НОВЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ НОВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES AND THEIR NEW APPLICATION

Известный уровень техники
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к коротким пептидам и их применению. В частности, настоящее изобретение относится к коротким пептидам с биологической активностью.
Описание связанного уровня техники
В данной области техники известны пептиды для лечения заболеваний и в виде фармацевтических композиций. Например, в патенте США No. 6191113 раскрывается пептид, обладающий ингибиторной активностью в отношении роста гладкомышечных клеток и, следовательно, применим для профилактики и лечения патологических состояний, связанных с ростом гладкомышечных клеток, таких как атеросклероз, рестеноз после ангиопластики, стеноз просвета после трансплантации кровеносного сосуда и саркома гладких мышц. Патент No. США 6184208 раскрывает другой пептид, который, как обнаружено, модулирует физиологические процессы, такие, как активность эпителиальной зоны роста в отношении прибавки массы и роста волос. Более того, публикация PCT WO 03/006492 и патентная заявка США No. 10/237405 предположили, что определенные пептиды и их фармацевтические композиции являются биологически активными и способными модулировать иммунные ответы.
Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение коротким пептидом или пептидами, обладающими биологической активностью.
Краткое изложение существа изобретения
Пептиды в соответствии с настоящим изобретением индивидуально синтезированы с помощью стандартных химических методов. С применением различных тестов на животных и in vitro проанализированы различные биологические функции этих пептидов с использованием методов, описанных в последующих ссылках, как описано ниже. Названия пептидов даны с кодом “CMS”, за которым следует номер. Пептидная последовательность и соответствующие номера ID представлены в таблице 1. В общей сложности было идентифицировано семь новых пептидов, имеющих биологическую активность in vivo, и они указаны звездочкой после ID номера последовательности. Остальные пептиды были описаны ранее в публикации WIPO WO 03/006492, но новые и изобретательски новые признаки были найдены в настоящем изобретении. Для облегчения ссылки последовательностям, которые найдены в публикации WO 03/006492, даны те же ID номера последовательности.
Таблица 1
Перечень ID No. последовательностей
Название пептида
Последовательность пептида
1
CMS-001
Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe
2
CMS-017
Ile-Val-Thr-Asn-Thr-Thr
3
CMS-008
Lys Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu
4*
CMS001.30
Pro-Thr-Thr-Lys-Thr-Tyr
5*
CMS001.31
Pro-Thr-Thr-Lys-Thr-Tyr-phe-Pro
6
Нет последовательности
7
CMS-014
Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val
8*
CMS024.04
Tyr-Ser-Nle, где Nle=норлейцин (2-аминокапроевая кислота)
9*
CMS024.05
Tyr-Thr-Val
10*
CMS024.14
(3,5-дибром-Tyr)-Ser-Leu
11*
CMS024.16
Leu-Tyr-Ser
12
Нет последовательности
13
Нет последовательности
14
Нет последовательности
15
CMS-023
Ala Ala Phe
16
Нет последовательности
17
Нет последовательности
18
Нет последовательности
19
Нет последовательности
20
Нет последовательности
21
CMS-030
Phe Glu Glu Met
Соответственно в одном аспекте настоящее изобретение относится к по существу чистым пептидам, имеющим последовательности, идентифицированные как SEQ ID No.4, 5, 8-11. Таким образом, настоящее изобретение также относится к по существу чистому пептиду, включающему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к по существу чистому пептиду, состоящему по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Изобретение также относится к по существу чистому пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. В конкретном осуществлении пептиды могут модулировать, но не ограничиваются модуляцией, одно или более из следующего: усталость, нарушения питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит.
В более предпочтительном осуществлении пептиды могут модулировать, но не ограничиваются модуляцией, одного или более из следующих состояний: запаса гликогена в печени, уровня молочной кислоты в крови, индуцированного облучением иммунодефицита, инфекционного гепатита B, отторжения трансплантата кожи, рака печени, рака желудка, воспаления, липидов, триглицеридов и суммарного холестерина крови, гиперчувствительности иммунной системы, пролиферации Т-лимфоцитов, смешанной пролиферации лимфоцитов, ожирения и повышенной по сравнению с нормальной массы тела.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к по существу чистым пептидам, которые являются функциональными производными пептидов, имеющих последовательности ID No.4, 5, 8-11. Таким образом, настоящее изобретение также относится к по существу чистому пептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая является функциональным производным биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к по существу чистому пептиду, состоящему по существу из аминокислотной последовательности, которая является функциональным производным биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Изобретение также относится к по существу чистому пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, являющемуся функциональным производным биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. В конкретном осуществлении пептиды, являющиеся функциональными производными, могут модулировать, но не ограничиваются модуляцией, одно или более из следующего: усталость, нарушения питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из пептида, включающего одну из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, состоящий по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из пептида, включающего SEQ ID No.4, 5, 8-11. Изобретение также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, состоящий по существу из аминокислотной последовательности, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к гибридным пептидам, содержащим примыкающий к пептиду лидирующий пептид, причем пептид, включает, по существу состоит из, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Настоящее изобретение также относится к гибридным пептидам, содержащим примыкающий к пептиду лидирующий пептид, пептид, включающий функциональное производное биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид включает, по существу состоит из, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
Настоящее изобретение также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий лидирующую аминокислотную последовательность, примыкающую к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая является функциональным производным биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий лидирующую аминокислотную последовательность, примыкающую к нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, состоящий по существу из аминокислотной последовательности, которая является функциональным производным биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
В конкретном осуществлении пептиды, получаемые в любом из описанных выше генетических векторах, могут модулировать, но не ограничиваются модуляцией, одно или более из следующего: усталость, нарушение питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму с геномом, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к микроорганизму с геномом, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, состоящий по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму с генетическим материалом, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, предпочтительно экзогенный пептид, включающий аминокислотную последовательность, которая является функциональным производным биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к микроорганизму с генетической композицией, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный пептид, состоящий по существу из аминокислотной последовательности, которая является функциональным производным биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. При применении в данном описании экзогенный пептид относится к пептиду, обладающему аминокислотной последовательностью, которая отличается от любых других пептидов, обычно экспрессирующихся микроорганизмом в своей природной, немодифицированной форме.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму с генетической композицией, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, предпочтительно экзогенный гибридный пептид, включающий лидирующую аминокислотную последовательность, примыкающую к пептиду, причем пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к микроорганизму с геномом, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный пептид, включающий лидирующую аминокислотную последовательность, примыкающую к пептиду, состоящему по существу из или состоящему из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму с генетической композицией, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный гибридный пептид, включающий лидирующую аминокислотную последовательность, примыкающую к пептиду, причем пептид включает аминокислотную последовательность, которая является функциональным производным биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к микроорганизму с генетической композицией, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный гибридный пептид, включающий лидирующую аминокислотную последовательность, примыкающую к пептиду, состоящему по существу из или состоящему из аминокислотной последовательности, которая является функциональным производным биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
В конкретном осуществлении пептиды, получаемые в любом из описанных выше микроорганизмов, могут модулировать, но не ограничиваются модуляцией, одно или более из следующих состояний: усталость, нарушение питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей по существу чистый пептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей практически чистый пептид, состоящий по существу из или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей по существу чистый пептид, включающий функциональное производное биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к фармацевтической композиции, включающей практически чистый пептид, состоящий по существу из функционального производного биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей практически чистый пептид, состоящий из функционального производного биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей SEQ ID No.4, 5, 8-11.
В конкретном осуществлении пептиды, представленные в любой из описанных выше фармацевтических композиций, могут модулировать, но не ограничиваются модуляцией, одно или более из следующего: усталость, нарушение питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему обеспечение по существу чистым пептидом, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11; и смешивание указанного по существу чистого пептида с фармацевтически приемлемым носителем. Оно также относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему обеспечение практически чистым пептидом, состоящим по существу из или состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11, и смешивание указанного по существу чистого пептида с фармацевтически приемлемым носителем.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему обеспечение по существу чистым пептидом, включающим аминокислотную последовательность, которая является функциональным производным биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11; и смешивание указанного по существу чистого пептида с фармацевтически приемлемым носителем.
Изобретение дополнительно относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему обеспечение по существу чистым пептидом, состоящим по существу из или состоящим из аминокислотной последовательности, которая является функциональным производным биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11; и смешивание указанного по существу чистого пептида с фармацевтически приемлемым носителем.
В связи с любым из описанных выше способов пептид может модулировать, но не ограничивается модуляцией, одно или более из следующих состояний: активность иммунной системы, усталость, нарушения питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения человека, включающему введение человеку фармацевтически эффективной дозы по существу чистого пептида, включающего, по существу состоящего из или состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11. Оно также относится к способу лечения человека, включающему введение человеку фармацевтически эффективной дозы по существу чистого пептида, включающего, по существу состоящего из или состоящего из аминокислотной последовательности, которая является функциональным производным биологически активного пептида, причем этот биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11.
В конкретном осуществлении описанные выше пептиды, применяемые для лечения человека, могут быть использованы для модуляции, но не ограничиваются ею, одного или более из следующих состояний человека: усталости, нарушений питания, метаболических нарушений, нарушения липидного обмена, ацидоза, активности иммунной системы, эффектов облучения, гепатита, отторжения трансплантированного органа, роста раковой опухоли и аппетита.
В связи с любой из описанных выше нуклеотидных последовательностей пептиды и/или гибридные пептиды, экспрессирующиеся с этих последовательностей нуклеиновых кислот, могут модулировать, но не ограничиваются модуляцией, следующие состояния: усталость, нарушения питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит.
В еще одном осуществлении настоящее изобретение относится к применению биологически активного пептида, причем указанный биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.1, 2, 15, или ее функциональных производных, для получения лекарства для модуляции, по меньшей мере, одного из следующих состояний: гепатита, усталости, уровня запаса гликогена в печени, уровня молочной кислоты в крови и иммунологической реакции у индивидуума. Оно также относится к способу модуляции гепатита, уровня запаса гликогена в печени, уровня молочной кислоты в крови или иммунологической реакции у индивидуума, включающему введение фармацевтически эффективной дозы биологически активного пептида, причем указанный биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, состоящую по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.1, 2, 15, или ее функциональных производных.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению биологически активного пептида, причем указанный биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID No.3, 7, 21, или их функциональных производных, для получения лекарства для модуляции, по меньшей мере, одного из следующих состояний: усталости, воспаления, аппетита, массы тела, жировых отложений организма, уровня липидов в крови, уровня триглицеридов в крови, уровня холестерина в крови, воспаления и иммунитета. Настоящее изобретение также относится к способу модуляции, по меньшей мере, одного из следующих состояний: усталости, воспаления, аппетита, массы тела, жировых отложений организма, уровня липидов в крови, уровня триглицеридов в крови, уровня холестерина в крови, воспаления и иммунитета у индивидуума, включающему введение фармацевтически эффективной дозы биологически активного пептида, причем указанный биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No.3, 7, 21, или ее функциональных производных.
В дополнительном осуществлении настоящее изобретение применяется к пищевой композиции, содержащей пептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID No.4, 5, 8-11, или его функциональных производных, и на ее применение для получения пищевой добавки.
В дополнительном осуществлении в настоящем изобретении предлагаются улучшенные производные пептида SEQ ID No.4, 5, 8-11 и их функциональные производные. Усиленные производные этих пептидов включают молекулу-усилитель, оперативно связанную с этими пептидами таким образом, чтобы улучшить или увеличить терапевтическую эффективность пептида. Усиление эффекта может представлять собой пролонгированный эффект, укороченный эффект, отставленное начало эффекта, ускоренное начало эффекта, усиленную интенсивность эффекта, пониженную интенсивность эффекта, снижение побочных эффектов, создание одного или более эффектов, отставленное снижение эффекта, ускоренное снижение эффекта и направленную доставку пептида к конкретному местонахождению у индивидуума. Примеры таких молекул-усилителей и усиленных производных описываются ниже. В некоторых аспектах изобретения молекулы-усилители могут лечить или предотвращать, но не ограничиваются лечением и предотвращением, вирусные инфекции и иммунологические нарушения. Дополнительные аспекты настоящего изобретения включают способы усиления терапевтических эффектов пептида, включающие, состоящие по существу из или состоящие из пептида, выбранного из группы, состоящей и SEQ ID No.4, 5, 8-11, и его производных, включающих указанный пептид, оперативно связанный с молекулой, которая усиливает терапевтический эффект. В некоторых аспектах изобретения указанная оперативно связанная молекула, которая усиливает терапевтический эффект, не является пептидом, который примыкает к пептиду, выбранному из группы, состоящей и SEQ ID No.4, 5, 8-11, и его производным, в существующем в природе пептиде.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается композиция, включающая по существу чистый пептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей и SEQ ID No.4, 5, 8-11, и его производных.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается способ снижения эффектов болезни человека с помощью введения фармацевтически эффективной дозы биологически активного пептида, включающего, состоящего по существу из или состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей и SEQ ID No.4, 5, 8-11. В некоторых осуществлениях человек страдает от, по меньшей мере, следующих состояний: усталости, нарушений питания, метаболических нарушений, нарушения липидного обмена, ацидоза, активности иммунной системы, эффектов облучения, гепатита, отторжения трансплантированного органа, роста раковой опухоли и аппетита.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается способ модуляции или лечения состояния, включающий введение биологически активного пептида, имеющего аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из SEQ ID No. 1 или ее функционального производного, где состояние выбрано из группы, состоящей из: усталости, уровня запаса гликогена в печени, уровня молочной кислоты и иммунной реакции у индивидуума.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается способ модуляции уровня запаса гликогена в печени, уровня молочной кислоты или иммунной реакции у индивидуума с помощью введения фармакологически эффективной дозы биологически активного пептида, включающего, состоящего по существу из или состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID No. 1 или ее функциональных производных.
В еще одном аспекте изобретения предлагается биологически активный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No. 2 или 15 или ее функциональных производных для получения лекарства для лечения гепатита.
В еще одном аспекте изобретения предлагается способ лечения гепатита у индивидуума с помощью введения фармакологически эффективной дозы биологически активного пептида, причем биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No. 2 или 15 или ее функциональных производных.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается биологически активный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из SEQ ID No. 3 или ее функциональных производных, для получения лекарства для облегчения усталости.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается способ облегчения усталости у индивидуума с помощью введения фармакологически эффективной дозы биологически активного пептида, имеющего аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из SEQ ID No. 3 или ее функциональных производных.
В еще одном аспекте изобретения предлагается применение биологически активного пептида, имеющего аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из SEQ ID No. 21 или ее функциональных производных, для получения лекарства для модуляции, по меньшей мере, одного из следующих состояний: воспаления, аппетита, массы тела, жировых отложений организма, уровня липидов в крови, уровня триглицеридов в крови, уровня холестерина в крови, воспаления и иммунитета.
