СИСТЕМЫ И МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ КЛЕТОК, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ УЛЬТРАКОРОТКУЮ Т2*-РЕЛАКСОМЕТРИЮ
SYSTEMS AND METHODS OF CELL MEASUREMENT, USING ULTRASHORT T2*-RELAXOMETRY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
2
Настоящее изобретение относится к системам и способам, которые измеряют быстро затухающую Т*-релаксацию, для эффективного определения количества меченых клеток при помощи магнитно-резонансного изображения. Открытые системы и способы полезны в различных применениях, включая транспорт клеток и клеточную терапию.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ex vivo
2
2
2
Клеточная терапия, использующая стволовые клетки и иммунные клетки, с целью восстановления и реваскуляризации все более часто применяются в клинических испытаниях. Успех или неудача могут зависеть от точной доставки клеток к заданным органам. Определение количества клеток, доставленных к заданной ткани(тканям), имеет огромное значение для расчета оптимальной дозы и времени клеточной терапии. Чтобы метить клетки , использовались агенты суперпарамагнитной окиси железа (SPIO), обеспечивающие исследователям возможность контролировать миграцию, пролиферацию и хоминг этих клеток с помощью магнитно-резонансного (МР) изображения. Мечение SPIO вызывает эффект релаксации c высокой скоростью (R*), который возрастает линейно с возрастанием концентрации железа. R* определяется как 1/Т*.
2
2
2
2
2
.
Т*-релаксометрия обычно достигается получением множества градиент-эхо изображений. В тканях, содержащих клетки, меченные железом с высокой концентрацией, Т* может быть ультракороткой. В приведенных в качестве примера случаях Т* находится ниже 1-2 миллисекунд, хотя точный период Т* меняется от применения к применениюВремя эхо для градиентного эхо как правило ограничивается настройками аппаратуры. На практике обычно ультракороткого времени эхо является недостижимым. Поэтому затухание сигнала в тканях с ультракоротким Т* является как правило слишком быстрым для нормального градиент-эхо изображения.
Несмотря на все современные достижения, остается потребность в системах и/или способах, которые преодолеют трудности, связанные с традиционными техниками определения количества клеток. Кроме того, остается потребность в таких техниках определения количества клеток, которые не требуют модификации аппаратуры и/или специализированных расчетов РЧ импульса. Кроме того, нужны системы и способы для эффективного и надежного контроля и/или определения количества меченых клеток, например меченых стволовых клеток, в различных применениях, включая клеточную терапию и подобные. Эти и другие нужды удовлетворяются раскрытыми системами и способами.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ex vivo
Настоящее изобретение обеспечивает системы и способы для измерения и/или определения количества клеток в различных применениях, например транспорте клеток или клеточной терапии. Иллюстративные варианты осуществления раскрытых систем и способов включают использование клеток, которые были помечены контрастирующим агентом, или других идентифицирующих характеристик. Меченые клетки контролируются с помощью МР изображения, чтобы оценить миграцию, пролиферацию и/или хоминг меченых клеток. Обычно контрастирующий агент представляет собой SPIO, хотя альтернативные контрастирующие агенты могут использоваться без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения.
2
2
2
2
2
2
2
2
.
Согласно настоящему изобретению Т*-релаксометрия преимущественно используется при измерении концентрации клеток в различных применениях, связанных с клетками. Поскольку в клетках, меченных железом с высокой концентрацией, Т* является ультракороткой, в настоящем описании раскрыты предпочтительные системы и способы для измерения Т*-релаксометрии, такие системы и способы используют последовательность спин-эхо изображений вместо стандартных градиент-эхо изображений для достижения желаемых результатов. В приведенных в качестве примера случаях Т* не превышает 1-2 миллисекунд, хотя раскрытые системы и способы полезны в применении в широком диапазоне значений Т*, такие значения Т* как правило отличаются от применения к применениюРаскрытые системы и способы индуцируют нормальный спин-эхо сигнал, генерирующий первое спин-эхо изображение с последующим индуцированием множества спин-эхо сигналов, генерирующих серию дополнительных спин-эхо изображений от соответствующих смещений эхо, до вышеупомянутого затухания Т* и затем получением схем Т* при помощи подбора экспоненты.
