СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ИЗ СОДЕРЖАЩЕЙ ЛИПИДЫ БИОМАССЫ С ПОМОЩЬЮ ГИДРОФОБНОГО ДИОКСИДА КРЕМНИЯ
METHOD FOR ISOLATING LIPIDS FROM LIPID-CONTAINING BIOMASS USING HYDROPHOBIC SILICON DIOXIDE

Настоящее изобретение относится к способу выделения липидов из содержащей липиды биомассы с помощью гидрофобного диоксида кремния.
Содержащие ПНЖК (полиненасыщенные жирные кислоты) липиды представляют большой интерес для кормовой, пищевой и фармацевтической промышленности. Вследствие чрезмерного отлова рыбы крайне необходимы альтернативные источники содержащих ПНЖК липидов, помимо рыбьего жира. Оказалось, что кроме некоторых штаммов дрожжевых грибков и водорослей, чрезвычайно хорошим источником содержащих ПНЖК липидов, являются в частности, клетки микроводорослей, таких как относящихся к отряду Thraustochytriales.
Однако в случае микроорганизмов и, в частности, в случае клеток микроорганизмов отряда Thraustochytriales, которые продуцируют содержащие ПНЖК липиды, выделение масла из клеток оказывается особенно затруднительным. Наиболее эффективной методикой выделения масла являлось использование органических растворителей, таких как гексан. Однако использование органических растворителей создает вредные условия работы, требует использования дорогостоящего взрывобезопасного оборудования и требует проведения дорогостоящей процедуры регенерации растворителя для предотвращения загрязнения окружающей среды.
При попытках избежать использования органических растворителей оказалось, что эффективной альтернативной методикой выделения масла является высаливание масла с использованием больших количеств хлорида натрия. Однако использование больших количеств хлорида натрия приводит к получению в качестве побочного продукта делипидизированной биомассы, которую, вследствие высокого содержания соли, невозможно использовать в качестве ингредиента корма, поэтому способ не является особенно рациональным. Кроме того, высокая концентрация соли приводит к быстрой коррозии использующегося изготовленного из стали оборудования.
Таким образом, задачей настоящего изобретения являлась разработка эффективного способа выделения липида, предпочтительно содержащего ПНЖК липида, из содержащих липиды клеток, предпочтительно отряда Thraustochytriales, и одновременно не только предотвращения необходимости использования органических растворителей, но и предотвращения необходимости использования больших количеств солеи и предпочтительно также предотвращения необходимости использования больших количеств основания и/или высокого значения рН для осуществления эффективного выделения масла из клеток.
Другой задачей настоящего изобретения получали являлась разработка способа выделения липида, предпочтительно содержащего ПНЖК липида, из содержащих липиды клеток, предпочтительно клеток микроорганизмов отряда Thraustochytriales, и одновременно получения делипидизированной биомассы, которую можно использовать в промышленности, в частности, в области сельского хозяйства.
Согласно изобретению установлено, что эффективное выделение липида из биомассы можно осуществить, если биомассу, предпочтительно после лизиса, инкубируют с гидрофобным диоксидом кремния, предпочтительно при значении рН, примерно соответствующем нейтральной среде, и при температуре, равной от 50 до 100°С. Путем поддержания температуры существенно ниже 100°С и исключения использования высоких значений рН можно предотвратить по меньшей мере существенное омыление сложных эфиров жирных кислот. Таким образом, разработан экологически благоприятный, рациональный, а также проводимый при мягких условиях способ выделения липидов из содержащихся в биомассе клеток.
Поскольку также отсутствует необходимость использования щелочной среды и, таким образом, добавления щелочных реагентов, а также органических растворителей, получают биомассу, которая содержит чрезвычайно небольшие количества солей и/или в основном не содержит органические растворители, и поэтому она оказывается крайне подходящей для применения, в частности, в области сельского хозяйства.
Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является способ выделения липидов из содержащей липиды биомассы, включающий следующие стадии:
a) получение суспензии биомассы, где содержащиеся в биомассе клетки включают в среднем не менее 10 мас.% липидов;
b) необязательно лизис содержащихся в биомассе клеток;
c) добавление к суспензии гидрофобного диоксида кремния;
d) нагревание полученной таким образом суспензии до температуры, равной не ниже 50°С, предпочтительно равной от 50 до 100°С, более предпочтительно от 65 до 95°С, и инкубирование суспензии в течение не менее 20 мин, предпочтительно в течение от 20 мин до 30 ч, более предпочтительно от 30 мин до 26 ч, более предпочтительно от 1 до 24 ч, от 2 до 20 ч, от 3 до 15 ч или от 4 до 10 ч;
e) отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей остатки клеток водной фазы.
Предпочтительно, если стадии проводят в указанном порядке, однако гидрофобный диоксид кремния необязательно можно добавить до лизиса суспензии или, с другой стороны, гидрофобный диоксид кремния можно добавить после того, как суспензию уже нагрели.
Предпочтительно, если суспензию биомассы дополнительно концентрируют до или после добавления гидрофобного диоксида кремния до обеспечения полного содержания сухого вещества (ПССВ), составляющего от 20 до 60 мас.%, если ПССВ в суспензии не находится в этом диапазоне.
Таким образом, предпочтительным объектом настоящего изобретения является способ выделения липидов из содержащей липиды биомассы, включающий следующие стадии:
a) получение суспензии биомассы, содержащей клетки, которые включают содержащий ПНЖК липид;
b) необязательно лизис содержащихся в биомассе клеток;
c) концентрирование суспензии до обеспечения полного содержания сухого вещества (ПССВ), составляющего от 20 до 60 мас.%, предпочтительно от 25 до 60 мас.%, более предпочтительно от 30 до 55 мас.%, если суспензия обладает более низким ПССВ;
d) добавление к суспензии гидрофобного диоксида кремния;
e) нагревание полученной таким образом суспензии до температуры, равной не ниже 50°С, предпочтительно равной от 50 до 100°С, более предпочтительно от 65 до 95°С, и инкубирование суспензии в течение не менее 20 мин, предпочтительно в течение от 20 мин до 30 ч, более предпочтительно от 30 мин до 26 ч, более предпочтительно от 1 до 24 ч, от 2 до 20 ч, от 3 до 15 ч или от 4 до 10 ч;
f) проводимое с помощью механических средств отделение свободного масла от содержащей остатки клеток водной фазы.
В этом варианте осуществления настоящего изобретения стадии (а) - (f) предпочтительно проводят в указанном порядке. Однако концентрирование биомассы также необязательно можно провести до лизиса клеток или гидрофобный диоксид кремния можно добавить до лизиса и/или концентрирования суспензии, или, с другой стороны, гидрофобный диоксид кремния можно добавить после того, как суспензию уже нагрели.
Предпочтительно, если стадии лизиса клеток, концентрирования суспензии, добавления гидрофобного диоксида кремния и инкубирования суспензии с гидрофобным диоксидом кремния проводит при механическом перемешивании, более предпочтительно при перемешивании или встряхивании соответствующей суспензии. Перемешивание и/или встряхивание можно провести с использование перемешивающего устройства и/или встряхивающего устройства соответственно. В частности, можно использовать перемешивание при низком сдвиговом усилии и/или перемешивание в осевом направлении, в частности, как это описано в WO 2015/095694. Мешалки, подходящие для перемешивания, включают, в частности, лопастные мешалки с прямыми лопастями, лопастные мешалки Руштона, мешалки с осевым потоком, мешалки с радиальным потоком, мешалки с вогнутыми дисковыми лопастями, высокоэффективные мешалки, пропеллерные мешалки, лопастные мешалки, турбинные мешалки и их комбинации.
В способах, предлагаемых в настоящем изобретении, добавление диоксида кремния приводит к разрушению эмульсии, содержащейся в суспензии, с образованием содержащей масло легкой фазы и содержащей воду, остатки клеток и соли тяжелой фазы. В контексте настоящего изобретения такое разрушение эмульсии также называется "деэмульгированием".
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофобный диоксид кремния добавляют к суспензии до обеспечения конечной концентрации в суспензии, составляющей от 0,005 до 0,25 мас.% гидрофобного диоксида кремния. Предпочтительно, если гидрофобный диоксид кремния добавляют в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию, составляющую от 0,008 до 0,20 мас.%, более предпочтительно от 0,012 до 0,15 мас.%, более предпочтительно от 0,015 до 0,10 мас.%.
В соответствии с настоящим изобретением термин "гидрофобный диоксид кремния" может означать гидрофобный диоксид кремния одного типа или смесь гидрофобных диоксидов кремния разных типов.
Гидрофобные диоксиды кремния зарегистрированы под регистрационным №CAS: 68611-44-9, и они имеются в продаже, например, под торговыми названиями Sipernat или Aerosil (Evonik Industries, Germany). Гидрофобные диоксиды кремния отличаются тем, что они содержат гидрофобные группы, химически связанные с поверхностью. Химическими группами предпочтительно являются алкильные или полидиметилсилоксановые группы. Гидрофобный диоксид кремния можно получить, например, путем химической обработки гидрофильного диоксида кремния алкоксисиланами, силазанами или силоксанами.
Гидрофобные диоксиды кремния, предпочтительно применяющиеся в настоящем изобретении, обладают смачиваемостью метанолом, составляющей не менее 40%, предпочтительно не менее 45%, более предпочтительно не менее 50%, более предпочтительно от 40 до 65%, особенно предпочтительно от 45 до 60%.
Смачиваемость метанолом является мерой гидрофобности порошкообразного диоксида кремния. Для определения этого значения отвешивают определенное количество порошкообразного диоксида кремния и помещают в воду. При этом порошкообразный диоксид кремния остается на поверхности. Затем определяют количество метанола, необходимое для смачивания порошка. В контексте настоящего изобретения термин "смачиваемость метанолом" означает выраженное в об.% содержание метанола в смеси метанол-вода, в которой осаждается 50% гидрофобного диоксида кремния.
Гидрофобные диоксиды кремния, предлагаемые в настоящем изобретении предпочтительно обладают плотностью утряски (непросеянные; определяют в соответствии со стандартом ISO 787-11), равной от 100 до 200 г/л, более предпочтительно от 125 до 175 г/л. Размер частиц гидрофобного диоксида кремния (d50; определяют с помощью дифракции лазерного излучения; в соответствии со стандартом ISO 13320-1) предпочтительно составляет от 2 до 50 мкм, более предпочтительно от 5 до 20 мкм, особенно предпочтительно от 8 до 15 мкм. Потери при сушке гидрофобного диоксида кремния (при 105°С в течение 2 ч; определяют в соответствии со стандартом ISO 787-2) предпочтительно составляют не более 10%, особенно предпочтительно не более 6%. Потери при прокаливании гидрофобного диоксида кремния (при 1000°С в течение 2 ч; определяют в соответствии со стандартом ISO 3262-1) предпочтительно составляют не более 10%, особенно предпочтительно не более 6%.
