УЛУЧШЕННЫЕ ЭКСПРЕССИЯ И ПРОЦЕССИНГ ТРАНСГЕНА

1. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
(a) 5'- и 3'-транспозон-специфичный инвертированный концевой повтор (ITR),
(b) по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок экспрессии/процессинга трансгена (ТЕР) или функциональную РНК ТЕР, расположенную между 5'- и 3'-ITR, и которая находится под контролем промотора, и
(c) возможно по меньшей мере один трансген, также расположенный между 5'- и 3'-ITR, который находится под контролем промотора трансгена, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты необязательно является частью вектора.
2. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один эпигенетический регуляторный элемент, в особенности, по меньшей мере один элемент MAR (участок прикрепления к матриксу).
3. Рекомбинантная молекула кислоты по п. 2, отличающаяся тем, что указанный элемент MAR расположен между 5'- и 3'-ITR и что необязательно трансген, такой как ген устойчивости к антибиотику или ген, кодирующий иммуноглобулин, возможно находящийся под контролем дополнительного промотора, расположен между 5'- и 3'-ITR, например между 5'-ITR и MAR.
4. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный белок ТЕР или указанная функциональная РНК ТЕР представляет собой белок или функциональную РНК, которая непосредственно или опосредованно участвует во встраивании последовательностей нуклеиновых кислот в геном, процессинге или трансляции продукта РНК трансгена или участвует в перемещение в ЭР, секреции, процессинге, фолдинге, транспорте ЭР-Гольджи-плазматическая мембрана, гликозилировании и/или другой посттрансляционной модификации белков, таких как продукты экспрессии трансгенов.
5. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный белок ТЕР представляет собой белок пути секреции белка, белок пути рекомбинации, белок процессинга белка или метаболический белок, включая шапероны, такие как BiP, или белок из комбинации перечисленных путей.
6. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 5, отличающаяся тем, что указанный белок ТЕР представляет собой один или более из следующих белков пути секреции белка: hSRP14, hSec61α1, hSec61β, hSec61γ, hSRP54, hSRP9, hSRPRα, hSRPβ и hCANX, или белок ТЕР соответствует одной или более из следующих последовательностей аминокислот белков пути секреции белка: hSRP14 с последовательностью SEQ ID NO: 13, hSec61α1 с последовательностью SEQ ID NO: 15, hSec61β с последовательностью SEQ ID NO: 17, hSec61γ с последовательностью SEQ ID NO: 19, hSRP54 с последовательностью SEQ ID NO: 21, hSRP9 с последовательностью SEQ ID NO: 23, hSRPRα с последовательностью SEQ ID NO: 25, hSRPβ с последовательностью SEQ ID NO: 27, и hCANX с последовательност% или 98% указанным последовательностям.
7. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный белок ТЕР представляет собой один или более из следующих белков процессинга белка или метаболических белков: hUCP4, hCMPSAT, rST6Gal1, hCOMSC, Т-синтазу человека, hP4HA1, hP4HB, hGILZ, hCyPB, hNRF2, hHK1, hPDI, hPIN1, hSEPW1, hCALR, hDDOST, hHSP40, hATP5A1, hSERCA2, hPDIA4, hHSC70/HSPA8, hHYOU1, hCMP-SAS, беклин-1 человека, hERdj3, CHO-AGE, hWip1, hRTP4, hREEP2, hDPM1 и hDRiP78.
8. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный белок ТЕР представляет собой шаперон, в частности белок BiP, а конкретнее, синтетическое производное белка BiP (DroBiP), последовательность которого на 80, 90, 95 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 60.
9. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 2 или 3, отличающаяся тем, что указанный элемент MAR выбран из последовательностей SEQ ID NO: 1 (MAR 1-68), 2 (MAR 1_6), 3 (MAR X_S29), 4 (MAR S4), 5 (MAR лизоцима цыпленка), представляет собой сконструированный, в частности, перестроенный аналог и/или его последовательность по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: с 1 по 5.
10. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3 или 6, отличающаяся тем, что указанная функциональная РНК ТЕР внутри указанной клетки включает/состоит из последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей функциональную РНК, предпочтительно микроРНК или кшРНК, которая препятствует экспрессии по меньшей мере одного белка пути рекомбинации, такого как, но не ограничиваясь перечисленными: Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, циклин D1, Ercc, MDC1, Bard1, лигаза 1, Mre11 и/или 53BP1.
11. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3 или 6, отличающаяся тем, что длина указанной молекулы нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 5000, 6000, 7000, 8000, 90000 или 10000 п.о.
12. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3 или 6, отличающаяся тем, что 5'- и 3'-ITR представляют собой 5'- и 3'-ITR транспозона Спящая Красавица или предпочтительно транспозона PiggyBac.
13. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3 или 6, отличающаяся тем, что после первой трансфекции клетки млекопитающего указанной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты и второй последующей трансфекции дополнительной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей трансген, встраивание и/или экспрессия трансгена оказывается повышенной в указанной клетке по сравнению с клеткой, не подвергнутой указанной первой трансфекции.
14. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3 или 6, отличающаяся тем, что указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой часть вектора.
15. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 14, отличающаяся тем, что указанный вектор содержит единичный элемент MAR, два или более элементов MAR, при этом указанный элемент(ы) расположен между 5'- и 3'-ITR.
16. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п. 14, отличающаяся тем, что указанный вектор содержит два элемента MAR, при этом первый элемент MAR расположен в 3'-5' направлении от ТЕР или функциональной РНК ТЕР и второй элемент MAR расположен в 5'-3' направлении от ТЕР или функциональной РНК ТЕР, при этом указанный первый элемент MAR включает элемент MAR 1_6 и/или элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, в частности, перестроенные MAR на основе MAR 1-6, а конкретнее, элементы, последовательность которых по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична SEQ ID NO: 8 (MAR 1_6R2), и второй элемент MAR включает элемент MAR 1-68 и/или элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1.
17. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 14, отличающаяся тем, что указанный вектор содержит единичный элемент MAR, при этом указанный единичный элемент MAR расположен в 5'-3' направлении от ТЕР или функциональной РНК ТЕР, и при этом единичный элемент MAR представляет собой MAR 1-68, или элемент MAR Х-29, и/или элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, в частности, перестроенный MAR на основе MAR 1-68 или MAR Х-29, в частности, элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 6, 7 или 10 (элементы MAR 1_68R, 1_68R2 или X_29R3) или 9, и предпочтительно представляет собой элемент MAR Х-29 и/или элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 3.
18. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 14, отличающаяся тем, что указанный ТЕР или функциональная РНК ТЕР находится под контролем промотора EF1-альфа, и за ним возможно следует поли(А) сигнал BGH.
19. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 14, отличающаяся тем, что указанный вектор содержит промотор(ы) и/или энхансер(ы) или продукты их слияния, такие как GAPDH, CGAPDH, SV40p, CMVp, СНО EF1-альфа, СНО Actb и/или СНО Hspa5.
20. Способ экспрессии ТЕР или функциональной РНК ТЕР, включающий
обеспечение рекомбинантной клетки млекопитающего, содержащей трансген, и где указанный вектор представляет собой вектор согласно по любому из пп. 14-19, который экспрессирует ТЕР или функциональную РНК ТЕР, при этом ТЕР или функциональная РНК ТЕР, экспрессируемая с помощью указанного вектора, возможно повышает экспрессию трансгена в указанной клетке млекопитающего на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70%.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанный вектор содержит единичный элемент MAR Х-29 и/или последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 3, и тем, что через более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 недель культивирования ТЕР или функциональная РНК ТЕР, экспрессируемая с указанного вектора, повышает экспрессию интересующего гена на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70%.
22. Рекомбинантная клетка млекопитающего, содержащая не более чем 20, 15, 10 или 5 рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот по пп. 1-14, предпочтительно встроенных в геном указанной клетки в виде единичных копий.
23. Рекомбинантная клетка млекопитающего по п. 22, отличающаяся тем, что указанная последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующая белок ТЕР внутри указанной клетки, включает(ют)/состоит(ят) из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, по пп. 6, 7 и/или 8.
24. Рекомбинантная клетка млекопитающего по п. 23, отличающаяся тем, что указанная последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональную РНК ТЕР внутри указанной клетки, включает(ют)/состоит(ят) из последовательности(ей) нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональную РНК, предпочтительно микроРНК или кшРНК, которая препятствует экспрессии по меньшей мере одного белка рекомбинации, предпочтительно, гена гомологичной рекомбинации, такого как, но не ограничиваясь перечисленными: Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, циклин D1, Ercc1, MDC1, Bard1, лигаза 1, Mre11 и/или 53BP1.
25. Рекомбинантная клетка млекопитающего по любому из пп. 22-24, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой первичную стволовую клетку, клетку хомячка, например, СНО (клетку яичника китайского хомячка), или клетку человека, например клетку HEK293.
