Способ проведения ПЦР в режиме реального времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 337C/G гена fshr (rs43745234)
METHOD FOR REAL-TIME PCR FOR CATTLE GENOTYPING BY ALLELES 337C/G OF FSHR (RS43745234) GENE

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма 337C/G (rs43745234) гена fshr, кодирующего рецептор фолликулостимулирующего гормона (FSHR) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.
Одним из ключевых этапов технологии ускоренного воспроизводства крупного рогатого скота является отбор коров-доноров, наиболее чувствительных к процедуре гормональной стимуляции овуляции и способных произвести, в результате, максимальное количество зрелых ооцитов [Bó G.A., Mapletoft R.J. Historical perspectives and recent research on superovulation in cattle. Theriogenology. 2014. vol. 81. no. 1. P. 38-48. doi: 10.1016/j.theriogenology. 2013.09.020.]. Несмотря на то, что в последние десятилетия в технологию трансплантации эмбрионов были внедрены ряд новых высокотехнологичных методов, эффективность процедуры стимуляции суперовуляции у коров-доноров существенно не увеличилась. Одним из основных лимитирующих факторов развития технологии является высокая вариабельность ответа со стороны организма коров-доноров на гормональную обработку. Физиологический эффект обработки коров-доноров гонадотропинами по-прежнему остается индивидуальным и непредсказуемым [Palubinskas G. et al. Superovulatory response in relation to the size and side of ovary location in high yielding dairy cows on the first day of treatment protocol. Veterinarski arhiv. 2016. vol. 86. no. 1. P. 65-76]. Вместе с тем исследования показали, что эффективность стимуляции овуляции тесно связан с аллельными вариантами гена FSHR, кодирующего рецептор фолликулостимулирующего гормона [Fauser В., Diedrich K., Devroey P. Predictors of ovarian response: Progress towards individualized treatment in ovulation induction and ovarian stimulation. Human Reproduction Update. 2008. vol. 14. no. 1. P. 1-14. doi: 10.1093/humupd/dmm034].
FSHR принадлежит к классу к мембранных рецепторов, связанных с G-белкам, чья активация запускает сигнальный путь циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) [Katritch V., Cherezov V., Stevens R. Structure-function of the G protein-coupled receptor superfamily. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 2013. vol. 53. vo. 1. P. 531-556. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-032112-135923. В геноме Bos taurus ген FSHR локализован на хромосоме 11 и состоит из 10 экзонов. Первые 9 экзонов кодируют внеклеточный домен рецептора, экзон 10 кодирует трансмембранный домен [Minj A. et al. Molecular characterization of follicle stimulating hormone receptor (FSHR) gene in the Indian river buffalo (Bubalus bubalis). General and Comparative Endocrinology. 2008. vol. 158, no. 2, P. 147-153. doi: 10.1016/J.YGCEN.2008.07.003]. В литературе накоплены данные о связи точечных мутаций в гене FSHR (SNP, single nucleotide polymorphism) с суперовуляторным ответом на стимуляцию гонадотропинами. В гене FSHR В. taurus SNP были выявлены в 5-'UTR и кодирующей частях методом SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) и исследованы на предмет возможных ассоциаций с репродуктивным потенциалом у крупного рогатого скота голштинской породы [Sharifiyazdi Н., Mirzaei A., Ghanaatian Z. Characterization of polymorphism in the FSH receptor gene and its impact on some reproductive indices in dairy cows. Animal Reproduction Science. 2018. vol. 188. P. 45-50. doi: 10.1016/j.anireprosci.2017.11.006; Yang W.C., Li S.J., Chen L., Yang L.G. FSHR genotype affects estrogen levels but not pregnancy rates in Luxi cattle subjected to embryo transfer. Genetics and Molecular Research. 2014. vol. 13. No. 1. P. 1563-1569. doi: 10.4238/2014.March.12.8; Milazzotto M.P. et al. New molecular variants of hypothalamus-pituitary-gonad axis genes and their association with early puberty phenotype in Bos taurus indicus (Nellore). Livestock Science. 2008. vol. 114. vo. 2-3. P. 274-279. doi: 10.1016/j.livsci.2007.05.006]. Особый интерес представляет несинонимичные замены в экзонах, поскольку такого рода изменения в первичной структуре гена влияют на последовательность и конформацию соответствующего белка. В данном контексте, особое внимание привлекает однонуклеотидный полиморфизм 337C/G (rs43745234) в экзоне 4 гена FSHR, соответствующая аминокислотной замене Р113А. Было выявлено, что особи, гомозиготные по аллелю G (генотип G337G) характеризуются более высоким процентом жизнеспособных эмбрионов, животные с генотипами G337G и гетерозиготы (генотип G337C) имеют меньше неоплодотворенных ооцитов по сравнению с коровами, гомозиготными по аллелю С (генотип С337С) [Cory А.Т., Price С.А., Lefebvre R., Palin M.F. Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine follicle-stimulating hormone receptor and effects of genotypes on superovulatory response traits. Animal Genetics. 2013. vol. 44. no. 2. P. 197-201. doi: 10.1111/j.l365-2052.2012.02380.x]. Таким образом, ген fshr, кодирующий FSHR, является одним из перспективных генетических маркеров репродуктивного статуса крупного рогатого скота.
Для дифференциации аллельных вариантов генов наиболее широко используется метод ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов).
