СПОСОБЫ ПЭГИЛИРОВАНИЯ ПО АМИНОГРУППЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧНЫХ КОНЪЮГАТОВ БЕЛКОВ И ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ

1. Способ получения конъюгатов белок-полиэтиленгликоль, включающий
- приготовление водного раствора белка, содержащего белок, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, и хелатирующий агент, причем хелатирующий агент выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновых кислот, гидроксиаминокарбоновых кислот, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF);
- добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 25:1 до около 1,5:1; и
- взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль, причем буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного белкового раствора от 4,0 до 6,0.
2. Способ по п. 1, в котором борсодержащий восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из цианборгидрида натрия¸ диметиламиноборана, триметиламиноборана, 2-метилпиридинборана, триацетоксиборгидрида натрия, триэтиламиноборана, морфолинборана, трет-бутиламиноборана и 5-этил-2-метил-пиридинборана.
3. Способ по п. 1, в котором борсодержащий восстанавливающий агент является 2-метилпиридинбораном.
4. Способ по п. 1, в котором в результате взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с белком образуется конъюгат белок-полиэтиленгликоль – сайт-специфично моноПЭГилированный белок, составляющий более 75% всех образовавшихся конъюгатов белок-полиэтиленгликоль.
5. Способ по п. 1, в котором белок выбирают из группы, состоящей из инсулина, паратиреоидного гормона, фрагмента паратиреоидного гормона, гормона роста, глюкагоноподобного пептида-1, энфувиртида и октреотида.
6. Способ по п. 4, в котором белок представляет собой инсулин и конъюгат белок-полиэтиленгликоль представляет собой инсулин, сайт-специфично моноПЭГилированный по концевому остатку фенилаланина цепи В – конъюгат PEG-PheB1-инсулин.
7. Способ по п. 1, в котором белок представляет собой фрагмент паратиреоидного гормона.
8. Способ по п. 1, в котором буферный раствор содержит неорганическую соль фосфорной кислоты.
9. Способ по п. 1, в котором аминополикарбоновую кислоту выбирают из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусной кислоты (ADA), бис(аминоэтил)гликолевого эфира N,N,N’,N’-тетрауксусной кислоты (EGTA), транс-диаминоциклогексантетрауксусной кислоты (DCTA), глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.
10. Способ по п. 5, в котором аминополикарбоновая кислота является этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA).
11. Способ по п. 1, в котором гидроксиаминокарбоновую кислоту выбирают из группы, состоящей из N-гидроксиэтилиминодиуксусной кислоты (HIMDA), N,N-бис-гидроксиэтилглицина и N-трис(гидроксиметил)метилглицина.
12. Способ по п. 1, в котором the N-замещенный глицин представляет собой глицилглицин.
13. Способ получения конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль, включающий
- приготовление водного раствора инсулина, содержащего инсулин, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, органический растворитель и хелатирующий агент, представляющий собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA);
- добавление в водный раствор инсулина борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 25:1 до около 1,5:1; и
- взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и инсулина с образованием конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль, причем буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного раствора инсулина от 4,0 до 6,0, и в результате взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с инсулином образуется конъюгат PEG-PheB1-инсулин, составляющий более 75% всех образовавшихся конъюгатов инсулин-полиэтиленгликоль.
14. Способ по п. 13, в котором борсодержащий восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из цианборгидрида натрия¸ диметиламиноборана, триметиламиноборана, 2-метилпиридинборана, триацетоксиборгидрида натрия, триэтиламиноборана, морфолинборана, трет-бутиламиноборана и 5-этил-2-метил-пиридинборана.
15. Способ по п. 13, в котором борсодержащий восстанавливающий агент является 2-метилпиридинбораном.
16. Способ по п. 13, в котором в момент начала реакции метоксиполиэтиленгликоля альдегида и инсулин присутствуют в молярном соотношении от около 10:1 до около 1:1.
17. Способ по п. 13, в котором борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 22:1 до около 5,5:1.
18. Способ по п. 13, в котором органический растворитель выбирают из группы, состоящей из этилового спирта, метилового спирта, диметилсульфоксида (DMSO), диоксана, ацетонитрила, диметилформамида (DMF) и N-метилпирролидона (NMP).
19. Способ по п. 13, в котором органический растворитель является диоксаном.
20. Способ по п. 13, в котором в ходе реакции ПЭГилирования рН водного раствора инсулина составляет 5,0.
21. Способ по п. 13, в котором инсулин является человеческим.
22. Способ по п. 13, в котором в результате взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с инсулином образуется конъюгат PEG-PheB1-инсулин, составляющий 75-85% всех образовавшихся конъюгатов инсулин-полиэтиленгликоль.
23. Способ получения микросфер, содержащих конъюгат белка с полиэтиленгликолем, которые обеспечивают его замедленное высвобождение; этот способ включает:
- приготовление водного белкового раствора, содержащего белок, буферный раствор с нужным рН и хелатирующий агент, причем этот хелатирующий агент выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновых кислот, гидроксиаминокарбоновых кислот, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF);
- добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 25:1 до около 1,5:1;
- взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль, причем буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного белкового раствора от 4,0 до 6,0;
- смешивание конъюгата белок-полиэтиленгликоль в органическом растворителе и полимера, способного к биологической деградации, с образованием смеси;
- эмульгирование смеси конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера в водном растворе с образованием эмульгированной смеси; и
- отверждение эмульгированной смеси конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера с образованием микросфер, обеспечивающих замедленное высвобождение.
24. Способ по п. 23, в котором борсодержащий восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из цианборгидрида натрия¸ диметиламиноборана, триметиламиноборана, 2-метилпиридинборана, триацетоксиборгидрида натрия, триэтиламиноборана, морфолинборана, трет-бутиламиноборана и 5-этил-2-метил-пиридинборана.
25. Способ по п. 23, в котором борсодержащий восстанавливающий агент является 2-метилпиридинбораном.
26. Способ по п. 23, в котором белок представляет собой инсулин и конъюгат белок-полиэтиленгликоль представляет собой инсулин, сайт-специфично моноПЭГилированный по концевому остатку фенилаланина цепи В – конъюгат PEG-PheB1-инсулин.
27. Способ по п. 26, в котором конъюгат PEG-PheB1-инсулин образуется с выходом 75-85% от всех образовавшихся конъюгатов инсулин-полиэтиленгликоль.
28. Способ по п. 23, в котором буферный раствор содержит неорганическую соль фосфорной кислоты.
29. Способ по п. 23, в котором хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
30. Способ по п. 23, в котором борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 25:1 до около 5:1.
31. Способ по п. 23, в котором в процессе реакции ПЭГилирования рН водного раствора белка составляет 5,0.
32. Способ по п. 23, в котором органический растворитель является дихлорметаном.
33. Способ по п. 23, в котором биоразлагаемый полимер выбирают из группы, состоящей из полилактида, полигликолида, поли(d,1-лактид-ко-гликолида), поликапролактона, полиортоэфира, сополимера простого и сложного эфиров и сополимера полилактида и полиэтиленгликоля.
34. Способ по п. 23, в котором биоразлагаемый полимер является поли(d,1-лактид-ко-гликолидом).