Анализ спектра антител к вирусу гепатита с у пациентов ФБУ «1477 ВМКГ флота » по опыту работы лаборатории инфекционной иммунологии

тельность возбудителей к антибиотикам определялась согласно критериям Национального комитета по стандартизации лабораторных исследований (NCCLS).

Результаты и обсуждения: микробный пейзаж возбудителей ВП за период наблюдения представлен следующими штаммами: S. рneumoniae (52,49%), S. рyogenes (19,32%), Y. influenzae (12,57%), S.aureus (4,41%), M. catarrhalis (2,15%), прочие возбудители (9,06%).

Определена чувствительность к антибиотикам 134 штаммов S. рneumoniae, выделенных от больных ВП. Процент нечувствительных штаммов к указанным антибиотикам составил в 2003 и 2008 гг. соответственно, к пенициллину (МПК > 2 мг/л) 23,5 и 33,5%; к цефтриаксону (МПК > 4 мг/л) 5,2 и 13,8%; к эритромицину (МПК> 2 мг/л) 16,8 и 29,2%; к тетрациклину (МПК > 4 мг/л) 21,6 и 28,4%; к хло-

рамфениколу (МПК > 8 мг/л) 1,1 и 6,3% и левофлок-сацину (МПК > 8 мг/л) 1,6 и 8,4%.

Выводы.

- в закрытом коллективе у лиц молодого возраста ведущим возбудителем ВП является S. рneumoniae, причем его этиологическая значимость возрастает. Отмечается более низкая по сравнению с данными литературы этиологическая роль Y influenzae и стабильное выделение M. catarrhalis, чья роль по данным других авторов признается несущественной;

- зарегистрировано некоторое снижение чувствительности основных возбудителей к антибиотикам цефалоспоринового и пенициллинового рядов, что можно объяснить постепенным формированием у возбудителей механизмов резистентности к препаратам этих групп. За период наблюдения выявилась выраженная тенденция к формированию устойчивости возбудителей ВП к препаратам эритромицинового ряда.

Nosach K.S., Andryukov B.G., *Martynovа A.V. Laboratory monitoring etiological structure and antimicrobial resistance agents community-acquired pneumonia in young people in private groups. FBU "1477 Naval Hospital, Navy", Vladivostok; * GOU VPO «Vladivostok State Medical University, " Vladivostok.

Keywords: community-acquired pneumonia, etiologic structure, closed groups.

Сведения об авторах:

Носач Екатерина Сергеевна, врач-эпидемиолог ФБУ «1477 военно-морской клинический госпиталь флота». 690005, Владивосток, ул. Ивановская, 4. 8(423)246-78-14; e-mail: vmkg26826@mail.ru.

Андрюков Борис Георгиевич, заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, заведующий лабораторным отделением ФБУ «1477 военно-морской клинический госпиталь флота». 690005, Владивосток, ул. Ивановская, 4. Тел.:8(423)253-94-43; e-mail: andrukov_bg@mail.ru.

Мартынова Алина Викторовна, доктор медицинских наук, доцент кафедры эпидемиологии ГОУ ВПО «ВГМУ». Владивосток, ул. Острякова, 2. e-mail: clinmicro@yandex.ru.

© Коллектив авторов, 2012 УДК 616.9

Овчинникова О.В., Сиротинская Е.К., Окунева Е.А.

АНАЛИЗ СПЕКТРА АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С У ПАЦИЕНТОВ фБУ «1477 ВМКГ

флота» по опыту работы лаборатории инфекционной иммунологии

ФБУ «1477 военно-морской клинический госпиталь флота», Владивосток

Авторы провели анализ иммуноглобулинового спектра сывороток пациентов, прошедших обследование в 2009-2011 гг. в лаборатории инфекционной иммунологии лабораторного отделения ФБУ «1477 ВМКГ флота» на маркеры вирусного гепатита С (ВГС). Сделан вывод, что использование тест-систем для определения спектра антител к отдельным белкам ВГС (сог-а/г, №3, №4, №5, ^М-НСУ) является более информативным, чем обычные подтверждающие тесты, особенно в условиях динамического наблюдения.

Ключевые слова: вирусный гепатит С, диагностика, антитела.

