ВАКЦИНА ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА КУР
VACCINE AGAINST COLIBACTERIOSIS OF HENS

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к птицеводству, и может быть использовано для профилактики колибактериоза кур.
Колибактериоз - энзоотическая септическая болезнь различных видов домашних птиц (преимущественно кур), вызываемая патогенными типами кишечной палочки различных серологических групп. Болезнь наносит существенный экономический ущерб птицевоству.
Для профилактики колибактериоза используют различные препараты: антибиотики, сульфаниламидные, бактериальные препараты, биологически активные вещества.
1
2
В частности, известен препарат (патент РФ №1424169 по кл. МПК A61K 31/00, опуб. 10.04.1995), содержащий сульфадимезин, фуразолидон, химкокцид, витамины В и В.
Известен бактериальный препарат для профилактики и лечения колибактериоза птиц на основе пропионовых и ацидофильных бактерий (см. патент РФ №2048810 по кл. МПК A61K 35/74, опуб. 27.11.1995), состоящий из культур Laktobacillus brevis Б-3 и Propionibacterium Spermalii в соотношении 1,0:1,0; 1,25:0,75; 1,5:0,5.
Известно биологически активное вещество (патент РФ №2355410 по кл. МПК A61K 36/00, опуб. 20.05.2009), содержащее растительные экстракты из листьев облепихи крушиновидной, и/или экстракт травы маклейи сердцевидной или маклейи мелкоплодной, и/или экстракт расторопши пятнистой, и/или экстракт корней и травы эхинацеи пурпурной.
Однако все эти препараты относятся к средствам неспецифической профилактики колибактериоза. Основным недостатком их является невысокая эффективность, большое число противопоказаний, высокая себестоимость препаратов.
Наиболее эффективным способом борьбы с колибактериозом является вакцинация.
Известна вакцина против колибактериоза птиц, выпускаемая ФГУП Ставропольская биофабрика (Черных М.Н. Иммуногенные свойства инактивированной вакцины против колибактериоза кур // Актуальные проблемы ветеринарии. Тезисы докладов научной конференции. ЛВИ, - 1991. - С.92-94), содержащая взвесь бактерий Escherichia, инактивированных формалином. Вакцинацию проводят аэрозольно двукратно с интервалом в два дня из расчета 1 мл/куб.м и экспозицией 45 минут.
Однако использование инактивированных вакцин приводит к созданию менее напряженного и непродолжительного иммунитета по сравнению с живыми вакцинами. Кроме этого, применение аэрозольной вакцинации не эффективно.
Наиболее близкой к заявляемой является вакцина против колибактериоза (патент РФ №2344832 по кл. МПК A61K 39/108, опуб. 27.01.2009), содержащая суспензию инактивированных бактерий E.coli штамма №389 (078), аминоэтиленимин и липосомообразующую смесь, содержащую фосфолипиды, сахара, наполнители и водорастворимые полимеры. Вакцину вводят внутримышечно в дозе 0,5 мл на голову.
Действие данной вакцины основано на повышении антибактериальной активности, которая не предусматривает предотвращения воздействия на организм птицы токсинов, являющихся основной причиной проявления колибактериоза.
Изобретение направлено на решение задачи создания простой в изготовлении, дешевой и эффективной живой вакцины против колибактериоза кур, обладающей высокоиммуногенными и протективными свойствами за счет формирования антитоксического иммунитета.
6
6
3
Для решения поставленной задачи вакцина против колибактериоза кур, содержащая растворитель и антиген на основе культур Escherichia coli, согласно изобретению содержит в качестве растворителя физиологический раствор, а в качестве антигена - антиген из штамма Е.coli «Б-5» с содержанием 1,0×10-2,0×10 микробных клеток в 1 см физиологического раствора.
6
6
3
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано дешевых, эффективных и простых в изготовлении живых вакцин против колибактериоза кур, обладающих высокоиммуногенными и протективными свойствами за счет использования антигена из штамма Е.coli «Б-5», представляющего собой бактериальную массу с содержанием 1,0×10-2,0×10 микробных клеток в 1 см.