26. Рекомбинантная клетка млекопитающего, содержащая: а) по меньшей мере одну функциональную РНК ТЕР и/или по меньшей мере одну рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок ТЕР или кодирующую функциональную РНК ТЕР,
и
б) рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую:
(i) по меньшей мере один интересующий трансген, и
(ii) необязательно элемент MAR.
27. Рекомбинантная клетка млекопитающего по п. 26, отличающаяся тем, что указанный белок ТЕР представляет собой по меньшей мере один ТЕР по пп. 6, 7 или 8.
28. Рекомбинантная клетка млекопитающего по п. 26 или 27, отличающаяся тем, что указанная функциональная РНК представляет собой временно трансфицированную миРНК или кшРНК, которая транскрибируется с указанной по меньшей мере одной изолированной последовательности нуклеиновой кислоты, при этом указанная миРНК или указанная процессированная кшРНК представляет собой антисмысловую РНК длиной 20, 21, 22, 23, 24 или 25 пар оснований, которая полностью комплементарна 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательным нуклеотидам мРНК по меньшей мере одного целевого гена, который является частью рекомбинантного пути НГСК (негомологичного соединения концов), ГР (гомологичной рекомбинации), ОМСК (опосредованного микрогомологией соединения концов) или представляет собой белок репарации ДНК, такой как MDC1 (медиатор контрольных точек повреждения ДНК 1).
29. Рекомбинантная клетка млекопитающего по п. 28, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один целевой ген, который является частью:
- НГСК, представляет собой 53ВР1 (белок 1, связывающий опухолевый супрессор р53),
- ГР, представляет собой
Rad51 (белок репарации ДНК RAD51), Rad51B (гомолог 2 белка репарации ДНК RAD51), Rad51C (гомолог 3 белка репарации ДНК RAD51),
Rad51D (гомолог 4 белка репарации ДНК RAD51), Rad52 (белок репарации ДНК RAD52), Rad54 (белок репарации и рекомбинации ДНК RAD54),
Xrcc2 (репарация после облучения рентгеновскими лучами, комплементирующая нарушенную репарацию в клетках китайского хомячка 2),
Xrcc3 (репарация после облучения рентгеновскими лучами, комплементирующая нарушенную репарацию в клетках китайского хомячка 3),
Brca1 (рак молочной железы 1, раннее начало),
Brca2 (рак молочной железы 2, раннее начало),
Bard1 (связанный с BRCA1 домен RING 1),
- ОМСК, представляет собой
Ercc1 (эксцизионная репарация, кросс-комплементирующая нарушенную репарацию у грызунов, группа комплементации 1),
Mre11 (мейотическая рекомбинация 11)
лигазу 1 (ДНК-лигаза 1),
и/или
представляет собой белок репарации ДНК MDC1.
30. Рекомбинантная клетка млекопитающего по любому из пп. 26, 27 или 29, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один трансген экспрессирует терапевтический белок, такой как иммуноглобулин, гормон, такой как эритропоэтин, или фактор роста, и при этом необязательно встраивание и/или экспрессия трансгена повышена в рекомбинантной клетке млекопитающего по сравнению с клеткой, не содержащей указанную рекомбинантную молекулу(ы) нуклеиновой кислоты.
31. Рекомбинантная клетка млекопитающего по любому из пп. 26, 27 или 29, отличающаяся тем, что указанная клетка содержит по меньшей мере две функциональные РНК ТЕР, при этом одна или обе РНК ТЕР представляют собой временно трансфицированные миРНК, или экспрессируются с указанной изолированной последовательности(ей) нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональную РНК ТЕР.
32. Рекомбинантная клетка млекопитающего по любому из пп. 26, 27 или 29, отличающаяся тем, что указанная рекомбинантная клетка млекопитающего сдержит элемент MAR.
33. Способ трансфекции клеток млекопитающих, в частности, клеток хомячка, включающий:
трансфекцию, возможно при первой трансфекции, указанных клеток млекопитающих
(i) по меньшей мере одной, по меньшей мере двумя, по меньшей мере тремя или по меньшей мере четырьмя из указанных рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-13 и/или
(ii) по меньшей мере одной, по меньшей мере двумя, по меньшей мере тремя или по меньшей мере четырьмя изолированными функциональными РНК ТЕР и по меньшей мере одним трансгеном, который необязательно является частью рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, которой возможно трансфицируют при второй, последующей трансфекции, возможно вместе с изолированной нуклеиновой кислотой или мРНК, экспрессирующей транспозазу, которая распознает указанные 5'- и 3'-ITR.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанную клетку трансфицируют более чем одной рекомбинантной молекулой нуклеиновых кислот, включая по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре из указанных рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один, два или три из белков ТЕР, приведенных в п. 6.
