СПОСОБ УСТАНОВЛЕНИЯ ОТЛИЧИТЕЛЬНЫХ ПРИЗНАКОВ В ХИМИЧЕСКОМ СОСТАВЕ МОНОГЕННЫХ ЛИНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА
METHOD OF ESTABLISHING DISTINGUISHING FEATURES IN CHEMICAL COMPOSITION OF MONOGENIC SUNFLOWER LINES

Изобретение относится к области разработки способа установления состава природного материала путем разделения жидкостей, полученных в результате пробоподготовки, методом газовой хроматографии, включающим обработку исследуемых экстрактов адсорбентом, с последующим определением методом масс-спектрометрии химических соединений, отличительных для каждой из моногенных линий подсолнечника.
Установление качества продукции сельского хозяйства является важной задачей государственных служб и учреждений, на которые возлагаются функции контроля продукции агропромышленного комплекса. Обеспечение мероприятий по контролю потребительских свойств товаров возможно при наличии надежных методов оценки качества продукции.
Подсолнечник используют главным образом как маслично-белковое растение, дающее пищевое масло и белок, хорошо сбалансированный по аминокислотному составу. Также моногенные линии подсолнечника, различающиеся окраской язычковых лепестков, могут использоваться в декоративном цветоводстве. Урожайность подсолнечника, а также качественный состав получаемой продукции и цветовые характеристики язычковых лепестков определяются генетическими свойствами растений. Поэтому установление отличительных признаков в химическом составе моногенных линий подсолнечника является актуальной задачей.
Решение настоящей задачи может быть осуществлено при разработке методологических подходов, обеспечивающих возможность эффективного аналитического контроля генетических признаков растительных культур. Настоящее изобретение содержит материалы по разработке методики аналитического контроля, обеспечивающего выявление отличительных признаков в химическом составе растительного материала.
К числу новых приемов, обеспечивающих выращивание гибридных семян подсолнечника с высокой генетической чистотой, относится генетическое маркирование родительских моногенных линий. В качестве маркерных могут быть использованы гены, контролирующие морфологические признаки, в частности различную окраску язычковых цветков [Барнашова Е.К., Константинова Е.А., Лобачев Ю.В. Использование маркерных генов в селекции сортов и гибридов подсолнечника // В сб. «Вопросы биологии, экологии, химии и методики обучения». Вып.8. СГУ им. Н.Г.Чернышевского. Саратов. 2005. - С.36-39]. Значительным препятствием при развитии настоящего направления является отсутствие доступных и надежных методов анализа генетических признаков моногенных линий подсолнечника.
Разработка надежной методики установления принадлежности растения к той или иной моногеннной линии способствует более интенсивному изучению и, следовательно, широкому распространению генетического маркирования подсолнечника при помощи цвета язычковых лепестков.
Моногенные линии подсолнечника сложно различить между собой, поскольку отличия между ними заключаются в наличии одного гена, определяющего отличия данного типа растения, также ответственного за цвет язычковых лепестков. При ярком солнечном свете лепестки обычно хорошо различаются по цвету, но для определения генетической чистоты или более точного определения принадлежности растения к той или иной моногенной линии визуальный контроль недостаточен в силу своей малой информативности.
Исследования по установлению отличительных особенностей моногенных линий подсолнечника методом колориметрии [Константинова Е.А. Генетический контроль и селекционная ценность окраски язычковых цветков у подсолнечника. Автореферат диссертации кандидата биологических наук. - Саратов, Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова, 2004, - 18 с.] показали, что полученные спектральные характеристики недостаточны для подтверждения генетической чистоты моногенных линий.
Разработка более объективного метода определения отличительных признаков моногенных линий подсолнечника возможна при установлении химического состава растительного материала.
Для надежного установления химического состава растительного сырья необходимо использовать инструментальные методы анализа [Fico G., Bruca A., De Tommasi N., Tome F., Morelli I. Aconitum napellus subsp neomontanum // Phytochemistry. 2001, V.57, №4. - S.543-546].
