ПИЩЕВАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ШТАММЫ LACTOCOCCUS И УМЕНЬШАЮЩАЯ СИПТОМЫ АЛЛЕРГИИ, В ЧАСТНОСТИ У МЛАДЕНЦЕВ И ДЕТЕЙ
EDIBLE COMPOSITION CONTAINING STRAINS LACTOCOCCUS AND REDUCING ALLERGY SYMPTOMS, PARTICULARLY IN INFANTS AND CHILDREN

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к микробиологии и пищевой промышленности. В частности, оно имеет отношение к применению пробиотиков, таких штаммов как Lactococcus, в производстве пищевых композиций для уменьшения аллергических симптомов у детей с пищевой аллергией при воздействии аллергенов.
Уровень техники
Аллергии входят в число наиболее распространенных проблем со здоровьем, влияющих на жизнь пациентов любого возраста. В настоящее время Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) считает аллергические заболевания эпидемией. Показано, что за последние десятилетия увеличилась распространенность аллергических заболеваний. Высокий показатель распространения и повышенную тяжесть аллергических проявлений связывают с современным образом жизни, особенно городским.
Аллергическая сенсибилизация в детстве, особенно в раннем детстве и, в частности, к пищевым аллергенам, имеет решающее значение и представляет наивысший интерес как начало развития "аллергического фенотипа" или "атопии", которая способствует последующей сенсибилизации к другим аллергенам. Следовательно, аллергические реакции в детстве могут быть первым шагом аллергического каскада, приводящего впоследствии к многочисленным аллергическим реакциям на протяжении жизни, процесс часто называется "атопический марш". Например, исследование группы людей показало, что у детей с устойчивой пищевой гиперчувствительностью в раннем возрасте резко увеличивается риск развития аллергических ринитов (аллергии на пыльцу, поллиноза) или астмы в более позднем детстве (Ostblöm et al 2008). У детей с умеренными формами пищевой гиперчувствительности также имеется риск развития респираторных аллергических реакций, но в меньшей степени по сравнению с детьми, демонстрирующими устойчивую пищевую гиперчувствительность. Поэтому ослабление тяжести пищевой гиперчувствительности может быть крайне важным для замедления "атопического марша".
В этом контексте умение справляться со случаями аллергии и предотвращение аллергических реакций в детстве и младенчестве имеют очень большое значение.
Иммунная система младенцев активно развивается в течение нескольких первых лет жизни. Воздействие на аллергические реакции, предотвращение, избегание, умение справляться с ними, уменьшение и модулирование аллергических реакций у таких юных пациентов может влиять на их аллергический статус (кратковременный, а также долгосрочный) позднее в жизни.
Предотвращение аллергических реакций может быть достигнуто на разных уровнях:
"Первичное предотвращение" - это результат предотвращения или уменьшения риска сенсибилизации пациентов к аллергенам, характеризующийся отсутствием или пониженными уровнями аллерген-специфичных антител IgE. Предотвращение или уменьшение сенсибилизации будет приводить к отсутствию или уменьшению аллергических симптомов после воздействия некоторых аллергенов. При помощи модулирования (изменения) пути, ведущего к сенсибилизации пациента в отношении одного аллергена или одной группы аллергенов (первичное предотвращение), также можно изменить последующий аллергический ответ.
"Вторичное предотвращение" - это результат модулирования симптомов аллергии, т.е. частоты или интенсивности аллергической реакции у пациента, уже сенсибилизированного к одному или нескольким аллергенам, в случае, когда пациент вновь подвергается воздействию указанного аллергена(-ов). Путем модулирования частоты или интенсивности аллергических симптомов (вторичное предотвращение) связанные с аллергенами неудобства сводятся к минимуму.
Принимая во внимание эти различные концепции предотвращения аллергии, можно предположить, что в силу свойственных им механизмов действия некоторые соединения могут действовать только на одном или сразу на двух этих специфических уровнях предотвращения. Некоторые, например, могут только уменьшать сенсибилизацию к специфическому аллергену (первичное предотвращение), тогда как другие соединения могут влиять только на вторичное предотвращение и уменьшать тяжесть аллергических реакций. Другие соединения могут оказаться способными влиять и на сенсибилизацию и на симптомы, таким образом эффективно способствуя и первичному и вторичному предотвращению. Кроме того, соединения, проявляющие благоприятное воздействие в виде уменьшения симптомов одной формы аллергии, могут оказывать действие или не оказывать действия на другую форму аллергии, вызванную другим аллергеном.
Пищевые аллергены входят в число первых аллергенов, с которыми встречаются младенцы в начале жизни; в основном, младенцы, не получающие полностью грудное вскармливание, сталкиваются с белками коровьего молока. Белки молока действительно входят в число наиболее частых причин наблюдаемой пищевой аллергии у младенцев, за ними следуют белки яиц и пшеницы. В большинстве случаев пищевые аллергии могут проявляться у младенцев и маленьких детей в виде кожных (сыпь, экзема и др.) и желудочно-кишечных симптомов (колики в животе; боль, в частности в животе; рвота). Может происходить дальнейшая сенсибилизация, и могут наблюдаться случаи аллергических реакций, когда младенец/маленький ребенок подвергается действию новых продуктов, таких как зерновые, овощи, фрукты, орехи или рыба.
Респираторные аллергены (так называемые "аллергены из воздуха") распространены повсеместно. Они могут быть сезонными (такими как пыльца) или постоянными (клещи домашней пыли, тараканы, перхоть домашних питомцев, плесени и грибки). Они вызывают симптомы респираторной аллергии, проявляющиеся в виде назальных (слизисто-водянистые выделения из носа, зуд, чиханье, заложенность) или глазных симптомов (слезящиеся глаза, зуд, покраснение) у детей и взрослых.
Традиционными молочнокислыми бактериями для закваски молока являются лактококки. Было показано, что отдельные штамм лактококков приносят пользу для здоровья, и поэтому по определению ВОЗ эти штаммы могут считаться пробиотиками. Например, описано противоаллергическое действие отдельного штамма Lactococcus: Makoto Enomoto et al описывает в GB 2077101 А (опубликованом 16 декабря 1981) противоаллергическую композицию, содержащую "лактобактерию", принадлежащую к роду Streptococcus, что является старым обозначением Lactococcus (т.е. Streptococcus lactis в настоящее время называется Lactococcus lactis).
Кроме того, описано действие различных пробиотических культур или смесей пробиотиков на аллергическую иммунную систему, например, ЕР 1858336 (WO 2006697949) описывает смесь пробиотиков, которые могут уменьшать риск появления аллергических реакций из-за альбумина и глобулинов пшеничной муки. JP 2006028050 описывает свойства композиций, подавляющих кожную аллергию, которые содержат пробиотические бактерии, такие как Lactobacillus и Streptococcus.
Тем не менее остается необходимость уменьшения аллергических реакций и симптомов аллергии, в частности, в популяции маленьких детей и младенцев. Это особенно важно, если учесть созревание кишечной и иммунной систем, происходящее у маленьких детей, и ввиду множества новых аллергенов, действию которых подвергаются маленькие дети, особенно в период отлучения от груди.
Проблема аллергических реакций пищевого происхождения в раннем возрасте еще больше усложняется специфическими пищевыми потребностями младенцев и маленьких детей. В число факторов, важных для обеспечения наиболее подходящего питания младенцев и маленьких детей, входят калорийность потребляемой пищи, плотность калорий, разнообразие желательных питательных веществ (нутриентов), содержание белка и качество белка. Также важным является наличие микронутриентов, таких как витамины и минералы, при этом их концентрация ограничивается специально рекомендованными пределами, соответствующими возрасту пациентов, которым предназначается питание. Фактически, матрицы пищевой доставки для маленьких детей и младенцев являются по большей части сложными, но они являются также менее разнообразными: например, младенцам, несмотря на то, что они являются потенциально аллергичными, обычно необходим определенный белковый баланс в матрице из белков молочного происхождения. Присутствие множества таких нутриентов может усилить действие пищевых аллергенов. В таких сложных матрицах слабые пищевые аллергены, неспособные инициировать аллергическое проявление в одиночку, потом при инициировании аллергической реакции могут становиться более сильными. Можно видеть, что действие подобных соединений, которые могут нейтрализовать аллергены или влиять на предотвращение аллергии, в таких комплексных питательных матрицах может быть уменьшено или аннулировано. Точнее говоря, нельзя предсказать, будут ли соединения, в целом признанные способными влиять на предотвращение аллергии, оставаться активными (и до какой степени) в сложных матрицах, таких как пищевая композиция для младенцев и маленьких детей.
Существует необходимость облегчения симптомов пищевых аллергий в популяциях младенцев и маленьких детей, в истории болезни которых имеются случаи аллергии, и/или они являются подверженными аллергии.
Необходимо обеспечить полноценную питательную композицию, которая не только обеспечивает целый ряд нутриентов, но также уменьшает тяжесть аллергических реакций.
