Зависимость растворимости хитозана от молекулярной массы и значения рН среды

Р. З. Хайруллин, С. Н. Куликов, В. Е. Тихонов,

Е. А. Степнова, С. А. Лопатин, В. П. Варламов

ЗАВИСИМОСТЬ РАСТВОРИМОСТИ ХИТОЗАНА

ОТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И ЗНАЧЕНИЯ рН СРЕДЫ

Ключевые слова: хитозан, молекулярная масса, растворимость.

Хитозан является полимером растворимость которого зависит как от его молекулярной массы, так и от значения кислотности среды. Установлению данной зависимости посвящена настоящая работа, для чего был использован ряд хитозановых образцов имеющих различную молекулярную массу и низкую степень полидисперсности.

Key words: chitosan, molecular weight, solubility.

The solubility of chitosan polymer depends on its degree of polymerization and level of acidity. The role of acidity in solubility of well characterized chitosan with low polydispersity and with different molecular weights was studied.

Введение

Хитозан - природный сополимер ацетилглюкозамина и глюкозамина, представляющий собой гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования, расположению ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению рКа [1]. Каждый из этих параметров может существенно влиять на биологические свойства полимера [2], например, на его биоцидную активность [3]. Одним из важных переменных параметров хитозанового полимера является его степень полимеризации, а значит и молекулярная масса. Известно, что хитозан хорошо растворим в кислых растворах, но от молекулярной массы зависит растворимость полимера при щелочных значениях рН среды. Однако установление подобной зависимости осложняется тем, что образцы хитозанов часто обладают высокой степенью полидисперсности. Поэтому для оценки растворимости хитозана, которая может сильно влиять на проявление им биологических свойств [4], необходимо использовать узкодисперсные образцы полимера с охарактеризованным молекулярно массовым распределением [5].

В связи с вышесказанным, целью работы явилось установление зависимости выпадения в осадок хитозанов от их молекулярной массы и значения рН среды.

Экспериментальная часть

В работе использовались образцы низкомолекулярных узкодиспресных хитозанов, полученных с помощью кислотного гидролиза высокомолекулярного крабового хитозана. Полученные образцы хитозанов анализировали хроматографическим методом как описано в работе [6]. Определяли средневесовую молекулярную массу (Mw), среднечисловую молекулярную массу (Mn) и значение полидисперсности хитозанов (Mw/Mn). Степень деацетили-рования (СД) определяли методом ПМР. Характеристики используемых в эксперименте образцов хитозанов приведены в таблице 1.

Низкомолекулярные хитозаны в виде гидрохлоридов растворяли в дистиллированной воде до концентрации 8 мг/мл (массу хитозана рассчитывали без противоиона).

Таблица 1 - Характеристики образцов хитозана

Мш, Да Мш/Мп СП*, (Мш/172) СД, %

728 1,41 4 95

1524 1,39 8 93

2090 1,40 12 97

2283 1,34 13 -

4224 1,38 24 -

8300 1,50 49 99

12761 1,92 74 95

15057 1,61 87 94

* Степень полимеризации.

Исследование растворимости хитозанов проводили в комплексной буферной системе на основе органических кислот - морфолинэтансульфоновой (МЕЭ) и 2-[трис(гидроксиметил)метиламино]-1-этансульфоновой (ТЕЭ). Использовали 0,15 М МЕЭ-ТЕЭ-Ма буфер (содержащий эквимолярные количества МБЭ и ТБЭ) с различными значениями рН: 7,0 7,5 и 8,0. В первый ряд лунок 96-луночного плоскодонного микропланшета вносили по 180 мкл буферного раствора, в который добавляли 20 мкл раствора хитозана. Раствор тщательно перемешивали и 100 мкл переносили в следующую лунку, содержащую 100 мкл буфера. Таким образом готовили двукратные разведения растворов хитозана, содержащие 400, 200, 100, 50, 25 и 12,5 мкг/мл вещества. После добавления всех образцов хитозана растворы в микропланшете выдерживали при комнатной температуре, проводя измерение оптической плотности растворов сразу после добавления вещества, а также спустя 1, 5 и 24 ч. Перед измерением выпавший в осадок хитозан ресуспендировали, помещая микропланшет на качалку, и, выдерживая в течение пяти минут при 500 об/мин. Образование осадка (растворимость хитозана) оценивали по изменению оптической плотности, регистрируемого с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм.

Результаты и их обсуждение

Как известно, значение рКа для хитозана не является величиной постоянной, колеблется в пределах 6,2-6,5, и очень сильно зависит от молекулярной массы [7]. Для хитозано-вых олигомеров это значение может быть заметно выше, приближаясь к рКа глюкозамина равного 7,9. Таким образом, хитозаны с различной молекулярной массой будут обладать различной растворимостью и с различной интенсивностью будут выпадать в осадок при одном и том же значени рН раствора.

Как было указано выше для более достоверного установления зависимости растворимости хитозана от его степени полимеризации необходимо использовать узкодисперсные образцы полимера с охарактеризованным молекулярно массовым распределением. Поэтому нами были получены узкодисперсные образцы хитозана с различными молекулярными массами, включающие в себя как небольшие олигомеры со степенью полмериза-ции около 10, так и типичные низкомолекулярные формы с Мw 5-20 кДа (табл. 1). Все образцы имели высокие и примерно одинаковые уровни значений деацетилирования, что позволяло говорить о сопоставимости образцов по данному параметру и существенном различии между ними только по весовым характеристикам.

