СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАН-НУКЛЕИНОВОГО ГИДРОЛИЗАТА
METHOD TO PRODUCE CHITOSAN-NUCLEIC HYDROLYSATE

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения белково-нуклеиновых гидролизатов из рыбного сырья, и может быть использовано в рыбной, мясной и других отраслях пищевой промышленности, а также в медицине, биохимии и сельскохозяйственном производстве.
Анализ научно-технической и патентной документации показал, что существуют различные способы получения комплекса биологически активных продуктов. В основном, это получение белковых гидролизатов, содержащих биологически ценные вещества, такие как аминокислоты, дезоксинуклеозиды, олигонуклеотиды и др.
Однако главный недостаток известных способов заключается в том, что в результате полученные нуклеиновые продукты имеют низкий потенциал использования. В силу того, что они имеют высокую молекулярную массу, трансфекция (доставка) этих веществ непосредственно в клетку организма ограничена. Необходима компактизация таких молекул. Для этого часто используют катионные полимеры, которые способствуют этому процессу. Однако применение этих систем ограничено из-за плохой биосовместимости. Поэтому создание биосовместимых комплексных полимерных систем - актуальная задача в области биомедицины, косметологии и др. отраслях.
Известен способ получения пептидов/аминокислот из сырья, содержащего белок. Способ включает измельчение сырья и нагрев его, добавление воды и гидролиз с помощью эндогенных ферментов. При этом необходимым условием гидролиза является использование щелочных ферментов. Оптимальная ферментация осуществляется при рН 7,6-8,2 при температуре 44-45°С. Для прекращения гидролиза используют повышенную температуру, выше 70°С. Полученный гидролизат подвергают мембранной фильтрации для выделения фракции пептидов/аминокислот желаемого молекулярного веса. Гидролизатный фильтрат концентрируют до желательного уровня концентрации пептидов и аминокислот (п. РФ №2333663, A23J 3/04, 2006).
Главным недостатком известного способа является многостадийность процесса и нерациональное использование сырья, поскольку в процессе получения пептидов/аминокислот отводятся ценные продукты гидролиза, в частности, ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота).
Кроме того, использование щелочной среды для гидролиза также является негативным фактором, поскольку щелочная среда способствует развитию микрофлоры, и приходится использовать УФ-облучение или другое, что усложняет производственный процесс.
Известен способ получения продукта, обогащенного свободными аминокислотами путем ферментативного гидролиза белоксодержащего сырья. Способ осуществляют путем ферментативного гидролиза в течение 1,5-6,0 часов при температуре 35-40°С. Для получения лечебно-профилактического продукта белковое сырье измельчают и заливают 5-20%-ным водно-спиртовым раствором из расчета 1:1-1:5 и подщелачивают раствором NaOH до рН 8,0-8,5. Гидролиз проводят с использованием ферментных препаратов в количестве 0,1-1,0% от массы сырья. Инактивацию ферментов осуществляют нагреванием смеси до 70-80°С в течение 15-20 минут. Целевой продукт выделяют путем фильтрации (п. РФ №2171066, A23L 1/325, A23L 1/33, 2001).
Недостатком указанного способа является использование щелочной среды, которая благоприятна для развития патогенной микрофлоры.
Кроме того, требуется постоянный контроль за рН среды.
В добавок использование высокой температуры для инактивации фермента способствует дальнейшему распаду полученного продукта.
Наиболее близким к заявленному способу является способ получения белково-нуклеинового гидролизата из морского животного сырья, а именно из молок лососевых и осетровых рыб, путем ферментативного гидролиза сырья коллагеназой. Способ предусматривает гомогенезацию молок и автолиз при рН 4,5-5,0, температуре 37-39°С в течение 46-50 часов. При этом гомогенезированные молоки подвергают обезжириванию флокуляцией хитозаном. Автолизат разделяют на жидкую фракцию, которую нагревают до 80°С для инактивации ферментов, и осадок, который подвергают ферментативному гидролизу. Затем гидролизат и жидкую фракцию объединяют, а смесь используют в качестве готового продукта (п. РФ №2055482, A23J 3/04, A23J 3/00, A23J 3/34, А61К 35/60, 1996).
Недостатком известного способа является длительность процесса получения гидролизата, более 60 часов. По мнению авторов заявленного изобретения стадия автолиза - излишняя ступень процесса, поскольку в дальнейшем используется ферментативный гидролиз, который, в принципе, позволяет получить те же продукты расщепления за более короткое время.
Задачей изобретения является разработка способа получения хитозан-нуклеинового гидролизата с высокой физиологической ценностью, а также повышение выхода низкомолекулярного нуклеинового продукта.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения хитозан-нуклеинового гидолизата ферментативный гидролиз ведут в присутствии ингибитора в течение 10-12 часов, а хитозан добавляют в гидролизат после гидролиза при соотношении 0,5-1,0:1,0 с последующим смешиванием компонентов.
Технический результат заключается в ускорении процесса получения нуклеинового гидролизата.
Заявленный технический результат достигается за счет того, что гидролиз сырья ведут ферментным препаратом «Коллагеназа» в присутствии ингибитора в течение 10-12 часов, а хитозан добавляют в соотношении 0,5-1,0:1,0 в гидролизат после гидролиза.
