Анализ изоферментов при изучении внутривидового полиморфизма возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, № 3, с. 80-85

УДК 633.854.78:581.2:577.15

АНАЛИЗ ИЗОФЕРМЕНТОВ ПРИ ИЗУЧЕНИИ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛОЖНОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЫ ПОДСОЛНЕЧНИКА*

С.З. ГУЧЕТЛЬ, Т.С. АНТОНОВА, Н.М. АРАСЛАНОВА, Т.А. ЧЕЛЮСТНИКОВА, М.В. ИВЕБОР, С.А. РАМАЗАНОВА

Оптимизировали условия электрофореза в горизонтальном крахмальном геле применительно к изоферментам возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника (Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni) и оценивали степень изоферментного полиморфизма у разных рас популяции.

Ключевые слова: ложная мучнистая роса, подсолнечник, Plasmopara halstedii, расы, изоферменты, полиморфизм.

Интенсификация сельского хозяйства является многофакторной причиной образования разновидностей и физиологических рас патогенных грибов — возбудителей болезней сельскохозяйственных растений. Новые расы грибов возникают в результате гибридизации, мутаций, гетерокариозиса и т.д. Расообразование ускоряется при нарушении сроков севооборота культуры, интродукции инфицированного семенного материала. Увеличение в процессе селекции количества генетически разнородных сельскохозяйственных культур создает экологические ниши для образовавшихся физиологических рас патогена, идентификация и дифференциация которых остается актуальной и достаточно трудной задачей при селекции устойчивых сортов. Это относится и к возбудителю ложной мучнистой росы подсолнечника.

Ложная мучнистая роса (ЛМР) является одним из наиболее вредоносных и распространенных в мире заболеваний подсолнечника. Возбудитель этой болезни — гриб Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni относится к классу Oo-mycetes (порядок Peronosporales, сем. Peronosporaceae). По разным сведениям, у него насчитывается от 11 до 17 рас, паразитирующих на растениях подсолнечника (1, 2). В регионах Северного Кавказа к настоящему времени обнаружено семь рас (3). Идентификация рас этого патогена осуществляется с помощью тест-набора линий-дифференциаторов, которые с 2000 года используются как международный стандарт для определения патотипов возбудителя ЛМР (4). При этом не всегда удается четко дифференцировать некоторые патотипы патогена, выявить связь между ними, обнаружить внутрирасовую изменчивость, обусловленную накоплением признаков адаптации к генетическим изменениям хозяина.

В последние годы проблема идентификации и наблюдения эволюционных изменений у патогенных грибов успешно решается с помощью белковых и ДНК-маркеров (5-7). Лебедева для сравнения «ячменных» и «ржаных» изолятов R secalis использовала анализ шести изоферментных систем и один RAPD-праймер (8). Для 20 изолятов Rhizoctonia solani подгрупп AG1-1A и AG1-1B исследование 15 изоферментных систем подтвердило деление образцов на соответствующие группы (9). Komjati с соавт. анализировали две изоферментные системы при изучении природы локальных популяций P. halstedii на территории Венгрии и прилегающей к ней части Сербии (10). В основном полевые изоляты изученных ими рас оказались гомозиготными и мономорфными по этим биохимическим признакам.

Целью нашей работы была оптимизация условий для электрофоретического разделения изоферментов возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в горизонтальном крахмальном геле и оценка степени их полиморфизма у разных рас.

Методика. Для выявления внутривидовых различий P. halstedii мы анализировали 41 изолят четырех рас: 330, 700, 710 и 730 — соответственно 19, 1, 8 и 13 изолятов, собранных с пораженных растений подсолнечника разных сортообразцов в различных районах Краснодарского края в 2004-2006 годах (табл. 1). Расовую принадлежность изолятов определяли в соответствии с номенклатурой, предложенной Tourvielle de Labrouhe с соавт. (4). Искусственное заражение растений подсолнечника линий-дифференциаторов осуществляли по общепринятой методике погружением корней проростков в инокулюм зооспор (11).

