Гемостатический материал, гемостатическое средство и перевязочный материал на его основе
HEMOSTATIC MATERIAL, HEMOSTATIC MEANS AND MATERIAL BASED THEREON

Изобретение относится к медицине, в частности к средствам, используемым для остановки наружных кровотечений, конкретно к гемостатическому материалу на основе O,O'-пальмитоилхитозана, а также местным гемостатическим средствам на основе упомянутого материала, выполненным в жидкой или гелеобразной форме, а также в форме перевязочного материала. Изобретение предназначено для защиты жизни и здоровья человека, подвергшегося воздействию экстремальных факторов.
Хитозан - линейный аминополисахарид, образующийся путем частичного N-деацетилирования хитина (поли-N-ацетил-β-(1-4)-D-глюкозамина)
, причем одним из параметров хитозана является степень деацетилирования (DD), которая определяется как отношение количества глюкозаминных звеньев (n) к общему числу мономерных звеньев в молекуле полисахарида: DD=n/(n+m). Доля деацетилированных звеньев со свободной аминогруппой, определяемая как степень деацетилирования (DD), составляет обычно от 70 до 90% (Кучина Ю.А., Долгопятова Н.В., Новиков В.Ю., Сагайдачный В.А., Морозов Н.Н. «Инструментальные методы определения степени деацетилирования хитина» // Вестник МГТУ, 2012, том 15, №1, стр. 107-113).
Гемостатические свойства хитозана широко известны: хитозан имеет свойство за счет наличия реакционноспособной аминогруппы деполяризовать гемовые группы гемоглобина, вызывая, таким образом, агглютинацию эритроцитов крови (Rao S.B., Sharma C.R "Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential" // J. Biomed. Mater. Res., 1997, vol. 34(1), pp. 21-28; Klokkevold P.R., Fukayama H., Sung E.C., Bertolami C.N. "The effect of chitosan (poly-N-acetyl glucosamine) on lingual hemostasis in heparinized rabbits" // J. Oral. Maxillofac. Surg., 1999, vol. 57(1), pp. 49-52; Pogorielov M., Kalinkevich O., Deineka V., et al. "Haemostatic chitosan coated gauze: in vitro interaction with human blood and in-vivo effectiveness" // Biomater. Res., 2015, 19:22). Сгустки из агглютинированных эритроцитов и других форменных элементов крови вызывают быстрое преобразование крови в гель, который существенно замедляет или полностью останавливает кровотечение, давая возможность естественным механизмам остановки кровотечения вступить в действие.
Также известно, что растворимость хитозана в водных растворах зависит от водородного показателя (pH) раствора, причем при pH>6 хитозан практически нерастворим (Филиппова О.Е., Корчагина Е.В. «Хитозан и его гидрофобные производные: получение и агрегация в разбавленных водных растворах» // Высокомолекулярные соединения, сер. А, 2012, том 54, №7, с. 1130-1152). В растворах, имеющих высокий pH, хитозан практически нерастворим, образует мицеллы, агрегаты. Таким образом в крови, в норме имеющей pH около 7, хитозан также нерастворим, и при попытках использовать хитозан в чистом виде лишь очень незначительная часть его будет доступна для реакции с форменными элементами крови, что в значительной мере ограничивает эффективность чистого хитозана для целей гемостаза, так как в этом случае лишь непосредственный контакт хитозана с источником кровотечения может обеспечить образование сгустка, препятствующего кровотечению. Обеспечение такого контакта крайне затруднительно даже в благоприятных условиях, так как требует возможности визуального определения источника кровотечения и фиксации хитозана в области контакта с источником кровотечения. Даже в этом случае достигнутый гемостаз будет крайне ненадежен, так как при малейшем механическом воздействии образовавшийся сгусток может быть смещен от места контакта, и в результате потребуется повторное наложение гемостатика.
Для повышения реакционной способности хитозана при контакте с кровью его растворяют в растворах кислот с последующим высушиванием, получая сухую соль хитозана. Так как хитозан не является достаточно сильным основанием, то при повторном растворении кислотность раствора повышается за счет кислоты, отделившейся в результате гидролиза. Таким образом, хитозан становится растворим в крови, сохраняя при этом свою способность вызывать агглютинацию форменных элементов крови (патенты Великобритании GB 2095995, 13.10.1982, МПК A61K 31/715, A61L 31/04, A61L 33/08 и GB 2129300, 16.05.1984, МПК A61K 31/715, A61K 35/56, A61L 15/28, А61Р 43/00). Однако в этом случае с кровью успевает прореагировать лишь малая часть хитозана, непосредственно соприкасающаяся с кровью. В результате образуется тонкая корка, которая при движениях пациента, увеличении давления или ином воздействии может оторваться от места своего прикрепления с последующим возобновлением кровотечения, что крайне опасно значительной кровопотерей до вновь достигнутого гемостаза (см. US 20090186851 A1, абзац [0007]). Таким образом, для полевых условий данный метод также малоприменим.
В заявке на патент США US20090186851 (дата публикации 23.07.2009, МПК A61K 31/722, А61Р 17/02, А61Р 7/04) для стабилизации сгустка в раневой полости предлагается использовать соль хитозана в смеси с нейтральным наполнителем, который, очевидно, уменьшает реактивность хитозана. При этом за счет замедления гемостаза обеспечивается лучшее пропитывание гемостатического порошка и образование более крупного и более стабильного в ране сгустка. Однако при этом следует отметить следующие недостатки изобретения. Во-первых, очевидно, что замедляется сам гемостаз, и в результате до момента достижения полного гемостаза происходит смешивание гемостатического порошка с кровью и образование густой взвеси, через которую кровь, в случае мощного кровотечения, быстро проделывает каналы, вследствие чего кровотечение возобновляется. Во избежание возобновления кровотечения при применении данного гемостатического средства необходима мануальная компрессия раны в течение не менее 3 минут, что зачастую затруднительно в полевых условиях. Во-вторых, сами по себе размеры гелеобразного сгустка не обеспечивают необходимой стабильности сгустка в ране, так как не пропитанный кровью порошок в свободном виде, в подавляющем большинстве случаев остающийся в значительном количестве в полости раны, мобилен, а сгусток там, где он не окружен порошком, также имеет лишь слабую адгезию к окружающим тканям и при механическом воздействии легко отрывается, таким образом, например, самостоятельное передвижение пациента крайне затруднительно. В-третьих, данный метод, очевидно, уменьшает общее количество активного компонента в ране, что приводит к потреблению значительного количества материала, которого может не оказаться в ране при возобновлении кровотечения. Таким образом, данный подход не обеспечивает полностью надежную остановку кровотечения. Наконец, изобретение, раскрытое в заявке US 20090186851, предусматривает добавление в гемостатический порошок для облегчения его пропитывания поверхностно-активных веществ, таких как блок-сополимеры на основе этиленоксида и пропиленоксида, жирные кислоты, соли жирных кислот и поверхностно-активные вещества на основе диоксида кремния, при этом токсикологические свойства многих поверхностно-активных веществ до сих пор не до конца изучены, что может делать их использование в составе гемостатика небезопасным.