В еще одном аспекте изобретения предлагается способ модуляции, по меньшей мере, одного из следующих состояний: воспаления, аппетита, массы тела, жировых отложений организма, уровня липидов в крови, уровня триглицеридов в крови, уровня холестерина в крови, воспаления и иммунитета, у индивидуума, включающий введение фармакологически эффективной дозы биологически активного пептида, причем биологически активный пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из SEQ ID No. 21 или ее функциональных производных.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается применение биологически активного пептида, имеющего аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из SEQ ID No. 7 или ее функциональных производных, для получения лекарства для модуляции иммунной системы у индивидуума.
В еще одном аспекте изобретения предлагается способ модуляции иммунной системы индивидуума с помощью введения фармакологически эффективной дозы биологически активного пептида, имеющего аминокислотную последовательность, включающую, состоящую по существу из или состоящую из SEQ ID No. 7 или ее функциональных производных.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
Как описано в данном описании, пептиды, как обнаружено, имеют важную биологическую активность. Пептиды можно легко синтезировать с помощью стандартных способов синтеза из L-аминокислот, но их можно также синтезировать с помощью методов генной инженерии с применением нуклеиновых кислот, которые имеют последовательности, кодирующие индивидуальные пептиды. Все цитируемые ссылки включены в данное описание во всей своей полноте.
Как применяется в данном описании, «по существу чистый пептид» относится к пептидам, которые очищены, по меньшей мере, на 40% и более предпочтительно на 60%, и более предпочтительно более чем на 90%. В наиболее предпочтительном осуществлении чистота составляет приблизительно 99%-100%. По существу чистый пептид может быть применен для получения фармацевтических и пищевых составов, которые могут быть сложными смесями, как описано ниже.
Как применяется в данном описании, термин «гибридный пептид» применяется для обозначения пептидов, которые содержат дополнительные пептиды, включенные в описанный в данном описании исходный биологически активный пептид, имеющий последовательность, описанную выше, или в его функциональные производные, но все еще сохраняют по существу сходную активность. Дополнительные пептиды включают лидирующие пептиды, которые содержат, например, аминокислотную последовательность, которая узнается одной или более клетками прокариот или эукариот в качестве сигнала для секреции гибридного белка из клетки. Секреция может быть прямой секрецией или непрямой - через секреторные везикулы.
Как описано выше, другим осуществлением настоящего изобретения является пептид или полипептид, состоящий по существу из пептида по настоящему изобретению. Как применяется в данном описании, термин «состоящий по существу из» относится к пептиду или полипептиду, включающему аминокислотную последовательность пептидов настоящего изобретения вместе с дополнительными аминокислотами на карбоксильном и/или аминоконцах и который сохраняет активность предлагаемых в данном описании пептидов настоящего изобретения. Так, в качестве не ограничивающего примера, когда активностью пептида по настоящему изобретению является модуляция иммунной активности, пептид или полипептид «состоящий по существу из» пептида настоящего изобретения должен обладать способностью модулировать иммунную активность, как предлагается в данном описании, в том смысле, что пептид не должен обладать любыми характеристиками, которые ощутимо снижают способность пептида или полипептида модулировать иммунную активность или которые создают реальное изменение по сравнению с основными и новыми характеристиками пептида как модулятора иммунной активности. Таким образом, в представленном выше примере полноразмерный существующий в природе полипептид, обладающий исходной активностью, отличной от модуляции иммунной активности, и содержащий где-то в себе аминокислотную последовательность пептида настоящего изобретения, не должен являться пептидом или полипептидом, «состоящим по существу из» пептида настоящего изобретения. Подобным образом, в представленном выше примере генетически сконструированный пептид или полипептид, который обладает исходной активностью, отличной от модуляции иммунной активности, но включает где-то в себе аминокислотную последовательность пептида настоящего изобретения, не должен являться пептидом или полипептидом, «состоящим по существу из» пептида настоящего изобретения.
В предпочтительном осуществлении термин «состоящий по существу из» относится к пептидам или полипептидам, которые обладают четырьмя или менее аминокислотами в дополнение к одному из пептидов настоящего изобретения. В более предпочтительном осуществлении тот же самый термин относится к пептидам или полипептидам с двумя аминокислотами в дополнение к одному из пептидов настоящего изобретения. В наиболее предпочтительном осуществлении тот же самый термин относится к пептидам или полипептидам с одной аминокислотой в дополнение к одному из пептидов настоящего изобретения.
Кроме примера с модуляцией иммунной активности, использованного для представленной выше иллюстрации, указанное выше определение также применимо для всех пептидов настоящего изобретения в отношении активности, которую обеспечивают такие пептиды. В частности, указанное выше определение применимо к пептидам изобретения, обладающим активностью при модуляции усталости, нарушений питания, метаболических нарушений, нарушения липидного обмена, ацидоза, активности иммунной системы, эффектов облучения, гепатита, отторжения трансплантированного органа, роста раковой опухоли и аппетита.
Специалисты в данной области техники могут легко определить, является ли пептид или полипептид по существу пептидом настоящего изобретения с помощью указанных выше определений путем измерения активности пептида или полипептида с применением тестов, описанных ниже.
Специалисты в данной области техники могут легко определить, является ли пептид или полипептид по существу пептидом настоящего изобретения с помощью указанных выше определений путем измерения активности пептида или полипептида с применением тестов для модуляции нарушений, таких как усталость, нарушения питания, метаболические нарушения, нарушение липидного обмена, ацидоз, активность иммунной системы, эффекты облучения, гепатит, отторжение трансплантированного органа, рост раковой опухоли и аппетит, которые предлагаются в данном описании в отношении конкретного пептида настоящего изобретения.
Применяемый в данном описании и в формуле изобретения термин «нарушение» относится к любым состояниям организма, которые выпадают из нормального диапазона при измерении стандартными методами. Например, у человека «нарушение липидного обмена» относится к состоянию, при котором уровень любого из липидов в организме превышает нормальный диапазон для данного конкретного субъекта с учетом пола, роста и возраста при определении стандартными медицинскими диагностическими тестами.
Пептид может быть введен любым подходящим путем. Примерами путей ведения являются внутривенное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение, подкожное введение и подкожная имплантация с устройством, облегчающим доставку, таким как липосома, или без него, защита с постоянным высвобождением и тому подобное. Таким образом, настоящее изобретение включает устройства для введения пептида субъекту. В некоторых осуществлениях устройство может представлять собой шприц. Пептид может быть также введен в любой форме перорального введения. Примеры могут включать, но не ограничиваются этим, таблетку, капсулу, суспензию, раствор, лепешку и тому подобное, в обычной форме без модификации или в форме с замедленным высвобождением, или с защитой в желудочно-кишечном тракте, или без нее. Пептид может быть дополнительно применен в любой форме местного нанесения, такой как мазь, крем, гель и т.д. с или без устройства, облегчающего трансдермальную доставку, или в виде ингалятора порошка, растворенного или в виде липосомной защитной формы.
Понятно, что может быть возможным добавление дополнительных аминокислот к амино- или карбоксильным концам описанных и раскрытых в данном описании пептидов в качестве другого способа практики настоящего изобретения. Например, одну или две аминокислоты можно добавить к раскрытому пептиду без влияния на его биологическую функцию. Может быть также возможным добавление трех или четырех аминокислот при все еще сохраненной функции пептидов. Все это обозначается как варианты одного и того же пептида. Альтернативно одна или две аминокислоты могут быть удалены из пептида без влияния на его биологическую активность. Дополнительно может быть возможным удаление трех или четырех аминокислот без влияния на биологическую функцию пептидов. Это обозначается как фрагменты рассматриваемого пептида. Более того, в практике другого аспекта настоящего изобретения могут быть применены производные пептида, такие, как при консервативной замене одной аминокислоты на другую в пределах одного и того же функционального класса. Например, в пептидах, имеющих неполярные или гидрофобные боковые цепи, может быть возможной замена одной боковой группы на другую без снижения биологической активности. В качестве дополнительного примера в пептид может быть введен линкер/спейсер с образованием вариантов, но варианты, все еще сохраняющие свою активную часть как в исходном пептиде, применяемом в данном исследовании. Это также является рассматриваемыми вариантами пептидов. Аналог пептида, как применятся в данном описании, включает пептиды, которые имеют молекулы аминокислот, которые имитируют структуру природной аминокислоты, например аналог с различной структурой остова или заменой на D-аминокислоту. Как дополнительный пример, хотя аминокислоты, применяемые для синтеза пептидов, находятся в их L оптической изомерной форме, пептиды с одной или более аминокислотами в последовательности, замещенными на D-форму, могут иметь сходную биологическую активность. Термин «функциональное производное», как применяется в формуле изобретения, предназначен для включения фрагментов, вариантов, аналогов или химических производных пептида.
Применение идентифицированных выше пептидов в фармацевтических составах может быть использовано в качестве возможного лечения описанных в данном описании нарушений, таких как иммунологические нарушения, рак, усталость, отторжение трансплантата и тому подобное. Составы могут содержать один из идентифицированных пептидов, смешанный с другими активными или неактивными компонентами, включая другие пептиды. Альтернативно один из перечисленных пептидов может быть применен для получения состава совместно с не перечисленными в данном описании пептидами. Они могут быть введены во внутривенной, внутримышечной, внутрикожной, подкожной или внутридермальной форме. Способ введения может представлять собой также внутриартериальную инъекцию, которая ведет к органу, нуждающемуся в лечении. Другие способы введения представляют собой трансдермальное введение, ингаляцию в виде порошка или спрея и другие формы доставки, известные специалисту в данной области техники. Состав можно также применять перорально и он может содержать носители, которые могут быть использованы для предотвращения гидролиза пептида в желудке после перорального приема, или любые другие носители, известные в данной области техники.
Фармацевтический состав может включать любые из известных фармацевтических носителей. Примеры подходящих носителей включают любой стандартный фармацевтически приемлемый носитель, известный специалистам в данной области техники. Они включают, но не ограничиваются этим, физиологический солевой раствор, воду, эмульсии, включая смеси масла и воды или эмульсии триглицеридов, и другие типы агентов, наполнители, покрытые таблетки и капсулы. Подходящий носитель может быть выбран на основе способа введения фармацевтической композиции.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагаются описанные в данном описании улучшенные производные пептида и их функциональные производные. Биологически активные пептиды настоящего изобретения могут быть конъюгированы с другими биологически эффективными или полезными молекулами для обеспечения дополнительного эффекта или применения, или для усиления их терапевтической эффективности. В данной области техники известно много потенциальных конъюгирующих молекул, их биологических эффектов и способов конъюгации молекул с пептидами. Примеры конъюгирующих молекул включают, но не ограничиваются этим, органическое соединение, углевод, сахар, полисахарид, аминокислоту, полимер аминокислот, пептид, стероид, белок, выделенный домен белка, липидную молекулу, жирную кислоту, желчную кислоту, полиамин, ингибитор протеаз и тому подобное. Может быть также использовано сочетание конъюгирующих молекул.
Некоторые из пептидов изобретения имеют индивидуально терапевтическое влияние на конкретный тип клеток или ткани. Одним важным требованием к молекулам, конъюгирующимся с пептидными лекарствами, является направленная доставка пептида к конкретному местоположению или участку организма индивидуума, подвергаемого лечению. Таким способом пептидное лекарство и его эффекты могут быть сконцентрированы в месте локализации клеточного или тканевого типа, которому предназначается терапевтический эффект. Это может усилить эффект по сравнению с тем, который должно иметь сходное молекулярное количество свободного, неконъюгированного пептида. Другие требования к конъюгирующим молекулам могут включать, например, увеличение жизни пептида, изменение растворимости пептида, изменение активности пептида и изменение биодоступности пептида.
Химические реакции для конъюгации настоящих пептидов с конъюгирующими партнерами могут быть выведены специалистом в данной области техники без чрезмерного экспериментирования. Различные способы конъюгации описаны, например, в Haas et al., Kidney Intl.,52(6):1693, 1997; Fiume et al., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3):275, 1997; Di Stefano et al., Biochem. Pharmacol., 61(4):459, 2001; Huang et al., Chem. Biol., 7(7):453, 2000; Leopold et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 23(4):397, 1995; Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3):434, 1997; Kramer et al. J. Biol. Chem., 269(14): 10621, 1994; Toth et al. (J.Med.Chem., 42(19):4010, 1999; Kim et al., (Biomaterials, 23:2311, 2002; Oldham et al. (Int. J. Oncology, 16:125, 2000; и Fitzpatrick et al. Anticancer Drug Design, 10:1, 1995, все из которых включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
Генная терапия и способ лечения
Генная терапия, основанная на раскрытых пептидных последовательностях, может быть осуществлена с помощью создания последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует один из этих пептидов. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована химически и оперативно связана с промотором, и клонирована в экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор затем вводят в организм человека как форму для генной терапии для экспрессии в клетке человека. Применяемый в данном описании термин «генетические векторы» включает эти экспрессионные векторы. Векторы, которые могут быть пригодны для генной терапии, включают ассоциированные с аденовирусом (Mizuno, M. et al. (1998), Jpn J Cancer Res 89, 76-80) векторы LNSX (Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) и лентивирусные (Goldman, MJ. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268), раскрытия которых включены в данном описании в качестве ссылки во всей своей полноте.
Другие носители для доставки пептидов включают экспрессионные векторы, кодирующие желаемый пептид, которые могут быть перенесены в организм, который может реплицироваться в организме-хозяине, которому желательно ввести пептид без значительных вредных влияний на здоровье организма-хозяина. Например, экспрессионные векторы могут быть перенесены в организм, который не является патогенным для организма-хозяина, которому желательно ввести пептид. В некоторых осуществлениях экспрессионный вектор продуцирует желаемый пептид в организме бактерий или грибов, который не оказывает существенных вредных влияний на здоровье организма-хозяина, которому предполагается ввести пептид. Например, экспрессионный вектор, кодирующий желаемый пептид, может представлять собой экспрессионный вектор, который продуцирует желаемый пептид в организме, таком как лактобактерии, E. coli или дрожжи. В одном осуществлении экспрессионный вектор продуцирует желаемый пептид в микробе, обычно обнаруживаемом в желудочно-кишечном тракте млекопитающих, или в микробе, толерантном для пищеварительного тракта млекопитающих. Некоторые штаммы микробов, в которых может экспрессироваться желаемый пептид, включают, но не ограничиваются этим, штаммы Lactobacillus, такие как L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus или другие; штаммы Bifidobacterium, такие как B. adolescentis, B. animalus, B. bifldum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum или другие; Enterococcus faecalis или Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis или Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; или Saccharomyces cerevisiae, или Saccharomyces boulardii.
Последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют пептиды настоящего изобретения, синтезируют химически или получают с помощью других способов, включая, но не ограничиваясь этим, обратную транскрипцию мРНК для получения молекул кДНК, которые могут быть включены в экспрессионные векторы для переноса генов в желаемые организмы с помощью способов генной инженерии, знакомых специалистам в данной области техники. Экспрессионные векторы могут представлять собой ДНК-векторы или РНК-векторы. Например, экспрессионные векторы могут быть основаны на плазмиде или генетических элементах вирусов. Экспрессионные векторы могут представлять собой векторы, которые реплицируются вне хромосом, или векторы, которые интегрированы в хромосому.
Экспрессионные векторы включают промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующий пептид настоящего изобретения. Промотор может представлять собой регулируемый промотор, такой как индуцибельный промотор или конститутивный промотор. В некоторых осуществлениях может быть выбран промотор для обеспечения желаемого уровня экспрессии пептида. Кроме того, если это желательно, экспрессионные векторы могут включать другие последовательности для стимуляции продукции, презентации и/или секреции пептидов. В некоторых осуществлениях нуклеиновая кислота, кодирующая пептид настоящего изобретения, оперативно связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая управляет секрецией пептида. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая пептид настоящего изобретения, может быть оперативно связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнальный пептид.
В некоторых осуществлениях экспрессионные векторы, которые конструируются для кодирования пептидов настоящего изобретения, могут представлять собой экспрессионные векторы, которые адаптированы для экспрессии пептида настоящего изобретения в штаммах бактерий, составляющих нормальную флору пищеварительного тракта млекопитающих, таких как штаммы Lactobacillus и Bacillus subtilis. Примеры таких экспрессионных векторов могут быть найдены в патентах США No. 6100388, принадлежащем Casas, и No. 5728571, принадлежащем Bellini, соответственно. Должно быть понятно, что может быть использован любой экспрессионный вектор, облегчающий экспрессию пептида настоящего изобретения в организме, который не вреден для здоровья организма-хозяина, которому должен быть введен пептид.
В некоторых осуществлениях экспрессионные векторы, которые создаются для кодирования пептидов настоящего изобретения, могут представлять собой экспрессионные векторы, которые адаптированы для экспрессии пептида настоящего изобретения в штаммах дрожжей, к которым хорошо толерантен пищеварительный тракт млекопитающих, таких как Saccharomyces cerevisiae; или, предпочтительно, Saccharomyces boulardii, которые могут образовывать колонии в пищеварительном тракте человека, и применяются для лечения определенных форм диареи. Могут быть использованы дрожжевые экспрессионные векторы, которые конститутивно экспрессируют гетерологичные белки и пептиды, они являются высоко стабильными, таким образом, хорошо переносятся потомству клеток при митозе и мейозе и могут включать кодирующую последовательность для сигнального пептида или пептидов, которая управляет высокими уровнями секреции рекомбинантного белка. Пример такого дрожжевого вектора дан в патенте США No. 6391585, принадлежащем Jang et al., который включен в данное описание специально в качестве ссылки во всей своей полноте.
Экспрессионные векторы, кодирующие пептиды настоящего изобретения, могут быть введены в организм, в котором планируется экспрессия пептидов с помощью способов, известных в данной области техники. Эти способы включают традиционные методы трансформации бактерий, дрожжей или других микробов путем применения химически компетентных бактериальных клеток, электропорации или трансформации ацетатом лития (для дрожжей), например, а также с помощью последних достижений в трансформации бактериальных штаммов, не поддающихся этим процедурам. В некоторых осуществлениях экспрессионные векторы вводят в лактобактерии, известные как не поддающиеся трансформации, с помощью способа, раскрытого Leer et al. (WO 95/35389), раскрытие которого включено в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Введенные последовательности могут быть включены в микробную хромосомную ДНК или могут оставаться в виде элементов внехромосомной ДНК.
Этот генетически сконструированный микроб, содержащий экспрессионный вектор, можно затем инокулировать в пищеварительный тракт, влагалище, трахею и т.д. для достижения поддерживаемой иммунотерапии. В некоторых осуществлениях организмы, экспрессирующие пептиды настоящего изобретения, проглатываются в неактивной форме или, предпочтительно, в живом виде. В пищеварительном тракте эти микроорганизмы продуцируют указанные пептиды, высвобождают их в просвет с помощью секреции или лизиса микроорганизма, или другим образом представляют пептид хозяину, в результате чего пептиды производят предназначенный им эффект в организме-хозяине. В других осуществлениях пептиды представляются хозяину на слизистой мембране носовых ходов, влагалища или тонкого кишечника.
Другим способом лечения является применение липосом как средств для доставки конкретной нуклеиновой кислоты к клеткам в организме человека. Нуклеиновая кислота (такая, как экспрессионный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанные в данном описании пептиды) может быть доставлена в среде, содействующей клеточному захвату и включению в хромосому, как описано в Gao, X. and Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 и патенте США No. 6207456, раскрытие которых включено в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Альтернативно сам пептид может быть инкапсулирован в липосому и доставлен непосредственно с применением метода, описанного в патенте США No. 6245427, раскрытие которого включено в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Все научные публикации и указанные патенты включены в данное описание в качестве ссылки.
Последовательности нуклеиновой кислоты, пригодные для указанной выше генной терапии, и способ лечения включают последовательности, которые кодируют эти пептиды и их функциональные производные. Любые из пронумерованных последовательностей нуклеиновой кислоты могут быть использованы для кодирования этих пептидов и их производных на основе системы вырожденности кодонов.
Пример 1
Влияние CMS-001 и CMS-008 на вызванную тренировкой усталость у мышей
Цель
: Исследовать снимающее усталость действие CMS-001 и CMS-008 у мышей BALB/c
Методы
: Для наблюдения снимающего усталость действия CMS-001 и CMS-008 использовали модель истощающего плавания мышей BALB/c. Определяли время истощающего плавания, гликоген печени, азот мочевины в сыворотке (BUN) и уровень молочной кислоты в сыворотке после введения CMS-001 и CMS-008. Также определяли уровни малонового диальдегида (MDA), супероксиддисмутазы (SOD), аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке для исследования возможного механизма снимающего усталость действия CMS-001 и CMS-008.
Результаты
: Было обнаружено, что CMS-001 и CMS-008 в подходящих концентрациях способны продлевать время истощающего плавания мышей, снижать уровень BUN, повышать уровень гликогена печени и снижать накопление молочной кислоты в крови статистически значимо по сравнению с контрольным физиологическим раствором (P<0,05). Было дополнительно обнаружено, что CMS-001 и CMS-008 способны также подавлять повышение уровней MDA, ALT и AST в крови и увеличивать активность SOD во время истощающей тренировки статистически значимо по сравнению с контрольным физиологическим раствором (P<0,05).
Заключение
: Было обнаружено, что CMS-001 и CMS-008 обладают способностью снимать усталость и могут быть использованы для терапии связанных с усталостью состояний.
Материалы и методы
1. :
Лекарство и реагенты
1.1.
CMS-001 и CMS-008 синтезировали на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
Набор для определения азота мочевины: Beckman Coulter, Inc., Fullerton, California, США.
Набор антраценкетонового реагента: Shanghai Fifth Union Laboratory, Shanghai, China, PRC.
Наборы реагентов MDA и SOD: Nanjing Jiancheng Bio-engineering Corporation, Nanjing, China, PRC.
Наборы реагентов AST и ALT: Beijing Zhongsheng Bio-engineering High Technology Corporation, Beijing, PRC.
Животные
1.2.
Самцов мышей BALB/c отдельной группы, не содержащей патогенов, массой 18-22 г получали из Академии военной медицины и научного Центра экспериментальных животных, PR China.
Мышей случайным образом распределяли в группы CMS-001 (20 мкг/кг/день, 5 мкг/кг/день), CMS-008 (500 мкг/кг/день, 125 мкг/кг/день) и контроль с физиологическим раствором. Тестируемое вещество вводили путем внутрибрюшинной инъекции раз в день в течение 30 дней без перерыва. Через неделю после начала введения тестируемого вещества мышей тренировали плавать в течение 10 мин при температуре воды 25±1°С.
Экспериментальное оборудование
1.3.
Плавательный бассейн (50 см×50 см×40 см).
Полностью автоматизированный биохимический анализатор RA-1000.
Автоматизированный анализатор молочной кислоты 1500SPORT.
Влияние CMS-001 и CMS-008 на время истощающего плавания мышей
[1]
1.4.
Через 30 мин после последней инъекции мышей взвешивали и к хвостам мышей на расстоянии приблизительно 1 см от тела прикрепляли кусочки свинца, соответствующие 5% массы тела. Мышей помещали в плавательный бассейн с глубиной воды 30 см и температурой 25±1°С. Конечности мышей двигались на протяжении всего процесса. Фиксировали время плавания до наступления гибели.
Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровень азота мочевины в сыворотке после тренировки
1.5.
Через 30 мин после последней инъекции мышей без увеличения массы помещали для плавания в течение 90 мин в плавательный бассейн с глубиной воды 30 см и температурой 30±1°С. Мышам затем давали отдохнуть в течение 30 мин и собирали кровь из глазного синуса. Выделяли сыворотку и определяли BUN с помощью полностью автоматизированного биохимического анализатора.
Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровень гликогена в печени мышей
[2]
1.6.
Через 30 мин после последней инъекции мышей забивали декапитацией, печень отделяли, промывали физиологическим раствором и сушили фильтровальной бумагой. Тщательно отвешивали 100 мг печени и определяли уровень гликогена печени с помощью набора антраценкетонового реагента.
Масса гликогена (мг) на 100 г печени=DU/DS×0,5×об. жидкости при гомогенизации/масса печени (г) ×100×0,9,
где DU = поглощение образца
DS = поглощение стандарта
Об. жидкости при гомогенизации=8 мл.
Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровень молочной кислоты в крови мышей после тренировки
[3]
1.7.
Через 30 мин после последней инъекции сначала отбирали 20 мкл крови из глазного синуса. Мышей затем взвешивали и к хвостам мышей на расстоянии приблизительно 1 см от тела прикрепляли кусочки свинца, соответствующие 4% массы тела. Мышей помещали на 10 мин в плавательный бассейн с глубиной воды 30 см и температурой 30±1°С. Конечности мышей двигались на протяжении всего процесса. Сразу после тренировки и после отдыха в течение 20 мин вновь отбирали по 20 мкл крови из глазного синуса. Кровь добавляли к 40 мкл гипотонического буфера и подвергали действию ультразвука. Уровень молочной кислоты в крови определяли с помощью анализатора молочной кислоты.
Увеличение количества молочной кислоты после тренировки рассчитывают, основываясь на уровне молочной кислоты сразу после тренировки минус уровень молочной кислоты перед тренировкой.
Количество удаляемой молочной кислоты после отдыха рассчитывали, основываясь на уровне молочной кислоты сразу после тренировки минус уровень молочной кислоты после отдыха.
1.8. Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровень SOD, MDA, AST и ALT после истощающей тренировки
[4]
Через 30 мин после последней инъекции мышей без увеличения массы помещали для плавания в плавательный бассейн с глубиной воды 30 см и температурой 25±1°С . Как только мыши начинали тонуть, их спасали и сразу отбирали кровь из глазного синуса. Выделяли сыворотку и определяли уровни SOD, MDA, AST и ALT.
1.9. Статистический метод
Различие между группами анализировали с помощью анализа ANOV дисперсии.
2. Результаты
Таблица 1.1
Влияние CMS-001 и CMS-008 на время истощающего плавания мышей
Группы
Дозы (мкг/кг/день)
No.
Время плавания (мин)
Увеличение времени плавания (%)
CMS-001
20
15
99,8±30,6*
48,0*
CMS-001
5
18
105,7±19,8*
56,7*
CMS-008
500
15
116,5±17,7*
72,7*
CMS-008
125
18
106,5±19,4*
57,9*
Физиологический раствор
-
16
67,5±28,0
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, P<0,05.
Таблица 1.2
Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровень азота мочевины в сыворотке после тренировки
Группы
Дозы (мкг/кг/день)
No.
Азот мочевины (ммоль/л)
CMS-001
20
17
7,3±2,1*
CMS-001
5
18
6,9±1,6*
CMS-008
500
17
7,1±2,0*
CMS-008
125
18
7,2±2,3*
Физиологический раствор
-
17
9,0±2,5
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, P<0,05.
Таблица 1.3
Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровень гликогена в печени мышей
Группы
Дозы (мкг/кг/день)
No.
Гликоген печени (мг/100 г ткани печени)
CMS-001
20
8
1567±604*
CMS-001
5
10
439±271*
CMS-008
500
8
1408±457*
CMS-008
125
10
1275±726*
Физиологический раствор
-
10
271±217
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, P<0,05.
Таблица 1.4
Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровень молочной кислоты в сыворотке мышей после тренировки
Группы
Дозы (мкг/кг/день)
No.
Увеличение молочной кислоты после тренировки (моль/л)
Удаление молочной кислоты после отдыха (моль/л)
CMS-001
20
15
2,56±0,41*
3,14±0,64*
CMS-001
5
13
2,60±0,33*
2,96±0,33*
CMS-008
500
15
2,23±0,30*
3,71±0,22*
CMS-008
125
13
2,70±0,15*
3,62±0,57*
Физиологический раствор
-
14
4,60±0,16
2,00±0,44
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, P<0,05.
Таблица 1.5
Влияние CMS-001 и CMS-008 на уровни SOD, MDA, AST и ALT в сыворотке после истощающей тренировки
Группы
Дозы (мкг/кг/день)
No.
MDA (нмоль/л)
SOD (Ед/мл)
AST (Ед/л)
ALT (Ед/л)
CMS-001
20
9
4,4±0,2*
400,6±45,6*
117,0±19,2*
32,7±3,0*
CMS-008
500
9
4,1±0,4*
415,7±31,5*
116,6±18,8*
32,9±5,2*
Физиологический раствор
-
9
6,9±0,3
342±27,3
145,2±32,3
40,2±8,2
Заключение
Данное исследование показало, что CMS-001 и CMS-008 обладают следующими свойствами:
[5]
1. Продлевать время плавания мышей, что указывает на способность CMS-001 и CMS-008 увеличивать физические возможности животного.
[6]
2. Снижать BUN у мышей, что указывает на способность CMS-001 и CMS-008 снижать потребность в катаболизме белка для получения энергии во время физической нагрузки.
[6]
3. Повышать резерв гликогена печени у животного во время отдыха, что увеличивает физические возможности животных.
[7]
4. Снижать уровень молочной кислоты в крови после физической нагрузки и увеличивать скорость удаления молочной кислоты впоследствии, что указывает на способность CMS-001 и CMS-008 снижать скорость продукции молочной кислоты или удалять молочную кислоту во время физической нагрузки.
