Способ стимуляции регенерации печени у крыс
METHOD FOR STIMULATING LIVER REGENERATION IN RATS

Изобретение относится к онкологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изучения в эксперименте возможности стимуляции процесса регенерации печени у животных после удаления ее части.
Регенеративная медицина - это жизненно важная область, дающая развитие процессу регенерации печени. Печень - один из «волшебных» органов, благодаря своей мощной регенеративной способности (см. Yin L, Wang Y, Guo X, et al. Comparison of gene expression in liver regeneration and hepatocellular carcinoma formation. Cancer Manag Res. 2018;10:5691-5708. https://doi.org/10.2147/CMAR.S172945). Будучи единственным висцеральным органом, который может восстановить свою первоначальную массу за счет компенсаторного роста после частичной гепатэктомии (PH) или воздействия токсинов, регенерация печени привлекает исследователей в двух основных аспектах: 1) биология регенерации печени, 2) применение в лечении болезни печени человека. В обоих аспектах были достигнуты огромные достижения, которые были рассмотрены во многих обзорах (см. Liu M., Chen P. Proliferationinhibiting pathways in liver regeneration (review). Mol. Med. Rep. 2017; 16: 23-35. https://doi.org/10.3892/mmr.2017.6613; см. Michalopoulos GK. Hepatostat: liver regeneration and normal liver tissue maintenance. Hepatology. 2017;65:1384-1392. https://doi.org/10.1002/hep.28988; см. Abu Rmilah A., Zhou W., Nelson E., Lin L., Amiot B., Nyberg SL. Understanding the marvels behind liver regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2019;8:e340. https://doi.org/10.1002/wdev.340; см. Gao C., Peng J. All routes lead to Rome: multifaceted origin of hepatocytes during liver regeneration. Cell regeneration (London, England). 2021;10(1):2. https://doi.org/10.1186/s13619-020-00063-3).
Печень, в основном, состоит из гепатоцитов и нормализует различные метаболические процессы, от углеводов до липидов (см. Yin L., Wang Y., Guo X., et al. Comparison of gene expression in liver regeneration and hepatocellular carcinoma formation. Cancer Manag Res. 2018;10:5691-5708. https://doi.org/10.2147/CMAR.S172945; см. Valizadeh A., Majidinia M., Samadi Kafil H., et al. The roles of signaling pathways in liver repair and regeneration. J Cell Physiol. 2019; 234:14966-14974. https://doi.org/10.1002/jcp.28336.). Несколько факторов могут вызвать повреждение печени, например, случайное или преднамеренное проглатывание токсинов, хирургическое вмешательство или процессы трансплантации (см. Clemens MM., McGill MR., Apte U. Mechanisms and biomarkers of liver regeneration after drug-induced liver injury. Adv Pharmacol 2019; 85:241-262. https://doi.org/10.1016/bs.apha.2019.03.001.). Известно, что печень обладает высокой способностью к регенерации поврежденных тканей по сравнению с другими органами в организме (см. Kojima H., Nakamura K., Kupiec-Weglinski JW. Therapeutic targets for liver regeneration after acute severe injury: a preclinical overview. Expert Opin Ther Targets. 2020; 24:13-24. https://doi.org/10.1080/14728222.2020.1712361). Кроме того, регенеративная медицина как одна из междисциплинарных областей трансляционной науки, привлекающая внимание мирового исследовательского сообщества, использует методы тканевой инженерии и терапии стволовыми клетками для замены поврежденного органа искусственным органом, который находится в прямой связи с иммунной системой (см. Sergeeva O., Sviridov E., Zatsepin T. Noncoding RNA in liver regeneration-from molecular mechanisms to clinical implications. Semin Liver Dis. 2020;40:070-083. https://doi.org/10.1055/s-0039-1693513).
В различных оригинальных или обзорных статьях молекулярные и функциональные механизмы были подробно исследованы на экспериментальных моделях (например, крысах и мышах) и клинических исследованиях для выявления важных генов и сигнальных путей, участвующих в регенерации печени (см. Kojima H., Nakamura K., Kupiec-Weglinski JW. Therapeutic targets for liver regeneration after acute severe injury: a preclinical overview. Expert Opin Ther Targets. 2020; 24:13-24. https://doi.org/10.1080/14728222.2020.1712361).
