Морфологические критерии периодизации роста осевого скелета свиньи

УДК 619:616-092.19 А.В. Сахаров

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ПЕРИОДИЗАЦИИ РОСТА ОСЕВОГО СКЕЛЕТА СВИНЬИ

Изучены морфогистохимические характеристики клеток и матрикса хрящевой ткани зон роста тел позвонков свиньи в различные возрастные периоды. Выявленные закономерности морфогенетических преобразований клеток прехондральной мезенхимы в процессе дифференцировки позволяют уточнить временные границы стадий развития позвоночника и выделить четыре фазы роста позвоночника.

Ключевые слова: пластинка роста, хрящевая ткань, хондробласт, пролиферация, дифференцировка, онтогенез, фазы развития позвоночника.

A.V. Sacharov MORPHOLOGICAL CRITERIA OF THE GROWTH PERIODIZATION OF THE PIG BACKBONE

The morphogistochemical characteristics of the cells and the matrix of cartilaginous tissue in growth zones of pi'g vertebra in different age periods have been studied. Revealed regularities of the morphogenetic transformations of prochondral mezenhima cells in the process of differentiation allow to clarify the temporal borders in stages of backbone development and to differentiate four phases of backbone growth.

Key words: growth zone, cartilaginous tissue, chondroblast, proliferation, differentiation, ontogenesis, phases of backbone growth.

Высокая интенсивность роста свиньи является одним из отличительных физиологических признаков данного вида животных и дает определенные преимущества при изучении закономерностей формирования позвоночника перед другими видами сельскохозяйственных животных. Эти преимущества обусловлены сравнительно коротким промежутком времени прохождения определенных стадий развития - от первичной закладки осевого скелета и формирования его структурных компонентов - до последующей их структуризации. Считается, что рост позвоночника происходит не равномерно, а имеет определенные пики, связанные с изменением активности нейроэндокринной системы в определенные периоды онтогенеза [2]. Это должно найти отражение в изменении структурной организации всех компонентов позвоночника на протяжении фаз его роста. Имеющиеся в научной литературе сведения по данному вопросу фрагментарны и противоречивы [3]. Исследование морфогенетических закономерностей роста осевого скелета, определение периодов развития и фаз роста позволяют приблизиться к пониманию патогенеза аномалий и пороков его развития - как врожденных, так и возникающих в постнатальном периоде, а также уточняют временные границы тератогенного терминационного периода [1].

Материал и методы исследования

Исследование проводилось на помесных свиньях пород крупная белая и ландрас. Фрагменты тел позвонков в количестве 686 образцов выделяли из грудного отдела позвоночника предплодов и плодов свиньи, а также поросят в период от новорожденности до 8 месяцев постнатального периода. Все образцы фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина и декальцинировали в забуференном растворе ЭДТА. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в целлоидин-парафин. На санном микротоме готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм и монтировали на предметные стекла.

Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином Бемера и эозином. Гликоген и гликопротеины определяли в реакции с реактивом Шиффа по Мак-Манусу. Реакцию на суммарные кислые гликозаминогликаны (ГАГ) ставили с альциановым синим по С. Стидмену. Локализацию ке-ратансульфата (КС), хондроитинсульфата (ХС), гиалуроновой кислоты в клетках и межклеточном веществе, а также их пространственно-упорядоченную организацию в межклеточном веществе хрящевой ткани изучали в реакции с толуидиновым синим при рН 1,5; 2,5 и 5,0 соответственно. Пространственную организацию коллагена в межклеточном веществе определяли реакцией с пикросириусом красным и оценивали интенсивность рефракции в поляризованном свете. Морфометрические характеристики определяли с помощью комплекса программ AxioVision. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при Р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

У предплода свиньи на сроке 3,5-4 недель гестации позвоночник представлен хордой и расположен-

ными вокруг нее мелкими клетками вытянутой или полигональной формы (рис.1, А). В их цитоплазме идентифицируются диффузно расположенные мелкие гранулы гликогена и отмечается интенсивная реакция на гиалуроновую кислоту. В слабо развитом межклеточном веществе гистохимически выявляются коллаген и гиалуроновая кислота. Совокупность указанных морфогистохимических признаков позволяют заключить, что в данной возрастной период позвоночный столб свиньи находится на бластемной стадии развития.

