Штамм энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana для защиты сельскохозяйственных растений от насекомых и клещей- вредителей растений.
STRAIN OF ENTOMOPATHOGENIC FUNGUS BEAUVERIA BASSIANA FOR PROTECTION OF AGRICULTURAL PLANTS FROM INSECTS AND MITES, PLANT PESTS

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, касается биологических средств для защиты растений от членистоногих (насекомых и клещей) - вредителей и представляет собой штамм энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana 17НА, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (адрес: 117545 Россия, Москва 1-й Дорожный проезд, д. 1) под номером F-1526, дата депонирования: 19.08.2020.
Использование энтомопатогенных микроорганизмов для борьбы с насекомыми-вредителями сельскохозяйственных растений представляется перспективной альтернативой химическим инсектицидам. В этом аспекте микроскопические грибы, по сравнению с бактериями и вирусами, интересны, главным образом по двум причинам: 1) отсутствие узкой специализации по отношению к насекомым-мишеням у большинства штаммов; 2) для запуска инфекционного процесса достаточно попадания споры гриба на наружные покровы насекомого. На первом этапе инфекционного процесса конидия гриба адгезируется на кутикулу насекомого посредством неспецифических гидрофобных и электростатических взаимодействий. Затем конидия прорастает, формируя в большинстве случаев аппрессорий, который разрывает кутикулу. Как только гриб дорастает до гемоцеля, его клетки приобретают дрожжеподобную форму (так называемые гифальные тельца), которые поэтапно поражают ткани хозяина, приводя в итоге к мумификации насекомого. Эти клетки также могут продуцировать вторичные метаболиты с иммуносупрессивной активностью, усиливающие развитие грибной инфекции. Мумифицированное насекомое является источником инфекции для других насекомых, что в ряде случаев может приводить к возникновению эпизоотий.
Среди энтомопатогенных грибов наиболее широкое применение в качестве основы микробиологических инсектицидов нашли представители родов Beauveria и Metarhizium.
Известен штамм Beauveria bassiana CL 67-13n (a.c. СССР 572163), полученный в результате направленного изменения вирулентности природного изолята, проявляющий высокую вирулентность против вредителей лесного хозяйства.
Известны штаммы Beauveria bassiana 113Н-278 (a.c. СССР 507645), полученный методом селекции на основе естественного моноспорового рассева после пассажа через колорадского жука, и Beauveria bassiana VILL 476-4С (a.c. СССР 982630), полученный путем ступенчатой селекции под действием нитрометилбиурета из штамма 113Н-278, обладающий более высокой продуктивностью и вирулентностью, предназначенные для использования в качестве продуцента препарата боверина для борьбы с колорадским жуком.
Известен штамм Beauveria bassiana ВКПМ Г-399 (а.с. СССР 1688820) для производства инсектицидного препарата боверина против насекомых-вредителей сельского и лесного хозяйства. Активность штамма выявлена против колорадского жука (личинок и имаго), зернового точильщика, амбарного долгоносика, рисового долгоносика, булавовидного хрущака.
Известен штамм Beauveria bassiana 70И (патент СССР 1795980) для получения энтомопатогенного препарата. Активность описана против тепличной белокрылки на огурце и личинок лиственничной мухи в лесной подстилке под кроной лиственницы.
Известен штамм Beauveria bassiana ЦК МК "Б" N ЦКМ F-54Ц, (патент РФ 2034469) для получения энтомопатогенного препарата, обладающий повышенной продуктивностью и терморезистентностью. Среди чувствительных к нему насекомых5 указаны трипе, оранжерейная белокрылка и паутинный клещ.
Известен штамм Beauveria bassiana АТСС N 74040 (патент РФ 2103873) для получения энтомопатогенного препарата против хлопкового долгоносика, белянки сладкого картофеля и хлопкового слепняка.
Известен штамм Beauveria bassiana ВКМ F-3732 D (патент РФ 2172588) для получения энтомопатогенных препаратов, обладающий высокой продуктивностью в глубинной культуре. Штамм активен против личинок и кубышек саранчи.
Известен штамм Beauveria bassiana IC 1530-25-1 (патент РФ 2704859) для производства биопрепарата против колорадского жука, грибных патогенов и стимуляции роста картофеля в вегетационный период.
Известен штамм Beauveria bassiana СФ 127-13 (заявка РФ 2015109186), являющийся активным началом энтомопатогенного препарата.