Вирусный гепатит С (ВГС) продолжает оставать- болезней печени: хронического гепатита, цирроза,

ся одной из центральных проблем здравоохранения. гепатоцеллюлярной карциномы. Установление диа-

Отличительная особенность и опасность скрытое гноза базируется на выявлении специфических се-

или малосимптомное течение инфекции, она дли- рологических маркеров. Это важно не только для

тельное время может оставаться нераспознанной. дифференциальной диагностики гепатита С, но и

Именно ВГС-инфекция является основной при- суждения о стадии заболевания, прогнозирования

чиной формирования всей группы хронических его течения, оценки активности процесса и эффек-

тивности противовирусной терапии [1].

Наиболее широко используется определение анти НСУ-антител. Принципиальное значение имеет ген-диагностика, основанная на детекции РНК НСУ. Недавно появилась возможность обнаружения циркулирующих НСУ-антигенов. Выявление анти НСУ-антител проводят при помощи твердофазного имму-ноферментного анализа (ИФА) на основе комплекса структурных и не структурных вирусных пептидов.

Внедрение диагностических тест-систем третьего поколения позволило сократить сроки первичного выявления анти-НСУ при остром ВГС, существенно повысить чувствительность и специфичность реакции. Первые антитела (обычно анти-сог-а/г, анти-^3, анти-^5) удаётся обнаружить в среднем через 50 (20-150) дней [2]. Частота выявления анти-НСУ среди РНК-НСУ позитивных образцов крови приближается к 100% [2,3]. На фоне хронической инфекции антитела выявляются постоянно, а после элиминации вируса сохраняются длительное время. Поэтому формальное наличие анти НСУ не всегда говорит о присутствии вируса в организме и не позволяет судить об активности процесса. Для суждения о вирусной нагрузке, активности НСУ репликации, риска хронизации, разграничение острого и хронического гепатита, длительности хронического процесса и степени поражения печени предложено использовать определение спектра антител к различным НСУ-пептидам, а также наблюдать за их качественной и количественной динамикой [3,4].

Детекция антител к каждому из НСУ-антигенов имеет самостоятельное значение. Известно, что анти-сог-а/г, анти-^3 выявляются на самых ранних этапах сероконверсии, анти-^4 и анти-^5 как правило появляются позднее.

Анти NS3 могут являться самостоятельным диагностическим маркером острой НСУ-инфекции. Высокие титры анти-^3 при остром гепатите С свидетельствуют о высокой вирусной нагрузке, а длительное сохранение в острой фазе связано с высоким риском хронизации инфекционного процесса [1, 4].

Высокие титры NS4 и высокие титры соответствующих антител чаще свидетельствуют о длительности инфекционного процесса и, по всей видимости, коррелируют со степенью поражения печени. Имеются данные, говорящие о том, что выявление анти-^5 в высоких титрах часто свидетельствует о присутствии вирусной РНК, а в острой стадии является предиктором хронизации инфекционного процесса [2,5].

По современным представлениям ^М-ответ в острой фазе ВГС не следует классическому пути антителообразования: ^М анти-НСУ могут выявляться одновременно и даже позднее, чем IgG анти-НСУ. Поэтому обнаружение ^М анти-НСУ не всегда может быть использовано как маркер острой

инфекции. Вместе с тем длительность циркуляции

а.сог^М (3-5 месяцев) является фактором, прогнозирующим персистентную инфекцию, а их выявление при хроническом ВГС свидетельствует о реактивации вируса, т. е. обострении процесса. Этому соответствует корреляция между темпами снижения анти-сог-^М и эффективностью противовирусной терапии [3,5,6].

В подтверждающих иммуноферментных тест-системах при отсутствии убедительных оснований для признания сыворотки анти-ВГС-позитивной или анти-ВГС-негативной решением является сообщение неопределённого результата исследований согласно критериям, внесённым в настоящее время в инструкции к тест-системам. Так в т/с ЗАО «Вектор-Бест» «Рекомби Бест анти-ВГС-спектр» позитивным считается результат не только при обнаружении антител по всем четырём белкам к ВГС, но и при обнаружении только анти-сог-а/г или антител только к двум неструктурным белкам. При обнаружении же антител только к одному из неструктурных белков результат расценивается как неопределённый [1,5,6].

