СРЕДСТВО ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ В РУБЦЕ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ
AGENT FOR FERMENTATION IMPROVEMENT IN RUMINANT SCARS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению смеси цитрусовых флавоноидов для улучшения ферментации в рубце жвачных животных.
Уровень техники
У млекопитающих нет подходящих пищеварительных ферментов для усвоения структурных углеводов, т.е. целлюлозы. Поэтому, а также для получения доступа к такому важному источнику питательных веществ, у травоядных животных имеются развитые ферментационные камеры, содержащие симбиотическую флору, способную к перевариванию или ферментации таких питательных веществ. Эти камеры расположены либо до основного отдела желудка, где происходит переваривание (у жвачных), либо после него (у животных с постжелудочными ферментаторами, т.е. у непарнокопытных, кроликов). Микроорганизмы рубца лишь частично используют эти углеводы и выделяют летучие жирные кислоты (уксусную, пропионовую и масляную кислоту), которые как продукты ферментации являются наиболее важными источниками энергии для жвачных животных. Микроорганизмами, размножающимися в рубце, являются те, которые способны адаптироваться к условиям, имеющимся в этой камере, и использовать принятую пищу. Различные частицы пищи, углеводы и белки подвергаются ферментации, и вырабатывание летучих жирных кислот поддерживается избыточной биомассой, генерируемой в рубце, которая, в свою очередь, является основным источником белка, поглощаемого в итоге в двенадцатиперстной кишке.
Целлюлозоразлагающие бактерии (целлюлолитические) оптимально растут при pH-уровне, равном 6,4-7, и вырабатывают больше уксусной кислоты, чем виды бактерий (амилолитические), выполняющие ферментацию крахмала и сахара. Их оптимальный pH-уровень равен примерно 5,5, и когда эти уровни уменьшаются, происходит увеличение удельной выработки молочной кислоты.
По мере интенсификации систем производства жвачных животных, откорм на базе фуража был заменен на применение обогащенных рационов, составленных из зерновых растений, которые увеличивают темпы роста и снижают текущие затраты. Обогащенные рационы или замена структурных углеводов (целлюлозы) на быстроферментирующиеся растворимые углеводы (крахмал) ведут, однако, к появлению некоторых пищеварительных дисфункций, таких как ацидоз и вздутие живота.
Ацидоз рубца может быть определен как пищеварительное изменение, вызванное приемом большого количества пищи, богатой ферментируемыми углеводами, и это одна из наиболее частых дисфункций, встречающихся у откармливаемых телят.
Он может привести к смерти и начинается с изменения бактериальной флоры с грамм-отрицательной на грамм-положительную, благоприятствующую развитию видов, таких как Streptococcus bovis (S.Bovis) или Megasphaera elsdenii (M.elsdenii) и изменению доли летучих жирных кислот. Доля уксусной и пропионовой кислоты уменьшается, с увеличением доли масляной и молочной кислоты. Увеличение доли молочной кислоты влияет на сократительную способность рубца, вызывая метеоризм из-за неспособности к удалению вырабатываемого газа. Острые симптомы: отсутствие аппетита, зеленовано-желтые водянистые испражнения, атония рубца, хромота, втягивание живота и обезвоживание. Подострые формы включают частый метеоризм, аномальное состояние шерсти и появление гнойников в печени, обнаруживаемых после забоя.
Вздутие живота или метеоризм определяется как пищеварительное изменение, вызванное избыточным образованием и накоплением газа в результате ферментации (углекислый газ и метан), приводящим к аномальному раздуванию второго отдела желудка жвачных.
Традиционно, добавление антибиотических веществ (ионофоров, таких как монензин) поддерживало вышеперечисленные дисфункции рубца в латентном состоянии. Постепенный вывод таких веществ из употребления в качестве ускорителей роста привел, однако, к появлению этих условий, приводящих к росту показателей смертности или заболеваемости, которые негативно влияют на доходы. Влияние на показатели производства сельского хозяйства настолько важно, что требуются другие вещества вместо этих антибиотических веществ.
Патент США №4443471 относится к различным химическим производным ускорителей роста жвачных животных марок М-139603 и М-139603 и его применению для снижения количества метана, вырабатываемого в результате ферментации в рубце жвачных животных.
Патент США №5196432 относится к применению альфа-2 антагониста адренолитика в лечении жвачных животных, страдающих от молочного ацидоза.