2
2
2
ss
2
ss
2
2
2
2
-t/T
-TE/T2
-(t-TE)/T2*
Спин-эхо сигналы, выходящие из клеток, формируются для МР изображений первыми радиочастотными (РЧ) импульсами, за которыми следуют вторые радиочастотные импульсы, соответственно. При помощи спин-эхо сигналов строится кривая T, где для клеток, меченных частицами/наночастицами SPIO, T гораздо длиннее, чем Т*, и определяется через Me. Кривая затухания Т* спин-эхо затем определяется через Mee. Множество спин-эхо изображений берется на разных интервалах, определяемых шагом смещения эхо, который может быть меньше 1 мс. Схема ультракороткого Т* строится по первому спин-эхо изображению и множеству спин-эхо изображений с подходящим смещением эхо при помощи подбора экспоненты. Полная схема Т* строится при помощи наложения схемы ультракороткого Т* на схему нормального Т*.
Дополнительные свойства, функции и преимущества раскрытых систем и способов будут ясны из последующего описания, в частности при чтении с прилагаемыми чертежами.
КРАТКОЕ ОПСИАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Чтобы помочь специалистам в данной области техники в создании и использовании раскрытых систем и способов, приведена ссылка на прилагаемые чертежи, на которых:
2
Фиг.1 представляет собой схематическую последовательность стандартной Т* релаксометрии, получаемой при помощи многократного градиентного эхо;
2
Фиг.2 представляет собой схематическую последовательность ультракороткой Т* релаксометрии;
Фиг.3a представляет собой аксиальное градинет-эхо изображение крысы с опухолью;
Фиг.3b представляет собой аксиальное спин-эхо изображение со смещением 0,8;
Фиг.3с представляет собой plussian blue-деформированный срез опухоли;
2
Фиг.4а представляет собой схему нормального Т*, скрытого пороговым сигналом для устранения шума;
2
2
Фиг.4b представляет собой схему ультракороткого Т*, наложенного на схему нормального Т*;
2
Фиг.5a представляет R* схемы меченых боковых опухолей;
2
Фиг.5b представляет R* схемы не меченых боковых опухолей;
Фиг.6(а)-6(с) представляет собой гистограммы опухолей с разным количеством меченых железом клеток; и
2
3
Фиг.7 представляет собой график, иллюстрирующий линейную корреляцию R* с количеством клеток/мм.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2
Раскрыты системы и способы для измерения и/или определения количества клеток, не требующие модификаций аппаратуры и/или разработок специализированного РЧ сигнала. Раскрытые системы/способы имеют широкий спектр применений, включающий применения для транспорта клеток и клеточной терапии. Меченые клетки контролируются при помощи генерации МР изображений для того, чтобы отследить их миграцию, пролиферацию и хоминг. Периоды быстро затухающей Т* - релаксации измеряются путем генерации МР изображений, чтобы эффективно определить количество меченых клеток, как здесь описано.
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Агенты SPIO влияют на период Т, Т и Т*-релаксации. Влияние SPIO в компартментах клетки на Т*-релаксацию в десять раз больше, чем на Т-релаксацию. В результате в клетках, меченых SPIO, Т намного длиннее, чем Т*. Раскрытые системы и способы используют сравнительно длинное Т затухание с помощью получения серии спин-эхо изображений, чтобы преимущественно облегчить определение значения Т*, несмотря на значительное ослабление сигнала, связанное с затуханием ультракороткого Т*.
2
.
На Фиг.1 показана основная схема нормальной Т*-релаксометрии, используя последовательность многократного градиентного эхо. Сигнал индуцируется РЧ импульсом с небольшим поворотом угла. Вслед за импульсом возбуждения применяется градиентное считывание, чтобы произвести эхо. Время между РЧ импульсом и серединой градиента считывания определяется как «ТЕ». Очевидно, что временной интервал ТЕ ограничивается РЧ импульсом и формой волны градиента для градиента выбора отрезков, и градиентом считывания Таким образом, ТЕ ограничивается настройками аппаратуры, включая, в частности, силу градиента и время нарастания градиента.
ss
ss
2
-TE/T2*
Сигнал, полученный от градиентного эхо, определяется через M , где M представляет собой намагниченность в устойчивом состоянии. В тканях, содержащих клетки, меченные железом с высокой концентрацией, Т* может быть ниже 1-2 миллисекунд. Следовательно, сигнал может затухать до уровня шума со временем эхо в пару миллисекунд. Приложенные ранее усилия по уменьшению ТЕ включали модификацию оборудования или большой объем работ над разработкой последовательности, и не смогли стать оптимальными или полезными для множества традиционных применений.
