СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ СТОЙКОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD OF DETERMINING OSMOTIC RESISTANCE OF ERYTHROCYTES

Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики различных анемий.
В настоящее время используют много способов, позволяющих оценить стойкость эритроцитов к воздействию различных факторов, способных спровоцировать их разрушение, то есть вызвать гемолиз. Однако известные способы зачастую неточны, трудоемки и растянуты во времени. Поэтому существует проблема создания упрощенного способа, позволяющего снизить трудоемкость определения стойкости эритроцитов к гемолизу.
Известен способ оценки стойкости эритроцитов к кислотному гемолитику путем определения величины светопропускания стандартизированной взвеси эритроцитов с построением графика гемолиза (Лабораторное дело. - 1965. - №9. - С. 530-531).
Ход определения.
Берут из прокола пальца 1-2 капли крови и помещают в пробирки с 2-3 мл физиологического раствора.
Стандартизация условий достигается доведением оптической плотности взвеси эритроцитов до величины, равной 0,7 единиц экстинции (D) в кювете с рабочей длиной 30 мм. Берут 2,0 мл взвеси эритроцитов с оптической плотностью 0,7 D и помещают в кювету, находящуюся в правом пучке света фотоэлектроколориметра. В левое гнездо вставляют кювету с физиологическим раствором.
К взвеси эритроцитов добавляют 2,0 мл 0,004 Η раствора соляной кислоты и сразу же отмечают показания ФЭК на правом барабане. Затем показания снимают через каждые 30 секунд до тех пор, пока они не станут постоянными. Значение оптической плотности записывают в столбик напротив соответствующих отметок времени.
Для построения графика кислотной стойкости эритроцитов производят следующие расчеты.
Из первого показания оптической плотности вычитают последнее. Таким образом узнают изменение оптической плотности, соответствующее 100% гемолизу. Полученный результат делят на 100 и получают изменение оптической плотности, приходящееся на 1% гемолиза.
1. Из каждого предыдущего показания оптической плотности вычитают последующее и получают изменения оптической плотности в каждые последующие 30 секунд.
2. Данные, полученные по пункту 2, делят на оптическую плотность, соответствующую 1% гемолиза (пункт 1), и получают процент гемолизировавшихся эритроцитов за каждые последующие 30 секунд.
3. Полученные результаты выражают графически. Недостатками известного способа являются:
1) трудоемкость;
2) длительность по времени.
Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ определения осмотической стойкости эритроцитов по Лимбеку и Рибьеру (Руководство по клиническим лабораторным исследованиям. - М.: Медгиз, 1960, С. 96-98), при котором используют гипотонические растворы с концентрациями соли от 0,56 до 0,28%. Их разливают в ряд пробирок, затем одной и той же пипеткой от гемометра Сали в каждую пробирку приливают по 0,02 мл крови, взятой из мякоти пальца. Осторожным встряхиванием пробирки достигают равномерности взвеси крови в солевом растворе. Пробирки оставляют в штативе при комнатной температуре на 1 час, затем в течение 5 минут центрифугируют при 2000 об/мин, после чего отмечают максимальный и минимальный уровень осмотической стойкости.
Чтение результатов.
Максимальный и минимальный уровень стойкости - это те концентрации соли, при которых гемолиз начался и закончился.
Уровень максимальной стойкости, то есть первые следы гемолиза, определяют на глаз по легкой желтизне, а уровень минимальной стойкости (полное разрушение эритроцитов) - по интенсивно красному цвету и полной прозрачности раствора.
Нормальные границы осмотической стойкости:
иля минимальной стойкости колебания в пределах 0,48-0,46%; для максимальной - 0,34-0,32%.
12
Понижение стойкости эритроцитов, по мнению авторов метода, имеет место при врожденном сфероцитозе, а при остром гемолитическом кризе и B-дефицитной анемии расширение границ стойкости.
Недостаткамм известного способа являются его трудоемкость и длительность:
1) увеличение гемолиза в отдаленные промежутки времени может произойти за счет микробного прироста и за счет поглощения углекислого газа воздуха;
2) результаты учитывают через 3-4-24 часа, тогда как осмотический гемолиз эритроцитов совершается быстро, достигая своего максимума уже через 5 минут.
Авторы предлагают способ определения осмотической стойкости эритроцитов, позволяющий оценить склонность эритроцитов к осмотическому гемолизу с использованием автоматического гематологического анализатора и рассчитать индекс осмотической стойкости, снижающийся или повышающийся при наличии в исследуемой крови большого количества эритроцитов, склонных или более стойких к разрушению осмотическим гемолитиком.
