ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus pumilus А 1.5, В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Bacillus pumilus A 1.5 BACTERIA STRAIN AS AGENT FOR INCREASING PLANT PRODUCTIVITY AND PLANT PROTECTION FROM DISEASES CAUSED BY PHYTOPATHOGENIC MICROORGANISMS

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма эндофитных бактерий p.Bacillus в качестве средства для повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.
Современное высокоэффективное сельскохозяйственное производство невозможно без применения удобрений и средств защиты растений. Так, широкое использование минеральных удобрений, в первую очередь азотных, позволило за последние 50 лет более чем в 5 раз поднять урожайность основных сельскохозяйственных культур в развитых странах. Однако процесс получения и применения минеральных азотных удобрений является наиболее энергоемким - на него расходуется до от 30 до 50% всей энергии, потребляемой в сельскохозяйственном производстве.
В настоящее время известно множество микробиологических препаратов для сельского хозяйства различного назначения: ростостимулирующих, а также подавляющих развитие фитопатогенных бактерий и грибов.
Микроорганизмы могут стимулировать их рост (Azospirillum), связывать азот (Rhizobium), предотвращать заболевания растений (Pseudomonas или Bacillus), или же уничтожать насекомых (Streptomyces).
Известен «Способ обработки семян», описанный в заявке №2170987 Великобритании с приоритетом от 14.02.85 г., МКИ 4 A01C 1/06, опубликованный в ИСМ №10 за 1987 г. Указанный способ предусматривает обработку семян составом, состоящим из микроорганизмов, носителя, например отрубей, и клея, такого как смола гатти. Наиболее благоприятные результаты получаются при обработке семян пшеницы.
6
9
Известен также «Способ защиты капусты от бактериальных болезней» по патенту №1793878 с приоритетом от 10.12.90 г., опубликованному 07.02.93 г. в БИ РФ №5. По названному способу для защиты капусты от бактериозов семена капусты после гидротермической обработки обрабатывают суспензией штамма бактерий «Pseudomonas sp. ВКПМ В-3481» в концентрации 10-10 клеток/мл из расчета 20 мл на 1 кг семян. Применение бактериальной суспензии «Pseudomonas sp. ВКПМ В-3481» снижает развитие сосудистого и слизистого бактериозов и увеличивает урожайность капусты.
Также известен «Способ получения субстрата для выращивания растений» по патенту РФ №1829892 с приоритетом 20.04.90 г. авторов Васюченка И.К., Перебитюка А.Н., Пигулевского B.C., Березко М.Н. и Пучко В.Н.
Изобретение относится к способам получения субстратов для выращивания рассады и овощных культур с использованием биомассы бактерий рода Pseudomonas - ингибиторов развития фитопатогенных микроорганизмов. По данному способу получают субстрат путем внесения в торф известковых, минеральных и бактериальных удобрений с последующим перемешиванием компонентов, а в качестве бактериального удобрения используют биомассу штамма бактерий Pseudomonas putida fluorescens ЦМПМ В-3481.
Известен также «Способ получения биоудобрений» по патенту РФ №2130005 с приоритетом от 06.04.1996 г. авторов Райманова И.Т., Алимовой Ф.К., Ожигановой Г.У., Хабибуллина Р.Э., Крыловой Н.И., Фаттаховой А.Н.
8
9
Способ заключается в том, что штамм или сообщество микроорганизмов стерильно культивируют на питательной среде до достижения титра бактериальной массы 10-10 кл/мл. Полученную биомассу отделяют от среды, концентрируют. Концентрированную биомассу наносят на высушенный гранулированный куриный помет. Иммобилизованную таким образом биомассу высушивают. Данный способ обеспечивает повышение выживаемости микроорганизмов и повышение биологической активности почвы.
Известно также «Бактериальное удобрение «НИКА» и способ получения бактериальных удобрений» по заявке №99100664 с приоритетом от 21.01.99 г. авторов Виноградова Е.Я., Виноградова А.Е.
