СМЕСЬ ОЛИГОСАХАРИДОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГРУДНОГО МОЛОКА
HUMAN BREAST MILK OLIGOSACCHARIDE MIXTURE

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к олигосахаридам человеческого грудного молока («ОГМ»), в частности к LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, а также к применению этих смесей для улучшения здоровья людей.
Предпосылки создания изобретения
В последние годы ОГМ стали предметом большого интереса из-за своего участия в различных биологических процессах, происходящих в человеческом организме. Молоко млекопитающих содержит по меньшей мере 130 таких сложных олигосахаридов (Urashima et al, Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York, 2011, ISBN: 978-1-61122-831-1).
Ранее единственным источником ОГМ было молоко млекопитающих, которое содержит, главным образом, воду, а также 55–70 г/л лактозы, 24–59 г/л липидов, приблизительно 13 г/л белков, 5–15 г/л ОГМ и приблизительно 1,5 г/л минеральных веществ.
Однако в последние годы было разработано несколько способов для синтеза ОГМ, учитывая их роль в многочисленных биологических процессах человека. В связи с этим были разработаны способы получения ОГМ при помощи микробной ферментации, ферментативных процессов, химического синтеза или комбинации этих технологий. Например, при помощи химических процессов можно получить Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc или лакто-N-неотетраозу («LNnT»), как описано в WO 2011/100980 и WO 2013/044928; Galpβ1-3GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc или лакто-N-тетраозу («LNT») можно синтезировать, как описано в WO 2012/155916 и WO 2013/044928; 6’-O-сиалиллактозу («6’-SL) можно синтезировать, как описано в WO 2011/100979; смесь LNT и LNnT можно получить, как описано в WO 2013/091660; 2’-O-фукозиллактозу («2’-FL») можно получить, как описано в WO 2010/115934 и WO 2010/115935; 3-фукозиллактозу («3-FL») можно получить, как описано в WO 2013/139344; и 6’-SL можно получить, как описано в WO 2010/100979. В качестве примеров биотехнологических процессов в WO 01/04341 и WO 2007/101862 описан способ получения базовых олигосахаридов грудного молока, необязательно содержащих в качестве заместителей фукозу или сиаловую кислоту, в том числе LNnT, 6’-SL и 3’-O-сиалиллактозы («3’-SL»), с применением генетически измененных E. coli; а в WO 2015/032412 описано получение 2’-FL и дифукозиллактозы или Fuc(α1-2)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Glc («DFL») с применением генетически модифицированных E. coli. В качестве примера ферментативных процессов сиалилированные олигосахариды можно получать, как описано в EP-A-577580.
Также предпринимались усилия по разработке способов ферментативного синтеза смесей олигосахаридов ОГМ без необходимости синтеза всех входящих в смесь олигосахаридов, как описано в WO 2012/156897 и WO 2012/156898. В таких способах предложены реакционные смеси, содержащие множество разных олигосахаридов.
Накапливаются данные, что присутствующая в человеческом пищеварительном тракте популяция микроорганизмов, именуемая микробиотой, играет важную роль в здоровом состоянии и при патологиях. Когда состав кишечной микробиоты сдвигается от равновесного значения, это имеет последствия для человеческого организма-хозяина. Последние исследования предполагают роль дисбаланса кишечной микробиоты при отдельных заболеваниях, таких как рак, ожирение, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, астма и, возможно, даже аутизм. Считается, что некоторые неперевариваемые волокна, включая ОГМ, положительно модулируют микробиоту, и они привлекают все больший интерес в плане лечения одного или нескольких таких заболеваний. Однако многие перевариваемые волокна модулируют микробиоту неспецифическим образом, тогда как другие не могут оказать достаточно широкого но специфического модулирующего эффекта.
Следовательно, существует потребность в специфической модуляции микробиоты с целью борьбы с отдельными заболеваниями разными способами, а также для одновременной борьбы со многими заболеваниями. В частности, существует потребность в композиции, которую можно применять, среди прочего, для лечения и/или профилактики бактериальных и вирусных инфекций, в частности в желудочно-кишечном тракте и дыхательных путях, улучшения когнитивной функции и/или для повышения эффективности противораковых средств в отношении опухолей.