Из публикации международной заявки WO 2012123728 (дата публикации 20.09.2012, МПК A61F 13/00) известно также использование хитозана в чистом виде в качестве гемостатического средства в смеси с одним или несколькими веществами, имеющими биоадгезивные свойства, что повышает адгезию гемостатического порошка к тканям. Также в указанной заявке описано производство перевязочного гемостатического материала (бинта), известного под товарным знаком Celox, который является наиболее близким аналогом для перевязочного гемостатического материала согласно настоящему изобретению. Однако авторы заявки WO 2012123728 не рассматривают влияние биоадгезивных веществ на свойства самого хитозана, в то время как широко применяемые биоадгезивные агенты (такие как карбоксиметилцеллюлоза) способны ослаблять гемостатические свойства и/или растворимость хитозана. Кроме того, при достаточной степени измельчения порошка хитозан может реагировать с биоадгезивным веществом, что дополнительно снижает его активность. Наконец, хитозан в чистом виде имеет очень слабые гемостатические свойства.
С другой стороны известно, что немодифицированный хитозан, обладая слабо выраженной гемостатической активностью, взаимодействует с элементами крови достаточно медленно. В связи с этим, для проявления им гемостатических свойств необходимо длительное время, что имеет отрицательное значение при массивных кровотечениях.
В уровне техники также описаны способы усиления гемостатических свойств хитозана путем придания ему гидрофобных свойств, например, N-алкилированием, что, предположительно, дополнительно позволяет гидрофобным мембранам клеток связываться с гидрофобными элементами гидрофобно-модифицированного хитозана (Не Q., Guan J., Huang S. "Synthesis and characterization of hydrophobically modified chitosan" // African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2012, vol. 6(48), pp. 3285-3292). Однако в данной работе проведены лишь in vitro испытания по взаимодействию с кровью N-алкилированного хитозана в водном растворе уксусной кислоты, что не отвечает практическим условиям применения, так как гидрофобно-модифицированный хитозан имеет такую же, как немодифицированный хитозан, или еще более низкую растворимость в средах с pH>6 (Phillippova О.Е., Korchagina E.V., "Chitosan and its hydrophopbic derivatives: preparation" // Polymer Science, Ser. A, 2012, vol. 54(7), pp. 552-572).
В работах Доулинга и Де Кастро (Dowling М.В., et al., Biomaterials, 2011, vol. 32, pp. 3351-3357; De Castro, G.P. et al., J. Trauma, 2012, vol. 72, No 4, pp. 899-907) описывается применение гидрофобно-модифицированного хитозана путем N-алкилирования исходного хитозана додецилальдегидом и 4-октадецилбензальдегидом, соответственно (аналогичный метод модификации применялся и в работе Хе и его коллег, см. ссылку выше). По совокупности существенных признаков техническое решение, раскрытое в статье De Castro, является наиболее близким аналогом для гемостатического материала, раскрытого в рамках настоящего изобретения. Принципиальным отличием гемостатического материала из работ Де Кастро и Доулинга является то, что количество N-замещенных гидрофобными группами звеньев в обеих работах было незначительным (от 1 до 6% по молям); иными словами, большая часть аминогрупп в цепочке хитозана находилась в неизмененном виде. В обеих работах приводится гипотеза о том, что гидрофобные «хвосты» связываются с мембранами клеток крови, что и обуславливает более быстрое и надежное гелеобразование при реакции с кровью. Кроме того, в работе Доулинга указывается, что при необходимости гелеобразование может быть обращено, например, при помощи α-циклодекстрина. Это дополнительно увеличивает полезные свойства гемостатиков на основе гидрофобно-модифицированных хитозанов, так как предоставляет дополнительный механизм удаления гемостатического материала из раны, с тканей или из поврежденного сосуда при последующих манипуляциях. В работе Де Кастро отмечается, что для исследований in vivo выбран только хитозан с 6% замещенных групп, что косвенно указывает на то, что степени замещения (то есть доли модифицированных гидрофобными группами звеньев хитозана) ниже 6 мол. % недостаточно для создания гемостатического материала; там же приводится вывод об увеличении адгезии к окружающим тканям пропорционально увеличению степени замещения гидрофобными группами звеньев. Таким образом, очевидно, что большая степень гидрофобного N-замещения (наличие большого количества гидрофобных «хвостов») выгодна как для гемостаза, так и для адгезии к окружающим тканям. Однако в той же работе отмечается, что дальнейшее увеличение степени гидрофобного замещения (выше 6% по молям) приводит к значительному ухудшению растворимости и увеличению вязкости водных растворов, что затрудняет использование таких материалов для изготовления гемостатиков. Следует отметить, что данная особенность хитозана превращаться в медообразную субстанцию широко известна, например, из патента США US 5061792 (дата публикации 29.10.1991, МПК С08В 37/08, С07Н 1/00, С07Н 13/00). Также известна и крайне низкая растворимость гидрофобно-модифицированных хитозанов, в том числе N-алкилированных, при pH>6 (Phillippova О.Е., Korchagina E.V., "Chitosan and its hydrophopbic derivatives: preparation" // Polymer Science, Ser. A, 2012, vol. 54(7), pp. 552-572). Таким образом, при N-алкилировании достижение значительной степени замещения крайне затруднительно по указанным выше причинам. Очевидно также, что при таком способе модификации к одному мономерному звену хитозана может быть присоединен только один гидрофобный «хвост». Кроме того, N-замещение гидрофобными группами приводит к снижению гемостатической активности по аминогруппам. Также образование производными хитозана солей с кислотами становится затруднительным, так как аминогруппа занята гидрофобным «хвостом», таким образом затрудняется приготовление водорастворимых солей таких гидрофобно-модифицированных хитозанов при высокой степени гидрофобного замещения.
