МУЛЬТИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
MULTIVALENT VACCINE AGAINST BREAST CANCER

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке в соответствии с 35 U.S.C. §119 испрашивается приоритет временной заявки США, имеющей серийный номер No. 61/624680, поданной 16 апреля 2012 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ МАТЕРИАЛА
Приведено в качестве ссылки полное содержание машиночитаемого списка последовательностей, поданного одновременно с настоящей заявкой и обозначенного следующим образом: один ASCII (текстовый) файл 6222 байт, названный «PCT seq list_ST25.txt», созданный 15 апреля 2013 года.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Рак молочной железы является второй наиболее распространенной причиной смерти от рака среди женщин. В настоящее время предотвращение рака молочной железы преимущественно включает в себя снижение модифицируемых факторов риска, включая раннюю детекцию посредством медицинского осмотра и маммограмм, избегание не являющейся необходимой гормональной терапии после менопаузы, снижение употребления алкоголя, снижение массы тела, увеличение физической активности и генетическое тестирование мутаций генов, определяющих чувствительность к раку молочной железы типа 1 и типа 2 (BRCA1 и BRCA2 соответственно). Более агрессивные способы для подверженных высокому риску пациентов включают в себя химиопрофилактику с помощью тамоксифена, ралоксифена и ингибиторов ароматазы, так же, как профилактическую двустороннюю мастэктомию и оофорэктомию.
Несмотря на значительный риск для здоровья рака молочной железы и недостаточность профилактических мер, иммунотерапия рака молочной железы не разработана в качестве неотъемлемой части стандарта лечения. Для опухолеспецифических антигенов в качестве мишеней для противораковой вакцинации долгое время получали менее чем оптимальные результаты. Общей целью противораковой вакцинации традиционно являлась бустер-стимуляция латентного иммунного ответа на опухолеспецифические антигены. Способы включали в себя способы на основе клеток, включающие в себя иммунизацию цельными аутологичными или аллогенными опухолями, так же, как способы на основе антигенов, включающие в себя иммунизацию белками или пептидами со сверхэкспрессией в опухолях и пониженной экспрессией в нормальных тканях. Рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) и муцин (MUC1) являются преобладающими антигенами, используемыми в исследованиях вакцин против рака молочной железы человека. Хотя вакцинации с использованием этих антигенов могут показывать эффекты уменьшения опухоли, ни один антиген не обеспечивает специфичности для какой-либо ткани или опухоли, поскольку оба экспрессируются во множестве нормальных тканей и опухолей. Таким образом, отсутствие наследственной тканеспецифичности нацеленного на HER2 и MUC1 иммунитета может в конечном счете приводить к значительным системным аутоиммунным последствиям при проявлении сильного иммунного ответа.
Полноценная аутоиммунная атака, достаточная для индукции направленного поражения молочной железы, может обеспечивать эффективную терапию против развившихся злокачественных новообразований молочной железы, если антиген-мишень конститутивно экспрессируется в опухолях молочной железы. Более того, если выбранный антиген-мишень экспрессируется в нормальной ткани молочной железы в условиях, которые можно легко устранить, тогда вакцина может обеспечивать безопасную и эффективную защиту против развития рака молочной железы.
Альфа-лактальбумин (α-лактальбумин) человека представляет собой экспрессируемый в определенных условиях, специфический для молочной железы связанный с дифференцировкой белок, обнаруженный в большинстве злокачественных новообразований молочной железы. Экспрессия α-лактальбумина, как неотъемлемого связанного с дифференцировкой белка, вовлеченного в регуляцию биосинтеза лактозы, является специфической для молочной железы, и его экспрессия и синтез зависят от условий лактации. α-Лактальбумин человека также конститутивно экспрессируется в большинстве опухолей молочной железы, является специфическим для молочной железы и является достаточно иммуногенным для индукции эффективного провоспалительного иммунного ответа. Таким образом, иммунизация против α-лактальбумина человека предлагает безопасный и эффективный способ вакцинации для предотвращения рака молочной железы.
Обширные исследования авторов настоящего изобретения с использованием иммунизации α-лактальбумином в моделях опухолей на мышах показали его значительный потенциал для ингибирования роста опухолей молочной железы, особенно при введении в профилактических условиях или на ранней стадии в ходе роста опухоли молочной железы. На основании этих исследований с α-лактальбумином заявители разработали систему принципов для отбора иммунотерапевтических мишеней для вакцинации и предотвращения рака молочной железы, а именно: 1) антиген должен является конститутивно сверхэкспрессированным в большинстве опухолей-мишеней; 2) экспрессия антигена-мишени в нормальной ткани должна являться зависимой от условий; и 3) условие, определяющее экспрессию антигена-мишени в нормальной ткани, должно являться легко устранимым. При этих необходимых условиях связанные с лактацией белки, характеризующиеся экспрессией, ограниченной функциональным состоянием молочной железы и зависимой от него, выделяются в качестве идеальных мишеней-кандидатов для профилактической вакцинации против рака молочной железы.
На основании значительного противоопухолевого ответа, достигнутого посредством вакцинации α-лактальбумином в отсутствие побочного воспаления нормальных тканей, заявители заключают, что мультивалентная вакцина, содержащая два или более связанных с лактацией белка-кандидата, может существенно улучшать эффективность вакцинации против опухолей молочной железы. Улучшения противоопухолевого эффекта с использованием способа мультивалентной вакцинации можно достигать на двух уровнях: 1) посредством увеличения силы иммунного ответа против возникающей опухоли благодаря активации большего репертуара T-клеток, содержащего множество линий T-клеток, узнающих более одной опухолеспецифической мишени; 2) посредством покрытия более широкого диапазона опухолей, включая опухоли, не экспрессирующие белок, на который нацелен способ моновалентной вакцинации, такой как α-лактальбумин. Кроме того, мультивалентная вакцина может обладать потенциалом для нацеливания на опухоли с утратой или понижающей регуляцией экспрессии одного или нескольких белков или приобретенной попеременной экспрессией белков из-за дисрегуляции транскрипции в ходе их постепенного изменения от нормы до диспластической стадии, до стадии карциномы in situ, до инвазивной и до метастазирующей стадий постепенного изменения опухоли молочной железы. Иными словами, способ мультивалентной вакцины может оказывать большее направленное на множество мишеней иммунологическое давление как на опухоли на ранних стадиях, так и на развивающиеся опухоли. Он может таким образом покрывать большее разнообразие опухолей и увеличивать эффективность профилактики, так же, как обеспечивать более эффективную терапию посредством снижения вероятности избегания опухолью и возникновения устойчивости к вакцине.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявители идентифицировали 4 зависимых от лактации белка-кандидата, а именно α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и κ-казеин. Каждый из белков характеризуется сверхэкспрессией в опухолях молочной железы мыши 4T1 и во многих опухолях молочной железы человека, так же, как изолированной экспрессией, ограниченной только лактирующей мышью и тканями молочной железы человека. В соответствии с одним из вариантов осуществления каждый из этих белков используют для индукции иммунной защиты против развития рака молочной железы в отсутствие какого-либо побочного повреждения нормальной ткани молочной железы, так же, как других нормальных тканей, включая головной мозг, сердце, легкое, почку, печень, селезенку, желудок, кишечник, матку, яичники и мочевой пузырь.
В соответствии с одним из вариантов осуществления, изобретение относится к мультивалентной антигенной композиции, содержащей два или более иммуногенных полипептида человека, выбранных из связанных с лактацией белков человека. В одном варианте осуществления связанные с лактацией полипептиды выбраны из группы, состоящей из полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3, и полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4. Мультивалентная антигенная композиция может, как правило, дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, пригодный для введения пациенту-человеку. В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция может содержать три различных связанных с лактацией полипептида человека и в следующем варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция может содержать четыре различных связанных с лактацией полипептида человека.
