СРЕДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭТИХ КЛЕТОК С ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
MEDIUM FOR CULTIVATION OF MULTIPOTENT STROMAL CELLS FROM HUMAN ADIPOSE TISSUE AND METHOD OF CULTIVATION OF SAID CELLS WITH ITS APPLICATION

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и может быть использовано в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии с целью получения качественного клеточного материала для лечения целого ряда заболеваний человека, таких как сердечно-сосудистые заболевания, повреждения нервной системы, урологические, гинекологические заболевания и бесплодие, заболевания пародонта, дефекты костного аппарата, заболевания суставов, ожоги, а также для коррекции возрастных изменений и кожных дефектов в дерматокосметологии. Предлагается среда для культивирования стромальных клеток из жировой ткани (СКЖТ) и способ культивирования этих клеток с ее применением. Изобретение позволяет получить in vitro культуру аутологичных клеток жировой ткани, отличающуюся повышенной жизнеспособностью и безопасностью при полном сохранении мультипотентных свойств культивированных клеток, т.е. их способности дифференцироваться в различных направлениях: адипогенном, хондрогенном, остеогенном, нейральном и эндотелиальном.
Уровень техники
Стромальные клетки из жировой ткани человека (СКЖТ) обладают свойствами, во многом сходными со свойствами наиболее изученных на данный момент взрослых стволовых клеток - мезенхимных клеток костного мозга (МККМ) (Трактуев и др., 2006; Lee et al., 2004). В настоящее время известно, что СКЖТ могут дифференцироваться в эпителиальные и нейрональные клетки (Zhao et al., 2003), эндотелиальные и гладкомышечные клетки (Yeh et al., 2003; Wijelath et al., 2004), а также способны дифференцироваться в кардиомиоцитарном (Yeh et al. 2003), адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях (Zuk et al., 2002). СКЖТ могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных СКЖТ приводит к получению гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток (Zuk et al., 2002). В большинстве протоколов выделения и культивирования СКЖТ используется среда с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) или фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Эти сыворотки содержат необходимый коктейль факторов роста, гормонов и витаминов, стимулирующих клеточную адгезию и пролиферацию в условиях культивирования in vitro (Mazlyzam et al., 2004; Liu et al., 2004; Llames et al., 2004). В то же время накапливается все больше сведений о том, что клетки, выращенные с использованием сывороток животных, потенциально небезопасны, в частности, существует риск заражения прионами или вирусами культуры клеток при культивировании с использованием сывороток животных (Doerr et al., 2003), а также возможность иммунной реакции со стороны организма реципиента (Spees et al., 2004; Sundin et al., 2007). Кроме того, было показано, что длительное культивирование в присутствии ФБС значительно изменяет свойства клеток различного происхождения. Так, мезенхимные клетки костного мозга, культивированные в присутствии ФБС, характеризуются нестабильностью транскриптома, включая изменение экспрессии генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоз и клеточную адгезию (Shahdadfar et al., 2005).
В связи с этим в последние годы предпринимаются попытки исключить из культуральных сред для выращивания стволовых клеток сыворотки животных и найти им адекватную замену. В частности, хорошие результаты в этом плане дает применение собственной (аутологичной) сыворотки крови пациента. Так, показано, например, что мезенхимные клетки костного мозга при культивировании с использованием аутологичной сыворотки активно пролиферируют в культуре, сохраняя при этом стабильный геном и транскриптом, мультипотентность и способность дифференцироваться в нескольких направлениях (Shahdadfar et al., 2005; Mazlyzam et al., 2000); а фибробласты - способность синтезировать компоненты внеклеточного матрикса (коллаген I и III типа, фибронектин и эластин) до поздних пассажей в культуре (патент РФ №2382077).
Что касается СКЖТ, то, во-первых, число работ, предлагающих использование для их культивирования питательной среды с добавлением аутологичной сыворотки (АС), весьма ограничено, во-вторых, авторы этих работ, как правило, экспериментируют с различными средами, содержащими животную сыворотку, и ограничиваются лишь указанием на возможность (или предпочтительность) замены ФБС аутологичной сывороткой, и в-третьих, в опубликованных работах, связанных с применением АС-содержащих сред для культивирования СКЖТ, информация о качестве получаемой при этом культуры либо отсутствует, либо носит фрагментарный характер, (см., например, опубликованные заявки США 20080159998 и 20100008992).
