КОМПОЗИЦИИ ИЗ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ГРАНУЛЫ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, СПОСОБ ИХ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
COMPOSITION OF PROBIOTIC MICROORGANISMS, GRANULES CONTAINING THEM, METHOD OF THEIR PRODUCTION AND THEIR USE

Предметом настоящего изобретения является композиция или премикс из пробиотиков, содержащие живые или жизнеспособные пробиотические микроорганизмы и клеточные стенки дрожжей и/или дезактивированные дрожжи, поскольку присутствие клеточных стенок дрожжей и/или дезактивированных дрожжей позволяет, в частности, стабилизировать пробиотические микроорганизмы. Эта композиция или премикс могут быть использованы для изготовления гранул, которые будут предназначены для кормления животных.
Термин «пробиотики» обозначает живые микроорганизмы, которые при поглощении в достаточном количестве с пищей помимо их традиционного действия как продуктов питания оказывают положительное влияние на организм хозяина, улучшая свойства кишечной флоры. Они являются альтернативой применению антибиотиков при кормлении животных. Чаще всего, речь идет о бактериях или дрожжах, присутствующих либо в корме, либо в обогащающих добавках.
Существует четыре основных типа пробиотиков:
- молочнокислые бактерии (лактобактерии и кокки),
- бифидобактерии человеческого или животного происхождения,
- различные дрожжи, в числе которых дрожжи типа Saccharomyces,
- другие спорулирующие бактерии, в числе которых Bacillus subtillis и B.cereus.
Микроорганизмы, погибшие под воздействием температуры, не соответствуют определению пробиотиков, даже если им можно приписать некоторое терапевтическое действие.
В широком смысле, термин «пробиотики» также обозначает продукты питания, содержащие такие микроорганизмы.
Пробиотики все больше и больше используются как в питании человека, так и при кормлении животных, более конкретно, в качестве заменителя антибиотиков, принимая во внимание переход к более здоровому, естественному и экологически сбалансированному питанию. При кормлении животных эти микроорганизмы, как правило, добавляют в гранулированный корм в виде премикса, содержащего также витамины, микроэлементы и аминокислоты.
Вместе с тем, включить пробиотические микроорганизмы в гранулы не всегда легко, действительно, в большинстве случаев пробиотические микроорганизмы разрушаются в процессе грануляции. Этот этап изготовления гранул проводится в присутствии пара при температуре от 60°С до 100°С и под давлением от 0,5 до 3,5 бар, при таких температурных условиях и влажности эти микроорганизмы обычно погибают.
В заявке на изобретение ЕР 0694610 устойчивость к грануляции у дрожжей вида Phaffia rhodozyma, продуцирующих краситель астаксантин, которые используются для кормления в рыбоводстве с целью придания красного цвета мышцам выращиваемых лососей и форели, была улучшена способом высушивания в присутствии сахара, такого как глюкоза.
Однако в этом случае речь шла не о пробиотических дрожжах, которые для выполнения своих функций должны оставаться живыми до поглощения животными.
Удивительным и неожиданным образом изобретатели обнаружили, что стабильность пробиотических микроорганизмов в премиксах может улучшаться с течением времени за счет смешивания с клеточными стенками дрожжей и/или дезактивированными дрожжами вместо других традиционно используемых носителей премикса, таких как пшеничная мука или карбонат кальция. Эта стабильность, повышающаяся с течением времени, делает их более устойчивыми к грануляции.
Уже имеется описание использования клеточных стенок дрожжей в области фармакологии, пищевой промышленности и сельского хозяйства. Клеточные стенки используются в качестве индифферентного вещества при изготовлении фармацевтических таблеток, более конкретно, в качестве связывающего агента, обладающего свойствами дезинтегранта (Ozeki et al. AAPS PharmSciTech, 2003; 4(3):E41)
или в качестве компонента материала для оболочки (ЕР 1159882, Yuasa et al. Int J. Pharm., 2002, Apr 26; 237 (1-2):15-22). Тем не менее, по сведениям, которыми располагает подавшее заявку общество, до настоящего времени возможность их использования для повышения стабильности живых или выживающих микроорганизмов не рассматривалась.