35. Способ по пп. 33 или 34, отличающийся тем, что каждая из указанных молекул нуклеиновых кислот является частью вектора, и тем, что осуществляют котрансфекцию указанными векторами.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная котрансфекция, предпочтительно котрансфекция рекомбинантными молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими белки SRP14, SRP9 и SRP54, повышает встраивание и/или экспрессию трансгена в указанной клетке по сравнению с клеткой, не подвергнутой такой котрансфекции.
37. Способ по п. 33, отличающийся тем, что множество указанных клеток млекопитающих, которые стабильно экспрессируют указанный белок ТЕР или функциональную РНК ТЕР, получают, чтобы получить рекомбинантные клетки млекопитающих, и при этом указанное множество рекомбинантных клеток млекопитающих не зависит от присутствия указанного элемента MAR.
38. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанные клетки млекопитающих трансфицируют второй раз.
39. Способ по п. 33, отличающийся тем, что по меньшей мере 30%, 40% или 45% указанных клеток млекопитающих становятся рекомбинантными клетками млекопитающих и экспрессируют указанный трансген.
40. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанная клетка млекопитающего трансфицирована указанной по меньшей мере одной изолированной функциональной РНК ТЕР и вектором, содержащим указанный по меньшей мере один трансген и необязательно 3'-ITR и 5'-ITR, фланкирующие указанный по меньшей мере один трансген, возможно вместе с изолированной нуклеиновой кислотой или мРНК, экспрессирующей транспозазу, которая распознает указанные 5'- и 3'-ITR.
41. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанный трансген представляет собой терапевтический белок, такой как иммуноглобулин, гормон, цитокин или фактор роста.
42. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты необязательно содержит маркер отбора и что указанный по меньшей мере один трансген экспрессируется
(a) без отбора по указанному маркеру, или
(b) с отбором по указанному маркеру, например, путем добавления селекционного агента в культуральную среду, и
(c) в отсутствие транспозазы, или
(d) в присутствии транспозазы.
43. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанная функциональная РНК ТЕР кодируется рекомбинантной последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей кшРНК, или включает/состоит из миРНК, которая препятствует экспрессии по меньшей мере одного гена гомологичной рекомбинации, такого как, но не ограничиваясь перечисленными: Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, циклин D1, Ercc1, MDC1, Bard1, лигаза 1, Mre11 и/или 53BP1.
44. Способ по п. 33, отличающийся тем, что встраивание и/или экспрессия трансгена повышена в такой клетке по сравнению с клеткой, не трансфицированной указанными изолированными молекулами нуклеиновых кислот и/или по меньшей мере одной из указанных изолированных функциональных РНК ТЕР.
45. Набор, в одном контейнере содержащий по меньшей мере один вектор, содержащий любую из указанных рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот согласно пп. 1-13, и во втором необязательном контейнере содержащий вектор, кодирующий подходящую транспозазу, и в дополнительном контейнере содержащий инструкцию по применению указанного вектора или векторов.
46. Набор по п. 45, отличающийся тем, что более чем один вектор предусмотрен в одном или более контейнерах, и что указанные белки ТЕР представляют собой по меньшей мере два из следующих белков: шаперон, SRP14, SRP9 или SRP54.
47. Набор по п. 45, отличающийся тем, что указанная функциональная(ные) РНК ТЕР внутри указанного вектора(ов) включает(ют)/состоит(ят) из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих микроРНК, миРНК или кшРНК, которая препятствует экспрессии по меньшей мере одного гена гомологичной рекомбинации, такого как, но не ограничиваясь перечисленными: Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2 циклин D1, Ercc1, MDC1, Bard1, лигаза 1, Mre11 и/или 53BP1, и необязательно в дополнительном контейнере молекулу(ы) миРНК, которая препятствует экспрессии по меньшей мере одного гена гомологичной рекомбинации, такого как, но не ограничиваясь перечисленными: Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Xrcc2, Xrcc3, Rad52, Rad54, Brca1, Brca2, циклин D1, Ercc1, MDC1, Bard1, лигаза 1, Mre11 и/или 53BP1.
48. Применение рекомбинантных нуклеиновых кислот по пп. 1-13 и/или рекомбинантных клеток млекопитающих по пп. 22-31 предпочтительно для повышения встраивания и/или экспрессии трансгена.
