Полиморфизм генов цитокинов у новорожденных с внутриутробными инфекциями

Полиморфизм генов цитокинов у новорожденных с внутриутробными инфекциями

Н.Д. Гулыев, Н.Д. Рагимова

Научно-исследовательский институт педиатрии им. К.Фараджевой, Баку, Азербайджан

Cytokine gene polymorphisms in newborn infants with intzauterine infections

N.D. Guliev, N.D. Ragimova

K. Faradzheva Research Institute of Pediatrics, Baku, Azerbaijan

Проведено изучение ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов интерлейкинов ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 у 50 новорожденных с внутриутробными инфекциями и у 76 здоровых новорожденных. Установлена связь аллельных вариантов генов этих цитокинов с уровнем их продукции. У наблюдавшихся новорожденных определена нуклеотидная последовательность промоторных участков гена ИЛ-1р в позициях —31, +3954, —511, ИЛ-6 в позициях —174, —572, —597, ИЛ-18 в позициях —656, —137, +105 и ИЛ-10 в позициях —592, —819. Установлено, что нуклеотидные полиморфизмы (SNP), локализованные в промоторах регуляторных участках генов указанных цитокинов, способствуют их влиянию на транскрипционную активность, тем самым изменяя уровень соответствующих цитокинов. Полученные данные позволяют использовать результаты определения полиморфизма генов цитокинов у новорожденных в качестве предиктора врожденной инфекции.

Ключевые слова: новорожденные, внутриутробные инфекции, полиморфизм гена, интерлейкин-6, интерлейкин-1,интерлей-кин-1р, интерлейкин-10, интерлейкин-18.

The association of interleukin (IL) 1p, IL-6, IL-10, and IL-18 gene promoter region polymorphisms was investigated in 50 newborn infants with intrauterine infections and in 76 healthy neonates. The allelic variants of the genes of these cytokine were established to be related to their production levels. The examined neonatal infants showed nucleotide sequence in the promotor regions of IL1p gene at positions -31, +3954, and -511, IL-6 at positions -174, -572, and -597, IL-18 at positions -656, -137, and +105, and IL-10 at positions -592, -819 and -1082. The single nucleotide polymorphisms (SNP) in the promotor regions the genes in the above-mentioned cytokines were found to influence their transcriptional activity, thus altering the level of the respective cytokines. The findings make it possible to use the results of identifying cytokine gene polymorphisms as a predictor of neonatal congenital infection.

Key words: neonatal infants, intrauterine infections, gene polymorphism, interleukin-6, interleukin-1, interleukin-ip, interleukin-10, interleukin-18.

Внутриутробные инфекции — наиболее актуальные и дискуссионные проблемы современной неонатологии, так как они занимают ведущее место в причине мертворождаемости, преждевременных родов, младенческой смертности, заболеваемости и ранней инвалидизации.

В настоящее время многие авторы отмечают значительную роль цитокинов в патогенезе развития инфекционного процесса у новорожденных, а также их информативности в прогнозе реализации инфекции [1—4]. Выработка цитокинов в ответ на различные экзогенные агенты является генетически детерминированной. Согласно последним данным различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут влиять на уровень продукции цитокинов и тем самым на характер развития и протекания иммунного ответа [5].

Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, причем количество полиморфных участков в одном гене может достигать

© Н.Д. Гулиев, Н.Д. Рагимова, 2015 Ros Vestn PerinatolPediat 2015; 6:42-47

Адрес для корреспонденции: Гулиев Насиб Джафар оглу — д.м.н., проф., директор Научно-исследовательского института педиатрии Рагимова Наиля Джалил гызы — к.м.н., доцент, зам.директора по науке указанного учреждения Az 1065 Баку, ул.Басти Багирова, д. 17.

нескольких десятков. Они локализованы как в кодирующих участках гена — экзонах, так и в некодирую-щих интронах и, что особенно важно, в промоторных участках гена. Именно эти участки ДНК определяют количество белкового компонента [6—10].

Целью настоящего исследования явилось изучение ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов интерлейкинов — ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 у новорожденных с внутриутробными инфекциями.

Характеристика детей и методы исследования

Проведено комплексное проспективное контролируемое обследование новорожденных детей, находившихся на лечении в отделениях анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии и патологии доношенных и недоношенных детей Научно-исследовательского института педиатрии им. К.Я. Фарадже-вой (Баку, Азербайджан) в 2012—2014 гг.

