УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ В ВИРУСАХ ОСПОВАКЦИНЫ/ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ
IMPROVED METHODS FOR OBTAINING LIBRARIES OF POLYNUCLEOTIDES IN SMALLPOX VIRUSES/EUKARYOTIC CELLS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент No. 62/370009, поданной 2 августа 2016 г., полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0002] Полное содержание поданного в электронном виде списка последовательностей в текстовом файле ASCII (наименование «58008-168081_Sequence_Listing_ascii_ST25.txt; размер: 4020 байт; и дата создания: 31 июля 2017 г.»), поданного с этой заявкой, приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение относится к улучшенному способу идентификации представляющих интерес белков, например, связывающих молекул, таких как антитела или их фрагменты, в эукариотических клетках, и в частности, к улучшенному способу получения библиотек белков, например, библиотек тяжелых и/или легких цепей антител для экспрессии в эукариотических клетках.
Библиотеки для экспрессии в эукариотах
[0004] Основным инструментом в области молекулярной биологии является перевод поли (A)+ мРНК в двухцепочечную (дц) кДНК, которую затем можно вставлять в клонирующий вектор и экспрессировать в подходящей клетке-хозяине. Способ, общий для множества стратегий клонирования кДНК, включает конструирование «библиотеки кДНК», представляющей собой коллекцию клонов кДНК, происходящих из поли(A)+ мРНК, полученной из клетки представляющего интерес организма. Например, для выделения кДНК, экспрессирующей полипептиды субъединицы иммуноглобулина или антитела, библиотеку кДНК можно получать из пре-B-клеток, B-клеток или плазматических клеток. Известны способы конструирования библиотеки кДНК в различных экспрессирующих векторах, включая векторы на основе нитевидного бактериофага, бактериофага лямбда, космидных и плазмидных векторов.
[0005] Использовали множество различных способов выделения генов-мишеней из библиотек кДНК, с различным успехом. Они включают, например, использование зондов для гибридизации нуклеиновых кислот, представляющих собой меченые фрагменты нуклеиновой кислоты, имеющие последовательности, комплементарные последовательности ДНК гена-мишени. Когда этот способ используют для клонов кДНК в трансформированных бактериальных хозяевах, колонии или бляшки, сильно гибридизующиеся с зондом, вероятно, содержат последовательности ДНК - мишени. Способы гибридизации, однако, не требуют, и не проводят измерения экспрессии конкретного клона кДНК. Альтернативные способы скрининга основаны на экспрессии в бактериальном хозяине, например, можно проводить скрининг колоний или бляшек посредством иммуноанализа по связыванию с антителами, образованными против представляющего интерес белка. Однако анализы экспрессии в бактериальных хозяевах часто затруднены, поскольку, например, белок недостаточно экспрессируется в бактериальных хозяевах, белок экспрессируется в неправильной конформации, или белок не подвергается процессингу и/или транспорту, как в эукариотической системе. Со многими из этих проблем столкнулись при попытках получения молекул антител в бактериальных хозяевах, как упомянуто выше.
[0006] Соответственно, использование экспрессирующих библиотек в эукариотах, например, дрожжах или млекопитающих, для выделения кДНК, кодирующих представляющие интерес белки, например, связывающие молекулы, такие как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, обеспечивает несколько преимуществ над бактериальными библиотеками. Например, связывающие молекулы, такие как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, и их субъединицы, экспрессированные в эукариотических хозяевах, могут являться функциональными и могут подвергаться типичной эукариотической посттрансляционной модификации. Белок, обычно транспортируемый через систему внутриклеточной мембраны к поверхности клетки, может завершать процесс транспорта. Кроме того, использование эукариотической системы делает возможным выделение полинуклеотидов, кодирующих представляющие интерес белки, на основании функциональной экспрессии эукариотических РНК или белка. Например, связывающие молекулы, такие как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, можно выделять на основании их специфичности для данного антигена. См., например, Патент США No. 7858559, Публикацию патентной заявки США No. 2016-0152971, и Предварительную патентную заявку США No. 62/326501, поданную 22 апреля 2016 г., полное содержание каждого из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. См. также Smith et al., Nature Medicine 7:967-972 (2001).
Поксвирусные векторы
[0007] Поксвирусные векторы широко используют в качестве экспрессирующих векторов для экспрессии белка и антигена в эукариотических клетках. Простота клонирования и размножения вируса осповакцины во множестве клеток-хозяев привела к широкому использованию поксвирусных векторов для экспрессии чужеродного белка и в качестве переносчиков для доставки вакцины (Moss, B., Science 252:1662-7 (1991)).
[0008] Традиционно поксвирусные векторы не использовали для идентификации неизвестных представляющих интерес генов из комплексной популяции клонов, поскольку высоко эффективного, дающего высокий титр способа клонирования не существовало для поксвирусов. Авторы настоящего изобретения, однако, разработали способ получения разнообразных библиотек кДНК в рекомбинантных поксвирусах с использованием тримолекулярной рекомбинации. См., например, Zauderer, Патент США No. 6706477, выданный 16 марта 2004 г., и Zauderer et al., Патент США No. 7858559, выданный 28 декабря 2010 г., полное содержание каждого из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
[0009] Тримолекулярная рекомбинация сама по себе представляет собой высоко эффективный, дающий высокий титр способ получения рекомбинантных поксвирусов. Остается необходимость дальнейшего улучшения способа с использованием тримолекулярной рекомбинации для получения даже большего количества рекомбинантных вирусов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Настоящее изобретение относится к способу конструирования библиотеки, содержащей множество представляющих интерес полинуклеотидов. Способ включает: (a) расщепление выделенного генома поксвируса для получения первого фрагмента вируса и второго фрагмента вируса, где первый фрагмент не является гомологичным второму фрагменту; (b) получение популяции плазмид-переносчиков, где каждая содержит представляющий интерес полинуклеотид, фланкированный 5'-фланкирующей областью и 3'-фланкирующей областью, где 5'-фланкирующая область содержит область, гомологичную 3'-концу первого фрагмента вируса, и 3′-фланкирующая область содержит область, гомологичную 5'-концу второго фрагмента вируса; и где плазмиды-переносчики являются способными к гомологичной рекомбинации с первым и вторым фрагментами вируса, таким образом, что формируется жизнеспособный геном поксвируса; (c) введение плазмиды-переносчика и первого и второго фрагментов вируса в клетку-хозяина млекопитающих, пермиссивную для инфекционности поксвируса; (d) добавление ингибитора сборки поксвируса; и (e) обеспечение гомологичной рекомбинации плазмиды-переносчика и первого и второго фрагментов вируса, таким образом, получение библиотеки жизнеспособных модифицированных геномов поксвируса, где каждый содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. В конкретных аспектах способ может дополнительно включать (f) выделение библиотеки. В конкретных аспектах, стадия (c) может включать трансфекцию клетки-хозяина млекопитающего плазмидами-переносчиками и первым и вторым фрагментами вируса, где клетку-хозяина поддерживают в культуральной среде после трансфекции.
[0011] В конкретных аспектах, ингибитор сборки поксвируса может представлять собой рифампицин (рифампин) или его производное. В конкретных аспектах, рифампицин или его производное можно добавлять в культуральную среду, содержащую трансфицированные клетки, через приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 30 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 42 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 54 часа, или приблизительно 60 часов после трансфекции. В конкретных аспектах, рифампицин или его производное добавляют в культуральную среду в концентрации приблизительно 30 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 70 мкг/мл, приблизительно 80 мкг/мл, приблизительно 90 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 110 мкг/мл, приблизительно 120 мкг/мл или приблизительно 130 мкг/мл. В конкретных аспектах, рифампицину или его производному позволяют оставаться в культуральной среде в течение приблизительно одних суток, приблизительно двух суток, приблизительно трех суток, приблизительно четырех суток или приблизительно пяти суток. В конкретных аспектах, культуральную среду меняют после обработки рифампицином или его производным, и трансфицированные клетки-хозяева можно далее культивировать без рифампицина в течение приблизительно одних суток, приблизительно двух суток или приблизительно трех суток.
[0012] Способ, в рамках изобретения, может обеспечивать увеличенное количество независимых модифицированных геномов поксвируса по сравнению с библиотекой, конструированной посредством этого способа, но в отсутствие ингибитора сборки поксвируса. В конкретных аспектах, количество независимых модифицированных геномов поксвируса увеличено по меньшей мере приблизительно в один раз, приблизительно в пять раз, приблизительно в десять раз, приблизительно в пятнадцать раз, приблизительно в двадцать раз, приблизительно в двадцать пять раз или приблизительно в тридцать раз по сравнению с библиотекой, сконструированной посредством этого способа, но в отсутствие ингибитора сборки поксвируса. В конкретных аспектах, библиотека может включать увеличенный титр вируса по сравнению по сравнению с библиотекой, сконструированной посредством этого способа, но в отсутствие ингибитора сборки поксвируса.
[0013] В конкретных аспектах способа в рамках изобретения, выделенный геном поксвируса может содержать первый участок узнавания для первой эндонуклеазы рестрикции и второй участок узнавания для второй эндонуклеазы рестрикции. В соответствии с этим аспектом, первый и второй фрагменты вируса можно получать посредством расщепления генома вируса с использованием первой эндонуклеазы рестрикции и второй эндонуклеазы рестрикции, и затем выделения первого и второго фрагментов вируса. В конкретных аспектах, выделенный геном поксвируса представляет собой выделенный геном вируса осповакцины. В конкретных аспектах, выделенный геном вируса осповакцины может представлять собой геном WR или его модифицированное производное, или геном модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA) или его модифицированное производное. В конкретных аспектах, первый и второй участки узнавания фермента рестрикции могут быть расположены в фрагменте HindIII J вируса осповакцины. В конкретных аспектах, первый фермент рестрикции может представлять собой Not I. В конкретных аспектах, участок для второго фермента рестрикции может представлять собой Apa I. В конкретных аспектах, выделенный геном вируса осповакцины может представлять собой геном вируса v7.5/tk или геном вируса vEL/tk. В конкретных аспектах, вирус-помощник может представлять собой вирус оспы кур. В конкретных аспектах, 5'- и 3'-фланкирующие области из плазмиды-переносчика являются способными к гомологичной рекомбинации с геном тимидинкиназы вируса осповакцины. В конкретных аспектах, 5'- и 3'-фланкирующие области из плазмиды-переносчика являются способными к гомологичной рекомбинации с фрагментом HindIII J вируса осповакцины.
[0014] В конкретных аспектах способа в рамках изобретения, каждая плазмида-переносчик может включать вставку представляющего интерес полинуклеотида, лигированную в плазмиду, такую как, но без ограничения: pVHE, pVLE и/или pVKE. В конкретных аспектах, каждый представляющий интерес полинуклеотид может включать кодирующую область для представляющего интерес полипептида, способную к экспрессии в инфицированной вирусом осповакцины клетке. В конкретных аспектах, каждый представляющий интерес полинуклеотид может кодировать полипептид антитела или субъединицы антитела, включающий вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее антигенсвязывающ фрагмент, вариабельную область легкой цепи антитела или ее антигенсвязывающ фрагмент, или их комбинацию. В конкретных аспектах, каждый полипептид субъединицы антитела может дополнительно включать константную область или ее фрагмент, сигнальный пептид, способный управлять экспрессией на поверхности клетки или секрецией полипептида субъединицы антитела, или их комбинацию. В конкретных аспектах, каждая плазмида-переносчик может дополнительно включать область контроля транскрипции в функциональной связи с представляющим интерес полинуклеотидом, где область контроля транскрипции функционирует в цитоплазме инфицированной вирусом осповакцины клетки. В конкретных аспектах, область контроля транскрипции может включать промотор поксвируса, например промотор вируса осповакцины p7.5, промотор вируса осповакцины pEL или промотор вируса осповакцины MH-5.