Изложение сущности изобретения
Первый аспект изобретения относится к искусственной смеси ОГМ или к содержащей ее композиции, причем указанные ОГМ состоят, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL. Эта смесь необязательно может содержать лактозу. Предпочтительно смесь ОГМ, по существу, состоит из следующих компонентов:
i. от около 55 мас.% до около 75 мас.% 2’-FL, более предпочтительно от около 60 мас.% до около 70 мас.%;
ii. от около 2 мас.% до около 10 мас.% LNnT, более предпочтительно от около 3 мас.% до около 7 мас.%;
iii. от около 10 мас.% до около 20 мас.% LNT, более предпочтительно от около 12 мас.% до около 18 мас.%;
iv. от около 1 мас.% до около 10 мас.% DFL или 3-FL, более предпочтительно от около 2 мас.% до около 8 мас.%;
v. от около 1 мас.% до около 10 мас.% 3’-SL, более предпочтительно от около 2 мас.% до около 8 мас.%; и
vi. от около 5 мас.% до около 15 мас.% 6’-SL, более предпочтительно от около 7 мас.% до около 13 мас.%.
Второй аспект изобретения относится к композиции для применения в: i) профилактике и/или лечении вирусных и/или бактериальных инфекций у людей, в частности у младенцев или детей младшего возраста; ii) специфическом модулировании природной микробиоты людей, в особенности младенцев или детей младшего возраста; и/или iii) улучшении когнитивной функции людей, в частности младенцев и детей младшего возраста. Композиция содержит искусственную смесь ОГМ настоящего изобретения, состоящую, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL, как описано выше. Эта композиция содержит множество различных ОГМ с новыми комбинациями свойств и биологических активностей. Эта композиция в особенности полезна против вирусных и бактериальных кишечных инфекций благодаря специфической модуляции кишечной микробиоты с увеличением содержания Bifidobacterium, модуляции связывания вирусов и патогенных бактерий клетками эпителия кишечника и улучшению барьерной функции кишечника. Эта композиция также в особенности полезна против вирусных и бактериальных инфекций дыхательных путей, благодаря ингибированию связывания патогенов с человеческими эпителиальными клетками.
В одном конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения предназначена для применения в профилактике и/или лечении вирусных инфекций, вызванных вирусом гриппа.
Третий аспект изобретения относится к способу модуляции природной микробиоты человека с целью увеличения численности Bifidobacterium, в особенности с целью повышения эффективности противораковых средств в отношении опухолей у человека. Способ включает введение человеку искусственной смеси ОГМ настоящего изобретения, состоящей, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL, как описано выше. Бактерия Bifidobacterium может играть роль стимулятора иммунитета, поскольку увеличение ее численности может усилить ответ раковых пациентов на противораковый препарат. Это свойство делает эту смесь пригодной в качестве вспомогательного средства при терапии рака.
Четвертый аспект изобретения относится к способу модуляции природной кишечной микробиоты человека с целью увеличения численности как Bifidobacterium, так и Barnesiella, а также уменьшения численности Ruminococcus gnavus. Способ включает введение человеку искусственной смеси ОГМ настоящего изобретения, состоящей, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL, как описано выше. Увеличенная численность Bifidobacterium и Barnesiella и сниженная численность Ruminococcus gnavus делает кишечную среду человека менее склонной к воспалениям и обеспечивает улучшение барьерной функции кишечника. Эти эффекты могут предотвращать и/или лечить такие заболевания, как воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника и другие состояния, связанные с воспалением и нарушением барьерной функции кишечника.
Пятый аспект изобретения относится к способу модуляции природной микробиоты человека с целью увеличения численности Bifidobacterium и по меньшей мере сохранения численности Faecalibacterium. Способ включает введение человеку искусственной смеси ОГМ настоящего изобретения, состоящей, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL, как описано выше. Увеличение численности Bifidobacterium и по меньшей мере сохранение численности Faecalibacterium делает кишечную среду человека менее склонной к воспалениям и обеспечивает улучшение барьерной функции кишечника. Предпочтительно численность Ruminococcus gnavus снижается. Эти эффекты могут предотвращать и/или лечить такие заболевания, как воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника и другие состояния, связанные с воспалением и нарушением барьерной функции кишечника.
Как в четвертом, так и в пятом аспекте изобретения численность Proteobacteria также предпочтительно снижается.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу профилактики или лечения вирусных и/или бактериальных инфекций у человека, в особенности кишечных инфекций и инфекций дыхательных путей. Способ включает введение человеку искусственной смеси ОГМ настоящего изобретения, состоящей, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL, как описано выше.
Седьмой аспект изобретения относится к способу улучшения когнитивной функции у людей, в частности у младенцев. Способ включает введение человеку искусственной смеси ОГМ настоящего изобретения, состоящей, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL, как описано выше.
Графические материалы
Фиг. 1 - доля мышей, демонстрирующих клиническую оценку выше 1, что означает наличие симптомов заболевания. (n = 10 в каждой группе).
