Активация парамиксовирусов протеазами в культурах нормальных и раковых клеток

оригинальные исследования

13. Lee K.H., Medlock J.M., Heo S.T. Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, and migratory birds. J. Bacteriol. Virol. 2013; 43 (4): 235-43.

14. Zhang W.S, Zeng X.Y., Zhou M.H., Jiao Y.J., Wen T., Guo X.L. et al. Seroepidemiology of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus in Jiangsu Province. Disease Surveillance. 2011; 26: 676-8.

15. Zhao L., Zhai S., Wen H., Cui F., Chi Y., Wang L. et al. Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, Shandong province, China. Emerg. Infect. Dis. 2012; 18 (6): 963-5.

16. Denic S., Janbeih J., Nair S., Conca W., Tarig W.U.Z., Al-Salam S. Acute thrombocytopenia, leucopenia, and multiorgan dysfunction: the first case of SFTS Bunyavirus outside China? Case Rep. Infect. Dis. 2011; 2011: 204056.

17. Takahashi T., Maeda K., Suzuki T., Ishido A., Shigeoka T., Tominaga T. et al. The first identification and retrospective study of severe fever with thrombocytopenia syndrome in Japan. J. Infect. Dis. 2014; 209 (6): 816-27.

18. Bao C., Guo X., Qi X., Hu J., Zhou M., Varma J.K. et al. A family cluster of infections by a newly recognized bunyavirus in easern China, 2007: further evidence of person-to-person transmission. Clin. Infect. Dis. 2011; 53 (12): 1208-14.

19. Gai Z., Liang M., Zhang Y., Zhang S., Jin C., Wang S.W. et al. Person-to-person transmission of severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus through blood contact. Clin. Infect. Dis. 2012; 54 (2): 249-52.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© ЖИРНОВ О.П., 2017 УДк 578.831.1:578.23].083.2

Жирное О.П.

активация парамиксовирусов протеазами в культурах нормальных и раковых клеток

Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва

Изучали размножение парамиксовирусов Сендай и болезни Ньюкасла (ВБН) в культурах нормальных и раковых клеток. В культуре клеток почки собаки МйСК и ее дериватов с тетрациклинрегулируемой экспрессией трансмембранных протеаз НАТ и TMPRSS2 наблюдалось образование неинфекционных вирио-нов с нерасщепленным белком F0. Тетрациклиновая индукция протеаз НАТ и TMPRSS2 в инфицированных клетках приводила к протеолизу F0 > F1 + F2 и образованию высокоинфекционного вируса. При расщеплении протеазой НАТ, помимо F0 (м. м. 65 кД), F1 (50 кД) и F2 (15 кД), у вируса Сендай выявлялся дополнительный фрагмент F3 с м. м. 38 кД, что указывало на наличие второго сайта расщепления в молекуле F1, чувствительного к протеазе НАТ. При размножении вируса Сендай и ВБН в культуре раковых клеток Сасо-2 и Н1299 синтезировался инфекционный вирус, содержащий часть молекул в расщепленной форме F1 + F2. В культуре Н1299 в вирусе Сендай наряду с F0, F1 и F2 обнаруживался также фрагмент 38К. Количество расщепленного белка F1 + F2 и инфекционного вируса в раковых культурах Сасо-2 и Н1299 значительно возрастало на поздних сроках инфекции, что указывало на индукцию клеточных вирусакти-вирующих протеаз в раковых клетках при вирусной инфекции. ВБН вызывал значительно более быструю гибель раковых клеток Сасо-2 по сравнению с вирусом Сендай. Полученные данные показывают, что раковые клетки в отличие от нормальных клеток могут синтезировать протеазы, активирующие инфекци-онность парамиксовирусов, и по этой причине они становятся более уязвимыми для парамиксовирусной инфекции по сравнению с нормальными клетками.

Ключевые слова: парамиксовирусы; протеолитическая активация; протеазы; НАТ; TMPRSS2; апоптоз; клеточный лизис; вирусные онколитики. Для цитирования: Жирнов О.П. Активация парамиксовирусов протеазами в культурах нормальных и раковых клеток. Вопросы вирусологии. 2017; 62 (2): 65-72. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-2-65-72

Для корреспонденции: Жирнов Олег Петрович, д-р биол. наук, профессор, зав. лаб. вирусного патогенеза Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва. E-mail: zhirnov@inbox.ru

20. Liu Y., Li Q., Hu W., Wu J., Wang Y., Mei L. et al. Person-to-person transmission of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus. Vector Borne Zoonotic Dis. 2012; 12 (2): 156-60.

21. Tang X., Wu W., Wang H., Du Y., Liu L., Kang K. et al. Human-to human transmission of severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus through contact with infectious blood. J. Infect. Dis. 2013; 207 (5): 736-9.

22. Cui F., Cao H., Wang L., Zhang S.F., Ding S.J., Yu X.J. et al. Clinical and epidemiological study on severe fever with thrombocytopenia syndrome in Yiyuan country, Shandong province, China. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2013; 88 (3): 510-2.

23. Sun Y., Jin C., Zhan F., Wang X., Liang M., Zhang Q. et al. Host cytokine storm is associated with disease severity of severe fever with thrombocytopenia syndrome. J. Infect. Dis. 2012; 206 (7): 1085-125.

24. Zhang Y.Z., He Y.W., Dai Y.A., Xiong Y., Zheng H., Zhou D.J. et al. Hemorrhagic fever caused by a novel Bunyavirus in China: pathogenesis and correlates of fatal outcome. Clin. Inf. Dis. 2012; 54 (4): 527-33.

