Оценка показателей иммунного статуса и хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов крови при хронических вирусных гепатитах у детей

© СОЛОВЬЕВА И.А., САВЧЕНКО А.А., МАРТЫНОВА Г.П.

ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА И

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ

КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ У ДЕТЕЙ

И.А. Соловьева, А.А. Савченко, Г.П. Мартынова Красноярский государственный медицинский университет им. проф.

В.Ф.Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов;

НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, директор - член-корр. РАМН

В. Т. Манчук.

Резюме. В работе представлены результаты исследования по изучению состояния иммунного статуса и хемилюминесценции нейтрофильных грануло-цитов крови у 52 детей с хроническими вирусными гепатитами В и С. Установлено, что изменения в системе иммунитета характеризуются снижением показателей клеточного и повышением активности гуморального звена иммунной системы. При сравнении параметров индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов крови у больных хроническими гепатитами обнаружены различия в зависимости от этиологического фактора.

Ключевые слова: хронические гепатиты, иммунный статус, хемилюминес-ценция

Соловьева Ирина Андреевна - аспирант кафедры детских инфекционных бо-лезнейКрасГМУ; e-mail: iasolov@mail.ru.

Савченко Андрей Анатольевич - д.м.н., проф., заведующий лабораторией молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, зав. каф. физиологии КрасГМУ; e-

mail: aasavchenko@yandex.ru.

Мартынова Галина Петровна - д.м.н., проф., зав. каф. детских инфекционных болезней КрасГМУ; e-mail: doc-martynova@yandex.ru, тел. 8(391)2243295.

Вирусные гепатиты относятся к широко распространенным заболеваниям у детей. Среди вирусных гепатитов с парентеральным путем передачи особую социальную значимость имеют гепатиты В и С ввиду их повсеместной распространенности, высокого хрониогенного потенциала, развития неблагоприятных последствий и исходов [4,14]. Хотя в результате проведения массовой дополнительной иммунизации населения отмечается устойчивое снижение заболеваемости вирусным гепатитом В за 2008 г., по сравнению с аналогичным периодом 2007 г. - на 25%, в том числе среди детей и подростков - в 2,6 раза, при ВГС, наоборот, отмечается рост данного показателя (на 7-15% ежегодно), причем 7085% инфицированных составляют подростки до 19 лет [5]. Хроническое течение вирусных гепатитов свидетельствует о персистенции возбудителя и его способности преодолевать иммунный надзор [1,4,13,18]. В развитии, а так же в исходе вирусных инфекций решающее значение имеет не только уровень репликации вируса, но и совершенство механизмов взаимосвязи специфического иммунитета с системой неспецифической резистентности обусловленной, в том числе, состоянием реактивности фагоцитирующих клеток [9,13].

Одну из ключевых ролей в обеспечении иммунного ответа на внедрение возбудителя играют нейтрофилы и макрофаги и их функциональные возможности [1,3,6,8]. Определение хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов может использоваться как один из критериев их способности к завершенному фагоцитозу [2,10]. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные проблеме хронических вирусных гепатитов (ХВГ) у взрослых, имеются лишь единичные публикации, затрагивающие изучение показателей иммунитета в детском возрасте. В то же время именно у детей можно ожидать наиболее выраженные изменения, связанные с быстротой возникновения нарушений состояния иммунной системы при воздействии вирусных агентов, что указывает

на актуальность изучения иммунного статуса и показателей хемилюминесцен-ции (ХЛ) нейтрофильных гранулоцитов крови при ХВГ у детей.

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей иммунного статуса и показателей ХЛ нейтрофильных гранулоцитов крови у детей с хроническими вирусными гепатитами В (ХГВ) и С (ХГС).

