ФЕРМЕНТЫ ГЛАЗАМИ РЕСТАВРАТОРОВ, ИЛИ ОСТРОУМНЫЙ И ИЗОБРЕТАТЕЛЬНЫЙ ИДАЛЬГО ДОН-КИХОТ ЛАМАНЧСКИЙ

Ю.В. Иванова

ФЕРМЕНТЫ ГЛАЗАМИ РЕСТАВРАТОРОВ, ИЛИ ОСТРОУМНЫЙ И ИЗОБРЕТАТЕЛЬНЫЙ ИДАЛЬГО ДОН-КИХОТ ЛАМАНЧСКИЙ

Статья освещает потенциал ферментов в освобождении поверхности живописи от нежелательных веществ, вызывающих материальное разрушение произведения и искажающих его эстетические характеристики. Рассматриваются критерии выбора фермента для «расчистки», специфика создания реставрационной методики, предполагающей соблюдение точнейшего баланса между условиями, необходимыми для действия фермента, и требованиями безопасности произведения. Присущие ферментам свойства рассматриваются с точки зрения их привлекательности или нежелательности для реставрации. Преимуществами ферментов перед традиционными методиками «расчисток» (с помощью кислот, щелочей, органических растворителей) являются эффективность, мягкость и специфичность действия, нетоксичность, возможность быстро получить желаемый результат при минимальном расходе действующего вещества, что соответствует одному из основополагающих принципов современной научной реставрации - принципу минимального вмешательства в произведение. Однако некоторые свойства ферментов ограничивают их применение в реставрации. Таковы их лабильность; необходимость высокой степени очистки; обязательность строгого соблюдения определенных показателей (pH, температуры и др.) для их успешного действия, что сопряжено с необходимостью нанесения на произведение дополнительных веществ, с этапом завершающей промывки живописи растворами ПАВ, легкими органическими растворителями.

Ключевые слова: реставрация, ферменты, свойства ферментов, критерии выбора, методики.

Y. Ivanova

ENZYMES SEEN BY RESTORERS EYES OR THE INGENIOUS GENTLEMAN DON QUIXOTE OF LA MANCHA

This paper deals with potential utilization of enzymes for removing of undesirable compounds evoking material destruction and distortion of esthetic characteristics of painting. Criteria of enzyme selectivity for clearing, specificity of restoration methods that should comply exact balance of conditions required for enzymes activity and security of painting are discussed. The enzymes properties are analyzed from the viewpoint of their attractiveness and undesirability in restoration. The enzymes effectivity, specificity, nontoxicity and rapid results obtaining make enzymatic clearing very attractive. This approach is more magnetic than traditional methods of clearing with utilization of acids, alkaline or organic solvents and therefore corresponds to the modern trend of minimal meddling in the work of art. However, some enzymes properties restrict their utilization. For instance, all enzymes are very labile and require high degree of purification. All enzymes can be utilized only under strict conditions such as temperature and pH. Finally, after enzymatic clearing additional steps of washing with surfactants and light organic solvents are required.

Keywords: restoration, enzymes, properties of enzymes, selection criteria, methods.

Удаление с поверхности живописи чужеродных веществ («расчистка») является необратимым вмешательством. Оно наиболее рискованно из-за близости к красочному слою и наиболее заметно зрителю.

С химической точки зрения «расчистка» - это растворение некоего материала без воздействия на нижележащие авторские слои. Традиционные «расчистки» предполагают физическое, физико-химическое или химическое воздействие на удаляемый субстрат и все они имеют недостатки. Кислоты и щелочи действуют на все материалы, с которыми контактируют. Многие пигменты и красители при контакте с щелочами и/или кислотами необратимо изменяют цвет, а некоторые основы живописи (например, известьсодержащие штукатурки, гипс) крайне чувствительны к растворам с кислыми значениями рН. Что касается органических растворителей, то хотя для ряда реставрационных операций полный отказ от них невозможен, они небезопасны для произведения и окружающей среды.

С конца XX века особое внимание привлекла экологическая безопасность любых форм деятельности. Насущной стала и экономия природных ресурсов. Это привело к поиску альтернативных, т. н. «зеленых» технологий, исключающих необратимые изменения окружающей среды и эффективных при минимальном потреблении ресурсов. В реставрации одной из таких технологий являются «расчистки» с помощью ферментов.

Исследования, начавшиеся в 20-х годах XX в., позволили определить структуру многих ферментов и установить механизм их действия. Позднее удалось разработать методы очистки ферментов и получения их в высоко активной форме, внедрить ферменты в промышленность1, а затем и в реставрацию2.

Ферменты катализируют (ускоряют) протекание химических реакций, при которых одни вещества (субстраты) превращаются в другие (продукты). Некоторые реакции протекают самопроизвольно и достаточно быстро. Например, если смешать кислоту и щелочь, то без всяких дополнительных катализаторов произойдет реакция нейтрализации и образуется раствор соли. Однако разрушение и растворение в воде полимера (например, состарившейся белковой пленки) происходит крайне медленно, если происходит вообще. Возникает необходимость добавить вещество-катализатор, которое ускорило бы разрушение именно этой пленки. Ферменты обеспечивают протекание реакций, которые без них протекали бы очень медленно или не протекали бы вовсе. Они ускоряют протекание реакции в 108-1012 раз и способны осуществлять несколько сотен тысяч каталитических актов за минуту3.

