ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ШТАММА BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ СИМПТОМОВ СИНДРОМА РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА
BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM STRAINS FOR APPLICATION IN GASTROINTESTINAL DISEASES

В настоящее время заболевания, связанные с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта и/или связанные с нежелательной воспалительной активностью в желудочно-кишечном тракте, являются широко распространенными. Заболевания обеих групп характеризуются абдоминальной болью, чувством дискомфорта, вздутием, метеоризмом, диареей, запором, нарушением пищеварения, императивным позывом к дефекации и/или уменьшением и/или увеличением частоты стула, чувством неполного опорожнения кишечника и/или их сочетаниями, и вызывают существенное ухудшение общего самочувствия человека, страдающего этими заболеваниями. В частности, эффективное лечение синдрома раздраженного кишечника (СРК) до сих пор отсутствует (Brenner and Chey, 2009). Применение нескольких лекарственных препаратов при СРК, было прекращено или ограничено по причине неблагоприятного воздействия на здоровье. Кроме того, существующее лечение в основном направлено на отдельные симптомы и не приводит к ослаблению СРК и повышению качества жизни (КачЖ) в целом.
Принято считать, что заболевания, коррелирующие с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, такие как СРК или воспалительные заболевания кишечника, сопровождаются (i) нарушением баланса микробиоценоза кишечника (Kassinen et al, 2007) и/или (ii) нарушением барьерной функции желудочно-кишечного тракта (Marshall et al, 2004). Полагают, что это приводит к снижению в желудочно-кишечном тракте количества пробиотических бактерий, таких как Bifidobacteria. Кроме того, считается, что нарушение функций кишечного барьера вызывает нежелательное проникновение факультативных патогенных бактерий в слизистую оболочку, что может впоследствии приводить к воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте. Недавно проведенные исследования предполагают, что воспаление приводит к возникновению характерных симптомов СРК, таких как боль, нарушение моторики и дисфункция кишечника.
Нарушение баланса микробиоценоза кишечника в основном характеризуется снижением числа непатогенных микроорганизмов, живущих в организме человека, таких как Bifidobacteria, тогда как количество факультативных патогенных микроорганизмов, таких как Enterobacteria, повышается (Jian-Min et al., 2004). Считается, что у людей такой дисбаланс вызывает повышение образования газообразных соединений и короткоцепочечных жирных кислот, нарушение моторики, скопление газов и боль. Таким образом, в попытках вернуть микробиоценоз кишечника в состояние равновесия в центре внимания оказались пробиотические бактерии. Предположительно, они оказывают благоприятное действие на иммунные функции за счет конкурентного ингибирования и могут благотворно воздействовать на организм-хозяин за счет улучшения микробного баланса кишечника. "Пробиотики", включающие пробиотические непатогенные бактерии, живущие в организме человека, обозначаются как живые микроорганизмы, входящие в состав пищевых продуктов и лекарств, которые помимо присущих им питательных свойств способны влиять на состояние здоровья при попадании внутрь в определенных количествах. Традиционно, с целью оказания положительного эффекта на состояние здоровья, в составе ферментированных молочных продуктов или лекарств использовали смеси различных микроорганизмов, в частности, некоторые виды Lactobacillus и Streptococcus.
В данной области было проведено много исследований, однако, поскольку дисбаланс микробиоценоза является только одной стороной медали, неудивительно, что большинство методов лечения, направленных только доставку пробиотиков в желудочно-кишечный тракт, не достигли успеха в ослаблении всех симптомов у пациентов, страдающих функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта. Например, диагностика СРК основана на Римских критериях III (Rome III), которые представляют собой: абдоминальную боль или дискомфорт по меньшей мере в течение 3 дней в месяц на протяжении последних трех месяцев с появлением симптомов по меньшей мере 6 месяцев назад, связанные по меньшей мере с двумя из следующих критериев: (а) облегчение после дефекации, (б) начало связано с изменением частоты стула или (в) с изменением формы стула, которые часто сопровождаются метеоризмом или вздутием, а также нарушением дефекации в форме запора и/или диареи. У пациентов с такими симптомами могут страдать социальные и личностные функции и снижаться качество жизни. Даже если удается в большой мере снять такие симптомы как боль/дискомфорт, вздутие/метеоризм, императивный позыв к дефекации, необходимо улучшить общее качество жизни (КачЖ) пациента, связанное с состоянием здоровья. В настоящее время ни один из методов лечения, включая пробиотики и др., не позволяет добиться облегчения симптомов боли/дискомфорта, вздутия/метеоризма и нарушения пищеварения одновременно с улучшением качества жизни КачЖ.
В связи с этим, следует принимать во внимание второй важный аспект в развитии функционального нарушения желудочно-кишечного тракта, который касается нарушения барьерной функции желудочно-кишечного тракта, характеризующегося его повышенной проницаемостью. Согласно одной распространенной теории, кишечные расстройства и расстройства иммунной системы позволяют патогенным микроорганизмам, которые могут преобладать в кишечника в случае дисбаланса микробиоценоза, проходить через барьер и проникать в слизистую оболочку, вызывая таким образом воспалительные реакции. Было проведено несколько исследований, основанных на этой гипотезе, которые были направлены на лечение и ослабление воспалительных реакций и их влияния на желудочно-кишечный тракт. Например, EP 1141235 описывает штамм Bifidobacterium longum infantis (В.infantis) UCC35624 для применения в пищевых добавках и лекарствах, который проявляет выраженную способность стимулировать противовоспалительный ответ хозяина за счет снижения уровней IL-8 (Whorwell et al, 2006) и нормализации соотношения IL-10/IL-12 (O'Mahony et al, 2005). Полагают, что эта способность может быть главным фактором, обусловливающим влияние штамма Bifidobacterium longum infantis UCC35624 на СРК и симптомы воспалительных заболеваний кишечника. Однако, в различных публикациях задается вопрос, может ли влияние В.infantis быть отнесено за счет прямых противовоспалительных свойств. Кроме того, несмотря на то, что у Lactobacillus salivarius также было продемонстрировано выраженное противовоспалительное действие in vitro и в моделях на мышах, сравнимое с таковым В.infantis, у этого микроорганизма не было обнаружено существенного влияния, ослабляющего СРК и его симптомы.
Наиболее важно то, что эффективность пробиотиков строго штаммоспецифична и только некоторые штаммы могут быть способны облегчать СРК и его симптомы. На сегодняшний день влияние пробиотиков на симптомы заболеваний, которые связаны с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, таким как СРК, было изучено в нескольких исследованиях (O'Mahony et al, 2005, Kajander et al, 2005; Williams et al, 2008; Guyonnet et al, 2007). Однако, только в некоторых из них было показано значимое улучшение. Кроме того, ни один пробиотический штамм не показал одновременно значимого влияния, ослабляющего симптомы синдрома раздраженного кишечника, и улучшения качества жизни. Эти данные могут быть объяснены тем фактом, что эффективность пробиотиков строго штаммоспецифична. Принято считать, что свойства одного пробиотического штамма не могут передаваться другому (Brenner and Chey, 2009). Следовательно, важно признавать, что эффективность и влияние отдельного пробиотического штамма не может быть предсказана, что подчеркивает важность тестирования и подтверждения эффективности отдельно взятого штамма. Для этой цели в экспериментальной части приводится описание методик.
Никогда ранее в исследованиях пробиотиков не было продемонстрировано одновременного подавления вышеупомянутых симптомов (боли/вздутия/метеоризма/императивного позыва к дефекации/нарушения пищеварения) и улучшения качества жизни пациента при таком заболевании, как СРК. Таким образом, существует значительная потребность в лечении, которое могло бы облегчить симптомы боли/дискомфорта, вздутия/метеоризма, императивного позыва к дефекации и нарушения пищеварения и общего качества жизни пациента, страдающего функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, с приведением микробиоценоза кишечника в состояние баланса, а также восстановлением функциональных свойств стенки кишечника.
2
2
В связи с вышеизложенным, в настоящем изобретении предложен штамм Bifidobacterium bifidum (В.bifidum) или его мутант или вариант для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающий индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, а также штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства, представляющий собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант, который не только продемонстрировал значимое облегчение симптомов абдоминальной боли/дискомфорта, вздутия/метеоризма, императивного позыва к дефекации и/или нарушения пищеварения при желудочно-кишечном заболевании, в частности СРК, но кроме этого одновременно позволил значительно улучшить качество жизни пациента. Также предложен пробиотический препарат и применение штамма и пробиотического препарата. Ослабление СРК в целом, наряду с облегчением отдельных симптомов боли/дискомфорта, вздутия/метеоризма, императивного позыва к дефекации и/или нарушения пищеварения с одновременным улучшением КачЖ при помощи штаммов по изобретению, таких как штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающий индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, или штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, представляющие собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант, было неожиданным результатом, поскольку из предшествующего уровня техники известно и общепризнано, что эффективность пробиотика строго штаммоспецифична и даже близкородственные представители штаммов одного вида Bifidobacterium как правило не обладают сравнимыми свойствами или даже являются неэффективными при желудочно-кишечных заболеваниях (Brenner and Chey, 2009). Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы изобретения полагают, что чрезвычайная и неожиданная эффективность штамма Bifidobacterium bifidum по изобретению, и в частности Bifidobacterium bifidum MIMBb75 обусловлена его способностью предупреждать прохождение патогенных бактерий через кишечный барьер желудочно-кишечного тракта и их проникновение в слизистую оболочку. Полагая, что нарушение барьерной функции обусловлено "дырами" или ослабленными участками кишечной стенки, через которые патогенные микроорганизмы могут проникать в слизистую оболочку, авторы изобретения считают, что адгезия непатогенных клеток к стенке кишечника снижает проницаемость барьера, действуя по принципу "затыкания дыр", и таким образом улучшает состояние кишечной стенки. Следовательно, штамм и пробиотический препарат по изобретению оказывают двойной положительный эффект на желудочно-кишечную флору и состояние здоровья, поскольку не только предупреждают воспалительные реакции слизистой оболочки, но также восстанавливают баланс микробиоценоза кишечника. Кроме того, очень важным является то, что подавление симптомов или самого заболевания также сохраняется во время «отмывочной» фазы, т.е. фазы после завершения терапии, когда, например, индивиду или пациенту больше не вводят штамм по изобретению, его мутант или вариант или пробиотический препарат, имеющий в своем составе штамм по изобретению, его мутант или вариант. В случае штамма, мутанта или варианта по изобретению, положительное влияние штамма, мутанта или варианта по изобретению сохраняется по отношению к вместе взятым симптомам СРК, абдоминальной боли/дискомфорту, вздутию/метеоризму и нарушению пищеварения во время «отмывочной» фазы, как будет подробно описано ниже, а также представлено в разделах «Примеры» и «Графические материалы».
2
Таким образом, в настоящем изобретении предложен штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства, причем штамм или его мутант или вариант демонстрируют адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладают индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5.
