Гистологическая характеристика ткани печени у крыс, длительно получавших карпрофен

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-19-12-257-262

УДК 619: 615.276: 615.065

ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТКАНИ ПЕЧЕНИ У КРЫС, ДЛИТЕЛЬНО ПОЛУЧАВШИХ КАРПРОФЕН

Лазаренко1 Л.В., Косарева2 П.В.

1ФКОУ ВО Пермский институт ФСИН России, г. Пермь, Российская Федерация.

2ФГБОУ ВО Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Российская Федерация.

Аннотация. Целью исследования было оценить характер поражения ткани печени у экспериментальных животных при моделировании НПВП-гепатопатии. Моделирование НПВП-индуцированного поражения печени у нелинейных белых крыс осуществляли пероральным введением карпрофена в течение 21 дня в дозах: 4 мг/кг (терапевтическая доза), 8 мг/кг, 20 мг/кг и 40 мг/кг. Полученные результаты сравнивали с контрольной группой. По окончании эксперимента производили взятие образцов ткани печени с соблюдением правил эвтаназии. При длительном пероральном приеме карпрофена в ткани печени экспериментальных животных отмечались патоморфологические изменения, характерные для токсического поражения органа: полнокровие центральных вен и расширение синусоидных капилляров, зернистая дистрофия, некроз гепатоцитов, появление двуядерных клеток, полнокровие сосудов триад. У части животных наблюдались морфологические признаки вакуольной и жировой дистрофии гепатоцитов. Дистрофические и некротические процессы в ткани печени, появление двуядерных клеток наблюдались у животных всех экспериментальных групп, данные изменения имели дозозависимый эффект. Появление двуядерных клеток в паренхиме указывает на преобладание амитоза. При увеличении дозы препарата нарастала выраженность гемодинамических нарушений, которая проявлялась полнокровием сосудов триад. Обнаруженная у отдельных экспериментальных животных жировая дистрофия гепатоцитов может указывать на развитие оксидативного стресса при действии высокой дозы препарата.

Ключевые слова: карпрофен, НПВП-гепатопатия, гистопатологические изменения.

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) получили широкое применение в клинической ветеринарной практике. Они назначаются при лечении воспаления, боли различной этиологии, лихорадки; при заболеваниях опорно-двигательного аппарата НПВП, как правило, применяются длительными курсами. На российском рынке ветеринарных препаратов ассортимент данной группы достаточно разнообразен, при назначении животным используют мелоксикам (Meloxidyl, Локсиком), карпрофен (Римадил Р, Кар-продил F, Норокарп, РИКАРФА), мавакоксиб (Тро-коксил), фирококсиб (Previcox), флуниксин (Flunixin LS), цимикоксиб (Цималджекс), кетопрофен (Айнил, Кетопроф, Кетофен, Кетонил, Флексопрофен) и другие.

Из представленных препаратов продолжительнее всех в ветеринарной практике применяется карпрофен, при лечении собак он назначается чаще, чем другие НПВП [1]. Карпрофен относится к селективным ингибиторам ЦОГ-2, предназначен для домашних животных. По мнению Forsyth S.F. с соавторами [2], карпрофен является одним из наиболее безопасных НПВП.

Тем не менее, использование карпрофена сопряжено с определенным риском побочных эффектов со

стороны желудочно-кишечного тракта. После проведенной гастроскопии симптомы воспаления слизистой желудка были выявлены у 17 из 24 собак (70 %), получавших НПВП в течение 28 дней, при этом отмечается отсутствие клинических признаков желудочных расстройств [2]. В проведенных исследованиях Reimer M.E. [3] выявлял признаки эрозивно-язвенного поражения слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки у собак, получавших карпрофен, но в тоже время указывал на сложность дифференциации побочных эффектов применения карпрофена от других гастроэнтерологических заболеваний.

Меньше сведений имеется о гепатотоксическом действии карпрофена. В систематическом обзоре [4] указывается, что частота побочных эффектов, связанных с поражением слизистой желудочно-кишечного тракта при приеме карпрофена составляет до 3,8%, а частота возникновения гепатопатий (по мониторингу сывороточной активности печеночных ферментов) -0,05%. MacPhail C.M. [5] описывает гепатоцеллюляр-ный токсикоз у 21 собаки, связанный с применением карпрофена.

—--—

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

Для определения частоты побочных эффектов у собак с нарушениями опорно-двигательной функции конечностей, которым назначали карпрофен, исследовали показатели крови и кала на скрытую кровь. Выборка составила 116 животных различных возрастных и породных групп, которые получали карпрофен в дозировке 2 мг/кг [6]. НПВП-обусловленные гастро- и эн-теропатии наблюдались у 24,3% животных, признаков гепатотосичности не выявляли.

