КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БИОПЛЕНОК НА ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ТКАНЯХ
COMPOSITION AND METHOD FOR DETECTING BIOFILMS IN VIABLE TISSUES

Настоящее изобретение относится к композиции, которую можно применять к таким жизнеспособным тканям, как хронические раны (например, ножные язвы, пролежневые язвы, диабетические язвы стоп), остро возникшие раны (например, порезы, ссадины, ожоги), кожа и кости, для обнаружения микробных биопленок в качестве раннего предупреждающего индикатора того, что ткань находится под риском возникновения инфекции. Более конкретно изобретение относится к композиции, способной делать биопленки на жизнеспособных тканях различимыми, в то же время избегая раздражения раны и кожи, а также задержки излечения. Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к набору для применения при обнаружении биопленок на жизнеспособных тканях.
Жизнеспособные ткани часто колонизуются множеством микроорганизмов, некоторые из которых могут вызывать инфекцию. Становится все более общепризнанным, что на заживление хронических и остро возникших ран отрицательно влияет присутствие микроорганизмов, колонизующих рану. Убедительным доказательством является то, что эти микроорганизмы могут существовать на ранах преимущественно в виде биопленок. Во время колонизации бактерии и другие микроорганизмы, такие как дрожжи и грибы, прикрепляются к тканям и образуют биопленку посредством секреции полимерных веществ внеклеточного матрикса. Этот способ роста придает микроорганизмам внутри биопленки степень защиты в виде физической защиты от местных и системных противомикробных средств благодаря окружающему матриксу. Кроме того, полагают, что микроорганизмы внутри биопленок имеют измененные фенотипы и генотипы по сравнению с их свободно плавающими планктонными аналогами. Известно, что микроорганизмы биопленки являются метаболически менее активными, и это тоже может обеспечить степень устойчивости к таким традиционным противомикробным средствам, как антибиотики, которые, как известно, действуют против метаболически-активных бактерий. Кроме того, присутствие биопленок в ранах также препятствует иммунной системе хозяина при воспалительном микробном клиренсе и в фазах грануляции и реэпителиализации нормального процесса заживления ран.
Таким образом, существует необходимость развития способов или устройств для ускоренного обнаружения присутствия биопленки в жизнеспособных тканях до и после выбранных протоколов лечения. Это бы помогло исследователям понимать, существуют ли микроорганизмы, в состоянии биопленок на коже и в ранах, и позволило бы им проследить созревание или клиренс таких биопленочных сообществ. Способ или устройство для обнаружения биопленки также позволило бы исследователям развивать эффективные противопленочные стратегии и эффективные лечебные протоколы излечения ран, и в клинической практике это бы указывало на выбор подходящих повязок на рану и способствовало мониторингу эффективности протокола, предоставленного лечащим врачом, занимающегося лечением раны.
2+
2+
3+
Как правило, в связи с биопленками возникает проблема бактерий, заключенных внутри экзополимерного вещества (или матрикса), которое состоит из длинноцепочечных полисахаридов со сложными связями, такими как 1,3- или 1,4-β-связанные гексозные соединения (примерами некоторых типичных полисахаридов биопленок являются тейхоевая кислота, кетальсвязанные пируваты N-ацетилглюкозамин и уроновые кислоты: D-гулуроновая, D-галактуроновая и маннуроновая кислоты), белка (из которого некоторые могут играть структурную роль), ДНК (внеклеточная, некоторая часть которого может играть структурную роль), липидов, ионов металлов (Ca, Mg, Fe и т.д.) и воды. Кроме того, биопленки могут быть связаны с нежизнеспособными тканями хозяина такими, как отторгающаяся и некротизированная ткань.
Внеклеточные полимерные вещества биопленок (EPS) также относят к внеклеточному матриксу биопленки или происходящей из бактерий ткани. В то время как по массе биопленка состоит главным образом из воды и бактерии могут составлять только от 10 до 20% объема биопленки, EPS составляет большую часть биомассы/сухой массы пленки.
