Оптимизация теста определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕСТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ППД ТУБЕРКУЛИНА

ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Ю.М. Мясоедов, С.В. Морозов

Аннотация. Определены оптимальные параметры теста биологическая активность ППД туберкулина для млекопитающих использование которых позволит получать достоверные результаты при контроле препарата.

Ключевые слова: ППД туберкулин для млекопитающих, сенсибилизация, микобактерии, морские свинки, кожная реакция ГЗТ.

Первым этапом в выявлении больных и инфицированных M. bovis животных согласно наставлению по диагностике туберкулеза животных является аллергическая проба, предусматривающая использование ППД туберкулина для млекопитающих [5], основным показателем качества которого является величина биологической активности, определяемая на сенсибилизированных морских свинках [7]. В свою очередь, величина биологической активности туберкулина определяет диагностическую чувствительность и специфичность аллергической пробы в условиях хозяйства [2]. В связи с этим к тесту определения величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих разработаны ряд требований, которые изложены в нормативной документации МЭБ и ВОЗ, соблюдение которых является обязательным для производителей мико-бактериальных аллергенов [1,3,7,9,10,11].

Вместе с тем, учитывая исследования многочисленных референтных лабораторий, результаты которых оформлены в виде нормативов определения величины биологической активности, может осуществляться с использованием различных сенсибилизирующих доз при моделировании туберкулиновой ГЗТ [3], различной величины антигенной нагрузки и количества вводимых доз ППД туберкулина для млекопитающих [1,2,11].

Учитывая вышеизложенное, целью исследования было: подбор оптимальных параметров, использование которых позволит получать достоверные результаты при контроле препарата.

В работе использовали самок морских свинок - альбиносов, в количестве 106 голов, массой 500±100 г, одновременно полученных из ФГБУ НЦБМТ РАМН, Крюково, из совокупности, которых были сформированы 10 групп, по 9-10 голов. Животных содержали в вольерах, на стандартном рационе кормления, с использованием гранулированного корма.

Морские свинки были сенсибилизированы микобактериями M. bovis штамм BCG (ФГУП НПО Микроген), при проведении первого этапа исследований различными дозами, последующих этапов одной дозой. Через месяц, после развития состояния ГЗТ, животных использовали в опытах.

При проведении исследований были использованы

2 эталонные серии туберкулина, очищенного (ППД) для млекопитающих, производства ФГУП «Курская биофабрика», биологический эквивалент которых соответствовал Международному стандарту PPD-bovine.

Разведения ППД туберкулина осуществляли на фосфатном буфере, с учётом содержания в инъекционной дозе от 0,04 до 1000 Международных Единиц, которые внутрикожно вводили морским свинкам.

Учет кожных реакций ГЗТ осуществляли через 24 часа, после введения разведений туберкулинов, путём

определения средних размеров аллергических реакций [1]. Статистическую обработку результатов исследования осуществляли по следующим показателям: логарифм относительной активности; коэффициент активности; усреднённый тангенс угла наклона прямых к горизонтальной линии; доверительный интервал; сходимость значений биологической активности [2]; U-критерий Уилкоксона [4].

Нормативной документаций ВОЗ, для сенсибилизации морских свинок, предусмотрено использование разных доз микобактерий, без обоснования предпочтительности применения того или иного варианта [13]. При этом исследованиями, проведёнными отечественными учёными на группах морских свинок, сенсибилизированных разным количеством микобактерий и при использовании одной дозы ППД туберкулина было продемонстрировано различие по иммуногенности [8].

В свою очередь иммуногенность варианта сенсибилизации является одним из критических критериев, уровень которой должен обеспечивать развитие кожных реакций ГЗТ в диапазоне от 8 до 25 мм [11], охарактеризовать которую целесообразно при использовании нескольких дозировок ППД туберкулина. Кроме того использование нескольких дозировок ППД туберкулина позволяет определить как иммуногенность, так и чувствительность варианта сенсибилизации.

