Стимуляция коллагеногенеза при имплантации герниологических эндопротезов в эксперименте

Стимуляция коллагеногенеза при имплантации герниологических эндо-протезов в эксперименте

С.В. Иванов, В.А. Лазаренко, И.С. Иванов, А.В. Цуканов, Д.В. Тарабрин,

Г.Н. Гафаров, И.А. Иванова, Р.С. Надиров1

Курский государственный медицинский университет, кафедра хирургических болезней № 1, г.Курск; Центр Научной Хирургии им. М.А.Топчибашева, г.Баку1

Основой патогенеза развития грыж передней брюшной стенки в настоящее время является нарушение коллагенового обмена, что обуславливает слабость апоневроза. В конце прошлого столетия внимание гернио-логов привлекло изучение проблемы возникновения грыж передней брюшной стенки с точки зрения коллагенового обмена. Была выдвинута концепция, отражающая нарушение соотношения коллагена I типа к III типу и, как следствие, появление грыжевой болезни [1]. Соотношение коллагена I типа к III обеспечивает прочность соединительной ткани. Изменение этого соотношения в сторону коллагена III типа ведет к слабости и снижению механической функции передней брюшной стенки [2,3,4,7].

Синтез коллагеновых фибрилл является многоэтапным и сложным процессом, происходящим в организме, и на каждом из этапов возможны нарушения. Так, восполнение недостающих элементов нормализует данный процесс [5,11]. Оротовая кислота, входящая в состав восстанавливающего агента 4-оксипролина, необходима для сохранения атома железа при гидроксилировании про-лина [9,10]. Источниками оротовой кислоты являются свиная печень, кисломолочные продукты, дрожжи. В медицине известен препарат «Оротат калия», который влияет на обменные процессы в организме, участвует в синтезе коллагеновых волокон, стимулирует деление клеток [13].

Анализируя данные литературы, нами не выявлено работ, описывающих действие «Оротата калия» на формирование соединительной ткани и изменения соотношения типов коллагена в апоневрозе при грыжах передней брюшной стенки, что определило актуальность нашего исследования.

ЦЕЛЬЮ исследования являлось исследование неоколлагеногенеза при имплантации

эндопротезов «Parietene ProGrip» и «Эсфил» на фоне применения «Оротата калия».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Экспериментальное исследование выполнено на 185 особях сингенных белых лабораторных мышей-самцов со средним весом 45-50 гр. В зависимости от вида имплантированного эндопротеза и применения препарата «Оротат калия», все животные были разделены на 4 группы. Животным 1-й группы (n=43) имплантировали эндопротез фирмы ООО Линтекс (С-Петербург) «Эсфил». Во 2-й группе (47) использовался эн-допротез «Parietene ProGrip» фирма Coviden (Франция). 3-ю группу (n=46) составили животные, которым имплантировали эндопро-тез «Эсфил» и в кормовой рацион добавляли препарат «Оротат калия» в виде порошка из расчета 0,75 мг на одно животное в сутки. Животным 4-й группы (n=49) имплантировали эндопротез «Parietene ProGrip» и также в кормовой рацион добавляли препарат «Оротат калия». Животные 3-й и 4-й групп получали препарат на протяжении всего эксперимента. Животные выводились из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом на 7, 10, 30, 60, 90 сутки. Полученные гистологические срезы помещали на предметные стекла и окрашивали пикроси-риусом красным (Sirius Red) по стандартной методике [6,12]. Препараты исследовали на поляризационном микроскопе Altami Polar 2 в обычном и поляризационном свете. Анализ соотношения типов коллагена в соединительной ткани вокруг эндопротеза проводили по цветовой гамме, так коллаген I типа при поляризационной микроскопии имел красную окраску, III тип коллагена - зеленую. Для определения соотношения коллагена I и III типов использовали программный комплекс Altami Studio 3.0 и ImageJ. Для изучения плотности коллагеновых волокон

вычисляли концентрацию пикселем на дюйм при помощи графического редактора [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. При анализе гистологических микропрепаратов в

поляризационном свете в 1 и 2 группах на 7-е и 10-е сутки эксперимента достоверных отличий в динамике соотношения коллагенов I и III типов не выявлено (Рис. 1).

