СУСПЕНДИРОВАНИЕ И КЛАСТЕРИЗАЦИЯ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С ЦЕЛЬЮ ИХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В ПАНКРЕАТИЧЕСКИЕ ЭНДОКРИННЫЕ КЛЕТКИ

1. Способ выращивания и дифференцировки плюрипотентных клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе, включающий культивирование плюрипотентных клеток в плоской прикрепленной культуре до агрегированных кластеров клеток и дифференцировку кластеров плюрипотентных клеток в динамической перемешиваемой суспензионной культуральной системе, в котором стадия дифференцировки включает использование ингибитора Cyp26.
2. Способ по п.1, причем указанный способ увеличивает процент клеток в фазе G0/G1 клеточного цикла.
3. Способ по п.1, в котором культивирование включает среду, содержащую от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% бычьего сывороточного альбумина.
4. Способ по п.3, в котором среда дополнительно включает в себя ингибитор Rho-киназы.
5. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки являются прикрепленными.
6. Способ увеличения процента клеток в фазе G0/G1 клеточного цикла, включающий выращивание плюрипотентных клеток в плоской прикрепленной культуре до агрегированных кластеров клеток в среде, включающей в себя от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% бычьего сывороточного альбумина, перенос кластеров плюрипотентных стволовых клеток из плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензию и культивирование клеток в динамической суспензии в среде с добавлением малой молекулы и, необязательно, представителя семейства TGFβ.
7. Способ по п.6, в котором малая молекула представляет собой MCX, и причем представитель семейства TGFβ представляет собой GDF-8.
8. Способ по п.6, в котором выращивание включает среду, содержащую ингибитор Rho-киназы.
9. Способ дифференцировки плюрипотентных клеток в дефинитивную энтодерму, включающий выращивание плюрипотентных клеток в плоской прикрепленной культуре до агрегированных кластеров клеток в среде, включающей в себя от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% бычьего сывороточного альбумина, перенос кластеров плюрипотентных стволовых клеток из плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензию и культивирование клеток в динамической суспензии в среде с добавлением MCX и GDF8 или WNT3A и активина A.
10. Способ по п.9, в котором выращивание включает среду, содержащую ингибитор Rho-киназы.
11. Способ выращивания и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе, включающий выращивание плюрипотентных стволовых клеток в плоской прикрепленной культуре до агрегированных кластеров клеток, перенос кластеров плюрипотентных стволовых клеток из плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензию и дифференцировку плюрипотентных клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе, причем клетки выращивают до агрегированных кластеров клеток в среде, которая включает в себя от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% бычьего сывороточного альбумина.
12. Способ по п.11, в котором кластеры плюрипотентных клеток дифференцируют для создания популяции панкреатических клеток-предшественников, популяции нейронных клеток-предшественников или популяции клеток-предшественников кардиомиоцитов.
13. Способ по п.11, в котором плюрипотентные стволовые клетки выбираются из следующих: индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, клетки, полученные из ткани пуповины человека, партеноты, человеческие эмбриональные стволовые клетки (клетки hES) и клетки, извлеченные из амниотической жидкости.
14. Трансплантируемый клеточный продукт, полученный из стволовых клеток, содержащий популяцию дифференцированных панкреатических клеток-предшественников, полученных посредством способа по п.11.
15. Способ выращивания и дифференцировки плюрипотентных клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе, включающий:
a. выращивание плюрипотентных клеток в плоской прикрепленной культуре до агрегированных кластеров клеток в среде, включающей в себя от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% бычьего сывороточного альбумина;
b. перенос кластеров плюрипотентных клеток с плоской прикрепленной культуры в динамическую суспензионную культуру с использованием ферментативного или хелатирующего агента;
c. поддержание кластеров клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе; и
d. дифференцировку кластеров плюрипотентных клеток в динамически перемешиваемой суспензионной культуральной системе для генерирования популяции панкреатических клеток-предшественников, популяции нейронных клеток-предшественников или популяции клеток-предшественников кардиомиоцитов;
причем дифференцировочная среда включает в себя кислород в диапазоне от недостаточности кислорода до приблизительно 30% от уровня окружающей среды, уровень липидов в диапазоне от 0,1% до приблизительно 2% или их комбинацию.
16. Способ по п.15, в котором кластеры стволовых клеток экспрессируют CD9, SSEA4, TRA-1-60 и TRA-1-81, и не экспрессируют CXCR4.
17. Способ по п.15, в котором среда для выращивания дополнительно включает ингибитор Rho-киназы.
18. Способ по п.15, в котором среда для дифференцировки содержит от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% бычьего сывороточного альбумина.
19. Способ по п.15, в котором плюрипотентные клетки выбирают из группы, состоящей из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, клеток, полученных из ткани пуповины человека, партенотов, человеческих эмбриональных стволовых клеток (клетки hES) и клеток, извлеченных из амниотической жидкости.
20. Способ по п.15, в котором по данному способу генерируются панкреатические клетки-предшественники, экспрессирующие фактор транскрипции β-клеток.
21. Способ по п.15, в котором факторами транскрипции являются PDX1 и/или NKX6.1.