25. The Korea Centers for Disease Control and Prevention. Prevention. of severe fever with thrombocytopenia syndrome. (in Korean) Available at: http://www.cdc.go.kr/CDC/notice/CdcKrIntro0201. jsp?menuIds=H0ME001

Поступила 10.06.16 Принята в печать 11.10.16

original research

Zhirnov O.P.

PARAMYXOVIRUSES ACTIVATION BY HOST PROTEASES IN CULTURES OF NORMAL AND

CANCER CELLS

D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Federal State Budgetary Institution «Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 123098, Russian Federation

Multiplication of paramyxovirus Sendai and Newcastle disease virus (NDV) was studied in cultures of normal and tumor cells. Production of noninfectious virus with uncleaved F0 was observed in canine kidney cell line MDCK (line H) and its derivatives carrying tetracycline-regulated expression of transmembrane protease HAT or TMPRSS2 with trypsin-like cleavage specificity. Under tetracycline induction, a cleavage F0 (65 kD) F1 (50 kD)+F2(15 kD) and production of infectious virus were observed in these cell cultures. Under tetracycline induction, the additional subunit 38K (m.w. 38 kDa) of the F protein was detected both in infected MDCK-HAT cells and in newly synthesized Sendai virus in addition to F0, F1 and F2, indicating thereby a second HAT-sensitive proteolytic site in the F0 molecule. Highly infectious virus containing cleaved F1+F2 was produced in cultures of cancer cells Caco-2 and H1299. Virus Sendai synthesized in H1299 cells contained 38 K subunit indicating a cleavage of the F0 at a second site by H1299 host cell proteases. Levels of cleaved F1+F2 and infectious virions were higher at the late stage of infection in cancer cells, suggesting thus the induction of virus-activating proteases in Caco-2 and H1299 cells under infection with paramyxoviruses. NDV virus was found to induce more rapid death of cancer cells Caco-2 than Sendai virus. Cooperatively, the obtained data show that cancer cells in distinction to nonmalignant cells can synthesize protease(s) activating infectivity of paramyxoviruses. Thus, they are more vulnerable to paramyxovirus infection than normal cells.

K e y w or d s: paramyxoviruses; proteolytic activation; proteases; HAT; TMPRSS2; apoptosis; cell lysis; viral oncolytics. For citation: Zhirnov O.P. Paramyxoviruses activation by host proteases in cultures of normal and cancer cells. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2017; 62(2): 65-72. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/05074088-2017-62-2-65-72

For correspondence: OlegP. Zhirnov, Dr. Biol. Sci., Professor, Head of the Laboratory of Viral Pathogenesis, D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Federal State Budgetary Institution «Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 123098, Russian Federation. E-mail: zhirnov@ inbox.ru.

Acknowledgements. This work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (Grants Nos. 17-04-01726 and 17-04-01934). The study of the apoptosis of malignant cells was supported by the Russian Science Foundation and the German Research Foundation (DFG) (Collaboration project No. 18-44-04028). The study of the paramyxovirus reproduction was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. №14-15-01073).

The author is grateful to E. Böttcher-Friebertshäuser and Prof. H. D. Klenk (Institute of Virology, Philipps University, Marburg, Germany) for the MDCK cell cultures used for HAT and TMPRSS2 protease expression. The author is grateful to Prof. P.M. Chumakov (V.A. Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia) and Prof. S. Ludwig (Institute of Molecular Virology, Münster, Germany) for helpful discussion. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Received 07 July 2016 Accepted 11 October 2016

Введение

Парамиксовирусы относятся к оболочечным вирусам, содержащим одноцепочечную РНК негативной полярности. В вирусном геноме закодировано 6 основных генов: NP - P - M- F - HN - L, которые экспрессируются один за другим по механизму старт - стоп с образованием соответствующих 6 основных структурных полипептидов [1]. В гене Р закодированы дополнительные уникальные антиинтерфероновые белки V и С, которые образуются по механизму сдвига рамки трансляции вирусной мРНК [2, 3]. Известно, что белок F, выполняющий функцию слияния вирусной и клеточной мембраны, претерпевает точечное разрезание клеточными протеазами на 2 фрагмента F1 и F2. У различных штаммов парамиксовирусов участок расщепления F0 имеет либо единичный остаток Argj, либо полиаргининовый сайт с мотивом Arg - X - Arg/Lys - Argj, который расщепляется протеазами трипсинового и фуринового типа соответственно [4, 5]. Протеолитическое разрезание активирует сливающую функцию белка F и повышает способность вируса заражать клетки-мишени [4-6].

В инфицированных клетках вновь синтезированные вирусные белки формируют вирусное потомство и затем индуцируют цитопатогенное действие, которое приводит к отсроченной гибели клеток после завершения репродукции вируса. В последние годы наблюдается повышенный интерес к изучению механизмов вирусной

гибели клеток, что связано с развитием нового направления в химиотерапии раковых опухолей с помощью вирусов - так называемых вирусных онколитиков [7-9]. Одними из наиболее перспективных кандидатов на роль онколитического агента рассматриваются парамиксови-рус Сендай и вирус болезни Ньюкасла (ВБН), которые имеет высокую тропность к инфекции клеток человека и высокий литический потенциал [10].

Механизмы размножения вируса и гибели клеток имеют двоякую зависимость как от свойств вируса, так и от природы клеток. В частности, вызывает интерес изучение регуляции протеолитической активации вируса клеточными протеазами в нормальных и раковых клетках. В этом сравнении важное значение приобретает тот факт, что раковые клетки имеют дефекты в системе интерферона, что делает их наиболее уязвимыми для вирусов. С другой стороны, возникает вопрос, какие свойства вируса и какие вирусные белки вовлечены в регуляцию размножения вирусов различных семейств в процессе лизиса клеток.

