Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины
METHOD FOR PRODUCING AUTOLOGOUS THROMBOCYTE LYSATE AS A BASE FOR CELLULAR BIOMEDICAL PREPARATIONS OF VETERINARY MEDICINE

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины.
Продукты фракционирования плазмы крови человека используются для лечения различных заболеваний. Эти производные включают богатую тромбоцитами плазму, сыворотку, гель тромбоцитов и лизат тромбоцитов (PL). Среди них PL содержит больше факторов роста, чем другие, и его производство является недорогим и простым. PL является одним из надлежащих источников факторов высвобождения тромбоцитов. Он используется в росте и пролиферации клеток и является хорошей альтернативой фетальной бычьей сыворотке. В последние годы клиническое использование PL стало более привлекательным. PL представляет собой раствор, насыщенный факторами роста, белками, цитокинами и хемокинами, и применяется для лечения различных заболеваний, таких как заживление ран, регенерация костей, алопеция, мукозит полости рта, корешковая боль, остеоартрит и заболевания глаз. Кроме того, его можно использовать в клеточной культуре для клеточной терапии и трансплантации тканей. Фактор роста тромбоцитов, фактор роста фибробластов, инсулиноподобный фактор роста, трансформирующий фактор роста β и фактор роста эндотелия сосудов являются ключевыми факторами роста PL, играющими основную роль в пролиферации клеток, заживлении ран и ангиогенезе.
Лизат тромбоцитов первоначально был предложен Doucet et al. В качестве альтернативы сыворотке животных для экспансии MCK ex vivo. [Doucet С.et al., 2005]. Биологически активные молекулы и факторы роста, содержащиеся в PL, поддерживают рост МСК, полученных из костного мозга (ВМ) [Muller I. et al., 2006; Bieback K. et al., 2009; Fekete N. et al., 2012; Bartmann C. et al., 2007], пуповинной крови (UCB) [Avanzini M.A. et al., 2009, Reinisch A. et al., 2007] и жировой ткани (AT) [Naaijkens В.A. et al., 2012; Cholewa D. et al., 2011; Blande I.S. et al., 2009], показывая перспективные результаты по сравнению с FBS.
Тромбоциты содержат биоактивные молекулы и факторы роста, которые высвобождаются из α-гранул после разрушения тромбоцитов физическими или физиологическими методами. Среди них факторы коагуляции, молекулы адгезии, ингибиторы протеаз и протеогликаны, основной фактор роста, выделенный из фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста (EGF), HGF, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), растворимый CD40L, TGF-β1, молекула межклеточной адгезии-1, молекула адгезии сосудистых клеток-1, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, хемокин (СС) лиганд 5 и хемокин (СХС) лиганд 1 / 2/3 [Fekete N. et al., 2012]. Все эти молекулы влияют на пролиферацию и функции клеток [Schallmoser K. et al., 2006] и могут более эффективно способствовать пролиферации по сравнению с FBS [Castegnaro S. et al., 2011].
В последние годы PL используется в качестве дополнения в культуральной среде стромальных клеток [Chou M.L., et al., 2016].
9
Наиболее близким по технической сущности заявляемому (или выбранному в качестве прототипа) является способ «Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток» (RU 2648162 С2). Способ заключается в получении ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов (ЛТ) из тромбоцитарной массы (ТМ) доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток человека. Представленный способ включает нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов 1,75×10 кл/мл посредством центрифугирования тромбоцитарной массы при 3130 g в течение 40 минут при 20°С и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема до указанной концентрации тромбоцитов. Трехкратный температурный лизис нормированного образца путем замораживания на сутки до -80°С и размораживания при +37°С. Осаждение клеточного дебриса посредством центрифугирования при 3130 g в течение 40 минут при 20°С, сбор супернатанта с получением индивидуального образца лизата тромбоцитов с последующим его микроскопическим контролем при увеличении ×200 на наличие в поле зрения не более 3-х фрагментов тромбоцитов.