Из уровня техники известен способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 337C/G (rs43745234) гена fshr, обеспечивающий их идентификацию на основе метода ПЦР-ПДРФ (прототип - [Cory А.Т., Price С.А., Lefebvre R., Palin M.F. Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine follicle-stimulating hormone receptor and effects of genotypes on superovulatory response traits. Animal Genetics. 2013. vol. 44. no. 2. P. 197-201. doi: 10.1111/j.l365-2052.2012.02380.x]. Способ состоит в том, что аллели 337C/G (rs43745234) выявляют обработкой содержащего их участка гена fshr длиной 286 пар нуклеотидов, полученного методом ПЦР с использованием праймеров F:  и R:  с помощью эндонуклеазы рестрикции HgaI и последующим анализом полученных фрагментов ДНК методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле.
Основными недостатками данного метода являются многостадийность анализа (амплификация полиморфного участка гена, рестрикция полученного ампликона специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов), его длительность (более 6-8 часов), вероятность недостоверных результатов в случае неоптимального соотношения количества ДНК, рестриктазы и времени рестрикции.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в повышении надежности детекции аллелей 337C/G (rs43745234) гена fshr, в упрощении анализа и сокращении времени его проведения до 1,5 часов.
Технический результат достигается тем, что способ проведения ПЦР в режиме реального времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 337C/G гена fshr (rs43745234), отличается тем, что используются:
прямой праймер;
обратный праймер
FSHR337C - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
FSHR337G - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
Перечень графических материалов.
На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена fshr длиной 96 п.н., кодирующие аллели 337C/G (rs43745234). Жирным шрифтом отмечены последовательности праймеров, курсивом - последовательности зондов.
На фиг. 2 представлены: А - кривые флуоресценции для гомозиготных образцов по аллелю С (генотип С337С). Б - кривые флуоресценции для гомозиготных образцов по аллелю G (генотип G337G). В - кривые флуоресценции для гетерозигот G337C. Г - график распределения аллелей 337C/G гена fshr.
Патентуемый способ заключается в проведения ПЦР в режиме реального времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам 337C/G (rs43745234) гена fshr. Заявленный способ отличается тем, что используются два общих для аллельных вариантов праймера: прямой праймер FSHR-F:  и обратный праймер FSHR-R:  фланкирующие участок гена fshr длиной 96 п.н., и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan: FSHR337C:  и FSHR337G:  (фиг. 1).
Точки мутаций те же, что и в прототипе, однако подход детекции иной: в заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма методом ПЦР в режиме реального времени с помощью флуоресцентно-меченых аллель-специфичных зондов.
В патентуемом способе идентификации аллельных вариантов 337C/G (rs43745234) гена fshr на основе ПЦР в режиме реального времени используются два праймера, общие для обоих аллелей гена, и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan (Фиг. 1). Праймеры FSHR-F и FSHR-R инициируют амплификацию участка гена fshr крупного рогатого скота длиной 96 п.н. Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2.5 мкл 10х буфера для HS TaqDNA полимеразы (Евроген, Россия), 2,5 мкл смеси прямого праймера FSHR-F:  и обратного праймера FSHR-R:  с концентрацией 10 мкМ, 1 мкл зонда FSHR337C: ' (10 мкМ), 1 мкл зонда FSHR337G:  (10 мкМ), 1 мкл смесь дНТФ (5 мМ), 0,3 мкл HS TaqDNA полимеразы (Евроген, Россия), 10-30 нг ДНК. Программа для проведения ПЦР: 1-ый цикл: 95°С - 3 мин; далее 40 циклов при следующих условиях: 95°С - 20 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 20 сек. Детекция флуоресценции проводилась на стадии отжига праймеров и зондов по каналам FAM и VIC. ПЦР и анализ результатов генотипирования проводили с использованием амплификатора LightCycler с программным обеспечением версии SW1.1. Идентификация аллелей 337C/G (rs43745234) проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и VIC, соответственно. Для определения генотипа животного используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и VIC. Программное обеспечение для амплификатора LightCycler 96 версии SW1.1. представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (Фиг. 2Г). Для гомозиготных образцов по аллелю С (генотип С337С) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM (Фиг. 2А). Для гомозиготных образцов по аллелю G (генотип G337G) детектируется сигнал по каналу VIC (Фиг. 2Б). Для гетерозиготного образца (генотип G337C) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции (Фиг. 2В). Наличие двух красителей, FAM и VIC, позволяют однозначно определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена DGAT1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип животного.
Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК коров черно-пестрого голштинизированного скота. По результатам генотипирования 47,37% животных являлись гетерозиготами (генотип G337C), 47,37% - гомозиготами по аллелю С (генотип С337С) и 5,26% животных - гомозитотами по аллелю G (генотип G337G). Валидацию способа проводили с помощью ПЦР-ПДРФ анализа по прототипу (Cory А.Т., Price С.А., Lefebvre R., Palin M.F. Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine follicle-stimulating hormone receptor and effects of genotypes on superovulatory response traits. Animal Genetics. 2013. vol. 44. no. 2. P. 197-201. doi: 10.1111/j.l365-2052.2012.02380.x). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали. Однако патентуемый способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям 337C/G (rs43745234) гена fshr позволяет значительно (до 1,5 часа) сократить время проведения анализа, что выгодно отличает его от ПЦР-ПДРФ анализа.
Таким образом, разработан эффективный и надежный способ для экспресс-идентификации аллельных вариантов 337C/G (rs43745234) гена fshr крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени с использованием аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зондов. Разработанный метод позволяет проводить генотипирование до 480 животных по аллельным вариантам 337C/G (rs43745234) гена fshr (в зависимости от модели амплификатора) в течение 1,5 часов и может быть использован для отбора перспективных коров-доноров эмбрионов.