СПОСОБ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ
METHOD FOR PRE-INOCULATION PROCESSING OF PATHOLOGICAL MATERIAL FOR MYCOBACTERIAL RECOVERY

Изобретение относится к лабораторным исследованиям, касается способа предпосевной обработки патологического материала и может быть использовано для выявления микобактерий с целью лабораторной диагностики, выявления резервуаров и механизмов передачи возбудителей.
Трудности, связанные с выделением чистых культур микобактерий, обусловлены обсемененностью большинства анализируемых образцов микроорганизмами (сапрофитами, дрожжеподобными грибами и др.), размножающимися быстрее микобактерий.
Результативность бактериологического исследования на туберкулез во многом зависит от предварительной обработки патологического материала и качества питательной среды, используемой для культурального исследования. Особенностью микобактерий является то, что наличие большого количества миколовых кислот в клеточной стенке играет важную биологическую роль в повышенной резистенции микобактерий к воздействию кислот, щелочей, спиртов, антисептических веществ и дезинфектантов. На этой особенности строения клеточной стенки микобактерий и основаны все методы предпосевной обработки патматериала перечисленными выше химическими веществами, которые, с одной стороны, сохраняют жизнеспособность микобактерий, а с другой - подавляют рост неспецифической микрофлоры, которой инфицирован исследуемый материал. Однако при обработке патологического материала не только уничтожается побочная микрофлора, но и погибает часть микобактерий. Поэтому следует использовать такие вещества и в таких концентрациях, которые оказывали бы минимальное губительное действие на микобактерий и максимальное на сопутствующую микрофлору. Обнаружение таких веществ составляет одну из актуальных задач ветеринарной и гуманной медицины.
В практике микробиологических лабораторий в настоящее время используют растворы серной (А.Ф. Коржинская, 1926; К.К. Креслинг, 1929; А.Н. Маккавейская, 1956, метод А.П. Аликаевой, 1971), соляной (Ю.А. Юденич, 1928), щавелевой кислот (метод Гона, Левенштейна-Сумиоши), едкого натра (метод флотации О.В. Мартова, 1971), гипохлорита кальция и других растворов /1/. Недостатками перечисленных методов является достаточно губительное действие кислот и щелочей на микобактерий, что влияет на скорость появления и интенсивность первичного роста колоний,
Растворы кислот в малых концентрациях для обработки исследуемого материала на наличие микобактерий не обеспечивают освобождение его от сопутствующей микрофлоры. Так, при обработке 3% растворами серной, соляной и щавелевой кислот процент загрязнения посевов может составлять от 50 до 80. При обработке 5% раствором щавелевой кислоты процент загрязнения - 33. При обработке материала 5% раствором щавелевой кислоты без последующего промывания физиологическим раствором, как рекомендует Банникова Б.Н. (1980), роста микобактерий на средах Левенштейна-Йенсена и Финн II не происходит, так как рН среды в ней изменяется ниже 6,8. При обработке материала по методу А.П. Аликаевой растворами кислот более высокой концентрации (10-15%) с однократным промыванием (в течение 5 минут физиологическим раствором) в 70% случаев посевы уничтожаются. При использовании щелочей отмечается разбухание волокон тканей, затрудняющее отбор материала и его распределение по среде при посеве /2/. Кроме того, щелочи снижают вязкость гомогената, в связи с чем посевы на питательные среды становятся затруднительными, не полностью покрывают всю поверхность среды, и, вероятно, микобактерии, находящиеся в обволоченном слизью состоянии, не находят контакта с питательной средой /3/.
Используемые в медицинской практике для обработки мокроты такие детергенты, как двузамещенный фосфорнокислый натрий, трехзамещенный фосфорнокислый натрий и хлоргексидинглюконикум при воздействии на патологический материал (лимфатические узлы) в течение 30 минут, 1, 2 часов и 1 суток не обеспечивали подавление сопутствующей микрофлоры, а в 96% случаев посевы были загрязнены банальной микрофлорой.
