СПОСОБ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
METHOD OF THERAPY OF MALIGNANT DISEASES

Изобретение относится к области медицины, а именно к применению препаратов на основе белка теплового шока (БТШ) 70.
Белки теплового шока (БТШ, HSP) играют важную роль в обеспечении гомеостаза организма и в экстремальных для организма условиях. К основным клеточным процессам, регулируемым БТШ, относятся клеточный цикл и деление, дифференцировка, эмбриогенез, апоптоз, сигнальная трансдукция, репарация ДНК, трансмембранный и везикулярный транспорт, реакция на стрессовые воздействия, в том числе на патогены.
Белки теплового шока относятся к семейству высоко консервативных внутриклеточных белков. Они подразделяются на несколько семейств в зависимости от их молекулярной массы: HSPH (Hsp110), HSPC (Hsp90), HSPA (Hsp70), DNAJ (Hsp40), семейство малых HSPB (sHSP), а также семейство шаперонинов HSPD/E (HSP60/HSP10) (Kampinga H.H., Hageman J., Vos M.J., et al. Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins. Cell Stress Chaperones. 2009; 14(1):105-111).
Наибольший интерес, по данным литературы, вызывают белки из семейства БТШ70 (Feder M.E., Hofmann G.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology // Annu. Rev. Physiol. - 1999. - Vol.61. - P.243-282; H. Hauser, L. Shen, Q.L. Gu et al. Secretory heat-shock protein as a dendritic cell-targeting molecule: a new strategy to enhance the potency of genetic vaccines // Gene Ther. - 2004. - Vol.11, №11. - P.924-932).
БТШ70 известен благодаря двум своим свойствам, которые, возможно, связаны друг с другом. Во-первых, белок обладает шаперонной активностью, то есть способностью связывать вновь синтезированные или поврежденные полипептиды с последующим восстановлением их структуры или удалением их из клетки. Действие шаперонного механизма, основанного на БТШ70, до конца не изучено. Однако установлено, что в нем участвует не только сам БТШ70, но и другие белки, в частности, активирующие его АТФазу. Шаперонный механизм, позволяющий проводить коррекцию сборки полипептидных цепей и крупных надмолекулярных комплексов во всех органеллах, необходим любой клетке в нормальных условиях, тем более при действии повреждающих агентов. Именно поэтому в условиях стресса, когда появляются неправильно собранные белковые системы, клетка включает аппарат синтеза БТШ70, что приводит к накоплению этого белка в высокой концентрации. Полное отсутствие экспрессии БТШ70 или его недостаточное количество в клетке может порождать различные патологии или усиливать чувствительность клеток, а следовательно, и организма в целом к стрессовым воздействиям. В то же время эксперименты по защите клеток от внешних поражающих факторов с помощью введенного экзогенного БТШ70 демонстрируют "спасающую" роль гетерологичного пептида. Поэтому в настоящее время все большее внимание биологов привлекает защитная роль БТШ70 при его экзогенном введении. Показано, например, что применение экзогенного БТШ70 in vitro увеличивает устойчивость культуры нервных клеток к тепловому стрессу и стауроспорин-обусловленному апоптозу (Guzhova I., Kislyakova K., Moskaliova О., Fridlanskaya I., Tytell M., Cheetham M., Margulis B. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance // Brain Res. - 2001. - Vol.914, №№1-2. - P.66-73; Negulyaev Y.A., Vedernikova E.A., Kinev A.V., Voronin A.P. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - Vol.1282, №1. - P.156-62).
Белки, относящиеся к семейству БТШ70, индуцируются в клетках и тканях всех известных организмов, включая человека, под действием огромного числа факторов абиогенного и натурального происхождения. В отдельной клетке млекопитающих имеется несколько членов семейства, однако только один из них, БТШ70 или БТШ72 (реже БТШ70), способен накапливаться в клетках в ходе их реакции на какое-либо воздействие.
На сегодняшний день достаточно подробно изучен защитный эффект БТШ70 в отношении целого ряда химических факторов: солей тяжелых металлов, различных химических соединений, являющихся неблагоприятными сопутствующими факторами химического производства, цитотоксических лекарственных средств, однако практически отсутствуют данные о профилактической эффективности БТШ70 в отношении токсинов, занимающих промежуточное положение между факторами химической и биологической природы.