На сроке 6 недель гестации позвоночник плода представлен формирующимися телами позвонков и межпозвонковыми дисками (рис.1, Б). Тела позвонков выполнены мелкими клетками округлой формы и межклеточным веществом, в котором гистохимически определяются коллаген, сульфатированные и несульфа-тированные ГАГ. По данным поляризационнно-оптического анализа, секретируемые клетками специфические для хрящевой ткани биополимеры находятся лишь на начальных этапах макромолекулярной организации. Интенсивное красное свечение макромолекул коллагена в поляризованном свете указывает на его принадлежность к коллагену 1-го типа (рис.1, Д).

Позвоночник плода свиньи 8-недельного возраста представлен хрящевыми телами позвонков и межпозвонковыми дисками (рис.1, В). При анализе серийных срезов тел позвонков, выполненных в сагиттальной плоскости, отчетливо заметно, что очаги остеогенеза локализуются латерально по отношению к продольной оси тела позвонка, смещены к вентральной продольной связке. С каудальной и краниальной поверхностей тело позвонка ограничено широкими хрящевыми пластинками роста (ПР). В межклеточном веществе ПР определяются все типичные для хряща биополимеры: коллаген, сульфатированные и несульфатирован-ные ГАГ, гликопротеины. Высокий уровень пространственно-упорядоченной организации их макромолекул регистрируется лишь в межклеточном веществе гипертрофической зоны ПР. При постановке топооптической реакции на коллаген в зоны гипертрофии ПР и энхондрального остеогенеза впервые регистрируется присутствие коллагена 2 типа по зеленому свечению в поляризованном свете (рис.1, Е). Совокупность указанных морфогистохимических признаков свидетельствует, что в данный возрастной период полностью завершился переход от мезенхимной стадии развития позвоночника к хрящевой, достоверным маркером которой является экспрессия клетками коллагена 2 типа. В данный возрастной период рост позвоночного столба осуществляется за счет увеличения хрящевой модели тел позвонков. Морфологическими признаками интенсивного роста тел позвонков являются широкая ПР и несовершенный остеогенез.

На сроке 12 недель гестации у плодов свиньи в телах позвонков отмечается формирование новых ядер оссификации в дорсальном отделе тела позвонка. В данный возрастной период тело позвонка представляет собой массивную костную структуру, ограниченную с краниальной и каудальной поверхностей хрящевой пластинкой роста (рис. 1, Г, З). В препаратах тел позвонков новорожденных поросят отмечается расширение дорсальных и вентральных центров оссификации вследствие активной инвазии хрящевого матрикса кровеносными сосудами.

В возрасте 7-30 суток (рис.1, И, К, Л) в толще зоны пролиферации ПР возникают обширные центры оссификации, которые полностью сливаются между собой на 40 сутки (рис. 1, М). Результатом этого процесса является структуризация тела позвонка, которая приводит к формированию двух самостоятельных структур - провизорной пластинки роста и дефинитивной структуры - замыкательной пластинки. В дальнейшем увеличение линейных размеров позвоночного столба осуществляется за счет функциональной активности клеток ПР, которая исчезает в результате ее замещения костной тканью после завершения периода роста свиньи, позвонок приобретает строение, характерное для взрослого животного.

Таким образом, позвоночник свиньи в онтогенезе проходит три стадии развития: бластемную, хрящевую и костную. На стадии бластемы структурные компоненты позвоночного столба представляют собой скопления мезенхимных клеток, в цитоплазме которых выявляются гликоген и гиалуроновая кислота. Эта стадия приходится на конец эмбрионального - начало плодного периодов, что соответствует 3,5-4 неделям внутриутробного развития. Бластемная стадия сменяется хрящевой и уже на 8 неделе гестации в межклеточном веществе формирующихся тел позвонков определяются основные компоненты хрящевой ткани, маркером которой является коллаген 2 типа. Переход клетками мезенхимы с биосинтеза коллагена 1 типа на коллаген 2 типа может рассматриваться как критический период в развитии тел позвонков свиньи. В период 8-12 недель внутриутробного развития и до новорожденности происходит активное замещение хрящевой модели позвоночника на костную. Полное замещение хрящевого позвонка на костный происходит к 8 месяцам постнатального развития.

