БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ, ПОДАВЛЯЮЩИЙ РАЗВИТИЕ ПЛАНКТОННЫХ И БИОПЛЕНОЧНЫХ ФОРМ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ В ВОДНОЙ СРЕДЕ
BIOLOGICAL PREPARATION FOR INHIBITING DEVELOPMENT OF PLANKTON AND BIOFILM FORMS OF MICROALGAE IN WATER ENVIRONMENT

Изобретение относится к промышленной биотехнологии, в частности производству и применению биологических средств борьбы с микроскопическими водорослями.
Массовое развитие микроскопических водорослей (микроводорослей) является серьезной экономической и социальной проблемой. Микроскопические водоросли могут существовать в двух состояниях - суспендированном (планктонном) и в виде биологической пленки («мата»). Физиологические и биохимические свойства микроводорослей в этих состояниях существенно различаются. Высокая антропогенная нагрузка на водные источники в результате поступления промышленных, хозяйственно-бытовых и сельскохозяйственных сточных вод приводит к загрязнению водоемов за счет роста и развития различных видов микроскопических водорослей (микроводорослей) и, прежде всего, сине-зеленых водорослей (цианобактерий). Увеличение численности микроводорослей в водоемах приводит к неблагоприятным последствиям, таким как образование трехмерных структурированных биологических пленок («матов»), что проявляется в «цветении» воды. «Цветение» водоемов сопровождается последующим отмиранием избыточной биомассы микроводорослей, выделением токсинов, нарушением кислородного режима, органолептическими проявлениями гниения. Процесс разложения и гниения составляющих биопленки («маты») микроводорослей сопровождается выбросом в воду ряда токсических соединений (фенолов, индола, скатола). Высокая численность клеток микроводорослей при их отмирании может приводить к гипоксии и гибели многих аэробных организмов [1-3]. Некоторые виды микроводорослей продуцируют ряд специфических токсинов, в том числе нейро- и гепатотоксины, представляющие серьезную угрозу здоровью людей и животных. Антидотов к токсинам микроводорослей не существует. Микроводоросли вызывают ряд аллергических заболеваний. В связи с глобальным потеплением климата планеты широкое распространение микроводорослей приобретает характер глобальной мировой проблемы [4]. Серьезный экономический ущерб, а также токсическое воздействие микроводорослей на окружающую среду диктует необходимость разработки методов подавления развития микроскопических водорослей и прогнозирования состояния водных экосистем.
В настоящее время известны различные физические, химические и биологические средства подавления развития микроводорослей.
Ультрафиолетовое облучение, ультразвук, электролиз воды направлены на создание условий, либо препятствующих развитию водорослей, либо разрушающих уже образовавшиеся сообщества микроводорослей - «маты». Ультразвуковая обработка «цветущей» воды хотя и является достаточно эффективной, приводит к нежелательным последствиям (снижает рН, количество общего азота и фосфора в воде и повышает температуру воды), а электролиз воды связан с большими финансовыми затратами [5, 6], в широких масштабах их не используют.
Химические гербициды с альгицидными свойствами (диурон, симазин, атразин) способны снижать численность водорослей, однако их отрицательное влияние на водные биоценозы, выражающееся в отсутствии избирательности действия, летальном, мутагенном и тератогенном эффектах, фактически исключает возможность использования этих веществ.
Альтернативой для подавления развития микроводорослей в водной среде является применение биологических средств на основе бактерий и их метаболитов, обладающих альгицидными свойствами. Известны штаммы бактерий, подавляющие развитие микроводорослей [7-13], однако сведений о биологических препаратах на основе таких бактерий в источниках информации не обнаружено.
Задача заявляемого изобретения: разработать биологический препарат, подавляющий развитие в водной среде различных форм микроводорослей.
Задача решена путем разработки биологического препарата «Алгалат», подавляющего развитие планктонных и биопленочных форм микроскопических водорослей в водной среде, полученного путем смешивания активного начала в виде культуральной жидкости штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 с носителем в виде гранул вспученного перлитового песка в соотношении, в мас.%: от 4:1 до 3:2, с последующим высушиванием.