Сам фермент во время реакции не претерпевает изменений, следовательно, сохраняет способность участвовать в последующих реакциях (или циклах). Когда первая молекула субстрата будет преобразована, катализатор запустит второй цикл, затем третей и т. д. Как правило, катализатор инактивируется лишь после множества циклов. Именно поэтому минимальные количества фермента способны преобразовывать большие количества субстрата, что существенно снижает стоимость работ ими. Кроме того, при обращении к ферментам соблюдается основополагающий для реставрации принцип минимального вмешательства (применяется минимальное количество реагента).

Эффективность фермента определяется количеством субстрата, которое миллиграмм фермента может преобразовать за единицу времени, или его удель-

ной активностью. Одни ферменты (некоторые липазы, пепсин) имеют высокую удельную активность (ок. 1500-2000 ед/мг), а другие (некоторые протеазы микробного происхождения) обладают существенно меньшей удельной активностью (0,1-1 ед/мг). Для «расчисток» рекомендуются ферменты с активностью около 1000 ед/мг4. При обращении к низко активным ферментам приходится существенно увеличивать количество фермента, максимально приближаться к оптимальным условиям его действия (об этом см. ниже), существенно удлинять время контакта фермента с произведением. Хотя при этом получить желаемый результат удается, это опасно для объекта реставрации. Активность фермента на субстратах, с которыми работают реставраторы, требуется измерять специально, поскольку, например, триглицериды (жиры), которые приходится удалять с живописи, отличаются от триглицеридов, содержащихся в промышленных маслах.

Ферменты, как правило, являются белками (ферментативной активностью могут обладать и рибонуклеиновые кислоты, но это скорее исключение). Белки представляют собой линейный полимер, состоящий из следующих друг за другом в определенной последовательности аминокислот (аминокислотных остатков). Длина белковой (полипептидной) цепи варьирует от 100-200 до десятков тысяч аминокислотных остатков. Цепочка аминокислот сворачивается в пространстве, зачастую образуя очень красивые причудливые трехмерные конструкции.

Биологическая активность фермента, как и любого белка, обусловлена наличием в его структуре активного центра, в котором расположены аминокислоты (аминокислотные остатки), обеспечивающие связывание субстрата, а также аминокислоты, осуществляющие его химическое превращение с последующим высвобождением продуктов реакции. Именно характерный набор аминокислот и их расположение в активном центре обеспечивает способность ферментов преобразовывать лишь определенный субстрат или их высокую специфичность, отличающую ферменты от обычных химических катализаторов, например, платины, никеля5. Некоторые ферменты обладают абсолютной специфичностью, т. е. воздействуют лишь на один субстрат, но большинство действует на группу структурно похожих субстратов.

В реставрации применяют лишь немногие из ныне известных ферментов, расщепляющих некоторые высокомолекулярные вещества. Преимущественно это ферменты класса гидролаз, хотя описано применение представителя класса оксидаз - лакказы, производимой грибами рода Trametes, с помощью которой с камня удалили красные пятна продигиозина (комплекс пигментов, образующийся в результате жизнедеятельности бактерий Serratia marcescens)6.

Для удаления материалов, содержащих углеводы (крахмал, гуммиарабик и другие камеди), применяют различные гликозид гидролазы. Они расщепляют молекулы полисахаридов до моносахаридов, дисахаридов или олигосахаридов, которые более растворимы в водных средах. Ферменты подкласса гликогидролаз могут быть животного (птиалин слюны или панкреатическая амилаза поджелудочной железы), растительного (ферменты из клубней картофеля, сои, гороха, фасоли, хрена, редьки, горчицы, сахарного тростника, винограда, семян злаков), бактериального (Bacillus) или грибкового (Aspergillus) происхождения. Эти ферменты преимущественно интересны реставраторам бумаги, книг.

Для удаления трудно растворимых состарившихся олиф, масел, масляно-смо-ляных лаков, восков применяют липазы. Они, разрушая сложноэфирные связи,

расщепляют молекулы нейтральных жиров на жирные кислоты и глицерин, которые могут быть удалены водными растворами. Некоторые липазы (или, более обобщенно, эстеразы) способны гидролизовать сложные эфиры, т. е. помогают в удалении восков и состарившихся акриловых и виниловых смол. Липазы извлекают из тканей животных (например, из поджелудочной железы), из растительного сырья (пшеницы, овса), их вырабатывают бактерии (Bacillus) и грибы (Aspergillus и Penicillinum).

Для воздействия на состарившиеся белковые пленки применяют протеа-зы, расщепляющие длинные полипептидные цепи белков на короткие фрагменты (пептиды), которые обычно лучше растворимы в воде, поэтому легче удаляются. Кроме того, часть протеаз способна с невысокой скоростью гидролизовать сложные эфиры, т. е. обладает эстеразной активностью. Протеазы могут иметь животное происхождение. Их извлекают из желудочного сока и поджелудочной железы (пепсин, трипсин; смеси ферментов - панкреатин, желудочные протеазы), из личинок жуков-кожеедов (Dermestes frischii, Dermestes maculates), из гепатопанкреаса промысловых видов крабов. Второй источник протеаз - растения (ананас, папайя, инжир). Наконец, некоторые протеолитические ферменты вырабатываются бактериями (Bacillus и Clostridium histolyticum) и грибами (Aspergillus). В реставрации могут быть применены ферменты из групп эндопептидаз (например, трипсин или химо-трипсин) и экзопептидаз (аминопептидазы, карбоксипептидаз, дипептидгидролазы).