Как видно, гуморальный иммунный ответ, его динамика и структура, в том числе особенности продукции антител к определённым белкам ВГС, во многом остаются не выясненными, хотя и активно изучаются. Исследование этих позиций актуально в практическом аспекте.

Целью нашей работы явился анализ иммуноглобулинового спектра сывороток пациентов, проходящих обследование на маркеры вирусного гепатита С (ВГС).

Материалы и методы. Работа проводилась в лаборатории инфекционной иммунологии ФБУ «1477 ВМКГ флота» в течение 2009-2011 гг. Контингент обследуемых: пациенты отделений госпиталя, доноры крови, пациенты поликлиники, военнослужащие из частей. Материалом служила сыворотка крови пациентов. Было исследовано 734 образца сывороток пациентов. Анализ проводили на стандартном оборудовании. Учёт результатов проводился на спектрофотометре «Мультискан XL» при длинах волн 420-620 нм. Использовались тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск): «Бест анти ВГС», «Бест анти ВГС-спектр», «РекомбиБест анти ВГС-^М-стрип», «ВГС а/т а/г-ИФА-Бест». Использовался метод твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА).

Статистическую обработку полученных данных результатов проводили с использованием программ Statistika 5.0.

Результаты и их обсуждение. По результатам исследования, все сыворотки были разделены на четыре группы, включающие несколько вариантов, отличающихся по спектру антител к индивидуальным

вирусным белкам.

Первая группа: определение антител IgG к сог-а/г, №3, №4, №5 и ^М-НСУ.

Вторая группа: определение антител IgG к сог-а/г, суммарным ^-белкам и IgM-HCУ.

Третья группа: определение антител IgG к сог-а/г, NS3, NS4, NS5.

Четвёртая группа: определение только антител IgGк сог-а/г, и суммарных антител к NS-белкам.

Как видно из табл. 1 и 2 наиболее часто встречаемые варианты спектра антител из первых двух групп сывороток - это варианты с наличием антител одно-

временно как к сог-а/г, так и антитела к неструктурным белкам (всего - 69,29%). Из них почти половина (30,06%) составили сыворотки с наличием ещё и антител класса М (^М-НСУ), остальные - 39,23% только антитела класса IgG к сог-а/г, и ^-белкам. Доля сывороток с наличием антител только к сог-а/г или только к неструктурным белкам составляет 14,47% и 14,95%, соответственно. И всего лишь 1,29% - это сыворотки с вариантом 8 из первой группы: с наличием только IgG к сог-а/г и ^М-НСУ, без антител к неструктурным белкам.

Таблица 1

Варианты спектра антител к ВГС первой группы

Номера вариантов сог ^3 ^4 ^5 |дм Абс. %

1 + + + + + 51 16,19

2 + + + - + 20 6,35

3 + + - + + 2 0,64

4 + - + + + 2 0,64

5 + + - - + 3 0,95

6 + - + - + 6 1,9

7 + - - + + 0 0

8 + - - - + 4 1,27

Всего сывороток вариантов 1-8 88 27,94

9 + + + + - 44 13,97

10 + + + - - 46 14,6

11 + + - + - 4 1,27

12 + - + + - 5 1,59

13 + + - - - 23 7,3

14 + - + - - 6 1,9

15 + - - + - 2 0,64

16 + - - - - 42 13,33

Всего сывороток вариантов 9-16 172 54,6

17 - + + + - 2 0,64

18 - + + - - 1 0,32

19 - + - + - 0 0

20 - - + + - 2 0,64

21 - + - - - 14 4,44

22 - - + - - 33 10,47

23 - - - + - 3 0,95

Всего сывороток вариантов 17-23 55 17,46

Всего 315 100

Таблица 2

Варианты спектра антител к ВГС второй группы

Номера вариантов сог ^ сумм. |дм Абс. %

1 + + + 103 33,55

2 + + - 114 37,13

3 + - + 4 1,3

4 + - - 48 15,64

5 - + - 38 12,38

Всего 307 100

При анализе вариантов спектра антител третьей и четвёртой групп также отмечается наибольший удельный вес с одновременным определением антител класса IgG к сог-а/г и неструктурным белкам -

57,14%, а варианты с выявлением антител только к неструктурным белкам встречаются почти в равной степени - в 20,54% и 22,32% случаев, соответственно (табл. 3 и 4).