8
9
3
Известна вакцина против колибактериоза свиней на основе антигена из штамма Е.coli «Б-5» с содержанием 2,4×10-2,4×10 микробных клеток в 1 см физиологического раствора (патент РФ №2248806 по кл. МПК A61K 39/108, опуб.27.03.2005).
Однако вакцина пригодна лишь для профилактики колибактериоза поросят и в данной концентрации неприменима для кур.
Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».
Штамм Escherichia coli Б-5, предназначенный для изготовления вакцины, депонирован в ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ)» (справка о депонировании №1807/15 от 10.10.2002). Штамм выделен из селезенки павшего поросенка 10-дневного возраста.
Штамм характеризуется следующими свойствами.
Культуральные и морфологические признаки.
Культивирование осуществляют вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 37(±0,5)°С в течение от 18 до 48 часов при аэробных условиях. При этом на МПБ колонии растут диффузно, образуя интенсивную муть и легко разбивающийся осадок, на МПА вначале образуются гладкие, выпуклые, блестящие с ровными краями колонии S-формы. В последующем возможно образование переходных от S- к R-форме колоний и суховатых с неровными краями R-форм колоний (до 50%). На агаре Эндо формируются темно-красные с металлическим блеском колонии.
Ферментативные свойства.
Микроорганизм обладает подвижностью, проявляет каталазную активность, дает положительную реакцию с метилротом, продуцирует индол, ферментирует глюкозу с газообразованием, а также лактозу, арабинозу, маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит.
Условия и состав сред для токсинообразования: бульон Хоттингера.
Антигенные свойства.
Продукт, синтезируемый штаммом Escherichia coli Б-5 - термолабильный экзотоксин, не подверженный нейтрализации поливалентной антитоксической сывороткой против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных.
Молекулярно-генетическая особенность штамма - треки штамма как в S-, так и в R-формах имеют репликон размером около 0,3 кв, в данном репликоне имеется ген, кодирующий В-субъединицу термолабильного токсина (ЛТ), обуславливающий иммуногенную активность штамма. Структурные гены ЛТ дополнительно интегрированы и в хромосому микробной клетки. В клетках штамма имеется репликон, несущий генетическую информацию регуляторного свойства, необходимую для синтеза ЛТ-продукции. У штамма имеется в наличии иммуногенный эпитоп, но отсутствует репликон, ответственный за реактогенность эшерихий.
Чувствительность к антибиотикам (зона задержки роста в мм): полимиксин - 11, стрептомицин - 25, левомицетин - 25, рифампицин - 9, карбенициллин - 15; не чувствителен к: оксациллину, доксициклину, линкомицину, тетрациклину, олеандомицину, ампициллину, пенициллину.
Вирулентные свойства.
8
3
10
3
50
Внутрибрюшинное введение культуры штамма в концентрации 5,0·10 м.к./см и объеме 0,5 мл гибели белых мышей не вызывает. LД - 1,2·10 м.к./см. Гибель белых мышей наступает в течение суток.
Определение энтеротоксигенных свойств штамма.
Для определения токсинообразования культивирование штамма проводили в питательном составе Mundeli в течение 20 часов. Полученную бульонную культуру разделяли на токсиносодержащий материал и бакмассу методом стерилизующей фильтрации. Культуральная жидкость, лишенная бактериального компонента, служила материалом, содержащим экзотоксин Е.coli.
Устойчивость к температуре определяли прогреванием токсиносодержащего материала в течение 10-минутного кипячения при 100°С и последующим его введением белым мышам.
Культивирование штамма можно осуществлять, например, на разработанной и запатентованной Саратовской НИВС (патент №2142505) питательной среде следующего состава (мас.%): аминокровин 5-20; пептон 0,6-1,5; хлористый аммоний 0,08-0,18; хлористый натрий 0,09-0,11; гидролизат казеина 9-20; питательная среда «ИГЛА» 52-61; дистиллированная вода - остальное. На данной среде культивирование осуществляют в течение 7 суток при температуре 37(±0,5)°С, затем суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочная жидкость являлась энтеротоксигенным материалом.
