СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ КАТЕХОЛАМИН- И СЕРОТОНИН-РЕЦЕПТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ
METHOD FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF EXPRESSION LEVEL OF CATECHOL AMINE- AND SEROTONIN-RECEPTOR COMPLEXES ON SURFACE OF LEUCOCYTES

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для количественного определения рецепторных комплексов к катехоламинам (КА) и серотонину (СТ) на клетках в мазках крови или в срезах тканей человека и животных.
Наличие на поверхности лимфоцитов КА- и СТ-рецепторных комплексов определяют с помощью люминесцентно-гистохимического метода Фалька-Хилларпа (1962) [15] в модификациях авторов [5, 17]. Метод основан на превращении моноаминов (норадреналина) и вторичных аминов (адреналина), связанных с белком, под действием паров формалина в четвертичные амины - дигидроизохинолины, люминесцирующие в ультрафиолетовом свете.
Известны способы количественного определения катехоламин- и серотонин-рецепторных комплексов на поверхности клеток, основанные на измерении интенсивности люминесценции исследуемых объектов при облучении ультрафиолетовым светом [15].
Способы пригодны для определения рецепторных комплексов на клетках в мазках крови или срезах тканей в модификациях разных авторов [5, 9, 16, 17]. Люминесцирующие клеточные объекты исследуют визуально с помощью люминесцентного микроскопа, оснащенного электронно-оптическим устройством для микрофлюорометрии (ФМЭЛ). С помощью насадки ФМЭЛ объект (клетку) помещают в область так называемого зонда - участка оптической системы ФМЭЛ фиксированного размера, пропускающего свечение клетки на фотоэлектроумножитель (ФЭУ) [1]. Для работы ФЭУ  и насадки ФМЭЛ необходим высоковольтный источник питания. ФЭУ преобразует интенсивность свечения клетки в электрический ток, напряжение которого регистрируют измерительными приборами. Предполагают, что значение выходного напряжения ФМЭЛ пропорционально светимости и уровню экспрессии КА- и СТ-рецепторных комплексов на поверхности клеток. Результаты выражают в единицах измерения напряжения - вольтах. Для повышения точности измерений используют средние значения параметров нескольких объектов, а результат нередко выражают с учетом интенсивности свечения фона мазка. Все измерения объектов микроскопии проводят последовательно в различных участках исследуемого мазка.
Кроме того, возможно получение фотографических изображений люминесцирующих объектов микроскопии при использовании фотоприставок различных конструкций. Однако отсутствуют сведения о способах количественного определения интенсивности люминесцентного излучения по фотоизображениям.
Основной недостаток описанных выше способов измерения - искажение результатов измерений вследствие конструкционных особенностей ламповых приборов, обусловливающих нестабильность и скачкообразные изменения характеристик их работы [3, 7]. Это характерно как для ртутно-кварцевой лампы люминесцентного микроскопа (источника возбуждающего ультрафиолетового излучения), так и ФЭУ (приемника люминесцентного излучения). Искажения усугубляются за счет неодновременного измерения интенсивности люминесценции исследуемых объектов и фона мазка.
Измерение характеристик объектов с помощью ФМЭЛ проводится вслепую, т.е. когда объект закрыт меткой зонда. Фиксированный размер зондов не позволяет исследовать отличающиеся по размерам объекты в одинаковых условиях, поскольку одновременно с объектом в оптическую область измерений попадает фон мазка.
Другим недостатком этих способов измерения является использование специальной дорогостоящей аппаратуры (ФМЭЛ). Стоимость последней на порядок выше стоимости современной цифровой фотокамеры. Также перечисленные выше способы требуют от лаборанта специальных навыков работы с ФМЭЛ. Кроме того, микроскопия и неодновременное измерение интенсивности люминесценции нескольких участков поля зрения также увеличивают трудоемкость измерений.
Задачей предлагаемого способа является упрощение и повышение точности количественной оценки уровня экспрессии катехоламин- и серотонин-рецепторных комплексов на поверхности клеток.
Поставленную задачу решают за счет того, что цифровую обработку изображений объектов микроскопии проводят с помощью программных продуктов семейства Adobe Fotoshop, для чего открывают файл изображения объектов микроскопии с помощью программного продукта семейства Adobe Fotoshop, в окне «Каналы» выбирают «Зеленый», затем с помощью «Лассо» выделяют измеряемый объект по контуру; в качестве характеристики яркости исследуемого объекта используют значение показателя «Среднее» в окне «Гистограмма»; причем для повышения точности измерений проводят определение характеристик пяти клеток обследуемого индивида и пяти областей фона мазка, после чего уровень экспрессии катехоламин- и серотонин-рецепторных комплексов на поверхности клеток рассчитывают как отношение среднего значения яркости изображения клеток к среднему значению яркости изображения фона мазка, выраженное в процентах.
