Изменения микроструктуры печени после частичной гепатэктомии у крыс

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

101

Изменения микроструктуры печени после частичной гепатэктомии у крыс

И.М. Газизов 12, М.С. Калигин 21, Д.И. Андреева 12, Т.С. Йылмаз 1,

А.А. Гумерова 2, А.П. Киясов 2

1 Казанский государственный медицинский университет, Казань

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

Changes of liver microstructure after partial hepatectomy in rats

I.M. Gazizov12, M.S. Kaligin 12, D.I. Andreeva 12, T.S. Yilmaz1, A.A. Gumerova 2, A.P. Kiassov2

1 Kazan State Medical University, Kazan

2 Kazan Federal University, Kazan

Высокая способность печени млекопитающих к регенерации является одним из излюбленных примеров «регенеративной медицины». При этом репарация печени не может рассматриваться как обычный процесс гипертрофии органа, а должен иметь определенные закономерные этапы. Знание этих этапов необходимо для правильной интерпретации данных в ходе терапии пациентов с патологией печени, в том числе при клеточной терапии. Однако исследования изменений микроструктуры печени в ходе репаративной регенерации крайне малочисленны. Данная работа проведена с целью оценки этих изменений в ходе репаративного процесса после частичной гепатэктомии у крыс. В ходе эксперимента через 1, 2, 3, 5, 7 сут. после операции оценивали размеры печеночных долек, измеряя межпортальные расстояния, анализировали пролиферацию клеток, участие в регенерации перисинусоидальных клеток, желчных протоков, афферентных и эфферентных сосудов печени, исследуя экспрессию специфических маркеров различных клеточных типов методами иммуногистохимии. Результаты исследования показали, после частичной гепатэктомии изменение микроструктуры печени осуществляется в два этапа: 1) гиперплазия печеночных долек путем пролиферации клеток печени до четвертых суток и 2) деление печеночных долек за счет ветвления желчных протоков, ветвей печеночной артерии, воротной вены и центральных вен с четвертых до седьмых суток.

Ключевые слова: микроструктура печени, регенерация, печеночная долька, частичная гепатэктомия.

В течение трехсотлетнего периода изучения печени сложились многочисленные концепции, объясняющие ее структурную организацию. Предположения о наличии в печени структурных единиц впервые были высказаны в работах И. Вепфера (1664) и М. Мальпиги (1666), в 1833 г. F. Kiernan описал классическую печеночную дольку [1], в 1906 г. F. Mall охарактеризовал портальную дольку [2], в 1954 г. A. Rappaport описал печеночный ацинус [3], а в 1970 г. E. Bloch была предложена динамичная функциональная единица печени [4]. Все эти концепции довольно «искусственны», но, тем не менее, они позволяют лучше понять сложно устроенный, многофункциональный орган. При этом микроструктура печени — динамична, и, безусловно, меняется в ходе развития и регенерации печени.

Классической моделью изучения регенерации печени является модель частичной гепатэктомии (ЧГ). Она была предложена и выполнена на кры-

e-mail: ilnazaziz@mail.ru

Ability of mammalian liver to regenerate is one of the favorite examples of "regenerative medicine". At the same time liver regeneration can not be viewed as a simple hypertrophy, it must have some appropriate steps. Understanding of these processes is crucial for correct interpretation of liver therapy results, especially after cellular therapy. But, unfortunately, original and first-hand data regarding changes in liver microstructure during regeneration is relatively scarce. This work was dedicated to study changes of liver microstructure during liver regeneration after partial hepatectomy in rats. We analyzed proliferative processes, perisinusoidal cells involvement, sizes of classical hepatic lobules, participation of bile ducts, branches of afferent and efferent hepatic vessels in liver regeneration on 1, 2, 3, 5, 7 postoperative days. Our results have shown that liver microstructure during regeneration after partial hepatectomy undergoes two stages: hypertrophy of hepatic lobules by proliferation of liver cells until 4th day and division of hepatic lobules by branching of bile ducts, hepatic artery, portal and central veins from 4th until 7th postoperative day.

Key words: liver microstructure, regeneration, liver lobule, partial hepatectomy.

сах в 1931 г. G.M. Higgins и R.M. Anderson и позволила установить, что оставшиеся доли восстанавливают массу печени в течение 1—2 нед. [5]. В дальнейшем при изучении регенерации на модели ЧГ были описаны кинетика пролиферативного ответа различных клеточных типов [6], последовательность и уровень вовлечения факторов роста, факторов транскрипции, генов, роль гормонов [7], внеклеточного матрикса [8]. Однако, несмотря на длительное и детальное изучение регенерации печени после ЧГ, вопрос об изменении морфофункциональных единиц печени до сих пор остается практически неизученным.

