СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ В ОБРАЗЦЕ ПАНКРЕАТИНА
METHOD FOR RECOVERY AND VIRAL LOAD TEST IN PANCREATINE SAMPLE

Настоящее изобретение относится к способу практически количественного выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и способу количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина.
Панкреатин представляет собой уже давно известную смесь различных обладающих физиологической активностью компонентов, которую получают из панкреатических желез млекопитающих. Основными компонентами панкреатина являются пищеварительные ферменты, прежде всего панкреатическая липаза, а также амилазы и протеазы. Благодаря его ценным терапевтическим свойствам и высокой степени безопасности при применении панкреатин уже давно используют с большим успехом в качестве фармацевтического препарата в ферментной заместительной терапии. В этом отношении наибольшее значение имеет панкреатическая липаза, однако амилазы и протеазы также вносят значительный вклад в терапевтическое благоприятное действие панкреатина. Для терапевтических целей панкреатин, как правило, получают из крупного рогатого скота («бычий панкреатин») или свиней («свиной панкреатин»), при этом свиной панкреатин с количественной точки зрения имеет наибольшее значение. Методы получения панкреатина для терапевтических целей известны per se, например, они описаны в публикации ЕР 0115023 А.
Вследствие того, что панкреатин получают из организма животных, исходные продукты могут содержать нежелательные биологические компоненты, такие как бактериальные или вирусные примеси. Однако в течение более чем 100 лет коммерческого применения фармацевтических продуктов, содержащих панкреатин, не было зафиксировано ни одного случая вредного воздействия содержащего вирусные примеси панкреатина на пациентов. Тем не менее, компании, производящие фармацевтические продукты, которые получают из биологических тканей и/или жидкостей организма, испытывают все возрастающее давление со стороны регулирующих административных органов в отношении повышения уровня безопасности выпускаемых ими продуктов путем снижения содержания всех примесей до максимального низкого уровня независимо от того, считается ли рассматриваемая примесь патогенной для человека или нет. Таким образом, для применения панкреатина в фармакологических продуктах желательно располагать надежными аналитическими методами обнаружения и количественной оценки таких биологических примесей.
До настоящего времени не был разработан надежный метод количественного обнаружения или выделения вирусных примесей в образце панкреатина. Это, по-видимому, обусловлено тем, что обладающие ферментативной активностью компоненты панкреатина несовместимы с линиями клеток, которые применяют для размножения вирусов с помощью методов, известных обычным специалистам в данной области, что затрудняет или даже делает невозможным определение титра вируса в образце панкреатина.
Таким образом, в основу изобретения была положена задача разработать способ практически количественного выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и способ количественного определения вирусной нагрузки в этом образце панкреатина. В частности, задача изобретения заключалась в том, чтобы разработать способ практически количественного выделения инфекционной вирусной нагрузки из образца панкреатина и способ количественного определения инфекционной вирусной нагрузки в этом образце панкреатина.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что вирусную нагрузку, прежде всего инфекционную вирусную нагрузку, в образце панкреатина можно практически количественно определять в том случае, когда вирусную нагрузку сначала выделяют из образца панкреатина с помощью многостадийного процесса центрифугирования и затем выделенную вирусную нагрузку количественно оценивают с использованием известных per se вирусологических методов.
В опубликованном JP 12856990 уже был описан метод концентрирования или выделения вирусов гепатита с использованием нестандартной комбинации низкоскоростного центрифугирования и ультрацентрифугирования.
Первый вариант осуществления изобретения относится к способу выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина, заключающемуся в том, что:
а) приготавливают жидкий опытный образец панкреатина, пригодный для центрифугирования, из образца панкреатина, не изменяя его вирусной нагрузки;
б) подвергают по меньшей мере одну определенную часть опытного образца панкреатина, полученного на стадии а) способа, по меньшей мере одному низкоскоростному центрифугированию в условиях, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, не образуют дебрис;
в) отбрасывают все твердые отложения, которые необязательно образуются на стадии б) способа во время низкоскоростного центрифугирования и сохраняются в супернатанте опытного образца панкреатина;
г) подвергают по меньшей мере одну определенную часть супернатанта опытного образца панкреатина, полученного на стадии в) способа, ультрацентрифугированию в среде со ступенчатым градиентом, где продолжительность ультрацентрифугирования и относительную центробежную силу для центрифугирования выбирают таким образом, чтобы вирусная нагрузка количественно транспортировалась из супернатанта опытного образца панкреатина в целевую фракцию, находящуюся выше пограничного слоя или в пограничном слое между расположенным сверху компонентом градиента с наименьшей концентрацией и расположенным снизу компонентом градиента со следующей более высокой концентрацией; и
д) количественно выделяют целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку из супернатанта опытного образца панкреатина.
Второй вариант осуществления изобретения относится к способу количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, прежде всего инфекционной вирусной нагрузки в образце панкреатина. В этом втором варианте осуществления изобретения в дополнение к способу, предложенному в первом варианте осуществления изобретения, осуществляют после стадии д) способа дополнительную стадию е) способа, которая заключается в том, что количественно определяют вирусную нагрузку в образце панкреатина путем определения титра вирусной инфекции в содержащей вирусную нагрузку целевой фракции.
Если специально не указано иное, то все технические и научные понятия, употребляемые ниже, должны иметь в каждом случае такое же значение, которое обычно подразумевает специалист в конкретной области техники. Диапазоны температур, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «0-15°С», обозначают диапазон температур от 0°С до 15°С, включая в каждом случае границы диапазона. Интервалы времени, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «30-120 мин», обозначают интервал времени от 30 мин до 120 мин, включая в каждом случае границы диапазона. Интервалы времени, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «2-8 ч», обозначают интервал времени от 2 ч до 8 ч, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны относительной центробежной силы, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «1500-5000×g», обозначают относительную центробежную силу, находящуюся в диапазоне от 1500×g до 5000×g, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны объема, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «10-15 мл», обозначают диапазон объема от 10 мл до 15 мл, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны мер длины, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «80-100 мм», обозначают диапазон мер длины от 80 мм до 100 мм, включая в каждом случае границы диапазона.
Способ, предлагаемый в изобретении, можно применять для всех типов панкреатина животного происхождения и, в частности, его можно применять для обычных поступающих на рынок типов свиного панкреатина и бычьего панкреатина. Предпочтительно способ осуществляют на образцах свиного панкреатина.
Способ, предлагаемый в изобретении, в целом можно применять для выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и последующего количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина. В частности, способ можно применять для выделения и количественного определения вирусной нагрузки в образцах панкреатина, где вирусная нагрузка представляет собой ротавирус А коров, вирус энцефаломиокардита (EMCV), цирковирус свиней (PCV), парвовирус свиней (PPV), ротавирус А свиней, тешовирус свиней и/или вирус заболевания свиней с везикулярным синдромом (SVDV). Благодаря очень близким свойствам человеческий Коксаки-вирус В 5/1 можно использовать в качестве модели для проверки пригодности способа, предлагаемого в изобретении, для выделения и/или количественного определения SVDV. Благодаря очень близким свойствам ротавирус А коров (например, штамм В 223) можно использовать в качестве модели для проверки пригодности способа, предлагаемого в изобретении, для выделения и/или количественного определения ротавируса А свиней.