Принимая во внимание вышеперечисленное, первым этапом исследования было определение дозы микобактерий, обеспечивающее оптимальное соотношение иммуногенности и чувствительности варианта сенсибилизации морских свинок, приемлемое для определения величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.

При реализации данного этапа исследования было сформировано 4 группы морских свинок, которых сенсибилизировали разными дозами M. bovis BCG: 0,4 мг внутрикожно, 0,2 мг внутрикожно, 0,2 мг подкожно, 0,1 мг внутрикожно. Через месяц, после введения микобактерий, оценивали иммуногенность и чувствительность вариантов сенсибилизации. При этом иммуногенность оценивали по интенсивности, а чувствительность по частоте проявления кожных реакций ГЗТ на различные дозы ППД туберкулина для млекопитающих. В исследовании были использованы дозы ППД туберкулина для млекопитающих в диапазоне от 0,04 МЕ до 125 МЕ. Вариантом сравнения была использована группа морских свинок, которым вводили микобактерии в дозе 0,2 мг внутрикожно, использование которого регламентировано ГОСТ 16739 [1]. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Сопоставление средних значений, полученных при использовании различных доз ППД туберкулина в 1,3,4 группах со значениями контрольной группы, продемонстрировало различие. Так при использовании дозы 125 МЕ, в первой группе интенсивность реакций была выше, а в третьей и четвёртой группах интенсивность реакций была достоверно ниже, в сравнении с контролем. При использовании дозы 25 МЕ интенсивность реакции в первой группе не отличалась от контроля, вместе с тем в группе 3 и 4 интенсивность реакций была достоверно ниже, чем в контроле.

Таблица 1 - Интенсивность развития и частота проявления кожных реакций ГЗТ на ППД туберкулин для млекопитающих в группах морских свинок сенсибилизированных разными дозами M. bovis BCG

Показатели

Вариант и доза сенсибилизации морских свинок

0,4 мг, в/к 0,2 мг, в/к 0,2 мг, п/к 0,1 мг, в/к

1 группа

M±m f M±m f M±m f M±m f

Доза туберкулина, МБ 125 18,75*±1,92 1 17,9±1,58 1 16,6*±0,80 1 16,5*±0,96 1

25 15,63±0,83 1 15,3±1,16 1 13,5*±1,05 1 14,2*±0,90 1

5 11,75*±0,60 1 13,1±1,50 1 12,1*±0,83 1 11,5*±1,04 1

1 8,5 0,2 10±2,34 1 7,25 0,4 0 0

0,2 0 0 0 0 0 0 0 0

0,04 0 0 0 0 0 0 0 0

Примечание: *Разница достоверна при р< 0,05

Сокращения: в/к - внутрикожно п/к - подкожно

При использовании дозы 5МЕ интенсивность в 1,3,4 группах была ниже в сравнении с контролем. При использовании дозы 1 МЕ интенсивность в 1,3,4 группах по сравнению с контролем не оценивалась, в связи с различной частотой проявления значений. При этом, во всех группах реакции на дозы ниже 1 МЕ не регистрировались. Оценка частоты проявления аллергических реакций продемонстрировала, что при использовании дозировок в диапазоне от 5 МЕ до 125 МЕ частота реакций во всех группах соответствовала 1, в то время как при использовании дозы 1 МЕ частота проявления реакций была максимальной в контрольной группе, при отсутствии реакций в четвёртой группе, и минимальным значениям в третьей и первой группах. Из полученных результатов следует, что оптимальным сочетанием интенсивности и чувствительности характеризуется 2 группа. Результаты исследований, полученные при реализации первого этапа, предполагают проведение сравнительных исследований при разработке варианта сенсибилизации с использованием, как микобактерий различной вирулентности, так и инактивированных.

Определение величины биологической активности ППД туберкулина подразумевает внутрикожное введение комплекса антигенов, при этом известно, что в зависимости от технологии изготовления препарата, штамма микобактерий, используемых питательных сред, отношение биологической активности аллергена к содержанию биологически активных пептидов в препарате (обозначаемая как удельная активность) может быть различной. В связи с этим, в организм морских свинок вводится различное количество биологически активных соединений, что может привести к развитию таких иммунологических эффектов, как бустер - эффект [12], феномен Коха [6], и обусловить получение недостоверных результатов. Учитывая это, вторым этапом исследования было определение величины антигенной нагрузки приемлемое для определения величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих. Критерием оценки при проведении второго этапа исследования служила частота проявления кожных аллергических реакций ГЗТ. При этом учитывая результаты, полученные при реализации первого этапа исследования, последующие эксперименты были проведены с использованием внутрикожной сенсибили-

зации морских свинок, M. bovis BCG в дозе 0,2 мг. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Из полученных данных видно, что частота проявления аллергических реакций в четырёх экспериментальных группах различалась. В первой группе (суммарное количество белка 138,72 мкг) частота аллергических реакций зависела от дозы: с максимальным значением на дозу 1000 МЕ и минимальным на дозу 5 МЕ, при отсутствии реакций на дозу 1 МЕ. Во второй и третьей группах, при использовании доз в диапазоне от

1 МЕ до 125 МЕ, и в диапазоне от 1 Ме до 25 МЕ соответственно, соответствующих по белку 18,72 мкг и 3,72 мкг было выявлено, что частота аллергических реакций не изменялись, и соответствовала 1. Аналогичные результаты получены в четвёртой группе при использовании 20 МЕ и 2 МЕ, соответствующих белку 24 и 2,4 мкг использование которых не приводило к изменению частоты. Из полученных данных следует, что использование антигенной нагрузки в диапазоне 2,64 мкг - 18,72 мкг приемлемо для определения величины биологической активности ППД туберкулина.

В разных лабораториях, специализирующихся на контроле микобактериальных аллергенов определение величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих осуществляется с использованием различного количества дозировок: 2, 3, 4, с 2, 5 и 10 кратным интервалом. Вместе с тем нормативными документами не регулируется приоритет в выборе того или иного варианта. При этом принимая во внимание эпизоотическую обстановку в мире по туберкулёзу и коммерческое использование ППД туберкулина для млекопитающих в диагностических целях, результаты аллергической пробы препаратов, полученных в разных фирмах, должны быть тождественными [10].

Учитывая это, следующим этапом исследования была оценка биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих, при использовании различных доз. Исследование было осуществлено на трёх группах сенсибилизированных морских свинок. На животных первой группы исследования проводили с использованием двух доз: 20 и 2 МЕ [1], на особях второй группы исследования осуществляли при использовании трёх дозировок: 25, 5, 1 МЕ [7], на животных третьей группы исследования осуществляли с применением четырёх доз: 20, 10, 5, 2,5 МЕ [11]. Результаты исследования представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 2 - Частота проявления кожных реакций ГЗТ на различные дозы ППД туберкулина для млекопитающих______________________________________________________________________________________

Показатели Дозы ППД туберкулина для млекопитающих МЕ (мкг белка) Суммарное количество белка, мкг

1000

Интенсивность и частота аллергических реакций

Пять доз, группа 1

M± m -н 02 -Н (N 2, 1, 2 17,86± 2,08 -н 28 4, 3, - 14,17± 1,76 - 0 138,72

f 1 0,78 0,67 - 0,33 - 0

Четыре дозы, группа 2

M± m - 17,90± 1,58 15,30± 1,16 - 13,1± 1,5 - 10,0± 2,34 18,72

f - 1 1 - 1 - 1

Три дозы, группа 3

M± m - - 18,39± 0,50 - 14,60± 0,43 - 9,56± 0,42 3,72

f - - 1 - 1 - 1

Две дозы, группа 4

M± m - - - 20,11± 0,69 - 15,67± 0,38 - 2,64

f - - - 1 - 1 -

Примечание: - разведение ППД туберкулина не использовалось

Таблица 3 - Средние арифметические значения кожной реакции ГЗТ на различные дозы ППД туберкулина для млекопитающих______________________________

Группа Пре- парат Дозировки ППД туберкулина

25 20 10 5 2,5 2 1

I (n=10) Э1 - 19,25 - - - 13,75 -

Э2 - 18,83 - - - 13,88 -

II (n=10) Э1 19,27 - - 15,62 - - 12,7

Э2 19,31 - - 15,04 - - 12,23

III (n=10) Э1 - 20,2 16,8 15,3 13,1 - -

Э2 - 19,8 16,9 14,7 13,0 - -

Сокращения: Э1 - Эталонная серия №1;

Э2 - Эталонная серия №2.

