ЭКСПАНСИЯ ЛИМФОЦИТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПОЗИЦИИ ЦИТОКИНОВ ДЛЯ АКТИВНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ

1. Композиция, предназначенная для экспансии лимфоцитов, содержащая по меньшей мере два типа цитокинов, выбранных из интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-15 (IL-15) и интерлейкина-21 (IL-21).
2. Композиция по п.1, содержащая два или три типа цитокинов.
3. Композиция по п.1 или 2, где композиция находится в жидкой форме, в частности, клеточной культуральной среде.
4. Композиция по п.3, где концентрация IL-2 в жидкой композиции находится в диапазоне от 10 до 6000 Е/мл, предпочтительно в диапазоне от 500 до 2000 Е/мл, более предпочтительно в диапазоне от 800 до 1200 Е/мл.
5. Композиция по п. 3 или 4, где концентрация IL-15 находится в диапазоне от 0,1 до 100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне от 2 до 50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне от 5 до 20 нг/мл.
6. Композиция по одному из пп. 3-5, где концентрация IL-21 находится в диапазоне от 0,1 до 100 нг/мл, предпочтительно в диапазоне от 2 до 50 нг/мл, более предпочтительно в диапазоне от 5 до 20 нг/мл.
7. Способ получения популяции клинически значимых лимфоцитов, включающий следующие стадии:
получение образца из организма млекопитающего, в частности, образца ткани или образца жидкости организма, содержащего по меньшей мере один лимфоцит, и необязательно разделение клеток в образце из организма,
культивирование образца из организма in vitro для экспансии и/или стимуляции лимфоцитов в образце, где культивирование включает применение IL-2, IL-15 и/или IL-21,
и необязательно определение присутствия клинически значимого лимфоцита в культивированном образце.
8. Способ по п.7, где клинически значимые лимфоциты выбраны из опухолереактивных лимфоцитов, патогенреактивных лимфоцитов и аутоиммунных реактивных лимфоцитов, предпочтительно опухолереактивных лимфоцитов.
9. Способ по п. 7 или 8, где образец из организма выбран из группы, состоящей из периферической крови, пуповинной крови, костного мозга, лимфатических узлов, печени, плеврального экссудата, грудины, брюшной полости, синовиальной жидкости, брюшины, забрюшинного пространства, тимуса и опухоли.
10. Способ по п.9, где образец из организма выбран из периферической крови.
11. Способ по одному из пп. 7-10, где млекопитающее, в частности, человек, выбрано из млекопитающего с опухолевым заболеванием, млекопитающего, имеющего риск развития опухолевого заболевания, млекопитающего с инфекционным заболеванием, млекопитающего, имеющего риск развития инфекционного заболевания, млекопитающего с аутоиммунным заболеванием, млекопитающее, имеющего риск развития аутоиммунного заболевания.
12. Способ по одному из пп. 7-11, где культивирование in vitro включает первую стадию экспансии, включающую инкубацию в культуральной среде, содержащей IL-2, IL-15 и IL-21, до тех пор, пока лимфоциты не станут детектируемыми.
13. Способ по п.12, где время инкубации на первой стадии экспансии находится в диапазоне от 6 ч до 180 суток, предпочтительно в диапазоне от 4 до 10, более предпочтительно в диапазоне от 6 до 8 суток, наиболее предпочтительно составляет примерно 7 суток.
14. Способ по п. 12 или 13, где культивирование in vitro включает вторую стадию экспансии, включающую инкубацию в культуральной среде, содержащей фидерные клетки и/или антитело против CD3 в дополнение к IL-2, IL-15 и IL- 21.
15. Способ по п.14, где отношение фидерных клеток к лимфоцитам находится в диапазоне от 1:1 до 1:100, предпочтительно в диапазоне от 1:2 до 1:50, более предпочтительно в диапазоне от 1:5 до 1:20, наиболее предпочтительно оно составляет примерно 1:10.
16. Способ по одному из пп. 12-15, где первая стадия экспансии включает добавление IL-2, IL-15 и IL-21 на одной и той же временной точке в клеточную культуру.
17. Способ по одному из пп. 12-15, где первая стадия экспансии включает добавление по меньшей мере одного из IL-2, IL-15 и IL-21 по отдельности на различные временные точки в клеточную культуру.