Применяемый на стадии а) способа, предлагаемого в изобретении, жидкий опытный образец панкреатина, который можно использовать для центрифугирования, получают из образца панкреатина без изменения или модификации в нем вирусной нагрузки, прежде всего инфекционной вирусной нагрузки. Это можно осуществлять, например, путем приготовления суспензии опытного образца панкреатина из образца панкреатина. Суспензию опытного образца панткреатина приготавливают путем объединения образца панкреатина со средой для культуры клеток, которая пригодна для линии клеток, используемой для культивирования предназначенных для изучения видов вируса, и с одним или несколькими антибиотиком(ами), пригодным(и) для этой цели. Как правило, для получения раствора антибиотиков, который необязательно применяют на стадии а) способа, можно использовать любые антибиотики. Как правило, применяют антибиотики широкого спектра действия или смеси таких антибиотиков широкого спектра действия. Пригодные антибиотики можно выбирать, например, из группы, включающей антибиотики β-лактамового типа, такие как пенициллины, цефалоспорины (включая оксацефемы и карбацефемы), карбапенемы и монобактамы; стрептомицин (включая стрептомицина сульфат); неомицины (включая неомицин А, неомицин В и паромомицин); канамицины (включая канамицин, гентамицин, амикацин и тобрамицин); спектиномицин; тетрациклины (включая тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин и миноциклин); макролидные антибиотики (включая эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин, йозамицин и спирамицин); ингибиторы гиразы (включая налидиксиновую кислоту, циноксацин, пипемидиновую кислоту, норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин и флероксацин); антагонисты фолиевой кислоты (включая сульфонамидные антибиотики, диаминобензилпиримидины и их комбинации); хлорамфеникол; линкозамиды; гликопептидные антибиотики (включая ванкомицин и теикопланин); фосфомицин; полипептидные антибиотики (включая полимиксин В, колистин, бацитрацин и тиротицин) и мупироцин. Предпочтительными антибиотиками являются стрептомицина сульфат и смеси стрептомицина сульфата и пенициллина, например, «коктейль» из антибиотиков. Один или несколько антибиотиков можно применять, например, в виде раствора в растворителе, который пригоден для одного или нескольких антибиотиков в каждом случае, т.е. в виде раствора антибиотиков.
Суспензию опытного образца панкреатина, как правило, приготавливают при охлаждении до температуры 0-15°С, например, до температуры 4-10°С. Компоненты для получения суспензии опытного образца панкреатина, как правило, перемешивают при охлаждении на льду в течение по меньшей мере 30 мин, например, 30-120 мин, предпочтительно 45-90 мин, в частности, в течение 50 или 60 мин. Цель охлаждения суспензии опытного образца панкреатина в каждом случае заключается в том, чтобы избежать или по меньшей мере существенно снизить любую нежелательную дезактивацию вирусной нагрузки, обусловленную обладающими ферментативной активностью компонентами, присутствующими в образце панкреатина. Один из вариантов осуществления изобретения относится также к суспензии опытного образца панкреатина, которую можно приготавливать согласно стадии а) способа.
Какие среды для культур клеток применяют в каждом случае для приготовления суспензии опытного образца панкреатина на стадии а) способа, определяется тем, какие виды вирусов требуется выделять и/или количественно определять с помощью способа, предлагаемого в изобретении. Для культивирования и обнаружения конкретных видов вирусов используют разрешенные для применения культуры клеток, в которых подлежащие изучению виды вирусов инициируют, если это возможно, цитопатическое действие (СРЕ). СРЕ приводит к модификации зараженных вирусом клеток, которую можно выявлять с помощью световой микроскопии. Если виды вирусов размножаются в культуре клеток без СРЕ, то, как правило, такое размножение можно, тем не менее, выявить с помощью известных per se непрямых методов обнаружения.
Если, например, требуется выделить и/или количественно определить ротавирус А коров, то можно, например, применять для его культивирования клетки почки эмбриона обезьяны (клетки линии МА-104). В этом случае в качестве среды для культуры клеток можно применять известную per se модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (среда Дульбекко). Если требуется выделить и/или количественно определить EMCV, то для его культивирования можно применять клетки почки свиньи (клетки линии РК-15) или клетки почки эмбриона свиньи (клетки линии SPEV). В случае клеток линии РК-15 можно применять в качестве пригодной среды для культуры клеток, например, известную per se минимальную незаменимую среду (MEM). В случае клеток линии SPEV в качестве среды для культуры клеток можно применять среду Дульбекко. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить PCV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии РК-15. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить PPV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки почки свиньи (клетки линии SK-6). В этом случае в качестве среды для культуры клеток можно применять, например, среду Дульбекко. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить ротавирус А свиней, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии МА-104. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить тешовирус свиней, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии РК-15. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить SVDV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии SPEV. Специалист в данной области располагает сведениями о том, какие линии клеток пригодны для культивирования конкретных видов вирусов и какие среды для культивирования клеток можно использовать для этой цели. Виды вирусов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, и пригодные для этой цели линии клеток можно получать из соответствующих источников, таких, например, как «Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection)», Манассас, США (АТСС), «Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур ГмбН (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Брауншвейг, Германия (DSMZ), «Институт Фридриха-Лёффлера (Friedrich-Löffler-Institut)», Федеральный исследовательский институт ветеринарии (Federal Research Institute for Animal Health), Инзель Римс, Германия (FLI) или «Отделение ветеринарной службы (Veterinary Service Division)» «Департамента сельского хозяйства и сельского развития (Department of Agriculture and Rural Development)», Белфаст, Великобритания (DARD).
На стадии б) способа опытный образец панкреатина, полученный на стадии а) способа, можно либо использовать полностью, либо можно использовать определенную часть опытного образца панкреатина, в частности, определенный объем этого опытного образца панкреатина. Предпочтительно опытный образец панкреатина, полученный на стадии а) способа, используют полностью.
На стадии б) способа при осуществлении низкоскоростного центрифугирования можно создавать условия, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, прежде всего от ≥120 S до 5000 S, еще не образуют дебрис. Как правило, вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, прежде всего вирусы, характеризующиеся константами седиментации от ≥120 S до 5000 S, еще не образуют дебрис, когда низкоскоростное центрифугирование осуществляют при относительно небольших центробежных силах, составляющих в каждом случае менее 10000×g, предпочтительно составляющих в каждом случае 1500-5000×g, наиболее предпочтительно составляющих в каждом случае 2000-3500×g, например, составляющих в каждом случае 2700×g. Продолжительность стадии низкоскоростного центрифугирования обычно составляет по меньшей мере 5 мин, как правило, 5-60 мин, прежде всего 10-45 мин, предпочтительно 10-30 мин, например, 15 мин. В предпочтительном варианте осуществления стадии б) способа стадии низкоскоростного центрифугирования осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С, например, до температуры 4-10°С, предпочтительно в охлаждаемой центрифуге.
Цель осуществления процедур низкоскоростного центрифугирования на стадии б) способа заключается в основном в удалении из суспензии панкреатина таких компонентов панкреатина, как нерастворимые частицы и т.д., которые разрушаются в процессе выделения и/или количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, для получения супернатанта опытного образца панкреатина, пригодного для дальнейшего процессинга. Таким образом, твердые отложения, которые необязательно получают на стадиях низкоскоростного центрифугирования, как правило, отбрасывают при осуществлении стадии в), в то время как супернатант используют на следующей стадии г) способа. Стадии низкоскоростного центрифугирования с последующим отбрасыванием необязательно полученных при этом твердых отложений, как правило, повторяют до тех пор, пока твердые отложения не перестают образовываться. Как правило, после осуществления 1-3 повторов, в частности уже после одного повтора, не требуется дополнительных повторов стадий низкоскоростного центрифугирования с последующим отбрасыванием необязательно полученных при этом твердых отложений. В одном из вариантов осуществления изобретения твердое отложение, полученное при осуществлении стадии б) способа, может представлять собой осадок.
В одном из вариантов осуществления изобретения осуществляют отмывку отложения, полученного на стадиях низкоскоростного центрифугирования, перед его отбрасыванием один раз или более, например, 1-3 раза, с помощью пригодной жидкости для отмывки. Пригодной жидкостью для отмывки может служить, например, сам супернатант опытного образца панкреатина, полученный после низкоскоростного центрифугирования, который затем можно применять на стадии г) способа. Если жидкость для отмывки отлична от супернатанта опытного образца панкреатина, то после завершения отмывки отложения ее объединяют с супернатантом опытного образца панкреатина и затем используют на стадии г) способа. Наиболее предпочтительно осуществлять отмывку отложения указанным выше образом перед осуществлением стадии г) способа в том случае, когда вирусная нагрузка образца панкреатина представляет собой EMCV.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является также супернатант опытного образца панкреатина, который можно получать согласно указанным выше стадиям а)-в) способа.