Фиг. 2 - площадь под графиком (AUC) для клинической оценки заболевания в течение периода 14 дней после инфицирования гриппом. (n = 10 в каждой группе), статистическая значимость определена непараметрическим тестом Краскела–Уоллиса со множественными сравнениями по Данну в сравнении с контролем. Указаны значения p.
Фиг. 3 - вес тела (в граммах) в течение периода 14 дней после инфицирования гриппом. Группа, получающая 1%-ю или 5%-ю смеси ОГМ, теряла вес существенно меньше, чем контрольная группа, и это указывает на то, что эти мыши были менее больны по сравнению с контрольными. (n = 10 в каждой группе). По данным статистического теста, проведенного методом 2-факторного дисперсионного анализа, на массу тела существенно влияли факторы времени и лечения (p < 0,0001), и при сравнении контроля с 1%-й смесью ОГМ значение p = 0,0002, а при сравнении контроля с 5%-й смесью ОГМ значение p = 0,0001.
Подробное описание изобретения
В настоящем документе следующие термины имеют приведенные ниже определения.
Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев.
Выражение «ребенок младшего возраста» означает ребенка в возрасте от одного до трех лет (также называется ребенком, начинающим ходить).
Выражения «композиция для младенцев и детей младшего возраста» и «композиция для введения младенцам или детям младшего возраста» могут использоваться на взаимозаменяемой основе.
В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая смесь ОГМ по настоящему изобретению, является питательной композицией. Выражение «питательная композиция» означает композицию, которой вскармливают субъекта. Данная питательная композиция обычно предназначена для перорального или внутривенного применения и обычно включает в себя источник липидов или жира и источник белка. В конкретном варианте осуществления питательная композиция представляет собой искусственную питательную композицию.
Выражение «детская смесь» при использовании в настоящем документе относится к продукту питания, специально предназначенному для применения в пищу младенцами в течение первых месяцев жизни, который сам по себе удовлетворяет потребности в питании этой категории лиц (статья 2(c) Директивы Европейской комиссии 91/321/EEC 2006/141/EC от 22 декабря 2006 г. о детских смесях и детских смесях для прикармливаемых детей). Оно также относится к питательной композиции, предназначенной для младенцев, как определено в Codex Alimentarius (Codex STAN 72-1981) и стандарте «Специальные продукты для младенцев» (включая статью «Продукты питания для специальных медицинских целей»). Выражение «детская смесь» охватывает как «начальную детскую смесь», так и «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей».
«Смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей» дают начиная с 6-го месяца. Она составляет главный жидкий элемент в постепенно увеличивающемся разнообразии рациона для лиц данной категории.
Выражение «детское питание» означает продукт питания, специально предназначенный для применения в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Выражение «детская композиция на зерновой основе» означает продукт питания, специально предназначенный для применения в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Термин «обогатитель» относится к жидким или твердым питательным композициям, которые подходят для смешивания с грудным молоком или детской смесью.
В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что искусственная смесь ОГМ, состоящая, по существу, из LNnT, LNT, 2’-FL, 3’-SL, 6’-SL и либо DFL, либо 3-FL, предпочтительно DFL, и необязательно лактозы, может обеспечить получение композиции для профилактики или лечения бактериальных или вирусных инфекций путем специфической модуляции кишечной микробиоты, связывания вирусов, уменьшения переноса патогенов и улучшения барьерной функции кишечника. Кроме этого, смесь ОГМ настоящего изобретения функционирует как рецептор-ловушка и связывается с ротавирусами, не позволяя ротавирусам прикрепляться к клеткам кишечника человека. Эти свойства в сочетании с улучшением барьерной функции кишечника делают смесь ОГМ подходящей для профилактики и лечения кишечных инфекций.
В некоторых аспектах изобретения композиция, таким образом, предназначена для применения в профилактике и/или лечении вирусных и/или бактериальных инфекций у людей, в частности у младенцев и детей младшего возраста.
В одном конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения предназначена для применения в профилактике и/или лечении вирусных инфекций, вызванных вирусом гриппа.
Композицию настоящего изобретения можно, в частности, применять для профилактики или лечения симптомов, связанных с гриппом, таких как лихорадка, боль в суставах, головная боль, усталость, потеря веса…
Композицию настоящего изобретения можно, в частности, применять для уменьшения применения лекарственных препаратов при гриппе. В одном конкретном варианте осуществления она также может предотвратить применение антибиотиков при бактериальной интеркуррентной инфекции после гриппа.
