Влияние аллогенного гидроксиапатита на метаболизм костной ткани

УДК 577.

ВЛИЯНИЕ АЛЛОГЕННОГО ГИДРОКСИАПАТИТА НА МЕТАБОЛИЗМ КОСТНОЙ ТКАНИ1

© 2007 Е.В. Писарева, М.Ю. Власов, О.В. Грибкова,

В.Г. Подковкин, Л.Т. Волова, Е.Н. Архипова2

Данная работа посвящена изучению влияния аллогенного гидро-ксиапатита на процессы метаболизма костной ткани у животных. Действие гидроксиапатита испытывали на двух моделях резорбции костной ткани - модели кратковременной гипертермии и гипоэстро-генной модели. Полученные результаты могут служить основанием к использованию аллогенного гидроксиапатита для профилактики развития резорбции костной ткани.

Введение

В последнее время возросло количество различных заболеваний опорнодвигательного аппарата, расширился контингент лиц, страдающих нарушениями регуляции обмена костной ткани. Часто причинами подобных нарушений могут быть неблагоприятная экологическая обстановка, заболевания внутренних органов, постоянные стрессы. При снижении процессов костеобразования и усилении процессов резорбции кость подвергается атрофии, что обозначают термином «остеопороз» [1, 2]. В наших экспериментах на животных были отработаны две модели резорбции костной ткани: модель кратковременной гипертермии и модель, основанная на эффекте гипоэстрогенемии. С целью борьбы с потерей костной массы в медицинской практике широко используют целый ряд препаратов, регулирующих обмен кальция и фосфора в организме [3]. Весьма перспективным в этом отношении нам представляется аллогенный гидроксиапатит [4, 5]. Он получается из натуральной кости и кроме кальция и фосфора содержит микроэлементы в тех же количествах, в которых они имеются в костной ткани. Поэтому его применение способствует более эффективному протеканию процессов регенерации. В ЦНИЛ СамГМУ разработан новый способ получения аллогенного гидроксиапатита (патент на изобретение № 2168998) и способ его введения в организм путем создания эктопического депо в мышечной ткани (патент № 2219933). Для оценки активности процессов формирования и резорбции кости, а также при динамической оценке эффективности проводимого лечения при-

1 Представлена доктором биологических наук, профессором С. А. Сачковым.

2 Писарева Елена Владимировна (pella1@rambler.ru), Власов Михаил Юрьевич, Грибкова Ольга Витальевна, Подковкин Владимир Георгиевич (podkovkin@rambler.ru), Волова Лариса Теодоровна, Архипова Екатерина Николаевна, кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

бегают к определению биохимических маркеров [6-9]. К маркерам резорбции костной ткани относят свободный оксипролин; концентрацию ионов кальция и неорганического фосфата в сыворотке крови; кальций и креатинин мочи; гидрок сипролин мочи; пиридолин и дезоксипиридолин мочи и плазмы; устойчивая к тартрату кислая фосфатаза плазмы; продукты деградации коллагена I типа - К- и С-телопептиды; гликозиды гидроксилизина. Маркеры образования костной ткани: белковосвязанный оксипролин; сывороточный остеокальцин; общая и специфическая костная щелочная фосфатаза; проколлагеновые С- и К-пептиды [7].

Целью исследования было испытание препарата на двух моделях резорбции костной ткани у животных (модель кратковременной гипертермии и гипоэстро-генная модель) посредством определения специфических структурнофункциональных и биохимических изменений в организме экспериментальных животных при моделировании резорбции костной ткани.

Методика исследований

Эксперименты проведены на 200 белых лабораторных крысах-самках весом 180-250 г. Животные были разделены на три группы. В первой группе их подвергали воздействию повышенной температуры окружающей среды (70 °С) с ежедневными сеансами в течение нескольких дней. В эксперименте горячий воздух подавался в камеру, в которой одновременно находилось 5-6 крыс. Интенсивность нагрева регулировалась с помощью реле с контактным термометром, к которому был подключен источник тепла. Во всех частях камеры температура воздуха была одинаковая.

