Анализ количества клеток с фенотипом CD34+CD38- и CD34+cd38-cd19+ в качестве потенциальных лейкемических стволовых клеток при остром лимфобластном лейкозе у детей

66

Актуальные вопросы гематологии

Полученные данные позволяют заключить, что частота нахождения родственного гистосовместимого донора связана с особенностями распределения некоторых параметров системы HLA у больных и их сибсов.

Учитывая, что одной из поставленных це-

лей проводимых исследований являлось определение возможностей поиска неродственного донора ГСКК для трансплантации, целесообразно было сравнить распределение HLA-антигенов белорусской популяции доноров с жителями других стран (таблица 2).

Таблица 2 — Сравнительные данные частоты HLA генов среди жителей г. Минска и других популяций

Антиген г. Минск г. Москва г. Санкт-Петербург Западная Европа Польша

А1 0,1369 0,1403 0,1042 0,1580 0,1398

А2 0,2789 0,2986 0,3059 0,2700 0,2720

А3 0,1544 0,1288 0,1454 0,1260 0,1282

А9 0,1112 0,1242 0,1482 0,1036 0,1365

А25 0,0646 0,0635 0,0304 0,0204 0,0408

А26 0,0487 0,0476 0,0646 0,0395 0,0356

А11 0,0726 0,0529 0,0852 0,0506 0,0890

Аw19 0,0972 0,1013 0,0660 0,1499 0,0963

A28 0,0228 0,0258 0,0410 0,0439 0,0305

Ax 0,0127 0,0140 0,0006 0,0221 0,0112

B5 0,0646 0,0726 0,1148 0,0589 0,0824

B7 0,1254 0,1340 0,1489 0,1040 0,0890

B8 0,0540 0,0840 0,0775 0,0917 0,0673

B12 0,1056 0,0689 0,1042 0,1660 0,1000

B13 0,0566 0,0450 0,0339 0,0319 0,0566

B14 0,0228 0,0424 0,0373 0,0240 0,0305

B15 0,0619 0,0673 0,0605 0,0485 0,0513

B16 0,0593 0,0286 0,0301 0,0532 0,0764

B17 0,0461 0,0398 0,0386 0,0573 0,0566

B18 0,0945 0,0434 0,0541 0,0620 0,0356

B21 0,0126 0,0228 0,0179 0,0218 0,0303

Bw22 0,0305 0,0151 0,0233 0,0364 0,0566

B27 0,0434 0,0356 0,0510 0,0463 0,0566

B35 0,0835 0,0945 0,0635 0,0986 0,1112

B37 0,0177 — 0,0077 0,0112 —

B40 0,0673 0,0673 0,0622 0,0811 0,0513

B41 0,0202 0,0228 0,0282 — 0,0101

Bx 0,0340 0,1159 0,0532 0,0356 0,0282

Анализ представленных данных показал, что во всех рассматриваемых популяциях имеет место одинаковое значение частот HLA генов. Следовательно, при поиске потенциальных доноров СКК для неродственных трансплантаций реально существует возможность их нахождения не только в регистре данных Республики Беларусь, но и в аналогичных регистрах других стран. При этом предпочтение при интеграции следует отдавать странам с западнославянской популяцией населения.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

1. Зарецкая, Ю. М. HLA 50 лет / Ю. М. Зарецкая, Ю. А. Леднев. — Тверь, 2008. — 152 с.

2. Миланович, Н. Ф. Трансплантация гемопоэтических клеток в Республике Беларусь / Н. Ф. Миланович // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: тр. Всерос. на-уч.-практ. конф., посвящ. 50-летию Кировского НИИ гематологии и переливания крови. — Минск, 2010. — С. 254-256.

3. Трансплантация аллогенных и аутологичных гемопоэтических стволовых клеток при острых лейкозах (итоги 20-летнего опыта) / В. Г. Савченко [и др.] // Терапевтический архив. — 2007. — Т. 79, № 7. — С. 30-35.

