Участие системы глутатиона в поддержании функционального состояния нейтрофилов при остром воспалении

Участие системы глутатиона в поддержании функционального состояния нейтрофилов при остром воспалении

Жаворонок Т. В.

Glutathione system participation on neutrophils functional status during acute inflammation

Zhavoronok T.V.

Проведено исследование состояния системы глутатиона (содержания восстановленного, окисленного, белково-связанного глутатиона, SH-групп белков и активности глутатионпероксидазы) и функциональных свойств (продукции гидроксильного радикала, интерлейкина-8, фактора некроза опухолей а и активности миелопероксидазы) нейтрофилов, полученных у больных внебольничной пневмонией. Выявлена роль восстановленной и белково-связанной форм глутатиона в регуляции активности миелопероксидазы и продукции гидроксильного радикала нейтрофилами крови в условиях инкубации клеток с блокатором синтеза глутатиона de novo бутионинсульфоксимином. Установлено, что для поддержания функционального состояния нейтрофилов более важен синтез глутатиона de novo, чем активность каталазы (ингибирование 3-амино-1,2,4-триазолом).

Ключевые слова: глутатион, нейтрофилы, острое воспаление, интерлейкины.

There was conducted the study of glutathione system status (the content of reduced, oxidized, protein-bound glutathione, SH-groups of proteins and glutathionperoxydase activity) and functional properties (the production of hydroxyl radical, IL-8, TNF-а and myeloperoxidase activity) of neutrophils received from people with community-acquired pneumonia. There was revealed the role of reduced and protein-bound glutathione in the regulation of myeloperoxidase activity and production of hydroxyl radical by blood neutrophils when incubating cells with glutathione synthesis blocker de novo (buthioninesulfoximine). and catalase inhibitor (3-amino-1,2,4-triazole). It was ascertained that glutathione synthesis de novo is more important than catalase activity (inhibition by 3-amino 1,2,4-triasole) to support neutrophil functional condition.

Key words: glutathione, neutrophils, acute inflammation, interleukins.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

© Жаворонок Т. В.

УДК 616-002-036.11:616.155.34:577.152.34

Введение

глутатиона (GSH), который определяет редокс-состояние нейтрофилов и влияет на эффективность их функционирования [5—7]. GSH выступает акцептором АФК [7, 14], кофактором ряда ферментов антиок-сидантной и детоксикационной систем [3, 6, 15], участвует в экспрессии редокс-чувствительных генов, регуляции внутриклеточной сигнализации [5, 7, 13]. Изучение механизмов поддержания редокс-состояния GSH в нейтрофилах актуально в плане поиска путей увеличения эффективности функционирования этих клеток как эффекторов острого воспаления.

Развитие и исходы острого воспаления зависят от функционального состояния нейтрофилов. Интегральной частью воспалительного ответа считают гиперпродукцию нейтрофилами активных форм кислорода (АФК), способных вместе с провоспалительными ци-токинами (фактор некроза опухолей (TNF) а, интер-ферон-у, интерлейкины (IL) 1, 8 и др.) поддерживать воспаление [4, 6]. Накопление АФК в самих нейтро-фильных гранулоцитах может приводить к окислительной модификации макромолекул, нарушению функций, повреждению и гибели клеток вследствие развития окислительного стресса (ОС) [6, 8, 10]. Основой защиты клеток от повреждающего действия АФК служит восстановительный потенциал системы

Цель работы — оценить роль системы глутатиона в механизмах изменений функциональных свойств нейтрофильных лейкоцитов крови при внебольничной пневмонии (ВП).

Материал и методы

Обследовано 48 больных (23 мужчины и 25 женщин в возрасте (36 ± 4) года) внебольничной пневмонией средней степени тяжести, поступивших в стационар в порядке скорой медицинской помощи. Диагноз соответствовал современным стандартам диагностики ВП [9]. Группу контроля составили 27 здоровых доноров (10 мужчин и 17 женщин) в возрасте от 18 до 50 лет (средний возраст (33 ± 6) лет). Материалом для исследования служила венозная кровь, полученная с использованием вакуумных систем BD Vacutainer (Greiner-bio-one, Австрия), с гепарином лития до проведения терапии.

