DIACEREIN OR ANALOGUES THEREOF FOR INHIBITING ASC EXPRESSION, NLRP3 EXPRESSION AND/OR COMPLEXING OF NLRP3 INFLAMMASOMES
ДИАЦЕРЕИН ИЛИ ЕГО АНАЛОГИ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ASC, ЭКСПРЕССИИ NLRP3 И/ИЛИ ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСА NLRP3 ИНФЛАММАСОМ

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии
ASC (связанного с апоптозом крапчатоподобного белка, содержащего домен рекрутирования каспазы [CARD]), экспрессии NLRP3 (белка семейства NLR, содержащего пириновый домен 3), и/или образования комплекса NLRP3 инфламмасом. В частности, изобретение относится к способам лечения и/или предупреждения заболевания, опосредованного ASC и/или NLRP3 и/или образованием комплекса NLRP3 инфламмасом, с помощью диацереина или его аналогов. Также предлагаются фармацевтические композиции, содержащие диацереин или его аналоги.
Описание предшествующего уровня техники
[0002] Рецепторы нуклеотидсвязывающего олигомеризационного домена (NLR) представляют собой эволюционно консервативное семейство цитозольных рецепторов с трехсторонней структурой, которые имеют общий центральный нуклеотидсвязывающий и олигомеризационный (NACHT) домен, который обычно фланкирован С-концевым доменом богатых лейцином повторов (LRR) и N-концевым эффекторным пириновым доменом (PYD) или доменом рекрутирования каспазы (CARD). После активации молекулами, ассоциированными с патогенами, или молекулами, ассоциированными с повреждениями, NLR олигомеризуют и рекрутируют адаптерный белок ASC и прокаспазу-1 цистеиновой протеазы и образуют комплекс инфламмасом, что приводит к автокатализу и активации каспазы-1. Активная каспаза-1 в конечном итоге расщепляет провоспалительные цитокины предшественника pro-IL-1β и pro-IL-18 в их зрелые секретируемые формы.
[0003] Образование комплекса инфламмасом из NLR связано с патогенезом широкого спектра заболеваний, включая генетически наследуемые аутовоспалительные состояния, а также хронические заболевания. В частности, оно связано с такими заболеваниями, как болезнь Альцгеймера, атеросклероз, метаболический синдром и возрастная дегенерация желтого пятна.
[0004] На основании вышеуказанного механизма, подавление NLR или ASC, а также образования комплекса инфламмасом было рассмотрено в качестве потенциального способа лечения заболеваний, опосредованных этими белками (Ozaki et al., журнал ((Journal of Inflammation Research), 2015, 8:15-27).
[0005] Публикация США №2014/0199320 раскрывает способ лечения акне путем ингибирования IL-1β, NLRP3, ASC, рецептора IL-1 типа 1, каспазы-1 или катепсина В многочисленными ингибиторами, включая ингибиторы IL-1β. Однако, в публикации акцентируется внимание на подавлении IL-1β, а не NLRP3 и ASC, и, поэтому, дается малое представление о том, какие ингибиторы будут оказывать прямое ингибирующее действие на NLRP3 и ASC.
[0006] Кроме того, было разработано большое количество реагентов, которые нацелены на IL-1β и IL-18 (продукты активации инфламмасом), для лечения воспалительных заболеваний, включая анакинру (рекомбинантный антагонист рецептора IL-1), канакинумаб (антитело IL-1β), рилонацепт (растворимый рецептор-ловушка IL-1), белок, связывающий IL-18, растворимые рецепторы IL-18 и моноклональные антитела к рецепторам anti-IL-18, но эти реагенты подавляют IL-1β или IL-18, а не NLRP3 и ASC.
[0007] Поэтому, в данной области техники по-прежнему существует потребность в конкретных способах и соединениях, которые способны подавлять NLR или ASC и ингибировать образование комплекса инфламмасом.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что диацереин и его аналоги являются отличными ингибиторами экспрессии ASC и NLR (особенно NLRP3) и, соответственно, способны снижать образование комплекса инфламмасом. Таким образом, диацереин и его аналоги могут использоваться для лечения и/или предупреждения заболеваний, опосредованных ASC и/или NLR.