В настоящей работе изучали размножение парамиксо-вирусов Сендай и ВБН в клеточных культурах, которые различались уровнем экспрессии протеаз, способных расщеплять вирусный белок слияния F0 (м. м. 68 кД) ^ F1 (50 кД) + F2 (15 кД) и активировать инфекцион-ность вируса. Сравнивали зависимость механизма гибели клеток от интенсивности разрезания белка F0 ^

F1 в клетках различного происхождения. Оказалось, что интенсивность разрезания вирусного белка F0 ^ F1 значительно усилена в опухолевых клетках и это коррелирует с повышением продукции инфекционного вируса и усилением вирусиндуцированного клеточного слияния и формирования гигантских симпластов на поздних сроках инфекции. Таким образом, полученные данные указывают на то, что раковые клетки более уязвимы для парамиксовирусной инфекции по сравнению с нормальными клетками.

Материал и методы

Клетки. Культуры эпителиальных клеток MDCK-Н (эпителиальная линия почки собаки MDCK-Н), Сасо-2 (линия аденокарциномы толстого кишечника), Н1299 (эпителиальная линия легочной карциномы) культивировали в минимальной среде Дульбеко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров («Gibco BRL») и антибиотиков гентамицина (25 мкг/мл), пенициллина (50 Ед/мл), стрептомицина (50 мкг/мл) [11]. Культуру клеток MDCK-Н, содержащую интегрированный ген протеазы human airway trypsin (НАТ) (MDCK-НАТ) либо ген протеазы transmembrane protease serin S2 (TMPRSS2) (MDCK-SS2) под тетрациклинрегулируемым промотором, культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки коров, или с добавлением в среду 0,5 мкг/мл доксициклина для индукции соответствующих протеаз [12]. Все клеточные линии получены из коллекции клеточных культур Института вирусологии Марбурга (Германия).

Вирусы. Вирус Сендай (штамм 960/Z) и ВБН (штамм LaSota) размножали в аллантоисной полости 10-дневных безлейкозных куриных эмбрионов в течение 72 ч при 36oC при множественности заражения около 104 фоку-собразующих единиц (ФОЕ) на эмбрион. Вируссодер-жащую аллантоисную жидкость эмбрионов отбирали, аликвотили и хранили при -80oC.

Определение инфекционности вируса методом вирусных фокусов в клеточной культуре. 2-дневную культуру клеток MDCK-Н инкубировали в теченда 1 ч при 37oC с разведениями исследуемых вирусов, приготовленными на среде DMEM. Через 7-8 ч клеточные культуры фиксировали 4% параформальдегидом и последовательно инкубировали с антителами, специфичными для вируса Сендай или ВБН и антивидовым конъюгатом перокси-дазы хрена. Единичные инфицированные клетки (вирусные центры) окрашивали тетраметилбензидиновым субстратом «True Blue» (KPL). Центры инфекции (ЦОЕ - центробразующие единицы) подсчитывали на 1 мл исследуемой суспензии в световом микроскопе при 75-кратном увеличении [13].

Анализ апоптозного профиля хроматиновой ДНК. Осадки клеток суспендировали в 50 мкл фосфатного буфера (ФБ) и смешивали с 250 мкл буфера, содержащего 0,6% додецилсульфата натрия (ДСН), 10 мМ ЭДТА и 15 мМ Трис-НС1 (pH 8,0), к полученной суспензии добавляли 70 мкл 5 М NaCl. Полученную смесь оставляли на ночь при 4oC и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 20 мин для удаления агломератов хроматина. Супернатант последовательно обрабатывали РНКазой А (0,1 мг/мл) и протеиназой К (0,5 мг/мл) при 37oC по 30 мин каждой. Суспензию смешивали с тремя объемами 96% этанола, инкубировали при -20oC в течение 2 ч, сформированные преципитаты ДНК осаждали при 14 000 об/мин 20 мин, растворяли в 10 мМ Трис-HCl (pH

оригинальные исследования

8,0) и анализировали в 1% агарозном геле, как описано ранее [14].

Электрофорез в полиакриламидном геле и вестерн-блот-анализ (ВБ). Полипептиды зараженных клеток фракционировали в полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем ДСН, и из геля белки переносили на ни-троцеллюлозную бумагу Protran 0,45 мк («Schleicher & Schull») полусухим методом [15]. Мембрану промывали в ФБ, инкубировали 2 ч в 3% обезжиренном молоке и далее в течение 2 ч в ФБ, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина («Sigma») и специфические антивирусные антитела. В работе использовали антитела к очищенному белку F0 вируса Сендай и ВБН, цыплячью сыворотку против цельного ВБН («Нарвак», Россия). Затем мембрану промывали ФБ и обрабатывали видоспе-цифическим конъюгатом пероксидазы хрена («Dako») с последующей усиленной идентификацией позитивных компонентов с помощью усиленной хемилюминесцен-ции (ECL) с суперсубстратом («Pierce») [14].

Электрофорез в полиакриламидном геле и окраска гелей. Полипептиды вирусных проб фракционировали в ПААГ и после электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем смесь этанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 5:1:5 по объему. После фиксации гели окрашивали Кумаси голубым G-350 и несвязав-шуюся краску отмывали раствором, содержащим 5 и 7% этанола и уксусной кислоты соответственно [16, 17].

