Эффективны ли иммуномодуляторы при бронхолегочном воспалении у крыс?

ПСИХОНЕИРОФАРМАКОЛОГИЯ

© И.В. ЗАРУБИНА, А.В. БОЛЕХАН, А.Ю. РЫЛЕЕВ, 1017

А.Б. ЖУМАШЕВА, П.Д. ШАБАНОВ; 2005

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

ЭФФЕКТИВНЫ ЛИ ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ ПРИ БРОНХОЛЕГОЧНОМ ВОСПАЛЕНИИ У КРЫС?

Резюме

Сравнивали

энергостабилизирующее и иммунотропное действие иммуномодуляторов трекрезана (25 мг/кг) и полиоксидония (0,75 мг/кг) при моделировании бронхолегочного воспаления у крыс. При экспериментальной бронхопневмонии, вызванной введением скипидара в бронхи животных, оба препарата проявили

энергостабилизирующий эффект, что проявлялось снижением уровня лактата, продуктов гидролиза АТФ-АДФ и АМФ, а также увеличением содержания пирувата и АТФ в лимфоцитах крови и ткани легких крыс.

Энергостабилизирующее действие полиоксидония было более выражено в тканях легких, по направленности эффектов сопоставимо с действием трекрезана, по силе уступало ему. В параллельных исследованиях показано, что трекрезан и полиоксидоний нормализуют иммунный статус лимфоцитов у крыс с острым бронхолегочным воспалением.

Ключевые слова

иммуномодуляторы; трекрезан; полиоксидоний;

экспериментальная пневмония; энергетический обмен; лимфоциты; крысы

ВВЕДЕНИЕ

Разработка средств этиотропной терапии вторичных иммунодефи-цитных состояний вследствие острых бронхолегочных заболеваний, в частности пневмоний, до настоящего времени сохраняет приоритетное значение [2]. Однако традиционные средства антибактериальной терапии становятся все менее эффективными в отношении широкого спектра возбудителей пневмоний, что приводит к увеличению частоты затяжного характера течения заболевания и его хронизации [3].

Попытки выделить какой-то один ведущий механизм развития острой пневмонии не увенчались успехом [10, 11]. Однако наиболее специфические различия, обусловленные этиологическим фактором, на клеточном уровне теряют свою специфику вследствие общности механизмов клеточных повреждений. Такими универсальными процессами при острых бронхолегочных заболеваниях являются нарушение кислородного режима и изменение иммунного ответа.

В каскаде метаболических изменений при кислородной недостаточности центральным звеном является так называемая биоэнергетическая гипоксия, в основе которой лежат последовательные изменения свойств митохондриального ферментного комплекса, приводящие к нарушениям энергосинтезирующей функции дыхательной цепи [5]. Все стадии биоэнергетической гипоксии коррелируют с изменениями содержания АТФ в ведущих энергозависимых процессах в клетках. В связи с этим уровень адениннуклеотидов и, особенно, величина энергетического заряда адениловой системы являются информативными при гипоксических состояниях вследствие бронхолегочных воспалений.

Иммунный статус относится к важнейшим факторам, определяющим исход воспалительного процесса в легких наряду с длительностью персистенции бактериальной, вирусной или микоплазменной инфекции. Характеристики процесса легочного воспаления тесно связаны с иммунным статусом, поэтому выявление функционального состояния Т- и В-лимфоцитов и фагоцитирующих клеток при острых бронхолегочных воспалениях дает возможность использования иммунологических исследований в качестве дополнительных методов диагностики и прогнозирования течения указанных заболеваний, оценивать активность и направленность воспалительного процесса, полноту выздоровления.

Учитывая комплексный характер нарушений, которые возникают в организме при бронхолегочных воспалениях, связь их с механизмами

неспецифической резистентности, системой снабжения организма кислородом, процессами энерго-1018 обеспечения метаболизма и состоянием иммунной системы, представляется целесообразным использовать лечебные средства с широким спектром фармакологической активности, способные воздействовать на базальные клеточные процессы и стимулировать адаптационные возможности организма, в комплексной терапии острых бронхолегочных воспалений.

В значительной степени этим требованиям отвечают недавно появившиеся препараты трекрезан и полиоксидоний.

Трекрезан — триэтаноламмониевая соль 2-ме-тилфеноксиуксусной кислоты — высокоэффективное средство с выраженными адаптогенным и иммуностимулирующим терапевтическим действием. Препарат создан в Иркутском институте органической химии СО РАН, прошел доклинические и клинические испытания и с 1994 г. разрешен Фармакологическим комитетом МЗ РФ к широкому применению (рег. № 94/151/7).