Животным второй группы проводили овариоэктомию, создавая, таким образом, гипоэстрогенное состояние. Кастрация проводилась стандартным способом [10]. После овариоэктомии у животных брали влагалищные мазки каждый день в течение 7 дней. В эксперимент включали только тех крыс, у которых не было обнаружено циклических изменений во время этого периода. Срок наблюдения после овариоэктомии: 2,5 мес.

В третью группу (контроль) входили интактные животные, содержавшиеся в аналогичных условиях.

Инъекции гидроксиаппатита проводили половине животных из каждой экспериментальной группы, оставшиеся крысы составляли группы сравнения. Суспензии стерильного ГАП в изотоническом растворе хлорида натрия (40 мг/0,2 мл) однократно вводили с помощью одноразового шприца в бедренные мышцы крыс. Объектами исследований являлись кровь, надпочечники, печень и мышечная ткань животных. Для проведения биохимических исследований животных умерщвляли путем декапитации с помощью специально разработанного устройства “гильотины” (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.).

Для оценки метаболизма костной ткани в сыворотке крови крыс определяли: содержание свободного и белковосвязанного оксипролина, активность щелочной фосфатазы, содержание кальция и неорганического фосфата. Проводилось биометрическое измерение массы и линейных размеров костей крыс.

Результаты и их обсуждение

Результаты гистологических и биохимических исследований показали, что у животных после овариоэктомии, и у животных, подвергавшихся высокотемпературному воздействию, развиваются процессы резорбции костной ткани. Нами отмечено снижение интенсивности биосинтеза коллагена, рассасывание костных стенок гаверсовых каналов, истончение костных балок спонгиозы и появление многочисленных остеокластов в нишах резорбции. Процессы разрежения костной ткани сопровождались активизацией функции коры надпочечников, проявляющейся в виде увеличения концентрации 11-оксикортикостероидов в тканях этих желез на 17-21%. Для оценки метаболизма костной ткани в сыворотке крови крыс определяли: содержание свободного и белковосвязанного оксипролина, активность щелочной фосфатазы, содержание кальция и неорганического фосфата. Проводилось биометрическое измерение массы и линейных размеров костей крыс. Полученные результаты свидетельствуют о снижении плотности костной ткани и потере костной массы в результате усиления резорбции. У животных после высокотемпературного воздействия и овариоэктомии отмечено повышение уровня свободного оксипролина (рис. 1), маркера резорбции костной ткани, до 40 %, в то время как содержание белковосвязанного оксипролина оставалось в пределах нормы.

Щ авариоэктомия _| гипертермия

1 2 3

Рис. 1. Содержание свободного и белковосвязанного оксипролина в сыворотке крови крыс и 11-оксикортикостероидов в ткани надпочечников крыс после овариоэктомии и гипертермии. 1 - свободный оксипролин, 2 - белковосвязанный оксипролин, 3 -

11-оксикортикостероиды. * - отличия от контроля статистически значимы с доверительной вероятностью р<0,05

Повышение активности щелочной фосфатазы, фермента разрушающего ингибиторы кальцификации и стимулирующего минерализацию костной ткани, не было отмечено в обеих экспериментальных группах. Уровень неорганического фосфата и кальция находился в основном в пределах нормы, что можно объяснить действием механизмов фосфорно-кальциевого гомеостаза. Таким образом, в исследуемых моделях выявлено повышение маркеров резорбции костной ткани.

