СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РИСКА АТЕРОСКЛЕРОЗА НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВАРИАНТОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА
METHOD FOR ASSESSING GENETIC RISK OF ATHEROSCLEROSIS BASED ON DETERMINATION OF MITOCHONDRIAL GENOME VERSIONS

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики степени предрасположенности к риску развития атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний.
В России, как и в большинстве индустриальных стран, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) занимают первое место в структуре инвалидизации и смертности, в том числе преждевременной, а также ведут к эскалации расходов на здравоохранение. Поскольку морфологической основой смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в 90% случаев является атеросклероз, то вклад заболеваний атеросклеротического генеза и их последствий в России в общую смертность является наиболее весомым. Одной из причин распространенности атеросклероза и заболеваний атеросклеротического генеза является недостаточное количество верифицированных биомаркеров, использование которых позволяло бы выявлять индивидуальную предрасположенность к атеросклерозу и проводить раннюю и эффективную профилактику. Атеросклероз является мультифакторным заболеванием, в развитии и прогрессировании которого играет значительную роль взаимодействие фенотипических, средовых, социально-экономических и генетических факторов. За последнее десятилетие, в условиях стремительного расширения возможностей молекулярно-генетического анализа, большое количество исследований в области медицинской генетики посвящено поиску генетических биомаркеров атеросклероза и ССЗ. Ассоциация с атеросклерозом и ИБС была обнаружена для полиморфизмов генов, продукты которых так или иначе вовлечены в метаболизм сосудистой стенки, участвуют в процессах активации эндотелия, развитии воспалительных реакций, регуляции миграции и пролиферации гладкомышечных клеток, а также связаны с коагуляцией и фибринолизом [Arvanitis D.A., Flouris G.A., Spandidos D.A. Genomic rearrangements on VCAM1, SELE, APEG1 and AIF1 loci in atherosclerosis // J. Cell. Mol. Med. - 2005. - Vol. 9, №1. - P. 153-159; Baumgart D., Haude M.,  G. et al. Augmented alpha-adrenergic constriction of atherosclerotic human coronary arteries // Circulation. - 1999 - Vol. 99, №16. - P. 2090-2097; Ben Assayag E., Shenhar-Tsarfaty S., Bova I. et al. Association of the -757T>C polymorphism in the CRP gene with circulating C-reactive protein levels and carotid atherosclerosis // Thromb. Res. - 2009. - Vol. 124, №4. - P. 458-462; Chen S.N., Cilingiroglu M., Todd J. et al. Candidate genetic analysis of plasma high-density lipoprotein cholesterol and severity of coronaryatherosclerosis // BMC Med. Genet. - 2009. - Vol. 10. - P. 111-114; Elosua R., Ordovas J.M., Cupples L.A. et al. Variants at the APOA5 locus, association with carotid atherosclerosis, and modification by obesity: the Framingham Study // J Lipid Res. - 2006. - Vol. 47, №5. - P. 990-996; Evans D., Bode A., von der Lippe G. et al. Cerebrovascular atherosclerosis in type III hyperlipidemia is modulated by variation in the apolipoprotein A5 gene // Eur. J. Med. Res. - 2011. - Vol. 16, №2). - P. 79-84; Gardener H., Beecham A., Cabral D. et al. Carotid plaque and candidate genes related to inflammation and endothelial function in Hispanics from northern Manhattan // Stroke. - 2011. - Vol. 42, №4. - P. 889-896;  J.,  I., Kaczmarczyk M. et al. Low frequency haplotypes of E-selectin polymorphisms G2692A and C1901T give increased protection from coronary artery disease // Med. Sci. Monit. - 2011. - Vol. 17, №6. - P. 334-340; Heinonen P., Jartti L.,  M.J. et al. Deletion polymorphism in the alpha2B-adrenergic receptor gene is associated with flow-mediated dilatation of the brachial arter // Clin. Sci. (Lond). - 