Предпочтительно, указанный штамм представляет собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант. Кроме того, предложен штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства, причем штамм представляет собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант. Указанный штамм, мутант или вариант особенно полезен для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного препарата для профилактики и/или лечения заболевания, связанного с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, сопровождающегося нежелательной воспалительной активностью в желудочно-кишечном тракте, дисбалансом микробиоценоза кишечника, снижением количества Bifidobacteria в желудочно-кишечном тракте и/или нарушением барьерной функции желудочно-кишечного тракта, и/или для применения с целью ослабления, предупреждения и/или лечения у индивида абдоминальной боли, дискомфорта, вздутия, метеоризма, императивного позыва к дефекации, нарушения пищеварения и/или уменьшения и/или увеличения частоты стула, чувства неполного опорожнения кишечника, вместе взятых симптомов СРК и/или их сочетания или для улучшения качества жизни пациента. Пригодность штамма, мутанта или варианта в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства для ослабления, предупреждения и/или лечения у индивида абдоминальной боли, дискомфорта, вздутия, нарушения пищеварения, метеоризма, императивного позыва к дефекации и/или уменьшения или увеличения частоты стула, чувства неполного опорожнения, вместе взятых симптомов СРК и/или их сочетания можно оценить по 7-балльной шкале Лайкерта, которую обычно используют в клинических исследованиях и которая будет описана ниже. Качество жизни (КачЖ) пациента можно оценить при помощи стандартного опросника SF-12, который также известен специалистам в данной области, используется в клинических испытаниях и признан в качестве стандарта для оценки КачЖ. Кроме того, в случае вместе взятых симптомов СРК, абдоминальной боли/дискомфорта, вздутия/метеоризма положительное влияние штамма, мутанта или варианта по изобретению сохраняется во время «отмывочной» фазы, как будет подробно описано ниже и представлено в разделах «Примеры» и «Графические материалы».
В одном воплощении заболевание выбрано из группы, состоящей из спастического колита, воспалительного заболевания кишечника, например, болезни Крона или язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, паучита или постинфекционного колита, рака желудочно-кишечного тракта, системного заболевания, такого как ревматоидный артрит, аутоиммунных заболеваний, обусловленных нежелательной воспалительной активностью, диарейного заболевания, обусловленного нежелательной воспалительной активностью, такого как диарея, вызванная Clostridium difficile, антибиотико-ассоциированная диарея, ротавирусная диарея или постинфекционная диарея, а также их сочетания, предпочтительно, заболевание представляет собой спастический колит.
В одном воплощении штамм, мутант или вариант по изобретению представляет собой генетически модифицированный мутант; либо штамм, его мутант или вариант представляет собой вариант естественного происхождения. В альтернативных воплощениях клетки штамма, мутанта или варианта являются жизнеспособными или нежизнеспособными. Приготовление продукта, содержащего нежизнеспособные клетки, проще, клетки можно легко ввести в состав лекарственных препаратов, а условия хранения являются гораздо менее строгими, чем в случае жизнеспособных клеток. Клетки могут быть убиты термически или путем изменения pH или воздействия давления. Однако, жизнеспособные клетки способны заселить желудочно-кишечный тракт индивида, страдающего от заболевания или симптома, которые описаны здесь, и таким образом, обладают большей эффективностью в ослаблении, предупреждении и/или лечении у индивида такого заболевания или симптома.
2
В изобретении также предложен пробиотический препарат, содержащий штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства, причем штамм или его мутант или вариант демонстрируют адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладают индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, как, например, Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант. Предпочтительно, пробиотический препарат предназначен для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства.
В предпочтительном воплощении пробиотический препарат также содержит по меньшей мере один пребиотик. Предпочтительно, пребиотик представляет собой инулин или фруктоолигосахарид.
В любом из воплощений, упомянутых выше, пробиотический препарат также содержит по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое соединение, проглатываемый носитель, адъювант, бактериальный компонент, лекарство, биологическое соединение и/или белок и/или пептид, в частности, белок и/или пептид, с высоким содержанием глутамина/глутамата, липид, углевод, витамин, минеральный элемент и/или микроэлемент; возможно по меньшей мере одно указанное фармацевтически приемлемое соединение выбрано из группы, состоящей из одного или более витаминов, таких как витамины группы В, одного или более минеральных элементов, таких как кальций или магний, одного или более углеводов, таких как лактоза, мальтодекстрин, инулин, декстроза, маннитол, мальтоза, декстрин, сорбитол, фруктоза и их смеси. Предпочтительно, проглатываемый носитель представляет собой капсулу, таблетку, порошок или пищевой продукт; возможно пищевой продукт представляет собой молочный продукт, сквашенное молоко, йогурт, замороженный йогурт, йогуртный продукт, такой как ферментированный йогуртный напиток, питьевой йогурт, сыр, ферментированные сливки, десерты на основе молока, ферментированное молоко или гуманизированное молоко, сухое молоко, концентрат молока, плавленый сыр, заправку, напиток и др.
В одном воплощении пробиотический препарат также содержит белок и/или пептид, в частности, белок и/или пептид с высоким содержанием глутамина/глутамата, липид, углевод, витамин, минеральный элемент и/или микроэлемент.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
В любом из вышеуказанных воплощений штамм, мутант или вариант могут находиться в составе пробиотического препарата в количестве более чем 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или пищевого продукта, возможно в количестве не менее чем 10, 10, 10, 10 или 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или пищевого продукта, предпочтительно штамм, его мутант или вариант находится в количестве более чем 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или продукта, более предпочтительно штамм, его мутант или вариант находится в количестве более чем 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или продукта, еще более предпочтительно штамм, его мутант или вариант находится в количестве более чем 10 КОЕ или более чем 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или продукта. "Однократная доза" обозначает количество порошка, которое содержит более чем 10 КОЕ, возможно не менее чем 10, 10, 10, 10 или 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно более чем 10 КОЕ, более предпочтительно более чем 10 КОЕ, еще более предпочтительно более чем 10 КОЕ или более чем 10 КОЕ. Таким образом, однократная доза порошка представляет количество, содержащее стандартную дневную дозу пациента, однако, дневная доза может быть увеличена или уменьшена по нескольким причинам и при помощи нескольких способов, которые описаны ниже. Обычное весовое количество у однократной дозы порошка должно быть легко проглатываемым и перевариваемым, составляя от мг до нескольких граммов, например, 5 г, 10 г, 15 г или более. Однократная доза порошка также может быть смешана с любым пищевым продуктом, упомянутым здесь, а также с другим пищевым продуктом, который считается подходящим по мнению специалиста в данной области. Так, количество КОЕ на весовое количество порошка может значительно превышать стандартную дневную дозу в количестве порошка, которое считается легко проглатываемым и перевариваемым. В данном случае порошок следует развести другими соединениями, которые допускаются в составе пробиотического препарата, согласно описанию выше. "Однократная доза пищевого продукта" или "пищевой продукт" как правило обозначает обычное весовое или объемное количество, которое считается стандартным или обычным количеством конкретного пищевого продукта, используемого в качестве проглатываемого носителя, обычное количество предлагается в качестве потребляемой съедаемой или выпиваемой порции, расфасованной порции или т.п. "Однократная доза проглатываемого носителя" таким образом обозначает таблетку, капсулу, суппозиторий или т.п. или однократную дозу порошка или однократную дозу пищевого продукта, которая обозначает обычное весовое или объемное количество, которое считается стандартным или обычным количеством конкретного пищевого продукта, применяющегося в качестве проглатываемого носителя, обычное количество предлагается в качестве потребляемой съедаемой или выпиваемой порции, расфасованной порции или т.п.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
В любом из указанных выше воплощений суточное количество штамма, мутанта или варианта, которое вводят пациенту в составе пробиотического препарата, составляет не менее 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или пищевого продукта, возможно не менее чем 10, 10, 10, 10 или 10 КОЕ, предпочтительно не менее чем 10 КОЕ, более предпочтительно не менее чем 10 КОЕ, еще более предпочтительно не менее чем 10 КОЕ или не менее чем 10 КОЕ.
Пробиотический препарат согласно любому из вышеуказанных воплощений полезен и предлагается для применения в качестве пробиотика в составе пищевых продуктов и/или в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, связанного с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, с нежелательной воспалительной активностью в желудочно-кишечном тракте, снижением количества Bifidobacteria в желудочно-кишечном тракте и/или нарушением барьерной функции желудочно-кишечного тракта, и/или для ослабления, предупреждения и/или лечения у индивида абдоминальной боли, дискомфорта, вздутия, метеоризма, нарушения пищеварения, императивного позыва и/или уменьшения и/или увеличения частоты стула, чувства неполного опорожнения, вместе взятых симптомов СРК и/или их сочетания. Возможно, заболевание выбрано из группы, состоящей из спастического колита, воспалительного заболевания кишечника, например, болезни Крона или язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, паучита или постинфекционного колита, рака желудочно-кишечного тракта, системного заболевания, такого как ревматоидный артрит, аутоиммунных заболеваний, обусловленных нежелательной воспалительной активностью, диарейного заболевания, обусловленного нежелательной воспалительной активностью, такого как диарея, вызванная Clostridium difficile, антибиотико-ассоциированная диарея, ротавирусная диарея или постинфекционная диарея, а также их сочетания. Предпочтительно, заболевание представляет собой спастический колит.
В изобретении также предложено применение штамма, мутанта или варианта по изобретению и пробиотического препарата по изобретению в качестве пробиотика в составе пищевых продуктов и/или в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, связанного с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, с нежелательной воспалительной активностью в желудочно-кишечном тракте, снижением количества Bifidobacteria в желудочно-кишечном тракте и/или нарушением барьерной функции желудочно-кишечного тракта, и/или для ослабления, предупреждения и/или лечения у индивида абдоминальной боли, дискомфорта, вздутия, метеоризма, нарушения пищеварения, императивного позыва и/или уменьшения и/или увеличения частоты стула, чувства неполного опорожнения кишечника и/или их сочетания. Возможно, заболевание выбрано из группы, состоящей из спастического колита, воспалительного заболевания кишечника, например, болезни Крона или язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, паучита или постинфекционного колита, рака желудочно-кишечного тракта, системного заболевания, такого как ревматоидный артрит, аутоиммунных заболеваний, обусловленных нежелательной воспалительной активностью, диарейного заболевания, обусловленного нежелательной воспалительной активностью, такого как диарея, вызванная Clostridium difficile, антибиотико-ассоциированная диарея, ротавирусная диарея или постинфекционная диарея, а также их сочетания.
Также предлагается способ получения пробиотического препарата по изобретению, включающий по меньшей мере следующие этапы:
2
а) ферментацию и/или выращивание штаммов или мутантов или вариантов по изобретению, предпочтительно штамма или его мутанта или варианта, демонстрирующего адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающего индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, или штамма Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, или его мутанта или варианта в богатой белком жидкой среде для культивирования,
б) сбор клеток путем центрифугирования, стабилизацию, лиофилизацию, измельчение и просеивание клеток,
в) возможно смешивание/соединение клеток с одним или несколькими представителями группы, состоящей из пребиотика, фармацевтически приемлемого соединения, адъюванта, бактериального компонента, лекарства, биологического соединения, белка и/или пептида и т.д. и
г) введение клеток из этапа б) или смеси из этапа в) в проглатываемый носитель.
