Особенности иммунного ответа после воздействия общей гипертермии на экспериментальных животных

9. Моделирование одностороннего ишемического повреждения нейронов стриатума с помощью непродолжительной окклюзии средней мозговой артерии / Д.Э. Коржевский [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - № 147 (2). - С. 217-219.

10. Структурная организация микроглиоцитов стриатума после транзиторной фокальной ишемии / Д.Э. Коржевский [и др.] // Морфология. - 2012. - № 141 (2). - С. 28-32.

11. Механизмы нейропротективного эффекта компонента зеленого чая - L-теанина / М. А. Зухурова [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2010. - N° 4(36) - С. 67-71.

12. Катехоламинергические структуры переднего мозга крыс после транзиторной ишемии / И. П. Григорьев [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2012. - № 2(42) - С. 57-60.

13. Гипоксическое и фармакологическое прекондиционирование как механизмы защиты при фокальной ишемии головного мозга крысы / М. А. Зухурова [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2010. - № 3(35) - С. 84-89.

14. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats / Garcia G.H. [et al.] // Statistical validation. Stroke. - 1995. - Vol.26. №4. - Р.627-634.

15. Kitagawa K. CREB and cAMP response element-mediated gene expression in the ischemic brain / K. Kitagawa // FEBS J. - 2007. - № 274. - Р. 3210-7

16. Li Y. Enhancing the GLP-1 receptor signaling pathway leads to proliferation and neuroprotection in human neuroblastoma cells / Y. Li // J Neurochem. - 2010. - June; № 113(6). - Р. 1621-1631.

УДК 616-092.9: 612.57: 612.112.3

© И.А. Кривошапкин, А.В. Ефремов, Е.Н. Самсонова, М.Г. Пустоветова, 2014

И.А. Кривошапкин, А.В. Ефремов, Е.Н. Самсонова, М.Г. Пустоветова ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Новосибирск

В настоящем исследовании было проведено определение содержания CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ лимфоцитов у 60 крыс-самцов линии Вистар. Отмечалось снижение количества иммунокомпетентных клеток на 1-е сутки постгипер-термического периода с восстановлением к 3-м суткам. Далее количество СD3+, СМ+, СD20+ лимфоцитов продолжало повышаться. Содержание СМ+ и CD16+ лимфоцитов оставалось в пределах контрольных значений.

Ключевые слова: иммунокомпетентные клетки, CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ лимфоциты, общая гипертермия.

I.A. Krivoshapkin, A.V. Efremov, E.N. Samsonova, M.G. Pustovetova FEATURES OF IMMUNE RESPONSE AFTER GENERAL HYPERTHERMIA

ON EXPERIMENTAL ANIMALS

This study was carried out to determine CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD16 +, CD20 + lymphocytes in 60 male Wistar rats. We noted a decrease in the number of immune cells in 1 st day of posthyperthermic period with the restoration by the 3rd day. Then the number of Cd3 +, CD4 +, Cd20 + cells continued to rise. Content of CD4 + and CD16 + cells remained within the reference values. Key words: immune cells, CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD16 +, CD20 + cells, general hyperthermia.

В настоящее время гипертермия как локальная, так и общая, находится в центре внимания врачей различного профиля, особенно онкологов [1,2,3,4]. Локальная гипертермия в форме терморадио-, термохимио- и термора-диохимиотерапии применяется при лечении онкологических больных в самостоятельном виде или в рамках неоадъювантной и адъ-ювантной терапии. В применении искусственной управляемой гипертермии в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией скрыты немалые резервы, в частности при многокомпонентном лечении больных с далеко зашедшими злокачественными новообразованиями (первичные местнораспространенные, рецидивные и/или метастатические опухоли), а также с локализованными, но крайне неблагоприятными формами заболевания [5,6].

В научной литературе идет активная дискуссия о механизмах действия локальной и общей гипертермии на организм человека и

ее влиянии на патогенез различных заболеваний [7,8]. Состояние общей гипертермии тела представляет собой один из вариантов тяжелого стресса, адаптация к которому лежит за пределами физиологических возможностей организма. Характер развития стресс-реакции во многом определяется функциональным состоянием лимфоидной ткани, макрофагов и ретикулоэндотелиальной системы [9, 10]. Клинические и экспериментальные работы, посвященные влиянию общей гипертермии на организм человека, в подавляющем большинстве проводились в диапазоне температур 37-42°С. Вместе с тем известно, что гибель опухолевых клеток происходит только при температуре более 43°С [11].

Поскольку основными областями применения общей гипертермии являются онкология и инфектология, то наибольший интерес представляют вопросы влияния гипертермии на состояние иммунной системы.

