СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫХ БИБЛИОТЕК С ВЫСОКОЙ ПРОПУСКНОЙ СПОСОБНОСТЬЮ И АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМОВ

1. Способ получения полинуклеотидной библиотеки, включающий добавление второго адаптера к каждому из множества одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов на или около концевой области, противоположной первому адаптеру, присоединенному к каждому из одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов, где первый адаптер содержит штрих-код носителя, а множество одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов содержит:
(i) один или несколько одноцепочечных полинуклеотидов-мишеней, содержащих ампликон на основе одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней или комплементарных таковым, присутствующих в клетке, принадлежащей к популяции клеток; и
(ii) коллекцию одноцепочечных полинуклеотидов, каждый из которых включает ампликон полинуклеотида или комплементарного таковому, в клетке, принадлежащей к популяции клеток; и
где каждый из полинуклеотидов из (i) и (ii), происходящих из одной и той же клетке популяции клеток, содержит одну и ту же последовательность штрих-кода носителя.
2. Способ по п. 1, в котором множество одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов содержит полинуклеотиды из (i) и (ii) множества клеток, принадлежащех популяции клеток.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором каждый из множества одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов дополнительно содержит молекулярный штрих-код, являющийся уникальным для каждого одноцепочечного полинуклеотида или его амплифицированного продукта.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором коллекция одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов из каждой клетки, принадлежащей популяции клеток, в совокупности включает комплементарные цепи ДНК (кДНК) транскриптома или частичного транскриптома.
5. Способ по п. 4, в котором транскриптом или частичный транскриптом в совокупности включают по меньшей мере 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% транскриптов, присутствующих в геноме клетки.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором каждый из одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов имеет размер, который более чем или приблизительно более чем 50 пар оснований, 100 пар оснований или 200 пар оснований.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором каждый из одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов имеет размер от или приблизительно от 50 пар оснований (н.п.) до 1500 н.п., от 50 н.п. до 1250 н.п., от 50 н.п. до 1000 н.п., от 50 н.п. до 750 н.п., от 50 н.п. до 500 н.п., от 100 н.п. до 1500 н.п., от 100 н.п. до 1250 н.п., от 100 н.п. до 1000 н.п., от 100 н.п. до 750 н.п., от 100 н.п. до 500 н.п., от 200 н.п. до 1500 н.п., 200 н.п. до 1250 н.п., от 200 н.п. до 1000 н.п., от 200 н.п. до 750 н.п. или от 250 н.п. до 500 н.п.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором добавление второго адаптера проводят в гомогенной смеси, содержащей множество одноцепочечных полинуклеотидов со штрих-кодом.
9. Способ получения полинуклеотидной библиотеки, включающий:
(а) лизирование клеток в каждом из множества носителей, где каждый из указанных носителей содержит клетку, принадлежащую популяции клеток;
(b) продуцирование в каждом носителе множества комплементарных полинуклеотидов, причем указанное продуцирование включает (i) продуцирование одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней, комплементарных одному или нескольким полинуклеотидам-мишеням, присутствующим в клетке, с использованием одного или нескольких специфичных для мишени праймеров; и (ii) создание коллекции полинуклеотидов, каждый из которых является комплементарным полинуклеотидному транскрипту в клетке.
10. Способ по п. 9, в котором коллекцию полинуклеотидов в (ii) получают при использовании случайных олигопраймеров.
11. Способ по п. 9 или 10, в котором каждый из указанных носителей дополнительно содержит множество олигонуклеотидов, несущих молекулярной штрих-код, единичный олигонуклеотид или пул олигонуклеотидов со штрих-кодом носителя и первый адаптер или пул первых адаптеров, при этом способ дополнительно включает:
(c) присоединение к множеству, необязательно, к каждому из множества комплементарных полинуклеотидов одного из множества олигонуклеотидов, несущих молекулярный штрих-код, тем самым генерируя множество полинуклеотидов с молекулярным штрих-кодом, каждый из которых содержит молекулярный штрих-код, где, необязательно, молекулярный штрих-код каждого из молекулярных штрих-кодированных полинуклеотидов отличается от молекулярных штрих-кодов, содержащихся в других молекулярных штрих-кодированных полинуклеотидах данного множества, и/или представляет собой уникальный молекулярный штрих-код;
(d) присоединение одного из единичного олигонуклеотида или пула олигонуклеотидов, несущих штрих-код носителя или их амплифицированного продукта и первого адаптера или одного из пула первых адаптеров или амплифицированного продукта таковых ко множеству, необязательно к каждому, полинуклеотидов с молекулярным штрих-кодом, тем самым генерируя множество полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, необязательно одноцепочечных полинуклеотидов с двумя штрих-кодами, каждый из которых содержит молекулярный штрих-код и штрих-код носителя, причем каждый из полинуклеотидов с двойным штрих-кодами одного и того же носителя содержит тот же самый штрих-код носителя.
12. Способ по п. 11, дополнительно включающий (e) получение одноцепочечных ампликонов множества полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, необязательно каждого из множества.
13. Способ по п. 12, дополнительно включающий (f) добавление второго адаптера к каждому из одноцепочечных ампликонов, где первый адаптер и второй адаптер присутствуют на или около противоположных концов каждого из одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодом.