Также было обнаружено, что смесь ОГМ настоящего изобретения может увеличивать концентрацию сиаловой кислоты в мозговых ганглиозидах и гликопротеинах, улучшая синаптогенез и нейрональное развитие. Это делает смесь ОГМ подходящей для введения людям, в особенности младенцам, в целях улучшения когнитивной функции.
Смесь ОГМ настоящего изобретения также позволяет:
i) увеличить в кишечнике природную численность бактерий Bifidobacterium и
ii) увеличить в кишечнике численность бактерий Barnesiella и/или по меньшей мере сохранить численность бактерий Faecalibacterium, и
iii) уменьшить в кишечнике численность Ruminococcus gnavus и/или Proteobacteria.
Эти эффекты могут сделать среду кишечника менее склонной к воспалениям. В сочетании с улучшением барьерной функции кишечника, эти эффекты смеси ОГМ могут предотвращать и/или лечить такие заболевания, как воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника и другие состояния, связанные с воспалением и нарушением барьерной функции.
Неожиданно было обнаружено, что увеличение численности бифидобактерий в кишечнике, индуцированное смесью ОГМ настоящего изобретения, увеличивает эффективность противораковых средств в отношении опухолей. Бифидобактерии действуют как помощники иммунитета, усиливая ответ больного раком на противораковый агент. Это свойство делает эту смесь ОГМ пригодной в качестве вспомогательного средства при терапии рака.
Предпочтительно смесь ОГМ настоящего изобретения содержит: i) от около 55 мас.% до около 75 мас.% 2’-FL, более предпочтительно от около 60 мас.% до около 70 мас.%; ii) от около 2 мас.% до около 10 мас.% LNnT, более предпочтительно от около 3 мас.% до около 7 мас.%; iii) от около 10 мас.% до около 20 мас.% LNT, более предпочтительно от около 12 мас.% до около 18 мас.%; iv) от около 1 мас.% до около 10 мас.% DFL или 3-FL, более предпочтительно от около 2 мас.% до около 8 мас.%; v) от около 1 мас.% до около 10 мас.% 3’-SL, более предпочтительно от около 2 мас.% до около 8 мас.%; и vi) от около 5 мас.% до около 15 мас.% 6’-SL, более предпочтительно от около 7 мас.% до около 13 мас.%. Смесь ОГМ настоящего изобретения также может содержать лактозу, но она не считается активным ингредиентом смеси.
Смесь ОГМ можно вводить людям в любой подходящей форме, например в виде единичной дозированной формы (например, таблетки, капсулы, саше с порошком и т.п.) или питательной композиции.
Единичная дозированная форма может содержать приемлемый носитель, например фосфатно-солевой буферный раствор, смеси этанола в воде, воду и эмульсии, такие как эмульсия масла в воде или воды в масле, а также различные смачивающие агенты или эксципиенты. Единичная дозированная форма также может содержать другие материалы, которые не дают неблагоприятной, аллергической или иной нежелательной реакции при введении пациенту. Носители и другие материалы могут включать растворители, диспергирующие агенты, покрытия, агенты, стимулирующие абсорбцию, агенты с контролируемым высвобождением и один или более инертных эксципиентов, таких как крахмалы, полиолы, гранулирующие агенты, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, смазывающие средства, связующие вещества и агенты, улучшающие распадаемость таблеток. При необходимости на таблеточные дозированные формы композиции стандартными водными или безводными способами могут быть нанесены покрытия.
Единичную дозированную форму настоящего изобретения можно вводить перорально, например в виде таблетки, капсулы или пеллеты, содержащей заданное количество смеси, или в виде порошка или гранул, содержащих заданную концентрацию смеси, или в виде геля, пасты, раствора, суспензии, эмульсии, сиропа, болюса, электуария или кашицы, в виде жидкости на водной или не водной основе, содержащих заданную концентрацию смеси. Вводимая перорально композиция может содержать одно или более связующих веществ, смазывающих веществ, инертных разбавителей, вкусоароматических агентов и увлажнителей. Вводимая перорально композиция, например таблетка, может иметь необязательное покрытие, и она может быть выполнена так, чтобы обеспечивать длительное, отсроченное или контролируемое высвобождение содержащейся в ней смеси ОГМ.
Единичную дозированную форму настоящего изобретения также можно вводить при помощи ректального суппозитория, аэрозольного баллона, назально-желудочной трубки или прямой инфузии в желудочно-кишечный тракт или в желудок.
