СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЖИЗНЕСТОЙКОСТИ ЭМБРИОНОВ РЫБ В АКВАКУЛЬТУРЕ
METHOD FOR IMPROVING RESILIENCE OF FISH EMBRYOS IN AQUACULTURE

Область техники
Изобретение относится к рыбной промышленности, к аквакультуре, а именно, к способам стимуляции развития и защиты эмбрионов рыб для повышения их жизнестойкости в неблагоприятных условиях среды при искусственном разведении рыб. Предлагаемое изобретение может быть использовано при выращивании рыб в индустриальных хозяйствах, в том числе, на предприятиях, занимающихся искусственным воспроизводством эндемичных байкальских сиговых рыб и других холодноводных рыб (сиговых, лососевых).
Уровень техники
В России, как и в мировой практике, для улучшения продуктивности сельского хозяйства (растениеводства, птицеводства, животноводства) и в аквакультуре (рыборазведении) используют природные и синтетические стимуляторы развития и роста [1,2, 3-8].
Одним из неблагоприятных условий среды при разведении рыб является забор воды для инкубации икры из естественных водоемов с нестабильным гидрохимическим составом.
Известен способ стимуляции развития гидробионтов, при котором в воду, где обитают последние, вносят биологически активное вещество, в качестве которого используют полиаквагидроксокомплексы алюминия (ПАГКА) [3].
Недостатки известного способа обусловлены выбором биологического вещества, так как предлагаемые ПАГКА относятся к веществам переменного
состава и в водной среде модифицируют. Модификационные превращения вносимых стимуляторов трудно поддаются контролю, требуют постоянного их внесения в среду обитания гидробионтов, что не является гарантией сохранения ее безопасности. Нет данных и по уровню безопасности получаемого продукта.
Известны фармацевтические композиции для стимуляции роста и/или проявления устойчивости к заболеваниям у аквакультуры, содержащие химические молекулы пептидной природы. [4]. Недостатками данного метода является быстрое разрушение композиций, используемых в качестве стимуляторов, в нейтральной или в слабокислой среде, а также при незначительном увеличении температуры растворов и водной среды.
Известен способ стимуляции икры промысловых рыб, заключающийся в инкубации оплодотворенной икры в воде с биологически активными соединениями: смесь β-каротина, α-токоферола, убихинона Q10, пирогаллола и аскорбиновой кислоты [5].
Недостатком способа является использование сложного состава из дорогостоящих компонентов. Способ достаточно трудоемок и не экономичен в исполнении.
В качестве аналога к предлагаемому решению может быть рассмотрен способ стимуляции развития рыб, при котором икру в стадии подвижного эмбриона обрабатывают биологически активным веществом в виде водного раствора экстракта, полученного из отходов переработки продукции растениеводства, в дозе 0,001 - 0,01% раствора [6].
Необходимость приготовления экстракта и обеспечение наличия его активности требует значительных трудозатрат.
Нестабильность и непостоянство состава биологически активного вещества, используемого для обработки икры, вызывает ряд трудностей, связанных как с качеством, так и с дозированием применяемого продукта, а, следовательно, влияет на эффективность применения этого стимулятора.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом настоящего изобретения является устранение неблагоприятных факторов при разведении рыб в аквакультуре, увеличение выклева и выживаемости икры рыб в стадии подвижного эмбриона, повышение их иммунитета, снижение затрат на устранение негативных факторов, уменьшение затрат на лечение и профилактические мероприятия.
Технический результат достигают применением биологически активного вещества на ранних этапах онтогенеза рыб. Для этого в процессе инкубации оплодотворенной икры используют водный раствор арилхалькогенилацетатов трис(2-гидроксиэтил)аммония - «протатранов», относящихся к общей формуле:
2
2
2
2
3
-
+
R-ArXCHCO ⋅ HN(CHCHOH) (А),
3
где R = 2-СН, 4-Cl
2
X = халькоген (О, SO)
а именно, соединения формулы 1 или формулы 2:
3
6
4
2
2
2
2
3
-
+
2-СН-CHOCHCO ⋅ HN(CHCHOH) (1) или
6
4
2
2
2
2
2
3
-
+
4-Cl-CHSOCHCO ⋅ HN(CHCHOH) (2).
