ПРИМЕНЕНИЕ КАРРИМИЦИНА ИЛИ ЕГО АКТИВНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ
USE OF CARRIMYCIN OR ITS ACTIVE INGREDIENTS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области лекарственных веществ, а конкретно - к применению карримицина или его действующих ингредиентов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Карримицин - инновационный антибиотик, получаемый путем клонирования группы 4″-о-ацил-трансферазы штамма-продуцента карбомицина в штамме-продуценте спирамицина посредством технологии генной модификации, направленного ацилирования спирамицина 4″-OH и добавления боковой цепи изовалерила в положение 4″, содержащий изовалерил-спирамицин в положении 4″ в качестве основного ингредиента.
Карримицин состоит из множества производных спирамицина с общей концентрацией основных действующих ингредиентов - изовалерил-спирамицинов (I+II+III) - не менее 60 %, и является фармацевтически приемлемой лекарственной композицией. Центральная структура представляет собой 16-членное лактоновое кольцо, соединенное с молекулой форозамина, молекулой микаминозы и молекулой микарозы. Основные ингредиенты, изовалерил-спирамицин I, II и III, отличаются от строения спирамицина тем, что группа, объединенная с положением 4″ микарозы, представлена изовалерилом, а не гидроксилом. На настоящее лекарственное вещество компанией Shenyang Tonglian Pharmaceutical и другими лицами совместно была подана заявка как на новое лекарственное вещество типа 1.1.
Химическое строение основных ингредиентов карримицина приведено в формуле (I):
Формула (I)
2
3
2
где при R=H и R'=COCHCH(CH) она представляет собой изовалерил-спирамицин I;
3
2
3
2
где при R=COCH и R'=COCHCH(CH) она представляет собой изовалерил-спирамицин II; и
2
3
2
3
2
где при R=COCHCH и R'=COCHCH(CH) она представляет собой изовалерил-спирамицин III.
Карримицин - 16-членный макролидный антибиотик, имеющий активные группы, такие как карбоксильная, алкоксильная, эпокси-группа, кетонная, формильная, а также пару сопряженных С=С, и обладает молекулярной массой приблизительно 884-982. Ввиду схожести химического строения карримицин и макролидные антибиотики обладают множеством общих свойств: они легкорастворимы в большинстве органических растворителей, таких как сложные эфиры, ацетон, хлороформ и спирты, слаборастворимы в петролейном эфире и нерастворимы в воде; их молекулярные структуры содержат две диметиламиногруппы и являются слабощелочными, благодаря чему они легкорастворимы в кислых водных растворах. Они обладают «отрицательной растворимостью», при которой с повышением температуры растворимость падает. Поскольку изовалерил-спирамицин, основной ингредиент карримицина, обладает длинной углеродной цепью в положении 4″ и слабой гидрофильностью, его растворимость в воде ниже, чем у спирамицина и 4″-ацетилспирамицина.
Карримицин - белый некристаллический порошок со слабой гигроскопичностью, удельным вращением около -80,8 и максимальной длиной волны ультрафиолетовой абсорбции, равной 231-232 нм. Сам по себе он имеет хромофорную группу со слабой флуоресценцией и выдает фиолетовую реакцию при контакте с концентрированной серной или соляной кислотой, приводящую к возникновению интенсивной фиолетовой флуоресценции с максимальным значением светопоглощения, равным 231-232 нм.
Лекарственное вещество обладает хорошей липофильностью, хорошей проникаемостью в ткани, быстрой оральной абсорбцией, долгой сохраняемостью в условиях in-vivo и устойчивым постантибиотическим эффектом. В соответствии с отношением полезного действия и химической конформации, после ацеляции положения 4″ макролидных антибиотиков у последних улучшилась липофильность и активность in-vivo, а также значительно улучшились противобактериальная активность in-vivo и клинические терапевтические эффекты; при этом стабильность антибиотиков in-vivo возрастает по мере роста углеродной цепи 4″-сложного гидроксиэфира, то есть, изовалерил-спирамицин > бутирил-спирамицин > пропионил-спирамицин > ацетил-спирамицин.
+
-
Предварительные фармакодинамические испытания in-vitro и in-vivo показали, что лекарственное вещество не только обладает хорошей противобактериальной активностью против большинства грамположительных бактерий (G), но также оказывает определенное воздействие на некоторые грамотрицательные бактерии (G); различные технические показатели лекарственного вещества явно превосходят азитромицин, эритромицин, ацетил-спирамицин и медемицин; в особенности оно обладает сильной противобактериальной активностью в отношении микоплазмы пневмонии; оно также обладает некоторой противобактериальной активностью против бактерий, резистентных к эритромицину - гонококка, пневмококка, золотистого стафилококка, синегнойной палочки, гемофильной палочки, бактероидов фрагилис, легионеллы, тетайотамикронных бактероидов и палочки газовой гангрены; а также обладает слабой перекрестной резистентностью к золотистому стафилококку с клинической устойчивостью к эритромицину. В основном, карримицин будет применяться в лечении инфекционных заболеваний, вызванных грамположительными бактериями, особенно инфекций верхних дыхательных путей, а также может применяться против инфекций мочевыделительной системы и т.п.
В недавнем исследовании заявителем было установлено, что карримицин или его действующие ингредиенты - изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III или их сочетания - оказывают положительный эффект на резистентность к сенилизму, диабету или болезни Альцгеймера, что обеспечивает теоретическое обоснование клинического применения лекарственного вещества, карримицина, или его действующих лекарственных ингредиентов, а также важные экономические и социальные полезные эффекты.
Ввиду этого было предложено настоящее изобретение.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель настоящего изобретения состоит в создании нового лекарственного вещества для профилактики и/или лечения заболевания.
Чтобы реализовать вышеуказанную цель, в настоящем изобретении применяются следующие технические решения:
предлагается препарат для профилактики и/или лечения заболевания, представленного болезнью Альцгеймера, диабетом или сенилизмом; этот препарат включает в себя первый действующий ингредиент, и этот ингредиент включает в себя один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III
или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Кроме того, препарат также включает в себя второй действующий ингредиент:
когда заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера, второй действующий ингредиент предпочтительно представлен как минимум одним из лекарственных веществ от болезни Альцгеймера;
когда заболевание представляет собой диабет, второй действующий ингредиент представлен как минимум одним из антидиабетических средств; и
когда заболевание представляет собой сенилизм, второй действующий ингредиент представлен как минимум одним из лекарственных веществ для замедления старения или увеличения продолжительности жизни.
Кроме того, препарат и фармацевтически приемлемый носитель объединяются в клинически приемлемый лекарственный препарат, предпочтительно имеющий форму таблетки, капсулы, драже, инъекционного раствора, препарата с замедленным высвобождением или частицы системы для введения.
Помимо этого, доза лекарственного вещества колеблется в диапазоне от 10 до 1500 мг/кг; предпочтительно - от 50 до 1000 мг/кг; еще более предпочтительно - от 100 до 500 мг/кг.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается комбинированный продукт для профилактики и/или лечения заболевания, представленного болезнью Альцгеймера, диабетом или сенилизмом; этот комбинированный продукт включает в себя первый препарат с действующим ингредиентом, и этот ингредиент включает один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III
или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Кроме того, комбинированный продукт дополнительно включает второй препарат:
когда заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера, второй препарат предпочтительно представлен как минимум одним из лекарственных веществ для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера;
когда заболевание представляет собой диабет, второй препарат представлен как минимум одним из лекарственных веществ для профилактики и/или лечения диабета; и
когда заболевание представляет собой сенилизм, второй препарат представлен как минимум одним из лекарственных веществ для замедления старения или увеличения продолжительности жизни.
Кроме того, соотношение количества первого препарата со вторым препаратом составляет 1~99:99~1, предпочтительно - 5~95:95~5, более предпочтительно - 10~90:90~10, а наиболее предпочтительно - 20~80:80~20.
Дополнительно лекарственное вещество для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера включает вещество, действующее на холинергическую систему, вещество, действующее на рецептор N-метил-D-аспартата, антиоксидант, противовоспалительное средство, вещество, ингибирующее образование белка Aβ, эстроген, фактор роста нервной ткани, нимодипин и антиапоптотический агент; и
лекарственные вещества для профилактики и/или лечения диабета включают в себя как минимум один из следующих компонентов: бигуанидное сахароснижающее вещество, сульфонилмочевинное сахароснижающее вещество, ингибитор α-глюкозидазы, сенсибилизатор инсулина, несульфонилмочевинный стимулятор секреции инсулина и инсулин.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается применение препарата или комбинированного продукта при изготовлении препарата для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера, повышения умственных способностей, профилактики и/или лечения диабета, замедления старения или увеличения продолжительности жизни.
В частности, применение для получения препарата для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера и повышения умственных способностей включает в себя применение для получения препарата для снижения гидролиза ацетилхолина, препарата для уменьшения интенсивности когнитивного расстройства и дискинезии, препарата для защиты внутримозговых нервных клеток, а также применение для получения препарата для предотвращения уменьшения массы тела, улучшения иммунитета или повышения количества лейкоцитов.
