Способ выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных
METHOD FOR DETECTING RNA OF SCHMALLENBERG DISEASE VIRUS IN FARM ANIMALS

Изобретение откосится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики вирусных и инфекционных заболеваний у животных, в частности к методам выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у животных.
Известен способ выявления инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2460803, C12Q 1/68, 2014 г), включающий выделение РНК из биологического материала инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченого зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией - Threshold.
Наиболее близким потехнической сущности является способ выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у животных, включающий выделение РНК из биологического материала по выбору: цельная кровь, сыворотка крови, фрагменты тканей и органов сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контрольных образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя вируса Шмалленберга олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченого зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией Threshold (патент РФ №2515916, C12Q 1/68, 2014 г. - прототип
Недостатком прототипа является недостаточная специфичность и чувствительность, олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченого зонда и контрольных образцов, что влияет на точность диагностики.
Техническим результатом является повышение точности диагностики.
3
Технический результат достигается тем, что в способе выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных, включающем выделение РНК из биологического материала по выбору: цельная кровь, сыворотка крови, фрагменты тканей и органов сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контрольных образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя вируса Шмалленберга олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченого зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией Threshold, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса Шмалленберга и фрагмент генома бактериофага MS2 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам:
JOE/ Yellow для специфического сигнала возбудителя вируса Шмалленберга;
Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики вируса болезни Шмалленберга используют две последовательные реакции: обратной транскрипции вирусной РНК для получения кДНК и полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента полученной кДНК матрицы. Обе реакции проводятся последовательно в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома артериита олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченого зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ОТ-ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации и возможность ошибки при переносе кДНК в другую пробирку для ПЦР. Кроме того, детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики возбудителя вируса болезни Шмалленберга, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены скриншоты графиков и таблицы, на рис. 1 - представлен канал Cy5/Red - для тестирования сигнала внутреннего контрольного образца (ВКО), на рис. 2 представлен канал JOE/Yellow для специфического сигнала возбудителя вируса Шмалленберга; на рис. 3 - таблица количественных данных для Cycling A. A.Yellow (вирус Шмалленберга) и A.Red (ВКО).
Способ выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных осуществляется следующим образом.
3
Для исследования с целью выделения РНК используют биологический материал животных по выбору: цельная кровь, сыворотка крови, фрагменты тканей и органов взятые от животных инфицированных возбудителем вируса болезни Шмалленберга. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса болезни Шмалленберга и фрагмент генома бактериофага MS2 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
Затем измеряют накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE/ Yellow для специфического сигнала возбудителя вируса Шмалленберга; Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Вирус болезни Шмалленберг является представителем семейства буньявирусы (Bunyaviridae), рода ортобуньявирусы (Orthobunyavirus), серогруппы Симбу (Simbu serogroup). Вирус состоит из трех сегментов, называемых S (короткая), М (средняя) и L (длинная) и передается через кровососущих насекомых. Праймеры комплементарны консервативной области гена нуклеокапсидного белка N вируса болезни Шмалленберг (Schmallenberg virus N, NSs genes for nucleocapsid protein, non-structural protein, complete cds, strain: 167/Wiltshire/2012, код доступа LC309157.1, участок между 360 и 446) и не комплементарны каким-либо участкам геномов других вирусов. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченый зонд Shm-Z (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Shm-F и Shm-R). Зонд был помечен красителем HEX. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1 Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
С помощью программы «O1igo 6.0» проанализирована нуклеотидная последовательность бактериофага MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940). Бактериофаг MS2 содержит однонитевую позитивно ориентрованную РНК размером 3569 оснований. В результате анализа внутри гена белка `созревания` (maturation protein) выбран участок между 200 и 350 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченый зонд MS2P, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров MS2F и MS2R. Используя программу «Oligo 6.0» описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Пример конкретного осуществления способа выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных.
Для исследования используют следующий материал:
- Цельную кровь забирают в пробирку с ЭДТА, желательно использовать одноразовые системы взятия крови. Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.
- Сыворотку крови для ее получения берут 5 мл крови в пробирку без антикоагулянта. Желательно использовать одноразовые системы взятия крови.
- Фрагменты тканей и органов павших животных (головной мозг, спинной мозг, плацента, пуповина), отбирают в стерильный контейнер.
- Околоплодную жидкость новорожденных животных с пороками развития и мертворожденных плодов, берут в объеме не менее 1 мл в стерильные пробирки.
- Кровососущие насекомые, переносчики вируса (комары, мокрецы), отбирают не менее 20 особей в контейнер.
