Способ моделирования инфицированной раны на крысах SPF категории
METHOD FOR SIMULATING INFECTED WOUND IN SPF RATS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в фармакологии для тестирования фармакологически активных веществ, обладающих дерматотропной ранозаживляющей активностью.
Известен способ моделирования инфицированной раны у крыс, заключающийся в том, что полученную рану инфицировали культурами патогенных микроорганизмов, таких как синегнойная палочка (Staphylococcus aureus), пиогенный стрептококк (Streptococcus pyogenes), палочка Фридлендера (Klebsiella pneumoniae), или культурами микроорганизмами, относящимися к нормофлоре, но при попадании в рану вызывающие инфицированное воспаление бактероиды (Bacteroides frogilis), кишечная палочка (Escherichia coli) [1-14]. Наиболее близким к предлагаемому (прототипом) является способ, указанный в [10]: крысам подкожно вводили взвесь (суспензию) Staphylococcus aureus, после образования гнойника проводили его вскрытие. Недостатком данного способа является то, что используемые для инфицирования раны микроорганизмы относятся к III-IY группе патогенности, что влечет за собой целый ряд жестких требований со стороны государственных контролирующих органов. Работа с данными патогенами регламентируется Санитарными правилами (СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней), согласно которым необходимо лицензирование деятельности, а кроме того данные правила устанавливают особенные требования к помещениям, в которых проводится работа с микроорганизмами, к обеззараживанию и утилизации отходов, к персоналу [15], что ведет к значительным затратам.
Еще одним недостатком известного способа моделирования инфицированной раны у крыс является сложность и дороговизна его использования в виварии, содержащем животных SPF категории. Согласно определению, приведенному в «Большой Медицинской Энциклопедии», животные SPF категории - это животные без специфических патогенных факторов или возбудителей (SPF - англ. Specific Pathogen Free). Для содержания таких животных необходим высший уровень санитарно-гигиенических мероприятий. Внесение извне патогенных микроорганизмов и работа с ними в таком виварии не допустима, поскольку животные, получившие такие микроорганизмы, утрачивают свою SPF категорию и становятся опасными для других животных этого вида, содержащихся в данном виварии.
Целью предлагаемого изобретения является разработка способа моделирования инфицированной раны, позволяющего сохранить животным SPF категорию, и снизить финансовые затраты на разработку и использование данной модели.
Поставленная цель достигается тем, что крысам SPF категории инфицирование раны осуществляется при помощи фекальных микроорганизмов, полученных от самих животных. Фекалии крыс SPF категории не содержат опасных для этого вида животных и для персонала (экспериментаторов и сотрудников вивария) патогенов, но при подкожном введении до нанесения раны вызывают развитие локального инфекционного воспаления, которое после удаления над ним кожи приводит к появлению инфицированной раны.
Новым в предлагаемом способе является получение инфицированной раны у крыс SPF категории без утраты ими SPF категорию с помощью микроорганизмов, содержащихся в организме самих животных.
Разработка лекарственных препаратов для лечения инфицированных ран является важным направлением фармакологии, что обусловлено серьезной медико-социальной проблемой, т.к. количество пациентов с острыми гнойными заболеваниями мягких тканей не уменьшается несмотря на достигнутый прогресс противомикробной терапии, и имеет тенденцию к росту, составляя до 35-40% от всего количества хирургических пациентов [16; 17]. Проведение доклинических исследований эффективности и безопасности новых лекарственных средств требует стандартизации всех условий проведения исследований, включая стандартизацию животных по их качеству, а также стандартизацию условий их содержания и использования. Известно, что понятие качества для лабораторных животных включает в себя, во-первых, их генетический статус, во-вторых, их микробиологический статус, для поддержания (сохранения) которого требуются особые условия вивария. В доклинических исследованиях необходимо использовать животных с установленным генетическим и микробиологическим статусом, что достигается специальными условиями разведения и содержания лабораторных животных. Общепринятые в мире правила проведения доклинических исследований включают использование животных SPF категории. В России для животных SPF категории, поскольку создание таких вивариев и их рабна настоящее время еще немного вивариев ота на должном уровне требует значительных затрат, а внесение каких-либо патогенов извне приводит к необходимости серьезных санитарно-гигиенических мероприятий, что влечет за собой дополнительные затраты. В связи с изложенным выше представляется чрезвычайно актуальным получить модель инфицированной раны, которую можно использовать в условиях вивария для животных SPF категории.
