Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов
METHOD OF SPECTROMETRIC DETERMINATION OF CONCENTRATION OF 146S FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS PARTICLES IN NON-INACTIVATED RAW MATERIAL FOR A VACCINE BY ESTIMATING THE NUMBER OF MOLECULES OF VIRAL RNA RELEASED AFTER IMMUNE CAPTURE OF VIRIONS

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением спектрометрического метода измерения количества молекул РНК, выделенных из полных частиц вируса ящура после иммунного захвата, и разработанной линейной модели зависимости числа молекул вирусной РНК от концентрации 146S частиц вируса ящура.
Ящур - острое, лихорадочное, высококонтагиозное вирусное заболевание, которому подвержены дикие и домашние парнокопытные животные [1]. Возбудителем является РНК-содержащий вирус, принадлежащий к порядку Picornavirales, роду Aphthovirus семейства Picornaviridae. Вирус ящура характеризуется высокой антигенной изменчивостью за счет мутаций в генах капсидных белков, представлен типами А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и множеством подтипов [2].
1
2
3
4
1
3
0
1
2
3
g
Вирион вируса ящура имеет диаметр около 23-25 нм, геном представляет собой одноцепочечную позитивную РНК, состоящую приблизительно из 8500 н.о. При репродукции в биосистеме вирус ящура образует 4 варианта компонентов: 146S частицы (вирионы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP-VP-VP-VP; 75S компонент, лишенный РНК и включающий в себя 60 копий полипептида VP-VP-VP; 12S частицы, представленные белками VP VP, VP; 3,8S субъединицы, состоящие из неструктурного белка VP [1].
Ящур причиняет значительный экономический ущерб в связи с большими затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства. Система мер для борьбы и профилактики заболевания предусматривает массовую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [3, 4].
В процессе промышленного производства противоящурных вакцин особое внимание уделяют концентрации 146S частиц, которые обладают важнейшими биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, влияющими на иммуногенную активность вакцинных препаратов [1]. Это является основанием для исследования каждой серии вакцинного сырья на определение концентрации 146S частиц, применяя количественный вариант реакции связывания комплемента (РСК) и обратно-транскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР-РВ). РСК имеет ряд недостатков: трудоемкость и продолжительность проводимого анализа (до 3 суток), невозможность одновременного исследования большого количества проб, достаточно высокая себестоимость процедуры [1]. Метод ОТ-ПЦР-РВ позволяет ускорить проведение анализа до 4 часов, однако требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов. В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения количества 146S компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины на основе альтернативного метода.
Задачей настоящего изобретения являлась разработка высоко чувствительного, специфичного, быстрого и более дешевого способа определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача была решена благодаря созданию нового способа определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением спектрометрического метода анализа РНК, выделенной из вирионов после штаммоспецифического иммунного захвата. С помощью данного метода предложена модель определения количества молекул РНК, выделенных из полных частиц вируса ящура, вида:
где, К - кратность разведения элюата РНК, выделенной из 146S частиц вируса ящура;
262
OD - значение оптической плотности элюата РНК, выделенной из 146S частиц вируса ящура, при длине волны 262 нм;
320
OD - значение оптической плотности экстракта РНК, выделенной из 146S частиц вируса ящура, при длине волны 320 нм;
260 К-
OD - значение оптической плотности отрицательного контроля при длине волны 260 нм;
23
-1
Na - постоянная Авогадро (6,022045⋅10 моль);
рибонуклеозида
Мw - средний молекулярный вес рибонуклеозида (340,5 Да);
L - длина генома вируса ящура (8500 н.о.);
РНКвя
41,67 - фактор РНК вируса ящура (F);
7,48
1/10 - суммарный коэффициент перевода массы из [мкг] в [г] и пересчета количества молекул РНК вируса ящура из 30-кратного элюата в 1-кратный раствор.
146S
РНК146S
146S
РНК146S
2
С применением разработанного способа между значениями концентрации 146S частиц (C) и количеством молекул РНК, экстрагированных из полных вирусных частиц (N), выявлена зависимость, отраженная в виде положительной линейной функции C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837 с высокой достоверностью аппроксимации R=0,9996. Предложенная модель позволяет оценивать концентрацию 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Сущность изобретения пояснена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Зависимость концентрации 146S частиц вируса ящура от количества молекул РНК, экстрагированной из полных частиц после иммунного захвата (количество молекул выражено в экспоненциальном формате);
Фиг. 2 - Спектрограммы разведений стандартного 30х элюата РНК вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 (сверху вниз отражены графики для некоторых разведений элюатов, соответствующих концентрациям 146S частиц: 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,1 мкг/мл);
Фиг. 3 - Электрофореграмма препарата стандартной РНК, выделенной из 146S частиц вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011;
Фиг. 4 - Спектр поглощения элюатов РНК вируса ящура исследуемых штаммов для оценки чистоты и определения концентрации 146S частиц в исходных суспензиях;
Фиг. 5 - Электрофореграммы элюатов РНК вируса ящура различных штаммов (А - Азия-1 №2145/Таджикистан/11, Б - А №2029/ Турция/06, В - О №2212/Приморский/14, Г - А №2269/ВНИИЗЖ/15, Д - О №2147/Приморский/12, Е - САТ-2 Саудовская Аравия 7/2000).
Сущность изобретения заключается в новом подходе по определению количества 146S частиц вируса ящура в сырье для вакцины с помощью спектрометрического метода и разработанной положительной линейной модели. Заявляемый способ основан на проведении реакции штаммоспецифического иммунного захвата, выделении РНК вируса ящура из образующихся иммунных комплексов «146S частица вируса ящура-штаммоспецифическое антитело», спектрометрическом анализе количества молекул вирусной РНК и расчете концентрации 146S частиц с помощью предложенной модели. По итогам анализа оценивают степень чистоты полученного экстракта РНК вируса ящура с помощью спектрального анализа и гель-электрофореза, определяют количество молекул вирусной РНК по расчетной формуле на основе значений экстинкции. На основании выборки известных значений концентрации 146S частиц вируса ящура разных типов и установленных спектрометрическим методом количеств молекул вирусной РНК разработана положительная линейная модель, позволяющая определять содержание 146S частиц в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины по результатам спектрометрического анализа.
