НОВЫЕ ФУКОЗИЛТРАСФЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
NEW FUCOSYLTRANSFERASES AND APPLICATIONS THEREOF

Настоящее изобретение относится к новым фукозилтрансферазам и к их применениям.
Многие (глико)протеины, (глико)липиды или олигосахариды требуют присутствия определенных фукозилированных структур, для того, чтобы демонстрировать определенную биологическую активность. Например, многие внутриклеточные механизмы распознавания требуют наличия фукозилированных олигосахаридов: например, для того, чтобы быть связанными молекулами клеточной адгезии, такими, как L-селектин, специфические клеточные структуры должны включать фукозилированные углеводы. Другой пример фукозилированных структур, обладающих биологической функцией, представляет собой структуры, которые образуют АВ0 систему группы крови. Кроме того, терапевтические (глико)протеины представляют собой самый быстро растущий класс фармацевтических реагентов, вследствие чего их фармакокинетические свойства и стабильность приписываются их гликанам.
По причине своей комплексной природы, химический синтез гликоконъюгатов является основной проблемой и ассоциируется с существенными сложностями. В отличие от белков и нуклеиновых кислот, для которых являются доступными коммерческие синтезаторы, гликаны - не говоря уже о гликоконъюгатах - не могут (пока) синтезироваться при использовании общей коммерческой системы. Помимо требования необходимости контроля стереохимии, образование специфических связей остается сложным.
Ввиду комплексности, ассоциированной с химическим или комбинированным ферментативно/химическим синтезом гликоконъюгатов, последние подходы использовали гликозилтрансферазы для ферментативного синтеза (глико)протеинов и (глико)липидов, включающих остатки олигосахаридов.
Фукозилтрансферазы, которые принадлежат к семейству ферментов гликозилтрансфераз, широко экспрессируются у позвоночных, беспозвоночных, растений и бактерий. Они катализируют перенос остатка фукозы от донора, как правило, гуанозин-дифосфат фукозы (GDP-фукозы) на акцептор, который включает олигосахариды, (глико)протеины и (глико)липиды. Такие фукозилированные субстраты являются втянутыми в различные биологические и патологические процессы.
Основываясь на сайте присоединения, Фукозилтрансферазы подразделяются на альфа-1, 2-, альфа-1, 3/4- и O-фукозилтрансферазы. Некоторые альфа-1,2-фукозилтрансферазы были идентифицированы, например, у бактерий Helicobacter pylori и Escherichia coli, у млекопитающих, у Caenorhabditis elegans и Schistosoma mansoni, а также у растениях. Большинство из этих ферментов либо может, либо не может экспрессироваться в активной форме в бактериальных системах, или не может использовать лактозу в качестве акцептора.
У млекопитающих GDP-фукоза синтезируется в цитоплазме посредством синтеза de novo и пути повторной утилизации. При de novo синтезе GDP-манноза преобразуется в GDP-фукозу с помощью двух ферментов, в то время как путь повторной утилизации использует свободную цитозольную фукозу в качестве субстрата. В клетке GDP-фукоза концентрируется в везикулах и узнается фукозилтрансферазами в качестве донорного субстрата. Тем не менее гетерологичная функциональная экспрессия эукариотических гликозилтрансфераз и, в частности фукозилтрансфераз, оказалась сложной для достижения в прокариотических экспрессионных системах. Олигосахариды млекопитающие, в частности, человека, такие как НМО, не являются известными из прокариотических источников, в результате чего открытие гликозилтрансфераз делает эти олигосахариды крайне маловероятными.
Поскольку биологическая активность многих коммерчески важных олигосахаридов, (глико)протеинов и (глико)липидов зависит от присутствия определенных остатков фукозы, в области техники существует потребность в эффективном синтезе или продукции гликоконъюгатов, которые имеют желаемый(е) олигосахаридный(е) остаток(остатки).
Таким образом, объект настоящего изобретения заключается в обеспечении средств и методов, посредством которых фукозилированные субстраты могут быть получены с помощью эффективного пути при снижении временных затрат и материальных затрат, такой путь обеспечивает высокие количества желаемого субстрата.
В соответствии с изобретением эта задача решается, среди прочего, путем обеспечения полинуклеотида, который может быть, например, изолированным, синтетическим, рекомбинантным или синтетическим, кодирующего полипептид с активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы и включающего последовательность или состоящего из последовательности, выбранной из группы, которая состоит из:
a) SEQ ID No.1 в соответствии с прилагаемым списком последовательностей;
b) последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной SEQ ID No.1;
c) последовательностей нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются при жестких условиях с последовательностями нуклеиновой кислоты, которые определяются в а) и b), или с их комплементарными цепями.
Полинуклеотид в соответствии с изобретением (смотри SEQ ID No.1) представляет собой фукозилтрансферазу видов Escherichia coli серогруппы O126.
Новая идентифицированная фукозилтрансфераза обладает удивительными эффектами, поскольку при ее использовании могут осуществляться реакции, которые не существуют в природе в организмах-источниках: В рамках объема настоящего изобретения было обнаружено, что указанная выше идентифицированная альфа-1,2-фукозилтрансфераза является способной использовать лактозу в качестве субстрата и способна продуцировать фукозилированные олигосахариды, в частности, 2'-фукозиллактозу. До настоящего времени ни одна из известных альфа-1,2-фукозилтрансфераз, изолированных из бактерий, не была показана как такая, которая использует лактозу в качестве природного субстрата для продукции фукозиллактозы. Таким образом, пригодность вновь идентифицированной фукозилтрансферазы для использования в производстве фукозилированных олигосахаридов является весьма удивительной, и, следовательно, ее применение представляет собой отличный инструмент для легкой, эффективной и экономичной продукции, например, олигосахаридов человеческого молока (НМО), таких как фукозиллактоза. Сегодня более 80 соединений, принадлежащих к НМО, были структурно охарактеризованы, они представляют собой класс комплексных олигосахаридов, которые функционируют как пребиотики. Кроме того, структурная гомология НМО по отношению к эпителиальным эпитопам учитывается для протективных свойства, направленных против бактериальных патогенов. В желудочно-кишечном тракте младенцев НМО избирательно способствует росту отобранных штаммов бактерий и, таким образом, инициируют развитие уникальной микробиоты кишечника у младенцев, находящихся на грудном вскармливании.
Так как до сих пор структурная сложность этих олигосахаридов препятствовала их синтетическому производству, основным источником для НМО все же оставалось человеческое молоко. Таким образом, существует необходимость в НМО, которые могут быть быстро и легко получены и которые могут быть обеспечены с помощью - удивительно подходящей - фукозилтрансферазы, представленной в данной заявке.