Недостатком данного метода является то, что тромбоцитарный лизат используется только при культивировании клеток. Кроме того, данный способ характеризуется множественными циклами очистки, необходимыми при культивировании клеточной линии. При использовании тромбоцитарного лизата в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов, клеточный дебрис при лизисе аутологичных тромбоцитов можно не центрифугировать. Все тромбоцитарные факторы и клеточный дебрис способствуют более эффективной активации стромальных клеток в клеточном препарате.
В способах создания клеточных продуктов на основе стромальных клеток, таких как биотрансплантанты, в качестве среды/основы для продукта используют физиологический раствор. Так в способе «Биотрансплантат и способ лечения остеопороза» (патент РФ №RU 2265442 С1, 2004 г., A61K 35/28 (2000.01); A61K 35/48 (2000.01); А61Р 19/10 (2000.01)). Способ лечения остеопороза заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн. в 50-100 мл физиологического раствора.
Другой способ «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения» (патент РФ RU 2 659 204 С1) характеризуется тем, что он содержит от 5 млн. мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в 1 мл физиологического раствора.
Недостатком данного способа является использования физиологического раствора для разведения клеточного препарата. Использование тромбоцитарного лизата в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины, позволяет улучшить качество продукта, в частности его терапевтических свойств, посредством ростовых и противовоспалительных факторов, присутствующих непосредственно в тромбоцитарном лизате.
Заявляемый способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов является методом изоляции аутологичной плазмы богатой тромбоцитами из крови, последующего температурного лизиса обогащенной тромбоцитами плазмы и использования в качестве основы для клеточного препарата.
Задачей заявляемого изобретения является разработка высокоэффективного способа получения аутологичного тромбоцитарного лизата для применения в качестве основы для клеточного препарата ветеринарной медицины.
Поставленная задача решается тем, что в изобретении «Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины», при котором в основе для клеточных биомедицинских препаратов содержится тромбоцитарный лизат и плазма крови, полученные из аутологичной крови, предназначенные для разведения стромальных клеток при использовании клеточного препарата в ветеринарной медицине.
Используемый в заявленном изобретении тромбоцитарный лизат, получают из аутологичной крови, которую центрифугируют, отбирают плазму богатую тромбоцитами.
В «Способе получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины» тромбоциты изолируют от форменных элементов крови, концентрируют тромбоциты посредством центрифугирования и последующего многократного температурного лизиса.
Способ осуществляется следующим образом.
Аутологичная венозная кровь пациента в присутствие антикоагулянта гепарином или этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) центрифугируется 10 минут при 1800 об/мин. После чего в стерильных условиях ламинарного бокса из пробирки отбирается верхняя фракция обогащенной тромбоцитами плазмы крови. Для изоляции и концентрации тромбоцитов полученная фракция подвергается повторному центрифугированию 15 минут при 3600 об/мин. Осадок тромбоцитов разводится в 1 мл аутологичной плазмы крови и определяется концентрация тромбоцитов. Полученный концентрат тромбоцитов подвергается температурному лизису, посредством многократных 3-5 циклов быстрой заморозки до -80°С и разморозки до +37°С. При температуре -80°С образцы находятся 24-48 часов. При температуре +37°С образцы находятся 30-60 минут. Последний цикл температурного лизиса завершается заморозкой образца и хранением при -80°С. Для применения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины замороженную пробу аутологичного лизата тромбоцитов размораживают при температуре +37°С и используют для разведения клеточного материала и используют непосредственно перед применением клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины.
Условия поэтапного центрифугирования позволяют выделить чистую популяцию тромбоцитов без примесей других типов форменных элементов крови.
Условия центрифугирования позволяют сконцентрировать максимальное количество тромбоцитов в минимальном объеме.
Условия многократных циклов лизиса тромбоцитарной массы позволяют денатурировать более 95% тромбоцитов (Фиг. 1).
Ниже на таблице 1 показана эффективность предложенного способа лизирования тромбоцитов выражающееся в числе тромбоцитов в 1 мл плазмы.