14. Способ получения полинуклеотидной библиотеки, включающий:
(а) лизирование клеткок в каждом из множества носителей, где каждый из указанных носителей содержит клетку из образца, содержащего популяцию клеток, множество олигонуклеотидов с молекулярным штрих-кодом, единичный олигонуклеотид или пул олигонуклеотидов с штрих-кодом носителя и первый адаптер или пул первых адаптеров;
(b) продуцирование в каждом носителе множества комплементарных полинуклеотидов, причем указанное продуцирование указанного множества комплементарных полинуклеотидов включает (i) продуцирование одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней, комплементарных одному или нескольким целевым полинуклеотидным транскриптам, присутствующим в клетке; и (ii) создание коллекции полинуклеотидов, каждый из которых по отдельности комплементарен полинуклеотидному транскрипту в клетке;
(c) присоединение к каждому комплементарному полинуклеотиду одного из множества олигонуклеотидов, несущих молекулярный штрих-код, тем самым генерируя множество полинуклеотидов со штрих-кодом, каждый из которых содержит уникальный молекулярный штрих-код;
(d) присоединение одного из единичного олигонуклеотида или пула олигонуклеотидов, несущих штрих-код носителя, или амплифицированного продукта таковых и первого адаптера или одного из пула первых адаптеров или их амплифицированного продукта к каждому из штрих-кодированных полинуклеотидов, тем самым генерируя множество полинуклеотидов с двойным штрих-кодами, необязательно одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, где каждый из полинуклеотидов с двойным штрих-кодом содержит молекулярный штрих-код и штрих-код носителя, и где каждый из полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, принодлежащих одному носителю, содержит тот же самый и тот же штрих-код носителя;
(е) получение одноцепочечного ампликона каждого из множества полинуклеотидов с двумя штрих-кодами; и
(f) добавление второго адаптера к каждому из одноцепочечных ампликонов, тем самым добавляя второй адаптер к одноцепочечному полинуклеотиду с двуойным штрих-кодом, где первый адаптер и второй адаптер присутствуют на или около противоположных концов каждого из одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодами.
15. Способ по любому из пп. 11-14, где первый адаптер включает олигонуклеотид со штрих-кодом.
16. Способ по любому из пп. 9-15, в котором коллекция полинуклеотидов из каждой клетки, принадлежащей популяции клеток, в совокупности включает последовательности, комплементарные транскриптам транскриптома или частичного транскриптома клетки.
17. Способ по п. 16, в котором транскриптом или частичный транскриптом включает по меньшей мере 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% транскриптов, присутствующих в геноме клетки.
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней из (i) и/или полинуклеотидов из (ii), на основе которых получены ампликон (i) и/или ампликон (II) является/происходят из ДНК.
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней из (i) и/или полинуклеотидов из (ii), на основе которых получены ампликон (i) и/или ампликон (II), является/происходит из РНК.
20. Способ по п. 19, в котором РНК представляет собой мРНК.
21. Способ по любому из пп. 9-20, в котором каждый из единичного или нескольких комплементарных полинуклеотидов из (b) представляет собой кДНК.
22. Способ по любому из пп. 1 и 2, в котором каждый из единичного или нескольких штрих-кодированных одноцепочечных полинуклеотидов представляет собой цепь кДНК.
23. Способ по любому из пп. 1-22, в котором первый адаптер и/или второй адаптер содержит по меньшей мере один универсальный сайт праймирования.
24. Способ по любому из пп. 1-3, в котором:
первый адаптер и второй адаптер отличаются; и/или
первый адаптер содержит первый универсальный праймирующий сайт, а второй адаптер содержит второй универсальный праймирующий сайт, де, необязательно, первый универсальный праймирующий сайт и второй универсальный праймирующий сайт различны.
25. Способ по п. 24, в котором первый универсальный праймирующий сайт и/или второй универсальный праймирующий сайт представляет собой или содержит праймирующий сайт P7(C7) или непрерывную часть такового, или праймирующий сайт P5 (C5), или непрерывную часть такового, и где, необязательно, непрерывная часть таковых достаточна для отжига комплементарной последовательности.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором первый универсальный праймирующий сайт представляет собой или содержит праймирующий сайт P7(C7) или его непрерывную часть, а второй универсальный праймирующий сайт представляет собой или содержит праймирующий сайт P5(C5) или его непрерывную часть.
27. Способ по п. 25 или 26, в котором сайт праймирования P7(C7) содержит последовательность AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCA (SEQ ID NO: 77) или представляет собой ее непрерывную часть.
28. Способ по п. 25 или 26, отличающийся тем, что праймирующий сайт Р5 содержит последовательность AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT (SEQ ID NO: 78) или представляет собой его непрерывную часть.
29. Способ по любому из пп. 25-28, в котором непрерывная часть содержит по меньшей мере или по меньшей мере примерно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов в длину.
30. Способ по любому из пп. 25, 26, 28 или 29, в котором сайт праймирования P5 представляет собой непрерывную часть, указанную в SEQ ID NO: 25 (AGATCGGAAGAGCGTCGTGT).
31. Способ по любому из пп. 1-8 и пп. 13-30, в котором добавление второго адаптера включает гибридизацию шарнирного (splint) олигонуклеотида с каждым из одноцепочечных полинуклеотидов со штрих-кодом в присутствии олигонуклеотида, содержащего второй универсальный праймирующий сайт, и где шарнирный (splint) олигонуклеотид содежит (i) последовательность, комплементарную второму универсальному праймирующему сайту, и (ii) вырожденную последовательность выступа, способную случайным образом отжигаться с 3'-концом одноцепочечного полинуклеотида со штрих-кодом.
32. Способ по п. 31, в котором перед гибридизацией шарнирный (splint) олигонуклеотид и олигонуклеотид, содержащий второй универсальный праймирующий сайт, отжигают с образованием дуплекса адаптера с шарнирным олигонуклеотидом.
3-12
33. Способ по п. 31 или 32, в котором вырожденная последовательность выступа содержит последовательность (N), где N представляет собой любой нуклеотид.
