СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
METHOD FOR OBTAINING L-AMINOACID USING BACTERIUM OF Enterobacteriaceae FAMILY

Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что в указанной бактерии усилена экспрессия гена ycfR.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для увеличения продукции L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов рекомбинантной ДНК (патент США 4,278,765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).
В ходе недавно проведенных исследований было установлено, что белок YcfR участвует в формировании биопленки и ответе на стресс, а также что делеция гена ecfR у Е.coli приводит к увеличению чувствительности клеток к различным видам стресса. Анализ делеционных мутантов ycfR с использованием микрочипов показал, что такие мутанты имели увеличенную экспрессию некоторых генов ответа на стресс, вызываемый действием кислот, а также осмотический, окислительный и тепловой стресс. В частности, делеция гена ycfR приводит к увеличению экспрессии генов gadABC и gadE, отвечающих за устойчивость к кислотам, генов osmY, osmB и отрХ, активируемых осмотическим стрессом, и гена супероксиддисмутазы sodC. Таким образом, предполагается, что YcfR является белком устойчивости к различным видам стресса (Zhang XS et al. J Bacteriol 189(8); 3051-62 (2007)).
Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих использование усиления экспрессии гена ycfR для получения L-аминокислот.
Краткое описание изобретения
Цели настоящего изобретения включают повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения неароматических или ароматических L-аминокислот с использованием этих штаммов.
Вышеуказанные цели были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что усиление экспрессии гена ycfR может приводить к увеличению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-цитруллин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.
Предоставляется бактерия семейства Enterobacteriaceae, обладающая способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-цитруллин, L-орнитин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-цитруллин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae - продуцента L-аминокислоты, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена ycfR в указанной бактерии усилена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой указанная экспрессия усилена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена ycfR.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-цитруллина, L-орнитина и L-аргинина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя выращивание описанной выше бактерии в питательной среде и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-цитруллина, L-орнитина и L-аргинина.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретения
1. Бактерия
Бактерия согласно настоящему изобретению представляет собой бактерию-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированную таким образом, что экспрессия гена ycfR в указанной бактерии усилена.
Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» может означать бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия выращивается в указанной питательной среде.
Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также может означать бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в количествах, больших по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким, как штамм Е.coli K-12, и, может означать, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, или не менее чем 1.0 г/л в другом примере. Термин «L-аминокислота» включает, например, L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цитруллин, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.
Термин «ароматическая L-аминокислота» включает, например, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает, например, L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин, L-цитруллин, L-орнитин и L-аргинин.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543). Примерами могут служить бактерии, принадлежащие к роду Escherichia или Pantoea.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» может означать, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol, 43, 162-173 (1993)).
Термин "усиление экспрессии гена" может означать, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например, в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций могут включать увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, усиление экспрессии гена и т.д. Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и т.п. Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Кроме того, штаммы, которые могут быть использованы в качестве контроля, включают, например, Escherichia coli К-12 или Pantoea ananatis FERM BP-6614.
Ген ycfR (синонимы: bhsA, ECK1098, b1112) кодирует предполагаемый белок внешней мембраны YcfR из Е. coli. Ген ycfR (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 1168296 по 1168553; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположен между генами ycfQ и ycfS на хромосоме Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ycfR и аминокислотная последовательность белка YcfR, кодируемого геном ycfR, представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно.
Поскольку у представителей различных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, ген ycfR не ограничивается геном, последовательность которого приведена в SEQ ID NO: I, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO: 1. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном ycfR, может иметь гомологию не менее 80% или не менее 90% в другом примере, или не менее 95% в другом примере, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO. 2, при условии, что он имеет активность белка YcfR. Термин "вариант белка", может означать белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, или от 1 до 15 в другом примере, или от 1 до 5 в другом примере, в SEQ ID NO: 2. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для трехмерной структуры белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру.
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: счет, идентичность и сходство.
Замена, делеция, вставка или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков являются консервативной(-ыми) мутацией(-ями), если сохраняется активность. Типичным примером консервативной мутации является консервативная замена. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tur на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.
