Активность некоторых ключевых ферментов метаболизма в зеленых проростках ячменя при гипобарической гипоксии

С.А. Войцековская, Т.П. Астафурова, Г.С. Верхотурова, Т.А. Зайцева

АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА В ЗЕЛЕНЫХ ПРОРОСТКАХ ЯЧМЕНЯ ПРИ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

Работа выполнена при финансовой поддержке НП «Университеты России», проект № УР 07.01.400.

Исследовано влияние гипобарической гипоксии на активность ферментов различных метаболических путей в зеленых проростках ячменя в условиях освещения. Обнаружена активация работы ключевых ферментов дыхательных путей: гликолиза, спиртового брожения и пентозофосфатного цикла и фотосинтетического метаболизма в проростках ячменя в условиях гипо-барической гипоксии как в темноте, так и на свету. Компенсаторные перестройки обмена веществ у зеленых растений при дефиците кислорода связаны с трансформацией дыхательных путей и активацией ферментов темновой фазы фотосинтеза.

Изучение механизмов приспособления организмов к изменяющимся условиям среды обитания становится особенно актуальным в связи с глобальными изменениями климата, загрязнением окружающей среды, а также для решения различных практических задач. Способность растений произрастать в обедненной кислородом среде связана с формированием целого комплекса анатомо-морфологических и физио-лого-биохимических приспособлений, среди последних ведущая роль принадлежит приспособлениям процесса дыхания. Оптимальное для дыхания парциальное давление кислорода составляет 21%, снижение этого показателя отражается на уровне и структуре процесса дыхания. Качественные перестройки дыхания при недостатке кислорода представляют собой компенсаторные изменения в обмене веществ, выражающиеся в трансформации дыхательных путей, которые остаются недостаточно изученными, особенно для фотосинтезирующих органов растения.

При затоплении, образовании ледяной корки, создании асфальтовых покрытий в городах недостаток кислорода испытывают в первую очередь гетеротрофные органы растения. В высокогорных районах, при загрязнении атмосферы в условиях кислородной недостаточности оказывается целое растение. Адаптационные механизмы, обусловленные взаимодействием фото- и нефотосинтезирующих органов растительного организма, экспериментально можно изучать в условиях гипобарической гипоксии путем снижения парциального давления газов, среди которых наибольшее значение имеют кислород и углекислый газ.

Компенсаторные перестройки дыхательного метаболизма при недостатке кислорода в значительной степени отражают использование сформированных систем гликолиза и пентозофосфатного пути окисления глюкозы, поставляющих АТФ, достаточно большое количество промежуточных веществ для биосинтезов и биологических восстановителей [1]. О ходе адаптивных перестроек метаболизма в анаэробных условиях можно судить по изменению активности некоторых ключевых ферментов метаболизма. Целью настоящей работы являлось изучение активности ферментов дыхательного и фотосинтетического метаболизма при гипобарической гипоксии в зеленых проростках ячменя на свету и в темноте. В задачи работы входило:

1) определение активности заключительного энзима спиртового брожения алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1, АДГ) в условиях освещения при гипоксии;

2) исследование влияния гипобарической гипоксии на активность фермента пентозофосфатного пути глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49, Г-6-ФДГ);

3) сравнение работы одного из завершающих фермен-

тов гликолиза пируваткиназы (КФ 2.7.1.40, ПК) в условиях аэрации и анаэробиоза на свету и в темноте;

4) изучение действия гипобарической гипоксии на активность фотосинтетического фермента глицеральде-гидфосфатдегидрогеназы НАДФН-зависимой (КФ 1.2.1.13, ГАФДГ-НАДФН).