Таким образом, гемостатический порошок на основе гидрофобно-модифицированного хитозана, полученного N-алкилированием, согласно работе Де Кастро (который выбран в качестве наиболее близкого аналога настоящего изобретения), не будет обладать достаточной гемостатической активностью ввиду его низкой растворимости, в результате чего ему будут присущи те же недостатки, что и немодифицированному хитозану, так как лишь очень незначительная часть хитозана будет доступна для взаимодействия с кровью для образования гелеобразного сгустка. Несмотря на то, что способ гидрофобной модификации хитозана O,O'-ацилированием известен (Tong Y., et al. "Synthesis of O,O'-dipalmitoyl chitosan and its amphiphilic properties and capability of cholesterol absorption" // Carbohydrate Polymers, 2005, vol. 60(2), pp. 229-233), гемостатические свойства O,O'-дипальмитоилхитозана ранее не изучались. Также из уровня техники не известны доказанные научные объяснения химических процессов, влияющих на гемостатические свойства указанных соединений хитозана, а из гипотез, выдвигаемых различными авторами, неочевидно, как будет влиять та или иная модификация на гемостатические свойства производных хитозана.
Задачей настоящего изобретения является создание водорастворимой гидрофобно-модифицированной формы хитозана с целью улучшения его гемостатических свойств.
Технический результат заключается в повышении гемостатической активности модифицированного хитозана, в придании гидрофобно-модифицированному хитозану высокой водорастворимости, в повышении гемостатических свойств гемостатического материала на основе модифицированного хитозана, а также в расширении арсенала гемостатических средств.
Здесь и далее под гемостатическим агентом подразумевается как немодифицированный хитозан, так и модифицированный хитозан, включая N-алкилированный хитозан, N-ацилированный хитозан и O,O-ацилированный хитозан, в том числе O,O'-дипальмитоилхитозан, или их соли; под гемостатическим материалом подразумевается гемостатический агент в сочетании с одним или несколькими биоадгезивными нейтральными веществами; под гемостатическим средством подразумевается гемостатический материал в жидкой или гелеобразной форме, получаемый путем добавления к гемостатическому материалу воды или воды в сочетании с загустителем; под перевязочным гемостатическим материалом подразумевается материал, состоящий из одного или нескольких слоев полотна с нанесенным на него гемостатическим средством в твердой, жидкой или гелеобразной форме.
Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что гемостатический материал включает гемостатический агент O,O'-дипальмитоилхитозан или его соль и одно или несколько биоадгезивных нейтральных веществ.
В предпочтительном варианте реализации изобретения упомянутый гемостатический материал представляет собой порошок.
Также в предпочтительном варианте реализации изобретения:
- гемостатический агент представляет собой соль O,O'-дипальмитоилхитозана, причем упомянутая соль выбрана из группы, включающей цитрат O,O'-дипальмитоилхитозана, лактат O,O'-дипальмитоилхитозана, малат O,O'-дипальмитоилхитозана, сукцинат O,O'-дипальмитоилхитозана, ацетат O,O'-дипальмитоилхитозана, сульфат O,O'-дипальмитоилхитозана и акрилат O,O'-дипальмитоилхитозана;
- O,O'-днпальмитоилхитозан имеет молекулярный вес в диапазоне от 1400 до 4500 кДа;
- доля O,O'-дипальмитоилзамещенных звеньев хитозана в гемостатическом агенте составляет от 40 до 65%;
- доля свободных аминогрупп в гемостатическом агенте составляет от 50 до 90%;
- содержание гемостатического агента в гемостатическом материале составляет не менее 5 мас. %;
- биоадгезивное нейтральное вещество представляет собой вещество, которое способствует прикреплению материала к раневым поверхностям;
- биоадгезивное нейтральное вещество представляет собой вещество, не препятствующее удалению гемостатического материала из раны путем промывания физиологическими растворами и механического извлечения;
- биоадгезивное нейтральное вещество не снижает и/или не оказывает отрицательного влияния на исходную гемостатическую способность гемостатического агента;
10
30
- биоадгезивное нейтральное вещество представляет собой соединение или комбинацию соединений, выбранных из группы, включающей карбополы, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, 2-акриламидо-2-метилпропансульфоновую кислоту, полимеры акриловой кислоты, сшитые дивинилгликолем, и их соли, полимеры акриловой кислоты, сшитые аллилсахарозой и/или аллилпентаэритритом; сополимеры, включающие полимеры акриловой кислоты и С-С алкилакрилаты, сшитые аллилпентаэритритом; редкосшитые акриловые гомополимеры, сополимеры и блок-сополимеры полиэтиленгликоля и эфира жирной кислоты с длинной алкильной цепью, карбоксиметилкрахмал, немодифицированный крахмал, модифицированный крахмал, карбоксиметилцеллюлозу, гуаровую камедь, ксантановую смолу, коллаген, желатин;
- гемостатический материал содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество (ПАВ);
- гемостатический материал содержит ПАВ в количестве не менее 0,01 мас. %;
- ПАВ выбрано из группы, включающей сополимеры на основе оксида этилена, сополимеры на основе оксида пропилена, блок-сополимеры на основе оксида этилена и оксида пропилена, глицерин, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, жирные кислоты, соли жирных кислот, ПАВ на основе силикона и эмульгаторов; при этом жирные кислоты, предпочтительно, выбраны из группы, включающей лауриловую кислоту и олеиновую кислоту;
- жидкостная проницаемость в упомянутый гемостатический материал составляет не менее 30 мм за 1 минуту.
Предпочтительно, гемостатический материал может быть использован для производства средств для обработки, закрытия ран.
Еще одним объектом настоящего изобретения является гемостатическое средство в жидкой или гелеобразной форме, изготовленное из вышеупомянутого гемостатического материала.
В предпочтительном варианте реализации изобретения упомянутое средство в жидкой форме представляет собой раствор, а в гелеобразной форме представляет собой гель.