Материалы и методы

Под нашим наблюдением находилось 52 ребенка в возрасте 12-17 лет больных ХВГ. Наблюдение осуществлялось в диспансерном кабинете гепатологиче-ского центра на базе инфекционного отделения МУЗ ГКБ №20 им. И. С. Берзона (г. Красноярск). Диагноз ХВГ был выставлен на основании данных анамнеза заболевания, клинической картины и лабораторно-инструментальных методов обследования, включающих определение тимоловой пробы, протромбинового индекса (ПТИ), протромбинового времени (ПТВ), концентраций общего белка, холестерина, билирубина и его фракций, активности АлАТ, АсАТ и щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Этиология ХВГ устанавливалась с помощью методов ИФА и ПЦР. При помощи ИФА в сыворотке крови обнаруживались специфические серологические маркеры ХВГ: у больных ХГВ - HBsAg (HBs скрин, НПО “Вектор”, Россия) и анти-HBcIgG (анти-HBC набор 2, НПО “Вектор”, Россия), у больных ХГС (анти-HCV спектр, НПО “Вектор”, Россия) - антитела к core-протеину и к неструктурным белкам вируса (анти-NS^ анти-NS^ анти-NS^. Необходимо отметить, что у больных ХГВ анти-HBcIgM не выявлялись (анти-HBC-M скрин, НПО “Вектор”, Россия). С помощью метода ПЦР (TV1-100 R0,5 амплисенс, НПО “Вектор”, Россия) у больных в зависимости от этиологии заболевания определялась ДНК ВГВ или РНК ВГС.

Этиологическая структура наблюдаемых нами больных представлена следующим образом: ХГВ составил 67,3% (35 детей), ХГС - 32,7% (17 детей). Давность установленного хронического процесса (на момент обследования) в печени варьировала от 1 года до 14 лет. Чаще длительность заболевания составляла 1-5 лет (59,3%).

Лимфоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови на градиенте плотности фиколл-верографина [7]. Методом непрямой иммунофлуоресценции, используя соответствующие FITC-меченые моноклональные антитела фирмы ТОО «Сорбент» (г. Москва) определяли CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD16+-, CD19+- и HLA-DR+- клетки. Дополнительно производили подсчет иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+) и индекса активации Т-лимфоцитов (HLA-DR+/CD19+). Концентрацию иммуноглобулинов класса А, М, G в сыворотке крови определяли методом иммунодиффузии в геле [15]. Содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови изучали методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле [12].

Исследование спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов крови осуществляли по методу P. De Sole et al. с помощью хемилюминесцентного анализатора “CL3606M” (Красноярск, Россия) [2,10]. Результаты хемилюминесцентного анализа характеризовали по следующим параметрам: время выхода на максимум интенсивности ХЛ (Tmax), максимальное значение интенсивности ХЛ (Imax) и площадь (S) под хемилюминесцентной кривой. Усиление ХЛ, индуцированной зимозаном, оценивали соотношением площади индуцированной ^инд) к площади спонтанной ^спонт) и определяли как индекс активации.

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интер-квартильного размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007).

Результаты и обсуждение

Нами проведен комплексный анализ клинической картины и результатов лабораторного обследования больных ХВГ. Из эпидемиологического анамнеза установлено, что контакт в семье с больными ХГВ или ХГС имел место у 24 детей (46,1%), переливание крови и ее компонентов проводилось 20 пациентам

(38,5%). У 3 детей (5,7%) отмечалось сочетание нескольких эпидемиологических факторов (переливание крови и экстракция зуба, переливание крови и наличие татуировок, контакт в семье и татуировки).

При осмотре 41 пациент (81%) предъявлял жалобы на слабость, у 38 детей (73%) имела место быстрая утомляемость, снижение толерантности к физическим и умственным нагрузкам отмечалось у 20 больных (38,5%), у 16 (30,7%)-инверсия сна. Эмоциональная лабильность была выявлена у половины обследуемых - 26 детей (50%). Болевой синдром имел место у 36 больных (69,2%). Как правило, боли носили периодический характер (у 40 пациентов - 76,9%). Преобладал ноющий характер болей (46 детей, что составило 88,5%), у 37 больных (71,2%), боли локализовались в правом подреберье, реже в эпигастрии и области левого подреберья, в 32,7% (17 чел.) усиливались после употребления жирной пищи, а у 6 детей (11%) - появлялись после курения. Также имели место ухудшение аппетита у 16 детей (30,7%), тошнота у 2 больных (3,8%), и горечь во рту у 8 детей (15,3%), носовые кровотечения выявлялись в 9,6% случаев (5 чел.).

Признаки хронической интоксикации обнаруживались практически у всех больных. Так, капиллярит на щеках и межлопаточной области имел место у 34 пациентов (65,4%), сосудистые звездочки, локализованные на лице, тыльной поверхности кистей выявлялись в 23,1% (12 чел.), в 61,5% случаев (32 чел.) была видна, расширенная венозная сеть на груди и животе, у 14 больных (26,9%) -«синяки» на нижних конечностях. При осмотре у 28 пациентов отмечалась об-ложенность языка (53,8%), у 18 (34,6%) - умеренное, в основном за счет правой доли, увеличение печени.