Результаты

В первой части работы исследовали протеолиз вирусного белка F0 ^ F1 и уровень продукции инфекционного вируса при размножении вируса Сендай и штамма ЛаСота ВБН в к MDCK (линия Н) и ее производных линиях, содержащих гены трансмембранных протеаз НАТ и TMPRSS2 под контролем тетрациклинового промотора [12], а также 2 линии раковых клеток человека Сасо-2 (линия эпителиальных клеток аденокарциномы кишечника человека) и Н1299 (линия эпителиальных клеток карциномы респираторного тракта человека). Как видно на рис. 1, вирус Сендай, выращенный в клетках MDOT-SS2 (см. рис. 1, а) и MD^-НАТ (см. рис. 1, б) без индукции доксициклином, содержал нерасщеплен-ный белок F0 (м. м. 60 кД). Такой вирус имел низкую инфекционность, которая заметно возрастала в 1000 раз и более после обработки трипсином (табл. 1). Аналогичные данные получены с вирусом Сендай в культуре клеток МDСК-Н (не показано). При размножении вируса в культурах клеток MD^-НАТ и MDOT-SS2 в присутствии доксициклина, индуцирующего синтез протеаз НАТ и TMPRSS2, вирусное потомство имело расщепленный белок F1 (м. м. 50 кД) (см. рис. 1, а, б; дорожки 2 и 4). Количественная оценка, выполненная на основании сканирования гелей, показала, что около 40-70% белка F0 в вирусе, синтезируемом в клетках с доксициклином, переходило в расщепленную форму F1. Такой вирус имел высокую инфекционность, которая не возрастала после обработки трипсином (см. табл. 1).

В вирусе Сендай, продуцируемом в клетках МDСК-НАТ при индукции протеазы НАТ, помимо F0 (м. м. 65 кД) и F1 (50 кД) выявлялся дополнительный фрагмент 38К c м. м. 38 кД ^м. рис. 1, б; дорожки 2, 4). Для доказательства того, что фрагмент 38К является продуктом белка F, проводили вестерн-блот-анализ с применением анти^-антител. Как видно на рис. 2, фрагмент 38К реагировал с анти^-антителами наряду с F0- и F1-белками,

Рис. 1. Белковый профиль вируса Сендай, выращенного в клеточных культурах. Культуру клеток МОСК-$$2 (а) и МБСК-НАТ (б) инкубировали в среде без (дорожки 1, 2) и с доксициклином (3, 4), заражали вирусом Сендай и через 20 ч после заражения собирали культуральную жидкость. Образцы культуральной жидкости делили на 2 части, одну из которых не обрабатывали (1, 3), а вторую обрабатывали трипсином (2, 4) и выделяли вирус. Белки вируса анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с последующей окраской геля Кумаси голубым R-350. Здесь и на рис. 3: справа показана дорожка с маркерами (М), м. м. указана справа в килодальтонах (кД).

что доказывало его происхождение из белка F0. Эти данные подтверждают наличие второго сайта расщепления в молекуле F1, чувствительного к протеазе НАТ.

Таблица 1

Инфекционная активность вируса Сендай при размножении в клеточных культурах МDСK

Культура клеток Обработка клеток доксициклином Инфекционность, ФОЕ/мл*

без обработки трипсином с предобработкой трипсином

MDCK-H - 1,6±0,3103 3,2±0,4-107

+ 2,1±0,3 107 3,3±0,6107

MDCK-НАТ - 1,4±0,3 103 4,3±0,6-106

+ 1,7±0,4 106 2,3±0,6-106

MDCK-SS2

1,4±0,3-102 1,5±0,4-106

4,3±0,6-105 2,3±0,6-106

Примечание. * - Культуры клеток почки собаки заражали вирусом Сендай с множественностью около 1 ФОЕ на клетку. Культуральную жидкость в клетках отбирали через 28 ч после заражения и определяли инфекционность вируса методом фокусов в культуре клеток МDСК-Н с предварительной обработкой трипсином и без нее, как описано в разделе «Материал и методы».

Таблица 2

инфекционная активность вируса Сендай при размножении в культуре раковых клеток

Культура Период ви- Инфекционность, ФОЕ/мл*

клеток русного сбора, ч после заражения без обработки трипсином с предобработкой трипсином

Сасо-2

Н1299

3-36 36-72 3-22 22-45

1,6±0,3105 2,1±0,3107 1,2±0,3 104 1,3±0,4 105

3,2±0,4-106 3,3±0,6-107 4,3±0,6-106 2,3±0,6-106

Примечание. * - Культуру клеток заражали вирусом Сен-дай с множественностью около 1 ФОЕ на клетку. Культуральную жидкость в клетках Сасо-2 и Н1299 отбирали через 22 и 36 ч после заражения соответственно, определяли инфекционность вируса методом фокусов в культуре клеток МDСК с предварительной обработкой трипсином и без нее, как описано в разделе «Материал и методы».

38К-фрагмент, как следует из рис. 1, б, и 2, выявлялся в составе вируса, указывая на сохранение его связи с молекулой F1 в вирусной частице.

При изучении размножения ВБН в клетках МDСК получены сходные данные (табл. 2). Без индукции доксициклином в клетках МDСК-SS2 и МДСК-НАТ синтезировался вирус с низкой инфекционностью, которая возрастала более чем в 100 раз после обработки трипсином. При размножении ВБН в культурах МDСК-SS2 и МDСК-НАТ в присутствии доксициклина синтезировался высокоинфекционный ВБН, который после обработки трипсином практически не увеличивал свою инфекционную активность.

