Исследование процесса L-трансформации в популяции сальмонелл методами электронной и лазерной интерференционной микроскопии

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, № 6

УДК 579.6:579.842.14:57.012:57.086

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА L-ТРАНСФОРМАЦИИ В ПОПУЛЯЦИИ САЛЬМОНЕЛЛ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОННОЙ И ЛАЗЕРНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ

А.Ю. АРСЕНЮК1, И.Б. ПАВЛОВА1, П.С. ИГНАТЬЕВ2

Существование бактерий в отсутствие клеточной стенки — весьма своеобразное и широко распространенное явление, к которому неприменимы принципы классической микробиологии. L-трансформация бактерий с образованием L-форм затрудняет обнаружение патогенов и служит причиной многочисленных ложноотрицательных заключений по результатам биопроб, так как L-формы находятся в некультивируемом состоянии. Процесс L-трансформации при воздействии абиотического (тетрациклин) и биотического (биологически активные вещества Bacillus subtilis) факторов, а также реверсию нестабильных L-форм исследовали в популяции Salmonella enterica serovar typhimurium методами просвечивающей и сканирующей электронной (ПЭМ и СЭМ), а также лазерной модуляционной интерференционной (МИМ) микроскопии. Выявлены закономерные морфологические признаки L-форм, способных реверсировать в исходное состояние. С появлением методов оптической микроскопии, обладающих сверхразрешением, стало доступно изучение процесса L-трансформации в режиме реального времени на живых бактериях (без фиксации и окрашивания). Полученные на лазерном интерференционном микроскопе МИМ-321 (Россия) трехмерные фазовые портреты позволили не только однозначно идентифицировать L-формы бактерий, но и с высокой точностью определить их основные морфологические параметры (диаметр, периметр, высота, площадь, объем). С применением современных алгоритмов обработки этих данных внутри нестабильных L-форм зарегистрированы кольцевые структуры, идентифицированные нами как ДНК. Гетероморфизм со всеми проявлениями L-трансформации характерен для патогенных и условно патогенных бактерии (как в норме, так и при действии любых абиотических и биотических факторов), что способствует выживанию вида. Изучение биологических особенностей L-трансформации имеет важное значение для понимания процессов существования потенциальных резервуаров возбудителей в природе, а также в патогенезе рецидивов хронических заболеваний.

Ключевые слова: L-трансформация, гетероморфизм, биологическая изменчивость, абиотические и биотические факторы, биологически активные вещества, популяции патогенных бактерий, стабильные и нестабильные L-формы, реверсия, просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия, лазерная интерференционная микроскопия.

Keywords: L-transformation, heteromorphism, biological variability, abiotic and biotic agents, BAS, pathogenic bacteria populations, stable and unstable L-forms, reversion, electron microscopy, interference microscopy.

Изучение теоретических аспектов биологической изменчивости патогенных микроорганизмов и их выживаемости при воздействии L-транс-формирующих агентов до сих пор остается актуальным. Как известно, под влиянием неблагоприятныж факторов популяции патогенныж бактерий способны переходить в состояние гетероморфизма с различными проявлениями L-трансформации, включая образование клеток сферопластного или протопластного типа разного размера и конфигурации, а также мелких L-форм, лишенных клеточных стенок (1-4).

Нестабильные L-формы представляют собой клетки, изменившие морфологические, физиологические и биохимические характеристики и утратившие типичный бактериальный характер, но сохранившие геном и при благоприятных условиях (питательный субстрат, температура, рН) способные к реверсии за счет саморегулирующейся системы, необходимой для построения новой клеточной стенки. Стабильные L-формы — это клетки, потерявшие способность к реверсии в исходное состояние. До настоящего времени нет единого мнения об их роли в биологических процессах как в окружающей среде, так и в организме хозяина.

Целью настоящей работы бышо изыскание новыгх способов вышвления

L-форм, а также объективной оценки их стабильности, поскольку до недавнего времени реверсия оставалась основным критерием при идентификации нестабильных L-форм.

Методика. В качестве модельного объекта использовали Salmonella enterica serovar typhimurium (штамм 1951 из коллекции музея Всероссийского НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии).

Для изучения ультраструктуры сальмонелл препараты фиксировали 4 % глутаровым альдегидом в фосфатном буфере (рН 6,9-7,0), образцы обезвоживали и заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и изучали с использованием просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) со сканирующей приставкой Hitachi-800 (Япония).

