Применение обращенно-фазовой хроматографии для анализа бензэтония хлорида в глазных каплях

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.28: 617.07

Применение обращенно-фазовой хроматографии для анализа бензэтония хлорида в глазных каплях

А.С. Осипов, Е.Б. Нечаева, О.А. Победин

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, Москва, Россия

Резюме: Исследована возможность применения подвижных фаз с триэтиламином для количественного определения бензэтония хлорида в глазных каплях. Подвижные фазы представляют собой смесь ацетонитрила или метанола и 0,3% три-этиламмония фосфата (рН 3,0) в соотношении от 50:50 до 65:35. Наряду с колонками С8 хроматографические колонки с нитрильными и фенильными сорбентами также могут быть применены для количественного определения бенэтония хлорида. Наилучшие результаты хроматографирования бенэзтоний хлорида были получены на нитрильной колонке Zorbax Eclipse XDB—CN 150x4,6 мм (5 мкм) и на фенильной колонке АСЕ 3 Phenyl 150x4,6 мм (3 мкм). Эффективность колонок по пику бензэтония составила 6570—11200 т.т. Применение подвижных фаз, содержащих триэтиламмоний фосфат, по сравнению с подвижными фазами с тетрабутиламмонием гидросульфатом, позволит существенно снизить себестоимость аналитической работы по определению бензэтония хлорида.

Ключевые слова: ВЭЖХ; глазные капли; бензэтоний хлорид; триэтиламин.

Библиографическое описание: Осипов АС, Нечаева ЕБ, Победин ОА. Применение обращенно-фазовой хроматографии для анализа бензэтония хлорида в глазных каплях. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения 2014; 4: 12-16.

REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY FOR THE ANALYSIS OF BENZETHONIUM CHLORIDE IN EYE DROPS A.S. Osipov, E.B. Nechaeva, O.A. Pobedin

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russia

Abstract: The possibility of using mobile phases with triethylamine for the assay of benzethonium chloride in eye drops was studied. Mobile phases are the mixtures of acetonitrile or methanol and 0.3% triethylammonium phosphate (pH 3.0) in a ratio of 50:50 to 65:35. Along with C8 columns nitrile and phenyl sorbet chromatographic columns can be used for the assay ofbenzethonium chloride. Best results when performing benzethonium chloride chromatography were obtained on a nitrile column Zorbax Eclipse XDB—CN 150^4,6 mm (5 micron) and on a phenyl column ACE 3 Phenyl 150^4,6 mm (3 microns). The effectiveness of the columns to the peak of benzethonium was 6570-11200 theoretical plates. The use of mobile phases, containing triethylammonium phosphate, compared with mobile phases with tetrabutylammonium hydrogensulfate, will significantly reduce the cost of analytical work to identify benzethonium chloride.

Key words: HPLC; eye drops; benzethonium chloride; triethylamine.

Bibliographic description: Osipov AS, E.B. Nechaeva EB, O.A. Pobedin OA. Reverse phase chromatography for the analysis of benzethonium chloride in eye drops. Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products Bulletin 2014; 4: 12-16.

Бензэтоний хлорид применяется в офтальмологической практике как антисептическое средство. Кроме того, бензэтоний хлорид обладает некотьорыми другими фармакологическими свойствами [1—4]. Бензэтоний хлорид, обладая высокой гидрофобностью и четвертичной аминогруппой является достаточно трудным объектом для хроматографирования (рис. 1) по причине склонности к образованию мицелл в водных и водно-органических растворах. Препарат и его лекарственные формы описаны в Британской и Американской фармакопеях [5—7], однако методики анализа бензэтония хлорида с помощью метода ВЭЖХ в них до последнего времени не были приведены. Только в последней редакции монографии Американской фармакопеи (37 изд.) на субстанцию бензэтония хлорида приведена методика количественного определения препарата с помощью метода ВЭЖХ [8]. Для определения препарата рекомендовано использовать