ss
2
2
2
2
-TE/T2
На Фиг.2 схематично изображены различные параметры, связанные с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения. Согласно раскрытым системам и способам, спин-эхо используется, чтобы получить изображение. Использование спин-эхо заменяет традиционное использование градиентного эхо. В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения, спин-эхо формируется 90-градусным РЧ сигналом, за которым следует 180-градусный РЧ сигнал. Интенсивность сигнала за ТЕ определяется отношением M . Поскольку в клетках, меченных SPIO, Т гораздо длиннее, сигнал, полученный от спин-эхо гораздо сильнее сигнала, полученного от градиентного эхо, что помогает избежать негативных последствий, связанных с большой потерей сигнала на изображении. Схема ультракороткой Т*-релаксации может затем быть наложена на схему нормального Т* для создания конечной Т*-схемы в зоне обзора.
2
2
2
Измерение ультракороткой Т*-релаксации может быть достигнуто получением серий спин-эхо изображений, как показано на Фиг.2. Первое эхо получается как нормальное спин-эхо изображение. Следующие изображения получаются путем смещения считывания по направлению к кривой затухания Т2* используя шаги, подходящие для смещения эхо, которые могут быть ниже 1 миллисекунды. Этот способ позволяет получить образец кривой затухания Т*, построенной по спин-эхо сигналу. Затем могут быть получены схемы Т* путем подбора экспоненты.
ss
-TE/T2
-(t-TE)/T2*
Обращаясь к Фиг.2, получают серию изображений с последовательностью спин-эхо. Первое сканирование получается в виде стандартного спин-эхо изображения. Последующие сканирования (сканирование 2- сканирование 5) получаются со смещением эхо по кривой затухания Т2*, определяемой отношением: Mee. Как показано на фиг.2, раскрытые системы и способы эффективны в преодолении ограничений, связанных с быстрым затуханием Т2*, путем успешного применения спин-эхо.
,
Для дальнейшей иллюстрации применений и преимуществ, связанных с раскрытыми системами и способами сделана ссылка на следующие примеры. Однако нужно понимать, что данные примеры не являются ограничивающими объем настоящего изобретения, а только демонстрирующими иллюстративные варианты осуществления и/или выгоды изобретения:
Пример 1:
in vivo
in vivo
2
Чтобы облегчить измерение быстро затухающей Т2*-релаксации в тканях, содержащих клетки, меченные железом с высокой концентрацией, где затухание Т2* слишком быстрое для составления нормальной схемы многократного градиентного эхо, использовалась следующая методика. МР эксперименты  на крысах с опухолями, меченными железом, использовались для демонстрации того, что раскрытая методика может быть использована для количественной оценки ультракороткой Т*, не превышающей 1-2 миллисекунд или ниже. В сочетании с составлением схемы регулярной Т2*, раскрытая техника может быть использована, чтобы обеспечить количественную оценку и контроль тканей, содержащих клетки, меченные большим количеством железа.
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
in vivo
Наночастицы SPIO широко используются, чтобы влиять на периоды релаксации T, Т и Т* меченых тканей и клеток. Период релаксации Т* представляет собой наиболее чувствительный параметр для обнаружения клеток, меченных SPIO, и, основываясь на преимуществах раскрытых в настоящем описании систем и способов, Т*-релаксометрия может быть успешно использована для количественной оценки и контроля меченных стволовых клеток в клеточной терапии. Как упоминалось выше, Т*-релаксометрию как правило получают построением множества градиент-эхо изображений. Однако в тканях, содержащих клетки, меченные железом с высокой концентрацией, Т* может быть ниже 2 миллисекунд, и, следовательно, затухание сигнала происходит слишком быстро для периода нормального градиентного эхо. Используя преимущества сравнительно долгого затухания Т клеток, связанных со SPIO, раскрытая система/способ используется для измерения быстро затухающей Т*-релаксации при помощи серии спин-эхо изображений. В иллюстративном примере, была проведена количественная оценка короткого Т* на крысах с опухолями, меченными железом.