Вакцину против колибактериоза кур готовят следующим образом.
Осуществляют культивирование штамма. Для этого штамм Е.coli «Б-5» засевают в пробирки вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 37(±0,5)°С в течение 18 часов при аэробных условиях.
6
6
3
Полученную бактериальную массу смывают физиологическим раствором и получают суспензию с содержанием микробных клеток 1,0×10-2,0×10 в 1 см физиологического раствора.
3
6
6
3
Данное содержание микробных клеток в суспензии было подобрано экспериментальным путем. Содержание микробных клеток в 1 см менее чем 1,0×10 снижает эффективность вакцины, не обеспечивая защитную реакцию организма цыплят. Содержание микробных клеток более 2,0×10 в 1 см физиологического раствора делает вакцину более токсичной и негативно влияет на привесы.
3
Вакцину вводят перорально цыплятам трехнедельного возраста в объеме 0,5 см.
Пример 1.
Обоснование протективного действия вакцины против колибактериоза кур.
Протективное действие вакцины изучали путем заражения различными вирулентными штаммами иммунизированных данной вакциной и неиммунизированных цыплят по изменению среднесуточных привесов и по изменению поражений внутренних органов.
Для этого формировали 4 группы цыплят в возрасте 22 дня в количестве 20 голов в каждой. Первая группа была контрольной, в которой цыплят не иммунизировали.
3
6
6
6
3
5
6
6
3
В опытных группах вакцину вводили перорально цыплятам в объеме 0,5 см с содержанием микробных клеток 1,0×10, 2,0×10 и 4,0×10 в 1 см физиологического раствора на голову (соответственно 5,0×10, 1,0×10 и 2,0×10 микробных клеток в 0,5 см).
7
3
Через 23 дня после иммунизации проводили пероральное заражение цыплят смесью вирулентных культур из штаммов Е.coli №389 (O78), Е.coli №388 (O2) и Е.coli №1 в дозе 6,0×10 микробных клеток в 0,5 см на голову.
Спустя 12 дней после заражения (в возрасте 57 дней) проводили взвешивание и вынужденный убой птицы, после чего изучали патоморфологические изменения внутренних органов.
Результат изменения привесов цыплят при заражении вирулентной культурой иммунизированных данной вакциной и контрольных цыплят представлен в таблице 1.
Таблица 1.
Хар-ка групп цыплят
Содержание микробных клеток в 1 см<sup>3</sup> физиологического раствора
Содержание микробн. клеток в иммуниз. дозе (0,5 см<sup>3</sup>)
Средний вес в группе в возрасте 45 дней (г)
Средний вес в группе в возрасте 57 дней (г)
Среднесуточный привес (г)
Контроль
-
-
240,4
208,0
-2,7
1 опытная
1,0×10<sup>6</sup>
5,0×10<sup>5</sup>
234,5
300,0
+5,5
2 опытная
2,0×10<sup>6</sup>
1,0×10<sup>6</sup>
256,0
300,0
+3,7
3 опытная
4,0×10<sup>6</sup>
2,0×10<sup>6</sup>
278,0
300,0
+1,8
5
6
3
Из данных таблицы 1 следует, что наибольшие привесы наблюдались при содержании микробных клеток в иммунизирующей дозе 5,0×10 или 1,0×10 микробных клеток в 1 см исходного раствора вакцины.
Патоморфологические изменения внутренних органов иммунизированных и неиммунизированных цыплят, зараженных вирулентными культурами штамма Е.coli, представлены в таблице 2.
Положительная динамика среднесуточных привесов у иммунизированных цыплят после заражения их вирулентными штаммами E.coli (см. таблицу 1), а также наименьший процент патоморфологчисеких изменений внутренних органов (см. таблицу 2) свидетельствуют о том, что подобранное экспериментальным путем содержание микробных клеток в иммунизирующей дозе достаточно для защиты цыплят от колибактериоза и в то же время не оказывает негативного влияния на физиологию роста цыплят.
