СПОСОБЫ МОДУЛЯЦИИ ВКУСОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
METHODS FOR MODULATION OF TASTE RECEPTORS

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США № 62/090138, поданной 10 декабря 2014 года, содержание которой включено посредством ссылки в полном объеме, и в отношении которой испрашивается приоритет.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Раскрытый настоящим объект относится к соединениям, которые модулируют активность вкусового рецептора умами, и к ароматизирующим композициям, которые включают по меньшей мере одно такое соединение, а также к способам идентификации таких соединений. Ароматизирующие композиции можно применять для усиления или модификации вкусовой привлекательности, вкуса и/или аромата пищевых продуктов для домашних животных. Ароматизирующие композиции могут включать комбинации соединений и могут быть добавлены в пищевые продукты для домашних животных в различных форматах систем доставки. Соединения, которые модулируют активность вкусового рецептора умами, могут включать одно или несколько трансмембранных соединений, нуклеотидных производных, нуклеотидов, первую аминокислоту, вторую аминокислоту или их комбинации.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Профили вкуса для съедобных композиций включают основные вкусы, такие как сладкий, соленый, горький, кислый, умами и кокуми. Профили вкуса также были описаны как включающие вкусы свободных жирных кислот. Химические соединения, которые вызывают эти вкусы, часто упоминаются как вещества, стимулирующие вкусовые ощущения. Предполагается, что вещества, стимулирующие вкусовые ощущения, воспринимаются во рту и горле рецепторами вкуса, которые передают сигналы в мозг, где регистрируются вещества, стимулирующие вкусовые ощущения, и регистрируются результирующие профили вкуса. Вкусовые рецепторы включают в себя вкусовые рецепторы класса T1R, такие как T1R1, T1R2 и T1R3, которые взаимодействуют в виде гетеродимеров для функционирования в качестве вкусовых рецепторов. Например, T1R2/T1R3 реагирует на сладкие раздражители, а гетеродимер T1R1/T1R3 распознает вкус умами. Кошки и члены семейства кошачьих не способны экспрессировать функциональный мономер T1R2, что указывает на то, что основным вкусовым рецептором класса T1R у кошек является рецептор умами, T1R1/T1R3. Кроме того, кошки демонстрируют предпочтение к пищевым композициям со вкусом умами.
Существует несколько заметных различий между человеческими T1R1/T1R3 и кошачьими рецепторами T1R1/T1R3. Например, человеческий T1R1/T1R3 реагирует на аминокислоту глутамат в качестве агониста и на нуклеотиды, в частности, IMP и GMP, в качестве положительных аллостерических модуляторов. Человеческий T1R1/T1R3 также реагирует на соединения, которые связывают трансмембранный домен рецептора. Например, с помощью экспериментов по обмену доменов, было показано, что N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид), который представляет собой положительный аллостерический модулятор рецептора, связывается с трансмембранным доменом T1R1 человека (Zhang et.al. Proc Natl Acad Sci USA. 105(52):20930-4, 2008). Известно также, что аллостерические модуляторы, которые связываются с трансмембранным доменом, модулируют активность множества членов GPCR класса III, включая рецепторы mGluR и CaSR-рецептор. Однако и человеческие, и кошачьи T1R1/T1R3 синергически реагируют на комбинации нуклеотидов и аминокислот.
Производители корма для домашних животных имеют давнее желание поставлять пищевые продукты для домашних животных, которые бы обладали высокой пищевой ценностью. Кроме того, особенно это касается корма для кошек и собак, производители корма для домашних животных желали бы получить высокую степень вкусовой привлекательности, чтобы домашние животные могли получать полноценную питательную пользу от своего корма. Домашние животные, особенно кошки, являются, как известно, непостоянными в своих пищевых предпочтениях и часто отказываются есть корм, который он получали в течение некоторого времени, или отказываются есть больше, чем минимальное количество корма. В результате владельцы домашних животных часто меняют типы и марки кормов, чтобы поддерживать своих питомцев в здоровом и удовлетворенном состоянии.
Несмотря на недавние достижения в технологиях вкуса и аромата, остается потребность в соединениях, которые могут улучшать или модифицировать вкусовую привлекательность пищевых продуктов для домашних животных путем улучшения или модификации вкусовых, текстурных и/или ароматизирующих профилей пищевого продукта для домашних животных. Улучшение или модификация может заключаться в увеличении интенсивности желательного свойства, замене желательного свойства, который отсутствует или каким-то образом потерян в пищевом продукте для домашних животных, или для уменьшения интенсивности нежелательного свойства. В частности, желательно увеличение интенсивности вещества, стимулирующего вкусовые ощущения в пищевом продукте для домашних животных. Таким образом, в данной области техники существует необходимость в композициях для повышения вкусовой привлекательности и/или вкуса умами пищевых продуктов для домашних животных.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Раскрытый настоящим объект изобретения относится к ароматизирующим композициям и к способам получения и модификации таких композиций в различных пищевых продуктах для домашних животных. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим одно или несколько трансмембранных соединений и/или нуклеотидных производных, которые усиливают, увеличивают и/или модулируют активность рецептора умами, T1R1/T1R3.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает соединения и композиции, которые модулируют активность кошачьего рецептора умами. В одном примере, кошачий рецептор умами экспрессируется клеткой, и соединение или композиция контактируют с клеткой. Кошачий рецептор умами может включать рецептор T1R1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
in silico
Взаимодействие между соединениями и композициями может включать, например, водородную связь, ковалентную связь, нековалентную связь, солевой мостик, физическое взаимодействие и их комбинации. Такие взаимодействия могут быть определены, например, путем сайт-направленного мутагенеза, рентгеновской кристаллографии, рентгеновской спектроскопии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), оценки поперечных связей, масс-спектроскопии, электрофореза, анализа смещения и их комбинаций. В некоторых примерах взаимодействия могут быть определены .
В некоторых вариантах осуществления соединения и композиции увеличивают активность кошачьего рецептора умами при связывании лиганда с кошачьим рецептором умами.
В одном варианте осуществления соединения взаимодействуют с аминокислотами в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами, содержащем домен Venus Flytrap. В одном примере, композиции стабилизируют замкнутую конформацию домена Venus Flytrap кошачьего рецептора умами.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы модуляции активности кошачьего рецептора умами, включающие контакт композиции с кошачьим рецептором умами, где композиция взаимодействует в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Ser172, Thr149, Thr148, Glu301, Tyr220, Glu170, Asp302, His71, Arg277, His308, Ser306, Ser384, Ala380, His47, Asn69, Asp302, Met383, Ser385, Ile309, Ser107, Asp49 и их комбинаций.
В одном варианте осуществления композиция содержит аминокислоту и взаимодействует в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Ser172, Thr149, Thr148, Glu301, Tyr220, Glu170, Asp302 и их комбинаций.
В других вариантах осуществления композиция содержит нуклеотид или нуклеотидное производное и взаимодействует в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более аминокислотами, выбранным из группы, состоящей из His71, Arg277, His308, Ser306, Ser384, Ala380, His47, Asn69, Asp302, Met383, Ser385, Ile309, Ser107, Asp49 и их комбинаций. Например, нуклеотид или нуклеотидное производное может взаимодействовать с одной, двумя, тремя, четырьмя пятью или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из His71, Arg277, His308, Ser306, Ser384, Ala380, His47, Asn69, Asp302 и их комбинаций.
В определенном варианте осуществления композиция, содержащая нуклеотид или нуклеотидное производное, взаимодействует с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Met383, Ser385, Ile309, Ser107, Asp49 и их комбинаций.
В других вариантах осуществления композиция, содержащая нуклеотид или нуклеотидное производное, взаимодействует, по меньшей мере, с одной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из His71, Arg277, His308, Ser306, Ser384, Ala380, His47, Asn69 и Asp302.
Еще в других вариантах осуществления композиция, содержащая нуклеотид или нуклеотидное производное, взаимодействует по меньшей мере с тремя аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из His71, Arg277, His308, Ser306, Ser384, Ala380, His47, Asn69 и Asp302.
В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая нуклеотид или нуклеотидное производное, взаимодействует с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из His71, His47, Arg277, His308, Ile309, Asn69, Ser107, Asp49 и их комбинаций, где одна или несколько аминокислот в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами взаимодействует с фосфатом нуклеотида или нуклеотидного производного. Например, композиция может взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из His71, His47, His308, Asn69 и их комбинаций. В других примерах, по меньшей мере, одно из взаимодействий осуществляется с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из His71, His47, His308 и Asn69.
В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая нуклеотид или нуклеотидное производное, взаимодействует с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Asp302, Ser306 и их комбинаций, где одна или несколько аминокислот в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами взаимодействуют с сахаром нуклеотида или нуклеотидного производного.
В других вариантах осуществления композиция, содержащая нуклеотид или нуклеотидное производное, взаимодействует с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Ser384, Ser385, Ala380, Met383, Glu170, Asp302 и их комбинаций, где одна или несколько аминокислот в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами взаимодействует с азотистым основанием нуклеотида или нуклеотидного производного. Например, композиция может взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Ser384, Ala380 и Asp302.
В других вариантах осуществления композиция, содержащая нуклеотид или нуклеотидное производное, взаимодействует с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из His71, His47, Arg277, His308, Ile309, Asn69, Ser107, Asp49, Asp302, Ser306, Ser384, Ser385, Ala380, Met383, Glu170, Asp302 и их комбинаций.
Например, композиция может взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из His71, His47, His308 и Asn69.
В других примерах композиция может дополнительно взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Ser384, Ala380 и Asp302.
Еще в других примерах композиция может взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Asp302 и Ser306, и где композиция взаимодействует с двумя или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Ser384, Ser385, Ala380, Met383, Glu170 и Asp302.
В других примерах композиция может взаимодействовать с двумя или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из His71, His47, Arg277, His308, Ile309, Asn69, Ser107 и Asp49. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно взаимодействует с двумя или более аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Ser384, Ser385, Ala380, Met383, Glu170 и Asp302.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает композиции, которые модулируют активность кошачьего рецептора умами, где соединения взаимодействуют с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более аминокислотами в трансмембранном домене семь кошачьего рецептора умами.
В одном варианте осуществления одну или несколько аминокислот выбирают из группы, состоящей из Ala795, Ala796, Asn792, Trp773, Phe776, Ala731, Phe728, Leu730, Phe732, Asn735, Ala689, Ser686, Gln690, Ile693, Cys694, Leu695, Arg634, Gln635, Phe642, Ala639, Ala643, Leu638 и их комбинаций.
Например, композиция может взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Trp773, Phe776, Phe732, Phe728, Leu730, Leu695, Leu638, Phe642 и их комбинаций.
В других примерах, композиция взаимодействует с одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из Trp773, Phe776, Phe732, Phe728, Phe642 и их комбинаций.
В других примерах, композиция взаимодействует с Asn735, Ser686 или с обеими.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ идентификации композиции, которая модулирует активность кошачьего рецептора умами, включающий контакт тестируемого агента с кошачьим рецептором умами, детектирование взаимодействия между тестируемым агентом и одной или несколькими аминокислотами в сайте взаимодействия кошачьего рецептора умами, как описано в настоящем документе, и отбор в качестве композиции тестируемого агента, который взаимодействует с одной или несколькими аминокислотами. Способ может дополнительно включать определение активности кошачьего рецептора умами после контакта тестируемого агента с кошачьим рецептором умами.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает контакт лиганда кошачьего рецептора умами с кошачьим рецептором умами и отбор в качестве композиции тестируемого агента, который увеличивает активность кошачьего рецептора умами.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пищевые продукты, включающие композицию, которая модулирует активность кошачьего рецептора умами, как описано в настоящем документе, где композиция присутствует в пищевом продукте в концентрации примерно от 0,0001 масс.% примерно до 10 масс.%. В других вариантах осуществления композиция присутствует в пищевом продукте в концентрации примерно от 0,001 м.д. примерно до 1000 м.д. В других вариантах осуществления композиция присутствует в пищевом продукте в концентрации примерно от 1 мкМ примерно до 1 М.
В некоторых вариантах осуществления композиция присутствует в количестве, эффективном для повышения вкусовой привлекательности пищевого продукта, как определено панелью дегустаторов вкуса.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ увеличения интенсивности вкуса умами в пищевом продукте, включающий смешивание пищевого продукта с композициями, описанными в настоящем документе, где композиция присутствует в смеси в концентрации примерно от 0,0001 масс.% примерно до 10 масс.%. В других вариантах осуществления композиция присутствует в смеси в концентрации примерно от 0,001 м.д. примерно до 1000 м.д. В других вариантах осуществления композиция присутствует в смеси в концентрации примерно от 1 мкМ примерно до 1 М.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы получения пищевого продукта, содержащего композицию, описанную в настоящем документе, где способ включает термическую обработку предшественника пищевого продукта, где композицию получают во время термической обработки. Примеры термической обработки включают, например, стерилизацию, перегонку в реторте, экструзию, литье под давлением или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления пищевые продукты, описанные в настоящем документе, содержат пищевые продукты для домашних животных, например пищевые продукты для кошек, такие как влажные и/или сухие пищевые продукты для кошек. В других примерах пищевые продукты для домашних животных содержат пищевые продукты для собак, такие как влажные и/или сухие пищевые продукты для собак.
В других вариантах осуществления пищевые продукты, описанные в настоящем документе, содержат пищевые продукты для человека.
Вышеизложенное довольно широко описывает особенности и технические преимущества настоящей заявки, чтобы более подробное описание, которое следует ниже, могло быть более понятно. Дополнительные функции и преимущества заявки будут описаны ниже, которые составляют объект формулы заявки. Специалистам в данной области должно быть понятно, что раскрытая концепция и конкретный вариант осуществления могут быть легко использованы в качестве основы для модификации или проектирования других структур для выполнения тех же целей настоящей заявки. Специалистам в данной области также должно быть понятно, что такие эквивалентные конструкции не выходят за рамки сущности и объема заявки, как изложено в прилагаемой формуле изобретения. Новые признаки, которые, как полагают, являются характерными для заявки как в отношении их организации, так и способа работы, вместе с другими объектами и преимуществами будут лучше поняты из следующего описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
in vitro
На Фигуре 1 показаны кривые дозовой зависимости для гуанозинмонофосфата (GMP) в качестве тестируемого соединения для активации кошачьего рецептора умами T1R1/T1R3 . На данной фигуре (а также на фигурах 2-12, 14 и 38-45 показаны четыре кривые: тестируемое соединение в буфере, тестируемое соединение в буфере с 20 мМ аланином, тестируемое соединение в буфере с 0,2 мМ IMP и тестируемое соединение в 20 мМ аланина и 0,2 мМ IMP. Горизонтальные оси представляют собой концентрации тестируемого соединения в мМ. Вертикальными осями являются рецепторные ответы, измеренные в виде ΔF/F во флуоресцентном анализе или в виде Lum в анализе люминесценции.
На Фигуре 2 показаны кривые дозовой зависимости для 2'-деоксиаденозин-3',5'-O-бисфосфата.
На Фигуре 3 показаны кривые дозовой зависимости для натриевой соли инозин-5'-дифосфата (IDP).
На Фигуре 4 показаны кривые дозовой зависимости для 2'-/3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил)аденозин-5'-O-монофосфата.
На Фигуре 5 показаны кривые дозовой зависимости для 2'-/3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил) гуанозин-5'-O-монофосфата.
На Фигуре 6 показаны кривые дозовой зависимости для тринатриевой соли инозин трифосфата (ITP).
На Фигуре 7 показаны кривые дозовой зависимости для N6-бензоиладенозин-5'-О-монофосфата.
На Фигуре 8 показаны кривые дозовой зависимости для дилитиевой соли аденозин-5'-O-тиомонофосфата.
На Фигуре 9 показаны кривые дозовой зависимости для натриевой соли аденозин-3',5'-дифосфата и аланина (1:1000).
На Фигуре 10 показаны кривые дозовой зависимости для натриевой соли аденозин-3',5'-дифосфата и аланина (1:100).
На Фигуре 11 показаны кривые дозовой зависимости для натриевой соли аденозин-3',5'-дифосфата и аланина (1:10).
На Фигуре 12 показаны кривые дозовой зависимости для натриевой соли аденозин-3',5'-дифосфата.
На Фигуре 13 показаны кривые дозовой зависимости для инозин монофосфата (IMP) для активации кошачьего T1R1/T1R3. IMP использовали в качестве контроля для экспериментов, описанных на Фигурах 1-13 и 38-45.
На Фигуре 14 показана общая структурная модель домена VFT кошачьего T1R1/T1R3, связанного с IMP и L-аланином. Показано, что L-аланин и IMP связываются в активном сайте между верхней и нижней глобулами домена VFT.
На Фигуре 15 показана модель кошачьего VFT T1R1, связанного с L-аланином. L-аланин связывается с шарнирной областью домена VFT. Предполагаемые водородные связи, солевой мостик и Pi-катионные взаимодействия показаны между L-аланином и следующими аминокислотами T1R1: Thr149, Ser172, Tyr220, Thr148, Glu170 и Asp302. Взаимодействия показаны пунктирными линиями. Glu170 и Asp302 координируют цвиттерионный азот связанных аминокислот при электростатически невыгодном связывании L-глутамата и L-аспарагиновой кислоты, нативных лигандов для рецептора умами человека.
in silico
На Фигуре 16 показана -модель кошачьего VFT T1R1, связанного с GMP. Предполагаемые взаимодействия водородной связи и солевого мостика показаны пунктирными линиями между фосфатом GMP и His47, His71, Arg277 и Asn69; Сахаром GMP и Asp302 и Ser306; и основанием GMP и Ser384, His308 и Ala380.
in silico
На Фигуре 17 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует, что Asp302 из T1R1 могут одновременно координировать цвиттерионный азот остова связанной аминокислоты (L-аланин слева) и молекулу сахара связанного нуклеотида (GMP справа).
in silico
На Фигуре 18 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным 3',5'-дифосфатом.
in silico
На Фигуре 19 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным XMP.
in silico
На Фигуре 20 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным N-ацетил-5'-GMP.
in silico
На Фигуре 21 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным 2'-3'-AEC-5'-AMP.
in silico
На Фигуре 22 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным 5'd-GMPS.
in silico
На Фигуре 23 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным 5'-O-2-тиодифосфатом.
in silico
На Фигуре 24 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным 6-тиогуанозин-5'-O-монофосфатом.
in silico
На Фигуре 25 показана -модель кошачьего VFT T1R1, которая демонстрирует предполагаемые взаимодействия между T1R1 и связанным CMP.
in silico
На Фигуре 26 показана -модель кошачьего VFT T1R1, связанного с аденозин-3',5'-дифосфатом. Предполагаемые взаимодействия водородной связи и солевого мостика показаны пунктирными линиями между фосфатами аденозин-3',5'-дифосфата и His71, His47, Asn69, Arg281, Arg277, His308 и Ile309; сахаром аденозин-3',5'-дифосфата и Asp302 и Ser306; и основанием аденозин-3',5'-дифосфата и Ser384.
in silico
На Фигуре 27 показана -модель трансмембранного домена кошачьего T1R1. Трансмембранное соединение, метиловый эфир N-бензил-L-фенилаланина, показано закрепленным внутри трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 28 показана -модель метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 29 показана -модель 2-амино-N-фенетилбензамида, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 30 показана -модель N-(2-(1H-индол-3-ил)этил)никотинамида, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 31 показана -модель 1-бензил-3-(2-(5-хлортиофен-2-ил)-2-оксоэтил)имидазолидин-2,4,5-триона, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 32 показана -модель этил(2,2-дифенилацетил)карбамата, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 33 показана -модель 2-((3,5-дихлорфенил)карбамоил)циклогексанкарбоновой кислоты, закрепленной в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 34 показана -модель N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 35 показана -модель 1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил)имидазолидин-2,4,5-триона, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
in silico
На Фигуре 36 показана -модель производного 1Н-имидазо[4,5-с]пиридин-2(3H)-она, закрепленного в трансмембранной области T1R1.
На Фигуре 37 показаны кривые дозовой зависимости для 1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил)имидазолидин-2,4,5-триона.
На Фигуре 38 показаны кривые дозовой зависимости для 1-(2-бромфенил)-3-((1R,2S)-2-гидрокси-2,3-дигидро-1Н-инден-1-ил)мочевины.
На Фигуре 39 показаны кривые дозовой зависимости для N-(бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-2-пропилпентанамида.
На Фигуре 40 показаны кривые дозовой зависимости для N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида.
На Фигуре 41 показаны кривые дозовой зависимости для N-(2-амино-2-оксо-1-фенилэтил)-3-хлор-4,5-диметоксибензамида.
На Фигуре 42 показаны кривые дозовой зависимости для (E)-3-(4-метоксифенил)-N-(пентан-3-ил)акриламида.
На Фигуре 43 показаны кривые дозовой зависимости для 2-((5-(4-(метилтио)фенил)-2H-тетразол-2-ил)метил)пиридина.
На Фигуре 44 показаны кривые дозовой зависимости для N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида в присутствии GMP и фенилаланина.
На Фигуре 45 показан график, отображающий значения ΔF/F0 для N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида в присутствии GMP и фенилаланина.
На Фигуре 46 показаны кривые дозовой зависимости для положительного и отрицательного контролей при активации кошачьего T1R1/T1R3 для экспериментов, описанных на Фигурах 1-14 и 38-45. Кривые дозовой зависимости для аминокислот определяли в присутствии 0,2 мМ IMP. Кривые дозовой зависимости для нуклеотидов определяли в присутствии 20 мМ аланина.
in silico
На Фигуре 47 показана -модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
in silico
На Фигуре 48 показана -модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
in silico
На Фигуре 49 показана -модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
На Фигуре 50 показана in silico-модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
На Фигуре 51 показана in silico-модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
На Фигуре 52 показана in silico-модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
На Фигуре 53 показана in silico-модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
На Фигуре 54 показана in silico-модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
На Фигуре 55 показана in silico-модель трансмембранного соединения, закрепленного в трансмембранной области T1R1, в соответствии с одним примерным вариантом осуществления раскрытого объекта.
На Фигуре 56A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 1,3-дибензилпиримидин-2,4,6(1H,3H,5H)-трионом в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (В) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 1,3-дибензилпиримидин-2,4,6(1H,3H,5H)-трионом в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP, или обоих 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 57А-В показано (А) активация T1R1/T1R3 с помощью 4-бензил-3-бутил-1-(2-оксо-2-(пирролидин-1-ил)этил)-1Н-1,2,4-(4H)-она в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью 4-бензил-3-бутил-1-(2-оксо-2-(пирролидин-1-ил)этил)-1Н-1,2,4-триазол-5(4Н)-она в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 58А-В показана (А) активация T1R1/T1R3 с помощью 2-((3,5-дихлорфенил)карбамоил)циклогексанкарбоновой кислоты в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью 2-((3,5-дихлорфенил)карбамоил)циклогексанкарбоновой кислоты индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP,
На Фигуре 59А-В показана (А) активация T1R1/T1R3 с помощью 4-ацетамидо-N-(1-(2-гидроксиэтил)-3-фенил-1Н-пиразол-5-ил)бензамида в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью 4-ацетамидо-N-(1-(2-гидроксиэтил)-3-фенил-1Н-пиразол-5-ил)бензамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 60A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 с помощью этилового эфира (дифенилацетил)карбаминовой кислоты в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью (Дифенилацетил)карбаминовой кислоты индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 61А-В показана (А) активация T1R1/T1R3 с помощью N,N'-(бутан-1,4-диил)диникотинамида в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (В) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью N,N'-(бутан-1,4-диил)диникотинамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или 20 мМ L-аланина и 0,2 ММ IMP.
На фигуре 62A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 с помощью N-фенэтилникотинамида в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью N-фенэтилникотинамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 63A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 с помощью 2-амино-N-фенэтилбензамидом в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью 2-амино-N-фенэтилбензамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 64A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 с помощью N-фенэтилбензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью N-фенэтилбензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих 20 мМ L-аланина И 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 65A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 с помощью N-фенэтилбензамида в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью N-фенэтилбензамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 66А-В показана (А) активация T1R1/T1R3 с помощью N-бензоил-DL-лейцинамида в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью N-бензоил-DL-лейцинамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих, 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 67А-В показана (А) активация T1R1/T1R3 с помощью N-(2-(1Н-индол-3-ил)этил)никотинамида в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (В) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью N-(1Н-индол-3-ил)этил)никотинамида индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих, 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 68A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 с помощью гидрохлорида сложного метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью гидрохлорида сложного метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих, 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 69A-B показана (A) активация T1R1/T1R3 с помощью 6-тиогуанозин-5'-О-дифосфата (6-T-GDP) в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью 6-тиогуанозин-5'-О-дифосфата (6-T-GDP) индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих, 20 мМ L -аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 70А-В показана (А) активация T1R1/T1R3 с помощью 6- хлорпуринрибозид-5'-О-трифосфата (6-Cl-PuTP) в присутствии 20 мМ L-аланина или 0,2 мМ IMP и (B) кривые дозовой зависимости для активации T1R1/T1R3 с помощью 6-хлорпурин-рибозид-5'-O-трифосфата (6-Cl-PuTP) индивидуально в буфере или в присутствии 20 мМ L-аланина, 0,2 мМ IMP или обоих, 20 мМ L-аланина и 0,2 мМ IMP.
На Фигуре 71 показаны кривые дозовой зависимости для положительного и отрицательного контролей при активации кошачьего T1R1/T1R3 для экспериментов, описанных на Фигурах 57-75. Кривые дозовой зависимости для аминокислот определяли в присутствии 0,2 мМ IMP. Кривые дозовой зависимости для нуклеотидов определяли в присутствии 20 мМ аланина.
На Фигуре 72A-D показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью трансмембранного соединения, 1-бензил-3-(2-(3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]диоксепин-7-ил)-2-оксоэтил)имидазолидин-2,4,5-триона индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) и (C) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). (D) показывает графическое представление данных из обоих (A) и (B). Трансмембранное соединение проявляло активность PAM.
На Фигуре 73A-F показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью трансмембранного соединения 1-бензил-3-(2-(5-хлортиофен-2-ил)-2-оксоэтил)имидазолидин-2,4,5-триона индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) и (C) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). (D) показывает графическое представление данных из обоих (A) и (B). (E) и (F) показывают кривые дозовой зависимости для трансмембранного соединения, поскольку концентрацию GMP поддерживали постоянной, а концентрацию Ala варьировали, а когда концентрацию Ala поддерживали постоянной, то варьировали концентрацию GMP в клетках, экспрессирующих T1R1/T1R3 (индуцированные), и в пустых контрольных клетках, которые не экспрессировали T1R1 (не индуцированные). Трансмембранное соединение проявляло активность PAM.
На Фигуре 74A-E показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью трансмембранного соединения N-(гептан-4-ил бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). На (C) показано графическое представление данных из (A) и (B). На (D) и (E) показаны кривые дозовой зависимости для трансмембранного соединения, поскольку концентрацию GMP поддерживали постоянной, а концентрацию Ala варьировали, а когда концентрацию Ala поддерживали постоянной, то варьировали концентрацию GMP в клетках, экспрессирующих T1R1/T1R3 (индуцированные, (D)), и в пустых контрольных клетках, которые не экспрессировали T1R1 (не индуцированные, (E)). Трансмембранное соединение проявляло активность агониста и PAM.
На Фигуре 75A-E показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью транс-мембранного соединения гидрохлорида метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина (оценка профиля агониста) и (B) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). На (C) показано графическое представление данных из (A) и (B). На (D) и (E) показаны кривые дозовой зависимости для трансмембранного соединения, поскольку концентрацию GMP поддерживали постоянной, а концентрацию Ala варьировали, и когда концентрацию Ala поддерживали постоянной, а концентрацию GMP варьировали в клетках, экспрессирующих T1R1/T1R3 (индуцированные, (D)), и в пустых контрольных клетках, которые не экспрессировали T1R1 (неиндуцированные, (E)). Трансмембранное соединение проявляет активность агониста и PAM.
На Фигуре 76A-E показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью трансмембранного соединения гидрохлорида метилового эфира N-бензил-D-фенилаланина индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). На (C) показано графическое представление данных из (A) и (B). На (D) и (E) показаны кривые дозовой зависимости для трансмембранного соединения, когда концентрацию GMP поддерживали постоянной и варьировали концентрацию Ala, и когда концентрацию Ala поддерживали постоянной и варьировали концентрацию GMP в клетках, экспрессирующих T1R1/T1R3 (индуцированные, (D)), и в пустых контрольных клетках, которые не экспрессировали T1R1 (неиндуцированные, (E)). Трансмембранное соединение проявляет активность агониста и PAM.
На Фигуре 77A-E показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью трансмембранного соединения гидрохлорида метилового эфира бензил-L-лейцина индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM), на (C) показано графическое представление данных из (A) и (B). На (C) и (E) показаны кривые дозовой зависимости для трансмембранного соединения, когда концентрацию GMP поддерживали постоянной и варьировали концентрацию Ala, и когда концентрацию Ala поддерживали постоянной и варьировали концентрацию GMP в клетках, экспрессирующих T1R1/T1R3 (индуцированные, (D)), и в пустых контрольных клетках, которые не экспрессировали T1R1 (неиндуцированные, (E)). Трансмембранное соединение проявляет активность агониста и PAM.
На Фигуре 78A-E показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью трансмембранного соединения Метил-2-бензиламино-2-фенилацетата индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). На (C) показано графическое представление данных из (A) и (B). На (D) и (E) показаны кривые дозовой зависимости для трансмембранного соединения, когда концентрацию GMP поддерживали постоянной и варьировали концентрацию Ala, и когда концентрацию Ala поддерживали постоянной и варьировали концентрацию GMP в клетках, экспрессирующих T1R1/T1R3 (индуцированные, (D)), и в пустых контрольных клеток, которые не экспрессировали T1R1 (неиндуцированные, (E)). Трансмембранное соединение проявляет активность агониста и PAM.
На Фигуре 79А-Е показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью транс-мембранного соединения, гидрохлорида бензилового эфира L-фенилаланина, индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). На (C) показано графическое представление данных из (A) и (B). На (D) и (E) показаны кривые дозовой зависимости для трансмембранного соединения, когда концентрацию GMP поддерживали постоянной и варьировали концентрацию Ala, и когда концентрацию Ala поддерживали постоянной и варьировали концентрацию GMP в клетках, экспрессирующих T1R1/T1R3 (индуцированные, (D)), и в пустых контрольных клетках, которые не экспрессировали T1R1 (неиндуцированные, (E)). Трансмембранное соединение проявляет активность агониста и PAM.
На Фигуре 80A-B показана активация T1R1/T1R3: (A) с помощью трансмембранного соединения 1,3-дибензилпиримидин-2,4,6(1H,3H,5H)-триона индивидуально (оценка профиля агониста) и (B) в присутствии GMP и аланина (оценка профиля PAM). Трансмембранное соединение проявляет агонистическую активность.
На Фигуре 81 показана последовательность нуклеиновой кислоты кошачьего рецептора T1R1 (SEQ ID NO: 1).
На Фигуре 82 показана аминокислотная последовательность кошачьего рецептора T1R1 (SEQ ID NO: 2).
На Фигуре 83 показана последовательность нуклеиновой кислоты кошачьего рецептора T1R3 (SEQ ID NO: 3).
На Фигуре 84 показана аминокислотная последовательность кошачьего рецептора T1R3 (SEQ ID NO: 4).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
На сегодняшний день остается потребность в модификаторе вкуса, который может обеспечить желаемый уровень вкуса умами для увеличения и/или улучшения вкусовой привлекательности различных пищевых продуктов для домашних кошек. Настоящая заявка относится к ароматизирующим композициям, которые включают, по меньшей мере, одно нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение. Ароматизирующие композиции можно использовать для повышения вкусовой привлекательности и/или улучшения или изменения вкуса различных пищевых продуктов для домашних животных, таких как полноценный корм для домашних животных. В некоторых вариантах осуществления ароматизирующие композиции можно использовать для увеличения вкуса умами пищевого продукта для домашних животных. Ароматизирующие композиции могут дополнительно включать комбинации соединений, включающих нуклеотиды и/или аминокислоты, и могут быть добавлены в пищевые продукты для домашних животных в различных форматах систем доставки.
1. Определения
Термины, используемые в этом описании, как правило, имеют свои обычные значения в уровне техники в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, где используется каждый термин. Определенные термины обсуждаются ниже или в другом месте описания, чтобы предоставить дополнительные указания практикующему специалисту в описании композиций и способов изобретения, и в том, что касается их получения и применения.
При использовании в настоящем документе, использование слова «a» или «an» в сочетании с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или в описании может означать «один», но это также согласуется со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более чем один». Кроме того, термины «имеющий», «включающий», «содержащий(containing)» и «содержащий (comprising)» являются взаимозаменяемыми, и специалисту в данной области понятно, что эти термины не являются ограничивающими.
Термин «примерно» или «приблизительно» означает допустимый диапазон погрешностей для конкретного значения, определенного специалистом в данной области техники, который будет частично зависеть от способа измерения или определения значения, то есть от ограничений системы измерений. Например, «примерно» может означать в пределах 3 или более чем 3 стандартных отклонения в соответствии с практикой в данной области техники. Альтернативно, «примерно» может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% и еще более предпочтительно до 1% от заданного значения. Альтернативно, особенно в отношении биологических систем или процессов, этот термин может означать диапазон порядка значения, предпочтительно диапазон до 5 раз и, более предпочтительно, диапазон до 2 раз от значения.
При использовании в настоящем документе, «вкус» относится к ощущению, вызванному активацией или ингибированием рецепторных клеток в полости рта объекта. В некоторых вариантах осуществления вкус может быть выбран из группы, состоящей из сладкого, кислого, соленого, горького, кокуми и умами. В некоторых вариантах осуществления «вкус» может включать вкус свободной жирной кислоты. См., например, публикацию Cartoni et al., J. of Neuroscience, 30 (25): 8376-8382 (2010), содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления вкус проявляется у объекта посредством «вещества, стимулирующего вкусовые ощущения». В некоторых вариантах осуществления вещество, стимулирующее вкусовые ощущения, является синтетическим веществом, стимулирующим вкусовые ощущения. В некоторых вариантах осуществления вещество, стимулирующее вкусовые ощущения, готовят из природного источника.