[0015] В конкретных аспектах способа в рамках изобретения, клетка-хозяин является способной к упаковке модифицированных геномов вируса осповакцины в инфекционные частицы вируса осповакцины. В соответствии с этим аспектом, плазмиды-переносчики и первый и второй фрагменты вируса можно вводить в клетку-хозяина млекопитающего, которая содержит, или подвергнута инфекции, чтобы содержать вирус-помощник, где клетка-хозяин является непермиссивной для продукции инфекционных частиц вируса для вируса-помощника, но поддерживает упаковку модифицированных геномов вируса осповакцины в инфекционные частицы вируса осповакцины.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0016] Настоящее изобретение относится к способу получения библиотеки полинуклеотидов, кодирующих функциональные представляющие интерес полипептиды, например, связывающие молекулы, такие как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, или их субъединицы, в эукариотической системе, где библиотека имеет улучшенные сложность и разнообразие по сравнению с существующими способами. Например, настоящее изобретение относится к способу конструирования экспрессирующей библиотеки полинуклеотидов, которая кодирует и может экспрессировать представляющие интерес полипептиды, например, связывающие молекулы, такие как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, или их субъединицы, где полинуклеотиды, кодирующие представляющие интерес полипептиды, можно идентифицировать и выделять из экспрессирующей библиотеки, где библиотеку конструируют в векторе на основе поксвируса, например вируса осповакцины, где скрининг библиотеки проводят в клетках-хозяевах эукариот, например, млекопитающих, и где способ обеспечивает библиотеку с увеличенными сложностью и разнообразием по сравнению с существующими способами.
[0017] Настоящее изобретение относится к конструированию комплексных библиотек полинуклеотидов в эукариотических клетках-хозяевах с использованием векторов на основе поксвируса, например вируса осповакцины, сконструированных посредством тримолекулярной рекомбинации. Сложность и разнообразие библиотеки можно улучшать посредством приведения клеток-хозяев млекопитающих, в которых конструируют библиотеку, в контакт с ингибитором репликации поксвируса, например вируса осповакцины, например, рифампицином (рифампином), на некоторый период времени в процессе конструирования.
Определения
[0018] Термин единственного числа объекта относится к одному или нескольким из этих объектов; например, «антитело» понимают как представляющее одно или несколько антител. Как таковые, термины единственного числа, «один или несколько» и «по меньшей мере один», можно использовать в настоящем описании взаимозаменяемо.
[0019] Кроме того, «и/или» при использовании в настоящем описании следует принимать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов, в присутствии или в отсутствие другого. Таким образом, термин «и/или», как используют в такой фразе, как «A и/или B» в настоящем описании, предназначен для включения «A и B», «A или B», «A» (отдельно) и «B» (отдельно). Подобным образом, термин «и/или», как используют в такой фразе, как «A, B и/или C», предназначен для включения каждого из следующих вариантов осуществления: A, B и C; A, B или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (отдельно); B (отдельно); и C (отдельно).
[0020] Если не определено иное, технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это описание. Например, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; и Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, предоставляют специалисту в данной области общий словарь многих из терминов, используемых в этом описании.
[0021] Единицы, приставки и символы обозначены в их форме, принятой в Système International de Unites (SI). Числовые диапазоны являются включительными для чисел, определяющих диапазон. Если не указано иное, аминокислотные последовательности описаны слава направо в ориентации от амино-конца до карбокси-конца. Заголовки, представленные в настоящем описании, не являются ограничением для различных аспектов описания, которые могут относиться в качестве ссылки к описанию в целом. Соответственно, определенные непосредственно ниже термины более полно определены со ссылкой на описание в целом.
[0022] В рамках изобретения, термин «неприродные» вещество, композиция, объект и/или любая комбинация веществ, композиций или объектов, или любые его грамматические варианты, представляет собой условный термин, который конкретно исключает, но только исключает, те формы вещества, композиции, объекта и/или любой комбинации веществ, композиций или объектов, которые хорошо известны специалисту в данной области как «природные», или которые определены или интерпретированы, или могут быть в любое время определены или интерпретированы экспертом или административным или судебным органом, как «природные».
[0023] В рамках изобретения, термин «полипептид» предназначен для включения формы единственного числа «полипептид», так же как формы множественного числа «полипептиды», и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин «полипептид» относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот, и не относятся к конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, «белок», «аминокислотная цепь» или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение «полипептид», и термин «полипептид» можно использовать вместо любого из этих терминов или взаимозаменяемо с ним. Термин «полипептид» также предназначен для обозначения продуктов постэкспрессионной модификации полипептида, включая, без ограничения, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование и дериватизацию посредством известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление, или модификацию посредством неприродных аминокислот. Полипептид может происходить из биологического источника или может быть получен рекомбинантным способом, но, необязательно, является транслированным с обозначенной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез.
[0024] Полипептид, как описано в настоящем описании, может иметь размер приблизительно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они необязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой обозначают как свернутые, и полипептиды, которые не имеют определенной трехмерной структуры, но вместо этого могут принимать большое количество различных конформаций, обозначают как развернутые. В рамках изобретения, термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной группой углевода, которая присоединена к белку через содержащую кислород или содержащую азот боковую цепь аминокислоты, например серина или аспарагина.
[0025] Под «выделенным» полипептидом или его фрагментом, вариантом или производным понимают полипептид, который не находится в его природном окружении. Конкретный уровень очистки не является необходимым. Например, выделенный полипептид может являться удаленным из его нативного или природного окружения. Полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считают выделенными, как описано в настоящем описании, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, выделенные, фракционированные, или частично или в основном очищенные посредством любого пригодного способа.
[0026] В рамках изобретения, термин «неприродный» полипептид, или любые его грамматические варианты, представляет собой условный термин, который конкретно исключает, но только исключает, те формы полипептида, которые хорошо известны специалисту в данной области как «природные», или которые определены или интерпретированы, или могут быть в любое время определены или интерпретированы экспертом или административным или судебным органом, как «природные».
[0027] Другие полипептиды, описанные в настоящем описании, представляют собой фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеуказанных полипептидов, и любую их комбинацию. Термины «фрагмент», «вариант», «производное» и «аналог», как описано в настоящем описании, включают любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые из свойств соответствующего нативного антитела или полипептида, например, специфическое связывание с антигеном. Фрагменты полипептидов включают, например, протеолитические фрагменты, так же как полученные в результате делеции фрагменты, в дополнение к конкретным фрагментам антитела, обсуждаемым в другом месте настоящего описания. Варианты, например, полипептида, включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными в результате замен, делеций или вставок аминокислот. В конкретных аспектах, варианты могут являться неприродными. Неприродные варианты можно получать с использованием известных в данной области способов мутагенеза. Варианты полипептидов могут включать консервативные или неконсервативные замены, делеции или добавления аминокислот. Производные представляют собой полипептиды, измененные таким образом, чтобы иметь дополнительные признаки, не обнаруженные в исходном полипептиде. Примеры включают слитые белки. Варианты полипептида могут быть также обозначены в настоящем описании как «аналоги полипептида». В рамках изобретения, «производное» полипептида может также обозначать рассматриваемый полипептид, имеющий одну или несколько аминокислот, химически дериватизированных посредством реакции с функциональной боковой группой. В качестве «производных» включены также пептиды, содержащие одно или несколько производных двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролином можно заменять пролин; 5-гидроксилизином можно заменять лизин; 3-метилгистидином можно заменять гистидин; гооомосерином можно заменять серин; и орнитином можно заменять лизин.
[0028] «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой одна аминокислота заменена на другую аминокислоту, имеющую сходную боковую цепь. Семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена фенилаланином тирозина представляет собой консервативную замену. В конкретных вариантах осуществления, консервативные замены в последовательностях полипептидов и антител по настоящему описанию не прекращают связывания полипептида или антитела, содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном, с которым связывается связывающая молекула, например, иммуноглобулин или антитело. Способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не уничтожают связывание антигена, хорошо известны в данной области (см., например, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).
[0029] Термин «полинуклеотид» включает одиночную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот, и относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкции, например, матричной РНК (мРНК), кДНК, или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может включать общепринятую фосфодиэфирную связь или не являющуюся общепринятой связь (например, амидную связь, как обнаружено в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термины «нуклеиновая кислота» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относятся к любым одному или нескольким фрагментам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.
[0030] Под «выделенными» нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом понимают любую форму нуклеиновой кислоты или полинуклеотида, которая отделена от своего природного окружения. Например, очищенный из геля полинуклеотид, или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащийся в векторе, считают «выделенным». Также, фрагмент полинуклеотида, например, продукт ПЦР, сконструированный для наличия участков рестрикции для клонирования, считают «выделенным». Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или в основном) полинуклеотиды в неприродном растворе, таком как буфер или солевой раствор. Выделенные молекулы РНК включают полученные in vivo или in vitro транскрипты РНК с полинуклеотидов, где транскрипт не представляет собой транскрипт, обнаруживаемый в природе. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетически. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может представлять собой или может включать регуляторный элемент, такой как промотор, участок связывания рибосомы или терминатор транскрипции.
[0031] В рамках изобретения, «неприродный» полинуклеотид, или любые его грамматические варианты, представляет собой условное определение, которое конкретно исключает, но только исключает, те формы полинуклеотида, которые хорошо известны специалисту в данной области как «природные», или которые определены или интерпретированы, или могут быть в любое время определены или интерпретированы экспертом или административным или судебным органом, как «природные».
[0032] В рамках изобретения, «кодирующая область» представляет собой часть нуклеиновой кислоты, состоящую из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или TAA) не транслируется в аминокислоту, его можно рассматривать как часть кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, участки связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или более кодирующих области могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например, в одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, в отдельных (различных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область, или может включать две или более кодирующих области, например, один вектор может отдельно кодировать вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может включать гетерологичную кодирующую область, либо слитую, либо не слитую с другой кодирующей областью. Гетерологичные кодирующие области включают, без ограничения, области, кодирующие специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.
[0033] В конкретных вариантах осуществления, полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В случае ДНК, полинуклеотид, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, в норме может включать промотор и/или другие элементы для контроля транскрипции или трансляции, функционально связанные с одной или несколькими кодирующими областями. Функциональная связь представляет собой связь, когда кодирующая область для продукта гена, например полипептида, является связанной с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы помещать экспрессию продукта гена под влияние или контроль регуляторной последовательность(последовательностей). Два фрагмента ДНК (такие как кодирующая область для полипептида и ассоциированный с ней промотор) являются «функционально связанными», если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей желательный продукт гена, и если характер связи между двумя фрагментами ДНК не мешает способности регуляторных последовательностей для экспрессии управлять экспрессией продукта гена, или не мешает способности ДНК-матрицы подвергаться транскрипции. Таким образом, промоторная область может являться функционально связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор является способным вызывать транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой специфический для клеток промотор, приводящий к значительной транскрипции ДНК в предопределенных клетках. Другие элементы для контроля транскрипции, помимо промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут являться функционально связанными с полинуклеотидом для управления специфической для клеток транскрипцией.
[0034] Множество областей для контроля транскрипции известно специалистам в данной области. Они включают, без ограничения, области для контроля транскрипции, функционирующие в клетках позвоночных, такие как, но без ограничения, фрагменты промотора и энхансера из цитомегаловирусов (немедленный ранний промотор, в сочетании с интроном-A), вируса обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие области для контроля транскрипции включают области, происходящие из генов позвоночных, таких как гены актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и β-глобина кролика, так же как другие последовательности, способные контролировать экспрессию гена в эукариотических клетках. Дополнительные пригодные области для контроля транскрипции включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, так же как индуцируемые лимфокинами промоторами (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами). В конкретных аспектах, области для контроля транскрипции могут представлять собой области для контроля транскрипции поксвируса, например вируса осповакцины, более подробно обсуждаемые в другом месте настоящего описания.
[0035] Подобным образом, множество элементов для контроля трансляции известно обычным специалистам в данной области. Они включают, но без ограничения, участки связывания рибосомы, кодоны инициации и терминации трансляции, и элементы, происходящие из пикорнавирусов (в частности, внутренний участок связывания рибосомы, или IRES, также обозначаемый как последовательность CITE).
[0036] В других вариантах осуществления, полинуклеотид может представлять собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК), транспортной РНК или рибосомной РНК.