Так, существует фактическая потребность в пробиотических микроорганизмах, которые бы оставались стабильными с течением времени таким образом, чтобы воздействие на здоровье поглощающего их животного было реальным.
В этой связи объектом изобретения является композиция из пробиотиков или премикс, включающие:
- от 0,5 до 75% живых или жизнеспособных пробиотических микроорганизмов (а), выбранных из группы, включающей пробиотические дрожжи, пробиотические бактерии типа молочнокислых бактерий, выбранных из числа лактобактерий, и бифидобактерии за исключением bacillis и их смеси,
- от 10 до 95% компонента (b), выбранного из числа клеточных стенок дрожжей и дезактивированных дрожжей, и
- от 0 до 95% питательной добавки (с), более конкретно, состоящей из витаминов, и/или микроэлементов, и/или аминокислот, и/или других добавок, предназначенных для кормления животных,
при этом процентное содержание представляет собой отношение сухой массы к общей массе композиции.
В рамках настоящего изобретения под «выживающими» или «жизнеспособными» микроорганизмами подразумевают микроорганизмы, которые в присутствии питательной среды вновь обретают способность к делению и формированию колоний.
В качестве примера пробиотических дрожжей можно назвать пробиотические дрожжи, выбранные из группы, включающей дрожжи рода Saccharomyces, предпочтительно вида Saccharomyces cerevisiae, или рода Kluyveromyces, такие как Kluyveromyces marxianus и их смеси.
Предпочтительными примерами штаммов Saccharomyces cerevisiae являются штамм Saccharomyces cerevisiae Sc47, депонированный в Национальной коллекции дрожжевых культур (NCYC) под номером 47, штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный в Национальной коллекции культур и микроорганизмов института Пастера (CNCM) под номером 1-1077, штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный в Национальной коллекции культур и микроорганизмов института Пастера (CNCM) под номером 1-1079, штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный в (Агро)Промышленной коллекции грибов и дрожжей (MUCL) под номером 39885, штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный в Центральном бюро культур грибов (CBS) под номером 39493.94, штамм Kluyveromyces marxianus, депонированный в (Агро)Промышленной коллекции грибов и дрожжей (MUCL) под номером 39434, и их смеси.
Наиболее предпочтительно, чтобы композиция по настоящему изобретению включала дрожжи, соответствующие штамму Saccaharomyces cerevisiae Sc47, депонированному в Национальной коллекции дрожжевых культур (NCYC) под номером 47.
Так, по совершенно конкретному способу осуществления вышеупомянутая композиция из пробиотиков или премикс включают:
- от 0,5 до 75%, предпочтительно от 5 до 30% живых или жизнеспособных дрожжей,
- от 10 до 80%, предпочтительно от 25 до 50% клеточных стенок дрожжей и/или дезактивированных дрожжей,
- от 0 до 95%, предпочтительно от 5 до 80% питательной добавки,
при этом процентное содержание представляет собой отношение сухой массы к общей массе композиции.
Эта композиция, в частности, адаптирована для кормления животных с однокамерным желудком.
Что касается клеточных стенок дрожжей, они могут быть выбраны из числа разных видов дрожжей, используемых в пищу, например, Saccaharomyces cerevisiae. Более конкретно, клеточные стенки дрожжей получают из дрожжей, поступающих в продажу под марками PRONARDY, SAFMANNAN или BIOMOS, которые выпускаются компаниями Prodessa, Biospringer и Alltech соответственно.
Клеточные стенки дрожжей могут быть получены способами, известными специалистам, более конкретно, можно назвать автолиз дрожжевых клеток с последующим отделением нерастворимой части, содержащей клеточные стенки, от растворимой части с помощью физических средств.
В рамках настоящего изобретения дезактивированными дрожжами считаются дрожжи, полностью лишенные своих свойств вызывать брожение. Можно использовать любой тип дезактивированных дрожжей, если это пищевые дрожжи, например, Saccaharomyces. Их получают способами, известными специалистам, более конкретно с помощью термической обработки.