Трекрезан относится к малотоксичным соединениям (ЛД50 для крыс >3700 мг/кг при внутрибрю-шинном и > 6500 мг/кг при пероральном введении препарата), оказывает стресспротекторное действие на моделях иммобилизационного и болевого гиподи-намического стресса, обладает способностью ускорять репарацию поврежденных тканей (печень, миокард, мышцы), защищает внутренние органы от повреждающего действия токсинов, СВЧ-облучения, инфекционного фактора. Препарат обладает выра-

женной антиоксидантной активностью и иммуностимулирующими свойствами [6].

Одним из перспективных иммунокорректоров является полиоксидоний [7]. Препарат оказывает активирующее действие на неспецифическую резистентность организма, фагоцитоз, гуморальный и клеточный иммунитет. Одним из основных биологических свойств полиоксидония является способность стимулировать антиинфекционную резистентность организма. Полиоксидоний действует на все звенья фагоцитарного процесса: активирует миграцию фагоцитов, усиливает клиренс чужеродных частиц из кровотока, повышает поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов.

Известно, что бактерицидность фагоцитов обусловлена кислороднезависимыми и кислородзависи-мыми механизмами. Оказалось, что полиоксидоний подавляет спонтанное образование внеклеточных, но стимулирует образование внутриклеточных активных форм кислорода. В отношении индукции синтеза цитокинов полиоксидоний выступает как истинный иммуномодулятор, стимулируя их спонтанный и индуцированный синтез. Наряду с иммуномодули-рующими свойствами полиоксидония следует выделить антитоксический, антиоксидантный и мембра-нотропный эффекты [8]. Следует отметить, что энер-гостабилизирующие эффекты полиоксидония не известны.

Цель исследования заключалась в сравнительном изучении энергостабилизирующего и иммунотроп-ного действия трекрезана и полиоксидония при экспериментальном бронхолегочном воспалении у крыс.

Таблица 1

Влияние полиоксидония и трекрезана на показатели энергетического обмена в лимфоцитах крови крыс при остром бронхолегочном воспалении

Группы животных / / / / / Энергетический заряд

Интактные 3,12 ± 0,04 0,26 ± 0,01 2,84 ± 0,04 0,71 ± 0,02 0,44 ± 0,01 0,870 ± 0,03

С пневмонией 7,50 ± 0,11 0,05 ± 0,01 1,30 ± 0,06 1,2 ± 0,04 0,82 ± 0,03 0,568 ± 0,01

+ полиоксидоний 5,43 ± 0,10 0,12 ± 0,01 1,83 ± 0,03 1,01 ± 0,05 0,72 ± 0,02 0,683 ± 0,01

+ трекрезан 4,51 ± 0,14 0,15 ± 0,01 2,11 ± 0,04 0,97 ± 0,06 0,71 ± 0,02 0,808 ± 0,02

Примечание: а — р < 0,05 в сравнении с интактными животными; б — р < 0,05 — в сравнении с группой с пневмонией.

Таблица 2

Влияние полиоксидония и трекрезана на показатели энергетического обмена в легких крыс при остром бронхолегочном воспалении

Группы животных / / / / / Энергетический заряд

Интактные 2,81 ± 0,6 0,37 ± 0,01 3,51 ± 0,09 0,57 ± 0,02 0,28 ± 0,02 0,870 ± 0,03

С пневмонией 8,55 ± 0,11 0,03 ± 0,01 1,08 ± 0,03 1,19 ± 0,02 0,68 ± 0,05 0,568 ± 0,01

+ полиоксидоний 5,93 ± 0,09 0,12 ± 0,01 1,83 ± 0,01 0,81 ± 0,01 0,63 ± 0,01 0,683 ± 0,01

+ трекрезан 4,35 ± 0,02 0,16 ± 0,01 2,14 ± 0,04 0,71 ± 0,04 0,53 ± 0,01 0,808 ± 0,02

Примечание: а — p < 0,05 в сравнении с интактными животными; б — p < 0,05 — в сравнении с группой с пневмонией.

МЕТОДИКА

Эксперименты выполнены на 126 крысах-самцах Вистар массой 200—250 г., полученных из питомника Рапполово РАМН (Ленинградская область). Животных содержали в виварии в стандартных условиях освещения и питания. Исследования осуществляли в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [9].

В первой серии опытов изучали изменение энергетического обмена и иммунологических показателей в лимфоцитах и ткани легких при остром брон-холегочном воспалении у крыс. Во второй серии опытов исследовали влияние трекрезана и полиоксидония на показатели энергетического обмена и иммунологических показателей в лимфоцитах и ткани легких при остром бронхолегочном воспалении у крыс.

