СРЕДСТВО ПРОТИВ ВИРУСА ЯЩУРА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ, ОТНОСЯЩИХСЯ К СЕМЕЙСТВУ СВИНЕЙ ИЛИ ОВЕЦ, И СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЯЩУРА У ЖИВОТНЫХ, ОТНОСЯЩИХСЯ К СЕМЕЙСТВУ СВИНЕЙ ИЛИ ОВЕЦ
MURRAIN VIRUS DRUG FOR PIG OR SHEEP FAMILY ANIMALS, AND METHODS FOR MURRAIN PREVENTION AND TREATMENT IN PIG OR SHEEP FAMILY ANIMALS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к средству против вируса ящура, предназначенному для животных, относящихся к семействам свиньи или овец (здесь и далее упоминаемые как «свиньи и др.»), содержащему 3-оксо-3,4-дигидро-2-пиразинкарбоксамид (здесь и далее обозначаемый Т-1105), или его соль; и способу лечения, включая превентивный и терапевтический способ для ящура свиней и др.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ящур является одним из серьезных инфекционных заболеваний домашних животных, а именно парнокопытных, включая коров, свиней, овец и др. Кроме того, это заболевание вызывает нарушения развития, движения и тому подобные у домашних животных, что быстро снижает их коммерческую ценность, и является инфекционным заболеванием, характерным для домашних животных, но не заразным для человека. Для мирового животноводческого хозяйства ящур определен как наиболее важное заболевание животных, о котором необходимо предупреждать, по мнению как экспортирующих, так и импортирующих стран.
Ящур также является международным инфекционным заболеванием, и в настоящее время широко распространен в мире, включая Азию, Африку и Южную Америку. Также и в Японии в 2000 году произошла вспышка эпидемии. Если болезнь имела место, ей сопутствует множество сложностей по профилактике ее распространения, так как вирус является высокотрансмиссивным (легко передается). Проявление болезни вызывает огромное потрясение в животноводческом хозяйстве. Поэтому во всем мире на лечение ящура, включая профилактику и терапию, затрачиваются большие усилия.
Средства профилактики для контроля данного заболевания ограничены ограничением импорта, контролем гигиены, карантином и забоем пораженных животных. При вспышке эпидемии в качестве превентивной профилактической меры осуществляется программа вакцинации с применением инактивированной вакцины на национальном или региональном уровне, или в областях, примыкающих к очагу эпидемии. Однако затруднено раннее выявление этого заболевания, и болезнь распространяется настолько быстро, что вакцинация не может за нею успеть. Кроме того, так как вирус высокоизменчив, вакцинация сама по себе не может полностью предотвратить инфекцию. То есть в настоящее время нет идеальной терапевтической методики для свиней и др. (Парнокопытные).
Брошюра WO 00/10569 описывает, что Т-1105 имеет превосходное противовирусное действие против гриппа (Патентный Документ 1). Однако в нем не раскрыты особым образом ни противовирусное средство против ящура свиней и др., ни способ лечения от ящура свиней и др., включая превентивный или терапевтический способ.
Патентный Документ 1: брошюра WO 00/10569
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Существует острая необходимость в идеальном противовирусном средстве против ящура свиней и др. и способе лечения от ящура свиней и др., включая превентивный или терапевтический способ.
В этих обстоятельствах авторы настоящего изобретения, в результате напряженных исследований, обнаружили, что противовирусное средство против ящура, содержащее Т-1105 или его соль, потенциально имеет терапевтический эффект против ящура в свиньях и др., и является полезным для лечения, включая терапию, от ящура свиней и др., и, таким образом, осуществили изобретение.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что противовирусное средство против ящура, содержащее Т-1105 или его соли, имеет сильный терапевтический эффект против ящура в овцах, и является полезным для лечения, включая терапию, от ящура овец/ и, таким образом, осуществили изобретение.
Противовирусное средство против ящура, содержащее Т-1105 или его соли, полезно для лечения, включая профилактику и терапию, от ящура свиней и др.
ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Здесь и далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано.
В данном описании, если существуют сольваты и гидраты, либо соли Т-1105, они могут применяться, если не указано иное. Также могут применяться различные формы кристаллов.
