СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ
METHOD OF PRODUCTION OF NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF LACTOBACILLI

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к получению питательных сред для культивирования лактобактерий, и может быть использовано для производства пробиотических препаратов.
Известна питательная среда для культивирования бифидо- или лактобактерий (Пат. РФ №2287572), которая готовится путем смешивания дрожжевого автолизата, гидролизата казеина и натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, в полученную смесь вносят молочную сыворотку, содержащую 15% сухих веществ с гидролизованной на 50-70% лактозой и обезжиренное молоко, перемешивают, стерилизуют и охлаждают.
9
Недостатком данного способа и среды является труднодоступность некоторых компонентов среды для микробиологических лабораторий. Рост лактобактерий на данной среде затруднительно контролировать визуально, т.к. она не прозрачна, кроме того, среда не позволяет получить биомассу лактобактерий в высоких концентрациях (свыше 10 КОЕ/мл).
Известна питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий (Пат. РФ №2158302), которая готовится путем разведения белкового гидролизата крови или белкового гидролизата заменителя крови дистиллированной водой в соотношении 1:2, после чего в него вносят агар-агар в количестве 0,7-0,8 г/л и аскорбиновую кислоту в количестве 0,01-0,10 г/л. Полученный состав предварительно прогревают текучим паром 30 мин, а затем стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин.
Недостатком данного способа является низкая технологичность процесса, требующая дополнительных энергозатрат, связанных с нагреванием и стерилизацией полученного состава, кроме того, в известном способе отсутствует контроль pH среды в процессе приготовления, что может негативно влиять на ее ростовые свойства. Недостатком самой питательной среды является слабый рост молочнокислых бактерий из-за недостаточной питательности и по причине наличия агар-агара в ее составе, который препятствует распределению этих микроорганизмов в толще среды, т.к. они не обладают подвижностью.
прототип
Известен также способ приготовления питательной среды, который является наиболее близким по сути предлагаемому изобретению и поэтому взят авторами за (Дзержинская И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов: Учебное пособие. - Астрахань: Издательство АГТУ, - 2008. - 236 с.). Предварительно готовят отвар капусты следующим образом: 500,0 г свежей капусты кипятят 30 мин в 1 л водопроводной воды. Затем в полученный отвар добавляют ингредиенты: натрий фосфорнокислый - 2,0 г, магний сернокислый - 1,0 г, пептон - 5,0 г, глюкозу - 10,0 г, лимоннокислый натрий - 10,0 г, после чего смесь стерилизуют.
9
Недостатком данного способа является отсутствие контроля за pH среды в процессе приготовления и использование водопроводной воды, которая может содержать вредные для лактобактерий вещества (например, хлор). Кроме того, на приготовленной данным способом среде, лактобактерии растут и размножаются медленно, что не позволяет получить их биомассу в высоких концентрациях (более 10 КОЕ/мл).
Техническим результатом заявляемого изобретения является интенсификация процесса культивирования и увеличение выхода биомассы лактобактерий путем использования легко воспроизводимой, дешевой, с хорошими ростовыми свойствами питательной среды.
Технический результат достигается тем, что способ приготовления питательной среды для культивирования лактобактерий, включающий смешивание отвара капусты с ингредиентами и стерилизацию смеси при 0,5 атм в течение 25-30 мин, отличается тем, что в качестве  ингредиентов используют предварительно приготовленный раскисленный  до рН 6,7-6,9 кислотный гидролизат крови  убойных животных в количестве 9-10% от объема питательной среды и молочную сыворотку, после этого к раскисленному кислотному гидролизату крови убойных животных добавляют остальные ингредиенты в следующем порядке и при соотношении, масс.%: дрожжевой аутолизат - 9,0-10,0, молочную сыворотку - 9,0-10,0, глюкозу - 1,9-2,0, и доводят объем до 100 масс.% отваром капусты, затем смесь нагревают и кипятят в течение 5-7 минут, после чего определяют pH питательной среды и доводят до значения 6,7-6,9, после этого полученную питательную смесь фильтруют и фасуют во флаконы
Новизна предлагаемого способа состоит в последовательности смешивания исходных отвара капусты с ингредиентами, в качестве которых выступают кислотный гидролизат крови убойных животных  (источник аминокислот и минералов), дрожжевой аутолизат (источник аминокислот и витаминов группы B), молочная сыворотка (источник аминокислот, лактозы, минералов и витаминов) и глюкоза, а также в том, что значение pH питательной смеси доводят до 6,7-6,9.
В связи с тем что исходное значение pH кислотного гидролизата крови убойных животных меньше единицы, то перед тем, как этот ингредиент ввести в питательную смесь, его необходимо раскислить, в противном случае получаемая среда нестабильна, после автоклавирования становится мутной, выпадает обильный осадок, лактобактерии на такой среде плохо растут. Оптимальное содержание водородных ионов в питательной среде для лактобактерий должно находиться в диапазоне 6,7-6,9, в связи с чем до этого значения доводится pH кислотного гидролизата крови убойных животных и получаемой питательной среды. Кроме того, при таком значении pH в процессе автоклавирования не разрушаются углеводы (глюкоза и лактоза), присутствующие в питательной среде.
