СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРОВ ИЗ БЕЛКОВ ШЕЛКА ПАУКОВ

1. Способ получения полимеров выделенного белка шелка паука, включающий стадии, на которых:
(1) берут белок шелка паука, состоящий из 170-760 аминокислотных остатков и содержащий:
N-концевой фрагмент, состоящий по меньшей мере из одного фрагмента из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука; и
повторяющийся фрагмент из 70-300 аминокислотных остатков, происходящих из повторяющегося фрагмента белка шелка паука; и возможно
C-концевой фрагмент из 70-120 аминокислотных остатков, который происходит из C-концевого фрагмента белка шелка паука;
(2) берут раствор указанного белка шелка паука в жидкой среде с рН 6,4 или выше и/или ионной композицией, которая предотвращает полимеризацию указанного белка шелка паука, возможно включают удаление липополисахаридов и других пирогенов;
(3) корректируют свойства указанной жидкой среды до рН 6,3 или ниже и ионной композиции, которая обеспечивает полимеризацию указанного белка шелка паука;
(4) оставляют белок шелка паука для образования полимеров в жидкой среде, имеющей рН 6,3 или ниже и ионную композицию, которая обеспечивает полимеризацию указанного белка шелка паука; и
(5) выделяют полимеры белка шелка паука из указанной жидкой среды.
2. Способ по п.1, где рН жидкой среды со стадий (3) и (4) составляет 6,2 или ниже, например 6,0 или ниже, и/или где рН жидкой среды со стадий (3) и (4) составляет 3 или выше, например 4,2 или выше.
3. Способ по п.1, где ионная сила жидкой среды со стадий (3) и (4) находится в диапазоне от 1 до 250 мМ.
4. Способ по п.1, где рН жидкой среды со стадии (2) составляет 6,7 или выше, например 7,0 или выше.
5. Способ по п.1, где рН жидкой среды со стадии (2) находится в диапазоне от 6,4 до 6,8.
6. Способ по п.1, где указанный полимер представляет собой волокно, пленку, пену, сеть или ячеистую структуру.
7. Способ по п.6, где указанный полимер представляет собой волокно, имеющее диаметр более 0,1 мкм и длину более 5 мм.
8. Способ получения димеров выделенного белка шелка паука, включающий стадии, на которых:
(1) берут белок шелка паука из 170-760 аминокислотных остатков, содержащий:
N-концевой фрагмент, состоящий по меньшей мере из одного фрагмента из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука; и
повторяющийся фрагмент из 70-300 аминокислотных остатков, происходящих из повторяющегося фрагмента белка шелка паука; и возможно
C-концевой фрагмент из 70-120 аминокислотных остатков, который происходит из C-концевого фрагмента белка шелка паука;
(2) берут раствор димеров белка шелка паука в жидкой среде с рН 6,4 или выше и/или ионной композицией, которая предотвращает полимеризацию указанного белка шелка паука; и
(3) выделяют димеры, полученные на стадии (2), возможно включают удаление липополисахаридов и других пирогенов.
9. Способ по п.8, где рН жидкой среды со стадии (2) составляет 6,7 или выше, например 7,0 или выше.
10. Способ по п.1 или 8, где стадия (1), на которой берут указанный белок шелка паука, включает подстадии, на которых:
(а) экспрессируют молекулу полинуклеиновой кислоты, которая кодирует указанный белок шелка паука в подходящем хозяине; и
(б) выделяют белок, полученный на подстадии (а), возможно включают удаление липополисахаридов и других пирогенов.
11. Способ по п.1 или 8, где белок шелка паука, который берут на стадии (1), состоит из 170-600 аминокислотных остатков и содержит один N-концевой фрагмент из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука.
12. Способ по п.1 или 8, где N-концевой фрагмент белка шелка паука, который берут на стадии (1), содержит по меньшей мере два фрагмента из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука.
2
2
13. Способ по п.1 или 8, где указанный белок выбран из группы белков, определенных формулами NT-REP-CT, NT-REP-CT, NT-REP и NT-REP, где
NT представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 100 до 160 аминокислотных остатков, который представляет собой N-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука;
n
n
n
n
REP представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 300 аминокислотных остатков, где указанный фрагмент выбран из группы L(AG)L, L(AG)AL, L(GA)L, L(GA)GL, где
n представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый индивидуальный сегмент А представляет собой аминокислотную последовательность из 8-18 аминокислотных остатков, где от 0 до 3 аминокислотных остатков не являются Ala, а остальные аминокислотные остатки представляют собой Ala;
каждый индивидуальный сегмент G представляет собой аминокислотную последовательность из 12-30 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 40% аминокислотных остатков представляют собой Gly; и
каждый индивидуальный сегмент L представляет собой линкерную аминокислотную последовательность из 0-20 аминокислотных остатков; и
СТ представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 120 аминокислотных остатков, который представляет собой C-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука.