В одном варианте осуществления изобретение относится к мультивалентной антигенной композиции, содержащей:
полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;
полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;
полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3; и
полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции специфического для связанного с лактацией белка иммунного ответа у пациента. Способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей связанный с лактацией пептид, описанной в настоящем документе, пациенту. Композицию можно вводить либо профилактически до детекции злокачественной опухоли (например, в ответ на генетическое тестирование мутаций генов, определяющих чувствительность к раку молочной железы типа 1 и типа 2 (BRCA1 и BRCA2 соответственно)), или композицию можно вводить терапевтически (либо отдельно, либо совместно с другими видами противораковой терапии). В одном варианте осуществления изобретение относится к способу активации T-клеток человека, способных индуцировать специфический для ткани молочной железы воспалительный ответ у пациента-человека. Способ включает стадию контакта T-клеток с композицией, содержащей выделенные дендритные клетки человека, предварительно подвергнутые воздействию композиции, содержащей связанный с лактацией полипептид, описанной в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1A-1C. Показана иммуногенность рекомбинантного α-лактальбумина мыши. Клетки лимфатических узлов оценивали через 10 суток после иммунизации самок мышей SWXJ α-лактальбумином, и показаны вторичные ответы, которые являются a) антигенспецифическими к рекомбинантному α-лактальбумину мыши, но не к рекомбинантному кохлину человека в диапазоне дозирования (см. фиг. 1A); b) вызванными у очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток в ответ на 25 мг/мл α-лактальбумина (см. фиг. 1B); и c) соответствующими провоспалительному профилю цитокинов типа 1 с высокой продукцией IFNγ и IL-2 и низкой продукцией цитокинов типа 2, IL-4, IL-5 и лактальбумина (см. фиг. 1С). Все планки погрешностей показывают ±SEM.
Фиг. 2. Показан анализ ткани молочной железы в ходе аутоиммунно индуцированного повреждения молочной железы. Анализ ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени ткани лактирующей молочной железы показывает значимо повышенные уровни экспрессии IFNγ (p=0,001), но не IL-10 (p>0,10). Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.
Фиг. 3A-3B. Показано, что вакцинация α-лактальбумином профилактически ингибирует рост опухолей молочной железы. Рост аутохтонных опухолей молочной железы является значимо ингибированным у мышей MMTV-neu в возрасте десяти месяцев, иммунизированных α-лактальбумином в возрасте восьми недель (p=0,0004; фиг. 3А). Рост трансплантированных опухолей 4T1 является значимо ингибированным после профилактической иммунизации α-лактальбумином за 13 суток до инокуляции опухоли (p=0,0006; Фиг. 3B). Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.
Фиг. 4A-4C. Показано, что вакцинация α-лактальбумином лечит прижившиеся растущие трансплантированные опухоли молочной железы. Значимое ингибирование роста опухоли 4T1 происходит после иммунизации α-лактальбумином через 5 суток после инокуляции опухоли (p<0,01; фиг. 4A) и через 13 суток после инокуляции опухоли (p<0,01; фиг. 4B), но не через 21 сутки после инокуляции опухоли (p>0,10; 20 фиг. 4C). Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.
Фиг. 5. Показано, что вакцинация α-лактальбумином лечит развившиеся растущие аутохтонные опухоли молочной железы. Значимое ингибирование (p<0,0006) роста необычайно агрессивных аутохтонных опухолей происходит после иммунизации α-лактальбумином трансгенных мышей MMTV-PyVT в возрасте 6 недель. Из-за массивного многоочагового роста опухоли, опухоли у мышей MMTV-PyVT являются пригодными для измерения только в одном направлении. Наибольшие измерения всех десяти опухолей MMTV-PyVT складывают для расчета общей опухолевой нагрузки в мм на каждые сутки.
Фиг. 6A-6C. Показано, что специфические для α-лактальбумина T-клетки индуцируют воспаление и цитотоксичность для опухоли. Для вторичных ответов на α-лактальбумин, как измерено посредством ELISA, показан провоспалительный фенотип типа-1, включающий в себя высокий уровень продукции IFNγ по сравнению с IL-5 и IL-10 (фиг. 6A). Анализ ELISPOT TIL показывает, что скорее CD4+, а не CD8+ T-клетки продуцируют IFNγ (фиг. 6B). Гибель культивированных клеток опухолей 4T1 ингибируют посредством обработки культивированных примированных α-лактальбумином LNC антителами, специфическими для CD8 мыши, что указывает на то, что CD8+ T-клетки опосредуют специфическую для 4T1 цитотоксичность (фиг. 6C).
Фиг. 7A-7D. Показано, что ингибирование роста опухоли посредством вакцинации α-лактальбумином опосредовано T-клетками. Перенос примированных α-лактальбумином LNC наивным мышам-реципиентам BALB/c в те же сутки, что и инокуляция опухолей 4T1, приводит к a) значимому ингибированию роста опухоли (p<0,0001; фиг. 7A); b) к значимому снижению встречаемости несущих опухоль мышей (p<0,03; фиг. 7B); и c) к значимому снижению конечной массы опухоли (p<0,0008; фиг. 7C). По сравнению с примированными овальбумином (OVA) LNC, значимое ингибирование роста опухоли происходит у наивных мышей после введения либо CD4+ T-клеток (p=0,002; фиг. 7D, левая панель), либо CD8+ T-клеток (p=0,003; фиг. 7D, правая панель), обогащенных отделением на магнитных бусинах от примированных α-лактальбумином LNC. Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.
Фиг. 8. Показано примирование in vitro T-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека с использованием полученных из крови дендритных клеток (DC) для тестирования доступности репертуара узнающих α-лактальбумин человека T-клеток. Примирование PMBC α-лактальбумином приводит к увеличенной частоте продуцирующих IFNγ T-клеток при последующем представлении α-лактальбумина (вторичный ответ).
Фиг. 9. Дифференциальная экспрессия связанных с лактацией белков в линиях клеток рака молочной железы человека. РНК, выделенную из линий клеток рака молочной железы человека, клеток SK-BR-3 и HCC1937 (ATCC, Manassas, VA), подвергали амплификации ОТ-ПЦР в течение 38 циклов с геноспецифическими праймерами. Для клеток трижды отрицательного рака молочной железы HCC1937, полученных из первичного злокачественного новообразования молочной железы, показана амплификация всех белков, за исключением β-казеина, в то время как HER2-положительные клетки рака молочной железы SK-BR-3, полученные из метастазирующей опухоли молочной железы, не экспрессировали α-лактальбумин, но экспрессировали все другие связанные с лактацией белки. Экспрессия гена домашнего хозяйства β-актина происходила во всех линиях клеток, но не после амплификации контрольного вектора авторов настоящего изобретения, разработанного для экспрессии только α-лактальбумина человека.
3
Фиг. 10A-10B. Иммуногенность очищенных связанных с лактацией белков у самок мышей BALB/cJ. Элюаты белка с аффинных колонок Ni-NTA подвергали электрофорезу в 10% полиакриламидном геле с Трис-HCl (см. фиг. 10A). В окрашенном Кумасси геле показаны полосы очищенного связанного с лактацией белка предсказанного размера в дорожках слева от каждого маркера белка kaleidoscope (см. Фиг. 10B). Через десять суток после иммунизации самок мышей BALB/cJ (n=3/группу) 100 мкг рекомбинантного α-лактальбумина мыши или рекомбинантного α-казеина мыши в CFA, дренирующие LNC тестировали по вторичным пролиферативным ответам (поглощению H-тимидина). Оба белка являлись высоко иммуногенными с антигенспецифическими вторичными ответами на α-лактальбумин (левая панель) и α-казеин (правая панель) и без ответов на контрольные антигены, OVA и лизоцим куриного яйца, где последний обладает значительной гомологией с α-лактальбумином.