Гранулированное бактериальное удобрение содержит культуру бактериального штамма Bacillus mucilaginosus (ВКМБ 1451D), сорбент и остатки культуральной жидкости с метаболитами, при определенном соотношении ингредиентов. При этом в качестве сорбента это удобрение может содержать измельченную растительную массу, торф, вермикулит. В частном случае культивирование проводят при использовании в качестве питательного субстрата водного экстракта птичьего помета с добавлением мелассы. Способ получения бактериальных удобрений на основе Bacillus mucilaginosus включает в себя культивирование указанного штамма на жидких питательных средах-гидролизатах отходов промышленности и сельского хозяйства, после чего полученный продукт смешивают с сорбентом и гранулируют.
Известна группа изобретений «Способ предпосевной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур» по патенту РФ №2140138 с приоритетом от 13.11.98 г., авторов Чеботаря В.К., Быковой Н.В., Темновой О.В., Орловой Н.А. и Хотяновича А.В.
Указанные способы осуществляются с помощью биофунгицидного препарата, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 (депонирован под рег. номером ВНИИСХМ Д-606 в группе эпифитных микроорганизмов). Способ получения биофунгицидного препарата заключается в смешивании культуральной жидкости, содержащей штамм B.s. Ч-13, который предварительно культивируют в жидкой стерильной питательной среде, с эмульсией ПВА, водным разбавителем и стерильным мелом или доломитом в определенных пропорциях. Изобретения позволяют повысить эффективность защиты овощных культур от фитопатогенных грибов путем предпосевной обработки семян.
Известно изобретение «Способ получения биоудобрений» по патенту РФ №2241692 с приоритетом от 11.10.2002 г. авторов Чеботаря В.К., Козакова А.Е., Ерофеева С.В.
Этот способ заключается в совмещении гранулированных минеральных удобрений с микробной биомассой в виде бактериального препарата на основе штамма «Bacillus subtilis Ч-13», обладающего антагонистическими свойствами к фитопатогенам и ростостимулирующим действием. Совмещение производят путем нанесения на поверхность гранул минеральных удобрений бактериального препарата в виде сухого порошка (опудривания), либо в виде жидкой мелкодисперсной фракции (опрыскивания), либо в виде жидкой фракции в составе влагозащитных композиций минеральных удобрений. Указанный способ обеспечивает повышение эффективности защиты растений от инфекционных болезней, проникающих вместе с минеральными удобрениями.
Известно изобретение «Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней» по патенту РФ №2099947 с приоритетом от 15.11.1996 г. на имя Института Микробиологии и вирусологии НАН Украины (UA) и НПО «Башкирское» (RU), МПК A01N 63/00; C12N 1/20; C12R 1:125, публикация 27.12.1997 г.
9
10
Основу биопрепарата «Фитоспорин» составляет штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 с концентрацией клеток 10-10 на 1 мл физраствора в количестве 92-98 об.% и наполнитель в количестве 2-8 об.%. При этом штамм Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, что позволяет использовать его для защиты различных видов сельскохозяйственных, декоративных, древесных растений.
Эндофитными называются бактерии, которые способны колонизировать внутренние ткани растения, не вызывая при этом его заболевания и не оказывая отрицательный эффект на его развитие.
Бактериальные эндофиты колонизируют те же экологические ниши в растениях, что и фитопатогенные микроорганизмы, поэтому являются перспективным биоконтрольным агентом для борьбы с фитопатогенами.
Находясь в эндосфере, эндофиты имеют существенное преимущество перед организмами, обитающими в ризосфере и филлосфере за счет стабильного pH, влажности, потока питательных веществ и отсутствия конкуренции со стороны большого числа других микроорганизмов. Энергия, затраченная растением на производство биомассы эндофитных бактерий, адекватно компенсируется за счет улучшения развития и физиологического состояния растения-хозяина.
Эндофитные бактерии способны уменьшать или предотвращать отрицательное воздействие фитопатогенных микроорганизмов на растения, т.е. являются весьма перспективными для разработки микробиологических экологически безопасных приемов борьбы с заболеваниями растений.
Проведенные исследования по изучению ростстимулирующей активности эндофитных бактерий показали, что они отличаются от биоконтрольных штаммов ризосферных бактерий, т.к. не только ингибируют рост фитопатогенных микроорганизмов, но и стимулируют развитие растений за счет улучшения минерального питания, в т.ч. фосфорного питания растений, продуцируют ИУК и сидерофоры. Было показано, что эндофитные бактерии способны продуцировать витамины, необходимые для растений. Кроме того, было обнаружено, что эндофитные бактерии обладают целым рядом дополнительных свойств, необходимых для улучшения развития растений, таких как: регуляция осмотического давления, регуляция работы устьиц, модификация развития корневой системы растений, регуляция азотного питания растения.
