Рацемический 2,17аβ-дисульфамоилокси-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен в качестве ингибитора пролиферации опухолевых клеток MCF-7
RACEMIC 2,17ALFABETA-DISULFAMOYLOXY-3-METHOXY-D-HOMO-8ALPHA-ESTRA-1,3,5 (10)-TRIENE AS MSF-7 TUMOR CELLS PROLIFERATION INHIBITOR

Изобретение относится к синтезу рацемического 2,17аβ-дисульфамоилокси-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триена, ингибирующего пролиферацию опухолевых клеток МСF-7. Это предполагает возможность его применения в медицине.
Рак молочной железы (РМЖ) у женщин является «ведущим» онкологическим заболеванием [1]. 60-70% опухолей этой локализации эстрогенозависимы [1], т.е. скорость пролиферации опухолевых клеток значительно возрастает в присутствии этой группы гормонов. В настоящее время разрабатывается новая стратегическая линия лечения таких заболеваний под действием различных носителей, содержащих сульфаматную группу [2]. Этот подход считают весьма перспективным, поскольку сульфаматы стероидных эстрогенов могут ингибировать рост различных видов злокачественных опухолей [3-5]. Как правило, используют модифицированные стероидные эстрогены с сульфаматной группой при С-3, единственным исключением является соединение (I) [6] – прототип.
(I)
Целью изобретения является создание новых ингибиторов роста клеток рака молочной MCF-7, подобных стероиду (I).
Поставленная цель достигается синтезом рацемического 2,17аβ-дисульфамоилокси-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триена (II), отличающегося от стероида (I) величиной кольца D. В принципе это должно способствовать более легкому проникновению данного соединения в опухолевые клетки. Дополнительным преимуществом схемы синтеза является большая доступность исходного стероида (III) по сравнению с использованным ранее при получении сульфамата (I).
Схема синтеза сульфамата (II) представлена ниже.
Ацетат 2-ацето-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17аβ-ола (IV).
o
o
К раствору 5 г соединения (Ш) [7] в 50 мл нитробензола и 2 мл уксусного ангидрида добавляют раствор 7 г хлористого алюминия в 50 мл нитробензола при 0C. Реакционную смесь перемешивают при 5C в течение 24 ч, после чего выливают в 300 мл воды со льдом. Продукты реакции экстрагируют тремя порциями хлороформа по 150 мл, объединенный экстракт промывают равным объемом 1%-ного раствора бикарбоната натрия, затем равным объемом воды, сушат над сульфатом натрия. Осушитель отфильтровывают, растворители удаляют в вакууме при давлении 4 мм рт. столба и температуре 75ºC, остаток кристаллизуют из смеси хлороформ-метанол. Получают 4.44 г соединения (IV) (выход 79%, т. пл. 191.5-193ºС).
24
32
4
Найдено, %: С 74.85; Н 8.44. СНО. Вычислено, %: С 74.97; Н 8.39.
2
4
2,17аβ-Диацетокси-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен (V). К раствору 1 г соединения (IV) в 20 мл хлористого метилена добавляли 600 мг NaHPO и 800 мг м-хлор-надбензойной кислоты в 20 мл хлористого метилена. Реакционную смесь перемешивали 20 ч при комнатной температуре, а затем выливали в 350 мл диэтилового эфира. После обычной обработки органическую фазу промывали равным объемом насыщенного раствора бикарбоната натрия, а затем водой до нейтральной реакции. Растворители удаляли в вакууме, остаток кристаллизовали из смеси этилацетат-гексан, получали 780 мг (75%) соединения (V), т. пл. 178.5-179.5ºС.
13
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
17a
18
17а
2
3
Спектр ЯМР С, δ, м.д.: 122.4 (С), 137.6 (С), 148.5 (С), 111.9 (С), 134.8 (С), 31.0 (С), 20.8 (C), 37.1 (С), 39.6 (С), 134.1 (С), 27.6 (С), 37.1 (С), 41.2 (С), 46.4 (С), 23.9 (С), 25.4 (С), 27.0 (С), 81.5 (C), 13.5 (С), 55.7 (СНО), 20.9 и 170.7 (ацетильная группа при С), 20.3 и 169.2 (ацетильная группа при С).