Необходимо обеспечить питательную композицию, модулирующую аллергическую реакцию у юных пациентов, страдающих от аллергии (от легких форм до умеренных), так как у этих пациентов имеются особенные потребности, обусловленные неполноценной зрелостью их кишечной и иммунной систем.
Существует необходимость модулирования аллергических реакций у маленьких детей, которые не переносят фармацевтические молекулы, например, путем вмешательства в питание, например, включая модуляторы иммунной системы в режим регулярного питания.
Необходимо обеспечить питательную композицию, модулирующую аллергическую реакцию у маленьких детей в период отлучения от груди, когда кишечный тракт претерпевает существенное изменение, и когда вводятся новые твердые продукты питания, потенциально содержащие новые аллергенные белки, и поэтому пациент является особенно чувствительным к сенсибилизации пищевыми аллергенами.
Существует необходимость в обеспечении пищевой композиции, которая поможет лучше справиться с симптомами или уменьшить симптомы респираторной аллергии (т.е. аллергических реакций, связанных с передающимися по воздуху аллергенами) у детей и взрослых после воздействия сезонных (например, пыльцы) или постоянных аллергенов, находящихся в воздухе, (например, клещей домашней пыли, тараканов, перхоти домашних питомцев, плесени и грибков).
Существует необходимость в обеспечении полноценной пищевой композиции, которая сможет восстанавливать баланс иммунной системы у пациентов с аллергией и таким образом будет эффективной при модулировании различных симптомов аллергических реакций (кожной, пищевой, респираторной), в частности у слабых пациентов, пациентов с пониженным иммунитетом и пациентов старшего возраста.
Существует необходимость в облегчении симптомов аллергических реакций при помощи эффективной композиции, уменьшающей экспозицию к интактным аллергенам, даже в том случае, когда композиция не может непосредственно уменьшить сенсибилизацию к аллергенам.
Существует необходимость в композиции, которая оказывает положительное действие на вторичное предотвращение аллергии, притом, что она необязательно влияет на первичное предотвращение тех же самых аллергических реакций.
Наконец, необходима композиция, более всего подходящая для юных пациентов, которая путем уменьшения симптомов может помочь снизить "аллергический фенотип" и таким образом может снизить сенсибилизацию к новым аллергенам в последующей жизни. Существует необходимость ослабления "атопического марша".
Сущность изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение предоставляет полноценную питательную композицию для уменьшения симптомов аллергических реакций пищевого происхождения у пациентов с аллергией, вызванной пищевыми аллергенами или другими аллергенами, в частности у юных пациентов, грудных детей и новорожденных, в частности, эффективную во время отлучения ребенка от груди.
Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию, существенно способствующую вторичному предотвращению аллергических реакций, вызванных пищевыми аллергенами, притом, что они необязательно влияют на первичное предотвращение по отношению к тем же самым аллергенам.
В третьем аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию, содержащую пробиотики, в частности, принадлежащие к роду Lactococcus.
В другом аспекте композиция изобретения является эффективной при уменьшении аллергических симптомов к аллергенам из воздуха у детей и взрослых.
Изобретение может дополнительно обеспечить композицию, восстанавливающую иммунное равновесие у индивидуумов с аллергией, и таким образом являющуюся эффективной при разных типах аллергических реакций.
В частности, изобретение может быть полезно для уменьшения аллергических реакций позднее в жизни.
Краткое описание фигур
Фигура 1/Таблица 1: Профиль секреции цитокинов Th2-смещенными человеческими РВМС (мононуклеарными клетками периферической крови) после совместного культивирования с Lactococcus lactis NCC 2287 (SL131), клетки депонированы Nestec S.A. под номером CNCM 1-4154, Lactococcus lactis NCC 2180 (SL60) CNCM 1-4199 или Lactobacillus plantarum NCC 1107 (Lp8) CNCM 1-4227. Мононуклеарные клетки периферической крови человека смещали в сторону Th2-типа с помощью IL-4 и анти-CD40 антител в течение 3 дней, затем были добавлены бактериальные штаммы. На 5 день супернатанты собирали и количественно определяли цитокины с помощью метода ELISA.
Фигура 2/Таблица 2: Профиль мРНК Th2-смещенных человеческих РВМС после совместного культивирования с L. lactis NCC 2287 (SL131). Мононуклеарные клетки периферической крови человека смещали в сторону Th2-типа с помощью IL-4 и анти-CD40 антител в течение 3 дней, затем добавили L. lactis NCC 2287 (SL131). Через 10 час и 24 часа после этого клетки собрали и измерили уровни экспрессии мРНК с помощью qRT-PCR.
Фигура 3: Схематическое описание мышиной OVA-модели пищевой аллергии.
8
Фигура 4: Уменьшение симптомов пищевой аллергии у мышей, получивших 5×10 КОЕ/мл L. lactis NCC 2287 (SL131) или L. plantarum NCC 1107 (Lp8) или в течение периода сенсибилизации (первичное) или в течение последней недели до стимуляции аллергеном (вторичное). Представлены результаты двух независимых экспериментов.
Фигура 5: Средние уровни протеазы 1 в тучных клетках (мастоцитах) мышей (ММСР-1) в сыворотке крови через 4 часа после стимулирования.
Фигура 6/Таблица 3: Выработка цитокинов брыжеечными LN лимфоцитами и спленоцитами, повторно стимулированными ex vivo.
Фигура 7/Таблица 4: Уровни экспресиии генов в подвздошной кишке, изолированной через 4 часа после стимулирования.
7
Фигура 8: Выработка цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) индивидуумов с аллергией на пыльцу злаковых трав в среде или в присутствии экстракта аллергенной пыльцы злаковых трав (ALK-Abello wässrig 6 grass). После 2 дней культивирования добавили NCC 2287 (SL131) в концентрации 10 КОЕ/мл. Культивирование РВМС продолжали в течение дополнительных 3 дней, что давало общую продолжительность культивирования 5 дней.
7
Фигура 9: Выработка цитокинов клетками цельной крови, полученными от индивидуумов с аллергией на пыльцу злаковых трав или от индивидуумов без аллергии, в присутствии или без NCC 2287 (SL131) при 10 КОЕ/мл в культуре в течение 5 дней.
Раскрытие изобретения
Определения:
В этом описании следующие термины имеют следующие значения:
Термин "пациенты" означает млекопитающих, включая людей и животных, в частности обычных домашних животных, таких как кошки и собаки. Термин "пациент" включает младенцев, детей, подростков, взрослых, ослабленных субъектов, субъектов с пониженным иммунитетом и/или пожилых людей или животных в соответствующие периоды жизни.
"Полноценная пищевая композиция". Для цели этого документа полноценная пищевая композиция представляет собой композицию, содержащую значительное количество, как правило 20% или более, основных питательных нутриентов, рекомендованных для данного возраста. Такие основные нутриенты обычно предоставляются в таком количестве и пропорции, чтобы обеспечить 20% или более конкретных рекомендованных доз нутриентов для данного возраста, с учетом использования их в достаточном количестве для обеспечения рекомендованного потребления калорий для данного возраста. Полноценная пищевая композиция обычно содержит источник белка, источник липидов, источник углеводов в сбалансированной пропорции, соответствующей рекомендации для этого возраста. Кроме того, она обычно включает питательные микроэлементы (микронутриенты), такие как витамины и минералы, а также источник незаменимых аминокислот и источник незаменимых жирных кислот. Однако понятно, что полноценная пищевая композиция может не содержать все конкретные нутриенты или все рекомендованные количества для удовлетворения всех питательных потребностей младенцев или маленьких детей. Полноценная пищевая композиция исключает композиции, содержащие только Lactococcus или Lactococcus в преобладающем количественном соотношении.
"Симптомы аллергических реакций" обычно включают симптомы, вызванные аллергенами. Такие симптомы включают кожные симптомы (покраснение кожи, сыпь, зуд, дерматит, экзему), глазные (зуд и слезотечение), желудочно-кишечные (гиперемия, боль в животе, колики, рвота, диарея), респираторные (зуд в носу, закупорка носового канала, ринит, астма) и в тяжелых случаях системные (головокружение, спутанность сознания, анафилактическая реакция) проявления.
"Первичное предупреждение аллергических реакций" означает все меры, направленные на избежание или уменьшение аллергической (иммунологической) сенсибилизации, например, предотвращение появления или уменьшение специфических IgE антител.
"Вторичное предупреждение аллергических реакций" означает предотвращение или уменьшение развития аллергических заболеваний/аллергических симптомов у сенсибилизированного индивидуума.
"Период отлучения ребенка от груди" - это период, во время которого младенцы адаптируются с исключительно жидкого питания к твердой или полутвердой пище, и от почти единственного типа питания (в большинстве случаев материнским молоком или молочной смесью) к целому ряду пищевых продуктов.
"Сенсибилизация" означает стимулирование/развитие аллерген-специфических IgE-антител.
"Повышение иммунитета" можно охарактеризовать увеличением Th-1 цитокинов, главным образом IFNγ, которое требуется для защиты от воздействий вредных микробов, в частности у индивидуумов с подавленным иммунитетом, без сопутствующего увеличения ингибиторных цитокинов, таких как IL-10.
