Рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующая простат-специфический мембранный антиген человека
RECOMBINANT HUMAN BREAST CANCER CELL LINE BRCCH4E-134, EXPRESSING HUMAN PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новой клеточной линии рака молочной железы человека BrCCh4e-134, обладающей стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и экспрессирующей простат-специфический мембранный антиген (PSMA) в качестве трансгена. Данная клеточная линия предназначена для лабораторных и доклинических исследований с целью оценки эффективности противоопухолевых препаратов, особенно обладающих таргетным действием по отношению к PSMA-положительным опухолям.
Рак простаты (РП) является вторым по частоте встречаемости онкологическим заболеванием у мужчин в развитых странах и находится на третьем месте по частоте смертельных исходов у онкобольных мужчин [1]. После хирургической резекции раннедиагностированного рака простаты необходимо проведение химио- и/или радиотерапии для предотвращения рецидивов и метастазов. В случае метастатических форм РП химио- и радиотерапия являются недостаточными мерами для предотвращения рецидивов. Дополнительные преимущества таким больным может обеспечить таргетная терапия, направленная на специфические мишени рака простаты. Важным аспектом для исследования таргетных препаратов является наличие негативной клеточной модели, в идеале отличающейся только наличием таргетной молекулы. Простат-специфический мембранный антиген (PSMA) является молекулой, характерной для большинства раков простаты, а уровень экспрессии PSMA коррелирует со степенью тяжести заболевания, в том числе с метастатическими формами заболевания [2].
Известна клеточная линия аденокарциномы простаты человека 22Rv1 (№ CRL-2505 в коллекции АТСС), полученная из аденокарциномы человека, выращенной на мышах-ксенографтах. Для стабильной экспрессии PSMA клетки культивируют в присутствии дигидрокситестостерона. Помимо PSMA клетки 22Rv1 экспрессируют андрогеновые рецепторы. Клетки 22Rv1 туморогенны в мышах nude. С использованием линии 22Rv1 было проведено исследование противоопухолевого потенциала препаратов, направленных к PSMA.
Известна клеточная линия метастатической аденокарциномы простаты человека LNCaP (№ CRL-1740 в коллекции АТСС), полученная из материала биопсии метастаза лимфатического узла пациента с аденокарциномой простаты. Также как и клетки 22Rv1, LNCaP помимо PSMA, экспрессируют андрогеновые рецепторы. При трансплантации на мышей опухоль развивается лишь в 50% случаев и характеризуется медленным ростом [3].
Другой возможностью получения PSMA-положительных клеточных моделей является трансдукция PSMA-негативных клеток конструкциями, обеспечивающими экспрессию PSMA в качестве трансгена. Такие трансгенные PSMA-положительные линии также широко востребованы и успешно применяются, например, сконструированные на основе PSMA-негативных клеток карциномы простаты Du145 и РС3, а также на основе нормальных фибробластов 3Т3 [4]. Указанные трансгенные клеточные линии удобны для исследования таргетных препаратов, имеющих специфичность к PSMA антигену in vitro и в опухолевых моделях на животных. Кроме того, наличие PSMA-негативных родительских линий позволяет оценивать вклад цитотоксической и таргетной компоненты.
Тем не менее, трансгенные линии рака простаты, как правило, сохраняют локализацию преимущественного метастазирования при создании метастатических опухолевых моделей на животных. Наиболее характерным сайтом метастазирования аденокарциномы простаты (более 90% случаев) является костная локализация, и такая особенность сохраняется для внутривенно перевиваемых клеточных линий рака простаты, в том линий РС-3, VCaP, DU145 и LNCaP. Известно, что подкожная имплантация мышам клеток рака простаты редко ведет к появлению метастазов, и только ортотопическая имплантация опухолевых клеток в простату позволяет получать модели спонтанного метастазирования [5]. Стоит отметить, что вероятность формирования опухолевых узлов при ортотопической трансплантации на 25% ниже, чем при подкожной. Суммируя сказанное, ортотопическое введение опухолевых клеток в простату позволяет получить модели, метастазирующие в лимфоузлы, однако такой способ введения опухолевых клеток более трудоемкий и требует специальных медицинских навыков, поскольку осуществляется в процессе открытой операции на брюшной полости. Такая особенность клеточных линий рака простаты создает трудности при анализе антиметастатического потенциала препаратов на модельных животных, поскольку не воспроизводит метастазы в лимфоузлах [6, 7].
Известны PSMA-позитивные метастатические клеточные модели РП, полученные с помощью внутрисердечной имплантации иммунодефицитным животным клеток аденокарциномы простаты. При такой трансплантации эффективно формируются метастазы в костях и других отдаленных органах [8]. По аналогии с ортотопической трансплантацией, внутрисердечная трансплантация клеток РП является трудоемкой и травматичной для экспериментальных животных.
Таким образом, существующие PSMA-позитивные клеточные модели РП человека имеют ограничения в области метастатических моделей на животных.
В то же время, последние исследования показали, что в тканях рака молочной железы человека (РМЖ), а также в клетках кровеносных сосудов, инфильтрирующих эти опухоли, встречаются клетки, экспрессирующие PSMA [9]. При этом экспрессия белка PSMA в отдаленных метастазах рака молочной железы была гораздо выше, чем в первичных опухолевых узлах. Поэтому, расширение арсенала охарактеризованных опухолевых клеточных линий, экспрессирующих белок PSMA, для разработки PSMA-направленных таргетных препаратов остается актуальной задачей.
Наиболее близкой к заявляемой клеточной линии - прототипом, является рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека LMD-MDA-MB-231-PSMA, экспрессирующая белок PSMA человека в качестве трансгена. Эта линия была сконструирована на основе линии клеток LMD-MDA-MB-231, полученных из легочного метастаза мышей линии NOD-SCID, с трансплантированными клетками аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 (№ CRM-HTB-26 в АТСС). Для экспрессии PSMA клетки LMD-MDA-MB-231 трансдуцировали лентивирусными частицами LV-PSMA, представляющими собой частицы, псевдотипированные белком вируса везикулярного стоматита VSV-G и кодирующими последовательность мРНК гена PSMA человека [10].
3
Недостатками известной линии является то, что при значительных размерах первичного опухолевого узла (200 мм), формируемого в иммунодефицитных животных, не продемонстрирована способность опухоли LMD-MDA-MB-231-PSMA к метастазированию. Кроме этого, известная рекомбинантная клеточная линия не предназначена для тестирования активности антиметастатических препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.
Задачей изобретения является расширение арсенала PSMA-положительных клеточных линий, используемых для исследования таргетных противоопухолевых препаратов и изучения особенностей карциногенеза, и обеспечение возможности эффективно оценивать антиметастатический потенциал препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.
Технический результат: получение новой рекомбинантной
клеточной линии, экспрессирующей простат-специфический мембранный антиген человека (белок PSMA человека), обладающей туморогенностью и способностью метастазировать, которая может быть использована для тестирования активности антиметастатических препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.
Указанный технический результат достигается новой рекомбинантной клеточной линией рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующей белок PSMA человека и обладающей туморогенностью и способностью метастазировать.
Рекомбинантную клеточную линию рака молочной железы человека BrCCh4e-134 получают на основе культуры клеток рака молочной железы BrCCh4e [хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 799Д] путем лентивирусной трансдукции. Рекомбинантную клеточную линию BrCCh4e-134 получали следующим образом. Для интеграции кДНК кассеты, кодирующей PSMA, клетки BrCCh4e обрабатывали соответствующими лентивирусными частицами. Сборку вирусных частиц, псевдотипированных поверхностным белком G вируса везикулярного стоматита (VSV), проводили в клетках линии HEK293T, используя стандартный протокол кальций-фосфатной трансфекции [11]. В качестве векторной плазмиды использовали рекомбинантную лентивирусную плазмиду pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo, кодирующую полноразмерный белок человека PSMA, с использованием вспомогательных плазмид pMD2.G и psPAX2 [12].