Соль Т-1105 включает обычно подразумеваемую соль, образованную с участием гидроксильной группы. Соль, образованная с участием гидроксильной группы, включает, например, соль с щелочным металлом, таким как натрий и калий, соль с щелочно-земельным металлом, таким как кальций и магний, соль аммония, равно как и соль с азотсодержащим органическим основанием, таким как триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, пиридин, N,N-диметиланилин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, диэтиламин, дициклогексиламин, новокаин, дибензиламин, N-бензил-β-фенетиламин, 1-эфенамин и N,N-дибензилэтилендиамин. Среди солей, описанных выше, предпочтительная соль включает фармакологически приемлемую соль, и натриевая соль является наиболее предпочтительной.
Противовирусное средство против ящура свиней и др., содержащее Т-1105 или его соли, по изобретению, демонстрирует превосходный противовирусный эффект в отношении вируса ящура, который относится к роду Афтовирусов. Вирус ящура включает, например, серотипы А, О и С Европейского типа, серотип Азия 1 Азиатского типа, серотипы SAT1, SAT2 и SAT3 Африканского типа, и их подтипы.
Противовирусное средство против ящура свиней и др., содержащее Т-1105 или его соли, по изобретению, является более эффективным, в частности, против вирусов серотипов А, О и С, также как и против Азия 1, чье появление наблюдалось в Азии.
В настоящем изобретении термин «свинья» подразумевает животное, принадлежащее к семейству Свиньи, Парнокопытные, Млекопитающие, Позвоночные; и особым образом включает свинью и дикого кабана, и предпочтительно свинью.
Т-1105 или его соли могут назначаться свиньям и др. к приему парентерально как инъекции после разведения дистиллированной водой для инъекций или физиологическим раствором; либо могут назначаться к приему орально или парентерально в качестве композиции, предназначенной для животного, например, таблеток, крупных драже, порошков, гранул, тонкоизмельченных гранул, капсул, эмульсий, жидкостей, суспензий, предсмешанных композиций, сиропов, паст или аэрозолей, согласно известным фармацевтическим способам производства, с применением фармацевтически приемлемых растворителей и инертных наполнителей, если таковые требуются.
Т-1105 или его соли, либо композиция, предназначенная для животного, могут при необходимости применяться в смеси с животным кормом, например необработанными/грубыми кормами, такими как сено, солома, травы, силосные культуры, корнеплоды и фрукты, дикие растения, листья деревьев и силос; и концентрированными кормами, такими как зерна, хлебные злаки и комбикорм с высокой питательностью. Также средство может применяться при добавлении в питьевую воду и тому подобное.
Предпочтительные формы приема включают назначение в виде инъекций, таких как внутримышечные, подкожные и внутрибрюшинные инъекции, и оральный прием путем примешивания Т-1105 к корму для животных.
Противовирусное средство против ящура свиней и др. и животный корм для свиней и др. согласно настоящему изобретению могут быть произведены, например, при стабилизации Т-1105 или его солей путем разведения или инкапсуляции твердыми или жидкими носителями для создания, например, таблеток, крупных драже, порошков, гранул, тонкоизмельченных гранул, капсул, эмульсий, жидкостей, суспензий,
предсмешанных композиций, сиропов, паст или аэрозолей, либо, альтернативно, непосредственного диспергирования в кормах или питье, или в носителе, который будет к ним добавлен. Твердые носители включают, к примеру, лактозу, сахарозу, крахмал, муку, кукурузную муку, отруби, соевое масло, обезжиренные рисовые отруби, рапсовый жмых, остатки соцветий бобовых, целлюлозу, дрожжевые клетки, рыбную кормовую муку, выжимки арахиса, кормовую ракушечную муку и карбонат кальция; жидкие носители включают, например, воду, физиологический раствор и физиологически безопасные органические растворители. Также при необходимости могут быть добавлены вспомогательные вещества, такие как эмульгирующие средства, диспергирующие средства, суспендирующие вещества/ увлажняющие средства, загустители, студнеобразователи и растворители. Такая форма является предсмешанной формой. Далее могут быть подмешаны консерванты, бактерицидные средства, антигельминтные средства, антиоксиданты, красители, ароматизаторы, антибактериальные средства, антибиотики, препараты ферментов, препараты молочнокислых бактерий, жаропонижающие средства, анальгетики и противовоспалительные средства. Могут быть примешаны другие лекарственные препараты для животных. Также могут быть добавлены различные виды витаминов, минералов и аминокислот.