Известна композиция для борьбы с личинками жуков-щелкунов (патент РФ 2311778), содержащая твердый носитель и микробиологический источник лизина, а также маточную культуру энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana F-65 и янтарную кислоту. Известна микробная композиция для борьбы с личинками жуков-щелкунов (патент РФ 2311768), содержащая твердый носитель и микробиологический источник лизина, а также равнообъемную смесь маточных культур энтомопатогенных грибов Beauveria bassiana F-65 и Metarrhizium anisopliae var. anisopliae F-596 и янтарную кислоту.
Общим недостатком перечисленных изобретений является ограниченность или неопределенность спектра насекомых-вредителей, против которых эффективно применение указанных штаммов Beauveria bassiana. При этом известно, что широта спектра поражаемых насекомых относится к штаммоспецифичным свойствам.
Задачей заявленного изобретения является выделение нового природного энтомопатогенного штамма гриба, поражающего широкий спектр насекомых-вредителей, в том числе трипса пшеничного, белокрылку, хлопковую совку, зеленую цикадку, злаковых тлей, гороховую тлю, бахчевую тлю, картофельную тлю, капустную моль, луковую моль, картофельную моль, кукурузного мотылька, вредную черепашку, яблонную плодожорку, гроздевую листовертку, личинок колорадского жука, жука-щелкуна, хлебных пилильщиков и других насекомых-вредителей, а также паутинного клеща, и совместимого хотя бы с некоторыми химическими пестицидами, что позволило бы проводить совместные обработки без потери жизнеспособности биологического агента.
Эта задача решается благодаря выделению и использованию штамма Beauveria bassiana 17НА, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (адрес: 117545 Россия, Москва 1-й Дорожный проезд, д. 1) под номером F-1526, дата депонирования: 19.08.2020. Штамм был выделен из личинок колорадского жука третьего возраста. Видовая принадлежность культуры была определена на основании результатов секвенирования нуклеотидной последовательности ITS - D1/D2 рДНК, в ФГБУ «ГосНИИГенетика».
Заявленный штамм имеет следующие характеристики.
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки.
При температуре 25°С на картофельно-декстрозном агаре и среде Сабуро при рассеве суспензии конидий видимые невооруженным глазом колонии появляются на третьи сутки роста и имеют диаметр не более трех мм. Колонии растут достаточно медленно, достигая диаметра 38-42 мм к 14 суткам роста. Колонии белого цвета, бархатистые, довольно плотные, прилегают к поверхности среды, мицелий врастает в агар на небольшую глубину; с возрастом колонии становятся мучнистыми. Колонии белого цвета независимо от возраста культуры, обратная сторона - желтоватая. Штамм не продуцирует растворимых пигментов; выделение экссудата также не характерно.
Штамм Beauveria bassiana 17НА имеет следующие микроморфологические признаки. Вегетативные гифы септированные, разветвленные, бесцветные, с гладкими стенками, 1-2 мкм шириной. Конидиеносцы одиночные, но собраны в плотные мутовки из 4-5 и более штук, с расширенным основанием и тонкой вытянутой вершиной с зигзагообразным недетерминированным рахисом, образуются латерально на воздушных гифах. Конидии бесцветные, несептированные, с тонкими гладкими стенками, имеют размер 2-3 мкм, форму, близкую к сферической, иногда со слабозаметной выемкой у основания. При поверхностном росте воздушные конидии агрегированы в сферические кластеры среди воздушного мицелия и а имеют высокогидрофобную оболочку. При глубинном культивировании штамма происходит образование бластоспор, форма которых зависит от состава питательной среды и возраста культуры и может быть вытянутой (почти палочковидной), овальной, лимоновидной, округлой, подобной кофейным зернам.
Физиолого-биохимические признаки.
Штамм является аэробом, сапротрофом, при контакте с насекомыми - активным энтомопатогеном.
Для роста оптимальной является температура 28°С, при этом на питательных средах штамм может расти в диапазоне температур от +12 до +35°С. Оптимальные значения рН среды находятся в пределах 6,7-7,5, рост отмечается при значениях рН среды от 3,0 до 9,0.
В качестве источника; углерода и энергии утилизирует глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, гликоген, крахмал, глицерин, полисорбаты 20-80, природные жиры растительного и животного происхождения.
В качестве источника азота Beauveria bassiana 17НА может использовать соли аммония, нитраты, мочевину, органический азот в виде аминокислот и пептидов.