[0009] Основная цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ ингибирования экспрессии ASC, экспрессии NLRP3 и/или образования комплекса NLRP3 инфламмасом в клетке, включающий в себя приведение клетки в контакт с соединением, выбираемым из группы, состоящей из диацереина, реина, моноацетилреина, солей, сложных эфиров и их пролекарств (далее именуемой «диацереин или его аналоги»).
[00010] Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ ингибирования экспрессии ASC, экспрессии NLRP3 и/или образования комплекса NLRP3 инфламмасом в нуждающемся в этом объекте, включающий в себя введение диацереина или его аналогов в упомянутый объект.
[00011] Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ лечения и/или предупреждения заболевания, опосредованного ASC и/или NLRP3 и/или образованием комплекса NLRP3 инфламмасом, в нуждающемся в этом объекте, включающий в себя введение диацереина или его аналогов в упомянутый объект.
[00012] Подробная технология и предпочтительные варианты осуществления, реализованные для данного изобретения, описаны в нижеследующих пунктах, сопровождаемых прилагаемыми чертежами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[00013] На ФИГ. 1 показаны изображения ASC и NLRP 3, полученные путем флуоресцентной конфокальной микроскопии после стимулирования клеток ТНР-1 мононатриевым уратом (МНУ) и их обработки различными дозами реина;
[00014] ФИГ. 2 представляет собой статистическую гистограмму, показывающую область окрашивания ASC после стимулирования клеток ТНР-1 с помощью МНУ и их обработки различными дозами реина; и
[00015] ФИГ. 3 представляет собой статистическую гистограмму, показывающую область окрашивания NLRP 3 после стимулирования клеток ТНР-1 с помощью МНУ и их обработки различными дозами реина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00016] Термин «терапевтически эффективное количество» в контексте настоящего описания относится к количеству, которое частично снимает или уменьшает один или несколько симптомов заболевания.
[00017] Термин «диацереин или его аналоги» в контексте настоящего описания относится к диацереину, реину, моноацетилреину или соли, или сложному эфиру, или его про лекарству.
[00018] Термин «пролекарство» в контексте настоящего описания относится к любому соединению, которое может быть преобразовано в реин и проявляет свою физиологическую функцию в организме в форме реина.
[00019] Если в настоящем документе не указано иное, термины, обозначающие некий объект или конкретный объект и т.п., используемые в настоящем описании (особенно в нижеприведенной формуле изобретения), включают в себя форму как единственного, так и множественного числа.
[00020] По химическому составу реин представляет собой 9, 10-дигидро-4, 5-дигидрокси-9, 10-диоксо-2-антраценкарбоновую кислоту, которая имеет структуру формулы (I). Одно из его пролекарств, диацереин, представляет собой 4, 5-бис (ацетилокси) 9, 10-дигидро-4, 5-дигидрокси-9, 10-диоксо-2-антраценкарбоновую кислоту, которая имеет структуру формулы (II). Диацереин полностью преобразуется в реин до достижения большого круга кровообращения и проявляет свою физиологическую функцию в организме в форме реина.
Формула (I)
Формула (II)

[00021] Диацереин является противовоспалительным средством, широко используемым при лечении остеоартрита, которое продемонстрировало ингибирование передачи сигнала интерлейкина-1 (IL-1). В настоящее время капсулы диацереина доступны в концентрации 50 мг и продаются в разных странах под различными торговыми наименованиями, включая Art 50, Artrodar и т.д.
[00022] Как было указано выше, авторами настоящего изобретения обнаружено, что диацереин или его аналоги могут ингибировать экспрессию ASC. Таким образом, изобретение обеспечивает способ ингибирования экспрессии ASC в клетке, включающий в себя приведение клетки в контакт с соединением, выбираемым из группы, состоящей из диацереина, реина, моноацетилреина, солей, сложных эфиров и их пролекарств.
[00023] В одном варианте осуществления клетка в данном способе является человеческой клеткой.
[00024] Настоящее изобретение также обеспечивает способ ингибирования экспрессии AS С в нуждающемся в этом объекте, включающий в себя введение диацереина или его аналогов в объект.
