Способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 878 СТ гена scd1 (rs41255693) методом ПЦР в режиме реального времени
METHOD FOR CATTLE GENOTYPING BY ALLELES 878 OF SCD1 (RS41255693) GENE BY PCR IN REAL TIME

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма 8780Т гена scd1 (rs41255693), кодирующего стеароил-СоА-десатуразу крупного рогатого скота, молекулярно-генетическим методом исследования.
Стеароил-СоА-десатураза (SCD1) является ключевым ферментом биосинтеза мононенасыщенных жирных кислот, катализируя образование двойной связи в цис-кофигурации между 9 и 10 углеродными атомами у целого ряда жирных кислот, содержащих от 12 до 19 углеродных атомов [Gamarra D, Aldai N, Arakawa A, et al. (2018) Distinct correlations between lipogenic gene expression and fatty acid composition of subcutaneous fat among cattle breeds. BMC Vet Res 14: 167]. У крупного рогатого скота ген scd1 расположен в области 26q21 [Bernard L, Leroux С, Hayes H, et al. (2001) Characterization of the caprine stearoyl-CoA desaturase gene and its mRNA showing an unusually long 3-UTR sequence arising from a single exon. Gene 281: 53-61], имеет длину приблизительно около 17 kb, включает в себя шесть экзонов и пять интронов. Открытая рамка считывания состоит из 1080 нуклеотидов, кодирующих белок - из 359 аминокислотных остатков. На сегодняшний день обнаружено несколько полиморфных участков гена scd1 у крупного рогатого скота, и показана их связь составом жирных кислот молока и мяса крупного рогатого скота [Taniguchi, М. Genotype of stearoyl-CoA desaturase is associated with fatty acid composition in Japanese Black cattle / M. Taniguchi, T. Utsugi, K. Oyama, H. Mannen, M. Kobayashi, Y. Tanabe, A. Ogino, S. Tsuji // Mammalian Genome. - 2004. - Vol.14. - P. 142-148; Kgwatalala PM, Ibeagha-Awemu EM, Hayes JF, et al. (2009) Stearoyl-CoA desaturase 1 3'UTR SNPs and their influence on milk fatty acid composition of Canadian Holstein cows. JAnim Breed Genet 126: 394-403]. Соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в молоке и мясе крупного рогатого скота влияет на их вкусовые, питательные и диетические свойства, при этом с точки зрения диетологии предпочтительны легкоплавкие ненасыщенные жирные кислоты [Ladeira MM, Schoonmaker JP, Gionbelli MP, et al. (2016) Nutrigenomics and Beef Quality: A Review about Lipogenesis. Int J Mol Sci 17; Gebreyesus G, Buitenhuis AJ, Poulsen NA, et al. (2019) Multi-population GWAS and enrichment analyses reveal novel genomic regions and promising candidate genes underlying bovine milk fatty acid composition. BMC Genomics 20:178]. Для одного из полиморфных участков 5-ом экзона гена scdU а именно rs41255693 (с.878С>Т, p.Ala293Val.), была показана связь генотипа 878С/С (293А1а/А1а) с большим содержанием мононенасыщенной олеиновой кислоты в молоке и мясе [Pegolo S, Cecchinato A, Mele М, et al. (2016) Effects of candidate gene polymorphisms on the detailed fatty acids profile determined by gas chromatography in bovine milk. J Dairy Sci 99: 4558-4573; Taniguchi, M. Genotype of stearoyl-CoA desaturase is associated with fatty acid composition in Japanese Black cattle / M. Taniguchi, T. Utsugi, K. Oyama, H. Mannen, M. Kobayashi, Y. Tanabe, A. Ogino, S. Tsuji // Mammalian Genome. - 2004. - Vol.14. - P. 142-148].
Несмотря на наличие достоверных данных о связи замены rs41255693 с жировым составом молока и мяса крупного рогатого скота, на сегодняшний день нет простого в исполнении, быстрого и надежного метода генотипирования крупного рогатого скота по замене rs41255693. Для дифференциации аллельных вариантов генов наиболее широко используется метод ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). Однако имеющиеся методы, основанные на ПЦР-ПДРФ анализе [патент Р3619833 В2; Glazko VI, Andreichenko IN, Kovalchuk SN, et al. (2017) Candidate genes for control of cattle milk production traits. Russian Agricultural Sciences 42: 458-464], не являются простыми и экономически выгодными.
