ВАРИАНТЫ ПЛАЗМИНОГЕНА И ПЛАЗМИНА

1. Выделенный вариант плазминогена, отличающийся тем, что:
(i) он содержит в своем каталитическом домене лизин или аргинин во внутреннем положении Р и мутацию по меньшей мере одной аминокислоты в положении [P+/-n], где n равно 1, 2, 3, 4 или 5, и где аминокислота в положении [P+/-n] не является лизином и не является аргинином; и
(ii) наличие мутации из (i) уменьшает степень аутопротеолитического распада варианта плазмина, полученного из указанного варианта плазминогена, по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, определена с помощью хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату.
2. Вариант плазминогена по п. 1, содержащий в своем каталитическом домене мутацию по меньшей мере двух внутренних аминокислот:
- в положениях [P+/-n] и [P+/-n']; где n и n' равны 1, 2, 3, 4 или 5; где аминокислоты в положениях [P+/-n] и [P+/-n'] не являются лизином и не являются аргинином; и где n и n' отличаются друг от друга, если оба либо прибавлены, либо вычтены из P; или
- в положениях [P+/-n] и [P'+/-n]; где P' является большей величиной из P и P'; где аминокислота в положении P' является лизином или аргинином; где n равно 1, 2, 3, 4 или 5; где аминокислота в положении [P'+/-n] не является лизином и не является аргинином; и где, при наличии, исключены положения, перекрывающиеся между [P+n] и [P'-n];
и где наличие мутации указанных по меньшей мере двух внутренних аминокислот уменьшает степень аутопротеолитического распада варианта плазмина, полученного из указанного варианта плазминогена, по сравнению со степенью аутопротеолитического распада плазмина дикого типа, которая, например, определена с помощью хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату.
3. Вариант плазминогена по п. 2, дополнительно содержащий мутацию любой одной или нескольких аминокислот лизин или аргинин каталитического домена, включая аминокислоты лизин или аргинин в любом из положений P и/или P', в аминокислоту, не являющуюся ни лизином, ни аргинином.
4. Вариант плазминогена по п. 2, где указанная внутренняя аминокислота в положении P или P' выбрана из:
(i) лизина в положении 137 каталитического домена плазмина человека или соответствующего лизина или аргинина каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека;
(ii) лизина в положении 147 каталитического домена плазмина человека или соответствующего лизина или аргинина каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека; или
(iii) аргинина в положении 158 каталитического домена плазмина человека или соответствующего аргинина или лизина каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека;
где указанный каталитический домен плазмина человека начинается с аминокислоты валин в положении 1, которая является такой же аминокислотой валин, что встречается в положении 562 Glu-плазминогена человека.
5. Вариант плазминогена по п. 1, где указанная аминокислота в положении [P+/-n] является аминокислотой глутамат в положении 138 каталитического домена плазмина человека или соответствующего аминокислотного остатка каталитического домена плазмина, отличного от плазмина человека.
6. Вариант плазминогена по п. 1, где указанный плазминоген представляет собой Glu-плазминоген, Lys-плазминоген, мидиплазминоген, миниплазминоген, микроплазминоген, дельтаплазминоген.
7. Вариант плазминогена по любому из пп. 1-6, применяемый в качестве лекарственного препарата.
8. Вариант плазминогена по пп. 1-6 для индуцирования или стимулирования лизиса патологического отложения фибрина у субъекта; для индуцирования заднего отслоения стекловидного тела глаза и/или для индуцирования разжижения стекловидного тела глаза, или для облегчения хирургической витрэктомии глаза у субъекта, для ферментного очищения раны поврежденной ткани субъекта; для снижения циркулирующего фибриногена или для снижения уровней α2-антиплазмина у субъекта; или для снижения риска патологического отложения фибрина.
9. Вариант плазмина, полученный из варианта плазминогена по любому из пп. 1-6.
10. Вариант плазмина по п. 9, дополнительно отличающийся тем, что его константа аутолиза составляет не более 95% константы аутолиза плазмина дикого типа.
кат
кат
11. Вариант плазмина по п. 9, дополнительно отличающийся тем, что каталитическая константа k находится в диапазоне от 10% до 200% k плазмина дикого типа.
кат
кат
12. Вариант плазмина по п. 9, дополнительно отличающийся тем, что его константа аутолиза составляет не более 95% константы аутолиза плазмина дикого типа, и его каталитическая константа k находится в диапазоне от 10% до 200% k плазмина дикого типа.
13. Вариант плазмина по п. 9, где указанный плазмин представляет собой Glu-плазмин, Lys-плазмин, мидиплазмин, миниплазмин, микроплазмин, дельтаплазмин.
14. Вариант плазмина по любому из пп. 9-13, применяемый в качестве лекарственного препарата.
