Связанное с возрастом закисление микроокружения и цитоплазмы клеток: влияние на организменном уровне и на уровне клеточной культуры

XXIII МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

СВЯЗАННОЕ С ВОЗРАСТОМ ЗАКИСЛЕНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ И ЦИТОПЛАЗМЫ КЛЕТОК: ВЛИЯНИЕ НА ОРГАНИЗМЕННОМ УРОВНЕ И НА УРОВНЕ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ Г.В. Моргунова, А.А. Клебанов, А.Н. Хохлов

Сектор эволюционной цитогеронтологии, биологический факультет, Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Изменение уровня pH в значительной мере влияет на жизнеспособность клеток. Закисление межклеточного пространства в тканях и ростовой среды в кульутральных флаконах многие исследователи считают основной причиной старения. Однако мы полагаем, что накопление кислых продуктов, которое и ведет к снижению уровня pH в микроокружении клеток, является следствием старения, а не его причиной. На внутриклеточный и внеклеточный pH влияет баланс между процессами синтеза и распада веществ. Нарушение этого баланса приводит к закислению внешней среды, причинами же нарушения являются накопившиеся внутренние повреждения клетки.

Ключевые слова: pH ростовой среды, ацидотическая альтерация, старение, насыщающая плотность культуры, цитогеронтология, «стационарное старение»

AGE-RELATED ACIDIFICATION OF THE MICROENVIRONMENT AND CYTOPLASM OF CELLS: THE EFFECT FOR THE ORGANISM AND FOR THE CELL CULTURE G.V. Morgunova, A.A. Klebanov, A.N. Khokhlov

Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology Lomonosov Moscow State University Moscow

Changes in pH significantly affect the cell viability. Many researchers consider acidification of an intercellular space in tissues and acidification of a growth medium in the culture flasks as a main cause of aging. However, we believe that the accumulation of acidic products, which leads to a decrease in the pH in the microenvironment of cells, is a consequence of aging but is not its cause. The balance between the processes of synthesis and decomposition of substances affects the intracellular and extracellular pH level. Disturbance of this balance leads to acidification of medium, but cause of this disturbance is accumulated lesions in cells.

Key words: growth medium pH, acidic alteration, aging, saturating cell density, cytogerontology, stationary phase aging

Протекание любого биологического процесса может происходить только в определенном диапазоне pH. Поддержание этого показателя необходимо для нормального функционирования организма, его тканей и клеток, а также внутриклеточных органелл и макромолекул. Процессы переваривания и распада происходят при слабокислых значениях pH, синтез новых молекул и структур - при слабощелочных. В целом, уровень pH в тканях и полостях организма млекопитающих близок к нейтральному, поэтому при культивировании клеток млекопитающих создают условия, при которых кислотно-щелочной баланс поддерживают в диапазоне от 7,2 до 7,4.

При постановке экспериментов с длительным культивированием клеток в стационарных условиях, всегда необходимо учитывать изменения уровня pH культуральной среды. Кислые продукты обмена веществ, которые накапливаются в ней при длительном пребывании клеток в стационарной фазе роста, способствуют снижению pH. Авторы работ, посвященных хронологическому старению дрожжей и клеточных культур млекопитающих [1-4], считают закисление среды ключевой причиной старения клеток.

И.А. Аршавский в своей монографии «Физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития (основы негэнтро-пийного онтогенеза)» называет основным фактором повреждения ДНК у теплокровных животных не температуру, а ацидотическую альтерацию [5]. Сама концепция автора, описанная в книге, базируется на смещении баланса между двумя противостоящими процессами -анаболизмом и катаболизмом. При развитии организма преобладает анаболизм, сопутствующее ему защелачивание внутренней среды и упорядочивание системы, а при старении - катаболизм, сопутствующее ему закисление и распад, или диссипация системы.

На наш взгляд, понижение pH среды - это лишь последствие процесса старения, но не его причина [6]. Безусловно, кислые продукты распада способствуют ухудшению жизнеспособности клеток, таким образом несколько ускоряя процесс старения, но ключевым механизмом, запускающим этот процесс, являются изменения в самих клетках, а именно повреждения макромолекул и нарушения в работе внутриклеточных систем [7], возникающие из-за ограничения пролиферации и, как следствие, невозможности масштабного обновления клеточных компонентов.