Также в предпочтительном варианте реализации изобретения:
- для получения жидкой формы гемостатический материал растворяют в воде;
- для получения гелеобразной формы гемостатический материал растворяют в воде с последующим добавлением загущающего агента;
- загущающий агент выбирают из группы, включающей полисахариды, полиэтиленгликоли, полисилоксаны, циклические полисилоксаны, полиакрилаты, этоксилированные насыщенные спирты, растительные камеди и/или их производные, и/или их сочетания, и/или продукты их взаимодействия, в том числе сополимеры.
Еще одним объектом настоящего изобретения является перевязочный материал для остановки кровотечений, состоящий из одного или нескольких слоев полотна и нанесенного на них гемостатического средства, изготовленного из гемостатического материала путем растворения в дистиллированной воде и, не обязательно, последующего добавления загущающего агента, в форме раствора или геля.
В предпочтительном варианте реализации изобретения перевязочный материал представлен в форме бинта или губки, или тампона, или нетканого материала из вискозы, или тонкого гибкого субстрата, или тканой марли, или пленки.
Также в предпочтительном варианте реализации изобретения:
- материал полотна выбран из группы, включающей хлопок, нетканые материалы, биоразлагаемые материалы, материалы, содержащие волокна,
- материал, содержащий волокна, выбран из группы, включающей материалы на основе волокон целлюлозы, полимолочной кислоты, полилакапролактона, материалы на основе волокон хитина, хитозана, альгинатных волокон;
1,2
1
2
3
3

- нетканый материал выбран из группы, включающей полиэстер, целлюлозу, полиэфир, полипропилен, а также вискозу или их комбинации, в том числе полученные по технологии Спанлейс ( Vaughn, Е.: "Spunlaced Fabrics", Canadian Textile Journal, October 1978, pp. 31-36.,  M.G. Kamath, A. Dahiya, R.R. Hegde "Spunlace (Hydroentanglement)", Nonwovens Science and Technology II, April, 2004, http://www.engr.utk.edu/mse/Textiles/Spunlace.htm) или Спанджет ( Rieter Perfojet: SPUNjet Technology, Nonwovens Industry, November 2003);
- раствор гемостатического материала нанесен пропиткой или напылением;
2
- плотность упомянутого полотна составляет от 60 до 180 г/м;
2
- количество впитанного раствора составляет не менее 12 г/м;
- упомянутый материал дополнительно содержит впитывающий слой полотна или бумаги;
- упомянутый материал состоит из нескольких слоев полотна, сшитых и/или склеенных между собой.
Далее изобретение подробно описывается со ссылкой на фигуру 1.
На фиг. 1 приведены результаты реологических испытаний трех вариантов состава гемостатических материалов, при этом динамический модуль накопления (в Па) обозначен как G', а динамический модуль потерь (в Па) обозначен как G''.
В рамках настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что гемостатическая активность хитозана может быть усилена путем его гидрофобной модификации по двум свободным гидроксильным группам с сохранением активности аминогруппы. При этом у O-ацилированного хитозана сохраняется активность аминогрупп. При этом, так как доказанного научного объяснения химических процессов, влияющих на гемостатическую способность соединений хитозана, не существует (объяснения имеются лишь в виде гипотез, выдвигаемых различными авторами), в свете предшествующего уровня техники усиление гемостатических свойств хитозана за счет его O-ацилирования является неочевидным для специалиста в данной области.
Полученные соли O-ацилированных хитозанов, согласно результатам проведенных в рамках настоящего изобретения испытаний, имеют как гораздо более высокую гемостатическую активность по сравнению с немодифицированным хитозаном, так и, в отличие от N-алкилированных и иных гидрофобно-модифицированных хитозанов, описанных в уровне техники в работах Доулинга и Де Кастро, сохраняют высокую активность в больших объемах крови ввиду своей растворимости в крови, а следовательно, и большую реакционную способность при взаимодействии с форменными элементами крови.
При реализации изобретения установлено, что при синтезе O,O'-дипальмитоилхитозана предпочтительно использовать хитозан с молекулярной массой в диапазоне от 600 до 1500 кДа. Если для синтеза гемостатического агента использовать хитозан с низкой молекулярной массой (ниже 500-600 кДа), то полученная из него соль O,O'-дипальмитоилхитозана практически не будет проявлять требуемых гемостатических свойств. При использовании хитозана с молекулярной массой выше 1500-1600 кДа появляются сложности с подготовкой хитозана к синтезу O,O'-замещенного хитозана, так как растворимость полученной соли O,O'-дипальмитоилхитозана значительно снижается. С учетом вышесказанного, оптимальный диапазон молекулярной массы O,O'-дипальмитоилхитозана составляет 1400-4500 кДа.
Доля (степень замещения) O,O'-дипальмитоилзамещенных звеньев в макромолекуле гемостатического агента составляет от 40 до 65%. Выбор диапазона обусловлен тем, что гемостатические свойства O,O'-дипальмитоилхитозана растут пропорционально доле O,O'-дипальмитоилзамещенных звеньев, однако при доле замещенных звеньев около 40-60% значение гемостатической способности выходит на плато, и при достижении степени замещения 65-70% и выше начинается конкурирующий процесс N-ацилирования свободных аминогрупп, в результате чего начинает снижаться гемостатическая способность O,O'-дипальмитоилзамещенного хитозана.
При реализации изобретения также установлено, что оптимальное количество свободных аминогрупп в гемостатическом агенте составляет от 50 до 90%. В данный диапазон основной вклад вносит значение степени деацетилирования исходного хитозана (DD), однако учитывается и минимальное влияние замещения аминогрупп при побочной реакции N-ацилирования пальмитоилхлоридом. Доля свободных аминогрупп в диапазоне от 50 до 90% является оптимальной ввиду того, что при увеличении количества свободных аминогрупп свыше 90% невозможно достичь высокой доли O,O'-дипальмитоилзамещенных звеньев в макромолекуле гемостатического агента и, следовательно, значимого увеличения гемостатических свойств полученного материала по сравнению с исходным хитозаном; с другой стороны, при уменьшении количества свободных аминогрупп ниже 50%, несмотря на рост степени замещения, начинает снижаться гемостатическая способность O,O'-дипальмитоилзамещенного хитозана.
