ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ ЧИП И СПОСОБ БЫСТРОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ПРИСУТСТВИЯ ЦЕЛЕВЫХ МОЛЕКУЛ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
ELECTROPHORETIC CHIP AND METHOD FOR FAST DETECTION OF THE PRESENCE OF TARGET NUCLEIC ACID MOLECULES

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
С настоящей заявкой связаны следующие документы, WO2018/122856, дата публикации 5 июля 2018 г., WO2018/122852, дата публикации 5 июля 2018 г., и PCT/IL2018/050726, дата подачи 4 июля 2018 г., содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США с серийным № 62/610997, поданной 28 декабря 2017 г., содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение, в целом, относится к амплификации по типу катящегося кольца.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является предложение усовершенствованных способов амплификации по типу катящегося кольца (RCA).
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложен хранящийся при комнатной температуре электрофоретический чип для использования в способе быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в растворе; хранящийся при комнатной температуре электрофоретический чип, включающий множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных отложений микрогеля, при этом каждое из множества иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных отложений микрогеля содержит материалы, подходящие для проведения амплификации по типу катящегося кольца и связывания по меньшей мере одной из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты, каждое из отложений микрогеля содержит по меньшей мере следующие элементы, предварительно закрепленные в нем: RCA-зонд, специфический для по меньшей мере одной из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один праймер.
Предпочтительно, отложения микрогеля являются обезвоженными и могут быть вновь гидратированы при помещении в раствор, содержащий по меньшей мере одну целевую молекулу нуклеиновой кислоты. Дополнительно или альтернативно, по меньшей мере один праймер включает по меньшей мере один прямой праймер и по меньшей мере один обратный праймер.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения RCA-зонд предварительно гибридизован с по меньшей мере одним праймером.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каждое из отложений микрогеля в гидратированном состоянии, как правило, имеет полусферическую форму.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных отложений микрогеля образуют соответствующее множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля, и электрофоретический чип используют в способе, включающем нанесение раствора на каждую из множества иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля, проведение амплификации по типу катящегося кольца по меньшей мере, как правило, одновременно в каждой из множества иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля при наложении на них электрических полей в процессе разных стадий амплификации по типу катящегося кольца, и обнаружение присутствия по меньшей мере одной из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в соответствующей по меньшей мере одной из иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля, при этом обнаружение происходит в течение короткого периода времени после нанесения раствора, составляющего менее 30 минут.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения также предложен способ быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в растворе, включающий нанесение раствора на по меньшей мере множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля на электрофоретическом чипе, при этом каждая из множества иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля содержит отложение микрогеля, содержащее материалы, подходящие для связывания особой молекулы из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты, и проведение амплификации по типу катящегося кольца, при этом проведение амплификации по типу катящегося кольца по меньшей мере, как правило, происходит одновременно в иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областях микрогеля при наложении на них электрических полей в процессе разных стадий амплификации по типу катящегося кольца, и обнаружение присутствия по меньшей мере одной из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в соответствующей по меньшей мере одной из иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля, при этом обнаружение происходит в течение короткого периода времени после нанесения раствора, составляющего менее 30 минут.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения обнаружение включает оптическое обнаружение. Предпочтительно, обнаружение включает флуоресцентное обнаружение.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения наложение электрических полей происходит в процессе по меньшей мере двух разных стадий амплификации по типу катящегося кольца.
Предпочтительно, электрические поля, как правило, являются по меньшей мере одинаковыми в каждой из иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения обнаружение происходит в течение периода времени менее 20 минут. Более предпочтительно, обнаружение происходит в течение периода времени менее 15 минут.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения наложение электрических полей в процессе амплификации по типу катящегося кольца включает по меньшей мере одно из следующего: наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для направления целевых молекул нуклеиновой кислоты в растворе к отложениям микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для направления продуктов гибридизации целевой молекулы нуклеиновой кислоты с RCA-зондом в растворе к отложениям микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для повторного захвата RCA-ампликонов, удаляющихся из отложений микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для направления RCA-зондов в отложения микрогеля для гибридизации с по меньшей мере одним из захватывающих зондов и праймеров, уже связанных с отложениями микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для удаления нежелательных молекул из областей микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для удлинения RCA-ампликонов, которые связаны с отложениями микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для сжатия RCA-ампликонов, которые связаны с отложениями микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для перемешивания RCA реагентов вблизи RCA-ампликонов, которые связаны с отложениями микрогеля, наложение электрического поля на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для повышения скорости действия ферментов в RCA и наложение электрического поля с последовательно меняющейся на противоположную полярностью на иммобилизованные, разделенные в пространстве и электрически изолированные области микрогеля для повышения строгости условий связывания RCA-ампликонов с отложениями микрогеля.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения электрофоретический чип представляет собой хранящийся при комнатной температуре электрофоретический чип.
Предпочтительно, электрофоретический чип включает множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных отложений микрогеля, при этом каждое из множества иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных отложений микрогеля содержит материалы, подходящие для проведения амплификации по типу катящегося кольца и связывания по меньшей мере одной из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты, каждое из отложений микрогеля содержит по меньшей мере следующие элементы, предварительно закрепленные в нем: RCA-зонд, специфический для по меньшей мере одной из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один праймер.
Краткое описание ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение будет лучше понято и оценено после изучения следующего далее подробного описания в сочетании с чертежами, в которых:
Фиг. 1A и 1B представляют собой упрощенные наглядные иллюстрации в собранном и в разобранном виде конструкции электрофоретического чипа, созданного и действующего в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, включающего множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля в процессе проведения амплификации по типу катящегося кольца (RCA);
Фиг. 2A и 2B представляют собой упрощенные наглядные иллюстрации в собранном и в разобранном виде конструкции электрофоретического чипа, показанного на Фиг. 1A и 1B, включающего множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля в функциональной конфигурации для хранения в обезвоженном состоянии;
Фиг. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H и 3I в совокупности представляют собой упрощенную иллюстрацию предпочтительного способа создания электрофоретического чипа, используемого в вариантах осуществления, представленных на Фиг. 1A - 2B;
Фиг. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I и 4J представляют собой упрощенные иллюстрации типичных этапов процесса быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения;
Фиг. 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I и 5J представляют собой упрощенные иллюстрации типичных этапов процесса быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения;
Фиг. 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H, 6I и 6J представляют собой упрощенные иллюстрации типичных этапов процесса быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения;
Фиг. 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I и 7J представляют собой упрощенные иллюстрации типичных этапов процесса быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения;
Фиг. 8 представляет собой диаграмму, обобщающую результаты Примера I; и
Фиг. 9 представляет собой диаграмму, обобщающую результаты Примера II.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Фиг. 1A и 1B представляют собой упрощенные наглядные иллюстрации в собранном и в разобранном виде конструкции электрофоретического чипа 100, созданного и действующего в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, который включает множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных специфических для целевых молекул областей микрогеля, в процессе проведения амплификации по типу катящегося кольца (RCA), и Фиг. 2A и 2B представляют собой упрощенные наглядные иллюстрации в собранном и в разобранном виде конструкции электрофоретического чипа, показанного на Фиг. 1A и 1B, в котором множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля показаны в функциональной конфигурации для хранения в обезвоженном состоянии. Следует отметить, что конструкция электрофоретического чипа 100 является особенно подходящей для использования в способе, описанном в настоящем документе далее, со ссылкой на Фиг. 7A - 7I.
Как показано на Фиг. 1A и 1B, конструкция электрофоретического чипа 100 включает камеру, ограниченную субстратом 110, структурой боковых стенок 120 и окном 130. Доступ во внутреннее пространство камеры предпочтительно обеспечивается входным отверстием для раствора 140 и выходным отверстием для раствора 150, сформированными в субстрате 110.
Электрофоретический чип 160 сформирован на субстрате 110, как более подробно описано ниже в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 3A - 3I. Множество специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170, предпочтительно имеющих связанные с ними разные кольцевые RCA-зонды, прямые праймеры и обратные праймеры, в настоящем документе, как правило, символически обозначаемые номером 175, иммобилизованы на отдельных участках нахождения рабочих электродов 180, образуя электрофоретический чип 160. На Фиг. 1A и 1B специфические для целевых молекул отложения микрогеля 170 показаны в функциональной конфигурации, подходящей для амплификации по типу катящегося кольца.
На Фиг. 2A и 2B специфические для целевых молекул отложения микрогеля показаны в обезвоженном состоянии, подходящем для хранения, и обозначены ссылочным номером 190. Понятно, что специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 на Фиг. 2A и 2B в гидратированном состоянии, возникающем вследствие подачи соответствующего раствора, предпочтительно, раствора, содержащего целевую молекулу нуклеиновой кислоты, во внутреннюю часть конструкции электрофоретического чипа 100, предпочтительно принимают функциональную конфигурацию, показанную на Фиг. 1A и 1B, где они обозначены ссылочным номером 170.