хроматографическую колонку Zorbax Eclipse XDB-CN 150x4,6 мм (5 мкм). В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила и буферного раствора в соотношении 42:58. Буферный раствор представляет собой 2% раствор триэтиламина в воде, доведенный до значения рН 3,0 фосфорной кислотой (буферный раствор триэтиламмония фосфата). По литературным данным, наиболее часто для определения бензэтония хлорида в лекарственных препаратах применяют хро-матографирование на колонках с сорбентами С18 при использовании подвижных фаз, состоящих из смесей метанола и водных растворов аммония ацетата или 0,1% уксусной кислоты [9-11]. Известно применение ЯМР-спектроскопии для определения бензэтония хлорида в экстракте семян грейпфрута [12].

В глазных каплях отечественного производства количественное содержание бензэтоний хлорида либо не определяют совсем (только лишь подтверждают при-

Рис. 1. Структурная формула бензэтония хлорида

сутствие бензэтония хлорида в составе лекарственной формы методом ТСХ), либо для этого используют хро-матографирование испытуемых образцов на колонке с немодифицированным силикагелем (подвижная фаза: метанол — гексан — триэтиламин — уксусная кислота 800:200:5:1). В этой связи необходимо отметить, что подготовка водной пробы для нормально-фазовой хроматографии достаточно длительна и трудоемка, при этом существует возможность неконтролируемых потерь анализируемого образца. Впоследствии для определения бензэтоний хлорида в глазных каплях стали использовать хроматографирование на колонках с сорбентами С8. При этом применяют подвижную фазу, представляющую собой смесь 0,3% натрия додецилсульфата (рН 3,0) в воде и ацетонитрила в соотношении (35:65). Следует отметить, что полная отмывка хроматографической колонки от применявшегося в составе подвижной фазы детергента проблематична. Не полностью удаленный с колонки натрий додецилсульфат будет оказывать влияние на результат хроматографирования при переходе на иные условия анализа. Фактически, данная колонка может быть использована только с подвижными фазами, содержащими натрий додецилсульфат, что не всегда удобно в повседневной практике. В этой связи, по причине легкости отмывки хроматографической колонки от компонентов буферных растворов, применение подвижных фаз, содержащих триэтиламмоний фосфат, обладает очевидным преимуществом.

Ранее на колонках с сорбентами С8, нитрильной колонке 2огЪах СВ СК, а также на фенильной колонке «Диасфер Фенил» была показана перспективность применения ион-парного реагента тетрабутиламмо-ния гидросульфата (ТБА) для анализа бензэтоний хлорида в составе подвижных фаз, содержащих метанол или ацетонитрил [14—16]. При этом содержание метанола или ацетонитрила в подвижных фазах было сравнительно большое, соответственно 75% и 65%. Кроме того, определенным недостатком предложенной методики является использование ион-парного реагента ТБА. Следует отметить, что ион-парные реагенты квалификации для ВЭЖХ имеют высокую стоимость. С целью сокращения стоимости анализа было бы рационально уменьшить содержание органических модификаторов и исключить ТБА из состава подвижных фаз. В этой связи, следует отметить, что триэтиламин имеет существенно меньшую стоимость, чем ТБА и другие ион-парные реагенты.