Противовирусное средство против ящура свиней и др. согласно настоящему изобретению назначается к приему домашнему скоту или животным семейства Свиньи и др., с целью лечения, включая профилактику и/или терапию, ящура. Особенно предпочтительно назначение свиньям.
Соответствующие дозировки могут быть выбраны в зависимости от возраста, веса тела, симптомов животного, подвергаемого воздействию, и способа приема. Например, доза от 1 до 2000 мг/кг веса животного может приниматься путем разделения на одну-несколько ежедневных доз. Частота может быть повышена в зависимости от симптомов. Период приема не ограничен особым образом, тогда как обычно для получения удовлетворительной эффективности достаточно приема в течение от 1 до 10 дней. Также возможно назначение к приему с перерывами.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано Тестовыми Примерами, которые никоим образом не ограничивают настоящее изобретение. Т-1105 или его соли, согласно настоящему изобретению, могут быть получены путем покупки коммерческого продукта либо произведены с помощью любой известной технологии или технологий, основанных на ней или их комбинации. Следующие эксперименты в Тестовых Примерах с 1 по 3 проводились в Национальном институте здоровья животных в Токио, относящемся к Национальной организации сельскохозяйственных и продовольственных исследований, независимому административному институту.
Тестовый Пример 1. Изучение in vitro противовирусного эффекта против ящура
Определялось действие Т-1105 на вирус ящура (штамм O/JPN/2000).
Вирус ящура (штамм O/JPN/2000) был адсорбирован на субкультивированные клетки - производные почки свиньи - в концентрации приблизительно от 30 до 100 копий/на плашку, при 37°С в течение 1 часа. Раствор, содержащий вирусы, был удален, и клетки промывались культуральной средой MEM с рН, дведенным до 7,4, затем покрывались культуральной средой MEM, содержащей 2% бычью сыворотку и дополненной 1,5% метилцеллюлозой, в которой в два этапа было разведено и добавлено 20 мкг/мл Т-1105.
50
Через три дня культивирования клетки фиксировались и окрашивались 10% забуференным до нейтрального рН формалином, содержащим 0,2% кристаллического фиолетового, и затем подсчитывалось число бляшек. Путем сравнения количества бляшек с таковым в необработанной группе был определен уровень ингибирования 50% бляшкообразования (IC). Результат оказался равным 1,6 мкг/мл.
Было определено действие Т-1105 на вирус ящура (серотипы А, С и Asia 1).
50
50
50
1,5
Вирусные концентрации А, С и Asia 1 составили 10 ТСID, 10 TCID и 10 TCID, соответственно. После адсорбции вируса на клетки IBRS-2 при 37°С в течение 1 часа 20 мкг/мл Т-1105 было разведено в два этапа и каждое из разведении было добавлено к клеткам, через 48 часов клетки фиксировались и окрашивались 10% забуференным до нейтрального рН формалином, содержащим 0,2% кристаллического фиолетового. Если ингибирование цитопатического действия наблюдалось в одной или более из 4 лунок повторностей каждой концентрации, концентрация определялась как эффективная. Результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1
Серотип вируса ящура
25% (или более) икгибирующая концентрация (мкг/мл)
А
0,625
С
0,313
Asia 1
1,25
Т-1105 продемонстрировал превосходный эффект против вируса ящера.
