Способ моделирования инфицированной раны у крыс на фоне длительно текущего сахарного диабета
METHOD OF SIMULATING AN INFECTED WOUND IN RATS WITH BACKGROUND OF LONG-TERM CURRENT DIABETES MELLITUS

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности хирургии, к средствам, способствующим этиопатогенетическому выяснению закономерностей репаративной регенерации при различных способах лечения на фоне длительно текущего сахарного диабета.
Прогрессивное увеличение числа больных с гнойными осложнениями синдрома диабетической стопы, особенно на фоне длительно текущего сахарного диабета, трудности лечения являются не только медицинской, но и социальной проблемой. Вследствие этого продолжаются экспериментальные работы с целью поиска медикаментозных и немедикаментозных методов коррекции изменений, вызванных сахарным диабетом.
На данный момент имеются воспроизводимые модели трофической язвы. Известен способ моделирования трофической язвы конечности (Патент СССР №1390634, Бюл. №15, 23.04.1988 г.) путем выделения седалищного нерва и помещения его в спираль электрода с дальнейшим проведением его стимуляции электрическим током напряжением 4-6. В течение 1-2 ч с одновременным нарушением кровотока в конечности. Однако в данном способе представлена модель формирования трофической раны на фоне венозной недостаточности, а также для осуществления этого способа требуется специальное оснащение лаборатории, этиология трофической язвы не соответствует венозной.
Наиболее близким к предлагаемому является способ моделирования трофической раны в эксперименте (Патент РФ №2510083, Бюл. №8, 20.03.2014 г.), включающий иссечение кожи в межлопаточной области у крыс до поверхностной фасции в виде круга диаметром 20 мм, после чего по краям раны накладывали кисетный шов, а также кожнофасциальные узловые швы, затем на поверхности дна образованной раны производили рассечение поверхностной фасции поперечными и продольными разрезами с образованием ячеек размером 5×5 мм. Однако данный способ не позволяет говорить о формировании инфицированной раны на фоне длительно текущего сахарного диабета.
Задача предлагаемого способа: моделирование инфицированной раны на фоне длительно текущего сахарного диабета в эксперименте для дальнейшей возможности этиопатогенетического выяснения закономерностей репаративной регенерации при различных способах лечения.
Поставленную задачу осуществляют за счет того, что в эксперимент были введены крысы в количестве 120 штук, самцы популяции линии Wistar массой 180,0-200,0 г, возрастом- 4 месяцев. Крысы были распределены в три группы по 40 крыс в каждой: первая группа - крысы без сахарного диабета; вторая группа крыс, которым натощак, после 24 часового голодания формировали аллоксан-ремаксол индуцированный сахарный диабет (СД), который вызывали интраперитонеальным введением 5% аллоксана в дозе 200 мг/кг (40 мг), через 15 минут интраперитониальным введением гепатопротектора ремаксола 13 мл/кг (2,5 мл), обладающего детоксицирующим действием; третья группа - крысы, которым после 24 часового голодания формировали аллоксан индуцированный сахарный диабет (СД), который вызывали интраперитонеальным введением 5% аллоксана в дозе 200 мг/кг (40 мг).
Аллоксановая модель сахарного диабета является одной из самых распространенных и изученных. Она активно применяется исследователями по всему миру. Аллоксан является структурным аналогом глюкозы, за счет чего он накапливается в В-клетках поджелудочной железы и приводит к их гибели с последующим развитием диабета. При этом поражению В-клеток сопутствуют дегенеративные изменения в почках и печени, что обуславливает высокую смертность лабораторных животных в первые сутки после введения аллоксана. Проблема нарушений нескольких видов обмена при введении аллоксана, превалирование проявлений оксидативного стресса как типового патологического процесса при поражении ключевого органа, участвующего во всех видах обменных процессов (печень) диктуют необходимость назначения патогенетических лекарственных средств из группы метаболических корректоров с гепатопротективной и антиоксидантной направленностью. Одним из перспективных препаратов в этой области является ремаксол (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург) - сбалансированный инфузионный раствор, обладающий гепатопротекторным действием. Под действием ремаксола ускоряется переход анаэробных процессов в аэробные, улучшается энергетическое обеспечение гепатоцитов, увеличивается синтез макроэргов, повышается устойчивость мембран клеток печени к повреждению продуктами перекисного окисления липидов, восстанавливается активность ферментов антиоксидантной защиты. Препарат уменьшает проявления цитолиза, что проявляется в снижении индикаторных ферментов и билирубина, улучшает экскрецию прямого билирубина в желчь. Ремаксол способствует уменьшению проявлений холестаза, о чем свидетельствуют снижение активности экскреторных ферментов гепатоцитов (щелочной фосфатазы и гаммаглюта-милтранспепти дазы).
