СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ
METHOD OF OBTAINING TISSUE ENGINEERING STRUCTURE

Настоящее изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к способам создания тканеинженерных конструкций.
Тканеинженерные конструкции представляют собой биомедицинский клеточный продукт, который состоит из клеток (клеточных линий), биосовместимого материала и вспомогательных веществ.
Термин «тканеинженерная конструкция» означает любой биомедицинский клеточный продукт, который состоит из клеточной линии (клеточных линий) и биосовместимого материала (Atala A, Kasper FK, Mikos AG. Engineering complex tissues. Sci Transl Med. 2012; Nov 14; 4(160): 160rv12).
Термин «биосовместимый материал» означает любой биосовместимый материал природного или синтетического происхождения. Например, к таким материалам относятся биосовместимые полимеры (полилактат и полиглюконат), биосовместимые металлы и сплавы (титан, платина, золото), биосовместимые природные полимеры (коллаген).
Термин «клетка» означает любую живую клетку, содержащуюся в биологической ткани млекопитающего, например человека.
Тканеинженерные конструкции используются при создании биологических заместителей для восстановления или улучшения функционирования тканей (Skalak, R., and С.F. Fox. 1988. Tissue engineering. New York: Liss). Клетки как компонент конструкции могут быть получены из разных источников и находиться на разных стадиях дифференцировки от малодифференцированных клеток до высокодифференцированных специализированных клеток. Биосовместимые материалы могут быть природного или синтетического происхождения.
Известные способы получения тканеинженерных конструкций требуют приготовления суспензии клеток и нанесения этой суспензии на биосовместимый материал.
Патент ЕР 1002859 А1 раскрывает способ создания тканеинженерной конструкции, в котором пористый волокнистый материал заполняется суспензией клеток.
Патент ЕР 2075015 В1 раскрывает способ получения мышечной тканеинженерной конструкции путем заселения пористого биоматериала суспензией гладкомышечных клеток.
Патент US 5716404 А раскрывает тканеинженерную конструкцию для реконструкции молочной железы, в которой клетки (мезенхимальные стволовые клетки, миоциты, хондроциты, адипоциты, миофибробласты) соединяются с полимерным матриксом.
Патент US 5861313 А раскрывает тканеинженерную конструкцию, в которой выделенные эпителиальные и мезенхимальные клетки желчного протока млекопитающих используются для заселения трехмерного матрикса.
Патент СА 2351396 раскрывает тканеинженерную конструкцию для реконструкции кожи, в которой выделенные кератиноциты и фибробласты дермы производят биосовместимый материал в качестве компонента конструкции.
Общим недостатком всех вышеуказанных способов является наличие стадии культивирования клеток in vitro. Культивация in vitro некоторых специализированных клеток, в частности эпителиоцитов желчного протока, может приводить к потере их функций и ограничивать последующую экспансию клеток в составе тканеинженерной конструкции (Culture of Epithelial Cells, Second Edition. Edited by R. Ian Freshney and Mary G. Freshney. P.8).
Чтобы избежать стадии выделения клеток, в альтернативных способах получения тканеинженерных конструкций биосовместимый материал имплантируется в ткани организма in vivo.
Патент US 6309635 В1 раскрывает способ получения тканеинженерной конструкции внутри организма с целью улучшения условий прорастания сосудов и соединительной ткани путем имплантации биосовместимого материала в организм млекопитающего. Конструкция представляет собой гибридный органоид, состоящий из паренхиматозных клеток, взятых из одной ткани, и сосудистых, а также внеклеточных элементов, взятых из другой ткани того же организма, на полимерной матрице. Недостатком метода является необходимость проведения дополнительных операций по имплантации биосовместимого материала в организм и по его дальнейшему извлечению с целью повторной имплантации в область предполагаемого использования конструкции. Данная особенность значительно ограничит клиническое применение тканеинженерных конструкций, полученных описанным способом, т.к. увеличит травматизацию больных, сроки лечения и дальнейшего восстановления, а также риски послеоперационных осложнений.
Проблемой, решаемой изобретением, является способ создания тканеинженерной конструкции, в котором фрагмент нативной кожи соединяется с биосовместимым материалом вне организма.
Указанная проблема решается способом получения тканеинженерной конструкции, заключающимся в том, что фрагмент нативной кожи соединяют с биосовместимым материалом вне организма.
Технический результат состоит в улучшении функции клеток на материале каркаса за счет выхода клеток из ткани-источника клеток непосредственно на биосовместимый материал, увеличении популяции выделенных клеток и устранении риска повреждения клеток при их ферментативном снятии с культуральной поверхности, что позволяет сократить объем забираемой ткани-источника клеток, а также общие сроки создания тканеинженерной конструкции.
Способ осуществляют следующим образом, выполняя последовательные этапы.
1. Фрагмент нативной кожи, полученный при биопсии, резекции, удалении органа и аспирации, в стерильных условиях помещают в контейнер с транспортной средой, состоящей из специализированных питательных сред с добавлением высокой дозы антибиотиков для снижения рисков контаминации выделяемой культуры клеток. Транспортировку контейнера с фрагментом нативной ткани осуществляют в специальном медицинском термоконтейнере с хладоэлементами, исключающем значительные колебания температуры. Время транспортировки не должно превышать 24 часа с момента забора нативной ткани, т.к. более длительные сроки транспортировки приводят к снижению жизнеспособности клеток в забранной ткани.
2. Вне организма, в стерильных условиях, фрагмент нативной кожи помещают в полную питательную среду, состоящую, например, из полной питательной среды DMEM/F12 и 10% фетальной бычьей сыворотки, на дно чашки Петри эпителиальной стороной вверх. Дополнительным действием может быть обработка ферментами (коллагеназы, трипсин, диспазы и др.) нативной ткани для облегчения дальнейшей миграции клеток на поверхность биосовместимого материала.
2
2
3. Далее фрагмент кожи соединяют с поверхностью биосовместимого материала путем создания физического контакта, например, помещая сверху на дермальную сторону кожи каркас из биосовместимого материала в присутствии полной питательной среды. Соединение фрагмента ткани с поверхностью биосовместимого материала также может быть осуществлено не только на плоскости, но и в трехмерном пространстве в присутствии полной питательной среды. Соединенные фрагменты помещают в СО-инкубатор при 37°С, 5% СО и повышенной влажности.
4. Создание тканеинженерной конструкции вне организма может быть подтверждено с помощью проведения морфологического (гистологического) исследования или с помощью различных методов микроскопии. Предпочтительным методом является конфокальная микроскопия, которая может быть осуществлена без фиксации исследуемого образца тканеинженерной конструкции с оценкой жизнеспособности клеток, входящих в ее состав, что необходимо для оценки качества планируемой для имплантации тканеинженерной конструкции. Также конфокальная микроскопия позволяет определять особенности распределения клеток внутри трехмерных конструкций.
Приводим конкретный пример осуществления способа. Пример является иллюстративным и не ограничивает охват изобретения.
Пример 1
Настоящий пример иллюстрирует способ получения тканеинженерной конструкции на основе фрагмента нативной кожи.
Фрагмент кожи был забран после получения информированного согласия в условиях процедурного кабинета и помещен в контейнер с транспортной средой, состоящей из DMEM/F12 с 3% пенициллина-стрептомицина (Gibco). Вне организма, в стерильных условиях фрагмент поместили в полную питательную среду, состоящую из DMEM/F12 и фетальной бычьей сыворотки (Gibco), на дно чашки Петри эпителиальной стороной вниз. Фрагмент нативной кожи был соединен с мембраной из хитозана путем создания физического контакта - сверху на дермальный слой кожи был помещен каркас из биосовместимого материала в присутствии полной питательной среды.
На 7-е сутки дермальные фибробласты вышли из эпителия фрагмента кожи и заполнили мембрану из биосовместимого материала, что было определено с помощью световой микроскопии при фазовом контрасте. Таким образом, была получена тканеинженерная конструкция-заменитель для использования в качестве искусственной кожи на основе соединения нативной биологической ткани с биосовместимым материалом вне организма. Представлено на рис. 1, где 1 - тканеинженерная конструкция, состоящая из фрагмента нативной кожи - 2, соединенной с биосовместимым материалом хитозаном - 3.
Таким образом, в предлагаемом способе фрагмент нативной кожи соединяется с биосовместимым материалом вне организма.
Способ по изобретению позволяет создавать тканеинженерную конструкцию с включением любых типов клеток, для которых стадия культивирования in vitro является нежелательной, в том числе и дермальных фибробластов.