4
Способ осуществляют следующим образом. Для приготовления мазков смешивают 20 мкл цельной крови с равным объемом 5% раствора MgSO. Предметные стекла высушивают в струе теплого воздуха в течение 15 минут.
Обработку мазков крови парами формалина проводят в герметическом эксикаторе объемом 3 литра. Для определения КА-рецепторных комплексов в эксикатор добавляют 1,866 г параформа и 525 мкл дестилированной воды. В эксикаторе создают глубокий вакуум (до 0,05 атм) с помощью вакуумного насоса. Затем эксикатор с мазками крови помещают в сухожаровой шкаф при температуре 80°С на 1 час; а для выявления СТ-рецепторных комплексов в эксикатор добавляют 2,175 г параформа, 660 мкл воды, инкубацию проводят при температуре 80°С в течение 2 часов.
Обработанные мазки исследуют с помощью люминесцентного микроскопа серии «ЛЮМАМ». Используют светофильтры возбуждения: СЗС-24 (2 мм) λ=300-600 нм, СС-15 (2 мм) λ=340-420 нм; запирающие светофильтры: ЖС-18+ЖС-19 λ=360-440 нм, λ=480-700 нм, светоделительные пластины: для катехоламинов - с областью отражения 400-440 нм, областью пропускания 500-700 нм («Зеленая-2»), для серотонина - с областью отражения 340-370 нм, областью пропускания 425-500 нм («Голубая»).
При микроскопии клеток проводят съемку объектов на цифровую камеру, адаптированную к оптической системе микроскопа, цифровую обработку изображений объектов микроскопии проводят с помощью программных продуктов семейства Adobe Fotoshop.
Для этого открывают файл изображения объектов микроскопии с помощью программного продукта семейства Adobe Fotoshop, см. чертеж.
На чертеже представлена обработка фотографического изображения объектов люминесцентной микроскопии в Adobe Photoshop CS СЕ, где 1 - кнопка инструмента «Лассо», 2 - выделенное изображение лимфоцита, 3 - канал «Зеленый», 4 - окно «Гистограмма», показатель «Среднее».
В окне «Каналы» выбирают «Зеленый». Затем в панели инструментов Adobe Fotoshop выбирают инструмент «Лассо». С помощью «Лассо» выделяют измеряемый объект по контуру. При этом в окне «Гистограмма» будут отражены результаты цифровых характеристик выделенного фрагмента изображения (клетки - объекта исследования). В качестве характеристики яркости исследуемого объекта следует использовать значение показателя «Среднее». Шкала яркости объекта принимает значения в диапазоне от 0 (минимальная яркость объекта) до 255 единиц (максимальная яркость объекта).
Для повышения точности измерений проводят определение характеристик пяти клеток обследуемого индивида и пяти областей фона мазка.
Относительная яркость люминесцентного изображения клетки отражает уровень экспрессии КА- и СТ-рецепторных комплексов. Его рассчитывают как отношение среднего значения яркости изображения клеток к среднему значению яркости фона мазка, выраженное в процентах:
ЭР=100%·ЯО/ЯФ,
где ЭР - уровень экспрессии КА- или СТ-рецепторных комплексов клеток обследуемого индивида, ЯО - среднее значение яркости исследуемых клеток, ЯФ - среднее значение яркости фона мазка.
Предложенный способ был использован для количественной оценки КА- и СТ-рецепторных комплексов лимфоцитов у 197 пациентов с диффузным гнойным перитонитом в раннем послеоперационном периоде. Причинами развития перитонита являлись травмы и ранения, перфоративные язвы желудка и ДПК, панкреонекрозы, воспалительные заболеваниями органов брюшной полости.
У 91 пациента, составивших первую группу, определен уровень экспрессии КА-рецепторных комплексов лимфоцитов. Исследование выполнено с помощью люминесцентного микроскопа «ЛЮМАМ Р-8» и фотометрической насадки ФМЭЛ-1А. В каждом мазке крови измерялась светимость пяти лимфоцитов, а фоновая светимость препарата измерялось в пяти разных точках. Выходное напряжение насадки ФМЭЛ-1А измеряли с помощью милливольтметра. В качестве результирующего показателя использовали разность средних значений светимости лимфоцитов и фона мазка; результат выражали в мВ [1].