Такие биопленки, которые обнаруживают на зубах в виде зубного налета, часто легко увидеть невооруженным глазом ввиду их толщины, цвета и природы субстрата, на котором они образуются. Визуализация биопленки, например в хронических или остро возникших ранах, не является простой задачей ввиду свойственных ранам цветов и содержанию ран. Хронические и остро возникшие раны, как правило, являются комплексными в отношении содержания мертвой или нежизнеспособной ткани (отторгающейся), экссудата, гноя, крови, лекарственных средств, перевязочных компонентов, в дополнение к бактериям и биопленке. Вследствие этого может представляться трудным обнаружить присутствие биопленки в ране, поскольку визуализация биопленок ран невооруженным глазом является затруднительной. Таким образом, существует необходимость в средствах, способствующих обнаружению биопленки, например, посредством композиции, которая способна окрашивать биопленки ран, с тем чтобы они были визуализированы. Будучи визуализированной, биопленка может быть подвергнута соответствующему лечению.
К удивлению, нами обнаружено, что возможно преимущественно окрашивать биопленки с применением композиции, содержащей красящее вещество, которое позволяет обнаружить биопленку.
Таким образом, первый аспект изобретения представляет окрашивающую композицию для применения при обнаружении биопленки на жизнеспособной ткани, в то время как композиция преимущественно окрашивает биопленку и содержит цветное или флуоресцентное окрашивающее средство в растворе в количестве, эффективном для окрашивания указанной биопленки и способствующем его обнаружению.
Предпочтительно биопленку делают обнаруживаемой невооруженным глазом или в сочетании с освещением и/или оптическими устройствами.
Предпочтительно, окрашивающим средством является краситель, который селективно связывается с EPS/бактериями и не связывается с жизнеспособной тканью. Окрашивающее средство не должно окрашивать небиопленочные компоненты в значительной мере, например в хронических или остро возникших ранах, таких как ткань раны, окружающая кожа, отторгающаяся (мертвая или омертвевшая) ткань, экссудат, кровь, гной, клетки воспаления (нейтрофилы, макрофаги), клетки, участвующие в процессе излечения (фибробласты, эндотелиальные клетки, кератиноциты), или лекарственные средства, или перевязочные компоненты, которые могут остаться в ране. Такое окрашивающее средство должно быть предпочтительно молекулой требуемого размера и структуры; например, низкомолекулярной массы, компактная, плоская молекула, которая способна к диффузии через EPS и бактериальные клеточные мембраны. Окрашивающее средство может иметь анионные группы для придания цвета и, возможно, флуоресцентных свойств и может иметь катионные группы для взаимодействия зарядов с отрицательно заряженными полисахаридами EPS биопленки и бактериальными клеточными стенками. Эти заряженные группы предпочтительно должны быть постоянными зарядами, чтобы на них не влияло pH примененных составов или жизнеспособной ткани/окружающей среды биопленки.
Такое окрашивающее средство имеет предпочтительно подходящий цвет или яркость, чтобы могло быть возможным наблюдать окрашенную биопленку непосредственно невооруженным глазом. Однако вследствие комплексности и высоко пигментированной природы ран некоторые цвета красителя может быть трудно наблюдать. Например, некротизированные раны, струпные раны или кровоточащие раны могут иметь оттенки черного, коричневого, красного, желтого и т.д. цветов. В то время как голубые и зеленые красители могут считаться здесь предпочтительными, они могут становиться темного или черного цвета, будучи помещенные рядом или на ткань коричневого, красного или желтого цвета. Не полагаясь исключительно на способность наблюдателя обнаружить окрашивание невооруженным глазом, более предпочтительно применять краситель, который может флуоресцировать, чтобы его можно было быстрее обнаружить. Многие классы соединений, которые потенциально являются окрашивающими средствами, также являются флуоресцентными и потому они способны абсорбировать кванты света определенных длин волн и становиться электронно возбужденными, излучая эту световую энергию в виде флуоресценции. Такую флуоресценцию можно обнаруживать с применением световых фильтров, которые специально приспособлены к спектру излучения флуоресценции соответствующих молекул, чтобы наблюдатель визуально наблюдал узкий спектральный диапазон, который соответствует длинам волн флуоресценции. Например, линзы со специфическими оптическими фильтрами, такими, которые применяют для безопасности при работе с лазерами, могли бы быть применены в сочетании с соответствующим специфическим источником света для обнаружения флуоресценции, таким образом, делая возможным обнаружение биопленки на жизнеспособных тканях. Этот способ обнаружения биопленки может иметь преимущества над обнаружением биопленок невооруженным глазом, при этом возможно флуоресцентное обнаружение даже очень тонких биопленок, которые могут быть толщиной лишь в несколько слоев микробных клеток, и оно не зависит исключительно от окрашивания, видимого самого по себе.