[00025] В одном варианте осуществления объектом является человек.
[00026] Экспрессия ASC предпочтительно ингибируется, по меньшей мере, на 30% и более предпочтительно, по меньшей мере, на 50% диацереином или его аналогами.
[00027] Поскольку ASC участвует в образовании комплексов инфламмасом из различных NLR, диацереин или его аналоги могут подавлять образование этих комплексов инфламмасом путем снижения экспрессии ASC и, таким образом, могут использоваться для лечения заболеваний, опосредованных этими комплексами.
[00028] На момент публикации четко определено пять различных комплексов инфламмасом, а именно NLRP1, NLRP2, NLRP3, AIM2 и IPAF/NLRC4. Каждая инфламмасома активируется в ответ на различные раздражители. Согласно описанию, другие представители семейства NLR, а именно NLRP6, NLRP7 и NLRP12, также образуют инфламмасомы с ASC, что приводит к активации каспазы-1, хотя по-прежнему неизвестны их специфические лиганды.
[00029] На момент публикации комплекс NLRP3 инфламмасом (т.е. инфламмасомы, образуемой с помощью NLRP3, ASC и прокаспазы-1) являлся наиболее изученной инфламмасомой, которая показала значительную причастность к развитию хронических заболеваний.
[00030] Также было обнаружено, что диацереин или его аналоги ингибируют экспрессию NLRP3. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу ингибирования экспрессии NLRP3 и/или образования комплекса NLRP3 инфламмасом в клетке, включающему в себя приведение клетки в контакт с диацереином или его аналогами.
[00031] В одном варианте осуществления клетка в данном способе является человеческой клеткой.
[00032] Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования экспрессии NLRP3 и/или образования комплекса NLRP3 инфламмасом в нуждающемся в этом объекте, включающему в себя введение диацереина или его аналогов в упомянутый объект.
[00033] В одном варианте осуществления объектом является человек.
[00034] Экспрессия NLRP3 предпочтительно ингибируется, по меньшей мере, на 30% и более предпочтительно, по меньшей мере, на 50% диацереином или его аналогами.
[00035] Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ лечения и/или предупреждения заболевания, опосредованного ASC и/или NLRP3 и/или образованием комплекса NLRP3 инфламмасом в объекте, включающий в себя введение в объект, нуждающийся в таком лечении и/или предупреждении, терапевтически эффективного количества диацереина или его аналогов. Введение приводит к снижению экспрессии ASC и/или экспрессии NLRP3 в объекте.
[00036] В одном варианте осуществления объектом является человек.
[00037] В одном варианте осуществления диацереин или его аналоги вводят в дозе приблизительно от 5 до 500 мг в сутки.
[00038] Заболевание в данном способе предпочтительно выбирают из группы, включающей в себя подагру, псевдоподагру, профилактику обострения подагры, индуцированную ожирением инсулинорезистентность, диабет 2 типа, болезнь Альцгеймера (БА), возрастную дегенерацию желтого пятна (ВДЖП), атеросклероз, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), ревматоидный артрит (РА), рак, системную красную волчанку (СКВ), астму, аллергическую астму, контактную гиперчувствительность, солнечную эритему, повреждение кожи, индуцированное ультрафиолетовыми лучами спектра В, эссенциальную гипертензию, криопирин-ассоциированные периодические синдромы (КАПС), синдром Макла-Уэльса (СМУ), семейные холодовые аутовоспалительные синдромы (СХАС), младенческое мультисистемное воспалительное заболевание/хронический младенческий неврологический кожно-артикулярный синдром (ММВЗ/ХМНКАС), В-клеточную неходжкинскую лимфому, острый инфаркт миокарда, инфаркт миокарда, аллергический ринит, назальный полипоз, аутоиммунный энцефаломиелит (АЭМ), рассеянный склероз (PC), фиброз кожи при системном склерозе человека (ССк), гломерулосклероз, ассоциированный с гипергомоцистеинемией (ггцис), терминальную стадию почечной недостаточности (ТСПН), атеросклероз, фиброз печени, фиброз почек, фиброз легких, хронические легочные фиброзные заболевания, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), фиброзирующее заболевание легких, кистозный фиброз (КФ), фиброз миокарда, фиброз панкреатических островков, хроническую болезнь почек (ХБП), кристаллические нефропатии, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), окулярную болезнь Бехчета, увеит, псориаз, асбестоз, силикоз, малярию, денге, бактериальную инфекцию, аллергический дерматит, гипероксическое повреждение легких, конъюнктивит, кератит, атопический дерматит, псориатический артрит, витилиго, болезнь Крона, метаболические синдромы, связанные с ожирением, ассоциированные с воспалением виды рака, гиперчувствительный дерматит, семейную средиземноморскую лихорадку (ССЛ), семейную ирландскую лихорадку (СИЛ), семейную холодовую крапивницу (СХК), пиогенный стерильный артрит, гангренозную пиодермию, акне (PAPA), системный ювенильный артрит, дефицит мевалонат-киназы (ДМК), буллезный эпидермолиз (БЭ), эпидермолитический ихтиоз (ЭИ) и синдром Шницлера (СШ).