Тестовый Пример 2(1). Фармакокинетическое исследование Т-1105 (свиньи, коровы)
Пища, содержащая 1% Т-1105, скармливалась свиньям (стандартные лабораторные, вес 10 кг, 2 особи) и коровам (черная японская корова, вес 200 кг, 2 особи) в дозировке 100 мг/кг. Через 2 и 8 часов после приема из яремной вены каждого животного отбиралось по 1,5 мл крови с использованием промытых гепарином шприцов, кровь центрифугировалась при 4°С и 2000 об/мин в течение 10 мин, и 250 мкл плазмы крови переносилось в микропробирки на 1,5 мл. Концентрация Т-1105 была измерена на основе калибровочной кривой, построенной по значениям в контрольных пробах. Для получения калибровочной кривой та же процедура была проведена в качестве предварительной обработки плазмы, путем добавления 50 мкл 5-кратного раствора Т-1105 к 200 мкл контрольной плазмы. К 250 мкл каждого из опытных образцов и опытных образцов для построения калибровочной кривой было добавлено по 500 мкл метанола, образцы перемешивались и центрифугировались при 4°С и 10000 об/мин в течение 10 мин. Собиралась надосадочная фракция, которая после удаления белков высушивалась. Остаток был растворен в 500 мкл подвижной фазы ВЭЖХ, полученный раствор центрифугировался при 10°С и 3000 об/мин в течение 10 мин, и надосадочная фракция использовалась для измерения. Условия измерения ВЭЖХ были следующими.
Аналитическая колонка: Develosil ODS-MG-5 (4,6 мм I.D.×250 мм), Nomura Chemical Co., Ltd.
Предохранительная колонка: Develosil ODS-MG-5 (4,0 мм I.D.×10 мм), Nomura Chemical Co., Ltd.
Температура колонки: 40°С
Подвижная фаза ВЭЖХ: метанол/1 моль/L фосфатный буфер (рН 7,0)/дистиллированная вода/бромид тетрабутил аммония (50:50:900:1,6, v/v/v/w).
Объемная скорость потока: 1,0 мл/мин
Длина волны при детекции: 350 нм
Объем инъекции: 100 мкл
Температура автодозатора: задано 10°С
Время анализа: приблизительно 18 мин
Была построена калибровочная кривая, и по области пика и среднему определена концентрация Т-1105 в опытных образцах плазмы для соответствующих особей.
Тестовый Пример 2(2). Фармакокинетическое исследование Т-1105 (овцы)
Пища, содержащая 1% Т-1105, скармливалась овцам (корридель, вес 63 и 67 кг, 2 особи) в дозировке 100 мг/кг. Через 2 и 8 часов после приема из яремной вены каждого животного отбиралось по 1,5 мл крови с использованием промытых гепарином шприцов, кровь центрифугировалась при 4°С и 2000 об/мин в течение 10 мин, и 250 мкл плазмы крови переносилось в микропробирки на 1,5 мл. К опытным образцам плазмы было добавлено по 500 мкл метанола, образцы перемешивались и центрифугировались при 4°С и 10000 об/мин в течение 10 мин. Собиралась надосадочная фракция, которая после удаления белков высушивалась. Остаток был растворен в 500 мкл подвижной фазы ВЭЖХ, полученный раствор центрифугировался при 10°С и 3000 об/мин в течение 10 мин, и надосадочная фракция собиралась для измерения. Измерение проводилось при тех же условиях, что и в Тестовом Примере 2(1).
Калибровочная кривая была получена с помощью стандартных растворов, а концентрации Т-1105 в тестовых образцах плазмы для соответствующих особей определялись на основе значений области пика и среднего.
Результаты Тестовых Примеров 2(1) и (2) показаны в таблице 2.
Таблица 2
Концентрация в плазме (мкг/мл)
2 часа после приема
8 часов после приема
Свиньи
75,0
36,4
Овцы
30,9
10,2
Коровы
7,86
0,173
Высокая концентрация Т-1105 в крови поддерживается у свиней и овец, демонстрируя отличную фармакокинетику.
Тестовый Пример 3. Тест эффективности приема комбикорма
Терапевтический эффект Т-1105 на ящур оценивался с применением модели системной инфекции свиней.
6
50
Свиньи (стандартные лабораторные, вес 10 кг, 2 особи в группе с приемом вещества (№№1 и 2) и 2 особи в группе без приема (№№3 и 4)) были инъецированы вирусом ящура в количестве 10 TCID в подушечку передней ноги, и инициировалась инфекция.