В соответствии с настоящим изобретением термин "полинуклеотид(ы)» обычно относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, которые могут представлять собой немодифицированные РНК или ДНК, или модифицированные РНК или ДНК. "Полинуклеотид(ы)" включает(ют), но без ограничения, одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков или одно-, двух- и трехцепочечных участков, одно- и двухцепочечной РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, что более типично, двухцепочечными или трехцепочечными участками, или смесь одно- и двухцепочечных участков. Кроме того, термин "полинуклеотид", используемый в данной заявке, относится к трехцепочечным участкам, содержащим РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Цепочки в таких участках могут быть из той же молекулы или из разных молекул. Участки могут включать все из одной или более молекул, но обычно включают в себя только участок некоторых молекул. Одна из молекул трехспирального участка часто представляет собой олигонуклеотид. Используемый здесь термин "полинуклеотид(ы)" включает также ДНК или РНК, как описано выше, которые содержат одно или несколько модифицированных оснований. Таким образом, ДНК или РНК со скелетами, модифицированные для обеспечения стабильности или по другим причинам, представляют собой "полинуклеотид(ы)", как этот термин используется в данной заявке. Кроме того, ДНК или РНК, содержащие необычные основания, такие как инозин, или измененные основания, такие как тритилированные основания, которые являются только двумя примерами, представляют собой полинуклеотиды в том смысле, как этот термин используется в данной заявке. Следует иметь в виду, что большое разнообразие модификаций, которые были сделаны для изменения ДНК и РНК, служит многим полезным целям, которые являются известными специалистам в данной области техники. Термин "полинуклеотид(ы)", как он используется в данной заявке, охватывает такие химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток, в том числе, например, простых и сложных клеток. Кроме того, "полинуклеотид(ы)" также охватывает короткие полинуклеотиды, которые часто называют олигонуклеотидом(ами).
Термин "полипептид(ы)" относится к любому пептиду или белку, содержащему две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями. "Полипептид(ы)" относится(ятся) как к коротким цепям, которые обычно упоминаются как пептиды, олигопептиды и олигомеры, и более длинным цепям, которые обычно называют белками. Полипептиды могут содержать аминокислоты, отличные от 20 аминокислот, кодируемых генами. "Полипептид(ы)" включает(ют) также такие, которые модифицированы либо в результате естественных процессов, таких как процессинг и другие посттрансляционные модификации, а также с помощью методов химической модификации. Такие модификации являются хорошо описанными в основных работах и в более подробных монографиях, а также в обширной литературе и исследованиях, и являются хорошо известными специалистам в данной области техники. Следует иметь в виду, что тот же тип модификации может присутствовать в той или иной степени в нескольких местах в данном полипептиде. Кроме того, данный полипептид может содержать множество типов модификаций. Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбокситерминальные концы. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производной липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, сшивание, циклизацию, дисульфидные связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, присоединение липида, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование и АДФ-рибозилирование, селеноилирование, добавление аминокислот к белкам с помощью переноса, опосредованного РНК, такое, как аргинилирование и убиквитинизация. Полипептиды могут быть разветвленными или циклическими, с разветвлениями или без них. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут быть результатом посттрансляционных природных процессов, а также могут быть получены с помощью полностью синтетических методов.
"Изолированный" означает преобразованный человеком из своего природного состояния, то есть, если он существует в природе, то он был изменен или извлечен из своей исходной среды, или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, который естественным образом присутствует в живом организме не является "изолированным", но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от сопутствующих материалов его естественного состояния, является "изолированным" в том смысле, как этот термин используется в данной заявке.
Подобно этому, "синтетическая" последовательность, как этот термин используется в настоящей заявке, означает любую последовательность, которая была создана синтетически, а не непосредственно выделена из природного источника. "Рекомбинантный" означает генетически сконструированную ДНК, полученную путем трансплантации или сплайсинга генов из одного вида в клетки организма-хозяина из отличных видов. Такая ДНК становится частью набора генов хозяина и подвергается репликации.
Подобно этому, "синтетическая" последовательность, как этот термин используется в настоящей заявке, означает любую последовательность, которая была создана синтетически, а не непосредственно выделена из природного источника. "Рекомбинантный" означает генетически сконструированную ДНК, полученную путем трансплантации или сплайсинга генов из одного вида в клетки организма-хозяина из отличных видов.
Термин "полинуклеотид, кодирующий полипептид", как используется в данной заявке, охватывает полинуклеотиды, которые включают последовательность, кодирующую полипептид в соответствии с изобретением, в частности, альфа-1,2-фукозилтрансферазу, имеющую аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO:2. Термин также охватывает полинуклеотиды, которые включают один непрерывный участок или прерывистые участки, которые кодируют полипептид (например, прерванный интегрированным фагом или инсерцией последовательности или "редактированием") вместе с дополнительными участками, которые также могут содержать кодирующие и/или некодирующие последовательности.
"Вариант(ы)" в том значении, как этот термин используется в данной заявке, представляет собой полинуклеотид или полипептид, который отличается от эталонного полинуклеотида или полипептида, соответственно, но сохраняет его существенные свойства. Типичный вариант полинуклеотида отличается по нуклеотидной последовательности от эталонного полинуклеотида. Изменения в нуклеотидной последовательности варианта могут или не могут привести к изменению аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого эталонным полинуклеотидом. Нуклеотидные изменения могут привести к аминокислотным заменам, вставкам, делециям, слияниям и усечениям в полипептиде, кодируемом эталонной последовательностью, как описано ниже. Типичный вариант полипептида отличается по аминокислотной последовательности от другого, эталонного полипептида. Как правило, различия ограничены так, что последовательности эталонного полипептида и варианта являются весьма близкими в целом, и во многих участках являются идентичными. Варианты эталонного полипептида могут отличаться по аминокислотной последовательности одной или более заменами, вставками, делениями в любой комбинации. Замещенный или встроенный аминокислотный остаток может или не может представлять собой такой, который кодируется генетическим кодом. Вариант полинуклеотида или полипептида может быть природным, таким, как аллельный вариант, или это может быть вариант, который является известным как такой, который не встречаются в природе. Не встречающиеся в природе варианты полинуклеотидов и полипептидов могут быть получены с помощью методик мутагенеза, путем прямого синтеза, а также другими рекомбинантными способами, известными специалистам в данной области техники.