Содержание диоксида кремния в гидрофобном диоксиде кремния предпочтительно составляет не менее 95 мас.%, особенно предпочтительно не менее 97 мас.% (определяют в соответствии со стандартом ISO 3262-19). Содержание углерода в гидрофобном диоксиде кремния предпочтительно составляет не более 3,5%, в частности, от 0,2 до 3,5 мас.%, особенно предпочтительно не более 2%, в частности, от 0,5 до 2 мас.% (определяют в соответствии со стандартом ISO 3262-19). Значение рН гидрофобного диоксида кремния (5% раствор в смеси воды и метанола состава 1:1; определяют в соответствии со стандартом ISO 787-9) предпочтительно составляет от 7 до 10,5, особенно предпочтительно от 7,5 до 9.
Гидрофобным диоксидом кремния (диоксидами кремния), который можно применять в соответствии с настоящим изобретением, является, например, выпускающийся под торговыми названиями Sipernat D 10, Sipernat D13, Sipernat D 15, Sipernat D 17 и Aerosil типов R, RX, RY и NX, предпочтительным является Aerosil R 202 (Evonik Industries, Germany).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофобный диоксид кремния применяют в виде смеси деэмульгаторов, которая кроме гидрофобного диоксида кремния содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. По меньшей мере одно поверхностно-активное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из следующих: неионогенные, анионогенные, цвиттерионные, амфолитические и катионогенные поверхностно-активные вещества. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одним поверхностно-активным веществом предпочтительно является неионогенное поверхностно-активное вещество.
Предпочтительными анионогенными поверхностно-активными веществами являются алкилсульфаты, сульфаты простых алкиловых эфиров полигликоля и простые эфиры карбоновых кислот, содержащие в молекуле в алкильной группе от 10 до 18 атомов С и вплоть до 12 групп простого эфира гликоля, сложные моно- и диалкиловые эфиры сульфоянтарной кислоты, содержащие в алкильной группе от 8 до 18 атомов С, и сложные моноалкилполиоксиэтиловые эфиры сульфоянтарной кислоты, содержащие в алкильной группе от 8 до 18 атомов С и от 1 до 6 оксиэтиленовых групп, моноглицеридсульфаты, фосфаты простых алкиловых и алкениловых эфиров, а также продукты конденсации белка и жирных кислот.
3
Цвиттерионные поверхностно-активные вещества содержат в молекуле по меньшей мере одну четвертичную аммониевую группу и по меньшей мере одну группу -СОО<->- или SO<->. Особенно предпочтительными цвиттерионными эмульгаторами являются так называемые бетаины, такие как N-алкил-N,N-диметиламмонийглицинаты, N-ациламинопропил-N,N-диметиламмонийглицинаты и 2-алкил-3-карбоксиметил-3-гидроксиэтилимидазолины, каждый из которых содержит в алкильной гили ацильной группе от 8 до 18 атомов углерода, а также кокоациламиноэтилгидроксиэтилкарбоксиметилглицинат.
8
30
8
22
Типичными неионогенными поверхностно-активными веществами, применимыми в соответствии с настоящим изобретением, являются линейные или разветвленные жирные кислоты C-С и их соли с Na, K, аммонием, Са, Mg и Zn; алканоламиды жирных кислот; глюкамиды жирных кислот; N-алкилглюкамиды и С-С-алкиламин-N-оксиды.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными неионогенными поверхностно-активными веществами являются алкоксилированные, предпочтительно этоксилированные и/или пропоксилированные, более предпочтительно этоксилированные соединения, а также алкилированные сахара и предпочтительно алкоксилированные алкилированные сахара.
8
22
12
22
8
15
12
22
3
6
8
22
Примерами алкоксилированных соединений являются алкоксилированные жирные спирты, гидроксисахара, жирные кислоты, алкилфенолы, касторовое масло, гидрированное касторовое масло, алканоламиды жирных кислот и амины жирных кислот; в частности, продукты реакции присоединения от 4 до 30 молей этиленоксида и/или от 0 до 5 молей пропиленоксида к линейным жирным спиртам С-С, жирным кислотам С-С и С-С-алкилфенолам; сложные моно- и диэфиры жирных кислот С-С и продуктов присоединения от 1 до 30 молей этиленоксида к С-С-полиолам, в частности, к глицерину, этиленоксиду и полиглицерину; продукты присоединения к сложным эфирам жирных кислот и метилглюкозида, продукты присоединения от 5 до 60 молей этиленоксида к касторовому маслу и гидрированному касторовому маслу, частичные сложные эфиры полиолов, содержащих 3-6 атомов углерода, с жирными кислотами С-С; продукты реакции присоединения от 1 до 30 молей этиленоксида к алканоламидам жирных кислот и аминам жирных кислот.
2
x
Другими примерами алкоксилированных соединений являются алкоксилированные сложные алкиловые эфиры жирных кислот формулы R<1>CO-(OCHCHR<2>)OR<3>, в которой R<1>CO обозначает линейную или разветвленную, насыщенную и/или ненасыщенную ацильную группу, содержащую от 6 до 22 атомов углерода, R<2>обозначает водород или метил, R<3>обозначает линейные или разветвленные алкильные группы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода, и х обозначает числа, равные от 1 до 20.
x
8
22
8
16
Другими примерами неионогенных поверхностно-активных веществ являются моно-, олиго- и полиалкилгликозиды, описывающиеся общей формулой RO-(Z), в которой R обозначает С-С-алкил, предпочтительно С-С-алкил, Z обозначает сахар и х обозначает количество звеньев сахара. В качестве структурного элемента Z можно включать любой моно-, олиго- или полисахарид. Обычно включают сахара, содержащие 5 или 6 атомов углерода, а также соответствующие олигосахариды, например, глюкозу, фруктозу, галактозу, арабинозу, рибозу, ксилозу, ликсозу, аллозу, альтрозу, маннозу, гулозу, идозу, талозу и/или сахарозу. Предпочтительными структурными элементами - сахарами являются глюкоза, фруктоза и сахароза, особенно предпочтительной является глюкоза. Применимые в настоящем изобретении алкилполигликозиды содержат в среднем от 1,1 до 5, предпочтительно от 1,1 до 2,0, особенно предпочтительно от 1,1 до 1,8 звеньев сахара. В соответствии с настоящим изобретением также можно использовать алкоксилированные гомологи указанных алкилполигликозидов. Предпочтительно, если эти гомологи содержат в среднем вплоть до 10 этиленоксидных и/или пропиленоксидных звеньев в одном алкилгликозидном звене.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве неионогенных поверхностно-активных веществ используют сложные эфиры гидроксисахаров с жирными кислотами и/или алкоксилированные производные таких соединений. В этом случае предпочтительными гидроксисахарами являются глицерин, полиглицерин, сорбит, изосорбид и сорбитаны, в частности 1,4-сорбитан. Примерами таких сложных эфиров гидроксисахаров с жирными кислотами являются полиглицерил-2-диполигидроксистеарат и полиглицерил-3-диизостеарат.
12
22
16
18
Особенно предпочтительными примерами таких сложных эфиров гидроксисахаров с жирными кислотами являются сложные эфиры сорбитана, в частности, 1,4-сорбитана, с жирными кислотами С-С, предпочтительно с жирными кислотами C-C, в которых сложноэфирная связь предпочтительно образована с омега-гидроксигруппой сорбитана.
Конкретными примерами являются сорбитанмонолаурат, сорбитанмонопальмитат, сорбитанмоностеарат, сорбитанмоноолеат, сорбитансесквиолеат, сорбитантриолеат и сорбитанизостеарат, причем особенно предпочтительным является сорбитанмоноолеат.Сорбитанмоноолеат имеется в продаже и выпускается под торговым названием Span 80 (Croda, USA).
12
22
16
18
Особенно предпочтительными примерами таких алкоксилированных сложных эфиров гидроксисахаров с жирными кислотами являются сложные эфиры этоксилированного сорбитана, в частности, этоксилированного 1,4-сорбитана, с жирными кислотами С-С, предпочтительно с жирными кислотами С-С, в которых все свободные гидроксигруппы сорбитана предпочтительно содержат от 1 до 5, более предпочтительно от 1 до 3 этоксилатных групп и в которых связь жирной кислоты образована с этоксилированной омега-гидроксигруппой сорбитана. Эти соединения также называются полисорбатами. Конкретными примерами являются ПЭГ-20-сорбитанмонолаурат (ПЭГ = полиэтиленгликоль), ПЭГ-4-сорбитанмонолаурат, ПЭГ-20-сорбитанмонопальмитат, ПЭГ-20-сорбитанмоностеарат, ПЭГ-4-сорбитанмоностеарат, ПЭГ-20-сорбитантристеарат и ПЭГ-20-сорбитанмоноолеат, причем особенно предпочтительным является ПЭГ-20-сорбитанмоноолеат.ПЭГ-20-сорбитанмоноолеат, также известный, как полисорбат 80, имеется в продаже и выпускается под торговым названием Tween 80 (Croda, USA).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в композиции деэмульгаторов используют смесь по меньшей мере двух неионогенных поверхностно-активных веществ. Предпочтительно, если в композиции деэмульгаторов используют смесь неионогенного поверхностно-активного вещества, обладающего низким значением ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс), предпочтительно равным менее 8, особенно предпочтительно от 3 до 6, и неионогенного поверхностно-активного вещества, обладающего высоким значением ГЛБ, предпочтительно равным более 12, особенно предпочтительно от 13 до 17. Предпочтительными примерами такой смеси являются смесь Span 80 и Tween 80 (Croda, USA) или смесь Brij 92 и Brij 98 (Uniqema, USA), (определение ГЛБ приведено в публикации Rompp-Lexikon Chemie (Eds.: J. Falbe, M. Regitz), 10th edition, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, (1997), page 1764).
n
2n
x
Подходящими деэмульгаторами, обладающими значением ГЛБ, равным менее 8, в частности, являются соединения общей формулы R<1>-O-R<2>, в которой R<1>обозначает первичную линейную алкильную, алкенильную или ацильную группу, содержащую от 18 до 30 атомов углерода, такую как бегенильная, эруцильная или арахидильная группа, и R<2>обозначает водород, группу формулы -(CHO)-H, в которой х=1 или 2 и n=2-4, или полигидроксиалкильную группу, содержащую от 4 до 6 атомов углерода и от 2 до 5 гидроксигрупп, такие как пентаэритрит, триметилолпропан, диглицерин или метилглюкоза.
В случае, если в смеси деэмульгаторов гидрофобный диоксид кремния используют в комбинации по меньшей мере с одним поверхностно-активным веществом, то отношение количества гидрофобного диоксида кремния к количеству поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от 1:50 до 50:1. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофобный диоксид кремния содержится в смеси деэмульгаторов в количестве, составляющем от 1 до 50 мас.%, предпочтительно в количестве, составляющем от 2 до 25 мас.%, особенно предпочтительно в количестве, составляющем от 3 до 15 мас.%.