В настоящее время не описано модели инфицированной раны, которую можно использовать в виварии для животных SPF категории без угрозы утраты ими своего микробиологического статуса, все известные способы используют патогенные микроорганизмы III-IV групп патогенности (опасности).
Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста. Идентичного способа получения инфицированной раны у животных SPF категории, не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.
Данное изобретение может быть использовано на практике для скрининга новых фармакологически активных веществ с дерматотропной ранозаживляющей активностью.
Исходя из выше изложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим критериям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
2
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Эксперименты проведены с использованием самцов крыс стока SD (Sprague Dawley) SPF категории, полученных из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН (г. Пущино Московской области). Животные содержались в виварии барьерного типа. До операции животных содержали группами, а после операции - поодиночке в индивидуально вентилируемых клетках 1500U (Евростандарт тип IV S) с полезной площадью пола 1500 см (производитель «Tecniplast», Италия). В качестве подстилочного материала использовался подстил Рехофикс МК-2000 - гранулят из стержневой части початков кукурузы (производитель Rettenmaier, Германия). Во время исследования животные имели неограниченный доступ к корму и воде. Для кормления животных использовали полноценный корм для содержания крыс и мышей sniff R/M-H V1534-300 (производитель Ssniff Spezialdiaten, Германия). Питьевая вода готовилась при помощи системы обратного осмоса RiOs 30 компании Merck Millipore. Животные содержались в регулируемых условиях окружающей среды, регуляция проводилась автоматически блоками подготовки воздуха Smart Flow (производитель «Tecniplast», Италия). Внутри клетки с животными поддерживались следующие параметры микроклимата: температура воздуха 20-26°С, относительная влажность воздуха 30-70%.
Моделирование раны проводили следующим образом. Предварительно до нанесения кожной раны, подготовили операционное поле в области спины (ближе к голове на уровне лопаток). У крыс удалили шерсть при помощи триммера и подкожно сделали инъекцию предварительно подготовленной суспензии на основе фекалий в концентрации 0,1 – 0,8%, в объеме 3 мл. На 2-3-й день после инъекции под анестезией (ингаляция изофлурана) операционное поле обрабатывали кожным антисептиком, подсушивали стерильной салфеткой, с использованием трафарета и хирургического маркера наносили контур раны диаметром 2 см, а затем при помощи ножниц удаляли участок кожи с подлежащей жировой клетчаткой. В качестве позитивного контроля использовали лекарственный препарат Левомеколь, мазь для наружного применения (производства ОАО «НИЖФАРМ», Россия). Полученную рану у животных опытной группы покрывали слоем препарата, затем у животных контрольной и опытной групп рану покрывали сухой стерильной марлевой салфеткой, прокладывали слой полиэтиленовой пленки и фиксировали бинтом на 48 часов. По истечении этого времени повязка была снята и до конца периода наблюдения рана оставалась открытой.
При подборе условий моделирования осмотр состояния раны проводили при снятии повязки, затем 3 дня спустя, оценивали наличие небольших (до мм в диаметре) и больших (от 2 до 10 мм в диаметре) гнойников, а также их количество. Количество небольших гнойников разделяли на незначительное (1-4), среднее (5-12), большое (более 12); количество больших оценивали по занимаемой ими площади раны - часть (до 1/2) и вся поверхность. При оценке ранозаживления в экспериментах с Левомеколем оценивали площадь раны. Для этого при осмотре замеряли размер раны (продольный и поперечный), вычисляли площадь раны по формуле (1):
2
где S - площадь (мм), А, В - размеры (мм), π - число пи (3,1415). Результаты выражали в процентах от первоначального размера раны.
Фекальную суспензию готовили следующим образом: фекалии из клетки с экспериментальными животными были собраны, взвешены и помещены в физиологический раствор, проинкубированы при 37°С в течение 24-48 часов. Концентрацию суспензии, способ ее подготовки и необходимый объем введения установили в предварительных экспериментах (см. пример 1). В исследовании была использована концентрация суспензии, не вызывающая гибели животных.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA 8.0. Использовали t-критерий Стьюдента. Результаты в таблице 3 представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего - Mean ± SEM. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.