Применение для получения препарата для профилактики и/или лечения диабета включает в себя получение препарата для профилактики и/или лечения диабета типа I или II или определенных типов диабета, а предпочтительно применение для получения препарата для обеспечения секреции инсулина или снижения содержания сахара в крови или защиты островковой β-клетки, или получения препарата для профилактики и/или лечения диабета и поддержания массы тела.
Применение для получения препарата для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни включает в себя получение такого препарата посредством изменения активности транскрипционного фактора DAF-16; применение для получения препарата для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни посредством улучшения уровня экспрессии SIR2.1 в виде гомологичного белка SIR2 и воздействия на активность DAF-16 посредством SIR2.1; или применение для получения препарата для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни посредством активации AMPK для непосредственного увеличения активности FOXO/DAF-16.
Ниже представлено подробное описание настоящего изобретения:
Первостепенная цель настоящего изобретения состоит в получении лекарственного вещества для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.
Чтобы реализовать вышеуказанную цель, в настоящем изобретении применяются следующие технические решения:
по настоящему изобретению предлагается лекарственное вещество для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера, и действующий ингредиент этого вещества включает один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин III, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин I или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Карримицин представляет собой смесь этих трех действующих ингредиентов - изовалерил-спирамицина I, изовалерил-спирамицина II и изовалерил-спирамицина III - и, помимо них, также содержит примеси.
Кроме того, лекарственное вещество включает фармацевтически приемлемый носитель.
Также это лекарственное вещество имеет клинически приемлемую форму таблетки, капсулы, драже, инъекционного раствора, препарата с замедленным высвобождением или частицы системы для введения.
Помимо этого, доза лекарственного вещества колеблется в диапазоне от 10 до 1500 мг/кг.
Дополнительно доза лекарственного вещества колеблется в диапазоне от 50 до 1000 мг/кг.
Также доза лекарственного вещества колеблется в диапазоне от 100 до 500 мг/кг.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается комбинированный продукт для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера. Этот комбинированный продукт включает первый препарат, действующий ингредиент которого включает один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин III, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин I, или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Кроме того, комбинированный продукт дополнительно включает второй препарат.
Помимо этого, второй препарат включает как минимум одно из лекарственных веществ для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.
Дополнительно лекарственное вещество для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера включает в себя вещество, действующее на холинергическую систему, вещество, действующее на рецептор N-метил-D-аспартата, антиоксидант, противовоспалительное средство, вещество, ингибирующее образование белка Aβ, эстроген, фактор роста нервной ткани, нимодипин и антиапоптотический агент.
Также по настоящему изобретению предлагается применение любого из вышеприведенных лекарственных веществ или комбинированных продуктов для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера и повышения умственных способностей.
Болезнь Альцгеймера (БА) - нейродегенеративное заболевание с прогрессирующей деменцией в качестве основного клинического проявления. Гипотеза о холинергическом нарушении представляет собой недавно общепризнанную теорию о болезни Альцгеймера (БА), и это нарушение считается важной причиной болезни. Холинергическая система рассматривается как важная точка целевого воздействия лекарственных веществ при БА. Опыты показывают, что за счет снижения гидролиза ацетилхолина лекарственное вещество по настоящему изобретению повышает концентрацию ацетилхолина в гиппокампе и коре головного мозга, за счет чего улучшается когнитивная функция и обеспечивается профилактика и/или лечение болезни Альцгеймера.
Также по настоящему изобретению предлагается применение любого из вышеприведенных лекарственных веществ или комбинированных продуктов для снижения гидролиза ацетилхолина.
Также по настоящему изобретению предлагается применение любого из вышеприведенных лекарственных веществ или комбинированных продуктов для уменьшения интенсивности когнитивного расстройства и дискинезии.
Дополнительно по настоящему изобретению предлагается применение любого из вышеприведенных лекарственных веществ или комбинированных продуктов для защиты внутримозговых нервных клеток.
По настоящему изобретению предлагается применение любого из вышеприведенных лекарственных веществ или комбинированных продуктов для снижения массы тела, улучшения иммунитета и повышения количества лейкоцитов.
Вторая цель настоящего изобретения состоит в получении лекарственного вещества для профилактики и/или лечения диабета.
Чтобы реализовать вторую цель, в настоящем изобретении применяются следующие технические решения:
предлагается лекарственное вещество для профилактики и/или лечения диабета, и действующий ингредиент этого вещества включает один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Лекарственное вещество по настоящему изобретению включает фармацевтически приемлемый носитель.
Лекарственное вещество по настоящему изобретению может быть получено посредством применения фармацевтически приемлемого носителя в форме таблетки, капсулы, драже, инъекционного раствора, препарата с замедленным высвобождением или частицы системы для введения.
Доза действующего ингредиента лекарственного вещества по настоящему изобретению колеблется в диапазоне от 10 до 1500 мг/кг; предпочтительно - в диапазоне от 50 до 1000 мг/кг; еще более предпочтительно - в диапазоне от 100 до 500 мг/кг.
Диабет представлен диабетом типа I или II или определенными типами диабета.
Диабет имеет множество проявлений патогенеза, и лекарственное вещество для профилактики и/или лечения диабета по настоящему изобретению преимущественно нацелено на диабет, провоцируемый следующими факторами: несбалансированность клеток Th1 и Th2 и факторов их экспрессии, потеря β-клеток по причине воздействия на организм вирусов, чрезмерная экспрессия гена UCP2 или мутация аутосомы.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается комбинированный продукт для профилактики и/или лечения диабета, включающий первый препарат, действующий ингредиент которого включает один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III, или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Комбинированный продукт по настоящему изобретению дополнительно включает второй препарат, содержащий как минимум одно из лекарственных веществ, обеспечивающих лечение диабета.
Второй препарат предпочтительно включает в себя как минимум один из следующих компонентов: бигуанидное сахароснижающее вещество, сульфонилмочевинное сахароснижающее вещество, ингибитор α-глюкозидазы, сенсибилизатор инсулина, несульфонилмочевинный стимулятор секреции инсулина и инсулин.
Предпочтительно, чтобы соотношение количества первого препарата со вторым препаратом составляло 1~99:99~1, предпочтительно - 5~95:95~5, более предпочтительно - 10~90:90~10, а наиболее предпочтительно - 20~80:80~20.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается применение как минимум одного из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III для получения препарата для профилактики и/или лечения диабета; и
диабет представлен диабетом типа I или II или определенными типами диабета.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается применение как минимум одного из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III для обеспечения секреции инсулина или снижения содержания сахара в крови или защиты островковой β-клетки.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается применение как минимум одного из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III для получения препарата для профилактики и/или лечения диабета и поддержания массы тела.
Третья цель настоящего изобретения состоит в получении лекарственного вещества для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни.
Чтобы реализовать третью цель, в настоящем изобретении применяются следующие технические решения:
предлагается композиция для замедления старения или увеличения продолжительности жизни, включающая первый действующий ингредиент, который включает один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III, или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Кроме того, композиция также включает второй действующий ингредиент.
Второй действующий ингредиент включает как минимум одно из лекарственных веществ для замедления старения или увеличения продолжительности жизни.
Согласно настоящему изобретению из как минимум одного первого и как минимум одного второго действующих ингредиентов можно получить сложный препарат.
Кроме того, при получении сложного препарата соотношение количества первого действующего ингредиента со вторым составляет 1~99:99~1, предпочтительно - 5~95:95~5, более предпочтительно - 10~90:90~10, а наиболее предпочтительно - 20~80:80~20.
Помимо этого, композицию получают за счет применения приемлемого эксципиента с лекарственным веществом, продуктом медицинского назначения или пищевой добавкой.
Кроме того, лекарственное вещество представляет собой фармацевтически приемлемую лекарственную форму.
Дополнительно фармацевтически приемлемая лекарственная форма имеет форму таблетки, капсулы, драже, инъекционного раствора, препарата с замедленным высвобождением или частицы системы для введения.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается комбинированный продукт для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни, включающий первый препарат, действующий ингредиент которого включает один из следующих компонентов карримицина: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III, или сочетает в себе два или три следующих компонента: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Согласно настоящему изобретению карримицин представляет собой смесь разных действующих ингредиентов - изовалерил-спирамицина I, изовалерил-спирамицина II и изовалерил-спирамицина III - и, помимо них, также содержит примеси.
Кроме того, комбинированный продукт дополнительно включает второй препарат.
Дополнительно второй препарат включает как минимум одно из лекарственных веществ для замедления старения или увеличения продолжительности жизни.
Согласно настоящему изобретению первый и второй препараты могут вводиться в сочетании друг с другом. При комбинированном введении первый и второй препараты не имеют заданного порядка введения, и первым может быть введен как первый, так и второй препарат, а также оба препарата могут быть введены одновременно.
Соотношение количества первого препарата со вторым препаратом составляет 1~99:99~1, предпочтительно - 5~95:95~5, более предпочтительно - 10~90:90~10, а наиболее предпочтительно - 20~80:80~20.
Кроме того, первый препарат представляет собой фармацевтически приемлемую лекарственную форму.
Дополнительно фармацевтически приемлемая лекарственная форма имеет форму таблетки, капсулы, драже, инъекционного раствора, препарата с замедленным высвобождением или частицы системы для введения.
По настоящему изобретению дополнительно предлагается композиция или комбинированный продукт в форме препарата для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни.