Под предпочтительным окрашиванием подразумевают, что окрашивающее средство селективно связывается с биопленкой скорее, чем с жизнеспособными тканями хозяина. Таким образом, окрашивающее средство можно применять для обнаружения биопленки посредством выявления присутствия и расположения биопленки. Окрашивающее средство становится связанным или адсорбированным внеклеточными молекулами матрикса биопленки, а также связанным или адсорбированным и/или впитанным бактериальными клетками биопленки скорее, чем тканями раны. Предпочтительно окрашивание биопленки окрашивающим средством обнаруживает присутствие биопленки, делая ее обнаруживаемой невооруженным глазом. Для некоторых окрашивающих средств окрашенная биопленка может быть сделана флуоресцентной, например посредством освещения источником света. Флуоресценция может сделать окрашенную биопленку более видимой. Источник света выбран для излучения света соответствующей длины волны, чтобы окрашивающее средство поглощало световую энергию в виде квантов для возбуждения окрашивающего средства и вызывания флуоресценции. Наблюдение флуоресценции может быть улучшено посредством применения подходящих оптических фильтров, которые исключают нефлуоресцентные длины волн для окрашивающего средства, например в виде линз с оптическими фильтрами.
Композиции по первому аспекту изобретения содержат одно или несколько окрашивающих средств, способных к предпочтительному окрашиванию биопленок. Предпочтительно окрашивающим средством является краситель, окрашивающий биопленку, максимально поглощающий в видимой области, более предпочтительно от 380 нм до 720 нм и даже более предпочтительно от 500 нм до 600 нм, поскольку это создает широкий диапазон источников света, пригодных для использования с композицией по изобретению или для включения в набор по изобретению.
Предпочтительно окрашивающее средство производит достаточную флуоресценцию для обнаружения таким образом, что диапазон длин волн, подходящий для возбуждения, и отдельный и более высокий диапазон длин волн, подходящий для обнаружения флуоресценции, может быть получен от устройств освещения и обнаружен с применением устройств на основе линз с оптическими фильтрами.
Окрашивающие средства, пригодные для использования в композициях по изобретению, наиболее предпочтительно являются выбранными из средств, основанных на органических химических соединениях, наиболее вероятно содержащих ароматические кольцевые структуры, например бензол, или расширенное сопряжение, например в порфирине или феофорбидах, скорее со слитыми полициклическими углеводородами, например нафталином, антраценом, фенантралином и пиреном, и наиболее вероятно также содержащие гетероциклические ароматические структуры, где гетероциклическим атомом или атомами являются кислород, азот или сера или их смесь, например фуран, тиофен, пиррол, пиран, пиридин и оксазин.