Таблица 3

Спектры антител третьей группы

№№ СОГ ^3 ^4 ^5 Абс. %

1 + + + + 9 23,08

2 + + + - 7 17,95

3 + + + - 0 0

4 + - + + 0 0

5 + + - - 1 2,56

6 + - + - 1 2,56

7 + - - + 0 0

8 + - - - 9 23,08

27 69,23

9 - + + + 0 0

10 - + + - 0 0

11 - + - + 0 0

12 - - + + 0 0

13 - + - - 4 10,26

14 - - + - 7 17,95

15 - - - + 1 2,56

12 30,77

Всего 39 100

Таблица 4

Спектр антител четвёртой группы

№№ СОГ ^ сумм Абс. %

1 + + 46 63,01

2 + - 14 19,18

3 - + 13 17,81

Всего 73 100

В первой группе большая часть проанализированных образцов была отнесена к вариантам 1 (наличие IgG ко всем 4 белкам ВГС без^М) - 16,19%, 9 (наличие IgG ко всем 4 белкам ВГС без ^М), 10 (наличие IgG к 3 белкам: к сог-а/г, №3, №4) - 14,6%, 16 (антитела только к сог-антигену) - 13,33%, 13 (антитела к сог-а/г и №3) - 7,3%, а среди сывороток без антител к сог-а/г наибольшую долю составили сыворотки с вариантом 22 - с наличием IgG только к белку NS4 - 10,47%. Аналогичные результаты получены и в третьей группе сывороток.

Наибольшая доля проанализированных сывороток приходилась на варианты 1 (наличие антител к 4 белкам) и 8 (антитела только сог-антигену) - по 23,08%, а также на вариант 2 (антитела к 3 антигенам сог-а/г, №3, №4) и вариант 14 (антитела только к №4) - по 17,95%.

Из проанализированных сывороток не было ни одной с вариантами 7 и 19 из первой группы, с вариантами 3, 4, 7, 9, 10, 11. 12, из третьей группы.

С учётом результатов проведённого исследования можно сделать вывод, что большинство (84,6%) сывороток, содержащих серологические маркеры (IgG) к двум, трём, четырём, антигенам ВГС, только анти-сог-а/г, а также ^М-НСУ (варианты 1-20 первой группы сывороток, варианты 1-4 второй группы, варианты 1-12 третьей группы и варианты 1-2

четвёртой группы) принадлежат пациентам с вирусным гепатитом С в анамнезе (острым, хроническим, перенесенным). Но на основании только серологических маркеров сложно определить остроту и давность заболевания. Из этой группы больных представляют интерес сыворотки, содержащие только анти-сог-а\г (15,4%) и одновременно IgG анти-сог-а/г и ^М-НСУ (1,1%).

Анализ историй болезни пациентов, сыворотки которых содержат только антитела ксог-антигену, показал, что в 55% случаев есть указания на хронический или перенесённый вирусный гепатит С, а также у части больных есть указания на парентеральный анамнез. У некоторых отмечается повышение уровня трансаминаз, изменения в печени при УЗИ-исследованиях, большинство с хроническими заболеваниями ЖКТ, с воспалительно-дегенеративными изменениями костно-суставной системы, 1 - с недифференцированным гепатитом, 1 - с неспецифическим реактивным гепатитом и этим пациентам было рекомендовано дообследование на ВГС.

Среди пациентов, сыворотки которых содержали и анти-сог-а/г и ^М-НСУ, были пациенты с парентеральным анамнезом, гипербилирубинемией, повышением уровня трансаминаз и одна история болезни пациента с циррозом печени, как исходом ВГС, активным прогрессирующим течением, фазой деком-

пенсации, синдромом портальной гипертензии.

15,4% сывороток, проанализированных в лаборатории, имели антитела только к неструктурным белкам (вариант 5 второй группы и вариант 3 четвёртой группы), а 8,4% -это те самые варианты иммуноглобулинового ответа, которые называют неопределёнными, т.е. сыворотки только с антителами к одному из неструктурных белков (варианты 21-23 первой группы и варианты 13-15 третьей группы).