Цель работы: Адаптация методики количественного определения бензэтония хлорида в фармакопейных субстанциях к условиям определения данного детергента в глазных каплях. Кроме того, целью работы также было исследование возможности применения хроматографических колонок с нитрильными и фенильными сорбентами для анализа бензэтоний хлорида в лекарственных препаратах с использованием подвижных фаз с триэтиламмония фосфатом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проводилась на хроматографе «Agilent», серия 1100 (Agilent Technologies, США). Использовали колонки: Zorbax Eclipse XDB—CN 150x4,6 мм, 5 мкм, Zorbax Rx C8 150x4,6 мм, 5 мкм, Zorbax CB CN 150x4,6 мм, 5 мкм (Agilent Technologies, США), Ace 3 Phenyl 150x4,6 мм, 3 мкм (Advanced Chromatography Technologies, Шотландия) и «Дисфер-110-Фенил» 150x4,6 мм, 5 мкм (БиоХимМак, Россия). Детектирование проводили при длине волны 230 нм. Скорость потока элюента — 1,0 мл/мин. Температура колонки — 25°С. Ввод образцов в объеме 20 или 10 мкл. В качестве рабочего стандартного образца применяли бензэтоний хлорид производства (ФГУП «ЦХЛС—ВНИХФИ», Россия). Анализировали два противоглаукомных препарата в виде глазных капель: препарат № 1 (клофелин+проксодалол) и препарат № 2 (пилокарпин+проксодалол) [13] производства ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия. Пробы перед анализом разводили 1:1 подвижными фазами, либо вводили в прибор без разведения. Испытуемые растворы перед введением в хроматограф фильтровали через мембранный капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм (Био-ХимМак, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Необходимо отметить, что концентрация бензэто-ний хлорида в глазных каплях невелика — 0,1мг/мл, а среди компонентов препаратов, способных удерживаться на обращенно-фазовой колонке, бензэтоний хлорид составляет по массе 0,815% в препарате № 1 и лишь 0,497% в препарате № 2. Однако, пик бензэ-тония в глазных каплях при применении подвижных фаз, содержащих триэтиламмоний фосфат, уверенно детектируется (рис. 2 и 3). В большей части исследованных условий хроматографирования эффективность колонок по пику бензэтония составляла свыше 5000 теоретических тарелок (т.т.).

Хроматографирование препарата № 1 проводилось более детально. Некоторые результаты хромато-графирования препарата приведены в табл. 1, объем ввода образца в хроматограф — 20 мкл. Подвижные фазы были подобраны таким образом, чтобы время удерживания бензэтония составляло около 4—5 мин. Это обусловлено не только целью сокращения времени анализа. По причине низкой концентрации бенэ-тония хлорида в лекарственных препаратах, с целью

Рис. 2. Хроматограмма глазнъа капель — препарат № 1.

Условия анализа: колонка АСЕ 3 Phenyl 150*4,6мм (3мкм); подвижная фаза: ацетонитрил — 0,3% триэтиламина фосфат в воде, pH3,0 (60:40); скорость потока — 1,0мл/мин; детектирование при 230 нм. 1 — бензэтоний хлорид

Рис. 3. Хроматограмма глазнъа капель — препарат № 2. Условия анализа: колонка Zorbax Eclipse XDB-CN 150*4,6мм (5мкм); подвижная фаза: метанол — 0,3%, триэтиламина фосфат в воде, pH3,0 (64:35); скорость потока — 1,0 мл/мин; детектирование при 230 нм. 1 — бензэтоний хлорид

повышения точности измерений, желательно, чтобы высота пика бензэтония была больше.

Хроматографирование препарата № 1 проводи -лось более детально. Некоторые результаты хромато-графирования препарата приведены в табл. 1, объем ввода образца в хроматограф - 20 мкл. Подвижные фазы были подобраны таким образом, чтобы время удерживания бензэтония составляло около 4-5 мин. Это обусловлено не только целью сокращения времени анализа. По причине низкой концентрации бенэ-тония хлорида в лекарственных препаратах, с целью повышения точности измерений, желательно, чтобы высота пика бензэтония была больше.

Наилучшие результаты хроматографирования бе-нэтоний хлорида были получены на нитрильной колонке Zorbax Eclipse XDB-CN и на фенильной колонке АСЕ 3 Phenyl, эффективность колонок по пику бензэтония составила 6570-11200 т.т. В отличие от этого, при анализе глазных капель на колонке Zorbax CB CN не происходило образование пика бензэтония правильной формы (пик «раздваивался»). Повышение температуры хроматографирования до 40оС улучшает форму пика бензэтония, однако эффективность колонки остается низкой (табл. 1). Необходимо отметить, что при анализе глазных капель на колонке Zorbax CB CN с использованием подвижных фаз с ТБА всегда формировались пики бензэтония правильной формы, и эффективность колонки была свыше 6000 т.т. [16].

