ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ПРОТИВ ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ И СПОСОБЫ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
MEDICATED PRODUCT FOR SMALLPOX VIRUS AND METHOD FOR PRODUCING AND USING IT

Изобретение относится к области фармацевтики, химической технологии, вирусологии, медицины и ветеринарии. Изобретение касается химически синтезированного средства против вируса натуральной оспы, способа его получения, а также способа профилактики и лечения вирусных заболеваний, в частности, вызванных вирусом натуральной оспы.
Несмотря на то что более 30 лет назад была успешно завершена программа глобальной ликвидации оспы, вирус натуральной оспы (ВНО) остается проблемой для общественного здравоохранения. Человеческая популяция в настоящее время подвергается потенциальной опасности применения природных или рекомбинантных штаммов ВНО и вируса оспы обезьян (BOO) в качестве биологического оружия [Parker S., Chen N.G., Foster S. et al. Evaluation of disease and viral biomarkers as triggers for therapeutic intervention in respiratory mousepox - an animal model of smallpox. Antiviral Res. 2012; 94 (1): 44-53]. Последствия вспышки оспы в человеческой популяции в настоящее время могут стать даже более катастрофическими, чем в предшествующем столетии. Это связано с тем, что программа вакцинации была прекращена во всем мире примерно в 1976 году. В результате этого к настоящему времени более половины населения Земли не имеет иммунитета против ортопоксвирусных инфекций, а повышенная мобильность людей (включая межконтинентальные авиаперелеты) повысила скорость распространения вируса по планете.
Более того, в условиях постоянного роста категорий населения с иммунодефицитными состояниями вакцинация живым вирусом осповакцины становится проблематичной по причине возможности возникновения серьезных поствакцинальных осложнений. Кроме того, вспышки оспы обезьян в популяции людей в Африке и случаи ее распространения представляют собой серьезную угрозу населению всего мира [Борисович С.В., Маренникова С.С., Махлай А.А. и др. Оспа обезьян: особенности распространения после отмены обязательного оспопрививания. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012; 2: 69-73]. В связи с этим особую важность приобретает проблема успешного устранения поствакцинальных осложнений и вспышек ортопоксвирусных заболеваний с помощью высокоэффективных химиотерапевтических препаратов. Именно поэтому в разработку усовершенствованных мер борьбы с натуральной оспой, включая новые вакцины и противовирусные лекарства, вкладываются крупные государственные инвестиции [LeDuc J.W., Jahrling P.В. Strengthening national preparedness for smallpox: an update. Emerging Infectious Diseases. 2001; 7: 155-157].
В настоящее время спектр лечебно-профилактических препаратов, используемых для экстренной профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами, в том числе ВНО, чрезвычайно ограничен. К этим средствам относятся тиосемикарбазоны, аналоги нуклеозидов и нуклеотидов, ациклические нуклеозиды и нуклеотиды [Parker S., Handley L., Buller M. Therapeutic and prophylactic drugs to treat orthopoxvirus infections. Future Virol. 2008; 3 (6): 595-612]. Таким образом, разработка высокоэффективных противовирусных препаратов, обладающих лечебно-профилактическим действием при заражении ВНО, является важной задачей для сохранения здоровья и жизни людей.
Предшествующий уровень техники
Разработка лекарственных препаратов против натуральной оспы - сложный, длительный и дорогостоящий процесс. Сначала проводится серийное крупномасштабное тестирование антиортопоксвирусной активности полученных соединений in vitro с целью выявления наиболее сильнодействующего, так называемого лидирующего соединения. В большей части опубликованных работ описываются именно эти начальные этапы. Тем не менее, лишь небольшая часть химических соединений, которые подавляют репликацию суррогатных ортопоксвирусов (вирусы осповакцины, оспы коров, эктромелии и др.) в клеточных культурах, обладают эффективностью в отношении ВНО in vitro, а тем более в экспериментах на моделях оспы у лабораторных животных.
Так, ViroPharma и USAMRIID при скрининге более миллиона соединений идентифицировали несколько классов активных агентов. Далее активные соединения оценивались в отношении BOO, ограниченное число кандидатов было выбрано для тестирования с использованием ВНО. В итоге, для разработки на более высоком уровне, в том числе для испытаний на лабораторных животных, был отобран только один ST-246 [Yang G., Pevear D.C., Davies M.H. et al. An Orally Bioavailable Antipoxvirus Compound (ST-246) Inhibits Extracellular Virus Formation and Protects Mice from Lethal orthopoxvirus Challenge. J. Virol. 2005; 79 (20): 13139-13149; Smee D.F. Progress in the discovery of compounds inhibiting orthopoxviruses in animal models. Antiviral Chemistry & Chemotherapy. 2008; 19: 115-124]. Дальнейшие успехи в разработке этого соединения как прототипа изобретения будут описаны ниже.

Известен препарат Метисазон (Марборан), который проявлял умеренную противовирусную активность в отношении ВНО при демонстрации 50%-ного ингибирования, но вызывать 80%-ное ингибирование репликации был способен только в максимально переносимой концентрации [Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 2003; 57: 13-23]. Была проведена оценка большого количества близких соединений класса тиосемикарбазонов in vitro, и несколько соединений испытывались на мышиных моделях, проявляя при этом только умеренную профилактическую активность, но ни одно из этих соединений не было отобрано для последующих испытаний на приматах.