Предпочтительно, если оставшейся частью смеси деэмульгаторов является поверхностно-активное вещество (вещества), однако кроме поверхностно-активных веществ в смесь деэмульгаторов можно включить дополнительные ингредиенты, например, с целью изменения физических характеристик смеси деэмульгаторов.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют смесь деэмульгаторов, которая содержит гидрофобный диоксид кремния в количестве, составляющем от 3 до 15 мас.%, и по меньшей мере одно, предпочтительно два неионогенных поверхностно-активных вещества в количестве, составляющем не менее 85 мас.%, где неионогенное поверхностно-активное вещество (вещества) предпочтительно выбрано из числа сложных эфиров гидроксисахаров и жирных кислот и/или алкоксилированных производных таких соединений, предпочтительно из числа сложных эфиров сорбитана и жирных кислот, предпочтительным является сорбитанмоноолеат, и этоксилированных сложных эфиров сорбитана и жирных кислот, предпочтительным является ПЭГ-20-сорбитанмоноолеат, и их смесей.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофобный диоксид кремния используют в комбинации с маслом, предпочтительно в комбинации с содержащим триглицерид маслом, таким как масло из микроводорослей или растительное масло, где примерами растительных масел являются соевое масло, масло канолы и кукурузное масло. Если гидрофобный диоксид кремния используют в комбинации с маслом, то отношение количества гидрофобного диоксида кремния к количеству масла предпочтительно составляет от 1:50 до 50:1, особенно предпочтительно от 1:1 до 1:20.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофобный диоксид кремния используют в комбинации по меньшей мере с одним неионогенным поверхностно-активным веществом и одновременно в комбинации по меньшей мере с одним маслом, предпочтительно в комбинации по меньшей мере с одним содержащим триглицерид маслом.
Поскольку в соответствии с настоящим изобретением нет необходимости увеличивать или уменьшать значение рН, реакцию предпочтительно проводят при значении рН, примерно соответствующем нейтральной среде, для обеспечения мягких условий и предотвращения омыления липидов. Таким образом, значение рН предпочтительно поддерживают равным от 5 до 9, более предпочтительно от 6 до 8 и особенно предпочтительно от 6,5 до 8,0. В случае ферментативного бульона, для удобства можно использовать ферментативный бульон после завершения ферментации, без проведения какого-либо регулирования значения рН.
При необходимости или при желании значение рН можно регулировать с использованием оснований или кислот.
В соответствии с настоящим изобретением регулирование значения рН обычно можно провести с использованием оснований или кислот, известных специалистам в данной области техники. Уменьшение значения рН можно обеспечить, в частности, путем использования органических или неорганических кислот, таких как серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, борная кислота, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, хлорная кислота, гипохлористая кислота, хлористая кислота, фторсерная кислота, гексафторфосфорная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, муравьиная кислота, или их комбинаций. Поскольку предпочтительно избегать высокого содержания хлорида, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, не используют хлористоводородную кислоту или используют лишь ее небольшие количества. В соответствии с настоящим изобретением серная кислота является предпочтительным веществом для уменьшения значения рН. Увеличение значения рН можно обеспечить, в частности, путем использования органических или неорганических оснований, таких как гидроксиды, в частности, гидроксид натрия, гидроксид лития, гидроксид калия и/или гидроксид кальция, карбонаты, в частности, карбонат натрия, карбонат калия или карбонат магния, и/или бикарбонаты, в частности, бикарбонат лития, бикарбонат натрия и/или бикарбонат калия. Кислоты и основания предпочтительно используют в жидком виде вследствие удобства использования, предпочтительно в виде концентрированных растворов, где концентрация кислоты или основания в растворе предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 55 мас.%, особенно предпочтительно в диапазоне от 20 до 50 мас.%. В частности, серную кислоту предпочтительно также используют в концентрированном виде.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, если после получения суспензии в соответствии со стадией (а) проводят стадию лизиса. Стадию лизиса можно не проводить, если, например, вследствие использующихся условий ферментации клетки или большая часть клеток уже лизированы или легко разрушаются при проведении одной из последующих стадий способа без проведения стадии лизиса в явном виде.
Лизис содержащихся в биомассе клеток в соответствии со стадией (b) можно провести по методикам, известным специалистам в данной области техники, предпочтительно по ферментативной, механической, физической или химической методике или путем использования комбинации этих методик.
В зависимости от продолжительности обработки и/или величины приложенного усилия можно получить композицию, содержащую только лизированные клетки, или композицию, содержащую смесь остатков клеток и интактных клеток. Термин "содержащая лизированные липиды биомасса" означает суспензию, которая содержит воду, остатки клеток и масло, высвобожденное содержащимися в биомассе клетками, однако, кроме того, она может содержать другие компоненты, в частности, соли, интактные клетки, другое содержимое лизированных клеток, а также компоненты ферментативной среды, в частности, питательные вещества. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лизированная биомасса, полученная после стадии лизиса клеток, содержит лишь небольшие количества интактных клеток, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5% (в пересчете на полное количество интактных клеток, содержащихся в биомассе до лизиса клеток).
Лизис клеток можно провести, например, с использованием пресса Френча для клеток, ультразвукового устройства, гомогенизатора, устройства для микропсевдоожижения, шаровой мельницы, стержневой мельницы, галечной мельницы, бисерной мельницы, размалывающих вальцов при высоком давлении, ударной дробилки с вертикальным валом, промышленного смесителя, смесителя с большим сдвиговым усилием, лопастного смесителя и/или гомогенизатора Polytron.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лизис клеток включает ферментативную обработку клеток с помощью разрушающего стенки клеток фермента.
В соответствии с настоящим изобретением разрушающий стенки клеток фермент предпочтительно выбран из числа следующих: протеазы, целлюлазы (например, Cellustar CL (Dyadic), Fibrezyme G2000 (Dyadic), Celluclast (Novozymes), Fungamyl (Novozymes), Viscozyme L (Novozymes)), гемицеллюлазы, хитиназы, пектиназы (например, Pectinex (Novozymes)), сахаразы, мальтазы, лактазы, альфа-глюкозидазы, бета-глюкозидазы, амилазы (например, Alphastar Plus (Dyadic); Termamyl (Novozymes)), лизозимы, нейраминидазы, галактозидазы, альфа-маннозидазы, глюкуронидазы, гиалуронидазы, пуллуланазы, глюкоцереброзидазы, галактозилцерамидазы, ацетилгалактозаминидазы, фукозидазы, гексозаминидазы, идуронидазы, мальтазы-глюкоамилазы, ксиланазы (например, Xylanase Plus (Dyadic), Pentopan (Novozymes)), бета-глюканазы (например, Vinoflow Max (Novozymes), Brewzyme LP (Dyadic)), маннаназы и их комбинации. Протеаза может быть выбрана из числа следующих: серинпротеазы, треонинпротеазы, цистеинпротеазы, аспартатпротеазы, металлопротеазы, протеазы глутаминовой кислоты, алкалазы (субтилизины) и их комбинации. Хитиназой может являться хитотриозидаза. Пектиназа может быть выбрана из числа следующих: пектолиазы, пектозимы, полигалактуроназы и их комбинации.
Значение рН, подходящее для использования фермента, зависит от оптимального значения рН для действия фермента.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют фермент, для действия которого оптимальное значение рН равно от 7,0 до 9,0, предпочтительно равно примерно 7,5, таким образом, значение рН, использующееся при проведении этой стадии, равно от 7,0 до 9,0, предпочтительно от 7,0 до 8,0, более предпочтительно от 7,3 до 7,7. Предпочтительным ферментом, который можно использовать в этом диапазоне значений рН, является алкалаза.
Предпочтительно, если фермент добавляют в виде концентрированного раствора фермента, предпочтительно в количестве, составляющем от 0,01 до 1,5 мас.%, более предпочтительно в количестве, составляющем от 0,03 до 1,0 мас.%, наиболее предпочтительно в количестве, составляющем от 0,05 до 0,5 мас.%, которое означает количество концентрированного раствора фермента, добавленное в пересчете на полное количество суспензии, полученной после добавления концентрированного раствора фермента.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лизис клеток проводят следующим образом:
i) суспензию, полученную на стадии (а), нагревают до температуры, равной от 50 до 70°С, предпочтительно до температуры, равной от 55 до 65°С, и к суспензии добавляют разрушающий стенки клеток фермент, предпочтительно ферментативный бульон, и при необходимости регулируют значение рН до обеспечения подходящего значения, при котором фермент действует надлежащим образом;
ii) температуру и значение рН поддерживают в диапазонах, указанных на стадии (ii), в течение по меньшей мере 1 ч, предпочтительно в течение по меньшей мере 2 ч, более предпочтительно в течение от 2 до 4 ч.
На стадии (i) фермент можно добавить до или после нагревания суспензии и/или до или после регулирования значения рН. Аналогичным образом, нагревание суспензии можно провести до или после регулирования значения рН. Однако в предпочтительном варианте осуществления фермент добавляют после нагревания суспензии и после регулирования значения рН, если вообще необходимо регулирование значения рН. В особенно предпочтительном варианте осуществления все процедуры проводят примерно в одно и то же время.
Предпочтительно, если на стадиях (i) и (ii) суспензию непрерывно перемешивают с использованием перемешивающего устройства и/или встряхивающего устройства.
В соответствии с настоящим изобретением деэмульгирование предпочтительно проводят с использованием суспензии, обладающей содержанием сухого вещества, составляющим от 20 до 60 мас.%, предпочтительно от 25 до 60 мас.%, особенно предпочтительно от 30 до 55 мас.% или от 30 до 45 мас.%. Это можно обеспечить путем получения на стадии (а) суспензии, обладающей соответствующим высоким содержанием биомассы, или путем концентрирования суспензии, предпочтительно после лизиса содержащихся в биомассе клеток. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения после необязательного лизиса содержащихся в биомассе клеток и до проведения стадии деэмульгирования суспензию концентрируют до обеспечения полного содержания сухого вещества, составляющего от 20 до 60 мас.%, более предпочтительно от 25 до 60 мас.%, особенно предпочтительно от 30 до 55 мас.%, наиболее предпочтительно от 30 до 50 мас.% или от 30 до 45 мас.%.
Концентрирование суспензии предпочтительно проводят путем выпаривания воды при температуре, не превышающей 100°С, предпочтительно равной от 70 до 100°С, более предпочтительно от 80 до 90°С, до обеспечения полного содержания сухого вещества, составляющего от 20 до 60 мас.%, более предпочтительно от 25 до 60 мас.%, особенно предпочтительно от 30 до 55 мас.% или от 30 до 45 мас.%.