Использование ремаксола является новым в подобных исследованиях.
С помощью ремаксола удалось сформировать картину длительно текущего сахарного диабета. И продлить жизнь животным на необходимый срок для получения заявленных результатов эксперимента и его завершения.
Животные находились в одинаковых условиях проживания, получали одинаковое питание. За животными наблюдали в течение 93 дней. Так в первой группе крыс без сахарного диабета выжило 38 крыс (в связи с адаптацией в новых условиях), во второй группе выжило 30 крыс, а в третьей - 23 крысы. У крыс второй группы через 93 дня были полностью купированы токсическое проявления (в виде резкого увеличения суточного потребления воды (более 120 мл), полифагией, полиурией, гипергликемией, резкой потери в весе, выпадении волосяного покрова) за счет антиоксидантного и гепатопротективного действия ремаксола. Тем временем как у крыс в третьей группе эти токсические проявления наблюдались на всем протяжении эксперимента, которые и обусловили в дальнейшем высокую гибель животных в этой группе. При анализе токсических явлений в виде потере веса крыс следует, что у крыс в первой группе статистически значимого снижения веса в течение трех месяцев не наблюдалось, во второй группе животных средние показатели веса также не имели тенденции к резкому снижению, тем временем как у крыс в третьей группе средний вес животных к концу третьего месяца наблюдения снизился в среднем на 40% от исходного и значительно был ниже чем у животных в первой и второй исследуемых группах (Табл. 1).
За это время у крыс из второй и третьей группы был сформирован сахарный диабет. Ежедневно утром натощак крысам второй и третьей группы брали венозную кровь из хвостовой вены, средние показатели глюкозы крови крыс в течение 3 месяцев во второй группе составили 7,3 мкмоль/л, в третьей-7,9 мкмоль/л, что доказывает сформированный длительно текущий сахарный диабет. Регистрацию уровня глюкозы в крови у крыс второй и третей группы осуществляли глюкометром Ascensia Entrust фирмы Bayer
В дальнейшем крысам всех трех групп формировали инфицированную рану, следующим образом. За 15 минут до операции с целью премедикации экспериментальным животным вводили атропина сульфат в дозе 0,05 мг/кг подкожно. Далее, в стерильных условиях, под эфирным наркозом, на выбритом от шерсти участке кожи в межлопаточной области выполняли иссечения кожи до поверхностной фасции в виде круга диаметром 40 мм, на поверхности дна образованной раны выполняли рассечение поверхностной фасции поперечными и продольными взаимно перпендикулярными разрезами (Фиг. 1). По краям раны накладывали кисетный шов, стягивали, доводя рану в диаметре до 20 мм. В целях удержания краев раны и предотвращения их сближения накладывали кожнофасциальные узловые швы (Фиг. 2). Далее выполняли контроль на гемостаз. Затем в рану вносили марлевый тампон с взвесью суточной культуры полиантибиотикорезистентного клинического штамма золотистого стафилококка в дозе 2 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора (Фиг. 3). Накладывали асептическую повязку.