Эти окрашивающие средства демонстрируют также свойства флуоресценции. Наиболее пригодными являются те, которые поглощают и излучают свет длин волн в видимом электромагнитном спектре (380-720 нм). Скорее всего такие средства имеют химические структуры, которые содержат расширенную область сопряжения, например флуорон и его производные (альтернативно известные в качестве ксантенов и родаминов), такие как эозин, эритрозин, бенгальский розовый, флуоресцеин-5-изотиоцианат, 5-хлорметил флуоресцеин, 6-карбокси флуоресцеин, 2,7-бис-(карбокси этил)-5(6)-карбокси флуоресцеин; родамин B, родамин 6G, родамин 123, родамин иодацетамид, сульфородамин B, сульфородамин 101, тетраметил родамины или техасский красный. Производные цианина, такие как 3,3’-дигексадецилиндокарбоцианины, 3,3’-дипропилоксадикарбоцианин, фталоцианин дисульфонат алюминия, тетрасульфофталоцианин алюминия, фталоцианины алюминия, фталоцианины цинка, нафталоцианины или мукополисахарид-окрашивающий альциановый синий. Акридин и его производные, такие как акрифлавин, аминакрин, 2-аминоакридин или 9-аминоакридин. В конечном итоге, подходящие средства могут прийти из классов производных оксазина, таких как нильский синий, нильский красный, Fura Red или Fura-2; квиналон и его производные; производные аденозина, такие как 2’3’-О-(2,4,6-тринитро-циклогексадиенилидин)аденозин 5’-трифосфат или 3’-О-(N-метилантранилоил)аденозин 5’-трифосфат; триарилметаны, такие как синий патентованный V, кристаллический фиолетовый, бриллиантовый синий или ирис-грин; фенотиазины, такие как метиленовый синий или толуидиновый синий O и его производные, такие как 1-метилметилен синий или 1,9-диметилметилен синий; производные фенантридина, такие как этидий или гидроэтидин; производные феофорбида, такие как феофорбид натрия, и производные порфирина, такие как хлорин e6, производные бензопорфирина, порфирины, 10 мезо-тетра порфирины, гематопорфирины или протопорфирины.
Окрашивающее средство предпочтительно включено в композицию на уровне от 0,0001% до 1% по массе, более предпочтительно от 0,0025% до 0,025% по массе, даже более предпочтительно от 0,0025% до 0,01% по массе.
Композиции по настоящему изобретению могут быть в форме, которая легко адгезируется к тканям и может с легкостью вымываться после короткого срока, чтобы способствовать визуализации окрашенной биопленки. Вязкая жидкость, например гель на основе воды или глицерина (в виде гелевого аппликатора, спрея или полоски), пенящийся мусс, крем или мазь, обеспечили бы близкий контакт с поверхностью раны. Альтернативно, тонкая, растворимая, литая пленка или лиофилизированная, растворяющаяся пластина могла бы быть использована для обеспечения близкого контакта с поверхностью раны. В любой такой системе доставки состав предпочтительно должен был бы легко смываться с жизнеспособных тканей с применением стандартных иригантов, таких как физиологический раствор, за несколько секунд.
Композиция в форме геля также может содержать загуститель, такой как производное целлюлозы, такое как гидроксиэтилцеллюлоза (HEC), карбоксиметилцеллюлоза или гидроксипропил целлюлоза; камеди; производные сахара/спирта, такие как глицерин, сорбит, мальтит, маннит, мальтодекстрин или полидекстроза; природные полимеры, такие как желатин, пектин, хитозан или альгинат; синтетические полимеры, такие как карбопол, поливинилпирролидон, поливинилацетат, поливиниловый спирт, полиакрилат, полиметакрилат, полиэтиленгликоль или полоксамеры. Предпочтительно композиция в форме геля может содержать от 1 до 5% по массе загустителя и наиболее предпочтительно HEC.
Композиция по изобретению может быть в форме геля и может также содержать увлажнитель, такой как пропиленгликоль (ПГ), глицерин, полиэтиленгликоль, полидекстроза, сорбит, триэтаноламин, циклометикон, аммоний лактат или сложный эфир глицерина. Предпочтительно композиция содержит от 5% до 15% по массе увлажнителя и наиболее предпочтительно ПГ.
14-16
Предпочтительно композиция по изобретению содержит эксципиенты для оптимизации связывания красителя с биопленкой. Например, композиция по изобретению может также содержать металл-хелатирующее средство, такое как тетранатрий этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА), лимонная кислота, деферасирокс, деферипрон, дефероксамин, деферазоксан, этиленгликоль тетрауксусная кислота, глюонная кислота, нитрилтриуксусная кислота или трицитрат натрия на уровне от 0,1 до 2,0% по массе, или средство для способствования проникновению окрашивающего средства в биопленку, такое как поверхностно-активное вещество, например твин 80, спан 20, или коамидопропилбетаин (CAPD) и, в частности, катионное поверхностно-активное вещество на основе четвертичного аммония, такое как диалкил диметил хлорид аммония, алкил пиридиния хлорид, бензалкония хлорид (BaCl), бензетония хлорид (BeCl), кокамфодиацетат динатрия, цетил морфолиниум этосульфат или алкил триметил хлорид аммония на уровне от 0,1 до 1,0% по массе. Добавление поверхностно-активного вещество может также действовать в качестве пенящегося средства. Например, поверхностно-активные вещества BeCl, твин 80, спан 20, CAPD, Cолефин сульфонат натрия или софтизан 649 могут действовать в качестве пенящих средств для придания составу характеристик пенящегося мусса.
