Способ исследования борьбы с биопленками E. coli препаратом, содержащим наночастицы серебра
METHOD FOR STUDYING THE CONTROL OF E. COLI BIOFILMS WITH A PREPARATION CONTAINING SILVER NANOPARTICLES

Изобретение относится к областям медицины и ветеринарии и может быть использовано для разрушения биопленок.
В медицине и ветеринарии используется большое разнообразие токсичных для бактерий антибиотиков и антисептиков, принадлежащих к различным классам органических соединений (бета-лактамы, макролиды, тетрациклины, флуороквинолоны, сульфонамиды, аминогликозиды, имидазолы, соединения пептидной природы, четвертичные соли аммония и др.). Большинство известных в настоящее время антибиотиков и антисептиков эффективны в отношении планктонных (свободно живущих) форм бактерий. Формируя биопленку (многоклеточное сообщество бактерий, окруженное матриксом и прикрепленное к внешним или внутренним поверхностям организма-хозяина или неживых предметов), бактерии приобретают резистентность к антибиотикам и антисептикам (Hoiby N., Bjarnsholt Т., Givskov М, Molin S., Ciofu О. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. - 2010. - vol. 35. - P 322-332. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011; Dufour D., Leung V., Levesque CM. Bacterial biofilm: structure, function, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. -2012. - vol. 22. - P. 2-16. doi: 10.1111m / j 1601-1546.2012.00277), а также оказываются недоступными для уничтожения клетками иммунной системы (Leid J.G. Bacterial biofilms resist key host defenses. Microbe. - 2009. - vol. 4(2). - P. 66-70). Поэтому лечение и профилактика вызываемых биопленками заболеваний представляет большие трудности (Romling U., Balsalobre С.Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative treatment strategies (Review). J Intern Med. - 2012. - vol. 272. - P. 541- 561. doi: 10.1111/joim. 12004; Gupta P., Sarkar S., Das В., Bhattacharjee S., Tribedi P. Biofilm, pathogenesis and prevention - a journey to break the wall: a review. Arch Microbiol. - 2015. - vol. 198(1). - P. 1-15. doi 10.1007/s00203-015-l 148-6).
Известно, что биопленки вызывают порядка 80% бактериальных инфекций человека и животных (Pletzer D., Coleman S.R., Hancock R.E. Anti-biofilm peptides as a new weapon in antimicrobial warfare. Curr Opin in Microbiol. - 2016. - vol. 33. - P. 35-40. doi: 10.1016/j.mib.2016.05.01) разнообразные воспалительные и связанные с ними аутоиммунные и онкологические заболевания, поражения сердечно-сосудистой системы. Благодаря этому биопленки служат одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Высокая устойчивость биопленок к внешним воздействиям создает также проблемы для дезинфекции медицинских изделий, поддержания личной и профессиональной гигиены, лечения сельскохозяйственных и домашних животных. Соответственно, разработка методов разрушения бактериальных биопленок представляет одну из наиболее актуальных задач современной биотехнологии, медицины, ветеринарии и смежных областей здравоохранения.
Внедрение нанотехнологий в различные области науки обусловлено их уникальными свойствами в отношении биологических объектов. Наночастицы, в частности наночастицы металлов и их соединений, в настоящее время нашли широкое применение в различных сферах деятельности, в том числе в биологии и медицине в качестве альтернативных антибактериальных препаратов (Патент РФ №2542280. Способ получения пленок с наноструктурным серебром / О.А. Баранова, П.М. Пахомов. -Опубл. 20.02.2015. Бюлл. 5.; Самсонова М.В. Наномедицина: современные подходы к диагностике и лечению заболеваний, вопросы безопасности // Пульмонология. 2008. №5. С.5-13; Dogra V., Kaur G., Kaur A., Kumar R., Kumar S. In vitro assessment of antimicrobial and genotoxic effect of metallosurfactant based nickel hydroxide nanoparticles against Escherichia coli and its genomic DNA. Colloids Surf В Biointerfaces. - 2018. - vol. -170. - P.99-108. doi: 10.1016/j.colsurfb. 2018.05.069). В частности, наночастицы серебра характеризуются высокой антибактериальной активностью в отношении широкого ряда бактерий, в том числе возбудителей заболеваний человека и животных (Григорьев М.Г., Бабич Л.Н. Использование наночастиц серебра против социально значимых заболеваний // Молодой ученый. 2015. №9. С. 396-401; Khatami Мю, Zafarnia N., Heydarpoor Bami Мю, Sharifi I., Singh H. Antifungal and antibacterial activity of densely dispersed silver nanospheres with homogeneity size which synthesized using chicory: An in vitro study. J Mycol Med. 2018. pii: SI 156-5233(18)30054-4. doi: 10.1016/j.mycmed. 2018.07.007).