Клетки, оказавшиеся в условиях, при которых их возможность делиться ограничена, переходят в состояние покоя. Оно характеризуется упрочнением клеточной мембраны, уменьшением размеров клеток, изменением метаболического профиля [8]. Таким образом, клетки переходят в новый режим существования, в котором им нужно поддерживать четкий баланс между процессами анаболизма и катаболизма. Процесс распада необходим им также как и синтез, ведь в только так клетка может устранить испорченные макромолекулы и органеллы, а из полученных при этом строительных блоков построить новые структуры [9]. Активация аутофагии - катаболического процесса - помогает клеткам выживать в стационарных условиях. При макроаутофагии в клетке формируются кислые везикулы - ауто-фаголизосомы, где идет интенсивная деградация органелл и участков цитоплазмы [10]. В пределах одной клетки довольно сложно решить проблему с накоплением повреждений синтезом новых структур и «разбавлением» за счет этого испорченных элементов. Такое «разбавление» возможно, если речь идет о многоклеточном организме или о культуре клеток. Оно затрагивает уже не внутриклеточные структуры, а сами клетки с повреждениями, и происходит это только при условии, что вся их популяция гомогенна (т.е. допустима замена одних элементов другими) или близка к гомогенной, как, например, у пресноводной гидры [11]. Однако, когда речь идет о постмитоти-ческих клетках или популяциях покоящихся клеток, внутриклеточный катаболизм становится для них единственным способом устранения повреждений и сохранения жизнеспособности.

Поддержание pH на оптимальном уровне важно также на начальных этапах роста культуры клеток. При посеве, как правило, не удается избежать некоторого защелачивания ростовой среды, поэтому рост культуры в значительной мере зависит от буферной емкости, что было показано как в работе Цессарини и Игла [12], так и в наших собственных экспериментах (данные не представлены). Если выращивать клетки на среде, содержащей неулетучивающийся органический буфер, как HEPES, например, клетки достигают большей насыщающей плотности, чем при выращивании на среде с обычным бикарбонатным буфером. Причем есть некоторые различия между разными клеточными культурами как раковыми, так и нормальными - оптимальный для роста pH колеблется от 6,9 до 7,8. Таким образом, получается, что настоящего контактного торможения культура достигает только при нейтральном pH, а при защелачивании ее рост прекращается несколько раньше. Известно, что при защелачивании микроокружения клеток их мембрана уплотняется и становится менее проницаемой для веществ (при закислении происходит обратный процесс) [13]. При pH 8,3 содержание белка в расчете на одну клетку увеличивается в 5-8 раз к 16 сут культивирования [12], что свидетельствует о перестройке метаболизма клетки. Вероятно, образующийся избыток белка позволяет клеткам выживать в условиях высокого pH. Иными словами, нельзя сказать, что защелачивание благоприятно сказывается на жизнеспособности клеток.

Хотелось бы отметить, что даже если обеспечивать оптимальный уровень pH кульутральной среды на протяжении всего длительного эксперимента, клетки все равно будут погибать. Поддержание pH с помощью буфера способствует росту культуры, так как клеток в самом начале мало, а среда не кондиционирована. Буфер способствует повышению уровня плато, культура достигает большей плотности, однако после фазы «плато» все равно происходит вымирание. Было показано, что при использовании культуральной среды с пониженным содержанием глюкозы или с заменой глюкозы на неферментируемый источники углерода, дрожжи, находящиеся в стационарной фазе роста, вымирают значительно медленнее [3], ситуация сопоставима с той, которая наблюдается при использовании буфера. Это, вероятно, говорит о том, что клетки при избытке глюкозы вырабатывают значительно больше продуктов обмена веществ и быстрее «загрязняют» окружающую их среду, ускоряя процесс старения.

КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕРОНТОЛОГИЯ, 9-10, 2018

Жизнедеятельность клеток в культуре и в организме четко связана с pH. Управляя этим показателем можно, повлиять на рост и гибель клеток, причем не только нормальных, но и трансформированных. И ацидоз, и алкализация являются неблагоприятными факторами, вызывающими ухудшение жизнеспособности клеток, но механизмы их влияния различаются, как и адаптивные ответы клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Murakami C.J., Wall V., Basisty N., Kaeberlein M. Composition and acidification of the culture medium influences chronological aging similarly in vineyard and laboratory yeast. PloS One. 2011; 6 (9): e 24530.

2. Burhans W.C., Weinberger M. Acetic acid effects on aging in budding yeast: are they relevant to aging in higher eukaryotes? Cell Cycle. 2009; 8 (14): 2300-2302.

3. Burtner C.R., Murakami C.J., Kennedy B.K., Kaeberlein M. A molecular mechanism of chronological aging in yeast. Cell Cycle. 2009; 8 (8) 1256-1270.

4. Leontieva O.V., Blagosklonny M.V. Yeast-like chronological senescence in mammalian cells: phenomenon, mechanism and pharmacological suppression. Aging (Albany NY). 2011; 3 (11): 1078-1091.

5. Аршавский И.А. Физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития (основы негэнтропийного онтогенеза). М.: Наука, 1982. 270 с.

6. Morgunova G.V., Klebanov A.A., Marotta F., Khokhlov A.N. Culture medium pH and stationary phase/chronological aging of different cells. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017; 72 (2): 47-51.

7. Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Morgunova G.V. Does Aging Have a Purpose? Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017; 72 (4): 222-224.

8. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. Свойства и функции в организме. М.: Наука, 1983. 176 с.

9. Morgunova G.V., Klebanov A.A., Khokhlov A.N. Some remarks on the relationship between autophagy, cell aging, and cell proliferation restriction. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016; 71: 4: 207-211.