14. Полимер белка шелка паука, где указанный белок состоит из 170-760 аминокислотных остатков и содержит:
N-концевой фрагмент, состоящий по меньшей мере из одного фрагмента из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука; и
повторяющийся фрагмент из 70-300 аминокислотных остатков, происходящих из повторяющегося фрагмента белка шелка паука; и возможно
C-концевой фрагмент из 70-120 аминокислотных остатков, который происходит из C-концевого фрагмента белка шелка паука.
15. Полимер белка шелка паука по п.14, где белок шелка паука состоит из 170-600 аминокислотных остатков и содержит один N-концевой фрагмент из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука.
16. Полимер белка шелка паука по п.14, где N-концевой фрагмент белка шелка паука содержит по меньшей мере два фрагмента из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука.
2
2
17. Полимер белка шелка паука по п.14, где указанный белок выбран из группы белков, определенных формулами NT-REP-CT, NT-REP-CT, NT-REP и NT-REP, где
NT представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 100 до 160 аминокислотных остатков, который представляет собой N-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука;
n
n
n
n
REP представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 300 аминокислотных остатков, где указанный фрагмент выбран из группы L(AG)L, L(AG)AL, L(GA)L, L(GA)GL, где
n представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый индивидуальный сегмент А представляет собой аминокислотную последовательность из 8-18 аминокислотных остатков, где от 0 до 3 аминокислотных остатков не являются Ala, а остальные аминокислотные остатки представляют собой Ala;
каждый индивидуальный сегмент G представляет собой аминокислотную последовательность из 12-30 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 40% аминокислотных остатков представляют собой Gly; и
каждый индивидуальный сегмент L представляет собой линкерную аминокислотную последовательность из 0-20 аминокислотных остатков; и
СТ представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 120 аминокислотных остатков, который представляет собой C-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука.
18. Полимер белка шелка паука по п.14, состоящий из полимеризованных димеров указанного белка.
19. Полимер белка шелка паука по п.14, где содержание липополисахаридов и других пирогенов составляет 1 EU(эндотоксиновая единица)/мг выделенного белка или ниже.
20. Полимер белка шелка паука по любому из пп.14-19, представляющий собой волокно, пленку, пену, сеть или ячеистую структуру.
21. Полимер белка шелка паука по п.20, представляющий собой волокно, имеющее диаметр более 0,1 мкм и длину более 5 мм.
22. Димер белка шелка паука, где указанный белок состоит из 170-760 аминокислотных остатков и содержит:
N-концевой фрагмент, состоящий по меньшей мере из одного фрагмента из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука; и
повторяющийся фрагмент из 70-300 аминокислотных остатков, происходящих из повторяющегося фрагмента белка шелка паука; и возможно
C-концевой фрагмент из 70-120 аминокислотных остатков, который происходит из C-концевого фрагмента белка шелка паука.
23. Димер белка шелка паука по п.22, где белок шелка паука состоит из 170-600 аминокислотных остатков и содержит один N-концевой фрагмент из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука.
24. Димер белка шелка паука по п.22, где N-концевой фрагмент белка шелка паука содержит по меньшей мере два фрагмента из 100-160 аминокислотных остатков, происходящих из N-концевого фрагмента белка шелка паука.
2
2
25. Димер белка шелка паука по любому из пп.22-24, где указанный белок выбран из группы белков, определенных формулами NT-REP-CT, NT-REP-CT, NT-REP и NT-REP, где
NT представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 100 до 160 аминокислотных остатков, который представляет собой N-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука;
n
n
n
n
REP представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 300 аминокислотных остатков, где указанный фрагмент выбран из группы L(AG)L, L(AG)AL, L(GA)L, L(GA)GL, где
n представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый индивидуальный сегмент А представляет собой аминокислотную последовательность из 8-18 аминокислотных остатков, где от 0 до 3 аминокислотных остатков не являются Ala, а остальные аминокислотные остатки представляют собой Ala;
каждый индивидуальный сегмент G представляет собой аминокислотную последовательность из 12-30 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 40% аминокислотных остатков представляют собой Gly; и
каждый индивидуальный сегмент L представляет собой линкерную аминокислотную последовательность из 0-20 аминокислотных остатков; и
СТ представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 120 аминокислотных остатков, который представляет собой C-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука.
