УЛУЧШЕННЫЕ ИММУННЫЕ КЛЕТКИ С ДВОЙНОЙ КШРНК И КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ

1. Вектор, содержащий:
последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию по меньшей мере одного гена, ослабляющего функцию иммунных клеток, и
последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR) или моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR).
2. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что экспрессия двух типов кшРНК характеризуется тем, что они, соответственно, регулируются двумя разными промоторами.
3. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.
4. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6, полученные из разных видов.
5. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга в векторе.
6. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, представляет собой рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.
7. Вектор по п. 6, отличающийся тем, что рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.
8. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, выбран из группы, состоящей из FAS, CD45, PP2A, SHIP1, SHIP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cb1-b, CD147, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10R альфа, KLGR1, DNMT3A и A2aR.
9. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что два типа кшРНК нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунных клеток, или при этом два типа кшРНК нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунных клеток.
10. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что два типа кшРНК нацелены на PD-1.
11. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что из двух типов кшРНК i) одна кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3, или ii) одна кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.
12. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что из двух типов кшРНК последовательность оснований, кодирующая одну кшРНК, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219, а последовательность оснований, кодирующая вторую кшРНК, содержит другую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219.
13. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что мишень для CAR или mTCR представляет собой опухолевый антиген человека, экспрессия которого повышена в раковой клетке, раковой ткани и/или микроокружении опухоли, или мутантную форму антигена, обнаруженную в раковой клетке, раковой ткани и/или микроокружении опухоли.
14. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что вектор содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 220 или 221.
15. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса или ретровирусный вектор.
16. Иммунная клетка, содержащая вектор по п. 1, отличающаяся тем, что экспрессия одного или более генов снижена до 40% или менее, по сравнению с их экспрессией в отсутствие кшРНК.
17. Иммунная клетка по п. 16, отличающаяся тем, что иммунная клетка представляет собой человеческую Т-клетку или натуральную клетку-киллер (NK).
18. Фармацевтическая композиция, содержащая иммунную клетку по любому из пп. 1-17.
19. Фармацевтическая композиция по п. 18 для лечения пациента, нуждающегося в иммунной терапии, отличающаяся тем, что иммунную клетку первоначально получают от пациента.
20. Фармацевтическая композиция по п. 19, отличающаяся тем, что у пациента имеется опухоль или злокачественное новообразование, при которых обнаруживается мишень и/или увеличение или изменение уровней мишени CAR или mTCR, экспрессируемых в иммунной клетке.
21. Иммунная клетка, содержащая генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном, и агент генетического разрушения, снижающий или способный снижать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки.
22. Иммунная клетка по п. 21, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).
23. Иммунная клетка по п. 22, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR.
24. Иммунная клетка по п. 23, отличающаяся тем, что CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции.
25. Иммунная клетка по п. 24, отличающаяся тем, что внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.
26. Иммунная клетка по п. 24, отличающаяся тем, что внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ).
27. Иммунная клетка по п. 26, отличающаяся тем, что внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу.
28. Иммунная клетка по п. 27, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, и CD28.
29. Иммунная клетка по п. 28, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB).
30. Иммунная клетка по п. 28, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD28.
31. Иммунная клетка по п. 22, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR.
32. Иммунная клетка по п. 31, отличающаяся тем, что TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).
33. Иммунная клетка по п. 31 или 32, отличающаяся тем, что целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.