[8]
5. Снижать уровень MDA, что указывает на способность CMS-001 и CMS-008 снижать образование свободных радикалов во время физической нагрузки.
[8]
6. Повышать уровень SOD, что указывает на способность CMS-001 и CMS-008 увеличивать удаление свободных радикалов во время физической нагрузки.
7. Снижать уровень ALT и AST, что указывает на способность CMS-001 и CMS-008 защищать клетки сердца и печени от повреждения во время физической нагрузки.
8. CMS-001 и CMS-008 могут быть пригодны для лечения нарушений, связанных с усталостью при физической нагрузке.
Ссылки:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
5
1. Mizunoya W, Oyaizu S, Ishihara K et al. Protocol for measuring the endurance capacity of mice in an adjustable-current swimming pool. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 May; 66(5):1133-6.
2. HE Ling, WANG Ming, CHEN Run etc. The effect of blood lactic acid * blood serum carbamide nitrogen and liver hepatin affected by gen-seng. Prevent Medicine Literature Information, 2002, 8(3):293-294.
3. WANF Xiao-xue, QIU Juan, SONG Yu etc. Study on Effect of Theanine of Fatigue. China Commonality Sanitation Journal, 2002, 18(3):315-317.
4. Thomas D P > Marshall K I. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structure. Int J Sport Med > 1988, (9):257-260.
5. JIN Zong-lian. Evaluation principle and method of function food. Beijing: Beijing University Publishing Company, 1995.
6. Sanitation ministry, Evaluation progress and test methods of health care food. Ministry of Public Health, PR China.
7. Westerblad, et al. Changes of intracellular pH due to repetitive stimulation of single fibers from mouse skeletal muscle. J Physiol; 1992 Apr; (499):49-71.
8. Groussard C, Rannou-Bekono F, Machefer G, et al. Changes in blood lipid peroxidation markers and antioxidants after a single sprint anaerobic exercise. Eur J Appl Physiol. 2003 Mar; 89(l):14-20.
Пример 2
Иммунорегулирующее действие CMS-001 у мышей с индуцированным лучевой терапией иммунодефицитом
Цель
: Исследовать иммунорегулирующее действие CMS-001 на животной модели индуцированного лучевой терапией иммунодефицита.
Способы
137
: Мышиная модель иммунодефицита была исходно основана на облучении Cs. Затем вводили CMS-001 и с помощью способа MMT анализировали изменение в скорости пролиферации T-лимфоцитов.
Результаты
: Было обнаружено, что в дозе 20 мкг/кг/день CMS-001 способен статистически значимо (P<0,05) увеличивать скорость пролиферации T-лимфоцитов.
Материалы и методы
Лекарство и реагенты
CMS-001: Синтезирован на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
Раствор Хенкса, сыворотка плодов телят и RPMI-1640: Hyclone, Logan, Utah.
ConA и MTT: Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.
1.2. Экспериментальные животные
Самцов мышей BALB/c отдельной группы, не содержащей патогенов (SPF), массой 18-22 г получали из Академии военной медицины и научного Центра экспериментальных животных, PR China.
[1]
Получение животной модели, введение CMS-001 и измерение скорости пролиферации T-лимфоцитов
137
6
[2]
2
Самцов мышей Balb/c случайным образом распределяли в группы: CMS-001 (20 мкг/кг/день, 5 мкг/кг/день), контрольный физиологический раствор и нормальный контроль. Всех мышей, исключая группу нормального контроля, экспонировали с 600 рад Cs (82,83 рад/мин в течение 7,2 мин). Тестируемое вещество растворяли в 0,5 мл физиологического раствора и вводили внутрибрюшинно раз в день на протяжении 15 дней без перерыва после облучения. Через день после последнего введения тестируемого соединения стерильно изымали селезенку у мышей. Селезенки диспергировали до одиночных клеток, промывали и концентрацию клеток доводили до 4×10/мл с помощью RPMI-1640. В лунки 96-луночного культурального планшета вносили по 100 мкл клеток и 100 мкл Con A (до конечной концентрации 5 мкг/мл). Готовили также контрольные блэнки базального уровня без Con A. Клетки инкубировали при 37°С и 5% CO в течение 68 час. Пролиферацию T-лимфоцитов определяли способом MTT . Показатель стимуляции рассчитывали следующим образом: Показатель стимуляции (SI)=средняя величина ОП лунок с Con A/ средняя величина ОП лунок блэнка базального уровня.
Результат
2.
Таблица 2.1
Влияние CMS-001 на пролиферацию T-лимфоцитов у мышей с индуцированным облучением иммунодефицитом
Группы
Доза
No.
SI
CMS-001
20 мкг/кг/день
10
1,27±0,19*
Контроль физиологического раствора
-
8
1,11±0,08
Нормальный контроль
-
10
3,42±0,93*
*По сравнению с группой с физиологическим раствором, P<0,05.
Заключение
Было обнаружено, что CMS-001 способен статистически значимо стимулировать пролиферацию T-лимфоцитов у мышей с индуцированным облучением иммунодефицитом, что указывает на возможность использования CMS-001 в качестве иммуностимулятора у больных с иммунодефицитом после лучевой терапии.
Ссылки
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
1. New drugs (Western medicine) research direction principle before clinic. Chinese Sanitation Ministry Drug Political Situation. 1993, 7:128-137.
2. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003, 3(28).
Пример 3
Влияние CMS-014 на приживаемость кожного аллотрансплантата у мышей
Цель
: Исследовать иммуносупрессорное действие CMS-014 с помощью модели кожного аллотрансплантата.
Методы
57
: Кусочки кожи мышей CBL/6 пересаживали мышам BALB/c и определяли среднее время приживления (MST) кожного аллотрансплантата.
Результаты
: Было обнаружено, что CMS-014 способен статистически значимо (p<0,05) продлевать жизнеспособность кожного аллотрансплантата по сравнению с контрольным физиологическим раствором.
Заключение
: CMS-014 может быть использован в качестве иммуносупрессорного агента для контроля реакции отторжения после пересадки органов.
Материалы
Лекарства и другие реагенты
CMS-014: Синтезирован на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
Циклоспорин A (CsA): Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland.
Физиологический раствор: China OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, PR China.
2
NaS: Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China.
Животные
d
Реципиенты: мыши Balb/c(H-2) отдельной группы, не содержащей патогенов (SPF), в возрасте 6 недель с массой 18-22 г: Академия наук военной медицины, Китай.
57
d
Доноры: мыши CBL/6(H-2), SPF, возраст 6 недель, масса 18-22 г: Академия наук военной медицины, Китай.
2. Формирование групп и лечение
2.1. Формирование групп и введение тестируемого вещества
Мышей Balb/c распределяли случайным образом в группы CMS-014 (500 мкг/кг/день, 250 мкг/кг/день, 125 мкг/кг/день) циклоспорина A (10 мг/кг/день) и контрольного физиологического раствора (0.5 мл/день). Половина мышей были самцами, а половина - самками.
Тестируемые соединения растворяли в 0,5 мл физиологического раствора и вводили внутрибрюшинно в течение 5 дней до трансплантации кожи с последующими ежедневными инъекциями до окончательного отторжения трансплантата кожи.
Пересадка кожи
2.2.
2
57
2
2
[1]
[2]
Лоскут шерсти со спины мышей Balb/c удаляли с помощью 8% раствора NaS. На следующий день получали раневую поверхность приблизительно 1 см хирургическим удалением кожи, после чего на раневую поверхность помещали кусочек кожи хвоста полной толщины размером 1 см от соответствующего по полу донора мыши CBL/6J. Область хирургической операции закрывали и защищали слоем пропитанной парафином марли с покрытием закрывающим пластырем. Через 6 дней после трансплантации пластырь удаляли и за мышью-реципиентом наблюдали ежедневно на предмет жизнеспособности аллотрансплантата. Окончательный момент отторжения принимали соответствующим сохранению жизнеспособности аллотрансплантата менее 10%.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с помощью теста на выживание Каплана-Мейера.
Результаты
Таблица 3.1
Влияние CMS-014 на MST аллотрансплантатов кожи мышей
Группы
Дозы
No.
MST (дни)
CMS-014
500 мкг/кг/день
9
9,8±0,4*
CMS-014
250 мкг/кг/день
10
9,8±0,5*
CMS-014
125 мкг/кг/день
9
10,0±0,5*
CsA
10 мг/кг/день
9
11,6±0,8*
Физиологический раствор
0,5 мл/день
8
8,1±0,4
*По сравнению с группой с физиологическим раствором, P<0,05.
Заключение
Было обнаружено, что CMS-014 способен статистически значимо (p<0,05) продлевать выживание кожного аллотрансплантата по сравнению с контрольным физиологическим раствором. CMS-014 может быть использован в качестве иммуносупрессорного агента для контроля реакции отторжения после пересадки органов.
Ссылки:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
[1] Ming Jiankuo, Wang Xingbing, Huang Baojun, et al. Peptide Nucleic Acid Antisense Prolongs Skin Allograft Survival by Means of Blockade of CXCR3 Expression Directing T Cells into Graft. The Journal of Immunology, 2003, 170:1556-1565.
[2] Steven H. Borenstein, Jeremy Graham, et al. CD8+ T Cells Are Necessary for Recognition of Allelic, But Not Locus-Mismatched or Xeno-, HLA Class I Transplantation Antigens. The Journal of Immunology, 2000; 165:2341-2353.
Пример 4
Ингибирующее действие CMS-017 и CMS-023 на вирус гепатита B in vitro
Пример 4a. Гепатит человека
Тестируемые пептиды добавляли к культуральной среде линии клеток 2.2.15. После инкубации определяли концентрации поверхностного антигена гепатита B (HBsAg), антигена e гепатита B (HBeAg) и ДНК вируса гепатита B (HBV-ДНК) в культуральной среде и сравнивали с контрольными значениями. Было обнаружено, что пептиды CMS-017 и CMS-023 в подходящей концентрации обладают активностью против вируса гепатита B in vitro, статистически значимой по сравнению с контролем (P<0,05). Заключается, что данные пептиды могут быть использованы для лечения инфекции вируса гепатита B.
1. Материалы
Пептиды cms-017 и cms-023 были синтезированы на заказ (из источника l-аминокислот) American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, California, USA.
Линия клеток 2.2.2.15, трансфецированных ДНК вируса гепатита B (HBV) человека, была получена от National Center For Drug Screening (Shanghai, China) (тест один) и Department Of Infectious Diseases Of The First Hospital affiliated to Beijing University (тест два).
Среда для клеточных культур MEM была от GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, California, USA.
Наборы ИФА для анализа HBsAg и HBeAg были от Shanghai Shiye Kehua Biotech. Company, Shanghai, PR China.
Набор флуоресцентной количественной ПЦР для определения HBV-ДНК был от DA-AN gene company of Zhongshan Medical University, Guangzhou, PR China.
Методы
Тест 1: Ингибирующее действие пептидов на HBsAg и HBeAg при максимальной нетоксичной концентрации
6
2
Клетки 2.2.15 в log фазе собирали и доводили до концентрации 2×10/мл средой MEM (содержащей 10% сыворотку плодов телят, 100 мг/мл пенициллин и 100 Е/мл стрептомицин). Суспензию инокулировали на 24-луночный планшет для культивирования по 1,5 мл на лунку и инкубировали при 37°С, 5% CO в течение 48 часов для прикрепления. Добавляли пептиды до конечной концентрации 400 мкг/мл при 3 параллельных лунках на образец. Готовили также ряд контрольного блэнка (3 лунки), в котором пептид заменяли культуральной средой. Планшет инкубировали при 37°С в течение 4 дней, после чего культуральную среду заменяли свежеприготовленной средой (того же состава, что и исходная) и планшет инкубировали еще в течение 4 дней. В конце инкубации собирали супернатанты культуры и определяли титры HBsAg и HBeAg с помощью способа ИФА по инструкции производителя набора для определения. Проценты ингибирования лекарствами рассчитывали следующим образом:
% ингибирования=(Средняя концентрация контроля-Средняя концентрация образца)/Средняя концентрация контроля × 100%
Тест 2: Ингибиторное действие пептидов на HBV-ДНК
Повторяли описанные выше в тесте 1 получение и инкубацию клеточной суспензии, но при концентрации пептидов 160 мкг/мл. В конце инкубации собирали супернатанты и определяли концентрации HBV-ДНК с помощью флуоресцентной количественной ПЦР по инструкции производителя набора для определения.
% ингибирования=(Средняя концентрация ДНК контроля-Средняя концентрация ДНК образца)/Средняя концентрация ДНК контроля × 100%
Статистика
Для статистического анализа использовали t-тест Стьюдента. Статистически значимым принимали P<0,05.
Результаты
Таблица 4.1
Ингибирующее действие пептидов на HBsAg и HBeAg при 400 мкг/мл
Пептид
Отношение ингибирования для HBsA
Отношение ингибирования для HBеA
CMS-017
68,6%*
62,2%*
CMS-023
54,4%*
53,7%*
* По сравнению с контрольным блэнком, P < 0,05.
Таблица 4.2
Ингибирующее действие пептидов на HBV-ДНК при 160 мкг/мл
Пептид
% ингибирования HBV-ДНК
CMS-017
90,8%*
CMS-023
70,8%*
* По сравнению с контрольным блэнком, P<0,05.
Заключение
Было обнаружено, что при подходящей концентрации CMS-017 и CMS-023 способны ингибировать развитие вируса гепатита B in vitro статистически значимо по сравнению с контролем (P<0,05). Это указывает на возможность использования CMS-017 и CMS-023 для лечения связанных с гепатитом B вирусных инфекций.
Пример 4b. Противовирусное действие CMS-017 на гепатит B уток in vivo
Цель
: Исследовать противовирусное действие CMS-017 на вирус гепатита B уток (DHBV) in vivo.
Методы
CMS-017 растворяли в физиологическом растворе и вводили животной модели гепатита B уток Chongqing путем внутримышечной инъекции в течение 28 дней. Определяли в сыворотке уровни DHBV ДНК и DHBsAg (антигена поверхности гепатита B уток) с помощью «дот-блот» гибридизации и ИФА, соответственно, и сравнивали с контрольным блэнком.
Результаты
Было обнаружено, что CMS-017 способен снижать уровни DHBV ДНК и DHBsAg в сыворотке в период лечения (P<0,01). Через 7 дней после прекращения лечения наблюдалось возобновление симптомов.
Материалы и методы
1. Животная модель
[2]
7
[3]
0,1 мл DHBV ДНК позитивной сыворотки (5×10 копий/мл) инокулировали в брюшную полость однодневных уток Chongqing для формирования животной модели гепатита. Через 10 дней после инокуляции отбирали образцы крови из яремной вены и подтверждали успешность инфекции с помощью «дот-блот» гибридизации с зондом DHBV ДНК, меченным дигокси. Уток подращивали до 2-недельного возраста для введения в исследование.
