КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

1. Способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту
+
(i) популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, полученной из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34-клеток в условиях высокой жесткости; и
+
(ii) популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, полученной из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34-клеток в условиях низкой жесткости,
причем одна или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, генетически модифицированы:
(i) рекомбинантным вектором для генной терапии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид группы комплементации анемии Фанкони (FANC), или его функциональный вариант или фрагмент; или
(ii) системой редактирования генов, направляющей прямую репарацию эндогенного мутированного гена FANC,
причем первый биологический образец и второй биологический образец необязательно являются одним и тем же биологическим образцом.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий:
+
(a) получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34-клеток в условиях высокой жесткости;
+
(b) получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34-клеток в условиях низкой жесткости,
(c) генетическую модификацию одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости:
(i) рекомбинантным вектором для генной терапии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид группы комплементации A анемии Фанкони (FANCA), или его функциональный вариант или фрагмент; или
(ii) системой редактирования генов, направляющей прямую репарацию эндогенного мутированного гена FANC, и
(d) введение субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, что обеспечивает лечение анемии Фанкони.
3. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что каждый из первого биологического образца и второго биологического образца независимо представляет собой периферическую кровь или костный мозг.
4. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что первый биологический образец и второй биологический образец представляют собой периферическую кровь, полученную после обработки субъекта ГКСФ, плериксафором или комбинацией ГКСФ и плериксафора.
+
+
5. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что отбор CD34-клеток в условиях высокой жесткости включает нанесение первого биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34-клетки, одно- или многократную промывку матрицы для захвата буфером для отмывки и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, с матрицы для захвата с использованием элюирующего буфера.
+
+
6. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что отбор CD34-клеток в условиях низкой жесткости включает нанесение второго биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34-клетки, обеспечение возможности протекания несвязанной фракции второго биологического образца через матрицу для захвата и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, с матрицы для захвата с помощью элюирующего буфера.
7. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, генетически модифицируют.
8. Способ по любому из пп. 1, 2, 6 или 7, характеризующийся тем, что популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, генетически модифицируют.
9. Способ по любому из пп. 1-8, характеризующийся тем, что процентное содержание CD34+-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, в два-четыре раза превышает процентное содержание CD34+-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости.
10. Способ по любому из пп. 1-9, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости, содержит CD34+-клетки с чистотой > 20% или > 30%.
11. Способ по любому из пп. 1-10, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, содержит CD34+-клетки с чистотой < 30%.
12. Способ по любому из пп. 1-11, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости, содержит CD34+-клетки с выходом > 20%.
13. Способ по любому из пп. 1-12, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, содержит CD34+-клетки с выходом > 35%.
14. Способ по любому из пп. 1-3, характеризующийся тем, что рекомбинантный вектор для генной терапии содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую в порядке от 5’к 3’:
(a) последовательность промотора, активного у эукариот; и
(b) последовательность, кодирующую полипептид гена FANC человека, его функциональный фрагмент или вариант;
причем последовательность, кодирующая полипептид гена FANC человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с последовательностью промотора, активной у эукариот; а ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG.
15. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что система редактирования генов включает:
(a) белок Cas или полинуклеотид, кодирующий белок Cas;
(b) нРНК; и
(c) матрицу для репарации, содержащую последовательность, содержащую ген FANC или его фрагмент, перекрывающий одну или более мутаций в эндогенном гене FANC,
причем указанная онРНК сконфигурирована для направления матрицы для репарации к гену FANC, причем ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG, а система редактирования генов способна к прямой репарации эндогенного гена FANC.
16. Способ по любому из пп. 1-15, характеризующийся тем, что указанный способ подавляет развитие, останавливает прогрессирование и/или вызывает обратное прогрессирование гематологического проявления анемии Фанкони у субъекта; причем гематологическое проявление анемии Фанкони необязательно выбрано из одного или более из недостаточности костного мозга, тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии.
17. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что отбор выполняют с помощью отбора на основе магнитных гранул.
18. Способ по п. 4, дополнительно включающий одно- или многократное выполнение афереза периферической крови.
19. Способ по любому из пп. 1-18, характеризующийся тем, что указанный способ приводит к прогрессирующему увеличению количества генно-модифицированных клеток анемии Фанкони со временем.
20. Способ по любому из пп. 1-19, характеризующийся тем, что указанный способ приводит к восстановлению одного или более гемопоэтических линий, угнетенных у субъекта до введения субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости.
21. Способ по п. 20, характеризующийся тем, что одна или более из гемопоэтических линий содержат одно или более из лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов.
22. Способ по любому из пп. 1-19, характеризующийся тем, что указанный способ приводит к восстановлению одного или более гематологических параметров, пониженных у субъекта до введения субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости.
23. Способ по п. 22, характеризующийся тем, что гематологический параметр представляет собой уровень гемоглобина.
24. Способ получения генетически модифицированных клеток для лечения анемии Фанкони, включающий:
+
(a) получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34-клеток в условиях высокой жесткости;
(b) получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34+-клеток в условиях низкой жесткости, и
(c) генетическую модификацию одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, рекомбинантным вестором для генной терапии анемии Фанкони, причем вектор для генной терапии необязательно содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид группы комплементации анемии Фанкони (FANC) или его функциональный вариант или фрагмент.
25. Способ по п. 24, характеризующийся тем, что каждый из первого биологического образца и второго биологического образца независимо представляет собой периферическую кровь или костный мозг.
