СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ФАКТОРОВ ХОМИНГА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
METHOD FOR DETERMINATION OF PRODUCTION OF STEM CELL HOMING FACTORS

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицины.
Достижения в области клеточных технологий привели к возможности развития нового направления в лечении целого ряда заболеваний - с помощью клеточной терапии. Перспективность реализации данного подхода во многом связана со знанием механизмов и закономерностей функционирования прогениторных клеток, определяющих их пролиферативно-дифференцировочный статус, способность к миграции и хомингу в область повреждения.
Известны способы изучения миграции стволовых клеток in vitro и роль различных факторов, определяющих их хоминг, с помощью специальных камер, содержащих полупроницаемые мембраны и фильтры, способные под влиянием градиента концентрации хемоаттрактантов пропускать прогениторные элементы [1, 2]. При этом регистрация мигрировавших клеток определяется методами клеточного сортинга.
Недостатком данных способов является необходимость использования высокоспециализированного и дорогостоящего оборудования и материалов.
Задачей, решаемой данным изобретением, является упрощение способа.
2
2
2
2
Поставленная задача достигается тем, что клеточный материал, содержащий прогениторные клетки, находящиеся в жидкой культуральной среде, помещают поверх предварительно подготовленной агаровой среды, в которой находятся клеточные элементы микроокружения отдельных тканей, продуцирующие факторы хоминга. Полученную двухслойную культуру инкубируют в СО-инкубаторе при 37°С, 5% СО и 100% влажности воздуха в течение 2-24 ч. Затем путем отмывания с поверхности агаровой среды собирают неприлипшие клетки, переносят их в полувязкую культуральную среду и инкубируют в CO-инкубаторе при 37°С, 5% СО и 100% влажности воздуха в течение 3-14 сут. После чего на основании регистрации разницы количества прогениторных элементов, содержащихся в клеточном материале, до и после его помещения на агаровую среду, осуществляют подсчет мигрировавших под влиянием факторов хемотаксиса клеток-предшественников. При этом наличие клеток-предшественников определяется по способности клеточного материала к колониеобразованию.
Новым в предлагаемом способе является использование в качестве полупроницаемой мембраны агаровой среды и изучение колониеобразующей способности клеточного материала в качестве критерия оценки миграции прогениторных клеток.
Полученные в последние годы сведения о свойствах мультипотентных клеток-предшественников организма открыли возможность развития новой стратегии лечения многих заболеваний - с помощью стволовых клеток [3, 4]. Причем наиболее физиологичным подходом к решению задач регенеративной медицины является метод фармакологической стимуляции эндогенных стволовых клеток (СК) путем подражания деятельности естественных регуляторных систем их функционирования [3, 4]. Изучение закономерностей жизнедеятельности и механизмов регуляции СК является основой для выбора необходимых направлений и «точек-приложения» действия потенциальных лекарственных средств - модификаторов функций прогениторных элементов. При этом весьма привлекательным выглядит возможность повышения регенераторного потенциала организма за счет модуляции процессов миграции и хоминга («оседания и приживления») СК, которые, как известно, осуществляются во многом благодаря градиенту концентрации хемоаттрактантов, вырабатываемых клеточными элементами микроокружения (фибробластами, макрофагами и др.) [1, 2].
Изучение миграции СК и роль различных факторов, определяющих их хоминг, осуществляются с помощью способов, в основе которых лежит использование специальных камер, оснащенных полупроницаемыми мембранами. При этом для подсчета мигрирующих элементов используют различные виды сортинга, предполагающие использование клеточного либо магнитного сортера [1, 2].
В то же время для изучения биологии СК в экспериментах in vitro при культивировании различных тканей широко используется агаровая среда, а также метод колониеобразования как инструмент определения содержания прогениторных элементов в клеточном материале [5]. Тем не менее, на сегодняшний день не известна возможность использования агаровой среды в качестве полупроницаемой мембраны, через которую может осуществляться миграция СК, в том числе под влиянием хемоаттрактантов, выработанных клетками, находящимися в ней. Кроме того, не исследована валидность применения метода колониеобразования для изучения хоминга прогениторных элементов.
