СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКАН-ХИТОЗАНОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ ОТХОДОВ ПИВОВАРЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА
PRODUCTION METHOD OF GLUCAN-CHITOSAN COMPLEX FROM YEAST BIOMASS OF BREWING WASTE

Изобретение относится к области биотехнологий, а именно к методам выделения глюкан-хитозанового комплекса, и может быть использовано в лабораторной и производственной практике для получения глюкан-хитозанового комплекса из дрожжевых отходов пищевой пивоваренной промышленности, для дальнейшего использования в медицине как компонент пищевых волокон, микробиологии и в производстве полимерных материалов.
Известен «Способ получения глюкан-хитозанового комплекса», включающий стадию депротеинизации мицелия хитинсодержащего микроскопического гриба обработкой его разбавленным раствором едкого натра и деацетилирования концентрированным раствором едкого натра при повышенной температуре, при этом используют мицелий грибов, выбранных из группы, включающей Aspergillus niger, Blakeslia trispora, Actinomyces roseum, P.chrysogenum, а депротеинизацию осуществляют двумя-четырьмя обработками при 60-90°C, после чего реакционную массу обрабатывают разбавленным раствором соляной, азотной или ортофосфорной кислот и отмывают от жиров и липидов органическим растворителем, а деацетилирование проводят 20-29%-ным раствором едкого натра при 110-125°C в течение 30-120 мин.
Патент РФ на изобретение №2043995, МПК: С08В 37/08, публ. 1995.09.20.
Известен «Способ получения хитозанглюканового комплекса», включающий культивирование гриба Aspergillus niger с последующей обработкой мицелия разведенным и концентрированным растворами NaOH, отмывку от щелочи и лиофильную сушку целевого продукта. При этом полученный после культивирования мицелий предварительно подвергают воздействию 2 н. соляной кислоты, затем обрабатывают смесью, содержащей 0,1% детергента, 0,1 этанола(96%) на основе 2% раствора NaOH, при соотношении комплекса реагентов и мицелия 3:1, в качестве концентрированного раствора NaOH используют его 20-25%-ный раствор и обработку ведут 1-2 часа.
Патент РФ на изобретение №2121505, МПК: С12Р 19/04, публ. 1998.11.10.
Недостатком этих способов является использование отходов производств антибиотиков и лимонной кислоты, представленных мицелием микроскопических грибов, при этом объемы отходов (мицелиальной биомассы) несоизмеримо малы по сравнению с отходами пивоваренных производств, которые в среднем по пивоваренным предприятиям России составляют до 20-25 т в сутки. Также к недостаткам следует отнести сложность технологии предварительной подготовки биомассы, а также многостадийность и многократность ее обработки, что влечет дополнительные финансовые расходы. Необходимость использования концентрированных растворов щелочей, более 20% при температуре более 100°C, кроме того, многократная промывка спиртовыми растворами этанола влечет дополнительные расходы.
Наиболее близким аналогом к способу в предложенном в качестве изобретения техническом решении является «Способ получения бета-глюканов клеточной стенки дрожжей», характеризующийся тем, что клетки дрожжей разрушают механическим методом, суспензию отмытых клеточных стенок обрабатывают ультразвуком с частотой 18-30 кГц. Предпочтительно 18-22 кГц, сопутствующие полисахариды разрушают обработкой щелочью или ферментом и осаждением выделяют целевой продукт.
Патент РФ на изобретение №2216595, МПК: C02F 3/34, публ. 2007.12.10.
Технический результат заключается в повышении качества глюкан-хитозанового комплекса и его биологической активности путем получения его из дрожжевых отходов пищевой пивоваренной промышленности.
Технический результат достигается тем, что «Способ получения глюкан-хитозанового комплекса из дрожжевой биомассы отходов пивоваренного производства» включает механическую и ультразвуковую обработку дрожжевой биомассы, разрушение белков путем обработки полученной суспензии щелочными реагентами с последующим выделением целевого продукта. Причем в качестве дрожжевой биомассы используют отходы пивоваренных производств в виде живых дрожжей «Saccharomyces cerevisiae». При этом дрожжи предварительно медленно замораживают до температуры -15°C в течение 24 часов. После механического разрушения биомассу помещают в ультразвуковую баню с частотой излучателя 35 кГц и мощностью 285 Вт и обрабатывают 15 минут при температуре 20°C. Полученную биомассу подкисляют соляной кислотой до рН=5,5 и обрабатывают ферментным препаратом в количестве одной таблетки, содержащей липазу - 3500 Ед Ph.Eur., амилазу - 4200 Ед Ph.Eur. и протеазу - 250 Ед Ph.Eur. на 1 кг дрожжевой биомассы в пересчете на сухое вещество, затем удаляют липидные компоненты дрожжей. При этом процесс ферментации осуществляют при t=20-29°C в течение 30-60 мин. Дальнейшее разрушение белков осуществляют с помощью щелочных компонентов при температуре 55°C на водяной бане в течение 60 минут с помощью 4%-ного водного раствора едкого натра при соотношении биомассы на основе дрожжей и щелочи, равной 1:4. Затем нейтрализуют среду и осаждают гидрозоль глюкан-хитозанового комплекса центрофугированием в течение 10 мин. Полученный осадок в виде хитин-глюканового комплекса высушивают при t=55°C в течение 48 часов.