При использовании в настоящем документе, «профиль вкуса» относится к комбинации вкусов, таких как, например, один или более из сладкого, кислого, соленого, горького, умами, кокуми и вкуса свободной жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления профиль вкуса получают с помощью одного или нескольких веществ, стимулирующих вкусовые ощущения, которые присутствуют в композиции с одинаковыми или разными концентрациями. В некоторых вариантах осуществления профиль вкуса относится к интенсивности вкуса или комбинации вкусов, например, сладкого, кислого, соленого, горького, умами, кокуми и вкуса свободной жирной кислоты, которые детектируются объектом или любым анализом, известным в данной области. В некоторых вариантах осуществления модификация, изменение или вариация комбинации веществ, стимулирующих вкусовые ощущения, в профиле вкуса может изменить сенсорный опыт объекта.
В некоторых вариантах осуществления термин «послевкусие» относится к интенсивности вкуса пищевого продукта, который воспринимается после удаления пищевого продукта изо рта или полости рта.
Используемый в настоящем документе термин «ароматизатор» относится к одному или нескольким сенсорным стимулам, таким как, например, один или несколько вкусовых (taste) (вкусовых (gustatory)), обонятельных (smell) (обонятельных (olfactory)), сенсорных (тактильных) и температурных (термических) раздражителей. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления сенсорный опыт объекта, подвергаемого воздействию ароматизатора, может быть классифицирован как характерный опыт для конкретного ароматизатора. Например, ароматизатор может быть идентифицирован объектом, но не ограничиваясь этим, как цветочный, цитрусовый, ягодный, ореховый, карамельный, шоколадный, перечный, дымный, сырный, мясной и т.д., ароматизатор. При использовании в настоящем документе, ароматизирующая композиция может быть выбрана из жидкости, раствора, сухого порошка, спрея, пасты, суспензии и любой их комбинации. Ароматизатором может быть натуральная композиция, искусственная композиция, идентичная натуральной или любая их комбинация.
Используемые в настоящем документе как взаимозаменяемые, термины «аромат» и «запах» относятся к обонятельному ответу на раздражитель. Например, и не в качестве ограничения, аромат может быть получен с помощью ароматизирующих веществ, которые воспринимаются обонятельными рецепторами обонятельной системы.
Используемый в настоящем документе термин «профиль вкуса» относится к комбинации сенсорных раздражителей, например, вкусов, таких как сладкий, кислый, горький, соленый, умами, кокуми и вкусы свободных жирных кислот, и/или обонятельных, тактильных и/или термических раздражители. В некоторых вариантах осуществления профиль ароматизаторов содержит один или несколько ароматизаторов, которые вносят вклад в сенсорный опыт объекта. В некоторых вариантах осуществления модификация, изменение или вариация комбинации раздражителей в профиле ароматизаторов может изменять сенсорный опыт объекта.
Используемый в настоящем документе термин «смешивание», например, «смешивание ароматизирующей композиции или их комбинация согласно настоящей заявке вместе с пищевым продуктом» относится к способу, где ароматизирующую композицию или индивидуальные компоненты ароматизирующей композиции смешивают или добавляют к готовому продукту или смешивают с некоторыми или со всеми компонентами продукта во время образования продукта, или термин относится к некоторой комбинации этих стадий. При использовании в контексте смешивания термин «продукт» относится к продукту или любому из его компонентов. Эта стадия смешивания может включать способ, выбранный из стадии добавления ароматизирующей композиции к продукту, распыления ароматизирующей композиции на продукту, покрытия композиции ароматизатора на продукт, суспендирования продукта в ароматизирующей композиции, нанесения ароматизирующей композиции в виде краски на продукт, намазывания ароматизирующей композиции на продукт, инкапсулирования ароматизирующей композиции в продукте, смешивания ароматизирующей композиции с продуктом и любую их комбинацию. Ароматизирующая композиция может представлять собой раствор, жидкость, сухой порошок, спрей, пасту, суспензию и любую их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения ароматизирующей композиции могут быть получены во время термической обработки пищевого продукта для домашних животных, например стерилизации, перегонки с ретортой, литьевого формования и/или экструзии из соединений-предшественников, присутствующих в пищевом продукте для домашних животных. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение ароматизирующей композиции могут быть получены во время обработки пищевого продукта для домашних животных, и в пищевой продукт для домашних животных могут быть добавлены путем смешивания дополнительные компоненты ароматизирующей композиции, например нуклеотид и/или аминокислота.
Используемый в настоящем документе термин «м.д.» означает миллионные доли и является относительным массовым параметром. Миллионная доля представляет собой микрограмм на грамм, так что компонент, который присутствует в количестве 10 м.д., присутствует как 10 мкг специфического компонента на 1 грамм агрегатной смеси.
Используемый в настоящем документе термин «вкусовая привлекательность» может относиться к общей готовности человека или животного, не являющегося человеком, например, домашнего питомца, есть определенный пищевой продукт. Увеличение «вкусовой привлекательности» пищевого продукта может привести к увеличению удовольствия и принятия пищи человеком или животным, не являющимся человеком, гарантируя то, что человек или животное, не являющееся человеком, будет питаться «здоровым количеством» пищи. Используемый в настоящем документе термин «здоровое количество» пищевого продукта относится к количеству, которое позволяет человеку или животному, не являющемуся человеком, поддерживать или достигать потребления, вносящего вклад в его общее состояние здоровья с точки зрения питательных микроэлементов, питательных макроэлементов и калорий, например, так как изложено в «Mars Petcare Essential Nutrient Standards». В некоторых вариантах осуществления «вкусовая привлекательность» может означать относительное предпочтение человека или животного, не являющегося человеком, в отношении одного пищевого продукта над другим. Например, когда у человека или животного, не являющегося человеком, предпочтение отдается одному из двух или более пищевых продуктов, предпочтительный пищевой продукт более «приятен» и обладает «улучшенной вкусовой привлекательностью». В некоторых вариантах осуществления относительная вкусовая привлекательность одного пищевого продукта по сравнению с одним или несколькими другими пищевыми продуктами может быть определена, например, с помощью сравнения по свободному выбору, например, с помощью относительного потребления пищевых продуктов или других подходящих мер предпочтения, указывающих на вкусовую привлекательность. Вкусовая привлекательность может быть определена с помощью стандартного протокола тестирования, в котором животное имеет равный доступ к обоим пищевым продуктам, такого как тест, называемый «тестом с двумя чашами», или «сравнительный тест». Такое предпочтение может возникать из любых ощущений животного, но может быть связано, помимо прочего, с вкусом, послевкусием, запахом, ощущением во рту и/или текстурой.
Термин «корм для домашних животных» или «пищевой продукт для домашних животных» означает продукт или композицию, предназначенную для потребления домашним животным, таким как кошки, собаки, морские свинки, кролики, птицы и лошади. Например, но не для ограничения, домашнее животное может быть «домашней» кошкой, такой как Felis domesticus. В некоторых вариантах осуществления домашнее животное может быть «домашней» собакой, например Canis lupus familiaris. «Корм для домашних животных» или «пищевой продукт для домашних животных» включает в себя любые пищевые продукты, корм, закуски, пищевые добавки, жидкости, напитки, угощения, игрушки (жевательные и/или пригодные к потреблению игрушки), заместители или заменители еды.
Термин «пища для человека» или «пищевой продукт для человека» означает продукт или композицию, предназначенную для потребления человеком. «Пища для человека» или «пищевой продукт для человека» включает в себя любые продукты питания, пищу, закуски, пищевые добавки, жидкости, напитки, угощения, игрушки (жевательные и/или пригодные к потреблению игрушки), заместители или заменители еды.
В некоторых вариантах осуществления «пищевой продукт» включает в себя пищевые продукты для человека и/или для домашних животных.
Используемый в настоящем документе термин «полноценно питательный» относится к пищевому продукту, например, пищевому продукту для домашних животных, который содержит все известные требуемые питательные вещества для предполагаемого получателя пищевого продукта в соответствующих количествах и пропорциях, основанных, например, на рекомендациях признанных или компетентных органов в области кормления домашних животных. Таким образом, такие пищевые продукты могут служить единственным источником питания для поддержания жизни без добавления дополнительных источников питания.
Используемый в настоящем документе термин «ароматизирующая композиция» относится, по меньшей мере, к одному соединению или его биологически приемлемой соли, которое модулирует, включая усиление, умножение, потенцирование, уменьшение, подавление или индуцирование, вкусы, запахи, ароматы и/или текстур природного или синтетического вещества, стимулирующего вкусовые ощущения, вкусовой профиль, ароматизирующий профиль и/или текстурный профиль у животного или человека. В некоторых вариантах осуществления ароматизирующая композиция содержит комбинацию соединений или их биологически приемлемых солей. В некоторых вариантах осуществления ароматизирующая композиция содержит одно или несколько вспомогательных веществ.
Используемый в настоящем документе термин «агонист» относится, по меньшей мере, к одному соединению или его биологически приемлемой соли, которое модулирует, включая усиление, умножение, потенцирование или индуцирование, активность рецептора, с которым он связывается, или взаимодействует каким-либо иным образом. В некоторых вариантах осуществления этот термин используется для описания соединений, которые действуют самостоятельно для активации рецептора, или для описания соединений «положительного аллостерического модулятора» (также известных как «РАМ»), которые положительно усиливают действие других агонистов.
Используемый в настоящем документе термин «синергия», «синергично» или «синергический эффект» относится к эффекту, создаваемому двумя или более отдельными компонентами, где суммарный эффект, производимый этими компонентами при их использовании в комбинации, больше, чем сумма индивидуальных эффектов каждого компонента, действующего индивидуально. Используемый в настоящем документе термин «синергически эффективный» относится к любому комбинированному количеству нуклеотидного производного и/или трансмембранного соединения и дополнительного соединения (например, аминокислоты, нуклеотида или соединения, которое связывается с трансмембранными доменами T1R1 или T1R3 (см., например, Zhang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2008 Dec 30, 105 (52): 20930-4, Epub 2008 Dec 22)), которое демонстрирует синергическую активацию рецептора T1R1/T1R3 или увеличенную вкусовую привлекательность пищевого продукта для домашних животных.
1
20
1
6
Термин «алкил» относится к линейной или разветвленной углеводородной группе С-С (предпочтительно С-С), состоящей исключительно из атомов углерода и водорода, не содержащей ненасыщенных связей, и которая присоединена к остальной части молекулы с помощью одинарной связи, например, метил, этил, n-пропил, 1-метилэтил (изопропил), n-бутил, n-пентил, 1,1-диметилэтил (трет-бутил).
2
20
2
12
Термин «алкенил» относится к алифатической углеводородной группе C-C (предпочтительно C-C), содержащей, по меньшей мере, одну углерод-углеродную двойную связь, и которая может быть прямой или разветвленной цепью, например, представляет собой этенил, 1-пропенил, 2-пропенил (аллил), изопропенил, 2-метил-1-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил.
2
20
2
12
Термин «алкинил» относится к алифатической углеводородной группе С-С (предпочтительно С-С), содержащей по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, и которая может быть прямой или разветвленной цепью, например этинил, 1-пропинил, 2-пропинил,
3
6
6
15
Термин «циклоалкил» означает ненасыщенную, неароматическую моно- или полициклическую углеводородную кольцевую систему (содержащую, например, C-C), такую как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил. Примеры мультициклических циклоалкильных групп (содержащих, например, C-C) включают пергидронафтильную, адамантильную и норборнильную группы с мостиковой циклической группой или спиробициклическими группами, например, спиро(4,4)нон-2-ил.
Термин «циклоалкалкил» относится к циклоалкилу, как определено выше, непосредственно присоединенному к алкильной группе, как определено выше, что приводит к созданию стабильной структуры, такой как циклопропилметил, циклобутилэтил или циклопентилэтил.
Термин «эфирный» относится к алкильной группе или циклоалкильной группе, как определено выше, содержащей, по меньшей мере, один кислород, включенный в алкильную цепь, например метилэтиловый эфир, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран. Такие группы также могут быть описаны как алкоксиалкильные или алкоксициклоалкильные группы.
Термин «аминоалкил» относится к алкильной группе или циклоалкильной группе, как определено выше, содержащей, по меньшей мере, один атом азота, например n-бутиламин и тетрагидрооксазин.
Термин «арил» относится к ароматическим радикалам, имеющим в диапазоне примерно от 6 примерно до 14 атомов углерода, к таким как фенил, нафтил, тетрагидронаптил, инданил, бифенил.
2
6
5
2
4
6
5
Термин «арилалкил» относится к арильной группе, как определено выше, непосредственно связанной с алкильной группой, как определено выше, например -CHCH и -CHCH.
Термин «гетероциклический» относится к стабильному 3-15-членному кольцевому радикалу, который состоит из атомов углерода и одного или более, например, от одного до пяти гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. Для целей настоящей заявки гетероциклический кольцевой радикал может быть моноциклической или бициклической кольцевой системой, которая может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, а атомы азота, углерода, кислорода или серы в гетероциклическом кольцевом радикале могут быть необязательно окислены до различной степени окисления. Кроме того, атом азота может быть необязательно кватернизован; и кольцевой радикал может быть частично или полностью насыщенным, или кольцевой радикал может быть полностью ненасыщенным (т.е. гетероароматическим или гетероарильным ароматическим). Гетероциклический кольцевой радикал может быть присоединен к основной структуре по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к созданию стабильной структуры.
Термин «гетероарил» относится к гетероциклическому кольцу, в котором кольцо является ароматическим.
Термин «гетероарилалкил» относится к радикалу гетероарильного кольца, как определено выше, непосредственно связанному с алкильной группой. Гетероарилалкильный радикал может быть присоединен к основной структуре по любому атому углерода из алкильной группы, что приводит к созданию стабильной структуры.
Термин «гетероциклил» относится к радикалу гетероциклического кольца, как определено выше. Гетероциклический кольцевой радикал может быть присоединен к основной структуре по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к созданию стабильной структуры.
В некоторых вариантах осуществления термин «рецептор умами» относится к рецептору, сопряженному с G-белком (GPCR), например, к GPCR T1R1/T1R3. Рецептор умами может быть, например, рецептором умами кошки, собаки, человека или млекопитающего, не являющегося человеком.
В некоторых вариантах осуществления кошачий T1R1 представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере, на 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80 процентов, (гомология в качестве термина, используемого в настоящем документе, может быть измерена с использованием стандартного программного обеспечения, такого как BLAST или FASTA), и кодируется, например, нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или последовательностью, гомологичной ей, по меньшей мере, на 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80 процентов (гомология в качестве термина, используемого в настоящем документе, может быть измерена с использованием стандартного программного обеспечения, такого как BLAST или FASTA).
В некоторых вариантах осуществления кошачий T1R3 представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, или последовательность, гомологичную ей, по меньшей мере, на 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80 процентов, (гомология в качестве термина, используемого в настоящем документе, может быть измерена с использованием стандартного программного обеспечения, такого как BLAST или FASTA), и кодируется, например, нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или последовательностью, гомологичной ей, по меньшей мере, на 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80 процентов (гомология в качестве термина, используемого в настоящем документе, может быть измерена с использованием стандартного программного обеспечения, такого как BLAST или FASTA).
2. Нуклеотидные производные
in silico
Настоящее изобретение относится к ароматизирующим композициям, которые включают, по меньшей мере, одно нуклеотидное производное. В некоторых в вариантах осуществления нуклеотидное производное представляет собой соединение, усиливающее вкус умами. Нуклеотидные производные, раскрытые в настоящем документе, идентифицировали с помощью -моделирования нуклеотидных производных в связывающем кармане кошачьего рецептора T1R1/T1R3 («рецептор умами»). Ароматизирующие композиции можно использовать для усиления или изменения вкусовой привлекательности, вкуса или аромата пищевого продукта для домашних животных. Ароматизирующие композиции могут включать комбинации соединений, например комбинации одного или нескольких нуклеотидных производных и/или одной или нескольких аминокислот и/или одного или нескольких нуклеотидов и/или одного или нескольких трансмембранных соединений, как описано в настоящем документе, и могут быть добавлены в композиции пищевых продуктов для домашних животных в различных форматах системы доставки.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное может представлять собой соединение, указанное в Таблицах 2 и 5-13 ниже.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-1, имеющее следующую структуру:
1
Где R выбран из группы, состоящей из незамещенного или замещенного пурина или замещенного или замещенного пиримидина ;
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1-4
2
2
2
2
2
1-4
18
2
0-4
2
0-4
2
2
0-4
2
0-4
2
где R выбран из монофосфата, дифосфата, трифосфата, OP(W)(OH), -OP(W)(OH)OP(W)(OH), -OP(W)(ОН)OP(W)(ОН)OP(W)(ОН), -OS(O)арил(H), -OS(O)арил(CH3), -P(W)(OH), -OP(W)(OH)OS(O)(OH), -OP(W)(OH)Z, -P(W)(ОН)OP(W)(ОН), -O(CH)OP(W)(OH), -OS(W)(OH), -OP(W)(ОН)CHOP(W)(OH), -OP(W)(OH)OP(W)O(CH)R, -(CH)COOH, -(СН)S(O)(OH), -(CH)C(O)NHOH и -(CH)B(OH);
3
2
где X выбран из O, S, N(R) и CH;
где W выбран из O и S;
3
3
где R выбран из H и CH;
4
5
14
15
18
2
3
6
6
2
3
1
6
2
2
11
3
11
17
n
11
17
2-3
11
2
1-6
2
2
1-6
44
где R, R, R, R, R независимо выбирают из H, OH, SH, СН, СН, OR, SR, CHCH, низшего алкила, разветвленного и неразветвленного (C-C), XC(O)низшего алкила, -XC(O)CHPh, -P(W)(OH), -XC(O)PhR, -OP(O)(OH)O, OCH, N(R, R), -О(C)R, RO-, N(H или независимо низший алкил) и COOR, -OC(W)NH(CH)NH, -OC(W)NH(CH)R
2
3
6
6
2
3
1
6
2
2
11
3
11
17
n
11
17
2-3
11
2
1-6
2
где R44 представляет собой H, OH, SH, CH, CH, OR, SR, CHCH, низший алкил с разветвленным и неразветвленным (C-C), XC(O)-низший алкил, -XC(O)CHPh, -P(W)(OH), -XC(O)PhR, -OP(O)(OH)O, OCH, N(R, R), -O(C)R, RO-, N(H или независимо низший алкил) или COOR, -OC(W)NH(CH)NH;
16
17
Где Z выбран из пиперидина, морфолина, пиперазина, N-метилпиперазина, N (R)(R); и
6
11
16
17
2
3
3
12
13
2
3
1
6
2
2
12
3
12
13
n
12
13
2-3
12
где R, R, R и R независимо выбраны из H, OH, SH, CH, CH, OCH, COOR, N(R)(R), CHCH, низший алкил разветвленный и неразветвленный (C-C), -XC(O)низший алкил, CHPh, -P(W)(OH), -XC(O)PhR, -OP(O)(OH)O, OCH, N(R, R), -O(C)R, RO-, N(H или независимо низший алкил) и COOR; и
12
13
2
3
3
2
3
где R и R независимо выбраны из H, OH, SH, CH, CH, OCH и CHCH.
В некоторых вариантах осуществления R1 в формуле Nt-1 выбран из
и .
1
В некоторых вариантах осуществления R в формуле Nt-1 выбран из соединений, перечисленных в Таблице 1.
1
Таблица 1. R-группа нуклеотидных производных формулы Nt-1
R1
<img file="00000004.jpg" he="29" wi="34" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>1</sub>, Q<sub>2</sub>, Q<sub>3</sub> и Q<sub>4</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N(R<sub>19</sub>)(R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub> -C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-6</sub> NH<sub>2</sub>, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10 </sub>и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде Y выбран из C или N.
<img file="00000005.jpg" he="28" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>2</sub>, Q<sub>3</sub> и Q<sub>4</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N(R<sub>19</sub>)(R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде Y или W независимо выбраны из O, S, C или N.
<img file="00000006.jpg" he="25" wi="35" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>30</sub> и Q<sub>4</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10 </sub>и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде Y или W независимо выбраны из O, S, C или N.
<img file="00000007.jpg" he="25" wi="38" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>4</sub> выбран из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила C <sub>1</sub> -C <sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арил, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде Y или W независимо выбраны из O, S, C или N.
<img file="00000008.jpg" he="34" wi="40" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>7</sub> выбран из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N(R<sub>19</sub>)(R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде W выбран из O, S, C или N.
<img file="00000009.jpg" he="38" wi="43" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>7</sub> и Q<sub>8</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде W выбран из O, S, C или N.
<img file="00000010.jpg" he="30" wi="31" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q <sub>2</sub>, Q <sub>3</sub>, Q<sub>7</sub> и Q<sub>8</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>) - <sub>1-4</sub> арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде W выбран из O, S, C или N.
<img file="00000011.jpg" he="38" wi="40" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>7</sub> выбран из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub> -C <sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде W выбран из O, S, C или N.
<img file="00000012.jpg" he="30" wi="25" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>2</sub>, Q<sub>3</sub> и Q<sub>7</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>) <sub>0 -4</sub> Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-; игде W выбран из O, S, C или N.
<img file="00000013.jpg" he="29" wi="30" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где Q<sub>2</sub>, Q<sub>3</sub> И Q<sub>4</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, незамещенного или замещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), замещенного или незамещенного арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>3</sub>H<sub>5</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, Cc-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph;где R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>)-(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> и -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>-;где W выбран из O и S;где Y выбран из C и N, а когда Y представляет собой азот, R <sub>50</sub> отсутствует, и когда Y представляет собой углерод, R <sub>50</sub> выбран из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, -N (R<sub>19</sub>) (R<sub>20</sub>), F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), арила, -(CH<sub>2</sub>)<sub>1-4</sub>арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH2)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, COOH, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, cC6H10 и -CH2CH2CH2 CH<sub>2</sub>-;где Q<sub>6</sub> выбран из Me и Ph; игде R<sub>19</sub> и R<sub>20</sub> независимо выбраны из H, CH<sub>3</sub>, -SCH<sub>3</sub>, F, Cl, Br, I, -OCH<sub>3</sub>, O, S, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C<sub>1</sub>-C<sub>10</sub>), -(CH<sub>2</sub>) <sub>1-4</sub> арила, SCH<sub>3</sub>, S(O)<sub>1-2</sub>Q<sub>6</sub>, COOCH<sub>3</sub>, COOEt, -(CH<sub>2</sub>)<sub>0-4</sub>Ph, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>4</sub>H<sub>7</sub>, c-C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>, c-C<sub>6</sub>H<sub>10</sub>, -CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub> и арила.
<img file="00000014.jpg" he="27" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где W выбран из O или S;где Q <sub>3</sub> выбран из замещенного или незамещенного низшего алкила, разветвленного и неразветвленного (C<sub>1</sub>-C<sub>15</sub>), замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного фурана, замещенного или незамещенного тиофена, замещенного или незамещенного фенила, замещенного или незамещенного пиридина и замещенного или незамещенного нафталина; игде Q<sub>4</sub> выбран из O, S, CH<sub>3</sub>, SCH<sub>3</sub>, H, Br, F, Cl и I.
<img file="00000015.jpg" he="27" wi="50" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где W выбран из O или S;где R получают из боковых цепей 21 встречающихся в природе аминокислот;где Q выбран из замещенного или незамещенного низшего алкила, разветвленного и неразветвленного (C<sub>1</sub>-C<sub>15</sub>), замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного фурана, замещенного или незамещенного тиофена, замещенного или незамещенного фенила, замещенного или незамещенного пиридина и замещенного или незамещенного нафталина; игде Q<sub>4</sub> выбран из O, S, CH<sub>3</sub>, SCH<sub>3</sub>, H, Br, F, Cl и I.
<img file="00000016.jpg" he="26" wi="39" img-content="undefined" img-format="jpg" />
где W выбран из O или S;где Q <sub>30</sub> выбран из замещенного или незамещенного низшего алкильного разветвленного и неразветвленного (C<sub>1</sub>-C<sub>15</sub>), замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного фурана, замещенного или незамещенного тиофена, замещенного или незамещенного фенила, замещенного или незамещенного пиридина и замещенного или незамещенного нафталина; игде Q<sub>4</sub> выбран из O, S, CH<sub>3</sub>, SCH<sub>3</sub>, H, Br, F, Cl и I.
2
3
2
3
1-2
3
1-2
3
1-2
3
3
3
3
Заместители в замещенных группах, описанные в настоящем документе, например, «замещенный алкил», «замещенный арил», «замещенный фуран», «замещенный тиофен», «замещенный алкил», «замещенный фенил», «замещенный пиримидин» или «замещенный нафталин», могут быть одинаковыми или различными с одной или несколькими выбранными группами из групп, описанных в настоящей заявке, и могут представлять собой водород, галоген, метил, амидо, ацетил, нитро (-NO), гидроксил (-ОН), оксо (= O), тио (= S), OCH, метилендиокси, CN, NO, COOH, SOH, S(O)CH, S(O)арил, SCH, OH, N(R), COOCH, OC(O)CH, SH, сульфонил, сульфонамидо, сульфат, циано, азидо, трифторметил (-CF), метокси (-OCH), трет-бутилкарбамат (-Boc) или необязательно замещенные группы, выбранные из алкила, циклоалкила, алкенила, алкокси, арила, арилокси, арилалкила, эфира, карбокси, гидроксила, гетероарила, гетероарилалкила, сульфонила и гетероциклической группы. «Замещенная» функциональная группа может иметь один или несколько заместителей.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-2, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-3, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-4, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-5, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-6, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-7, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-8, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-9, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-10, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-11, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-12, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-13, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-14, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-15, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-16, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-17, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-18, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-19, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-20, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-21, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-22, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-23, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-24, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-25, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-26, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-27, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-28, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-29, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-30, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-31, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-32, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-33, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-34, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-35, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-36, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-37, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-38, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-39, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-40, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-41, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-42, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-43, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-44, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-45, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-46, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-47, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-48, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-49, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-50, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-51, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-52, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-53, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-54, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное включает соединение формулы Nt-55, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное может представлять собой соль, стереоизомер или приемлемую форму соединений формул Nt-1 - Nt-55 и/или соединений, перечисленных в таблицах 2 и 6-14.
Таблица 2: Нуклеотидные производные
Химическое название
Аденозин-3',5'-дифосфат (ADP)
2'-/3'-O-(N'-метил-антранилоил) аденозин-5'-O-монофосфат (MANT-AMP)
2'-дезокси-3'-О-(N'-метилантранилоил) аденозин-5'-О-монофосфат
Аденозин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-AMPS)
1,N6-этеноаденозин-5'-O-монофосфат (ε-5'-AMP)
2'-дезокси-N6-метиладенозин 3',5'-дифосфат
2'-дезоксиаденозин-3',5'-O-бисфосфат
Аденозин-5'-фосфосульфат
N6- Циклопентиладенозин-5'-O-монофосфат (6-cPe-5'-AMP)
Аденозин-5'-O-тиомонофосфат
2'-дезоксиаденозин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-dAMPS)
2'-/3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил)аденозин-5'-O-монофосфат (2'-/3'-AEC-5'-AMP)
N6-Метиладенозин-5'-монофосфат
2'-дезоксиаденозин-5'-монофосфат
2'-дезокси-1,N6-этеноаденозин-5'-О-монофосфата
7-диазааденозин-5'-O-монофосфат (7-CH-5'-AMP/5'-TuMP)
8-хлораденозин-5'-O-монофосфат (8-Cl-5'-AMPS)
N6-бензоиладенозин-5'-O-монофосфат (6-Bnz-5'-AMP)
6-тиогуанозин-5'-O-монофосфат (6-Т-5'-GMP)
2'-дезоксигуанозин-5'-О-монофосфоротиоат
2'-,3'-O-(N'-метилантранилоил)гуанозин-5'-O-монофосфат (MANT-5'-GMP) (флуоресцентный аналог 5'-GMP)
Гуанозин-5'-монофосфоротиоат (5'-GMPS)
2'-Дезокси-3'-O-(N'-метилантранилоил)гуанозин-5'-O-монофосфат
Гуанозин-5'-О-(2-тиодифосфат)
2'-дезоксигуанозин-3',5'-О-бисфосфат
2'-дезоксигуанозин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-dGMPS)
N-Лактоил-5'-GMP
N-Ацетил-5'-GMP
Гуанозин-5'-дифосфат
2'-/3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил)гуанозин-5'-O-монофосфат (2'-/3'-AEC-5'-GMP)
Гуанозин-5'-трифосфат
2'-дезоксигуанозин-5'-монофосфат
Гуанозин-5'-монофосфорофосфат 4-морфолин-N,N'-дициклогексилкарбоксамидин
8-бромгуанозин-5'-O-монофосфат (8-Br-5'-GMP)
2-амино-6-хлорпиринерибозид-5'-O-монофосфат (2-NH2-6-Cl-5'-PuMP)
6-Хлоропуринрибозид-5'-О-монофосфат
6-Тиоинозин-фосфат
Инозин-трифосфат (ITP)
2'-дезоксиинозин-5'-О-монофосфоротиоат
Инозин-5'-дифосфат (IDP)
Уридин-5'-монофосфоморфолидат 4-морфолин-N,N'-дициклогексилкарбоксамидин
2'-дезоксиуридин-5'-O-монофосфосфоротиоат (5'-dUMPS)
Рибавирин-5'-монофосфат
-
2-
2-
-
-
-
3-
2-
-
-
2-
3+
2+
+
+
2+
+
3+
2+
+
+
3
3
3
4
4
3
2
4
4
3
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные настоящего изобретения содержат соль нуклеотидного производного, например, но не ограничиваясь этим, соль ацетата или соль формиата. В некоторых вариантах осуществления соль нуклеотидного производного содержит анион (-) (например, но не ограничиваясь ими, Cl, O, CO, HCO, OH, NO, PO, SO, CHCOO, HCOO и CO), связанный посредством ионной связи с катионом (+) (например, но не ограничиваясь ими, Al, Ca, Na, K, Cu, H, Fe, Mg, NH и HO). В других вариантах осуществления соль нуклеотидного производного содержит катион (+), связанный ионной связью с анионом (-).
in silico
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные по настоящему изобретению идентифицируют посредством -моделирования кошачьего рецептора T1R1/T1R3 («рецептор умами»), где нуклеотидные производные по настоящему изобретению содержат структуру, которая вписывается в сайт связывания кошачьего рецептора T1R1/T1R3.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные по настоящему изобретению идентифицируют посредством анализа , где нуклеотидные производные активируют кошачий рецептор T1R1/T1R3, экспрессируемый клетками . В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные активируют рецептор индивидуально или в комбинации с другими связывающими агентами T1R1/T1R3, такими как описанные в настоящем документе нуклеотиды, аминокислоты и трансмембранные соединения, и/или в комбинации с аминокислотами, описанными в настоящем документ, которые связываются с одним или с несколькими другими рецепторами. В некоторых вариантах осуществления анализ  включает анализы , описанные в разделе «Примеры» настоящей заявки.
2.1. Сайт связывания нуклеотидов T1R1
В настоящей заявке также предлагаются композиции, которые модулируют рецептор умами, например, рецептор T1R1/T1R3, где композиции взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами в домене Venus Flytrap рецептора умами. В некоторых вариантах осуществления домен Venus Flytrap (VFT) присутствует в T1R1. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействует композиция, содержат одну или несколько из Thr449, Ser172, Glu170, Glu301, His71, His47, Arg277, His308, Asn69, Asn302, Ser306, Ser384, Asp302, Ser306 и Ala380.
В одном неограничивающем варианте осуществления композиция содержит нуклеотид и/или нуклеотидное производное, где нуклеотид и/или нуклеотидное производное взаимодействует с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью или более из His71, Arg277, His308, Ser306, Ser384, Ala380, His47, Asn69 и Asp302 T1R1.
В другом неограничивающем варианте осуществления композиция содержит нуклеотид и/или нуклеотидное производное, где нуклеотид и/или нуклеотидное производное взаимодействует с одной, двумя, тремя, четырьмя или более из Met383, Ser385, Ile309, Ser107 и Asp49 T1R1,
3
При связывании нуклеотида и/или нуклеотидного производного аминокислотные остатки VFT могут координировать фосфаты, дифосфаты, трифосфаты, бисфосфаты, миметики фосфатов (например, кислотные функциональные группы, такие как СООН, SOH, NHOH и т. д.) нуклеотида и/или нуклеотидного производного и включают одну или несколько из His71, His47, Arg277, His308, Ile309, Asn69, Ser107 и Asp49 T1R1.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один фосфат нуклеотида и/или нуклеотидного производного взаимодействует с одной, двумя, тремя, четырьмя или более из His71, His47, Arg277, His308 и Asn69 T1R1. В неограничивающем примере, связывание нуклеотида и/или нуклеотидного производного с VFT включает взаимодействия между отрицательно заряженными группами аминокислот в области связывания фосфата VFT и фосфата нуклеотида и/или нуклеотидного производного.
Аминокислотные остатки VFT могут координировать атомы сахара нуклеотида и/или нуклеотидного производного (или, например, модифицированный сахар или замену сахара) и могут включать Asp302 и/или Ser306 T1R1.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере, одна молекула сахара нуклеотида и/или нуклеотидного производного взаимодействует с аминокислотами Asp302 и/или Ser306 T1R1.
Аминокислотные остатки VFT могут координировать с азотистым основанием нуклеотида и/или нуклеотидного производного и могут включать одну или несколько из Ser384, Ser385, Ala380, Met383, Glu170 и Asp302 T1R1.
В некоторых вариантах осуществления азотистое основание нуклеотида и/или нуклеотидного производного взаимодействует с одним, двумя или более из Ser384, His308 и Ala380 T1R1.
