СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО (SCISANDRA CHINENSIS (TURCZ.) BAILL.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO
METHOD FOR INCREASING EFFICIENCY OF CULTIVATING CALLUS CULTURE OF CHINESE MAGNOLIA VINE (SCISANDRA CHINENSIS (TURCZ.) BAILL.), IN VITRO CONDITIONS

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для культивирования каллусной культуры лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.).
В последнее время лекарственное растительное сырье получило повышенный научный интерес в качестве альтернативы синтетическим фармацевтическим препаратам. Биологически активные вещества (БАВ) растений играют важную роль в поддержании и укреплении здоровья человека, в лечении заболеваний сердечно-сосудистых, онкологических, сахарного диабета, ожирения и др. [1,2].
Болезни сердечно-сосудистой системы (инфаркт миокарда, артериальная гипертония, инсульт и др.) являются ведущей причиной смертности [3-5]. В 2018 г. они составили 46,8% от всех случаев смерти в России. В 2017 г. в России выявлено почти 541 тыс. онкологически больных жителей. От злокачественных новообразований ушли из жизни 290,7 тыс. человек, что составляет 15,9% в общей структуре смертности [6]. В течение 1-го года погибает 22,5% пациентов, так как около 40% впервые выявленных злокачественных новообразований имеют III-IV стадию заболевания.
Таким образом, общая картина состояния здоровья населения отражает острую необходимость развития отечественной науки на более современном уровне, включая использование всех возможных резервов в освоении природных компонентов из лекарственных видов растений для получения биологически активных веществ и целевого использования в лечении тяжелых заболеваний.
Перспективным сырьем для фармацевтической промышленности является такое лекарственное растение, как лимонник китайский (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.).
S. chinensis является ценным лекарственным растением, используемым в традиционной и современной китайской медицине. Включен в Международную фармакопею под редакцией ВОЗ в список важных лекарственных растений [7]. В Российской фармакопее растение относится к классическим адаптогенам наряду с элеутерококком колючим (Eleutherococcus senticosus (Rupr.) Maxim.), женьшенем обыкновенным (Panax ginseng C.A. Mey.), левзеей сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides (Willd.) Dittrich) и др. [8].
Биологически активные вещества лимонника китайского, выступающие в качестве адаптогенов, оказывают нормализующее действие независимо от характера патологических изменений и неспецифически повышают сопротивляемость организма стрессорам различной природы.
В медицинских целях используют семена и цельные плоды, в народной же - все органы растения (в том числе стебли и корневую систему). На основе сырья S. chinensis производят следующую продукцию: масло и экстракт (жидкий) из семян, экстракт (сухой) из плодов растения и др. Данную продукцию используют в производстве обогащенных биологически активными добавками продуктов питания [9].
Состав лимонника китайского представлен сахарами, органическими кислотами (лимонная, яблочная, фумаровая, винная), витаминами (С, Е, группы В и др.), фенольными кислотами, лигнанами, дубильными веществами, фитостеролами, эфирным маслом [10-12]. Эфирное масло плодов S. chinensis богато сесквитерпеновыми углеводородами. Кротова И.В. и Ефремов А.А. в своей работе рассматривают составные компоненты эфирного масла плодов лимонника китайского. Более 60% эфирного масла представлено сесквитерпенами, также обнаружены алифатические, моноциклические, бициклические терпены [13].
Для обеспечения своевременной и бесперебойной поставки лекарственного сырья необходимо параллельно с традиционными способами размножения широко внедрять современные методы биотехнологии растений. Их применение существенно ускоряет процесс получения экологически чистого сырья с повышенным содержанием биологически активных веществ. К таким методам относится культивирование клеток и органов растений (каллусные, суспензионные, корневые культуры) в условиях in vitro. Каллусные культуры рассматриваются как дедифференцированная масса клеток, полученных из эксплантатов, инокулированных in vitro в среде, состоящей из относительно более высоких концентраций ауксинов или комбинации равных концентраций ауксинов и цитокининов [14]. В растениях, где желаемые метаболиты присутствуют в листьях, создание культур in vitro из листьев и их использование для экстракции соединений является идеальной альтернативой.
Из существующего уровня техники известен способ повышения эффективности культивирования in vitro березы повислой, лимонника китайского, рододендрона и сирени {патент РФ №2619177, опубл. 12.05.2017). Суть метода состоит в том, что растения, выращиваемые на питательных средах для мультипликации (для лимонника китайского на среде Кворина-Лепуавра с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-бензиламинопурина 0,5 мг/л), переносят на свежую питательную среду через 3 недели, допуская наличие на одном экспланте не более двух почек. При переносе растений на свежую питательную среду предпочтение отдается побегам, развившимся из пазушных почек, поскольку они характеризуются большей степенью ювенильности, чем побеги, полученные за счет апикального роста.
