Влияние двухвалентных ионов на физические свойства бислойных мембран из цвиттерионных и кислых фосфолипидов

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© ШЕВЧЕНКО Е.В., АНТОНОВ В.Ф., 1995 УДК 577.352:612.014.462.4

ч

ВЛИЯНИЕ ДВУХВАЛЕНТНЫХ ИОНОВ НА ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИСЛОЙНЫХ МЕМБРАН ИЗ ЦВИТТЕРИОННЫХ И КИСЛЫХ ФОСФОЛИПИДОВ

Шевченко Е.В., Антонов В.Ф.

Резюме. Как известно, свойства липидных бислоев меняются с изменением температуры. Поскольку большинство биологических систем функционирует при постоянной температуре, особый интерес приобретает исследование всевозможных изменений свойств мембран под действием различных внешних факторов — химического состава окружающей среды (pH, концентрации солей одно- и двухвалентных металлов), а также физических воздействий со стороны внешних полей [2,7]. Очевидно, что к этим воздействиям наиболее чувствительными должны быть мембраны, содержащие заряженные липиды.

Ионы кальция играют исключительно важную роль во многих физиологических процессах, связанных с проницаемостью клеточных мембран [7,10,14]. Не исключено, что эти физиологические воздействия связаны с взаимодействием ионов Са с фосфолипидной частью биологических мембран и соответствующими структурными изменениями [1-2].

Следует отметить, что работы по исследованию влияния двухвалентных катионов на физические свойства липидных мембран проводились обычно на суспензии липосом. В таких экспериментах нельзя исключить возможность межмембран-ного взаимодействия в результате агрегации. В настоящей работе исследования были проведены на плоских бислоях. В этом случае имеется возможность контролировать физико-химические параметры липидного бислоя во время эксперимента.

Методы и материал

Плоские бислойные липидные мембраны формировали по методу Мюллера-Рудина в тефлоновой ячейке. Методика измерений подробно описана в работе [1]. В работе были использованы липиды: дипальмитоилфосфатидилхолин (БРРС) фирмы «Ауапй», дипальмитоилфосфатидная кислота (БРРА) фирмы «вегуа» и тиоаналог дипаль-митоилфосфатидной кислоты (1;Ыоп-ВРРА) (синтез Д.А.Предводителева, МПГУ). Температуру фазового перехода липидов определяли по скачку проводимости [6].

Липосомы для калориметрических измерений готовили добавлением фонового раствора к сухой навеске липида до конечной концентрации липида в суспензии 0,5-1,0 мг/мл. Образцы нагревали до температуры около 60°С и встряхивали в тече-

ние нескольких минут, добиваясь получения однородной суспензии мультислойных липосом, в которую добавляли затем растворы солей Мя, Са, Ве до необходимой концентрации.

Калориметрические кривые были получены на дифференциальном сканирующем калориметре ДАСМ-4 производственного объединения «Био-физприбор» (Пущино). В качестве образца сравнения были использованы растворы ионов той же концентрации, что и в суспензии липосом. Сканирование проводилось дважды в интервале температур 10-100°С, скорость нагрева 1 град/мин. Характеристики фазового перехода определялись стандартной процедурой.

Результаты и обсуждение

Была измерена зависимость температуры фазового перехода от концентрации двухвалентных ионов для двух кислых липидов — БРРА и ее тиоаналога. Для сравнения исследовались бислои из БРРС. С увеличением концентрации кальция температура, при которой появлялись флуктуации тока, характерные для фазового перехода, повышалась. Наибольшее повышение температуры перехода наблюдалось при концентрации кальция 1 мМ. Выше 25 мМ скачки тока не регистрировались во всем доступном интервале температур [1].

На рис.1 показаны полученные зависимости Т = 1:(рСа) для двух фосфатидных кислот. Определение температуры перехода было проведено также калориметрическим методом. Данные по влиянию ионов Са на температуру фазового перехода суспензии липосом из фосфатидной кислоты приведены также на рис.1 (треугольниками). Результаты разных методов хорошо совпадают. Кроме того, из данных калориметрических измерений следует, что температура перехода повышается до 97°С при концентрации Са 10 мМ и далее не изменяется.