Для достижения заявленного результата гидролиз ведут в течение 10-12 часов. Для определения оптимума времени гидролиза были проведены эксперименты и результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Содержание нуклеиновых кислот в процессе гидролиза
Продолжительность гидролиза, час
С<sub> нуклеиновых кислот</sub>, мг/мл (концентрация)
0
1,12
2
7,15
4
7,57
6
7,79
8
8,15
10
8,58
12
8,95
24
8,95
Данные таблицы свидетельствуют о нарастании количества нуклеиновых кислот (нуклеиновых продуктов) с увеличением продолжительности гидролиза до 12 ч. При последующем увеличении времени гидролиза до 24 ч концентрация нуклеиновых продуктов остается неизменной. Таким образом, практически было установлено, что для полного гидролиза рыбных молок и выделения максимального количества нуклеиновых продуктов гидролиза достаточно 10-12 часов.
Был исследован также качественный состав нуклеиновых продуктов, полученных в результате гидролиза. По окончании гидролиза были получены следующие нуклеиновые продукты: олигонуклеотиды, мононуклеотиды, нуклеозиды. По сравнению с прототипом уже по истечении 10-12 часов были получены низкомолекулярные нуклеиновые продукты, которые лучше усваиваются организмом, т.е. являются более физиологически ценными. Для определения качественного состава гидролизата применялся стандартный метод тонкослойной хроматографии.
Результаты представлены на рисунке 1.
Полученные данные также позволяют сделать вывод, что оптимальная продолжительность гидролиза составляет 12 ч, т.к. последующее увеличение времени гидролиза не изменяет качественный состав нуклеинового материала в гидролизате.
Таким образом, экспериментально установлено, что гидролиз проводят в течение 10-12 часов для максимального выделения физиологически ценных продуктов гидролиза, которые хорошо усваиваются организмом. Кроме того, они легко связываются с хитозаном, что обеспечивает доступ их непосредственно в клетку организма. Тем самым решается поставленная задача - получение хитозан-нуклеинового комплекса.
Для снижения активности фермента в процессе гидролиза используют ингибитор, например сорбиновую кислоту или безводный хлорид кальция. К тому же они способствуют подавлению микрофлоры гидролизата, что позволяет увеличить срок хранения продукта.
Заявленный результат достигается также при внесении хитозана в гидролизат, т.е. после стадии гидролиза, в отличие от прототипа, где хитозан используют до гидролиза, для обезжиривания гомогенезированных молок и после флокуляции выводят из гомогената.
В заявленном изобретении хитозан вносят в гидролизат, который содержит комплекс нуклеиновых продуктов, имеющих отрицательный потенциал, в результате чего молекулы хитозана, несущие положительно заряженные аминогруппы, могут образовывать биополимерный комплекс. Именно такой комплекс имеет потенциальные преимущества в сравнении с известными нуклеиновыми продуктами. Главное - это возможность трансфекции нуклеинового материала непосредственно в клетку организма, что позволяет достаточно быстро влиять на ответную реакцию организма. Причем такой комплекс защищает нуклеиновый материал от биодеградации при транспорте в потоке биологической жидкости, поскольку он находится в связанном состоянии. А поскольку хитозан отличается низкой токсичностью и хорошей биосовместимостью, использование такого комплекса имеет большие возможности. Кроме того, хитозан подавляет рост бактерий, что способствует сохранению продукта.
Все это позволяет сделать вывод, что полученный комплекс хитозан-нуклеиновый продукт может иметь широкое практическое применение.
На основе экспериментов установлено, что в гидролизат добавляют хитозан в соотношении 0,5-1,0:1,0.
Так, если соотношение хитозана в гидролизате будет менее 0,5:1,0, то снижается его физиологическая ценность, продукт теряет способность быть функциональным.
Если соотношение хитозана в гидролизате будет более 1,0:1,0, то ухудшаются органолептические свойства продукта, появляется вяжущий привкус, что снижает его потребительскую способность.
Способ осуществляется следующим образом.
Берут молоки рыб, добавляют к ним воду и ацетатный буфер, помещают все в блендер и гомогенизируют. В гомогенат вносят ферментный препарат, ингибитор и смешивают. Смесь инкубируют в течение 10-12 часов. После гидролиза в гидролизат вносят хитозан в соотношении 0,5-1,0:1,0 и интенсивно перемешивают. При необходимости гидролизат может быть подвергнут концентрации и дальнейшей сушке.
Пример 1. Берут 1,0 кг замороженных молок горбуши, добавляют к ним 8,0 литров воды и 1,0 литр ацетатного буфера для получения рН среды 5,0. Все это помещают в блендер и гомогенизируют. В гомогенат вносят 0,007 кг ферментного препарата «Коллагеназа» и 0,01 кг сорбиновой кислоты и смешивают. Смесь инкубируют при температуре 38°С в течение 12 часов. После чего берут 10,0 литров гидролизата, вносят в него 1%-ный раствор хитозана в количестве 5,0 литров (соотношение 0,5:1,0) и интенсивно перемешивают. Полученный продукт упаривают до объема 1,0 литр.
Пример 2. Берут 1,0 кг молок сельди, добавляют к ним 8,0 литров воды и 1,0 литр ацетатного буфера до рН среды 5,0. Смесь гомогенизируют. В гомогенат вносят 0,007 кг ферментного препарата «Коллагеназа» и 0,001 кг сорбиновой кислоты и смешивают. Смесь инкубируют в течение 10 часов при температуре 37°С. После чего в гидролизат вносят 1%-й раствор хитозана в количестве 10,0 литров (соотношение 1:1) и интенсивно перемешивают. Полученный продукт упаривают до объема 1,0 литр.
Пример 3. Выполняют по примеру 1, но в качестве сырья берут молоки кеты. В качестве ингибитора берут 0,02 кг хлорида кальция, а смесь инкубируют в течение 11 часов.