Бактерии-эпифиты бурых водорослей в утилизации нефти в экосистемах северных морей

УДК 504.4.06

БАКТЕРИИ-ЭПИФИТЫ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ В УТИЛИЗАЦИИ НЕФТИ В ЭКОСИСТЕМАХ СЕВЕРНЫХ МОРЕЙ

Е.В. Семенова, Д.С. Шлыкова., А.М. Семенов, М.Н. Иванов*,

О.В. Шеляков*, А.И. Нетрусов

Методом люминесцентной микроскопии исследовано эпифитное микробное сообщество морских макрофитов Fucus sp., собранных в литорали Белого моря. Выявлена обильная колонизация поверхности макрофита разнообразными бактериями, дрожжами и микроскопическими водорослями. С использованием фрагментов таллома фукусов получены активные накопительные культуры микроорганизмов — окислителей нефти и ее производных. В микрокосмных экспериментах на биостанции биофака МГУ на Белом море в условиях, близких к естественным, выявлена высокая УВ-окисляющая способность отселектирован-ного из накопительных культур эпифитного микробного сообщества. Скорость утилизации нефти зависела от ее концентрации и количества использованной для этого процесса биомассы эпифитного микробного сообщества.

Ключевые слова: эпифиты, бурые водоросли, макрофиты, микроорганизмы, нефть, нефтеочистка.

Несмотря на развитие нефтедобывающих и транспортных технологий, загрязнение морских акваторий нефтью и нефтепродуктами, к сожалению, не уменьшается. По разным оценкам, ежегодно в воды океана попадает 1,1—7,2 млн тонн сырой нефти (Gamila, Ibrahim, 2004). Удаление нефти и ее продуктов из морских экосистем, даже при активном участии в этом процессе человека, в существенной степени происходит за счет обитающих в морской воде углеводородокисляющих микроорганизмов (УМ), т.е. путем самоочищения этих экосистем. Хорошо известно, что в процессах самоочищения водных экосистем от нефтяных загрязнений основную роль играют планктонные микроорганизмы (Коронелли и др., 1989; Перетрухина и др., 2006). Однако существует мнение, что в процессах окисления нефти и нефтепродуктов в местах обильного произрастания макроскопических водорослей определенную роль могут играть и эти макрофиты, в частности фукусовые, или, как их традиционно называют, бурые водоросли. Предполагается, что углеводородокисляющие бактерии вступают в симбиотические взаимодействия с этими фитоби-онтами, обеспечивая более эффективную очистку акватории от нефти и нефтепродуктов (Gamila, Ibrahim, 2004; Ibrahim, Gamila, 2004). Нейтрализация нефтяного загрязнения консорциумом водорослей с микроорганизмами может быть ускорена не менее чем на треть (Bokn, 1987; Binark et al., 2000). По мнению других исследователей, бурые водоросли, в частности Fucus vesiculosus, осуществляют

включение углеводородов (УВ) в собственный метаболизм (Воскобойников, 2008). Другими словами, основываясь на фактах ускорения деградации углеводородов нефти в присутствии талломов макрофитов и фактах биохимического обнаружения углеводородов нефти в тканях таких водорослей, некоторые авторы склонны отдавать приоритет в деструкции углеводородов именно макрофитам. Однако эти факты нисколько не исключают роли и вклада в окисление УВ нефти бактерий-эпифитов водорослей.

Целью настоящей работы являлась проверка способности ассоциации микроорганизмов, выделенных с поверхности бурых водорослей, окислять нефть в микрокосмах, моделирующих условия Белого моря.

Материалы и методы

Образцы бурых водорослей были собраны в зоне литорали Белого моря в районе биологической станции МГУ (Кандалакшская губа Белого моря) в августе 2007 г. при температуре морской воды 10-12°.

Для выявления микробного пейзажа поверхностей бурых водорослей готовили препараты-отпечатки с разных участков таллома. Кусочки таллома размером около 1—2 см2 прикладывали к чистому стерильному предметному стеклу и выдерживали во влажной камере в течение 2 сут. После этого отпечатки окрашивали акридином оранжевым (разведение 1 : 104) и микроскопировали под люми-

* Национальный комитет по науке и промышленности. 115184, Москва, ул. Бахрушина, 1/7.