Следует отметить, что ввод образцов глазных капель без разведения в хроматограф закономерно по-

вышал площадь пика бензэтония в два раза, однако при этом эффективность колонки сокращалась на 42—47% в зависимости от типа колонки и состава подвижной фазы. С сокращением доли органического модификатора в подвижной фазе и, соответственно, с увеличением времени удерживания бензэто-ния различие в эффективности колонок, вызванное разным способом введения образца, уменьшалось. Также повышало эффективность хроматографиче-ских колонок по пику бензэтония уменьшение объема ввода образца препаратов без разведения с 20 до 10 мкл. При вводе образцов без разведения в объеме 10 мкл, эффективность хроматографических колонок была лишь на 19—23% меньше, чем при вводе образцов с разведением 1:1 подвижными фазами.

ВЫВОДЫ

1. Применение подвижных фаз, содержащих три-этиламмоний фосфат, по сравнению с подвижными фазами с тетрабутиламмонием гидросульфатом, позволит существенно снизить себестоимость аналитической работы по определению бензэтония хлорида.

2. Наряду с колонками С8 хроматографические колонки с нитрильными и фенильными сорбентами также могут быть применены для количественного определения бензэтония хлорида. Кроме того, анализ на хроматографических колонках с нитрильными сорбентами позволяет уменьшить содержание ацето-нитрила или метанола в подвижных фазах, что также снижает себестоимость проведения измерений.

Таблица 1

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПИКА БЕНЗЭТОНИЯ ПРИ АНАЛИЗЕ ПРЕПАРАТА «ПРОКСОФЕЛИН», ПОЛУЧЕННЫЕ НА РАЗЛИЧНЫХ КОЛОНКАХ

Наименование колонки; скорость потока; состав подвижной фазы Время удерживания (минуты) Эффективность колонки (в теоретических тарелках) Коэффициент асимметрии пика

Zorbax Rx C8 150x4,6 мм (5 мкм); 1,0 мл/мин; ацетони-трил - 0,3%, триэтиламина фосфат в воде рН 3,0 (60:40) 4,35 4100 1,46

Zorbax Rx C8 150x4,6 мм (5 мкм); 1,0 мл/мин; метанол — 0,3%, триэтиламина фосфат в воде рН 3,0 (75:25) 5,47 4770 1,46

Zorbax Eclipse XDB—CN 150x4,6 мм (5 мкм); 1,0 мл/мин; ацетонитрил — 0,3% триэтиламина фосфат в воде pH 3,0 (50:50) 3,97 7890 1,11

Zorbax Eclipse XDB-CN 150x4,6 мм (5мкм); 1,0 мл/мин; метанол — 0,3% триэтиламина фосфат в воде pH 3,0 (65:35) 3,40 6570 1,02

Zorbax CB-CN 150x4,6 мм (5мкм); 1,0 мл/мин; ацетонитрил — 0,3%, триэтиламина фосфат в воде, pH 3,0 (55:45), 40оС 4,05 2160 1,31

АСЕ 3 Phenyl 150x4,6 мм (3мкм) 1,0 мл/мин; ацетонитрил — 0,3%, триэтиламина фосфат в воде, рН 3,0 (60:40) 4,71 9850 1,19

АСЕ 3 Phenyl 150x4,6 мм (3мкм) 1,0 мл/мин; метанол — 0,3%, триэтиламина фосфат в воде, рН 3,0 (80:20) 4,74 11200 1,06

