СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ
ROSMARINIC ACID SYSNTHESIS METHOD

Изобретение относится к фармацевтическому производству и касается способа получения розмариновой кислоты.
Розмариновая кислота, т.е. ([[3-(3,4-Дигидроксифенил)-1-оксо-2E-пропенил]окси]-3,4-дигидроксибензопропионовая кислота), является субстанцией, широко используемой в фармакологии и парафармацевтике для производства лекарственных средств и биологически активных добавок к пище. Она имеет низкую токсичность, быстро выводится из кровотока [Phytochemistry, 62, р.121-125, 2003]. Розмариновая кислота проявляет седативный эффект [RU 2275931 С1, 2006.05.10; JP 2002275061, 2002.09.25], антиоксидантную, противовоспалительную активность [JP 2005272362, 2005.10.06], антимутагенную, антибактериальную [RU 2006108863, 27.09.2007] и противовирусную активность [RU 2001192257, 2002.11.27], в частности, используется в терапии Herpes simplex.
Розмариновая кислота входит в состав композиций, используемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе при хронической устойчивой стенокардии [RU 2328300 С2, 2008.07.10; CN 1923803, 2007.03.07; JP 4243822, 1992.08.31], кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваниях [RU 2006136529, 2008.04.27; JP 4243822, 1992.08.31]; в качестве антиаллергического средства [JP 2004097108, 2004.04.02; US 2006134236, 2006.06.22]; для защиты суставов в качестве противовоспалительного и анальгетического средства [KR 2002008211, 2002.11.27]; для лечения язвы желудка [CN 1153778, 1997.07.09], острой и хронической почечной недостаточности [CN 1977834, 2007.06.13], фиброза печени и почек [CN 101095668, 2008.01.02].
Розмариновая кислота применяется в косметическом производстве [Petersen M., Simmonds M-S.J.//Phytochemistry, 62, р.121-125, 2003; RU 2003138141, 2005.06.10].
Традиционными источниками получения розмариновой кислоты и ее производных являются растения видов Boraginaceae и Lamiaceae, в частности мелисса (Melissa officinalis) и розмарины Rosmarinus officinalis [Petersen M., Simmonds M-S.J.//Phytochemistry, 62, р.121-125, 2003]. Известны также технологические способы получения розмариновой кислоты из культуры клеток тканей растений, например Coleus blumei и Salvia officinalis [Petersen M., Simmonds M-S.J.//Phytochemistry, 62, p.121-125, 2003], Lavanda vera [Georgiev M. et all//Food Chemistry, 94(1), p.111-114, 2006].
Известен способ получения розмариновой кислоты из ароматических растений путем экстракции измельченного сырья спиртом, концентрирования экстракта, растворения остатка в воде, экстракции водной фазы толуолом при рН 4,5, затем метил-трет-бутил эфиром при рН 3,5-4 с добавлением соляной кислоты поэтапно, упаривания эфирного экстракта, растворения его в воде с активированным углем при нагревании, фильтрации, добавки кристаллов розмариновой кислоты в качестве затравки, охлаждения при 0-5°С в течение 6 часов, фильтрования и сушки в вакууме при 60°С в течение 24 час. Выход целевого продукта - 1,08% от веса сырья, чистота - 90,6% от стандарта [WO 03/066568 А1, 2003.08.14].
К недостаткам данного способа относятся длительность и трудоемкость, а также токсичность и пожароопасность.
Известен способ получения розмариновой кислоты путем экстракции сырья методом настаивания, ультразвуковой обработки, добавления антиоксиданта в экстракт, доведения рН экстракта до кислого значения, нагревания, фильтрации и хроматографии на полиамидной смоле, или ионообменной смоле, или крупно-пористой смоле на стандартных колонках [CN 1995007 А, 2007.07.11].
К недостаткам способа можно отнести недостаточно высокую степень очистки целевого продукта на ионообменных смолах, а также необходимость наличия высокотехнологичных ультразвуковых экстракторов.