По предпочтительному способу осуществления изобретения содержание сухих веществ в дезактивированных дрожжах составляет более 95%.
При использовании смеси дезактивированных дрожжей и клеточных стенок дрожжей, происхождение дрожжей может быть идентичным или различным.
Композиция из пробиотиков по изобретению обладает весьма удовлетворительной однородностью.
Без привязки к теории присутствие клеточных стенок дрожжей и/или дезактивированных дрожжей в композиции или премиксе по изобретению позволяет стабилизировать пробиотические микроорганизмы за счет уменьшения содержания влаги в пробиотических микроорганизмах и стабилизации этого содержания с течением времени. Содержание влаги, напротив, значительно увеличивается с течением времени при использовании классического носителя премикса, такого рода, какой описан в предыдущих методиках, и, более конкретно, включающего пшеничную муку или карбонат кальция. Кроме того, использование карбоната кальция может вызвать проблемы абразивности и сегрегации.
A
Так, по конкретному способу осуществления при изменении процента содержания сухого вещества в пробиотических микроорганизмах, V, определенном в соответствии с приведенным ниже тестом А, отмечена позитивная вариация.
Тест А:
0
0
В момент Т, то есть перед смешиванием пробиотических микроорганизмов с клеточными стенками дрожжей и/или дезактивированными дрожжами, содержание сухого вещества в пробиотических микроорганизмах измеряют согласно стандарту ISO 1741. Получают значение показателя DM.
T
Измеряют содержание сухого вещества в пробиотических микроорганизмах в момент Т=14 дней, то есть через 14 дней после смешивания пробиотических микроорганизмов с клеточными стенками дрожжей и/или дезактивированными дрожжами. Получают значение показателя DM.
T
0
0
После этого рассчитывают V=[(DM-DM)/DM]×100.
Предпочтительно вариация процента содержания сухого вещества в пробиотических микроорганизмах V превышает 0,5%, более предпочтительно - превышает 1%.
По конкретному способу осуществления композиция или премикс по изобретению включают, кроме того, питательную добавку, которая, в частности, содержит витамины, и/или микроэлементы, и/или аминокислоты, и/или другие добавки, предназначенные для кормления животных.
Входящие в композицию витамины выбраны из группы, включающей: витамин А, витамин D3, витамин Е, витамины В1, В2, В5, В6, В12, С, РР, биотин, фолиевую кислоту, холин, витамин К3, пантотеновую кислоту и их смеси.
Входящие в композицию микроэлементы могут быть пищевыми минеральными солями. Они выбраны из группы, включающей: медь, цинк, железо, магний, йод, селен и их смеси.
Входящие в композицию аминокислоты выбраны из группы, включающей: метионин, лизин, L-треонин, триптофан и их смеси.
7
10
8
10
Описанные выше композиция или премикс из пробиотиков могут быть непосредственно введены в корм для животных. Обычно композицию по изобретению вводят в корм из расчета от 5·10 до 5·10 КОЕ пробиотических микроорганизмов на кг полноценного корма, предпочтительно от 5·10 до 5·10 КОЕ на кг полноценного корма.
9
Например, если пробиотическим микроорганизмом композиции по изобретению являются дрожжи Saccaharomyces cerevisiae Sc47, выпускаемые компанией Лесаффр (Lesaffre) под маркой BIOSAF, композиция по изобретению должна быть введена в корм для животных таким образом, чтобы получить от 2,5 до 8·10 КОЕ Saccharomyces cerevisiae Sc47 на кг полноценного корма.
Описанную выше композицию из пробиотиков можно также использовать в гранулах из пробиотиков, предназначенных, властности, для кормления животных.
Таким образом, по другому способу осуществления изобретение относится к гранулам из пробиотиков, которые включают:
- Описанную выше композицию из пробиотиков или премикс и
- Питательную смесь, адаптированную для конкретного вида животных.
Как правило, гранулы по изобретению включают один промилле пробиотических микроорганизмов по весу.