Предпочтительно композиция по изобретению имеет pH в диапазоне от 5 до 7 и наиболее предпочтительно приблизительно 5,5.
Предпочтительно композиция по изобретению находится в форме вязкой жидкости и содержит загуститель, такой как HEC, увлажнитель, такой как ПГ, металлохелат, такой как ЭДТА, поверхностно-активное вещество, такое как BeCl, и воду и, в частности. 2,0% масс./об. гидроксиэтилцеллюлозы, 10,0% масс./об. пропиленгликоли, 0,5% ЭДТА, 0,5% BeCl и приблизительно 87% об./об. стерильной, дистиллированной воды. Альтернативно, композиции по настоящему изобретению могут быть в форме раствора, наносимого на рану из шприца, саше, бутылки-спрея, бутылки-аэрозоля, неаэрозольной бутылки, кисточкой или в форме гелевой пластины, пленки или растворяющейся капсулы.
Состав может быть заключительно стерилизован посредством автоклавирования или гамма-облучения. Альтернативно, состав может быть консервированным раствором, содержащим, например, такие консерванты, как DMDM гидантоин или парабены, такие как метил-, этил- или пропилпарабен.
Композицию по настоящему изобретению применяют преимущественно на жизнеспособных тканях, которые демонстрируют признаки клинической инфекции (воспаление, зловоние, гнойный экссудат, гипоксия и т.д.), могут находиться под угрозой инфекции, содержать некротические массы (ткань, происходящая от хозяина) или биопленку (ткань, происходящая от бактерий) или, как правило, являются тканями, не поддающимися лечению. Композицию можно применять при смене повязки, для обнаружения биопленки, а также для мониторинга эффективности схемы лечения и непосредственно будущего лечения посредством редукции в обнаруженной биопленке.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к набору компонентов для применения при обнаружении биопленок на жизнеспособных тканях, содержащему: композицию, содержащую окрашивающее средство, которое предпочтительно окрашивает биопленки, и источник света, способный вызывать флуоресценцию окрашивающего средства.
Предпочтительно набор дополнительно содержит оптические фильтры для осуществления специфической детекции флуоресценции в форме очков или встроенных оптических фильтров.
Источник света может быть белым источником света, таким как вольфрам, галоген или импульсная ксеноновая лампа, который проходит через фильтр коротких длин волн. Предпочтительно источник света является монохромным источником или источником узкополосного спектра, который не требует фильтрации или аттенуации, такой как светоизлучающий диод с выходным сигналом, который тесно коррелирует со спектральными характеристиками окрашивающего средства. Таким образом, источник света является предпочтительно небольшим, портативным, ручным и таким, который не выделяет или выделяет пренебрежимо малое количество тепла. Источник света может служить для многократного использования или для разового применения.
max
Предпочтительно набор дополнительно содержит очки или источник света содержит встроенные линзы для применения при обнаружении биопленки, где очки или линзы содержат фильтр для исключения всех длин волн света ниже максимума поглощения (Abs) окрашивающего средства. Таким образом, пользователь получает помощь при обнаружении флуоресценции окрашивающего средства, присутствующего в биопленке. Более предпочтительно, очки или светофильтр эффективны при излучении длин волн света, соответствующих спектру флуоресценции окрашивающего средства. Очки могут служить для многократного использования или разового применения (точно так же, как и встроенная в источник света линза).
Предпочтительно набор дополнительно содержит раствор для орошения раны для промывания жизнеспособной ткани перед и/или после освещения источником света.