В способе используют водный раствор препарата с концентрацией не выше 0.0001%.
Протатраны указанных формул добавляют в водный раствор для промывания икры в стадии подвижного эмбриона до выхода личинок рыб.
Предлагаемые в качестве биологически активных веществ протатраны получены на основе коммерчески доступных алканоламинов (например, триэтаноламина) и биологически активных арилхалькогенилуксусных кислот.
Протатраны формулы 1:
3
6
4
2
2
2
2
3
-
+
2-СН-CHOCHCO ⋅ HN(CHCHOH) (1)
или формулы 2:
6
4
2
2
2
2
2
3
-
+
4-Cl-CHSOCHCO ⋅ HN(CHCHOH) (2),
добавляемые в малых количествах в водный раствор при инкубации икры, начиная от стадии подвижного эмбриона до выхода личинок, способны увеличить выживаемость эмбрионов.
Синтезированные авторами в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН соединения (А) имеют уникальное трициклическое "атрановое", точнее, "протатрановое", строение [7-15]:
Арилхалькогенилацетаты трис(2-гидроксиэтил)аммония - «протатраны» (А)
Протатраны (А) представляют собой бесцветные нетоксичные (LD50 = 1300-6000 мг/кг) низкоплавкие порошки, устойчивые при хранении, хорошо растворимые в воде, спирте и в других органических растворителях.
Протатраны, состоящие из биологически активных катионов аммония и анионов протонных кислот, могут легче, чем другие соединения преодолевать клеточные мембраны. Предполагается, что успешный транспорт протатранов обуславливается тем, что они проникают через мембрану в форме водородосвязанных комплексов. Это делает ионные пары и их агрегаты «нейтральнее», облегчая проникновение через модельную мембрану [16].
-1
В результате специальных исследований выявлена высокая и разнообразная физио- и фармакологическая (противоопухолевая, антиметастатическая, антитромботическая, антиоксидантная, иммунотропная, защитная и др.) активность протатранов. Кроме того, протатраны в микроконцентрациях (до 1 ⋅ 10 вес. %) оказались мощными стимуляторами различных биологических процессов. Так, получены положительные результаты изучения стимулирующего действия протатранов на животных, птиц, насекомых, растения, грибы, бактерии, клетки и ферменты [7,8,12-20]. Показано, что применение протатранов, например, в сельском хозяйстве,
повышает продуктивность растениеводства, шелководства, птицеводства и животноводства [21].
Об использовании протатранов в аквакультуре (рыборазведении) до настоящего времени не известно.
Впервые предложено использование протатранов формулы 1 или формулы 2 (далее протатраны 1 или 2) для увеличения выживаемости эмбрионов. Данные вещества обладают мембранстабилизирующим, цитопротекторным действием, улучшают белковый, жировой, минеральный и углеводный обмены с проявлением имунностимулирующего эффекта и могут быть использованы для увеличения выклева и выживаемости эмбрионов и личинок рыб [7,8,12-20].
Предложен способ обработки икры водным раствором протатранов 1 или 2 в процессе инкубации оплодотворенной икры.
Впервые установлено, что при искусственной инкубации икры сиговых рыб для увеличения выживаемости эмбрионов достаточно использовать низкие (0.0001%) концентрации водного раствора протатранов 1 или 2 - синтетических соединений нового поколения (арил-халькогенил-ацетатов трис(2-гидроксиэтил)аммония).
Таким образом, данное техническое решение соответствует условиям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Осуществление изобретения
Экспериментальные работы проводили в контролируемых условиях условиях на чашках Петри [22].