2
Штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающий индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, как, например, Bifidobacterium bifidum MTMBb75, или его мутант или вариант, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, а также штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант для применения в качестве пробиотика в составе пищевых продуктов и/или в качестве лекарственного средства, представляющий собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант (оба штамма обозначаются как «штаммы» или «клетки» по изобретению) принадлежат роду Bifidobacteria, который представлен грамположительными неподвижными, зачастую разветвленными анаэробными бактериями, как правило присутствующими в желудочно-кишечном тракте и во влагалище. Они обычно выделяются из кала здоровых детей и взрослых. При упоминании штаммов обычно подразумевают и клетки штамма. Ранее было показано, что Bifidobacteria способствуют пищеварению, ассоциированы с более низким уровнем заболеваемости аллергией и могут играть роль в предупреждении некоторых видов опухолевого роста. Bifidobacteria принадлежат Actinobacteria, семейству Bifidobacteriaceae. Bifidobacterium bifidum MIMBb75 можно получить из Коллекции Промышленных Культур Микроорганизмов (Industrial Microbiology Culture Collection, DiSTAM) университета г. Милан, Италия, кроме того Bifidobacterium bifidum MIMBb75 был депонирован в Коллекцию Микроорганизмов и Клеточных Культур Германии (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Брауншвейг, Германия) 26 января 2011 под регистрационным номером DSM 24514. Штаммы, мутанты и варианты Bifidobacterium bifidum согласно изобретению обладают ингибиторной активностью в отношении большого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий. Штаммы Bifidobacterium bifidum, его варианты или мутанты по изобретению проявляют широкий спектр антибактериальной активности, включая виды Staphylococcus, Pseudomonas, Coliform и Bacillus. "Мутант" штамма согласно настоящему изобретению обозначает штамм Bifidobacterium bifidum, который был модифицирован, т.е. подвергнут мутации при помощи стандартных методов молекулярной биологии, известных специалистам в данной области. "Вариант" штамма согласно изобретению представляет собой вариант естественного происхождения, т.е. вариант, появляющийся в желудочно-кишечном тракте и влагалище здоровых детей и взрослых, близко родственный штамму Bifidobacterium bifidum. Как мутант, так и вариант штамма по изобретению обладают схожими свойствами со штаммом Bifidobacterium bifidum согласно изобретению и, в частности, со штаммом Bifidobacterium bifidum MIMBb75, благотворными для пациентов, страдающих от любого заболевания или симптома, описанного в данном документе. Как вариант, так и мутант рассматриваются как ДНК-гомологи штамма. В рамках настоящего изобретения термин "гомолог" используется в отношении штаммов, обладающих определенной степенью "гомологии", т.е. "идентичности" или "сходства" на уровне хромосомной ДНК. Для определения этой степени гомологии или сходства существует множество алгоритмов. Предпочтительно гомологию можно определять при помощи программы Lasergene компании DNA star Inc., Madison, Wisconsin (USA), с использованием метода CLUSTAL (Higgins et al., 1989, Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151). Организм, являющийся "гомологичным" (= по существу схожим) на уровне хромосомной ДНК, имеет по меньшей мере 55% или 60%, предпочтительно по меньшей мере 65% или 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75% или 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85% или 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии на уровне хромосомной ДНК.
2
2
2
"Заболевание" в изобретении представляет собой любое состояние индивида, также обозначаемого пациентом или человеком, которое нарушено по сравнению с состоянием индивида, который считается здоровым. Как правило, заболевание по изобретению связано с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, с нежелательной воспалительной активностью в желудочно-кишечном тракте, дисбалансом микробиоценоза кишечника, снижением количества бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте, нарушением барьерной функции желудочно-кишечного тракта и/или их сочетанием. Типичные заболевания, на которые направлены штаммы, мутанты, варианты, пробиотические препараты и их применение представляют собой все заболевания желудочно-кишечного тракта или пищеварительной системы, такие как спастический колит, воспалительное заболевание кишечника, например, болезнь Крона или язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, паучит или постинфекционный колит, рак желудочно-кишечного тракта, системное заболевание, такое как ревматоидный артрит, аутоиммунные заболевания, обусловленные нежелательной воспалительной активностью, диарейное заболевание, обусловленного нежелательной воспалительной активностью, такое как диарея, вызванная Clostridium difficile, антибиотико-ассоциированная диарея, ротавирусная диарея или постинфекционная диарея, или др., а также их сочетания. "Симптом" или "отдельный симптом" в изобретении представляет собой форму проявления заболевания у индивида, такую как абдоминальная боль, дискомфорт, вздутие, метеоризм, нарушение пищеварения, императивный позыв и/или уменьшение и/или увеличение частоты стула, чувство неполного опорожнения кишечника, взятые вместе симптомы СРК и/или их сочетание, а также общее снижение качества жизни. "Взятые вместе симптомы СРК" включают суммарную оценку всех отдельных симптомов, относящихся к СРК, упомянутых выше. "Пациент" (= субъект или человек или животное) представляет собой здорового или нездорового индивида, который получает пробиотический препарат по изобретению или штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающий индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, или терапию штаммом Bifidobacterium bifidum или его мутантом или вариантом, представляющим собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант, в превентивных целях, не страдая каким-либо заболеванием или каким-либо симптомом, упомянутым здесь, или который получает пробиотический препарат по изобретению или штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающий индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, или терапию штаммом Bifidobacterium bifidum или его мутантом или вариантом, представляющим собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант, в целях лечения, поскольку пациент, субъект, человек или животное страдает от любого заболевания или любого симптома, упомянутого здесь, такого как заболевание желудочно-кишечного тракта, или связанного с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, с нежелательной воспалительной активностью в желудочно-кишечном тракте, дисбалансом микробиоценоза кишечника, снижением количества Bifidobacteria в желудочно-кишечном тракте и/или нарушением барьерной функции желудочно-кишечного тракта или от симптома, такого как абдоминальная боль, дискомфорт, вздутие, метеоризм, нарушение пищеварения, императивный позыв и/или уменьшение и/или увеличение частоты стула, чувство неполного опорожнения, и/или их сочетания или от общего снижения качества жизни. Таким образом, пациент (= субъект) нуждается в новой терапии, такой как терапия штаммом Bifidobacterium bifidum или его мутантом или вариантом, демонстрирующим адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающим индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, или в терапии штаммом Bifidobacterium bifidum или его мутантом или вариантом, представляющим собой Bifidobacterium bifidum MTMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант. Пациент, субъект или индивид может также представлять собой субъекта, не имеющего какого-либо из упомянутых выше заболеваний или симптомов.
2
"Адгезивный штамм" в изобретении представляет собой штамм Bifidobacteria bifidum или его мутант или вариант, обладающий адгезивными свойствами по отношению к клеткам кишечника человека и таким образом способный связываться с клетками кишечной стенки человека или животного, снижая таким образом проницаемость кишечного барьера и улучшая состояние стенки кишечника, действуя по принципу "затыкания дыр". Простой способ исследования этого свойства у штамма Bifidobacterium bifidum или его мутанта или варианта приведен в разделе «Примеры». В этой связи, штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10, предпочтительно приблизительно 20, более предпочтительно приблизительно 30, еще более предпочтительно приблизительно 40, наиболее предпочтительно приблизительно 50 или 55 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток, или обладающий индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, предпочтительно по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 2,5, еще более предпочтительно по меньшей мере 3, считается адгезивным штаммом или его мутантом или вариантом.
2
Пробиотический препарат по данному изобретению предназначен для применения в качестве пробиотика в составе пищевых продуктов и/или в качестве лекарственного средства и содержит штамм или адгезивный штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10, предпочтительно приблизительно 20, более предпочтительно приблизительно 30, еще более предпочтительно приблизительно 40, наиболее предпочтительно приблизительно 50 или 55 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток, или обладающий индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, предпочтительно по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 2,5, еще более предпочтительно по меньшей мере 3, или Пробиотический препарат по данному изобретению предназначен для применения в качестве пробиотика в составе пищевого продукта и/или в качестве лекарственного средства и содержит штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, представляющий собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант. Пробиотический препарат по данному изобретению может также рассматриваться как фармацевтический препарат. «Пищевой продукт» по существу обозначает любую форму вещества или субстанции, которая может быть проглочена и переварена человеком и предпочтительно, также животным. Как правило, сюда входят субстанции или вещества, которые могут быть выпиты или съедены для обеспечения нутритивной поддержки организма и/или доставления удовольствия. В случае человека эти вещества могут иметь растительное, микробное или животное происхождение. В настоящем изобретении, в частности, подразумеваются пищевые продукты, содержащие микроорганизмы, в частности, по меньшей мере штаммы по данному изобретению, а также другие вещества, упоминающиеся здесь, возможно входящие в состав пробиотического препарата, такие как по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое соединение, проглатываемый носитель, адъювант, бактериальный компонент, лекарство, биологическое соединение и/или белок и/или пептид, в частности, белок и/или пептид с высоким содержанием глутамина/глутамата, липид, углевод, витамин, минеральный элемент и/или микроэлемент; возможно указанный по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое соединение выбрано из группы, состоящей из одного или более витаминов, таких как витамины группы В, одного или более минеральных элементов, таких как кальций или магний, одного или более углеводов, таких как лактоза, мальтодекстрин, инулин, декстроза, маннитол, мальтоза, декстрин, сорбитол, фруктоза и их смеси. "Лекарственное средство" как правило не считается пищевым продуктом, поскольку лекарственное средство как правило вводят только человеку или пациенту при определенных условиях, которые расцениваются не как состояние здоровья, а как заболевание. Тем не менее, лекарственное средство также может обеспечивать нутритивную поддержку организма и/или доставлять удовольствие, как, например, в случае если субъект страдает от депрессии. Как правило, на лекарственные средства и терапевтическую продукцию распространяются более строгие требования и процессы получения разрешений. Такие процессы получения разрешений не являются обязательными в случае пищевых продуктов, которые считаются основным способом внедрения и основным применением штаммов, мутантов и вариантов по изобретению. Как уже отмечалось выше, "пробиотик" в изобретении включает пробиотические непатогенные бактерии, живущие в организме человека, и обозначается как продовольствие и медицинские добавки, содержащие живые микроорганизмы, которые помимо присущих им питательных свойств способны влиять на состояние здоровья при поступлении внутрь в определенных количествах. Традиционно, с целью оказания положительного эффекта на состояние здоровья, в составе ферментированных молочных продуктов или лекарств использовали смеси различных микроорганизмов, в частности, некоторые виды Lactobacillus и Streptococcus. В данном изобретении пробиотик включает по меньшей мере адгезивные штаммы Bifidobacterium bifidum no изобретению или его мутанты или варианты или штамм Bifidobacterium bifidum MIMBb75 по изобретению или его мутанты или варианты. Однако, в пробиотическом препарате по данному изобретению в качестве бактериального компонента могут присутствовать другие штаммы, клетки, мутанты или варианты других видов, которые считаются полезными пробиотиками. Таковыми являются, например, пробиотические штаммы видов Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus или их смеси. Таким образом, "бактериальный компонент" обозначает жизнеспособный или нежизнеспособный штамм или клетку пробиотического штамма, как упоминалось выше, и может также применяться в виде таких соединений, как биологические молекулы, полисахариды, липиды и т.п., имеющие бактериальное происхождение или продуцируемые при ферментации бактериями или бактериальной экспрессии. Бактериальным компонентом можно считать даже отмерший материал любых видов бактерий.