Термины "альфа-1,2-фукозилтрансфераза" или "фукозилтрансфераза" или нуклеиновая кислота/полинуклеотид, кодирующий "альфа-1,2-фукозилтрансферазу" или "фукозилтрансфераза" относятся к гликозилтрансферазе, которая катализирует перенос фукозы от донорного субстрата, например, GDP-фукозы, на акцепторную молекулу в альфа-1,2-связи. Молекула акцептора может представлять собой углевод, олигосахарид, белок или гликопротеин, или липид или гликолипидов, а также может быть, например, N-ацетилглюкозамином, N-ацетиллактозамином, галактозой, фукозой, сиаловой кислотой, глюкозой, лактозой или любой их комбинацией. В рамках этих терминов также предполагаются нуклеиновые кислоты/полинуклеотиды и полипептиды, полиморфные варианты, аллели, мутанты и межвидовые гомологи, которые имеют аминокислотную последовательность, которая обладает более чем примерно 60% идентичности аминокислотной последовательности, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, предпочтительно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичности аминокислотной последовательности, предпочтительно в участке, содержащем, по крайней мере, приблизительно 25, 50, 100, 200, 500, 1000 или более аминокислот, с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой в соответствии с SEQ ID NO:1, или последовательностью аминокислот из SEQ ID No.2.
Кроме того, полипептид альфа-1,2-фукозилтрансферазы может быть изменен путем вставки или делеции пептидных последовательностей для того, чтобы модифицировать его активность. Например, полипептидные последовательности могут быть слиты с полипептидом альфа-1,2-фукозилтрансферазы, для того, чтобы осуществлять дополнительную ферментативную активность. Альтернативно, аминокислоты могут быть делегированы для того, чтобы удалить или модифицировать активность белка. Белок может быть модифицирован для того, чтобы устранить ферментативную активность альфа-1,2-фукозилтрансферазы, но при этом сохранить его трехмерную структуру. Такие модификации были бы полезны для разработки антител против полипептида альфа-1,2-фукозилтрансферазы.
Кроме того, генные продукты альфа-1,2-фукозилтрансферазы могут включать белки или полипептиды, которые представляют собой функционально эквивалентные продукты гена. Такой эквивалент генного продукта альфа-1,2-фукозилтрансферазы может содержать делеции, вставки или замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью гена альфа-1,2-фукозилтрансферазы, описанной выше, но который приводит к "молчащим" изменениям, создавая функционально эквивалентный генный продукт альфа-1,2-фукозилтрансферазы. Аминокислотные замены могут быть сделаны на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы вовлеченных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; двухмерные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. В контексте данного изобретения термин "функционально эквивалентный", используемый в данной заявке, относится к полипептиду, способному демонстрировать существенно подобную активность in vivo, что и эндогенный продукт гена альфа-1,2-фукозилтрансферазы, кодируемый последовательностью гена альфа-1,2-фукозилтрансферазы, описанной выше, о чем можно судить по любому из множества критериев, включая, но не ограничиваясь таковыми, как антигенность, то есть, способность связываться с антителом к альфа-1,2-фукозилтрансферазе, иммуногенность, то есть, способность вызывать образование антитела, которое способно связываться с белком или полипептидом альфа-1,2-фукозилтрансферазы, а также по ферментативной активности.
В объем настоящего изобретения входят белки, полипептиды и их производные (включая фрагменты) альфа-1,2-фукозилтрансферазы, которые являются дифференциально модифицированными в процессе трансляции или после трансляции. Кроме того, неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть введены в качестве замены или вставки в полипептидную последовательность альфа-1,2-фукозилтрансферазы.
Полипептид альфа-1,2-фукозилтрансферазы может быть получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. Методы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, могут быть использованы для создания векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие альфа-1,2-фукозилтрансферазу и соответствующие сигналы контроля транскрипционные и трансляции. Эти методы включают, например, in vitro методики рекомбинантной ДНК, синтетические способы и in vivo генетическую рекомбинацию. См., например, способы, описанные у Sambrook и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
"Олигосахарид", как этот термин используется в данной заявке, и как обычно его понимают в уровне техники, относится к сахаридному полимеру, содержащему небольшое количество, обычно от трех до десяти, простых сахаров, то есть моносахаридов.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение обеспечивается вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, как указано выше, кодирующую полипептид, который обладает активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы, где последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной с регуляторными последовательностями, которые узнаются клетками хозяина, трансформированными с помощью вектора. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор представляет собой вектор экспрессии, а в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения вектор может присутствовать в форме плазмиды, космиды, фага, липосомы или вируса.
Кроме того, изобретение относится к хозяйским клеткам, содержащим последовательность, состоящую из полинуклеотида в соответствии с изобретением и как описано выше, где последовательность представляет собой последовательность, чужеродную для хозяйской клетки, и где последовательность является интегрированной в геном хозяйской клетки. Таким образом, "чужеродный для хозяйской клетки" означает, что последовательность не встречается в природе в указанной хозяйской клетке, то есть, последовательность является гетерологичной по отношению к хозяйской клетке. Гетерологичные последовательности могут быть стабильно введены, например, путем трансфекции, трансформации или трансдукции в геном хозяйской клетки, при этом могут использоваться методики, которые будут зависеть от хозяйской клетки, в которую должна быть введена последовательность. Различные методики являются известными специалистам в данной области и раскрыты, например, у Sambrook и соавт., 1989, см. выше. Таким образом, хозяйская клетка, в которую была введена гетерологичная последовательность, будет продуцировать гетерологичный белок, который кодируется полинуклеотидом в соответствии с изобретением.
Для рекомбинантного получения хозяйские клетки могут быть генетически сконструированы для встраивания экспрессионных систем или их частей или полинуклеотидов в соответствии с изобретением. Введение полинуклеотида в хозяйскую клетку может осуществляться с помощью способов, описанных во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Davis и соавт., Basic Methods in Molecular Biology, (1986) и Sambrook с соавт., 1989, см. выше.
Таким образом, полинуклеотид в соответствии с изобретением, может, например, входить в состав вектора, который должен быть стабильно трансформирован/трансфицирован в хозяйские клетки. В векторе полинуклеотид в соответствии с изобретением находится под контролем, например, индуцируемого промотора, таким образом, что экспрессия гена/полинуклеотида может специфически направляться, и, если это является желательным, ген может быть сверхэкспрессирован таким образом.
Для получения полипептидов в соответствии с изобретением может быть использовано большое разнообразие систем экспрессии. Такие векторы включают, среди прочих, хромосомный, эписомальный и вирусные векторы, например, векторы, полученные из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозонов, из дрожжевых эписом, из инсерционных элементов, из дрожжевых хромосомных элементов, из вирусов, и векторы, полученные из их комбинации, такие, как те, что получены из плазмиды и генетических элементов бактериофага, такие как космиды и фагемиды. Конструкция экспрессионной системы может содержать контрольные участки, которые регулируют, а также вызывают экспрессию. В общем случае, любая система или вектор, пригодные для поддержания, амплификации или экспрессии полинуклеотидов и/или для экспрессии полипептида у хозяина могут использоваться для экспрессии в этом отношении. Соответствующие последовательности ДНК могут быть встроены в систему экспрессии с помощью любой из различных хорошо известных и традиционных методик, таких как, например, те, которые изложены у Sambrook и соавт., смотри выше.
