СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛАССОВ ЛИПИДОВ И ПОДКЛАССОВ ФОСФОЛИПИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF LIPID CLASSES AND PHOSPHOLIPID SUBCLASSES IN BIOLOGICAL MATERIALS

Изобретение относится к области биохимии, в частности к методам исследования классов липидов и подклассов фосфолипидов в биологических материалах, и может найти применение в учебном процессе и при проведении научно-исследовательской работы.
Известен способ определения количества отдельных классов липидов в биологических материалах с применением биохимических методов (Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Кондрахин И.П., Архипов А.В. и др. - М.: Издательство «КолосС», 2004. - С.139-150.) - [1].
Недостаток данного способа в том, что при этом требуются многочисленные разные химические реактивы и посуда для определения разных классов липидов, что делает этот способ трудоемким и дорогостоящим.
Известен способ определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов методом тонкослойной хроматографии с использованием пластинки тонкого закрепленного слоя силикагеля. При этом количество отдельных классов липидов и подклассов фосфолипидов после разделения их на тонком слое определяют химическим методом в соскобленных силикагелях с отдельными липидами от стеклянной пластинки (Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Кондрахин И.П., Архипов А.В. и др. - М.: Издательство «КолосС», 2004. - С.150-155) - [2].
Недостаток этого способа в том, что количество общих фосфолипидов определяют по содержанию фосфора в пробах, соскобленных со старта. На старте при разделении липидов на классы вместе с фосфолипидами остаются другие классы липидов (глюко- и галактолипиды и т.д.) и при этом их, количество не учитывается. Поэтому полученные данные о количестве отдельных классов липидов бывают неточными. Кроме того, не всегда удается полностью соскоблить силикагель от стекла с отдельными классами липидов, что отрицательно сказывается на точности полученных результатов исследований.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности признаков является способ определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов методом тонкослойной хроматографии с использованием приготовленных и готовых пластин (Силуфол) с тонко закрепленным слоем и денситометра для расчета количества классов липидов после их проявления на хроматограмме. При этом процедура определения классов липидов значительно облегчается и упрощается. Определение количества общих фосфолипидов в липидых экстрактах по содержанию фосфора дает возможность определить их количество наиболее точно (7. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Кондрахин И.П., Архипов А.В. и др. - М.: Издательство «КолосС», 2004. - С.155-157.). 2. Джавадов А.К. Определение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрией // Лабораторное дело, 2. Москва: Медицина, 1989. - с.28-29.) - [3].
Основным недостатком данного способа является то, что при этом также не удается определить количество других полярных липидов, которые остаются на старте с фосфолипидами и из-за этого данные, полученные о количестве отдельных классов липидов, бывают также неточными. Кроме того, количество общих фосфолипидов определяется химическим способом по содержанию фосфора в липидных экстрактах, что требует дополнительных реактивов и много времени.
Задачей изобретения является упрощение способа определения содержания классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов и повышение точности полученных результатов.
Поставленная задача достигается благодаря тому, что в известном способе, заключающемся в том, что методом тонкослойной хроматографии разделяют общие липиды на классы, фосфолипиды на подклассы, проявляют отдельные классы липидов на хроматограмме и рассчитывают их количество с использованием денситометра, согласно изобретению для определения количества общих фосфолипидов и неизвестных липидов, которые остаются на старте после разделения общих липидов на классы, липиды, остающиеся на старте, сдвигают с места на 0,5 см выше, липиды проявляют парами йода и рассчитывают площади пиков, соответствующие интенсивности окраски пятен липидов на хроматограмме с помощью денситометра. Затем количество классов липидов и подклассов фосфолипидов определяют расчетным методом, составляя пропорцию.
Сущность предлагаемого способа представлена на чертежах, где:
на фиг.1 изображена хроматограмма классов липидов до сдвига ФЛ+НЛ фракции;
на фиг.2 - выделение трека после сдвига фракции ФЛ+НЛ;
на фиг.3 - расчет трека;
на фиг.4 - результаты расчета трека.
Способ осуществляют следующим образом.