Наиболее близкими к решениям, предлагаемым в настоящем изобретении, являются культуральная среда и способ культивирования стромальных клеток жировой ткани, описанные в работе О.В.Повещенко с соавт., опубликованной в Бюллетене СО РАМН (№5 (133), 90-95) в 2008 г. Авторами предложено использование для получения культуры СКЖТ известной питательной среды DMEM, содержащей антибиотик и антимикотик, в комбинации с 10-20%-ной (предпочтительно 10%-ной) АС. При этом делается вывод о том, что замена ФБС на АС не оказывает отрицательно воздействия на такие свойства, как уровень пролиферации клеток и сроки образования ими субконфлюентного слоя. С точки зрения качества получаемой культуры внимание акцентируется, главным образом, на повышении безопасности ее применения в клеточной трансплантологии.
К сожалению, названный прототип, как и ряд других аналогов предлагаемого изобретения, оставляет открытым вопрос о таких важнейших функциональных характеристиках культивированных в предлагаемых условиях СКЖТ, как уровень апоптоза, степень сохранности недифференцированного состояния, потенциал в плане способности дифференцироваться в различных направлениях при индукции в соответствующих средах и т.д. Между тем предпринятая нами попытка получения клеток из жировой ткани человека путем культивирования их согласно прототипу, а именно в среде DMEM, содержащей антибиотик и антимикотик, с 10% аутологичной сывороткой показала, что СКЖТ, поддерживаемые в этих условиях, в целом демонстрируют сравнительно невысокий уровень пролиферативной активности, а получаемая культура частично утрачивает свою мультипотентность, в частности, обладает пониженной способностью к дифференцировке в остеогенном направлении. Кроме того, оказалось, что в условиях индукции дифференцировки в остеогенном направлении культура клеток, выращенная с использованием среды DMEM, характеризуется довольно низким уровнем пролиферативной активности и, по существу, представляет собой популяцию переживающих дифференцирующихся клеток с низким уровнем клеточных делений.
В связи с этим представлялось существенным решить задачу улучшения качественных показателей культуры, особенно в части поддержания ее мультипотентности, сохраняя при этом прочие преимущества, которые обеспечивает выращивание культуры без применения животных сывороток.
Раскрытие изобретения
TM
Поставленная задача была решена путем выбора оптимальной комбинации питательной среды с аутологичной сывороткой. По нашим данным, наилучшие результаты в плане решаемой проблемы повышения качественных показателей культуры СКЖТ, выращиваемой в присутствии аутологичной сыворотки, дает использование питательной среды AdvanceSTEM, содержащей антибиотик и антимикотик, с добавлением 10%-ной АС.
TM
TM
Среда AdvanceSTEM рекомендована фирмой-производителем (HyClone) как основная питательная среда для культивирования некоторых видов недифференцированных мезенхимных стволовых клеток, в частности клеток, происходящих из жировой ткани (http://www.thermo.com). Следует, однако, отметить, что эта среда не получила пока широкого практического применения, поэтому ее свойства и особенности изучены недостаточно. В настоящей работе были определены функциональные характеристики СКЖ, культивируемых в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением 10% сыворотки крови донора жировой ткани (аутологичной сыворотки), и основные показатели качества получаемой в результате культуры, а также проведено сравнение некоторых из них с соответствующими характеристиками, определенными для клеток, выращиваемых в среде DMEM с теми же дополнительными компонентами (согласно прототипу). При этом было установлено, что
TM
а) пролиферативная активность СКЖ при культивировании в среде AdvanceSTEM с 10% аутологичной сывороткой (по изобретению) достоверно выше, чем при выращивании их в среде DMEM с 10% АС (по прототипу) (пример 3, фиг.1);
б) повышение уровня пролиферации СКЖ, культивируемых в среде по изобретению, не влечет за собой повышения уровня апоптоза (пример 4, фиг.2);
в) клетки получаемой в предлагаемых условиях культуры полностью сохраняют свои мультипотентные свойства и демонстрируют (в соответствующих дифференцировочных средах) способность к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном, остеогенном и эндотелиальном направлениях (пример 5, фиг.3);
TM
г) культура, получаемая при выращивании клеток в среде AdvanceSTEM с 10% аутологичной сывороткой, характеризуется значительно более высоким потенциалом в плане индукции остеогенной дифференцировки и способности клеток к пролиферации в этих условиях, чем культура, выращенная в среде DMEM+AC согласно прототипу (пример 6, фиг.4 и фиг.5).
