СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ ДЕЦИДУАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ ЭНДОМЕТРИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR STIMULATION OF ENDOMETRIAL DECIDUA FORMATION EXPERIMENTALLY

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к созданию новых способов лечения невынашивания беременности и других заболеваний матки, связанных с несостоятельностью эндометрия, с целью последующего их клинического применения.
Неослабевающий интерес к проблеме невынашивания беременности определяется относительным постоянством частоты этой патологии (10-30%) практически во всех странах мира (Миронов А.В. и др., 2012). Репродуктивные потери, представляющие собой невосполнимую утрату жизненного потенциала популяции, принципиально отличаются от смертности других возрастных групп, поскольку нерожденные дети и умершие младенцы являются безвозвратной потерей человеческого капитала. Суммарные репродуктивные потери за весь постсоветский период (1991-2010 гг.) составили в целом по России 5515667 плодов (беременностей), что на 28866559 родившихся за эти годы детей составило 19,1 на 100 живорожденных. В структуре общих репродуктивных потерь фетоинфантильные потери составили 10,9% (умершие дети первого года жизни 7,4%, мертворожденные - 3,5%), пренатальные потери до 28 недель гестации - 89,1% (самопроизвольные аборты - 65,3%, аборты по медицинским показаниям -15,4%, по социальным показаниям - 8,4%) (Стародубов В.И. и др., 2012).
Имплантация и нормальное развитие беременности зависит от функциональной полноценности эндометрия. Морфологической основой спонтанных абортов и неразвивающихся беременностей является сочетание морфофункциональных признаков хронического продуктивного воспаления (микроабсцессы в маточно-плацентарной области, некроз децидуальных клеток в центрах абсцессов и в области воспалительных валиков) в сочетании с местными признаками гемостаза в париетальном эндометрии и d.basalis с расслаивающимися кровоизлияниями и тромбозом до образования ретроплацентарной гематомы, несмотря на адекватную децидуализацию эндометрия и достаточную гестационную перестройку спиральных артерий. Определение патологических изменений иммунореактивности организма, цитокинового статуса, тромбоцитарного и плазменного звеньев гемостаза, АМГФ (альфа-2-микроглобулин фертильности) в сыворотке крови являются прогностическими показателями структурно-функциональных изменений эндометрия при невынашивании беременности. С целью восстановления структурно-функциональных нарушений эндометрия у женщин с невынашиванием беременности разработан комплекс мероприятий, включающий: иммунотерапию, гипосенсибилизирующую терапию, улучшение микроциркуляции и трофики, восстановление двухфазного менструального цикла, физиотерапевтическое лечение и планирование беременности.
Физиотерапевтические воздействия осуществляют разными способами, например внутривенным введением озонированного физиологического раствора на протяжении 5 дней (RU 208624, Торчинов A.M. и др., 2009), введением в полость матки после аборта кислой фракции электрохимически активной воды с рН 3,3-4,1 до коагуляции содержимого полости матки (RU 2138270), акупунтурным воздействием на определенные точки с помощью микроигл (RU 213267), вибрации и электрическим током (RU 92007560), с помощью инфракрасного излучения минимальной мощности (RU 2112444) или электрическими биполярными импульсами воздействуют абдоминально-вагинально (RU 2223798). Для улучшения состояния эндометрия предлагается воздействовать абдоминально и интравагинально бегущим переменным магнитным полем (RU 2302885). Микроиглы можно вводить на фоне приема вобэнзима (RU 2159126). Для лечения антифосфолипидного синдрома с привычным невынашиванием беременности предлагается до зачатия проводить чрескожное низкоинтенсивное лазерное облучение крови в инфракрасной области спектра в сочетании с постоянным магнитным