[0037] Кодирующие области полинуклеотида и нуклеиновой кислоты могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторный или сигнальный пептиды, управляющие секрецией полипептида, кодированного полинуклеотидом, как описано в настоящем описании. В соответствии с сигнальной гипотезой, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которые отщепляются от зрелого белка, как только начинается экспорт растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалисту в данной области известно, что полипептиды, секретированные клетками позвоночных, могут иметь сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от полного или «полноразмерного» полипептида для получения секретированной или «зрелой» формы полипептида. В конкретных вариантах осуществления, используют нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи антитела, или функциональное производное этой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией полипептида, функционально связанного с ним. Альтернативно, можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих, или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменять на лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (TPA) человека или β-глюкуронидазы мыши.
[0038] В рамках изобретения, две полинуклеотидные области считают «гомологичными», если они могут подвергаться гомологичной рекомбинации в клетке-хозяине, например, в клетке-хозяине эукариот или млекопитающих. Гомологичная рекомбинация представляет собой тип генетической рекомбинации, в котором происходит обмен нуклеотидных последовательностей между двумя сходными или идентичными молекулами ДНК. Как правило, гомологичная рекомбинация может происходить, когда две отдельные полинуклеотидные цепи, например, выступающие концы двухцепочечной ДНК, могут гибридизоваться друг с другом благодаря спариванию комплементарных оснований. Цепи не обязательно должны быть на 100% комплементарными; более того, одноцепочечные области не должны иметь конкретную длину. Множество механизмов и функций гомологичной рекомбинации хорошо известны специалисту в области молекулярной биологии.
[0039] В рамках изобретения, «библиотека» представляет собой репрезентативное семейство полинуклеотидов, например, группу полинуклеотидов, родственных через, например, их происхождение из одного вида животного, типа ткани, органа или типа клеток, где библиотека суммарно содержит по меньшей мере два различных вида в пределах данного семейства полинуклеотидов. Библиотека полинуклеотидов может содержать, например, по меньшей мере два, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109 различных видов в пределах данного семейства полинуклеотидов. В конкретных аспектах, библиотека полинуклеотидов, в рамках изобретения, может кодировать множество полипептидов, содержащее представляющий интерес полипептид. В конкретных аспектах, библиотека полинуклеотидов, в рамках изобретения, может кодировать множество полипептидов субъединиц антитела, например, полипептидов субъединицы тяжелой цепи или полипептидов субъединицы легкой цепи. В этом контексте, «библиотека», в рамках изобретения, содержит полинуклеотиды из общего семейства, где семейство представляет собой полинуклеотиды, кодирующие полипептиды субъединиц антител конкретного типа и класса, например, библиотека может кодировать тяжелую цепь μ, γ-1, γ-2, γ-3, γ-4, α-1, α-2, ε или δ человека, или легкую цепь κ или λ человека. Хотя каждый член любой одной библиотеки, сконструированной согласно способам в рамках изобретения, может кодировать одну и ту же константную область тяжелой или легкой цепи и/или домен для заякоривания в мембране, библиотека совместно может содержать по меньшей мере две, по меньшей мере 5, или по меньшей мере 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109 различных вариабельных областей, связанных с общей константной областью.
[0040] Библиотека в рамках изобретения сконструирована в векторе на основе поксвируса, например, вируса осповакцины, и таким образом, содержит множество модифицированных геномов поксвируса, где каждый содержит гетерологичный полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид. «Сложность» или «разнообразие» библиотеки в рамках изобретения относится к количеству различных независимых модифицированных геномов поксвируса, содержащихся в библиотеке. Таким образом, можно сказать, что библиотека модифицированных геномов поксвируса имеет более высокую сложность, чем другая библиотека, имеющая такое же общее количество геномов поксвируса, когда более сложная библиотека содержит более высокое количество независимых модифицированных геномов поксвируса на общее количество геномов поксвируса.
[0041] В конкретных аспектах, библиотека может кодировать множество одноцепочечных фрагментов антител, где каждый содержит вариабельную область, такую как вариабельная область легкой цепи или вариабельная область тяжелой цепи, и/или как вариабельную область легкой цепи, так и вариабельную область тяжелой цепи, например, фрагмент ScFv.
[0042] Настоящее изобретение относится к способам конструирования библиотек полинуклеотидов, кодирующих представляющие интерес полипептиды, например, полипептиды, содержащие субъединицы антитела или их фрагменты. Кроме того, настоящее изобретение относится к библиотекам представляющих интерес полипептидов, например, полипептидов, содержащих субъединицы антитела или их фрагменты, сконструированных в экспрессирующих векторах на основе вируса осповакцины, в соответствии со способами, описанными в настоящем описании.
[0043] Под «клеткой-реципиентом» или «клеткой-хозяином», или «клеткой» понимают клетку или популяцию клеток, в которых можно конструировать и/или размножать библиотеки полинуклеотидов, в рамках изобретения. Клетка-хозяин, в рамках изобретения, как правило, представляет собой эукариотическую клетку или линию клеток, например, клетку или линию клеток позвоночных, млекопитающих, грызунов, мыши, примата или человека. Под «популяцией клеток-хозяев» понимают группу культивированных клеток, в которых «библиотеку», в рамках изобретения, можно конструировать, размножать и/или экспрессировать. Любая клетка-хозяин, пермиссивная для инфекционности вируса осповакцины, является пригодной для способов, представленных в этом описании. Клетки-хозяева для использования в способах, в рамках изобретения, могут являться адгерентными, например, клетками-хозяевами, которые растут прикрепленными к твердому субстрату, или, альтернативно, клетки-хозяева могут находиться в суспензии.
[0044] Клетки-хозяева в рамках изобретения могут включать конститутивный секреторный путь, где белки, например, представляющие интерес белки, экспрессированные посредством библиотеки, сконструированной способами в рамках изобретения, например, библиотеку полипептидов, включающую полипептиды субъединиц антител, секретируют из внутреннего пространства клетки либо для экспрессии на поверхности мембраны клетки, либо для полной секреции в форме растворимых полипептидов. В конкретных аспектах, представляющие интерес белки, экспрессированные на поверхности мембраны клетки, экспрессированы на поверхности оболочечного вируса, продуцированного клеткой-хозяином, например, внеклеточного оболочечного вируса осповакцины, или EEV. Связанные с мембраной формы полипептидов субъединиц антител первоначально следуют такому же пути, как и полностью секретируемые формы, проходя через просвет ER, за исключением того, что они остаются в мембране ER из-за присутствия одного или нескольких сигналов остановки транспорта, или «трансмембранных доменов». Трансмембранные домены представляют собой гидрофобные фрагменты из приблизительно 20 аминокислот, которые принимают альфа-спиральную конформацию по мере того, как они пересекают мембрану. Погруженные в мембрану белки заякориваются в фосфолипидном бислое плазматической мембраны. В трансмембранных формах представляющих интерес полипептидов, например, заякоренных в мембране полипептидах тяжелой цепи антитела, как правило, используют амино-концевые сигнальные пептиды, как в полностью секретируемых формах.
[0045] Сигнальные пептиды, трансмембранные домены и цитозольные домены известны для широкого множества связанных с мембраной и/или полностью секретируемых белков.
[0046] Пригодные трансмембранные домены могут включать, но без ограничения, специфический для вируса осповакцины EEV белок HA A56R, или специфические для вируса осповакцины EEV трансмембранные белки A33R, A34R, A36R или B5R. См., например, Публикацию патентной заявки США No. 2013/0288927, опубликованную 31 октября 2013 г. В конкретных аспектах специфический для EEV белок можно заякоривать в оболочке вируса посредством пальмитоилирования, например, белок F13L вируса осповакцины. См., например, Предварительную заявку США 62/326501, поданную 22 апреля 2016 г., полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
[0047] В рамках изобретения, термин «связывающая молекула» относится, в самом широком смысле, к молекуле, которая специфически связывается с рецептором, например, с эпитопом или антигенной детерминантой. Как описано далее в настоящем описании, связывающая молекула может включать один или несколько «антигенсвязывающих доменов», описанных в настоящем описании. Неограничивающим примером связывающей молекулы является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который сохраняет антигенспецифическое связывание.
[0048] Термины «связывающий домен» и «антигенсвязывающий домен» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к области связывающей молекулы, которая является необходимой и достаточной для специфического связывания эпитопа. Например, «Fv», например, вариабельную тяжелую цепь и вариабельную легкую цепь антитела, либо в форме двух отдельных субъединиц полипептида, либо в форме одной цепи, рассматривают как «связывающий домен».
[0049] Другие антигенсвязывающие домены включают, без ограничения, вариабельную тяжелую цепь (VHH) антитела, происходящую из видов верблюдовых (См., например, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)), или шесть определяющих комплементарность областей (CDR) антитела, экспрессирванных в фибронектиновом остове. «Связывающая молекула», как описано в настоящем описании, может включать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или более «антигенсвязывающих доменов».
[0050] Термины «антитело» и «иммуноглобулин» могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем описании. Антитело (или его фрагмент, вариант, или производное, как описано в настоящем описании) включает по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи (для видов верблюдовых) или по меньшей мере вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи. Основные структуры антител в системах позвоночных относительно хорошо известны. См., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). Если не указано иное, термин «антитело» включает все в диапазоне от небольшого антигенсвязывающего фрагмента антитела до полноразмерного антитела, например, антитела IgG, которое включает две полных тяжелых цепи и две полных легких цепи, антитела IgA, которое включает четыре полных тяжелых цепи и четыре полных легких цепи и может включать J-цепь и/или секреторный компонент, или антитела IgM, которое включает десять или двенадцать полных тяжелых цепей, и десять или двенадцать полных легких цепей, и может включать J-цепь.
[0051] Термины «иммуноглобулин» и «антитело» включают различные широкие классы полипептидов, которые можно различать биохимически. Специалисту в данной области понятно, что тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, (γ, μ, α, δ, ε) с некоторыми подклассами среди них (например, γ1-γ4 или α1-α2)). Характер этой цепи определяет «класс» антитела как IgG, IgM, IgA IgG или IgE, соответственно. Подклассы (изотипы) антител, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 и т.д. хорошо охарактеризованы и, как известно, придают функциональную специализацию. Модифицированные варианты каждого из этих классов и изотипов являются легко узнаваемыми для специалиста в данной области в свете настоящего описания, и, соответственно, входят в объем этого описания.
[0052] Легкие цепи классифицируют либо как каппа, либо как лямбда (κ, λ). Каждый класс тяжелой цепи может являться связанным с легкой цепью каппа или лямбда. Как правило, легкие и тяжелые цепи являются ковалентно связанными друг с другом, и «хвостовые» части двух тяжелых цепей являются связанными друг с другом посредством ковалентных дисульфидных связей или нековалентных связей, когда антитела получают посредством гибридом, B-клеток или генетически модифицированных клеток-хозяев. В тяжелой цепи, аминокислотные последовательности проходят от N-конца на раздвоенных концах конфигурации Y до C-конца внизу каждой цепи. Основная структура конкретных антител, например, антител IgG, включает две субъединицы тяжелой цепи и две субъединицы легкой цепи, ковалентно соединенные посредством дисульфидных связей для формирования структуры «Y», также обозначенной в настоящем описании как структура «H2L2».
[0053] Термин «эпитоп» включает любую молекулярную детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом. В конкретных аспектах, эпитоп может включать химически активные поверхностные скопления молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорил или сульфонил, и, в конкретных аспектах, может иметь трехмерные структурные характеристики, и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область мишени, которая связывается с антителом.
[0054] «Мультиспецифические связывающие молекулы или антитела» или «биспецифические связывающие молекулы или антитела» относятся к связывающим молекулам, антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые имеют способность к специфическому связыванию с двумя или более различными эпитопами на одной и той же или различной мишени(мишенях). «Моноспецифический» относится к способности связывать только один эпитоп.
[0055] Термин «мишень» используют в самом широком смысле для включения веществ, способных связываться со связывающей молекулой. Мишень может представлять собой, например, полипептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид или другую молекулу. Кроме того, «мишень» может, например, представлять собой клетку, орган или организм, включающие эпитоп, который может связываться со связывающей молекулой.