1. Изоляты рас возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника (Plasmopara halstedii), использованные в эксперименте

№ изо- лята Раса Место сбора Сортообразец- хозяин Дата сбора изолята

1 330 Краснодар, селекционное поле ВНИИМК Селекционный образец 1 9.03.05

2 330 То же поле Селекционный образец 2 9.03.05

3 330 То же поле Селекционный образец 3 07.06.06

4 330 То же поле Селекционный образец 4 06.06.06

5 330 То же поле Селекционный образец 5 9.06.04

6 330 То же поле ВК 680 30.05.05

7 330 Каневской р-н, колхозное поле Флагман 16.05.05

8 330 Каневской р-н, фермерское поле Мастер 16.05.05

9 330 Каневской р-н, поле 1 Арена 17.05.05

10 330 То же поле Арена 17.05.05

11 330 Каневской р-н, станица Новоминская, Албаши Родник 16.05.05

12 330 Станица Выселки Родник 27.06.05

13 330 То же поле Родник 27.06.05

14 330 Краснодар, демонстрационное поле ВНИИМК Не известен 22.06.05

15 330 То же поле Не известен 22.06.05

16 330 То же поле ВК 678 22.06.05

17 330 То же поле ВК 678 19.06.06

*

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Краснодарского края (грант № 06-04-96641).

18 330 То же поле ВК 678 19.06.06

19 330 То же поле ВК 678 19.06.06

20 700 Станица Выселки, поле 1 PR64F83 27.06.04

21 710 Не известно Гибрид 27.05.05

22 710 Станица Выселки, поле 1 PR64F83 27.06.04

23 710 Станица Выселки Родник 27.06.05

24 710 То же поле Родник 27.06.05

25 710 То же поле Родник 27.06.05

26 710 То же поле Родник 27.06.05

27 710 То же поле Родник 27.06.05

28 710 То же поле Родник 27.06.05

29 730 Не известно Гибрид 27.05.05

30 730 Краснодар, демонстрационное поле ВНИИМК ВК 678 22.06.05

31 730 Краснодар, селекционное поле ВНИИМК Родник 27.06.05

32 730 Станица Выселки Родник 27.06.05

33 730 То же поле Родник 27.06.05

34 730 То же поле Родник 27.06.05

35 730 То же поле Родник 27.06.05

36 730 То же поле Родник 27.06.05

37 730 То же поле Родник 27.06.05

38 730 То же поле Родник 27.06.05

39 730 То же поле Родник 27.06.05

40 730 То же поле Родник 27.06.05

41 730 То же поле Родник 27.06.05

Конидиальное спороношение было собрано с семядольных листьев проростков восприимчивого сорта подсолнечника ВНИИМК 8883, искусственно зараженных зооспорами изолята. Материал (2-5 мкг) гомогенизировали вручную стеклянным пестиком в плексигласовых лунках в 20 мкл 0,1 М трис-HCl буфера с добавлением 0,1 % поливинилпирро-лидона. Изоферменты патогена экстрагировали погружением в гомогенат кусочков ватмана ЗММ.

В лаборатории иммунитета и электрофореза Всероссийского НИИ масличных культур (ВНИИМК) для анализа изоферментов подсолнечника применяется электрофорез в крахмальном геле (12). Эта методика была оптимизирована для разделения изоферментов P. halstedii. Сравнивались 13 изоферментных систем: эстераза (EST, К.Ф. 3.1.1.1), аспарта-таминотрансфераза (ААТ, К.Ф. 2.6.1.1), глутаматдегидрогеназа (GDH, К.Ф. 1.4.1.2), кислая фосфатаза (АСР, К.Ф.3.1.3.2), супероксиддисмутаза (SOD, К.Ф. 1.15.1.1), лейцинаминопептидаза (LAP, К.Ф. 3.4.11.1), шикиматдегидроге-наза (SKDH, К.Ф. 1.1.1.25), алкогольдегидрогеназа (ADH, К.Ф. 1.1.1.1), малатдегидрогеназа (MDH, К.Ф. 1.1.1.37), глюкозофосфатдегидрогеназа (GPI, К.Ф. 5.3.1.9), фосфоглюкомутаза (PGM, К.Ф. 2.7.5.1), 6-фосфогюконатдегидрогеназа (6PGD, К.Ф. 1.1.1.44), малик-энзим (МЕ, К.Ф.1.1.1.40).

Электрофорез выполняли в 13 % горизонтальном крахмальном геле с добавлением 2,04 % сахарозы. Гелевые и электродные буферные системы подбирали экспериментально. Процедуру проводили в трех буферных системах для сравнения степени разрешения при разделении белковых продуктов изоферментных локусов (табл. 2).

