Штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris Yst-HSA-PDI1, продуцирующий рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин
METHYLOTROPHIC YEAST STRAIN PICHIA PASTORIS YST-HSA-PDI1, PRODUCING RECOMBINANT HUMAN SERUM ALBUMIN

Изобретение относится к биофармакологии, препаративной биохимии, биотехнологии и медицине и касается препарата человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и способа его получения.
Объектом изобретения является штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastorisYst-HSA-PDI1, продуцирующий рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин.
Альбумин является наиболее распространенным растворимым белком позвоночных и в то же время представляет собой белок с самой высокой концентрацией в плазме.
У людей ЧСА продуцируется в печени в виде глобулярного, негликозилированного белка с молекулярной массой 65 кДа. Данный белок участвует в большом числе существенных функций, которые включают регуляцию кровяного давления в системе циркуляции, а также транспортировку жирных кислот, аминокислот, желчных пигментов и многих молекул сыворотки.
Для поддержания нормального осмотического давления у пациента, страдающего от потери жидкости, такой как в случае хирургической операции, шока, ожога или отека, ЧСА вводят в качестве заменителя плазмы. Для данной цели ЧСА в настоящее время производят путем фракционирования крови, собранной у доноров крови. Однако данный способ получения неизбежно включает опасность контаминации инфекционными агентами, такими как вирус гепатита, вирус иммунодефицита человека и т.д. Поэтому очистка ЧСА из крови человека включает пастеризацию продукта и является очень дорогостоящей.
Клонирование кДНК, кодирующей ЧСА, в экспрессионный вектор, трансформация бактериальных или дрожжевых клеток хозяина с использованием данного вектора, культивирование трансформированных хозяев и выделение полученного таким образом ЧСА описаны, например, в ЕР 091527, ЕР 366400, ЕР 612761 и в публикации [Li В. et al. А novel protein expression system-РiсhiаРink™-аnd а protocol for fast and efficient recomblnant protein expression. AfricanJournalofBiotechnology, 2011, У.10, No.83, P.l9464-19472].Одна из проблем, связанных с выделением ЧСА из рекомбинантных клеток хозяина, основывается на том факте, что остаточные микробные компоненты, такие как бактериальные или дрожжевые белки или липиды, являются высокоантигенными для человека и, таким образом, ЧСА должен быть достаточно очищен.
Тот факт, что ЧСА, как белку-носителю, присуща связывающая активность в отношении множества микробных продуктов и компонентов культуры ткани, дополнительно усложняет схему счистки и ее результативность.
Это связано с ростом содержания в культуральной жидкости продуктов крови, таких как факторы коагуляции, получаемых путем рекомбинантной экспрессии генов, кодирующих данные факторы. Предполагается, что динамика рынка будет далее повышать относительную стоимость очистки ЧСА из крови. Для обеспечения достаточной поставки ЧСА для фармацевтического применения в данной области разработаны различные альтернативные способы получения ЧСА, в большей части которых применяется рекомбинантная экспрессия генов, кодирующих данный белок.
Штамм Pichia pastoris «PichiaPink Strain 4» является нокаутным по генам двух протеаз - pep4 и prb1. Эти протеазы вносят значимый вклад в протеолитическую активность в процессе культивирования дрожжевых клеток и экспрессии рекомбинантных белков, что может приводить к значительному уменьшению содержания интактных целевых белков и затруднениям в процессе их очистки.
Как известно из литературных данных, коэкспрессия дисульфидизомеразы PDI1 Pichiapastoris может существенно увеличить уровень продукции целевого рекомбинантного белка [YangJ. et al.Effect of cooperation of chaperones and gene dosageon the expression of porcine PGLYRP-1 in Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol., 2016, No.100, P.5453–5465] клетками дрожжей Pichiapastoris.
Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ и препарат, описанный в публикации [Li В. et al. А novel protein expression system-РiсhiаРink™-апd а protocol for fast and efficient recombinant protein expression. African Journal of Biotechnology, 2011, У.10, No.83, P.l9464-19472], изкоторойизвестенрекомбинантныйштамм-продуцентЧСА, полученный путем трансформации штаммов Pichia pastoris «PichiaPink Strain1-4» плазмидой pPink-НС, вкоторуюпосайтам EcoRI и KpnI вставленануклеотиднаяпоследовательность, кодирующаясигнальнуюпоследовательностьЧСАиЧСА. Указанная плазмида содержит обязательные для pPink-НС элементы, включающие нуклеотидные последовательности промотора, нативного терминатора и сигнала полиаденилирования АОХ1 гена алкогольгидрогеназы 1, последовательность TRP2 гена, последовательность гена ADE2 фосфорибозиламиноимидазол карбоксилазы. Полученные штаммы-продуценты секретировали ЧСА в диапазоне 73-334 мг/л. Также авторами продемонстрирован значительно меньший уровень протеолитической деградации с случае использования штаммов Pichiapastoris «PichiaPinkStrain 2-4», по сравнению с «PichiaPinkStrain 1». Данная публикация и была принята в качестве прототипа.
Технической проблемой настоящего изобретения является получение штамма метилотрофных дрожжей P.pastoris, секретирующегорекомбинантный сывороточный альбумин в культуральную среду на уровне, превышающем 1г/л в условиях роста в минимальной солевой среде и минимальной протеолитической деградацией целевого белка.
Поставленная техническая проблема решается за счет:
использования штамма Pichia pastoris «PichiaPink Strain 4», являющегося нокаутным по генам протеаз pep4 и prb1, вносящих значимый вклад в протеолитическую активность в процессе культивирования дрожжевых клеток и экспрессии рекомбинантных белков,
получения штамма Yst-HSA секретирующего рекомбинантный сывороточный альбумин человека в культуральную среду способом, описанным в работе (Li В. etal.А novel protein expression system-РiсhiаРink™-аnd а protocol for fast and efficient recombinant protein expression.African Journal of Biotechnology, 2011, У.10, No.83, P.l9464-19472), путем трансформации штамма метилотрофных дрожжей P.pastoris «PichiaPink Strain 4» экспрессионной генетической конструкцией рPink-HSA, содержащей нуклеотидную последовательность к ДНК сывороточного альбумина человека вместе с собственной сигнальной последовательностью (проЧСА). Генетическая конструкция рPink-HSA ( Фиг. 1А,SEQ ID NO: 1) получена на основе рPink-HС (Invitorgen) и содержит ген фосфорибозиламиноимидазол карбоксилазы ADE2, участвующей в биосинтезе пуриновых нуклеотидов, который способен комплементировать ауксотрофность по аденину исходного штамма «PichiaPink Strain 4»,трансформации клеток полученного штамма Yst-HSA экспрессионной генетической конструкцией pFLD1-PDI1 (Фиг. 1Б, SEQ ID NO: 2), содержащей нуклеотидную последовательность гена дисульфидизомеразы PDI1Pichiapastoris, с получением таким образом штамма Yst-HSA-PDI1, секретирующего рекомбинантный сывороточный альбумин человека в культуральную среду на уровне 1,4 г/л.
культивирования клеток штамма-продуцента в модифицированной минимальной солевой среде в условиях роста при высокой плотности в ферментере.
Обозначение «рPink» и «pFLD1» в экспрессионных генетических конструкциях рPink-HSA и pFLD1-PDI1 отражает содержание структурных элементов плазмидных ДНК рPink и pFLD1(“Invitrogen”, США) соответственно.
