Полиморфизм гена XRCC1 у детей с острым лимфобластным лейкозом

уровня ПС доношенных плодов и новорожденных наиболее значима, поскольку гибель функционально зрелых детей имеет существенную социальную роль. При правильной организации дородового наблюдения за беременными возможно снижение частоты преждевременных родов, уменьшение числа недоношенных новорожденных и снижения ПС. Предупреждение недонашивания беременности на популяционном уровне, интранатальная охрана плода являются резервами улучшения перинатальных показателей и качества здоровья родившихся детей.

Библиографический список

1. Барашнев Ю.И. Рос. Вестн. перинатол. и педиатр/ Ю.И. Барашнев. - 2001. -№ 1. - С. 6-11.

2. Белослудцева H.H. Перинатальная смертность в Нижегородской области: клинико-биологические и медико-соци-альныеаспекты:Автореф.дис....канд.мед.наук. - 1996.

3. Бурдули Г.М. Репродуктивные потери (причины, факто-рыриска,путипрофилактики):Автореф.дис. ...д-рамед.наук. -

И., 1998.

4. Глиняная С. В. Перинатальная смертность (статистика, причины, факторы риска): Автореф. дис. ...канд. мед. наук. -М., 1994.

5. МухинаТ.В. Здравоохранение Российской Федерации/ Т В. Мухин. - 2006. - № 1. - С.23-29.

6. ОбоскаловаТ.А. Акуш. и гинек./Т.А. Обоскалова. - 2005. -

№5. - С. 39-41.

7 Остроумова Л.А. Перинатальная смертность и медико-организационные аспекты ее профилактики в Западной Сибири: Автореф. дис.... канд. мед. наук - Екатеринбург, 1999.

8. Руководство по безопасному материнству / Кулаков В. И., Серов В Н., Барашнев Ю.И. и др. - М„ 1998.

9. Суханова Л.П. Акуш. и гинек./ Л.П. Суханова. - 2005. -№ 4. - С. 46-48.

10. Фролова О.Г., ГудимоваВ В., ПугачеваТ.Н. Вопр. совр. Педиатр/ О.Г.Фролов, В В. Гудимов, Т.Н. Пучачев. - 2003. -Т. 2, прил. №1. - С. 382-383.

11. Фролова О Г., ПугачеваТ.Н., ГудимоваВ.В. Акуш. и гинек. - 2005. -№ 5. - С. 36-38.

12. Чернуха Е. А. Акуш. и гинек. - 2005.-№5. - С.8-10.

КРАВЧЕНКО Елена Николаевна, к.мед.н., ассистент кафедры акушерства и гинекологии ЦПК и ППС.

Дата поступления статьи в редакцию: 03.06.2006 г. © Кравченко H.H.

УДК 616.155.392 К.с. КАЗНАЧЕЕВ,

H.A. СМЕТАННИКОВА, Т.И. ПОСПЕЛОВА, В.А. БЕЛЯВСКАЯ, В.Д. ЗЛОБИНА

Новосибирский государственной медицинский уюаерситет ГУ Исследовательский центр вирологии и биотехнологии «Вектор» Новосибирский областной детский онкогематологический центр

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА XRCC1

У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛЛСТНЫМ

ЛЕЙКОЗОМ

Состояние внутриклеточной системы контроля апоптоза играет важную роль в предрасположенности к развитию неоплазм«: мутантные аллели часто обеспечивают формфование неполноценных белков. Проводилось определение полиморфизма гена XRCC1 по локусу Ârg399Ght у детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). Выявлено накопление гомозигот Gln/Gh (XRCC1) и лиц с комбинациями M/M - W/M -W/M р53. Полученные данные свидетельствуют о значительных изменениях в системе р53 у детей, страдающих ОЛЛ.

Современные представления о патогенезе и подходах к терапии злокачественных опухолей сочетают в себе как информацию о различных особенностях опухолевых клеток, так и оценку индивидуальной реакции организма на цитостати-ческие средства, составляющие основу противоопухолевой терапии.

Лейкозы являются первичным опухолевым заболеванием костного мозга, при котором опухолевые клетки, поражая костный мозг, распространяются не только но органам кроветворения, но и в ЦНС, другие органы и системы. Показатель заболеваемости лейкозом в различных регионах России на 100 тысяч детского населения за последние 10 лет составил от

2,8 до 3,2 случаев в год. Наиболее часто острые лейкозы (ОЛ) выявляются в возрасте от 2 до 6 лет (так называемый «младенческий пик»): дети этого возраста составляют около 50% всех заболевших. У10-15% детей заболевание диагностируется в возрасте старше 10 лет, а у 1 -2% - до 1 года. Высказывается предположение, что такое возрастное распределение определяется длительностью латентного периода и отражает пренатальное происхождение ОЛ.