Процедура приготовления «Алгалата».
1. Среда для культивирования штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531
Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 культивировали в среде NBY следующего состава (мас.%): питательный бульон «Difco» - 0,8; дрожжевой экстракт «Difco» - 0,3; вода - остальное, рН доводили до 7,0.
Для приготовления агаризованной питательной среды в жидкую среду NBY вносили агар-агар (2,0 мас.%).
2. Свойства носителя для иммобилизации активного фактора
3
В качестве носителя для иммобилизации активного начала культуральной жидкости бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 выбран вспученный перлитовый песок, который производится из натуральной горной породы, подвергнутой тепловой обработке при температуре 900-1200°С, и представляет собой легкие пористые гранулы жемчужно-белого цвета размером от 0,16 до 1,25 мм с насыпной плотностью от 75 до 100-150 кг/м [14]. Вспученный перлитовый песок - природный материал, обладающий необходимыми потребительскими свойствами для создания биопрепарата: стерилен, химически инертен, легкий, сыпучий, не слеживается, негорючий, биологически стойкий и экологически чистый, не подвержен процессам гниения, воздухо- и водопроницаем, обладает высокими адсорбционными свойствами и может впитывать до 400% воды по массе. Гранулы вспученного перлитового песка обладают хорошей плавучестью, что позволяет препарату долго держаться на поверхности, постепенно погружаясь в воду, сохраняя эффективность в течение длительного срока действия.
3. Состав и преимущества биологического препарата «Алгалат»
8
9
Препарат состоит из культуральной жидкости штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531, включающей комплекс спор, вегетативных клеток (с титром КОЕ/мл от 8×10до 1-2×10) и продуктов метаболизма, и гранул вспученного перлитового песка, на которых этот комплекс иммобилизован.
Преимуществом заявляемого препарата «Алгалат» является то, что он хорошо хранится, удобен для транспортировки, дает стабильный объем, не слеживается, а альгицидные свойства проявляет в воде.
Изобретение подтверждено следующими примерами.
Пример 1
Культивирование альгицидного штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531
3
9
Для культивирования штамма ВКПМ В-10531 использовали стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см, в которые вносили 50-100 мл стерильной среды. Среду NBY готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0; разливали в колбы по 50 мл и стерилизовали при давлении 0,8 атм, температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы охлаждали до +20°С. Стерильность и рН среды контролировали путем отбора соответствующих проб. В качестве посевного материала использовали 5-10 мл культуры ВКПМ В-10531, полученной при культивировании в среде NBY в течение 16 часов при 30°С при встряхивании 250 об./мин. Отсутствие посторонней микрофлоры контролировали микроскопически. Продуктивность штамма определяли методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду. Конечный титр составлял 1×10 КОЕ/мл.
Пример 2
Культивирование микроскопических водорослей
Использовали штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp. 5781 - штамм получен с кафедры микробиологии Ленинградского государственного университета; Nostoc sp. A-10 - получен из коллекции IМЕТ, Йена, ГДР. Штаммы не фиксирующих азот одноклеточных цианобактерий Microcystis aeruginosa 562 и 905 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинция Хубей, г.Ухань).
Штаммы цианобактерий Anabaena и Nostoc выращивали в модифицированной среде BG-11 [15].
Штаммы Microcystis aeruginosa 562 и 905 выращивали в среде В-12 [16].
2
1
Микроводоросли культивировали в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл в 100 мл среды без аэрации при температуре 20°С и круглосуточном освещении в течение двух недель. Использовали люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивали освещенность 40 мкмоль квантов·м·с в области ФАР (Фотосинтетическая Активная Радиация).
Пример 3
Приготовление препарата «Алгалат»
Для приготовления препарата культуральную жидкость штамма ВКПМ В-10531, выращенного, как в примере 1, смешивали с гранулами вспученного перлитового песка в количестве 25 мас.% от общего количества препарата и высушивали при 40°С в течение 16 часов. Полученный порошкообразный препарат хранили при комнатной температуре в таре с плотно закрытой пробкой для предотвращения увлажнения.