Таким образом, в заявляемом способе получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины, проходит изоляция тромбоцитов от форменных элементов крови, их концентрация посредством центрифугирования и последующий многократный температурный лизис. Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов применяется для создания основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины, посредством добавления в тромбоцитарный лизат клеточного материала, представленного суспензией клеток для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины.
Заявляемый способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины позволяет получить лизат тромбоцитов который используется для разведения клеточного препарата, тем самым улучшая его качество, стимулируя активацию регенаративных свойств клеток, максимально сохраняя жизнеспособность клеточной составляющей, причем, полученный лизат тромбоцитов предназначен для добавления в клеточный препарат непосредственно перед его использованием.
Литература
1. Avanzini MA, Bernardo ME, Cometa AM, Perotti C, Zaffaroni N, Novara F, et al. Generation of mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate: a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood- and bone marrow-derived progenitors. Haematologica. 2009; 94(12):1649-60. doi: 10.3324/haematol.2009.006171.
2. Bartmann C, Rohde E, Schallmoser K, Purstner P, Lanzer G, Linkesch W, et al. Two steps to functional mesenchymal stromal cells for clinical application. Transfusion. 2007; 47(8):1426-35. doi: 10.1111/j.l537-2995.2007.01219.x.
3. Bieback K, Hecker A, Kocaomer A, Lannert H, Schallmoser K, Strunk D, et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 2009; 27(9):2331-41. doi: 10.1002/stem.139.
4. Blande IS, Bassaneze V, Lavini-Ramos C, Fae KC, Kalil J, Miyakawa AA, et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 2009; 49(12):2680-5. doi: 10.1111/j.1537-2995.2009.02346.x.
5. Castegnaro S, Chieregato K, Maddalena M, Albiero E, Visco C, Madeo D, et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Curr Stem Cell Res Ther. 2011;6(2): 105-14. doi: 10.2174/157488811795495440.
6. Cholewa D, Stiehl T, Schellenberg A, Bokermann G, Joussen S, Koch C, et al. Expansion of adipose mesenchymal stromal cells is affected by human platelet lysate and plating density. Cell Transplant. 2011; 20(9):1409-22. doi: 10.3727/096368910X557218.
7. Chou M.L., Burnouf T. Current methods to manufacture human platelet lysates (HPLs) for cell therapy and tissue engineering; possible trends in product safety and standardisation. Vox Sanguinis, 2016; 12, 168-175. doi: 10,1111/voxs.12316
8. Doucet C, Ernou I, Zhang Y, Llense JR, Begot L, Holy X, et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 2005; 205(2):228-36. doi: 10.1002/jcp.20391.
9. Fekete N, Gadelorge M, Furst D, Maurer C, Dausend J, Fleury-Cappellesso S, et al. Platelet lysate from whole blood-derived pooled platelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for the isolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells: production process, content and identification of active components. Cytotherapy. 2012; 14(5):540-54. doi: 10.3109/14653249.2012.655420.
10. Fekete N, Rojewski MT, Furst D, Kreja L, Ignatius A, Dausend J, et al. GMP-compliant isolation and large-scale expansion of bone marrow-derived MSC. PLoS One. 2012; 7(8):e43255. doi: 10.1371/journal.pone.0043255.
11. Muller I, Kordowich S, Holzwarth C, Spano C, Isensee G, Staiber A, et al. Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM. Cytotherapy. 2006; 8(5):437-44. doi: 10.1080/14653240600920782.
12. Naaijkens BA, Niessen HW, Prins HJ, Krijnen PA, Kokhuis TJ, de Jong N, et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 2012; 348(1):119-30. doi: 10.1007/s00441-012-1360-5.
13. Reinisch A, Bartmann C, Rohde E, Schallmoser K, Bjelic-Radisic V, Lanzer G, et al. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2007; 2(4):371-82. doi: 10.2217/17460751.2.4.371.
14. Schallmoser K, Strunk D. Preparation of pooled human platelet lysate (pHPL) as an efficient supplement for animal serum-free human stem cell cultures. J Vis Exp. 2009; 32. doi:10.3791/1523