У 106 пациентов, вошедших во вторую группу, исследованы уровни экспрессии КА- и СТ-рецепторных комплексов лимфоцитов. При люминесцентной микроскопии клеток проводилась съемка объектов на цифровую камеру Canon PowerShot A410 с площадью матрицы 4,0 Мпикс., адаптированную к окуляру люминесцентного микроскопа «ЛЮМАМ Р-8». Размер снимка поля микроскопии составил 1,76 Мпикс. Интенсивность люминесценции объектов микроскопии оценивали по предложенному способу с помощью Adobe Fotoshop CS СЕ.
Исследованы взаимосвязи между уровнем экспрессии КА- и СТ-рецепторных комплексов лимфоцитов и клинико-лабораторными данными обследованных пациентов. Учитывали следующие показатели: артериальное давление, количество лейкоцитов (L) и лимфоцитов общей популяции (АКЛ) в мкл периферической крови. Для характеристики уровня интоксикации использованы показатели лейкоцитарных индексов интоксикации в модификациях Я-Я.Кальф-Калифа (ЛИИкк), В.К.Островского (ЛИИос), С.Ф.Химича в модификации А.Л.Костюченко с соавт. (ЛИИх) [4]. В качестве характеристики глубины стрессорных нарушений использовано соотношение показателей процентного содержания лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов в мазке крови, предложенное Л.Х.Гаркави [2, 6].
Среди показателей иммунной системы учитывали процент и абсолютное число лимфоцитов (АБС), экспрессирующих рецепторы: CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD38, CD95. Также оценивали величину фагоцитарного индекса, концентрацию IgG и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Исследован уровень холестерина в сыворотке крови пациентов.
Первая и вторая группы пациентов были сопоставимы по половому и возрастному составу, показателям ЛИИ, уровню лейкоцитов и CD3+ лимфоцитов в периферической крови, продукции IgG и фагоцитарному индексу. Статистические расчеты произведены на персональном компьютере с помощью пакета статистических программ "Statistica for Windows'6.0". В качестве основных статистических параметров учитывали среднее арифметическое значение величин (М) и их стандартную ошибку (m).
Связь между полученными значениями уровней экспрессии рецепторов к КА и серотонину СТ и показателями тяжести состояния пациентов определяли методами корреляционного анализа с использованием критерия Спирмена.
Согласно полученным данным, средние значения уровня экспрессии на лимфоцитах рецепторов к КА в первой группе пациентов составили 70,79±5,64 мВ (табл.1), во второй - 163,94±3,50% (табл.2). Интенсивность экспрессии на лимфоцитах рецепторов к серотонину во второй группе пациентов составила 144,59±1,74% (табл.3).
Среднее время выполнения исследования уровня экспрессии КА-рецепторных комплексов на лимфоцитах с использованием фотометрической насадки ФМЭЛ-1А составило 17,62±0,32 минут (табл.1). При определении того же показателя по предложенному способу среднее время микроскопии и фотографирования мазков крови составило 2,74±0,05 минут (табл.2), время оценки интенсивности люминесценции по цифровым фотоизображениям - 5,22±0,08 минут. В среднем, с использованием предложенного способа, для оценки уровня экспрессии на лимфоцитах рецепторов к КА требовалось 7,56±0,09 минут, к серотонину - 7,95±0,09 минут (табл.3). Это свидетельствует о меньших затратах времени и трудоемкости исследования по предложенному способу.
При анализе полученных данных в первой группе пациентов отмечены положительные корреляционные связи между экспрессией КА и пульсом, минутным объемом кровотока, фагоцитарным индексом (табл.4), отрицательные коэффициенты корреляции с АКЛ, соотношеним лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов, экспрессией CD8+ рецепторов.
Табл.4
Коэффициенты корреляции между уровнями экспрессии на лимфоцитах рецепторов к КА и показателями тяжести состояния пациентов первой группы
Показатель
Коэффициенты корреляции Спирмена
Уровень достоверности
Пульс
0,26
р<0,05
МОК
0,25
р<0,05
АКЛ
-0,23
р<0,05
Лф/ с/я
-0,22
р<0,05
CD8+, %
-0,23
р<0,05
Фагоцитарный индекс
0,36
р<0,01
Во второй группе пациентов отмечены положительные коэффициенты корреляции между экспрессией рецепторов к КА и уровнем ЛИИ, экспрессией CD38-рецепторов, фагоцитарным индексом (табл.5); обратная связь с АКЛ, соотношением лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов, абсолютным числом CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD95+лимфоцитов. Это свидетельствует об индукции катехоламинами процессов апоптоза иммунокомпетентных клеток, что подтверждается ранее проведенными исследованиями [10, 12, 19].