В культуре опухолевых клеток Сасо-2 и Н1299 синтезировался высокоинфекционный вирус Сендай, содержащий белок F0 наряду с F1. При этом было установлено, что содержание F1 возрастало в вирусе на поздних сроках инфекции (20-42 ч после заражения) по сравнению с вирусом на ранних сроках инфекции (3-20 ч после заражения) (рис. 3). Это наблюдалось как в культуре клеток Н1299, так и в культуре Сасо-2 (не показано).

Рис. 2. Вестерн-блот-анализ белкового профиля вируса Сендай

с анти-Р-антителами. Вирус Сендай выращивали в культуре клеток MDCK-НАТ без индукции (дорожка 1) и с индукцией тетрациклином (3) синтеза протеазы НАТ. Вирус из культуральной жидкости подвергали электрофорезу и последующей идентификации белка Р методом ВБ с использованием специфических антител к белку Р. Дорожка 2 - вирус, продуцируемый в культуре без индукции тетрациклином и обработанный трипсином.

+

оригинальные исследования

Таблица 3

Инфекционная активность ВБН при размножении в культурах нормальных и раковых клеток

Культура клеток Культивирование клеток с доксициклином Инфекционность, ФОЕ/мл*

без обработки трипсином с предобработкой трипсином

MDCK-Н - 1,6±0,3103 3,2±0,4-107

MDCK-НАТ - 1,4±0,3 103 4,3±0,6-106

+ 1,7±0,4-106 2,3±0,6-106

Сасо-2 - 1,7±0,5 105 3,4±0,4-106

Н1299

1,5±0,2104

4,3±0,5 105

П р и м е ч а н и е. Культуры нормальных немалигнизированных (MDCK) и раковых (Н1299 и Сасо-2) клеток заражали ВБН (ЛаСота) с множественностью около 1 ФОЕ на клетку. Культуру клеток инкубировали с доксициклином и без него. Культуральную жидкость в клетках отбирали через 25 ч после заражения и определяли ин-фекционность вируса методом фокусов в культуре клеток MDCK-Н с предварительной обработкой трипсином и без нее, как описано в разделе «Материал и методы».

Параллельно с увеличением содержания F1 в вирусе на поздних сроках инфекции возрастала инфекционность такого вируса (табл. 3). Из этого следует, что инфекция парамиксовирусом Сендай опухолевых клеток приводила к индукции эндогенных протеаз, участвующих в расщеплении белка F0 ^ F1, и усилению инфекционности de novo синтезируемого вируса.

В следующей части изучали гибель клеток при инфекции вирусом Сендай и ВБН. При морфологическом исследовании с помощью светового микроскопа в культуре клеток MDCK-Н выявляли типичные признаки апоптоза в виде сморщенных клеток и характерных апоптозных фрагментов (апоптозных телец), напоминающих гроздья клеточных фрагментов (рис. 4; показаны стрелкой). В культуре клеток MDCK-НАТ и MDCK-SS2, инфицированных в присутствии тетрациклина, выявлялись сходные изменения с той разницей, что обнаруживались гигантские многоядерные клетки (рис. 5; показано

Рис. 3. Белковый профиль вируса Сендай, выращенного в культуре Н1299.

Культуру раковых клеток легкого человека Н1299 заражали вирусом Сендай и далее инкубировали в среде DМЕМ без сыворотки. Среду меняли через 20 и 40 ч после заражения, образцы культуральной жидкости, собранной через 20 ч (дорожки 1, 2) и 40 ч (3, 4) после заражения, делили на 2 части, одну из которых не обрабатывали (1, 3), а вторую обрабатывали трипсином (2, 4). Из культуральной жидкости выделяли вирус, и белки анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с последующей окраской геля Кумаси голубым R-350.

стрелкой), представляющие собой слившиеся соседние клетки (так называемые симпласты). Появление сим-пластов обусловлено протеолизом и активацией F0^•F1, который вызывал слияние плазматических мембран и объединение соседних клеток. Активирующий протео-лиз белка F0 - F1 + F2 происходил под действием индуцируемой протеазы НАТ или TMPRSS2. В отсутствие доксициклина образования клеточных симпластов в культурах, зараженных вирусом Сендай и ВБН, не обнаруживалось.

В культурах опухолевых клеток выявлялись вирусза-висимые вариации клеточной гибели при заражении вирусами. Во-первых, в культуре Сасо-2 значительно более быстрое и сильное цитодеструктивное действие развивалось при инфекции ВБН в сравнении с вирусом Сендай. Явные признаки гибели при заражении ВБН появлялись уже к 20 ч после заражения, тогда как при инфекции вирусом Сендай даже через 120 ч не обнаруживалось заметного цитопатического действия (ЦПД) в культуре инфицированных клеток и сохранялась продукция вируса (см. рис. 4). Во-вторых, оба вируса вызывали образование многоядерных симпластов в клеточной культуре Сасо-2, что коррелировало с расщеплением вирусного белка F0 ^ F1 в этой культуре (рис. 5, б). В-третьих, в зараженных клетках Сасо-2 не обнаруживалось формирование апоптозной ДНК-лестницы на поздних сроках инфекции как вирусом Сендай, так и ВБН, что указыва-

Рис. 4. Образование симпластов в культурах клеток Н1299 и Сасо-2 под действием вируса Сендай.