В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к выделенному полипептиду, который обладает активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы, состоящему из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей:
a) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No.:2;
b) аминокислотную последовательность аллельного варианта аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No.2, где указанный аллельный вариант кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях с противоположной цепью молекулы нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID No.1;
c) аминокислотную последовательность ортолога аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No.2, где указанный ортолог кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в жестких условиях с противоположной цепью молекулы нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID No.1; и
(d) фрагмент аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID No.2, где указанный фрагмент включает, по крайней мере, 10 последовательных аминокислот, где указанный фрагмент обладает активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы.
Термин "жесткие условия" относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой подпоследовательностью, но не с другими последовательностями. Жесткие условия являются зависимыми от нуклеотидной последовательности и будут различными при различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются, в частности, при повышенных температурах. Как правило, жесткие условия выбираются так, чтобы быть приблизительно на 15°C ниже, чем температура точки плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Tm представляет собой температуру (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных к целевой последовательности гибридизуются с целевой последовательностью при равновесии. Примерами жестких условий гибридизации могут быть следующие: 50% формамида, 5×SSC, и 1% SDS, инкубация при 42°C, или 5×SSC, 1% SDS, инкубация при 65°С, при промывке в 0,2×SSC и 0,1% SDS при 65°С.
Кроме того, изобретение относится к хозяйской клетке, содержащей вектор, как определено выше, или содержащей полинуклеотид в соответствии с изобретением в качестве гетерологичной последовательности, введенной в геном хозяйской клетки, в частности хозяйской клетки, которая является выбранной из группы, состоящей из грибков, включая дрожжи, бактерий, клеток насекомых, растений и животных. Особенно предпочтительно, если хозяйская клетка представляет собой клетку Escherichia coli.
Как используется в данной заявке, термин "хозяйская клетка" в настоящее время определяется как клетка, которая была трансформирована или трансфицирована или является способной к трансформации или трансфекции с помощью экзогенной полинуклеотидной последовательности.
Разнообразные хост-системы для экспрессии вектора могут быть использованы для экспрессии кодирующей последовательности гена альфа-1,2-фукозилтрансферазы в соответствии с изобретением. Такие хост-системы для экспрессии представляют собой векторы, с помощью которых кодирующая последовательность, представляющая интерес, может быть получена и последовательно очищена, а также представляют собой клетки, которые при трансформации или трансфекции с применением приемлемой кодирующей нуклеотидной последовательности демонстрируют продукт гена альфа-1,2-фукозилтрансферазы в соответствии с изобретением.
Ряд подходящих систем экспрессии и хозяева могут, например, быть найдены в WO/0026383 и ЕР 1243647, которые относятся к альфа-1,2-фукозилтрансферазе из Helicobacter pylori, публикация которых полностью относится к данной заявке.
В соответствии с другим аспектом изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который обладает активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы адаптируют к преимущественному использованию кодонов в соответствующей клетки.
Изобретение также относится к полинуклеотиду, вектору или полипептиду в соответствии с изобретением, соответственно, для получения фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида.
Таким образом, в соответствии с одним аспектом применения, продукцию указанного фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида осуществляют с помощью гетерологичной или гомологичной экспрессии полинуклеотида, кодирующего альфа-1,2-фукозилтрансферазу.
В соответствии с другим аспектом применения фукозилированный олигосахарид представляет собой олигосахарид, известный как такой из молока человека, такой, как 2'-фукозиллактоза.
Изобретение также относится к способу получения фукозилированных олигосахаридов, (глико)протеинов и (глико)липидов, включающему этапы:
a. обеспечения полипептида, обладающего активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы в соответствии с изобретением,
b. приведение в контакт полипептида, который обладает активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы этапа а., со смесью, включающей донорный субстрат, включающий остаток фукозы, и акцепторный субстрат, включающий моно- или олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид при условиях, в которых полипептид катализирует перенос остатка фукозы от донорного субстрата на акцепторный субстрат, что приводит, таким образом, к получению фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина или (глико)липида.
В соответствии с изобретением способ получения фукозилированных олигосахаридов может осуществляться в бесклеточной системе или в системе, содержащей клетки. Субстраты оставляют для реакции с полепептидом альфа-1,2-фукозилтрансферазы в течение достаточного периода времени и при условиях, способствующих образованию ферментативного продукта. Является понятным, что эти условия будут варьировать в зависимости от количеств и чистоты субстрата и фермента, либо в бесклеточной системе, либо в системе на основе клеток. Эти переменные могут быть легко подогнаны квалифицированным специалистом в данной области техники.
В бесклеточных системах полипептид в соответствии с изобретением, акцепторный(ые) субстрат(ы), донорный(ые) субстрат(ы) и, в случае необходимости, другие ингредиенты реакционной смеси, включая другие гликозилтрансферазы и добавочные ферменты соединяют путем перемешивания в водной реакционной среде. Эти ферменты могут использоваться в свободном виде в растворе или они могут быть связаны или иммобилизованы на основе, такой, как полимер, а субстраты могут прибавляться к основе. Основа может быть упакованной, например, в колонку.
Системы на основе клеток для синтеза фукозилированных олигосахаридов могут включать рекомбинантно модифицированные хозяйские клетки.
Таким образом, изобретение относится к способу получения фукозилированных олигосахаридов, (глико)протеинов и (глико)липидов, который включает этапы:
a. выращивания при условиях питания, приемлемых для продукции фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида, и приемлемых для экспрессии полипептида, который обладает активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы, хозяйской клетки так, как описано выше;
b. обеспечения, одновременно или последовательно с этапом а., донорного субстрата, содержащего остаток фукозы, и акцепторного субстрата, содержащего олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид, так что альфа-1,2-фукозилтрансфераза, которая экспрессируется в указанной хозяйской клетке, катализирует перенос остатка фукозы от донорного субстрата на акцепторный субстрат, продуцируя, таким образом, фукозилированный олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид; и
c. изоляции указанного фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида из хозяйской клетки или ее ростовой среды.
