Роль мю-опиоидных рецепторов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии

КАРДИОЛОГИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

УДК 616.001.16-092.19

Т. В. Ласукова, Л. Н. Маслов, С. В. Низкодубова, А. С. Горбунов,

Е. Жан, Т. Криг

РОЛЬ МЮ-ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ СЕРДЦА К ДЕЙСТВИЮ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ

Исследовали эффект активации ц-опиоидных рецепторов (OP) in vivo и in vitro на толерантность изолированного перфузируемого сердца крыс к глобальной ишемии (45 мин) и реперфузии (30 мин). Стимуляция ц-OP in vivo путем внутривенного введения агониста DAMGO уменьшала реперфузионный выброс креатинкиназы по сравнению с контрольной группой. Кардиопротекторный эффект не проявлялся после блокады -OP. Активация ц-OP in vitro с помощью добавления в перфузионный раствор до ишемии селективных агонистов DAMGO или DALDA в концентрации 170 нМ существенно не отразилась на сохранении целостности мембран кардиомиоци-тов. В то же время испольование ц-агониста DALDA в меньшей концентрации (33 нМ) сопровождалось выраженным цитопротекторным эффектом. Таким образом, активация ц-рецепторов обеспечивает увеличение устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям, которое зависит от способа введения и используемой концентрации препарата.

Ключевые слова: мю-опиоидныерецепторы, изолированное сердце, ишемия, реперфузия.

К настоящему времени накопился достаточно большой фактический материал, свидетельствующий о способности агонистов опиоидных рецепторов (ОР) увеличить выживаемость кардиомиоцитов при инфаркте миокарда [1-4]. В частности, согласно результатам Лишманова с соавт. [2], введение животным с экспериментальным инфарктом миокарда опиоидных пептидов (лей-энкефалина, мет-энкефалина, Р-эндор-фина) способствует существенному снижению степени повреждения сердечной мышцы. В работах проф. G. Gross установлено, что активация ц-опиоидных рецепторов с помощью морфина способствует ограничению размера зоны некроза при экспериментальной коронароокклюзии [3, 4]. Существуют данные о наличии цитопротекторных свойств лигандов 8-ОР [5-8]. На изолированных кардиомиоцитах группой ученых под руководством Y. Takasaki обнаружен кардиопротекторный эффект 8-агониста Мет5-энкефали-на [8]. На модели коронароокклюзии и реперфузии изолированного сердца крыс установлен защитный эффект другого неселективного 8-агониста [5]. Другими зарубежными авторами [9] показано защитное действие агонистов к-ОР. Таким образом, можно считать доказанным тот факт, что опиоидные рецепторы играют важную роль в регуляции устойчивости кар-диомиоцитов к действию ишемии-реперфузии. Однако остается спорным вопрос о том, где - в миокарде или других органах - расположены эти ОР. Кроме того, роль того или иного типа ОР в этом процессе также не до конца понятна. В своей работе мы иссле-

довали значение ц-опиоидных рецепторов в регуляции резистентности изолированного перфузируемого сердца к действию глобальной ишемии и реперфузии, а также локализацию опиоидных рецепторов, обеспечивающих устойчивость миокарда к патогенному действию ишемии и реперфузии.

Цель данной работы - изучить влияние активации ц-опиоидных рецепторов in vivo и in vitro на степень развития некротических повреждений кардиомиоци-тов при ишемии и реперфузии сердца крыс.

Методика

Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г. После торакотомии сердце быстро извлекали и немедленно помещали в охлажденный (+40 °С) раствор Кребса-Хензелайта. После прекращения спонтанных сокращений сердце помещали в термо стабилизируемую увлажненную камеру. В восходящую дугу аорты вводили канюлю, через которую поступал физиологический раствор. Ретроградную перфузию сердца проводили по методу Ланген-дорфа по открытому контуру раствором Кребса-Хензелайта, насыщенным карбогеном (+37 °С, рН=7.4) и содержащим (в мМ): NaCl - 120; KCl - 4.8; CaCl2 -2.0; MgSO4 - 1.2; KH2PO4 - 1.2; NaHCO3 - 20.0; глюкоза - 20.0. Для приготовления этого раствора применялись реагенты компании «Sigma» (St.Louis, США). Тотальную ишемию миокарда моделировали посредством полного прекращения подачи перфузи-онного раствора на 45 мин. После этого возобновляли перфузию и продолжали наблюдение в течение 30