Питательная смесь представляет собой смесь, обычно используемую специалистами для изготовления гранул, которые предназначены для кормления животных; ее состав зависит от вида животных, для которых она предназначается, но она обычно включает муку из растительного сырья, например, пшеничную муку, и/или муку из соевого или рапсового жмыха и/или свекловичного жома, и/или мелассу, и/или мочевину в известных специалисту пропорциях. После этого премикс вводят в сырье (корм), природа и качество которого зависят от вида животных.
При необходимости эту питательную смесь обогащают витаминами, и/или микроэлементами, и/или аминокислотами, и/или другими добавками, предназначенными для кормления животных, которые описаны выше в связи с композицией из пробиотиков по изобретению.
Гранулы по изобретению изготавливают способом, включающим следующие этапы:
- приготовление композиции или премикса из пробиотиков по изобретению,
- введение вышеупомянутой композиции или премикса в питательную смесь, адаптированную к виду животных, для которых она предназначена, преимущественно после латентного периода, продолжительностью, по меньшей мере, 14 дней;
- инжекцию водяного пара при температуре от 60°С до 100°С под давлением от 0,5 до 3,5 бар в ранее приготовленную смесь, и прессование.
Предпочтительно композиция или премикс, содержащие пробиотические микроорганизмы, оставляют в покое, по меньшей мере, на 15 дней, преимущественно на 1 месяц перед включением в питательную смесь.
В гранулах, полученных способом по изобретению, отмечается весьма высокая выживаемость микроорганизмов.
пг
дг
По конкретному способу осуществления выживаемость пробиотических микроорганизмов при грануляции можно оценить с помощью соотношения S, которое соответствует отношению числа КОЕ после грануляции (КОЕ) и числа КОЕ до грануляции (КОЕ), умноженному на 100. Выживаемость микроорганизмов в гранулах по настоящему изобретению такова, что величина соотношения S выше или равна 20%, предпочтительно выше или равна 50%, и наиболее предпочтительно выше или равна 70%.
Изобретение также относится к способу повышения стабильности гранул из пробиотиков, включающему приготовление композиции из пробиотиков или премикса, содержащих пробиотические микроорганизмы и клеточные стенки дрожжей, и/или дезактивированные дрожжи и при необходимости питательную добавку, содержащую, в частности, витамины, и/или микроэлементы, и/или аминокислоты, и/или другие добавки, предназначенные для кормления животных, при условии введения этой композиции в питательную смесь перед этапом грануляции посредством инжекции пара и прессования.
Как было сказано выше, обнаружилось, что устойчивость к температуре грануляции состоит, в частности, в увеличении или поддержании уровня содержания сухих веществ пробиотического микроорганизма, присутствующего в композиции по изобретению.
Гранулы по изобретению или гранулы, полученные способами по изобретению, предназначены для использования при кормлении животных.
Изобретение позволяет обеспечить контролируемое поступление пробиотических микроорганизмов, поскольку в итоге количество живых пробиотических микроорганизмов в корме для животного составляет, по меньшей мере, 20% от количества, использованного для приготовления композиции по изобретению или композиции для гранул.
Настоящее изобретение будет более конкретно описано и проиллюстрировано на приведенных ниже примерах и фигурах. Очевидно, что эти примеры даны только для иллюстрации объекта изобретения, для которого они ни в коей мере не являются ограничением.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: используемый материал
Примеры настоящего изобретения осуществлены с использованием следующего материала:
10
Пробиотические дрожжи - это дрожжи, выпускаемые под маркой BIOS AF (далее в примерах будет употребляться только термин BIOSAF). Продукт BIOSAF является концентратом живых клеток дрожжей Saccaharomyces cerevisiae, штамма Sc47, содержащим 1·10 КОЕ/г BIOSAF (NCYC 47). Этот продукт предназначен исключительно для кормления животных, он производится в форме микрогранул и обладает температурной устойчивостью при температуре до 80°С.
Использованные клеточные стенки дрожжей представляют собой клеточные стенки Saccaharomyces cerevisiae, которые были приготовлены с помощью автолиза с последующим центрифугированием.