В патенте США №5709894 описывается кормовая добавка для жвачных животных, содержащая глютаминовую кислоту и продукты ферментации кукурузы, предназначенная для увеличения ферментации в рубце жвачных животных.
В заявке на патент США №2003165487 описываются процедуры и композиции на основе фермента амилазы Aspergillus oryzae для увеличения эффективности ферментации в рубце жвачных животных и предотвращения опасного увеличения концентраций молочной кислоты в рубце, способствующие росту полезных микроорганизмов в рубце.
В заявке на патент США №2004009209 описывается процедура поддержания в здоровом состоянии рубца у жвачных животных, содержащая смесь патоки низкой влажности и буферного вещества.
В заявке на патент РСТ WO 9119489 описывается процедура регулирования pH-уровней в рубце у жвачных животных путем назначения янтарной кислоты и солей других карбоновых кислот в корм жвачных животных, содержащихся на высококалорийных рационах.
В заявке РСТ WO 9325616 приведена ссылка на продукт на основе крахмала, помещенный в раствор, полученный в результате реакции Мейлларда - реакции растворимых гетерологичных белков и редуцирующих сахаров. Этот продукт применяется для повышения эффективности микробной ферментации в рубце жвачных животных.
В заявке РСТ WO 2004009104 приведена ссылка на новый штамм М.Elsdenii и его применение, включая предупреждение и лечение молочного ацидоза у жвачных животных.
В заявке РСТ WO 2005000035 приведена ссылка на процедуру, проводимую для усиления ферментации в рубце жвачных животных и, в частности, для уменьшения образования метана, состоящую в назначении в корм расторимого экстракта люцерны, полученного из свежей люцерны.
В патенте EP 1323354 описана натуральная кормовая добавка на основе растительного материала.
Известно, что домашнему скоту скармливаются отходы переработки сельскохозяйственных культур и пищевой промышленности. Например, корма в виде отходов от переработки цитрусовых могут быть применены в качестве компонентов систем кормления жвачных животных. Они содержат множество энергетических субстратов для рубцовых микробов (Bampidis et al. Animal Feed Science and Technology, Elsevier, vol.128, 2006, 175-217). В патенте JP-52028922 описано лекарственное средство, содержащее среди прочего кожуру горького апельсина. Это лекарственное средство добавляется в корм лошадей, коров и домашней птицы.
Раскрытие изобретения
Сокращения
ΔCt - Увеличение в циклах амплификации
ΔΔCt - Увеличение в циклах амплификации по отношению к контрольным образцам полимеразной цепной реакции
Изобретатели-авторы настоящей заявки обнаружили, что смесь цитрусовых флавоноидов, а именно нарингина, экстракта горького апельсина и сепиолита, может регулировать процессы микробной ферментации, происходящие из-за назначения жвачным животным обогащенных рационов, увеличивающих эффективность процессов микробной ферментации и ограничивающих рост определенных видов, прямо связанных с процессами ацидоза рубца, в частности S.bovis.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению смеси, содержащей нарингин, экстракт горького апельсина и сепиолит, для улучшения ферментации в рубце жвачных животных.
В данной заявке термин "жвачное животное" включает в себя крупный рогатый скот, породы овец, коз и верблюдов.
Данная смесь предоставляет ряд преимуществ по сравнению с имеющимся уровнем техники, что делает ее весьма ценной в сфере кормления жвачных животных. Преимущества состоят в том, что все ингредиенты в этой смеси являются продуктами натурального происхождения и они легко доступны. С другой стороны, эта смесь проста в обращении и может быть приготовлена в соответствии с промышленными процедурами приготовления смесей, известных специалистам в данной отрасли. Эта смесь имеет также дополнительное преимущество - ограничение роста определенных видов, относящихся к появлению ацидоза рубца, в частности вида S.bovis. Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к применению указанной смеси для улучшения ферментации в рубце жвачных животных, ослабленных из-за дисбаланса естественной бактериальной флоры в рубце. Настоящее изобретение относится также к применению указанной смеси для предотвращения ухудшения ферментации в рубце жвачных животных, которое может быть вызвано дисбалансом естественной бактериальной флоры в рубце. Конкретной целью применения смеси, описанной в этом изобретении, является ограничение роста бактерий, вызывающих ацидоз рубца, таких как бактерии видов Lactobacillus, например Lactobacillus acidophilus и особенно S.bovis.