3
Фиг. 11A-11B. Иммуногенное разнообразие очищенных связанных с лактацией белков в различных линиях мышей. Нормальных самок мышей из линий, представляющих разнообразные варианты гаплотипов (n=3/линию), иммунизировали 100 мкг рекомбинантного α-лактальбумина мыши (см. фиг. 11A) или рекомбинантного α-казеина мыши в CFA (см. фиг. 11B). Через десять суток дренирующие LNC тестировали по вторичным пролиферативным ответам (поглощению H-тимидина) на примирующий иммуноген. κ-казеин являлся более иммуногенным, чем α-лактальбумин у мышей BALB/cJ, все еще не вызывая ответа у мышей RIIIS/J, C3H/HeJ и FVB.
Фиг. 12A-12B. Повышенной экспрессии гена IFNg не возникало в каких-либо исследованных нелимфоидных тканях от нормальных, здоровых, нелактирующих мышей, иммунизированных прекратившими экспрессию связанными с лактацией белками. Через шесть недель после иммунизации α-лактальбумином (см. фиг. 12A) или κ-казеином (см. фиг. 12B) тотальную РНК от нормальных нелактирующих мышей анализировали по экспрессии гена IFNg посредством общепринятой ОТ-ПЦР. Экспрессия гена IFNγ не детектирована в каких-либо нелимфоидных тканях.
Фиг. 13. Эффективность мультивалентной вакцинации против связанных с лактацией белков для регуляции рака молочной железы. При сравнении с контрольной вакцинацией полным адъювантом Фрейнда (CFA), рост трансплантированных опухолей молочной железы 4T1 у самок мышей BALB/c являлся значимо ингибированным (P<0,01 во всех случаях) после иммунизации α-лактальбумином или α-казеином в качестве индивидуальных иммуногенов или после совместной иммунизации, как α-лактальбумином, так и α-казеином. Все вакцинации происходили за сутки инокуляции опухоли. Все планки погрешностей показывают ±SE.
Фиг. 14. Дифференциальная экспрессия связанных с лактацией белков при раке молочной железы человека. РНК, выделенную из линий клеток рака молочной железы человека, клеток SK-BR-3 и HCC1937 (ATCC, Manassas, VA), подвергали амплификации ОТ-ПЦР в течение 38 циклов с геноспецифическими праймерами. Для линии клеток трижды отрицательного рака молочной железы, полученных из первичного злокачественного новообразования молочной железы, показана амплификация как α-лактальбумина, так и α-казеина, в то время как HER2-положительные клетки рака молочной железы SK-BR-3, полученные из метастазирующей опухоли молочной железы, экспрессировали α-казеин, но не экспрессировали α-лактальбумин. Экспрессия гена домашнего хозяйства β-актина происходила в обеих линиях клеток, но не после амплификации контрольного вектора, разработанного для экспрессии только α-лактальбумина человека.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
При описании и заявлении в формуле изобретения следующую терминологию используют в соответствии с определениями, указанными ниже.
Как применяют в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя любой из общепринятых фармацевтических носителей, таких как раствор фосфатно-солевого буфера, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода или вода/масло, и различные типы увлажняющих средств. Термин включает в себя также любое из средств, одобренных регуляторным органом Федерального правительства США или перечисленных в Фармакопее США для использования у животных, включая человека.
Как применяют в настоящем документе, термин «лечение» включает в себя профилактику конкретного нарушения или состояния, или облегчение симптомов, связанных с конкретным нарушением или состоянием, и/или предотвращение или исключение указанных симптомов.
Как применяют в настоящем документе, «эффективное» количество или «терапевтически эффективное количество» лекарственного средства относится к нетоксичному, но достаточному количеству лекарственного средства для обеспечения желаемого эффекта. Например, одним из желаемых эффектов может являться предотвращение или лечение рака молочной железы. Количество, которое является «эффективным», может меняться от субъекта к субъекту, в зависимости от возраста и общего состояния здоровья индивидуума, способа введения и т.п. Таким образом, не всегда возможно указать точное «эффективное количество». Однако подходящее «эффективное» количество в любом индивидуальном случае может определить специалист в данной области с использованием общепринятых экспериментов.
Термин «парентеральный» обозначает не через пищеварительный тракт, но посредством некоторых других способов, таких как интраназальный, ингаляция, подкожный, внутримышечный, интраспинальный или внутривенный.
Как применяют в настоящем документе, «линкер» представляет собой связь, молекулу или группу молекул, связывающих два отдельных соединения друг с другом. Линкеры могут обеспечивать оптимальное расположение в пространстве двух соединений или могут дополнительно обеспечивать лабильную связь, позволяющую отделение двух соединений друг от друга. Лабильные связи включают в себя фотоотщепляемые группы, кислотолабильные группы, щелочно-лабильные группы и отщепляемые ферментами группы.
Как применяют в настоящем документе, термин «пациент» без дополнительного указания предназначен для включения любых теплокровных позвоночных домашних животных (включая, например, но без ограничения, скот, лошадей, кошек, собак и других домашних животных) и человека.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
В соответствии с одним из вариантов осуществления представлена мультивалентная антигенная композиция для индукции иммунного ответа у пациента. В одном варианте осуществления мультивалентную антигенную композицию вводят профилактически для предотвращения рака молочной железы. В одном иллюстративном аспекте композицию вводят нелактирующим женщинам, подверженным риску развития рака молочной железы. Альтернативно в одном варианте осуществления композицию вводят, необязательно, в сочетании с другими известными видами противораковой терапии для лечения рака молочной железы. В соответствии с одним из вариантов осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит два или более связанных с лактацией белка или их антигенных фрагмента, включая, например, α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин.
В одном варианте осуществления описана мультивалентная вакцина против рака молочной железы человека, содержащая два или более иммуногенных связанных с лактацией полипептида. В одном варианте осуществления один из иммуногенных связанных с лактацией полипептидов содержит α-лактальбумин человека в соответствии с аминокислотной последовательностью. В одном варианте осуществления α-лактальбумин содержит последовательность:
KQFTKCELSQ LLKDIDGYGG IALPELICTM FHTSGYDTQA IVENNESTEY GLFQISNKLW CKSSQVPQSR NICDISCDKF LDDDITDDIM CAKKILDIKG IDYWLAHKAL CTEKLEQWLC EKL (SEQ ID NO: 1).
