СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ НА ТОКСИЧНЫЕ ВЕЩЕСТВА
METHOD OF EVALUATING REACTION OF PLANTS TO TOXIC SUBSTANCES

Изобретение относится к области растениеводства, физиологии растений, экологии и позволяет количественно оценить реакцию растений на неблагоприятные факторы окружающей среды, в частности на чрезмерное засоление, загрязнение тяжелыми металлами и токсическое действие других химических веществ.
Известны морфо-физиологические способы определения солеустойчивости растений, основанные на оценке скорости набухания или интенсивности прорастания семян в солевых растворах [1]. Реализация этих способов требует больших затрат времени. Они неприменимы для гетерогенных форм растений, т.к. их семена генетически неоднородны.
Существуют способы оценки действия химических веществ на растения, предусматривающие балльную (визуальную) оценку состояния растения по числу некротических пятен и степени увядания листьев [2]. Данные способы трудоемки и основаны на субъективных органолептических оценках. Сравнение с их помощью различных видов и сортов растений затруднительно, т.к. они имеют различные внешние проявления реакции на химические воздействия.
Используют оптические методы количественной оценки влияния различных химических препаратов на растения, предусматривающие оценку изменения спектральных характеристик или параметров флуоресценции листьев испытываемых растений [3-5]. Наиболее распространенным за рубежом является метод импульсно-модулированной хлорофиллфлуоресценции (Pulse Amplitude Modulation - РАМ) [5] - прототип. Известные оптические методы достаточно трудоемки и дают достоверные различия только при длительном воздействии токсичных веществ, когда появляются и визуальные признаки в виде некротизированных участков и т.п.
Целью изобретения является повышение чувствительности и уменьшение длительности количественной оценки реакции растений на токсичные вещества.
Поставленная цель достигается тем, что о реакции растений на токсичные вещества судят по изменению величины и знака коэффициентов уравнений регрессии, аппроксимирующих экспериментальные кривые изменения интенсивности и степени когерентности рассеянного тканями зондирующего квазимонохроматического светового пучка.
b
Действие химических веществ в токсичных концентрациях уменьшает скорость фотоиндуцированных перестроек растительной ткани. Например, с увеличением длительности инкубирования в 10 мМ растворе хлорида никеля крутизна спада интенсивности рассеянного листовой пластинкой малины зондирующего излучения заметно уменьшается (фиг.1). Количественно оценить этот процесс позволяют коэффициенты уравнений регрессии, аппроксимирующих экспериментальные данные. Во многих случаях удобно использовать степенные функции A×t, где t - длительность облучения, А и b - постоянные величины. Для различных сроков инкубирования уравнения регрессии экспериментальных кривых, представленных на фиг.1, принимают вид:
Контроль (начало инкубирования)
у=166,7 t<sup>-0,1314</sup>
1 сутки
у=125,2 t<sup>-0,0726</sup>
2 суток
у=105,1 t<sup>-0,0294</sup>
3 суток
у=101,9 t<sup>-0,0043</sup>
О величине ответной реакции растительного организма на токсичное вещество можно судить по изменению коэффициента b, отражающего скорость развития фотоиндуцированного процесса. Через 3 суток инкубирования листовых пластинок малины в 10 мМ растворе хлорида никеля они уменьшились более чем в 30 раз.
3
2
4
2
2
7
Пример 1. Для определения реакции растительного организма на соли тяжелых металлов использовали круглые, диаметром 21 мм, высечки листовых пластинок актинидии коломикта сорта Сентябрьская. Их помещали в чашки Петри с растворами Pb(NO) и (NH)CrO концентрацией 1 мМ и выдерживали в течение 13 суток при температуре 25°С и освещенности 30 лк. Контрольные образцы содержались в дистиллированной воде в тех же условиях. Источником зондирующего излучения служил полупроводниковый лазер с длиной волны генерации 650 нм. В процессе непрерывного облучения измеряли интенсивность и степень когерентности рассеянного тканями листовых пластинок зондирующего потока. Типичные результаты представлены на фиг.2.