В качестве среды со ступенчатым градиентом для стадии г) способа, как правило, используют ступенчатый двухфазный градиент сахарозы. Среда со ступенчатым градиентом предпочтительно представляет собой градиент, полученный с помощью 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. В качестве буфера для растворов сахарозы можно применять, например, нейтральные буферы (т.е. буферы со значением pH примерно 7). Предпочтительно применяют буфер ЗФР («забуференный фосфатом физиологический раствор», pH 7,2). Как правило, используют стерильные среды с градиентом. Двухфазный ступенчатый градиент сахарозы указанного выше типа обеспечивает наиболее пригодные условия для осаждения и, следовательно, для выделения вирусов, которые могут быть обнаружены. Кроме того, ступенчатые градиенты сахарозы, прежде всего полученные, как указано выше, с помощью 50% (мас./об.) необязательно забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об) забуференного раствора сахарозы, создают пригодные осмотические условия, которые не приводят к дезактивации любой присутствующей вирусной нагрузки. Ультрацентрифугирование, осуществляемое на стадии г) способа, гарантирует, например, что вирусная нагрузка, источником которой является образец панкреатина, практически количественно переносится из супернатанта опытного образца панкреатина в среду со ступенчатым градиентом. Понятие «практически количественно» в данном случае означает, что вирусная нагрузка, первоначально содержащаяся в опытном образце, выделяется настолько полностью, что разница между титром исходной вирусной нагрузки и титром вирусной нагрузки, выделенной в результате ультрацентрифугирования, равна или составляет менее половины единицы десятичного логарифма титра вируса (0,5 log-единицы). Кроме того, ультрацентрифугирование согласно стадии г) способа гарантирует, что вирусная нагрузка переносится в целевую фракцию, достаточно удаленную от опытного образца панкреатина, чтобы можно было механически отделить ее от опытного образца панкреатина без какого-либо повторного смешения фаз, нарушающего требуемое отделение.
Стадию г) способа обычно осуществляют путем внесения в ультрацентрифужную пробирку взятой в определенном объеме среды для градиентного центрифугирования (градиентной среды) с наибольшей концентрацией, на которую наслаивают взятые в определенном объеме градиентные среды со следующими более низкими концентрациями. Этот процесс повторяют столько раз, сколько необходимо для получения многофазной градиентной среды, где конечный (верхний) слой представляет собой объем жидкого опытного образца панкреатина, из которого требуется выделить вирусную нагрузку. В случае двухфазной градиентной среды на объем градиентной среды со следующей более низкой концентрацией сразу наслаивают объем жидкого опытного образца панкреатина или суспензии опытного образца панкреатина (объем опытного образца панкреатина), пригодного для центрифугирования. В случае двухфазной градиентной среды это позволяет создавать в ультрацентрифужной пробирке следующую последовательность фаз (сверху вниз): первый слой, представляющий собой объем опытного образца панкреатина (верхний слой), затем объем градиентной среды с наименьшей концентрацией (средний слой, например, представляющий собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы) и, наконец, объем градиентной среды с наибольшей концентрацией (нижний слой, покрывающий дно ультрацентрифужной пробирки; например, 50% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы). При наслаивании индивидуальных объемов необходимо соблюдать осторожность для того, чтобы гарантировать, что на соответствующих границах не возникало турбулентности или перемешивания.
Целевая фракция, используемая на стадии г) способа, как правило, представляет собой (I) часть градиентной среды с наименьшей концентрацией, которая достаточно удалена и отделена от объема опытного образца панкреатина, и (II) весь объем градиентной среды со следующей более высокой концентрацией. В случае двухфазной градиентной среды целевая фракция представляет собой, например, часть градиентной среды с наименьшей концентрацией, которая достаточно удалена и отделена от объема опытного образца панкреатина, и весь объем градиентной среды со следующей более высокой концентрацией, простирающийся до дна ультрацентрифужной пробирки.
При расчете положения целевой фракции, которая достаточно удалена от объема опытного образца панкреатина для того, чтобы можно было осуществлять последующее разделение, следует иметь в виду, что получаемые расчетом значения для положения частиц (т.е. положение вирусных частиц, выделенных из образца панкреатина), как правило, соответствуют вершине гауссовского распределения. В таком случае частицы должны быть распределены как выше, так и ниже их полученных расчетом положением. Таким образом, при определении требуемого расстояния целевой фракции от объема опытного образца панкреатина необходимо брать дополнительный запас для учета гауссовского распределения положений частиц. Вирусную нагрузку обычно переносят в целевую фракцию, которая достаточно удалена от объема опытного образца панкреатина для того, чтобы можно было осуществлять последующее разделение, если частицы, характеризующиеся константой седиментации, составляющей ≥120 S, в частности от ≥120 S до 5000 S, мигрировали вследствие ультрацентрифугирования из объема опытного образца панкреатина по меньшей мере на 10 мм, например, по меньшей мере на 15 мм, по меньшей мере на 20 мм, по меньшей мере на 25 мм или по меньшей мере на 30 мм в градиентную среду с наименьшей концентрацией. В случае описанной выше двухфазной градиентной среды градиентная среда с наименьшей концентрацией представляет собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы. В одном из вариантов осуществления стадии ультрацентрифугирования практически все частицы, характеризующиеся константой седиментации, составляющей ≥ 120 S, в частности, составляющей от ≥120 S до 5000 S, полностью проходили через градиентную среду с наименьшей концентрацией и концентрировались в пограничном слое, примыкающем к градиентной среде со следующей более высокой концентрацией (т.е. на «сахарозной подушке»). Специалист в данной области должен обладать сведениями о пригодных методах расчета и уметь применять соответствующие условия для ультрацентрифугирования. Пригодные условия для ультрацентрифугирования можно определять на основе характеристик вируса(ов), подлежащего(их) выделению из образца панкреатина (например, плотности и константы седиментации), при этом подразумевается, что можно применять известные per se упрощения (см., например, Lebowitz и др., «Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review»; Protein Science 11, 2002, cc.2067-2079).
При условии, что ультрацентрифугирование осуществляют с использованием обычных объемных соотношений и в среде для ступенчатого градиентного ультрацентрифугирования, предпочтительно в двухфазном ступенчатом градиенте сахарозы, вирусную нагрузку, как правило, транспортируют в целевую фракцию, пригодную для последующего выделения, осуществляя ультрацентрифугирование в течение по меньшей мере 1 ч, как правило, по меньшей мере 2 ч, например, в течение 2-8 ч, в частности, в течение 3-6 ч. Пригодная относительная центробежная сила для ультрацентрифугирования, предлагаемого в изобретении, составляет по меньшей мере 100000×g, например, 200000-350000×g. В одном из вариантов осуществления стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 3-6 ч при относительной центробежной силе, составляющей 200000-350000×g, в объемных соотношениях, обычно применяемых для ультрацентрифугирования, и в градиенте, полученном с использованием 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. В другом варианте осуществления стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 3,5-4,5 ч при относительной центробежной силе, составляющей 200000-300000×g, в объемных соотношениях, обычно применяемых для ультрацентрифугирования, и в градиенте, полученном с использованием 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. Объемные соотношения, обычно применяемые для ультрацентрифугирования, получают, например, в том случае, когда применяют обычные ультрацентрифужные пробирки. Обычными ультрацентрифужными пробирками в данном случае являются пробирки, имеющие объем 10-15 мл, в частности, 12-13 мл; внутренний радиус 6-8 мм, в частности, 7 мм, и высоту 80-100 мм, в частности, 85-95 мм. В том случае, когда на стадии г) способа используют обычную ультрацентрифужную пробирку, объем среды для градиентного ультрацентрифугирования с наибольшей концентрацией (например, 50% (мас./об.)-ного забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, 0,5 мл, объем градиентной среды со следующей более низкой концентрацией (например, 20% (мас./об.)-ного забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, 4,5 мл, и объем опытного образца панкреатина может составлять, например, 5 мл.