Генетическая конструкция рPink-HSA(Фиг.1А, SEQ ID NO: 1) содержит:
промотор гена алкогольоксидазы1 АОХ1 (5АОХ1) дрожжей Pichiapastoris,
нуклеотидную последовательность кДНК гена сывороточного альбумина человека, вместе с собственной сигнальной последовательностью proHSA (указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «HSA»),
3´-концевую последовательность гена цитохрома С1CYC1 Saccharomycescerevisiae,
точку начала репликации плазмид pUCori,
последовательность гена bla, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов E.coli к антибиотику ампициллин,
нуклеотидную последовательность гена фосфорибозиламиноимидазол карбоксилазы ADE2 под контролем собственного укороченного промотора,
нуклеотидную последовательность гена TRP2, необходимую для интеграции в TRP2 локус геномной ДНК клеток Pichiapastoris.
Генетическая конструкция pFLD1-PDI1 содержит (Фиг. 1Б, SEQ ID NO: 2):
нуклеотидную последовательность промотора формальдегид дегидрогеназы1 дрожжей P.pastoris(указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «FLD1»),
нуклеотидную последовательность гена дисульфидизомеразы PDI1 дрожжей P.pastoris(указанные структурные признаки отражены во введенном обозначении «PDI1»),
нативный терминатор и сигнал полиаденилирования гена алкоголь оксидазы AOX1 дрожжей Pichiapastoris,
последовательность гена фактора элонгации 1SaccharomycescerevisiaeTEF1,
промоторную последовательность T7,
последовательность гена блеомицина BleoRStreptoalloteichushindustanus, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к антибиотику зеоцину,
3´-концевую последовательность гена цитохрома С1CYC1 Saccharomycescerevisiae,
последовательность гена bla, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов E.coli к антибиотику ампициллин,
точку начала репликации плазмид pUCori.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма метилотрофных дрожжей PichiapastorisYst-HSA-PDI1, секретирующего человеческий сывороточный альбумин в культуральную среду на уровне 1,4 г/л в условиях роста в модифицированной минимальной солевой среде.
Данный технический результат достигается заявленным способом получения рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), включающим выделение и очистку из содержащего его источника. Для выделения ЧСА предварительно получают штамм-продуцент Yst-HSA дрожжей P.pastoris, на основе стабильно трансформированных клеток метилотрофных дрожжей P.pastoris штамма «PichiaPink Strain 4» способом, описанном в работе (Li В. etal.А novel protein expression system-РiсhiаРink™-аnd а protocol for fast and efficient recombinant protein expression.AfricanJournalofBiotechnology, 2011, У.10, No.83, P.l9464-19472), рекомбинантной генетической конструкцией рPink-HSA, содержащей нуклеотидную последовательность кДНК сывороточного альбумина человека вместе с собственной сигнальной последовательностью под контролем промотора гена алкогольоксидазы1 АОХ1 дрожжей P.pastoris.Генетическая конструкция рPink-HSA помимо нуклеотидной последовательности кДНК гена сывороточного альбумина человека, вместе с собственной сигнальной последовательностью под контролем промотора AOX1 гена алкогольгидрогеназы I содержит нуклеотидную последовательность гена ADE2 фосфорибозиламиноимидазол карбоксилазы под контролем собственного укороченного промотора (13 п.о.). Продукт гена ADE2 способен комплементировать ауксотрофность по аденину у трансформированных им клеток, а за счет укороченного промотора гена ADE2 степень ауксотрофности может быть детектирована окраской полученных трансформантов, что позволяет отбирать клоны, содержащие максимальное количество интегрированных генетических конструкций рPink-HSA, и,соответственно, максимальное количество интегрированных копий гена ЧСА. Затем получают штамм-продуцент Yst-HSA-PDI1 путем трансформации клеток полученного штамма Yst-HSA генетической конструкцией pFLD1-PDI1. Генетическая конструкция pFLD1-PDI1 содержит нуклеотидную последовательность гена дисульфидизомеразы PDI1 под контролем промотора формальдегид дегидрогеназы 1FLD1 дрожжей P.pastoris, что позволяет увеличить  продукцию ЧСА клетками полученного штамма Yst-HSA-PDI1 по сравнению с исходным штаммом Yst-HSA.
