Идентификация возбудителя сибирской язвы, выделенного из почвы скотомогильника

УДК 616.981.51:631.42

Н.А.Шишкова, Т.Б.Кравченко, Л.И.Маринин, А.Н.Мокриевич

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ,

ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПОЧВЫ СКОТОМОГИЛЬНИКА

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск

Использование современных генно-инженерных методов позволяет не только провести идентификацию сибиреязвенных штаммов, выделенных из почвы, но и осуществить сравнительные молекулярно-генетические исследования этих штаммов. Проведено лабораторное исследование 80 проб земли, взятых из старого скотомогильника, с использованием микробиологических и генетических методов. Эпидемическую значимость выделенных штаммов оценивали по результатам ПЦР с видоспецифическими праймерами и по данным многолокусного У№Ж-анализа. Выделено шесть штаммов, три из которых отнесены к B. anthracis, а остальные - к близкородственным бациллам. Показана принципиальная возможность использования данной комплексной методики для типизации сибиреязвенных штаммов и их дифференциации от близкородственных микроорганизмов.

Ключевые слова: почва, скотомогильники, B. anthracis, УМТО-анализ.

N.A.Shishkova, T.B.Kravchenko, L.I.Marinin, A.N.Mokrievich

Identification of Bacillus anthracis Isolated from Soil of the Animal Burial Site

State Scientific Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk

The usage of modem gene engineering methods makes it possible not only to identify anthrax strains isolated from soil, but also to hold out comparative molecular genetic assays with these strains. Carried out was the laboratory research of 80 soil samples isolated from the old animal burial site using microbiological and genetic techniques. Epidemiological significance of the isolated strains was evaluated on the basis of the results of PCR with species-specific primers and multi-locus VNTR-analysis data. Extracted were the six strains, three of which were classified as B. anthracis, and the rest - as closely related bacillus. Demonstrated was the possibility to use this particular complex method for anthrax strains typing and their differentiation from closely related microorganisms.

Key words: soil, animal burial sites, B. anthracis, VNTR-analysis.

Основным резервуаром возбудителя сибирской язвы и основным фактором, поддерживающим непрерывность эпизоотического процесса в очагах, является почва, которую можно считать вторым, после инфицированных животных, источником этого заболевания, поскольку доказана возможность заражения животных и людей непосредственно от почвы. В Российской Федерации насчитывается около 35 тыс. стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов с почвенными очагами, в которых учтено 7940 сибиреязвенных скотомогильников. На протяжении последних пяти лет на территории РФ зарегистрировано 43 случая заболевания людей сибирской язвой, из них 3 - с летальным исходом. К сожалению, на многих территориях до настоящего времени не налажен должный учет скотомогильников и контроль за их санитарным состоянием. Поэтому остается актуальной проблема выявления и мониторинга возникших в прошлом захоронений животных, погибших от сибирской язвы.

Выделенные из почвы сибиреязвенные штаммы часто имеют атипичные признаки, что затрудняет их идентификацию. Проведение ПЦР с соответствующими видоспецифическими праймерами дает возможность не только идентифицировать выделенные из почвы сибиреязвенные штаммы и оценить их эпидемическую опасность, но и провести сравнительные молекулярно-генетические исследования. Использование метода мультилокусного определения

вариабельного числа тандемных повторов (VNTR) позволяет обнаружить значительное внутривидовое разнообразие возбудителя сибирской язвы, считавшегося ранее мономорфным.

Целью работы являлась оценка возможности использования, наряду с классическими микробиологическими методами, современных генетических подходов с применением ПЦР с видоспецифическими праймерами [8] и многолокусного VNTR-анализа [7] для типизации и дифференциации штаммов, выделенных из почвы старого скотомогильника.

