СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИНООБРАЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ АФЛАТОКСИГЕННОГО ШТАММА

1. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма, отличающийся тем, что включает измерение выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1 штаммов Aspergillus flavus для получения отношения выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1 и оценку токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма в зависимости от отношения выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1.
2. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 1, отличающийся тем, что способ измерения выхода афлатоксина включает культивирование штаммов Aspergillus flavus, сбор спор Aspergillus flavus для культивирования со встряхиванием, после завершения культивирования фильтрацию с получением фильтрата и измерение концентрации афлатоксина в фильтрате.
3. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 2, отличающийся тем, что культуральная среда, используемая для культивирования штаммов Aspergillus flavus, представляет собой среду CDA, а условия культивирования являются следующими: культивирование при 28°C и влажности 90% в течение 10 дней; среда, используемая для культивирования со встряхиванием спор Aspergillus flavus, представляет собой жидкую среду с картофельной декстрозой, а условия культивирования являются следующими: культивирование со встряхиванием в течение 96 часов при 28°C и 200 об/мин.
4. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 2, отличающийся тем, что применяют способ иммуноаффинной очистки в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией для измерения концентрации афлатоксина в фильтрате после культивирования со встряхиванием спор Aspergillus flavus.
5. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 1, отличающийся тем, что способ измерения транскрипционной активности гена Nor-1 включает культивирование штамма Aspergillus flavus, сбор спор Aspergillus flavus для культивирования со встряхиванием, после завершения культивирования фильтрацию мицелия грибов Aspergillus flavus для высушивания с получением высушенных микроорганизмов, применение способа измерения транскрипционной активности гена Nor-1 для измерения транскрипционной активности гена Nor-1 в высушенных микроорганизмах.
6. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 1, отличающийся тем, что показатели выхода афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1 также можно получить посредством способа одновременного выявления на основе RT-PCR, при этом указанный способ включает следующие стадии:
(1) построение S-образной кривой для количественного определения афлатоксина: на стадии реакции иммунной конкуренции, если количество нанесенного в качестве покрытия моноклонального антитела к афлатоксину является постоянным, используют препараты стандарта афлатоксина для конкуренции с представленным на поверхности фага антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину за связывание с моноклональным антителом к афлатоксину, после завершения реакции иммунной конкуренции фаг с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину, связанным с моноклональным антителом к афлатоксину, элюируют, при этом препараты стандарта афлатоксина соответствуют разному количеству элюированного фага с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину, при этом во время нагревания в ходе ПЦР из содержащегося в элюате фага высвобождаются молекулы ДНК, и высвободившиеся молекулы ДНК используют в качестве мишеней для амплификации в реакции RT-PCR, при этом каждый элюат подвергают реакции одновременной RT-PCR-амплификации с использованием набора и после завершения реакции амплификации получают разные значения Ct, при этом логарифм концентрации афлатоксина используют в качестве абсциссы, а значение Ct используют в качестве ординаты, и для получения S-образной кривой для количественного определения афлатоксина проводят регрессионный анализ;
(2) построение кривой RT-PCR для транскрипционной активности гена Nor-1, предусматривающее серийное разведение образцов с известным числом копий фрагмента ДНК Tq-nor1 гена Nor1 с получением разного числа копий, а затем с использованием набора проведение реакции одновременной RT-PCR-амплификации для каждого числа копий Tq-nor1 отдельно, после завершения реакции амплификации получение разных значений Ct, использование логарифма числа копий Tq-nor1 в качестве абсциссы, а значения Ct в качестве ординаты для выполнения регрессионного анализа с получением при этом кривой для количественного определения транскрипции гена Nor-1;