Предпочтительные размеры конструкции электрофоретического чипа 100 и его различных компонентов, предполагая для простоты расчетов, что каждое отложение микрогеля 170 под воздействием раствора, как правило, принимает полусферическую форму, являются следующими:
3
Объем раствора: примерно 100 мм
Внутренняя высота от субстрата 110 до окна 130: 0,8 мм - 2,0 мм
Высота специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170 над субстратом 110 в функциональной конфигурации, показанной на Фиг. 1A и 1B: 0,5 мм - 1,25 мм
Высота специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190 над субстратом 110 в функциональной конфигурации, показанной на Фиг. 2A и 2B: 0,1 мм - 0,3 мм
2
Площадь поверхности каждого специфического для целевой молекулы отложения микрогеля 170 на субстрате 110 в функциональной конфигурации, показанной на Фиг. 1A и 1B: 0,0016-0,009 мм
2
3
Отношение площади поверхности каждого специфического для целевой молекулы отложения микрогеля 170, экспонированного в раствор, к объему раствора: 0,000016-0,00009 мм экспонированной площади поверхности отложения микрогеля на мм раствора.
Понятно, что фактическая площадь поверхности и фактическое отношение площади поверхности к объему раствора превышают, или равны площади поверхности и отношению, рассчитанным с использованием упрощающего предположения о полусферической форме.
Структура и сборка конструкции электрофоретического чипа 100 далее описана со ссылкой на Фиг. 3A - 3I.
На Фиг. 3A показано, что субстрат 110, как правило, представляет собой лист из полиэфира, такого как полиэтилентерефталат, предпочтительно толщиной 0,1 мм. На данной стадии в субстрате 110 могут быть проделаны входное отверстие для раствора 140 и выходное отверстие для раствора 150, предпочтительно, путем вырезания лазером. Альтернативно, входное отверстие для раствора 140 и выходное отверстие для раствора 150 могут быть сформированы в субстрате 110 на более поздней стадии.
На Фиг. 3B показано, что субстрат 110 сформирован с начальным структурированным слоем 200 из материала с высокой проводимостью, предпочтительно, путем трафаретной печати чернилами Henkel 479SS. Толщина слоя 200 предпочтительно составляет 0,03 мм. Слой 200 обеспечивает однородное проведение электрического тока к каждому из отложений микрогеля в конструкции электрофоретического чипа 100.
На Фиг. 3C показано последующее формирование углеродного слоя 210, совмещенного с начальным слоем 200, предпочтительно, путем трафаретной печати DuPont 7102 и BQ 221. Толщина слоя 210 предпочтительно составляет 0,03 мм. Слой 210 служит в качестве материала рабочего электрода, который экспонирован в раствор, как описано ниже в настоящем документе. Слой 210 также контролирует напряжение, приложенное между внутренним рабочим электродом 230 и внешним противоэлектродом 240.
Взаимно совмещенные слои 200 и 210 в совокупности образуют внешний противоэлектрод 240 и внутренний рабочий электрод 230, которые соединены с соответствующими электрическими контактами 250 и 260.
На Фиг. 3D показано, что структурированный диэлектрический слой 270 сформирован поверх слоев 200 и 210 и поверх субстрата 100, предпочтительно путем трафаретной печати чернилами CMI-101-80 79SS, коммерчески доступными от компании Creative Materials, Inc. (Ayer, MA). Диэлектрический слой 270 предпочтительно имеет толщину 0,04 мм.
Как показано на Фиг. 3D, диэлектрический слой 270 предпочтительно сформирован с отверстиями 272 и 274, которые предпочтительно соответствуют по размеру и расположению входному отверстию для раствора 140 и выходному отверстию для раствора 150. Диэлектрический слой 270 также предпочтительно формируют с удлиненными отверстиями 276 и 278, которые расположены над частями противоэлектрода 240. Длина каждого из удлиненных отверстий 276 и 278 предпочтительно составляет 100 мм. Кроме того, диэлектрический слой 270 сформирован со множеством отверстий 280, на чертеже показана матрица из восьми отверстий 280, которые расположены над рабочим электродом 230 и вместе с ним определяют дискретные местоположения рабочего электрода 180 (Фиг. 1B и 2B). Предпочтительно, все отверстия 280 представляют собой идентичные круглые отверстия с диаметром 0,2 мм - 0,5 мм и минимальным пространством между ними 1 мм.
На Фиг. 3E показано формирование матрицы отложений микрогеля 300 путем роботизированного нанесения пятен материала поверх местоположений рабочего электрода 180. Отложения микрогеля 300 предпочтительно имеют в основном полусферическую форму в гидратированном состоянии и диаметр в плоскости диэлектрического слоя 270, составляющий 0,70 мм, так что они физически отделены друг от друга. Отложения микрогеля 300 предпочтительно имеют высоту от 0,5 мм до 1,2 мм и экспонированную площадь поверхности 0,0016-0,009 квадратных миллиметров. Отложения микрогеля 300 предпочтительно сформированы из (бис)акриламидного гидрогеля, содержащего стрептавидин.
На Фиг. 3F показано, что отложения микрогеля 300 предпочтительно освещают УФ-излучением для полимеризации компонентов отложений микрогеля 300. К отложениям микрогеля 300 добавляют гистидин, и затем отложения микрогеля 300 промывают для удаления избытка гистидина.
После полимеризации отложения микрогеля 300 высушивают на воздухе, получая сухие отложения микрогеля 310, показанные на Фиг. 3G.
На Фиг. 3H показано, что разные специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320 и, предпочтительно, также прямые праймеры 322 и обратные праймеры 324, связаны с соответствующими разными высушенными отложениями микрогеля 310, созданными путем роботизированного нанесения пятен материала, за счет этого получают разные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 (Фиг. 2A и 2B). Понятно, что на чертежах специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320, прямые праймеры 322 и обратные праймеры 324 показаны символически и не в масштабе.
Следует понимать, что, хотя в варианте осуществления, представленном на Фиг. 3H-3I и на Фиг. 1A-2B, все специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320, прямые праймеры 322 и обратные праймеры 324 показаны связанными с отложениями микрогеля 310, в альтернативных вариантах осуществления одно или более из специфических для целевой молекулы нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320, прямых праймеров 322 и обратных праймеров 324 могут не быть связанными с отложениями микрогеля 310 и могут быть предоставлены в растворе совместно с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты. В варианте осуществления, представленном на Фиг. 3H-3I, и в альтернативных вариантах осуществления специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320, прямые праймеры 322 и обратные праймеры 324 расположены в иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областях микрогеля, специфических для целевых молекул, как описано ниже в настоящем документе для Фиг. 5A-7J.
Как показано на Фиг. 3I, после соответствующего промывания специфических для целевых молекул высушенных отложений микрогеля 190 и добавления рафинозы в качестве консерванта структуру боковых стенок 120 и окно 130 собирают на субстрате 110, таким самым завершая изготовление конструкции электрофоретического чипа 100 в подходящем для хранения состоянии, как описано выше для Фиг. 2A и 2B. Конструкция электрофоретического чипа 100 готова для использования в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, который относится к способу быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в растворе, включающему этапы:
нанесения раствора на по меньшей мере множество иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля на электрофоретическом чипе, при этом каждая из множества иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля содержит отложение микрогеля, содержащее материалы, подходящие для связывания особой молекулы из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты и проведения амплификации по типу катящегося кольца;
проведения амплификации по типу катящегося кольца по меньшей мере, как правило, одновременно в каждой из иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля при наложении на них электрических полей в процессе разных стадий амплификации по типу катящегося кольца; и
обнаружения присутствия по меньшей мере одной из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в соответствующей по меньшей мере одной из иммобилизованных, разделенных в пространстве и электрически изолированных областей микрогеля,
при этом обнаружение происходит в течение короткого периода времени после нанесения раствора, предпочтительно составляющего менее 30 минут, более предпочтительно менее 25 минут, и даже более предпочтительно менее 20 минут.
В следующем далее описании подробно описаны четыре варианта осуществления вышеуказанного способа со ссылкой на Фиг. 4A - 4J, Фиг. 5A - 5J, Фиг. 6A - 6J и Фиг. 7A - 7J, соответственно. Конструкция электрофоретического чипа 100, описанная выше в настоящем документе, является особенно подходящей для осуществления способа, представленного на Фиг. 7A - 7J.
Во всех из данных способов используют амплификацию по типу катящегося кольца. Амплификация по типу катящегося кольца является известным методом и описана, в частности, в следующих публикациях, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки:
et al.