В частности, настоящее изобретение относится к применению композиции или комбинированного продукта для получения препарата для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни посредством изменения активности транскрипционного фактора DAF-16; применение для получения препарата для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни посредством улучшения уровня экспрессии SIR2.1 в виде гомологичного белка SIR2 и воздействия на активность DAF-16 посредством SIR2.1; или применение для получения препарата для замедления старения и/или увеличения продолжительности жизни посредством активации AMPK для непосредственного увеличения активности FOXO/DAF-16 в комбинированном продукте.
Помимо этого, продукт представляет собой лекарственное вещество, продукт медицинского назначения или пищевую добавку.
Для исследования были отобраны Caenorhabditis elegans дикого типа, которых разделили на группу введения и группу без введения препарата; сначала выполнялось введение препарата в различных концентрациях и проводился замер кривых роста нематод, исследовалось влияние карримицина на физиологические показатели, связанные с продолжительностью жизни, такие как изменения количества яиц в кладке, а также активность и способность к перемещению нематод; после введения карримицина проводились дальнейшие замеры показателей выживаемости нематод после воздействия на них высокой температуры, равной 37°С, а также ультрафиолетового излучения и стимуляции.
Использование нематод в качестве эталона резистентности к старению имеет следующие преимущества:
60-80 % генов нематод крайне схожи с аналогичными человеческими генами, а также нематоды имеют двенадцать путей трансдукции сигналов, обнаруженных на данный момент. Caenorhabditis elegans в настоящем изобретении используется в качестве модельного организма для скрининга лекарственного вещества, обеспечивающего резистентность к старению. Подходящий мутант может быть подобран посредством использования богатого генетического ресурса нематод согласно целям исследования для изучения механизмов старения и резистентности к нему. Фактически, на примере нематод подтверждаются все из нескольких имеющихся теорий механизма старения. Таким образом, считается, что лекарственные вещества, обеспечивающие резистентность к старению у нематод, как правило, будут оказывать аналогичное полезное действие на человека.
На настоящий момент использование нематод Caenorhabditis elegans для анализа жизненных показателей насчитывает тридцатилетнюю историю. Вследствие своих уникальных преимуществ они стали самым первым эталоном, выбранным для исследований старения. Цикл смены поколений у нематод краткий и составляет приблизительно 3 дня, а также продолжительность их жизни в целом составляет около 3 недель. Это позволяет обеспечивать повторяемость и устойчивость опытов. Для обеспечения надежности подходов к проведению опытов и точности их результатов, а также гарантии того, что за счет скрининга лекарственных веществ можно будет получить более точную и достоверную информацию, необходимо повторное проведение опытов. Вследствие вышеприведенных уникальных преимуществ Caenorhabditis elegans стали самым первым эталоном, выбранным для исследований старения. Следовательно, нематод можно использовать для оценки воздействия композиции на устойчивость к старению и, в свою очередь, для определения возможности применения этой композиции для получения лекарственных веществ, обеспечивающих резистентность к старению.
Результаты настоящего исследования показывают, что карримицин обладает свойством сопротивления старению на примере Caenorhabditis elegans.
Согласно настоящему изобретению лекарственное вещество может быть получено за счет применения способов предыдущего уровня техники в различных фармацевтически приемлемых лекарственных формах, таких как таблетки и капсулы.
Согласно настоящему изобретению доза лекарственного вещества колеблется в диапазоне от 10 до 1500 мг/кг; предпочтительно - в диапазоне от 50 до 1000 мг/кг; еще более предпочтительно - в диапазоне от 100 до 500 мг/кг.
Опытным путем заявителем было установлено, что карримицин или действующие ингредиенты лекарственного вещества на его основе - изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III - или их сочетания оказывают положительный эффект на резистентность к болезни Альцгеймера, диабету или сенилизму, что обеспечивает теоретическое обоснование клинического продвижения лекарственного вещества, карримицина, или действующих лекарственных ингредиентов лекарственного вещества на его основе, а также важные экономические и социальные полезные эффекты.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 - скорость самопроизвольной чередующейся реакции групп крыс при проведении эксперимента с использованием Y-лабиринта по настоящему изобретению;
Фиг. 2 - общее количество раз входа в рукав группами крыс при проведении эксперимента с использованием Y-лабиринта по настоящему изобретению;
Фиг. 3 - индексы предпочтения в отношении новых объектов спустя 1 ч у групп крыс при проведении эксперимента на предмет распознавания крысами новых предметов;
Фиг. 4 - индексы предпочтения в отношении новых объектов спустя 24 ч у групп крыс при проведении эксперимента на предмет распознавания крысами новых предметов;
Фиг. 5 - индексы различения в отношении новых объектов спустя 1 ч у групп крыс при проведении эксперимента на предмет распознавания новых предметов по настоящему изобретению;
Фиг. 6 - индексы различения в отношении новых объектов спустя 24 ч у групп крыс при проведении эксперимента на предмет распознавания новых предметов по настоящему изобретению;
Фиг. 7 - задержка при попытке к спасению у групп крыс при проведении эксперимента с водным лабиринтом по настоящему изобретению;
Фиг. 8 - время, потраченное на переход через платформу, по группам крыс при проведении эксперимента с водным лабиринтом по настоящему изобретению;
Фиг. 9 - скорость плавания групп крыс при проведении эксперимента с водным лабиринтом по настоящему изобретению;
Фиг. 10 - влияние на жизненный цикл после введения карримицина;
Фиг. 11-а - анализ показателя подвижности после введения дозы карримицина 5 мкг/мл;
Фиг. 11-b - анализ показателя подвижности после введения дозы карримицина 10 мкг/мл;
Фиг. 12 - анализ показателей выживаемости при реакции на тепловое воздействие после введения карримицина;
Фиг. 13 - анализ показателей выживаемости под воздействием УФ излучения после введения карримицина;
Фиг. 14-a - анализ интенсивности флуоресценции на 10-й день после введения карримицина;
Фиг. 14-b - анализ интенсивности флуоресценции на 15-й день после введения карримицина;
Фиг. 15 - анализ интенсивности флуоресценции после введения карримицина;
Фиг. 16-a - анализ проникновения в ядро DAF-16 нематод TJ356 на 6-й день после введения карримицина; и
Фиг. 16-b - анализ интенсивности флуоресценции нематод TJ356 на 6-й день после введения карримицина;
обозначение KL на чертежах представляет карримицин, а обозначение RES - ресвератол.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Для обеспечения большей очевидности целей, технических решений и преимуществ примеров по настоящему изобретению далее в настоящем документе технические решения данных примеров будут описаны четко и полностью со ссылками на примеры по настоящему изобретению. Следующие примеры предназначены для объяснения настоящего изобретения, но не для ограничения его объема.
Следует отметить, что лекарственное вещество на основе карримицина в следующих примерах также может относиться к композиции, состоящей из одного или нескольких следующих компонентов: изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин II и изовалерил-спирамицин III.
Пример 1. Таблетированный карримицин
Характеристики: 200/350 мг
Рецептура ядра таблетки:
карримицин
200 г
микрокристаллическая целлюлоза
110 г
натрия крахмала гликолят
22 г
повидон K30 (5 %)
15 г
стеарат магния
3 г
_______________________
приготовление в количестве
1000 таблеток
Рецептура пленкообразующего раствора:
Opadry II
21 г
Дистиллированная вода
соответствующее количество
_______________________
приготовление в количестве
105 мл
Процесс приготовления:
30
Приготовление ядра таблетки: основной препарат и эксципиенты в соответствующем порядке пропускались через сито 100 меш, а затем выполнялось перемешивание рецептурного количества карримицина, рецептурного количества микрокристаллической целлюлозы и 1/2 рецептурного количества натрия крахмала гликолята до однородного состояния, после чего добавлялся водный раствор повидона K 5 % для получения мягкого материала. Для гранулирования использовалось сито 18 меш, и влажные гранулы просушивались в условиях обдува при температуре 60°С в течение 2 ч. После сушки влажных гранул для рассеивания гранул использовалось сито 18 меш, после чего добавлялась 1/2 рецептурного количества натрия крахмала гликолята и рецептурное количество стеарата магния. После равномерного перемешивания всех материалов смесь таблетировалась с помощью узкого вогнутого штампа диаметром 11 мм для получения ядра таблетки, содержащего лекарственное вещество, причем масса таблетки составляла 350 мг, а твердость - 6,5 кг.
Приготовление пленкообразующего раствора: было проведено взвешивание требуемого количества Opadry II (белого), в емкость для приготовления частями было добавлено необходимое количество воды, после чего скорость перемешивания была снижена до исчезновения завихрения, и для получения пленкообразующего раствора перемешивание продолжалось в течение 30 мин.
Приготовление таблеток с пленочной оболочкой: ядро таблетки размещали на установке для нанесения оболочки, устанавливались условия нанесения оболочки и производилось ее нанесение с основной частотой 20 об/мин при температуре воздуха на входе 40°С и 30°С на выходе, давлении распыла 0,02 МПа и расходом жидкого раствора 1 мл/мин. По достижении стабильного состояния оболочка распылялась в течение 1,5 часов до тех пор, пока поверхность таблеток не становилась гладкой и не приобретала однородный цвет. Таблетка проходила контроль, если она соответствовала стандартам контроля тонкопленочного покрытия. Покрытие увеличивало массу приблизительно на 5 %.