В соответствии с одним из вариантов осуществления представлена мультивалентная антигенная композиция, содержащая 2, 3 или 4 антигенных связанных с лактацией полипептидов. В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит два или более пептида, выбранных из α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека, где последовательность αS1-казеина представляет собой:
RPKLP LRYPERLQNP SESSEPIPLE SREEYMNGMN RQRNILREKQ TDEIKDTRNE STQNCVVAEP EKMESSISSS SEEMSLSKCA EQFCRLNEYN 20 QLQLQAAHAQEQIRRMNENS HVQVPFQQLN QLAAYPYAVW YYPQIMQYVP FPPFSDISNP TAHENYEKNNVMLQW (SEQ ID NO: 2);
последовательность β-казеина представляет собой:
ALALARETIE SLSSSEESIT EYKQKVEKVK HEDQQQGEDE HQDKIYPSFQ PQPLIYPFVE PIPYGFLPQN ILPLAQPAVV LPVPQPEIME VPKAKDTVYT KGRVMPVLKS PTIPFFDPQI PKLTDLENLH LPLPLLQPLM QQVPQPIPQT LALPPQPLWS VPQPKVLPIP QQVVPYPQRA VPVQALLLNQ ELLLNPTHQI YPVTQPLAPV HNPISV (SEQ ID NO: 3); и
последовательность κ-казеина представляет собой:
EVQNQKQPAC HENDERPFYQ KTAPYVPMYY VPNSYPYYGT NLYQRRPAIA INNPYVPRTY YANPAVVRPH AQIPQRQYLP NSHPPTVVRR PNLHPSFIAI PPKKIQDKII IPTINTIATV EPTPAPATEP TVDSVVTPEA FSESIITSTP ETTTVAVTPP ТА (SEQ ID NO: 4).
В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит полипептид из SEQ ID NO: 1 или полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 1 модификацией одной аминокислоты, и два или более полипептида, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 модификацией одной аминокислоты, где модификация аминокислоты представляет собой замену, делецию или вставку аминокислоты, или посттрансляционную модификацию аминокислоты. В одном варианте осуществления модификация одной аминокислоты представляет собой консервативную аминокислотную замену.
В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит 2, 3 или 4 полипептида, выбранные из группы, состоящей из полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3, и полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4. В одном варианте осуществления антигенная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, и полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2.
В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, и
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, и
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;
и полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2; и
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3; и
полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления представлена мультивалентная вакцина, содержащая полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;
полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;
полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3; и
полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления полипептиды из антигенных композиций связаны друг с другом через связывающую группу. В одном варианте осуществления полипептиды связаны способом голова к хвосту (т.е. аминоконец одного полипептида связан с карбоксиконцом второго полипептида). В следующем варианте осуществления полипептиды связаны посредством аминокислотного линкера, и в одном варианте осуществления линкер представляет собой дипептид или трипептид. Как правило, связывающие аминокислоты выбраны из глицина и аланина, и в одном варианте осуществления полипептиды связаны с помощью линкера Gly-Gly или Ala-Ala-Ala.
Следует принимать во внимание, что связанные с лактацией белки после введения процессируются in vivo протеазами до меньших пептидных фрагментов, способных связываться с молекулами MHC класса I и/или MHC класса II на антигенпредставляющих клетках. Затем T-клеточные рецепторы узнают и связывают молекулу MHC, с которой связан пептид, образуя первичный сигнал, инициирующий иммунный ответ.
В одном варианте осуществления вакцина дополнительно содержит адъювант и фармацевтически приемлемый носитель. Как применяют в настоящем документе, термин «адъювант» относится к средству, стимулирующему иммунную систему и увеличивающему ответ на вакцину. Адъюванты для вакцин хорошо известны специалистам в данной области. Для иллюстрации, GPI-0100 является пригодным для вакцин адъювантом. Как применяют в настоящем документе, термин «носитель» относится к ингредиенту, отличному от активного компонента (компонентов) в составе. Выбор носителя может в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения или применения, эффект носителя на растворимость и стабильность, и природа лекарственной формы. Фармацевтически приемлемые носители для полипептидных антигенов хорошо известны в данной области.
В одном варианте осуществления вакцину вводят профилактически для предотвращения рака молочной железы. В одном иллюстративном аспекте композицию вводят нелактирующим женщинам, подверженным риску развития рака молочной железы.
В одном варианте осуществления вакцину вводят для ингибирования распространения клеток опухоли. Вакцину можно вводить до или после детекции клеток опухоли молочной железы у пациента. Ингибирование распространения клеток опухоли следует понимать как относящееся к предотвращению возникновения, остановке, замедлению роста или уничтожению клеток опухолей.
В одном иллюстративном аспекте T-клетки иммунной системы человека активируют после введения иммуногенной композиции, содержащей α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и/или κ-казеин человека. Активированные T-клетки могут являться CD4+ и/или CD8+.
В одном варианте осуществления после введения вакцины, содержащей α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и/или κ-казеин человека, индуцируют провоспалительный ответ посредством последующей встречи иммуноцитов с α-лактальбумином, αS1-казеином, β-казеином или κ-казеином. Провоспалительный иммунный ответ включает в себя продукцию провоспалительных цитокинов и/или хемокинов, например интерферона гамма (IFNγ) и/или интерлейкина 2 (IL-2). Провоспалительные цитокины и хемокины хорошо известны в данной области. В соответствии с одним из вариантов осуществления полипептиды из мультивалентной антигенной композиции дополнительно модифицируют для получения иммуностимулирующего цитокина, ковалентно связанного с одним или несколькими полипептидами. В одном варианте осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-2 и интерлейкина-4.
Следует принимать во внимание, что когда вакцину против рака молочной железы вводят пациентам, ткань молочной железы которых активно не продуцирует α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин человека в значительных количествах (т.е. нелактирующим женщинам или женщинам, лишенным продуцирующих α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин клеток опухолей молочной железы), иммунизация α-лактальбумином, αS1-казеином, β-казеином или κ-казеином человека не вызывает существенного воспалительного иммунного ответа (т.е. способного вызывать повреждение ткани молочной железы) в ткани молочной железы. Последующая встреча с α-лактальбумином, αS1-казеином, β-казеином или κ-казеином человека, такими как экспрессированные клетками развивающейся опухоли, вызывает вторичный ответ иммунной системы. Вторичный ответ включает в себя, но без ограничения, увеличение продукции провоспалительных цитокинов, таких как IFNγ и IL-2, стимулирующих активную атаку иммунной системы против клеток, экспрессирующих α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин.
В случае, в котором α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и/или κ-казеин человека продуцируют только клетки молочной железы человека, провоспалительный иммунный ответ является специфическим для тканей молочной железы.
В одном варианте осуществления описан способ иммунизации пациента-человека против α-лактальбумина, αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека. Способ включает в себя стадию введения пациенту иммуногенной композиции, содержащей полипептид, содержащий два или более полипептида, выбранных из α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), β-казеина (SEQ ID NO: 3) и/или κ-казеина (SEQ ID NO: 4) человека. В одном аспекте иммуногенная композиция содержит полипептид, в основном состоящий из α-лактальбумина человека, и один другой полипептид, выбранный из группы из αS1-казеина, β-казеина и κ-казеина.
В одном варианте осуществления описан способ активации T-клеток человека, способных индуцировать специфический для ткани молочной железы воспалительный ответ у пациента-человека. Способ включает в себя стадию контакта T-клеток с композицией, содержащей выделенные дендритные клетки человека, ранее подвергнутые воздействию полипептида, содержащего два или более полипептида, выбранных из α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), β-казеина (SEQ ID NO: 3) и/или κ-казеина (SEQ ID NO: 4) человека. Активированные T-клетки проявляют вторичный ответ при последующем представлении α-лактальбумина, αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека. Вторичный ответ включает в себя продукцию провоспалительных цитокинов и/или хемокинов, включая, например, IFNγ.
В одном варианте осуществления описана вакцина для предотвращения или лечения рака молочной железы. Вакцина содержит иммуногенный полипептид, содержащий два или более полипептида, выбранных из α-лактальбумина, αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека. После введения пациентам, обладающим тканью молочной железы, продуцирующей α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин, вакцина индуцирует специфический для ткани молочной железы провоспалительный иммунный ответ.