При назначении карпрофена собакам с сопутствующими заболеваниями печени одновременно назначалась терапия, направленная на снижение негативного действия препарата. При анализе результатов частота побочных эффектов у таких животных составила 9,1%, при этом на протяжении всего курса в крови наблюдалось повышение активности АлАТ и АсАТ выше физиологических значений. При приеме карпрофена здоровыми собаками, в том числе и животными старше шести лет, изменений в биохимическом составе крови не отмечалось [1].

Raekallio M.R. с соавтоами [7] проводил исследовании на 22 собаках, получавших карпрофен в течение двух месяцев, биохимический анализ крови не выявил отклонений от нормы как до, так и после приема кар-профена, клинические признаки нарушения функции желудочно-кишечного тракта также отсутствовали.

Таким образом, сведения о гепатотоксическом действии карпрофена достаточно разнообразны, в связи с чем интерес представляют экспериментальные исследования по изучению влияния препарата на гистологическую структуру ткани печени животных при его длительном применении.

Исследования, проведенные нами ранее, продемонстрировали, что в печени животных с экспериментальной НПВП-индуцированной гепатопатией, связанной с длительным приемом нимесулида, отмечались изменения, характерные для токсического поражения. При изучении гистоструктуры ткани печени у крыс, длительно получавших нимесулид, отмечалось расширение синусоидных капилляров, очаги некрозов и белковой дистрофии [8].

Цель исследований. Оценить характер поражения ткани печени у экспериментальных животных при моделировании НПВП-гепатопатии с использованием различных дозировок карпрофена. Оценку проводили общепринятыми гистологическими методами.

Материалы и методы. Моделирование НПВП-ин-дуцированного поражения печени у нелинейных белых крыс (самцы и самки) c массой тела 200-250 г, осуществляли путем перорального введения карпрофена (препарат Римадил Р, Pfizer Animal Health, США) в течение 21 дня в следующих дозировках: 4 мг/кг (терапевтическая доза, рекомендованная производителем, n=26); 8 мг/кг (n=28), 20 мг/кг (n=22), 40 мг/кг (n=24).

Препарат давали на фоне обычного пищевого режима один раз в день за час до кормления.

В течение эксперимента осуществляли ежедневное наблюдение за животными - проводили оценку активности, внешнего вида, аппетита, физиологических функций. По окончании исследований животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Сразу после наступления биологической смерти животного забирали печень для проведения гистологического исследования.

Гистологическое исследование выполнено стандартными методиками [9]. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Результаты, полученные при проведении гистологического исследования образцов тканей от животных экспериментальных групп, сравнивали с результатами, полученными при исследовании биоматериала, полученного от животных контрольной группы (интактные животные, п=21).

Для проведения статистического анализа использован критерий Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. При гистологическом исследовании ткани печени у интактных животных визуализировалась следующая гистологическая картина. Печень представлена дольками, имеющими правильную гексагональную форму, дольки состоят из радиально расположенных печеночных балок, представляющих собой анастомозирующие тяжи печеночных клеток. Между балками видны синусоидные капилляры печени, выстланные эндотелиальными клетками. В центре долек визуализируются центральные вены, часть которых заполнена кровью. Поскольку в печени крысы междольковая соединительная ткань развита слабо, границы между дольками прослеживаются нечетко. Обнаружено, что большинство гепато-цитов одноядерные, в них хорошо выявляется однородно окрашенное ядро и гомогенная цитоплазма. В небольшом количестве обнаруживаются также дву-ядерные гепатоциты. Между дольками выявляются типичного строения триады и собирательные вены.

Для полного представления патогенеза НПВП-ассо-циированной гепатопатии были сформированы четыре экспериментальные группы крыс, которые получали разные дозировки карпрофена. В группах, получавших пяти- и десятикратную дозу отмечалась гибель животных.

При гистологическом исследовании ткани печени у крыс всех экспериментальных групп (100%) наблюдалось полнокровие центральных вен и расширение сину-соидных капилляров (рис. 1).

Также обнаруживались другие виды нарушений структуры ткани печени: зернистая дистрофия, некроз

гепатоцитов, появление двуядерных клеток, полнокровие сосудов триад (рис. 2).

У некоторых животных в ткани печени выявлены морфологические признаки вакуольной и жировой дистрофии гепатоцитов (рис. 3).