В качестве прототипа выбран способ получения розмариновой кислоты из Melissa officinalis путем экстракции листьев водой при 80-100°С, подкисления экстракта неорганической кислотой рН 2-2,5, фильтрации раствора, дальнейшей экстракции кислого водного раствора органическим растворителем, выбранным из группы, состоящей из органических эфиров, высших спиртов, не смешивающихся с водой, и эфиров алифатических карбоновых кислот; упаривания экстракта, растворения остатка в воде при 40-80°С, отстаивания при 2-8°С в течение 4-14 часов, фильтрации, выпаривания в вакууме до трети объема, отстаивания в течение 2-8 часов с добавлением зародышевых кристаллов, фильтрации, промывки ледяной водой и повторной кристаллизации при 4°С в течение 2 суток, фильтрации, промывки и сушки. Выход целевого продукта - 1,15% от веса сырья (55% от теоретического). Возможна очистка эфирного экстракта на Сефадексе LH-20 в 70% водном метаноле с последующей кристаллизацией [US 4354035, 1982.10.12].
К недостаткам известного способа относятся его многостадийность (15 стадий), использование токсичных и пожароопасных органических растворителей (диэтиловый или диизопропиловый эфиры или н-бутиловый спирт или этилацетат), недостаточно высокий выход целевого продукта. Сырье - Melissa officinalis в России не культивируется для промышленной переработки.
Таким образом, широкое применение розмариновой кислоты лимитировано недостаточным ее выпуском в связи с ограниченностью сырьевой базы и сложностью технологических процессов ее производства. В основном выпуск лекарственных средств на ее основе ограничен галеновыми препаратами. В этой связи возникла необходимость в поиске распространенного, постоянно возобновляемого источника сырья и простого, воспроизводимого технологического способа получения розмариновой кислоты.
Поставленная задача решена способом получения розмариновой кислоты из растительного сырья, включающим экстракцию водой и очистку, в котором согласно изобретению морскую траву семейства Zosteraceae экстрагируют водой в течение 6-8 ч при комнатной температуре при добавлении пищевой кислоты до рН 2,5-3,0, после экстракции полученный раствор фильтруют, траву прессуют, получая дополнительный экстракт, экстракты объединяют, их очистку осуществляют на мембранном микрофильтре, затем на хроматографической колонке с полихромом-1, целевой продукт элюируют 5-7% водным раствором этилового спирта, концентрируют и лиофилизуют.
С целью дополнительной очистки целевого продукта лиофилизат растворяют в дистиллированной воде, фильтруют, затем кристаллизуют при температуре 4°С и высушивают.
Заявителем было обнаружено, что розмариновая кислота может быть получена простым способом, обеспечивающим более высокий выход и чистоту целевого продукта, из морской травы семейства Zosteraceae (Zostera asiatica (зостера азиатская), Z. marina (зостера морская) и Phyllospadix iwatensis (филлоспадикс иватенский)).
Эти многолетние растения произрастают у открытых берегов на глубинах до 10 м, распространены на всем побережье Дальнего Востока. Запасы зостеры практически не ограничены. Ведется промысловая заготовка зостеры для производства пищевых пектинов - препаратов «Зостерин» и «Изостерит».
Заявителем разработана технология получения розмариновой кислоты из морского растительного сырья при сохранении возможности его использования для дальнейшей промышленной переработки.
Сущность предлагаемого способа состоит в следующем.
Морскую траву семейства Zosteraceae промывают питьевой водой, декантируют, измельчают и экстрагируют дистиллированной или деминерализованной водой с постепенным добавлением раствора пищевой кислоты до рН 2,5-3,0 при постоянном перемешивании в течение 6-8 ч при комнатной температуре. После экстракции полученный раствор фильтруют, траву прессуют, получая дополнительный экстракт. Прессованную траву направляют на дальнейшую переработку.
Экстракт фильтруют на мембранном микрофильтре (мембрана 6-15 кДа) и наносят на хроматографическую колонку с полихромом-1. Колонку отмывают дистиллированной водой. Полихром-1 (ТУ 6-09-10-1833-88) - продукт полимеризации тетрафторэтилена, часто используется в ГЖХ при анализе высокополярных соединений (воды, кислот, гликолей и т.п.), поскольку неполярная поверхность его лишена адсорбционных центров, и он не обладает каталитической активностью.
Розмариновую кислоту элюируют с колонки 5-7% водным раствором этилового спирта. Элюат концентрируют в вакууме до минимального объема и лиофилизуют. Получают продукт 80-82% степени чистоты в виде порошока светло-желтого цвета. Выход - 3% от веса сырья в пересчете на сухое сырье.
Для получения розмариновой кислоты с более высокой степенью чистоты полученный порошок растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды, фильтруют и кристаллизуют при температуре 4°С. Образовавшиеся кристаллы розмариновой кислоты отфильтровывают и высушивают. Это позволяет получить препарат со степенью чистоты 92-94%. Выход - 2% в пересчете на кристаллизованный продукт (80-85% от теоретического).
