Конструирование тест-системы для диагностики сифилиса

УДК 616.972

П.В. Храмцов,

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Создана и оптимизирована дот-аналитическая система на базе сенсибилизированных белком р17 дисков из нитроцеллюлозной мембраны. Разработанная тест-система апробирована при помощи стандартной панели сывороток и показала 100 %-ную чувствительность и специфичность. Продемонстрирована возможность синтеза твердофазного реагента на основе кардиолипинового антигена.

Ключевые слова: сифилис, диагностика, дот-блот анализ, углеродные наночастицы.

ВВЕДЕНИЕ

Заболеваемость сифилисом остается стабильно высокой в РФ в последние годы (более 30 чел. на 100 000 населения). В Пермском крае на протяжении последних 5 лет заболеваемость вдвое превышает средние показатели по РФ. Одной из главных причин этого является несовершенство системы ранней диагностики сифилиса. Именно повсеместные скринин-говые исследования призваны выявлять заболевших на начальных стадиях заболевания для назначения им своевременного лечения, их изоляции и ограничения распространения инфекции.

Чувствительность применяемых не-трепонемных скрининговых методов (качественная реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном и ее модификации), очевидно, недостаточна. Она составляет 90 %, что дает 10 % потенциально ложноотрицательных результатов.

Кроме того, положительные реакции наблюдаются лишь после 2-3-й недели наступления первичного сифилиса, то есть лишь спустя 6-7 недель после заражения. Столь позднее обнаружение антител к сифилису характерно для всех нетрепонем-ных серологических тестов, которые и используются в РФ для скрининга. Лучшие аналитические свойства демонстрируют системы, в которых для анализа используются белковые антигены трепонемы (р15, р17, р47 и др.).

Цель работы - конструирование неинструментальной твердофазной дот-имму-ноаналитической системы серологической экспресс-диагностики сифилиса на основе функционализированных углеродных наночастиц, предназначенной для проведения скрининговых исследований и мониторинга эффективности терапевтических мероприятий.

* Работа выполнена при финансовой поддержке программы «УМНИК-2013 (осень)» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере 1732ГУ1/2014.

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА 2/2015

МЕТОДЫ

Синтез диагностикумов производили по оригинальной двухэтапной методике, описанной в работе М.Б. Раева [1]. Для стандартизации диагностикумов исследовали их функциональные свойства в модельных аналитических системах. Структурные свойства оценивали при помощи атомно-силовой микроскопии (АСМ) и измерения обратного динамического рассеяния света (ОДРС). Эти два метода имеют принципиальное различие: АСМ предполагает исследование высушенного на твердой гладкой подложке образца углеродного конъюгата в концентрации на несколько порядков ниже рабочей, метод измерения ОДРС дает возможность исследовать концентрированные нативные пробы конъюгатов. Первый метод обеспечивает большую точность измерения, второй позволяет исследовать большее количество частиц, однако программная обработка результатов может приводить к погрешностям в итоговых результатах.

Для конструирования дот-иммуноана-литических систем серологической диагностики применяются два основных типа твердофазных реагентов: пористые (на основе целлюлозы, стекловолокна и др.) и непористые (как правило, на основе различных видов полистирола). Эти два типа материалов отличаются по своим свойствам. Пористые материалы имеют большую емкость по отношению к белкам, использующимся в качестве антили-гандов, обладают большей удельной площадью поверхности; непористые твердофазные реагенты - большей жесткостью и прочностью. В ходе наших исследований были протестированы оба типа твердофазных реагентов.

При подборе условий синтеза иммуно-сорбента необходимо решать проблему неспецифических взаимодействий компонентов анализа с твердой фазой. Твердая фаза, используемая в дот-анализе, обладает высокой сорбционной емкостью в отношении белков. Механизмы сорбции различны для разных типов твердых фаз:

для полистирола это, прежде всего, гидрофобные взаимодействия, для нитроцеллюлозы - электростатические и гидрофобные. Для предотвращения неспецифического связывания компонентов анализа (в первую очередь диагностикума и иммуноглобулинов сыворотки) с несенсиби-лизированными участками поверхности твердой фазы проводили процедуру блокирования. Для блокирования гидрофобных взаимодействий на поверхности твердой фазы использовали неионоген-ный детергент Твин-20. Для предотвращения неспецифической электростатической сорбции применяли ряд стандартных белковых блокаторов (бычий сывороточный альбумин, казеин, сухое молоко), из которых выбирали наилучший.

