AAV ВЕКТОРЫ С УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫМИ Rep-КОДИРУЮЩИМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМИ В СИСТЕМАХ ПРОДУКЦИИ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ

1. Нуклеотидная последовательность, содержащая открытую рамку считывания, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую парвовирусные белки Rep, в которой инициирующий кодон трансляции парвовирусного белка Rep78 представляет собой инициирующий кодон, который влияет на частичный скиппинг экзона при экспрессии в клетках насекомых.
2. Нуклеотидная последовательность по п.1, в которой инициирующий кодон выбран из ACG, TTG, CTG и GTG.
3. Нуклеотидная последовательность по п.1 или 2, содержащая контрольную последовательность экспрессии, которая содержит девятинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7 или нуклеотидную последовательность, по существу гомологичную SEQ ID NO:7, расположенную против направления считывания информации от инициирующего кодона в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Rep78 AAV.
4. Нуклеотидная последовательность по п.1, где парвовирусные белки Rep представляют собой белки Rep аденоассоциированного вируса (AAV).
5. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность по любому из пп.1-4, при этом нуклеотидная последовательность функционально связана с контрольными последовательностями экспрессии для экспрессии в клетке насекомого.
6. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.5, в которой нуклеотидная последовательность функционально связана с полиэдронным промотором.
7. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.5 или 6, которая представляет собой вектор, совместимый с клеткой насекомого, предпочтительно, бакуловирусный вектор.
8. Клетка насекомого, содержащая не более одного типа нуклеотидной последовательности, содержащей общую открытую рамку считывания, кодирующую один или несколько парвовирусных белков Rep.
9. Клетка насекомого по п.8, где общая открытая рамка считывания кодирует полноразмерный белок rep78.
10. Клетка насекомого по п.8 или 9, в которой нуклеотидная последовательность, содержащая общую открытую рамку считывания, кодирующую один или несколько парвовирусных белков Rep, представляет часть конструкции нуклеиновой кислоты, где нуклеотидная последовательность функционально связана с контрольными последовательностями экспрессии для экспрессии в клетке насекомого.
11. Клетка насекомого по п.8 или 9, содержащая первую нуклеотидную последовательность, содержащую открытую рамку считывания, кодирующую один или несколько парвовирусных белков Rep по любому из пп.1-4, или первую конструкцию нуклеиновой кислоты, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с контрольными последовательностями экспрессии для экспрессии в клетке насекомого по любому из пп.5-7.
12. Клетка насекомого по п.11, дополнительно содержащая
а) вторую нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность парвовируса с инвертированным концевым повтором (ITR); и
b) третью нуклеотидную последовательность, содержащую кодирующую последовательность парвовирусного капсидного белка, функционально связанную с контрольными последовательностями экспрессии для экспрессии в клетке насекомого.
13. Клетка насекомого по п.12, содержащая:
a) первую конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.5-7, дополнительно содержащую третью нуклеотидную последовательность, определенную в (b) п.9; и
b) вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую вторую нуклеотидную последовательность, определенную в (а) п.9.
14. Клетка насекомого по п.13, в которой вторая конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, совместимый с клеткой насекомого, предпочтительно, бакуловирусный вектор.
15. Клетка насекомого по любому из пп.12-14, в которой вторая нуклеотидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий генный продукт, и где по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая интересующий генный продукт, включена в геном парвовирусного вектора, продуцируемого клеткой насекомого.
16. Клетка насекомого по п.15, в которой указанная вторая нуклеотидная последовательность содержит две парвовирусных нуклеотидных последовательности ITR, при этом по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность, кодирующая интересующий генный продукт, расположена между двумя парвовирусными ITR-содержащими нуклеотидными последовательностями.
17. Клетка насекомого по п.12, в которой третья нуклеотидная последовательность содержит открытую рамку считывания, которая содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3 парвовируса, причем инициирующий кодон трансляции капсидного белка VP1 парвовируса выбран из ACG, TTG, CTG и GTG.
18. Клетка насекомого по п.17, в которой третья нуклеотидная последовательность содержит контрольную последовательность экспрессии, содержащую девятинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7 или нуклеотидную последовательность, которая по существу гомологична SEQ ID NO:7, расположенную против направления считывания информации от инициирующего кодона в нуклеотидной последовательности, кодирующей капсидный белок VP1 парвовируса.
19. Клетка насекомого по п.17 или 18, в которой третья нуклеотидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере одну модификацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей капсидный белок VP1 парвовируса, выбранную из С в нуклеотидном положении 12, А в нуклеотидном положении 21 и С в нуклеотидном положении 24.
20. Клетка насекомого по п.12, в которой по меньшей мере одна из нуклеотидных последовательностей: первая нуклеотидная последовательность, вторая нуклеотидная последовательность и третья нуклеотидная последовательность, стабильно интегрирована в геном клетки насекомого.
21. Клетка насекомого по п.8, в которой указанный парвовирус представляет собой AAV.
22. Способ получения рекомбинантного парвовирусного вириона в клетке насекомого, где указанный вирион содержит вторую нуклеотидную последовательность по любому из пп.12, 15 и 16, который включает стадии
a) культивирования клетки насекомого по любому из пп.12-21 в условиях, способствующих получению рекомбинантного парвовирусного вириона; и
b) выделения рекомбинантного парвовирусного вириона.
23. Способ по п.22, дополнительно включающий стадию аффинной очистки вириона с использованием анти-парвовирусного антитела, предпочтительно, иммобилизованного антитела.
24. Способ по п.23, где указанное анти-парвовирусное антитело представляет собой одноцепочечное верблюжье антитело или его фрагмент.
25. Способ по любому из пп.22-24, где рекомбинантный парвовирусный вирион представляет собой рекомбинантный вирион AAV.