В предпочтительном варианте осуществления стадии г) способа вне зависимости от прочих выбранных условий ультрацентрифугирование осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С, предпочтительно до температуры 4-10°С.

На этой стадии способа можно применять обычные охлаждаемые центрифуги, известные специалисту в данной области. Для стадии г) способа, как правило, применяют обычную имеющуюся на рынке ультрацентрифугу, такую как охлаждаемая ультрацентрифуга с ротором с качающимися стаканами, например, ультрацентрифуга Sorvall с ротором с качающимися стаканами модели «ТН-641».
Специалист в данной области, опираясь прежде всего на дополнительную техническую информацию, приведенную в описании настоящего изобретения, может повышать или понижать масштаб описанных выше стадий низкоскоростного центрифугирования и стадий ультрацентрифугирования в любой требуемой степени.
На стадии д) способа целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку, количественно выделяют из супернатанта опытного образца панкреатина. Выделение, как правило, осуществляют, устанавливая метку на ультрацентрифужную пробирку на предварительно определенной высоте границы фракции-мишени. Затем весь объем, находящийся выше этой границы, удаляют от оставшегося объема, например, путем аспирации. Аспирацию можно осуществлять, например, с помощью обычного шлангового насоса, трубопровода и капилляров, которые перед этим следует подвергнуть стерилизации. Пригодная скорость откачки составляет, например, 2 мл/мин. В процессе аспирации следует принимать меры для того, чтобы капилляр шлангового насоса всегда находился на верхней границе жидкости. Целевую фракцию, оставшуюся в ультрацентрифужной пробирке, можно затем удалять из ультрацентрифужной пробирки известным per se методом с помощью обычной одноканальной пипетки, предпочтительно со стерильным концом. В это же время можно удалять любой осадок, все еще остающийся в ультрацентрифужной пробирке, например, путем повторного всасывания и ресуспендирования с использованием одноканальной пипетки.
Один из вариантов осуществления изобретения относится также к выделенной целевой фракции, которую можно получать с помощью стадий а)-д) способа.
Если требуется осуществлять способ количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, то после стадии д) способа следует осуществлять стадию е) способа. На стадии е) способа вирусную нагрузку в образце панкреатина количественно определяют путем определения титра вирусной инфекции в целевой фракции, содержащей вирусную нагрузку. В данном случае количественное определение титра вирусной инфекции в целевой фракции можно осуществлять согласно рабочим процедурам, известным per se в вирусологии, например, с помощью известного per se принципа определения титра вирусной инфекции (VITD).
Можно, например, разводить целевую фракцию в соответствующем соотношении пригодной средой для культивирования клеток для получения опытного образца, предназначенного для определения вируса. В качестве пригодных сред для культивирования клеток можно использовать указанные выше среды, в каждом случае соответствующие исследуемым видам вирусов. В одном из вариантов осуществления изобретения для исключения ложных положительных реакций на присутствие вирусной инфекции разведенную или неразведенную целевую фракцию можно фильтровать через микрофильтр перед количественным определением вирусной нагрузки на стадии е).
50
50
Пригодное разведение можно получать, например, путем разведения целевой фракции средой для культивирования клеток до первоначального объема супернатанта опытного образца панкреатина, использованного на стадии г) способа. Затем в качестве первого шага можно сначала приготавливать известным per se методом серийные разведения опытных образцов, предназначенных для определения вируса, например, с использованием коэффициентов разведения 1:2, 1:5 или 1:10 или также комбинаций указанных коэффициентов разведения, для осуществления количественного VITD. Затем в качестве второго шага можно осуществлять известным per se методом инокуляцию пригодной суспензии клеток опытными образцами, предназначенными для определения вируса, имеющими различные концентрации из серийных разведении, после чего дают сформироваться слою клеток на предназначенных для определения вируса опытных образцах с различными концентрациями. После этого для исключения ложных положительных реакций на наличие вирусной инфекции, которые могут быть обусловлены присутствием микроорганизмов, таких как инертные бактерии или микоплазмы, как правило, целесообразно осуществлять фильтрацию опытных образцов, предназначенных для определения вируса, перед осуществлением инокуляции ими клеток-детекторов. Для этой цели опытный образец, предназначенный для определения вируса, или разведенный опытный образец, предназначенный для определения вируса, можно фильтровать через фильтр с соответствующим размером пор, такой как микрофильтр, например, микрофильтр с размером пор от 0,1 до 10 мкм (включая границы указанного диапазона; микрофильтрация), как правило, микрофильтр с размером пор 1 мкм. Затем фильтрат можно использовать в качестве опытного образца для дальнейших исследований. После этого в качестве третьего шага инокулированные опытные образцы анализируют (прочитывают) для определения уровня инфекции с помощью метода, зависящего от типа инфекции. Когда, например, можно использовать СРЕ в качестве индикатора заражения слоя клеток, то СРЕ определяют известным per se методом по истечении примерно 4-7 дней. Титрование (по методу конечных разведении) опытных образцов, предназначенных для определения вируса, позволяют в данном случае количественно определять присутствующую в исходном образце инфицирующую дозу. Титрование обычно осуществляют путем разведения с коэффициентов 10, т.е. на основе десятичной логарифмической шкалы. На практике обычно рассчитывают среднюю (50%) инфицирующую дозу (ID). В случае нескольких параллельных партий выявленное значение ID соответствует наибольшему (обратная величина) разведению опытного образца, предназначенного для определения вируса, при котором СРЕ можно выявить ровно в половине партий. Результаты необязательно можно дополнительно корректировать или интерполировать известным per se методом с помощью компьютера. Наиболее широко распространенными методами расчета титров вирусов являются методы Спирмана и Карбера (см. С.Spearman, Br. J. Psychol. 2, 1908. сс.227-242, и G.Kärber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162, 1931, сс.480-483; а также Bundesanzeiger [Federal gazette] №84, 4 мая 1994 г.) или Reed и Muench (см. Reed L.J., Muench H., Am. J. Hyg. 27, 1938, сс.493-497).
Можно использовать также другие индикаторы заражения клеточного слоя, такие, например, как индукция вирусного антигена или индукция бляшки. Специалисту в данной области известны такие методы и их применения для рассматриваемого случая, например, они описаны в таких учебниках по вирусологии, как H.W.Doerr и W.H.Gerlich, «Medizinische Virologie», изд-во Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1-е изд., 2002 г., или в более современных изданиях этой книги.