В одном варианте осуществления описан способ лечения злокачественной опухоли у пациента-человека. Способ включает в себя стадию введения пациенту композиции, содержащей два или более полипептида, выбранных из α-лактальбумина, αS1-казеина, β-казеина и κ-казеина человека, адъювант и фармацевтически приемлемый носитель, в количестве, эффективном для индукции специфического для ткани молочной железы воспалительного ответа у пациента-человека. В одном варианте осуществления адъювант представляет собой GPI-0100.
В одном варианте осуществления описан способ лечения злокачественной опухоли у пациента-человека. Способ включает в себя стадию введения пациенту связанной с лактацией композиции, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления композиция содержит выделенные дендритные клетки человека, нагруженные α-лактальбумином, αS1-казеином, β-казеином или κ-казеином, в количестве, эффективном для индукции специфического для ткани молочной железы воспалительного ответа у пациента-человека.
В одном варианте осуществления описан способ индукции специфического для ткани молочной железы воспалительного ответа у пациента-человека. Способ включает в себя введение пациенту композиции, где композиция содержит два или более полипептида, выбранных из α-лактальбумина, αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека, адъювант и фармацевтически приемлемый носитель, где увеличение количества узнающих α-лактальбумин продуцирующих IFNγ T-клеток получают после введения композиции.
В одном варианте осуществления описан способ индукции специфического для ткани молочной железы воспалительного ответа у пациента-человека. Способ включает в себя введение пациенту композиции, где композиция содержит выделенные дендритные клетки человека, нагруженные α-лактальбумином, αS1-казеином, β-казеином или κ-казеином человека, где увеличение количества узнающих α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин продуцирующих IFNγ T-клеток получают после введения композиции. Эффективное количество α-лактальбумина, αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека относится к количеству α-лактальбумина, αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека, которое является достаточным для захвата антигенпредставляющими клетками и/или активации T-клеток для вызова иммунного ответа.
В соответствии с различными вариантами осуществления для лечения или предотвращения рака молочной железы вводят одну или несколько бустер-инъекций вакцины.
T-клетки узнают отдельные пептиды белковых антигенов, представленные в контексте антигенпредставляющих молекул, которые, как правило, экспрессированы на макрофагах и дендритных клетках иммунной системы. Узнавание пептида, как правило, происходит после фагоцитарного процессинга антигена антигенпредставляющими клетками и нагрузки небольших пептидных фрагментов на молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и/или класса II. После того, как CD4+ T-клетки узнают пептиды, представленные на молекулах MHC класса II, они быстро пролиферируют и становятся эффекторными T-клетками, которые могут активировать другие иммунные эффекторные клетки.
Считают, что CD8+ T-клетки узнают пептиды, представленные молекулами MHC класса I, после чего они развиваются в цитотоксические эффекторные клетки, способные лизировать и уничтожать клетки, экспрессирующие конкретный белок. Молекулы CD4 и CD8 служат корецепторами из-за их взаимодействий с молекулами MHC. Считают, что они являются необходимыми для эффективного опосредованного T-клетками иммунного ответа.
Способность мультивалентной антигенной композиции, содержащей α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и/или κ-казеин человека, представлять собой эффективный полипептидный антиген в вакцине против рака молочной железы зависит от того, является ли α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин человека достаточно иммуногенным у человека для вызова провоспалительного иммунного ответа. Иммуногенность конкретного белка, такого как α-лактальбумин человека, является очень непредсказуемой и частично зависит от конкретной аминокислотной последовательности белка, его поглощения и процессинга антигенпредставляющими клетками на более мелкие пептидные фрагменты, доступности соответствующих участков связывания MHC для процессированных пептидных фрагментов, и доступности отвечающих соответствующим образом T-клеток со специфическими последовательностями рецепторов, которые могут узнавать и связывать пептид в контексте связывающего кармана MHC.
Мультивалентный белок можно вводить сериями или в сочетании с другими лекарственными средствами, используемыми в лечении злокачественных опухолей и других родственных заболеваний. Эти лекарственные средства включают в себя IFN-альфа, IFN-бета, интерлейкин-1, интерлейкин-2, фактор некроза опухоли, макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор активации макрофагов, лимфотоксин, фактор роста фибробластов и т.д. (полученные из природных источников или экспрессированные рекомбинантным способом). Альтернативно, мультивалентную вакцину можно вводить сериями или в сочетании с общепринятыми химиотерапевтическими средствами, такими как 5-фторурацил; паклитаксел; этопозид; карбоплатин; цисплатин; топотекан, метотрексат и т.д., и/или радиотерапией. В таких способах комбинированной терапии можно преимущественным образом использовать менее чем общепринятые дозы этих средств или включать менее радикальные режимы, таким образом, избегая любой потенциальной токсичности или рисков, связанных с этими способами терапии.
В соответствии с одним из вариантов осуществления антигенные полипептиды можно получать рекомбинантным способом, включая экспрессию нескольких полипептидов, связанных вместе в форме слитых пептидов. В одном варианте осуществления мультивалентную вакцину можно вводить в любой фармацевтически приемлемой форме, внутрь опухоли, перитуморально, внутрь очагов, внутривенно, внутримышечно, подкожно или местными способами для оказания местных терапевтических эффектов. В качестве альтернативы введению мультивалентной вакцины, ген, кодирующий вакцину, можно вводить в клетки злокачественных опухолей посредством обработки инфицированных клеток, например, посредством их соскребания, чтобы позволить поглощение ДНК, посредством электропорации, посредством прямой инъекции и т.д.
В одном аспекте изобретения представлен способ получения иммуногенного варианта пептида из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Способ включает в себя (i) получение исходного пептида, (ii) модификацию исходного пептида посредством замены, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот и (iii) тестирование варианта пептида из (ii) по иммуногенности. Пептиды можно также тестировать по их связыванию с HLA-A2 различными способами. (1) Посредством инкубации 50 мкМ пептида с клетками T2 в течение ночи, отмывки избытка пептида и затем проведения анализа FACs для оценки связывания на основании стабилизированной экспрессии HLA-A2 на клетках T2. (2) Посредством исследования способности пептидов индуцировать ответы T-клеток (как измерено анализами ELISA IFN-гамма) при загрузке на дендритные клетки, полученные из аутологичных моноцитов нормального донора в реакциях смешанной культуры лимфоцитов. В одном аспекте изобретения представлен способ получения антисыворотки против антигена, где указанный способ включает в себя введение мультивалентных композиций по изобретению или нуклеиновой кислоты, кодирующей связанные с лактацией полипептиды, экспрессирующего вектора, содержащего такую последовательность нуклеиновой кислоты, или клетки или T-клетки по изобретению не относящемуся к человеку млекопитающему, и выделение иммунной сыворотки от указанного млекопитающего. Представлено также антитело, которое можно получать из указанной сыворотки.
Пептиды по изобретению могут составлять от 8 до 50 аминокислот в длину, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25, от 8 до 20 аминокислот. Например, пептиды могут составлять 9-50 или 9-25 аминокислот в длину. Например, пептид по изобретению может составлять 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 20 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в длину. В одном варианте осуществления пептиды по изобретению составляют 9 или 10 аминокислот в длину. «Эпитоп», как применяют в настоящем документе, относится к той части пептида, которая является способной связываться с молекулой MHC и вызывать иммунный ответ. Он может представлять собой T-клеточный эпитоп.