Патент США № 5, 854, 033; Lizardi , Nature Genetics 19(3):225-232 (1998).
Michael G. Mohsen and Eric T. Kool, The Discovery of Rolling Circle Amplification and Rolling Circle Transcription, Acc Chem Res. 2016, 49(11): 2540-2550.
et al.
Cyphellophora
Peiying Feng, , Identification and Typing of Isolates of  and Relatives by Use of Amplified Fragment Length Polymorphism and Rolling Circle Amplification, Journal of Clinical Microbiology, 2013 Volume 51 Number 3, p. 931-937.
et al.
Signal Amplification by Rolling Circle Amplification on DNA Microarrays, G. Nallur , Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29. Vol. 29, No. 123, e118.
et al.
,
M. Monsur Ali , Rolling circle amplification: a versatile tool for chemical biology, materials science and medicine, Chemical Society Review, Chem. Soc. Rev. 2014, 43, 3324-3341.
Ali MM, Li F, Zhang Z, Zhang K, Kang D, Ankrum JA, Le XC, Zhao W. Rolling circle amplification: a versatile tool for chemical biology, materials science and medicine. Chem Soc Rev. 2014; 43:3324.
Kool, ET. Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides. US. 5714320. Feb 3. 1998.
Fire A, Xu S. Rolling replication of short DNA circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92:4641- 4645.
Nilsson M, Malmgren H, Samiotaki M, Kwiatkowski M, Chowdhary BP, Landegren U. Padlock Probes: Circularizing Oligonucleotides for Localized DNA Detection. Science. 1994; 265:2085-2088.
Различные способы, описанные ниже в настоящем документе, включают признаки, которые являются новыми и неочевидными для метода амплификации по типу катящегося кольца предшествующего уровня техники.
На Фиг. 4A - 4J проиллюстрированы основные стадии способа быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
Способ, представленный на Фиг. 4A - 4J, предпочтительно осуществляют с использованием конструкции электрофоретического чипа 100 в подходящем для хранения состоянии, описанном выше со ссылкой на Фиг. 2A и 2B, при этом только захватывающие зонды связаны с иммобилизованными, разделенными в пространстве и электрически изолированными отложениями микрогеля 190. Понятно, что для простоты субстрат 110, структура боковых стенок 120 и окно 130, а также различные слои, составляющие электрофоретический чип 160, описанный выше в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 1A - 2B, не показаны конкретно на Фиг. 4A - 4J. Каждая из Фиг. 4A - 4J представляет собой упрощенный вид сбоку в разрезе, в основном вдоль линий 4-4 на Фиг. 2A.
На Фиг. 4A показана конструкция электрофоретического чипа 100 в ее подходящем для хранения состоянии, показанном на Фиг. 2A, с символическими, не в масштабе, указателями различных олигонуклеотидных специфических для молекул нуклеиновой кислоты захватывающих зондов 400, таких как зонды, специфические, но без ограничения, для выявления патогенов инфекционного менингита или других заболеваний, которые связаны с соответствующими отдельными высушенными отложениями микрогеля 190. На Фиг. 4A указаны, в миллиметрах, внутренние размеры предпочтительных вариантов осуществления конструкции электрофоретического чипа 100, а также общие размеры иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190, которые расположены в центре, но немного выходят за пределы мест расположения рабочих электродов 180 (Фиг. 1A - 3I).
На Фиг. 4B показано введение, символически обозначенное стрелкой 401, раствора 402, содержащего один или более разных видов целевых молекул нуклеиновой кислоты 403, для заполнения внутреннего пространства конструкции электрофоретического чипа 100. Раствор 402 предпочтительно содержит, помимо целевых молекул нуклеиновой кислоты 403, прямые праймеры 322 и специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320.
Приготовление раствора 402 не является частью заявленного настоящего изобретения, и его выполняют общепринятыми методами, например, описанными в публикации Nasir Ali, Rita de Cбssia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International, Volume 2017, Article ID 9306564, 13 pages». Раствор 402 предпочтительно содержит жидкий элюент с низкой проводимостью, как правило, введенный в процессе приготовления раствора 402, который стимулирует направленное движение нуклеиновых кислот под действием электрического тока и стимулирует активность ферментов рестрикции в растворе 402. Предпочтительный жидкий элюент включает гистидин и буфер для ферментов рестрикции. На Фиг. 4B показаны высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 в их обезвоженном состоянии. Введение раствора 402 в конструкцию электрофоретического чипа 100, так что раствор 402 вступает в контакт с высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190, соответствует времени T0 и приводит к тому, что высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 переходят в гидратированное состояние, обозначенное ссылочным номером 170 (Фиг. 1A и 1B).
На Фиг. 4C показаны иммобилизованные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 170 в гидратированном состоянии, которое является результатом введения раствора 402, содержащего целевые молекулы нуклеиновой кислоты 403, который заполняет внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 100. На Фиг. 4C показано, что гидратированные специфические для целевых молекул электрически изолированные отложения микрогеля 170 имеют типичную максимальную высоту 1,25 мм. Гидратация специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170 до их состояния, показанного на Фиг. 4C, предпочтительно занимает примерно 10 секунд и предпочтительно завершается в момент времени T=T0+10 секунд.
На Фиг. 4D показано электрофоретическое направленное движение нуклеиновых кислот к гидратированным иммобилизованным, электрически изолированным отложениям микрогеля 170 в присутствии электрического поля постоянного тока предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, создаваемого между участками расположения рабочего электрода 180 за счет рабочего электрода 230 и противоэлектрода 240 (Фиг. 1A и 1B). Участки линий электрического поля указаны ссылочными номерами 410, и направление электрического поля указано стрелками 412. Понятно, что линии электрического поля очерчивают трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 420, каждая из которых сосредоточена вокруг отдельного специфического для целевой молекулы отложения микрогеля 170.
Понятно, что направленное движение молекул, а также различные этапы, описанные ниже в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 4E - 4J, происходят не только на поверхности отложений микрогеля 170, но также и в объеме отложений микрогеля 170.
Как показано на Фиг. 4D, наложение электрического поля постоянного тока на трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 420 вызывает быстрое движение целевых молекул нуклеиновой кислоты 403, специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320 и прямых праймеров 322 к специфическим для целевых молекул отложениям микрогеля 170, что, в свою очередь, облегчает специфическую гибридизацию между целевыми молекулами нуклеиновой кислоты 403 и специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320, специфическую гибридизацию между прямыми праймерами 322 и специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320, а также захват специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320 специфическими для целевых молекул захватывающими зондами 400, при этом захватывающие зонды 400 связаны с гидратированными специфическими для целевых молекул электрически изолированными отложениями микрогеля 170.
Продолжительность стадии, проиллюстрированной на Фиг. 4D, составляет от 30 секунд до 120 секунд. Стадия, проиллюстрированная на Фиг. 4D, предпочтительно завершается в момент времени T=T0 + [40-130] секунд.
На Фиг. 4E показана стадия лигирования, которая, как правило, следует за стадией направленного движения, показанной на Фиг. 4D, и предпочтительно имеет место в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 4D. Стадия лигирования предпочтительно происходит в присутствии лигирующего фермента 428, например, лигазы T-4, которую вводят в конструкцию электрофоретического чипа 100 в растворе. Продолжительность стадии лигирования, как правило, составляет от 120 до 240 секунд. Стадия лигирования предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[160-370] секунд.
На Фиг. 4F показана стадия RCA полимеризации, которая обычно следует за стадией лигирования, показанной на Фиг. 4E, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 4E.
Bst
Стадия RCA полимеризации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  429, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 100 в растворе, а также прямого праймера 322, который связан с кольцевым RCA-зондом 320, который, в свою очередь, связан с захватывающим зондом 400, который, в свою очередь, связан со специфическим для целевой молекулы отложением микрогеля 170, предпочтительно, при температуре 65 градусов Цельсия. Результатом стадии RCA полимеризации является образование длинных RCA-ампликонов 440. Как показано на Фиг. 4F, после связывания фермента полимеразы 429 со специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320 целевые молекулы нуклеиновой кислоты 403 вытесняются со специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320, как указано стрелками 442. Продолжительность стадии RCA полимеризации, как правило, составляет 300-720 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[460-1090] секунд.
Bst
На Фиг. 4G показана стадия удлинения ампликонов, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 4F, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в направлении, противоположном направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 4F, которое указано стрелками 444. В проиллюстрированном варианте осуществления удлинение ампликонов 440 происходит в направлении, указанном стрелкой 448. Стадия удлинения ампликонов предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  429, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324 при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии удлинения ампликонов, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0 + [465-1105] секунд.