мин. Стимуляцию ц-рецепторов in vivo осуществляли с помощью внутривенного введения селективного агониста этих рецепторов H-Tyr-D-Ala-Gly-N-Me-Phe-Gly-ol (DAMGO) в дозе 0,1 мг/кг за 15 мин до выделения сердца. Сердца этих крыс после стабилизационного периода (20 мин) подвергали ишемии (45 мин) и реперфузии (30 мин). Активацию ц-рецепто-ров in vitro проводили путем добавления DAMGO или селективного ц-агониста NH2-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (DALDA) в перфузионный раствор в конечной концентрации 170 и 33 нМ/л. По окончании 20 мин адаптации к условиям нормоксической перфузии сердца перфузировали в течение 15 мин раствором Кребса-Хензелайта, содержащим DAMGO или DALDA в указанной концентрации, затем - 15 мин без препаратов, после чего моделировали тотальную ишемию (45 мин) и реоксигенацию (30 мин). Опиоидные пептиды были синтезированы в компании Multiple Peptide Systems (США). Контролем служили изолированные сердца интактных животных. Степень повреждения кардио-миоцитов оценивали по уровню креатинфосфокина-зы (КФК) в оттекающем от сердца перфузате. Активность КФК определяли с помощью энзиматического набора «NAC-activated CK47-20 kit» (Sigma, США) и пересчитывали на 1 г ткани сердца.

Результаты экспериментов обработаны статистически с применением критерия Манна-Уитни.

Результаты исследования

В контрольной серии активность креатинкиназы в перфузате, оттекающем от сердца, при реперфузии возросла в 4.5 раза по сравнению с исходными дои-шемическими значениями (рисунок), что согласуется с литературными данными о повреждении сарколеммы кардиомиоцитов в реоксигенационном периоде [6]. Предварительная активация ц-рецепторов с помощью внутривенной инъекции DAMGO никак не повлияла на исходный, фоновый уровень креатин-фосфокиназы (КФК) в доишемическом периоде (рисунок), но при этом оказывала выраженный кардио-протекторный эффект при ишемии-реперфузии. Об этом свидетельствовало двукратное снижение активности данного маркера повреждения мембран кардио-миоцитов в перфузионном растворе, оттекающем от сердца в период реперфузии (рисунок).

Для того чтобы убедиться в ц-рецепторной специфичности обнаруженных эффектов, были проведены эксперименты с использованием селективного бло-катора этих рецепторов СТАР. В результате было установлено, что обнаруженный нами цитопротекторный эффект DAMGO имеет специфический характер, поскольку предварительная селективная блокада ц-ре-цепторов полностью его устраняла (рисунок). Как видно из рисунка, кардиопротекторный эффект DAMGO не удавалось воспроизвести, если введение данного агониста ц-ОР проводилось на фоне предварительной блокады ц-ОР с помощью СТАР. Антаго-

U/r 25

20

15 -

10

5 -

Контроль DAMGO CTAP CTAP+ Контроль DAMGO CTAP CTAP+ DAMGO DAMGO

U/r

25-

Исходные значения до ишемии

20-

15-

10-

5 -

Во время реперфузии ## ##

## __________!_

_L

rT^É

# * _I_

Контроль DAMGO DALDA DALDA Контроль DALDA DALDA DAMGO 170 нМ 170 нМ 33нМ 33 нМ 170 нМ 170нМ

Влияние стимуляции ц-рецепторов in vivo (а)и in vitro ( б)на активность креатинфосфокиназы в перфузионном растворе до ишемии и во время реперфузии. *-P0.O5 по сравнению с контролем;#Р0.О5; #P0.O1 по сравнению с исходными значениями

нист ц-ОР СТАР сам по себе не влиял на уровень КФК в перфузате (рисунок, а).

Таким образом, активация ц-рецепторов in vivo эффективно предупреждает возникновение реперфу-зионного «оглушения» сердца in vitro. Исходя из сказанного логично было предположить, что отмеченные нами эффекты обусловлены активацией кардиальных ц-рецепторов. Для того чтобы подтвердить или опровергнуть это предположение, мы провели серии экспериментов с добавлением селективных лигандов этих рецепторов DAMGO и DALDA в перфузионный раствор перед моделированием ишемии.