Материалы и методы

Работа проведена на 18 штаммах из Коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ: B. anthracis 71/12 (2-я вакцина Ценковского); СТИ-1; CTH-RIF4; 1 Коломна; 81/1; 10; 32 (603); 193 Куба II; Dakar; B. sub-tilis 168; B. subtilis var. niger; B. thuringiensis 1373; B. megaterium 1433; B. brevis 1409; B. cereus 217 (an-thracoides); B. cereus 164; B. cereus 504; B. polymixa.

Исследованы пробы почвы, взятые из старого скотомогильника (захоронению более 70 лет), находящегося в Тверской области. Исследуемый участок разделили на квадраты и отобрали в целом 80 проб земли. Диагностические исследования проб почвы проводились в соответствии с методическими указаниями по лабораторной диагностике и обнару-

жению возбудителя сибирской язвы [1]. Выделение штаммов проводили на высокочувствительной плотной питательной среде по Луриа-Бертани (LA) [3] с полимиксином В. Из почвы было выделено шесть изолятов, которые получили обозначения П-1, П-4о, П-4, П-4ш, П-4с и П-14. Штаммы культивировали при температуре 37 °С в жидкой и на плотной питательных средах.

Пробоподготовку и выделение ДНК проводили в соответствии с методическими указаниями «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР» [2]. Праймеры для определения величин vrr-фрагментов синтезированы на фирме Amersham. Прямые праймеры были мечены Cy™5 амидитом (Pharmacia, США). Видоспецифические праймеры для B. anthracis были синтезированы фирмой «Литех» (Москва). ПЦР проводили с использованием набора Ready-to-go-Beads (Amersham Pharmacia Biotech, США) на термоциклере Терцик (Москва). Для определения размеров ПЦР-ампликонов с видоспецифическими праймерами использовали стандартный способ оценки по показателю электрофоретической подвижности в геле агарозы (1,2 %) с последующим окрашиванием бромистым этидием или в полиакриламидном геле (6 %) с последующим окрашиванием серебром в сравнении с маркером молекулярных масс 100 bp. Определение нуклеотидных последовательностей и размеров фрагментов осуществляли на автоматическом секвенаторе ALFexpressII (Amersham Pharmacia Biotech, США) с использованием меченных Cy™5 амидитом праймеров.

При выполнении данных работ соблюдали требования безопасной работы, изложенные в Санитарноэпидемиологических правилах «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований была проведена оценка культурально-морфологических свойств выделенных из почвы штаммов. По характеру роста в L-бульоне выделенные 6 штаммов бацилл можно было подразделить на три типа культур. Кроме того, были оценены способность штаммов к лизису специфическими сибиреязвенными бактериофагами

Гамма и КВИЭВ, чувствительность к ампициллину и гемолитическая активность [3]. Полученные характеристики выделенных штаммов представлены в табл. 1, из данных которой видно, что к типичным штаммам B. anthracis можно отнести только два из шести изолятов - штаммы П-1 и П-4о. Отсутствие капсулы при культивировании этих штаммов на бикарбонатно-сывороточном агаре, вероятно, связано с их частичной аттенуацией в процессе длительного нахождения в почве.

Далее было проведено выделение ДНК из исследуемых и контрольных штаммов и тестирование в ПЦР с набором праймеровpag, lef, cya, cap, Ba SIS, комплементарных к выявленным локусам генома сибиреязвенного микроба по методу [6]. Для сравнения исследовали штаммы B. anthracis с различными гено- и фенотипами (81/1; 71/12; СТИ-1; СТИ-Я№4; 1; 10; 32; 193; Dakar) и 9 штаммов близкородственных бацилл. Результаты представлены в табл. 2.