Способность протеаз разрушать белки может быть использована для удаления с живописи животного клея и желатина (в основном состоящих из коллагена), казеина. Эти клеи в прошлом широко применяли для укрепления живописи, для «оживления» цвета, для создания искусственной патины. С помощью протеаз удается эффективно гидролизовать и белки растительного происхождения. Еще одна сфера применения протеаз - раздублирование живописных тканевых основ.

Большую часть ферментов, ныне опробованных в реставрации, производят американские компании Sigma-Aldrich и Fluka, хотя список производителей очень велик.

С точки зрения реставраторов привлекательными качествами ферментов являются:

1. ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ действия, позволяющая удалять лишь определенные вещества;

2. ЭФФЕКТИВНОСТЬ (удельная активность) фермента, позволяющая работать достаточно быстро с использованием минимальных количеств фермента;

3. МЯГКОЕ, ЩАДЯЩЕЕ действие ферментов в сравнении с тем, которое оказывает большинство традиционных химических веществ;

4. НЕТОКСИЧНОСТЬ.

Однако ферменты имеют ряд особенностей, которые в глазах реставраторов являются их НЕДОСТАТКАМИ. Рассмотрим этот вопрос подробнее.

Методика работы ферментными растворами состоит из этапов:

1) приготовления раствора фермента,

2) нанесения его на поверхность,

3) экспозиции,

4) удаления сухим тампоном раствора и размягченных загрязнений,

5) промывки обработанного участка водным раствором ПАВ (поверхностно-активного вещества), затем чистой водой и, наконец, легкими углеводородами (например, очищенным бензином или уайт-спиритом).

Очищенные ферменты выпускают в виде сухих (лиофилизированных) порошков, которые перед использованием должны быть растворены. Ферменты капризны. Они будут действовать только при определенном СОСТАВЕ РАСТВОРА, который, однако, не должен разрушать произведение. Какие же вещества входят в такой раствор?

В большинстве случаев ферменты используют в виде водных растворов, а вода может навредить поверхности или «телу» реставрируемого объекта. Бесспорно, эта опасность присутствует и при работе любыми водосодержащими составами. Реставраторы знают, что клее-меловые грунты гигроскопичны и от воды могут набухать; холст, особенно не очень старый, при намокании и последующем высыхании сильно и нерегулярно изменяет линейные размеры; деревянные основы живописи и полихромной деревянной скульптуры при увлажнении могут коробиться. Известно, что красочные слои «тощей» темперы или красок, связующим которых служат животные и растительные клеи, могут быть растворены водой (по крайней мере, частично). Наконец, особого рода чувствительность к водному раствору могут иметь и поверхностные слои произведения, состоящие из сильно состарившегося масла и некоторых смолистых материалов. В таких материалах при старении (окислении) происходит образование гидроксильных и карбоксильных групп, что повышает их гидрофильность. Сам по себе контакт с водой для разрушения этих материалов недостаточен, так как, несмотря на присутствие полярных групп, основой вещества остаются водонерастворимые липофильные соединения (растворению состарившихся олиф препятствует их полимеризация и образование «сшивок» между соседними молекулами). Однако молекулы воды могут прочно связываться с такими веществами, не растворяя их. В результате этого связывания слой липофильного материала белеет, мутнеет, утрачивает прозрачность. Причем такие изменения мало обратимы, поскольку речь идет не о впитавшейся воде, которая рано или поздно испарится с восстановлением прозрачности, а о воде, химически связанной с материалом.

Опасность повреждения водой удается снизить, применяя загущенный раствор фермента - ферментный гель. Гель удерживает воду и растворенные в ней вещества на поверхности произведения, не позволяя им диффундировать в его «тело»7. Гель, содержащий раствор фермента, значительно быстрее приводит к набуханию или разложению пленки нежелательного вещества. В большинстве случаев гель наносят на поверхность через японскую бумагу. При длительной экспозиции гель предохраняют от высыхания, накрыв тонкой пленкой типа пищевой. Экспозицию определяют для каждого конкретного произведения (обычно от 1 до 10 мин.).

Отдельные ферменты требуют добавления в раствор дополнительных веществ. Например, некоторые липазы быстро теряют активность в водной среде, но сравнительно долго активны в присутствии стабилизаторов (например, глицерина или лактозы).

Для действия части липаз требуется присутствие ко-фактора - ионов кальция. Эти ионы в изобилии имеются, например, в известковой штукатурке или в казе-инате кальция, но если такие вещества отсутствуют, кальций приходится добавлять в раствор в виде какой-либо водорастворимой соли.

Недостаток ферментов - их ЛАБИЛЬНОСТЬ (нестойкость). Условия внутри живой клетки, где ферменты вырабатываются и функционируют, способствуют их сохранению, но, будучи извлеченными из клетки, ферменты под действием света, повышенной температуры или в результате окисления кислородом воздуха денатурируют (денатурация может быть как обратимой, так и необратимой) и постепенно утрачивают присущие им свойства. В сухом виде (в порошке) при правильном хранении ферменты могут сохранять активность 9-12 месяцев и даже долее, а их растворы могут храниться в холодильнике 2-3 недели с постепенным снижением активности вплоть до ее исчезновения. Именно поэтому нет смысла готовить растворы ферментов впрок. В реставрации невозможно точно предвидеть, какое количество субстрата придется обработать ферментом, следовательно, невозможно и точно рассчитать, сколько именно фермента потребуется для «расчистки» той или иной поверхности. При использовании фермента в гелевой форме можно ориентироваться на площадь поверхности, которую нужно покрыть гелем. Обычно исходят из того, что 100 мл геля покрывают 1 м2 поверхности.