Это значительно улучшает возможности экспериментов в отличие от использования классических методов инкубации икры в аппаратах Вейса, так как сохраняет одинаковые условия инкубации. Были учтены возможности универсальности технологических решений при инкубации с учетом общих требований: обеспечение процесса дыхания, реализация температурного режима, сохранение удовлетворительного санитарного режима состояния
среды. При этом, имели место простота отбора погибших икринок и компактность работ.
Возможность осуществления изобретения иллюстрируется приведенным ниже описанием проведенных работ. Полученные данные сведены в прилагаемые таблицы.
Пример 1. Получение сиговых рыб и их гибридов
Исследования выживаемости байкальских сиговых рыб и их гибридов в искусственных условиях проведены для широкого спектра байкальских сиговых рыб, в том числе, их гибридов. Для эксперимента были выбраны: байкальский омуль, байкальский озерный сиг, байкальский озерно-речной сиг или пыжьян и их гибриды.
При хорошем качестве половых продуктов оплодотворяемость икры сиговых рыб обычно составляет более 85%, без учета патологии развития [23]. Поэтому ход эмбриогенеза необходимо контролировать, просматривая икру под микроскопом на различных этапах развития для выявления аномалий развития, которые зависят как от качества икры, так и от условий ее инкубации.
По биотехнологическим показателям при инкубации икры в норме выживаемость икры должна составлять 40-70% при температуре +0.1°С - +2°С. По биотехнологическим нормам икринки сиговых рыб развиваются в течении 55-90 суток. Затем происходит освобождение мальков из оболочек следующим образом: в железе вылупления, расположенной на нижней поверхности головы, образуется особое вещество - фермент вылупления. Оно появляется в железе после начала пульсации сердца, затем количество возрастает вплоть до последней стадии развития эмбриона (эмбриогенеза). Двигаясь в ослабленных оболочках, эмбрион разрывает их, выходит в воду и становится предличинкой [22- 24].
Учет отхода икры проводили после прохождения стадии гаструляции, так как эта стадия является наиболее уязвимой к воздействию факторов внешней среды, и сопровождается повышенной гибелью икры. Повышенная
гибель эмбрионов наблюдается перед выходом их из оболочки и во время этого процесса, что связано с серьезной перестройкой обмена у эмбрионов. Во все критические периоды развития эмбрионов тщательно следили за стабильностью абиотических факторов и оберегали икру от различных механических воздействий.
Экологический температурный диапазон инкубации икры для сиговых составляет от +0.2°С до +10°С. В данном эксперименте он был +2°С. Если повысить температуру воды на 1 градус - развитие икры ускориться. Но при температуре +10°С икра погибает. Также икринки погибают при обрастании сапролегнией вне зависимости от температуры. Грибок Saprolegnia (Сапролегния) является возбудителем опасного заболевания свободноживущих, прудовых и аквариумных рыб - сапролегниоза. Поэтому важно, чтобы при развитии оплодотворенной икры была достаточная проточность, которую нам в опытах на чашках Петри заменила стабильная температура и обеспечение процесса дыхания за счет неполного погружения икринок в воду. В чашках Петри, где инкубировалась оплодотворенная икра соблюдался обязательный контакт икринки с воздухом - половина икринки находилась в воздухе и дыхание зародыша обеспечивалось диффузией газов через микропленку воды.
Количество икры в порции от каждого вида особей составляло 500 шт. Каждую порцию икры до выхода личинок промывали каждые три дня бутылированной байкальской водой без добавок.
В таблице 1 приведены данные исследования выживаемости икринок байкальских сиговых рыб и гибридов при искусственном оплодотворении и инкубации в очищенной байкальской воде без добавок.
По результатам выживаемости для дальнейших исследований был выбран байкальский озерно-речной сиг (байкальский пыжьян), показавший наибольшую степень выживаемости икринок.