Необходимость нагрева и кипячения смеси перед автоклавированием объясняется тем, что в молочной сыворотке содержатся крупномолекулярные белковые структуры (альбумины, глобулины, казеин), которые при термическом воздействии (автоклавировании) выпадают в осадок и негативно изменяют свойства конечного продукта.
Фильтрование позволяет получить прозрачную питательную среду, которая не изменяет своих физических свойств при последующем автоклавировании.
Стерилизация полученной питательной среды при 0,5 атм в течение 25-30 мин автоклавированием регламентируется общими правилами приготовления питательных сред, содержащих углеводы (Дзержинская И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов: Учебное пособие. - Астрахань: Издательство АГТУ, - 2008. - 236 с.).
Поэтому только при сочетании в процессе приготовления питательной среды заявленных признаков можно получить питательную среду, отличающуюся хорошими ростовыми свойствами, которые обеспечивают высокую интенсивность роста и накопления биомассы лактобактерий.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Кислотный гидролизат крови получают по авторскому способу (патент РФ №2186497).
Дрожжевой аутолизат получают по Розанову (Н.И. Розанов Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. - М.: Гос. из-во с.-х. литературы, 1952. - С.91).
Молочную сыворотку получают в условиях лаборатории, для чего в 1 л подогретого до 60-70°C натурального молока с жирностью 2,5% при постоянном помешивании добавляют 2,5-3 мл 70% уксусной кислоты (эссенции), после створаживания сгусток казеина отделяют, а сыворотку фильтруют через ватно-марлевый фильтр и используют для приготовления среды.
Отвар капусты готовят по Квасникову (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.65).
Кислотный гидролизат крови убойных животных в количестве 9-10% от объема питательной среды предварительно раскисляют до pH 6,7-6,9, после чего к нему добавляют дрожжевой аутолизат в количестве 9-10%, молочную сыворотку в количестве 9-10%, глюкозу в количестве 1,9-2% и доводят объем смеси до 100 масс.% отваром капусты. Полученную смесь нагревают до кипения, кипятят 5-7 минут, определяют pH питательной среды и доводят до 6,7-6,9, после этого полученную питательную среду фильтруют, затем фасуют во флаконы и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм в течение 25-30 мин.
Готовая питательная среда это прозрачная, светло-коричневого цвета жидкость с легким, приятным молочно-хлебным запахом. В этой питательной среде лактобактерии быстро дают обильный рост и накапливают высокую биомассу.
Примеры приготовления питательной среды для культивирования лактобактерий.
Пример 1. В колбу емкостью 1 л помещают 100 мл кислотного гидролизата крови убойных животных и приливают 16 мл 10% раствора гидроксида натрия, устанавливают pH 6,7, после этого в колбу приливают 100 мл дрожжевого аутолизата, 100 мл молочной сыворотки, 2 г глюкозы и доводят объем до 1 л отваром капусты. Полученную смесь нагревают до кипения и кипятят 7 минут, после чего измеряют pH и при необходимости доводят pH до 6,7. Далее питательную смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, разливают во флаконы объемом 100 мл и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм в течение 25 мин. Готовая питательная среда прозрачная, светло-коричневого цвета с легким, приятным молочно-хлебным запахом.
Для оценки технического результата в приготовленную среду (опытную) и среду, приготовленную по прототипу (контрольную), вносят Lactobacillus plantarum в количестве 1000 клеток. Через 6, 9, 12 и 24 ч из культуральных сред отбирают пробы для определения численности лактобактерий.
6
4
Результаты опыта представлены в таблице 1, из которой видно, что в опытной среде интенсивность роста бактерий очень высокая, превышающая таковую в контрольной на 1-3 порядка. Так, уже через 6 ч после посева в опытной питательной среде количество лактобактерий было на порядок выше посевной дозы, в то время как в контрольной среде количество бактерий увеличилось только в 2 раза. Через 9 ч в опытной среде количество лактобактерий уже составляло 4×10 КОЕ/мл, в то время как в контрольной только 2×10 КОЕ/мл. Через 12 ч в опытной среде количество лактобактерий было уже на 3 порядка большим, чем в контрольной среде. К концу культивирования (через 24 ч) в опытной среде концентрация лактобактерий составила 90 млрд КОЕ/мл, в то время как в контрольной - 70 млн КОЕ/мл.
