Области применения ДНК-цитометрии в педиатрической практике

morphisms at the glutathione S-transferase Pi locus and association with susceptibility to bladder, testicular and prostate cancer // Carcinogenesis. - 1997. - Vol. 18. - P. 641-644.

5. Helzlsouer K. J., Huang H-Y., Strickland P. T. et al. Association between glutathione-S-transferase M1, P1 and T1 genetic polymorphisms and development of breast cancer // J. Natl. Cancer Inst. -1998. - Vol. 90, - P. 512-518.

6. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M. N. Y.; Haman press, 1984. - V.2. - P. 31-34.

7. Menegon A., Board P. G., Blackburn A. C. et al. Parkinson disease, pesticides and glutathione transferase polymorphisms // Lancet - 1998. - Oct. 24; 352 (9137): 1344-1346.

8. Nakachi K. Polymorphisms of the CYP1A1 and glutathione-S-transferase genes associated with susceptibility to lung cancer. In relation to cigarette dose in a Japanese population / K. Nakachi, K. Imai, S. Hayashi // Cancer Res. - 1993. - Vol. 53, - P. 2994-2999.

УДК 616-053.2-07:575

© Н.Ф. Хисамова, Л.Р. Кальметьева, З.Р. Хаматдинова,2009

Н.Ф. Хисамова, Л.Р. Кальметьева, З.Р. Хаматдинова ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ДНК-ЦИТОМЕТРИИ В ПЕДИАТРИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

ГУЗ Республиканская детская клиническая больница, г. Уфа

Статья посвящена обсуждению результатов исследования показателей системы иммунитета и ДНК-цитометрии клеток периферической крови у детей с хроническим гломерулонефритом, получающих комплексную иммуносупрессивную терапию. Анализ полученных данных позволил выявить особенности иммунологической реактивности, плоидности клеток и кинетики клеточного цикла, которые позволяют оценить активность процесса и эффективность иммуносупрессивной терапии.

Ключевые слова: ДНК-цитометрия периферической крови, хронический гломерулонефрит, дети, иммуносупрессивная терапия.

N.F. Khisamova, L.R. Kalmetieva, Z.R. Khamatdinova FIELDS OF USING OF DNA-CYTOMETRY IN PEDIATRICAL PRACTICE

This article is related to the discussion of the results of the studies of the index of immunal system and DNA-cytometry of blood cells of the children with chronical glomerulonephritis, which are under immunosuppression. Complex analysis of the data defind the peculiarities of immunologic reactivity, ploidy of cells and cellular cycle kinetics, which allow to give characteristics of the activity of process and efficacy of immunocuppressiv therapy.

Key words: DNA-cytometry of blood cells, chronical glomerulonephritis, children, immunocuppressiv therapy.

Хронический гломерулонефрит (ХГ) является важнейшей проблемой детской нефрологии, несмотря на небольшой удельный вес в общей структуре нефропатий [Н.А. Коровина и др., 1990; Л.Д. Панова и др., 2005]. Среди приобретённых заболеваний почек у детей ХГ является вторым по распространённости заболеванием после инфекции мочевыводящих путей, одной из основных причин развития хронической почечной недостаточности (ХПН), инвалидизации в детском, юношеском и молодом возрасте [В .И. Наумова, 1997; Ф.И. Руснак и др., 1997]. За последние 10-15 лет увеличилась частота латентных и хронических форм гломерулонефрита, протекающих с более ранним нарушением почечных функций, в том числе за счёт присоединения тубулоинтерстициального компонента [Сергеева К.М., 1999; Картамышева Н.Н. и др., 2005; Мотлох Л.Н. и др., 2006]. Известно, что при лечении больных ХГ патогенетически обоснованной является комплексная иммуно-

супрессивная терапия. Однако, несмотря на применение современных фармакологических препаратов, оценка эффективности проводимой терапии и прогнозирование результатов лечения представляют большие трудности.

В связи с этим перспективным является использование новейших технологий для изучения процессов, протекающих в иммуноком-петентных клетках. Физиологическое состояние клеток и способность к осуществлению присущих им функций характеризуется, в частности, уровнем ДНК (плоидностью) и показателями кинетики клеточного цикла. Для объективной оценки этих параметров широкое распространение получает проточная ци-тофлуориметрия, разделом которой является ДНК-цитометрия [Saha I. et al., 2000]. По прогнозам специалистов [Шмаров Д.А., Козинец Г.И., 2004], в самом ближайшем будущем можно ожидать внедрения проточной ДНК-цитометрии в практику работы клиникодиагностических лабораторий.

