Молекулярно-биологические факторы в диагностике цервикальной интраэпителиальной неоплазии

Новые технологии

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ В ДИАГНОСТИКЕ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ

Ю.Н. Пономарева1, И.Б. Манухин2, Л.А. Ашрафян3

Московская областная больница №5; 2кафедра акушерства и гинекологии МГМСУ; 3ФГУРНЦРР, Москва

MOLECULAR BIOLOGICAL FACTORS IN THE DIAGNOSIS OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIAS

Yu.N. Ponomareva1, I.B. Manukhin2,L.A. Ashrafyan3

Moscow Regional Hospital Five; 2Department of Obstetrics and Gynecology, Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Russian X-ray Radiology Research Center, Russian Agency for Medical Technologies, Moscow

The authors have made a complex analysis of the molecular biological factors associated with cervical intraepithelial neoplasia. They have revealed that infection by oncogenic human papillomavirus types is associated with suppressed apoptosis and enhanced cellular proliferative activity, which can be effectively used in the diagnosis and prediction of cervical neoplasias to optimize management tactics and to improve the results of treatment.

Key words: cervix uteri, cervical neoplasia, apoptosis, proliferation

Широкая распространенность, разнообразие патологических состояний и потенциальный риск злокачественной трансформации эпителия шейки матки (ШМ), определяют высокую значимость прогностических критериев возникновения и развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН). Частота возникновения предраковых заболеваний ШМ составляет, по данным различных авторов, от 10,7 до 38,8%, опухолей от 3,7 до 22,5% [1—3].

На протяжении двух десятилетий рак ШМ (РШМ) остается одним из наиболее распространенных новообразований и составляет около 5% в структуре злокачественных опухолей у женщин [2]. Тенденцией настоящего времени является значительный рост заболеваемости среди молодых женщин, представляющих не только репродуктивно значимую часть населения, но и активную в социальном отношении группу [3, 4]. При этом в возрастной группе от 20 до 40 лет РШМ является основной причиной смерти среди всех больных злокачественными новообразованиями женской половой сферы [2].

Общепризнано, что проблема цервикальных опухолей связана не только с устойчиво высокой заболеваемостью раком, но и с трудностями диагностики эпителиальных дисплазий, представляющих собой один из этапов малигнизации цервикального эпителия. По мнению экспертов ВОЗ, РШМ, выявленный на стадии предрака, — полностью предотвратимое заболевание [5]. В связи с этим изучение механизмов цервикального онкогенеза с позиций взаимосвязи различных молекулярно-биологических маркеров при ЦИН и во время их прогрессии в рак представляет огромный клинический интерес. Материалы и методы

Для изучения диагностической и прогностической значимости папилломавирусной инфекции (вирус папилломы человека — ВПЧ), регуляторов апоптоза и пролиферации клеток при ЦИН

проведено комплексное клинико-морфологическое исследование 214 пациенток с морфологически подтвержденным диагнозом предрака ШМ. Возраст обследованных варьировал от 23 до 42 лет и составил в среднем 35,3±8,1 года.

Диагностика заболеваний шейки матки включала в себя клинические, кольпоскопические, цито-гистологические и иммуногистохимические (ИГХ) методы исследования. Стадирование и систематизацию предраковых процессов ШМ проводили в соответствии с общепринятой Международной статистической классификацией болезней (1992), гистологической классификацией опухолей женского полового тракта ВОЗ (1995). В обследованной группе женщин у 62 (29±3,1%) пациенток выявлена ЦИН I, у 60 (28±3,1) — II и у 92 (49±3,4) — III степени.

При оценке цервикального биотопа определяли наличие ассоциированных с патологией ШМ сексуально-трансмиссивных инфекций: ВПЧ типов 6/11, 16/18, 31/33, 35/45, Chlamydia trachomatis, вируса простого герпеса (ВПГ)-430 1-го и 2-го типа, цитомегаловируса (ЦМВ)-500. Диагностика проводилась методом анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) по общепринятой методике с применением тест-систем АмплиСенс-100-R (Москва) [6]. Материалом для ПЦР-исследования служили соскобы эпителия цервикального канала и поражений ШМ, взятые одноразовыми зондами до проведения комплексного обследования и лечения заболеваний ШМ. Контрольную группу при определении типа ВПЧ составили 50 здоровых женщин без патологических изменений в ШМ, отобранных методом случайного выбора из общей популяции.