В камеру для хромато граф ирования за 30 минут до начала исследования заливают подвижную фазу, состоящую из гексана, эфира и ледяной уксусной кислоты в соотношении 80:20:1. Заднюю внутреннюю стенку камеры покрывают чистой фильтровальной бумагой, чтобы создать хорошее насыщение камеры парами, что улучшает разделение классов липидов. Подвижную фазу наливают в таком объеме (10 мм), чтобы хорошо пропитать фильтровальную бумагу. Камеру закрывают притертой крышкой и ставят в вытяжной шкаф.
Количество общих липидов в биологических материалах определяют путем экстрагирования их с помощью смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1.
Далее на пластины марки Сорбфил размером 10×30 мм, отступая 12 мм от нижнего края, с помощью микрощприца в виде полосы наносят экстракт липидов, подготовленный для хроматографирования из расчета на 10 мг липидов 0,1 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 1:1.
После этого пластины ставят с небольшим наклоном (около 60°) к стенке камеры для хроматографирования и при подъеме фронта растворителей на высоту 9,5 см ее вынимают и сушат при комнатной температуре.
Затем пластину повторно переносят в камеру для хроматографирования с подвижной фазой, состоящей из хлороформа, метанола и воды в соотношении 65:25:4, подготовленной за 20 минут до начала исследования. После подъема фронта растворителей на высоту 3,0 см от нижнего края ее вынимают и снова сушат при комнатной температуре, после чего и помещают в эксикатор, содержащий кристаллы йода и закрывают крышкой. При такой двумерной хроматографии липиды, оставшиеся на старте, тоже поднимаются незначительно выше, и это позволяет избежать ошибки при определении интенсивности окрашивания пятен с парами йода.
На пластине пятна (треки) классов липидов располагаются в следующем порядке: фосфолипиды и некоторые другие липиды (ФЛ+НЛ), моноацилглицеролы (МГ), холестерол (ХЛ), диацилглицеролы (ДГ), неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), триацилглицеролы (ТГ) и эфиры холестерола (ЭХ).
Через 5 часов пластину вынимают из эксикатора и быстро помещают в осветительную камеру денситометра «Сорбфил» и получают изображение треков (пятен) на мониторе компьютера с помощью видеокамеры. Затем линиями выделяют каждый трек отдельно и производят их расчет, а далее получают результаты расчета треков, которые характеризуют площадь пиков и интенсивность окрашивания отдельных треков на пластине. Сумму полученных цифр берут за 100 процентов и определяют процентное отношение каждого класса липидов а, зная содержания общих липидов в исследуемом материале (мг/%), находят количество отдельных классов липидов.
Для определения количества общих ФЛ и их подклассов на пластины Сорбфил, размером 10×30 мм, отступая 12 мм от нижнего края, наносят с помощью микрощприца в виде полосы экстракт липидов, подготовленный для хроматографирования из расчета на 10 мг липидов 0,1 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 1:1.
Затем пластину ставят с небольшим наклоном (около 60°) к стенке камеры для хроматографирования с подвижной фазой, состоящей из хлороформа, метанола и воды в соотношении 65:25:4, подготовленной за 20 минут до исследования и закрывают притертой крышкой. После подъема фронта растворителей на высоту 9,5 см ее вынимают и сушат при комнатной температуре и также помещают в эксикатор, содержащий кристаллы йода.
На пластине пятна подклассов ФЛ по мере возрастания Rf располагаются в следующем порядке: лизофосфатидилхолин (ЛФХ), сфингомиелин (СМ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатидилэтаноамин (ФЭ) и кардиолипин (КЛ), а далее все остальные классы липидов в виде общего пятна.
Через 5 часов пластины вынимают из эксикатора и быстро денситометром определяют интенсивность окраски каждого отдельного трека подклассов ФЛ и треков всех нейтральных липидов выше указанным образом. Затем подсчитывают суммы цифр, отражающие интенсивность окраски всех подклассов ФЛ и прибавляют цифры, отражающие интенсивность окраски нейтральных липидов. Далее суммы двух цифр, отражающие интенсивность окраски всех треков на пластине, берут за 100% и, исходя из этого, подсчитывают процент общих фосфолипидов от общих липидов.
