НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ КОДИРУЮЩЕЙ ЧАСТИ ГЕНА BRCA1 И ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR DETERMINATION OF NUCLEOTIDE SEQUENCE OF CODING PART OF BRCA1 GENE AND DETECTION OF MUTATIONS, ASSOCIATED WITH HEREDITARY FORMS OF BREAST CANCER

1. Область техники
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для выявления онкологических мутаций гена BRCA1, ассоциированных с наследственным раком молочной железы, и оценки рисков развития заболевания.
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у женщин: он поражает как минимум каждую десятую жительницу развитых стран и занимает лидирующие позиции по смертности вследствие несовершенства ранней диагностики. Индивидуальный риск РМЖ зачастую ассоциирован с отягощенной наследственностью, т.е. с накоплением случаев опухолей молочной железы у кровных родственниц больной.
2. Уровень техники
Из литературных данных известно, что у жительниц России примерно 20% РМЖ, возникших в молодом возрасте (до 40-50 лет) и/или на фоне неблагоприятной наследственности, и/или в форме билатерального процесса, объясняются мутациями в гене BRCA1. У женщин с наличием мутаций гена BRCA1 риск развития рака РМЖ на протяжении жизни составляет 50-80%, развития рака во второй молочной железе - 40-60%. Мутации в этом гене также приводят к повышенному риску развития опухолей яичников: 15-45%. BRCA1 - ген-супрессор клеточной пролиферации, мутации в котором приводят к неконтролируемому делению и в итоге к возникновению злокачественной опухоли. В кодирующей части гена BRCA1 описано более 800 мутаций, связанных с формированием РМЖ.
Из аналогов данного изобретения можно выделить следующие:
1) Способ выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени»: Mitrofanov D.V., Chasovnikova О.В., Kovalenko S.P., Liakhovich V.V. Detection of 5382insC mutation in human BRCA1 gene using fluorescent labeled oligonucleotides. // Mol Biol (Mosk). 2009 Nov-Dec; 43(6):999-1005.
2) Способ выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 при помощи обнаружения полиморфизма конформаций одноцепочечной ДНК: Tamboom K, Kaasik K, Arsavskaja J, Tekkel M, Lilleorg A, Padrik P, Metspalu A, Veidebaum. BRCA1 mutations in women with familial or early-onset breast cancer and BRCA2 mutations in familial cancer in Estonia. // Hered Cancer Clin Pract. 2010 Apr 9; 8(1):4.
Недостатком этих подходов является необходимость использования специфических олигонуклеотидов, предназначенных для выявления уже заранее известных мутаций.
3) Способ выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 при помощи обнаружения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с помощью высокоточного анализа кинетики плавления: Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations. // Hum Mutat. 2009 Jun; 30(6):857-9.
Недостаток этого способа состоит в том, что он позволяет установить только факт изменения последовательности, но не конкретный тип мутации.
Самым эффективным способом выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 является полное определение его кодирующей последовательности с помощью метода секвенирования.
Предлагаемое изобретение, представляющее собой набор синтетических олигонуклеотидов для осуществления полного секвенирования кодирующей части гена BRCA1, позволяет с высокой точностью и достоверностью выявлять все генетические изменения в последовательности гена BRCA1 в той или иной степени, ассоциированные с развитием РМЖ.
Изобретение может быть использовано как для идентификации мутаций у больных с наследственными формами РМЖ с целью выбора наиболее подходящей тактики лечения, так и для проведения генетического тестирования здоровых членов семьи с целью оценки возможных рисков развития заболевания и обнаружения рака на ранних стадиях.
2. Раскрытие изобретения
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является определение полной нуклеотидной последовательности гена BRCA1 и достоверное обнаружение всех онкологических мутаций, присутствующих в данной последовательности.
Указанный результат достигается в результате амплификации кодирующей части гена BRCA1 с помощью предлагаемых синтетических олигонуклеотидов с последующим секвенированием полученных продуктов амплификации с использованием этих же синтетических олигонуклеотидов.
Создание специфических праймеров для амплификации (предмет изобретения)
Выбор специфических праймеров для амплификации интересующего фрагмента ДНК осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области.