Ферменты легко инактивируются под действием некоторых химических веществ (т.н. ингибиторов). Ингибиторы могут загрязнять обрабатываемые поверхности или быть составной частью произведения. Например, нередко в красочном слое присутствуют ионы тяжелых металлов - серебра, ртути, свинца, хрома, кадмия (в свинцовых белилах, миниуме, джаллорино, киновари, красных и желтых кадмиях, хромовых зеленых). Эти ионы в ферменте связываются с определенными аминокислотами, что приводит к утрате каталитической активности. Следовательно, присутствие ингибиторов в растворе и/или в субстрате делает ферментативную обработку затруднительной или невозможной. Так, запись маслом может оказаться устойчивой к действию липаз, если действие фермента подавляется солями тяжелых металлов, которые имеются в ее пигментах. Косвенно это подтверждает практика: неплохо поддаются воздействию липаз тонкие записи типа лессировоч-ных, содержащие мало пигмента и много масла, или толстослойные записи, содержащие железо (с охрами, умбрами, сиенами и др. земляными пигментами). Менее исследовано, какое действие оказывают на липазы ионы меди (азурит, малахит, ярь-медянка).

У некоторых ферментов в активных центрах или в участках связывания субстратов располагаются катионы металлов. Контакт такого фермента с хелаторами (веществами, которые обладают высоким сродством к катионам металлов и способны «вырывать» эти катионы из молекулы фермента), также приведет к инактивации. Например, в присутствии хелатора может быть ингибирована одна из карбок-сипептидаз, поскольку хелатор извлечет катионы металла из ее активного центра. Следовательно, работа таким ферментом требует, чтобы и в растворе, и в субстрате не было хелаторов или их количество было минимально.

Известны и ингибиторы другого типа. Некоторых органические соединения (растворители, моющие средства) способны изменять пространственную структуру белка. Изменение «упаковки» (сворачивания) белковой цепи может вести к денатурации и потере ферментативной активности.

Подавление активности фермента всегда напрямую зависит от количества ингибитора.

«Недостатком» ферментов является и то, что они АКТИВНЫ ПРИ достаточно ОГРАНИЧЕННЫХ УСЛОВИЯХ.

Во-первых, почти все биологические процессы зависят от pH среды, в которой они протекают, и даже небольшие изменения pH существенно влияют на скорость процесса. Для активности каждого фермента требуются определенные оптимальные значения рН среды. Как правило, диапазон значений рН (т.н. рН оптимум), при котором ферменты максимально активны, сравнительно узок. Даже незначительные сдвиги pH приводят к изменению пространственной укладки белковой молекулы (т.н. нативной структуры) и снижению ферментативной активности. Зависимость активности фермента от pH среды можно узнать из графиков, которые обычно предоставляют производители, или из специальной литературы. Например, амилазы действуют при нейтральных значениях рН; липазы, продуцируемые плесневыми грибами, наиболее активны в слабокислой среде; липаза, выделенная из желудочного сока, имеет рН оптимум около 5; панкреатическая липаза обладает максимальной активностью при рН 8-9. рН оптимум протеазы пепсина находится при кислых или очень кислых значениях рН (в желудке, где функционирует пепсин, рН близок к единице). Очевидно, что показатели рН, при которых конкретный фермент будет активен, не должны разрушать реставрируемый объект. Поэтому в реставрации чаще всего используют ферменты, активные или хотя бы частично сохраняющие активность при рН от 5,8 до 88. Например, пепсин, функционирующий в желудке при рН около 1, в реставрации обычно применяют при не оптимальном рН около 5,5.

Как правило, ферменты растворяют в т. н. буферных растворах. В широком смысле буферными (от англ. buff - смягчать удар) называют системы, которые поддерживают неизменным значение какого-либо параметра (например, рН) даже при изменении их состава. Буферный раствор (буфер) - это сопряженная кислотно-основная пара. Пару могут составлять слабая кислота (донор протонов) и сопряженное с ней основание (акцептор протонов), либо слабое основание и сопряженная с ним кислота9. Для реставрации подходят кислотно-основные буферы - растворы, способные противодействовать изменению pH при их разведении или при добавлении к ним небольших количеств кислоты (H+) или основания (OH-). Буфер на протяжении обработки обеспечивает неизменность рН раствора, несмотря на то, что раствор будет контактировать с кислым или щелочным удаляемым веществом10. Для каждого интервала рН имеется довольно широкий выбор буферных растворов.

Здесь стоит напомнить, что удаление лежащего на живописи состарившегося чужеродного слоя, который имеет кислую реакцию, с помощью ферментного раствора с щелочным pH будет сопровождаться нейтрализацией с неизбежным образованием солей.

Во-вторых, ферментативные реакции могут активно протекать лишь при определенной температуре. Большинство ферментов, имеющихся в продаже, активны при 37-40°С, т. е. при температуре тела теплокровных животных или несколько выше. Поэтому приходится подогревать и раствор, и поверхность произведения (проще всего это делать с помощью лампы накаливания мощностью ок. 50W, помещенной на удобном для работы расстоянии). При этом превышать

45-50°С нельзя и потому, что ферменты при высокой температуре необратимо инактивируют, и потому, что такое нагревание вредно для произведения. «Расчистку» желательно вести при комнатной температуре 20-25°C. К сожалению, в таких условиях активность ферментов невысока, следовательно, для получения результата приходится удлинять время контакта фермента с субстратом, что опасно для реставрируемого объекта. Это подтолкнуло к поиску ферментов, активных при более низких температурах.