[0056] Как легкие, так и тяжелые цепи разделяют на области структурной и функциональной гомологии. Термины «константный» и «вариабельный» используют функционально. В этом отношении, следует понимать, что вариабельные области (которые можно взаимозаменяемо называть в настоящем описании «вариабельными доменами») как вариабельной части легкой (VL) цепи, так и вариабельной части тяжелой (VH) цепи, определяют узнавание и специфичность для антигена. Напротив, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (например, CH1, CH2 или CH3) придают биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание рецептора Fc, связывание комплемента и т.п. По соглашению нумерация доменов константной области увеличивается по мере того, как они отдаляются от антигенсвязывающего участка или амино-конца антитела. N-концевая часть представляет собой вариабельную область, и в C-концевой части находится константная область; домены CH3 (или CH4 в случае IgM) и CL находятся на карбокси-конце тяжелой и легкой цепи, соответственно.
[0057] Шесть «определяющих комплементарность областей» или «CDR», присутствующие в типичном антигенсвязывающем домене антитела, представляют собой короткие, не являющиеся непрерывными последовательности аминокислот, которые расположены специфическим образом для формирования антигенсвязывающего домена, по мере того, как антитело принимает свою трехмерную конфигурацию в водном окружении. Для остальных аминокислот в антигенсвязывающем домене, обозначенных как «каркасные» области, показана меньшая межмолекулярная изменчивость. Каркасные области по большей части принимают конформацию β-листа, и CDR формируют петли, которые соединяют, и в некоторых случаях, формируют часть структуры β-листа. Таким образом, каркасные области действуют для формирования остова, обеспечивающего расположение CDR в правильной ориентации посредством межцепьевых, нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, сформированный посредством расположенных CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность обеспечивает нековалентное связывание антитела с родственным ему эпитопом. Специалист в данной области легко может идентифицировать аминокислоты, составляющие CDR и каркасные области, соответственно, для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, поскольку они определены множеством различных способов (см., «Sequences of Proteins of Immunological Interest», Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), полное содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки).
[0058] Конкретные молекулы антител могут также иметь эффекторные функции, опосредованные связыванием эффекторных молекул. Например, связывание компонента комплемента C1 с антителом активирует систему комплемента. Активация комплемента является важной для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может также быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность. Кроме того, конкретные антитела могут связываться с клетками посредством области Fc из области Fc антитела, связывающейся с рецептором Fc (FcR) на клетке. Существует ряд рецепторов Fc, которые являются специфическими для различных классов антител, включая, но без ограничения, IgG (рецепторы гамма), IgE (рецепторы эта), IgA (рецепторы альфа) и IgM (рецепторы мю). Связывание антитела с рецепторами Fc на поверхностях клеток может запускать ряд важных и разнообразных биологических ответов, включая, без ограничения, поглощение и разрушение покрытых антителом частиц, выведение иммунных комплексов, лизис покрытых антителом клеток-мишеней посредством клеток-киллеров (называемый антителозависимой опосредуемой клетками цитотоксичностью или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и/или контроль продукции антител.
[0059] В случае, когда существует два или более определений термина, используемых и/или принятых в данной области, определение термина, в рамках изобретения, предназначено для включения всех таких значений, если явно не указано противоположное. Конкретным примером является использование термина «определяющая комплементарность область» («CDR») для описания не являющихся непрерывными участков связывания антигена, обнаруженных внутри вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Эти конкретные области описаны, например, в Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, «Sequences of Proteins of Immunological Interest» (1983) и в Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Определения Kabat и Chothia включают перекрывание или подгруппы аминокислот при сравнении друг с другом. Тем не менее, использование любого определения (или других определений, известных обычным специалистам в данной области) для обозначения CDR антитела или его варианта предназначено для включения в объем термина, как определяют и применяют в настоящем описании, если не указано иное. Соответствующие аминокислоты, включающие CDR, как определено в каждой из процитированных выше ссылок, указаны ниже в таблице 1 в качестве сравнения. Точные номера аминокислот, включающие конкретную CDR, могут меняться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалист в данной области может общепринятым образом определять, что аминокислоты включают конкретную CDR, принимая во внимание аминокислотную последовательность вариабельной области антитела.
Таблица 1: Определения CDR*
Kabat
Chothia
VH CDR1
31-35
26-32
VH CDR2
50-65
52-58
VH CDR3
95-102
95-102
VL CDR1
24-34
26-32
VL CDR2
50-56
50-52
VL CDR3
89-97
91-96
*Нумерация всех определений CDR в таблице 1 приведена в соответствии с системой нумерации, указанной в Kabat et al. (см. ниже).
[0060] Вариабельные домены антител можно анализировать, например, с использованием информационной системы IMGT (www://imgt.cines.fr/) (IMGT/V-Quest), для идентификации фрагментов вариабельной области, включая CDR. (См., например, Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36:W503-508, 2008).
[0061] В Kabat et al. определена также система нумерации последовательностей вариабельного домена, применимая к любому антителу. Специалист в данной области может однозначно приписать эту систему «нумерации Kabat» к последовательности любого вариабельного домена, не опираясь на какие-либо экспериментальные данные помимо самой последовательности. В рамках изобретения, «нумерация Kabat» относится к системе нумерации, указанной в Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, «Sequence of Proteins of Immunological Interest» (1983). Однако, если использование системы нумерации Kabat не отмечено в явной форме, последовательную нумерацию используют для всех аминокислотных последовательностей в этом описании.
[0062] Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные включают, но без ограничения, поликлональные, моноклональные, человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fv, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, Fv с дисульфидными связями (sdFv), однодоменные антитела, такие как антитела VHH верблюдовых, фрагменты, содержащие домен VL или VH, фрагменты, полученные посредством экспрессирующей библиотеки Fab. Молекулы ScFv известны в данной области и описаны, например, в Патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулинов или антител, включенных в это описание, могут относиться к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекул антител. Предусмотрены также новые изотипы иммуноглобулиновых рецепторов антигена (IgNAR) (например, из акул), которые являются двухвалентными и содержат одну цепь, включающую вариабельный домен IgNAR (VNAR). (См., Walsh et al., Virology 411:132-141, 2011).
[0063] Под «специфически связывается», как правило, понимают, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное связывается с эпитопом посредством его антигенсвязывающего домена, и что связывание сопряжено с некоторой комплементарностью между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. В соответствии с этим определением, говорят, что связывающая молекула «специфически связывается» с эпитопом, когда она связывается с этим эпитопом, посредством его антигенсвязывающего домена, более активно, чем она может связываться со случайным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» используют в настоящем описании для качественной оценки относительной аффинности, с которой конкретная связывающая молекула связывается с конкретным эпитопом. Например, можно считать, что связывающая молекула «A» имеет более высокую специфичность для данного эпитопа, чем связывающая молекула «B», или можно сказать, что связывающая молекула «A» связывается с эпитопом «C» с более высокой специфичностью, чем она имеет для родственного эпитопа «D».
[0064] Можно сказать, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, описанная в настоящем описании, связывается с антигеном-мишенью со скоростью диссоциации (k(off)), меньшей или равной 5 X 10-2 с-1, 10-2 с-1, 5 X 10-3 с-1, 10-3 с-1, 5 X 10-4 с-1, 10-4 с-1, 5 X 10-5 с-1, или 10-5 с-1 5 X 10-6 с-1, 10-6 с-1, 5 X 10-7 с-1 или 10-7 с-1.
[0065] Можно сказать, что связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант, или производное, описанные в настоящем описании, связывается с антигеном-мишенью со скоростью связывания (k(on)), большей или равной 103 M-1 с-1, 5 X 103 M-1 с-1, 104 M-1 с-1, 5 X 104 M-1 с-1, 105 M-1 с-1, 5 X 105 M-1 с-1, 106 M-1 с-1 или 5 X 106 M-1 с-1, или 107 M-1 с-1.
[0066] Говорят, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, конкурентно связывается с эталонным антителом или антигенсвязывающим фрагментом против данного эпитопа, если она предпочтительно связывается с этим эпитопом, до такой степени, что она блокирует, до некоторой степени, связывание эталонного антитела или антигенсвязывающего фрагмента с этим эпитопом. Конкурентное ингибирование можно определять любым способом, известным в данной области, например, конкурентными анализами ELISA. Можно сказать, что связывающая молекула конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела или антигенсвязывающего фрагмента с данным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.
[0067] В рамках изобретения, термин «аффинность» относится к показателю силы связывания индивидуального эпитопа с одним или несколькими антигенсвязывающими доменами, например, молекулы антитела. См., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988), на страницах 27-28. В рамках изобретения, термин «авидность» относится к общей стабильности комплекса между популяцией антигенсвязывающих доменов и антигена. См., например, Harlow, на страницах 29-34. Авидность относится к аффинности индивидуальных антигенсвязывающих доменов в популяции для специфических эпитопов, а также к валентностям антитела и антигена. Например, взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и антигеном с высоким количеством повторов структуры эпитопа, таким как полимер, представляет собой взаимодействие с высокой авидностью. Взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и рецептором, присутствующим с высокой плотностью на поверхности клетки, также может представлять собой взаимодействие с высокой авидностью.
[0068] Связывающие молекулы или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, как описано в настоящем описании, можно также описывать или определять в отношении их перекрестной реакционной способности. В рамках изобретения, термин «перекрестная реакционная способность» относится к способности связывающей молекулы, например, антитела или его фрагмента, варианта или производного, специфической для одного антигена, вступать в реакцию с вторым антигеном; показатель родственности между двумя различными антигенными веществами. Таким образом, связывающая молекула имеет перекрестную реакционную способность, если она связывается с эпитопом, отличным от индуцировавшего его формирование. Имеющий перекрестную реакционную способность эпитоп, как правило, содержит множество комплементарных структурных признаков, одинаковых с индуцирующим эпитопом, и в некоторых случаях, может фактически соответствовать лучше, чем оригинал.
[0069] Связывающую молекулу, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное можно также описывать или определять в отношении ее аффинности связывания с антигеном. Например, связывающая молекула может связываться с антигеном с константой диссоциации или KD, не более чем 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M или 10-15 M.
[0070] Фрагменты антител, включающие одноцепочечные антитела или другие антигенсвязывающие домены, могут существовать отдельно или в комбинации с одним или несколькими из следующего: шарнирная область, домены CH1, CH2, CH3 или CH4, J-цепь, или секреторный компонент. Включены также антигенсвязывающие фрагменты, которые могут включать любую комбинацию вариабельной области(областей) с одним или несколькими из шарнирной области, доменов CH1, CH2, CH3, или CH4, J-цепи или секреторного компонента. Связывающие молекулы, например, антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, могут происходить из любого источника среди животных, включая птиц и млекопитающих. Антитела могут представлять собой антитела человека, мыши, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади или курицы. В другом варианте осуществления, вариабельная область может происходить из хрящевых рыб (например, из акул). В рамках изобретения, «человеческие» антитела включают антитела, имеющие аминокислотную последовательность человеческого антитела, и включают антитела, выделенные из библиотек человеческих антител или из животных, которые являются трансгенными по одному или нескольким человеческим антителам и могут, в некоторых случаях, экспрессировать эндогенные иммуноглобулины, и в некоторых случаях - нет, как описано ниже и, например, в Патенте США No. 5939598 от Kucherlapati et al.
[0071] В рамках изобретения, термин «субъединица тяжелой цепи» или «домен тяжелой цепи» включает аминокислотные последовательности, происходящие из тяжелой цепи антитела, связывающая молекула, например, антитело, содержащее субъединицу тяжелой цепи, может включать по меньшей мере один из: домена VH, домена CH1, шарнирного домена (например, верхней, средней и/или нижней шарнирной области), домена CH2, домена CH3, домена CH4 или его варианта или фрагмента.
[0072] Субъединицы тяжелой цепи связывающей молекулы, например, антитела или его фрагмента, могут включать домены, происходящие из различных молекул антитела. Например, субъединица тяжелой цепи полипептида может включать домен CH1, происходящий из молекулы IgG1, и шарнирную область, происходящую из молекулы IgG3. В другом примере, субъединица тяжелой цепи может включать шарнирную область, происходящую, частично, из молекулы IgG1 и, частично, из молекулы IgG3. В другом примере, субъединица тяжелой цепи может содержать химерный шарнир, происходящий, частично, из молекулы IgG1 и, частично, из молекулы IgG4.
[0073] В рамках изобретения, термин «субъединица легкой цепи» или «домен легкой цепи» включает аминокислотные последовательности, происходящие из легкой цепи антитела. Субъединица легкой цепи включает по меньшей мере один из доменов VL или CL (например, Cκ или Cλ).