Так, из уровня техники известен способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 878С>Т гена scd1 (rs41255693), обеспечивающий их идентификацию на основе метода ПЦР-ПДРФ (патент JP3619833B2; Taniguchi, М. Genotype of stearoyl-CoA desaturase is associated with fatty acid composition in Japanese Black cattle / M. Taniguchi, T. Utsugi, K. Oyama, H. Mannen, M. Kobayashi, Y. Tanabe, A. Ogino, S. Tsuji // Mammalian Genome. - 2004. - Vol.14. - P. 142-148). Способ состоит в том, что генотипирование крупного рогатого скота по замене rs41255693 проводят в 2 этапа. На первом этапе проводят ПЦР с прямым праймером 5'-ATGTATGGGACCACGCCCTTATGAC-3' (SEQ ID NO: 3) и обратным праймером 5'-CTGTCCCTTAGTTTTATAGTGGAATG-3', (SEQ ID NO: 4) при следующих условиях: предварительная денарурациия ДНК при 94 0 С в течении 2 мин, затем 35 циклов ПЦР со следующим профилем: 94°- С 30 сек, 65°С - 30 сек, 72 0 С - 1 мин, и затем d финальная элонгация при 72°С в течении 7 мин. На втором этапе анализа продукт ПЦР длиной 323 п. н. обрабатывают рестриктазой Fnu 4HI (Fsp 4HI) в течение 3-16 часов, и полученные рестрикты анализируются методом электрофореза в 3% агарозном геле. При этом расщепляется только аллельный вариант гена 878С, соответствующий аминокислотному остатку аланина. Рестрикты имели следующие размеры: для генотипа 878С/С - 29,48 и 68 п. о., для генотипа 878Т/С - 29, 48, 68 и 116 п. о., для генотипа 878Т/Т -29 и 116 п.о.
Прототипом является метод ПЦР-ПДРФ, предложенный Глазко с соавторами (Glazko VI, Andreichenko IN, Kovalchuk SN, et al. (2017) Candidate genes for control of cattle milk production traits. Russian Agricultural Sciences 42:458-464), согласно которому для ПЦР использовали по 0,2 мкМ праймеров SCD1-293R1: 5'-GGAAGAGAACAGCCCAAAGG-3' и SCD1-293F1: 5'-GCCACCTTATTCCGTTATGCCC-3. ПЦР проводили при следующих условиях: предварительная денатурации при 98°С в течение 30 с, 40 циклов амплификации: 98°С - 10 с, 60°С - 20 с, 72°С - 30 с. Рестрикцию полученных ампликонов длиной 411 п. н. проводили в 15 мкл смеси, содержащей 1.5 мкл Юхбуфера и 1 ед. эндонуклеазы Fau I (Сибэнзим, Россия) в течение 16 часов при 55°С.Результаты рестрикции оценивали методом электрофореза в 1,2% агарозном геле. Рестрикты имели следующие размеры: для генотипа 878С/С - 126 и 285 п. о., для генотипа 878Т/С - 411, 125 и 285 п. о., для генотипа 878Т/Т-411 п. о.
Основными недостатками данных двух методов являются многостадийность анализа (амплификация полиморфного участка гена, рестрикция полученного ампликона специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов), его длительность (8-16 часов), вероятность недостоверных результатов в случае неоптимального соотношения количества ДНК, рестриктазы и времени рестрикции.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в повышении надежности детекции аллелей 8780Т гена scd1 (rs41255693), в упрощении анализа и сокращении времени его проведения до 1 часа.
Технический результат достигается тем, что способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 878 ОТ гена scd1 (rs41255693) методом ПЦР в режиме реального времени состоит в том, что используются:
прямой праймер SCD1-D 5'- CCCTTATGACAAGACCATCAACC -3',
обратный праймер SCD1-R 5'- GACGTGGTCTTGCTGTGGACT -3'
SCD1-T - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'-FAM- CTTACCCACAGCTCCCA-BHQ1-3'
SCD1-C- аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'VIC-TACCCGCAGCTCCC-3- BHQ1,
при этом для гомозиготных образцов по аллелю Т (генотип 878Т/Т) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных образцов по аллелю С (генотип 878С/С) детектируется сигнал по каналу VIC, для гетерозиготного образца (генотип 878Т/С) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей, FAM и VIC, позволяет однозначно определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена scd1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип животного.
Перечень графических материалов.