Полагают, что при нормальных условиях БТШ70 "работает" в клетках как молекулярный шаперон, функция которого заключается в свертывании/развертывании, формировании ансамблей белков или их разрушении, а также транслокации цитоплазматических белков. В условиях стресса БТШ70 способствует удалению из клетки денатурированных белков, что облегчает нормальное функционирование клеток. Протективное действие БТШ70 может быть обусловлено и его способностью модифицировать активность кальций-зависимых калиевых каналов, как это наблюдается при его экзогенном применении.
В последние годы выяснилось, что члены семейства БТШ70 играют важную роль в онкогенезе и гибели клеток. С открытием их иммуномодулирующей противоопухолевой активности все больше и больше внимание исследователей привлекает возможность их использования в клинической онкологии. В настоящее время сформировалось два основных подхода к применению БТШ. Первое направление основано на пептид-связывающей функции БТШ, и их способности доставлять определенные опухолевые антигены в антиген-презентирующие клетки (АПК) с последующим формированием специфического иммунного ответа. Второе направление в терапии определяется их (прежде всего БТШ90) исключительной ролью в поддержании внутриклеточного гомеостаза. При внутри- или подкожном введении БТШ индуцируют как адаптивный, так и врожденный иммунный ответ за счет антиген-презентирующих клеток (АПК), таких как макрофаги и дендритные клетки. Избирательное выключение функции БТШ различными фармакологическими агентами приводит к гибели раковых клеток и задержке роста опухоли, однако данное воздействие является высокоспецифичным для каждого типа опухоли и индивидуальным для каждого пациента.
В частности, для профилактики и лечения опухолей предлагается композиция, содержащая БТШ70 или его фрагмент и опухолевоспецифический пептид (RU 2283129, 2006). Недостатком такой композиции является значительное число противопоказаний, связанных с воздействием на организм пептида.
Известны работы в области создания противоопухолевых препаратов на основе гибридных, слитых и других белков HSP. Например, в опубликованной заявке на изобретение РФ №2003101965/14, опубл. 07.2004 г., описан способ лечения заболеваний, связанных с вирусом папилломы человека (бородавки, рак шейки матки и прямой кишки и т.д.) с помощью композиции, содержащей гибридный белок, включающий микобактериальный белок теплового шока (HSP65 или HSP70 из Mycobacterium bovis) и белок вируса палилломы. Лечение может осуществляться либо путем введения субъекту рекомбинантного гибридного белка, либо путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, которая содержится в вирусном векторе.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание более эффективного способа лечения опухолевых/онкологических заболеваний при помощи БТШ70.
Технический результат заключался в получении достаточно эффективного способа лечения опухолевых/онкологических заболеваний, что достигалось использованием БТШ, полученного с помощью разработанного авторами штамма-продуцента Escherichia coli BB 1553, трансформированного векторной плазмидой pMSHsp70. Как показали проведенные исследования, полученный по данной технологии белок эффективен для лечения опухолей мозга и меланомы при его введении интратуморально в однократной суточной дозе 0,5 мг белка. Лечение включает в себя курс из 5-8 инъекций с интервалом в 1-2 дня.
Исходный препарат представляет собой раствор или лиофилизат для приготовления раствора для инъекций по 0,5 мг белка в ампуле.
Сущность и преимущества способа иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Оценка терапевтической эффективности локальной аппликации БТШ70 изучалась в модели подкожной меланомы B16F10 у мышей линии C57BL/6. В эксперименте животные были разделены на три группы (по 10 животных в каждой группе; n=30): (1) контрольная группа (n=10); (2) многократное введение БТШ70 (n=10); (3) многократное введение 0.9% физиологического раствора (n=10).
6
Для создания модели подкожной меланомы животным подкожно вводилось 1×10 клеток меланомы B16F10 в питательной среде DMEM (содержащей 10%-ую сыворотку плодов коровы (FBS), 2 мМ L-глутамин, гентамицин). Спустя 7 дней от момента имплантации опухоли производилась трехкратная интратуморальная инъекция (на 7, 9 и 11-е сутки) белка теплового шока (15 мкг БТШ70 в физиологическом растворе на одну инъекцию; 10 мкл объем одной инъекции). В качестве контроля производилось трехкратное внутриопухолевое введение 0.9% физиологического раствора (10 мкл на одно введение) в те же сроки от момента имплантации глиомы, что и при введении БТШ70. Оценивалась выживаемость животных с построением кривых Каплана-Мейера.
