ПОЛУЧЕНИЕ УЛУЧШЕННОЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ PAH ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТЯЖЕЛОЙ PKU С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ, НАПРАВЛЕННОЙ НА ПЕЧЕНЬ

1. Вариант полипептида фенилаланингидроксилазы (PAH), необязательно полипептид человеческой PAH, предусматривающий две, три или четыре аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256, при этом необязательно полипептид человеческой PAH дикого типа содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1.
2. Вариант полипептида PAH по п. 1, где аминокислотная замена предусматривает:
a) одну или несколько из M180T, K199P, S250P и G256A;
b) K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P или
c) M180T, K199P, S250P и G256A;
при этом необязательно вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или T323R и F327T, и/или вариант полипептида PAH характеризуется аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере приблизительно 80% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3 или содержит ее.
3. Вариант полипептида PAH по п. 1 или 2, где вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, G442A, P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, добавления S в положении 453, F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y, F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P и N376P, в полипептиде человеческой PAH дикого типа.
4. Вариант полипептида PAH, где вариант полипептида PAH предусматривает:
a) одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A и G442A, в полипептиде человеческой PAH дикого типа;
b) одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H и добавления S в положении 453, в полипептиде человеческой PAH дикого типа или
c) одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y, F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P и N376P, в полипептиде человеческой PAH дикого типа,
при этом необязательно вариант полипептида PAH предусматривает одно или несколько из:
i) N-концевого усечения, необязательно усечения N-концевого регуляторного домена и/или усечения аминокислотных остатков 1-102 полипептида PAH дикого типа;
ii) C-концевого усечения, необязательно усечения тетрамеризационного домена и/или усечения аминокислотных остатков 429-452 полипептида PAH дикого типа; и
iii) аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотным остаткам 103-428 полипептида PAH дикого типа.
5. Вариант полипептида PAH по любому из пп. 1-4, где вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой.
6. Вариант полипептида PAH по п. 5, где одна или несколько аминокислотных замен для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой расположены в положениях 270-295 и/или 380-405 полипептида PAH дикого типа.
7. Вариант полипептида PAH по любому из пп. 1-6, где вариант полипептида PAH слит с полипептидом, нацеливающимся на печень, при этом необязательно полипептид, нацеливающийся на печень, представлен HGF или его фрагментами или гликопротеинами, которые связываются с асиалогликопротеиновым рецептором гепатоцитов.
8. Вариант полипептида PAH по любому из пп. 1-5, где вариант полипептида PAH является пегилированным и/или нитрозилированным.
9. Вариант полипептида PAH по п. 6, где вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотную замену I374C, при этом остаток Cys в положении 374 является нитрозилированным.
10. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PAH, где:
a) полипептид PAH представляет собой вариант полипептида PAH по любому из пп. 1-9, и/или
b) полипептид PAH представляет собой полипептид человеческой PAH, а нуклеиновая кислота является кодон-оптимизированной, при этом необязательно нуклеиновая кислота представляет собой мРНК, или нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PAH, функционально связана с промотором, и промотор необязательно выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина (TTR), промотора mTTR482, промотора mA1MB2-mTTR482, промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, промотора LSP, промотора LP1, химерного промотора, специфического в отношении печени (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT), составного промотора энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/промотор гена β-глобина кролика (CAG), промотора гена фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа), промотора гена β-глюкуронидазы человека, промотора гена β-актина курицы (CBA), модифицированного промотора гена β-актина курицы (CBA) или SEQ ID NO:17, ретровирусного LTR-промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора гена дигидрофолатредуктазы и промотора гена 13-актина.
11. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 10, где нуклеиновая кислота дополнительно предусматривает одно или несколько из
сигнала полиаденилирования, необязательно сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнала полиаденилирования SV40 или pA TK HSV;
интрона, необязательно гибридного интрона генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика, еще более необязательно модифицированного гибридного интрона генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика под SEQ ID NO:15;
одного или нескольких ITR и спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты, при этом необязательно спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована с удалением последовательностей ATG, еще более необязательно спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой спейсерную последовательность интрона A1AT под SEQ ID NO:16.
12. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 10 или 11, где последовательность нуклеиновой кислоты на по меньшей мере 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:14 или содержит ее.
13. Кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с:
a) промотором, предусматривающим промотор гена транстиретина мыши (mTTR), при этом необязательно промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482; и
(i) энхансером, предусматривающим один или два модифицированных энхансера гена протромбина (pPrT2), один или два модифицированных энхансера гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb), энхансер II вируса гепатита B (HE11) или энхансер CRM8, при этом необязательно энхансер расположен со стороны 5'-конца относительно промотора mTTR; и/или
(ii) 3'-элементом, где 3'-элемент представляет собой 3'-элемент гена альбумина (3'Alb) или 3'-элемент гена альбумина, связанный с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу (SMAR) гена альфа-1-антитрипсина человека (3'AlbSMAR), при этом необязательно 3'-элемент расположен со стороны 3'-конца относительно трансгена;
и
при этом необязательно трансген кодирует полипептид PAH или вариант полипептида PAH.
14. Кассета экспрессии по п. 13, где кассета экспрессии дополнительно содержит
интрон, необязательно гибридный интрон генов β-актина курицы/β-глобина кролика; и/или
сигнал полиаденилирования, необязательно сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.
15. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 10-12 или кассету экспрессии по п. 13 или 14, где необязательно вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
16. Вектор на основе rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 10-12 или кассету экспрессии по п. 13 или 14, фланкированные одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где необязательно
нуклеиновая кислота или кассета экспрессии фланкированы двумя ITR AAV, и/или
ITR AAV представляют собой ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши.
17. Вектор на основе rAAV по п. 16, где вектор на основе rAAV содержит нуклеиновую кислоту по любому из пп. 10-12, при этом вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу
ITR AAV2;
промотор, необязательно промотор m1A1MB2-mTTR482 или промотор LP1;
интрон, необязательно гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика;
нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PAH, где необязательно полипептид PAH представляет собой вариант полипептида PAH по любому из пп. 1-9, и/или где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PAH, является кодон-оптимизированной нуклеиновой кислотой по п. 10 или 11;
спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты, при этом необязательно спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты из интрона гена альфа-1-антитрипсина человека, при этом еще более необязательно интрон гена альфа-1-антитрипсина человека был мутирован с удалением последовательностей ATG;
сигнал полиаденилирования, необязательно сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; и
ITR AAV2.
18. Вектор на основе rAAV по п. 16 или 17, где вектор представляет собой самокомплементарный вектор, при этом необязательно вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PAH, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности полипептида PAH,
при этом первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины, при этом еще более необязательно первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, где мутантный ITR AAV предусматривает делецию D-области и предусматривает мутацию последовательности концевого разрешения.
19. Частица rAAV, содержащая вектор на основе rAAV по любому из пп. 16-18, где необязательно:
a) вирусная частица rAAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1; или
b) вирусная частица rAAV содержит сконструированный капсид AAV, необязательно капсид DJ или капсид LK03.
20. Композиция, содержащая вариант полипептида PAH по любому из пп. 1-9, нуклеиновую кислоту по любому из пп. 10-12, кассету экспрессии по п. 13 или 14 или частицу rAAV по п. 19, где необязательно композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
21. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 10-12, кассету экспрессии по п. 13 или 14, вектор по п. 15 или вектор на основе rAAV по любому из пп. 16-18.
22. Способ получения варианта полипептида PAH, при этом способ включает культивирование клетки по п. 21 в условиях, обеспечивающих продуцирование варианта полипептида PAH, где необязательно способ дополнительно включает стадию очистки варианта полипептида PAH.
23. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума или снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму варианта полипептида PAH по любому из пп. 1-9, нуклеиновой кислоты по любому из пп. 10-12, кассеты экспрессии по п. 13 или 14, вектора по п. 15, вектора на основе rAAV по любому из пп. 16-18, частицы rAAV по п. 19, клетки по п. 21 или композиции по п. 20, где необязательно у индивидуума отсутствует активность PAH, или где уровень фенилаланина в крови у индивидуума до лечения является повышенным по сравнению с уровнем фенилаланина в крови у подобранных по принципу паритетности контрольных индивидуумов.
24. Способ по п. 23, где вариант полипептида PAH, нуклеиновую кислоту, кассету экспрессии, вектор, вектор на основе rAAV, частицу rAAV, композицию или клетку вводят внутривенно, внутриартериально, внутрипеченочно, внутрипортально, внутрибрюшинно или подкожно, и/или где введение осуществляют в комбинации с другим видом терапии, при этом необязательно другой вид терапии представляет собой лечение с помощью тетрагидробиоптерина, лечение с помощью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) или пегилированной PAL или диету с ограничением потребления фенилаланина.
25. Набор, содержащий вариант полипептида PAH по любому из пп. 1-9, нуклеиновую кислоту по любому из пп. 10-12, кассету экспрессии по п. 13 или 14, вектор по п. 15, вектор на основе rAAV по любому из пп. 16-18, частицу rAAV по п. 19 или композицию по п. 20, где необязательно набор дополнительно содержит инструкции по применению, буферы и/или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и/или флаконы, ампулы и/или шприцы.