Определение мутантного гена-супрессора р53 (р53mut), антиапоптозного гена bcl-2, антигена ядер пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen — PCNA) проведено ИГХ-методом c использованием моноклональных антител к р53mut

(клон Б07, разведение 1:100, «Бако», Дания), Ьс1-2 (клон 124, рабочее разведение 1:20, «Бако», Дания) и РСКА (клон РС-10, предварительное разведение, «Бако», Дания). Для иммунного окрашивания использован стрептавидин-биотин-пероксидазный метод («Бако», Дания) [7]. Подсчет иммунопози-тивных клеток проводился в 20 произвольно выбранных полях зрения при кратности увеличения х400. Индексы мечения р53ши1 и РСКА рассчитывали как отношение числа позитивно окрашенных ядер к общему числу ядер. При оценке Ьс1-2 определялось соотношение числа клеток с окрашенной цитоплазмой и общего количества клеток [8]. ИГХ-исследование проведено с применением биоптатов ШМ, полученных до начала лечения пациенток. Контрольную группу составили 10 образцов морфологически неизмененных тканей ШМ.

Данные представлены в виде М±ш, где М — среднее арифметическое, ш — ошибка среднего. Для оценки статистически значимых различий полученных данных использовали критерий Стью-дента (1), критический уровень значимости принимался меньшим или равным 0,05. В табл. 1—4 приведены коэффициенты только статистически значимых различий.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования обнаружено, что в подавляющем большинстве случаев ЦИН ассоциированы с ВПЧ-инфицированием. В многочисленных данных литературы продемонстрирована высокая клиническая значимость диагностики ВПЧ [1, 3, 5, 9, 10]. Это определяется необходимостью формирования групп онкологического риска с выявлением тех пациенток, которым показано проведение активной комплексной профилактики и доклинической диагностики РШМ.

Характерными для ВПЧ клетками считаются койлоциты, образующиеся в тканях в результате цитопатического эффекта вирусов и представляющие собой клетки плоского эпителия промежуточного типа неправильной формы с увеличенными в разной степени ядрами, неровной складчатой мембраной, гиперхроматозом и выраженной перинуклеарной зоной просветления [9, 10]. В группе обследованных у 53,2±3,4% больных неоплазиями отмечена койло-цитарная атипия цервикального эпителия (см. рисунок).

Образец цервикального эпителия с койлоцитарной атипией клеток при инфицировании ВПЧ. Окрашивание гематоксилин-эозином, х400

В настоящее время основным методом идентификации папилломавирусной инфекции является молекулярно-биологическое выявление ДНК ВПЧ различных типов. Известно, что около 12 типов ВПЧ — потенциально онкогенные [1, 9].

При определении типа ВПЧ

Таблица 1. Распределение типов ВПЧ у обследованных женщин

Число пациенток, % инфицированных

Тип ВПЧ Контроль Группа ЦИН I степени ЦИН II степени ЦИН III степени

6 6±3,4 9,7±3,8 6,7±3,2

11 4±2,8 6,5±3,1 3,3±2,3 1,1±1,1

16 2±2 9,7±3,8 13,3±4,4 34,8±5

р=0,031 p<0,001

р2=0,003 р1=0,009

18 — 3,2±2,2 6,7±3,2 18,4±4

р2=0,038 р1=0,004

31 — — — 4,4±2,1

33 — — 3,3±2,3 3,3±1,9

35 — — — 5,4±2,4

45 — — 6,7±3,2 4,4±2,1

Смешанный — — 10,0±3,9 6,5±2,6

Итого ... 12,0±4,6 29,1±5,8 50±6,5 78,3±4,3

р=0,028 p<0,001 p<0,001

р1=0,018 р1<0,001

р2<0,001

Примечание. p — статистическая значимость различий по сравнению с группой контроля; р1 — с ЦИН I; р2 — с ЦИН III степени.

Новые технологии

Новые технологии

Таблица 2. Экспрессия р53mut при ЦИН

Экспрессия р53mut I

Число 6,5±3,1 16,7±4,8 40,2±5,1

положительных ^<0,001

случаев р1=0,002

Уровень 4,8±1,2 2,3±1,2 13,1±2,9

экспрессии р=0,048

р1=0,013

Примечание. р — статистическая значимость различий с ЦИН I степени; р1 — с ЦИН II степени.

обусловлен преимущественно папилломавирусами популяционного риска — 6-го и 11-го типов и лишь в 2±2% наблюдений отмечен ВПЧ 16-го типа.

ВПЧ 6-го и 11-го типов также идентифицировались при ЦИН I—II степени и редко встречались при III степени заболевания. Из онкогенных типов ВПЧ при ЦИН превалирующим был 16-й тип вируса, он достоверно чаще встречался при тяжелой степени поражения ШМ. Отмечена прямая корреляционная зависимость между выявлением в цервикальном эпителии 16, 18, 31, 33, 35, 45-го типов ВПЧ, которые принято рассматривать как канцерогенные, и степенью тяжести предраковых изменений ШМ. Так, коэффициент корреляции г между инфицированием ВПЧ и тяжестью поражения эпителиального пласта при ЦИН I степени составил 0,762 (р=0,001), при ЦИН II — 0,862 (р=0,047) и при ЦИН III степени — 0,835 (р=0,037).

Многочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что наиболее выраженное цито-патическое действие на цервикальный эпителий с формированием стойких неспецифических патологических изменений с хронизацией процесса и усилением дисбаланса между пролиферацией и апоптозом клеток оказывают ассоциированные сексуально-трансмиссивные инфекции [1, 3, 9, 11].

При изучении особенностей распределения смешанных сексуально-трансмиссивных инфек-

ций в зависимости от степени тяжести ЦИН установлено, что частота выявления хламидийно-па-пилломавирусной инфекции составила 16,8±2,6%. Именно с этим вариантом инфицирования, за исключением моноинфекции ВПЧ, связано развитие эпителиальных дисплазий ШМ с тенденцией увеличения числа инфицированных пациенток при ЦИН II—III степени. Значительно реже по сравнению с хламидийной инфекцией встречалось сочетание ВПЧ с ЦМВ и ВПГ — 5,1± 1,5 и 6,1±1,6% (р=0,004 и р=0,034) соответственно.

Постоянство клеточного состава эпителия ШМ поддерживают строго скоординированные между собой процессы: пролиферация, дифференцировка и апоптоз клеток [11, 12], одними из основных регуляторов которых считаются онкогены р53 и Ьс1-2.

При исследовании р53ши1 и Ьс1-2 выявлены следующие особенности их экспрессии при ЦИН. Онкоген р53ши1 определялся в 21,3±4,2% случаев ЦИН (см. табл. 2), в здоровых тканях ШМ этого онкогена не обнаружено. Число р53ши1-позитив-ных случаев и средние значения экспрессии р53ши1 при ЦИН I и II степени не различались в отличие от ЦИН III степени, при которой экспрессия р53ши1 встречалась более чем в 40% наблюдений и превышала 13% окрашенных ядер.

Только в 2,3±1% случаев одновременно с р53ши1 определялся Ьс1-2. В большинстве наблюдений обнаружены Ьс1-2-позитивные поражения при отсутствии экспрессии р53ши1;, либо Ьс1-2-не-гативные образцы экспрессировали р53ши1. Рядом исследователей показано, что регуляция экспрессии Ьс1-2 по принципу обратной связи ассоциирована с геном р53 и вполне вероятно, что в регуляции экспрессии Ьс1-2 может участвовать не только нормальный р53, но и его мутированный тип, при этом определенный уровень продукции р53 способен нивелировать гиперэкспрессию Ьс1-2 [13].

В цервикальном эпителии здоровых женщин Ьс1-2 определялся преимущественно в базальной части эпителиального пласта, а уровень его экспрессии не превышал 4% клеток. При ЦИН I—II степени частота и уровень экспрессии Ьс1-2 не отличались от показателей группы контроля. Отличительной чертой ЦИН III степени явилось уменьшение случаев определения Ьс1-2 с появлением образцов с гиперэкспрессией этого онкогена (см. табл. 3).

Представленные данные показывают, что появление р53ши1 и аберрантная экспрессия Ьс1-2 имеют критическое значение в процессе развития неопластических изменений цервикального

Таблица 3. Экспрессия Ь^-2 в неизмененном

цервикальном эпителии и при ЦИН

Число пациенток, %

Экспрессия Ь^-2 контроль Группа ЦИН I степени ЦИН II степени ЦИН III степени

Число положительных 90±9,5 87,1±4,3 80±5,6 51,1±5,2

случаев р1<0,001 р1<0,001 р=0,018

Уровень экспрессии 2,1±0,3 4,5±0,6 6,3±1,4 12,4±2

р1=0,006 р1=0,048 р=0,044

Число отрицательных 10±9,5 12,9±4,3 20±5,6 48,9±5,2

случаев р1<0,001 р1<0,001 р=0,018

Примечание. Здесь и в табл. 4: р — статистическая значимость различий по сравнению с группой контроля; р1 — с ЦИН III степени.

эпителия в результате нарушения гибели инфицированных клеток, что закономерно приводит к их нерегулируемой пролиферации. Так, при ЦИН число РСКА-позитивных клеток возрастало более чем в 5 раз по сравнению с показателями контрольной группы, при этом пролиферирующие клетки занимали большую часть толщины эпителиального пласта, составляя в среднем от 10 до 30% (см. табл. 4). Показатели экспрессии РСКА при ЦИН I и II степени не отличались. Цервикальные неоплазии тяжелой степени характеризовались значительным увеличением пролиферативной активности клеток по сравнению с таковой в группе контроля и соответствующими показателями при ЦИН I—II степени.

Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о достаточно высокой распространенности ВПЧ у здоровых женщин, которые формируют группу потенциального риска осуществления злокачественной трансформации цервикального эпителия. Определение ВПЧ как диагностического критерия неопластических процессов ШМ в ряде случаев не позволяет прогнозировать развитие цервикального рака, так как в большинстве наблюдений инфицирование имеет кратковременный характер и заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. Однако прогностическая значимость ВПЧ-тестирования значительно возрастает, в случае если на фоне ВПЧ-инфицирования уже имеется картина ЦИН, что может свидетельствовать о наличии канцерогенного риска. Длительная персистенция вирусов сопровождается их интеграцией в клеточный геном и появлением мутаций, причем неопластическая трансформация возникает с большей вероятностью при взаимодействии папилломавирусов с другими сексуально-трансмиссивными инфекциями — хламидиями, ВПГ и ЦМВ [9, 10].

Известно, что изменения в генетическом аппарате инфицированных клеток могут быть обусловлены нарушением программы клеточной гибели. Одним из механизмов нарушения апоптоза являются мутации в генах, контролирующих гибель клеток.

Таблица 4. Уровень экспрессии PCNA

в неизмененном цервикальном эпителии и при ЦИН

Группа

Число пациенток, %

Контроль

Степень ЦИН I

II

III

3,5±1,5

15,5±3,3

p=0,053

p1=0,045

15,5±3

p=0,03

p1=0,048

28,6±4,3

p=0,023

p — статистическая значимость различии с контролем; p1 -статистическая значимость различии с CIN III.

В ряду этих процессов находятся потеря функций гена-супрессора опухолевого роста р53 в результате его превращения в мутантный тип и гиперэкспрессия протоонкогена Ьс1-2. В результате проведенных исследований показано увеличение продукции р53ши по мере нарастания неопластических изменений ШМ и уменьшение частоты определения Ьс1-2 с высоким уровнем экспрессии этого онкогена в Ьс1-2-положительных случаях. Генетические нарушения посредством изменения темпов гибели клеток влияют на пролиферативную активность, динамически возрастающую при ЦИН, и создают условия для неконтролируемого роста клеток.

Совокупность указанных молекулярно-биологических особенностей течения ЦИН имеет определяющее значение в развитии предрака ШМ и его клиническом течении. Выявление сексуально-трансмиссивных инфекций с типированием вирусов папиллом, определение уровня р53ши1;, Ьс1-2, пролиферативной активности могут эффективно использоваться в комплексной диагностике ЦИН, благодаря формированию дифференцированного подхода к тактике ведения, выбору метода терапии и прогнозированию заболевания.

1. Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии. Л.: Медицина, 1989.

2. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2002 г. Под ред. М.И. Давыдова, Е.М. Аксель. М.: РОНЦ им. Н.Н. Блохина, РАМН, 2004.

3. Кулаков В.И., Тохиян А.А. Проблемы злокачественных новообразований репродуктивной системы в практике гинеколога. Журн акуш жен бо-лезн 2002^1(вып 1):9—12.

4. Новикова Е.Г. Диагностика предраковых заболеваний и начальных форм рака шейки матки. Заболевания шейки матки, влагалища и вульвы (Клинические лекции). Под ред. В.Н. Прилеп-ской. М.: МЕДпресс, 2000. с. 153—60.

5. Кондриков Н.И., Прилепская В.Н.

ЛИТЕРАТУРА

IX Всемирный конгресс по патологии шейки матки и кольпоскопии. Акуш гинекол 1996;(6):51—2.

6. Бауэр Х.М., Грир К.Е., Мано М.М. Применение ПЦР для диагностики папилломавирусных инфекций гениталий. В кн.: Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Пер.

с англ. Под ред. С. Херрингтон, Дж. Макги. М.: Мир, 1999.

7. Руководство по иммуногистохими-ческой диагностике опухолей человека. Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райх-лина. Казань, 2004.

8. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуноцитохимия. СПб.: ВЦЭРМ МЧС России, 2002.

9. Минкина Г.Н., Манухин И.Б., Франк Г.А. Предрак шейки матки. М.: Аэрограф-медиа, 2001.

10. Schlecht N.F., Kulaga S., Ferreira S. et al. Persistent human papillomavirus infection as a predictor of cervical intraepithelial neoplasia. JAMA 2001;286(24):3106—14.

11. Hale A.J., Smith C.A., Sutherland L.C. et al. Apoptosis: molecular regulation of cell death. Eur J Biochem 1996;236(1):26.

12. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). М.: Медицина, 2001.

13. Liang J.Y., Jiang J.X., An X.H. et al. Bcl-2 protooncogene expression in cervical carcinoma cell lines containing inactive p53. J Cell Biochem 1995;57(3):509—21.

Новые технологии