Факт применения в качестве полупроницаемой мембраны in vitro агаровой среды, а также изучение колониеобразующей способности клеточного материала с целью исследования миграции стволовых клеток и продукции элементами микроокружения тканей факторов хоминга прогениторных клеток для специалиста не является очевидным и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют упростить способ, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых эффективных способов клеточной терапии. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
2
2
2
2
Клеточный материал, содержащий прогениторные клетки, находящиеся в жидкой культуральной среде, помещают поверх предварительно подготовленной агаровой среды, в которой находятся клеточные элементы микроокружения отдельных тканей, продуцирующие факторы хоминга. Полученную двухслойную культуру инкубируют в CO-инкубаторе при 37°С, 5% CO и 100% влажности воздуха в течение 2-24 ч. Затем путем отмывания с поверхности агаровой среды собирают неприлипаюшие клетки, переносят их в полувязкую метилцеллюлозную культуральную среду и инкубируют в CO-инкубаторе при 37°С, 5% CO и 100% влажности воздуха в течение 3-14 сут. После чего на основании регистрации разницы количества прогениторных элементов, содержащихся в клеточном материале, до и после его помещения на агаровую среду осуществляют подсчет мигрировавших под влиянием факторов хемотаксиса клеток-предшественников. При этом наличие клеток-предшественников определяется по способности клеточного материала к колониеобразованию. Количество мигрировавших клеток и продукцию хемотаксических веществ, активных в отношении прогениторных клеток, оценивают в условных единицах по формуле:
Х=а-в,
где а - количество колоний, выросших (в контроле) из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, не содержащей клеток; в - количество колоний, выросших из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на клетках культуры костного мозга мышей линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 36 шт., массой 18-20 г.Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Пример 1
2
2
2
2
2
2
У мышей линии CBA/CaLac, массой 22 г, умерщвленных с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) выделяли бедренную кость, очищали ее от мягких тканей и промывали канал 0,5 мл питетельной среды (90% RPMI-1640, 90% эмбриональной телячей сыворотки (ЭТС), "Sigma", США). Костный мозг ресуспендировали шприцом через иглы уменьшающегося диаметра, отмывали центрифугированием и подсчитывали их количество, определяя жизнеспособность миелокариоцитов с помощью 0,5% трипанового синего ("Serva", ФРГ) [5]. Затем помещали в агаровую среду следующего состава: 1% бактоагар («Difco», США), 50% среды DMEM ("Sigma", США), 20% ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Sigma", США) и доводили концентрацию клеток до 106 жизнеспособных миелокариоцитов/мл. Клеточный материал в 2 мл среды помещали в чашки Петри (диаметр 30 мм) и инкубировали в СО инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% CO и 100% влажности воздуха в течение 5 сут. После этого на агаровую культуру с клеточным материалом и на агаровую среду, не содержащую клеток (контроль), «наслаивали» 3 млн вновь полученных миелокариоцитов, находящихся в 2 мл культуральной среды (80% среды DMEM ("Sigma", США), 20% ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Sigma", США). При этом в случае изучения миграции кроветворных предшественников использовали неприлипающие клетки кроветворной ткани, а при исследовании миграции стомальных прекурсоров применяли цельный костный мозг. Полученные культуры инкубировали в CO инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% CO и 100% влажности воздуха в течение 2-3 ч. Затем путем пятикратного отмывания (средой DMEM ("Sigma", США)) с поверхности агаровых сред собирали неприлипшие клетки, отмывали их центрифугированием, переносили в 24-луночные планшеты в полувязкой культуральной среде. Для изучения числа грануломоноцитарных (КОЕ-ГМ) и эритроидных (КОЕ-Э) клеток-предшественников среда была следующего состава: 1% метилцеллюлозы ("Sigma", США), 50% RPMI ("Sigma", США), 20% ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), а также при клонировании КОЕ-ГМ 5 мкг/л рекомбинантного Г-КСФ («Нейпоген», Швейцария) и 0,5 Ед/мл рекомбинантного эритропоэтина ("Sigma", США) при культивировании КОЕ-Э. Клеточный материал инкубировали в СО-инкубаторе при 37°С, 5% CO и 100% влажности воздуха в течение 3 и 7 сут соответственно.
При исследовании миграции мезенхимальных прекурсоров клеточный материал в аналогичном режиме инкубировали 7 сут в среде, состоявшей из 1% метилцеллюлозы ("Sigma", США), 50% DMEM ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Sigma", США). После этого производили подсчет эритроидных, грануломоноцитарных и фибробластных (КОЕ-Ф) колоний [5]. Под колонией подразумевали клеточное образование, содержащее 50 и более клеток. Затем определяли разницу количества прогениторных элементов, собранных с агаровой среды без клеток, и отмытых со среды, в которой находились миелокариоциты.
Количество мигрировавших клеток и продукцию хемотаксических веществ, активных в отношении прогениторных клеток и определяющуюся как хемотаксическая активность (ХТА), оценивали в условных единицах по формуле:
Х=а-в,
где а - количество колоний, выросших из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, не содержащей клеток (в контроле); в - количество колоний, выросших из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки (опыт).
В ходе эксперимента количество прогениторных элементов в клеточном материалале, состоящем из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки, было достоверно ниже, чем их содержание во фракции неприлипающих клеток, собранных с поверхности агаровой среды без клеток (табл.). При этом количество мигрировавших клеток / ХТА исследуемого материала в отношении различных предшественников было практически равным.
Предлагаемый способ позволяет объективно изучать миграцию стволовых клеток in vitro и продукцию элементами микроокружения тканей факторов хоминга прогениторных клеток различных классов.
Таблица
Прогениторные клетки
КОЕ-Ф
КОЕ-ГМ
КОЕ-Э
Количество колоний
Контроль
57,3±2,4
36,8±1,7
42,6±2,7
Опыт
26,1±2,9*
17,6±1,02*
22,3±0,97*
ХТА / количество мигрировавших клеток
21,2±1,3
19,2±1,3
20,3±1,45
* - отмечена достоверность различия показателя от его значения в контроле при р<0,05
Источники информации
1. Kim C.H., Broxmeyer H.E. In Vitro Behavior of Hematopoietic Progenitor Cells Under the Influence of Chemoattractants: Stromal Cell-Derived Factor-1, Steel Factor, and the Bone Marrow Environment // Blood, Vol.91 No.1 (January 1), 1998: pp.l00-110.
2. Aiuti A., Webb I.J., Bleui C, Springer Т., Gutierrez-Ramos J.C. The Chemokine SDF-1 Is a Chemoattractant for Human CD34 + Hematopoietic Progenitor Cells and Provides a New Mechanism to Explain the Mobilization of CD34 + Progenitors to Peripheral Blood // J. Exp. Med. - Vol.185. - January 1997. №1. - Р.111-120.
3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др. Фармакологические аспекты регенеративной медицины // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - приложение 2. - С.14-21.
4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др. Фармакологическая регуляция стволовых клеток // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т.7. - Ч.1. - С.1662-1663.
5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.