49. Вектор экспрессии, содержащий
(a) трансген, который фланкирован в 3'-5' направлении промотором и в 5'-3' направлении сигналом полиаденилирования,
(b) единичный элемент MAR в 5-3' направлении от сигнала полиаденилирования, или
(c) первый элемент MAR в 3'-5' направлении от интересующего трансгена и второй элемент MAR в 5'-3' направлении от места встраивания указанного трансгена.
50. Вектор экспрессии по п. 49, отличающийся тем, что указанный единичный или первый и второй элементы MAR выбраны из элементов MAR 1_68, 1_6, 1_6R2, 1_68R, 1_68R2, X_29R3, или X_29 или элементов, последовательности которых по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 или 10.
51. Вектор экспрессии по п. 49, отличающийся тем, что указанный единичный элемент или первый и второй элементы MAR выбран/выбраны из перестроенных элементов MAR 1_6R2, 1_68R, 1_68R2 или X_29R3 или элементов, последовательности которых по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 6, 7, 8 или 10, при этом необязательно указанный элемент(ы) MAR повышает экспрессию интересующего трансгена на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% по сравнению с их неперестроенными аналогами.
52. Вектор экспрессии по пп. 49-51, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор EF1-альфа и указанный сигнал полиаденилирования представляет собой поли(А) сигнал BGH.
53. Вектор экспрессии по пп. 49-51, отличающийся тем, что указанный вектор содержит промотор(ы), и/или энхансер(ы), или продукты их слияния, такие как GAPDH, CGAPDH, CSV40p, CMVp, СНО Ef1-альфа, СНО Actb или СНО Hspa5.
54. Вектор экспрессии по п. 53, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой промотор GAPDH и содержит энхансер CMV.
55. Вектор экспрессии по пп. 49-51 или п. 54, отличающийся тем, что указанный один или первый и второй MAR, энхансер, промотор, интересующий трансген и сигнал полиаденилирования расположены между 5'- и 3'-ITR.
56. Вектор экспрессии согласно пп. 49-51 или 54, содержащий
(a) единичный элемент MAR в 5-3' направлении от сигнала полиаденилирования, при этом указанный единичный элемент MAR предпочтительно представляет собой элемент MAR 1-68 или MARX-29 и/или элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, в частности, перестроенный MAR на основе MAR 1-68 или MAR Х-29, в частности, элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична последовательностям SEQ ID NO: 6, 7 или 10 (элементы MAR 1_68R, 1_68R2 или X_29R3) или SEQ ID NO: 9, и предпочтительно представляет собой элемент MAR Х-29, и/или его последовательность по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 3, или
(b) первый элемент MAR в 3'-5' направлении от интересующего трансгена и второй элемент MAR в 5'-3' направлении от указанного интересующего трансгена при этом указанный первый элемент MAR, предпочтительно включает элемент 1_6, и/или его последовательность по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, в частности, идентична перестроенным MAR на основе MAR 1-6, в частности элементам, последовательности которых по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 8 (MAR 1_6R2), и второй элемент MAR, который предпочтительно включает элемент MAR 1-68, и/или последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1.
57. Вектор экспрессии согласно п. 56, содержащий единичный элемент MAR, отличающийся тем, что указанный единичный элемент MAR расположен в 5'-3' направлении от сайта полиаденилирования и представляет собой MAR 1-68 или MAR Х-29, и/или его последовательность по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, в частности, идентична перестроенным MAR на основе MAR 1-68 или MAR Х-29, в частности, элементам, последовательность которых по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательностям SEQ ID NO: 6, 7 или 10 (элементы MAR 1_68R, 1_68R2 или X_29R3) или 9, и предпочтительно представляет собой элемент, полученый из MAR Х-29, и/или элемент, последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 3.
58. Вектор экспрессии согласно п. 56, содержащий первый элемент MAR в 3'-5' направлении от трансгена и второй элемент MAR в 5'-3' направлении от указанного интересующего трансгена, отличающийся тем, что указанный первый элемент MAR включает элемент MAR 1_6, и/или его последовательность по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO 2, и указанный второй элемент MAR включает элемент MAR 1_68 и/или его последовательность по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1.
59. Способ экспрессии трансгена, включающий
обеспечение рекомбинантной клетки млекопитающего, содержащей один из векторов по пп. 49-58, содержащих указанный трансген и экспрессирующих указанный трансген, при этом указанный элемент(ы) MAR повышает экспрессию указанного трансгена предпочтительно на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70%.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что указанный вектор содержит единичный элемент MAR Х_29 и/или нуклеиновую кислоту, последовательность которой по меньшей мере на 80, 90, 95, 98, 99 или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 3, и что через более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 недель культивирования указанный элемент MAR повышает экспрессию интересующего трансгена на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70%.