С целью исследования цитокинового статуса у новорожденных с вирусными и бактериальными инфекциями в сыворотке крови определялось содержание иммуноглобулинов IgM и IgG. Проводился имму-ноферментный анализ (ИФА) стандартным методом с помощью набора реактивов «Human» (Германия) на анализаторе «Sirio» (Италия). Для уточнения этиологии врожденной инфекции осуществляли иссле-

дование биологических сред ребенка (кровь, слюна, моча) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводили бактериологическое исследование различных сред организма, как нестерильных локусов, так и гемокультуры. Уровень цитокинов определяли стандартным методом твердофазового («сэндвич»-ва-риант) ИФА с использованием диагностических тест-систем производства «Вектор-Бест» (Новосибирск). Образцы сыворотки крови (0,5—1,0 мл) новорожденных, взятые на 3-5-е сутки жизни, хранили до определения цитокинов при —20 °С.

Полиморфизм генов промоторных регионов ИЛ-1р в позициях (—31), (+3954), (—511), ИЛ-6 в позициях -174, -572, -597, ИЛ-18 в позициях -656, -137, +105 и ИЛ-10 в позициях -592, -819 и -1082 определялся у 76 здоровых и 50 новорожденных с внутриутробными инфекциями. Сравнительный анализ полиморфизма генов интерлейкинов проводился по следующей методике. Образцы сыворотки крови (5 мл) смешивались с 0,5 МЭДТА и хранились при -20 °С. Экстракция ДНК проводилась по методу «Saltinout». С целью определения полиморфизма генов использовались методы PCR-RFLP (Polimeraza change reaction - полимеразная цепная реакция-Restriction Fragment Length Polymor-physm - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). При амплификации генов различных цито-кинов использовались олигонуклеотидные праймеры, комплементарные фланкирующим областям амплифи-цируемого ДНК фрагмента. После ПЦР амплифициро-ванные фрагменты ДНК при помощи рестриктазы Taq 1 расщеплялись на фрагменты. Фрагменты RFLP наносились на 2% агарозные гели с 1хТАЕ буфером (40 mM Трис-ацетат, 1 mM ЭДТА pH 8,0) и проводился электрофорез. В последующем гелевые пластинки окрашивались 0.05% раствором бромида этидия. Частота соответствующих аллелей и генотипов у наблюдавшихся здоровых и инфицированных детей рассчитывалась по агарозным гелям. Достоверность полученных данных определялась при помощи х2 -теста с использованием SPSS компьютерной программы.

С целью определения функционального полиморфизма генов ИЛ-1-p, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 проводилось наблюдение за 63 новорожденными с внутриутробной инфекцией, верифицированной ИФА и ПЦР. Среди инфицированных новорожденных диагностирована цитомегаловирусная инфекция у 27, микст-инфекция (цитомегаловирус+герпесвирус, цитомегало-вирус+токсоплазма) у 20 и бактериальная инфекция у 16 новорожденных. Из них у 7 новорожденных был диагностирован сепсис, у 9 - локальный воспалительный процесс инфекционного генеза (пневмония, пиодермия, омфалит, остеомиелит, конъюнктивит, отит).

Из 63 детей 37 родились доношенными и 26 недоношенными. Средний гестационный возраст доношенных детей на момент рождения составил 38,5±0,2 нед, недоношенных детей с низкой мас-

сой тела — 33,6±0,3 нед, с очень низкой массой тела — 29,6±0,4 нед, с экстремальной низкой массой тела — 26,3±0,5 нед. При этом колебания среднего значения массы тела у доношенных новорожденных находились в пределах 3000±117 г, у недоношенных детей — 1892±42, 1226±29 и 900±62 г соответственно. Контрольную группу составили 76 новорожденных без признаков инфекции.

Результаты и обсуждение

Ведущими в клинической картине заболевания у наблюдавшихся новорожденных выступали интоксикационный, желтушный синдромы, неврологические расстройства, синдром дыхательных расстройств. Полиморфизм проявлений внутриутробных инфекций был обусловлен рядом гомеостатических особенностей организма, а также врожденным иммунодефицитом. Дыхательная недостаточность сохранялась длительное время, а также развивалась пневмония. Течение раннего периода адаптации у инфицированных новорожденных осложнялось гнойным коньюнктиви-том, бронхолегочными нарушениями. У новорожденных с выявленными сочетанными внутриутробными инфекциями отмечалась гепатоспленомегалия.