Смесь является активной при добавлении в корм в твердой форме при концентрациях от 100 до 300 миллионных долей (мд, от 100 до 300 г/тонну корма). Этот факт основан на лабораторных исследованиях, в которых действие этой натуральной смеси было проанализировано в диапазоне доз от 100 до 300 мд.
Согласно одной точке зрения количество нарингина в изобретенной смеси находится в пределах 10÷25 мас.%, предпочтительно 15÷25 мас.%, и еще предпочтительнее оно равно примерно 20 мас.%.
Согласно второй точке зрения количество экстракта горького апельсина в изобретенной смеси находится в пределах 10÷65 мас.%, предпочтительно 20÷60 мас.%, и еще предпочтительнее оно равно примерно 40 мас.%. Отмечено, что экстракт горького апельсина содержит нарингин, и поэтому общее количество нарингина в изобретенной смеси будет больше чем указанное выше количество.
Согласно третьей точке зрения, количество нарингина, экстракта горького апельсина и сепиолита составляет 100 мас.% от массы смеси.
В первом варианте осуществления это изобретение относится к применению смеси, содержащей нарингин в пределах 10÷25 мас.%, экстракт горького апельсина в пределах 10÷65 мас.% и сепиолит в эффективном количестве вплоть до 100 мас.% (баланс смеси) для улучшения ферментации в рубце жвачных животных.
В варианте осуществления, производном от вышеназванного, смесь содержит нарингин в пределах от 15 до 25 мас.%, экстракт горького апельсина в пределах от 20 до 60 мас.% и сепиолит в эффективном количестве вплоть до 100 мас.%, а точнее 20 мас.% нарингина, 40 мас.% экстракта горького апельсина и 40 мас.% сепиолита.
Указанные выше соотношения (в % по массе) приведены в расчете к общей массе смеси.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения путем применения вышеназванных смесей регулируются процессы микробной ферментации, возникающие в результате назначения жвачным животным обогащенных рационов корма.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения путем применения вышеназванных смесей ограничивается рост бактерий, вызывающих ацидоз у жвачных животных, в частности вида S.bovis. Настоящее изобретение относится, таким образом, также к применению вышеуказанных смесей для предотвращения или лечения ацидоза у жвачных животных, включая как острые, так и подострые формы, согласно приведенному здесь описанию.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения путем применения вышеназванных смесей оптимизируется производство в отрасли интенсивного откорма жвачных животных, в частности телят.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения применение вышеназванных смесей состоит в добавлении их в корм в твердой форме при концентрациях от 10 до 2000 мд по массе, точнее в пределах от 50 до 1000 мд, а еще точнее в пределах от 100 до 300 мд.
Флавоноиды являются классом водорастворимых растительных пигментов, к лечебным свойствам которых растет интерес. Нарингин является флавоноидом, а именно гликолизированным флаваноном, получаемым из кожуры некоторых цитрусовых фруктов (грейпфрута, Citrus paradisi и горького апельсина, Citrus aurantium), и в значительной степени обеспечивающим их горький вкус. Он также обнаружен в мякоти фруктов и в листьях, цветках и семенах этих растений.
Результаты некоторых исследований говорят о том, что биосинтез нарингина, так же, как и у других флавононов, подвержен влиянию факторов окружающей среды и генетических факторов, определяя изменения в уровнях концентрации этих химических соединений. Концентрация в пределах от 15 до 18 г на кг кожуры свежего грейпфрута считается обычным значением. Его количество также варьируется; в незрелом фрукте оно выше, чем в зрелом.
Находя применение в парфюмерии и пищевой промышленности, в которой он используется для добавления запаха в кондитерские изделия, напитки и хлебобулочные изделия, нарингин продолжает применяться благодаря своим антиоксидатным и антимутагенным свойствам, а также в качестве стабилизатора масла.
