Перенос и экспрессия малых интерферирующих РНК в клетках млекопитающих с помощью лентивирусных векторов

ОБЗОРЫ

УДК 577.21

Перенос и экспрессия малых интерферирующих РНК в клетках млекопитающих с помощью лентивирусных векторов

Т. Д. Лебедев*, П. В. Спирин, В. С. Прасолов

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32 *E-mail: saint_john@list.ru Поступила в редакцию 19.09.2012

РЕФЕРАТ РНК-интерференция является удобным инструментом, позволяющим модулировать экспрессию генов. Широкому применению РНК-интерференции мешает несовершенство методов эффективной доставки изучаемых генов в клетки-мишени. Одна из удобных и эффективных систем переноса генов и их экспрессии - система, основанная на применении лентивирусных векторов, направляющих синтез малых шпилечных РНК (shPHK) - предшественников siPHK. Использование подобных систем позволяет добиться устойчивой и долговременной экспрессии shPHK в клетках. В представленном обзоре рассмотрены такие подходы к созданию лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK, как адаптация процессинга искусственных shPHK к механизмам, используемым клеточными микроРНК, и экспрессия сразу нескольких shPHK. В настоящее время активно разрабатываются подходы к применению РНК-интерференции в терапии наследственных, онкологических и вирусных заболеваний. Совершенствование методов конструирования лентивирусных векторов, а также изучение механизмов процессинга малых интерферирующих PHK позволяют рассматривать лентивирусные векторы, направляющие синтез shPHK, как один из самых перспективных инструментов доставки малых интерферирующих PHK.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА лентивирусные векторы, shPHK, PHK-интерференция.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ siPHK - малые интерферирующие PHK; miPHK - микроPHK; RISC - RNA-induced silencing complex; shPHK - малые шпилечные PHK; дцPHK - двухцепочечная PHK; HIV-1 - вирус иммунодефицита человека типа 1; VSV-G - белок G вируса везикулярного стоматита; CMV - цитомегаловирус; H1, U6 - промоторы ДHK-полимеразы III.

ВВЕДЕНИЕ

Метод РНК-интерференции широко используется для подавления экспрессии генов. К преимуществам этого метода относятся простота, возможность быстрого и существенного снижения экспрессии любого интересующего гена, высокая специфичность действия. Благодаря этим свойствам РНК-интерференцию применяют для изучения роли определенных генов в различных клеточных процессах. С этой целью созданы целые библиотеки siРНК, направленных против большого числа генов. В последнее время активно разрабатываются подходы к применению РНК-интерференции при наследственных заболеваниях, различных нейродегенеративных заболеваниях, злокачественных опухолях, а также в качестве противовирусной терапии. Еще одна область применения РНК-интерференции - поиск новых мишеней, воздействие на которые эффективно при различных заболеваниях.

РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

РНК-интерференция - механизм специфичного к последовательности подавления экспрессии генов, который индуцируется присутствием в клетке экзогенной либо эндогенной двухцепочечной РНК (дцРНК) [1]. Этот эволюционно консервативный механизм работает практически во всех эукариотических организмах. Источником экзогенной дцРНК служат вирусы или искусственно введенная дцРНК. Эндогенная дцРНК образуется в результате транскрипции собственных генов клетки и часто выполняет регуляторные функции. Общим этапом РНК-интерференции является разрезание длинной дцРНК белком Dicer, который относится к семейству РНКаз типа III (рис. 1), в результате чего образуются малые дуплексы siРНК длиной 21-25 нуклеотидов. Дуплекс содержит пару неспаренных нуклеотидов и пару гидроксильных групп на З'-концах и монофосфаты на 5'-концах (рис. 1). Подобная структура РНК-

Pol

ol III

ткт

о

ш

"О

О О

Pre-mipнк shРНK

Drosha

ЇЇТЇЇТрУІііііііііі0ііііііііііі^) иііііішііііііііишшО pri-miРНK &

•<

A

Exportin-5

ч>

Dicer

Ядро

guide

ЧЧП'І!!!

sseng

*

5,-p^——3,-OH assenger

3, Qppiiiiiijiiiiiiniiifr p

мРНК RISC

111111111111111111111111 її >тЖіИІІіі±Ц-Ш1ШШІШШ1

Цитоплазма

Рис. 1. Процессинг малых интерферирующих РНК в клетке. pri-miPHK транскрибируются РНК-полимеразой II, полученные транскрипты подвергаются кепированию и полиаденилированию. После этого под действием РНКазы типа III Drosha вырезается pre-miPHK. shPHK транскрибируется РНК-полимеразой III с образованием shPHK с трифосфатом на 5'-конце. Обе шпилечные структуры, pre-miPHK и shPHK, транспортируются из ядра в цитоплазму белком Exportin-5. В цитоплазме белок Dicer вырезает из шпилечных структур и экзогенных двухцепочечных PHK последовательности будущих miPHK и siPHK. В результате процессинга белком Dicer образуются дуплексы PHK длиной 21-25 п.н., имеющие пару неспаренных нуклеотидов на З'-концах, а также ОН-группы на З'-концах и монофосфаты на 5'-кон-цах. Направляющая цепь (guide strand) загружается в белковый комплекс RISC, который связывается с мРН^ комплементарной последовательности направляющей цепи, пассажирская цепь (passenger strand) при этом удаляется из комплекса

дуплексов обеспечивает их нормальный процессинг белком семейства Ago, который играет ключевую роль в формировании комплекса RISC (RNA-induced silencing complex) [2]. Фрагменты РНК, которые образуются после разрезания дцРНК белком Dicer, включаются в состав комплекса RLC (RISC-loading complex), содержащего белки Dicer и TRBP. На следующем этапе происходит формирование комплекса предшествующего RISC (pre-RISC). В состав этого комплекса входит белок Ago-2, который разрезает РНК-дуплекс, оставляя в комплексе лишь направляющую цепь (guide strand) [3]. Эта цепь определяет специфичность подавления экспрессии, другая цепь, называемая пассажирской (passenger strand), удаляется из комплекса [4]. Выбор направляющей цепи происходит независимо от будущей мишени, ею становится цепь, 5'-конец которой обладает меньшей термодинамической стабильностью [5]. На следующем этапе направляющая цепь, входящая в RISC, связывается с участком мРНК-мишени по принципу комплементарности (рис. 1).

Процесс разрушения мРНК происходит в два этапа. Сначала в мРНК возникает первичный разрыв, обусловленный эндонуклеазной активностью PIWI-домена белка Ago. После этого под действием клеточных экзонуклеаз происходит разрушение (деградация) мРНК-мишени [6]. При неполной ком-

плементарности siРНК и мРНК первичный разрыв не образуется и соответственно мРНК не подвергается деградации. Важно отметить, что даже при неполной комплементарности направляющей цепи и мРНК подавление экспрессии гена может осуществляться на стадии трансляции подобно тому, как это делает miРНК [7]. Другой механизм действия siРНК связан с образованием комплекса RITS (RNA-induced transcriptional silencing), включающего белок Ago-1. мРНК-мишень распознается комплексом RITS в ходе транскрипции в результате взаимодействия с РНК-полимеразой II [8]. На следующем этапе в состав RITS могут вовлекаться гистон-метилтрансферазы, которые метилируют гистоны, что приводит к уплотнению хроматина и подавлению экспрессии на эпигенетическом уровне.