Целью нашей работы стала оценка морфологических изменений классической печеночной дольки в ходе репаративной регенерации. Для изучения размеров печеночных долек мы применяли морфометрический метод, для изучения элементов портального тракта — иммуногистохимическое исследование

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

102

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

с помощью моноклональных антител к различным клеточным типам печени.

Материал и методы

Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах, находящихся на стандартном пищевом рационе вивария центральной научно-исследовательской лаборатории Казанского ГМУ со свободным доступом к воде. Операция ЧГ (67%) печени проводилась в условиях операционной под эфирным наркозом по методике, описанной ранее [9]. Удаленные во время операции доли печени взвешивали, фотографировали и использовали в качестве контроля. Эксплантацию органов производили через 1, 2, 3, 5 и 7 сут. после операции, материал помещали в 10% нейтральный формалин на 0,2 М фосфатном буфере (рН = 7,4) на 24 ч для фиксации, после чего изготавливали гистологические препараты по стандартной методике.

Срезы печени окрашивали иммуногистохимически с коммерческими антителами к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA, клон PC10, DAKO, 1:100), десмину (клон D33, DAKO, 1:30), а-гладкомышечному актину (a-SMA, клон 1A4, DAKO, 1:50), цитокератину 19 (клон ВА17, DAKO, 1:50). Иммуногистохимическая реакция была проведена стрептавидин-биотиновым методом при помощи визуализационной системы LSAB фирмы DAKO (Дания).

Морфометрические исследования проводили при помощи морфометрической окулярной сетки при увеличении х400 на микроскопе Leica DM 1000 (Германия). Классическая печеночная долька может быть представлена в виде правильного шестиугольника, в центре которого располагается центральная вена, а по углам — портальные тракты. Площадь правильного шестиугольника вычислялась по формуле:

S = 3 х l2 xV3/2,

где S — площадь шестиугольника, l — длина одной из сторон шестиугольника. Таким образом, для вычисления площади печеночных долек мы подставили значения межпортальных (порто-портальных) расстояний в формулу вычисления площади правильного шестиугольника.

Статистический анализ проводили при помощи графического пакета Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Макроскопическое исследование показало, что восстановление массы оставшихся после ЧГ долей печени до исходного веса органа (7—10 г) завершалось к восьмым суткам после операции. При рутинном морфологическом исследовании через сутки после ЧГ мы наблюдали расширение синусоидных капилляров, которое исчезало к четвертым суткам, и стеатоз гепатоцитов, который через 1 сут. после операции можно было охарактеризовать как мелкокапельный, через 3 — крупнокапельный, через 5 — среднекапельный, через 7 — мелкокапельный в единичных гепатоцитах.

Результаты исследования экспрессии PCNA показали, что через сутки после операции происходило нарастание числа делящихся гепатоцитов (табл. 1), максимум их пролиферативной активности приходился на 2 сут. (рис. 1A). В последующем экспрессия PCNA в гепатоцитах уменьшалась, а через 7 сут. была сравнима с контрольными образцами. Среди делящихся гепатоцитов мы обнаружили также PCNA-позитивные синусоидные клетки печени и хо-лангиоциты, пик пролиферации которых наблюдали на 3—5 сут. после операции.

Морфометрическое исследование показало, что межпортальные расстояния увеличивались со вторых суток после операции, достигая максимума через трое суток (164,2% по отношению к норме). Далее межпортальные расстояния уменьшались, составляя через 7 сут. 108% от контроля (табл. 2). Размеры печеночных долек, находящиеся в прямой зависимости от межпортальных расстояний, увеличивались со вторых суток после частичной гепатэк-томии, достигали максимума (269,2% от нормы) через трое, а далее постепенно снижались до 116,5% через 7 сут. (см. табл. 1).

Изучение экспрессии десмина показало, что через сутки после операции происходило резкое увеличение числа десмин-позитивных перисинусо-идальных клеток, пик их количества мы наблюдали через трое суток (рис. 1Б), но и через 7 сут. число десмин-позитивных перисинусоидальных клеток оставалось выше, чем в контроле (см. табл. 1).

Таблица 1. Количество PCNA-позитивных гепатоцитов и десмин-позитивных перисинусоидальных клеток в печени здоровых животных и крыс, перенесших частичную гепатэктомию

Срок эксперимента Число PCNA-позитивных гепатоцитов/0,04 мм2 Число десмин-позитивных перисинусоидальных клеток/0,04 мм2

перипортально перицентрально перипортально перицентрально

Контроль 0,005 0,0001 2,5±0,7 1,9±0,7

1 сут. 20±4* 11,5±3,8* 13,2±2,3* 13,6±2*

2 сут. 60,5±14,2* 45,4±12,5* 17,3±2* 17,2±2,8*

3 сут. 22,2±5,6* 11±2,5* 26,3±4* 25,8±4*

5 сут. 9,2±3* 0,8±0,75* 19,6±4,2* 18,3±3,2*

7 сут. 3,2±1,3* 0,5±0,6* 9,7±3,2* 8,5±3,2*

— различия статистически значимы при сравнении с показателями нормы при p<0,01.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

103

Рис. 1.