26. Способ по п. 25, характеризующийся тем, что первый биологический образец и второй биологический образец представляют собой периферическую кровь, полученную после обработки субъекта ГКСФ, плериксафором или комбинацией ГКСФ и плериксафора.
+
+
27. Способ по п. 24, характеризующийся тем, что отбор CD34-клеток в условиях высокой жесткости включает нанесение первого биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34-клетки, одно-или многократную промывку матрицы для захвата буфером для отмывки и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, с матрицы для захвата с использованием элюирующего буфера.
+
+
28. Способ по п. 24, характеризующийся тем, что отбор CD34-клеток в условиях низкой жесткости включает нанесение второго биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34-клетки, обеспечение возможности протекания несвязанной фракции второго биологического образца через матрицу для захвата и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, с матрицы для захвата с помощью элюирующего буфера.
29. Способ по п. 24, характеризующийся тем, что популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии.
30. Способ по любому из пп. 24-29, характеризующийся тем, что популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии.
31. Способ по любому из пп. 24-30, характеризующийся тем, что процентное содержание CD34+-клеток в популяции клеток, обогащенной CD34 в условиях высокой жесткости, в два-четыре раза превышает процентное содержание CD34+-клеток в популяции клеток, обогащенной CD34 в условиях низкой жесткости.
32. Способ по любому из пп. 24-31, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная CD34 в условиях высокой жесткости, содержит CD34+-клетки с чистотой > 20% или > 30%.
33. Способ по любому из пп. 24-32, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, содержит CD34+-клетки с чистотой < 30%.
34. Способ по любому из пп. 24-33, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная CD34 в условиях высокой жесткости, содержит CD34+-клетки с выходом > 20%.
35. Способ по любому из пп. 24-34, характеризующийся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, содержит CD34+-клетки с выходом > 35%.
36. Способ по любому из пп. 24-35, характеризующийся тем, что рекомбинантный вектор для генной терапии анемии Фанкони содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую в порядке от 5’к 3’:
(a) последовательность промотора, активного у эукариот; и
(b) последовательность, кодирующую полипептид гена FANC человека или его функциональный фрагмент или вариант;
причем последовательность, кодирующая полипептид гена FANC человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с последовательностью промотора, активной у эукариот; а ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG.
37. Способ по любому из пп. 24-35, характеризующийся тем, что рекомбинантный вектор для генной терапии анемии Фанкони содержит систему редактирования генов, способную выполнять направленную репарацию эндогенного гена FANC, причем указанная система редактирования генов содержит:
(a) белок Cas или полинуклеотид, кодирующий белок Cas;
(b) нРНК; и
(c) матрицу для репарации, содержащую последовательность, содержащую ген FANC или его фрагмент, перекрывающий одну или более мутаций в эндогенном гене FANC;
причем указанная онРНК сконфигурирована для направления матрицы для репарации к гену FANC, причем ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG.
38. Способ по п. 24, характеризующийся тем, что отбор (а) и/или (b) выполняют путем отбора на основе магнитных гранул.
39. Способ по п. 24 или 38, характеризующийся тем, что отбор (а) и/или (b) выполняют с использованием антител или их функциональных фрагментов, специфично связывающихся с CD34.
40. Способ по п. 24 или 38, характеризующийся тем, что отбор (а) и/или (b) выполняют с использованием скорости потока 10-20 мл/мин.
41. Композиция, содержащая:
+
(a) популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, полученную из первого биологического образца путем отбора CD34-клеток в условиях высокой жесткости; и
(b) популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, полученную из второго биологического образца путем отбора CD34+-клеток в условиях низкой жесткости,
причем одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии анемии Фанкони.
42. Композиция по п. 41, характеризующаяся тем, что каждый из первого биологического образца и второго биологического образца независимо представляет собой периферическую кровь или костный мозг.
43. Композиция по п. 41, характеризующаяся тем, что первый биологический образец и второй биологический образец представляют собой периферическую кровь, полученную от субъекта после обработки субъекта ГКСФ, плериксафором или композицией ГКСФ и плериксафора.
44. Композиция по любому из пп. 41-43, характеризующаяся тем, что процентное содержание CD34+-клеток в популяции клеток, обогащенной CD34 в условиях высокой жесткости, в два-четыре раза превышает процентное содержание CD34+-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости.
45. Композиция по любому из пп. 41-44, характеризующаяся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости, содержит CD34+-клетки с чистотой > 20% или > 30%.
46. Композиция по любому из пп. 41-45, характеризующаяся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, содержит CD34+-клетки с чистотой < 30%.
47. Композиция по любому из пп. 41-46, характеризующаяся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости, содержит CD34+-клетки с выходом > 20%.
48. Композиция по любому из пп. 41-47, характеризующаяся тем, что популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, содержит CD34+-клетки с выходом > 35%.
49. Композиция по любому из пп. 41-48, характеризующаяся тем, что популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии.
50. Композиция по любому из пп. 41-49, характеризующаяся тем, что популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии.
51. Композиция по любому из пп. 41-50, характеризующаяся тем, что рекомбинантный вектор для доставки гена содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую в порядке от 5’к 3’:
(a) последовательность промотора, активного у эукариот; и
(b) последовательность, кодирующую полипептид FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант;
причем последовательность, кодирующая полипептид FANC человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с последовательностью промотора, активной у эукариот; а ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG.
52. Фармацевтическая композиция, включающая композицию по любому из пп. 41-51 и фармацевтически приемлемый носитель.