Пример 2
Искусственно оплодотворенную икру байкальского озерно-речного сигапыжьяна
Coregonus pidschian, инкубировали в лабораторном холодильнике с активной вентиляцией в стеклянных чашках Петри с внутренним диаметром 9,2 см и объемом 100 мл, в соответствии с методикой [22]. Весь период инкубации, до выхода личинок икру промывали каждые три дня, поддерживая температуру на уровне +2°С. В чашках Петри, где инкубировалась оплодотворенная икра, соблюдался обязательный контакт икринки с воздухом - половина икринки находилась в воздухе и дыхание зародыша обеспечивалось диффузией газов через микропленку воды. К обработке икры протатранами приступали на стадии подвижного эмбриона. Контрольную порцию икры инкубировали в бутилированной байкальской воде без добавок. Другую порцию икры инкубировали в 0,0001% водном растворе протатрана 1. Еще одну порцию икры инкубировали в 0,0001% водном растворе протатрана 2. Количество икры в каждой порции составляло 500 штук (по 250 штук на чашке).
В таблице 2 представлены результаты исследования выживаемости икринок байкальского сига-пыжьяна при использовании в качестве биологически активного препарата протатранов формул 1 и 2 с концентрацией 0,0001%.
2
2
2
3
3
2
3
6
4
2
2
2
2
3
6
4
2
2
2
2
2
3
-
+
-
+
-
+
Экспериментами была подтверждена возможность применения арил-халькогенилацетатов трис(2-гидроксиэтил)аммония - «протатранов», общей формулы R-ArXCH2CO ⋅ HN(CHCHOH) (А), где R = CH,Cl; X = халькоген (О, SO), а именно, соединений формул: 2-СН-CHOCHCO ⋅ HN(CHCHOH) (1) или 4-Cl-CHSOCHCO ⋅ HN(CHCHOH) (2) в качестве стимуляторов развития и защиты рыб на этапах онтогенеза. Обладая антиоксидантными свойствами, протатраны 1 и 2 в процессе инкубации оплодотворенной икры улучшают выживаемость икринок при использовании водных растворов стимулятора роста с концентрацией не выше 0,0001%. Обработка указанными протатранами повышает иммунитет и способствует освобождению личинок рыб от грибковой инфекции.
Проведенные исследования показали, что синтезированные соединения 1 и 2 из ряда протатранов позволяют сократить объемы используемой для получения рыб икры и средства на ее лечение и для профилактических мероприятий. Результаты подтверждают перспективность использования протатранов ряда А, в частности, соединений 1 и 2, в качестве эффективных биостимуляторов роста и развития гибридов сиговых и лососевых рыб. Впервые обнаруженный эффект положительного влияния протатрановых соединений на снижение смертности икры сиговых рыб может быть использован при разработке экологически безопасных и действенных методов в технологии промышленного рыборазведения.
Предлагаемое изобретение возможно использовать в промышленных масштабах и на малых аквакультурных предприятиях при искусственной инкубации оплодотворенной икры рыб для снижения эмбриональной гибели в стадии подвижного эмбриона.
Синтез протатранов был осуществлен в соответствии с государственным контрактом (АААА-А16-116112510004-0) на оборудовании Байкальского аналитического центра коллективного пользования СО РАН.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Иркутской области в рамках научных проектов №17-44-388106, 20-54-44017, №20-43-380001 и №20-016-00114.
Экспериментальные работы проводили в рамках фундаментальных научных исследований по государственному заданию 0345-2016-0002 (АААА-А16-116122110066-1) «Молекулярная экология и эволюция живых систем Центральной Азии в условиях глобальных экологических изменений» на базе уникальной научной установки «Экспериментальный пресноводный аквариумный комплекс байкальских гидробионтов» (ПАК), который является частью научно-технологической инфраструктуры Российской федерации и функционирует в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Biostimulants in agriculture [Текст] / P. Brown, S. Saa // Front. Plant Sci. - 2015.- V. 6.- P. 1-3; DOI: 10.3389/fpls.2015.00671.
2. The role of biostimulants and bioeffectors as alleviators of abiotic stress in crop plants [Текст] / M. J. Van Oosten, O. Pepe, S. De Pascale, S. Silletti, A. Maggio // Chem. Biol. Technol. Agric. - 2017. - 4:5; DOI 10.1186/s40538-017-0089-5.
