Неинвазивный способ оценки интенсивности апоптотических процессов у больных сахарным диабетом 1 типа
NON-INVASIVE METHOD FOR ASSESSING INTENSITY OF APOPTOTIC PROCESSES IN TYPE 1 DIABETES MELLITUS PATIENTS

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической диагностике, и может быть использовано для неивазивного выявления и оценки динамики течения сахарного диабета 1 типа.
Гипергликемия при сахарном диабете 1 типа приводит к усилению свободнорадикального окисления биомолекул [Павлюченко И.И., Басов А.А., Быков И.М., Орлова С.В. Интегральные методы оценки уровня эндогенной интоксикации и перекисного окисления биомолекул при острых и хронических заболеваниях // Аллергология и иммунология. – 2004. – Т. 5. – № 4. – С. 551–554.], что оказывает негативное влияние на ткани, снижая потенциал их антиоксидантной защиты, особенно в крови и ротовой жидкости [Esper R.J., Vilarino J.O., Machado R.A. Endothelial dysfunction in normal and abnormal glucose metabolism // Adv. Cardiol. – 2008. – V. 45. – P. 17–43.]. Окислительный стресс, развивающийся в результате дисбаланса функционирования антирадикальной защиты и чрезмерной выработки активных форм кислорода, запускает апоптотические механизмы повреждения β-клеток и тем самым ускоряет прогрессирование сахарного диабета [Prentki M., Nolan C.J. Islet β cell failure in type 2 diabetes. J Clin Inv 2006; 116: 7: 1802—1812.]. Известно, что апоптоз включает себя несколько стадий: стадия индукции апоптоза, эффекторная стадия апоптоза и стадия, непосредственно, реализации апоптоза [Adams J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis / J.M. Adams // Genes and Development/ - 2003. – N 17. – P. 2481 – 2495].
Известно, что слюна в достаточном количестве содержит такие биомаркеры окислительного стресса, как 8-оксо-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG) и супероксиддисмутаза (СОД) [Buczko P., Zalewska A., Szarmach I., “Saliva and oxidative stress in oral cavity and in some systemic disorders,” Journal of Physiology and Pharmacology, vol. 66, no. 1, pp. 3–9, 2015.].
Таким образом, слюна может быть использована в качестве тест объекта, который позволит осуществлять систематический мониторинг и неинвазивный скрининг состояния апоптотических процессов в организме больных сахарным диабетом 1 типа.
Для оценки сложившейся патентной ситуации авторами выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2019 гг. Анализ документов произведен по направлению: неинвазивный способ оценки интенсивности апоптотических процессов у больных сахарным диабетом 1 типа. Оценка апоптотических процессов в организме больных сахарным диабетом 1 типа произведена на основе данных о концентрации 8-оксо-2'-дезоксигуанозина и активности супероксиддисмутазы в слюне.
Существует способ диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом с помощью оценки интенсивности апоптоза лимфоцитов по патенту РФ №2452965. Изобретение может быть использовано для диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития хронических осложнений у больных сахарным диабетом. Недостатком данного метода является то, что, во-первых, используются клетки крови, что является инвазивным способом, кроме того, с помощью данного способа можно спрогнозировать только риск развития осложнений.
Известен метод для прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом, основанный на выделении ДНК из периферической венозной крови, при этом проводят анализ полиморфизма -308G/A гена фактора некроза опухоли α и выявления аллеля -308A TNFα (патент РФ 2507520). К недостаткам данного метода, как и предыдущего подхода, относятся инвазивность и возможность прогноза только риска развития осложнений при сахарном диабете. Также следует отметить, что фактор некроза опухоли α относится к воспалительным цитокинам, и по его уровню нельзя достоверно судить об активности апоптотических процессов.
Известен способ, позволяющий диагностировать диабет по инфракрасным (ИК) спектрам поглощения слюны здорового и больного сахарным диабетом человека [David A Scott, Diane Е Renaud, Sathya Krishnasamy, Pinar, Nurcan Buduneli, Kan-Zhi Liu Diabetes-related molecular signatures in infrared spectra of human saliva // Diabetology & Metabolic Syndrome. 2010. V. 2:48.]. Способ заключается в том, что проводится забор проб слюны человека; записываются ИК-спектры полос поглощения слюны здорового и больного диабетом человека с помощью метода ИК-Фурье спектроскопии; по разнице ИК-спектров диагностируют диабет второго типа.
Необходимо отметить относительную неточность данного метода, так как разница ИК-спектров полос поглощения слюны здорового и больного сахарным диабетом человека не может служить достоверным критерием для диагностики данного заболевания.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не обнаружен неинвазивный способ оценки интенсивности апоптотических процессов у больных сахарным диабетом 1 типа на основе данных о концентрации 8-оксо-2'-дезоксигуанозина и активности супероксиддисмутазы в слюне. В связи с этим интерес представляет определение активности апоптотических процессов в организме больных сахарным диабетом 1 типа с использованием слюны с целью разработки простого неивазивного способа мониторинга и контроля эффективности терапии.
