Способ раннего прогнозирования развития врожденного инфекционного заболевания новорожденных
METHOD FOR EARLY PREDICTION OF THE DEVELOPMENT OF CONGENITAL INFECTIOUS DISEASE OF NEWBORNS

Данное изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования развития врожденных инфекционных заболеваний у доношенных новорожденных с целью предупреждения неблагоприятных исходов.
Врожденные инфекционные заболевания (ВИЗ) являются одной из актуальных медико-социальных проблем во всем мире и занимают ведущее место среди причин перинатальной заболеваемости и смертности не только у недоношенных, но и доношенных новорожденных.
ВИЗ представляют значительную трудность в диагностике и прогнозировании, что обусловлено многообразием клинических проявлений заболеваний, отсутствием среди них дифференциально значимых симптомов, а также частыми латентными и субклиническими формами со стертыми или минимальными проявлениями.
Источником ВИЗ является мать ребенка, от которой возбудитель в анте- или интранатальном периоде проникает в организм плода различными путями, в том числе через плаценту, а незрелая иммунная система плода не способна адекватно распознать инфекционные агенты и элиминировать их.
Большую практическую ценность для диагностики и прогнозирования внутриутробного инфицирования у плодов, рожденных от матерей высокого инфекционного риска, представляет морфологическое исследование последа, которое позволяет оптимизировать курацию новорожденных и предотвратить развитие тяжелых перинатальных осложнений.
Однако, высокая частота выявления инфекционных плацентитов при низкой специфичности их морфологических проявлений затрудняют анализ разнородных факторов развития патологии фетоплацентарной системы. А выявляемые при морфологическом исследовании патологические процессы нередко представлены сложным комплексом циркуляторных, дистрофических, иммунных, воспалительных, компенсаторно-приспособительных, инволютивных изменений.
Зачастую при доношенной беременности и рождении ребенка с долженствующими массо-ростовыми показателями и удовлетворительным состоянием при рождении, гистологическое исследование плаценты не выявляет воспалительных изменений, а строение ворсинчатого хориона является термопластическим, что позволяет судить об отсутствии риска реализации ВИЗ. Однако, в дальнейшем в позднем неонатальном периоде происходит манифестация ВИЗ с вовлечением в воспалительный процесс различных органов и систем новорожденного. В этой связи применяемый в широкой клинической практике метод световой микроскопии зачастую не позволяет достоверно установить природу выявляемых морфологических изменений в последе, что диктует необходимость включения дополнительных диагностических и прогностических маркеров в схему исследования плаценты.
Известен способ прогнозирования врожденных вирусных инфекций по результатам исследования последа, изложенный в работе О.А. Аксенова, А.А. Закиной «Способ диагностики внутриутробных вирусных инфекций у детей» (2006). Данный способ осуществляется путем морфологического исследования плаценты, определения в крови матери и ребенка IgM и IgG антител в реакции мРСК с исследованием ретроплацентарной крови, крови ребенка и матери, а также определения вирусных антигенов, специфических иммунных комплексов с антигенами и специфических низкоавидных антител IgG3, IgG 1-2. Описанная методика сопряжена с высокой стоимостью, технической сложностью, многоэтапностью выполнения, что не позволяет применять ее в рутинной повседневной практике.
Существует работа М.Т. Луценко и И.А. Андриевской «Морфометрические исследования фетоплацентарного барьера ворсинок плаценты при герпесной и цитомегаловирусной инфекции» // Бюллетень СО РАМН. 2010. том 30. №3. С. 137-140. Авторами показано, что при активизации герпес - инфекций во время беременности происходят выраженные изменения в перестройке кровеносного русла в терминальных ворсинках плаценты, отмечается недостаточность обеспечения ворсинок кровеносными сосудами, которые далеко отстают от синцитиотрофобласта, что приводит к снижению газообмена и формированию гипоксии плода. Количество сосудов на поперечном сечении ворсинок снижается до 3-5, в контроле - 6-7 сосудов. Увеличивается расстояние между кровеносным сосудом и внутренней поверхностью синцитиотрофобласта до 2,5 mkm по сравнению с контролем (1,0 (0,003 mkm)).
Недостатком данного способа является ограничение сведений только по герпес -вирусным инфекциям. Но этиопатогенетическим фактором перинатальной заболеваемости и смертности могут быть и другие актуальные для перинатального периода инфекции, составляющие биоценоз генитального тракта женщины, другие представители микрофлоры женщины. Данный способ не обеспечивает точного и своевременного прогнозирования.