Известен способ идентификации компонентов растительного сырья методом жидкостной хроматографии [De Souza K.C.B., Schapoval E.E.S., Bassani V.L. LC determination of flavonoids: separation of quercetin, luteolin and 3-O-methylquercetin in Achyrocline satureioides preparations / Pharm. and Biomed. Anal. 2002. V.28, №3-4. - P.771-777]. Этот способ неприемлем для установления строения химических соединений, так как используется для подтверждения структур известных веществ путем сравнения с эталонным образцом. Данный способ эффективен лишь при исследовании составов, состоящих из стандартных компонентов при наличии конкретных образцов (эталонов) всех возможных соединений.
Метод ядерного магнитного резонанса был использован для расшифровки состава и установления индивидуальных веществ, выделенных из цветов Azadirachta indica [Bina S. Siddiqui, Syed Tariq Ali, Munawwer Rasheed, Muhammad Nadeem Kardar. Chemical Constituents of the Flowers of Azadirachta indica / Helvetica Chimica Acta. 2003, V.86, №8. - P.2787-2796]. Для успешного использования этого способа анализа потребовалось первоначально выделять индивидуальные вещества с помощью химической модификации и последующей идентификации образующихся форм. Такой подход требует значительных затрат времени и реактивов.
В литературе описано [Wang Ying-hong, He Wen-yi, Li Xiao-mei, Li Bing, Liu Xing, Lin Мао. Application of LC-NMR and nano probe technology in natural products / Chinese Journal of Magnetic Resonance. 2002, V.19. - S.325-336] использование для исследования природных продуктов метода жидкостной хроматографии, совмещенной с ядерным магнитным резонансом. Метод отличается необходимостью использования очень сложного оборудования. Для обеспечения анализа исследуемого состава методом ядерного магнитного резонанса необходимо использовать дорогостоящие дейтерированные растворители. Этот метод удобен для исследования структур индивидуальных соединений, но он не пригоден для расшифровки сложных составов, типа экстрактов природных материалов.
Во всех перечисленных методах определялись составы конкретных проб отдельного вида растений, но не устанавливались отличительные вещества для моногенных линий или подобных форм растений.
Более приемлемым для исследования природного материала, с целью выявления химического состава, является способ, объединяющий жидкостную хроматографию и масс-спектрометрию [Dugo P., Mondello L., Dugo L., Stancanelli R., Dugo. LC-MS for the identification of oxygen heterocyclic compounds in citrus essential oils / J. Pharm. and Biomed. Anal. 2000, №1, с.147-154]. Данный способ позволяет эффективно разделить исследуемую смесь и установить наличие компонентов путем сравнения характеристик масс-спектров с имеющимися базами данных. На основании наибольшего технического соответствия с представляемой разработкой настоящий способ предлагается принять за прототип.
Недостатками прототипа являются:
- данный способ требует привлечения сложного аппаратурного комплекса для анализа (дорогое оборудование, большие затраты на обслуживание);
- необходим тщательный подбор используемых для жидкостной хроматографии растворителей;
- при обслуживании жидкостного хроматографа производится затрата значительного количества дефицитного и дорогого растворителя;
- подготовка и проведение анализа требуют длительного времени, поэтому этим методом не может обрабатываться значительное количество проб природного материала;
- описанный способ применяется для установления конкретного состава определенного типа растений, но не использовался для поиска отличительных веществ в моногенных линиях или подобных форм.
Целью настоящего изобретения является разработка способа установления химического состава растительного материала и выявление отличительных признаков для моногенных линий подсолнечника путем идентификации компонентов, содержащихся в экстрактах язычковых лепестков.
Для достижения цели была разработана методика обработки природного материала, приготовления проб и анализа полученных экстрактов.