Острое бронхолегочное воспаление (бронхопневмонию) моделировали следующим образом: под эфирным наркозом хирургическим путем обнажали трахею и уколом между двумя хрящевыми полукольцами иглой диаметром 0,8 мм в ее просвет вводили 0,1 мл живичного скипидара. Разрез на шее ушивали. Непосредственно сразу после операции и далее на протяжении 5 дней животным опытной группы внутри-брюшинно вводили раствор трекрезана (25 мг/кг) или полиоксидония (0,75 мг/кг). На пятые сутки эксперимента животные подвергались декапитации для забора материала для исследования.

Легкие гомогенизировали в жидком азоте и в них и выделенных из крови лимфоцитах определяли био-

химические показатели, характеризующие энергетический обмен. Содержание молочной и пировиног-радной кислот определяли в 10%-м гомогенате ткани мозга, приготовленном на 6N хлорной кислоте, энзиматическим методом [15]. Свободные аденин-нуклеотиды определяли с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на пластинах «силуфол» и последующим сканированием на спектрофлуо-риметре MPF-4 «Hitachi» [4]. Интегративной величиной, объединяющей три компонента аденило-вой системы в единую формулу и позволяющей судить о направленности обменных процессов в ткани, служит энергетический заряд [14].

Величину энергетического заряда адени-ловой системы рассчитывали по формуле: АТФ + 0,5АДФ/АТФ + АДФ + АМФ.

Для иммунологических исследований лимфоциты выделяли из цельной крови крыс в градиенте плотности фикол—уротраст. В работе использовали взвесь лимфоцитов, содержащую 2 х 106 клеток в 1 мл при контроле на их жизнеспособность. Исследование клеточного звена иммунитета включало определение реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ) с конканавалином А (Кон-А) и фитогемагглютинином (ФГА), характеризующее функциональное состояние субпопуляции Т-лимфо-цитов [13]. Состояние механизмов неспецифической защиты организма оценивалось по уровню ней-трофильного фагоцитоза по отношению к микробной тест-культуре после их совместной инкубации. Определяли показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ), фагоцитарный показатель (ФП) — процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов,

фагоцитарное число (ФЧ) — среднее число микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом.

1020 Степень активности кислороднезависимых микро-бицидных систем фагоцита оценивали с помощью лизосомально-катионного теста (ЛКТ). Кислород-зависимые антиинфекционные системы фагоцитов определяли в тесте восстановления нитросинего тет-разолия (НТС-тест).

Выборка для каждой группы животных составила не менее 10 крыс. Математическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере Pentium III 1700 мГц с использованием стандартного пакета программ Statistica for Windows методами вариационной статистики (t-критерий Стьюдента) при р < 0,05.

АДФ на 32 % и АМФ на 22 % (р < 0,05). Наряду с этим увеличивалось содержание пирувата в три раза и АТФ на 69 %, а также значение энергетического заряда адениннуклеотидов.

Применение трекрезана снижало в лимфоцитах крыс содержание лактата на 40 %, АДФ на 19 % и АМФ на 16% (р < 0,05). Содержание пирувата возрастало в три раза и АТФ на 62 %. В тканях легких при действии трекрезана уровень лактата достоверно снижался на 49%, АДФ на 40% и АМФ на 22 % на фоне увеличения содержания пирувата в пять раз и АТФ на 98 % (р < 0,05). Изменения содержания адениннуклеотидов сопровождались увеличением их энергетического заряда в лимфоцитах крови и тканях легких крыс.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Энергостабилизирующие эффекты трекрезана и полиоксидония при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении

Острое бронхолегочное воспаление у крыс сопровождалось увеличением в лимфоцитах и ткани легких содержания лактата, АДФ и АМФ на фоне снижения содержания пирувата и АТФ. При этом более выраженные метаболические изменения наблюдались в тканях легких. Так, в лимфоцитах крыс с брон-холегочным воспалением содержание лактата достоверно возрастало на 140 %, АДФ — на 69 % и АМФ на 86 % (табл. 1). Содержание пирувата снижалось на 81 % и АТФ — на 54% (р < 0,05). В легких содержание лактата увеличивалось на 204 %, АДФ — на 109 % и АМФ на 143 %. Наряду с этим достоверно снижалось содержание пирувата на 92 % и АТФ на 69 %. Изменения в адениннуклеотидном пуле приводили к снижению величины энергетического заряда адениннуклеотидов, что свидетельствует о развитии энергодефицита в лимфоцитах и тканях легких крыс при остром бронхолегочном воспалении (табл. 2).