Пример 2. Таблетированный карримицин (из расчета на 1000 таблеток)
Рецептура:
порошок-сырец карримицина
1000 г
гидроксипропилцеллюлоза (5 %)
с низкой степенью замещения
92,5 г
натрия крахмала гликолят (3 %)
55,5 г
стеарат магния (1 %)
18,5 г
крахмал
суммарная масса минус масса другого сырья и эксципиентов
суммарная масса
1850 г
Процесс приготовления: соответствующее количество крахмала было взвешено, разбавлено до концентрации 15 % и нагрето до образования пасты для получения вяжущего вещества; основной материал карримицин, а также эксципиенты в виде крахмала, гидроксипропилцеллюлозы с низкой степенью замещения, натрия крахмала гликолята и стеарата магния были пропущены через сито 100 меш в соответствующем порядке, и затем необходимые основной материал и эксципиенты были взвешены согласно количеству, указанному в рецептуре. После полного смешивания лекарственного вещества А (карримицина), крахмала и гидроксипропилцеллюлозы с низкой степенью замещения до однородного состояния была использована крахмальная паста с концентрацией крахмала 15 % для преобразования смеси в мягкий материал, который был гранулирован посредством сита 14 меш, и затем эти гранулы были высушены при температуре 50-60°С до получения влажности 3-5 %. Для рассеивания гранул использовалось сито 14 меш, после чего для смешивания были добавлены карбоксиметилкрахмал натрия и стеарат магния, и была измерена концентрация гранул. Согласно концентрации гранул была вычислена масса таблетки, и смесь была таблетирована (посредством узкого вогнутого штампа диаметром 9 мм), после чего была проведена проверка на разность массы таблеток. После прохождения проверки таблетки были упакованы.
Пример 3. Капсулированный карримицин (из расчета на 10000 гранул)
Рецептура:
порошок-сырец карримицина
1000 г
крахмал
1080 минус масса порошка-сырца лекарственного вещества А
лекарственная капсула № 3
1000 гранул
вазелиновое масло
50 мл
Процесс приготовления: основной материал в виде карримицина и вспомогательный материал в виде медицинского крахмала были по-отдельности взвешены согласно количеству по формуле для данного процесса, а затем полностью перемешаны в миксере в течение 1,5-2 часов. Данные, полученные при отборе образцов и проверке концентраций, в целом должны были совпадать с теоретическими данными (масса каждой капсулы составляла приблизительно 0,105 г), и затем сертифицированные лекарственные капсулы № 3 и смешанное сырье для загрузки были помещены в приспособление для заполнения в соответствии с требованиями автоматической капсюлировочной машины, после чего заполненные капсулы подверглись испытанию на различие образцов (±10 % или менее, <0,3 г) для определения соответствия скорости растворения требованиям. Капсулы, соответствовавшие требованиям после испытания, были помещены в глянцовочную машину для глянцевания в течение 15-20 минут с добавлением вазелинового масла, после чего они были извлечены для проверки их соответствия упаковке для готовой продукции.
Пример 4. Высушенный сироп карримицина (из расчета на 10000 упаковок)
Рецептура:
порошок-сырец карримицина
1250 г
лимонная кислота (0,5 %)
15 г
сахароза
суммарная масса минус масса другого сырья и эксципиентов
суммарная масса
около 5000 г
пигмент (куркумин)
около 1 г
Процесс приготовления: порошок-сырец карримицина, лимонная кислота и сахароза были в соответствующем порядке измельчены до получения гранул посредством скоростной вихревой мельницы, и 85 % гранул были пропущены через сито 300 меш, а 15 % - через сито 180 меш. Затем мелкоизмельченный порошок был отвешен в количестве, предусмотренном рецептурой, и полностью перемешивался в течение 1-1,5 часов, были измерены значения концентрации, рассчитана норма загрузки (теоретическая норма загрузки составила 500 мг на пакет). После этого смесь была помещена в машину для упаковки в пакеты, была установлена бумага с алюминиевой фольгой и проведено заполнение в соответствии с требованиями машины для заполнения. Допуск по расхождениям находился в пределах ±5 %, и после заполнения и прохождения осмотра изготавливалась наружная упаковка.
Пример 5. Гранулированный карримицин (из расчета на 10000 упаковок)
Рецептура:
порошок-сырец карримицина
1250 г
сахарная пудра
20000 г
декстрин
9000 г
повидон K<sub>30</sub>5 %
соответствующее количество
Процесс приготовления: порошок-сырец карримицина, сахарная пудра и декстрин были пропущены через сито 120 меш, а затем отвешены в количестве, предусмотренном рецептурой, и равномерно перемешаны. Вышеприведенные смешанные материалы были преобразованы в мягкий материал с помощью повидона K30 5 % в виде клейкого вещества, после чего этот мягкий материал был гранулирован с помощью колебательного гранулятора, высушен при 70°С, а гранулы были распределены и предварительно упакованы после прохождения проверки.
Пример 6. Карримицин в форме лиофилизированного порошка для инъекций
500 мг порошка-сырца карримицина были перемешаны до однородного состояния с равномолярным количеством пропиленгликоля, и эта смесь была растворена в 5 мл воды для получения светло-желтого прозрачного раствора со значением рН от 4,6 до 5,6 единиц. Далее в форме лиофилизированного пропанта в светло-желтый прозрачный раствор были добавлены 40 г маннитола, и после быстрой заморозки при низкой температуре в течение 9 часов материал был лиофилизирован для получения рыхлого вещества светло-желтого цвета, которое перед использованием было растворено в 10 мл стерилизованной воды.
Пример испытания 1. Установление наличия у карримицина функции защиты островковой клетки путем проведения опытов на клетках
Целью испытания является оценка способности испытуемого образца карримицина обеспечивать защиту островковой β-клетки.
Клеточный штамм:
крысиная клетка инсулиномы, или INS-клетка, приобретенная в клеточном ресурсном центре института общих медицинских исследований Китайской академии наук.
Реагенты:
питательный раствор RPMI1640 и эмбриональная телячья сыворотка, приобретенные у компании Gibco из США, а также трипсин, глютамин, пенициллин, стрептомицин, диметисульфоксид (DMSO), метил-тиазол-тетразолий (MTT), аллоксан (аллоксана моногидрат, чистота ≥ 98,0 %), приобретенные у компании Sigma из США.
Инструменты:
углекислотный инкубатор (Sanyo, Япония), фермент-связанный иммуносорбентный анализатор (Tecan, Австрия), 96-луночный культуральный планшет (Corning, США) и инвертированный микроскоп (Motic, Китай).
Этапы процедуры следующие:
адгезивная клетка:
5
2
в качестве адгезивной клетки выступала клетка INS-1, которая в фазе логарифмического роста была подкормлена трипсином, перемешана в полной среде, а затем была приготовлена суспензия отдельных клеток. Концентрация клеток была задана как 1*10/мл, и клетка была посеяна на 96-луночный культуральный планшет по 100 мкл на лунку, культивирована в инкубаторе в течение 24 ч при концентрации СО, равной 5 %, и температуре 37°С. Клетки были сгруппированы в соответствии с требованиями опыта, и клетки в группе введения были введены с аллоксаном дозой 24 ммоль/л, а также одновременно было введено испытуемое лекарственное вещество (карримицин) в разных концентрациях (0,2, 0,4 и 0,8 ммоль); для каждой концентрации были выделены по 4 лунки, и выращивание всех групп было продолжено на 24 ч при температуре 37°С. Дополнительно были сформированы нормальная контрольная группа (без введения препарата), эталонная группа (с введением только аллоксана) и группа положительного контроля (на базе аллоксана был введен метморфин в концентрации 0,5 ммоль/л). Затем из всех групп был получен супернатант, трижды тщательно промыт фосфатно-солевым буферным раствором, и в каждую лунку были добавлены по 100 мкл новообразованной культуральной среды, содержащей 0,5 мг/мл МТТ, после чего выращивание было продолжено в течение 4 ч при температуре 37°С. После этого из всех групп был тщательно извлечен супернатант, в каждую лунку были добавлены 150 мл DMSO, и все группы подверглись равномерному перемешиванию посредством микроосциллятора в течение 10 минут. Оптическая плотность всех групп измерялась с помощью микропланшетного ридера при длине волны 492 нм.
Оценка результатов:
показатели выживаемости клетки INS-1 под действием лекарственного вещества рассчитываются по следующей формуле:
492
492
выживаемость INS-клетки (%) = A (группа введения)/A (нормальная контрольная группа)×100 %
Результат: итог оценки обеспечения испытуемым лекарственным веществом защиты островковой клетки представлен в приведенной далее таблице 1:
Таблица 1: защита INS-1(x±s) посредством карримицина
Группа
Дозировка
Выживаемость (%)
Нормальная контрольная группа
--
100,00
Эталонная контрольная группа
--
75,48±4,23<sup>*</sup>
Группа положительного контроля
0,5 ммоль
92,91±6,69<sup>##</sup>
Группа введения
0.2 ммоль
89,87±4,60<sup>##</sup>
0,4 ммоль
93,28±3,91<sup>###</sup>
0,8 ммоль
97,73±5,29<sup>###</sup>
*
##
###
p<0,05 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с эталонной контрольной группой,  p<0,001 при сопоставлении с эталонной контрольной группой; образец демонстрирует хороший эффект защиты клетки INS-1.