Понятно, что стадии, показанные на Фиг. 4F и 4G, можно повторять с перерывами несколько раз, при этом каждая из нескольких стадий, показанных на Фиг. 4F, имеет меньшую продолжительность, чем продолжительность, указанная выше, и они разделены стадией, показанной на Фиг. 4G.
На Фиг. 4H показана стадия экспоненциальной RCA амплификации, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 4F, и стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 4G, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое обычно имеет направление, противоположное направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 4G, как показано стрелкой 412, но предпочтительно при этом в течение коротких периодов времени полярность электрического поля меняют на противоположную. На данной стадии создаются дополнительные ампликоны 450 с использованием обратных праймеров 324.
Bst
Стадия экспоненциальной RCA амплификации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  429, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324 при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии экспоненциальной RCA амплификации, которая происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 4F, и стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 4G, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации, показанная на Фиг. 4F, стадия удлинения ампликонов, показанная на Фиг. 4G, и стадия экспоненциальной RCA амплификации, показанная на Фиг. 4H, предпочтительно завершаются в момент времени T=T0+[465-1105] секунд.
На Фиг. 4I показана стадия направленного движения после RCA полимеризации, которая обычно происходит после завершения стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 4F, стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 4G, и стадии экспоненциальной RCA амплификации, показанной на Фиг. 4H, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое, как правило, имеет то же направление, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 4H. Стадия направленного движения после RCA полимеризации является особенно полезной для концентрирования ампликонов 440, которые находятся в растворе 402 на расстоянии от специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170, и их повторного захвата на специфических для целевых молекул отложениях микрогеля 170, как указано стрелками 460, и, предпочтительно, сбора ампликонов 440 в одном участке внутри каждой области микрогеля 420. Продолжительность стадии направленного движения после RCA полимеризации продолжается, как правило, 10-30 секунд. Стадия направленного движения после RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[475-1135] секунд.
На Фиг. 4J показана стадия регистрации, которая обычно следует за стадией направленного движения после RCA полимеризации. Стадия регистрации предпочтительно происходит в присутствии флуоресцентных репортеров 470, комплементарных ампликонам 440 и 450, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 100 в растворе. Продолжительность стадии регистрации, как правило, составляет 10-30 секунд. Стадия регистрации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[485-1165] секунд.
После завершения стадии регистрации и последующей стадии промывания, не показано, обнаружение присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты можно выполнять обычными флуоресцентными методами обнаружения. Таким образом, понятно, что обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно завершается в пределах срока от 8 минут до 20 минут после начального поступления раствора 402 во внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 100.
Понятно, что, если приготовление раствора 402 завершается в пределах 4-5 минут после получения образца, например, путем взятия крови у пациента, обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты может быть завершено в пределах 12-25 минут после взятия образца.
На Фиг. 5A - 5J показаны основные стадии способа быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
Способ, показанный на Фиг. 5A - 5J, предпочтительно осуществляют с использованием конструкции электрофоретического чипа 500 в подходящем для хранения состоянии, как описано выше для Фиг. 2A и 2B, при этом прямые праймеры 322 связаны с иммобилизованными и разделенными в пространстве депозитами микрогеля 190. Понятно, что для простоты субстрат 110, структура боковых стенок 120 и окно 130, а также различные слои, составляющие электрофоретический чип 160, конкретно не показаны. Каждая из Фиг. 5A - 5J представляет собой упрощенный вид сбоку в разрезе, в основном вдоль линий 4-4 на Фиг. 2A.
На Фиг. 5A показана конструкция электрофоретического чипа 500 в его высушенной, обезвоженной функциональной конфигурации, аналогичной той, которая показана на Фиг. 2A, с символическими, не в масштабе, указателями различных олигонуклеотидных прямых праймеров 322, которые связаны с соответствующими разными высушенными отложениями микрогеля 190.
На Фиг. 5A показаны, в миллиметрах, внутренние размеры предпочтительного варианта осуществления конструкции электрофоретического чипа 500, а также общие размеры иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190.
Понятно, что способ, показанный на Фиг. 5A - 5J, отличается от способа, показанного на Фиг. 4A - 4J, в том, что вместо связывания захватывающих зондов 400 с иммобилизованными высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190 в способе, показанном на Фиг. 4A - 4J, прямые праймеры 322, которые также служат в качестве захватывающих зондов, связаны с иммобилизованными высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190 в способе, показанном на Фиг. 5A - 5J.
На Фиг. 5B показано введение, символически изображенное стрелкой 501, раствора 502, содержащего целевые молекулы нуклеиновой кислоты 503, для заполнения внутреннего пространства конструкции электрофоретического чипа 500. Данный раствор предпочтительно содержит специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320, помимо целевых молекул нуклеиновой кислоты 503.
Приготовление раствора 502 не является частью заявленного настоящего изобретения, и его выполняют общепринятыми методами, например, описанными в публикации Nasir Ali, Rita de Cбssia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International, Volume 2017, Article ID 9306564, 13 pages». Раствор 502 предпочтительно содержит жидкий элюент с низкой проводимостью, как правило, введенный в процессе приготовления раствора, который стимулирует направленное движение нуклеиновых кислот под действием электрического тока и стимулирует активность ферментов рестрикции в растворе 502. Предпочтительный жидкий элюент включает гистидин и буфер для ферментов рестрикции. На Фиг. 5B показаны высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 в их обезвоженном состоянии. Введение раствора 502 в конструкцию электрофоретического чипа 500, так что раствор 502 вступает в контакт с высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190, соответствует времени T0 и приводит к тому, что высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 переходят в гидратированную форму, обозначенную ссылочным номером 170 (Фиг. 1A и 1B).
На Фиг. 5C показаны иммобилизованные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 170 в гидратированном состоянии, которое является результатом введения раствора 502, содержащего целевые молекулы нуклеиновой кислоты 503, который заполняет внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 500. На Фиг. 5C показано, что гидратированные специфические для целевых молекул электрически изолированные отложения микрогеля 170 имеют типичную максимальную высоту 1,25 мм. Гидратация специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170 до их состояния, показанного на Фиг. 5C, предпочтительно занимает примерно 10 секунд и предпочтительно завершается в момент времени T=T0+10 секунд.
На Фиг. 5D показано электрофоретическое направленное движение нуклеиновых кислот к гидратированным иммобилизованным, электрически изолированным отложениям микрогеля 170 в присутствии электрического поля постоянного тока предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр. Участки линий электрического поля указаны ссылочными номерами 510, и направление электрического поля указано стрелками 512. Понятно, что линии электрического поля очерчивают трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 520, каждая из которых сосредоточена вокруг отдельного специфического для целевой молекулы отложения микрогеля 170.
Понятно, что направленное движение молекул, а также различные этапы, описанные ниже в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 5E - 5J, происходят не только на поверхности отложений микрогеля 170, но также и в объеме отложений микрогеля 170.
Как показано на Фиг. 5D, наложение электрического поля постоянного тока на трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 520 вызывает быстрое движение целевых молекул нуклеиновой кислоты 503 и специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320 к специфическим для целевых молекул отложениям микрогеля 170, что, в свою очередь, облегчает специфическую гибридизацию между целевыми молекулами нуклеиновой кислоты 503 и специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320. Быстрое движение специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320 к специфическим для целевых молекул отложениям микрогеля 170 также облегчает специфическую гибридизацию гибридизация между прямыми праймерами 322, которые связаны со специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 170, и специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320.
Продолжительность стадии, показанной на Фиг. 5D, составляет от 30 секунд до 120 секунд. Стадия, показанная на Фиг. 5D, предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[40-130] секунд.
На Фиг. 5E показана стадия лигирования, которая, как правило, следует за стадией направленного движения, показанной на Фиг. 5D, и предпочтительно имеет место в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 5D. Стадия лигирования предпочтительно происходит в присутствии лигирующего фермента 528, например, лигазы T-4, которую вводят в конструкцию электрофоретического чипа 500 в растворе. Продолжительность стадии лигирования, как правило, составляет от 120 до 240 секунд. Стадия лигирования предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[160-370] секунд.
Bst
На Фиг. 5F показана стадия RCA полимеризации, которая обычно следует за стадией лигирования, показанной на Фиг. 5E, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 5E. Стадия RCA полимеризации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  529, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 500 в растворе, а также прямого праймера 322, который связан со специфическим для целевой молекулы отложением микрогеля 170, предпочтительно при температуре 65 градусов Цельсия. Результатом стадии RCA полимеризации является образование длинных RCA-ампликонов 540 (Фиг. 5G). Как показано на Фиг. 5F, после связывания фермента полимеразы 529 со специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320 целевые молекулы нуклеиновой кислоты 503 вытесняются со специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320, как указано стрелками 542. Продолжительность стадии RCA полимеризации, как правило, составляет 300-720 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[560-1090] секунд.