Определение антител к одному из неструктурных белков распределилось следующим образом: анти-№3 - 2,5%, анти-№4 - 5,4%, анти-№5 - 0,5%. Анти-^4 - определялись в 1,8 раза чаще, чем анти-NS3 и анти-^5 вместе взятые.

Данные варианты результатов ИФА могут быть обусловлены неспецифической реакцией, связанной с индивидуальными особенностями сыворотки крови или конструктивными особенностями тест-системы. При анализе историй болезни с подобными результатами встречаются истории с указанием на перенесённый острый ВГС или ложноположительный результат. У многих пациентов имеет место алиментарно-коституциональное ожирение с жировым гепатозом и стеатозом поджелудочной железы, хронические воспалительные заболевания ЖКТ, остеохондрозы, инфекционно-токсический миокардит, диффузно-токсический зоб, аутоиммунные заболевания (ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреодит), хроническая ревматическая болезнь, саркоидоидоз, лимфопролиферативное заболевание, хотя у небольшой части пациентов есть указание на ВГС.

На основании анализ полученных данных можно сделать следующие выводы.

1. Использование тест-систем для определения спектра антител к отдельным белкам ВГС (сог-а/г, №3, №4, №5, ^М-НСУ) является более информа-

тивным, чем обычные подтверждающие тесты, особенно в условиях динамического наблюдения.

2. Неопределённый результат должен ориентировать лечащего врача и пациента на дальнейшее наблюдение и проведение дополнительных клинических и лабораторных исследований.

3. Кроме метода ИФА целесообразно использование метода ПЦР для обнаружения РНК ВГС в биологических субстратах (в сыворотке крови, лимфоцитов, ткани печени) для определения репликативного процесса и оценки результатов интерферон терапии.

4. В случае отсутствия в учреждении ПЦР-лаборатории, альтернативной данному методу может служить вновь созданный набор (ИФА) для одновременного определения сог-а/г и антител к ВГС.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Баранов А. В., Малеев В. В. Взаимосвязь между уровнем РНК НСУ и антител к ней при ХГС // Микробиология. 2009. №5. С. 19-22.

2. Бондаренко А. Л., Попонин Д. М., Устюжани-нов В. Н. Титр антител класса G к различным белкам вируса гепатита С // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. №5. С. 21-25.

3. Сюткин В. Е. Новые возможности повышения эффективности противовирусной терапии больных ХГС. // Инфекционные болезни. 2009. №2. С.55-59.

4. Сюткин В. Е. Стратегия лечения ХГС на современном этапе // Клиническая фармакология и терапия. 2008. №2. С. 16-18.

5. Потапова А. А., Редченко Е. Б., Тогузов Р. Т. и соавт. Отсутствие РНК вируса гепатита С в сыворотках с неопределённым результатом исследуемых антител к вирусу гепатита С при массовом скрининге крови // Иммунология. 2008. №6. С.41-44.

6. Ястребова О.Н. // Новости Вектор-Бест. 2009. №1. С.51

ОусЫпшкоуа O.V., Sirotinskaya E.K., Окипеуа E.A. Analysis of the spectrum of antibodies to hepatitis c virus in patients FBU "1477 VMKG navy" on experience of infectious laboratory immunology. FBU ”1477 Naval Hospital, Navy”, Vladivostok.

The authors have analyzed the spectrum of immunoglobulin sera of patients that have passed Shih-examination in 2009-2011. in the laboratory of infectious immunology laboratory department FBU "1477 VMKG fleet" for markers of hepatitis C virus (HCV). It is concluded that the use of test kits to determine the spectrum of antibodies to individual HCV proteins (cor-a / r, NS3, NS4, NS5, IgM-HCV) is more informative than the usual confirmatory tests, especially in the follow-up.

Keywords: hepatitis C virus, diagnostics, antibodies.

Автоа-коааеспондент:

Овчинникова Ольга Вениаминовна, заведующая лабораторией инфекционной иммунологии лабораторного отделения ФБУ «1477 ВМКТ флота»; тел.: 89146787168; e-mail: olsa.11@mail.ru