СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ БОЛЕЗНИ ТРАНСПЛАНТАТА ПОСЛЕ СКВОЗНОЙ КЕРАТОПЛАСТИКИ
METHOD FOR PREDICTION OF GRAFT VS HOST DISEASE FOLLOWING PENETRATING KERATOPLASTY

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования болезни трансплантата у пациентов, перенесших сквозную кератопластику.
В настоящее время благодаря совершенствованию микрохирургической техники и методик, разработке новых лекарственных препаратов кератопластика стала рядовой операцией. Несмотря на это, отдаленные результаты пересадки роговицы остаются по-прежнему неблагоприятными - отторжение кератотрансплантата происходит у 5-70% пациентов, что в значительной мере определяется этиологией бельма (J.С.Hill. High risk corneal grafting. // Br. J. Ophthalmol. - 2002. - Vol.86. - №9. - P.945).
Известен способ прогнозирования развития помутнений трансплантата роговицы (патент 2227299, 07.08.2002), при котором выявляют формулу расстройств иммунной системы  и прогнозируют в соответствии с ней помутнение трансплантата роговицы. Способ обеспечивает эффективность прогноза после кератопластики в раннем послеоперационном периоде. Данный способ прогнозирует исход кератопластики, однако не учитывает исходной этиологии патологического процесса, приведшего к кератопластике.
β
β
Известен способ прогнозирования отторжения роговичного трансплантата после кератопластики по поводу ожоговых бельм (патент RU 2210774 22.10.2001 - ближайший аналог). Способ обеспечивает высокую степень достоверности прогнозирования отторжения роговичного трансплантата у больных, перенесших кератопластику по поводу ожоговых бельм, и заключается в определении в сыворотке крови и/или слезной жидкости содержания интерлейкина-1-бета (ИЛ-1). При его обнаружении в пред- или раннем послеоперационном периоде прогнозируют отторжение трансплантата. Причем ИЛ-1 определяют с помощью иммуноферментного анализа. Способ обеспечивает высокую степень достоверности прогнозирования отторжения роговичного трансплантата, но не выявляет этиологическую причину заболевания и не служит критерием назначения соответствующей (этиотропной) терапии.
Таким образом, известные способы прогнозирования развития болезни трансплантата при СКП не отражают (не учитывают) этиологического фактора.
Задачей изобретения является разработка нового подхода в диагностике этиологии и прогнозирования исхода кератопластики.
Общеизвестным методом борьбы за жизнь любого трансплантата является (местное и системное) применение иммуносупрессивной терапии, включающей как глюкокортикоиды, так и селективные препараты (циклоспорин A, FK506). Обратной стороной такой тактики ведения больных может быть реактивация вирусных инфекций при кератопластике, в этом аспекте в литературе рассматриваются прежде всего вирусы простого герпеса - ВПГ1 и ВПГ2. Информация о роли ВГЧ-6 в литературе практически отсутствует и непосредственно к кератопластике не относится. Реактивацию ВГЧ-6 описывают в «большой трансплантологии» внутренних органов (почки, печень). Однако критерии для назначения противовирусных средств не разработаны.
В связи с этим нами были проведены параллельные исследования по выявлению ДНК-вирусов группы герпеса в крови и роговице реципиентов и серологических маркеров этих вирусов (антитела разных классов в сыворотке). По нашим наблюдениям, наиболее неблагоприятным оказалось выявление вирусной ДНК (в роговице и/или в крови) при отсутствии противовирусных IgG-антител. На фоне высоких уровней защитных антител риск развития реакции отторжения трансплантата снижался, что говорит о том, что наибольшее прогностическое значение имеет выявление вирусных ДНК в роговице в сочетании с определенным уровнем IgG-антител в сыворотке. Целенаправленный анализ исходов кератопластики у пациентов с различными уровнями IgG-антител к ВГЧ-6 показал, что при уровне IgG-антител ниже 0.3 мкг/л у большинства развивается болезнь трансплантата. Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность разработки этиопатогенетических подходов к послеоперационному ведению пациентов «высокого риска» отторжения трансплантата со своевременным назначением противовирусных препаратов. Технический результат достигается за счет исследования фрагментов роговицы реципиента для выявления ДНК-вируса и параллельной серодиагностики (ИФА) IgG-антител.