Пример 1.
Экспериментально установлено, что для получения инфицированной раны при помощи фекальной суспензии необходимо, во-первых, вводить суспензию подкожно до нанесения раны (эксперимент 1), во-вторых, использовать концентрацию суспензии в диапазоне 0,104 - 0,833% (эксперимент 2). Более низкие или более высокие концентрации суспензии не пригодны.
Эксперимент 1. Необходимость предварительной (до нанесения раны) подкожной инъекции для получения инфицированной раны установлена экспериментально. Было сформировано 3 группы по 2 крысы в каждой, каждому животному было нанесено по 2 раны, как описано выше. Края и дно раны представляли собой полость, которую затем заполняли суспензией в концентрациях 10 (группа №1), 50 (группа №2) и 100% (группа №3) так чтобы верхний уровень суспензии совпадал с краями раны (примерный объем используемой суспензии составлял около 3 мл), на каждую рану была наложена стерильная марлевая салфетка, которую также пропитали суспензией в аналогичной концентрации, затем прокладывали слой полиэтиленовой пленки и фиксировали бинтом. При снятии повязок на 3-й день полость раны промывали стерильным физиологическим раствором, чтобы убрать конгломераты экскремента, попавшие вместе с фекальной суспензией, и проводили осмотр ран на предмет наличия гнойников. Результаты осмотра представлены в таблице 1. Все раны были чистыми, без гнойников, края раны были воспалены, ровные, отмечено начальные стадии формирования струпа.
Эксперимент 2. Для выбора оптимальной концентрации фекальной суспензии для ее подкожного введения был проведен с следующий эксперимент. Сформировали 8 групп животных по 4 крысы в каждой группе. Каждое животное получило по одной инъекции суспензии в концентрации 0,052% (группа №1), 0,104% (группа №2), 0,208% (группа №3), 0,417% (группа №4), 0,833% (группа №5), 1,667% (группа №6), 3,333% (группа №7) и 6,667% (группа №8). На 3-й день кожу над местом инъекции убирали, накладывали повязку, которую снимали на 3-й день (т.е. на 6-й день от дня инъекции) и оценивали наличие гнойников разного размера и их количество. День введения суспензии считали 1-м, день нанесения раны - 3-м, день снятия повязок - 6-м днем эксперимента. Результаты представлены в таблице 2.
При введении суспензии в концентрации 3,333 и 6,667% наблюдалась генерализация инфекции, которая к 6-му дню приводила к гибели большинства животных в группе, при этом наблюдалось появление в ране больших гнойников, занимающих всю поверхность раны, а также наличие уплотнений под кожей в области боковых поверхностей тела. При введении самой малой концентрации (0,052%) на 6-й день наблюдали незначительное количество небольших гнойников. По результатам данного эксперимента был сделан вывод о том, что оптимальной концентрацией суспензии оказался диапазон 0,104-0,833%.
Пример 2.
Использование предлагаемого способа моделирования инфицированной раны с использованием стандартного противомикробного и ранозаживляющего препарата Левомеколь показало пригодность данного способа моделирования для оценки фармакологически активных веществ, обладающих дерматотропной ранозаживляющей активностью. Было сформировано 2 группы животных по 5 крыс в каждой (группа контроля - без лечения и группа опыта - лечение Левомеколем). Всем животным была сделана одна подкожная инъекция фекальной суспензии в концентрации 0,833%, на 3-й день кожу над местом инъекции убирали, группе контроля накладывали сухую повязку, группе опыта наносили Левомеколь и затем накрывали рану повязкой. Каждой крысе было нанесено по одной ране. На 3-й день (т.е. на 6-й день от дня инъекции) повязки снимали и оценивали размеры раны, как описано выше, на 6-й, 9-й, 12-й и 15-й день эксперимента (т.е. на 3-й, 6-й, 9-й и 12-й день после операции). Результаты оценки площади раны представлены в таблице 3.
Литература
1. Житнюк И.Д. Лечение инфицированных ран порошкообразной смесью. // Вестник хирургии. 1967. №12. С. 69-74.