В способе в соответствии с изобретением донорный субстрат может представлять собой GDP-фукозу. Является особенно предпочтительным, когда донорный субстрат представляет собой GDP-фукозу.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения акцепторный субстрат выбирают из N-ацетилглюкозамина, N-ацетиллактозамина, галактозы, фукозы, сиаловой кислоты, глюкозы, лактозы или любой их комбинации. В частности, лактоза является предпочтительной в качестве акцепторного субстрата.
Термин "субстрат", используемый в данной заявке, означает любой материал или комбинации различных материалов, которые могут подвергаться воздействию полипептида в соответствии с изобретением, что приводит к образованию фукозилированных олигосахаридов.
Субстраты оставляют для реакцию с полипептидом альфа-1,2-фукозилтрансферазы в течение достаточного времени и при приемлемых условиях для того, чтобы позволить осуществить образование ферментативного продукта. Эти условия будут меняться в зависимости от количества и чистоты субстрата и фермента и от того, является ли система бесклеточной или системой на основе клеток. Эти переменные могут легко регулироваться специалистами в данной области техники.
В соответствии с одним аспектом способа в соответствии с изобретением, донорный субстрат обеспечивается на стадии b. с помощью его производства в хозяйской клетке. При этом преобразование фермента, например, фукозы, которая должна прибавляться к хозяйской клетке, в GDP-фукозу, одновременно осуществляется в хозяйской клетке. Этот фермент может представлять собой, например, бифункциональную киназу фукозы/гуанилилтрансферазу фукозы-1-фосфата, например, как Fkp из Bacteroides fragilis, или комбинацию одной отдельной киназы фукозы вместе с одной отдельной гуанилилтрансферазой фукозы-1-фосфата, подобно тем, которые являются известными из нескольких видов, включая Homo sapiens, Sus scrofa и Rattus norvegicus.
Кроме того, на стадии b. донорный субстрат может быть добавлен к среде для культуры клеток/хозяйским клеткам или может продуцироваться клетками путем собственного обмена веществ.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, включающему следующие этапы:
а) выращивания хозяйских клеток, трансформированных или трансфицированных для включение последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из i) SEQ ID NO:1 из включенного в данную заявку списка последовательностей, ii) последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной SEQ ID No.1, и iii) последовательностей нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностями нуклеиновой кислотой, определенными в i) или ii) или их комплементарными цепями, при приемлемых условиях питания таким образом, чтобы последовательность нуклеиновой кислоты, выбранная из i), ii) и iii), подвергалась экспрессии как пептид, который обладает активностью альфа-1,2-фукозилтрансферазы;
b) обеспечения, одновременно или последовательно с этапом а., донорного субстрата, содержащего остаток фукозы, и акцепторного субстрата, содержащего олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид, так что альфа-1,2-фукозилтрансфераза, которая экспрессируется в указанной хозяйской клетке, катализирует перенос остатка фукозы от донорного субстрата на акцепторный субстрат, продуцируя, таким образом, фукозилированный олигосахарид, (глико)протеин или (глико)липид; и
c) изоляции указанного фукозилированного олигосахарида, (глико)протеина и/или (глико)липида из хозяйской клетки или ее ростовой среды.
В способах в соответствии с изобретением, пептид, который экспрессируется в хозяйской клетке, демонстрирует активность альфа-1,2-фукозилтрансферазы и, таким образом, переносит остаток фукозы от донора, например, гуанозин-дифосфат фукозы (GDP-фукозы), на акцептор, который включают олигосахариды, (глико)протеины и (глико)липиды. В этом случае фукозилированный таким образом акцепторный субстрат может быть использован в качестве пищевой добавки для дополнения детского питания, или в качестве терапевтически или фармацевтически активного соединения. С помощью новых методов фукозилированные продукты могут быть легко и эффективно обеспечены без необходимости осуществления сложных, затратных по времени и по стоимости синтетических процессов.
Как используется в данной заявке, термин "изоляция" означает сбор или выделение из системы экспрессии генов продукта, полученного с помощью альфа-1,2-фукозилтрансферазы в соответствии с изобретением.
В соответствии с этим настоящее изобретение также относится к фукозилированному олигосахариду, (глико)протеину и/или (глико)липиду, полученным с помощью способов в соответствии с изобретением, а также к использованию полинуклеотида, вектора или полипептида, как описано выше, для производства фукозилированных олигосахаридов, (глико)протеинов и/или (глико)липидов.
В соответствии с еще одним воплощением получение указанного фукозилированного олигосахарида (глико)протеина и/или (глико)липида осуществляется с помощью гетерологичной или гомологичной (сверх)экспрессии полинуклеотида, кодирующего альфа-1 2-фукозилтрансферазу.
Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данной заявке, как правило, имеют то же значение, как это обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Как правило, номенклатура, которая используется в данной заявке и лабораторных процедурах при использовании клеточных культур, молекулярной генетики, органической химии и химии нуклеиновых кислот и гибридизации, описанных выше и ниже, является хорошо известной и обычно используемой в данной области техники. Стандартные методики используются для нуклеиновой кислоты и пептидного синтеза. Как правило, ферментативные реакции и стадии очистки осуществляют в соответствии со спецификацией производителя.
Настоящее изобретение также охватывает фрагменты полинуклеотидных последовательностей, раскрытых в данной заявке.
Дополнительные преимущества следуют из описания вариантов осуществления и прилагаемых рисунков.
Само собой разумеется, что вышеуказанные признаки и признаки, которые еще должны быть объяснены ниже, могут быть использованы не только в соответственно указанных комбинациях, но и в других комбинациях или сами по себе, без отступления от объема настоящего изобретения.