10. Rubinsztein D.C., Marino G., Kroemer G. Autophagy and aging. Cell. 2011; 146 (5): 682-695.

11. Khokhlov A.N. On the immortal hydra. Again. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2014; 69 (4): 153-157.

12. Ceccarini C., Eagle H. pH as a determinant of cellular growth and contact inhibition. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 1971; 68 (1): 229-233.

13. Конев С.В., Мажуль В.М. Межклеточные контакты. Минск: Наука и техника, 1977. 312 с.

REFERENCES

1. Murakami C.J., Wall V., Basisty N., Kaeberlein M. Composition and acidification of the culture medium influences chronological aging similarly in vineyard and laboratory yeast. PloS One. 2011; 6 (9): e24530. (In Russ.).

2. Burhans W.C., Weinberger M. Acetic acid effects on aging in budding yeast: are they relevant to aging in higher eukaryotes? Cell Cycle. 2009; 8 (14): 2300-2302.

3. Burtner C.R., Murakami C.J., Kennedy B.K., Kaeberlein M. A molecular mechanism of chronological aging in yeast. Cell Cycle. 2009; 8 (8): 1256-1270.

4. Leontieva O.V., Blagosklonny M.V. Yeast-like chronological senescence in mammalian cells: phenomenon, mechanism and pharmacological suppression. Aging (Albany NY). 2011; 3 (11): 1078-1091.

5. Arshavsky I.A. Fiziologicheskie mekhanizmy i zakonomernosti individual'nogo razvitiya (osnovy negentropiinogo ontogeneza) (Physiological Mechanisms and Regularities of Individual Development (Foundations of Negentropic Ontogeny)). Moscow: Nauka, 1982. 270 pp.

6. Morgunova G.V., Klebanov A.A., Marotta F., Khokhlov A.N. Culture medium pH and stationary phase/chronological aging of different cells. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017; 72 (2): 47-51.

7. Khokhlov A.N., Klebanov A.A., Morgunova G.V. Does aging have a purpose? Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017; 72 (4): 222-224.

8. Epifanova O.I., Terskikh V.V., Polunovsky V.A. Resting cells. Properties and functions in organism. M.: Nauka, 1983. 176 pp. (In Russ.).

9. Morgunova G.V., Klebanov A.A., Khokhlov A.N. Some remarks on the relationship between autophagy, cell aging, and cell proliferation restriction. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016; 71 (4): 207-211.

10. Rubinsztein D.C., Marino G., Kroemer G. Autophagy and aging // Cell. 2011; 146 (5): 682-695.

11. Khokhlov A.N. On the immortal hydra. Again. Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2014; 69 (4): 153-157.

12. Ceccarini C., Eagle H. pH as a determinant of cellular growth and contact inhibition. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 1971; 68 (1): 229-233.

13. Konev S.V., Mazhul' V.M. Mezhkletochnye kontakty (Intercellular Contacts). Minsk: Nauka i tekhnika, 1977. 312 pp. (In Russ.).

Сведения об авторах:

Моргунова Галина Васильевна - научный сотрудник сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел.: 8 (495) 939-15-90. E-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru

Клебанов Александр Александрович - научный сотрудник сектора эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел.: 8 (495) 939-15-90. E-mail: klebanov@mail.bio.msu.ru

Хохлов Александр Николаевич - докт. биол. наук, зав. сектором эволюционной цитогеронтологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ. Тел.: 8 (495) 939-15-90. E-mail: khokhlov@mail.bio.msu.ru

About the authors:

Morgunova Galina Vasil'evna - Associate Researcher, Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. Address: School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Phone: 8 (495) 939-15-90. E-mail: morgunova@mail.bio.msu.ru

Klebanov Alexander Alexandrovich - Associate Researcher, Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. Address: School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Phone: 8 (495) 939-15-90. E-mail: klebanov@mail.bio.msu.ru

Khokhlov Alexander Nikolaevich - Doctor of biological Sciences, DBSci, Head of Evolutionary Cytogerontology Sector, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow. Address: School of Biology, Lomonosov Moscow State University, 1-12 Leninskiye Gory, Moscow, 119234. Phone: 8 (495) 939-15-90. E-mail: khokhlov@mail.bio.msu.ru

СТАРЕНИЕ ПО МЕСТУ ЖИТЕЛЬСТВА: ЗДОРОВЬЕ, ИСКЛЮЧЕНИЕ И СОЦИАЛЬНОЕ УЧАСТИЕ

И.С. Петухова

Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия ФГАОУ ВО Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики,

Санкт-Петербург, Россия Петрозаводский государственный университет, г. Петрозаводск

Социальное исключение и благополучие пожилых стали популярным объемом исследования специалистов из разных областей, начиная с 1990-х гг. Демографическое старение вызывает изменение возрастной структуры населения. В последние годы значительно увеличилось количество исследований в области демографического старения населения, социального благополучия пожилых, дохода, социального исключения, старения по месту жительства ('ageing in place'). Однако, все еще недостаточно