Введение животным полиоксидония приводило к достоверному увеличению в лимфоцитах содержания пирувата на 140 %, АТФ на 41 % и снижению уровня лактата на 28 %, АДФ на 16 % и АМФ на 12%. В тканях легких полиоксидоний в большей степени влиял на показатели энергетического обмена, чем в лимфоцитах. На фоне введения полиоксидония содержание лактата в легких снижалось на 31 %,

Влияние трекрезана и полиоксидония на иммунологические показатели в лимфоцитах крови крыс при экспериментальном остром бронхолегочном воспалении

Многие бронхолегочные заболевания сопровождаются развитием вторичной иммунологической недостаточности. Нарушения со стороны иммунной системы могут быть вызваны отрицательным влиянием причинного микроорганизма на состояние защитных сил организма, а также иметь ятрогенное происхождение [12]. Состояние иммунного статуса сложным образом взаимосвязано с рядом характеристик процесса легочного воспаления: степенью тяжести пневмонии, вариантом течения и исхода заболевания. Комплекс повреждающих факторов бактериального воспаления с увеличением тяжести пневмонии способен оказывать все более выраженное влияние на механизмы клеточной и гуморальной защиты организма.

В случае развития затяжной пневмонии в ответ на бактериальную инфекцию выявляется более резкое, чем при острой пневмонии, увеличение Т-кле-точного звена иммунитета уже на 1—2 неделе болезни, уменьшаются субпопуляции индукторов хелпер-ных клеток, обеспечивающих пролиферацию и дифференцировку фагоцитирующих и антителооб-разующих клеток. В свою очередь, состояние иммунной системы существенным образом влияет на характер течения острой пневмонии. Тяжелая и длительно текущая пневмония возникает на фоне угнетения систем комплемента, фагоцитоза и функциональной недостаточности клеточного звена иммунитета.

В развитии легочного воспаления особая роль принадлежит системе фагоцитирующих клеток. Состояние нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов во многом определяет возникновение, течение и исход патологического процесса бронхолегочной системы.

Особенно актуально это в настоящее время, когда значительно изменился характер иммунного ответа организма пациента при острой пневмонии. Обусловлено это, в первую очередь, широким применением антибактериальных средств при этом заболевании. Абсолютное и относительное количество лейкоцитов и нейтрофилов повышается существенно лишь при средней степени тяжести и тяжелой острой пневмонии.

Моделируемое острое бронхолегочное воспаление у крыс сопровождалось повышенной фагоцитарной активностью лимфоцитов, угнетением Т-лимфоцитар-ной функции и активности кислороднезависимых мик-робицидных систем фагоцитов (табл. 3). Известно, что степень снижения показателей фагоцитоза зависит от характера процесса, его течения и тяжести, при этом степень снижения показателей фагоцитоза находится в прямой корреляции со степенью тяжести бронхолегочного воспаления.

Введение трекрезана и полиоксидония крысам с острым бронхолегочным воспалением приводило к восстановлению показателей иммунитета до значе-

ний, характерных для интактных животных. При этом оба препарата проявили сопоставимое действие.

Таким образом, в результате проведенных иссле- 1021 дований установлено, что трекрезан и полиоксидо-ний эффективны при терапии экспериментального острого бронхолегочного воспаления у крыс. Эффекты трекрезана и полиоксидония на показатели иммунной защиты были сходными и отличались лишь по одному показателю — реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ), стимулируемой конка-навалином А.

По-видимому, действие полиоксидония, более выраженное в легких, обусловлено его большей биодоступностью в тканях легкого по сравнению с лимфоцитами. Известно, что полиоксидоний взаимодействует с мембраной лимфоцитов, но в цитоплазме лимфоцитов обнаруживается в малых количествах [8].

Учитывая тесную связь между нарушениями энергетического обмена и активаций перекисного окисления липидов, можно предположить, что стабилизация энергетического обмена на фоне применения трекрезана и полиоксидония обусловлена их антиоксидантными свойствами. Однако механизмы энергостабилизирующего действия трекре-зана и полиоксидония при воспалительных брон-холегочных заболеваниях требуют дальнейших исследований.