МикроРНК отличаются от siРНК как механизмом действия, так и некоторыми особенностями процессинга. Транскрипция miРНК осуществляется при помощи РНК-полимеразы II. Полученные РНК подвергаются кепированию и полиаденилированию [9]. Одни miРНК могут кодироваться отдельными генами, другие - целыми кластерами генов. miРНК могут транскрибироваться вместе с мРНК, при этом последовательность, кодирующая miРНК, находится в интроне белоккодирующего гена [7]. В результате транскрипции образуется pri-miРНК - предшественник miРНК.

А

LTR

puro — H1

LH1 shPHK

3'-LTR

^_loop a-sense TTTTT

I

=0

1__LTR

S4тPHKUs3 s

I

I [

CMV GFP

5'-LTR

I

Обратная транскрипция и интеграция провируса

CMV GFP

V\V

В

Б

Pис. 2. Схемы векторов, направляющих синтез shPHK. А - Экспрессионная кассета вставлена между двумя LTR-последовательностями лентивирусного вектора. Экспрессия shPHK направляется промотором H1. Транскрипция начинается с последовательности будущей siPHK (sense), затем следуют «петли» (loop), перевернутая последовательность, комплементарная siPHK (a-sense), и терминирующая последовательность (тимины). В векторе также присутствует ген устойчивости к пуромицину (puro), что позволяет проводить селекцию [47]. Б - Экспрессионная кассета клонирована в последовательность 3'-LTR. Во время обратной транскрипции кассета удваивается, после интеграции провируса образуются две копии экспрессионной кассеты. В таком векторе можно клонировать еще и маркерный ген, например, ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), под промотором CMV [45]. В - Экспрессионная кассета, кодирующая shPHK, слитую с тPHK (S4тPHKLys3-shPHK). После транскрипции химерная PHK подвергается процессингу, подобно обычной тPHK, в результате чего высвобождается shPHK [52]

Его структура включает последовательность будущей miPHK, терминирующую петлю и фланкирующие последовательности [10]. Процессинг pri-rniPHK происходит в ядре с помощью комплекса, состоящего из двух РНКаз III - Drosha и DGCR8 (у млекопитающих). В результате процессинга образуются предшественники miPHK длиной примерно 65 п.н., имеющие форму «шпильки» (рис. 1) [11]. Транспорт рге-miPHK в цитоплазму осуществляется белком Exportin-5 (рис. 1). В цитоплазме pre-miPHK разрезаются белком Dicer, в результате чего образуется дуплекс длиной примерно 22 п.н. [12]. Дуплекс miPHK, в отличие от дуплекса siPHK, обычно содержит неспаренные нуклеотиды в центре. Затем miPHK включается в комплекс RISC аналогично siPHK [13].

В отличие от siPHK, miPHK обычно полностью комплементарна только небольшому участку мPHK длиной несколько нуклеотидов. Полностью комплементарный мPHK участок miPHK чаще всего включает нуклеотиды 2-8 с 5'-конца и называется «seed»-последовательностью. «Seed»-последовательность определяет специфичные мишени miPHK [14]. miPHK обычно связывается с участком мPHK, который находится в З'-нетранслируемой области и представлен несколькими копиями в одной и той же мPHK.

Поскольку размер участка, который должен быть полностью комплементарным, невелик, то сразу несколько разных мРНК могут служить мишенью одной тіРНК. Предполагается, что полная комплементар-ность тіРНК и мРНК-мишени может приводить к деградации мРНК, а в случае неполного комплементарного связывания тіРНК и мРНК - к нарушению трансляции [7, 15].

Введение в клетки млекопитающих длинных дцРНК приводит к интерфероновому ответу, поэтому используют короткие, химически синтезированные siРНК, которые наиболее приближены по структуре к природным siРНК [16]. Однако действие синтетических siРНК носит кратковременный характер (несколько дней), что связано с их разрушением под действием клеточных нуклеаз. Помимо этого концентрация таких siРНК снижается при делении клеток. Эти недостатки можно обойти, используя векторы, которые направляют синтез малых шпилечных РНК (shРНК) - предшественников siРНК. shРНК содержат последовательность направляющей цепи siРНК (длиной 21-29 п.н.), следующую за ней петлю примерно из 9 нуклеотидов, и последовательность, комплементарную направляющей цепи siРНК (рис. 2А). Использование такой структуры позволя-

ет обеспечить подавление экспрессии гена в течение длительного времени [17].

Для доставки shPHK в клетки оптимально использовать лентивирусные векторы. Важная особенность жизненного цикла лентивирусов - способность встраивать свой геном (в составе провирусной ДHK) в клеточную ДHK. ^оме того, лентивирусы, в отличие от простых ретровирусов, способны заражать неделящиеся клетки. ^смотря на применение в качестве основы для вектора таких лентивирусов, как вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек и вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, наиболее часто используемым остается вирус иммунодефицита человека типа 1 (HIV-1), что обусловлено наилучшей изученностью его жизненного цикла [18, 19].

ЛЕНТИВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ

Для переноса и экспрессии генов используют нерепликационно-компетентные системы на основе лентивирусов [20]. Такие системы позволяют встраивать в геном клетки-мишени ДHK (трансген), кодирующий целевой ген. Обычный лентивирусный вектор содержит цис-элементы вирусного генома, необходимые для сборки и интеграции вирусной частицы, а также последовательность, кодирующую целевой ген. Все транс-элементы вирусного генома из вектора удаляют. Основной способ получения лентивирус-ных векторов - котрансфекция вектора и плазмид, кодирующих вирусные белки [19]. Для снижения риска возникновения репликационно-компетентных частиц в результате рекомбинации компоненты генома вируса, необходимые для сборки лентивирусного вектора, обычно разделяют на три-четыре плазмиды: одну-две упаковочных, собственно векторную и плазмиду, кодирующую белок оболочки вируса. В настоящее время в упаковочных системах третьего поколения используют конструкции, из которых удалены все цис-элементы, кроме RRE и донорного сайта сплайсинга, необходимого для посттранскрип-ционного процессинга мPHK. Вместо длинного концевого повтора (LTR, long terminal repeat) используют также гетерологичный промотор (обычно CMV) и сигнал полиаденилирования вируса SV40. Гены rev и gag/pol вводят в клетки в составе разных экспрессирующих кассет. Используют также гуманизацию генов gag/pol, что позволяет экспрессировать их независимо от rev. Это дает возможность удалить также RRE из упаковывающей системы [21]. Важно, что столь значительные модификации в упаковочной системе не влияют на эффективность трансдукции лентивирусным вектором и существенно снижают риск образования репликационно-компетентных частиц в результате гомологичной рекомбинации.

Для снижения риска негомологичной рекомбинации разработана транс-лентивирусная упаковывающая система, в которой кодирующий участок gag/pol разделен на две части и встроен в состав двух разных экспрессирующих плазмид [22].

Псевдотипирование лентивирусных векторов

С целью увеличения тропизма лентивирусных частиц белок оболочки HIV-1 часто заменяют на белок G вируса везикулярного стоматита (VSV). Такие псевдо-типированные лентивирусные частицы позволяют осуществлять трансдукцию практически всех видов клеток. Подобная модификация не только расширяет тропизм вирусных частиц, но и делает более устойчивыми. Еще одно важное свойство VSV-G - его способность облегчать проникновение вектора в клетку путем эндоцитоза, тем самым уменьшая потребность во вспомогательных белках оболочки [23]. K основным недостаткам лентивирусных частиц, псевдотипиро-ванных VSV-G, относится их быстрая элиминация из системы кровообращения компонентами иммунной системы [24].