2
2
26. Выделенный белок шелка паука, который состоит из 170-760 аминокислотных остатков и выбран из группы белков, определенных формулами NT-REP-CT, NT-REP-CT, NT-REP и NT-REP, где
NT представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 100 до 160 аминокислотных остатков, который представляет собой N-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука.
n
n
n
n
REP представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 300 аминокислотных остатков, где указанный фрагмент выбран из группы L(AG)L, L(AG)AL, L(GA)L, L(GA)GL, где
n представляет собой целое число от 2 до 10;
каждый индивидуальный сегмент А представляет собой аминокислотную последовательность из 8-18 аминокислотных остатков, где от 0 до 3 аминокислотных остатков не являются Ala, а остальные аминокислотные остатки представляют собой Ala;
каждый индивидуальный сегмент G представляет собой аминокислотную последовательность из 12-30 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 40% аминокислотных остатков представляют собой Gly; и
каждый индивидуальный сегмент L представляет собой линкерную аминокислотную последовательность из 0-20 аминокислотных остатков; и СТ представляет собой белковый фрагмент, имеющий от 70 до 120 аминокислотных остатков, который представляет собой C-концевой фрагмент, происходящий из белка шелка паука.
27. Выделенный белок шелка паука по п.26, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:3-5, 17, 19-23, 25 и 31.
28. Композиция, содержащая выделенный белок шелка паука по любому из пп.26 и 27, растворенный в жидкой среде, имеющей рН 6,4 или выше и/или ионную композицию, которая предотвращает полимеризацию указанного белка шелка паука.
29. Композиция по п.28, где указанная жидкая среда имеет рН 7,0 или выше.
30. Композиция по любому из пп.28 и 29, где содержание липополисахаридов и других пирогенов составляет 1 EU/мг выделенного белка или ниже.
31. Применение белка шелка паука по любому из пп.26 и 27 для получения димеров белка шелка паука.
32. Применение белка шелка паука по любому из пп.26 и 27 для получения полимеров белка шелка паука.
33. Применение димера белка шелка паука по любому из пп.22-25 для получения полимеров выделенного белка шелка паука.
34. Применение по любому из пп.32-33, где указанные полимеры получают в жидкой среде, имеющей рН 6,3 или ниже и ионную композицию, которая обеспечивает полимеризацию указанного белка шелка паука.
35. Выделенная молекула полинуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:14-16, 18 и 24; последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие SEQ ID NO:3-5, 17, 19-23, 25 и 31; последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют белок шелка паука по п.23; и комплементарные им последовательности нуклеиновых кислот.
36. Способ получения белка шелка паука по любому из пп.26 и 27, включающий стадии, на которых:
(1) экспрессируют молекулу полинуклеиновой кислоты, которая кодирует указанный белок шелка паука в подходящем хозяине; и
(2) выделяют белок, полученный на стадии (1), возможно включают удаление липополисахаридов и других пирогенов.
37. Способ обратимой сборки полимера или олигомера из молекул одного типа или молекул нескольких разных типов, включающий стадии, на которых:
(1) берут указанные молекулы, причем каждая молекула содержит:
(а) по меньшей мере одну первую связывающую группировку из 100-160 аминокислотных остатков, которая происходит из N-концевого фрагмента белка шелка паука, и
(б) вторую группировку, которая индивидуально выбрана из белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов;
(2) берут раствор указанных молекул в жидкой среде с рН 6,4 или выше и/или ионной композицией, которая предотвращает полимеризацию или олигомеризацию указанных(ой) молекул(ы) через указанные связывающие группировки;
(3) корректируют свойства указанной жидкой среды до рН 6,3 или ниже и ионной композиции, которая обеспечивает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул через указанные связывающие группировки;
(4) обеспечивают сборку указанных молекул в полимер или олигомер через указанные связывающие группировки в жидкой среде, имеющей рН 6,3 или ниже и ионную композицию, которая обеспечивает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул через указанные связывающие группировки.