полем проекции подключичных, локтевых, бедренных и подколенных артерий (RU 2188680). Однако эти способы лечения невынашивания беременности при самостоятельном применении имеют низкую эффективность и поэтому используются как дополнение к основному медикаментозному лечению с целью уменьшения дозы лекарственного препарата, уменьшая тем самым вредные побочные эффекты лекарств. С этой же целью предлагается использовать гомеопатические препараты (RU 2321403) и лекарственные средства, влияющие на иммунитет (RU 2232028, RU 2452481, RU 2007126885, RU 2283653). Известен метод предупреждения спонтанного или привычного выкидыша, основанный па введении женщине одного или нескольких иммунологически активных экзогенных гестогенных препаратов, начиная с момента овуляции. Препарат (экзогенный гестоген), агонист рецептора прогестерона человека, выбирается из числа следующих: desogestrel; dimethisterone; dydrogesterone; ethynodiol; ethynodiol diacetate; etono-gestrel; gestodene; hydroxyprogesterone; hydroxyprogesterone caproate; keto-desogestrel; lynestrenol; medrogestone; medroxyprogesterone; medroxyprogesterone acetate; megestrol; megestrol acetate; nestorone; nomegestrol; nomegestrol acetate; norethynodrel; norgestimate; norgestrienone; promegestone; quingestanol; quingestanol acetate and trimegestone, dydrogesterone. Лечение начинается с этапа диагностики, когда выделяют МКПК (мононуклеары) из образца периферической крови, их культивируют с белковым экстрактом трофобласта, анализируют концентрации цитокинов Th1 и Th2 в супернатанте культуры МККМ и расчитывают соотношение Th1/Th2 для каждой пациентки. В зависимости от величины этого соотношения назначают лечение тем или иным препаратом. Рекомендуется пероральное введение, но возможно интравагинальное и трансдермальное введение. Дозы: 2,5-100 мг/день, обычно 5-60 мг/день, в зависимости от состояния, индивидуальной чувствительности и т.д.
Лечение бесплодия и предотвращения невынашивания беременности, вызванных бруцеллезом, предлагается использовать антитела (JP 2008222590). Предложен способ снижения риска невынашивания, основанный на применении препаратов, ингибирующих экспрессию тканевого фактора (TF, например статинов) и/или активность нейтрофилов и/или моноцитов (например статинов), а также методы диагностики лиц с повышенным риском невынашивания (US 20090312411). Терапия начинается до беременности (например, за 1 мес до планируемой беременности), или после ее начала и продолжается весь период риска невынашивания (например, 1-й триместр), затем прекращается, либо в течение всей беременности, до родов. Лекарственные формы: обычно в виде органических или неорганических солей. Формы введения: инъекционные, пероральные, назальные, буккальные (для симвастатина: 80 мг/день). Способ имеет относительно низкую эффективность.
Сочетанная терапия, направленная на профилактику патологии новорожденных, выкидышей и бесплодия у женщин путем нормализации гормонального фона до уровня молодых женщин и терапии ингибиторами ароматаз (US 20090137478). Для этого проводят регуляцию уровней ФСГ, эстрогена, активности ЛГ, эстрадиола и прогестерона, с приведением их к показателем здоровых молодых женщин и вводят ингибитор фермента ароматазы, который регулирует уровень эстрадиола. Используют следующие препараты: гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), его агонист, и/или антагонист; ФСГ; ЛГ и/или хорионический гонадотропин, прогестерон, ингибитор фермента ароматазы. Длительность терапии: от 2-4 до 34 месяцев. Положительный эффект благодаря способу предполагается следующий: профилактика женского бесплодия, нормализация созревания фолликулов и ооцитов, стимуляция верной сегрегации хромосом в ооцитах и в раннем эмбриогенезе. К недостаткам способа можно отнести очень высокую вариабельность результата. Маловероятно, что такая терапия поможет эффективно снизить риск развития хромосомных нарушений.