Изменения в биохимическом анализе крови характеризовались тенденцией к гипохолестеринемии и диспротеинемии. Однако концентрация билирубина и активность трансаминаз не превышали нормальных показателей.

При исследовании состояния иммунного статуса у детей с ХГВ и ХГС обнаружены значительные изменения относительно контрольных значений, но при отсутствии статистически достоверных различий в иммунологических показа-

телях между группами больных хроническими вирусными гепатитами (табл. 1). Так, независимо от этиологического фактора, у больных хроническими гепатитами снижается процентное содержание лимфоцитов в периферической крови, а также абсолютное количество СБ4+- и СВ8+-клеток, при повышении относительного уровня СБ19+-клеток и лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер НЬЛ-БЯ. Кроме того, только у больных ХГВ в крови статистически достоверно повышается количество лейкоцитов и абсолютное число СБ19+-лимфоцитов, и снижается процентное содержание СБ4+-клеток относительно контрольных параметров. У детей с ХГС обнаружено увеличение относительного количества зрелых Т-лимфоцитов (СБ3+-клетки), при снижении абсолютного числа СВ16+-клеток по сравнению с контрольной группой.

Анализ показателей, характеризующих состояние гуморального иммунитета у больных ХГВ и ХГС, позволил обнаружить однонаправленные изменения относительно контрольных значений (табл. 2). Независимо от этиологии, у наблюдаемых больных повышается концентрация ^ Л и ^ О и уровень ЦИК в сыворотке крови.

При исследовании параметров ХЛ нейтрофильных гранулоцитов крови не обнаружено статистически достоверных различий между показателями спонтанной ХЛ у больных ХВГ и группой контроля (табл. 3). Однако при сравнении параметров индуцированной ХЛ у больных ХВГ установлены различия в зависимости от этиологического фактора по сравнению с контрольными значениями. Так, у больных ХГВ отмечено достоверное снижение максимального значения интенсивности (Ітах) и индекса активации относительно контрольных уровней, что указывает на снижение компенсаторных возможностей нейтрофи-лов крови. При этом время выхода на максимум интенсивности ХЛ и площадь (Б) под хемилюминесцентной кривой не отличались от показателей группы контроля. У детей с ХГС наблюдалось только снижение максимального значения ХЛ реакции по сравнению с контрольной группой.

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что, в зависимости от этиологического фактора, показатели иммунного статуса у детей с

ХВГ различаются незначительно. Так, у больных ХГВ, и у больных ХГС в периферической крови наблюдается снижение абсолютного числа СБ4+-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов на фоне повышения процентного содержания СБ19+- и НЬЛ-БК+-клеток. Необходимо отметить, что НЬЛ-БЯ-рецептор экспрессируется на поверхности и активированных клеток [6,13].

Анализ полученных данных показал статистически значимое снижение КК-клеток только у детей с ХГС. Известно, что в данное время клеточная популяция, как фактор неспецифической резистентности, играет важную роль в системе противовирусного иммунитета, лизируя вирус-инфицированные клетки [8,12,17].

Изменение показателей гуморального звена иммунной системы при ХВГ у детей не зависит от этиологического фактора. При этом с увеличением количества В-лимфоцитов также выявляется повышение концентрации ^ Л и ^ О. Можно предположить, что независимое от этиологического фактора увеличение количества ЦИК у больных ХВГ связано как с постоянным наличием антигена в организме, способствующего повышению образования ЦИК, так и со снижением реактивности клеточного звена иммунитета и показателей ХЛ фагоцитирующих клеток. Известно, что макрофаги и нейтрофильные гранулоци-ты являются ключевыми клетками, участвующими в утилизации иммунных комплексов из периферической крови [7,18].

Таким образом, для детей с ХВГ характерно развитие дисбаланса иммунной системы, характеризующегося снижением величин параметров клеточного звена иммунной системы и ряда показателей индуцированной хемилюминесцен-ции нейтрофильных гранулоцитов, при повышении активности гуморального звена иммунитета.

ESTIMATION OF IMMUNE STATUS INDEXES AND CHEMILUMENESCENCE OF NEURTOPHIL GRANULOCYTES IN CHRONIC VIRUS HEPATITIS IN CHILDREN

I.A. Solov’eva, A.A. Savchenko, G.P. Martinova

Krasnoyarsk State Medical University named after prof. Voino-Yasenetsky Abstract. The paper presents the study of immune status and chemilumenescence of neutrophil granulocytes in 52 children with chronic virus hepatitis B and C. It was revealed that changes in the immune system are characterized with the decrease of cellular immunity and increase of humoral immunity. The pattern of induced chemilu-minescence of blood neurtophil in patients with chronic hepatitis differ in relation with the etiological factors.

