Современные подходы к изучению микрофлоры у ВИЧ-инфицированных детей

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МИКРОФЛОРЫ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ДЕТЕЙ

THE MODERN APPROACHES TO MICROFLORA STUDY IN HIV-POSITIVE CHILDREN

Захарова Ю.В. Zakharova Y.V. Марковская А.А. Marcovskaya A.A. Леванова Л.А. Levanova L.A.

Кемеровская государственная медицинская академия, Kemerovo State Medical Academy

г. Кемерово, Россия Kemerovo, Russia

Цель: Изучение биологических свойств индигенной и условно-патогенной микрофлоры для минимизации риска развития вторичных бактериальных инфекций у ВИЧ-инфицированных детей. Материалы и методы: В работе использованы 33 штамма бифидобак-терий и 30 штаммов условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от ВИЧ-инфицированных (20 человек) и здоровых (15 человек) детей. Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами. У индигенной и оппортунистической микрофлоры изучены антилизоцимная, адгезивная и антагонистическая активности. Результаты: Установлено, что основу развития эндогенных инфекций у ВИЧ-позитивных детей составляет изменение персистентного потенциала условно-патогенных микроорганизмов, а также антагонизма и адгезивной активности бифидобактерий.

Ключевые слова: бифидобактерии; условно-патогенные микроорганизмы; антагонизм; персистенция; адгезивная активность.

The aim: To study the biological properties of indigenous and opportunistic microflora for risk minimization of secondary bacterial infection in children with HIV.

Materials and methods: 33 strains of Bifidobacteria and 30 strains of opportunistic Enterobacteria isolated from children with HIV-infection (20 participants) and healthy persons (15 participants) were used for the study. Isolation and identification of microorganisms were performed by conventional methods. Antilysocime, adhesive and antagonistic activity of indigenous and opportunistic bacteria was investigated.

Results: It is revealed that the basis of development of endogenous infections in HIV-positive children is determined by change of persistence potential of opportunistic microorganisms, antagonism and adhesive activity of Bifido-bacteria.

Key words: вifidobacteria; opportunistic microorganisms; antagonism; persistence; adhesive activity.

Санитарно-эпидемиологическая ситуация по ВИЧ-инфекции в Российской Федерации остается неоднозначной. По данным Г.Г. Онищенко, ежегодно увеличивается число детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, растет удельный вес подтвержденных случаев ВИЧ-инфекции среди детей с риском перинатальной передачи вируса иммунодефицита человека [1]. Низкая продолжительность жизни, задержка психомоторного и умственного развития ВИЧ-инфицированных детей являются не просто медицинской, но и социальной проблемой, так как данные показатели оказывают влияние на здоровье населения в целом и демографические показатели в стране [1, 2].

В настоящее время одним из приоритетных направлений в профилактической деятельности и в борьбе с ВИЧ-инфекцией в педиатрической практике является увеличение продолжительности жизни инфицированных детей и минимизация риска развития вторичных бактери-

альных осложнений [1]. Это связано с тем, что у ослабленных детей, инфицирование которых произошло до 1,5-летнего возраста, уже на стадии первичных проявлений они могут приводить к летальному исходу [2].

Наиболее крупным резервуаром для микробов-оппортунистов является толстый кишечник, так как здесь обитает более 400 видов микроорганизмов, в том числе и условно-патогенные бактерии [3]. Они формируют ассоциативные сожительства с доминантными микросимбионтами — бифидобактериями и лактобациллами. У здорового человека индигенная микрофлора обеспечивает колонизационную резистентность слизистых, а также контролирует экспрессию факторов вирулентности условно-патогенных бактерий, что предупреждает развитие оппортунистических болезней [4-7]. Очевидно, что у ВИЧ-инфицированных детей происходит нарушение определенных механизмов поддержания микроэкологического гомеостаза, что яв-

ляется патогенетической основой формирования эндогенных инфекций. В большинстве случаев при развитии вторичных бактериальных инфекций у детей с иммуноде-фицитами проводят исследование качественного и количественного состава микрофлоры, тогда как характер взаимоотношений микросимбионтов при формировании ассоциаций изучен недостаточно.