Установлено, что оптимальной формой гемостатического материала является порошок. При этом содержание гемостатического агента в гемостатическом материале должно составлять не менее 5 мас. %, так как при меньшем содержании агента материал не будет проявлять необходимые гемостатические свойства. С другой стороны, содержание гемостатического агента в гемостатическом материале выше 25-30% по массе снижает стабильность образовавшегося сгустка, так как в реакцию с кровью успевает вступить лишь малая часть гемостатического материала, которая образует хрупкую корку. Таким образом, оптимальным можно считать содержание гемостатического агента в гемостатическом материале в диапазоне от 5 до 25 мас. %.
Также установлено, что содержание поверхностно-активных веществ в гемостатическом материале должно составлять не менее 0,01 мас. %, так как в этом случае ускоряется пропитывание сгустка кровью, также, дополнительно, повышается равномерность пропитывания, что позволяет избежать появления каналов, полостей и т.п. со свободной кровью в массе сгустка, таким образом улучшается стабильность образовавшегося сгустка в полости раны. При этом оптимальным будет содержание ПАВ от 0,01 до 0,5 мас. %, так как содержание ПАВ выше 0,5 мас. % вызывает мицеллообразование в маточном растворе хитозана, что резко снижает его растворимость. Кроме того, возможно негативное влияние высокого содержания ПАВ (выше 0,5 мас. %) на рану, в частности блокировка собственных механизмов тромбообразования, замедление заживления раны и т.п.
Значение жидкостной проницаемости в гемостатический материал (т.е. степени пропитывания массы материала свободной жидкостью, находящейся на поверхности материала за единицу времени), которая иллюстрирует способность материала поглощать и связывать кровь, составляет не менее 30 мм за 1 минуту, так как при меньшей жидкостной проницаемости наблюдается слабая пропитываемость сгустка кровью, что значительно снижает его стабильность в ране, вызывает образование каналов, полостей со свободной кровью, что способствует возникновению рецидивов кровотечений при механическом воздействии на рану.
15
31
В рамках настоящего изобретения заявлен гемостатический материал на основе соли O-ацилированного хитозана (в частности, O,O'-пальмитоилхитозана), а также изготовленное из указанного гемостатического материала гемостатическое средство и перевязочный материал для остановки кровотечений, состоящий из нескольких слоев полотна и нанесенного на него слоя гемостатического средства, при этом гемостатическое средство, предпочтительно, выполнено в форме раствора или геля. O,O'-пальмитоилхитозан получают на основе хитозана путем его O-ацилирования пальмитоилхлоридом CHC(O)Cl по методике, описанной в статье Тонга и его коллег (Tong Y., et al. "Synthesis of O,O'-dipalmitoyl chitosan and its amphiphilic properties and capability of cholesterol absorption" // Carbohydrate Polymers, 2005, vol. 60(2), pp. 229-233), что обеспечивает гидрофобные свойства такому производному хитозана с одновременной защитой аминогруппы при образовании соли.
Полученная таким образом соль хитозана сохраняет реактивность аминогруппы, одновременно приобретая гидрофобные свойства, что усиливает гемостатический эффект благодаря амфифильности молекулы.
В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения, гемостатический материал на основе соли O-ацилированного хитозана используют в смеси с нейтральным веществом, не снижающим гемостатическую функциональность хитозана, но высокогигроскопичным (способным быстро пропитываться, в том числе влагой из воздуха, с последующим самосвязыванием и затвердеванием) и биоадгезивным (способным обеспечивать достаточную адгезию к биологическим тканям). При этом такое вещество должно быть биоразлагаемо, чтобы возможное попадание в рану частиц гемостатика не было опасно для пациента. Такие свойства имеет, например, модифицированный крахмал.
Заявляемый гемостатический материал имеет следующие преимущества по сравнению с известными из предшествующего уровня техники средствами того же назначения.
1. Позволяет избежать проблем с медленным достижением гемостаза, так как имеет значительно более высокую реактивность в отношении крови по сравнению как с чистым хитозаном, так и с его солями. Таким образом время давления, оказываемого на рану, сокращается до 0,5-1,0 мин, значительно снижается вероятность возникновения каналов прохождения крови внутри гемостатического материала до наступления гемостаза.
2. Биоадгезия, а также способность частиц вспомогательного вещества к связыванию и отвердеванию в высоковлажной среде раны позволяют увеличить стабильность сгустка в ране, так как все гемостатическое средство к моменту достижения гемостаза представляет собой единое целое, связанное с окружающими тканями.
3. В случаях повторных кровотечений высокая активность O,O'-пальмитоилхитозана позволяет сохранить гемостатические свойства, что приведет к немедленной остановке возобновившегося кровотечения.
4. Избежать добавления ПАВ, так как O,O'-пальмитоилхитозан сам по себе является амфифильным соединением.
5. Использование в качестве биоадгезивного вещества биоразлагаемых материалов позволяет меньше внимания уделять поиску в ране частиц гемостатика, что сокращает затраты на последующие хирургические вмешательства.
Для выяснения гемостатических свойств водорастворимых гидрофобно-модифицированных солей хитозанов и выявления их преимуществ перед известными из уровня техники гемостатическими средствами на основе хитозана и его производных проводились испытания, включая исследование растворимости, реологические испытания, исследование скорости тромбообразования, подбор биоадгезивного агента и исследование гемостатических свойств предлагаемого средства в условиях in vitro.
Ниже приведены некоторые примеры осуществления данного изобретения. Не являясь единственно возможными, приведенные примеры наглядно демонстрируют возможность достижения заявленного технического результата в различных вариантах осуществления изобретения.
Во всех испытаниях под «гемостатическим агентом» понимается один из следующих материалов.
1. Высокомолекулярный хитозан (800-1000 кДа) со степенью деацетилирования 95% (далее «хитозан»).
2. N-додецилхитозан со степенью замещения (долей N-додецилзамещенных звеньев хитозана) 6% согласно прототипу из статьи De Castro et al. (далее «N-алкилированный хитозан»).
3. Сукцинат O,O'-пальмитоилхитозана с долей O,O'-дипальмитоилзамещенных звеньев 63%, долей свободных аминогрупп 83% (далее «соль O-ацилированного хитозана»).
Пример 1. Исследования растворимости гемостатических агентов
Каждый из агентов, взятых в количестве 10 г, постепенно, в течение 1 минуты, добавлялся при равномерном помешивании к 1 литру дистиллированной воды с pH, доведенным до 7 при помощи NaOH. Через 3 минуты визуально оценивали достигнутую растворимость. Результаты испытаний представлены в таблице 1.