3. A.c. 1551308 СССР, МКИ A01K 61/00. Способ стимуляции развития гидробионтов / Фомовский М.А. и др.; Институт гидробиологии АН УССР. - №4451660/31-13; Заявл. 30.06.88; Опубл. 23.03.90. Бюл. №11.
4. Патент №2416 618 RU, МПК С07К 7/08; C07K 7/06; C07K 14/60; A61K 38/00. Соединения, представляющие собой пептидные аналоги стимуляторов секреции гормона роста, и содержащие их препараты / Родригес Фернандес Роландо Эдуардо (CU) и др.; Сентро де инхеньерия хенетика и биотекнолохия (CU). - №2008138569/10; Заявл. 28.02.2007; Опубл. 20.04.2011.
5. Патент №789063 RU, МПК А01К 61/00. Способ повышения жизнестойкости оплодотворенной икры молоди рыб / Чернышов В.И. и Тамбиев А.Х. - №2568164/28-13; Заявл. 09.01.78; Опубл. 23.12.80.
6. Патент №2028046 РФ, МПК А01К 61/00. Способ стимуляции развития рыб / Яковенко Е.Я. - №5007262/13; Заявл. 30.10.1991; Опубл. 09.02.1995.
7. Mirskova A.N., Directed synthesis and immunoactive properties of (2-hydroxyethyl)-ammonium salts of 1-R-indol-3-ylsulfanyl(sulfonyl)alkanecarboxylic acids [Text] / A. N. Mirskova, G. G. Levkovskaya, O. P. Kolesnikova, О. M. Perminova, E. V. Rudyakova, S. N.
Adamovich // Russ. Chem. Bull. - 2010. - V. 59(12). - 2236-2246; DOI: 10.1007/sl 1172-010-0384-9.
8. Мирскова, A.H. 2-Гидроксиэтиламмониевые соли органилсульфанил(сульфонил)-уксусных кислот - новые фармакологически активные соединения [Текст] / А.Н. Мирскова, Р.Г. Мирсков, С.Н. Адамович, М.Г. Воронков // Хим. интерес. устойч. развития. - 2011. - №19. - С. 467-478.
9. Chipanina, N.N. The proton transfer and hydrogen bonding complexes of (2-hydroxyethyl)amines with acids: A theoretical study [Text] / N. N. Chipanina [et al.] // Comput. Theor. Chem. - 2012. - V. 985. - P. 36-45; DOI: 10.1016/j. comptc. 2012.01.033.
10. Adamovich, S.N. Synthesis and crystal structure of 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazonium-cyclooctadecane bis(4-chloro-2-methylphenoxyacetate) [Text] / S.N. Adamovich, A.N. Mirskova, R.G. Mirskov, Uwe Schilde // Chem. Cent. J. -2011. -5:23; DOI: 10.1186/1752-153X-5-23.
2
2
11. Mirskova, A.N. Reaction of pharmacological active tris-(2-hydroxyethyl)ammonium 4-chlorophenylsulfanylacerate with ZnCl or NiCl: first conversion of a protic ionic liquid into metallated ionic liquid [Text] / A.N. Mirskova, S.N. Adamovich, R.G. Mirskov, Uwe Schilde //Chem. Cent. J. - 2013. - 7:34; DOI: 10.1186/1752-153X-7-34.
12. Мирскова, A.H. Фармакологически активные соли и ионные жидкости на основе 2-гидроксиэтиламинов, арилхалькогенилуксусных кислот и эссенциальных металлов [Текст] / А.Н. Мирскова, С.Н. Адамович, Р.Г. Мирсков, М.Г. Воронков // Известия АН. Сер. хим. - 2014. - Т. 9. - С.1869-1883.
13. Mirskova A.N. Immunoactive ionic liquids based on 2-hydroxyethylamines and l-R-indol-3-ylsulfanylacetic acids. Crystal and molecular structure of immunodepressant tris-(2-hydroxye1hyl)ammonium indol-3-ylsulfanylacetate [Text] / A.N. Mirskova, S.N. Adamovich, R.G. Mirskov, O.P. Kolesnikova, Uwe Schilde // Open Chem. - 2015. - V. 13. - P. 149-155; DOI:10.1515/chem-2015-0018.
