СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ ЧУМНОГО МИКРОБА
METHOD FOR DETECTING PLAGUE MICROBE ANTIGENS

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования различного материала на наличие антигенов чумного микроба.
Несмотря на то что в практике здравоохранения используется ряд методов обнаружения антигенов чумного микроба, все они не лишены тех или иных недостатков, поэтому усовершенствование существующих и разработка новых современных методов лабораторной диагностики чумы остается актуальной задачей.
Известен способ обнаружения антигенов чумного микроба, включающий нанесение исследуемого материала на подложку, блокирование свободных сайтов нитроцеллюлозной мембраны раствором бычьего сывороточного альбумина, промывку и обработку подложки специфическими IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена. Проявление результатов осуществляется после заключительной отмывки рабочим раствором субстрата (o-дианизидин или 3,3′-диаминобезидин). (Полунина Т.А. Разработка дот-иммуноферментного анализа для обнаружения клеток возбудителя особо опасных инфекций // Автореф. дис. канд. мед. наук. 03.00.07. - Саратов, 1990. - 19 с.). Однако данный способ имеет ряд недостатков, связанных с использованием ферментов. Термолабильность, канцерогенность и нестойкость некоторых ферментных субстратов требуют очень осторожной работы с ними, что делает этот способ неудобным в работе.
Наиболее близким к предлагаемому является способ обнаружения антигенов чумного микроба с помощью противочумных IgG, меченных коллоидным серебром. Метод включает адсорбцию исследуемого материала на подложке, блокирование свободных участков связывания раствором инертного белка, детекцию адсорбированных антигенов с помощью специфических иммуноглобулинов, меченных частицами коллоидного серебра, и визуализацию результатов путем погружения подложки в раствор проявителя, состоящего из метола, лимонной кислоты и азотнокислого серебра (Т.Ю.Загоскина, А.А.Докорина, Е.Ю.Марков, В.Б.Николаев, Н.М.Андреевская, В.А.Михайлова, Т.А.Иванова, С.А.Белькова, Е.П.Голубинский / Конструирование тест-системы для обнаружения антигенов чумного микроба в дот-иммуноанализе с частицами коллоидного серебра в качестве маркеров специфических антител (Методические рекомендации) // Иркутский науч.-иссл. противоч. ин-т Сибири и ДВ МинСоцЗдрав РФ. - Иркутск, 2004. - С.8). Однако данный способ имеет следующие недостатки: способ достаточно дорог, т.к. используется дорогостоящий и не всегда доступный реактив - азотнокислое серебро, кроме того, обязательное использование свежеприготовленного раствора проявителя и отсутствие возможности хранения конъюгата в лиофилизированном виде делают способ достаточно трудоемким.
Цель изобретения - снижение трудоемкости, упрощение и повышение доступности способа.
Поставленная цель достигается тем, что для обнаружения антигенов чумного микроба используют твердую подложку с размером пор 0,17-0,60 мкм, которую помещают в фосфатный буфер на 20-30 минут, после чего ее высушивают при комнатной температуре и затем помещают в раствор противочумных IgG на 30 минут при температуре 37°C. Затем подложку отмывают фосфатным буфером и блокируют свободные участки 1% раствором казеината натрия, в который помещают подложку на 20-30 минут при температуре 20-25°C. После этого наносят на подложку исследуемый материал и затем помещают ее в раствор меченых противочумных IgG на 40-60 минут при комнатной температуре. В качестве меченых противочумных IgG используют противочумные IgG, меченные дисперсным красителем «Dianix luminous red B». Затем подложку извлекают, высушивают при комнатной температуре и визуально определяют наличие или отсутствие антигенов чумного микроба. При формировании на подложке окрашенных пятен определяют наличие в исследуемом материале антигенов чумного микроба, а при отсутствии на подложке окрашенных пятен - отсутствие в материале антигенов чумного микроба.
Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что подложку помещают в 0,067 М фосфатный буфер, содержащий 0,14 М NaCl, на 20-30 минут, после чего ее высушивают при комнатной температуре и затем помещают в раствор противочумных IgG (раствор готовят из расчета 500 мкг сухого белка на 1 мл 0,01 М фосфатного буфера) на 30 минут при температуре 37°C, после чего отмывают подложку 0,01 М фосфатным буфером и блокируют свободные участки 1% раствором казеината натрия, в который помещают подложку на 20-30 минут при температуре 20-25°C. Затем наносят на подложку исследуемый материал, после чего помещают подложку в раствор меченых противочумных IgG на 40-60 минут при комнатной температуре. В качестве меченых противочумных IgG используют противочумные IgG, меченные дисперсным красителем «Dianix luminous red B», затем подложку извлекают, высушивают при комнатной температуре и визуально определяют наличие или отсутствие антигенов чумного микроба
Таким образом, данное техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».
Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ обнаружения антигенов чумного микроба, который осуществлялся бы на твердых пористых подложках с применением противочумных IgG, меченных дисперсным красителем.
Предлагаемые режимы способа обеспечивают достижение поставленной цели: способ экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов, доступен для широкого применения, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием. При этом предлагаемый способ имеет высокую чувствительность и специфичность.
Данный способ обнаружения антигенов чумного микроба может быть использован как в клинических и научно-исследовательских лабораториях, так и полевых условиях в природных очагах данной инфекции.
Таким образом, предлагаемый способ обнаружения антигенов чумного микроба соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Предлагаемый способ обнаружения антигенов чумного микроба осуществляют следующим образом: твердую подложку с размером пор 0,17-0,60 мкм помещают в 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,2), содержащий 0,14 М NaCl, на 20-30 мин. Затем подложку высушивают при комнатной температуре (20-25°C), после чего погружают ее в раствор противочумных IgG (раствор готовят из расчета 500 мкг по сухому белку на 1 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,2)) на 30 мин при 37°C, отмывают 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,2). Затем свободные участки связывания на подложке блокируют 1% раствором казеината натрия в течение 20-30 мин при 20-25°C. Подложку промывают 0,01 М фосфатным буфером pH 7,2 и высушивают при комнатной температуре. Исследуемый материал, предварительно обработанный раствором формалина согласно санитарно-эпидемиологическим правилам безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности) СП 1.3.1285-03 (Москва, 2003), наносят на подложку в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала (высыхание при 20-25°C в течение 20-30 мин) подложку промывают 0,01 М фосфатным буфером для удаления несвязавшегося материала и помещают на 40-60 минут в раствор противочумных IgG, меченных дисперсным красителем.
Получение меченых IgG осуществляют следующим способом: мечение IgG проводят из расчета 15 мкг (по белку) на 1 мл раствора, состоящего из 9,25 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,4), содержащего 0,01 M NaCl, и 0,75 мл 5% суспензии красителя «Dianix luminous red B». После инкубации полученной суспензии в течение 1 часа при комнатной температуре добавляют 2 мл раствора 30% БСА в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 0,005 М NaCl, и инкубируют суспензию еще 1 час. Затем суспензию центрифугируют при 12000 g в течение 20 мин и осадок ресуспендируют в 0,0333 М фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 0,125 М NaCl, 5% БСА и 0,01% мертиолят натрия, доводя до исходного (начального) объема.
После инкубации в растворе противочумных IgG, меченных дисперсным красителем, подложку извлекают, высушивают на воздухе и визуально проводят регистрацию результатов реакции. В случае наличия в исследуемом материале антигенов возбудителя чумы и в положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимых или корпускулярных антигенов чумного микроба) на подложке формируются окрашенные в темно-бордовый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость, неинфицированные объекты окружающей среды и т.п.) и при отсутствии антигенов чумного микроба в исследуемом материале формирования окрашенных пятен не происходит, подложка остается чистой (неокрашенной).