[00039] Более предпочтительно заболевание в данном способе выбирают из группы, включающей в себя аллергическую астму, контактную гиперчувствительность, солнечную эритему, повреждение кожи, индуцированное ультрафиолетовыми лучами спектра В, эссенциальную гипертензию, криопирин-ассоциированные периодические синдромы (КАПС), синдром Макла-Уэльса (СМУ), семейные холодовые аутовоспалительные синдромы (СХАС), младенческое мультисистемное воспалительное заболевание/хронический младенческий неврологический кожно-артикулярный синдром (ММВЗ/ХМНКАС), В-клеточную неходжкинскую лимфому, острый инфаркт миокарда, инфаркт миокарда, аллергический ринит, назальный полипоз, аутоиммунный энцефаломиелит (АЭМ), рассеянный склероз (PC), фиброз кожи при системном склерозе человека (ССк), гломерулосклероз, ассоциированный с гипергомоцистеинемией (ггцис), терминальную стадию почечной недостаточности (ТСПН), атеросклероз, фиброз печени, фиброз почек, фиброз легких, хронические легочные фиброзные заболевания, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), фиброзирующее заболевание легких, кистозный фиброз (КФ), фиброз миокарда, фиброз панкреатических островков, хроническую болезнь почек (ХБП), кристаллические нефропатии, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), окулярную болезнь Бехчета, увеит, псориаз, асбестоз, силикоз, малярию, денге, бактериальную инфекцию, аллергический дерматит, гипероксическое повреждение легких, конъюнктивит, кератит, атопический дерматит, псориатический артрит, витилиго, болезнь Крона, метаболические синдромы, связанные с ожирением, ассоциированные с воспалением виды рака, гиперчувствительный дерматит, семейную средиземноморскую лихорадку (ССЛ), семейную ирландскую лихорадку (СИЛ), семейную холодовую крапивницу (СХК), пиогенный стерильный артрит, гангренозную пиодермию, акне (PAPA), системный ювенильный артрит, дефицит мевалонат-киназы (ДМК), буллезный эпидермолиз (БЭ), эпидермолитический ихтиоз (ЭИ) и синдром Шницлера (СШ).
[00040] Изобретение также обеспечивает создание фармацевтических композиций для лечения заболеваний, модулируемых описанными механизмами. Фармацевтические композиции изобретения содержат терапевтически эффективные количества диацереина или его аналогов, которые являются достаточными для достижения цели введения этих композиций. Фармацевтические композиции изобретения могут быть представлены в любой подходящей лекарственной форме, включая, помимо прочего, таблетки, пероральные растворы, инъекции и другие распространенные лекарственные формы.