В других неограничивающих вариантах осуществления молекула сахара нуклеотида и/или нуклеотидного производного взаимодействует с Asp302 VFT, где Asp302 ориентирована так, чтобы одновременно координировать цвиттерионный азот остова связанной аминокислоты и сахар нуклеотида или нуклеотидного производного.
В некоторых вариантах осуществления композиция взаимодействует с доменом Venus Flytrap (VFT) умами в соответствии с любой комбинацией описанных в настоящем документе взаимодействий, например одно, два, три или более взаимодействий. Взаимодействия между нуклеотидом и/или нуклеотидным производным и VFT могут дополнительно включать дополнительные гидрофобные взаимодействия, которые добавляют к энергии взаимодействия нуклеотида и/или нуклеотидного производного с VFT.
in silico
В некоторых вариантах осуществления взаимодействие между композицией и одной или несколькими аминокислотами включает одну или несколько водородных связей, ковалентных связей, нековалентных связей, солевых мостиков, физических взаимодействий и их комбинации. Взаимодействия может также представлять собой любое взаимодействие, характерное для взаимодействия рецептора лиганда, известного в данной области техники. Такие взаимодействия могут быть определены, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза, рентгеновской кристаллографии, рентгеновских или других спектроскопических методов, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), оценки поперечных связей, масс-спектроскопии или электрофореза, анализов смещения на основе известных агонистов, структурного определения и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления взаимодействия определяют, например, , с помощью теоретических средств, таких как закрепление соединения в домене VFT с использованием молекулярного докинга, молекулярного моделирования, молекулярной симуляции или других способов, известных специалистам в данной области техники.
В настоящей заявке также предлагаются способы идентификации соединения, которое модулирует активность рецептора умами, например, T1R1, где соединение идентифицировано на основании его способности взаимодействовать с одной или несколькими описанными в настоящем документе аминокислотами, которые присутствуют в домене VFT T1R1.
В некоторых вариантах осуществления способ включает контакт тестируемого агента с кошачьим рецептором умами T1R1, детектирование взаимодействия между тестируемым агентом и еще одной аминокислотой в сайте взаимодействия с VFT кошачьего рецептора умами T1R1, и отбор в качестве соединения тестируемого агента, который взаимодействует с одной или несколькими аминокислотами.
3. Трансмембранные соединения
in silico
Настоящее изобретение относится к ароматизирующим композициям, которые содержат, по меньшей мере, одно трансмембранное соединение. В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение представляет собой соединение, усиливающее вкус умами. Трансмембранные соединения, раскрытые в настоящем документе, были идентифицированы посредством -моделирования предполагаемых агонистов в трансмембранной области T1R1 кошачьего рецептора T1R1/T1R3 («рецептор умами»). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение представляет собой композицию, которая взаимодействует (например, связывается) с областью T1R1, содержащей трансмембранный домен T1R1. В некоторых вариантах осуществления такие взаимодействия с трансмембранным доменом T1R1 агонистичны рецептору T1R1/T1R3 или умами. В других вариантах осуществления трансмембранное соединение действует синергично с другими агонистами или модуляторами T1R1 для модуляции активности рецептора T1R1/T1R3 или умами.
Ароматизирующие композиции можно использовать для усиления или модификации вкусовой привлекательности, вкуса или аромата пищевого продукта для домашних животных. Ароматизирующие композиции могут включать комбинации соединений, например, комбинации трансмембранных соединений и/или нуклеотидов и/или нуклеотидных производных и/или аминокислот, и могут быть добавлены к композициям пищевых продуктов для домашних животных в различных формах системы доставки.
3.1 Производные амина I
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-1, имеющее следующую структуру:
1
Где X выбран из группы, состоящей из О и S;
1
Где n равно 1-3;
2
Где n равно 0-4 (где, когда n равно 0, то присутствует химическая связь);
4
Где n равно 0-3;
1
2
3
1
8
5
Где R, R и R независимо выбраны из группы, состоящей из H, =O, =S, разветвленного или неразветвленного и замещенного или незамещенного низшего алкила (C-C) и R;
4
1
8
2
2
Где R выбран из группы, состоящей из H, разветвленного или неразветвленного низшего алила (C-C) и (CH)n-арила;
5
3
3
2
2
3
2
3
2
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
6
5
2
2
2
2
2
1
10
2
0-4
3
5
4
7
5
9
6
10
2
n2
2
2
2
H
c
Где R выбран из группы, содержащей H, CH, CH(CH), CHCH(CH), CH(CH)CHCH, CHCHSCH, CHSH, CHSeH, CHOH, CH(OH)CH, CHC(O)NH, CHCHC(O)NH, CHCHCHNHC(NH)NH, CH(1-имидазолил), CH(CH)CHNH, CHCOOH, CHCHCOOH, CHCH, CH(4-гидроксифенил), CH[3-ил-(1Н-Индол)], CH(циклопентил), CH(циклогексил), CH(инданил), независимо разветвленный или неразветвленный низший алкил (C-C), (CH)PH, -CH, c-CH, c-CH, c-CH, фенил, биарил, (CH)арил, пиридин, тиофен, CHPh, CHпиридин и CHтиофен,
3
3
13
4
1
11
11
12
11
12
11
12
1
5
2
2
2
2
2
1
1
2
1
1
2
арильная и алкильная (как разветвленные, так и неразветвленные) группы могут быть необязательно замещены метилом, OH, SH, OCH, SCH, COOH, COOR, S(O)nR, C(O)R, C(O)NRR, CN, NRR, NRC(O)R, арилом, метилендиокси, алкилом (C-C), CHSSCHCH(COOH)(NH), галогеном (F, Cl, Br, I), NO, NHC(=NH)NH, P(=X)(OR), OP(=X)(OR);
5
6
Где R и R могут быть соединены с образованием циклических колец, таких как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил (т.е. спиро-кольца);
6
1
4
Где R выбран из группы, состоящей из H, и разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C-C);
7
1
6
2
n1
11
12
14
8
9
Где R выбран из группы, состоящей из H, AA, OH, O, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C-C), O(CH)арила, NRR, N(R)OH, C(R)(R), арила и гетероарила;
8
9
1
6
Где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из H, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C-C), арила, алкиларила и алкилгетероарила;
11
12
3
1
6
2
n1
Где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из Н, СН, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (С-С), фенила, арила и (СН)арила;
13
3
2
3
2
где R выбран из группы, состоящей из Н, СН, СНСН, СНарила и трет-бутила;
14
3
где R выбран из группы, состоящей из H и CH; и
где АА выбран из группы, состоящей из встречающейся в природе альфа-аминокислоты или (R) или (S) - конфигурации (т.е. протеогенных аминокислот).
В одном неограничивающем варианте осуществления все асимметричные конфигурации рассматриваются для раскрытых в настоящем изобретении составов.
В некоторых вариантах осуществления арил имеет свое стандартное химическое значение и может включать в себя, но не ограничивается ими, Ph, пиридин, тиофен, фуран, нафтил, индол, бензотиофен, бензофуран, хинолон, изохинолин, пиррол, N-(метил)пирол, имидазол, тиазол, пиримидин, изоксазол, оксазол, изоиндол, индолизин, пурин, пиразин и пиридазин.
В некоторых вариантах осуществления присоединения арильной группы могут быть осуществлены в различных углеродных центрах, что должно быть понятно специалисту в данной области техники.
В других неограничивающих вариантах осуществления когда соединение включает два арильных кольца (например, фенилы), то одно или оба кольца могут быть замещены биарильной кольцевой системой. Такие биарильные кольцевые системы включают, например, фенил - фенил, фенил - пиридил, фенилтиофен, тиофен - тиофен и фенил - фуран.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-2, имеющее следующую структуру:
4
5
6
7
1
1
Где R, R, R, R, X и n такие, как определено для формулы Tm-1.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-20, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-21, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-22, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-23, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-24, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-25, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-26, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-27, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-28, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-29, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-30, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-31, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-32, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-33, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-34, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-35, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-36, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-37, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-38, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-39, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-40, имеющее следующую структуру:
3.2 Производные амина II
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-3, имеющее следующую структуру:
1
где X выбран из группы, состоящей из О и S;
1
2
1
2
где n и n равны 0-4 (где, когда n и/или n равны 0, присутствует химическая связь);
1
1
10
2
n2
3
5
4
7
5
9
6
10
2
n2
2
2
2
1
6
1
где R выбран из группы, состоящей из разветвленного или неразветвленного низшего алкила (С-С), (СН)Ph, c-CH, c-CH, c-CH, c-CH, фенила, (CH)арила, Ph, пиридина, тиофина, CHPh, CHпиридина, CHтиофена, O-арила, Ph, пиридина, тиофена, фурана, нафтила, индола, бензотиофена, бензофурана, хинолона, изохинолина, пиррола, N-(метил)пиррола, имидазола, тиазола, пиримидина, изоксазола, оксазола, изоиндола, индолизина, пурина, пиразина, пириазина, O-алкила(C-C), биарила и OR (например, карбаматы),
3
3
13
n4
1
11
11
12
11
12
11
12
1
5
2
2
2
2
2
1
1
2
1
1
2
арильная и алкильная (как разветвленные, так и неразветвленные) группы могут быть необязательно замещены метилом, OH, SH, OCH, SCH, COOH, COOR, S(O)R, C(O)R, C(O)NRR, CN, NRR, NRC(O)R, арилом, метилендиокси, алкилом (C-C), CHSSCHCH(COOH)(NH), галогеном (F, Cl, Br, I), NO, NHC(=NH)NH, P(=X)(OR) или OP(=X)(OR);
2
3
2
где R выбран из группы, состоящей из H, CH, (CH) и арила;
3
4
5
1
8
2
n2
1
где R, R и R независимо выбраны из группы, состоящей из H, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C-C), (CH)арила и R;
11
12
3
1
6
2
n1
Где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из Н, СН, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (С-С), фенила, арила и (СН)арила;
13
3
2
3
2
где R выбран из группы, состоящей из Н, СН, СНСН, СНарила и трет-бутила;
В некоторых вариантах осуществления арил имеет его стандартное химическое значение и может включать, но не ограничиваясь этим, Ph, пиридин, тиофен, фуран, нафтил, индол, бензотиофен, бензофуран, хинолон, изохинолин, пиррол, N-(метил)пирол, имидазол, тиазол, пиримидин, изоксазол, оксазол, изоиндол, индолизин, пурин, пиразин и пириазин.
В некоторых вариантах осуществления присоединения арильной группы могут быть осуществлены в различных углеродных центрах, что должно быть понятно специалисту в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления асимметричные центры могут иметь либо (R), либо (S) конфигурацию, что должно быть понятно специалисту в данной области техники.
В одном неограничивающем варианте осуществления рассматриваются все асимметричные конфигурации для раскрытых в настоящем изобретении составов.
В других неограничивающих вариантах осуществления, когда соединение включает два арильных кольца (например, фенил), то одно или оба кольца могут быть замещены биарильной кольцевой системой. Такие биарильные кольцевые системы включают, например, фенил - фенил, фенил - пиридил, фенилтиофен, тиофен - тиофен и фенилфуран.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-4, имеющее следующую структуру:
1
2
где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из арила, циклоалкила (например, циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила) и гетероарила (например, но не ограничиваясь ими, Ph, пиридина, тиофена, фурана, нафтила, индола, бензотиофена, бензофурана, хинолона, изохинолина, пиррола, N-(метил)пиррола, имидазола, тиазола, пиримидина, изоксазола, оксазола, изоиндола, индолизина, пурина, пиразина, и пиридазина);
3
3
13
n4
1
11
11
12
11
12
1
5
2
2
2
2
2
3
1
1
2
1
1
2
где арильные группы или циклоалкильные группы необязательно могут быть замещены метилом, OH, SH, OCH, SCH, COOH, COOR, S(O)R, C(O)R, C(O)NR,R, CN, NRC(O)R, арилом, метилендиокси, алкилом (C-C), CHSSCHCH(COOH)(NH), галогеном (F, Cl, Br, I), NO, NHC(=NH)NH, CHO, CF, P(=X)(OR) или OP(=X)(OR);
где циклоалкильные группы могут необязательно содержать гетероатомы в кольцах (например, О, N и/или S), например пиперидин, пиперазин, тетрагидротиофен, пиран, пирролидин или тетрагидрофуран;
1
где n=0-4;
11
12
13
1
где R, R, R и X являются такими, как определено в настоящем документе; и
4
где n=0-4.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-41, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-42, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-43, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-44, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-45, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-46, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-47, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-48, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-49, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-50, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-51, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-52, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-53, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-54, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-55, имеющее следующую структуру:
3.3 Производные парабановой кислоты
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-6, имеющее следующую структуру:
1
2
где R или R независимо выбраны из группы, состоящей из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного алкинила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арилалкила, замещенного или незамещенного гетероарилалкила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклического соединения, замещенного или незамещенного алкокси, замещенного или незамещенного арилокси, гидроксила, водорода, замещенной или незамещенной эфирной группы, замещенного или незамещенного бензотиазолила, замещенного или незамещенного пиридила, замещенного или незамещенного нафтила, замещенного или незамещенного тиенила, замещенного или незамещенного бензотиенила, замещенного или незамещенного индолила, замещенного или незамещенного изохинолила, замещенного или незамещенного хинолила, замещенного или незамещенного инденила или замещенного или незамещенного инданила.
1
2
В некоторых вариантах осуществления R или R могут содержать следующую структуру:
3
4
5
6
7
где R3, R4, R5, R6 и R7 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, циано, азидо, гидроксила, замещенного или незамещенного сульфонила, замещенного или незамещенного сульфонамида, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арилалкила, замещенного или незамещенного гетероарилалкила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного амида, замещенного или незамещенного гетероцикла, замещенного или незамещенного алкокси, замещенного или незамещенного арилокси, замещенного или незамещенного эфира, замещенного или незамещенного карбокси, замещенного или незамещенного ацила, замещенного или незамещенного бензотиазолила, замещенного или незамещенного пиридила, замещенного или незамещенного нафтила, замещенного или незамещенного тиенила, замещенного или незамещенного бензотиенила, замещенного или незамещенного индолила, замещенного или незамещенного изохинолила, замещенного или незамещенного хинолила или замещенного или незамещенного гетероаренила или замещенного или незамещенного индена или замещенного или незамещенного инданила. В некоторых вариантах осуществления два или более из R, R, R, R и R могут быть взяты вместе с образованием кольца, которое может быть гетероциклическим (т.е. содержать один или несколько гетероатомов) или которое может быть полностью карбоциклическим и которое может независимо быть насыщенным или ненасыщенным.
2
3
3
Заместители в замещенных группах, описанные в настоящем документе, например, «замещенный эфир», «замещенный карбокси», «замещенный ацил», «замещенный сульфонил», «замещенный алкил», «замещенный алкенил», «замещенный циклоалкил», «замещенный циклоалкалкил», «замещенный арилалкил», «замещенный арил», «замещенный гетероцикл», «замещенный гетероарилалкил», «замещенный гетероарил», «замещенный нафтил», «замещенный фенил», «замещенный тиенил», «замещенный бензотиенил», «замещенный пиридил «Замещенный индолил», «замещенный изохинолил», «замещенный хинолил», «замещенный бензотиазолил», «замещенный гетероарил», «замещенный инденил» или «замещенный инданил» могут быть одинаковыми или разными, содержащими одну или несколько групп, выбранных из групп, описанных в настоящей заявке, а также включают водород, галоген, амидо, ацетил, нитро (-NO), гидроксил (-ОН), оксо (= O), тио (= S), сульфонил, сульфанил, тио, циано, азидо, трифторметил (-CF), метокси (-OCH), трет-бутилкарбамат (-Boc) или необязательно замещенные группы, выбранные из алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, алкокси, арила, арилалкила, эфира, карбокси, гидроксила, гетероарила, сульфонила и гетероцикла. «Замещенная» функциональная группа может иметь один или несколько заместителей.
1
2
В одном неограничивающем варианте осуществления варианте осуществления R и R представляют собой незамещенные фенильные группы.
1
2
В одном неограничивающем варианте осуществления R представляет собой незамещенную фенильную группу, и R представляет собой замещенную фенильную группу.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-7, имеющее следующую структуру:
1
2
где R и R определены выше для формулы Tm-6.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-5, имеющее следующую структуру:
1
3
где X выбран из группы, состоящей из O, N(R), S;
2
3
где Х и Х независимо выбраны из группы, состоящей из О и S;
3
1
4
где R выбран из группы, состоящей из H и разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C-C); а также
1
2
2
n
1
1
2
n
1
2
1
где R и R имеют значения, определенные выше для формулы Tm-6, а также могут быть (CH)C(=X)R, (CH)C(=X)R, где X представляет собой O или S, и n равно 4.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-9, имеющее следующую структуру:
1-5
1
2
где X независимо выбирают из группы, состоящей из О и S; и где R и R определены выше для формулы Tm-6.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-10, имеющее следующую структуру:
1-5
1
2
где X выбирают независимо из группы, состоящей из О и S; и где R и R определены выше для формулы Tm-6.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-11, имеющее следующую структуру:
1-3
1
2
где X выбирают независимо из группы, состоящей из O и S; и где R и R определены выше для формулы Tm-6.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-56, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-57, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-58, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-59, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-60, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-61, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-62, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-63, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-64, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-65, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-66, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-67, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-68, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-69, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-70, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-71, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-72, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-73, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-74, имеющее следующую структуру:
3.4 Производные имидазопиридинона
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-19, имеющее следующую структуру:
1
2
где R или R независимо выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного алкинила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арилалкила, замещенного или незамещенного гетероарилалкила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероцикла, замещенного или незамещенного алкокси, замещенного или незамещенного арилокси, гидроксила, водорода, замещенного или незамещенного эфира, замещенного или незамещенного бензотиазолила, замещенного или незамещенного пиридила, замещенного или незамещенного нафтила, замещенного или незамещенного тиенила, замещенного или незамещенного бензотиенила, замещенного или незамещенного индолила, замещенного или незамещенного изохинолила, замещенного или незамещенного хинолила, замещенного или незамещенного инденила или замещенного или незамещенного инданила.
1
2
В некоторых вариантах осуществления R или R могут включать следующую структуру:
3
4
5
6
7
3
4
5
6
7
где R, R, R, R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, циано, азидо, гидроксила, замещенного или незамещенного сульфонила, замещенного или незамещенного сульфонамида, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арилалкила, замещенного или незамещенного гетероарилалкила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного амида, замещенного или незамещенного гетероциклического соединения, замещенного или незамещенного алкокси, замещенного или незамещенного арилокси, замещенного или незамещенного эфира, замещенного или незамещенного карбокси, замещенного или незамещенного ацила, замещенного или незамещенного бензотиазолила, замещенного или незамещенного пиридила, замещенного или незамещенного нафтила, замещенного или незамещенного тиенила, замещенного или незамещенного бензотиенила, замещенного или незамещенного индолила, замещенного или незамещенного изохинолила, замещенного или незамещенного хинолила или замещенного или незамещенного гетероаренила или замещенного или незамещенного индена или замещенного или незамещенного инданила. В некоторых вариантах осуществления два или более из R, R, R, R и R могут быть взяты вместе с образованием кольца, которое может быть гетероциклическим (т.е. содержать один или несколько гетероатомов) или которое может быть полностью карбоциклическим и которое может независимо быть насыщенным или ненасыщенным.
2
3
3
Заместители в замещенных группах, описанные в настоящем документе, например, «замещенный эфир», «замещенный карбокси», «замещенный ацил», «замещенный сульфонил», «замещенный алкил», «замещенный алкенил», «замещенный циклоалкил», «замещенный циклоалкалкил», «замещенный арилалкил», «замещенный арил», «замещенный гетероцикл», «замещенный гетероарилалкил», «замещенный гетероарил», «замещенный нафтил», «замещенный фенил», «замещенный тиенил», «замещенный бензотиенил», «замещенный пиридил», «замещенный индолил», «замещенный изохинолил», «замещенный хинолил», «замещенный бензотиазолил», «замещенный гетероарил», «замещенный инденил» или «замещенный инданил» могут быть одинаковыми или разными, содержащими одну или несколько групп, выбранных из групп, описанных в настоящей заявке, а также водород, галоген, амидо, ацетил, нитро (-NO), гидроксил (-ОН), оксо (=O), тио (= S), сульфонил, сульфанил, тио, циано, азидо, трифторметил (-CF), метокси (-OCH), трет-бутилкарбамат (-Boc) или необязательно замещенные группы, выбранные из алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, алкокси, арила, арилалкила, эфира, карбокси, гидроксила, гетероарила, сульфонила и гетероцикла. «Замещенная» функциональная группа может содержать один или несколько заместителей.
1
2
В одном неограничивающем варианте осуществления R и R представляют собой незамещенные фенильные группы.
1
2
В одном неограничивающем варианте осуществления R представляет собой незамещенную фенильную группу, и R представляет собой замещенную фенильную группу.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-12, имеющее следующую структуру:
4
где Y выбран из группы, состоящей из О, S и N(R);
1-3
где X независимо выбраны из группы, состоящей из C, O, N и S;
3
4
n
4
4
5
4
5
2
4
5
1
2
2
2
2
2
3
2
2
6
2
6
2
n
где R представляет собой замещенный или незамещенный ароматический заместитель, где заместитель представляет собой, например, H, OR, S(O)R, N(R)(R), CN, COOH, COOR, C(O)N(R)(R), SON(R)(R), галоген (например, Cl, Br, Fl, I), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкил (C-C8), арил, биарил, P(O)(OH), NHOH, B(OH), C(=NH)NH, NHC(=NH)NH, NO, CF, -OCHO- (т.е. метилендиокси), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкин (C-C), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкен (C-C), (CH)арил;
4
5
1
8
2
6
2
6
2
n
где R и R независимо представляют собой H, разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкил (С-С), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкин (С-С), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкен (С-С), арил, (CH)арил;
где n=0-4; и
1
2
где R и R имеют значения, описанные для формулы Tm-19.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-13, имеющее следующую структуру:
4
где Y выбран из группы, состоящей из О, S и N(R);
1-4
где X независимо выбирают из группы, состоящей из C, O, N и S;
3
4
n
4
4
5
4
5
2
4
5
2
2
2
2
2
2
2
6
2
6
2
n
где R представляет собой замещенный или незамещенный ароматический заместитель, где заместитель представляет собой, например, H, OR, S(O)R, N(R)(R), CN, COOH, COOR, C(O)N(R)(R), SON(R)(R), галоген (например, Cl, Br, Fl, I), H, разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкил (C1-C8), арил, биарил, P(O)(OH), NHOH, B(OH), C(=NH)NH, NHC(=NH)NH, NO, CF3, -OCHO- (т.е. метилендиокси), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкин (C-C), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкен (C-C), (CH)арил;
4
5
1
8
2
6
2
6
2
n
где R и R независимо представляют собой H, разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкил (С-С), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкин (С-С), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкен (С-С), арил, (CH)арил;
где n=0-4; и
1
2
где R и R имеют значения, как описано для формулы Tm-19.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-14, имеющее следующую структуру:
где X выбран из группы, состоящей из C, O, N и S; и
1-3
где R такие, как описано для формул Tm-19, Tm-12 и Tm-13.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-15, имеющее следующую структуру:
1-2
где R такие, как описано для формул Tm-19, Tm-12 и Tm-13.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-16, имеющее следующую структуру:
где X выбран из группы, состоящей из C, O, N и S; и
1-2
где R такие, как описано для формул Tm-19, Tm-12 и Tm-13.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-17, имеющее следующую структуру:
1-2
где R такие, как описано для формул Tm-19, Tm-12 и Tm-13.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-18, имеющее следующую структуру:
1
где R такой, как описано для формул Tm-19, Tm-12 и Tm-13.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-75, имеющее следующую структуру:
3.5 Производные пиримидин-2,4,6-триона
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-8, имеющее следующую структуру:
1
12
где X выбран из группы, состоящей из O, N(R) и S;
2
3
где Х и Х выбраны независимо из группы, состоящей из О и S;
4
7
8
9
где Х выбран из группы, состоящей из NH, N(R) и C(R,R);
1
1
2
3
где n равно 0-1, а когда n равно 0, то химическая связь находится между двумя атомами углерода, несущими Х и Х;
7
8
9
1
20
3
7
2
n2
где R, R и R независимо выбраны из группы, состоящей из H, замещенного или незамещенного разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C-C), арила, гетероарила, циклоалкила (C-C) и замещенного, незамещенного, разветвленного или неразветвленного C(CH)арила,
2
4
5
2
4
5
2
2
2
2
2
3
замещение по алкильной и арильной группам включает функциональные группы, известные специалистам в данной области, такие как ОН, NH, галоген, SH, нитро, арил, алкен, COOH, COOR, C(O)N(R)(R), SON(R)(R), NO2, P(O)(OH), NHOH, B(OH), C(=NH)NH, NHC(=NH)NH, NO и CF;
4
5
1
8
2
6
2
6
2
n
где R и R независимо представляют собой H, разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкил (С-С), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкин (С-С), разветвленный или неразветвленный замещенный или незамещенный низший алкен (С-С), арил, (CH)арил;
2
где n равно 0-10;
12
1
4
где R выбран из группы, состоящей из H, разветвленного или неразветвленного низшего алкила (C-C); и
1
2
где R и R независимо выбраны из группы, состоящей из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного алкинила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арилалкила, замещенного или незамещенного гетероарилалкила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероцикла, замещенного или незамещенного алкокси, замещенного или незамещенного арилокси, гидроксила, водорода, замещенного или незамещенного эфира, замещенного или незамещенного бензотиазолила, замещенного или незамещенного пиридила, замещенного или незамещенного нафтила, замещенного или незамещенного тиенила, замещенного или незамещенного бензотиенила, замещенного или незамещенного индолила, замещенного или незамещенного изохинолила, замещенного или незамещенного хинолила, замещенного или незамещенного инденила или замещенного или незамещенного инданила.
1
2
В некоторых вариантах осуществления R и/или R могут включать следующую структуру:
3
4
5
6
7
3
4
5
6
7
где R, R, R, R и R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, циано, азидо, гидроксила, замещенного или незамещенного сульфонила, замещенного или незамещенного сульфонамида, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного арилалкила, замещенного или незамещенного гетероарилалкила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного амида, замещенного или незамещенного гетероцикла, замещенного или незамещенного алкокси, замещенного или незамещенного арилокси, замещенного или незамещенного эфира, замещенного или незамещенного карбокси, замещенного или незамещенного ацила, замещенного или незамещенного бензотиазолила, замещенного или незамещенного пиридила, замещенного или незамещенного нафтила, замещенного или незамещенного тиенила, замещенного или незамещенного бензотиенила, замещенного или незамещенного индолила, замещенного или незамещенного изохинолила, замещенного или незамещенного хинолила или замещенного или незамещенного гетероаренила или замещенного или незамещенного индена или замещенного или незамещенного инданила. В некоторых вариантах осуществления два или более из R, R, R, R и R могут быть взяты вместе с образованием кольца, которое может быть гетероциклическим (т.е. содержать один или несколько гетероатомов) или которое может быть полностью карбоциклическим и которое может независимо быть насыщенным или ненасыщенным.
1
2
В одном неограничивающем варианте осуществления R и R представляют собой незамещенные фенильные группы.
1
2
В одном неограничивающем варианте осуществления R представляет собой незамещенную фенильную группу, и R представляет собой замещенную фенильную группу.
1
2
2
n
1
1
n
1
2
1
В одном неограничивающем варианте осуществления R и R имеют значения, определенные выше для формул Tm-6, Tm-19, Tm-12 и Tm-13, а также могут быть (CH)C(=X)R, (CH2)C(=X)R, где X представляет собой O или S, и n равно 0-4.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-76, имеющее следующую структуру:
3.6 Дополнительные трансмембранные соединения
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-77, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-78, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-79, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-80, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-81, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-82, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-83, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-84, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-85, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-86, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-87, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-88, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-89, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-90, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-91, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-92, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-93, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-94, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-95, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-96, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-97, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-98, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-99, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-100, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение содержит соединение формулы Tm-101, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-102, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение включает соединение формулы Tm-103, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение содержит соединение формулы Tm-104, имеющее следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения трансмембранное соединение включает соединение, описанное в таблице 3 ниже.
Таблица 3. Трансмембранные соединения.
Названиесоединения
5-бром-N-(пентан-3-ил)фуран-2-карбоксамид
3,4-диметил-N-(пентан-3-ил)бензамид; N-(1-этилпропил)-3,4-диметилбензамид
4-метокси-3-метил-N-(1-фенилэтил)бензамид
N-(2,3-диметилциклогексил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Этил-2-(бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамидо)-3-метилбутаноат; Этил-N-(1,3-бензодиоксол-5-илкарбонил)валинат
4-метокси-3-метил-N-(пентан-2-ил)бензамид
N-(пентан-3-ил)-2,3-дигидро[Ь][1,4]диоксин-6-карбоксамид
3,4-диметокси-N-(пентан-3-ил)бензамид
(E)-метил-3-метил-2-(3-(тиофен-2-ил)акриламидо)бутаноат
(Е)-3-(3,4-диметоксифенил)-N-(пентан-2-ил)акриламид; (2E)-3-(3,4-диметоксифенил)-N-(пентан-2-ил)проп-2-енамид
(Е)-3-(4-метоксифенил)-N-(2-метилциклогексил)акриламид
N1-фенэтил-N2-(пиридин-3-илметил)оксаламид; N-(2-фенилэтил)- N'-(пиридин-3-илметил)этандиамид
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
1-(2-бромфенил)-3-((1R,2S)-2-гидрокси-2,3-дигидро-1H-инден-1-ил)мочевина
N-(бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-2-пропилпентанамид
1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил)имидазолидин-2,4,5-трион
N-(2-амино-2-оксо-1-фенилэтил)-3-хлор-4,5-диметоксибензамид
(Е)-3-(4-метоксифенил)-N-(пентан-3-ил)акриламид
2-((5-(4-(метилтио)фенил)-2Н-тетразол-2-ил)метил)пиридин
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
3.7 Соли трансмембранных соединений
-
-
-
2-
2-
-
-
-
3-
2-
-
-
2-
-
3+
2+
+
+
2+
+
3+
2+
+
+
+
2+
3
3
3
4
4
3
2
4
4
3
2
В некоторых вариантах осуществления трансмембранные соединения по настоящему изобретению включают соль трансмембранного соединения, например, но не ограничиваясь этим, соль ацетата, соль ТФК или соль муравьиной кислоты. В некоторых вариантах осуществления соль трансмембранного соединения содержит анион (-) (например, но не ограничиваясь ими, Cl, F, Br, O, CO, HCO, OH, NO, PO, SO, CHCOO, HCOO, CO и CN), связанный посредством ионной связи с катионом (+) (например, но не ограничиваясь ими, Al, Ca, Na, K, Cu, H, Fe, Mg, Ag, NH, HO, Hg). В других вариантах осуществления соль трансмембранного соединения содержит катион (+), связанный ионной связью с анионом (-).
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение может быть солью, стереоизомером или пригодной к переработке формой трансмембранного соединения, описанного в настоящем документе, например, соединений формул Tm-1 - Tm-104.
3.8 Сайт связывания T1R1 трансмембранного соединения
В настоящей заявке предлагаются композиции, которые модулируют активность рецептора умами, например, рецептора T1R1/T1R3, где композиции взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами в трансмембранном домене рецептора умами, например, с трансмембранным доменом семь (7TM) в T1R1. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют композиции, включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более из Ala795, Ala796, Asn792, Trp773, Phe776, Ala731, Phe728, Leu730, Phe732, Asn735, Ala689, Ser686, Gln690, Ile693, Cys694, Leu695, Arg634, Gln635, Phe642, Ala639, Ala643 и Leu638.
В конкретном неограничивающем варианте осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют композиции, включают Asn735 и/или Ser686.
В других неограничивающих вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют композиции, включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более Trp773, Phe776, Phe732, Phe728, Leu730, Leu695, Leu638 и Phe642.
В других неограничивающих вариантах осуществления аминокислоты, с которыми взаимодействуют композиции, содержат 1, 2, 3, 4 или более Trp773, Phe776, Phe732, Phe728 и Phe642. В неограничивающем примере, аминокислоты, которые взаимодействуют с композицией, подвергаются стэкинг-взаимодействию в кольце со связанной композицией.
В некоторых вариантах осуществления композиция взаимодействует с доменом 7TM умами в соответствии с любой комбинацией взаимодействий, описанных в настоящем документе, например, с одним, двумя, тремя или более взаимодействиями. Взаимодействия между композицией и 7ТМ могут дополнительно включать дополнительные гидрофобные взаимодействия, которые добавляют к энергии взаимодействия композиции с 7ТМ.
in silico
В некоторых вариантах осуществления взаимодействие между композицией и одной или несколькими аминокислотами домена 7TM T1R1 включает одну или несколько водородных связей, ковалентных связей, нековалентных связей, солевых мостиков, физических взаимодействий и их комбинации. Взаимодействием может также представлять собой любое взаимодействие, характерное для взаимодействия рецептора лиганда, известного в данной области техники. Такие взаимодействия могут быть определены, например, путем сайт-направленного мутагенеза, рентгеновской кристаллографии, рентгеновских или других спектроскопических методов, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), оценки поперечных связей, масс-спектроскопии или электрофореза, криомикроскопии, анализов смещения на основе известных агонистов, структурного определения и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления взаимодействия определяют , например, с помощью теоретических способов, таких как закрепление соединения в домене T1R1 7TM с использованием молекулярного докинга, молекулярного моделирования, молекулярной симуляции или других способов, известных специалистам в данной области.
В настоящей заявке также предлагаются способы идентификации соединения, которое модулирует активность рецептора умами, например, T1R1, где соединение идентифицировано на основании его способности взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами, описанными в настоящем документе, которые присутствуют в домене 7TM T1R1.
В некоторых вариантах осуществления способ включает контакт тестируемого агента с кошачьим рецептором умами T1R1, детектирование взаимодействия между тестируемым агентом и одной или несколькими аминокислотами в сайте взаимодействия 7TM кошачьего рецептора умами T1R1 и отбор в качестве соединения тестируемого агента, который взаимодействует с одной или несколькими аминокислотами.