Процессы развития, восстановления и регенерации печени жизненно важны и сложны и, несомненно, заслуживают изучения молекулярных механизмов и эпигенетики (см. Hyslip J., Martins P. Liver repair and regeneration in transplant: state of the art. Curr Transplant Rep. 2020;1-9. https://doi.org/10.1007/s40472-020-00269-z; см. Macchi F., Sadler KC. Unraveling the epigenetic basis of liver development, regeneration and disease. Trends Genet 2020; 36:587-597. https://doi.org/10.1016/j.tig.2020.05.002.). Кроме того, необходимо использование различных терапевтических средств, так для регенерации печени, включают циклоспорин А, трийодтиронин, инфузию мезенхимальных стволовых клеток, трансформирующий фактор роста β (TGF-β), интерлейкин (IL) -1, ядерный фактор κB (NF-κB), фактор некроза опухоли α (TNF-α), IL-6, глутамин и аминокислоты с имитирующими и ингибирующими эффектами (см. Hyslip J., Martins P. Liver repair and regeneration in transplant: state of the art. Curr Transplant Rep. 2020;1-9. https://doi.org/10.1016/j.tig.2020.05.002.). Несмотря на высокую способность к регенерации, печень может поражаться тяжелыми и запущенными заболеваниями печени. Иногда это можно исправить с помощью регенерации печени, управляемой клетками-предшественниками, однако этот подход может оказаться бесполезным в прогрессивных условиях и требует тщательного рассмотрения для будущего проектирования и разработки тактики (см. So J., Kim A., Lee SH., et al. Liver progenitor cell-driven liver regeneration. Exp Mol Med 2020; 52: 1230-1238. https://doi.org/10.1038/s12276-020-0483-0).
Стоит отметить, что сложный процесс регенерации печени состоит из трех фаз: фазы прайминга, пролиферации и терминации (см. Tao Y., Wang M., Chen E., et al. Liver regeneration: analysis of the main relevant signaling molecules. Mediators Inflamm. 2017; 2017: 4256352. https://doi.org/10.1155/2017/4256352.). На стадии прайминга задействованы основные пути, связанные с цитокинами, такие как TNF-α и IL-6. На стадии пролиферации значительную роль могут играть полные митогены эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста α (TGF-α) и гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF). Между тем окончательный процесс регенерации печени остается неясным. Однако некоторые исследования показали, что членов семейства TGF-β, таких как TGF-β1, достаточно для прекращения регенерации печени через 48 часов после частичной гепатэктомии (около двух третей печени) (см. Еda S., Yamanoi A., Hishikawa Y., et al. Transforming growth factor-β1 released from the spleen exerts a growth inhibitory effect on liver regeneration in rats. Lab Invest 2003; 83:1595-1603.https://doi.org/10.1097/01.lab.0000095686.10639.c8).
Этого периода может быть достаточно для получения информации, позволяющей понять процесс регенерации печени при анализе временных рядов. Более того, ранняя фаза пролиферации регенерации печени имеет решающее значение для улавливания значимых транскриптомных сигнатур (см. Colak D., Al-Harazi O., Mustafa OM., et al. RNA-Seq transcriptome profiling in three liver regeneration models in rats: comparative analysis of partial hepatectomy, ALLPS, and PVL. Sci Rep. 2020; 10: 1-15. https://doi.org/10.1038/s41598-020-61826-1.).
Как сложный биологический процесс, регенерация печени требует дополнительных клинических и экспериментальных исследований, чтобы понять различные биологические и молекулярные аспекты этого процесса в течение длительного времени (см. Asnaashari S., Amjad E., Sokouti B. A comprehensive investigation on liver regeneration: a meta-analysis and systems biology approach. Clinical and experimental hepatology. 2021; 7(2): 183-190. https://doi.org/10.5114/ceh.2021.107564).