Пример испытания 2.
Целью испытания является оценка воздействия испытуемого образца (карримицина) на сахар в крови у мыши-диабетика.
Реагенты:
аллоксан (аллоксана моногидрат, чистота ≥ 98,0 %) и метформин (чистота 97 %), приобретенные у компании Sigma-Aldrich.
Набор для измерения уровня инсулина, приобретенный у компании Rongsheng Biotech Co., Ltd. (номер партии: E02I0006).
Инструменты:
быстродействующий глюкометр, индикаторная бумага для измерения сахара в крови (Johnson & Johnson, США) и электронные аналитические весы.
Животное:
куньминская мышь, свободная от патогенной микрофлоры, с массой тела 18-20 г.
Процедура:
исследование воздействия карримицина на снижение показателей сахара крови включает отбор куньминских мышей, внутрибрюшную инъекцию аллоксана в дозировке 160 мг/кг для формирования эталонной группы мышей. На этапе моделирования был проведен отбор мышей с устойчивыми показателями сахара в крови (10-25 ммоль/л), деление их в произвольном порядке на эталонную контрольную группу, группу положительного контроля (метморфин с дозировкой 200 мг/кг) и группу введения (с карримицином в качестве лекарственного вещества с дозировкой 25, 50 и 100 мг/кг). Одновременно была сформирована нормальная контрольная группа, которая получила пищевой физиологический раствор.
После формирования эталонной группы и зондового питания в течение 30 и 45 дней мышей не кормили в течение 16 часов, после чего проводилось их взвешивание. После взвешивания бралась проба крови с кончика хвоста, и уровень сахара в крови натощак измерялся глюкометром. После измерения показателей сахара в крови мышам однократно внутрижелудочно вводилось вещество. Спустя 2 ч мышам в каждой группе вводили раствор глюкозы путем зондового питания в дозировке 2 г/кг, и с кончика хвоста бралась проба крови. После введения глюкозы (Bg0, Bg0,5 и Bg2) измерялись показатели сахара в крови во временные отрезки 0, 0,5 и 2 ч, и вычислялась площадь под фармакокинетической кривой сахара крови (AUC) (реакция на сахароустойчивость) по следующей формуле:
AUC = 0,25*(Bg0+4*Bg0,5+3*Bg2); и
после формирования эталонной группы и зондового питания в течение 45 дней мышей не кормили в течение 16 ч и отбирали пробу крови из дна венозного сплетения. Перед отбором крови капилляры увлажняли гепарином, отбирали 0,5 мл крови из дна венозного сплетения, центрифугировали ее при 3500 об/мин в течение 10 минут, а затем отбирали плазму для испытаний. Извлекался супернатант, а показатели инсулина измерялись по методу ELISA. Выполнялись действия согласно указаниям в наборе.
Измерение инсулиновой резистентности: после измерения сахара в крови натощак и уровня инсулина инсулиновая резистентность рассчитывалась по следующей формуле:
инсулиновая резистентность = уровень сахара в крови натощак * уровень инсулина натощак/22,5 (по последним исследованиям показатель >2,6 указывает на наличие инсулиновой резистентности).
Все данные подверглись статистическому анализу посредством применения программного обеспечения SPSS16.0. Все данные, полученные в ходе опыта, были отображены в виде среднего значения плюс/минус квадратическое отклонение (x±s). Средние значения по группам были сопоставлены в рамках отличий посредством дисперсионного анализа, где значение P < 0,05 указывает на значительные отличия. Результаты приведены в таблицах 2-6. На 30-й и 45-й дни после формирования эталонных групп и внутрижелудочного введения масса тела животных в эталонной группе в сравнении с нормальной контрольной группой значительно снизилась, уровень сахара в крови натощак значительно повысился, сахароустойчивость снизилась, явное влияние на уровень инсулина в сыворотке натощак не было выявлено, а инсулиновая резистентность значительно повысилась.
Карримицин может нейтрализовывать симптом потери массы тела у мыши-диабетика, снижать уровень сахара в крови натощак у мышей, а также повышать сахароустойчивость, явным образом не воздействует на уровень инсулина в сыворотке натощак, однако может снижать инсулиновую резистентность, что указывает на то, что карримицин обладает хорошей эффективностью по снижению уровня сахара в крови.
Таблица 2: изменения массы тела в группах подопытных животных (г) (x±s)
Группа
Дозировка (мг/кг)
Дозировка
Набор массы тела на 30-й день
Набор массы тела на 45-й день
Нормальная контрольная группа
--
--
6,63±2,74
9,51±2,72
Эталонная контрольная группа
--
--
2,14±1,97<sup>*</sup>
0,58±2,04<sup>*</sup>
Группа положительного контроля
200
200 мг/кг
5,94±1,03<sup>#</sup>
7,26±1,48<sup>#</sup>
Группа введения
25
100 мг/кг
3,52±1,31<sup>#</sup>
4,58±1,18<sup>#</sup>
50
200 мг/кг
4,75±1,67<sup>#</sup>
5,87±1,36<sup>#</sup>
100
400 мг/кг
5,81±1,80<sup>#</sup>
6,81±1,37<sup>#</sup>
*
#
p<0,05 в сравнении с нормальной контрольной группой;  p<0,05 в сравнении с эталонной контрольной группой, n=8.
Таблица 3: изменения уровня сахара в крови в группах подопытных животных (ммоль/л) (x±s)
Группа
Дозировка (мг/кг)
День 0
День 30
День 45
Нормальная контрольная группа
--
5,28±0,42
4,68±0,97
4,81±0,52
Эталонная контрольная группа
--
17,84±1,35<sup>***</sup>
22,62±1,43<sup>***</sup>
20,16±1,66<sup>*</sup>
Группа положительного контроля
200
18,07±1,26<sup>***</sup>
14,94±1,03<sup>**#</sup>
10,24±1,07<sup>*##</sup>
Группа введения
25
17,95±1,81<sup>***</sup>
16,52±1,31<sup>**#</sup>
14,58±1,91<sup>*#</sup>
50
18,20±1,54<sup>***</sup>
16,15±1,67<sup>**#</sup>
12,87±1,81<sup>*#</sup>
100
17,98±0,85<sup>***</sup>
15,81±1,80<sup>**#</sup>
11,81±1,71<sup>*##</sup>
*
**
***
#
##
###
p<0,05 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,001 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,05 при сопоставлении с эталонной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, p<0,001 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, n=8.
Таблица 4: влияние карримицина на сахароустойчивость у мыши-диабетика (x±s) (день 30)
Группа
Дозировка (мг/кг)
Уровень сахара в крови
AUC
0 ч
0,5 ч
2 ч
Нормальная контрольная группа
--
6,0±0,7
7,9±1,0
6,6±1,0
14,3±0,9
Эталонная контрольная группа
--
14,0±1,9<sup>**</sup>
29,6±2,8<sup>**</sup>
20,6±2,1<sup>***</sup>
49,1±3,0<sup>***</sup>
Группа положительного контроля
200
14,6±1,4<sup>**</sup>
19,8±1,8<sup>**##</sup>
13,5±1,9<sup>**#</sup>
33,6±2,7<sup>**#</sup>
Группа введения
25
14,4±2,4<sup>**</sup>
21,8±2,2<sup>**#</sup>
25,4±3,0<sup>**</sup>
44,6±4,1<sup>**</sup>
50
14,7±2,0<sup>*</sup>
19,9±2,8<sup>**##</sup>
14,9±2,0<sup>**#</sup>
34,8±3,2<sup>**#</sup>
100
13,5±1,5<sup>*</sup>
20,6±2,1<sup>**##</sup>
15,0±2,1<sup>**#</sup>
35,2±2,4<sup>**#</sup>
*
**
***
#
##
###
p<0,05 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,001 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,05 при сопоставлении с эталонной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, p<0,001 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, n=8.
Таблица 5: влияние карримицина на сахароустойчивость у мыши-диабетика (x±s) (день 45)
Группа
Дозировка (мг/кг)
Уровень сахара в крови
AUC
0 ч
0,5 ч
2 ч
Нормальная контрольная группа
--
5,9±0,7
6,9±1,4
6,4±1,3
13,2±0,9
Эталонная контрольная группа
--
14,4±1,4<sup>**</sup>
31,2±2,1<sup>***</sup>
23,6±1,8<sup>**</sup>
52,5±3,0<sup>***</sup>
Группа положительного контроля
200
14,1±1,5<sup>**</sup>
18,9±1,7<sup>**#</sup>
13,2±1,7<sup>**#</sup>
32,3±2,1<sup>**#</sup>
Группа введения
25
14,7±2,4<sup>**</sup>
22,2±3,1<sup>**#</sup>
24,2±2,6<sup>**</sup>
44,0±3,0<sup>**#</sup>
50
14,4±2,0<sup>**</sup>
20,2±2,8<sup>**#</sup>
15,1±2,2<sup>**#</sup>
35,1±1,2<sup>**#</sup>
100
13,7±1,5<sup>**</sup>
19,4±2,1<sup>**#</sup>
14,9±2,4<sup>**#</sup>
34,0±2,1<sup>**#</sup>
*
**
***
#
##
###
p<0,05 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,001 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,05 при сопоставлении с эталонной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, p<0,001 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, n=8.