Таблица 4 - Статистические показатели биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих при использовании различных дозировок_________________________

Г руппа Расчётные данные

b Lg R R МЕ Д.И., % % Ак.

I 10,45 0,028 1,066 10660 83-123 -

II 9,5 -0,0035 0,99 9900 84-117 94

III 7,72 0,0323 1,08 10800 77-120 102

Сокращения: Д.И., % - доверительный интервал

% Ак. - процент активности.

Принимая во внимание то, что в первой группе животных было использовано наименьшее количество доз, данная группа, при сопоставлении с другими являлась контрольной. Так было выявлено, что в первой группе величина биологической активности соответствовала значению - 10660 МЕ, во второй - 9900 МЕ, в третьей -10800 МЕ. Последующая оценка сходимости полученных данных согласно формулы: R=100 ± 20% [7] продемонстрировала идентичность результатов исследования. При этом границы доверительного интервала, рассчитанные для каждой группы, соответствовали 50200%, что свидетельствовало о достоверности полученных результатов биологической активности. В свою очередь одним из часто используемых является вариант, в котором предполагается использование 3 доз ППД туберкулина для млекопитающих (25, 5, 1 МЕ) как контрольного, так и тестируемого аллергенов, что в сумме по белку будет соответствовать 7,44 мкг, что в 2,5 раза ниже максимально определённой границы расчётного диапазона.

Выводы:

1. Использование для внутрикожной сенсибилизации морских свинок микобактерий M. bovis BCG в дозе 0,2 мг, характеризуется оптимальным соотношением иммуногенности и чувствительности, приемлемое для определения величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.

2. Определение величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих целесообразно проводить при суммарной антигенной нагрузке в диапазоне 2,64- 18,72 мкг.

3. Использование 4,3,2 дозировок при определении величины биологической активности ППД туберкулина даёт равнозначные результаты.

Список использованных источников

1 ГОСТ 16739-88. Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих. - М.: Изд-во стандартов, 1988. - 21с.

2 Кассич Ю. Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним. - Киев: Урожай, 1990.-С.63-65.

3 Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36-й доклад. Серия технических докладов 745. ВОЗ. Женева. С.43.

4 Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. -352 с.

5 Наставление по диагностике туберкулеза животных. -М., 2002. - 63 с.

6 Стефан Х.Е. Кауфманн. Краткая история научных работ Роберта Коха о туберкулёзе // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2003. - №9. - С. 36- 42.

7 Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены. - М.: Медицина, 1990. - С. 52-53.

8 Экспериментальное изучение препарата вакцины БЦЖ-М с уменьшенной нагрузкой / Яблокова Т. Б., Писаренко Н.Н., Леви Д.Т. и др. // Проблемы туберкулеза. - 1985. -№6. - С. 52-55.

9 European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002. Council of Europe Strasbourg. -P.2088-2089.

10 Instructions for Use. VLA-PPD BOV. Version 1 dated 1st June 1998. The 1 st International Standard for TUBERCULIN, PURIFIED PROTEIN DERIVATIVE (PPD), BOVINE.

11 OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. - 2009. - P. 359-369.

12 Menzies. Interpretation of repeated tuberculin tests. Boosting conversion, and reversion// Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 1999. Vol. 159.-P.15-21.

Информация об авторах

Мясоедов Юрий Михайлович, кандидат биологических наук, ФГУП «Курская биофабрика», е-mail: MyasoedovYurij@ Yandex.ru, тел. (4712) 53-91-53.

Морозов Сергей Владимирович, кандидат биологических наук, ФГБОУ вПо «Курская ГСХА».