У контрольных образцов во время лазерного зондирования наблюдали хорошо выраженный спад интенсивности и рост когерентности рассеянного излучения. На четвертые сутки инкубации высечек листовых пластинок в растворе дихромата аммония показатели степени b регрессионных уравнений уменьшились в 2…3 раза (фиг.2А и 2Б). Через 13 суток химического воздействия фотоиндуцированные процессы в тканях претерпели еще большие изменения. Интенсивность рассеянного излучения стала не снижаться, а возрастать, что привело к смене знака коэффициента b. Рост когерентности практически отсутствовал. Это указывает на фотодеструкцию хлорофилл-белкового комплекса и нарушение нативной организации микроструктуры ткани. Т.е. химическое ингибирование физиологической активности клеток сменилось их деградацией.
Наиболее репрезентативную оценку позволяет получить сложение скоростей изменения интенсивности и когерентности рассеянного излучения в процессе светового зондирования. Для этого достаточно провести алгебраическое суммирование показателей степени соответствующих регрессионных уравнений с учетом их знаков. Чем больше отклоняется такой динамический показатель от контрольного значения, тем сильнее выражена реакция растения на токсическое воздействие. В таблице 1 приведены динамические показатели реакции листовых пластинок актинидии коломикта сорта Сентябрьская на токсичное действие солей свинца и хрома.
2
v
m
Пример 2. Сравнение чувствительности заявленного способа и прототипа проведено на малине сорта Пересвет и актинидии коломикта сорта Сентябрьская. Высечки листовых пластинок инкубировали 3 суток при температуре 25°С и освещенности 600 лк в чашках Петри с растворами NiCl и NaF концентрацией 10 мМ, NaCl - 200 мМ. Контрольные образцы содержались в дистиллированной воде в тех же условиях. О реакции растительной ткани на химическое воздействие судили по изменению величины приведенной флуоресценции хлорофилла F/F (прототип) и динамического показателя (заявленный способ).
2
Растворы солей NaCl, NaF и NiCl ингибирующих концентраций в разной степени повлияли на функциональное состояние листовых пластинок малины и актинидии (фиг.3). Оба метода показали большую устойчивость малины (фиг.3А и 3Б). Вероятно, это обусловлено ее высокой экологической пластичностью. Самой токсичной оказалась соль никеля, что хорошо согласуется с известными литературными данными. Ее ингибирующее действие отчетливо заметно у актинидии на первые и у малины на вторые сутки инкубации. В этот период надежно определить действие менее токсичных солей NaCl и NaF удается только заявленным методом (фиг.3Б и 3Г). Различия с контролем достигают 100% и статистически достоверны. Приведенная флуоресценция хлорофилла в таких же условиях изменялась не более чем на 15% (фиг.3А и 3В).
2
Особенностью заявленного метода является то, что он позволяет количественно оценивать не только функциональную активность организма, но и интенсивность деградационных процессов. Через 3 суток инкубации в 200 мМ растворе NaCl или 10 мМ растворе NiCl динамика фотоиндуцированных перестроек меняет свою направленность, что проявляется в росте интенсивности и спаде когерентности рассеянного зондирующего пучка. Аналитически это выражается в смене знака динамического показателя с положительного на отрицательный (фиг.3Г).
д
Для сравнения результатов измерений, полученных разными способами, целесообразно перейти к безразмерным единицам с помощью так называемого коэффициента действия К=100(К-O)/К, где К и О -количественные оценки состояния биологического объекта в контроле и опыте. Он показывает, на сколько процентов изменилось физиологическое состояние растительной ткани в результате химической обработки. В таблице 2 приведены значения коэффициентов действия в эксперименте, проиллюстрированном фиг.3. На исследуемых культурах заявленный способ показал значительно большую чувствительность, чем прототип. Особенно это заметно в первые сутки инкубирования в растворах NaCl и NaF, когда методом РАМ зарегистрировано незначительное (1…4%) изменение физиологической активности растительной ткани. Заявленным способом эти же отклонения от контрольного уровня оцениваются в 14…35%. Т.е. диагностика токсического действия может начаться на более ранних этапах химического поражения растительных организмов.