38. Способ по п.37, где указанные молекулы со стадии (1) являются идентичными, и где указанный полимер или олигомер со стадии (4) представляет собой гомополимер или гомоолигомер.
39. Способ по п.37, где указанные молекулы со стадии (1) не являются идентичными, и где указанный полимер или олигомер со стадии (4) представляет собой гетерополимер или гетеролигомер.
40. Способ по п.37, где указанный полимер или олигомер со стадии (4) растворяют в указанной жидкой среде, имеющей рН 6,3 или ниже и ионную композицию, которая обеспечивает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул.
41. Способ по п.37, где рН жидкой среды со стадий (3) и (4) составляет 6,2 или ниже, например 6,0 или ниже, и/или где рН жидкой среды со стадий (3) и (4) составляет 3 или выше, например 4,2 или выше.
42. Способ по п.37, где ионная сила жидкой среды со стадии (4) находится в диапазоне от 1 до 250 нМ.
43. Способ по п.37, где рН жидкой среды со стадии (2) составляет 6,7 или выше, например 7,0 или выше.
44. Способ по п.37, где рН жидкой среды со стадии (2) находится в диапазоне от 6,4 до 6,8.
45. Способ по п.37, где указанная вторая группировка представляет собой белок.
46. Способ по п.37, дополнительно включающий стадию:
(5) корректировки свойств указанной жидкой среды до рН 6,4 или выше и/или ионной композиции, которая предотвращает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул, для разборки указанного полимера или олигомера.
47. Способ по п.46, где рН жидкой среды со стадии (5) составляет 6,7 или выше, например 7,0 или выше.
48. Способ по п.46, где рН жидкой среды со стадии (5) находится в диапазоне от 6,4 до 6,8.
49. Способ по п.46, где полимер или олигомер со стадии (4) используют в исследованиях взаимодействия, разделении, индукции активности ферментных комплексов или в анализах FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции).
50. Способ по любому из пп.37-49, где по меньшей мере один тип молекулы со стадии (1) иммобилизован на твердой подложке или на матрице аффинной среды.
51. Способ детекции взаимодействий связывания между поднабором молекул, содержащимся в наборе молекул, включающий стадии, на которых:
(1) берут указанный набор молекул, где каждая молекула содержит:
(а) по меньшей мере одну первую связывающую группировку из 100-160 аминокислотных остатков, которая происходит из N-концевого фрагмента белка шелка паука, и
(б) вторую группировку, которая индивидуально выбрана из белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов;
(2) берут раствор указанного набора молекул в жидкой среде с рН 6,4 или выше и/или ионной композицией, которая предотвращает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул;
(3) корректируют свойства указанной жидкой среды до рН 6,3 или ниже и ионной композиции, которая обеспечивает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул;
(4) обеспечивают сборку указанных молекул в полимер или олигомер через указанные связывающие группировки в жидкой среде, имеющей рН 6,3 или ниже и ионную композицию, которая обеспечивает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул;
(5) корректируют свойства указанной жидкой среды до рН 6,4 или выше и/или ионной композиции, которая предотвращает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул, для разборки указанного полимера или олигомера; и
(6) определяют присутствие взаимодействий связывания, которые не опосредованы через указанные связывающие группировки, между двумя или более чем двумя разными молекулами, которые образуют указанный поднабор молекул.
52. Применение одной или более молекул, каждая из которых содержит:
(а) по меньшей мере одну первую связывающую группировку из 100-160 аминокислотных остатков, которая происходит из N-концевого фрагмента белка шелка паука, и
(б) вторую группировку, которая индивидуально выбрана из белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов;
для обратимой сборки полимера или олигомера из указанных молекул через указанные связывающие группировки в растворе с рН 6,3 или ниже и ионной композицией, которая обеспечивает полимеризацию или олигомеризацию указанных молекул.
53. Применение по п.52, где полимер или олигомер используют в исследованиях взаимодействий, разделении, индукции антивности ферментных комплексов или анализе FRET.
54. Аффинная среда, содержащая матрицу и лиганд для аффинных взаимодействий, связанный с указанной матрицей, где лиганд содержит по меньшей мере один фрагмент из 100-160 аминокислотных остатков, который происходит из N-концевого фрагмента белка шелка паука.
55. Аффинная среда по п.54, где матрица выбрана из группы, состоящей из частиц и фильтров.