Морфометрическая оценка онтогенеза функциональных особенностей гепатоцитов в условиях длительного кормления гомогенизированной пищей

УДК 591.436.2:599.3234

Т. И. Кузнецова, Р. М. Хайруллин

МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ОНТОГЕНЕЗА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЕПАТОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО КОРМЛЕНИЯ ГОМОГЕНИЗИРОВАННОЙ ПИЩЕЙ

Аннотация. Исследовано влияние питания гомогенизированной пищей на онтогенез функциональных особенностей клеток паренхимы печени белых крыс в постнатальном периоде. Установлено, что длительное потребление гомогенизированной пищи обусловливает гипотрофические изменения ге-патоцитов со 120-х по 240-е сутки постнатального развития и увеличение их числа на стандартную площадь среза в период с 60-х по 240-е сутки постнатального онтогенеза. На основании результатов двухфакторного анализа (MANOVA) авторами показано, что эти изменения взаимосвязаны как с возрастом, так и с фактором питания. Доказывается, что фактор физических свойств пищи модифицирует становление функций клеток печени в онтогенезе.

Ключевые слова: печень, гепатоцит, гомогенизированная пища.

Abstract. The article investigates the effect of homogenized food on the ontogeny of functional features of parenchymal liver cells of white rats in postnatal period. The authors have established that prolonged consumption of homogenized food causes oligotrophic changes of hepatocytes from 120th to 240th day of postnatal development and increase their quantity on a standard shear area from 60th to 240th day of postnatal ontogenesis. On the basis of bifactor analysis results (MANOVA), the researcher have proved that these changes are linked with both age and nutritional factors. It is proved that food physical properties factor modifies the formation of liver cell functions in ontogeny.

Key words: liver, hepatocytes, homogenized food.

Введение

Онтогенез и становление функций пищеварительной системы животных тесно связаны с образом их жизни, средой обитания и пищевой специализацией, тип потребляемой пищи может влиять на развитие всех органов пищеварительного тракта [1-3]. Показано, что потребление различного типа растительного корма грызунами и парнокопытными млекопитающими обусловливает ультраструктурные различия гепатоцитов этих животных [4, 5]. Изменение содержания белков, жиров в диете лабораторных крыс является причиной колебаний размеров клеток паренхимы печени [6-8]. В то же время характер воздействия физических свойств потребляемой пищи на морфофункциональные особенности клеток печени остается практически неизученным, несмотря на то, что доказано влияние питания механически измельченной пищей на морфогенез ряда органов пищеварительной системы [9-11]. Учитывая тесную интеграцию всех органов пищеварительного тракта, представляется, что свойства пищи могут также оказывать опосредованное воздействие на онтогенез и функции печеночных клеток, выяснение которого и явилось целью настоящего исследования.

1. Материалы и методы исследования

Исследование проводили на 100 самцах белых беспородных крыс, на 21-е сутки постнатального онтогенеза случайным образом разделенных на контрольную и опытную группы. Животных контрольной группы содержали на стандартном рационе. Животные опытной группы получали пищу того же состава с аналогичной пищевой и энергетической ценностью, но после тщательного механического измельчения (гомогенизации). Средний размер частиц го-могената составлял 1-2 мм. Рацион разрабатывался с учетом пищевой ценности и сбалансированности всех его компонентов, в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ РФ № 163 от 10 марта 1996 г. Животным обеспечивался свободный доступ к воде и пище в любое время суток. Другие условия содержания крыс были идентичными. Содержание животных проводилось в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 6 апреля 1973 г. и Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Объектом исследования послужила печень, участки ткани левой боковой доли которой у контрольных и опытных животных исследовали на 21-е (поздний молочный период), 60-е (ранний пубертатный период), 120-е (поздний пубертатный период), ^0-е (репродуктивный период), 240-е сутки (период возмужания) [12]. Все манипуляции с животными проводились согласно приказу № 755 от 12 августа 1977 г. по МЗ СССР «О гуманном обращении с экспериментальными животными», а также положениями Хельсинской Декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 19S3, 19S9 и 2000 гг.

Морфометрию структур печени проводили на стандартно окрашенных гистологических срезах толщиной 5 мкм [13]. С помощью компьютерной программы денситофотометрии «Mecos-C1» (РФ) измеряли площадь сечения (мкм2) гепатоцитов. Для подсчета количества одноядерных и двуядерных ге-патоцитов на стандартной площади среза применялась квадратно-сетчатая окулярная вставка, подсчет производился при 280-кратном увеличении, на площади 10 000 мкм2 [14]. Относительное количество двуядерных гепатоци-тов вычисляли по формуле

N™ = (^Ж)  100,

где N2i% - относительное количество двуядерных гепатоцитов (%); N2l- - количество двуядерных гепатоцитов на стандартную площадь среза (10 000 мкм2); N - суммарное количество одноядерных и двуядерных гепатоцитов на стандартную площадь среза (10 000 мкм2).