0,93 0,95 0,94 0,96

7

10

60

90

30 сутки

Эсфил  Parietene ProGrip Рис. 1. Динамика соотношения I типа коллагена к III типу в парапротезной капсуле на различных сроках без применения «Оротата Калия»

Таблица 1. Плотность коллагеновых волокон

Длительность експеримента Группы животных Значение плотности коллгеновых волокон

30 сутки 60 сутки 90 сутки

1 группа 114,9±15,6*# 176,2±17,2*# 239,8±11,2*#

2 группа 149,5±13,3*# 221,8±16,9*# 278,1±19,5*#

3 группа 177,4±16,1*# 262,7±16,4*# 323,9±13,2*#

4 группа 219,1±18,4*# 305,2±21,2*# 364,5±13,1*#

Примечание:* - p<0,05 при сравнении между группами на одинаковых сроках эксперимента; # - p<0,05 при сравнении между группами на различных сроках эксперимента.

На 30-е сутки эксперимента в 1-й и 2-й группах визуализировалась соединительнотканная капсула вокруг нитей эндопротеза, отмечалась строгая направленность и непрерывность пучков коллагеновых волокон. Анализ данных, полученных при исследовании капсулы вокруг эндопротеза «Эсфил», показывал, что степень ее зрелости была достоверно меньше по сравнению с группой, которой имплантировался «Parietene ProGrip». Плотность коллагеновых волокон составила 114,9±15,6 pixel/дюйм (Таб. 1). Отмечались «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы, свидетельствующие о преобладании в своей структуре рыхлой волокнистой соединительной ткани, что гово-

рило о ее незрелости. При имплантации эндопротеза «Эсфил» отмечалось достоверное увеличение содержания коллагена I типа в сравнении с 10 -ми сутками эксперимента.

В препаратах, полученных на 30-е сутки эксперимента при имплантации «Parietene ProGrip», отмечалось, что капсула имеет плотную структуру и отсутствуют «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы, плотность коллагеновых волокон составила 149,5±13,3 pixel/дюйм (Таб. 1). Анализ цветовой гистограммы показал преобладание красного цвета, что свидетельствовало о доминировании коллагена I типа над III. Такое преобладание говорило о лучшей прочности парапротезной капсулы, что важно в предот-

вращении возникновения рецидива вентральных грыж. Вероятнее всего такое преобладание было связано с покрытием полипропиленовых нитей эндопротеза «Parietene ProGrip» полимолочной кислотой в отличие от стандартного полипропиленового эндо-протеза «Эсфил».

При поляризационной микроскопии препаратов 2 -й группы, полученных на 60-е сутки эксперимента, было отмечено, что структура парапротезной капсулы была более выраженной по сравнению с 1-й группой. Отмечались организованно направленные пучки коллагеновых волокон, плотно расположенные относительно друг друга. Анализ цветовой гистограммы показал явное преобладание красного цвета, что свидетельствовало о значительном преобладании коллагена I типа и в сравнении с предыдущим сроком. ^отношение коллагенов I типа к III составило 1, 96, что было достоверно больше в сравнении с I группой животных.

К 90-м суткам эксперимента отмечалось значительное преобладание коллагена I типа над III типом при использовании обоих эн-допротезов. Однако, в группе с применением «Parietene ProGrip» отмечалось более интен-

Н Н

о> S I

<и

Э

0

1

н о о и

сивное окрашивание капсулы в красный цвет, пучки волокон плотно располагались относительно друг друга. Плотность колла-геновых волокон составила 278,1±19,5 pixel/дюйм, что было достоверно больше в сравнении с группой животных, в которой использовался «Эсфил» (Таб. 1). Соотношение типов коллагена при использовании эндопротеза «Эсфил» составило 1,75, что практически в 1,5 раза меньше по сравнению с группой, в которой использовался «Parietene ProGrip».

Изучение парапротезной капсулы на 7-е и 10-е сутки эксперимента при использовании «Оротата Калия» в 3-й и 4-й группе животных, показало явное отсутствие отличий по соотношению типов коллагена между собой, а также в сравнении с группами животных, в которых препарат не применялся (Рис. 2,3,4.). Вероятнее всего отсутствие отличий в соотношении типов коллагенов было связано с воспалительной реакцией и сменой фаз воспаления (альтерации и экссудации) на данных сроках исследования, как нормальный ответ организма на травму и внедрение инородного тела (синтетического материала).