Культуру раковых клеток кишечника Сасо-2 (1, 2) и легкого Н1299 (3, 4) человека заражали вирусом Сендай и далее инкубировали в среде DМЕМ без сыворотки. Незараженные (1, 3) и зараженные через 25 ч (2; Сасо-2) и 48 ч (4; Н1299) клеточные культуры фотографировали в световом микроскопе в видимом свете при ув. 250.

НЗ СЕНДАЙ ВБН

Рис. 5. Цитодеструктивное действие вируса Сендай и ВБН в культурах немалигнизированных и раковых клеток. Культуры немалигнизированных (МБСК) и раковых (Н-1299 и Сасо-2) клеток заражали вирусом Сендай или ВБН с множественностью около 1 БОЕ на клетку. Через 27 ч после заражения клетки исследовали в световом микроскопе и фотографировали при ув. 250.

ло на некротический тип гибели клеток (рис. 6, дорожки 1-4). В-четвертых, при инфекции раковых клеток Н1299 вирусом Сендай и ВБН выявлялись явные отличия признаков гибели от наблюдаемых в культуре Сасо-2, поскольку обнаруживалась ступенчатая деградация хромосомной ДНК, указывающая на апоптозный механизм гибели опухолевых клеток под действием как вируса Сендай, так и ВБН (рис. 6; дорожки 6, 7). В-пятых, в отличие от клеток Сасо-2 интенсивность и скорость гибели клеток Н1299 были сходные при заражении вирусом Сендай и ВБН, при этом явные признаки апоптоза в обоих случаях развивалось уже к 20-му часу после заражения (рис. 5). Эти данные указывают на то, что механизм и интенсивность гибели клеток могут зависеть как от вируса, так и от типа опухолевых клеток.

Обсуждение

Известно, что для парамиксовирусов характерен феномен активации инфекционности вириона, реализуемый посредством точечного протеолитического расщепления поверхностного гликопротеида F0 (м. м. ~ 65 кД) на 2 фрагмента - F1 (50 кД) и F2 (15 кД). Такое расщепление происходит после остатка Арг в определенном участке (протеолитическом сайте) молекулы F0 после остатка

iWWwW*ww

Рис. 6. Профиль клеточной ДНК в клетках Сасо-2 и Н1299, инфицированных вирусом Сендай и ВБН. Культуру клеток Сасо-2 инфицировали вирусом Сендай (дорожки 2, 3) и ВБН (4) и инкубировали 45 ч (2, 4) и 98 (3) после заражения. Незара-женные клетки инкубировали параллельно (1). Клетки Н1299 заражали вирусом Сендай (8) и ВБН (9) и инкубировали в течение 45 ч после заражения. Дорожка 5 - незараженные клетки Н1299. Из клеток выделяли ДНК и фракционировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Дорожка 1 - маркерные ДНК с м. м. 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2,5, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 тыс. пар оснований соответственно (показано стрелками слева).

оригинальные исследования

Рис. 7. Схема двухступенчатого протеолиза белка F0 вируса Сендай.

Показана локализация доменов в белке F0 вируса Сендай. Стрелками указаны участки предполагаемого расщепления трипсиноподобной про-теазой НАТ. Серым цветом заштрихованы участки распознавания проте-азой в протеолитическом сайте F0 при расщеплении на субъединицы F1, F2 и F3, F4; снизу приведены последовательности аминокислот в сайте расщепления (протеолитическом сайте). Гидрофобные участки (так называемые фузионные пептиды) заштрихованы точками.

Арг [4-6]. Существуют 2 типа протеолитического сайта: с единичным остатком Арг (моноаргининовый сайт) и с двумя и более остатками Арг (полиаргининовый сайт) [6]. Для первой группы штаммов активирующими про-теазами служат протеазы трипсиновой специфичности, так называемые трипсиноподобные протеазы, тогда как для второй группы роль активирующих протеаз выполняют фурин, кексин, PEX6 и подобные протеазы [4-6].

Вирус Сендай и ВБН (штамм ЛаСота) имеют белок F0 с моноаргининовым сайтом разрезания. Расщепление такого участка может происходить под действием трипсина или протеаз со сходной специфичностью. В настоящей работе установлено, что трансмембранные протеазы НАТ и TMPRSS2 обладают способностью расщеплять белок F0 вируса Сендай и ВБН/ЛаСота и активировать его симпла-стообразующую функцию и инфекционность вирионов. Протеазы НАТ и TMPRSS2 относятся к классу сериновых трансмембранных протеаз типа I, расщепляющих белки-субстраты преимущественно по остатку Arg [18, 19]. Эти протеазы являются гликопротеидами, которые синтезируются в клетках на мембранах и транспортируются на клеточную поверхность, как и вирусный гликопротеид F0. В ходе совместного транспорта протеазы НАТ и TMPRSS2 претерпевают собственный точечный протеолиз для своей активации и после этого способны расщеплять F0 ^ Fl + F2 на этапе транспорта к плазматической мембране или на ее поверхности.

Важная особенность протеолиза F0 обнаружена в опухолевых клетках Н1299 и Сасо-2, которая заключалась в его заметном усилении в клетках на поздних сроках инфекции. Следует подчеркнуть, что протеолиз F0 и активация вируса Сендай и ВБН не развивались в не-малигнизированных (нормальных) клеточных линиях, таких как МDСК и CV1. Эти наблюдения говорят о том, что инфекция парамиксовирусами опухолевых клеткок приводит к индукции протеаз, способных расщеплять белок F0. В результате такой индукции клеточных про-теаз вирус стимулирует собственную активацию инфек-ционности и симпластообразования и способствует распространению вирусной инфекции в раковых клеточных культурах.