Деление на группы и введение
Уток с подтвержденной инфекцией DHBV случайным образом распределяли в следующие группы:
1) Контрольная группа (n=12): Нормальный физиологический раствор, 1 мл в день, вводимый внутримышечной инъекцией.
2) Группа CMS-017 (n=12): 200 мкг/кг/день CMS-017 (растворенный в 1 мл нормального физиологического раствора) вводимый внутримышечной инъекцией, 1 раз в день.
[4]
Лечение продолжали в течение 4 недель и наблюдение продолжали еще в течение одной недели после прекращения лечения. Отбирали 1 мл образцы крови из наружной яремной вены на 0, 7, 14, 21, 28 и 35 дни после начала лечения. Сыворотку выделяли и хранили при -20°С до анализа.
Отслеживаемые параметры
1) Уровень DHBV ДНК в сыворотке
[3]
2
Зонд DHBV ДНК флуоресцентно метили в соответствии с протоколом производителя набора для промечивания (Roche Co.). Сыворотку уток подвергали дот-блоттингу (2 точки на образец) на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали с флуоресцентно меченным зондом для количественного определения DHBV ДНК. В качестве внутреннего стандарта использовали DHBV ДНК 40 мкл+DHBsAg 100 мкл. Для амплификации флуоресценции использовали флуориметрический реагент CDP-Star. Для сканирования пленки применяли сканнер Vuego Scan (Brisa-620st), а для количественного анализа блотов использовали программу Discovery Series Quantity One. Величину блота описывали как «объем» (объем=интенсивность×мм).
2) Уровень DHBsAg в сыворотке
[5-8]
Уровень DHBsAg определяли способом ИФА , и О.П. получали с помощью ридера для ИФА (Bio-TEK Co.) при 490 нм.
4. Статистический анализ
Для каждой группы применяли парный t-критерий с использованием программы SPSS.
Результаты
1. Изменения концентрации DHBV ДНК в сыворотке
Таблица 4.3
Титр DHBV ДНК в сыворотке до, во время и после лечения
DHBV ДНК (объем)
До лечения
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 5
Нормальный физиологический раствор
2055,9±521,8
1952,5±621,5
2048,6±692,3
2031,2±722,3
1886,0±641,3
2118,5±468,1
CMS-017
2207,0±237,5
1991,8±378,9*
1925,0±549,9*
1743,9±555,0*
1544,9±389,7*
1742,7±437,0*
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, P<0,05.
1. Изменения уровня DHBsAg в сыворотке
Таблица 4.4
О.П. DHBsAg в сыворотке до, во время и после лечения
До лечения
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 5
Нормальный физиологический раствор
0,949±0,688
0,761±0,540
0,892±0,762
0,867±0,802
0,701±0,673
0,871±0,634
CMS-017
0,928±0,402
0,761±0,328
0,668±0,310*
0,551±0,268*
0,479±0,279*
0,488±0,182*
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, P<0,05.
Заключение
Было обнаружено, что в подходящей концентрации CMS-017 обладает статистически значимыми антигепатитными свойствами in vivo по сравнению с контрольным физиологическим раствором (P<0,05). CMS-017 может быть использован для лечения нарушений, связанных с вирусной инфекцией.
Ссылки:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2):89-91.
2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua. Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4):295-297.
3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1):13-15.
4. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Purification of Duck hepatitis B surface antigen and its applications. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 2001;26(l):14-16.
5. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. A comparison of specifically immune response in DHBV-infected ducks. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(3): 166-168.
6. Tang Ni, Huang Ailong, Qi Zhenyuan, et al. Immune response of acutely infected ducks to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Microbiology and Immunology 2000; 2(4):24-29.
7. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4):209-211.
8. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003,3 (28).
Пример 5
Ингибирующее действие CMS024-16 на пересаженный голым мышам ксенотрансплантат карциномы желудка человека BGC-823
Материалы
1.
Лекарства и реагенты
1.1.
CMS024-16: Синтезирован на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
5-Fu: Tianjin Jinyao Amino Acid Co., Tianjin, PR China.
Сыворотка плодов телят: Hyclone, Logan, Utah.
Среда клеточной культуры RPMI-1640: GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, California, USA.
Животные
1.2.
Здоровых самок голых мышей BALB/c (nu/nu), отдельной группы, не содержащей патогенов (SPF), в возрасте 4-5 недель получали из Академии военной медицины, China.
Линии клеток
1.3.
Линия клеток BGC-823 карциномы желудка человека: Cancer Research Department, China Medical Science Institute.
Методы
2.
Получение животной модели и определение противоопухолевого действия
[1]
2.1.
7
Линию клеток BGC-823 карциномы желудка человека в log фазе доводили до концентрации 2×10/мл и затем инокулировали подкожно в спину голых мышей (0,1 мл на мышь). Инокулированных животных случайным образом распределяли в группы CMS024-16 (160 мкг/кг/день, 320 мкг/кг/день и 640 мкг/кг/день, все по 0,2 мл/день), положительного контроля (5-Fu, 20 мг/кг/день по 0,2 мл/день) и отрицательного контроля (нормальный физиологический раствор, 0,2 мл/день). Введение тестируемых веществ путем внутрибрюшинной инъекции начинали на следующий день после имплантации опухоли, 1 раз в день на протяжении 30 дней без перерывов. Через день после последней инъекции опухолевые массы собирали и определяли их массу. Показатель ингибирования=(Средняя масса отрицательного контроля-Средняя масса тестируемой группы)/(Средняя масса отрицательного контроля)×100%
Статистический анализ
2.2.
Результаты выражали в виде среднего ± станд.откл. Для статистического анализа использовали ANOVA программы SPSS. Статистически значимыми принимали величины P <0,05.
Результаты
3.
Таблица 5.1
Ингибирующее действие CMS024-16 на пересаженный голым мышам ксенотрансплантат карциномы желудка человека BGC-823
Группа
Доза
N
Масса опухоли
Показатель ингибирования (%)
CMS024-16
640 мкг/кг/день
8
1,31±0,77*
54,4*
CMS024-16
320 мкг/кг/день
8
1,59±1,017*
44,7*
CMS024-16
160 мкг/кг/день
8
1,32±0,68*
54,0*
5-Fu
20 мг/кг/день
9
1,70±0,70*
40,8*
Нормальный физиологический раствор
0,2 мл/день
8
2,87±1,05
-
* По сравнению с группой нормального физиологического раствора, p<0,05.
Заключение
4.
Было обнаружено, что CMS024-16 в дозе 160-640 мкг/кг/день способен ингибировать рост пересаженного голым мышам ксенотрансплантата карциномы желудка человека BGC-823 статистически значимо по сравнению с группой нормального физиологического раствора (P<0,05).
Ссылка
Следующая ссылка включена в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
1. Li XH, Zhang GY, Luo FJ, Xu MH, Li Q. The effect of Helicobacter pylori on the expression of metallo proteinases in gastric carcinoma cell lines. World J Chinese Digestion, 2003, ll(5):544-546.
Пример 6
Ингибирующее действие пептидов на гепатокарциному H22 in vivo
Цель:
Исследовать влияние пептидов на рост гепатокарциномы H22 у мышей.
Методы
: Мышей BALB/c разделяли случайным образом на группы контрольного физиологического раствора, 5-Fu, нормального контроля, пептидов. Клетки карциномы печени H22 пересаживали путем внутрибрюшинной инъекции, и тестируемые вещества также вводили внутрибрюшинной инъекцией 1 раз в день. Фиксировали время выживания мышей и сравнивали с контролями.
Результаты
: Было обнаружено, что в дозах 80 мкг/кг/день CMS-024.04, CMS-024.05, CMS-024.14, CMS-024.16 способны продлевать жизнь мышей с трансплантированными опухолевыми клетками H22 статистически значимо по сравнению с группой контрольного физиологического раствора (P<0,05).
Заключение
: Было обнаружено, что CMS-024.04, CMS-024.05, CMS-024.14 и CMS-024.16 способны продлевать жизнь мышей с трансплантированным раком печени H22, что указывает на возможность использования данных пептидов для лечения рака.
Материалы и методы
1.
Лекарства и реагенты
1.1.
CMS-024.04, CMS-024.05, CMS-024.14 и CMS-024.16 готовили на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
5-FU (5-фторурацил) был от Tianjin Jinyao Aminophenol Ltd., Tianjin, China.
Физиологический раствор был от China OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, China.
RPMI-1640 и сыворотка плодов телят (FBS) были от GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, California, USA.
Раствор D-Hanks был от Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.
Животные
1.2.
Здоровые мыши BALB/c (категории CLA, 6-8 недель, масса 18-22 г) были из Центра животных Академии военной медицины, Beijing, China.
Линии клеток
1.3.
Мыши-носители линии клеток H22 карциномы печени были из Tumor Department of Medical Institute of China Medical Academy of Science, Beijing, China.
Формирование групп животных
1.4.
Здоровых мышей BALB/c случайным образом включали в группы CMS-024.04, CMS-024.05, CMS-024.14 и CMS-024.16 (80 мкг/кг/день), 5-Fu (20 мг/кг/день, один раз в два дня), физиологического раствора (0,2 мл/день) и нормальную группу (без инокуляции опухолевых клеток).
Введение мышиной модели карциномы печени H22
1.5.
7
Мышей, инокулированных гепатокарциномой, забивали через 6-8 дней. Собирали асцит и концентрацию клеток доводили до 5×10/мл раствором D-Hanks. 0,2 мл содержимого инокулировали внутрибрюшинно каждой мыши BALB/c, исключая мышей нормального контроля.
Введение тестируемого вещества
1.6.
Введение тестируемого вещества начинали на следующий день после инокуляции опухолевых клеток. Пептиды и физиологический раствор вводили ежедневно, а 5-FU раз в два дня в течение 60 дней без перерывов до гибели мышей.
Запись времени выживания
1.7.
Записывали время смерти и рассчитывали удлинение времени выживания. Удлинение времени выживания рассчитывали следующим образом:
Удлинение выживания (%)=(Среднее количество дней выживания тестируемой группы)-(Среднее количество дней выживания группы контрольного физиологического раствора)/(Среднее количество дней выживания группы физиологического раствора)×100%.
Мышей, которые выживали на протяжении более 60 дней, рассматривали как долгожителей.
Статистический метод
1.8.
Для статистического сравнения использовали способ Каплана-Мейера, и величины P, равные или меньшие 0,05, принимали как статистически значимые.
Результаты
2.
Эксперимент был проведен в два разных временных периода с результатами, приводимыми ниже.
Таблица 6.1
Влияние пептидов на выживание мышей с трансплантированной гепатокарциномой H22
Группы
Доза
N
Время выживания (дни)
Время выживания (дни)
Удлинение выживания (%)
CMS-024.04
80 мкг/кг
16
19,0±0,9
20,2±4,4*
15,8*
CMS-024.05
80 мкг/кг
16
19,0±1,0
19,3±2,4*
10,4*
Контрольный физиологический раствор
0,2 мл/день
16
18,0±0,3
17,4±2,1
-
5-Fu
20 мг/кг
16
30,0±2,0
32,5±6,3*
84,5*
Нормальные
-
16
60
60
-
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, P<0,05.
Таблица 6.2
Влияние пептидов на выживание мышей с трансплантированной гепатокарциномой H22
Группы
Доза
N
Время выживания (дни)
Время выживания (дни)
Удлинение выживания (%)
CMS-024.14
80 мкг/кг
16
16,0±0,0
27,6±8,5*
50,3
CMS-024.16
80 мкг/кг
16
18,0±1,0
29,0±7,9*
57,8
Контрольный физиологический раствор
-
16
16,0±0,1
18,4±3,3
-
5-Fu
20 мг/кг
16
18,0±0,4
24,5±11,1*
33,3
Нормальные
-
16
60
60
-
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, P<0,05.
Заключение
3.
Было обнаружено, что CMS-024.04, CMS-024.05, CMS-024.14 и CMS-024.16 способны продлевать жизнь мышей с трансплантированным раком печени H22 статистически значимо по сравнению с группой контрольного физиологического раствора, что указывает на возможность использования данных пептидов для лечения рака.
Ссылки
:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылок во всей их полноте.
[1] Y Zhai and ZJ Lu. Effect of thalidomide on tumor growth in mouse hepatoma H22 model. Ai Zheng, Dec 2003; 22(12):1301-6.
[2] YX Yang, L Zhu, X He, et al. Antitumor activity of mitoxantrone- nanosphere against murine liver tumor H22. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, Jan 2004; 35(l):68-70.
Пример 7
Влияние CMS-030 на индуцированное карагенином опухание конечностей у крыс
Цель
: Исследовать противовоспалительные свойства CMS-030.
Методы
: Для изучения противовоспалительных свойств CMS-030 использовали животную модель индуцированного карагенином опухание конечностей.
Результаты
: Было обнаружено, что в дозе 2-20 мкг/мл CMS-030 способен статистически значимо (P<0,01) подавлять опухание конечностей в группе с лечением по сравнению с контрольными группами.
Заключение: Было обнаружено, что CMS-030 обладает статистически значимым противовоспалительным действием на животной модели индуцированного карагенином опухания конечностей у крыс.
Материалы и методы
1.
Лекарства и реагенты
1.1.
CMS-030: синтезировали на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
Карагенин: Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.
Дексаметазон (DXM): Tianjin JinYao Co. Ltd., Tianjin, PR China.
Животные
1.2.
Крысы Wistar в возрасте 6-8 недель массой 180-220 г, Vitalriver Experiment Animal Co. Ltd., Beijing, PR China.
Методы
[1]
1.3.
Крыс Wistar случайным образом распределяли в группу DXM (0,2 мг/кг/день), группу контрольного физиологического раствора (1 мл/день) группы трех доз CMS-030 (2, 10, 20 мкг/мл/день). Все лекарства разбавляли до 0,5 мл физиологическим раствором и вводили внутрибрюшинно (в/б) ежедневно. Через две недели введения лекарства на правую конечность наносили 0,15 мл 1% карагенина в физиологическом растворе путем подкожной инъекции. Через 0,5 час точно измеряли окружность правой конечности и опухание конечности рассчитывали вычитанием окружности до провокационной пробы из величины после провокационной пробы. Индекс ингибирования (%)=(опухание конечности в группе контрольного физиологического раствора-опухание конечности в группе с лекарством)/опухание конечности в группе контрольного физиологического раствора×100%.
Статистический анализ
1.4.
Статистический анализ проводили с помощью одностороннего анализа ANOVA.
Результаты
2.