34. Способ по любому из пп. 31-33, в котором вырожденная последовательность выступа содержит последовательность NNNNNN, где N представляет собой любой нуклеотид (SEQ ID NO: 24).
35. Способ по любому из пп. 31-34, где шарнирный (splint) олигонуклеотид содержит последовательность ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN, где N представляет собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 26).
36. Способ по любому из пп. 31-35, где олигонуклеотид, содержащий второй универсальный сайт праймирования, содержит последовательность AGATCGGAAGAGCGTCGTGT (SEQ ID NO: 25).
37. Способ по любому из пп. 1-8 и пп. 11-36, в котором олигонуклеотид со штрих-кодом носителя содержит по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 нуклеотидов.
38. Способ по любому из пп. 1-8 и пп. 11-37, в котором олигонуклеотид со штрих-кодом носителя содержит от или приблизительно от 10 до 30 нуклеотидов.
39. Способ по любому из пп. 1-8 и пп. 11-38, в котором олигонуклеотид со штрих-кодом носителя содержит вырожденную последовательность.
14-17
40. Способ по любому из пп. 1-8 и пп. 11-39, в котором олигонуклеотид со штрих-кодом носителя содержит последовательность (N), где N представляет собой любой нуклеотид, и где, необязательно, по меньшей мере один или два N в последовательности представляют собой W, где W представляет собой аденин или тимин.
41. Способ по любому из пп. 1-8 и пп. 11-40, в котором олигонуклеотид со штрих-кодом носителя содержит последовательность NNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:80), WNNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:81), NWNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:82) или NNWNNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:83), где N представляет собой любой нуклеотид, а W представляет собой аденин или тимин.
42. Способ по любому из пп. 11-41, в котором каждый носитель содержит пул первых адаптеров, содержащий пул олигонуклеотидов со штрих-кодом носителя, причем каждый олигонуклеотид со штрих-кодом носителя пула первых адаптеров содержит по меньшей мере один сдвиг по основанию или добавленное основание, по сравнению с по меньшей мере одним другим из олигонуклеотидов со штрих-кодом носителя.
43. Способ по п. 42, где олигонуклеотиды со штрих-кодом носителя пула первых адаптеров содержат последовательности NNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:80), WNNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:81), NWNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:82) и NNWNNNNWNNNNWNNNN (SEQ ID NO:83), где N представляет собой любой нуклеотид, а W представляет собой аденин или тимин.
44. Способ по любому из пп. 11-43, в котором на стадии (d) способ дополнительно включает амплификацию:
единичного олигонуклеотида или пула олигонуклеотидов со штрих-кодом носителя; или
единичного адаптера или пула первых адаптеров, где первые адаптеры включают единичный олигонуклеотид или пул олигонуклеотидов, несущих штрих-код носителя, где:
амплификацию проводят до или одновременно с прикреплением олигонуклеотида со штрих-кодом носителя.
45. Способ по любому из пп. 11-44, в котором присоединение олигонуклеотида со штрих-кодом носителя включает гибридизацию области олигонуклеотида, несущего штрих-код носителя, с областью каждого из комплементарных полинуклеотидов или с областью каждого из полинуклеотидов с молекулярным штрих-кодом.
46. Способ по п. 45, в котором такая область содержит 3'-маркированый/меченый полинуклеотид, комплементарный 3'-концевой области молекулярного штрих-кода полинуклеотидов, несущих молекулярный штрих-код.
47. Способ по любому из пп. 9-46, в котором на стадии (b):
один или несколько полинуклеотидов-мишеней получают путем обратной транскрипции полинуклеотида(ов)-мишени(ей) в присутствии обратной транскриптазы и одного или нескольких мишень-специфичных праймеров, комплементарных целевой последовательности полинуклеотида(ов)-мишени(ей); и/или
коллекцию полинуклеотидов получают путем обратной транскрипции полинуклеотидных транскриптов в клетке в присутствии обратной транскриптазы и одного или нескольких праймеров транскриптома, комплементарных полинуклеотидному транскрипту в клетке.
48. Способ по любому из пп. 1-47, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней представляют собой полинуклеотид иммунной молекулы или ее цепи.
49. Способ по любому из пп. 1-48, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают по меньшей мере два полинуклеотида-мишени, каждый из которых представляет собой полинуклеотид цепи иммунной молекулы.
50. Способ по любому из пп. 1-49, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают полинуклеотид TCR или его цепь.
51. Способ по любому из пп. 1-50, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают первый полинуклеотид, полинуклеотид альфа-рецептора Т-клеток (TCRα) и второй полинуклеотид рецептора Т-клеток (TCRβ).
δ
52. Способ по любому из пп. 1-50, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают первый полинуклеотид-полинулеотид гамма-рецептора Т-клеток (TCRγ) и второй полинуклеотид, полинуклеото дельта рецептора Т-клеток (TCRdelta; TCR).
53. Способ по любому из пп. 1-49, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают полинуклеотид антитела или его цепи.
54. Способ по любому из пп. 1-49 и 53, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают первый полинуклеотид полинуклеотида тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) и второй полинуклеотид полинуклеотида легкой цепи иммуноглобулина (IgL).
55. Способ по любому из пп. 47-54, в котором один или несколько мишень-специфичных праймеров и/или один или несколько транскриптомных праймеров содержат poly(T) последовательность.
56. Способ по любому из пп. 47-54, в котором один или несколько транскриптомных праймеров включают смесь случайных гексамерных олигонуклеотидных праймеров.
57. Способ по любому из пп. 47-56, в котором один или несколько мишень-специфичных праймеров содержат один или несколько праймеров, комплементарных целевым последовательности(тям) полинуклеотида-мишени.
58. Способ по п. 57, в котором один или несколько мишень-специфичных праймеров включают по меньшей мере первый праймер и второй праймер.