Нейтрофильные лейкоциты выделяли на двойном градиенте Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция) плотностью 1,077 и 1,093 г/см3, трижды отмывали средой RPMI-1640 (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) и готовили суспензию клеток, стандартизованную до 2 • 106 в 1 мл. Жизнеспособность нейтрофилов в тесте с 0,5%-м трепа-новым синим (Serva, США) составляла 95%. Клетки культивировали с полной питательной средой, содержащей 90% RPMI-1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия), инактивированную при температуре 56 °С в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глута-мина, 100 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль Hepes (Flow, Великобритания). Для оценки роли системы GSH в поддержании функционирования нейтрофилов их инкубировали с бутионинсульфоксимином (BSO) с концентрацией 1 ммоль (Sigma, США) — блокатором ключевого фермента синтеза глутатиона у-глутамил-цистеинсинтазы [12] или 3-амино-1,2,4-триазолом (АТ) с концентрацией 2 ммоль (Sigma, США) — ингибитором каталазы [14], исключающим влияние фермента на редокс-статус и функционирование нейтрофилов.

В среде инкубации нейтрофилов оценивали содержание TNF-a и IL-8 ИФА-тест-системами (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), продукцию клетками НО^ по содержанию продуктов разрушения модельного субстрата — раствора 2-дезокси-Э-рибозы (МР, США) в концентрации 15 ммоль [1]. Часть суспензии нейтрофилов лизировали с 1%-м тритоном X-100, сохраняя стандартную концентрацию клеток, далее определяли: активность миелопероксидазы (МРО), учитывая преобразование о-фенилендиамина (МР, США) [1], глу-татионпероксидазы (GPO), катализирующей реакцию GSH и гидроперекиси т-бутила [1], содержание сульф-

гидрильных SH групп белка (белок SH) и связанного с белком GSH (белок SSG) методом S. Kojma и соавт. [13], учитывая способность 1%-го боргидрида натрия (Sigma, США) высвобождать GSH из связи с белками. Лизат клеток депротеинировали 5%-й сульфосалици-ловой кислотой и оценивали содержание GSH и его окисленной формы (GSSG) методом S. Kojma и соавт. [11], основанным на ферментативной реакции рециркуляции и блокировании SH-групп GSH винилпири-лидином (Wako, Япония). Количество белка в пробах определяли методом Бредфорд, основанным на окрашивании аргинина и лизина в белках Кумасси голубым G-250.

Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики. Результаты представлены в таблицах в виде медианы Ме, верхнего и нижнего квартилей Q1—Q3. Для оценки нормальности распределения показателей использовали тест Шапиро—Уилки, достоверности различий независимых выборок — ранговый критерий Манна—Уитни, зависимых выборок — непараметрический критерий Вилкоксона. Для выявления взаимосвязей между показателями, оценки их силы и направления применяли корреляционный анализ Спирмена. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

У пациентов с ВП в нейтрофилах зарегистрировано увеличение продукции IL-8, TNF-a, секреции НО^ и активности MPO в сравнении с показателями в контрольной группе (р < 0,05) (таблица). Повышение продукции цитокинов и АФК является следствием функциональной перестройки нейтрофилов с целью выполнения ими защитной функции по элиминации флогогенов.

Оценка состояния системы глутатиона в нейтро-фильных лейкоцитах крови при ВП показала снижение содержания GSH, белка SH, индекса GSH/GSSG (в 3,0; 1,9 и 6,5 раза соответственно) и рост концентрации GSSG и белка SSG (в 1,7 и 11,6 раза соответственно) относительно контрольных величин (р < 0,05) (таблица). Следовательно, зарегистрированное снижение внутриклеточного фонда GSH во многом обусловлено связыванием трипептида с функциональными SH-группами белков, что препятствует их необратимой инактивации. Недостаток GSH в нейтрофилах при ВП способствовал

Жаворонок Т. В.

Участие системы глутатиона в поддержании функционального состояния нейтрофилов.