Bst
На Фиг. 5G показана стадия удлинения ампликонов, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 5F, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в направлении, противоположном направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 5F, которое указано стрелками 544. Удлинение ампликонов 540 происходит в направлении, указанном стрелкой 548. Стадия удлинения ампликонов предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  529, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324 при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии удлинения ампликонов, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[565-1105] секунд.
Понятно, что стадии, показанные на Фиг. 5F и 5G, можно повторять с перерывами несколько раз, при этом каждая из нескольких стадий, показанных на Фиг. 5F, имеет меньшую продолжительность, чем продолжительность, указанная выше, и они разделены стадией, показанной на Фиг. 5G.
На Фиг. 5H показана стадия экспоненциальной RCA амплификации, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 5F, и стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 5G, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое обычно имеет направление, противоположное направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 5G, как показано стрелкой 512, но предпочтительно при этом в течение коротких периодов времени полярность электрического поля меняют на противоположную. На данной стадии создаются дополнительные ампликоны 550 с использованием обратных праймеров 324.
Bst
Стадия экспоненциальной RCA амплификации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  529, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324 при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии экспоненциальной RCA амплификации, которая происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 5F, и стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 5G, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации, показанная на Фиг. 5F, стадия удлинения ампликонов, показанная на Фиг. 5G, и стадия экспоненциальной RCA амплификации, показанная на Фиг. 5H, предпочтительно завершаются в момент времени T=T0+[465-1105] секунд.
На Фиг. 5I показана стадия направленного движения после RCA полимеризации, которая обычно происходит после завершения стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 5F, стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 5G, и стадии экспоненциальной RCA амплификации, показанной на Фиг. 5H, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое, как правило, имеет то же направление, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 5H. Стадия направленного движения после RCA полимеризации является особенно полезной для концентрирования ампликонов 540, которые находятся в растворе 502 на расстоянии от специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170, и их повторного захвата на специфических для целевых молекул отложениях микрогеля 170, как указано стрелками 560, и предпочтительно концентрирования ампликонов 540 в одном участке внутри каждой области микрогеля 520. Продолжительность стадии направленного движения после RCA полимеризации продолжается, как правило, 10-30 секунд. Стадия направленного движения после RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[475-1135] секунд.
На Фиг. 5J показана стадия регистрации, которая обычно следует за стадией направленного движения после RCA полимеризации. Стадия регистрации предпочтительно происходит в присутствии флуоресцентных репортеров 570, комплементарных ампликонам 540 и 550, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 500 в растворе. Продолжительность стадии регистрации, как правило, составляет 10-30 секунд. Стадия регистрации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[585-1165] секунд.
После завершения стадии регистрации и последующей стадии промывания, не показано, обнаружение присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты можно выполнять обычными флуоресцентными методами обнаружения. Таким образом, понятно, что обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно завершается в пределах срока от 8 минут до 20 минут после начального поступления раствора 502 во внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 500.
Понятно, что, если приготовление раствора 502 завершается в пределах 4-5 минут после получения образца, например, путем взятия крови у пациента, обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты может быть завершено в пределах 12-25 минут после взятия образца.
На Фиг. 6A - 6J показаны основные стадии способа быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
Способ, показанный на Фиг. 6A - 6J, предпочтительно осуществляют с использованием конструкции электрофоретического чипа 600 в подходящем для хранения состоянии, как описано выше для Фиг. 2A и 2B, при этом прямые праймеры 322 и специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320 связаны с иммобилизованными и разделенными в пространстве отложениями микрогеля 190. Понятно, что для простоты субстрат 110, структура боковых стенок 120 и окно 130, а также различные слои, составляющие электрофоретический чип 160, конкретно не показаны. Каждая из Фиг. 6A - 6J представляет собой упрощенный вид сбоку в разрезе, в основном вдоль линий 4-4 на Фиг. 2A.
На Фиг. 6A показана конструкция электрофоретического чипа 600 в его высушенной, обезвоженной функциональной конфигурации, аналогичной той, которая показана на Фиг. 2A, с символическими, не в масштабе, указателями различных олигонуклеотидных прямых праймеров 322 и специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320, которые связаны с соответствующими разными высушенными отложениями микрогеля 190.
На Фиг. 6A показаны, в миллиметрах, внутренние размеры предпочтительного варианта осуществления конструкции электрофоретического чипа 600, а также общие размеры иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190.
Понятно, что способ, показанный на Фиг. 6A - 6J, отличается от способа, показанного на Фиг. 4A - 4J, в том, что вместо связывания захватывающих зондов 400 с иммобилизованными высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190 в способе, показанном на Фиг. 4A - 4J, специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320 специфически гибридизованы с прямым праймерами 322, которые связаны с иммобилизованными высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190 в способе, показанном на Фиг. 6A - 6J.
На Фиг. 6B показано введение, символически изображенное стрелкой 601, раствора 602, содержащего целевые молекулы нуклеиновой кислоты 603, для заполнения внутреннего пространства конструкции электрофоретического чипа 600.
Приготовление раствора 602 не является частью заявленного настоящего изобретения, и его выполняют общепринятыми методами, например, описанными в публикации Nasir Ali, Rita de Cбssia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International, Volume 2017, Article ID 93065. Раствор 602 предпочтительно содержит жидкий элюент с низкой проводимостью, как правило, введенный в процессе приготовления раствора, который стимулирует направленное движение нуклеиновых кислот под действием электрического тока и стимулирует активность ферментов рестрикции в растворе 602. Предпочтительный жидкий элюент включает гистидин и буфер для ферментов рестрикции. На Фиг. 6B показаны высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 в их обезвоженном состоянии. Введение раствора 602 в конструкцию электрофоретического чипа 600, так что раствор 602 вступает в контакт с высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190, соответствует времени T0 и приводит к тому, что высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 переходят в гидратированное состояние, обозначенное ссылочным номером 170 (Фиг. 1A и 1B).
На Фиг. 6C показаны иммобилизованные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 170 в гидратированном состоянии, которое является результатом введения раствора 602, содержащего целевые молекулы нуклеиновой кислоты 603, который заполняет внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 600. На Фиг. 6C показано, что гидратированные специфические для целевых молекул электрически изолированные отложения микрогеля 170 имеют типичную максимальную высоту 1,25 мм. Гидратация специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170 до их состояния, показанного на Фиг. 6C, предпочтительно занимает примерно 10 секунд и предпочтительно завершается в момент времени T=T0+10 секунд.
На Фиг. 6D показано электрофоретическое направленное движение нуклеиновых кислот к гидратированным иммобилизованным, электрически изолированным отложениям микрогеля 170 в присутствии электрического поля постоянного тока предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр. Участки линий электрического поля указаны ссылочными номерами 610, и направление электрического поля указано стрелками 612. Понятно, что линии электрического поля очерчивают трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 620, каждая из которых сосредоточена вокруг отдельного специфического для целевой молекулы отложения микрогеля 170.
Понятно, что направленное движение молекул, а также различные этапы, описанные ниже в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 6E - 6J, происходят не только на поверхности отложений микрогеля 170, но также и в объеме отложений микрогеля 170.
Как показано на Фиг. 6D, наложение электрического поля постоянного тока на трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 620 вызывает быстрое движение целевых молекул нуклеиновой кислоты 603 к специфическим для целевых молекул отложениям микрогеля 170, что, в свою очередь, облегчает специфическую гибридизацию между целевыми молекулами нуклеиновой кислоты 603и специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320, при этом кольцевые RCA-зонды 320 связаны с прямыми праймерами 322, при этом прямые праймеры 322 связаны с гидратированными, специфическими для целевых молекул, электрически изолированными отложениями микрогеля 170.
Продолжительность стадии, показанной на Фиг. 6D, составляет от 30 секунд до 120 секунд. Стадия, показанная на Фиг. 6D, предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[40-130] секунд.
На Фиг. 6E показана стадия лигирования, которая, как правило, следует за стадией направленного движения, показанной на Фиг. 6D, и предпочтительно имеет место в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 6D. Стадия лигирования предпочтительно происходит в присутствии лигирующего фермента 628, например, лигазы T-4, которую вводят в конструкцию электрофоретического чипа 600 в растворе. Продолжительность стадии лигирования, как правило, составляет от 120 до 240 секунд. Стадия лигирования предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[160-370] секунд.