В рамках дот-блот-анализа оптимизация сводится к подбору объемов исследуемого образца, диагностикума, времени инкубации, буферных систем. В случае объемов пробы и диагностикума оптимальный объем, по своей сути, является минимально необходимым для корректной постановки анализа. Это связано с экономией реагентов и стремлением использовать как можно меньший объем биологического материала для тестирования.

Подбор оптимальной процедуры тестирования проводили, сравнивая варианты последовательного и одномоментного внесения в аналитическую систему диагности-кума и исследуемой пробы. Первый вариант предполагает формирование на поверхности твердой фазы комплекса «антиген-антитело» и последующую его детекцию частицами углерод - G-белок после промывки. Вариант с одномоментным внесением проще для исполнения, не требует дополнительной промывки, однако функцио-нализированные углеродные частицы могут при таком способе анализа взаимодействовать не только с целевыми антителами, но с любыми IgG образца. Это может негативно повлиять на чувствительность анализа. Таким образом, в данном случае необходимо было найти наилучший процедур-

ный вариант с точки зрения простоты и чувствительности теста.

Определение аналитических свойств сконструированной тест-системы можно проводить различными способами, например, использовать стандартные образцы или же клинический материал, содержание/отсутствие целевых антител в котором подтверждено референсными тестами. Как правило, при наличии коммерческой стандартной панели сывороток в первую очередь используют именно ее в качестве ре-ференса. В случае позитивных результатов при тестировании стандартной панели проводят более масштабные исследования на клиническом материале. Мы решили пойти именно таким путем. В нашей работе была использована стандартная панель производства ЗАО «Медико-биологический союз» (Россия) из 24 сывороток крови, из которых 16 содержали антитела к возбудителю сифилиса, оставшиеся 8 - нет.

Исследование стабильности иммуно-сорбентов играет значительную роль при

создании коммерческих тест-наборов. Ранее было продемонстрировано, что углеродные диагностикумы, которые использованы нами для создания тест-системы, имеют длительный срок хранения (более 10 лет). Таким образом, срок годности тест-набора будет зависеть главным образом от стабильности иммуносорбента. Для ее исследования в ходе первого этапа был заложен эксперимент. В основу исследований стабильности иммуносорбентов при хранении лег метод стабилизации твердофазных реагентов, разработанный М.Б. Раевым [Патент РФ № 2327992]. Для оценки сохранения свойств иммуносор-бентов нитроцеллюлозные диски, сенсибилизированные антигеном р17 в концентрации 0,01 мг/мл, обрабатывали 30 %-ным раствором сахарозы и высушивали. Часть стабилизированных иммуно-сорбентов поместили на хранение в различные температурные условия: +25 °С и 5 ± 3 °С, другую часть исследовали непосредственно после высушивания.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование функциональных свойств диагностикума

Функциональные свойства диагности-кума проводили в модельных диагностических системах: прямом определении IgG на полистироле (рис. 1) и определении

титра стандартной псевдотуберкулезной сыворотки из набора для постановки реакции непрямой гемагглютинации (рис. 2).

Структурные свойства, а именно размеры частиц, определяли при помощи АСМ и измерения ОДРС.

Рис. 1. Прямое определение IgG на полистироле. Стрелками отмечены последние визуализируемые точки и соответствующие концентрации IgG, БСА - отрицательный контроль

Разведения

сыеорогки

С -G белак 2014 г.

С -G белок 2Q02 г

Рис. 2. Определение титра стандартной псевдотуберкулезной сыворотки. К - отрицательный контроль (сыворотка крови здорового человека), отмечены последние визуализируемые точки

1/500 1/1000 1/2000 1/40Q0 1/BOQO 1/16000 1У32000 1/640001/123000 К

ООООООФ«. •• ООО о о о С #. ••

Рис. 3. АСМ-изображение функционализированных G-белком углеродных наночастиц

При измерении размеров частиц конъ-югата углерод - G-белок при помощи АСМ (рис. 3) средний размер частиц составил 98 ± 17 нм (ошибка среднего 1,84).