Единичная дозированная форма настоящего изобретения также может содержать терапевтические средства, такие как антивирусные средства, антибиотики, пробиотики, анальгетики и противовоспалительные средства. Подходящую дозировку такой композиции для пациента можно определить традиционным способом, на основе таких факторов, как состояние иммунитета пациента, масса тела и возраст. В некоторых случаях дозировкой будет концентрация, сходная с содержанием ОГМ, имеющихся композиции, в человеческом грудном молоке. Требуемое количество, как правило, может лежать в диапазоне от около 200 мг до около 20 г в день, в некоторых вариантах осуществления — от около 300 мг до около 15 г в день, от около 400 мг до около 10 г в день, в некоторых вариантах осуществления - от около 500 мг до около 10 г в день, в некоторых вариантах осуществления — от около 1 г до около 10 г в день. Подходящие схемы введения можно определить способами, известными специалистам в данной области.
Смесь ОГМ настоящего изобретения также можно добавлять к питательной композиции. Например, ее можно добавлять к детской смеси, пищевой композиции, раствору для восстановления водного баланса или поддерживающему рациону или добавке для пожилых людей или лиц с нарушениями иммунитета. Питательная композиция может представлять собой, например, детскую смесь, начальную детскую смесь, смесь для прикармливаемых детей или смесь последующего уровня, детское питание, детскую композицию на зерновой основе, обогатитель, такой как обогатитель грудного молока, или добавку. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция изобретения представляет собой детскую смесь, обогатитель или добавку, которые могут предназначаться для первых 4 или 6 месяцев жизни. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. В некоторых других вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой обогатитель. Обогатитель может представлять собой обогатитель грудного молока (например, обогатитель грудного молока) или обогатитель смеси, такой как обогатитель детской смеси или обогатитель смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.
В такую питательную композицию также могут входить макронутриенты, такие как пищевые жиры, углеводы и белки. К пищевым жирам относятся, например, кокосовое масло, соевое масло, моноглицериды и диглицериды. К углеводам относятся, например, глюкоза, пищевая лактоза и гидролизованный кукурузный крахмал. К белкам относятся, например, соевый белок, молочная сыворотка и обезжиренное молоко. В такую питательную композицию также можно включать витамины и минеральные вещества (например, кальций, фосфор, калий, натрий, хлорид, магний, марганец, железо, медь, цинк, селен, йод, витамины A, E, D, C и комплекс витаминов B).
Питательную композицию можно получить любым подходящим способом. Далее композиция будет описана на примере.
Например, смесь, такую как детская смесь, можно получать путем смешивания источника белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих пропорциях. На данной стадии можно включать эмульгаторы в случае их применения. На данной стадии можно добавлять витамины и минеральные вещества, но обычно их добавляют позднее для предотвращения термического разложения. Перед перемешиванием можно растворять любые липофильные витамины, эмульгаторы и т.п. в источнике жира. Затем можно примешивать воду, предпочтительно воду, очищенную обратным осмосом, с образованием жидкой смеси. Температура воды для удобства находится в диапазоне от около 50°C до около 80°C, чтобы облегчать диспергирование ингредиентов. Для образования жидкой смеси можно применять доступные в продаже разжижители.
На данной стадии можно добавлять смесь ОГМ настоящего изобретения, в особенности если готовый продукт имеет жидкую форму. Если конечный продукт должен представлять собой порошок, эти элементы при необходимости также можно добавлять на данной стадии.
Затем жидкую смесь гомогенизируют, например в две стадии.
Затем жидкую смесь можно термически обрабатывать для снижения бактериальной нагрузки путем быстрого нагрева жидкой смеси, например, до температуры в диапазоне от около 80°C до около 150°C в течение периода времени от около 5 секунд до около 5 минут. Это можно осуществлять путем нагнетания пара, с помощью автоклава или теплообменника, например пластинчатого теплообменника.
Затем жидкую смесь можно охлаждать до температуры от около 60°C до около 85°C, например, путем мгновенного охлаждения. Затем жидкую смесь можно снова гомогенизировать, например, в две стадии: под давлением в диапазоне от приблизительно 10 МПа до приблизительно 30 МПа на первой стадии и от приблизительно 2 МПа до приблизительно 10 МПа на второй стадии. Затем гомогенизированную смесь можно дополнительно охлаждать для добавления любых термочувствительных компонентов, например витаминов и минеральных веществ. На данной стадии для удобства регулируют рН и содержание твердых веществ в гомогенизированной смеси.
Если конечный продукт должен представлять собой порошок, гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, такой как распылительная сушилка или сублимационная сушилка, и превращают в порошок. Влагосодержание порошка должно составлять менее приблизительно 5 мас.%. Также на этом этапе или альтернативно можно добавить смесь ОГМ настоящего изобретения путем сухого смешивания или путем перемешивания в форме сиропа из кристаллов, вместе с пробиотическим (-и) штаммом (-ами) (если используются), и смесь подвергают распылительной сушке или сублимационной сушке.