При исследовании популяций в колониях и микроколониях с сохранением естественной архитектоники был использован метод, основанный на способности биологически активных веществ (БАВ), продуцируемых Bacillus subtilis, диффундировать через поры мембранных фильтров в плотную питательную среду. Культуру бактерий-антагонистов В. subtilis (ТНП-3, получен из коллекции музея Якутского НИИ сельского хозяйства) (50 мкл, плотность суспензии 109 кл/мл) наносили в виде капли в центр мембранного фильтра Владипор (ООО «Владипор», Россия) с диаметром пор 0,22 мкм, помещенного на поверхность плотной питательной среды МПА, и культивировали при 37 °С. Через 48 ч выявлялся обильный рост колоний. Такие фильтры удаляли и вместо них помещали новые, на поверхность которых наносили взвесь исследуемых сальмонелл (105 кл/мл). Контролем служили варианты, в которых сальмонеллы росли без воздействия БАВ В. subtilis. Для установления стабильности L-форм и выявления процесса реверсии клеток в исходную форму часть фильтров с отсутствием видимого роста бактерий помещали для подращивания на поверхность свежей питательной среды (МПА) и культивировали в течение 5 сут при 37 °С. Выросшие на поверхности мембранных фильтров колонии фиксировали парами 25 % глутарового альдегида, 2-кратно обезвоживали парами пропи-леноксида, монтировали на медные подложки и напыляли золотом на установке Hitachi-E-102 (Япония). Морфологию популяций сальмонелл исследовали на электронном микроскопе Hitachi-800 со сканирующей приставкой Hitachi-8010 (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении от х1 до х30 000.

Для сравнения морфологии выявленных стабильных и нестабильных L-форм бактерий использовали модуляционный интерференционный микроскоп (МИМ, модель МИМ-321) производства ООО «Лаборатории АМФОРА» (Россия). Препараты готовили следующим образом: на зеркальную подложку, предварительно покрытую тонким слоем парафина, наносили 10 мкл культуры сальмонелл (105 кл/мл), которую, как при приготовлении мазка крови, с помощью специального стекла равномерно тонким слоем распределяли по поверхности. Для исследования процесса L-трансформации на поверхность бактерий помещали каплю глицерина с растворенным в нем тетрациклином (25 мкг).

Данные обрабатывали статистически с использованием програм-мых пакетов MIM-Visualizer производства ООО «Лаборатории АМФОРА» (Россия) и Microcal ORIGN

Результаты. Ульраструктурный анализ (ПЭМ) выявил у сальмонелл характерное для грамотрицательных бактерий строение клеточной стенки. Она состояла из наружного липопротеидного и внутреннего мукопептидного (пептидогиликан) слоя в виде одноконтурной структуры, оп-

ределяющей ригидность клеточной стенки. За ней располагался жизненно важный органоид — цитоплазматическая мембрана, представленная характерной трехслойной липопротеидной структурой (мембрана Робертсона). Основной генетический компонент бактерии — молекула ДНК (нуклеоид, не имеющий оболочки) была свободно распределена среди рибосом и полирибосом цитоплазмы (5).

В то время как ультраструктурный анализ (ПЭМ) позволяет выявлять только статическое состояние органоидов, МИМ дает возможность без трудоемкой предварительной пробоподготовки изучать в режиме реального времени нативную структуру бактериальной клетки и естественное состояние ее органоидов.

Принцип действия использованного нами микроскопа МИМ основан на измерении разности фаз Дф при прохождении лазерного излучения через микрообъект (6, 7). На рисунке 1 (цветная вклейка после стр. 56) схематично показано возникновение локальных задержек фазы в случае модельного объекта — эритроцита человека. Для нахождения искомой функции Дф объект освещают плоским волновым фронтом. При прохождении через объект фронт приобретает локальные задержки фазы, которые зависят от плотности и геометрии объекта. Для определения величины задержки используется интерферометр, в котором световая волна, прошедшая через объект, складывается с плоской опорной волной. Возникающая таким образом интерференционная картина позволяет вычислить искомую задержку фазы Дф.

Трехмерное представление функции Дф(х, у z) называется фазовым портретом, который относят к классу функциональных изображений, где информация представлена в виде распределения количественного параметра — разности фаз Дф(х, у) световой волны, связанной с оптической плотностью исследуемого микрообъекта. Для простоты восприятия и интерпретации фазовых портретов разность фаз, измеряемая в градусах, может быть выражена в нанометрах. Для визуализации внутренних структур клетки использовался метод градиентной фильтрации изображения, который позволяет визуализировать области с максимальной крутизной рельефа. У МИМ-321 разрешение превосходит таковое у классических оптических микроскопов и достигает от 150 до 15 нм в зависимости от оптических свойств измеряемого объекта и техники исследования.

На изображениях сальмонелл в контроле, полученных методами ПЭМ (рис. 2, А, см. цветную вклейку после стр. 56) и МИМ (см. рис. 2, Б), видна многослойная клеточная стенка, цитоплазма и нуклеоид. Разница в размерах сальмонелл была обусловлена неодинаковыми способами пробоподготовки: для изучения ультраструктуры проводили фиксацию, обезвоживание и заливку в эпоксидные смолы, что уменьшает объем и размеры структурных элементов бактериальной клетки, в то время как прижизненное исследование на МИМ-321 дает реальный фазовый портрет поверхностных и внутренних структур.