Таблица 1
Ростовые свойства питательной среды, приготовленной по заявляемому способу
Среда
Количество бактерий Lactobacillus plantarum, КОЕ/мл
Время культивирования, ч
6
9
12
24
Опытная (приготовленная по заявляемому способу)
2×10<sup>4</sup>
2×10<sup>6</sup>
9×10<sup>8</sup>
9×10<sup>10</sup>
Контрольная (приготовленная по прототипу)
2×10<sup>3</sup>
2×10<sup>4</sup>
6×10<sup>5</sup>
7×10<sup>7</sup>
Пример 2. В колбу емкостью 1 л помещают 90 мл кислотного гидролизата крови убойных животных и приливают 14 мл 10% раствора гидроксида натрия, устанавливают pH 6,9, после этого в колбу приливают 90 мл дрожжевого аутолизата, 90 мл молочной сыворотки, 1,9 г глюкозы и доводят объем до 1 л отваром капусты. Полученную смесь нагревают до кипения и кипятят 5 минут, после чего измеряют pH и при необходимости доводят pH до 6,9. Далее смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, разливают во флаконы объемом 100 мл и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм в течение 25 мин. Готовая питательная среда прозрачная, светло-коричневого цвета с легким, приятным молочно-хлебным запахом.
Для оценки технического результата в приготовленную среду (опытную) и среду, приготовленную по прототипу (контрольную), вносят Lactobacillus plantarum в количестве 1000 клеток. Через 6, 9, 12 и 24 ч из культуральных сред отбирают пробы для определения численности лактобактерий.
6
4
Результаты опыта представлены в таблице 2, из которой видно, что в опытной среде интенсивность роста бактерий очень высокая, превышающая таковую в контрольной на 1-3 порядка. Так, уже через 6 ч после посева в опытной питательной среде количество лактобактерий было на два порядка выше посевной дозы, в то время как в контрольной среде количество бактерий увеличилось только в 5 раз. Через 9 ч в опытной среде количество лактобактерий уже составляло 6×10 КОЕ/мл, в то время как в контрольной только 2×10 КОЕ/мл. Через 12 ч в опытной среде количество лактобактерий было уже на 3 порядка большим, чем в контрольной среде. К концу культивирования (через 24 ч) в опытной среде концентрация лактобактерий составила 40 млрд КОЕ/мл, в то время как в контрольной - 70 млн КОЕ/мл.
Таблица 2
Ростовые свойства питательной среды, приготовленной по заявляемому способу
Среда
Количество бактерий Lactobacillus plantarum, КОЕ/мл
Время культивирования, ч
6
9
12
24
Опытная (приготовленная по заявляемому способу)
2×10<sup>5</sup>
6×10<sup>6</sup>
3×10<sup>8</sup>
4×10<sup>10</sup>
Контрольная (приготовленная по прототипу)
5×10<sup>3</sup>
2×10<sup>4</sup>
6×10<sup>5</sup>
7×10<sup>7</sup>
Пример 3. В колбу емкостью 1 л помещают 100 мл кислотного гидролизата крови убойных животных и приливают 14 мл 10% раствора гидроксида натрия, устанавливают pH 6,9, после этого в колбу приливают 100 мл дрожжевого аутолизата, 100 мл молочной сыворотки, 2 г глюкозы и доводят объем до 1 л отваром капусты. Полученную смесь нагревают до кипения и кипятят 5 минут, после чего измеряют pH и при необходимости доводят pH до 6,9. Далее смесь фильтруют через фильтровальную бумагу, разливают во флаконы объемом 200 мл и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм в течение 30 мин. Готовая питательная среда прозрачная, светло-коричневого цвета с легким, приятным молочно-хлебным запахом.
Для оценки технического результата в приготовленную среду (опытную) и среду, приготовленную по прототипу (контрольную), вносят Lactobacillus plantarum в количестве 1000 клеток. Через 6, 9, 12 и 24 ч из культуральных сред отбирают пробы для определения численности лактобактерий.
6
4
Результаты опыта представлены в таблице 3, из которой видно, что в опытной среде интенсивность роста бактерий очень высокая, превышающая таковую в контрольной на 1-3 порядка. Так, уже через 6 ч после посева в опытной питательной среде количество лактобактерий было на порядок выше посевной дозы, в то время как в контрольной среде количество бактерий увеличилось только в 7 раз. Через 9 ч в опытной среде количество лактобактерий уже составляло 5×10 КОЕ/мл, в то время как в контрольной только 2×10 КОЕ/мл. Через 12 ч в опытной среде количество лактобактерий было уже на 3 порядка большим, чем в контрольной среде. К концу культивирования (через 24 ч) в опытной среде концентрация лактобактерий составила 90 млрд КОЕ/мл, в то время как в контрольной - 70 млн КОЕ/мл.
Таблица 3
Ростовые свойства питательной среды, приготовленной по заявляемому способу
Среда
Количество бактерий Lactobacillus plantarum, КОЕ/мл
Время культивирования, ч
6
9
12
24
Приготовленная по заявляемому способу
2×10<sup>4</sup>
5×10<sup>6</sup>
7×10<sup>8</sup>
9×10<sup>10</sup>
Приготовленная по прототипу
7×10<sup>3</sup>
2×10<sup>4</sup>
6×10<sup>5</sup>
7×10<sup>7</sup>
Таким образом, питательная среда, приготовленная по заявляемому способу, обеспечивает интенсивный рост лактобактерий и значительное накопление биомассы лактобактерий, а следовательно, способ может быть использован в исследовательских целях и для производства пробиотических препаратов.