Аналогичное действие на температуру перехода бислоев из БРРА и ее тиоаналога оказывают и другие двухвалентные ионы. На рис.2 приведены термограммы, демонстрирующие действие ионов Ве на Т суспензии липосом из БРРА. Можно видеть, что уже при концентрации Ве 0,1 мМ температура перехода начинает повышаться. Как и в случае ионов Са происходит как бы «насыщение» зависимости, при концентрации Ве 10 мМ температура перехода достигает 87-88°С и далее не изменяется.

Для сравнения действия двухвалентных ионов на кислые и цвиттерионные липиды была изме-

т, °с 100

90

80

70

60

50

40

--4-

ИРРС

со

'Г)<Г

3 2 10 рСа

Рис.1. Зависимость температуры фазового перехода Тп бислойных липидных мембран от концентрации кальция в среде. • — Тп определена электрическим методом, А — Т определена методом ДСК

рена зависимость температуры фазового перехода бислоев из БРРС при тех же концентрациях кальция. Данные представлены на рис. 1. Видно, что температура основного перехода не меняется во всем исследованном интервале концентраций. В то же время, как следует из данных по дифракции рентгеновских лучей [9], в области концентраций Са свыше 50 мМ наблюдается резкое увеличение порядка в плоскости мембраны. При низких концентрациях (менее 1 мМ) ионы Са влияют в основном на агрегационную устойчивость суспензии липосом.

Поскольку электрическим методом предпере-ход не регистрируется, исследования были проведены калориметрическим методом. Суспензия липосом из БРРС в фоновом электролите обнаруживает основной фазовый переход гель-жидкий кристалл при температуре 42,5°С и предпереход при 35,5°С, что хорошо согласуется с литературными данными [15] (рис.З а).

Результаты по влиянию разных катионов на положение пиков основного перехода и предпере-хода приведены на рис.4. Данные по влиянию ионов магния получены нами, для ионов кальция — приведены из работы [9]. Можно видеть, что результаты для обоих катионов близки.

Калориметрические измерения, проведенные с ионами Ве, показали существенное отличие этих ионов от ионов Са и М§. Уже при концентрации Ве 1,8 мМ становится заметным расщепление основного пика: дополнительно возникает слабый пик при 39,9°С, а высокий пик смещается к температуре 42,5”С (рис.З). Повышение концентрации Ве до 10 мМ сопровождается резким уменьшением пиков основного перехода и предперехо-

да вплоть до исчезновения пика предперехода. Амплитуда высокотемпературного пика растет, а его положение смещается к высоким температурам [3]. Начиная с концентрации Ве 30 мМ и более изменений в термограммах не наблюдается (рис.З д, е).

Известно, что двухвалентные ионы магния и в особенности кальция вызывают повышение температуры фазового перехода многих заряженных липидов: фосфатидилсерина, фосфатидной кислоты и других [8,11,13]. Отмечается весьма значительное повышение температуры уже при концентрациях Са 0,1-1 мМ. В работе [4] показано повышение температуры основного перехода более чем на 100°С.

Проведенная нами экспериментальная работа и теоретический расчет [2] показали, что при добавлении к бислоям из БРРА двухвалентных ионов формируются мостики типа кальциевых. При этом создаются устойчивые поверхностные структуры. Появление на концентрационной зависимости области «насыщения» (рис. 1) подтверждает наше предположение. По-видимому, формирование кальциевых мостиков может происходить только до определенной концентрации ионов. Эта концентрация определяется эффективностью связывания катиона с липидом. Когда молекулы липида в бислое оказываются полностью связанными с катионами мостиками, повышение температуры прекращается.

Интересно отметить различия в концентрационных зависимостях для фосфатидной кислоты и ее тиоаналога. Из рис.1 видно, что температура

Рис.2. Кривые теплопоглощен 1 суспензии липосом из ОРРА в зависимости от дсбавленнсгс бериллия, а — фоновый раствор б — 0,1; в — 0,3; г — 10,0 мМ Ве

т, °с

ш

I

I

о

ц

и

о

с

о

ч

с

ш

Е-*

40

50

60 Т,°С

Рис.З. Термограммы суспензии липосом из ОРРС в водном растворе КС1 в присутствии ионов Ве. а — фоновый раствор, б — 1,8; в — 8,0; г — 10,0;

д — 30,0; е — 100,0 мМ Ве

перехода для бислоев из ЬЫоп-ОРРА также повышается с ростом концентрации кальция, но до существенно меньших значений (82°С для 1;Ыоп-БРРА и 98”С для БРРА). По-видимому, это различие можно объяснить более тесной упаковкой молекул в бислое из фосфатидной кислоты.