Ближайшим способ к нашему заявочному материалу принята работа Д.В. Мусатова, О.В. Кожарской, Н.М. Ивахнишиной, С. В. Супрун и О.В. Островской «Способ прогнозирования риска развития внутриутробных инфекций новорожденного по морфометрическим параметрам терминальных ворсин плаценты» (2020). Авторами показано, что существует возможность прогнозирования риска развития внутриутробной инфекции у новорожденного при помощи определения среднего числа капилляров и среднего расстояния от капилляров до синцитиотрофобласта в терминальных ворсинах плаценты, полученной от доношенных и недоношенных беременностей. Новорожденного относят к группе риска развития внутриутробной инфекции при среднем числе капилляров в 5 полях зрения в терминальных ворсинах каждой из плацент 5,28-5,42 и расстоянии от капилляров до синцитиотрофобласта 1,47-1,77 мкм в плаценте от доношенной беременности и при среднем числе капилляров в терминальных ворсинах 3,78-4,16 и расстоянии от капилляров до синцитиотрофобласта 2,0-2,40 мкм в плаценте от недоношенной беременности, завершенной в 30-36 недель гестации.
Недостатком данного способа является лишь количественная оценка капиллярного русла ворсин без уточнения качественной характеристики и степени зрелости эндотелия последнего. Данное обстоятельство может обусловить гиподиагностику патологии капиллярного русла ворсин, в том числе при ранних и латентных изменениях. Таким образом, данный способ не обеспечивает точного и своевременного прогнозирования.
С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ прогнозирования развития врожденного инфицирования новорожденных. Технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в повышении точности и своевременном прогнозировании за счет качественной оценки зрелости капиллярного русла терминальных ворсинок планценты.
Это достигается тем, что путем иммуногистохимической оценки дистального звена сосудистого русла ворсинчатого хориона плаценты, авторы исследуют фрагменты материнской поверхности плаценты от доношенных детей, рожденных на сроке 37 недель и более, проводят иммуногистохимическое исследование с применением маркера CD 15, производят оценку интенсивности и распространенность иммуноокрашивания в 10 полях зрения: 0 баллов, отрицательная - отсутствие окрашивания; 1 балл, слабая - слабое или минимальное окрашивание, продукт реакции светло-коричневого цвета; 2 балла, умеренная - коричневого цвета; 3 балла, выраженная - темно-коричневого цвета; затем осуществляют расчет коэффициента экспрессии по формуле:
где
Б - интенсивность окраски в баллах: от 0 до 3,
П - процент окрашенных клеток для каждого значения Б, и при коэффициенте экспрессии 6,0-7,8 в микрососудах терминальных и промежуточных ворсин хориона, прогнозируют развитие врожденного инфекционного заболевания новорожденных.
В результате многолетнего опыта работы в области лечения детей с ВИЗ, авторы обнаружили, что выявление ВИЗ у новорожденных имеет различные сроки: у части больных заболевание развивается очень быстро в 1-3 сутки жизни, у других реализация инфекционного заболевания проходит позже (на 14-28 сутки заболевания), в связи с чем диагностика затягивается, соответственно, терапия зачастую назначается в более поздние сроки, после вирусологического и бактериологического подтверждения заболевания, что негативно влияет на исход заболевания.
В результате анализа исходов лечения наблюдаемых новорожденных стала очевидной необходимость раннего прогноза ВИЗ для выбора правильной тактики ведения и своевременного проведения терапии. В процессе анализа морфологического исследования плацент различными методами и течения инфекционного процесса у этих же детей, авторы впервые обнаружили, что только осуществление иммуногистохимического исследования плаценты с применением маркера CD 15 с оценкой зрелости дистального звена сосудистого русла ворсин обеспечивает возможность четкого прогнозирования развития ВИЗ. Так, при проведении иммуногистохимической диагностики плаценты с применением маркера CD 15 у детей с реализованными инфекционными заболеваниями, родившихся на сроке гестации 37 недель и выше при регистрации коэффициента экспрессии 6,9±0,9 в микрососудах терминальных и промежуточных ворсин хориона, у всех новорожденных регистрировалось ВИЗ различной этиологии.
Авторы показали, что необходимым критерием для прогнозирования реализации врожденного инфекционного заболевания является подтверждение факта незрелости дистального звена капиллярного русла виллезного дерева, что позволяет выявить латентные и перенесенные на ранних сроках гестации инфекционные поражения при отсутствии явных морфологических признаков воспалительных и структурных изменений в плаценте при доношенной беременности и удовлетворительном состоянии новорожденного при рождении.
Мы показали, что виллезный эндотелий в ворсинах дистального звена плаценты незрел в случаях патологических изменений, обусловленных инфекционно- воспалительными процессами, а иммунодетекция CD 15 является ценным маркером для выявления незрелости эндотелия сосудистого русла ворсин хориона при ВИЗ.