ЕЗ авариоэктомия _| гипертермия

Рис. 2. Содержание свободного и белковосвязанного оксипролина в сыворотке крови крыс и 11-оксикортикостероидов в ткани надпочечников крыс после овариоэктомии и гипертермии при однократной инъекции гидроксиапатита. 1- свободный оксипролин, 2 - белковосвязанный оксипролин, 3 - 11- оксикортикостероиды. * - отличия от контроля статистически значимы с доверительной вероятностью р.<0,05

Выделенный по новой методике аллогенный гидроксиапатит был испытан нами в указанных моделях костной резорбции. Препарат однократно эктопически вводили в мышечную ткань животных, создавая, таким образом, депо гидроксиа-патита. В результате исследований получены данные о значительных гистологических и биохимических изменениях показателей метаболизма костной ткани, свидетельствующих об активизации процессов остеогенеза [4,5], а именно, происходило увеличение концентрации белковосвязанного оксипролина в крови без изменений содержания свободного (рис.2). При этом внутримышечное введение аллогенного гидроксиапатита интактным животным не вызывало существенных морфологических изменений костной ткани. Уровень биохимических показателей метаболизма костной ткани в крови животных не выходил за пределы физиологической нормы, что не свидетельствовало о нарушении гомеостаза кальция. Никаких изменений содержания кальция и неорганического фосфора в крови не выявлено. По всей видимости, введение в мышечную ткань ГАП предположительно вызывает незначительное кратковременное повышение содержания соответст-

вующих минеральных компонентов в крови, что угнетает секрецию паратиреоид-ного гормона и приводит к снижению до уровня физиологической нормы концентрации кальция и неорганического фосфора. Морфологические исследования периферических органов иммуногенеза не обнаруживали наличия у препарата им-муногенных свойств [4]. Наряду с этим, при однократном внутримышечном введении суспензии аллогенного гидроксиапатита после многократного теплового воздействия, сохранялась повышенной активность функции коры надпочечников (на 21 %). Полученные результаты свидетельствуют о наличии неблагоприятного влияния изучаемого физического фактора на организм, что проявляется в усилении стрессовой реакции. При этом в крови животных происходили значительные изменения биохимических показателей метаболизма костной ткани в виде увеличения концентрации белковосвязанного оксипролина на 32 % при нормализации уровня свободного, что свидетельствует об усилении синтеза коллагена и замедлении процессов резорбции костной ткани.

40

30

§ 20 о &10

*-10

-20

-30

Рис. 3. Влияние введения аллогенного гидроксиапатита на уровень оксипролина в крови животных. * - отличия от контроля статистически значимы с доверительной вероятностью р<0,05

Также изучалось комбинированное влияние инъекций ГАП на организм животных на фоне теплового воздействия (рис. 3). В первой серии животным однократно вводили суспензию ГАП. Через две недели нами было обнаружено, что внутримышечное введение аллогенного гидроксиапатита здоровым крысам не вызывает структурных нарушений костной ткани. Содержание оксипролина и кальция, уровень активности щелочной фосфатазы в крови животных не выходят за пределы физиологической нормы.

Во второй серии животным делали инъекции гидроксиапатита, а потом подвергали их тепловому воздействию. Спустя 2 недели после окончания термиче-

ГАП

ГАП перед ГАП после нагревом нагрева

ЕЭ белковосвязанный оксипролин  свободный оксипролин

ского воздействия животных выводили из эксперимента. Было выявлено, что введение аллогенного гидроксиапатита перед началом курса тепловых процедур не вызывает изменения уровня белковосвязанного оксипролина, а уровень свободного оксипролина падает. Это свидетельствует о замедлении процессов распада коллагена.

В третьей серии суспензию ГАП животным вводили после окончания тепловых процедур. Установлено, что уже через 2 недели, происходят значительные изменения биохимических показателей в виде увеличения концентрации белковосвязанного оксипролина на 32 % при нормализации уровня свободного, что свидетельствует об усилении синтеза коллагена. Количество остеокластов снижается, а число активных остеобластов возрастает.