Экстракт горького апельсина может быть извлечен из грунтовых цитрусовых плодов (особенно Citrus aurantium) обычными операциями, применяемыми в этой отрасли, такими как экстракция, фильтрация, сгущение, осаждение, очистка и окончательная сушка. Процессы экстракции могут выполняться в двойных алканол/водных системах, в которых алканол выбирается из метанола, этанола, пропанола и т.п. Применение метанола является более предпочтительным. В типичном экстракте горького апельсина общее количество содержащихся флавоноидов находится в пределах от 31,5 до 71,5 мас.%, например от 45 до 55 мас.% (при определении при помощи ВЭЖХ). Эти флавоноиды, в частности, включают нарингин, неогесперидин и понцирин. В типичном случае общее содержание флавоноидов будет составлять: (а) 17,5÷35,1 мас.%, например 25÷27 мас.% нарингина, (b) 7,7÷16,9 мас.%, например 11÷13 мас.%, неогесперидина и (с) 2,1÷6,5 мас.%, например 3÷5 мас.%, понцирина.
В свою очередь, сепиолит представляет собой гидратированный силикат магния, который обязан своим происхождением известковым осадкам морских ископаемых. Это глинистый минерал белого или немного желтоватого цвета. С древности он примененялся в качестве зубного порошка.
Смесь, описанная в настоящем изобретении, применяется для жвачных животных, страдающих от или подвергающихся риску пострадать от ухудшения ферментации в рубце. К ним, в частности, относятся следующие жвачные животные:
1) Жвачные животные, откармливаемые с применением высококонцентрированных (зерновых) диет, например, для улучшения эффективности питания и предотвращения появления процессов кетоза, особенно если жвачное животное:
a) является животным, откармливаемым по интенсивной системе;
b) является высокопродуктивной самкой, дающей молоко, и находящейся на пике лактиции, когда питание концентратами достигает наивысшей пропорции; или
c) овца или коза со осложненной беременностью, которая вынашивает более одного ягненка, и чья способность к потреблению пищи ограничена.
2) Животные, подвергшиеся к внезапным изменениям диеты, особенно если имеются следующие изменения:
a) с подножного корма (очень грубые корма) на высококонцентрированные рационы; или
b) с плохо усваиваемого крахмала (сорго или кукуруза) на хорошо усваиваемый (пшеница или ячмень).
В пояснительных целях для лучшего понимания этого изобретения дается следующий пример.
Осуществление изобретения
Пример 1: Результаты применения смеси в рационе телят дозами от 100 до 300 мд.
Данные по динамике ферментации были проанализированы на основе протокола, предложенного в публикации Theodorou М К et al., Animal Feed Science and Technology, 48 (3), p.185-197, Aug 1994. В качестве посевного материала была применена жидкость из рубца телят, полученная в результате операций промышленного интенсивного откорма. Смесь по изобретению (20 мас.% наригина, 40 мас.% экстракта горького апельсина и 40 мас.% сепиолита) была инкубирована с посевным материалом и применяемым промышленно кормом для телят (600 мг), добавляемым с соломой зерновых культур в обычных пропорциях (80:20 концентрат:солома). Дозы смеси были инкубированы трехкратно в двух порциях (2 теленка) в герметично запечатанных бутылках с 800 мл раствора посевного материала.
Испытание длилось 48 часов, при этом регистрировалось давление внутри бутылки через 2, 4, 6, 12, 24, 36 и 48 часов. Объем производимого газа устанавливался на основании значений давления. Через 10 часов инкубации одна из бутылок была отделена, и была взята проба содержимого для определения летучих жирных кислот и изоляции ДНК, используемой для молекулярных генетических тестов.
Извлечение ДНК было проведено при помощи комплекта QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen Ltd, Carwley, West Sussex, UK). Концентрация и чистота ДНК (общее количество ДНК) были определены спектрометром (NanoDrop), измеряющим поглощение света при 260 и 280 нм.
Количество ДНК бактерий и вида S.bovis было подсчитано посредством полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени при помощи системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7000 со специфическим праймером для всего количества бактерий (Maeda Н et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology, 39 (1), p.81-86, Oct 2003) и S.bovis (Tajima K et al., Applied and Environmental Microbiology, 67 (6), p.2766-2774, Jun 2001). В эталона для подсчета концентрации общего количества бактерий в питательной среде использовался ДНК концентрат бактериальных образцов, полученных дифференциальным центрифугированием жидкости из рубца (500 g, 10 мин, за которым следует повтор для 20000 g, 20 мин). Численность бактерий S.bovis была выражена относительно общего количества бактерий посредством выражения ΔΔCt, описанного в источнике Livak К J et al., Methods (San Diego, Calif.), 25 (4), p.402-408, Dec 2001.