Одним из методов лечения, который может быть клинически применен для успешной хирургии печени, является терапия тромбоцитами (например, агонисты рецепторов тромбопоэтина, искусственные тромбоциты (см. Karagiannis P., Eto K. Manipulating megakaryocytes to manufacture platelets ex vivo. J Thromb Haemost. 2015; 13(1):S47-53.  https://doi.org/10.1111/jth.12946.) и лиофилизированные тромбоциты (см. Horimizu M., Kawase T., Nakajima Y., et al. An improved freeze-dried PRP-coated biodegradable material suitable for connective tissue regenerative therapy. Cryobiology. 2013; 66: 223-232. https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2013.01.006). Он играет положительную защитную роль для гепатоцитов, что способствует регенерации печени (см. Takahashi K., Liang C., Oda T., et al. Platelet and liver regeneration after liver surgery. Surg Today. 2020; 50: 974-983. https://doi.org/10.1007/s00595-019-01890-х). Наконец, хотя генная терапия путем активации аутофагии с использованием трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) может способствовать регенерации печени, подавление аутофагии может привести к функциональной недостаточности печени (см. Amiri F., Molaei S., Bahadori M., et al. Autophagy-modulated human bone marrow-derived mesenchymal stem cells accelerate liver restoration in mouse models of acute liver failure. Iran Biomed J. 2016; 20: 135-144. https://doi.org/10.7508/ibj.2016.03.002).
Печень обладает уникальной способностью возвращаться к стандартным размерам в течение короткого периода времени после травмы или частичной гепатэктомии (PH). Ранее было показано, что прогрессирование заболеваний печени зависит от повторяющихся раундов апоптоза и пролиферации гепатоцитов (см. Chen Y., Xu Z., Zeng Y., Liu J., Wang X., Kang Y. Altered metabolism by autophagy defection affect liver regeneration. PloSone. 2021; 16(4): e0250578. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250578).
Регенерация печени после резекции является многостадийным процессом, который включают в себя активацию цитокинов, факторов роста и метаболических сетей. Активация инициирующих факторов приводит к синтезу ДНК, репликации клеток и увеличению размера клеток в процессе регенерации печени (см. Mao SA., Glorioso JM., Nyberg SL. Liver regeneration. Transl Res. 2014;163(4):352-62. https://doi.org/10.1016/j.trsl.2014.01.005). Эти инициирующие факторы также позволяют печени поддерживать свои основные метаболические функции в течение нескольких дней после резекции (Michalopoulos GK. Advances in liver regeneration. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2014;8(8):897-907. https://doi.org/10.1586/17474124.2014.934358).
Для изучения процесса регенерации печени применялись различные подходы. Первый и самый радикальный подход - резекция части (до 70%) долей печени (см. Friederike Böhm, Ulrike A. Köhler, Tobias Speicher, Sabine Werner. Regulation of liver regeneration by growth factors and cytokines. EMBO Mol Med. 2010; 2(8): 294-305. https://doi.org/0.1002/emmm.201000085). Способность регенерации печени после резекции (частичная гепатэктомия) является предпосылкой для трансплантации печени. Этот подход хорошо зарекомендовал себя на людях, крысах, мышах и рыбках данио. Основным препятствием для этого подхода является проблема остановки кровотечения после операции (см. Ce Gao, Jinrong Peng. All routes lead to Rome: multifaceted origin of hepatocytes during liver regeneration.Cell Regen. 2021;10:2. https://doi.org/10.1186/s13619-020-00063-3.). Второй подход - использовать химические вещества, чтобы вызвать повреждение печени или убить гепатоциты, а затем следить за процессом регенерации печени.