0,91 108  0,95 104

10

Эсфил

30 сутки

| Parietene ProGrip

60

90

Рис. 2. Динамика соотношения I типа коллагена к III типу в парапротезной капсуле на различных сроках при добавлении в кормовой рацион «Оротата Калия»

При сравнении результатов исследования за начиная с 30 -х суток и на последующих соотношения типов коллагена в группах с сроках эксперимента, отмечались достоверно использованием одного и того же эндопроте- лучшие результаты в группах, где выполня-

7

лась стимуляция коллагеногенеза «Оротатом Калия». Помимо явного влияния «Оротата Калия» на синтез коллагена, полученные результаты могли быть обусловлены сменой фаз воспаления и наступлением фазы пролиферации на данных сроках (30 суток и далее).

При поляризационной микроскопии препаратов, полученных на 30-е сутки эксперимента в 3 -й и 4-й группах, определялись достоверные отличия по соотношению типов коллагена в сравнении с предыдущими сроками. Соотношение коллагена I и III типов при имплантации эндопротеза «Parietene ProGrip» было достоверно больше по сравнению с группой животных, которым имплантировался «Эсфил», 1,92 и 1,49 соответственно. Плотность коллагеновых волокон в 4-й группе составила 219,1±18,4 pixel/дюйм.

На 60-е сутки эксперимента в 3-й группе животных отмечалась многослойная пара-протезная капсула, с отсутствием дефектов, плотность которой составила 262,7±16,4 pixel/дюйм. При использовании препарата «Оротата Калия» и эндопротеза «Parietene ProGrip» на 60-е сутки эксперимента соотношение I и III типов коллагена составило 2,94, плотность парапротезной капсулы -305,2±21,2 pixel/дюйм.

Микроскопическая оценка препаратов на 90-е сутки эксперимента показала, что соединительнотканная капсула по плотности коллагеновых волокон, соотношения коллагенов I и III типов достигает своего максимума в обеих группах.

При экспериментальном использовании эндопротеза «Эсфил» в сочетании с «Орота-том Калия» на 90 сутки капсула имела незначительные «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы, плотность коллаге-новых волокон была равна 323,9±13,2 pixel/дюйм, что в сравнении с 4 группой животных было достоверно меньше. Применение «Оротата Калия» в 4 группе животных позволило значительно увеличить показатели плотности коллагеновых волокон (364,5±13,1 pixel/дюйм), соотношения типов коллагена (3,44) по сравнению с эндопроте-зом «Эсфил» и группами животных, которым препарат в кормовой рацион не добавлялся.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ. В ходе нашего исследования начиная с 30-х суток и до окончания эксперимента было выявлено лучшее течение процесса коллагеногенеза и формирование соединительнотканной парапротезной капсулы при использовании эндопротеза «Parietene ProGrip» по сравнению с группой животных с эндопротезом «Эсфил». Учитывая полученные результаты вероятнее всего имело место стимуляция коллагеногенеза со стороны полимолочной кислоты, покрывающей нити эндопротеза «Parietene ProGrip». Так же нами было выявлено стимулирующее действие «Оротата Калия» на синтез коллагена, в условиях имплантации синтетических материалов, проявляющееся в увеличении соотношения коллагена I типа над III, что говорило о зрелости соединительнотканной капсулы вокруг эндопротезов. Лучший эффект наступал на 30-сутки эксперимента и наблюдался на последующих сроках исследования, что скорее всего было связано со сменой фаз воспаления и наступлением фазы пролиферации на данных сроках. Учитывая явное стимулирующее действие «Оротата Калия» на коллагеногенез и преобладание коллагена I типа, что говорит о лучшей прочности парапротезной капсулы, можно рекомендовать применение «Оротата Калия» у пациентов для профилактики возникновения рецидива вентральных грыж.

Экспериментальное применение эндопро-теза «Parietene ProGrip» во 2 и 4 экспериментальных группах показывало достоверно лучшие результаты в сравнении с эндопроте-зом «Эсфил» без и с добавлением в кормовой рацион животных «Оротата Калия», что было связано со структурными особенностями эндопротезов, в частности покрытием полипропиленовых нитей эндопротеза «Parietene ProGrip» полимолочной кислотой в отличие от стандартного полипропиленового эндопротеза «Эсфил».