Печень крысы после частичной гепатэктомии (ЧГ):

А - 2 сут. после ЧГ, экспрессия PCNA гепатоцитами;

Б - 3 сут. после ЧГ, экспрессия десмина перисинусоидальными клетками;

В - 5 сут. после ЧГ, ветви печеночной артерии, экспрессия a-SMA;

Г - 5 сут. после ЧГ, центральные вены печени, экспрессия a-SMA;

Д - 5 сут. после ЧГ, желчные протоки, экспрессия цитокератина 19. Иммуногистохимическая реакция.

Ув.: х400

Таблица 2. Изменения размеров печеночных долек после частичной гепатэктомии

Срок эксперимента Среднее расстояние между портальными трактами, % Средняя площадь портальных трактов, %

контроль 100

1 сут. 100,6±1,6 101,2

2 сут. 121,5±2,8* 146,2

3 сут. 164,2±3,4** 269,2

5 сут. 140,3±4,1* 196,2

7 сут. 108,0±3,1 116,5

* — различия статистически значимы при сравнении с контролем при р<0,01; ** — различия статистически значимы при сравнении с контролем при р<0,001.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

104

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

Экспрессия a-SMA была обнаружена только в гладкомышечных клетках стенки сосудов портальных трактов, в перисинусоидальных клетках она отсутствовала на всех сроках после операции. Через 5 сут. и, в меньшей степени, через 7 сут. после операции мы наблюдали ветвление как афферентных (рис. 1В), так и эфферентных сосудов печеночных долек (рис. 1Г).

Исследование экспрессии цитокератина 19 показало, что данный маркер в контрольных образцах печени экспрессировался только в цитоплазме холангиоцитов. В большинстве портальных трактов находилось по 2—3 желчных протока. В экспериментальных образцах с 3 по 7 сут. после операции мы наблюдали увеличение числа внутрипеченочных желчных протоков. Наибольшее число желчных протоков было отмечено на 5 сут., когда в каждом портальном тракте выявлялось 4—6 протоков, а в некоторых их число доходило до пятнадцати. На этом сроке мы также наблюдали формирование новых желчных протоков путем ветвления (рис. 1Д).

Таким образом, результаты наших исследований позволили нам установить, что в основе изменений, происходящих с печеночными дольками после ЧГ, лежат пролиферация всех клеточных типов печени и ветвление элементов портального тракта и печеночной вены, ведущие к новообразованию печеночных долек путем их деления. Весь этот процесс мы можем разделить на два этапа: 1) гиперплазия печеночных долек, 2) деления печеночных долек (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение изменения печеночных долек в ходе регенерации после частичной гепатэктомии. Ветви печеночной артерии красного цвета, центральные вены - синего

Гиперплазия печеночных долек достигается путем пролиферации клеток печени, которая достаточно подробно описана в литературе, и наше исследование подтверждает эти данные [6]. Первыми клетками, входящими в пролиферацию являются гепатоциты, их интенсивное деление увеличивает объем паренхимы печени и размер печеночных долек (табл. 2), что проявляется в увеличении межпортальных расстояний, достигающих максимума через 3 сут. после ЧГ (табл. 2). Следует отметить, что в пролиферации гепатоцитов важную роль играют перисинусоидальные клетки. Они уже через сутки после операции усиливают экспрессию дес-мина и пролиферируют, вступая в процесс неполной активации и вырабатывая фактор стволовых клеток [10], фактор роста гепатоцитов [11], трансформирующий фактор роста-a, что изменяет характер межклеточных взаимоотношений с гепатоцитами [12] и способствует их делению.