"Пробиотик" означает препараты микробных клеток или компонентов микробных клеток, оказывающие благоприятное воздействие на здоровье и самочувствие хозяина. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10). Определение пробиотика полностью принято и согласуется с определением ВОЗ. Пробиотик может содержать единственный штамм микроорганизма, смесь разных штаммов и/или смесь бактерий разных видов и родов. В случае использования смесей, форма единственного числа "пробиотик" может использоваться для обозначения пробиотической смеси или препарата. Для целей настоящего изобретения микроорганизмы рода Lactococcus считаются пробиотиками.
"Пребиотик" в большинстве случаев означает неусваиваемый пищевой ингредиент, благотворно влияющий на хозяина путем стимулирования селективного роста и/или активности микроорганизмов, присутствующих в кишечнике хозяина, и таким образом улучшающий здоровье хозяина.
Аллергические реакции, имеющие «воздушное происхождение» или "аллергены из воздуха" используются как синонимы респираторных аллергенов и респираторных аллергических реакций.
"Кожные аллергические реакции или кожные аллергии" - это аллергические реакции, симптомы которых проявляются на коже или наружных покровах, или действие которых затрагивает кожу или наружные покровы. Они могут включать красноту, сыпь или шелушение кожи.
Штамм Lactococcus lactis (L. lactis) NCC 2287 (Nestle Culture collection) представляет собой штамм L. lactis с другим названием SL131 и международным идентификационным индексом CNCM-I-4154 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes at Institute Pasteur, Paris, France). Штамм Lactococcus lactis (L. lactis) NCC 2180 (Nestle Culture collection) представляет собой штамм L. lactis с другим названием SL60 и международным идентификационным индексом CNCM-I-4199. Штамм Lactobacillus plantarum NCC 1107 (Nestle Culture Collection) представляет собой L. plantarum с другим названием Lp8 и международным идентификационным индексом CNCM 1-4227. Идентификация CNCM относится к Национальной коллекции культур микроорганизмов Института Пастера, 22 rue du docteur Roux, 75724 Paris, France.
Изобретатели доказали, что можно облегчить аллергическую реакцию и ее симптомы в том случае, когда сенсибилизированным молодым млекопитающим предоставляется полноценная пищевая композиция, содержащая L. lactis NCC 2287 (SL131). Это определяет положительное действие на вторичное предотвращение аллергических реакций.
Неожиданно этот эффект не сопровождался уменьшением сенсибилизации молодых млекопитающих к аллергенам (т.е. первичного предотвращения аллергических реакций не наблюдалось).
Действие композиции:
Изобретение имеет отношение к применению микроорганизмов родов Lactococcus, конкретнее, отдельного штамма Lactococcus lactis, и еще конкретнее штамма NCC 2287 (SL131), для производства полноценной питательной композиции, предназначенной для уменьшения симптомов у пациентов с аллергическими реакциями, вызванными пищевыми или присутствующими в воздухе или кожными аллергенами. Изобретатели доказали, что потребление Lactococcus, в общем, и L. lactis NCC 2287 (SL131), в частности, приводит к уменьшению симптомов пищевой аллергии в группе мышей, получавших пищевую композицию, содержащую указанный штамм Lactococcus. Это наблюдается, в том случае, когда аллергическая реакция (иммунизация) индуцируется после сенсибилизации. Эта модель воспроизводит пищевую аллергию у людей, когда люди (как правило, младенцы/маленькие дети) естественным путем сенсибилизируются к пищевым аллергенам и впоследствии вновь подвергаются воздействию указанных аллергенов. Следовательно, бактериальный штамм L. lactis NCC 2287 (SL131) демонстрирует защитное действие.
В одном варианте осуществления изобретения действие композиции является, конкретнее, действием на вторичное предотвращение аллергических реакций. Как видно из уменьшения подсчета клинических показателей аллергических реакций на мышиной модели, симптомы аллергических реакций действительно значительно уменьшаются. Как правило, могут включаться все симптомы или некоторые из обычно распознаваемых симптомов аллергических реакций.
В одном варианте осуществления изобретения симптомы включают диарею, раздражение кожи, воспаление желудочно-кишечного тракта, кожную сыпь, воспаление кожи, глазные или респираторные симптомы или их комбинации.
В одном варианте осуществления изобретения симптомы сопровождаются высвобождением биохимических медиаторов (посредников), таких как триптаза, химаза, гистамин, лейкотриены.
В одном варианте осуществления изобретения композиция, однако, не оказывает действия на сенсибилизацию пациентов к аллергенам. В самом деле первичное предотвращение, по-видимому, не достигается при помощи композиции, содержащей L. lactis NCC 2287 (SL131). Субъекты являются по-прежнему сенсибилизированными к пищевым аллергенам, но при повторном воздействии сенсибилизирующего аллергена развивается меньше симптомов аллергии. Без связи с какой-либо теорией предполагается, что действие, таким образом, не понижает естественную иммунную защитную реакцию (которая оказывает положительное действие на пациента), а просто уменьшает проявление симптомов аллергии.
В одном варианте осуществления изобретения композиция значительно влияет на иммунный ответ, инициированный в результате воздействия аллергенов из воздуха. В ответ на стимулирование Z. lactis NCC 2287 (SL131), мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и клетки цельной крови индивидуумов с аллергией на пыльцу злаковых трав секретировали повышенные количества цитокинов (IFNγ и IL-10), что говорит о восстановлении иммунного равновесия у индивидуумов с аллергией. Таким образом, композиция имеет дополнительное преимущество, являясь эффективной в отношении различных аллергических нарушений, вызванных широким набором аллергенов (пищевых, кожных и аллергенов из воздуха).
В одном варианте осуществления композиция изобретения содержит L. lactis NCC 2287 (SL131) и оказывает положительное действие на уменьшение симптомов аллергии, в частности у пациента, страдающего от пищевых, кожных аллергических реакций и аллергической реакции на аллергены из воздуха.
В одном варианте осуществления композиция уменьшает сенсибилизацию к другим аллергенам в последующей жизни. Полагают, что композиция способствует (или, по меньшей мере, не препятствует) естественным процессам созревания иммунитета и, следовательно, способна оказывать долгосрочное действие на снижение сенсибилизации к тем же самым аллергенам или к другим аллергенам (уменьшение сенсибилизации в последующей жизни). Предполагается, что композиция изобретения может оказать такое долгосрочное благоприятное действие благодаря снижению симптомов аллергии (вторичное предотвращение) и обеспечению возможности созревания природного иммунитета.
В одном варианте осуществления изобретения композиция ингибирует иммунные ответы на сигналы, запускающие аллергические ответы, у разных видов млекопитающих. Композиция может использоваться для уменьшения симптомов у таких видов, как кошки и собаки, у которых, как известно, развиваются аллергические реакции.
В одном варианте осуществления изобретения композиция ингибирует аллергические иммунные ответы и одновременно поднимает уровни иммунных ответов, необходимых для борьбы с вредными микробами. Таким образом композиция может быть эффективной для повышения иммунной функции у ослабленных, пожилых и госпитализированных субъектов.
Композиция изобретения и ее применение:
Композиция изобретения может быть полноценной питательной композицией, такой как детская смесь, или может предоставлять значительную часть полноценной диеты. Предпочтительно композиция представляет собой полноценную питательную композицию, удовлетворяющую все или почти все пищевые потребности намеченного (целевого) организма, в тех случаях, когда она является единственным источником питательных веществ. В другом варианте осуществления, таком как, детское питание, композиция предоставляет часть полноценной диеты, предпочтительно 50% или более или 20% или более (количественно и качественно). В одном варианте осуществления композиция содержит детские зерновые продукты. В одном варианте осуществления композиция может быть жидкой композицией для детей, содержащей зерновые продукты, или детским питанием. В одном варианте осуществления композиция содержит молочные продукты (порошкообразные или жидкие) для детей и взрослых. В одном варианте осуществления композиция представляет собой средство для ухода за домашними животными/питание для домашних питомцев (сухой или влажный корм, препараты для местного применения для домашних животных).
Используемый пробиотик представляет собой бактерии рода Lactococcus. Хотя изобретатели не могут исключить, что другие пробиотики могут оказывать подобное действие, отсутствуют экспериментальные данные, которые могут подтвердить, что другие роды или штаммы пробиотиков являются такими же эффективными, кроме В. longum, в частности В. longum NCC 2705, который описан теми же авторами в совместно рассматриваемой заявке.
В одном варианте осуществления изобретения пробиотик представляет собой штамм L. lactis NCC 2287 (SL131). В одном варианте осуществления изобретения штамм представляет собой L. lactis NCC 2180 (SL60).