Технический результат – повышение точности и сокращение времени ранней диагностики апоптических процессов в организме больных сахарным диабетом 1-го типа. Заявленный способ позволяет выполнить неинвазивную экспресс-диагностику сахарного диабета 1 типа.
Предлагаемая методика основана на том, что в слюне группах здоровых доноров и больных сахарным диабетом 1 типа определяют активность супероксиддисмутазы (СОД) и концентрацию 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG). На основе полученных данных рассчитывают коэффициент активности апоптотических процессов.
Обоснованием для предлагаемого способа явились результаты, полученные при изучении показателей двух групп исследуемых:
1-я группа – условно здоровые доноры;
2-я группа - больные сахарным диабетом 1 типа, длительность заболевания более 5 лет.
Слюну берут утром натощак после ополаскивания ротовой полости водой комнатной температуры. Сбор слюны производят в объеме не менее миллилитра, например, с использованием стоматологического тампона. Сразу после забора проб тампоны со слюной помещают в пробирки-слюносборники и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут.
Активность супероксиддисмутазы (СОД) в 1 мл слюны определяют по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия в неэнзиматической системе феназинметасульфата и НАДН [Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа. Вопр. мед. химии. 1994; 40 (2): 56—58.].
Определение содержания 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG) в 1 мл слюны проводят методом конкурентного иммуноферментного анализа. Измерение концентрации 8-оксо-2'-дезоксигуанозина в пробах производят с помощью анализатора иммуноферментных реакций АИФР-01 УНИПЛАН.
а
Рассчитывают коэффициент активности апоптотических процессов (К) по следующей формуле:
8-OHdG
СОД
где  С – концентрация 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (нг/мл), а Е – активность супероксиддисмутазы (Е/мл).
Результаты расчетов исследованных групп представлены в таблице.
*
Примечание: - статистически значимые различия показателей между больными сахарным диабетом 1 типа и практически здоровыми лицами.
а
При анализе полученных данных выявлено повышение концентрации 8-оксо-2'-дезоксигуанозина и снижение активности супероксиддисмутазы в слюне у больных сахарным диабетом 1 типа (p<0,05) по сравнению с контролем, что свидетельствует об интенсификации апоптотических процессов  при снижении активности антиоксидантной системы организма, приводящей к свободнорадикальному повреждению ДНК (Таблица 1). Таким образом, данные показатели характеризуются обратно пропорциональной зависимостью, что положено в основу расчета коэффициента апоптотических процессов (К).
а
Коэффициент апоптотических процессов (К) в контрольной группе – 0,06±0,004 (границы доверительного интервала при P= 0,95: 0,054 - 0,064), у больных с сахарным диабетом 1 типа – 0,26±0,008 (границы доверительного интервала при P= 0,95: 0,252-0,268). Различия статистически значимы.
а
а
а
Таким образом, значение коэффициента активности апоптотических процессов (К) 0,064 и менее соответствует отсутствию апоптических процессов в организме. Диапазон значений К от 0,065 до 0,251 свидетельствует об индукции апоптоза. Диапазон значений К выше 0,251 соответствует стадии реализации апоптоза в организме, в результате  свободнорадикального повреждения ДНК при сахарном диабете 1 типа.
Соотношение супероксиддисмутазы и 8-оксо-2'-дезоксигуанозина в слюне характеризует отсутствие или наличие апоптических процессов в организме больных сахарным диабетом 1 типа, показывает развитие клинической картины заболевания.
Предлагаемый способ поясняется следующими клиническими примерами.
Пример 1
Обследуемый Ч. (40 л.). Отмечает хорошее самочувствие и отсутствие каких-либо жалоб. Удовлетворительные результаты общего клинического осмотра. Биохимические показатели углеводного и липидного обмена соответствуют норме. Уровень гликозилированного  гемоглобина в крови 5 % (уровень глюкозы 5,3 ммоль/л)
а
а
Анализ результатов с применением заявленного способа у обследуемого Ч. выявил следующие показатели в слюне: концентрация 8-OHdG – 7,98 нг/мл, активность СОД - 130,1 Е/мл, коэффициент апоптических процессов (К) – 0,061. Результат соответствует диапазону значений К, характерным для практически здорового человека 0,054 - 0,064.
Пример 2
Больной Г. (33 г.). Диагноз: сахарный диабет, тип 1, стадия декомпенсации. Длительность заболевания 6 лет. Уровень  гликозилированного  гемоглобина в крови 8 % (уровень глюкозы 10,2 ммоль/л), нормальные значения углеводного обмена превышены. Предъявляет жалобы на сухость во рту, жажду, быструю утомляемость, головную боль, головокружение, шум в ушах.
а
а
Анализ результатов с применением заявленного способа у обследуемого Г. выявил следующие показатели в слюне: концентрация 8-OHdG – 19,34 нг/мл, активность СОД - 75,3 Е/мл, коэффициент апоптических процессов (К) – 0,257. Результат соответствует значениям К, свойственным больным сахарным диабетом 1 типа в стадии реализации апоптоза (0,252-0,268).