Использованные дезактивированные дрожжи представляют собой клеточные стенки Saccaharomyces cerevisiae, которые были приготовлены с помощью термической обработки.
Физические свойства приведены в таблице 1 ниже.
Клеточные стенки дрожжей
Дезактивированные дрожжи
BIOSAF
Гранулометрия
Средний диаметр = 182,4 мкм, 68% частиц имеют диаметр от 80,6 до 412,8 мкм
Средний диаметр = 178,4 мкм, 68% частиц имеют диаметр от 103,9 до 306,4 мкм
Средний диаметр = 1354,2 мкм, 68% частиц имеют диаметр от 992,5 до 1847,8 мкм
Клеточные стенки дрожжей
Дезактивированные дрожжи
BIOSAF
Кажущаяся плотность, г/см<sup>3</sup>
0,452
0,629
0,797
Влажность, %
3,5
4,5
7,0
Пример 2
2.1 Приготовление премикса
Вручную готовят различные смеси (премиксы 1-3), состав которых приведен в таблице 2 ниже:
Материал
Премикс 1
Премикс 2
Премикс 3
Премикс 4
BIOSAF
14%
14%
14%
14%
Клеточные стенки дрожжей
14%
86%
-
-
Дезактивированные дрожжи
-
-
-
86%
Пшеничная мука
-
-
14%
Питательная добавка
72%
-
72%
-
Процент рассчитан по массе относительно общей массы премикса.
Премикс 3 соответствует композиции, входящей в состав гранул в соответствии с предыдущей методикой.
2.2 Динамика содержания сухого вещества
Содержание сухого вещества BIOSAF, присутствующего в каждом из премиксов 1-3, определяли по согласно официальному стандарту ISO 1741 в момент Т=1 день, 2 дня, 7 дней и 14 дней.
Вариация уровня содержания сухого вещества по Тесту А приведена в таблице 3 ниже:
T
0
0
V=[(DM-DM)/DM]×100
Премикс/время контакта
1 день
2 дня
7 дней
14 дней
Премикс 1
+0,1%
+0,5%
+0,6%
+0,7%
Премикс 2
+0,4%
+0,5%
+0,8%
+1,2%
Премикс 3
-0,9%
-0,9%
-1,0%
-1,2%
Важно отметить, что время контакта между BIOSAF и другими компонентами премикса играет главную роль, поскольку оно соответствует установлению равновесия влажности продуктов. Если фактор времени неблагоприятен для смеси BIOSAF - пшеничная мука, то в случае носителя премикса на базе клеточных стенок дрожжей и/или дезактивированных дрожжей он должен составлять минимум 14 дней.
Пример 3
Предшествующие исследования показали, что способ смешивания может привести к повреждению продукта BIOSAF и сделать его более подверженным к поглощению влаги из окружающей среды. В связи с этим было необходимо изготовить премикс из клеточных стенок дрожжей - BIOSAF в промышленных условиях, чтобы подтвердить положительное действие упомянутых клеточных стенок дрожжей.
3.1 Изготовление премикса промышленным способом
BIOSAF закладывают в бункер высотой 5-6 метров. В процессе изготовления дрожжи перемещают на расстояние 50 м к смесителю по вертикальному пневматическому транспортеру диаметром 10 см (перенос в плотной фазе). Напор воздуха (предварительно очищенного, высушенного и охлажденного) позволяет проталкивать продукт через транспортер посредством последовательных порций воздуха и продукта. На выходе из транспортера дозирующий ковш контролирует вес продукта перед подачей в смеситель с лопатками, куда одновременно вводится смесь. Используемый смеситель - это смеситель с лопатками, скорость его вращения составляет 120 об/мин и продолжительность смешивания - 60 секунд. Конечный премикс направляет к устройству для кондиционирования в мешках или россыпью.
Состав премиксов, изготовленных промышленным способом, приведен в таблице 4.
