СИНТЕТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
SYNTHETIC NUTRIENT MEDIUM FOR GROWING MICROORGANISMS

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к конструированию синтетических сред для выращивания микобактерий туберкулеза разных видов, Pseudomonas molleo, синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, стафилококков, сальмонелл, Е. coli, протея и т.д. а также пробиотических микроорганизмов.
По своему происхождению питательные среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные), искусственные с использованием универсального источника азота и углерода - пептонов, полученных путем неполного расщепления белков с помощью ферментов (пепсина, трипсина) - это различные гидролизаты: рыбные, казеиновые, мясные, дрожжевые - и синтетические питательные среды, приготовленные из сбалансированных химических компонентов (Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб., 1998. - С.78-79).
В то же время при изготовлении стафилококковой, колисальмонеллезной анатоксинвакцин, маллеина для целей гуманной и ветеринарной медицины выращивание микроорганизмов производится на средах с использованием мясопептонно-картофельного бульона или гидрализатов мяса, рыбы, казеина, отличающихся нестабильностью состава, неравномерностью роста и содержанием балластных веществ в препаратах.
Известные синтетические питательные среды Курской биофабрики (питательные среды Евглевского №1 и №2) используются для выращивания микобактерий туберкулеза разных видов при изготовлении диагностических аллергенов (Евглевскнй А.А. Экспериментальное обоснование и практические аспекты диагностики и профилактики инфекционных и аллергических болезней животных. Автореф. дис. … докт. вет. наук, Ленветинститут, 1990. - С.8-9).
Однако указанные синтетические среды универсальностью не обладают. А содержание сернокислого цинка 0,1 г/л не всегда обеспечивает поверхностное выращивание микобактерий туберкулеза. Известные среды имеют также в своем составе дефицитный цитрат аммония.
Практически выращивание микобактерий туберкулеза проводится с использованием синтетических сред для получения туберкулезного аллергена - туберкулина ППД вместо МПКГБ. Синтетические среды не содержат балластные вещества мяса, казеина, пептона, и впервые были использованы для получения ППД-туберкулина (F.Seibert в 1934 г., М.А.Линниковой в 1939 г., А.А.Евглевским в 1963 г.)
Известная синтетическая питательная среда для выращивания микобактерий туберкулеза (патент №2139345, 10.10.1999, автор А.А.Евглевский) включает, мас.%: лимонную кислоту 6,0±2,0; аспарагин 7,5±1,5; цитрат аммония 3,0±1,0; сернокислый магний 0,75±0,15; сернокислое железо 0,075±0,015; сернокислый цинк 0,15±0,075; двухзамещенный фосфорно-кислый калий 7,5±1,5; глицерин - остальное.
Однако указанная синтетическая среда пригодна для выращивания только микобактерий туберкулеза, то есть не обладает универсальностью, пригодностью для выращивания ряда других патогенных и пробиотических микроорганизмов при изготовлении биопрепаратов.
Целью предлагаемого изобретения является повышение питательных свойств синтетической среды, пригодной для стабильного роста и максимального накопления ряда патогенных и пробиотических микроорганизмов.
Поставленная цель достигается путем увеличения содержания лимонной кислоты до 9-11 г/л, сернокислого цинка до 0,5 г/л, дополнительным внесением янтарной кислоты 3,0 г/л, фосфорнокислого натрия 2-х замещенного 1,5 г/л, глицина 1,0 г/л, хлористого натрия 0,5 г/л, снижением содержания дорогостоящего аспарагина до 2-4 г/л и полным изъятием дефицитного цитрата аммония.
Разработанная синтетическая среда содержит химические ингредиенты в следующем соотношении, в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонная кислота 9,0-11,0; аспарагин - 2,0-4,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 6,0; сернокислый цинк - 0,5; сернокислый магний - 0,7; сернокислое железо - 0,1; хлористый натрий - 0,5; фосфорнокислый натрий двухзамещенный - 1,5; глицин - 1,0; янтарная кислота - 3,0 и глицерин 40-50 мл.
Реакция среды устанавливается 5-10% раствором аммиака до рН 7,0-7,1 перед автоклавированием, а для выращивания стафилококков до рН 7,5-7,6 с увеличением хлористого натрия до 5-6 г/л.
Введение лимонной и янтарной кислот (ди-, трикарбоновые кислоты цикла Кребса) способствует повышению обмена веществ у микроорганизмов, улучшению растворимости химических ингредиентов и образованию цитрата аммония при нейтрализации лимонной кислоты 5-10% раствором аммиака. Образование цитрата аммония как азотистого соединения, необходимого для построения белковых молекул микроорганизмов, способствует улучшению обмена веществ и росту микробной биомассы. Введение в состав питательной среды глицина в сочетании с аспарагином (амид аспарагиновой кислоты) улучшает биосинтез белковых структур микроорганизмов, а хлористый натрий и фосфорнокислый натрий двухзамещенный повышают буферность среды, способствуют сохранению рН среды при длительном выращивании микобактерий туберкулеза и стафилококков.
Предлагаемый состав среды отличается от прототипа и аналогов качественным и количественным соотношением ингредиентов и обеспечивает накопление отжатой убитой бакмассы микобактерий туберкулеза до 130±10,0 г/л после 60-суточного выращивания, микробных тел сальмонелл и Е. coli после 2-3-суточного инкубирования до 70±10,0 млрд/мл, стафилококков после 10-12-суточного выращивания до 13±1,0 млрд/мл, пробиотиков после 2-3-суточного выращивания 70-90 млрд/мл. Таким образом, заявляемая универсальная синтетическая среда отвечает условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».