(3) осуществление культивирования штаммов Aspergillus flavus с получением спор Aspergillus flavus, при этом используют споры Aspergillus flavus для культивирования со встряхиванием, после завершения культивирования фильтруют раствор для культивирования штамма от мицелия грибов Aspergillus flavus; после разбавления раствора для культивирования штамма в некотором соотношении его используют для замены препаратов стандарта афлатоксина в иммунной реакции, проводимой на стадии (1), для осуществления реакции, основанной на иммунной конкуренции, после реакции иммунной конкуренции фаг с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину, связанным с моноклональным антителом к афлатоксину, элюируют, и молекулы ДНК, высвобождаемые содержащимися в элюате фагами, используют в качестве матрицы для количественной амплификации афлатоксина в реакции одновременной RT-PCR-амплификации; дополнительно после высушивания мицелия грибов Aspergillus flavus общую РНК выделяют и подвергают обратной транскрипции с получением cDNA, и cDNA разбавляют в некотором соотношении и используют в качестве матрицы для количественной амплификации гена Nor-1 в реакции одновременной RT-PCR-амплификации;
(4) использование молекул ДНК, высвобождаемых фагом, и cDNA в качестве матриц для одновременной реакции RT-PCR-амплификации, при этом после реакции амплификации получают два значения Ct, и эти два значения Ct соответственно сопоставляют с S-образной кривой для количественного определения афлатоксина и кривой для количественного определения транскрипции гена Nor-1, при этом выполняют преобразование для получения концентрации афлатоксина и транскрипционной активности гена Nor-1 с определением отношения выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1.
7. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 6, отличающийся тем, что фаг с представленным на поверхности антиидиотипическим наноантителом к афлатоксину представляет собой фаг VHH 2-5, а моноклональное антитело к афлатоксину представляет собой моноклональное антитело к афлатоксину 1С11.
2
8. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 6, отличающийся тем, что в реакционной системе, предусматривающей реакцию одновременной RT-PCR-амплификации, конечная концентрация прямых и обратных праймеров Ph-F, Ph-R, Tq-nor1-F и Tq-nor1-R составляет от 300 нМ до 400 нМ; флуоресцентный зонд: конечная концентрация Ph-зонда и Tq-зонда составляет от 200 нМ до 400 нМ; конечная доза ДНК-полимеразы: от 0,5 Ед до 1,0 Ед; конечная концентрация MgCl: от 1 мМ до 2 мМ; конечная концентрация dNTP: от 200 мкМ до 400 мкМ.
2
2
9. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 6, отличающийся тем, что реакционная система, предусматривающая реакцию одновременной RT-PCR-амплификации, содержит 5 мкл мастер-микса Universal Probe для qPCR, 0,1 мкл Ph-F, 0,1 мкл Ph-R, 0,1 мкл Ph-зонда, 2 мкл фаговой матрицы, 0,1 мкл Tq-nor1-F, 0,1 мкл Tq-nor1-R, 0,1 мкл Tq-зонда, 1 мкл матрицы гена Nor-1, 0,2 мкл ДНК-полимеразы, 0,8 мкл MgCl, 0,2 мкл dNTP, при этом добавляют HO для доведения до 10 мкл.
10. Способ оценки токсинообразующей способности афлатоксигенного штамма по п. 1, отличающийся тем, что токсинообразующую способность афлатоксигенного штамма обозначают как Y, и отношение выхода афлатоксина к транскрипционной активности гена Nor-1 (AFT/Nor-1) обозначают как X, при этом формула для оценки токсинообразующей способности Aspergillus flavus представляет собой Y=10,14Х - 16,20, при этом для высокотоксигенного штамма токсинообразующая способность составляет >150 нг/мл; умеренная токсинообразующая способность: 50 < токсинообразующая способность < 150 нг/мл; низкая токсинообразующая способность соответствует токсинообразующей способности < 50 нг/мл; отсутствие выработки токсина: 0, при этом подставляют указанные выше значения в формулу для расчета диапазона оценки токсинообразующей способности, причем AFT/Nor-1 > 16,4 указывает на высокотоксигенный штамм; 6,5<AFT/Nor-1<16,4 указывает на умеренно токсигенный штамм; 0<AFT/Nor-1 < 6,5 указывает на низкотоксигенный штамм; AFT/Nor-1=0 указывает на нетоксигенный штамм.