Цель исследования — изучение биологических свойств бифидобак-терий и условно-патогенных микроорганизмов для минимизации риска развития вторичных бактериальных инфекций у ВИЧ-инфицированных детей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Стандартным бактериологическим методом проведено исследование фекальной микрофлоры у 20 ВИЧ-инфицированных детей в возрасте 1,7 ± 0,2 года [8]. Группу сравнения составили 15 детей с отрицательными результатами им-муноферментного анализа на ВИЧ-антитела того же возраста и пола.

Дизайн исследования проводился по типу «случай-контроль». Идентификацию бактерий и грибов проводили с использованием коммерческих тест систем ANAERO-TEST 23, STAPHY-TEST 16, STREPTO-TEST 16, AUXOCOLOR, СИБ для энтеробактерий набор № 2. Интерпретацию результатов бактериологического обследования вели согласно региональным значениям нормы [9]. Биологические свойства изучали у 33 штаммов Bifidobacterium spp (18 штаммов получены от детей опытной группы и 15 штаммов — от детей группы сравнения) и у 30 микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (20 штаммов получены от ВИЧ-позитивных, 10 культур — от ВИЧ-негативных детей).

Адгезивные свойства микроорганизмов изучали согласно методике В.И. Брилиса. Для этого культуры выращивали в течение 24 часов на скошенном мясо-пептонном агаре с учетом типа дыхания. Взвесь микроорганизмов готовили на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации Ю9КОЕ/мл. Клеточным субстратом служили формализированные эритроциты человека 0(1) группы Rh(+), густотой 100 млн/мл. Эритроциты и взвесь микроорганизмов в равных объемах, по 50 мкл, соединяли в пробирках и инкубировали при 37°С в течение 1 часа, регулярно встряхивая смесь. После этого готовили мазок, высушивали, фиксировали 96 % спиртом 15 минут и окрашивали по Романовско-му-Гимза. Изучение адгезии проводили под световым микроскопом, подсчет вели на 50 эритроцитах. Оценку результатов опыта вели по индексу адгезивности микроорганизма (ИАМ), который характеризует среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ < 1,75; низкоадгезивными — от 1,76 до 2,5; сред-неадгезивными — от 2,51 до 4,0, высокоадгезивными — при ИАМ > 4,0.

Активность кислотообразования бифидобактерий определяли титро-метрическим методом. С этой целью к суточным культурам бифидобак-

№ 3 [сентябрь]

терий, выращенных на среде Блау-рокка в объеме 5 мл, добавляли по 2 капли индикатора бромтимолово-го синего и титровали 0,1н NaOH. Количество щелочи, пошедшей на титрование, соответствует количеству кислоты, образуемой в 5 мл культуральной жидкости. Окончательный результат выражали в градусах Тернера: Т° = А х К х 20, где А — количество 0,1н щелочи, пошедшее на титрование 5 мл исследуемой жидкости, К — поправка к титру, определяемая при титровании 0,1н раствора щелочи 0,1н янтарной кислотой, Т°— величина, выражающая количество 0,1н щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца.

Антагонистическую активность бифидобактерий по отношению к энтеробактериям определяли методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде. На чашку со средой Shadler-agar (BBL, США) петлей 2 мм наносили полоску культуры бифидобактерий и инкубировали 72 часа в анаэро-стате с газогенерирующим пакетом. Далее, к выросшей культуре, подсевали аэробных участников ассоциаций, предварительно выращенных на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 18 часов. Посев производили петлей диаметром 1 мм в направлении от зоны роста индигенных бактерий, не касаясь ее и перпендикулярно ей. Чашки инкубировали при температуре 37°С 24 часа в аэробных условиях. Учет результатов вели по величине зоны отсутствия роста клебсиелл, которую выражали в мм.

