СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЛИСТЬЯХ ДУБА ЧЕРЕШЧАТОГО
METHOD FOR QUANTIFYING AMOUNT OF FLAVONOIDS IN LEAVES OF PETIOLATE OAK

Данное изобретение создано в рамках направления развития химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого (Quercus robur L.).
Вопрос стандартизации биологически активных соединений в лекарственном растительном сырье на сегодняшний день является весьма значимым в современной фармацевтической практике, а именно в процессе осуществления контроля качества. С этой целью необходимо разрабатывать новые и усовершенствовать имеющиеся методы количественного определения БАС как в сырье фармакопейном так и в перспективном но малоизученном сырье, каким является листья дуба черешчатого.
Изучение химического состава перспективных растительных объектов является важным направлением в современной фармации. Дуб черешчатый (Quercus robur L.) представитель семейства буковые (Fagaceae) является малоизученным растением, в качестве фармакопейного лекарственного растительного сырья (ЛРС) которого применяется кора [2, 3, 5]. Листья дуба черешчатого являются источником биологически активных соединений (БАС) фенольной природы, а именно флавоноидов - рутина. Однако в научной литературе, отсутствуют данные относительно вопросов количественного определения и стандартизации веществ флавоноидной природы в листьях дуба черешчатого.
Для листьев дуба черешчатого на сегодня отсутствуют методики спектрофотометрического определения флавоноидов. Однако, опираясь на имеющиеся данные фармакопейных методик анализа БАС в коре дуба черешчатого и исходя из данных о фитохимическом составе морфологических органах дуба черешчатого, мы предполагаем, что будет рациональным использовать спектрофотометрический метод определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого в пересчете на рутин, как на представителя группы флавоноидов.
Прототипом данной методики стал способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного, недостатком которого является невозможность его применения к листьям дуба черешчатого [7]. Поэтому, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого в пересчете на рутин.
Технический результат достигается тем, что получают водно-спиртовое извлечение из листьев дуба черешчатого путем однократной экстракции в течение 30 минут 80% этиловым спиртом воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, в соотношении «сырье-экстрагент» 1:50; количественное определение суммы флавоноидов проводят методом дифференциальной спектрофотомерии при длине волны 412 нм в пересчете на рутин и содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:
где:
х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;
m - масса сырья, г;
0
m - масса Государственного стандартного образца рутина, г;
W - потеря в массе при высушивании, %;
в случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 240:
где:
х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
240 - удельный показатель поглощения  Государственного стандартного образца рутина при длине волны 412 нм;
W - потеря в массе при высушивании, %.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно рутин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из листьев дуба черешчатого. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения дуба черешчатого наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (Фигура 1 в Приложении 1), как и в случае рутина (Фигура 2 в Приложении 2), где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из листьев дуба черешчатого или исходный раствор рутина соответственно, а кривая 2 -раствор водно-спиртового извлечения из листьев дуба черешчатого в присутствии алюминия хлорида или раствор рутина в присутствии алюминия хлорида соответственно.
Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор рутина, а кривая 2 -раствор рутина с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО рутина в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев дуба черешатого в дифференциальном варианте на фигуре 3 (Приложение 3) так же обнаруживается при длине волны 412 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора рутина.
Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого при аналитической длине волны 412 нм.
Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 (Приложение 4) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев дуба черешчатого от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 80% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 (Приложение 5) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев дуба черешчатого от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 30 минут.
В таблице 3 (Приложение 6) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев дуба черешчатого от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы 3 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
В таблице 4 (Приложения 7) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев дуба черечшатого от степени измельчения листьев. Из таблицы 4 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при степени измельчения - 2 мм.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 80% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 30 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, оптимальная степень измельчения - 2 мм.
Следует обратить внимание, что для листьев дуба черешчатого рутин не является специфичным веществом, однако пересчет на него производился исходя из схожих максимумов поглощения раствора рутина и водно-спиртового извлечения листьев дуба черешчатого находятся в области 412 нм и характерного для рутина кратковолнового и длинноволнового спектров, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин при длине волны 412 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья листьев дуба черешчатого измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г точной навески измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 80% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через фильтр с красной полосой.
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца рутина.
Около 0,0207 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б рутина). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
D - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;
m - масса сырья, г;
0
m - масса Государственного стандартного образца рутина, г;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
В случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 240:
где:
D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - масса сырья, г;
240 - удельный показатель поглощения  Государственного стандартного образца рутина при 412 нм;
W - потеря в массе при высушивании в процентах.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Аналитическую пробу сырья листьев дуба черешчатого (заготовлено в Самарской области, Похвистневский район, с. Первомайск, июль-август 2019 г. ) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. 1,0116 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 80% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).
Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца рутина
0,0207 г рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
Содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
где:
0,6649 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,4472 - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;
1,0116 - масса сырья, г;
0,0207 - масса стандартного образца рутина, г;
6,9 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин х=1,65%.
Пример 2.
При необходимости определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого в отсутствии стандартного образца рутина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца рутина.
После измерения оптической плотности извлечения из листьев дуба черешчатого при длине волны 412 нм, содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения рутина, равное 240:
где:
0,6649 - оптическая плотность испытуемого раствора;
1,0116 - масса сырья, г;
240 - удельный показатель поглощения  стандартного образца рутина при 412 нм;
6,9 - потеря в массе при высушивании в процентах.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин х=1,83%, что сопоставимо со значением, полученном в примере 1 в пределах погрешности (±0,18).
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±11,1%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях дуба черешчатого с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно 80% этиловым спиртом, позволяющим исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для листьев дуба черешчатого вещество флавоноидной природы - рутин, определяющее характер кривой поглощения в УФ-спектре испытуемого раствора (длина волны 412 нм)
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±11,1%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа листьев дуба черешчатого.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
1. Губанов И.А., Киселева К.В., Новиков B.C., Тихомиров В.Н., Иллюстрированный определитель растений Средней России. Т. - 2: Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные). М: Т-во научных изданий КМК, Ин-т технологических исследований. - 2003. - С. 34.
2. ГФ РФ XIV издания / ФС.2.5.0071.18 Дуба кора Quercus cortex. - М: Минздрав РФ. - 2018. - С. 6029-6033.
3. Кароматов И.Д., Махмудова Г.Ф.К. Дуб обыкновенный - применение в лечебной практике // Биология и интегративная медицина. - 2016. - №3. - С. 41-47.
4. Киселева Т.Л., Смирнова Ю.А. Лекарственные растения в мировой медицинской практике: государственное регулирование номенклатуры и качества. - М.: Издательство профессиональной ассоциации натуротерапевтов. - 2009. - С. 183-184.
5. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов) / В.А. Куркин. - 4-е, перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2019. - 966-969 с.
6. Куприянова Е.А., Куркин В.А. Разработка подходов к стандартизации листьев тополя черного // Аспирантский вестник Поволжья. - 2018. - №5-6. - С. 17-21. doi:10.17816/2072-2354.2018.18.3.17-21
7. Патент РФ №2701726 01.10.2019. Способ количественного определения суммы фдавоноидов в листьях тополя черного.