Пример 4
Оценка альгицидной активности препарата «Алгалат» в лабораторных условиях
Альгицидную активность препарата, приготовленного, как в примере 3, выявляли при совместном инкубировании с микроводорослями Nostoc, Anabaena или Microcystis, выращенными, как в примере 2, путем совместного инкубирования в течение 96 часов при комнатной температуре. Препарат вносили в инкубационную смесь в соотношении 1:5. Активность препарата оценивали по изменению оптической плотности смеси, которую измеряли при длине волны 590 нм в нулевой момент времени и после совместной инкубации. Альгицидную активность оценивали как остаточную оптическую плотность смеси при длине волны 590 нм по формуле:
Т
Н
(ОП)=(ОП/ОП)×100,
Н
Т
где ОП - начальная ОП, ОП - ОП после инкубации в течение Т часов соответственно.
Поскольку микроводоросли синтезируют ряд пигментов (хлорофилл, фикобилины, каротиноиды), альгицидную активность оценивали также визуально по изменению окраски инкубационных смесей планктонных форм микроводорослей и препарата: «обесцвечивание» смеси отражало лизис микроводорослей. Лизис клеток микроводорослей подтверждали также микроскопированием.
Таблица 1
Альгицидная активность «Алгалата» против различных цианобактерий в лабораторных условиях
Обработка
Остаточная оптическая плотность (ОП)<sup>а</sup>, %
Nostoc
Anabaena
Microcystis
Обработка «Алгалатом»
13,50
15,50
45,50
<sup>а</sup> Остаточную оптическую плотность измеряли в смеси микроводорослей из различных образцов с «Алгалатом» после 96 часов инкубации в процентах от оптической плотности контроля
Пример 5
Оценка альгицидной активности препарата «Алгалат» по отношению к образцам микроводорослей, полученным из природных водоемов
Использовали природные образцы воды, содержащие различные типы микроскопических водорослей из природных водоемов России (Саратовской и Московской областей) и Китая (озеро Дианчши, провинции Юннань). При микроскопическом анализе в образцах в большом количестве выявляли нитчатые (типа Nostoc, Anabaena) и одноклеточные микроводоросли (типа Microcystis). Кроме того, в образцах выявлены другие виды микроводорослей. Таксономическую идентификацию микроводорослей не проводили. Опыты проводили в стандартных пробирках. Изменение цвета инкубационной смеси микроводорослей и «Алгалата» наблюдали через 96 часов. При световой микроскопии выявляли лизис клеток микроводорослей. В контрольных пробирках (без добавления препарата и/или с добавлением гранул не обработанного вспученного перлитового песка) изменения окраски микроводорослей не наблюдали, то есть образцы оставались сине-зеленого цвета, а также при световой микроскопии лизиса клеток не обнаружено. «Алгалат» - гранулы вспученного перлитового песка, содержащие бактериальный препарат, добавляли в обрабатываемые пробирки с образцами воды из природных водоемов в соотношении 1:5. Изменение цвета смеси наблюдали через 96 часов инкубации сначала до светлого желто-зеленого, а затем до полного обесцвечивания. При световой микроскопии выявляли лизис клеток микроводорослей.
Таблица 2
Альгицидная активность «Алгалата» в образцах воды, взятых из природных водоемов
Обработка
Остаточная оптическая плотность (ОП), %
Водохранилище, Саратовская область
Учинское водохранилище, Московская область
Река Скалба, Московская область
Озеро Дианчши, провинция Юннань, Китай (образец 1)<sup>а</sup>
Озеро Дианчши, провинция Юннань, Китай (образец 2)<sup>а</sup>
Обработка «Алгалатом»
20,50
25,50
15,50
17,50
50,00
<sup>а</sup>Образцы 1 и 2, отобранные из различных участков озера Дианчши, провинция Юннань (Китай), отличались по составу и количеству нитчатых и одноклеточных водорослей
Пример 6
Приготовление биопленок - трехмерных структур микроводорослей в лабораторных условиях
Для получения биопленок - трехмерных структур микроводорослей («матов») - в лабораторных условиях цианобактерии Nostoc, Anabaena и Microcystis выращивали в колбах, как в примере 2, но в течение 2-х месяцев. Затем жидкую планктонную культуру микроводорослей переносили в чашки Петри и культивировали в них в течение последующих 4 недель при температуре 20°С при круглосуточном освещении, как в примере 2, до образования биопленок.