Многие факты, накопленные за последние два десятилетия, говорят о том, что состояние внутриклеточной системы контроля апоптоза играет важную роль в предрасположенности различных групп людей к развитию неоплазий. Молекулярно-биоло-гические исследования выявили разительную вариабельность активности многих белков, играющих ключевую роль в процессах регуляции клеточной смерти. Иногда колебания активности обусловлены присутствием ингибиторов или активаторов [ 1 ]; другим классическим распределением активности белков в популяции является бимодальность при практическом отсутствии интраиндивидуальной вариабельности. Этот вариант обычно наблюдается как следствие генетического полиморфизма определенных ферментов. Генетический полиморфизм охарактеризован для белков как ранней, так и поздней фазы апоптоза [2).

Мутантные аллели часто обеспечивают формирование неполноценных белков, что приводит к снижению или отсутствию специфической активности [3,4). Вариантные аллели гетерогенно распределены в различных популяциях: 1% арабов, 5 — 8% белого населения и до 30% представителей азиатской расы имеют гомозиготность или сочетанную гетерозигот-ность по мутантным аллелям XR.CC 1.

Очень важной для клетки (и для канцерогенеза) является ее способность воссоединять случайные двойные разрывы (ДР) ДНК, что осуществляется двумя различными репарационными механизмами — негомологическим воссоединением концов (НГВК) ДНК и путем гомологической рекомбинации (ГР) при наличии по соседству второй копии неповрежденного идентичного по нуклеотидной последовательности сегмента ДНК, например сестринской хроматиды. Поскольку в диплоидных ядрах гомологичные хромосомы пространственно разделены (хромосомные территории), репарация путем ГР преимущественно происходит в Б- и С2 фазах клеточного цикла, а НГВК осуществляется во время любой фазы цикла. В геномах высших эука-риот имеется много повторов, по которым возможна репарация путем ГР, однако такая репарация ДР практически полностью подавлена и приводит к хромосомным транслокациям. Главным механизмом подавления потенциально кластогенной ГР между повторами и неправильного (эктопических) воссоединения концов ДНК при репарации ДР является, по-видимому, локальная специфическая модификация хроматина по гистону Н2АХ - фосфорилиро-ваниелизина-139 (или образованиеу-Н2АХ) [5,6].

Наиболее изученной системой репарации ДНК является эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН). При ЭРН модифицированные нуклеотиды, в частности пиримидиновые димеры, удаляются изпо-врежденной нити благодаря действию нуклеаз ХРС-. и ЕЯСС1 /ХРР, а образующийся при этом однотяже-

вый пробел заполняется ДНК-полимеразами <1 или е с помощью РСЫА и зашивается ДНК-лигазои. Белок ХИСС1 (Х-гау-герап-сго55-сотр1етепипд) не обладает каталитической активностью, но служит как

структурный белок в системе зксцизионной репарации оснований. Взаимодействуя Ы-концевым доменом с ДНК-полимеразой и С-концевым доменом с ДНК-лигазой Ш, он способствует замещению поли-меразы лигазой и стимулирует реакцию лигирова-ния. Клеточные линии с дефектным геном Х11СС1 проявляют высокую чувствительность к рентгеновскому излучению и имеют большое количество не-репарированных однонитевых разрывов [7].

У мышей инактивирующие гомозиготные мутации генов ДНК-полимеразы р, АРЕ1/11ЕР1, ЫС1 и Х11СС1 приводят к эмбриональной летальности. Дефекты в генах системы репарации приводят к нестабильности микросателлитных сегментов и мутациям по различным генам, в том числе и по генам опухолевых супрессоров [7].

Популяционные исследования подтверждают, что частота выявления определенных мутаций зависит от региона, в котором проводилась выборка группы. Следует отметить, что в Европе наблюдается североюжный градиент снижения частоты вариантных аллелей ХЯСС1 [8].

В специальных исследованиях, направленных на выявление ассоциации между вариантами генотипа Х11СС1 и частотой лимфом и лейкозов, М. Ьетов и соавторы [8] выявили более высокую частоту нормального аллеля у взрослых пациентов с лейкозами и отсутствие ассоциации генотипа и развития лимфогранулематоза и неходжкинскихлимфом [9]. Результаты, опубликованные. М. Кга^полпсИ и соавторами [10], не отражают корреляции геиотипа с частотой острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей.