По итогам анализа научных сведений предложенный способ оценки количества 146S частиц вируса ящура в сырье для вакцины до настоящего времени не применялся. Для определения концентрации 146S компонента вируса ящура используют РСК и ОТ-ПЦР-РВ [1, 4, 5]. По сравнению с РСК разработанный способ характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. В сравнении с ОТ-ПЦР-РВ предложенный способ является более экономичным и позволяет проводить исследование проб за 3 часа. Исходя их этого, предложенный способ актуально применять для определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины. Ключевым элементом заявляемого способа является выявление зависимости количества молекул РНК вируса ящура от значения экстинкции при длине волны 262 нм, а также установление положительной линейной зависимости между содержанием 146S частиц разных типов вируса ящура в сырье для вакцины и количеством молекул РНК, экстрагированных из полных вирусных частиц.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении спектрометрического метода оценки количества молекул РНК, выделенных из полных частиц вируса ящура после иммунного захвата, и разработанной линейной модели для определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Сведений о разработке предлагаемого способа определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины авторами не обнаружено.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости концентрации 146S частиц вируса ящура от количества молекул РНК, экстрагированных из полных частиц после штаммспецифического иммунного захвата (Фиг. 1).
Проводят сенсибилизацию иммунологического 24-луночного планшета, поверхность которого свободна от ДНК и РНК, DNase и RNase, высокоочищенными штаммоспецифическими поликлональными антителами против вируса ящура в объеме 1 мл суспензии с концентрацией иммуноглобулинов G 5 мкг/мл. После иммобилизации при температуре 4±2°С в течение 18 часов лунки планшета подвергают трехкратному промыванию 1/15 М фосфатным буферным раствором (ФБР), открытые сайты связывания блокируют 0,5% суспензией бычьего сывороточного альбумина (BSA) при температуре 37±1°С в течение 1 часа и вновь лунки промывают 1/15 М ФБР 3 раза. Данную процедуру подготовки планшета осуществляют заранее, до проведения анализа.
6
6
Для исследования проб вируса ящура определенного штамма с неизвестной концентрацией 146S частиц используют: положительный контроль (суспензия вируса ящура, репродуцированного в суспензионной культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21) с известной концентрацией клеток); отрицательный контроль (не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,0⋅10-3,0⋅10 клеток/мл). В лунки с нанесенными штаммспецифическими антителами против 146S частиц вируса ящура вносят по 3,0 мл образцов и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 1 часа. В результате контакта антител и антигенов вируса ящура на поверхности лунок формируется иммунные комплексы. Проводят отмывание иммунных комплексов от балластных компонентов с использованием 1/15 М ФБР. Образовавшиеся иммунные комплексы «146S частица-антитело» разведений стандарта, контролей и проб ресуспендируют в 1 мл 1/15 М ФБР.
2+
На следующем этапе проводят выделение связанной иммунным комплексом РНК 146S частиц вируса ящура за счет лизиса нуклеопротеидных и полипептидных структур с последующим фракционированием РНК от ДНК, липопротеидных и белковых составляющих. Лизис осуществляют с использованием 10 мл раствора, содержащего 50% фенола (рН<7,0) и 50% гуанидинизотиоцианата (ГТЦ) 4М, который смешивают с 1 мл суспензии иммунного комплекса. Инкубацию смеси проводят при температуре 23-25°С в течение 20 минут для полного диссоциирования полипептидных и нуклеопротеидных комплексов. При этом комплекс фенола и ГТЦ обеспечивает сохранение целостности РНК благодаря высокой ингибирующей активности компонентов в отношении РНКаз. Полученный лизат подвергают центрифугированию при 13500 об/мин в течение 8 минут. Данная процедура позволяет полностью удалять конгломераты, не содержащие РНК вируса ящура. Полученный надосадок переносят в центрифужную пробирку, добавляют 2,5 мл хлороформа и инкубируют содержимое в течение 4 минут с периодическим перемешиванием. После инкубирования смесь подвергают центрифугированию при 13500 об/мин в течение 12 минут при температуре 4±2°С. В результате осаждения происходит разделение содержимого пробирки на три фазы: 1) нижнюю фазу соломенного цвета, содержащую комплекс фенола и хлороформа со связанными липидами и полипептидами; 2) среднюю фазу белого цвета, включающую в свой состав пептидные составляющие и ДНК; 3) верхнюю фазу, представляющую собой прозрачный экстракт РНК [5, 6]. Полностью отбирают верхнюю фазу, не затрагивая остальные фракции, и добавляют 4,5 мл 100%-ого изопропилового спирта. Смесь инкубируют в течение 8 минут при температуре 23-25°С, после этого содержимое пробирки центрифугируют при 13500 об/мин в течение 8 минут при температуре 25°С. Супернатант удаляют, оставляя осадок РНК вируса ящура, к которому добавляют 2,0 мл 80%-ого этилового спирта. Содержимое перемешивают и осаждают при 14000 об/мин в течение 6 минут при температуре 23-25°С. Надосадок удаляют, осадок РНК высушивают в потоке воздуха комнатной температуры в течение 5 минут. К высушенному осадку добавляют 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0-7,2), свободного от РНКаз и Mg, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 2-3 минут для полного растворения РНК вируса ящура. В работе используют буфер ТЕ с нейтральным показателем кислотности (рН 7,0-7,2) для предотвращения деградации РНК вируса ящура [7]. Таким образом, получают по 100 мкл 30-кратных (30х) элюатов РНК вируса ящура относительно исходного объема вирусной суспензии (3000 мкл), вносимой для инкубации в планшет на стадии иммунного захвата.
