЛ-2, -4, -10 и др. [4, 7, 10, 16].

Факт дозозависимого влияния цитокинов на апоптоз активно обсуждается современными исследователями [6, 12, 17]. Для подтверждения теории о дозозависимости эффекта цитокинов на реализацию апоптоза лимфоцитов были использованы различные дозы рекомбинантных ФНО-а, ИЛ-2 и ИЛ-4 в диапазоне от 0,015 до i нг/мл. Проведенное in vitro исследование показало, что рФНО-а оказывает свой проапопто-тический эффект в отношении лимфоцитарных

клеток в полной питательной среде, начиная с концентрации 0,05 нг/мл (р < 0,001) (рисунок, табл. 1). В то время как рИЛ-2 и рИЛ-4 проявляли свое проапоптотическое действие лишь в среде, лишенной ростовых факторов, начиная с концентрации 0,10 (р < 0,01) и 0,15 нг/мл (р < 0,01) соответственно (рисунок, табл. 2). Полученные данные, вероятно, объясняются тем, что ИЛ-2 и ИЛ-4 действуют только на лимфоциты, получившие какой-либо активаци-онный сигнал (в данном случае — отсутствие ростовых факторов), в то время как ФНО-а действует даже на неактивные лимфоциты [16].

о —1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1

0,015 0,025 0,050 0,100 0,150 0,250 0,500 1,000

Доза цитокиаа, нг/мл —— Клетки, инкубированные с рИЛ-2 ---*--- Клетки, инкубированные с рИЛ-4 - • - Клетки, инкубированные с рФНО-а

Изменение количества клеток в апоптозе в культуре лимфоцитов крови в зависимости от концентрации рИЛ-2, рИЛ-4 и рФНО-а

в инкубационной среде

Таблица 1

Показатели апоптоза лимфоцитов при их инкубации in vitro

с проапоптотической дозой рекомбинантного ФНО-а

Показатель Интактные клетки (полная среда) Инкубация с рФНО-а

Количество лимфоцитов в апоптозе, % 1,69 (1,04—2,08) 8,73 (7,30—12,40) р < 0,001

Внутриклеточный уровень АФК, усл. ед. 0,035 (0,008—0,095) 0,079 (0,076—0,326) р < 0,05

Количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным ми-тохондриальным потенциалом, % 2,24 (1,34—2,89) 4,54 (1,76—6,78) р < 0,05

Примечание. Здесь и в табл. 2: p — достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями ин-тактных клеток.

Таблица 2

Количество апоптотически измененных клеток, клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, внутриклеточный уровень активных форм кислорода в условиях культивирования лимфоцитов in vitro с проапоптотической

дозой рекомбинантных ИЛ-2 и ИЛ-4

Показатель Интактные клетки (бессывороточная среда) Инкубация с рИЛ-2 Инкубация с рИЛ-4

Количество лимфоцитов в апоптозе, % 9,45 (8,36—10,52 ) 16,20 (11,75—17,87) р <0,01 16,39 (10,12—21,60) р < 0,01

Внутриклеточный уровень АФК, усл. ед. 0,047 (0,028—0,078) 0,078 (0,059—0,170) р < 0,05 0,086 (0,040—0,145) р < 0,05

Количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным митохондри-альным потенциалом, % 2,25 (1,27—3,66) 7,63 (5,20—8,97) р < 0,001 5,00 (4,50—6,22 ) р < 0,01

Механизмы проапоптотического действия цитокинов до конца не изучены. Среди множества факторов, опосредующих эффекты цитокинов, выделяют редокс-состояние клетки-мишени, которое определяется главным образом интенсивностью внутриклеточной продукции АФК, а также участием некоторых митохондриальных факторов [8, 12, 14]. АФК выполняют функцию вторичных посредников при реализации лиганд-рецепторных взаимодействий гормонов, цитокинов, факторов роста и их рецепторов [5]. Кроме того, они изменяют экспрессию ряда генов, в том числе и транскрипционных факторов, участвующих в регуляции клеточного цикла, дифференцировки и программированной гибели клетки [15].

В результате инкубации клеток с рФНО-а внутриклеточная продукция АФК оказалась практически вдвое (р < 0,05) выше соответствующего показателя в интактных лимфоцитах. Аналогичным оказалось влияние рИЛ-2 и рИЛ-4 (р < 0,05) на уровень АФК в клетке (табл. 1 и 2).

Рассматривая механизмы участия АФК в реализации апоптоза, особое внимание следует уделить митохондриям. Эти органеллы являются не только мишенями действия АФК, но и одним из главных источников их образования в клетке, концентрируя в себе большую часть окислительных путей метаболизма, содержат многочисленные редокс-переносчики и центры, потенциально способные к одноэлектронному

восстановлению кислорода до радикала супероксид-аниона — предшественника других АФК

[3, 14].

При проведении цитометрической оценки лимфоцитов после их инкубации с рФНОа, рИЛ-2 и рИЛ-4 в проапоптотической дозе количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом достоверно (р < 0,05, р < 0,001 и р < 0,01 соответственно) возрастало по сравнению с аналогичным показателем в интактной культуре (см. табл. i и 2). Известно, что к снижению Ду приводит открытие митохондриальных пор из-за смещения равновесия активных форм белков семейства Bci-2 в сторону проапоптотических протеинов [ii, 13]. При этом происходит высвобождение в цитозоль апоптозиндуцирующего фактора, цитохрома с и некоторых прокаспаз. Активация каспазы-9 запускает инициацию кас-пазы-з и -7, которые, в свою очередь, расщепляют различные белки, приводя к появлению биохимических и морфологических признаков апоптоза [2, 9, 13].

