Влияние углеродного наноструктурного материала на фертильность пыльцы высших цветковых растений

УДК 58

ВЛИЯНИЕ УГЛЕРОДНОГО НАНОСТРУКТУРНОГО МАТЕРИАЛА НА ФЕРТИЛЬНОСТЬ ПЫЛЬЦЫ ВЫСШИХ ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЙ

© Л.Ф. Яндовка, А.А. Гусев, А.Г. Ткачев

Ключевые слова: фертильность пыльцы; углеродный наноматериал «Таунит»; Cerasus fruticosa; C. Vulgaris; C. Avium; Microcerasus tomentosa; Amygdalus nana.

Изучена фертильность пыльцевых зерен растений Cerasus fruticosa, C. vulgaris, C. avium, Microcerasus tomentosa и Amygdalus nana после однократной обработки коллоидным водным раствором УНМ «Таунит» разных концентраций в период микроспорогенеза. В большинстве случаев фертильность пыльцы после воздействия УНМ «Таунит» понижается. Варианты концентрации «Таунита», после которых происходит существенное снижение процента морфологически сформированной пыльцы, у видов различаются.

Распространение и внедрение наноматериалов во многие сферы жизни в последнее время является нарастающим процессом. Ряд ученых считает эти субстанции вполне безопасными, однако другие настаивают, что проводимая оценка экологической и медицинской безопасности наноматериалов явно недостаточна [1-4]. Особое внимание проблеме безопасности наночастиц уделяется и официальными органами - в 2007 г. вступило в силу постановление Главного государственного санитарного врача РФ «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов», в котором говорится: «...наноматериалы могут обладать совершенно иными физико-химическими свойствами и биологическим (в том числе токсическим) действием, чем вещества в обычном физико-химическом состоянии, в связи с чем они относятся к новым видам материалов и продукции, характеристика потенциального риска которых для здоровья человека и состояния среды обитания во всех случаях является обязательной» [5].

Углеродные нанотрубки, открытые в 1991, являясь одним из самых перспективных наноматериалов [6], тем не менее также являются источником экологического риска [7]. В Тамбовском государственном университете им. Г.Р. Державина на базе специализированной лаборатории проводится комплексная экологическая оценка углеродного наноматериала «Таунит» (УНМ «Таунит»), промышленно производимого ООО «НаноТехЦентр», г. Тамбов. Этот материал представляет собой наномасштабные нитевидные образования поликристаллического графита цилиндрической формы с внутренним каналом (многостенные углеродные нанотрубки (Multi Walled Carbon Nano Tubes, MWCNT)).

Общеизвестно, что наиболее уязвимым органом любого растения к факторам среды является цветок со всеми его элементами. Т.Б. Батыгина [8] в монографии отмечает, что любые факторы среды больше всего влияют на развитие генеративных органов (тычинка, пестик); при неблагоприятных условиях этот процесс

нарушается, что снижает продуктивность растения и фактически определяет урожай. Исследования реакции репродуктивных структур растений видов Cerasus, Microcerasus и Amygdalus на воздействия экологических факторов в литературе не получили достаточного развития. Одни авторы [9] считают, что на фертильность пыльцы влияет физиологическое состояние растений; другие авторы [10, 11] выделяют влияние двух факторов (условия года и генотип) на фертильность пыльцы; третьи авторы считают, что на жизнеспособность пыльцы плодовых растений существенное влияние оказывает агротехника выращивания [12]. Установлено неблагоприятное влияние температурного стресса на процесс формирования пыльцевых зерен [12, 13].

Исследования реакции репродуктивных структур плодовых растений на воздействия наноматериалов в литературе еще не получили развития. В связи с этим целесообразным представляется исследование влияния углеродного наноматериала «Таунит» на формирование андроцея. Разработка этого вопроса может помочь в решении ряда вопросов генетико-селекционной работы и экологической безопасности высокотехнологичных производств.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объектом исследования были выбраны многолетние косточковые растения, относящиеся, согласно Н.Н. Цвелеву [14], к трем родам - Cerasus Mill. (Cerasus fruticosa - вишня степная, C. vulgaris - вишня обыкновенная (сорт Владимирская), C. avium - черешня (сорт Итальянка)), Microcerasus M. Roem. (M. tomen-tosa - вишня войлочная) и Amygdalus (Amygdalus nana -миндаль низкий). По 10 побегов из разных ярусов кроны исследуемых растений обрабатывали однократно коллоидным водным раствором УНМ «Таунит» в различных концентрациях в один из периодов формирования пыльников (по классификации О.П. Камели-ной, [15]) - микроспорогенез в материнских клетках микроспор (апрель). Затем изучали фертильность зрелой