Штаммы эндофитных бактерий могут быть использованы непосредственно для инокуляции семян или саженцев, уменьшая таким образом влияние биотических и абиотических факторов на растение за счет активной колонизации внутренних тканей растений и последующего позитивного биохимического и физиологического воздействия на растение.
Таким образом, использование взаимодействий эндофит-растение способно обеспечить увеличение урожая сельскохозяйственных культур, способствовать фиторемедиации почв, ингибировать развитие патогенов, фиксировать азот атмосферы и производить биологически активные вещества.
Из статьи «Выявление взаимодействия токсигенных грибов и эндофитных бактерий в зерне пшеницы для создания способов борьбы с токсигенными инфекциями и получения высококачественных продуктов питания (09-04-13782)» авторов В.К. Чеботарь, А.В. Щербаков, М.А. Фадеева, Н.В. Мальфанова, С.В. Ерофеев, Е.П. Чижевская, Т.Ю. Гагкаева, О.П. Гаврилова, А.С Филипас, A.M. Бондаренко, А.Л. Тарасов, опубликованных в сборнике Материалы Всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России», 14-15 апреля 2010 г., М., 2010 г., стр.35-39, известен штамм эндофитных бактерий Bacillus subtilis 8A, который выбран в качестве прототипа.
Штамм депонирован в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 14.11.2011 г. под номером RCAM 00876 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов (копия справки о депонировании прилагается). Указанный штамм обладает высокой фунгицидной и бактерицидной активностью. Установлена также высокая ростостимулирующая активность штамма Bacillus subtilis 8A и биопрепарата на его основе, что приводит к повышению урожайности растений. Опытным путем подтверждено, что эффективность штамма обусловлена способностью его бактерий создавать с растениями микробно-растительную систему путем колонизирования ризосферы и корневой системы растений.
Для разработки препаратов на основе эндофитных бактерий необходимы, в частности, выявление и отбор наиболее устойчивых и эффективных штаммов эндофитных микроорганизмов, оптимизация режимов их культивирования и способов получения биопрепаратов на их основе.
Задачей изобретения является выявление штамма эндофитных бактерий, пригодного для использования в сельском хозяйстве в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов, позволяющего расширить арсенал подобных средств.
Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней в сельском хозяйстве используется штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus A1.5, позволяющий расширить арсенал подобных средств.
Штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus A1.5 был выделен из зерна озимой пшеницы сорта «Есаул» (Ставропольский край) и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии вГНУВНИИСХМ 06.05.2013 г. под регистрационным номером RCAM 02057 (справка о депонировании прилагается).
Штамм A1.5 характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.
Клетки имеют форму мелких прямых палочек размерами (1,5-2) мкм в длину, подвижные, с монополярным и перитрихиальным расположением жгутиков. Штамм образует споры, расположенные в центре клеток, положительно окрашивается по Граму.
Среда культивирования: питательный агар (готовая питательная среда производства ООО «Биокомпас-С», ТУ 10-02-02-789-176-94). На питательном агаре образует кожистые колонии 10-15 мм в диаметре ярко-оранжевого цвета, пастообразной консистенции с неровными изрезанными ризоидными краями и плоским профилем, матовая консистенция в центре переходит в блестящую к краю колонии. Оптимальная температура для роста 32°C. При температуре более 45°C и менее 15°C рост замедленный. Оптимальное значение pH среды 7,1, рост происходит также при pH от 4,5 до 8,0.
В качестве единственного источника углерода штамм использует декстрин, мальтозу, целлобиозу, сахарозу, туранозу, стахиозу, раффинозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, галактозу, манитол, глицерол, пектин. Использует минеральные формы азота - соли аммония и нитраты, аминокислоты и белки.
Штамм не гидролизует желатин; утилизирует аминокислоты: L-аланин, L-аргинин, L-аспартам, L-глутамин, L-серин; органические кислоты: лимонную, яблочную, γ-аминомасляную, α-кетомасляную, ацетоуксусную, уксусную. Штамм обладает каталазной и оксидазной активностью, ацетоина и индола не образует. Штамм способен расти при 8% NaCl и 45°C.