18. Способ по п.17, где IL-21 добавляют первым и, в частности, IL-15 добавляют вторым перед добавлением IL-2.
19. Способ по п.17, где IL-15 добавляют первым и, в частности, IL-21, добавляют вторым перед добавлением IL-2.
20. Способ по одному из пп. 7-19, где популяция клинически значимых лимфоцитов является моноклональной, олигоклональной или поликлональной.
21. Способ по одному из пп. 12-20, где культуральная среда на первой и/или второй стадии экспансии содержит по меньшей мере один антиген для экспансии.
22. Способ по п.21, где антиген для экспансии представляет фрагмент TAA, в частности, пептид, содержащий по меньшей мере восемь последовательных аминокислот аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.
23. Способ по одному из пп. 12-22, где культивирование in vitro дополнительно включает стадию рефокусирования, включающую инкубирование в культуральной среде, содержащей рефокусирующие клетки.
24. Способ по п.23, где время стадии рефокусирования находится в диапазоне от 1 до 6 суток, предпочтительно от 1 до 3 суток.
25. Способ по п. 23 или 24, где отношение рефокусирующих клеток к лимфоцитам находится в диапазоне от 1:1 до 1:100, предпочтительно в диапазоне от 1:5 до 1:10.
26. Способ по одному из пп. 7-25, где культивирование включает добавление промоторного соединения для стимуляции экспансии специфической субпопуляции лимфоцитов, в частности гамма-дельта Т-клеток (γδ-T-клетки).
27. Способ по одному из пп. 7-26, дополнительно включающий выделение популяции клинически значимых лимфоцитов из экспансированной клеточной культуры.
28. Способ по одному из пп. 7-27, где тестирование на присутствие клинически значимых лимфоцитов включает применение антигенов для оценки.
29. Способ по п.28, где антигены для оценки презентируются культивированному образцу в форме, выбранной из клеток, в частности, опухолевых клеток, полученных от того же млекопитающего что и культивированный образец (аутологичные клетки), по меньшей мере частично генетически совпадающих аллогенных клеток, в частности, опухолевых клеток или клеток, экспрессирующих клинически значимые антигены в виде трансгена.
30. Способ по п. 28 или 29, где тестирование на присутствие клинически реактивных лимфоцитов включает контактирование лимфоцитов с по меньшей мере одним клинически значимым антигеном и определение изменения в продукции цитокинов, в частности, продукции IFN-γ, пролиферации клеток, цитотоксичности, передаче сигналов и/или внутриклеточном фосфорилировании.
31. Иммунотерапия для лечения или профилактики инфекционного заболевания, опухолевого заболевания или аутоиммунного заболевания у млекопитающего, включающая следующие стадии:
получение или генерация популяции клинически значимых лимфоцитов способом по одному из пп. 7-30, где образец из организма получен от указанного млекопитающего; и
введение популяции клинически значимых лимфоцитов указанному млекопитающему.
32. Иммунотерапия по п. 31, где опухолевое заболевание выбрано из глиобластомы и рака поджелудочной железы.
33. Иммунотерапия по п. 31 или 32, где популяция клинически значимых лимфоцитов
приводит к регрессии раковых клеток у млекопитающего;
препятствует перерождению предраковых очагов в злокачественные очаги;
приводит к быстрому старению опухолевых клеток или предраковых клеток;
приводит к удалению позитивных на аутоантиген клеток;
приводит к гибели, остановке роста или сдерживанию патогенов;
препятствует развитию раковых стволовых клеток; и/или
индуцирует остановку роста раковых клеток или клеток, экспрессирующих аутоантигены.
34. Композиция по одному из пп. 1-6 для применения в медицине, в частности, для лечения или профилактики инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания или опухолевого заболевания.
35. Композиция для применения по п.34, где применение включает генерацию популяции клинически значимых лимфоцитов способом по одному из пп. 7-31.
36. Набор для применения в иммунотерапии, в частности, для лечения опухолевого заболевания, где набор содержит IL-2, IL-15 и IL-21 и необязательно по меньшей мере один компонент, который стимулирует TCR, в частности, OKT3, костимуляторные молекулы, фидерные клетки и пептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере одного клинически значимого антигена.