В примере стандартного применения композицию по изобретению наносят на всю рану или на нужные области для получения тонкого, но плотного слоя композиции, например от 0,1 до 0,5 см толщины. Композицию оставляют на месте от 0,1 до 15 минут, более предпочтительно от 0,5 до 2 минут. Предшествуя освещению, состав можно оставить на месте или более предпочтительно избыток состава вымывают из раны с применением подходящего раствора для орошения раны. Вымывание избытка состава позволяет посредством окрашивания проявить расположение биопленки в ране, чтобы эти области можно было обработать, например посредством кюретажной ложки.
Затем рану осматривают на предмет присутствия преимущественно окрашенной биопленки. Это может быть произведено невооруженным глазом, или рану можно освещать источником света на расстоянии в диапазоне от 1 до 50 см. Предпочтительно источник света находится на расстоянии от 5 до 20 см. Источник света спектрального излучения выбран, чтобы соответствовать спектру флуоресценции окрашивающего средства; например, для бенгалроза, который имеет максимум флуоресценции 575 нм, подходящий источник света может излучать свет с длиной волн от 550 до 600 нм. Это приводит к флуоресценции средства в окрашенной биопленке. Предпочтительно пользователь надевает очки для наблюдения за раной или наблюдает рану через встроенные в источник света линзы. Очки или линзы обладают системой фильтрации света, которая исключает длины волн света ниже диапазона флуоресценции окрашивающего средства, и позволяет любой флуоресценции становиться значительно заметной и специфичной и, таким образом, происходит обнаружение любой биопленки.
Как правило, лечение проходит при последовательных сменах повязок. Рану можно дополнительно проверять на предмет присутствия и редукции биопленки невооруженным глазом или с применением источника света и очков или встроенной линзы. Затем на рану можно наложить повязку с соответствующими первичной и вторичной повязками.
Ниже следует краткое описание фигур и таблиц.
Фиг.1. Исходный скрининг выбранных красителей, когда биопленка окрашивается с применением биопленок, выращенных в CDFF (n=6).
Фиг.2a. Скрининг выбранных красителей, когда биопленка окрашивается с применением биопленок, выращенных в CDC реакторе биопленок (n=9). Данные о поглощении.
Фиг.2b. Скрининг выбранных красителей, когда биопленка окрашивается с применением биопленок, выращенных в CDC реакторе (n=9). Данные о концентрации.
Фиг.3. Образцы, окрашенные бенгалрозом с ЭДТА и BaCl (RBEB) (A-C) и контрольные (D-E) образцы мяса, содержащего смешанные биопленки S. aureus и P. Aeruginosa.
Фиг.4. Возраст биопленки S. aureous против концентрации красителя.
Фиг.5. Возраст биопленки P. aeruginosa против концентрации бенгалроза.
Следующие ниже примеры являются показательными по настоящему изобретению.
ПРИМЕР 1
Оценка биопленочных красителей с применением биопленочного ферментера с постоянной глубиной
Биопленочный ферментер с постоянной глубиной (CDFF) применяли для культивирования 4-дневных смешанных биопленок Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. В кратком изложении, биопленки формировали в желобах в 15 PTFE чанах вокруг края вращающейся стальной конструкции, в которой инокулят или стерильные среды для выращивания могли непрерывно стекать. Скребок распределял бактериальный инокулят или среду над чанами по мере того, как вращалась конструкция, поддерживая биопленки на постоянной глубине. Каждый чан содержал 5 передвижных порций, 4 мм в диаметре, которые углубили на глубину 300 мкм. Полученные в результате биопленки, которые росли в порционных отсеках, репродуцировали в отношении внешнего вида и микробиологической композиции и их можно было убирать из CDFF через пробоотборное отверстие с применением стерильных инструментов. В двух повторениях чаны, содержащие биопленки, удаляли из CDFF, однократно промывали посредством погружения в стерильный физиологический раствор в течение 5 секунд, затем инкубировали в 10 мл объемов следующих потенциальных красителей биопленок при концентрации 100 мкМ в деионизованной воде и оставляли в темноте в течение двух минут: эритрозин; бенгалроз; ирис-грин; бенгалроз с 2% масс./об. ЭДТА и 1% масс./об. хлорида бензалкония (BaCl) (RBEB); бенгалроз с 2% масс./об. тетранатрий ЭДТА и 1% масс./об. хлорида бензалкония в 2% масс./об. гидроксиэтилцеллюлозе и 10% масс./об. геле пропиленгликоля (гель-RBEB). После другого промывания в физиологическом растворе шесть порций каждого красителя инкубировали в течение ночи при 37°C в 6 мл объеме 2% додецилсульфата натрия (SDS) в воде для расщепления. Образцы затем центрифугировали при 13000 об./мин в течение 10 минут для разделения супернатанта и расщепленного клеточного детрита. Спектры поглощения желаемых супернатантов затем измеряли посредством спектрофотометра, и эти спектры сравнивали со спектрами известных концентраций (100 мкМ) каждого красителя в 2% SDS.