Рис. 1. Полнокровие центральной вены и выраженное расширение синусоидных капилляров. Окраска гематоксилином и эозином х 600.

Рис. 2. Полнокровие центральной вены, расширение синусоидных капилляров, зернистая дистрофия, некрозы и регенерация гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином х 600.

Нарушения структуры ткани печени, которые выявляли при просмотре препаратов, в меньшей степени были выражены у группы животных, получавших терапевтическую дозу карпрофена - участки зернистой дистрофии гепатоцитов выявлялись у 80,7% животных, участки некроза - у 38,5%. Появление большого количества гипертрофированных двуядерных клеток отмечено у 61,5% животных группы. В паренхиме печени у животных, получавших повышенные дозировки, эти нарушения обнаруживали в 100% случаев.

Полнокровие сосудов триад наблюдалось у 50% крыс, получавших карпрофен в дозировке 8 мг/кг (превышающей терапевтическую дозу в 2 раза), и у всех

животных в группах с применением пяти- десятикратной дозы. У животных, получавших терапевтическую дозировку, эти признаки не наблюдались.

Признаки вакуольной и жировой дистрофии гепато-цитов были обнаружены при микроскопии препаратов ткани печени у крыс, получавших карпрофен в дозе 20 мг/кг (пятикратная дозировка), данные нарушения были выявлены у половины животных. При этом, дистрофические изменения клеток сопровождались некрозами паренхимы на ограниченных участках, в местах некроза находили большое количество двуядерных клеток.

В целом, изменения в ткани печени у животных опытных групп выглядели следующим образом (табл. 1).

Таблица 1.

Гистопатологические изменения в паренхиме печени у крыс опытных групп, получавших карпрофен

Признак Доза 4 мг/кг, % животных в группе Доза 8 мг/кг, % животных в группе Доза 20 мг/кг, % животных в группе Доза 40 мг/кг, % животных в группе

Полнокровие центральных вен 100 100 100 100

Расширение синусоидных капилляров 100 100 100 100

Зернистая дистрофия 80,7 100 100 100

Вакуольная дистрофия - - 50 -

Некрозы 38,5 100* 100* 100*

Двуядерные клетки 61,5 100* 100* 100*

Полнокровие сосудов триад - 50* 100* 100*

Жировая дистрофия - - 50 -

*р<0,05 по отношению к терапевтической дозе

Обнаруженные нами гистопатологические изменения в ткани печени при НПВП-гепатопатии, вызванной длительным приемом карпрофена, согласуются с данными других авторов. Enescu А. С с соавторами [10] при экспериментальном моделировании токсического поражения печени, индуцированного приемом лекарственных веществ различных классов, отмечал, что через две недели эксперимента в ткани органа наблюдалась зернистая и вакуольная дистрофия гепатоцитов, иногда - жировая дистрофия, полнокровие центральных вен и синусоидных капилляров, периваскулярный отек. Спустя три недели, помимо вышеперечисленных признаков, обнаруживались лимфоплазмоцитарные инфильтраты, впоследствии развивались некрозы паренхимы и ее фиброз.

Теггасаало L. [11] описывает развитие подострого токсического лекарственного поражения печени у человека, обусловленного постоянным приемом препаратов, в течение от нескольких недель до нескольких месяцев, поражение морфологически характеризовалось формированием фиброза и регенераторными процессами. Для НПВП-индуцированных поражений печени одним из признаков является микровезикулярный стеа-тоз [10], поскольку в основе патогенеза лекарственно-индуцированного поражения печени лежит оксидатив-ный стресс, в клетке происходит накопление свободных радикалов и повреждение липидов мембран клетки [12].

Показано, что характерным признаком токсического поражения печени являются воспалительные инфильтраты вокруг портальных триад, расширение си-нусоидных и желчных капилляров, дегенеративные и регенераторные изменения гепатоцитов [13].

Таким образом, при пероральном приеме карпро-фена - нестероидного противовоспалительного препарата, предназначенного специально для животных, в ткани печени экспериментальных животных, получав-

ших препарат в течение 21 дня, отмечались патоморфо-логические изменения, характерные для токсического лекарственного поражения печени с дозозависимым эффектом. При этом обращало на себя внимание нарастание выраженности гемодинамических нарушений в паренхиме железы.

Для полного понимания патогенеза НПВП-ассоции-рованной гепатопатии и разработки путей ее патогенетической коррекции, обнаруженные изменения требуют дальнейшего изучения с применением современных методов гистологической диагностики.