Пробиотический препарат по изобретению может также содержать по меньшей мере один пребиотик или сочетание двух, трех, четырех или более различных пребиотиков. В изобретении предполагается, что "пребиотик" служит питательным веществом для штаммов по изобретению и позволяет им сохраняться в жизнеспособном и здоровом состоянии после восстановления из лиофильно-высушенного состояния. Как правило, на грамм микробных клеток, т.е. на грамм штамма требуется 2-5 г, предпочтительно 2,5 г, более предпочтительно по меньшей мере 2,5 г, еще более предпочтительно по меньшей мере 3 г, наиболее предпочтительно по меньшей мере 4 г пребиотика. Как правило, у человека в качестве пребиотика используют неперевариваемые компоненты пищи, такие как некоторые углеводы. Примеры пребиотиков включают углеводы, предпочтительно олигосахариды, инулин, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, псиллиум, олигофруктозу, изомальтоолигосахариды, ксилоолигосахариды, олигосахариды сои, мальтодекстрин, глюкоолигосахариды, маннанолигосахариды, арабиногалактан, арабинксилан, лактосахарозу, глюкоманнан, лактулозу, полидекстрозу, олигодекстран, гентиолигосахарид, пектиновый олигосахарид, ксантановую камедь, гуммиарабик, гемицеллюлозу, резистентный крахмал и его производные, а также их смеси и/или сочетания.
Пробиотический препарат по изобретению может также содержать по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое соединение, по меньшей мере один проглатываемый носитель, по меньшей мере один адъювант, по меньшей мере один бактериальный компонент, по меньшей мере одно лекарство, по меньшей мере одно биологическое соединение и/или по меньшей мере один белок и/или пептид, в частности, белок и/или пептид, с высоким содержанием глутамина/глутамата, липид, углевод, витамин, минеральный элемент и/или микроэлемент.
"Фармацевтически приемлемое соединение" обозначает жидкое, твердое или газообразное химическое или биологическое соединение, которое приемлемо для использования в фармацевтической композиции или препарате и характеризуется хорошей переносимостью организмом человека и животного с физиологической точки зрения, фармакологически инертное или не оказывающее вредного воздействия на физиологию реципиента. В составе пробиотического препарата по изобретению может содержаться по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять или более различных фармацевтически приемлемых соединений в различном количестве. Количество может регулироваться производителем в зависимости от определенных потребностей применяемого штамма Bifidobacterium bifidum, в соответствии с конкретным применением, способом введения или режимом дозирования. Примеры фармацевтически приемлемых соединений включают пребиотики, углеводы, липиды, витамины, минеральные элементы, микроэлементы, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, мальтодекстрин, инулин, лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, декстрозу, фруктозу, сорбитол, фруктоолигосахарид, маннитол, кукурузный крахмал, кристаллическую целлюлозу, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинаты, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, целлюлозу, поливинил пирролидон, трагакант, желатин, предпочтительно бычий желатин, жидкую смолу, аминосалицилат, сульфасалазин, 5-аминосалициловую кислоту, 4-аминосалициловую кислоту, бензалазин, двухлористоводородную соль, олсалазин, балсалазид, субсалицилат висмута, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу эфиры метоксибензойной кислоты, эфиры пропоксибензойной кислоты, тальк, стеарат магния, инертные полимеры, воду и минеральные масла, йод, магний, комплекс аспартата и аскорбата магния, аминокислотный хелат магния, цинк, аминокислотный хелат цинка, селен, аминокислотный комплекс селена, медь, аминокислотный хелат меди, марганец, аминокислотный хелат марганца, хром, полиникотинат хрома, молибден, аминокислотный хелат молибдена, калий, комплекс аспартата и аскорбата калия, холин, битартрат холина, инозитол, ванадий, ванадилсульфат, бор, цитрат/аспартат бора, цитрусовые биофлавоноиды, модифицированную целлюлозную камедь, кремний, растительный стеарин, диоксид титана, стеарат магния, предпочтительно по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или более указанных фармацевтически приемлемых соединений выбраны из группы, состоящей из одного или более витаминов, таких как витамины группы В, одного или более минеральных элементов, таких как магний и кальций, одного или более углеводов, желатина, предпочтительно бычьего желатина, маннитола, декстрина, фруктозы, сорбитола, пребиотика, мальтозы, мальтодекстрина, инулина, декстрозы, железа, лактозы и их смесей. Кроме того, пробиотический препарат может содержать фармацевтически приемлемые наполнители, связывающие вещества, любриканты, смачивающие агенты, разрыхлители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, консерванты, подсластители и ароматизаторы, которые известны специалистам в данной области.
1
2
3
5
6
7
9
12
1
2
3
5
6
7
9
12
m
2
n
Пробиотический препарат и штаммы или его мутант или вариант по данному изобретению могут быть объединены в составе рецептуры таким образом, что после введения пациенту штамм или клетки высвобождаются быстро, пролонгировано или медленно. Примерами витаминов, которые могут входить в состав пробиотического препарата по изобретению, являются водорастворимые и водонерастворимые витамины, такие как витамин А (например, ретинол, ретиналь и каротиноиды, включая бета каротин), витамин B (тиамин), витамин B (рибофлавин), витамин B (например, ниацин, ниацинамид, никотинамид), витамин B (пантотеновая кислота), витамин B (например, пиридоксин, пиридоксамин, пиридоксаль), витамин B (биотин), витамин B (например, фолиевая кислота, фолиновая кислота), витамин B (например, цианокобаламин, гидроксикобаламин, метилкобаламин), витамин C (аскорбиновая кислота), витамин D (например, эргокальциферол, холекальциферол), витамин E (например, токоферолы, токотриенолы), витамин K (например, филлохинон, менахиноны), предпочтительно в состав пробиотического препарата по изобретению входят витамины группы B, такие как витамин B (тиамин), витамин B (рибофлавин), витамин B (например, ниацин, ниацинамид, никотинамид), витамин B (пантотеновая кислота), витамин B (например, пиридоксин, пиридоксамин, пиридоксаль) витамин B (биотин), витамин B (например, фолиевая кислота, фолиновая кислота), витамин B (например, цианокобаламин, гидроксикобаламин, метилкобаламин) и их смеси. Примерами минеральных элементов, входящих в состав пробиотического препарата по изобретению, являются магний, кальций, цинк, селен, железо, медь, марганец, хром, молибден, калий, ванадий, бор, титан, предпочтительно присутствуют магний и/или кальций. "Микроэлемент" представляет собой химический элемент, который требуется лишь в очень малых количествах для роста, развития и/или физиологии организма, предпочтительно организма человека. "Углеводы" представляют собой органические соединения, состоящие только из углерода, водорода и кислорода и имеющие эмпирическую формулу C(HO), где соотношение между атомами водорода и кислорода составляет 2:1. "Липиды" представляют собой биологические соединения, которые по меньшей мере частично водонерастворимы, из-за наличия длинной гидрофобной углеводородной цепи. Липиды являются очень важной составной частью клеточных мембран в биологических системах.
"Проглатываемый носитель" в данном изобретении представляет собой носитель, который применяют для введения пробиотического препарата или штамма или его мутанта или варианта по изобретению индивиду или пациенту, чтобы облегчить проглатывание пробиотического препарата и штаммов или его мутанта или варианта по изобретению. Термин "молочный продукт" в данном документе включает среду содержащую молоко животного и/или растительного происхождения. Молоко животного происхождения включает молоко коров, овец, коз и буйволов. В качестве молока растительного происхождения можно упомянуть любую сбраживаемую субстанцию растительного происхождения, которую можно применять согласно изобретению, в частности, получаемую из соевых бобов, риса или зерновых культур. Возможный проглатываемый носитель выбран из группы, включающей капсулу, таблетку, порошок, гранулу пастилку, оболочку, облатку, эликсир, эмульсию, раствор, сироп, суспензию, мягкую и твердую желатиновую капсулу, суппозиторий, асептически упакованный порошок или пищевой продукт; возможно пищевой продукт представляет собой молочный продукт, сквашенное молоко, йогурт, замороженный йогурт, йогуртный продукт, такой как ферментированный йогуртный напиток, питьевой йогурт, сыр, ферментированные сливки, десерты на основе молока, ферментированное молоко или гуманизированное молоко, сухое молоко, концентрат молока, плавленый сыр, заправку, напиток и др. "Адъювант" в изобретении представляет собой фармакологический или иммунологический агент, модифицирующий действие других агентов, таких как лекарств или вакцин, или пробиотического препарата, штамма или его мутанта или варианта по настоящему изобретению, при этом самостоятельно почти не оказывая прямого влияния.
"Лекарство" обозначает химическое или биологическое соединение, которое является фармацевтически активным, и при этом фармацевтически переносимо пациентом, такое как бисакодил, лоперамид, аминосалицилат, сульфасалазин, 5-аминосалициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, бензалазин, двухлористоводородная соль, олсалазин, балсалазид, субсалицилат висмута или их смеси. Такое соединение может представляют собой любое соединение, поддерживающее благотворное действие пробиотического препарата или штамма, его мутанта или варианта по изобретению, либо напрямую, либо опосредованно. «Напрямую» обозначает, что защищается непосредственно сам штамм Bifidobacterium bifidum или его мутант или вариант, поддерживается его рост или адгезия к кишечному барьеру. «Опосредованно» означает, что в состав пробиотического препарата как по отдельности, так и в сочетании с другими лекарствами могут входить дополнительные вещества или соединения, т.е. лекарства, которые считаются полезными при профилактике и/или лечении заболевания, связанного с функциональным нарушением желудочно-кишечного тракта, с нежелательной воспалительной активностью в желудочно-кишечном тракте, с дисбалансом микробиоценоза кишечника, снижением количества Bifidobacteria в желудочно-кишечном тракте и/или нарушением барьерной функции желудочно-кишечного тракта, или для применения с целью ослабления, предупреждения и/или лечения у индивида абдоминальной боли, дискомфорта, вздутия, метеоризма, нарушения пищеварения, императивного позыва и/или уменьшения и/или увеличения частоты стула, чувства неполного опорожнения и/или их сочетания или для улучшения качества жизни пациента. В частности, в состав пробиотического препарата может входить лекарство, которое является известным лекарственным средством для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как спастический колит, воспалительное заболевание кишечника, например, болезнь Крона или язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, паучит или постинфекционный колит, рак желудочно-кишечного тракта, системное заболевание, такое как ревматоидный артрит, аутоиммунное заболевание, обусловленное нежелательной воспалительной активностью, диарейное заболевание, обусловленное нежелательной воспалительной активностью, такое как диарея, вызванная Clostridium difficile, антибиотико-ассоциированная диарея, ротавирусная диарея или постинфекционная диарея, а также их сочетания. Примеры таких лекарств, известных специалистам в данной области, могут быть найдены в регистре Rote Liste, 2010, Германия, или любом другом фармацевтическом регистре. "Биологическое соединение" может представлять собой любое биологическое соединение, такое как углевод, аминокислота, липид, нуклеиновая кислота, белок, пептид, клеточный компартмент, фосфолипид, полиэфир, растительный, животный или микробный компонент."Белок", "пептид" или "полипептид" следует понимать в их общепринятом толковании, подразумевающем линейную структуру протеиногенных или непротеиногенных аминокислот, причем белки могут также содержать одну или более субъединиц и веществ, важных для осуществления каталитической функции, таких как витамины, минеральные элементы или другие вещества.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
"Колониеобразующая единица" (КОЕ) представляет собой характеристику жизнеспособных бактериальных клеток штамма Bifidobacterium bifidum или его мутанта или варианта по изобретению. Пробиотический препарат по изобретению содержит штамм, его мутант или вариант в концентрации более 10 КОЕ, возможно не менее 10, 10, 10, 10 или 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или пищевого продукта, предпочтительно штамм, мутант или вариант содержится в концентрации более 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или пищевого продукта, более штамм, мутант или вариант содержится в концентрации более 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или пищевого продукта, еще более предпочтительно штамм, мутант или вариант содержится в концентрации более 10 КОЕ на капсулу или таблетку или на однократную дозу порошка или пищевого продукта. Суточное количество штамма, его мутанта или варианта, вводимое пациенту в составе пробиотического препарата составляет не менее 10 КОЕ, возможно не менее 10, 10, 10, 10 или 10 КОЕ, предпочтительно не менее 10 КОЕ, более предпочтительно не менее 10 КОЕ, еще более предпочтительно не менее 10 КОЕ или менее 10 КОЕ. Суточное количество может быть увеличено в зависимости от физиологического состояния пациента, т.е. при наличии тяжелых симптомов. В этом случае количество может быть повышено в два, три или несколько раз. Наоборот, суточное количество может быть снижено, уменьшено наполовину или сокращено в два, три или четыре раза, например, в случае непереносимости или приеме дополнительного лекарственного препарата, либо, как упоминалось ранее, суточное количество можно вводить не ежедневно, а один раз в два или три дня или раз в неделю. Штамм, его мутант или вариант или пробиотический препарат можно принимать в любое время, которое субъект или пациент считает подходящим, например, утром, в полдень, во второй половине дня или вечером, предпочтительно, утром, например, после пробуждения, или вечером, например, перед сном. Если штамм, его мутант или вариант или пробиотический препарат содержит проглатываемый носитель, представляющий собой пищевой продукт, введение осуществляют в соответствии с природой проглатываемого продукта, т.е. пищевого продукта. Если штамм, его мутант или вариант или пробиотический препарат содержит проглатываемый носитель, такой как капсулу или таблетку или аналогиный проглатываемый носитель, введение осуществляют перорально, с одновременным употреблением напитка или воды, предпочтительно воды.