2
2
2
Последовательность действий: измерение ультракороткой Т* было достигнуто с помощью получения серий спин-эхо изображений, как показано на Фиг.2. Первое эхо было получено в виде нормального спин-эхо изображения. Следующие изображения были получены при помощи смещения считывания по направлению к кривой Т*, используя шаги, не превышающие 1 миллисекунду. Это позволило получить кривую затухания Т* из спин-эхо сигнала.
in vivo
6
2
2
Эксперимент : клетки меланомы С8161 были помечены (Feridex)-протамин сульфатными (FEPro) комплексами с помощью процедур мечения, которые известны в данной области техники. 2х10меченых FEPro или немеченых (контрольных) клеток меланомы были билатерально подкожно имплантированы в бок 5 голых крыс. Приблизительно через две недели после заражения опухолевыми клетками выполнялось ОМР на 3Т Intera whole-body scaner (Philips Medical System) при помощи специализированной 7-сантиметровой РЧ-катушки в форме соленоида для крыс. Схема нормальной Т* была получена последовательностью многократного градиентного эхо (MGES) [TR/TE = 1540/16 мс, 13 эхо, матрица 256×256, 17 отрезков, толщина отрезков = 1,0 мм, зона обзора= 80 мм, NEX = 4]. Чтобы измерить короткую Т*, были получены пять наборов спин-эхо изображений с шагом считывания эхо 0 мс, 0,4 мс, 0,8 мс, 1,2 мс, 2,3 мс соответственно, со следующими параметрами: TR/TE = 1000/6,4, матрица 144×144, 17 отрезков, толщина отрезков = 1,5 мм, зона обзора = 80 мм, NEX = 4.
Анализ данных:
2
2
2
2
анализ данных выполнялся при помощи инструментов программного обеспечения IDL. Схемы Т* были получены при помощи подбора экспоненты. Оба набора данных (то есть схема нормальной Т* и схема короткой Т*) были совмещены и показаны как схема Т*.
2
2
2
Схема ультракороткой Т*-релаксометрии и схема стандартной MGES Т* были получены для 4 крыс. На Фиг.3а показано аксиальное градиент-эхо изображение от боковых опухолей крысы. Отсутствие сигнала в меченых опухолях было вызвано клетками, меченными железом с высокой концентрацией, как показано на Фиг.3с. Однако спин-эхо изображение той же опухоли (Фиг.3b) меньше подвержено затуханию сигнала, обусловленному сравнительно долгим временем Т2-релаксации клеток, связанных со SPIO. Схема Т*, измеренная при помощи MGES (Фиг.4а), показывает площадь высоких значений Т2* на границе опухоли, показывающих последовательное ослабление FEPro-мечения по мере роста опухоли. На схеме MGES T2* нельзя обнаружить никакого сигнала вследствие быстрого затухания T2*, вызванного клетками, меченными железом с высокой концентрацией, в центре опухоли. Для сравнения, схема ультракороткой T2* (Фиг.4b) демонстрирует значения Т2* в центре опухоли, cоставляющие приблизительно ≤1 мс, что соответствует областям клеток, меченных железом с высокой концентрацией, согласно Фиг.3а.
Заключение:
in vivo
in vivo.
Этот эксперимент демонстрирует эффективное измерение времени ультракороткой T2*-релаксации в клетках и тканях. МР эксперименты демонстрируют, что этим способом можно измерять значения ультракороткого T2* вплоть до 1 мс или ниже в клетках, меченных железом с высокой концентрацией. В сочетании с традиционной схемой Т2*, раскрытая техника может использоваться для обеспечения количественной оценки и контроля тканей, содержащих клетки, меченные большим количеством железа,
Эксперимент 2
Оценка количества меченых стволовых клеток в заданных тканях в экспериментальных моделях чрезвычайно важна, чтобы подобрать оптимальную дозу и время для клеточной терапии в клинических испытаниях. Агенты SPIO используются для мечения клеток, чтобы контролировать их миграцию, пролиферацию и хоминг при помощи МР изображения. Скорость релаксации R2* (1/T2*) является чувствительным параметром для количественного определения внутриклеточных SPIO.
2
2
2
in vivo
in vivo
В этом иллюстративном примере было изучено количественное отношение между числом меченных железом клеток и скоростью релаксации R2* у крысы с опухолью. Более конкретно, было изучено количественное соотношение между меченными железом клетками и скоростью тканевой релаксации R* у крысы с опухолью. Эксперименты  показали хорошую линейную корреляцию между количеством меченных железом клеток и тканевой R*. В дальнейшем данные показали, что измерение R* является надежным и чувствительным способом определения количества меченых клеток .