Объектом исследования служили 8-суточные зеленые проростки озимого ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Скороход. Растения выращивали при температуре воздуха 22-24°С под люминесцентными лампами интенсивностью 40 Вт/м2 с 12-часовым фотопериодом. Гипоксические условия достигались помещением растений в барокамеры с пониженным парциальным давлением кислорода (2 кПа) на 16 ч в условиях освещения или темноты. Контрольные группы растений выдерживали такое же количество времени при нормальной аэрации и атмосферном давлении на свету или в темноте. Количественное определение белка в растениях осуществляли по методу Бредфорда [2]. Изучение ферментативной активности проводили спектрофотометрически по изменению оптической плотности при 340 нм в ходе окислительно-восстановительных превращений НАД+ или НАДФ+ [3-5]. Результаты обрабатывали статистически [6].

Основной путь распада глюкозы в бескислородной среде - гликолиз, обеспечивающий клетку энергией. Возрастание активности гликолитических энзимов в анаэробных условиях наблюдали у многих растительных объектов [7]. Однако скорость переключения на гликолиз, предельный уровень и динамика различаются у растений, контрастных по устойчивости к гипоксии. У неустойчивых объектов увеличение активности гликолиза оказывается кратковременным. У приспособленных растений этот процесс при меньшей интенсивности осуществляется в течение продолжительного времени, что обеспечивает достаточное количество АТФ для поддержания синтетических реакций. Активность одного из ферментов гликолиза - ПК в проростках ячменя возрастала в 1,5 раза в условиях гипобарической гипоксии в темноте по сравнению с контролем при аэрации (табл. 1). В освещенных проростках ячменя гипоксия также индуцировала возрастание активности этого гликолитиче-ского энзима, хотя и в меньшей степени, чем в темно-вом варианте. Известно, что в ходе пируваткиназной реакции гликолиза путем субстратного фосфорилиро-вания образуется АТФ, необходимая для поддержания энергетического баланса.

Активность ферментов дыхательного метаболизма в проростках ячменя при нормальной аэрации и в условиях гипобарической гипоксии на свету или в темноте

Варианты Ферменты

пируваткиназа алкогольдегидрогеназа глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

мЕ/мг белка % мЕ/мг белка % мЕ/мг белка %

Аэрация, свет 45,3±3,25 100 111,4±5,43 100 2,6±0,16 100

Гипоксия, свет 55,3±4,85 122 428,3±20,13 384 14,4±0,62 554

Аэрация, темнота 33,6±1,20 100 123,3±6,06 100 1,3±0,15 100

Гипоксия, темнота 50,3±5,05 167 394,3±7,25 320 6,6±0,85 508

Примечание. Р ~ 8 кПа, Ро ~ 2 кПа. Освещенность 40 Вт/м2. Время экспозиции 16 ч. Все различия между контролем и опытом достоверны при р<0,05.

Поддержание высокой скорости гликолиза требует непрерывного реокисления восстанавливающихся в ходе его коферментов, которое в отсутствии кислорода как конечного акцептора электронов в электронтранспорт-ной цепи митохондрий может происходить у растений в конечных реакциях спиртового брожения. Этим можно объяснить значительное возрастание активности заключительного энзима спиртового брожения АДГ в проростках ячменя при гипобарической гипоксии. Если в условиях аэрации при нормальном атмосферном давлении активность АДГ составляла 123,3 мЕ/мг белка, то после 16-часовой гипобарической гипоксии в темновом варианте достигала 394,3 мЕ/мг белка, что составляет 320% к соответствующему контролю (табл. 1). Присутствие света во время гипоксического воздействия в барокамере усиливало протекание заключительной реакции брожения. Увеличение активности АДГ по восстановлению ацетальдегида в этанол должно приводить к накоплению этого токсичного конечного продукта брожения. Однако из литературных источников известно, что накопление этанола интенсивно нарастает только у неприспособленных к гипоксии растений. У приспособленных объектов его содержание постепенно стабилизируется вследствие протекания разнообразных адаптационных механизмов [1, 8].

