СПОСОБ И СИСТЕМА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА

1. Способ хроматографии по существу APF для получения комплекса биологически активного ботулинического нейротоксина типа А, включающий следующие последовательные этапы:
(а) культивацию бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF);
(б) ферментацию бактерий Clostridium botulinum из питательной среды в примерно от 2 до примерно 75 л среды ферментации по существу APF, при этом, по меньшей мере, одна питательная среда и среда ферментации включают белок растительного происхождения;
(в) сбор среды ферментации путем удаления остатков клеток, присутствующих в среде ферментации;
(г) концентрацию собранной среды ферментации путем фильтрации;
(д) разведение концентрированной среды ферментации путем добавления буфера;
(е) первый этап контакта, в ходе которого разведенная собранная среда ферментации контактирует с анионообменной средой, таким образом, биологически активный ботулинический нейротоксин улавливается анионообменной средой;
(ж) элюирование уловленного ботулинического нейротоксина из анионообменной среды с получением первого элюента;
(з) второй этап контакта, в ходе которого первый элюент контактирует с катионообменной средой для удаления примесей из первого элюента, в результате чего получают второй элюента;
(и) обработку второго элюента диафильтрацией и
7
7
(к) фильтрацию обработанного второго элюента с получением комплекса биологически активного ботулинического нейротоксина типа А с использованием способа хроматографии по существу APF, при этом полученный комплекс ботулинического нейротоксина типа А обладает активностью от 2,0·10 до примерно 6,0·10 единиц/мг комплекса ботулинического нейротоксина типа А.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда ферментации включает не более чем примерно 5% в/о белкового продукта растительного происхождения, не более чем примерно 2% в/о экстракта дрожжей и не более чем примерно 2% в/о глюкозы, при этом уровень рН среды ферментации составляет от примерно 6,5 до примерно 8,0 на начало этапа ферментации.
3. Способ по п.1. отличающийся тем, что этап культивации проводят до тех пор, пока значение оптической плотности питательной среды при примерно 540 нм не составляет от примерно 0,8 до примерно 4,5 ЕП.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап ферментации проводят в течение от примерно 60 до примерно 80 ч и до тех пор, пока значение оптической плотности среды ферментации при примерно 890 нм не снизится до значений от примерно 0,05 до примерно 0,7 ЕП.
4
7
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап культивации начинают путем введения рабочего банка клеток Clostridium botulinum (APF) в питательную среду и такой рабочий банк клеток включает, по меньшей мере, примерно от 1·10 до 5·10 колониеобразующих единиц Clostridium botulinum на 1 мл рабочего банка клеток, и такой рабочий банк клеток Clostridium botulinum имеет, по существу, однородную морфологию.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный ботулинический токсин включает 1 нг или менее остаточной нуклеиновой кислоты на каждый мг полученного ботулинического нейротоксина.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что способ проводят в течение одной недели или менее.
8. APF-способ хроматографии для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, включающий последовательные этапы:
(а) добавления бактерий Clostridium botulinum из рабочего банка клеток APF в питательную среду APF;
(б) культивацию бактерий Clostridium botulinum в питательной среде;
(в) ферментацию бактерий Clostridium botulinum из этапа (б) в среде ферментации APF до момента возникновения лизиса клеток Clostridium botulinum;
(г) сбора культуры ферментации для получения собранной среды ферментации;
(д) концентрации собранной среды ферментации путем фильтрации;
(е) разведения профильтрованной среды ферментации путем добавления буфера для получения разведенной среды ферментации;
(ж) первый этап контакта, в ходе которого разведенная среда ферментации контактирует с улавливающей хроматографической средой, представленной анионообменной средой;
(з) второй этап контакта, в ходе которого элюент из первого этапа контакта контактирует с очищающей хроматографической средой, представленной катионообменной средой; и
(и) фильтрации элюента из второго этапа контакта с получением биологически активного ботулинического нейротоксина в ходе улучшенного APF-способа, при этом полученный ботулинический нейротоксин включает 1 нг или менее остаточной нуклеиновой кислоты на каждый 1 мг полученного ботулинического нейротоксина, при этом способ проводят в течение одной недели или менее.
9. Способ получения биологически активного ботулиновового нейротоксина посредством хроматографии, по существу, не содержащей животного происхождения продуктов (APF), включающий этапы: (а) предоставления среды ферментации по существу APF; (б) ферментации бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации и (в) восстановления биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации путем контакта среды ферментации с анионообменной хроматографической средой с последующим контактом элюента из анионообменной хроматографической среды с катионообменной колонкой, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин в ходе способа хроматографии (по существу APF).
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что полученный ботулинический токсин включает одну часть или менее остаточной нуклеиновой кислоты на миллион частей полученного ботулинического нейротоксина.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что способ проводят в течение одной недели или менее.
12. Биологически активный ботулинический нейротоксин, полученный в ходе способа по п.9.
13. Система хроматографии по существу APF для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, включающая:
первый аппарат для анаэробной культивации бактерий Clostridium botulinum, и такой первый аппарат способен включать от примерно 200 мл до примерно 1 л питательной среды по существу APF;
второй аппарат для анаэробной ферментации бактерий Clostridium botulinum, которые были культивированы в первом аппарате, при этом второй аппарат способен содержать от примерно 2 до примерно 75 л среды ферментации по существу APF и включать, по меньшей мере, один одноразовый датчик, выбранный из группы, включающей датчик окисления-восстановления, датчик рН и датчик вязкости;
третий аппарат для сбора среды ферментации;
четвертый аппарат для концентрации собранной среды ферментации и разведения профильтрованной среды ферментации;
пятый аппарат для проведения первой очистки ботулинического нейротоксина, полученного из собранной среды, при этом пятый аппарат включает анионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный первый раз ботулинический нейротоксин;
шестой аппарат для проведения второй очистки ботулинического нейротоксина, при этом такой шестой аппарат включает катионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный второй раз ботулинический нейротоксин;
седьмой аппарат для выполнения третьей очистки ботулинического нейротоксина, при этом аппарат включает среду с гидрофобным взаимодействием, что позволяет получить очищенный в третий раз ботулинический нейротоксин; и
7
7
восьмой аппарат для фильтрации очищенного в третий раз ботулинического нейротоксина, при этом восьмой аппарат включает фильтрующую мембрану, и полученный таким образом ботулинический нейротоксин обладает активностью от примерно 2,0·10 единиц/мг ботулинического нейротоксина до примерно 6,0·10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, и полученный ботулинический нейротоксин включает 1 нг или менее остаточной нуклеиновой кислоты на каждый 1 мг полученного ботулинического нейротоксина, при этом способ проводят в течение одной недели или менее.
14. Система по п.13, отличающаяся тем, что она дополнительно включает модульную систему контроля атмосферы, которая содержит анаэробную камеру, способную включать первый аппарат, и такая анаэробная камера имеет встроенный высокоэффективный воздушный фильтр.
15. Система хроматографии, по существу не содержащая продуктов животного происхождения (APF), для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, включающая: (а) среду ферментации по существу APF; (б) бактерии Clostridium botulinum в среде ферментации для ферментации; (в) анионообменную хроматографическую среду для восстановления биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации и (г) катионообменную хроматографическую среду для дополнительного восстановления биологически активного ботулинического нейротоксина из элюента из анионообменной хроматографической среды, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин в ходе способа хроматографии по существу APF.