1
262
280
1
1
262
235
2
2
2
320
205-259
263-325
260-262
На следующем этапе осуществляют спектрометрический анализ экстракта РНК вируса ящура, оценивая поглощение исследуемым образцом монохроматического ультрафиолетового света. Данное исследование позволяет определять степень чистоты элюата и давать заключение о достоверности результатов определения количества молекул вирусной РНК и соответствующих ей 146S частиц. Измерения спектральной поглощающей способности стандартных, контрольных и опытных образцов проводят в кварцевых кюветах (длина оптического пути (1) составляет 10 мм, минимальный объем аналита - 50 мкл) при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 23-25°С. Оценивают содержание в препарате остатков фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидинизотиоцианата, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, определяя значения оптической плотности (OD, optical density) при 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно [8]. Элюат РНК считают свободным от примесей белка и фенола, если коэффициент экстинкции (R), представляющий собой соотношение OD/OD, находится в пределах 1,8-2,2 и оптимально составляет примерно 2,0. Более низкие значения R указывают на наличие ДНК, белковых составляющих и остатков фенола в препарате. Более высокие значения коэффициента R свидетельствуют о деградации нуклеиновой кислоты и наличии свободных нуклеотидов. Экстракт РНК вируса ящура считают незагрязненным полисахаридами, если OD/OD (коэффициент экстинкции R) соответствует значению 2,0 [9]. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие значение R уменьшается на 0,002. Значения коэффициента R большие 2,0 могут указывать на деградацию молекул РНК. Отсутствие взвеси крупных частиц в элюате подтверждается, если OD приближено к нулевому значению [9, 10]. Если OD и/или OD превышают OD, а также наблюдаются выраженные двойные пики на спектрограмме, то достоверность определения количества молекул РНК и, как следствие, концентрации 146S частиц вируса ящура значительно снижается. В таком случае рекомендуется повторно провести этап экстрагирования вирусной РНК из исходного материала и спектральный анализ вновь полученного элюата.
Для оценки целостности РНК вируса ящура и отсутствия контаминации ДНК проводят горизонтальный гель-электрофорез денатурированной РНК, по итогам которого детектируют четко различимый бэнд нуклеиновой кислоты вируса ящура без наличия выраженных посторонних полинуклеотидных фрагментов. В качестве стандарта длины нуклеотидных последовательностей применяют маркер молекулярной массы РНК RiboRuler High Range RNA Ladder/ready-to-use, содержащий 8 одноцепочечных транскриптонов РНК длиной 200-6000 н.о. в 1 mM этилендиаминтетраацетате (ЭДТА) (рН 6,0). Электрофорез проводят в тонком 0,6%-ном агарозном геле, приготовленном на основе агарозы Е, 1х электродного буфера, свободного от РНКаз, в градиенте напряженности 1-2 В/см геля в течение 45 минут. Для индикации РНК после электрофореза гель окрашивают раствором красителя с концентрацией бромистого этидия 0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl (рН 9,0) в течение 50 минут. Детекцию РНК-бэндов проводят в УФ-трансиллюминаторе и делают снимок с помощью гель-документирующей системы.
262
РНК146S
262
РНК146S
2
После подтверждения высокой степени чистоты экстракта РНК, выделенного из 146S частиц вируса ящура, из него получают серию разведений стандарта, соответствующих концентрациям 146S частиц от 0,1 до 4,0 мкг/мл с шагом 0,1 мкг/мл. Проводят измерение экстинкции полученных стандартных образцов при длине волны 262 нм (OD) и устанавливают зависимость между количеством молекул РНК (N) и OD для разработки модели расчета N. Проводят установление зависимости концентрации 146S частиц в неинактивированном сырье для вакцины от числа молекул РНК, экстрагированных из вирионов вируса ящура, в процессе построения положительной линейной модели. Оценивают степень достоверности аппроксимации (R). На основе разработанной модели рассчитывают значение концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины.
Пример 1. Исследование стандартного образца культурального вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011. Определение концентрации 146S частиц культурального вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины спектрометрическим методом по количеству выделенной вирусной РНК после иммунного захвата вирионов.
6
6
На первом этапе исследования проводят иммунный захват 146S частиц вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 с применением иммунологического планшета, который сенсибилизирован высокоочищенными поликлональными антителами, специфичными к полным частицам вируса указанного штамма. В качестве положительного стандарта используют неинактивированную суспензию вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, репродуцированного в суспензионной клеточной линии ВНК-21, с концентрацией 146S частиц 4,0 мкг/мл. Отрицательным контрольным образцом служит суспензия клеточной линии ВНК-21 с концентрацией клеток 2,0⋅10-3,0⋅10 клеток/мл, не инфицированных вирусом ящура.
В лунки иммунологического планшета с сенсибилизированными антителами против 146S частиц вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 вносят положительный стандарт и отрицательный контроль по 1,0 мл в 3 лунки (общий объем составляет по 3,0 мл) и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 1 часа. Исследование проводили в 3 повторениях. В результате формируются иммунные комплексы «146S частица вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 - штаммспецифические антитела». Из планшета удаляют суспензию, проводят трехкратное промывание поверхности лунок с использованием 1/15 М ФБР. Полученные иммунные комплексы положительного стандарта и пробы, а также содержимое отрицательного контроля ресуспендируют в 1,0 мл 1/15 М ФБР.
К 1,0 мл полученных суспензий добавляют по 10,0 мл раствора, содержащего 50% фенола (рН<7,0) и 50% гуанидинизотиоцианата (ГТЦ) 4М. Смесь инкубируют при температуре 23-25°С в течение 20 минут. Полученные лизаты подвергают центрифугированию при 13500 об/мин в течение 8 минут. Супернатанты после осаждения переносят в центрифужные пробирки, добавляют по 2,5 мл хлороформа и инкубируют содержимое в течение 4 минут с периодическим перемешиванием. После инкубирования суспензии центрифугируют при 13500 об/мин в течение 12 минут при температуре 4-5°С. В результате осаждения происходит разделение содержимого пробирки на три фазы: нижнюю, среднюю и верхнюю. В новые пробирки аккуратно без остатка отбирают верхнюю фазу и добавляют по 4,5 мл 100%-ого изопропилового спирта. Смеси инкубируют в течение 8 минут при температуре 23-25°С, после этого содержимое пробирок осаждают при 13500 об/мин в течение 8 минут при температуре 23-25°С. Супернатанты удаляют, оставляя осадок РНК вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011. К РНК добавляют по 2,0 мл 80%-ого этилового спирта, содержимое каждой пробирки перемешивают и осаждают при 14000 об/мин в течение 6 минут при температуре 23-25°С. Аккуратно удаляют супернатанты, а осадок вирусной РНК высушивают в потоке воздуха комнатной температуры в течение 5 минут. РНК растворяют в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ ЭДТА, рН 7,0-7,2), содержимое прогревают при 60±2°С в течение 2-3 минут, тем самым получая 30х элюат РНК вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 (n=3).