4
11
5
8
6
7
3
5
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит от 10 до 10 КОЕ на грамм сухой композиции. В том случае, когда композиция представляет собой детскую смесь количество пробиотика в детской смеси может составлять от 10 до 10 КОЕ/г детской смеси. В одном варианте осуществления композиция содержит между 10 5×10 КОЕ/г, то есть в дозе необходимой для оказания физиологического действия. В одном варианте осуществления устанавливается, что пробиотики в низких дозах могут оказывать благотворное воздействие, в частности, когда композиция содержит пребиотики и белки в определенном ограниченном количестве. В таком варианте осуществления пробиотики присутствуют в композиции в количестве 10-10 КОЕ/г.
Пребиотики, являющиеся олигосахаридами и/или белками, могут присутствовать в композиции в количестве, не превышающем 4 г/100 кал или менее чем 2 г/100 ккал, или менее чем 1,8 г/100 ккал, или менее чем 1,5 г/100 ккал.
Пробиотики можно смешивать с сухой или влажной композицией изобретения. Для повышения стабильности или жизнеспособности пробиотиков в композиции могут применяться некоторые виды обработки или специальные процессы. Пробиотик можно использовать в сухой форме или во влажной форме. После смешивания пробиотика с композицией смесь может быть обработана до такой степени, которая незначительно влияет на жизнеспособность пробиотиков. В другом варианте осуществления пробиотики частично или полностью инактивируют до, во время или после смешивания. В одном варианте осуществления пробиотики приводятся в инактивированное состояние и/или приводятся в состояние, когда они не способны воспроизводиться, до применения композиции изобретения. Например, этого можно достичь при помощи термической обработки или других описанных способов обработки.
В одном варианте осуществления пробиотик является мертвым или неспособным воспроизводиться (нереплицируемым) или инактивированным, чтобы привести его в состояние неспособности к воспроизведению. Термин пробиотик также включает значение "части или фрагменты пробиотической бактерии".
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит Пребиотики. Известно, что Пребиотики включают углеводы, а конкретнее олигосахариды. Кроме того, известно, что они широко используются в качестве ингредиентов функционального питания. Они не поддаются гидролизу ферментами пищеварительного тракта человека, могут достичь толстого кишечника в неразложившемся виде и обеспечить углеводный материал, в частности, пригодный для роста бифидобактерий или других пробиотиков. Олигосахариды, например, могут быть получены из глюкозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, крахмала, ксилана, гемицеллюлозы, инулина или их смеси. Очищенные коммерчески доступные пребиотические продукты, такие как фрукто-олигосахариды, содержат более, чем 95% твердых веществ в форме олигосахаридов.
Предпочтительный вариант осуществления композиции представляет собой пищевую композицию, содержащую, по меньшей мере, один пребиотик.
Предпочтительный вариант осуществления пребиотика включает олигосахарид, полученный из глюкозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, крахмала, ксилана, гемицеллюлозы, инулина или их смеси. Более предпочтительно олигосахарид включает фруктоолигосахарид. Наиболее предпочтительно пребиотик содержит смесь фруктоолигосахарида и инулина. Предпочтительно эта смесь содержит PREBIO1 или смесь коммерчески доступных RAFTILOSE и RAFTILINE.
Предпочтительно, вариант осуществления пребиотического компонента композиции содержит примерно от 50% до 90% фруктоолигосахарида. Более предпочтительно он содержит примерно от 60% до 80% фруктоолигосахарида. Наиболее предпочтительно он содержит примерно 70% фруктоолигосахарида. Предпочтительно, вариант осуществления пребиотика содержит примерно от 10% до 50% инулина. Более предпочтительно он содержит примерно от 20% до 40% инулина. Наиболее предпочтительно он содержит около 30% инулина. В одном варианте осуществления пребиотический компонент может составлять примерно 0,1% - 10% композиции.
В одном варианте осуществления композиция изобретения дополнительно включает экстракт яблок, содержащий полифенолы. Экстракт яблок может помочь в снижении симптомов аллергических пищевых реакций у пациентов с аллергией, индуцированной пищевыми аллергенами. По существу, экстракт яблок действует синергетически с пробиотиком Lactococcus для модулирования, уменьшения или облегчения аллергических реакций у пациентов с пищевой аллергией. В одном варианте осуществления такая композиция используется для детского питания и/или детских зерновых продуктов, которые по своей природе представляют собой подходящий носитель для композиции. В дополнительном варианте осуществления детское питание или детские зерновые продукты содержат яблочный экстракт или продукт из яблок. В одном варианте осуществления изобретения яблочный экстракт является белковым экстрактом, коммерциализированным Val de Vire Bioactives (Conde sur Vire, Франция) под названием "Pomactiv HFV". В одном варианте осуществления яблочный экстракт является подобным или полученным из упомянутого Pomactiv HFV и оказывает подобное действие. В одном варианте осуществления применение яблочного экстракта, в частности вместе с L. Lactis, представляет особый интерес для детей, не являющихся младенцами, подростков, взрослых или животных, таких как кошки и собаки в соответствующем возрасте.
Предположительный механизм действия:
В течение последних десятилетий количество аллергических болезней постоянно увеличивалось, и в настоящее время ВОЗ считает эти болезни эпидемией. В общем смысле, считается, что аллергия является результатом дисбаланса между Th1 и Th2 ответами иммунной системы, что приводит к сильному смещению в сторону выработки Th2 медиаторов. Поэтому, без связи с теорией, предполагается, что аллергию можно уменьшить (смягчить), подавить или предотвратить, восстановив соответствующее равновесие между Th1 и Th2 «ветвями» иммунной системы. Это подразумевает необходимость уменьшения Th2-ответов или усиления, по меньшей мере, временно, Th1-ответов. Первый должен характеризоваться пониженной выработкой Th2-цитокинов, таких как IL-5, последний должен характеризоваться повышенной выработкой Th1-цитокинов, таких как IFNγ.
В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит гидролизованные или частично гидролизованные белки. Пищевая композиция на основе (частично) гидролизованных белков особенно подходит для иммунной системы и желудочно-кишечного тракта младенцев/маленьких детей, так как гидролизованные белки легче усваиваются и обладают пониженной аллергенностью по сравнению с интактными белками. Кроме того, без связи с теорией, можно предположить, что гидролизованные белки могут быть предпочтительным субстратом для пробиотиков и кишечных бактерий (в частности, бактерий, проявляющих протеолитическую активность) по сравнению с интактными белками, что приводит к улучшенному действию пробиотического штамма и, таким образом, синергизму (взаимному усилению действия) между гидролизованными белками и пробиотиками. Это дает наиболее подходящую композицию для иммунной системы и желудочно-кишечного тракта младенцев/маленьких детей с пищевой аллергией. В таком случае самую высокую значимость имеет комбинация L. lactts NCC 2287 (SL131) с гидролизованными белками.
В одном варианте осуществления гидролизованные белки являются гидролизованными белками сыворотки и/или казеина. В одном варианте осуществления гидролизованные белки получаются в результате действия трипсина и/или химотрипсина на белки (особенно, белки сыворотки). В одном варианте осуществления гидролизованные белки включают белки сои или/и яичные белки. В одном варианте осуществления гидролизованные белки получаются в результате действия протеаз, таких как Protamex и/или Flavourzyme (Novozyme, Дания), В одном варианте осуществления белки композиции, предпочтительно гидролизованные белки включают белки злаков или яичные белки. В. одном варианте осуществления гидролизованные белки получаются в результате действия алкалазы (Alcalase). Композиция изобретения может содержать смесь 2 или более указанных источников белка.
Целевая группа:
Композиция изобретения соответственно предназначается для разных категорий пациентов, включающих и относительно молодых пациентов, у которых развиваются симптомы к пищевым аллергенам, и молодых и взрослых пациентов с проявлениями аллергии к аллергенам из воздуха или контактным аллергенам. Другие виды млекопитающих (в частности, млекопитающие, не являющиеся человеком, или домашние животные, такие как кошки, собаки или лошади, но также могут включаться кролики, морские свинки, хомяки, мыши, поросята, львы, тигры или крысы), реагирующие на подобные аллергены, также могут получить пользу от применения композиции. Предпочтительно пациентами с пищевой аллергией являются достаточно юные пациенты, все еще проходящие через фазу созревания их иммунной системы и их желудочно-кишечного тракта. У таких пациентов действие композиции может быть более сильным или более быстрым. В одном варианте осуществления композиция представляет собой детскую смесь, детский зерновой продукт и/или детское питание. Предпочтительно композиция предназначается для детей в возрасте менее 6 лет, для детей от рождения до 3 лет или от рождения до отлучения ребенка от груди. В одном варианте осуществления композиция является детской смесью для начала питания или последующего питания. Предпочтительно пищевая композиция содержит подавляющее большинство необходимых нутриентов для кормления детей.
В одном варианте осуществления пищевая композиция представляет собой детскую зерновую композицию для младенцев/детей в возрасте от 1 до 4 лет. Конкретнее, композиция может предназначаться для и вводиться во время периода отлучения от груди и/или вплоть до 12 месяцев после этого. Период отлучения от груди является действительно важным относительно изобретения, так как младенцы подвергаются воздействию целого ряда пищевых продуктов в течение периода отлучения от груди, в то время, как еще претерпевают созревание и перестройку своей иммунной системы и желудочно-кишечного тракта. Поэтому в течение этого периода особо важное значение имеет эффективный контроль аллергического ответа.