Существенным недостатком предложенного способа является отсутствие вариаций питательных сред для первого этапа культивирования, вследствие чего сложно утверждать о достаточной эффективности способа.
Известна питательная среда для размножения лимонника китайского в условиях in vitro (патент РФ №2440414, опубл. 20.01.2012) следующего состава, мг/л: аммоний азотнокислый 400,0; калий азотнокислый 1800,0; магний сернокислый 360,0; калий фосфорнокислый 270,0; кальций азотнокислый 1200,0; железо сернокислое 27,8; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3; марганец сернокислый 1,0; борная кислота 6,2; цинк сернокислый 8,6; натрий молибденовокислый 0,25; медь сернокислая 0,025; кобальт хлористый 0,025; калий йодистый 0,08; тиамин 0,4; пиридоксин 0,5; никотиновая кислота 0,5; глицин 2,0; инозитол 100,0; гидролизат казеина 250,0; глюкоза 15000,0; агар 7000,0; 6-бензиламинопурин 1,0; индолилмасляная кислота 0,1 и вода до 1 л.
Данная питательная среда направлена на усиление побегообразования, вследствие чего она недостаточно эффективна для культивирования дедифференцированных клеток лимонника китайского.
Описан способ размножения лимонника китайского (патент CN №106171991, опубл. 07.12.2016), предусматривающий следующие этапы: помещение стерилизованных спящих почек лимонника китайского в индукционную среду для получения каллуса; разрезание каллуса, а затем помещение его в культуральную среду для индукции эмбриогенного каллуса; перенос эмбриогенного каллуса в жидкую среду, чтобы вызвать соматические эмбрионы для получения глобулярных эмбрионов; перенос глобулярных зародышей в полутвердую среду для проращивания соматических зародышей для получения укорененных проростков; пересадку укорененных проростков в матричную среду с массовым соотношением перлита и торфа при массовом соотношении 1:2,8-3,2 и пересадку рассады после культивирования. Компоненты индукционной среды следующие: среда Мурасиге-Скуга, содержащая 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту 1,8-3,2 мг/л, тидиазурон 0,15-0,25 мг/л, сахарозу 28-32 г/л и агар 6,5-7,5 г/л.
К недостатку заявленного способа следует отнести недостаточный выход биологически активных веществ в биомассе каллуса, а также использование агара в количестве 7 г, что не способствует созданию оптимальной плотности питательной среды.
В ходе проведения патентного поиска не выявлено техническое решение, которое может быть признано ближайшим аналогом.
Техническая задача, решаемая использованием разработанного изобретения, состоит в разработке нового эффективного способа культивирования лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) в условиях in vitro.
Техническим результатом, полученным при реализации заявленного способа, является получение биомассы каллусной культуры лимонника китайского с большим выходом и высоким содержанием биологически активных веществ фенольной природы.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ культивирования каллусной культуры лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.), включающий стерилизацию посадочного материала, приготовление питательной среды на минеральной основе Мурасиге-Скуга (MS) или Гамборга (В-5) с добавлением или без гормонов - 6-бензиламинопурина (6-БАП) и нафтилуксусной кислоты (НУК), культивирование в стерильных условиях при фотопериоде (свет/темнота) 16/8 часов, температуре 25±2°C и влажности 60-70%.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами (таблица 1):
2
Пример 1. На первом этапе производят стерилизацию посадочного материала. Для этого листовые пластины лимонника китайского отмывают детергентом и для стерилизации помещают в 0,1%-ный раствор сулемы (HgCl) на 1 мин. После стерилизации материал трехкратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. Листовые пластинки разрезают скальпелем на сегменты размером 5×5 мм и используют в качестве эксплантов.
На втором этапе готовят агаризованную питательную среду. Для этого все компоненты, за исключением витаминов и гормонов, разводят в 1,0 л дистиллированной воды, доводят до кипения, автоклавируют при температуре 121°C в течение 20 мин. После остывания среды в стерильных условиях через мембранный фильтр добавляют витамины и гормоны. Готовую питательную среду разливают по чашкам Петри (диаметр 60 мм). Для культивирования каллусной биомассы лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) используют безгормональную питательную среду следующего состава (на 1 л бидистиллированной воды): минеральная основа по В-5, сахароза 30,0 г/л, гидролизат казеина 500,0 мг/л, инозит 100,0 мг/л, тиамин 10,0 мг/л, пиридоксин 1,0 мг/л, никотиновая кислота 1,0 мг/л, агар бактериологический 20,0 г/л.
На третьем этапе стерильные листовые экспланты помещают на застывшую агаризованную питательную среду для инициации развития каллуса. Культивирование проводят в стерильных условиях климатической камеры при фотопериоде (свет/темнота) 16/8 часов, температуре 25±2°C и влажности 60-70% воздуха. Каллус при пересеве делят на 3-7 частей в зависимости от прироста.