Примеры
Все процедуры, указанные в приведенных ниже примерах, осуществляли в стерильных условиях на стерильном лабораторном столе. Необходимо соблюдать все процедуры, которые обычно применяют в вирусологических лабораториях, например, процедуры, обеспечивающие безопасность. Применяли, среди прочего, следующие материалы:
1) раствор антибиотиков, 1,0 г стрептомицина сульфата и 1,2 г пенициллина растворяли в 20 мл дважды дистиллированной воды и фильтровали через фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Затем фильтрат разделяли на аликвоты объемом по 1 мл и необязательно хранили при -20°С до использования;
2) среда Дульбекко, среда для культур клеток, которую использовали для клеток линии SK 6, клеток линии SPEV и клеток линии МА 104;
3) одноканальные пипетки со стерильными концами;
4) FCS, фетальная телячья сыворотка, которую получали от фирмы Bio Whittaker (сыворотка);
2
5) колбы для культур тканей, стерильные, площадь дна колбы составляла в каждом случае 25, 75 или 175 см;
6) mEM, среда для культур тканей, дополненная 1,5 г/л бикарбоната натрия и 1 мМ пируватом, которую использовали для клеток линии РК-15;
7) титрационные микропланшеты, стерильные, 96-луночные с крышкой;
8) суспензия PAN, 10%-ная суспензия, панкреатина; отвешивали 1,0 г свиного панкреатина (если не указано иное) в стерильных условиях и вносили в лабораторный стакан, объединяли с 1 мл раствора антибиотиков и (если не указано иное) с 8,0 мл конкретной соответствующей среды для клеточных культур и (если не указано иное) суспендировали в течение 60 мин в ледяной бане при перемешивании;
9) буфер Pardee, буфер Pardee, содержащий диоксид углерода;
10) зФР, стерильный «забуференный фосфатом физиологический раствор» (pH 7,2);
11) пипетки, стерильные;
12) наконечники для пипеток, стерильные в стерильных поддонах;
2

13) пластиковые мешки, непроницаемые для CO, снабженные застежкой («Anaerocult» фирмы Merck);
14) поликлональное антитело к PPV, конъюгированное с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), получали от фирмы NatuTec GmbH;
15) пробирки, стерильные вместимостью 15 и 50 мл;
16) раствор сахарозы, 20%, забуференный ЗФР, стерильный; концентрацию регулировали известным per se методом с помощью обычного рефрактометра;
17) раствор сахарозы, 50%, забуференный ЗФР, стерильный; концентрацию регулировали известным per se методом с помощью обычного рефрактометра;
18) пробирки с завинчивающейся крышкой, стерильные;

19) раствор трипсина, «TrypL Express», получали от фирмы INVITROGEN;
20) шланговый насос, получали от фирмы «ismaTec», скорость накачки вплоть до 5,8 мл/мин;

21) охлаждаемая ультрацентрифуга, «Sorvall Pro 80» с ротором типа «ТН-641»;
22) ультрацентрифужные пробирки, стерильные вместимостью 11 мл, размеры 9×90 мм;
23) блоки для разведении, 96-луночные вместимостью по 1,0 мл/лунку;
24) клетки линии МА-104: получали от фирмы FLI;
25) клетки линии РК-15: получали от фирмы DARD;
26) клетки линии SK-6: получали от фирмы FLI;
27) клетки линии SPEV: получали от фирмы FLI;
28) суспензии клеток линий SK 6, SPEV и РК-15, предназначенные для тестирования, содержащие во 200000 клеток/мл в среде для культур клеток, дополненной 10% FCS;
29) стерильные пробирки типа Falcon вместимостью 15 мл.
Пример 1: Исследование вредного воздействия панкреатина на различные линии клеток
При проведении обнаружения вирусов в материале опытных образцов с использованием клеточных культур необходимо оценивать вредное воздействие подлежащего изучению образца панкреатина на клетки для того, чтобы иметь возможность исключить ложные отрицательные результаты при оценке СРЕ. Поэтому были проведены описанные ниже исследования по оценке вредного воздействия суспензии опытного образца панкреатина на различные линии клеток.
Для тестирования вредного воздействия брали порции суспензии PAN объемом по 0,5 мл, которую обозначали как «опытный образец суспензии панкреатина».

Низкоскоростное центрифугирование: Оставшуюся часть суспензии PAN центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин (2700×g) и 4°С в обычной охлаждаемой центрифуге (Megafuge 1.0 R Heraeus SEPATECH с ротором с качающимися стаканами №2704). После низкоскоростного центрифугирования супернатант центрифугировали еще в течение 15 мин при 4000 об/мин и 4°С и обозначали его как «супернатант, полученный после низкоскоростного центрифугирования», который применяли для титрования вируса и ультрацентрифугирования. Два осадка, полученные в каждом случае после низкоскоростного центрифугирования, объединяли (общий объем 1 мл), ресуспендировали в 9 мл соответствующей пригодной среды для культур клеток и обозначали как «осадок».
Ультрацентрифугирование: из опытного образца «супернатанта, полученного после низкоскоростного центрифугирования» отбирали 5,0 мл и подвергали ультрацентрифугированию на ультрацентрифуге. Для этой цели вносили с помощью пипетки по 0,5 мл 50%-ного раствора сахарозы в такое количество ультрацентрифужных пробирок, которое требовалось для осуществления тестирования. Держа ультрацентрифужную пробирку под наклоном, на этот слой осторожно наслаивали 4,5 мл 20%-ного раствора сахарозы, между двумя растворами образовывался различимый разделяющий слой. Затем также осторожно и избегая турбулентности и перемешивания, на 20%-ный раствор сахарозы наслаивали слой взятого, как описано выше, опытного образца «супернатанта, полученного после низкоскоростного центрифугирования» объемом 5,0 мл. После этого ультрацентрифужные пробирки подвешивали в ультрацентрифужный ротор. Для этой цели в каждом случае две ультрацентрифужные пробирки на противоположных сторонах ротора уравновешивали с помощью ЗФР, вставляли в соответствующие держатели и плотно закрывали прилагаемой к пробирке крышкой. После установки держателей в ротор опытные образцы центрифугировали в течение 4 ч при 10°С и 40000 об/мин (273799×g). После ультрацентрифугирования ультрацентрифужные пробирки вынимали из держателей на стерильном лабораторном столе и наносили метку на высоте 1,5 см от дна ультрацентрифужной пробирки. С помощью шлангового насоса, трубопровода и капилляров, которые предварительно были простерилизованы, жидкость, находящуюся выше метки, удаляли путем аспирации из ультрацентрифужной пробирки при скорости откачивания 2 мл/мин, при этом капилляр всегда находился на верхней границе жидкости. Эту полученную таким образом первую фракцию обозначали как «верхняя фракция после ультрацентрифугирования». «Нижнюю фракцию после ультрацентрифугирования» (1,5 мл), оставшуюся в ультрацентрифужной пробирке, в каждом случае удаляли из ультрацентрифужной пробирки с помощью одноканальной пипетки. Любой осадок, который мог остаться на дне ультрацентрифужной пробирки, ресуспендировали путем повторного всасывания с помощью одноканальной пипетки и также удаляли. Объем «нижней фракции после ультрацентрифугирования» доводили в стерильной градуированной пробирке с помощью соответствующей пригодной среды для культур клеток до 5,0 мл, что соответствовало первоначальному объему анализируемого опытного образца, содержащего вирус. До осуществления последующей обработки две полученные таким образом фракции хранили при 4°С или, как в случае длительного хранения, при -20°С.
Затем тест-образцы, представляющие собой «тест-образец суспензии панкреатина», «супернатант после низкоскоростного центрифугирования», «осадок» (после низкоскоростного центрифугирования), «верхнюю фракцию после ультрацентрифугирования» и «нижнюю фракцию после ультрацентрифугирования» (после доведения объема до 5,0 мл), тестировали в отношении их вредного воздействия на различные линии клеток. Для этого приготавливали в каждом случае серийные разведения опытных образцов. Все предназначенные для тестирования опытные образцы подвергали дополнительному разведению с коэффициентом 2, начиная с разведения 1:5, с помощью соответствующей пригодной среды для культур клеток. В титрационные микропланшеты добавляли в 8 повторностях порции по 100 мкл на лунку суспензии клеток, содержащей клетки линии РК-15, SPEV или SK 6, в каждом случае 100 мкл полученных разведении опытных образцов к 100 мкл свежеполученной суспензии клеток. Когда тестировали клетки линии МА 104, то использовали титрационные микропланшеты со слоем клеток, нанесенным за 24 ч до этого. Для этой цели в каждом случае среду для культур клеток удаляли из лунок и заменяли 100 мкл свежей среды для культур клеток, не содержащей сыворотку, получая конечные разведения опытного образца 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. В качестве контроля в восемь лунок каждого титрационного микропланшета вносили по 100 мкл среды для культур клеток вместо 100 мкл серийных разведении. Пары планшетов вместе с пробиркой, содержащей 4 мл буфера Pardee, и фильтровальной бумагой помещали в воздухонепроницаемые пакеты и плотно закрывали с помощью закрывающего зажима. Затем планшеты инкубировали при 36±1°С в течение периода времени вплоть до 7 дней. В течение периода инкубации планшеты ежедневно обследовали с помощью микроскопа в отношении уровня СРЕ, т.е. в отношении лизиса клеток и/или дегенерации клеток и отсутствия образования слоя клеток в результате вредного воздействия панкреатина. Конечное обследование проводили через семь дней. Титрование повторяли в том случае, если дегенерацию клеток уже обнаруживали в контролях при осуществлении конечного считывания.