Известен способ фотодинамической терапии для инактивации бактерий и биопленок, в котором используют катионный пурпуринимид в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической инактивации бактериальных биопленок (патент РФ №2565450, опубл. 20.10.2015). К недостаткам этого способа фотодинамической терапии следует отнести низкий уровень фотостабильности используемой композиции, что приводит к коротким срокам хранения и к существенным ограничениям при проведении терапии. Другим ограничением при использовании вышеуказанной композиции является низкий уровень эффективности терапии очагов бактериального поражения, обусловленный низким уровнем биодоступности молекул. Кроме того, предлагаемые для аппликационного применения растворы химических агентов имеют значительную химическую активность, что приводит к их ускоренному выводу или инактивации.
Известен способ предотвращения образования биопленок на подложке, на которую нанесены частицы с локальным плазмонным резонансом (медь, серебро, золото, полупроводники, оксиды металлов) с плотностью 1-100 частиц/мкм (патент РФ №2650376, опубл. 11.04.2018). Предполагается, что при освещении поверхности поглощение и нагрев наночастиц предотвратят прикрепление микроорганизма к поверхности, ингибирование формирования биопленки и (или) разрушение уже сформированной биопленки. Недостатки данного способа заключаются в удалении наночастиц вследствие метаболизма, окисления и физико-химических процессов, сопровождающих нагревание в биосистемах (кипение, кавитация, флотация и т.п.).
Известны также химические и микробиологические способы инактивации биопленок химическими агентами путем непосредственной аппликации их растворов - смеси ферментов (заявка РФ №2009106069, опубл. 27.08.2010), бактериофага (патент РФ №2565824, опубл. 20.10.2015; патент РФ №2646102, опубл. 01.03.2018), а также штаммами бактерий (патент РФ №2576008, опубл. 27.02.2016), комплексом антимикробных пептидов насекомых (патент РФ №2664708, опубл. 21.08.2018; патент РФ №2699712, опубл. 09.09.2019), одного или нескольких ненасыщенных алифатических длинноцепочечных спиртов или альдегидов определенной формулы (RU 2012126070), сипрозу (заявка РФ №2014145270, опубл. 10.107111.2016), ионы серебра в составе композиций (патент РФ №2553363, опубл. 10.06.2015). Недостатком данных способов является их относительно кратковременный эффект (вследствие метаболизма), необходимость повторения, но избегания передозировки. Использование бактериофагов в борьбе с биопленками с каждым годом набирает популярность. Но на сегодняшний день не получены достоверные результаты, которые показывают эффективность их применения. Бактериофаг высоко специфичен, т.е. действует только против одного вида бактерии и не эффективен по отношению к другим. Экспериментально доказано, что использование низких концентраций фаговых частиц или применение фагов в отношении бактерий, которые проявляют резистентность к фагам, стимулирует образование биопленок. Выделение и (или) получение генетически модифицированных фагов, действие которых будет направлено на разрушение биопленок - очень сложная, дорогая и трудная задача. Действие ферментов в основном направлено на разрушение матрикса (например, ДНКаза). При этом бактерии остаются жизнеспособными и вполне могут формировать биоматрикс заново и формировать новый очаг инфекции.