Материал
Премикс 1 бис
Премикс 3 бис
Премикс 5
BIOSAF
14%
14%
56%
Клеточные стенки дрожжей
14%
-
44%
Дезактивированные дрожжи
-
-
-
Пшеничная мука
-
14%
-
Питательная добавка
72%
72%
-
3.2 Динамика содержания сухого вещества
Динамику содержания сухого вещества в BIOSAF в этих различных премиксах в зависимости от времени определяли тем же способом, что и в примере 2.
Аналогично премиксам, приготовленным вручную, содержание сухого вещества BIOSAF снижается в премиксе, включающем пшеничную муку (премикс 3 бис): с 93% до 91,7%.
Содержание сухого вещества в премиксах по изобретению остается стабильным в премиксе 1 бис (14% клеточных стенок дрожжей), а в премиксе 5 (44% клеточных стенок дрожжей) повышается на 0,3% после месяца контакта.
Влияние клеточных стенок дрожжей на влажность BIOSAF не так велико, если смесь была приготовлена в промышленных условиях, тем не менее, не было отмечено снижения содержания сухого вещества BIOSAF, аналогичного снижению при использовании классических носителей премиксов (например, на базе пшеницы).
Пример 4
4.1 Изготовление гранул
Опыты по грануляции выполнялись на лабораторном прессе с фиксированной плоской дисковидной фильерой (пресс KAHL. 14 - 175,3 кВт, имеющий диаметр и толщину каналов, соответственно, 4 и 20 мм (то есть коэффициент сжатия 5)). Устройство для кондиционирования (INRA - Национальный институт агрономических исследований, Нант, Франция) с 32 вращающимися лопастями имеет длину 544 мм и вместимость 3,75 л. Двигатель мощностью 2,2 кВт управляется регулятором скорости, который контролирует производительность. Температура устанавливается на уровне устройства для кондиционирования (на 80° и 90°С).
В описанных выше условиях были изготовлены две партии гранул. Первая партия гранул была изготовлена при температуре вдувания водяного пара 80°С, а вторая партия - при температуре вдувания водяного пара 90°С.
Премиксы использовали сразу после из приготовления. Состав гранул приведен ниже.
Гранулы 1
Гранулы 2
Пшеница
29,3%
29,3%
Соевый жмых
25%
25%
Рапсовый жмых
20%
20%
Свекловичный жом
20%
20%
Меласса
3%
3%
Мочевина
2%
2%
Премикс 3 бис
0,7%
-
Премикс 5
-
0,7%
4.2 Исследование устойчивости к грануляции
Для каждой партии гранул определяли выживаемость BIOSAF. Результаты приведены ниже.
Гранулы
80°С
90°С
Гранулы 1
9,4%
2,6%
Гранулы 2
23,9%
5,4%
Способы расчета:
% устойчивости или выживаемость = количество оживляемых клеток в гранулах (в КОЕ/г)×100/количество оживляемых клеток в композиции для грануляции непосредственно перед грануляцией (в КОЕ/г).
Результаты показывают очень низкий уровень выживаемости, который свидетельствует о низкой устойчивости к грануляции дрожжей BIOSAF, включенных в премикс 5 по изобретению (гранулы 2).
Пример 5
Способом, аналогичным таковому в примере 4, были изготовлены гранулы с использованием премиксов 3 бис и 5, состав которых приведен в примере 3. Но эти премиксы были приготовлены за один месяц до грануляции.
Гранулы 1
Гранулы 3
Пшеница
29,3%
29,3%
Соевый жмых
25%
25%
Рапсовый жмых
20%
20%
Свекловичный жом
20%
20%
Меласса
3%
3%
Мочевина
2%
2%
Премикс 3 бис
0,7%
-
Премикс 5
-
0,7%
5.2 Исследование устойчивости к грануляции
Для каждой партии гранул устанавливали устойчивость к грануляции путем определения выживаемости дрожжей BIOSAF. Результаты приведены ниже.
Гранулы
80°С
Гранулы 1
4,6%
Гранулы 2
27,9%
Из полученных результатов следует, что гранулы, соответствующие изобретению, обладают устойчивостью к грануляции и, следовательно, в шесть раз более высокой выживаемостью.