НАПРАВЛЕННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА КРЫСЫ

1. Способ направленной модификации представляющего интерес геномного локуса в плюрипотентной клетке крысы, включающий:
(a) введение в плюрипотентную клетку крысы большого таргетирующего вектора (LTVEC), содержащего вставку нуклеиновой кислоты, фланкированную 5'-гомологичным плечом крысы и 3'-гомологичным плечом крысы, причем полная совокупность 5'- и 3'-гомологичных плечей составляет по меньшей мере 10 т.н., но менее 150 т.н., и
(b) идентификацию генетически модифицированной плюрипотентной клетки крысы, содержащей направленную генетическую модификацию в представляющем интерес локусе,
причем направленная генетическая модификация способна передаваться по зародышевой линии.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация является биаллельной.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку крысы.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что плюрипотентную клетку крысы получают из штамма DA или штамма ACI.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы характеризуется экспрессией по меньшей мере одного маркера плюрипотентности, включающего Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, рецептор LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 или их комбинацию.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы характеризуется одним или более из следующих свойств:
(а) отсутствие экспрессии одного или более маркеров плюрипотентности, включающих с-Myc, Ecat1 и/или Rexo1;
(b) отсутствие экспрессии мезодермальных маркеров, включающих ген брахиурии и/или Bmpr2;
(c) отсутствие экспрессии одного или более эндодермальных маркеров, включающих Gata6, Sox17 и/или Sox7, или
(d) отсутствие экспрессии одного или более нейральных маркеров, включающих Nestin и/или Рах6.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полная совокупность 5'- и 3'-гомологичных плечей LTVEC составляет от около 10 т.н. до около 30 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 120 т.н. или от около 120 т.н. до 150 т.н.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полная совокупность 5'- и 3'-гомологичных плечей LTVEC составляет от около 16 т.н. до около 150 т.н.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация включает:
(a) замену эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты крысы гомологичной или ортологичной последовательностью нуклеиновой кислоты;
(b) делецию эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты крысы;
(c) делецию эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты крысы,
причем делеция находится в диапазоне от около 5 т.н. до около 10 т.н., от около 10 т.н. до около 20 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 150 т.н. или от около 150 т.н. до около 200 т.н., от около 200 т.н. до около 300 т.н., от около 300 т.н. до около 400 т.н., от около 400 т.н. до около 500 т.н., от около 500 т.н. до 1 м.н., от около 1 м.н. до около 1,5 м.н., от около 1,5 м.н. до около 2 м.н., от около 2 м.н. до около 2,5 м.н. или от около 2,5 м.н. до около 3 м.н.;
(d) экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, находящуюся в диапазоне от около 5 т.н. до около 10 т.н., от около 10 т.н. до около 20 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 150 т.н., от около 150 т.н. до около 200 т.н., от около 200 т.н. до около 250 т.н., от около 250 т.н. до около 300 т.н., от около 300 т.н. до около 350 т.н. или от около 350 т.н. до около 400 т.н.;
(e) экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую гомологичную или ортологичную последовательность нуклеиновой кислоты;
(f) химерную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты человека и крысы;
(g) условную аллель, фланкированную целевыми последовательностями сайт-специфической рекомбиназы, или
(h) репортерный ген, функционально связанный с промотором активным в клетке крысы.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что представляющий интерес геномный локус содержит: (i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна 5'-гомологичному плечу крысы, и (ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна 3'-гомологичному плечу крысы.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что первая и вторая последовательность нуклеиновой кислоты разделены по меньшей мере 5 т.н., но менее 3 м.н.
12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что первая и вторая последовательность нуклеиновой кислоты разделены по меньшей мере 5 т.н., но менее 10 т.н., по меньшей мере 10 т.н., но менее 20 т.н., по меньшей мере 20 т.н., но менее 40 т.н., по меньшей мере 40 т.н., но менее 60 т.н., по меньшей мере 60 т.н., но менее 80 т.н., по меньшей мере около 80 т.н., но менее 100 т.н., по меньшей мере 100 т.н., но менее 150 т.н., или по меньшей мере 150 т.н., но менее 200 т.н., по меньшей мере около 200 т.н., но менее около 300 т.н., по меньшей мере около 300 т.н., но менее около 400 т.н., по меньшей мере около 400 т.н., но менее около 500 т.н., по меньшей мере около 500 т.н., но менее около 1 м.н., по меньшей мере около 1 м.н., но менее около 1,5 м.н., по меньшей мере около 1,5 м.н., но менее около 2 м.н., по меньшей мере около 2 м.н., но менее около 2,5 м.н. или по меньшей мере около 2,5 м.н., но менее около 3 м.н.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что стадия введения (а) дополнительно включает введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, который способствует гомологичной рекомбинации между таргетирующей конструкцией и представляющим интерес геномным локусом в плюрипотентной клетке крысы.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что нуклеазный агент включает
(a) химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе цинкового пальца, гибридизированный с эндонуклеазой FokI, или
(b) химерный белок, содержащий подобную активатору транскрипции эффекторную нуклеазу (TALEN), гибридизированную с эндонуклеазой FokI.
15. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что стадия введения (а) дополнительно включает введение в плюрипотентную клетку крысы:
(i) первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный с первой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR),
(ii) второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный с геномной целевой последовательностью, связанной с гидовой РНК (гРНК),
причем геномная целевая последовательность непосредственно фланкирована на 3'-конце последовательностью мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ).
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что представляющий интерес геномный локус содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID №: 1.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что гРНК содержит третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую РНК (crRNA) коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), и трансактивирующую РНК CRISPR (tracrRNA).
18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что белок Cas представляет собой Cas9.
19. Способ по п. 15, отличающийся тем, что гРНК включает:
(a) химерную РНК с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 2 или
(b) химерную РНК с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 3.
20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что crRNA содержит SEQ ID №: 4; SEQ ID №: 5 или SEQ ID №: 6.
21. Способ по п. 17, отличающийся тем, что tracrRNA содержит SEQ ID №: 7 или SEQ ID №: 8.
22. Модифицированный геномный локус крысы, содержащий:
(i) инсерцию гомологичной или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты человека;
(ii) замену эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты крысы гомологичной или ортологичной последовательностью нуклеиновой кислоты человека или
(iii) их комбинацию,
причем модифицированный геномный локус крысы способен передаваться по зародышевой линии.
23. Модифицированный геномный локус крысы по п. 22, отличающийся тем, что размер инсерции или замены составляет от около 5 т.н. до около 400 т.н.
24. Геномный локус крысы по п. 22, отличающийся тем, что размер инсерции или замены составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н., от около 10 т.н. до около 20 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 150 т.н., от около 150 т.н. до около 200 т.н., от около 200 т.н. до около 250 т.н., от около 250 т.н. до около 300 т.н., от около 300 т.н. до около 350 т.н. или от около 350 т.н. до около 400 т.н.
25. Способ создания гуманизированной крысы, включающий:
(a) таргетинг представляющего интерес геномного локуса в плюрипотентной клетке крысы таргетирующей конструкцией, содержащей нуклеиновую кислоту человека, для образования генетически модифицированной плюрипотентной клетки крысы;
(b) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки крысы в эмбрион-хозяин крысы и
(c) вынашивание эмбриона-хозяина крысы суррогатной матерью; причем суррогатная мать воспроизводит потомство крыс, содержащее модифицированный геномный локус, который включает:
(i) инсерцию последовательности нуклеиновой кислоты человека;
(ii) замену последовательности нуклеиновой кислоты крысы в представляющем интерес геномном локусе гомологичной или ортологичной последовательностью нуклеиновой кислоты человека;
(iii) химерную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты человека и крысы, или
(iv) их комбинацию,
причем модифицированный геномный локус способен передаваться по зародышевой линии.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что таргетирующая конструкция представляет собой большой таргетирующий вектора (LTVEC), а полная совокупность 5'- и 3'-гомологичных плечей LTVEC составляет по меньшей мере 10 т.н., но менее 150 т.н.
27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что полная совокупность 5'- и 3'-гомологичных плечей таргетирующей конструкции составляет от около 10 т.н. до около 30 т.н., от около 20 т.н. до 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н. или от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 120 т.н. или от около 120 т.н. до 150 т.н.
28. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты человека составляет по меньшей мере 5 т.н., но менее 400 т.н.
29. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты человека составляет по меньшей мере 5 т.н., но менее 10 т.н., по меньшей мере 10 т.н., но менее 20 т.н., по меньшей мере 20 т.н., но менее 40 т.н., по меньшей мере 40 т.н., но менее 60 т.н., по меньшей мере 60 т.н., но менее 80 т.н., по меньшей мере около 80 т.н., но менее 100 т.н., по меньшей мере 100 т.н., но менее 150 т.н., по меньшей мере 150 т.н., но менее 200 т.н., по меньшей мере 200 т.н., но менее 250 т.н., по меньшей мере 250 т.н., но менее 300 т.н., по меньшей мере 300 т.н., но менее 350 т.н. или по меньшей мере 350 т.н., но менее 400 т.н.
30. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку крысы.
31. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что плюрипотентную клетку крысы получают из штамма DA или штамма ACI.
32. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы характеризуется экспрессией по меньшей мере одного маркера плюрипотентности, включающего Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, рецептор LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 или их комбинацию.
33. Способ по любому из пп. 25-27, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы характеризуется одной или более из следующих особенностей:
(a) отсутствие экспрессии одного или более маркеров плюрипотентности, включающих с-Myc, Ecat1 и/или Rexo1;
(b) отсутствие экспрессии одного или более мезодермальных маркеров, включающих ген брахиурии и/или Bmpr2;
(c) отсутствие экспрессии одного или более эндодермальных маркеров, включающих Gata6, Sox17 и/или Sox7, или
(d) отсутствие экспрессии одного или более нейральных маркеров, включающих Nestin и/или Рах6.
34. Модифицированная крыса, содержащая гуманизированный геномный локус, причем гуманизированный геномный локус включает:
(i) инсерцию гомологичной или ортологичной последовательности нуклеиновой кислоты человека;
(ii) замену последовательности нуклеиновой кислоты крысы в эндогенном геномном локусе гомологичной или ортологичной последовательностью нуклеиновой кислоты человека;
(iii) химерную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты человека и крысы, или
(iv) их комбинацию,
причем гуманизированный геномный локус способен передаваться по зародышевой линии.
35. Крыса или клетка крысы, содержащая направленную генетическую модификацию в своем геномном локусе,
причем геномный локус представляет собой локус рецептора гамма интерлейкина-2, локус АроЕ, локус Rag1, локус Rag2 или локус Rag2/Rag1,
причем направленная генетическая модификация включает:
(a) делецию эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты крысы в геномном локусе;
(b) инсерцию гомологичной нуклеиновой кислоты, ортологичной нуклеиновой кислоты или химерной нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты человека и крысы, или
(c) их комбинацию,
при этом направленная генетическая модификация является передаваемой по зародышевой линии крысы или крысы, воспроизведенной из клетки крысы.
36. Крыса или клетка крысы по п. 35, отличающаяся тем, что
(a) делеция эндогенной нуклеиновой кислоты крысы в геномном локусе составляет по меньшей мере около 10 т.н. или
(b) делеция эндогенной нуклеиновой кислоты крысы в геномном локусе составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н., от около 10 т.н. до около 20 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 150 т.н. или от около 150 т.н. до около 200 т.н., от около 200 т.н. до около 300 т.н., от около 300 т.н. до около 400 т.н., от около 400 т.н. до около 500 т.н., от около 500 т.н. до 1 м.н., от около 1 м.н. до около 1,5 м.н., от около 1,5 м.н. до около 2 М.Н., от около 2 м.н. до около 2,5 м.н. или от около 2,5 м.н. до около 3 м.н.;
(c) инсерция экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе составляет по меньшей мере около 5 т.н. или
(d) инсерция экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н., от около 10 т.н. до около 20 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 150 т.н., от около 150 т.н. до около 200 т.н., от около 200 т.н. до около 250 т.н., от около 250 т.н. до около 300 т.н., от около 300 т.н. до около 350 т.н. или от около 350 т.н. до около 400 т.н.
37. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что
(a) направленная генетическая модификация в локусе рецептора гамма интерлейкина-2 приводит к уменьшению активности или потере активности белка рецептора гамма интерлейкина-2;
(b) направленная генетическая модификация в локусе АроЕ приводит к уменьшению активности или потере активности белка АроЕ;
(c) направленная генетическая модификация в локусе Rag1 приводит к уменьшению активности или потере активности белка Rag1;
(d) направленная генетическая модификация в локусе Rag2 приводит к уменьшению активности или потере активности белка Rag2 или
(e) направленная генетическая модификация в локусе Rag2/Rag1 приводит к уменьшению активности или потере активности белка Rag2 и активности Rag1.
38. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что направленная генетическая модификация локуса рецептора гамма интерлейкина-2 включает:
(a) делецию целого кодирующего участка рецептора гамма интерлейкина-2 крысы или его части;
(b) замену целого кодирующего участка рецептора гамма интерлейкина-2 крысы или его части кодирующим участком рецептора гамма интерлейкина-2 человека или его частью или
(c) замену эктодомена кодирующего участка рецептора гамма интерлейкина-2 крысы эктодоменом рецептора гамма интерлейкина-2 человека или
(d) по меньшей мере делецию размером 3 т.н. локуса рецептора гамма интерлейкина-2.
39. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что направленная генетическая модификация локуса АроЕ включает:
(a) делецию целого кодирующего участка АроЕ или его части или
(b) по меньшей мере делецию размером 1,8 т.н. локуса АроЕ, содержащую кодирующий участок АроЕ.
40. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что направленная генетическая модификация локуса Rag2 включает:
(a) делецию целого кодирующего участка Rag2 или его части;
(b) по меньшей мере делецию размером 5,7 т.н. локуса Rag2, содержащую кодирующий участок Rag2.
41. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что направленная генетическая модификация локуса Rag2/Rag1 включает:
(a) делецию целого кодирующего участка Rag2 или его части и делецию целого кодирующего участка Rag1 или его части или
(b) делецию размером по меньшей мере 16 т.н. локуса Rag2/Rag1, содержащую кодирующий участок Rag2.
42. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что направленная генетическая модификация включает инсерцию экспрессионной кассеты, содержащей селективный маркер в локусе рецептора гамма интерлейкина-2, локусе АроЕ, локусе Rag1, локусе Rag2 или локусе Rag2/Rag1.
43. Крыса или клетка крысы по п. 42, отличающаяся тем, что экспрессионная кассета содержит ген lacZ, функционально связанный с эндогенным промотором в геномном локусе, и промотор убиквитина человека, функционально связанный с селективным маркером.
44. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что направленная генетическая модификация в локусе рецептора гамма интерлейкина-2, локусе АроЕ, локусе Rag1, локусе Rag2 или локусе Rag2/Rag1 включает инсерцию самоделетирующейся селекционной кассеты.
45. Крыса или клетка крысы по п. 44, отличающаяся тем, что самоделетирующаяся селекционная кассета содержит ген селективного маркера, функционально связанный с промотором активным в клетке крысы, и ген рекомбиназы, функционально связанный со специфическим по мужским зародышевым клеткам промотором, причем самоделетирующаяся селекционная кассета фланкирована сайтами рекомбинационного распознавания, распознаваемыми рекомбиназой.
46. Крыса или клетка крысы по п. 45, отличающаяся тем, что
(a) специфический по мужским зародышевым клеткам промотор представляет собой промотор протамина-1 или
(b) ген рекомбиназы кодирует Cre, а сайты рекомбинационного распознавания являются сайтами loxP.
47. Крыса или клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что инсерция экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе содержит репортерную нуклеиновую кислоту, функционально связанную с эндогенным промотором рецептора гамма интерлейкина-2, эндогенным промотором АроЕ, эндогенным промотором Rag1 или эндогенным промотором Rag2.
48. Крыса или клетка крысы по п. 47, отличающаяся тем, что репортерная нуклеиновая кислота кодирует репортер, включающий β-галактозидазу, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, белок с улучшенной желтой флуоресценцией (EYFP), Emerald, белок с улучшенной зеленой флуоресценцией (EGFP), CyPet, белок с голубой флуоресценцией (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазу, щелочную фосфатазу или их комбинацию.
49. Клетка крысы по п. 35 или 36, отличающаяся тем, что клетка крысы представляет собой плюрипотентною клетку крысы или эмбриональную стволовую (ЭС) клетку крысы.
50. Клетка крысы по п. 49, отличающаяся тем, что плюрипотентная клетка крысы или эмбриональная стволовая (ЭС) клетка крысы
(a) получена из штамма DA или штамма ACI;
(b) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного маркера плюрипотентности, включающего Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, рецептор LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 или их комбинацию, или
(c) характеризуется одним или более из следующих свойств:
(i) отсутствие экспрессии одного или более маркеров плюрипотентности, включающих с-Myc, Ecat1 и/или Rexo1;
(ii) отсутствие экспрессии мезодермальных маркеров, включающих ген брахиурии и/или Bmpr2;
(iii) отсутствие экспрессии одного или более эндодермальных маркеров, включающих Gata6, Sox17 и/или Sox7, или
(iv) отсутствие экспрессии одного или более нейральных маркеров, включающих Nestin и/или Рах6.