Взятые в эксперимент образцы хитозана в виде солей гидрохлорида хорошо растворялись в дистиллированной воде и не образовывали осадков при длительном хранении в виде растворов (рН 5,5-6,0). Однако в ходе проведения эксперимента при повышении значения рН до слабощелочных наблюдалось образование осадка (рис. 1). Потеря молекулами хитозана растворимости происходит из-за депротеинизации аминогрупп полимера при за-щелачивании среды. Количество образуемого осадка зависило от концентрации вещества. Наиболее заметные изменения в оптической плотности растворов наблюдались при концентрации 50 мкг/мл и более.

Было показано, что по прошествии 24 ч инкубации при рН 7,0 не происходило образование осадка ни одним из хитозанов (рис. 1), тогда как при рН 7,5 в течение первого часа образуют заметное количество осадка образцы с Mw 4,2 кДа и более, а при рН 8,0 образцы с Mw не менее 2,2 кДа (данные не представлены).

Выпадение хитозанов в осадок практически завершается в течение первых 5-и часов для образцов с Mw 4,2 кДа и более поскольку оптическая плотность их растворов в дальнейшем существенно не изменялась, тогда как для более низкомолекулярных образцов выпадение в осадок продолжалось, о чём свидетельствовало дальнейшее повышение оптической плотности их растворов (данные не представлены).

Образец с Mw 728 не выпадал в осадок вне зависимости от значения рН среды, тогда как образец с Mw 1524 образовывал незначительное его количество при рН 8,0 только после 24 ч инкубации (рис. 1). Возможно это связано с содержанием в данном образце некоторого количества достаточно высокополимерных молекул хитозана, поскольку образец не является абсолютно гомогенным.

Таким образом, выпадение в осадок (растворимость) хитозана зависит как от их молекулярной массы так и от значения рН среды. С повышением молекулярной массы растворимость хитозанов уменьшается и они образуют осадок. Наилучшей растворимостью в слабощелочных условиях обладают олигомеры хитозана со степенью полимеризации до 12-13, в меньшей степени растворимы образцы с Mw до 4,2 кДа, что соответствует степени полимеризации равной примерно 25. Хитозаны с большей молекулярной массой при высоких значениях рН обладают наименьшей растворимостью.

ХИТ0 5ЭН, мкгЛіл

а

ХИТ 053 Н, М КГІЛ л,

б

H1T0J3H, мкгЛіл

___________________________________________________в__________________________________________________

Рис. І - Зависимость растворимости хитозанов от их степени полимеризации (указаны в легендах) и значения рН среды после 24 ч инкубации: а - при значении рН 7,0; б - при значении рН 7,5; в - при значении рН 8,0

Заключение

Была установлена зависимость выпадения в осадок (растворимость) хитозанов от их молекулярной массы и значения рН среды. Показано, что в щелочных условиях наиболее оправдано использование олигомерных форм хитозана со степенью полимеризации примерно до 25, которые обладают хорошей растворимостью в подобных условиях.

Работа выполенеа при финансовой поддержке регионального гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 09-04-99035рофи).

Литература

1. Скрябин, К.Г. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука, 2002. - 368 с.

2. Куликов, С.Н. Роль структуры в биологической активности хитозана / С.Н Куликов., Ю.А.Тюрин, Д.А.Долбин, Р.З. Хайруллин // Вестник Казанского технол. ун-та. - 2007. - №6. - С.10-14.

3. Куликов, С.Н. Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры / С.Н.Куликов, Ю.А.Тюрин, Р.С.Фассахов, В.П. Варламов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - №5. - С.91-97.

4. Lim, C-H. Review of ^itosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals / C-H. Lim, S.M. Hudson // J. Macromol. Sci. - 2003. - Vol.C43. - №2. - P.223-269.

5. Ильина, А.В. О необходимости фракционирования образцов низкомолекулярного хитозана для оценки его биологической активности / А.В. Ильина, В.П. Варламов // Материалы 7-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - М.: ВНИ-РО, 2003. - С. 311-315.

6. Лопатин, С.А. Фракционирование хитозана методом ультрафильтрации / С.А. Лопатин, М.С. Дербенева, С.Н.Куликов, В.П.Варламов, О.А.Шпигун // Журнал Аналитической Химии. - 2009. Т.64. - №6. - С.666-670.

7. Tharanathan, R.N. Chitin - the undisputed biomolecule of great potential / R.N. Tharanathan, F.S. Kit-tur // Crit. Rev. Nutr. - 2003. - Vol.43. - P.61-87.

© Р. З. Хайруллин - ФГУН КНИИЭМ Роспотребнадзора, лаб. иммунологии и разработки аллергенов, ru1979@yandex.ru; С. Н. Куликов - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. той же лаборатории; В. Е. Тихонов - канд. хим. наук, ст. науч. сотр. Института элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН; Е. А. Степнова - канд. хим. наук, науч. сотр. того же ин-та; С. А. Лопатин -канд. хим. наук, ст. науч. сотр. Центра «Биоинженерия» РАН; В. П. Варламов - д-р хим. наук, проф., зав. лаб. Центра «Биоинженерия» РАН, varlamov@biengi.ac.ru.