Как правило, пробиотический препарат и штаммы по изобретению вводят в соответствии с конкретной формой пробиотика, пищевого продукта или лекарственного средства. Обычно пробиотический препарат и штаммы по изобретению вводят перорально, предпочтительно парентерально или ректально.
Способ получения пробиотического препарата по изобретению включает по меньшей мере следующие этапы:
2
а) ферментацию и/или выращивание штамма Bifidobacterium bifidum или его мутанта или варианта, демонстрирующего адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или обладающего индексом адгезии, равным по меньшей мере 1,5, или штамма Bifidobacterium bifidum или его мутанта или варианта, представляющего собой Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированный под регистрационным номером DSM 24514, или его мутант или вариант в богатой белком жидкой среде для культивирования,
б) сбор клеток вышеупомянутых штаммов путем центрифугирования, стабилизацию, лиофилизацию, измельчение и просеивание клеток,
в) возможно смешивание/соединение клеток с одним или несколькими представителями группы, состоящей из пребиотика, фармацевтически приемлемого соединения, адъюванта, бактериального компонента, лекарства, биологического соединения, белка и/или пептида и
г) введение клеток из этапа б) или смеси из этапа в) в проглатываемый носитель.
Прежде всего следует отметить, что ферментацию и выращивание штаммов Bifidobacterium bifidum, мутантов или вариантов по изобретению можно осуществлять при помощи стандартных методов и способов, известных специалистам в данной области, таких как описанные в "Probiotics and Health Claims", Wolfgang Kneifel, Seppo Salminen, John Wiley & Sons; 1. Edition (7 January 2011).
Как правило, среда для выращивания и/или ферментации штаммов Bifidobacterium bifidum, мутантов или вариантов по изобретению содержит по меньшей мере воду, декстрозу дрожжевой экстракт и минеральные элементы. Стандартная среда, применяемая для выращивания и/или ферментации штаммов или его вариантов или мутантов по изобретению, представляет собой бульон MRS (Difco, Detroit, MI, USA) с добавлением 0,05% L-цистеина гидрохлорида (cMRS). Для специалистов является очевидным, что для выращивания, ферментации и предварительного культивирования бактериальных организмов, таких как штаммы Bifidobacterium bifidum, можно также использовать другие среды. Возможно перед этапом «а» проводить предварительное культивирование штаммов или его вариантов или мутантов во встряхиваемой колбе. Для этого в упомянутую выше стандартную среду объемом по меньшей мере 200 мл, предпочтительно по меньшей мере 300 мл, более предпочтительно по меньшей мере 400 мл, еще предпочтительно по меньшей мере 500 мл и наиболее предпочтительно по меньшей мере 600 мл инокулируют по меньшей мере одну клетку штамма или его варианта или мутанта. Как правило, эту прекультуру выращивают в течение ночи в анаэробных условиях при 37°C и 220 об/мин.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
После этого прекультуру можно полностью или частично использовать для инокуляции в аппараты для предварительной ферментации большего объема, равного по меньшей мере 500 л, предпочтительно по меньшей мере 600 л, более предпочтительно по меньшей мере 700 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 800 л, наиболее предпочтительно по меньшей мере 1000 л. После ферментации штаммов, вариантов и мутантов по изобретению в аппарате для предварительной ферментации, по меньшей мере часть клеточной культуры, содержащей указанные штаммы, варианты и мутанты, переносят в основной ферментер, имеющий объем по меньшей мере 5000 л, предпочтительно по меньшей мере 7500 л, более предпочтительно по меньшей мере 10000 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 15000 л и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20000 л. Кроме того, в аппарате для предварительной ферментации и в основном ферментере для ферментации и выращивания штаммов Bifidobacterium bifidum, его мутантов и вариантов по изобретению применяют вышеупомянутую стандартную среду. После исчерпания запасов углеводов, содержащихся в среде, которые служат питательными веществами для штаммов, мутантов и вариантов по изобретению, ферментацию и выращивание останавливают, а клетки собирают. Как правило, плотность клеток после исчерпания запасов углеводов составляет по меньшей мере 10 КОЕ, возможно не менее 10, 10, 10, 10 или 10 клеток/мл, предпочтительно по меньшей мере 10 клеток/мл, более предпочтительно по меньшей мере 10 клеток/мл, еще более предпочтительно по меньшей мере 10 клеток/мл или по меньшей мере 10 клеток/мл. Специалистам известны способы определения плотности клеток или биомассы, такие как определение биомассы в единицах сухого веса, с помощью стандартных методов высушивания и гравиметрического определения в предварительно взвешенных стеклянных колбах или путем измерения оптической плотности при помощи спектрофотометра (такого как Hitachi U-I 100, Япония) по поглощению при 578 нм.
Аппараты для предварительной и основной ферментации могут быть сделаны на основе стандартного биореактора, подходящего для культивирования, ферментации, выращивания и/или производства штамма, мутанта и/или варианта штамма Bifidobacterium bifidum по изобретению. Производителями стандартных биореакторов являются, например, Applikon Biotechnology B.V. (Schiedam, Нидерланды), Infers (Bottmingen, Швейцария), Bioengineering (Wald, Швейцария) и Sartorius Stedim Biotech GmbH (Gottingen, Германия). Как предварительную, так и основную ферментацию осуществляют периодическим способом, что как правило означает, что в процессе ферментации не добавляют среду или другие компоненты.
После основной ферментации клетки собирают путем центрифугирования, например, при помощи дисковой центрифуги или сепаратора с рабочей производительностью приблизительно 2000-15000 л/ч, поставляемых GEA Westfalia Separator Group GmbH (Oelde, Германия) или других. Затем клетки стабилизируют, лиофильно высушивают, измельчают и просеивают с использованием стандартных устройств и способов, хорошо известных специалистам. Лиофильное высушивание позволяет получить концентрат, имеющий объем от 500 л до 1000 л, предпочтительно от 600 л до 800 л и вес приблизительно от 100 кг до 200 кг, предпочтительно ~150 кг.
После этого клетки возможно смешивают с пребиотиком и/или по меньшей мере одним из представителей группы, состоящей из фармацевтически приемлемого соединения, проглатываемого носителя, адъюванта, бактериального компонента, лекарства, биологического соединения и/или белка и/или пептида и/или их смесей, в частности, белка и/или пептида с высоким содержанием глутамина/глутамата, липида, углевода, витамина, минерального элемента и/или микроэлемента; возможно по меньшей мере одно указанное фармацевтически приемлемое соединение выбрано из группы, состоящей из одного или более витаминов, таких как витамины группы B, одного или более минеральных элементов, таких как кальций или магний, одного или более углеводов, таких как лактоза, мальтодекстрин, инулин, декстроза, маннитол, мальтоза, декстрин, сорбитол, фруктоза и их смесей в различных количествах.