59. Способ по п. 57 или 58, в котором один или несколько мишень-специфичных праймеров включают по меньшей мере праймеры к последовательности-мишени множества полинуклеотидов-мишеней, каждый из которых кодирует иммунную молекулу или ее цепь.
60. Способ по п. 59, где иммунная молекула представляет собой рецептор Т-клетки или антитело.
61. Способ по любому из пп. 58-60, в котором, по меньшей мере первый праймер комплементарен последовательности-мишени полинуклеотида первой цепи иммунной молекулы, а второй праймер является комплементарным последовательности-мишени полинуклеотида второй цепи иммунной молекулы.
62. Способ по любому из пп. 58-61, в котором первый и второй праймеры являются комплементарными последовательности-мишени различных цепей TCR полинуклеотидов TCR.
63. Способ по любому из пп. 58-62, в котором:
первый праймер является комплементарным последовательности-мишени полинуклеотидной последовательности TCRalpha, а второй праймер является комплементарным последовательности-мишени полинуклеотидной последовательности TCRbeta; или
первый праймер является комплементарным последовательности-мишени полинуклеотидной последовательности TCRgamma, а второй праймер является комплементарным последовательности-мишени полинуклеотидной последовательности TCR-дельта.
64. Способ по п. 62 или 63, в котором последовательность-мишень полинуклеотидов цепей TCR представляет собой последовательность константной области.
65. Способ по любому из пп. 58-64, в котором:
первый праймер является комплементарным последовательности-мишени константной области полинуклеоидной последовательности TCR-альфа, а второй праймер является комплементарным последовательности-мишени константной области полинуклеотидной последовательности TCR-бета; или
первый праймер является комплементарным последовательности-мишени константной области полинуклеоидной последовательности TCRgamma, а второй праймер является комплементарным последовательности-мишени константной области полинуклеоидной последовательности TCR-дельта.
66. Способ по любому из пп. 58-61, в котором по меньшей мере первый и второй праймеры комплементарны последовательностям-мишеням полинуклеотидов различных цепей, принадлежащих антителу.
67. Способ по любому из пп. 58-61 и п. 66, в котором первый праймер комплементарен последовательности-мишени полинуклеотидной последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH), а второй праймер является комплементарным последовательности-мишени полинуклеотидной последовательности легкой цепи иммуноглобулина (IgL).
68. Способ по п. 66 или 67, в котором последовательность-мишень полинуклеотидов последовательности цепи антитела представляет собой последовательность константной области.
H
L
69. Способ по любому из пп. 58-61 и пп. 66-68, где первый праймер является комплементарным последовательности-мишени константной области (C) последовательности полинуклеотида тяжелой цепи, а второй праймер является комплементарным последовательности-мишени константной области (С) полинуклеотидной последовательности легкой цепи.
70. Способ по п. 68 или 69, в котором
H
последовательность-мишень полинуклеотида C происходит из IgM, IgD, IgA, IgE или IgG или их комбинации; и/или
L
последовательность-мишень полинуклеотидной последовательности C происходит из Igkappa, Iglambda или их комбинаций.
71. Способ по любому из пп. 1-70, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней содержат полноразмерную кодирующую последовательность.
72. Способ по пп. 9-71, в котором один или несколько полинуклеотидов-мишеней и коллекция полинуклеотида(ов) продуцируются в носителе в том же самом реакционном объеме.
73. Способ по любому из пп. 9-72, в котором на стадии (b) получение множества комплементарных полинуклеотидов включает использование нематричной терминальной трансферазы, и при этом три или более нематричных нуклеотида, рибонуклеотида или их аналогов добавляются к 3'-концу каждого продуцируемого комплементарного полинуклеотида.
74. Способ по п. 73, в котором нематричная терминальная трансфераза представляет собой обратную транскриптазу или полимеразу.
75. Способ по п. 73 или 74, в котором нематричная терминальная трансфераза представляет собой обратную транскриптазу, и где обратная транскриптаза выбрана из списка: обратная транскриптаза Superscript II, обратная транскриптаза Maxima, обратная транскриптаза Protoscript II, обратная транскриптаза вируса мышиного лейкоза Малони (MMLV-RT), обратная транскриптаза HighScriber, обратная транскриптаза вируса птичьего миелобластоза (AMV), любая обратная транскриптаза, обладающая терминальной активностью дезоксинуклеотидил-трансферазы и комбинации таковых.
76. Способ по любому из пп. 11-75, в котором на стадии (с) присоединение включает гибридизацию области одного из множества олигонуклеотидов, несущих молекулярный штрих-код, с тремя или более нематричными нуклеотидами каждого из комплементарных полинуклеотидов.
77. Способ по п. 76, где множество олигонуклеотидов, несущих молекулярный штрих-код, предоставлено в виде множества олигонуклеотидов с переключением матрицы, каждый из которых содержит 3'-часть, комплементарную трем или более нематричным нуклеотидам.
78. Способ по п. 77, в котором олигонуклеотид переключения матрицы также содержит 5'-концевую область, комплементарную части первого адаптера, причем первый адаптер включает олигонуклеотид со штрих-кодом носителя.
79. Способ по любому из пп. 47-78, в котором:
обратная транскриптаза обладает активностью переключения матрицы;
по меньшей мере некоторые цепи из множества продуцируемых комплементарных полинуклеотидов содержат 3'-выступ, содержащий три или более нематричных нуклеотида;
множество олигонуклеотидов, несущих молекулярный штрих-код, представлено в виде множества олигонуклеотидов с переключением матрицы, каждый из которых содержит (1) 5'-концевую область, комплементарную 3'-меченому олигонуклеотиду, содержащему первый адаптер и олигонуклеотид со штрих-кодом носителя, (2) молекулярный штрих-код и (3) 3'-часть, комплементарную трем или более нематричным нуклеотидам 3'-выступа; и
олигонуклеотид переключения матрицы служит матрицей для обратной транскриптазы, так что молекулярный штрих-код включается в каждый комплементарный полинуклеотид для получения полинуклеотидов с молекулярных штрих-кодом.
