ИМПЕДИМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

Техническое решение относится к области аналитической химии и фармакологии, а именно к устройствам для определения повреждений ДНК и лекарственных препаратов, и может быть использована для определения генотоксичности новых лекарственных противораковых препаратов и загрязнителей окружающей среды по их повреждающему действию.
Определение повреждений ДНК имеет большое научное и промышленное значение. Важной проблемой является оценка генотоксичности и диагностика повреждения ДНК радиологическими и химическими факторами (лекарственными и наркотическими препаратами, загрязнителями окружающей среды). Большинство существующих методов определения повреждения ДНК основаны на использовании флуоресцентных сенсоров и электрофореза. Недостатком применяемых в настоящее время устройств для ДНК-диагностики является громоздкость и высокая стоимость. Устройства для быстрой и простой ДНК-диагностики требуются в медицине, фармакологии и ветеринарии.
2
10
4
2
10
Известно устройство для обнаружения повреждений двухцепочечных полинуклеотидов в результате метаболизма таких тестовых соединений, как возможные наркотические и лекарственные препараты [US 2005208542]. Устройство представляет собой биосенсор на основе электрода, покрытого полиионным слоем, слоем/ями белка и слоем/ями двухцепочечного полинуклеотида. Первый слой белка химически связан с полинуклеотидным слоем (ДНК), причем роль белка состоит в преобразовании генотоксических соединений в метаболиты, повреждающие двухцепочечную ДНК. Биосенсор также содержит слой редокс-полимера, состоящий из [Ru(bpy)(PVP)](ClO), [Ru(bpy)2poly(4-винилпиридин)Cl] или их комбинации. Измерительное устройство включает один или два одинаковых или разных биосенсора на твердой подложке. Измерение проводится методом квадратно-волновой вольтамперометрии.
Известны толстопленочные чувствительные электроды для определения нуклеиновых кислот [US 6063259]. Устройство применимо для обнаружения повреждений ДНК на толстопленочных электродах методом инверсионной потенциометрии. Устройство включает в себя несколько электродов, выполненных методом трафаретной печати (углеродные и металлические чернила, причем металл представляет собой золото или платину) на общей подложке. В состав устройства входят электрод сравнения, вспомогательный электрод и рабочий электрод. Один из электродов предназначен для накопления нуклеиновых кислот. Один из рабочих электродов покрыт двухцепочечной ДНК и служит для определения взаимодействия нуклеиновых кислот с веществами-мишенями, другой рабочий электрод покрыт одноцепочечной ДНК и служит для анализа последовательность-специфических реакций гибридизации нуклеиновых кислот.
Известно устройство, позволяющее методом анализа на месте проводить обнаружение повреждения клеточной ДНК [US 2012058467]. Устройство состоит из пластины, содержащей множество ячеек и целый ряд скважин, находящихся в жесткой взаимосвязи друг с другом и проникающих в каждую лунку с оси, боковых стенок и основания. Устройство посредством электродов обеспечивает электрофоретический ток в каждой лунке.
К недостаткам данных устройств относится высокая стоимость, многокомпонентный сложный состав чувствительного слоя, сложность конструкции сенсора, возможная неспецифическая адсорбция мешающих компонентов пробы.
Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа по наибольшему количеству совпадающих признаков и достигаемому техническому результату, является импедиметрический биосенсор для определения повреждений ДНК на основе стеклоуглеродного электрода, модифицированного электрополимеризованным полиметиленовым синим, полиэлектролитным комплексом ДНК, включающим нативную ДНК, полиаллиламин гидрохлорид (PAH) и полистиролсульфонат (PSS) [А.В. Порфирьева, В.Б. Костылева, А.И. Замалеева, Г.А. втюгин, Р.Ф. Фахруллин, В.З. Латыпова, Ученые записки Казанского государственного университета, Т.152, кн.3, (2010), С.33-47]. Общим недостатком биосенсоров на основе полиэлектролитов является их низкая адгезия к материалу электрода, сложность контроля пространственной структуры слоя ДНК, аккумулируемой на поверхности за счет электростатических взаимодействий. Также к недостаткам следует отнести недостаточную механическую устойчивость покрытия, многостадийный протокол его нанесения, неспецифическую сорбцию и мешающее влияние веществ, способных к электростатическим взаимодействиям с ДНК.