H
H1
С
CM
SCM
PM
37. Клинически значимый лимфоцит, полученный способом по одному из пп. 7-30, где клинически значимый лимфоцит выбран из В-клетки, NK-клетки и Т-клетки, где Т-клетка предпочтительно выбрана из хелперной Т-клетки (T-клетки или CD4+ Т-клетки), в частности, T-клетки, цитотоксической Т-клетки (Т-клетки или CD8+ Т-клетки), в частности, CD8+CXCR3+ Т-клетки, Т-клетки памяти, в частности, Т-клетки центральной памяти (Т-клетка), стволовой Т-клетки памяти (T-клетки) или Т-клетки периферической памяти (T-клетки), гамма-дельта Т-клетки (γδ-Т-клетки), NK-T-клетки, ассоциированной со слизистой инвариантной Т-клетки (MAIT), двойной негативной Т-клетки (CD3+CD4-CD8- T-клетки).
38. Клинически значимый лимфоцит по п. 36 или 37, где лимфоцит выбран из:
лимфоцита, который экспрессирует молекулы, способствующие поступлению в ткани, в частности, опухолевую или инфицированную или воспаленную ткань (например, CXCR3); и
лимфоцита, который обогащен в отношение маркеров любого из долговременной памяти, в частности, маркеры CD117 и с-kit, активации антигенспецифических иммунных ответов и цитолитических иммунных клеточных реакций, в частности, маркер CD107a.
39. Лимфоцит, полученный способом по одному из пп.7-30,
CM
SCM
PM
экспрессирующий молекулы и цитокины, способствующие образованию комбинации лимфоцитов, пригодных для медицинского применения, включая предшественники Т-клеток, клетки T, T и/или T;
экспрессирующий молекулы и цитокины, которые способствуют экспансии клинически значимых лимфоцитов;
продуцирующий цитокины, выбранные из IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-17 и любой их комбинации;
представляющий CD3+CD4-CD8- Т-клетку.
40. Популяция клинически значимых лимфоцитов, полученных способом по одному из пп. 7-30.
41. Популяция лимфоцитов, полученных способом по одному из пп. 7-30, включающая популяцию клинически значимых лимфоцитов.
42. Популяция лимфоцитов по п.41, отличающаяся одним или более из следующих признаков:
reg
процент T в расчете к общему количеству Т-клеток составляет менее 5%, предпочтительно менее 3%;
H1
H
процент T-клеток в расчете к общему количеству T-клеток составляет по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%,
процент CXCR3+ Т-клеток в расчете к общему количеству CD8+ Т-клеток составляет по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%,
процент 4-1ВВ+ Т-клеток в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 2%, более предпочтительно, по меньшей мере 2,5%,
процент CD117+ Т-клеток в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 2%, более предпочтительно, по меньшей мере 2,5%,
процент CD3+CD4-CD8- клеток в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 3%, более предпочтительно, по меньшей мере 5%; и
процент γδT-клеток в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 3%, более предпочтительно, по меньшей мере 5%.
43. Популяция лимфоцитов по пп. 41 или 42, отличающаяся одним или более из следующих признаков:
процент предшественников Т-клеток (CD45RA+ CCR7+) в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 2%, более предпочтительно, по меньшей мере 3%;
процент Т-клеток центральной памяти (CD45RA-CCR7+) в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 2%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%;
процент Т-клеток периферической памяти (CD45RA-CCR7-) в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 2%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%; и
процент эффекторных Т-клеток (CD45RA+CCR7-) в расчете к общему количеству Т-клеток составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 3%, более предпочтительно, по меньшей мере 5%.
44. Популяция лимфоцитов по одному из пп. 41-43, отличающаяся одним или более из следующих признаков:
процент клинически значимых Т-клеток составляет по меньшей мере 0,1% в расчете к общему количеству Т-клеток, определяемый мультимерными растворимыми комплексами МНС-пептида или внутриклеточной продукцией цитокинов;
внутриклеточная продукция цитокинов после стимуляции антигеном имеет значение, по меньшей мере в 2 раза превышающее стандартное отклонение без стимуляции антигеном; и
индукция CD107a после стимуляции антигеном имеет значение, по меньшей мере в 2 раза превышающее стандартное отклонение без стимуляции антигеном.