Результирующий штамм-продуцент Yst-HSA-PDI1 выращивают в модифицированной минимальной питательной среде в условиях культивирования в ферментере, затем отобранную культуральную среду осветляют последовательным центрифугированием при 2000 и 10000 g, супернатант концентрируют ультрафильтрацией, диализуют, проводят катионообменную хроматографию на колонке Source S. Адсорбированный ЧСА элюируют фосфатным буфером, элюат содержит рекомбинантный ЧСА.
Полученный ЧСА может быть использован в качестве препарата для различных медицинских целей.
Заявленное изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:
Фиг.1 – Схема экспрессионных генетических конструкций рPink-HSA (А) и pFLD1-PDI1 (Б).
Фиг.2 – Электрофореграмма в 1% агарозном геле продуктов ПЦР полученных при амплификации последовательности проЧСА с: (2-4) - геномной ДНК полученных трансформантов; (6) - геномной ДНК штамма «PichiaPink Strain 4»P. рastoris; (1,5) - плазмидной ДНК рPink-HSA. (М) - маркер молекулярных масс. Верхняя яркая полоса – 3000п.о., далее вниз – 2000, 1500 п.о., нижняя яркая полоса -1000 п.о.
Фиг.3 – Электрофореграмма в 10% ПААГ аликвот культуральной среды после экспрессии ЧСА клетками 1-4 – рекомбинантных клонов штамма Yst-HSA-PDI1, 5 – препарат ЧСА, выделенного из сыворотки крови, Pink – культуральная среда после культивирования клеток P.pastoris штамма PichiaPinkStrain4. М – маркер молекулярных масс: 130, 110, 70 (красная полоса), 55, 40 и 35 кДа.
Фиг.4 – Электрофоретический анализ препарата ЧСА. Левая дорожка – маркер молекулярных масс белков (PageRulerPrestainedProteinLadder). Правая дорожка – рекомбинантный сывороточный альбумин, 15 мкг/лунка.
Изобретение иллюстрируют следующими примерами.
ПРИМЕР 1
Получение штамма Yst-HSA.
Нуклеотидную последовательность проЧСА амплифицируют методом ПЦР с полученной нами ранее плазмидной ДНК рPIC9-HSAс использованием специфических олигонуклеотидов
(5') AATAGAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATT
(5') AATAGGTACCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG,
комплементарных 5'- и 3'-концам последовательности проЧСА, соответственно, и содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции EcoRI и KpnI. ПЦР-продукт размером около 1800 п.о., содержащий последовательность проЧСА, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции EcoRI и KpnI и, после очистки из агарозного геля, объединяют в реакции лигирования с аналогично рестрицированным вектором pPink-HC (“Invitrogen”, США). Полученной лигазной смесью трансформируют электрокомпетентные клетки штамма E. coli DH5α. Нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий сывороточный альбумин (V00495), определяют в составе конструкции pPink-HSA секвенированием по методу Сенгера. ДНК плазмиды pPink-HSA линеаризируют по сайту SpeI, и полученным набором фрагментов ДНК трансформируют электрокомпетентные клетки P. pastoris штамма «PichiaPink Strain 4» методом электропорации. Селекцию трансформантов осуществляют на селективной среде, не содержащий аденин.
ПРИМЕР 2
Анализ интеграции нуклеотидной последовательности проЧСА в дрожжевой геном штамма «PichiaPink Strain 4».
Полученные трансформанты тестируют на чашках с агаризованной средой PAD, не содержащей аденина. В результате визуального контроля среди полученных трансформантов отбирают несколько клонов с диапазоном окраски от розового до белого. Наличие нуклеотидной последовательности проЧСА в дрожжевом геноме анализируют при помощи метода ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов, соответствующих 5’- и 3’- концам последовательности проЧСА. При использовании в качестве матрицы геномной ДНК рекомбинантных клонов и плазмидной ДНК вектора pPink-ЧСА получают фрагменты ДНК размером около 1800 п.о., соответствующие последовательности проЧСА. В случае геномной ДНК штамма GS115 появление фрагмента не наблюдают (Фиг. 2).