На следующем этапе исследования проводят оценку чистоты элюата РНК вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 положительного стандарта с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света. Образец РНК сканируют в кварцевой кюветы (l=10 мм) при температуре 23-25°С и регистрируют значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм каждые 2 нм, осуществляя полную запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Specrtrum v. 5.0 (Фиг. 2).
205-259
263-325
260-262
1
262
280
1
2
262
235
2
По результатам анализа 30х кратного препарата выявили, что значения OD и OD не превышают OD (0,001-1,006<1,007-1,014 и 1,013-0,004<1,007-1,014), что является признаком высокой степени чистоты полученного элюата РНК (n=3). Из данных спектрального исследования стандарта видно отсутствие выраженных пики на графике при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствует о практически полном отсутствии загрязнения препарата примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. При этом коэффициент экстинкции (R) составляет 1,988 (OD/OD=1,014/0,510) (близко к норме 2,000), что подтверждает отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка и остатков фенола. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в растворе не наблюдается, так как R не превышает 2,000. Элюат РНК вируса ящура положительного стандарта не загрязнен полисахаридами и ГТЦ, поскольку коэффициент экстинкции (R) (OD/OD=1,014/0,506) соответствует значению 2,004. Учитывая, что при замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие значение R уменьшается на 0,002, в полученном элюате наличие примесей углеводов не выявлено.
Наличие целостной РНК 146S частиц и отсутствие контаминации ДНК подтверждают с помощью гель-электрофореза. Стандартный образец цельной РНК в объеме 15 мкл смешивают с 3 мкл деионизированной воды, свободной от РНКаз, и 12 мкл денатурирующей смеси, состоящей из 2 мл 6 М глиоксаля, 5 мл ДМСО и 1 мл 10х буфера для электрофореза (0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,0) при температуре 50°С в течение 50 минут. Готовят тонкий 0,6%-ный агарозный гель с использованием агарозы Е и 1х электродного буфера. 5 мкл денатурированной РНК стандарта смешивают с 2,5 мкл окрашивающего буфера (50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1х буфере для электрофореза) и вносят в слот геля. В качестве стандарта длины нуклеотидных последовательностей применяют маркер молекулярной массы РНК RiboRuler High Range RNA Ladder/ready-to-use, содержащий 8 одноцепочечных транскриптонов РНК длиной 200-6000 н.о. в 1 mM этилендиаминтетраацетате (ЭДТА) (рН 6,0). Электрофорез проводят в градиенте напряженности 1-2 В/см геля в течение 45 минут. После электрофореза гель-пластину окрашивают раствором красителя с концентрацией бромистого этидия 0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl (рН 9,0) в течение 50 минут. Просмотр РНК-бэндов проводят в УФ-трансиллюминаторе и детектируют с помощью гель-документирующей системы. Электрофореграмма препарата денатурированной стандартной РНК, выделенной из 146S частиц вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, представлена на фиг. 3, из которого видно, что РНК не деградирована, и элюат практически не содержит фрагментов ДНК. Таким образом, полученный препарат РНК является высокоочищенным и может быть использован в качестве стандарта для дальнейшей работы.
ATP
UTP
GTP
CTP
ATP
UTP
GTP
CTP
На следующем этапе исследования проводят выявление зависимости 146S частиц культурального вируса ящура от количества молекул вирусной РНК. Максимальный уровень поглощения одноцепочечных рибонуклеиновых кислот отмечается при длинах волн 252-271 нм, что объясняется высокой спектральной поглощающей способностью рибонуклеозид-5'-трифосфатов в данном диапазоне, а именно, для аденозин-5'-трифосфата (λ) - 259 нм, уридин-5'-трифосфата (λ) - 262 нм, гуанозин-5'-трифосфата (λ) - 252 нм, цитидин-5'-трифосфата (λ) - 271 нм [11, 12]. Спектральные исследования доказывают, что поглощения мономеров цельных рибонуклеиновых кислот сливаются, обеспечивая максимальную экстинкцию в указанном диапазоне длин волн [11, 13, 14]. Проведя нуклеотидный анализ РНК различных штаммов 7 типов вируса ящура, определили средние процентные соотношения рибонуклеозид-5'-трифосфатов (W, W, W, W) в составе генома. Результаты исследования отражены в таблице 1.
max
Полученные данные позволили рассчитать средние значения длин волн (λ) с максимальным уровнем поглощения РНК для каждого типа возбудителя ящура, пользуясь формулой:
Так, определено, что для генома штаммов вируса ящура типа А
max
λ составляет 261,64 нм (259⋅0,251+264⋅0,209+252⋅0,257+271⋅0,283),
для типа О - 261,51 нм (259⋅0,256+264⋅0,214+252⋅0,259+271⋅0,271),
для типа С - 261,68 нм (259⋅0,251+264⋅0,212+252⋅0,254+271⋅0,283),
для типа Азия-1 - 261,63 нм (259⋅0,247+264⋅0,212+252⋅0,259+271⋅0,282),
для типа САТ-1 - 261,74 нм (259⋅0,252+264⋅0,210+252⋅0,251+271⋅0,287),
для типа САТ-2 - 261,70 нм (259⋅0,254+264⋅0,207+252⋅0,253+271⋅0,286),
для типа САТ-3 - 261,77 нм (259⋅0,253+264⋅0,209+252⋅0,249+271⋅0,289).
max
Расчетные значения λ подтверждены биоспектрометрическими исследованиями элюатов РНК вируса ящура типов А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и эмпирически составили 262 нм.
-1
-1
260
262
Количество молекул РНК в чистом препарате рассчитывают, пользуясь законом Бугера-Ламберта-Бера, в соответствии с которым отмечается ослабление параллельного монохроматического пучка света при прохождении через поглощающую среду. На основе данного закона возможно найти соотношение концентрации частиц, поглощающих излучение, и количества поглощенного света [15]. При λ 260-262 нм средний коэффициент экстинкции для одноцепочечной РНК составляет 0,024 (мкг/мл) см. Исходя из этого, раствор с содержанием нуклеиновой кислоты 1,00 мг/мл при прохождении ультрафиолетового света с длиной волны 260 нм имеет значение OD, соответствующее 24,000 [14], и, как следствие, оптическая плотность, равная 1,000, соответствует элюату, содержащему 41,67 мкг РНК/мл. В случае с нуклеиновой кислотой вируса ящура в результате измерений выявили, что максимальное поглощение РНК наблюдается при λ=262 нм, при этом для высокоочищенного экстракта с содержанием РНК 41,67 мкг/мл значение OD составляет 1,000.