Обследованию подлежат плаценты от доношенных (срок гестации 37 недель и выше) беременностей. Функциональной и структурной зрелости плацента достигает на сроке гестации от 37 недель. На этом сроке строение ворсинчатого хориона представлено преимущественно терминальными ворсинами, в меньшей степени в структуре представлены промежуточные ворсины хориона. Сосудистый эндотелий в норме при доношенной беременности должен иметь зрелое строение. Применение иммуногистохимического исследования с применением маркера CD 15 позволяет выявить патологию сосудистого русла ворсин путем окрашивания измененного эндотелия сосудов и прогнозировать реализацию ВИЗ на ранних сроках.
Авторы показали, что иммуногистохимическое окрашивание фрагментов материнской поверхности плаценты (базальные и суббазальные отделы) является наиболее информативным. Оценка данных зон плаценты является наиболее показательной ввиду того, что в указанных участках наиболее часто регистрируются инфекционно-воспалительные и структурные изменения, связанные с гематогенным путем передачи инфекции от матери к плоду (наиболее типичный путь передачи внутриутробных вирусных инфекций).
Выбранное авторами число полей, в которых регистрируется изменение микро- и макрососудов, а также интенсивность окрашивания иммуногистохимического маркера CD 15 получены и обоснованы экспериментальным путем, при статистической обработке данных иммуногистохимического исследования с учетом результатов динамичного клинического наблюдения за новорожденными и детьми, а также лабораторными и инструментальными обследованиями.
Нами установлено, что описанные данные являются необходимыми и достаточными для осуществления прогноза врожденного инфекционного заболевания. В случае прогнозирования с помощью предлагаемого способа развития ВИЗ у новорожденного далее выбирают тактику последующей инвазивной диагностики методом ПЦР и ИФА и алгоритм лечения.
Таким образом, предложенный авторами способ отличается новизной, неочевидностью, изобретательским уровнем, что обеспечивает положительный результат. В доступной нам литературе подобного способа прогнозирования ВИЗ не обнаружено, а совокупность предложенных авторами признаков позволяет нам заявить способ как заявочный материал на изобретение.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Обследованию подлежали плаценты от доношенных (срок гестации 37 недель и выше) беременностей. Для иммуногистохимического исследования были использованы парафиновые блоки плацент исследуемых детей. Из фрагментов, взятых из материнской поверхности плаценты, изготавливались парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивали на иммуногистостейнере Leica Microsystems. Для постановки иммуногистхимической реакции были использованы мышиные моноклональные антитела анти-IgM против CD 15-антигена. При иммуногистохимическом исследовании анализировались микрососуды дистального звена ворсинчатого хориона (промежуточные и терминальные ворсины хориона) в 10 полях зрения каждой из плацент. Оценка интенсивности иммуно-гистохимической реакции осуществлялась в баллах: отрицательная (0 баллов) - отсутствие окрашивания (фиг. 1), слабая (1 балл) - слабое или минимальное окрашивание (фиг. 2), продукт реакции светло-коричневого цвета, умеренная (2 балла) - коричневого цвета (фиг. 3), выраженная (3 балла) - темно-коричневого цвета (фиг. 4). В каждом поле зрения определялся процент позитивно окрашенных эндотелиальных клеток при каждом значении интенсивности окраски (в 10 полях зрения при низком увеличении микроскопа (×50)). Коэффициент экспрессии рассчитывался для каждого наблюдения по формуле:
где Б - интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3), П - процент окрашенных клеток для каждого значения Б.
Под нашим наблюдением находилось 40 доношенных новорожденных с ВИЗ и 10 доношенных новорожденных, у которых диагноз ВИЗ не реализовался (контрольная группа). В ходе исследования произведено иммуногистохимическое исследование плацент с применением маркера CD 15. У всех обследованных детей при анализе гистологических заключений в плаценте имели место разного рода неспецифические гистологические изменения (компенсаторно-приспособительные, воспалительные, инволютивные), характеризующие различную степень риска развития ВИЗ, что не позволяло однозначно прогнозировать развитие ВИЗ. Иммуногистохимическое исследование с применением маркера CD 15 позволило выявить значимые изменения со стороны сосудистого русла ворсин, что дало возможность судить о патологии последнего и прогнозировать развитие ВИЗ.
При исследовании плацент детей с реализацией ВИЗ были выявлены достоверные отличия иммуноокрашивания с применением маркера CD 15 в сосудах дистального звена ворсин хориона плаценты (табл. 1).
Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.
Пример №1. Пациент К.