В настоящее время проводится исследование еще двух потенциальных противооспенных соединений с активностью на стадии репликации ДНК: Цидофовир (Vistide) - лекарство, которое разрешено применять при лечении герпесного ретинита, и СМХ001 - липидное пролекарство цидофовира. Эти соединения проявляют активность против суррогатных ортопоксвирусов в лабораторных моделях с использованием мелких грызунов. Однако полученные данные показали, что СМХ001 не обеспечивает значительную защиту от летальной инфекции мышей вирусом эктромелии [Parker S., Chen N.G., Foster S. et al. Evaluation of disease and viral biomarkers as triggers for therapeutic intervention in respiratory mousepox - an animal model of smallpox. Antiviral Res. 2012; 94 (1): 44-53].
Было обнаружено также, что введение Цидофовира обезьянам, зараженным ВНО, до начала болезни, но не после, могло предотвращать их смерть. Однако для получения оптимальных результатов была необходима очень высокая доза Цидофовира (20 мг/кг), которая вызывала развитие острой нефротоксичности. При этом вмешательство после появления оспенных поражений в этих моделях оказалось безуспешным [Всемирная организация здравоохранения. Научный обзор исследований вируса натуральной оспы, 1999-2010 гг. http://whqlibdoc.who.int/hq/2010/WHO_HSE_GAR_BDP_2010.3_rus.pdf. Дата обращения 16.09.2013].
Известно, что гидразоны азидокетонов алициклического и алифатического ряда проявляли слабую и умеренную активность in vitro против вирусов эктромелии, осповакцины, оспы коров, оспы обезьян [Патент РФ №2376283, МПК C07C 251/76, опубл. 20.12.2009]. Недостатком перечисленных выше аналогов является их невысокая антиортопоксвирусная активность, а также отсутствие исследований их активности в отношении ВНО.
2,4
Известно также химическое соединение 7-[N'-(4-трифтор-метилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты, обладающее активностью в отношении вирусов эктромелии, осповакцины и оспы коров, и способ его получения с использованием в технологическом процессе высокотоксичного реактива - метанола [Патент РФ №2412160, МПК C07C 243/38, опубл. 20.02.2011]. Однако ингибирующая активность полученного соединения в клеточной культуре Vero в отношении перечисленных суррогатных ортопоксвирусов, судя по индексу селективности, была в 1,5 раза ниже, чем активность препарата сравнения ST-246, что может быть связано с использованием метанола в технологии получения описанного препарата.
Кроме того, существенным недостатком полученного соединения является то, что его активность исследовалась только в отношении суррогатных ортопоксвирусов и только в культуре клеток, а не в отношении ВНО на лабораторных модельных животных, инфицированных ВНО, что не является доказательством его противооспенного действия при введении в организм животных или людей. Для убедительного обоснования и рекомендации данного химического соединения в качестве противооспенного средства обязательно требуется получить результаты его высокой эффективности в отношении ВНО не только in vitro, но и в экспериментах на животных. Так, в отчете Института медицины Соединенных Штатов подчеркивается, что «наиболее убедительной причиной необходимости долговременного сохранения запасов живых ВНО является их важнейшая роль в тестировании и разработке противовирусных лекарственных средств, предназначенных для применения в случае вспышки натуральной оспы» [US Institute of Medicine. Live variola virus: considerations for continuing research. National Academy Press, Washington, DC, 2009]. Несмотря на то что в мире были идентифицированы многочисленные соединения, ингибирующие репликацию суррогатных ортопоксвирусов во многих тест-системах in vitro, лишь небольшая часть из них способна проявлять противовирусную активность в отношении ВНО in vitro, а еще меньшая - in vivo. В связи с этим демонстрация того, что данное химическое соединение проявляет высокую активность в отношении ВНО in vivo является обязательным и необходимым условием, чтобы позиционировать и рекомендовать его в качестве противооспенного средства для лечения и профилактики натуральной оспы.
Также основополагающим недостатком синтезированного химического соединения является то, что в технологии его получения используется спирт метанол, токсичность которого примерно в 10000 раз больше, чем у этанола [Физиологическое действие и токсичность спиртов. http://alcogol.su/page.php?al=fiziologicheskoe_dejstvi. Дата обращения 16.09.2013]. Использование метанола в производстве средств медицинского назначения создает опасность для работников и окружающей среды, что делает практически невозможным лицензирование предприятия по производству лекарственного противооспенного средства в связи с необходимостью соблюдения всех пунктов действующих Санитарных правил [СП 2.3.3.2892-11 «Санитарно-гигиенические требования к организации и проведению работ с метанолом» от 12.07.2011 г.; СП 4079-86 «Санитарные правила для предприятий по производству лекарственных препаратов» от 14.03.1986 г.]. Тем более что согласно пункту 3.1 СП 2.3.3.2892-11, «применение метанола допускается лишь в тех производственных процессах, где он не может быть заменен другими менее токсическими веществами».
Итак, сумма всех перечисленных недостатков данного аналога является убедительным доказательством того, что описанное выше химическое соединение, полученное согласно патенту РФ №2412160, не может быть рекомендовано и использовано в качестве субстанции для создания лекарственного средства против натуральной оспы.