Таблица 3

Влияние полиоксидония и трекрезана на иммунологические показатели в лимфоцитах крыс при остром бронхолегочном воспалении

Группы животных РТМЛ -А, % РТМЛ % % ПЗФ % нет базовая HCT стимулируемая

Интактные 84 ± 2,0 54,6 ± 3,4 94,5 ± 0,1 13,4 ± 0,5 22,5 ± 1,4 1,44 ± 0,02 0,31 ± 0,02 0,61 ± 0,02

С пневмонией 59 ± 1,1 41,4 ± 2,4 80,3 ± 1,3 18,9 ± 0,5 28,3 ± 0,9 1,36 ± 0,01 0,43 ± 0,02 0,70 ± 0,01

+ полиоксидоний 80 ± 1,8 51,3 ± 3,3 93,6 ± 0,9 14,9 ± 0,4 22,6 ± 0,8 1,43 ± 0,01 0,33 ± 0,03 0,64 ± 0,05

+ трекрезан 68 ± 2,0 50,1 ± 3,0 94,5 ± 0,7 13,8 ± 1,2 22,6 ± 1,1 1,44 ± 0,03 0,32 ± 0,02 0,61 ± 0,02

Примечание: РТМЛ — реакция торможения миграции лимфоцитов; Кон-А — конканавалин-А; ФГА — фитогемагглютинин; ПЗФ — показатель завершенности фагоцитоза; ФП — фагоцитарный показатель; ФЧ — фагоцитарное число; ЛКТ — лизосомально-катионный тест; НТС — тест восстановления нитросинего тетразолия; а — p < 0,05 в сравнении с интактными животными, б — p < 0,05 в сравнении с группой с пневмонией.

ВЫВОДЫ

1022 1. При экспериментальной бронхопневмонии трекрезан и полиоксидоний обладают энергостаби-лизирующим действием, что проявляется в снижении уровня лактата, продуктов гидролиза АТФ—АДФ и АМФ, в увеличении содержания пи-рувата и АТФ в лимфоцитах крови и ткани легких крыс.

2. Энергостабилизирующее действие полиокси-дония более выражено в тканях легких, по направленности эффектов сопоставимо с действием трек-резана, по силе уступает ему.

3. Введение трекрезана и полиоксидония животным с острым бронхолегочным воспалением приводит к нормализации иммунного статуса лимфоцитов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бизюкин А.В., Сеодаева С.К. Новый методический подход к изучению метаболизма фагоцитирующих клеток // Пульмонология. — 1995. — № 1. — С. 46-49.

2. Вишнякова Л.А., Путов Н.В. Этиология острой пневмонии // Тер. арх. — 1990. — Т. 62, № 3. — С. 15-18.

3. Дангиг И.И., Скипский И.М., Смульская Г.П. Затяжная пневмония: факторы риска и лечебная тактика // Тер. арх. — 1999. — № 3. — С. 32-35.

4. Зарубина И.В., Криворучко Б.И. Разделение и прямое количественное определение адениннуклеотидов на силуфоле // Укр. биохим. журн. — 1982. — Т. 54, № 4. — С. 437-439.

5. Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Молекулярная фармакология антигипоксантов. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2004. — 368 с.

6. Казимировская В.Б., Дьяков В.М., Воронков

М.Г., Ковальчук С.Ф. Трекрезан: токсикология, фармакология, результаты клинических испытаний. — Иркутск, 1996.

7. Козлов Ю.А. Полиоксидоний в комплексном лечении гнойно-воспалительных заболеваний // Terra medica nova. — 2005. — № 1. — С. 2-5.

8. Пинегин Б.В., Некрасов А.В., Хаитов Р.М. Иммуномодулятор «полиоксидоний»: механизмы действия и аспекты клинического применения // Медлайн экспересс. — 2005. — № 1(177). — С. 19-23.

9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П. Фисе-нко. — М.: МЗ РФ, 2000.

10. Чучалин А.Г. Пневмонии — актуальная проблема медицины (вступительное слово): Мат. главного симпозиума «Пневмонии». — М., 1997. — С. 1.

11. Чучалин А.Г., Ноников В.Е. Вопросы этиологии, иммунной патологии и терапии острой пневмонии // Клин. мед. — 1991. — № 1. — С. 71-74.

12. Фомина Т.Д., Походзей И.В. Иммунологическая реактивность организма и клинико-рентгенологическая картина острой пневмонии у взрослых // Тер. арх. — 1986. — №4. — С. 108-110.

13. Хавинсон В.Х., Морозов В.Т. Методические рекомендации по проведению иммунологических исследований (методы оценки Т- и В-систем иммунитета): Уч. мат. — Л., 1980. — 44 с.

14. Atkinson D. The energy charge of the adenilate pool as a regulatory parameter. Interaction witle feedback modifiers // Biochemistry. — 1968. — Vol. 7, N 10. —P. 40304034.

15. Marbach E.P., Weil M.H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate // Clin. Chem. — 1967. — N 13. — P. 314-325.