2. Воленко А.В. Перспективы и возможности профилактического промывания хирургических ран пульсирующими струями жидкости под давлением. // Хирургия. 1998. №4. С. 45-50.
3. Афиногенов Г.Е., Пострелов Н.А., Смирнов О.А., Афиногенова А.Г., Кольцов А.И. Новый способ моделирования хирургической раны в эксперименте. // Успехи современного естествознания. 2004. №2. С. 57-58.
4. Суховей Ю.Г., Цирятьева С.Б., Минин А.С., Самусев Р.С, Сыч А.С., Костоломова Е.Г. Способ моделирования инфицированной раны мягких тканей. // Патент РФ №2321898 от 10.04.2008.
5. Григорьев Г.Е., Лепехова С.А., Гольдберг О.А., Коваль Е.В., Зарицкая Л.В. Способ моделирования инфицированной кожной раны. // Патент RU 2431890 от 20.10.2011.
6. Бесчастнов В.В., Орлинекая Н.Ю., Кудыкин М.Н. Экспериментальная и клиническая оценка возможности дозированной дермотензии в условиях инфицированной раны мягких тканей. // Российский медицинский журнал. 2012. №3. С. 32-34.
7. Сендрякова В.Н., Кокаева И.К., Трохов К.А., Букатин М.В. Проблемы моделирования гнойной раны у крыс. // Материалы V Международной студенческой научной конференции «Студенческий научный форум». URL:<ahref="https://scienceforum.ru/2013/article/2013006246">https://scienceforum.ru/2013/article/2013006246</a> (дата обращения: 15.01.2020).
8. Ковалева М.А., Крышень К.Л., Макарова М.Н., Алякринская А.А. Обзор экспериментальных моделей для изучения препаратов, применяемых при кожных заболеваниях. // Международный вестник ветеринарии. 2016. №3. С. 160-167.
9. Луценко В.Д., Шапошников А.А., Круть У.А., Маголин Г.Ф., Луханина Е.М., И Ванникова К.Н., Шевченко Т.С. Обоснование применения биоактивных сорбционно-гелиевых композиций при лечении гнойных ран. // Новости хирургии. 2016. Т. 24 (3). С. 222-226.
Ю.Маскин С.С, Павлов А.В., Иголкина Л.А., Максимова П.В., Сулейманова Л.Р. Экспериментальное моделирование гнойного процесса в мягких тканях: сравнение методов инфицированной раны и подкожного абсцесса. // Международный журнал экспериментального образования. 2017. №4-2. С. 165-167; URL:http://expeducation.ru/ru/article/view?id=11481 (дата обращения: 15.01.2020).
11. Круть У.А., Корокин М.В. Фармакологическая коррекция гнойного раневого процесса фитоминералсорбентами у крыс. // Кубанский научный медицинский вестник. 2017. №2 (163). С. 91-94.
12. Блинова Е.В., Миронов М.А., Блинов Д.С. Регенерация инфицированной кожной раны на фоне топического воздействия солями п-ацетил-6- аминогексановой кислоты. // The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2018. Vol. 20. No 7. http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-7
13. Парийская E.H., Захарова Л.Б., Орлова О.Г., Рыбальченко О.В., Голованова Н.Э., Астратенкова И.В. Опыт моделирования гнойно-воспалительной раны на фоне иммуносупрессии. // Лабораторные животные для научных исследований. 2018. №4. С. 116-124. https://doi.org/DOI 10.29296/2618723X
14. Туренко А.Д., Джопуа М.А., Гуменюк И.С., Исянова Д.Р., Гуменюк А.С., Ушмаров Д.И. Способ моделирования экспериментальной раны мягких тканей у крыс для разработки тактики лечения // Заявка на изобретение. №охранного документа 0002703709 от 21.10.2019.
15. СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ, Постановление от 28 января 2008 года №4).
16. Корейба К.А. Хирургические инфекционные поражения кожи и мягких тканей. Лечение длительно незаживающих ран: моногр. / К.А. Корейба, А.Р. Газиев. Казань: Отечество, 2011. 253 с.
17. Винник Ю.С. Современные методы лечения гнойных ран / Ю.С. Винник, Н.М. Маркелова, B.C. Тюрюмин // Сибирское медицинское обозрение. 2013. №1. с. 18-24.