Модели на животных обеспечивают стабильные и воспроизводимые экспериментальные конструкции, которые успешно отражают аналогии с людьми и используются с момента первой публикации Higgins G, Anderson R. в 1931 году (см. Higgins G., Anderson R. Experimental pathology of liver: restoration of liver in white rat following partial surgical removal. AMA Arch Pathol. 1931;12:186-202; см. Forbes SJ., Newsome PN. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2016;13:473-485. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2016.97; см. Nevzorova YA., Tolba R., Trautwein C., Liedtke C. Partial hepatectomy in mice. Lab Anim. 2015;49:81-88. https://doi.org/10.1177/0023677215572000; см. Сидоренко Ю.С., Франциянц Е.М., Комарова Е.Ф., Погорелова Ю.А., Шихлярова А.И. Способ получения экспериментальных злокачественных опухолей легких. Патент на изобретение RU 2375758 C1, 10.12.2009; см. Гаркави Л.Х., Шихлярова А.И., Марьяновская Г.Я., Барсукова Л.П., Коробейникова Е.П., Серебрякова Т.П., Кузьмина Н.М., Верховцева А.И. Способ комбинированного лечения злокачественных опухолей. Патент на изобретение RU 2175564 C2, 10.11.2001; см. Сидоренко Ю.С., Горошинская И.А., Владимирова Л.Ю., Нескубина И.В., Немашкалова Л.А., Шалашная Е.В. Способ определения распространенности патологического процесса при онкологических заболеваниях. Патент на изобретение RU 2241987 C2, 10.12.2004). С тех пор описанная модель на крысах была очень хорошо задокументирована и теперь служит основным методом исследования регенерирующей печени. Эти модели способствовали многим открытиям, которые подняли новые вопросы, новые ответы и потребности в экспериментальных условиях.
На сегодняшний день общепринято, что «компенсаторная гиперплазия» - это термин, который более точно описывает то, что мы называем «регенерацией печени». Размер печени регулируется гепатостатом, где строго поддерживается пропорция, близкая к 3% массы тела млекопитающих (см. B. Delgado-Coello Coello. Liver regeneration observed across the different classes of vertebrates from an evolutionary perspective. Heliyon. 2021; 7(3): e06449 https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e06449.).
Таким образом, когда происходит потеря массы печени, все типы клеток меняют свою стадию покоя на активную стадию, что дает им возможность делиться и восстанавливать размер печени, хотя исходная структура, состоящая из разных долей, не восстанавливается. Также очевидно, что компенсаторная гиперплазия полностью отличается от регенерации у животных, потерявших конечность. Тем не менее, термин «регенерация печени» исторически используется в литературе (см. B. Delgado-Coello Coello. Liver regeneration observed across the different classes of vertebrates from an evolutionary perspective. Heliyon. 2021; 7(3):e06449 https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e06449).
Известен «Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте» (см. патент на изобретение RU 2232550 С2, опубл. 20.07.204, Бюл. № 20). В данном решении проводят предварительную ксенотрансплантацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 часов до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции 90% печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки. Недостатками данного метода являются сложность технического выполнения и высокая вероятность развития осложнений при ксенотрансплантации. Кроме того, 100% летальность крыс контрольной группы затрудняет проведение эксперимента из-за невозможности сравнения показателей в опытной и контрольной группах животных. По данным большинства исследователей наиболее оптимальной для изучения регенерации печени у крыс является резекция 70% органа.
Современные методы стимуляции регенерации резецированной печени должны быть направлены не только на усиление пролиферации гепатоцитов, но и восстановление функции органа в целом. Быстрый рост гепатоцеллюлярных элементов нарушает образование структур печени. Исходом участков с избыточным скоплением печеночных клеток, с отсутствием или недостаточностью микроциркуляторного русла является некроз. Однако большинство исследований носят кратковременный характер, что не позволяет проследить факт восстановления структуры и функции печени.