Одна из основных проблем, возникающих при использовании малых интерферирующих PHK, - недостаточная специфичность их доставки в клетки-мишени. Помимо VSV-G для псевдотипирования могут применяться и гетерологичные гликопротеины лиссавирусов, вируса лимфоцитарного хориоменин-гита, альфавирусов и бакуловирусов [25]. Эффективность трансдукции клеток печени повышается при использовании белка оболочки вируса гепатита C или бакуловируса [26]. Псевдотипирование ленти-вирусных частиц белками оболочки вируса бешенства (Rabies virus) позволяет лентивирусам заражать клетки центральной нервной системы in vivo [27]. Белки оболочки других вирусов часто используют для обеспечения более эффективной тканеспецифичной трансдукции.

Широкое распространение все больше получают методы, позволяющие экспонировать на поверхности вирусных частиц различные клеточные рецепторы или антитела к ним [28-30]. Общий принцип подобного подхода заключается в создании слитого белка, который, с одной стороны, можно успешно встраивать в состав оболочки векторных частиц и обеспечивать относительную стабильность таких частиц. С другой стороны, этот белок несет участок лиганда, необходимый для связывания с рецептором. Чаще всего основой для такого химерного белка служит гликопротеин амфотропного вируса лейкоза мышей A-MLV, гемагглютинины вирусов гриппа и кори. Эти вирусные белки оболочки модифицируют таким образом, чтобы они не могли распознавать свои естественные рецепторы, что позволяет избежать

неспецифичного заражения. По такому принципу были созданы лентивирусные векторы, содержащие на своей поверхности эпидермальный фактор роста (EGF) или одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv) к CD20, слитые с гемагглютинином вируса кори и предназначенные для специфичного заражения B-клеток [31]. Другой подход состоит в создании лентивирусных частиц, на поверхности которых экспонирован гликопротеин A-MLV, слитый с scFv к CD3 либо с интерлейкином-7 (IL-7) [32, 33]. Подобная система позволяет осуществлять заражение Т-клеток. Можно также использовать для псевдотипирования сразу два лиганда: фактор стволовых клеток (SCF), слитый с гликопротеином A-MLV, и тромбопоэтин (TPO), конъюгированный с гемагглютинином вируса гриппа. Трансдукция клеток популяции CD34+ лентивирусными частицами, несущими на своей поверхности либо тромбопоэтин, либо SCF, или оба лиганда, оказалась значительно более эффективной, чем при использовании VSV-G в качестве белка оболочки [34].

Лиганды клеточных рецепторов экспонируют на поверхности вирусных частиц не только при помощи поверхностных белков оболочки вирусов. В этом случае используемый белок должен содержать трансмембранный домен, а на поверхности вирусного вектора должен присутствовать белок оболочки, который может осуществлять слияние вируса с клеткой. С этой целью используют модифицированные белки оболочки вируса Синдбис или VSV-G, которые теряют способность связываться со своим «родным» рецептором. Вирус Синдбис имеет два поверхностных белка оболочки, E1 и E2. Белок E1 отвечает за слияние с клеткой, а E2 - за связывание с рецептором, при этом белок E1 функционирует независимо от E2. По такому принципу создан лентивирусный вектор с трансмембранной формой SCF и модифицированным белком оболочки вируса Синдбис [35]. При отсутствии у белка трансмембранного домена, необходимого для локализации на поверхности лентивирусных частиц, к нему присоединяют трансмембранный домен VSV-G или лейкоцитарного антигена HLA [36]. Для псевдотипирования лентивирусных частиц антителами необходимо, чтобы в упаковывающей системе присутствовали не только гены, кодирующие легкие и тяжелые цепи антител, но и гены белков Iga и IgP, необходимых для экспонирования антител. По такой схеме получают лентивирусные частицы, на поверхности которых экспонированы антитела к поверхностным белкам CD20, DS-SIGN и CD3 [37-39].

Белки оболочки вируса Синдбис также используются для псевдотипирования лентивирусных частиц антителами. Для этого белок E2 модифицируют, встраивая в него Fc-связывающий домен белка

A (ZZ-домен), который связывает иммуноглобулины IgG. Трансдукция такими лентивирусными частицами возможна только в присутствии моноклональных антител. Выбор антител определяет тропизм ленти-вируса, что позволяет создавать вирусные частицы, специфичные к клеткам различной природы, не внося при этом изменений в упаковывающую систему [40]. K недостаткам белков оболочки вируса Синдбис относится зависимость активности белка E1 от pH (значение pH должно быть в диапазоне 4.5-5.0).

Снижение стабильности таких химерных белков при псевдотипировании лентивирусных частиц также можно считать их недостатком. ^обходимо отметить и снижение эффективности заражения клеток-мишеней при использовании таких лентивирусных частиц, что, однако, может компенсироваться высокой специфичностью.

Другой подход, позволяющий обеспечить специфичное заражение клеток, состоит в использовании в составе оболочки вируса белков, связывание которых со специфичным поверхностным рецептором приводит к значительному снижению эффективности трансдукции клеток, внесение трансгена в которые нежелательно [29]. Такой препятствующий заражению белок можно связать с вирусным гликопротеином при помощи аминокислотной последовательности, чувствительной к определенным протеазам. В этом случае заражение происходит в два этапа: сначала лиганд на поверхности вируса связывается с клеточным рецептором, а затем под действием определенных протеаз происходит расщепление пептидной вставки. После расщепления вставки гликопротеин может связываться со своим специфичным рецептором на поверхности клеток. Подобный подход позволяет осуществлять заражение клеток в присутствии определенных протеаз.

Использование тканеспецифичных промоторов

^специфичная трансдукция клеток, а следовательно, экспрессия трансгена в этих клетках может приводить к различным негативным эффектам. В частности, экспрессия трансгена в антигенпредставляющих клетках (AnK) может вызывать развитие иммунного ответа и активацию T-клеток [41]. Для снижения эффекта от неспецифичного заражения используют тканеспецифичные промоторы. Псевдотипирование и использование тканеспецифичных промоторов позволяют добиться экспрессии трансгена только в требуемых клетках. Однако тканеспецифичные промоторы могут быть довольно слабыми, и уровень экспрессии целевого гена может быть недостаточным. С целью усиления таких промоторов могут использоваться энхансеры более сильных промоторов. Энхансер промотора CMV, используемый вместе

с различными тканеспецифичными промоторами, обеспечивает многократное увеличение экспрессии целевого гена, не снижая при этом специфичности промоторов [42]. Место встраивания трансгена в геном клетки-мишени определяется случайным образом, но встраивание происходит предпочтительно в транскрипционно активные области. Важно учитывать, что встроенный трансген может случайно оказаться под контролем сильного промотора. В таком случае его экспрессия не будет зависеть от ткане-специфичности промотора, поэтому, чтобы избежать этого, используют инсуляторы, которые блокируют эффекты соседних энхансеров [28].