3
Таким образом, изобретение относится к композициям, содержащим два или более иммуногенных связанных с лактацией полипептида, выбранных из SEQ ID NO 1, 2, 3 или 4, или их функциональных вариантов, которые влияют на связывание, облегчают связывание или вносят вклад в связывание пептида с молекулой MHC. В следующем аспекте по изобретению представлен способ получения иммуногенного варианта пептида, где способ включает в себя (i) получение исходного пептида, где исходный пептид содержит фрагмент из по меньшей мере 9 последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, (ii) модификацию последовательности исходного пептида посредством замены, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот (таким образом получая вариант пептида) и (iii) тестирование варианта пептида из (ii) по иммуногенности. В частности, вариант можно тестировать по его способности связываться с молекулой MHC и индуцировать специфический иммунный ответ T-клеток. Способы тестирования варианта пептида по иммуногенности известны в данной области. Такие способы включают в себя, например, оценку связывания пептидов с клетками T2, показывающую стабилизацию молекулы HLA-A2 на поверхности клеток T2. Это можно проводить в одной временной точке или в форме зависимости от времени, чтобы показать скорость диссоциации пептида. Дополнительные способы включают в себя: i) реакции смешанной культуры лимфоцитов, в которой полученные из моноцитов дендритные клетки нагружают пептидом и стимуляцию T-клеток оценивают посредством анализов пролиферации (с H-тимидином), ii) анализы секреции цитокинов (секреции IFN-гамма, измеренной посредством анализов ELISA или ELISpot), iii) продукции IFN-гамма, измеренной посредством анализов внутриклеточных цитокинов проточной цитометрией, iv) анализов на бусинах CBA для определения массива цитокинов, продуцированных после стимуляции, v) количественное измерение присутствия или экспансии специфических T-клеток с использованием стрептамеров, тетрамеров или пентамеров (т.е. мультимеров пептид-МНС, с которыми связываются T-клетки, если они узнают специфический пептид, представленный на MHC) в анализах проточной цитометрии или массивов pMHC, и vi) очистку специфических для пептида T-клеток с использованием стрептамеров, тетрамеров или пентамеров для дальнейших исследований секреции цитокинов или уничтожения CTL (см. vi) и vii)), анализы уничтожения CTL (высвобождения хрома, анализы CTL in vivo или анализы JAM), в которых клетки-мишени могут являться нагруженными пептидом или эндогенно экспрессировать интересующий антиген, и ответа T-клеток на мишени посредством измерения красителя CFSE или пролиферации T-клеток или высвобождения хрома.
ПРИМЕР 1
Заявители идентифицировали 4 зависимых от лактации белка-кандидата, а именно α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и κ-казеин, для использования в вакцине для предотвращения или лечения рака молочной железы. Каждый из белков характеризуется сверхэкспрессией в опухолях молочной железы 4T1 мыши и во многих опухолях молочной железы человека, так же, как изолированной экспрессией, ограниченной только лактирующей мышью и тканями молочной железы человека. В соответствии с одним из вариантов осуществления каждый из этих белков используют для индукции иммунной защиты против развития рака молочной железы в отсутствие какого-либо побочного повреждения нормальной ткани молочной железы, так же, как других нормальных тканей, включая головной мозг, сердце, легкое, почку, печень, селезенку, желудок, кишечник, матку, яичники и мочевой пузырь. Каждый рекомбинантный белок мыши можно использовать для активной иммунизации самок мышей BALB/c. Иммуногенность можно измерять посредством определения частот T-клеток в примированных 10 суток клетках лимфатических узлов, и способность защищать против инокулированных опухолей молочной железы 4T1 можно измерять начиная с двух недель после вакцинации. В молочной железе и других тканях от нормальных вакцинированных мышей и от несущих опухолей вакцинированных мышей можно исследовать воспаление по гистологии и по экспрессии медиаторов воспаления посредством ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени. Исследования авторов настоящего изобретения могут определять способность каждого рекомбинантного белка опосредовать клинически эффективную защиту против роста опухоли молочной железы и то, возникает ли такая защита в отсутствие воспаления нормальных тканей. Успешно выбранные белки-мишени-кандидаты можно использовать в комбинации для определения того, является ли мультивалентная вакцина более эффективной для ингибирования роста опухоли молочной железы, чем отдельная моновалентная вакцина. Наконец, каждый белок-кандидат, выбранный для включения в оптимизированную мультивалентную вакцину авторов настоящего изобретения, можно проверять по иммуногенности у женщин посредством примирования in vitro человеческим рекомбинантным вариантом и определения частот антигенной специфичности T-клеток, продуцирующих провоспалительный цитокин, интерферон-гамма. Исследования авторов настоящего изобретения могут идентифицировать компоненты - белки-мишени для включения в мультивалентную профилактическую вакцину против рака молочной железы, разработанную для индукции оптимизированного иммунологического давления против любого угрожающего роста опухолей молочной железы человека.
Данные авторов настоящего изобретения показывают, что однократная иммунизация специфическим для молочной железы связанным с лактацией белком, α-лактальбумином, обеспечивает значительный уровень эффективной, но все еще безопасной профилактики против роста угрожающих опухолей молочной железы, в частности, в свете обширной детекции α-лактальбумина в злокачественных новообразованиях молочной железы человека и отсутствия какого-либо поддающегося детекции воспаления молочной железы у нормальных мышей, иммунизированных α-лактальбумином. Данные авторов настоящего изобретения показывают также, что включение других мишеней связанных с лактацией белков в дизайн вакцины авторов настоящего изобретения может облегчать более широкий ответ на вакцину в гетерогенной популяции и более широкое узнавание возникающих опухолей, все без значительного увеличения вероятности аутоиммунных осложнений
ПРИМЕР 2: Иммунизация α-лактальбумином активирует как CD4+, так и CD8+ провоспалительные T-клетки.
Рекомбинантный α-лактальбумин мыши очищают в денатурирующих условиях с использованием аффинной хроматографии на никеле-нитрилотриуксусной кислоте с последующей обращено-фазовой HPLC. Самок мышей SWXJ иммунизируют рекомбинантным α-лактальбумином мыши. Через десять суток после иммунизации клетки лимфатических узлов (LNC) у мышей обладают зависимой от дозы пролиферацией при вторичных ответах на α-лактальбумин и не отвечают на рекомбинантный кохлин человека, полученный в E. coli практически идентичным способом (см. фиг. 1A). Как CD4+, так и CD8+ T-клетки вовлечены в способность отвечать на α-лактальбумин (см. фиг. 1B). Более того, для α-лактальбумина показан провоспалительный фенотип, вовлеченный в высокий уровень продукции интерферона-гамма (IFNγ) и IL-2 и низкий уровень продукции IL-4, IL-5 и IL-10 (см. фиг. 1С).
ПРИМЕР 3: Иммунизация нелактирующих мышей α-лактальбумином не может индуцировать воспаление молочной железы.
Для ткани молочной железы нелактирующих мышей, иммунизированных α-лактальбумином, не показано воспалительной инфильтрации, но вместо этого постоянно показаны выделенные индивидуальные CD3+ T-клетки, мигрирующие через паренхиму молочной железы. Однако обширная инфильтрация T-клеток постоянно происходит через ткань молочной железы лактирующих мышей, иммунизированных α-лактальбумином. Для ткани молочной железы от лактирующих контрольных мышей, иммунизированных только CFA, не показано инфильтрации воспалительных T-клеток. Анализ инфильтрирующих в молочную железу T-клеток проточной цитометрией показывает высокую частоту CD3+CD4+ T-клеток и CD3+CD8+ T-клеток, экспрессирующих маркер активации CD44high. Анализ количественной ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени показывает, что ткань молочной железы от лактирующих мышей, иммунизированных α-лактальбумином, обладает значимо повышенными уровнями экспрессии IFNγ (p=0,001), но не IL-10 (p>0,10) по сравнению с уровнями, экспрессированными в ткани молочной железы от необработанных нормальных нелактирующих или лактирующих мышей, или от лактирующих мышей, иммунизированных только CFA (см. фиг. 2).