4. Ароматизирующие композиции
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующие композиции согласно настоящему изобретению могут быть использованы для усиления вкуса умами и/или повышения вкусовой привлекательности пищевых продуктов для домашних животных, таких как пищевые продукты для кошек. Ароматизирующие композиции могут содержать комбинации соединений и могут быть добавлены к пищевому продукту для домашних животных в различных системах доставки.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам модуляции вкуса умами пищевого продукта для домашних животных, включающим: a) обеспечение по меньшей мере одного пищевого продукта для домашних животных или его предшественника и b) объединение пищевого продукта для домашних животных или его предшественника, по меньшей мере, с количеством, модулирующим вкус умами, по меньшей мере, одной ароматизирующей композиции, например, содержащей одно или несколько нуклеотидных производных и/или одно или несколько трансмембранных соединений или их съедобную приемлемую соль с образованием улучшенного пищевого продукта для домашних животных.
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующие композиции согласно настоящему изобретению могут усиливать вкус умами и/или вкусовую привлекательность пищевого продукта для домашних животных, такого как, например, пищевой продукт для домашних животных, включающий влажные пищевые продукты для домашних животных, сухие пищевые продукты для домашних животных, питьевые продукты для домашних животных и/или снэковые продукты для домашних животных.
В некоторых вариантах осуществления одна или несколько ароматизирующих композиций согласно настоящему изобретению могут быть добавлены к пищевому продукту для домашних животных в количестве, эффективном для модификации, улучшения или иного изменения вкуса или профиля вкуса пищевого продукта для домашних животных. Модификация может включать, например, увеличение или усиление вкуса умами пищевого продукта для домашних животных, как определено животными, например, кошками и/или собаками, или в случае тестирования состава, как определено панелью дегустаторов вкуса у животных, например кошек и/или собак, с помощью процедур, известных в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, можно получить пищевой продукт для домашних животных, который содержит достаточное количество, по меньшей мере, одной ароматизирующей композиции, описанной в настоящем документе, например, содержащей нуклеотидное производное, например соединение формулы Nt-1, с получением пищевого продукта для домашних животных, имеющего желаемый вкус, например, умами.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, может быть получен пищевой продукт для домашних животных, который содержит достаточное количество, по меньшей мере, одной ароматизирующей композиции, описанной в настоящем документе, например, содержащей трансмембранное соединение, например соединение формулы Tm-1 - Tm-19, с получением пищевого продукта для домашних животных, имеющего желаемый вкус, например, умами.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно получить пищевой продукт для домашних животных, который содержит достаточное количество ароматизирующей композиции, содержащей по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть или более нуклеотидных производных.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может быть получен пищевой продукт для домашних животных, который содержит достаточное количество ароматизирующей композиции, содержащей по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять, шесть или более трансмембранных соединений.
В некоторых вариантах осуществления модулирующее количество одной или нескольких ароматизирующих композиций согласно настоящему изобретению может быть добавлено к пищевому продукту для домашних животных, так что пищевой продукт для домашних животных будет обладать повышенной вкусовой привлекательностью по сравнению с пищевым продуктом для домашних животных, приготовленным без ароматизирующей композиции, как определено животными, например, кошками и/или собаками, или в случае тестирования состава, как определено панелью дегустаторов вкуса животных с помощью процедур, известных в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления согласно настоящему изобретению ароматизирующую композицию добавляют к пищевому продукту для домашних животных в количестве, эффективном для увеличения, улучшения и/или модификации вкусовой привлекательности пищевого продукта для домашних животных.
Концентрация ароматизирующей композиции, смешанной с пищевым продуктом для домашних животных, для модуляции и/или улучшения вкусовой привлекательности и/или вкуса умами пищевого продукта для домашних животных, может варьироваться в зависимости от переменных, таких как, например, конкретный тип пищевого продукта для домашних животных, соединения со вкусом умами, которые уже присутствуют в пищевом продукте для домашних животных и их концентрации, а также усиливающий эффект конкретной ароматизирующей композиции на такие соединения со вкусом умами.
Для обеспечения такого вкуса умами и/или модификации вкусовой привлекательности может быть использован широкий спектр концентраций ароматизирующих композиций. В некоторых вариантах осуществления настоящей заявки ароматизирующую композицию смешивают с пищевым продуктом для домашних животных, где ароматизирующая композиция присутствует в количестве примерно от 0,001 м.д. примерно до 1000 м.д.. Например, но без ограничения, ароматизирующая композиция может присутствовать в количестве примерно от 0,001 м.д. примерно до 750 м.д., примерно от 0,001 м.д примерно до 500 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 250 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 150 м.д., примерно от 0,001 примерно до 100 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 75 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 50 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 25 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 15 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 10 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 5 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 4 м. д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 3 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 2 м.д., примерно от 0,001 м.д. примерно до 1 м.д., примерно от 0,01 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 0,1 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 1 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 2 м.д. примерно до 1 000 м.д., примерно от 3 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 4 м.д. примерно до 1000 м.д. примерно от 5 примерно до 1000 м.д., примерно от 10 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 15 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 25 примерно до 1000 м.д., примерно от 50 примерно до 1000 м.д., примерно от 75 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 100 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 150 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 250 м.д. примерно до 1000 м.д., примерно от 250 примерно до 1000 м.д., примерно от 500 м.д. примерно до 1000 м.д. или примерно от 750 м.д. примерно до 1000 м.д. и значения между ними.
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующая композиция присутствует в пищевом продукте для домашних животных в количестве, более, чем примерно 0,001 м.д., более чем примерно 0,01 м.д., более чем примерно 0,1 м.д., более чем примерно 1 м.д., более чем примерно 2 м.д., более чем примерно 3 м.д., более чем примерно 4 м.д., более чем примерно 5 м.д., более чем примерно 10 м.д., более чем примерно 25 м.д., более чем примерно 50 м.д., более чем примерно 75 м.д., более чем примерно 100 м.д., более чем примерно 250 м.д., более чем примерно 500 м.д., более чем примерно 750 м.д. или более чем примерно 1000 м.д. и значения между ними.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное согласно настоящему изобретению присутствует в пищевом продукте в количестве, достаточном для модуляции, активации и/или усиления рецептора умами, например рецептора T1R1/T1R3. Например, но не в качестве ограничения, нуклеотидное производное может присутствовать в пищевом продукте в количестве примерно от 1 примерно до 1 М, примерно от 1 нМ примерно до 1 М, примерно от 1 мкМ примерно до 1 М, примерно от 1 мМ примерно до 1 М, примерно от 10 мМ примерно до 1 М, примерно от 100 мМ примерно до 1 М, примерно от 250 мМ примерно до 1 М, примерно от 500 мМ примерно до 1 М, примерно от 750 мМ примерно до 1 М, примерно от 0,001 мкМ примерно до 1 М, примерно от 0,001 мкМ примерно до 750 мМ, примерно от 0,001 мкМ примерно до 500 мМ, примерно от 0,001 мкМ примерно до 250 мМ, примерно от 0,001 мкМ примерно до 100 мМ, примерно от 0,001 мкМ примерно до 50 мМ, примерно от 0,001 мкМ примерно до 25 мМ, примерно от 0,001 мкМ примерно до 10 мМ, примерно от 0,001 мкМ до 1 мМ, примерно от 0,001 мкМ до 100 мкМ или примерно от 0,001 мкМ примерно до 10 мкМ, и значения между ними.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранное соединение настоящего изобретения присутствует в количестве, которого достаточно для модуляции, активации или усиления рецептора умами, например кошачьего рецептора T1R1/T1R3.Например, но не для ограничения, трансмембранное соединение может присутствовать в пищевом продукте в количестве примерно от 1 пМ примерно до 10 М, примерно от 1 пМ примерно до 1 М, примерно от 1 нМ примерно до 1 М, примерно от 1 мкМ примерно до 1 М, примерно от 1 мМ примерно до 1 М, примерно от 10 мМ примерно до 1 М, примерно от 100 мМ примерно до 1 М, примерно от 250 мМ примерно до 1 М, примерно от 500 мМ примерно до 1 М, примерно от 750 мМ примерно до 1 М, примерно от 1 мкМ примерно до 1 М, примерно от 1 мкМ примерно до 750 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 500 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 250 мМ, от примерно от 1 мкМ примерно до 100 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 50 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 25 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 10 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 1 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 100 мкМ или примерно от 1 мкМ примерно до 10 мкМ, и значения между ними.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, ароматизирующую композицию смешивают с пищевым продуктом, где ароматизирующая композиция присутствует в количестве примерно от 0,0001 примерно до 10 мас.% (Масс./Масс.) пищевого продукта. Например, но без ограничения, ароматизирующая композиция может присутствовать в количестве примерно от 0,0001% примерно до 10%, примерно от 0,0001% примерно до 1%, примерно от 0,0001% примерно до 0,1%, примерно от 0,0001 примерно до 0,01%, примерно от 0,0001% примерно до 0,001%, примерно от 0,001% примерно до 10%, примерно от 0,001% примерно до 1%, примерно от 0,01% примерно до 1% или примерно от 0,1% примерно до 1% и значения между ними.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения согласно настоящему изобретению смешивают вместе в различных соотношениях или смешивают вместе с другими соединениями, например нуклеотидами и/или аминокислотами и/или фуранонами, с образованием различных ароматизирующих композиций. Неограничивающие примеры нуклеотидов, аминокислот и фуранонов раскрыты в заявках на патент PCT/EP2013/072788, PCT/EP2013/072789, PCT/EP2013/072790 и PCT/EP2013/072794, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения, которые смешивают с другими соединениями, представляют собой одно или несколько соединений формулы Nt-1 - Nt-55 и/или одно или несколько соединений формулы Tm-1 - Tm-104.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные, которые смешивают с другими соединениями, включают нуклеотидные производные формул Nt-1 - Nt-55 и Таблицы 2 и 6-14.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранные соединения, которые смешивают с другими соединениями, включают трансмембранные соединения формул Tm-1 - Tm-104.
4.1 Нуклеотиды
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, одно нуклеотидное производное и/или, по меньшей мере, одно трансмембранное соединение и, по меньшей мере, один нуклеотид, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, два, три, четыре, пять или более нуклеотидов, как описано в настоящем документе. Неограничивающие примеры нуклеотидов включают гуанозинмонофосфат (GMP), гуанозиндифосфат (GDP), гуанозинтрифосфат (GTP), аденозинмонофосфат (AMP), аденозиндифосфат (ADP), аденозинтрифосфат (ATP), цитидинмонофосфат (CMP), цитидиндифосфат (CDP), цитидин трифосфат (CTP), инозинмонофосфат (IMP), инозиндифосфат (IDP, инозинтрифосфат (ITP), уридинмонофосфат (UMP), уридиндифосфат (UDP), уридинтрифосфат (UTP), тимидинмонофосфат ), тимидиндифосфат (TDP), тимидинтрифосфат (TTP) и ксантозинмонофосфат (XMP), ксантозиндифосфат (XDP) и ксантозинтрифосфат (XTP) или любое нуклеотидное производное, как описано формулой Nt-1.
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующая композиция может включать нуклеотид, присутствующий в пищевом продукте, который может присутствовать в количестве примерно от 1 пМ примерно до 1 М, примерно от 1 нМ примерно до 1 М, примерно от 1 мкМ примерно до 1 М, примерно от 1 мМ примерно до 1 М, примерно от 10 мМ примерно до 1 М, примерно от 100 мМ примерно до 1 М, примерно от 250 мМ примерно до 1 М, примерно от 500 мМ примерно до 1 М, примерно от 750 мМ примерно до 1 М, примерно от 1 мкМ примерно до 1 М, примерно от 1 мкМ примерно до 750 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 500 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 250 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 100 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 50 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 25 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 10 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 1 мМ, примерно от 1 мкМ примерно до 100 мкМ или примерно от 1 мкМ примерно до 10 мкМ, и значения между ними.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотид может присутствовать в количестве, составляющем более чем примерно 1 мМ или более чем примерно 2,5 мМ пищевого продукта для домашних животных. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления нуклеотид и/или нуклеотидное производное может присутствовать в количестве, составляющем менее чем примерно 100 мМ, менее чем примерно 50 мМ, менее чем примерно 20 мМ или менее чем примерно 10 мМ пищевого продукта для домашних животных. В некоторых вариантах осуществления нуклеотид присутствует в количестве приблизительно 5 мМ пищевого продукта для домашних животных.
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующая композиция содержит по меньшей мере одно трансмембранное соединение и по меньшей мере один нуклеотид и/или нуклеотидное производное, которое может представлять собой IMP, GMP или их смесь. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеотид может представлять собой комбинацию GMP и IMP, включающую примерно от 1% примерно до 99% GMP и примерно от 1% примерно до 99% IMP или примерно от 20% примерно до 80% GMP и примерно от 20% примерно до 80% IMP или примерно 50% GMP и примерно 50% IMP или примерно 10% GMP и примерно 90% IMP, или примерно 20% GMP и примерно 80% IMP, или примерно 30% GMP и примерно 70% IMP или примерно 40% GMP и примерно 60% IMP, или примерно 60% GMP и примерно 40% IMP, или примерно 70% GMP и примерно 30% IMP, или примерно 80% GMP и примерно 20% IMP или примерно 10% GMP и примерно 90% IMP.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислоту, как описано в настоящем документе.
4.2 Аминокислоты
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, одно нуклеотидное производное и/или, по меньшей мере, одно трансмембранное соединение и, по меньшей мере, одну аминокислоту, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, две, три, четыре, пять или более аминокислот, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или более первых аминокислот и/или по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или более вторых аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, одну первую аминокислоту и, по меньшей мере, одну вторую аминокислоту.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, две первые аминокислоты и, по меньшей мере, одну вторую аминокислоту.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, одну первую аминокислоту и, по меньшей мере, две вторых аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция содержит, по меньшей мере, две первых аминокислоты и, по меньшей мере, две вторых аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ароматизирующая композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один нуклеотид, как описано в настоящем документе.
Неограничивающие примеры первой аминокислоты включают триптофан, фенилаланин, гистидин, глицин, цистеин, аланин, тирозин, серин, метионин, аспарагин, лейцин и их комбинации.
Неограничивающие примеры второй аминокислоты включают аспарагин, треонин, изолейцин, пролин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, гидроксилпролин, аргинин, цистин, глутамин, лизин, валин, орнитин, таурин, мононатриевую соль глутаминовой кислоты (MSG) и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере, одна первая аминокислота и/или вторая аминокислота индивидуально или в комбинации могут присутствовать в количестве примерно от 1 мМ примерно до 1 М или примерно от 250 мМ примерно до 1 М, или примерно от 5 мМ примерно до 500 мМ, или примерно от 10 мМ примерно до 100 мМ, или примерно от 15 мМ примерно до 50 мМ, или примерно от 20 мМ примерно до 40 мМ пищевого продукта для домашних животных. В некоторых вариантах осуществления аминокислота (аминокислоты) может присутствовать в количестве, составляющем менее чем примерно 1 М, менее чем примерно 200 мМ, менее чем примерно 100 мМ, менее чем примерно 50 мМ, менее чем примерно 20 мМ или менее чем примерно 10 мМ пищевого продукта для домашних животных. В некоторых вариантах осуществления первая аминокислота и/или вторая аминокислота, индивидуально или в комбинации, могут присутствовать в количестве примерно 25 мМ пищевого продукта для домашних животных.
4.2.1 Сайт связывания аминокислот T1R1
Аминокислоты композиций, описанных в настоящем документе, которые модулируют рецептор умами, например, рецептор T1R1/T1R3, могут взаимодействовать с одной или несколькими аминокислотами в домене Venus Flytrap рецептора умами. В некоторых вариантах осуществления домен Venus Flytrap (VFT) присутствует в T1R1. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты VFT, с которыми взаимодействует композиция, содержат одну или несколько из Thr149, Tyr220, Thr148, Thr449, Ser172, Glu170, Glu301, His71, His47, Arg277, His308, Asn69, Asn302, Ser306, Ser384, Asp302, Ser306 и Ala380.
В одном неограничивающем варианте осуществления композиция содержит аминокислоту, где аминокислота взаимодействует с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более из Ser172, Thr149, Thr148, Glu301, Tyr220, Glu170 и Asp302 T1R1.
В других неограничивающих вариантах осуществления композиция взаимодействует с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более из Thr149, Ser172, Tyr220, Thr148, Glu170 и/или Asp302, где взаимодействия могут включать, например, водородные связи, солевые мостики и/или Pi-катионные взаимодействия.
В неограничивающем примере композиция взаимодействует с Glu170 и/или Asp302 домена VFT, где композиция не включает L-глутамат или L-аспарагиновую кислоту. В одном варианте осуществления Glu170 и Asp302 помогают координировать цвиттерионный азот аминокислотного лиганда композиции, который соответствует активному сайту T1R1, одновременно создавая электростатическую среду, которая непригодна для связывания L-глутамата и L-аспарагиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления композиция взаимодействует с VFT в соответствии с любой комбинацией взаимодействий, описанных в настоящем документе, например, с одним, двумя, тремя или более взаимодействиями. Взаимодействия между аминокислотой и VFT могут дополнительно включать дополнительные гидрофобные взаимодействия, которые добавляют к энергии взаимодействия аминокислоты с VFT.
in silico
В некоторых вариантах осуществления взаимодействие между композицией и одной или несколькими аминокислотами VFT включает одну или более водородную связь, ковалентную связь, нековалентную связь, солевой мостик, физическое взаимодействие и их комбинации. Взаимодействием может также быть любое взаимодействие, характерное для взаимодействия рецептора-лиганда, известного в данной области техники. Такие взаимодействия могут быть определены, например, путем сайт-направленного мутагенеза, рентгеновской кристаллографии, рентгеновских или других спектроскопических методов, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), оценки поперечных связей, масс-спектроскопии или электрофореза, анализов смещения на основе известных агонистов, структурного определения и их комбинаций. В определенных вариантах осуществления взаимодействия определяют, например, , с помощью теоретических средств, таких как закрепление соединения в область VFT с использованием молекулярного докинга, молекулярного моделирования, молекулярной симуляции или других способов, известных специалистам в данной области техники.
Настоящая заявка также обеспечивает способы идентификации соединения, которое модулирует активность рецептора умами, например, T1R1, где соединение идентифицировано на основе его способности взаимодействовать с одной или несколькими описанными в настоящем документе аминокислотами, которые присутствуют в домене VFT T1R1.
В некоторых вариантах осуществления способ включает контакт тестируемого агента с кошачьим рецептором умами T1R1, детектирование взаимодействия между тестируемым агентом и еще одной аминокислотой в сайте взаимодействия с VFT кошачьего рецептора умами, и отбор в качестве соединения тестируемого агента, который взаимодействует с одной или несколькими аминокислотами.
5. Системы доставки
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующие композиции настоящей заявки могут быть включены в систему доставки для использования в пищевых продуктах для домашних животных. Системы доставки могут быть жидкими или твердыми, водными или неводными. Системы доставки, как правило, адаптированы в соответствии с потребностями ароматизирующей композиции и/или пищевого продукта для домашних животных, в который будет введена ароматизирующая композиция.
Ароматизирующие композиции могут быть использованы в жидкой форме, в сухой форме и/или в твердой форме. При использовании в сухой форме могут быть использованы подходящие средства сушки, такие как распылительная сушка. Альтернативно, ароматизирующая композиция может быть инкапсулирована или абсорбирована водорастворимыми материалами, включая, но не ограничиваясь ими, такие материалы, как целлюлоза, крахмал, сахар, мальтодекстрин, гуммиарабик и так далее. Фактические способы получения таких сухих форм хорошо известны в данной области и могут быть применены к объекту, раскрытому настоящим.
Ароматизирующие композиции объекта, раскрытого настоящим, могут быть использованы во многих различных физических формах, хорошо известных в данной области техники, чтобы обеспечить первоначальный импульс вкуса, аромата и/или текстуры; и/или продолжительное ощущение вкуса, аромата и/или текстуры. Не ограничиваясь этим, такие физические формы включают в себя свободные формы, такие как высушенные распылением, порошкообразные и гранулированные формы и инкапсулированные формы и их смеси.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения ароматизирующей композиции могут быть получены во время обработки корма для домашних животных. Например, и без ограничения, нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения могут быть получены из соединений-предшественников во время термической обработки, например перегонки с ретортой, экструзии и/или стерилизации корма для домашних животных.
В некоторых вариантах осуществления как отмечено выше, способы инкапсулирования могут быть использованы для модификации ароматизирующих систем. В некоторых вариантах осуществления ароматизирующие соединения, ароматизирующие компоненты или вся ароматизирующая композиция могут быть полностью или частично инкапсулированы. Инкапсулирующие материалы и/или методы могут быть выбраны для определения типа модификации ароматизирующей системы.
В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующие материалы и/или способы выбирают для улучшения стабильности ароматизирующих соединений, ароматизирующих компонентов или ароматизирующих композиций; в то время как в других вариантах осуществления инкапсулирующие материалы и/или способы выбраны для модификации профиля высвобождения ароматизирующих композиций.
Подходящие инкапсулирующие материалы могут включать, но не ограничиваются ими, гидроколлоиды, такие как альгинаты, пектины, агары, гуаровые смолы, целлюлозы и т.п., белки, поливинилацетат, полиэтилен, сшитый поливинилпирролидон, полиметилметакрилат, полилактиды, полигидроксиалканоаты, этилцеллюлозу, поливинилацетатфталат, сложные эфиры полиэтиленгликоля, сополимер метакриловой кислоты и метилметакрилата, сополимер этилена и винилацетата (EVA) и тому подобное, и их комбинации. Подходящие методы инкапсулирования могут включать в себя, но не ограничиваются этим, распылительное покрытие, распылительную сушку, охлаждение распылением, абсорбцию, адсорбцию, комплексообразование включения (например, создание ароматизирующего/циклодекстринового комплекса), коацервацию, покрытие с псевдоожиженным слоем или другой способ можно использовать для инкапсулирования ингредиента с инкапсулирующим материалом.
Инкапсулированные системы доставки ароматизирующих агентов или подсластителей могут содержать гидрофобную матрицу жира или воска, окружающую ядро подсластителя или ароматизирующего агента. Жиры могут быть выбраны из любого ряда стандартных материалов, таких как жирные кислоты, глицериды или сложные полиглицериновые эфиры, сложные эфиры сорбита и их смеси. Примеры жирных кислот включают, но не ограничиваются ими, гидрогенизированные и частично гидрогенизированные растительные масла, такие как пальмовое масло, пальмоядровое масло, арахисовое масло, рапсовое масло, масло рисовых отрубей, соевое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло и их комбинации. Примеры глицеридов включают, но не ограничиваются ими, моноглицериды, диглицериды и триглицериды.
Воски могут быть выбраны из группы, состоящей из натуральных и синтетических восков и их смесей. Неограничивающие примеры включают парафиновый воск, петролатум, карбовакс, микрокристаллический воск, пчелиный воск, карнаубский воск, воск канделлилы, ланолин, воск восковницы, воск сахарного тростника, воск спермацеты, воск рисовых отрубей и их смеси.
Жиры и воски можно использовать индивидуально или в комбинации в количествах, варьирующих примерно от 10 примерно до 70%, и альтернативно в количествах примерно от 30 примерно до 60% по массе инкапсулированной системы. При использовании в комбинации, жир и воск могут присутствовать в соотношении примерно от 70:10 до 85:15, соответственно.
Типичные инкапсулированные ароматизирующие композиции, ароматизирующий агент или системы доставки подсластителей раскрыты в патентах США №№ 4597970 и 4723845, описания которых включены в настоящий документ с помощью ссылки в полном объеме.
Жидкие системы доставки могут включать, но не ограничиваются ими, системы с дисперсией ароматизирующих композиций по настоящему изобретению, такие как углеводные сиропы и/или эмульсии. Жидкие системы доставки могут также включать экстракты, где нуклеотидное производное, трансмембранное соединение и/или ароматизирующие композиции солюбилизированы в растворителе. Системы доставки твердых веществ могут быть созданы распылительной сушкой, распылительным покрытием, распылительным охлаждением, сушкой в псевдоожиженном слое, абсорбцией, адсорбцией, коацервацией, комплексообразованием или любым другим стандартным методом. В некоторых вариантах осуществления система доставки может быть выбрана так, чтобы она была совместимой или работающей в съедобной композиции. В некоторых вариантах осуществления система доставки будет включать маслянистый материал, такой как жир или масло. В некоторых вариантах осуществления система доставки будет включать в себя кондитерский жир, такой как масло какао, заменитель какао-масла, заместитель какао-масла или эквивалент какао-масла.
При использовании в сухой форме могут быть использованы подходящие средства сушки, такие как распылительная сушка. Альтернативно, ароматизирующая композиция может адсорбироваться или абсорбироваться на субстратах, таких как водорастворимые материалы, такие как целлюлоза, крахмал, сахар, мальтодекстрин, гуммиарабик и т. д., то есть может быть инкапсулированной. Фактические способы получения таких сухих форм хорошо известны в данной области.
6. Пищевые продукты для домашних животных
Ароматизирующие композиции объекта, раскрытого настоящим, могут быть использованы в широком спектре пищевых продуктов для домашних животных. Неограничивающие примеры подходящих пищевых продуктов для домашних животных включают в себя влажные (wet) пищевые продукты, сухие пищевые продукты, влажные (moist) пищевые продукты, пищевые добавки для домашних животных (например, витамины), питьевые продукты для домашних животных, закуски и угощения, а также категории пищевых продуктов для домашних животных, описанные в настоящем документе.
Комбинация ароматизирующей композиции (композиций) объекта, раскрытого настоящим, вместе с пищевым продуктом для домашних животных и необязательными ингредиентами, когда это желательно, обеспечивает ароматизирующий агент, который обладает неожиданным вкусом и придает, например, вкус умами и/или пикантные вкусовые ощущения. Ароматизирующие композиции, описанные в настоящем документе, могут быть добавлены до, во время или после обработки состава или упаковки пищевого продукта для домашних животных, и компоненты ароматизирующей композиции могут добавляться последовательно или одновременно. В некоторых вариантах осуществления один или несколько компонентов ароматизирующих композиций, раскрытых в настоящем документе, могут быть получены во время получения пищевого продукта для домашних животных из соединений-предшественников, например, во время термической обработки пищевых продуктов. Например, и без ограничения, нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение ароматизирующей композиции может быть получено во время получения пищевого продукта для домашних животных, а дополнительные компоненты ароматизирующей композиции могут быть добавлены до, во время или после обработки состава или упаковки пищевого продукта для домашних животных.
В некоторых вариантах осуществления пищевой продукт для домашних животных представляет собой полноценный сухой пищевой продукт. Сухой или с низким содержанием влаги полноценный пищевой продукт для домашних животных может содержать менее чем примерно 15% влаги и включать примерно от 10 примерно до 60% жира, примерно от 10% примерно до 70% белка и примерно от 30% примерно до 80% углеводов, например, пищевых волокон и зольного остатка.
В некоторых вариантах осуществления пищевой продукт для домашних животных представляет собой полноценный питательный влажный пищевой продукт. Влажный или с высоким содержанием влаги полноценный питательный пищевой продукт для домашних животных может содержать более чем примерно 50% влаги. В некоторых вариантах осуществления влажный пищевой продукт для домашних животных включает примерно от 40% жира, примерно от 50% белка и примерно от 10% углеводов, например, пищевых волокон и зольного остатка.
В некоторых вариантах осуществления пищевой продукт для домашних животных представляет собой полноценный питательный влажный пищевой продукт. Влажный, например, полувлажный или полусухой или умеренно сухой или умеренно влажный или промежуточный или содержащий среднюю влажность полноценный питательный пищевой продукт для домашних животных содержит примерно от 15 примерно до 50% влаги.
В некоторых вариантах осуществления пищевой продукт для домашних животных является снэк-продуктом для домашних животных. Неограничивающие примеры пищевых снэк-продуктов для домашних животных включают закусочные батончики, жевательные резинки для животных, хрустящие лакомства, зерновые слитки, закуски, печенье и сладкие продукты.
В некоторых вариантах осуществления источник белка может быть получен из растительного источника, такого как белок люпина, белок пшеницы, соевый белок и их комбинации. Альтернативно или дополнительно, источник белка может быть получен из множества животных источников. Неограничивающие примеры животного белка включают говядину, свинину, домашнюю птицу, баранину или рыбу, включая, например, мышечное мясо, мясной субпродукт, мясную муку или рыбную муку.
7. Методы измерения вкусовых свойств
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, свойства вкуса, аромата и/или вкусовой привлекательности пищевого продукта для домашних животных могут быть модифицированы путем смешивания ароматизирующей композиции с пищевым продуктом или путем генерирования в условиях приготовления пищевого продукта, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления свойство(свойства) может быть усилено или уменьшено путем увеличения или уменьшения концентрации ароматизирующей композиции, смешанной или полученной с пищевым продуктом. В некоторых вариантах осуществления вкусовые свойства модифицированного пищевого продукта могут быть оценены, как описано в настоящем документе, и концентрация ароматизирующей композиции, смешанной или полученной с пищевым продуктом, может быть увеличена или уменьшена на основе результатов оценки.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, свойства вкуса и/или вкусовой привлекательности могут быть измерены с помощью анализа , в котором измеряется способность соединения активировать кошачий рецептор умами, экспрессируемый клетками  в различных концентрациях. В некоторых вариантах осуществления увеличение активации рецептора коррелирует с повышением вкусовых свойств и/или вкусовой привлекательности соединения. В некоторых вариантах осуществления композицию измеряют индивидуально или в комбинации с другими соединениями. В некоторых вариантах осуществления анализ  включает анализы , описанные в разделе «Примеры» настоящей заявки. В некоторых вариантах осуществления анализ  включает рекомбинантные клетки, экспрессирующие рецептор умами, кодируемый нуклеиновой кислотой, вводимой в клетки (например, экзогенной нуклеиновой кислотой). В других неограничивающих вариантах осуществления анализ  включает клетки, экспрессирующие рецептор умами, который является нативным для клеток. Примеры таких клеток, экспрессирующих нативный рецептор умами, включают, например, но не ограничиваясь ими, вкусовые клетки кошек и/или собак. В некоторых вариантах осуществления вкусовые клетки кошек и/или собак, экспрессирующие рецептор умами, выделяют из кошек и/или собак и культивируют .
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, вкусовые свойства и/или вкусовая привлекательность могут быть измерены с использованием дегустаторов вкуса. Например, но не для ограничения, панель может содержать кошек-дегустаторов. В некоторых вариантах осуществления панель может включать в себя собак-дегустаторов. В некоторых вариантах осуществления вкусовая привлекательность пищевого продукта для домашних животных может быть определена путем потребления пищевого продукта для домашних животных, содержащего индивидуально ароматизирующую композицию (например, тест с одной чашей, монадическое ранжирование). В некоторых вариантах осуществления вкусовая привлекательность пищевого продукта для домашних животных может быть определена с помощью предпочтительного потребления пищевого продукта для домашних животных, содержащего ароматизирующую композицию, описанную в настоящем документе, в сравнении с пищевым продуктом для домашних животных, который не содержит ароматизирующую композицию или содержит другую ароматизирующую композицию (например, тест с двумя чашами для тестирования предпочтений, различий и/или выбора).
В некоторых вариантах осуществления вкусовая привлекательность и/или вкус умами ароматизирующей композиции можно определить с помощью предпочтительного потребления водного раствора, содержащего ароматизирующую композицию, описанную в настоящем документе, в сравнении с водным раствором, который не содержит ароматизирующую композицию или содержит другую ароматизирующую композицию (например, тест с двумя сосудами). Например, панель растворов может использоваться для сравнения вкусовой привлекательности ряда концентраций соединений при монадическом воздействии. В некоторых вариантах осуществления раствор может содержать усилитель вкусовой привлекательности, например, L-гистидин, в качестве пищевого/положительного вещества, стимулирующего вкусовые ощущения, для увеличения потребление исходного раствора, что позволяет идентифицировать потенциальное отрицательное воздействие тестируемого соединения.
Коэффициент потребления для каждого пищевого продукта для домашних животных или водного раствора может быть определен путем измерения количества потребленного рациона, разделенного на общее потребление. Затем можно рассчитать коэффициент потребления (CR), для сравнения потребления одного рациона в отношении другого рациона для определения предпочтительного потребления одного пищевого продукта или водного раствора по сравнению с другим. В качестве альтернативы или дополнительно, разницу в приеме (г) можно использовать для оценки средней разницы в приеме между двумя растворами в тесте с двумя сосудами или между двумя пищевыми продуктами для домашних животных в тесте с двумя чашами при выбранном уровне значимости, например, на уровне значимости 5%, чтобы определить среднюю разницу в приеме с доверительным интервалом 95%. Однако может использоваться любой уровень значимости, например уровень значимости 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 или 50%. В некоторых вариантах осуществления процентные значения предпочтений, например, процентное предпочтение животного одного раствора или пищевого продукта представляет собой процент от общего количества жидкости или пищевого продукта, поглощенного во время теста, в котором учитывается этот раствор или пищевой продукт.
8. Методы получения
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения по настоящему изобретению могут быть получены с использованием стандартных процессов хемосинтеза. В некоторых вариантах осуществления способ хемосинтеза обеспечивает нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение, имеющее чистоту, составляющую, по меньшей мере, 99,999%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 85 или по меньшей мере 80%.В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения могут быть получены с использованием стандартных процессов гидролиза, таких как те, которые используют кислоты, ферменты или комбинацию кислот и ферментов.
Нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения по настоящему описанию также могут быть получены в условиях приготовления пищи, например, во время производства пищевого продукта для домашних животных. Например, но не в качестве ограничения, нуклеотидные производные и/или трансмембранные соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены во время термической пищевой обработки, например стерилизации, перегонки с ретортой и/или экструзии, из соединений-предшественников, присутствующих в корме для домашних животных. В некоторых вариантах осуществления жидкое и/или порошкообразное вещество, усиливающее вкусовую привлекательность, можно также добавлять для улучшения вкуса корма для домашних животных, например, к сухому пищевому продукту для домашних животных и для повышения вкусовой привлекательности пищевого продукта для домашних животных. Вещество, стимулирующее вкусовую привлекательность, может быть гидролизатом мяса (например, печени) и/или гидролизатом растительного продукта и может необязательно включать другие вещества, стимулирующие вкусовую привлекательность, известные в данной области. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение могут быть смешаны вместе или получены вместе с жидким и/или порошкообразным веществом, стимулирующим вкусовую привлекательность, до его добавления в пищевой продукт для домашних животных. Альтернативно или дополнительно, нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение может быть смешано или получено вместе с жидким и/или порошкообразным веществом, стимулирующим вкусовую привлекательность, после его добавления в пищевой продукт для домашних животных.
В некоторых вариантах осуществления ароматизирующие композиции настоящего изобретения содержат одно или несколько трансмембранных соединений формул Tm-1 - Tm-104. В некоторых вариантах осуществления такие соединения могут, без ограничения, быть синтезированы любыми способами, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления трансмембранные соединения в виде производных парабановой кислоты могут быть синтезированы в соответствии со следующей схемой синтеза:
9. Неограничивающие примеры ароматизирующих композиций настоящего изобретения
Как описано в настоящем документе, существует по меньшей мере три различных сайта связывания, присутствующих на кошачьем рецепторе T1R1/T1R3 (т.е. рецептор умами), которые позволяют связывание небольших молекул и/или соединений. Один из сайтов связывания, присутствующих на кошачьем рецепторе T1R1/T1R3, может связывать нуклеотид и/или нуклеотидные производные, как описано в настоящем документе. Второй сайт связывания, присутствующий на кошачьем рецепторе T1R1/T1R3, может связывать аминокислоты первой группы, как описано в настоящем документе, а третий сайт связывания, присутствующий на кошачьем рецепторе T1R1/T1R3 (т.е. домен 7TM T1R1), может связывать трансмембранные соединения, как описано в настоящем документе. Без привязки к какой-либо конкретной теории связывание аминокислоты первой группы, как раскрыто в настоящем документе, может изменить конформацию кошачьего рецептора T1R1/T1R3, чтобы обеспечить больший контакт со связанным нуклеотидом и/или нуклеотидным производным и привести к синергической активации рецептора умами. Описанные в настоящем документе аминокислоты второй группы могут взаимодействовать с одним или несколькими другими рецепторами и не конкурировать с первыми аминокислотами за связывание с рецептором умами. Добавление аминокислоты второй группы к ароматизирующей композиции может улучшить восприятие вкуса композиции. Связывание трансмембранного соединения с рецептором, как описано в настоящем документе, дополнительно активирует рецептор, таким образом усиливая или изменяя вкусовую привлекательность пищевого продукта, содержащего такие соединения.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере один нуклеотид и/или нуклеотидное производное, которое связывается с первым сайтом связывания на рецепторе умами и/или по меньшей мере одна аминокислота первой группы, которая связывается со вторым сайтом связывания на рецепторе умами и/или по меньшей мере одно трансмембранное соединение, которое связывается с третьим сайтом связывания на рецепторе умами (например, в 7TM-домене рецептора умами) и/или по меньшей мере одна аминокислота второй группы, которая связывается с отдельным рецептором.
Раскрытый настоящим объект обеспечивает ароматизирующие композиции, которые содержат по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять или более нуклеотидных производных и/или по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или более нуклеотидов и/или по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять или более трансмембранных соединений и/или по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот первой группы и/или по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот второй группы.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот первой группы и/или по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот второй группы, выбранных из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере одну аминокислоту первой группы, выбранную из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере одну аминокислоту второй группы, выбранную из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере одну аминокислоту первой группы и, по меньшей мере, одну аминокислоту второй группы, выбранную из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере две аминокислоты первой группы и, по меньшей мере, одну аминокислоту второй группы, выбранную из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере одну аминокислоту первой группы и, по меньшей мере, две аминокислоты второй группы, выбранные из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере две аминокислоты первой группы и по меньшей мере две аминокислоты второй группы, выбранные из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере один нуклеотид и, по меньшей мере, одну аминокислоту первой группы, выбранную из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и по меньшей мере один нуклеотид и, по меньшей мере, одну аминокислоту второй группы, выбранную из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное и, по меньшей мере, один нуклеотид и, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот первой группы и/или по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот второй группы, выбранных из Таблицы 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, по меньшей мере один нуклеотид и, по меньшей мере, одну аминокислоту первой группы и, по меньшей мере, одну аминокислоту второй группы, выбранную из Таблицы 4.
Таблица 4. Аминокислоты.
Аминокислоты Первой Группы:
Аминокислоты Второй Группы:
L-триптофан
L-пролин
L-фенилаланин
Гидрокси-L-пролин
L-гистидин
L-глутаминовая кислота
Глицин
Глутамат натрия (MSG)
L-цистеин
L-аспарагиновая кислота
L-аланин
L-аргинин
L-Тирозин
L-цистин
L-серин
L-Глютамин
L-Метионин
L-Изолейцин
L-лейцин
L-лизин
L-аспарагин
L-Треонин
L-валин
L-орнитин
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, гистидин и пролин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, аланин и пролин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, глицин и пролин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, фенилаланин и пролин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, триптофан и пролин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, тирозин и пролин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, гистидин и треонин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, аланин и треонин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, глицин и треонин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, фенилаланин и треонин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, триптофан и треонин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, тирозин и треонин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, гистидин и глутаминовую кислоту.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, аланин и глутаминовую кислоту.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, глицин и глутаминовую кислоту.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, фенилаланин и глутаминовую кислоту.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, триптофан и глутаминовую кислоту.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую по меньшей мере одно нуклеотидное производное, тирозин и глутаминовую кислоту.
В некоторых вариантах осуществления любая из ароматизирующих композиций, описанных выше, может дополнительно содержать по меньшей мере один нуклеотид и/или по меньшей мере одно трансмембранное соединение, как описано в настоящем документе.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую аденозин-3',5'-дифосфат и аланин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую 6-тиогуанозин-5'-О-монофосфат и аланин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую 2'-,3'-O-(N'-метилантранилоил) гуанозин-5'-О-монофосфат и аланин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую 2-амино-6-хлорпиринерибозид-5'-О-монофосфат и аланин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую 6-хлорпиринерибозид-5'-О-монофосфат и аланин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию ароматизатора, включающую инозинтрифосфат (ITP) и аланин.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую инозинтрифосфат (ITP), аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую 1-(2-бромфенил)-3-((1R,2S)-2-гидрокси-2,3-дигидро-1Н-инден-1-ил)мочевину, аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую N-(бензо[d][1,3] диоксол-5-ил) -2-пропилпентанамид, аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид, аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую N-(2-амино-2-оксо-1-фенилэтил)-3-хлор-4,5-диметоксибензамид, аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую (E)-3-(4-метоксифенил)-N-(пентан-3-ил)акриламид, аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую 1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил) имидазолидин-2,4,5-трион, аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую 1H-имидазо[4,5-с]пиридин-2(3H)-он, аланин и IMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид, фенилаланин и GMP.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает ароматизирующую композицию, содержащую комбинацию N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид с первой аминокислотой (аминокислоты группы A), второй аминокислотой (аминокислота группы В) и с одним или несколькими нуклеотидами, как описано ниже.
Таблица 5. Ароматизирующие композиции, содержащие трансмембранное соединение, первую аминокислоту (группа А), вторую аминокислоту (группа В) и нуклеотид.
Трансмембранное соединение:
Аминокислота Группы А:
Аминокислота Группы В:
Нуклеотид:
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Ala
Pro
IMP+GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Ala
Pro
IMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Ala
Pro
GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Gly
Pro
IMP+GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Gly
Pro
IMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Gly
Pro
GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
His
Pro
IMP+GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
His
Pro
IMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
His
Pro
GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Ala
Thr
IMP+GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Ala
Thr
IMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Ala
Thr
GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Gly
Thr
IMP+GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Gly
Thr
IMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
Gly
Thr
GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
His
Thr
IMP+GMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
His
Thr
IMP
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
His
Thr
GMP
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пищевой продукт для домашних животных, содержащий ароматизирующую композицию, как описано в настоящем документе, где ароматизирующая композиция присутствует в количестве примерно от 0,001 м.д. примерно до 1000 м.д..
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пищевой продукт для домашних животных, содержащий ароматизирующую композицию, как описано в настоящем документе, где ароматизирующая композиция присутствует в концентрации примерно от 0,0001 мас.% примерно до 10 мас.% пищевого продукта для домашних животных.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пищевой продукт для домашних животных, содержащий ароматизирующую композицию, как описано в настоящем документе, где ароматизирующая композиция присутствует в количестве, выше чем примерно 1 м.д.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пищевой продукт для домашних животных, содержащий ароматизирующую композицию, как описано в настоящем документе, где ароматизирующая композиция присутствует в количестве, более чем примерно 10 м.д.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пищевой продукт для домашних животных, содержащий ароматизирующую композицию, как описано в настоящем документе, где ароматизирующая композиция присутствует в количестве, более чем примерно 100 м.д..
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пищевой продукт для домашних животных, содержащий описанное в настоящем документе нуклеотидное производное, которое присутствует в количестве примерно от 1 пМ примерно до 1 М.
10. Неограничивающие примеры способов настоящего изобретения
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ повышения вкусовой привлекательности пищевого продукта для домашних животных, включающий смешивание пищевого продукта для домашних животных с ароматизированной композицией, включающей нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение, как описано в настоящем документе, где нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение присутствует в концентрации примерно от 1 пМ примерно до 10 М или примерно от 1 пМ примерно до 1 М в смеси.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ увеличения вкусовой привлекательности пищевого продукта для домашних животных, включающий получение пищевого продукта для домашних животных вместе с ароматизированной композицией, включающей нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение, как описано в настоящем документе, где нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение присутствует в концентрации примерно от 1 пМ примерно до 10 М или примерно от 1 пМ примерно до 1 М в продукте.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ увеличения вкуса умами пищевого продукта для домашних животных, включающий смешивание пищевого продукта для домашних животных с ароматизированной композицией, включающей нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение, как описано в настоящем документе, где нуклеотидное производное присутствует в смеси в концентрации от 0,001 м.д. до 1000 м.д..
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ увеличения вкусовой привлекательности пищевого продукта для домашних животных, включающий смешивание пищевого продукта для домашних животных с ароматизирующей композицией, включающей нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение, как описано в настоящем документе, где ароматизаторующая композиция присутствует в смеси в концентрации от 0,001 м.д. до 1000 м.д..
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ увеличения вкуса умами пищевого продукта для домашних животных, включающий смешивание пищевого продукта для домашних животных с ароматизирующей композицией, включающей нуклеотидное производное и/или трансмембранное соединение, как описано в настоящем документе, где ароматизирующая композиция присутствует в смеси в концентрации примерно от 0,0001% примерно до 10% по массе.
11. ПРИМЕРЫ
Раскрытый настоящим объект будет лучше понятен из нижеследующих Примеров, которые приведены в качестве иллюстрации, а не ограничения.
Пример 1. Активация рецептора T1R1/T1R3 нуклеотидными производными.
in vitro
Настоящий пример описывает активацию кошачьего рецептора T1R1/T1R3 нуклеотидными производными .
in silico
in vitro
in vitro
Нуклеотидные производные, которые могут функционировать в качестве активаторов T1R1/T1R3, были идентифицированы с помощью -моделирования с кошачьим рецептором умами, T1R1/T1R3, и выбраны для дальнейшего тестирования . Функциональную характеристику выбранных нуклеотидных производных  использовали для оценки эффективности нуклеотидного производного при активации рецептора T1R1/T1R3 индивидуально и в комбинации с аминокислотами и/или нуклеотидами.
Методы. Клетки НЕК293, которые стабильно экспрессируют T1R3 и индуцируемо экспрессируют T1R1, подвергали воздействию нуклеотидных производных индивидуально для активации рецептора умами. Активацию рецептора T1R1/T1R3 детектировали путем изменения уровня внутриклеточного кальция с использованием чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя. Клетки, которые экспрессируют T1R3, но не T1R1, использовали в качестве контроля. Для сбора данных использовали FLIPR Tetra или FlexStation 3.
50
50
50
50
Для каждого нуклеотидного производного были получены кривые дозовой зависимости и определены следующие свойства: EC нуклеотидного производного индивидуально; EC нуклеотидного производного с 20 мМ аланина; EC нуклеотидного производного с 0,2 мМ IMP; И EC нуклеотидного производного с 20 мМ аланина и 0,2 мМ IMP.
50
Термин половинная максимальная эффективная концентрация (ЕС) относится к концентрации соединения, которое вызывает ответ, соответствующий половине между базовой линией и максимумом после определенного времени воздействия. В каждом эксперименте серийные разведения до 0,1 мМ, 1 мМ или 10 мМ нуклеотидного производного добавляли к клеткам, экспрессирующим T1R1/T1R3.
50
Результаты. Обработка клеток HEK293, экспрессирующих рецепторы T1R1/T1R3 с помощью 2'-деоксиаденозин-3',5'-O-бисфосфата индивидуально (например, в буфере) или в комбинации с 20 мМ аланином приводила к активации T1R1/T1R3 рецептора, о чем свидетельствует изменение уровня внутриклеточного кальция (ΔF/F0).В присутствии аланина или в буфере, 2'-дезоксиаденозин-3',5'-O-бисфосфат приводил к наблюдаемой величине EC 0,02 мМ (Таблица 6 и Фигура 2). Эти результаты выявили, что 2'-дезоксиаденозин-3',5'-O-бисфосфат является положительным активатором рецептора T1R1/T1R3.
50
50
Было обнаружено, что нуклеотидное производное, дилитиевая соль аденозин-5'-O-тиомонофосфата, служит активатором только T1R1/T1R3 (Фигура 8 и Таблица 6). В присутствии 20 мМ аланина, который имеет значение ЕС, равное только 13,6 мМ, ЕС дилитиевой соли аденозин-5'-O-тиомонофосфата уменьшилось от более чем 1 мМ до 0,06 мМ, а ΔF/F0 значительно увеличилось (Фигура 8 и Таблица 6). Эти результаты предполагают, что аланин и нуклеотидные производные, например аденозин-5'-O-тиомонофосфат, действуют синергетически для активации T1R1/T1R3.
Без привязки к конкретной теории эти результаты демонстрируют, что нуклеотидные производные индивидуально или в комбинации с аминокислотой, например аланином, могут функционировать в качестве положительных модуляторов рецептора T1R1/T1R3.
Таблица 6. Активация T1R1/T1R3 нуклеотидными производными
Название
Химическая структура
Номер CAS
EC50 - индивидуально (мМ)
EC50 - с Ala (мМ)
EC50 - с IMP (мМ)
EC50 - с Ala и IMP (мМ)
2'-деоксиаденозин-3', 5'-O-бисфосфат
<img file="00000060.jpg" he="51" wi="42" img-content="undefined" img-format="jpg" />
16174-58-6
0,02 ± 0,009
0,02 ± 0,005
--
--
Натриевая соль инозин 5'-дифосфата (IDP)
<img file="00000177.jpg" he="26" wi="59" img-content="undefined" img-format="jpg" />
81012-88-6
--
0,65 ± 0,07
--
--
2'-/ 3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил) Гуанозин-5'-О-монофосфат (2'-/3'-AEC-5'-GMP)
<img file="00000057.jpg" he="55" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
N/A
0,07 ± 0,04
0,14 ± 0,02
>3
>3
Тринатриевая соль инозина трифосфата (ITP)
<img file="00000178.jpg" he="29" wi="58" img-content="undefined" img-format="jpg" />
35908-31-7
0,05 ± 0,03
0,08 ± 0,01
0,02 ± 0,03
0,03 ± 0,01
N6-Бензоиладенозин-5'-O-Монофосфат (6-Bnz-5'-AMP)
<img file="00000059.jpg" he="54" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
40871-55-4
> 1
> 1
0,72 ± 0,25
> 1
Дилитиевая соль аденозин-5'-O-тиомонофосфата
<img file="00000179.jpg" he="43" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
93839-85-1
> 1
0,06 ± 0,03
> 1
> 1
натриевая соль аденозин-3', 5'-дифосфата
<img file="00000180.jpg" he="34" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />
75431-54-8
--
0,001 ± 0,1
--
--
Натриевая соль аденозин-3', 5'-дифосфата+Ala (1: 1000)
<img file="00000180.jpg" he="34" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />
75431-54-8
> 0,01
> 0,01
> 0,01
--
Натриевая соль аденозин-3', 5'-дифосфат+Ala (1: 100)
<img file="00000180.jpg" he="34" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />
75431-54-8
> 0,03
0,003 ± 0,0003
--
--
Натриевая соль аденозин-3', 5'-дифосфата+Ala (1:10)
<img file="00000180.jpg" he="34" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />
75431-54-8
> 0,03
0,003 ± 0,0003
--
--
Пример 2 - Активация рецептора T1R1/T1R3 соединениями нуклеотидных производных в комбинации с аминокислотой.
Настоящий пример описывает активацию кошачьего рецептора T1R1/T1R3 нуклеотидными производными в комбинации с аминокислотой in vitro.
Нуклеотидные производные оценивали для определения эффективности нуклеотидных производных при активации рецептора T1R1/T1R3 в комбинации с одним или несколькими нуклеотидами и/или одной или несколькими аминокислотами.
Методы. Клетки НЕК293, которые стабильно экспрессируют T1R3 и индуцируемо экспрессируют T1R1, подвергали воздействию нуклеотидных производных индивидуально или в комбинации с одной или несколькими аминокислотами и/или с одним или несколькими нуклеотидами для активации рецептора умами. Активацию рецептора T1R1/T1R3 детектировали путем изменения уровня внутриклеточного кальция с использованием чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя и/или люминесцентной репортерной системы. Клетки, которые экспрессируют T1R3, но не T1R1, использовали в качестве контроля. Для сбора данных использовали FLIPR Tetra или FlexStation 3.
50
50
Для каждого нуклеотидного производного были получены кривые зависимости дозового ответа и определены следующие свойства в присутствии 20 мМ аланина: ЕС нуклеотидного производного, максимальная реакция рецептора в присутствии нуклеотидного производного, максимальный ответ рецептора в присутствии нуклеотидного производного по отношению к реакции рецептора в присутствии IMP и пороговое количество нуклеотидного производного, которое приводит к активации рецептора T1R1/T1R3. Значения EC для используемого положительного и отрицательного контроля суммированы в Таблице 16.
50
Результаты: Влияние всех нуклеотидных производных, протестированных при активации T1R1/T1R3, показано в Таблице 15. Обработка клеток HEK293, экспрессирующих рецепторы T1R1/T1R3, нуклеотидным производным, натриевой солью аденозин-3',5'-дифосфата (ADP), в комбинации с 20 мМ аланина приводила к активации рецептора T1R1/T1R3, что было показано максимальным изменением внутриклеточного уровня кальция (ΔF/F0) и наблюдаемым значением EC50 0,001 мМ. Напротив, нуклеотид, монофосфат аденозина (AMP), в присутствии 20 мМ аланина давал наблюдаемое значение EC 0,011 мМ (Таблица 7).Эти результаты показывают, что нуклеотидное производное на основе аденозина демонстрирует улучшенную активность при активации рецептора T1R1/T1R3 по сравнению со стандартным нуклеотидом, из которого он был получен. Аналогичные результаты были получены для натриевой соли 2'-/3'-O-(N'-метилантранилоил) аденозин-5'-O-монофосфат (Таблица 7). Кроме того, нуклеотидные производные на основе аденозина также демонстрировали более низкое пороговое значение для активации рецепторов по сравнению с AMP (Таблица 7).
50
50
Производные на основе гуанозина, 6-тиогуанозин-5'-О-монофосфат, 2'-деоксигуанозин-5'-О-монофосфоротиоат (натриевая соль); 2'-,3'-O-(N'-метилантранилоил)гуанозин-5'-O-монофосфат; гуанозин-5'-монофосфоротиоат (натриевая соль); 2'-дезокси-3'-O-(N'-метилантранилоил) гуанозин-5'-O-монофосфат; гуанозин-5'-O-(2-тиодифосфат), 2'-дезоксигуанозин-3', 5'-O-бисфосфат; И 2'-деоксигуанозин-5'-О-монофосфоротиоат, как наблюдалось, действуют как активаторы T1R1/T1R3 в присутствии аланина (Таблица 8). Как показано в Таблице 8, эти нуклеотидные производные на основе гуанозина проявляли улучшенную активность по сравнению со стандартным нуклеотидом, гуанозинмонофосфатом (GMP). Например, 6-тиогуанозин-5'-О-монофосфат показал значение ЕС 0,0009 мМ в присутствии аланина и пороговое значение 0,0002 мМ; тогда как GMP показал значение EC 0,02 мМ и пороговое значение 0,008 мМ (Таблица 8 и Фигура 1).
50
50
50
Также наблюдали, что нуклеотидные производные на основе пурина, 2-амино-6-хлорпиринерибозид-5'-O-монофосфат (2-NH2-6-Cl-5'-PuMP) и 6-хлорпиринерибозид-5'-O-монофосфат действуют как активаторы рецептора T1R1/T1R3 (Таблица 9). Например, 2-амино-6-хлорпиринерибозид-5'-О-монофосфат в присутствии аланина показал значение ЕС 0,0005 мМ с пороговым значением 0,00013 мМ, и 6-хлорпиринерибозид-5'-О-монофосфат в присутствии аланина имеет значение EC 0,002 мМ с пороговым значением 0,0005 мМ (Таблица 9). Напротив, пуриновый рибозид-5'-O-монофосфат (5'-PuMP) показал значение EC 0,02 мМ с пороговым значением 0,005 мМ в присутствии аланина, что указывает на то, что пуриновые нуклеотиды активировали кошачий рецептор умами при более низкой концентрации по сравнению со стандартным нуклеотидом 5'-PuMP (Таблица 9).
50
50
50
50
50
Было обнаружено, что производные нуклеотида на основе инозина активируют рецептор в присутствии аланина (Таблица 11). 6-тиоинозинфосфат показал значение ЕС 0,02 мМ в присутствии аланина, и инозинтрифосфата (ITP) показал значение EC 0,08 мМ в присутствии аланина (Таблица 11 и Фигура 6). Стандартный нуклеотид, монофосфат инозина (IMP) показал значение ЕС 0,07 мМ, что указывает на повышение активности 6-тиоинозинфосфата по сравнению с IMP. Аналогичные результаты наблюдались для нуклеотидных производных на основе уридина, где нуклеотидные производные проявляли улучшенную активность по сравнению с монофосфатом уридина (UMP). Например, нуклеотидное производное на основе уридина, 5'-монофосфофорофосфолидат уридин-4-морфолин-N,N'-дициклогексилкарбоксамидин, показало значение ЕС более чем 3 мМ по сравнению с величиной EC UMP, превышающей 30 мМ (Таблица 12).
Без привязки к определенной теории эти результаты показывают, что нуклеотидные производные функционируют как положительные модуляторы рецептора T1R1/T1R3 и проявляют улучшенную активность по сравнению со стандартными нуклеотидами.
Таблица 7. Активация T1R1/T1R3 аденозином и нуклеотидными производными на основе аденозина
Название
Химическая структура
Номер CAS
EC0 - с Ala (мМ)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс. отв. % От IMP
Порог (мМ)
Аденозин-3', 5'-дифосфат натрия (ADP)
<img file="00000180.jpg" he="34" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />
75431-54-8
0,001
0,9578
98,9
0,00025
Натриевая соль 2'-/ 3'-O-(N'-метилантранилоил) аденозин-5'-O-монофосфата (MANT-AMP)
<img file="00000054.jpg" he="52" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
85287-53-2
0,01
1,915
154,1
0,0025
Динатриевая соль аденозин-5'-монофосфата (AMP)
<img file="00000181.jpg" he="29" wi="53" img-content="undefined" img-format="jpg" />
4578-31-8
0,011
1,5470
159,8
0,003
2'-дезокси-3'-О-(N'-метилантранилоил) аденозин-5'-О-монофосфат
<img file="00000182.jpg" he="41" wi="34" img-content="undefined" img-format="jpg" />
N/A
0,01
0,3975
32,0
0,0025
Аденозин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-AMPS)
<img file="00000183.jpg" he="45" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
19341-57-2
0,011
1,2435
128,4
0,003
1, N6-этеноаденозин-5'-O-монофосфат (ε-5'-AMP)
<img file="00000184.jpg" he="26" wi="54" img-content="undefined" img-format="jpg" />
103213-41-8
0,04
1,4766
152,5
0,010
2'- Дезокси-N6-метиладенозин-3',5'-дифосфат диаммониевая соль (MRS 2179 гидрат соли аммония)
<img file="00000185.jpg" he="63" wi="63" img-content="undefined" img-format="jpg" />
101204-49-3
0,05
1,8150
146,1
0,013
2'-деоксиаденозин-3', 5'-O-бисфосфат
<img file="00000060.jpg" he="51" wi="42" img-content="undefined" img-format="jpg" />
16174-58-6
0,02
0,8
76,4
0,005
Натриевая соль аденозин-5'-фосфоросульфата
<img file="00000186.jpg" he="45" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
102029-95-8
0,03
0,8658
89,4
0,008
N6- Циклопентиладенозин-5'-O-монофосфат (6-CPE-5'-AMP)
<img file="00000187.jpg" he="44" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
117778-38-8
0,05
1,2317
127,2
0,013
Дилитиевая соль аденозин-5'-O-тиомонофосфата
<img file="00000179.jpg" he="43" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
93839-85-1
0,06
1,4
139,4
0,015
2'-деоксиаденозин-5'-O-монофосфоротиоат, натриевая соль(5'-DAMPS)
<img file="00000046.jpg" he="39" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
64145-26-2
0,06
1,0375
83,5
0,015
2'-/3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил) аденозин-5'-O-монофосфат (2'-/3'-AEC-5'-AMP)
<img file="00000056.jpg" he="57" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
81012-88-6
0,09
2,2
213,9
0,0225
Натриевая соль N6-метиладенозин-5'-монофосфата
<img file="00000188.jpg" he="38" wi="53" img-content="undefined" img-format="jpg" />
81921-35-9
0,08
0,9907
102,3
0,020
2'-деоксиаденозин-5'-монофосфат
<img file="00000189.jpg" he="39" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
653-63-4
0,14
1,1503
118,8
0,035
2'-дезокси-1,N6-этеноаденозин-5'-О-монофосфат
<img file="00000190.jpg" he="98" wi="120" img-content="undefined" img-format="jpg" />
60508-81-8
0,2
0,87
70,0
0,05
7-диазааденозин-5'-O-монофосфат (7-CH-5'-AMP/5'-TuMP)
<img file="00000191.jpg" he="41" wi="58" img-content="undefined" img-format="jpg" />
16719-46-3
0,75
0,4979
51,4
0,188
8-Хлораденозин-5'-O-монофосфат, натриевая соль 8-Cl-5'-AMPS
<img file="00000044.jpg" he="51" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
37676-40-7
0,8
0,79
63,6
0,2
N6-Бензоиладенозин-5'-O-монофосфат (6-Bnz-5'-AMP)
<img file="00000059.jpg" he="54" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
40871-55-4
> 1
1,1
105,6
0,3
Таблица 8. Активация T1R1/T1R3 гуанозином и нуклеотидными производными на основе гуанозина
Название
Химическая структура
Номер CAS
EC<sub>50</sub> - с Ala (Мм)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс. отв. % от IMP
Порог (мМ)
6-тиогуанозин-5'-O-монофосфат (6-Т-5'-GMP)
<img file="00000192.jpg" he="47" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
74686-78-5
0,0009
1,3614
140,6
0,0002
2'-деоксигуанозин-5'-O-монофосфоротиоат, натриевая соль
<img file="00000047.jpg" he="48" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
87358-26-7
0,01
1,0775
86,7
0,0025
2'-, 3'-O-(N'-метилантранилоил) гуанозин-5'-O-монофосфат (MANT-5'-GMP) Флуоресцентный аналог 5'-GMP
<img file="00000193.jpg" he="46" wi="61" img-content="undefined" img-format="jpg" />
85287-54-3
0,0056
0,7190
74,3
0,0014
Натриевая соль гуанозин-5'-монофосфоротиоата (5'-GMPS)
<img file="00000052.jpg" he="42" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
76310-16-2
0,01
1,29
103,8
0,0025
2'-Дезокси-3'-O-(N'-метилантранилоил) гуанозин-5'-O-монофосфат
<img file="00000194.jpg" he="47" wi="43" img-content="undefined" img-format="jpg" />
N/A
0,01
0,295
23,7
0,0025
Гуанозин-5'-О-(2-тиодифосфат)
<img file="00000195.jpg" he="35" wi="43" img-content="undefined" img-format="jpg" />
71376-97-1
0,01
0,5875
47,3
0,0025
2'-дезоксигуанозин-3',5'-О-бисфосфат
<img file="00000196.jpg" he="128" wi="123" img-content="undefined" img-format="jpg" />
16174-59-7
0,02
1,8925
152,3
0,005
2'-деоксигуанозин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-dGMPS)
<img file="00000197.jpg" he="41" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
87358-26-7
0,02
0,8446
87,2
0,005
динатриевая соль Гуанозинмонофосфата (GMP)
<img file="00000198.jpg" he="46" wi="72" img-content="undefined" img-format="jpg" />
5550-12-9
0,03
1,2786
132,1
0,008
N-Лактоил-5'-GMP
<img file="00000199.jpg" he="45" wi="65" img-content="undefined" img-format="jpg" />
N/A
0,1
1,3600
140,5
0,025
N-Ацетил-5'-GMP
<img file="00000200.jpg" he="33" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />
N/A
0,1
1,3351
137,9
0,025
Натриевая соль гуанозина 5'-дифосфата
<img file="00000201.jpg" he="41" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
43139-22-6
0,2
1,7550
141,2
0,050
2'-/ 3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил) Гуанозин-5'-О-монофосфат (2'-/3'-AEC-5'-GMP)
<img file="00000057.jpg" he="55" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
N/A
0,14
1,1
109,5
0,035
Гидрат натриевой соли гуанозин 5'-трифосфата
<img file="00000202.jpg" he="39" wi="62" img-content="undefined" img-format="jpg" />
36051-31-7
0,7
1,8075
145,5
0,175
Гидрат натриевой соли 2'-деоксигуанозин 5'-монофосфата
<img file="00000203.jpg" he="25" wi="39" img-content="undefined" img-format="jpg" />
N/A
0,24
0,5926
61,2
0,060
4'-морфолин-N, N'-дициклогексилкарбоксамидина, 5'-монофосфонофосфат гуанозина
<img file="00000204.jpg" he="42" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