Проблема связывания двухвалентных катионов с кислыми фосфолипидными мембранами обсуждается в работе [12] в связи с сильным увеличением (до 8 мН/м) поверхностного натяжения монослоев из фосфатидилсерина при увеличении концентрации Са в растворе до 1 мМ. Авторы предположили, что такое изменение происходит вследствие адсорбции ионов Са и определяется в основном изменением электростатической энергии. Подобные исследования были проведены и для фосфатидной кислоты. Отмечено, что в присутствии ионов Са поверхностное натяжение мо-

50

40

30

2-

I

Рчс.4. Зависимость температуры фазового перехода и пред-перехода суспензии липосом из ОРРС в зависимости от концентрации Мд

нослоев из БРРА также повышается.

Сравнение данных по изменению поверхностного натяжения [5,12] и собственных результатов позволяет предположить, что происходит особое связывание, когда 1 катион связывает две молекулы фосфолипида, при этом формируется область полярных групп и увеличивается поверхностное натяжение.

Различие в связывании разных двухвалентных катионов можно объяснить различием мест связывания на липиде. Количественные различия в действии кальция и магния обусловлены и различиями констант адсорбции соответствующих катионов и степени заполнения центров связывания [7].

Влияние ионов бериллия на физические свойства липидных мембран представляет особый интерес в сопоставлении с другими двухвалентными ионами благодаря особенностям его физико-химических свойств в водных растворах. Ион Ве обладает минимальными размерами, следовательно, имеет высокую плотность поверхностного заряда, поэтому при гидратации таких ионов может происходить диссоциация протонов воды и образовываться комплексы с разным эффективным зарядом. Концентрация этих комплексов должна расти с pH и концентрацией бериллия. Эти свойства Ве должны проявляться при адсорбировании катионов на заряженных группах фосфолипидов, что будет изменять и свойства собственно липидного бислоя.

О серьезных изменениях в структуре границы раздела мембрана — вода прямо свидетельствуют данные калориметрии. В присутствии бериллия обнаруживается значительная гетерогенность суспензии липосом, аналогов которой в доступной нам литературе не обнаружено. С ростом концентрации Ве увеличивается доля той компоненты, температура основного перехода которой выше, чем в фоновом электролите. Увеличение доли высокотемпературной компоненты наблюдается в области концентраций, где заметно возрастает часть поверхности, занятой адсорбированными катионами.

Влияние двухвалентных ионов на температуру фазового перехода обычно рассматривается только как следствие изменения плотности заряда в диффузной части двойного слоя [4,7]. Однако количественные различия эффектов бериллия

и других ионов свидетельствуют, что основной вклад обусловлен ионами, непосредственно связанными с липидными молекулами, т.е. ионами в плотной части двойного слоя.

Мы считаем, что указанные эффекты в значительной мере обусловлены существованием регулярной сети латеральных водородных связей, образуемых молекулами воды при взаимодействии с головками фосфолипидов. Особая роль двухвалентных лонов в уплотнении бислоя, которое проявляется в резком увеличении температуры фазового перехода и резком увеличении поверхностного натяжения бислоя, определяется способностью этих иоров участвовать в создании межмолекулярных связей [1].

ЛИТЕРАТУРА

1. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. — М.: Наука, 1992, С. 136.

2. Армстронг К. Ионные токи, ворота и воротные токи /Мембраны: ионные каналы. — М.: Мир, 1981, С.98-128.

3. Ермаков Ю.А., Махмудова С.С., Шевченко Е.В., Лобышев В.И. Влияние бериллия на электростатические и термодинамические свойства мембран из дипальмитоиллецитина /Биологич. мембраны. — 1993, т.10, № 2, С.212-224.

4. Маркин B.C., Козлов М.М. Влияние двухвалентных катионов на температуру фазового перехода в липидных мембранах /Биофизика. — 1984, т.29, С.65-69.

5. Микаэлян Л.Г., Аджян С.А. Физико-химические характеристики плоских липидных мембран при фазовом переходе /Биофизика. — 1986, т.31, С.643-646.