Пример 2. Обоснование антитоксического действия вакцины.
7
3
Для доказательства того, что иммунизация данной вакциной из штамма E.coli «Б-5» создает не столько антибактериальную, сколько антитоксическую защиту, в сыворотке крови цыплят, описанных в примере 1 (иммунизированных заявляемой вакциной и затем через 23 дня зараженных смесью вирулентных культур из штаммов Е.coli №389 (O78), Е.coli №388 (O2) и Е.coli №1 в дозе 6,0×10 микробных клеток в 0,5 см на голову) определяли концентрации образующихся in vitro иммунокомплексов к токсинам указанных вирулентных штаммов.
В таблице 3 представлены концентрации иммунокомплексов к токсинсодержащему материалу (ТСМ) штаммов E.coli «Б-5», Е.coli №389 (O78), Е.coli №388 (O2) и Е.coli №1.
Таблица 3
№ опытной группы
Содержан. микробн. клеток в иммуниз. дозе (м.к.)
Концентрации иммунокомплексов к ТСМ штаммов Е.coli
Б-5
№1
№388 (O2)
№389 (O78)
1
5,0×10<sup>5</sup>
18,48
16,22
17,10
12,34
2
1,0×10<sup>6</sup>
13,78
11,12
13,22
9,14
3
2,0×10<sup>6</sup>
10,22
9,24
10,86
8,38
Из таблицы 3 следует, что в сыворотке крови образуются иммунокомплексы с токсинсодержащим материалом вирулентных штаммов, что подтверждает формирование эффективного антитоксического иммунитета у иммунизированных цыплят. Увеличение содержания микробных клеток в иммунизирующей дозе приводит к снижению концентрации иммунокомплексов ко всем исследуемым штаммам эшерихий (E.coli «Б-5», Е. coli №389 (O78), Е.coli №388 (O2) и Е.coli №1).
Пример 3. Оценку иммуногенных свойств вакцины проводили также путем определения содержания цитокинов (интерлейкинов ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, интерферона (ИФ-γ) и фактора некроза опухоли ФНО-α) в сыворотке крови при внутримышечном введении вакцины из штамма E.coli «Б-5».
Для этого формировали опытную и контрольную группы цыплят в возрасте 48 дней по 5 голов в каждой группе.
Через 11 дней проводили забор крови и определяли цитокины.
Определение интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли проводили с помощью набора реагентов тест-системы производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Постановку иммуноферментного анализа осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Результаты учитывали на спектрофотометре для микропланшетов при длине волны 490 нм (для ИЛ-1) и 492 нм (для ФНО-α). По значениям оптической плотности стандартного образца строили калибровочную кривую и с учетом оптической плотности образцов определяли концентрацию ИЛ-1 и ФНО-α.
Определение интерферона - γ и других интерлейкинов (ИЛ-4 и ИЛ-6) проводили согласно рекомендациям производителя с помощью набора реагентов тест-систем «γ-Интерферон-ИФА-БЕСТ» и «ИЛ-4-ИФА-БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-БЕСТ», г.Новосибирск. Учет результатов проводили по общепринятой методике.
Результат усредненных значений показателей представлен в таблице 4.
Таблица 4.
Характеристика группы
Содержание цитокинов (пг/мл)
ИЛ-1
ИЛ-4
ИЛ-6
ИФ-γ
ФНО-α
контрольная
118,8
11,1
12,8
42,9
10,7
опытная
550,2
19,3
28,7
110,2
28,5
В результате установлено, что вакцина активизирует выработку цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФ-γ, ФНО-α).
Таким образом, заявляемая вакцина эффективна, безвредна, обладает антитоксическим эффектом, протективными свойствами, не требует специального оборудования для изготовления, имеет низкую себестоимость и проста в применении.