Сконструированная рекомбинантная лентивирусная плазмида pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo имеет следующие характеристики:
- имеет размер 9671 п. о.;
- кодирует человеческий белок PSMA;
- состоит из следующих элементов:
а) фрагмента ДНК размером 2253 п. о., кодирующего человеческий белок PSMA;
б) гибридного конститутивного промотора человеческого фактора элонгации трансляции альфа (EF1a) и Т-лимфотропного вируса человека (HTLV), обеспечивающего конститутивную и сильную экспрессию целевого белка PSMA в клетках млекопитающих;
в) генетических маркеров:
AMPr - ген ампициллин-резистентности (bla), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli;
zeo - селективный ген устойчивости к зеоцину (ген ble Streptoalloteichus hindustanus);
г) гибридного RSV-5'LTR промотора, состоящего из последовательностей вируса саркомы Раусса (RSV) и ВИЧ-1, обеспечивающего ТАТ-независимый синтез вирусных транскриптов в клетках-паковщицах лентивирусных частиц;
д) модифицированных генетических элементов ВИЧ-1 (сРРТ, gag, env, RRE), необходимых для корректного процессинга вирусной РНК и сборки лентивирусных частиц;
е) 5'LTR и 3'dLTR-последовательностей ВИЧ-1, обеспечивающих стабильную интеграцию заключенных между ними последовательностей в геном клеток млекопитающих без возможности их дальнейшей повторной мобилизации;
ж) последовательности WPRE - регуляторного элемента вируса гепатита сурков, обеспечивающего увеличение стабильности и трансляции транскриптов;
з) элемента IRES - внутреннего сайта посадки рибосомы кардиовируса А, обеспечивающего кэп-независимую инициацию трансляции сцепленного маркеа zeo.
Графическая карта рекомбинантной лентивирусной плазмиды pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo представлена на Фиг. 1, а ее нуклеотидная последовательность представлена на Фиг. 2.
Трансдукцию проводили методом спинокуляции [13] с различными MOI (multiplicity of infection, множественность инфекции) в присутствии 8 мкг/мл полибрена (Sigma, США). Через 48 часов после трансдукции клетки подвергали селекции на среде с добавлением зеоцина (400 мкг/мл) в течение 7 дней. Клетки BrCCh4e-134 окрашивали антителами к PSMA (ThermoFisher, США), конъюгированными с фикоэритрином (РЕ). Далее, для получения гомогенной PSMA-эксперессирующей линии, клетки клонировали на сортере Sony SH800 (Sony, Япония).
Полученная клеточная линия BrCCh4e-134 обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.
Морфологические признаки PSMA-экспрессирующей клеточной линии рака молочной железы человека BrCCh4e-134 характеризуются следующим образом.
Культура представлена клетками округлой формы, иногда с двумя-тремя длинными отростками. Более 80% клеток окрашиваются антителами против Ki-67.
Маркерные признаки клеточной линии BrCCh4e-134 следующие:
Поверхностная экспрессия белка PSMA человека.
Культуральные свойства клеточной линии BrCCh4e-134 характеризуются следующим образом.
2
Клеточная линия BrCCh4e-134 культивируется в питательной среде IMDM (GIBCO, США) в присутствии 10% эмбриональной сыворотки телят (FBS) (SigmaAldrich, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (GIBCO, США) в атмосфере 5% СО при 37°С. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. При субкультивировании клетки пересаживают каждые 2-3 дня, кратность рассева - 1:3-1:4 при использовании раствора TripLE (Gibco BRL Co., Invitrogen)
Условия криоконсервации следующие.
6
2
Среда IMDM, 50%, FBS, 40%, DMSO, 10%. Стандартный режим замораживания, хранение в жидком азоте, 2×10 клеток/ампулу. Размораживание быстрое, при 37°С. 1 мл клеточной суспензии разводят в 10 мл среды DMEM, осаждают центрифугированием, 800 об/мин, клетки ресуспендируют в 4 мл IMDM с 20% FBS во флакон с площадью поверхности 25 см. Жизнеспособность после криоконсервации ≥ 70% (окраска трипановым синим).
Анализ контаминации.