несцентным микроскопом (МИКМЕД 2 ЛЮМАМ РПО 11, ОМО, г. С.-Петербург).

Отселектированная ассоциация микроорганизмов — деструкторов нефти быта получена путем длительной инкубации накопительной культуры на среде с нефтью. Накопительную культуру получали на минеральной среде (г/л): KNO3 — 4,0; KH2PO4 — 0,6; Na2HPO4 — 1,4; MgSO4 — 0,8: NaCl — 20, рН — 7,0. В качестве источника углерода использовали 2% бакинской нефти. Посевным материалом служили фрагменты таллома фукусовых водорослей (Fucus sp.), использованные ранее для получения препаратов-отпечатков.

Накопительную культуру инкубировали на качалке (280—300 об/мин), при температуре 28—30°. За развитием накопительной культуры наблюдали визуально и микроскопически. Через 7 сут накопительную культуру помещали в холодильник при 10—12°.

Селекцию нефтеокисляющего сообщества проводили в течение нескольких месяцев путем пересева 1 мл накопительной культуры в новую порцию среды указанного выше состава. Для выявления культивируемого разнообразия бактерий и определения титра микроорганизмов в накопительной культуре осуществляли ее кратное (1 : 10) разведение в стерильной среде без нефти и высев 0,01 мл на агаризованную среду МПБ + сусло (1:1). Чашки инкубировали при 10° в течение 7 дней.

Из отдельных колоний, выросших в этих условиях, выделили 10 штаммов чистых культур микроорганизмов. Способность чистых культур потреблять углеводороды сырой нефти проверяли в тех же условиях, что и получение накопительной культуры.

Кроме отдельных чистых культур была получена ассоциация микроорганизмов путем смыва всех колоний, выросших на чашках Петри. Эту ассоциацию использовали в качестве посевного материала для получения биомассы, которая была затем использована в микрокосмном эксперименте на Белом море.

Ассоциацию микроорганизмов выращивали на минеральной среде указанного выше состава с нефтью, на качалке, при температуре 30° в течение 10 сут. Биомассу собирали центрифугированием при 8000 об/мин и густую пастообразную массу хранили в замороженном виде. Перед началом эксперимента биомассу размораживали и разводили в стерильной морской воде до титра 1 • 1010.

Полученную суспензию микроорганизмов иммобилизовали на нитроцеллюлозных фильтрах диаметром 47 мм, размер пор 0,45 мкм. Для этого фильтр помещали на несколько секунд в суспензию, изымали и высушивали на воздухе. Эксперимент проводили в специальных павильонах Бело-

Рис. 1. Проточный бокс с перегородкой и внесенными фильтрами, пропитанными биомассой и разными концентрациями нефти

морской биологической станции в пластиковых аквариумах объемом 5 литров с протоком морской воды и имитацией физико-химических и биологических условий акватории Белого моря. Скорость протока регулировалась таким образом, чтобы соответствовать скорости колебания воды в прибойной зоне. Поверхность аквариумов была разделена на 2 части с помощью пенопластовой перегородки, что позволяло инкубировать экспериментальные и контрольные фильтры одновременно в одном сосуде (рис. 1).

Фильтры с иммобилизованной на них биомассой пропитывали нефтью в разной концентрации. Использовали 100%-ю нефть и ее разведения в 10 и 100 раз. Нефть разводили с помощью дизельного топлива. В одну часть аквариума вносили экспериментальные фильтры с иммобилизованными микроорганизмами и пропитанные разными концентрациями нефти. В другую часть аквариума вносили контрольные фильтры, содержащие разные концентрации нефти без биомассы. Эксперимент проводили в двух повторностях.

Результаты и их обсуждение

Микроскопирование отпечатков таллома выявило обильное заселение его микроорганизмами (рис. 2). Вся поверхность таллома покрыта морфологически разными микроорганизмами. При сравнении микробного пейзажа разно удаленных от поверхности воды участков таллома наблюдается заметное снижение количества и разнообразия микробного сообщества в направлении от поверхностных участков таллома к глубинным. Микробное сообщество поверхностных участков таллома представлено главным образом бактериями. С глубиной бактериальное обилие снижается при сохранении морфологического разнообразия, а количество микроскопических водорослей увеличивается.