На фиг.1 представлено, что ирис-грин оказался наиболее эффективным красителем биопленок, выращенных в CDFF, за которым следует бенгалроз с ЭДТА и BaCl в жидкой форме. Оказывается, что добавление эксципиентов ЭДТА и BaCl повышает захват бенгалроза в биопленки.
ПРИМЕР 2
Оценка биопленочных красителей с применением биопленочного реактора CDC
Для культивирования 48-часовых смешанных биопленок Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa применяли биопленочный реактор Центра для контроля заболеваний (CDC). В кратком изложении, биопленки формировали на образцах для испытаний на стержнях реактора, которые находились внутри сосуда реактора, содержащего постоянно смешиваемую культуру S. aureus и P. aeruginosa при 35°C. Образцы для испытаний, содержащие биопленки, удаляли из стержней, однократно промывали посредством погружения в стерильный физиологический раствор в течение 5 секунд, затем инкубировали в 10 мл объемах следующих биопленочных красителей при концентрации 100 мкМ в деионизованной воде, в темноте в течение двух минут: эритрозин; бенгалроз; альциановый синий; родамин B; родамин 123; бенгалроз с 2% масс./об. ЭДТА и 1% масс./об. BaCl (RBEB). Вслед за другим промыванием в физиологическом растворе для каждого красителя добавляли по девять испытательных образцов каждый к 2 мл объемам 2% SDS для переваривания при установке ‘high’ в течение 1 минуты, затем инкубировали в течение ночи в темноте при 37°C для расщепления. Образцы затем центрифугировали при 13000 об./мин в течение 5 минут для разделения супернатанта и расщепленного клеточного детрита. Спектры поглощения желаемых супернатантов затем измеряли посредством спектрофотометра, и эти спектры сравнивали со спектрами известных концентраций (100 мкМ) каждого красителя в 2% SDS.
На фиг.2a представлено, как в отношении абсолютного поглощения или ‘яркости’ RBEB являлся наиболее эффективным биопленочным красителем, за которым следует углеводный краситель, альциановый синий. Выявили, что ЭДТА и/или BaCl повышают захват бенгалроза более чем на 60%. Когда те же данные были выражены как отношение измеренного поглощения: поглощение при 100 мкМ (т.е. концентрация), альциановый синий оказался наиболее эффективным биопленочным красителем.
ПРИМЕР 3
Оценка биопленочных красителей с применением биопленочной модели свиной грудинки
7
Биопленочную модель свиной грудинки применяли для дополнительной оценки биопленочных красителей. Куски свиной грудинки разрезали с применением 20 мм бора, и 6 мм бор применяли для создания углублений в центре образцов. Образцы затем стерилизовали посредством гамма-облучения. Образцы инокулировали с применением 10 мкл объемов а~1×10 КОЕ/мл смешанной суспензии S. aureus и P. aeruginosa затем инкубировали при 35°C в запечатанных парафильмом чашках Петри в течение 72-96 часов. Было выявлено, что только образцы с видимыми биопленками в центральном высверленном отверстии были затем окрашены посредством погружения образцов в 10 мл объемы 100 мкМ бенгалроза с 2% масс./об. ЭДТА и 1% масс./об. BaCl (RBEB) в течение двух минут с ополаскиванием в физиологическом растворе перед и после окрашивания. Контрольные образцы не окрашивали и, таким образом, только погружали в физиологический раствор в течение 2 минут. Образцы затем фотографировали, и примеры некоторых представлены на фиг.3. Три показанных образца (AtoC), которые были окрашены посредством RBEB, ясно демонстрируют селективный захват красителя биопленками, которые содержались внутри углублений. Эти три контрольных образца показывают, что без этого окрашивания трудно точно определить, присутствует ли и где присутствует биопленка в образцах.
