Новые маркеры репродуктивных нарушений, находящиеся в области генов интерлейкинов

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ |

А.В. Шабалдин, М.Л. Филипенко, А.Н. Глушков, Т.А. Симонова, Н.К. Жилинская, Л.А. Гордеева, А.В. Остапцева, Е.Н. Воронина

Научный центр СО РАН, Областной перинатальный центр, г. Кемерово Институт биоорганической химии СО РАН, г. Новосибирск

НОВЫЕ МАРКЕРЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ, НАХОДЯЩИЕСЯ В ОБЛАСТИ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ

Интенсивные исследования на протяжении последних нескольких лет показали, что ин-терлейкин1 рецептор антагонист (ИЛ1) и интерлейкин4 (ИЛ4) являются молекулами, участвующими в иммунной толерантности и репрезентированными на фетоплацентар-ной поверхности. Исходя из этого, мы исследовали частоту полиморфизма генов, кодирующих ИЛ1 и ИЛ4 у женщин с репродуктивными нарушениями. Высокая частота встречаемости гомозигот по аллелю 2R антагониста рецептора ИЛ1 при привычном невынашивании беременности дает основание считать данный генотип генетическим маркером этого заболевания.

Ключевые слова: ИЛ1, ИЛ4, полиморфизм генов, привычное невынашивание беременности, репродуктивные нарушения.

Extensive studies over the past few years have identified interleukinl receptor antagonist (IL1) and interleukin4 (IL4) as molecules involved in immune tolerance and represented at the fetal-maternal interface. Therefore we investigated the frequency of polymorphism in genes encoding interleukin 1 RA and interleukin 4 in women with reproductive disoders. The frequency of genotypes homozygous for allele 2R (receptor antagonist IL1) was found to be significantly increased in women with idiopathic recurrent miscarriage. These findings give us the reasons to believe this genotype as genetic marker assotiated with fetal loss.

Key words: IL1, IL4, gene polymorphism, idiopathic recurrent miscarriage, reproductive disoders, fetal loss.

Нормальное вынашивание беременности связано с иммунным распознаванием антигенов полуаллогенных плода и плаценты иммунокомпетентными клетками матери [2, 5, 13]. Основным следствием иммунных процессов, происходящих в эндометрии, является выработка цитокинов, обладающих ростостимулирующим и трофическим эффектами в отношении фетопла-центарных тканей [3]. Соответственно, любые репродуктивные потери могут быть связаны с нарушением иммунного распознавания в системе мать-плод [2, 12], а также с нарушениями экспрессии фетотрофических интерлейкинов, таких как интерлейкина 1 и антагониста его рецептора, интерлейкинов 4, 6, 8 [3]. В генах, кодирующих эти интерлейкины, выявлен полиморфизм за счет микро- и макросателлитов [1, 14]. Исследования в австрийской популяции показали, что некоторые из этих аллелей могут быть генетическими маркерами таких нарушений, как привычное невынашивание беременности (ПНБ) и тяжелые формы преэклампсии [11]. Эти данные требуют подтверждения для других популяций мира, в

том числе, проживающих в экологически неблагоприятных условиях.

Целью работы явилось исследование полиморфизма генов антагониста рецептора интерлейкина 1 (IL1-aR) и интерлейкина 4 (IL4) у женщин с ПНБ и врожденными пороками развития плода (ВПРП), проживающих в Кемеровской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследованы 76 женщин с ПНБ, имевших в анамнезе 2 или 3 выкидыша в ранние сроки беременности, до 15 недель (1-я группа), и 56 беременных женщин, у которых по данным УЗИ были выявлены ВПРП: анэнцефалия, гидроцефалия, менингомиелоцеле, синдром Арнольда-Киари II, экзэнцефалия, spina bifida, гидронефроз II-III степени, множественные пороки развития, гастроши-зис (2-я группа). Контрольную группу составили 76 женщин, с физиологическим течением беременности.