Пример 1. Обнаружение антигенов чумного микроба осуществляли по способу, описанному выше. Твердую подложку с размером пор 0,60 мкм помещали в 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,2), содержащий 0,14 М NaCl, на 20 мин. Затем подложку высушивали при комнатной температуре, после чего погружали ее в раствор противочумных IgG (раствор готовят из расчета 500 мкг по сухому белку на 1 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,2)) на 30 мин при 37°C. Затем подложку отмывали 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,2). После отмывания свободные участки связывания на подложке блокировали 1% раствором казеината натрия в течение 20 мин при 20°C. После этого подложку промывали 0,01 М фосфатным буфером pH 7,2 и высушивали при комнатной температуре. Образец снега, искусственно контаминированный корпускулярным антигеном чумного микроба, наносили на подложку в виде капель по 1 мкл. После полного впитывания исследуемого материала (при 20°C в течение 30 мин) подложку промывали 0,01 М фосфатным буфером для удаления несвязавшегося материала и помещали на 40 минут в раствор противочумных IgG, меченных дисперсным красителем «Dianix luminous red B». После инкубации в растворе противочумных IgG, меченных дисперсным красителем, подложку извлекали, высушивали на воздухе при комнатной температуре и визуально проводили регистрацию результатов.
5
На подложке с исследуемым образцом (снег) и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация корпускулярного антигена чумного микроба) сформировались четкие стойко окрашенные в темно-бордовый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость, неконтаминированный снег) формирования окрашенных пятен не наблюдалось, подложка осталась неокрашенной (чистой). Чувствительность способа составила ≥1×10 м.к./мл корпускулярных антигенов чумного микроба.
Пример 2. Обнаружение антигенов чумного микроба осуществляли по способу, описанному выше. Твердую подложку с размером пор 0,17 мкм помещали в 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,2), содержащий 0,14 М NaCl, на 30 мин. Затем подложку высушивали при комнатной температуре, после чего погружали ее в раствор противочумных IgG (раствор готовят из расчета 500 мкг по сухому белку на 1 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,2)), на 30 мин при 37°C. Затем подложку отмывали 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,2). После отмывания свободные участки связывания на подложке блокировали 1% раствором казеината натрия в течение 30 мин при 25°C. После этого подложку промывали 0,01 М фосфатным буфером pH 7,2 и высушивали при комнатной температуре. Исследуемый образец, содержащий капсульный антиген чумного микроба, наносили в виде капель по 2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала (при 25°C в течение 20 мин) подложку промывали 0,01 М фосфатным буфером для удаления несвязавшегося материала и помещали на 60 минут в раствор противочумных IgG, меченных дисперсным красителем «Dianix luminous red B». После инкубации в растворе противочумных IgG, меченных дисперсным красителем, подложку извлекали, высушивали при комнатной температуре и визуально проводили регистрацию результатов.
На подложке с исследуемым материалом, содержащим капсульный антиген чумного микроба, и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимого антигена чумного микроба) сформировались четкие стойко окрашенные в темно-бордовый цвет пятна. В отрицательном контроле (разводящая жидкость) формирования окрашенных пятен не наблюдалось, подложка оставалась неокрашенной, чистой. Чувствительность способа составила ≥10 нг/мл капсульного антигена чумного микроба.
Указанный способ обнаружения антигенов чумного микроба был использован при анализе 34 проб (штаммы чумного микроба разных подвидов, искусственно контаминированные объекты внешней среды, капсульный антиген, изолированный из чумного микроба).
5
Предлагаемый способ позволил обнаружить наличие микробных клеток чумного микроба в концентрации ≥1×10 м.к./мл, а капсульного антигена чумного микроба в концентрации ≥10 нг/мл.
7
Перекрестное реагирование с близкородственными в антигенном отношении микроорганизмами (Y.enterocolitica O:3 (2 штамма), Y.enterocolitica O:9 (2 штамма), Y.pseudotuberculosis (6 штаммов), Francisella tularensis) в концентрациях ≤10 м.к./мл отсутствует.
Исследование материала, содержащего антигены чумного микроба, параллельно проводили по способу-прототипу. По чувствительности и специфичности предлагаемый нами способ обнаружения антигенов чумного микроба не уступает способу-прототипу. Однако предлагаемый способ по сравнению со способом-прототипом дешевле, проще, доступнее. Меченные дисперсным красителем IgG можно лиофильно высушивать и длительно хранить, что делает способ более удобным в работе. Простота постановки способа, не требующего специальной аппаратуры и дорогостоящих реактивов, в сочетании с высокой чувствительностью, специфичностью и экономичностью позволяет использовать предлагаемый способ как в лабораторных, так и в полевых условиях.