В настоящей работе обнаружено, что протеаза НАТ способна расщеплять белок F0 вируса Сендай не только в каноническом сайте, но и в дополнительном участке, что приводит к образованию нового фрагмента F3 с м. м. около 37К (м.м. 37 кД). Этот вывод подтверждается наблюдениями о сходном расщеплении F0 в клетках МDСК-НАТ при индукции протеазы НАТ, но не в клетках, экспрессирующих TMPRSS2. Рассмотрение первичной структуры гена F0 свидетельствует о том, что таким дополнительным протеолитическим сайтом может служить остаток R (А^)-412 или K (Lys)-414 в участке SQDRjSKjG, имеющем сходство с каноническим сайтом расщепления А^-185 в участке APQSRjF. Пока не ясно, имеет ли такое расщепление функциональное значение, например для усиления фузионной функции белка F за счет второго N-концевого пептида, возникающего в субъединице F3 и состоящего из гидрофобных аминокислот (рис. 7). В этом случае вирус Сендай может обладать двумя доменами слияния в субъединицах F1 и 37К (F3) и иметь повышенную способность к образованию клеточных симпластов в различных тканях, включая раковые ткани, характеризующиеся повышенным уровнем протеазы НАТ. Примечательно, что расщепление во втором сайте F1 ^ F3 + F4 наблюдалось в раковых клетках Сасо-2. Из этого вытекает предположение о том, что в этой линии опухолевых клеток экспрессируется протеа-за НАТ (или ее аналоги), вызывающая двухступенчатое расщепление белка F вируса Сендай, F0 ^ F1 + F2 и F1 ^ F3 + F4. Важно отметить, что протеолиз F0 и активация вируса Сендай не наблюдались в нетуморогенных (нормальных) клеточных линиях, таких как МDСК и CV1.

Результаты настоящей работы указывают на вариабельность механизмов клеточной гибели, индуцированной вирусом Сендай и ВБН (ЛаСота) в различных клеточных системах. Использованные вирусы Сендай и ВБН вызывали гибель нормальных (немалигнизирован-ных) клеток CV1 и МDСК с явными признаками апоп-тоза и ступенчатой деградацией хроматиновой ДНК (так называемой ДНК-лестницей). В раковых клетках Сасо-2 и Н1299 вирусное цитодеструктивное действие кардинально различалось. Во-первых, гибель одних раковых клеток, таких как Сасо-2, не имела характерного апоптозного профиля деградации хроматиновой ДНК, тогда как в других раковых клетках типа Н1299 гибель сопровождалась признаками апоптоза. Во-вторых, вирус Сендай и ВБН вызывали гибель раковых клеток с разной интенсивностью. ВБН вызывал быструю гибель клеточного монослоя, тогда как вирус Сендай вызывал быструю деструкцию клеток Н1299 и слабое цитопати-ческое действие без видимой гибели клеточного монослоя в культуре Сасо-2. Эти данные говорят о том, что механизмы, лежащие в основе вирусиндуцированной гибели раковых клеток, имеют двоякую реципрокную зависимость как от типа опухолевых повреждений клеточного метаболизма, так и от вирусных факторов, воздействующих на биохимические пути апоптоза в клетках. Этот вывод имеет важное значение для стратегии выбора вирусного штамма в онколитическом лечении различных типов опухолей.

Интересно, что раковые клетки характеризуются повреждением биохимических путей, участвующих в регуляции пролиферации и гибели клеток (апоптоза), таких как система интерферона, дефекты факторов транскрипции р53, NFkB и т. п. [20-25]. При заражении различными

цитолитическими вирусами в раковых культурах будет формироваться специфическое соотношение вирусных факторов и клеточного метаболизма, характерного для типа опухоли, которое будет порождать особый фенотип гибели клеток. Из этого следует, что для уничтожения определенного вида опухоли необходим селективный вирус-онколитик, который способен преодолевать онко-генный дефект раковых клеток и вызывать их апоптоз или некроз. В настоящей работе показано, что раковые клетки Н1299 обладают высокой чувствительностью к гибели, вызванной как ВБН, так и вирусом Сендай. Напротив, линия клеток из опухоли кишечника человека Сасо-2 имела высокую резистентность к вирусам Сен-дай и гриппа [26], и только ВБН вызывал быструю деструкцию и гибель клеток данного типа. Дальнейшее изучение и понимание механизмов вирусного поражения опухолей позволят выработать принципы такого выбора вирусов-онколитиков и создать их банк.

Благодарность. Автор благодарит E. Bottcher-Friebertshauser и ргоГ H.D. KLenk из Института вирусологии Университета Филиппа г. Марбурга (Германия) за предоставление культур клеток MDCK, экспрессирую-щих протеазы HAT и TMPRSS2, а также проф. П.М. Чумакова из Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и ргоГ S. Ludwig из Института молекулярной вирусологии Университета г. Мюнстера (Германия) за полезное и конструктивное обсуждение темы исследований.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты 17-04-01726, 17-04-01934). Исследования апоптоза малигнизированных клеток проведены при поддержке совместного проекта Российского научного фонда и немецкого фонда DFG № 18-4404028. Исследования репродукции парамиксовирусов проведены в рамках гранта РНФ № 14-15-01073.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

16. Жирнов О.П., Букринская А.Г. Изучение белков вируса Сендай: протеолитическая активность в составе вирусных частиц. Вопросы вирусологии. 1977; (5): 571-8.

REFERENCES

1. Lamb R.A., Parks G.D. Paramyxoviridae: their viruses and their replication. In: Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M., eds. Fields Virology. 5th ed. Philadelphia, USA: Wolters Kluwer and Lippincot Williams and Willkins; 2007.