Наличие ДНК-вируса без усиления защитных механизмов (IgG) расценивается нами как прогностически неблагоприятный фактор, требующий медикаментозной коррекции.

Способ осуществляется следующим образом. У пациента во время кератопластики иссекают фрагмент собственной роговицы. ДНК из фрагментов роговицы реципиента выделяют, например, с использованием набора NucleoSpin (Macherey-Nagel, Германия). Роговицы лизируют в буфере (200 мкл) с протеиназой К - термостатирование 1,5 часа при 55°C и затем 20 мин при 95°C. Затем центрифугирование 5 мин при 12,5 тыс. об/мин. Определение ВГЧ6-вирусной ДНК в образцах проводят методом гнездовой ПЦР.
Вирус
Праймеры первого этапа
для Праймеры второго этапа
для Размер ампликона на втором этапе ПЦР, н.о.
ВГЧ6
HV67cs1/HV 67cs2a
HV 67cs2a HV6d
403
Показателем эффективности выделения ДНК служат результаты определения человеческого гена GAPDH методом реал-тайм ПЦР, что позволяет контролировать возможное ингибирование реакции, правильность забора клинической пробы, эффективность выделения ДНК на стадии пробоподготовки. Реакцию проводят в термоциклере ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), гнездовую ПЦР на герпесвирусы проводят, в частности, в термоциклере Терцик (ДНК-технология, Россия). Программы первого и второго этапов гнездовой ПЦР были одинаковы. Праймеры синтезировали в ЗАО «Евроген РУ» (Россия), зонд синтезировали в ООО «ДНК-Синтез» (Россия). В каждой постановке присутствовали контрольные положительные и отрицательные образцы. Анализ продуктов амплификации проводят электрофорезом в 1,5% агарозном геле с EtBr. Противовирусные антитела выявляют с помощью иммуноферментного анализа (например, тест-система Векто HHV-6-IgG, РУ №ФСР 2011/09853, Вектор-Бест, Россия).
Результаты оценивают следующим образом: наличие ДНК-вируса в роговице реципиента в сочетании с высокими титрами IgG-антител к ВГЧ-6 свидетельствует о высокой степени противовирусной защиты и, следовательно, о благоприятном прогнозе (прозрачный трансплантат) без проведения специфической терапии; тогда как наличие (ДНК) ВЧГ-6 в роговице в сочетании с титрами IgG-антител ниже 0,3 мкг/л в сыворотке крови является плохим прогностическим признаком и показанием для проведения специфической противовирусной терапии.
Пример 1. Больная В., 56 лет, диагноз: OD - поствоспалительное помутнение роговицы; OS - здоров. Проведена сквозная кератопластика на OD. В день операции проведена серодиагностика уровня IgG к ВГЧ-6 и ПРЦ-исследование удаленного фрагмента роговицы реципиента на ДНК ВГЧ-6. ПЦР-исследование фрагмента роговицы выявило наличие ДНК ВГЧ-6, а серодиагностика - высокий уровень IgG к ВГЧ-6 (3,5 мкг/л). Специфическая противовирусная терапия в данном случае не показана, так как уровень «защитных» IgG высокий. Полная эпителизация трансплантата на фоне репаративной терапии отмечалась на 7 сутки, отдаленные результаты (12 месяцев) показали, что трансплантат прозрачный, неоваскуляризации нет. Это свидетельствует о том, что полученные показатели действительно явились прогностическими.
Пример 2. Больной В., 45 лет, диагноз: OS - поствоспалительное помутнение роговицы. Проведена сквозная кератопластика на OS. В день операции проведена серодиагностика уровня IgG к ВГЧ-6 и ПЦР-исследование удаленного фрагмента роговицы реципиента. ПЦР-исследование фрагмента роговицы выявило наличие ДНК ВГЧ-6, а серодиагностика - отсутствие IgG к ВГЧ-6. Данное сочетание было расценено как прогностически неблагоприятное. В послеоперационном периоде развилась эрозия с последующим помутнением трансплантата.
Таким образом, полученный способ позволяет прогнозировать возможный исход кератопластики, основываясь на данных ПЦР-диагностики вирусной (ВГЧ-6) ДНК в роговице реципиента и уровне «защитных» IgG антител в ВГЧ-6 в сыворотке крови.