Техническим результатом заявляемого способа является упрощение способа.
Технический результат достигается тем, что кровь в равных объемах помещают в мерные пробирки №1 и №2 с 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1, подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 15 мин, после этого плазму отсасывают пипеткой; полученную эритроцитарную массу из мерной пробирки №1 разводят 0,85% раствором хлорида натрия в соотношении 1:1, эритроцитарную массу из мерной пробирки №2 разводят 0,425% раствором хлорида натрия в соотношении 1:1; обе мерные пробирки одновременно центрифугируют еще 15 мин при 1500 об/мин, после чего покачиванием или легким встряхиванием кровь перемешивают с надосадочной жидкостью до однородного состояния, затем из каждой пробирки с помощью устройства для исследования проб крови Microvette забирают по 200 мкл эритроцитарной массы и производят подсчет эритроцитов в автоматическом гематологическом анализаторе: вначале производят подсчет эритроцитов в пробе, взятой из мерной пробирки №1, затем - из мерной пробирки №2 и в заключение рассчитывают индекс осмотической стойкости (ИОС), который определяют по формуле:
1
2
ИОС=RBC/RBC, где
1
12
RBC - количество эритроцитов (×10/л) из мерной пробирки №1,
2
12
RBC - количество эритроцитов (×10/л) из мерной пробирки №2;
и при значении ИОС 1,50-1,60 эритроциты оценивают как среднестойкие к осмотическому гемолизу; 1,30-1,49 - как низкостойкие; 1,61-1,8 - как высокостойкие.
Способ осуществляют следующим образом.
Оборудование: автоматический гематологический анализатор, например, «Hemolux 19» (Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd., China); центрифуга лабораторная (ОПн-3У4,2); устройства для исследования проб крови Microvette с антикоагулянтом 200 мкл К3Е (К3-ЭДТА) «Сарштедт АГ&Ко», Германия.
Реактивы:
1) антикоагулянт - 3,8% раствор цитрата натрия (получают, растворяя 3,8 г цитрата натрия (РЕАХИМ ОСЧ-6-4 Михайловский завод химреактивов) в 100 мл дистиллированной воды);
2) 0,85% раствор хлорида натрия (получают, растворяя 0,85 граммов хлорида натрия (РЕАХИМ ОСЧ-6-4 Михайловский завод химреактивов) в 100 мл дистиллированной воды);
3) осмотический гемолитик - 0,425% раствор хлорида натрия (получают, разбавляя 0,85% раствор хлорида натрия равным объемом дистиллированной воды).
Ход определения.
Из локтевой вены широкой сухой иглой берут кровь и в равных объемах помещают в мерные пробирки №1 и №2 с 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1. Покачиванием или легким встряхиванием кровь перемешивают с антикоагулянтом.
Кровь подвергают центрифугированию на центрифуге при 1500 об/мин в течение 15 мин, после чего плазму отсасывают пипеткой. Полученную эритроцитарную массу из мерной пробирки №1 разводят 0,85% раствором хлорида натрия в соотношении 1:1; эритроцитарную массу из мерной пробирки №2 разводят 0,425% раствором хлорида натрия в соотношении 1:1; обе мерные пробирки одновременно центрифугируют еще 15 мин при 1500 об/мин. После центрифугирования покачиванием или легким встряхиванием кровь перемешивают с надосадочной жидкостью до однородного состояния. Из каждой мерной пробирки с помощью устройства для исследования проб крови Microvette забирают по 200 мкл эритроцитарной массы и производят подсчет эритроцитов в автоматическом гематологическом анализаторе «Hemolux 19».
Вначале производят подсчет эритроцитов в пробе, взятой из мерной пробирки №1, далее - подсчет эритроцитов в пробе, взятой из мерной пробирки №2.
В заключение рассчитывают индекс осмотической стойкости (ИОС), который определяют по формуле:
1
2
ИОС=RBC/RBC, где
1
12
RBC - количество эритроцитов (×10/л) из мерной пробирки №1, полученное в устройстве для исследования проб крови Microvette при подсчете в автоматическом гематологическом анализаторе «Hemolux 19»,
2
12
RBC - количество эритроцитов (×10/л) из мерной пробирки №2, полученное в устройстве для исследования проб крови Microvette при подсчете в автоматическом гематологическом анализаторе «Hemolux 19»; и при значении ИОС 1,50-1,60 эритроциты оценивают как среднестойкие к осмотическому гемолизу; 1,30-1,49 - как низкостойкие; 1,61-1,8 - как высокостойкие.
Заявляемый способ прост и удобен в применении, экономичен по времени и найдет широкое применение в клинике для диагностики различных анемий.