Taблицa 1

Фертильность пыльцы видов Cerasus, Microcerasus и Amygdalus после однократной обработки побегов углеродным наноматериалом «Taунит» в период микроспорогенеза

Объект исследо- вания Вариант опыта (концентрация УНМ, %) Ацетокарминовый метод Проращивание на искусственной питательной среде. Пыльцевых зерен

Пыльцевых зе] ен

всего, шт. % окрашенных ± m крупных, % средних, % мелких, % всего просмотрено, шт. проросших пыльцевыми трубками длинными и средней длины, % і m

Cerasus fruticosa контроль 22G 1GG,GG і G 1,3б 78,29 2G,35 272 13,22 і 2,G

0,1 248 47,98 і 3,1 G 2G,18 79,82 288 8,33 і 1,б

0,05 28G 31,43 і 2,7 G 47,87 52,13 332 13,25 і 1,8

0,025 3GG 1б,б7 і 2,1 G 48,27 51,73 413 8,47 і 1,3

0,01 28G 5G,GG і 2,9 G 27,14 72,8б 395 8,35 і 1,4

0,005 32G 87,5G і 1,8 G 28,57 71,43 26G 9,23 і 1,7

0,002 213 9б,33 і 1,2 1,4G 5G,G7 49,93 217 12,9G і 2,2

0,001 244 9б,б7 і 1,1 G 5G,GG 5G,GG 291 15,4б і 2,1

0,0005 295 5G,23 і 2,9 1G,33 б1,б7 28,GG 3GG 22,б7 і 2,4

0,0001 36G 5G,GG і 2,б 1G,GG б2,22 27,78 217 19,35 і 2,б

Cerasus avium контроль 4GG 1GG,GG і G 2,5G 55,GG 45,GG 3б9 22,22 і 2,1

0.1 3GG 78,77 і 2,3 1,GG бб,б7 32,33 48G 7,5G і 1,2

0.05 32G 55,GG і 2,7 13,75 18,75 бб,25 4GG 3G,GG і 2,2

0.025 37G 94,59 і 1,1 7,14 7,17 85,б9 299 13,G4 і 1,9

0.01 26G 1GG,GG і G 1,15 7б,92 21,93 28G 3,93 і 1,1

0.005 3G3 б5,75 і 2,7 33,33 6G,GG б,б7 352 18,75 і 2,G8

0.002 4G1 98,25 і G,6 G 7G,GG 3G,GG 217 19,35 і 2,б

0.001 4GG 1GG,GG і G 2,5G 78,75 18,75 2б5 22,б4 2,5

0.0005 25G 92,GG і 1,7 G 47,83 52,17 28G 27,5G і 2,б

0.0001 28G 45,GG і 2,9 23,17 G 7б,83 4G5 38,27 і 2,4

Microcera-sus tomen-tosa контроль 3GG 1GG,GG і G G 83,33 1б,б7 211 31,28 і 3,1

0,1 32G 93,75 і 1,3 G G 1GG,GG 39G б,15 і 1,2

0,05 38G 1GG,G і G G G 1GG,GG 354 8,47 і 1,4

0,025 3G4 б5,79 і 2,7 G 75,GG 25,GG 318 18,24 і 2,1

0,01 25G 88,25 і 2,G G 4G,33 59,б7 31G 15,48 і 2,G

0,005 327 1GG,GG і G G 58,29 41,71 22G 25,GG і 2,9

0,002 479 98,33 ±0,5 G 43,33 5б,б7 342 25,15 і 2,3

0,001 282 1GG,GG і G G 42,8б 57,14 3G8 15,58 і 2,G

0,0005 318 1GG,G і G 4,9 77,б4 17,4б 39б 34,G9 і 2,3

0,0001 41G 1GG,G і G 3,25 7G,GG 2б,75 46G 19,57 і 1,8

Amygdalus nana контроль 38G 94,74 і 1,1 2,77 83,33 13,9G 332 б2,б5 і 2,б

0,1 349 бб,21 і 2,5 7,5G 12,57 79,93 48б 4,12 і G,9

0,05 357 б4,58 і 2,5 5,18 39,25 55,57 498 21,2б і 1,8

0,025 28G 71,43 і 2,б 7,5G 12,5G 8G,GG 324 9,88 і 1,б

0,01 24G 89,17 і 2,G G 32,71 б7,29 444 5,41 ^1,G

0,005 3G5 88,19 і 1,8 7,87 б5,33 2б,8 387 2G,16 і 2,G

0,002 288 88,33 і 1,8 35,71 3,57 6G,72 372 11,29 і 1,б