В связи с этим ген ycfR может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что он кодирует функциональный белок YcfR. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 60%, 70%, 80%, 90% или 95% в разных примерах, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная или многократная отмывка, или двух- или трехкратная в другом примере, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+ (Amersham) в жестких условиях - 15 минут. Отмывка может быть выполнена два или три раза. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно составляет около 100-1000 п.н.
Методы усиления экспрессии гена включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в бактерии семейства Enterobacteriaceae, может увеличивать число копий гена. Могут использоваться низкокопийные векторы. Примеры низкокопийных векторов включают, но не ограничиваются ими, pSC101, pMW118, pMW119, и т.п. Термин "низкокопийный вектор" используется для векторов, число копий которого в клетке достигает пяти.
Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и т.п. Например, один акт Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3 копий гена.
Число копий гена также может быть увеличено путем введения множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому может быть выполнена гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в хромосомной ДНК, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.
R
L
Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК под контроль сильного промотора. Примерами сильных промоторов являются lac промотор, trp промотор, trc промотор, P или P промоторы фага λ. Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.
С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор мутации, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена. Кроме того, известно, что замена нескольких нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на трансляционную способность мРНК. Например, обнаружен 20-кратный разброс в уровне экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих стартовому кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984).
Кроме того, возможно ввести нуклеотидную замену в область промотора гена на бактериальной хромосоме, результатом чего является усиление функции промотора. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, можно осуществить, например, таким же способом, что и замена гена с использованием чувствительной к температуре плазмиды, как раскрыто в международной заявке WO 00/18935 и заявке Японии JP 1-215280 А.
Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Бактерия-продуцент L-аминокислоты
В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия генаус/R усилена, может быть использована бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии гена ycfR в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия гена ycfR уже усилена, способности к продукции L-аминокислот.
Бактерия-продуцент L-треонина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-треонина, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е. coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е. coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е. coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е. coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е. coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.
Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.
R
В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина также может быть использован штамм Е.coli ВКПМ В-5318 (Европейская заявка 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным относительно изолейцина, и чувствительный к температуре С1 репрессор фага λ и P-промотор замещает регуляторную область в треониновом опероне на плазмиде pVIC40. Штамм ВКПМ В-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером В-5318.
Бактерия может быть дополнительно модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:
- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;
- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;
- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;
- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;
- гена asd, кодирующего аспартат-р-семиальдегиддегидрогеназу, и
- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).
Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е. coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона, из оперона может быть удалена область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO 2005/049808, заявка РСТ WO 2003/097839).
Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.
th
Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е. coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и отрХ. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт кодону ATG (тезисы 17 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; Европейская заявка ЕР 1013765 A).
Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Бактерия-продуцент L-лизина
Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (PERM BP-1543, NRRL B-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.
Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США 5827698).
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ppc), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (cyo) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5,830,716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.
Примеры родительских штаммов, которые могут использоваться для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, катализирующих реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).
Бактерия-продуцент L-цистеина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-цистеина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е. coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е. coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP 11155571 А2); штамм Е. coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307A1) и подобные им.
Бактерия-продуцент L-лейцина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-лейцина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающим, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879A), и подобные им.
Бактерия может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, которые могут быть представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка ЕР 1239041 А2).
Бактерия-продуцент L-гистидина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-гистидина, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е. coli NRRL B-12116-B12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli Н-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобными им.
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры таких генов включают гены, кодирующие АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisI), фосфорибозил - АТФ- фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.
Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ. 2003677 и 2119536).
Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710 А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ. 2119536), и т.д.
Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты
+
+
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC(Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм был перенесен природный аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli К12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC (ВКПМ В-8961), который обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, дефектные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, или штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают глутаматдегидрогеназу (gdh), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgmI), фосфоглицераткиназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу (tpiA), фруктозобифосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pftA, pfkB) и глюкозофосфатизомеразу (pgi).
Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А и ЕР 952221 А.
Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что снижена экспрессия генов цитратсинтетазы и/или фосфоенолпируваткарбоксилазы, и/или дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А и ЕР 952221 А.