Bst
На Фиг. 6F показана стадия RCA полимеризации, которая обычно следует за стадией лигирования, показанной на Фиг. 6E, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 6E. Стадия RCA полимеризации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  629, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 600 в растворе, а также прямого праймера 322, который связан со специфическим для целевой молекулы отложением микрогеля 170, предпочтительно при температуре 65 градусов Цельсия. Результатом стадии RCA полимеризации является образование длинных RCA-ампликонов 640 (Фиг. 6G). Как показано на Фиг. 6F, после связывания фермента полимеразы 629 со специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320 целевые молекулы нуклеиновой кислоты 603 вытесняются со специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320, как указано стрелками 642. Продолжительность стадии RCA полимеризации, как правило, составляет 300-720 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[460-1090] секунд.
Bst
На Фиг. 6G показана стадия удлинения ампликонов, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 6F, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в направлении, противоположном направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 6F, которое указано стрелкой 644. Удлинение ампликонов 640 происходит в направлении, указанном стрелкой 648. Стадия удлинения ампликонов предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  629, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324 при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии удлинения ампликонов, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[465-1105] секунд.
Понятно, что стадии, показанные на Фиг. 6F и 6G, можно повторять с перерывами несколько раз, при этом каждая из нескольких стадий, показанных на Фиг. 6F, имеет меньшую продолжительность, чем продолжительность, указанная выше, и они разделены стадией, показанной на Фиг. 6G.
На Фиг. 6H показана стадия экспоненциальной RCA амплификации, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 6F, и стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 6G, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое обычно имеет направление, противоположное направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 6G, но предпочтительно при этом в течение коротких периодов времени полярность электрического поля меняют на противоположную. На данной стадии создаются дополнительные ампликоны 650 с использованием обратных праймеров 324.
Bst
Стадия экспоненциальной RCA амплификации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  629, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324 при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии экспоненциальной RCA амплификации, которая происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 6F, и стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 6G, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации, показанная на Фиг. 6F, стадия удлинения ампликонов, показанная на Фиг. 6G, и стадия экспоненциальной RCA амплификации, показанная на Фиг. 6H, предпочтительно завершаются в момент времени T=T0+[465-1105] секунд.
На Фиг. 6I показана стадия направленного движения после RCA полимеризации, которая обычно происходит после завершения стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 6F, стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 6G, и стадии экспоненциальной RCA амплификации, показанной на Фиг. 6H, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое, как правило, имеет то же направление, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 6H. Стадия направленного движения после RCA полимеризации является особенно полезной для сбора ампликонов 640, которые находятся в растворе 602 на расстоянии от специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170, и их повторного захвата на специфических для целевых молекул отложениях микрогеля 170, как указано стрелками 660, и предпочтительно концентрирования ампликонов 640 в одном участке внутри каждой области микрогеля 620. Продолжительность стадии направленного движения после RCA полимеризации продолжается, как правило, 10-30 секунд. Стадия направленного движения после RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[475-1135] секунд.
На Фиг. 6J показана стадия регистрации, которая обычно следует за стадией направленного движения после RCA полимеризации. Стадия регистрации предпочтительно происходит в присутствии флуоресцентных репортеров 670, комплементарных ампликонам 640 и 650, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 600 в растворе. Продолжительность стадии регистрации, как правило, составляет 10-30 секунд. Стадия регистрации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[485-1165] секунд.
После завершения стадии регистрации и последующей стадии промывания, не показано, обнаружение присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты можно выполнять обычными флуоресцентными методами обнаружения. Таким образом, понятно, что обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно завершается в пределах срока от 8 минут до 20 минут после начального поступления раствора 602 во внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 600.
Понятно, что, если приготовление раствора 602 завершается в пределах 4-5 минут после получения образца, например, путем взятия крови у пациента, обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты может быть завершено в пределах 12-25 минут после взятия образца.
На Фиг. 7A - 7J показаны основные стадии способа быстрого обнаружения присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Понятно, что для простоты субстрат 110, структура боковых стенок 120 и окно 130, а также различные слои, составляющие электрофоретический чип 160, конкретно не показаны. Каждая из Фиг. 7A - 7J представляет собой упрощенный вид сбоку в разрезе, в основном вдоль линий 4-4 на Фиг. 2A.
На Фиг. 7A показана конструкция электрофоретического чипа 700 в его высушенной, обезвоженной функциональной конфигурации, аналогичной той, которая показана на Фиг. 2A, с символическими, не в масштабе, указателями различных олигонуклеотидных прямых праймеров 322, специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320 и обратных праймеров 324, которые связаны с соответствующими разными высушенными отложениями микрогеля 190. На Фиг. 7A показаны, в миллиметрах, внутренние размеры предпочтительного варианта осуществления конструкции электрофоретического чипа 700, а также общие размеры иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190.
Понятно, что способ, показанный на Фиг. 7A - 7J, отличается от способа, показанного на Фиг. 4A - 4J, в том, что вместо связывания захватывающих зондов 400 с иммобилизованными высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190 в способе, показанном на Фиг. 4A - 4J, специфические для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевые RCA-зонды 320 специфически гибридизованы с прямым праймерами 322, которые связаны с иммобилизованными высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190, и обратные праймеры 324 также связаны с иммобилизованными высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190 в способе, показанном на Фиг. 7A - 7J.
На Фиг. 7B показано введение, символически изображенное стрелкой 701, раствора 702, содержащего целевые молекулы нуклеиновой кислоты 703, для заполнения внутреннего пространства конструкции электрофоретического чипа 700.
Приготовление раствора 702 не является частью заявленного настоящего изобретения, и его выполняют общепринятыми методами, например, описанными в публикации Nasir Ali, Rita de Cбssia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International, Volume 2017, Article ID 93065. Раствор 702 предпочтительно содержит жидкий элюент с низкой проводимостью, как правило, введенный в процессе приготовления раствора, который стимулирует направленное движение нуклеиновых кислот под действием электрического тока и стимулирует активность ферментов рестрикции в растворе 702. Предпочтительный жидкий элюент включает гистидин и буфер для ферментов рестрикции. На Фиг. 7B показаны высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 в их обезвоженном состоянии. Введение раствора 702 в конструкцию электрофоретического чипа 700, так что раствор 702 вступает в контакт с высушенными специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 190, соответствует времени T0 и приводит к тому, что высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 переходят в гидратированное состояние, обозначенное ссылочным номером 170 (Фиг. 1A и 1B).
На Фиг. 7C показаны иммобилизованные специфические для целевых молекул отложения микрогеля, обозначенные ссылочным номером 170 (Фиг. 1A и 1B), в гидратированном состоянии, которое является результатом введения раствора 702, содержащего целевые молекулы нуклеиновой кислоты 703, который заполняет внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 700. На Фиг. 7C показано, что гидратированные специфические для целевых молекул электрически изолированные отложения микрогеля 170 имеют типичную максимальную высоту 1,25 мм. Гидратация специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170 до их гидратированного состояния, показанного на Фиг. 7C, предпочтительно занимает примерно 10 секунд и предпочтительно завершается в момент времени T=T0+10 секунд.
На Фиг. 7D показано электрофоретическое направленное движение целевых молекул нуклеиновой кислоты 703 к гидратированным иммобилизованным, электрически изолированным отложениям микрогеля 170 в присутствии электрического поля постоянного тока предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр. Участки линий электрического поля указаны ссылочными номерами 710, и направление электрического поля указано стрелками 712. Понятно, что линии электрического поля очерчивают трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 720, каждая из которых сосредоточена вокруг отдельного специфического для целевой молекулы отложения микрогеля 170.
Понятно, что направленное движение молекул, а также различные этапы, описанные ниже в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 7E - 7J, происходят не только на поверхности отложений микрогеля 170, но также и в объеме отложений микрогеля 170.
Как показано на Фиг. 7D, наложение электрического поля постоянного тока на трехмерные иммобилизованные разделенные в пространстве и электрически изолированные специфические для целевых молекул области микрогеля 720 вызывает быстрое движение целевых молекул нуклеиновой кислоты 703 к специфическим для целевых молекул отложениям микрогеля 170, что, в свою очередь, облегчает специфическую гибридизацию между целевыми молекулами нуклеиновой кислоты 703и специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320, при этом кольцевые RCA-зонды 320 связаны с прямыми праймерами 322, при этом прямые праймеры 322 связаны со специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 170.
Продолжительность стадии, показанной на Фиг. 7D, составляет от 30 секунд до 120 секунд. Стадия, показанная на Фиг. 7D, предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[40-130] секунд.
Понятно, что необязательная стадия удаления (не показано) может быть добавлена после стадии направленного движения, показанной на Фиг. 7D, до проведения стадий, описанных ниже со ссылкой на Фиг. 7E - 7J, и она предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в направлении, противоположном направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 7D. Стадию удаления, предпочтительно, проводят для удаления неспецифических целевых молекул, которые гибридизовались с кольцевыми RCA-зондами 320.