Табл.5
Коэффициенты корреляции между уровнями экспрессии на лимфоцитах рецепторов к КА и показателями пациентов второй группы
Показатель
Коэффициенты корреляции Спирмена
Уровень достоверности
АКЛ
-0,45
p<0,001
Лф/ с/я
-0,37
p<0,0001
ЛИИос
0,22
p<0,05
CD16+,%
-0,34
p<0,001
CD38+, %
0,20
p<0,05
АБС CD3+
-0,42
p<0,0001
АВС CD4+
-0,46
p<0,0001
АВС CD8+
-0,46
p<0,0001
АВС CD16+
-0,49
p<0,0001
АВС СD16+нейтрофилы
-0,19
p<0,05
АВС CD20+
-0,38
p<0,0001
АВС CD25+
-0,45
p<0,0001
АВС CD38+
-0,35
p<0,001
АВС CD95+
-0,41
p<0,0001
Фагоцитарный индекс
0,26
p<0,01
Табл. 6
Коэффициенты корреляции между уровнями экспрессии на лимфоцитах рецепторов к СТ и показателями пациентов второй группы
Показатель
Коэффициенты корреляции Спирмена
Уровень достоверности
L
-0,65
p<0.0001
ЛИИкк
-0,26
p<0,01
ЛИИос
-0,44
p<0,0001
ЛИИх
-0,58
p<0,0001
АКЛ
-0,20
p<0,05
Лф/ с/я
0,50
p<0,0001
CD16+, %
0,34
p<0.0001
CD20+, %
0,36
p<0,0001
АВС CD38+
-0,21
p<0,05
АВС CD95+
-0,20
p0,05
Фагоцитарный индекс
0,27
p<0,01
Фагоцитарное число
0,45
p<0,0001
Фагоцитирующие нейтрофилы
-0,46
p<0,0001
IgG
0,59
p<0.0001
Уровень экспрессии рецепторов к серотонину во второй группе пациентов обратно связан с числом лейкоцитов (табл.6). Отмечена отрицательная связь СТ с показателями ЛИИ, положительная связь с отношением лимфоцитов к сегментоядерным нейтрофилам. Обнаружена положительная связь СТ с продукцией IgG, экспрессией CD16- и СD20-рецепторов, абсолютным количеством CD38+ и CD95+ лимфоцитов, фагоцитарным индексом и числом фагоцитирующих нейтрофилов, что описано ранее [13, 18, 20]. Полученные данные согласуются с современными представлениями об участии серотонина в регуляции гомеостаза при стрессовых нарушениях [14] и при активации иммунной системы [8]. Серотонин принимает участие в функционировании антиноцицептивной системы [11], повышение его продукции снижает выраженность стрессов и депрессивных расстройств [13], сопровождающих травмы и хирургические вмешательства [21].
Таким образом, проведенные исследования подтверждают информативность данных, полученных с помощью предлагаемого способа количественной оценки уровня экспрессии КА- и СТ-рецепторных комплексов. Уровень достоверности полученных показателей выше в сравнении с результатами измерений, полученных с помощью насадки для микрофлюорометрии (ФМЭЛ). Вероятной причиной этого являются меньшие разбросы и большая точность измерений, проведенных с использованием предложенного способа.
Преимуществами предлагаемого способа являются:
1) повышение точности результатов измерений;
2) при оценке интенсивности люминесценции объектов микроскопии по предложенному способу можно индивидуально настраивать форму и размер области измерений (аналога оптического зонда ФМЭЛ);
3) более низкая стоимость адаптированных к окуляру микроскопа цифровых фотокамер по сравнению с ФМЭЛ;
4) более простая в эксплуатации регистрирующая часть прибора: цифровая фотокамера вместо ФМЭЛ;
5) снижение суммарных затрат времени на проведение исследования за счет значительного снижения времени микроскопии.
Предлагаемый способ может быть рекомендован для количественной оценки уровня экспрессии катехоламин- и серотонин-рецепторных комплексов на клетках в мазках крови или в срезах тканей человека и животных.
Использованные источники
1. Андрейчиков, А.В. Подвижная почка, или метаболический паттерн «отмеченных» нефроптозом. / А.В.Андрейчиков. - Красноярск: Поликом, 2002. - 195 с.
2. Гаркави, Л.Х. Адаптационные реакции и резистентность организма. / Л.Х.Гаркави, Е.Б.Квакина, М.А.Уколова. - Ростов н/Д., 1977. - 100 с.