Заключение. При длительном пероральном приеме карпрофена в ткани печени экспериментальных животных отмечались патоморфологические изменения, характерные для токсического поражения органа. При просмотре гистологических препаратов выявлены следующие нарушения структуры ткани: полнокровие центральных вен и расширение синусоидных капилляров, зернистая дистрофия, некроз гепатоцитов, появление двуядерных клеток, полнокровие сосудов триад. У животных, получавших пятикратную дозировку препарата, наблюдались морфологические признаки вакуольной и жировой дистрофии гепатоцитов.

Обнаруженные нарушения структуры ткани мы связываем с действием карпрофена, поскольку, подобная картина нарушений наблюдалась также при экспериментальных исследованиях, проведенных с применением нимесулида.

При интерпретации полученных результатов можно сделать вывод, что при длительном применении препарата структура ткани печени изменяется уже при назначении терапевтической дозы. Наиболее характерными признаками были гемодинамические нарушения. Дистрофические и некротические процессы в ткани печени, а также появление двуядерных клеток наблюдались у животных всех экспериментальных групп, но данные изменения имели дозозависимый эффект.

Появление двуядерных клеток в паренхиме указывает на преобладание амитоза, связанного с усилением регенеративных процессов в поврежденной ткани. При увеличении дозы препарата нарастала выраженность гемодинамических нарушений, которая проявлялась также полнокровием сосудов триад. Обнаруженная у отдельных экспериментальных животных жировая дистрофия гепатоцитов может указывать на развитие окси-дативного стресса при действии высокой дозы препарата.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Кемельман Е.Л., Варенов К.С., Архипова А.А. Оценка частоты возникновения гастроэнтерологических осложнений при назначении собакам карпрофена в комбинации с омепразолом // Российский ветеринарный журнал. 2015. №1. С. 16-19.

[2] Endoscopy of the gastroduodenal mucosa after carpro fen, meloxicam and ketoprofen administration in dogs / S.F. Forsyth, W.G. Guilford, S.J. Haslett, J. Godfrey // JSAP. 1998. № 39(9). P. 421-424.

[3] Reimer M.E. The gastroduodenal effects of buffered aspirin, carprofen, and etodolac in healthy dogs // J Vet Intern Med. 1999. №13. P. 472-477.

[4] Monteiro-Steagall B.P., Steagall P.V., Lascelles B.D. Systematic review of nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced adverse effects in dogs // J Vet Intern Med. 2013. №27. P. 1011-1019.

[5] Hepatocellular toxicosis associated with administration of carprofen in 21 dogs. / C.M. MacPhail, M.R. Lappin, D.J. Meyer [et al.] // J Am Vet Med Assoc. 1998. № 212. P. 1895-1901.

[6] Сравнительная оценка безопасности применения нестероидных противовоспалительных средств при лечении собак с нарушениями опорно-двигательной функции конечностей / Л.С. Барсегян, С.А. Ягников, О.А.Кулешова [и др.]. // Российский ветеринарный журнал. 2015. №6. С. 18-21.

[7] Evaluation of adverse effects of long-term orally administered carprofen in dogs / M.R. Raekallio, A.K. Hielm-Bjorkman, J. Kejonen [et al.] // J Am Vet Med Assoc. 2006. № 228. P. 876-880.

[8] Экспериментальная НПВП-индуцированная гепатопа-тия при длительном приеме нимесулида / Л.В.Лаза-ренко, П.В. Косарева, Е.И.Самоделкин, В.П. Хоринко // Пермский медицинский журнал. 2015. Т. 32 . №3. С. 120-123 . '

[9] Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника: руководство для врачей и лаборантов. М.: «Медицина». 1996. 544 с.

[10] Enescu A., Mitrut P., Buteica E., Stanoiu B. Drug-induced hepatitis - morphological and ultrastructural aspects. Romanian Journal of Morphology and Embryology 2007. №48 (4). P. 449-454.

[11] Terracciano L. S11: Morphology of drug-induced hepato-toxicity // Experimental and Toxicologic Pathology. 2009. V. 61, № 3. P. 261-262.

[12] Hepatocyte mitochondrion respiratory chain in rats with experimental toxic hepatitis / Shiriaeva A.P., Baidiuk E.V., Arkad'eva A.V. [et al.] // Tsitologiia. 2007. 49(2). P. 125132.

[13] Hamid S., Mahajan R., Singh H., Carbaryl A. Pesticide causes «Toxic Hepatitis» in albino rats // J. Cytol. Histol. 2012. № 3-4. P. 1-5.