Экспрессия трансгена может регулироваться на посттранскрипционном уровне. В основе механизма такой регуляции лежит PHK-интерференция. ^ данный момент известно более 200 miPHK, которые обладают тканеспецифичной экспрессией. Показано, что внесение в ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) четырех сайтов, узнаваемых miPHK miR-142, экспрессирующейся в основном в гемо-поэтических клетках, приводит к снижению уровня флуоресценции только в этих клетках [28, 43]. Учитывая, что постоянно открывают новые паттерны экспрессии miPHK в различных клетках, можно предположить, что этот метод представляет большой интерес для осуществления тонкого контроля экспрессии вносимых генов.

Малые шпилечные РНК

shPHK являются предшественниками siPHK. Обычно их экспрессируют с использованием промоторов PHK-полимеразы III, таких, как U6 или H1 (мыши или человека) [43]. Эти промоторы имеют небольшой размер (около 400 п.н.), при этом транскрипция начинается с позиции +1, а в случае промотора U6 желательно, чтобы транскрипция начиналась с гуанина [44]. Сигналом терминации транскрипции служит последовательность из 5-6 остатков тимина, что приводит к получению двухцепочечной shPHK с неспаренным 3'-концом, необходимым для дальнейшего процессинга белком Dicer. Промоторы U6 и H1 обеспечивают стабильный и достаточно высокий уровень экспрессии shPHK в клетках всех типов. shPHK, полученные в результате транскрипции с помощью PHK-полимеразы III, не имеют 5'-кепа и 3'-поли(А)-последовательности, они не подвергаются процессингу белком Drosha. Их транспорт в цитоплазму осуществляется при участии белка Exportin-5 [12]. Использование промоторов PHK-полимеразы III при создании лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK, позволяет добиться высокого уровня экспрессии shPHK практически в любых клетках. Существуют подходы, при которых кассеты,

экспрессирующие shPHK, клонируют в область 3'-LTR лентивирусного вектора [45]. При синтезе провируса в качестве матрицы для 5'-LTR используется 3'-LTR. В результате в провирусной вставке оказываются две копии экспрессионной кассеты (рис. 2Б).

В лентивирусный вектор часто включают маркерные гены, в качестве которых обычно используют гены, кодирующие флуоресцентные белки или сообщающие клеткам устойчивость к определенному антибиотику. Присутствие в векторе маркерных генов позволяет проводить селекцию трансдуцирован-ных клеток и оценивать эффективность трансдукции. С помощью лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK, получены клеточные линии, в которых происходило стабильное подавление экспрессии активированных онкогенов, выявляемых при острых миелоидных лейкозах. В качестве маркерного гена в вектор был внесен ген устойчивости к пуромицину (рис. 2A) [46, 47].

При конструировании векторов, направляющих синтез shPHK, важно учитывать, что повышенный уровень экспрессии shPHK в клетках может иметь неблагоприятные последствия. Показано, что трансдук-ция гепатоцитов мыши вектором на основе аденоассо-циированного вируса, в котором транскрипция shPHK контролируется промотором U6, в половине случаев приводит к повреждению печени [48]. В этой работе [48] использовали 49 различных векторов, каждый из которых кодировал уникальную shPHK. Токсический эффект этих векторов связывают с конкуренцией между shPHK и клеточными miPHK за взаимодействие с белками Dicer и Exportin-5, участвующими в процессинге обоих видов малых PHK. Существенно, что получаемая shPHK содержит на 5'-конце трифос-фат, который может вызывать интерфероновый ответ и прекращать трансляцию белков в клетке. Сличив двух неспаренных нуклеотидов на 3'-конце стебля shPHK существенно для эффективной работы про-цессирующих белков Exportin-5 и Dicer. Увеличение числа неспаренных нуклеотидов заметно снижает функциональную активность таких shPHK [49-51]. Избежать образования трифосфата на 5'-конце можно при помощи подхода, в котором происходит совместная транскрипция shPHK и тPHK [52]. При этом синтезируется химерная PHK, процессируемая клеточными эндонуклеазами, в результате чего образуется shPHK, содержащая монофосфат на 5'-конце (рис. 2В). Использование промоторов тPHK позволяет предотвратить возникновение неспецифических ответов, при этом уровень экспрессии shPHK оказывается значительно ниже, чем при использовании промоторов полимеразы III.

Если же первые 2-8 нуклеотидов направляющей цепи siPHK комплементарны «seed»-

л

miPHK

EF1

SA

ДLNGFR

_JL__

miPHK вырезается в результате сплайсинга

CMV

О

Рис. 3. Схемы векторов, направляющих синтез модифицированных тіРНК А - тіРНК клонирована под промотор EF1', так что она экспрессируется вместе с участком гена NGFR(ALNGFR) в первом интроне и вырезается в результате сплайсинга. SD - до-норный сайт сплайсинга; SA - акцепторный сайт сплайсинга [62]. Б - тіРНК экспрессируется в составе экзона 3 гена ВІС, в котором она присутствовала изначально [63]

Б

последовательности какой-либо miPHK, то такая siPHK может работать как miPHK. Это может приводить к неспецифичному действию siPHK. Способность siPHK действовать как miPHK может использоваться для подавления экспрессии некоторых генов, например, в случае гена CCR5 [53]. siPHK, специфичная в отношении гена CCR5, комплементарна «seed»-последовательности в 3'-UTR мPHK. Такая siPHK вызывала деградацию мPHK и приводила к нарушению трансляции, как это происходит при действии miPHK. При выборе последовательности shPHK следует учитывать, что 5'-конец направляющей цепи дуплекса, образуемого в результате процессинга, должен обладать меньшей термодинамической стабильностью. ^соблюдение этих правил может привести к тому, что в RISC попадет пассажирская цепь вместо направляющей, в результате чего снизится специфичность действия shPHK. Предполагается, что промотор H1 лучше подходит для использования in vivo, чем промотор U6, поскольку промотор H1, несмотря на его меньшую эффективность, менее токсичен [54]. Успешное применение лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK, показано на животных моделях различных заболеваний [55-57]. В частности, экспрессия shPHK сохранялась на протяжении 9 мес. после инъекции лентивирусных частиц, и поддерживалось подавление экспрессии репортерного гена в клетках головного мозга мыши [58].

Избежать возникновения нежелательных эффектов, связанных с применением shPHK (интерферо-новый ответ, конкуренция с клеточными miPHK, неспецифичность действия), позволяют различные подходы. Pяд из них основан на адаптации процессинга искусственных shPHK к механизмам, используемым клеточными miPHK [59]. Для этого можно заменить последовательность направляющей

цепи будущей miPHK на искусственную, сохранив при этом структуру предшественников miPHK. miPHK транскрибируются полимеразой II, поэтому при конструировании вектора предпочтительно использовать промоторы этого фермента. Показано, что в векторе на основе аденоассоциированного вируса экспрессия shPHK, находящейся под контролем промотора U6, в 10 раз выше, чем экспрессия miR-30 под тем же промотором. Однако уровень подавления репортерного гена оказался примерно одинаковым при значительно более низком токсическом эффекте конструкции, содержащей miR-30 [60, 61]. Hедостат-ком систем на основе miR-30 является то, что в качестве направляющей цепи в данном случае Dicer может выбирать обе цепи дуплекса miPHK.