Поскольку при сканирующей электронной микроскопии применялись щадящие методы фиксации и обезвоживания, не нарушающие естественную архитектонику в микробном сообществе, удалось получить объективную информацию о нативном состоянии бактерий в популяциях (810). Было установлено, что бактерии формируют колонии и микроколонии, где тесно связаны между собой благодаря наличию экзопродуктов различной природы, продуцируемых клеточной стенкой и образующих межклеточный матрикс, от степени развития которого зависит образование покровов — биопленок (см. рис. 2, Б, слева).

Как известно, неблагоприятное воздействие на бактерии приводит к нарушению нормального бинарного деления. Использование МИМ-321 по зволило на ранних стадиях в реальном времени регистрировать влияние Ь-трансформирующего фактора. Так, при воздействии тетрациклина зафиксировали нарушения целостности клеточной стенки, что свидетельствует о начальной стадии проявления гетероморфизма (рис. 3, б, в; см. цветную

При исследовании Ь-трансформирующего действия БАВ, продуцируемых

В. &иЫШ&, на популяции сальмонелл с использованием СЭМ мы наблюдали образование мелких Ь-форм разного размера (0,20,5 мкм) (рис. 4).

Было установлено, что по морфологическим критериям Ь-формы различались между собой. Часть мелких клеток имели вид выпуклого однородного шара (см. рис. 4, а; рис. 5, е), в то время как другие представляли собой уплощенную сферу с выраженным темным центром (см. рис. 4, б; 5, ж).

Для изучении закономерностей процессов Ь-трансформации исследовали воздействие биотических (биологически активные вещества, продуцируемые В. subtilis) и абиотических (антибиотик тетрациклин) факторов на популяции сальмонелл.

На фазовых портретах содержащей и лишенной ДНК Ь-формы (см. рис. 5, цветная вклейка после стр. 56) четко видно, что нестабильные Ь-формы (см. рис. 5, а, г, е), в которых присутствует ДНК, представляли собой сферу с выпуклой вершиной, в то время как стабильные Ь-формы (см. рис. 5, б, д, ж) были уплощенными, с пустым центром, что отражено на профилях фазовых портретов (см. рис. 5, в).

При сравнении градиентных фазовых портретов, полученных на МИМ-321, у части Ь-форм в центре выявлялись плотные кольцевидные структуры, предположительно идентифицированные нами как ДНК (см. рис. 5, г), которые, однако, обнаруживались не всегда (см. рис. 5, д).

После воздействия тетрациклина число нестабильных Ь-форм, содержащих ДНК и потенциально способных к реверсии, в популяциях не превышало 25 % исследуемых клеток. Полученное нами в результате статистической обработки процентное соотношение стабильных и нестабильных Ь-форм — величина непостоянная, которая зависела в первую очередь от Ь-трансформирующего агента, а также от ряда других факторов, требующих дальнейшего изучения.

Следует отметить, что процесс реверсии клеток в исходное состояние занимал больше времени, чем нормальное развитие бактериальной популяции (5 сут). После подращивания на мембранных фильтрах наблю-

вклейку после стр. 56).

Рис. 4. Нестабильные (а) и стабильные (б) L-формы Salmonella enterica serovar typhimurium после воздействия биологически активных веществ, продуцируемых Bacillus subtilis. Электронный микроскоп Hitachi-800 (Япония) со сканирующей приставкой Hitachi-8010.

дался трудноразличимый неконтрастный рост культуры в виде уплощенных мелких колоний (рис. 6, а).

Рис. 6. Реверсия нестабильных L-форм в популяции Salmonella enterica serovar typhimurium: а —

рост на мембранных фильтрах Владипор (ООО «Владипор», Россия) на МПА, б — изображение микроколонии, полученное методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Электронный микроскоп Hitachi-800 (Япония) со сканирующей приставкой Hitachi-8010.

Исследование методом СЭМ продемонстрировало, что в центральной части популяции имеются клетки, способные к реверсии в исходное состояние, на что указывало формирование на поверхностях покровов, которые могут образовываться только при полной репарации клеточных стенок. Процесс реверсии свидетельствовал о том, что эти нестабильные L-формы содержали полноценный геном и полностью сохраняли морфологические, биохимические и патогенные свойства. В то же время по периферии колонии обнаруживались единичные разрозненные уплощенные клетки с темным центром — стабильные L-формы (см. рис. 6, б), не способные к реверсии вследствие неполноценности ДНК, что позволяет рассматривать их как морфологических мутантов, фенотип которых генетически детерминирован (3).