Изучение особенностей неврологического статуса у наблюдавшихся новорожденных показало высокую частоту и степень выраженности неврологических симптомов. При анализе неврологического статуса наиболее часто выявлялось гипоксическое поражение ЦНС — у 44 (70,0%) новорожденных. Синдром повышенной возбудимости достоверно чаще наблюдался у детей с цитомегаловирусной инфекцией и со смешанной вирусной инфекцией (у 22,0 и 30% соответственно). Синдром угнетения отмечался чаще у детей со смешанной инфекцией (у 80%).

Для инфицированных новорожденных было характерно наличие судорожного синдрома. Судороги носили преимущественно фокальный или мульти-фокальный характер. Судороги отмечались у 18,8% детей с бактериальной инфекцией, тогда как у детей с цитомегаловирусной инфекцией — лишь у 10%.

По результатам анализа характера структурных изменений в головном мозге, полученным при использовании инструментальных методов исследования, у доношенных и недоношенных детей преобладали внутричерепные кровоизлияния. При нейросоногра-фии встречались также такие поражения, как вентри-куломегалия и вентрикулит, являющиеся проявлением генерализованной внутриутробной инфекции. Формирование множественных кист и перивентри-кулярной лейкомаляции чаще наблюдалось у новорожденных со смешанной инфекцией.

Изучение уровня интерлейкинов у новорожденных с врожденными инфекциями выявило наличие дисбаланса в цитокиновом профиле и преобладание ТЫ компонента иммунного ответа. Это подтверждалось повышением уровня провоспалитель-

ных (ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-18) цитокинов и снижением уровня противовоспалительного цитокина (ИЛ-10) в сравнении с показателями контрольной группы.

В результате исследования полиморфизма генов ИЛ-6 в позициях -174 G/C, -572 G/C и -572 G/A были выявлены достоверно значимые различия ал-лельных вариантов G и C между здоровыми и инфицированными новорожденными в позиции -174. Так, у больных установлен значительно более высокий уровень аллеля G (у 65% больных и у 43,4% здоровых). Частота аллеля С у здоровых новорожденных равнялась 56,6%; встречаемость СС генотипа составляла 47,4%.

Также была установлена зависимость между ал-лельными вариантами в позиции -572 G/C. Низкая встречаемость аллеля G (65,8%) отмечена у новорожденных контрольной группы, в то время как у инфицированных она составила 88%. В позиции -572 установлена коррелятивная связь между аллелями G/C и генотипом больных детей. Частота аллеля C значительно ниже (в 2,8 раза) у больных новорожденных. Помимо этого гомозигота CC не встречалась у инфицированных новорожденных, тогда как у здоровых ее частота составила 17,1%. Статистическая корреляция между заболеванием и аллельными вариантами G/A в позиции -597 не обнаружена.

Особый интерес представляет зависимость от га-плотипов и гаплогенотипов у здоровых и больных новорожденных. Частота гаплотипа GCC в контрольной группе составила 24,3%, у больных - 2%. Соответственно этому у здоровых новорожденных частота гаплогенотипа GCC/GCC составила 17,1%; у больных данный гаплогенотип не обнаружен. Полученные нами данные свидетельствуют об ассоциации аллельных вариантов гена ИЛ-6 с внутриутробными инфекциями, в особенности в позициях -572 G/C(C^G) и 174 G/C(C^G). Носители аллельного варианта -572G и -174 G гена ИЛ-6 имеют повышенный риск к инфекциям по сравнению с вариантом C/C в этих локусах.

Определение нуклеотидных последовательностей С и Т в регуляторной части промотора гена ИЛ-1р за исключением позиции -511 не показало ассоциации с внутриутробными инфекциями. Частота аллеля С в ИЛ-1р позиции -511 была выше у больных новорожденных по сравнению со здоровыми. Частота T аллеля и TT генотипа гена ИЛ-1р была выше у здоровых детей. Следует отметить, что установленные точечные мутации в промоторной части гена ИЛ-1р (-511 вариант) оказывают влияние на развитие и формирование перинатальных инфекций и значительно повышают риск заболеваний (табл. 1).

В ряду иммунорегуляторных медиаторов ИЛ-18 занимает особое положение, так как является одним из ключевых цитокинов, участвующих в формировании врожденного и приобретенного иммунного ответа. Нами изучалась частота встречаемости аллельных вариантов в промоторе гена ИЛ-18 в пози-

циях —656, —137, +105 у новорожденных с внутриутробными инфекциями и у здоровых новорожденных (табл. 2). Исследование полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции —656 выявило однонуклео-тидные замещения у новорожденных с внутриутробными инфекциями. У инфицированных детей в позиции —656 ИЛ-18 наблюдалась низкая частота Т аллеля по сравнению со здоровыми (соответственно 31 и 52,6%), гомозигот с генотипом ТТ было на 30% больше в группе здоровых. В когорте больных только у одного ребенка встречался генотип ТТ.