Основным препаратом, содержащим липазу - 3500 Ед Ph.Eur., амилазу - 4200 Ед Ph.Eur. и протеазу - 250 Ед Ph.Eur., является Мезим форте, один из препаратов для коррекции экзокринной недостаточности поджелудочной железы.
Способ осуществляется следующим образом: отходы пивоваренных производств, содержащих смесь различных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae в виде биомассы (30-35% в пересчете на сухое вещество) медленно замораживают в течение 24 часов при температуре 15°C, таким образом, достигается преимущественный рост крупных кристаллов льда, которые способствуют разрушению клеток дрожжей. Затем замороженную биомассу раскалывают на небольшие куски размером (1×1×1 см). Помещали в коническую колбу с небольшим количеством холодной воды (t=4°C). Колбу с еще замороженными кусочками дрожжей помешали в ультразвуковую баню с частотой излучателя 35 кГц, 285 Вт и обрабатывали ультрозвуком в течение 15 мин при температуре воды в бане 20°C. При этой процедуре происходила полная деструкция клеток дрожжей, т.к. под действием ультразвуковых колебаний создавался кавитационный эффект. Кавитационные пузырьки в жидкости, пульсируя и захлопываясь вблизи клеточных структур, приводили к деструкции, а еще нерастаявшие кристаллы льда (выступающие в роли «поражающих элементов») внутри и снаружи клеток приводили еще к большему деструкционному эффекту.
На первой стации депротеинизации и удаления липидных компонентов полученную биомассу подкисляли соляной кислотой до рН=5,5 и добавляли ферментный препарат 1 табл., например Мезим форте, один из препаратов для коррекции экзокринной недостаточности поджелудочной железы, его состав: липаза - 3500 Ед Ph.Eur., амилаза - 4200 Ед Ph.Eur., протеаза - 250 Ед Ph.Eur.) на 1 кг дрожжевой биомассы (в пересчете на сухое вещество). Процесс ферментация проводился на водяной бане при t=25°C в течение 30 мин.
Затем полученную биомассу на основе дрожжей смешивали с раствором NaOH. Окончательное разрушение белков (депротеинизацию) и удаление липидных веществ осуществляли в 4%-ном водном растворе едкого натра при соотношении биомассы на основе дрожжей и щелочи 1:4, при температуре t=55°C на водяной бане в течение 60 мин. При этом по окончании процесса в колбе происходит разделение жидкости на 2 фракции. Верхний слой маслянистой прозрачной жидкости (светло-коричневой жидкости) и нижний слой бесцветной жидкости (в виде чуть прозрачной суспензии). Раствор охлаждали. Разделяли деконтированием две жидкости. В дальнейшем использовали нижний слой жидкости.
Затем полученный раствор доводили до нейтральной реакции соляной кислотой. При этом гидрозоль дрожжевого хитин-хитозанового комплекса оседал в течение суток, т.к. частицы хитин-глюканового комплекса очень малы. Процесс оседания частиц хитин-глюканового комплекса ускоряли с помощью центрифугирования в течение 10 мин, при при 3000g. По окончании центрифугирования образовывался плотный осадок светло серого цвета. Затем полученный хитин-глюкановый комплекс высушивали в сухожаровом шкафу при t=55°C в течение 48 часов.
Примеры конкретного выполнения способа получения хитин-глюканового комплекса.
Пример 1. Живую биомассу дрожжей массой 1 кг медленно замораживали в холодильнике до t=-15°C в течение 24 часов. Затем замороженную биомассу раскалывали на небольшие куски размером (1×1×1 см). Помещали в коническую колбу с небольшим количеством холодной воды (t=4°C). Колбу с еще замороженными кусочками дрожжей помещали в ультразвуковую баню частотой излучателя 35 кГц, 285 Вт (пиковая мощность 300 Вт) и обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин при температуре воды в бане 20°C. Полученную биомассу подкисляли соляной кислотой до рН=5,5, добавлением ферментного препарата 1 табл. (состав: Липазы - 3500 Ед Ph.Ew., амилазы - 4200 Ед Ph.Eur., протеазы - 250 Ед Ph.Eur.) на 1 кг дрожжевой биомассы (в пересчете на сухое вещество). Ферментация при t=25°C в течение 30 мин. Полученную массу дрожжей смешивали с 4%-ным водным раствором NaOH при соотношении дрожжей и щелочи 1:4, при температуре t=55°C на водяной бане в течение 60 мин. Затем раствор охлаждали и доводили до нейтральной реакции соляной кислотой. При этом гидрозоль дрожжевого хитин-хитозанового комплекса оседал в течение суток, т.к. частицы хитин-глюканового комплекса очень малы. По истечении суток жидкость над осадком декантировали, пастообразный осадок светло-серого цвета помещали в сухожаровой шкаф. Затем хитин-глюканового комплекс высушивали в сухожаровом шкафу при t=55°C в течение 72 часов. Масса хитин-глюканового комплекса составила 80 г, т.е. выход составил 8% от массы исходной дрожжевой биомассы.