Технической задачей создания заявляемой полезной модели является повышение надежности, точности и простоты работы устройства для определения повреждений ДНК, исключение использования дорогостоящих реагентов в составе сенсора, упрощение конструкции сенсора, улучшение операционных характеристик ДНК-сенсоров за счет подавления неспецифической адсорбции мешающих компонентов пробы, повышения регулярности строения поверхностного биочувствительного слоя и повышения емкости чувствительного слоя в отношении ДНК.
Заявленное техническое решение устраняет недостатки, присущие наиболее близкому аналогу, и обеспечивает реализацию поставленной задачи. Технический результат заключается в повышении точности, простоты и надежности определения повреждений ДНК, в упрощении конструкции сенсора, в улучшении операционных характеристик ДНК-сенсоров за счет исключения неспецифической сорбции, в увеличении чувствительности определения повреждений ДНК за счет повышения регулярности строения поверхностного биочувствительного слоя и его емкости в отношении ДНК, а также в исключении дорогостоящих реагентов из состава сенсора.
Сущностью заявленного технического решения является создание импедиметрического сенсора для определения повреждений ДНК на основе стеклоуглеродного электрода и нативной ДНК, характеризующегося тем, что чувствительный слой сенсора включает карбодиимидно активированный наноструктурированный комплекс тиакаликсарена с серебром и слой красителя Нейтрального красного с иммобилизованной на нем ДНК.
Заявленное техническое решение поясняется фиг.1, на которой показан тиакаликсарен, используемый в составе чувствительного слоя импедиметрического сенсора, фиг.2, на которой изображена конструкция импедиметрического сенсора, и таблицей, в которой приведены характеристики электрохимического импеданса чувствительного слоя сенсора на основе стеклоугеродного электрода, покрытого слоем карбодиимидно активированного наноструктурированного комплекса тиакаликсарена с серебром и слоем красителя Нейтрального красного с иммобилизованной на нем ДНК, до и после инкубирования в реактиве Фентона при различных концентрациях перекиси водорода.
Выполнение импедиметрического сенсора на основе стеклоуглеродного электрода и нативной ДНК, где чувствительный слой сенсора включает карбодиимидно активированный наноструктурированный комплекс тиакаликсарена с серебром и слой красителя Нейтрального красного с иммобилизованной на нем ДНК, обеспечивает технический результат - простоту конструкции сенсора и измерения сигнала, низкую стоимость сенсора за счет использования в составе чувствительного слоя недорогих реактивов, высокую точность, надежность и чувствительность определения повреждений ДНК, улучшенные операционные характеристики ДНК-сенсоров за счет отсутствия неспецифической сорбции и высокой емкости поверхностного слоя в отношении ДНК, что обеспечивается наличием в составе чувствительного слоя наноструктурированного комплекса тиакаликсарена с серебром, который обеспечивает высокую адгезию ДНК к поверхности сенсора, обеспечивает регулярное строение биочувствительного слоя. Сенсор имеет простую конструкцию, низкую стоимость, малое время изготовления за счет отсутствия в его составе электрополимеризованных полимеров и полиэлектролитных комплексов. Слой тиакаликсаренового комплекса представляет собой самособирающиеся наноразмерные частицы, которые обеспечивают воспроизводимое строение поверхностного слоя и регулярное расположение большого числа молекул ДНК. Такое строение слоя обеспечивает однородность и устойчивость покрытия, а значит, стабильность и воспроизводимость сигнала сенсора. Таким образом, чувствительность определения повреждений ДНК достигнута за счет того, что тиакаликсареновый комплекс обеспечивает большую емкость поверхностного слоя сенсора по отношению к ДНК, а также обеспечивает отсутствие стерических препятствий для доступа аналита и отсутствие неспецифической сорбции. Краситель Нейтральный красный обеспечивает улучшение характеристик сенсора и чувствительность регистрации повреждения ДНК благодаря высокой скорости электронообменных процессов с его участием и достижению более плотного и надежного электрического контакта между ДНК и электродом.