ПРИМЕР 4: Профилактическая вакцинация α-лактальбумином ингибирует рост опухолей молочной железы.
Мыши MMTV-neu экспрессируют не активированный протоонкоген neu (ErbB2 или HER2/neu) под регуляцией длинного концевого повтора вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV) и обладают 50% встречаемостью спонтанных опухолей молочной железы к возрасту 205 суток. Мышей MMTV-neu в возрасте восьми недель иммунизируют либо α-лактальбумином в CFA, либо только CFA. Всех мышей подвергают эвтаназии, когда первая опухоль достигает 17 мм в диаметре (в возрасте около 10 месяцев). После завершения эксперимента у всех иммунизированных CFA контрольных мышей развиваются опухоли молочной железы. В сравнении, ни у одной из мышей, иммунизированных α-лактальбумином, не показано каких-либо поддающихся детекции опухолей молочной железы (p=0,0004; см. фиг. 3А).
Профилактическая вакцинация α-лактальбумином является также эффективной против поддающихся трансплантации опухолей 4T1. Для мышей BALB/c, иммунизированных α-лактальбумином за 13 суток до инокуляции клеток опухолей 4T1, показано значимое ингибирование роста (p=0,0006; см. фиг. 3B).
ПРИМЕР 5: Вакцинация α-лактальбумином ингибирует рост прижившихся трансплантированных опухолей молочной железы 4T1.
После подкожной инокуляции мышам BALB/c 2×104 клеток опухолей 4T1 опухоли хорошо приживаются в пределах 5 суток после инокуляции, и поддающиеся пальпации опухоли присутствуют в пределах 2-3 недель после инокуляции. После инокуляции клеток опухолей 4T1 вакцинацию α-лактальбумином проводят на 5 сутки после инокуляции, на 13 сутки после инокуляции и на 21 сутки после инокуляции. Значимое ингибирования роста опухолей наблюдают при вакцинации на 5 сутки (p<0,01; см. фиг. 4A) и при вакцинации на 13 сутки (p<0,01; см. фиг. 4B), но не при вакцинации на 21 сутки (см. фиг. 4C). Отсутствие ингибирования роста опухолей у мышей, вакцинированных через 21 сутки после инокуляции, может являться обусловленным укороченным 11-суточным периодом наблюдения между временем иммунизации и временем, когда опухоли достигают максимального размера, предписывающего эвтаназию.
ПРИМЕР 6: Вакцинация α-лактальбумином ингибирует рост развившихся аутохтонных опухолей молочной железы.
Для трансгенных мышей MMTV-PyVT показана утрата способности к лактации, совпадающая с экспрессией трансгена, и развитие поддающихся пальпации очень агрессивно растущих опухолей молочной железы к возрасту 5 недель. В этом примере трансгенных мышей MMTV-PyVT вакцинируют в возрасте 6 недель α-лактальбумином. Наблюдают значимое ингибирование роста очень агрессивных развившихся аутохтонных опухолей у MMTV-PyVT (p<0,0006; см. фиг. 5). Таким образом, для вакцинации α-лактальбумином показана эффективная защита и терапия против роста опухоли молочной железы, и она является особенно эффективной, когда иммунизация происходит до появления поддающихся пальпации опухолей у трансгенных мышей MMTV-PyVT.
ПРИМЕР 7: Специфические для α-лактальбумина T-клетки индуцируют воспаление и цитотоксичность для опухолей.
Мышей ВALB/с вакцинируют α-лактальбумином и инокулируют клетками 4T1. Приблизительно через 32 суток после инокуляции для опухолей у мышей BALB/c показана обширная инфильтрация CD3+ T-клеток. По сравнению с этим, эти воспалительные инфильтраты не возникают в опухолях от контрольных мышей, иммунизированных CFA. Анализ проточной цитометрией инфильтрирующих в опухоль лимфоцитов (TIL) показывает преобладание CD4+ (64,3%) T-клеток по сравнению с CD8+ (14,4%) T-клетками.
Более того, для вторичных ответов на 50 мкг/мл α-лактальбумина, как измерено посредством ELISA, показан провоспалительный фенотип типа 1, включающий высокий уровень продукции IFNγ по сравнению с IL-5 и IL-10 (см. фиг.6A). Анализ ELISPOT TIL показывает, что скорее CD4+, а не CD8+ T-клетки продуцируют IFNγ, поскольку его секрецию культивированными T-клетками ингибируют обработкой антителами, специфическими для класса II, но не класса I (см. фиг. 6B). Однако, гибель культивированных клеток опухолей 4T1 ингибируют посредством обработки культивированных примированных α-лактальбумином LNC антителами, специфическими для CD8, но не CD4 мыши (см. фиг. 6C). Этот результат указывает на то, что CD8+ T-клетки опосредуют специфическую для 4T1 цитотоксичность.
ПРИМЕР 8: Ингибирование роста опухоли молочной железы посредством вакцинации α-лактальбумином опосредовано T-клетками.
В одни и те же сутки наивным мышам-реципиентам BALB/c инокулируют опухоли 4T1 и примированные α-лактальбумином LNC. Значимое ингибирование роста опухоли наблюдают у этих мышей (p<0,0001; см. фиг. 7A). Более того, встречаемость несущих опухоль мышей значимо снижена в этом примере (p<0,03; см. фиг. 7B), и конечная масса опухоли также значимо снижена (p<0,0008; см. фиг. 7C).
Наивным мышам далее вводили a) CD4+ T-клетки, обогащенные отделением на магнитных бусинах от примированных α-лактальбумином LNC, b) CD8+ T-клетки, обогащенные отделением на магнитных бусинах от примированных α-лактальбумином LNC, или c) контрольные примированные овальбумином (OVA) LNC. Значимое ингибирование роста опухоли наблюдают у мышей после введения CD4+ T-клеток, обогащенных отделением на магнитных бусинах от примированных α-лактальбумином LNC (p=0,002; см. фиг. 7D, левая панель), и CD8+ T-клеток, обогащенных отделением на магнитных бусинах от примированных α-лактальбумином LNC (p=0,003; см. фиг. 7D, правая панель) по сравнению с примированными OVA LNC. Этот пример указывает на то, что активированные CD4+ и CD8+ TIL опосредуют защитный и терапевтический эффекты вакцинации α-лактальбумином на рост опухоли молочной железы.
ПРИМЕР 9: Доступность узнающих α-лактальбумин T-клеток у женщин
Доступность и диапазон репертуара T-клеток оценивают в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) посредством примирования in vitro против α-лактальбумина и измерения полученных частот антигенспецифических продуцирующих IFNγ T-клеток. Происходящие из моноцитов DC получали из PBMC, взятых у пациента-женщины в возрасте 29 лет. Отбор адгерентных клеток продолжали культивированием в среде X-VIVO (BioWhittaker, Walkersville, MD) с 500 Ед./мл rhGMCSF и rhlL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ). Через шесть суток после начала культивирования DC сенсибилизировали 75 мкг/мл очищенного рекомбинантного α-лактальбумина человека (rh α-лактальбумина) и интенсивно отмывали через 48 часов. Отмытые DC совместно культивировали с очищенными на нейлоновой вате наивными T-клетками от того же самого донора в соотношении 1:5 (DC к T-клеткам). Приблизительно через 72 часа после совместного культивирования, примированные in vitro T-клетки и не примированные T-клетки от одного и того же донора обогащали посредством пропускания через нейлоновую вату и повторно культивировали с γ-облученными (3000 рад (30 Дж/кг)) PBMC в качестве питающих клеток в соотношении 1:10 (питающих клеток к T-клеткам) на планшетах ELISPOT (Polyfiltronics, Rockland, MA), предварительно покрытых связывающим антителом мыши против IFNγ человека (#M-700A; Endogen, Cambridge, MA). Частоты узнающих α-лактальбумин продуцирующих IFNγ T-клеток определяли спустя 48 часов с использованием вторичного биотинилированного антитела мыши против IFNγ (#M701; Endogen) и разделения ELISPOTS с использованием автоматического анализатора Immunospot Satellite (Cellular Technology, Cleveland, OH).