[00041] При введении в нуждающийся в этом объект, диацереин или его аналоги могут быть изготовлены в виде фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции, предполагаемые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть представлены в твердой форме, в форме раствора, эмульсии, дисперсии, мицеллы, липосомы и пр. Композиции возможно вводить любыми способами, известными в данной области техники, в том числе внутривенно, местно, внутрикожно, внутримышечно, чрескожно, подкожно, интраназально, парентерально, интратекально, вагинально, ректально, колоректально, перорально, внутричерепно, ретроорбитально или внутригрудинно. Композиции предпочтительно адаптированы для перорального введения. Например, препарат можно смешивать с подходящими вспомогательными веществами для изготовления таблеток, капсул, пилюль, пастилок, таблеток для рассасывания, растворов, порошков или гранул, суспензий, твердых или мягких капсул и любых других пригодных для использования форм.
[00042] В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство вводится в объект совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, подходящими для лечения соответствующих заболеваний, которые выбираются из группы, включающей в себя фактор VIII свертывания крови, фактор IX свертывания крови, ацетаминофен и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), включая ингибиторы ЦОГ-2.
[00043] Примеры НПВП включают в себя, помимо прочего, 2-арилпропионовые кислоты, такие как ибупрофен, кеторолак и напроксен; n-арилантраниловые кислоты, такие как мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; оксикамы, такие как пироксикам и мелоксикам; и арилалкановые кислоты, такие как диклофенак, этодолак, индометацин и сулиндак. Примеры ингибиторов ЦОГ-2 включают в себя, помимо прочего, целекоксиб, эторикоксиб, рофекоксиб и валдекоксиб. Примеры фактора VIII и фактора IX свертывания крови включают в себя, помимо прочего, Геликсат, Моноклат-П, Бериате, Бенефикс, Алпроликс, Иделвион и Риксубис.
[00044] В некоторых вариантах осуществления диацереин или его аналог может быть единственным действующим веществом в композициях изобретения. Композиции изобретения могут содержать фармацевтические вспомогательные вещества (т.е. неактивные соединения), распространенные в данной области техники.
[00045] Подходящие вспомогательные вещества включают в себя антиоксиданты, гелеобразующие вещества, регуляторы/буферы рН, способствующее проникновению вещества, консерванты, хелатирующие вещества, увлажнители, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, загустители, растворители и стабилизаторы. В данном случае вспомогательные вещества/ингредиенты в настоящем изобретении могут иметь несколько функций, например, одно вспомогательное вещество может использоваться в качестве поверхностно-активного вещества и/или стабилизатора и/или эмульгатора и т.д.
[00046] Примеры антиоксидантов включают в себя, помимо прочего, одно или несколько веществ, в том числе витамин С, витамин А и альфа-липоевая кислота, аскорбилпальмитат, пиросульфит натрия, бутилгидроксианизол (БГА), бутилгидрокситолуол (БГТ) и т.п.
[00047] Подходящие гелеобразующие вещества могут включать в себя, помимо прочего, одно или несколько веществ, в том числе гуаровые, ксантановые и каррагеновые камеди, анионные, неионные, катионные и липофильно модифицированные гуаровые смолы, полиакриловые кислоты, полиметакриловые кислоты, целлюлозные смолы, полиэтиленгликоли, гидроксиалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, полиалкиленамины и т.п.
[00048] Примеры регуляторов/буферов рН включают в себя, помимо прочего, одно или несколько веществ, в том числе бикарбонат натрия, бикарбонат калия, гидроксид магния, лактат магния, глюконат магния, гидроксид алюминия, копреципитат гидроксида алюминия/бикарбоната натрия, аминокислоты, глицинат алюминия, цитрат натрия, тартрат натрия, ацетат натрия, карбонат натрия, полифосфат натрия, полифосфат калия, пирофосфат натрия, пирофосфат калия, гидрофосфат натрия, гидроортофосфат калия, тринатрийфосфат, трикалийфосфат, фосфат натрия, ацетат натрия, метафосфат калия, оксид магния, гидроксид магния, карбонат магния, силикат магния, ацетат кальция, глицерофосфат кальция, хлорид кальция, гидроксид кальция, лактат кальция, карбонат кальция, бикарбонат кальция и т.п.