Измерение ОДРС частиц дает возможность оценить их распределение в растворе по размерам за несколько минут, метод удобен благодаря своей простоте и оперативности. Полученный график распределения частиц конъюгата по размерам продемонстрировал, что большая часть частиц имеет линейные размеры от 70 до 200 нм, а преобладают частицы размером 90-100 нм, что согласуется с результатами АСМ (рис. 4).

Свежесинтезированный диагностикум тестировали в сравнении с аналогичным диагностикумом, синтезированным более 10 лет назад. Критериями оценки были чувствительность (ее определяли по последней визуализируемой точке в ряду

серийных разведений сыворотки и IgG) и специфичность (ее оценивали по отсутствию сигнала в контрольных зонах теста). Было продемонстрировано, что применение свежесинтезированного диагностику-ма обеспечивает требуемую чувствительность и специфичность модельных аналитических систем.

Подбор оптимальных условий синтеза иммуносорбентов

Тестирование иммуносорбентов осуществляли в модельных аналитических системах, предназначенных для полуколичественного определения антител в ре-ференсных антитрепонемных сыворотках из стандартной панели.

Для проведения анализа на нитроцел-люлозной мембране из нее изготавливали диски диаметром 5 мм. Диски сенсибилизировали, сорбируя на них 5 мкл раствора

Рис. 4. График распределения по размерам функционализированных G-белком углеродных наночастиц (методом измерения ОДРС). В легенде указан год синтеза диагностикумов

антигена р17 в ЗФР, и высушивали. Использовали 6 серийных разведений анти-лиганда, кратных двум, начиная с концентрации 0,1 мг/мл. В качестве контроля на часть дисков сорбировали БСА в концентрации 0,1 мг/мл. Затем диски погружали в блокирующий раствор на 60 мин. В качестве блокаторов использовали ЗФРТ, ЗФР + 1 % БСА, ЗФР + 1 % казеин, ЗФР + 1 % сухое молоко. Контрольные диски погружали в ЗФР, не содержащий неионогенных и белковых блокато-ров. После иммуносорбент промывали ЗФРТ и инкубировали в течение 30 мин с образцом референсной сыворотки, содержащей или не содержащей антитела к сифилису. Затем диски трехкратно промывали ЗФРТ и инкубировали в растворе конъюгата углеродных частиц с G-бел-ком. Чувствительность анализа оценивали по последней визуализируемой точке в ряду серийных разведений сыворотки, специфичность - по наличию/отсутствию сигнала на контрольных дисках.

Оптимальная концентрация антигена р17 - 0,01 мг/мл (рис. 5). Она обеспечивает высокую чувствительность и специфичность детекции. Применение концен-

трации 0,1 мг/мл, повышавшей чувствительность в 2 раза, было признано нецелесообразным из соображений экономии.

При подборе оптимального блокатора оценивали эффективность снижения неспецифического сигнала, а также учитывали его влияние на аналитические характеристики анализа. Было показано, что оптимальным блокатором является ЗФРТ (рис. 6). Добавление белковых блокаторов приводило к снижению чувствительности детекции, хотя они уменьшают уровень неспецифического сигнала столь же эффективно, как и твин-20. В ходе экспериментов было выяснено, что для успешного блокирования при помощи ЗФРТ достаточно трехкратно промыть иммуносор-бент этим раствором в течение 5 мин.

Для синтеза иммуносорбентов на основе непористого материала использовали планшеты из непрозрачного полистирола. На дно лунок полистирольных планшетов каплями сорбировали антиген р17 T. pallidum в КББ в концентрациях 0,1, 0,05, 0,01 мг/мл. В качестве отрицательного контроля на дно лунки сорбировали БСА в концентрации 0,1 мг/мл. Планшеты помещали на 30 мин во влажную камеру в