Из табл. 1 видно, что чистый хитозан и N-алкилированный хитозан не растворяются в крови, в связи с чем проведение реологических и иных испытаний по гемостатической способности с достаточно большим количеством крови не представляется возможным. Следовательно, такие нерастворимые материалы трудно применимы для целей гемостаза по означенным выше причинам.
Пример 2. Реологические испытания гемостатических агентов
Так как хитозан и N-алкилированный хитозан нерастворимы при pH выше 6, испытания проводились с использованием 0,3 М раствора уксусной кислоты.
К 1 литру 0,3 М раствора уксусной кислоты добавляли 10 г каждого из материалов, 15 мл полученных растворов смешивались с 100 мл непригодной для трансфузий кровью человека, консервированной коммерчески доступным гемоконсервантом ЦОЛИПК-12а, включающим лимонную кислоту, глюкозу, фосфат натрия трехзамещенный, 4% раствор NaOH и бидистиллированную воду. Полученную смесь помещали в реометр «Physica MCR 102», проводили испытания для определения динамического модуля накопления и динамического модуля потерь. При этом, если модуль потерь оказывался выше модуля накопления, делали вывод, что материал представляет собой гель. Результаты реологических испытаний представлены на фиг. 1.
Из результатов проведенных реологических испытаний видно, что все три материала показывают гелеобразование при взаимодействии с кровью, однако механическая прочность геля с солью O-ацилированного хитозана оказывается выше, чем N-алкилированного, тогда как немодифицированный хитозан при этом дает лишь очень непрочный в механическом отношении гель.
Пример 3. In vitro испытания гемостатических агентов на тромбообразование
Для определения связываемости гемоглобина применяли метод абсорбционной спектрофотометрии для определения концентраций несвязанного гемоглобина в растворах крови с гемостатическими агентами. Для этого 5 мл донорской крови, непригодной для трансфузий, помещали в колбу Эрленмейра, к крови добавляли 1,25 мл 0,2 М раствора хлорида кальция, затем к полученному раствору добавляли при перемешивании 3,75 мл раствора каждого из агентов в 0,3 М растворе уксусной кислоты. Полученные растворы анализировали спектрофотометрически в видимой области спектра, в области с центром при 575 нм и с шириной диапазона около 250 нм (для учета как оксигемоглобина, так и дезоксигемоглобина). Измерения показателя поглощения проводились с интервалом 2 минуты при длине волны в максимуме пика поглощения. Результаты испытаний представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что O-ацилированный хитозан связывает гемоглобин крови быстрее и в большей степени, чем N-алкилированный хитозан. Таким образом, O-ацилированный хитозан имеет значительное преимущество в качестве гемостатического материала перед N-алкилированным.
Испытания продемонстрировали, что соли O-ацилированных хитозанов проявляют более высокие гемостатические способности, а также растворимость, по сравнению как с N-алкилированными хитозанами, что, предположительно, связано с полным заполнением связей аминогрупп хитозана радикалами кислоты и N-алкилирующего агента, ввиду чего присущая хитозану активность по аминогруппе исчезает, что препятствует дополнительному связыванию эритроцитов с цепочками хитозана по аминогруппам; так и с чистым хитозаном. Также данные опыты могут свидетельствовать о большей активности O-ацилированной модификации ввиду наличия двух гидрофобных «хвостов».
Пример 4. Испытания гемостатического агента с биоадгезивным агентом
Для определения наилучшего биоадгезивного вещества-наполнителя проводились следующие испытания.
Для оценки степени стабильности средства в ране, характеризующейся способностью средства впитать всю истекшую кровь (жидкостная проницаемость), а также способностью связываться в единый стабильный труднопроницаемый сгусток, проводилась экспериментальная оценка степени пропитываемости и связывания, для чего в лабораторную пробирку диаметром 20 мм наливали 10 мл воды с синим красителем (Е123, индигокармин). После чего на поверхность воды насыпалось исследуемое средство в количестве до 20 г. По длине пропитанной жидкостью зоны порошкообразного средства оценивалась относительная степень пропитываемости. После оценки степени пропитывания пробирка немедленно переворачивалась, фиксировалось истечение или отсутствие истечения жидкости из пробирки. Результаты приведены в таблице 3.
Таким образом, в результате испытаний установлено следующее.
1. Степень пропитывания при использовании 20 мас. % сукцината O,O'-ацилированного хитозана в смеси с 80 мас. % карбоксиметилкрахмала наибольшая, по сравнению с использованием других агентов.
2. Стабильный труднопроницаемый сгусток образовался только при использовании сукцината O,O'-ацилированного хитозана в смеси с 80% карбоксиметилкрахмала.
Пример 5. Приготовление гемостатического материала
Для приготовления гемостатического материала сукцинат O,O'-пальмитоилхитозана в форме гранул фракцией от 0,2 до 1,2 мм смешивают в смесителе типа HD-15 "пьяная бочка" в пропорции 20:80 по массе с карбоксиметилкрахмалом в форме гранул фракцией от 0,2 до 1 мм. После смешивания производят контроль фракционного состава материала путем просеивания. При необходимости, для дальнейшего изготовления гемостатических средств (например, бинтов, гелей), гемостатический материал может быть растворен в дистиллированной воде, например, в пропорции 1 часть материала на 10 частей дистиллированной воды.
Пример 6. Оценка биоадгезивных свойств гемостатических материалов
Для оценки биоадгезивных свойств предлагаемого материала проводились следующие испытания. Для оценки приклеивания к сухим и влажным тканям использовалась часть брюшины свиньи, охлажденной для сохранения влажности. На брюшину накладывался отрезок бинта размером 2,5×2,5 см с пришитой к центру отрезка петлей, на наложенный отрезок бинта устанавливался груз весом 2 кг. Через 1, 3 и 10 минут оценивалась степень приклеивания к тканям необходимого для отрыва усилия в Ньютонах. Результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4.
Сравнение биоадгезивных свойств гемостатических материалов.
Испытываемый образец
Усилие отрыва, H
через 1 мин
через 3 мин
через 10 мин
Гемостатический материал согласно настоящему изобретению (см. пример 5)
2,8
3,2
3,2
Celox<sup></sup><sup>4</sup> (<sup>4</sup> Согласно данным из US 20090186851 и WO 2012123728.)