Обратная зависимость наблюдалась по G аллель-ному варианту. Носителей аллеля G в контрольной группе было 47,4%, в группе больных — 69%. Таким образом, выявлено статистически значимое повышение частоты аллеля G (T^G) в позиции —656 у новорожденных с внутриутробными инфекциями. Определение аллельных вариантов полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в позиции —137 показало снижение частоты встречаемости аллеля G (65%) и генотипа GG (52%) у больных детей по сравнению с контрольной группой — соответственно 79,6 и 68,7%. Достоверной разницы в позиции + 105 гена ИЛ-18 между инфицированными и здоровыми новорожденными не отмечено.

Четкая закономерность по локусу ИЛ-18 наблюдалась по частоте встречаемости гаплотипов и гапло-генотипов. Носители CTG гаплотипа в группе здоровых детей составляли 7,9%, в то время как у больных этот гаплотип не встречался. Аналогичная картина отмечена при сравнении ATG/CTG гаплогеноти-па, который не был выявлен у больных, в то время как у здоровых составлял 15,8%.

Выявленная ассоциация продукции ИЛ-18 с ал-лельными вариантами промоторного региона гена ИЛ-18 в позициях —656 и —137 свидетельствует о генетической детерминированности уровня синтеза этого интерлейкина. В свою очередь установленное возрастание частоты встречаемости генотипов, ассоциированных с высоким уровнем продукции ИЛ-18, указывает на патогенетическую активность при внутриутробной инфекции.

Сочетанное носительство гаплогенотипа может оказывать существенное влияние на соотношение экспрессии и продукции этих белков и служить одной из основных причин дисрегуляции воспалительного процесса. Причинами разницы в продукции цитокина могут быть обусловленные мутацией изменения скорости транскрипции, стабильности мРНК или активности синтезируемого белка.

Данные о связи продукции ИЛ-18 с аллельным полиморфизмом промотора гена у больных с внутриутробными инфекциями и здоровых новорожденных представляют несомненный интерес. Функциональная значимость однонуклеотидных мутаций в промо-торной области гена выражается в стимуляции продукции гена ИЛ-18 у инфицированных детей.

Таблица 1. Частота встречаемости аллелей и генотипов по локусам генов ИЛ-6, ИЛ-1р у здоровых и больных новорожденных

Генотип Больные

ИЛ-6

GG 27

GC 11

СС 12

Частота аллелей абс., %

G 65

С 35

Равенство Харди-Вайнберга 0.001** 0,00**

Тест х2

GG, GC, СС 0,026*

GG, СС 0,007**

GG, GC+CC 0,028*

GG+GC, СС 0,008**

G, С 0,019*

ИЛ-6

GG 38

GC 12

СС 0

Частота аллелей, абс. %

G 44

С 6

Равенство Харди-Вайнберга 0.548™ 0,248™

Тест х2

GG, GC, СС 0,001**

GG, СС 0,001**

GG, GC+CC 0,002**

GG+GC, СС 0,002**

G, С 0,005**

ИЛ-1Р

СС 29

СТ 11

ТТ 10

Частота аллелей абс.

С 34.5

Т 15.5

Равенство Харди-Вайнберга 0,004** 0,020*

Тест х2

СС, СТ, ТТ 0,001**

СС, ТТ 0,000**

СС, СТ+ТТ 0,000**

СС+СТ, ТТ 0,004**

С, Т 0,002**

Примечание. Здесь и в табл. 2: *-5%, **-1% — статистическая значимая разница.

Определение полиморфизма промоторной части гена ИЛ-10 показало, что гомозиготные носители аллелей СС имеют повышенный риск к инфекциям, а также высокий уровень синтезируемого ИЛ-10. Гомозиготные носители аллельного варианта СС полиморфного локусов -592 и -819 исходно продуцируют большее количество цитокина ИЛ-10 по сравнению с генотипами АА и ТТ.

Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружены функционально значимые полиморфизмы в промоторном регионе гена Ш-10 в позиции -592 А/С, -819 Т/С, возникшие в результате одиночных нуклеотидных замен.