2002. - Vol. 103, №5. - P. 517-524; Huijgen R., Vissers M.N., Kindt I. et al. Assessment of carotid atherosclerosis in normocholesterolemic individuals with proven mutations in the low-density lipoprotein receptor or apolipoprotein В genes // Circ. Cardiovasc. Genet. - 2011. - Vol. 4, №4. - P. 413-417; Ivey M.E., Osman N., Little P.J. Endothelin-1 signalling in vascular smooth muscle: pathways controlling cellular functions associated with atherosclerosis // Atherosclerosis. - 2008. - Vol. 199, №2. - P. 237-247; Karathanasis S.K., Ferris E., Haddad I.A. DNA inversion within the apolipoproteins AI/CIII/AIV-encoding gene cluster of certain patients with premature atherosclerosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84, №20. - P. 7198-7202;  A.,  M., Radak D. et al. The association of ACE I/D gene polymorphism with severe carotid atherosclerosis in patients undergoing carotid endarterectomy // J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. - 2012. Vol. 13, №1. - P. 141-147; Liu H., Peng Y., Liu F. et al. Correlation between endothelin-1 and atherosclerosis in chronic hemodialysis patients // J. Nephrol. - 2010. - Vol. 23, №5. - P. 593-602; Muendlein A., Saely C.H., Marte T. et al. Synergistic effects of the apolipoprotein E epsilon3/epsilon2/epsilon4, the cholesteryl ester transfer protein TaqIB, and the apolipoprotein C3 -482 C>T polymorphisms on their association with coronary artery disease // Atherosclerosis. - 2008. - Vol. 199, №1. - P. 179-186; Nagai Т., Ogimoto A., Okayama H. et al. A985G polymorphism of the endothelin-2 gene and atrial fibrillation in patients with hypertrophic cardiomyopathy // Circ. J. - 2007. - Vol. 71, №12. - P. 1932-1936; Pernow J., Shemyakin A.,  F. New perspectives on endothelin-1 in atherosclerosis and diabetes mellitus // Life Sci. - 2012. - Vol. 91, №13-14. - P. 507-516; Scheer W.D., Boudreau D.A., Hixson J.E. et al. ACE insert/delete polymorphism and atherosclerosis // Atherosclerosis. - 2005. - Vol. 178, №2. - P. 241-247; Woo J., Tang N.L., Leung J., Kwok T. The Alu polymorphism of angiotensin I converting enzyme (ACE) and atherosclerosis, incident chronic diseases and mortality in an elderly Chinese population // J. Nutr. Health. Aging. - 2012. - Vol. 16, №3. - P. 262-268]. При этом известные генетические факторы риска, включающие многочисленные полиморфизмы ядерного генома, в состоянии объяснить не более 5% вариабельности клинических проявлений атеросклероза, в частности ишемической болезни сердца (ИБС). При этом имеется ограниченное количество работ, направленных на изучение ассоциации изменений в митохондриальном геноме с атеросклерозом. В основном описаны мутации митохондриального генома, для которых была выявлена взаимосвязь с митохондриальными заболеваниями - миопатиями, энцефалопатиями, наследуемой глухотой, сахарным диабетом и др. [Andreu A.L., Hanna M.G., Eichmann H.R. et al. Exercise intolerance due to mutations in the cytochrome В gene of mitochondrial DNA. // New Engl. J. Med. - 1999. - Vol. 341. - pp. 1037-1044; Choi M., Lebon S.,  P. et al. The mitochondrial DNA G13513A MELAS mutation in the NADH dehydrogenase 5 gene is a frequent cause of Leighlike syndrome with isolated complex I deficiency. // J. Med. Genet. - 2003. - Vol. 40. - pp. 188-191; Matsunaga H., Tanaka Y., Tanaka M. et al. Antiatherogenic mitochondrial genotype in patients with type 2 diabetes. // Diabetes Care. - 2001. - Vol. 24. - pp. 500-503; Fu K., Harden R., Johns T. et al. A novel heteroplasmic tRNAleu(CUN) mtDNA point mutation in a sporadic patient with mitochondrial encephalomyopathy segregates rapidly in skeletal muscle and suggests an approach to therapy. // Hum. Mol. Genet. - 1996. - Vol. 5. - pp. 1835-1840;  R., Scharfe C., Hoeltzenbein M. et al. Childhood onset mitochondrial myopathy and lactic acidosis caused by a stop mutation in the mitochondrial cytochrome с oxidase III gene. // J. Med. Genet.. - 2002. - Vol. 39. - pp. 812-816; Kim D.