На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена scd1 длиной 90 п. н., кодирующие аллели 8780Т гена scd1 (rs41255693). Жирным шрифтом отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.
На фиг. 2 представлен пример детекции аллельных вариантов 8780Т гена scd1 (rs41255693) крупного рогатого скота методом ПЦР в реальном времени. Представлены кривые флуоресценции (B-D) и диаграмма распределения генотипов (А).
Патентуемый способ заключается в проведения ПЦР в режиме реального времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам 8780Т гена scd1 (rs41255693). Заявленный способ отличается тем, что используются два общих для аллельных вариантов праймера: прямой SCD1- D: 5'- CCCTTATGACAAGACCATCAACC -3' и обратный праймер SCD1-R: 5'-GACGTGGTCTTGCTGTGGACT -3' фланкирующие участок гена scd1 длиной 90 п.н., и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan: SCD1-T:5'-FAM - CTTACCCACAGCTCCCA-BHQ1-3' и SCD1-C: 5'VIC-TACCCGCAGCTCCC-3- BHQ1 (фиг. 1).
Точки мутаций те же, что и в прототипе, однако подход детекции иной: в заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма методом ПЦР в режиме реального времени с помощью флуоресцентно-меченых аллель-специфичных зондов.
В патентуемом способе идентификации аллельных вариантов 8780Т гена scd1 (rs41255693) на основе ПЦР в режиме реального времени используются два праймера, общие для обоих аллелей гена, и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan (Фиг. 1). С помощью праймеров SCD1-D и SCD1-R амплифицируется фрагмента гена scd1 длиной 90 п.н. Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси ПЦР, содержащей 5 мкл реактива LightCycler 480 Probes Master («Roche», Швейцария), по 1 мкМ прямого праймера SCD1- D: 5'- CCCTTATGACAAGACCATCAACC -3' и обратного праймера SCD1-R: 5-GACGTGGTCTTGCTGTGGACT -3' (10 мкМ), по 0,4 мкМ аллель-специфичных зондов SCD1-T: 5'-FAM- СТТАСССACAGCTCCCA-BHQ1 -3' и SCD1-C: 5'VIC-TACCCGCAGCTCCC-3- BHQ1, 10 нг ДНК. ПЦР проводили с помощью прибора LightCycler 96 («Roche», Швейцария) в оптимизированных условиях (95°С - 10 мин.; 95°С - 20 сек., 55°С - 30 сек., 72°С 20 сек., 40 циклов). Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и VIC. Для анализа результатов использовали программное обеспечение к амплификатору LightCycler 96 версии SW1.1 (Roche, Switzerland). Идентификация аллелей 878С и Т гена scd1 (rs41255693) проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей VIC и FAM, соответственно. Для определения генотипа животного используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и VIC. Программное обеспечение для амплификатора LightCycler 96 версии SW1.1. представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (Фиг. 2А). Для животных с генотипом 878Т/Т наблюдается рост флуоресцентного сигнала по каналу FAM (Рисунок 1 Б). Для коров с генотипом 878С/С сигнал флуоресцентного регистрировался по каналу VIC (Рисунок 1Г). Для гетерозиготных коров (генотип 878Т/С) детектируются сигналы по обоим каналам - FAM и VIC (Рисунок 1В). Таким образом, результаты ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфичных зондов TaqMan позволяют определять присутствие каждого из исследуемых аллелей Т и С гена scd1 (rs41255693) в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип животного.
Валидацию разработанного метода проводили с помощью ПЦР-ПДРФ анализа, как описано в прототипе (Glazko VI, Andreichenko IN, Kovalchuk SN, et al. (2017) Candidate genes for control of cattle milk production traits. Russian Agricultural Sciences 42: 458-464). Результаты обоих методов генотипирования полностью совпали, однако, разработанный нами метод позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа, что выгодно отличает его от ПЦР-ПДРФ анализа (16 часов).
Таким образом, нами разработан эффективный и надежный способ для экспресс-идентификации аллельных вариантов 878С>Т гена scd1 (rs41255693) крупного рогатого скота на основе ПЦР в режиме реального времени с использованием аллель-специфических флуоресцентно-меченых зондов TaqMan. Данный способ позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа, что выгодно отличает его от ПЦР-ПДРФ анализа, использованного в прототипе, позволяет проводить одновременно генотипирование большого количества (до 480 животных, в зависимости от модели амплификатора) и может быть использован для отбора коров с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот в мясе и молоке.