Ассоциация, установленная между однонуклео-тидными заменами в генах интерлейкинов и частотой заболеваемости внутриутробными инфекциями, способствует определению групп риска и генотипов предрасположенности к инфекциям. Эти данные могут быть использованы как эффективные мар-

Таблица 2. Частота встречаемости аллелей и генотипов по локусам ИЛ-18, ИЛ-10 у здоровых и больных новорожденных

керы для прогнозирования. Особый интерес представляет прямая корреляционная зависимость между аллельными вариантами генов интерлейкинов и продукцией соответствующих цитокинов. Выявленная ассоциация уровня цитокинов с аллельными вариантами промоторных регионов генов интерлей-кинов свидетельствует о генетической детерминированности их продукции.

Таким образом, установлено, что нуклеотид-ные полиморфизмы (SNP), локализованные в промоторах регуляторных участков генов цитокинов, способствуют их влиянию на транскрипционную активность генов, тем самым изменяя уровень соответствующих цитокинов. Полученные данные позволяют использовать определение полиморфизма генов цитокинов у новорожденных в качестве предиктора врожденной инфекции.

Генотип ИЛ-18

TT 1

TG 29

GG 20

Частота аллелей, абс. %

T 15,5

G 34,5

Равенство Харди-Вайнберга 0,016* 0,770ns

Тест х2

TT, TG, GG 0,000**

TT, GG 0,000**

TT, TG+GG 0,000**

TT+TG, GG 0,07ns

T, G 0,018*

ИЛ-18

GG 26

GC 13

CC 11

Частота аллелей, абс. %

G 32

C 17

Равенство Харди-Вайнберга 0,008** 0,041*

Тест х2

GG, GC, CC (Additiv) 0,096ns

GG, CC 0,044*

GG, GC+CC 0,044*

GG+GC, CC 0,078ns

G, C 0,069ns

ИЛ-10

TT 0

Продолжение Таблицы 2.

ТС 16

СС 34

Частота аллелей, абс. %

Т 8

С 42

Равенство Харди—Вайнберга 0,175ns 0,730ns

X2

ТТ, ТС, СС 0,001**

ТТ, СС 0,000**

ТТ, ТС+СС 0,001**

ТТ+ТС, СС 0,002**

Т, С 0,005**

ИЛ-10

АА 0

АС 16

СС 34

Частота аллелей, абс. %

А 8

С 42

Равенство Харди-Вайнберга 0,175ns 0,730ns

Тест х2

АА, АС, СС 0,001**

АА, СС 0,000**

АА, АС+СС 0,001**

АА+АС, СС 0,002**

А, С 0,005**

ЛИТЕРАТУРА

1. Шабалов Н.Н. Общебиологическая проблема: закономерности и их последствия перинатального инфицирования человека. Педиатрия 2012; 91: 3: 27.

2. Тирская Ю.И., Белкова Т.Н., Рудакова Е.Б. и др. Врачебная тактика при внутриутробных инфекциях. Акушерство и гинекология 2011; 8: 42-47.

3. Васильев В.В., Скрипченко Н.В., Романова Е.С. и др. Диагностика и прогнозирование некоторых врожденных инфекций в системе беременная-плод-ребенок первого года жизни. Рос вестн перинатол и педиатр 2013; 58: 3: 92-97.

4. Sampedo M.A., Martines L.A., Teatino P.M., Rodriguez-Granger J. Diagnosis of congenital infection. Enferm infect Microbiol Clin 2011; 29: Suppl 5: 15-20.

5. Долгих Т.И., Белкова Т.Н., Тирская Ю.И. др. Клинико-иммунологические аспекты внутриутробных инфекций с поражением центральной нервной системы у новорожденных. Цитокины и воспаление 2011; 1: 12-17.

6. Мироненко М.И., Долгих Т.И. Роль аллельного полиморфизма генов CD14, TLR2, TLR6 в развитие инфекции, вызванной семейством Herpesviridae. Мед иммунол 2010; 12: 1-2: 151-154.

7. Цыган В.Н., Иванов А.М., Камилова Т.А. и др. Генный полиморфизм иммуногенетической сигнальной системы. Инфектология 2011; 3: 2: 21-27.

8. Клаг У.С., Каммингс М.Р. Основы генетики. Пер. с англ. М.: Техносфера, 2009; 896.

9. Макконки Э. Мир биологии и медицины. Геном человека. Пер. с англ. М.: Техносфера, 2009; 288.

10. Hallman M. Premature birth and diseases in premature infants: common genetic background? J Matern Fetal Neonatal Med 2012; 25: Suppl 1: 21-24.

Поступила 09.02.15