Пример 2. Аналогичен примеру 1, но в состав питательной среды дополнительно вводится 3,0 мг 6-БАП и 1,5 мг НУК.
Пример 3. Аналогичен примеру 1, но в составе питательной среды в качестве источника минеральных компонентов используется основа по В-5.
Пример 4. Аналогичен примеру 3, но в состав питательной среды вводится 3,0 мг 6-БАП и 1,5 мг НУК.
Результаты анализа индекса роста каллусной биомассы лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) представлены в таблице 2.
Показано, что максимальный выход биомассы наблюдается при использовании питательной среды, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скугу. Средний показатель индекса роста на среде с минеральной основой MS составил 21,075, что в 1,26 раза превышает показатель среды с минеральными солями по Гамборгу. При этом значительное влияние на рост культуры оказывают гормоны, в особенности совместное использование 6-БАП и НУК (в этом случае индекс роста составил 23,11).
Результаты изучения содержания БАВ фенольной природы в каллусной культуре лимонника китайского (таблица 3) прямо пропорциональны результатам по изучению индекса роста каллусных культур. Максимальное накопление биологически активных веществ наблюдается при использовании питательной среды по примеру 4. По сравнению с содержанием БАВ в исходном материале (листовые пластины лимонник китайского), каллусная культура по примеру 4 накапливает БАВ в 1,34 раза больше.
Таким образом, заявляемый способ обеспечивает высокое накопление биомассы и большое содержание биологически активных веществ фенольной природы в каллусной культуре лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.).
Список литературы
1. Cicero, A.F.G. Food and plant bioactives for reducing cardiometabolic disease: How does the evidence stack up? / A.F.G. Cicero, A. Colletti // Trends in food science & technology. - 2017. - Vol. 69, P. B. - P. 192-202.
2. Delivery of bioactives in food for optimal efficacy: What inspirations and insights can be gained from pharmaceutics? / E. Nowak, Y.D. Livney, Z. Niu, H. Singh // Trends in food science & technology. - 2019. - Vol.91. - P. 557-573.
3. Boytsov, S. Regional challenges and opportunities in cardiovascular research: The Russian Federation «SWOT» analysis / S. Boytsov, F. Van de Werf // American heart journal. - 2011. - Vol. 161, №3. - P. 427-430.
4. Risk of cardiovascular disease morbidity and mortality in frail and pre-frail older adults: Results from a meta-analysis and exploratory meta-regression analysis / N. Veronese, E. Cereba, B. Stubbs, M. Solmi et al. // Ageing Research Reviewsio - 2017. - Vol. 35. - P. 63-73.
5. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors, 1990-2019: update from the GBD 2019 study / G. Roth, G. Mensah, C. Johnson, G. Addolorato et al. // Journal of the American College of Cardiology. - 2020. - Vol. 76, 1. 25. - P. 2982-3021.
6. Здравоохранение в России. 2019: Стат. сб. / Росстат. - М. - 2019. - 170 с.
7. Accumulation of dibenzocyclooctadiene lignans in agar cultures and in stationary and agitated liquid cultures of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill / A. Szopa, A. Kokotkiewicz et al. // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2016. - 100. - P. 3965-3977.
8. Medicinal Plants from the 14th edition of the Russian Pharmacopoeia, recent updates / A.N. Shikov, I.A. Narkevich, E.V. Flisyuk, V.G. Luzhanin, O.N. Pozharitskaya // Journal of Ethnopharmacology. - 2020. - 113685. - 112 p.
9. Фармакокинетика лигнанов лимонника китайского / В.М. Косман, М.В. Карлина, О.Н. Пожарицкая и др. // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2015. - Т. 13 (4). - С. 3-21.
10. Comparative Studies on Polyphenolic Composition, Antioxidant and Antimicrobial Activities of Schisandra chinensis Leaves and Fruits / A. Mocan, G. Crisan et al. // Molecules. - 2014. - 19. - P. 15162-15179.
11. Фармакокинетика лигнанов лимонника китайского / В.М. Косман, М.В. Карлина, О.Н. Пожарицкая и др. // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2015. - Т. 13 (4). - С. 3-21.
12. Phytochemical and biotechnological studies on Schisandra chinensis cultivar Sadova No. 1 - a high utility medicinal plant / А. Szopa, M. Klimek-Szczykutowicz et al. // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2018. - 102. - P. 5105-5120.
13. Кротова, И.В. Исследование химического состава плодов лимонника китайского / И.В. Кротова, А.А. Ефремов // Химия растительного сырья. - 1999. - №4. - С. 131-133.
14. Srivastava, P. Chapter 30 - Herbal medicine and biotechnology for the benefit of human health / P. Srivastava, M. Singh, R. Chaturvedi // Models in Discovery and Translation. - 2020. - P. 613-629.