[0074] Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, можно описывать или определять в отношении эпитопа(эпитопов) или части(частей) антигена, которые они узнают или специфически связывают. Часть антигена-мишени, которая специфически взаимодействует с антигенсвязывающим доменом антитела, представляет собой «эпитоп» или «антигенную детерминанту». Антиген-мишень может содержать один эпитоп или по меньшей мере два эпитопа, и может включать любое количество эпитопов, в зависимости от размера, конформации и типа антигена.
[0075] В рамках изобретения, термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором иммунореактивная область или участок получены или происходят из первого вида, и константная область (которая может являться интактной, частичной или модифицированной) получена из второго вида. В некоторых вариантах осуществления связывающая мишень область или участок может происходить из не относящегося к человеку источника (например, мыши или примата), и константная область является человеческой.
[0076] Термины «мультиспецифическое антитело» или «биспецифическое антитело» относятся к антителу, имеющему антигенсвязывающие домены, которые являются специфическими для двух или более различных эпитопов внутри одной молекулы антитела. В дополнение к канонической структуре антитела, можно конструировать другие связывающие молекулы с двумя различными специфичностями связывания. Связывание эпитопов биспецифическими или мультиспецифическими антителами может являться одновременным или последовательным. Триомы и гибридные гибридомы являются двумя примерами линий клеток, которые могут секретировать биспецифические антитела. Биспецифические антитела можно также конструировать рекомбинантными способами. (Ströhlein and Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry and Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)). Биспецифическое антитело может также представлять собой диатело. Таким образом, биспецифическая связывающая молекула, которая является мультимерной, потенциально может иметь несколько различных антигенсвязывающих доменов, каждый с различной специфичностью.
[0077] В рамках изобретения, термин «сконструированное антитело» относится к антителу, в котором вариабельный домен в любой из тяжелой и легкой цепи или в обеих изменен посредством по меньшей мере частичной замены одной или нескольких аминокислот либо в CDR, либо в каркасных областях. В конкретных аспектах, полноразмерные CDR из антитела известной специфичности можно прививать в каркасные области гетерологичного антитела. Хотя альтернативные CDR могут происходить из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого происходят каркасные области, CDR может также происходить из антитела другого класса, например, из антитела из другого вида. Сконструированное антитело, в котором одна или несколько «донорных» CDR из не относящегося к человеку антитела с известной специфичностью привиты в каркасную область человеческой тяжелой или легкой цепи, обозначено в настоящем описании как «гуманизированное антитело». В конкретных аспектах не все из CDR заменены на полные CDR из донорной вариабельной области, и антигенсвязывающая способность донора все еще может быть перенесена на вариабельные домены реципиента. Принимая во внимание объяснения, приведенные, например, в Патентах США No. 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, это полностью находится в компетенции специалиста в данной области, либо посредством проведения общепринятых экспериментов, либо посредством проверки способом проб и ошибок, для получения функционального сконструированного или гуманизированного антитела.
[0078] В рамках изобретения, термин «сконструированный» включает манипуляцию с молекулами нуклеиновой кислоты или полипептида посредством способов синтеза (например, посредством рекомбинантных способов, синтеза пептидов in vitro, посредством ферментативного или химического связывания пептидов или некоторой комбинации этих способов).
[0079] В рамках изобретения, термины «связанный», «слитый» или «слияние», или другие грамматические эквиваленты можно использовать взаимозаменяемо. Эти термины относятся к соединению двух или более элементов или компонентов, любыми способами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные способы. «Слияние в рамке считывания» относится к соединению двух или более открытых рамок считывания (ORF) полинуклеотида для формирования непрерывной более длинной ORF, способом, поддерживающим рамку считывания для трансляции исходных ORF. Таким образом, рекомбинантный слитый белок представляет собой одиночный белок, содержащий два или более фрагментов, соответствующих полипептидам, кодированным исходными ORF (где фрагменты в норме не являются соединенными таким образом в природе). Хотя рамку считывания таким образом делают непрерывной на протяжении слитых фрагментов, фрагменты могут являться физически или пространственно разделенными посредством, например, линкерной последовательности в рамке считывания. Например, полинуклеотиды, кодирующие CDR вариабельной области антитела, могут являться слитыми, в рамке считывания, но разделенными полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область антитела или дополнительные области CDR, при условии, что «слитые» CDR совместно транслируются в качестве части непрерывного полипептида.
[0080] В контексте полипептидов, «линейная последовательность» или «последовательность» представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от амино-конца до карбокси-конца, в котором аминокислоты, соседние друг с другом в последовательности, являются непрерывными в первичной структуре полипептида.
[0081] Часть полипептида, которая является «амино-концевой» или «N-концевой» по отношению к другой части полипептида, представляет собой ту часть, которая идет раньше в последовательной полипептидной цепи. Подобным образом, часть полипептида, которая является «карбокси-концевой» или «C- концевой» по отношению к другой части полипептида, представляет собой ту часть, которая идет позже в последовательной полипептидной цепи. Например, в типичном антителе, вариабельный домен является «N-концевым» по отношению к константной области, и константная область является «C-концевой» по отношению к вариабельному домену.
[0082] Термин «экспрессия», в рамках изобретения, относится к процессу, посредством которого из гена образуется биохимический продукт, например, полипептид. Этот процесс включает любое проявление функционального присутствия этого гена в клетке, включая, без ограничения, нокдаун гена, так же как временную экспрессию и стабильную экспрессию. Он включает, без ограничения, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК), и трансляцию такой мРНК в полипептид(ы). Если конечный желательный продукт является биохимическим, экспрессия включает образование этого биохимического продукта и любых предшественников. Экспрессия гена образует «продукт гена». В рамках изобретения, продукт гена может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например, матричную РНК, полученную посредством транскрипции гена, либо полипептид, транслированный с транскрипта. Продукты генов, описанные в настоящем описании, кроме того, включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и т.п.
[0083] Термин «эукариота» или «эукариотический организм» предназначен, чтобы включать все организмы царств животных, растений и протистов, включая простейших, грибы, дрожжи, зеленые водоросли, одноклеточные растения, многоклеточные растения и всех животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. Термин не включает бактерии или вирусы. «Эукариотическая клетка» предназначена, чтобы включать отдельную «эукариотическую клетку» так же как множество «эукариотических клеток», и включает клетки, происходящие из эукариот.
[0084] Термин «позвоночное» предназначен, чтобы включать единственное число «позвоночное», так же как множественное «позвоночные», и включает млекопитающих и птиц, так же как рыб, рептилий и земноводных.
[0085] Термин «млекопитающее» предназначен, чтобы включать единственное число «млекопитающее» и множественное «млекопитающие», и включает, но без ограничения, человека; приматов, таких как обезьяны, мартышки, орангутаны и шимпанзе; псовых, таких как собаки и волки; кошачьих, таких как кошки, львы и тигры; лошадиных, таких как лошади, ослы и зебры, продовольственных животных, таких как коровы, свиньи и овцы; копытных, такие как олени и жирафы; грызунов, таких как мыши, крысы, хомяки и морские свинки; и медведей. В конкретных аспектах, млекопитающее представляет собой субъекта-человека.
[0086] Термины «культура тканей» или «культура клеток», или «культура», или «культивирование» относятся к поддержанию или выращиванию тканей или клеток растения или животного in vitro в условиях, позволяющих сохранение архитектуры клеток, сохранение функции клеток, дальнейшую дифференцировку или все три. «Клетки первичной культуры» представляют собой клетки, взятые непосредственно из ткани, т.е., популяцию клеток одного и того же вида, выполняющих одну и ту же функцию в организме. Обработкой таких клеток ткани протеолитическим ферментом трипсином, например, диссоциируют их на отдельные клетки первичной культуры, которые растут или сохраняют архитектуру клеток при рассеве на планшеты для культивирования. Культуры клеток, полученные в результате манипуляции с первичными клетками в культуре тканей, называют «вторичными культурами клеток». Большинство вторичных клеток делятся конечное количество раз и затем умирают. Небольшое количество вторичных клеток, однако, могут проходить этот «период кризиса», после которого они являются способными размножаться неопределенно долго с образованием стабильной «линии клеток». Жидкую среду, в которой культивируют клетки, обозначают в настоящем описании как «культуральную среду» или «культуральные среды». Культуральная среда, в которую желательные молекулы, например, вирусы или белки, например, молекулы антител, секретированы в ходе культивирования клеток, в настоящем описании может быть обозначена как «кондиционированная среда».
[0087] В рамках изобретения, термин «идентифицировать» относится к способам, в которых желательную молекулу, например, полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес белок с желательными характеристиками или функцией, отличают от множества или библиотеки таких молекул. Способы идентификации включают «отбор» и «скрининг» или «пэннинг». В рамках изобретения, способы «отбора» представляют собой способы, в которых желательные молекулы можно напрямую выделять из библиотеки. В рамках изобретения, способы «скрининга» или «пэннинга» представляют собой способы, в которых пулы, содержащие желательные молекулы, подвергают анализу, в котором желательную молекулу можно детектировать. Затем аликвоты пулов, в которых детектирована эта молекула, разделяют на последовательные меньшие пулы, которые анализируют подобным образом, пока не получают пул, который является высоко обогащенным желательной молекулой.
Поксвирусные векторы
[0088] Библиотеки полинуклеотидов, сконструированные в соответствии со способами в рамках изобретения, можно конструировать в поксвирусном векторе. «Поксвирус» включает любой член семейства Poxviridae, включая подсемейства Chordopoxviridae (поксвирусы позвоночных) и Entomopoxviridae (поксвирусы насекомых). См., например, B. Moss in: Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2080 (1990). Хордопоксвирусы включают, среди прочего, следующие роды: ортопоксвирус (например, вирус осповакцины, вирус натуральной оспы, поксвирус енота); авипоксвирус (например, вирус оспы кур); каприпоксвирус (например, вирус оспы овец); лепорипоксвирус (например, вирус фибромы кроликов (Шоупа) и миксомы); и суипоксвирус (например, вирус оспы свиней). Энтомопоксвирусы включают три рода: A, B и C. Вирус осповакцины представляет собой ортопоксвирус-прототип, и является разработанным и хорошо охарактеризованным в качестве вектора для экспрессии гетерологичных белков.
[0089] Поксвирусы отличаются большим размером и сложностью, и сходным образом содержат большие и сложные геномы. Следует отметить, что репликация поксвирусов происходит полностью внутри цитоплазмы клетки-хозяина. Центральные части геномов поксвируса являются сходными, в то время как концевые части геномов вирусов характеризуются большей изменчивостью. Соответственно, считают, что центральная часть геномов поксвируса несет гены, ответственные за необходимые функции, общие для всех поксвирусов, такие как репликация. В отличие от этого, концевые части геномы поксвируса, по-видимому, являются ответственными за такие характеристики, как патогенность и диапазон хозяев, которые изменяются среди различных поксвирусов, и могут с большей вероятностью не являться необходимыми для репликации вируса в культуре ткани. Следовательно, если геном поксвируса необходимо модифицировать посредством реаранжировки или удаления фрагментов ДНК, или введения экзогенных фрагментов ДНК, часть природной ДНК, которую подвергают реаранжировке, удаляют или разрушают посредством введения экзогенной ДНК, может находиться в областях, как считают, не являющихся необходимыми для репликации вируса и продукции инфекционных вирионов в культуре ткани, например, в более отдаленных областях.
[0090] Природный геном вируса осповакцины представляет собой перекрестно сшитую, двухцепочечную линейную молекулу ДНК, из приблизительно 186000 пар оснований (п.о.), которая характеризуется инвертированными концевыми повторами. Геном вируса осповакцины полностью секвенирован, и множество не являющихся необходимыми областей идентифицированы в геноме вируса осповакцины. См., например, Perkus, M. E., et al., Virology 152:285-97 (1986); и Kotwal, G. J. and Moss B., Virology 167:524-37. Наиболее широко используемой не являющейся необходимой областью для вставки чужеродных генов в вирус осповакцины является локус тимидинкиназы, локализованный в фрагменте HindIII J в геноме. В конкретных векторах на основе вируса осповакцины, локус tk модифицирован, чтобы содержать один или два уникальных участка для ферментов рестрикции, позволяющие удобное использование способа тримолекулярной рекомбинации для получения библиотеки. См. ниже, а также Zauderer, Публикация PCT No. WO 00/028016.