Полученные морфометрические данные подвергали статистическому анализу, применяя однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ с помощью лицензионных компьютерных программ обработки статистических данных Statistica 6 (USA, Statsoft.Inc.), SpSS 13.0 (USA) [15, 16]. Динамику возрастных изменений оценивали на основе post-hoc попарных сравнений двух соседних значений при помощи критерия наименьшей существенной разницы (LSD-test).

2. Результаты исследования и их обсуждение

На обзорных гистологических препаратах печень контрольных и опытных животных исследуемых нами групп имела четко различимое дольчатое

строение, балки органа не деформированы, синусоиды и центральные вены не расширены, портальные тракты с незначительным количеством соединительной ткани, триады типичного строения. Гепатоциты имели четкие границы, содержали одно-два ядра, цитоплазма гепатоцитов бледно-розовая, гомогенная.

В ранний период постнатального онтогенеза (21-60-е сутки) наблюдается уменьшение количества гепатоцитов на стандартную площадь среза (10 000 мкм2) как в контрольной, так и в опытной группах (рис. 1).

Рис. 1. Возрастная динамика суммарного количества гепатоцитов животных контрольной (контроль) и опытной (опыт) групп

Указанные изменения связаны с ростом гепатоцитов в этот период, что выражается в увеличении их площади сечения с 129,11 ± 0,51 до 209,07 ± ± 1,55 мкм2 у контрольных и 214,28 ± 1,37 мкм2 у опытных животных соответственно. При этом размеры и количество клеток опытных животных были статистически значимо больше соответствующих значений контрольных животных. Эта «временная» гипертрофия и повышенное количество гепатоци-тов опытных животных, вероятно, являются признаком первой фазы (становления) адаптационно-компенсаторного процесса в печени, ее начальной реакцией, направленной на усиление функциональной активности органа для преодоления воздействия фактора (измененные физические свойства пищи) [17]. Для анализа количества клеток на единицу площади нами были использованы такие показатели, как количество одноядерных и двуядерных клеток на стандартную площадь среза. В первом возрастном периоде онтогенеза (с 21-х по 60-е сутки) также уменьшается количество одноядерных и дву-ядерных гепатоцитов животных обеих экспериментальных групп, в частности, количество одноядерных гепатоцитов 21-суточных животных составляет 64,08 ± 1,30 и уменьшается до 22,08 ± 0,37 на единицу площади среза у контрольных и до 29,41 ± 0,60 у опытных 60-суточных животных соответственно (рис. 2).

Абсолютное и относительное количество двуядерных гепатоцитов изменяется сходным образом. Различия в абсолютном количестве двуядерных гепатоцитов между контрольными и опытными 60-суточными животными

статистически значимы (рис. 3), однако различия между этими значениями (в процентном выражении) статистически недостоверны (рис. 4).

Рис. 2. Возрастная динамика количества одноядерных гепатоцитов в печени животных контрольной (контроль) и опытной (опыт) групп

Рис. 3. Возрастная динамика количества двуядерных гепатоцитов в печени животных контрольной (контроль) и опытной (опыт) групп

Следовательно, большее количество двуядерных гепатоцитов у 60-суточных опытных животных, по сравнению с контрольными, связано не с их гиперплазией, ас их гипотрофией. Увеличение значения двуядерных паренхимных клеток печени у 60-суточных животных обеих экспериментальных групп (р < 0,05), по сравнению с 21-суточными животными (рис. 4), свидетельствует об усилении регенераторных процессов, обусловленных, вероятно, переходом от молочного питания к питанию кормом взрослых животных.

В последующий возрастной период (60-120-е сутки) наблюдается уменьшение количества гепатоцитов на единицу площади в обеих экспериментальных группах. Поскольку с возрастом площадь сечения гепатоцитов также увеличивается, то у 120-суточных контрольных животных отмечается уменьшение количества гепатоцитов на стандартную площадь среза, из кото-

рых 18,32 ± 0,33 приходится на одноядерные паренхимные клетки (рис. 1, 2). В отличие от контрольных, гепатоциты опытных животных того же возраста характеризуются менее интенсивным ростом площади сечения, что обусловливает их повышенное количество на стандартную площадь среза у 120-суточных опытных животных, из которых 22,25 ± 0,30 - одноядерные, а 0,61 ± 0,05 -двуядерные (рис. 3, 4). В период с 60-х по 120-е сутки, по сравнению показателями контрольных животных, количество двуядерных клеток опытных животных уменьшается более резко и значительно, и статистически значимо не изменяется в последующие возрастные этапы (120-180-е, 180-240-е сутки). Уменьшение количества двуядерных клеток в период с 60-х по 120-е сутки, вероятно, обусловлено цитотомией двуядерных клеток, что является признаком интенсивных регенераторных процессов [18, 19].