Моногенные линии подсолнечника, использованные в работе, различались между собой окраской язычковых цветков. За желтую, лимонную, бело-желтую, оранжевую, зелено-желтую окраску язычковых цветков отвечают рецессивные аллели генов st, l, la, o, pa соответственно. Таким образом, рецессивные аллели генов st, l, la, o, pa были использованы в качестве маркерных признаков материнских и отцовских форм гибридов. Установление отличительных признаков в химическом составе моногенных линий подсолнечника устанавливало возможность распознания генетической принадлежности и установления генетической чистоты растительного материала.
ПРОБОПОДГОТОВКА
Навеску 3,0 г свежесобранных лепестков язычковых цветков подсолнечника тщательно измельчали механическим способом, образующийся растительный материал помещали в пробирку объемом 15 мл с притертой пробкой и заливали 5,0 мл экстрагента.
В качестве экстрагента использовалась смесь хлороформа и метанола, в соотношении 7/3 объемных частей соответственно. Вещества, используемые в качестве компонентов для получения экстрагента, соответствовали категории качества - чда (чистый для анализа).
Содержимое пробирки, закрытое пробкой, выдерживали в течение 5 часов, периодически встряхивая. Затем пробирка с содержимым помещалась в ультразвуковую ванну фирмы «Retsch» (Германия), заполненную водой комнатной температуры. Содержимое пробирки подвергалось воздействию ультразвука частотой 20 кГц в течение 4 часов.
После завершения процесса обработки ультразвуком пробирку фиксировали в статичном положении и отстаивали содержимое в течение 30 минут. Затем из пробирки отбирали пробу 2 мл раствора (экстракт растительного сырья), не содержащего механических примесей растительного материала. Пробу экстракта упаривали на водяной бане в токе азота (квалификации хч - химически чистый) до получения концентрированного раствора объемом 0,4 мл. Готовая проба подвергалась анализу.
МЕТОД АНАЛИЗА
Для расшифровки состава образцов использовался метод хроматомасс-спектрометрии. Метод основан на использовании газовой хроматографии, включающем обработку исследуемых экстрактов адсорбентом, для разделения анализируемой смеси с последующим детектированием разделенных компонентов масс-спектральным детектором в режиме полного сканирования.
УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА
Анализ образцов экстрактов язычковых лепестков подсолнечника осуществлялся на хроматомасс-спектральном комплексе «MS-25RF» фирмы «Kratos» (Англия). Объем вводимой пробы составлял - 1 мкл.
На первой стадии анализа производилось разделение компонентов, входящих в состав пробы, с использованием колоночной газожидкостной хроматографии. Хроматографическое разделение компонентов исследуемого образца проводилось на кварцевой капиллярной колонке «DB-5» длиной 60 м, с неподвижной фазой адсорбента SE-54, производства фирмы «J&W Scientific» (США).
Типовая настройка хроматографа производилась в следующем режиме:
- начальная температура колонки
- 40°С;
- время выдержки
- 6 мин;
- скорость подъема температуры колонки
- 10°С/мин;
- конечная температура колонки
- 300°С;
- время выдержки
- 10 мин;
- температура инжектора
- 280°С;
- температура интерфейса
- 280°С;
- давление на инжекторе
- 1 атм;
- поток газа-носителя (гелий) в колонке
- 1 мл/мин;
- деление потока гелия в инжекторе
- 1:10.
После прохождения хроматографической колонки разделенная парогазовая смесь направлялась в камеру детектора-катарометра. Выходящий с детектора сигнал обрабатывался на типовом интеграторе и выводился на самописец. Выходная кривая представляла собой последовательность отдельных пиков, соответствующих индивидуальным химическим веществам, обнаруженным в пробе экстрагента.