Концентрирование суспензии предпочтительно проводят в испарителе с принудительной циркуляцией (например, выпускающемся фирмой GEA, Germany) для обеспечения быстрого удаления воды Альтернативно или дополнительно, концентрирование можно провести с помощью испарителя с падающей пленкой, пленочного испарителя и/или роторного испарителя.
Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, в качестве дополнительной стадии включает извлечение содержащего ПНЖК липида из деэмульгированной композиции путем отделения содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соли, остатки клеток и остаточное количество масла водной фазы.
Стадия извлечения содержащего ПНЖК липида в качестве необязательной стадии может включать нейтрализацию деэмульгированной суспензии, если деэмульгирование не проводили при значении рН, соответствующем нейтральной среде.
При необходимости или при желании нейтрализацию деэмульгированной композиции предпочтительно проводят путем добавления кислоты, предпочтительно серной кислоты, или основания, предпочтительно гидроксида натрия, до обеспечения значения рН, равного от 5 до 9, предпочтительно от 5,5 до 8,5, особенно предпочтительно от 6,0 до 8,0 или от 6,5 до 7,5. Перед проведением отделения легкой фазы от водной фазы нейтрализованную композицию можно перемешивать при этом соответствующем нейтральной среде значении рН в течение от нескольких минут до нескольких часов.
Отделение содержащей масло легкой фазы от содержащей воду, соли и остатки клеток тяжелой фазы предпочтительно проводят с помощью механических средств и предпочтительно при температуре, равной 60-90°С, более предпочтительно 70-80°С, и предпочтительно при значении рН, равном 6-9, более предпочтительно 7-8,5. Термин "с помощью механических средств" означает, а частности, методики фильтрования и центрифугирования, известные специалистам в данной области техники.
После отделения содержащей масло легкой фазы полученное таким образом содержащее ПНЖК масло можно дополнительно обработать с использованием методик, известных специалистам в данной области техники, в частности, провести очистку, отбеливание, дезодорирование и/или вымораживание.
Особое преимущество способа, предлагаемого в настоящем изобретении, заключается в том, что его можно осуществить без использования какого-либо органического растворителя, в частности, без использования какого-либо полярного или неполярного органического растворителя. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для выделения содержащего ПНЖК масла из биомассы не используют органические растворители, в частности, полярные или неполярные органические растворители, или используют лишь их небольшие количества. Типичными органическими растворителями являются гексан и этанол.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют менее 2 мас.% неполярных органических растворителей, более предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,1 мас.%. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения совсем не используют неполярный органический растворитель. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения обычно используют менее 2 мас.% органических растворителей, особенно предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,1 мас.%. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для выделения содержащего ПНЖК масла из биомассы совсем не используют органические растворители. В частности, для этого варианта осуществления это означает, что суспензия, использующаяся в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, а также все композиции, полученные на указанных отдельных стадиях способа, предпочтительно не содержат неполярные органические растворители, более предпочтительно содержат органические растворители в целом в количестве, составляющем менее 2 мас.%, более предпочтительно менее 1 мас.%, особенно предпочтительно менее 0,5 или 0,3 мас.%, наиболее предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Другое преимущество способа, предлагаемого в настоящем изобретении, заключается в том, что можно обеспечить чрезвычайно эффективное отделение масла от оставшейся биомассы без добавления хлорида натрия, который обычно используют для высаливания масла из биомассы. Предпочтительно, если способ можно осуществить вообще без добавления хлоридов, наиболее предпочтительно без добавления каких-либо солей для высаливания масла. Однако в суспензии могут содержаться незначительные количества хлоридов, в частности, хлорида натрия, вследствие состава ферментативной среды, использующейся для выращивания биомассы.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для улучшения выделения масла совсем не используют хлорид натрия или используют лишь его небольшие количества. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для выделения масла из биомассы используют менее 1 мас.% хлорида натрия, более предпочтительно, если используют менее 0,5 или 0,2 мас.% хлорида натрия, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%, где выраженное в мас.% количество означает количество в пересчете на полную массу композиции после добавления хлорида натрия. В частности, для этого варианта осуществления это означает, что суспензия, использующаяся в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, а также все композиции, полученные на указанных отдельных стадиях способа, предпочтительно содержат хлорид натрия в количестве, составляющем менее 2 мас.%, более предпочтительно менее 1 мас.%, особенно предпочтительно менее 0,5 или 0,3 мас.%, наиболее предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,1 или 0,05 мас.%.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для улучшения выделения масла совсем не используют хлориды или используют лишь их небольшие количества. В этом варианте осуществления для выделения масла из биомассы предпочтительно используют менее 1 мас.% хлоридов, более предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.% хлоридов, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%, где выраженное в мас.% количество означает количество в пересчете на полную массу композиции после добавления хлоридов. В частности, для этого варианта осуществления это означает, что суспензия, использующаяся в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, а также все композиции, полученные на указанных отдельных стадиях способа, предпочтительно содержат хлорид, в частности, хлориды, в количестве, составляющем менее 2 мас.%, более предпочтительно менее 1 мас.%, особенно предпочтительно менее 0,5 или 0,3 мас.%, наиболее предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,1 или 0,05 мас.%.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для улучшения выделения масла совсем не используют соли или используют лишь их небольшие количества. В этом варианте осуществления для выделения масла из биомассы предпочтительно используют менее 1 мас.% солей, более предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.% солей, наиболее предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%, где выраженное в мас.% количество означает количество в пересчете на полную массу композиции после добавления солей. В частности, для этого варианта осуществления это означает, что суспензия, использующаяся в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, а также все композиции, полученные на указанных отдельных стадиях способа, предпочтительно содержат соли в целом в количестве, составляющем менее 2 мас.%, более предпочтительно менее 1 мас.%, особенно предпочтительно менее 0,5 или 0,3 мас.%, наиболее предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Другое преимущество способа, предлагаемого в настоящем изобретении, заключается в том, что можно обеспечить чрезвычайно эффективное отделение масла от оставшейся биомассы без добавления оснований, таких как гидроксид натрия, который обычно используют для разрушения эмульсии. Предпочтительно, если способ можно осуществить вообще без добавления оснований, чтобы также не требовалась последующая нейтрализация суспензии. Это приводит к получению биомассы, которая содержит лишь сравнительно небольшие количества солей в целом, и поэтому содержат лишь небольшое количество золы. Однако можно добавить небольшие количества оснований, в частности, для регулирования значения рН, например, если значение рН суспензии после ферментации является слишком низким или для облегчения протекания деэмульгирования. Это означает, что в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, не используют основания или используют лишь их небольшие количества. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют менее 4 мас.% оснований, более предпочтительно, если в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, используют менее 2 или 1 мас.% оснований, наиболее предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, где выраженное в мас.% количество означает количество в пересчете на полную массу композиции после добавления основания.
Однако в альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения для облегчения деэмульгирования и увеличения конечного выхода масла можно добавить щелочи, в частности, гидроксид натрия, предпочтительно в небольших количествах.
Поскольку деэмульгирование можно провести без использования оснований, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительно, если во время всей процедуры значение рН можно поддерживать равным менее 9, предпочтительно менее 8,5, 8 или 7,5, это обеспечивает возможность обработки липида при очень мягких условиях и существенно уменьшает степень гидролиза сложных эфиров жирных кислот, содержащихся в липиде. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения во время всей процедуры значение рН поддерживают равным менее 9, предпочтительно в диапазоне от 4,5 до 9, более предпочтительно менее 8,5, 8 или 7,5, особенно предпочтительно в диапазоне от 4,5 до 8,5, от 4,5 до 8 или от 4,5 до 7,5.
Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают чрезвычайно эффективное отделение масла, содержащегося в биомассе, от остатков клеток и других веществ, содержащихся в суспензии, в частности, в ферментативном бульоне. С помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, из биомассы предпочтительно можно выделить и отделить с использованием весьма экономичных и рациональных условий более 80 мас.%, особенно предпочтительно более 90 мас.% масла, содержащегося в биомассе.
Выход выделенного масла предпочтительно определяют путем анализа количества метилового эфира жирной кислоты (МЭЖК). Для этого содержащиеся липиды сначала омыляют с помощью КОН. Затем свободные жирные кислоты метилируют с помощью МеОН. Затем можно определить количество метилированных жирных кислот с помощью газовой хроматографии с использованием внутреннего стандарта.
Кроме того, согласно изобретению установлено, что масло, полученное с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, обладает некоторыми характеристиками, превосходящими характеристики содержащих ПНЖК масел, раскрытых до настоящего времени в данной области техники. В частности, оно обладает чрезвычайно низкими показателями окисляемости и чрезвычайно низким содержанием свободных жирных кислот. Кроме того, вследствие способа получения масло содержит определенное количество гидрофобного диоксида кремния.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является масло, полученное или получаемое способом, предлагаемым в настоящем изобретении.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является масло, предпочтительно содержащее ПНЖК масло, содержащее гидрофобный диоксид кремния в количестве, составляющем от 5 част./млн (мас./мас.) до 10 мас.%, предпочтительно от 10 част./млн (мас./мас.) до 5 мас.%, особенно предпочтительно от 0,01 до 4 мас.%, от 0,1 до 3 мас.% или от 0,5 до 2,5 мас.%.
В особенно предпочтительном варианте осуществления для разрушения эмульсии используют лишь небольшие количества гидрофобного диоксида кремния, таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является содержащее ПНЖК масло, содержащее гидрофобный диоксид кремния в количестве, составляющем от 5 до 200 част./млн (мас./мас.), предпочтительно от 10 до 150 част./млн (мас./мас.), более предпочтительно от 20 до 100 част./млн (мас./мас.), особенно предпочтительно от 20 до 80 част./млн (мас./мас.).
Масло, предлагаемое в настоящем изобретении, предпочтительно содержит ПНЖК в количестве, составляющем не менее 10 мас.%, предпочтительно не менее 20 мас.%, особенно предпочтительно от 25 до 70 мас.%, от 30 до 65 мас.% или от 45 до 60 мас.%.