34. Иммунная клетка по п. 33, отличающаяся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из:
5T4 (трофобластического гликопротеина), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеина), AlbZIP (андроген-индуцируемого bZIP), HPG1 (специфического к простате человека гена-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α --метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитора активации Т-клеток 1, содержащего вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомного антигена-1), BCL-2 (В-клеточного ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 (WD-повтора домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцина 1), CA 19-9 (ракового антигена 19-9), CA 72-4 (ракового антигена 72-4), CA125 (ракового антигена 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемого антигена на меланоме), CASP-8 (каспазы 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластера дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (ракового эмбрионального антигена SG8), CLCA2 (канал-переносчика-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевого антигена хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназы-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярного антигена 9), Cten (С-концевого тензиноподобного белка), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохрома p450 типа 1 подсемейства b семейства 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированного с меланомой антигена B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептора эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигина), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептора A2), EphA3, ErbB3 (рецептора тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилителя субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (факторп роста фибробластов 5), FN (фибронектинп), Fra-1 (Fos-связанного антигена-1), G250/CAIX (карбоангидразы 9), GAGE-1 (G антигена-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (гена, дифференциально экспрессируемого в простате), GnT-V (глюконаткиназы), gp100 (специфического для линии меланоцитов антигена GP100), GPC3 (глипикана-3), HAGE (спирального антигена), HAST-2 (члена 1 семейства сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептора тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазина), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуина-2), hTERT, iCE (каспазы 1), IGF-1R (рецептора инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединицы рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептора интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкина-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансферазы 1), KK-LC-1 (антигена-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антигена, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антигена меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Mel an-A (антигена меланомы, распознаваемого Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептора меланокортина-1), М-КСФ (макрофагального колониестимулирующего фактора), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксной металлопротеиназы 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидразы 9), MRP-3 (ассоциированного с множественной лекарственной устойчивостью белка-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдогена 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимеразы), NGEP (нового гена, экспрессируемого в простате), NMP22 (белка ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмина), NSE (нейронспецифической энолазы), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбрионального антиген-незрелый рецептора ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансферазы), OS-9 (лектина эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (члена-4 семейства P-антигена ), PAI-1 (ингибитора активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатической кисло фосфатазы), PART-1 (транскрипта-1, регулируемого андрогеном простаты), PATE (белка-1, экспрессируемого простатой и яичками), PDEF (полученного из простаты фактора Ets), Pim-1-киназы (сайта-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы-1), POTE (экспрессируемого в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (антигена, преимущественно экспрессируемого при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфического антигена), PSCA (антигена стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфического рецептора, связанного с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфического мембранного антигена), RAGE-1 (ассоциированного с опухолью антигена почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечного убиквитарного белка-1), RU2, SAGE (антигена саркомы), SART-1 (антигена-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемого Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белка спермы 17), SSX-1 (члена-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктазы STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированного антигена-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированного гликопротеина-72), TARP(белка TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующего фактора роста β), TGFbR1 1 (рецептора-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминазы 4), TRAG-3(гена-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локуса рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторного рецепторного потенциала 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназного активатора плазминогена), VEGF (фактора роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белка опухоли Вильмса 1).
35. Иммунная клетка по п. 34, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой CD19 или CD22.
36. Иммунная клетка по п. 35, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой CD19.
37. Иммунная клетка по любому из пп. 34-36, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой раковый антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.
38. Иммунная клетка по п. 33, отличающаяся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из:
α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A1 1/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, и TPI/m; и
при этом целевой антиген представляет собой раковый антиген, который представляет собой мутированную форму антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.
39. Иммунная клетка по любому из пп. 21-38, отличающаяся тем, что экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, вызывает одно или более из следующего:
i) ингибирование пролиферации иммунной клетки;
ii) индукция клеточной гибели иммунной клетки;
iii) ингибирование способности иммунной клетки распознавать целевой антиген и/или подвергаться активации;
iv) индукция дифференцировки иммунной клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;
v) ослабление реакций иммунной клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу иммунной клетки; или
vi) усиление реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.
40. Иммунная клетка по п. 39, отличающаяся тем, что ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, выбран из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A, и A2aR.
41. Иммунная клетка по п. 39, отличающаяся тем, что ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.
42. Иммунная клетка по п. 41, отличающаяся тем, что ген, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки, кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.
43. Иммунная клетка по п. 42, отличающаяся тем, что рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.
44. Иммунная клетка по любому из пп. 21-43, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию иммунной клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие агента генетического разрушения.
45. Иммунная клетка по п. 44, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.
46. Иммунная клетка по п. 45, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.
47. Иммунная клетка по п. 46, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, и 2B4.
48. Иммунная клетка по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки посредством РНК-интерференции (РНКи).
49. Иммунная клетка по п. 48, отличающаяся тем, что более чем один агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки в иммунной клетке посредством РНКи.
