СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИН-СЕКРЕТИРУЮЩИХ КЛЕТОК

Способ получения инсулин-секретирующих клеток энтодермы поджелудочной железы, содержащий следующие стадии:
(а) получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ИПСК;
(б) исправление мутации в гене инсулина ИПСК;
(в) индукция дифференцировки ИПСК с исправленной мутацией в гене инсулина в эндотермальном направлении;
(г) получение из клеток дефинитивной эндодермы, полученной из ИПСК с исправленной мутацией в гене инсулина, инсулин-продуцирующих клеток, используя лентивирус;
(д) получение зрелых инсулин-продуцирующих клеток;
где на первой стадии (а) для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток используют персональные дермальные фибробласты пациента, которые имеют мутацию, приводящую к диабету;
где на второй стадии (б) для исправления мутации в ИПСК применяют способ CRISPR-Cas9, который позволяет проводить разрезание и введение вставки лишь в мутантном аллеле, не затрагивая нормальную аллель, при этом редактирование мутации проводят в последовательности интрона гена инсулина, содержащего мутацию c.188-31G>A в участке с последовательностью SEQ ID NO 4, где последовательности специфической части (gRNA) выбирают иа группы SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 3, а последовательности для гомологичной рекомбинации выбирают из группы SEQ ID NO 5 - SEQ ID NO 7;
где на третьей стадии (в) за счет дифференцировки ИПСК с исправленной мутацией в гене инсулина в дефинитивную эндодерму получают энтодермальные клетки-предшественники;
где на четвертой стадии (г) проводят дифференцировку энтодермальных клеток-предшественников в инсулин секретирующие клетки поджелудочной железы и через сутки культивирования в клетки трансдуцируют кДНК гена PDX1 человека SEQ ID NO 8, имеющего свой сайт полиаденилирования под контролем конститутивного промотора CMV SEQ ID NO 9 или EFla SEQ ID NO 10 в составе лентивирусного вектора;
где на пятой стадии (д) получение зрелых инсулин-продуцирующих клеток осуществляют путем проведения: стадии эндокринной индукции в течение 5 дней; стадии созревания эндокринных предшественников в течение 14 дней; стадии получения зрелых бета-клеток в течение 7 дней, при этом на стадии получения зрелых бета-клеток в состав среды входят компоненты, входящие в группу DMEM, Glutamax, NaHCO3, BSA, глюкоза ITS-X, гепарин, ALK5inhll, GC1, Trolox, N-Acetylcysteine.