После 10 мин перфузии изолированного сердца раствором, содержащим DAMGO в конечной концентрации 170 нМ, кардиопротекторного эффекта мы не отметили. В этой серии экспериментов уровень реперфузионного выхода креатинкиназы в оттекающий от сердца раствор достоверно не отличался от такового в контроле, хотя имелась тенденция к снижению активности этого показателя (рисунок, б). Применение другого селективного агониста ц-рецеп-торов DALDA in vitro в конечной концентрации 170 нМ также не оказало кардиопротекторного действия (рисунок, б). Однако совершенно иная картина наблюдалась при использовании DALDA в меньшей концентрации - 33 нМ. В этой серии экспериментов предва-

а

0

6

0

рительная перфузия изолированного сердца раствором, содержащим пептид в указанной концентрации, способствовала значительному снижению степени ишемического и реперфузионного повреждения кар-диомиоцитов. Как показано на рисунке, активность креатинкиназы в оттекающем от сердца во время реперфузии растворе оказалась в 1.5 раза меньшей соответствующих величин в контроле (рисунок, б).

Обсуждение результатов

Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что активация ц-рецепторов in vivo и in vitro способствует повышению устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным воздействиям. Об этом свидетельствует снижение степени повреждения кардиомиоцитов во время реперфузии по сравнению с контролем. Отмеченное в наших экспериментах кар-диопротекторное действие DAMGO при его внутривенном применении, можно, на наш взгляд, объяснить следующим образом.

Известно, что предварительное введение опиоидов (in vivo) способствует «ингибированию» процессов пероксидации липидов в изолированных сердцах [10]. Основываясь на литературных данных о роли свободных радикалов в формировании ишемических и реперфузионных повреждений миокарда [11], можно предположить, что подавление процессов свободнорадикального окисления липидов вносит существенный вклад в кардиопротекторное действие опи-оидов. С другой стороны, доказана тесная взаимосвязь свободнорадикального окисления липидов с циклооксигеназным обменом арахидоновой кислоты [12]. Опубликованные нами ранее данные свидетельствуют о том, что стимуляция ц-рецепторов in vivo способствует увеличению содержания простацикли-на в плазме крови и миокарде [13]. Одновременно отмечалось снижение содержания тромбоксана в крови и ткани сердца [13]. Такое изменение баланса про-станоидов способствует повышению толерантности сердца к ишемическим и реперфузионным воздействиям. В пользу высказанной точки зрения свидетельствуют данные о кардиопротекторной активности простациклина в условиях ишемии и реперфузии сердца [14, 15] и о кардиопатогенной роли тромбоксана в генезе ишемических и реперфузионных повреждений сердца [16]. С другой стороны, существуют данные о том, что опиоиды способны модулировать секрецию ряда гормонов и биологически активных соединений, в частности предсердного натрийуретичес-кого пептида [17]. Показано, что стимуляция ц-рецеп-торов способствует многократному увеличению уровня предсердного натрийуретического пептида в крови [17]. Важно отметить, что этот пептид способен

повышать толерантность миокарда к ишемии [18]. Возможно, что натрийуретический пептид принимает участие в механизме кардиопротекторного действия ц-агониста DAMGO in vitro.

В экспериментах с добавлением ц-агонистов в перфузионный раствор мы получили достаточно неоднозначные результаты. Так, применение селективных агонистов ц-ОР DAMGO или DALDA в концентрации 170 нМ, существенно не отразилось на сохранении целостности мембран кардиомиоцитов. В этом случае нами была зарегистрирована лишь тенденция к снижению выхода креатинкиназы в перфузионный раствор. Данный факт хорошо согласуется с результатами исследований, проведенных нами ранее [10], в которых было показано, что более выраженное «ан-тиоксидантное» действие на изолированное сердце эн-кефалины проявляли не при введении в перфузион-ный раствор, а только при их предварительном внутривенном введении [10]. Кроме того, уровень про-стациклина в миокарде также увеличивался лишь при in vivo-активации опиоидных рецепторов [10]. В то же время использование агониста ц-рецепторов DALDA в меньшей концентрации (33 нМ) сопровождалось выраженным цитопротекторным эффектом. Можно предположить, что кардиопротекторный эффект этого пептида связан с активацией кардиальных ц-рецепторов, а исчезновение этого защитного эффекта при увеличении концентрации агониста могло быть результатом активации неопиоидных рецепторов опиоидных пептидов [19, 20]. В пользу подобной точки зрения свидетельствуют данные о том, что некоторые эффекты ц-агонистов являются результатом их взаимодействия с неопиоидными рецепторами [19, 20]. С аналогичной ситуацией столкнулась группа исследователей, возглавляемых L. H. Opie, которым в экспериментах на изолированном сердце также удалось обнаружить кардиопротекторное действие ц-агонис-та DADLE в низких концентрациях и исчезновение данного эффекта при увеличении содержания этого пептида в перфузионном растворе [5].