РНКвя
320
260 K-
262
РНКвя
рибонуклеозида
23
-1
6
1,48
7,48
Применение закона Бугера-Ламберта-Бера справедливо для определения числа молекул вирусной РНК в разбавленных элюатах, поскольку при высоких концентрациях аналита (>1,00 мг/мл) расстояние между молекулами поглощающего УФ-свет вещества значительно снижается. В результате увеличивается влияние каждой частицы на распределение поверхностного заряда между соседними молекулами, что может изменить способность РНК поглощать излучение при указанной длине волны. Таким образом, для определения количества молекул РНК вируса ящура в препаратах с высокой концентрацией требуется готовить разведения аналита с использованием буфера ТЕ. До измерения абсорбции разведения элюата необходимо проводить автоматическое вычитание фоновых значений буфера ТЕ. Для расчета содержания РНК 146S частиц в препарате требуется учитывать фактор пересчета для нуклеиновой кислоты возбудителя ящура (F=41,67), кратность разведения (К), а также вычитать фоновое значение проб (OD) и отрицательного контроля (OD) из OD. При определении количества молекул РНК вируса ящура (N) учитывают число Авогадро (6,022045⋅10 моль), средний молекулярный вес рибонуклеозида (Мw=340,5 Да), длину РНК вируса ящура (L=8500 н.о.) [14], а также производят перевод массы нуклеиновой кислоты из [мкг] в [г] в соответствии с требованиями Международной системы единиц Le Systeme International d'Unites [16] (коэффициент 1/10) и пересчет количества молекул из 30х элюата в 1х материал (коэффициент 1/10) (общий коэффициент пересчета составляет 1/10).
При репродукции вируса ящура в чувствительных клеточных линиях происходит формирование 146S частиц (вирионов), каждая из которых включает в свой состав одну молекулу РНК. Необходимо отметить, что в суспензиях вируса ящура РНК находится не только в составе вирионов (98-99%), но и в незначительном количестве (1-2%) в свободном состоянии [17]. Иными словами, при расчете количества РНК, выделенных из полных частиц, следует учитывать коэффициент 0,98.
РНК146S
Определяют количество молекул РНК, экстрагированных из 146S частиц вируса ящура (N) с использованием расчетной формулы:
РНК146S
На следующем этапе исследования разрабатывали модель определения концентрации 146S частиц вируса ящура по количеству молекул выделенной вирусной РНК. Для выявления зависимости концентрации 146S частиц вируса ящура от количества молекул вирусной РНК получают серию разведений 30х стандарта РНК, выделенной из суспензии вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 с содержанием полных частиц 4,0 мкг/мл, соответствующих концентрации 146S частиц от 0,1 до 4,0 мкг/мл с шагом 0,1 мкг/мл. До измерения абсорбции полученных стандартных образцов осуществляют автоматическое вычитание фоновых значений буфера ТЕ. Проводят спектральный анализ приготовленных положительных стандартов, определяя значения экстинкции при длинах волны 262 и 320 нм. Оптическую плотность отрицательного контроля измеряют для выявления наличия неспецифических молекул РНК, максимальное поглощение для которых отмечается при λ 260 нм. Результаты измерений и расчета количества молекул РНК, выделенных из 146S частиц, отражены в таблице 2, из которой видно, что значения N для всех разведений 30х стандарта с количеством 146S частиц от 0,1 до 4,0 мкг/мл находятся в диапазоне от 7 315 278 733 до 287 546 725 579, соответственно.
146S
РНКвя
146S
РНК146S
Полные частицы вируса ящура включают в свой состав одну молекулу РНК [1], при этом содержание свободной РНК в вирусных суспензиях не значительно, исходя из этого, следует, что существует прямая зависимость количества 146S частиц и числа молекул РНК вируса ящура при расчетах в одинаковом объеме. По литературным данным известно, что для вируса ящура молекулярная масса цельных вирионов (Mw) в среднем составляет 8080000 Да [17]. Учитывая, что геном вируса имеет длину около 8500 н.о. [1] и средний молекулярный вес рибонуклеозида равен 340,5 Да, молекулярная масса вирусной РНК (Мw) составляет около 2 894 250 Да, что в среднем в 2,79 раз меньше по сравнению с Mw. Иными словами, теоретически концентрация 146S частиц (мкг/мл) в суспензиях вируса ящура в среднем в 2,79 раз выше, чем концентрация вирусной РНК (мкг/мл), отсюда следует, что , или . Данное выражение подставляем в отношение  вместо m, учитывая, что , где
РНК
m - масса РНК вируса ящура;
Na - постоянное число Авогадро;
L - длина генома вируса ящура (8500 н.о.);
рибонуклеозида
Мw - средний молекулярный вес рибонуклеозида (340,5 Да);
6
1/10 - коэффициент перевода массы из [мкг] в [г].
В результате преобразований получаем, что .
146S
10
Таким образом, теоретически число молекул PHК в 7,46×10 больше концентрации 146S частиц (мкг/мл), что подтверждается экспериментально при проведении анализа разведений стандартов с известными концентрациями 146S частиц с помощью предложенного способа (Табл. 3). Степень достоверности определения количества молекул РНК, выделенных из суспензий вируса ящура с концентрациями 146S частиц от 0,1 до 4,0 мкг/мл, находилась в диапазоне от 95,03 до 99,02%.
146S
РНК146S
146S
РНК146S
2
На основе полученных данных о количестве молекул вирусной РНК в разведениях стандарта и концентрации 146S частиц им соответствующих построен калибровочный график зависимости C и N, который представлен в виде модели C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837 с достоверностью аппроксимации R=0,9996 (Фиг. 1). В отрицательном контроле вирус ящура не обнаружен.
Полученная модель на основе количества молекул РНК вируса ящура, выделенной из 146S частиц после их иммунного захвата, позволяет определять концентрацию цельных вирионов в культуральных вирусных суспензиях.
На заключительном этапе работы проводили тестирование неинактивированной суспензии вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011 для вакцины. Манипуляции по иммунному захвату 146S частиц и выделению из них РНК вируса ящура, а также оценку степени чистоты полученного 30х элюата РНК с помощью спектрального анализа и гель-электрофореза для пробы проводили так, как описано выше в примере 1. Результаты исследования представлены на фиг. 4 и 5А.