Таблица 7.1
Противовоспалительное действие CMS-030 в отношении индуцированного карагенином опухания конечностей у крыс
Группа
Доза
N
Окружность до провокационной пробы (см)
Опухание (см)
Индекс ингибирования (%)
0,5 час
0,5 час
CMS-030
2 мкг/кг/д
10
2,78±0,06
3,20±0,87**
37,0**
CMS-030
10 мкг/кг/д
10
2,76±0,03
3,10±0,10**
50,2**
CMS-030
20 мкг/кг/д
10
2,74±0,04
3,12±0,05**
43,8**
DXM
0,2 мг/кг/д
9
2,49±0,05
2,74±0,10**
63,0**
Физиол. раствор
0,5 мл/д
10
2,80±0,06
3,47±0,08
-
** По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, P<0,01.
Заключение
[2]
Была создана животная модель острого воспаления in vivo в виде индуцированного карагенином опухания конечностей у крыс и ее использовали для оценки противовоспалительного действия лекарств. Карагенин способен индуцировать избыточный синтез простагландина в месте воспаления. Вместе с другими вазоактивными веществами избыточно продуцируемый простагландин обычно индуцирует местное опухание. Было обнаружено, что CMS-030 способен статистически значимо (P<0,01) ингибировать опухание конечностей, индуцированное карагенином у крыс. Таким образом было показано, что CMS-030 обладает противовоспалительными свойствами.
Ссылки
:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылок во всей их полноте.
[1] Li Jinhua, Zhang Huiqing, Zheng Kezhi, et al. Inhibitory effects of Orgotein on the swelling of hind paw in rats induced by carrageenin. Suzhou University Journal of Medical Science, 2002, VoI, 22(4):386-388.
[2] Huang Zhili, Kagoshima Masatoyo, Kagawa Eiichiro, Anti-inflammatory and ulcerogenic effects of 3-(N,N-diethylamino) propylindometacin HCl. Acta Pharmacologica Sinica, 1997, VoI, 18(4):306-308.
Пример 8
Влияние CMS-030 на ожирение
Цель
: Определить эффект CMS-030 против ожирения с использованием животной модели перекармливаемых крыс.
Методы
: Была разработана модель ожирения путем кормления крыс высокопитательной диетой в течение 6 недель. Крыс затем обрабатывали CMS-030 (подкожно, в дозах 150, 300 и 600 мкг/кг/день) или физиологическим раствором в течение 4 недель. Крыс взвешивали раз в неделю и забивали для измерения брюшных и семенниковых жировых тел и липидов крови в конце эксперимента.
Результаты
: Было обнаружено, что CMS-030 способен снижать массу тела, показатели жировых тел, уровень триглицеридов сыворотки и уровень общего холестерина в сыворотке крыс статистически значимо по сравнению с группой контрольного физиологического раствора (P<0,05).
Заключение
: CMS-030 обладает свойствами против ожирения и может быть использован для лечения нарушений индуцированного диетой ожирения.
Материалы и методы
Материалы
1.
Тестируемое вещество и животные
1.1.
CMS-030 был синтезирован на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
Самцы крыс Sprague-Dawley (SD), отдельной группы, не содержащей патогенов, массой 135±15 г: The Experimental Animal Center of First Military Medical University.
Наборы реагентов
1.2.
Триглицеридный набор: Shanghai Rongcheng Biotechnology Laboratory.
Набор для общего холестерина сыворотки: Zhongsheng Beikong Biotechnology Holding Ltd.
Материалы
2.
[1]
Высокопитательную и нормальную пищу готовили в соответствии с предписаниями The Guideline for Pre-clinical Research of Anti-obesity Drug, issued by State Food and Drug Administration, PR China (SFDA).
[2]
Модель ожирения получали кормлением крыс высокопитательной диетой в течение 6 недель. Крыс с ожирением затем обрабатывали CMS-030 (150, 300 и 600 мкг/кг/день, раз в день, подкожно) или физиологическим раствором в течение 4 недель. Во время введения тестируемого вещества всех крыс содержали на нормальной диете. Крыс взвешивали раз в неделю и забивали в конце эксперимента для измерения брюшных и семенниковых жировых тел и массы селезенки, печени, почек и тимуса. Отбирали также кровь крыс для анализа липидов крови.
Индекс жировых тел рассчитывали следующим образом: масса жирового тела (г)/масса тела (г)×1000.
Индекс органа рассчитывали следующим образом: масса органа (г)/ масса тела (г) x 1000.
Статистический анализ
3.
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для сравнения внутри каждой группы или между группами применяли парный t-критерий или однофакторный анализ ANOVA с использованием программы DAS (Drug And Statistics Ver 1.0). P<0,05 принимали как статистически значимое.
Результаты
4.
Таблица 8.1
Влияние CMS-030 на массу тела крыс (единица:грамм)
Группа
n
0 недель
1 неделя
2 недели
3 недели
4 недели
Нормальный контроль
10
224,6±15,6*
252,0±18,0*
277,9±20,2*
305,0±26,9*
332,0±22,7*
Контрольный физиологический раствор
10
342,6±23,8
386,2±26,9
386,1±24,6
410,8±25,7
408,8±24,5
CMS-030:600 мкг/кг/день
12
339,0±27,0
365,4±25,7
355,1±24,6*
361,7±32,6*
369,9±30,0*
CMS-030:300 мкг/кг/день
12
338,0±22,8
369,7±26,1
359,6±23,7*
364,3±22,6*
366,3±24,5*
CMS-030:150 мкг/кг/день
12
327,0±26,9
348,9±23,9*
346,5±22,7*
351,8±25,0*
354,0±26,3*
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, *p<0,05.
Таблица 8.2
Влияние CMS-030 на индекс жировых тел крыс
Группа
n
Индекс жира тела
Индекс жирового тела семенников
Нормальный контроль
10
4,3±1,2*
4,6±0,9*
Контрольный физиологический раствор
10
6,0±1,8
5,5±0,9
CMS-030: 600 мкг/кг/день
12
4,5±1,1*
5,0±0,7*
CMS-030: 300 мкг/кг/день
12
3,8±2,1*
4,0±1,1*
CMS-030: 150 мкг/кг/день
12
3,9±1,6*
3,6±0,9*
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, *p<0,05.
Таблица 8.3
Влияние CMS-030 на триглицериды (TG) крови и общий холестерин (TCH) у крыс
Группа
n
TG (мг/дл)
TCH (мг/дл)
Контрольный физиологический раствор
8
101,8±31,2
333,3±24,5
Нормальный контроль
8
36,4±9,1*
225,7±55,0*
CMS-030: 600 мкг/кг/день
12
40,6±7,9*
228,1±39,8*
CMS-030: 300 мкг/кг/день
11
32,7±6,7*
234,9±39,1*
CMS-030: 150 мкг/кг/день
12
51,5±19,4*
270,9±33,0*
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, *p<0,05.
Таблица 8.4
Влияние CMS-030 на потребление пищи крысами (единица: г/день)
Группа
Одна неделя
Две недели
Три недели
Четыре недели
Нормальный контроль
13,2±1,3*
18,3±6,1*
18,6±035
17,6±2,7
Контрольный физиологический раствор
11,7±2,3
15,5±3,0
18,21±0,43
18,4±0,59
CMS-030: 600 мкг/кг/день
13,8±5,4
15,9±1,7
18,2±0,69
18,5±0,61
CMS-030: 300 мкг/кг/день
13,2±4,8
16,9±1,6
18,1±0,74
18,4±0,59
CMS-030: 150 мкг/кг/день
13,2±3,1
16,1±1,8
18,3±0,67
17,8±0,53*
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, *p<0,05.
Таблица 8.5
Влияние CMS-030 на индексы органов у крыс
Группа
n
Индекс тимуса
Индекс печени
Индекс селезенки
Контрольный физиологический раствор
12
1,1±0,3
25,5±2,3
2,0±0,3
Нормальный контроль
8
1,3±0,3
25,5±1,2
2,4±0,2*
CMS-030: 600 мкг/кг/день
12
1,1±0,2
24,3±2,2
2,0±0,2
CMS-030: 300 мкг/кг/день
12
1,0±0,3
23,1±1,3*
2,0±0,2
CMS-030: 150 мкг/кг/день
12
0,9±0,2
25,9±3,6
2,0±0,2
*По сравнению с контрольным физиологическим раствором, *p<0,05.
Заключение
Было обнаружено, что CMS-030 в подходящей дозе способен вызывать снижение массы тела и снижать уровни липидов крови у крыс с пищевым ожирением статистически значимо по сравнению контрольным физиологическим раствором (P<0,05). Во время введения вещества аппетит существенно не менялся. CMS-030 может быть пригоден для лечения, связанным с перееданием, - ожирения и гиперлипидемии.
Ссылки
:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылок во всей их полноте.
1. SFDA, PR China. The guideline for pre-clinical research of new drugs. 1993. 193-194.
2. Bays HE. Current and investigational anti-obesity agents and obesity therapeutic treatment targets. Obes Res. 2004; 12 (8):1197-1211.
Пример 9
Влияние CMS-030 на гиперчувствительность отставленного типа у мышей
Цель
: Исследовать ингибирующее действие CMS-030 на гиперчувствительность отставленного типа (DTH) у мышей.
Методы
: Для демонстрации иммуносупрессорного действия CMS-030 использовали индуцированное 2,4-динитрофторбензолом (DNFB) опухание уха.
Результаты
: Было обнаружено, что при 10 мкг/кг/день CMS-030 способен подавлять индуцированное DNFB опухание уха у мышей статистически значимо по сравнению с контрольным физиологическим раствором (P<0,01).
Заключение
: CMS-030 обладает иммуносупрессорными свойствами и может быть пригоден для лечения связанных с иммунитетом нарушений.
Материалы и методы
1.
Лекарства и реагенты
1.1.
CMS-030: Синтезирован на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
2,4-динитрофторбензол (DNFB): Smack Co. Ltd.
2
Сульфид натрия (NaS): Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China.
Животные
1.2.
Мыши Balb/c отдельной группы, не содержащей патогенов (SPF), в возрасте 6-8 недель, массой 18-22 г: Академия военной медицины, PR China.
Методы
1.3.
Мышей BALB/c случайным образом распределяли в группы контрольного физиологического раствора (0,5 мл/день) и CMS-030 (10 мкг/кг/день). Тестируемое вещество растворяли в 0,5 мл физиологического раствора и вводили внутрибрюшинно 1 раз в день в течение двух недель перед сенсибилизацией.
2
[1]
У мышей на животе удаляли шерсть с помощью 8% раствора NaS за один день до сенсибилизации. DNFB растворяли в смеси ацетон/оливковое масло (4:1) до конечной концентрации 1% и 50 мкл наносили на оголенный участок для сенсибилизации. Через четыре дня после исходной сенсибилизации 10 мкл 1% раствора DNFB наносили местно на правое ухо для вызова воспаления гиперчувствительности отставленного типа. Тот же объем растворителя без DNFB наносили на левое ухо в качестве точки отсчета. Через 24 час использовали 6-мм пуансон для получения кусочка ткани уха одинаковой локализации левого и правого уха и ткань аккуратно взвешивали. Опухание уха рассчитывали вычитанием из массы ткани из правого уха массы ткани из левого уха той же мыши . Показатель ингибирования (%)=(Опухание уха с контрольным физиологическим раствором-Опухание уха в тестируемой группе)/Опухание уха с контрольным физиологическим раствором×100%.
Статистический анализ
1.4.
Статистический анализ проводили односторонним анализом ANOVA с помощью SPSS.
Результаты
2.
Таблица 9.1
Ингибирующее действие CMS-030 на DH у мышей
Группа
Доза
n
Опухание уха (мг)
Показатель ингибирования (%)
CMS-030
10 мкг/кг/день
17
3,69±2,31*
46,5*
Физиологический раствор
0,5 мл/день
18
6,91±2,50
-
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, p<0,01.
Заключение
3.
Было обнаружено, что CMS-030 способен подавлять ответ гиперчувствительности отставленного типа у мышей на DNFB статистически значимо по сравнению с контрольным физиологическим раствором (P<0,05). Это указывает на то, что CMS-030 может быть использован для лечения нарушений иммунитета, связанных с гиперчувствительностью.
Ссылка
:
Следующая ссылка включена в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
[1] Li Weidong, Ren LianSheng, Lin Zhibin, et al. Preliminary study on immunomodulating actions of Actarit in mice. Journal of Beijing Medical University, 2000, VoI, 1(32): 1-3.
Пример 10
Исследования иммуносупрессорных свойств CMS-030 in vivo
Цель
: Исследовать способность CMS-030 противодействовать отторжению аллотрансплантата и возможные механизмы действия.
Методы
: Иммуносупрессорные свойства CMS-030 наблюдали с помощью теста пролиферации T-лимфоцитов и смешанной реакции лимфоцитов (MLR) in vitro. Действие CMS-030 на выживание аллотрансплантата на животной модели аллотрансплантата кожи и сердечной мышцы мышей in vivo. Также наблюдали действие CMS-030 на трансформированные T-клетки и секрецию ИЛ-2 клетками селезенки реципиента аллотрансплантата.
Заключение
: Наблюдалась способность CMS-030 подавлять реакцию отторжения аллотрансплантата. Она может опосредоваться подавлением активности T-лимфоцитов и секрецией ИЛ-2 лимфоцитами.
Материалы и методы
1.
Животные
1.1.
b
d
57
Пятинедельные самцы и самки мышей Balb/c (H-2) и СBL/6J (H-2) отдельной группы, не содержащей патогенов: The Institute for Laboratory Animals of Military Medical Academy of Science (Beijing, China). Половина самцов и половина самок.
57
Новорожденные мыши СBL/6J были собственного разведения.
Лекарства и другие реагенты
1.2.
CMS-030: Синтезирован на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
Циклоспорин (CsA): Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland. Растворить до конечного объема 0,5 мл для всех групп CsA.
Сыворотка коров, RPMI-1640, раствор Хенкса: GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, California, USA.
MTT, ConA: Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA.
NaS: Tianjin Beilian Fine Chemicals Co., Ltd., Tianjin, PR China.
Набор ИФА для ИЛ-2 мыши: R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA.
Группы животных
1.3.
Для тестирования in vivo мышей случайным образом распределяли в группы
CMS-030 (10 мкг/кг/день).
CMS-030 (2 мкг/кг/день).
CsA (10 мг/кг/день).
Нормальный физиологический раствор (0,5 мл/день).
Растворы вводили внутрибрюшинной инъекцией раз в день в течение 5 дней до трансплантации и продолжали еще в течение 20 дней после операции.
Влияние CMS-030 на пролиферацию T-лимфоцитов in vitro
[1]
1.4.