51. Способ модификации целевого геномного локуса в локусе рецептора гамма интерлейкина-2, локусе АроЕ, локусе Rag1, локусе Rag2 или локусе Rag2/Rag1 в плюрипотентной клетке крысы, причем способ включает:
(а) введение в плюрипотентную клетку крысы большого таргетирующего вектора, содержащего вставку нуклеиновой кислоты, фланкированную 5'- и 3'-гомологичными плечами крысы, гомологичными целевому геномному локусу,
(b) идентификацию генетически модифицированной плюрипотентной клетки крысы, содержащей направленную генетическую модификацию в целевом геномном локусе,
причем направленная генетическая модификация способна передаваться по зародышевой линии крысы, воспроизведенной из плюрипотентной клетки крысы.
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что таргетирующий вектор представляет собой большой таргетирующий вектора (LTVEC), в котором полная совокупность 5'- и 3'-гомологичных плечей крысы составляет по меньшей мере 10 т.н., но менее 150 т.н.
53. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что введение таргетирующего вектора в плюрипотентную клетку крысы приводит к: (i) делеции эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты крысы в целевом геномном локусе; (ii) инсерции экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в целевой геномный локус или (iii) их комбинации.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что
(a) делеция эндогенной нуклеиновой кислоты крысы в геномном локусе составляет по меньшей мере около 10 т.н. или
(b) делеция эндогенной нуклеиновой кислоты крысы в геномном локусе составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н., от около 10 т.н. до около 20 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 150 т.н. или от около 150 т.н. до около 200 т.н., от около 200 т.н. до около 300 т.н., от около 300 т.н. до около 400 т.н., от около 400 т.н. до около 500 т.н., от около 500 т.н. до 1 м.н., от около 1 м.н. до около 1,5 м.н., от около 1,5 м.н. до около 2 м.н., от около 2 м.н. до около 2,5 м.н. или от около 2,5 м.н. до около 3 м.н.;
(с) инсерция экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе составляет по меньшей мере около 5 т.н. или
(d) инсерция экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н., от около 10 т.н. до около 20 т.н., от около 20 т.н. до около 40 т.н., от около 40 т.н. до около 60 т.н., от около 60 т.н. до около 80 т.н., от около 80 т.н. до около 100 т.н., от около 100 т.н. до около 150 т.н., от около 150 т.н. до около 200 т.н., от около 200 т.н. до около 250 т.н., от около 250 т.н. до около 300 т.н., от около 300 т.н. до около 350 т.н. или от около 350 т.н. до около 400 т.н.
55. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что
(a) направленная генетическая модификация в локусе рецептора гамма интерлейкина-2 приводит к уменьшению активности или потере активности белка рецептора гамма интерлейкина-2;
(b) направленная генетическая модификация в локусе АроЕ приводит к уменьшению активности или потере активности белка АроЕ;
(c) направленная генетическая модификация в локусе Rag1 приводит к уменьшению активности или потере активности белка Rag1;
(d) направленная генетическая модификация в локусе Rag2 приводит к уменьшению активности или потере активности белка Rag2 или
(e) направленная генетическая модификация в локусе Rag2/Rag1 приводит к уменьшению или потере активности белка Rag2 и потере активности белка Rag1.
56. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация локуса рецептора гамма интерлейкина-2 включает:
(a) делецию целого кодирующего участка рецептора гамма интерлейкина-2 крысы или его части;
(b) замену целого кодирующего участка рецептора гамма интерлейкина-2 крысы или его части кодирующим участком рецептора гамма интерлейкина-2 человека или его частью или
(c) замену эктодомена кодирующего участка рецептора гамма интерлейкина-2 крысы эктодоменом рецептора гамма интерлейкина-2 человека или
(d) по меньшей мере делецию размером 3 т.н. локуса рецептора гамма интерлейкина-2, содержащую кодирующий участок рецептора гамма интерлейкина-2.
57. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация локуса АроЕ включает:
(a) делецию целого кодирующего участка АроЕ или его части или
(b) по меньшей мере делецию размером 1,8 т.н. локуса АроЕ, содержащую кодирующий участок АроЕ.
58. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация локуса Rag2 включает:
(a) делецию целого кодирующего участка Rag2 или его части или
(b) по меньшей мере делецию размером 5,7 т.н. локуса Rag2, содержащую кодирующий участок Rag2.
59. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация локуса Rag1/Rag2 включает:
(a) делецию целого кодирующего участка Rag2 или его части и делецию целого кодирующего участка Rag1 или его части, или
(b) делецию размером по меньшей мере 16 т.н. локуса Rag2/Rag1, содержащую кодирующие участки Rag2 и Rag1.
60. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что вставка нуклеиновой кислоты содержит экспрессионную кассету, включающую полинуклеотид, кодирующий селективный маркер.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что экспрессионная кассета содержит ген lacZ, функционально связанный с эндогенным промотором в геномном локусе, и промотор убиквитина человека, функционально связанный с геном селективного маркера.
62. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что вставка нуклеиновой кислоты содержит самоделетирующуюся селекционную кассету.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что самоделетирующаяся селекционная кассета содержит ген селективного маркера, функционально связанный с промотором активным в плюрипотентной клетке крысы, и полинуклеотид, кодирующий рекомбиназу, функционально связанную со специфическим по мужским зародышевым клеткам промотором, причем самоделетирующаяся селекционная кассета фланкирована сайтами рекомбинационного распознавания, распознаваемыми рекомбиназой.
64. Способ по п. 63, отличающийся тем, что
(a) специфический по мужским зародышевым клеткам промотор представляет собой промотор протамина-1 или
(b) ген рекомбиназы кодирует Cre, а сайты рекомбинационного распознавания являются сайтами loxP.
65. Способ по п. 53, отличающийся тем, что инсерция экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в геномном локусе содержит репортерную последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с эндогенным промотором рецептора гамма интерлейкина-2, эндогенным промотором АроЕ, эндогенным промотором Rag1 или эндогенным промотором Rag2.
66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что репортерная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует репортер, включающий β-галактозидазу, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, белок с улучшенной желтой флуоресценцией (EYFP), Emerald, белок с улучшенной зеленой флуоресценцией (EGFP), CyPet, белок с голубой флуоресценцией (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазу, щелочную фосфатазу или их комбинацию.
67. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку крысы.
68. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что плюрипотентная клетка крысы
(a) получена из штамма DA или штамма ACI, или
(b) характеризуется экспрессией маркера плюрипотентности, включающего Oct-4, Sox-2, щелочную фосфатазу или их комбинацию, или
(c) характеризуется одним или более из следующих свойств:
(i) отсутствие экспрессии одного или более маркеров плюрипотентности, включающих с-Myc, Ecat1 и/или Rexo1;
(ii) отсутствие экспрессии мезодермальных маркеров, включающих ген брахиурии и/или Bmpr2;
(iii) отсутствие экспрессии одного или более эндодермальных маркеров, включающих Gata6, Sox 17 и/или Sox7, или
(iv) отсутствие экспрессии одного или более нейральных маркеров, включающих Nestin и/или Рах6.
69. Способ по п. 51 или 52, дополнительно включающий идентификацию направленной генетической модификации в целевом геномном локусе, причем на стадии идентификации применяется количественный анализ для оценки модификации аллели (МОА) в целевом геномном локусе.
70. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что стадия введения (а) дополнительно включает введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, который способствует гомологичной рекомбинации между таргетирующим вектором и целевым геномным локусом в плюрипотентной клетке крысы.
71. Способ по п. 70, отличающийся тем, что нуклеазный агент включает химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе цинкового пальца, гибридизированный с эндонуклеазой FokI.
72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что способ приводит к биаллельной модификации целевого геномного локуса.
73. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что стадия введения (а) дополнительно включает введение в плюрипотентную клетку крысы:
(i) первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный с первой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR),
(ii) второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный с геномной целевой последовательностью, связанной с гидовой РНК (гРНК),
причем геномная целевая последовательность непосредственно фланкирована на 3'-конце последовательностью мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ).
74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что представляющий интерес геномный локус содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID №: 1.
75. Способ по п. 73, отличающийся тем, что гРНК содержит третью последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую РНК (crRNA) коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), и трансактивирующую РНК CRISPR (tracrRNA).
76. Способ по п. 73, отличающийся тем, что белок Cas представляет собой Cas9.
77. Способ по п. 73, отличающийся тем, что гРНК включает:
(a) химерную РНК с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 2 или
(b) химерную РНК с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 3.
78. Способ по п. 75, отличающийся тем, что crRNA содержит SEQ ID №: 4; SEQ ID №: 5 или SEQ ID №: 6.
79. Способ по п. 75, отличающийся тем, что tracrRNA содержит SEQ ID №: 7 или SEQ ID №: 8.