СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА В ХРИЗАНТЕМЫ

1. Диагностический набор для обнаружения белка оболочки вируса В хризантем (CVB), включающий:
a) поликлональные антитела к белку оболочки вируса В хризантем (CVB) у растений как заявлено в п.2;
b) конъюгат, меченый щелочной фосфатазой;
c) сенсибилизирующий буфер;
d) экстракционный буфер;
e) буфер ECI;
f) буфер PNP.
2. Способ обнаружения вируса В хризантем (CVB) у растений, включающий стадии:
a) обеспечения очищенного белка оболочки CVB с применением разработанных праймеров
Последовательности ID I: Смысловой праймер ATGCCTCCCAAACCGGCACCAGGTGAT
Последовательности ID 2: Антисмысловой праймер TTTATAATGTCTTATTATTCGCAT
b) получения поликлональных антител к белку оболочки CVB, полученному на стадии (а);
c) выполнения прямого антительного твердофазного иммуноферментного сандвич-анализа (DAS ELISA) для обнаружения CVB.
3. Способ по п.2, в котором полный белок оболочки CVB амплифицировали из розы с применением разработанных праймеров, имеющих
Последовательность ID I: Смысловой праймер ATGCCTCCCAAACCGGCACCAGGTGAT
Последовательность ID 2: Антисмысловой праймер TTTATAATGTCTTATTATTCGCAT
4. Способ по п.2, в котором полный белок оболочки CVB, содержащий последовательность ID, имеющую № CAI51623: MPPKPAPGDNEGNASGSTPTPSPPHPARTAEEARLRLAEMEREREQEQSLEEMNSNTPDDDARNISRLTQLAALLRREQTNVTNMALEIGPALQPPPNMRGDPTNMYSQVSTDFLWKIKPQRISNNMATSEDMVKIQVALEGLGVPTESVKEVIIRLVLNCANTSSSVYQDPKGVIEWDGGAIIADDVVGVINEHSTLRKVCRLYAAVAWNYMHLQQTPPSDWSAMGFHPNVKYAAFDFFDYVENGAAIGFSGGIVPKPTRAEYVAYNTYKMLALNKAKNNDTFGNFDSATTGGRQGPAIHNNLNNANNKTL, клонирован в pGEX-2TK с последующей трансформацией штамма E-coli BL 21.
5. Способ по п.2, в котором экспрессию белка оболочки индуцируют 0,25-1 мМ IPTG при температуре приблизительно 25°С в течение 3,5-4 ч.
6. Способ по п.2, в котором очищение белка оболочки CVB выполняют известным способом.
7. Способ по п.2, в котором кроликов иммунизируют четыре раза очищенным белком оболочки PNRSV, полученным на стадии 1(а), и полным адъювантом Фрейнда в отношении 1: 1 с недельными интервалами.
8. Способ по п.2, в котором иммунизацию проводят внутримышечно, подкожно или внутривенно.
9. Способ по п.2, в котором у кроликов отбирают кровь через 14-15 дней для того, чтобы получить поликлональные антитела к белку оболочки CVB.
10. Способ по п.2, в котором поликлональные антитела к белку оболочки CVB являются очищенными из сыворотки известными способами.
11. Способ по п.2, в котором титрационные микропланшеты сенсибилизируют поликлональными антителами, разведенными в сенсибилизирующем буфере в соотношении от 1:500 до 1:1000 с последующей промывкой PBS-T 4-5 раз.
12. Способ по п.2, в котором тестируемые образцы приготавливают в титрационных микропланшетах вымачиванием зараженной листовой ткани из растения в экстракционном буфере с последующим растворением первичного антигена 1×-1/150×.
13. Способ по п.2, в котором титрационный микропланшет инкубируют в течение ночи при приблизительно 37°С с последующей промывкой для того, чтобы позволить антигену покрыть стенки.
14. Способ по п.2, в котором конъюгат антитела, полученный на стадии 2(b) в буфере ECI, добавляют в соотношении от 1:500 до 1:1000 в течение приблизительно 2 час при приблизительно 37°С с последующей промывкой PBS-T.
15. Способ по п.2, в котором около 100 мкл приблизительно 1 мг/мл раствора р-нитрофенилфосфата в буфере PNP добавлено в смесь, как заявлено в п.14.
16. Способ по п.2, в котором реакцию останавливают добавлением около 50 мкл приблизительно 3М NaOH после 15-20 мин для получения желтого цветного продукта.
17. Способ по п.2, в котором цветной продукт является конъюгатом антигена и антитела.
18. Способ по п.2, в котором оптическую плотность окрашенного продукта измеряют при 405 нм для обнаружения вируса В хризантем (CVB).