ВЫВОДЫ:

1. В ходе эксперимента нами было выявлено стимулирующее действие «Оротата Калия» на синтез коллагена, в условиях имплантации синтетических материалов, проявляющееся в увеличении соотношения кол-

лагена I типа над III во всех группах исследования.

2. Оптимизация коллагеногенеза в эксперименте заключалась в увеличении соотношения коллагена I типа к III типу в 1,37 раза при имплантации «Parietene ProGrip» по сравнению с материалом «Эсфил» на 90-е сутки эксперимента, что проявлялось ускорением созревания соединительнотканной капсулы и способствовало ранней изоляции эндопротеза от прилежащих тканей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ермолов А.С. и др. Причины рецидивов при применении синтетических протезов в хирургии послеоперационных ВГ (ПОГ) / Актуальные вопросы герниологии : материалы IX конф. М., 2012, с.77-79.

2. Rosch R. et al. Analysis of collagen-interacting proteins in patients with incisional hernias // Langenbecks Arch. Surg., 2003, vol. 387, N 11/12, p.427-432.

3. Ozdogan М. et al. Changes in collagen and elastic fiber contents of the skin, rectus sheath, transversalis fascia and peritoneum // Bratisl. Lek. Listy, 2006, vol. 107, N 6/7, p.235-238.

4. Junge K. et al. Decreased collagen type I/III ratio in patients with recurring hernia after implantation of alloplastic prostheses // Langenbecks Arch. Surg., 2004, vol. 389, N 1, p.17-22.

5. Broderick G. et al. Dermal collagen matrices for ventral hernia repair: comparative analysis in a rat model // Hernia, 2012, vol. 16, N 3, p.333-343.

6. Donahue T.R., Hiatt J.R., Busuttil R.W. Collagenase and surgical disease // Hernia, 2006, vol. 10, 6, p.478-485.

7. Hulmes D.J. Building collagen molecules, fibrils, and suprafibrillar structures // J. Struct. Biol., 2002, Vol. 137, N >4 p.2-10.

8. Si Z. et al. Impaired balance of type I and type III procollagen mRNA in cultured fibro-blasts of patients with incisional hernia // Surgery, 2002, vol. 131, p.324-331.

9. Maude R.J., Buapetch W., Silamut K. A simplified, low-cost method for polarized light microscopy // Am. J. Trop. Med. Hyg., 2009, vol. 81, p.782-783.

10. Ottani V., Raspanti M., Ruggeri A. Collagen structure and functional implications // Micron, 2001, N 12, p. 251-260.

11. Meyer A.L. et al. Quantitative and qualitative analysis of collagen types in the fascia transversalis of inguinal hernia patients // Arq. Gastroenterol., 2007, vol. 44, N 3, p. 230-234.

12. Weaver R. Rediscovering polarized light microscopy // American Laboratory, 2003, vol. 35, p.55-61.

13. Ye§ilel O.Z., Ka§ta§ G., Buyukgungor O. The novel polymeric potassium complex with a new coordination mode of orotic acid N: Synthesis and structural characterization // Inorg. Chem. Commun., 2007, vol. 10, Issue 8, s.936-939.

SUMMARY

Stimulating of neocollagenesis with hernio endoprosthesis implantation in experiment S.V. Ivanov, V.A. Lazarenko, I.S. Ivanov, A.V. Tsukanov, D.V. Tarabrin, H.N. Gafa-rov, I.A. Ivanova, R.S. Nadirov

Department of surgical diseases №1 Kursk State Medical University; Scientific Centre of Surgery named. M.A.Topchibashev, Baku

The histological preparations were examined using polarizing microscopy. Analyzed the ratio of types I and III collagen in the connective tissue around the prosthesis was performed according to the color, individually for each type. The use of prosthesis "Parietene ProGrip" in the 2 and 4 experimental groups showed significantly better results in comparison with the endoprosthesis "Esfil" without and with the addition to the diet of animals "Potassium Orotate". In the experiment, we detected a stimulating effect "Potassium Orotate" on the synthesis of collagen, in the conditions of implantation of synthetic materials, which is manifested in the increase in the ratio of collagen type I over III.