Для получения пробиотического препарата по изобретению, как правило, 15-40 г, предпочтительно 18-35 г, более предпочтительно 20-30 г, еще более предпочтительно 22-28 г, наиболее предпочтительно 25 г клеток, штамма Bifidobacterium bifidum, его мутанта или варианта по изобретению смешивают с 50-100 г, предпочтительно с 60-90 г, более предпочтительно с 65-85 г, еще более предпочтительно с 70-80 г, наиболее предпочтительно с 75 г одного или более веществ, выбранных из группы, состоящей из пребиотика, углевода, фармацевтически приемлемого соединения или их смесей, служащих питательными веществами для клеток, штамма, его мутанта или варианта, и возможно смешивают с 30-70 г, предпочтительно с 35-65 г, более предпочтительно с 40-60 г, еще более предпочтительно с 45-55 г, наиболее предпочтительно с 50 г одного или более веществ, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого соединения, проглатываемого носителя, адъюванта, бактериального компонента, лекарства, биологического соединения и/или белка и/или пептида, в частности, белка и/или пептида с высоким содержанием глутамина/глутамата, липида, углевода, витамина, минерального элемента, микроэлемента или их смесей, для улучшения текучести пробиотического препарата. Предпочтительно, 15-40 г, предпочтительно 18-35 г, более предпочтительно 20-30 г, еще более предпочтительно 22-28 г, наиболее предпочтительно 25 г клеток, штамма Bifidobacterium bifidum его мутанта или варианта по изобретению смешивают с 50-100 г, предпочтительно с 60-90 г, более предпочтительно с 65-85 г, еще более предпочтительно с 70-80 г, наиболее предпочтительно с 75 г углевода, смеси углеводов, пребиотика или их смеси и, возможно, с 30-70 г, предпочтительно с 35-65 г, более предпочтительно с 40-60 г, еще более предпочтительно с 45-55 г, наиболее предпочтительно с 50 г одного или более веществ, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемого соединения, углевода, витамина, минерального элемента, микроэлемента или их смесей. Более предпочтительно, 15-40 г, предпочтительно 18-35 г, более предпочтительно 20-30 г, еще более предпочтительно 22-28 г, наиболее предпочтительно 25 г клеток, штамма Bifidobacterium bifidum, его мутанта или варианта по изобретению смешивают с 50-100 г, предпочтительно с 60-90 г, более предпочтительно с 65-85 г, еще более предпочтительно с 70-80 г, наиболее предпочтительно с 75 г углевода, инулина, фруктоолигосахарида или их смеси и, возможно, с 30-70 г, предпочтительно с 35-65 г, более предпочтительно с 40-60 г, еще более предпочтительно с 45-55 г, наиболее предпочтительно с 50 г одного или более веществ, выбранных из группы, состоящей из витамина, такого как витамин группы B, одного или более минерального элемента, такого как кальций или магний, одного или более углевода, такого как лактоза, мальтодекстрин, инулин, декстроза, маннитол, фруктоолигосахарид, маннит, мальтоза, декстрин, сорбитол, фруктоза и их смеси. Еще более предпочтительно, 25 г клеток Bifidobacterium bifidum, штамма Bifidobacterium bifidum, его мутанта или варианта по изобретению смешивают с 75 г вещества, выбранного из группы, состоящей из углевода, пребиотика, мальтодекстрина, инулина, декстрозы, маннитола, мальтозы, декстрина, сорбитола, фруктозы и их смеси и смешивают с 50 г вещества, выбранного из группы, состоящей из целлюлозы, фармацевтически приемлемого соединения, проглатываемого носителя, адъюванта, бактериального компонента, лекарства, биологического соединения и/или белка и/или пептида, в частности, белка и/или пептида с высоким содержанием глутамина/глутамата, липида, углевода, витамина, минерального элемента, микроэлемента и их смеси. Наиболее предпочтительно, 25 г клеток, штамма Bifidobacterium bifidum, его мутанта или варианта по изобретению смешивают с 75 г мальтодекстрина и с 50 г целлюлозы. Смешивание/соединение компонентов с клетками, штаммом, его мутантом или вариантом по изобретению после ферментации и/или выращивания штамма, сбора, стабилизации, лиофильного высушивания, измельчения и просеивания, можно осуществлять при помощи стандартных методик, устройств и способов, известных специалистам в данной области, предпочтительно применять смесительную колонну. Очевидно, что при смешивании/соединении можно использовать большие или меньшие количества, в зависимости от объема устройства, используемого для смешивания/соединения, при условии, что соотношение компонентов соответствует соотношениям, упомянутым выше. Обычное соотношение составляет, например, 25% штамма, 75% пребиотика или углевода или мальтодекстрина и 50% фармацевтически приемлемого соединения, такого как целлюлоза.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Например, 50 мг - 300 мг, предпочтительно 75 мг - 250 мг, более предпочтительно 100 мг - 200 мг, еще более предпочтительно 120 мг - 175 мг, наиболее предпочтительно 150 мг клеток, штамма Bifidobacterium bifidum, его мутанта или варианта по изобретению или упомянутых выше смесей или пробиотических препаратов по изобретению вводят в однократную дозу проглатываемого носителя, например, в капсулу, таблетку, пастилку, оболочку, облатку, эликсир, эмульсию, раствор, сироп, суспензию, мягкую и твердую желатиновую капсулу, суппозиторий, асептически упакованный порошок или пищевой продукт; такой как молочный продукт, сквашенное молоко, йогурт, замороженный йогурт, йогуртный продукт, такой как ферментированный йогуртный напиток, питьевой йогурт, сыр, ферментированные сливки, десерты на основе молока, ферментированное молоко или гуманизированное молоко, сухое молоко, концентрат молока, плавленый сыр, заправку, напиток и др., предпочтительно 50 мг, предпочтительно 75 мг, более предпочтительно 100 мг, еще более предпочтительно 120 мг и наиболее предпочтительно 150 мг клеток, штамма Bifidobacterium bifidum, его мутанта или варианта по изобретению или упомянутые выше смеси вводят в капсулу, таблетку, пастилку, оболочку, облатку, мягкую и твердую желатиновую капсулу, суппозиторий, более предпочтительно в капсулу, мягкую и твердую желатиновую капсулу Таким образом, после такого введения однократная доза проглатываемого носителя, т.е. капсула, таблетка, порошок, гранула, пастилка, оболочка, облатка, эликсир, эмульсия, раствор, сироп, суспензия, мягкая и твердая желатиновая капсула, суппозиторий, асептически упакованный порошок или пищевой продукт, такой как молочный продукт, сквашенное молоко, йогурт, замороженный йогурт, йогуртный продукт, такой как ферментированный йогуртный напиток, питьевой йогурт, сыр, ферментированные сливки, десерты на основе молока, ферментированное молоко или гуманизированное молоко, сухое молоко, концентрат молока, плавленый сыр, заправка и/или напиток содержит более 10 КОЕ, возможно не менее чем 10, 10, 10, 10 или 10 КОЕ, предпочтительно более 10 КОЕ, более предпочтительно более 10 КОЕ, еще более предпочтительно более 10 КОЕ или более 10 КОЕ. В любом случае, весовое количество может быть изменено в зависимости от концентрации КОЕ таким образом, чтобы количество клеток, штамма Bifidobacterium bifidum, его мутанта или варианта по изобретению в конечном продукте, таком как капсула, таблетка, порошок, гранула, пастилка, оболочка, облатка, эликсир, эмульсия, раствор, сироп, суспензия, мягкая и твердая желатиновая капсула, суппозиторий, асептически упакованный порошок или пищевой продукт, соответствовало более чем 10 КОЕ, возможно не менее чем 10, 10, 10, 10 или 10 КОЕ, предпочтительно более чем 10 КОЕ, более предпочтительно более чем 10 КОЕ, еще более предпочтительно более чем 10 КОЕ или более чем 10 КОЕ. В случае, если количество КОЕ составляет менее 10 КОЕ, возможно не менее чем 10, 10, 10, 10 или 10 КОЕ, 10 КОЕ, 10 КОЕ, даже 10 КОЕ или менее чем 10 КОЕ, пациент может отрегулировать упомянутое выше количество КОЕ, приняв более чем одну дозу проглатываемого носителя.
9
9
В приведенном в качестве примера воплощении в одну желатиновую капсулу, предпочтительно капсулу из бычьего желатина, вводят 25 мг клеток штамма Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, т.е. по меньшей мере 10 КОЕ Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, 75 мг мальтодекстрина и 50 мг целлюлозы. Предпочтительно, упомянутую выше капсулу с 25 мг клеток штамма Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, содержащую по меньшей мере 10 КОЕ Bifidobacterium bifidum MIMBb75 депонированного под регистрационным номером DSM 24514, 75 мг мальтодекстрина и 50 мг целлюлозы, вводят один раз в сутки. Проглатываемые носители, как правило, должны иметь качество от стандартного до высокого, должны соответствовать гигиеническим требованиям, предъявляемым к пищевым добавкам, и могут быть получены у различных производителей. Капсулы, например, капсулы из бычьего желатина, например, могут быть получены в компании Capsugel (Bornem, Belgium).
9
9
В другом предпочтительном воплощении смешивают 25 мг клеток штамма Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, предпочтительно содержащих по меньшей мере 10 КОЕ Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, и 2 г мальтодекстрина и принимают это за однократную дозу порошка. Предпочтительно, упомянутую выше однократную дозу порошка с 25 мг клеток штамма Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, т.е. по меньшей мере 10 КОЕ Bifidobacterium bifidum MIMBb75, депонированного под регистрационным номером DSM 24514, вводят один раз в сутки.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Независимо от того, какой конкретный проглатываемый носитель выберет субъект или пациент, суточное количество клеток, штамма, мутанта или варианта Bifidobacterium bifidum, вводимых пациенту в составе пробиотического препарата, составляет не менее 10 КОЕ, возможно не менее чем 10, 10, 10, 10 или 10 КОЕ, предпочтительно не менее чем 10 КОЕ, более предпочтительно не менее чем 10 КОЕ, еще более предпочтительно не менее чем 10 КОЕ или не менее чем 10 КОЕ. Альтернативные дозы обсуждались выше.
Изобретение не ограничено воплощениями, которые описаны выше в данном документе и которые могут различаться в деталях.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Условия культивирования бактерий
Как правило, виды Bifidobacterium, такие как Bifidobacterium bifidum MIMBb75, выращивали стандартным способом в течение ночи в анаэробных условиях при 37°C в бульоне MRS (Difco, Detroit, MI, USA) с добавлением 0,05% L-цистеина гидрохлорида (cMRS).
2. Исследование адгезивных свойств Bifidobacterium bifidum MIMBb75 по отношению к эпителиальным клеткам кишечника человека линии Сасо-2
2.1 Адгезия бактерий к клеткам Сасо-2
-1
-1
8
Это исследование можно провести для выяснения, обладают ли определенные штаммы Bifidobacteria адгезивными свойствами по отношению к клеткам кишечника человека, и следует ли их, таким образом, расценивать как адгезивные штаммы в рамках настоящего изобретения. Клетки аденокарциномы кишечника человека Сасо-2 (АТСС НТВ-37) выращивали стандартным способом в 3-см чашках Петри на покровных стеклах для микроскопии в среде Дюльбекко в модификации Игла с добавлением 10% (об/об) инактивированной нагреванием (30 мин при 56°C) эмбриональной телячьей сыворотки 100 Ед мл пенициллина, 100 мг мл стрептомицина, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 2 мМ L-глутамина и инкубировали при 37°C в инкубаторе с водяной рубашкой в атмосфере с содержанием 95% воздуха и 5% диоксида углерода. Для этого исследования подходят эпителиальные клетки из любого источника in vivo, включая, но не ограничиваясь эпителиальными клетками, полученными из желудочно-кишечного тракта человека, однако клетки Сасо-2 или их производные являются наиболее предпочтительными и имеются в наличии в коллекциях клеточных культур, таких как АТСС и ЕСАСС. Культуральную среду заменяли дважды в неделю. Для исследования адгезии клетки использовали через 15 дней после достижения конфлюентности (полностью дифференцированные клетки). Монослой клеток осторожно промывали два раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (pH 7,3) перед добавлением бактериальных клеток. Концентрацию бактериальных клеток в культуре, выращиваемой в течение ночи, определяли при помощи микроскопа после окрашивания DAPI (4',6'-дамидино-2-фенилиндол). Приблизительно 2×10 клеток каждого штамма, ресуспендированных в ФСБ (pH 7,3), инкубировали с монослоем полностью дифференцированных клеток Сасо-2. После инкубации в течение 1 ч при 37°C в анаэробных условиях все монослои отмывали три раза ФСБ для удаления несвязанных бактерий. Затем клетки фиксировали 3 мл метанола и инкубировали в течение 8 мин при комнатной температуре. После удаления метанола клетки окрашивали 3 мл раствора красителя Гимзе (1:20) (Carlo Erba, Милан, Италия) и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем лунки отмывали до тех пор, пока отмывочный раствор не становился бесцветным и высушивали в инкубаторе в течение 1 ч. Затем покровные стекла для микроскопии удаляли из чашек Петри и исследовали под микроскопом (увеличение ×100) с иммерсионным маслом.
Количество адгезированных бактерий подсчитывали под микроскопом в 20 случайно выбранных полях зрения и вычисляли среднее значение. Статистическую значимость различий определяли при помощи непарного t-критерия Стьюдента.
2
2
Было обнаружено, что Bifidobacterium bifidum MIMBb75 обладает хорошей способностью к адгезии к клеткам кишечника человека Сасо-2, поскольку значительная часть клеток этого бактериального штамма оставалась присоединенными к монослою Сасо-2, что подтверждало, что адгезия не была связана только с неспецифическим физическим захватом. В частности, количество бактериальных клеток, адгезированных к 1 мм монослоя эпителиальных клеток, приблизительно равнялось 55, что составляло индекс адгезии (бактериальные клетки/100 клеток Сасо-2) равный 3,874 (P<0,026). В этой связи, штамм Bifidobacterium, демонстрирующий адгезию по меньшей мере приблизительно 10 бактериальных клеток на мм монослоя эпителиальных клеток или имеющий индекс адгезии, равный по меньшей мере 1,5, считается адгезивным штаммом.
2.2 Получение экстракта клеточной стенки бактерий
2
2
Бактериальные клетки из 0,2 л жидкой культуры собирали путем центрифугирования и обрабатывали согласно методам, описанным ранее Mattarelli et al. (1993), с применением френч-пресса (12000 Ib/in, ~2142 кг/см) для разрушения клеток.