-S., Jung D.-S., Park K.-H. et al. Histochemical and molecular genetic study of MELAS and MERF in Korean patients. // J. Korean Med. Scien.. - 2002. - Vol. 17. - pp. 103-112; Varlamov D.A., Kudin A.P., Vielhaber S. et al. Metabolic consequences of a novel missense mutation of the mtDNA CO I gene. // Hum. Mol. Genet. - 2002. - Vol. 11. - pp. 1797-1805; Jeppesena T.D., Schwartzc M., Hansen K. Late onset of stroke-like episode associated with a 3256C→T point mutation of mitochondrial DNA. // J. Neurol. Sci. - 2003. - Vol. 214. - pp. 17-20]. Некоторые из этих мутаций обнаруживали ассоциацию с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как инфаркт миокарда, артериальная гипертензия, различные виды кардиомиопатии. Другое направление изучения ассоциации митохондриального генома с сердечно-сосудистыми заболеваниями предполагает оценку риска этих заболеваний у лиц, относящихся к различным митохондриальным гаплогруппам. Ряд исследований подтверждает, что принадлежность человека к той или иной митохондриальной гаплогруппе, определяемой на основе совокупности наследуемых мутаций митохондриальной ДНК, может влиять на прогрессирование различных мультифакторных заболеваний, в том числе сахарного диабета 2-го типа, рака пищевода и болезни Альцгеймера [Castro M.G., Huerta С., Reguero J.R. et al. Mitochondrial DNA haplogroups in Spanish patients with hypertrophic cardiomyopathy // Int J Cardiol. - 2006. - Vol. 112. - №2. - P. 202-206; van der Walt J.M., Dementieva Y.A., Martin E.R. et al. Analysis of European mitochondrial haplogroups with Alzheimer disease risk // Neuroscience Letters. - 2004. - Vol. 365. - №1. - P. 28-32; Li X.Y., Guo Y.B., Su M. et al. Association of mitochondrial haplogroup D and risk of esophageal cancer in Taihang Mountain and Chaoshan areas in China // Mitochondrion. - 2011. - Vol. 11. - №1. - P. 27-32; Feder J., Ovadia O., Blech I. et al. Parental diabetes status reveals association of mitochondrial DNA haplogroup J1 with type 2 diabetes // BMC Medical Genetics. - 2009. - Vol. 10. - №60. - doi: 10.1186/1471-2350-10-60]. Недавние исследования выявили повышенный риск раннего инфаркта миокарда у жителей севера Испании, принадлежащих к гаплогруппе Н, и повышенный риск ИБС у жителей Австрии, принадлежащих к гаплогруппе Т [Palacin М., Alvarez V., Martin М. et al. Mitochondrial DNA and TFAM gene variation in early-onset myocardial infarction: evidence for an association to haplogroup H // Mitochondrion. - 2011. - Vol. 11. - №1. - P. 176-181; Kofler В., Mueller E.E., Eder W. et al. Mitochondrial DNA haplogroup T is associated with coronary artery disease and diabetic retinopathy: a case control study // BMC Medical Genetics. - 2009. - Vol. 10 - №35. - doi: 10.1186/1471-2350-10-35].
Известен способ генетической диагностики предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, основанный на исследовании генотипов генов-кандидатов сердечнососудистой патологии, в частности, по анализу полиморфных вариантов ядерных генов AGTR1, АСЕ, MTHFR, AGT, GNB3, NOS3, F5, ITGB3 и F2 (РФ №2376372 C12N 15/00, 2006).
Известен способ диагностики предрасположенности к ишемической болезни сердца (РФ №2243558 G01N 33/48, 2000), заключающийся в сравнении количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК в образце крови больного субъекта с количественным аналогичного уровня в образце крови контрольного субъекта, не страдающего атеросклерозом. При этом определяют количественную степень повреждений митохондриальной ДНК методом количественной ПЦР, где ДНК обрабатывают гликозилазой FAPY до указанного уровня ПЦР-амплификации. Однако в известном решении исследуются крупные приобретенные делеции митохондриальной ДНК, то есть качественные изменения, что недостаточно для высокой точности диагностики.