[00049] Примеры способствующих проникновению веществ включают в себя, помимо прочего, одно или несколько веществ, в том числе моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, диметилсульфоксид, пропиленгликоль, изопропилмиристат (ИПМ), кальципотриен, детергенты, смягчающие вещества, этоксидигликоль, триацетин, пропиленгликоль, бензиловый спирт, лауретсульфат натрия, диметилизосорбид, изопропилмиристат, масло триглицеридов средней цепи (масло ТСЦ), ментол, изопропилпальмитат, изопропилизостеарат, пропиленгликольмоностеарат, лецитин, диизопропиладипат, диэтилсебацинат, олеиновая кислота, этилолеат, мочевина, глицерил олеат, каприловый/каприновый триглицерид, пропиленгликоль дикаприлат/дикапрат, лаурет 4, олет-2, олет-20, пропиленкарбонат, ноноксинол-9, 2-н-нонил-1,3-диоксолан, С7-С14-гидрокарбил замещенный 1,3-диоксолан, 1,3-диоксан или ацеталь, ноноксинол-15 и т.п.
[00050] Консервантами могут выступать, например, одно или несколько веществ, в том числе бензоат натрия, бутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, этилендиаминтетрауксусная кислота, эфиры параоксибензойной кислоты, хлорбутанол, бензиловый спирт, фенилэтиловый спирт, дегидроуксусная кислота, сорбиновая кислота, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, нитрат фенилртути, тимеросал, метил-, этил- и/или пропилпарабен.
[00051] Примеры подходящих растворителей включают в себя, помимо прочего, одно или несколько веществ, в том числе спирт, касторовое масло, диизопропиладипат, этоксилированный спирт, этиловый спирт, цитрат жирного спирта, глицерин, 1,2,6-гексантриол, гексиленгликоль, изопропиловый спирт, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, минеральное масло, фосфорная кислота, полиэтиленгликоль 300, полиэтиленгликоль 400, полиэтиленгликоль 1450, полиэтиленгликоль 8000, моноцетиловый эфир полиэтиленгликоля 1000, моностеарат полиэтиленгликоля, моностеарат полиэтиленгликоля 400, полиэтиленгликоли, полиоксил-20-цетостеариловый эфир, полиоксипропилен-15-стеариловый эфир, полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 80, полисорбаты, пропиленкарбонат, пропиленгликоль, очищенная вода, денатурированный спирт SD alcohol 40, триглицериды насыщенных жирных кислот и т.п.
[00052] Подходящими стабилизаторами или поверхностно-активными веществами могут выступать, например, одно или несколько веществ, в том числе ионное поверхностно-активное вещество полисорбат, твин 20, твин 40, твин 60, твин 80, полиэтиленгликолевые эфиры нонилфенола, (алкилфенол-гидроксиполиоксиэтилен), поли(окси-1,2-этандиил), альфа-(4-нонилфенол)-омега-гидрокси-, разветвленного строения (т.е. поверхностно-активное вещество Tergitol NP-40), смеси полиэтиленгликолевых эфиров нонилфенола (т.е. поверхностно-активное вещество Tergitol NP-70 (70% воды)), феноксиполиэтоксиэтанолы и их полимеры, такие как Triton, Poloxamer, Spans, Tyloxapol, различные сорта бриджа, додецилсульфат натрия, цетиловый спирт, стеариновая кислота, полиоксил стеарат и т.п.
[00053] Даже если ингредиент предлагаемых композиций может быть действующим веществом в составах предшествующего уровня техники для целей, отличных от лечения соответствующих вышеупомянутых заболеваний, он по-прежнему считается фармацевтическим вспомогательным веществом для целей предлагаемых композиций, поскольку этот ингредиент не присутствует в количестве, достаточном для эффективного лечения соответствующего заболевания.
[00054] Диацереин или его аналоги и дополнительные терапевтические средства могут содержаться в одном составе или могут вводиться совместно в виде отдельных составов.
[00055] Далее настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано нижеследующими примерами. Однако эти примеры представлены только в иллюстративных целях и не ограничивают объем настоящего изобретения.