50. Иммунная клетка по п. 49, отличающаяся тем, что агенты генетического разрушения нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, или при этом различные агенты генетического разрушения нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунной клетки, например, при этом первый агент генетического разрушения нацелен на первый ген, а второй агент генетического разрушения нацелен на второй ген.
51. Иммунная клетка по любому из пп. 48-50, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК).
52. Иммунная клетка по п. 51, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется более чем одной кшРНК.
53. Иммунная клетка по п. 52, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется двумя кшРНК.
54. Иммунная клетка по любому из пп. 52, 53, отличающаяся тем, что две кшРНК нацелены на PD-1.
55. Иммунная клетка по любому из пп. 52, 53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3.
56. Иммунная клетка по любому из пп. 52, 53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на CTLA-4.
57. Иммунная клетка по любому из пп. 52, 53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на LAG-3.
58. Иммунная клетка по любому из пп. 52, 53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.
59. Иммунная клетка по любому из пп. 51-58, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК.
60. Иммунная клетка по п. 59, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК.
61. Иммунная клетка по п. 59, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК.
62. Иммунная клетка по любому из пп. 59-61, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая кшРНК, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219 и 238-267.
63. Иммунная клетка по любому из пп. 59-62, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая кшРНК, присутствует в векторе.
64. Иммунная клетка по п. 63, отличающаяся тем, что экспрессия разных кшРНК регулируется разными промоторами.
65. Иммунная клетка по п. 64, отличающаяся тем, что экспрессия двух разных кшРНК регулируется двумя разными промоторами.
66. Иммунная клетка по п. 65, отличающаяся тем, что два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.
67. Иммунная клетка по п. 66, отличающаяся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6.
68. Иммунная клетка по п. 67, отличающаяся тем, что промоторы U6 получают из разных видов.
69. Иммунная клетка по любому из пп. 65-68, отличающаяся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга.
70. Иммунная клетка по любому из пп. 21-69, отличающаяся тем, что каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и агента(ов) генетического разрушения экспрессируется из вектора.
71. Иммунная клетка по п. 70, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор и агент(ы) генетического разрушения экспрессируются из одного и того же вектора.
72. Иммунная клетка по любому из пп. 70, 71, отличающаяся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.
73. Иммунная клетка по п. 72, отличающаяся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса.
74. Иммунная клетка по п. 73, отличающаяся тем, что лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.
75. Иммунная клетка по любому из пп. 21-74, отличающаяся тем, что иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки и натуральной клетки-киллера (NK).
76. Иммунная клетка по п. 75, отличающаяся тем, что иммунная клетка представляет собой Т-клетку.
77. Иммунная клетка по п. 76, отличающаяся тем, что Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку или CD8+ Т-клетку.
78. Иммунная клетка по п. 76 или 77, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR или mTCR в одном и том же векторе.
79. Иммунная клетка по п. 78, отличающаяся тем, что каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга.
80. Иммунная клетка по п. 79, отличающаяся тем, что CAR нацелен на CD19, первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.
81. Способ получения иммунной клетки, включающий введение в иммунную клетку одновременно или последовательно в любом порядке:
(1) гена, кодирующего генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном; и
(2) агента генетического разрушения, причем агент генетического разрушения, или его экспрессия, снижает или способна снижать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки,
тем самым получая иммунную клетку, в которой экспрессируется генетически сконструированный антигенный рецептор, и снижается экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки.
82. Способ по п. 81, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).
83. Способ по п. 82, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR.
84. Способ по п. 83, отличающийся тем, что CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции.
85. Способ по п. 84, отличающийся тем, что внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.
86. Способ по п. 84, отличающийся тем, что внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ).
87. Способ по п. 86, отличающийся тем, что внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу.
88. Способ по п. 87, отличающийся тем, что костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, и CD28.
89. Способ по п. 88, отличающийся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB).
90. Способ по п. 88, отличающийся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD28.
91. Способ по п. 82, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR.
92. Способ по п. 91, отличающийся тем, что TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).
93. Способ по любому из пп. 81-92, отличающийся тем, что целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.