Масло, предлагаемое в настоящем изобретении, предпочтительно содержит свободные жирные кислоты (СЖК) в количестве, составляющем менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,8 мас.%, более предпочтительно менее 0,5 мас.%. Свободные жирные кислоты являются нежелательными побочными продуктами, получаемыми при выделении содержащих ТАГ (триацилглицерины) липидов, наличие которых предпочтительно избегать.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является масло, предпочтительно содержащее ПНЖК масло, которое содержит сложные эфиры жирных кислот, предпочтительно ТАГ, в количестве, составляющем не менее 50 мас.%, предпочтительно не менее 70 или 80 мас.%, особенно предпочтительно в количестве, составляющем не менее 85 или 90 мас.%, отличающееся тем, что оно содержит свободные жирные кислоты (СЖК) в количестве, составляющем менее 0,6 мас.%, предпочтительно в количестве, составляющем менее 1 мас.%, особенно предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,8 мас.%, более предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,5 мас.%.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является содержащее ПНЖК масло, обладающее следующими характеристиками: а) количество гидрофобного диоксида кремния составляет от 5 част./млн до 10 мас.%, предпочтительно от 10 част./млн до 5 мас.%, особенно предпочтительно от 0,01 до 4 мас.%, от 0,1 до 3 мас.% или от 0,5 до 2,5 мас.%; b) содержание свободных жирных кислот предпочтительно составляет менее 1 мас.%, более предпочтительно менее 0,8 мас.%, особенно предпочтительно менее 0,5 мас.%; с) пероксидное число предпочтительно равно менее 0,5, более предпочтительно менее 0,3, особенно предпочтительно менее 0,15; d) анизидиновое число предпочтительно равно менее 15, более предпочтительно менее 10; е) содержание влаги и примесей предпочтительно составляет менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 мас.%; f) вязкость предпочтительно равна менее 250 сП, более предпочтительно менее 200 сП, особенно предпочтительно менее 160 сП; g) температура вспышки предпочтительно равна не ниже 350°С, более предпочтительно не ниже 400°С, особенно предпочтительно не ниже 450°С; h) содержание омега-3-жирных кислот, предпочтительно ДГК (докозагексаеновая кислота) и ЭПК (эйкозапентаеновая кислота), предпочтительно составляет не менее 35 мас.%, более предпочтительно не менее 40 или 45 мас.%, наиболее предпочтительно не менее 50 мас.%; i) количество каждой из ДГК и ЭПК предпочтительно составляет не менее 8 мас.%, предпочтительно не менее 10 мас.%, наиболее предпочтительно не менее 15 мас.%; j) содержание триацилглицеридов предпочтительно составляет не менее 50 мас.%, особенно предпочтительно не менее 70 или 80 мас.%, более предпочтительно не менее 90 мас.%; к) количество органических растворителей предпочтительно составляет менее 0,5 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 мас.%, особенно предпочтительно менее 0,05 мас.%, наиболее предпочтительно менее 0,01 мас.%; l) количество хлоридов предпочтительно составляет менее 0,1 мас.%, более предпочтительно менее 0,05 мас.%, особенно предпочтительно менее 0,01 мас.%; m) содержание неочищенного жира предпочтительно составляет более 90 мас.%.
Анизидиновое число (АЧ) определяют в соответствии с официальной методикой AOCS (Американское общество нефтяных химиков) Cd 18-90. АЧ является мерой количества продуктов вторичной реакции жирных кислот, которая протекает при окислении масла, таких как альдегиды и кетоны.
Пероксидное число (ПЧ) определяют в соответствии с официальной методикой AOCS CD 8-53. ПЧ является мерой количества продуктов первичной реакции, которая протекает при окислении масла, таких как пероксид и гидропероксиды. В соответствии с настоящим изобретением ПЧ измеряют в мэкв./кг.
Содержание свободных жирных кислот определяют в соответствии с официальной методикой AOCS, AOCS Са 5а-40. Содержание влаги определяют в соответствии с официальными методиками AOCS, АОАС (Ассоциация официальных агрохимиков) 930.15, 935.29. Содержание нерастворимых примесей определяют в соответствии с официальной методикой AOCS, AOCS 3а-46. Количество ДГК и ЭПК определяют в соответствии с официальной методикой AOCS, AOCS Се-1b-89. Полное количество жира определяют в соответствии с официальной методикой AOCS, AOCS 996.06. Количество неочищенного жира определяют в соответствии с официальными методиками AOCS, АОАС 920.39, 954.02.
Поскольку выделение масла проводят без использования растворителей или с использованием лишь их небольших количеств, а также без использования хлорида натрия или с использованием лишь его небольшого количества, водная фаза, полученная в качестве побочного продукта, предпочтительно также в основном не содержит органические растворители и хлорид натрия. Таким образом, водную фазу можно использовать различным образом, сразу после отделения масляной фазы или после дополнительной обработки, такой как концентрирование и/или сушка.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, водная суспензия, содержащая биомассу, предпочтительно делипидизированную биомассу, полученная или получаемая способом, предлагаемым в настоящем изобретении. Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является концентрат или высушенный продукт, полученный или получаемый путем концентрирования и/или сушки этой водной суспензии. Если водную суспензию концентрируют, то предпочтительно, если ее сушат до обеспечения полного содержания сухого вещества (ПССВ), составляющего от 20 до 60 мас.%. В приведенном ниже описании выражение "водная суспензия, предлагаемая в настоящем изобретении" означает водную фазу, полученную после отделения масляной фазы, а также любые концентрированные суспензии этой водной фазы, полученные путем концентрирования этой водной фазы. Сушку предпочтительно проводят путем выпаривания растворителя, как это дополнительно описано ниже.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, водная суспензия, содержащая биомассу, предпочтительно остатки клеток делипидизированной биомассы, характеризующаяся содержанием солей, составляющим менее 15 мас.%, предпочтительно от 4 до 12 мас.%, особенно предпочтительно от 6 до 10 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием неполярных органических растворителей, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%, наиболее предпочтительно менее 0,01 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием хлорид-ионов, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения, в частности, также является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, водная суспензия, содержащая биомассу, предпочтительно остатки клеток делипидизированной биомассы, характеризующаяся содержанием солей, составляющим менее 15 мас.%, предпочтительно от 4 до 12 мас.%, особенно предпочтительно от 6 до 10 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием органических растворителей, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%, наиболее предпочтительно менее 0,01 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием хлорид-ионов, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Поэтому предпочтительным объектом настоящего изобретения также является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, водная суспензия, содержащая биомассу траустохитридиевых, предпочтительно остатки клеток делипидизированной биомассы траустохитридиевых, характеризующаяся содержанием солей, составляющим менее 15 мас.%, предпочтительно от 4 до 12 мас.%, особенно предпочтительно от 6 до 10 мас.%, и предпочтительно характеризующаяся содержанием неполярных органических растворителей, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%, наиболее предпочтительно менее 0,01 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием хлорид-ионов, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Поэтому особенно предпочтительным объектом настоящего изобретения также является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, водная суспензия, содержащая биомассу траустохитридиевых, предпочтительно остатки клеток делипидизированной биомассы траустохитридиевых, характеризующаяся содержанием солей, составляющим менее 15 мас.%, предпочтительно от 4 до 12 мас.%, особенно предпочтительно от 6 до 10 мас.%, и предпочтительно характеризующаяся содержанием органических растворителей, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%, наиболее предпочтительно менее 0,01 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием хлорид-ионов, составляющим менее 1 мас.%, предпочтительно менее 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Водные суспензии, предлагаемые в настоящем изобретении, описанные выше, предпочтительно обладают полным содержанием сухого вещества (ПССВ), составляющим от 20 до 60 мас.%, особенно предпочтительно от 25 до 55 мас.%, более предпочтительно от 30 до 50 мас.%, установлено, что сами концентрированные суспензии являются особенно подходящими для применения в контексте настоящего изобретения, как это описано ниже.
Водные суспензии, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать в качестве продукта для разных целей, как это дополнительно раскрыто ниже. Альтернативно, водную суспензию также можно дополнительно обработать для увеличения общего выхода масла. Дополнительную обработку и выделение дополнительного количества масла можно провести с использованием гидроксида натрия.
В соответствии с настоящим изобретением термин "хлорид" означает обнаруживаемое количество хлора. Количество содержащегося хлора можно определить, например, путем элементного анализа в соответствии со стандартом DIN EN ISO 11885. Хлор содержится в форме солей, которые называются "хлоридами". Содержание хлорида, указанное в настоящем изобретении, также называющееся содержанием "хлорид-ионов" означает только обнаруживаемое количество хлора, а не количество всей соли-хлорида, которая кроме хлорид-иона также содержит катионный противоион.
Предпочтительно, если полное содержание сухого вещества (ПССВ) определяют с помощью гравиметрического анализа. Для этого образец однородной суспензии, обладающий определенным объемом, взвешивают до и после сушки вымораживанием. Масса оставшегося высушенного образца соответствует полному количеству сухого вещества, содержащегося в этой обладающей определенным объемом суспензии.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения содержащую воду, соли, остаточное количество масла и остатки клеток водную фазу, которую получают в качестве побочного продукта на стадии извлечения масла, описанной выше, превращают в высушенную биомассу путем сушки биомассы до обеспечения полного содержания сухого вещества, составляющего более 90 мас.%.
Вследствие способа получения биомасса содержит чрезвычайно небольшое количество солей, предпочтительно золы, составляющее менее 30 мас.%, особенно предпочтительно от 15 до 20 мас.%.
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения также является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, биомасса, предпочтительно делипидизированная биомасса, характеризующаяся содержанием золы, предпочтительно, солей, составляющим менее 30 мас.%, предпочтительно от 8 до 30 мас.%, более предпочтительно от 12 до 20 мас.%, особенно предпочтительно от 15 до 20 мас.%.
Биомасса, предпочтительно делипидизированная биомасса, предлагаемая в настоящем изобретении, предпочтительно характеризуется содержанием неполярных органических растворителей, составляющим менее 2 мас.%, предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1, 0,05 или 0,02 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризуется содержанием хлорид-ионов, составляющим менее 2 мас.%, предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Таким образом, предпочтительным объектом настоящего изобретения также является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, биомасса траустохитридиевых, предпочтительно делипидизированная биомасса траустохитридиевых, характеризующаяся содержанием золы, предпочтительно солей, составляющим менее 30 мас.%, предпочтительно от 8 до 30 мас.%, более предпочтительно от 12 до 20 мас.%, особенно предпочтительно от 15 до 20 мас.%, и предпочтительно содержанием неполярных органических растворителей, составляющим менее 2 мас.%, предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1, 0,05 или 0,02 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием хлорид-ионов, составляющим менее 2 мас.%, предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Таким образом, особенно предпочтительным объектом настоящего изобретения также является содержащая липиды, предпочтительно ПНЖК, биомасса траустохитридиевых, предпочтительно делипидизированная биомасса траустохитридиевых, характеризующаяся содержанием золы, предпочтительно солей, составляющим менее 30 мас.%, предпочтительно от 8 до 30 мас.%, более предпочтительно от 12 до 20 мас.%, особенно предпочтительно от 15 до 20 мас.%, и предпочтительно содержанием органических растворителей, составляющим менее 2 мас.%, предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1, 0,05 или 0,02 мас.%, и предпочтительно дополнительно характеризующаяся содержанием хлорид-ионов, составляющим менее 2 мас.%, предпочтительно менее 1, 0,5 или 0,2 мас.%, более предпочтительно менее 0,1 или 0,05 мас.%.