На втором этапе производилась масс-спектрометрия индивидуальных веществ с целью их идентификации путем установления молекулярной массы и структуры органического соединения. Разделенная парогазовая смесь, поступающая из хроматографического блока аналитического комплекса, направлялась в камеру ионизации масс-спектрометра. Результатом масс-спектрального анализа явилось получение масс-спектров индивидуальных соединений, находящихся в пробе экстрагента растительного материала. Оценка интенсивности пиков на масс-спектрах принималась в процентах по отношению к общей величине ионного тока.
Стандартный режим работы масс-спектрометра имел следующие характеристики:
- температура источника ионов
- 200°С;
- фактическая энергия ионизации
- 70 Эв;
- номинальное значение вакуума в зоне
источника ионов
- 1×10<sup>-5</sup> мм ртутного столба;
- температура квадруполя
- 200°С;
- ток эмиссии электронов
- 300 мкА;
- диапазон полного сканирования
массовых чисел
- 35…600 атомных единиц массы.
Идентификация обнаруженных веществ производилась по наличию и соотношению характеристичных ион-фрагментов, зарегистрированных на масс-спектрах, путем эталонного сравнения с использованием масс-спектральных характеристик индивидуальных химических соединений из баз данных библиотечных каталогов масс-спектров «Willey 275», «NBS-75» и «NIST 98». При установлении степени совпадения, равной ≥90%, индивидуальное соединение считалось идентифицированным.
ПРИМЕР ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНДИВИДУАЛЬНОГО СОЕДИНЕНИЯ
После прохождения газового хроматографа каждая из фракций смеси, соответствующая индивидуальному химическому соединению, направлялась в камеру ионизации масс-спектрометра, где подвергалась воздействию электронов. В результате происходило расщепление индивидуального соединения с образованием ряда характеристичных фрагментов. Регистрация фрагментов производилась в виде масс-спектра, соответствующего данному соединению. Идентификация соединений производилась путем сравнения характеристик полученного масс-спектра индивидуального соединения с материалами баз данных библиотечных каталогов масс-спектров.
На чертеже - а представлен масс-спектр индивидуального соединения, зарегистрированного в экстракте желтых (st) лепестков подсолнечника. Масс-спектр, выявленный в результате компьютерного поиска по библиотечным данным каталога масс-спектров «NIST 98», приводится на чертеже - в.
Статистическая оценка характеристичных масс-пиков показала высокую вероятность соответствия (96,3%) конкретного масс-спектра каталожной выборке. На основании данных сравнения соединение было идентифицировано как 6-ацетил-2,5-дигидрокси-1,4-нафтохинон.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАСШИФРОВКИ СОСТАВА ЭКСТРАКТОВ
В настоящей работе представлены результаты анализа следующих язычковых лепестков моногенных линий подсолнечника: желтых (st), лимонных (l), бело-желтых (la), оранжевых (o), зелено-желтых (pa). Опытные образцы анализировались в виде экстрактов, приготовленных по специально разработанной методике.
В результате проведения анализов было установлено, что хроматограммы всех образцов содержат значительное количество пиков (порядка 60…90), соответствующих индивидуальным химическим соединениям. При расшифровке состава образцов предложенным методом были идентифицированы от 85 до 95% индивидуальных соединений, зарегистрированных в результате хроматографического разделения проб экстрагентов. Анализ характера идентифицированных соединений показал, что в пробах, независимо от сорта подсолнечника, присутствуют вещества различных химических классов, основными из которых являются: углеводороды (алканы, алкены, циклические и полициклические соединения), органические кислоты и их эфиры, сложные спирты, производные фенола, фенантрена, фурана, нафталина, хинолина.
Для решения задачи по разработке методики выявления отличительных признаков моногенных линий подсолнечника наиболее целесообразно производить оценку состава экстрагентов по содержанию производных следующих классов химических соединений: нафталина, фенантрена, хинолина. Полученные результаты по расшифровке состава экстрактов природного материала представлены в примерах 1…5.