TM
TM
TM
Отдельно следует отметить, что наблюдаемый факт существенного (в сравнении с прототипом) повышения способности СКЖ, культивируемых по изобретению, к остеогенной дифференцировке с сохранением высокого пролиферативного потенциала клеток в условиях ее индукции является неожиданным, поскольку питательная среда AdvanceSTEM не демонстрирует никаких преимуществ в плане влияния на эти показатели по сравнению с DMEM (это с очевидностью следует из сравнения свойств культур, выращенных в DMEM+ФБС и AdvanceSTEM+ФБC на фиг.5). С этой точки зрения высокий потенциал СКЖТ в плане индукции остеогенной дифференцировки и пролиферации в этих условиях, проявляющийся при использовании комбинации AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой, представляется неожиданным техническим результатом, достигаемым при реализации данного изобретения.
Краткое описание чертежей
TM
Фиг.1 - Сравнительный анализ пролиферативной активности стромальных клеток жировой ткани, культивированных в среде AdvanceSTEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (Adv+FBS) или 10% аутологичной сыворотки крови пациентов (Adv+auto), или в среде DMEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (DMEM+FBS) или 10% аутологичной сыворотки крови пациентов (DMEM+auto).
TM
Фиг.2 - Цитофлуориметрический анализ. Распределение живых и апоптических клеток в популяции стромальных клеток из жировой ткани человека, культивированных в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (А) или аутологичной сыворотки крови пациентов (В). Распределение СКЖТ по фазам клеточного цикла при культивировании с ФБС (Б) или АС (Г).
TM
Фиг.3 - Индукция дифференцировки стромальных клеток жировой ткани, культивированных в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациентов, в адипоцитарном (А), хондрогенном (Б), остеогенном (В) и эндотелиальном (Г) направлениях.
TM
Фиг.4 - Иммунофлуоресцентное окрашивание на маркер остеогенной дифференцировки (остеокальцин) и маркер пролиферирующих клеток (Ki-67) культур клеток СКЖТ при индукции остеогенной дифференцировки в течение 7 дней, полученных в среде AdvanceSTEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки (Adv + FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (Adv + auto), или в среде DMEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки (DMEM + FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (DMEM + auto).
TM
Фиг.5 - Сравнительный анализ пролиферативной активности стромальных клеток жировой ткани в условиях индукции остеогенной дифференцировки при культивировании в среде AdvanceSTEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (Adv+FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (Adv + auto), или в среде DMEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (HyClone) (DMEM+FBS) или аутологичной сыворотки крови пациентов (DMEM + auto).
Осуществление изобретения.
При осуществлении изобретения помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы хорошо известные специалистам методики по культивированию клеток.
Пример 1. Получение первичной культуры СКЖТ человека.
TM
Выделение клеток проводили согласно ранее опубликованному протоколу (Zuk et al., 2001) с некоторыми модификациями. Для получения первичной культуры клеток СКЖТ человека использовали подкожный жир, полученный в результате удаления интактного жирового отложения при проведении пластических/косметических операций. Выделение клеток осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Ткань измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких (размером не более нескольких кубических миллиметров) кусочков и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл, Worthington Biochemical, США) и диспазы (40 ед/ мл Invitrogen Corporation, Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образец инкубировали при 37°С в течение 30 мин при постоянном покачивании; по окончании инкубации к нему добавляли равный объем среды AdvanceSTEM (HyClone) (# SH30879.01) и центрифугировали при 200g в течение 10 мин.
TM
TM
5
TM
2
2
Белесый поверхностный слой, представленный зрелыми адипоцитами и кусочками ферментативно необработанной ткани, удаляли, а осадок, состоящий из стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ), а также остатков соединительной ткани и клеток крови, суспендировали в лизирующем буфере для эритроцитов. Полученную смесь инкубировали 2-3 минуты в 37°С при перемешивании, после чего к образцу добавляли равный объем среды AdvanceSTEM (HyClone) (# SH30879.01) и фильтровали через нейлоновые мембраны (BD Falcon Cell Stainer # 352340) с размером пор 40 микрон. Для очищения популяции стромальных клеток от клеток крови и клеточного дебриса на конечном этапе суспензию центрифугировали при 200g 5 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде AdvanceSTEM (HyClone) (# SH30879.01)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) (# SV30079.01). Затем высаживали клетки на чашки Петри (Corning) диаметром 60 мм в количестве 1×10 клеток СКЖТ на каждую чашку и культивировали в 4 мл среды AdvanceSTEM (HyClone) (# SH30879.01) / Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) (# SV30079.01) с добавлением либо ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (HyClone), либо аутологичной сыворотки крови пациента (донора жировой ткани) (см. пример 2). На следующий день среду культивирования меняли на свежую среду этого же состава и выращивали клетки в CO - инкубаторе (5% СО; 95% воздуха) при 37°С. Смену среды проводили каждые 2-3 дня; при достижении монослоя клетки пассировали с использованием HyQTase (HyClone) (# SV30030.01).