8
Наиболее близким аналогом (прототипом) является препарат ST-246 - химическое соединение 4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-етеноциклопроп [f]изоиндол-2(1Н)-ил)бензамида, обладающее противовирусной активностью не только в отношении суррогатных ортопоксвирусов, но и в отношении ВНО [Huggins J., Goff A., Hensley L. et al. Nonhuman Primates Are Protected from Smallpox Virus or Monkeypox Virus Challenges by the Antiviral Drug ST-246. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2009; 53 (6): 2620-2625]. В данной публикации приведена лечебно-профилактическая активность перорально введенного ST-246 в дозе 300 мг/кг/сут в течение 14 суток обезьянам Cynomolgus (массой 3,5 кг), которые были инфицированы посредством внутривенного введения штамма Harper ВНО в дозе 1×10 БОЕ (бляшкообразующих единиц) каждому животному. Три обезьяны начинали получать ST-246 непосредственно после заражения, а три обезьяны получали ST-246 через 1 сут после заражения, две обезьяны в контроле получали плацебо. Обе обезьяны, получавшие плацебо, были эвтаназированы в связи с тяжестью развившегося заболевания, тогда как все обезьяны, получавшие ST-246, оставались живыми при отсутствии каких-либо значимых клинических или лабораторных признаков заболевания.
8
Однако приведенный выше прототип имеет существенные недостатки: во-первых, заражение ВНО осуществлялось не через органы дыхания, которые являются «входными воротами» ВНО при заражении людей, а внутривенным способом, в результате чего у обезьян создавалась искусственная виремия, и тяжелое заболевание оспой развивалось значительно быстрее, чем у людей; во-вторых, использованная для заражения обезьян доза ВНО, равная 10 БОЕ/животное, на несколько порядков превышает дозы ВНО, которые могут инфицировать и вызывать заболевание человека; в-третьих, по биоэтическим и экономическим причинам, а также с учетом сложности и опасности работы с инфицированными ВНО обезьянами защитная эффективность ST-246 была продемонстрирована только на небольшом количестве этих животных (по 3 обезьяны в пролеченных группах, 2 в группе плацебо).
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового эффективного средства против ВНО, способа его получения и применения, а также расширение спектра средств против ВНО, используемых в медицине и ветеринарии.
2,4
Указанный технический результат достигается созданием лечебно-профилактического средства на основе химического соединения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты (НИОХ-14) в дозе от 4 до 60 мг/кг массы тела, обладающего активностью против вируса натуральной оспы.
2,4
Технический результат достигается также тем, что в способе получения лечебно-профилактического средства против вируса натуральной оспы, включающем последовательное растворение и взаимодействие гидразида 4-трифторбензойной кислоты и 3,3а,4,4а,5,5а,6.6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этено-циклопроп[f]-фурана в соотношении молей 1:1 в растворителе по схеме (I), приведенной ниже, с последующим перемешиванием полученной суспензии до получения осадка, который удаляют из раствора, отфильтровывают и сушат с получением конечного продукта химического соединения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты (НИОХ-14), согласно изобретению в качестве растворителя используют этиловый или изопропиловый спирт, процессы приготовления суспензии реагентов, отделения и фильтрации осадка осуществляют при температуре +2-10°C, а выход сухого продукта составляет 96,0%.
Схема (I) получения препарата НИОХ-14:
Технический результат достигается также тем, что в способе применения лечебно-профилактического средства против вируса натуральной оспы для профилактики и лечения млекопитающих, включающем пероральное введение средства по п.1 формулы в организм 1 раз в сутки в диапазоне доз от 4 до 60 мг/кг массы тела млекопитающего в течение не менее 4-х суток.
50
Оценку противооспенной эффективности субстанции лекарственного средства осуществляют с использованием лабораторной модели натуральной оспы при интраназальном заражении ВНО в дозе 30 ИД (50%-х инфицирующих доз) 14-17-суточных аутбредных мышей ICR (массой 9-12 г) и введении препарата в дозе 60 мкг/г массы мыши 1 раз в день за 1 сутки до заражения, в день заражения и далее в течение 2 суток после заражения, а затем через 3 суток после заражения оценивают концентрацию ВНО в легких и долю инфицированных мышей.
Ниже приведены составы заявляемого средства.
2,4
Состав 1 для млекопитающих, в том числе для человека, с низким уровнем обмена веществ в организме. Лечебно-профилактическое средство (для млекопитающих с низким уровнем метаболизма) на основе химического соединения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты (НИОХ-14) в дозе 4 мг/кг массы тела, обладающее активностью против вируса натуральной оспы.
2,4
Состав 2 для млекопитающих с высоким уровнем обмена веществ в организме. Лечебно-профилактическое средство на основе химического соединения 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты (НИОХ-14) в дозе 60 мг/кг массы тела, обладающее активностью против вируса натуральной оспы.