В результате расшифровки массива полученных данных было установлено, что ряд химических соединений обнаружен в пробах экстрактов всех видов лепестков подсолнечника, независимо от их принадлежности к той или иной моногенной линии. К этим соединениям относятся:
1Н-циклопропа[α]нафталин;
7,8-диметил-5(1-метилэтил)-трицикло-[4.4.0.0.(2,7)]-дек-8-ен-4-ол;
5,8-диметокси-2,4-диметил хинолин;
1,4-нафталендион;
3b-этенил-1,3а,3b,7,7-пентаметил-додекагидро-1Н-нафто-[2,1-b]пиран;
7-этенил-1,2,3,4,4а,4в,5,6,7,8,8а,9-додекагидро-1,1,4в,7-тетраметил-[4аS-(4аа,4вв,7а,8аа)]фенантрен;
1,1,4а-триметил-6-метилен 5-(3-метил-2,4-пентадиенил)-декагидронафталин;
кауран-16-ол;
7-этенил-1,2,3,4,4а,4в,5,6,7,9,10,10а-додекагидро-1,4а,7-триметил-1-
фенантренкарбоксальдегид;
13β-метил 13-винилподокарп-7-ен-3-он;
кауран-16-ен-18-оевая кислота.
Перечисленные химические вещества признаны характеристичными для всех исследованных типов язычковых лепестков моногенных линий подсолнечника, имеющих рецессивные аллели генов: желтые (st), лимонные (l), бело-желтые, (la), оранжевые (o), зелено-желтые (pa).
Расшифровка химического состава экстрактов из язычковых лепестков пяти различных моногенных линий подсолнечника показала, что каждая из моногенных линий имеет отличительные признаки в виде индивидуальных химических веществ установленной структуры. Полученные данные представлены в таблице.
Таблица - Индивидуальные химические вещества, отличительные для моногенных линий подсолнечника
№ п/п
Обозначение гибрида
Цвет лепестков
Наименование химических соединений, являющихся отличительными признаками гибридов
1
St
желтые
1а,2,4,5,6,7,7а-октагидро-1,1,7,7а-тетраметил-1Н-циклопропа[α]нафталин
2
L
лимонные
4,4а,5,6,7,8-гексагидро-4,4а-диметил-(1-метилэтенил)нафталин
3
O
оранжевые
1,2,3,4-тетрагидро-1,1,2,4,4,7-гексаметилнафталин;2-метилтио-1,4-нафтохинон;3,5,9-триметил-3,5,5,6,7,9-гексагидро-нафто-2,8-диокси[1,2-β]-фуран 1,7-диметил-1,8-нафтазиридин-4-он-3-карбоксазид; 8-гидрокси-3,3,5-триметил-1,2,3,4,5,5,6,7,8,9,9,10,11,11-тетрадекагидро-индено[1,2-α]нафталин.
4
La
бело-желтые
1,4,4,7-тетраметил-1,4,5,6,7,8-гексагидро-2(3Н)нафталенон
5
Pa
зелено-желтые
2-этенилнафталин
1,8-ди-(пропинил)нафталин
1,8-дигидрокси-2-ацетил-3-метилнафталин
На основании полученных данных была установлена возможность определения отличительных признаков индивидуальных гибридов подсолнечника методом хроматомасс-спектрометрии.
Разработанная методика установления индивидуальных химических соединений, характеризующих конкретную линию подсолнечника, показала, что каждый цвет лепестков: желтые (st), лимонные (l), бело-желтые (la), оранжевые (o), зелено-желтые (pa) - имеют от одного до пяти идентифицируемых методом хроматомасс-спектрометрии индивидуальных веществ, которые являются отличительными для данной моногенной линии.
Настоящая методика отличается простотой пробоподготовки и высокой производительностью, может быть использована в качестве способа идентификации генетической принадлежности методом оценки химического состава экстрактов язычковых лепестков подсолнечника.
Полученные результаты могут быть использованы государственными службами технического контроля при проведении мероприятий по определению качества аграрной продукции методом установления генетической принадлежности сельскохозяйственных культур.