11001 гоо 1 доо 1 воо 11боо 1 эгоо 1 ыоо к

Больной

Здоровый

оо

I 0,1 Р.!Г|'Р.1Л

о о ##••• #

БОЛЬНОЙ Здоровый

Больной Г  ^ ЗДОрбИй

Больней ЗДОРОВЫЙ

0.05 нгТмЛ

0,026 мАм л

0,01м Лип

0.0С6 м.п'мп

0.003 МГ^мП

Рис. 5. Подбор оптимальной сенсибилизирующей концентрации антилиганда на нитроцеллюлозной мембране. «Больной» - ряд дисков, инкубированных с контрольной положительной сывороткой крови, «здоровый» - диски, инкубированные с контрольной отрицательной сывороткой крови. К - диски, сенсибилизированные БСА. Белой меткой показана последняя визуализируемая точка в ряду серийных разведений сыворотки. Справа указаны сенсибилизирующие концентрации антилиганда

Рис. 6. Подбор оптимального блокирующего реагента. Слева указаны протестированные блокаторы. В верхней части рисунка - титры референсной положительной сыворотки крови. Последние визуализируемые точки в ряду серийных разведений сыворотки обозначены меткой. Концентрация антилиганда - белка р17 - 0,01 мг/мл

термостат (Т = +37 °С). После завершения экспозиции капли удаляли при помощи водоструйного насоса. Сенсибилизированные планшеты промывали ЗФРТ и 60 мин инкубировали при мягком перемешивании с исследуемыми референсными сыворотками крови в 8 серийных разведениях, кратных двум, начиная с разведения 1/100. Затем иммуносорбент промывали и в лунки вносили диагностикум на 15 мин. После завершения каждого этапа инкубации планшеты трехкратно промывали ЗФРТ. Результаты оценивали визуально по наличию или отсутствию окрашивания в зоне сорбции антигена. Титр сыворотки определяли по последней достоверно отличной от фона окрашенной точке в ряду серийных разведений.

Оптимальной для сенсибилизации полистирола была признана концентрация антигена р17 0,01 мг/мл, применение более высоких концентраций антилиганда не привело к увеличению чувствительности детекции. Все контроли сработали корректно (рис. 7). Чувствительность де-

текции при использовании иммуносор-бентов на основе нитроцеллюлозы и полистирола была одинаковой, однако длительность инкубации с сывороткой при использовании полистирольной подложки была вдвое большей. В дальнейшем для конструирования дот-аналитической системы было решено использовать нит-роцеллюлозный иммуносорбент.

Конструирование дот-аналитической системы и ее оптимизация

Диски из нитроцеллюлозной мембраны сенсибилизировали антигеном р17 в концентрации 0,01 мг/мл в ЗФР. Диски высушивали, помещали в лунки планшета для серологических реакций, трижды промывали ЗФРТ, а затем инкубировали с двукратными серийными разведениями (начиная с 1:100) положительной референс-ной сыворотки в течение 15, 30 и 60 мин. После инкубации диски вновь трехкратно промывали ЗФРТ и на 15 мин вносили ди-агностикум в объеме 70 мкл. Объем диаг-ностикума был подобран эксперименталь-

1поо 1/2ЭС 1/400 1/аоо 1леоо шгоо

1

1/100 1/200 1/400 1/800 1МвС0 " ЗФРТ р17 0.1 МГ/МЛ р17 0.05 мг/мл

Рис. 7. Подбор оптимальной сенсибилизирующей концентрации антилиганда на полистироле. «+» - ряд лунок, в которые вносили положительную референсную

сыворотку, выше указаны ее разведения, «-» - ряд лунок, в которые вносили отрицательную референсную сыворотку, ниже указаны ее разведения 1/100, ЗФРТ - лунка, в которую вносили ЗФРТ. Черньм кругом обведена лунка, в которой находятся последние визуализируемые точки в ряду серийных разведений сыворотки. Схема сорбции антигенов в лунке приведена ниже

но, как наименьший объем, обеспечивающий полноценное смачивание диска. Разведения сыворотки вносили в лунки в количестве 100 мкл. Для постановки анализа необходимо менее 10 мкл сыворотки крови, непосредственно в анализе используется многократно разведенная сыворотка крови, вследствие чего нет особого смысла минимизировать ее объем.