В приведенной ниже таблице 1 представлены результаты тестирования различных опытных образцов в отношении их вредного воздействия на различные линии клеток. Если опытный образец оказывал вредное воздействие вплоть до конечного разведения, например, составляющего 1:640, но не оказывал вредного воздействия в разведении 1:1280, то соответствующий результат для этого образца указан в таблице как «образец оказывает вредное воздействие при ≥1:640, но <1:1280».
Таблица 1
Результаты тестирования суспензий панкреатина и их подфракций в отношении вредного воздействия на различные линии клеток
Линии клеток
РК-15
МА-104
SK6
SPEV
Опытные образцы
Образец оказывает вредное воздействие вплоть до разведения:
Опытный образец суспензии панкреатина
≥1:640
≥1:160
≥1:320
≥1:320
<1:1280
<1:320
<1:640
<1:640
Супернатант после низкоскоростного центрифугирования
≥1:640
≥1:160
≥1:320
≥1:320
<1:1280
<1:320
<1:640
<1:640
Осадок
≥1:160
≥1:80
≥1:80
≥1:40
<1:320
<1:160
<1:160
<1:80
Верхняя фракция после ультрацентрифугирования
≥1:320
≥1:160
≥1:320
≥1:320
<1:640
<1:320
<1:640
<1:640
Нижняя фракция после ультрацентрифугирования
≥1:40
≥1:20
≥1:20
≥1:20
<1:80
<1:40
<1:40
<1:40
Результаты, представленные в таблице 1, четко свидетельствуют о том, что «нижняя фракция после ультрацентрифугирования», которую подвергали стадии ультрацентрифугирования согласно изобретению и в которой была сконцентрирована вирусная нагрузка, обладала существенно меньшим вредным воздействием на исследованные линии клеток по сравнению с другими исследованными опытными образцами.
Если сравнивать вредное воздействие опытного образца необработанной суспензии панкреатина с воздействием нижних фракций после ультрацентрифугирования, то можно видеть, что в описанном выше тесте вредное воздействие уменьшалось в 8 раз в отношении клеток линии МА-104 и в 16 раз в отношении каждой из трех других тестированных линий клеток. Супернатант еще оставался слегка мутным после того, как опытный образец суспензии панкреатина дважды подвергали низкоскоростному центрифугированию. В процессе ультрацентрифугирования эти нерастворимые частицы осаждались в виде тонкого отложения на дне ультрацентрифужной пробирки. Это отложение также подвергали ресуспендированию и оно входило в состав «нижней фракции после ультрацентрифугирования». Таким образом, можно предполагать, что это отложение вносит вклад в остаточное вредное воздействие «нижней фракции после ультрацентрифугирования» и что его остаточное вредное воздействие можно еще более уменьшить путем удаления, не осуществляя более ресуспендирования указанного выше отложения.
Пример 2: Исследование образцов панкреатина с добавлением более высокого титра вируса
50
Цель исследований образцов панкреатина с добавлением более высокого титра вируса («тесты с высоким уровнем внесенного вируса» (high-spike-тесты)) заключалась, среди прочего, в том, чтобы продемонстрировать, что способ, предлагаемый в изобретении, можно применять для количественного выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и его компонентов, которые могут оказывать вредное воздействие на живые клетки. Для этой цели для каждого предназначенного для исследования вируса приготавливали известным методом «препараты с внесенным вирусом», имеющие высокий титр. В контексте настоящего описания «высокий титр» в каждом конкретном случае (в зависимости от применяемого вида вируса) означает титр препарата с внесенным вирусом, который равен по меньшей мере 4 единицам десятичного логарифма (log) средней «цитопатогенной дозы для тканевой культуры» на мл исследуемого опытного образца (TCID/мл). Препараты с внесенным PCV с высоким титром можно приготавливать согласно методу, описанному у I.Tischer и др., Arch. Virol. 96, 1987, сс.39-57, путем предварительной обработки используемых для культивирования клеток линии РК-15 раствором D-(+)-глюкозамина.
а. Тесты с высоким уровнем внесенного EMCV (штамм LC 75)
50
0,75 мл препарата с внесенным EMCV (штамм LC 75) с высоким титром (7,70±0,10 log TCID/мл) и 0,75 мл раствора антибиотиков добавляли к суспензии PAN (полученной путем добавления 4,5 мл среды Дульбекко к 0,75 г панкреатина и перемешивания в течение 50 мин при охлаждении на льду) и образовавшуюся суспензию перемешивали еще в течение 10 мин. Для титрования вируса брали 0,5 мл этой суспензии и помещали на хранение при 4°С до осуществления титрования («фракция 1 с высоким титром EMCV»). Оставшуюся часть суспензии центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин (2700×g) и 4°С. Полученный после центрифугирования супернатант повторно центрифугировали в новой центрифужной пробирке в течение 15 мин при 4°С и 4000 об/мин. После второго центрифугирования супернатант количественно переносили в стерильную пробирку («фракция 2 с высоким титром EMCV»). Два осадка после низкоскоростного центрифугирования ресуспендировали с помощью 6,5 мл среды Дульбекко, объединяли и повторно центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин и 4°С. Полученный супернатант переносили в стерильную пробирку. Отмывку осадка повторяли еще дважды, используя каждый раз порции по 6,5 мл свежей среды Дульбекко. Три раствора для отмывки объединяли и использовали для титрования вируса («фракция 3 с высоким титром EMCV»). После трех отмывок осадок ресуспендировали в 6,5 мл среды Дульбекко и затем титровали («фракция 4 с высоким титром EMCV»).
5,0 мл «фракции 2 с высоким титром EMCV» подвергали ультрацентрифугированию в ступенчатом градиенте сахарозы, как описано выше в примере 1. После ультрацентрифугирования получали отдельно верхнюю («фракция 5 с высоким титром EMCV») и нижнюю («фракция 6 с высоким титром EMCV») фракции и осуществляли титрование.
-3
-2
-2
-1
-2
-3
Приготавливали серийные разведения вируса с коэффициентом разведения 3 и переносили каждое из 12-кратных разведении в 12 параллельных лунок на титрационные микропланшеты, содержащие суспензию клеток линии SPEV. Внесенный вирус - титрование из разведения 10; фракция 1 с высоким титром EMCV - титрование из разведения 10; фракция 2 с высоким титром EMCV - титрование из разведения 10; фракция 4 с высоким титром EMCV - титрование из разведения 10; фракция 3 с высоким титром EMCV - титрование из разведения 10; фракция 5 с высоким титром EMCV - титрование из неразведенного опытного образца; фракция 6 с высоким титром EMCV - титрование в трех повторностях из разведения 10.
2
Титрационные микропланшеты инкубировали при 36±1°С в атмосфере, содержащей примерно 5% CO, и по истечении 6-7 дней обследовали с помощью микроскопа в отношении развития СРЕ в лунках. Титр рассчитывали в опытных образцах согласно методу Спирмана-Карбера. Результаты, полученные в тесте с высоким уровнем внесенного EMCV, представлены ниже в таблице 2.
Таблица 2
Результаты, полученные в тесте с высоким уровнем внесенного EMCV в суспензиях панкреатина
Опытный образец
Титр log TCID<sub>50</sub>/мл<sup>1)</sup>
Объем опытного образца [мл]
Вирусная нагрузка [log TCID<sub>50</sub>/мл + log объема]<sup>2)</sup>
Внесенный вирус (EMCV)
7,70±0,10
0,75
7,58±0,20
Фракция 1 с высоким титром EMCV
7,14±0,10
7,5
8,02±0,20
Фракция 2 с высоким титром EMCV
7,38±0,09
5
8,08±0,18
Фракция 4 с высоким титром EMCV
3,32±0,08
7,5
4,20±0,16
Фракция 3 с высоким титром EMCV
5,67±0,10
19,5
6,96±0,20
Фракция 5 с высоким титром EMCV
4,71±0,10
8,5
5,64±0,20
Фракция 6 с высоким титром EMCV(l)
6,99±0,11
5
7,69±0,22
Фракция 6 с высоким титром EMCV (2)
7,07±0,10
5
7,77±0,20
Фракция 6 с высоким титром EMCV (3)
6,99±0,10
5
7,69±0,20
Среднее значение для 3 фракций 6 с высоким титром EMCV<sup>3)</sup>
7,02±0,05<sup>3)</sup>
5
7,72±0,10
<sup>1)</sup> Величина представлена с указанием стандартного отклонение для индивидуального титрования; <sup>2)</sup> Величина представлена с указанием 95%-ного доверительного интервала; <sup>3)</sup> Величина представлена с указанием стандартного отклонения по 3 определениям.