Из анамнеза известно, что настоящая беременность 1-я, протекала с угрозой прерывания на ранних сроках. Роды на 39 неделе гестации, раннее излитие околоплодных вод, приращение плаценты. Ребенок родился с весом 3240,0 г., ростом - 50,0 см. При макроскопическом исследовании плаценты - размер - 16,0×13,0×1,8 см, масса 437,0 г, хориальная пластинка - амниотическая оболочка гладкая, блестящая; магистральные сосуды полнокровны, материнская поверхность - дольчатость неравномерная, рельеф несколько сглажен, на разрезе плацентарная ткань неравномерного кровенаполнения; пуповина 43,0×1,0 см, извита, на поперечном срезе 3 сосуда. Гистологически - нормопластический тип строения плаценты, реактивные, компенсаторно-приспособительные, инволютивные изменения. При иммуногистохимическом исследовании проведена оценка капиллярного русла терминальных и промежуточных ворсин хориона суббазального пространства материнской поверхности плаценты в 10 полях зрения с расчетом коэффициента экспрессии по формуле  Коэффициент экспрессии составил 7,2. Полученные данные указывают на наличие патологической незрелости эндотелия в микрососудах плаценты, выявленное при иммуногистохимическом исследовании с применением маркера CD 15, при этом гистологически при рутинном исследовании плацента имеет правильное гистологическое строение, воспалительных изменений не выявлено. На основании проведенного иммуногистохимического исследования плаценты можно прогнозировать ВИЗ у ребенка, а также судить о необходимости тщательного мониторинга в условиях стационара (для своевременной диагностики инфекционно-воспалительных процессов). Предположение подтвердилось: несмотря на удовлетворительное состояние при рождении (масса тела - 3240,0 г, оценка по шкале Ангар 8/9 баллов), в позднем неонатальном периоде диагностирована амниальная пневмония.
Прогноз по заявленному способу подтвержден.
Пример №2. Пациент А.
Беременность 3-я, предшествовали 2 медицинских аборта, во время беременности женщина не состояла на учете в женской консультации. Роды начались на 37-й неделе гестации с ранним излитием околоплодных вод. При макроскопическом исследовании плаценты - размер - 18,0×17,0×1,0 см, масса 480,0 г, хориальная пластинка - амниотическая оболочка гладкая, блестящая; магистральные сосуды полнокровны, материнская поверхность - дольчатость не выражена, рельеф сглажен, на разрезе плацентарная ткань полнокровна; пуповина 52,0×1,0 см, извита, на поперечном срезе 3 сосуда. Гистологически -признаки диссоциированного созревания ворсин хориона. Масса тела ребенка 3310,0 г, рост 53,0 см. Оценка по шкале Агар 9/9 баллов. При иммуногистохимическом исследовании, с применением маркера CD 15, проведена оценка капиллярного русла терминальных и промежуточных ворсин хориона суббазального пространства материнской поверхности плаценты в 10 полях зрения, с расчетом коэффициента экспрессии по формуле .
Коэффициент экспрессии составил 6,7. Полученный результат свидетельствует о наличии патологической незрелости эндотелия в микрососудах плаценты, при этом гистологически при рутинном исследовании плаценты воспалительных изменений Пне выявлено. Прогноз по заявленному способу подтвердился. На основании полученных иммуногистохимических данных сделан вывод о высокой вероятности развития ВИЗ у новорожденного. Новорожденный находился на стационарном лечении в отделении патологии новорожденных (ОПН) с диагнозом генерализованная вирусно-бактериальная инфекция с поражением легких и почек.
Прогноз по заявленному способу подтвержден.
Пример №3. Пациент П.
Беременность 1-я, протекавшая благоприятно. Роды на 39-й неделе гестации, через естественные родовые пути. При макроскопическом исследовании плаценты - размер -17,0×15,0×1,2 см, масса 510,0 г, хориальная пластинка - амниотическая оболочка гладкая, блестящая; магистральные сосуды полнокровны, материнская поверхность - дольчатость равномерная, рельеф выражен, на разрезе плацентарная ткань умеренного кровенаполнения; пуповина 48,0×1,0 см, на поперечном срезе 3 сосуда. Гистологически - термопластический тип строения плаценты. Масса тела ребенка 3820,0 г, рост 53,0 см. Оценка по шкале Агар 8/9 баллов. При иммуногистохимическом исследовании, с применением маркера CD15, проведена оценка капиллярного русла терминальных и промежуточных ворсин хориона суббазального пространства материнской поверхности плаценты в 10 полях зрения, коэффициент экспрессии составил 0,9. На основании полученных иммуногистохимических данных сделан вывод об отсутствии вероятности реализации ВИЗ у новорожденного. Новорожденный выписан из роддома на 3 сутки, период адаптации и новорожденности без особенностей.
Прогноз по заявленному способу не подтвержден.
Способ позволяет прогнозировать на ранних сроках ВИЗ у ребенка, а также судить о необходимости тщательного мониторинга в условиях стационара (для своевременной диагностики инфекционно - воспалительных процессов). Предупредить неблагоприятные исходы, выбор алгоритма лечения.
Способ представляет большую практическую ценность для прогноза внутриутробного инфицирования у доношенных плодов, рожденных от матерей высокого инфекционного риска, позволяет оптимизировать курацию новорожденных и предотвратить развитие тяжелых перинатальных осложнений у доношенных новорожденных.