6
Штамм Bacillus subtilis A1.5 был проверен на способность подавлять развитие фитопатогенных и токсигенных грибов из рода Fusarium (F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides). Определение фунгицидной активности проводилось методом «колодцев» на картофельно-декстрозном агаре (Difco). Суспензии конидий (5 мл концентрацией 1×10 конидий/мл) штаммов фитопатогенных грибов были добавлены к 250 мл теплого картофельно-декстрозного агара. После перемешивания среда была разлита в чашки Петри. После застывания в каждой чашке пробочным сверлом были проделаны 8 мм колодцы (по 4 на одну чашку). Тестируемые бактериальные штаммы выращивали стационарно на мясопептонном бульоне в течение 5 суток при 28°C. Затем 100 мкл бактериальной суспензии были инокулированы в приготовленные колодцы в трехкратной повторности. Антифунгальную активность штаммов определяли как зону ингибирования роста фитопатогенных грибов вокруг колодцев через 3-5дней инкубирования в чашках при 28°C.
В таблице 1 представлены сравнительные результаты по антагонистической активности двух штаммов эндофитных бактерий: прототипа - Bacillus subtilis 8A и заявляемого штамма Bacillus pumilus A1.5, по отношению к фитопатогенным бактериям.
Таблица 1
Антагонистическая активность штаммов бактерий - эндофитов по отношению к фитопатогенным бактериям
Штамм эндофитных бактерий
Зона ингибирования роста, мм
Pseudomonas syringiae (штамм 213)
Pseudomonas syringiae (штамм 8511)
Erwinia carotovora var. atroseptica (штамм 822)
Clavibacter michiganense subs sepedonicus (штамм 6028)
Bacillus subtilis 8A (прототип)
20,0±1,5
21,7±1,1
25,5±1,5
23,5±1,9
Bacillus pumilus A1.5 (заявленный)
24,3±1,2
22,1±1,3
33,1±1,6
36,0±2,1
Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus A1.5 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям по сравнению с прототипом - штаммом Bacillus subtilis 8A.
Также была проанализирована бактерицидная активность штамма Bacillus subtilis A1.5 по отношению к различным штаммам фитопатогенных бактерий (Erwinia carotovora var. atroceptica 822, Pseudomonas syringae pv. tomato, Pseudomonas syringae 8511, Clavibacter michiganensis pv. sepedonicum 6028). Антагонистическую активность эндофитных бактерий анализировали согласно методу «агаровых блочков». Для чего тестируемые бактерии-антагонисты сначала выращивали в течение 4-х суток при 28°C на твердом питательном агаре. После инкубации стерильным пробочным сверлом в агаре вырезали блочки диаметром 8 мм. Тест-культуры фитопатогенных бактерий высевали сплошным газоном на агаризованый 2% картофельный агар, после чего на картофельный агар сразу выкладывали блочки с бактериями-антагонистами. После этого чашки Петри инкубировали 24 ч при 28°C и судили о степени бактерицидной активности штаммов эндофитных бактерий по диаметру зон ингибирования роста фитопатогенных бактерий вокруг агаровых блочков.
В таблице 2 представлены сравнительные результаты по антагонистической активности двух штаммов эндофитных бактерий: прототипа - Bacillus subtilis 8A и заявляемого штамма Bacillus pumilus A1.5, по отношению к фитопатогенным грибам.
Таблица 2
Антагонистическая активность штаммов бактерий - эндофитов по отношению к фитопатогенным грибам
Штамм эндофитных бактерий
Зона ингибирования роста, мм
Fusarium culmorum
Fusarium graminearum
Fusarium sporotrichioides
Rhizoctonia solani
Bacillus subtilis 8A (прототип)
16,5±1,0
17,3±1,0
21,7±1,0
29,5±1,9
Bacillus pumilus A1.5 (заявленный)
17,5±1,0
18,5±1,0
22,0±1,0
82,0±1,7
Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus A1.5 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8A.
Экспериментально установлено, что штамм Bacillus pumilus A1.5 обладает фунгицидной активностью против фитопатогенных бактерий Clavibactet michiganens ss. sepedonicum, Erwinia carotovora ss. atroseptica, Pseudomonas syringae, фитопатогенных грибов Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichioides, Rhizoctonia solani и фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам (например, яровая и озимая пшеница, лен, подсолнечник).