[0091] Библиотеки полинуклеотидов, кодирующих представляющие интерес полипептиды, например, субъединицы полипептидов антител, можно вставлять в поксвирусные векторы, например, векторы на основе вируса осповакцины, в функциональной связи с областью контроля транскрипции, функционирующей в цитоплазме инфицированной поксвирусом клетки.
[0092] Области контроля транскрипции поксвируса содержат промотор и сигнал терминации транскрипции. Экспрессия генов в поксвирусах регулируется в зависимости от времени, и промоторы для ранних, промежуточных и поздних генов имеют различные структуры. Конкретные гены поксвирусов экспрессируются конститутивно, и промоторы для этих «ранних-поздних» генов имеют гибридные структуры. Разработаны также синтетические ранние-поздние промоторы. См. Hammond J. M., et al., J. Virol. Methods 66:135-8 (1997); Chakrabarti S., et al., Biotechniques 23:1094-7 (1997). Любой промотор поксвируса можно использовать в способах в рамках изобретения.
[0093] Примеры ранних промоторов включают промотор белка 7,5-кДа (также поздний промотор), промотор ДНК-полимеразы, промотор tk, промотор РНК-полимеразы, промотор белка 19-кДа, промотор белка 22-кДа, промотор белка 42-кДа, промотор белка 37-кДа, промотор белка 87-кДа, промотор H3′, промотор H6, промотор D1, промотор D4, промотор D5, промотор D9, промотор D12, промотор I3, промотор M1 и промотор N2. См., например, Moss, B., «Poxviridae and their Replication» IN Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2088 (1990). Ранние гены, транскрибируемые в вирусе осповакцины и других поксвирусах, узнают сигнал терминации транскрипции TTTTTNT, где N может представлять собой любой нуклеотид. Транскрипция в норме останавливается приблизительно на 50 п.о. выше этого сигнала. Соответственно, если гетерологичные гены необходимо экспрессировать с ранних промоторов поксвируса, необходимо следить, чтобы исключить встречаемость этого сигнала в кодирующих областях для этих генов. См., например, Earl, P. L., et al., J. Virol. 64:2448-51 (1990).
[0094] Примеры поздних промоторов включают промотор белка 7,5-кДа, промотор MIL, промотор белка 37-кДа, промотор белка 11-кДа, промотор 11L, промотор 12L, промотор 13L, промотор 15L, промотор 17L, промотор белка 28-кДа, промотор H1L, промотор H3L, промотор H5L, промотор H6L, промотор H8L, промотор D11L, промотор D12L, промотор D13L, промотор A1L, промотор A2L, промотор A3L и промотор P4b. См., например, Moss, B., «Poxviridae and their Replication» IN Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2090 (1990). Поздние промоторы, по-видимому, не узнают сигнал терминации транскрипции, узнаваемый ранними промоторами.
[0095] Конститутивные промоторы для использования в способах в рамках изобретения могут включать синтетические ранние-поздние промоторы, описанные в Hammond and Chakrabarti, ранний-поздний промотор MH-5 и промотор белка 7,5-кДа или промотор «p7.5».
[0096] Ряд ослабленных поксвирусов, в частности, вирусов осповакцины, разработали и использовали в качестве векторов. Например, модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) представляет собой сильно ослабленный штамм вируса осповакцины, полученный в ходе более 570 пассажей в первичных эмбриональных фибробластах курицы (Mayr, A. et al., Infection 3:6-14 (1975)). В выделенном вирусе делетировано приблизительно 15% ДНК вируса осповакцины дикого типа, которые сильно влияют на ограничение диапазона хозяев вируса. MVA не может реплицироваться или реплицируется очень неэффективно в большинстве линий клеток млекопитающих. Уникальным признаком этого ограничения диапазона хозяев является то, что блокирование в непермессивных клетках возникает на относительно поздней стадии цикла репликации. Экспрессия поздних вирусных генов является относительно ненарушенной, однако морфогенез вириона является прерванным (Suter, G. and Moss, B., Proc Natl Acad Sci USA 89:10847-51 (1992); Carroll, M. W. and Moss, B., Virology 238:198-211 (1997)). Высокие уровни синтеза вирусного белка даже в непермессивных клетках-хозяевах делают MVA особенно безопасным и эффективным экспрессирующим вектором. Однако, поскольку MVA не может завершать цикл инфекции в большинстве клеток млекопитающих, для выделения инфекционного вируса в течение множества циклов отбора, необходимо комплементировать недостаточность MVA посредством совместной инфекции или суперинфекции с использованием вируса-помощника, который сам является дефектным и который можно впоследствии отделять от инфекционных рекомбинантов MVA посредством дифференциального размножения при низкой MOI в пермиссивных для MVA клетках-хозяевах.
[0097] В рамках изобретения, термин «комплементация» относится к восстановлению утраченной функции в транс-положении посредством другого источника, такого как клетка-хозяин, трансгенное животное или вирус-помощник. Утрата функции вызвана утратой продукта гена дефектного вируса, ответственного за эту функцию. Таким образом, дефектный поксвирус представляет собой нежизнеспособную форму исходного поксвируса, и представляет собой форму, которая может становиться жизнеспособной в присутствии комплементации. Клетка-хозяин, трансгенное животное или вирус-помощник содержит последовательность, кодирующую продукт утраченного гена, или «комплементирующий элемент». Комплементирующий элемент может, в некоторых аспектах, являться способным к экспрессии и стабильно интегрированным в клетку-хозяина, трансгенное животное или вирус-помощник, и в конкретных аспектах, является сконструированным таким образом, чтобы вызывать небольшой риск или не вызывать риска рекомбинации с геномом дефектного поксвируса.
[0098] Вирусы, полученные в комплементирующей линии клеток, являются способными к инфекции некомплементирующих клеток, и кроме того, являются способными к экспрессии на высоком уровне продуктов ранних генов. Однако, в отсутствие продукта необходимого гена, отключения некоторых генов хозяина, репликации ДНК, упаковки и продукции вирусных частиц не происходит.
Способ тримолекулярной рекомбинации
[0099] Традиционно, поксвирусные векторы, такие как вирус осповакцины, не использовали для идентификации ранее неизвестных представляющих интерес генов из комплексных библиотек, поскольку высокоэффективного, обеспечивающего высокую сложность, высокие титры, способа конструирования и скрининга библиотек не существовало для вирусов осповакцины. Традиционный способ экспрессии гетерологичного белка в вирусе осповакцины включает гомологичную рекомбинацию in vivo между плазмидой-переносчиком и интактным геномом вируса осповакцины, и прямое лигирование in vitro. При использовании традиционной гомологичной рекомбинации, эффективность получения рекомбинантного вируса была порядка приблизительно 0,1% или менее. Хотя эффективность получения рекомбинантного вируса с использованием прямого лигирования выше, получаемый в результате титр является относительно низким. Таким образом, использование вектора вируса осповакцины было ограничено клонированием ранее выделенной ДНК для целей экспрессии белка и разработки вакцины.
[0100] Тримолекулярная рекомбинация, как описано в Zauderer, Публикация PCT No. WO 00/028016, является высоко эффективным, обеспечивающим высокие титры способом получения рекомбинантного поксвируса, например, рекомбинантного вируса осповакцины. Способ тримолекулярной рекомбинации позволяет получение рекомбинантных вирусов с эффективностью по меньшей мере 90%, и титрами, по меньшей мере на 2 порядка диапазона выше, чем титры, полученные посредством прямого лигирования. Принимая во внимание эту высокую эффективность, библиотеки полинуклеотидов, способные экспрессировать представляющие интерес полипептиды, например, полипептиды субъединиц антител, можно конструировать в поксвирусных векторах, например, векторах на основе вируса осповакцины, с использованием тримолекулярной рекомбинации.
[0101] Под «тримолекулярной рекомбинацией» или «способом тримолекулярной рекомбинации» понимают способ получения модифицированного генома вируса, например, генома поксвируса, например, генома вируса осповакцины, содержащего гетерологичный представляющий интерес полинуклеотид, посредством введения двух негомологичных фрагментов генома вируса, т.е., двух «плеч» генома вируса, которые являются неспособными подвергаться гомологичной рекомбинации друг с другом, и вектора-переносчика или ДНК-переносчика, содержащих представляющий интерес полинуклеотид, в клетку-реципиента, и обеспечения рекомбинации трех молекул ДНК in vivo. В результате рекомбинации, образуется жизнеспособный геном вируса, который содержит каждый из двух фрагментов генома и представляющий интерес полинуклеотид. Таким образом, способ тримолекулярной рекомбинации как описано в настоящем описании, может включать: (a) расщепление выделенного генома поксвируса, например, генома вируса осповакцины, для получения первого фрагмента вируса и второго фрагмента вируса, где первый фрагмент не способен подвергаться гомологичной рекомбинации с вторым вирусным фрагментом; (b) получение популяции плазмид-переносчиков, содержащих представляющие интерес полинуклеотиды, кодирующие представляющие интерес полипептиды, например, полипептиды субъединиц антитела, например, легких цепей антител, тяжелых цепей антител, или антигенспецифических фрагментов любого из них, посредством функциональной связи с областью для контроля транскрипции, фланкированной 5′-фланкирующей областью и 3′-фланкирующей областью, где 5′-фланкирующая область содержит область, гомологичную 3'-концу первого фрагмента вируса, и 3′-фланкирующая область содержит область, гомологичную 5'-концу второго фрагмента вируса; и где плазмиды-переносчики являются способными к гомологичной рекомбинации с первым и вторым фрагментами вируса, таким образом, что может формироваться жизнеспособный геном вируса; (c) введение плазмиды-переносчика, описанной в (b), и первого и второго фрагментов вируса, описанных в (a), в клетку-хозяина в условиях, в которых плазмида-переносчик и два фрагмента вируса могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vivo, т.е., тримолекулярной рекомбинации, таким образом, получение жизнеспособного модифицированного генома вируса, содержащего полинуклеотид, который кодирует представляющий интерес полипептид, например, полипептид субъединицы антитела; (d) добавление ингибитора сборки поксвируса, например, рифампицина, как описано в другом месте настоящего описания, и выделение модифицированных геномов вируса, полученных этим способом. В конкретных аспектах, выделенный модифицированный геном поксвируса может являться упакованным в инфекционную вирусную частицу.
[0102] Под «эффективностью рекомбинации» или «эффективностью продукции рекомбинантного вируса» понимают соотношение рекомбинантного вируса к общему количеству вируса, продуцированного в ходе получения библиотек вирусов способами в рамках изобретения. Эффективность можно рассчитывать посредством деления титра рекомбинантного вируса на общий титр вируса и умножения на 100%. Например, титр можно определять посредством анализа бляшек неочищенного препарата вируса для хранения на соответствующих клетках, либо с использованием отбора (например, для рекомбинантного вируса), либо без отбора (например, для рекомбинантного вируса плюс вируса дикого типа). Способы отбора, в частности, если гетерологичные полинуклеотиды вставлены в локус тимидинкиназы (tk) вируса, хорошо известны в данной области и включают устойчивость к бромдезоксиуридину (BDUR) или другим аналогам нуклеотидов из-за повреждения гена tk. Примеры способов отбора описаны в настоящем описании.
[0103] Под «высоко эффективной рекомбинацией» понимают эффективность рекомбинации по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.
[0104] Можно использовать ряд систем отбора, включая, но без ограничения, тимидинкиназу, такую как тимидинкиназа вируса простого герпеса (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазу (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) и аденин-фосфорибозил-трансферазу (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817), гены которых можно использовать в клетках tk-, hgprt- или aprt-, соответственно. А также, можно использовать устойчивость к антиметаболитам в качестве основания для отбора по следующим генам: dhfr, придающий устойчивость к метотрексату (Wigler, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, придающий устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, придающий устойчивость к аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); и hygro, придающий устойчивость к гигромицину (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147).