94. Способ по п. 93, отличающийся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из:
5
5T4 (трофобластического гликопротеина), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеина), AlbZIP (андроген-индуцируемого bZIP), HPG1 (специфического к простате человека гена-1), αβ1-интегрина, α5β6-интегрина, α -метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитора активации Т-клеток 1, содержащего вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомного антигена-1), BCL-2 (В-клеточного ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 (WD-повтора домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцина 1), CA 19-9 (ракового антигена 19-9), CA 72-4 (ракового антигена 72-4), CA125 (ракового антигена 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемого антигена на меланоме), CASP-8 (каспазы 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластера дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (ракового эмбрионального антигена SG8), CLCA2 (канал-переносчика-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевого антигена хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназы-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярного антигена 9), Cten (С-концевого тензиноподобного белка), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохрома p450 типа 1 подсемейства b семейства 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированного с меланомой антигена B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептора эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигина), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептора A2), EphA3, ErbB3 (рецептора тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилителя субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (факторп роста фибробластов 5), FN (фибронектинп), Fra-1 (Fos-связанного антигена-1), G250/CAIX (карбоангидразы 9), GAGE-1 (G антигена-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (гена, дифференциально экспрессируемого в простате), GnT-V (глюконаткиназы), gp100 (специфического для линии меланоцитов антигена GP100), GPC3 (глипикана-3), HAGE (спирального антигена), HAST-2 (члена 1 семейства сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептора тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазина), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуина-2), hTERT, iCE (каспазы 1), IGF-1R (рецептора инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединицы рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептора интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкина-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансферазы 1), KK-LC-1 (антигена-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антигена, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антигена меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антигена меланомы, распознаваемого Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептора меланокортина-1), М-КСФ (макрофагального колониестимулирующего фактора), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксной металлопротеиназы 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидразы 9), MRP-3 (ассоциированного с множественной лекарственной устойчивостью белка-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдогена 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимеразы), NGEP (нового гена, экспрессируемого в простате), NMP22 (белка ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмина), NSE (нейронспецифической энолазы), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбрионального антиген-незрелый рецептора ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансферазы), OS-9 (лектина эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (члена-4 семейства P-антигена ), PAI-1 (ингибитора активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатической кисло фосфатазы), PART-1 (транскрипта-1, регулируемого андрогеном простаты), PATE (белка-1, экспрессируемого простатой и яичками), PDEF (полученного из простаты фактора Ets), Pim-1-киназы (сайта-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы-1), POTE (экспрессируемого в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (антигена, преимущественно экспрессируемого при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфического антигена), PSCA (антигена стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфического рецептора, связанного с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфического мембранного антигена), RAGE-1 (ассоциированного с опухолью антигена почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечного убиквитарного белка-1), RU2, SAGE (антигена саркомы), SART-1 (антигена-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемого Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белка спермы 17), SSX-1 (члена-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктазы STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированного антигена-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированного гликопротеина-72), TARP(белка TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующего фактора роста β), TGFbR1 1 (рецептора-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминазы 4), TRAG-3(гена-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локуса рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторного рецепторного потенциала 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназного активатора плазминогена), VEGF (фактора роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белка опухоли Вильмса 1).
95. Способ по п. 94, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой CD19 или CD22.
96. Способ по п. 95, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой CD19.
97. Способ по любому из пп. 94-96, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой раковый антиген, при этом раковый антиген представляет собой антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.
98. Способ по п. 93, отличающийся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из:
α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A1 1/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, и TPI/m; и
при этом целевой антиген представляет собой раковый антиген, причем раковый антиген представляет собой мутированную форму антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.
99. Способ по любому из пп. 81-98, отличающийся тем, что экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, вызывает одно или более из следующего:
i) ингибирование пролиферации иммунной клетки;
ii) индукция клеточной гибели иммунной клетки;
iii) ингибирование способности иммунной клетки распознавать целевой антиген и/или активироваться;
iv) индукция дифференцировки иммунной клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;
v) ослабление реакции иммунной клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу иммунной клетки; или
vi) усиление реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.
100. Способ по п. 99, отличающийся тем, что ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, выбран из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A, и A2aR.
101. Способ по п. 99, отличающийся тем, что ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.