Рис. 4. Возрастная динамика относительного количества двуядерных гепатоцитов (%) в печени животных контрольной (контроль) и опытной (опыт) групп

В последующие периоды онтогенеза (120-180-е, 180-240-е сутки) количество гепатоцитов животных обеих экспериментальных групп на стандартную площадь среза возрастает. Количество паренхимных клеток печени на единицу площади у контрольных животных к 180-суточному возрасту увеличивается до 20,42 ± 0,34 (р < 0,05) и статистически значимо не изменяется в последующий возрастной период (180-240-е сутки). Количество одноядерных гепатоцитов контрольных животных в репродуктивный период (180-е сутки) возрастает до 20,01 ± 0,37 клетки, и в последующем возрастном периоде не изменяется, при этом площадь сечения гепатоцитов животных данной группы продолжает также увеличиваться (260,41 ± 0,93 мкм2). Необходимо отметить, что количество двуядерных клеток в печени контрольных животных к 180-суточному возрасту достигает минимальных значений (0,40 ± 0,05 клетки) и статистически значимо не изменяется в последующий период, что, вероятно, связано с окончанием роста органа, установлением структурной зрелости его ткани и достижением базового уровня функционирования [17].

В отличие от животных контрольной группы, у 180-суточных опытных животных количество одноядерных гепатоцитов увеличивается до 25,49 ± ± 0,37 клетки на стандартную площадь среза (рис. 2), а двуядерных - до

0,65 ± 0,06, тогда как общее количество гепатоцитов составляет 26,32 ± 0,37,

клеток, что превосходит аналогичные показатели контрольных животных того же возраста (р < 0,05) и сопровождается медленным возрастанием площади сечения гепатоцитов (229,78 і 0,80 мкм2). Со 180-х по 240-е сутки у опытных животных количество одноядерных и двуядерных гепатоцитов на стандартной площади среза печени статистически значимо не изменяется. Необходимо отметить, что количество двуядерных гепатоцитов опытных животных превышает аналогичный показатель контрольных животных того же возраста, что может свидетельствовать о повышенном уровне регенерационных процессов. В период со 120-х по 240-е сутки постнатального онтогенеза гепа-тоциты опытных животных, по сравнению с геапатоцитами животных контрольной группы, характеризуются меньшей площадью сечения, что обусловливает их повышенное количество на стандартную площадь среза. Данные изменения паренхимы печени опытных животных, вероятно, соответствуют заключительной стадии адаптивно-компенсаторного процесса - истощения, которое характеризуется гипотрофией клеток и субклеточных структур, снижением функциональной активности органа.

Результаты двухфакторного анализа (MANOVA) показали, что на изменение значений количества клеток на единицу площади большее по силе влияние оказывает фактор возраста (g2 = 0,810, р < 0,05), чем фактор типа пищи (g2 = 0,051, р < 0,05), и их совместное воздействие (g2 = 0,022, р < 0,05). Изменения количества одноядерных и двуядерных гепатоцитов, обусловленные возрастом (g2 = 0,806, р < 0,0 и g2 = 0,638, р < 0 ,05 соответственно), также являются более существенными, тогда как фактор свойства пищи менее интенсивно влияет как на количество одноядерных (g2 = 0,057, р < 0,05), так и на число двуядерных (g2 = 0,003, р < 0,05) гепатоцитов.

Обобщая результаты настоящего исследования, можно заключить, что длительное потребление исключительно гомогенизированной пищи оказывает определенное влияние на становление функций гепатоцитов крыс в пост-натальном онтогенезе. С 21-х по 240-е сутки постнатального развития количество одноядерных, двуядерных, а также суммарное количество гепатоцитов на стандартную площадь среза печени опытных животных превышает аналогичные показатели контрольных животных. Причиной тому, очевидно, являются адаптивно-компенсаторные процессы в паренхиме печени с 120-х по 240-е сутки постнатального онтогенеза, также проявляющиеся в гипотрофи-ческих изменениях гепатоцитов опытных животных.

Список литературы

1. Рыбальченко, В. К. Физиология и биохимия пищеварения животных и человека I В. К. Рыбальченко. - М., 2002. - 365 с.

2. Уголев, А. М. Теория адекватного питания и трофология I А. М. Уголев. - Л. : Наука, 1991. - 272 с.

3. Уголев, А. М. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. Элементы современного функционализма I А. М. Уголев. - Л. : Наука, 1985. - 544 с.