В последние годы внимание привлекли протеолитические ферменты, синтезируемые морскими организмами. Эти ферменты действуют в экстремальных условиях - при высокой концентрации солей и при низкой температуре (от 4°C и немного выше)11.

Опубликовано успешное удаление при температуре 19-25,5°С пленок казеина и желатина с расписанного дерева XVII и XVIII веков с помощью протеаз, извлеченных из морских организмов12.

С помощью экстракта из морских беспозвоночных типа стрекающих (Cnidaria), обладающего протеазной активностью, удалось гидролизовать при 25°С белковые слои на расписанном дереве; снять при 24°С старую профзаклейку, поставленную на животный клей, с картины маслом на холсте; гидролизовать при 19°С слой животного клея на расписанной скульптуре из воска. Во всех этих случаях по окончании ферментативной обработки поверхность промывали тампонами с дистиллированной водой13.

При лабораторных испытаниях за 10 минут при 4-30°C экстракт коралловых полипов (Anthozoa), обладающий протеазной активностью (предположительно, содержащий металлопротеазы), успешно гидролизовал казеин. Исследователи сравнили результаты обработки экстрактом коралловых полипов (Anthozoa) или коммерческой протеазой из Aspergillus sojae (тип XIX) (ее наносили в том же буфере с аналогичным рН). Оказалось, что экстракт удовлетворительно удалял казеиновый слой в концентрации 1 мг/мл, а коммерческая протеаза давала ту же степень «расчистки» в концентрации 10 мг/мл. Кроме того, экстракт «работал» при комнатной температуре (19-2б°С), а для коммерческой протеазы требовалось нагревание до 37°С14.

Лабораторно доказана возможность удаления пчелиного и карнаубского восков, широко применявшихся реставраторами в прошлом, с помощью экстракта из морских организмов (губок, медуз, морских анемон, ракообразных, рыб), обладающих эстеразной активностью15.

Однако, несмотря на потенциал таких смесей ферментов, они недостаточно очищены, а высокая степень очистки крайне важна в реставрации, поскольку обуславливает и большую активность, и большую избирательность действия.

В прошлом для удаления с холстов старого, плохо растворимого дублиро-вочного клея, состоящего из смеси животного клея и крахмала, пробовали применить панкреатин, выделяемый из поджелудочной железы. Панкреатин содержит ферменты со всеми тремя типами активности: протеолитической, липолитической и амилолитической. Такая смесь не обладала одним из ценнейших свойств высоко-очищенных ферментов - избирательности к субстрату. На органических основах (холсте, дереве, бумаге) и, особенно, на полихромных произведениях применение панкреатина оказывалось разрушительным16. Единственный оправданный случай обращения к нему - тотальное удаление органической патины с камня.

Хотя идея однократного воздействия смесью ферментов на состоящий из разных материалов субстрат (например, на загрязнения) привлекательна, предпочтительнее наносить ферменты раздельно в определенной последовательности, а не в смеси. Ведь только при работе очищенными изолированными ферментами можно предвидеть показатели их ферментативной активности (амилолитической, протеолитической или липолитической), максимально использовать избирательность, гарантировать большую степень контроля над процессом, сведя вмешательство в произведение к минимуму и избежав нежелательного побочного действия. Разные типы ферментов можно применить поочередно, с условием, что последними будут нанесены протеолитические ферменты (в противном случае их гидролитическая активность может подавить действие тех ферментов, которые будут нанесены после них).

Смесь ферментов и низкомолекулярных соединений, содержащаяся в грубых экстрактах, может бесконтрольно влиять на «расчистку». Эта опасность не исключается и при работе с недостаточно очищенными ферментами, выпускаемыми промышленностью, поскольку в упаковках с маркировкой определенного фермента нередко выпускается смесь ферментов, которая потенциально может запустить каскадный, трудно контролируемый процесс.

Для решения этой проблемы изыскивают способы получения высокоочи-щенных ферментов. Одно из предложений - обратиться к генной инженерии. Некоторые микроорганизмы после изменения генома начинают синтезировать желаемые ферменты в больших количествах. После очистки этих ферментов получают их гомогенные препараты, которые можно применять в желаемых сочетаниях и в нужных концентрациях.

Применение высокоочищенного фермента с известным механизмом действия позволяет контролировать его «работу», в нужный момент останавливая ее с помощью ингибиторов. Такая методика может стать уникальным био-инструментом реставрации.

В-третьих, высокая стоимость некоторых ферментов делает их малодоступными для реставрации. Стоимость зависит как от типа фермента, так и от степени его очистки. Типичный пример - коллагеназы, которые могли бы стать оптимальным решением для удаления состарившегося животного клея, но их высокая цена препятствует их широкому применению в реставрации.

Методика ферментативных обработок включает этап завершающей промывки живописи после удаления с нее сухим тампоном нежелательных веществ и ферментного геля. Раствор фермента содержит твердые нелетучие водорастворимые соединения (буфер, хелатор, ко-фактор, загуститель и т.п.). Лишь промывка водой гарантирует полное удаление этих остатков. Эмпирически установлено, что лучший результат достигается, если при первой промывке к воде добавляют ПАВ (бычью желчь, обычно 0,2% (вес/объем)); Tween 20 (обычно 1-2% (объем/ объем)); т.н. искусственную слюну)17. Несколько слов об искусственной слюне.