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу (асеА), α-кетоглутаратдегидрогеназу (sucA), фосфотрансацетилазу (pta), ацетаткиназу (ack), синтазу ацетогидроксикислот (ilvG), ацетолактатсинтазу (ilvI), форматацетилтрансферазу (pfl), лактатдегидрогеназу (ldh) и глутаматдекарбоксилазу (gadAB). Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы и способы их получения описаны в патентах США 5,378,616 и 5,573,945. Конкретно, примеры таких штаммов могут включать в себя следующие штаммы:
R
Е.coli W3110sucA::Km
Е.coli AJ12624 (FERM BP-3853)
Е.coli AJ12628 (FERM BP-3854)
Е.coli AJ12949 (FERM BP-4881)
R
Е.coli W3110sucA::Km - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме Е. coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.
Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например, штамм AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США 5,908,768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5,393,671); штамм Е.coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6,110,714) и подобные им.
Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6,331,419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute ofBioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то что штамм AJ13356, был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.
Бактерия-продуцент L-фенилаланина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL В-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и пободные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E. coli К-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), штамм E. coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E. coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E. coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А 1).
Бактерия-продуцент L-триптофана
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-триптофана, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е. coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не ингибируемую серином по типу обратной связи и аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не ингибируемую триптофаном по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е. coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), в которых отсутствует активность триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ W09708333, патент США 6319696), и подобные им. Также могут быть использованы бактерии - продуценты L-триптофана принадлежащие к роду Escherichia, в которых увеличена активность белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (заявки на патент США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы, и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е. coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е. coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-триптофана, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4,371,614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).
Бактерия-продуцент L-пролина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий-продуцентов L-пролина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно, примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина, включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, участвующие в выведении L-аминокислоты из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).
th
Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е. coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al (The 15 Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.
Бактерия-продуцент L-аргинина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-аргинина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 А1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР 1170358 А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР 1170361 А1), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-аргинина, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу (carAB).
Бактерия-продуцент L-цитруллина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента цитруллина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как мутантные по N-ацетилглутаматсинтазе штаммы Е. coli 237/pMADS11, 237/pMADS12 и 237/pMADS13 (RU 2215783, ЕР 1170361 B1, US 6790647 B2).
Также бактерия-продуцент L-цитруллина может быть получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например, из штамма Е. coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации аргининсукцинатсинтазы, кодируемой геном argG.
Фраза "инактивация аргининсукцинатсинтазы" означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит неактивную аргининсукцинатсинтазу или также она может означать, что бактерия не способна синтезировать аргининсукцинатсинтазу. Инактивация аргининсукцинатсинтазы может быть осуществлена путем инактивации гена argG.
Фраза "инактивация гена argG" означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Также возможно, что область модифицированной ДНК не способна к естественной экспрессии гена из-за делеции части гена или всего гена, сдвига рамки считывания гена, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации прилегающих к гену областей, включая последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор, энхансер, аттенюатор, сайт связывания рибосомы и т.д..
Наличие или отсутствие гена argG на хромосоме бактерии может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п.. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количество белка, кодируемого геном argG, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.
Экспрессия гена argG может быть ослаблена введением в ген на хромосоме такой мутации, что внутриклеточная активность кодируемого геном белка уменьшена по сравнению с таковой в немодифицированном штамме. Такой мутацией гена может быть замена одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делеция одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставка гена устойчивости к антибиотику, или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D.H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена argG также может быть ослаблена путем модификации экспрессии регуляторных последовательностей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).
Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известный как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645(2000), заявка РСТ WO 2005/010175) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 A). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).
Бактерия-продуцент L-орнитина
Бактерия-продуцент L-орнитина может быть легко получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например, штамма Е. coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы, кодируемой генами argF и argI. Методы для инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы описаны выше.
Бактерия-продуцент L-валина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Н-81 (ВКПМ В-8066), NRRL В-12287 и NRRL В-12288 (патент США 4,391,907), ВКПМ В-4411 (патент США 5,658,766), ВКПМ В-7707 (европейская патентная заявка ЕР 1016710 А2), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем, чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, в опероне может быть разрушен ген ilvA для того, чтобы снизить активность треониндеаминазы.
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина, также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм E. coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм E. coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411.
+
Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством Н-АТФазы (заявка РСТ WO 96/06926).
Бактерия-продуцент L-изолейцина
Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-изолейцина, включают в себя, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969А), мутантные штаммы с устойчивость к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882А). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458А, патент Франции 0356739 и патент США 5998178).