Работа над созданием праймеров строится обычно следующим образом:
1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей человеческого генома в интересующем исследователя гене выбирается уникальный участок, отличающий его от любого другого фрагмента любого другого организма.
2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения полимеразной цепной реакции (как правило, 2 праймера). Многие из таких программ находятся в свободном доступе в интернете. Среди них можно упомянуть Oligo (версия 6.42), Primer Select из пакета Lasergene (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, USA), Primer Designer (ИМБ), Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), Primer Quest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др.
3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.
4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей праймеров для конкретных целей.
Предлагаемый набор синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для амплификации кодирующей части гена BRCA1 отличается тем, что содержит праймеры следующего нуклеотидного состава:
Помимо предлагаемых праймеров, в реакционную смесь для амплификации входят следующие компоненты:
- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dgTP, dCTP);
- фермент Taq-полимераза;
2
- реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl);
Амплификация кодирующей части гена BRCA1
Кодирующая часть гена BRCA1 (5592 п.н.) состоит из 24 фрагментов (экзонов). Большинство экзонов имеет небольшие размеры, часто менее 100 п.н., и есть один большой экзон (10-й), который составляет ~60% кодирующей области. В случае небольших экзонов предлагаемый набор праймеров позволяет амплифицировать целый экзон с прилегающими фрагментами интронов (некодирующие участки гена). В случае больших экзонов амплификация проводится в виде нескольких перекрывающихся фрагментов.
Амплификация кодирующей части гена BRCA1 с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов (праймеров) осуществляется из расчета 29 реакций на один образец геномной ДНК по следующей схеме:
Реакция амплификации проводится с использованием специализированного оборудования - амплификаторов Терцик, ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) согласно следующему температурному режиму:
№ п.п.
Температура
Время
Количество циклов
1.
94°C
1 мин
1
94°C
15 с
2.
64°C
15 с
5
72°C
15 с
94°C
5 с
3.
64°C
15 с
35
67°C
15 с
4.
10°C
Хранение
Секвенирование кодирующей части гена BRCA1
После окончания реакции амплификации полученные на первом этапе анализа продукты амплификации используются для постановки реакции секвенирования.
В реакции секвенирования продуктов амплификации, полученных в результате первого этапа анализа, используется только 1 праймер из пары, используемой для постановки реакции амплификации.
Реакция секвенирования кодирующей части гена BRCA1 с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов (праймеров) осуществляется из расчета 29 реакций на один образец ДНК по следующей схеме:
Реакция секвенирования проводится с применением набора меченых дидезоксирибонуклеотидтрифосфатов (BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, США) и специализированного оборудования - амплификаторов Терцик, ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) согласно следующему температурному режиму:
№ п.п.
Температура
Время
Количество циклов
1.
96°C
1 мин
1
96°C
10 с
2.
56°C
20 с
40
72°C
20 с
4.
10°C
Хранение
Секвенирование проводится с использованием автоматического секвенатора genetic Analyzer 3130/3130x1 (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя.
4. Осуществление изобретения
Данный набор применяется следующим образом:
1) Получение биологического материала от больного. В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты тканей, кровь, соскобы букального эпителия.
2) Выделение и очистка препаратов ДНК из исходных образцов. Способы выделения ДНК из биологического материала хорошо известны специалистам и, как правило, включают стадии лизиса клеток, выделения ДНК и ее очистки. Быстрое и качественное выделение ДНК можно проводить с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (не являются предметом данного патента).
3) Амплификация полученных препаратов геномной ДНК с применением предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов, специфичных к кодирующей части гена BRCA1 (23 отдельных реакции).
4) Секвенирование продуктов амплификации, полученных в п.3 с применением предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов, специфичных к кодирующей части гена BRCA1 (29 отдельных реакций).
5) Анализ результатов реакции секвенирования проводится с использованием программного обеспечения Sequencing Analysis v5.3.1 (Applied Biosystems, США), Chromas, SeqMan.
Пример графического представления результатов, полученных с использованием предлагаемого набора праймеров, приведен на чертеже.