Слюна, вырабатываемая слюнными железами, на 98% состоит из воды и на 2% из смеси белков (глобулина, альбумина, муцина) и ферментов в крайне низкой концентрации (амилаз, птиалина (фермент, расщепляющий крахмал и некоторые полисахариды), липаз и протеаз), а также минимальных количеств кислот (аскорбиновой, лимонной, молочной), органических и неорганических веществ (солей

натрия, калия, магния, кальция, хлора, фосфатов). Эффективное очищающее действие слюны известно давно, но невозможность ее получения в достаточных количествах и присутствие в ней бактерий, которыми можно «заразить» живопись, препятствовали ее внедрению. В 1976 году, после исследования состава и механизма действия естественной слюны, была выдвинута идея создания слюны искусственной, содержащей лишь часть компонентов, имеющихся в натуральной, но всё же действующей как эмульгатор и, одновременно, лишенной недостатков натуральной слюны. Высокая эмульгирующая способность муцина, содержащегося в искусственной слюне, обеспечивает полное удаление нежелательного субстрата, уже частично гидролизованного ферментом. Крайне низкие концентрации (ок. 0,55%) сухих веществ, растворенных в синтетической слюне, освобождают от опасений по поводу того, что на произведении сохранятся ее остатки.

Промывка водным раствором ПАВ поверхности, обработанной ферментами, очень важна18. Время действия фермента ограничено, поэтому фрагменты макромолекул нежелательного субстрата, образовавшиеся на поверхности, всё же достаточно велики и часто липофильны. Их нелегко растворить и удалить водой, часть их остается на поверхности. Действие ПАВ, способного растворить гидрофобные материалы, гарантирует полное удаление таких остатков, т. е. завершает «расчистку». Эффективность ПАВ доказать просто: на сухом тампоне, которым удаляют гель, остатков субстрата не видно - тампон остается бесцветным, но при последующей промывке раствором ПАВ он обретает очень интенсивный цвет. Такую обработку полезно повторить 2-3 раза.

Далее следует промывка дистиллированной водой, затем поверхность просушивают 4-5 часов, а потом промывают легкими углеводородами, которые являются ингибиторами фермента (эта промывка также помогает проявить цвет).

Очевидно, что все вещества, применяемые для промывки после обработки ферментами, не должны наносить произведению вреда.

Работа с ферментами требует осторожности. Прежде чем обратиться к ним, нужно получить ответы на несколько вопросов.

Во-первых, раз действие ферментов избирательно по отношению к удаляемому веществу (они «узнают» лишь определенные вещества, не влияя на все остальные), нужно знать, какова природа материала, который требуется удалить -полисахарид, белок или липид. От ответа на этот вопрос зависит выбор фермента - амилазы, протеазы, липазы.

Во-вторых, нужно знать, каковы материалы, составляющие произведение. Ведь будут пригодны лишь те ферменты, которые, расщепив субстрат, не затронут памятника19.

В-третьих, важно оценить сохранность расчищаемой поверхности. Потертости, приподнятости и утраты красочного слоя и грунта, кракелюр - зоны риска. Именно там нижележащие слои произведения обнажены или, как минимум, легкодоступны. В некоторой степени от проникновения фермента к нижележащим слоям может предохранить краткость воздействия, напрямую связанная с удельной активностью фермента, и его нанесение в геле.

Наконец, нужно взвесить, не повредят ли условия и сопутствующие материалы, необходимые для действия фермента (рН среды, время экспозиции,

температура, влажность, способ нанесения, состав раствора фермента, вещества, необходимые для его удаления и инактивации после обработки), реставрируемому объекту?

В совокупности ответы на эти - многочисленные и, нередко, взаимосвязанные - вопросы и определяют выбор фермента. Приведем два примера.

Не раз было отмечено, что протеазы, гидролизующие белки, оказывались неспособны помочь в удалении с настенной живописи пленки казеина. Это объясняется тем, что на стенописи казеин может присутствовать не в чистом виде, а в виде казеината кальция (смеси казеина и известкового теста), который устойчив к воздействию ферментов. Иногда проблему разрешают, добавив в раствор фермента хелаторы, например, ЭДТА (этилен-диамин-тетрауксусную кислоту). ЭДТА способна образовывать комплексы с ионами двух- и трехвалентных металлов (следовательно, и с ионами кальция), которые будут «вырваны» из казеината кальция, что позволит с большей легкостью удалить казиновый слой. Однако при необходимости удалить казеинат кальция добавление ЭДТА к протеазам нельзя рассматривать как универсальный способ работы с этими ферментами. Во-первых, достичь эффективного связывания катионов металла с ЭДТА удается лишь при условии, что все используемые растворы имеют нейтральные или щелочные значения рН, а щелочная среда пригодна не для всех протеаз. Во-вторых, активность некоторых протеаз, действующих в нейтральной среде, зависит от наличия в ней цинка или других катионов. Таковы, например, протеазы, вырабатываемые микроорганизмами Bacillus, Aspergillus, Streptomyces и Pseudomonas. Добавление ЭДТА к раствору таких протеаз приведет к связыванию этих ионов и удалению их из активного центра ферментов, что обернется инактивацией протеаз. Так сужается перечень протеаз, пригодных для работы.