Таблица 6. Уровень инсулина натощак (ммоль/л) и инсулиновая резистентность (ИР) по группам подопытных животных
Группа
Дозировка (мг/кг)
Уровень инсулина натощак (ммоль/л)
Инсулиновая резистентность (ИР)
Нормальная контрольная группа
--
2,36±0,07
0,50
Эталонная контрольная группа
--
2,56±1,28
2,29<sup>***</sup>
Группа положительного контроля
200
2,32±1,26
1,06<sup>**###</sup>
Группа введения
25
2,38±2,54
1,54<sup>*##</sup>
50
1,97±1,65
1,13<sup>*##</sup>
100
1,93±2,61
1,01<sup>**###</sup>
*
**
***
#
##
###
p<0,05 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,001 при сопоставлении с нормальной контрольной группой,  p<0,05 при сопоставлении с эталонной контрольной группой,  p<0,01 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, p<0,001 при сопоставлении с эталонной контрольной группой, n=8.
Пример испытания 3: воздействие карримицина на модель введения A
в билатеральный гиппокамп CA1 крысы Спрег-Доули, чтобы вызвать болезнь Альцгеймера
1-42
β
Подопытное животное:
здоровые самцы крыс Спрег-Доули (категория SPF) с массой тела 220-260 г, коммерчески доступные от компании Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd, с лицензией номер SCXK (liao) 2015-0001.
Исследуемые лекарственные вещества и реагенты:
карримицин
1-42
Aβ: коммерчески доступен от компании Sigma, США;
ресвератрол: компания Aladdin (партия № K1414052) (Лос-Анджелес, штат Калифорния, США).
Лабораторные приборы:
Стереотаксический аппарат: Stoelting, США, модель 51600 (Киль, штат Висконсин, США);
Водный лабиринт Морриса, аппарат для автоматического сбора и анализа данных: Beijing Shuolinyuan Instruments Co. Ltd. (Пекин, Китай);
Y-лабиринт, аппарат для автоматического сбора и анализа данных: Beijing Shuolinyuan Instruments Co. Ltd. (Пекин, Китай).
Этапы процедуры:
Разделение на группы: брались самцы крыс Спрег-Доули с массой тела 220-260 г, адаптивное кормление выполнялось 3 дня, в течение которых обеспечивался свободный доступ к воде и еде, с циклами дня и ночи по 12 часов. Крысы в произвольном порядке были разделены на 6 групп: контрольную группу имитации операции, эталонную группу, три группы, в которых скармливались 25, 50 и 100 мг/кг карримицина, и одну группу, в которой скармливались 30 мг/кг лекарственного вещества с положительным эффектом - ресвератрола.
1-42
1-42
Процесс исследования: Aβ растворялся с помощью гексафторизопропанола/стерильного физиологического раствора до получения концентрации 2 мкг/мкл, выдерживался и созревал при температуре 4°C в течение 24 ч для образования олигомера Aβ, и затем сохранялся. Во время операции крыса была подвергнута действию наркоза посредством внутрибрюшинной инъекции 3,5 % хлоралгидрата (350 мг/кг), затем закреплена на стереотаксическом аппарате. Один укол выполнялся с помощью микрошприца в билатеральный гиппокамп CA1 в задней части на расстоянии 3,6 мм от брегмы (в качестве центра), а также ±2,5 мм справа и слева с глубиной ввода иглы 3,1 мм. 2,5 мкл (0,5 мкл/мин) было введено в течение 5 мин в каждую сторону гиппокампа с задержкой иглы в течение 5 мин, чтобы получить модель деменции крысы. Равное количество раствора хлорида натрия было введено аналогичным методом в билатеральный гиппокамп CA1 крысы из контрольной группы имитации операции, которая является выбранной экспериментальной моделью животного: моделирование посредством введения Aβ в боковой желудочек; равное количество раствора хлорида натрия было введено аналогичным методом в билатеральный гиппокамп CA1 крысы из контрольной группы имитации операции, при этом амилоидная бляшка бета-амилоидного белка (Aβ) представляет собой общепризнанный патологический маркер болезни Альцгеймера, а применение вышеуказанной экспериментальной модели животного для изучения воздействия карримицина при лечении заболевания центральной нервной системы, болезни Альцгеймера, имеет значительное теоретическое основание.
1-42
На следующий день после закрепления экспериментальной модели животного, в контрольной группе имитации операции и эталонной группе было выполнено внутрижелудочное введение с использованием соответствующих растворов; в других группах сравнения было выполнено внутрижелудочное введения с использованием 25, 50 и 100 мг/кг карримицина и 30 мг/кг лекарственного вещества с положительным эффектом - ресвератрола. На 12 день после инъекции Aβ в гиппокамп были выполнены исследования с использованием Y-лабиринта, водного лабиринта, а также на предмет распознавания новых предметов. Продолжалось введение во время поведенческого опыта 1 раз в день до исчезновения поведенческих признаков.
Опыт с помещением крысы в Y-лабиринт: на 12 день после введения выполнялся опыт с использованием Y-лабиринта в группах крыс. Опыт с помещением крысы в Y-лабиринт нацелен на изучение воздействия карримицина на самопроизвольные чередующиеся движения и кратковременную память крыс. Аппарат состоит из трех деревянных опорных рукавов с внутренним углом 120 градусов между ними: рукав A, рукав B и рукав C. Во время опыта крысы были помещены в конец рукава A, где им было позволено свободно входить и покидать все три рукава. Регистрировалось суммарное время, затраченное на вход в рукав, а также порядок входа в течение 8 мин для каждой крысы. Посредством использования последовательного входа в три разных рукава в качестве правильной чередующейся реакции, регистрировалось время правильных чередующихся реакций. Скорость самопроизвольной чередующейся реакции используется для отражения способности кратковременной пространственной памяти.
Опыт на предмет распознавания крысами новых предметов: на 14-15 день после введения выполнялся опыт на предмет распознавания новых предметов: в группах крыс. Опыт на предмет распознавания крысами новых предметов, нацелен на изучение воздействия карримицина на память при распознавании фигур. Экспериментальная аппаратура представляет собой черное пластмассовое открытое поле в форме круга диаметром приблизительно 60 см и высотой 20 см. Данный опыт был разделен на этап адаптации и этап испытания. На этапе адаптации 2 - 3 крысы каждый раз помещались на открытое поле; им была предоставлена возможность свободного перемещения в течение 3 мин, чтобы адаптироваться к среде. Процесс выполнялся 2 раза в день в течение 2 дней. На третий день выполнялось испытание, в котором одна крыса каждый раз помещалась на открытое поле сначала с возможностью свободного перемещения в течение 3 мин, после чего ее доставали. 2 одинаковых предмета (A1, A2) помещались в центре открытого поля, крысы помещалась на открытое поле и выполнялась регистрация продолжительности (tA1, tA2) изучения крысой двух предметов в течение 5 мин. Спустя 1 час предмет A2 заменяли новым предметом B, крыса снова помещалась на открытое поле и выполнялась регистрация продолжительности (tA1, tB) изучения крысой двух предметов. Спустя 24 ч предмет B заменяли предметом C, крыса снова помещалась на открытое поле и выполнялась регистрация продолжительности (tA1, tC) изучения крысой двух предметов. Стандартный критерий изучения заключается в том, что крыса направляет свой нос в направлении предметов и находится на расстоянии не более 1 см от предметов, или касается носа, облизывает предметы или касается предмета передней лапой. Рассчитывались индексы предпочтения и различения в отношении новых предметов.
Формулы расчета индекса предпочтения:
индекс предпочтения (1 ч)=tB/(tA1+tB)
индекс предпочтения (24 ч)=tC/(tA1+tC)
Формулы расчета индекса различения:
индекс различения (1 ч)=(tB-tA1)/(tA1+ tB)
индекс различения (24 ч)=(tC-tA1)/(tA1+ tC)
Опыт с помещением крысы в водный лабиринт: на 20 день после введения выполнялся опыт с использованием водного лабиринта Морриса в группах крыс. Опыт с использованием водного лабиринта Морриса нацелен на изучение воздействия карримицина при исследовании нарушений памяти. Водный лабиринт состоит из черного водного бассейна в форме круга из нержавеющей стали диаметром 1,5 м и высотой 50 сантиметров, а также круглой металлической платформы диаметром 10 сантиметров, которая может свободно перемещаться. Перед опытом водный бассейн заполнялся водой (температура воды - 24±1°C) до уровня выше платформы на 1 сантиметр. На этапе подготовки соответствующая процедура выполнялась 1 раз в день утром и во второй половине дня в течение 6 дней. Платформа размещалась в четвертом квадранте, крыса помещалась в воду мордой к стенке бассейна и выполнялась регистрация в течение 90 секунд. Если крыса находила платформу в течение 90 секунд, ей давали отдохнуть на платформе в течение 10 секунд; если у нее не получалось найти платформу в течение 90 секунд, ее направляли к платформе, где она отдыхала в течение 10 секунд. После окончания подготовки проводится испытание путем удаления платформы, позволяя крысе свободно плавать в течение 90 секунд. Система лабиринта автоматически регистрирует продолжительность нахождения крысы в изначальном квадранте платформы (целевом квадранте).
