МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНКАЗА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Модифицированный белок ДНКазы I, содержащий аминокислотную последовательность белка ДНКазы I, в которой по меньшей мере одна группа карбоновой кислоты в указанном белке ДНКазы I заменена амидной группой с формулой:
где каждый из R' и R'' независимо выбран из группы, состоящей из водорода и насыщенного или ненасыщенного, замещенного или незамещенного углеводородного фрагмента, необязательно прерываемого одним или более гетероатомами, где модифицированный белок ДНКазы I характеризуется по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего:
a) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 5 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 50% от гидролитической активности в отношении ДНК модифицированного белка ДНКазы I в условиях отсутствия человеческого немышечного актина, при концентрации модифицированной ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл;
b) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 50 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 20% от гидролитической активности в отношении ДНК модифицированного белка ДНКазы I в условиях отсутствия человеческого немышечного актина, при концентрации ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл;
c) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 5 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 150% от гидролитической активности в отношении ДНК немодифицированного белка ДНКазы I в присутствии 5 мкг/мл человеческого немышечного актина, при концентрации ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл;
d) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 50 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 150% от гидролитической активности в отношении ДНК немодифицированного белка ДНКазы I в присутствии 50 мкг/мл человеческого немышечного актина, при концентрации ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл; и
50
50
e) IC по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК в присутствии человеческого немышечного актина, которая по меньшей мере в два раза превышает IC немодифицированного белка ДНКазы I по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК в присутствии человеческого немышечного актина.
2. Модифицированный белок ДНКазы I по п. 1, где по меньшей мере один из R' и R'' представляет собой указанный насыщенный или ненасыщенный, замещенный или незамещенный углеводородный фрагмент, необязательно прерываемый одним или более гетероатомами.
3. Модифицированный белок ДНКазы I по п. 1 или 2, где указанная амидная группа имеет общую формулу:
где R' выбран из группы, состоящей из алкила, алкенила и алкинила, каждый из которых является незамещенным или замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из гидрокси и амино.
4. Модифицированный белок ДНКазы I по п. 3, где R' содержит от 1 до 10 атомов углерода.
5. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 3-4, где указанный алкил, указанный алкенил или указанный алкинил замещен одной или более гидроксигруппами.
6. Модифицированный белок ДНКазы I по п. 3, где R' представляет собой трис(гидроксиметил)метил.
7. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 3-4, где указанный алкил, указанный алкенил или указанный алкинил замещен одной или более аминогруппами.
8. Модифицированный белок ДНКазы I по п. 7, где R' представляет собой 2-аминоэтил.
9. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-8, где указанная по меньшей мере одна группа карбоновой кислоты выбрана из группы, состоящей из карбоксильной группы в боковой цепи аминокислотного остатка и С-концевой группы карбоновой кислоты.
10. Модифицированный белок ДНКазы I по п. 9, где указанная боковая цепь аминокислотного остатка представляет собой боковую цепь аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из остатка глутаминовой кислоты, остатка аспарагиновой кислоты, остатка N-метилглутаминовой кислоты, остатка N-метиласпарагиновой кислоты, остатка α-метилглутаминовой кислоты, остатка α-метиласпарагиновой кислоты, остатка γ-карбоксиглутаминовой кислоты, остатка N-(карбоксиметил)глицина, остатка N-(2-карбоксиэтил)глицина и остатка α-аминоадипиновой кислоты.
11. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-10, где по меньшей мере две из указанных групп карбоновых кислот белка ДНКазы I, необязательно по меньшей мере пять из указанных групп карбоновых кислот, заменены указанной амидной группой.
12. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-11, характеризующийся константой Михаэлиса по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК, которая ниже константы Михаэлиса у немодифицированного белка ДНКазы I по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК.
13. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-12, характеризующийся константой Михаэлиса по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК, которая не превышает 20 мкг/мл ДНК.
14. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-13, характеризующийся специфической активностью по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК, которая составляет по меньшей мере 70% от специфической активности немодифицированного белка ДНКазы I по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК.
15. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-13, характеризующийся каталитической эффективностью по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК, которая превышает каталитическую эффективность немодифицированного белка ДНКазы I по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК.
16. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-15, где менее 10 массовых процентов модифицированной ДНКазы I имеет мультимерную форму.
17. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-16, где указанный белок ДНКазы I является рекомбинантным белком.
18. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-16, где указанный белок ДНКазы I является рекомбинантным растительным белком.
19. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-18, где указанный белок ДНКазы I по меньшей мере на 80% гомологичен человеческому белку ДНКазы I.
20. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-18, где белок ДНКазы I содержит N-концевой остаток глицина.
21. Модифицированный белок ДНКазы I по п. 20, где белок ДНКазы I содержит или имеет аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2.
22. Модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-18, где белок ДНКазы I содержит или имеет аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 1.
23. Способ получения модифицированного белка ДНКазы I по любому из пп. 1-22, причем способ включает проведение реакции указанного белка ДНКазы I с аминосодержащим соединением с формулой:
HNR'R'',
в присутствии связующего средства,
где каждый из R' и R'' представляет собой насыщенный или ненасыщенный, замещенный или незамещенный углеводородный фрагмент, необязательно прерываемый одним или более гетероатомами, независимо выбранный из группы, состоящей из водорода и замещенного или незамещенного алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила, гетероалициклической группы и гетероарила.
24. Способ по п. 23, где указанное аминосодержащее соединение характеризуется общей формулой:
2
HN-R',
где R' представляет собой насыщенную или ненасыщенную алкильную группу, причем она является незамещенной или замещена одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из гидрокси и амино.
25. Способ по любому из пп. 23 и 24, где указанное связующее средство представляет собой карбодиимид.
26. Способ по п. 25, где указанный карбодиимид представляет собой CMC (N-циклогексил-N'-(2-морфолиноэтил)карбодиимид-мето-n-толуолсульфонат).
27. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-22 и фармацевтически приемлемый носитель.
28. Фармацевтическая композиция по п. 27 дополнительно содержащая соль кальция.
29. Фармацевтическая композиция по п. 28, причем концентрация кальция в композиции находится в диапазоне от 5 до 15 мМ кальция.
30. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-29, дополнительно содержащая полисорбат 80.
2
31. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-30, содержащая приблизительно 10 мМ СаСl, приблизительно 0,01% полисорбата 80, приблизительно 140 мМ NaCl и приблизительно 5 мг/мл указанного модифицированного белка ДНКазы I.
32. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-31, причем она составлена для доставки посредством небулайзера.
33. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-32, причем модифицированный белок ДНКазы I представляет собой белок ДНКазы I со степенью чистоты по меньшей мере 90%.
34. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-33 или модифицированный белок ДНКаза I по любому из пп. 1-22 для применения в уменьшении вязкости мокроты.
35. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-33 или модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-22 для применения в уменьшении содержания ДНК в мокроте.
36. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-33 или модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-22 для применения в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с избыточной внеклеточной ДНК в жидкости, секрете или ткани нуждающегося в том субъекта.
37. Фармацевтическая композиция или модифицированный белок ДНКазы I по п. 36, причем указанное заболевание или состояние представляет собой легочное заболевание или состояние.
38. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-33 или модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-22 для применения в лечении муковисцидоза у нуждающегося в том субъекта.
39. Композиция или модифицированный белок ДНКазы I для применения по любому из пп. 36-38, где указанный субъект страдает инфекцией легких, вызванной Pseudomonas.
40. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 27-33 или модифицированный белок ДНКазы I по любому из пп. 1-22 для применения в лечении заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из бронхита, немуковисцидозного бронхоэктаза, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), красной волчанки, волчаночного нефрита, синдрома Коккейна, синдрома Ангельмана, мужского бесплодия, метастатической злокачественной опухоли, сепсиса, вызванного вирусной, бактериальной, грибковой или протозойной инфекцией, инфаркта миокарда, атеросклероза, сахарного диабета, гиперчувствительности замедленного типа и маточного нарушения.
41. Модифицированный белок ДНКазы I, содержащий аминокислотную последовательность белка ДНКазы I, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток представляет собой подвергнутый неклеточной модификации аминокислотный остаток, причем модифицированный белок ДНКазы I характеризуется по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующих:
a) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 5 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 50% от гидролитической активности в отношении ДНК модифицированного белка ДНКазы I в условиях отсутствия человеческого немышечного актина, при концентрации модифицированной ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл;
b) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 50 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 20% от гидролитической активности в отношении ДНК модифицированного белка ДНКазы I в условиях отсутствия человеческого немышечного актина, при концентрации ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл;
c) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 5 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 150% от гидролитической активности в отношении ДНК немодифицированного белка ДНКазы I в присутствии 5 мкг/мл человеческого немышечного актина, при концентрации ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл;
d) гидролитическая активность в отношении ДНК в присутствии 50 мкг/мл человеческого немышечного актина, которая составляет по меньшей мере 150% от гидролитической активности в отношении ДНК немодифицированного белка ДНКазы I в присутствии 50 мкг/мл человеческого немышечного актина, при концентрации ДНКазы I, составляющей 45 нг/мл; и
50
50
e) IC по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК в присутствии человеческого немышечного актина, которая по меньшей мере в два раза превышает IC немодифицированного белка ДНКазы I по отношению к гидролитической активности в отношении ДНК в присутствии человеческого немышечного актина.