102. Способ по п. 101, отличающийся тем, что ген, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки, кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.
103. Способ по п. 102, отличающийся тем, что рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.
104. Способ по любому из пп. 81-103, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию иммунной клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие агента(ов) генетического разрушения.
105. Способ по п. 104, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.
106. Способ по п. 105, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.
107. Способ по п. 106, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, и 2B4.
108. Способ по любому из пп. 105-107, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки посредством РНК-интерференции (РНКи).
109. Способ по п. 108, отличающийся тем, что более чем один агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки в иммунной клетке посредством РНКи.
110. Способ по п. 109, отличающийся тем, что агенты генетического разрушения нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, или нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунной клетки, причем первый агент генетического разрушения нацелен на первый ген, а второй агент генетического разрушения нацелен на второй ген или в любой их комбинации.
111. Способ по любому из пп. 108-110, отличающийся тем, что РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК).
112. Способ по п. 111, отличающийся тем, что РНКи опосредуется более чем одной кшРНК.
113. Способ по п. 112, отличающийся тем, что РНКи опосредуется двумя кшРНК.
114. Способ по п. 112 или 113, отличающийся тем, что две кшРНК нацелены на PD-1.
115. Способ по п. 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3.
116. Способ по п. 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на CTLA-4.
117. Способ по п. 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на LAG-3.
118. Способ по п. 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.
119. Способ по любому из пп. 111-118, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК.
120. Способ по п. 119, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК.
121. Способ по п. 119, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК.
122. Способ по любому из пп. 119-121, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219 и 238-267.
123. Способ по любому из пп. 119-122, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, присутствует в векторе.
124. Способ по п. 123, отличающийся тем, что экспрессия разных кшРНК, соответственно, регулируется разными промоторами.
125. Способ по п. 124, отличающийся тем, что экспрессия двух разных кшРНК, соответственно, регулируется двумя разными промоторами.
126. Способ по п. 125, отличающийся тем, что два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.
127. Способ по п. 126, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6.
128. Способ по п. 127, отличающийся тем, что промоторы U6 получают из разных видов.
129. Способ по любому из пп. 125-128, отличающийся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга.
130. Способ по любому из пп. 81-129, отличающийся тем, что каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и агента(ов) генетического разрушения экспрессируется из вектора.
131. Способ по п. 130, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор и агент(ы) генетического разрушения экспрессируются из одного и того же вектора.
132. Способ по любому из пп. 130-131, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.
133. Способ по п. 132, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса.
134. Способ по п. 133, отличающийся тем, что лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.
135. Способ по любому из пп. 81-134, отличающийся тем, что иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки и натуральной клетки-киллера (NK).
136. Способ по п. 135, отличающийся тем, что иммунная клетка представляет собой Т-клетку.
137. Способ по п. 136, отличающийся тем, что Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку или CD8+ Т-клетку.
138. Способ по п. 136 или 137, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR в одном и том же векторе.
139. Способ по п. 138, отличающийся тем, что каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга.
140. Способ по п. 139, отличающийся тем, что CAR нацелен на CD19, первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.
141. Композиция, содержащая иммунную клетку по любому из пп. 21-80.
142. Фармацевтическая композиция, содержащая иммунную клетку по любому из пп. 21-80 и фармацевтически приемлемый носитель.
143. Способ лечения, включающий введение нуждающемуся в иммунотерапии субъекту, имеющему заболевание или патологическое состояние, иммунной клетки по любому из пп. 21-80 или композиции по п. 141 или 142.
144. Способ по п. 143, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием.
145. Способ по п. 143 или 144, отличающийся тем, что заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, например, опухоль.
146. Иммунная клетка по любому из пп. 21-80 или композиция по пп. 141-142 для применения при лечении заболевания или патологического состояния.
147. Применение иммунной клетки по любому из пп. 21-80 или композиции по пп. 121-122 в изготовлении лекарственного препарата для лечения заболевания или патологического состояния.
148. Иммунные клетки или композиция по п. 146, или применение по п. 147, отличающиеся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием.
149. Применение, композиция или иммунная клетка по п. 147 или 148, отличающиеся тем, что заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, например, опухоль.