Масс-спектр, m/z (%): 400 (15), 358 (100), 243 (2), 189 (6), 188 (4), 187(4), 176 (9), 175 (8), 163 (4), 150 (4), 137 (6).
24
32
5
Найдено, %: С 72.12; Н 8.14. СНО. Вычислено, %: С 71.97; Н 8.05.
2,17аβ-Дигидрокси-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен (VI).
К раствору 200 мг 2,17aβ-диацетокси-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триенa (V) в смеси 5 мл бензола и 3 мл метанола добавляют 150 мг NaOH и перемешивают 2 часа при 50ºС, ход реакции контролируют методом ТСХ. Реакционную смесь выливают в 1н HCl (10 мл), экстрагируют этилацетатом (3×10 мл). Органические слои промывают водой (2×5 мл), насыщенным раствором хлористого натрия (1×15 мл), сушат над сульфатом натрия. Растворитель удаляют на роторном испарителе, остаток кристаллизуют из метанола. Получают 145 мг (95%) продукта гидролиза, т. пл. 210-212ºС.
Спектр ЯМР 1Н
(DMSO, δ, м.д.): 8.49 с (1H), 6.51 с (1Н), 6.48 с (1Н), 4.26 с (1Н), 3.69 с (3H), 3.01 д (1H, J=21.1 Гц) 2.59 т (1H, J=13.8 Гц), 2.47-2.37 м (2H), 1.83-1.49 м (9H), 1.35-1.24 м (3H) 1.16-1.03 м (2H) 0.78 с (3Н).
Спектр ЯМР 13С
(DMSO, δ, м.д.): 146.50, 145.22, 134.79, 127.10, 116.39, 112.93, 79.35, 56.41, 47.02, 42.07, 42.23, 39.10, 38.70, 31.58, 31.33, 29.00, 26.54, 25.25, 22.01 13.35
20
28
3
Найдено, %: С 75.84, Н 8.90. СНО. Вычислено, %: С 75.91; Н 8.92.
2,17аβ-Дисульфамоил-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен (II).
К раствору 100 мг 2,17аβ-дигидрокси-3-метокси-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триена (VI) в 2 мл сухого диметилацетамида при комнатной температуре добавляют 150 мг сульфамоилхлорида, реакционную смесь перемешивают 8 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь выливают в насыщенный раствор хлористого натрия (10 мл), продукты реакции экстрагируют тремя порциями этилацетата по 5 мл. Объединенную органическую фазу промывают двумя порциями воды по 5 мл, равным объемом насыщенного раствора хлористого натрия, сушат над сульфатом натрия. Осушитель отфильтровывают, растворители удаляют в вакууме, остаток кристаллизуют из метанола, получают 105 мг (70%) целевого продукта, т. пл. 212-214ºС.
Спектр ЯМР 1Н
(DMSO, δ, м.д.): 7.80 с (2H), 7.35 с (2H), 7.05 с (1Н), 6.78 с (1Н), 4.00 м (1Н), 3.74 с (3H), 2.85-2.61 м (4H) 2.05-1.92 м (2H), 1.87-1.15 м (11H), 0.88 с (3Н).
Спектр ЯМР 13С
(DMSO, δ, м.д.): δ 150.23, 137.85, 135.86, 134.27 124.01, 113.77, 89.14, 56.58, 47.04, 41.55, 41.22, 38.78, 37.95, 31.58, 28.58, 28.43, 25.92, 24.81, 14.09.
20
30
2
7
2
Найдено, %: С 50.72, Н 6.43 N 5.74. СНNОS. Вычислено, %: С 50.61; Н 6.37 N 5.90.