Если предпочтительна жидкая композиция, гомогенизированную смесь можно стерилизовать, а затем асептически разливать в подходящие контейнеры или можно сначала разливать в контейнеры, а затем стерилизовать в автоклаве.
Примеры
Пример 1
К участию в исследовании всего были привлечены 50 здоровых субъектов мужского и женского пола. После скринингового визита и 1–2-недельного подготовительного периода проводили отбор и рандомизацию субъектов по 2 группам по 25 субъектов в каждой. Одной группе вводили продукт для лечения, содержащий 5 г следующей смеси ОГМ настоящего изобретения:
i) 14,2 мас.% LNT
ii) 5,3 мас.% LNnT
iii) 63,7 мас.% 2’-FL
iv) 4,2 мас.% DFL,
v) 3,7 мас.% 3’-SL и
vi) 8,9 мас.% 6’-SL
Другой группе давали плацебо (содержащее 2 грамма глюкозы). Продукт для лечения и плацебо имели порошковую форму в контейнере с единичной дозой.
Субъекты были пригодными для участия в исследовании, если имели возраст по меньшей мере 18 лет. Все привлеченные субъекты имели возможность и желание понимать и соблюдать процедуры исследования. Субъекты исключались из исследования, в следующих случаях: если они принимали участие в клиническом исследовании в течение месяца перед скрининговым визитом; если они имели аномальные результаты при скрининговых анализах, которые имели клиническое значение для участия в исследовании; если они страдали от тяжелого заболевания, такого как злокачественные образования, диабет, тяжелая коронарная болезнь сердца, болезнь почек, неврологическое заболевание или тяжелое психическое заболевание, или от любого состояния, способного исказить результаты исследования; если они применяли большие дозы пробиотических добавок (йогурт был разрешен) в течение 3 месяцев перед исследованием; если принимали антибиотики в течение 3 месяцев до исследования; если принимали на регулярной основе любые лекарственные препараты, способные повлиять на оценку симптомов, в течение 2 недель до исследования; если были беременны или кормили грудью.
При скрининговом визите собирали анамнез и данные о принимаемых лекарственных препаратах и брали образец крови для анализа безопасности. Выдавали набор для сбора анализа кала. Пациентам давали инструкцию хранить свои образцы в морозильнике до следующего визита.
При втором визите проверяли критерии пригодности для участия в исследовании и пригодных субъектов рандомизировали по трем группам исследования. Собирали образцы кала и выдавали оборудование для новых образцов. Субъектов знакомили с интерактивной интернет-системой, ежедневно регистрирующей данные, и предоставляли лечебные или контрольные продукты. Субъектам напоминали, чтобы они не изменяли свой обычный рацион питания в ходе исследования. Собирали образцы крови для исследования на биомаркеры. Образцы кала хранили до анализа при -80°C. Образцы кала подвергали анализу с секвенированием 16S рРНК.
Исследование проводили в течение 8 недель, в течение которых субъекты ежедневно употребляли плацебо или лечебный продукт. Субъектам давали задание потреблять продукты утром с завтраком. Соблюдение режима отслеживали при помощи интерактивной интернет-системы. Субъекты также применяли эту систему для регистрации следующей информации:
- информации по бристольской шкале формы кала (BSF),
- информации о симптомах, таких как боль в животе, дискомфорт в животе, схватки в животе, вздутие живота и ощущение переполнения живота,
- дополнительной информации по шкале оценки желудочно-кишечных симптомов (GSRS).
Анкета включала в себя 15 пунктов, охватывающих пять аспектов (боль в животе, несварение, рефлюкс, диарея, запор), и в ней использовалась семибалльная шкала Ликерта.
В конце исследования каждый субъект совершал заключительный визит к медицинской группе. Образцы кала и образцы крови собирали и исследовали, как и ранее.
Анализ кала показывает, что субъекты, получавшие смесь ОГМ настоящего изобретения имеют увеличенную численность Bifidobacterium и Barnesiella и сниженную численность Firmicutes, в особенности Clostridia и Ruminococcus gnavus. Численность Faecalibacterium у этих субъектов остается без изменений. Численность Proteobacteria у этих субъектов снижена.
Пример 2
Двадцать самок мышей C57BL/6J в возрасте 7 недель содержали индивидуально для предотвращения перекрестного загрязнения и давали им обработанную облучением пищу и воду. Мышей делили на 2 группы по 10 в каждой.