205-259
263-325
260-262
1
262
280
2
262
235
2
Из данных спектрограммы (Фиг. 4) видно, что средние значения OD и OD не превышают OD (0,001-0,801<0,802-0,810 и 0,801-0,003<0,802-0,810), следовательно, элюат выделенной РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Полученный препарат не загрязнен примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на графике отсутствуют выраженные пики при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R) составляет 1,995 (OD/OD=0,810/0,406), что приближено к норме 2,000 и означает высокую степень чистоты элюата РНК вируса ящура и практически полное отсутствие белка и остатков фенола после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R) составляет 1,990 (OD/OD=0,810/0,407), что близко к 2,000 и обуславливает высокую чистоту препарата. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие значение R уменьшается на 0,002, следовательно, в полученном элюате наличие полисахаридных примесей составляет не более 5% (доля примесей полисахаридов =((2,000-1,990)⋅100%)/0,002), что допустимо.
По результатам гель-электрофореза препарата денатурированной РНК, выделенной из 146S частиц пробы вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, видно, что вирусная РНК не деградирована, и элюат практически не содержит фрагментов ДНК (Фиг. 5А). Таким образом, препарат РНК, выделенной из пробы вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, имеет высокую степень чистоты, что позволяет с высокой достоверностью определить число молекул РНК.
262
320
260
к-
По итогам спектрометрического исследования средние значения OD составляют 0,810±0,001, OD - 0,003±0,000, OD - 0,006±0,000. Исходя из полученных данных, рассчитывают число структурных частиц в элюате, пользуясь формулой:
146S
РНК146S
146S
РНК146S
Среднеарифметическое количество молекул РНК, выделенных из 146S частиц вируса ящура штамма Азия-1 2145/Таджикистан/2011, составляет 225 366 856 349±281 356 874. Пользуясь разработанной линейной моделью связи C и N, отраженной функцией C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837, определили значение концентрации 146S частиц вируса ящура штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, которое составило 3,132±0,004 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (3,150±0,170 мкг/мл) и ОТ-ПЦР-РВ (3,136±0,040 мкг/мл) (Табл. 4). Отсюда следует, что разработанная с помощью данных спектрального анализа линейная модель позволяет оценивать концентрацию 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Пример 2. Определение концентрации 146S частиц культурального вируса ящура штамма А №2029/Турция/2006 в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины спектрометрическим методом по количеству выделенной вирусной РНК после иммунного захвата вирионов.
Подготовку пробы, проведение спектрального анализа и гель-электрофореза РНК, выделенной из 146S частиц вируса ящура штамма А №2029/Турция/2006 неинактивированного сырья для вакцины, осуществляли так же, как указано в примере 1. Результаты исследования представлены на фиг. 4, 5Б и в таблице 4.
260-262
1
262
280
2
262
235
2
Из данных спектрограммы 30х элюата РНК вируса ящура штамма А №2029/Турция/2006 (Фиг. 4, табл. 4) следует, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD (0,001-0,482<0,483-0,488 и 0,487-0,002<0,483-0,488), иными словами, препарат полученной РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Элюат не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, так как на спектрограмме отсутствуют выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R) составляет 1,984 (OD/OD=0,488/0,246), что приближено к значению нормы 2,000 и означает высокую степень чистоты элюата РНК вируса ящура и практически полное отсутствие белка и остатков фенола после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R) соответствует значению 1,992 (OD/OD=0,488/0,245), что близко к 2,000 и обуславливает высокую чистоту препарата. При замещении 1% РНК на полисахариды коэффициент R снижается на 0,002, иными словами, в полученном препарате наличие углеводов не превышает 4% (доля примесей полисахаридов =((2,000-1,992)⋅100%)/0,002), что допустимо.
Из электрофореграммы элюата денатурированной РНК, выделенной из 146S частиц пробы вируса ящура штамма А №2029/Турция/2006, видно, что вирусная РНК не деградирована, и препарат не содержит фрагментов ДНК (Фиг. 5Б). Таким образом, 30х элюат РНК, выделенной из пробы вируса ящура штамма А №2029/Турция/2006, имеет высокую степень чистоты, что дает возможность с высокой достоверностью определить количество молекул РНК в препарате.
262
320
260К-
В результате спектрометрического анализа элюата РНК получены следующие средние значения экстинкции: OD=0,488±0,001, OD=0,002±0,000, OD=0,006±0,000. Пользуясь данными и формулой:
определяют среднее количество структурных частиц в элюате.
146S
РНК146S
146S
РНК146S
Среднеарифметическое число молекул РНК, выделенных из 146S частиц вируса ящура штамма А №2029/Турция/2006, составляет 135 051 299 685±281 356 875. Пользуясь разработанной линейной моделью связи C и N, отраженной функцией C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837, определили значение концентрации 146S частиц вируса ящура штамма А №2029/Турция/2006, которое составило 1,878±0,004 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,900±0,180 мкг/мл) и ОТ-ПЦР-РВ (1,895±0,032 мкг/мл) (Табл. 4). Таким образом, представленная линейная модель с помощью спектрального исследования позволяет оценивать концентрацию 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Пример 3. Определение концентрации 146S частиц культурального вируса ящура штамма О №2212/Приморский/2014 в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины спектрометрическим методом по количеству выделенной вирусной РНК после иммунного захвата вирионов.
Исследование пробы вируса ящура штамма О №2212/Приморский/2014 проводили так же, как отражено в примере 1.
205-259
263-325
260-262
1
262
280
2
262
235
Данные спектрального исследования продемонстрированы на фиг. 4 и в таблице 4, из которых видно, что средние значения OD и OD не превышают OD (0,001-0,311<0,312-0,314 и 0,311-0,001<0,312-0,314), следовательно, элюат выделенной РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Препарат не загрязнен примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, так как на спектрограмме отсутствуют выраженные пики при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R) соответствует значению 1,987 (OD/OD=0,314/0,158), что приближено к значению нормы 2,000 и означает практически полное отсутствие белка и остатков фенола в элюате РНК. Коэффициент экстинкции (R) составляет 2,000 (OD/OD=0,314/0,157), что соответствует норме (2,000) и обуславливает отсутствие полисахаридных остатков и признаков деградации вирусной РНК.