3. Двойное слепое рандомизированное и плацебо-контролируемое исследование для изучения эффективности Bifidobacterium bifidum MIMBb75 у пациентов, имеющих синдром раздраженного кишечника
3.1 Краткое описание
9
122 пациента были рандомизированы для получения плацебо (N=62) или Bifidobacterium bifidum MIMBb75 (N=60) (также обозначаемая "группа, получающая Bifidobacteria"). Индивиды получали либо 1×10 КОЕ/капсулу, либо плацебо один раз в сутки на протяжении 4 недель. Тяжесть СРК и отдельных симптомов СРК регистрировали ежедневно с использованием 7-балльной шкалы Лайкерта.
3.2 Исследуемая популяция
Участники исследования были набраны из пациентов ведущих исследователей, а также по объявлению. Протокол диетологического исследования был представлен в этический комитет коллегии врачей Баварии (Bavarian Chamber of Physicians). Для включения в исследование рассматривались не имеющие ярких клинических проявлений лица в возрасте от 18 до 68 лет, имеющие выраженность СРК от легкой до умеренной (критерии Rome III). Индивидов с органическими воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта, системными заболеваниями, онкологическими заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями, диабетом, известной непереносимостью лактозы или иммунодефицитом, предстоящей операцией на брюшной полости, за исключением аппендэктомии, с положительными результатами сигмоидоскопии или колоноскопии за последние 5 лет при возрасте старше 50 лет, диагностированным гипертиреозом, применением нейролептических препаратов или системным применением кортикостероидов по меньшей мере в течение 3 месяцев до начала исследования, серьезным психическим расстройством, целиакией или беременностью исключали.
3.3 Дизайн исследования
Исследование представляло собой проспективное многоцентровое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое диетологическое исследование в двух группах. На протяжении исследования пациенты ежедневно регистрировали симптомы СРК, взятые вместе, а также оценивали отдельные симптомы СРК при помощи дневника пациента. Кроме того, во время врачебного приема пациентов опрашивали о вместе взятых и отдельных симптомах СРК (2-4 визиты) и качестве жизни (визит 3 и 4). Врачебный прием проходил при скрининге, через две недели (вводная фаза), через 6 недель (окончание лечения) и через 8 недель (окончание «отмывочной» фазы) (Фигура 1).
После того, как пациенты подписывали информированное согласие, они получали право на скрининговое обследование в день 1 (1 визит), которое включало сбор полного медицинского анамнеза и физический осмотр. Образец крови отправляли на анализ в центральную лабораторию, включая выполнение анализа на беременность. При визите для скринингового обследования пациенты получали рекомендации поддерживать привычный им режим питания и образ жизни на протяжении всего исследования, а также им выдавали дневник пациента.
Во время второго визита (день 15) проверяли дневники пациентов. Пациентов, испытывавших боль от слабой до умеренной на протяжении по меньшей мере 2 дней во время второй недели вводной фазы, и соответствующих всем критериями включения и не имевших ни одного критерия исключения, рандомизировали 1:1 для получения либо В. bifidum MIMBb75, либо плацебо. Лечение назначали в соответствии со списком блочной рандомизации, сгенерированным при помощи компьютера, с размером блока, равным 4. Размер блока был неизвестен исследователям. В ходе интервенционного периода пациенты получали ежедневно в течение 4 недель либо одну капсулу, содержащую пробиотический препарат, либо выглядещее идентичным образом плацебо. Выбор назначаемого лечения был неизвестен как пациентам, так и сотрудникам исследовательского центра.
В конце фазы лечения (3 визит, день 43) исследователи собирали неиспользованный исследуемый препарат и пустые упаковки, чтобы удостовериться в соблюдении предписанного режима лечения. Собирали и анализировали дневники пациентов.
После «отмывочной» фазы, не включавшей прием пищевой добавки (4 визит, день 57) проводили полное физическое обследование и брали образцы крови. В качестве средств экстренной терапии были разрешены бисакодил и лоперамид. Другие пробиотики и лекарственные препараты, которые могли повлиять на эффективность исследуемого препарата, запрещались.
3.4 Изготовление пробиотика
9
Пищевую добавку изготавливали в соответствии с требованиями надлежащей производственной практики (GMP). В.bifidum MIMBb75 выращивали в жидкой среде с высоким содержанием белка, собирали путем центрифугирования, стабилизировали, лиофильно высушивали, измельчали и просеивали. Сухой порошок бактерий смешивали с фармацевтически приемлемым соединением и заполняли им капсулы из расчета 1×10 КОЕ. Капсулы плацебо выглядели идентичным образом и содержали мальтодекстрин.
3.5 Описание конечных точек
Предварительно заданный основной показатель эффективности представлял собой общую оценку индивидом симптомов СРК при помощи 7-балльной шкалы Лайкерта. Пациентов просили ежедневно отвечать на вопрос "Если бы Вы оценивали Ваши симптомы СРК (например, абдоминальную боль/дискомфорт, вздутие/метеоризм, нарушение пищеварения, императивный позыв, ритм дефекации) в целом, как Вы ощущали эти симптомы на протяжении последних 24 часов?" Возможные ответы варьировали от 0 (ни в малейшей степени), 1 (очень слабо), 2 (слабо), 3 (умеренно), 4 (сильно), 5 (очень сильно) до 6 (невыносимо).
Вспомогательные показатели эффективности включали отдельные симптомы СРК, такие как "абдоминальная боль/дискомфорт", "вздутие/метеоризм", "нарушение пищеварения" и "императивный позыв", описанные по той же 7-балльной шкале Лайкерта. На основании баллов отдельных симптомов дополнительно формировалась сочетанная оценка симптомов в баллах, как среднее арифметическое трех отдельных оценок симптомов в баллах. Кроме того, в дневнике ежедневно отмечалось уменьшение и/или увеличение частоты стула, чувство неполного опорожнения и прием других лекарственных препаратов.
По окончанию лечения, а также в конце исследования врачи просили пациентов дать общую оценку эффективности и переносимости. Эффективность оценивали с помощью следующего вопроса: "Пожалуйста оцените, как Вы себя чувствовали на протяжении 4 недель лечения, учитывая Ваше общее самочувствие и симптомы абдоминального дискомфорта/боли и изменения ритма дефекации. Как бы Вы классифицировали изменение Ваших симптомов на протяжении последних 4 недель по сравнению с тем, как Вы себя обычно чувствовали до приема исследуемого препарата?" Возможными ответами были: "полное улучшение (1), существенное улучшение (2), некоторое улучшение (3), отсутствие изменений (4) или ухудшение (5)". Варианты "полное улучшение" и "существенное улучшение" расценивали как "достаточное улучшение". Качество жизни, связанное с состоянием здоровья, оценивали при помощи опросника SF-12 до начала лечения и в конце лечения.
Нежелательные явления регистрировали на протяжении всего исследования, а во время 3 и 4 визита к врачу просили дать общую оценку переносимости. Лабораторные показатели и основные физиологические показатели оценивали при визите для скринингового обследования и в конце исследования.
3.6 Статистические методы
3.6.1 Оценка объема выборки
Снижение общей оценки симптомов СРК индивидом (SGA) по меньшей мере на 20% по 7-балльной шкале Лайкерта расценивали как значимый эффект лечения. На основании опубликованных данных (Whorwell, 2006), прогнозируемые различия в общей оценке симптомов СРК индивидами между группами, получавшими В.bifidum MIMBb75 и плацебо, составляли 0,6 баллов по 7-балльной шкале Лайкерта (например, 3,0 в группе плацебо и 2,4 в группе, получавшей Bifidobacteria). На основании тех же данных предполагаемая величина стандартного отклонения составила 1,0. С такими условными допущениями, при использовании теста Уилкоксона-Манна-Уитни с двусторонним уровнем значимости а=0,05 и мощностью 1-β=0,8, объем выборки должен был составлять 47 пациентов в каждой группе. При предполагаемом показателе отсева после рандомизации на уровне 15-20% было запланировано набрать 110 рандомизированных пациентов, и с учетом возможного выбытия из исследовании до его начала было набрано 132 пациента.
3.6.2 Статистический анализ
Основной целью данного исследования было доказательство значимого снижения общей оценки индивидом вместе взятых симптомов СРК в конце лечения в группе, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с группой плацебо. Общую оценку индивидом рассчитывали для каждого индивида как среднее арифметическое значение на исходном уровне, во время лечения и во время «отмывочной» фазы. Чтобы учесть возможные различия в исходных значениях, в качестве основного целевого параметра было задано изменение относительно исходного значения, рассчитанное как средний балл на протяжении 4 недель лечения за вычетом среднего балла за время вводной фазы (1-2 недели). Для сравнения групп использовали непараметрический критерий Ван Элтерена, стратифицированный исследовательскими центрами. Значения P<0,05 считали статистически значимыми.
Первичный анализ был проведен на популяции «намеренных лечиться» пациентов, в которую были включены все пациенты, прошедшие рандомизацию. Пропущенным значениям после исходных были приписаны исходные значения основного целевого параметра, и таких пациентов считали не ответившими на лечение. Во вспомогательных целях проводили дополнительный анализ популяции пациентов, которые придерживались протокола исследования.
Описательный анализ вспомогательных целевых параметров был выполнен по имеющимся данным.
Для сравнения эффектов лечения использовали непараметрический критерий Вилкоксона для анализа количественных переменных или точный критерий Фишера для анализа бинарных переменных. Все значения р были двусторонними.
Вспомогательные показатели эффективности учитывали лечебный эффект, который характеризовали как облегчение симптомов в ходе лечения в 50% случаев (улучшение по меньшей мере в течение 2 из 4 недель во время лечения, улучшением считали снижение оценки по меньшей мере на один балл по сравнению с исходной). Статистический анализ проводили с помощью программы SAS для windows, версия 9.1.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.
3.7 Результаты
3.7.1 Индивиды
Всего в исследование было включено 132 пациента и 122 пациента были рандомизированы для получения либо плацебо (N=62), либо В. bifidum MIMBb75 (N=60). У всех пациентов, прошедших рандомизацию, было проанализировано «намерение лечиться» (intent to treat, ITT) (N=122). Один из пациентов, не пришедший на прием после рандомизации, был исключен из анализа нежелательных явлений. Всего в анализ согласно протоколу исследования было включено 103 пациента (49 плацебо, 54 активный препарат) (Фигура 2).
3.7.2 Исходные показатели
По исходным показателям между группами не было значимых различий. 21,5% были классифицированы как имеющие СРК с преобладанием диареи, 19,8% - как имеющие СРК с преобладанием запора и 58,7% - перемежающийся СРК, при этом между группами, получавшими Bifidobacteria и плацебо, не наблюдалось достоверных различий.
По демографическим параметрам группы, получавшие лечение, были сопоставимы, женщины составляли приблизительно 67%, а средний вес пациентов составлял приблизительно 71 кг, что соответствовало ИМТ=24. Средний возраст пациентов составлял 41 год в группе плацебо и 37 лет в группе, получавшей Bifidobacteria (Таблица 1).