Мышам давали ампициллин (0,5 г/литр) с питьевой водой, которую меняли каждые 3 дня. Через 1 неделю введение ампициллина с питьевой водой прекращали. Далее 1 группе давали лечебный продукт, содержащий следующую смесь ОГМ настоящего изобретения:
14,2 мас.% LNT
5,3 мас.% LNnT
63,7 мас.% 2’-FL
4,2 мас.% DFL,
3,7 мас.% 3’-SL и
8,9 мас.% 6’-SL.
Лечебный продукт добавляли в питьевую воду 1 группы в суммарной концентрации 40 мг/мл. Другая группа получала с питьевой водой 40 мг/мл глюкозы. Свежую воду давали ежедневно и все мыши имели свободный доступ к питьевой воде. Мышей кормили кормом для грызунов, и свежий корм давали ежедневно.
Через два дня после завершения введения ампициллина мышей каждой группы через оральный зонд заражали устойчивым к ванкомицину штаммом Enterococcus faecium (VRE). Свежие фекальные пеллеты собирали в разные сроки для определения уровней VRE. VRE количественно определяли путем посева нескольких разведений фекальных пеллет на агаровые чашки Enterococcosel с ванкомицином. Колонии VRE идентифицировали по внешнему виду и подтверждали окрашиванием по Граму. Для подтверждения присутствия VRE у инфицированных мышей выполняли ПЦР на ген vanA, придающий устойчивость к ванкомицину.
Мышей отслеживали в течение 2 недель, после чего подвергали эвтаназии. Собирали содержимое просвета кишечника из подвздошной, слепой и толстой кишки, которое немедленно замораживали и хранили при -80°C. ДНК выделяли при помощи 96-луночного набора для выделения ДНК PowerSoil DNA Isolation Kit (MO-BIO). В качестве отрицательного контроля для ПЦР оставляли по меньшей мере одну пустую лунку на планшете. ПЦР проводили с прямым праймером S-D-Bact-0341-b-S-17 и обратным праймером S-D-Bact-0785-a-A-21 (Klindworth et al. Nucleic Acids Res. 41, e1 (2013)) с присоединенными адаптерами Illumina. Это универсальные праймеры бактериальной 16S рРНК, нацеленные на область V3-V4. Использовали следующую программу ПЦР: 98°C в течение 30 с, 25x (98°C в течение 10 с, 55°C в течение 20 с, 72°C в течение 20 с), 72°C в течение 5 мин. Амплификацию проверяли, прогоняя продукты на 1%-м агарозном геле. Добавляли штрихкоды при помощи гнездовой ПЦР, используя набор Nextera Index Kit V2 (Illumina) и следующую программу ПЦР: 98°C в течение 30 с, 8x (98°C в течение 10 с, 55°C в течение 20 с, 72°C в течение 20 с), 72°C в течение 5 мин. Прикрепление праймеров проверяли, прогоняя продукты на 1%-м агарозном геле.
Продукты гнездовой ПЦР нормализовали, используя набор SequalPrep Normalization Plate Kit, и объединяли. Объединенные библиотеки концентрировали путем выпаривания, и концентрацию ДНК в объединенных библиотеках измеряли на флуориметре Qubit с применением набора Qubit High Sensitivity Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Секвенирование выполняли на настольном секвенаторе MiSeq с применением набора MiSeq Reagent Kit V3 (Illumina) для секвенирования спаренных концов 2x 300 п.о. Для биоинформатического анализа данных секвенирования применяли 64-битную версию USEARCH (Edgar, 2013).
У мышей, получавших смесь ОГМ настоящего изобретения, число колоний VRE уменьшалось до неопределимого уровня в течение 14 дней. Плотность VRE уменьшалась в течение 5 дней. У мышей, получавших смесь ОГМ, также наблюдалась более высокая численность Porphyromonadaceae, в особенности Barnesiella. Не получавшие лечение мыши продолжали содержать большое количество VRE по всему кишечнику.
Пример 3
Ниже в таблице 1 приведен пример состава питательной композиции (например, детской смеси), содержащей смесь ОГМ настоящего изобретения. Эта композиция приведена исключительно в качестве иллюстрации.