Рис. 1. Морфология структурных компонентов осевого скелета свиньи на различных стадиях развития

и фазах роста:

А - тело позвонка предплода свиньи на сроке 4-х недель гестации. Реакция на суммарные кислые ГАГ в цитоплазме клеток и матриксе обозначена темной стрелкой; двойной - хорда. Альциановый синий. Ув. 100 х;

Б - тело позвонка плода свиньи на сроке 6 недель гестации. Центр оссификации смещен к вентральной продольной связке. Темная стрелка - вентральный отдел тела позвонка; светлая - дорсальный. Гематоксилин-эозин. Ув. 40 х;

В - тело позвонка плода свиньи на строке 8 недель гестации. Пластинка роста обозначена темной стрелкой; светлой - зона остеогенеза. Гематоксилин-эозин. Ув. 40;

Г - тело позвонка плода свиньи на сроке 12 недель гестации. Пластинка роста обозначена темной стрелкой; светлой - зона остеогенеза; двойной темной - сосуды. Гематоксилин-эозин. Ув. 40;

Д - тело позвонка плода свиньи на сроке 6 недель гестации. Рефракция коллагена 1 типа обозначена светлой стрелкой. Пикросириус красный. Ув.200 х.

Е - тело позвонка плода свиньи на сроке 8 недель гестации. Рефракция коллагена 1 типа обозначена светлой стрелкой; двойной светлой - коллагена 2 типа. Пикросириус красный. Ув. 200 х;

Ж - тело позвонка плода свиньи на сроке 12 недель гестации. Рефракция коллагена 2 типа обозначена светлой стрелкой. Пикросириус красный. Ув. 400 х;

З - тело позвонка новорожденного поросенка. Пластинка роста обозначена темной стрелкой; светлой - зона остеогенеза; двойной темной - сосуды. Гематоксилин-эозин. Ув. 40;

И - тело позвонка поросенка в возрасте 7 суток. Пластинка роста обозначена темной стрелкой; светлой - зона остеогенеза; двойной темной - сосуды. Гематоксилин-эозин. Ув. 40;

К - тело позвонка поросенка в возрасте 14 суток. Пластинка роста обозначена темной стрелкой; светлой - зона остеогенеза; двойной темной - сосуды. Гематоксилин-эозин. Ув. 40;

Л - тело позвонка поросенка в возрасте 30 суток. Слияние дорсального (темная стрелка) и вентрального (светлая стрелка) ядер оссификации. Гематоксилин-эозин. Ув. 40;

М - тело позвонка поросенка в возрасте 40 суток. Пластинка роста обозначена темной стрелкой; светлой - замыкательная пластинка. Гематоксилин-эозин. Ув. 40.

Выявленные закономерности морфогенетических преобразований структурных компонентов позвоночника позволяют выделить четыре фазы его роста. Первая фаза характеризируется совокупностью процессов, которые направлены на увеличение массы тел позвонков. Временные границы этой фазы приходятся на промежуток от 6 до 8 недель пренатального периода. Вторая фаза развития позвоночника приходится на возраст от 8 недель до новорожденности и характеризуется процессами, направленными на замещение хрящевой модели позвонка на костную. В третьей фазе развития позвоночника кроме увеличения размеров тел позвонков происходит структуризация элементов позвонка, обусловленная возникновением центров окостенения в толще ПР на 7 сутки и их полным слиянием на 40 сутки постнатального периода онтогенеза. Четвертая фаза развития позвоночника наступает к 8 месяцам и характеризует окончательный синостоз апофизов тел позвонков, что приводит к образованию полноценного позвонка, характерного для взрослого животного.

Выводы

1. В процессе развития позвоночный столб свиньи проходит три стадии: бластемную, хрящевую и костную. Их временные границы соответствуют 4-й неделе гестации, 6-8-й неделям гестации, 12-й неделе гестации - 8 месяцам постнатального периода соответственно.

2.Рост позвоночника свиньи характеризуется четырьмя фазами, временные границы которых приходятся на 6-8-ю неделю гестации, 8-ю неделю гестации - новоржденность, 7-40 суток постнатального периода, 40 суток - 8 месяцев соответственно.

Литература

1. Михайловский, М.В. Хирургия деформаций позвоночника / М.В. Михайловский, Н.Г. Фомичев. - Новосибирск: Сиб. ун. изд-во, 2002. - 431 с.

2. Орел, А.М. Развитие и изменение позвоночника / А.М. Орел // Бюл. Моск. проф. объединения мануальных терапевтов. - 2003. - №5. - C. 99-101.

3. Beier, F. Cell-cycle control and the cartilage growth plate / F. Beier // J. Cell. Physiol. - 2005. - Vol. 202. -

№ 1. - P. 1-8.