При наличии недостаточности функции желтого тела предпочтение отдается хорионическому гонадотропину, поскольку он после 8 недель беременности стимулирует синтез эндогенного прогестерона желтым телом и трофобластом. Дополнительно оказывается прямое стимулирующее действие на процесс имплантации плодного яйца, а также усиливается выработка релаксина - гормона, необходимого для роста и расслабления матки. Для лечения раннего самопроизвольного выкидыша достаточно широко используется как симптоматическая (полу/постельный режим, физический и сексуальный покой, психологическая поддержка) терапия, так и назначение седативных средств, спазмолитиков, витаминотерапии, гормональных препаратов. В настоящее время очень осторожно применяют эстрогены, которые показаны только в случае подтвержденной гипоэстрогении на ранних сроках беременности, но к 9-10 неделям должны быть полностью отменены. С целью сохранения беременности в течение первых 20 недель целесообразно и эффективно назначение прогестеронов (прогестерона и его синтетических аналогов, прогестогенов). Наиболее патогенетически обоснованный метод лечения самопроизвольного прерывания беременности - назначение бета-адреномиметиков (токолитиков) с 16 недели беременности. Токолитики, воздействуя на бета-адренорецепторы, приводят к снижению тонуса и сократительной активности миометрия. В качестве комплексной терапии угрожающего позднего самопроизвольного выкидыша возможно парентеральное применение сульфата магния, нестероидных противовоспалительных препаратов и недигидроперидиновых блокаторов кальциевых каналов (Тетелютина Ф.К. и др., 2010).
Для лечения гиперпластических процессов эндометрия у больных метаболитическим синдромом наряду с приемом прогестеронов (прогестерона и прогестогенов) назначают метформин (RU 2438662). С целью повышения эффективности лечения бесплодия, вызванного малыми формами внешнего генитального эндометриоза, применяют синтетические андрогенные препараты (RU 2273481).
Для профилактики преждевременных родов и невынашивания беременности, связанных со спонтанными или брадикинин-индуцированными (но не окситоцин- или простогландин F2-альфа-индуцированных) сокращениями миометрия предлагаются препараты, содержащие пептид адреномедуллин (в нескольких вариантах состава). Адреномедуллин получают из ткани феохромоцитомы или синтезируют (ЕР 1205185, US 20070161555). Для указанных целей препараты оказались недостаточно эффективными и нашли применение в основном перед кесаревым сечением и для лечение дисменореи. Предложен способ стимуляции роста плаценты и преодоления проблем, связанных с нарушениями плацентарного развития путем измерения уровня макрофагального ингибирующего цитокина-1 (МИЦ-1) или сходного белка в биологических жидкостях. Затем доводят общий уровень МИЦ-1 в плацентарном экстракте (т.е. эндогенного и введенного) до 15-70 нг/мл, лучше до 30-50 нг/мл и поддерживают этот уровень весь период беременности. Метод введения любой: перорально, назально, инъекционно, в матку. Возможно использование вирусных векторов (генетической инженерии). Это позволяет снизить риск невынашивания или преждевременных родов (ЕР 1914554). Однако этот метод достаточно трудоемкий и дорогой, поскольку требует регулярных лабораторных диагностических исследований.
К настоящему времени накоплен достаточный материал, свидетельствующий о важной роли прогестерона в обеспечении физиологического течения беременности. На основе прогестерона созданы эффективные стероидные соединения, обладающие прогестагенным действием при оральном введении (ацетомепрегенол, утрожестан, дюфастон и др.). Вместе с тем поиск высокоэффективных и безопасных синтетических аналогов прогестерона продолжается. Как показали экспериментальные исследования, способность поддерживать процесс развития беременности у овариэктомированных крольчих обеспечивает недостаточно высокий процент сохранения бластоцист. При введении изопропилового эфира ацетомепрегенола количество сохраненных бластоцист составило 47,6% от числа проовулировавших фолликулов; при введении бутамепрегенола - 56,14%. Дюфастон, широко используемый в акушерской практике, сохранял лишь 28% бластоцист от числа проовулировавших фолликулов (Корхов В.В. и др., 2008). В результате анализа англоязычных публикаций по использованию прогестогенов в лечении невынашивании беременности, представленных в базах данных MEDLINE и Embase за большой период времени (1966-2011 годы), был сделан вывод о том, что в настоящее время нет убедительных данных в пользу выбора прогестагенов для уменьшения случаев прерывания беременности (Likis F.E. et al., 2012).