Во всех группах проводился забор венозной крови на антикоагулянте, с последующим получе-

НОВЫЕ МАРКЕРЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ, НАХОДЯЩИЕСЯ В ОБЛАСТИ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ

нием лейковзвеси, из которой выделяли ДНК методом перхлоратной экстракции с последующим эта-нольным осаждением [15].

Исследование полиморфизма IL1-aR проводили с помощью полимеразной-цепной реакции (ПЦР) с праймерами фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находятся вариабельное количество тан-демных повторов — 86 н.п. (VNTR). Для амплификации использовали олигонуклеотидные праймеры IRA1 CCCACTCATGGCCTTGTTC и IRA2 GGCTCAATGGGTACCACATC, выбранные с помощью программы GENERUNNER на основании нуклеотидной последовательности гена ILl-aR (GENEBANK, U65590). В результате амплификации мы детектировали фрагменты ДНК размером 438, 524, 610, и 696 н.п. с 2, 3, 4 или 5 тандемными повторами, соответственно. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R и 5R, и соответствовали аллелям ILl-aR 2, 3, 1, 4 [9] и IL1RN* 2, 4, 1, 3 [12].

Для VNTR IL-4 использовался метод ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находятся вариабельное количество тандемных повторов — 70 н.п. (VNTR): 5, GG C TAC TGT GTG GTA AAT AG 3, и 5, CCT ACA ACC GAT CTG TCA GG 3,. В результате амплификации детектировали фрагменты ДНК размером 255 и 325 н.п. с 2 и 3 тан-демными повторами, соответственно. Эти аллели были обозначены как 2R и 3R [9].

Для обнаружения ассоциаций между аллелями, генотипами IL1-aR, IL4 и ВПРП, ПНБ применяли стандартные статистические методы. Попарное сравнение контрольных и опытных частот производили с помощью Т-критерия Фишера для долей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование распределения VNTR аллелей IL1-aR в группах женщин с ПНБ и ВПРП выявило высокую частоту аллеля 4R IL1-aR и низкую частоту аллеля 3R IL1-aR, что характерно для европеоидных популяций [11] (табл. 1). Достоверных различий по отдельным аллелям между группами не обнаружено. Это указывает на отсутствие среди них маркеров данных заболеваний. Наиболее высокая частота во всех группах была у 4R/4R IL1-aR, наиболее низкая — у 2R/3R и 4R/5R IL1-aR, но в целом частоты этих генотипов во всех группах были сопоставимы. Достоверность была достигнута лишь для 2R/2R IL1-aR, частота которого в группе с ПНБ была почти на порядок выше, чем в контрольной группе. Это указывает на то, что хотя частота аллеля 2R IL1-aR была выше при ПНБ, но только гомозиготный генотип (межаллельное взаимодействие) может претендовать на маркер ПНБ.

Для IL4 мы обнаружили более высокую встречаемость 3R аллеля и низкую 2R в группе с ВПРП (табл. 2). Но наибольшее значение имеет тот факт, что 2R/2R вообще не встречался в группе женщин

Таблица 1

Частота встречаемости VNTR аллелей и генотипов IL1-Ra

Аллели Контроль ПНБ ВПРП Р

2R 18,4 21,О 17,5

3R О,6 О О

4R 54,6 55,2 7О,О

5R 1,9 1,3 О

Генотипы Контроль ПНБ ВПРП Р

2R/2R 1,3 9,2+* 2,5 *< О,О5

2R/3R 1,3 О О

2R/4R 3О,2 22,3 3О,О

2R/5R 3,9 1,3 О

4R/4R 39,4 43,4 55,О

4R/5R О 1,3 О

Таблица 2

Частота встречаемости VNTR аллелей и генотипов IL4

Аллели Контроль (n = 45) ПНБ (n = 65) ВПРП (n = 36) Р

2R 24,4 17,6 5,5-* *< О,О1

3R 61,1 77,6 8О,5+* *< О,О1

Генотипы Контроль (n = 76) ПНБ (n = 76) ВПРП (n = 56) Р

2R/2R 11,1 3,Г* О-* 1*< О,О5, *< О,О5

2R/3R 24,4 29,3 11,1-* *< О,О5

3R/3R 48,9 63,О 75,О

с ВПРП и редко определялся в группе с ПНБ. По-видимому, 2R/2R является протектором ПНБ и ВПРП, в противовес 2R/2R IL1-aR, который является индуктором этих заболеваний.