0,3
0,6
0,7
К сухим тканям ни один из образцов адгезии не имел.
Пример 7. In vitro испытания гемостатической способности гемостатических материалов
Для оценки гемостатической способности в лабораторных условиях применялся метод осаждения взвеси бентонита раствором исследуемого материала. Для этого в 100 мл воды добавляли 1,5 г гемостатического средства. В течение 3-х минут раствор умеренно перемешивали. Полученный раствор отфильтровывали через 3 минуты после начала растворения. Затем оценивали необходимое время для осаждения 150 мл отстоявшейся 0,5% взвеси бентонита 0,5 мл раствора исследуемого материала. Результаты испытаний приведены в таблице 5.
Пример 8. Изготовление жидкой и гелеообразной форм гемостатического средства
a). Для изготовления жидкой формы используют активный материал (чаще всего в форме гранулированного порошка) и дистиллированную воду. Активный материал растворяют в дистиллированной воде в пропорции 10 кг материала в 100 кг дистиллированной воды до получения однородного раствора без включений, агрегатов, нерастворенных частиц. Растворение проводят в низкоскоростной мешалке объемом 250 л.
b). Для изготовления гелеообразной формы гемостатика используют загущающий агент Dow Corning RM 2051, представляющий собой коммерчески доступную эмульсию натрия полиакрилата в диметиконе. В мешалку с приготовленной жидкой формой гемостатика приливают загущающий агент в количестве 2 кг и перемешивают в течение 4 часов.
Полученное гемостатическое средство в форме геля или жидкости перемещают в питающий бак дозаторно-укупорочной линии. Линию настраивают на нужный объем продукта. Розлив, в общем случае, ведется в полимерные емкости (флаконы), снабженные винтовым наконечником с пробкой с контролем вскрытия. Флаконы могут иметь дозирующую систему в виде поршня или кнопки. На заключительной стадии осуществляется радиационная стерилизация готовых флаконов дозой гамма-излучения не менее 15 кГр, затем готовые флаконы перемещают в этикетировочную машину и производят контроль качества.
Пример 9. Изготовление гемостатических бинтов
Для изготовления бинтов гемостатических используют:
2
- нетканое полотно плотностью от 60 до 180 г/м необходимой ширины (от 0,03 до 0,15 м) в форме бобины общей длиной до 1 км;
- гемостатический агент или материал в форме гранулированного порошка или гемостатическое средство в форме геля или раствора.

В другом варианте реализации изобретения возможно изготовление многослойных бинтов, для формирования которых также используют впитывающие полотна или бумагу, впитывающие агенты (например, модифицированные силикаты, такие как 385441 Aldrich Octyl-functionalized silica gel, BASF Sorbead, EMD Millipore 1125720001, 227196 Aldrich, или агенты собственного производства) в форме порошков, гранул, волокон.
В случае если гемостатический агент имеется в форме порошка, производят его растворение в дистиллированной воде в пропорции 10 кг гранулированного порошка по весу в 100 кг дистиллированной воды до получения однородного раствора без включений, агрегатов, нерастворенных частиц. Растворение проводят в низкоскоростной мешалке объемом 250 л.
В случае нанесение раствора гемостатического материала пропиткой:
- готовый раствор активного вещества помещают в кювету питающего бассейна;
- заправляют ленту полотна через подающие валки и каландр;
- подающий валок питающего бассейна опускают до глубины 0,3 см от дна кюветы;
- задают настройки каландрирования: температура 60°С, давление 0,6 МПа, скорость протяжки 10 м/мин;
- настраивают резательную линию на необходимую длину бинта и метод укладки;
- прогревают каландр;
- кратковременным включением линии на минимальной скорости протягивают полотно до появления (визуально) пропитанного полотна на выходе каландра до входа в резательную машину; припуск на входе резательной машины устанавливают не менее 0,3 м;
2
2
- запускают линию до конца изготовления первого бинта, бинт взвешивают, контрольный параметр: количество впитанного раствора в г/м (в общем случае - не менее 12 г/м);
- запускают линию на изготовление;
- нарезанные бинты принимают из машины на колесную этажерку вакуумную сушилку шкафную;
- заполненную этажерку помещают в вакуумную сушилку шкафную, сушку производят до падения влажности в исходящем потоке до 10%;
- в некоторых вариантах реализации изобретения, после сушки дополнительно осуществляют текстурирование бинта в текстурирующей машинке с получением перфорации или эффекта умягчения и проч.;
- при изготовлении многослойных бинтов дополнительно многослойные бинты перемещают на линию формирования и прошивки;
- при этом в питающую емкость помещают впитывающий агент (при использовании);
- заправляют в машину для прошивки ленты готового полотна и впитывающего полотна;
- линию прошивки запускают, при этом на нижний готовый бинт накладывается впитывающее полотно/бумага, на полученный пакет накладывается верхний готовый бинт;
- начальный конец пакета и край пакета прошивается или склеивается: пакет поворачивается раскрывом вверх, в раскрыв при перемещении пакета насыпается впитывающий агент, одновременно прошивается или склеивается верхний край пакета; через каждые 3-10 см осуществляется поперечная сшивка или склейка для уменьшения перемещения порошкообразных агентов внутри пакета; по достижению нужной длины осуществляется окончательная поперечная сшивка или склейка. Сшитые пакеты (готовый бинт многослойный) пропускают через грохот для равномерного распространения впитывающего агента, затем прокатывают через прессующие валки при давлении 1 МПа;
- готовые бинты помещают в фасовочно-складывательную линию; линию настраивают в соответствии с требованиями заказчика; бинты упаковываются в вакуумно-фольгированную упаковку;
- производится радиационная стерилизация готовых упаковок общей принятой дозой не менее 15 кГр гамма-излучения;
- производится контроль качества отделом ОТК.