Таким образом, исследование процесса L-трансформации в популяции Salmonella enterica serovar typhimurium методами сканирующей, просвечивающей электронной (СЭМ, ПЭМ) и лазерной модуляционной интерференционной микроскопии (МИМ) дало возможность выявить закономерные морфологические признаки L-форм, способных реверсировать в исходное состояние. С появлением методов оптической микроскопии, обладающих сверхразрешением, стало доступно изучение L-трансформации в режиме реального времени на живых бактериях (без фиксации и окрашивания). Полученные с помощью МИМ трехмерные фазовые портреты позволили не только однозначно идентифицировать L-формы бактерий, но и с высокой точностью определить основные морфологические параметры клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем). С применением современных алгоритмов обработки этих данных внутри нестабильных L-форм зарегистрированы кольцевые структуры (предположительно ДНК). Следует отметить, что гетероморфизм со всеми проявлениями L-трансформации характерен для популяций патогенных и условно патогенных бактерий и способствует выживанию вида как в норме, так и при воздействии любых абиотических и биотических факторов. Изучение биологических особенностей L-трансформации имеет важное значение для понимания процессов существования потенциальных резервуаров возбудителей в природе, а также в патогенезе рецидивов хронических заболеваний.

1. Пешков М. А. Сравнительная цитология синезеленых водорослей, бактерий и акти-номицетов. М., 1966.

2. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии. М., 1973.

3. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий (механизм образования, структура, роль в патологии). М., 1981.

4. П а в л о в а И.Б., К ули ко в с ки й А.В., Б о т в и н ко И.В. Электронно-микроско-

пическое исследование развития бактерий в колониях. Гетероморфный рост бактерий в процессе естественного развития популяций. ЖМЭИ, 1990, 12: 12-15.

5. Авакян А.А., Кац Л.Н., Павлова И.Б. Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных. М., 1972.

6. Лопарев А.В., Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Осипов П.А., Маза-

ло в И.Н., Козырев А.В. Высокоскоростной модуляционный интерференционный микроскоп для медико-биологических исследований. Измерительная техника, 2009, 11: 60-64.

7. Игнатьев П.С., Индукаев К.В., Осипов П.А., Сергеев И.К. Лазерная интерференционная микроскопия для нанобиотехнологий. Медицинская техника, 2013, 1: 277.

8. Павлова И.Б. Закономерности развития популяций бактерий в окружающей среде

(электронно-микроскопическое исследование). Докт. дис. М., 1999.

9. Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Банникова Д.А. Атлас морфологии популя-

ций патогенных бактерий. М., 2007.

10. Павлова И.Б., Банникова Д.А., Кононенко А.Б. Сапрофитизм популяций

патогенных листерий. М., 2013.

1ГИУ Всероссийский НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии,

123022 г. Москва, Звенигородское ш., 5, e-mail: aarsenuk@gmail.com;

2000 «Лаборатории АМФОРА»,

123007 г. Москва, ул. 5-я Магистральная, 11, офис 18, e-mail: ips@amphoralabs.ru

EXAMINATION OF L-TRANSFORMATION IN Salmonella BY ELECTRON AND LASER INTERFERENCE MICROSCOPY

A.Yu. Arsenyuk1, I.B. Pavlova1, P.S. Ignat’ev2 Summary

The existence of bacteria without a cell wall was found to be a quite specific and widespread phenomenon, which could not be explained in terms of classical microbiology. The L-transformation of bacteria makes difficult determining the athogens and leads to the false-negative conclusions of biological assays because of L-forms are in uncultivated state. The L-transformation caused by abiotic (tetracycline) and biotic (Bacillus subtilis) factors as well as reversion of L-forms were studied in Salmonella enterica serovar typhimurium population using transmission electron and laser interference microscopy. The morphological parameters of L-forms, which are able to reverse in an initial state, were revealed. Development of super-resolution optical microscopy methods makes possible conducting real-time studies of L-transformation with the living non-modified bacteria. The 3D phase portraits obtained using laser interference microscope MIM-321 make it possible to identify L-forms clearly as well as to determine its basic morphological parameters (diameter, perimeter, height, surface, volume). The ring shaped structures (supposedly identified as DNA) were detected using the modern algorithms of signal processing. It is important to note that heteromorphism including all stages of L-transformation is inherent for all pathogenic and conditionally pathogenic bacteria (both in normal conditions and under biotic and abiotic factors treatment) to provide population survival. The study of L-transformation is extremely important for understanding of potentially infectious agent’s reservoirs as well as chronic disease relapses in vivo.

Вниманию читателей! Вышли в свет книги:

И.Б. Павлова, Е.М. Ленченко, Д.А. Банникова. Атлас морфологии популяций патогенных бактерий. М.: изд-во «Колос», 2007, 180 с.

Поступила в редакцию 24 апреля 2013 года