Митохондрии десятилетиями изучались с точки зрения метаболизма и образования АТФ. Однако в последние годы митохондриальная динамика и ее влияние на биоэнергетику и клеточный гомеостаз также стали оценены. Митохондрии проходят регулярные циклы слияния и деления, регулируемые различными сигналами, включая потребности клетки в энергии и патофизиологические стимулы, и обнаруживается сеть критических белков и мембранных липидов, участвующих в митохондриальной динамике. Гепатоциты - это клетки с высоким уровнем метаболизма, которые имеют большое количество митохондрий, что предполагает биологически значимую роль митохондриальной динамики в повреждении и восстановлении гепатоцитов. Основываясь на текущей информации, очевидно, что изменения в слиянии и делении митохондрий являются отличительными признаками патофизиологии печени. Эти изменения в митохондриальной динамике влияют на множественные связанные митохондриальные реакции, такие как митофагия и митохондриальный биогенез, которые являются важными адаптивными ответами, способствующими восстановлению печени. Текущее внимание к характеристике молекулярных механизмов митохондриальной динамики имеет огромное значение для патофизиологии печени и может дать существенное понимание механизмов восстановления и регенерации печени (см. Ramachandran A., Umbaugh D. S., Jaeschke H. Mitochondrial Dynamics in Drug-Induced Liver Injury. Livers. 2021; 1(3),102-115. https://doi.org/10.3390/livers1030010).
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа стимуляции регенерации печени у крыс за счёт трансплантации митохондрий, выделенных из печени интактных крыс.
Поставленная цель достигается тем, что крысам сначала удаляют левую долю печени и через 24 часа животным внутрибрюшинно на протяжении двух недель по схеме: 5 дней введения - 2 дня перерыв, вводят свежевыделенные митохондрии из печени интактных крыс из расчета 11,4 мг белка в 0,5 мл физиологического раствора на 1 животное.
Изобретение «Способ стимуляции регенерации печени у крыс» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальной онкологии для ускорения процесса компенсаторной гиперплазии (регенерации) печени после удаления ее левой доли.
Новизна изобретения заключается в том, что для реализации эффекта используют митохондрии, выделенные из печени интактных крыс, и вводят их через прокол в брюшную полость оперированным крысам по схеме: пять дней введения - 2 дня перерыв.
Для лучшего понимания способа предлагаем фигуры.
Фигура 1. Фрагмент культи резецированной доли печени крысы под влиянием МХТ: а ,б - выраженное гипертрофическое изменение капсулы культи с формированием волокон молодой соединительной ткани и наполнением клеточными компонентами гистиоцитарного, эндотелиального, лимфо- и моноцитарного типа; в, г - активация процессов неоангиогенеза с формированием кровеносных сосудов разного диаметра, заполненных клеточными элементами крови; д - формирование печеночных балок, разделенных синусами с обильным кровонаполнением; е - ускорение биогенеза культи печени с полноценной структурой долек печени (центральная вена и окружающая система портальных трактов).Окраска гематоксилин-эозином. Ув.х 5, х10, х100.
Фигура 2. Фрагмент культи резецированной доли печени крысы в контроле (без применения МХТ): а, б - истонченная структура капсулы культи печени с небольшими участками фиброзирования слоистого типа; а, г - присутствие «светлоклеточных фокусов», свидетельствующих о фокальном накоплении гликогена в гепатоцитах; в, г - участки перипортального фиброза вокруг и внутри крупных сосудов, опустошенных или заполненных клетками крови на фоне типичной тканевой структуры восстановленной части печени.  Окраска гематоксилин-эозином. Ув.х 5, х10.
Изобретение «Способ стимуляции регенерации печени у крыс» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для ускорения процесса регенерации печени и изучения патогенеза этого процесса.
«Способ стимуляции регенерации печени у крыс» осуществляется следующим образом.
Экспериментальные животные были разделены на следующие группы:
1) группа сравнения - интактные животные (n=10);
2) контрольная группа - резекция печени (n=10);
3) основная группа - резекция печени+митохондрии (n=10).
Белым беспородным крысам-самцам массой 210-220 г. под ксилазолетиловый наркозом - ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем - Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела проводят срединную лапаротомию и выполняют предельно допустимую по объему резекцию левой доли печени, что составляет 70% от массы этого органа и эквивалентно объему данной резекции печени у человека. После наступления медикаментозного сна ассистент фиксирует крысу в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригают, кожу обрабатывают 70% раствором этилового спирта. Экспериментатор в стерильных условиях производит срединную лапаротомию от мечевидного отростка длиной 4 см. Печень мобилизируют посредством пересечения связок. Удаляют левую долю после предварительного лигирования сосудов. Лапаротомное отверстие ушивают после санации брюшной полости и контроля гемостаза послойно, узловым швом и обрабатывает шов 5% спиртовым раствором йода.