Таким образом, полученные экспериментальные результаты свидетельствуют об отсутствии нарушений метаболизма костной ткани после введении аллогенно-го гидроксиапатита в мышцу здоровым животным и наличии профилактического и терапевтического эффекта от его введения при повышенной костной резорбции в исследованных моделях у животных .

Заключение

Таким образом, использованные нами в опытах на животных экспериментальные модели позволили впервые оценить системные изменения в организме при эктопическом введении аллогенного гидроксиапатита, полученного по оригинальной разработке. Экспериментальные данные свидетельствуют о нормализации метаболизма и снижении процессов резорбции костной ткани, что может служить основанием к использованию этого препарата в профилактических целях при развитии резорбции костной ткани.

Литература

[1] Франке, Ю. Остеопороз / Ю. Франке, Г. Рунге. - М.: Медицина, 1995. -299 с.

[2] Рожинская, Л.Я. Системный остеопороз / Л. Я. Рожинская. - М.: Мокеев, 2000. - 195 с.

[3] Шварц, Г. Я. Фармакотерапия остеопороза / Г. Я. Шварц. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 36S с.

[4] Изучение биохимических показателей в организме крыс при применении гидроксиапатит-содержащих препаратов / М.Ю. Власов [и др.] // Сборник тезисов и статей 36-ой итоговой научно-практической конференции Самарского военно-медицинского института. 2003. - С. 15-29.

[5] Подковкин, В.Г. Показатели метаболизма костной ткани, функции коры надпочечников и состояния иммунокомпетентных органов у животных после эктопической имплантации аллогенного гидроксиапатита / В.Г. Подковкин [и др.] // Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий: Материалы всеросс. симпоз. с междунар. участ. 2004. - С. 50-67.

[6] Ермакова, И.П. Биохимические маркеры обмена костной ткани и их клиническое использование / И.П.Ермакова // Лаборатория. - М., 2001. -№ 1. - С. 3-5.

[7] Мазурова, В.И. Актуальные вопросы диагностики и лечения остеопороза / В.И. Мазурова, Е.Г. Зоткина. - СПб: Фолиант, 199S. - 95 с.

[8] Лоренс Риггз, Б. Остеопороз: этиология, диагностика, лечение / Б. Лоренс Риггз. - М.: Бином, 2000. - 558 с.

[9] Эпилтон Здоровые кости. Что необходимо знать об остеопорозе / Эпилтон, Ненси. - М.: КРОН-пресс, 1998. - 158 с.

[10] Сергеева, Л.И. Физиология систем крови, кровообращения и внутренней секреции. Лабораторный практикум по курсу «Физиология человека и животных» / Л.И. Сергеева, В.Е. Кузьмина. - Самара: Самарский государственный университет, 1991. - 70 с.

Статья поступила в редакцию 25/IX/2006;

в окончательном варианте - 26/XII/2006.

THE EFFECT OF ALLOGENIC HYDROXYAPATITE ON BONE TISSUE’S METABOLIZM3

© 2007 E.V. Pisareva, M.Y. Vlasov, O.V. Gribkova, V.G. Podkovkin,

L.T. Volova, E.N. Arkhipova4

In the paper an allogenic hydroxyapatite’s effect on process of bone tissue’s metabolism into animals is studied. The effect of hydroxyapatite is tested on two models of bone’s resorption - the model of transitory hyperthermia and hypoestrogenic model. The obtained data can lead to usage of allogenic hydroxyapatite in protection from development of bone tissue’s resorption.

Paper received 25/IX/2006.

Paper accepted 26/XII/2006.

3 Communicated by Dr. Sci. (Biology) Prof. S.A. Satchkov.

4 Pisareva Elena Vladimirovna (pella1@rambler.ru), Vlasov Mikhail Yurievich, Gribkova Olga Vitalievna, Podkovkin Vladimir Georgievitch (podkovkin@rambler.ru), Volova Larisa Teodorovna, Arkhipova Ekaterina Nickolaevna, Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.