Использование композиции, состоящей из катионного пептида LTP и молекул РНК против респираторных вирусов
APPLICATION OF COMPOSITION CONSISTING OF CATIONIC LTP PEPTIDE AND MOLECULES OF RNA AGAINST RESPIRATORY VIRUSES

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения респираторных вирусных инфекций.
Введение
Предпосылками изобретения явилось следующее. Эпидемиологические исследования распространенности вирусных инфекций позволяют утверждать, что среди всех вирусных патогенов именно респираторные вирусы (грипп, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и т.д.) являются самыми распространенными (более 90% от всех случаев инфекционных заболеваний). 23 мая 2005 года Всемирная ассамблея здравоохранения внесла поправки в «Международные медико-санитарные правила», где в первую группу наиболее опасных вирусных патогенов наравне с оспой и полиомиелитом включили и респираторные вирусы, вызывающие грипп и тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) или (SARS). Стоит отдельно отметить, что респираторные вирусы (вирус гриппа, РСВ и риновирусы) приводят к осложнениям у пациентов с уже существующей воспалительной патологией легких, такой как бронхиальная астма, что выражается в учащении приступов заболевания [Liu et al., 2012].
На сегодняшний день насчитывается более 60-ти противовирусных препаратов, одобренных FDA (Food and Drug Administration) в США для применения у человека. Однако практически все из них направлены против таких патогенов как ВИЧ-1, Гепатит В и С, герпес и цитомегаловирус [De Clerq, 2008]. Несмотря на десятилетия изучения респираторных вирусных инфекций к настоящему моменту не существует эффективных, безопасных и при этом доступных средств лечения и профилактики. Вакцинопрофилактика гриппа считается наиболее эффективным способом снижения заболеваемости и смертности. Однако эффективность противогриппозных вакцин составляет 70-80% среди взрослых людей, а в группе риска (младенцы, пожилые люди, беременные женщины и иммунокомпрометированные пациенты) уровень защиты составляет лишь 30-40%. Если для профилактики гриппа используются в основном вакцины, то для лечения применяют химиопрепараты: ремантадин «Flumadine», амантадин «Symmetrel», занамивир «Relenza» и озельтамивир «Tamiflu», а также средства на основе интерферонов (бетаферон, гриппферон, виферон и т.д.) или их индукторов (арбидол, амиксин, кагоцел и др.). Однако первые из них имеют множество побочных эффектов и дорогостоящи, а вторые эффективны лишь в первые 1-2 дня после появления симптомов заболевания.
Для РСВ также отсутствуют эффективные и широкодоступные лечебно-профилактические средства. Попытки создать профилактическую вакцину оказались неудачными, поэтому в настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин), однако он вызывает многочисленные побочные эффекты. Существует опыт применения средств против РСВ на основе нейтрализующих антител IGIV (Respigam), palivizumab (Synagis), MEDI-524 (Numab). Клинические испытания данных препаратов продолжаются, но их применение будет ограничено из-за высокой стоимости.
Невозможность создания эффективных вакцин для респираторных вирусов объясняется их высокой изменчивостью, которая приводит к появлению новых штаммов, в отношении которых оказываются неэффективными ранее созданные вакцины и препараты. Все это приводит к значительным экономическим затратам на разработку и тестирование новых лекарственных средств. В связи с изменчивостью вирусов и возникновением у них резистентности крайне актуальным является создание доступных противовирусных препаратов с широким спектром действия.
Поиск новых противовирусных агентов широкого спектра действия привел к появлению нового класса противовирусных препаратов, основанных на пептидах. Многочисленные исследования продемонстрировали противовирусную активность ряда природных пептидов (дефензинов и кателицидинов). Они подавляют широкий спектр вирусов включая ВИЧ-1, вирус гриппа, респираторный синцитиальный вирус, вирус герпеса и т.д. В итоге, на сегодняшний день существует около 15 пептидсодержащих противовирусных препаратов, проходящих клинические испытания [Thakur et al., 2012].
Один из известных примеров пептидных противовирусных препаратов это 36-членный пептид Т20 (Enfuvirtide), являющийся ингибитором слияния (фьюжн) ВИЧ-1 с клеткой. Фактически, пептид имитирует фрагмент трансмембранного белка ВИЧ-1 gp41 - так называемый HR2-участок, и препятствует правильному связыванию участков HR1 с HR2, необходимому для слияния вириона с клеткой. Данный препарат является первым клинически одобренным пептидным фьюж-ингибитором [Kilby et al., 1998]. Существует ряд модификаций Т20, включая пегилированые и гликозилированые производные с улучшенной фармакокинетикой [Veronese et al., 2005]. В результате многолетних исследований противовирусных пептидов сформировалась их большая коллекция с разной функциональной направленностью и архитектурой [Thakur et al., 2012].