По итогам гель-электрофореза денатурированной РНК, выделенной из 146S частиц пробы вируса ящура штамма О №2212/Приморский/2014, вирусная нуклеиновая кислота не деградирована, и элюат не содержит фрагментов ДНК (Фиг. 5В). Исходя из данных спектрального анализа и электрофореза, полученный элюат РНК характеризуется высокой степенью чистоты, что позволяет с высокой достоверностью определить число структурных частиц (молекул РНК) в препарате.
262
320
260
К-
В результате спектрального анализа элюата вирусной РНК получены следующие средние значения оптической плотности: OD=0,314±0,002, OD=0,002±0,000, OD=0,006±0,000. Пользуясь данными и формулой:
146S
РНК146S
146S
РНК146S
рассчитывают среднее количество молекул РНК в элюате, которое составляет 86 095 203 549±562 713 749. Пользуясь предложенной линейной моделью связи C и N, отраженной функцией C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837, определили значение концентрации 146S частиц вируса ящура штамма О №2212/Приморский/2014, которое составило 1,198±0,008 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,21±0,150 мкг/мл) и ОТ-ПЦР-РВ (1,199±0,045 мкг/мл) (Табл. 4). Таким образом, представленная линейная модель с помощью спектрального исследования позволяет оценивать концентрацию 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Пример 4. Определение концентрации 146S частиц культурального вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины спектрометрическим методом по количеству выделенной вирусной РНК после иммунного захвата вирионов.
Подготовку пробы, проведение спектрального анализа и гель-электрофореза РНК, выделенной из 146S частиц вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 неинактивированного сырья для вакцины, осуществляли так же, как указано в примере 1. Результаты исследования приведены на фиг. 4, 5Г и в таблице 4.
260-262
1
262
280
2
262
235
2
По итогам спектрального анализа 30х элюата РНК вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD (0,001-0,403<0,404-0,407 и 0,403-0,001<0,404-0,407), следовательно, препарат выделенной РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Экстракт РНК не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на графике отсутствуют выраженные пики при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R) составляет 1,995 (OD/OD=0,407/0,204), что приближено к норме 2,000 и означает практически полное отсутствие белка и остатков фенола после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R) соответствует значению 1,995 (OD/OD=0,407/0,204), что близко к 2,000 и обуславливает высокую чистоту элюата. При замещении 1% РНК на полисахаридные компоненты коэффициент R снижается на 0,002, следовательно, в полученном препарате наличие углеводов не превышает 2,5% (доля примесей полисахаридов =((2,000-1,995)⋅100%)/0,002), что допустимо.
Из электрофореграммы элюата денатурированной РНК, выделенной из 146S частиц пробы вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, видно, что РНК не деградирована, и препарат не содержит фрагментов ДНК (Фиг. 5Г). Таким образом, по итогам спектрального анализа и гель-электрофореза полученный элюат имеет высокую степень чистоты, что дает возможность с высокой достоверностью определить количество молекул РНК в препарате.
262
320
260 к-
В результате спектрального исследования экстракта РНК вируса ящура получены следующие средние значения экстинкции: OD=0,407±0,001, OD=0,003±0,000, OD=0,006±0,000. Пользуясь данными и формулой:
определяют среднее количество структурных частиц в элюате.
146S
РНК146S
146S
РНК146S
Среднеарифметическое число молекул РНК, выделенных из 146S частиц вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, составляет 111 698 679 114±281 356 870. Пользуясь разработанной линейной моделью связи C и N, отраженной функцией C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837, определили значение концентрации 146S частиц вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, которое составило 1,553±0,004 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,580±0,170 мкг/мл) и ОТ-ПЦР-РВ (1,555±0,041 мкг/мл) (Табл. 4). Таким образом, представленная линейная модель с помощью спектрального исследования позволяет оценивать концентрацию 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Пример 5. Определение концентрации 146S частиц культурального вируса ящура штамма О №2147/Приморский/2012 в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины спектрометрическим методом по количеству выделенной вирусной РНК после иммунного захвата вирионов.
Исследование пробы вируса ящура штамма О №2147/Приморский/2012 проводили так же, как отражено в примере 1.
205-259
263-325
260-262
1
262
280
2
262
235
Данные спектрального исследования продемонстрированы на фиг. 4 и в таблице 4, из которых видно, что средние значения OD и OD не превышают OD (0,002-0,335<0,336-0,339 и 0,334-0,001<0,336-0,339), следовательно, экстракт РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Элюат не загрязнен примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, так как на спектрограмме отсутствуют выраженные пики при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R) составляет 1,982 (OD/OD=0,339/0,171), что приближено к значению нормы 2,000 и означает практически полное отсутствие белка и остатков фенола в элюате РНК. Коэффициент экстинкции (R) соответствует значению 1,994 (OD/OD=0,339/0,170), что близко к норме (2,000), следовательно, обуславливает отсутствие признаков деградации вирусной РНК и содержание полисахаридных примесей в количестве, не превышающим 3% (доля примесей полисахаридов =((2,000-1,994)⋅100%)/0,002), что является допустимым.
В результате проведения гель-электрофореза денатурированной РНК, выделенной из 146S частиц пробы вируса ящура штамма О №2147/Приморский/2012, выявлено, что вирусная нуклеиновая кислота не деградирована, и элюат не содержит фрагментов ДНК (Фиг. 5Д). Исходя из данных спектрального анализа и электрофореза, полученный элюат РНК характеризуется высокой степенью чистоты, что позволяет с высокой достоверностью определить число молекул РНК в препарате.
262
320
260 к-
В результате спектрального исследования экстракта вирусной РНК получены следующие средние значения оптической плотности: OD=0,339±0,002, OD=0,001±0,000, OD=0,006±0,000. Пользуясь данными и формулой:
146S
РНК146S
146S
РНК146S
рассчитывают среднее количество молекул РНК в элюате, которое составляет 93 410 482 282±562 713 747. Пользуясь разработанной линейной моделью связи C и N, отраженной функцией C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837, определяем значение концентрации 146S частиц вируса ящура штамма О №2147/Приморский/2012, которое составило 1,299±0,008 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (1,33±0,160 мкг/мл) и ОТ-ПЦР-РВ (1,302±0,052 мкг/мл) (Табл. 4). Таким образом, представленная линейная модель с помощью спектрального исследования позволяет оценивать концентрацию 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Пример 6. Определение концентрации 146S частиц культурального вируса ящура штамма САТ-2 Саудовская Аравия 7/2000 в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины спектрометрическим методом по количеству выделенной вирусной РНК после иммунного захвата вирионов.