На 8-12 сутки со дня операции у крыс во всех трех группах отмечается отек исследуемой области, рана со скудным фибринозно-гнойным отделяемым, дно раны покрыто участками фибрина, вялыми грануляциями, кожа вокруг раны отечна, несколько гиперемирована (Фиг. 4), что свидетельствует о формировании инфицированной раны. При этом у крыс во второй группе, вследствие поражения сосудов микроциркуляторного русла одновременно с задержкой созревания соединительной ткани в дальнейшем замедлились процессы формирования и роста грануляций, тормозилась эпителизация раневого дефекта, что приводило к удлинению сроков полного заживления до 25-30 дней по сравнению с крысами из первой группы без сахарного диабета, у которых рана эпителизировалась в среднем к 18 суткам, а в 3 группе крыс с сахарным диабетом, индуцированным аллоксаном, заживление раневого дефекта наступило позднее 45 суток, что говорит о более выраженной интоксикации организма данной группы животных (Табл.1).
Динамику заживления ран вычисляли по формуле Поповой Л.Н., основанной на регистрации скорости уменьшения раневой поверхности во времени, результаты планиметрии фиксировали на 3, 9, 18, 27, 36 и 45 сутки. Измерения повторяют через равные промежутки времени у всех животных, а затем вычисляют процент уменьшения площади раневой поверхности за сутки по отношению к предыдущему результату по формуле:
2
Где ΔS искомая величина в см;
2
S - величина площади раны при предшествующем измерении в см;
n
2
S - величина площади раны в настоящий момент в см;
t - число дней между измерениями (Кузин М.И. Раны и раневая инфекция. М. Медицина, 1990, с. 258).
Предлагаемый способ позволяет моделировать инфицированную рану на фоне длительно текущего сахарного диабета в эксперименте со всеми характерными для нее признаками.
Заявленным способом были смоделированы инфицированные раны на экспериментальных животных (крысы популяции линии Wistar) и во всех случаях достигнут указанный экспериментальный результат. Животные были выведены из эксперимента спустя 7 месяцев после начала эксперимента с помощью ингаляций эфирным наркозом.
В доступных источниках научно-медицинской и патентной информации авторами не был найден тождественный способ моделирования инфицированной раны на фоне длительно текущего сахарного диабета в эксперименте. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию "Новизна".
Исследованиями авторов доказано, что предлагаемый способ моделирования инфицированной раны на фоне сахарного диабета в эксперименте повышает точность модели за счет ухудшения иннервации на фоне сахарного диабета, учитывает наличие локальной гипоксии и нарушение микроциркуляции. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию "Изобретательский уровень".
Экспериментальный пример 1. Половозрелому самцу крысы популяции линии Wistar массой 200,0 г, возраста 4 месяца, была сформирована инфицированная рана после 93 дней наблюдения. Рану формировали следующим образом: за 15 минут до операции с целью премедикации вводили атропина сульфат в дозе 0,05 мг/кг подкожно. После предварительной обработки кожи в асептических условиях под эфирным наркозом на выбритом от шерсти участке в межлопаточной области выполняли иссечения кожи до поверхностной фасции в виде круга диаметром 40 мм. На поверхности дна образованной раны выполняли рассечение поверхностной фасции поперечными и продольными, взаимно перпендикулярными разрезами. По краям раны накладывали кисетный шов для создания картины нарушения микроциркуляции, стягивали, доводя рану в диаметре до 20 мм. В целях удержания краев раны и предотвращения их сближения накладывали кожнофасциальные узловые швы. Далее выполняли контроль на гемостаз. Затем в рану вносили марлевый тампон с взвесью суточной культуры полиантибиотикорезистентного клинического штамма золотистого стафилококка в дозе 2 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Наложили асептическую повязку. Смену асептической повязки проводили через день. Через 2 недели была сформирована инфицированная рана. Заживление раны наступило на 18 сутки после ее формирования. Крыса выведена из эксперимента спустя 7 месяцев после наблюдения с помощью ингаляций эфирным наркозом.
Экспериментальный пример 2. Половозрелому самцу крысы популяции линии Wistar массой 200,0 г, возраста 4 месяца сформирован длительно текущий аллоксан-ремаксол индуцированный сахарный диабет.
Натощак, после 24 часового голодания интраперитонеально вводили 5% аллоксана в дозе в дозе 200 мг/кг (40 мг) мг с последующим (через 15 минут) введением ремаксола 13 мл/кг (2,5 мл) (так же интраперитониально) Средние показатели глюкозы крови крысы в течение 3 месяцев составили 7,3 мкмоль/л.