Получение природных пептидов или их рекомбинантных аналогов является дорогостоящим, что ограничивает их широкое применение в медицинской практике. В связи с этим для снижения себестоимости и увеличения доступности пептидов ряд исследовательских коллективов предлагает создавать более короткие синтетические аналоги. Искусственный синтез полноразмерных природных пептидов дорог, однако экспериментально показано, что укороченные природные пептиды (до размера 13-14 аминокислот) также проявляют выраженную противовирусную активность [Doss et al., 2012].
Таким образом, будущее развитие пептидной противовирусной технологии связано с созданием более коротких синтетических аналогов, которые будут наиболее дешевыми в производстве.
Проведенные патентные исследования показали наличие ряда охранных документов в области использования пептидных соединений против вирусных патогенов, в том числе и респираторных вирусов. Запатентованные пептидные композиции в основном представлены аналогами природных пептидов, например дефензинов, или линейными синтетическими пептидами. В заявленном изобретении в качестве противовирусного агента выступает композиция, состоящая из синтетического не линейного, а разветвленного (дендримерного) пептида LTP и молекул миРНК. Таким образом, прямых аналогов заявляемого изобретения, представляющего собой композицию, состоящую из катионного дендримерного пептида - LTP и двух молекул миРНК, не выявлено.
Задачей предлагаемого изобретения является создание малотоксичного средства для лечения респираторных вирусных инфекций. Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание малотоксичной композиции, состоящей из дендримерного катионного пептида LTP и молекул миРНК (малых интерферирующих РНК), обладающей противовирусной активностью. Для этого композиция, обладающая выраженным противовирусным эффектом по отношению к респираторным вирусам, содержит катионный дендримерный пептид LTP с формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2 и молекулы siRNA представленные последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - использование комплекса, состоящего из катионного пептида LTP и молекул РНК, против респираторных вирусов.
Описание изобретения
Композиция содержит катионный дендримерный пептид LTP с формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2 и молекулы siRNA, представленные последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 (табл. 1) в соотношении 25:1 по массе. Композиция является малотоксичной, ее LD50=325 мг/кг при исследовании на мышах.
Изобретение поясняется чертежом, где на фиг. 1 представлена диаграмма, демонстрирующая изменение (в процентах) количества погибших животных (мышей (СВА×C57Bl/6)F1), которые внутрибрюшинно получали композицию «siIL4-89-153/LTP» в дозе 0,1 мг/кг/день в течение 10 дней с последующим заражением мышей вирусом гриппа штамм PR8.
Противовирусная активность заявленной композиции в отношении респираторных вирусов характеризуется примером 1.
Пример 1
Композицию разводили физиологическим раствором (ФР) и вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг в течение 10 дней. Объем введения - 500 мкл на мышь. Исследования противовирусной активности проведены на мышах гибридах (СВА×C57Bl/6)F1, самцах, возраста 2-2,5 месяца, массой 20-22 г. Дизайн исследования представлен в таблице 2.
Через 3 суток после окончания введения препарата мышей заражали вирусом гриппа PR8 (адаптированный штамм, вирулентный для мышей) в дозе, вызывающей при данных условиях опыта летальный эффект у 30% животных.
Наблюдение за животными проводили в течение 10 дней от момента заражения; регистрировали изменение массы тела и гибель животных. Подсчитывали процент выживших мышей.
Математическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Для анализа результатов исследования использовали прикладной программный пакет Statistika (версия 6.0). Достоверность различий исследуемых параметров оценивали с помощью непараметрического аналога критерия Стьюдента - критерия Манна-Уитни.
Анализ динамики гибели животных (фиг. 1) показал наличие противовирусного эффекта от введения композиции курсом 10 раз по 0.1 мг/кг (суммарная доза 1 мг/кг), поскольку происходила защита экспериментальных животных от гибели, вызванной действием вируса.
За время наблюдения после заражения падение массы тела выживших животных составила 10-20%, что свидетельствует о слабовыраженном течении инфекционного процесса (табл. 3).
Таким образом, в исследованиях по оценке неспецифической резистентности мышей к инфекции установлено, что курсовое введение исследуемой композиции в суммарной дозе 1 мг/кг и 5 мг/кг приводит к защитному действию, что выражается в снижении гибели животных.
Перечень последовательностей
<110> ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России
<120> Использование композиции, состоящей из катионного пептида LTP и молекул РНК, против респираторных вирусов
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 4
<210> SEQ ID NO 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Human
<400> SEQUENCE 1
<210> SEQ ID NO 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Human
<400> SEQUENCE 2
<210> SEQ ID NO 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Human
<400> SEQUENCE 3
<210> SEQ ID NO 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Human
<400> SEQUENCE 4