Трансдукция клеток лентивирусным вектором, несущим ген рецептора фактора роста нервов (NGFR), в первый интрон которого под контроль промотора EFla встроена последовательность, кодирующая pri-miR-223 (около 200 п.н.), приводит к стабильной экспрессии и гена NGFR, и miPHK (рис. 3A). Последовательность направляющей цепи в «стебле» miPHK можно заменить последовательностями направляющих цепей других miPHK или siPHK [62]. Существует также подход, который позволяет обеспечить стабильную экспрессию гена BIC мыши и кодируемой им miR-155 с измененной последовательностью направляющей цепи (рис. 3Б) [63]. Вектор, содержащий участок гена BIC, в том числе и последовательность miR-155, направлял успешную экспрессию как исходной микроPHK, так и микроPHK с измененной последовательностью направляющей цепи (рис. 3Б) [63]. В настоящий момент не существует общих правил конструирования искусственных miPHK, что связано, в первую очередь, с недостаточной изученностью их процессинга.

Одновременный синтез нескольких малых интерферирующих РНК

В некоторых случаях предпочтительна одновременная экспрессия сразу нескольких siPHK, например, при проведении противовирусной терапии. Это связано с тем, что некоторые вирусы мутируют с высокой скоростью и велика вероятность возникновения устойчивости к действию конкретной siPHK. Использование мультиплексных конструкций, позволяющих синтезировать сразу несколько siPHK, значительно снижает вероятность возникновения устойчивых форм вируса.

Поэтому был создан лентивирусный вектор, направляющий синтез длинных шпилечных PHK (lhPHK) со структурой «петля-стебель». Процессинг таких lhPHK происходит при участии белка Dicer, под действием которого образуются несколько siPHK. Hуклеотидная последовательность lhPHK, предшественника siPHK, подбирается по тому же принципу, как и в случае shPHK. С помощью lhPHK размером 50-80 п.н. - предшественника двух-трех siPHK против разных участков общего региона генов tat/rev, было достигнуто подавление репликации HIV-1 (рис. 4A) [64]. Сходный метод использовали при подавлении репликации вирусов гепатита B и C [65, 66]. Эффективность процессинга lhPHK белком Dicer снижается по мере приближения последовательности siPHK к «петле», что приводит к образованию различного количества siPHK и неравномерному подавлению экспрессии генов-мишеней.

Поскольку промоторы PHK-полимеразы III имеют достаточно небольшой размер (200-400 п.н.), то в один вектор можно встраивать сразу несколько последовательностей siPHK, каждая из которых контролируется собственным промотором. При этом берут разные промоторы PHK-полимеразы III (U6, H1 и 7SK), так как использование одинаковых промоторов может привести к рекомбинации между их последовательностями и делеции одной или нескольких экспрессионных кассет в четырех случаях из пяти [67]. Был сконструирован вектор, обеспечивающий синтез четырех shPHK под контролем промоторов U6, H1 мыши и U6, 7SK человека. При этом промоторы H1 мыши и u6 человека были слиты в один двунаправленный промотор (рис. 4Б). С помощью этого вектора достигнуто подавление экспрессии четырех различных генов [68].

Для одновременной экспрессии нескольких siPHK можно использовать кластеры, кодирующие по-лицистронные miPHK, из которых образуются несколько pre-miPHK. В результате транскрипции кластера генов miR-17-92 образуются двухцепочечная pri-miPHK размером около 1 т.п.н. - предшественники шести различных pre-miPHK. Kластер генов

mir-17-92 использовали при создании лентивирус-ных векторов, направляющих синтез четырех HIV-1-специфичных miPHK. Из кластера генов взяли последовательности, которые кодируют pre-miPHK и содержат по 40 нуклеотидов с каждой стороны структуры «петля-стебель», и встроили их в вектор. Последовательности направляющих цепей будущих miPHK заменили участками, специфичными в отношении HIV-1 (рис. 4B) [69]. При замене последовательностей направляющих цепей учитывали такие особенности структуры первоначальных miPHK, как мисматчи и термодинамическая стабильность.

Применение малых интерферирующих РНК

В настоящее время разрабатываются подходы к клиническому применению малых интерферирующих РНК Проводятся клинические испытания нескольких десятков препаратов на основе siPHK, направленных против заболеваний различной природы. При этом испытан только один препарат, в котором используется лентивирусная доставка shPHK. Применение лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK, сдерживается их относительной небезопасностью, обусловленной возможными неспецифическими ответами, которые может вызывать экспрессия shPHK в клетках, а также вероятностью инсерционного мутагенеза. Однако использование лентивирусных векторов для доставки siPHK имеет ряд существенных преимуществ. С их помощью можно добиться стабильного и продолжительного синтеза shPHK в делящихся и неделящихся клетках, что делает перспективным их применение при хронических заболеваниях.

Механизм РН^интерференции является частью системы противовирусной защиты организма, поэтому значительный интерес представляет использование РНКинтерференции при хронических вирусных инфекциях [59, 70, 71], к которым относятся заболевания, вызываемые вирусами гепатита B и C, а также HIV-1. Однако при применении РНК интерференции существует вероятность возникновения резистентных форм вируса, что ограничивает применение этого метода [72]. Современные методы позволяют создавать лентивирусные векторы, которые могут кодировать сразу три-четыре shPHK, специфичных в отношении различных вирусных генов, что позволяет значительно снизить вероятность появления устойчивых форм вируса. Существующие методы доставки siPHK в Т-клетки и макрофаги -мишени HIV-1, малоэффективны. Использование лентивирусных векторов может быть эффективным способом введения siPHK в клетки-мишени HIV-1. Однако в случае лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK, специфичных в отношении

Л

siPHKI siPHK2 siPHK3

0

j mU6^; shPHKI

1 A.

shPHKI 5 Linkl 5 shPHK2

;^hU6 Щ "ShPHK3 Link2

t ----------

-5- shPHK4 £ 7SK

I CMV^----

-------j pA 1

Рис. 4. Различные подходы к мультиплексной экспрессии малых интерферирующих PHK. A - Длинные шпилечные PHK (IhPHK) содержат последовательности нескольких siPHK (выделены красным), которые затем вырезаются белком Dicer [64]. Б - Экспрессия четырех shPHK с одного вектора под действием разных промоторов PHK-полимеразы III [68]. В — Экспрессия нескольких miPHK с использованием полицистрона mir-17-92. miPHK с измененными последовательностями направляющих цепей (выделены красным) были встроены в основу полицистрона mir-17-92 [69]

Б

В

вирусных генов, возможно снижение как эффективности формирования лентивирусных частиц, так и их титра [73], поэтому в гены, используемые в упаковочной системе, вводят точечные мутации, которые не влияют на синтез белков, необходимых для сборки вирусных частиц. Подбор таких мутаций несколько усложняет процесс конструирования вектора, особенно если shPHK подбирают к консервативным участкам HIV-1. При заражении HIV-1 белок оболочки вируса связывается с рецептором CD4+, экспонированным на поверхности клеток-мишеней, а в качестве корецептора вирус использует клеточный рецептор CCR5. Известно, что гомозиготная делеция в гене CCR5 человека делает клетки устойчивыми к заражению HIV-1, при этом мутация, по-видимому, практически не влияет на нормальное функционирование клеток [74]. Показано, что подавление экспрессии рецептора ccR5 с помощью shPHK также делает клетки устойчивыми к заражению вирусом как in vitro, так и in vivo [75-78]. K настоящему вре-

мени выявлено несколько белков, функции которых не являются жизненно необходимыми для Т-клеток или макрофагов, но играют важную роль в жизненном цикле HIV-1 [79].

