Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О
INACTIVATED EMULSION VACCINE FOR O-TYPE APHTHOUS FEVER

Ящур по классификации ФАО/МЭБ относится к группе «трансграничных инфекций», имеющих большую экономическую значимость для торговли и продовольственной безопасности всех стран. Вирус ящура может легко распространяться и приобретать размах эпизоотий. В Российской Федерации разработана система мер борьбы и профилактики ящура, предусматривающая предупреждение занесения вируса в страну, систематическую вакцинацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне и проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса гомологичного полевым изолятам [1].
В 2014 году в Забайкальском и Приморском крае Российской Федерации, а также в сопредельных странах были зарегистрированы вспышки ящура типа О. Нуклеотидное секвенирование полевых изолятов вируса, выделенных в Забайкальском крае, позволило отнести его к генетической линии PanAsia топотипа ME-SA [2]. Вирус этой же линии циркулировал в 2014 году в Монголии.
Вспышка ящура в Приморском крае вызвана изолятом вируса, который принадлежит генетической линии Муа-98 топотипа SEA и имеет высокую степень нуклеотидного родства (96,87%) с изолятом, выделенным в 2014 году в Южной Корее [2].
Профилактическая эффективность вакцин, определяемая по эпидемиологическим показателям, устанавливается в группах привитых животных при угрозе возникновения и распространения болезни. Вакцины должны обеспечивать создание массовой невосприимчивости и препятствовать распространению эпизоотических штаммов вируса ящура.
Для успешного проведения профилактической групповой иммунизации необходима информация об антигеном соответствии вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов, циркулирующих в зоне профилактической вакцинации. При возникновении вспышек заболевания именно путем определения нуклеотидного и антигенного соответствия полевого изолята производственному штамму можно наиболее оперативно определить подходящий штамм для производства вакцин, применяемых в зонах риска [3].
Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики ящура используют требуемые типы вируса, подбирают штаммы с богатым набором антигенных вариаций внутри типа и с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм, имеющий широкий спектр иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона, выбирают с помощью его исследования в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины.
Кроме того, производственному штамму предъявляются высокие требования по стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также по сохранению вируса во время инактивации и длительного хранения [4].
Важной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, возникающая в различные временные промежутки, на разных территориях, и зависящая от видового состава восприимчивого поголовья животных, его иммунного статуса и множества других факторов.
Считается, что преимущественно замены аминокислотных последовательностей имеют место в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Возникающие генетические и антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, ими индуцируемой [1, 5].
Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого изолята, могут варьировать от незначительных, детектируемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного изолята с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном.
В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.
1
1
Известны штаммы вируса ящура типа О, использовавшиеся в качестве производственных на территории России в течение последних 50 лет. Среди них выделяют штамм O №1618 Чечено-Ингушский/66, выделенный в 1966 году, а также штамм O №194, выделенный в 1957 году в Волгоградской области. Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны, в настоящее время их поддерживают в Коллекции штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Известен штамм О 1736/Абхазия/2000 вируса ящура, выделенный от КРС в Гальском районе Абхазии, который применяется для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.
Известен штамм О 1964/Монголия/2004, обнаруженный у КРС в феврале 2004 года в Восточно-Гобийском аймаке Монголии, который используется для производства диагностических и вакцинных препаратов [6].
Также известен штамм О №1734/Приморский/2000, выделенный 13 апреля 2000 года от свиней в ОПХ «Степное» села Элитное Уссурийского района Приморского края [7].
1
1
Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штамма О №1734/Приморский/2000, показавший, что данный вирус принадлежит к генетической линии PanAsia типа О. Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе в Японии, Корее, Вьетнаме, Монголии, а также Армении и Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 году также была вызвана паназиатским вирусом. Исследуемый вирус имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О Вьетнам/99 и О Тайвань/99. Установлено, что изолят О №1734/Приморский/2000 отличается от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов O №194 и O №1618, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики.
Производственный штамм О №1734/Приморский/2000 вируса ящура применяется в Российской Федерации в качестве производственного при создании средств диагностики и специфической профилактики, используемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.