угнетению антиоксидантной активности вРО в 1,6 раза по сравнению с показателем в контроле (р < 0,05).

Влияние блокатора синтеза глутатиона и ингибитора каталазы на состояние системы глутатиона и функциональные свойства нейтрофилов крови у пациентов с внебольничной пневмонией

Группа обследованных GSH, нмоль/мг белка GSSG, нмоль/мг белка GSH / GSSG Белок SH, нмоль/мг белка Белок SSG, нмоль/мг белка GFO, нмоль/(мин-мг белка) НО', нмоль/мг белка МРО, усл. ед./мг белка IL-8, пг/мл TNF-a, пг/мл

Здоровые доноры Интактные нейтрофилы

Интактные нейтрофилы 1,62 (1,23— 1,92)* 0,47 (0,37— 0,66)* 2,84 (2,45— 4,67)* 1,69 (1,50— 1,93)* 0,58 (0,47— 0,70)* 97,66 (89,78— 113,5)* 46,79 (40,64— 52,74)* 832,00 (747,80— 924,01)* 325,91 (312,91— 335,40)* 168,31 (153,27— 171,47)*

С га с н е я я Нейтрофилы, инкубированные с AT 1,33 (1,09— 1 71)*, ** 0,58 (0,51— 0,69)* 2,03 (2,04— 2,69)* 1,58 (1,50— 1,83)* 0,63 (0,61— 0,81)* 57,84 (49,45— 73,69)* 27,44 (18,28— 35,05)** 746,7 (562,9— 822,8) 305,51 (270,73— 371,30)* 144,60 (125,10— 176,90)*

а С Нейтрофилы, инкубированные с BSO 0,85 (0,81— 0,96)*, ** 0,66 (0,57— 0,76)*, ** 1,43 (1,31— 1 70)* ** 0,28 (0,25— 0,34)*, ** 0,65 (0,61— 0,70)* 39,53 (35,20— 42,78)*, ** 32,56 (24,38— 36,64)** 615,59 (571,89— 686,89)*, ** 320,50 (290,32— 340,12)* 153,90 (135,90— 164,60)*

* р < 0,05 по сравнению с показателями в интактных нейтрофилах у здоровых доноров. ** р < 0,05 по сравнению с показателями в интактных нейтрофилах у больных ВП.

Редокс-чувствительные тиоловые группы GSH и белков расходуются для защиты клетки от избытка НО' и других АФК [5, 11].

Культивирование нейтрофилов крови пациентов с ВП в условиях блокады синтеза GSH de novo приводило к дополнительному снижению содержания GSH, свободных тиоловых групп белков, коэффициента GSH/GSSG и активности GPO (в 1,9; 6,0; 2,0 и 2,5 раза соответственно) по сравнению с аналогичными параметрами в интактных нейтрофилах, полученных у больных ВП (р < 0,05). При этом содержание белка SSG оставалось на прежнем уровне, что указывает на нарушение механизмов глутатионирования в защите тиоловых центров белков от окислительной деградации.

Добавление BSO в среду инкубации нейтрофилов, праймированных в условиях ВП, снижало образование НО' и активность MPO в 1,4 раза относительно аналогичных значений в клетках, культивированных в отсутствие блокатора синтеза GSH (р < 0,05) (таблица). На фоне низкого уровня GSH в клетках при ВП блокада его дополнительного синтеза могла усилить процессы окислительной модификации белка, приводящие к повреждению активных центров МРО, а также НАДФ-оксидазы и супероксиддисмутазы, участ-

вующих в образовании субстрата для МРО [4]. В результате повышение активности MPO полностью нивелировалось, более того, показатель становился в 1,2 раза меньше величин, регистрируемых у здоровых доноров (р < 0,05). Подтверждением данного предположения является наличие положительной корреляционной связи между содержанием GSH и активностью МРО при инкубации с BSO нейтрофилов, полученных у больных ВП (r = 0,61; р < 0,05).

