СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА ИРИСИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ, В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR INCREASING CONCENTRATION OF IRISIN PROTEIN IN BLOOD PLASMA IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к нормальной физиологии, геронтологии и может быть использовано для профилактики заболеваний, ассоциированных с возрастом, а также для продления периода активного долголетия.
В настоящее время актуальным является поиск немедикаментозных методов сохранения здоровья и увеличения продолжительности жизни людей пожилого и старческого возраста. В 2012 году был открыт белок ирисин, синтез которого снижается по мере старения. Доказана тесная связь между концентрацией белка ирисина и длиной теломер - маркеров продолжительности жизни клетки. Повышение концентрации белка ирисина сопровождается улучшением течения «возрастных» заболеваний, в том числе гипертонической болезни, а также болезней Паркинсона и Альцгеймера.
Доказано, что выделение белка ирисина связано с физической работой, но при этом не любая физическая нагрузка приводит к увеличению его концентрации в плазме крови.
Поэтому важной задачей является создание эффективных немедикаментозных профилактических мероприятий, направленных на улучшение качества жизни и ее продолжительности, разработка оптимального режима физических тренировок, приводящих к увеличению концентрации белка ирисина в плазме крови.
Известен способ повышения концентрации белка ирисина в скелетной мышце и сыворотке крови после сильной физической нагрузки, описанный Brenmoehl J. et al. [Brenmoehl J. Albrecht E. Komolka K. Schering L. Langhammer M. Hoeflich A. Maak S. Irisin Is Elevated in Skeletal Muscle and Serum of Mice Immediately after Acute Exercise. Int J Biol Sci. 2014 Mar 11; 10(3): 338-49. doi: 10.7150/ijbs.7972. eCollection 2014]. Установлено методом вестерн-блоттинга с антителами, характерными для белка ирисина, что белок ирисин существует в мышцах и сыворотке крови мышей независимо от физической нагрузки и что его концентрация увеличивается сразу после однократной сильной принудительной физической нагрузки на беговой дорожке.
Недостатком известного способа является то, что авторы использовали модель однократной интенсивной физической нагрузки, которая может сопровождаться ухудшением течения заболеваний сердечно-сосудистой системы и сопутствующих заболеваний.
Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ повышения концентрации белка ирисина в плазме крови, в эксперименте путем физических тренировок по методу H.J. Kim et al. [Kim HJ, So B, Choi M. et al. Resistance exercise training increases the expression of irisin concomitant with improvement of muscle function in aging mice and humans. Exp Gerontol. 2015; 70: 11-17.]. Физическим тренировкам подвергались мыши-самцы в возрасте 19 месяцев на протяжении 12 недель в режиме 3 дня в неделю. Для тренировок использовалась сетчатая наклонная поверхность длиной 1 м под углом 85° с шириной ячейки 1,5 см. Мыши помещались к подножью поверхности и поднимались вверх. После отдыха в течение 2 минут упражнение повторялось. Через неделю тренировок добавляли груз, фиксированный на хвосте, составляющий 10% от веса мыши. Отмечалось повышение концентрации белка ирисина в плазме крови.
Недостатком известного способа является отсутствие возможности дозирования физических нагрузок, заключающейся в регулировании интенсивности и длительности физических тренировок.
Авторы предлагают эффективный способ повышения концентрации белка ирисина в плазме крови, в эксперименте, путем навязанных физических нагрузок, заключающихся в использовании определенных режимов физических тренировок.
Техническим результатом заявляемого способа является расширение перечня немедикаментозных средств, позволяющих повысить концентрацию белка ирисина в плазме крови.
Технический результат достигается тем, что крыс самцов принудительно подвергают физическим тренировкам в тредбане в течение 2 часов со скоростью 6-8 м/мин 3 раза в неделю: понедельник, среда, пятница в течение 30 дней.
Способ осуществляют следующим образом.
Режимы физических тренировок, приводящие к повышению концентрации белка ирисина, найдены экспериментальным путем.
2
В экспериментах использовался тредбан, представляющий собой барабан из плексигласового стекла диаметром 1 м без сквозной оси, для исключения фиксации животных на ней. Тредбан был разделен на 10 индивидуальных полых секций. Каждая секция имеет отверстия для вентиляции и удаления экскрементов, а также дверцу для обслуживания отсека. Размер каждой секции тредбана определялся, исходя из норм содержания животных, т.е. не менее 1-2 см горизонтальной поверхности беговой дорожки на 1 г массы тела животного. Тредбан через редуктор приводится в движение электродвигателем, снабженным реостатом, при помощи которого возможно изменять скорость вращения барабана.
Эксперименты по изучению влияния различных режимов физических тренировок на концентрацию белка ирисина были проведены на 48 крысах самцах Wistar в возрасте 12-13 недель, массой 250-300 г. Животные были размещены в клетках с полубарьерной системой в экологически контролируемых условиях с 12 часовым светлым и 12 часовым темным циклом, комнатная температура составляла 22,5±0,2°С и влажность составляла 50-60%. Пресная водопроводная вода и корм находились в свободном доступе. Животные были разделены на 4 группы и составляли первую контрольную группу и вторую контрольную группу, первую опытную группу и вторую опытную группу по 12 крыс самцов в каждой группе.