Размножение микроорганизма может осуществляться несколькими способами. При поверхностном способе конидии и мицелий штамма Beauveria bassiana 17НА вносят на поверхность питательной среды в чашках Петри, микробиологических матрацах или в любой микробиологической посуде с большой площадью рабочей поверхностью, далее биомасса распределяется по поверхности среды шпателем Дригальского и сосуды инкубируются в термостате при 27°С.
При глубинном способе культивирования, конидии штамма прорастают и образуют мицелий в жидкой питательной среде в конических колбах Эрленмейера, либо в качалочных колбах, либо в ферментере. При культивировании конидий и мицелия штамма в колбах используют шейкеры инкубаторы. Колбы, наполненные питательной средой на 1/4-1/3 от своего объема, инокулируются аликвотами биомассы штамма с плотной питательной среды, устанавливаются на шейкер-инкубатор и качаются при 28°С в течение 3-5 суток. При культивировании в ферментере питательная среда в культуральном сосуде инокулируется суточным мицелием штамма, полученным в колбах описанным выше способом.
В качестве питательной среды для глубинного культивирования подходит среда Чапека-Докса с дрожжевым экстрактом (состав, г/л: сахароза - 30,0; нитрат натрия - 3,0, сульфат магния - 0,5, хлорид калия - 0,5, сульфат железа (II) - 0,01, фосфат калия двузамещенный - 1,0, дрожжевой экстракт (ДЭ) - 0,5; вода дистиллированная до 1 л; рН 7,0) или среда Сабуро (состав, г/л: глюкоза - 40 г/л, пептон - 10 г/л, вода водопроводная до 1 л; рН 7,0).
Штамм Beauveria bassiana 17НА является патогеном трипса пшеничного, белокрылки, хлопковой совки, зеленой цикадки, злаковых тлей, гороховой тли, бахчевой тли, картофельной тли, капустной моли, луковой моли, картофельной моли, кукурузного мотылька, стеблевого мотылька, вредной черепашки, яблонной плодожорки, гроздевой листовертки, личинок колорадского жука, жука-щелкуна, хлебных пилильщиков и других насекомых-вредителей, а также паутинного клеща. При этом пчелы не проявляют чувствительности к этому штамму.
Бластоспоры штамма Beauveria bassiana 17НА сохраняют жизнеспособность в баковых смесях с такими фунгицидами, как Феразим, КС (действующее вещество - карбендазим) и Скальпель, КС (действующее вещество - флутриафол), а также гербицидами на основе хлорсульфурона.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
8
Пример 1. Крупноделяночный полевой опыт по выявлению эффективности заявленного штамма Beauveria bassiana 17НА проводили в 2017 году в Узбекистане в Уртачирчикском районе Ташкентской области в фермерском хозяйстве «QURBONALI AGRO» на посевах хлопчатника в борьбе с хлопковой совкой, тлями и паутинным клещом. Для обработки использовали глубинную культуру гриба, полученную на среде Чапека-Докса с дрожжевым экстрактом, с титром 1×10 бластоспор/мл и нормой расхода 3 л/га. Внесение биологического агента осуществляли посредством опрыскивания (расход рабочей жидкости - 300 л/га). Площадь опытных делянок составляла 1 га для каждого варианта опыта в трехкратной повторности. Учет численности вредителей проводился перед обработкой растений (предварительный учет), затем на 3, 7 и 14 сутки после опрыскивания. Результаты представлены в таблице 1. Биологическая эффективность Beauveria bassiana 17НА в борьбе с хлопковой совкой, тлями и паутинным клещом на хлопчатнике составила 80,4%, 84,9% и 91,6% соответственно, что свидетельствует о высокой степени патогенности штамма Beauveria bassiana 17НА по отношению к различным членистоногим и отсутствии у него выраженной специализации.
8
Пример 2. Полевые испытания эффективности Beauveria bassiana 17НА проводили в 2017 году в Ростовской области на луке против гусениц луковой моли и на картофеле против гусениц картофельной моли. Для обработки использовали глубинную культуру гриба, полученную на среде Чапека-Докса с дрожжевым экстрактом, с титром 1×10 бластоспор/мл и нормой расхода 3 л/га. В обоих случаях было проведено по 2 обработки по вегетации посредством опрыскивания с нормой расхода рабочей жидкости 300 л/га с интервалом 10 суток. Учет численности вредителей проводился перед обработкой растений (предварительный учет), затем на 3, 7 и 10 сутки после опрыскивания. Результаты представлены в таблицах 2 и 3. В обоих случаях были достигнуты высокие показатели эффективности применения Beauveria bassiana 17НА по контролю численности гусениц луковой и картофельной моли.