2. Способ
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические кислоты. В зависимости от типа ассимиляции используемого микроорганизма может также использоваться спирт, включая этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, или в пределах от 30 до 38°С в другом примере. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, или от 6.5 до 7.2 в другом примере. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
L-tac
Пример 1. Конструирование штамма Е. coli MG1655 PycfR
L-tac
L-tac
Штамм Е. coli MG1655 PycfR получили путем замены области нативного промотора гена ycfR в штамме MG1655 промотором P.
L-tac
R
Для замены области нативного промотора renaycfR фрагмент ДНК, содержащий промотор P и маркер устойчивости к хлорамфениколу (Cm), кодируемый геном cat, интегрировали в хромосому штамма Е. coli MG1655 вместо области нативного промотора методом, описанным Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645), также называемым "Red-зависимая интеграция" и/или "Red-направляемая интеграция".
L-tac
L-tac
L-tac
Фрагмент, содержащий промотор P, соединенный с геном cat, получили в ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК штамма Е.coli MG1655PxylE (WO 2006/043730). Нуклеотидная последовательность промотора P представлена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 3). Для амплификации использовали праймеры P1 (SEQ ID NO: 4) и Р2 (SEQ ID NO: 5). Праймер Р1 содержит 36 нуклеотидов, комплементарных области, локализованной в 146 п.н. перед стартовым кодоном гена ycfR, введенных в праймер для дальнейшей интеграции в бактериальную хромосому, а праймер Р2 содержит 36 нуклеотидов, идентичных 5'-последовательности гена ycfR.
2
L-tac
ПЦР проводили с использованием амплификатора "Gene Amp PCR System 2700" (Applied Biosystems). Реакционная смесь для ПЦР (общий объем - 50 мкл) содержала 5 мкл 10× ПЦР-буфера с 15 мМ MgCl ("Fermentas", Lithuania), no 200 мкМ каждого dNTP, 25 пкМ каждого используемого праймера и 1 Ед. Taq-полимеразы ("Fermentas", Lithuania). В качестве матрицы для ПЦР в реакционную смесь добавляли приблизительно 20 нг геномной ДНК E. coli MG1655PxylE.
Температурные условия были следующие: начальная денатурация ДНК в течение 5 мин при 95°С; затем 35 циклов: денатурация при 95°С в течение 30 сек, отжиг при 54°С в течение 30 сек и элонгация при 72°С в течение 1,5 мин; конечная элонгация в течение 5 мин при 72°С. Затем амплифицированный фрагмент ДНК очищали путем электрофореза в агарозном геле, выделяли с использованием "GenElute Spin Columns" ("Sigma", USA) и осаждали этанолом. Полученный фрагмент ДНК использовали для электропорации и Red-зависимой интеграции в бактериальную хромосому штамма Е. coli MG1655/pKD46.
2
600
L-tac
L-tac
R
R
R
Клетки MG1655/pKD46 выращивали в течение ночи при 30°С в жидкой среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), затем разбавляли 1:100 средой SOB (Дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 0.5 г/л; Триптон, 20 г/л; KCl, 2.5 мМ; MgCl, 10 мМ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и L-арабинозу (10 мМ) (арабинозу используют для индукции плазмиды, содержащей гены Red системы) и выращивали при 30°С до достижения оптической плотности бактериальной культуры OD=0.4-0.7. Выросшие клетки из 10 мл бактериальной культуры трижды отмывали ледяной деионизованной водой и суспендировали в 100 мкл воды. 10 мкл фрагмента ДНК (100 нг), растворенного в деионизованной воде, добавляли к суспензии клеток. Электропорацию осуществляли в электропораторе "Bib-Rad" (USA) (No. 165-2098, version 2-89) в соответствии с инструкциями изготовителя. После электропорации клетки добавляли к 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), инкубировали в течение 2 часов при 37°С, затем высевали на L-агар, содержащий 25 мкг/мл хлорамфеникола. Колонии, выросшие в течение 24 ч проверяли на присутствие маркера Cm вместо области нативного промотора гена ycfR, с помощью ПЦР с использованием праймеров РЗ (SEQ ID NO: 6) и Р4 (SEQ ID NO: 7). Для этого свежевыделенные колонии суспендировали в 20 мкл воды, затем 1 мкл полученной суспензии использовали в ПЦР. Температурные условия были следующие: начальная денатурация ДНК в течение 10 мин при 95°С; затем 30 циклов: денатурация при 95°С в течение 30 сек, отжиг при 55°С в течение 30 сек и элонгация при 72°С в течение 1 мин; конечная элонгация в течение 7 мин при 72°С. Несколько проверенных Cm колоний содержали требуемый фрагмент ДНК ~2000 п.н., что подтверждает присутствие промотора P и ДНК маркера Cm вместо 228 п.н. области нативного промотора гена ycfR. Один из полученных штаммов излечили от термочувствительной плазмиды pKD46 путем культивирования при 37°С, полученный штамм был назван Е. coli MG1655 PycfR.