По результатам исследования было выявлено, что внутриопухолевая инфузия белка БТШ70 статистически достоверно увеличивает выживаемость животных (P<0,001). Так, в контроле средняя продолжительность жизни животных составила 21,3±1,3 дня (приведены среднее и стандартная ошибка среднего, M±SE). Трехкратная внутриопухолевая инъекция БТШ70 приводила к увеличению выживаемости - 33,19±2,3 дня, что статистически отличается от контроля и от группы с трехкратным введением физиологического раствора (выживаемость - 21,0±2,2 дня) (P<0,001).
Дополнительно к оценке выживаемости мышей было произведено измерение веса опухолевого узла. Животные были разделены также на три группы по 10 мышей в каждой. На 16-е сутки от момента имплантации клеток B16F10 и проведения инъекций БТШ70 или физиологического раствора животные были выведены из эксперимента, произведен забор опухолевого узла. При сравнении веса опухолевых узлов было выявлено статистически достоверное различие по группам. В контроле вес меланомы составил 2,9±0,6 граммов, тогда как в случае применения БТШ70 вес опухоли не превышал 1,1±0,7 граммов (при введении физиологического раствора - 3,1±0,8 граммов) (P<0,001). Полученные результаты исследования подтверждают терапевтическую эффективность многократного внутриопухолевого введения БТШ70 в модели подкожной меланомы.
Пример 2. Больная М., 10 лет (06.08.2000 г.р.) поступила на отделение нейрохирургии детского возраста ФГУ РНХИ им. проф. А.Л. Поленова с жалобами на выраженные головные боли, иногда сопровождающиеся тошнотой и рвотой. Описанная симптоматика появилась с декабря 2010 г.
На компьютерной томограмме (КТ) головного мозга в области левой гемисферы мозжечка и черве мозжечка выявлено объемное образование с нечеткими и неровными контурами размерами 42×42×33 мм, деформирующее IV желудочек. Выполнено хирургическое лечение: костно-пластическая субокиципитальная краниотомия, частичное удаление опухоли левого полушария и червя мозжечка. Гистологическое исследование выявило анапластическую астроцитому (степень анаплазии III).
По окончании операции в ложе удаленной опухоли был имплантирован силиконовый катетер. На контрольной послеоперационной магнитно-резонансной томографии головного мозга с контрастным усилением отмечалось незначительное накопление контрастного вещества по задне-медиальной поверхности ложа левой гемисферы мозжечка.
Больной было выполнено введение препарата БТШ70 в дозе 500 мкг на 1 введение в 0,5 мл физиологического раствора на 1, 3, 5, 7 и 9 сутки после операции (общая доза составила 2,5 мг белка).
Через 1,5-2 часа после каждого введения препарата отмечалось повышение температуры тела до 38°C, появление головных болей незначительной интенсивности (grade II). Указанные симптомы проходили самостоятельно через 5-6 часов и не требовали симптоматической терапии.
Через 4 недели от момента последней инъекции белка на контрольной МРТ головного мозга по окончании курса введения препарата данных, свидетельствующих о наличии патологической ткани, не выявлено, что было расценено как полный ответ на проведенную терапию согласно радиологическим критериям Macdonald et al.
Для оценки формирования специфического противоопухолевого ответа был проведен тест гиперчувствительности замедленно типа (тест ГЗТ), когда внутрикожно в область предплечья пациента до курса терапии и по его окончании вводятся аутологичные опухолевые антигены. В рассматриваемом клиническом наблюдении после введения БТШ70 результаты теста ГЗТ были положительные, что может свидетельствовать в пользу формирования противоопухолевого иммунного ответа.
По данным иммунологических исследований субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови отмечался рост уровня Т-лимфоцитов (включая субпопуляции CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+HLA DR+), повышение спонтанной и индуцированной продукции цитокинов INFγ, TNFα.
По окончании курса лечения БТШ70 отмечена стабилизация состояния пациент и он был переведен для дальнейшего наблюдения в онкологический диспансер по месту жительства.
Пример 3. Больной 4 лет (04.04.2006 г.р.) поступил на отделение нейрохирургии детского возраста ФГУ РНХИ им. проф. А.Л.Поленова с жалобами на периодические головные боли, сопровождающиеся на высоте головных болей многократной рвотой; общую слабость, быструю утомляемость.
Из анамнеза известно, что с ноября 2010 г. мальчик стал жаловаться на интенсивные головные боли в течение дня, стал вялым, слабым, адинамичным. Затем головные боли стали сопровождаться многократной рвотой (приносящей больному облегчение), головокружением.