80. Способ по любому из пп. 77-79, в котором 3'-часть, комплементарная трем или более нематричным нуклеотидам, содержит нуклеотид, рибонуклеотид или аналог таковых.
81. Способ по любому из пп. 73-80, в котором три или более нематричных нуклеотида содержат три или более С-нуклеотида, а 3'-часть, комплементарная трем или более нематричным нуклеотидам, содержит один или несколько G-нуклеотидов или рибонуклеотид или аналог таковых.
82. Способ по любому из пп. 73-81, в котором олигонуклеотид с переключением матрицы дополнительно содержит 3'-модифицированный нуклеотид, который блокирует удлинение олигонуклеотида с переключением матрицы обратной транскриптазой или ДНК-полимеразой.
83. Способ по п. 82, где модификация представляет собой дезокси-, фосфатную, амино- или алкильную модификацию 3'-концевого нуклеотида.
84. Способ по любому из пп. 11-83, в котором стадия (d) дополнительно включает удлинение каждого из множества полинуклеотидов с молекулярным штрих-кодом после присоединения для генерирования множества полинуклеотидов с двойным штрих-кодом.
85. Способ по любому из пп. 1-84, в котором носитель представляет собой лунку, эмульсию, каплю или микрокапсулу.
86. Способ по любому из пп. 12-85, включающий объединение содержимого двух или более из множества носителей перед стадией (е), в результате чего образуется гомогенная смесь, содержащая два или более из множества одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодом.
87. Способ по п. 86, в котором объединение содержимого множества носителей включает разрушение двух или более из множества носителей и объединение одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодом из двух или более разрушенных носителей.
88. Способ по п. 86 или 87, включающий перед стадией (е) отбор или очистку одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, имеющих размер более чем или более чем приблизительно 50 пар оснований, более чем 100 пар оснований или более чем 200 пар оснований.
89. Способ по любому из пп. 86-88, включающий перед стадией (е) отбор или очистку одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, имеющих размер от или приблизительно от 50 пар оснований (н.п.) до 1500 н.п., 50 н.п. до 1250 н.п., от 50 н.п. до 1000 н.п., от 50 н.п. до 750 н.п., от 50 н.п. до 500 н.п., от 100 н.п. до 1500 н.п., от 100 н.п. до 1250 н.п., от 100 н.п. до 1000 н.п., от 100 н.п. до 750 н.п., от 100 н.п. до 500 н.п., 200 н.п. до 1500 н.п., от 200 н.п. до 1250 н.п., от 200 н.п. до 1000 н.п., от 200 н.п. до 750 н.п. или от 250 н.п. до 500 н.п.
90. Способ по любому из пп. 1-89, в котором одноцепочечные полинуклеотиды с двойным штрих-кодом содержат в порядке (от 5'до 3'): первый адаптер, штрих-код носителя, молекулярный штрих-код и второй адаптер.
91. Способ по любому из пп. 1-90, в котором первый адаптер расположен в или около 5' области одноцепочечного штрих-кодированного полинуклеотида, необязательно одноцепочечного полинуклеотида с двойным штрих-кодом.
92. Способ по любому из пп. 1-91, в котором второй адаптер расположен в или около 3' области одноцепочечного штрих-кодированного полинуклеотида, необязательно одноцепочечного полинуклеотида полинуклеотида с двойным штрих-кодом.
93. Способ по любому из пп. 13-92, в котором одну или несколько стадий (а)-(f) проводят в растворе и/или не проводят в присутствии твердой подложки, где, необязательно, твердая подложка представляет собой или содержит гранулу.
94. Способ по любому из пп. 11-93, в котором по меньшей мере стадии (с) и (d) проводят в растворе и/или не проводят в присутствии твердой подложки, где, необязательно, твердая подложка представляет собой или содержит гранулу.
95. Способ по любому из пп. 12-94, в котором каждую из стадий (а)-(е) проводят в растворе и/или не проводят в присутствии твердой подложки, где, необязательно, твердая подложка представляет собой или содержит гранулу.
3
3
4
4
5
5
6
6
96. Способ по любому из пп. 1-95, в котором популяция клеток включает в себя по меньшей мере или по меньшей мере примерно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, или 5×10 клеток.
97. Способ по любому из пп. 1-96, в котором популяция клеток происходит из биологического образца, полученного от субъекта.
98. Способ по п. 97, в котором биологический образец представляет собой или содержит образец цельной крови, образец лейкоцитарной оболочки, образец мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), образец нефракционированных Т-клеток, образец лимфоцитов, образец лейкоцитов, продукт афереза или продукт лейкафереза.
99. Способ по любому из пп. 1-98, где популяция клеток содержит иммунные клетки.
100. Способ по п. 99, где иммунные клетки включают лимфоциты или антиген-презентирующие клетки.
101. Способ по п. 99 или 100, где иммунная клетка представляет собой лимфоцит или его подтип, В-клетку или ее подтип, Т-клетку или ее подтип или комбинацию таковых.
102. Способ по п. 101, где иммунная клетка представляет собой Т-клетку, которая является CD4+ и/или CD8+ Т-клеткой.
103. Способ по любому из пп. 1-102, в котором популяция клеток обогащена или включает Т-клетки центральной памяти, Т-клетки эффекторной памяти, наивные Т-клетки, Т-клетки стволовой центральной памяти, Т-клетки эффектора и регуляторные Т-клетки.