Цель исследования - изучить содержание CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ лимфоцитов в крови после воздействия общей гипертермии.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на 60 крысах-самцах линии Вистар массой 220-230 г, содержавшихся в условиях вивария в соответствии с требованиями приказов «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» от 06.041973 г. № 104573, а также № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Разогревание животных до 43,5 °С проводили в соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [8]. Животных забивали методом де-капитации под эфирным наркозом на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сутки после общей гипертермии. В группу контроля вошли 7 интактных крыс этой же породы. В качестве материала исследования использовали периферическую кровь.

Исследование клеточного звена иммунной системы проводили путем определения моноклональных антител к следующим маркерам: CD3+ (клон G4.18, 1:100, FITC,зеленый; cat. № LS-C58677; LifeSpan Biosciences), CD4+ (клон OX-35, 1:100, Alexa567, красный; cat.№ LS-C106953; LifeSpan Biosciences), CD8+ (клон OX-8, 1:100, FITC, зеленый; cat. № LS-C45150; LifeSpan BioSciences), СD 16+ (клон FCR4G8; cat. № MBS673332; MyBioSource, Inc.) - на люминесцентном микроскопе AXIO SCOPE A1 LED (Carl Zeiss Microimaging GmbH 07740 Jena, Germany). Статистическую обработку результатов исследования проводи-

ли, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (m) и представляли в виде M±m. Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента, достоверными считались результаты при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Воздействие высокой температуры на организм млекопитающих, как и действие многих стресс-факторов, вызывает значительные изменения нейро-эндокринной и иммунной системы, метаболических и обменных процессов на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях. В механизме развития стрессовой реакции главную роль играет длительное и значительное повышение концентрации катехоламинов и глюкокортикоидов. Катехоламины и глюкокортикоиды проявляют синергизм в своих биологических эффектах, усиливают метаболическое и физиологическое (в частности мембранотропное) действие друг друга, поэтому вряд ли возможно в полной мере дифференцировать патологические изменения, обусловленные раздельным влиянием их высоких концентраций. Тем не менее, если концентрация катехоламинов возрастает в первые же секунды стрессового воздействия, то гиперкортицизм требует для своего развития как минимум 1 час. Гиперкорти-цизм, особенно длительный обусловливает выраженную инволюцию и деструкцию тими-ко-лимфатической системы, угнетает костномозговое кроветворение, тормозит механизмы клеточного и гуморального иммунитета, кил-лерную активность Т-лимфоцитов. Выход из иммунодепрессии начинается только через несколько дней [13].

В табл. 1 приведены результаты исследования содержания субпопуляций лимфоцитов после воздействия общей гипертермии.

Таблица 1

Динамика содержания субпопуляций лимфоцитов в крови у экспериментальных животных после применения общей гипертермии, %

Срок исследования Субпопуляция лимфоцитов

CD3+ CD4+ CD8+ CD20+ CD16+

1-е сутки 48,42±2,01* 26,48±1,41* 15,25±1,32* 11,17±1,05* 7,28±0,83*

3-и сутки 63,54±1,98 29,34±2,07 19,56±1,50 13,38±1,22 7,41±1,04*

7-е сутки 71,28±2,51* 38,19±2,34* 18,79±1,08 17,09±1,77* 8,34±1,63

14-е сутки 62,41±3,02 35,76±2,54* 17,23±1,12 16,74±1,34* 8,87±1,76

Контроль 59,9±2,6 31,7±2,72 18,41±1,44 14,03±1,36 9,11±1,03

* - Отличие от величины соответствующего показателя группы контроля статистически значимо при р < 0,05.

При изучении влияния общей гипертермии на содержание лимфоцитов в сыворотке крови, было отмечено, что на 1-е сутки постгипертермического периода изучаемый показатель снизился на 28%. На 3-и сутки эксперимента содержание лимфоцитов в сыворотке крови животных данной группы не отличалось от контрольных значений. Период

с 7-х по 14-е сутки наблюдения характеризовался повышением содержания лимфоцитов в сыворотке крови: на 7-е сутки - на 24%, на 14-е сутки - на 38%.

В 1-е сутки наблюдения отмечалось снижение содержания СБ3+ лимфоцитов в крови до 48,42±2,01%. На 7-е сутки постги-пертермического периода было зафиксирова-

но повышение содержания СБ3+ лимфоцитов в крови у экспериментальных животных до 71,28±2,515%. В остальные сроки наблюдения изучаемый показатель не отличался от контрольных значений.