Известна вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма О №1734/Приморский/2000, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта в эффективном соотношении.
Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъювантов служат Montanide ISA-70 и Montanide ISA-206, а сорбированной - гидроокись алюминия (ГОА).
Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей проводят с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида.
Известен штамм О №2102/Забайкальский/2010, выделенный в июле 2010 года от больной свиньи в поселке Абагайтуй Забайкальского района Забайкальского края (экспертиза №2102). Данный штамм относится к генетической линии SEA.
3
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма О №2102/Забайкальский/2010, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъювантов в соотношении, мкг/см:
В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без внесения сыворотки с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при pH среды 7,4-7,6.
Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей применяют полигексаметиленгуанидин (ПГМГ). Инактивацию антигена проводят с использованием АЭЭИ, для последующей нейтрализации которого в суспензию добавляют тиосульфат натрия.
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2102/Забайкальский/2010 представляет собой суспензию, состоящую преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
В 2014 году появился вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2212/Приморский/2014, выделен в мае 2014 года от больной свиньи в ООО «Мерси Трейд» с. Прохоры Спасского района Приморского края (экспертиза №2212). Производственный штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа O получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Основной существенный недостаток известных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоит в их недостаточной иммуногенной активности, что объясняется невысокой степенью защиты восприимчивых животных от эпизоотических изолятов вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии, Дальнего Востока.
Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины противоящурной инактивированной эмульсионной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против полевых изолятов вируса ящура типа О, распространенных на территории Центральной и Юго-Восточной Азии, Дальнего Востока.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных эмульсионных против ящура типа О.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа О, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
3
Разработанная вакцина в 1 см препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17, в количестве не менее 3,0 мкг и масляные адъюванты Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 предпочтительно в количестве 600000,0-700000,0 или 500000,0-575000,0 мкг, соответственно.
Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О депонирован 29 мая 2015 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм ВЯ О №2212/Приморский/2014 (производственный).
Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/2-17), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/2-17, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без внесения сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при pH среды 7,4-7,6. Инактивацию вируса проводят с использованием АЭЭИ с концентрацией 0,025-0,050% от объема вируссодержащей суспензии. По окончании процесса АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [8]. Инактивированный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,005-0,007% от общего объема [9].
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2212/Приморский/2014 представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура.
Качественное и количественное содержание вирусного сырья в продукте оценивают в реакции связывания комплемента (РСК) [10].
3
Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см не менее 0,5 мкг 146S иммуногенных компонентов вируса ящура.
Необходимую концентрацию 146S иммуногенных компонентов в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена методом проточной ультрафильтрации.
Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата ящурного антигена и масляного адъюванта в соотношении 4:6 и 1:1 по массе, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют масляный адъювант производства фирмы «Seppic» марок Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206.
Полученная вакцина представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана.
1. Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма О №2212/Приморский/2014 в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура в эффективном количестве.
3
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенные компоненты вируса ящура в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см.
3. В качестве целевой добавки вакцина содержит масляный адъювант.
4. В качестве масляного адъюванта вакцина содержит адъювант Montanide ISA-70.
3
5. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 600000,0-700000,0 мкг в 1 см готового препарата.
3
6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве, мкг/см готового препарата:
7. В качестве масляного адъюванта вакцина содержит адъювант Montanide ISA-206.
3
8. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве 500000,0-575000,0 мкг в 1 см готового препарата.
3
9. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/2-17 и масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве, мкг/см готового препарата:
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии, Дальнего Востока.
Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антигенный материал из штамма О №2212/Приморский/2014, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа О, вызывающего в последние годы вспышки заболевания в странах Центральной и Юго-Восточной Азии, Дальнего Востока.
Сущность изобретения пояснена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура О №2212/Приморский/2014 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.
Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О.
Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного штамма типа О №2212/Приморский/2014 вируса ящура индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:20.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм О №2212/Приморский/2014 принадлежит к топотипу Юго-Восточная Азия (SEA) генетической линии Муа-98 вируса ящура серологического типа О.