ПРИМЕР 3
Выбор клона штамма-продуцента рекомбинантного сывороточного альбумина человека Yst-HSA.
Для выбора штамма-продуцента ЧСА (Yst-HSA) среди отобранных трансформантов по результатам аналитической экспрессии выбирают клон, обеспечивающий максимальный уровень экспрессии целевого белка. Для этого исследуемые клоны вносят в 10 мл полной жидкой среды BMMG, рН=6.0 (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 50 мМ глюкоза, 100 mM калий-фосфатный буфер, рН=6.0, 13.4 г/л дрожжевой азотной основы, 1.6 мкМ биотин, 2% глицерин) и инкубировуют 24 часа при 30°С при перемешивании. Далее выросшие клетки осаждают центрифугированием и клеточный осадок суспендируют пипетированием в 1 мл среды BMMY, рН=6.0 (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1% метанол, 100 mM калий-фосфатный буфер, рН=6.0, 13.4 г/л дрожжевой азотной основы, 1.6 мкМ биотин) для индукции экспрессии. Через 24 часа клетки удаляют центрифугированием и аликвоты супернатантов анализируют с помощью электрофореза в ПААГе. По результатам электрофоретического анализа среди проанализированных клонов был выбран один с лучшим уровнем экспрессии ЧСА, называемый далее Yst-HSA.
ПРИМЕР 4
Получение штамма-продуцента рекомбинантного сывороточного альбумина человека Yst-HSA-PDI1.
Нуклеотидную последовательность PDI1 амплифицируют методом ПЦР с геномной ДНК P. pastoris с использованием специфических олигонуклеотидов
(5') AATACACGTGAAACGATGCAATTCAACTGGGATATT и
(5') AATACTCGAGTTAAAGCTCGTCGTGAGCGT,
комплементарных 5'- и 3'-концам последовательности проЧСА, соответственно, и содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции PmlI и XhoI. ПЦР-продукт размером около 1800 п.о., содержащий последовательность дисульфидизомеразы PDI1, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции PmlI и XhoI и, после очистки из агарозного геля, объединяют в реакции лигирования с вектором pFLD1(“Invitrogen”, США)предварительно рестрицированнымэндонуклеазами рестрикции PmlI и SalI. Полученной лигазной смесью трансформируют электрокомпетентные клетки штамма E. coli  DH5α. Нуклеотидную последовательность, кодирующую  дисульфидизомеразы PDI1, определяют в составе конструкции pFLD1-PDI1 секвенированием по методу Сенгера. ДНК плазмиды  pFLD1-PDI1 линеаризируют по сайту ClaI, и полученным набором фрагментов ДНК трансформируют электрокомпетентные клетки P. pastoris штамма pPink-HSA методом электропорации. Селекцию трансформантов осуществляют на селективной среде, содержащий антибиотик зеоцин 100 мкг/мл.
ПРИМЕР 5
Выбор клона штамма-продуцента рекомбинантного сывороточного альбумина человека Yst-HSА-PDI1.
Для выбора штамма-продуцента ЧСА (Yst-HSA-PDI1) среди отобранных трансформантов по результатам аналитической экспрессии выбирают клон, обеспечивающий максимальный уровень экспрессии целевого белка. Для этого исследуемые клоны вносят в 10 мл полной жидкой среды BMMG, рН=6.0 (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 50 мМ глюкоза, 100 mM калий-фосфатный буфер, рН=6.0, 13.4 г/л дрожжевой азотной основы, 1.6 мкМ биотин, 2% глицерин) и инкубируют 24 часа при 30°С при перемешивании. Далее выросшие клетки осаждают центрифугированием и клеточный осадок суспендируют пипетированием в 1 мл среды BMMY, рН=6.0 (20 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1% метанол, 100 mM калий-фосфатный буфер, рН=6.0, 13.4 г/л дрожжевой азотной основы, 1.6 мкМ биотин) для индукции экспрессии. Через 24 часа клетки удаляют центрифугированием и аликвоты супернатантов анализируют с помощью электрофореза в ПААГе. По результатам электрофоретического анализа среди проанализированных клонов был выбран один с лучшим уровнем экспрессии ЧСА, называемый далее Yst-HSA-PDI1 (Фиг. 3).