Дети с ОЛЛ обычно получают лечение согласно группам риска, определяемым по прогностическим факторам, по протоколу, включающему системную полихимиотерапию и специфическую профилактическую терапию для предотвращения поражения ЦНС: интратекальная химиотерапия с (или без) облучением головного мозга. К факторам, определяющим продолжительность полной ремиссии и потенциально полное излечение, отнесен ряд прогностических переменных: клинические параметры - возраст пациента, уровень лейкоцитов крови и биологические свойства лейкозных клеток (гистохимическая, морфологическая - ФАБ, иммуногистохи-мическая, цито генетическая характеристика). Интенсивность режима индукции ремиссии основана на классификации, отражающей риск развития рецидива, определенного на основе анализа прогностических факторов, Этот подход, используемый для диф-ференцировки инициальной терапии, позволяет уменьшить токсический эффект и существенно увеличивает выживаемость.

При остром лимфобластном лейкозе клетки классифицируются по морфологическим критериям РгепсЬ-Атепсап-ВгШвЬ (РАВ). Использование этой схемы показывает, что у 80-85% детей с ОЛЛ клетки имеют Ь1 или 1.2 морфологию. В большинстве исследований Ь1 морфология ассоциируется с лучшим прогнозом.

15 % детей с ОЛЛ имеют Т-клеточный фенотип и требуют изначально более интенсивного лечения: Т-клеточный ОЛЛ С02 свидетельствует о благоприятном прогнозе, в то время как С07 +, С02-, и С05-иммунофенотип - «про-тимоцит» - определяет менее благоприятный прогноз.

Около 80 % пациентов имеют лейкозные клетки предшественников В-лимфоцитов и «сА1Ха» СШ0 антиген. Существуют три главных подтипа В-клеток при ОЛЛ: ранние рге-В, рге-В и В-клетки. Приблизи-

тельно две третьих пациентов имеют ранний рге-В фенотип и прогностически самую лучшую перспективу. Когда pre-В фенотипу сопутствует хромосо-мальная t (1; 19) транслокация, прогноз по сравнению с ранним pre-В ОЛЛ ухудшается. Достаточно редко (у 1% пациентов) выявляется иммунофенотип В.

Как аллели «дикого» типа, так и мутантные могут играть защитную роль или быть фактором риска развития опухоли, что отражает вариабельность физиологической ролл фермента. Необходимо, однако, иметь в виду, что только 5% генома кодирует белки и требует точного воспроизведения во время репликации, поэтому мутации в 95% генома (в некодирую-щей ДНК), особенно в дифференцированных соматических клетках, редко приводят к заметным фенотипическим эффектам. Что касается половых и стволовых клеток, то в них повреждения ДНК должны легче индуцировать апоптоз, а не репарацию.

Материалы и методы

С целью уточнения механизмов развития опухолевого процесса и прогноза заболевания проводилось определение полиморфизма гена XRCC1 по локусу Arg399Gln, изолированно или в комбинации с другими функционально значимыми изменениями генов-регуляторов апоптоза (р53 и CCR5).

Исследовались мононуклеарныелейкоциты периферической крови детей, страдающих ОЛЛ, в период между постановкой диагноза и до начала противоопухолевой терапии. Забор крови проводился в стерильных условиях с последующим выделением мононуклеарной фракции циркулирующих клеток на фиколловом градиенте. Всего было обследовано 32 ребенка (13 мальчиков и 19 девочек) в возрасте от 2 месяцев до 14 лет. Среднее количество лейкоцитов периферической крови на момент постановки диагноза составляло 63,5±0,23 *10й/л. Доля бластных клеток составляла 83,5±7,2%. Все больные проходили обследование и лечение по протоколу ALL-MB2002. Определение полиморфизма XRCC1 (Arg399Gln), р53 (Агд72Рго по экзону 4, dupl6 bp по интрону 3 and Mspl по интрону 6) проводилось посредством PCR-RF LP-анализа.

Результаты анализировались для всей группы пациентов, детей с лейкозом из предшественников В-клеток (ВСР ОЛЛ) и (пре-)Т-ОЛЛ, а также для всех пациентов в соответствии с группами риска. Статистический анализ проведен с применением программы «SPSS for Windows» (SPSS Inc., Chicago, II., USA) версия 9.0. Анализ включал тест корреляции по Пирсону (chi-square test), непараметрический MannWhitney тест. Уровень достоверности принят как 0,05.