1
Антигенное родство штамма О №2212/Приморский/2014 с производственными штаммами вируса ящура O Manisa, О №1734/Приморский/2000, О PanAsia2, О/Тайвань 3/97, О №2102/Забайкальский/2010 и О №2147/Приморский/2012 изучено в РМН.
1
1
1
1
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r) составило для O Manisa - 0,45, О №1734/Приморский/2000 - 0,08, О PanAsia2 - 0,08, О №2102/Забайкальский/2010 - 0,18 и О №2147/Приморский/2012 - 0,38, О/Тайвань 3/97 - 0,09. При значении r>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r<0,3 полевой изолят отличается от производственного [11]. Следовательно штамм вируса ящура О №2212/Приморский/2014 не имеет выраженного антигенного родства с большинством производственных штаммов вируса ящура, используемых в ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм О №2212/Приморский/2014 репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки сирийского хомячка (BHK-21) и почки свиньи (IB-RS-2). В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 5,0 до 7,5 lg ТЦД/см. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 3 пассажей (срок наблюдения).
Гено- и хемотаксономическая характеристики
6
Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10Д.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP, VP, VP и VP. Липопротеидная оболочка отсутствует.
1
66a
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм О №2212/Приморский/2014 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при pH 7,2-7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм О №2212/Приморский/2014 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О, обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.
Для снижения эпизоотической опасности ящура типа О и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.
Получена высокоиммуногенная инактивированная эмульсионная вакцина против ящура типа О из штамма О №2212/Приморский/2014.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение и исследование биологических свойств штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура.
Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О был изолирован из полевого материала, поступившего в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в виде эпителия афт от свиней, подозреваемых в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. С целью проведения изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов.
2
3
50
Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса в культуре первично-трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией в течение 3 последовательных пассажей. Для постановки биопробы в первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД/клетка), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После инкубации при температуре 37°C в течение 0,5 часа во флаконы вносили по 5 см поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37°C до появления ЦПД вируса, характеризующегося округлением клеток, дегенерацией и отделением клеток от стекла, повышение оптической плотности суспензии. После развития ЦПД флаконы подвергали процессу замораживания-оттаивания, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 об/мин (1200 g) в течение 0,25 ч. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК для детекции вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Возбудитель ящура считали адаптированным к: культурам клеток, если в течение 18-24 часов клеточный монослой деструктировал под влиянием вируса на 90-100%.
Вирус, адаптированный к культуре клеток IB-RS-2 использовали для получения антигена для РСК.
Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21/2-17 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.
Результаты исследований представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной активности штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О к использованным клеточным культурам.
Пример 2. Сравнительный анализ биологических свойств штамма О №2212/Приморский/2014 с производственными штамма вируса ящура типа О.
При изучении свойств штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура выявлены значительные преимущества в сравнении с другими используемыми производственными штаммами.
В таблицах 3 и 4 приведены результаты культивирования штаммов О №2212/Приморский/2014 и О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О, из которых следует:
1) штаммы О №2212/Приморский/2014 и О; №2102/Забайкальский/2010 имеют разное время репродукции - 10,30±0,35 и 12,40±0,45 часов, соответственно;
3
2) накопление иммуногенных компонентов при культивировании вируса ящура О №2212/Приморский/2014 выше, чем у штамма О №2102/Забайкальский/2010. Концентрация 146S иммуногенного компонента при культивации вируса ящура О №2212/Приморский/2014 и О №2102/Забайкальский/2010 составила 2,28±0,16 и 1,88±0,10 мкг/см, соответственно.
Пример 3. Получение инактивированного антигена и исследование влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75S) компоненты вируса ящура штаммов О №2212/Приморский/2014 и О №2102/Забайкальский/2010.
50
Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа О готовят из штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура, выращенного в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2-17. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при pH среды 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005-0,200 ТЦД/клетка.