4. Bone marrow donor’s worldwide annual report 2008. — Leiden, 2009.

5. Bone marrow donor’s worldwide annual report 2009 — Leiden, 2010.

УДК 616.155.392-003.24-036.11-053.2+615.324

АНАЛИЗ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК С ФЕНОТИПОМ CD34+CD38- И CD34+CD38-CD19+ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЛЕЙКЕМИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ОСТРОМ ЛИМФОБЛАСТНОМ ЛЕЙКОЗЕ У ДЕТЕЙ

Л. В. Мовчан, Т. В. Шман

Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии, г. Минск

Методом многопараметрической проточной цитофлуориметрии определяли количество предполагаемых лейкемических стволовых клеток (ЛСК) в образцах костного мозга 54 пациентов с первичным В-линейным острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) на момент диагностики лейкоза (0-й день), уровень минимальной ос-

Актуальные вопросы гематологии

67

таточной болезни (МОБ) определяли на 0-й и 15-й дни индукционной терапии. В ходе работы было выявлено, что среди клеток с фенотипом СБ34+С038- преобладали лейкемические предшественники В-клеток с фенотипом СБ34+СВ38-СБ19+. Большее процентное содержание как СБ34+Сб38-, так и СВ34+СБ38-СБ19+ среди общей популяции лейкемических клеток ассоциировалось с худшим ответом на терапию. Поэтому исходное количество таких клеток может рассматриваться как прогностический маркер при ОЛЛ у детей.

Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, минимальная остаточная болезнь.

ANALYSIS OF THE NUMBER OF CELLS WITH CD34+CD38-AND CD34+CD38-CD19+ PHENOTYPES AS POTENTIAL LEUKEMIC STEM CELLS IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA IN CHILDREN

L. V. Movchan, T. V. Shman

Republican Research Center for Pediatric Oncology and Hematology, Minsk

The number of the supposed leukemic stem cells in marrow samples of 54 patients with primary B-linear acute lymphoblastic leukemia was detected by the method of multiparametric flow cytofluorimetry in leukemia diagnosis (zero day). The level of minimal residual disease was estimated on zero and on the fifteenth days of induction therapy. In the course of the research it was found out that leukemic B-cell precursors with СD34+СD38-CD19+ phenotype prevailed among the cells with СD34+СD38-phenotype. The high percentage of both СБ34+СБ38-, СБ34+СБ38-, and СD34+СD38-CD19+ among the general population leukemic cells was associated with a worse response to the therapy. Therefore, the initial number of such cells can be considered as a prognostic marker in acute lymphoblastic leukemia in children.

Key words: acute lymphoblastic leukemia, minimal residual disease, flow cytofluometry, leukemic stem cells.

Введение

Актуальной проблемой в онкологии является выявление и характеристика свойств стволовых опухолевых клеток, которые инициируют и поддерживают рост опухоли, а также способствуют прогрессии заболевания. В середине 90-х гг. XX в. были получены первые экспериментальные данные о существовании особой популяции клеток при остром миелоид-ном лейкозе (ОМЛ) с иммунофенотипом GD34+CD38-, которая способна инициировать лейкоз в иммунодефицитных мышах [7]. Клетки с такими свойствами называют лейкоз инициирующими или лейкемическими стволовыми клетками (ЛСК) [2]. В случае с острым ОЛЛ нет единого мнения о фенотипе ЛСК. Есть данные указывающие, что клетки с фенотипом CD19-CD133+ [4], CD34+CD38+ CD19+ и CD34+CD38-CD19+ [6], CD34+CD19-,

CD34+CD19+, так и CD34-CD19+ [8] обладают свойствами ЛСК. При этом выявлено, что количество клеток с фенотипом СD34+CD38-при диагностике лейкоза ассоциируется с неблагоприятным прогнозом при ОМЛ у детей [10], а также прямо коррелирует с количеством остаточных лейкемических клеток при терапии ОЛЛ у детей [5].

Цель исследования

Исследование количества клеток с иммунофенотипом СD34+СD38- и СD34+СD38-СD19+ в качестве потенциальных ЛСК, а также оценка взаимосвязи между их содержанием и ранним ответом на терапию при В-линейном ОЛЛ у детей.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены 54 пациента с первичным В-линейным ОЛЛ. Среди них лей-козные клетки 4-х пациентов имели иммунофенотип Pro-B, common B — 47 пациентов, Pre-B — 3 пациента. Все пациенты проходили лечение по протоколу МБ-2008 в ГУ «РНПЦДОГ».