Технический результат заключается в повышении выхода, степени чистоты розмариновой кислоты, в упрощении способа (процесс включает 7-8 стадий, способ-прототип - 15 стадий, в заявляемом способе в отличие от прототипа не используются токсичные органические растворители).
На фиг.1 представлено содержание розмариновой кислоты в экстракте Zostera asiatica (анализ методом ВЭЖХ)
(12,83 - пик, соответствующий времени удерживания розмариновой кислоты).
На фиг.2 приведена ВЭЖХ розмариновой кислоты (чистота 80-85%).
На фиг.3 приведена ВЭЖХ розмариновой кислоты в кристаллах (чистота 92-94%).
Для анализа использовали жидкостный хроматограф "LaChrom" (Merck Hitachi), снабженный насосом L-7100, УФ детектором L-7400, термостатом L-7300, интегратором D-7500 и колонкой Agilent Technologies Zorbax Eclipse XDB-C18, 3.5 µm (75 см х 4.6 мм) с защитной колонкой Hypersil ODS, 5 µm (4.0 см × 4.0 мм). Колонку термостатировали при 30°С. Разделение примесей проводили смесью растворителей: А (вода + 1% ледяной уксусной кислоты) и В (ацетонитрил + 1% ледяной уксусной кислоты) в следующем режиме: 0-5 мин - изократический, 90% А, 10% В; 5-35 мин градиентный, 90-10% А, 10-90% В. Скорость подачи растворителей 1 мл/мин. Детектирование проводили при 270 нм.
Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Морскую траву Zostera asiatica в количестве 3 кг на сырой вес промывают питьевой водой. Воду сливают. Траву измельчают, загружают в реактор и экстрагируют 10 л дистиллированной воды с постепенным добавлением 5% раствора соляной кислоты до рН 2,5 при постоянном перемешивании в течение 6 ч при комнатной температуре; рН экстракта поддерживают добавлением 5% раствора соляной кислоты.
После окончания процесса экстракции полученный раствор отфильтровывают, траву прессуют, получая дополнительный экстракт, а прессованную траву отправляют на дальнейшую переработку.
Экстракты объединяют и фильтруют на мембранном микрофильтре (мембрана 6-15 кДа), затем наносят на хроматографическую колонку с полихромом-1 с размером частиц 0,5-1 мм (0,5 кг). Промывают колонку дистиллированной или деминерализованной водой (2-3 л). Элюируют розмариновую кислоту 5% водным раствором этилового спирта (1,5 л). Полученный элюат концентрируют упариванием в вакууме до объема 0,5 л и лиофильно высушивают. Получают 8 г розмариновой кислоты в виде порошка светло-желтого цвета. Чистота препарата 80-82% (по данным ВЭЖХ).
Пример 2. Морскую траву Phyllospadix ivantensis в количестве 30 кг на сырой вес промывают пресной питьевой водой. Воду сливают. Траву измельчают, загружают в реактор и экстрагируют 100 л деминерализованной воды с добавлением 7% раствора фосфорной кислоты до рН 3,0 при постоянном перемешивании в течение 8 ч при комнатной температуре; рН экстракта поддерживают добавлением 7% раствора фосфорной кислоты.
После окончания процесса экстракции полученный раствор отфильтровывают, траву прессуют, получая дополнительный экстракт, и отправляют на дальнейшую переработку.
Экстракты объединяют, затем фильтруют на мембранном микрофильтре (мембрана 6-15 кДа) и наносят на хроматографическую колонку с полихромом-1 с размером частиц 0,5-1 мм (5 кг). Промывают колонку дистиллированной или деминерализованной водой (20-30 л). Элюируют розмариновую кислоту 7% водным раствором этилового спирта (10 л). Затем элюат концентрируют упариванием в вакууме до объема 2 л и лиофильно высушивают.
Полученный порошок светло-желтого цвета растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды, фильтруют и кристаллизуют при температуре 4°С. Образовавшиеся кристаллы розмариновой кислоты отфильтровывают и высушивают. Получают 60 г розмариновой кислоты. Чистота препарата 92-94% (по данным ВЭЖХ).
Пример 3.
Розмариновую кислоту получают, как описано в примере 1 или 2, но в качестве сырья используют Zostera marina.