Диасфер—110—Фенил 150x4,6 мм (5мкм); 1,0 мл/мин; ацетонитрил — 0,3%, триэтиламина фосфат в воде pH 3,0 (60:40) 4,94 7350 1,05

Диасфер—110—Фенил 150x4,6 мм (5мкм); 1,0 мл/мин; ацетонитрил — 0,3%, триэтиламина фосфат в воде pH 3,0 (65:35) 4,47 5840 1,09

ЛИТЕРАТУРА

REFERENCES

1. Lang E, Jilani K, Zelenak C, Pasham V, Bobbala D, Qadri SM, Lang F. Stimulation of suicidal erythrocyte death by benzethonium. Cellular Physiology and Biochemistry 2011; 28 (2): 347-54.

2. Zaman Z, Speeleveld E, Sneyers L, Desmet K. Inhibition of acetylcholine esterase and choline esterase by benzethonium chloride and avoidance of the benzethonium chloride carry-over inhibitory effect. European Journal Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 1997; 35(8): 603-607.

3. Pitaro J Mood ZA, Daniel SJ. Ototoxicity of aluminum acetate/benzetho-nium chloride otic solution in the chinchilla animal model. The Laryngoscope 2013; 123(10): 2521-25.

4. Coates KM, Flood P. Ketamine and its preservative, benzethonium chloride, both inhibit human recombinant alpha7 and alpha4beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptors in Xenopus oocytes. British Journal of Pharmacology 2001; 134(4): 871-9.

5. British Pharmacopoeia 2009. Monograph: Benzethonium Chloride.

6. United State Pharmacopoeia 36 ed. Monograph: Benzethonium Chloride.

7. United State Pharmacopoeia 36 ed. Monograph: Benzethonium Chloride Tincture.

8. United State Pharmacopoeia 37 ed. Monograph: Benzethonium Chloride.

9. Wang H, Del Grosso AV, May JC. Determination of benzethonium chloride in anthrax vaccine adsorbed by HPLC. Biologicals 2006; 34 (4): 257-63.

10. Antoniou CG, Markopoulou CK, Kouskoura MG, Koundourellis JE. Study and development of reversed-phase HPLC systems for the determination of 2-imidazolines in the presence of preservatives in pharmaceutical preparations. Journal of AOAC Internation 2011; 94(3): 703-12.

11. Avula B, Dentali S, Khan A. Simultaneous identification and quantification by liquid chromatography of benzethonium chloride, methyl paraben and triclosan in commercial products labeled as seed extract. Pharmazie 2007; 62(3): 593-6.

12. Bekiroglu S, Myrberg O, Ostman K, Ek M, Arvidsson T, Rundlöf T et al. Validation of a quantitative NMR method for suspected counterfeit products exemplified on determination of benzethonium chloride in grape-

1. Lang E, Jilani K, Zelenak C, Pasham V, Bobbala D, Qadri SM, Lang F. Stimulation of suicidal erythrocyte death by benzethonium. Cellular Physiology and Biochemistry 2011; 28 (2): 347-54.

2. Zaman Z, Speeleveld E, Sneyers L, Desmet K. Inhibition of acetylcholine esterase and choline esterase by benzethonium chloride and avoidance of the benzethonium chloride carry-over inhibitory effect. European Journal Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 1997; 35(8): 603-607.

3. Pitaro J Mood ZA, Daniel SJ. Ototoxicity of aluminum acetate/benzetho-nium chloride otic solution in the chinchilla animal model. The Laryngoscope 2013; 123(10): 2521-25.

4. Coates KM, Flood P. Ketamine and its preservative, benzethonium chloride, both inhibit human recombinant alpha7 and alpha4beta2 neuronal nicotinic acetylcholine receptors in Xenopus oocytes. British Journal of Pharmacology 2001; 134(4): 871-9.