Как следует из приведенных в табл. 2 результатов, только два из шести выделенных штаммов являются «полноценными» B. anthracis в генетическом отношении - это штаммы П-1 и П-4о (в ПЦР выявлены все пять видоспецифических ПЦР-фрагментов pag, lef, cya, cap, Ba SIS), что согласуется с характеристиками выделенных штаммов, приведенными выше. Штамм П-4 можно отнести к атипичному бескапсульному варианту B. anthracis, сходному с атипичными штаммами B. anthracis 10, 32, 193 и Dakar, также дефектными по гену отечного фактора. Штаммы П-4с, П-4ш и П-14 несли только один хромосомный маркер Ba SIS, который обнаруживается и у B. cereus, следовательно, их можно отнести к близкородственным штаммам.

Дополнительно с помощью иммуноблоттинга с кроличьими моноспецифическими сыворотками, полученными нами ранее к отдельным компонентам сибиреязвенного токсина, изучены спектры секрети-руемых почвенными штаммами белков (данные не приведены). Показано, что все три компонента токсина синтезируются только штаммами П-1 и П-4о, что подтверждает данные ПЦР.

Для генотипирования выделенных почвенных штаммов нами был использован метод многоло-кусного VNTR-типирования с использованием шести хромосомных vrrA, vrrB1, vrrB2, vrrC1, vrrC2 и cg3 и двух плазмидных маркеров pXO1 и pXO2

Таблица I

Свойства штаммов бацилл, выделенных из почвы скотомогильника

Штамм Свойства штаммов

Проба с фагами Г амма и КВИЭВ Зона ингибирования на среде с ампициллином, мм Гемолиз на кровяном агаре Проба с гамма-глобулином Морфология колоний на бикарбонатно-сывороточной среде Рост в L-бульоне

П-1 + 22 + Шероховатые Типичный рост

П-4о + 10 + Шероховатые Типичный рост

П-4 + З + ± Шероховатые Осадок, бульон мутный

П-4ш 0 + Шероховатые Осадок, бульон мутный

П-4с 0 + Шероховатые Осадок, бульон мутный

П-14 0 + Шероховатые Осадок, бульон прозрачный

Результаты постановки ПЦР Таблица 2 с ДНК некоторых штаммов бацилл

Праймер

Штамм Ba 813 152 п.н. .н. c4 6 2 lef 385 п.н. .н. £ Е ^ ЧС 4 5 pag 747 п.н.

П-1 + + + + +

П-4о + + + + +

П-4 + - + - +

П-4ш + - - - -

П-4с + - - - -

П-14 + - - - -

B. anthracis 81/1 + + + + +

B. anthracis 71/12 + + + + +

B. anthracis СТИ-1 + - + + +

B. anthracis СТИ Rif4 + - - - -

B. anthracis 10 -атипичный + - + - +

B. anthracis 32 -атипичный + - + - +

B. anthracis 193 -атипичный + - + - +

B. anthracis Dakar + - + - +

B. cereus 504 + - - - -

B. cereus 217 (anthracoides) + - - - -

B. cereus 164 - - - - -

B. subtilis 168 - - - - -

B. subtilis var. niger - - - - -

B. thuringiensis - - - - -

B. brevis - - - - -

B. polymixa - - - - -

B. megaterium - - - - -

[7]. Результаты определения величин вариабельных фрагментов по этим локусам приведены в табл. 3.

Из представленных данных видно, что выделенные из почвы штаммы П-1 и П-4о с типичными культурально-морфологическими признаками, чувствительные к ампициллину и сибиреязвенному

бактериофагу и являющиеся типичными штаммами B. anthracis по результатам ПЦР с видоспецифическими праймерами, укладываются также в схему VNTR-типирования, разработанную для B. anthra-cis. Полученные значения величин фрагментов по 8 локусам позволяют отнести штаммы П-1 и П-4о к подгруппе B. anthracis А3. Следовательно, из почвы старого скотомогильника нами выделены два типичных эпидемически значимых штамма B. anthracis, несущих генетические элементы, кодирующие синтез компонентов токсина и капсулы.