В отношении применения композиции изобретения, дети, младенцы или новорожденные могут быть детьми с аллергией. Дети с аллергией - это дети, младенцы и новорожденные, испытавшие, по меньшей мере, один случай аллергической реакции (легкой, умеренной или тяжелой) к пищевому аллергену. В одном варианте осуществления изобретения у детей, младенцев или новорожденных проявлялись тяжелые аллергические реакции к пищевым аллергенам и/или наблюдался более чем один случай умеренной или тяжелой пищевой аллергии. Симптомы аллергических реакций могут включать разные известные симптомы, такие как воспаление или покраснение кожи, желудочно-кишечные симптомы или респираторные симптомы.
Пищевые аллергены, рассматриваемые настоящим изобретением, включают все типы аллергенов природного происхождения или обычно присутствующие в продуктах питания, в частности продуктах питания для детей (например, младенцев, новорожденных, детей младшего возраста). В другом варианте осуществления пищевые аллергены являются аллергенами, которые чаще всего обнаруживаются в продуктах питания для детей постарше, подростков и взрослых.
В одном варианте осуществления пищевая композиция является композицией для детей и взрослых, страдающих от респираторных аллергических реакций. Респираторные аллергены, рассматриваемые настоящим изобретением, включают все типы аллергенов из воздуха, которые могут быть сезонными (например, пыльца) или постоянными (например, клещи домашней пыли, тараканы, перхоть домашних питомцев, плесени и грибки). Понятно, что младенцы могут быть, в частности, чувствительными к аллергенам, находящимся в воздухе, при непосредственном воздействии или воздействии позже в жизни (при "обучении" иммунной системы).
В одном варианте осуществления пищевая композиция является композицией, предназначенной для других видов млекопитающих, не являющихся человеком. Такие животные могут включать кошек, собак или лошадей, а кроме того могут включать кроликов, морских свинок, хомяков, мышей, поросят, львов, тигров или крыс, тех животных, у которых могут развиваться различные проявления аллергических симптомов.
В одном варианте осуществления пищевая композиция является композицией, обеспечивающей повышение иммунитета у ослабленных, госпитализированных и пожилых взрослых людей с подавленным иммунным статусом.
В одном варианте осуществления композиция изобретения представляет собой пищевую композицию для взрослых, пожилых или ослабленных пациентов. Предпочтительно, в одном примере, композиция представляет собой пищевую композицию с полным набором аминокислот, углеводов, жиров и микронутриентов (таких как витамины), такую, чтобы достаточно удовлетворять потребности в качестве питания и калориях ослабленных пациентов. В одном варианте осуществления композиция представляет собой энтеральную композицию, предназначенную для парентерального питания пациентов, не усваивающих твердую пищу.
Экспериментальные результаты, раздел 1:
Пробиотики, преимущественно принадлежащие к родам Lactobacillus и Bifidobacterium, были исследованы в серии тестов на клетках человека и животных в отношении их способности препятствовать аллергической сенсибилизации или развитию аллергических симптомов у сенсибилизированных индивидуумов. Мы решали вопрос, имеют ли бактерии родов Lactococcus потенциал для уменьшения развития аллергической сенсибилизации или ее симптомов. Конкретно, мы исследовали свойства и влияние Lactococcus lactis NCC 2287 (SL131) и Lactococcus lactis NCC 2180 (SL60).
На первоначальном этапе мы разработали и использовали систему in vitro на основе лимфоцитов человеческой крови для определения профиля цитокинов, индуцированных Lactococcus. Мы предположили, что наблюдаемые профили могут иметь прогностическое значение в отношении выработки цитокинов, индуцированных теми же самыми штаммами in vivo, и таким образом в отношении биологических эффектов, которые оказывают указанные штаммы.
Клетки индивидуумов с аллергией или индивидуумов со склонностью к развитию аллергии отличаются способностью вырабатывать Th2-цитокины. Чтобы частично воспроизвести этот статус in vitro, мы разработали модель клеточной культуры Th2-смещенных мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) в качестве альтернативы использованию РВМС от доноров с аллергией. Th2-смещение индуцировали, культивируя РВМС с интерлейкином (IL)-4 + анти-СD40 антителами, как подробно описано в разделе Методы. Цитокины IFNγ, IL-10 и IL-5 определяли с помощью метода ELISA в супернатанте клеток, стимулированных Lactococcus.
Фигура 1/Таблица 1 показывает, что L. lactis NCC 2287 (SL131) индуцирует сильную секрецию IFNγ и IL-10, сопровождающуюся ингибированием секреции IL-5. Подобным образом, L. lactis NCC 2180 (SL60) индуцировал выработку IFNγ и IL-10 и подавлял секрецию IL-5. Для сравнения другой вероятный пробиотический штамм, а именно Lactobacillus plantarum NCC1107 (Lp8), индуцировал только низкие уровни IFNγ и IL-10, но был хорошим ингибитором выработки IL-5.
Фигура 2/Таблица 2 представляет подтверждение этих результатов в отношении L. lactis NCC 2287 (SL131) на уровне мРНК. Уровни экспрессии различных генов были проанализированы через 10 и 24 часа после начала совместного культивирования Th2-смещенных человеческих РВМС с L. lactis NCC 2287 (SL131), LPS или без стимулирования.
Культивирование Th2-смещенных РВМС с L. lactis NCC 2287 (SL131) приводило к сильной индукции мРНК IFNγ и IL-10 (Фигура 2). Максимум экспрессии мРНК был достигнут через 10 часов совместного культивирования с L. lactis NCC 2287 (SL131). Потом с помощью L. lactis NCC 2287 (SL131) был индуцирован профиль экспрессии мРНК Tbet, основного регулятора фактора транскрипции ТЫ-цитокинов. С помощью LPS-стимулирования был индуцирован умеренно низкий уровень мРНК, в то время как уровни транскрипции в нестимулированных культурах (только среда) только немного колебались. После стимулирования L. lactis NCC 2287 (SL131) транскрипция мРНК IL-5 увеличивалась в течение короткого периода после начала культивирования, до того как была сильно подавлена и опускалась ниже уровней необработанных Th2-клеток (среда). Подобный профиль экспрессии мРНК отмечался для GATA-3, основного регулятора фактора транскрипции Th2-цитокинов. В общей сложности эти данные подтверждают результаты, полученные на уровне белка (Фиг.1/Таблица 1).
Действие L. lactis NCC 2287 (SL131) in vivo было проверено на мышиной модели пищевой аллергии (мышиная OVA-модель пищевой аллергии, показанная на Фиг.3).
В течение 7 недель с недельными интервалами мышей BALB/c сенсибилизировали овальбумином (OVA) + холерный токсин пероральным способом. На этой модели пероральное стимулирование большой дозой OVA в конце периода сенсибилизации приводит к клиническим симптомам, таким как диарея, почесывание, взъерошенный мех, цианоз и потеря подвижности.
8
L. lactis NCC 2287 (SL131) (5×10 КОЕ/мл; неограниченно) давали мышам с питьевой водой во время фазы сенсибилизации с 1 по 43 или 50 дни (первичное предотвращение) или в течение последней недели экспериментов (дни 43-50; вторичное предотвращение).
Фигура 4 показывает клинические симптомы, наблюдаемые в двух отдельных экспериментах.
После иммунизации мышей, обработанных L. lactis NCC 2287 (SL131) в течение последней недели эксперимента (вторичное предотвращение), развивались менее тяжелые клинические симптомы, чем у сенсибилизированных, необработанных животных (положительный контроль). Потребление мышами L. lactis NCC 2287 (SL131) в течение фазы сенсибилизации эксперимента (первичное предотвращение) не привело к уменьшению симптомов. В эксперименте 1 параллельно с L. lactis NCC 2287 (SL131) был проверен L. plantarum NCC 1107 (Lp8). Этот штамм не уменьшал аллергические симптомы ни при первичном, ни при вторичном предотвращении, что находилось в соответствии с нашим предположением in vitro.
Как показано на Фигуре 5, в дополнение к клиническому счету определяли уровни в сыворотке мышей протеазы 1 мастоцитов (ММСР-1) в качестве меры активации кишечных мастоцитов при стимулировании аллергеном. Потребление L. lactis NCC 2287 (SL131) во «вторичном предотвращении» понижало уровни ММСР-1 в сыворотке по сравнению с необработанными контрольными животными (Фигура 5). Обработка L. lactis NCC 2287 (SL131) в «первичном предотвращении» не влияла на уровни ММСР-1 в сыворотке.