Пример 2. Выделение аутологичной сыворотки крови пациента.
Забор крови осуществляется на базе медицинских учреждений, имеющих соответствующие медицинские лицензии. Забор крови в количестве 80 мл осуществляли в пробирки с гелем для получения сыворотки крови (Vacuette # 455071 BD, США). При формировании кровяного сгустка пробирки с кровью центрифугировали при 400 rcf в течение 10 минут. Дальнейшее получение сыворотки осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Сыворотку (желтый супернатант) отбирали в пробирку и последовательно фильтровали через фильтры 0,45 микрон (Millipore) 0,22 микрона (Millipore). Далее сыворотку использовали для культивирования СКЖТ или замораживали и хранили при температуре -20°С.
TM
Пример 3. Сравнительная оценка пролиферации клеток СКЖТ при культивировании в средах AdvanceSTEM и DMEM.
6
TM
TM
Культуру клеток СКЖТ в количестве 1×10 высевали на чашки Петри диаметром 60 мм и культивировали в среде AdvanceSTEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) или DMEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone)c добавлением 10% ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (HyClone) или 10% аутологичной сыворотки крови пациента. Каждые 24 часа клетки снимали с чашки с помощью 0,25% раствора трипсина (ПанЭко) и производили подсчет абсолютного числа клеток с помощью прибора для подсчета количества клеток Countess Automated Counter (Invitrogen). Общая длительность эксперимента составляла 120 часов. Статистическую обработку проводили с использованием программы Microsoft Office Excel 2003.
TM
При подсчете клеток, культивируемых в различных средах, было установлено, что максимальный уровень пролиферации демонстрируют клетки, выращиваемые в среде AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой (Adv + auto на фиг.1). При этом показатель пролиферативной активности клеток, культивируемых по изобретению, достоверно отличается от соответствующего показателя клеток, выращиваемых как в той же питательной среде с ФБС (Adv + FBS на фиг.1), так и в среде DMEM с АС (прототип, DMEM + auto на фиг.1).
Поскольку известно, что избыточное стимулирование пролиферации может приводить к повышению уровня апоптоза клеток в культуре, представлялось необходимым получить ответ на вопрос, является ли сочетание среды AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой оптимальным для получения культуры СКЖТ с этой точки зрения. Для этой цели была проведена оценка уровня апоптоза и распределения клеток СКЖТ по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии.
Пример 4. Оценка уровня апоптоза и распределения клеток СКЖТ по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии.
TM
Для сравнительного анализа пролиферативной активности и уровня апоптоза в культуре клеток СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (фетальной бычьей сыворотки) (HyClone) или аутологичной сыворотки крови пациента, было проведено исследование с использованием проточной цитометрии. Клетки СКЖТ снимали с чашек с помощью реагента HyQTase (HyClone), который затем удаляли центрифугированием. Затем суспензию клеток фиксировали ледяным 70% этанолом в течение 2 часов при -20°С и окрашивали в течение 30 минут при комнатной температуре раствором йодистого пропидия (PI на ФСБ, 50 мкг/мл, Invitrogen), содержащего 200 мкг/мл РНКазы-А (Invitrogen) и 0,1% Тритона Х-100. Содержание ДНК в клетках определяли методом проточной цитометрии с помощью клеточного сортера MoFlo (DakoCytomation, Форт Коллинз, США) по флуоресценции йодистого пропидия в диапазоне длин волн 600-625 нм (при возбуждении длиной волны 488 нм) согласно ранее описанному методу (Traganos, 2004). Эксперимент повторяли 2 раза. На фиг.2 представлены результаты одного из экспериментов в виде гистограмм распределения клеток в соответствии с интенсивностью флуоресценции PI, которая пропорциональна количеству ДНК в клетке.