Содержание СБ4+ лимфоцитов крови у экспериментальных животных контрольной группы составило 31,7±2,72%. В группе животных, подвергшихся воздействию общей гипертермии, отмечалась следующая динамика данного показателя: в 1-е сутки постгипертер-мического периода содержание СБ4+ лимфоцитов снижалось на 20% по отношению к контрольным значениям, на 3-и сутки наблюдения оно не отличалось от контрольных значений. На 7-е сутки постгипертермического периода были зафиксированы максимальные значения СБ4+ лимфоцитов у животных первой группы - 38,19±2,34%. К окончанию эксперимента (14-е сутки) содержание СБ4+ лимфоцитов в крови у экспериментальных животных снизилось до 35,76±2,54%, но это было выше контрольных значений. При анализе содержания СБ8+ лимфоцитов в крови у экспериментальных животных в постгипертермическом периоде были выявлены следующие изменения. У животных контрольной группы данный показатель составил 18,41±1,44 %. На 1-е сутки наблюдения отмечалось снижение содержания СБ8+ лимфоцитов в крови. В остальные сроки наблюдения изучаемый показатель достоверно не отличался от контрольных значений.

При анализе содержания СБ20+ лимфоцитов в крови у экспериментальных животных были выявлены следующие изменения. У животных первой группы, подвергшихся воздействию общей гипертермии, в 1-е сутки наблюдения отмечалось снижение содержания СБ20+ лимфоцитов в крови. На 3-и сутки постгипертермического периода изучаемый показатель не отличался от контрольных значений, с 7-х по 14-е сутки наблюдения

содержание СБ20+ лимфоцитов в крови у животных данной группы превысило контрольные значения. Содержание СБ 16+ лимфоцитов в крови у экспериментальных животных контрольной группы составило 9,11± 1,03%. В группе животных, подвергшихся воздействию общей гипертермии, отмечалась следующая динамика данного показателя: с 1-х по 3-и сутки постгипертермического периода содержание СБ 16+ лимфоцитов снижалось, в остальные сроки наблюдения не отличалось от контрольных значений.

Заключение

Таким образом, в 1-е сутки после воздействия общей гипертермии отмечается снижение относительного и абсолютного количества иммунокомпетентных клеток. Значительное снижение количества лимфоцитов в ранние сроки постгипертермического периода связано, по-видимому, с тем, что повышенные концентрации глюкокортикоидов при термическом стрессе вызывают апоптоз лим-фоидных элементов [14], а катехоламины способствуют хоумингу лимфоцитов в ткани. К 3-м суткам после воздействия общей гипертермии относительное и абсолютное количество СD3+, СD4+, СD8+, СБ 16+ и СD20+ лимфоцитов восстанавливалось. Это связано с рекрутированием лимфоцитов из костного мозга, где происходит интенсивное восстановление количественного и качественного состава клеток. Далее относительное и абсолютное количество СD3+, СD4+, СD20+ лимфоцитов продолжало повышаться, что возможно вызвано поступлением в кровь продуктов клеточной деструкции и внутриклеточных антигенов с последующей стимуляцией иммунной системы. Относительное содержание СD8+ и СБ 16+ лимфоцитов оставалось в пределах контрольных значений, но при этом абсолютное содержание данных субпопуляций лимфоцитов также повышалось.

Сведения об авторах статьи:

Кривошапкин Иван Алексеевич - аспирант кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52. E-mail: decoivan@yandex.ru. Ефремов Анатолий Васильевич - член-корр. РАМН, д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52. E-mail: AVE 48@yandex.ru.

Самсонова Елена Николаевна - д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52. E-mail: еlena-samsonova@mail.ru. Пустоветова Мария Геннадьевна - д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52. E-mail: patophisiolog@mail.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Осинский, С.П. Гипертермия в клинической онкологии: современное состояние проблемы (по итогам 20-й ежегодной конференции Европейского общества гипертермической онкологии) / С.П. Осинский // Онкология. - 2002. - 4(4). - С. 288-292.

2. Diverse immune mechanisms may contribute to the survival benefit seen in cancer patients receiving hyperthermia / A.J. Peer [и др.] // Immunol Res. - 2010. - 46(1-3). - Р. 137-54.

3. Шелыгин, Ю.А. Обоснованность применения интраоперационной внутритазовой химиотерапии в сочетании с гипертермией при лечении рака прямой кишки / Ю.А. Шелыгин, Е.Г. Рыбаков, И.А. Ревельский, М.В. Алексеев // Вопросы онкологии. -2011.-N 2.-С.173-178.

4. Мардынский, Ю.С. Комбинированное лечение больных раком полости рта с использование «условно-динамического» режима фракционирования лучевой терапии и локо-регионарной гипертермии. / Ю.С. Мардынский, О.К. Курпешев, В.С. Медведев, С.А. Максимов // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. - № 1. - С.80-83.

5. Операционная изолированная химиогипертермическая перфузия легкого с удалением легочных метастазов /А.В. Бирюков [и др.] // Вестник хирургии им.И.И.Грекова. - 2010.-N 4.-С.12-16.