Антилизоцимную активность (АЛА) микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, как фактора персистенции, осуществляли методом отсроченного антагонизма в агаре по P.M. Muriana, T.R. Klae-hammer в модификации О.В. Бухарина. Готовили ряд чашек Петри с питательным агаром, содержащим лизоцим в различных концентрациях (от 1 до 10 мкг/мл). На поверхность сред «пятачками» засевали исследуемые культуры микроорганизмов. После инкубации в течение 24 часов при 37°С выросшие колонии убивали в течение 30-40 минут парами хлороформа. Затем сверху на колонии наслаивали 3-4 мл по-

Я^^^^Н ^ 63

лужидкого агара, смешанного с 0,1 мл взвеси индикаторной культуры Micrococcus lysodeikticus АТСС 15307 мутностью 10 ед. оптического стандарта мутности. Через сутки инкубации в термостате проводили учет результатов опыта по наличию или отсутствию роста микрококка на поверхности и вокруг колоний исследуемых культур, инактивиро-вавших известную концентрацию лизоцима в питательной среде.

Все полученные результаты были обработаны с помощью прикладной компьютерной программы STATIS-TICA 6,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Среди обследованных ВИЧ-инфицированных детей у 35 % микроэкологические нарушения были интерпретированы как 1 степень дис-бактериоза, у 40 % — как 2 степень дисбактериоза (p < 0,05), в 25 % случаев у детей были зарегистрированы дисбиотические нарушения 3 степени (p > 0,05). При 1 степени микроэкологических нарушений титр бифидофлоры составил 8,3 ± 0,2 ^КОЕ/г, а при 2 степени не превышал 6,9 ± 0,3 ^КОЕ/г. Самый низкий уровень колонизации слизистой бифидобактериями был у детей с 3 степенью дисбакте-риоза, так как он составил 6,1 ± 0,2 ^КОЕ/г. Независимо от степени микроэкологических нарушений, у ВИЧ-инфицированных детей доминировали Bifidobacterium denti-um (44,4 %), B. longum (33,3 %), B. breve (22,2 %).

Распространенность микроэкологических нарушений 1 и 2 степени у детей из группы сравнения не отличалась от таковой у детей с ВИЧ-инфекцией, так как составляла 33,3 % и 46,7 %, соответственно (p > 0,05). Однако у ВИЧ-негативных детей в 13,3 % случаев состояние микрофлоры кишечника расценивали как эубиотическое (p > 0,05), а дис-микробиоценоз 3 степени был зарегистрирован в 3,7 раза реже, чем у ВИЧ-инфицированных (p < 0,05). Интенсивность колонизации би-фидофлорой слизистой кишечника у детей группы сравнения при 1 и 2 степенях микроэкологических нарушений была на 1-2 порядка выше, чем в опытной группе (9,2 ± 0,2 и 8,8 ± 0,4 ^КОЕ/г, p < 0,05).

Даже при 3 степени дисбактериоза количественный уровень доминантных микросимбионтов у ВИЧ-негативных детей не снижался ниже 7,2 ± 0,2 lgKOE/г. В структуре би-фидофлоры доминировали B. lon-gum (46,7 %) и B. breve (33,3 %), Bifidobacterium spp (20 %).

Установлено, что у всех ВИЧ-инфицированных детей в кишечнике вегетировали условно-патогенные энтеробактерии — клебси-еллы и гемолизинпродуцирующие кишечные палочки (p < 0,01). Количественный уровень данных микроорганизмов при 1 и 2 степенях дисбактериоза составил 5,5-5,8 lgKOE/г. При глубоких микроэкологических нарушениях титр условно-патогенных энтеробактерий достигал 7,8 ± 0,2 lgKOE/г. У детей же из группы сравнения количественный уровень Klebsiella spp. и Escherichia coli Hly+ был достоверно ниже, и при 1 степени микроэкологических нарушений он составил 3,4 ± 0,2 lgKOE/г, при 2 степени

— 4,4 ± 0,3 lgKOE/г, при 3 степени

- 6,8 ± 0,4 lgKOE/г (p < 0,05).