Некоторые варианты осуществления изобретения иллюстрируются на фигурах и объяснены более подробно в следующем описании. На фигурах:
Фиг.1А показывает соответствующие аминокислотную последовательность и последовательности ДНК гена, кодирующего альфа-1,2-фукозилтрансферазу WbgL из Е. coli O126WBGL;
Фиг.1B показывает карту вектора pET22bHIS6PropwbgL, то есть, оптимизированный по кодонам ген wbgL из Escherichia coli O126, который кодирует новую альфа-1,2-фукозилтрансферазу WbgL, клонированную в pET22b(+) (Novagen, Darmstadt, Germany, с помощью BamHI/XhoI), к которому предварительно прибавляли 18 пар оснований, кодирующих N-терминальный конец His-Tag и 621 пар оснований из пропептида липазы Staphylococcus hyicus при использовании NdeI/BamHI (описание смотри ниже);
Фиг.1C показывает карту вектора pACYC-wbgL, то есть оптимизированный по кодонам ген wbgL из Escherichia coli O126, который кодирует новую альфа-1,2-фукозилтрансферазу WbgL, клонированный в pACYCDuet-1 (Novagen с помощью NcoI/BamHI);
2+-
6
Фиг.2 показывает хроматограмму очистки WbgL с помощью колонки на основе IMAC NiNTA сефарозы (голубое: поглощение при 280 нм, красное: проводимость; фракции, содержащие His-пропептид-WbgL, которые элюировали из колонки, называли IMAC пулом);
6
6
6
Фиг.3 показывает SDS-ПААГЭ анализ экспрессии His-пропептид-WbgL в сырьевом экстракте и нерастворимые фракции Е.coli JM109(DE3) pET22bHIS6PropwbgL, а также промывочные фракции очистки His-пропептид-WbgL и очищенного His-пропептид-WbgL;
6
6
Фиг.4 показывает определение HiS-пропептид-WbgL на иммуноблоте при использовании моноклонального антитела анти-His, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия) после инкубации с DAB субстратом (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия);
6
Фиг.5 показывает беспрерывный фотометрический анализ очищенного His-пропептид-WbgL с помощью 0,4 мМ GDP-β-L-фукозы и 5 мМ лактозы, в котором активность может быть определена с помощью снижения поглощения при 340 нм, вызванного окислением NADH;
Фиг.6 показывает определение продукции 2'-фукозиллактозы с помощью WbgL реакции при использовании HPAEC-PAD в начале реакции, где не присутствовало никакой 2'-фукозиллактозы (А); и 2'-фукозиллактозу получали через 1 час осуществления WbgL реакции при использовании 2 мМ GDP-бета-L-фукозы и 5 мМ лактозы (В);
Фиг.7 показывает анализ реакционной смеси, начиная с 2 мМ GDP-фукозы и 5 мМ лактозы и WbgL при использовании капиллярного электрофореза в начале реакции, где может быть определена только GDP-β-L-фукоза (А); и через 16 часов проведения реакции, где может быть определен только гуанозин в качестве продукта разложения GDP, который высвобождается в результате активности WbgL (В);
Фиг.8 показывает относительную активность WbgL при различных значениях рН (рН 6,8-8,4) в 50 мМ Трис-HCl буфере;
Фиг.9 показывает повышение концентрации 2'-фукозиллактозы, измеренное в реакции WbgL, которая начинается с 2 мМ GDP-бета-L-фукозы и 5 мМ лактозы в различные моменты времени в течение 1 6 часов осуществления реакции;
Фиг.10 показывает ВЭЖХ хроматограмму; отделение с помощью колонки Phenomenex Rezex RCM Са2+ при использовании воды в качестве элюента (0,6 мл/мин, в течение 30 минут при 80°С) и определение с помощью рефрактометрического детектора (Shimadzu, Германия) (А); и ВЭЖХ хроматограмму; разделение с помощью колонки на основе Reprosil Carbohydrate, 5 мкм, 250×4,6 мм, при использовании смеси ацетонитрил/вода (68:32) в качестве элюента (1,4 мл/мин, в течение 20 минут при 35°С; определение с помощью рефрактометрического детектора (Shimadzu, Германия)) (В);
Фиг.11 показывает ЯМР спектр 2'-фукозиллактозы, полученной при использовании WbgL.
Пример
Клонирование гена
Для цитоплазматической экспрессии путативной альфа-1,2-фукозилтрансферазы WbgL модифицировали вектор экспрессии pET22b(+) (Novagen, Darmstadt, Германия). Таким образом, отрезали pelB лидирующую последовательность для периплазматической экспрессии в Е.coli при использовании рестрикционных ферментов NdeI и BamHI. Последовательность гена пропептида (SEQ ID No.3) липазы S.hyicus (Sauerzapfe, В., D. J. Namdjou, и др. (2008): "Characterization of recombinant fusion constructs of human beta-1,4-galactosyltransferase 1 and the lipase pre-propeptide from Staphylococcus hyicus." Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 50(2-4):128-140) подвергали амплификации из плазмиды pLGalTΔ38 при использовании праймеров
5'-CATATGCACCACCACCACCACCACAATGATTCGACAACACAAACAACGAC-3' (SEQ ID No.5) и
6
3'-GGATCCGTATGGTTTTTTGTCGCTCGCTTG-5' (SEQ ID No. 6), и сливали с модифицированным вектором pET22b с получением вектора pET22bHIS6Prop. Полученный вектор подвергали перевариванию с помощью BamHI и XhoI. Синтезировали ген, которые кодирует путативную альфа-1,2-фукозилтрансферазу WbgL из Е.coli O126, с помощью Geneart (Regensburg, Германия), включая рестрикционные сайты BamHI и XhoI. Лигирование в вектор pET22bHIS6Prop обеспечивало получение экспрессионного вектора pETHIS6PropwbgL (смотри Фиг.1А), который продуцировал His-пропептид-WbgL (513 аминокислот) в цитоплазме Е.coli после индукции с помощью изопропил тиогалактозида (IPTG). Альтернативно, ген wbgL клонировали с помощью NcoI/BamHI в вектор pACYCDuet-1 (Novagen, Darmstadt, Германия) после амплификации с использованием праймеров:
5'-GATCACCATGGGCAGCATTATTCGTCTGCAGGGTGGTC-3' (SEQ ID No.7)
6

и 5'-GATCAGGATCCTTAGCAGCTGCTATGTTTATCAACGTTGATCC-3' (SEQ ID No.8), с получением вектора pACYC-wbgL (смотри Фиг.1B). Для амплификации использовали плазмиды Е.coli Nova Blue (Novagen, Darmstadt, Германия) или Е.coli ТОР10 (Invitrogen, Darmstadt, Германия), а для экспрессии His-пропептид-WbgL Е.coli JM109(DE3) (Promega, Madison, USA).
Культивирование и экспрессия фукозилтрансфераз
600
Трансформанты выращивали в колбах Эрленмейера на 100 мл, содержащих 20 мл LB среды с 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали в течение ночи при 37°С и 130 об./мин. Для получения белка клетки выращивали в колбах Эрленмейера на 5 л с 1000 мл ТВ-среды при 37°С и 80 об./мин. Индукцию lacZ промотора осуществляли путем прибавления IPTG к культурам до получения заключительной концентрации 0,1 мМ (OD=0,6-0,8). Инкубацию осуществляли в течение 20 часов при 25°С и собирали клетки путем центрифугирования.