Наиболее близким аналогом является способ разрушения биопленок лазерным излучением с использованием композиции, содержащей серебро (публикация международной заявки WO 2014/089552, опубл. 12.06.2014). Разрушение биопленки на поверхности раны предполагается под действием локальной ударной волны, генерированной наносекундным лазерным излучением (длина волны 1064 нм) в слое серебросодержащей композиции на поверхности биопленки и вдавливающей бактерицидную композицию вглубь раны под действием последовательных лазерных импульсов. Основным недостатком метода является прямое лазерное воздействие на ткани, а также сложность оптимальной фокусировки, позволяющей под действием ударной волны обеспечить разрушение биопленки и транспорт композиции вглубь, но одновременно избежать разрушения компонент и целых клеток здоровой такни, а также микрососудов.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа исследования борьбы с биопленками Е. coli препаратом, содержащим наночастицы серебра.
6
Поставленная задача достигается тем, что способ исследования борьбы с биопленками Е. coli препаратом, содержащим наночастицы серебра, заключающийся в том, что к 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, вносят 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10 КОЕ/мл референтного штамма Е. coli АТСС 25922 или изолята Е. coli выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течение 24 ч при Т=37,5±0,5°С, результат исследования борьбы с биопленками, определяют по изменению интенсивности биопленкообразования, путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм.
Способ исследования борьбы с биопленками Е. coli препаратом, содержащим наночастицы серебра определяли согласно методике (O'Toole G.A. et al. 2000). Использование данного способа исследования позволяет оценить способность препаратов серебра препятствовать образованию биопленок у Е. coli.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Препарат Арговит представляет собой комплекс высокодисперсных частиц кластерного серебра, поливинилпирролидона и водного раствора, полученного электронно-лучевой обработкой водного раствора. Препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, спорообразующих и аспорогенных бактерий в виде монокультур и микробных ассоциаций (ООО НПЦ «Вектор-Вита», vectot-vita@ngs.ru).
Пример 1
6
Способ исследования борьбы с биопленками Е. coli препаратом, содержащим наночастицы серебра заключался следующим образом: в стерильный 96 луночный планшет вносят 0,2 мл раствора препарата арговит с содержанием действующего вещества 13 мг/мл, 0,2 мл мясопептонного бульона и 0,2 мл 1,5⋅10 КОЕ/мл референтного штамма Е. coli АТСС 25922 или изолята Е. coli выделенного от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания, с последующим инкубированием в течении 24 ч при Т=37,5±0,5°С.
После инкубации, планктонные микроорганизмы из каждой лунки удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Затем в лунки вносят по 0,125 мл 0,1% раствора генциан фиолетового, окрашивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее раствор удаляют, лунки промывают дистиллированной водой. Планшет высушивают на воздухе и в каждую лунку вносят 0,2 мл 95% этилового спирта, инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, затем полученную спиртовую вытяжку в объеме 0,125 мл переносят в чистый 96 луночный планшет и замеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм.
Пример 2
Способ исследования борьбы с биопленками Е. coli препаратом, содержащим наночастицы серебра, продемонстрирован в сравнении с действием антибактериального препарата лактобай на референтном штамме Е. coli АТСС 25922 и Е. coli выделенном от крупного рогатого скота с клиническим проявлением инфекционного заболевания.
Применение лактобая вызывает рост биопленкообразования более чем в 2,5 раза с 1,01±0,01 до 2,54±0,01 усл. ед.
Изучение влияние наночастиц серебра препаратом арговит на штамм Е. coli АТСС 25922 позволило установить снижение процесса биопленкообразования с 1,01±0,02 до 0,93±0,01 усл. ед., что подтверждает исследования изолятом Е. coli выделенным при лечении мастита коров. Антибактериальный препарат латобай как и при исследовании с изолятом Е. coli вызывал рост процесса биопленкообразования с 1,01±0,02 до 1,52±0,03. Влияние препаратов различных фармакологических групп на процесс биопленкообразования Е. coli, усл. ед представлены в таблице 1
Проведенные исследования показали, что применение препарата арговит содержащего наночастицы серебра значительно снижал уровень биопленкообразования как у референтного штамма, так и у изолята Е. coli.