После примирования α-лактальбумином для PMBC показана увеличенная частота продуцирующих IFNγ T-клеток (см. фиг. 8) при последующем воздействии α-лактальбумина (вторичный ответ). Наблюдаемый ответ является антигенспецифическим, поскольку анамнестические антигены OVA и рекомбинантный кохлин человека (rmКохлин), белок внутреннего уха, полученный в трансдуцированной E. coli способом, сходным с продукцией рекомбинантного α-лактальбумина человека, не вызывают увеличения частоты продуцирующих IFNγ T-клеток.
Взятые в совокупности, результаты, описанные в настоящем документе, показывают, что: 1) иммунизация α-лактальбумином активирует как CD4+, так и CD8+ провоспалительные T-клетки; 2) иммунизация нелактирующих млекопитающих α-лактальбумином не может индуцировать воспаление молочной железы; 3) профилактическая вакцинация α-лактальбумином ингибирует рост и встречаемость опухолей молочной железы; и 4) вакцинация α-лактальбумином ингибирует рост развившихся опухолей, иммунизация α-лактальбумином обеспечивает безопасную и эффективную вакцинацию в нескольких моделях рака молочной железы на мышах.
Важно, в настоящем документе показано также, что α-лактальбумин человека является достаточно иммуногенным для человека для активации T-клеток и вызова провоспалительного иммунного вторичного ответа. Таким образом, иммунизация людей α-лактальбумином человека обладает способностью обеспечивать безопасную и эффективную вакцинацию против рака молочной железы человека.
В то время как изобретение проиллюстрировано и подробно описано в предшествующем описании, такие иллюстрацию и описание следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие по характеру, следует понимать, что описаны только иллюстративные варианты осуществления и что все изменения и модификации, возникающие в пределах объема изобретения, являются желательными для защиты. Специалисты в данной области могут легко разработать свои собственные варианты осуществления, включающие один или несколько признаков, описанных в настоящем документе, и таким образом, попадающие в объем настоящего изобретения.
ПРИМЕР 10: Мультивалентная вакцинация против рака молочной железы
В примерах 4-7 показано, что однократная иммунизация специфическим для молочной железы связанным с лактацией белком, α-лактальбумином, обеспечивает значительный уровень эффективной и безопасной профилактики против роста возникающих опухолей молочной железы, в частности, в свете обширной детекции α-лактальбумина в злокачественных новообразованиях молочной железы человека и отсутствия какого-либо поддающегося детекции воспаления молочной железы, когда нормальных мышей иммунизируют α-лактальбумином (пример 3). Вакцинация α-лактальбумином показана также как обеспечивающая эффективную терапию при использовании для лечения развившихся растущих опухолей молочной железы. Дальнейшие эксперименты показывают, что вакцинация против другого специфического для молочной железы связанного с лактацией белка, α-казеина, обеспечивает сходную защиту против опухолей молочной железы при использовании в качестве отдельного иммуногена или при совместной иммунизации с α-лактальбумином (фиг. 13). Понятно, что совместная иммунизация обоими связанными с лактацией белками не индуцировала какой-либо усиленной защиты против опухолей молочной железы 4T1. Однако, важно отметить, что целью мультивалентной вакцинации является увеличение вероятности того, что у большего количества женщин может развиться иммунитет, и больше количество опухолей может быть затронуто более разнообразным иммунитетом. Любой данный субъект-человек может обладать или не обладать доступным репертуаром T-клеток, способным обеспечивать возможность отвечать на любой данный отдельный белок-мишень (отвечающие по сравнению с не отвечающими), и каждая возникающая опухоль молочной железы человека может экспрессировать или не экспрессировать любой данный отдельный белок-мишень (фиг. 14).
Диагностика и лечение рака молочной железы основаны в основном на присутствии или отсутствии трех рецепторов, известных как стимулирующие рост опухолей: рецепторы эстрогенов (ER), рецепторы прогестерона (PR) и рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2). Наиболее успешные способы лечения рака молочной железы нацелены на эти рецепторы. Когда опухоли молочной железы не экспрессируют ни один из этих рецепторов, т.е. опухоль является ER-отрицательной/PR-отрицательной/HER2-отрицательной, диагноз классифицируют как трижды отрицательный рак молочной железы (TNBC). TNBC является нечувствительным к некоторым из наиболее эффективных способов терапии, доступных для лечения рака молочной железы, включая нацеленные на HER2 лекарственные средства, такие как трастузумаб (герцептин), и эндокринные лекарственные средства, такие как тамоксифен или ингибиторы ароматазы. Кроме того, большинство генетически связанных с BRCA1 видов рака молочной железы представляют собой TNBC, и женщины с TNBC подвержены в три раза большему риску смерти от заболевания, чем женщины с ER+ ВС, наиболее распространенной формой ВС. Таким образом, женщины с TNBC обладают непропорционально более высокой частотой агрессивных опухолей, рецидивов и метастазирования и случаев смерти от рака молочной железы. TNBC является общепризнанным как наиболее летальная форма рака молочной железы.
Известно, что связывание прогестерона с рецептором прогестерона (PR) обеспечивает сильный ингибирующий сигнал для прекращения лактации и синтеза связанных с лактацией белков, включая α-лактальбумин и α-казеин. PR-отрицательные опухоли молочной железы являются неспособными к передаче сигнала этого сильного ингибирования синтеза связанных с лактацией белков. Таким образом, заявители сделали вывод, что PR-отрицательные опухоли молочной железы, включая TNBC, не могут передавать сигнал опосредованного прогестероном ингибирования синтеза α-лактальбумина и могут, таким образом, обладать значительной сверхэкспрессией α-лактальбумина. Для проверки этого вывода проведены поиски в ONCOMINE, базе данных связанных с злокачественными опухолями микромассивов с интегрированной платформой сбора данных, для поиска и анализа в режиме онлайн тысяч исследований дифференциальной экспрессии генов в различных типах злокачественных опухолей человека и их подтипах. Результаты поиска в ONCOMINE явно предоставляют многочисленные исследования, показывающие высокозначимую сверхэкспрессию связанных с лактацией белков в TNBC.
Для подтверждения этой сверхэкспрессии связанных с лактацией белков в TNBC в ходе роста in vivo опухолей молочной железы человека, авторы настоящего изобретения инфицировали линию клеток трижды отрицательного рака молочной железы HCC1937 (ATCC, Manassas, VA) лентивирусным вектором, обеспечивающим экспрессию люциферазы светляков под регуляцией промотора α-лактальбумина человека. Таким образом, биолюминесценция могла происходить в присутствии субстрата люциферина, только если ген α-лактальбумина (LALBA) подвергался активной транскрипции. Визуализация транскрипции α-лактальбумина происходила в ходе роста in vivo трижды отрицательной опухоли молочной железы человека HCC1937 у иммунодефицитных пермиссивных мышей nude.