0,001 251 87,б7 і 2,G 4,51 бб,25 29,24 312 3,85 і 1,G

0,0005 38б 95,33 і 1,1 4,43 71,б7 23,9G 51G 34,51 і 2,1

0,0001 36G 97,33 і G,8 5,55 8,33 8б,12 378 5,29 і 1,1

пыльцы (май). Для исследования использовали только свежую пыльцу (срок хранения не более 10 дней). Фертильность пыльцы оценивали двумя методами: 1) окрашивание ацетокармином, 2) проращивание на искусственной питательной среде, состоящей из агар-агара, сахарозы и борной кислоты [16].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Углеродный наноматериал «Таунит» влияет на процессы формирования пыльцевых зерен косточковых

растений (табл. 1, рис. 1). После однократной обработки пыльников коллоидным водным раствором наноматериала во время только одной из критических стадий их развития (микроспорогенеза) снижается фертильность зрелой пыльцы, определяемой ацетокарминовым методом. Процент окрашенных ацетокармином пыльцевых зерен после всех вариантов концентраций УНМ «Таунит» ниже, чем в контроле, у вишни степной и миндаля (разница составляет 3-83 %). У черешни после воздействия 0,01 % раствора процент морфологически сформированных пыльцевых зерен такой же, как

в контроле (100 %). Остальные варианты воздействия наноматериала у черешни снижают этот показатель. У вишни войлочной процент окрашенной ацетокармином пыльцы снижается по сравнению с контролем только после воздействия растворов в концентрации 0,1, 0,01, 0,025 и 0,002 % на 1,7-34 %; в остальных вариантах фертильность пыльцы не изменяется. Следует отметить, что отдельные варианты концентрации наноматериалов у исследуемых видов понижают процент морфологически сформированной пыльцы наиболее сильно. Фертильность пыльцы, определяемая окрашиванием, у вишни степной более всего снижается после воздействия 0,1 и 0,025 % растворов (разница составляет 52-83 %). У черешни этот показатель более всего понижается в результате воздействия 0,1, 0,05 и 0,0001 % растворов (разница составляет 21-55 %). Фертильность пыльцы вишни войлочной более всего понижается в результате воздействия 0,025 % (34 %); миндаля низкого - в результате воздействия 0,1, 0,05 и 0,025 % растворов наноматериала (68,0-75,4 %).

Соотношение количества пыльцевых зерен мелких, средних и крупных после воздействий растворов наноматериала различных концентраций у видов также различается. Более всего мелкой пыльцы, обычно не окрашивающейся ацетокармином (не имеющей оплодотворяющей способности), у вишни степной после воздействия 0,1 и 0,01 % концентраций; у черешни - после воздействия 0,025 % концентрации; вишни войлочной -0,1 и 0,05 %; миндаля низкого - 0,1 и 0,0001 %.