Однако усугубление дефицита GSH за счет отсутствия его синтеза de novo не было абсолютно фатальным для функциональной активности нейтрофилов. Добавление BSO в среду инкубации не влияло на продукцию клетками TNF-a и IL-8, выступающего ключевым стимулятором созревания и хемотаксиса ней-трофилов в очаг воспаления. Вероятно, происходило перераспределение пула GSH для обеспечения связывания фактора NF-kB с ДНК и поддержания синтеза цитокинов, регулирующих работу эффекторных клеток воспаления. Низкий уровень GSH в клетках влияет на связывание фактора NF-kB в ядре, поскольку активация факторов транскрипции и их контакт с регулятор-ными сайтами ДНК контролируется редокс-гомеостазом, основным показателем которого служит соотношение SH-групп и их SS-варианта [6, 7].

Синтез GSH de novo в сравнении с активностью каталазы вносит более существенный вклад в поддержание редокс-потенциала нейтрофилов, определяющего их функциональное состояние при остром воспалении. Ингибирование каталазы АТ в нейтрофилах пациентов с ВП приводило к компенсаторному перерасходу GSH и низкой активности GPO (р < 0,05), не влияя на активность МРО и продукцию цитокинов; регистрировалось лишь снижение образования НО^ в 1,7 раза по сравнению со значением параметра в ней-трофилах, инкубируемых без блокатора (р < 0,05). Известно, что ингибирование каталазы с помощью АТ сопровождается снижением активности ряда чувствительных к окислению ферментов, продукты которых участвуют в реакции Фентона, протекающей с образованием НО^ [2].

Заключение

Таким образом, нарушение функциональных свойств нейтрофилов крови (возрастание продукции НО\ IL-8, TNF-a и активности MPO) при остром воспалении сопровождается дисбалансом редокс-статуса клеток. Механизмы дисрегуляции редокс-зависимых систем нейтрофилов у пациентов с внебольничной пневмонией сопряжены со снижением емкости системы глутатиона (рост содержания его окисленной и белково-связанной форм при низких концентрациях его восстановленной формы и тиоловых групп белков). Ингибирование синтеза глутатиона de novo с помощью BSO угнетает кислородзависимые механизмы функциональной активности нейтрофилов (способность к продукции НО^ и активность MPO), необходимые для обеспечения микробицидной функции, и не влияет на синтез цитокинов IL-8 и TNF-a. Блокирование каталазы с помощью ингибитора АТ компенсируется заместительным вкладом системы глутатио-на в поддержание редокс-потенциала нейтрофилов при ВП, что отражается на функциональной активности клеток только снижением продукции НО\

В статье представлены результаты исследований, выполненных в рамках проекта, поддержанного Советом по грантам при Президенте РФ (НШ-2334.2008.7).

Литература

1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбин Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиокси-дантной защиты организма. СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. 103 с.

2. БайлякМ.М., Господарев А.В., Семчушкин Г.М., Лу-щак В.И. Ингибирование каталазы аминотриазолом приводит к снижению активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в клетках Saccharomyces cerevisiae // Биохимия. 2008. Т. 73, вып. 4. С. 15—23.

3.Жаворонок Т.В., Степовая Е.А., Рязанцева Н.В. и др. Закономерности нарушения окислительного метаболизма при острых воспалительных заболеваниях // Клинич. лаб. диагностика. 2006. № 12. С. 10—14.

4. Коваленко Е.И., Семенкова Г.Н., Черенкевич С.Н. Влияние пероксида водорода на способность нейтрофилов генерировать активные формы кислорода и хлора и сек-ретировать миелопероксидазу in vitro // Цитология. 2007. Т. 49, № 10. C. 837—847.

5. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона. II. Другие ферменты, тиол-дисульфидный обмен, воспаление и иммунитет, функции // Биомед. химия. 2009. Т. 55, В. 4. С. 365—379.

6.Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Реутов В.П. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: МАИК, 2006. 556 с.

7. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия. 2007. Т. 72, № 2. C. 158— 174.

8. Степовая Е.А., Жаворонок Т.В., Стариков Ю.В. и др. Влияние молекулы оксида азота на программированную гибель нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro // Бюл. экспер. биологии и медицины. 2008. Т. 146, № 12. С. 646—650.

9. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Страчунский Л.С. Пневмония. М.: Экономика и информатика, 2006. 464 с.

10.Burchill B.R., Oliver J.M., Pearson C.B. et al. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes // J. of Cell Biology. 1978. V. 76, № 2. P. 439—447.

11. Kojma S., Nadayama K.H., Ishida H. Low dose j-rays actrate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth // J. Radiat. Res. 2004. V. 45. P. 33—39.

12.Laragione T., Bonetto V., Casoni F. et al. Redox regulation of surface protein thiols: Identification of integrin-4 as a molecular target by using redox proteomics // PNAS. 2003. V. 100, № 25. P. 14737—14741.

13. Pietarinen-Runtti P., Lakari E., Raivio K.O., Kinnula V.L. Expression of antioxidant enzymes in human inflammatory cells // J. Physiol. Cell Physiol. 2000. V. 278, № 1. P. 118— 125.

14. Spolarics Z., Wu J.-X. Role of glutathione and catalase in H2O2 detoxification in LPS-activated hepatic endothelial and Kupffer cells // J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1997. V. 273. P. 1304—1311.

15. Zhu Y., Carvey P.M., Ling Z. Altered glutathione homeosta-sis in animals prenatally exposed to lipopolysaccharide // Neurochem. Int. 2007. V. 50, № 4. Р. 671—680.

Поступила в редакцию 17.03.10.2010 г. Утверждена к печати 13.05.2010 г.

Сведения об авторах

Т.В. Жаворонок — канд. мед. наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (г. Томск). Для корреспонденции

Татьяна Васильевна Жаворонок, тел.: 8 (3822) 42-09-22, 8-961-097-4530, факс 8 (3822) 53-33-09, e-mail: tavaza@ngs.ru

Влияние блокатора синтеза глутатиона и ингибитора каталазы на состояние системы глутатиона и функциональные свойства нейтрофилов крови у пациентов с

внебольничной пневмонией (Ме —

Группа обследованных ОЗН, нмоль/мг белка ОЗЗО, нмоль/мг белка ОЗН / ОЗЗО Белок-ЗН, нмоль/мг белка Белок-ЗЗО, нмоль/мг белка ОРО, нмоль/(мин-мг белка) НО; нмоль/мг белка МРО, усл. ед./мг белка 1Ь-8, пг/мл ТОТ-а, пг/мл

е Интактные 4,84 0,27 18,57 3,15 0,05 160,60 25,32 715,80 281,10 124,52

ыы вр оо нейтрофилы

рн оо дд со

Интактные 1,62 0,47 2,84 1,69 0,58 97,66 46,79 832,00 325,91 168,31

нейтрофилы (1,23—1,92)* (0,37—0,66)* (2,45—4,67)* (1,50—1,93)* (0,47—0,70)* (89,78—113,5)* (40,64— (747,80— (312,91— (153,27—

П В с 52,74)* 924,01)* 335,40)* 171,47)*

Нейтрофилы, 1,33 0,58 2,03 1,58 0,63 57,84 27,44 746,7 305,51 144,60

ыт н инкубиро- (1,09—1,71) (0,51—0,69)* (2,04—2,69)* (1,50—1,83)* (0,61—0,81)* (49,45—73,69)* (18,28—35,05) (562,9—822,8) (270,73— (125,10—

е и ванные с АТ *, ** ** 371,30)* 176,90)*

П Нейтрофилы, 0,85 0,66 1,43 0,28 0,65 39,53 32,56 615,59 320,50 153,90

инкубиро- (0,81—0,96) (0,57—0,76) (1,31—1,70) (0,25—0,34) (0,61—0,70)* (35,20—42,78) (24,38—36,64) (571,89—686,89) (290,32— (135,90—

ванные с БЗО *, ** *, ** *, ** *, ** *, ** ** *, ** 340,12)* 164,60)*

* р < 0,05 по сравнению с показателями в интактных нейтрофилах у здоровых доноров.

** р < 0,05 по сравнению с показателями в интактных нейтрофилах у больных ВП.

33

Бюллетень сибирской медицины, № 5, 2010