Таблица 1. Пример состава питательной композиции (например, детской смеси)
Питательные вещества
На 100 ккал
На литр
Энергетическая ценность (ккал)
100
670
Белок (г)
1,83
12,3
Жир (г)
5,3
35,7
Линолевая кислота (г)
0,79
5,3
α-Линоленовая кислота (мг)
101
675
Лактоза (г)
10,6
70,7
Минеральные вещества (г)
0,37
2,5
Na (мг)
23
150
K (мг)
89
590
Cl (мг)
64
430
Ca (мг)
62
410
P (мг)
31
210
Mg (мг)
7
50
Mn (мкг)
8
50
Se (мкг)
2
13
Витамин A (мкг эквивалента ретинола (ЭР))
105
700
Витамин D (мкг)
1,5
10
Витамин E (мг эквивалента токоферола (ЭТ))
0,8
5,4
Витамин K1 (мкг)
8
54
Витамин С (мг)
10
67
Витамин В1 (мг)
0,07
0,47
Витамин В2 (мг)
0,15
1,0
Ниацин (мг)
1
6,7
Витамин В6 (мг)
0,075
0,50
Фолиевая кислота (мкг)
9
60
Пантотеновая кислота (мг)
0,45
3
Витамин B12 (мкг)
0,3
2
Биотин (мкг)
2,2
15
Холин (мг)
10
67
Fe (мг)
1,2
8
I (мкг)
15
100
Cu (мг)
0,06
0,4
Zn (мг)
0,75
5
Олигосахариды (ОГМ)
2FL (г)
0,39
2,56
LNnT (г)
0,03
0,2
LNT (г)
0,08
0,56
DFL (г)
0,03
0,2
3SL (г)
0,03
0,2
6SL (г)
0,05
0,36
Пример 4
Ниже в таблице 2 приведен другой пример состава питательной композиции (например, детской смеси), содержащей смесь ОГМ настоящего изобретения. Эта композиция приведена исключительно в качестве иллюстрации.
Таблица 2. Пример состава питательной композиции (например, детской смеси)
Питательные вещества
На 100 ккал
На литр
Энергетическая ценность (ккал)
100
670
Белок (г)
1,83
12,3
Жир (г)
5,3
35,7
Линолевая кислота (г)
0,79
5,3
α-Линоленовая кислота (мг)
101
675
Лактоза (г)
10,9
72,7
Минеральные вещества (г)
0,37
2,5
Na (мг)
23
150
K (мг)
89
590
Cl (мг)
64
430
Ca (мг)
62
410
P (мг)
31
210
Mg (мг)
7
50
Mn (мкг)
8
50
Se (мкг)
2
13
Витамин A (мкг эквивалента ретинола (ЭР))
105
700
Витамин D (мкг)
1,5
10
Витамин E (мг эквивалента токоферола (ЭТ))
0,8
5,4
Витамин K1 (мкг)
8
54
Витамин С (мг)
10
67
Витамин В1 (мг)
0,07
0,47
Витамин В2 (мг)
0,15
1,0
Ниацин (мг)
1
6,7
Витамин В6 (мг)
0,075
0,50
Фолиевая кислота (мкг)
9
60
Пантотеновая кислота (мг)
0,45
3
Витамин B12 (мкг)
0,3
2
Биотин (мкг)
2,2
15
Холин (мг)
10
67
Fe (мг)
1,2
8
I (мкг)
15
100
Cu (мг)
0,06
0,4
Zn (мг)
0,75
5
Олигосахариды (ОГМ)
2FL (г)
0,19
1,28
LNnT (г)
0,015
0,1
LNT (г)
0,042
0,28
DFL (г)
0,015
0,1
3SL (г)
0,015
0,1
6SL (г)
0,027
0,18
Пример 5
Пример модели инфекции мышиным вирусом гриппа.
Мышей (возраст 5 недель; n = 30) случайным образом распределяли в одну из следующих групп. A, контроль (n = 10); B, 1%-я смесь ОГМ (n = 10); C, 5%-я смесь ОГМ (n = 10). Состав смеси ОГМ для композиции см. в таблице 3 ниже. ОГМ давали с питьевой водой. Все животные имели свободный доступ к одному и тому же рациону (KLIBA 2122). Через 2 недели мышам вводили штамм гриппа PR8 в дозе 100 БОЕ на мышь путем интраназальной инокуляции.
За мышами наблюдали в следующие 14 дней, давая клиническую оценку симптомам заболевания и потере массы тела.
Результаты (см. фиг. 1, 2 и 3) показывают, что смесь ОГМ, заявленная в настоящем документе, демонстрирует защиту от симптомов заболевания и потери массы тела, вызванных инфицированием вирусом гриппа.
Таблица 3. Состав смеси ОГМ, использованной в эксперименте
г/100 мл
1%
5%
2’FL (г)
0,64
3,2
LNnT (г)
0,05
0,25
LNT (г)
0,14
0,7
3’-SL (г)
0,05
0,25
6’-SL (г)
0,09
0,45
diFL (г)
0,05
0,25