Наиболее значимый тест определения фертильности пыльцы, учитывающий ее жизнеспособность, -

метод проращивания на искусственной питательной среде - также показал различную реакцию видов на воздействия «Таунита» (табл. 1, рис. 1). Результаты, полученные с использованием метода проращивания, отличаются от данных, полученных методом окрашивания. Не вся окрашенная ацетокармином пыльца имеет способность к прорастанию (в контроле и после обработки УНМ). При проращивании пыльцы из пыльников, обработанных УНМ в различных концентрациях, было отмечено разное соотношение количества проросших и не проросших пыльцевых зерен, а также разное соотношение длинных, средних и коротких пыльцевых трубок. Процент пыльцевых зерен, проросших длинными и средней длины пыльцевыми трубками, способными к оплодотворению, у всех видов значительно варьировал. Минимальный процент пыльцевых зерен, проросших длинными и средней длины пыльцевыми трубками, отмечен после обработки почек УНМ в концентрации 0,1 %: у вишни степной жизнеспособность пыльцы снижается по сравнению с контролем почти в 2 раза, у черешни жизнеспособность пыльцы понижается в 3 раза, вишни войлочной - в 5 раз, миндаля низкого - в 16 раз. Водные растворы УНМ в концентрациях 0,01-0,001 % также существенно понижают жизнеспособность пыльцы (2-37 % у вишни степной, 0,6-82 % у черешни, 20-73 % - вишни войлочной, 66-91 % - миндаля низкого). «Таунит» в концентрации 0,05 % у некоторых видов не снижает (вишня степная), а в ряде случаев - повышает (черешня) жизнеспособность пыльцы. Низкие концентрации УНМ у видов в основном повышают жизнеспособность

Рис. 1. Динамика показателей фертильности пыльцы (в %) в зависимости от концентрации наноматериала у растений: а) Cerasus fruticosa, б) Cerasus avium, в) Microcerasus tomentosa, г) Amygdalus nana

пыльцы. Так, у вишни степной и черешни «Таунит» в концентрациях 0,0001 и 0,0005 % повышает жизнеспособность пыльцевых зерен на 20-42 %. У вишни войлочной жизнеспособность пыльцы после обработки УНМ 0,0005 %-ной концентрации фертильность пыльцы повышается на 8 %. Фертильность пыльцевых зерен миндаля после обработки разными концентрациями наноматериала понижена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Однократная обработка пыльников водными растворами углеродного наноматериала «Таунит» в критические периоды их развития (микроспорогенез) влияет на фертильность пыльцевых зерен. Фертильность пыльцы, определяемой ацетокарминовым методом, в основном снижается у черешни, вишни степной и миндаля низкого. У вишни войлочной процент окрашенной ацетокармином пыльцы снижается по сравнению с контролем после воздействия 0,1, 0,01, 0,025 и 0,002 % концентрации; в остальных вариантах фертильность пыльцы не изменяется. У всех видов наиболее существенное снижение процента морфологически сформированной пыльцы происходит после обработки почек 0,1 % раствором УНМ. У вишни степной, вишни войлочной и миндаля низкого существенное снижение этого показателя происходит также после воздействия раствором 0,025 % концентрации. После воздействия раствора 0,05 % концентрации существенно снижается процент морфологически сформированной пыльцы у черешни и миндаля низкого.

Соотношение количества образовавшихся пыльцевых зерен мелких, средних и крупных после разных воздействий УНМ «Таунит» у видов различается. Более всего мелкой пыльцы, обычно не окрашивающейся ацетокармином, у вишни степной после воздействия растворами 0,1 и 0,01 %; у черешни - после воздействия раствором 0,0025 %; вишни войлочной - 0,1 и 0,05 %; миндаля низкого - 0,1 и 0,0001 %.

УНМ «Таунит» в концентрациях от 0,1 до 0,001 % в большинстве случаев понижает жизнеспособность пыльцы, определяемой проращиванием на искусственной питательной среде; в концентрациях 0,0001-0,0005 % в основном повышает жизнеспособность пыльцы.

В целом, установлено, что дестабилизация детерминированного состояния репродуктивного цикла мужского гаметофита, проявляющаяся в частоте его отклонений от нормы в условиях стресса (воздействия УНМ «Таунит»), таксоноспецифична.

Следует отметить, что в некоторых случаях наблюдаются существенные различия в результатах, полученных с помощью разных методик, что, по-видимому, можно объяснить воздействием, кроме УНМ «Таунит», других факторов. Представленные в работе результаты были получены в течение одного вегетационного сезона (2010 г), что определяет необходимость повторения эксперимента в последующие годы.