Поскольку получение предпочтительно проводят без использования неполярных органических растворителей, предпочтительно совсем без использования каких-либо органических растворителей, и без использования хлорида натрия, предпочтительно совсем без использования хлоридов, полученная биомасса предпочтительно не содержит каких-либо неполярных органических растворителей, предпочтительно не содержит каких-либо органических растворителей в целом, и, кроме того, в основном не содержит каких-либо хлорид-ионов, где термин "в основном не содержит" означает, что она содержит хлорид-ионы в количестве, составляющем менее 0,1 мас.%, особенно предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,05 мас.%.
Биомасса, предлагаемая в настоящем изобретении, обладает содержанием влаги, предпочтительно составляющим не более 10 мас.%, более предпочтительно не более 5 мас.%.
Полученная таким образом биомасса содержит липиды (неочищенный жир) в количестве, предпочтительно составляющем примерно от 3 до 14 мас.%, особенно предпочтительно от примерно 4 до примерно 14 мас.%, предпочтительно в количестве, составляющем от примерно 4,5 до примерно 12 мас.%, более предпочтительно в количестве, составляющем от примерно 5 до примерно 10 мас.%. Кроме того, липид предпочтительно содержит по меньшей мере одну ПНЖК, выбранную из группы, включающей ДГК и ЭПК, более предпочтительно смесь ДГК и ЭПК, где отношение количества ДГК к количеству ЭПК предпочтительно составляет от 3:2 до 4:1 и где количество ДГК предпочтительно составляет от 30 до 50 мас.% в пересчете на полное количество содержащихся липидов, и где количество ЭПК предпочтительно составляет от 10 до 20 мас.%. в пересчете на полное количество содержащихся липидов. В соответствии с этим, описанные выше водные суспензии также предпочтительно отличаются тем, что путем сушки их можно превратить в биомассу, обладающую таким содержанием жира и/или содержанием ЭПК, и/или содержанием ДГК, это осуществляют путем сушки водной суспензии до обеспечения содержания влаги, составляющего не более 10 мас.%, предпочтительно не более 5 мас.%.
Предпочтительно, если биомасса дополнительно содержит белки и/или аминокислоты в количестве, составляющем от 15 до 25 мас.%, более предпочтительно в количестве, составляющем от 17 до 23 мас.%, и предпочтительно обладает содержанием неочищенного белка, составляющим от 25 до 35 мас.%. Поскольку деэмульгирование проводят при мягких условиях, отношение массы свободных аминокислот к суммарной массе белков и пептидов предпочтительно составляет менее 9:1, более предпочтительно менее 5:1, особенно предпочтительно менее 1:1. Соответственно, водные суспензии, описанные выше, также предпочтительно отличаются тем, что путем сушки их можно превратить в биомассу, обладающую таким содержанием аминокислоты и/или неочищенного белка, и/или отношением количества свободных аминокислот к суммарной массе белков и пептидов, это осуществляют путем сушки водной суспензии до обеспечения содержания влаги, составляющего не более 10 мас.%, предпочтительно не более 5 мас.%.
Предпочтительно, если биомасса дополнительно обладает содержанием неочищенного волокна, составляющим менее 5 мас.%, предпочтительно менее 2 мас.%, более предпочтительно примерно 0 мас.%. Соответственно, водные суспензии, описанные выше, также предпочтительно отличаются тем, что путем сушки их можно превратить в биомассу, обладающую таким содержанием неочищенного волокна, это осуществляют путем сушки водной суспензии до обеспечения содержания влаги, составляющего не более 10 мас.%, предпочтительно не более 5 мас.%.
Высушенная биомасса предпочтительно представляет собой делипидизированную биомассу, это означает биомассу, из которой удалили большую часть липидов, предпочтительно способом, предлагаемым в настоящем изобретении. Поскольку отделение масла от биомассы является чрезвычайно эффективным, количество масла, оставшегося в биомассе, предпочтительно составляет менее 20 мас.%, более предпочтительно менее 15 мас.%, более предпочтительно менее 10 мас.% в пересчете на количество масла, первоначально содержащегося в биомассе. Однако, поскольку таким способом масло невозможно удалить полностью, в соответствии с настоящим изобретением существенное количество масла все еще содержится также в делипидизированной биомассе. Это означает, что в соответствии с настоящим изобретением термин "делипидизированная биомасса" означает лизированную биомассу, из которой удалили большую часть масла, предпочтительно способом, предлагаемым в настоящем изобретении, но которая все еще содержит существенное количество липидов, предпочтительно содержащих ПНЖК липидов, где количество липидов, содержащихся в высушенной делипидизированной биомассе предпочтительно составляет 3-14 мас.%, особенно предпочтительно 4-14 мас.%, более предпочтительно 4,5-12 мас.%, более предпочтительно 5-10 мас.%. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением термин "делипидизированная биомасса" также может означать "частично делипидизированную биомассу" или "в основном делипидизированную биомассу".
Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ получения биомассы, которая обладает низким содержанием солей, в основном не содержит неполярные органические растворители, предпочтительно не содержит органические растворители в целом, и которая дополнительно в основном не содержит хлорид натрия, предпочтительно не содержит хлориды в целом, включающий стадии способа, описанные выше.
Превращение содержащей воду, соли, остаточное количество масла и остатки клеток тяжелой фазы, которую получают в качестве побочного продукта на стадии извлечения масла, в высушенную биомассу путем сушки биомассы до обеспечения полного содержания сухого вещества, составляющего более 90 мас.%, можно провести разными путями.
В особенно предпочтительной методике превращение проводят путем концентрирования тяжелой фазы до обеспечения содержания сухого вещества, составляющего 30-50 мас.%, предпочтительно 35-45 мас.%, и последующего распылительного гранулирования биомассы, проводимого путем гранулирования в псевдоожиженном слое. Так, чрезвычайно эффективным образом можно получить биомассу, обладающую благоприятными характеристиками. Распылительное гранулирование, проводимое путем гранулирования в псевдоожиженном слое, более подробно описано в ЕР 13176661.0.
Концентрирование тяжелой фазы до обеспечения содержания сухого вещества, составляющего 30-50 мас.%, предпочтительно проводят путем выпаривания растворителя, предпочтительно путем выпаривания в вакууме, и/или с помощью роторного испарителя, пленочного испарителя или испарителя с падающей пленкой. Подходящей альтернативой выпариванию растворителя является обратный осмос.
В качестве альтернативы распылительному гранулированию можно использовать другие подходящие альтернативные методики сушки концентрированной тяжелой фазы, предпочтительно другие методики конвективной сушки, такие как туннельная сушка или распылительная сушка, предпочтительной является распылительная сушка с использованием сопла, или методики контактной сушки, такие как сушка в барабанной сушилке, или методики радиационной сушки, такие как сушка инфракрасным излучением, где при использовании этих методик обычно получают частицы, обладающие меньшим или большим диаметром.
В соответствии с настоящим изобретением во время проведения процедуры сушки для предотвращения слеживания к биомассе необязательно можно добавить агент, препятствующий слеживанию, предпочтительно диоксид кремния, более предпочтительно гидрофобный или гидрофильный диоксид кремния. Для этого суспензию, предпочтительно ферментативный бульон, содержащий биомассу, а также диоксид кремния, предпочтительно распыляют в определенную зону сушки. Альтернативно или дополнительно, биомассу можно смешать с агентом, препятствующим слеживанию, после проведения сушки. Описание использования диоксида кремния в качестве агента, препятствующего слеживанию, приведено, в частности в заявке на патент ЕР 13187631.0.
Превращение мелкозернистого порошка в крупнозернистый не содержащий пыли продукт можно провести по методикам гранулирования. При проведении этой последующей процедуры гранулирования необязательно можно использовать обычные органические или неорганические вспомогательные вещества или носители, такие как крахмал, желатин, производные целлюлозы или аналогичные вещества, которые обычно используют в пищевой промышленности или кормовой промышленности в качестве связующих агентов, гелеобразующих агентов или загустителей. Другие вспомогательные вещества, которые предпочтительно используют в соответствии с настоящим изобретением, раскрыты в WO 2016/050560, причем карбоксиметилцеллюлоза является особенно предпочтительным связующим агентом.
После сушки и необязательно гранулирования и/или просеивания биомассы высушенную биомассу предпочтительно хранят или упаковывают.
Измельченную биомассу, предлагаемую в настоящем изобретении, а также водные суспензии, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для разных целей. Так, например, их можно применять для получения пищевого продукта или кормового продукта. Альтернативно их можно применять непосредственно в качестве пищевого продукта или кормового продукта.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения является также является способ получения кормового продукта или пищевого продукта, в котором применяют измельченную биомассу и/или водную суспензию, предлагаемую в настоящем изобретении, и ее предпочтительно смешивают с дополнительными ингредиентами кормового продукта или пищевого продукта.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения измельченную биомассу и/или водную суспензию применяют для получения пищевого продукта или кормового продукта, где биомассу и/или водную суспензию предпочтительно смешивают с другими ингредиентами пищевого продукта или кормового продукта и затем обрабатывают и получают пищевой продукт или кормовой продукт.
В предпочтительном варианте осуществления смесь биомассы и/или водной суспензии и других ингредиентов пищевого продукта или кормового продукта обрабатывают по методике экструзии, чтобы получить порции пищевого продукта или кормового продукта, готовые для продажи. Альтернативно, также можно использовать методику пеллетирования.
В методике экструзии предпочтительно используют шнековый или двухшнековый экструдер. Экструзию предпочтительно проводят при температуре, равной 80-220°С, предпочтительно равной 100-190°С, при давлении, равном 10-40 бар, и при скорости вращения вала, равной 100-1000 об/мин, предпочтительно равной 300-700 об/мин. Время пребывания загруженной смеси предпочтительно составляет 5-30 с, особенно предпочтительно 10-20 с.
При проведении процедуры экструзии, которая является предпочтительной в соответствии с настоящим изобретением, процедура включает стадию уплотнения и стадию прессования.
Перед проведением процедуры экструзии предпочтительно тщательно смешивать компоненты друг с другом. Это предпочтительно осуществляют в барабане, снабженном лопастями. В предпочтительном варианте осуществления эта стадия смешивания включает введение пара, предпочтительно таким образом, чтобы обеспечить набухание крахмала, который предпочтительно содержится.
Предпочтительно, если дополнительные ингредиенты пищевого продукта или кормового продукта при необходимости измельчают до их смешивания с биомассой и/или водной суспензией для обеспечения получения однородной смеси на стадии смешивания. Измельчение дополнительных ингредиентов пищевого продукта или кормового продукта можно провести, например, с использованием молотковой мельницы.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения является способ кормления животных, в котором измельченную биомассу и/или водную суспензию, предлагаемую в настоящем изобретении, дают животным, предпочтительно после смешивания измельченной биомассы и/или водной суспензии с дополнительными ингредиентами кормового продукта, где животные предпочтительно выбраны из числа следующих: домашняя птица, свиньи, норки, жвачные животные, предпочтительно телята и мясной скот, овцы, козы, домашние животные или животные, использующиеся в аквакультуре.