Полученные результаты

Используя методологию множественной полиме-разной цепной реакции и рестрикции фрагмента в области полиморфизма, были проанализированы ал-лельные варианты гена XRCC1 в кодонах 399 (аргинин а глутамин) - (399 глутамин). Распределение изменений гена XRCC1 Arg399Gln в популяции по собственным данным характеризуется следующим образом: 33,5% Arg/Arg, 52,8% Arg/Gin, 13,5% Gin/ Gin (обследовано 196 здоровых детей в возрасте от 4 до 10 лет).

У детей, страдающих ОЛЛ, доля гетерозиготной группы Arg/Gin значительно снижена (3,36%), что составляет достоверную разницу по сравнению с популяцией (р<0,05).

Анализ комбинаций изменений генотипа выявил увеличение доли лиц:

1. с комбинацией Gln/Gln (XRCC1) и Рго/Рго (р53 codon 72) по сравнению с популяцией (OR= 10,23, 95%СГ6,93-13,61);

2. с комбинацией Gln/Gln (XRCC1) и М/М (отсутствие сайта рестрикции Mspl по интрону 6 гена рбЗ) по сравнению с популяцией (OR = 9,85, 95%С = 6,66-13,1);

3. с комбинациями M/M - W/M — W/M р53, положительно ассоциированной с «life expectancy» (Pro/Pro по кодону 72 экзона 4, W/dup 16bp по интрону 3, Mspl W/M по интрону 6), связанной с наличием генотипа Arg/Gin XRCC1, (OR=9,54, 95%CI = 6,46-12,69, respectively).

Сравнительный анализ частоты встречаемости гаплотипа р53 W-W- M (Arg по кодону 72 экзона 4, отсутствие dup 16 bp по интрону 3, отсутствие Mspl restriction site по интрону 6) у гетерозигот по одному из локусов показал статистически значимое накопление гаплотипа р53 W-W- M среди больных ОЛЛ по сравнению с популяцией (OR=4,7, 95%С1= 1,95-7,8).

Увеличение числа пациентов, имеющих одновременно измененные гены, управляющие как процессом репарации ДНК (XRC), так и запуском одного из основных механизмов апоптоза (р53), многократно увеличивает шансы закрепления изменений генотипа в делящихся клетках, что может привести к началу опухолевого процесса.

Не было получено корреляционной связи между исходом инициальной терапии и вариантами гаплотипа р53 (98% больных достигли ремиссии, срок наблюдения больных в ремиссии составляет от 3 до 16 месяцев).

Не удалось обнаружить достоверной разницы в исследуемой группе по общепринятым факторам прогноза: распределение по полу, иммунофе-нотипу бластных клеток; по возрасту констатации заболевания, уровню лейкоцитоза и абсолютного количества бластных клеток в анализе периферической крови.

Интерес к индивидуальной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, а также особенностям ответа на цитостатическую терапию и отдаленным результатам лечения отчетливо прослеживается при анализе литературы последних лет: в случае ОЛЛ у детей общепринятые факторы прогноза (количество бластных клеток, возраст, ответ опухолевых клеток на индукционную терапию преднизолоном, иммунофенотип, а также срок и локализация рецидива в случае его возникновения, определенные хромосомные аберрации) не могут полностью определить индивидуальную эффективность и токсичность терапии. Предпринимаются попытки использования дополнительных показателей в качестве прогностических факторов. Характеристики организма-хозяина, в частности, обнаружение гаплотипов, обеспечивающих формирование неполноценных белков со сниженной специфической активностью; способные повлиять на чувствительность к терапии онкологических заболеваний, несомненно, заслуживают дополнительного изучения.

Библиографический список

1. U D., Pritchaid M. Competition between cytochrome P-450 isozymes for NADPH-cytochrome P-450 oxidoreductase affects drug metabolism/ S. Hanlon, M. Pritchaid. D. Li, et al //J. Pharmacol. Exp. Ther.-1999; 289:661 - 667.

2. Dunning A. A systematic review of genetic polymorphisms

and breast cancer ris/A Dunning, C. Healey, P. Pharoah et al

CancerEpidemiol//BiomarkersPrev.-1999 8-843-854

3. Garcia-Barcelo M. Genetic analysis of ihe CYP2D6 locus in a Hong Kong Chinese population/ M. Garcia-Barcelo L Chow H.F.K. Chui, et al. Clin.Chem. -2000; 46: 18-23

4. Kubota Y. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and XRCC1 protein/Y. Kubota, RANash, A. Klungland P Schar DE Barnes, T. Lindahl. EMBO J. -1996, V. 15, n. 23, pp 6662-70 '

5. Marez D. Polymorphism of the cytochrome P450 2D6 gene in a European population: characterization of 48 mutations and 53 alleles, their frequences and evolution/ D. Marez, M. Legrand, N. Sabbagh, at al//Pharmacogenetics 1997;?: 193-202

6. Nocentini S. Rejoing kinetics of DNA single- and doublestrand breaks in normal and DNA ligase-deficient cells after exposure to ultraviolet C and gamma radiation: an evaluation of ligaling activities involved in different DNA repair processes/ S Nocentini//Radiat Res 1999, V. 151, n. 4, pp. 423-32.