Очистка фермента
2
2+-

40% (вес./вес.) клеточную суспензию Е.coli в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 7,6 разобщали путем обработки ультразвуком (4×15 сек.). После центрифугирования (15000 об./мин., 30 минут) осажденные клетки сохраняли для анализа продукции телец включения при использовании SDS-ПАГЭ. Сырьевой экстракт (15 мл) загружали на колонку IMAC (0,8 см × 10 см, 1,5 мл/мин.) при использовании NiNTA сефарозы (Qiagen, Hilden, Германия), которую предварительно уравновешивали при использовании 100 мл 50 мМ Трис-HCl рН 7,6 (буфер А). После этапа промывания с помощью буфера В, содержащего 0,3 М NaCl и 20 мМ имидазола, белки элюировали при использовании концентрации имидазола 300 мМ в буфере С (50 мМ Трис-HCl рН 7,6, 0,3 М NaCl и 300 мМ имидазола). Все фракции подвергали анализу на концентрацию белка и оценивали на ферментативную активность. Все фракции, содержащие активный растворимый WbgL, после элюирования с помощью буфера С соединяли вместе, и полученный раствор называли IMAC пулом (смотри Фиг.2).
SDS-ПАГЭ и определение с помощью Вестерн-блоттинга
6

Экспрессию His-пропептид-WbgL подвергали мониторингу с помощью SDS-ПАГЭ и Вестерн-блоттинга. Таким образом SDS-ПАГЭ анализ осуществляли при использовании 10% акриламидных гелей, отлитых в соответствии с инструкциями по отливки от Invitrogen (Invitrogen, Paisley, Объединенное Королевство). Образцы белка (40 мкг) загружали на каждую область геля. Предварительно окрашенный белковый лэддер PAGERuler™ (Fermentas, Vilnius, Литва) использовали для определения молекулярной массы. Белковые гели окрашивали при использовании Кумасси голубого (смотри Фиг.3).
6
6
6
6
Иммуноблоттинг осуществляли при использовании специфического анти-His-антитела для того, чтобы определить HisPropWbgL. Таким образом, образцы клеточного дебриса Е.coli JM109(DE3), сырьевого экстракта и IMAC фракции His-пропептид-WbgL разделяли на гелях SDS-ПАГЭ и переносили на PVDF мембраны с помощью NuPAGE Western прописи переноса (BioRad, Munchen, Германия). Мембраны блокировали при использовании 3% БСА в TBS буфере (10 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,2). Моноклональное анти-His-антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия) использовали для специфического связывания. После этапа промывания с помощью TBS буфера, содержащего 0,1% Твин 20 блотты инкубировали с DAB субстратом (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия) и HRP реакцию останавливали путем удаления раствора и добавления дистиллированной воды (смотри Фиг.4).
Анализы активности
6
Ферментативные активности His-пропептид-WbgL в сырьевом экстракте и IMAC фракциях определяли с помощью фотометрического анализа и НРАЕС-PAD анализа 2'-фукозиллактозы.
2
Фотометрический анализ проводили при использовании системы пируват киназа/лактат дегидрогеназа для определения высвободившегося GDP (Barratt, D. H., L. Barber, и др. (2001). "Multiple, distinct isoforms of sucrose synthase in pea." Plant Physiology 127(2):655-664.). Реакционная смесь для анализа на микротитровальных планшетах содержала 50 мМ Трис-HCl pH 7,6, 2 мМ GDP-бета-L-фукозы, 5 мМ лактозы, 1 мМ фосфоенолпирувата, 1 мМ DTT, 0,25 мМ NADH, 2 мМ MnCl, 5 ед. пируват киназы, и 5 ед. лактатдегидрогеназы в общем объеме 250 мкл. Реакцию начинали путем прибавления 100 мкл раствора фермента и продолжали при 340 нм при 30°С. Контрольные эксперименты для определения побочных активностей осуществляли без акцепторного субстрата лактозы (смотри Фиг.5).
2
Ферментативную активность также определяли с помощью HPAEC-PAD анализа для определения 2'-фукозиллактозы. Раствор для анализа содержал 2 мМ GDP-β-L-фукозы, 5 мМ лактозы, 50 мМ Трис-HCl pH 7,6 с 2 мМ MnCl, 1 мМ DTT, 1 ед. щелочной фосфатазы в общем объеме 175 мкл и инкубировали при 30°С после прибавления 175 мкл сырьевого экстракта и очищенного раствора фермента. Реакцию останавливали путем нагревания в течение 5 минут при 95°С в различные моменты времени, где скорость превращения является линейной. Отцентрифугированные образцы подвергали анализу с помощью Dionex HPAEC-PAD (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, США) на колонке CarboPac PA1 при использовании Chromeleon™ 6.40 программного обеспечения. Элюирование осуществляли с помощью 50 мМ NaOH при 30°С (скорость вытекания 1 мл/мин., 50 мкл введенного раствора). Концентрацию образовавшегося трисахарида 2'-фукозиллактозы определяли с помощью стандартной калибровочной кривой с коммерчески доступной 2'-фукозиллактозой и использовали для последующего подсчета ферментативной активности (смотри Фиг.6).
6
Как для HPAEC-PAD анализа, так и фотометрического анализа, 1 ед. His-пропептид-WbgL представляет собой количество фермента, которое обеспечивает продукцию 1 мкмоля продукта (GDP или 2'-фукозиллактозы) в минуту при стандартных условиях анализа.
2
4
7
2
GDP-бета-L-фукозу и ее потребление анализировали с помощью капиллярного электрофореза на аппарате Р/АСЕ MDQ от Beckman Coulter (Krefeld, Германия), оснащенном детектором УФ. Образцы для определения активированного донорного субстрата GDP-бета-L-фукозы останавливали путем нагревания (95°С) в течение 5 минут и центрифугировали в течение 10 минут при 15000 об./мин. (Rotina 35R, Hettich, Tuttlingen, Германия). Определение осуществляли на необработанном капилляре из кварцевого стекла (внутренний диаметр 75 мм, 57 см общая длина капилляра, 50 см до детектора) с помощью 50 мМ NaBO × 10 HO/64 мМ борной кислоты буфера, рН 8,9. Условия для движения и определения 25 кВ (23 мА) при 25,8°С, при этом УФ определяли при 254 нм, соответственно. Образцы вводили при использовании давления (50 секунд при давлении 0,5 фунта на квадратный д. юйм при обратном определении) (смотри Фиг.7). Идентичность CGP-бета-L-фукозы и образовавшегося гуанозина подтверждали с помощью коммерчески доступных субстратов.
рН оптимум и зависимость от ионов металла
6
2+
2+
Для исследования оптимального значения рН для активности рекомбинантного His-пропептид-WbgL, анализы осуществляли при различных значениях рН 50 мМ Трис-HCl буфера, которые колебались в пределах от рН 6,8 до 8,4. Оптимальное значение рН составляло 7,6 (смотри Фиг.8). Добавление ионов металла Mn к стандартному анализу позволяло оценить зависимость от ионов металла. Все образцы подвергали анализу с помощью HAPAEC-PAD так, как описано выше. Было показано, что фермент не зависел от ионов Mn.