7361-07-1
1,3
0,5121
52,9
0,325
8-Бромгуанозин-5'-О-монофосфат (8-Br-5'-GMP)
<img file="00000043.jpg" he="54" wi="67" img-content="undefined" img-format="jpg" />
21870-09-7
CNBD
0,375
30,2
1
Таблица 9. Активация T1R1/T1R3 нуклеотидными производными на основе пурина
Химическое название
Химическая структура
Номер CAS
EC50 - с Ala (мМ)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс. отв. % от IMP
Порог (мМ)
2-амино-6-хлоропуринрибозид-5'-О-монофосфат(2-NH2-6-Cl-5'-PuMP)
<img file="00000042.jpg" he="55" wi="75" img-content="undefined" img-format="jpg" />
16321-98-5
0,0005
1,8700
150,5
0,00013
6-Хлоропуринибозид-5'-O-монофосфат, натриевая соль
<img file="00000205.jpg" he="46" wi="63" img-content="undefined" img-format="jpg" />
5843-59-4
0,002
1,5325
123,3
0,0005
Пурин рибозид-5'-O-монофосфат (5'-PuMP)
<img file="00000206.jpg" he="38" wi="69" img-content="undefined" img-format="jpg" />
4578-31-8
0,02
2,0266
209,3
0,005
Таблица 10: Активация T1R1/T1R3 ксантозином
Химическое название
Химическая структура
Номер CAS
EC50 - с Ala (мМ)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс. отв.% От IMP
Порог (мМ)
динатриевая соль ксантозин-5'-монофосфат (XMP)
<img file="00000207.jpg" he="43" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
25899-70-1
0,1
1,6223
167,6
+0,025
Таблица 11. Активация T1R1/T1R3 инозином и нуклеотидными производными на основе инозина
Химическое название
Химическая структура
Номер CAS
EC50 - с Ala (мМ)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс. отв. % От IMP
Порог (мМ)
6-Тиоинозин фосфат
<img file="00000208.jpg" he="41" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />
53-83-8
0,02
1,3875
111,7
0,005
Динатриевая соль инозин-5'-монофосфата (IMP)
<img file="00000209.jpg" he="49" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" />
352195-40-5
0,07
0,8681
89,7
0,018
Тринатриевая соль инозин трифосфата (ITP)
<img file="00000210.jpg" he="33" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
35908-31-7
0,08
0,3
25,1
0,02
2'-дезоксиинозин-5'-O-монофосфоротиоат, натриевую соль
<img file="00000048.jpg" he="39" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
771477-45-3
0,1
1,0375
83,5
0,025
Натриевая соль инозин 5'-дифосфата (IDP)
<img file="00000177.jpg" he="26" wi="59" img-content="undefined" img-format="jpg" />
81012-88-6
0,65
0,3
33,3
0,1625
Таблица 12. Активация T1R1/T1R3 уридином и нуклеотидными производными на основе уридина
Химическое название
Химическая структура
Номер CAS
EC50 - с Ala (мМ)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс. отв. % От IMP
Порог (мМ)
Уридин 5'-монофосфоморфолидат 4-морфолин-N, N'-дициклогексилкарбоксамидин соль
<img file="00000211.jpg" he="30" wi="40" img-content="undefined" img-format="jpg" />
24558-91-6
> 3
1,0150
104,8
+2,000
2'-дезоксиуридин-5'-O-монофосфосфоротиоат (5'-dUMPS)
<img file="00000212.jpg" he="41" wi="54" img-content="undefined" img-format="jpg" />
205379-91-5
>30
0,4200
43,4
+5,000
Динатриевая соль уридин 5'-монофосфата (UMP)
<img file="00000213.jpg" he="41" wi="75" img-content="undefined" img-format="jpg" />
3387-36-8
> 30
0,2316
23,9
+3,000
Таблица 13. Активация T1R1/T1R3 с помощью цитидина
Химическое название
Химическая структура
Номер CAS
EC50 - с Ala (мМ)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс. отв. % От IMP
Порог (мМ)
Цитидин-5'-монофосфат (CMP)
<img file="00000214.jpg" he="42" wi="87" img-content="undefined" img-format="jpg" />
63-37-6
5,7
0,3066
31,7
1,425
Таблица 14. Активация T1R1/T1R3 с помощью различных нуклеотидных производных
Химическое название
Химическая структура
Номер CAS
EC50 - с Ala (мМ)
Макс. отв. (ΔF/F)
Макс.Соотв. %от IMP
Порог (мМ)
Рибавирин 5'-монофосфат, дилитиевая соль
<img file="00000215.jpg" he="43" wi="53" img-content="undefined" img-format="jpg" />
66983-94-6
0,7
1,5294
158,0
0,175
5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-β-D-рибофуранозил 5'-монофосфат (AICAR)
<img file="00000216.jpg" he="44" wi="75" img-content="undefined" img-format="jpg" />
3031-94-5
>1
0,6985
72,2
0,200
6- Тиогуанозин-5'-О-дифосфат
<img file="00000217.jpg" he="28" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
16541-19-8
0,18± 0,02
1,047
152,8
0,03
6-Хлоропурин-рибозид-5'-O- трифосфат
<img file="00000218.jpg" he="21" wi="67" img-content="undefined" img-format="jpg" />
55673-61-5
>0,03
0,345
50,4
0,01
Таблица 15. Модуляция T1R1/T1R3 нуклеотидными производными
N/D=не определеноN/T=не тестировалосьN/A=не активенCNBD=Невозможно определить
+ Аланин (20 мМ)
Название соединения
Активность
EC<sub>50</sub> (мМ)
Макс. отв. ΔF/F
Макс. отв. % от IMP
Порог (мМ)
N6- Циклопентиладенозин-5'-O-монофосфат (6-CPE-5'-AMP)
активный
0,05
1,2317
127,2
0,013
8-(4-Хлорфенилтио) аденозин-5'-O-монофосфат (8-pCPT-5'-AMP)
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
1, N6-этеноаденозин-5'-O-монофосфат (ε-5'-AMP)
активный
0,04
1,4766
152,5
0,010
Гуанозин-3'-O-монофосфат (3'-GMP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Гуанозин-2', 3'-циклический монофосфат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Пуриновый рибозид-5'-O-монофосфат (5'-PuMP)
активный
0,02
2,0266
209,3
0,005
6-азауридин-5'-монофосфат 6-Аза-Д-уридин-5'-монофосфат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(bD-Арабинофуранозил) цитозин 5'-монофосфат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
5-(6-амино-9Н-пурин-9-ил) -3,4-дигидрокситетрагидро-2-фуранкарбоновая кислота
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
[Ди-дезокситимидин] или натрий (5-(5-метил-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1 (2Н) -ил) тетрагидрофуран-2-ил) метил фосфат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Динатриевая соль аденозин-5'-монофосфата (AMP)
активный
0,011
1,5470
159,8
0,003
[AICAR] или 5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-β-D-рибофуранозил 5'-монофосфат
активный
>1
0,6985
72,2
0,200
Литиевая соль 8-(6-аминогексил) аминоаденозин-5'-монофосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль аденозин-5'-фосфоросульфата
активный
0,03
0,8658
89,4
0,008
Аденозин-3', 5'-дифосфат натриевая соль
активный
0,001
0,9578
98,9
0,00025
Натриевая соль цитидина 3', 5'-циклического монофосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Цитидин-5'-монофосфат (CMP)
активный
5,7
0,3066
31,7
1,425
Натриевая соль 2'-дезоксиинозин-5'-монофосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-деоксицитидин-5'-монофосфат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
гидрат натриевой соли 2'-деоксигуанозин 5'-монофосфата
активный
0,24
0,5926
61,2
0,060
натриевая соль гуанозин 3', 5'-циклическая монофосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
соль гуанозин 5'-монофосфонофосфат 4'-морфолин-N, N'-дициклогексилкарбоксамидина
активный
1,3
0,5121
52,9
0,325
Инозин 3': 5'-циклическая монофосфатная натриевая соль
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль N6-метиладенозин-5'-монофосфата
активный
0,08
0,9907
102,3
0,020
Гидрат динатриевой соли D-рибозы 5-фосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Дикалиевая соль сахароза 6'-монофосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Гидрат динатриевой соли тимидин-5'-монофосфата (TMP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Дигидрат хлорида тиамина монофосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
соль уридин 5'-монофосфоморфолидат 4'-морфолин-N, N'-дициклогексилкарбоксамидина
активный
>3
1,0150
104,8
+2,000
Динатриевая соль уридин 5'-монофосфата (UMP)
активный
>30
0,2316
23,9
+3,000
Абакавир 5'-фосфат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Ацикловир монофосфат Монофосфат ациклоглуозина
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
дилитиевая соль рибавирин 5'-монофосфата
активный
0,7
1,5294
158,0
0,175
Тенофовир
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
5'-тозил-аденозин
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
динатриевая соль ксантозин-5'-монофосфата (XMP)
активный
0,1
1,6223
167,6
+0,025
Аденозин, 5 '-(дигидрофосфоротиоат) Аденозин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-AMPS)
активный
0,011
1,2435
128,4
0,003
Цитидин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-CMPS)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Цитидин-3'-O-монофосфат (3'-CMP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
7-диазааденозин-5'-O-монофосфат (7-CH-5'-AMP/5'-TuMP)
активный
0,75
0,4979
51,4
0,188
2'-деоксигуанозин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-dGMPS)
активный
0,02
0,8446
87,2
0,005
2'-дезоксиуридин-5'-O-монофосфосфоротиоат (5'-dUMPS)
активный
> 30
0,4200
43,4
+5,000
2'-, 3'-O-(N'-метилантранилоил) гуанозин-5'-O-монофосфат (MANT-5'-GMP) Флуоресцентный аналог 5'-GMP
активный
0,0056
0,7190
74,3
0,0014
6-тиогуанозин-5'-O-монофосфат (6-Т-5'-GMP)
активный
0,0009
1,3614
140,6
0,0002
Динатриева соль 6 - [(4-нитробензил) тио] -9-Bd-рибофуранозилпурин-5'-монофосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Динатриевая соль уридин 3'-монофосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
соль Аденозин-5'-монофосфоморфолитиата 4-морфолин-N, N'-дициклогексилкарбоксамидина
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Аденилоянтарная кислота
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Динатриевая соль 2'-дезоксиуридин-5'-монофосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-деоксиаденозин-5'-монофосфат
активный
0,14
1,1503
118,8
0,035
Мононуклеотид никотиновой кислоты
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Тринатриевая соль оротидин 5'-монофосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Адефовир
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль ламивудин 5'-монофосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
динатриевая соль гуанозинмонофосфата (GMP)
активный
0,03
1,2786
132,1
0,008
N-Лактоил-5'-GMP
активный
0,1
1,3600
140,5
+0,025
N-Ацетил-5'-GMP
активный
0,1
1,3351
137,9
+0,025
N-глюконилэтаноламинфосфат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Динатриевая соль инозин-5'-монофосфата (IMP)
активный
0,07
0,8681
89,7
0,018
Трицирибин фосфат Трициклический нуклеозид монофосфат (TCN-P)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Гидрат натриевой соли гуанозин 5'-трифосфата
активный
0,7
1,8075
145,5
0,175
8-Бромаденозин-5'-монофосфат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Гидрат натриевой соли цитидин-5'-дифосфохолина
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль гуанозина 5'-дифосфата
активный
0,2
1,7550
141,2
0,050
гидрат соли аммония MRS 2179
активный
0,05
1,8150
146,1
0,013
Бета-никотинамид аденин динуклеотид гидрат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Гидрат динатриевой соли тимидин-5'-монофосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
6-Тиоинозин фосфат
активный
0,02
1,3875
111,7
0,005
((2S, 3R, 4S) -5-(6-(бензиламино) -9Н-пурин-9-ил) -3,4-дигидрокситетрагидрофуран-2-ил) метилдигидрофосфат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-дезокси-1, N6-этеноаденозин-5'-О-монофосфат
активный
0,2
0,87
70,0
0,05
2'-дезоксицитидин-3',5'-О-бисфосфат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
2-амино-6-Хлоропуринрибозид-5'-О-монофосфат
активный
0,0005
1,8700
150,5
0,00013
2'-амино-2'-дезоксиаденозин-5'-О-дифосфат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
3'-амино-3'-дезоксиаденозин-5'-О-дифосфат
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
натриевая соль N6-бензиладенозин-5'-О-дифосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
8-Бромгуанозин-5'-О-монофосфат
активный
CNBD
0,375
30,2
1
натриевая соль 8-хлораденозин-5'-О-монофосфата
активный
0,8
0,79
63,6
0,2
натриевая соль 6-Хлоропуринрибозид-5'-О-монофосфата
активный
0,002
1,5325
123,3
0,0005
натриевая соль 2-хлораденозин-5'-О-монофосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
натриевая соль N6-цмклопентиладенозин-5'-О-дифосфата 6-cPe-ADP
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
натриевая соль 2'-дезоксиаденозин-5'-О-монофосфоротиоата 5'-dAMPS
активный
0,06
1,0375
83,5
0,015
натриевая соль 2'-дезоксигуанозин-5'-О-монофосфоротиоата
активный
0,01
1,0775
86,7
0,0025
натриевая соль 2'-дезоксиинозин-5'-О-монофосфоротиоата
активный
0,1
1,0375
83,5
+0,025
2'-дезокси-3'-О-(N'-метилантранилоил) аденозин-5'-О-монофосфат
активный
0,01
0,3975
32,0
0,0025
2'-дезокси-3'-О-(N'-метилантранилоил) гуанозин-5'-О-монофосфат
активный
0,01
0,295
23,7
0,0025
2'-дезокси-3'-О-(N'-метилантранилоил) гуанозин-5'-О-дифосфат MANT-dGDP
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-дезоксигуанозин-3',5'-О-бисфосфат
активный
0,02
1,8925
152,3
0,005
натриевая соль 1,N6-этеноаденозин-5'-О-дифосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
натриевая соль Гуанозин-5'-О-(1-тиодифосфата), Sp-изомер
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль гуанозин-5'-монофосфоротиоата 5'-GMPS
активный
0,01
1,29
103,8
0,0025
Гуанозин-5'-О-(2-тиодифосфат)
активный
0,01
0,5875
47,3
0,0025
Гуанозин-5'-О-(а,р-метилен) дифосфат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
натриевая соль 2-метилтиоаденозин-5'-О-дифосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
натриевая соль N6-(1-метилбутил)-ADP
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль 2'-/ 3'-O-(N'-метилантранилоил) аденозин-5'-O-монофосфата MANT-AMP
активный
0,01
1,915
154,1
0,0025
Натриевая соль N6-(2-фенилэтил) аденозин-5'-O-дифосфата 6-PhEt-ADP
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
натриевая соль N6-фениладенозин-5'-О-дифосфата
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль 2-метилтиоаденозин-5'-O-монофосфата 2-MeS-AMP
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Натриевая соль инозин 5'-дифосфата (IDP)
активный
0,65
0,3
33,3
0,1625
2'-/ 3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил) аденозин-5'-O-монофосфат; 2'-/3'-AEC-5'-AMP
активный
0,09
2,2
213,9
0,0225
2'-/ 3'-O-(2-аминоэтилкарбамоил) Гуанозин-5'-О-монофосфат; 2'-/3'-AEC-5'-GMP
активный
0,14
1,1
109,5
0,035
Тринатриевая соль инозина трифосфата (ITP)
активный
0,08
0,3
25,1
0,02
N6-Бензоиладенозин-5'-O- монофосфат; 6-Bnz-5'-AMP
активный
> 1
1,1
105,6
0,3
7-деаза-2'-дезоксиаденозин-5'-O-монофосфат (7-CH-5'-dAMP/5'-dTuMP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-дезоксиаденозин-3', 5'-O-бисфосфат
активный
0,02
0,8
76,4
0,005
N6-(6-Аминогексил) аденозин-2', 5'-дифосфат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Дилитиевая соль аденозин-5'-O-тиомонофосфата
активный
0,06
1,4
139,4
0,015
Натриевая соль Рибофлавин Фосфата
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Сульфат цитидина
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-дезоксиуридин-5'-О-монофосфоротиоат (5'-dUMPS)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-дезоксицитидин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-dCMPS)
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
Уридин-5'-O-монофосфоротиоат (5'-UMPS)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
Таблица 16. Положительный и отрицательный контроли. EC50 аминокислот измеряли в присутствии 0,2 мМ IMP.
Тип контроля
Название соединения
EC50 (мМ)
положительный
L-аланин
13,6 ± 4,3 мМ
L-серин
31,5 ± 2,3 мМ
L-цистеин
39,5 ± 1,9 мM
L-Фенилаланин
1,9 ± 0,1 мМ
L-Триптофан
0,9 ± 0,1 мМ
L-гистидин
10,2 ± 1,7 мМ
L-Метионин
25,5 ± 3,7 мМ
L-Тирозин
10,3 ± 0,9 мМ
отрицательный
L-пролин
-
MSG
-
Хинин HCL
-
D-Глюкоза
-
Пример 3. Идентификация нуклеотидных и аминокислотных доменов взаимодействия T1R1.
in silico
Настоящий пример описывает -идентификацию аминокислот в T1R1, которые взаимодействуют с нуклеотидами и аминокислотами, которые связываются с T1R1.
Методы: кошачий T1R1 представляет собой G-белок-сопряженный рецептор группы C (GPCR), который образует комплекс с T1R3 с образованием гетеродимера вкусового рецептора умами. Модель домена Venus Flytrap кошачьего T1R1 (домен VFT) была построена с использованием кристаллической структуры метаботропного глутаматного рецептора 1EWT, другого GPCR группы C (Kunishima et al., Nature 407: 971-977 (2000)), которую можно получить из Белкового Банка данных (Berman et al., Nucleic Acids Research, 28: 235-242 (2000)). Кристаллические структуры VFT GPCR группы C, включая метаботропные глутаматные рецепторы mGluR1, mGluR3, mGluR5 и mGluR7, демонстрируют удивительно сходные режимы связывания лиганда с расщеплением активного сайта VFT. Эти режимы связывания лиганда использовали для ручного выравнивания кошачьей последовательности T1R1 VFT с профилем последовательностей метаботропных глутаматных рецепторов. Впоследствии это выравнивание использовали для моделирования гомологии с использованием программного пакета Modeller (Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30 (2006)).
Моделирование аминокислот в активном сайте T1R1: аланин (L-аланин) первоначально располагали в активном центре модели VTR кошачьего T1R1 после размещения цвиттерионного остова глутамата в кристаллических структурах mGluR. Полученный комплекс был уточнен с использованием молекулярной динамики и минимизации энергии. Энергию связи оценивали путем вычисления разницы между расчетной энергией комплекса и вычисленной энергией для выделенного лиганда и апо-белка с использованием континуальной модели для воды. Другие аминокислоты были встроены в связанный аланиновый каркас с использованием Discovery Studio (Dassault Systemes, BIOVIA Corp., Сан-Диего, Калифорния, США) и уточнены с использованием молекулярной динамики и минимизации энергии (Brooks et al., J Comput Chem. 30 (10 ): 545-614 (2009)). Конечные модели были выбраны для аминокислот как те, чьи расчетные энергии связи были сопоставимы с энергиями аланина, и которые также сохраняли консервативные взаимодействия с шарниром, наблюдаемым в кристаллических структурах mGluR.
Моделирование нуклеотидов в активный сайт T1R1: IMP и GMP первоначально располагали в активном сайте кошачьего VFT T1R1 после ранее опубликованного моделирования IMP в человеческом T1R1, как описано Zhang et. al. (Zhang et al., Proc Natl Acad Sci US A. 105 (52): 20930-4 (2008)). Нуклеотидные торсионные связи варьировались, и полученные модели были уточнены с использованием молекулярной динамики и минимизации энергии. Конечные модели были выбраны соответственно тем, чья энергия связи была сопоставима с энергией GMP, и которая также обнаружила взаимодействия нуклеотидов с консервативными остатками, которые были установлены как важные для связывания IMP с T1R1 человека посредством сайт-направленного мутагенеза (Zhang et al., Proc Natl Acad Sci US A. 105 (52): 20930-4 (2008)). Другие нуклеотиды и нуклеотидные аналоги сначала перекрывали модели IMP и GMP, а затем подвергались той же процедуре уточнения, оценки и отбора, которая была описана для IMP и GMP.
Результаты. Домен VFT кошачьего T1R1 состоит из двух долей, как показано на Фигуре 14. Верхняя доля и нижняя доля связаны тремя нитями белка, называемыми шарнирами. На Фигуре 14 верхняя доля - в верхней части фигуры; нижняя доля снизу на фигуре. Шарнир находится слева. Домен flytrap переходит из открытой в закрытую конформацию при связывании агонистом. Активные аминокислоты и нуклеотиды связываются с доменом VFT между двумя долями (см. Фигуру 14). Аминокислоты связываются с областью около шарнира (см. Фигуру 14: аланин показан в пространстве CPK, заполняющем визуализацию слева на фигуре). Нуклеотиды связываются с областью, более удаленной от шарнира, но все еще расположенной между долями flytrap (см. Фигуру 14: IMP показан в пространстве CPK, заполняющем визуализацию справа на фигуре).
Связывание аминокислот: Аминокислотные лиганды связываются с шарнирной областью VFT, как показано на Фигуре 14, и хорошо координируются взаимодействиями около шарнира. На Фигуре 15 показан пример режима связывания для L-аланина, иллюстрирующий возможные водородные связи, солевые мостиковые взаимодействия и взаимодействия Pi-катиона с Thr149, Ser172, Tyr220, Thr148, Glu170 и Asp302. Эти взаимодействия показаны пунктирными линиями.
Было установлено с помощью сайт-направленного мутагенеза, что остатки Thr149, Ser172 и Tyr220 играют важную роль в связывании L-глутамата в человеческом рецепторе умами (Zhang et al., Proc Natl Acad Sci US A. 105 (52): 20930-4 (2008)). Было показано, что мышиный Asn149, который соответствует кошачьему Thr148, важен для связывания аминокислот у мыши (Toda et al., J. Biol. Chem 288:36863-36877 (2013)). Glu170 и Asp302 присутствуют в кошачьем и мышином T1R1, но не у человека. У людей аминокислоты в этих положениях представляют собой аланин. Человеческий T1R1/T1R3 является высокоселективным для L-глутамата и L-аспарагиновой кислоты. Напротив, кошачий и мышиный T1R1/T1R3 реагируют на широкий спектр аминокислот. В модели, описанной в настоящем примере, Glu170 и Asp302 помогают координировать цвиттерионный азот аминокислотных лигандов, который соответствует активному сайту T1R1, одновременно создавая электростатическую среду, которая непригодна для связывания L-глутамата и L-аспарагиновой кислоты. С использованием сайт-направленного мутагенеза Toda et.al. показали, что Glu170 и Asp302 ответственны за наблюдаемую разницу в предпочтениях аминокислотных лигандов между кошачьими и человеческими последовательностями (Toda et al., J. Biol. Chem 288:36863-36877 (2013)).
Нуклеотидное связывание: Нуклеотиды связываются с положением, более дистальным по отношению к шарниру, чем аминокислоты, как показано на Фигуре 14. На Фигуре 16 показан пример режима связывания для GMP. Возможные взаимодействия водородной связи и солевого мостика с фосфатом GMP и T1R1 His47, His71, Arg277 и Asn69; сахаром GMP и T1R1 Asn302 и Ser306; и основанием GMP и T1R1 Ser384, His308 и Ala380. Эти взаимодействия показаны пунктирными линиями.
His308 показан как координирующий основание GMP, но также может колебаться для координации фосфата GMP. Также присутствуют дополнительные гидрофобные взаимодействия, которые добавляют к энергии взаимодействия лиганда с VFT, и гибкость различных сайтов связывания может варьироваться (данные не показаны). Различные нуклеотиды могут проявлять различные взаимодействия с T1R1, но могут перекрываться с взаимодействиями, описанными в настоящем документе для GMP. Структурно-активные зависимости (SAR) и модель T1R1 позволяют предположить, что присутствие отрицательно заряженной группы в области связывания T1R1 с фосфатом имеет важное значение для связывания нуклеотида с T1R1. SAR и модель предполагают, что присутствие нуклеотидного основания, расширенного основания, замещенного основания или другого биоизостерического замещения нуклеотидного основания, которое может образовывать взаимодействия в области связывания нуклеотидных оснований T1R1, также важно для связывания (примеры оснований см. Limbach et al., Nucleic Acids Research 22 (12): 2183-2196 (1994)).
Аналогично, на основе SAR и моделирования предполагают, что взаимодействие между сахаром нуклеотида (или молекулой, замещающей сахар) важно для успешного связывания нуклеотида с T1R1. Сахар может ориентировать подходящую отрицательно заряженную группу, чтобы также помочь установить взаимодействия между T1R1 и областью фосфата и областью основания нуклеотида.
Хотя различные нуклеотиды могут проявлять разные взаимодействия с T1R1, такие взаимодействия, вероятно, в значительной мере согласуются с этим набором возможных взаимодействий.
Мостиковые взаимодействия (Bridging interactions) между аминокислотным и нуклеотидным связыванием: Asp302 - представляет собой остаток, присутствующий в VFT T1R1 у многих видов, включая кошку и мышь. Однако у людей аминокислота в этом положении представляет собой аланин. Asp302 имеет гибкую боковую цепь, которая может ориентироваться, чтобы координировать цвиттерионный азот или боковую цепь связанного аминокислотного лиганда (Фигура 15) или может альтернативно ориентироваться для координации сахара связанного нуклеотида (Фигура 16). Кроме того, Asp302 также может быть ориентирован так, чтобы одновременно координировать цвиттерионный азот остова связанной аминокислоты и сахар нуклеотида (Фигура 17). Это мостиковое взаимодействие может усиливать синергический эффект между связанной аминокислотой и связанным нуклеотидом. Так как аминокислота в этом положении у человека представляет собой аланин, такое мостиковое взаимодействие невозможно у людей. Альтернативная конформация нуклеотидного основания может устанавливать дополнительные мостиковые взаимодействия между Glu170 и нуклеотидными основаниями (данные не показаны).
In silico
Пример 4. -идентификация трансмембранных соединений
В настоящем примере описано вычислительное моделирование рецептора T1R1/T1R3 для идентификации предполагаемых трансмембранных соединений.
In silico
Вычислительные подходы были использованы для анализа трехмерной структуры T1R1 для идентификации трансмембранных областей, которые могут быть использованы для селективной активации рецептора T1R1/T1R3. Хотя кристаллическая структура кошачьего T1R1 не была определена, структурная модель трансмембранной области T1R1 была сформирована на основе кристаллической структуры человеческого метаботропного глутаматного рецептора 1 GPCR (mGluR1) (Wu et al., 2014 Science Vol. 344, Стр. 58-64) и человеческого метаботропного глутаматного рецептора человека (mGluR5) (Dore et al., Nature. 2014 Jul 31;511(7511):557-62. Epub 2014 Jul 6). «»-моделирование затем использовали для идентификации небольших химических соединений, которые могли бы потенциально взаимодействовать с трансмембранным доменом мономера T1R1 рецептора T1R1/T1R3.
На Фигуре 28 показано взаимодействие метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина с T1R1. Можно наблюдать аспарагин (Asn) 735 трансмембранного домена T1R1, взаимодействующий с эфиром лиганда. Кластер арильных остатков расположен в активном центре, который может координировать с лигандом путем образования в кольце стэкинговых взаимодействий с фенильной группой лиганда справа на Фигуре. На Фигуре 35 показано моделирование 1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил)имидазолидин-2,4,5-триона в трансмембранной области T1R1. Phe642 Helix 6 и Phe776 Helix 2 взаимодействуют с фенильным кольцом 1-бензил-3- (2-оксо-2-фенилэтил) имидазолидин-2,4,5-триона, а Asn792 Helix 6 взаимодействует с карбонильной группой с помощью водородной связи (Фигура 35). Моделирование 1H-имидазо[4,5-с]пиридин-2(3H)-она в трансмембранной области T1R1 показывает водородную связь между Asn735 трансмембранной области T1R1 и 1H-имидазо[4,5-с]Пиридин-2(3H)-она (Фигура 36).
Пример 5. Активация рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями.
in vitro
Настоящий пример описывает активацию рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями .
in silico
in vitro
in vitro
На основании -моделирования, описанного в Примере 4, предполагаемые трансмембранные соединения T1R1/T1R3 были идентифицированы и отобраны для дальнейшего тестирования . Функциональная характеристика отобранных соединений  использовалась для оценки эффективности предполагаемых трансмембранных соединений при активации рецептора T1R1/T1R3 индивидуально или в комбинации с одним или несколькими нуклеотидами и/или одной или несколькими аминокислотами.
Методы. Клетки HEK293, которые стабильно экспрессируют T1R3 и индуцируемо экспрессируют T1R1, подвергали воздействию трансмембранных соединений индивидуально или в комбинации с одной или несколькими аминокислотами и/или одним или несколькими нуклеотидами для активации рецептора умами. Активацию рецептора T1R1/T1R3 детектировали путем изменения уровня внутриклеточного кальция с использованием чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя. Клетки, которые экспрессируют T1R3, но не T1R1, использовали в качестве контроля. Для сбора данных использовался FLIPR Tetra или FlexStation 3.
50
50
50
50
50
Для каждого трансмембранного соединения были получены кривые дозовой зависимости и определены следующие свойства: ЕС трансмембранного соединения индивидуально; EC трансмембранного соединения с 20 мМ аланином; EC трансмембранного соединения с 0,2 мМ IMP; И ЕС трансмембранного соединения с 20 мМ аланином и 0,2 мМ IMP. Термин половинная максимальная эффективная концентрация (ЕС) относится к концентрации соединения, которое вызывает ответ, соответствующий половине между исходным значением и максимумом после определенного времени воздействия. В каждом эксперименте серийные разведения до 10 мМ трансмембранного соединения добавляли к клеткам, экспрессирующим T1R1/T1R3.
50
50
Результаты. Обработка клеток HEK293, экспрессирующих рецепторы T1R1/T1R3, с помощью 1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил)имидазолидин-2,4,5-триона индивидуально (например, в буфере) или в комбинации с 20 мМ аланином приводила к активации рецептора T1R1/T1R3, что подтверждается изменением уровня внутриклеточного кальция (ΔF/F0) и приводила к наблюдаемому значению EC, превышающему 1 мМ. Напротив, 1-бензил-3- (2-оксо-2-фенилэтил) имидазолидин-2,4,5-трион в присутствии 0,2 мМ IMP или в присутствии 20 мМ аланина и 0,2 мМ IMP приводил к уменьшению значения EC до 0,32 ± 0,05 мМ и 0,33 ± 0,04, соответственно (Фигура 37 и Таблица 17). Эти результаты показывают, что IMP является положительным аллостерическим модулятором трансмембранного соединения 1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил)имидазолидин-2,4,5-триона, т.е. что соединения являются синергичными по действию на T1R1/T1R3.
50
Было обнаружено, что соединение N-(бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-2-пропилпентанамид функционирует как агонист индивидуально T1R1/T1R3 (Фигура 39 и Таблица 17). В присутствии IMP или IMP и аланина EC N- (бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-2-пропилпентанамида уменьшалось, а ΔF/F0 значительно увеличивалось (Фигура 39 и Таблица 17).Эти результаты предполагают, что аланин и IMP действуют синергически с N-(бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-2-пропилпентанамидом для активации T1R1/T1R3. Аналогичные результаты были получены для трансмембранного соединения N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида (Фигура 40 и Таблица 17).IMP функционировал как положительный аллостерический модулятор N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида.
50
Предполагаемое трансмембранное соединение, N-(2-амино-2-оксо-1-фенилэтил)-3-хлор-4,5-диметоксибензамид, не приводило к активации индивидуально T1R1/T1R3; однако в присутствии IMP или IMP и аланина N-(2-амино-2-оксо-1-фенилэтил)-3-хлор-4,5-диметоксибензамид активировали T1R1/T1R3, как выявлено по увеличению ΔF/F0 при более низких концентрациях и уменьшению EC (Фигура 41 и Таблица 17).Аналогичные результаты наблюдали с 2-((5-(4-(метилтио)фенил)-2Н-тетразол-2-ил) метил) пиридином (Фигура 43 и Таблица 17).
50
50
Соединение (E)-3-(4-метоксифенил)-N-(пентан-3-ил)акриламид функционирует как трансмембранное соединение T1R1/T1R3 с EC 0,45 ± 0,01. В присутствии IMP или IMP и аланина активность (E)-3-(4-метоксифенил)-N-(пентан-3-ил)акриламида значительно повышалась, в результате чего EC составляло 0,15 ± 0,02 и 0,08 ± 0,01, соответственно, что указывает на то, что IMP и аланин функционируют как аллостерические модуляторы (Е)-3-(4-метоксифенил)-N-(пентан-3-ил)акриламида (Фигура 42 и Таблица 17).
50
50
5
Далее анализировали трансмембранное соединение N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид. На Фигуре 44 показаны кривые дозовой зависимости N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида в присутствии GMP и фенилаланина; GMP, фенилаланина и аланина; GMP, фенилаланина и IMP; или GMP, фенилаланина, аланина и IMP. Присутствие аланина и IMP значительно уменьшало значение EC N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида по сравнению с величиной EC N-(гептан-4-ил)бензо[D][1,3]диоксол-5-карбоксамида в присутствии фенилаланина и GMP или в присутствии IMP индивидуально (Таблица 19). Как указано выше, IMP функционирует как аллостерический модулятор агонистической активности N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида; однако эти результаты показывают, что комбинация IMP и аланина приводит к более низкому значению EC0 и проявляет более высокий сдвиг в ΔF/F0, чем IMP индивидуально, что указывает на то, что эта комбинация проявляет синергический эффект с N-(гептан-4-ил)бензо[D][1,3]диоксол-5-карбоксамидом при активации T1R1/T1R3 (Фигура 44 и Таблица 19).Кроме того, ΔF/F0 приблизительно в 10 раз выше в присутствии тройной смеси N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамида, фенилаланина и GMP по сравнению с комбинацией Фенилаланина и GMP в отсутствии агониста (Фигура 45).
На Фигуре 46 показаны кривые дозовой зависимости положительного и отрицательного контролей, а результаты для активных соединений суммированы в Таблице 17. В Таблице 18 представлены результаты для всех тестируемых соединений. Для положительного и отрицательного контроля кривые дозовой зависимости для аминокислот определяли в присутствии 0,2 мМ IMP. Кривые дозовой зависимости для нуклеотидов определяли в присутствии 20 мМ аланина.
Без привязки к конкретной теории эти результаты показывают, что нуклеотиды индивидуально, например IMP, или комбинации нуклеотидов и аминокислот, например IMP и аланина, функционируют как положительные модуляторы описанных трансмембранных соединений, что приводит к уменьшению количества агониста, необходимого для достаточной активации рецептора T1R1/T1R3.