ПРИМЕР 4
Окрашивание бенгалрозом биопленок, выращенных с применением биопленочной модели на мембранном фильтре
5
Биопленочную модель с мембранным фильтром применяли для изучения эффекта концентрации бенгалроза на эффективности окрашивания биопленок. В кратком изложении, 5 мкл объем 5×10 КОЕ/мл суспензии S. aureus или P. aeruginosa добавляли в центр дисков стерильных мембранных фильтров (размер пор 0,2 мкм; Anodisc, Whatman), которые помещали в 7 мл объемы стерильного триптического соевого бульона в закрытые крышкой 6-луночные планшеты. Образцы инкубировали в течение 4 часов (незрелые биопленки) и 24 и 48 часов (зрелые биопленки), и избыток планктонных клеток смывали с фильтров. Биопленки на фильтрах окрашивали посредством пипетирования 2 мл объемов бенгалроза (60 мкМ или 300 мкМ) или физиологического раствора (отрицательный контроль) в течение 30 секунд, с последующим промыванием. Бенгалроз восстанавливали из образцов биопленок посредством переваривания и расщепления в течение ночи в 2% додецилсульфате натрия, центрифугирования, затем измерения спектров поглощения в UV-vis спектрофотометре. Захват бенгалроза на образец определяли посредством сравнения показателей поглощения со стандартной кривой бенгалроза в 2% SDS.
В таблицах 1 и 2 показано, что зрелые биопленки S. aureus и P. aeruginosa захватывали бенгалроз в зависимости от концентрации красителя и возраста биопленки. Было выявлено, что только в самых высоких концентрациях 300 мкМ незрелые 4-часовые биопленки были окрашены, хотя это, похоже, происходило благодаря некоторому окрашиванию самих фильтров. Фиг.4 и 5 представляют, как зрелые 48-часовые биопленки S. aureus и P. aeruginosa захватывали больше бенгалроза, чем 24-часовые биопленки, и также что в случае 300 мкМ бенгалроза результатом были значительно более окрашенные биопленки, чем в случае 60 мкМ бенгалроза. Этот простой способ определения количества захвата бенгалроза биопленками использует спектр поглощения красителя. Применение спектров поглощения для количественного определения красителя сходно с детекцией флуоресценции с применением источника света с оптическими фильтрами. Захват может затем альтернативно наблюдаться качественно невооруженным глазом или посредством наблюдения флуоресценции бенгалроза в сочетании с источником света и оптическим фильтром.
Таблица 1
Возраст (ч)
[RB](uM)
1
2
3
Среднее
Стандартное отклонение
4
0
0
0
0
0
0
4
60
0
0
0
0
0
4
300
1,59
1,45
1,64
1,56
0,10
24
0
0
0
0
0
0
24
60
1,66
1,72
2,17
1,85
0,28
24
300
4,82
4,55
3,95
4,44
0,45
48
0
0
0
0
0
0
48
60
1,22
1,12
1,37
1,24
0,12
48
300
6,26
5,18
5,71
5,72
0,54
Таблица 2
Возраст (ч)
[RB](uM)
1
2
3
Среднее
Стандартное отклонение
4
0
0
0
0
0
0
4
60
0
0
0
0
0
4
300
1,52
1,76
1,88
1,72
0,18
24
0
0
0
0
0
0
24
60
2,04
1,76
2,02
1,94
0,15
24
300
5,05
5,84
4,41
5,10
0,72
48
0
0
0
0
0
0
48
60
3,15
1,66
2,37
2,39
0,74
48
300
6,20
9,01
6,69
7,30
1,50