2,4
Пример 1. Получение химического соединения 7-[N'-(4-трифтор-метилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты (НИОХ-14)
К охлажденному до 15°C раствору 21,26* г гидразида 4-трифторбензойной кислоты в 150* мл этанола (или изопропанола**) присыпают одной порцией 19,58* г 3,3а,4,4а,5,5а,6.6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этено-циклопроп[f]-фурана по схеме (I), приведенной ниже:
1
19
13
-1
6
6
6
6
6
19
17
3
2
4
Образуется гомогенный раствор, из которого при температуре +2-10*** °C примерно через 10 минут начинает выпадать белый осадок. Суспензию перемешивают при +2-10*** °C в течение 4 часов, выпавший осадок отфильтровывают, трижды по 25* мл промывают на фильтре охлажденным этанолом (или изопропанолом**), сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 36,70* г (96%) вещества в виде белых кристаллов; t° пл. 164°C. ЯМР H (300 МГц, DMSO-d), δ, м.д., J/Гц: 0.06 (м, 2Н); 0.98 (м, 2Н); 2.85 (дд, J=10.1, 1.9 Гц, 1Н); 3.00 (уш. с, 1Н); 3.10 (уш. с, 1Н), 3.15 (дд, J=10.1, 1.9 Гц, 1Н); 5.59 (т, J=7.4 Гц, 1Н); 5.82 (т, J=7.4 Гц, 1Н); 7.87 (д, J=8.0 Гц, 2Н); 8.05 (д, J=8.0 Гц, 2Н); 9.93 (с, 1Н); 10.57 (с, 1Н); 11.49 (уш. с, 1Н). ЯМР F (300 МГц, d-DMSO, стандарт - CF), δ, м.д.: 101.18. ЯМР С (300 МГц, DMSO-d), δ, м.д.: 3.42, 9.91, 10.65, 33.53, 37.10, 47.55, 48.84, 126.35, 127.04, 128.53, 128.93, 132.24, 137.35, 165.18, 172.17, 174.89, 175.68. ИК-спектр (KBr, см): 1136, 1168, 1332, 1536, 1582, 1622, 1725, 2942, 3014, 3043, 3230. Вычислено, %: С, 57.87; Н, 4.35; F, 14.45; N, 7.10. CHFNO. Найдено, %: С, 57.59, 57.44; Н, 4.37, 4.40; N, 7.21, 7.18.
Примечание:
* - при масштабировании производства субстанции лекарственного препарата количество исходных компонентов соответствующим образом увеличивают;
** - токсичность этанола для человека меньше, чем у метанола примерно в 10000 раз, токсичность изопропанола примерно в 3,5 раза больше, чем у этанола, смертельных отравлений изопропанолом не зафиксировано [Физиологическое действие и токсичность спиртов. http://alcogol.su/page.php?al=fiziologicheskoe_dejstvi. Дата обращения 16.09.2013; Физические свойства и токсикологическая характеристика этанола и изопропанола. http://ru.convdocs.org/docs/index-18586.html. Дата обращения 16.09.2013].
*** - реакция проводится при температуре +2-10°C, а не при 0°C, как при использовании метанола, что существенно упрощает технологический процесс.
Способ получения заявляемого вещества прост в исполнении, исходные вещества доступны, выход составляет не ниже 96% от теоретически рассчитанного. Полученное соединение устойчиво на воздухе, легко растворимо в диметилформамиде и диметилсульфоксиде, малорастворимо в алифатических спиртах, ацетоне, воде, практически не растворимо в эфире, гексане.
Пример 2. Исследование противовирусной активности средства на основе соединения НИОХ-14, полученного с использованием этанола, в отношении ортопоксвирусов, в том числе вируса натуральной оспы in vitro
50
50
50
50
Оценку противовирусной эффективности препаратов проводили по адаптированной и модифицированной авторами методике [Baker R.O., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 2003; 57(1-2):13-23]. В лунки 96-луночных планшетов, содержащих монослой клеток Vero в 100 мкл среды DMEM с 2% эмбриональной сыворотки, сначала вносили по 50 мкл серийных разведении исследуемых соединений, а потом - по 50 мкл разведения штаммов ортопоксвирусов в дозе 1000 БОЕ/лунку. Токсическая активность соединений определялась по гибели клеток под воздействием препарата в лунках планшета, в которые вирус не вносили. В качестве контролей использовали монослои клеток в лунках планшета, в которые вносили вирус без соединений (контроль вируса) и монослои клеток в лунках, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток). После инкубирования в течение 4 суток монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным в течение 2 часов. Данная методика основана на способности тестируемых соединений предотвращать репродукцию вируса и его распространение от клетки к клетке, поэтому клетки не погибают и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный. После удаления красителя и отмывки лунок от его несвязавшейся фракции добавляли лизирующий буфер. Количество красителя, адсорбированное живыми клетками монослоя, оценивали по оптической плотности (ОП), которая является показателем количества неразрушенных под влиянием вируса клеток в монослое. ОП измеряли на спектрофотометре Emax (Molecular Devices, США) при длине волны 490 нм. Учет результатов проводили с использованием планшетного спектрофотометра Emax и программы SoftMax 4.0 (Molecular Devices, США), которая автоматически рассчитывала 50%-ную токсическую концентрацию (TC в мкг/мл) и 50%-ную ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC в мкг/мл) препаратов. По соотношению 50%-ной токсической и эффективной концентраций определяли терапевтический индекс (TI) (или индекс селективности - IS): TI=ТС/IC.