Известен способ восстановления эндометрия, выбранный нами в качестве прототипа (Nagori et al., 2011). Описан единичный случай - женщина 33 лет с первичным бесплодием (8 лет замужем). Неудачное экстракорпоральное оплодотворение (тяжелый случай синдрома Ашермана после выскабливания эндометрия). Общепринятый способ лечения, когда в матку помещали специальное контрацептивное устройство, которое проводило циклическую гормональную терапию на протяжении 6 месяцев для развития эндометрия, оказался неэффективным. Для восстановления эндометриальной ткани матки было проведено лечение стволовыми клетками, выделенными из костного мозга этой женщины (т.е. аутологичными). После пункции проводили забор костного мозга аспирацией в количестве 45 мл. Затем выделяли стволовые клетки при помощи магнитного сортинга по CD9, CD44, и CD90. Было получено 39 млн положительных по этим маркерам клеток, которые разведены в фосфатно-солевом буфере (0,7 мл) с 2% аутологичной сывороткой. На 2-й день менструального цикла, под контролем ультразвукового исследования, канюля введена в полость матки (0,5 см от дна), и клеточная суспензия введена в полость матки (от дна до середины) на обратном движении канюли. На протяжении 25 дней со дня трансплантации проводили гормональную терапию по схеме: эстрадиола валерат, 6 мг/день со дня трансплантации в течение 25 дней и медроксипрогестерона ацетат 10 мг/день с 20-го по 25-й день. Эндометрий периодически изучался на ультразвуковом приборе. Через 4,5 месяца при достижении толщины эндометрия 8 мм и хорошей васкуляризации (развитие спиральных сосудов) провели оплодотворение in vitro и перенос эмбриона. После оплодотворения проводили гормональную терапию по следующей схеме: прогестероновый вагинальный гель (Crinone 8%) дважды в день и этинил-эстрадиол 6 мг/день. Это приводило к успешной беременности, которая подтверждалась плодными оболочками (в том числе децидуальной оболочки), желточным мешочком зародыша и зародышевым полем с кардиальной активностью при ультразвуковом исследовании.
Таким образом, эндометриальные ангиогенетические стволовые клетки, изолированные из аутологичных взрослых стволовых клеток костного мозга. могли регенерировать поврежденный эндометрий, не отвечающий на общепринятое лечение синдрома Ашермана. Однако этот способ довольно травматичный (пункция костной ткани, которая может занимать 2-3 часа, и связана с риском развития осложнений) и трудоемкий.
Целью изобретения является снижение травматичности и времени выполнения способа. Поставленная цель достигается тем, что у самки крысы вызывали состояние псевдобеременности, затем в стенку матки имплантировали стволовые клетки, выделенные из эндометрия человека. Это позволило значительно упростить и снизить травматичность стимуляции образования децидуальной оболочки эндометрия. Это связано с относительной легкостью получения эндометриальной ткани из менструальной крови и небольшими затратами на выделение стволовых клеток из эндометриальной ткани.
2
Способ осуществляется следующим образом. Менструальную кровь, содержащую фрагменты эндометрия, получали от женщин, проходивших подготовку к экстракорпоральному оплодотворению в Международном центре репродуктивной медицины (г.Санкт-Петербург). Возраст пациенток составлял 30-40 лет. У всех менструальный цикл был регулярным 27-30 дней. Забор менструальной крови проводили на 2-й день менструального цикла. Кровь собирали аспиратором Ipas MVA plus с насадкой диаметром 4 мм, введенным в цервикальный канал до внутреннего зева. В среднем от каждой пациентки получали 1-2 мл. Полученный образец переносили в фосфатно-солевой буфер (PBS) с добавлением цитрата натрия и 10% смеси антибиотика и антимикотика (смесь пенициллина, стрептомицина и амфотерицина). В этом растворе при температуре 4°С кровь доставляли в лабораторию в течение 2-18 ч. Центрифугированный осадок, содержащий фрагменты эндометрия, ресуспензировали в PBS с добавлением 10% смеси антибиотика и антимикотика и инкубировали в течечние 1 ч при температуре 37°С. Затем отцентрифугированные эндометриально-менструальные клетки переносили в 6-см чашки Петри. Для получения адгезивной клеточной популяции клетки культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 1% смеси антибиотика и антимикотика, 1% глутамакса. Клетки культивировали в течение 3-7 сут. За это время среду меняли несколько раз. Полученную адгезивную популяцию клеток (4-9 млн) пересевали с помощью 0,05% раствора трипсина и EDTA в соотношении 1:4 до 5-го пассажа 2 раза за 1 нед., далее в соотношении 1:3 и замораживали. Для культивирования использовали флаконы Т25 и Т75. Плотность при пересеве составляла 14-15 тыс. кл./см.