Штамм П-4, отличающийся по ряду признаков от типового, а именно, по характеру роста в жидкой питательной среде, гемолизу эритроцитов и слабой чувствительности к ампициллину, имеет шесть из восьми совпадающих с известными величинами VNTR-локусов, в частности, уггА, уггВ1, уггВ2, уггС2. cg3, рХ01. Поскольку не амплифицировались фрагменты, соответствующие локусу ^тС1 и капсуле, то отнести штамм П-4 к какой-либо VNTR-подгруппе оказалось невозможным. Следовательно, нами выделен ранее не охарактеризованный атипичный штамм B. anthracis, не представляющий эпидемической опасности, но требующий дальнейшего детального изучения.

Для остальных штаммов (П-4ш, П-4с и П-14) по величинам угг-локусов получена картина, сходная с таковой для штамма B. cereus 504. Для уточнения полученных данных нами специально был отсекве-нирован рХ01-фрагмент штамма B. cereus 504. Ниже приведены результаты (шрифтом выделены прямой и обратный праймеры, а повторяющиеся последовательности - курсивом).

B. cereus 504 - рХ01 - 129 CAATmTTAACGATCAGATTAAGTГСA TTATTAACTCATAAGTAATGTATTAAAAAT TTTCAAATGGATTT

ААТ ААТ ААТ ААТ ААТ ААТ ААТ AACGGGACCAGCCATTATGAAGCAACTAATT CTAGA

Таблица 3

Величины фрагментов угг-областей штаммов, выделенных из сибиреязвенного скотомогильника

Штамм vrrA vrrB1 vrrB2 vrrC1 vrrC2 cg3 pXO1 pXO2

B. anthracis 81/1 313 230 161 609 600 152 135 136

B. anthracis 1 324 230 162 617 601 153 136 137

B. anthracis 71/12 315 230 161 611 527 153 135 136

B. anthracis СТИ-1 316 229 162 613 602 153 133 136

B. anthracis 10 * 315 230 160 613 599 156 136 136

B. anthracis Dakar 298 229 161 496 472 156 134 144

B. anthracis 32 * 312 230 161 - 528 155 133 136

B. anthracis 193 * 310 229 163 673 585 - - 136

П-1 313 228 164 613 532 153 133 135

П-4о 315 228 161 611 533 153 130 136

П-4 313 229 161 - 533 154 133 -

П-4ш 278 264 - - 336 - - -

П-4с 285 264 163 - 312 - - -

П-14 294 265 164 - 324 - - -

B. cereus 504 282 *Атипичные штаммы. 266 164 - 308 - 130 -

Результаты сиквенса фрагмента ДНК B. cereus полностью укладываются в классификацию, предложенную Р.Кеіт и соавт. для B. anthracis [7]. Это может быть связано с очень высокой степенью гомологии генома, что отражает недавнюю эволюцию B. anthracis от родительской субгруппы B. cereus [6]. Показано, что некоторые изоляты B. cereus содержат последовательности, сходные более чем с половиной последовательностей открытых рамок считывания плазмиды рХО1 B. anthracis, причем основная часть ДНК-фрагментов B. cereus имела сходство от 80 до 98 %.

Совпадение данных по локусам уггВ2 и рХ01 B. anthracis и B. cereus значительно затруднило однозначную дифференциацию этих видов, тем не менее, поскольку по всем остальным локусам имелись значительные отличия от B. anthracis, штаммы П-4ш, П-4с и П-14 с большой степенью вероятности можно отнести к B. cereus.

Это - еще одно свидетельство сложности процесса дифференциации бациллярных штаммов. С целью повышения эффективности типирования бацилл в настоящее время предлагаются различные комбинации методов в зависимости от поставленных задач, но, вследствие высокой генетической моно-морфности сибиреязвенного микроба, мультилокус-ный VNTR-анализ может оказаться наиболее приемлемым для типирования B. anthracis [4, 5].