К неспецифическим реакциям растений на различные неблагоприятные воздействия относится ускорение работы пентозофосфатного пути. Полагают, что в условиях кислородной недостаточности процессы гликолиза и апотомического распада осуществляются параллельно в силу тесной взаимосвязи [8]. Об усилении

Таким образом, обнаружена активация работы ферментов разных дыхательных путей: гликолиза (ПК), спиртового брожения (АДГ), пентозофосфатного цикла (Г-6-ФДГ) и фотосинтеза (ГАФДГ - НАДФН) в проростках ячменя в условиях гипобарической гипоксии как в темноте, так и на свету. Перестройки дыхательного метаболизма на анаэробный путь обмена в гетеротрофных

работы пентозофосфатного пути окисления глюкозы свидетельствует значительное возрастание активности его стартового энзима - Г-6-ФДГ, ускоряющего окисление глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконолактон. В проростках ячменя после 16-часового пребывания в анаэробной среде в условиях темноты наблюдали пятикратное увеличение активности Г-6-ФДГ по сравнению с темновым контролем при аэрации (табл. 1). Аналогичная тенденция наблюдалась и на свету, причем возрастание работы Г-6-ФДГ было даже более значительным, чем в темноте. Роль пентозофосфатного пути при дефиците кислорода состоит в образовании восстановителей и интермедиатов, необходимых для биосинтезов. Например, показано, что у ежовника, приспособленного к дефициту кислорода в его естественных условиях обитания, НАДФН из пентозофосфатно-го пути используется для синтеза жирных кислот [8].

Полученные данные по действию гипобарической гипоксии на дыхательный метаболизм зеленых проростков интересны с точки зрения внутриклеточных взаимоотношений органелл и влияния не только дыхания на фотосинтез, но и фотосинтеза на дыхание. Действительно, в экстремальных гипоксических условиях в зеленых листьях в темноте и на свету активируется фотосинтети-ческий фермент ГАФДГ-НАДФН (табл. 2). По-видимому, активация дыхательного метаболизма в клетках листа компенсирует дефицит СО2, НАДФН, АТФ и продуктов обмена и одновременно при непродолжительной гипоксии вызывает усиление фотосинтетической активности и стабилизацию первичных фотохимических реакций, локализованных в хлоропластах.

и автотрофных тканях растения, кооперация процессов дыхания и фотосинтеза позволяют поддерживать энергетический баланс клетки, ведут к образованию необходимого количества восстановителей и промежуточных соединений, необходимых для различных биосинтезов, что обеспечивает наряду с другими защитными реакциями устойчивость растений к гипоксии.

Т а б л и ц а 2

Активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы в проростках ячменя при нормальной аэрации и в условиях гипобарической гипоксии на свету или в темноте

Варианты мЕ/мг белка %

Аэрация, свет 188,7± 8,85 100

Гипоксия, свет 224,0±6,23 119

Аэрация, темнота 170,1±7,87 100

Гипоксия, темнота 259,7±7,45 153

Примечание. Р ~ 8 кПа, Ро ~ 2 кПа. Освещенность 40 Вт/м2. Время экспозиции 16 ч. Все различия между контролем и опытом достоверны при р<0,05.

ЛИТЕРАТУРА

1. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб.: Изд-во СПб. ун-та, 2002. 244 с.

2. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-due binding //

Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248.

3. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М.: Наука, 1980. 160 с.

4. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М.: Высшая школа, 1975. 397 с.

5. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. О направлении некоторых реакций цикла Кребса в зеленых листьях на свету // Физиология растений.

1983. Т. 30. С. 580-586.

6. Кузнецов В.Р. Методика ускоренного исчисления стандартного отклонения и ошибки средней // Социально-гигиенические исследования.

1970. С. 190-193.

7. Чиркова Т.В. Пути адаптации растений к гипоксии и аноксии. Л.: Изд-во ЛГУ, 1988. 244 с.

8. Семихатова О.А., Чиркова Т.В. Физиология дыхания растений. СПб.: Изд-во СПб. ун-та, 2001. 224 с.

Статья представлена лабораторией фотосинтеза НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета, поступила в научную редакцию «Биологические науки» 6 августа 2006 г., принята к печати 10 декабря 2006 г.