Известно применение для обработки дезинфектантов, содержащих альдегиды («Лизоформин 3000», «Биодез-Р», «Септодор-форте», «Делаксон») и активный хлор («Хлорантоин», «Биохлор»). При обработке патологического материала 0,15% водным раствором «Делаксона», 0,2% водным раствором «Хлорантоина» и 0,5% водным раствором «Лизоформина» рост колоний M.bovis выявляли на 18 и 19 сутки, однако 0,15% водный раствор «Делаксона» в 10% случаев не полностью убивал сопутствующую микрофлору. 0,1% водный раствор «Септодор-форте» не полностью подавлял рост сопутствующей микрофлоры (пророст - 10%). При обработке биоматериала 0,25% водным раствором «Делаксона», 0,4% водным раствором «Септодора-форте» и 0,15% водным раствором «Биохлора» чистота посевов составляла 100%, срок появления колоний - 21 сутки, интенсивность роста снижена. 2 и 3% водные растворы «Биодеза-Р» задерживали рост М bovis, но не обеспечивали 100% чистоту (пророст 10 и 20% соответственно). Повышение концентрации водных растворов «Делаксона» и «Хлорантоина» до 0,5% «Лизоформина» до 1,0% и «Септодорафорте» до 0,4% губительно действовало на микобактерии /4/.
Цель изобретения - оптимизация предпосевной обработки патологического материала для выделения микобактерий.
Поставленная цель достигается предпосевной обработкой патологического материала водным раствором дезинфекционного средства «Септустин».
Сущность способа заключается в предпосевной обработке патологического материала водным раствором дезинфекционного средства "Септустин" в концентрации 0,5% смешиванием в объемном соотношении 1:2 в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей двукратной в течение 15 минут отмывкой физиологическим раствором.
Дезинфекционное средство «Септустин» (изготовитель ООО «Уралстинол БИО», Россия), рекомендован для дезинфекции объектов ветеринарного надзора. Данный препарат из группы катионных ПАВ содержит в качестве дезинфицирующего вещества катамин АБ, а также спирт изопропиловый, неионогенное ПАВ, гидрокарбонат натрия и бромфеноловый синий /5/, обладает широким спектром действия в отношении возбудителей инфекционных болезней бактериальной (включая туберкулез), вирусной и грибковой этиологии /5/.
Пример 1. Воздействие дезинфекционного средства «Септустин» в зависимости от концентрации и экспозиции определяли на культурах микроорганизмов, полученных из ГИСК им. Л.А. Тарасовича. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Воздействие дезинфекционного средства «Септустин» на культуры микроорганизмов в зависимости от концентрации и экспозиции
Экспозиция, мин
Культура
15
30
60
120
0,1% водный раствор
Е.coli №17
+
-
-
-
Staph.aureus №6538 АТСС
+
-
-
-
M.avium (ГИСК)
+
+
+
+
M.tuberculosis(Academia)
+
+
+
+
M.bovis (Vallee)
+
+
+
+
0,25% водный раствор
Е.coli №17
-
-
-
-
Staph.aureus №6538 АТСС
-
-
-
-
M.avium (ГИСК)
+
+
+
+
M.tuberculosis(Academia)
+
+
+
+
M.bovis (Vallee)
+
+
+
+
0,5% водный раствор
Е.coli№17
-
-
-
-
Staph.aureus №6538 АТСС
-
-
-
-
M.avium (ГИСК)
+
+
+
+
M.tuberculosis(Academia)
+
+
+
+
M.bovis (Vallee)
+
+
+
+
Примечание: (+) - рост, (-) - отсутствие роста
Как видно из таблицы 1, бактерицидное действие дезинфекционного средства «Септустин» на микобактерии при испытанных концентрациях и экспозициях не отмечалось.
Пример 2. Патологический материал (сердце, почки, легкие) от мышей, зараженных М. avium (шт. ГИСК), измельчали в стерильной ступке стерильными ножницами, кусочки заливали раствором дезинфекционного средства «Септустин» 0,1, 0,25 и 0,5% концентрации в объемном соотношении 1:2 и оставляли на 30, 60 и 120 минут при комнатной температуре. Затем сливали надосадочную жидкость и промывали стерильным физиологическим раствором дважды в течение 15 минут, хорошо перемешивали и сливали, а кусочки растирали песком стерильным пестиком. Полученный гомогенат заливали стерильным физиологическим раствором, ступку закрывали стерильной пергаментной бумагой и через 5 минут отбирали верхний слой суспензии стерильной пипеткой и переносили в бактериологическую пробирку, из которой производили посев на питательную среду Левенштейна-Йенсена. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты исследования патологического материала от мышей (М.avium)
Концентрация дезинфекционного средства «Септустин», %
0,1
0,25
0,5
Экспозиция, мин
30
60
120
30
60
120
30
60
120
-
-
-
-
-
-
+
+
+
Как видно из таблицы 2, микобактерии выделяли после обработки патологического материала водным раствором дезинфицирующего средства «Септустин» 0,5% концентрации с экспозицией 30 минут, причем увеличение экспозиции не влияло на выявляемость.