ПРИМЕР 6
Получение препарата рекомбинантного сывороточного альбумина человека.
Наработка образца ЧСА клетками полученного штамма Yst-HSA-PDI1 осуществлялась в условиях культивирования в 2 литровом ферментере согласно изложенной ниже методике.
Для приготовления инокулята в качалочную колбу с 100 мл жидкой питательной средой BMMG, рН=6.0 петлей вносят одну типичную колонию штамма-продуцента ЧСАYst-HSA-PDI1. Колбу с посевом помещают в термостатируемую качалку и инкубируют в течение 48 часов при температуре 30ºС и 300 оборотах в минуту. Далее в ферментере, содержащем 1л стерильной модифицированной питательной среды BSM1 (26.7 мл/л 85 % фосфорной кислоты, 0.93 г/л сульфата кальция, 18.2 г/л сульфата калия, 14.9 г/л сульфата магния семиводного, 2.5 г/л гидроксида калия, 40 г/л глицерина) и 4,5 мл  солевого стока PTM1 (6 г/л сульфата меди пятиводного, 80 мг/л йодида натрия, 30 г/л моногидрата сульфата марганца, 200 мг/л молибдата натрия двухводного, 20 мг/л борной кислоты, 500 мг/л хлорида кобальта, 20 г/л хлорида цинка, 35 г/л соли Мора, 2 г/л биотина, 5 мл/л концентрированной серной кислоты), устанавливают следующие параметры: скорость вращения мешалки 1200 оборотов в минуту, подача стерильного воздуха в количестве 15 л в минуту, показания датчика растворенного кислорода (рО2) – 100%, температура - 30°С. После достижения установленных значений производят засев ферментера 100мл инокулята. Автоматическое регулирование рН на протяжении ферментационного процесса осуществляют 28%-ым раствором гидроксида аммония. Пеногаситель (Лапрол, Россия) добавлялся автоматически по мере необходимости. Первую фазу ферментации ведут в течение 36 часов до потребления всего содержащегося в среде глицерина, т.е. до увеличения уровня растворенного кислорода до 95%.
Вторую фазу ферментации ведут путем подачи раствора 50% глицерина, содержащий 12 мл солевого стока PTM1 на каждый литр раствора глицерина, с постоянной скоростью 18 мл/час с помощью перистальтического насоса до достижения веса влажной биомассы значения 220 г/л.
Для индукции экспрессии биосинтеза ЧСА (третья стадия ферментации) прекращают подачу питательного раствора и ведут ферментацию до увеличения уровня растворенного кислорода до 95%, одновременно понижая температуру культуральной жидкости до 24ºС. После достижения заданных значений начинают вводить метанол, содержащего 12 мл солевого стока PTM1 на каждый литр метанола при помощи перистальтического насоса. Скорость подачи раствора метанола устанавливают 3.6 мл/ч. Ведут ферментацию в течение трех часов до полной адаптации культуры к метанолу. Адаптация культуры характеризуется установившимся значением рО2>20%, и резким возрастанием значения рО2 в течение 30 сек при прекращении подачи метанола. После адаптации культуры к метанолу ведут ферментацию еще 1 час и затем  увеличивают скорость подачи раствора метанола до 7.2 мл/ч и ведут ферментацию еще 2 часа. Затем увеличивают скорость подачи раствора метанола до 11 мл/ч и вели ферментацию 72 часа. В течение первых 4 часов изменяют pH среды с 5,0 до 5,8 на 0,2 единицы каждый час.