Аналогичным способом выращивали биопленки различных природных штаммов микроводорослей, полученных из образцов воды природных водоемов Московской и Саратовской области (Россия) и озера Дианчши провинции Юннань (Китай).
Пример 7
Оценка альгицидной активности препарата «Алгалат» на биопленках в лабораторных условиях
Воздействию препарата «Алгалат» подвергали биопленки цианобактерий Nostoc, Anabaena, Microcystis, выращенные, как в примере 6, как при их индивидуальном, так и при совместном культивировании этих микроводорослей.
Препаратом «Алгалат» обрабатывали опытные чашки с биопленками цианобактерий Nostoc, Anabaena и/или Microcystis, выращенными как при индивидуальном, так и при совместном культивировании, как из культивируемых в лабораторных условиях, так и из природных водоемов. Препарат «Алгалат» вносили в чашки Петри с биопленками в соотношении 1:5 путем равномерного распыления по всей поверхности.
В контрольные чашки с биопленками вносили то же количество гранул не обработанного вспученного перлитового песка.
В опытных чашках через 96 часов наблюдали изменение цвета биопленок микроводорослей, контактирующих с препаратом, сначала до светлого желто-зеленого, а затем до полного обесцвечивания. Микроскопически выявляли лизис клеток микроводорослей.
В контрольных чашках при тех же условиях изменения окраски микроводорослей не наблюдали - биопленки оставались сине-зеленого цвета и микроскопически лизиса клеток не обнаружено.
Это подтверждает выраженное разрушающее воздействие препарата «Алгалат» на биопленки - трехмерные структуры микроводорослей, образованные в процессе развития различными типами микроводорослей, как культивируемых в лабораторных условиях, так и присутствующих в образцах, взятых из природных водоемов.
Литература
1. Tyagi M.M., Thkur J.K., Singh D.P. Kumar A., Prasuna E.G. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 9:9-21.
2. Kaebernic M., Rohlack Т., Christoffersen K., Neilan B.A. Environ. Microbiol. 2001, 3(11):669-679.
3. Rohlack Т., Dittman E., Henning M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65:737-739.
4. Kurmayer R., Dittman E., Fatner J., Chorus I. Microbiol. Ecol. 2002, 43:107-118.
5. Alam M.Z., Otaki M., Furumai H., Ohgaki S. Water Res. 2001, 35:1008-1014.
6. Ahn C.Y., Park M.H., Joung S.H., Kim H.S., Jang K.Y., Oh H.M. Environ. Sci. Technol., 2003, 37(13):3031-3037.
7. Ahn C.Y., Joung S.H., Jeon J.W., Kim H.S., Yoon B.D., Oh H.M. Biotechnol. Lett. 2003, 25(14):1137-42.
8. Imamura N, Motoike I, Shimada N, Nishikori M, Morisaki H, Fukami H. J. Antibiot (Tokyo), 2001, 54(7):582-7.
9. KR 20040094073.
10. KR 20030075874.
11. Hibayashi R., Imamura N. J. Antibiot. (Tokyo), 2003, 56(2):154-159.
12. Mayali X., Azam F. J. Eukaryot Microbiol. 2004, 51 (2):139-144.
13. Lovejoy C., Bowman J.P., Hallegraeff G. M. Applied and Environmental Microbiology. 1998, 64(8):2806-2813.
14. State Russian Standard 10832-91.
15. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriol. Rev. 1971, 35(2):71-205.
16. Nakagawa, M., Y. Takamura, and O. Yagi. Agric. Biol. Chem. 1987, 51:329-337.