Из данных, представленных в таблице 2, видно, что при осуществлении способа, предлагаемого в изобретении, вирусную нагрузку в необработанных образцах для теста с высоким уровнем внесенного вируса (фракции 1 и 2 с высоким титром EMCV) с учетом обычно принимаемого диапазона вариаций, составляющего 0,5 log-единиц, оказалось возможным по меньшей мере почти количественно выделить из нижней фракции после ультрацентрифугирования (фракция 6 с высоким титром EMCV). Кроме того, из результатов теста можно заключить также, что сам образец панкреатина не оказывал ингибирующего или инактивирующего действия на EMCV.
б. Тесты с высоким уровнем введенного парвовируса свиней
Парвовирус свиней (PPV) можно культивировать в растущих клетках линии SK 6. Если выход вируса оказывается слишком низким, то после культивирования вирус концентрируют.
50
1,0 мл препарата с введенным вирусом PPV с высоким титром (4,75±0,06 log TCID/мл) добавляли к суспензии PAN (которую приготавливали путем добавления 7,0 мл среды Дульбекко и перемешивания в течение 50 мин при охлаждении на льду) и образовавшуюся суспензию перемешивали еще в течение 10 мин. Отбирали 0,5 мл этой суспензии для титрования вируса и помещали на хранение при 4°С до осуществления титрования («фракция 1 с высоким титром PPV»). Оставшуюся часть суспензии центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин (2700×g) и 4°С. Полученный после центрифугирования супернатант подвергали повторному центрифугированию в новой центрифужной пробирке в течение 15 мин при 4°С и 4000 об/мин. Супернатант после второго центрифугирования количественно переносили в стерильную пробирку («фракция 2 с высоким титром PPV»). Два осадка после низкоскоростного центрифугирования ресуспендировали, используя в общей сложности 9 мл среды Дульбекко, объединяли и повторно центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин и 4°С. Образовавшийся супернатант переносили в стерильную пробирку. Отмывку осадка повторяли дважды, используя каждый раз порции по 9 мл свежей среды Дульбекко. После этого три раствора, применявшиеся для отмывки, объединяли и использовали для титрования вируса («фракция 3 с высоким титром PPV»). После трех отмывок осадок ресуспендировали в 9 мл среды Дульбекко и затем титровали («фракция 4 с высоким титром PPV»).
5,0 мл фракции 2 с высоким титром PPV подвергали ультрацентрифугированию в ступенчатом градиенте сахарозы, как описано выше в примере 1. После ультрацентрифугирования получали по отдельности верхнюю («фракция 5 с высоким титром PPV») и нижнюю («фракция 6 с высоким титром PPV») фракции и титровали.
2
Приготавливали серийные разведения вируса с коэффициентом разведения 3 и переносили каждое из 12-кратных разведении в 12 параллельных лунок на титрационные микропланшеты, содержащие суспензию клеток линии SK 6. Титрационные микропланшеты инкубировали при 36±1°С в атмосфере, содержащей примерно 5% CO, и по истечении 6-7 дней обследовали с помощью микроскопа в отношении развития СРЕ в лунках. После этого периода инкубации планшеты фиксировали путем добавления охлажденной на льду смеси ацетон/метанол и лунки с неопределенным СРЕ дополнительно инкубировали для определения конечного титра с меченным с помощью ФИТЦ антителом к PPV и затем обследовали с помощью микроскопа в УФ-лучах. Титр рассчитывали в опытных образцах согласно методу Спирмана-Карбера.
Таблица 3
Результаты, полученные в тестах с высоким уровнем внесенного PPV в суспензиях панкреатина
Опытный образец
Титр log TCID<sub>50</sub>/мл<sup>1)</sup>
Объем опытного образца [мл]
Вирусная нагрузка [log TCID<sub>50</sub>/мл + log объема]<sup>2)</sup>
Внесенный вирус (PPV)
4,95±0,15
1
4,95±0,30
Фракция 1 с высоким титром PPV
3,56±0,08
10
4,56±0,16
Фракция 2 с высоким титром PPV
4,47±0,08
5
5,17±0,16
Фракция 4 с высоким титром PPV
2,08±0,11
10
3,08±0,22
Фракция 3 с высоким титром PPV
2,38±0,09
27
3,81±0,18
Фракция 5 с высоким титром PPV
<3,15
8,5
<4,08
Фракция 6 с высоким титром PPV(l)
4,67±0
5
5,37±0
Фракция 6 с высоким титром PPV (2)
4,43±0,08
5
5.13±0.16
Фракция 6 с высоким титром PPV (3)
4,47±0,08
5
5,17±0,16
Среднее значение для 3 фракций 6 с высоким титром PPV<sup>3)</sup>
4,52±0,13<sup>3)</sup>
5
5,22±0,26
<sup>1)</sup> Величина представлена с указанием стандартного отклонения для индивидуального титрования; <sup>2)</sup> Величина представлена с указанием 95%-ного доверительного интервала; <sup>3)</sup> Величина представлена с указанием стандартного отклонения по 3 определениям.
Из данных, представленных в таблице 3, видно, что, как продемонстрировано в эксперименте с высоким уровнем введенного EMCV, при успешном осуществлении способа, предлагаемого в изобретении, вирусную нагрузку в необработанных опытных образцах с высоким уровнем введенного вируса (фракции 1 и 2 с высоким титром PPV) с учетом обычно принимаемого диапазона вариаций, составляющего 0,5 log-единиц, оказалось возможным по меньшей мере почти количественно выделить из нижней фракции после ультрацентрифугирования (фракция 6 с высоким титром PPV). В фракции 1 с высоким титром PPV, т.е. в присутствии нерастворимых частиц, был выявлен на одну log-единицу меньший титр PPV, чем во фракции 2 с высоким титром PPV. Таким образом, по-видимому, присутствие нерастворимых частиц нарушает титрование. Кроме того, из результатов теста можно заключить также, что сам по себе образец панкреатина не оказывал ингибирующего или инактивирующего действия на EMCV.
Пример 3: Исследование образцов панкреатина с добавлением низкого титра вируса
Цель исследований образцов панкреатина с добавлением пониженного титра вируса («тесты с низким уровнем внесенного вируса» (low-spike-тесты)) заключалась, среди прочего, в том, чтобы оценить предел обнаружения способа, предлагаемого в изобретении, для вируса, используемого в каждом конкретном случае. Количественное обнаружение вирусной нагрузки в индивидуальных опытных образцах с пониженными титрами вируса можно успешно осуществлять в том случае, если титр вируса в препарате с исходным добавленным вирусом с учетом обычно принятого диапазона вариаций, составляющего 0,5 log-единиц, можно по крайней мере почти количественно выявить в нижних фракциях после ультрацентрифугирования.
а. Тест с низким уровнем введенного EMCV
Приготавливали суспензию PAN (содержащую 2,5 г свиного панкреатина, 2,5 мл раствора антибиотиков, 20 мл среды Дульбекко). Тест с низким уровнем введенного вируса осуществляли с дублированием в виде независимых друг от друга тестов.
Для первого теста приготавливали указанные ниже партии, используя суспензию PAN и раствор вводимого вируса EMCV:
-3
-4
1) 4,5 мл суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10; результирующее разведение 10;
-4
-5
2) 4,5 мл суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10; результирующее разведение 10;
-5
3) 4,5 мл суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10; и т.д.
-6
4) 4,5 мл суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10;
-7
5) 4,5 мл суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10;
-8
6) 4,5 мл суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10.