Анализ ростстимулирующей активности штаммов эндофитных бактерий проводили по оригинальной методике с использованием растений редиса сорта «Дуро» и пшеницы сорта «Веда».
7
Для этого семена сначала стерилизовали в течение 2-х минут в 70% этаноле и отмывали в стерильной водопроводной воде. Затем семена замачивали на 30 мин в суспензии бактерий с титром клеток 10 КОЕ/мл и раскладывали в стерильные влажные камеры по 20 шт. в 3-х кратной повторности. Контрольные семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Далее растения инкубировали в фитотроне 72 ч при t=28°C. После инкубирования измеряли длину корешков и побегов, а ростстимулирующую активность тестируемых штаммов эндофитных бактерий рассчитывали по отношению к контрольным проросткам. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Ростостимулирующая активность бактерий - эндофитов в отношении проростков редиса
Вариант опыта
Средняя длина корня, мм
Средняя длина зеленой части ростка, мм
Контроль (без обработки)
10,4±1,5
17,3±1,1
Обработка Bacillus subtilis 8A (прототип)
13,5±1,3
22,5±2,0
Обработка Bacillus pumilus A1.5 (заявленный)
21,3±1,9
25,7±2,1
Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus A1.5 обладает более сильной ростостимулирующей активностью на проростках редиса по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8A.
Таблица 4
Ростостимулирующая активность бактерий - эндофитов в отношении проростков пшеницы
Вариант опыта
Средняя длина корня, мм
Средняя длина зеленой части ростка, мм
Контроль (без обработки)
8,1±0,7
11,5±1,0
Обработка Bacillus subtilis 8A (прототип)
12,1±1,0
14,3±1,4
Обработка Bacillus pumilus A1.5 (заявленный)
15,9±1,3
17,5±1,5
Из данных, приведенных в таблице 4, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus pumilus A1.5 обладает более сильной ростостимулирующей активностью на проростках пшеницы по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8A.
Высокая ростостимулирующая активность штаммов эндофитных бактерий (заявленного - Bacillus pumilus A1.5 и прототипа - Bacillus subtilis 8A) вызвана способностью создавать с растением микробно-растительную систему путем активной колонизации бактериями корневой системы и внутренних тканей (эндосферы) растения, что было подтверждено опытным путем.
Для исследования степени приживаемости эндофитных бактерий на корнях и внутренних тканях растений использовали озимую мягкую пшеницу сорта «Веда» и редис сорта «Дуро».
4
2
Бактерии Bacillus subtilis 8A и Bacillus pumilus A1.5 выращивали на среде LC (г/л) - триптон 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 8,0; MgSO·7HO - 2,5; агар - 18,1 мл 1М Tris буфера.
3
3
2
4
2
4
Колонизацию корней редиса и пшеницы бактериями изучали в гнотобиотических системах (Simon et. al. 1996), содержащих стерильный кварцевый песок с добавлением 15% питательного раствора (PNS) следующего состава (на 1 л): 5mM KNO, 5mM Ca(NO), 2mM MgSO, 1mM KHPO.
2
Семена пшеницы стерилизовали 30 сек 70% раствором этилового спирта, затем 6 мин - 0,1% сулемы (HgCl).
Семена редиса стерилизовали 30 сек 70% раствором этилового спирта, затем 5 мин - 3% раствором гипохлорита (HClO).
После стерилизации все семена тщательно отмывали стерильной водой, меняя воду 5-6 раз и 30 минут на качалке.
Затем семена раскладывали в стерильные чашки Петри на увлажненные фильтровальные бумажки (5 мл на чашку) и проращивали при температуре 28°C в течение суток.
5
Для инокуляции использовали ночную (20 часовую) культуру микроорганизмов, выращенную на качалке на жидкой среде LC при температуре 28°C. Клетки бактерий отделяли от ростовой среды центрифугированием и отмывали 0,85% раствором NaCl. Для инокуляции стерильные проростки редиса и пшеницы замачивали в течение 30 мин в суспензии с титром бактериальных клеток 10 КОЕ/мл.
Инокулированные проростки растений высаживали в кварцевый песок (на глубину 5-6 мм) в гнотобиотические системы по 1 растению на каждую систему. Повторность опыта - шестикратная.