7. Tebbs RS. Requirement for the Xrccl DNA base excision repair gene during early mouse development/ R.S. Tebbs, M L. Flannery, J.J. Meneses, A.Hartmann, J.D. Tucker,L.H. Thompson, J.E. Cleaver, R.A. Pedersen. Dev Biol 1999, V.208, n. 2, pp. 513-29.

8. Lemos M. Genetic polymorphism of CYP2D6, GSTM1 and XRCC1 and susceptibility to haematological neoplasias/M. Lemos, F. Cabrita et al. // Carcinogenesis 1999; 20:1225 - 1229.

9. Larson R. Prevalence of the inactivating 609 C_T polymorphism in the NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NOOl) gene in patients with primary and therapy-related myeloid leukemia/ R. Larson, Y. Wang, M.Banejee et al// Ibid. 94:803 - 807.

10. Krajinovic M. Susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia: influence of CYP1A1, CYP2D6, GSTM1,

and GSTT1 genetic polymorphisms/M. Krajinovic. D. Labuda C Richer etal.//Blood 1999; 93: 1496-1501.

11. Griese E. Analysis of the CYP2D6 gene mutations and their consequences for enzyme function in a West African population/E Griese, S. Asante-Poku, D. Ofori-Adjei et al. // Pharmacogenetics 1999;9:715-723.

12.SeegerK.TEL-AMLl fusion transcripl in relapsed childhood

acute lymphoblastic leukemia/K. Seeger, H. Adams, D. Buccwald et al.//Blood 1998;91:1716- 1722.

КАЗНАЧЕЕВ Константин Сергеевич, к.мед.н., доцент кафедры педиатрии Новосибирского государственного медицинского университета. СМЕТАННИКОВА Наталья Александровна, аспирант ГУ исследовательский центр вирологии и биотехнологии «Вектор».

ПОСПЕЛОВА Татьяна Ивановна, д.мед.н„ профессор, зав. кафедрой гематологии и трансфузиологии Новосибирского государственного медицинского университета.

БЕЛЯВСКАЯ Валентина Александровна, д.биол.н„ профессор, зав. лабораторией молекулярной биологии ГУ исследовательский центр вирологии и биотехнологии «Вектор».

ЗЛОБИНА Валентина Дмитриевна, зав. Новосибирским областнымдетским онкогематологическим центром.

Дата поступления статьи в редакцию: 02.06.2006 г. © Казначеев С.А., Сметанникова H.A., Поспелова Т.И., Белявская В.А., Злобина В.Д.

УДК: 615.9- 074 : 519.283 Q ß ДТАВИНА,

И.П. СТЕПАНОВА, В.Е. ВЫСОКОГОРСКИЙ

Омская государственная медмреккая академия Омский государственный аграрньм умаерситет

ВОЗМОЖНОСТИ ДИСПЕРСИОННОГО АНАЛИЗА ПРИ ОБРАБОТКЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ДАННЫХ

Предлагается новая методика дисперсионного анализа (построение П-критерия). позволяющая получать интегральные индексы интоксикации на основе только объективных значежй лабораторных показателей без субъективной процедуры балльной оцежи клинического состояния пациента.

В медико-биологических исследованиях все шире Были проанализированы рутинные лабораторные

используются современные статистические методы показатели крови и мочи 51 пациентов с диагнозом

анализа. Однако дисперсионный анализ, несмотря на «острое отравление уксусной кислотой» в возрасте

то, что он позволяет оценить степень влияния раз- от 17 до 82 лет (30 мужчин, 21 женщина) отделения

личных, одновременно действующих факторов на токсикологии БСМП № 1 г. Омска. Из них 23 пациеи-

результат наблюдения, используется крайне редко [ 1, та (14 мужчин, 9 женщин) - с благоприятным тече-

2, 3, 4]. Так, нам не известны случаи использования нием болезни (группа А) и 28 пациентов (16 мужчин,

этого метода для построения интегральных индексов 12женщин) - с летальным исходом (группа Б). Вре-

Интоксикации мя наблюдения составило от одного до 58 дней. Сум- I