Все партии инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и затем подвергали низкоскоростному центрифугированию в течение 15 мин при 4°С и 4000 об/мин (2700×g). Супернатанты после низкоскоростного центрифугирования в каждом случае переносили в новые центрифужные пробирки и подвергали еще один раз низкоскоростному центрифугированию в тех же условиях. При необходимости объем супернатантов, полученных после низкоскоростного центрифугирования, доводили до 5,0 мл с помощью среды для культур клеток и для каждого варианта 5,0 мл супернатантов, полученных после низкоскоростного центрифугирования, подвергали ультрацентрифугированию в ступенчатом градиенте сахарозы, как описано выше в примере 1. После ультрацентрифугирования верхние фракции («нижняя фракция 2 EMCV»; расположенная выше уровня 1,5 см в ультрацентрифужной пробирке) для каждого варианта откачивали с помощью шлангового насоса и соответствующие расположенные еще ниже фракции («нижняя фракция 3 EMCV») удаляли из ультрацентрифужной пробирки с помощью пипетки. Объем нижних фракций, полученных после ультрацентрифугирования, для каждого варианта доводили до 5,0 мл с помощью среды MEM и затем использовали для титрования или культивирования в колбах для культур ткани.
2
После этого на основе каждой из указанных выше партий 1)-3) приготавливали серийные разведения вируса с коэффициентом разведения 3 и переносили каждое из 12 разведении в 12 параллельных лунок на титрационные микропланшеты, содержащие суспензию клеток линии SPEV (порции по 100 мкл на лунку свежеприготовленной клеточной суспензии клеток линии SPEV в концентрации 200000 клеток/мл). Опытные образцы нижней фракции 3 EMCV для всех партий дополнительно переносили в колбы для культур ткани с площадью основания 25 см, содержащие порции по 10 мл свежеприготовленной клеточной суспензии клеток линии SPEV в концентрации 200000 клеток/мл. Для этой цели по 6 колб для культур ткани для каждого опытного образца заражали порцией 0,2 мл нижней фракции 3 опытного образца EMCV. Параллельно приготавливали в качестве контроля одну колбу для культур ткани без каких-либо добавлений. Все титрационные планшеты и колбы для культур ткани инкубировали при 36±1°С и в течение 6-7 дней обследовали с помощью микроскопа в отношении развития СРЕ в лунках или в колбах для культур ткани. Титр в титрованных опытных образцах рассчитывали согласно методу Спирмана-Карбера.
Если ни в одной из 6 колб для культур ткани рассматриваемой партии по истечении 7 дней не было обнаружено СРЕ, то эти колбы трижды подвергали замораживанию при -70°С и повторному оттаиванию. Содержимое всех колб для культур ткани объединяли и фильтровали через 0,1 мкм-фильтр (размер пор). Полученный фильтрат использовали для приготовления второго пассажа суспензии клеток линии SPEV: 2 колбы для культур ткани, каждая из которых содержала по 10 мл свежей суспензии клеток линии SPEV, заражали 2 мл суспензии, полученной после 1-го пассажа, и таким же образом инкубировали в течение периода времени вплоть до 7 дней при 36±1°С и обследовали в отношении развития СРЕ. Если и во 2-м пассаже не было обнаружено СРЕ, то дополнительно осуществляли 3-й пассаж. Если в 3-м пассаже также получали отрицательный результат, то можно считать, что исходный опытный образец не содержит EMCV.
В вышеуказанных тестах с низким уровнем введенного вируса с использованием серийных разведении EMCV был оценен предел обнаружения способа, предлагаемого в изобретении, который составил одну инфекционную единицу EMCV на 0,1 г используемого образца панкреатина.
б. Тест с низким уровнем введенного PPV
Приготавливали суспензию PAN (содержащую 2,5 г свиного панкреатина, 2,5 мл раствора антибиотиков, 20 мл среды Дульбекко). Тест с низким уровнем введенного вируса осуществляли с дублированием в виде независимых друг от друга тестов:
Для этой цели приготавливали указанные ниже партии, используя суспензию PAN и раствор вводимого вируса PPV.
-1
1) 4,5 суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10;
-2
2) 4,5 суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10;
-3
3) 4,5 суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10;
-4
4) 4,5 суспензии панкреатина + 0,5 мл вводимого вируса в разведении 10.
Все партии инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и затем подвергали низкоскоростному центрифугированию в течение 15 мин при 4°С и 4000 об/мин (2700×g). Супернатанты после низкоскоростного центрифугирования в каждом случае переносили в новые центрифужные пробирки и подвергали еще один раз низкоскоростному центрифугированию в тех же условиях. При необходимости объем супернатантов, полученных после низкоскоростного центрифугирования, доводили до 5,0 мл с помощью среды для культур клеток и для каждого варианта 5,0 мл супернатантов, полученных после низкоскоростного центрифугирования, подвергали ультрацентрифугированию в ступенчатом градиенте сахарозы, как описано выше в примере 1. После ультрацентрифугирования верхние фракции («нижняя фракция 2 PPV»; расположенная выше уровня 1,5 см в ультрацентрифужной пробирке) для каждого варианта откачивали с помощью шлангового насоса и соответствующие расположенные еще ниже фракции («нижняя фракция 3 PPV») удаляли из ультрацентрифужной пробирки с помощью пипетки. Объем нижних фракций, полученных после ультрацентрифугирования, для каждого варианта доводили до 5,0 мл с помощью среды Дульбекко и затем использовали для титрования или культивирования в колбах для культур ткани.
После этого на основе каждой из указанных выше партий 1)-3) приготавливали серийные разведения вируса с коэффициентом разведения 3 и переносили каждое из 12 разведении в 8 параллельных лунок на титрационные микропланшеты, содержащие суспензию клеток линии SK-6 (порции по 100 мкл на лунку свежеприготовленной клеточной суспензии клеток линии SPEV в концентрации 200000 клеток/мл).
6 колб для культур ткани для каждого опытного образца заражали порцией 0,2 мл нижней фракции 3 опытного образца PPV. Параллельно приготавливали в качестве контроля одну колбу для культур ткани без каких-либо добавлений. Все титрационные планшеты и колбы для культур ткани инкубировали при 36±1°С и в течение 6-7 дней обследовали с помощью микроскопа в отношении развития СРЕ в лунках или в колбах для культур ткани. Титр в титрованных опытных образцах рассчитывали согласно методу Спирмана-Карбера.
Если ни в одной из 6 колб для культур ткани рассматриваемой партии по истечении 7 дней не было обнаружено СРЕ, то эти колбы трижды подвергали замораживанию при -70°С и повторному оттаиванию. Содержимое всех колб для культур ткани объединяли и фильтровали через 0,1 мкм-фильтр (размер пор). Полученный фильтрат использовали для приготовления второго пассажа суспензии клеток линии SK-6: 2 колбы для культур ткани, каждая из которых содержала по 10 мл свежей суспензии клеток линии SK-6, заражали 2 мл суспензии, полученной после 1-го пассажа, и таким же образом инкубировали в течение периода времени вплоть до 7 дней при 36±1°С и обследовали в отношении развития СРЕ. Если и во 2-м пассаже не было обнаружено СРЕ, то дополнительно осуществляли 3-й пассаж. Если в 3-м пассаже не было обнаружено СРЕ, то через 7 дней среду для культур клеток удаляли из колб для 3-го пассажа и слой клеток фиксировали с помощью охлажденной на льду смеси ацетон/метанол (80:20 об./об.). Затем производили обнаружение зараженных клеток в колбах для культур ткани с использованием меченного с помощью ФИТЦ антитела к PPV (1 мл раствора антитела на колбу; инкубация в течение 60 мин при 37°С, отмывка буфером для отмывки и последующая оценка с помощью микроскопа в УФ-лучах). Если в колбах для 3-го пассажа не обнаружено зараженных клеток, то можно считать, что исходный опытный образец не содержит PPV.
В вышеуказанных тестах с низким уровнем введенного вируса с использованием серийных разведении PPV был оценен предел обнаружения способа, предлагаемого в изобретении, который составил одну инфекционную единицу PPV на 0,1 г используемого образца панкреатина.