Цель исследования. Определить диагностическое и прогностическое значение ДНК-цитометрии периферической крови в комплексной оценке иммунного статуса и функционального состояния клеток у детей с ХГ.

Материал и методы

Работа выполнена на базе отделения клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы (г. Уфа).

В соответствии с поставленной целью исследования проводились в несколько этапов. На первом этапе осуществлялось клинико-лабораторное обследование контрольной группы (n=30).

Следующим этапом работы было комплексное клинико-лабораторное обследование детей с хроническим гломерулонефритом (n=20) с начальными признаками нарушений детоксицирующей и выделительной функций почек (нефротическая и смешанная формы). Обследование пациентов проводили на фоне базисной терапии ХГН, которая включала прием гормонов (преднизолон) и цитостати-ков (сандиммун, азатиаприн), механизм им-муносупрессивного действия которых связан с влиянием на пролиферативную фазу иммунного ответа [Цыгин А.Н., Сергеева Т.В., 1998].

Комплексное обследование больных включало сбор анамнеза, анализ клинических данных, проведение лабораторных исследований. Иммунологическое обследование проводилось с использованием комплекса стандартизированных тестов, включающих оценку:

- клеточного звена иммунитета на проточном цитофлуориметре FACSCalibur с использованием моноклональных антител фирмы Becton Dickinson и определением относительного содержания основных популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+56+, CD19+, CD25+, CD95+, HLA-DR );

- плоидности и кинетики клеточного цикла клеток периферической крови методом проточной ДНК - цитометрии, основанным на связывании ДНК с флуоресцентным зондом -пропидиума йодидом, который позволяет определить долю клеток в различных фазах митотического цикла (G0/G1, S и G2+M). Образцы (не менее 20 000 клеток) анализировали на проточном цитофлуориметре, оборудованном модулем дискриминации дуплетов в программе ModFit;

- концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G (Ig A, Ig М, Ig

G), определяемых методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини;

- уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) осаждением полиэтиленг-ликолем [Имельбаева Э.А. и др., 2006].

Статистическую обработку результатов исследования проводили в операционной среде «Windows-XP» с использованием современных пакетов прикладных программ «8ТЛТ18Т1СЛ 6.0». Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялись медиана и интеркартильный размах (25 - 75 перцентилей). Достоверность различий оценивалась по критерию Манна-Уитни [Гланц С., 1999].

Результаты и обсуждение

Одним из условий адекватной характеристики состояния иммунной системы является чёткое представление о норме [Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, 2001].

На начальном этапе исследования проводилась оценка ДНК-гистограмм крови 30 практически здоровых детей (контрольная группа), отвечавших следующим требованиям:

- отсутствие жалоб на состояние здоровья в момент осмотра;

- перенесших вирусные заболевания в течение года не более 2 раз;

- не имевших признаков аллергии и другой хронической патологии.

ДНК-цитометрия периферической крови в контрольной группе характеризовалась следующими особенностями: показатели клеточного цикла отличались высокой стабильностью и варьировали в сравнительно узких пределах. В 100% случаев выявлялся диплоидный тип гистограмм, причём основная масса клеток 99,89% находилась в G0/1-фазе клеточного цикла, доля клеток в стадии синтеза ДНК составляла 0,1%, в фазе G2-М - 0,02%. Коэффициент вариации составил 2,57%.

Согласно поставленной цели проведено обследование 20 детей с нефротической и смешанной формами ХГ. Пациенты поступили в клинику в стадии обострения основного заболевания. Обследование больных детей проводилось на фоне комплексной иммуносу-прессивной терапии.

Для пациентов с нефротической формой ХГ были характерны протеинурия до 5 %о и более, гипопротеинемия до 40 г/л с преимущественным снижением альбуминовой фракции, гиперхолестеринемия до 8 ммоль/л и более, гиперфибриногенемия до 6 г/л и более.

При смешанной форме ХГ у пациентов отмечались протеинурия до 5 %о и более, ге-

матурия, непостоянная лимфоцитурия, гипо-протеинемия, гиперхолестеринемия, гипер-фибриногенемия, ускорение СОЭ.

Анализ гуморального звена (табл. 1) выявил достоверное снижение концентрации JgG и тенденцию к повышению уровня ^М.

При иммунофенотипировании лимфоцитов установлено увеличение количества общих Т-лимфоцитов (СБ3 - клеток) и высокий уровень маркёра ранней активации (СБ25). Обращает на себя внимание подавление активности участников противовирусного иммунитета - снижение количества ЕКК (СБ16+56+ - клеток).