3
Культивирование вируса проводят при температуре 36-37°C. Через 6-7 часов инкубирования определяют концентрацию живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то экспозицию с вирусом продолжают еще 2-3 часа. При достижении количества мертвых клеток до 90-95% репродукцию вируса ящура прекращают, а полученную суспензию контролируют на стерильность и оценку содержания 146S и 75S компонентов. Содержание 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до pH 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,050%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при температуре 36-37°C и pH 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток аминоэтилэтиленимина нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия. С целью флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов в теплую суспензию вносят 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007%. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.
Результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75S) компоненты штаммов О №2212/Приморский/2014 и О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура отражены в таблице 5.
Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что иммуногенные компоненты штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура не уступают в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства штамму О №2102/Забайкальский/2010. Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса штамма О №2212/Приморский/2014 не обнаружено изменений концентрации 146S компонентов.
Пример 4. Концентрирование антигена вируса ящура штамма О №2212/Приморский/2014 и масляного адъюванта для получения вакцины.
3
Полученный антиген контролируют на авирулентность и стерильность, содержание вирусспецифического белка и 146S компонентов вируса ящура. Необходимую концентрацию 146S компонентов в 1 см достигают с помощью ультрафильтрации. Для этих целей антиген концентрируют методом проточной ультрафильтрацией под давлением 1,5 атм. Адъювант Montanide ISA-70 стерилизуют в биореакторе при температуре 120°C и давлении 1,1 атм. в течение 40-60 минут. Для фильтрационной стерилизации адъюванта Montanide ISA-206 используют фильтр с диаметром пор 0,20 μm.
Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль стерильности продукции в соответствии с ГОСТ 28085-89.
Пример 5. Процесс диспергирования антигена и адъюванта для получения инактивированную эмульсионную против ящура из производственного штамма О №2212/Приморский/2014.
Инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа О получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 4:6 и 1:1, соответственно. В качестве масляных адъювантов применяют продукты марок Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
При изготовлении эмульсионной вакцины на основе Montanide ISA-206 адъювант и антиген подогревают до температуры 25-30°C и на коллоидных мельницах проводят диспергирование антигена и адъюванта в соотношении 1:1.
Эмульсионную вакцину на основе Montanide ISA-70 изготавливают при температуре адъюванта и антигена 18-25°C. После этого на коллоидных мельницах осуществляют диспергирование антигена и адъюванта в соотношении 4:6.
В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную против ящура из производственного штамма О №2212/Приморский/2014. Оптимальный компонентный состав полученной вакцины представлен в таблице 6 и 7.
3
3
Вакцина легко рассасывается в месте введения, не вызывает абсцессов, общей реакции в виде повышения температуры. Обладает выраженной иммуногенной активностью для свиней в прививной дозе 2 см через 21 день после введения. В 1 см должно содержаться не менее 3 мкг 146 S компонентов вируса ящура.
Пример 6. Оценка авирулентности и безвредности инактивированную эмульсионную против ящура из производственного штамма О №2212/Приморский/2014.
3
Для определения авирулентности вакцины на свиньях отобранную пробу вакцины вводили внутрикожно по 0,1 см в две точки венчика на каждой конечности. Вакцина была авирулентной - свиньи в течение 10 суток наблюдения остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура.
3
Контроль безвредности вакцины на свиньях проводили путем внутримышечного введения вакцины в область верхней трети шеи в дозе 6 см. Срок наблюдения составлял 10 суток. Следует отметить, что после инокуляции температура тела животного может повышаться до 41°C и удерживаться на протяжении 1-3 суток.
По результатам исследований вакцина была безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.
Пример 7. Оценка гуморального иммунитета у свиней при использовании противоящурных вакцин из штамма О №2102/Забайкальский/2010 и О №2212/Приморский/2014.
Изучен гуморальный иммунитет у свиней, привитых инактивированной эмульсионной вакциной из штамма О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура, против гетерологичного штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура. Уровень гуморального иммунитета оценивали против вакцинного штамма О №2102/Забайкальский/2010 и против производственного штамма О №2212/Приморский/2014.