В альтернативном варианте тестирования производили одномоментное внесение исследуемого образца и диагно-стикума. При этом все процедуры были идентичны, кроме того, что диски после сенсибилизации и промывки инкубировали в 70 мкл смеси диагностикума и разведенной сыворотки. При этом сначала были подготовлены двукратные разведения сыворотки в ЗФРТ, начиная с 1:100, а затем на каждом из растворов сыворотки было приготовлено разведение диагностикума. В полученных смесях инкубировали иммуносорбенты в течение 15, 30 и 60 мин.

В результате было продемонстрировано, что оптимальная длительность инкубации составляет 30 мин для последовательного варианта внесения пробы и диагностикума. Часовая инкубация не дает какого-либо прироста чувствительности, 15-минутная инкубация приводит к двукратному снижению чувствительности анализа. Получасовая инкубация является оптимальной и при одномоментном внесении сыворотки крови и диагностикума. При этом чувствительность анализа по сравнению с последовательной инкубацией снижается в 2 раза (рис. 8). Схема внесения пробы и диагно-стикума, а также длительность этапов инкубации не оказывали влияния на специфичность анализа. Во всех случаях тестирование отрицательной референс-ной сыворотки крови не приводило к ложноположительному результату.

В дальнейшем было решено использовать вариант последовательного внесения образца и углеродного диагностикума, который хоть более продолжителен (на 15 мин), но обеспечивает более высокую

чувствительность. Подготовка пробы к анализу также проще при использовании варианта анализа с последовательным внесением, что, как указано выше, играет немалую роль для конечного потребителя.

Тестирование сконструированной

системы при помощи стандартной референсной панели сывороток

Аналитические свойства сконструированной диагностической системы оценивались при помощи стандартной панели сывороток крови производства «Мед-БиолСоюз». Панель содержит 24 сыворотки крови, из которых 16 положительных и 8 отрицательных. Каждая сыворотка охарактеризована при помощи ряда отечественных тест-систем, предназначенных для выявления трепонемных антител. Из всех коммерчески доступных панелей она является наибольшей, однако все равно недостаточно объемна для полной оценки диагностических свойств тест-набора. Кроме того, панель предназначена для тестирования ИФА-наборов, однако ввиду отсутствия лучшего варианта, мы использовали именно ее. Более полная оценка разработанной тест-системы может быть проведена лишь на значительном массиве клинического материала.

1*100 1/2М 1.400 1*800 1*1600 1*6400

Рис. 8. Сравнение двух схем определения антител

к антигену р17 в референсных сыворотках: с последовательным (1, 3) и одновременным (2, 4, 5) внесением пробы и диагностикума. Тестировали две положительные сыворотки: А и Б, а также одну отрицательную: 5. Титры сывороток указаны в верхней части рисунка. Отмечены последние визуализируемые точки в рядах серийных разведений сывороток

Каждая из сывороток панели была подготовлена к исследованию согласно инструкции производителя. Сыворотки тестировали в 10 серийных разведениях в ЗФРТ, начиная с 1:100. Использовалась описанная выше последовательная схема: получасовая инкубация с сывороткой и пятнадцатиминутная - с диагностику-мом. Каждая из сывороток была дополнительно протестирована при помощи полуколичественной ИФА-тест-системы и МРП (рис. 9). Была продемонстрирована чувствительность и специфичность сконструированной системы на уровне 100 %. Однако, как отмечалось ранее, диагностическая панель недостаточно велика, чтобы делать окончательные выводы, кроме того, она содержит недостаточное число «сомнительных» сывороток с низким содержанием антител к возбудителю сифилиса.

Исследование иммуносорбентов, хранившихся при различных условиях, мониторинг изменения аналитических свойств иммуносорбентов с течением времени Длительное сохранение иммуносор-бентом аналитических свойств является важным условием создания эффективных систем диагностики. Основными повреж-

дающими факторами являются протеаз-ная активность контаминирующих твердую фазу микроорганизмов, а также колебания условий окружающей среды. Они вызывают структурно-конформационные изменения молекул антигена, приводящие к нарушению процесса распознавания антигенных детерминант антителами и снижению чувствительности и специфичности систем диагностики.

Исследование стабильности сенсибилизированных антигеном р17 нитроцел-люлозных дисков производили в предварительно подобранном оптимальном режиме: концентрация антигена для сенсибилизации составила 0,01 мг/мл, анализ проводили в варианте последовательной инкубации 30 мин с сывороткой и 15 мин с диагностикумом.