2. Huang Z., Krishnamurthy S., Panda A., Samal S.K. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist. J. Virol. 2003; 77 (16): 8676-85.

3. Park M.S., Garcia-Sastre A., Cros J.F., Basler C.F., Palese P. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 2003; 77 (17): 9522-32.

4. de Leeuw O.S., Koch G., Hartog L., Ravenshorst N., Peeters B.P. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin-neuraminidase protein. J. Gen. Virol. 2005; 86 (Pt. 6): 1759-69.

5. Morrison T.G. Structure and function of a paramyxovirus fusion protein. Biochim. Biophys. Acta. 2003; 1614 (1): 73-84.

6. Nagai Y., Inocencio N.M., Gotoh B. Paramyxovirus tropism dependent on host proteases activating the viral fusion glycoprotein. Behring. Inst. Mitt. 1991; (89): 35-45.

7. Tayeb S., Zakay-Rones Z., Panet A. Therapeutic potential of oncolytic Newcastle disease virus a critical review. Oncolytic. Virother. 2015; 4: 49-62.

8. Matveeva O.V., Guo Z.S., Senin V.M., Senina A.V., Shabalina S..A, Chumakov P.M. Oncolysis by paramyxoviruses: preclinical and clinical studies. Mol. Ther. Oncolytics. 2015; 2.

9. Ring C.J. Cytolytic viruses as potential anti-cancer agents. J. Gen. Virol. 2002; 83 (Pt. 3): 491-502.

10. Cuadrado-Castano S., Sanchez-Aparicio M.T., García-Sastre A., Villar E. Thetherapeutic effect of death: Newcastle disease virus and its antitumor potential. Virus. Res. 2015; 209: 56-66.

11. Zhirnov O.P., Vorobjeva I.V., Saphonova O.A., Poyarkov S.V., Ovcharen-ko A.V., Anhlan D. et al. Structural and evolutionary characteristics of HA, NA, NS and M genes of clinical influenza A/H3N2 viruses passaged in human and canine cells. J. Clin. Virol. 2009; 45 (4): 322-33.

12. Bottcher-Friebertshauser E., Lu Y., Meyer D., Sielaff F., Steinmetzer T., Klenk H.D. et al. Hemagglutinin activating host cell proteases provide promising drug targets for the treatment of influenza A and B virus infections. Vaccine. 2012; 30 (51): 7374-80.

13. Zhirnov O.P., Matrosovich T.Y., Matrosovich M.N., Klenk H.D. Aprotinin, a protease inhibitor, suppresses proteolytic activation of pandemic H1N1v influenza virus. Antivir. Chem. Chemother. 2011; 21 (4): 169-74.

14. Zhirnov O.P., Konakova T.E., Wolff T., Klenk H.D. NS1 protein of influenza A virus down-regulates apoptosis. J. Virol. 2002; 76 (4): 1617-25.

15. Zhirnov O. P., Ikizler M. R., Wright P. Cleavage of influenza A virus hemagglutinin in human respiratory epithelium is cell-associated and sensitive to exogenous antiproteases. J. Virol. 2002; 76 (17): 8682-9.

16. Zhirnov O.P., Bukrinskaya A.G. Study on Sendai virus proteins: proteolytic activity within virus particles. Voprosy virusologii. 1977;

17. Zhirnov O.P., Ovcharenko A.G., Bukrinskaya A.G. Myxovirus replication in chicken embryos can be suppressed by aprotinin due to the blockage of viral glycoprotein cleavage. J. Gen. Virol. 1985; 66 (Pt. 7): 1633-8.

18. Szabo R., Bugge T.H. Membrane-anchored serine proteases in vertebrate cell and developmental biology. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2011; 27: 213-35.

19. Murray A.S., Varela F.A., List K. Type II transmembrane serine proteases as potential targets for cancer therapy. Biol. Chem. 2016; 397 (9): 815-26.

20. Naik S., Russell S.J. Engineering oncolytic viruses to exploit tumor specific defects in innate immune signaling pathways. Expert. Opin. Biol. Ther. 2009; 9 (9): 1163-76.

21. Linge C., Gewert D., Rossmann C., Bishop J.A., Crowe J.S. Interferon system defects in human malignant melanoma. Cancer Res. 1995; 55 (18): 4099-104.

22. Abd-Elrahman I., Hershko K., Neuman T., Nachmias B., Perlman R., Ben-Yehuda D. The inhibitor of apoptosis protein Livin (ML-IAP) plays a dual role in tumorigenicity. Cancer Res. 2009; 69 (13): 5475-80.

23. Gurpinar E., Vousden K.H. Hitting cancers' weak spots: vulnerabilities imposed by p53 mutation. Trends Cell. Biol. 2015; 25 (8): 486-95.

24. Goldar S., Khaniani M.S., Derakhshan S.M., Baradaran B. Molecular mechanisms of apoptosis and roles in cancer development and treatment. Asian. Pac. J. CancerPrev. 2015; 16 (6): 2129-44.

25. Xu D.W., Zhang G.Q., Wang Z.W., Xu X.Y., Liu T.X. Autophagy in tumorigenesis and cancer treatment. Asian. Pac. J. Cancer Prev. 2015; 16 (6): 2167-75.

26. Zhirnov O.P., Klenk H.D. Human influenza viruses are proteolyti-cally activated and do not induce apoptosis in CACO-2 cells. Virology. 2003; 313 (1): 198-212.

Поступила 07.07.16 Принята в печать 11.10.16