Подготовку и исследование пробы спектрометрическим методом и с помощью гель-электрофореза проводили так же, как указано в примере 1. Результаты исследования приведены на фиг. 4, 5Е и в таблице 4.
260-262
1
262
280
2
262
235
2
В результате спектрального анализа 30х элюата РНК вируса ящура штамма САТ-2 Саудовская Аравия 7/2000 определили, что средние значения оптической плотности при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD (0,002-0,199<0,200-0,203 и 0,198-0,001<0,200-0,203), иными словами, элюат вирусной РНК отличается высокой степенью чистоты. Препарат РНК не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, фенола, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на графике отсутствуют выраженные пики при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R) составляет 1,971 (OD/OD=0,203/0,102), что приближено к норме 2,000 и означает практически полное отсутствие белковых компонентов и остатков фенола в экстракте РНК. Коэффициент экстинкции (R) соответствует значению 1,990 (OD/OD=0,203/0,102), что близко к 2,000 и обуславливает высокую чистоту элюата. При замещении 1% РНК на углеводы коэффициент R снижается на 0,002, иными словами, в полученном препарате наличие полисахаридов не превышает 5% (доля примесей углеводов =((2,000-1,990)⋅100%)/0,002), что допустимо.
Из электрофореграммы элюата денатурированной РНК, выделенной из 146S частиц пробы вируса ящура штамма САТ-2 Саудовская Аравия 7/2000, видно, что РНК не деградирована, и препарат не содержит фрагментов ДНК (Фиг. 5Е). Таким образом, по итогам спектрального анализа и гель-электрофореза полученный элюат характеризуется высокой степенью чистоты, что дает возможность с высокой достоверностью определить количество молекул РНК в препарате.
262
320
260
к-
По итогам спектрального исследования экстракта РНК вируса ящура получены следующие средние значения экстинкции: OD=0,203±0,002, OD=0,002±0,000, OD=0,006±0,000. Пользуясь данными и формулой:
определяют среднее количество структурных частиц в элюате.
146S
РНК146S
146S
РНК146S
Среднеарифметическое число молекул РНК, выделенных из 146S частиц вируса ящура штамма САТ-2 Саудовская Аравия 7/2000, составляет 54 864 590 497±562 713 752. Пользуясь разработанной линейной моделью связи C и N, отраженной функцией C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837, определили значение концентрации 146S частиц вируса ящура штамма САТ-2 Саудовская Аравия 7/2000, которое составило 0,764±0,008 мкг/мл, что коррелирует с результатами РСК (0,750±0,140 мкг/мл) и ОТ-ПЦР-РВ (0,765±0,044 мкг/мл) (Табл. 4). Таким образом, представленная линейная модель с помощью спектрального исследования позволяет оценивать концентрацию 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
2
146S
РНК146S
Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность исследования суспензий вируса ящура для определения концентрации 146S частиц в сырье для вакцины в течение 3-4 часов. В предлагаемом изобретении между концентрацией 146S частиц и количеством молекул РНК, выделенных из вирионов после специфического иммунного захвата и определенных спектрометрическим методом по формуле  установлена зависимость, которая представлена в виде линейной функции с высокой достоверностью аппроксимации R=0,9996. Разработанная модель имеет вид C=(3,9⋅N+566783689)/280818944837 и дает возможность оценивать значение концентрации 146S частиц разных типов в неинактивированном сырье для производства вакцины.
Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять значение концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе спектрометрического метода с последующим применением предложенной линейной модели.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов»:
1. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
th
2. Lubroth, J., Rodriguez, L. and Dekker, A. (2006) Vesicular diseases. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., D'Allaire, S. and Taylor, D.J., editors. Diseases of Swine. 9 ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. p. 517-536.
3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson [et al.] // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.
th
4. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - 7 ed. - Paris, 2012. - Vol. 1. Chap. 2.1.5. - p. 166-169.
5. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2). - 2006. - P. 581-585.
6. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.
7. Ross K.S. Repeated freezing and thawing of peripheral blood and DNA in suspension: effects on DNA yield and integrity / K.S. Ross, N.E. Haites, K.F. Kelly // Journal of Medical Genetics. - 1990. - Vol. 27 (9). - P. 569-570.
8. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. - М.: Высшая школа, 1989. - С. 20-22.
9. Glasel J. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios // BioTechniques. - 1995. - Vol. 18 (1). - P. 62-63.
10. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com (13 января 2010). Проверено 24 декабря 2018. http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm.
11. Voet D. Absorption spectra of nucleotides, polynucleotides, and nucleic acids / D. Voet, W. B. Gratzer, R. A. Cox, P. Doty // Biopolymers. - 1963. - Vol. 1(3). - P. 193-208.
12. Zhang R. Carbon black induced DNA damage and conformational changes to mouse hepatocytes and DNA molecule: A combined study using comet assay and multi-spectra methods / R. Zhang, X. Zhang, C. Jia, J. Pan, R. Liu // Ecotoxicol Environ Saf. - 2019. - Vol. 170. - P. 732-738.
13. Tataurov A.V. Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids / A.V. Tataurov, Y. You, R. Owczarzy // Biophys. Chem. - 2008. - Vol. 133 (1-3). - P. 66-70.
14. Досон P. Справочник биохимика: Пер. с англ. - М.: Мир. - 1991. - С. 467.
15. Крешков А.П. Основы аналитической химии. Физико-химические (инструментальные) методы анализа. - Изд. «Химия». - 1970. - 472 с.
16. Капорский Л.Н. Оптическая плотность // Физическая энциклопедия / Гл. ред. А.М. Прохоров. - М.: Большая Российская энциклопедия. - 1992. - Т. 3. - С. 441.
17. Strohmaier, K. Die Struktur des Virus der Maul-und Klauenseuche / K. Strohmaier, K.-H. Adam // Zbl. Vet.-med. B. - 1976. - Bd. 23, №5/6. - S. 483-506.