По этому поводу больной обследовался по месту жительства. На компьютерной томограмме (КТ) головного мозга выявлено объемное образование правой теменной доли 82×53 мм. Больному выполнено хирургическое лечение: костно-пластическая краниотомия в правой теменной области, частичное удаление опухоли правого бокового желудочка, имевшей серо-синюшный цвет, плотно-эластическую консистенцию. Гистологическое исследование - хориодкарцинома (анаплазия IV).
Больному в ложе удаленный опухоли был имплантирован силиконовый катетер для последующего введения БТШ70. В послеоперационном периоде проведен курс препарата БТШ70 в дозе 400 мкг на 1 введение в 0,5 мл физиологического раствора на 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 14 сутки после операции (общая доза составила 2,8 мг белка;).
Спустя 1 час от момента введения препарата у больного отмечался подъем температуры до 37,5-38°C, появление головных болей выраженной интенсивности (grade III) и рвоты (grade II) на высоте головной боли. Указанные реакции купировались симптоматической терапией.
По результатам контрольной МРТ головного мозга, проведенной через 4 недели после последней инъекции БТШ70, отмечался частичный ответ на проведенное лечение (согласно критериям Macdonald et al.). Результат ГЗТ-теста был положительным. По данным иммунологических исследований в периферической крови отмечалось повышение уровня Т-лимфоцитов, увеличение спонтанной и индуцированной продукции цитокинов INFγ, TNFα. Отмечено снижение уровня иммуносупрессивных Т-регуляторных клеток и продукции интерлейкина-10. По окончании курса введения БТШ70 отмечалась стабилизация состояния и пациент был переведен для дальнейшего лечения в онкологический диспансер по месту жительства
Пример 4. Были проведены исследования по безопасности внутриопухолевого введения белка теплового шока (БТШ70). У нейро-онкологических больных (n=12) с впервые выявленными опухолями без предшествующего лечения было продемонстрировано, что локальная аппликация БТШ хорошо переносится больными с приемлемым профайлом токсичности. После максимально возможной резекции опухоли в ложе удаленного новообразования имплантируется катетер для послеоперационного введения раствора белка теплового шока БТШ70. Далее проводится курс инъекций (всего 5-8 инъекций на курс с периодичностью через 1-2 дня).
Согласно радиологическим критериям Macdonald et al у 9 пациентов не наблюдалось изменений по данным магнитно-резонансной томографии (МРТ) (стабилизация заболевания), у 1 пациента отмечался полный ответ, у 1 пациента - частичный ответ, 1 - прогрессия заболевания.
Пример 5. Анализ специфического противоопухолевого ответа оценивался методом тестирования гиперчувствительности замедленного типа (DTH). При иммунологическом исследовании периферической крови у всех 12 пациентов отмечался рост Т-лимфоцитов в периферической крови (включая субпопуляции CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+HLADR+) (p<0,001). Параллельно росту относительного количества Т-лимфоцитов снижалось содержание В-лимфоцитов.
1
Анализ продукции цитокинов выявил увеличение сывороточного уровня содержания, а также спонтанной и индуцированной продукции цитокинов INFγ, TNFα. При этом статистически значимо снижалась продукция IL-4, IL-6 (p<0,001). Указанные изменения свидетельствуют в пользу формирования Т-клеточного иммунного ответа (по Th-хелперному типу). Анализ популяции Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+CD127-) показал значимое их снижение в динамике в результате введения Hsp70. Продукция цитокина IL-10 также значимо снижалась (p<0,001). Таким образом, под воздействием БТШ70 происходит активация Т-клеточного ответа иммунной системы с подавлением супрессорных регуляторных лимфоцитов.
Данные экспериментов на различных моделях опухолей показывают эффективность действия БТШ70 в модуляции противоопухолевого иммунного ответа организма. Этот вывод основан на результатах теста активации цитотоксических лимфоцитов, согласно которым введение БТШ70 увеличивает на 25-30% токсичность естественных клеток-киллеров в системе in vitro и на 30-40% специфическую активность Т-клеток). Кроме того, установлено, что его внутриопухолевое введение на 40% увеличивает продукцию гамма-интерферона в организме животных. Наконец, инъекция в опухоль вызывает мощную инфильтрацию последней естественными клетками-киллерами и CD4- и CD8-позитивными лимфоцитами. Таким образом, внутриопухолевое введение препарата БТШ70 вызывает задержку опухолевого роста через активацию систем врожденного и адаптивного иммунитета и способен активировать Т-клетки за счет образования комплекса с опухолевыми антигенами и перенесения их в антиген-презентирующие клетки, после чего запускается система специфического иммунного ответа.