6. Antonov V.F., Pertov V.V., Molnar A.A., et al. The appearance of single-ion channals in unmod-ofied lipid bilayer membranes at the phase transition temperature. /Nature. — 1980, v.283, P.585-586.

7. Cevs G., Marsh D. Phospholipid bilayers. Physical Principles and Models. /Awiley-Interscience P.John-Willey-Sons. — 1987, P.240.

8. Cullis P.R., Hope M.J., de Krujff B. et al. Phospho-

lipids and cellular regulation /Ed. Kuo J.F. Boca-ration: CRC Press Inc. — 1985, P.1-60.

9. Graddick W.A., Stomatoff J.B., Eisenberger F. et. al. Order — disorder and pretransition in dipalm-itoyle phosphatidylcholine multilayers /Biochim. Biophys. Res. Commun. — 1979. v.89, P.907-912.

10. Gumber S.C. Nonenzymatic phosphorylation of polyphosphoionsitides and phosphatidic acid is cat-alized by bivalent metal ions /Biochem.J. — 1989, v.232 (2), P.617-619.

11. Maggio B., Sturtevant J.M., Ju R.R. Effect of calcium ions on the thermotropic behavior of neutral and anionic glycosphingoiipids /Biochim. Biophys. Acta. — 1987, v.901, P.173-183.

12.. Ohki S., Ohshima H. Divalent cations inducted phosphatidil acid membrane tension /Biochim. Biophys. Acta. — 1985, v.812, P.147-156.

13. Papahadjopoulos D. Effect of bivalent cations and protons on termotropic properties of phospholipid membranes /J.Colloid Interface Sci. — 1987, v.58, P.459-470.

14. Small E.V., Mandershood J.G., de Kruijff B., de Gier J. Consequence of the interaction of calcium with dioleyl phosphatidic acid containing model membranes changed in membrane permeability / Biochim. Biophys. Acta. — 1986, v.860, № 1, P.99-103.

15. Tenchov B.G., Lis L.J., Quinn F.J. Mechanism and Kinetics of the subtransition in hydrated L — dipaimitoylphosphatidylcholine /Biochim. Biophys. Acta. — 1987, v.897, P.143-151.

Summary

Effect of bivalent ions on a physical properties of bilayer membranes (BLM) formed from zwitterion and acidic lipids was studied. The difference of Me dependence for these two lipids was obtained. The biological application of considered problem has been discussed.

© ОСИПЕНКО Б.Г., 1995 УДК 616.36:615.9

МИКРОСОМАЛЬНЫИ ТРАНСПОРТ ЭЛЕКТРОНОВ В МЕХАНИЗМЕ НЕКРОТОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ ДИМЕТИЛНИТРОЗАМИНОМ

Осипенко Б.Г.

Резюме: Токсическое повреждение печени диметилнитрозамином связано с глубокими нарушениями функций моноокси-геназной системы гепатоцитов.

Исследовали спектральные характеристики цитохрома Р-450 и электрон-транспортные свойства НАДФН- и НАДН-зависимых компонентов цепей микросомального окисления в условиях метаболизма диметилнитрозамина (ДМНА) до формальдегида в микросомальных мембранах печени. ДМНА угнетал восстановление цитохрома Р-450 и нитротетразолия в микросомальных мембранах, а также активировал 2,6-дихлорфе-нолиндофенол: редуктазу, зависимую от НАДФН.

Анализируются молекулярные механизмы инактивации цитохрома Р-450 и связанные с ними повреждения микросомального транспорта электронов.

Некроз печени, клинически фиксируемый нередко как острый гепатит неясной этиологии, во многих случаях является следствием токсического воздействия химических веществ (ксенобиотиков). Среди таких веществ известны распространенные продукты бытовой химии: хлорированные углеводороды циклического и алифатического рядов, нитрозамины, Д-галактозамин, алли-ловый и изопропиловый спирты, азо-соединения, составляющие основу красителей для волос или используемых в качестве стабилизаторов для продуктов питания («желтый для масла» —димети-ламиноазобензол), а также яды растительного происхождения (алкалоиды бледной поганки). Клинически установлено развитие некроза печени при употреблении таких лекарственных средств, как парацетамол, аминопирин, феноти-азины, левомпдетин, тетрациклин, стрептомицин, клиндамицин, цефелотин, ПАСК, гидразид изо-