[0105] Совместно, первый и второй фрагменты вируса или «плечи» генома вируса, как описано выше, как правило, содержат все гены, необходимые для репликации вируса и для продукции инфекционных вирусных частиц. Примеры пригодных плеч и способов их получения с использованием векторов на основе вируса осповакцины описаны в настоящем описании. См. также в Falkner et al., Патент США No. 5770212, руководство относительно необходимых областей для репликации вируса осповакцины.
[0106] Однако голая геномная ДНК поксвируса, такая как геномы вируса осповакцины, не может образовывать инфекционное потомство без кодируемых вирусом белка(белков)/функции(функций), ассоциированных с входящей вирусной частицей. Необходимые кодируемые вирусом функции включают РНК-полимеразу, которая узнает трансфицированную ДНК вируса осповакцины в качестве матрицы, инициирует транскрипцию и, в конечном счете, репликацию трансфицированной ДНК. См. Dorner, et al. Патент США No. 5445953.
[0107] Таким образом, для получения инфекционного потомства вируса посредством тримолекулярной рекомбинации с использованием поксвируса, такого как вирус осповакцины, клетка-реципиент может иметь функции упаковки. Функции упаковки можно обеспечивать посредством вируса-помощника, например, вируса, который, вместе с трансфицированной голой геномной ДНК, предоставляет соответствующие белки и факторы, необходимые для репликации и сборки потомства вируса.
[0108] Вирус-помощник может представлять собой близкородственный вирус, например, поксвирус из того же подсемейства поксвируса, что и вирус осповакцины, из того же или другого рода. В таком случае обеспечивает преимущество выбор вируса-помощника, предоставляющего РНК-полимеразу, которая узнает трансфицированную ДНК в качестве матрицы и таким образом, служит для инициации транскрипции и, в конечном счете, репликации трансфицированной ДНК. Если близкородственный вирус используют в качестве вируса-помощника, обеспечивает преимущество то, что он является ослабленным таким образом, что формирование инфекционного вируса нарушено. Например, чувствительный к температуре вирус-помощник можно использовать при непермиссивной температуре. В конкретных аспектах, используют гетерологичный вирус-помощник. Примеры включают, но без ограничения, авипоксвирус, такой как вирус оспы кур, или вирус эктромелии (оспы мышей). Авипоксвирусы обеспечивают необходимые функции помощника, но не реплицируются или не образуют инфекционные вирионы в клетках млекопитающих (Scheiflinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9977-9981 (1992)). Использование гетерологичных вирусов минимизирует количество событий рекомбинации между геномом вируса-помощника и трансфицированным геномом, которая происходит, когда гомологичные последовательности близкородственных вирусов присутствуют в одной клетке. См. Fenner & Comben, Virology 5:530 (1958); Fenner, Virology 8:499 (1959).
[0109] Альтернативно, необходимые функции помощника в клетке-реципиенте можно обеспечивать посредством генетического элемента, отличного от вируса-помощника. Например, клетку-хозяина можно трансформировать для конститутивного предоставления функций помощника, или клетку-хозяина можно временно трансфицировать с использованием плазмиды, экспрессирующей функции помощника, инфицировать с использованием ретровируса, экспрессирующего функции помощника, или обеспечивать любым другим экспрессирующим вектором, пригодным для экспрессии необходимых функций вируса-помощника. См. Dorner, et al. Патент США No. 5445953.
[0110] В соответствии со способом тримолекулярной рекомбинации, первый и второй фрагменты генома вируса являются неспособными к лигированию или рекомбинации друг с другом, т.е., они не содержат совместимых липких концов или гомологичных областей, или альтернативно, липкие концы обработаны с использованием фермента для дефосфорилирования. В конкретных аспектах, геном вируса может содержать первый участок узнавания для первой эндонуклеазы рестрикции и второй участок узнавания для второй эндонуклеазы рестрикции, и первый и второй фрагменты вируса получают посредством расщепления генома вируса подходящими эндонуклеазами рестрикции для получения «плеч» вируса, и первый и второй фрагменты вируса выделяют стандартными способами. В идеале, участки узнавания первой и второй эндонуклеазы рестрикции являются уникальными в геноме вируса, или альтернативно, расщепление с использованием двух эндонуклеаз рестрикции приводит к получению «плеч» вируса, включающих гены для всех необходимых функций, т.е., где первый и второй участки узнавания являются физически аранжированными в геноме вируса таким образом, что область, простирающаяся между первым и вторым фрагментами вируса, не является необходимой для инфекционности вируса.
[0111] Когда вектор на основе вируса осповакцины используют в способе тримолекулярной рекомбинации, можно использовать вектор на основе вируса осповакцины, содержащий геном вируса с двумя уникальными участками рестрикции внутри гена tk. Например, первый фермент рестрикции может представлять собой NotI, имеющий участок узнавания GCGGCCGC в гене tk, и второй фермент рестрикции может представлять собой ApaI, имеющий участок узнавания GGGCCC в гене tk. Иллюстративные векторы на основе вируса осповакцины включают геном вируса v7.5/tk или геном вируса vEL/tk. Merchlinsky, et al., Virology 238:444-451 (1997).
[0112] В соответствии с этим вариантом осуществления, используют плазмиду-переносчика с фланкирующими областями, способными к гомологичной рекомбинации с областью генома вируса осповакцины, содержащей ген тимидинкиназы. Фрагмент генома вируса осповакцины, содержащий фрагмент HindIII-J, содержащий ген tk, удобно использовать.
[0113] В конкретных аспектах, представляющие интерес полинуклеотиды могут являться функционально связанными с последовательностями для контроля экспрессии поксвируса, например, сильными конститутивными промоторами поксвируса, такими как p7.5 или синтетический ранний/поздний промотор.
[0114] Соответственно, плазмида-переносчик, в рамках изобретения, может содержать полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес белок, например, полипептид субъединицы антитела, например, тяжелой цепи, легкой цепи или антигенсвязывающего фрагмента тяжелой цепи или легкой цепи, посредством функциональной связи с промотором p7.5 вируса осповакцины или синтетическим ранним/поздним промотором. Плазмида-переносчик может представлять собой любую из плазмид-переносчиков, описанных в Публикации PCT No. WO 00/028016, Патенте США No. 6706477 или Патенте США No. 7858559, полное содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
[0115] В одном аспекте плазмида-переносчик, содержащая полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес белок, например, полипептид тяжелой цепи антитела, посредством функциональной связи с промотором p7.5 вируса осповакцины, может представлять собой pVHE, которая содержит последовательность, обозначенную в настоящем описании, как SEQ ID NO: 1:
GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCGGCCGCAAACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGCGCATATGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCTGTGAGAATTCCCCGTCGGATACGAGCAGCGTGGCCGTTGGCTGCCTCGCACAGGACTTCCTTCCCGACTCCATCACTTTCTCCTGGAAATACAAGAACAACTCTGACATCAGCAGCACCCGGGGCTTCCCATCAGTCCTGAGAGGGGGCAAGTACGCAGCCACCTCACAGGTGCTGCTGCCTTCCAAGGACGTCATGCAGGGCACAGACGAACACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACCCCAACGGCAACAAAGAAAAGAACGTGCCTCTTCCAGTGATTGCTGAGCTGCCTCCCAAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGGCTTCTTCGGCAACCCCCGCAGCAAGTCCAAGCTCATCTGCCAGGCCACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGCGCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGGACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAGAGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACTAGCACACTGACCATCAAAGAGAGCGACTGGCTCAGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAATGCGTCCTCCATGTGTGTCCCCGATCAAGACACAGCCATCCGGGTCTTCGCCATCCCCCCATCCTTTGCCAGCATCTTCCTCACCAAGTCCACCAAGTTGACCTGCCTGGTCACAGACCTGACCACCTATGACAGCGTCACCATCTCCTGGACCCGCCAGAATGGCGAAGCTGTGAAAACCCACACCAACATCTCCGAGAGCCACCCCAATGCCACTTTCAGCGCCGTGGGTGAGGCCAGCATCTGCGAGGATGACTGGAATTCCGGGGAGAGGTTCACGTGCACCGTGACCCACACAGACCTGCCCTCGCCACTGAAGCAGACCATCTCCCGGCCCAAGGGGGTGGCCCTGCACAGGCCCGATGTCTACTTGCTGCCACCAGCCCGGGAGCAGCTGAACCTGCGGGAGTCGGCCACCATCACGTGCCTGGTGACGGGCTTCTCTCCCGCGGACGTCTTCGTGCAGTGGATGCAGAGGGGGCAGCCCTTGTCCCCGGAGAAGTATGTGACCAGCGCCCCAATGCCTGAGCCCCAGGCCCCAGGCCGGTACTTCGCCCACAGCATCCTGACCGTGTCCGAAGAGGAATGGAACACGGGGGAGACCTACACCTGCGTGGTGGCCCATGAGGCCCTGCCCAACAGGGTCACTGAGAGGACCGTGGACAAGTCCACCGAGGGGGAGGTGAGCGCCGACGAGGAGGGCTTTGAGAACCTGTGGGCCACCGCCTCCACCTTCATCGTCCTCTTCCTCCTGAGCCTCTTCTACAGTACCACCGTCACCTTGTTCAAGGTGAAATGAGTCGAC
Амплифицированные посредством ПЦР вариабельные области тяжелой цепи можно вставлять в рамке считывания в уникальные участки BssHII и/или BstEII, указанные выше жирным шрифтом.
[0116] В другом аспекте, плазмида-переносчик, содержащая полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес белок, например, полипептид легкой цепи антитела, посредством функциональной связи с промотором p7.5 вируса осповакцины, может представлять собой pVKE, которая содержит последовательность, обозначенную в настоящем описании, как SEQ ID NO: 2:
GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCGGCCGCCCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACACGGGTGCACTTGACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGTCGAC
Амплифицированные посредством ПЦР вариабельные области легкой цепи каппа можно вставлять в рамке считывания в уникальные участки ApaLI и/или XhoI, указанные выше жирным шрифтом.
[0117] В другом аспекте плазмида-переносчик, содержащая полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес белок, например, полипептид легкой цепи антитела, посредством функциональной связи с промотором p7.5 вируса осповакцины, может представлять собой pVLE, которая содержит последовательность, обозначенную в настоящем описании, как SEQ ID NO: 3:
GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCGGCCGCCCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTTGACTCGAGAAGCTTACCGTCCTACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGTCGAC
Амплифицированные посредством ПЦР вариабельные области легкой цепи лямбда можно вставлять в рамке считывания в уникальные участки ApaLI и/или HindIII, указанные выше жирным шрифтом.
[0118] Под «вставкой ДНК» или «представляющим интерес полинуклеотидом» понимают один или несколько фрагментов гетерологичной ДНК, предназначенных для экспрессии в рекомбинантном поксвирусном векторе. «Представляющие интерес полинуклеотиды», в рамках изобретения, представляют собой полинуклеотиды, которые кодируют представляющие интерес белки, например, полипептиды субъединиц антител. Представляющий интерес полинуклеотид может представлять собой природный, неприродный, синтетический или их комбинацию. Способы получения представляющих интерес полинуклеотидов для использования в способах в рамках изобретения хорошо известны специалисту в данной области.
[0119] Под «плазмидой-переносчиком» понимают плазмидный вектор, который содержит представляющий интерес полинуклеотид, расположенный между 5′-фланкирующей областью и 3′-фланкирующей областью, как описано выше. 5′-фланкирующая область разделяет гомологию с первым вирусным фрагментом, и 3′-фланкирующая область разделяет гомологию с вторым вирусным фрагментом. В конкретных аспектах, плазмида-переносчик содержит пригодный промотор, такой как сильный, конститутивный промотор вируса осповакцины, выше представляющего интерес полинуклеотида. Термин «вектор» обозначает полинуклеотидную конструкцию, содержащую гетерологичный полинуклеотидный фрагмент, которая является способной обеспечивать перенос этого полинуклеотидного фрагмента в подходящую клетку-хозяин. В конкретных аспектах, полинуклеотид, содержащийся в векторе, является функционально связанным с подходящей контрольной последовательностью, способной обеспечивать экспрессию полинуклеотида в подходящем хозяине. Такие контрольные последовательности включают промотор для обеспечения транскрипции, необязательно, последовательность оператора для контроля такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие участки связывания рибосом в мРНК, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции. В рамках изобретения, вектор может представлять собой плазмиду, частицу фага, вирус, матричную РНК или просто потенциальную геномную вставку. После трансформации подходящего хозяина, вектор может реплицироваться и функционировать независимо генома хозяина, или сам может, в некоторых случаях, интегрировать в геном. Типичные плазмидные экспрессирующие векторы для экспрессии в культурах клеток млекопитающих, например, основаны на pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291) и pVL1392 (Pharmingen).