14. Ushakov, LA. The NMR study of biologically active metallated alkanol ammoinium ionic liquids [Text] / LA. Ushakov, V.K. Voronov, S.N. Adamovich, R.G. Mirskov, A.N. Mirskova // J. Mol. Struct. - 2016. - V. 1103. - P. 125-131; http://dx.doi.org/10.1016/i.molstruc.2015.08.074.
15. Adamovich, S. N. New atranes and similar ionic complexes. Synthesis, structure, properties [Text] / S. N. Adamovich// Appl. Organometal. Chem. - 2019. - V. 33(7), e4940; https://doi.org/10.1002/aoc.4940.
16. Stoimenovski, J. Enhanced membrane transport of pharmaceutically active protic ionic liquids [Text] / J. Stoimenovski, D.R. MacFarlane // Chem. Commun. -2011.- V. 47.- P. 11429-11431; DOI: 10.1039/C6NJ03709G.
17. Расулов, M.M. Комплекс бис-2-(метилфеноксиацетат) цинка с трис-2-(гидроксиэтил)амином активатор синтеза суммарной триптофанил-трнксинтетазы [Текст] / М.М. Расулов, М.Г. Воронков, М.К. Нурбеков, М.В. Зверева, А. Н. Мирскова, С.Н. Адамович, Р.Г. Мирсков // Доклады академии наук. - 2012. - Т. 444. - С.219-223.
18. Патент №2623034 РФ, МПК А61К 31/205; А61Р 35/00; А61Р 35/04. Противоопухолевое средство / Адамович С.Н., Мирскова А.Н. и Колесникова О.П.; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской академии наук. -№2016131263, Заявл. 28.07.2016. Опубл. 21.06.2017. Бюл. №18.
19. Патент №2642778 РФ, МПК C07D 209/30. Способ получения 1-R-индол-3-ил-сульфанилацетатов (2-гидроксиэтил)аммония / Мирскова А.Н., Адамович С.Н. и Мирсков Р.Г.; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской академии наук. - №2016112716, Заявл. 04.04.2016. Опубл. 26.01.2018. Бюл. №3.
20. Патент РФ 2511031, МПК C12N 1/20; C12N 1/38; C12Q 1/14; C12R 1/445. Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для
диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи / Крюкова Н.Ф., Адамович С.Н., Анганова Е.В., Мирсков Р.Г., Мирскова А.Н.; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской академии наук; Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук; Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования" Министерства здравоохранения РФ -№2012158118/10, Заявл. 28.12.2012. Опубл. 10.04.2014. Бюл. №10.
21. Мирскова, А.Н. Протатраны - эффективные биостимуляторы для сельского хозяйства, биотехнологии и микробиологии [Текст] / А.Н. Мирскова, С.Н. Адамович, Р.Г. Мирсков // Хим. интерес, устойч. развития. - 2016. - №24. - С. 713-729.
22. Семенченко СМ., Смешливая Н.В. Инкубация икры сиговых рыб COREGONIDAE в лабораторных условиях/ Вестник рыбохозяйственной науки, Государственный научно-производственный центр рыбного хозяйства (Тюмень)/Том: 4, Номер: 4 (16),2017, стр. 4-13, ГО: 35287796, ISSN: 2311-4274.
23. Черняев Ж. А. Воспроизводство сиговых рыб. Эколого-физиологические особенности размножения и. развития. М/ Товарищество научных изданий КМК, Москва, 2017, 329 с.
24. Семенченко С.М., Смешливая Н. В. Термотолерантность и терморезистентность сиговых рыб в эмбриогенезе // XII Съезд Гидробиологического общества при РАН: тезисы докладов. 16-20 сентября 2019 года г. Петрозаводск - г. Петрозаводск: КарНЦ РАН. - 2019. - С. 429 - 431.