Пример 2. Живую биомассу дрожжей массой 1 кг медленно замораживали в холодильнике до t=-15°C в течение 24 часов. Затем замороженную биомассу раскалывали на небольшие куски размером (1×1×1 см). Помещали в коническую колбу с небольшим количеством холодной воды (t=4°C). Колбу с еще замороженными кусочками дрожжей помещали в ультразвуковую баню частотой излучателя 30 кГц, 285 Вт (пиковая мощность 300 Вт) и обрабатывали ультрозвуком в течение 25 мин при температуре воды в бане 20°C. Полученную биомассу подкисляли соляной кислотой до рН=5,5, добавлением ферментного препарата 1 табл. (состав: Липазы - 3500 Ед Ph.Eur., амилазы - 4200 Ед Ph.Eur., протеазы - 250 Ед Ph.Eur.) на 1 кг дрожжевой биомассы (в пересчете на сухое вещество). Ферментация при t=29°C в течение 30 мин. Полученную массу дрожжей смешивали с 4%-ным водным раствором NaOH при соотношении дрожжей и щелочи 1:4, при температуре t=50°C на водяной бане в течение 90 мин. Затем раствор охлаждали и доводили до нейтральной реакции соляной кислотой. Процесс оседания частиц хитин-глюканового комплекса ускоряли с помощью центрифугирования в течение 10 мин, при 3000g. По окончании центрифугирования образовывался плотный пастообразный осадок светло-серого цвета, поместили  в сухожаровой шкаф. Затем хитин-глюканового комплекс высушивали в сухожаровом шкафу при t=55°C в течение 48 часов. Масса хитин-глюканового комплекса составила 10 г, т.е. выход составил 10% от массы исходной дрожжевой биомассы.
Пример 3. Живую биомассу дрожжей массой 1 кг медленно замораживали в холодильнике до t=-20°C в течение 24 часов. Затем замороженную биомассу раскалывали на небольшие куски размером (0,5×0,5×0,5 см). Помещали в коническую колбу с небольшим количеством холодной воды (t=4°C). Колбу с еще замороженными кусочками дрожжей помещали в ультразвуковую баню частотой излучателя 25 кГц, 285 Вт (пиковая мощность 300 Вт) и обрабатывали ультрозвуком в течение 30 мин при температуре воды в бане 20°C. Полученную биомассу подкисляли соляной кислотой до рН=5,5, добавлением ферментного препарата 1 табл. (состав: Липазы - 3500 Ед Ph.Eur., амилазы - 4200 Ед Ph.Eur., протеазы - 250 Ед Ph.Eur.) на 1 кг дрожжевой биомассы (в пересчете на сухое вещество). Ферментация при t=20°C в течение 60 мин. Полученную массу дрожжей смешивали с 4%-ным водным раствором NaOH при соотношении дрожжей и щелочи 1:4, при температуре t=60°C на водяной бане в течение 45 мин. Затем раствор охлаждали и доводили до нейтральной реакции соляной кислотой. Процесс оседания частиц хитин-глюканового комплекса ускоряли с помощью центрифугирования в течение 10 минут, при 3000g. По окончании центрифугирования образовывался плотный пастообразный осадок светло-серого цвета. Осадок, содержащийся в пробирке, после центрифугирования смешивали с этиловым спиртом 96% в соотношении 1:1 (для удаления остаточных липофильных вешеств), затем помещали пробирку в горизонтальный шейкер и встряхивали в течение 30 мин. Повторно центрифугировали с помощью центрифугирования в течение 10 мин, при 3000g. Полученный осадок сушили при 25°C в течение 8 часов. Затем хитин-глюканового комплекс высушивали в сухожаровом шкафу при t=50°C в течение 24 часа. При этом полученный в результате продукт был более светлым в сравнении с продуктами по 1 и 2 вариантам. Масса хитин-глюканового комплекса составила 10 г, т.е. выход составил 10% от массы исходной дрожжевой биомассы.
Предлагаемый в качестве изобретения «Способ получения глюкан-хитозанового комплекса» позволяет использовать дешевые отходы пивоваренных производств, содержащие смесь различных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Это, в конечном счете, способствует значительному удешевлению получаемого продукта и повышению рентабельности производства глюкан-хитозанового комплекса.