Таким образом, активация ц-рецепторов обеспечивает увеличение устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям, которая характеризуется снижением степени постишемической деструкции кардиомиоцитов. Агонисты ц-ОР, в зависимости от способа введения и используемой концентрации, оказывают неоднозначные эффекты на степень повреждения миокарда при ишемии и реперфузии.

Работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования и науки РФ (рег. № 2.1.1/210), Российского фонда фундаментальных исследований, Федерального агентства по науке и инновациям.

Список литературы

1. Slepushkin W. D., Pavlenko V. S., Zoloev G. K., Lasukova T. V. The role of enkephalins of acute myocardial infarction // Exp. Pathology. 1988. V. 35. No 2.

2. Лишманов Ю. Б., Маслов Л. H. Киоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защга сердца. Томск, 1994. 352 с.

3. Schultz J. J. et al. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the

rat heart // Circ. Res. 1996. V. 78.

4. Schultz J. J. et al. Ischemic preconditioning in the intact rat heart is mediated by 5,- but not |i- or к-opioid receptors

// Circ. Res. 1998. V. 97.

5. Aitchison K. A., Baxter G. F., Awan M. M. et al. Opposing effects on infarction of delta and kappa opioid receptor activation in the isolated rat heart: implications for ischemic preconditioning // Basic Res. Cardiol. 2000. V. 95.

6. Kark M. et al. Myocardial protection by ischemic preconditioning and delta opioid receptor activation in the isolated working rat heart // J. of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 2001. V. 91.

7. Fryer R. M., Wang Y., Hsu A. K., Gross G.J . Essential activation of PKS-d in opioid-initiated cardioprotection // Am. J. Physiol. 2001.

V. 280. No 3.

8. Takasaki Y., Wolf R. A., Chien G. L., Van Winkle D. M. Met5-enkephalin protects isolated adult rabbit cardiomyocytes via d-opioid receptors // Am. J. Physiol. 1999. V. 277.

9. Peart J. N. et al. Effect of exogenous kappa-opioid receptor activation in rat model of myocardial infarction // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2004. V. 43. No 3.

10. Лишманов Ю. Б., Реброва Т. Ю., Афанасьев С. А., Кравченко А. И. Влияние синтетических энкефалинов на синтез простагландинов и перекисное окисление липидов в изолированном сердце при активации свободнорадикальных процессов // Бюл. экспер. биол. мед. 1993. № 11.

11. Levraut J., Iwase H., Shao Z-H. et al. Cell death during ischemia:relationship to mitochondrial depolarization and ROS generation // Am. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003. V. 284.

12. Herbaczynska-Cedro K., Cordon-Majszak W. Attenuation by prostacyclin of adrenaline-stimulated lipid peroxidation in the myocardium// Pharmacol. Res. Commun. 1986. V. 18. No 4.

13. Маслов Л. H., Нарыжная H. В., Барбараш H. Л., Лишманов Ю. Б. Механизмы устойчивости сердца к стресс-индуцированным повреждениям // Рос. Физиол. журн. 1997. Т. 3. № 3.

14. Darius H., Osborne J. A., Reibel D. K., Lefer A. M. Protective actions of a stable prostacyclin analog in ischemia induced membrane damage in rat myocardium // Mol. Cell. Cardiol. 1987. No 3.

15. Ledda F. et al. Indirect evidence for a role prostaglandins as second messengers of the prejunctional effect of opioids in guinea-pig ventricular preparations // Eur. J. of Pharmacol. 1989. V. 162.

16. Wanlinsky P., Smith J. B., Lefer A. M. et al. Thromboxane A2 in acute myocardial infarction // Heat J. 1984. V. 108.

17. Vollmar A. M. et al. The effect of opioids on plasma atrial natriuretic peptide // Eur. J. of Pharmacol. 1987. V. 143.

18. Takata Y., Hirayama Y., Kiyomi S., Ogawa T. The beneficial effects of atrial natriuretic peptide on arrhythmias and myocardial hingh-energy phosphates after reperfusion // Cardiovasc. Res. 1996. V. 32.

19. Llobell F., Laorden L. Characterization of the opioid receptor subtypes mediating the negative inotropic effects of DAMGO, DPDPE and U-50, 488H in isolated human right atria strips // Neuropeptides. 1995. V. 29.

20. Wu D., Soong Y., Zhao G-M., Szeto H. H. A highly peptide analgesic that protects against ischemia-reperfusion-induced myocardial stunning // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2002. V. 283.