Фигура 6/Таблица 3 показывает выработку цитокинов повторно стимулированными ex vivo лейкоцитами. Для этого лимфоциты из мезенхимальных лимфатических узлов (MLN) собирали после стимулирования, повторно стимулировали 1 мг/мл OVA и культивировали в течение 72 часов. Уровни IL-1, IL-2, IL-4, КС, TNFα, IFN-γ, IL-5 и IL-10 измеряли с помощью многоканального теста (Mesoscale). Лимфоциты MLN мышей, обработанных L. lactis NCC 2287 (SL131), вырабатывали меньше IL-4, TNFγ, IFNγ и IL-10 по сравнению с положительным контролем (Таблица 3). Подобным образом спленоциты секретировали пониженные уровни IL-2, IL-4, TNFγ, IFN-γ, IL-5 и IL-10.
В кишечнике уровни экспрессии различных генов, связанных с аллергией, определяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR - смотри метод ниже). Определение экспрессии генов проводили на тканях из подвздошной кишки для группы «положительный контроль», группы «отрицательный контроль» и для группы, получавшей L. lactis NCC 2287 (SL131) в течение последней недели до стимулирования (вторичное предотвращение). Фигура 7/Таблица 4 иллюстрирует полученные результаты: Группа, получившая L. lactis NCC 2287 (SL131), продемонстрировала пониженную экспрессию различных генов, включая цитокины, интерлейкин (IL)-13, IL-10, интерферон (IFN)-γ и хемокин CCL11 (эотаксин) в подвздошных пейеровых бляшках и цитокины IL-13, IL-10, IL-12, IFN-γ, хемокины CCL11 (эотаксин) и CCL17 (ТАКС) в подвздошной кишке. Наблюдалось заметное увеличение рецептора хемокинов CCR3. Гены с пониженной экспрессией распознавали с помощью маркеров для Т-хелперов 2 фенотипа (IL-13, CCL11, CCL17), которые, как известно, управляют развитием аллергических реакций. Следовательно, эксперименты демонстрируют понижение (модулирование с понижением) иммунных ответов путем уменьшения экспрессии релевантных генов, в том случае, когда сенсибилизированные животные получают L. lactis NCC 2287 (SL131) (вторичное предотвращение). Полагают, что это должно способствовать противоаллергическому действию проверенных штаммов Lactococcus и уменьшению аллергических симптомов (вторичное предотвращение).
Экспериментальные результаты, раздел 2:
Ранее было проверено благотворное действие разных пробиотических штаммов на различные аллергические нарушения. Бактериальный штамм, проявивший пробиотическое действие в отношении кожной или пищевой аллергии, может быть или не быть эффективным при уменьшении аллергических симптомов, вызванных аллергенами из воздуха (см. в частности, J. Nutr. 2010 Mar; 140(3):713S-21S. e-pub 2010 Feb 3). Настоящие эксперименты рассматривали вопрос, есть ли у штамма L. lactis NCC 2287 (SL131) потенциал для оказания пробиотического действия на ответы, вызванные респираторными аллергенами, в дополнение к их полезному действию в отношении пищевых аллергических реакций. Действие NCC 2287 (SL131) на респираторные аллергические реакции оценивали у людей методом анализа ex vivo, используя или РВМС или клетки цельной крови от индивидуумов с аллергией на пыльцу злаковых трав.
Фигура 8 показывает действие NCC 2287 (SL131) на РВМС, полученные от индивидуумов с аллергией на пыльцу злаковых трав. L. lactis NCC 2287 (SL131) вызывает сильную выработку IFNγ и IL-10 в аллергических РВМС, что хорошо коррелирует с результатами, наблюдаемыми ранее в исследовании со смещенными Th-2. Было показано, что после повторного стимулирования смесью аллергенов злаковых трав ex vivo, L. lactis NCC 2287 (SL131) оказывает сходное благоприятное влияние, увеличивая уровни IFNγ и IL-10 и одновременно подавляя уровни IL-5.
На Фигуре 9, влияние L. lactis NCC 2287 (SL131) на индивидуумов с аллергией на пыльцу злаковых трав и без аллергии сравнили с помощью исследования на цельной крови человека. Фигура 9 показывает, что L. lactis NCC 2287 (SL131) увеличивает выработку IFNγ и у индивидуумов с аллергией и у индивидуумов без аллергии, но увеличивает уровни IL-10 только у индивидуумов с аллергией на пыльцу злаковых трав. Эти результаты означают, что L. lactis NCC 2287 (SL131) оказывает благоприятное действие против респираторных аллергенов в дополнение к действию в отношении пищевых аллергенов. Кроме того, поскольку IL10 не увеличивается у субъектов без аллергии, в то время как IFNγ увеличивается, NCC 2287 также может активизировать иммунную систему у менее иммунокомпетентных субъектов.
Заключение: Данные показывают, что потребление L. lactis NCC 2287 (SL131) сенсибилизированными животными приводит к уменьшению аллергических симптомов после воздействия сенсибилизирующего аллергена. Это действие было специфическим, потому что потребление L. plantarum NCC 1107 (Lp8) не оказывало защитного действия. Уменьшение симптомов сопровождалось понижением уровней ММСР-1 в сыворотке и пониженной секрецией цитокинов клетками мезенхимальных (брыжеечных) лимфатических узлов и спленоцитами, а также пониженной экспрессией ключевых генов, имеющих отношение к аллергии, в кишечнике, говоря о том, что изменение (модулирование) компонентов иммунной системы, таких как тучные клетки (мастоциты) и Th2-клетки, способствует защитному действию. От штамма SL60 ожидается подобный эффект.
Второй набор данных, оценивающих действие L. lactis NCC 2287 (SL131) на иммунные ответы, инициированные аллергенами из воздуха, показывает, что штамм может проявлять подобное пробиотическое действие по отношению к респираторным аллергическим реакциям путем увеличения выработки цитокинов IFNγ и IL-10, а также подавления вредных иммунных ответов (уменьшение выработки IL-5) у индивидуумов с аллергией.
Методы исследования
Реактивы и бактериальная биомасса:
Бактериальные биомассу получали путем культивирования каждого штамма в жидких культурах при стандартных условиях. Кинетику роста определяли для каждого штамма, и в соответствии с этим биомассу собирали через 3 часа после достижения стационарной фазы. В это время культуры промывали 2х в охлажденном PBS и замораживали в PBS с 20% глицерина при -80°С в аликвотах по 50 мкл. LPS (от Е. coli) покупали от компании Sigma (Buchs, Швейцария).
Выделение и культивирование Th2-смещенных РВМС человека:
6
7
6
5
Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяли с помощью фильтров, полученных из центра переливания крови "Centre de Transfusion of the CHUV". Пойманные фильтрами клетки смывали противотоком в приемники для сбора крови, содержащие 90 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) (Sigma). Клетки разводили раствором Хенкса 1:2, и выделяли РВМС при помощи центрифугирования в градиенте плотности на приборе Histopaque (Sigma). Клетки в интерфазе (или на границе раздела сред) собирали и два раза промывали HBSS. Затем РВМС ресуспендировали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, (cIMDM) (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки FBS (Bioconcept, Париж, Франция), 1% L-глутамина (Sigma) 1% пенициллина/стрептомицина (Sigma) и 0,1% гентамицина (Sigma). Клетки культивировали в 48-луночных планшетах (Milian, Мейран, Швейцария) при 1,5×10 клеток/мл в присутствии 50 нг/мл IL-4 (Bioconcept) и 1 мкг/мл анти-CD40 антител (R&D Systems, Абингтон, Англия) в среде cIMDM для того, чтобы индуцировать Th2-цитокиновый фенотип. LPS использовали в концентрации 1 мкг/мл. Через 3 дня культивирования добавили L. lactis NCC 2287 в количестве 10, 10 и 10 КОЕ/мл. После добавления ингредиентов культивирование РВМС продолжали в течение дополнительных 48 часов, что давало в результате общую продолжительность культивирования 5 дней.
Выделение и культивирование РВМС, полученных от людей-доноров с аллергией на злаковые травы:
6
7
У взрослых мужчин и женщин (от 18 до 40-летнего возраста) с подтвержденной аллергией (аллергический риноконъюнктивит или астма) на пыльцу злаковых трав собирали гепаринизированную венозную кровь (50 мл) в начале сезона пыления через 24-48 часов после появления первых симптомов. РВМС выделяли, как описано выше. Клетки ресуспендировали в среде RPMI (Sigma) с добавлением 8% человеческого сывороточного АВ (Blutspendedienst SRK, Берн, Швейцария) 1% L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% неосновных аминокислот (Invitrogen, Lucerne, Швейцария), 1% пирувата натрия (Invitrogen) и 0,1% гентамицина (Sigma). Клетки культивировали в 96-луночных планшетах (Milian, Мейран, Швейцария) при 1×10клеток/мл в трех различных условиях: 1) в среде, 2) в присутствии экстракта злаковых трав с аллергеном пыльцы (ALK-Abello wässrig 6 grass, Volketswil, Швейцария) 3) в присутствии 50 нг/мл IL-4 и 1 мкг/мл анти-СD40. Через 2 дня культивирования добавили L. lactis NCC 2287 в концентрации 10 КОЕ/мл. Культивирование РВМС продолжали в течение дополнительных 3 дней, что давало в результате общую продолжительность культивирования 5 дней.