5. British Pharmacopoeia 2009. Monograph: Benzethonium Chloride.

6. United State Pharmacopoeia 36 ed. Monograph: Benzethonium Chloride.

7. United State Pharmacopoeia 36 ed. Monograph: Benzethonium Chloride Tincture.

8. United State Pharmacopoeia 37 ed. Monograph: Benzethonium Chloride.

9. Wang H, Del Grosso AV, May JC. Determination of benzethonium chloride in anthrax vaccine adsorbed by HPLC. Biologicals 2006; 34 (4): 257-63.

10. Antoniou CG, Markopoulou CK, Kouskoura MG, Koundourellis JE. Study and development of reversed-phase HPLC systems for the determination of 2-imidazolines in the presence of preservatives in pharmaceutical preparations. Journal of AOAC Internation 2011; 94(3): 703-12.

11. Avula B, Dentali S, Khan A. Simultaneous identification and quantification by liquid chromatography of benzethonium chloride, methyl paraben and triclosan in commercial products labeled as seed extract. Pharmazie 2007; 62(3): 593-6.

12. Bekiroglu S, Myrberg O, Ostman K, Ek M, Arvidsson T, Rundlöf T et al. Validation of a quantitative NMR method for suspected counterfeit products exemplified on determination of benzethonium chloride in grapefruit seed

fruit seed extracts. Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis 2008; 47(4-5): 958-61.

13. Машковский МД. Лекарственные средства. 16-е изд. М.: Новая волна; 13. 2010.

14. Орлов ЕН, Осипов АС. Применение ион-парной хроматографии для 14. анализа бензэтония хлорида. В кн.: Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Выпуск 67. Пятигорск; 2012.

15. Осипов АС, Орлов ЕН. Применение метода ВЭЖХ для анализа 15. бензэтония хлорида в глазных каплях. Химико-фармацевтический журнал 2012; 46(11): 41-43.

16. Осипов АС, Нечаева ЕБ, Победин ОА, Орлов ЕН. Применение ион- 16. парной хроматографии для анализа бензэтония хлорида в глазных каплях. Разработка и регистрация лекарственных средств 2014; (2): 86-90.

extracts. Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis 2008; 47(4-5): 958-61.

Mashkovskiy MD. The Medicines. 16th ed. Moscow: Novaya volna; 2010 (in Russian).

Orlov EN, Osipov AS. The use of ion-pair chromatography for the analysis of benzethonium chloride. Development, research and marketing of new pharmaceutical products. Issue 67. Pyatigorsk; 2012 (in Russian). Osipov AS, Orlov EN. Application of HPLC for analysis of benzethonium chloride in eyedrops.Himiko-farmatsevticheskiy zhurnal 2012; 46(11): 41-43 (in Russian).

Osipov AS, Nechaeva EB, Pobedin OA, Orlov EN. The use of ion-pair chromatography for the analysis of benzethonium chloride in eyedrops. Raz-rabotka i registratsiya lekarstvennyh sredstv 2014; (2): 86-90 (in Russian).

ОБ АВТОРАХ:

AUTHORS:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Осипов Алексей Сергеевич. Главный эксперт лаборатории химико-фармацевтических препаратов № 2, канд. биол. наук. Нечаева Екатерина Борисовна. Заместитель начальника Испытательного центра экспертизы качества лекар ственных средств, канд. фарм. наук. Победин Олег Александрович. Ведущий эксперт лаборатории химико-фармацевтических препаратов № 2, канд. фарм. наук.

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8 Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation. Osipov /45. Chief expert of laboratory of chemical and pharmaceutical products № 2. Candidate of Biological Sciences.

Nechaeva EB. Deputy chief of Test center of quality expertise of medicines. Candidate of Pharmaceutical Sciences.

Pobedin OA. Leading expert of laboratory of chemical and pharmaceutical products № 2. Candidate of Pharmaceutical Sciences.

АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:

Осипов Алексей Сергеевич; Osipov@expmed.ru

Статья поступила 05. 09.2014 г.

Принята к печати 10.10.2014г.