Таблица 1.

Характеристика иммунологических показателей детей _________с хроническим гломерулонефритом_______________

Показатели Контрольная группа (n=30), Ме дети с ХГН (n=20), Ме

Ig A, г/л 0,86

Ig M, г/л 0,91

Ig G, г/л 10,00 (9,00-12,50) 7,00 (4,00-9,60)*

ЦИК, у. е. 31,00

CD3+, % 62,00 (58,00-67,00) 70,00 (63,00-78,00)*

CD4+, % 38,00

CD8+,% 37,00

CD19+, % 15,00

CD16+56+, % 22,00 (18,00-28,00) 16,00 (7,00-18,00)**

HLA-DR+ , % 9,00

CD25+, % 17,00 (15,00-20,00) 25,00 (18,00-36,00)*

CD95+, % 32,50

CD4+/CD8+ 1,00

Примечание: Различие с контролем статистически значимо:

* р<0,0І; ** р<0,00і.

Таблица 2.

Распределение клеток периферической крови по плоидности и фазам клеточного цикла у детей с ХГН и в контрольной группе

В табл. 2 отражены показатели плоид-ности и распределения клеток периферической крови по фазам клеточного цикла в группе детей с ХГН. В 100% случаев клетки периферической крови, как и в контрольной группе, имели диплоидный набор хромосом. Достоверные различия касались лишь распределения клеток по фазам клеточного цикла.

В группе детей с ХГН доля клеток в G2-фазе составила 0,09% , в 8- фазе 0,15%, (в

контрольной группе соответственно 0,02% и

0,10%). Коэффициент вариации пика Gi/0 в опытной группе не превышал 3,0%.

Существует множество факторов, влияющих на плоидность и жизненный цикл клетки. Сведения об изменениях, происходящих в различных органах и системах, малочисленны и разрозненны. В связи с этим проточная ДНК-цитометрия становится ценным диагностическим методом и все чаще применяется при мониторинге заболеваний.

В нашей работе была сделана попытка изучения функционального состояния клеток периферической крови методом проточной цитофлуориметрии при таком распространённом и весьма далёком от решения проблемы в педиатрии, как хронический гломерулонефрит.

Анализ результатов проведенных исследований позволил выявить особенности плоидности клеток и кинетики клеточного цикла в группе детей с ХГН. Как известно, одним из маркёров пролиферативной активности может служить уровень клеток в фазе синтеза ДНК. По данным ДНК-цитометрии клетки периферической крови имели диплоидный набор хромосом, кинетика клеточного цикла характеризовалась достоверным увеличением клеток в фазах пролиферации.

Перечисленные особенности иммунологической реактивности и ДНК-цитометрии клеток периферической крови отражают реакцию организма на базисную терапию. Комплексный подход, объединяющий клиническую картину заболевания, иммунологические показатели, кинетику клеточного цикла, позволяет всесторонне оценить активность процесса и эффективность иммуносупрессив-ной терапии.

Заключение

На основании анализа результатов проведенных исследований, включающих динамическое наблюдение в различные стадии заболевания, мы считаем возможным рекомендовать мониторинг показателей кинетики клеточного цикла в качестве маркера активности процесса и отчасти эффективности иммуно-супрессивной терапии при хронических гломерулонефритах.

Плоидность и кинетика клет. цикла клеточ-ногоци цикла Контрольная группа (n= 30), Ме Дети с ХГН (n= 20), Ме

Диплоидные, % І00 І00

Gi, % 99,89 (99,83-99,90) 99,77 (99,32-99,83) **

G2, % 0,02 (0,00-0,04) 0,09 (0,04-0,16) **

S, % 0,10 (0,09-0,11) 0,15 (0,09-0,37) *

CV 2,57 (2,29-2,83) 3,06 (2,38-3,84) **

Примечание: Различие с контролем статистически значимо:

* р<0,05, ** р<0,0І.

Контактная информация

Хисамова Назиля Фагилевна

ГУЗ Республиканская детская клиническая больница МЗ РБ, иммунологическая лаборатория с отделением клинической иммунологии,

Башкортостан, 450106, Уфа, ул. Ст. Кувыкина 98, тел. раб.: (347) 2557344, Факс: (347) 2548884, e-mail: naz6960@jandex.ru Кальметьева Линара Ринатовна

ГУЗ Республиканская детская клиническая больница МЗ РБ, врач-иммунолог

Башкортостан, 450106, Уфа, ул. Ст. Кувыкина 98, тел. раб.: (347) 2557344, Факс: (347) 2548884, e-mail: m_kalmetiev@mail.ru

Хаматдинова Земфира Робертовна

ГУЗ Республиканская детская клиническая больница МЗ РБ, врач клинико-лабораторной диагностики

Башкортостан, 450І06, Уфа, ул. Ст. Кувыкина 98, тел. раб.: (347) 2557344, Факс: (347) 2548884 e-mail: zemfiral02@mail.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М., І999. - 495 с.