Оценивая полученные данные по идентификации выделенных из старого скотомогильника бацилл, можно сделать вывод о том, что для точного подтверждения выделения возбудителя сибирской язвы по-прежнему необходимо проведение комплексных исследований - микробиологических, иммунобиологических и молекулярно-генетических. Микробиологический анализ показал присутствие в почве скотомогильника двух культур B. anthracis, обладающих всеми типичными для возбудителя сибирской язвы характеристиками. Эти данные были подтверждены результатами ПЦР с пятью праймерами к pag, Є, суа, сар, Ва 813, разработанными для генома сибиреязвенного микроба.

Дополнительные исследования выделенных штаммов с использованием мультилокусного VNTR-анализа позволили отнести выделенные штаммы П-1 и П-4о к подгруппе B. anthracis А3, выявить ранее не охарактеризованный атипичный штамм B. anthracis П-4, и предварительно отнести выделенные штаммы П-4ш, П-4с и П-14 с нетипичными для сибиреязвенного микроба свойствами к B. cereus.

Таким образом, нами показана принципиальная возможность использования комплексной методики

для типизации сибиреязвенных штаммов и их дифференциации от близкородственных микроорганизмов.

Работа выполнена по государственным контрактам Ф/2/09 от 09.07.2009 г. и 119-Д от 11.06.2009 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности (2009-2013 гг.).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания. МУК 4.2.2413-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2009. 67 с.

2. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР. Методические указания. МУ 3.5.5.-1034-01. М: МЗ РФ; 2001. 8 с.

3. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н., Бахтеева И.В., Белова Е.В., Борзилов А.И. и др. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы. М.: ЗАО МП «Гигиена»; 2009. 304 с.

4. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типирование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы. Мол. генет., микробиол., вирусол. 2003; 1:6-14.

5. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Цыганкова Е.А. и др. Фенотипические и генетические особенности культуральноморфологических вариантов Bacillus anthracis Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2008; 4:6-11.

6. Helgaso E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A, Fouet A., Mock M. et al. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis: one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ.Microbiol. 2000; 66:2627-30.

7. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L., Schupp J.M., Okinaka R. et al. Multiple-locus VNTR analysis (MLVA) reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000; 182:2928-36.

8. Patra G., Sylverste P., Ramisse V. et al. Specific oligonucleotide primers for rapid identification of Bacillus anthracis strains. Proc. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England, September 19-21, 1996. P. 45-fr

References

1. [Laboratory diagnostics and detection of Bacillus anthracis. Methodological instructive regulations. MIR 4.2.2413-08]. M.: State Rospotrebnadzor Centre of Hygiene and Epidemiology; 2009. 67 p.

2. [Decontamination of the test material, infected by the bacteria of the I-IV groups, while using PCR-based methods. Methodological instructive regulations. MIR 3.5.5-1034-01]. M.: Ministry of Health of the Russian Federation; 2001. 8 p.

3. Marinin L.I., Dyatlov I.A., Mokrievich A.N., Bakhteeva I.V., Belova E.V, Borzilov A.I. et al. [Methods for examination of Bacillus anthracis biological properties]. M.: ZAO MP “Gigiena”; 2009. 304 p.

4. Kutyrev V.V., Smirnova N.I. [Gene diagnostics and molecular typing of etiological agents of plague, cholera, and anthrax]. Mol. Gen. Microbiol Virusol. 2003; 1:6-14.

5. Tsygankova O.I., Eremenko E.I., Tsygankova E.A. et al. [Phenotypic and genetic peculiarities of the cultural and morphologic Bacillus anthracis variants]. Zh. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. 2008; 4:6-11.

Authors:

Shishkova N.A., Kravchenko T.B., Marinin L.I., Mokrievich A.N. State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: info@obolensk.org

Об авторах:

Шишкова Н.А., Кравченко Т.Б., Маринин Л. И., Мокриевич А.Н. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Московская обл., п. Оболенск, E-mail: info@obolensk.org

Поступила 22.04.11.