Другой пример - использование липаз для удаления, например, масляной записи с живописи маслом. К липазам будет чувствительно и красочное связующее. Поэтому если запись лежит непосредственно на красочном слое, применение ферментов допустимо лишь при существенной разнице в возрасте между слоями, поскольку старый слой (оригинал) сильно полимеризован и прочен, а более новый (запись) - нет. Но в таких случаях записи нетрудно удалять и традиционными способами, а наиболее избирательным методом окажется механическое удаление скальпелем, особенно, ведущееся под увеличением. Но если масляная запись сделана поверх лака, ферментная «расчистка» окажется безопаснее, чем традиционная полярными органическими растворителями (кетонами, спиртами, диметилсульфок-сидом, диметилформамидом) или щелочными реагентами. Области растворимости масла (в записи) и натуральной сильно полимеризированной смолы (лака между оригиналом и записью) в большей части перекрываются. Следовательно, растворители будут воздействовать и на запись, и на лежащий под ней лак, подвергая оригинал риску. Щелочные реагенты будут воздействовать на запись, поскольку ее маслянистые вещества, окислившиеся со временем, могут растворяться в щелочных растворах. Но и лежащий под записью старый лак также может быть окислен и в какой-то степени поврежден щелочью. Липолитический же фермент будет воздействовать лишь на слой масляной записи, поскольку водная среда, в которой он растворен, не может проникнуть в нижележащий слой лака. Именно поэтому удаление записи с помощью ферментов, гарантирующих сохранность красочного слоя, в этом случае будет успешной альтернативой и органическим растворителям,

и щелочам. Беспокойство же о том, что часть липаз активны в растворе с рН 8-9 (т.е. на произведение всё же будет нанесена щелочная среда), представляется преувеличенным. Неспецифическое растворение лака происходит при рН выше 9 и даже выше 10, поэтому слабощелочные растворы липаз не разрушат лак.

Приведенные примеры показывают, что для успешной «расчистки» с помощью ферментов и реставратору, и сотрудничающему с ним биохимику необходимы высокая квалификация и «остроумие и изобретательность», достойные прославленного героя Сервантеса.

Ферментативная реставрация имеет неоспоримые достоинства. Она способна предложить альтернативные методы и дополнить традиционные, помочь в разрешении ранее неразрешимых задач. Кроме того, эта био-технология позволяет снизить стоимость реставрации и за счет расходных материалов, и собственно работы, становящейся проще в исполнении20.

В заключение сделаем еще одно замечание. Иногда звучат сомнения в возможности применения ферментов в реставрации: в их остатках, сохранившихся после всех промывок, видят опасность для памятника. Рассмотрим две стороны вопроса.

Во-первых, о каких остаточных количествах фермента может идти речь? В 1992 году были опубликованы результаты удаления с бумаги крахмала методом погружения листа в раствор амилазы. По окончании обработки лист промыли в буферных растворах, а затем в воде. Исследование показало, что фермент удален более чем на 99%21.

Второе опасение касается потенциальной возможности начала неконтролируемой «работы» остатков фермента после завершения «расчистки». Остатки фермента минимальны. Но даже если они окажутся более существенными (например, при небрежной промывке), невозможно предположить, что при определенной температуре и наличии воды они могут «активироваться». Ни один биохимик не разделил бы это беспокойство и, вероятно, удивился возможности «пробуждения» фермента. В 1988 году Р. Уолберс продемонстрировал возможность удаления с масляной живописи состарившегося масляно-смоляного лака с помощью липаз грибкового происхождения. После обработки ферментом, удаления продуктов реакции и геля сухим ватным тампоном, последующей промывки поверхности раствором искусственной слюны, а затем углеводородами, проконтролировали активность фермента, оставшегося на поверхности. Она сократилась до 0,03% от исходной22.

Активировать фермент очень непросто. Эти капризные соединения не будут действовать без соблюдения конкретных показателей рН и температуры, без наличия определенного субстрата и ко-факторов, в присутствии ингибиторов. Кроме того, чтобы остатки фермента начали неконтролируемо «работать», нужно, чтобы они сохранились на произведении в активной форме, что невозможно без соблюдения условий хранения, т. е. без определенного состояния произведения и окружающей среды. Следовые количества фермента, быстро утратив активность, превращаются в минимальные остатки инертного белкового вещества. Если вспомнить, что живописные произведения сами по себе содержат много белковых субстанций, то говорить об опасности остатков фермента - значит сильно преувеличивать риск.

Примечания

1. Enzymes in industry - production and application. Weinheim: VCH Publishers, 1990. - 321 p.

2. Hatton M. Enzymes in a viscous medium // The paper conservator: journal of the Institute of Paper Conservation, 2, 1977. P. 9; Wendelbo 0. The enzymatic freeing of papyri from cartonnage // Restaurator: international journal for the preservation of library and archival material, 2, 1975. P. 41-52; Wolbers R. C. Notes for Workshop on New Methods in the Cleaning of Paintings. Marina del Rey: Getty conservation institute, 1990. - 158 p.

3. Dixon M., Webb E. C. Enzymes. N.Y.: Academic Press, 1964. - 971 p.

4. Cremonesi P. Luso degli enzimi nella pulitura di opere policrome. Padova: Il Prato, 1999. P. 92.

5. РебриковаН. Л. Биология в реставрации. М.: РИО ГосНИИР, 1999. С. 171-172 (RebrikovaN. L. Biologiya v restavracii. M.: RIO GosNIIR, 1999. S. 171-172).

6. KonkolN. et al. Enzymatic decolorization of bacterial pigments from culturally significant marble / N. Konkol, Ch. McNamara, J. Sembrat, M. Rabinowitz, R. Mitchell // Journal of Cultural Heritage, 10 (3), 2009. P. 362-366 [doi.org/10.1016/j.culher.2008.10.006].