Оптимальным подходом считается получение устойчивых к HIV-1 Т-клеток и макрофагов из их общих предшественников. С этой целью проводили трансдукцию ранних гемопоэтических клеток-предшественников лентивирусными векторами, которые направляют синтез shPHK, специфичных в отношении генов CCR5 или CXCR-4. Потомки таких клеток - Т-клетки и макрофаги - приобретали устойчивость к вирусу [80-82]. Существует подход, позволяющий экспрессировать shPHK вместе с другими генами. В качестве примера можно привести лентивирусный вектор, с помощью которого помимо экспрессии shPHK, специфичной в отношении общего участка генов tat/rev, удалось обеспечить синтез ложной мишени для вирусного белка TAT. Эта ложная мишень блокирует действие белка ТАТ, а также

синтез рибозима, специфичного в отношении рецептора ССИ5 [83, 84]. Эффективность такого вектора была проверена на гуманизированных мышах, с его помощью достигнуто стабильное ингибирование НГУ-1 на разных стадиях жизненного цикла [85]. Клинические испытания показали безопасность использования этого вектора при аутологичной трансплантации костного мозга больным НГУ-1 и лимфомой. У больных лимфомой на стадии ремиссии, достигнутой после стандартной схемы лечения, отсутствовали побочные эффекты, связанные с введением shРНК. Детектируемый уровень экспрессии shРНК сохранялся при этом у больных на протяжении 24 мес.

Злокачественные опухоли развиваются в результате возникновения мутаций, которые приводят к избыточной экспрессии генов, стимулирующих пролиферацию клеток и нарушение апоптоза. РНК-интерференция является удобным инструментом модуляции экспрессии генов. Считается, что методы, основанные на принципе РНК-интерференции, могут представлять значительный интерес для терапии опухолей. Классические подходы к терапии злокачественных заболеваний обладают рядом существенных недостатков, связанных с неспецифичностью их действия. Использование РНК-интерференции позволяет при относительно небольших затратах обеспечить специфическое воздействие на онкогены. В настоящий момент проходят клинические испытания около 10 препаратов на основе siРНК. Основное препятствие к применению РНК-интерференции в терапии злокачественных заболеваний - несовершенство методов доставки siРНК в опухолевые клетки. Одна из удобных и эффективных систем переноса генов основана на использовании лентивирусных векторов. Эти системы позволяют с высокой специфичностью встраивать в геном клеток-мишеней последовательностей, кодирующих shРНК. С этой целью активно разрабатывают методы псевдотипирования лентивирусных частиц и используют тканеспецифичные промоторы. Существенным потенциалом обладают и системы с мультиплексной экспрессией shРНК, благодаря которым появляется возможность специфически подавлять сразу несколько генов, участвующих в развитии опухоли. Использование нескольких shРНК, специфичных к разным участкам одного активированного онкогена, позволяет повысить эффективность таких систем [86].

Многие miРНК человека обладают способностью подавлять рост злокачественных опухолей [87, 88]. В связи с этим некоторые группы исследователей работают над использованием miРНК в терапии злокачественных новообразований, в клетках которых снижена экспрессия онкосупрессорных miРНК. Показано, что восстановление экспрессии онкосупрессорных

Рис. 5. Трансдукция клеток костного мозга ex vivo.

Во время аутологичной трансплантации клетки костного мозга трансдуцируют лентивирусными векторами, направляющими синтез shPHK. Затем трансдуцирован-ные клетки вводят больному после проведения лучевой терапии [84]

miPHK приводит к снижению скорости роста клеток немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака печени и хронического лимфолейкоза [89-92]. Однако неэффективность трансдукции in vivo до сих пор остается основной проблемой при применении лентивирусных векторов в качестве основного вида терапии. Наиболее подходящей областью для применения лентивирусных векторов, направляющих синтез shPHK, считается терапия лейкозов (рис. 5). Перспективной может быть аутологичная трансплантация кроветворных клеток, трансдуцированных лентиви-русным вектором, специфичным в отношении одного или нескольких активированных онкогенов. Безопасность такого подхода показана при использовании лентивирусных векторов, которые направляют синтез shPHK, ингибирующих HIV-1 [93].

Поиск новых генов-мишеней, вовлеченных в развитие опухолей, также рассматривается как перспективное направление применения shPHK. В настоящее время активно изучаются профили экспрессии генов в злокачественных клетках, благодаря чему уже удалось обнаружить целый ряд генов, повышенная экспрессия которых характерна для опухолей определенного типа. Созданы обширные библиотеки лентивирусных shPHK-векторов, которые позволяют осуществлять поиск генов, перспективных для разработки новых химиотерапевтических препаратов [94, 95]. Индуцированное shPHK подавление экспрессии онкогенов позволяет оценить их вклад в поддержание злокачественного статуса клеток опухоли, как это было сделано с помощью лентивирусных век-

торов, направляющих синтез shPHK, специфичных к онкогенам c-kit и AML1-ETO, в клетках, полученных от больного острым миелоидным лейкозом. Данную систему успешно использовали для изучения ингибирующего действия биназы на рецепторную тирозинкиназу KIT [96].

Предполагается, что shPHK можно успешно применять в генной терапии таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Альцгеймера, Паркинсона и Гентингтона. Тем более перспективным представляется использование лентивирусных векторов, поскольку лентивирусы способны преодолевать ге-матоэнцефалический барьер и заражать клетки цен-

тральной нервной системы. Лентивирусные векторы позволяют добиться стабильного синтеза shРНК, что может быть крайне важным в терапии таких хронических заболеваний. Псевдотипирование лентиви-русных векторов при помощи белка оболочки вируса бешенства может повысить эффективность заражения клеток центральной нервной системы.

Работа поддержана Государственным контрактом № 16.512.11.2266, Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и грантом РФФИ (грант № 11-04-01365-а).

C^mK ЛИТЕГАТУГЫ

1. Meister G., Tuschl T. // Nature. 2004. V. 431. № 7006. P. 343-349.

2. Tomari Y., Zamore P.D. // Genes Dev. 2005. V. 19. № 5. P. 517-529.

3. Kim K., Lee Y.S., Carthew R.W. // RNA. 2007. V. 13. № 1. P. 22-29.

4. Macrae I.J., Ma E., Zhou M., Robinson C.V., Doudna J.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 2. P. 512-517.

5. Collins R.E., Cheng X. // FEBS Lett. 2005. V. 579. № 26.

P. 5841-5849.

6. Shen B., Goodman H.M. // Science. 2004. V. 306. № 5698. P. 997.

7. Carthew R.W., Sontheimer E.J. // Cell. 2009. V. 136. № 4.

P. 642-655.

8. Lippman Z., Martienssen R. // Nature. 2004. V. 431. № 7006.

P. 364-370.

9. Kim V.N. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. № 5. P. 376-385.

10. Bartel D.P. // Cell. 2004. V. 116. № 2. P. 281-297.

11. Han J., Lee Y., Yeom K.H., Nam J.W., Heo I., Rhee J.K., Sohn S.Y., Cho Y., Zhang B.T., Kim V.N. // Cell. 2006. V. 125. № 5.