После третьих суток наступает второй этап восстановления печени — деление печеночных долек. Данный процесс инициируется увеличенной функциональной нагрузкой гипертрофированных печеночных долек и начинается с пролиферации синусоидных клеток, холангиоцитов и клеток сосудов. Пролиферация холангиоцитов максимальна через 3—5 сут. после ЧГ и сопровождается ветвлением желчных протоков, которое мы выявили при изучении экспрессии цитокератина 19. На этом же сроке происходит ветвление ветвей печеночной артерии, воротной и центральной вен. Ветвление элементов портального тракта подтверждается данными морфометрического анализа межпортальных расстояний, которые указывают на то, что через 5 сут. после ЧГ в паренхиме регенерирующей печени происходит уменьшение размеров печеночных долек, которое, видимо, достигается путем их деления. Наша гипотеза о возможности деления печеночных долек путем ветвления желчных протоков и сосудов портальных трактов в ходе репаративной регенерации также подтверждается результатами исследований с применением a-нафтилизотиоцианата. В экспериментах с повреждением печени a-нафтилизотиоцианатом было выявлено увеличение пролиферативных процессов с последующим ветвлением элементов портального тракта [13]. Также следует отметить, что интенсивное ветвление и рост сосудов печени в длину показаны при исследовании органогенеза печени, когда с 5 по 7 нед. гестации объем печени увеличивается в 100 раз и сосуды печени, адаптируясь к возрастающим функциональным нагрузкам, вынуждены претерпевать значительные изменения [14].

Подводя итог, можно сделать вывод, что во взрослой печени крыс в ходе репаративной регенерации после ЧГ происходят изменения микроструктуры, заключающиеся в последовательной гиперплазии и делении печеночных долек, которое в целом напоминает процессы, происходящие в ходе органогенеза печени.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований 12-04-97088-р_поволжье_а.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

105

ЛИТЕРАТУРА

1. Kiernan F. The anatomy and physiology of the liver. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol). 1833; 123: 711-70.

2. Mall F.P. A study of the structural unit of the liver. Am. J. Anat. 1906; 5: 277-308.

3. Rappaport A.M., Borowy A.J., Lougheed W.M. et al. Subdivision of hexagonal liver lobutes into a structural and functional unit. Anat. Rec. 1954; 119: 11-33.

4. Bloch E.H. The termination of hepatic arterioles and the functional unit of the liver as determined by microscopy of the living organ. Ann. NY Acad. Sci. 1970; 60: 78-87.

5. Higgins G.M., Anderson R.M. Experimental pathology of the liver: I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 1931; 12: 186-202.

6. Bucher N.R., Farmer S. Liver regeneration after partial hepatectomy: genes and metabolism. In: Strain A.J., Diehl A., editors. Liver growth and repair. London: Chapman and Hall, 1998; p. 3-27.

7. Taub R: Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5: 836-47.

8. Martinez-Hernandez A., Amenta P.S. The hepatic extracellular matrix. II. Ontogenesis, regeneration and cirrhosis. Virchows Arch. Pathol. Anat. Histopathol. 1993; 423; 77-84.

9. Higgins G.M., Anderson R.M. Experimental pathology of the liver: I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 1931; 12; 186-202.

10. Fujio K., Evarts R.P., Hu Z. et al. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat. Lab. Invest. 1994; 70(4): 511-6.

11. Fausto N. Hepatocyte differentiation and liver progenitor cells. Curr. Opin. Cell Biol. 1990; 2; 1036-42.

12. Taub R. Transcriptional control of liver regeneration. FASEB 1996; 10: 413-27.

13. Masyuk T.V., Ritman E.L., LaRusso N.F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver. Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. Am. J. Pathol. 2003; 162: 1175-82.

14. Collardeau-Frachon S., Scoazec J-Y. Vascular development and differentiation during human liver organogenesis. Anatom. Rec. 2008; 291: 614-27.

Поступила 28.08.2013

4-6 декабря, 2013

НАЦИОНАЛЬНЫЙ КОНГРЕСС ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ

НАЦИОНАЛЬНОЕ ОБЩЕСТВО РЕГЕНЕ РАТИ Б НОЯ МЕДИЦИНЫ

Москва, ул. Акэд. Опарина д. 4, ФГБУ НЦ ЛГиП им. В.м. Кулакова

Более-подробнз» информация на сайте wvuw.mediexparu

Стоимость регистрации на Конгресс

НДС не облагается

ЛаЙПТ.2СНЗ Г.

1500,

2000

р-

Организаторы:

Национальное общество регенеративной медицины

Конгресс-оператор МЕДИ Ивент

Пришло Прете! собрать под одной крышей RCCX СПецуцшиСТОИ. рдбрташцнХ d облаом бноТтанОЛоПчй, MJhpatiFluMHirix на ВОссТа удаление структуры к функции пряре-тДснмык тканей м OptaiKJH StifriOtou. ГЕ-негиковг инженеров, фармакологов, йрлчсй разных cix'u^jfibinxievi. чтобы дать нм возможность обменяться мнениями. представить результаты собственных исследований) кооперироваться для совместных научных проектов.

ОжццзетПн участив в конгрессе ведущих

HpyfewHbor слециалщтов.

Депмш младше Публикации игмш Шлет участие

бесплатно бесплатно

МЕДИ ЭКСПО

*7 Н95| 721-88-66, expogwiedlexpcLUj

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013