Культивирование цельной крови от людей-доноров с аллергией на злаковые травы и без аллергии.
7
У взрослых мужчин и женщин (от 18 до 50-летнего возраста) или с подтвержденной аллергией (аллергический риноконъюнктивит или астма) на пыльцу злаковых трав (история болезни и положительная скарификационная проба) или без аллергии (отсутствие истории болезни и отрицательная скарификационная проба) собирали гепаринизированную венозную кровь (10 мл) в начале сезона и на пике сезона пыления. Клетки цельной крови (100 мкл/лунку) ресуспендировали в среде RPMI (400 мкл/лунку) (Sigma) с добавлением 1% L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% неосновных аминокислот (Invitrogen, Lucerne, Швейцария) и 0,1% гентамицин (Sigma). Клетки культивировали в 48-луночных планшетах (Milian, Мейран, Швейцария) с или без L. lactis NCC 2287 при 10 КОЕ/мл в течение 5 дней.
Иммуноферментный анализ (ELISA) цитокинов:
Человеческий IFN-γ, человеческий IL-5, человеческий IL-10, мышиный IFN-γ, мышиный IL-13 и мышиный IL-10 определяли с помощью наборов DuoSet от компании R&D systems в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, измерили человеческий IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-8, TNF-α, IL-12, IL-13 с использованием набора 10-plex multiplex для определения человеческих Th1/Th2 (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, США) в соответствии с инструкциями производителя.
Оценка результатов ELISA:
Значения OD были преобразованы в пг/мл с помощью стандартных кривых. Чтобы отрегулировать большое варьирование от донора к донору, как правило наблюдаемое в случае РВМС от разных людей-доноров, данные стандартизировали в соответствии с произвольно выбранным внутренним стандартом. Значение IFN-γ (пг/мл), полученное для каждого донора путем стимулирования LPS, было взято за 100%. Для стандартизации значений IL-10, количество IL-10, индуцированного штаммом В. lactis NCC 2818 (депонирован Nestec SA под номером CNCM-I3446), было принято за 100%. Наконец, количество IL-5, индуцированного IL-4 и анти-СDS40 антителами в одной среде (т.е. при отсутствии пробиотиков) было взято за 100%.
Количественная оценка уровней экспрессии генов с помощью ПЦР в режиме реального времени:
6
2
РВМС (1,5×10 клеток/мл) культивировали в среде cIMDM с или без IL-4 (50 нг/мл) и анти-СD40 (1 мкг/мл) в течение трех дней. После этого к РВМС добавили ингредиенты, и собирали клетки через 10 часов и 24 часа. Общую РНК выделяли из стимулированных РВМС с помощью набора SV для выделения общей РНК (Promega, Wallisellen, Швейцария), включая обработку ДНКазой в соответствии с инструкциями производителя. Общую РНК определяли с помощью набора Ribogreen для количественного определения РНК (Molecular Probes, Basel, Швейцария). Реакцию обратной транскрипции проводили на 1 мкг общей РНК, используя набор Multiscribe Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США). Общую РНК смешивали с 50 мкМ произвольно выбранных гексамеров, 0,5 мМ dNTP (дезоксинуклеотидтрифосфаты), 20 U ингибитора РНКазы (Applied Biosystems), 62,5 U обратной транскриптазы Multiscribe, буфер IX RT и 5,5 мМ MgCl в окончательном объеме 100 мкл. Человеческий IFNγ, IL-10, IL-5, Tbet, GATA3, FoxP3 (Applied Biosystems) количественно определяли с помощью ПЦР в режиме реального времени (Applied Biosystems, ABI PRISM 7900HT), используя набор для определения генной экспрессии Taqman. Количественное определение было нормализовано со средним от 3 конститутивных генов: β-актин, GAPDH и HPRT (Applied Biosystems).
-ΔCt
На основе полученных значений порогового цикла (Ct) определяли относительную и нормализованную экспрессию мРНК для каждого гена, используя ΔCt. Значение Ct для каждого гена было скорректировано с помощью среднего значения Ct трех конститутивных генов. Результаты вычисляли как относительную экспрессию, используя формулу 2×К.
Модель пищевой аллергии, индуцированной OVA, на мышах:
8
Обыкновенных взрослых мышей BALB/c шестинедельного возраста сенсибилизировали пероральным путем (с помощью иглы для принудительного питания) 20 мг овальбумина (OVA) от компании Fluka (Buchs, Швейцария) + 10 мкг/мышь холерного токсина (использованного в качестве адьюванта) от компании LuBioscience (Lucerne, Швейцария) в течение 7 недель с недельными интервалами. Через неделю после сенсибилизации проводили стимулирование 100 мг OVA (перорально). В разные фазы эксперимента осуществляли вмешательство в питание путем введения L. lactis NCC 2287 (SL131) (5×10 КОЕ/мл в питьевой воде), в качестве первичного предотвращения во время периода сенсибилизации или в качестве вторичного предотвращения, начиная с конца фазы сенсибилизации (Фиг.3). Через пятнадцать минут после стимулировании за мышами наблюдали в течение 30 минут в индивидуальном режиме. Регистрировали и количественно оценивали клинические симптомы как указано далее (оценка аллергии в баллах - счет аллергии): 0: отсутствие симптомов, меньше чем 4 случая почесывания; 1: 4-10 случаев почесывания около носа и головы, отсутствие диареи; 2: более 10 случаев почесывания или взъерошенная шерсть и неподвижность или мягкий стул; 3: диарея или затрудненное дыхание или цианоз; 4: диарея в комбинации с неподвижностью после толчка, взъерошенная шерсть, затрудненное дыхание или цианоз; 5: анафилаксия. Через 4 часа после стимулирования мышей забивали (смещением шейных позвонков), отбирали кровь и последний сантиметр подвздошной кишки плюс одну пейерову бляшку, расположенную в том же районе, и замораживали в жидком азоте.
Сывороточная ММСР-1:
Количество протеазы 1 мастоцитов мышей (ММСР-1) в сыворотке определяли с помощью набора для ELISA от компании Moredun Scientific (Мидлотиан, Шотландия) согласно инструкциям производителя. Концентрацию ММСР-1 получали путем преобразования значений OD в пг/мл с использованием многочленной стандартной кривой.
Выделение и культивирование лимфоцитов из брыжеечных лимфатических узлов (MLN):
6
MLN гомогенизировали с помощью шприца с ситом (BD Falcon, Milian, Мейран, Швейцария). Клетки центрифугировали и промывали два раза в RPMI (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки FBS (Bioconcept, Paris, France), 1% L-глутамина (Sigma), 1% пенициллина/стрептомицина (Sigma), 0,1% гентамицина (Sigma), 0,1% р-меркаптоэтанола (Sigma). Клетки культивировали в 96-луночпых плоскодонных планшетах (Coming, Milian) в отсутствие или присутствии OVA в концентрации 1000 мкг/мл с 3×10 клеток/мл. Через 72 часа культуральные планшеты замораживали.
Определение цитокинов в супернатанте клеток брыжеечных лимфатических узлов и культивирование спленоцитов:
Мышиные IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-8, TNF-α, IL-12 измеряли с использованием набора мышиных Th1/Th2 9-plex multiplex (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, США) согласно инструкциям производителя.
Анализ экспрессии генов в кишечнике с помощью метода низкой плотности:
Выделение и количественное определение РНК:
Суммарные рибонуклеиновые кислоты (РНК) из подвздошной кишки и пейеровых бляшек извлекали согласно протоколу производителя, используя набор SV для выделения общей РНК, купленный у компании Promega (Dübendorf, Швейцария).
Количественное определение РНК проводили с помощью набора quant-IT Ribogreen Reagent, предоставленного компанией Promega (Dübendorf, Швейцария), согласно протоколу производителя.
Обратная транскрипция:
2
Реакцию обратной транскрипции проводили на 1 мкг общей РНК, используя набор Multiscribe Reverse Transcriptase от компании Applied Biosystems (Foster City USA). Общую РНК смешивали с 50 мкМ случайно выбранных гексамеров, 0,5 мМ dNTP, 20 U ингибитора РНКазы (Applied Biosystems), 62,5 U обратной транскриптазы Multiscribe, IX RT буфер и 5,5 мМ MgCl в окончательном объеме 50 мкл. Реакцию обратной транскрипции проводили на термоциклере Т3 (Biometra, Gottingen, Германия) с использованием следующей программы цикла: 10 мин при 25°С, 30 мин при 48°С, 5 мин при 95°С до окончания при 4°С.
Low Density Array (LDA):
Наборы и карты для определения экспрессии генов Low Density Arrays были разработаны онлайн на вебсайте Applied Biosytems (http://www3.appliedbiosystems.com/index.htm). Загрузку, пробег и анализ проводили в соответствии с протоколом производителя на количественном анализаторе ABI-Prism 7900НТ.