Зная количество общих липидов в пробах (мг/%), подсчитывают количество общих фосфолипидов а, учитывая процентное отношение подклассов фосфолипидов, подсчитывают их количество в мг в 100 мл или в 100 г сухого вещества, составляя пропорцию.
Применение предложенного способа определения классов липидов и подклассов фосфолипидов в липидных экстрактах биологических материалов методом тонкослойной хроматографии с использованием денситометра марки «Сорбфил» позволяет упразднить процедуру определения количества общих фосфолипидов, а также дает возможность определить количество других неидентифицированных классов липидов, которые при тонкослойной хроматографии классов липидов остаются на старте вместе с фосфолипидами и, следовательно, повышается точность полученных результатов исследований.
Пример. Допустим, после разделения общих липидов на классы (двумерной хроматографией) и проявления в парах йода на пластине ближе к старту обнаруживается пятно ФЛ+НЛ, чуть выше пятно МГ, затем ХЛ, ДГ, НЭЖК, ТГ и ЭХ (см. фиг.2). Далее быстро помещают пластину в. осветительную камеру денситометра «Сорбфил» и получают изображение треков на мониторе компьютера с помощью видеокамеры. Затем линиями выделяют каждый трек отдельно и производят их расчет, а далее получают результаты расчета треков, которые характеризуют площадь пиков и интенсивность окрашивания отдельных треков на пластине. Допустим, площадь пика (S), отражающая пятно ФЛ+НЛ составила 423,2, площадь пика МГ - 125,7; ХЛ - 367,9; ДГ - 235,8; НЭЖК - 126,6; ТГ - 467,9; а ЭХ - 897,5. После этого рассчитывают суммы площадей всех пиков (2645,0) и берут эту цифру за 100% и определяют процент каждого класса липидов от общих липидов, составляя пропорцию.
2645,0
100%
423,2
X
Отсюда, X=423,2·100/2645,0=16,0%
Где, X - процент ФЛ+НЛ фракций от общих липидов.
Таким же образом находят процентное отношение других остальных классов липидов от общих липидов.
Если содержание общих липидов в исследуемом материале составляет, например, 245,2 мг/% тогда содержание ФЛ+НЛ фракции составляет - 39,23 мг/%.
100%
245,2
16%
X
Отсюда X=16·245,2/100=39,23 мг/% или 39,23 мг в 100 мл (если материал жидкость)
При разделении общих ФЛ на подклассы и проявлении в парах йода на пластине ближе к старту находится пятно ЛФХ, чуть выше СМ, затем ФХ, и ФЭ, а далее пятно всех других классов липидов. Затем быстро помещают пластину в осветительную камеру денситометра «Сорбфил» и получают изображение треков на мониторе компьютера с помощью видеокамеры. Затем линиями выделяют каждый трек подклассов ФЛ отдельно и других классов липидов отдельно и производят их расчет, а далее получают результаты расчета треков, которые характеризуют площадь пиков и интенсивность окрашивания отдельных треков на пластине.
Допустим, площадь пика (S), отражающая пятно ЛФХ составила 213,6; СМ - 346,4; ФХ - 786,3; ФЭ - 156,3, а площадь пиков других классов липидов - 2145,3. Далее рассчитывают сумму площадей всех подклассов фосфолипидов (1502,6) и сумму площадей всех пиков на хромато грамме (3647,9).
Составляя пропорцию, рассчитывают процент общих ФЛ, от общих липидов следующим образом:
3647,9
100
1502,6
X
Отсюда X=1502,6·100/3647,9=41,19%
Зная количество общих липидов в исследуемом материале, определяют количество общих ФЛ в пробе. Если содержание общих липидов в исследуемом материале составляет, например, 245,2 мг/% тогда содержание общих ФЛ составляет - 100,9 мг/%.
100
245,2
41,19
X
Отсюда, X=41,19·245,2/100=100,9 мг/%.
Зная суммы площадей всех подклассов ФЛ, рассчитывают процентное отношение подклассов ФЛ (ЛФХ) следующим образом:
1502,6
100
213,6
X
Отсюда, X=213,6·100/1502,6=14.2%
Таким же образом рассчитывают процентное отношение других подклассов ФЛ.
Зная количества общих ФЛ в исследуемом материале, определяют количество отдельных подклассов ФЛ в пробе (мг/%).