15. Вариант плазмина по любому из пп. 9-13 для индуцирования или стимулирования лизиса патологического отложения фибрина у субъекта; для индуцирования заднего отслоения стекловидного тела глаза и/или для индуцирования разжижения стекловидного тела глаза, или для облегчения хирургической витрэктомии глаза у субъекта, для ферментного очищения раны поврежденной ткани субъекта; для снижения циркулирующего фибриногена или для снижения уровней α2-антиплазмина у субъекта; или для снижения риска патологического отложения фибрина.
16. Композиция, содержащая выделенный вариант плазминогена по любому из пп. 1-6, вариант плазмина по любому из пп. 9-13 или комбинацию любых из них и по меньшей мере один из фармацевтически приемлемого разбавителя, носителя или вспомогательного средства.
17. Композиция по п. 16, дополнительно содержащая по меньшей мере одно из антикоагулянта, тромболитического средства, противовоспалительного средства, противовирусного средства, антибактериального средства, противогрибкового средства, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антигистаминного средства или анестетика.
18. Способ скрининга в отношении аутопротеолитически стабильного варианта плазмина, при этом указанный способ включает:
(i) мутирование аминокислоты в положении [P+/-n], где аминокислота в положении P является аргинином или лизином, и где n равно 1, 2, 3, 4 или 5;
(ii) определение аутопротеолитической стабильности мутанта, полученного из (i), например, определенной при помощи хромогенного анализа или анализа биологической активности к субстрату;
(iii) сравнение аутопротеолитической стабильности мутанта, определенного в (ii), с аутопротеолитической стабильностью плазмина дикого типа и
(iv) отбор из (iii) мутанта, который является аутопротеолитически более стабильным, чем плазмин дикого типа, в качестве аутопротеолитически стабильного варианта.
19. Способ по п. 18, дополнительно включающий этап, где определяют протеолитическую активность аутопротеолитически стабильного варианта плазмина.
20. Способ скрининга в отношении аутопротеолитически стабильного варианта плазмина, при этом указанный способ включает:
(i) мутирование аминокислоты глутамат в положении 138 каталитического домена плазмина человека или соответствующего аминокислотного остатка плазмина, отличного от плазмина человека, в аминокислоту, отличающуюся от природной аминокислоты,
(ii) определение аутопротеолитической стабильности мутанта, полученного из (i), и
(iii) отбор из (ii) мутанта, который является аутопротеолитически стабильным, в качестве аутопротеолитически стабильного варианта плазмина;
где указанный каталитический домен плазмина человека начинается с аминокислоты валин в положении 1, которая является такой же аминокислотой валин, что встречается в положении 562 Glu-плазминогена человека.
21. Способ по п. 20, дополнительно включающий этап, где определяют протеолитическую активность аутопротеолитически стабильного варианта плазмина.
22. Способ увеличения стабильности при длительном хранении содержащей плазмин композиции, при этом указанный способ включает этап определения аутопротеолитически стабильного варианта плазмина по любому из пп. 9-13, способного храниться в течение длительного периода времени без существенной потери протеолитической активности.
23. Способ получения варианта плазминогена по любому из пп. 1-6, при этом указанный способ включает этапы:
(i) введения нуклеиновой кислоты, кодирующей плазминоген по любому из пп. 1-6, в подходящую клетку-хозяина, способную экспрессировать указанный плазминоген;
(ii) выращивания клетки-хозяина, полученной в (i), в условиях и в течение времени, достаточных для экспрессии указанного плазминогена в указанной клетке-хозяине; и
(iii) сбора плазминогена, экспрессированного в (ii).
24. Способ по п. 23, дополнительно включающий этап (iv), где плазминоген, собранный в (iii), очищают.
25. Способ получения варианта плазмина по любому из пп. 9-13, при этом указанный способ включает этапы:
(i) введения нуклеиновой кислоты, кодирующей плазминоген по любому из пп. 1-6, в подходящую клетку-хозяина, способную экспрессировать указанный плазминоген;
(ii) выращивания клетки-хозяина, полученной в (i), в условиях и в течение времени, достаточных для экспрессии указанного плазминогена в указанной клетке-хозяине;
(iii) сбора плазминогена, экспрессированного в (ii);
(iv) активации плазминогена из (iii) до плазмина.
26. Способ по п. 25, где плазминоген, собранный в (iii), очищают перед активацией в (iv).
27. Способ по п. 25, где активный плазмин, полученный в (iv), очищают.
28. Способ по любому из пп. 25-27, где получают производные активного плазмина и/или активный плазмин обратимо инактивируют.
29. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант плазминогена по любому из пп. 1-6.
30. Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 29.
31. Клетка-хозяин, трансформированная нуклеиновой кислотой по п. 29.
32. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п. 30.
33. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант плазмина по любому из пп. 9-13.
34. Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 33.
35. Клетка-хозяин, трансформированная нуклеиновой кислотой по п. 33.
36. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п. 34.