Апоптотические клетки идентифицировали при помощи Аннексина V, конъюгированного с фикоэритрином (AnV-PE, BD Biosciences, США). AnV селективно связывается с фосфатидилсерином, который в процессе апоптоза перераспределяется с внутренней стороны плазматической мембраны на внешнюю и оказывается доступным для AnV. Для идентификации таких клеток использовали 7-аминоактиномицин D (7-AAD, Beckman Coulter, Франция), окрашивающий ядра мертвых клеток. Для окраски клеток с помощью AnV-PE и 7-AAD клетки снимали с субстрата HyQTase (HyClone) и ресуспендировали в 200 мкл буфера для связывания AnV (BD Biosciences), после чего добавляли 5 мкл AnV-PE и 10 мкл 7-AAD. Клетки инкубировали 15 мин в темноте, после чего центрифугировали при 200g 5 мин, ресуспендировали в 200 мкл фосфатно-солевого буфера и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра-клеточного сортера MoFlo (DakoCytomation, Форт Коллинз, США). Флуоресценцию AnV-PE и 7-AAD возбуждали на длине волны 488 нм и анализировали в диапазоне длин волн 565-595 нм и 650-690 нм соответственно.
2
0
1
2
TM
TM
TM
TM
TM
TM
С помощью метода окрашивания ДНК в клетках СКЖТ флуоресцентным красителем йодистым пропидием и последующего однопараметрического анализа гистограммы распределения ДНК с использованием проточной цитометрии было показано, что средний процент клеток СКЖТ, находящихся в фазах G/M клеточного цикла, для среды AdvanceSTEM (HyClone) с добавлением ФБС (фиг.2 Б) составляет 20,60±1,38 (М±m), тогда как для среды AdvanceSTEM (HyClone) с добавлением АС (фиг.2 Г) аналогичный показатель равен 15,89±1,11 (М±m). При анализе данных проточной цитометрии с помощью программы Summit 4.3 (Dako Colorado, США) было установлено, что различия между показателями статистически недостоверны (р>0,05) по U-критерию Манна - Уитни. Не было выявлено достоверных различий ни по количеству клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла (для клеток СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с добавлением ФБС, этот показатель составлял 17,96±1,25 (М±m), а для клеток, культивированных в среде AdvanceSTEM с добавлением АС - 20,77±3,53 (М±m)), ни по количеству клеток, находящихся в G/G фазах. Вместе с тем были определены достоверные отличия в уровне апоптических клеток: в случае СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM с добавлением ФБС (фиг.2А), этот показатель составлял 2,23±0,3 (М±m), в то время как для клеток, культивированных в среде AdvanceSTEM с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента (фиг.2В), аналогичный показатель составлял 1,28±0,5 (М±m). Сходные результаты были получены при сравнении уровня пролиферации и апоптоза методом проточной цитометрии клеток, культивированных в среде DMEM с добавлением аутологичной сыворотки или ФБС: наблюдалось некоторое снижение уровня апоптоза при культивировании с использованием АС по сравнению с ФБС и незначительное увеличение количества клеток, находящихся в фазах G/M клеточного цикла (данные не представлены).
TM
TM
Таким образом, в ходе исследования было выявлено достоверное снижение числа клеток, находящихся в апоптозе, в случае использования среды AdvanceSTEM с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента по сравнению с культивированием в присутствии ФБС. Показатели распределения клеток по фазам клеточного цикла в исследованных культурах достоверно не различались. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что сочетание компонентов среды AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой крови пациента эффективно стимулирует пролиферацию СКЖТ в культуре без повышения уровня апоптоза.
TM
Пример 5. Подтверждение мультипотентности клеток СКЖТ, культивированных с использованием среды AdvanceSTEM и аутологичной сыворотки крови пациента.
TM
Известно, что популяция стромальных клеток, выделяемых из подкожной жировой клетчатки и культивируемых с использованием фетальной бычьей сыворотки, содержит мезенхимные стволовые клетки, обладающие мультипотентными свойствами, то есть способностью дифференцироваться в нескольких направлениях (Zuk et al., 2002). Для проверки мультипотентности, получаемой при культивировании с использованием AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой, СКЖТ 2-4 пассажей помещали в среду для индукции адипоцитарной, хондрогенной, эндотелиальной или остеогенной дифференцировки.
Адипоцитарная дифференцировка

TM
TM
TM
Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQTase (HyClone) и высевали на 12 луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60 - 100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли и клетки последовательно инкубировали в средах для индукции адипогенной дифференцировки Adipogenesis Induction Medium (#SCR020FR, Chemicon) и Adipogenesis Maintenance Medium (#SCR020FR, Chemicon) согласно протоколу производителя. Клетки культивировали 21 день, меняя среду в соответствии с протоколом производителя. По окончании эксперимента монослой клеток фиксировали 4% параформальдегидом в PBS 30-40 мин при комнатной температуре, отмывали PBS и водой. Монослой клеток окрашивали Oil Red О Solution (#SCR020FR, Chemicon) no стандартной методике (50 мин при комнатной температуре) для выявления в адипоцитах липидных капель. Затем клетки отмывали и докрашивали ядра гематоксилином. В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении адипоцитарной дифференцировки аналогичным образом; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, культивированные в AdvanceSTEM с ФБС без дальнейшей индукции дифференцировки. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.