Определение количества предполагаемых ЛСК проводили в образцах костного мозга пациентов на момент диагностики лейкоза (0-й день), уровень МОБ анализировали на 0-й и 15-й дни терапии методом четырехцветной проточной цитофлуориметрии. Использовали моноклональные антитела, конъюгированные с FITC, PE, PE-Cy5, PE-Cy7 в различных комбинациях. Для определения содержания предполагаемых ЛСК использовали комбинацию антител CD45/CD38/ CD34/CD19. Для анализа МОБ использовали следующие комбинации антител — CD45/CD20/CD10/CD19; CD45/CD34/CD10/CD19; GD45/CD38/CD10/CD19; CD45/CD11a/CD10/CD19; CD45/CD58/CD10/CD19 и методику, описанную ранее [1]. Учет и анализ результатов проводили на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter) в программе CXP. Учитывали не менее 500 тыс. клеток.

Статистический анализ проводили в программе «Statistica» 6.0. Результаты представлены в виде значений медианы и диапазона данных (25-75 персентили). Достоверность различий между независимыми группами рассчитывали с помощью U-теста Манна-Уитни. Корреляционные зависимости оценивали по тесту Спирмана.

68

Актуальные вопросы гематологии

Результаты исследования и их обсуждение Для 54 пациентов на момент диагностики ОЛЛ проанализировали количество лейкемических

клеток с возможными лейкоз-инициирующими свойствами. На рисунке 1 представлен пример такого анализа.

Рисунок 1 — Пример количественного анализа клеток предполагаемых ЛСК: а — распределение клеток по светорассеиванию; б — распределение клеток по экспрессии CD45; в — распределение клеток по экспрессии CD38 и CD34; г — гистограмма распределения клеток по экспрессии СD19

Клетки с фенотипом СВ34+СБ38-СБ19+ наиболее часто рассматривают в качестве потенциальных ЛСК при В-линейном ОЛЛ [9]. Для анализа их количества живые клетки выделяли по показателям прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания (а, регион R1), затем по сниженной экспрессии CD45 определяли регион бластных клеток (б, R2), далее среди бласт-ных клеток рассчитывали количество СD34+ (в, регион R3), а также процент наименее дифференцированных СD34+СD38-клеток (в, регион R4). Так, как среди СD34+СD38-клеток могут быть представлены нормальные гемопоэтические предшественники, поэтому далее дополнительно рассчитывали количество СD34+СD38-клеток, экспрессирующих CD19 (г, регион R5).

Среди бластных клеток для всех проанализированных случаев медиана количества СD34+ клеток составила 61 (7,9-95,2) %, СD34+СD38-клеток — 1,6 (0,3-10,8) %, СD34+СD38-СD19+ клеток — 1,4 (0,1-10,6) %. Таким образом, наблюдали прямую корреляцию между содержанием СD34+СD38-СD19+клеток и количеством СD34+ (R = 0,5 при р < 0,0001) и количеством СD34+СD38-клеток (R = 0,98 при р < 0,0001).

Так как уровень МОБ является наиболее важным прогностическим фактором при ОЛЛ [3], поэтому мы проанализировали связь между количеством предполагаемых ЛСК и уровнем МОБ на 15-й день терапии. Для этого пациентов разделили на группы согласно уровню МОБ на четыре группы. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Количество предполагаемых лейкимических стволовых клеток в группах пациентов с различным уровнем минимальной остаточной болезни на 15-й день терапии

Уровень МОБ, % N Количество клеток, %

CD34+ eD34+eD38- GD34+GD38-GD19+

1 >1 15 77,3 (57,3-93,5) 4,7 (1,9-20,9) *3,4 3,5 (1,7-20,6)*3,4

2 0,1-1,0 17 72,9 (16,0-95,2) 5,1 (0,5-24,7)*4 4,7 (0,2-24,4)*4

3 0,01-0,09 8 27,6

4 < 0,01 11 22,4

Примечание: * р < 0,05

Согласно представленным данным видно, гаемых ЛСК с иммунофенотипом СD34+СD38-

что большее процентное содержание предпола- СD19+, так и СD34+СD38- было выявлено в

Актуальные вопросы гематологии

69

группах пациентов с худшим ответом на терапию (уровень МОБ > 0,1 %) по сравнению с группами пациентов с меньшими значениями МОБ (< 0,1 %). При этом достоверных различий в содержании CD34+ клеток между исследуемыми группами не выявлено.