-ΔCt×K
6
Количественное определение было нормализовано относительного среднего значения 3 конститутивных генов: β-актина, GAPDH и HPRT. Исходя из полученных значений порогового цикла (Ct), была определена относительная и нормализованная экспрессия мРНК для каждого гена с помощью ΔCt. Значение Ct для каждого гена было откорректировано с помощью среднего значения Ct трех конститутивных генов. Результаты вычисляли как относительную экспрессию, используя формулу 2, К представляет собой 10 фактор. Кратно увеличенные результаты экспрессии были нормализованы относительно уровней экспрессии в группе Отрицательный контроль.
Пример 1:
Ниже приведен пример состава детской смеси для применения согласно настоящему изобретению. Эта композиция приведена только с целью иллюстрации. Источником белка является обыкновенная смесь белка сыворотки молока и казеина.
Нутриент
на 100 ккал
на литр
Энергия (ккал)
100
670
Белки (г)
1,83
12,3
Жиры (г)
5,3
35,7
Линолевая кислота (г)
0,79
5,3
α-Линоленовая кислота (мг)
101
675
Лактоза (г)
11,2
74,7
Пребиотик (100% GOS) (г)
0,64
4,3
Минералы (г)
0,37
2,5
Na (мг)
23
150
К (мг)
89
590
Сl (мг)
64
430
Са (мг)
62
410
Р (мг)
31
210
Mg (мг)
7
50
Mn (мг)
8
50
Se (мкг)
2
13
Витамин А (мкг RE)
105
700
Витамин D (мкг)
1,5
10
Витамин Е (мг ТЕ)
0,8
5,4
Витамин К1 (мкг)
8
54
Витамин С (мг)
10
67
Витамин В1 (мг)
0,07
0,47
Витамин В2 (мг)
0,15
1,0
Ниацин (мг)
1
6,7
Витамин В6 (мг)
0,075
0,50
Фолиевая кислота (мкг)
9
60
Пантотеновая кислота (мг)
0,45
3
Витамин В12 (мкг)
0,3
2
Биотин (мкг)
2,2
15
Холин (мг)
10
67
Fe (мг)
1,2
8
1 (мкг)
15
100
Cu (мг)
0,06
0,4
Zn (мг)
0,75
5
Lactococcus lactis NCC 2287 (SL131; см. экспериментальную часть)
2×10<sup>7</sup> КОЕ/г порошка
Пример 2:
Пример композиции изобретения: адаптированный молочный порошок для детей. Данная композиция является иллюстрацией изобретения.
Нутриент
На 100 ккал
На литр
Энергия (ккал)
100
670
Белки (г)
3,66
24,5
Жиры (г)
4,52
30,2
Линолевая кислота (г)
0,69
4,6
α-линоленовая кислота (мг)
73
490
Углеводы (г)
11,18
74,9
Пребиотик (100% GOS) (г)
0,64
4,3
Na (мг)
49
330
Са (мг)
183
1220
Витамин А (мкг RE)
77
520
Витамин D (мкг)
0,99
6,6
Витамин К1 (мкг)
4,7
32
Витамин С (мг)
9
60
Niacin (мг)
1,6
11
Фолиевая кислота (мкг)
39
260
Fe (мг)
1,5
10
Zn (мг)
1,2
7,9
Lactococcus lactis NCC 2287 (SL131; см. экспериментальную часть)
2×10<sup>8</sup> КОЕ/г порошка
Пример 3:
Пример композиции питьевого йогурта для детей и взрослых для применения согласно настоящему изобретению. Эта композиция является только иллюстрацией.
Нутриент
На 120 ккал
Энергия (ккал)
120
Белок (г)
7,8
Жиры (г)
3,4
Углеводы (г)
14,4
Са (мг)
502
Витамин С (мг)
17
Витамин D (IU)
85
Витамин К1 (мкг)
4,7
Цинк (мг)
2
Магний (мг)
29
Lactococcus lactis NCC 2287 (SL131; смотри экспериментальную часть).
2×10<sup>5</sup> КОЕ/г сухой массы (альтернативно: 5×10<sup>8</sup> КОЕ/г сухой массы
Пример 4:
Пример композиции корма для домашних животных (кошек или собак), предназначенного для взрослых домашних питомцев, с целью применения согласно настоящему изобретению. Эта композиция является только иллюстрацией и может включать комбинации нутриентов, как описано ниже.
Композиции включают полноценные продукты питания, направленные на удовлетворение необходимых пищевых потребностей животного, или биологически активные добавки к пище для введения животным.
В разных вариантах осуществления пищевые композиции, такие как пищевые композиции (корм) для домашних животных или композиции для лечения домашних животных, содержат примерно от 15% до 50% общего белка. Общий белок может включать растительные белки, такие как соевую муку, соевый белковый концентрат, кукурузную глютеновую муку, пшеничную клейковину, семя хлопчатника и арахисовую муку, или животные белки, такие как казеин, альбумин и белок мяса. Примеры подходящего белка мяса включают свинину, ягнятину, конину, мясо домашней птицы, рыбу и их смеси.
Пищевые композиции могут дополнительно содержать примерно от 5% до 40% жира. Примеры подходящих жиров включают животные жиры и растительные масла. Предпочтительно источник жира является источником животного жира, таким как сало. Также могут использоваться растительные масла, такие как кукурузное масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, масло рапсовых семян, соевое масло, масло оливы и другие масла, богатые мононенасыщенными и полиненасыщенными жирными кислотами.
Пищевые композиции могут дополнительно содержать примерно от 15% до 60% углеводов. Примеры подходящих углеводов включают хлебные злаки или зерновые культуры, такие как рис, кукуруза, сорго, люцерна, ячмень, соевые бобы, канола, овес, пшеница и их смеси. Кроме того, композиции могут необязательно содержать другие материалы, такие как сухую сыворотку и другие побочные продукты переработки молока.
Содержание влаги для таких пищевых композиций варьирует в зависимости от природы пищевой композиции. Пищевые композиции могут быть сухими композициями (например, гранулами), полувлажными композициями, влажными композициями или любыми их смесями. В предпочтительном варианте осуществления композиция является полным и сбалансированным по составу питательных веществ кормом для домашних животных. В этом варианте осуществления корм для домашних животных может быть "влажным кормом", "сухим кормом" или кормом с "промежуточным влагосодержанием". "Влажный корм" - это корм, продающийся, как правило, в консервных банках или в мешочках из фольги и обычно имеющий содержание влаги в пределах примерно от 70% до 90%. "Сухой корм" описывает корм для домашних животных, имеющий сходный с влажным кормом состав, но имеющий ограниченное влагосодержание, как правило, в пределах примерно от 5% до 15% или 20% (как правило, в форме небольших гранул, похожих на печенье). В одном предпочтительном варианте осуществления содержание влаги в композиции составляет примерно от 5% до 20%. Сухие пищевые продукты включают целый ряд продуктов с различным влагосодержанием, таким, при котором они являются относительно стойкими в хранении и устойчивыми к повреждению или загрязнению микробами или грибками. Также предпочтительными являются сухие пищевые композиции, представляющие собой прессованные пищевые продукты, такие как корм для домашних животных или закуски, предназначенные или для человека или для домашних животных.
Пищевые композиции также могут содержать один или более источников волокна. Термин "волокно" включает все источники "объема (массы)" в пищевом продукте, любые усваиваемые или неусваиваемые, растворимые или нерастворимые, поддающиеся ферментации или неподдающиеся ферментации. Предпочтительными волокнами являются волокна из растительных источников, таких как морские растения, однако также могут использоваться микробные источники волокна. Можно использовать целый ряд растворимых или нерастворимых волокон, которые известны специалистам в данной области техники. Источником волокна может быть свекольная стружка (из сахарной свеклы), аравийская камедь, камедь талха, подорожник, рисовые отруби, камедь бобов рожкового дерева, цитрусовый жом, пектин, фруктоолигосахарид, олигофруктоза с короткой цепью, маннан-олигофруктоза, волокно сои, арабиногалактан, галактоолигосахарид, арабиноксилан или их смеси.
Альтернативно, источником волокна может быть поддающееся ферментации волокно. Как было описано ранее, поддающееся ферментации волокно полезно для иммунной системы домашних животных. Поддающееся ферментации волокно или другие композиции, известные специалистам в данной области техники, которые обеспечивают пребиотик для усиления роста пробиотиков в кишечнике, также могут вводиться в композицию для усиления пользы, предоставляемой иммунной системе животного настоящим изобретением.
В некоторых вариантах осуществления содержание золы пищевой композиции находится в пределах примерно от 1% до 15%, предпочтительно примерно от 5% до 10%.
В предпочтительном варианте осуществления композиция представляет собой композицию, содержащую примерно от 15% до 50% белка, примерно от 5% до 40% жира, примерно от 5% до 10% содержания золы, и имеющую содержание влаги примерно от 5% до 20%. В других вариантах осуществления пищевая композиция дополнительно содержит пребиотики или пробиотики, как описано здесь.