L-tac
Пример 2. Продукция L-аргинина штаммом Е. coli 382 PycfR
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии renaycfR под контролем промотора P на продукцию L-аргинина, в штамм-продуцент L-аргинина Е. coli 382 переносили фрагменты ДНК из хромосомы описанного ранее штамма Е. coli MG1655PycfR с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926.
L-tac
Оба штамма, 382 и 382 PycfR, по-отдельности выращивали с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры выращивали при 32°С и при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.
Состав использованной ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0.
L-tac
Результаты пробирочных ферментации представлены в Таблице 1. Как следует из Таблицы 1, штамм 382 PycfR с усиленной экспрессией гена ycfR при обеих температурах выращивания накапливал большее количество L-аргинина, чем родительский штамм-продуцент L-аргинина Е. coli 382.
L-tac
Пример 3. Продукция L-цитруллина штаммом Е. coli 382ΔargG PfR
L-tac
L-tac
Для оценки влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-цитруллина может быть получен штамм 382ΔargG PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 PycfR в штамм-продуцент цитруллина Е.coli 382ΔargG. Штамм 382ΔargG может быть получен в результате делеции гена argG на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, гомологичные как области, прилегающей к гену argG, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).
L-tac
Оба штамма Е. coli, 382ΔargG и 382ΔargG PycfR, могут быть по-отдельности выращены с перемешиванием при 37 С в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32 С в течение 48 часов на роторной качалке.
После выращивания количество накопленного в среде L-цитруллина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее L-цитруллин пятно может быть вырезано, L-цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdClz.n количество L-цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
Возможный состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
L-аргинин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180 С в течение 2 часов. Значение pH доводят до 7.0.
L-tac
Пример 4. Продукция L-орнитина штаммом Е.coli 382ΔargFΔargI PycfR
L-tac
L-tac
Для оценки влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-орнитина может быть получен штамм 382ΔargFΔargI PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 PycfR в штамм-продуцент L-орнитина Е. coli 382ΔargFΔargI. Штамм 382ΔargFΔargI может быть получен в результате последовательных делеций генов argF и argI на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы две пары ПЦР-праймеров, гомологичных как областям, прилегающим к генам argF и argI, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).
L-tac
Оба штамма Е.coli, 382ΔargFΔargI и 382ΔargFΔargI PycfR, могут быть по-отдельности выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество накопленного в среде L-орнитина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее L-орнитин пятно может быть вырезано, L-орнитин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl и количество L-орнитина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
Возможный состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
L-аргинин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.
L-tac
Пример 5. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-3996 PycfR
L-tac
l-tac
Для оценки влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию треонина в штамм-продуцент L-треонина Е. coli ВКПМ В-3996 могут быть перенесены ДНК фрагменты из хромосомы описанного ранее штамма Е. coli MG1655PycfR с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма В-3996 PycfR. Штамм В-3996 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.
L-tac
Оба штамма, В-3996 и В-3996 PycfR, могут быть выращены при 37°С в течение 18-24 часов на L-агаре. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены при 32°С в течение 18 часов на роторной качалке (250 об/мин) в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% глюкозой. Затем в ферментационную среду может быть внесено вносили по 0.2 мл (10%) посевной культуры. Ферментация может быть проведена в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 65 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин).