В первой контрольной группе животные находились ежедневно в выключенном тредбане по 2 часа в день в течение 30 дней и не подвергались физическим тренировкам.
Во второй контрольной группе животные находились в выключенном тредбане 3 раза в неделю: понедельник, среда, пятница по 2 часа в день в течение 30 дней и не подвергались физическим тренировкам.
В первой опытной группе животные подвергались ежедневным 2-х часовым физическим тренировкам в тредбане путем принудительной ходьбы со скоростью 6-8 м/мин в течение 30 дней.
Во второй опытной группе животные подвергались 2-х часовым физическим тренировкам в режиме 3 раза в неделю: понедельник, среда, пятница в тредбане путем принудительной ходьбы со скоростью 6-8 м/мин в течение 30 дней.
Животные контрольных групп и опытных групп помещались в индивидуальные секции тредбана.
Физические тренировки проводились в вечернее время с 18 до 22 часов, что соответствует времени бодрствования крыс.
По истечении 30 дней осуществляли забор крови для получения сыворотки у животных опытных 1 и 2 групп и контрольных 1 и 2 групп. Перед забором крови предварительно производили наркотизацию животных путем внутрибрюшинного введения раствора телазола из расчета 14 мг/кг массы животного. Через 5 минут после инъекции препарата у фиксированных к малому операционному столику животных осуществляли оценку болевой чувствительности путем сдавливания корня хвоста, по которой оценивали степень наркотизации животного. При удовлетворительной наркотизации животного проводили вскрытие брюшной полости и выделение печеночного синуса. Кровь для исследования в объеме 5-6 мл получали путем забора из печеночного синуса в одноразовый полистироловый шприц с широкой иглой, не содержащий антикоагулянт. Кровь из шприца переливали в полистироловую градуированную центрифужную пробирку, которую помещали в водяную баню на 1 час при температуре 36,7°С, после чего пробирки с кровью, в которых образовались сгустки, центрифугировали на протяжении 15 мин при скорости 3000 об/мин (1200 g) на центрифуге типа СМ-50. Полученную таким образом сыворотку, переносили при помощи автоматической пипетки в полистироловые градуированные микроцентрифужные пробирки и замораживали при температуре минус 70°С. Данные образцы сыворотки находились в работе в течение недели. Перед процедурой анализа образцы помещали в комнатные условия.
Для определения концентрации белка ирисина в сыворотке крови использовали набор для определения фибронектина 3 типа (FNDC5) методом иммуноферментного анализа (ИФА) для крыс. Набор предназначен для количественного определения FNDC5 сэндвич-методом ИФА в сыворотке крови. Микропланшет в наборе сорбирован антителами, специфическими к FNDC5. Стандарты или образцы добавляются в определенные лунки планшета с антителами, конъюгированными с биотином и специфичными к FNDC5. Затем авидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP) добавляют в каждую лунку планшета и проводят инкубацию. После добавления ТМБ Substrate цвет изменяется только в лунках, содержащих FNDC5, антитела с биотином и авидин с пероксидазой хрена. Ферментативная реакция прекращается добавлением раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряют фотометрическим методом на длине волны 450±10 нм. Концентрацию FNDC5 в образцах рассчитывают в соответствии со стандартной (калибровочной) кривой.
Для статистической обработки результатов исследования использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Данные непараметрических совокупностей представлены в виде медианы (Me) и квартилей [25% и 75%]. Для всех тестов статистически достоверными считались различия, уровень значимости которых отвечал условию р<0,05.
Результаты исследований представлены в примерах 1 и 2.
Пример 1.
Результаты проведенного иммуноферментного анализа показали, что у животных 1 и 2 контрольных групп концентрация белка ирисина достоверно не отличалась и соответствовала 0,3 нг/мл [0,30-0,21] и 0,4 нг/мл [0,27-0,49] соответственно.
Пример 2.
Результаты проведенного иммуноферментного анализа показали, что у животных 1 и 2 опытных групп концентрация белка ирисина достоверно отличалась от контрольных групп и составляла в 1 опытной группе 0,7 нг/мл [0,60-1,15], во 2 опытной группе - 1,0 нг/мл [0,83-1,25].
Таким образом, экспериментальным путем выявлено, что для повышения концентрации белка ирисина в плазме крови наиболее эффективным режимом физических нагрузок является принудительная ходьба в тредбане в течение 2 часов со скоростью 6-8 м/мин 3 раза в неделю: понедельник, среда, пятница на протяжении 30 дней. После проведения исследований заявляемый способ может быть рекомендован для профилактики заболеваний, ассоциированных с возрастом: таких, как сахарный диабет 2-го типа, ожирение, болезней Паркинсона и Альцгеймера.