2. Картамышева, Н.Н. Тубулоинтерстициальные изменения при хронических заболеваниях по-

чек у детей / Н.Н. Картамышева, О.В. Чумакова, А.Г. Кучеренко. - М.: Медицина, 2005. - 93 с.

3. Коровина, Н.А. Гломерулонефрит у детей: [монография] / Н.А. Коровина, Л.П. Гаврюшова,

М. Шашинка. - М.: Медицина, І990. - 255 с.

4. Методические указания к занятиям по иммунологии и серологии для специалистов по клинической лабораторной диагностике / сост. Э.А. Имельбаева, Р.М. Хайруллина, Ю.А. Медведев [и др.]. - Уфа, 2004. - S7 с.

5. Наумова, В.И. Разработка проблем нефрологии в институте педиатрии РАМН / В.И. Наумова // Педиатрия. - І997. - № 2. - C. 43-45.

6. Распространенность инвалидности вследствие заболеваний органов мочевой системы у детей Республики Башкортостан / Л. Д. Панова, Л.И. Вахитова, Д.Ф. Зиятдинова [и др.]. // Нефрология и диализ. - 2005. - Т. 7, № І. - с.92-93.

7. Руснак, Ф.И. Влияние кальцитриола на иммунокомпетентные клетки у детей с хроническим гломерулонефритом в функционально-компенсированной стадии / Ф.И. Руснак // Педиатрия. -І997. - № 3. - C. 37-39.

8. Сергеева, К.М. Клинико-лабораторные критерии оценки характера течения гломерулонеф-рита у детей / К.М. Сергеева // Нефрология. - І999. - Т. 3, № 4. - С. 66-76.

9. Случай диффузного нефробластоматоза в клинической практике / Л.Н. Мотлох, С.О. Фала-леева, Т.Н. Меньшикова [и др.] // Педиатрия. - 2006. - № І. - С. І06-І07.

10. Хаитов, Р.М. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. - 200І. - № 4. - С. 4-6.

11. Цыгин, А.Н. Лечение хронического гломерулонефрита у детей / А.Н. Цыгин, Т.В. Сергеева // Российский педиатрический журнал. - І998. - № 2. - С. 55-57.

12. Шмаров, Д.А. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови / Д.А. Шмаров, Г.И. Козинец. - M.: МИА, 2004. - І28 c.

13. Ormerod M.G. Consensus report of the task force on standardization of DNA flow cytometry in clinical pathology / M.G. Ormerod, B.Tribukait, W.Giarretti. http: //archive.uwcm. ac.uk/ uwcm/hg/hoy/dna.html., 200І.

14. Role of DNA flow cytometry and image cytometry on effusion fluid / I. Saha, P. Dey, H. Vhora, R. Nijhawan // Diagn. Cytopathol. - 2000. - Vol. 22, N 2. - P. 81-85.

УДК 6І6.344-007.64-002-036. ii-089

© В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов, Д.И. Мехдиев, Ф.З. Багаутдинов, Р.Н. Гареев, 2009

В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов,

Д.И. Мехдиев, Ф.З. Багаутдинов, Р.Н. Гареев ОПЫТ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ДИВЕРТИКУЛИТА ТОЛСТОЙ КИШКИ

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава»

Заболеваемость дивертикулярной болезнью толстой кишки в различных странах достигает 30% от всей популяции. Дивертикулез толстой кишки встречается у 40% людей старше 70 лет. В обшей структуре стационарных больных пациенты с дивертикулезом толстой кишки и его осложнениями составляют в среднем 8,4% случаев. В 60% случаев дивертикулы располагаются в сигмовидной кишке, в 24% - в нисходящем отделе ободочной кишки, в левом фланге встречается у 17% больных.

Целью исследования явилось изучение результатов оптимизации диагностических мероприятий и выбора лечебной тактики при осложненных формах дивертикулярной болезни толстой кишки с позиции современных неинвазивных и ми-нипвазивных технологий.

Ключевые слова: дивертикулярная болезень, толстая кишка, дивертикулит.