В случае нанесения раствора гемостатического материала напылением осуществляют следующие операции:
- готовый раствор помещают в питательный бак форсуночного напыления;
- заправляют ленту полотна через подающие валки и каландр;
- настраивают напылительные форсунки на: расход 1,7 кг/мин, ширина факела распыла выбирается в зависимости от ширины используемого нетканного материала с таким расчетом, чтобы перекрывать ширину материала с припуском +3 мм с каждой из сторон, угол распыла: +60°, отстояние от полотна: 2 см;
- настраивают каландр: температура - 60°С, давление - 0,6 МПа, скорость протяжки - 10 м/мин;
- настраивают резательную линию на необходимую длину бинта и метод укладки;
- прогревают каландр;
- кратковременным включением линии на минимальной скорости протягивают полотно до появления (визуально) пропитанного полотна на выходе каландра до входа в резательную машину; припуск на входе резательной машины - не менее 0,3 м;
2
2
- запускают линию до конца изготовления первого бинта, бинт взвешивают, контрольный параметр: количество впитанного раствора в г/м (в общем случае - не менее 12 г/м);
- запускают линию на изготовление;
- нарезанные бинты принимают из машины на колесную этажерку вакуумную сушилку шкафную;
- заполненную этажерку помещают в вакуумную сушилку шкафную, сушку производят до падения влажности в исходящем потоке до 10%;
- опционно, после сушки проводят текстурирование в текстурирующей машинке (настройка на перфорацию, умягчение и проч.);
- опционно, при изготовлении многослойных бинтов бинты перемещают на линию формирования и прошивки;
- в питающую емкость помещают впитывающий агент (при использовании);
- заправляют в машину ленты готового полотна и впитывающего полотна;
- линию запускают, при этом на нижний готовый бинт накладывается впитывающее полотно/бумага, на полученный пакет накладывается верхний готовый бинт;
- начальный конец пакета и край пакета прошивается или склеивается: пакет поворачивается не сшитым краем вверх, в пакет через не сшитый край при перемещении пакета насыпается впитывающий агент, одновременно прошивается или склеивается верхний край пакета; через каждые 3-10 см осуществляется поперечная сшивка или склейка для уменьшения перемещения порошкообразных агентов внутри пакета; по достижению нужной длины осуществляется окончательная поперечная сшивка или склейка. Сшитые пакеты (готовый многослойный бинт) пропускают через грохот для равномерного распространения впитывающего агента, затем прокатывают через прессующие валки при давлении 1 МПа;
- готовые бинты помещают в фасовочно-складывательную линию; линию настраивают в соответствии с требованиями заказа; бинты упаковываются в вакуумно-фольгированную упаковку;
- производится радиационная стерилизация готовых упаковок общей принятой дозой не менее 15 кГрей гамма-излучения;
- производится контроль качества изготовленных гемостатических бинтов.
Пример 10. In vivo испытания на кроликах гемостатического средства и изготовленного на его основе перевязочного гемостатического материала

С целью установления эффективности гемостатического средства согласно настоящему изобретению и изготовленного на его основе перевязочного гемостатического материала в форме бинта взяли 28 кроликов весом от 3 до 4,5 кг, рандомизировали их по 8 особей. Для сравнения с перевязочным гемостатическим материалом по изобретению (изготовленным в форме бинта) также испытывали существующие на рынке перевязочные гемостатические материалы Celox Gauze (выпускается компанией Medtrade Products Ltd.) и HemCon ChitoGauze (выпускается компанией HemCon Medical Technologies Inc.), еще 4 кроликов - для контрольной группы.
Восьми особям на рану, образованную в области рассечения верхней брыжеечной артерии, помещали бинт, изготовленный в соответствии с настоящим изобретением,

- бинт со средством Celox Gauze - 8 особям,

- бинт HemCon ChitoGauze - 8 особям,
- накладывали давящую повязку из марлевого бинта шириной 6 см, длиной 1,5 м 4 особям контрольной группы.

Бинт Celox Gauze имеет достаточно жесткую структуру, что затрудняет его складывание в несколько слоев для помещения в рану и размещение там. Подобная жесткая структура Celox Gauze может приводить к травматизации окружающих тканей. Заметно наличие в ране свободного порошка, осыпающегося с бинта.
Бинт согласно настоящему изобретению имеет мягкую структуру, легко складывается в несколько слоев и размещается в ране, не травмируя окружающие ткани. Свободный порошок в ране отсутствует.
В ходе исследования бинты с вышеуказанными средствами складывали в 5 слоев. В течение 7 минут оказывалось мануальное давление на бинт, помещенный на область кровотечения. По истечении 7 минут оценивали степень пропитывания бинта кровью, гемостаз, сохранение гемостаза при смещении бинта. После чего прекращалось мануальное давление, и бинт оставляли в полости раны на 30 минут. После чего оценивали степень сохранения гемостаза. Результаты испытаний приведены в таблице 6.
Пример 11. In vivo испытания на свиньях гемостатического средства и изготовленного на его основе перевязочного гемостатического материала
Для оценки эффективности настоящего изобретения проведены экспериментальные исследования остановки массивных кровотечений на лабораторных свиньях массой тела 35-42 кг. Для испытания взято 8 свиней. Животные были разделены на две группы - одна опытная (5 особей) и одна контрольная (3 особи).
Испытание проводили у животных под релаксацией (которую обеспечивали путем введения 3,5-4,2 мл 2% ветранквила) с использованием местной анестезии 0,5% раствором новокаина - 10 мл в месте разреза в области паха с двух сторон. После разреза кожи и подкожной клетчатки обеих конечностей в паховой области выделяли пучок - бедренная артерия и вена, наносили ранение бедренной артерии в форме отверстия диаметром 6 мм. Давали истечь крови в течение 45 секунд, затем рану тампонировали: у 5 особей использовали перевязочный гемостатический материал (бинт) согласно настоящему изобретению, у 3 особей контрольной группы использовали марлевый бинт шириной 6 см, длиной 1,5 м. Тампоны в ране фиксировали бинтом путем наложения давящей повязки. Кроме давящей повязки дополнительно давления на рану не оказывали в течение всего эксперимента. Через 60 минут после наложения повязок повязки снимали, удаляли бинты из раны для проведения оценки гемостаза и выживаемости. Результаты приведены в таблице 7.
Результаты испытаний in vivo (примеры 10 и 11) демонстрируют, что 28 кроликов и 5 свиней, подвергнутых массивному кровотечению, выжило при использовании перевязочного гемостатического материала по настоящему изобретению. Представленные данные иллюстрируют адгезивные и гемостатические способности предлагаемого средства на основе O,O'-ацилированного хитозана, превосходящие аналогичные показатели известных кровоостанавливающих средств на основе других производных хитозана, отсутствие токсичности и травмирования прилегающих к ране тканей, что составляет неочевидные преимущества заявляемого технического решения.