В данной работе использовали вирусы осповакцины (штамм ЛИВП), оспы коров (штамм Гришак), оспы мышей - эктромелии (штамм К-1), оспы обезьян (штамм V79-1-005) и натуральной оспы (штаммы 6-58, Ind-3а, Congo-9 и Butler), полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцове, Новосибирская обл.). Вирусы нарабатывали в культуре клеток Vero. Концентрацию вирусов в культуральной жидкости определяли путем титрования методом бляшек на культуре клеток Vero, рассчитывали и выражали в десятичных логарифмах бляшкообразующих единиц в мл (lg БОЕ/мл). Концентрация вируса в использованных в работе образцах составляла от 5,6 до 6,7 lg БОЕ/мл. Наработанные и использованные в работе серии вирусов с указанным титром хранили при температуре минус 70°C. Исследования с использованием штаммов ВНО и BOO проводили в лаборатории с максимальным уровнем биологической защиты BSL-4, расположенной в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
2,4
Анализ данных, представленных в таблице 1, наглядно показывает, что заявляемое соединение 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (НИОХ-14), полученное без использования метанола при температуре +2-10°C, обладает не менее высокой активностью в отношении суррогатных ортопоксвирусов (вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии) в культуре клеток Vero, чем соединение-прототип ST-246-4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этеноциклопроп[f]изоиндол-2(1Н)-ил)-бензамид, судя по показателям TI (или IS).
Таблица 1
Показатели противовирусной активности препаратов НИОХ-14 и ST-246 в отношении суррогатных ортопоксвирусов в культуре клеток Vero
Препараты
ТС<sub>50</sub> (мкг/мл)
IC<sub>50</sub> (мкг/мл) в отношении вирусов:
TI (IS) (TC<sub>50</sub>/IC<sub>50</sub>)
осповакцины
оспы коров
эктромелии
НИОХ-14
>100
0,001
0,031
0,008
>100000
ST-246
>100
0,002
0,002
0,003
>50000
Примечание: ТС<sub>50</sub> - токсическая концентрация препарата; IС<sub>50</sub> - ингибирующая концентрация препарата; TI (IS) - терапевтический индекс (индекс селективности) препарата; приведено максимальное значение TI.
Кроме того, препарат НИОХ-14 был исследован на наличие противовирусной активности в отношении ВНО в культуре клеток Vero (табл.2).
Было показано, что в отношении штаммов ВНО in vitro НИОХ-14 обладал не меньшей противооспенной эффективностью по сравнению с ST-246 (табл.2).
Таблица 2
Показатели противовирусной активности препаратов НИОХ-14 и ST-246 в отношении штаммов вируса натуральной оспы (ВНО) в культуре клеток Vero
Препараты
ТС<sub>50</sub> (мкг/мл)
IС<sub>50</sub> (мкг/мл) в отношении штаммов ВНО:
TI (IS) (TC<sub>50</sub>/IC<sub>50</sub>)
Ind-3а
6-58
Congo-9
Butler
НИОХ-14
>100
0,001
0,003
0,003
0,002
>100000
ST-246
>100
0,002
0,004
0,003
0,001
>100000
Примечание: ТС<sub>50</sub> - токсическая концентрация препарата; IС<sub>50</sub> - ингибирующая концентрация препарата; TI (IS) - терапевтический индекс (индекс селективности) препарата; приведено максимальное значение TI.
2,6
8,10
2,6
0,810
2,6
8,10
Кроме того, в отношении штаммов ВНО in vitro была исследована активность других химических соединений: Гидрат 3-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]-додец-11-ен-4-ил}-1-(3-фторфенил)мочевины (НИОХ-162), НИОХ-92 [Селиванов Б.А., Тихонов А.Я., Беланов Е.Ф. и др. Метил, хлор и нитропроизводные N-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.]додец-11-ен-4-ил}-2-гидроксибензамида - противовирусные препараты, ингибирующие репликацию различных видов ортопоксвирусов. Патент РФ №2440983, рег. в Госреестре 27.01.2012] и НИОХ-32 [Селиванов Б.А., Тихонов А.Я., Беланов Е.Ф. и др. Гидрат n-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]додец-11-ен-4-ил}-2-гидроксибензамида, обладающий противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов. Патент РФ №2412168, рег. в Госреестре 20.02.2011], которые в экспериментах, проведенных авторами ранее, были активными в отношении суррогатных ортопоксвирусов (табл.3). Сравнительные результаты эффективности названных выше соединений, взятых для примера, в отношении суррогатных ортопоксвирусов и штаммов ВНО для соединений НИОХ-162, НИОХ-92, НИОХ-32, НИОХ-14 и ST-246 представлены в таблице 3.
Анализ полученных данных наглядно показывает, что соединение НИОХ-162, обладающее умеренной активностью против суррогатных ортопоксвирусов, тем не менее, было совсем неактивным в отношении всех штаммов ВНО (табл.3).
Соединение НИОХ-92, подавляющее продукцию вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии, было активным только в отношении одного штамма ВНО, а остальные штаммы ВНО не проявляли чувствительности к данному соединению (табл.3).