Культивирование клеток эндометрия для подготовки к трансплантации производилось с использованием среды DMEM/F12 с добавлением эмбриональной коровьей сыворотки и глютамина. На третий - четвертый день после пересева, когда культура клеток достигала монослоя, производилось снятие клеток с подложки и переведение их в суспензию. Для открепления клеток применялась смесь трипсина и ЭДТА. Поскольку ферментативное действие трипсина может повредить мембраны клеток, что привело бы к снижению их жизнеспособности при трансплантации, применялся трипсин низкой концентрации (0,05%) и на, возможно, более короткий срок (в пределах 5 мин). Для быстрого действия трипсина после удаления ростовой среды монослой клеток несколько раз промывался PBS. После открепления клеток действие трипсина инактивировалось путем добавления к суспензии достаточного количества ростовой среды с 10% содержанием сыворотки. Для достижения гомогенности суспензия аккуратно пипетировалась. После приготовления одноклеточной суспензии производился подсчет клеток в камере Горяева. Далее культуральная среда заменялась PBS. Для этого суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, сливали супернатант и ресуспензировали осадок в PBS, доводя количество клеток до нужной концентрации путем разведения. После чего суспензия клеток набиралась в шприцы в необходимом количестве для дальнейшей трансплантации. Все манипуляции во избежание инфицирования животного проводились с соблюдением стерильности.
Перед оперативным вмешательством на животном методом изучения влагалищных мазков была отобрана беспородная белая крыса в стадии «эструс». Для индукции псевдобеременности проводили раздражение влагалища фарадическим электрическим током частотой 1 Гц, напряжением 10 мВ на протяжении 40 секунд. После проведенных манипуляций животному предоставляли покой. На пятый день, в стерильных условиях, под эфирным наркозом животное фиксировали на операционном столе в спинном положении. Операционное поле тщательно выбривали и дважды обрабатывали антисептиком. Разрез 2-3 см проводили по средней линии живота от таза вверх. После вскрытия брюшной полости из боковых синусов в операционную рану извлекались рога матки. Оба рога (правый и левый) фиксировали с помощью пинцетов и прошивали ниткой 40-го размера в двух местах, вблизи яичника и вблизи вагинального конца рога. В район шва около яичника правого рога, в стенку матки трансплантировали суспензию стволовых клеток эндометрия (СКЭ) человека в 300 тыс. клеток. Далее все внутренние органы укладывались на свои места и рана ушивалась послойно. После трансплантации животному проводились ежедневные подкожные инъекции прогестерона (2 мг на грамм веса). Через 6 дней крыса выводилась из опыта передозировкой эфирного наркоза и для морфологического исследования извлекали оба рога матки.
Апробация способа проводилась на 30 половозрелых белых беспородных крысах-самках массой 200-220 г. Для подтверждения стимулирующего действия стволовых клеток эндометрия человека на образование децидуальной оболочки (децидуа) в матке крысы было проведено микроскопическое изучение крысиной эндометриальной ткани. Контрольным рогом служил левый рог матки, который только прошивался ниткой в двух местах аналогично правому рогу. Срезы сформировавшихся децидуа толщиной 15 мкм готовили на криостате так, чтобы плоскость среза была перпендикулярна или параллельна длинной оси рогов матки. При этом децидуа ориентировали так, чтобы срез проходил также параллельно мезометрально-антимезометральной оси матки. Строгая ориентация плоскостей срезов децидуа позволяет иметь репрезентативные срезы для изучения региональной дифференцировки клеток децидуа (Михайлов, 1998). Срезы фиксировали в смеси этанола-метанола при -20°С в течение 2 минут и окрашивали гематоксилином и эозином. При микроскопическом изучении оценивали целостность децидуа и отсутствие очагов воспаления или некроза, а также степень дифференцировки децидуа в мезометральном-антимезометральном направлении. Известно, что антимезометральную часть децидуа грызунов занимают т.н. большие децидуальные клетки (БДК), аналоги БДК человека, составляющие основную массу клеток децидуа у человека и крыс (Михайлов, 1998). Доля антимезометральной части колеблется от 30 до 40% площади среза децидуа. Мезометральная часть децидуа, контактирующая с мезометральным треугольником, образована т.н. малыми децидуальными клетками и гранулярными клетками эндометрия (Михайлов, 1998).