Таким образом, при первичном В-линейном ОЛЛ у детей среди клеток с фенотипом СD34+ СD38- преобладали лейкемические предшественники В-клеток с фенотипом СD34+СD38-CD19+. Большее процентное содержание как СD34+СD38-, так и СD34+СD38-CD19+ среди общей популяции лейкемических клеток ассоциировалось с худшим ответом на терапию. Поэтому исходное количество таких клеток может рассматриваться как прогностический маркер при ОЛЛ у детей.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Определение остаточных опухолевых клеток в костном мозге детей с B-линейным острым лимфобластным лейкозом методом проточной цитофлюорометрии / М. В. Белевцев [и др.] // Клин. лаб. диагностика. — 2006. — № 10. — С. 42-46.

2. Becker, M. W. Leukemia stem cells in 2010: current understanding and future directions / M. W. Becker, C. T. Jordan // Blood Rev. — 2011. — Vol. 25(2). — P. 75-81.

3. Campana, D. Minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia / D. Campana // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. — 2010. — P. 7-12.

4. Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood ALL / C. V. Cox [et al.] // Blood. — 2009. — Vol. 113(14). — P. 3287-3296.

5. High frequency of immature cells at diagnosis predicts high minimal residual disease level in childhood acute lymphoblastic leukemia / M. Ebinger [et al.] // Leuk. Res. — 2010. — Vol. 34(9). — P. 1139-1142.

6. CD34+CD38+CD19+ as well as CD34+CD38-CD19+ cells are leukemia-initiating cells with self-renewal capacity in human B-precursor ALL / Y. Kong [et al.] // Leukemia. — 2008. — Vol. 22, № 6. — P. 1207-1213.

7. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice / T. Lapidot [et al.] // Nature. — 1994. — Vol. 367. — P. 645-648.

8. In childhood acute lymphoblastic leukemia, blasts at different stages of immunophenotypic maturation have stem cell properties / C. le Viseur [et al.] // Cancer Cell. — 2008. — Vol. 14(1). — P. 47-58.

9. Flow minimal residual disease monitoring of candidate leukemic stem cells defined by the immunophenotype, CD34+CD38lowCD19+ in B-lineage childhood acute lymphoblastic leukemia / K. Wilson [et al.] // Haematologica. — 2010. — Vol. 95(4). — P. 679-683.

10. High proportion of leukemic stem cells at diagnosis is correlated with unfavorable prognosis in childhood acute myeloid leukemia / K. E. Witte [et al.] // Pediatr. Hematol. Oncol. — 2011. — Vol. 28(2). — P. 91-99.

УДК 616.155.392-003.24-036.12-08

АЛЕМТУЗУМАБ В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХС ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ

О. М. Морозова

9-я городская клиническая больница, г. Минск

В статье освещены результаты международных клинических исследований по использованию алемтузу-маба у пациентов с хроническим лимфолейкозом, приведены результаты собственного применения алметузу-маба как в монотерапии, так и в сочетании с химиопрепаратами (флюдарабином, циклофосфаном). Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение алемтузумаба у больных с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) является эффективным современным методом терапии.

Ключевые слова: хронический лимфолейкоз, моноклональные антитела, алемтузумаб.

ALEMTUZUMAB IN THE TREATMENT OF PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHATIC LEUKEMIA

О. М. Morozova

Municipal Clinical Hospital № 9, Minsk

The article elucidates the results of the international clinical research into the application of alemtuzumab in patients with chronic lymphatic leukemia (CLL) and presents the results of the application of alemtuzumab both in monotherapy and in the combination with chemomedicines (fludarabin, cyklofosfan). The received results testify that the application of alemtuzumab in CLL patients is an effective up-to-date method of therapy.

Key words: chronic lymphatic leukemia, homogenious antibodies, alemtuzumab.

Введение

Алемтузумаб — это противоопухолевое средство, представляющее собой генно-инженерные гуманизированные IgG1 каппа моноклональные антитела, специфически связывающиеся с гликопротеином CD52, который экспрессируется на поверхности нормальных и малигнизированных B- и T-лимфоцитов крови и не экспрессируется на гемопоэтических стволовых клетках [1].

В 2001 г. алемтузумаб был зарегистрирован в США и странах ЕС для лечения рецидивов у больных с ХЛЛ, получавших лечение алкилирующими препаратами и аналогами пуринов. Keating и соавт. [2] изучали эффективность и безопасность монотерапии алемтузумабом у больных ХЛЛ с резистентностью к флудараби-ну. У 93 больных с доказанной резистентностью к флударабину медиана выживаемости