Таблица 17. Трансмембранные соединения, которые модулируют активность T1R1/T1R3
+ Буфер (индивидуально)
+ Аланин (20 мМ)
+ IMP (0,2 мМ)
+ Аланин (20 мМ)+IMP (0,2 мМ)
Название соединения
Химическая структура
EC<sub>50</sub> (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
Макс. отв. ΔF/F
Макс. отв. % от IMP
Порог (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
Макс. отв. ΔF/F
Макс. отв. % Ala
Порог (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
5-бром-N-(пентан-3-ил) фуран-2-карбоксамид
<img file="00000219.jpg" he="18" wi="40" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 3
> 3
1,575
126,8
1
> 1
1,8425
149,6
0,3
> 1
3,4-диметил-N-(пентан-3-ил) бензамид; N-(1-этилпропил) -3,4-диметилбензамид
<img file="00000220.jpg" he="19" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 3
> 3
1,2150
97,8
3
2,1
1,5475
125,7
0,525
1,7
4-метокси-3-метил-N-(1-фенилэтил) бензамид
<img file="00000221.jpg" he="17" wi="39" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 3
> 3
0,51
41,0
3
1.4
1,1775
95,6
0,35
1.2
N-(2,3-диметилциклогексил) бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
<img file="00000222.jpg" he="22" wi="35" img-content="undefined" img-format="jpg" />
2
> 3
0,225
18,1
3
1,1
1,175
95,4
0,275
0.6
Этил-2-(бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамидо)-3-метилбутаноат; Этил-N-(1,3-бензодиоксол-5-илкарбонил)валинат
<img file="00000223.jpg" he="17" wi="42" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 10
> 10
0,3175
25,6
10
> 3
0,65
52,8
1
> 3
4-метокси-3-метил-N-(пентан-2-ил) бензамид
<img file="00000224.jpg" he="19" wi="45" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,4
0.2
1,5650
126,0
0,050
0,1
1,5875
128,9
+0,025
0.03
N-(пентан-3-ил)-2,3-дигидро[b][1,4] диоксин-6-карбоксамид
<img file="00000225.jpg" he="21" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 1
> 1
0,3125
25,2
0,3
0,3
0,8725
70,9
0,075
0.2
3,4-диметокси-N-(пентан-3-ил)бензамид
<img file="00000226.jpg" he="21" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 10
> 10
0,545
43,9
0,3
2
0,9975
81,0
0,5
> 3
(E) -метил-3-метил-2-(3-(тиофен-2-ил)акриламидо) бутаноат
<img file="00000227.jpg" he="16" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
CNBD
CNBD
0,1175
9,5
10
> 10
0,7375
59,9
1
> 10
(Е) -3-(3,4-диметоксифенил)-N-(пентан-2-ил)акриламид;(2E) -3-(3,4-диметоксифенил) -N-(пентан-2-ил)проп-2-енамид
<img file="00000228.jpg" he="16" wi="45" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 10
> 10
0,4375
35,2
1
2,2
1,07
86,9
0,55
1,9
(Е) -3-(4-метоксифенил)-N-(2-метилциклогексил)акриламид
<img file="00000229.jpg" he="18" wi="43" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 10
> 10
0,785
63,2
3
> 3
1,7725
144,0
0,3
> 3
N1-фенэтил-N2-(пиридин-3-илметил)оксаламид;N-(2-фенилэтил)-N'-(пиридин-3-илметил)этандиамид
<img file="00000230.jpg" he="12" wi="38" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 1
> 1
0,3750
30,2
1
> 0,3
0,7625
61,9
0,1
0.2
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
<img file="00000231.jpg" he="30" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0.7
1,1
1,7725
142,7
0,275
0,09
1,4725
119,6
0,225
0,1
1-(2-бромфенил)-3-((1R,2S)-2-гидрокси-2,3-дигидро 1H-инден-1-ил)мочевина
<img file="00000232.jpg" he="18" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 3
> 3
0,3
33,0
3
> 3
0,378
44,9
3
> 3
N-(бензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-2-пропилпентанамид
<img file="00000233.jpg" he="22" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,35
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
0,27
0,908
108,0
0,0675
0,09
1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил)имидазолидин-2,4,5-трион
<img file="00000234.jpg" he="24" wi="43" img-content="undefined" img-format="jpg" />
> 1
> 1
1,3
127,6
1
0,32
1,140
135,7
0,08
0,33
N-(2-амино-2-оксо-1-фенилэтил)-3-хлор-4,5-диметоксибензамид
<img file="00000235.jpg" he="48" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
0,68
0,415
49,4
0,17
0,75
(Е)-3-(4-метоксифенил)-N-(пентан-3-ил)акриламид
<img file="00000236.jpg" he="29" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,45
0,59
0.7
64,1
0,148
0,15
1,443
171,7
0,0375
0,08
2-((5-(4-(метилтио)фенил)-2Н-тетразол-2-ил)метил)пиридин
<img file="00000237.jpg" he="18" wi="39" img-content="undefined" img-format="jpg" />
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
0,63
0,678
80,7
0,1575
0,27
N-(гептан-4-ил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксамид
<img file="00000231.jpg" he="30" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,26
0,42
1.2
118,2
0,105
0,1
1,393
165,8
+0,025
0.03
CNBD: Не удалось определить
Таблица 18. Активация T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями
N/D=не определеноN/T=не тестировалосьN/A=не активенCNBD=Невозможно определить
+ Буфер (индивидуально)
+ Аланин (20 мМ)
+ IMP (0,2 мМ)
+ Аланин (20 мМ)+IMP (0,2 мМ)
Название соединения
Активность
EC<sub>50</sub> (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
Макс. отв. ΔF/F
Макс. отв. % от IMP
Порог (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
Макс. отв. ΔF/F
Макс. отв. % Ala
Порог (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
5-бром-N-(пентан-3-ил) фуран-2-карбоксамид
активный
> 3
> 3
1,575
126,8
1
> 1
1,8425
149,6
0,3
> 1
3,4-диметил-N-(пентан-3-ил) бензамид; N-(1-этилпропил) -3,4-диметилбензамид
активный
> 3
> 3
1,2150
97,8
3
2,1
1,5475
125,7
0,525
1,7
N-(2,4-диметилпентан-3-ил) -4-метоксибензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
4-этокси-N-(пентан-3-ил) бензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
4-метокси-3-метил-N-(1-фенилэтил) бензамид
активный
> 3
> 3
0,51
41,0
3
1,4
1,1775
95,6
0,35
1,2
N-(2,3-диметилциклогексил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
активный
2
> 3
0,225
18,1
3
1,1
1,175
95,4
0,275
0,6
Метил 2-(бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамидо) -4-метилпентаноат; Метил N-(1,3-бензодиоксол-5-илкарбонил) лейцинат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Этил-2-(бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамидо) -3-метилбутаноат; Этил N-(1,3-бензодиоксол-5-илкарбонил) валинат
активный
> 10
> 10
0,3175
25,6
10
> 3
0,65
52,8
1
> 3
4-метокси-3-метил-N-(пентан-2-ил) бензамид
активный
0,4
0,2
1,5650
126,0
0,050
0,1
1,5875
128,9
+0,025
0,03
N-(пентан-3-ил) -2,3-дигидро [b] [1,4] диоксин-6-карбоксамид
активный
> 1
> 1
0,3125
25,2
0,3
0,3
0,8725
70,9
0,075
0,2
3,4-диметокси-N-(пентан-3-ил) бензамид
активный
> 10
> 10
0,545
43,9
0,3
2
0,9975
81,0
0,5
> 3
(E) -метил-3-метил-2-(3-(тиофен-2-ил) акриламидо) бутаноат
активный
CNBD
CNBD
0,1175
9,5
10
> 10
0,7375
59,9
1
> 10
(Е) -3-(3,4-диметоксифенил) -N-(пентан-2-ил) акриламид; (2E) -3-(3,4-диметоксифенил) -N-(пентан-2-ил) проп-2-енамид
активный
> 10
> 10
0,4375
35,2
1
2,2
1,07
86,9
0,55
1,9
(Е) -3-(4-метоксифенил) -N-(2-метилциклогексил) акриламид
активный
> 10
> 10
0,785
63,2
3
> 3
1,7725
144,0
0,3
> 3
N-(2,3-дигидро-1H-инден-1-ил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N1-фенэтил-N2-(пиридин-3-илметил) оксаламид; N-(2-фенилэтил) -N '-(пиридин-3-илметил) этандиамид
активный
> 1
> 1
0,3750
30,2
1
> 0,3
0,7625
61,9
0,1
0,2
N-бензил-N '-(2-фенилэтил) этандиамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(4-хлорфенил) -3- [1-(4-метилфенил) пропил] мочевина; 1-(4-хлорфенил) -3-(1-(п-толил) пропил) мочевина
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-хлорфенил) -3-циклогексилмочевина
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(Е) -N-(2,4-диметилпентан-3-ил) -3-(4-фторфенил) акриламид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
5-бром-N-циклогептил-2-фурамиды;5-бром-N-циклогептилфуран-2-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-циклогексил-1,3-бензодиоксол-5-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(2-(диметиламино) этил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(2-(метиламино) -2-оксоэтил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(гептан-4-ил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
активный
0,7
1,1
1,7725
142,7
0,275
0,09
1,473
119,6
0,225
0,1
1-(2-бромфенил) -3 -((1R, 2S) -2-гидрокси-2,3-дигидро 1H-инден-1-ил) мочевина
активный
> 3
> 3
0,3
33,0
3
> 3
0,378
44,9
3
> 3
3-(7-бром-2,3-дигидро [Ь] [1,4] диоксин-6-ил) -1-(1-(4-хлорфенил) этил) -1-метилмочевина
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2,4-дихлорфенил) -3-(4-метоксибензил) мочевина
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(Е) -N-циклогексил-3-(4-пропоксифенил) акриламид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(Е) -N-циклогексил-3-(пиридин-4-ил) акриламид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(бензо [d] [1,3] диоксол-5-ил) -2-пропилпентанамид
активный
0,35
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
0,27
0,908
108,0
0,0675
0,09
N1-(4-метоксибензил) -N2-фенетилоксаламид
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
Активный
> 1
> 1
1,3
127,6
1
0,32
1,140
135,7
0,08
0,33
N1-(3,4-диметоксифенетил) -N2-(пиридин-3-илметил) оксаламид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(2-амино-2-оксо-1-фенилэтил) -3-хлор-4,5-диметоксибензамид
активный
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
0,68
0,415
49,4
0,17
0,75
(Е) -3-(4-метоксифенил) -N-(пентан-3-ил) акриламид
активный
0,45
0,59
0,7
64,1
0,148
0,15
1,443
171,7
0,0375
0,08
(Е) -3-(3-хлор-4,5-диметоксифенил) -N-циклогексилакриламид
N/A
1-(4-хлорбензил) -4-фенетилпиразин-2,3 (1H, 4H) -дион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-((3-метоксибензил) тио) -4-фенилфталазин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
3-(бензо [d] [1,3] диоксол-5-ил) -6 -((4-бромбензил) тио) пиридазин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
5-(3,5-дихлорфенил) -N -((3-метилпиридин-2-ил) метил) -1,3,4-тиадиазол-2-амин
неизвестно
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2 -((5-(4-(метилтио) фенил) -2Н-тетразол-2-ил) метил) пиридин
Активный
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
0,63
0,678
80,7
0,1575
0,27
5 -((2-хлорбензил) тио) -3-(4-метоксифенил) -1H-1,2,4-триазол
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2 -(((5-(п-толил) -4H-1,2,4-триазол-3-ил) тио) метил) пиридин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(гептан-4-ил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
активный
0,26
0,42
1,2
118,2
0,105
0,1
1,393
165,8
+0,025
0,03
Таблица 19. Активация T1R1/T1R3 комбинациями нуклеотидов, аминокислот и трансмембранных соединений
Название соединения
EC<sub>50</sub> - индивидуально (мМ)
EC<sub>50</sub> - с Ala (20 мМ)
EC<sub>50</sub> - с IMP (0,2 мМ)
EC<sub>50</sub> - с Ala (20 мМ) и IMP (0,2 мМ)
GMP
0,04 ± 0,01
0,05 ± 0,02
-
-
Фенилаланин
-
-
3,4 ± 0,7
-
N-(гептан-4-ил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
0,26 ± 0,09
0,42 ± 0,06
0,09 ± 0,04
0,03 ± 0,03
GMP+фенилаланин (1:30)
0,26 ± 0,04 мМ
0,29 ± 0,08
0,23 ± 0,04
-
GMP+фенилаланин (1: 3)
> 0,3
0,11 ± 0,02
-
-
GMP+фенилаланин (1: 0,3)
0,05 ± 0,01
0,09 ± 0,01
-
-
GMP+фенилаланин+N-(гептан-4-ил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид (1:30:10)
0,011 ± 0,001
0,008 ± 0,001
0,006 ± 0,0004
0,005 ± 0,001
Таблица 20. Положительные и отрицательные контроли, измеренные с помощью 0,2 мМ IMP.
Тип контроля
Название соединения
EC<sub>50</sub> (эффект с 0,2 мМ IMP)
положительный
L-аланин
13,6 ± 4,3 мM
L-серин
31,5 ± 2,3 мМ
L-цистеин
39,5 ± 1,9 мM
L-Фенилаланин
1,9 ± 0,1 мМ
L-Триптофан
0,9 ± 0,1 мМ
L-гистидин
10,2 ± 1,7 мМ
L-Метионин
25,5 ± 3,7 мМ
L-Тирозин
10,3 ± 0,9 мМ
IMP
0,08 ± 0,002 мМ
GMP
0,05 ± 0,004 мМ
отрицательный
L-пролин
-
MSG
-
Хинин HCL
-
D-Глюкоза
-
Пример 6. Активация рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями.
in vitro
Настоящий пример описывает активацию рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями .
in silico
in vitro
in vitro
На основании -моделирования, описанного в Примере 4, предполагаемые трансмембранные соединения T1R1/T1R3 были идентифицированы и отобраны для дальнейшего тестирования . Функциональную характеристику отобранных соединений  использовали для оценки эффективности предполагаемых трансмембранных соединений при активации рецептора T1R1/T1R3 индивидуально или в комбинации с одним или несколькими нуклеотидами и/или с одной или несколькими аминокислотами.
in vitro
Методы. Функциональную характеристику отобранных соединений  проводили, как описано в Примере 5.
50
50
50
50
Результаты. Как показано в Таблице 21, обработка клеток HEK293, экспрессирующих рецепторы T1R1/T1R3, с помощью N-бензил-L-фенилаланин метилового эфира HCl индивидуально (например, в буфере) приводила к активации рецептора T1R1/T1R3 с EC 0,03 ± 0,002 мМ. Объединение соединения с 20 мМ L-аланином увеличивало EC до 0,05 ± 0,001 мМ. Объединение соединения с 0,2 мМ IMP снижало EC до 0,02 ± 0,001 мМ, и объединение соединения с 20 мМ L-аланином и 0,2 мМ IMP снижало EC до 0,02 ± 0,021 мкм.
50
Таблица 21. EC N-бензил-L-фенилаланин метилового эфира HCl в активации T1R1/T1R3.
метиловый эфир N-бензил-L-фенилаланина HCl
<img file="00000238.jpg" he="25" wi="30" img-content="undefined" img-format="jpg" />
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,03 ± 0,002 мМ
+ 20 мМ L-аланин
0,05 ± 0,001 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,02 ± 0,001 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,02 ± 0,002 мМ
50
50
50
50
Как показано в Таблице 22, обработка клеток HEK293, экспрессирующих рецепторы T1R1/T1R3, с помощью N-(2-(1H-индол-3-ил)этил)никотинамида индивидуально (например, в буфере) приводила к активации рецептора T1R1/T1R3 с EC 0,15 ± 0,03 мМ. Объединение соединения с 20 мМ L-аланином увеличивало EC до более чем 0,1 мМ. Объединение соединения с 0,2 мМ IMP снижало EC до 0,05 ± 0,01 мМ, и объединение соединения с 20 мМ L-аланином и 0,2 мМ IMP снижало EC до 0,04 ± 0,01 мМ.
50
Таблица 22. EC N-(2-(1H-индол-3-ил)этил)никотинамида при активации T1R1/T1R3.
N-(2-(1Н-индол-3-ил) этил) никотинамид <img file="00000239.jpg" he="22" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,15 ± 0,03 мМ
+ 20 мМ L-аланин
> 0,1 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,05 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,04 ± 0,01 мМ
50
50
50
Как показано в Таблице 23, обработка клеток HEK293, экспрессирующих рецепторы T1R1/T1R3, с помощью 2-амино-N-фенетилбензамида индивидуально (например, в буфере) приводила к активации рецептора T1R1/T1R3 с EC 0,42 ± 0,01 мМ. Объединение соединения с 20 мМ L-аланином увеличивало EC50 до 0,48 ± 0,01 мМ. Объединение соединения с 0,2 мМ IMP снижало ЕС до 0,14 ± 0,03 мМ, и объединение соединения с 20 мМ L-аланином и 0,2 мМ IMP снижало ЕС до 0,09 ± 0,01 мМ.
50
Таблица 23. EC 2-амино-N-фенэтилбензамида при активации T1R1/T1R3.
2-амино-N-фенетилбензамид <img file="00000240.jpg" he="24" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,42 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин
0,48 ± 0,01 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,14 ± 0,03 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,09 ± 0,01 мМ
Без привязки к конкретной теории эти результаты показывают, что индивидуально нуклеотиды, например IMP, или комбинации нуклеотидов и аминокислот, например IMP и аланина, функционируют как положительные модуляторы описанных трансмембранных соединений, что приводит к уменьшению количества агониста, необходимого для достаточной активации рецептора T1R1/T1R3.
Пример 7. Активация рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями и нуклеотидными производными.
in vitro
Настоящий пример описывает активацию рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями и нуклеотидными производными .
in silico
in vitro
in vitro
На основании -моделирования, описанного в Примере 4, предполагаемые трансмембранные соединения T1R1/T1R3 были идентифицированы и отобраны для дальнейшего тестирования . Функциональную характеристику отобранных соединений  использовали для оценки эффективности предполагаемых трансмембранных соединений при активации рецептора T1R1/T1R3 индивидуально или в комбинации с одним или несколькими нуклеотидами и/или с одной или несколькими аминокислотами. Отобранные нуклеотидные производные также тестировали индивидуально или в комбинации с одним или несколькими нуклеотидами и/или с одной или несколькими аминокислотами.
in vitro
Методы. Функциональную характеристику отобранных соединений  проводили, как описано в Примерах 1, 2 и 5.
50
50
50
Результаты. Влияние всех трансмембранных соединений и нуклеотидных производных, протестированных при активации T1R1/T1R3, показано в Таблице 26. Обработка клеток HEK293, экспрессирующих рецепторы T1R1/T1R3, несколькими трансмембранными соединениями индивидуально в буфере приводила к активации T1R1/T1R3, как показано изменением уровня внутриклеточного кальция (ΔF/F0), как показано в Таблице 24A-O.Когда эти соединения объединяли с 0,2 мМ IMP или смесь 0,2 мМ IMP и 20 мМ аланина, трансмембранные соединения были более эффективны в активации T1R1/T1R3, о чем свидетельствовало снижение концентрации EC трансмембранных соединений (Таблица 24A -O и Фигуры 58-75).В Таблице 24A-O показаны EC для каждого активного трансмембранного соединения индивидуально (в буфере) и в присутствии L-аланина, IMP и L-аланина+IMP. В таблице 25 и на Фигуре 71 показаны EC и кривые дозовой зависимости для контрольных соединений (20 мМ аминокислоты в присутствии 0,2 мМ IMP). Без привязки к конкретной теории эти результаты показывают, что нуклеотиды индивидуально, например IMP, или комбинации нуклеотидов и аминокислот, например IMP и аланин, функционируют как положительные модуляторы описанных трансмембранных соединений, что приводит к уменьшению количества трансмембранного соединения, необходимого для достаточной активации рецептора T1R1/T1R3.
Таблицы 24A-O. EC50 трансмембранных соединений в активации T1R1/T1R3.
Таблица 24А
1,3-дибензилпиримидин-2,4,6 (1H, 3H, 5H) -трион
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
Индивидуально в буфере
0,26 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин
0,31 ± 0,05 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,52 ± 0,19 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
> 0,3 мМ
Таблица 24B
4-бензил-3-бутил-1-(2-оксо-2-(пирролидин-1-ил) этил) -1H-1,2,4-триазол-5 (4Н) -она
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
> 0,6 мМ
+ 20 мМ L-аланин
> 0,6 мМ
+ 0,2 мМ IMP
> 0,3 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
> 0,3 мМ
Таблица 24С
2 -((3,5-дихлорфенил) карбамоил) циклогексанкарбоновая кислота-1-ил) этил) -1H-1,2,4-триазол-5 (4H) -он
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,37 ± 0,05 мМ
+ 20 мМ L-аланин
0,49 ± 0,01 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,18 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,15 ± 0,01 мМ
Таблица 24D
4-ацетамидо-N-(1-(2-гидроксиэтил) -3-фенил-1Н-пиразол-5-ил) бензамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
N/A
+ 20 мМ L-аланин
N/A
+ 0,2 мМ IMP
> 0,1 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
> 0,1 мМ
Таблица 24E
Этиловый эфир (дифенилацетил) карбаминовой кислоты
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,25 ± 0,01 мM
+ 20 мМ L-аланин
0,38 ± 0,01 мM
+ 0,2 мМ IMP
0,12 ± 0,02 мM
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,10 ± 0,01 мM
Таблица 24F
N, N '-(бутан-1,4-диил) диникотинамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
N/A
+ 20 мМ L-аланин
N/A
+ 0,2 мМ IMP
0,60 ± 0,09 мM
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,61 ± 0,36 мM
Таблица 24G
N-фенетилникотинамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,37 ± 0,02 мМ
+ 20 мМ L-аланин
> 0,3 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,35 ± 0,1 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,22 ± 0,02 мМ
Таблица 24Н
2-амино-N-фенетилбензамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,42 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин
0,48 ± 0,01 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,14 ± 0,02 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,09 ± 0,01 мМ
Таблица 24I
N-фенетилбензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,12 ± 0,07 мМ
+ 20 мМ L-аланин
>1,0 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,04 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,03 ± 0,01 мМ
Таблица 24J
N-фенетилбензамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,33 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин
>1,0 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,12 ± 0,03 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,09 ± 0,02 мМ
Таблица 24K
N-бензоил-DL-лейцинамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
>0,6 мМ
+ 20 мМ L-аланин
>1,0 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,47 ± 0,07 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,91 ± 0,23 мМ
Таблица 24L
N-(2-(1Н-индол-3-ил) этил) никотинамид
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,15 ± 0,03 мМ
+ 20 мМ L-аланин
>0,1 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,05 ± 0,01 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,04 ± 0,10 мМ
Таблица 24M
Гидрохлорид метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
0,03 ± 0,002 мМ
+ 20 мМ L-аланин
0,05 ± 0,001 мМ
+ 0,2 мМ IMP
0,02 ± 0,001 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,02 ± 0,002 мМ
Таблица 24N
6-тиогуанозин-5'-O-дифосфат (6-T-GDP)
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
N/A
+ 20 мМ L-аланин
0,18 ± 0,02 мМ
+ 0,2 мМ IMP
N/A
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
0,28 ± 0,05 мМ
Таблица 24O
6- Хлоропурин-рибозид-5'-О-трифосфат (6-Cl-PuTP)
T1R1/T1R3 EC<sub>50</sub>
индивидуально в буфере
> 0,03 мМ
+ 20 мМ L-аланин
> 0,03 мМ
+ 0,2 мМ IMP
> 0,03 мМ
+ 20 мМ L-аланин+0,2 мМ IMP
> 0,03 мМ
Таблица 25. Положительный и отрицательный контроль активации трансмембранного соединения T1R1/T1R3
Тип контроля
Название соединения
EC<sub>50</sub> (эффект с 0,2 мМ IMP)
положительный
L-аланин
12,3 ± 1,3 мМ
L-серин
15,1 ± 2,3 мМ
L-цистеин
43,9 ± 5,6 мМ
L-Фенилаланин
0,5 ± 0,1 мМ
L-Триптофан
0,5 ± 0,1 мМ
L-гистидин
15,3 ± 3,2 мМ
L-Метионин
33,9 ± 1,5 мМ
L-Тирозин
9,3 ± 1,7 мМ
IMP
0,21 ± 0,04 мМ
GMP
0,09 ± 0,02 мМ
отрицательный
L-пролин
--
MSG
--
Хининовая HCL
--
D-Глюкоза
--
Таблица 26. Модуляция T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями
N/D=не определеноN/T=не тестировалосьN/A=не активенCNBD=Невозможно определить
+ Буфер (отдельно)
+ Аланин (20 мМ)
+ IMP (0,2 мМ)
+ Аланин (20 мМ)+IMP (0,2 мМ)
Название соединения
Активность
EC<sub>50</sub> (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
Макс. отв. ΔF/F
Макс. отв. % от IMP
Порог (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
Макс. отв. ΔF/F
Макс. отв. % Ala
Порог (мМ)
EC<sub>50</sub> (мМ)
L-цистеин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
43,9
0,5800
74,6
10,0
N/D
L-Фенилаланин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
0,5
0,5900
75,9
0,1
N/D
L-Триптофан
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
0,5
0,6750
86,8
0,1
N/D
L-серин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
15,1
0,7775
100,0
3,0
N/D
L-гистидин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
15,3
0,2825
36,3
10,0
N/D
L-аланин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
12,3
0,7775
100,0
3,0
N/D
L-Метионин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
33,9
0,3500
45,0
30,0
N/D
Инозин монофосфат (IMP)
N/T
N/D
0,21
0,6850
100,0
0,03
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Гуанозинмонофосфат (GMP)
N/T
N/D
0,09
0,7850
114,6
0,01
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
L-пролин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
N/D
MSG (натриевая соль глутаминовой кислоты)
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
CNBD
CNBD
CNBD
CNBD
N/D
Хинин HCL
N/T
CNBD
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
D-Глюкоза
N/T
CNBD
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
L-Тирозин
N/T
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
9,3
0,2958
38,0
3,0
N/D
Марс1: 1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(4-(2-(3-бензил-2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) ацетил) фенил) метансульфонамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-(2,3-дигидро-1Н-инден-5-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(4-(2-(3-(фуран-2-илметил) -2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) ацетил) фенил) ацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-(4-бромфенил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-(4-(метилсульфонил) фенил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(фуран-2-илметил) -3-(2-мезитил-2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-(2,3-дигидро [b] [1,4] диоксин-6-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-(2,4-диметоксифенил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-(3-метоксифенил) -2-оксоэтил) -3-(тиофен-2-илметил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-(3,4-диметилфенил) -2-оксоэтил) -3-(2-(тиофен-2-ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-оксо-2-фенилэтил) -3-(2-(тиофен-2-ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-(бензо [d] [1,3] диоксол-5-ил) -2-оксоэтил) -3-(2-(тиофен-2-ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-(3,4-дигидро-2Н-бензо [Ь] [1,4] диоксепин-7-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2-(3-бензил-2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) -N-(3-цианофенил) ацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-бензил-2-(3-бензил-2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) ацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(3-хлор-4-метоксифенил) -2-(3-(4-метоксифенил) -2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) ацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(циклогексилметил) -3-циклопентилимидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2-(3-бензил-2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) -N-метил-N-(4-метилциклогексил) ацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-оксо-2-(3-оксо-3,4-дигидро-2Н-бензо [Ь] [1,4] оксазин-6-ил) этил) -3-(2-(тиофен-2- ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-(2-метоксифенил) -2-оксоэтил) -3-(тиофен-2-илметил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-(нафталин-1-ил) -2-оксоэтил) -3-(2-(тиофен-2-ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-(5-хлорпиридин-2-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2-(бензофуран-2-ил) -2-оксоэтил) -3-бензилимидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Метил 4 -((3-бензил-2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) метил) бензоат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(4-(2-(3-бензил-2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) ацетил) фенил) пропионовой кислоты
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(2-хлорбензил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(3-фенилпропил) имидазолидин-2,4,5-трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1,3-дибензил-2-тиоксоимидазолидин-4,5-дион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1,3-дибензилпиримидин-2,4,6 (1H, 3H, 5H) -трион
активный
0,26
0,31
0,2925
42,7
0,1
0,52
0,2775
35,7
0,1
> 0,3
1-бензил-5-(4-гидрокси-3-метоксибензил) пиримидин-2,4,6 (1H, 3H, 5H) -трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-фенилтетрагидро-1H-тиено [3,4-d] имидазол-2 (3H) -он 5,5-диоксид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2-(1-бензил-2-оксо-1Н-имидазо [4,5-с] пиридин-3 (2H) -ил) -N-изобутилацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2-(4-бензил-3-метил-5-оксо-4,5-дигидро-1Н-1,2,4-триазол-1-ил) -N-(1-(тиофен-2-ил) этил) ацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
4-бензил-3-бутил-1-(2-оксо-2-(пирролидин-1-ил) этил) -1H-1,2,4-триазол-5 (4Н) -она
активный
> 0,6
> 0,6
0,8900
129,9
0,3
> 0,6
1,5025
193,2
0,1
> 0,6
1-(2-(4-фторфенил) -2-оксоэтил) -4-(4-метилбензил) пиразин-2,3 (1H, 4H) -дион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1,3-дифенетилпиримидин-2,4,6 (1H, 3H, 5H) -трион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
3-(4-метилбензил) -1-(2-(п-толилокси) этил) пиримидин-2,4 (1H, 3H) -дион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(3-хлор-4-метоксифенил) -2-(5-(4-хлорбензил) -1,1-диоксидо-1,2,5-тиадиазолидин-2-ил) ацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
4,4' -((2,2-диоксидобензо[с] [1,2,5] тиадиазол-1,3-диил) бис (метилен)) дибензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
3,3' -((2,2-диоксидобензо[с] [1,2,5] тиадиазол-1,3-диил) бис (метилен)) дибензонитрил
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2,5-дифенэтил-1,3,4-тиадиазол
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(4-метил-5-(пиридин-2-ил) тиазол-2-ил) никотинамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
5-(3-хлорбензил) -N-(пиридин-4-илметил) -1,3,4-оксадиазол-2-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N, N '-(4H-1,2,4-триазол-3,5-диил) бис (4-фторбензамид)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(2-хлорбензил) -5-(2,4-дихлорбензил) -1,3,4-оксадиазол-2-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(бензиламино) -1H-пиррол-2,5-дион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-бензил-3-(бензиламино) -1H-пиррол-2,5-дион
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2 -((3-(4-ацетилфенил) -4-метил-2-оксо-2,3-дигидро-1H-имидазол-1-ил) метил) -5-фторбензонитрил
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
6-метокси-N-(2-(1-(4-метилбензил) -2-оксо-1Н-имидазо [4,5-b] пиридин-3 (2H) -ил) этил) никотинамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(2-(1-бензил-2-оксо-1Н-имидазо [4,5-Ь] пиридин-3 (2H) -ил) этил) -3-метоксибензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1,3-дибензилтетрагидро-1H-тиено [3,4-d] имидазол-2 (3H) -он 5,5-диоксид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(4-хлорбензил) -3-(2-феноксиэтил) -1H-бензо [d] имидазол-2 (3H) -имин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2-(3-бензил-2-имино-2,3-дигидро-1Н-бензо [d] имидазол-1-ил) -1-(3,4-дихлорфенил) этанон
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(2,6-дигидрокси-4-метоксифенил) -3-фенилпропан-1-он
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
3-(3,4-диметоксифенил) -1-(2-гидрокси-4,6-диметоксифенил) пропан-1-он
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(Е) -1-(2-гидроксифенил) -3-фенилпроп-2-ен-1-он
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(Е) -1-(4-метоксифенил) -3-фенилпроп-2-ен-1-он
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(Е) -3-(3,4-диметоксифенил) -1-(2,4,6-триметоксифенил) проп-2-ен-1-он
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(Е) -1-(4-гидрокси-2-метоксифенил) -3-(4-гидроксифенил) проп-2-ен-1-он
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2-(2-аминобензамидо) пропановая кислота
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Метил-2-бензамидо-3-фенилпропаноат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Метил-2-(2,3-дигидроксибензамидо) -3-гидроксипропаноат
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(5-метилтиазол-2-ил) -9H-ксантен-9-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(5-ацетил-4-метилтиазол-2-ил) -2,2-дифенилацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(4-метилтиазол-2-ил) -2,2-дифенилацетамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(2-метил-3-нитробензил) -N-(пиридин-3-ил) этансульфонамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-бензил-2-изопропокси-N-(пиридин-4-ил) этансульфонамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
5-(феноксиметил) -3-фенилоксазолидин-2-он
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(4-хлор-2-фторфенил) хинолин-2-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(4-хлорфенил) -6-(4H-1,2,4-триазол-4-ил) пиколинамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2 -((3,5-дихлорфенил) карбамоил) циклогексанкарбоновая кислота
активный
0,37
0,49
1,1200
163,5
0,1
0,18
1,2275
157,9
0,03
0,15
1-(2,4-диметилфенил) -4-(3-метилпиперидин-1-ил) -1Н-пиразоло [3,4-d] пиримидин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(1Е, 2Е) -1,2-бис (3-фторбензилиден) гидразин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2 -((Е) -((Е) -бензилиденгидразоно)метил) фенол
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2 -((Е) -((Е) -(4-бромбензилиден) гидразон) метил) -4-нитрофенол
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
3-циано-N-(3-(2-метоксифенил) -1Н-пиразол-5-ил) бензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(1-(2-гидроксиэтил) -3-фенил-1Н-пиразол-5-ил) -3-метоксибензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
4-ацетамидо-N-(1-(2-гидроксиэтил) -3-фенил-1Н-пиразол-5-ил) бензамид
активный
CNBD
CNBD
0,0125
1,8
CNBD
> 1,0
0,4575
58,8
CNBD
> 1,0
2-(4-фторфенил) -1-тозилпирролидин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(3-(пиридин-2-илэтинил) фенил) пропионамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
1-(5-(фенилэтинил) тиофен-2-ил) этанон
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
(E) -1-(5-(фенилэтинил) тиофен-2-ил) этанон
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(3-метоксипропил) -4-(фенилэтинил) бензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Ro 67-4853
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Ro 01-6128
активный
0,25
0,38
0,5125
74,8
0,3
0,12
1,5525
199,7
0,01
0,10
ВУ 0361737
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
AMG-073 HCl (цинакальцет гидрохлорид)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
DCB
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
ВУ 0357121
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N, N '-(бутан-1,4-диил) диникотинамид
активный
CNBD
CNBD
0,0650
9,5
1,0
0,60
0,3825
49,2
0,1
0,61
N-фенетилникотинамид
активный
0,37
> 0,3
0,5725
83,6
0,1
0,35
1,1625
149,5
0,03
0,22
N-(2-(1Н-индол-3-ил) этил) никотинамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2-амино-N-фенетилбензамид
активный
0,42
0,48
0,6400
93,4
0,3
0,14
1,5125
194,5
0,01
0,09
N-изобутилбензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-фенетилбензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
активный
0,12
CNBD
0,0775
11,3
1,0
0,04
0,7150
92,0
0,01
0,03
N-(1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил) бензамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(1-(метиламино) -1-оксопропан-2-ил) Циннамамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-фенетилбензамид
активный
0,33
> 1,0
0,1400
20,4
0,6
0,12
0,9800
126,0
0,01
0,09
2 -((карбоксиметил) амино) -3-фенилпропановая кислота
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-бензоил-DL-лейцинамид
активный
> 0,6
> 1,0
0,8600
125,5
0,3
0,47
1,5900
204,5
0,1
0,91
N-(2-(1Н-индол-3-ил) этил) никотинамид
активный
0,15
> 0,1
1,1400
166,4
0,03
0,05
1,3225
170,1
0,003
0,04
гидрохлорид метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина
активный
0,03
0,05
1,8725
273,4
0,01
0,02
2,2500
289,4
0,003
0,02
N-бензил-L-лейцин
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N-(втор-бутил) -2Н-1,3-бензодиоксол-5-карбоксамид
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-/ 3'-O-(N'-метилантранилоил) инозин- 5'-O-монофосфат (MANT-5'-IMP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N6- Циклопентиладенозин-5'-O- Дифосфат (6-cPe-ADP/cpADP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
2'-3'-O-(N'-метилантранилоил) аденозин-5'-O-дифосфат (MANT-ADP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
6-тиогуанозин-5'-O-дифосфат (6-T-GDP)
активный
CNBD
0,18
1,0470
152,8
0,03
CNBD
0,0720
9,3
CNBD
0,28
6-Хлоропурин-рибозид-5'-O- Трифосфат (6-Cl-PuTP)
активный
> 0,3
> 0,3
0,3450
50,4
0,01
> 0,3
0,2350
30,2
0,003
> 0,3
2'-/ 3'-O-(N'-метилантранилоил) аденозин- 5'-О-трифосфат (MANT-ATP)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Бензил циннамат (одобрен ЕС)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Изобутилбензоат; Флавис 09.705
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
тартразин; Желтый № 5
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Хромотроп FB; Кармозин Фуд Ред 3
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Изобутилфенилацетат Флавис 09.705 (одобрен ЕС)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Фенилэтиловый эфир фенилацетата (одобрен ЕС)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Бензилбензоат (одобрен ЕС)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Бензилсалицилат (одобрен ЕС)
N/A
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
N/D
Пример 8. Активация рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями.
in vitro
Настоящий пример описывает активацию рецептора T1R1/T1R3 трансмембранными соединениями , где трансмембранные соединения функционируют как агонисты рецепторов и/или положительные аллостерические модуляторы (РАМ). При функционировании в качестве РАМ трансмембранные соединения усиливают действие нуклеотидов и аминокислот в отношении активности рецептора.
in silico
in vitro
На основании -моделирования, описанного в Примере 4, предполагаемые трансмембранные соединения T1R1/T1R3 идентифицировали и отбирали для дальнейшего тестирования in vitro в качестве агонистов рецепторов и/или РАМ. Функциональную характеристику отобранных соединений  использовали для оценки эффективности предполагаемых трансмембранных соединений в качестве агонистов и/или РАМ при активации рецептора T1R1/T1R3.
