Нанодиски для разрушения опухолевых клеток

Полезная модель относится к области биотехнологии, а именно к наночастицам, в частности к нанодискам, применяемым для разрушения опухолевых клеток с помощью магнитного поля.
В настоящее время показана перспективность применения магнитных наночастиц, модифицированных аптамерами для деструкции опухолевых клеток.
Известны наночастицы с ядром из оксида железа в оболочке из декстрана, связанные с аптамерами к рецептору эпидермального фактора роста HER2, применяемые для индукции магнитной гипертермии в клеточных культурах аденокарциномы человека SK-BR3, экспрессирующих HER2 (Katarzuna Pala/Tumor-specific hyperthermia with aptamer-tagged superparamagnetic nanoparticles/ Anna Serwotka, Filip Jelen, Piotr Jakimowicz, Jacek Otlewski/ International Journal of Nanomedicine. - V. 9. - P. 67-76. - 18.12.2013). Показана избирательность данного комплекса по отношению к культурам клеточной линии глиобластомы человека, экспрессирующей HER2. Под воздействием высокочастотных полей на комплексы известных наночастиц с аптамерами (280 кГц) происходит разрушение опухолевых клеток.
При этом, при воздействии на данные магнитные наночастицы высокочастотных полей, происходит их гипертермия, а именно нагрев, и гибель опухолевых клеток происходит в результате повышения температуры, но поскольку повышение температуры не является контролируемым, вследствие нагрева также могут пострадать и здоровые клетки, и ткани.
В качестве наиболее близкого аналога к заявляемой полезной модели выбраны известные магнитные микродиски, модифицированные антителами, применяемые для деструкции опухолевых клеток с помощью магнитного поля (Dong-Hyun Kim/ Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction/ Elena A. Rozhkova, Ilya Ulasov, Samuel D. Bader, Tijana Rajh, Maciej S. Lesniak, Valentyn Novosad. - Nature materials. - V. 9. - P. 165-171. - 2010). Данные магнитно-вихревые микродиски, получены методом магнетронного распыления и оптической литографии. Магнитно-вихревые микродиски имеют диаметр 1 микрометр, состоят из сплава железа и никеля в соотношении 20:80%, имеют толщину 60 нанометров и покрыты золотым слоем толщиной 5 нанометров. Применяют микродиски, модифицированные антителами к IL132R, белкам, экспрессирующимся клетками глиобластомы человека, для разрушения культуры клеток глиобластомы N10. Гибель опухолевых клеток происходит в результате процессов апоптоза, который запускается, в результате возбуждения вращающимся магнитным полем, величиной 90Э, дисков, связавшиеся с клетками культуры глиобластомы (Dong-Hyun Kim/ Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction/ Elena A. Rozhkova, Ilya Ulasov, Samuel D. Bader, Tijana Rajh, Maciej S. Lesniak, Valentyn Novosad. - Nature materials. - V. 9. - P. 165-171. - 2010).
Описанные диски модифицированы антителами. Однако известно, что антитела являются иммуногенными и обладают низкой стабильностью. Поэтому при введении их в организм, они в короткие сроки могут быть уничтожены иммунной системой, и, таким образом, их воздействие на опухолевые клетки будет незначительным.
Задачей заявленной полезной модели является повышение эффективности воздействия нанодисков на опухолевые клетки.
Поставленная задача решается за счет того, что нанодиски для разрушения опухолевых клеток, имеющие многослойную структуру, средний слой которых, покрыт с обеих сторон слоем золота толщиной по 5 нм, согласно заявляемой полезной модели выполнены диаметром 500 нм и толщиной 60 нм и включают средний слой из никеля, толщиной 50 нм, на слои золота нанесены аптамеры, специфичные к опухолевым клеткам, присоединяемые к слою золота посредством SH группы праймеров.
Технический результат полезной модели выражается в повышении эффективности воздействия нанодисков на опухолевые клетки и достигается за счет того, что нанодиски, присоединившиеся к опухолевой клетке за счет специфичных к ней аптамеров, совершают колебания в условиях магнитного поля, в результате чего воздействуют на белки опухолевой клетки, меняя их конформацию, или способствуют механическому разрушению клетки.
Заявляемая полезная модель поясняется схемой и фотографиями.
На фиг. 1 представлена схема строения нанодиска для разрушения опухолевых клеток.
Заявляемые нанодиски для разрушения опухолевых клеток, имеют многослойную структуру и включают слой из никеля 1, слои из золота 2, покрывающие никелевый слой с обеих сторон, аптамеры 3, специфичные к опухолевой клетке, присоединенные к слоям золота посредством праймеров 4, содержащих SH группы.
В основу изготовления металлической основы нанодисков положен известный способ, основанный на переносе металлических пленок с выступающих частей штампа на водорастворимую пленку [M.J. Lee, J. Kim, J.S. Lee, Y.S. Kim, Pressure-assisted printing with crack-free metal electrodes using an anti-adhesive rigifiex stamp, J. Mater. Chem., 2010, V. 20, р. 2746]. На поверхности полимера с помощью штампа формируют цилиндрические столбики диаметром 500 нм. Затем на столбики последовательно напыляют слои металлов: золото (Au) - 5 нм; никель (Ni) - 50 нм и снова золото -5 нм. Образовавшуюся на столбиках слоистую структуру Au-Ni-Au с вершин столбиков переносят на подложку с плоской полимерной поверхностью, для чего столбчатую структуру с напыленными на нее слоями металлов прижимают к плоской полимерной поверхности, обладающей большими адгезионными силами. При разъединении данных структур, на плоской полимерной поверхности остаются металлические нанодиски, перенесенные с вершин столбиков. Сформированные нанодиски удаляют с подложки путем растворения полимерного слоя 50% водным раствором спирта.
Далее полученную суспензию нанодисков модифицируют с помощью аптамеров следующим образом. Растворитель, содержащий нанодиски испаряют, после чего добавляют к нанодискам праймеры, содержащие SH группу на конце (что позволяет образовывать ковалентные связи серы с золотом), комплиментарные константной области аптамеров, разведенные в бидистилированной воде, в конечной концентрации 1 мкМ. Затем суспензию инкубируют в течение 24 часов при температуре 6°С на шейкере.
2+
2+
2+
2+
После этого к суспензии добавляют двухкратный фосфатный буфер, содержащий Ca и Mg и тщательно перемешивают. Затем добавляют аптамеры в конечной концентрации 200 нМ, разведенные с фосфатном буфере содержащем Са и Mg и инкубируют в течение 24 часов при температуре 6°С на шейкере.
Нанодиски для разрушения опухолевых клеток, подготовленные вышеописанным способом работают следующим образом.
Нанодиски для разрушения опухолевых клеток добавляют к образцу, содержащему опухолевые клетки или вводят в организм экспериментального животного. За счет присутствия на поверхности нанодисков специфичных к опухолевой клетке аптамеров, нанодиски присоединяются к опухолевой клетке. Образец или экспериментальное животное помещают в центр катушки, генерирующей электромагнитное поле частотой 50 Гц и величиной 100 Эрстед, то есть подвергают воздействию переменного магнитного поля. Под воздействием внешнего переменного магнитного поля, нанодиски, присоединившиеся к опухолевой клетке, совершают колебания в условиях магнитного поля с магнитным дипольным моментом параллельным плоскости диска. В результате чего воздействуют на белки опухолевой клетки, меняя их конформацию, или способствуют механическому разрушению клетки.
Таким образом, заявляемые нанодиски для разрушения опухолевых клеток, благодаря своей структуре, эффективно работают в условиях переменного магнитного поля, оказывая разрушающее воздействие на клетки опухоли.