24:0
22:0
26:0
Пример 3. Провели культуральное исследование патологического материала (брыжеечные лимфатические узлы) от убитой с контрольно-диагностической целью коровы с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих без видимых патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза, в хозяйстве, благополучном по туберкулезу. Патологический материал измельчали в стерильной ступке стерильными ножницами, кусочки заливали раствором дезинфекционного средства «Септустин» 0,5% концентрации в объемном соотношении 1:2 и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Затем сливали надосадочную жидкость и промывали стерильным физиологическим раствором дважды в течение 15 минут, хорошо перемешивали и сливали, а кусочки растирали стерильным пестиком со стерильным песком. Полученный гомогенат залили стерильным физиологическим раствором и провели посев на питательную среду Левенштейна-Йенсена с последующим культивированием при температуре 37°С. Через 19 дней выросли мелкие колонии белого цвета, которые окрашивали по Цилю-Нильсену и по морфологическим признакам идентифицировали как микобактерии, что подтверждали исследованием жирно-кислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. По хемотаксономическим характеристикам (по соотношению на хроматограммах эфиров миколовых кислот с числом атомов углерода больше 20, пик С больше пика С, пик С отсутствовал) микобактерии идентифицировали как М.scrofulaceum.
Пример 4. Провели культуральное исследование патологического материала (брыжеечные, заглоточные, подчелюстные, лимфатические узлы, печень, легкие) от четырех коров с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих, как в примере 2. При просматривании посевов учитывали выделение культур и чистоту посевов. В качестве контроля выбран метод А.П. Аликаевой. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Результаты исследования патологического материала от положительно реагировавших на ППД-туберкулин для млекопитающих коров
Показатели
Концентрация дезинфекционного средства «Септустин», %
6% серная кислота, экспозиция - 30 мин, контроль
0,1
0,25
0,5
Экспозиция, мин
30
60
30
60
30
60
Количество проб
4
4
4
4
4
4
4
Количество засеянных пробирок, из них с проростом (%)
40 12(30)
40 10(25)
40 4(10)
40 2(5)
40
40
40
Обнаружен рост микобактерии, количество проб
-
-
-
3
3
2
-
22:0
24:0
22:0
26:0
Как видно из таблицы 3, при обработке патологического материала водным раствором дезинфекционного средства «Септустин» концентрацией 0,5% с экспозицией 30 минут обеспечивалась 75% выявляемость микобактерий при 100% чистоте посевов. При увеличении экспозиции до 60 минут микобактерии выявлялись в 50% проб. В одной пробе рост мелких колоний белого цвета, не продуцирующих пигмент на свету и в темноте, отмечали на 7 сутки (на 10 сутки - в контроле). По результатам окраски по Цилю-Нильсену и по морфологическим признакам их идентифицировали как микобактерии, что подтверждали исследованием жирно-кислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. По хемотаксономическим характеристикам (хорошо выражены пики ненасыщенных жирных кислот С и С, преобладала тетракозановая кислота) микобактерии идентифицировали как М.fortuitum. В двух пробах на 7 сутки выросли слизистые блестящие колонии желтого цвета. По результатам окраски по Цилю-Нильсену и по морфологическим признакам их идентифицировали как микобактерии, что подтверждали исследованием жирно-кислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. По хемотаксономическим характеристикам (четко выражены пики кислот с 17 и 19 атомами углерода и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода больше 20, преобладала бегеновая кислота С, пик С отсутствовал) микобактерии идентифицировали как M.vaccae.
Проведенные исследования показали, что при предпосевной обработке биоматериала на выделение микобактерии туберкулеза наиболее эффективным является 0,5% раствор дезинфекционного средства «Септустин» при экспозиции 30 минут, что подтверждается высокой выявляемостью и чистотой посевов.
Источники информации
1. Дончеко Н.А. Усовершенствование средств и методов диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: автореф. дис… докт. вет. наук: 16.00.03, 16.00.04. - Новосибирск, 2008. - 36 с.
2. Гертман М.И. / Интенсификация молочного скотоводства и пути увеличения производства молока: Тез. докл. науч.-практ. конф. - Челябинск, 1986.
3. Патент РФ №2328526 С1, 2008.
4. http://www.nbuv.ua
5. Наставление по применению препарата «Септустин» для дезинфекции объектов ветнадзора. Уралстинол. - БИО. - 2002.