Иммуносорбент, обработанный

30 %-ным раствором сахарозы сохранил свои свойства при хранении в течение полугода при комнатной температуре и на холоду. Об этом свидетельствуют идентичные по показателям чувствительности и специфичности результаты сравнительного анализа с использованием свежесинтезированных и обработанных раствором сахарозы, хранившихся в течение 6 месяцев при +25 °С и +4 °С иммуносорбентов (рис. 10).

1моо ttfoo илоо ш U1SM шгаа целое шгию uíssoo ИФА РМП

1 1/160 1/2

1/1280 1/16

1/2560 1/32

Рис. 9. Определение титра сифилитических антител к антигену pl 7 в положительных (1-3) и отрицательных (4, 5) референсных сыворотках крови при помощи сконструированной дот-иммуноаналитической системы. Титры сывороток указаны в верхней части рисунка. Для каждой сыворотки приведены данные ее исследования при помощи ИФА и РМП. Отмечены последние визуализируемые точки в рядах серийных разведений сывороток

1нсо 1/гоо т^оо 1гаоо пбоо шгоо и&доо

О о • О О • • \ • •

1Л 00 1/100 1*00 Б 1/800 1П600 1/3200 ЗФРТ 1^$Д00

оо • О О О • О •

1Л0О ЗФРТ

1ЛОО М100 1М00 Б 1/800 1/1 МО 1/3200 1^6400

ООО • О • • \ О •

Рис. 10. Исследование изменения аналитических свойств иммуносорбентов при хранении. А - свежесинтезированные сенсибилизированные 0,01 мг/мл

антигена р17 нитроцеллюлозные диски; Б - нитроцеллюлозные диски, сенсибилизированные 0,01 мг/мл

антигена р17 хранились при температуре +25°С; В - нитроцеллюлозные диски, сенсибилизированные 0,01 мг/мл антигена р17 хранились при температуре +4°С. «+» - ряд дисков, инкубированных с положительной референсной сывороткой, выше указаны ее разведения, «-» - диск, инкубированный с отрицательной референсной сывороткой в разведении 1/100, ЗФРТ - диск, инкубированный с ЗФРТ, время указывает

длительность инкубации дисков с сывороткой. Тестирование производили в варианте последовательной

инкубации с сывороткой 30 мин и 15 с конъюгатом. Стрелкой обозначена последняя визуализируемая точка в ряду серийных разведений сыворотки

Синтез иммуносорбента на основе кардиолипинового антигена

На настоящий момент разработано лишь ограниченное число твердофазных тест-систем на основе кардиолипина. Главным образом это связано с природой антигена: кардиолипин представляет собой фосфолипид, а современные материалы твердых фаз для конструирования дот-блот- и иммунохроматографических анализов ориентированы на максимальную сорбцию белков. В основном это ка-

сается нитроцеллюлозной мембраны. Наиболее распространены ИФА-наборы, в которых детектируются антитела к кар-диолипину, сорбированному на полисти-рольной поверхности. В ходе работы мы пришли к идее создания тест-системы, позволяющей выявлять антитела не только к белковым антигенам трепонемы, но и неспецифические антитела. Подобное усовершенствование повысит информативность и диагностическую ценность тест-системы.

В ходе реализации проекта мы синтезировали иммуносорбент на основе кар-диолипинового антигена (КА). В качестве твердой фазы были использованы белые непрозрачные полистирольные планшеты ««ЬтЬго». КА производства «Микроген» представляет собой раствор 0,9 % холестерина, 0,27 % лецитина и 0,03 % кардиоли-пина в абсолютном этаноле. Наилучшие результаты были получены при сорбции КА в 50 %-ном этаноле в объеме 1 мкл. При этом изначально цельный КА разводили в 8 раз 96 %-ным этанолом, а затем еще в два раза дистиллированной водой. При сорбции КА в абсолютном спирте наблюдается растекание антигена по поверхности твердой фазы, что делает невозможной интерпретацию результатов анализа. Снижение гидрофобности за счет добавления равного объема воды решает эту проблему и позволяет получать ровные, четко визуализируемые точки (рис. 11). Также нами было продемонстрировано, что удаление твина-20 из всех буферов, кроме того, на котором разводится конъюгат, является необходимым условием получения достоверного результата.