Исследуемые образцы подготавливают следующим образом.
Пробы цельной крови с ЭДТА, сыворотки крови, околоплодной жидкости используют без предварительной подготовки. Для экстракции РНК используют 50 мкл цельной крови, околоплодной жидкости или 100 мкл сыворотки.
Из тканей и органов вырезают небольшие кусочки до 1 г весом. Растирают в отдельных фарфоровых ступках, добавляют по 5-10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 3 мин, после чего переносят 50 мкл верхней фазы в пробирки типа «Эппендорф» и используют для экстракции РНК.
Пробу комаров (используют 20-40 особей) растирают в 1 мл стерильного физиологического раствора с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков Полученные суспензии центрифугируют при 12 тыс об/мин в течение 1 мин. Для экстракции РНК используют 100 мкл надосадочной жидкости.
Далее проводят анализ с помощью набора реагентов «ПЦР-ШМАЛЛЕНБЕРГ-ФАКТОР»
Набор состоит из комплектов 1 и 2 реагентов для проведения обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР РВ и контрольных образцов.
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ШМАЛЛЕНБЕРГ-ФАКТОР» для выявления РНК вируса Шмалленберга в биологическом материале методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ОТ ПЦР РВ) ТУ 21.10.60-122-51062356-2016 (для диагностики in vitro) http://www.vetfaktor.ru/.
Состав набора приведен в таблицах 1 и 2.
* Возможна легкая опалесценция
Анализ состоит из трех этапов:
- экстракция (нуклеиновых кислот) НК;
- проведение ОТ-ПЦР РВ;
- учет результатов анализа.
Реакция ОТ-ПЦР РВ проводится в одной пробирке.
Экстракция (выделение) НК из клинического материала
Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), внутренний контрольный образец (ВКО SHMAL) по 10 мкл.
Внести исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначают как ВК-).
Выделять НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.
Выделенную РНК можно хранил, до 3 часов при температуре от 2°C до 8°C или в течение месяца при температуре не выше минус 68°C.
Подготовка образцов к проведению ОТ-ПЦР РВ
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО SCHMAL), ВКО SCHMAL и РНК буфера.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ SCHMAL
10 мкл ПЦР БУФЕР SCHMAL
0,75 мкл RT PCR ENZ
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб. Затем вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси, используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл НК соответствующей пробы, (включая пробу ВК-);
в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО SCHMAL.
Проведение ОТ-ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q», представлены в таблице 3.
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Запрограммировать прибор согласно инструкции производителя.
После завершения программы амплификации отработанные пробирки утилизируют в соответствии с МУ 1.3. 2569 -09.
Учет результатов анализа
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 2, 3, 4 и 5 Инструкции.
Учет результатов ОТ-ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4 и рис. 1, 2, 3.
Появление любого значения Ct (см. таблице 4, рис. 1,2) результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE (HEX)/Yellow и для отрицательного контроля этапа ОТ-ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых по каналу Cy5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по каналу JOE (HEX)/Yellow значение Ct также отсутствует) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР (таблица 4. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Cy5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробах или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР РВ. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.
Образец считается положительным (РНК вируса Шмалленберга обнаружена) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4, рис. 2, 3). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/ Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow > 37), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.
Для оценки специфичности предлагаемых внутреннего и положительного контрольных образцов для метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ОТ ПЦР РВ)ОТ-ПЦР РВ» для выявления РНК вируса Шмалленберга в биологическом материале исследовали препараты РНК, выделенной из образцов, содержащих гетерологичные вирусы и кровь от интактных животных.
Показано отсутствие неспецифических реакций компонентов набора в отношении НК следующих вирусов и микроорганизмов: Bovine coronavirus, Bovine leukemia virus, Bovine respiratory syncytial virus, Bovine viral diarrhoea virus, Rotavirus, Brucella abortus, Pasteurella multocida, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium paratuberculosis, Escherichia coli, Campylobacter fetus, Clostridium perfringens, Salmonella dublin, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis. Также показано отсутствие неспецифических реакций компонентов набора в отношении образцов ДНК КРС, овец, свиньи, курицы, человека, а также комаров рода Culex.
5
Для оценки чувствительности ОТ-ПЦР РВ проводили постановку реакции с использованием в качестве матрицы титрованного препарата транкрипта, полученного на рекомбинантной плазмиде, содержащей ограниченный праймерами ShmF и ShmR фрагмент генома вируса болезни Шмалленберг. Чувствительность системы составила 10 г-экв/мл.