Следующим этапом была оценка влияния межгенных (IL1-aR, ^4) взаимодействий на развитие выше указанной патологии (табл. 3). Как видно из таблицы, достоверность была достигнута для сочетания генотипов 4R/4R IL1-aR, 2R/2R ^4, которые встречались в контроле у 13,3 % обследованных и не встречались при ПНБ и ВПРП. Причем, при ВПРП статистическая разница с контролем была недостоверна.

Таблица 3

Частота встречаемости VNTR генотипов IL1-aR, И4

Генотипы IL1-aR, IL4 Контроль (n = 3О) ПНБ (n = 52) ВПРП Р (n = 22) Р

2R/2R,2R/2R О 3,8 О

2R/2R,2R/3R О 3,8 9,О

2R/2R,3R/3R 3,3 1,9 О

2R/4R,2R/2R О 1,9 О

2R/4R,2R/3R 13,3 5,7 4,5

2R/4R,3R/3R 23,3 25,О 4О,9

2R/5R,3R/3R 3,3 О О

4R/4R,2R/2R 13,3 О-* О *< О,О5

4R/4R,2R/3R 6,6 17,3 4,5

4R/4R,3R/3R 33,6 38,4 45,4

4R/5R,3R/3R О 1,9 О

№1(12) 2QQ3 с/^^тьи^^тав^^бассе

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ |

Полученные результаты подтверждают основные положения теории плацентарной иммунотро-фики, так как именно в генах интерлейкинов обнаружены молекулярно-генетические маркеры чувствительности и устойчивости к основным репродуктивным нарушениям. Прежде всего, это касается ПНБ, для которого обнаружены маркеры, находящиеся в обеих генетических областях IL4).

Возможно, 2R аллель ассоциирован или неравновесно сцеплен с функционально сильным лиган-дом, который в гомозиготности вызывает резкое торможение чувствительности клеток мишеней к действию IL1, который в первую половину беременности выполняет роль ростового фактора фе-топлацентарного комплекса [3]. Как следствие, происходит нарушение трофики плаценты, что влечет проникновение к плоду различных ксенобиотиков, и беременность прерывается. Косвенным подтверждением высокой активности лиганда у лиц 2R/2R IL1-aR могут быть литературные данные о связи этого генотипа c различными иммуноопосре-дованными заболеваниями с проградиентным течением: рассеянный склероз, системная красная волчанка, болезнь Крона и бульбарный вестибулит [4, 7, 8, 10], а также с низким уровнем IL1-aR в крови [6], возможно, за счет высокой тканевой специфичности.

Проведенное исследование показало очевидность того, что поиск генетических маркеров ВПРП и ПНБ необходимо проводить в локусах, ответственных за иммунное распознавание в системе мать-плод и иммунотрофику фетоплацентарных тканей: HLA, Т-клеточный рецептор, цитокины, коль скоро продукты этих генов создают эффективный фетоплацентарный барьер для ксенобиотиков. Особое значение приобретают исследования влияний межаллельных и межгенных взаимодействий, как внутри одного локуса, так и генома в целом.

Вместе с тем, полученные данные могут быть полезными практическому врачу для прогнозирования и предупреждения ВПРП и ПНБ. Используя типирование выше указанных генетических областей, можно не только контролировать, но и регулировать планирование семьи. Предлагаемый нами методический подход может быть применен и при наступившей беременности, в качестве дополнительного критерия ранней диагностики этой группы заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

1. Анализ распределения аллелей четырех гипервариабельных тан-демных повторов среди неродственных представителей русской нации, проживающих в Москве, с помощью полимеразной цепной реакции / Чистяков Д.А., Гаврилов Д.К., Овчинников И.В., Носиков В.В. // Молекуляр. биология. - 1993. - Т. 27, N 6. - С. 26-37.