Растения пшеницы и редиса выращивали в фитотроне при 21°C в течение 5 суток, после чего их извлекали из системы и определяли приживаемость бактерий путем измерения их количества в ризосфере и на корнях растений.
Результаты измерений приведены в таблицах 5 и 6.
Таблица 5
Приживаемость эндофитных бактерий в ризосфере и на корнях пшеницы с. «Веда»
Штамм эндофитных бактерий
Численность бактерий
Отношение числа бактерий на корне к числу бактерий в растении, %
Ризосфера
Корень
10<sup>5</sup> КОЕ/растение
10<sup>5</sup> КОЕ/г сух. ризосферы
10<sup>5</sup> КОЕ/корень
Прототип - Bacillus subtilis 8A
55±14
38±10
15±4
27,3
Заявленный - Bacillus pumilus A1.5
62±15
40±10
19±5
30,6
Таблица 6
Приживаемость эндофитных бактерий в ризосфере и на корнях редиса с. «Дуро»
Штамм эндофитных бактерий
Численность бактерий
Отношение числа бактерий на корне к числу бактерий в растении, %
Ризосфера
Корень
10<sup>5</sup> КОЕ/растение
10<sup>5</sup> КОЕ/г сух. ризосферы
10<sup>5</sup> КОЕ/корень
Прототип - Bacillus subtilis 8A
144±23
301±48
14,5±3,0
10,1
Заявленный - Bacillus pumilus A1.5
275±21
573±55
55,9±3,3
20,3
Результаты опытов по изучению приживаемости эндофитных бактерий в ризосфере и на корнях растений пшеницы и редиса, приведенные в таблицах 5, 6, показали, что штаммы эндофитов способны эффективно колонизировать ризосферу и корневую систему как однодольных (пшеница), так и двудольных (редис) растений, причем заявляемый штамм Bacillus pumilus A1.5 обладает более высокой колонизирующей активностью по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8A.
При использовании заявляемого штамма бактерии Bacillus pumilus A1.5 в составе биопрепаратов важным является также и то, что бактерии образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев после получения.
6
9
6
9
Концентрация (количество жизнеспособных клеток и спор) штамма бактерии Bacillus pumilus A1.5 для его эффективного использования в составе различных биопрепаратов должна составлять 10-10 клеток в 1 мл культуральной жидкости. Так как экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 10 кл/мл ведет к снижению антагонистического эффекта, а увеличение концентрации свыше 10 кл/мл не приводит к увеличению эффективности защитного и ростостимулирующего действия.
Ниже приведен пример получения биопрепарата на основе заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus pumilus A1.5 в жидкой форме.
Маточная культура
Для получения маточной культуры штамма бактерий Bacillus pumilus A1.5 использовали жидкую питательную среду КСБ (картофельно-сахарозный бульон), для чего сначала приготовили картофельный отвар, нарезав 200 г очищенного картофеля ломтиками и отварив его в 800 мл дистиллированной воды в течение 20 минут, затем отвар отфильтровали через ватно-марлевый фильтр, добавили в него 10 г сахарозы и довели значение pH смеси до 7,0.
9
Полученную жидкую питательную среду разлили в 750 мл качалочные колбы по 100 мл и стерилизовали 30 минут при 1 атм. Затем провели инокуляцию питательной среды в колбах стерильно микробиологической петлей из пробирки со скошенным питательным агаром, содержащим чистую культуру Bacillus pumilus A1.5. После этого колбы поместили на качалку (200 об/мин) и культивировали в течение 36 часов при температуре 28°C. Таким образом, в колбах была получена маточная культура Bacillus pumilus A1.5 с титром бактерий около 3×10 КОЕ/мл, которую хранили в холодильнике до 1 месяца при температуре 4-6°C для последующего засева ферментеров.
Рабочая культура
9
Рабочую культуру штамма бактерий Bacillus pumilus A1.5 для промышленного культивирования получали в бутылях или ферментерах на среде с мелассой и кукурузным экстрактом. Норма инокуляции маточной культурой 3-5%, продолжительность культивирования - 48 часов при температуре 28-30°C. При выращивании рабочих культур допускается повышение температуры до 33°C. Так получили концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus pumilus A1.5 с титром бактерий не менее 1×10 КОЕ/мл.