ЛИТЕРАТУРА

1. ButterR.S., Lettington A.H. // J. Chem. Vap. Deposit. 1995. V. 3. P. 182.

2. Shvedova A.A., Kisin E.R. et al. // Ibidem. 2004. V. A67. P. 87.

3. Thomson L.A., Law F.C., Rushton N., Franks J. // Biomatter. 1991.

V. 12. P. 37-42.

4. Tran C.L., Donaldson K. et. al. // J. Toxicol. Environ. Health. 2003.

V. A66. P. 1909.

5. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 31.10.2007 г. № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов» г. Москва. Доступ из справочно-правовой системы «Гарант».

6. Фостер Л. Нанотехнологии. Наука, инновации, возможности. Москва: Техносфера, 2008. 352 с.

7. Лысцов В.Н., Мурзин Н.В. Проблемы безопасности нанотехнологий. М.: МИФИ, 2007.

8. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. 103 с.

9. Жуков О.С., Колотева Н.И. Качество пыльцы сеянцев косточковых пород, полученных от гибридизации с использованием гиббе-реллина // Труды центральной генетической лаборатории им. Мичурина. Мичуринск, 1972. Т. 13. С. 14-21.

10. Рассветаева Э.Г. Характеристика особенностей пыльцевой фертильности косточковых // Цитолого-эмбриологические и генетикобиохимические основы опыления и оплодотворения растений. Матер. Всесоюз. совещания. Киев, 1982. С. 117-119.

11. Туровцева Н.М., Курсаков Г.А. Жизнеспособность пыльцы у отдаленных гибридов сортов и видов сливы // Бюл. науч. инф. Всерос. научн. -иссл. ин-та генет. и селекции плодовых раст. им. Мичурина. Мичуринск, 1995. Вып. 52. С. 24-30.

12. Волошина А.А. Морфогенез цветковых почек черешни и вишни и роль температурного фактора в их развитии в условиях Крыма // Вопросы опыления и оплодотворения плодовых деревьев: тр. гос. Никитского бот. сада. Т. XLV. Вып. IV. Харьков, 1970. С. 19-35.

13. Назарова М.Н., Истомина Е.А. Влияние температурных условий формирования пыльцы вишни войлочной на ее фертильность и частоту выхода геномных мутаций // Селекционно-генетические проблемы развития садоводства в средней полосе европейской части России. Мичуринск, 1995. С. 134-136.

14. Цвелев Н.Н. Определитель сосудистых растений Северо-Западной России (Ленинградская, Псковская и Новгородская области). СПб., 2000. С. 460-461.

15. Камелина О.П. Пыльник: строение, функции и разнообразие (Anther: structure, functions and diversity) // Матер. I Междунар. школы для молодых ученых. СПб., 2005. С. 40.

16. Романова Н.П., Шелаботин Г.П., Леонченко В.Г. и др. Методические рекомендации по применению цитологических методов в плодоводстве. М., 1988. 52 с.

БЛАГОДАРНОСТИ: Работа выполнена в рамках госконтрактов № П 208 от 23.04.2010 г. и № 16.740.11.0194 от 24.09.2010 г.

Поступила в редакцию 7 февраля 2011 г.

Yandovka L.F., Gusev A.A., Tkachyov A.G. INFLUENCE OF CARBONIC NANOSTRUCTURAL MATERIAL ON FERTILE OF POLLEN OF HIGH CERASUS PLANTS

The fertility of pollen grains in Cerasus fruticosa, C. vulgaris, C. avium, Microcerasus tomentosa and Amygdalus nana after a single treatment of the colloidal aqueous solution of carbon nanomaterial “Taunit” different concentrations during micro-porogenesis is studied. In most cases, pollen fertility after exposure to carbon nanomaterial “Taunit” decreases. Variations of concentration “Taunit”, after which there is a significant decrease in the percentage of morphologically formed pollen from different species.

Key words: fertility of pollen grains; carbon nanomaterial “Taunit”; Cerasus fruticosa; C. vulgaris; C. avium; Microcerasus tomentosa; Amygdalus nana.