HISTOLOGICAL CHARACTERISTICS OF LIVER TISSUE IN RATS RECEIVING

CARPROFEN FOR A LONG TIME

Lazarenko1 L.V., Kosareva2P.V.

1Perm Institute of the Federal Penal Service, Perm, Russian Federation. 2Perm State University, Perm, Russian Federation.

Annotation: The aim of study was to evaluate the nature of liver tissue damage in experimental animals in the simulation of NSAIDs-hepatopathy. Simulation of NSAID-induced liver damage in nonlinear white rats was performed by oral administration of carprofen for 21 days at doses of 4 mg / kg (therapeutic dose), 8 mg / kg, 20 mg / kg and 40 mg / kg. The results were compared with the control group. At the end of the experiment, a histological samples of liver tissue were taken in compliance with the rules of euthanasia. When assessing the nature of the damage to liver tissue, the pathomorphological changes characteristic of toxic lesions were noted. In animals of all experimental groups, the expansion of sinusoidal capillaries, foci of protein dystrophy and necrosis were noted. With an increase in the dose of the drug, the severity of hemodynamic disorders increased. The detected fatty degeneration of hepatocytes indicates the development of oxidative stress under the action of a high dose of the drug. Key words: carprofen, NSAIDs-hepatopathy, histopathologic changes.

REFERENCES

[1] Kemel'man E.L., Varenov K.S., Arhipova A.A. Ocenka chastoty vozniknoveniya gastroehnterologicheskih oslozhnenij pri naznachenii sobakam karprofena v kombinacii s omeprazolom // Rossijskij veterinarnyj zhurnal. 2015. №1. p. 16-19.

[2] Endoscopy of the gastroduodenal mucosa after carpro fen, meloxicam and ketoprofen administration in dogs / S.F.

Forsyth, W.G. Guilford, S.J. Haslett, J. Godfrey // JSAP. 1998. № 39(9). P. 421-424.

[3] Reimer M.E. The gastroduodenal effects of buffered aspirin, carprofen, and etodolac in healthy dogs // J Vet Intern Med. 1999. №13. P. 472-477.

[4] Monteiro-Steagall B.P., Steagall P.V., Lascelles B.D. Systematic review of nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced adverse effects in dogs // J Vet Intern Med. 2013. №27. P. 1011-1019.

[5] Hepatocellular toxicosis associated with administration of carprofen in 21 dogs. / C.M. MacPhail, M.R. Lappin, D.J. Meyer [et al.] // J Am Vet Med Assoc. 1998. № 212. P. 1895-1901.

[6] Sravnitel'naja ocenka bezopasnosti primenenija nesteroidnyh protivovospalitel'nyh sredstv pri lechenii so-bak s narushenijami oporno-dvigatel'noj funkcii konech-nostej / L.S. Barsegjan, S.A. Jagnikov, O.A.Kuleshova [i dr.]. // Rossijskij veterinarnyj zhurnal. 2015. №6. p. 18-21.

[7] Evaluation of adverse effects of long-term orally administered carprofen in dogs / M.R. Raekallio, A.K. Hielm-Bjorkman, J. Kejonen [et al.] // J Am Vet Med Assoc. 2006. № 228. P. 876-880.

[8] Jeksperimental'naja NPVP-inducirovannaja gepatopatija pri dlitel'nom prieme nimesulida / L.V.Lazarenko, P.V. Kosareva, E.I.Samodelkin, V.P. Horinko // Permskij medicinskij zhurnal. 2015. T. 32 . №3. p. 120-123 .

[9] Sarkisov D.S., Perov Ju.L. Mikroskopicheskaja tehnika: rukovodstvo dlja vrachej i laborantov. M.: «Medicina». 1996. 544 p.

[10] Enescu A., Mitrut P., Buteica E., Stanoiu B. Drug-induced hepatitis - morphological and ultrastructural aspects. Romanian Journal of Morphology and Embryology 2007. №48 (4). P. 449-454.

[11] Terracciano L. S11: Morphology of drug-induced hepato-toxicity // Experimental and Toxicologic Pathology. 2009. V. 61, № 3. P. 261-262.

[12] Hepatocyte mitochondrion respiratory chain in rats with experimental toxic hepatitis / Shiriaeva A.P., Baidiuk E.V., Arkad'eva A.V. [et al.] // Tsitologiia. 2007. 49(2). P. 125132.

[13] Hamid S., Mahajan R., Singh H., Carbaryl A. Pesticide causes «Toxic Hepatitis» in albino rats // J. Cytol. Histol. 2012. № 3-4. P. 1-5.