3. Захаров, В.Е. Основы статистической радиофизики: Учебное пособие. / В.Е.Захаров. - Калининград: Изд-во Калинингр. ун-та, 1997. - 94 с.
4. Костюченко, А.Л. Интенсивная терапия послеоперационной раневой инфекции и сепсиса. / А.Л.Костюченко, А.Н.Бельских, А.Н.Тулупов. - СПб.: Фолиант, 2000. - 448 с.
5. Крохина, Е.М. Симпатический (адренергический) компонент эффекторной иннервации сердечной мышцы. / Е.М.Крохина, П.Н.Александров // Кардиология. - 1969. - №3. - С.97-102.
6. О некоторых принципах адаптационной деятельности организма. / Л.Х.Гаркави, Е.Б.Квакина, М.А.Уколова и др. // 15 Съезд Всесоюзн. физиологич. общества: Тез. докл. - Л.: Наука, 1987. - C.60.
7. Букингем, М. Шумы в электронных приборах и системах: Пер. с англ. / М.Букингем. - М.: Мир., 1986. - 398 с.
8. 5-НТ(1В) receptors play a prominent role in the proliferation of T-lymphocytes. / J.Yin, R.H.Albert, A.P.Tretiakova, B.A.Jameson // J.Neuroimmunol. - 2006. - Vol.1-2. - P.68-81.
9. A study on the fluorescence intensity in rat leucocytes after administration of catecholamines, monoamineoxidase inhibitor and shizophrenic patients blood. / H.Yokoo, H.Kojima, K.Suetake, K.Arikawa // Psychology of shizophrenia: Proc. 8-th Int. Congr. Pharmacol, Gifu, 27-29 July 1981. - Oxford, 1982. - P.125-130.
10. Apoptotic signaling through the beta-adrenergic receptor. A new Gs effector pathway. / C. Gu, Y.C. Ma, J. Benjamin et al. // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.27. - P.20726-20733.
11. Behavioral, immunocytochemical and biochemical studies in rats differing in their sensitivity to pain. / М.Lehner, E.Taracha, A.Skorzewska et al. // Behav. Brain Res. - 2006. - Vol.10. - P.189-198.
12. Cioca, D.P. Apoptosis of peripheral blood lymphocytes is induced by catecholamines. / D.P.Cioca, N.Watanabe, М.Isobe // Jpn. Heart J. - 2000. - Vol.3. - P.385-398.
13. Circulating lymphocyte subsets in obsessive compulsive disorder, major depression and normal controls. / A.V.Ravindran, J.Griffiths, Z.Merali, H.Anisman // J.Affect. Disord. - 1999. - Vol.1-3. - P.1-10.
14. Cortisol decreases and serotonin and dopamine increase following massage therapy. / T.Field, M. Hernandez-Reif, M.Diego et al. // Int. J.Neurosci. - 2005. - Vol.10. - P.1397-1413.
15. Fulc, B. Fluorescence of catecholamines and related compounds condensed with formaldehyde. / B.Fulc, N.A.Hillarp // J.Histochem. Cytochem. - 1962. - Vol.10. - P.348-354.
16. Histofluorescence studies of monoamine neurons in the rat brain after cobaltous acetate intoxication. / M.Smialowska, T.Bugera-Piecuch, A.Bal, M.Smiaiek // Med. Biol. - 1987. - Vol.4. - P.193-198.
17. Jamur, M.C. Mast cell maturation in young rats: a histofluorescence and cytochemical study. / M.C.Jamur, L.O.Lunardi, I.Vugman // Acta Histochem. - 1997. - Vol.4. - P.379-389.
18. Leonard, B.E. The HPA and immune axes in stress: the involvement of the serotonergic system. / B.E.Leonard // Eur. Psychiatry. - 2005. - Vol.3. - P.302-306.
19. Marra, S. Intravenous catecholamine administration affects mouse intestinal lymphocyte number and apoptosis. / S.Marra, M.Bumett, L.Hoffman-Goetz // J.Neuroimmunol. - 2005. - Vol.1-2. - P.76-85.
20. Oxygen radical-induced natural killer cell dysfunction: role of myeloperoxidase and regulation by serotonin. / A.Betten, C.Dahlgren, U.H.Mellqvist et al. // J.Leukoc. Biol. - 2004. - Vol.6. - P.1111-1115.
21. Surgical stress response. / P.V.Giannoudis, H.Dinopoulos, B.Chalidis, G.M.Hall // Injury. - 2006. - Vol.37. - P.3-9.