8
Жидкая форма биопрепарата на основе штамма Bacillus pumilus A1.5. Полученный концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus pumilus A1.5 разводили стерильной водой в соотношении 1:10 или 1:20, в зависимости от получаемого титра концентрата бактериальной суспензии. Полученную жидкую форму выдерживали в течение 3-5 дней при температуре 20-25°C до получения титра бактерий не менее 3×10 КОЕ/мл концентрированного препарата, после чего биопрепарат, названный авторами ЭНДОХИТ, готов к использованию в сельском хозяйстве. Жидкий препарат стерильно разливали в полиэтиленовые бутылки или канистры, предварительно ополаскивая их спиртом.
Благодаря относительно высокой биологической активности используемого штамма и высокой скорости его роста, жидкий препарат в готовом виде, а также в производстве практически не заражается посторонней микрофлорой. Тем не менее необходим постоянный контроль всех этапов получения биопрепарата ЭНДОХИТ на основе штамма Bacillus pumilus A1.5.
Срок хранения полученного биопрепарата составляет не менее 12 мес.
Опытным путем установлено, что для обработки семян сельскохозяйственных растений оптимальным является применение 10% раствора биопрепарата ЭНДОХИТ, а для вегетирующих растений - 1% его раствора.
Эффективность биопрепарата, полученного указанным выше способом на основе штамма бактерий Bacillus pumilus A1.5, была проверена в вегетационных опытах на пшенице сорта «Есаул» и редисе сорта «Дуро Краснодарское».
Для проведения микровегетационных опытов сосуды объемом 3 л (для пшеницы) и 1 л (для редиса) набивались почвой до веса 3,4 и 1,4 кг соответственно. Перед посадкой семян почва проливалась до полной полевой влагоемкости водопроводной водой объемом 200 и 150 мл соответственно. Семена редиса и пшеницы были предварительно отобраны по размеру, простерилизованы и пророщены в стерильных чашках Петри со стерильной фильтровальной бумагой.
7
7
Одинаковые по размеру ростки растений поделили на три части. Одну часть ростков в течение 30 мин инокулировали в жидком препарате на основе штамма-прототипа Bacillus subtilis 8A с титром бактерий 10 КОЕ/мл, другую часть - в препарате, полученном указанным выше способом на основе заявляемого штамма Bacillus pumilus A1.5 с титром бактерий 10 КОЕ/мл, а третью часть проростков обработали стерильной водой (контроль).
Через 25 дней провели измерение биомассы растений пшеницы, а через 20 дней - измерение биомассы растений редиса.
Результаты опытов приведены в таблицах 7 и 8.
Таблица 7
Эффективность штаммов эндофитных бактерий в вегетационных опытах на пшенице с. «Есаул»
Вариант опыта: обработка биопрепаратом на основе штамма бактерий
Биомасса, г
Прибавка биомассы к контролю
г
%
Контроль (без обработки)
46
-
-
Bacillus subtilis 8A (прототип)
66
22
43,5
Bacillus pumilus A1.5 (заявляемый)
70
24
52,2
Таблица 8
Эффективность штаммов эндофитных бактерий в вегетационных опытах на редисе с. «Дуро Краснодарское»
Вариант опыта: обработка биопрепаратом на основе штамма бактерий
Биомасса
Длина корня
г
% прибавки к контролю
мм
% прибавки к контролю
Контроль (без обработки)
0,65
-
25,7
-
Bacillus subtilis 8A (прототип)
1,78
173,8
29,1
13,2
Bacillus pumilus A1.5 (заявляемый)
1,93
196,9
29,9
16,3
Сравнение данных, полученных по результатам микровегетационных опытов на пшенице сорта «Есаул» и редисе сорта «Дуро Краснодарское», приведенных в таблицах 7 и 8, позволяет сделать вывод, что биопрепарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus pumilus A1.5, является более эффективным при воздействии на пшеницу и редис по сравнению с биопрепаратом на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 8A.
Опытным путем было также установлено, что штамм Bacillus pumilus A1.5 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, например, таким как редис, салат, вико-овсяная смесь, яровая пшеница.
Таким образом, штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus A1.5 является пригодным для использования в сельском хозяйстве в качестве эффективного средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами, и расширяет арсенал подобных средств.