АНАЛИЗ ПРОФИЛЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ

1. Способ анализа в режиме реального времени профиля гликозилирования получаемого рекомбинантным образом гликозилированного полипептида в процессе культивирования, включающий следующие стадии:
(A) получение образца из культуральной среды при культивировании эукариотической клетки, вырабатывающей упомянутый гликозилированный гетерологичный полипептид,
(Б) введение образца в контакт с магнитными аффинными гранулами в условиях, подходящих для связывания гетерологичного полипептида с таковыми гранулами,
(B) высвобождение гликанов из гетерологичного полипептида, связанного с таковыми магнитными аффинными гранулами, без высвобождения самого гетерологичного полипептида из таковых магнитных аффинных гранул,
(Г) очистку высвобожденных гликанов со стадии (В) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии,
(Д) определение профиля гликозилирования гетерологичного полипептида посредством анализа очищенных гликанов со стадии (Г) с помощью масс-спектрометрии матрично-активированной лазерной десорбции и ионизации с времяпролетным масс-анализом.
2. Способ рекомбинантного получения гликозилированного гетерологичного полипептида, включающий следующие стадии:
(A) получение клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый гетерологичный полипептид,
(Б) культивирование клетки со стадии (А) в условиях, подходящих для экспрессии упомянутого гетерологичного полипептида,
(B) получение образца из культуральной среды упомянутой клетки,
(Г) введение образца в контакт с магнитными аффинными гранулами в условиях, подходящих для связывания гетерологичного полипептида с магнитными аффинными гранулами,
(Д) высвобождение гликанов из упомянутого гетерологичного полипептида, связанного с упомянутыми магнитными аффинными гранулами, без высвобождения самого упомянутого гетерологичного полипептида,
(Е) очистку упомянутых высвобожденных гликанов со стадии (Д),
(Ж) определение профиля гликозилирования гетерологичного полипептида,
(З) сравнение найденного профиля гликозилирования со стандартным профилем гликозилирования,
(И) изменение условий культивирования в соответствии с полученным на стадии (З) результатом, необязательно при продолжении культивирования с осуществлением стадии (К), или остановку культивирования и получение упомянутого гликозилированного гетерологичного полипептида, а также
(К) повтор стадий (В)-(З) с целью получения гликозилированного гетерологичного полипептида.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутый гликозилированный гетерологичный полипептид является иммуноглобулином.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что упомянутые магнитные аффинные гранулы являются магнитными аффинными гранулами со связанным с ними А-, G- или L-белком.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутое высвобождение гликанов является ферментативным высвобождением под действием N-гликозидазы.
6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутое высвобождение гликанов является химическим высвобождением посредством гидразинолиза.
7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутая очистка высвобождаемых гликанов осуществляется посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением смолы для обращено-фазовой хроматографии и/или катионообменной хроматографической смолы.
8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутое определение профиля гликозилирования гетерологичного полипептида осуществляют посредством анализа методом масс-спектрометрии матрично-активированной лазерной десорбции и ионизации с времяпролетным масс-анализом или посредством количественного разделения высвобожденных и очищенных гликанов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
9. Способ по п.2, отличающийся тем, стадии (Г)-(Ж) осуществляют в высокопроизводительном формате с использованием планшетов для микротитрования.
10. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутое изменение условий культивирования включает одно или несколько изменений в
(1) концентрации питательных веществ, углеводов, добавок, буфера, аммония, растворенного кислорода, и/или
(2) осмолярности, величины рН, температуры или плотности клеток, и/или
(3) состояние роста.
11. Способ по п.2, отличающийся тем, что он включает дополнительную стадию (Л):
(Л) выделение гликозилированного гетерологичного полипептида из культуральной среды или клеток.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что он включает после стадии (Л) дополнительную стадию (М):
(М) очистка упомянутого гетерологичного полипептида.
13. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутая стадия (Д) представляет собой:
(Д) высвобождение гликанов из гетерологичного полипептида и выделение высвобожденных гликанов без высвобождения гетерологичного полипептида из магнитных аффинных гранул посредством удаления магнитных аффинных гранул со связанным гетерологичным иммуноглобулином из образцом.
14. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутая стадия (Е) представляет собой:
(Е) очистку высвобожденных на стадии (Д) гликанов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на катионообменной смоле или с обращенной фазой.
15. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутая клетка является клеткой СНО, или клеткой ВНК, или клеткой НЕК.
16. Способ по п.2, отличающийся тем, что питательные вещества непрерывно добавляют в продолжение всего процесса культивирования клеток в зависимости от определенного профиля гликозилирования.
17. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутые культуральная среда и раствор питательного вещества не содержат сывороточных компонентов животного происхождения.
18. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутое культивирование является суспензионным культивированием.
6
6
19. Способ по п.2, отличающийся тем, что концентрация клеток после фазы роста составляет более 1·10 клеток на миллилитр или более 5·10 клеток на миллилитр, или же клетки характеризуются сухой массой клеток более 100 г/л или более 200 г/л.
20. Способ по п.2, отличающийся тем, что общая концентрация всех Сахаров в процессе культивирования составляет от 0,1 г/л до 10 г/л.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что общая концентрация всех Сахаров в культуральной среде составляет от 2 г/л до 6 г/л.
22. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутый гликозилированный гетерологичный полипептид составляет более 75% по массе от упомянутого связанного полипептида на стадии (Б) или (Г) соответственно.
23. Способ по п.2, отличающийся тем, что стадия (Д) дополнительно включает введение упомянутых высвобожденных гликанов в контакт с ферментом, вызывающим деградацию гликанов.
24. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутая стадия дегликозилирования (Д) включает денатурацию и/или разворачивание гликозилированного гетерологичного полипептида перед расщеплением гликана.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что упомянутый гликозилированный гетерологичный полипептид восстанавливают после денатурации.
26. Способ количественной характеристики маркера гликозилирования, экспрессируемого клеткой млекопитающего, включающий следующие стадии:
(A) введение содержащего гликозилированный полипептид образца, полученного из клеток млекопитающего, надосадочных жидкостей клеточных культур, клеточных лизатов или проб в контакт с магнитными аффинными гранулами,
(Б) ферментативное высвобождение гликанов из аффинно связанного гликозилированного полипептида под действием N-гликозидазы без высвобождения гликозилированного полипептида,
(B) очистку высвобожденных гликанов с помощью ВЭЖХ и/или катионообменной хроматографии,
(Д) определение количества маркера гликозилирования с помощью ЖХ-МС, МАЛДИ-ВП или количественной ВЭЖХ,
(Е) количественную характеристику маркера гликозилирования посредством сравнения найденного профиля гликозилирования со стандартным профилем.