Пример 3. Сравнительная оценка токсичного действия высоких концентраций хлорида натрия проведена на ежевике сорта Блэк сэтин, малине черной сорта Кумберленд, малине красной сорта Пересвет, землянике овальной и землянике домашней сортов Золушка и Урожайная ЦГЛ. Апикальные побеги ежевики и малины опускали нижней частью в растворы NaCl концентрацией 100 и 200 мМ и выдерживали в течение 72 часов при температуре 25°С и освещенности 200 лк. Контроль находился в тех же условиях, но в дистиллированной воде. Измеряли 4-5 лист сверху. Биологическая повторность 9…12-кратная. У земляники в растворах находились черешки листьев. Остальные условия содержания оставались такими же, как у малины.
На всех культурах надежные различия с контролем зарегистрированы на 2…3 сутки инкубирования. Среди рода Rubus наиболее устойчивой к засолению показала себя ежевика (фиг.5). При увеличении длительности воздействия 200 мМ раствора NaCl с 48 до 72 часов у нее наметился процесс адаптации, на что указывает рост динамического показателя. У земляники самые высокие значения этого параметра имел сорт Золушка. Сорок восемь часов инкубирования в 100 мМ растворе NaCl практически не повлияло на функциональную активность листовых пластинок (фиг.5). В то время, как у земляники овальной, по полученным числовым данным, она снизилась почти вдвое.
Проведенные исследования показали, что при оценке действия токсичных соединений предложенный способ по чувствительности существенно превосходит широко применяемый за рубежом метод РАМ и позволяет обнаруживать реакцию растений на более ранних этапах химического воздействия.
Литература
1. Удовенко Г.В., Волкова А.М. Определение в раннем возрасте солеустойчивости зерновых злаков по комплексу ростовых параметров. Методические указания. - СПб, 1993.
2. Леонченко В.Г. и др. Предварительный отбор перспективных генотипов плодовых растений на экологическую устойчивость и биохимическую ценность плодов. Методические рекомендации. - Мичуринск, 2007.
3. Веселовский В.А, Веселова Т.В. Люминесценция растений. - М.: Наука, 1990.
4. Application of chlorophyll fluorescence: in photosynthesis research, stress physiology, hydrobiology, and remote sensing / editer by H.K.Lichtenthaler - Kluwer: Acad. Publ., 1988.
5 Schreiber U., Neubauer C., Schliwa U. PAM-fluorometer based on medium-frequency pulsed Xe-Flash measuring light: a highly sensitive new tool in basic and applied photosynthesis research // Photosynth. Res. - 1990. - V.36. - P.65-72.
Таблица 1
Длительность инкубирования
Динамический показатель
Pb(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>
(NH<sub>4</sub>)Cr<sub>2</sub>О<sub>7</sub>
Контроль
0,179
0,185
4 суток
0,120
0,050
13 суток
-0,199
-0,030
Таблица 2
Длительность инкубирования, часы
Коэффициент действия, %
Малина
Актинидия
NaCl
NaF
NiCl<sub>2</sub>
NaCl
NaF
NiCl<sub>2</sub>
Известный способ
24
3,2
0,8
5,3
4,2
2,1
14,2
48
4,2
1,2
26,7
12,3
0
29,1
72
23,3
10,2
27,6
30,9
9,3
35,2
Заявленный способ
24
14,7
22,0
56,5
35,5
25,8
57,3
48
29,5
52,6
93,1
76,4
4,9
86,8
72
88,1
82,1
80,1
116,0
58,2
137,0