Таблица 3
Показатели эффективности действия химических соединений против суррогатных ортопоксвирусов и штаммов вируса натуральной оспы (ВНО)
Препараты
TI (IS)=ТС<sub>50</sub>/IС<sub>50</sub> для ортопоксвирусов
Суррогатные ортопоксвирусы:
Штаммы ВНО:
осповакцины
оспы коров
эктромелии
Ind-3а
6-58
Congo-9
Butler
НИОХ-162
>570
>70
>230
н/о
н/о
н/о
н/о
НИОХ-92
>33000
>192
>870
>2000
н/о
н/о
н/о
НИОХ-32
>25000
>6660
>1850
>3100
>1600
>1300
>1300
НИОХ-14
>100000
>3300
>12500
>100000
>33000
>33000
>50000
ST-246
>50000
>50000
>33000
>50000
>25000
>33000
>100000
Примечание: ТС<sub>50</sub> - токсическая концентрация препарата; IC<sub>50</sub> - ингибирующая концентрация препарата; TI (IS) - терапевтический индекс (индекс селективности) препарата; н/о - активность не обнаружена.
В результате наиболее высокая активность в отношении всех штаммов ВНО была зарегистрирована только для НИОХ-14 и его соединения-прототипа ST-246. При этом соединение НИОХ-32 тоже было активным в отношении всех штаммов ВНО, хотя и в меньшей степени, чем НИОХ-14 и ST-246 (табл.3).
На основании полученных данных при тестировании активности химических соединений в отношении ВНО in vitro для исследования в экспериментах на животных, инфицированных ВНО, были выбраны НИОХ-14 и НИОХ-32, а также препарат сравнения ST-246. Далее (пример 3) приведены результаты этих экспериментов.
Пример 3. Изучение противовирусной активности соединения НИОХ-14, полученного с использованием этанола, в отношении ВНО в экспериментах на животных (аутбредных мышах ICR)
На данном этапе работы использованы химические соединения НИОХ-32 и НИОХ-14, синтезированные в Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН. Химически синтезированное соединение НИОХ-14 было получено по описанному выше способу (Пример 1). В качестве препарата сравнения (прототипа для НИОХ-14) использовали соединение ST-246 с установленной противооспенной активностью, синтезированное в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова СО РАН по опубликованной методике [Jordan R., Bailey T.R., Rippin S.R. Compounds, compositions and methods for treatment and prevention of orthopoxvirus infections and associated diseases. Patent WO, N 2004/112718 A3; 2005].
Вирус. В экспериментах с животными использовали штамм Ind-3а ВНО, полученный из Государственной коллекции вирусов и риккетсий ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Вируссодержащие суспензии были приготовлены путем культивирования на культуре клеток Vero (биологическая концентрация штамма Ind-3а ВНО составляла 6,7 lg БОЕ/мл (десятичных логарифмов бляшкообразующих единиц в мл).
Животные. В исследованиях использовали 14-17 суточных аутбредных разнополых белых мышей ICR (массой 9-12 г). Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях.
50
Инфицирование мышей ВНО. Заражение мышей ВНО производили интраназально (и/н) по 30 мкл суммарно в обе ноздри в дозе 30 ИД/гол., что составляло 4,2 lg БОЕ/гол. Было сформировано 4 инфицированных группы по 7 мышей в каждой: группа мышей, получавших НИОХ-32; группа мышей, получавших НИОХ-14; группа мышей, получавших ST-246; группа контрольных мышей, получавших плацебо (раствор, содержащий 0,75% метилцеллюлозы и 1% твина-80, используемый для разведения препаратов).
Способы введения препаратов инфицированным ВНО животным. Химически синтезированные соединения НИОХ-32, НИОХ-14 и ST-246 вводили мышам перорально 1 раз в день в дозе 60 мкг/г за 1 сутки до заражения ВНО, в день заражения и далее в течение 2 суток после заражения (п/з). Контрольной группе животных перорально вводили плацебо. Через 3 суток п/з мышей эвтаназировали методом цервикальной дислокации, забирали легкие и готовили 4%-ные гомогенаты для определения в них титров ВНО.
Определение титров ВНО в гомогенатах легких инфицированных мышей. Концентрацию ВНО в гомогенатах легких, полученных через 3 суток п/з мышей, определяли стандартным для ортопоксвирусов методом подсчета количества бляшек при внесении последовательных разведении образцов в культуру клеток Vero и выражали в lg БОЕ/мл [Virology Methods Manual. Edited by: Brian W.J. Mahy and Hillar O. Kangro. San Diego: Academic Press; 1996]. В случаях когда концентрация ВНО в гомогенатах легких была ниже порога чувствительности метода титрования, при расчете средней величины использовали минимальное значение титра, которое можно было определить при данном способе титрования (0,4 lg БОЕ/мл).
95
M
2
Статистическая обработка. Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами [Закс Л. Статистическое оценивание. Перевод с немецкого. М.: Статистика; 1976] с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» (StatSoft Inc. 1984-2001) с оценкой достоверности отличий (p≤0,05) для 95% доверительного уровня (I) [Халафян А.А. Statistica 6. Статистический анализ данных. 2-е изд. М.: ООО «Бином-Пресс»; 2010]. Сравнение доли выживших животных в инфицированных группах проводили по критерию χ [Халафян А.А. Statistica 6. Статистический анализ данных. 2-е изд. М.: ООО «Бином-Пресс»; 2010]. Титры ВНО в легких мышей представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (М±S). Для сравнения титров ВНО в органах использовали U-критерий Манна-Уитни [Халафян А.А. Statistica 6. Статистический анализ данных. 2-е изд. М.: ООО «Бином-Пресс»; 2010].