Таблица 1
Демографические характеристики популяции «намеренных лечиться» пациентов (ITT-популяции). SD - стандартное отклонение, ИМТ - индекс массы тела
Плацебо
Активный препарат
N (%) или среднее арифм + SD
N (%) или среднее арифм + SD
N=122(62+60)
Возраст
40,98±12,80
36,65±12,42
Женский пол
41 (66,1)
41 (68,3)
5
Рост (см)
169,50±8,75
170,78±9,47
Вес (кг)
70,79±15,54
70,45±16,02
ИМТ
24,60±5,19
24,02±4,45
Тип СРК (N=122 (61+60))
С преобладанием диареи
12 (19,4)
14 (23,3)
10
С преобладанием запора
15 (24,2)
9 (15,0)
Перемежающийся тип
34 (54,8)
37 (61,7)
3.7.3 Общая оценка индивидами (SGA) симптомов СРК
Первичная конечная точка представляла собой снижение показателя SGA, характеризующего симптомы СРК, по данным регистрации общей оценки индивидами в своих дневниках. В.bifidum MIMBb75 достоверно облегчал вместе взятые симптомы СРК на -0,88 балла [95% доверительный интервал (ДИ): -1,07; -0,69] (от 2,95 во вводной фазе до 2,07 в фазе лечения) по сравнению только с -0,16 балла [95% ДИ: -0,32; 0,00] (от 2,79 во вводной фазе до 2,63 в фазе лечения) в группе плацебо (p<0,0001) согласно 7-балльной шкале Лайкерта. Еженедельная оценка SGA продемонстрировала значимое благотворное действие для пациентов в группе, получавшей Bifidobacteria, на каждой неделе, начиная со второй недели лечения и до конца исследования (Фиг.3).
3.7.4 Вторичные конечные точки
Вторичные конечные точки включали изменения отдельных симптомов СРК таких как "боль/дискомфорт", "вздутие/метеоризм", "нарушение пищеварения", "императивный позыв к дефекации", "уменьшение и/или увеличение частоты стула" и "чувство неполного опорожнения кишечника" по 7-балльной шкале Лайкерта. В ходе лечения В. bifidum MIMBb75 вызывал достоверное снижение боли/дискомфорта на -0,82 балла [95% ДИ: -1,01; -0,63] против -0,18 [95% ДИ: -0,35; -0,01] в группе плацебо (p<0,0001), и вздутия/метеоризма на -0,92 балла [95% ДИ: -1,15; -0,69] против -0,21 [95% ДИ: -0,37; -0,05] в группе плацебо (p<0,0001). Снижение сохранялось во время "отмывочной" фазы. Императивный позыв достоверно снижался на -0,67 балла [95% ДИ: -0,86; -0,48] против -0,21 [95% ДИ: -0,35; -0,07] в группе плацебо (p=0,0001) во время лечения, но не во время "отмывочной" фазы. Не было обнаружено влияния на частоту дефекаций и чувство неполного опорожнения кишечника (Фиг.4).
Еженедельная оценка отдельных симптомов СРК, таких как боль/дискомфорт и вздутие/метеоризм выявила значимый благотворный эффект у пациентов группы, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с группой плацебо, на каждой неделе, начиная со второй недели лечения и до конца исследования. Достоверное различие между группами, получавшими Bifidobacteria и плацебо, по показателю "императивный позыв" было продемонстрировано между 4 и 6 неделями (Фиг.5 и 6).
Нарушение пищеварения оценивалось при посещении врача по показателю опросника "удовлетворенность актом дефекации". Индекс удовлетворенности актом дефекации после лечения уменьшался от 3,89 до 2,44 в группе, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с изменением от 3,69 до 6,47 в группе плацебо (p=0,0002). Снижение сохранялось во время "отмывочной" фазы (2,33 в группе, получавшей Bifidobacteria, против 3,47 в группе плацебо, p<0,0001).
3.7.5 Сочетанный индекс
Для отдельных симптомов СРК (боль/дискомфорт, вздутие/метеоризм, императивный позыв) рассчитывали сочетанный индекс. Во время вводной фазы индекс в обеих группах был сопоставимым. Употребление В.bifidum MIMBb75 оказало значимое благотворное влияние на пациентов группы, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с плацебо (-0,80 в группе, получавшей Bifidobacteria; -0,20 в группе плацебо; p<0,0001). Этот эффект также сохранялся во время "отмывочной" фазы (-0,85 в группе Bifidobacteria; -0,31 в группе плацебо; p<0,0001).
3.7.6 Пациенты, у которых был достигнут лечебный эффект
Пациентами, у которых был достигнут суммарный лечебный эффект, были обозначены пациенты, отмечавшие улучшение среднего еженедельного индекса по меньшей мере на 1 балл по шкале Лайкерта по основному показателю (общая оценка индивидами симптомов СРК) по меньшей мере в течение двух из четырех недель лечения (облегчение симптомов в 50% случаев). Пациентами, у которых был достигнут лечебный эффект в отношении абдоминальной боли, были обозначены пациенты, отмечавшие улучшение в среднем на 1 балл в 50% случаев при оценке показателя "боль/дискомфорт".
Доля пациентов, у которых был достигнут суммарный лечебный эффект, составила 56,7% в группе, получавшей Bifidobacteria, и только 21,0% в группе плацебо (p=0,0001). Различие между группами было лишь немного менее выраженным при рассмотрении отдельного симптома "боль/дискомфорт", по которому доля пациентов, у которых был достигнут лечебный эффект, составила 48,3% в группе, получавшей Bifidobacteria и только 24,2% в группе плацебо (p=0,008) (Фиг.7).
3.7.7 Общая эффективность терапии, оцениваемая при посещении врача
Суммарная оценка эффективности была существенно лучше в группе, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с группой плацебо. По окончанию лечения 43,3% пациентов из группы, получавшей Bifidobacteria, испытывали достаточное улучшение по сравнению только с 8,1% в группе плацебо (p<0,0001). В конце исследования достаточное улучшение было зарегистрировано у 46,7% в группе, получавшей Bifidobacteria, и у 11,3% пациентов в группе плацебо (p<0,0001; Фиг.8).
3.7.8 Качество жизни, связанное с состоянием здоровья
Оценка суммы баллов по опроснику SF-12 выявила значимое улучшение качества жизни в группе, получавшей Bifidobacteria. Суммарный показатель, характеризующий физическое здоровье, улучшился по сравнению с исходными значениями на 3,99 в группе, получавшей Bifidobacteria, и только на 1,08 в группе плацебо (p=0,0185). Суммарный показатель, характеризующий психическое здоровье, улучшился по сравнению с исходными значениями на 5,78 в группе, получавшей Bifidobacteria, и только на 1,58 в группе плацебо (p=0,0083).
3.7.9 Нежелательные явления
Было зарегистрировано только 36 нежелательных явлений, предположительно связанных с исследуемым препаратом, 13 в группе плацебо и 23 в группе, получавшей лечение, однако в профиле побочного действия В.bifidum MIMBb75 и плацебо не было выявлено достоверных различий.
3.7.10 Выводы
В.bifidum MIMBb75 достоверно снижал общую оценку индивидом (SGA) симптомов СРК на -0,88 балла [95% ДИ: -1,07; -0,69] по сравнению только с -0,16 [95% ДИ: -0,32; 0,00] баллами в группе плацебо (p<0,0001). В.bifidum MIMBb75 также достоверно облегчал отдельные симптомы СРК, такие как боль/дискомфорт, вздутие/метеоризм, нарушение пищеварения и императивный позыв к опорожнению кишечника. Оценка суммы баллов по опроснику SF-12 выявила достоверное улучшение качества жизни в группе, получавшей Bifidobacteria. Кроме того, достаточное улучшение было зарегистрировано у 46,7% пациентов в группе, получавшей Bifidobacteria, и только у 11,3% пациентов в группе плацебо (p<0,0001).
Доля пациентов, у которых был достигнут суммарный лечебный эффект, составила 56,7% в группе, получавшей Bifidobacteria, и только 21,0% в группе плацебо (p=0,0001). Переносимость В.bifidum MIMb75 была хорошей, а по количеству нежелательных явлений различий с плацебо не отмечалось.
3.8 Заключение
B.bifidum MIMBb75 эффективно ослаблял СРК в целом, а также облегчал отдельные симптомы СРК. С учетом высокой эффективности В. bifidum MIMBb75 в отношении СРК и благоприятного профиля побочного действия, В.bifidum MIMBb75 обладает большим потенциалом для лечения СРК.
Это рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование продемонстрировало, что В.bifidum MIMBb75 обладает благотворным действием при лечении СРК. В данном исследовании В. bifidum MIMBb75 приводил к достоверному облегчению СРК в целом и связанных с ним симптомов, таких как боль/дискомфорт и метеоризм по сравнению с плацебо. Кроме того, В.bifidum MIMBb75 также достоверно улучшал качество жизни. Это благоприятное действие сохранялось во время "отмывочной" фазы после отмены приема. Доля пациентов, у которых был достигнут суммарный лечебный эффект, была достаточно высокой и составила 56,7% в группе, получавшей Bifidobacteria, по сравнению только с 21,0% в группе плацебо (p=0,0001). В конце исследования достаточное улучшение было зарегистрировано у 46,7% в группе, получавшей Bifidobacteria, и только у 11,3% пациентов в группе плацебо (p<0,0001).
На сегодняшний день влияние Bifidobacteria на СРК и его симптомы было изучено в нескольких исследованиях. Однако, только в некоторых из них было показано значимое благотворное действие. Кроме того, по сведениям авторов изобретения, ни один пробиотический штамм не продемонстрировал достоверного ослабления синдрома раздраженного кишечника и одновременного улучшения качества жизни. Наряду с тем, что в некоторых исследованиях эффективность могла быть не обнаружена из-за малого объема выборки и ошибок при рандомизации, несколько различных пробиотических штаммов неоднократно демонстрировали отсутствие значимого положительного эффекта при СРК. Не так давно Brenner et al. (2009) опубликовали систематический обзор рандомизированных контролируемых исследований (RCTs), целью которого была оценка эффективности, безопасности и переносимости пробиотиков при лечении СРК. Всего в анализ было включено 16 RCTs. Из них только один штамм Bifidobacteria продемонстрировал эффективность относительно облегчения симптомов СРК в двух спланированных должным образом исследованиях. Эти результаты могут быть следствием того, что эффективность пробиотиков строго штаммоспецифична и лишь немногие штаммы способны демонстрировать эффективность при СРК.
В заключение, В.bifidum MIMBb75 облегчает СРК в целом, а также симптомы СРК, обладая благоприятным профилем побочного действия.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг.1: схема исследования.
Фиг.2: диаграмма, изображающая общий дизайн исследования.
Фиг.3: сравнение влияния плацебо и В.bifidum MIMBb75 на вместе взятые симптомы СРК (согласно SGA, с еженедельной регистрацией по шкале от 0 до 6). Достоверное облегчение вместе взятых симптомов СРК в группе, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с группой плацебо.
Фиг.4: сравнение подавления симптомов СРК (B.bifidum MIMBb75 против плацебо) по изменению среднего балла во время лечения по отношению к исходному уровню.
Фиг.5: сравнение эффектов плацебо и B.bifidum MIMBb75 в отношении боли/дискомфорта (с еженедельной регистрацией по шкале Лайкерта от 0 до 6). Достоверное облегчение симптомов в группе, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с группой плацебо.
Фиг.6: сравнение эффектов плацебо и B.bifidum MIMBb75 в отношении вздутия/метеоризма (еженедельная регистрация по шкале от 0 до 6). Достоверное облегчение симптомов в группе, получавшей Bifidobacteria, по сравнению с группой плацебо.
Фиг.7: доля пациентов, у которых в ходе лечения был достигнут суммарный лечебный эффект (ITT).
Фиг.8: достаточное улучшение в ходе лечения (ITT).