7. Talarico F. et al. Applicazioni dei gel come supportanti nel restauro / F. Talarico, C. Caldi, M. Valenzuela, C. Zaccheo, A. Zampa, M. P. Nugari // Bollettino ICR: Istituto Superiore per la Conservazione ed il Restauro, 3, 2001. P. 101-118.

8. Добрусина С. А., ЧернинаЕ. С. Научные основы консервации. СПб.: РНБ, 1993. С. 51 (DobrusinaS. A., Chernina E. S. Nauchnye osnovy" konservacii. SPb.: RNB, 1993. S. 51).

9. МедведеваМ. В. Растворы: Учебно-метод. пособие. М.: Цифровичок, 2012. С. 50-51 (MedvedevaM. V. Rastvory : Uchebno-metod. posobie. M.: Cifrovichok, 2012. S. 5051).

10. Cremonesi P. Materiali e metodi per la pulitura di opere policrome. Firenze: Phase-Produtti per il Restauro, 1997. - 142 p.

11. Palla F. et al. Application of new proteases in removal protein layers from artistic works surfaces / F. Palla, G. Ferrara, A. Richiusa, R. M .C. Teri, M. Sebastianelli // 7th European symposium on religious art, restoration & conservation: proceedings book. Firenze: Nardini, 2015. Р. 66-69.

12. PallaF. et al. Bio-pulitura: proteasi da organismi marini / F. Palla, M. Cammarata, M. Salamone, M. Sebastianelli, A. Cuttitta, L. Tutino, M. G. Parisi, N. Billeci, G. Ghersi // Atti del 7 Congresso nazionale di archeometria: 22-24 febbraio 2012, Modena / a cura di G. Vezzalini e P. Zannini. Bologna: Pátron, 2012. P. 312-320. - URL: https://docplayer. it/35671346-Bio-pulitura-proteasi-da-organismi-marini.html (дата обращения: 05.10.2022).

13. Palla F. et al. Cold-active molecules for a sustainable Preservation and restoration of Historic-artistic manufacts / F. Palla, G. Barresi, A. Giordano, S. Schiavone, M. R. Trapani, V. Rotolo, M. G. Parisi, M. Cammarata // International journal of conservation science, 7 (1), 2016. P. 239-246. - URL: https://www.researchgate.net/publication/303787406_Cold-active_molecules_for_a_sustainable_preservation_and_restoration_of_historic-artistic_ manufacts (дата обращения: 05.10.2022).

14. Barresi G. et al. Marine organisms as source of bioactive molecules applied in restoration projects / G. Barresi, E. Di Carlo, M. R. Trapani, M. G. Parisi, C. Chille, M. F. Mule, M. Cammarata, F. Palla // Heritage Science, 3, 2015. P. 3-17 [doi 10.1186A40494-015-0046-1].

15. PallaF. Blue-Biotechnology and Biocleaning of Historic-Artistic Artifacts // Conservation Science in Cultural Heritage, 16 (1), 2016. P. 185-196 [doi.org/10.6092/ issn.1973-9494/7169].

16. CremonesiP. Materiali e metodi per la pulitura di opere policrome. P. 105.

17. Cremonesi P. Luso degli enzimi nella pulitura di opere policrome. P. 49.

18. Cremonesi P. Materiali e metodi per la pulitura di opere policrome; Lang S. A review of literature published in response to Wolbers' resin soaps, bile soaps and gels. Royal College of Art, Victoria & Albert Museum Joint Course, Conservation "Final year research project, April 1998". L.: Victoria & Albert Museum, 1998. - 192 p; WolbersR. C. Cleaning Painted Surfaces: Aqueous Methods. L.: Archetype Publications, 2000. - 198 p.

19. SorliniC., CappitelliF., Villa F. Batteri ed enzimi per la conservazione dei beni culturali // Sistemi biologici e beni culturali: area tematica Biologia e biotecnologie per i beni culturali / Atti del Convegno Nazionale AIAR, Palermo, 6-7 ottobre 2009. Palermo: Priulla s.r.l, 2012. P. 253-264.

20. RanalliG. et al. Biotechnology applied to cultural heritage: biorestoration of frescoes using viable bacterial cells and enzymes / G. Ranalli, G. Alfano, C. Belli, G. Lustrato, M. P. Colombini, I. Bonaduce, E. Zanardini, P. Abbruscato, F. Cappitelli, C. Sorlini // Journal of Applied Microbiology, 98 (1), 2005. P. 7-83.

21. Meyer A. T., Andrew W. W., BakerC. An investigation into the removal of enzymes from paper following conservation treatment // Journal of the American Institute for Conservation, 31, 1992. P. 313-323.

22. WolbersR. C. Aspects of the Examination and Cleaning of two Portraits by Richard and William Jennys // Preprints of papers presented at the sixteenth annual meeting of the American Institute for Conservation. New Orleans, Louisiana, June 1-5, 1988. Wash.: American Institute for Conservation of Historic and Artistic Works, 1988. P. 245-260.

Сведения об авторах

Иванова Юлия Владимировна - кандидат искусствоведения, ФГБНИУ «ГОСНИИР», ведущий научный сотрудник. 107014, Москва, ул. Гастелло, 44, стр. 1. E-mail: vostrapeppa@gmail.com

Ivanova Yulia - Ph.D., The State Research Institute for Restoration, Leading Researcher.

44-1, Gastello St., Moscow, Russia, 107014. E-mail: vostrapeppa@gmail.com