2
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Для визуализации может быть использован раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, может быть вырезано; L-треонин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-треонина может быть оценено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.
Состав среды для ферментации (г/л):
Глюкоза
80.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
22.0
NaCl
0.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7Н<sub>2</sub>О
0.8
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.02
MnSO<sub>4</sub> 5Н<sub>2</sub>О
0.02
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
СаСО<sub>3</sub>
30.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0. Антибиотики добавляют в среду после стерилизации.
L-tac
Пример 6. Продукция L-лизина штаммом Е. coli AJ11442 PycfR
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии генаус/Р на продукцию L-лизина можно получить штамм AJ11442 PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 PycfR в штамм-продуцент L-лизина Е. coli AJ1442.
L-tac
Оба штамма Е.coli, AJ11442 и AJ11442 PycfR, могут быть культивированы в L-среде при 37°С, и 0.3 мл полученной культуры может быть инокулировано в 20 мл среды для ферментации, содержащей необходимые антибиотики, в колбах объемом 500 мл. Культивирование может проводиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель - Sakura Seiki Co.). Затем выход L-лизина может быть рассчитан относительно израсходованной глюкозы для каждого штамма.
Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):
Глюкоза
40.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
24.0
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
1.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.01
MnSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
0.01
Дрожжевой экстракт
2.0
4
2
3
рН доводят до 7.0 с помощью КОН, и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO 7HO стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов и добавляют в среду до концентрации 30 г/л.
L-tac
Пример 7. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD) PycfR
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии renaycfR на продукцию L-цистеина можно получить штамм JM15(ydeD) PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655PycfR в штамм-продуцент L-цистеина Е. coli JM15(ydeD).
Штамм Е. coli JM15(ydeD) является производным штамма Е. coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей ген ydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5972663). Штамм JM15 (CGSC# 5042) может быть получен в Коллекции Генетического Фонда Coli при Центре Генетических Ресурсов E. coli (The Coli Genetic Stock Collection at the E.coli Genetic Resource Center, MCD Biology Department, Yale University) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6218168.
L-tac
Пример 8. Продукция L-лейцина штаммом Е. coli 57 PycfR
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-лейцина можно получить штамм 57 PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 PycfR в штамм-продуцент L-лейцина Е. coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6,124,121). Штамм 57 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) 19 мая 1997 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7386.
L-tac
Оба штамма Е.coli 57 и 57 PycfR, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.2 мл (10%) посевного материала. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин). Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы:бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1).
Может быть использована ферментационная среда (рН 7.2) следующего состава (г/л):
Глюкоза
60.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
25.0
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин
0.01
СаСО<sub>3</sub>
25.0
3
Глюкозу и СаСО стерилизуют отдельно.
L-tac
Пример 9. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80 PycfR
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии тенаус/R на продукцию L-гистидина можно получить штамм 80 PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655PycfR в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80. Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1)15 октября 1999 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7270 и затем, 12 июля 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
L-tac
Оба штамма Е.coli, 80 и 80 PycfR, могут быть по-отдельности выращены на L-бульоне при 29°С в течение 6 часов. Затем по 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: п-бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.
Может быть использована ферментационная среда (рН 6.0) следующего состава (г/л):
Глюкоза
100.0
Мамено (гидролизат соевых бобов)
0.2 общего азота
L-пролин
1.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
25.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.01
MnSO<sub>4</sub>
0.01
Тиамин
0.001
Бетаин
2.0
СаСО<sub>3</sub>
60.0
3
Глюкоза, пролин, бетаин и СаСО стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.
+
L-tac
Пример 10. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е. coli VL334thrC PycfR
+
+
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-глутаминовой кислоты можно получить штамм VL334thrC-PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655PycfR в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е. coli VL334thrC(ЕР 1172433). Штамм VL334thrC+ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 декабря 2004 г. с инвентарным номером ВКПМ В-8961. Затем, 8 декабря 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
+
+
L-tac
3
4
4
3
2
Оба штамма Е. coli, VL334thrCи VL334thrCPycfR, могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°С в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда может содержать глюкозу (60 г/л), сульфат аммония (25 г/л), KHPO (2 г/л), MgSO (1 г/л), тиамин (0.1 мг/мл), L-изолейцин (70 мкг/мл), и СаСО (25 г/л). pH доводят до 7.2. Глюкозу и мел стерилизуют отдельно. Выращивание может производиться при 30°С в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl.