Изучение биологических свойств

микрофлоры проводили в сравнительном аспекте, что позволило установить некоторые механизмы развития эндогенных заболеваний при ВИЧ-инфекции. Установлено, что адгезивная активность бифидобактерий у ВИЧ-инфицированных детей была достоверно ниже, чем у детей из группы сравнения, так как средние значения ИАМ составили 2,4 ± 0,2 и 4,2 ± 0,3, соответственно (p < 0,01). В большинстве случаев бифидофло-ра (55,6 %), выделенная от детей первой группы, обладала средней адгезивной активностью, тогда как 66,7 % штаммов, изолированных из кишечника детей группы сравнения, были отнесены к высоко адгезивным. Бифидобактерии от ВИЧ-инфицированных детей характеризовались низкой кислотообразующей способностью, которая не превышала 63,2 ± 0,5 Т°, в группе сравнения данный показатель был в 1,5 раза выше (94,8 ± 1,1, p < 0,05). Нарушение кисло-

тообразующей способности бифи-дофлоры у ВИЧ-инфицированных детей обуславливает низкую антагонистическую активность данных бактерий по отношению к условно-патогенной микрофлоре. Зона задержки роста условно-патогенных энтеробактерий после отсроченного культивирования с бифидобак-териями, изолированных от детей основной группы, не превышала 5,4 ± 0,2 мм, а в группе сравнения достигала 9,8 ± 0,2 мм (р < 0,01).

В основе механизма развития микроэкологических нарушений лежит изменение не только биологических свойств индигенных микроорганизмов, но и повышение персистентного потенциала условно-патогенных бактерий. Установлено, что гемолизинпродуцирую-щие кишечные палочки и клебсиел-лы у ВИЧ-инфицированных детей характеризовались более высокой АЛА (7,6 ± 0,2 мкг/мл), чем штаммы, изолированные от детей группы сравнения (2,8 ± 0,3 мкг/мл), что предопределяет возможность распространения данных бактерий за пределы «привычной» для них экологической ниши за счет нивелирования факторов врожденной противомикробной защиты, в частности, лизоцима.

ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки не всегда информативно для детализации механизмов развития вторичных бактериальных инфекций. Особую значимость приобретает исследование биологических свойств микрофлоры у ВИЧ-инфицированных детей, у которых оппортунистические бактериальные инфекции могут приводить к фатальному исходу. У ВИЧ-инфицированных детей в 65 % случаев в толстой кишке развиваются микроэкологические нарушения 2-3 степени, характеризующиеся низкими уровнями колонизации слизистой бифидофлорой и ростом числа условно-патогенных бактерий (р < 0,05). В структуре видового состава бифидобактерий у детей с ВИЧ-инфекцией домини-

руют Bifidobacterium dentium, которые, по данным ряда авторов, у здоровых детей являются представителями нормальной микрофлоры полости рта [10], а выделение данных анаэробов из толстой кишки расценивают как микроэкологические нарушения.

У ВИЧ-позитивных детей данный вид бифидобактерий является основным микросимбионтом, как по частоте, так и по уровню колонизации, что позволяет говорить о специфичности микроэкологических изменений при ВИЧ-инфекции. Данные виды би-фидобактерий обладают низкой адгезивной активностью к эпителию слизистой кишечника, что обуславливает нарушение колонизационной резистентности и «предоставление» рецепторного поля для транзиторных или постоянно обитающих условно-патогенных микроорганизмов.

Кроме того, индигенная микрофлора у детей с ВИЧ-инфекцией характеризуется относительно слабой кислотообразующей активностью и, соответственно, слабым антагонизмом по отношению к микробам-оппортунистам. Создаются благоприятные условия для увеличения количества условно-патогенных бактерий, уровень которых у ВИЧ-инфицированных детей достигает 7-8 lgKOE/г при региональной норме не более 4 lgKOE/г. У потенциально патогенных бактерий активизируются персистент-ные свойства, что позволяет им избегать регулирующего воздействия индигенной микрофлоры, а также нивелировать действие врожденных факторов защиты, в частности, лизоцима.