Продолжительность электрофореза 6-7 ч при постоянной силе тока 45 мА и переменном напряжении 50-70 В. После электрофореза гелевую пластину разрезали тонкой нихромовой нитью на 5-6 частей. Зоны энзиматической активности выявляли гистохимическим окрашиванием по стандартным прописям Vallejos (13).

Результаты. Из буферных систем, использованных при электрофоретическом разделении ферментов, оптимальной для SOD оказалась буферная система I, для АСР, MDH, GPI, PGM, 6PGD, МЕ, EST — III.

2. Характеристика активности изоферментов возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника (Plasmopara halstedii) при электрофоретическом разделении в различных буферных системах

Буферная система* Состав буфера Изофермент Ферментативная активность

гелевого 1 электродного

I 0,045 М Trizma base 0,3 М борная кислота EST +

0,001 М ЭДТА 0,1 М гидроксид на- ААТ -

0,025 М борная кислота трия GDH -

рН 8,6 (доводится HCl) рН 8,6 АСР +

SOD +

LAP -

SKDH -

ADH -

II 0,009 М L-гистидин 0,065 М L-гистидин EST +

0,004 М лимонная 0,03 М лимонная АСР +

кислота • Н2О кислота • Н2О ADH -

рН 5,7 рН 5,7 MDH +

GPI +

PGM +

6PGD +

МЕ +

III 0,009 М L-гистидин 0,065 М L-гистидин EST +

0,003 М лимонная 0,02 М лимонная АСР +

кислота • Н2О кислота • Н2О ADH -

рН 6,1 рН 6,1 MDH +

GPI +

PGM +

6PGD +

МЕ +

* Модифицированные буферные системы: I — Портера (14); II, III — - Cardy с соавт. (15).

У LAP, ADH, SKDH, AAT, GDH не проявилась энзиматическая активность (см. табл. 2). Таким образом, из 13 изоферментов, выбранных для оценки различий между изолятами P. halstedii, лишь восемь сохраняли активность при электрофоретическом разделении.

Полиморфизм электрофоретических спектров был обнаружен по одному изоферменту — эстеразе (EST). Эстераза возбудителя ЛМР на электрофореграммах была представлена двумя зонами ферментативной активности. Мы обозначили их римскими цифрами (II, I) в порядке увеличения электрофоретической подвижности изоферментов по направлению к аноду (рис.).

Электрофоретические спектры эстеразы у изолятов возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника

700 (6) и 330 (9, 10, 11, 12): 1, 3, 6, 7, 9, 10, 11, 12; 4 и 2, 5, 8 — соответственно фенотип EST 1-FF; EST 1-SS и EST 1-FS. I и II — зоны ферментативной активности.

В зоне II на всех элекрофореграммах регистрировали одну мономорфную фракцию. В зоне I у разных изолятов было выявлено три типа изоферментных спектров — два однополосных и один двухполосный. Однополосные спектры, имеющие меньшую электрофоретическую подвижность изоферментов по направлению к аноду, мы обозначили как EST 1-SS (slowly), большую подвижность — как EST 1-FF (fast), а двухполосные — EST 1-FS. Подобная аббревиатура была принята нами ранее при изучении полиморфных изоферментных вариантов подсолнечника (12). Поскольку эстераза мономерна, появление двухполосных спектров свидетельствует о гибридном характере изоформ. Все исследованные изо-ляты рас 330 и 700 были мономорфными и имели фенотип EST 1-FF. Полиморфизм эстеразы наблюдался среди изолятов рас 710 и 730.

Из восьми изолятов расы 710 пять (с разных полей и разных хозяев) были гомозиготными и имели фенотип EST 1-FF, а три (с одного поля и одного хозяина) — гетерозиготными (EST 1-FS) (№№ 25, 27, 28) (см. табл. 1). Из 13 изолятов расы 730 десять (преимущественно с одного поля и одного хозяина — растения подсолнечника сорта Родник) имели фенотип EST 1-FF, а два были гетерозиготными — EST 1-FS (№№ 38 и 40, станица Выселки) (см. табл. 1). В то же время аллозимный вариант EST 1-SS не был выявлен в выборке изолятов с этого поля, однако он был обнаружен у изолята № 30 (см. табл. 1) с другого хозяина (ВК 678) и другого поля — в Краснодаре на расстоянии около 140 км от станицы Выселки.

При анализе семи изоферментных систем (АСР, MDH, GPI, PGM, 6PGD, МЕ, SOD) нам не удалось выявить полиморфизм у исследованных изолятов. Komjati с соавт., изучавшие субпопуляции возбудителя ЛМР в Венгрии и Сербии методом целлюлозно-ацетатного гель-электрофореза изоферментов, обнаружили полиморфизм по GPI и PGM (10). Редкие контрастные аллозимные варианты GPI 100/113 и PGM 90/90 (обозначения авторов) встречались там с 1993 по 2000 годы преимущественно у изолятов рас 100 и 700. Возможно, отсутствие полиморфизма по этим изоферментам в нашей коллекции объясняется ограниченным генотипическим разнообразием растений-хозяев и редкой встречаемостью рас 100 и 700 на территории Краснодарского края, что не позволило использовать достаточную выборку изолятов этих патотипов. Кроме того, изучение рас патогена на Северном Кавказе началось сравнительно недавно, коллекция изоля-тов была собрана с 2004 по 2006 годы. Не исключено также, что альтернативные аллозимные варианты этих изоферментных систем присутствовали у рас, но в ходе естественного отбора произошла их элиминация. Косвенным подтверждением такого предположения является то, что контрастными аллозимами обладали «старые» венгерские расы 100 и 700.

Результаты нашей работы показывают, что популяция возбудителя ЛМР Краснодарского края характеризуется слабой внутривидовой вариабельностью по изученным изоферментам. Аналогичные результаты были получены авторами, анализировавшими молекулярно-генетическую структуру популяций этого патогена в других странах (10, 16). Охарактеризованные нами изоляты оказались полиморфными лишь по одной изоферментной системе. Но даже по этому признаку не было выявлено существенных различий между расами, поскольку преобладающим аллозимным вариантом являлся EST 1-FF, встречающийся у 85 % всех изученных изолятов четырех рас. Гетерозиготным фенотипом EST 1-FS обладали 12 % изолятов, у одного изолята (3 %) был обнаружен аллозим EST 1-SS.

Наличие альтернативных аллозимных вариантов у изолятов одной расы свидетельствует о внутрирасовой изменчивости P. halstedii. Komjati с соавт. предполагают, что гетерозиготные фенотипы изолятов возникают из-за возможного загрязнения одного изолята зооспорами другого (10). В нашем случае, когда в коллекции преобладал аллозим EST 1-FF, а контрастный ему EST 1-SS встречался всего один раз, гетерозиготный фенотип скорее всего не результат смешения зооспор, содержащих разный генетический материал, а истинная гетерозиготность патотипа. Мы имеем дело с физиологическими расами, которые, обладая одним и тем же набором генов вирулентности, могут быть гетерогенными по другим локусам. Наличие гетерозиготных фенотипов также свидетельствует о том, что при естественном расообразовании возможна гибридизация рас с разными генетическими характеристиками.

Таким образом, нами показано, что популяция возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника в Краснодарском крае имеет низкую внутривидовую вариабельность по изученным изоферментам. Существует внутрирасовый полиморфизм по изоферменту эстеразе у рас 710 и 730. Для выявления внутривидовой изменчивости Plasmopara halstedii,

поражающей растения подсолнечника, метод электрофореза изоферментов в крахмальном геле применен впервые. Анализ изоферментов может служить надежным средством наблюдения за эволюцией этого патогена. Изменение частоты аллозимных вариантов у рас и появление вариантов, ранее не наблюдавшихся, будет сигнализировать о накоплении генетической изменчивости и возникновении новых, возможно, более вирулентных патотипов возбудителя.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. V e a r F., T o u r v i e i l l e de L a b r o u h e D., M i l l e r J.F. Inheritance of the wide-range downy mildew resistance in the sunflower line RHA 419. Helia, 2003, 26, 39: 19-24.

2. V i r a n y i F. Downy mildew research in sunflower: facts and consideration (based on reports of to the FAO sub-group, Plasmopara halstedii for 19992001). FAO Technical Meeting, 7-9.10.2002, ENSAM-INRA, Montpellier, France, 2002: 10-15.

3. И в е б о р М.В., А н т о н о в а Т.С. Популяция возбудителя ложной мучнистой расы подсолнечника на Северном Кавказе. В сб.: Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника. Краснодар, 2006: 105-109.