Известен способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска (РФ №2287158 G01N 33 48, 2006), при котором производят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, амплификацию фрагментов генов PON1 и СЕТР, в пределах которых локализованы полиморфные нуклеотидные замены, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипов PON*BB и СЕТР*II прогнозируют риск развития гипертонической болезни. При данном способе исследуются полиморфные нуклеотидные замены в ядерных генах PON1 и СЕТР, ассоциированные с риском развития гипертонической болезни.
Однако практически все генетические маркеры риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), относящиеся к полиморфизмам ядерных генов, являются недостаточными для полной диагностики склонности к данным заболеваниям, что снижает точность их диагностики.
Наиболее близким к изобретению является метод определения предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и связанным с ними состояниями (US 2013136726 А1), заключающийся в использовании показателей гетероплазмии митохондриального генома по мутациям 652ins/delG, A1555G, С3256Т, Т3336С, G12315A, G13513A, G14459A, G14846A и G15059A. Данный метод не затрагивает мутации митохондриального генома, описываемые в настоящем изобретении. Для разработки способа определения генетического риска атеросклероза проведено обследование в выборке из 77 человек (34 мужчины [м] и 43 женщины [ж]) из Москвы и Московской области, со средним возрастом 63,0 лет (м: 60,5, ж: 64,9). 45 участников исследования (м: 23, ж: 22) характеризовались наличием атеросклеротических поражений сонных артерий по результатам ультрасонографического исследования (средний возраст 63,2 лет, м: 60,0, ж: 66,5). Количество условно здоровых лиц составило 32 (м: 11, ж: 21) со средним возрастом 62,7 лет (м: 61,6, ж: 63,2). Наличие сахарного диабета и онкологических заболеваний были критериями исключения при формировании выборки. Для оценки состояния стенки сонных артерий проводили ультрасонографию высокого разрешения в В-режиме с использованием линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц на ультразвуковом сканере SonoScape SSI-1000 (Китай). Протокол обследования включал сканирование левой и правой сонных артерий, области каротидного синуса, а также наружной и внутренней сонных артерий с фокусировкой на задней стенке артерии в трех фиксированных проекциях - переднебоковой, боковой и заднебоковой. Обследование проводили в положении лежа после 15-минутного отдыха. Всю процедуру сканирования записывали в цифровом формате для последующего анализа с помощью специализированного программного пакета. Измерения проводили на участке общей сонной артерии длиной 10 мм, противолежащем началу каротидного синуса. Толщину интимо-медиального слоя задней стенки общей сонной артерии определяли как расстояние от ведущего края первой эхогенной зоны до ведущего края второй эхогенной зоны. Среднее значение трех измерений (в переднебоковой, боковой и заднебоковой проекциях) рассматривали как интегральный показатель толщины интимо-медиального слоя. Для характеристики доклинического атеросклероза сонных артерий были использованы пограничные возрастно-половые значения ТИМС для жителей Московского региона [Собенин И.А., Сурнин С.А., Карагодин В.П., Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Чупракова О.В., Кожевникова Ю.А., Ковалевская Л.О., Орехов А.Н. Вариабельность показателя толщины комплекса интима-медиа общих сонных артерий в московской городской популяции среди лиц без клинических проявлений атеросклероза // Терапевтический архив. - 2011. - №12. - стр. 58-62]. При наличии атеросклеротической бляшки со стенозом сонной артерии более 20% или при наличии утолщения интимо-медиального слоя, превышающего границу 75-й процентили, а также при совокупности этих факторов, лицам присваивалась принадлежность к группе больных доклиническим атеросклерозом. Условно здоровые участники исследования характеризовались значениями ТИМС, не превышающими медианного значения для данной возрастной группы, а также отсутствием атеросклеротических бляшек.