104. Способ по любому из пп. 1-101, в котором популяция клеток обогащена B-клетками памяти, наивными B-клетками или B-клетками плазмобластов.
105. Способ по любому из пп. 97-104, в котором субъект является человеком.
106. Способ по любому из пп. 97-105, где у субъекта наблюдается рак, инфекция или аутоиммунное состояние.
107. Способ по п. 106, где инфекция представляет собой вирусную, бактериальную или грибковую инфекцию.
108. Способ по любому из пп. 1-107, дополнительно включающий амплификацию множества одноцепочечных полинуклеотидов со штрих-кодом, тем самым генерируя множество полинуклеотидных матриц.
109. Способ по п. 108, в котором амплификацию множества одноцепочечных полинуклеотидов со штрих-кодом проводят в присутствии первого набора праймеров, содержащего первый праймер, комплементарный первой последовательности адаптера, и второй праймер, комплементарный второй последовательности адаптера.
110. Способ по п. 109, в котором первый и/или второй праймер представляет собой универсальный праймер.
111. Способ по п. 110, в котором первый и/или второй праймер является комплементарным сайту праймирования P7(C7) или его непрерывной части или сайту праймирования P5(C5) или его непрерывной части.
112. Способ по п. 110 или 111, в котором первый праймер является комплементарным сайту праймера P7(C7) или его непрерывной части, а второй праймер является комплементарным сайту праймера P5(C5) или его непрерывной части.
113. Способ по п. 111 или 112, в котором
праймер, комплементарный сайту праймирования Р7(С7) или его непрерывной части, имеет или включает последовательность CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (SEQ ID NO:39); и/или
праймер, комплементарный сайту праймирования Р5(С5) или его непрерывной части, включает последовательность ACACGACGCTCTTCCGATCT (SEQ ID NO:27).
114. Способ по любому из пп. 109-113, в котором первый и/или второй праймер дополнительно содержит(ат) адаптер для секвенирования.
115. Способ по п. 114, в котором
праймер, комплементарный сайту праймирования Р7(С7) или его непрерывной части, дополнительно содержит последовательность CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[NNNNNN]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (SEQ ID NO:28); и/или
праймер, комплементарный сайту праймера Р5(С5) или его непрерывной части, содержит последовательность AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC (SEQ ID NO:76).
116. Способ по любому из пп. 1-115, дополнительно включающий очистку каждого из одноцепочечных штрих-кодированных полинуклеотидов, необязательно одноцепочечных полинуклеотидов с двойным штрих-кодом.
117. Полинуклеотидная библиотека, содержащая множество штрих-кодированных полинуклеотидов, полученных способом по любому из пп. 1-116.
118. Полинуклеотидная библиотека, содержащая множество штрих-кодированных полинуклеотидов, где множество штрих-кодированных полинуклеотидов включают: (i) один или несколько полинуклеотидов-мишеней, представляющих ампликон одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней, присутствующих в клетке, принадлежащей популяции клеток; и (ii) коллекцию полинуклеотидов, каждый из которых представляет ампликон полинуклеотида в клетке, и где каждый штрих-кодированный полинуклеотид содержит:
первый адаптер, содержащий первый универсальный сайт праймирования, который комплементарен первому универсальному праймеру;
олигонуклеотид со штрих-кодом носителя, содержащий штрих-код носителя, причем штрих-код носителя является одинаковым для всех штрих-кодированных полинуклеотидов из (i) и (ii), происходящих из одной и той же клетки, принадлежащей популяции клеток; и
вторую последовательность адаптера, содержащую второй универсальный сайт праймирования, комплементарный второму универсальному праймеру.
119. Полинуклеотидная библиотека по п. 118, в которой каждый из множества штрих-кодированных полинуклеотидов содержит молекулярный штрих-код, являеющийся уникальным для каждого полинуклеотида.
120. Полинуклеотидная библиотека по п. 118 или 119, в которой коллекция штрих-кодированных полинуклеотидных матриц из каждой клетки популяции клеток в совокупности включает комплементарные цепи ДНК (кДНК), соответствующие транскриптому или частичному транскриптому.
121. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-120, где транскриптом или частичный транскриптом в совокупности включает по меньшей мере 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% транскриптов, присутствующих в геноме клетки.
122. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-121, в которой каждая из штрих-кодированных полинуклеотидных матриц имеет размер, который больше или приблизительно больше, чем 50 пар оснований, больше чем 100 пар оснований или больше чем 200 пар оснований.
123. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-122, в которой каждый из штрих-кодированных полинуклеотидов имеет размер от или приблизительно от 50 пар оснований (н.п.) до 1500 н.п., от 50 н.п. до 1250 н.п., от 50 н.п. до 1000 н.п., 50 н.п. до 750 н.п., от 50 н.п. до 500 н.п., от 100 н.п. до 1500 н.п., от 100 н.п. до 1250 н.п., от 100 н.п. до 1000 н.п., от 100 н.п. до 500 н.п., от 100 н.п. до 500 н.п., от 200 н.п. до 1500 н.п., от 200 н.п. до 1250 н.п., от 200 до 1000 н.п., от 200 н.п. до 750 н.п. или от 250 н.п. до 500 н.п.
124. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-123, в которой первый адаптер содержит штрих-код носителя.
125. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-124, где штрих-кодированные полинуклеотиды являются одноцепочечными.
126. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-125, в которой первый адаптер и второй адаптер различаются.
127. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-126, в которой первый универсальный праймирующий сайт и/или второй универсальный праймирующий сайт представляет собой или содержит праймирующий сайт P7(C7) или его непрерывную часть или праймирующий сайт P5(C5), или его непрерывнею часть, и где, необязательно, непрерывная часть таковых достаточна для отжига комплементарной последовательности.
128. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-127, в которой первый универсальный праймирующий сайт представляет собой или содержит праймирующий сайт P7(C7) или его непрерывную часть, а второй универсальный праймирующий сайт представляет собой или содержит праймирующий сайт P5(C5) или его ненрерывную часть.
129. Полинуклеотидная библиотека по п. 127 или 128, в которой сайт праймирования Р7(С7) содержит последовательность agatcggaagagcacacgtctgaactcca (SEQ ID NO:77), или представляет собой непрерывную часть таковой.
130. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 127-129, в которой сайт праймирования P5 содержит последовательность agatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtgtagatctcggtggtcgccgtatcatt (SEQ ID NO:78), или представляет собой непрерывную часть таковой.
131. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 127-130, где непрерывная часть содержит по меньшей мере или, по меньшей мере приблизительно 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов в длину.
132. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 127-131, в которой сайт праймирования P5 представляет собой непрерывную часть, указанную в SEQ ID NO:25 (AGATCGGAAGAGCGTCGTGT).
133. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-132, в которой олигонуклеотид, содержащий штрих-код носителя, содержит по меньшей мере или по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 нуклеотидов.
134. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-133, в которой олигонуклеотид, содержащий штрих-код носителя, содержит от или приблизительно от 10 до 30 нуклеотидов.
135. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-134, где один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают полинуклеотид иммунной молекулы или ее цепи.
136. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-135, в которой один или несколько полинуклеотидов-мишеней содержат по меньшей мере два полинуклеотида-мишени, каждый из которых включает полинуклеотид цепи иммунной молекулы.
137. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-136, где один или несколько полинуклеотидов-мишеней включают один или несколько полинуклеотидов TCR или цепей таковых.
138. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-137, в которой один или несколько полинуклеотидов-мишеней содержат первый полинуклеотид- полинуклеотид альфа-рецептора Т-клеток (TCRα) и второй полинуклеотид- полинуклеотид рецептора Т-клеток (TCRβ).
139. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-137, в которой один или несколько полинуклеотидов-мишеней содержат первый полинуклеотид- полинуклеотид гамма-рецептора Т-клеток (TCRγ) и второй полинуклеотид- полинуклеотид дельта-рецептора Т-клеток (TCRdelta).
140. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-136, в которой один или несколько полинуклеотидов-мишеней содержат один или несколько полинуклеотидов антител или их цепей.
141. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-136 и 140, в которой один или несколько полинуклеотидов-мишеней содержат первый полинуклеотид- полинуклеотид тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) и второй полинуклеотид- полинуклеотид легкой цепи иммуноглобулина (IgL).
142. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-141, в которой полинуклеотиды со штрих-кодом содержат в порядке (от 5' до 3'): первый адаптер, олигонуклеотид со штрих-кодом носителя, молекулярный штрих-код и второй адаптер.
143. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-142, в которой первый адаптер расположен в или около 5'-области одноцепочечного полинуклеотида с двойным штрих-кодом.
144. Полинуклеотидная библиотека по любому из пп. 118-143, в которой второй адаптер расположен в или около 3'-области одноцепочечного полинуклеотида с двойным штрих-кодом.
145. Способ секвенирования одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней и/или полного или частичного транскриптома одной или нескольких клеток, включающий секвенирование одного или нескольких множеств штрих-кодированных полинуклеотидов, необязательно, полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, полученных по любому из пп. 1-116 или из полинуклеотидной библиотеки по любому из пп. 117-142.
146. Способ по п. 145, в котором полный или частичный транскриптом одной или нескольких клеток секвенируют.
147. Способ по п. 146, дополнительно включающий амплификацию полного транскриптома или его части перед секвенированием.
148. Способ по п. 147, в котором амплификацию проводят с использованием первого набора праймеров, содержащего первый праймер и второй праймер, специфичные для первой и второй последовательностей адаптера соответственно.
149. Способ по любому из пп. 145-148, в котором секвенируют один или несколько полинуклеотидов-мишеней из множества штрихкодированных полинуклеотидов.
150. Способ по п. 149, дополнительно включающий амплификацию одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней из множества штрихкодированных полинуклеотидов перед секвенированием.
151. Способ по п. 150, в котором полноразмерную последовательность одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней амплифицируют.
152. Способ по п. 150 или 151, в котором амплификацию проводят в присутствии второго набора праймеров, содержащего один или несколько первых праймеров, комплементарных одному или нескольким полинуклеотидам-мишеням, и второго праймера, комплементарного последовательности первого адаптера.
153. Способ по п. 152, в котором второй праймер из второго набора праймеров является комплементарным сайту праймирования P7 (C7) или его непрерывной части, или сайту праймтрования P5 (C5), или его непрерывной части.
154. Способ по п. 152 или 153, в котором второй праймер из второго набора праймеров является комплементарным сайту праймирования P7(C7) или непрерывной части таковой.
155. Способ по любому из пп. 152-154, в котором второй праймер из второго набора праймеров представляетили содержит последовательность CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (SEQ ID NO:39) или CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[NNNNNN]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT (SEQ ID NO:28).
156. Способ по любому из пп. 152-155, в котором один или несколько первых праймеров, комплементарных одному или нескольким полинуклеотидам, специфичны для последовательности-мишени иммунной молекулы или ее цепи.
157. Способ по п. 156, где иммунная молекула представляет собой рецептор Т-клетки или антитело.
158. Способ по п. 156 или 157, в котором один или несколько первых праймеров специфичны для последовательности-мишени константной области иммунной молекулы.