Через 93 дня после введения аллоксана и ремаксола, а также после исчезновения признаков интоксикации в виде резкого увеличения суточного потребления воды (более 120 мл), полифагией, полиурией, гипергликемией, резкой потери в весе, выпадении волосяного покрова, крысам формировали инфицированную рану. За 15 минут до операции с целью премедикации вводили атропина сульфат в дозе 0,05 мг/кг подкожно. После предварительной обработки кожи в асептических условиях под эфирным наркозом на выбритом от шерсти участке в межлопаточной области выполняли иссечения кожи до поверхностной фасции в виде круга диаметром 40 мм. На поверхности дна образованной раны выполняли рассечение поверхностной фасции поперечными и продольными, взаимно перпендикулярными разрезами. По краям раны накладывали кисетный шов для создания картины нарушения микроциркуляции, стягивали, доводя рану в диаметре до 20 мм.В целях удержания краев раны и предотвращения их сближения накладывали кожнофасциальные узловые швы. Далее выполняли контроль на гемостаз. Затем в рану вносили марлевый тампон с взвесью суточной культуры полиантибиотикорезистентного клинического штамма золотистого стафилококка в дозе 2 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Наложили асептическую повязку. Смену асептической повязки проводили через день. Через 2 недели была сформирована инфицированная рана на фоне длительно текущего сахарного диабета. Заживление раны наступило на 27 сутки после ее формирования. Крыса выведена из эксперимента спустя 7 месяцев после формирования сахарного диабета с помощью ингаляций эфирным наркозом.
Экспериментальный пример 3. Половозрелому самцу крысы популяции линии Wistar массой 200,0 г, возраста 4 месяца сформирован длительно текущий аллоксан индуцированный сахарный диабет.
Натощак, после 24 часового голодания интраперитонеально вводили 5% аллоксана в дозе в дозе 200 мг/кг (40 мг) мг. Средние показатели глюкозы крови крысы в течение 3 месяцев составили 8,1 мкмоль/л.
В течение трех месяцев общее состояние животного ухудшалось: резко увеличилось суточного потребления воды (около 150 мл), наблюдалась полифагия, полиурия, гипергликемия, резкая потеря в весе до 120 гр, выпадение волосяного покрова. Через 93 дня после введения аллоксана формировали инфицированную рану. За 15 минут до операции с целью премедикации вводили атропина сульфат в дозе 0,05 мг/кг подкожно. После предварительной обработки кожи в асептических условиях под эфирным наркозом на выбритом от шерсти участке в межлопаточной области выполняли иссечения кожи до поверхностной фасции в виде круга диаметром 40 мм. На поверхности дна образованной раны выполняли рассечение поверхностной фасции поперечными и продольными, взаимно перпендикулярными разрезами. По краям раны накладывали кисетный шов для создания картины нарушения микроциркуляции, стягивали, доводя рану в диаметре до 20 мм. В целях удержания краев раны и предотвращения их сближения накладывали кожнофасциальные узловые швы. Далее выполняли контроль на гемостаз. Затем в рану вносили марлевый тампон с взвесью суточной культуры полиантибиотикорезистентного клинического штамма золотистого стафилококка в дозе 2 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Наложили асептическую повязку. Смену асептической повязки проводили через день. Через 7 дней крыса погибла.
Предлагаемый способ позволил получить инфицированную рану на фоне длительно текущего сахарного диабета в эксперименте со всеми характерными для нее признаками: скудное фибринозно-гнойное отделяемым из раны, дно раны покрыто участками фибрина, вялыми грануляциями; кожа вокруг раны отечна, несколько гиперемирована.
Способ прост, эффективен, доступен, четко выполняет поставленную задачу, не требует дорогостоящего специального оборудования и может широко применяться в научно-исследовательских работах для возможности дальнейшего этиопатогенетического выяснения закономерностей репаративной регенерации инфицированных ран на фоне длительно текущего сахарного диабета при различных способах лечения.