На следующий день интактную крысу-донора митохондрий массой 210-220 г умерщвляли декапитацией на гильотине, вскрывали брюшную полость, производили перфузию печени ледяным физиологическим раствором, быстро извлекали и выделяли митохондрии методом ступенчатого центрифугирования.
Выделение митохондрий.
Печень интактной крысы перфузируют ледяным стерильным 0,9% раствором KCl. Митохондрии выделяли с применением дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER, USA по методу Егоровой М.В. и Афанасьева С.А. (см. Егорова М.В., Афанасьев С.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: Современные методические приемы. Сибирский медицинский журнал. 2011;26(1-1):22-28). Для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяли механическую обработку тканей с измельчением ножницами и гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма). На каждый грамм ткани добавляли по 10 мл среды выделения (0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4). Ткани гомогенизировали и центрифугировали первый раз 10 мин при скорости 1000 g, температура 0-2 °С, второе и третье центрифугирование осуществляется при 20000 g, 20 мин, температура 0-2 °С. Между центрифугированием проводили процедуру ресуспендирования осадка митохондрий в среде выделения. Митохондрии дополнительно очищали от лизосом, пероксисом, меланосом и т.п., центрифугируя в 23% градиенте Перколла. Суспензию субклеточных структур наслаивали на градиент Перколла, центрифугировали 15 мин при 21000 g, после этого наблюдалось разделение на 3 фазы, оставляли нижний слой митохондрий и ресуспендировали средой выделения. Следующую промывку митохондрий осуществляли путем центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g, температура 0-2 °С. В митохондриальной фракции определяли уровень белка. Митохондриальные образцы разводили 0,9% раствором NaCl до концентрации белка 11,4 г/л и вводили оперированным крысам основной группы (группа № 3). Такую процедуру проводили в течение 14 суток.
Животным контрольной группы по аналогичной схеме внутрибрюшинно вводили 0,5 мл физиологического раствора.
Судя по значениям весовых показателей печени после проведения митохондриальной терапии (МХТ), масса органа увеличивалась в 1,7 раза (р=0,05) относительно контрольной группы без МХТ (см. Таблица 1).
Таблица 1Средняя масса печени крыс разных групп (М±m)
Группа сравнения(интактные крысы, n=10)
Контрольная группа(резекция печени, n=10)
Основная группа(резекция печени+МХТ, n=10)
Масса печени (г)
11,87±0,309
9,85±0,249
16,93±0,427р<sup>1</sup>=0,0000р<sup>2</sup>=0,0000
Масса культи печени (г)
-
0,896±0,041
2,85±0,185р<sup>2</sup>=0,0000
Масса печени с резекцией доли, без культи (г)
-
8,94±0,200
14,35±0,441р<sup>2</sup>=0,0000
Примечание: р1- статистически значимо по отношению к показателю в группе сравнения; р2 - статистически значимо по отношению к показателю в контрольной группе. МХТ - митохондриальная терапия.
Восстановление массы печени у животных, не получавших МХТ, приближалась к показателям интактных крыс, что соответствует представлениям о поразительной способности к репаративной регенерации после частичной гепатэктомии с удалением как минимум 1/3 печени. Однако, суть нашего эксперимента состояла в доказательстве возможности ускорения стимулирующего влияния МХТ и раскрытию значительных потенциальных возможностей репаративной регенерации, равной которой нет ни в одном органе животных, а также человека.
После резекции доли печени у крыс и последующем введении взвеси живых митохондрий, масса органа превысила в 1,6 раза (р=0,05) показатели животных из группы сравнения, а сама культя печени при МХТ по своей массе превышала в 3,2 раза весовые показатели культи печени у крыс без МХТ. Фактически, такое значительное наращивание массы культи печени под влиянием МХТ за аналогичный период времени регенеративных процессов по сравнению с крысами без МХТ, подтвердило достижение основной цели разработанного нами способа, а именно, ускорения процессов регенерации печени с помощью митохондриальной терапии.