Исследования бактериального биоразнообразия были проведены при помощи денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) с применением специфических праймеров (Nubel U et al., Journal of Bacteriology, 178 (19), p.5636-5643, Oct 1996). При электрофорезе применялся 8%-й акриламидный гель с 50-65% денатурирующим градиентом мочевина/формамид, в течение 16 часов при 80 В. Гель был окрашен при помощи набора Amersham Biosciences (Швеция), и, после сканирования, диаграмма диапазона была проанализирована программой UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Arithmetic averages).
Действие смеси на ферментацию в рубце жвачных животных было проанализировано в соответствии с 2×2 (смесь×доза) факториальным дизайном эксперимента, в котором животное рассматривается как экспериментальный блок.
Результаты
1. - Выработка газа
В описанных ранее лабораторных условиях включение смеси в питательную среду не влияло ни на динамику производства летучих жирных кислот, ни на общее количество вырабатываемых летучих жирных кислот. Экспериментальное лечение также не повлияло на молярные пропорции наиболее важных летучих жирных кислот, которые демонстрировали среднюю пропорцию 60% уксусной кислоты, 29% пропионовой кислоты и 9% маслянной кислоты.
2. - Подсчет количества бактерий посредством полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени
2
3
В таблице 1 отображена общая концентрация ДНК, полученная при помощи спектрофотометрии (260 нм), и из нее видно, что концентрация ДНК в культуральной среде не изменилась из-за ввода смеси. Определение количества ДНК бактерий посредством более специфической процедуры - полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени - показало, что включение этой смеси вызвало значительное увеличение ДНК бактерий, указывая на ускорение роста бактерий. Наличие существенных различий в росте бактерий, обусловленных присутствием смеси, в дополнение к отличиям, обнаруженным в выработке газа (CO+NH), или большему выпуску летучих жирных кислот означает, что эта смесь положительно воздействует на эффективность микробного синтеза.
В той же таблице также отображена концентрация копий специфических ДНК-последовательностей для вида S.bovis, что идентифицирует эту бактерию, как один из продуцентов молочной кислоты и поэтому отнесенную к условиям, возникшим из-за ацидоза у жвачных животных. Добавление этой смеси создало очень значительное ограничение концентрации этих видов в питательной среде, с упомянутой концентрацией, выраженной в виде количества копий ДНК, соответствующих виду S.bovis (2(ΔCt)*1000) относительно общего количества копий ДНК бактерий или в виде относительного уменьшения количества копий относительно регулирующей среды.
Таблица 1
Концентрация различных типов ДНК в культуральной среде, подсчитанная посредством полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени; количество копий ДНК 16S в этой среде как индекс бактериального биоразнообразия
Диета
Контроль
Смесь
Значение
Доза (мд)
100
300
RSD
Диета
Доза
Всего ДНК
(мкг/мл)
37.3
39.7
32.3
6.98
нс
нс
ДНК бактерий
(мкг/мл)
8.19
24.3
21.5
2.75
0.0018
нс
S.bovis
2(ΔCt) *1000
4.03
1.17
1.1
0.84
0.01
нс
S.bovis
2(ΔΔCt)
0.31
0.29
0.14
нс
ДГГЭ
Н
15.50
15.0
15.9
1.44
нс
нс
* нс - несущественно
При анализе действия дозы этой смеси по вышеуказанным параметрам значительных различий из-за концентрации смеси не обнаруживается. Полученные результаты, таким образом, говорят, что начальные концентрации 100 и 300 мд превышают порог активности указанных компонентов в процессах ферментации в рубце жвачных животных. С другой стороны, несмотря на то, что исследуемая смесь изменила концентрацию вида S.bovis, она не изменила биоразнообразия этой популяции. Это подтверждает избирательное действие указанных веществ на определенные популяции микробов.
3. - Выводы и преимущества
Добавление исследуемой смеси с посевным материалом из обогащенных рационов корма, применяемых в условиях промышленного интенсивного откорма, вызывает значительные изменения в процессах ферментации в рубце жвачных животных.
Наличие смеси не изменяет уровни выработки газа или летучих жирных кислот. Однако она имеет большое влияние на различные популяции микробов в этом посевном материале. Стимулируя значительное повышение уровней синтеза в этих популяциях, смесь по изобретению одновременно в значительной мере подавляет рост вида S.bovis.