159. Способ по любому из пп. 156-158, в котором иммунная молекула представляет собой TCR, и один или несколько первых праймеров включают AGTCTCTCAGCTGGTACACGG (SEQ ID NO:37), ATGGCTCAAACACAGCGACCTC (SEQ ID NO:38) или их комбинацию.
160. Способ по любому из пп. 156-159, в котором иммунная молекула представляет собой антитело и, где один или несколько первых праймеров содержат любую из SEQ ID NO: 29-36 или их комбинацию.
161. Способ по любому из пп. 145-160, дополнительно включающий определение клеточного происхождения одного или нескольких штрих-кодированных полинуклеотидов, необязательно полинуклеотидов с двойным штрих-кодом.
162. Способ по п. 161, в котором определение клетки происхождения включает идентификацию последовательностей полинуклеотидов с двойным штрих-кодом, имеющих тот же самый штрих-код носителя, что говорит о происхождении из той же самой же клетки.
163. Способ по п. 161 или 162, где полинуклеотид-мишень представляет собой иммунную молекулу, содержащую первую полинуклеотидную цепь и вторую полинуклеотидную цепь, и способ включает выявление соответствия первой полинуклеотидной цепи и второй полинуклеотидной цепи одной и той же клетке, на основании присутствия того же самого штрих-кода носителя в секвенированных полинуклеотидах с двойным штрих-кодом.
164. Способ по любому из пп. 155-163, который дополнительно содержит количественное определение или определение числа полинуклеотидов с одним и тем же штрих-кодом, необязательно, с одним и тем же молекулярным штрих-кодом.
165. Способ по любому из пп. 155-164, в котором множество штрихкодированных полинуклеотидов представляет собой полинуклеотиды с двойным штрих-кодом, содержащие молекулярный штрих-код и штрих-код носителя, и способ дополнительно включает идентификацию последовательностей транскриптома и полинуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих одинаковый штрих-код носителя, тем самым предоставляя информацию о транскриптоме клетки, несущей полинуклеотид-мишень(ы).
166. Способ анализа транскриптома, включающий:
(а) секвенирование одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней из многих, принадлежащиго множеству штрих-кодированных полинуклеотидов, полученных способом по любому из пп. 1-116, или из множества штрих-кодированных полинуклеотидов библиотеки полинуклеотидов по любому из пп. 117-142, где полинуклеотиды со штрих-кодом представляют собой полинуклеотиды с двойным штрих-кодом, содержащие молекулярный штрих-код и штрих-код носителя, тем самым генерируя информацию о последовательности полинуклеотида-мишени из множества клеток;
(b) секвенирование всего транскриптома или его части из множества штрих-кодированных полинуклеотидов, полученных способом по любому из пп. 1-116, или из множества штрих-кодированных полинуклеотидов библиотеки полинуклеотидов по любому из пп. 117-142, где штрих-кодированные полинуклеотиды представляют собой полинуклеотиды с двойным штрих-кодом, содержащие молекулярный штрих-код и штрих-код носителя, тем самым генерируя данные транскриптома из множества клеток; и
(c) идентификацию информации о последовательностях из (a) и из (b), имеющих тот же самый штрих-код носителя, как происходящих из одной и той же клетки.
167. Способ анализа транскриптома выбранной отдельной клетки, включающий:
(а) амплификацию и секвенирование одного или нескольких полинуклеотидов-мишеней из множества штрих-кодированных полинуклеотидов, полученных способом по любому из пп. 1-116, или из многих, принадлежащих множеству штрих-кодированных полинуклеотидов из библиотеки полинуклеотидов по любому из пп. 117-142, где штрих-кодированные полинуклеотиды представляют собой полинуклеотиды с двойным штрих-кодом, содержащие молекулярный штрих-код и штрих-код носителя, тем самым генерируя информацию о последовательности для каждого из полинуклеотидов-мишеней по меньшей мере в одной из множества клеток;
(b) идентификацию штрих-кода(-ов) носителя, ассоциированного с одним из полинуклеотида(-ов)-мишени(ей), секвенированного в (а), таким образом идентифицируя выбранную отдельную клетку, несущую полинуклеотид-мишень;
(c) амплификацию и секвенирование транскриптома или его части из множества штрих-кодированных полинуклеотидов клетки, несущих штрих-код носителя, идентифицированный в (b), тем самым генерируя данные транскриптома из выбранной клетки, экспрессирующей полипептид-мишень.
168. Способ по п. 167, в котором транскриптом или его часть из выбранной клетки амплифицируют или секвенируют с использованием праймера, специфичного для штрих-кода носителя, идентифицированного в (b), и праймера, специфичного для последовательности второго адаптера штрих-кодированных полинуклеотидов.
169. Способ анализа транскриптома, включающий сопоставление информации о последовательности транскриптома или его части и по меньшей мере одного из полинуклеотидов-мишеней, происходящих из той же клетке, при этом информация о последовательности определяется на множестве штрих-кодированных полинуклеотидов, полученных по любому из пп. 1-114 или на множестве штрих-кодированных полинуклеотидов из библиотеки полинуклеотидов по любому из пп. 117-142, где штрих-кодированные полинуклеотиды представляют собой полинуклеотиды с двойным штрих-кодом, содержащие молекулярный штрих-код и штрих-код носителя, или определяется способом по любому из пп. 155-165.
170. Способ по п. 169, в котором последовательности, имеющие один и тот же штрих-код носителя, определяются как происходящие из одной и той же клетки.
171. Способ по любому из пп. 166-170, в котором данные транскриптома содержат параметр, характеристику, признак или фенотип, связанный с функцией или активностью клетки.
172. Способ по п. 171, в котором данные транскриптома связаны с активацией, истощением или пролиферативной активностью клетки.