При проведении морфологического контроля процессов стимуляции МХТ-индуцированного регенеративного биогенеза печени у крыс были отмечены существенные изменения прежде всего в капсульной зоне культи. При проведении МХТ эта зона демонстрировала депонирование важнейших клеточных элементов соединительной ткани, включая гистиоциты, лимфоциты, моноциты, фибробласты, эпителиоциты, ретикулоэндотелиальные клетки, необходимых для активного неоангиогенеза, формирования желчных протоков и структуризации печеночной ткани (см. фиг. 1, а-г). Активизация процессов неоангиогенеза хорошо просматривалась в капсульной зоне в виде наличия кровеносных сосудов разного диаметра, заполненных клеточными элементами крови (см. фиг.1 в, г), а также, расширенных кровеносных синусов в печени на участках формирования печеночных балок из гепатоцитов (см. фиг. 1д). Последние происходили не из стволовых клеток, а за счет дифференцированных гепатоцитов, примыкающих к портальным трактам и мигрирующим по направлению к центральным венам. Увеличивалось не только количество гепатоцитов, но и их объём, т.е. гиперплазия сочеталась с гипертрофией. Очевидно, эти два процесса развертываются одновременно и обеспечивают быстрое восстановление утраченной функции органа, поскольку изолированной гиперплазии как правило в норме не наблюдается. В качестве примера регенераторного процесса печени крысы в условиях МХТ при малом увеличении (см. фиг. 1е) продемонстрирована полноценная структурная единица - печеночная долька, включающая центральную вену, затем, перицентральную зону с печеночными балками из гепатоцитов (с функцией метаболизма ксенобиотиков), следующую переходную и перипортальную зону (с функцией синтеза белков). Определялась система портальных трактов с классической триадой - портальная артерия, портальная вена, желчный проток, расположенной по углам шестигранной структуры дольки
При анализе контрольных образцов культи печени (см. фиг. 2) обращало внимание, что на фоне истончения капсулы культи вплоть до участков с полным её отсутствием, встречались небольшие очаговые фиброзированные разрастания соединительнотканных волокон, слоистой структуры (см. фиг. 2 а, б). Различия в общей архитектонике культи печени контрольных животных заключались в наличии «светлоклеточных фокусов», свидетельствующих о фокальном накоплении гликогена в гепатоцитах (см. фиг. 2 а, г). На препаратах печени таких крыс можно было видеть крупные участки перипортального фиброза вокруг и внутри крупных сосудов, опустошенных или заполненных клетками крови (см. фиг. 2 в, г). Наряду с преобладанием структурированной ткани культи печени, сохраняющей дольковую принадлежность центральной вены, радиально сходящихся к ней печеночных балок и портальных триад, выявлялись очаги гиперплазии гепатоцитов с синцитиеподобной формой, что предположительно указывало на включение основного и универсального адаптационного механизмов регенерации, связанного с торможением аутофагических процессов.
Располагая данными световой микроскопии, можно заключить, что резекция доли печени и последующие процессы в печеночной ткани на фоне проведения МХТ приобретают выраженные черты ускорения физиологической регенерации, затрагивающей восстановление стромальных и паренхиматозных составляющих. Визуализированные процессы ускорения неоангиогенеза и образования желчных протоков с параллельным восполнением пула гепатоцитов и формированием генетически закрепленной дольковой структуры печени свидетельствовали о ведущей роли митохондриального компонента как триггерного механизма регенеративных процессов и самоорганизации биосистемы.
Технико-экономическая эффективность способа стимуляции регенерации печени у крыс заключается в том, что введение митохондрий, выделенных их интактной печени, ускоряет процесс регенерации печени после ее резекции. Это дает возможность изучать патогенез данного процесса, что важно для клиники. Способ экономичен, доступен.