Селезенки здоровых мышей Balb/c стерильно препарировали и погружали в охлажденный на льду раствор D-Hank's. Клетки селезенки получали разрушением селезенки матированными стеклянными пластинами в RPMI-1640. Клетки дважды промывали в RPMI-1640 при 4°С и 1200 об/мин в течение 10 мин. Клетки затем подсчитывали и доводили до концентрации, необходимой для каждого анализа. Жизнеспособность клеток в эксперименте определяли по исключению трипанового синего и должна была составлять более 95%.
5
2
Клетки селезенки от здоровых мышей культивировали в 96-луночных планшетах с доведением концентрации до 4×10 на лунку. В лунки добавляли CMS-030 в конечной концентрации 40 мкг/мл, 8 мкг/мл, 1,6 мкг/мл и 0,32 мкг/мл. Планшеты инкубировали в увлажненной атмосфере при 37°С, 5% CO в течение 68 час в присутствии конканавалина A (ConA) в конечной концентрации 5 мкг/мл. В группе положительного контроля CMS-030 не добавляли. Пролиферацию лимфоцитов измеряли колориметрическим анализом с 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромидом (MTT) в конце инкубации. В каждую лунку добавляли 20 мкл MTT и планшеты дополнительно инкубировали в течение 4 час. После этого в каждую лунку добавляли 100 мкл 0,04 М HCl в изопропиловом спирте для растворения формазанового преципитата. ОП каждого образца измеряли спектрофотометрически при 570 нм соотносительно с 630 нм.
Влияние CMS-030 на смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) in vitro
[2]
1.5.
6
6
57
2
2
Клетки селезенки от здоровых мышей Balb/c промывали охлажденным на льду раствором D-Hank's и ресуспендировали в RPMI-1640 до 8×10/лунку для образования реагирующих клеток. Суспензию клеток селезенки от здоровых мышей CBL/6J инкубировали с митомицином (25 мкг/мл) в течение 45 минут в RPMI-1640 при 37°С и 5% CO, после чего промывали RPMI-1640 и ресуспендировали до 8×10/лунку для образования стимулирующих клеток. Используя 96-луночный культуральный планшет для групп тестирования, добавить по 100 мкг реагирующих клеток, 100 мкг стимулирующих клеток и 20 мкл CMS-030 в конечной концентрации 40 мкг/мл, 8 мкг/мл, 1,6 мкг/мл и 0,32 мкг/мл. В группу положительного контроля добавляли 100 мкл реагирующих клеток, 100 мкл стимулирующих клеток и 20 мкл RPMI-1640. В группу отрицательного контроля добавляли 200 мкл стимулирующих клеток и 20 мкл RPMI-1640. Для каждого сочетания использовали шесть параллельных лунок. Через 5 дней инкубации при 37°С и 5% CO пролиферацию лимфоцитов измеряли колориметрическим анализом MMT.
Влияние CMS-030 на выживание трансплантата сердца in vivo
[3]
1.6.
57
Сердца доноров препарировали из мышей CBL/6J через 24 часа после рождения. Сердца погружали в раствор D-Hank's и удаляли кровь из полости сердца. Сердца трансплантировали подкожно в проходы ушной раковины здоровых взрослых реципиентов Balb/c. Воздух из сердца и прохода выдавливали легким нажатием. Начиная с шестого дня после трансплантации, ежедневно снимали электрокардиограмму (ЭКГ) трансплантированного сердца. Отсутствие сигнала ЭКГ на протяжении 3 дней подряд указывало на неудачную операцию трансплантации, и мышей исключали из статистического анализа. ЭКГ отслеживали ежедневно, и временем отторжения считали день, когда сигнал ЭКГ исчезал. Тестируемые вещества вводили внутрибрюшинно, начиная с 6 дня после операции. На группу приходилось 10 мышей. Циклоспорин A вводили в дозе 10 мг/кг/день, CMS-030 - в дозе 10 мкг/кг/день или 2 мкг/кг/день, а физиологический раствор - 0,5 мл/кг/день. Статистический анализ проводили с использованием log-рангового критерия Каплана-Мейера для сравнения с группой, обработанной физиологическим раствором.
Влияние CMS-030 на выживание кожного аллотрансплантата in vivo
[4]
1.7.
2
57
2
2
Участок шерсти на спине мышей Balb/c удаляли с помощью 8% раствора NaS. На следующий день создавали раневую поверхность приблизительно 1 см хирургическим удалением кожи, после чего на место раневой поверхности помещали кусочек кожи 1 см полной толщины из хвоста соответствующего по полу мыши-донора CBL/6J. Операционное поле закрывали и защищали слоем парафинированной марли и прикрывали пластырем. Через 8 дней после трансплантации пластырь удаляли, и мышь-реципиент контролировали ежедневно на предмет жизнеспособности аллотрансплантата. За конечную точку отторжения принимали момент, когда лишь менее 10% аллотрансплантата оставалось жизнеспособным. Внутрибрюшинную обработку тестируемыми веществами начинали за 6 дней до операции. На группу приходилось 10 мышей. Циклоспорин A вводили в дозе 10 мг/кг/день, CMS-030 - в дозе 10 мкг/кг/день или 2 мкг/кг/день, а физиологический раствор - 0,5 мл/кг/день. Лечение продолжали еще в течение 20 дней после операции.
Влияние CMS-030 на пролиферацию T-лимфоцитов in vivo
[5]
1.8.
6
2
Клетки селезенки от мышей-реципиентов трансплантата кожи выделяли и ресуспендировали в RPMI-1640 до 4×10/мл. В 96-луночный планшет вносили по 100 мкл клеток/лунку. В лунки для тестирования добавляли 100 мкл ConA до конечной концентрации 5 мкг/мл. В контрольные лунки вместо него добавляли 100 мкл RPMI-1640. Четыре параллельные лунки на каждое сочетание. Клетки инкубировали в течение 68 час при 37°С и 5% CO. Пролиферацию лимфоцитов измеряли колориметрическим анализом MTT. ОП каждого образца измеряли спектрофотометрически при 570 нм соотносительно с 630 нм. Данные представляли в виде индекса стимуляции, который представлял собой ОП тестируемой группы, деленную на ОП контрольной группы.
Влияние CMS-030 на уровень ИЛ-2 in vivo
[6]
1.9.
6
Клетки селезенки от мышей-реципиентов трансплантата кожи выделяли и ресуспендировали в RPMI-1640 до 2×10/мл. 1,5 мл клеток на лунку добавляли в 24-луночный планшет и инкубировали в течение 24 час для прикрепления. Добавляли 100 мкл ConA до конечной концентрации 10 мкг/мл. Клетки инкубировали еще в течение 48 часов, после чего собирали супернатант центрифугированием. Уровень ИЛ-2 в культуральных супернатантах определяли с помощью ИФА.
Статистический анализ
1.10.
Для анализа времени выживания аллотрансплантата использовали log-ранговый критерий Каплана-Мейера сравнения с контрольной группой. Для других экспериментов использовали сравнение средних с отклонениями 2-сторонним t-критерием Стьюдента.
Результаты
2.
Таблица 10.1
Влияние CMS-030 на пролиферацию T-лимфоцитов in vitro
Группа
Доза лекарств
No.
ОП
CMS-030
40 мкг/мл
6
0,332±0,062*
CMS-030
8 мкг/мл
6
0,281±0,041*
CMS-030
1,6 мкг/мл
6
0,311±0,027*
CMS-030
0,32 мкг/мл
6
0,315±0,043*
Положительный контроль
-
6
0,421±0,055
Отрицательный контроль
-
6
0,109±0,003*
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, p<0,01.
Таблица 10.2
Влияние CMS-030 на смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) in vitro
Группа
Доза лекарств
No.
ОП
CMS-030
40 мкг/мл
6
0,192±0,019*
CMS-030
8 мкг/мл
6
0,285±0,004*
CMS-030
1,6 мкг/мл
6
0,361±0,036*
Положительный контроль
-
6
0,440±0,043
Отрицательный контроль
-
6
0,145±0,019
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, p<0,01.
Таблица 10.3
Влияние CMS-030 на выживание трансплантата сердца in vivo
Группа
Доза лекарств
No.
Среднее время выживания (дни)
CMS-030
10 мкг/кг/д
9
12,0±2,2*
CMS-030
2 мкг/кг/д
9
11,5±1,9*
CsA
10 мг/кг/д
8
13,8±1,3*
Физиологический раствор
0,5 мл/д
10
9,1±1,4
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, p<0,05.
Таблица 10.4
Влияние CMS-030 на выживание аллотрансплантата кожи in vivo
Группа
Доза лекарств
No.
Среднее время выживания (дни)
CMS-030
10 мкг/кг/д
9
14,1±1,2*
CMS-030
2 мкг/кг/д
10
13,4±1,5
CsA
10 мг/кг/д
9
15,0±1,4*
Физиологический раствор
0,5 мл/д
9
11,0±1,3
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, p<0,01.
Таблица 10.5
Влияние CMS-030 на пролиферацию T-лимфоцитов in vivo
Группа
Доза лекарств
No.
Индекс стимуляции
CMS-030
10 мкг/кг/д
9
1,6±0,3*
CMS-030
2 мкг/кг/д
10
1,9±0,5*
CsA
10 мг/кг/д
9
1,8±0,3*
Физиологический раствор
0,5 мл/д
9
2,3±0,5
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, p<0,01.
Таблица 10.6
Влияние CMS-030 на уровень ИЛ-2 in vivo
Группа
Доза лекарств
No.
ИЛ-2 (пг/мл)
CMS-030
10 мкг/кг/д
9
599,0±121,8*
CMS-030
2 мкг/кг/д
10
577,4±163,1*
CsA
10 мг/кг/д
9
595,2±162,8*
Физиологический раствор
0,5 мл/д
9
787,4±227,8
* По сравнению с группой контрольного физиологического раствора, p<0,01.
Заключение
[7]
Было обнаружено, что в концентрации от 0,32 до 40 мкг/мл CMS-030 способен статистически значимо ингибировать индуцированную ConA пролиферацию T-лимфоцитов in vitro, что указывает на способность CMS-030 ингибировать пролиферацию T-лимфоцитов in vitro. MLR представляет собой эксперимент in vitro для определения ответа лимфоцитов на разные молекулы HLA-II и является моделью для предсказания потенциала отторжения после трансплантации органов. Было обнаружено, что в концентрации от 1,6 до 40 мкг/мл CMS-030 способен статистически значимо ингибировать смешанную реакцию лимфоцитов, что указывает на способность CMS-030 снижать потенциал отторжения после трансплантации органов.
[7]
Эксперименты с трансплантатом сердца и аллотрансплантатом кожи представляли собой животные модели для изучения подавления отторжения после трансплантации. Было обнаружено, что CMS-030 в дозе 2 мкг/кг/день и 10 мкг/кг/день способен статистически значимо продлевать выживание трансплантата, что указывает на способность CMS-030 подавлять отторжение трансплантата под действием иммунного ответа хозяина. Анализ клеток селезенки, выделенной из мышей-реципиентов кожного трансплантата, показал, что CMS-030 способен статистически значимо подавлять и активацию лимфоцитов, и секрецию ИЛ-2 T-лимфоцитами, что указывает на то, что продление выживания аллотрансплантата достигалось за счет подавления иммунного ответа животного-реципиента.
Ссылки
:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылок во всей их полноте.
[1] Roma Kalra, Shashi P. Singh, Juan C, et al. Immunosuppressive and Anti-Inflammatory Effects of Nicotine Administered by Patch in an Animal Model. Clinical and Diagnostic Laborarory Immunology, May 2004, 563-568.
[2] Dubey DP, Yunis I, Yunis EJ, et al. Cellar typing: mixed lymphocyte response and cell mediated lympholysis. American Society for Microbiology, 1986, 847-848.
[3] Vakeva A Laurila P,Meri S, et al.. Regulation of complement membrane attack complex formation in myocardial infarction. Am J Pathol, 1993,143:65.
[4] Ming Jiankuo, Wang Xingbing, Huang Baojun, et al. Peptide Nucleic Acid Antisense Prolongs Skin Allograft Survival by Means of Blockade of CXCR3 Expression Directing T Cells into Graft. The Journal of Immunology, 2003,170:1556-65.
[5] Maria A. Puertollano, Manuel A. de Pablo, et al. Relevance of Dietary Lipids as Modulators of Immune Functions in Cells Infected with Listeria monocytogenes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2002, 9:352-357.
[6] Mayumi H,Himeno K,Shin T, et al. Drug-induced tolerance to allografts in mice. Immunobiology, 1985, 169(2):147-161.
[7] Rene J.Duquesnoy Li YP. Transplantation immunobiology. 2002, 10:5-7.
Пример 11
Влияние пептидов на индуцированную тренировкой усталость у мышей
Цель
: Исследовать действие пептидов против усталости у мышей Balb/c.
Способы
: Время плавания самцов мышей Balb/c использовали в качестве животной модели для изучения действия пептидов против усталости.
Результаты
: Было обнаружено, что CMS-001.30 и CMS-001.31 способны продлевать время плавания мышей статистически значимо по сравнению с контролем (P<0,01).
Заключение
: CMS-001.30 и CMS-001.31 обладают свойством снижать усталость и могут быть использованы для лечения нарушений, связанных с усталостью.
Материалы и методы
1.
Лекарство и реагенты
1.1.
CMS-001.30 и CMS-001.31 были синтезированы на заказ Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR China.
Эритропоэтин (EPO): Japan Kunpeng Medical Corporation.
Животные
1.2.
Самцы мышей Balb/c отдельной группы, не содержащей патогенов (SPF), массой 18-22 г: Academy of Military Medicines and Sciences Experimental Animal Center, PR China.
Формирование групп и метод
[1]
1.3.
Самцов мышей Balb/c случайным образом распределяли в группы CMS-001.30 (20 мкг/кг/день), CMS-001.31 (20 мкг/кг/день), EPO (1000 Е/кг/день, три раза в неделю) и контрольного физиологического раствора. Тестируемое вещество растворяли в 0,5 мл физиологического раствора и вводили внутрибрюшинно раз в день в течение 30 дней без перерывов (EPO заменяли физиологическим раствором, если EPO не вводили). На десятый день мышей учили плавать в течение 10 мин при температуре воды 25±1°С. Через 30 мин после последнего введения тестируемого вещества мышей помещали в бассейн для плавания (50 см×50 см×40 см). Глубина воды составляла 30 см, а температура воды 25±1°С. Конечности мышей двигались на протяжении всего процесса. Записывали время (мин) плавания мышей до гибели.
Показатель увеличения времени истощающего плавания (ESTR) (%)=(Среднее время истощающего плавания тестируемой группы-Среднее время истощающего плавания группы контрольного физиологического раствора)/(Среднее время истощающего плавания группы контрольного физиологического раствора) ×100%.
Статистика
1.4.