Альтернативно биомассу и/или водную суспензию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять для внесения в почву, предпочтительно в качестве (органического) удобрения, источника АФК (источник азота/фосфора/калия), средства, улучшающего качество почвы, усилителя роста растений и/или средства, способствующего компостированию, для получения биогаза, для обработки сточных вод или в качестве альтернативного топлива, предпочтительно для цементных печей. Кроме того ее можно применять в качестве части ферментативной среды для получения микроорганизмов, предпочтительно для получения другой содержащей ПНЖК биомассы.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения является способ улучшения качества почвы, в котором измельченную биомассу и/или водную суспензию, предлагаемую в настоящем изобретении, разбрызгивают на почву и, возможно, смешивают с почвой, предпочтительно с обрабатываемой почвой или садовой почвой.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является способ удобрения и/или компостирования почвы, предпочтительно обрабатываемой или садовой почвы, в котором измельченную биомассу и/или водную суспензию, предлагаемую в настоящем изобретении, разбрызгивают на почву и, возможно, смешивают с почвой, предпочтительно с обрабатываемой почвой или садовой почвой.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является способ получения биогаза, в котором измельченную биомассу и/или водную суспензию, предлагаемую в настоящем изобретении, подвергают микробиологическому разложению при анаэробных условиях, предпочтительно с использованием метанобразующих бактерий.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является способ обработки сточных вод, в котором сточные воды смешивают с измельченной биомассой и/или водной суспензией, предлагаемой в настоящем изобретении.
Поэтому другим объектом настоящего изобретения также является способ получения микроорганизмов, предпочтительно предназначенных для получения содержащей ПНЖК биомассы, в котором измельченную биомассу и/или водную суспензию, предлагаемую в настоящем изобретении, используют в виде части ферментативной среды.
Содержащие липиды клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, в среднем содержат не менее 10 мас.% липидов, предпочтительно не менее 20 или 30, более предпочтительно не менее 40 или 50 мас.% липидов.
Предпочтительно, если содержащие липиды клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, дополнительно содержат полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК).
Содержащими липиды, предпочтительно ПНЖК, клетками, содержащимися в биомассе, предпочтительно являются клетки микроорганизмов или клетки растений. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки способны продуцировать ПНЖК благодаря поликетидсинтазной системе. Поликетидсинтазная система может являться эндогенной системой или, вследствие получения с помощью генной инженерии, экзогенной системой.
Соответственно, при использовании в настоящем изобретении термин "делипидизированная биомасса" предпочтительно означает биомассу, содержащую остатки таких содержащих ПНЖК клеток, предпочтительно дополнительно описанную ниже, полученную после проведения способа выделения из масла, предпочтительно дополнительно описанного выше.
Клетки растений могут быть выбраны, в частности, из числа клеток растений семейств Brassicaceae, Elaeagnaceae и Fabaceae. Клетки растений семейства Brassicaceae могут быть выбраны из числа клеток растений рода Brassica, в частности, масличного рапса, репы масличной и горчицы индийской; клетки растений семейства Elaeagnaceae могут быть выбраны из числа клеток растений рода Elaeagnus, в частности, видов Oleae europaea; клетки растений семейства Fabaceae могут быть выбраны из числа клеток растений рода Glycine, в частности, видов Glycine max.
Микроорганизмы, которые включают содержащие ПНЖК липиды, подробно описаны в предшествующем уровне техники. В этом контексте использующимися клетками могут являться, в частности, клетки, которые уже по своей природе продуцируют ПНЖК (полиненасыщенные жирные кислоты); однако ими также могут являться клетки, которые в результате использования подходящих методик генной инженерии или вследствие случайного мутагенеза обладают улучшенным продуцированием ПНЖК, или которым придана способность продуцирования ПНЖК. Продуцирование ПНЖК может являться ауксотрофным, миксотрофным или гетеротрофным.
Предпочтительно, если биомасса содержат клетки, которые продуцируют ПНЖК гетеротрофно. Предпочтительно, если клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, выбраны из числа клеток водорослей, грибов, предпочтительно дрожжевых грибков, бактерий или протистов. Более предпочтительно, если клетками являются клетки микроводорослей или грибов.
Подходящими клетками продуцирующих масло дрожжевых грибков являются, в частности, клетки дрожжевых грибков штаммов Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon и Lipomyces.
Подходящими клетками продуцирующих масло микроводорослей и подобных водорослям микроорганизмов являются, в частности, клетки микроорганизмов, относящихся к типу Stramenopiles (также называющиеся Heterokonta). Микроорганизмы типа Stramenopiles, в частности, могут быть выбраны из микроорганизмов следующих групп: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Develop ay ell a, Diplophrys, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Par males, Diatoms, Xanthophytes, Phaeophytes (бурые водоросли), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (включая Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales и Chromulinales.
Другие предпочтительные группы микроводорослей включают представители зеленых водорослей и динофлагеллатов, включая представители рода Crypthecodiurn.
Предпочтительно, если биомасса, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит клетки и более предпочтительно, если она в основном состоит из таких клеток, как клетки микроорганизмов класса Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, сетчатые слизистые грибы, слизистые сетки), предпочтительно клетки микроорганизмов семейства Thraustochytriaceae. Семейство Thraustochytriaceae (Thraustochytrids) включает рода. Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium и Ulkenia. Особенно предпочтительно, если биомасса содержит клетки микроорганизмов родов Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium или Thraustochytrium, наиболее предпочтительно рода Schizochytrium.
В соответствии с настоящим изобретением полиненасыщенной жирной кислотой (ПНЖК) предпочтительно является высоконенасыщенная жирная кислота (ВНЖК).
Клетки, содержащиеся в биомассе, предпочтительно отличаются тем, что они содержат не менее 20 мас.%, предпочтительно не менее 30 мас.%, особенно предпочтительно не менее 35 мас.% ПНЖК, в каждом случае в пересчете на массу сухих клеток.
В соответствии с настоящим изобретением термин "липид" включает фосфолипиды; свободные жирные кислоты; сложные эфиры жирных кислот; триацилглицериды; стерины и сложные эфиры стерина; каротиноиды; ксантофиллы (например, оксикаротеноиды); углеводороды; образованные из изопреноидов соединения и другие липиды, известные специалисту с общей подготовкой в данной области техники. Термины "липид" и "масло" используют в настоящем изобретении взаимозаменяемым образом.
В предпочтительном варианте осуществления более значительная часть липидов при этом находится в форме триглицеридов, причем предпочтительно, если не менее 50 мас.%, особенно предпочтительно не менее 75 мас.% и в особенно предпочтительном варианте осуществления не менее 90 мас.% содержащихся в клетках липидов находятся в форме триглицеридов.
В соответствии с настоящим изобретением полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) означают жирные кислоты, содержащие не менее двух, предпочтительно не менее трех двойных связей С-С. В соответствии с настоящим изобретением из числа ПНЖК предпочтительными являются высоконасыщенные жирные кислоты (ВНЖК). В соответствии с настоящим изобретением ВНЖК означают жирные кислоты, содержащие не менее четырех двойных связей С-С.
ПНЖК могут содержаться в клетке в свободной форме или в связанной форме. Примерами содержащихся в связанной форме ПНЖК являются фосфолипиды и сложные эфиры ПНЖК, в частности, моноацил-, диацил- и триацилглицериды. В предпочтительном варианте осуществления более значительная часть ПНЖК находится в форме триглицеридов, при этом предпочтительно, если не менее 50 мас.%, особенно предпочтительно не менее 75 мас.% и в особенно предпочтительном варианте осуществления не менее 90 мас.% содержащихся в клетках ПНЖК находятся в форме триглицеридов.
Предпочтительными ПНЖК являются омега-3-жирные кислоты омега-6-жирные кислоты, причем особенно предпочтительными являются омега-3-жирные кислоты. В контексте настоящего изобретения предпочтительными омега-3-жирными кислотами являются эйкозапентаеновая кислота (ЭПК, 20:5ω-3), предпочтительно (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)-эйкоза-5,8,11,14,17-пентаеновая кислота, и докозагексаеновая кислота (ДГК, 22:6ω-3), предпочтительно (4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)-докоза-4,7,10,13,16,19-гексаеновая кислота.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют клетки, предпочтительно микроорганизмов штамма Schizochytrium, которые одновременно продуцируют существенное количество ЭПК и ДГК, где ДГК предпочтительно получают в количестве, составляющем не менее 20 мас.%, более предпочтительно в количестве, составляющем не менее 30 мас.%, особенно предпочтительно в количестве, составляющем от 30 до 50 мас.%, и ЭПК получают в количестве, составляющем не менее 5 мас.%, предпочтительно в количестве, составляющем не менее 10 мас.%, особенно предпочтительно в количестве, составляющем от 10 до 20 мас.% (в пересчете на полное количество липида, содержащегося в клетках, соответственно). Клетки микроорганизмов штаммов Schizochytrium, продуцирующие ДГК и ЭПК можно получить путем последовательного мутагенеза с последующим отбором подходящих мутантных штаммов, которые превосходно продуцируют ЭПК и ДГК и обеспечивают конкретное соотношение ЭПК:ДГК. В качестве мутагена можно использовать любое химическое или нехимическое (например, ультрафиолетовое (УФ) излучение) средство, способное вызвать генетическое изменение в дрожжевых клетках. Эти средства можно использовать по отдельности или в комбинации друг с другом и химические реагенты можно использовать в неразбавленном виде или с растворителем.
Предпочтительные виды микроорганизмов рода Schizochytrium, которые одновременно продуцируют существенные количества ЭПК и ДГК, указанные выше, обладают идентификационными номерами АТСС (Американская коллекция типовых культур): РТА-10208, РТА-10209, РТА-10210 или РТА-10211, РТА-10212, РТА-10213, РТА-10214, РТА-10215.
Предпочтительно, если суспензия биомассы, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой ферментативный бульон. Суспензия, предпочтительно ферментативный бульон, предпочтительно обладает плотностью биомассы, равной не менее 80 или 100 г/л, особенно предпочтительно равной от 80 или 100 г/л до 250 г/л, более предпочтительно равной не менее 120 или 140 г/л, особенно предпочтительно равной от 120 или 140 г/л до 220 г/л, более предпочтительно равной не менее 160 или 180 г/л, особенно предпочтительно равной от 160 до 200 г/л (в пересчете на содержание сухого вещества). Таким образом, суспензию можно получить путем культивирования и выращивания подходящих клеток в ферментативной среде при условиях, при которых микроорганизмы продуцируют ПНЖК.