[Пример 1]
Клеточная культура
2
[00056] 20 мг порошка реина, растворенного в 1 мл 100%-ного диметилсульфоксида (ДМСО), перед использованием, стерилизовали через фильтрующие мембраны с размером пор 0,22 мкм и хранили при температуре -20°С. Кристаллы (10 мг/мл) мононатриевого урата (МНУ) получили в стерилизованном натрий-фосфатном буферном растворе (PBS). Динатриевую соль аденозин-5'-трифосфата (АТФ) растворенную в ddHO, стерилизовали через фильтрующие мембраны с размером пор 0,22 мкм. ТНР-1 и клеточную линию острого моноцитарного лейкоза человека (АТСС TIB-202) суспензировали в среде RPMI-1640 (GIBCO, Life Technologies, Гранд-Айленд, США), дополненной кондиционированными средами 10%-ной фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин-амфотерицин В). Для макрофагоподобной дифференциации клетки ТНР-1 примировали 0,1 мкмоль/л форболмиристилацетата (ФМА) в течение 24 часов. Дифференцированные клетки ТНР-1 культивировали с различной дозой обработки реином (0, 5 или 10 мкг/мл) при стимуляции 100 мкг/мл МНУ в течение 6 часов. Были собраны супернатанты культуры и клеточные лизаты. Для анализа жизнеспособности клеток детектировались клетки ТНР-1, примированные ФМА, при наличии или отсутствии инкубации реина в течение 24 часов с помощью набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (анализ с помощью CCK-8, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США). Для тестирования клеточной адгезии использовалась система анализа клеток в режиме реального времени xCELLigence в соответствии с инструкциями производителя.
Иммунофлуоресцентное окрашивание
6
[00057] Примированные ФМА клетки ТНР-1 (1×10 клеток/мл) культивировались с реином 0, 5 или 10 мкг/мл в течение ночи, а затем стимулировались кристаллами МНУ 100 мкг/мл в течение 6 часов. Для обнаружения экспрессии ASC и NLRP3 человека в клетках ТНР-1, фиксированных параформальдегидом, после обработки был проведен флуоресцентный конфокальный анализ. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Olympus FV1000. Окрашенные области распределения ASC (зеленый цвет) и NLRP3 (красный цвет) были количественно измерены и проанализированы с помощью анализатора Metamorph. Объединение изображений с ядерным окрашиванием с флуоресцентным красителем DAPI показывает колокализацию ASC с NLRP3 (желтый цвет) (шкалы, 10 мкм). Секции окрашивания были нормированы только на группу ФМА и показаны как относительная слагаемая величина со значениями для контроля необработанных объектов, произвольно заданными как 1. Данные были взяты из одного эксперимента с тремя полями (среднее значение ± SD). Р-значение определялось двухсторонним непарным t-тестом.
Результаты
[00058] При активации NLRP3 инфламмасом в клетке происходит агрегация NLRP3 и ASC доменов. Для измерения уровней белка NLRP3 и ASC в клетках ТНР-1, стимулированных МНУ, при обработке реином использовался флуоресцентный конфокальный анализ, и область окрашивания оценивалась количественно. Как видно на ФИГ. 1-3, результаты окрашивания иммунофлюоресценцией показали, что кристаллы МНУ повышают экспрессию белков NLRP3 и ASC (Р=0,0023 и 0,0032, соответственно). При обработке реином окрашивание участков ASC значительно уменьшилось примерно на 64,0% и 79,0% средней интенсивности области/клетки дозозависимым образом (Р=0,0011 и 0,0022, соответственно). Кроме того, реин ингибировал уровни NLRP3 примерно на 62,5% и 84,1% средней интенсивности области/клетки в МНУ-индуцированном воспалении (Р=0,014 и 0,0012, соответственно).
[00059] Настоящее исследование показало, что реин подавляет экспрессию ASC и NLRP3, тем самым ингибируя образование сборки ASC-пятен и комплекса NLRP3 инфламмасом.
[00060] Вышеуказанное изобретение относится к подробному техническому содержанию и его признакам. Специалисты в данной области техники могут продолжить исследования со множеством модификаций и замен на основе описаний и рекомендаций изобретения, не отступая от его характеристик. Тем не менее, несмотря на то, что такие модификации и замены не полностью раскрыты в вышеприведенных описаниях, они в основном были охвачены следующей прилагаемой формулой изобретения.