Различия между группами анализировали с помощью анализа дисперсии ANOVA
Результаты
2.
Таблица 11.1
Влияние пептидов на время истощающего плавания мышей
Группы
Дозы
No.
Время плавания (мин)
ESTR (%)
CMS-001.30
20 мкг/кг/день
20
186,4±15,2*
88,3*
CMS-001.31
20 мкг/кг/день
20
174,3±29,2*
76,0*
EPO
1000 Е/кг/день, 3 раза в неделю
20
126,1±20,4*
31,3*
Физиологический раствор
0,5 мл/день
20
99,0±11,2
-
* По сравнению с группой физиологического раствора, P<0,01.
Заключение
3.
Было обнаружено, что CMS-001.30 и CMS-001.31 обладают свойством снижать усталость и могут быть использованы для лечения нарушений, связанных с усталостью.
Ссылка
:
Следующая ссылка включена в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
1. Mizunoya W, Oyaizu S, Ishihara K, et al.Protocol for measuring the endurance capacity of mice in an adjustable-current swimming pool. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 May; 66(5):1133-1136.
На основании представленной выше информации из раскрытых пептидов могут быть получены разные фармацевтические составы. Фармацевтический состав может включать любой из известных фармацевтических носителей. Примеры подходящих носителей включают любой из стандартных фармацевтически приемлемых носителей, известных специалистам в данной области техники. Они включают, но не ограничиваются этим, физиологический солевой раствор, воду, эмульсии, включающие смеси масла и воды или эмульсии триглицеридов, и другие типы агентов, наполнителей, покрытых таблеток и капсул. Подходящий носитель может быть выбран на основании способа введения фармацевтической композиции.
Фармацевтический состав можно вводить посредством внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции и подкожной имплантации. Пептид можно также вводить в любой форме перорального введения, такой, как, например, таблетка, капсула, суспензия, раствор и тому подобное, в обычной форме без модификации или в форме с медленным высвобождением, или с наличием, или отсутствием желудочно-кишечной защиты. Пептид можно также вводить в любой форме местного нанесения, такой, как мазь, крем, гель и т.д. с облегчающим чрезкожным устройством или без него. Пептид также может быть переведен в его генетическую последовательность и клонирован в экспрессионную систему как таковой или в сочетании с другими пептидными последовательностями для получения результирующей пептидной молекулы для использования активности пептида, как описано в данном описании.
Доза каждого пептида может составлять 1 нг-10 г на кг массы тела. Предпочтительной дозой является 10 нг-10 мг на кг и более предпочтительно 1 мкг-1 мг на кг для инъекционного способа введения. Однако эффективная доза может быть такой низкой, как 1 нг на кг массы тела, поскольку один или более из пептидов могут действовать через рецепторы, которые обычно индуцируют каскад обычных физиологических ответов. Альтернативно один или более из пептидов могут быть просто инициаторами целого каскада реакций. Для перорального приема количество может составлять 1 нг-10 г в день на кг массы тела, более предпочтительно 0,1 мкг-1 г в день на кг массы тела и еще более предпочтительно 1мкг-10 мг в день.
Основанная на представленных выше пептидных последовательностях генная терапия может быть осуществлена на основании способов, известных в данной области техники, а также на основании патентной публикации WO 03/006492A2, которая включена в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Пептиды также могут быть конъюгированы с другими усиливающими молекулами на основании указаний, раскрытых в патентной публикации WO 2004/055042A1, которая включена в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
Ссылки
:
Следующие ссылки включены в данное описание в качестве ссылок во всей их полноте.
1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:134-135.
2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234.
3. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:140.
4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, l(6):356-358.
5. Qian Wang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483.
6. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:141.
7. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:132-133.
8. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:128-129.
9. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Phamalogical experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998,137-138.
10. Jiatai Li, clinical pharmacology(second edition). People's Health Publishing House. 1998, 1338-1339.
Пример 12
Доставка пептидов с помощью генетически сконструированных бактериальных штаммов Lactobacillus
Последующее предлагается в качестве одного примера способа доставки пептидов этого изобретения хозяину, как описано выше. Последовательность ДНК, которая кодирует один из пептидов, перечисленных в таблице 1 выше, синтезируют химическими способами и эту последовательность ДНК вставляют в экспрессионный вектор с применением стандартных способов генной инженерии, знакомых специалистам в данной области техники. Выбранный экспрессионный вектор содержит конститутивный промотор, функционирующий в Lactobacilli, сайт множественного клонирования для введения последовательностей ДНК в конкретной ориентации с 5' к 3', а также селективный маркерный ген, который придает устойчивость к антибиотику (для помощи в процедурах клонирования), и может включать другие последовательности для помощи в продукции и/или секреции пептидов, такие как последовательности сигнальных пептидов. Пример такого вектора предлагается в патенте США No. 5592908, принадлежащем Pavla, который включен в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Вкратце в этом патенте обсуждается несколько известных промоторов, которые работают в штаммах Lactobacillus, а также способ, раскрывающий новые промоторы в указанных бактериях, любой из которых может быть оперативно связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид настоящего изобретения, для экспрессии пептида в Lactobacilli. Нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальный пептид, такой как пептиды, включающие от 16 до 35 по большей части гидрофобных аминокислот, которые активны в Lactobacillus lactis, описанную в патенте США No. 5529908, цитированном выше, вставляют между промотором и нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид настоящего изобретения, так что нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальный пептид, находится в рамке считывания с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид настоящего изобретения.
В дополнение к последовательности, кодирующей пептид, синтезированная последовательность ДНК может включать последовательности, способствующие лигированию и клонированию указанной ДНК в экспрессионном векторе. Например, сайты узнавания ферментов рестрикции, которые соответствуют таковым, найденным в сайте множественного клонирования вектора, могут быть включены в синтезируемую ДНК на 5' и 3' концах последовательности, так что последовательность может быть клонирована в векторе в правильной ориентации. Как вектор, так и синтезированную ДНК гидролизуют конкретными ферментами рестрикции и затем очищают. За реакциями лигирования с вектором и синтезированной ДНК следует трансформация в подходящий штамм E. coli. Трансформированные бактерии высевают на среды, содержащие антибиотик, к которому в векторе придана устойчивость. Выбирают колонию трансформированных бактерий для ростовых культур и процедур получения плазмид; подтверждают присутствие синтезированной ДНК в правильной ориентации.
Этот экспрессионный вектор затем трансформируют в клетку бактерии-хозяина штаммов Lactobacillus, таких как L. acidophilus. Трансформированные клетки отбирают по свойству селективного маркера, найденного в последовательности вектора, и секреция пептида может быть подтверждена с помощью выполнения вестерн-блоттинга, выполнения гель-электрофореза пептидов, присутствующих в ростовой среде, или других стандартных способах. Трансформированную колонию бактерий выбирают и применяют для получения крупномасштабных культур генетически сконструированных бактерий. Культуру генетически сконструированных бактерий, экспрессирующих желаемый пептид, наращивают и, по меньшей мере, ее часть вводят в пищеварительный тракт, влагалище, трахею или другие зоны организма хозяина, в которых бактерии способны размножаться. Если это желательно, бактериальные культуры могут быть обработаны разными способами для получения добавки для потребления в кишечнике хозяина. Эта обработка включает лиофилизацию или другие методы консервации бактерий в дополнение к сочетанию бактерий с агентами-носителями, такими как растворы, растворители, дисперсионные среды, задерживающие агенты, эмульсии и тому подобное. Применение этих агентов для получения добавок хорошо известно в данной области техники. Например, бактерии могут быть использованы для создания культуральных молочных продуктов или других продуктов питания для потребления человеком, так что организм, экспрессирующий пептид, колонизирует пищеварительный тракт организма-хозяина. Ряд различных способов включения различных штаммов лактобактерий в продукты питания, такие как йогурт, корейская квашеная капуста, сыр и масло, раскрыты в патенте США No. 6036952, принадлежащем Oh, который включен в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. При потреблении бактерий через один из любого количества путей сконструированные организмы могут колонизировать пищеварительный тракт и дать возможность презентации и/или поглощению пептидов этого изобретения через слизистую выстилку пищеварительного тракта.
Пример 13
Доставка пептидов с помощью генетически сконструированной формы Bacillus subtilis
Последующее предлагается в качестве другого примера способа доставки пептидов этого изобретения хозяину, как описано выше. Последовательность ДНК, которая кодирует один из пептидов, перечисленных в таблице 1 выше, синтезируют химическими способами и эту последовательность ДНК вставляют в экспрессионный вектор с помощью методов генной инженерии, причем все методы известны в данной области техники. Выбранный экспрессионный вектор включает челночный вектор, такой как pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), способный реплицироваться как в E. Coli, так и в B. Subtilis, и содержащий ген устойчивости к антибиотику для отбора колоний трансформированных бактерий. Этот вектор может содержать конститутивный промотор, активный в B. subtilis, такой как промотор, происходящий от гена Sac B B. subtilis, а также нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, активный в B. subtilis, которая управляет эффективным экспортом экспрессируемых гетерологичных белков из бактериальной клетки. Пример такого вектора раскрыт в патенте США No. 6268169, принадлежащем Fahnestock, раскрытие которого включено в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Кратко, как подробно описано выше, ДНК, кодирующую пептид этого изобретения, синтезируют с сайтами для ферментов рестрикции и/или другими последовательностями для облегчения клонирования ДНК с помощью способов, знакомых специалистам в данной области техники. После трансформации в E. coli, высевания, селекции и репликации плазмиды для создания пула плазмид, плазмиду затем трансформируют в B. subtilis и трансформанты отбирают по свойству устойчивости к антибиотику в средах высевания.
Продукцию пептида в генетически сконструированной B. subtilis и его секрецию из нее подтверждают с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как радиоактивное промечивание пептидов для авторадиографического определения после анализа в ДДС-Na ПААГЭ или вестерн-блоттинг.
Культуру генетически сконструированных бактерий наращивают и, по меньшей мере, ее часть вводят в пищеварительный тракт, влагалище, трахею или другие зоны организма хозяина, в которых бактерии способны размножаться.
Пример 14
Доставка пептидов с помощью генетически сконструированных штаммов дрожжей Saccharomyces
Последующее предлагается в качестве другого примера способа доставки пептидов этого изобретения хозяину, как описано выше. Последовательность ДНК, которая кодирует один из пептидов, перечисленных в таблице 1 выше, синтезируют химическими способами и эту последовательность ДНК вставляют в экспрессионный вектор с помощью методов генной инженерии, причем все методы известны в данной области техники. Выбранный экспрессионный вектор включает вектор, стабильно поддерживающий экспрессию дрожжевых белков, включающий конститутивный промотор дрожжей, такой как pADHl, сайты репликации вектора как в дрожжах, так и в E. coli, ген или гены, придающие прототрофию ауксотрофному дрожжевому мутанту в целях отбора, сайт множественного клонирования (MCS) и, если это желательно, последовательности, которые кодируют сигнальный пептид. Векторы, такие как этот, коммерчески доступны и хорошо известны в данной области техники или могут быть легко сконструированы с применением стандартных способов. После вставки синтезированной ДНК в дрожжевой вектор, трансформации в E. coli, высевания трансформированных E. coli на селективные среды, селекции трансформированной бактериальной колонии и получения плазмидной ДНК из ростовой культуры бактерий из указанной колонии вектор трансформируют в Saccharomyces cerevisiae с помощью хорошо известных способов, таких как трансформация ацетатом лития или электропорация. Штамм Saccharomyces cerevisiae, выбранный для трансформации, представляет собой мутантный ауксотрофный штамм, который будет требовать ген в плазмиде для роста на минимальных средах высевания. Трансформированные колонии дрожжей выделяют с помощью высевания дрожжей на ростовые среды с отсутствием гена, обеспечиваемого вектором. Только те дрожжи, которые получили вектор и его селективный ген и экспрессируют его генный продукт, будут способны расти в колониях на минимальных средах. Подтверждение секреции пептида может быть с помощью выполнения вестерн-блоттинга, выполнения гель-электрофореза пептидов, присутствующих в ростовой среде или других стандартных способов.
Трансформированную колонию дрожжей выбирают и применяют для получения крупномасштабных культур. Культуру генетически сконструированных дрожжей, экспрессирующую желаемый пептид, наращивают и, по меньшей мере, ее часть вводят в пищеварительный тракт, влагалище, трахею или другие зоны организма хозяина, в которых бактерии способны размножаться. Если это желательно, дрожжевые культуры могут быть обработаны с помощью разнообразных способов для получения добавки для потребления в кишечнике хозяина. Эта обработка включает лиофилизацию или другие методы консервации дрожжей в дополнение к сочетанию бактерий с агентами-носителями, такими как растворы, растворители, дисперсионные среды, задерживающие агенты, эмульсии и тому подобное. Применение этих агентов для получения добавок хорошо известно в данной области техники. В другом осуществлении трансформированные дрожжи применяют для создания пищевых продуктов, таких как ферментированные молочные продукты, такие как йогурт или кефир, с помощью способов, известных специалистам в данной области техники. Как и в случае живых культур лактобактерий в этих пищевых продуктах, трансформированные дрожжи колонизируют пищеварительный тракт, по меньшей мере, временно и служат для презентации пептидов хозяину через просвет кишечника.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано с применением указанных выше способов и данных, а также конкретных примеров описанных в настоящем описании пептидов во многих случаях, понятно, что это является только примером и не должно быть воспринято как ограничение настоящего изобретения. Должно быть также понятно, что эти описанные в данном описании пептиды представляют некое осуществление настоящего изобретения, и тот же принцип настоящего изобретения может быть также применен к другим функционально эквивалентным пептидам, которые модифицируются без влияния на биологическую функцию этих пептидов. Более того, хотя описанное выше заболевание или нарушение для медицинского применения этих пептидов перечисляются для поддержки их пригодности, эти медицинские применения используются только как неограничивающие примеры и не должны быть использованы для ограничения объема формулы изобретения. Ясно, что существует другое возможное/предназначенное применение этих пептидов и их функциональных производных, такое как, но, не ограничиваясь этим, применение в качестве пищевой добавки для усиления или стимуляции иммунной системы, облегчения усталости, снижения молочной кислоты в крови нормального субъекта или больного с любыми инфекциями. Любое из таких применений также попадает в объем настоящего изобретения.
Что касается пептидов с последовательностями, которые были опубликованы ранее, в настоящем изобретении предлагается новое, неожиданное их применение, и считается, что эти новые показания поддерживают применение некоторых их этих известных пептидов для промышленного использования, которое ранее не было предусмотрено. Кроме новых медицинских применений, как описано выше и в формуле изобретения, они могут быть также применены в качестве диетических или пищевых добавок для улучшения состояния нормального индивидуума на основе представленных в данном описании указаний.