Анализ полученных срезов показал, что трансплантация стволовых клеток человека не нарушает дифференцировку децидуальных клеток и организацию ткани, сохраняя в образовавшейся децидуальной оболочке крыс взаимное расположение дифференцированных клеток.
По данным морфометрии срезы децидуа, в которые трансплантировали СКЭ человека, характеризовались увеличением диаметра в мезо-антимезометральном направлении примерно в 1,5-2 раза по отношению к диаметру срезов децидуа левого, контрольного рога. Так как децидуа имеет овальную форму, измерение диаметра дает представление о размерах децидуа и позволяет сравнивать децидуа друг с другом по их площади. Данные замеров представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние на рост децидуа трансплантации в рог матки псевдобеременных крыс стволовых клеток эндометрия (СКЭ) человека
Децидуа крыс на 11-й день псевдобеременности
Диаметр децидуа после трансплантации СКЭ человека (мм)
опытные децидуа
4,3±0,5 (р<0.05)
контрольные децидуа
2,6±0,5
Для оценки влияния трансплантации стволовых клеток на дифференцировку БДК, как наиболее дифференцированных клеток, была определена толщина слоя БДК и вычислена ее доля (%) в общем диаметре каждой децидуа (таблица 2).
Таблица 2
Изменение доли зоны БДК в общей толщине децидуа на 11-й день псевдобеременности после трансплантации СКЭ человека.
Децидуа крыс на 11-й день псевдобеременности
Доля зоны БДК в общей толщине децидуа после трансплантации СКЭ человека, %
опытные децидуа
35,4±3,6 (р>0.05)
контрольные децидуа
31,8±1,6
Из полученных данных следует, что доля антимезометральной (и соответственно, наоборот, мезометральной) стороны децидуа, сформированной БДК (и соответственно малых децидуальных клеток мезометральной стороны децидуа) у опытных децидуа не отличаются от таковых контрольных децидуа, которым не вводили клетки. Таким образом, установлено, что трансплантация СКЭ человека в месте будущего образования децидуа крыс существенно стимулирует рост децидуа по сравнению с контрольным рогом матки, сохраняя при этом организацию ткани и взаимное расположение дифференцированных клеток эндометрия. Полученные данные демонстрируют стимулирующее действие СКЭ человека на созревание и состоятельность эндометриальной ткани крыс в условиях псевдобеременности экспериментальных животных.
Таким образом, разработанный нами способ может использоваться для разработки клинического применения стволовых клеток для лечения невынашивания беременности и других заболеваний, связанных с нарушениями дифференцировки эндометрия и несостоятельности децидуа при беременности.
Список литературы
1. Патент RU 208624 Способ лечения невынашивания беременности. Дата подачи заявки 30.06.1993.
2. Патент RU 2138270 Способ профилактики послеабортных эндометритов. Дата подачи заявки 06.05.1996.
3. Патент RU 213267 Способ лечения невынашивания. Дата подачи заявки 02.04.1996.
4. Заявка на изобретение RU 92007560 Способ профилактического лечения женщин по поводу невынашивания беременности. Дата подачи заявки 23.11.1992.
5. Патент RU 2112444 Способ лечения невынашивания беременности ранних сроков. Дата подачи заявки 13.01.1995
6. Патент RU 2223798 Способ улучшения состояния эндометрия. Дата подачи заявки 13.06.2002.
7. Патент RU 2302885 Физический способ улучшения состояния эндометрия. Дата подачи заявки 02.02.2006.
8. Патент RU 2159126 Способ лечения невынашивания беременности. Дата подачи заявки 16.12.1999.
9. Патент RU 2188680 Способ лечения антифосфолипидного синдрома. Дата подачи заявки 30.03.2001.
10. Патент RU 2321403 Способ лечения бесплодия женщин. Дата подачи заявки 17.04.2006.