Синтетическая питательная среда, обеспечивающая стабильно высокое накопление микроорганизмов с последующим получением из них туберкулина ППД, туберкулезного анатоксина, маллеина, колибактериозной, колисальмонеллезной, стафилококковой анатоксин-вакцин и т.д., отвечает условию патентоспособности «промышленная применимость».
Синтетическую среду для выращивания микроорганизмов получали путем последовательного растворения в дистиллированной воде ингредиентов или растворения их с предварительным смешиванием компонентов в сухом виде в соотношении, г/л: лимонная кислота 10,0; аспарагин 3,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный 6,0; сернокислый цинк 0,5; сернокислый магний 0,7; сернокислое железо 0,1; хлористый натрий 0,5; фосфорнокислый натрий двухзамещенный 1,5; глицин 1,0; янтарная кислота 3,0; глицерин 50 мл - и последующей нейтрализацией среды 5-10% раствором аммиака и доведения объема жидкой среды добавлением дистиллированной воды до 1 литра.
Для выращивания стафилококков в составе синтетической среды содержание хлористого натрия довели до 5 г/л при сохранении вышеуказанного соотношения всех остальных компонентов, и рН среды до 7,5 в связи с особенностями физиологии этого вида микроорганизмов.
При приготовлении плотной основы синтетическую среду разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1 и добавляют 2,5% агара с последующей стерилизацией при 100°С в течение 30-60 минут и расфасовкой в пробирки, чашки Петри для уплотнения и дальнейшего использования для выращивания микроорганизмов.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Определение питательной ценности синтетической питательной среды при выращивании микобактерий туберкулеза.
В исследованиях использованы лабораторно-производственный штамм №8 микобактерий туберкулеза и свежевыделенные микроорганизмы.
Посев микроорганизмов проводили с помощью платиновой петли (спирали) на поверхность жидкой синтетической среды. В процессе инкубирования через 20-30 суток происходило полное покрытие пленкой микобактерий туберкулеза всей поверхности среды диаметром до 0,5-0,7 см, а через 60 суток утолщение пленки достигало 1,0 см и более. После автоклавирования выращенных микобактерий туберкулеза с последующим отжатием бакмассы через несколько слоев марли и высушиванием проводили взвешивание.
В среднем постоянное накопление полувлажной (отжатой через несколько слоев марли) бакмассы микобактерий туберкулеза составляло 120-130 г/л, а сухой - 12-13 г/л.
Пример 2. Выращивание микобактерий туберкулеза на плотной агаровой среде.
В синтетическую среду заявленного состава, а также при разведении ее дистиллированной водой 1:1 добавляли 2,5% агара, стерилизовали при 100°С в течение 30-60 минут, расфасовывали в пробирки и выращивали микобактерии туберкулеза. Рост микобактерий туберкулеза в пробирках с агаром происходит через 7-10 суток после посева микроорганизмов, как в варианте с заявленной концентрацией синтетической питательной среды, так и при ее разбавлении дистиллированной водой 1:1. Таким образом, при приготовлении плотной среды с добавлением агара приготовленную жидкую синтетическую среду разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1.
Пример 3. Испытание эффективности роста стафилококков, сальмонелл и кишечной палочки (Е. coli) на универсальной жидкой синтетической среде и на ее минеральной основе в заявленной концентрации и в разведении дистиллированной водой 1:1 с 2,5% агаром.
Концентрация стафилококков после 12±2,0 дневного выращивания в двухлитровых биобутылях с объемом среды, равной 1,0 литру, составляет 12±1,0 млрд./мл микробных клеток, а сальмонелл и кишечной палочки после 2-3 дневного инкубирования - 70±10,0 млрд/мл при сплошном прорастании колониями микроорганизмов агаровой поверхности пробирок на минеральной основе. При выращивании микроорганизмов на плотной агаровой среде жидкую минеральную основу предварительно разбавляют наполовину дистиллированной водой. Снижение концентрации в сочетании с 2,5% агаром не влияет на рост упомянутых микроорганизмов.
Приведенные примеры подтвердили пригодность питательной среды в предлагаемых вариантах для выращивания не только микобактерий туберкулеза, но и других патогенных микроорганизмов: сальмонелл, кишечной палочки, синегнойной палочки, протея, а также пробиотических микроорганизмов, то есть ее универсальность. Для выращивания стафилококков в составе среды увеличивают содержание хлористого натрия до 5-6 г/л и рН до 7,5-7,6 в соответствии с физиологическими требованиями этого вида микроорганизмов.
Результаты накопления бактериальной массы при выращивании микроорганизмов на заявленной питательной синтетической среде приведены в таблице.
Таблица
Накопление бактериальной массы при выращивании микроорганизмов на синтетической питательной среде.
№ п/п
Наименование микроорганизмов
Сроки выращивания
Накопление (концентрация) микроорганизмов
1.
Микобактерии туберкулеза (бычьего вида)
30 суток
60 г автоклавированной и отжатой бакмассы
60 суток
120 г автоклавированной и отжатой бакмассы
2.
Стафилококки (золотистый)
7 суток
7-8 млрд/мл
12 суток
12±1,0 млрд/мл
3.
Сальмонеллы
2-3 суток
70±10 млрд/мл
4.
Кишечная палочка
2-3 суток
70±10 млрд/мл
5.
Синегнойная палочка
2-3 суток
Густая слизеподобная
масса
6.
Сенная палочка - Bacillus
2-3 суток
Густая слизеподобная
subtil is
масса
7.
Лактобактерии
2-3 суток
Густая слизеподобная масса