L-tac
Пример 11. Продукция L-фенилаланина штаммом Е. coli AJ12739 PycfR
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-фенилаланина можно получить штамм Е. coli AJ12739 PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 PycfR в штамм-продуцент L-фенилаланина Е. coli AJ12739. Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197. Затем, 23 августа 2002 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
L-tac
Оба штамма Е. coli, AJ12739 и AJ12739 PycfR, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол:этилацетат:25% водного аммиака:вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.
Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):
Глюкоза
40.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
16.0
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0.1
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.01
MnSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
0.01
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
2.0
Тирозин
0.125
СаСО<sub>3</sub>
20.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.
L-tac
Пример 12. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (pGH5) PycfR
L-tac
l-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-триптофана можно получить штамм Е.coli SV164(pGH5) путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655PycfR в штамм-продуцент L-триптофана Е. coli SV164 P(pGH5). Штамм SV164 содержит аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не подверженную ингибированию триптофаном по типу обратной связи. Плазмида pGH5 содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не подверженную ингибированию серином по типу обратной связи. Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 и Европейском патенте 0662143.
L-tac
Оба штамма Е.coli, SV164 (pGH5) и SV164 (pGH5)PycfR, могут быть выращены с перемешиванием при 32°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5, 10 мг/мл). Полученные культуры (по 0.3 мл каждой) могут быть внесены в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (10 мг/мл), в пробирках размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 32°С в течение 72 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 11.
Компоненты используемой ферментационной среды представлены в Таблице 2; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 2, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.
L-tac
Пример 13. Продукция L-пролина штаммом Е. coli 702ilvA PycfR
L-tac
L-tac
ый
Для анализа влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-пролина можно получить штамм 702ilvA PycfR путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 PycfR. в штамм-продуцент L-пролина E. coli 702ilvA. Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1 Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012 и затем, 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
L-tac
Оба штамма Е.coli, 702ilvA и 702ilvA PycfR, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может проводиться в тех же условиях, как описано в Примере 10.
L-tac
Пример 14. Продукция L-валина штаммом Е.coli H-81 PycfR
L-tac
L-tac
Для анализа влияния усиления экспрессии гена ycfR на продукцию L-валина может быть использован штамм H-81 PycfR, полученный путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 PycfR в штамм-продуцент L-валина Е. coli H-81.
L-tac
Оба штамма, H-81 и H-81 PycfR, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне и по 0.1 мл каждой из полученных культур могут быть инокулированы в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм, и выращены при 32°С в течение 72 часов на роторной качалке. После культивирования в течение 48 часов и 72 часов количество накопленного L-валина может быть определено методом тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол:этилацетат:25% водного аммиака:вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.
Состав ферментационной среды, (г/л):
Глюкоза
60.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
18.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1.8
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.2
СаСО<sub>3</sub>
20.0
Тиамин
0.0001
3
СаСО стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. pH доводили до 7.0.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники, очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Таблица 1
Штамм
Количество L-аргинина, г/л
32°С
37°С
382 (контроль)
11.2±0.1
6.2±0.1
382 P<sub>l-tac</sub>ycfR
12.1±0.1
7.2±0.1
Таблица 2
Растворы
Компонент
Конечная концентрация, г/л
А
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1.5
NaCl
0.5
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
1.5
L-метионин
0.05
L-фенилаланин
0.1
L-тирозин
0.1
Мамено (общий N)
0.07
В
Этанол
20.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.3
С
CaCl<sub>2</sub>
0.011
D
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.075
Цитрат натрия
1.0
Е
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> 2H<sub>2</sub>O
0.00015
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
0.0025
CoCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O
0.00007
CuSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
0.00025
MnCl<sub>2</sub> 4H<sub>2</sub>O
0.0016
ZnSO<sub>4</sub> 7 H<sub>2</sub>O
0.0003
F
Тиамин
0.005
G
СаСО<sub>3</sub>
30.0
Н
Пиридоксин
0.03
pH раствора А - 7.1, доводится с использованием NH<sub>4</sub>OH.