Результаты:
1-42
Способность кратковременной памяти крыс согласно испытанию с использованием Y-лабиринта: результаты опыта показывают, что в сравнении с контрольной группой имитации операции, скорость самопроизвольной чередующейся реакции при помещении крыс из эталонной группы в Y-лабиринт значительно снижена; а в сравнении с эталонной группой, скорость самопроизвольной чередующейся реакции крыс из групп, получавших каррицимин (25, 50 и 100 мг/кг), и контрольной группы, получавшей ресвератрол (30 мг/кг), значительно увеличена (см. фиг. 1). Общее количество раз входа крыс из разных групп в рукава особо не отличается (см. фиг. 2). Можно добиться того, что карримицин сможет устранить вред, нанесенный кратковременной памяти в результате использования Aβ.
1-42
Способность запоминания фигур у крыс согласно испытанию на предмет распознавания новых предметов: результаты опыта показывают, что индексы различения на двух аналогичных предметах A1 и A2 в разных группах крыс особо не отличаются (см. таблицу 7). В опыте на предмет распознавания новых предметов, в сравнении с контрольной группой имитации операции, индексы предпочтения и различения на новых предметах у крыс из эталонной группы спустя 1 и 24 ч значительно снижены; а в сравнении с эталонной группой, все индексы предпочтения (см. фиг. 2 и 3) и индексы различения (см. фиг. 5 и 6) на новых предметах у крыс из групп, получавших карримицин и ресвератрол спустя 1 и 24 ч значительно увеличена. Следовательно, карримицин может устранить вред, нанесенный способности запоминая фигур в результате использования Aβ.
1-42
Таблица 7. Результаты испытания индекса различения на A1 и A2 в опыте на предмет распознавания крысами новых предметов при воздействии Aβ (N=4-5, среднее значение ± стандартная погрешность)
Группа
Доза (мг/кг)
Индекс различения на A1 и A2 (%)
Контрольная
-
45,34±9,24
Эталонная
-
49,24±8,96
Карримицин
25
43,65±7,59
50
48,98±6,35
100
54,76±4,88
Ресвератрол
30
52,87±5,43
Способность крыс к запоминанию при изучении согласно испытанию водного лабиринта Морриса: результат опыта показал, что в опыте с определением местоположения и ориентированием, по мере увеличения времени подготовки сокращались задержки при попытке к спасению во всех группах подопытных крыс, указывая на то, что способность к пространственной ориентации и обучению увеличилась у всех крыс. На второй день опыта, в сравнении с контрольной группой имитации операции, задержки при попытке к спасению у крыс из эталонной группы были значительно увеличены; в сравнении с эталонной группой, задержки при попытке к спасению в группах, получавших карримицин, и группе, получавшей ресвератрол, значительно уменьшились. На третий и четвертый дни сохранялась аналогичная тенденция (см. фиг. 7).
1-42
Результат испытания по пространственной ориентации показывает, что в сравнении с контрольной группой имитации операции, время, потраченное на переход через платформу у крыс из эталонной группы значительно снижено; в сравнении с эталонной группой, время, потраченное на прохождение через платформу в группах, получавших карримицин, и группе, получавшей ресвератрол, значительно увеличилось (см. фиг. 8); скорость плавания в разных группах крыс значительно не изменилась (см. фиг. 9), что указывает на то, что карримицин и расвератрол могут увеличить время, потраченное крысами на прохождение через платформу. Результат опыта показал, что карримицин сможет устранить вред, нанесенный способности к запоминанию при изучении и пространственной ориентации в результате использования Aβ.
Представленные выше опыты доказывают, что лекарственное вещество по настоящему изобретению оказывает положительный эффект в лечении заболевания центральной нервной системы - болезни Альцгеймера, что обеспечивает теоретическое основание для применения и клинического продвижения лекарственного вещества по настоящему изобретению в лечении заболеваний центральной нервной системы, а также что оно обеспечивает важные экономические и социальные полезные эффекты.
Пример испытания 4: определение методом опыта на предмет продолжительности жизни, продлевает ли воздействие карримицина жизнь Caenorhabditis elegans
Опытные материалы, реагенты и приборы
1.1 Штамм и нематода
E.coli OP50, предоставленный лабораторией Шеньянского фармацевтического университета
C.elegans N2, предоставленная лабораторией Шеньянского фармацевтического университета
1.2 Главные реагенты
безводный этанол (аналитически чистый)
Beijing Chemical Factory
гидроокись натрия (аналитически чистая)
Beijing Chemical Factory
триптон
OXOID
агаровый порошок
Dingguo Biological Engineering Company
пекарский порошок
OXOID
хлорид натрия (аналитически чистый)
Beijing Chemical Factory
хлорид кальция (аналитически чистая)
Beijing Chemical Factory
холестерин (аналитически чистый)
Shanghai Chemical Reagent Company
сульфат магния (аналитически чистый)
Beijing Chemical Factory
сульфат калия (аналитически чистая)
Beijing Chemical Factory
дигидроортофосфат калия (аналитически чистый)
Shanghai Reagent No.2 Factory
двузамещенный фосфорнокислый натрий (аналитически чистый)
Beijing Chemical Factory
диметилсульфоксид
1.3 Основные приборы
гелевое устройство для визуализации
компания ImageMaster Pharmacia
рабочее место для асептического приготовления лекарственных средств
Suzhou Cleaning Equipment Limited Company
биохимический инкубатор
Harbin Donglian Electronic Technology Co. LTD
спектрофотометр модель 752
Shanghai Precise Scientific Instruments Limited Company
оптический микроскоп
OLYMPUS
вибростенд с воздушным термостатом
Harbin Donglian Electronic Technology Co. LTD
центрифуга с охлаждением
Hettich zentrifug
баня-термостат с электрическим нагревом
Hebei Huanghua Aerospace Instrumentation Factory
высокотемпературная пастеровская печь
Sanyo, Япония
электротермическая сушильная камера
Nanjing Laboratory Instrument Factory
электронные аналитические весы
SHIMADZU
Этапы процедуры следующие:
1.1 Выращивание нематоды
Обеспечивалось питание гермафродитной нематоды стандартной питательной средой для нематод (NGM) с нанесением кишечной палочки OP50 при температуре выращивания 20°C. Наблюдались условия роста нематоды; нематода периодически перемещалась в новую среду NGM с нанесение кишечной палочки OP50.
1.2 Синхронизация нематоды
В первую очередь несколько нематод в нерестовый период были помещены на одну панель (конкретное количество определялось в соответствии с требуемым количеством нематод; как правило, в нерестовый период одна нематода может отложить приблизительно 8 яиц в течение одного часа). По прошествии 30 мин нематоды на панели извлекались, а яйца выдерживались, таким образом, можно было обеспечить аналогичный период роста.
1.3 Опыт для определения жизненного цикла
Чтобы систематически и точно определять жизненные циклы нематод, заранее назначались группа введения и контрольная группа методом использования культуры в жидкой среде. Выбиралась концентрация лекарственного вещества в группе введения, которая достигалась посредством разбавления физиологическим раствором. Использовался 24-луночный планшет; 420 микролитров жидкой культурной среды, 30 микролитров раствора бактерий и 50 микролитров карримицина было добавлено в каждую лунку (в контрольной группе использовалась жидкая среда S), чтобы общий объем жидкости в каждой из лунок составил 500 микролитров. 25 синхронизированных нематод были добавлены в каждую лунку и спустя каждые 24 ч выжившие нематоды перемещались в следующую новую лунку с аналогичным питательным раствором до гибели нематод. Нематоды, у которых отсутствовала реакция на механический раздражитель, или которые не ели, или у которых отсутствовали выделения, считались погибшими; каждые последующие 24 ч после перемещения регистрировалось количество выживших нематод в каждой группе; выполнялся расчет наибольшего количество выживших нематод в сутки и среднее количество выживших нематод в сутки в каждой группе.
Результаты опыта можно увидеть в таблице 8 и на фиг. 10, которые указывают на то, что карримицин может увеличить среднюю продолжительность жизни Caenorhabditis elegans, а также имеет видимое воздействие на концентрацию 5 мкг/мл.
Таблица 8
Концентрация (мкг/мл)
Средняя продолжительность жизни ±СО (дней)
кол-во
0
23,38±0,90
25
0,5
23,64±0,84
25
1
25,32±0,83
25
5
26,72±0,82*
25
10
26,97±0,87*
25
Пример испытания 5: определение методом испытания на предмет показателя подвижности, продлевает ли воздействие карримицина жизнь Caenorhabditis elegans
Реагенты: аналогичны примеру испытания 4.
Приборы: аналогичные примеру испытания 4.
Предмет опыта: Caenorhabditis elegans
Процедура: выполнялась синхронизация нематод из группы введения и нематод из контрольной группы; получали определенное количество синхронизированных нематод в каждой группе для культивации. После перехода во взрослую стадию (как правило, на третий день) выполнялось введение карримицина, а спустя 24 часа выполнялось измерение их скорости перемещения. Каждые 24 часа 10 нематод отбирались в произвольном порядке из каждой группы; измерялись расстояния, на которые они перемещались в течение определенного периода времени; регистрировались количества пиковых расстояний, которые преодолевали нематоды в течение 20 с.