4. Калашникова, М. М. Характеристика морфологической дифференцировки гепатоцитов животных разных классов в онтогенезе в зависимости от особенностей питания I М. М. Калашникова II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1997. - Т. і23, № і. - С. 4-10.

5. Хацаева, М. М. Морфофункциональные особенности печени сайгака в связи со спецификой питания : автореф. дис. ... канд. биол. наук I Хацаева М. М. - М.,

2005. - 22 с.

6. Новгородцева, Т. П. Состав липидов эритроцитов крови при развитии фиброза печени в условиях алиментарной дислипидемии / Т. П. Новгородцева, Ю. К. Караман, Н. В. Бивалькевич, Н. В. Жукова // Бюллетень СО РАМН. - 2010. -Т. 30, № 1. - С. 53-58.

7. Ely, J. O. Desoxyribonucleic acid of rat liver nuclei influenced by diet / J. O. Ely, M. N. Ross // Science. - 1951. - № 11. - Р. 70-73.

8. Omaragi, K. Effect of long-term hight-fat diet and Switching from a hight-fat to low-fat standart diet on hepatic accumulation in Sprague-Dawley rats / K. Omaragi, R. Tsuneyama, C. Inohara // Digestive Disease Science. - 2008. - № 2. - Р. 46-44.

9. Сыч, В. Ф. Морфометрические показатели околоушной слюнной железы белых крыс в условиях длительного потребления диспергированной пищи / В. Ф. Сыч, М. А. Семенова, Т. И. Кузнецова // Морфологические ведомости. -

2006. - № 1, 2. - С. 62-65.

10. Сыч, В. Ф. Постнатальный морфогенез слизистой оболочки фундального отдела желудка белых крыс при длительном питании диспергированной пищей /

B. Ф. Сыч, А. Ф. Санжапова, Е. В. Слесарева // Ученые записки УлГУ. - 2006. -Вып. 1 (10). - С. 80-86.

11. Сыч, В . Ф . Гистоморфология мышечной оболочки тощей кишки белых крыс после длительного потребления диспергированного корма / В. Ф. Сыч, Н. А. Цыганова, С. М. Слесарев, Н. А. Курносова // Ученые записки УлГУ. - 2006. -Вып. 1 (10). - С. 86-89.

12. Махинько, В. И. Константы роста и функциональные периоды развития в постнатальной жизни белых крыс / В. И. Махинько, В. Н. Никитин // Молекулярные и физиологические механизмы возрастного развития. - Киев : Наукова думка, 1975. - С. 308-326.

13. Коржевский, Д. Э. Основы гистологической техники / Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров. - СПб. : СпецЛит, 2010. - 95 с.

14. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия : руководство / Г. Г. Автандилов. - М. : Медицина, 1990. - 384 с.

15. Жижин, К. С. Медицинская статистика / К. С. Жижин. - Ростов н/Д. : Феникс,

2007. - 160 с.

16. Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / О. Ю. Реброва. - М. : Медиасфера, 2002. - 312 с.

17. Ташке, К. Введение в количественную цито-гистологическую морфологию / К. Ташке. - Будапешт : Изд-во Академии соц. респ. Румынии, 1980. - 191 с.

18. Сакута, Г. А. Клеточные механизмы регенерации цирротической печени крыс.

II. Влияние частичной гепатоэктомии на процессы пролиферации, полиплоидии и гипертрофии гепатоцитов / Г. А. Сакута, Б. Н. Кудрявцев // Цитология. - 2005. -Т. 47, № 2. - С. 379-387.

19. Солтыс, Т. В. Двуядерные гепатоциты как форма внутриклеточной регенерации при экспериментальном описторхозе / Т. В. Солтыс, В. Г. Зуевский // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Сургут, 2000. -

C. 204-205.

Кузнецова Татьяна Ивановна

аспирант, Институт медицины, экологии и физической культуры, Ульяновский государственный университет

Kuznetsova Tatyana Ivanovna Postgraduate students, Institute of Medicine, Ecology and Physical Training, Ulyanovsk State University

E-mail: tattkuznetsova@rambler.ru

Хайруллин Радик Магзинурович доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, Институт медицины, экологии и физической культуры, Ульяновский государственный университет

E-mail: khayrullin@list.ru

УДК 591.436.2:599.3234

Кузнецова, Т. И.

Морфометрическая оценка онтогенеза функциональных особенностей гепатоцитов в условиях длительного кормления гомогенизированной пищей / Т. И. Кузнецова, Р. М. Хайруллин // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2011. - № 3 (19). -

С.16-23.

Khayrullin Radik Magzinurovich Doctor of medical sciences, professor, head of sub-department of human anatomy, Institute of Medicine, Ecology and Physical Training, Ulyanovsk State University