Методики получения биомассы, в частности, биомассы, которая содержит клетки, содержащие липиды, предпочтительно ПНЖК, предпочтительно клетки микроорганизмов отряда Thraustochytriales, подробно описаны в предшествующем уровне техники (см., например, WO 91/07498, WO 94/08467, WO 97/37032, WO 97/36996, WO 01/54510). Обычно получение проводят путем культивирования клеток в ферментаторе в присутствии источника углерода и источника азота, а также с добавлением ряда других дополнительных веществ, таких как минералы, которые обеспечивают рост микроорганизмов и продуцирование ПНЖК. В этом случае можно обеспечить плотности биомассы, равные более 100 г/л, и производительности, составляющие более 0,5 (г липида)/л/ч. Предпочтительно, если процедуру проводят с использованием так называемой методологии периодического действия с подпиткой, т.е. во время ферментации проводят пошаговое добавление источников углерода и азота. Когда необходимая биомасса получена, продуцирование липида можно инициировать различным образом, например, путем ограничения количества источника азота, источника углерода или содержания кислорода, или с использованием их комбинации.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки выращивают до обеспечения плотности биомассы, равной не менее 80 или 100 г/л, особенно предпочтительно равной от 80 или 100 г/л до 250 г/л, более предпочтительно равной не менее 120 или 140 г/л, особенно предпочтительно равной от 120 или 140 г/л до 220 г/л, более предпочтительно равной не менее 160 или 180 г/л, особенно предпочтительно равной от 160 до 200 г/л (в пересчете на содержание сухого вещества), такие методики описаны, например, в US 7732170.
Предпочтительно, если клетки подвергают ферментации в среде, обладающей низким содержанием соли, в частности, для предотвращения коррозии. Это можно обеспечить путем использования вместо хлорида натрия не содержащих хлор солей натрия, таких как, например, сульфат натрия, карбонат натрия, гидрокарбонат натрия или карбонат натрия. Предпочтительно, если для ферментации хлорид используют в количествах, составляющих менее 3 г/л, более предпочтительно менее 500 мг/л, особенно предпочтительно менее 100 мг/л.
Подходящими источниками углерода являются спиртовые и неспиртовые источники углерода. Примерами спиртовых источников углерода являются метанол, этанол и изопропанол. Примерами неспиртовых источников углерода являются фруктоза, глюкоза, сахароза, меласса, крахмал и кукурузный сироп.
Подходящими источниками азота являются неорганические и органические источники азота. Примерами неорганических источников азота являются нитраты и аммониевые соли, предпочтительно, сульфат аммония и гидроксид аммония. Примерами органических источников азота являются аминокислоты, предпочтительно глутамат, и мочевина.
Кроме того, для обеспечения благоприятного воздействия на протекание ферментации также можно добавить неорганические и органические содержащие фосфор соединения и/или известные стимулирующие рост вещества, такие как, например, дрожжевой экстракт или жидкий кукурузный экстракт.
Предпочтительно, если клетки подвергают ферментации при значении рН, равном от 3 до 11, особенно предпочтительно от 4 до 10, и предпочтительно при температуре, равной не ниже 20°С, более предпочтительно от 20 до 40°С, особенно предпочтительно не ниже 30°С. Типичная процедура ферментации протекает в течение вплоть до примерно 100 ч.
После завершения ферментации клетки можно пастеризовать для уничтожения клеток и для дезактивации ферментов, которые могут способствовать разрушению липидов. Предпочтительно, если пастеризацию проводят путем нагревания биомассы при температуре, равной от 50 до 121°С, предпочтительно от 50 до 70°С, в течение промежутка времени, равного от 5 до 150 мин, особенно предпочтительно от 20 до 100 мин.
Аналогичным образом, после завершения ферментации можно добавить антиоксиданты для защиты ПНЖК, содержащихся в биомассе, от окислительного разложения. В этом случае предпочтительными антиоксидантами являются БГТ (бутилгидрокситолуол), БГА (бутилгидроксианизол), ТВНА (третичный бутилгидрохинон), этоксихин, бета-каротин, витамин Е, предпочтительно токоферол, и витамин С.Если используют антиоксидант, то предпочтительно, если его добавляют в количестве, составляющем от 0,001 до 0,1 мас.%, более предпочтительно в количестве, составляющем от 0,002 до 0,05 мас.% в пересчете на полное количество ферментативного бульона после добавления антиоксиданта.
Рабочие примеры
Пример 1: Получение лизированного и концентрированного ферментативного бульона
В сосуде с перемешивающим устройством непромытый клеточный бульон, содержащий клетки микроорганизмов (Schizochytrium sp.), при плотности биомассы, равной более 100 г/л, нагревали до 60°С. После нагревания суспензии значение рН устанавливали равным 7,5 с использованием гидроксида натрия (50 мас.% раствор NaOH), затем добавляли находящуюся в жидкой форме алкалазу (Alcalase 2.4 FG (Novozymes)) в количестве, составляющем 0,5 мас.% (в пересчете на массу бульона). Перемешивание продолжали при 60°С в течение 3 ч. Затем лизированную смесь клеток переносили в испаритель с принудительной циркуляцией (выпускающийся фирмой GEA, Germany) и нагревали до температуры, равной 85°С. Смесь концентрировали в испарителе с принудительной циркуляцией до обеспечения полного содержания сухого вещества, составляющего примерно 35 мас.%.
Пример 2: Деэмульгирование с использованием смеси гидрофобного диоксида кремния и поверхностно-активных веществ
К образцу лизированного и концентрированного ферментативного бульона, полученного в соответствии с примером 1, массой 1000 г добавляли 5 г смеси деэмульгаторов, содержащей 47,5 мас.% Tween 80, 47,5 мас.% Span 80 и 5 мас.% гидрофобного диоксида кремния, выбранного из числа следующих: Sipernat D10, Sipernat D17 и Aerosil 202 R (Evonik Industries, Germany). В качестве отрицательного контроля использовали 5 г смеси Tween 80 и Span 80 без добавления гидрофобного диоксида кремния. Смесь деэмульгаторов получали путем тщательного перемешивания компонентов, проводимого до использования смеси.
После добавления смеси деэмульгаторов полученную таким образом суспензию нагревали в сосуде с перемешивающим устройством при температуре, равной 90°С. Через 1 и 22 ч соответственно отбирали образцы объемом 100 мл и затем масло отделяли от водной фазы центрифугированием.
Результаты представлены в приведенной ниже таблице.
Как можно видеть, после инкубирования в течение 1 ч уже можно получить масло с высоким выходом, однако после инкубирования в течение 22 ч выход увеличивается.
Пример 3: Деэмульгирование с использованием разных количеств смеси деэмульгаторов
К образцам лизированного и концентрированного ферментативного бульона, полученного в соответствии с примером 1, массой 1000 г добавляли 1, 3, 5 или 8 г смеси деэмульгаторов, содержащей 47,5 мас.% Tween 80, 47,5 мас.% Span 80 и 5 мас.% Sipernat D17 (Evonik Industries, Germany), это соответствовало конечному количеству гидрофобного диоксида кремния в суспензии, составляющему 0,005, 0,015, 0,025 и 0,040 мас.% соответственно.
Полученные таким образом суспензии нагревали в сосуде с перемешивающим устройством при температуре, равной 90°С. Через 24 ч соответственно отбирали образцы объемом 100 мл и затем масло отделяли от водной фазы центрифугированием.
Результаты представлены в приведенной ниже таблице.
Как можно видеть, эффективное деэмульгирование происходит уже при добавлении смеси деэмульгаторов в количестве, составляющем 1 г/1 кг суспензии, это соответствует количеству гидрофобного диоксида кремния в суспензии, составляющему 0,005 мас.%.
Пример 4: Деэмульгирование при разных продолжительностях инкубирования
К образцу лизированного и концентрированного ферментативного бульона, полученного в соответствии с примером 1, массой 1000 г добавляли 5 г смеси деэмульгаторов, содержащей 47,5 мас.% Tween 80, 47,5 мас.% Span 80 и 5 мас.% Sipernat D17 (Evonik Industries, Germany), это соответствовало конечному количеству гидрофобного диоксида кремния в суспензии, составляющему 0,025 мас.%.
Полученную таким образом суспензию нагревали в сосуде с перемешивающим устройством при температуре, равной 90°С. Через 2, 4, 6 и 24 ч соответственно отбирали образцы объемом 100 мл и затем масло отделяли от водной фазы центрифугированием.
Результаты представлены в приведенной ниже таблице.
Как можно видеть, и в соответствии с результатами, приведенными в таблице 1, эффективное деэмульгирование происходит уже при небольших продолжительностях инкубирования, однако более высокие выходы получены при продолжительностях инкубирования, составляющих более 5 ч. Преимуществом сравнительно небольших продолжительностей инкубирования является наличие чрезвычайно небольшого количества свободных жирных кислот (СЖК) в конечном продукте.
Пример 5: Деэмульгирование при разных температурах
К 4 образцам лизированного и концентрированного ферментативного бульона, полученного в соответствии с примером 1, массой 1000 г добавляли 5 г смеси деэмульгаторов, содержащей 47,5 мас.% Tween 80, 47,5 мас.% Span 80 и 5 мас.% Sipernat D17 (Evonik Industries, Germany) соответственно, это соответствовало конечному количеству гидрофобного диоксида кремния в суспензии, составляющему 0,025 мас.%.
Полученные таким образом образцы нагревали в сосудах с перемешивающими устройствами в течение 24 ч при разных температурах, равных 30, 50, 70 и 90°С соответственно. Через 24 ч соответственно отбирали образцы объемом 100 мл и затем масло отделяли от водной фазы центрифугированием.
Результаты представлены в приведенной ниже таблице.
Как можно видеть, деэмульгирование происходит уже при чрезвычайно низких температурах, однако хорошие выходы получены при температурах, равных выше 50°С. Как и в случае небольших продолжительностей инкубирования, низкие содержания СЖК также получены при инкубировании при более низких температурах.
Пример 6: Изменение количества и природы поверхностно-активных веществ, содержащихся в смеси деэмульгаторов
К образцам лизированного и концентрированного ферментативного бульона, полученного в соответствии с примером 1, массой 1000 г добавляли разные количества смеси деэмульгаторов, содержащей гидрофобный диоксид кремния Sipernat D17 (Evonik Industries, Germany) и необязательно разные количества поверхностно-активных веществ.
Полученные таким образом образцы нагревали в сосудах с перемешивающими устройствами при 90°С. Через 24 ч соответственно отбирали образцы объемом 100 мл и затем масло отделяли от водной фазы центрифугированием.
Разные составы смеси деэмульгаторов и добавленные количества, а также полученные выходы масла представлены в приведенной ниже таблице:
Как можно видеть, эффективное деэмульгирование происходит при использовании разных поверхностно-активных веществ и даже без использования поверхностно-активных веществ. Однако поверхностно-активные вещества, несомненно, оказывают положительное влияние на выход.