Результат опыта: введение 5 мкг/мл и 10 мкг/мл карримицина может значительно увеличить способность нематод выполнять действия и перемещаться, что можно увидеть на фиг. 11-a и 11-b.
Пример испытания 6: определение методом испытания на предмет выживаемости Caenorhabditis elegans, продлевает ли воздействие карримицина жизнь Caenorhabditis elegans.
Реагенты: аналогичны примеру испытания 4.
Приборы: аналогичные примеру испытания 4.
Предмет опыта: Caenorhabditis elegans
Процедура: нематоды синхронно культивировались в нормальных условиях для культивирования до этапа L4; определенное количество гермафродитных нематод добавлялось в 30 мм одноразовую чашку для культивирования, содержащую 2 мл среды S; культивирование продолжалось при 20°C. Питательный раствор содержит карримицин, таллом E.coli OP50 (ОП600=0,2-0,3) и 50 мкм FUdR (с целью предотвращения роста потомства нематод). Контрольная группа культивировалась с помощью жидкой среды S без содержания карримицина. Следует учесть, что нематоды каждый день должны перемещаться в чашку для культивирования, содержащую свежую среду, чтобы обновить питательный раствор. Спустя 48 ч нематоды перемещались в условия с температурой 37°C; культивирование продолжалось в течение 10 ч; регистрировалось количество нематод, выживших после окончания культивирования в качестве показателя выживаемости при проведении опыта. Опыт должен параллельно повторяться 2-3 раза, а в качестве окончательного показателя выживаемости используется среднее значение.
Результаты опыта: также на фигуре можно увидеть, что в сравнении с контрольной группой, карримицин значительно улучшает способность к тепловому сопротивлению нематод и продлевает среднюю продолжительность выживания при 37°C, что можно увидеть на фиг. 12.
Пример испытания 7: определение методом испытания на предмет выживаемости Caenorhabditis elegans в условиях ультрафиолетового излучения, продлевает ли воздействие карримицина жизнь Caenorhabditis elegans.
Реагенты: аналогичны примеру испытания 4.
Приборы: аналогичные примеру испытания 4.
Предмет опыта: Caenorhabditis elegans
-3
3
Процедура: лабораторные культуральные планшеты с нематодами после синхронизации до фазы I4 фиксировались под ультрафиолетовой лампой; выполнялось предварительное облучение в течение 240 с; регистрировалось количество погибших и выживших нематод. Критерий гибели нематод является аналогичным критерию в опыте на предмет продолжительности жизни. Длина ультрафиолетовой волны составляла 254 нм, высота ультрафиолетовой лампы над культуральными планшетами - 15 см, и мощность - 1×10Вт/см. Группы сравнения были представлены контрольной группой и группой введения.
Результат опыта: на фигуре можно увидеть, что карримицин определенным образом влияет на сопротивление вредному воздействию ультрафиолетового облучения и окисления, что можно увидеть на фиг. 13.
Результаты
Опыт проводился как минимум 3 раза. Результаты представлены в виде средних значений и стандартных отклонений. В качестве критерия значимости в основном принимался t-критерий. Для статистического анализа данных и составления по ним таблиц применяется Excel и ПО SPSS16.0.
Пример испытания 8: испытание на предмет того, может ли карримицин снизить накопление липофусцина in-vivo в Caenorhabditis elegans дикого типа.
3
Процедура: культивирование выполнялось по методу культивирования в опыте на предмет продолжительности жизни в течение 10, 15 и 20 дней. Нематоды были подвергнуты действию наркоза с помощью NaN и помещены под флуоресцентный микроскоп с обратным расположением со светом возбуждения 340-380 нм и светом излечения 430 нм. Наблюдались уровни липофусцина in-vivo у нематод; формировались флуоресцентные изображения; уровни флуоресценции липофусцина in-vivo у нематод анализировались и обрабатывались с помощью ПО ImageJ.
В результате накопления и агрегации белков с поперечными связями и пр. в клетках различных тканей и органов в теле человека откладывается липофусцин, что приводит к замедлению клеточного метаболизма и снижению активности, тем самым вызывая отказ функций органов в теле человека в результате старения. Следовательно, липофусцин относится к признаку старения. Липофусцин обладает характеристикой автофлуоресценции; методом наблюдения нематод под флуоресцентным микроскопом можно определить их степень старения по интенсивности их флуоресценции. Результаты измерения представлены на фиг. 14-a и 14-b. Результаты показали, что накопленное количество липофусцина в группе ведения значительно снизилась в сравнении с контрольной группой.
Пример испытания 9: изучение механизма воздействия карримицина на продолжительность жизни нематод.
Анализ содержания sod-3 показал, что после введения количество экспрессируемого sod-3 in-vivo у нематод из группы ведения снизилось, а уровень флуоресценции липофусцина показал, что после введения содержание липофусцина из группы введения упало. В настоящем изобретении раскрывается воздействие карримицина на гены нижележащей последовательности daf-16 и daf-15 sod-3.
1. Карримицин может увеличить экспрессию антисенильного гена sod-3 у нематод in vivo.
Процедура: в данном опыте наблюдался объем экспрессии sod-3 с помощью штамма нематод CF1553 с меткой ЗФБ. Нематоды, которые достигли зрелости, беспрерывно обрабатывались карримицином в течение 6 дней; две группы нематод подвергались воздействию наркоза посредством 10 ммоль азида натрия и фиксировались в агарном геле 5 %; затем наблюдалась интенсивность флуоресценции нематод и выполнялась съемка с помощью флуоресцентного микроскопа с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 500-530 нм. Проводился количественный анализ интенсивности флуоресценции с помощью ПО ImageJ. Размер образца нематод в каждой из групп составлял 15. Опыт повторялся два раза.
Согласно теории свободных радикалов и сенильности активные формы кислорода являются гласной причиной старения организма и болезней. Наряду с процессом старения свободные радикалы в нематодах in vivo постепенно растут. Методом исследования в настоящем изобретении обнаружено, что карримицин может улучшить способность термического сопротивления нематод, а также сопротивление внутриклеточному стрессу у нематод. Поэтому автор настоящего изобретения обуславливает, препятствует ли карримицин процессу старения, воздействуя на антиоксидантного гена sod-3. После беспрерывной обработки нематод типа CF1553 (sod-3:ЗФБ) посредством карримицина в течение 6 дней с помощью флуоресцентного микроскопа было обнаружено, что объем экспрессии зеленых флуоресцентных белков в группе введения значительно увеличился в сравнении с нематодами из контрольной группы. Результаты приведены на фиг. 4. Результаты показали, что карримицин способен продлевать продолжительность жизни путем повышения антиоксидантного гена sod-3 с целью снижения уровня активных форм кислорода у нематод in vivo.
2. Карримицин может влиять на распространение DAF-16 в клетках.
Процедура: 30 единиц из каждой группы нематод TJ356 (DAF-16:ЗФБ) на этапе L4 помещались на панель NGM, где происходил интенсивный рост OP50 с кладкой яиц в течение 3-4 часов, после чего синхронизация нематод заканчивалась. После того, как яйца дорастали до стадии имаго, выполнялось введение 30 единицам из каждой группы. Определялось состояние проникновения в ядро DAF-16 нематод TJ356 на шестой день после введения и наблюдалось состояние проникновения в ядро DAF-16 посредством флуоресцентного микроскопа с обратным расположением.
Независимо от того, скапливается ли DAF-16 в ядре клетки или рассеивается в цитоплазме, это непосредственно относится к его активности. Как правило, DAF-16 располагается в цитоплазме in vivo и, в случае воздействия наружного стресса, происходит активация разных белков, что в свою очередь способствует проникновению в ядро клетки для выполнения транскрипции, чтобы начать экспрессию гена нижележащей последовательности с целью увеличения продолжительности жизни нематод. Исследования показали, что нехватка инсулина и окислительный стресс могут привести к скоплению DAF-16 в ядре клетки для улучшения способности нематод сопротивляться окислительному стрессу и увеличению продолжительности жизни нематод.
Из-за того, что увеличение продолжительности жизни нематод с помощью карримицна связано с DAF-16, автор настоящего изобретения обуславливает способность карримицина влиять на распространение DAF-16 в клетке. В настоящем изобретении раскрывается распространение DAF-16 в клетке с помощью DAF-16:ЗФБ у генетически модифицированных нематод TJ356. Нематоды, которые сразу перешли во взрослую стадию, подвергались обработке карримицином, и на шестой день после введение выполнялось наблюдения с помощью флуоресцентного микроскопа с обратным расположением.
В результате было обнаружено, что зеленая флуоресценция нематод TJ356, обрабатываемых карримицином, концентрировалась в ядре клетки в состоянии точечного скопления, при этом, зеленая флуоресценция нематод TJ356, которые не подвергались обработке карримицином, рассеивалась по всей клетке. Через 6 дней после обработки 5 и 10 мкг/мл карримицина скопление DAF-16 в ядре клетки значительно увеличивалось в сравнении с необработанными нематодами. Это указывает на то, что карримицин может способствовать проникновению DAF-16 в ядро клетки, как показано на Фиг. 16-a и 16-b.