Конструкция импедиметрического сенсора представлена на фиг.2. Импедиметрический сенсор состоит из стеклоуглеродного электрода, состоящего из токосъемника 1, изолирующего корпуса из политетрафторэтилена 2 и стеклоуглеродного стержня 3, а также из чувствительного слоя, включающего слой карбодиимидно активированного наноструктурированного комплекса тиакаликсарена (фиг.1) с серебром 4 и слой красителя Нейтрального красного с иммобилизованной ДНК 5. Чувствительный слой изготовлен путем последовательного капельного нанесения растворов, благодаря чему обеспечивается простота изготовления сенсора и возможность образования самособирающихся наноразмерных архитектур. Слой тиакаликсаренового комплекса получен путем капельного нанесения смеси раствора тиакаликсарена и триэтиламина в ацетоне и раствора нитрата серебра в воде. Смесь перед нанесением выдерживали в течение 30 минут. Карбодиимидную активацию проводили с помощью выдерживания сенсора в растворе 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида и N-гидроксисукцинимида в течение 30 минут. Для получения чувствительного слоя на поверхность капельно наносили раствор красителя Нейтрального красного на 15 минут, а затем раствор ДНК спермы лосося на 20 минут с последующим промыванием сенсора дистиллированной водой для удаления несвязанных компонентов.
3
6
4
6
4
2
2
Данное устройство используется для импедиметрического определения повреждения ДНК. Устройство функционирует следующим образом. Для измерения сигнала импедиметрический сенсор, платиновый противоэлектрод и хлоридсеребряный электрод сравнения опускают в ячейку объемом 5 мл, содержащую 0.05 М (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты, 0.1 М KCl (pH=7.0) и 0.01 М смеси ферроцианидов K[Fe(CN)] и K[Fe(CN)] и проводят измерение электрохимического импеданса при - 0.068 В в интервале частот от 100 кГц до 0.04 Гц с амплитудой напряжения 5 мВ. Между измерениями электроды инкубировали в течение 20 минут в реактиве Фентона для контроля окислительного повреждения ДНК, затем 10 минут - в 0.1 мМ растворе ЭДТА. Затем электроды промывали дистиллированной водой. Реактив Фентона представлял собой раствор 0.4 мМ ЭДТА, 2 М NaOH, 0.1 мМ FeSO, 0.4 мМ аскорбиновой кислоты и 9 мМ HO. Рассчитывают разность величин сопротивления переноса заряда и емкости границы раздела до и после инкубирования сенсора в реактиве Фентона, которую регистрируют как меру окислительного повреждения ДНК.
Пример использования устройства для определения повреждения ДНК при взаимодействии с реактивом Фентона. Наблюдается зависимость величины изменения сопротивления переноса заряда и емкости границы раздела от продолжительности инкубирования сенсора в реактиве Фентона, а также от концентрации перекиси водорода в составе реактива Фентона (Таб).
Измерения проводят при продолжительности инкубирования 20-60 минут.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемое устройство имеет следующие преимущества:
1) повышение воспроизводимости сигнала, более надежное функционирование устройства, повышение точности и простоты определения повреждений ДНК благодаря наличию в его составе наноструктурированного комплекса тиакаликсарена с серебром, который обеспечивает высокую адгезию ДНК к поверхности сенсора и регулярное строение биочувствительного слоя;
2) высокую стабильность сигнала за счет прочной иммобилизации ДНК;
3) простая конструкция сенсора за счет отсутствия электрополимеризованных и полиэлектролитных покрытий;
4) низкая стоимость сенсора за счет использования в составе чувствительного слоя недорогих реактивов;
5) улучшение операционных характеристик сенсора и повышение чувствительности определения повреждений ДНК за счет отсутствия неспецифической сорбции, повышения регулярности строения поверхностного слоя и его емкости в отношении ДНК.
(Таблица)
Концентрация H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, мМ
До инкубирования
R<sub>et</sub>, кОм
C, мкФ
-
23.3
1.5
Инкубирование 20 минут
3
24.2
4.7
4.5
32.0
7.7
6
46.6
22.1
9
24.0
7.1
12
24.5
7.1
Инкубирование 60 минут
3
21.9
6.8
4.5
57.4
27.9
6
59.1
37.9
9
69.3
33.1
12
53.0
31.8