Метод скрининга агонистов. Клетки HEK293, которые стабильно экспрессируют T1R3 и индуцируемо экспрессируют T1R1, подвергали воздействию трансмембранного соединения. Активацию рецептора T1R1/T1R3 выявляли путем изменения уровня внутриклеточного кальция с использованием чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя и/или люминесцентной репортерной системы. Клетки, которые не экспрессируют рецептор T1R1/T1R3, использовали в качестве контроля. Для сбора данных использовался FLIPR Tetra или FlexStation 3.
Каждое трансмембранное соединение испытывали в концентрациях 0,01 мМ, 0,1 мМ и 1 мМ. Кривые дозовой зависимости генерировали для каждого трансмембранного соединения, которое активировало T1R1/T1R3. Для генерирования кривых дозовой зависимости трансмембранное соединение тестировали в концентрациях от 0,0001 до 1,0 мМ в присутствии GMP и Ala. Создавали кривые дозовой зависимости, в которых Ala поддерживали постоянным при 20 мм и GMP увеличивали от 0,001 до 1 мМ (в частности, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 0,6 и 1 мМ). Аналогично, GMP поддерживали постоянным при 1 мМ, а концентрацию Ala изменяли между 0,1 и 100 мМ (в частности, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 60 и 100 мМ).
Метод скрининга PAM: клетки HEK293, которые стабильно экспрессируют T1R3 и индуцируемо экспрессируют T1R1, подвергали воздействию трансмембранного соединения индивидуально или в комбинации с Ala и GMP для активации рецептора умами. Активацию рецептора T1R1/T1R3 выявляли путем изменения уровня внутриклеточного кальция с использованием чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя и/или люминесцентной репортерной системы. Клетки, которые не экспрессируют рецептор T1R1/T1R3, использовали в качестве контроля. Для сбора данных использовался FLIPR Tetra или FlexStation 3.
Кривые дозовой зависимости генерировали для каждого трансмембранного соединения в концентрациях 0 (только буфер), 0,01, 0,1 и 1 мМ, где каждую из трех концентраций трансмембранного соединения тестировали в комбинации с 0,03 мМ GMP+100 мМ Ala (T1); 0,6 мМ GMP+10 мМ Ala (T2); 0,1 мМ GMP+60 мМ Ala (T3) и 0,3 мМ GMP+60 мМ Ala (T4). Смесь Т4 также тестировали в 2-кратных сериях разбавления (концентрация Т4 (Х)). В этих экспериментах первая тестируемая концентрация составляла 2Х (в 2 раза) концентрацию Т4. Последующие тестируемые концентрации представляли собой 2-кратные разведения от этой концентрации (1X, 0,5X и т.д.). Эту серию разбавлений тестировали с добавлением или без добавления тесттруемого соединения при постоянной концентрации 0,3 мМ.
Активацию рецептора умами также определяли в присутствии 1 мМ GMP+100 мМ Ala, с получением «максимального» уровня активации рецептора умами. Соединение классифицировали как PAM, если ответ на любую комбинацию соединения+Ala+GMP был больше, чем сумма ответа на соединение индивидуально и ответ на GMP+аланин индивидуально.
Результаты. Как показано в Таблице 27, 24 тестировали различные трансмембранные соединения и идентифицировали девять в качестве агонистов T1R1/T1R3, РАМ или и то, и другое.
Таблица 27. Трансмембранные соединения, которые функционируют как агонист T1R1/T1R3, PAM или и то и другое.
Название трансмембранного соединения
Агонист T1R1/T1R3
T1R1/T1R3 PAM
1
1-бензил-3-(2-оксо-2-фенилэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
2
1-бензил-3-(2-(2,3-дигидро-1Н-инден-5-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
3
1-бензил-3-(2-(4-бромфенил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
4
1-бензил-3-(2-(2,3-дигидро [b] [1,4] диоксин-6-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
5
1-бензил-3-(2-(2,4-диметоксифенил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
6
1-(2-оксо-2-фенилэтил) -3-(2-(тиофен-2-ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
7
1-(2-(бензо [d] [1,3] диоксол-5-ил) -2-оксоэтил) -3-(2-(тиофен-2-ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
8
1-бензил-3-(2-(3,4-дигидро-2Н-бензо [b] [1,4] диоксепин-7-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
Слабый PAM
9
2-(3-бензил-2,4,5-триоксоимидазолидин-1-ил) -N-(3-цианофенил) ацетамид
нет
нет
10
1-(2-(2-метоксифенил) -2-оксоэтил) -3-(тиофен-2-илметил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
11
1-(2-(нафталин-1-ил) -2-оксоэтил) -3-(2-(тиофен-2-ил) этил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
нет
12
1-бензил-3-(2-(5-хлорпиридин-2-ил) -2-оксоэтил) имидазолидин-2,4,5-трион
нет
Слабый PAM
13
1,3-дибензил-2-тиоксоимидазолидин-4,5-дион
нет
нет
14
N-(гептан-4-ил) бензо [d] [1,3] диоксол-5-карбоксамид
да
да
15
гидрохлорид метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина
да
да
16
Гидрохлорид метилового эфира N-бензил-D-фенилаланина
да
да
17
N-альфа-бензил-N-альфа-метил-L-фенилаланина гидрохлорид сложного метилового эфира
нет
нет
18
Гидрохлорид метилового эфира Бензил-L-лейцина
да
да
19
Метил-2-бензиламино-2-фенилацетат
да
да
20
Гидрохлорид бензилового эфира L-фенилаланина
да
да
21
Бензиловый эфир L-тирозина
нет
нет
22
N-бензил-L-Тирозин
нет
нет
23
2 -((4-метилбензил) амино) -3-фенилпропановая кислота
нет
нет
24
1,3-дибензилпиримидин-2,4,6 (1H, 3H, 5H) -трион
да
нет
Как описано в Таблице 28, девять из тестированных соединений были активными в качестве агонистов T1R1/T1R3 и/или РАМ. На Фигурах 72-80 показаны кривые дозовой зависимости для профилирования агонистов и профилирования PAM для каждого соединения, идентифицированного как агонист T1R1/T1R3 и/или PAM.
Без привязки к определенной теории эти результаты показывают, что только трансмембранные соединения могут активировать T1R1/T1R3 в качестве агонистов и могут также функционировать в качестве положительных аллостерических модуляторов активации GMP и Ala T1R1/T1R3, тем самым уменьшая количество агониста, необходимое для достаточной активации рецептора T1R1/T1R3.
Пример 9. Идентификация остатков T1R1 взаимодействующих с трансмембранным соединением.
in silico
Настоящий пример описывает -идентификацию аминокислот в T1R1, которые взаимодействуют с трансмембранными соединениями, которые связываются с T1R1.
Методы: Кошачий T1R1 представляет собой G-белок-сопряженный рецептор группы C (GPCR), также как и T1R2, T1R3, CaSR, GabaB и mGlu. GPCR группы C содержат (1) большой внешний домен, называемый доменом Venus Flytrap (VFT), (2) трансмембранный домен 7 (7TM) и (3) домен, богатый цистеином, который соединяет VFT и 7TM. Модель гомологии кошачьего домена 7TM T1R1 была построена на основе кристаллических структур 4OR2 и 4OO9 из белкового банка данных (Berman et al., Nucleic Acids Research, 28: 235-242 (2000)). 4OR2 и 4OO9 представляют собой кристаллические структуры частей двух метаботропных глутаматных рецепторов, которые представляют собой GPCR группы C. 4OR2 представляет собой кристаллическую структуру трансмембранного домена mGluR1 вместе со связанным отрицательным аллостерическим модулятором (NAM) (Wu et al., Science. 2014 Apr 4;344(6179):58-64. Epub 2014 Mar 6.). 4OO9 представляет собой кристаллическую структуру трансмембранного домена mGluR5 со связанным NAM (Dore et al., Nature. 2014 Jul 31;511(7511):557-62. Epub 2014 Jul 6). Модели были построены с использованием набора программ I-TASSER (Yang et al., Nature Methods, 12: 7-8 (2015)) и программного пакета Modeller (Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30 (2006)), которая является частью набора программ DiscoveryStudio (DS) от Dassault Systemes, BIOVIA Corp., Сан-Диего, Калифорния, США. Существует приблизительно 25% идентичности последовательности между доменами mGluR1 и кошачьим T1R1 7TM. Метиловый эфир N-бензил-L-фенилаланина закрепляется в аллостерическом сайте кошачьего T1R1 7TM в модели T1R1 с использованием программы докинга BioDock от BioPredict, Inc. (Oradell, NJ, USA). Для докинга аминокислот и нуклеотидов с VFT-доменом использовали аналогичный протокол, описанный для моделирования докинга нуклеотидов с VFT-доменом.
Результаты. В модели докинга метиловый эфир N-бензил-L-фенилаланина взаимодействует со следующими аминокислотами аллостерического 7TM-связывающего сайта кошачьего T1R1: Ala795, Ala796 и Asn792, которые находятся на спирали 7 из 7TM; Trp773 и Phe776, которые находятся на спирали 6 из 7TM; Ala731, Phe728, Leu730, Phe732 и Asn735, которые находятся на спирали 5 из 7TM; Ala689, Ser686, Gln690, Ile693, Cys694 и Leu695, которые находятся на спирали 4 из 7ТМ; И Arg634, Gln635, Phe642, Ala639, Ala643 и Leu638, которые находятся на спирали 3 из 7TM (Фигура 28. Сложноэфирная группа метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина образует водородную связь с Asn735. Модели других трансмембранных соединений иллюстрируют, что лиганд может образовывать водородные связи с Asn735, Ser686 или с обоими.
Большинство гидрофобных взаимодействий между метиловым эфиром N-бензил-L-фенилаланина и 7TM-доменом T1R1 происходит между лигандом и Trp773, Phe776, Phe732, Phe728, Leu730, Leu695, Leu638 и Phe642. Эти аминокислоты также обеспечивают большинство гидрофобных взаимодействий между другими трансмембранными лигандами T1R1 и трансмембранным доменом T1R1.
Яркой особенностью активного сайта T1R1 является количество остатков, которые могут подвергаться стэкинг-взаимодействиям в кольце в связанном лиганде. Модель метилового эфира N-бензил-L-фенилаланина, связанного с T1R1 7TM, показывает кольцевые стэкинг-взаимодействия из бензильной группы с трансмембранным доменом. Эта особенность характерна для моделей других активных трансмембранных соединений, связанных с T1R1 7TM. Они могут способствовать как связыванию, так и стабилизации активной конформации T1R1/T1R3. Аминокислоты T1R1 7TM, которые могут образовывать такие взаимодействия, включают Trp773, Phe776, Phe732, Phe728 и Phe642.
Хотя раскрытый настоящим объект и его преимущества описаны подробно, следует понимать, что здесь могут быть сделаны различные изменения, замены и изменения без отклонения от сущности и объема изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения. Кроме того, объем настоящей заявки не ограничивается конкретными вариантами осуществления способа, аппарата, производства и композиции вещества, средств, способов и стадий, описанных в спецификации. Как понятно специалисту в данной области техники из объекта изобретения, раскрытого настоящим, способы, аппараты, производства, составы вещества, средства, методы или стадии, существующие в настоящее время или которые будут разработаны позднее, которые выполняют, по существу, ту же самую функцию или достигают, по существу, того же результата, что и соответствующие варианты осуществления, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в соответствии с раскрытым объектом изобретения. Соответственно, прилагаемая формула изобретения включает в свой объем такие способы, аппараты, производство, составы вещества, средства, методы или стадии.
Патенты, патентные заявки, публикации, описания продуктов и протоколы цитируются в этой заявке, раскрытие которой включено в настоящий документ путем ссылки в полном объеме для всех целей.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  MARS, INCORPORATED
<120>  СПОСОБЫ МОДУЛЯЦИИ ВКУСОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
<130>  069269.0168
<150>  US 62/090138
<151>  2014-12-10
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  2526
<212>  ДНК
<213>  Felis catus
<400>  1
atgtcactcc cggcggctca cctggtcggc ctgcagctct ccctctcctg ctgctgggct       60
ctcagctgcc acagcacaga gacgtctgcc gacttcagcc tccctgggga ttacctcctc      120
gcaggtctgt tccctctgca ctctgactgt ccgggcgtga ggcaccggcc cacggtgacc      180
ctctgtgaca ggcccgacag cttcaacggt cacggctacc acctcttcca ggccatgcgg      240
tttggcatcg aggagataaa caactccacg gccctcctgc cgaacgtcac cctgggatac      300
cagctgtacg acgtgtgctc ggagtctgcc aacgtgtatg ccacactaaa cgtgctctcc      360
ctgctgggga cacatcacgt agagatccga gcagaccctt cccactattc gcccgccgcc      420
ctggctgtca ttgggcctga caccaccaac cacgcagcca ccactgcagc cctgctgagc      480
cccttcctgg tgcccctgat cagctacgag gccagcagcg tgacgctcgg agtgaagcgg      540
cattacccct cgtttctgcg caccatcccc agcgacaagc accaggtgga ggccatggtg      600
ctgctgctgc agagcttcgg gtgggtctgg atctcggtgg tcggcagcga cggcgactac      660
gggcagctgg gggtgcaggc gctggaggag caggccaccc agcagggcat ctgcgttgcc      720
ttcaaggaca tcatcccctt ctctgcccgg ccgggcgacg agaggatgca gggcatcatg      780
caccacctgg cccgagcgag gaccaccgtt gtggtcgttt tctccagcag gcagctggcc      840
agggtgttct ttgagtcggt ggtgctggcc aacctgactg ccaaggtgtg gatcgcctca      900
gaagactggg ccatctctag acacatcagc aatgtgcccg ggatccaggg cattggcaca      960
gtgctgggtg tggccatcca gcagaggctt gtccctggcc tgaaggagtt tgaagaggcc     1020
tatgtccagg cagataaggg ggcccctggg ccttgctcca ggacctccga gtgcagcagc     1080
aaccagctct gtagagagtg tcgggctttc acggcagagc agatgcccac gctcggggca     1140
ttctccatga gctctgctta taacgcctac cgggcagtct acgcagtggc ccatggcctc     1200
caccagctcc tgggctgtgc ctctggagcc tgttccaggg accgagtcta cccctggcag     1260
cttctggagc agatccgcaa ggtgaatttc ctcctacaca aggacaccgt gaggtttaat     1320
gacaacgggg accctctcag tggctacgac ataattgcct gggactggag tggccccaag     1380
tggaacttca gggtcattgg ctcctccatg tggcctccag ttcagctgga cataaataaa     1440
accaaaatcc ggtggcacgg gaaggacaac caggtgccaa agtctgtgtg ctccagcgac     1500
tgcctcgaag ggcaccagcg agtgatttcg ggtttctacc actgttgctt tgagtgtgtg     1560
ccctgtgagg ccgggagctt cctcaacaag agcgacctcc acagctgcca gccttgtggg     1620
aaagaagagt gggcacccgc gggaagtgaa acctgctttc cacgcaccgt ggtgtttttg     1680
acttggcacg agaccatctc ttgggtgctg ctggcagcta atacgttgct gctgctgctg     1740
gtgactggga ctgctggcct gtttgcctgg cacttagaca cccctgtggt gaagtccgct     1800
gggggccgac tgtgcttctt catgctgggc tccctggcag ggggcagctg tgggctctac     1860
ggcttttttg gggagcccac gctgcccaca tgcttgttgc gccaaagcct ccttgccctg     1920
ggttttgcca tcttcctgtc ctgcctgacc atccgctcct tccaactggt cttcatcttc     1980
aagttttctg ccaaggtacc caccttctac cgtgcctggg tccaaaacca cggtcctggc     2040
ctatttgtgg tgatcagctc aatggcccag ctgctcatct gtctaacttg gctggcggtg     2100
tggaccccac tgcccaccag ggagtaccag cgcttccctc agctggtggt gcttgattgc     2160
acagaggcca actcaccggg cttcatgttg gctttcgcct acaatggcct cctgtccgtc     2220
agcgcctttg cctgcagcta cctgggcaag gacctgccag agaactacaa cgaggccaaa     2280
tgtgtcactt ttagtctgct gctcaacttc gtgtcctgga ttgccttctt caccacggcc     2340
agcgtctacc agggcaagta cttgcccgcg gtcaacgtgc tggcggcgct gagcagcctg     2400
agtggcggct tcagcggtta tttcctcccc aagtgctacg tgatcctgtg ccgcccagat     2460
ctcaacagca cagagcactt ccaggcctcc atccaggagt acacgaggcg ctgcggctcc     2520
acctga                                                                2526
<210>  2
<211>  841
<212>  Белок
<213>  Felis catus
<400>  2
Met Ser Leu Pro Ala Ala His Leu Val Gly Leu Gln Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Cys Cys Trp Ala Leu Ser Cys His Ser Thr Glu Thr Ser Ala Asp Phe
20                  25                  30
Ser Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser
35                  40                  45
Asp Cys Pro Gly Val Arg His Arg Pro Thr Val Thr Leu Cys Asp Arg
50                  55                  60
Pro Asp Ser Phe Asn Gly His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg
65                  70                  75                  80
Phe Gly Ile Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Val
85                  90                  95
Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Glu Ser Ala Asn Val
100                 105                 110
Tyr Ala Thr Leu Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Thr His His Val Glu
115                 120                 125
Ile Arg Ala Asp Pro Ser His Tyr Ser Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile
130                 135                 140
Gly Pro Asp Thr Thr Asn His Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser
145                 150                 155                 160
Pro Phe Leu Val Pro Leu Ile Ser Tyr Glu Ala Ser Ser Val Thr Leu
165                 170                 175
Gly Val Lys Arg His Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Ser Asp
180                 185                 190
Lys His Gln Val Glu Ala Met Val Leu Leu Leu Gln Ser Phe Gly Trp
195                 200                 205
Val Trp Ile Ser Val Val Gly Ser Asp Gly Asp Tyr Gly Gln Leu Gly
210                 215                 220
Val Gln Ala Leu Glu Glu Gln Ala Thr Gln Gln Gly Ile Cys Val Ala
225                 230                 235                 240
Phe Lys Asp Ile Ile Pro Phe Ser Ala Arg Pro Gly Asp Glu Arg Met
245                 250                 255
Gln Gly Ile Met His His Leu Ala Arg Ala Arg Thr Thr Val Val Val
260                 265                 270
Val Phe Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe Phe Glu Ser Val Val
275                 280                 285
Leu Ala Asn Leu Thr Ala Lys Val Trp Ile Ala Ser Glu Asp Trp Ala
290                 295                 300
Ile Ser Arg His Ile Ser Asn Val Pro Gly Ile Gln Gly Ile Gly Thr
305                 310                 315                 320
Val Leu Gly Val Ala Ile Gln Gln Arg Leu Val Pro Gly Leu Lys Glu
325                 330                 335
Phe Glu Glu Ala Tyr Val Gln Ala Asp Lys Gly Ala Pro Gly Pro Cys
340                 345                 350
Ser Arg Thr Ser Glu Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Arg
355                 360                 365
Ala Phe Thr Ala Glu Gln Met Pro Thr Leu Gly Ala Phe Ser Met Ser
370                 375                 380
Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu
385                 390                 395                 400
His Gln Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Asp Arg Val
405                 410                 415
Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Glu Gln Ile Arg Lys Val Asn Phe Leu Leu
420                 425                 430
His Lys Asp Thr Val Arg Phe Asn Asp Asn Gly Asp Pro Leu Ser Gly
435                 440                 445
Tyr Asp Ile Ile Ala Trp Asp Trp Ser Gly Pro Lys Trp Asn Phe Arg
450                 455                 460
Val Ile Gly Ser Ser Met Trp Pro Pro Val Gln Leu Asp Ile Asn Lys
465                 470                 475                 480
Thr Lys Ile Arg Trp His Gly Lys Asp Asn Gln Val Pro Lys Ser Val
485                 490                 495
Cys Ser Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Ile Ser Gly Phe
500                 505                 510
Tyr His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Glu Ala Gly Ser Phe Leu
515                 520                 525
Asn Lys Ser Asp Leu His Ser Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp
530                 535                 540
Ala Pro Ala Gly Ser Glu Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu
545                 550                 555                 560
Thr Trp His Glu Thr Ile Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu
565                 570                 575
Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu
580                 585                 590
Asp Thr Pro Val Val Lys Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Phe Met
595                 600                 605
Leu Gly Ser Leu Ala Gly Gly Ser Cys Gly Leu Tyr Gly Phe Phe Gly
610                 615                 620
Glu Pro Thr Leu Pro Thr Cys Leu Leu Arg Gln Ser Leu Leu Ala Leu
625                 630                 635                 640
Gly Phe Ala Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Ile Arg Ser Phe Gln Leu
645                 650                 655
Val Phe Ile Phe Lys Phe Ser Ala Lys Val Pro Thr Phe Tyr Arg Ala
660                 665                 670
Trp Val Gln Asn His Gly Pro Gly Leu Phe Val Val Ile Ser Ser Met
675                 680                 685
Ala Gln Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Ala Val Trp Thr Pro Leu
690                 695                 700
Pro Thr Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro Gln Leu Val Val Leu Asp Cys
705                 710                 715                 720
Thr Glu Ala Asn Ser Pro Gly Phe Met Leu Ala Phe Ala Tyr Asn Gly
725                 730                 735
Leu Leu Ser Val Ser Ala Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu
740                 745                 750
Pro Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Leu
755                 760                 765
Asn Phe Val Ser Trp Ile Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Gln
770                 775                 780
Gly Lys Tyr Leu Pro Ala Val Asn Val Leu Ala Ala Leu Ser Ser Leu
785                 790                 795                 800
Ser Gly Gly Phe Ser Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu
805                 810                 815
Cys Arg Pro Asp Leu Asn Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln
820                 825                 830
Glu Tyr Thr Arg Arg Cys Gly Ser Thr
835                 840
<210>  3
<211>  2597
<212>  ДНК
<213>  Felis catus
<400>  3
atgcccggcc tcgctctcct gggcctcacg gctctcctgg gcctcacggc tccttggacc       60
acggggaggg cgcaacgtcc tgcttgtcac agcagctcag gatgcagggg gactatgtgc      120
tgggtgggct cttccctctg ggctctgccg agggtacagg tcttggcgac gggctgcagc      180
ccaatgccac cgtgtgcacc aggttctcgt ctctgggcct gctctgggcg ctggccgtga      240
agatggcggt ggaggagatc aacaacgggt cggccctgct gcccgggctg cacctgggct      300
atgacctctt tgacacgtgt tcagagccca tggtggccat gaagcccagc ctcgtgttca      360
tggccaaagc aggcagctgc agcattgccg cctactgcaa ttacacacag taccagcccc      420
gcgtgctggc cgtcatcggg ccccactcgt ctgagctcgc cctcgtcacc ggcaagttct      480
tcagcttctt ccttgtgcct caggtcagct acggcgccag caccgaccgg ctgagcaacc      540
gggagatctt cccgtccttc ttccgcacgg tgcccagcga ccaggtgcag gtggcggcca      600
tggtggagct gctgcaggag ctcggctgga actgggtggc ggcggtgggt agtgacgacg      660
agtatggccg gcagggcctg agcctcttct ccggcctggc cagcgccagg ggcatctgca      720
tcgcgcatga gggcctggtg ccactgccgc caggcagcct gcggctgggc gccctacagg      780
gcctgctgcg ccaggtgaac cagagcagcg tgcaggtggt ggtgctgttc tcctccgccc      840
acgcggcccg caccctcttc agctacagca tccgctgcaa gctctcaccc aaggtgtggg      900
tggccagcga ggcctggctg acctcagacc tggtcatgac gctgcccggc atgcctgggg      960
tgggcaccgt gctgggcttc ctgcagcagg gcgccccgat gccggagttc ccatcctacg     1020
tgcggacccg cctggccctg gccgctgacc ctgccttctg cgcctcgctg gacgctgaac     1080
agccaggcct ggaggagcac gtggtggggc cacgctgccc ccaatgtgac cacgtcacgc     1140
tagagaacct atctgcgggg ctgctgcacc accagacctt cgctgcctac gcggctgtgt     1200
atggcgtggc ccaggccctt cacaacacac tgcgctgcaa tgcctcgggc tgccccaggc     1260
gggagcctgt gcggccctgg cagctcctag agaacatgta caacgtgagc ttccgtgctc     1320
gcggcctggc actgcagttc gacgccagcg ggaacgtgaa cgtggattac gacctgaaac     1380
tgtgggtgtg gcaggacccg acgcccgagc tgcgcaccgt aggcaccttc aagggccgcc     1440
tggagctctg gcgctctcag atgtgctggc acacgccggg gaagcagcag cccgtgtccc     1500
agtgctcccg gcagtgcaag gagggccagg tgcgccgcgt gaagggcttc cactcttgct     1560
gttacgactg cgtggactgc aaggcgggca gttatcagcg caacccagat gacctcctct     1620
gcacccagtg tgaccaggac cagtggtccc cagaccggag cacacgctgc ttcgcccgca     1680
agcccatgtt cctggcatgg ggggagccag ctgtgctgct actgctcgcg ctgctggctc     1740
tggcgctggg cctggcgctg gcagccctgg ggctcttcct ctggcactcg gacagcccgc     1800
tggttcaggc ctcaggtggg ccacgggcct gctttggcct ggcctgcctg ggcctggtct     1860
gcctcagtgt cctcctgttc cctggccagc caggccctgc cagctgcctg gcccagcagc     1920
cactgttcca cctcccactc actggctgcc tgagcacgct tttcctgcaa gcggccgaga     1980
tatttgtggg gtcggagctg ccaccaagct gggctgagaa gatgcgtggc cgcctgcggg     2040
ggccctgggc ctggctggtg gtgctgcttg ctatgctggc agaagccgca ttgtgtgcct     2100
ggtacctggt agccttcccg ccagaggtgg tgacggactg gcgggtactg cccacagagg     2160
cgctggtgca ctgccacgtg cactcctgga tcagcttcgg cctggtgcat gccactaacg     2220
ccatgctggc cttcctctgc ttcctgggca ctttcctggt gcagagccgg ccaggccgct     2280
acaatggtgc ccgcggcctc acctttgcca tgctggccta cttcatcacc tggatctcct     2340
ttgtgcccct ctttgccaat gtgcacgtgg cctaccagcc tgccgtgcag atgggcacca     2400
tcctcctctg tgccctgggt atcctagcca ccttccacct gcccaagtgc tacctgctgc     2460
tgcagcggcc ggagctcaac acccctgagt tcttcctgga agacaatgcc agagcacagg     2520
gcagcagttg ggggcagggg aggggagaat cggggcaaaa acaagtgaca cccgatccag     2580
tgacctcacc gcagtga                                                    2597
<210>  4
<211>  865
<212>  Белок
<213>  Felis catus
<400>  4
Met Pro Gly Leu Ala Leu Leu Gly Leu Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Asp His Gly Glu Gly Ala Thr Ser Cys Leu Ser Gln Gln
20                  25                  30
Leu Arg Met Gln Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly
35                  40                  45
Ser Ala Glu Gly Thr Gly Leu Gly Asp Gly Leu Gln Pro Asn Ala Thr
50                  55                  60
Val Cys Thr Arg Phe Ser Ser Leu Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Val
65                  70                  75                  80
Lys Met Ala Val Glu Glu Ile Asn Asn Gly Ser Ala Leu Leu Pro Gly
85                  90                  95
Leu His Leu Gly Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Met Val
100                 105                 110
Ala Met Lys Pro Ser Leu Val Phe Met Ala Lys Ala Gly Ser Cys Ser
115                 120                 125
Ile Ala Ala Tyr Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala
130                 135                 140
Val Ile Gly Pro His Ser Ser Glu Leu Ala Leu Val Thr Gly Lys Phe
145                 150                 155                 160
Phe Ser Phe Phe Leu Val Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Thr Asp
165                 170                 175
Arg Leu Ser Asn Arg Glu Ile Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Asp Gln Val Gln Val Ala Ala Met Val Glu Leu Leu Gln Glu Leu
195                 200                 205
Gly Trp Asn Trp Val Ala Ala Val Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg
210                 215                 220
Gln Gly Leu Ser Leu Phe Ser Gly Leu Ala Ser Ala Arg Gly Ile Cys
225                 230                 235                 240
Ile Ala His Glu Gly Leu Val Pro Leu Pro Pro Gly Ser Leu Arg Leu
245                 250                 255
Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Arg Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln
260                 265                 270
Val Val Val Leu Phe Ser Ser Ala His Ala Ala Arg Thr Leu Phe Ser
275                 280                 285
Tyr Ser Ile Arg Cys Lys Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu
290                 295                 300
Ala Trp Leu Thr Ser Asp Leu Val Met Thr Leu Pro Gly Met Pro Gly
305                 310                 315                 320
Val Gly Thr Val Leu Gly Phe Leu Gln Gln Gly Ala Pro Met Pro Glu
325                 330                 335
Phe Pro Ser Tyr Val Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ala Ala Asp Pro Ala
340                 345                 350
Phe Cys Ala Ser Leu Asp Ala Glu Gln Pro Gly Leu Glu Glu His Val
355                 360                 365
Val Gly Pro Arg Cys Pro Gln Cys Asp His Val Thr Leu Glu Asn Leu
370                 375                 380
Ser Ala Gly Leu Leu His His Gln Thr Phe Ala Ala Tyr Ala Ala Val
385                 390                 395                 400
Tyr Gly Val Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Arg Cys Asn Ala Ser
405                 410                 415
Gly Cys Pro Arg Arg Glu Pro Val Arg Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn
420                 425                 430
Met Tyr Asn Val Ser Phe Arg Ala Arg Gly Leu Ala Leu Gln Phe Asp
435                 440                 445
Ala Ser Gly Asn Val Asn Val Asp Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp
450                 455                 460
Gln Asp Pro Thr Pro Glu Leu Arg Thr Val Gly Thr Phe Lys Gly Arg
465                 470                 475                 480
Leu Glu Leu Trp Arg Ser Gln Met Cys Trp His Thr Pro Gly Lys Gln
485                 490                 495
Gln Pro Val Ser Gln Cys Ser Arg Gln Cys Lys Glu Gly Gln Val Arg
500                 505                 510
Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Lys
515                 520                 525
Ala Gly Ser Tyr Gln Arg Asn Pro Asp Asp Leu Leu Cys Thr Gln Cys
530                 535                 540
Asp Gln Asp Gln Trp Ser Pro Asp Arg Ser Thr Arg Cys Phe Ala Arg
545                 550                 555                 560
Lys Pro Met Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu
565                 570                 575
Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Leu Ala Ala Leu Gly Leu
580                 585                 590
Phe Leu Trp His Ser Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro
595                 600                 605
Arg Ala Cys Phe Gly Leu Ala Cys Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val
610                 615                 620
Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Gly Pro Ala Ser Cys Leu Ala Gln Gln
625                 630                 635                 640
Pro Leu Phe His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu
645                 650                 655
Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Gly Ser Glu Leu Pro Pro Ser Trp Ala
660                 665                 670
Glu Lys Met Arg Gly Arg Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val
675                 680                 685
Leu Leu Ala Met Leu Ala Glu Ala Ala Leu Cys Ala Trp Tyr Leu Val
690                 695                 700
Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp Arg Val Leu Pro Thr Glu
705                 710                 715                 720
Ala Leu Val His Cys His Val His Ser Trp Ile Ser Phe Gly Leu Val
725                 730                 735
His Ala Thr Asn Ala Met Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe
740                 745                 750
Leu Val Gln Ser Arg Pro Gly Arg Tyr Asn Gly Ala Arg Gly Leu Thr
755                 760                 765
Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Ile Ser Phe Val Pro Leu
770                 775                 780
Phe Ala Asn Val His Val Ala Tyr Gln Pro Ala Val Gln Met Gly Thr
785                 790                 795                 800
Ile Leu Leu Cys Ala Leu Gly Ile Leu Ala Thr Phe His Leu Pro Lys
805                 810                 815
Cys Tyr Leu Leu Leu Gln Arg Pro Glu Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe
820                 825                 830
Leu Glu Asp Asn Ala Arg Ala Gln Gly Ser Ser Trp Gly Gln Gly Arg
835                 840                 845
Gly Glu Ser Gly Gln Lys Gln Val Thr Pro Asp Pro Val Thr Ser Pro
850                 855                 860
Gln
865
<---