6
6
2
2
2
2
2
Клети меланомы С8161 и клетки глиомы С6 были помечены (Feridex)-протамин сульфатными (FEPro) комплексами с помощью известных процедур. 2×10меченных FEPro или немеченых (контрольных) клеток меланомы (n=4) или 1×10 меченных FEPro или немеченых клеток глиомы (n=4) были билатерально подкожно имплантированы голым крысам. Приблизительно через две недели после заражения опухолевыми клетками выполнялось ОМР на 3Т Intera whole-body scaner (Philips Medical System) при помощи специализированной 7-сантиметровой РЧ-катушки в форме соленоида для крыс. Схема нормальной R* была получена последовательностью многократного градиентного эхо (MGES) [TR/TE = 1540/16 мс, 13 эхо, матрица 256×256, 17 отрезков, толщина отрезков = 1,0 мм, зона обзора = 80 мм, NEX = 4]. Чтобы измерить скорость релаксации R* в тканях с высокой концентрацией меченых клеток, были получены пять наборов спин-эхо изображений с шагом считывания эхо 0 мс, 0,4 мс, 0,8 мс, 1,2 мс, 2,3 мс соответственно, со следующими параметрами: TR/TE = 1000/6,4, матрица 144×144, 17 отрезков, толщина отрезков = 1,5 мм, зона обзора = 80 мм, NEX = 4. Скорость релаксации R2* была подсчитана путем подбора экспоненты при помощи инструментов программного обеспечения IDL. Оба набора данных (то есть схема регулярной R* и схема тканевой R* с высокой концентрацией меченых клеток) были совмещены. R2*-релаксация опухоли была подсчитана по пикселям как среднее от R*-релаксации по всему объему опухоли.
Результаты
3
3
3
: Мечение железом не изменило рост опухоли. Не было статистически значимой разницы в размерах опухоли меченых и немеченых опухолей. Размеры меченых опухолей находились в диапазоне от 1890 мм до 4950 мм на время построения изображения, что означает от 325 до 1056 меченых клеток на мм в восьми опухолях.
2
2
2
2
2
2
3
3
3
Мечение FEPro значимо удлинило скорость релаксации R* в опухоли. Фиг.5a и 5b иллюстрируют схемы R* меченой и немеченой опухоли соответственно. Влияние мечения железом на R*-релаксацию может быть также доказано при помощи R*-гистограммы опухоли с 1056 мечеными клетками/мм (Фиг.6а) и 325 мечеными клетками/мм (Фиг.6b). Меченые опухоли показали гораздо большее распространение R* по сравнению с контрольной опухолью (Фиг.6с). Средняя R* опухоли демонстрирует очень хорошую линейную корреляцию с количеством меченых клеток на мм (Фиг.7), с коэффициентом корреляции 0,91 (р<0,01).
Заключение
in vivo
in vivo
2
2
2
: в этом иллюстративном примере было исследовано количественное соотношение между меченными железом клетками и скоростью тканевой релаксации R*. Несмотря на то, что были использованы две различных линии опухолевых клеток, данные  демонстрируют хорошую линейную корреляцию между количеством меченных железом клеток и тканевой R*. Экспериментальные данные также показывают, что измерение R* представляет собой надежный и чувствительный инструмент для количественной оценки меченных железом клеток. Согласно этому раскрытые системы и способы могут использоваться для эффективной неинвазивной количественной оценки меченных железом клеток .
2
2
2
2
2
В целом, системы и способы настоящего изобретения предлагают значительно улучшенные техники для МР измерений меченых клеток в различных применениях. Действительно, современные исследования в области транспорта клеток и клеточной терапии начинаются с инъекций большого количества клеток, меченных SPIO, в заданный участок, что приводит к очень короткому Т* в меченых и окружающих клетках. Открытые системы и способы способствуют значительному улучшению в количественной оценке меченых клеток, несмотря на ультракороткое затухание Т*, с которым приходится сталкиваться в таких тканевых системах. Раскрытые системы и способы могут также применяться для измерения ультракороткой Т* других контрастирующих агентов, которые вызывают значимую разницу между Т и Т*-релаксацией.
Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на иллюстративные варианты осуществления и их реализации, раскрытые системы и способы не ограничены такими иллюстративными вариантами осуществления. Напротив, как будет видно специалистам в данной области техники из приведенного здесь описания, раскрытые системы и способы допускают модификации, изменения и усовершенствования без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Следовательно, настоящее изобретение определенно охватывает такие модификации, изменения и усовершенствования в пределах его объема.