Через 21 день культивирования СКЖТ в средах для индукции адипогенной дифференцировки клетки содержали большое количество липидных капель разного размера красного цвета, выявляемых при окраске Oil Red О Solution (#SCR020FR, Chemicon) (фиг.3А). При анализе СКЖТ, культивированных без индукции адипогенной дифференцировки, иногда встречались отдельные клетки, содержащие мелкие капли, окрашенные Oil Red, что свидетельствует о возможности спонтанной дифференцировки в адипогенном направлении в культуре. В случае положительного контроля (СКЖТ, культивированные с добавлением ФБС) интенсивность окрашивания культуры с использованием Oil Red не отличалась от клеток, культивированных с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в среде по изобретению они в полной мере сохраняют способность к адипоцитарной дифференцировке при индукции в соответствующих условиях.
Хондрогенная дифференцировка

TM

TM
TM
Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQTase (HyClone) и высевали на 12 луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60-100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли, клетки снимали с чашек Петри раствором HyQTase (HyClone) и центрифугировали в 1,5 мл пробирках по 2 млн клеток в пробирке при 200 g в течение 10 минут. Супернатант удаляли и добавляли к осадку клеток 1,5 мл среды для хондрогенной дифференцировки AdvanceSTEM Chondrogenic differentiation Medium (#SH30889.02, HyClone). Клетки инкубировали 28 дней, меняя среду каждые 3 дня в соответствии с протоколом производителя. В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении хондрогенной дифференцировки таким же образом; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, выращенные в среде с добавлением ФБС, без дальнейшей индукции дифференцировки. По окончании эксперимента клетки, культивированные в среде для индукции хондрогенной дифференцировки, формировали плотные образования на дне пробирки. Полученные клеточные агрегаты замораживали в среде Tissue-Tek О.С.Т. Compound и резали на криостате Microm HM 525 (Leica, Германия). Толщина срезов составляла 6-8 микрон. Срезы фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали гематоксилином Карачи (Bio-Optica, Italy) или толуидиновым синим (Bio-Optica, Italy) для выявления структур, характерных для хрящевой ткани. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.
Через 28 дней культивирования в среде для индукции хондрогенной дифференцировки клеток, при окрашивании гематоксилином Карачи или толуидиновым синим, наблюдалось формирование плотных структур на дне пробирки, характерных для новообразующегося хряща с хондроцитами (фиг.3Б). В случае положительного контроля (СКЖТ, культивированных с добавлением ФБС) наблюдалось формирование аналогичных структур. В случае отрицательного контроля СКЖТ не формировали плотных образований и оставались в виде отдельных клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании с использованием аутологичной сыворотки крови пациента СКЖТ в полной мере сохраняют способность дифференцироваться в хондрогенном направлении в условиях соответствующей индукции.
Эндотелиальная дифференцировка.

TM

TM
2
4
2
2
4
Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQTase (HyClone) и высевали на 12-луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60-100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли и добавляли среду для индукции эндотелиальной дифференцировки следующего состава: ЕВМ-2 с набором факторов роста (Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics, Lonza #CC3202). Клетки культивировали 14 дней в среде для индукции эндотелиальной дифференцировки, при этом среду культивирования меняли на свежую ежедневно в соответствии с протоколом производителя. По окончании эксперимента клетки фиксировали. Клетки, вступившие в эндотелиальную дифференцировку, выявляли иммуноцитохимически с помощью антител против CD31 человека - маркера зрелых эндотелиальных клеток. Для этого клетки промывали теплым фосфатно-солевым буфером (ФСБ: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ NaHPO*2HO, 1,4 мМ KHPO), фиксировали в 4% формалином на ФСБ в течение 15 мин и отмывали в ФСБ 3 раза по 10 мин. Для предотвращения неспецифического связывания стекла с клетками инкубировали в 10% растворе нормальной сыворотки донора вторых антител на 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в ФСБ в течение 40 мин. После этого наносили первые антитела против CD31 (PECAM-1) (mouse antirat, Pharmingen 22711D) в концентрации, рекомендованной производителем, разведенные на 1% БСА, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки отмывали от первых антител в ФСБ 3 раза по 10 мин и наносили вторые антитела, меченные флуорохромом Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A-21203), и инкубировали в течение 40-50 мин, отмывали в ФСБ 3 раза по 10 минут и докрашивали ядра DAPI (Molecular Probes, США) в концентрации 1 мкл/1 мл ФСБ в течение 20 минут. Затем клетки промывали 3 раза по 10 минут в ФСБ и заключали в водорастворимой специализированной среде для заключения иммунофлуоресцентных препаратов (Polysciences, Inc США). Препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica AF600 LX (Германия). В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении эндотелиальной дифференцировки тем же способом, что и опытные; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, культивированные в среде с использованием ФБС, без дальнейшей индукции дифференцировки. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.