Тестирование сывороток из стандартной панели продемонстрировало, что наиболее интенсивный сигнал дают сыворотки с высокой концентрацией антител к кардиолипину (титр в РМП более 1:8). При исследовании низкотитражных сывороток интенсивность сигнала недостаточно велика, что негативно влияет на чувст-

вительность теста. Наиболее верным путем продолжения исследований будет использование в качестве антигена чистого кардиолипина, недорогого и коммерчески доступного препарата. В ряде публикаций [5, 6] показана возможность использования чистого кардиолипина для создания тест-систем с высокой чувствительностью и специфичностью, поэтому дальнейшее совершенствование разработанной нами тест-системы в этом направлении мы видим весьма перспективным. В ходе исследований нам не удалось получить иммуно-сорбент на основе нитроцеллюлозы и КА, что, очевидно, связано со слишком высоким содержанием холестерина в КА [4]. Анализ литературных данных показывает, что использование для этой цели чистого кардиолипина приводит к весьма позитивным результатам [3, 4, 6].

Рис. 11. Определение антител к КА в референсных положительной и отрицательной сыворотках крови в полистирольном планшете: КА - кардиолипиновый антиген в 50 %-ном этаноле, содержание кардиолипина 0,002 %. IgG - иммуноглобулины G человека («Sigma»), сорбированы в ЗФР в концентрации 0,01 мг/мл

Синтезированы и охарактеризованы диагностические реагенты на основе функционализированных G белком стрептококка углеродных наночастиц.

Оптимизирован синтез иммуносор-бентов на основе белковых антигенов Treponema pallidum на двух видах твердых носителей: нитроцеллюлозе и полистироле. Отработаны приемы стабилизации твердофазных реагентов, обеспечивающие сохранение их аналитических свойств при длительном хранении.

Сконструирована и оптимизирована дот-аналитическая система на базе сенсибилизированных белком р17 дисков из нитроцеллюлозной мембраны.

Разработанная тест-система апробирована при помощи стандартной панели сывороток и показала 100 %-ную чувствительность и специфичность.

Продемонстрирована возможность синтеза твердофазного реагента на основе кардиолипинового антигена.

Библиографический список

1. Раев М.Б. Нанобиотехнологии в неинструментальной иммуноаналитике / под. ред. В.А. Демакова, Екатеринбург: УрО РАН, 2012. - 140 с.

2. Патент РФ № 2327992.

3. Costello P., Green F. Reactivity patterns of human anticardiolipin and other antiphospholipid antibodies in syphilitic sera // Infect. Immun. - 1986. - Vol. 51. I. 3. - P. 771-775.

4. Costello P., Green F. Cholesterol effects on the interaction of cardiolipin with anti-cardiolipin antibody // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. - 1987. - Vol. 896. I. 1. - P. 52-56.

5. Fialova L., Malbohan I., Malickova K. Avidity of anticardiolipin antibodies—A factor that could be important for their detection by ELISA methods // J. Applied Biomedicine. - 2014. - Vol. 12. I. 4. -P. 277-284.

6. Huang Q. [et al.]. Dot-immunogold filtration assay as a screening test for syphilis. // J. Clin. Microbiol. -1996. - Vol. 34. I. 8. - P. 2011-2013.

DEVELOPMENT OF TEST FOR SYPHILIS

P.V. Khramtsov

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the RAS

Non-instrumental dot blot serological syphilis test based on application of functionalized carbon nanoparticles was developed and optimized. Nitrocellulose membrane sensitized with Treponema pallidum pl7 protein served as an immunosorbent. Assay demonstrated 100 % sensitivity and specificity when tested with reference panel of serum. Possibility of detection of antibodies against cardiolipin was also shown.

Keywords: syphilis, diagnostics, dot blot assay, carbon nanoparticles.

Сведения об авторе

Храмцов Павел Викторович, аспирант, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (ИЭГМ УрО РАН), 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; ассистент кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15; e-mail: khramtsovpavel@yandex.ru

Материал поступил в редакцию 25.05.2015 г.