P. 887-901.

12. Yi R., Qin Y., Macara I.G., Cullen B.R. // Genes Dev. 2003.

V. 17. № 24. P. 3011-3016.

13. Gregory R.I., Chendrimada T.P., Cooch N., Shiekhattar R. // Cell. 2005. V. 123. № 4. P. 631-640.

14. Lai E.C. // Nat. Genet. 2002. V. 30. № 4. P. 363-364.

15. Wu L., Fan J., Belasco J.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 11. P. 4034-4039.

16. Agrawal N., Dasaradhi P.V., Mohmmed A., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. № 4. P. 657-685.

17. Van den Haute C., Eggermont K., Nuttin B., Debyser Z., Baekelandt V. // Hum. Gene Ther. 2003. V. 14. № 18. P. 17991807.

18. Cockrell A.S., Kafri T. // Mol. Biotechnol. 2007. V. 36. № 3.

P. 184-204.

19. Спирин П.В., Вильгельм А.Э., Прасолов B.C. // Молекуляр. биология. 2008. Т. 42. № 5. С. 913-926.

20. Pluta K., Kacprzak M.M. // Acta Biochim. Pol. 2009. V. 56.

№ 4. P. 531-595.

21. Kotsopoulou E., Kim V.N., Kingsman A.J., Kingsman S.M., Mitrophanous K.A. // J. Virol. 2000. V. 74. № 10. P. 4839-4852.

22. Kappes J.C., Wu X., Wakefield J.K. // Methods Mol. Med. 2003. V. 76. P. 449-465.

23. Aiken C. // J. Virol. 1997. V. 71. № 8. P. 5871-5877.

24. Croyle M.A., Callahan S.M., Auricchio A., Schumer G., Linse K.D., Wilson J.M., Brunner L.J., Kobinger G.P. // J. Virol. 2004. V. 78. № 2. P. 912-921.

25. Cronin J., Zhang X.Y., Reiser J. // Curr. Gene Ther. 2005. V. 5.

№ 4. P. 387-398.

26. Bartosch B., Vitelli A., Granier C., Goujon C., Dubuisson J., Pascale S., Scarselli E., Cortese R., Nicosia A., Cosset F.L. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 43. P. 41624-41630.

27. Mazarakis N.D., Azzouz M., Rohll J.B., Ellard F.M., Wilkes F.J., Olsen A.L., Carter E.E., Barber R.D., Baban D.F., Kingsman S.M., et al. // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. № 19.

P. 2109-2121.

28. Frecha C., Szecsi J., Cosset F.L., Verhoeyen E. // Curr. Gene Ther. 2008. V. 8. № 6. P. 449-460.

29. Verhoeyen E., Cosset F.L. // J. Gene Med. 2004. V. 6. Suppl 1. P. S83-S94.

30. Matrai J., Chuah M.K., Van den Driessche T. // Mol. Ther. 2010. V. 18. № 3. P. 477-490.

31. Funke S., Maisner A., Muhlebach M.D., Koehl U., Grez M., Cattaneo R., Cichutek K., Buchholz C.J. // Mol. Ther. 2008.

V. 16. № 8. P. 1427-1436.

32. Maurice M., Verhoeyen E., Salmon P., Trono D., Russell S.J., Cosset F.L. // Blood. 2002. V. 99. № 7. P. 2342-2350.

33. Verhoeyen E., Dardalhon V., Ducrey-Rundquist O., Trono D., Taylor N., Cosset F.L. // Blood. 2003. V. 101. № 6. P. 2167-2174.

34. Verhoeyen E., Negre D., Cosset F.L. // Methods Mol. Biol. 2008. V. 434. P. 99-112.

35. Froelich S., Ziegler L., Stroup K., Wang P. // Biotechnol. Bioeng. 2009. V. 104. № 1. P. 206-215.

36. Lei Y., Joo K.I., Zarzar J., Wong C., Wang P. // Virol. J. 2010.

V. 7. P. 35.

37. Yang L., Bailey L., Baltimore D., Wang P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 31. P. 11479-11484.

38. Yang H., Joo K.I., Ziegler L., Wang P. // Pharm. Res. 2009.

V. 26. № 6. P. 1432-1445.

39. Yang L., Yang H., Rideout K., Cho T., Joo K.I., Ziegler L., Elliot A., Walls A., Yu D., Baltimore D., et al. // Nat. Biotechnol. 2008. V. 26. № 3. P. 326-334.

40. Morizono K., Bristol G., Xie Y.M., Kung S.K., Chen I.S. // J. Virol. 2001. V. 75. № 17. P. 8016-8020.

41. Cui Y., Kelleher E., Straley E., Fuchs E., Gorski K., Levitsky H., Borrello I., Civin C.I., Schoenberger S.P., Cheng L., et al. // Nat. Med. 2003. V. 9. № 7. P. 952-958.

42. Gruh I., Wunderlich S., Winkler M., Schwanke K., Heinke J., Blomer U., Ruhparwar A., Rohde B., Li R.K., Haverich A., et al. // J. Gene Med. 2008. V. 10. № 1. P. 21-32.

43. Dykxhoorn D.M., Novina C.D., Sharp P.A. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. V. 4. № 6. P. 457-467.

44. Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Shank P.R., Ramrat-nam B. // Nucl. Acids Res. 2003. V. 31. № 17. P. 5033-5038.

45. Tiscornia G., Singer O., Verma I.M. // Nat. Protoc. 2006. V. 1. № 1. P. 234-240.

46. Спирин П.В., Баскаран Д., Губцов П.М., Зенкова М.А., Власов В.В., Черноловская Е.Л., Прасолов В.С. // Acta Naturae. 2009. Т. 1. № 2. С. 98-103.

47. Спирин П.В., Иикитенко И.А., Лебедев Т.Д., ?убцов П.М., Stocking C., Прасолов В.С. // Молекуляр. биология. 2011. Т.

45. № 6. С. 1036-1045.

48. Grimm D., Streetz K.L., Jopling C.L., Storm T.A., Pandey K., Davis C.R., Marion P., Salazar F., Kay M.A. // Nature. 2006. V. 441. № 7092. P. 537-541.

49. Hornung V., Ellegast J., Kim S., Brzozka K., Jung A., Kato H., Poeck H., Akira S., Conzelmann K.K., Schlee M., et al. // Science. 2006. V. 314. № 5801. P. 994-997.

50. Pichlmair A., Schulz O., Tan C.P., Naslund T.I., Liljestrom P., Weber F., Reis e Sousa C. // Science. 2006. V. 314. № 5801. P. 997-1001.

51. Kenworthy R., Lambert D., Yang F., Wang N., Chen Z., Zhu H., Zhu F., Liu C., Li K., Tang H. // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. № 19. P. 6587-6599.

52. Scherer L.J., Frank R., Rossi J.J. // Nucl. Acids Res. 2007.

V. 35. № 8. P. 2620-2628.

53. Ehsani A., Saetrom P., Zhang J., Alluin J., Li H., Sn0ve O. Jr., Aagaard L., Rossi J.J. // Mol. Ther. 2010. V. 18. № 4. P. 796-802.

54. An D.S., Qin F.X., Auyeung V.C., Mao S.H., Kung S.K., Baltimore D., Chen I.S. // Mol. Ther. 2006. V. 14. № 4. P. 494-504.

55. Gupta S., Maitra R., Young D., Gupta A., Sen S. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2009. V. 297. № 2. P. 627-636.

56. Bot I., Guo J., van Eck M., van Santbrink P.J., Groot P.H., Hildebrand R.B., Seppen J., van Berkel T.J., Biessen E.A. // Blood. 2005. V. 106. № 4. P. 1147-1153.