Уровень экспрессии ЧСА штаммом Yst-HSA-PDI1 определяют с помощью денатурирующего электрофореза в 10% ПААГе вместе с калибровочными разведениями стандартного образца препарата ЧСА. Денситометрический анализ полученной электрофореграммы показал, что уровень экспрессии ЧСА составил около 1,4 г/л.
После окончания культивирования культуральную среду осветляют центрифугированием, надосадочную жидкость подвергают ультрафильтрации на мембране Biomax 300 (Millipore, США).  Полученный фильтрат концентрируют до 500 мл при помощи ультрафильтрации на мембране Biomax 30 (Millipore, США) и проводят диафильтрацию к раствору, содержащему 100 мМNaCl и 50 мМNaOAc, pH 6,0. К полученному  раствору ЧСА добавляют каприлат натрия до 5 мМ и цистеин до 1 мМ и подвергают тепловой обработке в течение 2 часов при 65 oC. После окончания тепловой обработки доводят pH раствора до 4,5 ледяной уксусной кислотой. Инкубацию в кислых условиях ведут 14 часов при +4°С, образовавшийся осадок примесей отделяют центрифугированием.
К супернатанту воду mQ до достижения проводимости 8 мС/см и наносят на хроматографическую колонку, содержащую сорбент CaptoS (GEHealthcare), предварительно уравновешенную раствором «А» (50 мМNaCl, 50 мМNaOAc, pH 4,5). Элюцию ЧСА проводят 5% раствором натрия тетраборнокислого семиводного. Собранный элюат инкубируют в течение 16 часов при комнатной температуре для диссоциации мультимеров ЧСА, образовавшихся при нагревании и последующей обработке кислотой, а также для преципитации части гликозилированной формы ЧСА. После инкубации к раствору ЧСА добавляют сухой NaCl до проводимости 70 мС/см и затем доводят pH до 3,5 соляной кислотой. Полученный раствор центрифугируют и супернатант наносят на хроматографическую колонку, содержащую сорбент PhenylSepharosehisub (GEHealthcare), предварительно уравновешенную раствором «Б» (1 МNaCl, закисленного до pH 3,5 соляной кислотой). Элюцию ЧСА проводят раствором, содержащим 150 мМNaCl и 50 мМ фосфата натрия, pH 6,8. pH собранного элюата доводят до значения 6,5 фосфорной кислотой и добавляют в раствор очищенную воду воду mQ до проводимости 11±1 мС/см (конечная концентрация NaCl75 мМ) и наносят на хроматографическую колонку с сорбентом QSepharose 4 FF (GEHealthcare), предварительно уравновешенную буфером «В» (75 мМNaCl и 50 мМ фосфата натрия, pH 6,5). Несвязавшийся с сорбентом ЧСА далее очищают преципитацией NaCl. Для этого к раствору добавляют NaCl до конечной концентрации 1,5 М и добавляют уксусную кислоту при интенсивном перемешивании до образования обильного белого осадка (pH 3,5). Суспензию инкубируют 2 ч при +4oС и отделяют супернатант центрифугированием. Осадок растворяют в растворе 50 мМ фосфата натрия, pH 7,0 при одновременном титровании суспензии 1 МNaOH для поддержания постоянного значения pH. Полученный раствор ЧСА обессоливают в течение 5 циклов концентрирования-разбавления полученного раствора водой mQ значения проводимости фильтрата ниже 0,05 мС/см и концентрируют при помощи ультрафильтрационного модуля 30 кДа. К полученному раствору добавляют каприлат натрия до 5 мМ и хлорид натрия до 100 мМ. Электрофоретический анализ полученного препарата ЧСАс последующей денситометрией представлен на Фиг.4,чистота исследуемого образца составляет не менее 95%.