11. Патент RU 2232028 Способ лечения антифосфолипидного синдрома. Дата подачи заявки 29.11.2011.
12. Патент RU 2452481 Способ лечения больных с привычным невынашиванием беременности в первом триместре. Дата подачи заявки 16.12.2010.
13. Заявка на изобретение RU 2007126885 Средство для лечения женщин с привычным невынашиванием беременности инфекционного генеза при наличии или отсутствии антифосфолипидного синдрома. Дата подачи заявки 16.07.2007.
14. Патент RU 2283653 Способ лечения невынашивания беременности. Дата подачи заявки 10.04.2004.
15. Патент RU 2438662 Способ лечения доброкачественных гиперпластических процессов эндометрия у больных метаболитическим синдромом. Дата подачи заявки 16.07.2010.
16. Патент RU 2273481 Способ повышения эффективности лечения бесплодия, вызванного малыми формами внешнего генитального эндометриоза. Дата подачи заявки 27.05.2004.
17. Корхов В.В.. Петросян М.А., Лесик Е.А., Сергеева О.А. Изыскание новых синтетических аналогов прогестерона для сохранения беременности в опытах на животных. Психофармакология и биологическая наркология. 2008. Т.8. Вып.1-2. Часть 2. С.2368.
18. Миронов А.В., Джабиева А.А. Исходы беременности и родов у женщин с угрозой невынашивания в первом триместре. ФЭн-наука. 2012. №7. С.54-57.
19. Михайлов В.М. 1998. Жизненный цикл децидуальных клеток. Автореферат док. дис. Санкт-Петербург, 54 с.
20. Стародубов В.И., Суханова Л.П., Сыченков Ю.Г. Репродуктивные потери как медико-социальная проблема демографического развития России. Электронный научный журнал «Социальные аспекты здоровья населения» http://vestnikmednet.ru 01.02.2012 г.
21. Тетелютина Ф.К., Бушмелева Н.Н., Уракова Н.А., Давтян К.А., Михайлова Л.М., Бадриева Ю.Н. Современные подходы к лекарственной терапии при невынашивании беременности. Медицинский альманах. 2010. №4 (13) ноябрь. С.88-92.
22. Торчинов A.M., Цахилова Г., Параскевова С.А. Озонотерапия в комплексном лечении невынашивания беременности. Вестник новых медицинских технологий. 2009. Т.XVI. №2. С.107-108.
23. Патент ЕР 1205185 Uterine contraction inhibitors (Ингибиторы маточного сокращения). Дата подачи заявки 23.06.2000.
24. Заявка US 20070161555 Drug for inhibiting myometrial contraction (Препарат для подавления сокращения миометрия). Дата подачи заявки 28.06.2006.
25. Патент ЕР 1914554 Diagnostic assay and method of treatment involving macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1) (Диагностическое исследование и способ лечения, включающий макрофагальный ингибиторный цитокинин-1 (МИЦ-1)). Дата подачи заявки 20.04.2001.
26. Заявка US 20050020553 Prevention of miscarriage with immunomodulating non-endogenous gestagen compounds (Предупреждение невынашивания беременности иммуномодулирующими неэндогенными гестогенными препаратами). Дата подачи заявки 28.05.2004.
27. Патент JP 2008222590 Method for preventing miscarriage and sterility by brucella infection (Метод предотвращения невынишивания беременности и бесплодия, вызванных бруцеллезом). Дата подачи заявки 09.03.2007.
28. Заявка US 20090312411 Preventing or reducing risk of miscarriages (Предотвращение или уменьшение риска невынашивания беременности). Дата подачи заявки 09.02.2009.
29. Заявка US 20090137478 Hormone normalization therapy and uses therefor (Терапия для нормализации гормонов). Дата подачи заявки 12.11.2009.
30. Likis F.E., Andrews J.C., Woodworm A.L. et al. Progestogens for Prevention of Preterm Birth. 2012. Comparative Effectiveness Reviews, No. 74. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US).
31. Nagori C.B., Panchal S.Y., Patel H. Endometrial regeneration using autologous adult stem cells followed by conception by in vitro fertilization in a patient of severe Asherman's syndrome. J. Hum Reprod Sci. 2011.4(1):43-48.