ДНК из замороженной цельной крови выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. После выделения тотальной ДНК было проведено обогащение митохондриальной ДНК с использованием набора Qiagen™ REPLI-g Mitochondrial Kit. В 50 мл реакционной смеси было внесено около 50 нг исходной ДНК. Полученная обогащенная фракция ДНК содержала фрагменты размером 10-15 тыс. пар нуклеотидов. Для проведения высокоэффективного секвенирования митохондриального генома была использована система Roche 454 GS Junior Titanium. Из обогащенной мтДНК фракции отбирали 500 нг - количество, необходимое для создания библиотеки фрагментов ДНК и дальнейшего секвенирования. Пробоподготовка для секвенирования была проведена в соответствии с рекомендациями производителя и с использованием соответствующих реагентов. Запуск прибора и анализ качества секвенирования проводились посредством программ GS Sequencer и GS Run Browser (Roche Diagnostics GmbH). Анализ последовательностей митохондриальных ДНК производился с использованием программы GS Reference Mapper. Для картирования использовалась Кембриджская эталонная последовательность митохондриального генома человека rCRS NC_012920.1 [Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, et al. (1999) Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet 23: 147.]. Статистический анализ данных проводился с использованием программного пакета IBM SPSS Statistics v. 21.0.
При секвенировании митохондриального генома человека с использованием системы Roche GS Junior были достигнуты следующие показатели эффективности: средняя длина прочтения: 432,8±4,3 п.н.; среднее количество прочтений: 2653±317; среднее количество нуклеотидов: 1,15±0,14 млн п.н.; средний процент картируемых прочтений от общего количества: 16,4±1,8%. Исходя из этих параметров можно сделать вывод о том, что при секвенировании было обеспечено в среднем 70-кратное покрытие митохондриального генома, достаточное для высокоточной детекции однонуклеотидных замен.
Частота гомоплазмичных вариантов мтДНК была рассчитана как отношение общего количества вариантов, которые отличались от эталонной Кембриджской последовательности, к длине митохондриального генома, т.е. 16569 б.п. Частоты синонимичных и несинонимичных мутаций в различных регионах мтДНК были рассчитаны таким же образом, с использованием длины этих регионов. Частота мутаций в некодирующем регионе была более чем в 4 раза выше, чем в кодирующем. Синонимичные мутации в кодирующем регионе встречались чаще, чем несинонимичные. При этом частота несинонимичных, т.е. приводящих к изменению кодируемого продукта, гомоплазмичных мутаций в кодирующей области была достоверно выше у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (p<0,05).
Из обнаруженных гомоплазмичных мутаций митохондриального генома 26 вариантов были охарактеризованы как имеющие высокую встречаемость в обследованной выборке, причем 4 из них имели различную встречаемость у пациентов с атеросклерозом сонных артерий по сравнению с условно здоровыми лицами.
Встречаемость мутации Т204С (синонимичная мутация в некодирующем регионе) была достоверно выше у условно здоровых лиц по сравнению с пациентами с атеросклерозом сонных артерий (p<0,05). Встречаемость мутации G8251A (синонимичная мутация в гене субъединицы 2 цитохром С оксидазы) была достоверно выше у условно здоровых лиц по сравнению с пациентами с атеросклерозом сонных артерий (p<0,05). Встречаемость мутации Т1023 8С (синонимичная мутация в гене субъединицы 3 NADH-дегидрогеназы) была достоверно выше у условно здоровых лиц по сравнению с пациентами с атеросклерозом сонных артерий (p<0,05). Встречаемость мутации G12501A (синонимичная мутация в гене субъединицы 5 NADH-дегидрогеназы) была достоверно выше у условно здоровых лиц по сравнению с пациентами с атеросклерозом сонных артерий (p<0,05). Напротив, встречаемость мутации A1811G (мутация в гене 16S рибосомальной РНК) была достоверно выше у пациентов с атеросклерозом сонных артерий по сравнению с условно здоровыми лицами (p<0,05).
Техническим результатом, которого можно достичь при осуществлении изобретения, является повышение точности диагностики предрасположенности к атеросклерозу и сердечно-сосудистым заболеваниям.
Технический результат достигается за счет того, что согласно способу оценки индивидуального генетического риска атеросклероза на основе определения вариантов митохондриального генома, у человека берут образец крови, выделяют ДНК и проводят генотипирование митохондриальной ДНК любым доступным способом; обнаружение варианта A1811G свидетельствует о высоком генетическом риске атеросклероза, а обнаружение вариантов Т204С, G8251A, Т10238С, G12501A свидетельствует о низком генетическом риске атеросклероза.