3
Проведены испытания эмульсионной вакцины Против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примерах 3 и 4, и содержащей, мкг в 2 см:
авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма
О №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О 6,5
масляный адъювант Montanide ISA-206 1200000,0.
3
2
2
2
Испытание провели на 10 головах свиней. Эмульсионную вакцину вводили внутримышечно в дозе 2,0 см. Результаты исследований представлены в таблице 8, из данных которой видно, что эмульсионная вакцина стимулировала у свиней выработку вируснейтрализующих антител (ВНА) против гомологичного штамма О №2102/Забайкальский/2010 в количестве 5,90±0,58 log. Против гетерологичного штамма О №2212/Приморский/2014 титр ВНА был меньше и составлял 3,55±0,52 log. Разница в титрах вируснейтрализующих антител является существенной и достоверной. Из этого следует, что вакцина, изготовленная из производственного штамма О №2102/Забайкальский/2010 не создает гуморальный иммунитет для защиты животных от заражения гетерологичным вирусом ящура О №2212/Приморский/2014. По рекомендациям МЭБ (OIE) титр вируснейтрализующих антител должен составлять не менее 5,00 log [11].
Пример 8. Тестирование инактивированной эмульсионной противоящурной вакцины из штамма О №2212/Приморский/2014 на авирулентность, безвредность и иммуногенную активность.
3
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примерах 3 и 4, и содержащей, мкг в 2 см:
авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О 6,2
масляный адъювант Montanide ISA-206 1120000,0.
3
3
Авирулентность и безвредность полученной вакцины проверяли при тестировании на 5 головах свиней. Препарат вводили внутрикожно по 0,1 см в две точки венчика на каждой конечности, а затем внутримышечно в дозе 6,0 см. Наблюдение за клиническим состоянием животных вели в течение 10 суток. На протяжении всего срока наблюдения развития клинических признаков ящура у животных не было выявлено, что подтверждает авирулентность и безвредность вводимой вакцины.
50
50
3
По окончании контроля на авирулентность и безвредность вакцину проверили на иммуногенную активность вакцины для свиней. Испытание провели на 15 головах подсвинков. Результаты оценки иммуногенности разработанной вакцины представлены в таблице 9. Иммунизирующая доза (ИмД) препарата составляла 0,03 см, т.е. в прививной дозе вакцины содержалось больше 50 PD.
50
По рекомендациям МЭБ (OIE) вакцина против ящура должна содержать не менее 6 PD в прививном объеме для КРС [1]. Следовательно, изготовленная инактивированная эмульсионная вакцина из штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура проявляет высокую иммуногенную активность.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма О №2212/Приморский/2014 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии, Дальнего Востока.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина эмульсионная инактивированная против ящура типа О»:
1. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. -, Paris, 2016-Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
2. Официальный сайт Пербрайт - URL: http://www.wrlfmd.org/fmd_genotyping/fmd_genotyping.htm (дата обращения 02.06.2017 г.).
3. Дудников А.И., Борисов В.В., Дудников С.А. Противоящурный иммунитет и практические достижения в области противоящурной защиты // Пробл. зооiнженерii та вет. Медицини: зб. наук. прац. - Харькiв, 2007. - Вип. 15(40). - Ч. 2, - т. 1. - С. 116-120.
4. Ререр X. Ящур / Перевод с нем. Г.А. Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур / Под ред. А.Н. Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990. - С. 231-250.
6. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 / Т.А. Фомина, В.К. Спирин, А.И. Егорова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 94-104.
7. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1734 «Приморский-2000» / В.К. Спирин, А.И. Егорова, С.Р. Кременчугская [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 52-57.
8. Патент РФ №594771, A61K 39/12, 07.07.1993 г.
9. Патент РФ №2054039, C12N 7/02, A61K 39/135, 10.02.1996 г.
10. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК): утв. зам. директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» - Владимир, 2017.
11. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and beers). - 7th Edition, Paris, 2008. -Vol. 1. - P. 203-207.