На Фиг. 7E показана стадия лигирования, которая, как правило, следует за стадией направленного движения, показанной на Фиг. 7D, и предпочтительно имеет место в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 7D. Стадия лигирования предпочтительно происходит в присутствии лигирующего фермента 728, например, лигазы T-4, которую вводят в конструкцию электрофоретического чипа 700 в растворе. Продолжительность стадии лигирования, как правило, составляет от 120 до 240 секунд. Стадия лигирования предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[160-370] секунд.
Bst
На Фиг. 7F показана стадия RCA полимеризации, которая обычно следует за стадией лигирования, показанной на Фиг. 7E, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, в том же направлении, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 7E. Стадия RCA полимеризации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  729, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 700 в растворе, а также прямого праймера 322 и обратного праймера 324, которые связаны со специфическим для целевой молекулы отложением микрогеля 170, предпочтительно при температуре 65 градусов Цельсия. Результатом стадии RCA полимеризации является образование длинных RCA-ампликонов 740 (Фиг. 7G). Как показано на Фиг. 7F, после связывания фермента полимеразы 729 со специфическими для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевыми RCA-зондами 320 целевые молекулы нуклеиновой кислоты 703 вытесняются со специфических для целевых молекул нуклеиновой кислоты кольцевых RCA-зондов 320, как указано стрелками 742. Продолжительность стадии RCA полимеризации, как правило, составляет 300-720 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[460-1090] секунд.
Bst
На Фиг. 7G показана стадия удлинения и сжатия ампликонов, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 7F, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр в направлениях, как одинаковом, так и противоположном, направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 7F, которое указано стрелкой 744. Удлинение ампликонов 740 происходит в направлении, указанном стрелкой 748. Сжатие, как правило, происходит в направлении, противоположном направлению, указанному стрелкой 748. Удлинение и сжатие ампликонов усиливает гибридизацию обратных праймеров 324, которые связаны со специфическими для целевых молекул отложениями микрогеля 170, с ампликонами 740. Стадия удлинения и сжатия ампликонов предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  729, дНТФ (не показано) при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии удлинения ампликонов, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[465-1105] секунд.
Понятно, что стадии, показанные на Фиг. 7F и 7G, можно повторять с перерывами несколько раз, при этом каждая из стадий, показанных на Фиг. 6F, имеет меньшую продолжительность, чем продолжительность, указанная выше, и они разделены стадией, показанной на Фиг. 7G.
На Фиг. 7H показана стадия экспоненциальной RCA амплификации, которая обычно происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 6F, и стадии сжатия и удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 7G, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое обычно имеет направление, противоположное направлению электрического поля на этапе, показанном на Фиг. 7G, но предпочтительно при этом в течение коротких периодов времени полярность электрического поля меняют на противоположную. На данной стадии создаются дополнительные ампликоны 750 с использованием обратных праймеров 324.
Bst
Стадия экспоненциальной RCA амплификации предпочтительно происходит в присутствии фермента полимеразы  729, дНТФ (не показано) и обратного праймера 324 при температуре 65 градусов Цельсия. Продолжительность стадии экспоненциальной RCA амплификации, которая происходит во время стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 7F, и стадии удлинения ампликонов, показанной на Фиг. 7G, как правило, составляет 5-15 секунд. Стадия RCA полимеризации, показанная на Фиг. 7F, стадия удлинения ампликонов, показанная на Фиг. 7G, и стадия экспоненциальной RCA амплификации, показанная на Фиг. 7H, предпочтительно завершаются в момент времени T=T0+[465-1105] секунд.
На Фиг. 7I показана стадия концентрирования ампликонов после стадии RCA амплификации, которая обычно происходит после завершения стадии RCA полимеризации, показанной на Фиг. 7F, стадии удлинения и сжатия ампликонов, показанной на Фиг. 7G, и стадии экспоненциальной RCA амплификации, показанной на Фиг. 7H, и предпочтительно происходит в присутствии электрического поля постоянного тока, предпочтительно 10-300 вольт на сантиметр, которое обычно имеет то же направление, что и электрическое поле на этапе, показанном на Фиг. 7H. Стадия концентрирования ампликонов является особенно полезной для концентрирования ампликонов 740 и 750, как указано стрелками 760, в одном участке внутри каждой области микрогеля 720. Продолжительность стадии концентрирования ампликонов, как правило, составляет 10-30 секунд. Стадия направленного движения после RCA полимеризации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[475-1135] секунд.
На Фиг. 7J показана стадия регистрации, которая обычно следует за стадией направленного движения после RCA полимеризации. Стадия регистрации предпочтительно происходит в присутствии флуоресцентных репортеров 770, комплементарных ампликонам 740 и 750, которые вводят в конструкцию электрофоретического чипа 700 в растворе. Продолжительность стадии регистрации, как правило, составляет 10-30 секунд. Стадия регистрации предпочтительно завершается в момент времени T=T0+[485-1165] секунд.
После завершения стадии регистрации и последующей стадии промывания, не показано, обнаружение присутствия по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты из множества предварительно отобранных целевых молекул нуклеиновой кислоты можно выполнять обычными флуоресцентными методами обнаружения. Таким образом, понятно, что обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно завершается в пределах срока от 8 минут до 20 минут после начального поступления раствора 702 во внутреннее пространство конструкции электрофоретического чипа 700.
Понятно, что, если приготовление раствора 702 завершается в пределах 4-5 минут после получения образца, например, путем взятия крови у пациента, обнаружение по меньшей мере одной целевой молекулы нуклеиновой кислоты может быть завершено в пределах 12-25 минут после взятия образца.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Обнаружение патогенов менингита с использованием способа, показанного на Фиг. 7A - 7J,
и с использованием синтетической целевой молекулы ДНК, представляющей
Neisseria meningitidis
Neisseria meningitidis
Создавали конструкцию электрофоретического чипа, аналогичную конструкции электрофоретического чипа 700 (Фиг. 7A), содержащего 100 иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190, имеющих диаметр основания 0,45 мм и высоту примерно 0,2 мм - 0,3 мм. На 48 иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190 были нанесены кольцевые RCA-зонды 320, предварительно гибридизованные с прямыми праймерами 322 и с обратными праймерами 324, специфическими для целевой ДНК девяти различных патогенов, каждая из которых подходит для обнаружения менингита, включая, в частности, . Соответственно, 48 обработанных иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190 были специфическими для следующих целевых молекул:
Neisseria meningitidis
Отложение 1 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 2 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 3 - специфическое для
Escherichia coli
Отложение 4 - специфическое для
Escherichia coli
Отложение 5 - специфическое для
Escherichia coli
Отложение 6 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 7 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 8 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 9 - специфическое для
Отложение 10 - специфическое для энтеровируса
Отложение 11 - специфическое для энтеровируса
Neisseria meningitidis
Отложение 12 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 13 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 14 - специфическое для
Отложение 15 - специфическое для стрептококка группы B
Отложение 16 - специфическое для стрептококка группы B
Отложение 17 - специфическое для стрептококка группы B
Neisseria meningitidis
Отложение 18 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 19 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 20 - специфическое для
Haemophilus influenzae
Отложение 21 - специфическое для
Haemophilus influenzae
Отложение 22 - специфическое для
Haemophilus influenzae
Отложение 23 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 24 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 25 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 26 - специфическое для
Отложение 27 - специфическое для вируса герпеса человека
Отложение 28 - специфическое для вируса герпеса человека
Отложение 29 - специфическое для вируса герпеса человека
Отложение 30 - специфическое для вируса герпеса человека
Neisseria meningitidis
Отложение 31 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 32 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 33 - специфическое для
Отложение 34 - специфическое для пареховируса человека
Отложение 35 - специфическое для пареховируса человека
Отложение 36 - специфическое для пареховируса человека
Neisseria meningitidis
Отложение 37 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 38 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 39 - специфическое для
Lysteria monocytogenes
Отложение 40 - специфическое для
Lysteria monocytogenes
Отложение 41 - специфическое для
Lysteria monocytogenes
Отложение 42 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 43 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 44 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 45 - специфическое для
Varicella zoster
Отложение 46 - специфическое для
Varicella zoster
Отложение 47 - специфическое для
Varicella zoster
Отложение 48 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Раствор 702, содержащий целевые молекулы нуклеиновой кислоты 703 (концентрация 100 нМ), представляющей , подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа в момент времени T0. Раствор 702 также содержал буфер с низкой проводимостью, способствующий быстрому движению ДНК и гибридизации с RCA-зондами, находящимися на отложениях микрогеля.
Подача раствора 702 приводила к тому, что высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 переходили в их гидратированное состояние, обозначенное ссылочным номером 170, по прошествии 10 секунд (Фиг. 7B-7C).