В предварительно проведенных исследованиях авторами было установлено, что даже при использовании максимально возможных доз заражения ВНО клинические признаки заболевания оспой у аутбредных мышей ICR не развиваются, при этом ВНО размножается в носовой полости, легких и головном мозге при достижении максимальной продукции вируса в легких мышей через 2-3 суток п/з. В связи с этим противовирусное действие препаратов оценивали по подавлению размножения вируса в легких мышей через 3 суток после заражения ВНО. Данные о противовирусной активности НИОХ-32, НИОХ-14 и препарата сравнения ST-246 в отношении ВНО, полученные в экспериментах на аутбредных мышах ICR, представлены в таблице 4.
Достоверные отличия по проценту неинфицированных ВНО животных и титрам ВНО в легких через 3 сут после заражения наблюдались только в группах мышей, получавших препараты НИОХ-14 и ST-246. При этом противовирусное действие НИОХ-14 и ST-246 было одинаковым, а НИОХ-32 оказался неэффективным в отношении ВНО в экспериментах in vivo (табл.4).
Таблица 4
Противовирусная активность препаратов НИОХ-14 и НИОХ-32 (Патент РФ №2412168) в сравнении с ST-246 в экспериментах на мышах, инфицированных вирусом натуральной оспы (ВНО, штамм Ind-3а) в дозе 30 ИД<sub>50</sub>/гол.
Группы мышей, получавших препараты
Показатели инфицируемости и титры вируса в легких мышей массой 9-12 г, зараженных 30 ИД<sub>50</sub>/гол. ВНО
Количество и процент (%) инфицированных
Коэффициент защиты (КЗ)
Титры ВНО в легких^ (lg БОЕ/мл), M±S<sub>M</sub>
НИОХ-32, n=7
7 (100%)
0%
3,06±0,84
НИОХ-14, n=7
3* (43%)
57%
1,00±0, <sup>&</sup>
ST-246, n=7
3* (43%)
57%
1,01±0,79 <sup>&</sup>
Контроль ВНО, n=7
7 (100%)
-
3,00±0,85
Примечание:
коэффициент защиты (КЗ) = % инфицированных в контроле - % инфицированных в опыте; * - отличие от Контроля по критерию χ<sup>2</sup> при p=0,018; ^ - титры ВНО в легких определяли через 3 сут после инфицирования; в случаях когда в гомогенатах легких инфицированных мышей ВНО не выявлялся из-за существующего порога чувствительности метода титрования, использовали минимальное значение титра, которое можно было определить при данном способе титрования (0,4 lg БОЕ/мл); <sup>&</sup> - отличие от Контроля по U-критерию Манна-Уитни при p≤0,003; М - среднее, S<sub>M</sub> - стандартное отклонение; n - число животных в группе.
Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что введение НИОХ-14 так же, как и ST-246, приводит к достоверному уменьшению доли инфицированных ВНО мышей по сравнению с контрольной группой, судя по показателям наличия и отсутствия ВНО в легких. При этом НИОХ-14 так же, как и ST-246, проявляет значительный защитный противооспенный эффект, то есть у 57% зараженных ВНО животных, получавших исследуемые препараты, наличие ВНО в легких не обнаружено. Кроме того, в группах мышей, которым вводили НИОХ-14 или ST-246, концентрация ВНО в легких при введении препаратов достоверно снижается на 2 lg относительно уровня в контроле (табл.4).
Таким образом, в рамках проведенного исследования было показано, что в экспериментах на аутбредных мышах ICR, интраназально зараженных штаммом Ind-3а ВНО, химическое соединение НИОХ-14 проявляет высокую, сопоставимую с ST-246, противооспенную эффективность.
2,4
К настоящему времени полученные авторами результаты при проведении в течение нескольких лет тестирования противооспенной активности более 7000 химически синтезированных препаратов, позволили выбрать и рекомендовать в качестве лечебно-профилактического средства для применения против натуральной оспы единственное соединение 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (НИОХ-14), для которого авторами была доказана эффективность в отношении ВНО в экспериментах на животных, полученное по описанному выше способу с использованием этанола при температуре +2-10°C (Пример 1).
Пример 4. Обоснование и расчеты соотношения доз НИОХ-14, использованных для проведения испытания его противооспенной активности на животных и рекомендованных для человека
Исследование противовирусного действия препарата НИОХ-14 было проведено на аутбредных мышах ICR массой 9-12 г. При расчете эквивалентных для мышей доз НИОХ-14 были использованы опубликованные рекомендации [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р.У. М.: Медицина, 2005. - 832 С.; Трахтенберг И.М. и др. Проблема нормы в токсикологии - 2-е изд. - М.: Медицина, 1991. - 208 С.], где научно обосновано применение повышенных доз препаратов в пересчете на единицу массы мелких лабораторных животных.