TM
Через две недели индукции в опыте были обнаружены тубулярные структуры и островки клеток, несущие CD31-маркер зрелых эндотелиоцитов (фиг.3Г). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в AdvanceSTEM с АС они полностью сохраняют свой потенциал к дифференцировке в эндотелиальном направлении.
Остеогенная дифференцировка

TM
TM
TM
TM
Клетки снимали с чашек Петри раствором HyQTase (HyClone) и высевали на 12-луночные планшеты, предназначенные для культивирования клеток (без покрытия) в концентрации 60-100 тыс/мл. Клетки инкубировали в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента до получения монослоя. Затем среду культивирования удаляли и добавляли среду для индукции остеогенной дифференцировки. В качестве остеогенной среды использовали среду культивирования AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением компонентов коммерческого кита AdvanceSTEM Osteogenic Differentiation Kit (#SH30877.KT, HyClone), согласно инструкции производителя. Клетки культивировали 14-17 дней, меняя среду каждые 2-3 дня. По окончании индукции остеогенной дифференцировки монослой клеток фиксировали 70% этанолом в течение 1 часа при комнатной температуре, отмывали и окрашивали Ализариновым красным (Alizarin Red Solution, Chemicon) no стандартной методике (30 мин при комнатной температуре) для выявления отложений кальция в остеоцитах, согласно инструкции производителя. В качестве положительного контроля использовали клетки СКЖТ, культивированные в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) с добавлением ФБС (HyClone), которые индуцировали в направлении остеогенной дифференцировки тем же способом, что и опытные; в качестве отрицательного контроля использовали СКЖТ, выращенные в среде AdvanceSTEM с добавлением ФБС, без дальнейшей индукции дифференцировки. Эксперимент был повторен 3 раза с использованием СКЖТ, полученных от разных доноров.
TM
Через 14-17 дней культивирования в среде для индукции остеогенной дифференцировки опытные СКЖТ формировали плотный монослой клеток, большая часть которых при окраске Ализариновым красным содержала отложения кальция в виде крупных агрегатов оранжево-красного цвета, расположеных между слоем клеток и чашкой Петри (фиг.3В). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при культивировании СКЖТ в AdvanceSTEM с АС они в полной мере сохраняют способность дифференцироваться в остеогенном направлении при индукции в соответствующей среде.
TM
Таким образом, при культивировании СКЖТ в среде AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) в сочетании с аутологичной сывороткой крови пациента клетки демонстрируют характерные для мезенхимных стволовых клеток мультипотентные свойства, выражающиеся в их способности при индукции в соответствующих средах дифференцироваться по меньшей мере в четырех исследованных направлениях: адипогенном, хондрогенном, эндотелиальном и остеогенном.
Пример 6. Оценка способности СКЖТ, культивированных с использованием сред разного состава, к остеогенной дифференцировке.
При проведении предварительной серии экспериментов по изучению способности к различным видам дифференцировки клеток, культивированных согласно методике, предлагаемой в прототипе, нами был отмечен недостаточно высокий потенциал этих клеток в плане индукции к остеогенной дифференцировке. В связи с этим было проведено более детальное исследование зависимости способности СКЖТ к остеогенной дифференцировке от используемой при их культивировании среды.
TM
Клетки культивировали до 2-го пассажа в средах AdvanceSTEM (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) и DMEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100х (HyClone) с добавлением в каждом случае 10% аутологичной сыворотки или 10% ФСБ. Затем клетки высаживали на 8-луночные стеклянные плашки (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) и на следующий день меняли среду культивирования на среду для индукции остеогенной дифференцировки. После 7 дней индукции оценивали уровень дифференцировки клеток, а также их пролиферативную активность методом двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. Для иммунофлуоресцентного анализа клетки фиксировали в 4% растворе формалина (Sigma, США) на PBS (фосфатно-солевой буфер) в течение 2 мин при комнатной температуре с последующей 3-кратной отмывкой в PBS. После отмывки клетки покрывали 1% раствором БСА (бычий сывороточный альбумин) с 10% козьей сывороткой в течение 30 мин и инкубировали при комнатной температуре с кроличьими антителами против остеокальцина (Santa Cruz, #sc-30044) - маркера остеогенной дифференцировки и мышиными антителами против Ki-67 (BD, # 550609) - маркера пролиферирующих клеток в течение 1 часа. В качестве отрицательного контроля использовался 1% раствор БСА с 10% козлиной сывороткой. После отмывки в PBS клетки в течение 30 мин при комнатной температуре инкубировали в растворе PBS с флуоресцентно меченными вторичными козьими антителами (1:100) против иммуноглобулинов мыши (Alexa 488, Molecular Probes, США) или против иммуноглобулина кролика (Alexa 568, Molecular Probes, США).
TM
TM
TM
TM
Полученные результаты представлены на фиг.4 и фиг.5. Остеогенную дифференцировку через 7 дней наблюдали только в культуре СКЖТ, культивированных в AdvanceSTEM с добавлением аутологичной сыворотки (фиг.4). Во всех остальных случаях (AdvanceSTEM с 10% ФБС, DMEM с 10% аутологичной сывороткой и DMEM с 10% ФБС) отчетливые признаки остеогенной дифференцировки появлялись только на 21 день. Кроме того, только в условиях культивирования AdvanceSTEM с 10% аутологичной сывороткой в культуре сохранялся высокий уровень пролиферации при индукции остеогенной дифференцировки. При всех вариантах культивирования, кроме AdvanceSTEM с 10% АС на 7 день индукции остеогенной дифференцировки обнаруживались лишь отдельные Ki-67 - позитивные клетки (фиг.4), являющиеся свидетельством того, что популяция представляет собой культуру переживающих дифференцирующихся клеток с низким уровнем клеточных делений.
TM
TM
В количественном отношении пролиферацию клеток в дифференцирующейся культуре оценивали способом, описанным в примере 3. Из данных, приведенных на фиг.5, с очевидностью следует, что доля пролиферирующих СКЖТ (%Ki-67 позитивных клеток) в культуре, индуцированной к остеогенной дифференцировке, для клеток, культивированных в AdvanceSTEM с аутологичной сывороткой (Adv + auto на фиг.5) в несколько раз выше, чем для клеток, выращенных в любой другой среде (в сравнении с той же средой, с добавлением 10% ФБС - примерно в 5 раз; в сравнении с DMEM в сочетании с АС (прототип) - примерно в 4 и в сравнении с DMEM в комбинации с ФБС - примерно в 8 раз). При этом особое внимание обращает на себя факт 4-кратного увеличения данного показателя в сравнении с прототипом (рост доли Ki-67 позитивных клеток от 10 до 40%), который является неожиданным, поскольку сама по себе замена питательной среды (DMEM - в прототипе на AdvanceSTEM - в изобретении) не предполагает такого значительного роста пролиферативной активности, что с очевидностью следует из оценки результатов аналогичной замены при культивировании с использованием ФБС (сравни 2-й и 4-й столбики на фиг.5). Соответственно, может быть сделан вывод о том, что неожиданно высокий уровень пролиферации в условиях индукции остеогенной дифференцировки достигается только благодаря предлагаемой нами в изобретении комбинации питательной среды и сыворотки.
TM
Таким образом, сочетание основной питательной среды AdvanceSTEM (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) и аутологичной сыворотки крови пациента при культивировании СКЖТ согласно настоящему изобретению обеспечивает: а) более высокую пролиферативную активность клеток в культуре без отрицательного влияния на уровень апоптоза; б) получение культуры с лучшими, чем в прототипе, показателями сохранения мультипотентных свойств, в частности, обладающей значительно более высоким потенциалом в плане индукции остеогенной дифференцировки и способности клеток к пролиферации в этих условиях, чем культура, выращенная в среде DMEM + AC.
Получаемая способом по изобретению культура плюрипотентных клеток может в дальнейшем эффективно и безопасно использоваться в клинике для лечения целого ряда заболеваний человека: сердечно-сосудистых заболеваний, повреждений нервной системы различного генеза, урологических, гинекологических заболеваний и бесплодия, заболеваний пародонта, дефектов костного аппарата, заболеваний суставов, лечения обширных ожогов, а также для коррекции возрастных изменений и кожных дефектов в дерматокосметологии.
Источники информации