6. Pech M. MR-guided interstitial laser thermotherapy of colorectal liver metastases: efficiency, safety and patient survival./ M. Pech, G.Wieners, T. Freund, O. Dudeck, F. Fischbach, J. Ricke, M.D. Seemann // Eur J Med Res. 2007 April, 26;12(4):P.161-168.

7. Литвицкий П.Ф. Нарушения теплового баланса организма: гипертермия, гипертермические реакции, тепловой удар, солнечный удар. /П.Ф. Литвицкий// Вопросы современной педиатрии.- 2010.-N 1.-С.96-102.

8. Старченко В.В. Лихорадка и гипертермия. /В.В. Старченко// Новая аптека. - 2009.-N 10.-С.24-27.

9. Андреева, Л.И. Метаболические и функциональные особенности срочной реакции организма человека на перегревание / Л.И. Андреева, В.В. Горанчук, Н.А. Столярова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1999. - N° 1. - С. 19-23.

10. Управляемая гипертермия / Ф. В. Баллюзек [и др.] // СПб. : «Невский Диалект». - 2001. - 123 с.

11. Repasky E.A., Lee M. Complex effects of hyperthermia on the immune system and implications for cancer therapy // Abstract ICHO, 2008,- P.9.

12. Ефремов А. В. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А., Ибрагимов Р. Ш., Шорина Г. Н.// опубл. 2001.-Бюл. № 10.

13. Симакова И.В. Особенности эндокринно-метаболического статуса у крыс в динамике общей искусственной гитертермии: авто-реф. дисс. ... канд. мед наук / И.В. Симакова// Новосибирск. - 2005. - 20 с.

14. Новиков, В. С. Физиология экстремальных состояний / В. С. Новиков, В. В. Горанчук, Е. Б. Шустов// СПб. : Наука. - 1998. - 247 с.

УДК 612.111.4:615.9:547.412.4:615.849.19:577.352.38]-092.9 © Д.В. Срубилин, Д.А. Еникеев, В.А. Мышкин, И.Д. Исаков, 2014

Д.В. Срубилин, Д.А. Еникеев, В.А. Мышкин, И.Д. Исаков ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПОСТУПЛЕНИИ ДИХЛОРЭТАНА И НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа

Изучен фосфолипидный состав мембран эритроцитов у крыс при субхронической интоксикации дихлорэтаном (ДХЭ) до и после коррекции низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ). При многократном введении ДХЭ нарушается структурная организация клеточных мембран. НИЛИ благоприятно влияет на состояние мембран, повышая содержание фосфолипидов и приближая количество отдельных фосфолипидных фракций к исходному уровню.

Ключевые слова: лазерное излучение, дихлорэтан, фосфолипиды, мембрана.

D.V. Srubilin, D.A. Enikeev, V.A. Myshkin, I.D. Isakov LIPIDIC STRUCTURE OF ERYTHROCYTES' MEMBRANES AT LONG RECEIPT OF DICHLORETHANE AND AGAINST USE OF LOW INTENSIVE LASER

RADIATION

Phospholipid structure of erythrocytes' membrane state in rats subchronically intoxicated with dichlorethane (DCE) before and after correction by low intensive laser radiation have been studied. With multiple administration of DCE the structure of cellular membranes is damaged. The beneficial effects of low intensive laser radiation on the membrane state have been noted, raising the level of phospholipids and causing the quantity of separate phospholipids fractions to reach the initial level.

Key words: laser radiation, dichlorethane, membrane, phospholipids.

Отравления хлорированными углеводородами занимает 2-4-е места среди всех отравлений различными химическими веществами, причем 90% случаев приходится на отравление 1,2 дихлорэтаном (ДХЭ) и тетрах-лорметаном, приводящим к развитию тяжелых поражений [2]. При сохраняющейся высокой летальности от острых интоксикаций ДХЭ основную массу составляют отравления, наблюдаемые при длительном поступлении токсиканта в организм, когда явной клинической симптоматики может и не возникнуть. Важным патогенетическим звеном токсического действия дихлорэтана на организм в этом случае является изменение мембранных структур, что ведет к нарушению липид-

липидных и липид-белковых взаимодействий. Объектом настоящего исследования избрана мембрана эритроцитов, позволяющая судить о функции мембран организма в целом [1,5,7].

В рамках проблемы коррекции при хронической интоксикации ДХЭ остаются нерешенные научно-практические вопросы. Определенный интерес представляет метод лазерной терапии с использованием низкоэнергетических источников облучения [4].

В связи с этим целью исследования явилось изучение фосфолипидного состава мембран эритроцитов у крыс при субхронической интоксикации дихлорэтаном и на фоне применения низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ).