СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА AZOTOBACTER
METHOD OF MAKING BACTERIAL FERTILISER BASED ON AZOTOBACTER BACTERIA GENUS

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть реализовано в микробиологической промышленности для получения различных бактериальных удобрений.
Широко известно использование штаммов азотобактера при производстве удобрений для стимуляции роста и повышения хозяйственной продуктивности сельскохозяйственных растений, произрастающих на обедненных азотом почвах.
Микробная ассоциация обладает определенными морфологическими, биохимическими и физиологическими характеристиками, способна длительное время (в течение периода вегетации) функционировать в песчаной почве, обеспечивая нормальный рост и развитие таких сельскохозяйственных культур, как томат и огурец.
Микробная ассоциация в питательном растворе (далее суспензия) представляет собой бурую, достаточно прозрачную жидкость без опалесценции (рН 6,9-7,2), с едва заметным земляным запахом, без определенного вкуса. Суспензия способна хранится при комнатной температуре без видимых изменений более 1 месяца (затем на ее поверхности начинает нарастать бело-серая пленка, структура которой под микроскопом дает основание предполагать, что она образована ассоциацией аэробных бактерий, которые присутствовали в суспензии), в холодильнике около года. В состав микробной ассоциации входят представители следующих родов Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Arthrobacter, Cellnmonas, Clostridium, Azotobacter, Azomonas (Краткий определитель бактерий Берги, 1980) и цианобактерии порядков Chroococcales, Nostocales. Микробная ассоциация хорошо закрепляется в песчаной почве, способна к свободной азотофиксации, быстро размножается, разрастаясь в виде буро-зеленого налета.
Известен штамм Azotobacter chroococum, используемый для получения бактериального удобрения под огурцы (пат. РФ №2074157, кл. C05F 11/08 2002 г. - аналог), включающий штамм бактерий Azotobacter chroococum ВКПМ-6012.
Недостатком данного штамма является относительно низкая конкурентная способность по сравнению с другими микроорганизмами, которые могут его вытеснять, а также и низкая ростовая активность. За счет этого он не может обеспечить необходимым количеством азота в почвах им обедненных такую требовательную к азоту культуру, как огурец.
В качестве прототипа может быть рассмотрен способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter (пат. РФ №2286324, кл. C05F 11/08, 2005 г.), включающий приготовление бактериального удобрения путем предварительного культивирования бактерий на питательной среде.
Недостатком данного прототипа является то, что добавляют к синтетическим средам Берка и Эшби элементы натуральной питательной среды, а именно кормовые дрожжи и не в постоянной концентрации, что не позволяет со 100% гарантией тиражировать один и тот же результат культивирования бактерий.
Техническим результатом данного изобретения является приготовление устойчивой, хорошо тиражируемой бактериальной суспензии на исключительно синтетических средах.
Этот результат достигается тем, что в способе приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter, включающем культивирование бактерий на плотной среде Эшби, предварительно из жидких элективных культур выделяют свободные аэробные азотофиксаторы с последующим их культивированием в чистые культуры на плотной питательной среде, из чистых культур отбирают наиболее активно развивающиеся штаммы и переносят их в жидкую питательную среду, не содержащую азот, в полученную устойчивую бактериальную суспензию, стимулирующую рост сельскохозяйственных растений, добавляют микробиологический препарат на основе бактерий рода Псеводомонад и почвенный фильтрат, представляющий собой жидкость, полученную после фильтрации надосадочной части раствора черноземной почвы в воде, через бумажный фильтр и фильтр Беркефельда, все тщательно перемешивают, затем добавляют профильтрованную среду Эшби для азотобактера и олигонитрофилов с раствором микроэлементов по Федорову и осуществляют культивирование в ферментере при температуре 22-28°С и скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 10 суток - 4 раза в сутки по 2 часа.
Примеры приготовления бактериального удобрения
Пример 1
Способ заключается в получении устойчивой ассоциации почвенных микроорганизмов, обладающих ярко выраженной способностью к свободной азотофиксации и хорошо приживающихся в легких почвенных смесях, обедненных азотом.
Микробную ассоциацию, условно «Стим», получаем за счет создания в ферментере «Биореактор З» сообщества микроорганизмов, а именно суспензии, стимулирующей рост сельскохозяйственных растений.
Из почвенных образцов (черноземы Мичуринского района) в жидких элективных культурах выделили свободные аэробные азотофиксаторы и осуществили пересев их на твердую питательную среду, выделили их в чистую культуру. Затем в чистых культурах на плотной питательной среде их культивировали. Потом бактерии были идентифицированы (без выделения 16S РНК). Из чистых культур были отобраны наиболее активные развивающиеся штаммы, которые были перенесены в жидкую питательную среду (без азота) и через несколько пересевов получена устойчивая бактериальная суспензия, в состав которой входили представители родов Azotobacter и Azomonas, причем бактерии рода Azotobacter составили не менее 70% от общей численности микробов.
Полученная суспензия хорошо пересевается, стабильно растет при комнатной температуре без постоянного встряхивания.
Суспензия представляет собой бурую, достаточно прозрачную жидкость без опалесценции (рН 6,9-7,2) с едва заметным земляным запахом.
Затем в 2 литровую колбу вносим 100 мл полученной суспензии, 15 мл препарата на основе бактерий рода Псеводомонад - Байкал М-1 (ТУ 9291-001-507-10575-00) и 100 мл почвенного фильтрата (1 кг черноземной почвы залили 5 литрами теплой воды, тщательно перемешали, затем дважды профильтровали через двойной фильтр и отобрали нужное количество жидкости), все тщательно перемешали и довели объем жидкости до литра средой Эшби для азотобактера и олигонитрофилов с раствором микроэлементов по Федорову, затем осуществили культивирование в ферментере «Биореактор 3» при температуре 22-28°С, при скорости вращения мешалки 180 об/мин.
Вращение проводили периодически по 2 часа только в дневное время суток в течение 10 суток. Следует отметить, что в опытах с более длительным культивированием в ферментере микробного консорциума после слива культуры на лопастях мешалки образуется рыхлый, обильно циано-бактериальный налет.
Сразу же после культивирования «Стим» профильтровали через двойной бумажный фильтр, затем в фильтрате замачивали на 4 часа семена и проращивали во влажной камере в чашках Петри. В качестве биологических объектов были взяты семена огурца, томата, капусты, укропа. Через 7 дней после замачивания в воде и «Стим» были получены следующие результаты (таблица).
Пример 2
Аналогично примеру 1, но вместо препарата «Байкал М-1» добавляют препарат «Восток» (ТУ 92-91001654-51587-05).
Пример 3
Аналогично примеру 1, но полученную смесь культивируют в ферментере «Биореактор 3» при температуре 28°С.
В качестве биологических объектов были взяты семена огурца, томата, капусты, укропа. Через 7 дней после замачивания семян были получены следующие результаты (таблица).
Культуры
Среднее количество проросших семян, шт
По патенту №2286324
«Стим»
Огурец
11
19
Томат
12
18
Капуста
15
19
Укроп
10
19
Данные таблицы свидетельствуют о том, что семена разных видов растений положительно реагируют на воздействие «Стим».
Развитие проростков огурца под влиянием препарата проходит намного активнее. Интенсивность роста повышается.
Опыты по влиянию препарата на рост и развитие растений огурца на песке также подтвердили стимулирующее действие препарата (фиг.1-4). Без внесения в песок суспензии растения огурца развивались плохо, не цвели и не плодоносили (фиг.3). Двукратное внесение в почву суспензии дало возможность, требовательной к азоту культуре, активно расти и даже плодоносить (фиг.2).