В момент времени T=T0+10 секунд создавали постоянный ток 1,6 мА между контактами рабочего электрода и противоэлектрода 260 и 250, соответственно, с напряжением 4,5 В, что приводило к наложению электрического поля в пространстве электрофоретического чипа напряженностью 12,5 В/см и вызывало электрофоретическое направленное движение (Фиг. 7D). Продолжительность электрофоретического направленного движения составляла 40 секунд.
В момент времени T=T0+50 секунд раствор для реакции лигирования, содержащий фермент для реакции лигирования, лигазу T4 (Blunt T/A, от компании New England Biolabs), подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа, заменяя раствор 702, на период времени продолжительностью примерно 180 секунд (Фиг. 7E).
Bst
В момент времени T=T0+230 секунд раствор полимеразы, содержащий фермент полимеразу  729 и дНТФ (от компании New England Biolabs), подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа, заменяя раствор для реакции лигирования, на период времени продолжительностью примерно 720 секунд (Фиг. 7F).
В момент времени T=T0+950 секунд создавали постоянный электрический ток 1,6 мА между контактами рабочего электрода и противоэлектрода 260 и 250, соответственно, с напряжением 4,5 В, что приводило к наложению электрического поля в пространстве электрофоретического чипа напряженностью 12,5 В/см и обеспечивало повторный захват RCA-ампликонов из раствора полимеразы. Продолжительность данного этапа составляла примерно 20 секунд (Фиг. 7I).
Neisseria meningitidis
Neisseria meningitides
В момент времени T=T0+970 секунд раствор красного репортера, содержащий флуоресцентно меченые олигонуклеотиды (Alexa 647 от компании Integrated Device Technology, Inc., San Jose, CA), подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа, заменяя раствор полимеразы, на период времени продолжительностью примерно 30 секунд (Фиг. 7J). После вымывания раствора красного репортера получали флуоресцентное изображение конструкции электрофоретического чипа 700 через окно 130, и присутствие целевых молекул нуклеиновой кислоты 703, представляющих , были обнаружены в следующих из иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 31, 32, 33, 37, 38, 39, 43, 44 и 45. Присутствие целевых молекул нуклеиновой кислоты 703, представляющих ,не было обнаружено в следующих иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложениях микрогеля 170: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 46, 47 и 48.
Полученные результаты представлены на Фиг. 8. Следует отметить, что среднее отношение интенсивности флуоресцентных сигналов, полученных от отложений 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 31, 32, 33, 37, 38, 39, 43, 44 и 45, к интенсивности флуоресцентных сигналов, полученных от отложений 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 46, 47 и 48, составляло примерно 8,5.
Пример 2
Обнаружение патогенов менингита с использованием способа, показанного на Фиг. 7A - 7J,
и с использованием целевой молекулы геномной ДНК, экстрагированной из патогена
Neisseria meningitides
, внесенного в клинический образец спинномозговой жидкости
Neisseria meningitidis
Создавали конструкцию электрофоретического чипа, аналогичную конструкции электрофоретического чипа 700 (Фиг. 7A), содержащего 100 иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190, имеющих диаметр основания 0,45 мм и высоту примерно 0,2 мм - 0,3 мм. На 21 иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190 были нанесены кольцевые RCA-зонды 320, предварительно гибридизованные с прямыми праймерами 322 и с обратными праймерами 324, специфическими для целевой ДНК девяти различных патогенов, каждая из которых подходит для обнаружения менингита, включая, в частности, . Соответственно, 21 обработанных иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 190 были специфическими для следующих целевых молекул:
Escherichia coli
Отложение 1 - специфическое для
Escherichia coli
Отложение 2 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 3 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 4 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 5 - специфическое для
Отложение 6 - специфическое для энтеровируса
Отложение 7 - специфическое для энтеровируса
Neisseria meningitidis
Отложение 8 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 9 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 10 - специфическое для
Отложение 11 - специфическое для стрептококка группы B
Отложение 12 - специфическое для стрептококка группы B
Haemophilus influenzae
Отложение 13 - специфическое для
Haemophilus influenzae
Отложение 14 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 15 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 16 - специфическое для
Neisseria meningitidis
Отложение 17 - специфическое для
Lysteria monocytogenes
Отложение 18 - специфическое для
Lysteria monocytogenes
Отложение 19 - специфическое для
Varicella zoster
Отложение 20 - специфическое для
Varicella zoster
Отложение 21 - специфическое для
Neisseria meningitides
Neisseria meningitides
В клинический образец спинномозговой жидкости (СМЖ) добавляли патоген , и проводили экстракцию геномной ДНК с использованием общепринятого метода экстракции ДНК при помощи магнитных гранул. Внесенную концентрацию целевой ДНК в спинномозговой жидкости определяли эталонным методом ПЦР в реальном времени, получая концентрацию внесенного патогена в клиническом образце спинномозговой жидкости, составляющую 720 копий ДНК на микролитр СМЖ.
Раствор 702, приготовленный из клинического образца с добавленным материалом, подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа в момент времени T0. Раствор 702 также содержал буфер с низкой проводимостью, способствующий быстрому движению ДНК и гибридизации с RCA-зондами, находящимися на отложениях микрогеля.
Подача раствора 702 приводила к тому, что высушенные специфические для целевых молекул отложения микрогеля 190 переходили в их гидратированное состояние, обозначенное ссылочным номером 170, по прошествии 10 секунд (Фиг. 7B-7C).
В момент времени T=T0+10 секунд создавали постоянный электрический ток 1,6 мА между контактами рабочего электрода и противоэлектрода 260 и 250, соответственно, с напряжением 4,5 В, что приводило к наложению электрического поля в пространстве электрофоретического чипа напряженностью 12,5 В/см и вызывало электрофоретическое направленное движение (Фиг. 7D). Продолжительность электрофоретического направленного движения составляла 40 секунд.
В момент времени T=T0+50 секунд было наложено электрическое поле с обратной полярностью путем создания постоянного тока отрицательного знака 1,6 мА между контактами рабочего электрода и противоэлектрода 260 и 250, соответственно, с напряжением 4,5 В, что приводило к наложению электрического поля в пространстве электрофоретического чипа напряженностью 12,5 В/см и усиленному удалению не специфически связанных целевых ДНК. Продолжительность электрофоретического направленного движения составляла 10 секунд (Фиг. 7G).
В момент времени T=T0+60 секунд раствор для реакции лигирования, содержащий фермент для реакции лигирования, лигазу T4 (Blunt T/A, от компании New England Biolabs), подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа, заменяя раствор 702, на период времени продолжительностью примерно 180 секунд (Фиг. 7E).
Bst
В момент времени T=T0+240 секунд раствор полимеразы, содержащий фермент полимеразу  729 и дНТФ (от компании New England Biolabs), подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа, заменяя раствор для реакции лигирования, на период времени продолжительностью примерно 720 секунд (Фиг. 7F).
В момент времени T=T0+960 секунд создавали постоянный электрический ток 1,6 мА между контактами рабочего электрода и противоэлектрода 260 и 250, соответственно, с напряжением 4,5 В, что приводило к наложению электрического поля в пространстве электрофоретического чипа напряженностью 12,5 В/см и обеспечивало повторный захват RCA-ампликонов из раствора полимеразы. Продолжительность данного этапа составляла примерно 20 секунд (Фиг. 7I).
Neisseria meningitidis
Neisseria meningitides
В момент времени T=T0+980 секунд раствор красного репортера, содержащий флуоресцентно меченые олигонуклеотиды (Alexa 647 от компании Integrated Device Technology, Inc., San Jose, CA), подавали во внутреннее пространство электрофоретического чипа, заменяя раствор полимеразы, на период времени продолжительностью примерно 30 секунд (Фиг. 7J). После вымывания раствора красного репортера получали флуоресцентное изображение конструкции электрофоретического чипа 700 через окно 130, и присутствие целевых молекул нуклеиновой кислоты 703, представляющих , было обнаружено в следующих из иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложений микрогеля 170: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 15, 16 и 17. Присутствие целевых молекул нуклеиновой кислоты 703, представляющих ,не было обнаружено в следующих иммобилизованных высушенных специфических для целевых молекул отложениях микрогеля 170: 1, 2, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20 и 21.
Полученные результаты представлены на Фиг. 9. Следует отметить, что среднее отношение интенсивности флуоресцентных сигналов, полученных от отложений 3, 4, 5, 8, 9, 10, 15, 16 и 17, к интенсивности флуоресцентных сигналов, полученных от отложений 1, 2, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20 и 21, составляло примерно 4,3.
Специалисты в данной области понимают, что настоящее изобретение не ограничено тем, что конкретно описано и представлено в настоящем документе, но также включает сочетания и частичные сочетания признаков, описанных в настоящем документе, а также их модификации, отсутствующие в предшествующем уровне техники.