Заключение

Подводя итог полученным результатам исследования, следует отметить, что проапоптоти-ческие эффекты цитокинов носят дозозависимый характер и определяются состоянием внутриклеточных сигнальных систем. Важными внутриклеточными участниками апоптотической программы являются активные формы кислорода. Увеличе-

ние продукции АФК при цитокининдуцированном апоптозе сопряжено со снижением трансмембранного митохондриального потенциала, что свидетельствует о нарушении редокс-статуса клетки и заинтересованности митохондриально-го пути в реализации данного вида клеточной смерти.

Стало ясно, что с позиции нарушения апо-птоза можно объяснить развитие многих заболеваний человека, поскольку дисбаланс между пролиферацией клеток и программированной клеточной смертью ведет к патологическим изменениям органов и тканей. Цитокины являются одним из основных факторов, оказывающих регулирующее влияние на эти процессы. Нарушение цитокиновой сети выступает патогенетическим звеном ряда заболеваний, сопряженных с дисрегуляцией пролиферации и апоптоза, в связи с чем встает вопрос о поиске новых внутриклеточных мишеней и целесообразности использования цитокиновых молекул или применения антагонистов к ним в терапевтических целях.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России» на 2007— 2012 гг. (ГК № 02.512.12.0013 и ГК № 02.512.11.2285), при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (07-04- 12150_офи, 09-04-99025 р_офи).

Литература

1. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях // Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 2. С. 246—264.

2.БраМ., Квинан Б., Сузин С.А. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели // Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 2. С.

284—293.

3.Зоров Д.Б., Банников С.Ю., Белоусов В.В. и др. Друзья или враги: активные формы кислорода и азота // Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 2. С. 265—272.

4. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Часовских Н.Ю. и др. Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса // Бюл. эксперим. медицины и биологии. 2008. №3. С. 251—254.

5. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуля-ция клеточных функций // Биохимия. 2007. Т. 72.

Вып. 2. С. 158—174.

6. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами // Иммунология. 2002.

№ 4. С. 237—243.

7. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Литвинова Л.С. и др. Влияние рекомбинантных форм интерлейки-нов-5, -3 и эотаксина на апоптоз эозинофильных гранулоцитов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2007. Т. 143. № 4. С. 370—373.

8.Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Часовских Н.Ю. и др. Редокс-зависимая регуляция апоптоза: адаптивная роль активных форм кислорода при окислительном стрессе // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2008. Т. 94. № 6. С. 710—718.

9. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Соросовский образо-ват. журн. 2001. Т. 7. № 6. С. 4—10.

10. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме // Патолог. физиология и эксперим. терапия. 1998. № 2. С. 38—48.

11. Adams J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis // Genes & Development. 2003. Vol. 17. P. 2481—2495.

12. Callard R., George A.J.T., Stark J. Cytokines, chaos, and complexity // Immunity. 2003. Vol. 11. P. 507—513.

13. Dragovich T., Rudin C.M., Thompson C.B. Signal transduction pathways that regulate survival and cell death // Oncogene. 1998. Vol. 17. P. 3207—3213.

14. Fleufy C., Mignotte B., Vayssierre J.L. Mitochondrial reactive

oxygen species in cell death signaling // Biochimie. 2002. № 84. P. 131—141.

15. Jackson M.J., Papa S., Bruckdorfer J. Antioxidants, reactive

oxygen and nitrogen species, gene induction and mitochondrial function // Mol. Aspects Med. 2002. № 23. P. 209—285.

16.Lenardo M., Chan K.M., Hornung F. Mature T-lym phocyte

apoptosis-immune regulation in a dynamic and unpredictable antigenic environment // Annu Rev Immunol. 1999. № 17. P. 221—253.

17. Litvinova L.S., Ryazantseva N.V., Novitskii V.V. Cytokine

mediated apoptosis of granulocyte eosinophils in expressed blood eosinophilia // Cell and Tissue Biology. 2008. Vol. 2. № 1. P. 33— 37.

Поступила в редакцию 03.04.2009 г. Утверждена к печати 28.04.2009 г.

Сведения об авторах

Чечина О.Е. — канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск). БиктасоваА.К. - аспирант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

Чечина О.Е., Биктасова А.К., Сазонова Е.В. и др. Роль цитокинов в редокс-зависимой регуляции апоптоза Сазонова Е.В. — аспирант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

Жукова О.Б. — д-р мед. наук, доцент кафедры фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ (г. Томск).

Прохоренко Т.С. — старший лаборант кафедры фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ (г. Томск).

Крат И.В. — канд. мед. наук, врач-лаборант ГУЗ «ФМБА КБ № ei» (г. Северск), соискатель кафедры фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ (г. Томск).

Часовских Н.Ю. — канд. мед. наук, ассистент кафедры фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ (г. Томск).

Новицкий В.В. — д-р мед. наук, профессор, академик РАМН, зав. кафедрой патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

Рязанцева Н.В. — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ ( г. Томск).

Для корреспонденции

Чечина Ольга Евгеньевна, тел. 8-905-089-2137, e-maii: oiga_chechina@maii.ru