57. Eren-Ko§ak E., Turner C.A., Watson S.J., Akil H. // Biol. Psychiatry. 2011. V. 69. № 6. P. 534-540.

58. Makinen P.I., Koponen J.K., Karkkainen A.M., Malm T.M., Pulkkinen K.H., Koistinaho J., Turunen M.P., Yla-Herttuala S. // J. Gene Med. 2006. V. 8. № 4. P. 433-441.

59. Manjunath N., Wu H., Subramanya S., Shankar P. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. V. 61. № 9. P. 732-745.

60. McBride J.L., Boudreau R.L., Harper S.Q., Staber P.D., Mon-teys A.M., Martins I., Gilmore B.L., Burstein H., Peluso R.W., Polisky B., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105.

№ 15. P. 5868-5873.

61. Zeng Y., Wagner E.J., Cullen B.R. // Mol. Cell. 2002. V. 9. № 6. P. 1327-1333.

62. Amendola M., Passerini L., Pucci F., Gentner B., Bacchetta R., Naldini L. // Mol. Ther. 2009. V. 17. № 6. P. 1039-1052.

63. Chung K.H., Hart C.C., Al-Bassam S., Avery A., Taylor J., Patel P.D., Vojtek A.B., Turner D.L. // Nucl. Acids Res. 2006.

V. 34. № 7. P. 53.

64. Sano M., Li H., Nakanishi M., Rossi J.J. // Mol. Ther. 2008.

V. 16. № 1. P. 170-177.

65. Watanabe T., Sudoh M., Miyagishi M., Akashi H., Arai M., Inoue K., Taira K., Yoshiba M., Kohara M. // Gene Ther. 2006. V. 13. № 11. P. 883-892.

66. Weinberg M.S., Ely A., Barichievy S., Crowther C., Mufa-madi S., Carmona S., Arbuthnot P. // Mol. Ther. 2007. V. 15.

№ 3. P. 534-541.

67. Brake O., Hooft K.T., Liu Y.P., Centlivre M., von Eije K.J., Berkhout B. // Mol. Ther. 2008. V. 16. № 3. P. 557-564.

68. Gou D., Weng T., Wang Y., Wang Z., Zhang H., Gao L., Chen Z., Wang P., Liu L. // J. Gene Med. 2007. V. 9. № 9. P. 751-763.

69. Liu Y.P., Haasnoot J., ter Brake O., Berkhout B., Konstantinova P. // Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. № 9. P. 2811-2824.

70. Ashfaq U.A., Yousaf M.Z., Aslam M., Ejaz R., Jahan S., Ullah O. // Virol. J. 2011. V. 8. P. 276.

71. Morris K.V., Rossi J.J. // 3 2006. V. 13. № 6. P. 553-558.

72. Zheng Z.M., Tang S., Tao M. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005.

V. 1058. P. 105-118.

73. ter Brake O., Berkhout B. // J. Gene Med. 2007. V. 9. № 9.

P. 743-750.

74. Samson M., Libert F., Doranz B.J., Rucker J., Liesnard C., Farber C.M., Saragosti S., Lapoumeroulie C., Cognaux J., Forceille C., et al. // Nature. 1996. V. 382. № 6593. P. 722-725.

75. Anderson J., Akkina R. // Gene Ther. 2007. V. 14. № 17.

P. 1287-1297.

76. Qin X.F., An D.S., Chen I.S., Baltimore D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 1. P. 183-188.

77. Lee M.T., Coburn G.A., McClure M.O., Cullen B.R. // J. Virol. 2003. V. 77. № 22. P. 11964-11972.

78. Butticaz C., Ciuffi A., Munoz M., Thomas J., Bridge A., Pe-bernard S., Iggo R., Meylan P., Telenti A. // Antivir. Ther. 2003. V. 8. № 5. P. 373-377.

79. Brass A.L., Dykxhoorn D.M., Benita Y., Yan N., Engelman A., Xavier R.J., Lieberman J., Elledge S.J. // Science. 2008. V. 319. № 5865. P. 921-926.

80. Anderson J., Akkina R. // Retrovirology. 2005. V. 2. P. 53.

81. Banerjea A., Li M.J., Bauer G., Remling L., Lee N.S., Rossi J., Akkina R. // Mol. Ther. 2003. V. 8. № 1. P. 62-71.

82. An D.S., Donahue R.E., Kamata M., Poon B., Metzger M.,

Mao S.H., Bonifacino A., Krouse A.E., Darlix J.L., Baltimore D., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. № 32.

P. 13110-13115.

83. Li M.J., Kim J., Li S., Zaia J., Yee J.K., Anderson J., Akkina R., Rossi J.J. // Mol. Ther. 2005. V. 12. № 5. P. 900-909.

84. Tiemann K., Rossi J.J. // EMBO Mol. Med. 2009. V. 1. № 3.

P. 142-151.

85. Anderson J., Li M.J., Palmer B., Remling L., Li S., Yam P.,

Yee J.K., Rossi J., Zaia J., Akkina R. // Mol. Ther. 2007. V. 15.

№ 6. P. 1182-1188.

86. Senzer N., Barve M., Kuhn J., Melnyk A., Beitsch P., Lazar M., Lifshitz S., Magee M., Oh J., Mill S.W., et al. // Mol. Ther. 2012. V. 20. № 3. P. 679-686.

87. Zhang B., Pan X., Cobb G.P., Anderson T.A. // Dev. Biol. 2007. V. 302. № 1. P. 1-12.

88. Li C., Feng Y., Coukos G., Zhang L. // AAPS J. 2009. V. 11.

№ 4. P. 747-757.

89. Yu F., Yao H., Zhu P., Zhang X., Pan Q., Gong C., Huang Y., Hu X., Su F., Lieberman J., et al. // Cell. 2007. V. 131. № 6.

P. 1109-1123.

90. Cimmino A., Calin G.A., Fabbri M., Iorio M.V., Ferracin M., Shimizu M., Wojcik S.E., Aqeilan R.I., Zupo S., Dono M., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 39. P. 13944-13949.

91. Kota J., Chivukula R.R., O'Donnell K.A., Wentzel E.A., Montgomery C.L., Hwang H.W., Chang T.C., Vivekanandan P., Torbenson M., Clark K.R., et al. // Cell. 2009. V. 137. № 6.

P. 1005-1017.

92. Kumar M.S., Erkeland S.J., Pester R.E., Chen C.Y., Ebert M.S., Sharp P.A., Jacks T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008.

V. 105. № 10. P. 3903-3908.

93. DiGiusto D.L., Krishnan A., Li L., Li H., Li S., Rao A., Mi S., Yam P., Stinson S., Kalos M., et al. // Sci. Transl. Med. 2010.

V. 2. № 36. P. 36-43.

94. Yoshino S., Hara T., Weng J.S., Takahashi Y., Seiki M., Sakamoto T. // PLoS One. 2012. V. 7. № 4. P. 35590.

95. Palchaudhuri R., Hergenrother P.J. // ACS Chem. Biol. 2011. V. 6. № 1. P. 21-33.

96. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Spirin P.V., Fedorova T.V., Kretova O.V., Tchurikov N.A., Prassolov V.S., Ilinskaya O.N., Makarov A.A. // Cell Cycle. 2011. V. 10. № 23. P. 4090-4097.