Key words: chronic hepatitis, immune status, chemilumenescence.

Литература

1. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Моргунов К.В. Изменение показателей гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с хроническим гепатитом С различной тяжести // Вопр. вирусологии. - 2003. - № 3. -

С. 15-18.

2. Савченко А. А., Куртасова Л.М., Шакина Н. А. Применение хеми-люминесцентного анализа для оценки функциональной активности лейкоцитов крови у детей с иммунопатологическими состояниями / Метод. реко-менд. - Красноярск, 1996. - 19 с.

3. Собчак Д.М., Корочкина О.В. Оценка показателей Т-клеточного иммунитета и медиаторов иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - № 2. - С.37-42.

4. Учайкин В.Ф., Чуелов С.Б. Вирусные гепатиты у детей: от прошлого к настоящему // Детские инфекции. - 2006. - №4. - С.4-8.

5. Шахгильдян, И. В., Ясинский А. А., Михайлов М. И., Ершов О. Н., и др. Хронические гепатиты в Российской Федерации // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2008. - № 6. - С. 12-15

6. Ярилин А.А.Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.

7. Boyum A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marroow // Scand.J.Clin.Lab. Invest - 1968. - Vol.21 (Suppl.97). - P.77-80.

8. Chen M., Zhang D., Zhen W. et al. Characteristics of circulating T cell receptor gamma-delta T cells from individuals chronically infected with hepatitis B virus (HBV): an association between V(delta)2 subtype and chronic HBV infection // J. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 198, № 11. - P. 1643-1650.

9. Chen Y., Wei H., Sun R. et al. Increased susceptibility to liver injury in hepatitis B virus transgenic mice involves NKG2D-ligand interaction and natural killer cells // Hepatology. - 2007.- Vol. 46, № 3. - P. 706-715.

10. De Sole P., Lippa S., Lixxarru G. Whole blood chemiluminescence: a new technical approach to assess oxygen-dependent microbial activity of granulocytes // J.Clin.Lab. Autom. - 1983. - Vol. 3. - P. 391-400.

11. Ergunay K., Gurakan F., Usta Y. et al. Detection of TT virus (TTV) by three frequently-used PCR methods targeting different regions of viral genome in children with cryptogenic hepatitis, chronic B hepatitis and hbs carriers // Turk. J. Pediatr.-2008. - Vol. 50, № 5. - P. 432-437.

12. Haskova V., Kaslik J., Riha J. et al. Simple method of circulating immune complex detection in human sera by polyethylene glycol precipitation // J. Immunol. - 1978. - Vol. 154, № 8. - P. 399-406.

13. Ihan Hren N., Ihan A. T lymphocyte activation and cytokine expression in periapical granulomas and radicular cysts // Arch. Oral. Biol. - 2009. - Vol. 54, № 2. - P. 156-161.

14. Indolfi G., Bartolini E., Azzari C. et al. Intrafamilial transmission of hepatitis C virus: infection of the father predicts the risk of perinatal transmission // J. Med. Virol. - 2008. - Vol. 80, № 11. - P. 1907-1911.

15. Mancini G., Carbonara A., Heremans J. Immunochemical quantitation of antigens by single radial diffusion // Immunochem. - 1965 - Vol. 2, № 3. - P. 235-254.

16. Martinez J., Huang X., Yang Y. Direct action of type I IFN on NK cells is required for their activation in response to vaccinia viral infection in vivo // J. Immunol. - 2008. - Vol. 180, № 3. - P. 1592-1597.

17. Shenoy A.R., Kim B.H., Choi H.P. et al. Emerging themes in IFN-gamma-induced macrophage immunity by the p47 and p65 GTPase families // Immunobiology. - 2007. - Vol. 212, № 9-10. - P. 771-784.

18. You J., Sriplung H., Geater A. et al. Impact of viral replication inhibition by entecavir on peripheral T lymphocyte subpopulations in chronic hepatitis B patients // BMC Infect. Dis. - 2008. - Vol. 8. - P. 123.

Показатели клеточного иммунитета у детей с ХГВ и ХГС

Показатели Контроль N=73 1 ХГВ N=35 2 ХГС N=17 3

Ме С25-С75 Ме С25-С75 Ме С25-С75

Лейкоциты, 109/л 5,00 4,00-6,80 5,80 4,90-7,30 5,20 4,00-7,00

pi<0,05

Лимфоциты, % 46,0 40,0-55,0 33,0 24,0-44,0 34,0 30,0-39,0

p1<0,001 p1<0,001

Лимфоциты, 109/л 2,25 1,60-3,10 1,90 1,52-2,84 1,78 1,24-2,86

CD3+, % 68,0 62,0-75,0 68,0 60,0-78,0 78,0 70,0-80,0

p1<0,05

CD3+, 109/л 1,63 1,25-2,17 1,37 0,95-2,09 1,31 0,87-2,27

CD4+, % 44,0 39,5-49,0 39,0 34,0-46,0 38,0 32,0-46,0

p1<0,01

CD4+, 109/л 1,04 0,71-1,36 0,75 0,55-1,07 0,71 0,44-1,05

p1<0,05 p1<0,05

CD8+, % 28,0 24,0-31,5 26,0 24,0-30,0 28,0 22,0-30,0

CD8+, 109/л 0,62 0,47-0,91 0,55 0,37-0,67 0,45 0,33-0,80

p1<0,05 p1<0,05

CD16+, % 16,0 12,0-18,0 16,0 11,0-20,0 13,0 10,0-16,0

CD16+, 109/л 0,39 0,23-0,49 0,25 0,14-0,43 0,24 0,11-0,41

p1<0,05

CD19+, % 12,0 8,5-14,0 18,0 15,0-22,0 19,0 18,0-28,0

p1<0,001 p1<0,001

CD19+, 109/л 0,28 0,17-0,37 0,38 0,23-0,50 0,40 0,24-0,63

p1<0,05

HLA-DR+, % 17,0 14,0-21,0 24,0 20,0-26,0 28,0 23,5-30,5

p1<0,001 p1<0,001

HLA-DR+, 109/л 0,38 0,25-0,60 0,47 0,27-0,62 0,48 0,27-0,79

CD4+/CD8+ 1,52 1,38-1,79 1,48 1,15-1,74 1,36 1,07-2,20

Примечание: p1 - статистически достоверные различия с

контрольными величинами; р2 - статистически достоверные различия с показателями больных ХГВ.

Показатели гуморального иммунитета у детей с ХГВ и ХГС

Контроль ХГВ ХГС

Показатели N=73 1 N=35 2 N=17 3

Ме С25-С75 Ме С25-С75 Ме С25-С75

Ig A, г/л 1,27 1,00-2,10 3,20 1,70-4,30 2,00 1,40-3,00

pi<0,001 p1<0,05

Ig M, г/л 1,38 1,09-2,13 2,00 1,10-3,50 1,80 1,40-3,00

Ig G, г/л 10,95 8,85-15,20 17,00 10,40- 25,80 18,20 12,80- 21,00

p1<0,01 p1<0,01

ЦИК, о.е. 9,00 3,00-26,00 30,00 14,00- 92,00 26,00 18,00- 84,00

p1<0,001 p1<0,001

Примечание: то же, что и для табл. 1.

Хемилюминесценция нейтрофильных гранулоцитов крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С

Показатели Контроль N=13 1 ХГВ N=35 2 ХГС N=17 3

Me С25-С75 Me С25-С75 Me С25-С75

Спонтанная хемилюминесценция

Tmax, сек 1167 1G47-1954 1755 1G98-229G 1471 628-1981

3 Imax, о.е-xlG 16,8G 1G,82- 25,G6 18,75 8,29-25,45 15,96 8,85-23,15

S, о-е^ек^Ю6 1,57 1,16-2,98 2,15 1,22-6,68 5,3G l,4G-6,85

Зимозан-индуцированная хемилюминесценция

Tmax, сек 1365 965-1452 1443 1242-1787 1427 1G84-1574

Imax, о.е^Ю 79,85 56,21- 8G,7G 39,94 25,64- 54,4G 36,3G 3G,52- 61,58

Pi<G,Gl pl<G,G5

S, о.e.xсeк.x106 6,97 4,4G-9,l2 5,68 2,68-9,87 11,6G 3,l2-l5,3G

Sинд/Sспонт 4,G5 2,25-5,42 1,96 1,33-2,91 2,15 l,46-3,3G

pl<G,G5

Примечание: то же, что и для табл. 1.

PDF created with pdfFactory Pro trial version www. pdffactory. com