2. Влияние иммунных взаимодействий по АГ HLA в системе мать-плод на развитие беременности / Шабалдин А.В., Казакова Л.М., Глушков А.Н. и др. // Педиатрия. - 1998. - N 5. - С. 4-7.

3. Ширшев, С.В. Цитокины плаценты в регуляции иммуноэндокрин-ных процессов при беременности / Ширшев С.В. // Успехи сов-ремен. биологии. - 1994. - Т. 114, вып. 2. - С. 223-239.

4. Association of the interleukin 1 receptor antagonist gene with ulcerative colitis in Northern European Caucasians / Carter M.J., di Giovine F.S., Jones S. et al. // Gut. - 2001. - N 4. - P. 461-467.

5. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship / Wegman T.G., Lin Hui, Guilbert L., Mosmann T.R. // Immunol. Today. - 1993. - Vol. 14, N 17. - P. 353-356.

6. Imbalance production between interleukin-1beta (IL-1beta) and IL-

1 receptor antagonist (IL-1Ra) in bronchial asthma / Mao X.Q., Ka-wai M., Yamashita T. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2000. - Vol. 276, N 2. - P. 607-612.

7. Interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism as a disease severity factor in systemic lupus erythematosus / Blakemore A.I., Tar-low J.K., Cork M.J. et al. // Arthritis Rheum. - 1994. - N 9. - P. 1380.

8. Jeremias, J. Interleukin 1 receptor antagonist gene polymorphism in women with vulvar vestibulitis / Jeremias J., Ledger W.J., Witkin S.S. // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2000. - Vol. 182, N 2. - P. 283-285.

9. Mout, R. Repeat polymorphisms in the interleukin-4 gene (IL4) / Mout R., Willemze R., Landegent J.E. // Nucleic. Acids. Res. - 1991. -Vol. 19, N 13. - P. 3763.

10. Novel genetic association between ulcerative colitis and the antiinflammatory cytokine interleukin-1 receptor antagonist / Mansfield J.C., Holden H., Tarlow J.K. et al. // Gastroenterology. - 1994. - Vol. 106, N 3. -P. 637-642.

11. Piccinni, M-P. T-cell cytokines in pregnancy / Piccinni M-P. // Am. J. of Reprod. Immunol. - 2002. - Vol. 47. - P. 1-6.

12. Shabaldin, A.V. Genetic aspect of immunopathology in prenatal and postnatal period / Shabaldin A.V., Glushkov A.N. // Rus. J. Immunol. -1999. - Vol. 4, N 1. - P. 9-18.

13. Shigeru, S. Cytokine network at the feto-maternal interface / Shige-ru S. // J. of Reprod. Immunol. - 2000. - Vol. 47. - P. 87-103.

14. Tarlow, J.K. Polimorphizm in human IL-1 receptor antagonist gene intron

2 is caused by variable numbers of an 86-bp tandem repeat / Tarlow J.K. Blakemore A.I.F., Lernard A. // Human Genetics. - 1991. - P. 403-404.

15. Unfried, G. Interleukin 1 receptor antagonist polymorphism in women with idiopathic recurrent miscarriage / Unfried G., Tempfer C., Schneeberger C. // Fertil. Steril. - 2001. - Vol. 75, N 4. - P. 683.

ШАБАЛДИН Андрей Владимирович - кандидат медицинских наук, научный сотрудник Кемеровского научного центра СО РАН.

Защитил кандидатскую диссертацию по теме "Генетические аспекты формирования иммунной системы у детей раннего возраста" в 1997 г. Научный руководитель - Л.М. Казакова.