Кинетический анализ
6
Кинетические константы His-пропептид-WbgL для акцепторного субстрата лактозы и донорного субстрата GDP-бета-L-фукозы получали из исходного анализа при вариабельных концентрациях субстрата при использовании фотометрического анализа, описанного выше. Содержание GDP-бета-L-фукозы варьировало в пределах от 0,02 мМ до 4 мМ при постоянной концентрации 10 мМ лактозы, и содержание лактозы меняли в пределах от 0,05 до 40 мМ при постоянной концентрации 2 мМ GDP-бета-L-фукозы. Все данные определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментенг при использовании Sigma Plot 10 программного обеспечения (SPSS Science Software GmbH, Erkrath, Германия).
Таблица 1:
Кинетические константы рекомбинантной альфа-1,2-фукозилтрансферазы His6-пропептид-WbgL
Субстрат
Значение Km [мМ]
Vmax [мЕд./мг]
Vmax/Km [мЕд.*мг<sup>-1</sup>*мМ<sup>-1</sup>]
R<sup>2</sup>
Лактоза
5,3
170
32
0,9935
GDP-фукоза
0,27
167
618
0,9907
Изучение спектров акцепторного субстрата
6
Спектр субстратов рекомбинантного His-пропептид-WbgL подвергали анализу с помощью HPAEC-PAD в соответствии с анализом активности, описанным выше. Вместо 5 мМ лактозы подвергали анализу различные акцепторные субстраты для определения относительной активности по сравнению с лактозой.
Таблица 2:
Акцепторный спектр альфа-1,2-фукозилтрансферазы His6-пропептид-WbgL
Субстрат
Относительная активность [%]
Лактоза
100
Лактулоза
124
LacNAc тип I
28
LacNAc тип I
95
D-галактоза
71
3-фукозиллактоза
0
β-бензиллактоза
50
D-GalNAc
0
Субстрат
Относительная активность [%]
D-GalNH<sub>2</sub>
0
LacDiNAc
0
Продукция фукозилированных соединений
Клетки Е.coli BL21(DE3) ΔlacZ pDEST14-fkp pCOLA-lacY-fucP трансформировали с помощью pACYCDuet-1, несущего приемлемый ген фукозилтрансферазы. Колонии выращивали на 2YT планшетах с приемлемыми антибиотиками. Выращивали 5 мл ночных культур каждого штамма (2YT с антибиотиками) и из этих культур по 15 мл неорганической среды инокулировали до получения 1%. Клетки выращивали при использовании глицерина как источника углерода и при OD600=0,5 индуцировали с помощью 0,1 мМ IPTG и прибавляли 40 мМ лактозы и 30 мМ фукозы. Культуры инкубировали при 30°С и 120 об./мин. Продукцию 2'-фукозиллактозы подвергали мониторингу с помощью ВЭЖХ анализа. Сравнение количества 2'-фукозиллактозы (2'-FL), полученной с помощью экспрессии FucT2 из Helicobacter pylori, с экспрессией WbgL из Escherichia coli O126 является представленным в следующей Таблице 3:
Таблица 3:
Сравнение количества выхода 2'-фукозиллактозы при использовании альфа-1,2-фукозилтрансфераз FucT2 из Helicobacter pylori и WbgL из Escherichia coli O126
Фукозилтрансфераза
Выход 2'-FL [мМ]
Без фукозилтрансферазы
0,00
FucN2 (Helicobacter pylori)
2,01
WbgL (Escherichia coli O126)
4,05
Как можно увидеть из Таблицы 3, количество фукозилированного продукта 2'-фукозиллактозы было значительно выше при использовании альфа-1,2-фукозилтрансферазы в соответствии с изобретением, то есть, WbgL из Escherichia coli O126, по сравнению с альфа-1,2-фукозилтрансферазой FucT2 из Helicobacter pylori, которая представляет собой уровень техники.
Очистка продукта фукозилирования
2'-фукозиллактозу, полученную так, как описано выше, очищали в несколько этапов. Первый этап представлял собой очистку с помощью адсорбции на активированном древесном угле. Супернатанты культур, полученные из этапа продукции, наносили на слой активированного угля. Продукт, полученный в результате этого, собирали и подвергали анализу, но никакой оставшейся 2'-фукозиллактозы не определяли. Для удаления неспецифически связанных компонентов среды, таких, как, например, соли и аминокислоты, слой промывали при использовании дистиллированной воды (не определялось никакой 2'-FL в промывочном растворе). 2'-FL и оставшиеся лактозу и фукозу потом элюировали с помощью 96% этанола. Этанол последовательно выпаривали на роторном испарителе и остаток фильтровали при использовании 10 кДа модуля с перекрестным потоком (Microdyn Nadir, Германия). Оставшиеся соли удаляли с помощью электродиализа и после этого эндотоксины удаляли путем фильтрации при использовании модуля с перекрестным потоком (Pall, Германия). 2'-FL потом отделяли от лактозы и фукозы в диапазоне граммов при использовании материала для гель-фильтрационной хроматографии Biogel P-2 (BioRad, Германия), упакованного в стеклянную колонку 520 мм × 428 мм с порошковой керамикой. Очистку 2'-FL подвергали мониторингу с помощью тонкослойной хроматографии. Фракции, которые содержали только 2'-фукозиллактозу, объединяли и высушивали замораживанием.
Подтверждение идентичности продукта
Очищенную 2'-фукозиллактозу, полученную при использовании фукозилтрансферазы, которая представлена в данном изобретении, подвергали анализу с помощью 1Н-ЯМР (смотри Фиг.11). Полученный спектр был последовательным со спектром, который получали для стандарта 2'-FL (Dextra, Reading, Объединенное Королевство). В дополнение к этому, использовали различные методы ВЭЖХ для подтверждения идентичности полученной 2'-FL. HPAEC-PAD применяли так, как описано выше. Другие способы представляли собой разделение при использовании Phenomenex Rezex RCM Са2+ колонки с использованием воды в качестве элюента (0,6 мл/мин, в течение 30 минут при 80°С; определение осуществляли при использовании рефрактометрического детектора (Shimadzu, Германия)) (смотри Фиг.10А) и разделение проводили с помощью Reprosil углевода, 5 мкм, 250×4,6 мм, при использовании смеси ацетонитрил/вода (68:32) в качестве элюента (1,4 мл/мин, в течение 20 минут при 35°С; определение осуществляли при использовании рефрактометрического детектора (Shimadzu, Германия)) (смотри Фиг.10В).