Т-1105 принимался орально в форме комбикорма в количестве 200 мг/кг за 1 час до инфицирования, затем дважды в день (400 мг/кг/в день) в течение 6,5 дней. Ход изменения клинических признаков наблюдался вплоть до 8 дня после введения вируса. Также ход изменения вирусной нагрузки в плазме и назальном мазке измерялся до 3 дня после введения вируса.
Ниже показаны: ход изменения клинических признаков в таблице 3, вирусная нагрузка (количество вируса в крови) в таблице 4 и вирусная нагрузка в назальном мазке в таблице 5.
Таблица 3
№ свиньи
Дни после введения вируса
1
2
3
4
5
6
7
8
Группа, принимавшая Т-1105
1
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Группа, не принимавшая Т-1105
3
-
-
+
++
++
++
++
++
4
+
+
++
++
++
-: норма, +: хромота, ++: астазия
Группа животных, не принимавшая Т-1105, демонстрировала хромоту, невозможность стоять и образование нарывов на ногах, начиная со 2 дня после введения вируса, тогда как группа животных, принимавшая Т-1105, не проявляла изменений во внешнем виде.
Таблица 4
№ свиньи
Дни после введения вируса
1
3
Группа, принимавшая Т-1105
1
<0,14
<0,14
2
<0,14
<0,14
Группа, непринимавшая Т-1105
3
<0,14
34891
4
0,18
282,7
Единицы: ТСID<sub>50</sub>/мкл
Вирусная нагрузка в плазме резко возрастает в группе, не принимавшей Т-1105, тогда как в группе, принимавшей Т-1105, она остается на предельном уровне обнаружения и ниже.
Т-1105 демонстрирует превосходный терапевтический эффект в модели системной инфекции свиней.
Таблица 5
№ свиньи
Дни после введения вируса
1
3
Группа, принимавшая Т-1105
1
<0,07
<0,07
2
<0,07
<0,07
Группа, не принимавшая Т-1105
3
<0,07
160
4
<0,07
0,66
Единицы: ТСID<sub>50</sub>/мкл раствора мазка
Вирусная нагрузка в назальном мазке возрастает в группе, не принимавшей Т-1105, тогда как в группе, принимавшей Т-1105, она почти не повышается.
Т-1105 демонстрирует превосходный терапевтический эффект в модели системной инфекции свиней.
Кроме того, свиньи в группе, принимавшей Т-1105, не выявили показателей токсичности в период приема.
Тестовый Пример 4. Цитотоксичность
4
2
В 96-луночный планшет (IWAKI Co., Ltd) была внесена культуральная среда, содержащая предварительно установленную концентрацию Т-1105, в количестве 100 мкл/на лунку. Затем были приготовлены клетки Vero в концентрации 2×10 клеток/мл культуральной среды, полученная суспензия клеток высевалась в количестве 100 мкл/на лунку и культивировалась в условиях 5% COи 37°С в течение 4 дней. По окончании культивирования число жизнеспособных клеток определялось методом ХТТ (см., например, CANCER RESEARCH, vol.48, pp 4827-4833 (1988)).
50
Концентрация Т-1105, ингибирующая рост клеток на 50% (IC), составила 250 мкг/мл или более.
Как очевидно из вышеприведенных результатов, Т-1105 является довольно безопасным и эффективным противовирусным средством против ящура для свиней и др., при лечении ящура, вызванного вирусом ящура.
Пример композиции 1. Таблетки
10 г Т-1105 смешивались с 4,4 г лактозы, 4,4 г кристаллической целлюлозы, 1,0 г карбоксиметил-крахмала натрия и 0,20 г стеарата магния, затем порошковая смесь прессовалась в таблетки по 200 мг для получения таблеток, которые содержат по 100 мг Т-1105 каждая.
Пример композиции 2. (Комбикорм)
30 г Т-1105 смешивались с 2970 г коммерчески доступных кормов для свиней (JA ZEN-NOH) для получения 3000 г комбикорма, содержащего 1% Т-1105. Т-1105 в составе корма стабилен (не деградирует) в течение 24 часов.
ПРИМЕНЯЕМОСТЬ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
Средство против ящура, содержащее Т-1105 или его соль, полезно для лечения ящура, включая профилактику или терапию, для животных семейства Свиньи, и др.