[0120] Однако, «плазмида-переносчик», в рамках изобретения, не является ограниченной конкретными плазмидой или вектором. Любой фрагмент ДНК в кольцевой или линейной, или другой пригодной форме может действовать в качестве переносчика для переноса вставки ДНК в клетку-хозяина вместе с первым и вторым «плечами» вируса в способе тримолекулярной рекомбинации. Другие пригодные векторы включают фаг лямбда, мРНК, фрагменты ДНК и т.д., как описано в настоящем описании или иным образом известно в данной области. Множество плазмид может представлять собой «первичную библиотеку», такую как описанные в настоящем описании для лямбда.
Добавление ингибитора сборки вируса осповакцины
[0121] В соответствии со способами в рамках изобретения, ингибитор сборки вируса осповакцины можно добавлять для улучшения сложности, разнообразия и/или титра библиотек поксвируса, которые конструируют с использованием тримолекулярной рекомбинации. Одним таким ингибитором является рифампицин. Рифампицин представляет собой антибиотик, который, как правило, используют для лечения различных бактериальных инфекций. Рифампицин ингибирует бактериальную РНК-полимеразу, что делает его способным ингибировать синтез белков бактерии-хозяина в ходе экспрессии рекомбинантного белка в бактериях. Он также является способным обратимо ингибировать репликацию вируса осповакцины посредством предотвращения сборки ДНК и белков в частицы зрелого вируса (Moss., B., et al., Nature 224: 1280-1284 (1969)). Другие ингибиторы сборки поксвируса могут включать, без ограничения, азатиоприн, новобиоцин и/или митоксантрон.
[0122] В то время как ингибирование роста вируса обеспечивает преимущество в тех случаях, когда необходимо уменьшить скорость репликации, например, при спонтанной рекомбинации, тримолекулярная рекомбинация требует повторной сборки генома вируса для получения вируса. Таким образом, является неожиданным, что добавление ингибитора, такого как рифампицин, может улучшать качество, сложность и/или титр рекомбинантов, которые конструируют с использованием тримолекулярной рекомбинации. Однако, способы в рамках изобретения могут задерживать общий рост вируса, вплоть до окончания рекомбинации. Например, рифампицин можно добавлять после трансфекции, например, через приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 30 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 42 часа, приблизительно 48 часов, приблизительно 54 часа или приблизительно 60 часов после трансфекции, для увеличения количества индивидуальных (уникальных) конструируемых рекомбинантов, как посредством увеличения периода времени для прохождения рекомбинации, так и посредством предотвращения упаковки вируса из-за избыточного роста культур. В конкретных аспектах, рифампицин или его производное можно добавлять в культуральную среду в концентрации приблизительно 30 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 70 мкг/мл, приблизительно 80 мкг/мл, приблизительно 90 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 110 мкг/мл, приблизительно 120 мкг/мл, или приблизительно 130 мкг/мл. В конкретных аспектах рифампицин или его производное можно поддерживать в культуральной среде в течение приблизительно одних суток, приблизительно двух суток, приблизительно трех суток, приблизительно четырех суток или приблизительно пяти суток. После инкубации трансфицированных клеток с культуральной средой, содержащей рифампицин, культуральную среду можно заменять на культуральную среду без рифампицина, и трансфицированные клетки-хозяева можно далее культивировать без рифампицина в течение, например, приблизительно одних суток, приблизительно двух суток или приблизительно трех суток.
[0123] Способы конструирования библиотеки в рамках изобретения могут обеспечивать получение увеличенного количества независимых модифицированных геномов поксвируса, т.е., библиотеки с улучшенной сложностью и разнообразием, по сравнению с библиотекой, сконструированной в отсутствие ингибитора сборки поксвируса, например, рифампицина. Например, количество независимых модифицированных геномов поксвируса может быть увеличено по меньшей мере приблизительно в один раз, приблизительно в пять раз, приблизительно в десять раз, приблизительно в пятнадцать раз, приблизительно в двадцать раз, приблизительно в двадцать пять раз, или приблизительно в тридцать раз или более, по сравнению с библиотекой, сконструированной в отсутствие ингибитора сборки поксвируса, например, рифампицина. Кроме того, способы конструирования библиотеки, в рамках изобретения, могут обеспечивать получение библиотеки с увеличенным титром вируса по сравнению с библиотекой, сконструированной в отсутствие ингибитора сборки поксвируса. Как показано в примере 1, например, 80 мкг/мл рифампицина добавляют через 48 часов после трансфекции на период времени обработки 48 часов. После этого, среду меняют и проводят культивирование в течение следующих 48 часов. Конечным результатом является выход, по меньшей мере в пять раз больше, чем выход, когда рифампицин не добавляют.
[0124] В соответствии со способами в рамках изобретения, ингибитор сборки поксвируса, такой как рифампицин, можно использовать для любого поксвируса, например, для библиотеки вируса осповакцины, вне зависимости от исходной плазмиды и вне зависимости от типа представляющего интерес белка, скрининг которого проводят в библиотеке.
[0125] В этом описании используют, если не указано иное, общепринятые способы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, биологии трансгенов, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, находящиеся в компетенции специалиста в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе. (См., например, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. Патент США No. 4683195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 и 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); и Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
[0126] Общие принципы инженерии белков и антител приведены в Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press). Общие принципы инженерии белков приведены в Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Общие принципы связывания антител и связывания антитело-гаптен приведены в: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); и Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Кроме того, можно следовать стандартным способам иммунологии, известным в данной области и не описанным конкретно, как в Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) и Mishell and Shiigi (eds.) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).
[0127] Полное содержание всех ссылок, процитированных выше, так же как всех ссылок, процитированных в настоящем описании, приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Следующие примеры представлены с целью иллюстрации, а не с целью ограничения.
Примеры
Пример 1: Улучшение конструирования библиотеки вирусов осповакцины с использованием обработки рифампицином
Библиотека VHEH5VHA56RIresNeoFLVH3-30CR9B A
[0128] Трансфекцию выполняли с использованием 36 мкг ДНК вируса v7.5/tk, расщепленной Not I и Apa I, 12 мкг ДНК плазмиды-переносчика, 54×10^6 бляшкообразующих единиц (БОЕ) вируса оспы кур - помощника и 36×10^6 клеток BSC-1 в 6 100 мм2 чашках. Пять (5) чашек трансфицированных клеток пересевали в 5 многослойных культуральных флаконов через 24 часа после трансфекции. 1 чашку пересевали в флакон T175. Для определения эффективности рекомбинации, 2%, 1%, 0,5% и 0,25% трансфицированных клеток рассевали в 96-луночные планшеты в качестве планшетов для подсчета, в двух повторах. Через 48 часов после трансфекции, добавляли рифампицин в концентрации 80 мкг/мл в 1 группу планшетов для подсчета и в флакон T175. Лекарственное средство поддерживали в среде в течение 3 суток. На сутки 5, среду меняли, и клетки инкубировали в течение еще 2 суток без рифампицина. Клетки из многослойных культуральных флаконов, икубированных без рифампицина, собирали на сутки 5.
[0129] Количество рекомбинантных клонов рассчитывали согласно распределению Пуассона посредством наблюдения при микроскопии процента лунок, в которых образовались бляшки, в каждом 96-луночном планшете.
[0130] Эффективность без рифампицина составляла 23652 клонов/100 мм2 чашку.
[0131] Эффективность с рифампицином составляла 113148 клонов/100 мм2 чашку, важно, что этого достигали с использованием 1/8 от количества клеток и объема культуры клеток.
[0132] В последующих экспериментах, общая эффективность получения клонов с рифампицином была приблизительно в 10 раз выше, чем эффективность без рифампицина.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Vaccinex, Inc.
Smith, Ernest
Shi, Shuying
<120>  УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ В ВИРУСАХ
ОСПОВАКЦИНЫ/ЭУКАРИОТИЧЕСКИ КЛЕТКАХ
<130>  58008-168081
<150>  US 62/370,009
<151>  2016-08-02
<160>  3
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  1555
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Плазмида-переносчик, содержащая промотор pVHE
<400>  1
ggccaaaaat tgaaaaacta gatctattta ttgcacgcgg ccgcaaacca tgggatggag       60
ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggcgcg catatggtca ccgtctcctc      120
agggagtgca tccgccccaa cccttttccc cctcgtctcc tgtgagaatt ccccgtcgga      180
tacgagcagc gtggccgttg gctgcctcgc acaggacttc cttcccgact ccatcacttt      240
ctcctggaaa tacaagaaca actctgacat cagcagcacc cggggcttcc catcagtcct      300
gagagggggc aagtacgcag ccacctcaca ggtgctgctg ccttccaagg acgtcatgca      360
gggcacagac gaacacgtgg tgtgcaaagt ccagcacccc aacggcaaca aagaaaagaa      420
cgtgcctctt ccagtgattg ctgagctgcc tcccaaagtg agcgtcttcg tcccaccccg      480
cgacggcttc ttcggcaacc cccgcagcaa gtccaagctc atctgccagg ccacgggttt      540
cagtccccgg cagattcagg tgtcctggct gcgcgagggg aagcaggtgg ggtctggcgt      600
caccacggac caggtgcagg ctgaggccaa agagtctggg cccacgacct acaaggtgac      660
tagcacactg accatcaaag agagcgactg gctcagccag agcatgttca cctgccgcgt      720
ggatcacagg ggcctgacct tccagcagaa tgcgtcctcc atgtgtgtcc ccgatcaaga      780
cacagccatc cgggtcttcg ccatcccccc atcctttgcc agcatcttcc tcaccaagtc      840
caccaagttg acctgcctgg tcacagacct gaccacctat gacagcgtca ccatctcctg      900
gacccgccag aatggcgaag ctgtgaaaac ccacaccaac atctccgaga gccaccccaa      960
tgccactttc agcgccgtgg gtgaggccag catctgcgag gatgactgga attccgggga     1020
gaggttcacg tgcaccgtga cccacacaga cctgccctcg ccactgaagc agaccatctc     1080
ccggcccaag ggggtggccc tgcacaggcc cgatgtctac ttgctgccac cagcccggga     1140
gcagctgaac ctgcgggagt cggccaccat cacgtgcctg gtgacgggct tctctcccgc     1200
ggacgtcttc gtgcagtgga tgcagagggg gcagcccttg tccccggaga agtatgtgac     1260
cagcgcccca atgcctgagc cccaggcccc aggccggtac ttcgcccaca gcatcctgac     1320
cgtgtccgaa gaggaatgga acacggggga gacctacacc tgcgtggtgg cccatgaggc     1380
cctgcccaac agggtcactg agaggaccgt ggacaagtcc accgaggggg aggtgagcgc     1440
cgacgaggag ggctttgaga acctgtgggc caccgcctcc accttcatcg tcctcttcct     1500
cctgagcctc ttctacagta ccaccgtcac cttgttcaag gtgaaatgag tcgac          1555
<210>  2
<211>  446
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Плазмида-переносчик, содержащая промотор pVKE
<400>  2
ggccaaaaat tgaaaaacta gatctattta ttgcacgcgg ccgcccatgg gatggagctg       60
tatcatcctc ttcttggtag caacagctac acgggtgcac ttgactcgag atcaaacgaa      120
ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa      180
ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga      240
aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca      300
aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac      360
acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct      420
tcaacagggg agagtgttag gtcgac                                           446
<210>  3
<211>  455
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Плазмида-переносчик, содержащая промотор pVLE
<400>  3
ggccaaaaat tgaaaaacta gatctattta ttgcacgcgg ccgcccatgg gatggagctg       60
tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggcgtgcac ttgactcgag aagcttaccg      120
tcctacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga      180
aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag      240
tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc      300
aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact      360
acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca      420
caaagagctt caacagggga gagtgttagg tcgac                                 455
<---