2
о
Исследовали влияние стероида (II) на рост перевиваемой культуры клеток человека MCF-7 (аденокарцинома молочной железы). В качестве отрицательного контроля использовали нормальные кожные фибробласты человека (КФЧ) ранних пассажей. Клетки культивировали во флаконах Карреля в среде DMEM/F12 (Биолот) с добавлением 1% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Биолот), без антибиотиков, в 5% СОатмосфере, при 37С. Клетки высаживались на флаконы Карреля по 50 х 104 клеток на флакон. Для изучения пролиферативной активности клеток через 24 часа после посева в культуральную среду заменяли на среду, содержащую ингибитор сульфатазы до конечной концентрации 50 мкг/мл, после чего инкубировали данные опухолевые клеточные линии в течение различных промежутков времени (от 24 до 72 ч). Конечная концентрация ДМСО в культуральной среде не превышала 0.5%. Для исключения цитотоксического действия ДМСО проводили опыты с добавлением ДМСО без ингибитора сульфатазы. Для исключения неспецифического губительного действия веществ использовались нормальные кожные фибробласты человека. Далее клетки снимали раствором версена-трипсина (Биолот), рассеивали на флаконы Карреля, содержащие новую полную культуральную среду. Подсчет клеток проводили в момент достижения необработанными контрольными клетками максимальной плотности клеток на единицу площади поверхности культурального флакона (монослой), при этом их количество определялось как 100 %. Оказалось, что при концентрации стероида (II) 20 мкг/мл рост опухолевых клеток тормозится примерно в той же степени, что и под действием применяемого в клинической практике тамоксифена. При этом стероид (II) не тормозил рост нормальных кожных фибробластов человека. Этот результат весьма важен, так как механизмы действия стероида (II) и тамоксифена различны.
Литература
[1] Gururaj A.E., Rayala S.K., Vadlamudi R.K., Kumar R. Novel mechanisms of resistance to endocrine therapy: genomic and nongenomic considerations // Clin. Cancer Res. 2006. Vol. 12, pp. 1001s-1007s.
[2] Thomas M.P., Potter B.V.L. Estrogen O-sulfamates and their analogues: Clinical steroid sulfatase inhibitors with broad potential //J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2015. Vol. 153 (September), pp. 160-169.
[3] Leese M.P., Hejaz H.A.M., Mahon M.F., Newman S.P., Purohit A., Reed M.J., and Potter B.V.L. A-Ring-Substituted Estrogen-3-O-sulfamates: Potent Multitargeted Anticancer Agents // J. Med. Chem. 2005. Vol. 48, N 16, pp. 5243-5256.
[4] Leese M.P., Leblond B., Smith A., Newman S.P., Di Fiore A., De Simone G., Supuran S.T., Purohit A., Reed M.J., Potter B.V.L. 2-Substituted estradiol bis-sulfamates, multitargeted antitumor agents: synthesis, in vitro SAR, protein crystallography, and in vivo activity // J. Med. Chem. 2006. Vol. 49, N 26, pp. 7683-7696.
[5] Jourdan F., Leese M.P., Dohle W., Hamel E., Ferrandis E., Newman S.P., Purohit A., Reed M.J., Potter B.V.L. Synthesis, antitubulin, and antiproliferative SAR of analogues of 2-methoxyestradiul-3,17-O,O-bis-sulfamate. J. Med. Chem. 2010. Vol. 53, N 7, pp. 2942-2951.
[6] Морозкина С.Н., Дроздов А.С., Ковалев Р.А., Филатов М.В., Шавва А.Г. Рацемический 2,17β-дисульфамоилокси-3-метокси-8α-эстра-1,3,5(10)-триен в качестве ингибитора пролиферации опухолевых клеток МСF-7. Патент РФ 2562242 (2015).
[7] Ржезников В.М., Ананченко С.Н., Торгов И.В. Восстановление D-гомостероидов с ароматическим кольцом А щелочными металлами по Берчу. Химия природных соеди-нений. 1965. № 2, с. 90-100.