Рис. 2. Микробный пейзаж отпечатка поверхности таллома фукуса

Эпифитное микробное сообщество представлено как одиночными клетками, так и многочисленными микроколониями, что указывает на активный рост микроорганизмов на поверхности фукуса. Морфологически бактериальное разнообразие представлено кокками в виде одиночных клеток и цепочками, разными по размерам — от мелких до крупных, палочками и многочисленными полумесяцем изогнутыми клетками (рис. 2 и 3). Хорошо различимы бактерии с коринеформной морфологией. Множество бактериальных клеток представлено толстыми яйцеподобными клетками. Многие палочки содержат светящиеся включения, расположенные по концам клетки или в середине. Встречаются микроскопические водоросли, а также клетки, по размерам соответствующие дрожжам. В связи с тем что прокрашивание клеток акридином оранжевым на одном и том же препара-

А

* 4.  s

\ "J. »? *

• --.ai

те происходило не одинаково, можно полагать, что клетки находились в разном физиологическом состоянии и, в частности, часть из них была представлена мертвыми организмами. Таким образом, выывлены1 обильные и разнообразные эпифиты Fucus sp.

В накопительных культурах, полученных при инокуляции среды фрагментами фукуса, также бышо выявлено значительное морфологическое разнообразие микроорганизмов. На фиксированных и окрашенных фуксином препаратах быии обнаружены многочисленные палочкообразные, кокковид-ные и коринеформные бактериальные клетки, бактериальные споры и отдельные дрожжеподобные клетки.

Деградация нефтяной пленки в разных вариантах накопительной культуры (использованы фрагменты таллома из разныгх частей слоевища) протекала с разной интенсивностью. Некоторые варианты отличались полным исчезновением нефти и появлением интенсивно окрашенной розоватой пленки на поверхности жидкой среды. Высев на плотные среды показал, что титр клеток накопительных культур возрастал по мере увеличения срока инкубации от через 3 мес инкубации до 108 после 7 мес инкубации при 10—12°.

Микрокосмным экспериментом было установлено, что эпифитное микробное сообщество обладает значительной способностью окислять нефть.

Первое изменение в цветности фильтров быио обнаружено уже через 2 сут (рис. 4). Через 4 сут

Рис. 3. Морфологическое разнообразие микроорганизмов — эпифитов фукуса

Рис. 4. Сравнительная цветовая характеристика опытных (слева) и контрольных фильтров (справа) на второй день проведения опыта

фильтры с иммобилизованной биомассой УВ-окис-ляющих бактерий и пропитанные нефтью с концентрацией 10% и 1%, как показано на рис. 5, имели белый цвет, т.е. практически полностью были свободны от нефти.

Фильтр с адсорбированной на нем биомассой УВ-окисляющих бактерий и пропитанный 100%-й нефтью на шестой день эксперимента значитель-

Рис. 5. Цветовая характеристика опытного (слева) и контроль- Рис. 6. Опытный фильтр со 100%-й концентрацией нефти ного (справа) фильтра при 10%-й концентрации нефти на чет- на шестой день опыта

вертый день опыта

но посветлел по краям, однако в целом сохранял свою ярко-коричневую окраску (рис. 6).

Этими исследованиями подтверждается фундаментальная идея об активных микробно-расти-тельных взаимодействиях в морских экосистемах. Имеющиеся литературные данные о роли морских макрофитов в утилизации нефти и ее продуктов нашли подтверждение в наших исследованиях в виде УВ-окисляющей активности эпифитного микробного сообщества. Обилие микроорганизмов на поверхности фукусов существенно превосходит плотность, которую обнаруживают в окружающей их воде (Коронелли и др. 1989). Следовательно, многие водоросли можно рассматривать как носитель или даже как инкубатор микроорганизмов, в том числе и УВ-окисляющих.