Таким образом, изучение у ВИЧ-позитивных детей качественного и количественного состава микрофлоры, а также биологических свойств индигенных и условно-патогенных бактерий, позволяет выявить особенности микроэкологических изменений в толстой кишке, что необходимо учитывать при разработке мероприятий по коррекции микрофлоры и повышению их эффективности при ВИЧ-инфекции.

Литература:

1. Онищенко, Г.Г. Санитарно-эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации. Основные проблемы и приоритетные направления профилактической деятельности на современном этапе /Г.Г. Онищенко //Вестник РАМН. - 2009. - № 7. - С. 3036.

2. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика, лечение /Ю.В. Лобзин, К.В. Жданов, В.Л. Пастушенков. - СПб.: Фолиант, 2003. - 144 с.

3. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии /под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева и др. - М: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

4. Бухарин, О.В. Инфекция - модельная система ассоциативного симбиоза /О.В. Бухарин //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - № 1. - С. 83-86.

5. Видовая характеристика и факторы персистенции бифи-дофлоры кишечника в норме и при дисбиозах /Е.В. Иванова, Н.Б. Перунова, А.В. Валышев и др. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - № 2. - С. 89-93.

6. Enterococcus faecalis from newborn babies regulate endogenous PPARgamma activity and IL-10 levels in colonic epithelial cells /A. Are, L. Aronsson, S. Wang et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. (USA).

- 2008. - Vol. 12, N 105. - P. 1943-1948.

7. Molecular and cellular basis of microflora-host interactions /P. Winkler, D. Ghadimi, J. Schrezenmeir et al. //J. Nutr. - 2007. - Vol. 137, N 3, Suppl 2. - P. 756-772.

8. Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника (Отраслевой стандарт системы стандартизации в здравоохранении РФ. Приказ МЗ РФ № 231 от 09.06. 2003).

9. Леванова, Л.А. Микроэкология кишечника жителей Западной Сибири, коррекция дисбиотических состояний: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук /Л.А. Леванова. - М., 2003. - 48 с.

10. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммово-го разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста /А.Н. Шкопоров, Л.И. Кафарская, С.С. Афанасьев и др. //Вестник РАМН. - 2006. - № 1. - С. 45-50.

L Сведения об авторах: Information about authors Захарова Ю.В., к.м.н., доцент кафедры микробиологии, иммуно- Zakharova J.V., MD, assistant professor chair of microbiology, immu-логии и вирусологии ГОУ ВПО «Кемеровская государственная меди- nology and virology, State educational institution High vocational training цинская академия Росздрава», г. Кемерово, Россия. «Kemerovo State Medical Academy», Kemerovo, Russia Марковская А.А., аспирант кафедры микробиологии, иммуноло- Marcovskaya A.A., graduate student chair of microbiology, immun-гии и вирусологии ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицин- ology and virology, State educational institution High vocational training ская академия Росздрава», г. Кемерово, Россия. «Kemerovo State Medical Academy», Kemerovo, Russia. Леванова Л.А., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой микро- Levanova L.A., PhD, professor, head of the chair of microbiology, биологии, иммунологии и вирусологии ГОУ ВПО «Кемеровская госу- immunology and virology, State educational institution High vocational дарственная медицинская академия Росздрава», г. Кемерово, Россия. training «Kemerovo State Medical Academy», Kemerovo, Russia Адрес для переписки: Address for correspondence: Леванова Л.А., ул. Ворошилова 22 А, г. Кемерово, 650029 Levanova L.A., Voroshilov,s st., 22 A, Kemerovo, 650029 Моб. тел: +7-903-941-02-68 Mobile phone: +7-903-941-02-68 E-mail: micro@kemsma.ru E-mail: micro@kemsma.ru

т

№ 3 [сентябрь] 2010