Закон зависимости обмена веществ от массы тела отражает тенденцию к установлению соответствия между теплопродукцией и интенсивностью теплоотдачи в окружающее пространство. Потеря тепла на единицу массы тела оказывается тем больше, чем больше соотношение между поверхностью и объемом тела, причем это соотношение уменьшается при увеличении размера тела. Кроме того, у мелких животных изолирующий слой тела более тонкий: интенсивность метаболизма у мыши на 1 г массы тела больше, чем у человека.
Пересчет дозы полученного препарата НИОХ-14, использованной в экспериментах на мышах, инфицированных ВНО, на рекомендованную дозу для человека. Пересчет соотношения дозы препарата для мыши и человека осуществляли на основе имеющихся данных [Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А. Проблема нормы в токсикологии (Современные представления и методические подходы, основные параметры и константы). Москва: Медицина, 1991].
ч
ч
ч
ч
м
ч
м
м
м
м
ч
ч
2
2
2
2
2
2
2
У человека массой (m) 65 кг (65000 г) площадь поверхности тела (S) составляет ~1,99 м (19900 см), коэффициент S/m≈0,31 см/г. Площадь поверхности тела (S) мыши массой (m) 12 г равна ~60 см, У мыши коэффициент соотношения S/m≈4,62 см/г. Отношение этих коэффициентов для мыши и человека равно 4,62 см/г ÷ 0,31 см/г = 14,9. Исходя из того что коэффициент S/m у мышей выше, чем S/m у человека практически в 15 раз, можно сделать заключение, что интенсивность обмена веществ и скорость метаболизма введенного вещества у мыши в 15 раз выше, чем у человека. По этой причине доза препарата, вводимая мыши, на единицу массы может быть в 15 раз больше, чем у человека.
Исходя из того что при проверке противовирусной эффективности препарата НИОХ-14 в экспериментах на мышах была использована доза 60 мг/кг (60 мкг/г) массы мыши (0,72 мг/мышь = 720 мкг/мышь), то для человека эта доза может быть в 15 раз меньше, чем для мыши, и составлять 4,0 мг/кг массы тела человека (200-400 мг/человека в сутки).
Пересчет дозы американского препарата-прототипа ST-246, использованной в экспериментах на обезьянах Cynomolgus, инфицированных ВНО, на рекомендованную дозу для человека. В публикации, описывающей лечебно-профилактическую активность препарата-прототипа ST-246, вводимого в дозе 300 мг/кг/сут в течение 14 суток обезьянам Cynomolgus (массой 3,5 кг), инфицированным ВНО, пересчет и прогнозирование доз ST-246 для человека не приведен [Huggins J., Goff A., Hensley L. et al. Nonhuman Primates Are Protected from Smallpox Virus or Monkeypox Virus Challenges by the Antiviral Drug ST-246. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2009; 53 (6): 2620-2625]. Используя ту же схему пересчета (см. выше) доз препарата с животных на человека и данные, приведенные в статье для американского препарата-прототипа ST-246, получаем следующие результаты.
ч
ч
ч
ч
o
о
o
o
o
o
ч
ч
2
2
2
2
2
2
2
У человека массой (m) 65 кг (65000 г) площадь поверхности тела (S) составляет ~1,99 м (19900 см), коэффициент S/m≈0,31 см/г. Площадь поверхности тела (S) обезьяны массой (m) 3500 г равна ~2600 см, У обезьяны коэффициент соотношения S/m≈0,74 см/г. Отношение этих коэффициентов для обезьяны и человека равно 0,74 см/г ÷ 0,31 см/г = 2,4. Исходя из того что коэффициент S/m у обезьяны выше, чем S/m у человека практически в 2,5 раза, можно сделать заключение, что интенсивность обмена веществ и скорость метаболизма введенного вещества у обезьяны в 2,5 раза выше, чем у человека. По этой причине доза препарата, вводимая обезьяне, на единицу массы может быть в 2,5 раза больше, чем у человека.
Учитывая то, что при проверке противовирусной эффективности американского препарата ST-246 в экспериментах на обезьянах была использована доза 300 мг/кг массы обезьяны (1050 мг/обезьяну), то для человека эта доза может быть в 2,5 раза меньше, чем для обезьяны, и составлять 120 мг/кг массы тела человека (7800 мг/человека в сутки = 7,8 г/человека в сутки).
Согласно расчетам, проведенным на основании экспериментов авторов на инфицированных ВНО мышах, НИОХ-14 можно применять для человека в дозе 4,0 мг/кг массы тела человека, что в 30 раз меньше в сравнении с дозой американского препарата-прототипа ST-246 для человека, равной 120 мг/кг массы тела человека, рассчитанной на основании экспериментов на инфицированных ВНО обезьянах.
2,4
Таким образом, технический результат изобретения подтверждается тем, что заявляемое соединение 7-[N'-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0]нон-8-ен-6-карбоновой кислота (НИОХ-14), полученное с использованием этанола при температуре +2-10°C, проявляет противовирусное действие в отношении вируса натуральной оспы in vivo, отличается от американского препарата-прототипа ST-246 более высокой эффективностью в организме млекопитающих (судя по показателям теоретически пересчитанной дозы для человека с учетом использованной дозы для зараженных ВНО обезьян) и рекомендуется в качестве средства медицинского и ветеринарного назначения, применяемого для лечения и профилактики заболеваний оспой.