Метод определения деградации нефти по динамике обесцвечивания пропитанных нефтью фильтров, на которых ранее было иммобилизовано УВ-окисляющее МС, хотя и является качественным, но достаточно наглядным. Более того, это метод, по-видимому, может быть подвергнут калиброва-

нию и тем самым имеется перспектива переведения его в разряд количественных методов. Несомненно, что скорость деградации нефти зависит не только от ее концентрации, но и от соотношения концентрации нефти и биомассы микроорганизмов, ее окисляющих. Если при использовании не-разведенной нефти соотношение с иммобилизованной на фильтре биомассой микроорганизмов принять равным 1:1, то при разведении нефти соотношение с биомассой становилось 1 : 0,1 и 1 : 0,01.

Авторы благодарят проф. кафедры микробиологии Р.Н. Ивановского и н.с. А.И. Шестакова за помощь при проведении экспериментов на Белом море.

* * *

Исследования выполнены в рамках Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы", госконтракт № 02.515.11.5071 от 25 июня 2007 г.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Воскобойников Г.М. 2008. Исследования макрофитов Баренцева моря: история и направления // Мат-лы Межждунар. науч. конф. и VII школы по морской биологии. 9—13 июня 2008. Ростов н/Д. 2008. C. 73—75.

Коронелли Т.В., Ильинский В.В., Дер-мичева С.Г., Комарова Т.И., Беляева А.Н., Филиппова З.О., Розы нов Б.В. 1989. Углево-дородокисляющие микроорганизмы арктических вод и льдов // Изв. АН СССР. Сер. биол. № 4. 581—587.

Перетрухина И.В., Ильинский В.В., Литвинова М.Ю. 2006. Определение скоростей биодеградации нефтяных углеводородов в воде литорали Кольского залива // Вестник МГТУ. 9. № 5. 828—832

Binark N., Guven K.C., Gezgin T., Unlu S . 2000. Oil pollution of marine algae // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 64. 866—872.

B o k n T. 1987. Effects of diesel oil and subsequent recovery of commercial benthic algae // Hydrobiol. 151. 277—284.

Gamila H.A., Ibrahim M.B.M. 2004. Algal bioassay for evaluating the role of algae in bioremediation of crude oil: I-Isolated Strains // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 73. 883—889.

Ibrahim M.B.M., Gamila H . A . 2004. Algal bioassay for evaluating the role of algae in bioremediation of crude oil: freshwater phytoplankton assemblages // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 73. 971—978.

Поступила в редакцию 27.10.08

BACTERIA-EPIPHYTES OF BROWN MACRO ALGA IN UTILIZATION OF OIL IN ECOSYSTEMS OF NORTH SEA

E.V. Semenova, D.S. Shlykova, A.M. Semenov, M.N. Ivanov, O. V. Shelyakov, A.M. Netrusov

By method of luminescent microscopy epiphytic microbial community of Fucus sp. — sea macrophyts collected in the littoral zone of White Sea was investigated. Abundant colonization of a surface of the macrophyts by various bacteria, yeast and microscopic alga was revealed. With use of fukuses thallus fragments enrichment culture of microorganisms — active oxidizers of oil and its derivatives was obtain. In macrocosm experiments on a biological research station of MSU at the conditions imitate the natural high oxidizing ability of selected cultures of epiphytic microbial community was demonstrated. The rate of oil utilization depends on its concentration and amount of epiphytic microbial community biomass used for this process.

Key words: epiphytes, brown algae, macrophytes, microorganisms, oil, remediation.

Сведения об авторах

Семенова Елена Владимировна — канд. биол.наук, доц. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-45-45; e-mail: amsemenov@list.ru

Шлыкова Дарья Сергеевна — студентка 5-го курса кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. 89169394420.

Семенов Александр Михайлович — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-42-23; e-mail: amsemenov@list.ru

Нетрусов Александр Иванович — докт. биол. наук, проф., зав. кафедрой микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-27-63; e-mail: anetrusov@mail.ru

Иванов Михаил Николаевич — докт. эконом. наук, первый вице-президент "Национального комитета по науке и промышленности". Тел. (495)997-20-04; e-mail: anknp@mail.ru

Шеляков Олег Владимирович — акад. РНАН, президент "Национального комитета по науке и промышленности". Тел. (495)951-57-01; e-mail: anknp@mail.ru