4. T o u r v i e i l l e d e L a b r o u h e D., G u l y a T.J., R a s h i d Y.K. e.a. New nomenclature of race of Plasmopara halstedii (sunflower downy mildew). In: 15th International Sunflower Conference, Toulouse, France, 2000, 2: 161-166.

5. S h e p h e r d S.J., V a n W e s t P., G o w N.A.R. Proteomic analysis of asexual development of Phytophthora palmivora. Micol. Res., 2003, 107, 4: 395-400.

6. B a k o n y i J., L a d a y M., D u l a T. e.a. Characterization of isolates of Phitophtora infestans from Hungary. Eur. J. Plant Pathol., 2002, 108, 2: 139146.

7. Б у л а т С.А., М и р о н е н к о Н.В. Идентификация грибов и анализ их генетической изменчивости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с геноспецифичными и неспецифичными праймерами. Генетика, 1996, 32, 2: 165-183.

8. Л е б е д е в а Л.В. Специализация гриба Rhynchosporum secalis (Oud.) J.J. Davis, паразитирующего на ячмене. Мат. Второго Всерос. съезда по защите растений. СПб, 2005, I: 496-498.

9. M o h a m m a d i M., B a n i h a s h i m e M., H e d j a r o u d e G.-A. e.a. Genetic diversity among Iranian isolates of Rhizoctonia solani Kuhn. an-astamosis 1 subgroups based on isozyme analysis and total soluble protein pattern. J. Phytopathol., 2003, 151, 3: 162-170.

10. K o m j a t i H., B a k o n y i J., V i r a n y i F. Isoenzyme analysis: a tool for characterizing subpopulations of Plasmopara halstedii. In: Proc. 16th International Sunflower Conference. Fargo, North Dakota, USA, 2004, 1: 93-97.

11. А н т о н о в а Т.С., А р а с л а н о в а Н.М., Г о л о в и н А.В. и др. К вопросу о расовой принадлежности возбудителя ложной мучнистой росы на подсолнечнике на Северном Кавказе. Науч.-техн. бюл. ВНИИМК, 2000, 123: 16-20.

12. Т у р к а в С.З., Л о с к у т о в А.В., Г у б е н к о Т.П. Оценка генетической чистоты линий и гибридов подсолнечника с помощью изоферментных маркеров. Науч.-техн. бюл. ВНИИМК, 1996, 117: 33-37.

13. V a l l e j o s C.E. Enzyme activity staining. In: Isozymes in plant genetics and breeding: Part A. Amsterdam, Elsevier, 1983: 469-516.

14. Л е в и т е с Е.В. Генетика изоферментов растений. Новосибирск, 1986.

15. C a r d y B.S., S t u b e r C.W., G o o d m a n M.M. Techniques for starch gel electrophoresis of enzymes for maize (Zea mays L.). North Carolina State Univers, 1981.

16. R o e c k e l - D r e v e t P., T o u r v i e i l l e J., G u l y a T.J. e.a. Molecular variability of sunflower downy mildew, Plasmopara halstedii from different continent. Can. J. Microbiol., 2003, 49(8): 492-502.

ГНУ Всероссийский НИИ масличных культур Поступила в редакцию

им. В. С. Пустовойта, 19 февраля 2007 года

350038 г. Краснодар, ул. Филатова, 17, e-mail: vniimk-center@narod.ru

ANALYSIS OF ISOENZYMES DURING THE RESEARCH OF INTRASPECIFIC POLYMORPHYSM IN SUNFLOWER DOWNY MILDEW

S.Z. Guchetl’, T.S. Antonova, N.M. Araslanova, T.A. Chelyustnikova, M.V. Ivebor, S.A. Ramazanova S u m m a r y

The authors optimized the horizontal starch gel electrophoresis method in conformity with isoenzymes of sunflower downy mildew (Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni) in Krasnodar region. The analysis of intraspecific variability in P. halstedii by means of АСР, MDH, GPI, PGM, 6PGD, МЕ, EST, GOT isoenzymatic systems was made. It was shown that interracial differences on esterase are inessential. The seven others isoenzymatic systems are monomorphous for all studied isolated races 330, 700, 710, 730. The population of sunflower downy mildew in Krasnodar region has low intraspecific variability on studied isoenzymatic spectrums.