При длительном культивировании бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Анализ уреаплазмы и микоплазмы выполнен методом ОТ ПЦР в режиме реального времени с использованием пары праймеров: 5'GGCGAATGGGTAAGTAACACG3' и 5'CGATAACGCTTGCGACCTAT3', позволяющих выявлять Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma salivarium и Ureaplasma urealyticum. Тест на микоплазму и уреаплазму отрицательный.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение рекомбинантной клеточной линии BrCCh4e-134.
2
Клеточную линию BrCCh4e-134 получали на основе клеточной линии BrCCh4e (per. номер РККК(II) 799Д) путем ее трансдукции (заражения) лентивирусными частицами. Для получения лентивирусных частиц, ДНК рекомбинантной лентивирусной плазмиды pCDH-EF1a-PSMA-IRES-zeo смешивали с ДНК вспомогательных плазмид pMD2.G и psPAX2, необходимых для упаковки лентивирусных частиц, в молярном соотношении 4:1:3 и трансформировали клетки эмбрионального почечного эпителия человека HEK293T методом кальций-фосфатной трансфекции, после чего выращивали 6 ч в среде IMDM с добавлением фетальной сыворотки коров до 10%, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина в атмосфере 5% СО при 37°С. Через 6 часов после трансфекции среду в чашках заменяли на новую и инкубировали клетки 48 часов. Затем супернатанты кондиционированной среды фильтровали через 0.45 мкм PES-фильтры и использовали для заражения клеточной линии BrCCh4e методом спинокуляции в присутствии полибрена (8 мкг/ мл). Через 48 часов после заражения проводили селекцию трансдуктантов на среде с добавлением зеоцина (400 мкг/мл) в течение 7 дней. Наконец, клетки BrCCh4e-134 окрашивали антителами к PSMA (ThermoFisher, США), конъюгированными с фикоэритрином (РЕ) и для получения гомогенной PSMA-экспрессирующей линии клетки клонировали на сортере Sony SH800 (Sony, Япония).
Пример 2. Использование клеточной линии BrCCh4e-134 как модельной системы для оценки цитотоксического потенциала таргетного клеточного препарата Cyto-CAR-YT-Lact.
4
5
Анализ цитотоксической активности клеток CAR-NK клеточной линии YT - Cyto-CAR-YT-Lact, - проводили в режиме реального времени на приборе iCELLigence RTCA (ACEA Bioscience). Клетки Cyto-CAR-YT-Lact представляют собой генно-инженерно модифицированные "усиленные" NK-клетки линии YT, экспрессирующие CAR к PSMA, проапоптотический белок лактаптин для усиления неспецифической цитотоксической активности и имеют нокаут гена shp-2 для ослабления ингибирующего сигналинга. В качестве PSMA-негативного контроля использовали PSMA-негативную родительскую линию BrCCh4e. Клетки BrCCH4e и BrCCh4e-134 в количестве 3×10 высевали в 500 мкл полной среды IMDM в лунки 8-ми луночных планшетов (ACEA Bioscience, Корея) с интегрированными микроэлектронными сенсорами, позволяющими регистрировать изменение сопротивления электрического тока. Величина сопротивления зависит от размера и количества прикрепленных клеток и позволяет рассчитать относительное число жизнеспособных клеток (клеточный индекс, CI). Через 24 ч среду заменяли на порцию свежей среды, содержащей 1×10 клеток-эффекторов и инкубировали не менее 48 ч.
На Фиг. 3 и 4 представлены кривые жизнеспособности клеток BrCCh4e (Фиг. 3) и BrCCh4e-134 (Фиг. 4), обработанных эффекторными клетками. Анализ цитотоксической активности в режиме реального времени показал, что эффекторные клетки Cyto-CAR-YT-Lact (Cyto-CAR на Фиг. 3 и 4) высокоэффективно (практически на 100%) индуцируют гибель клеток-мишеней BrCCh4e-134 (Фиг. 4) и менее эффективностью гибель клеток без PSMA-антигена - клеток BrCCh4e (Фиг. 3). Клетки BrCCh4e-134 были резистентны к NK клеткам линии YT дикого типа (Фиг. 4). Таким образом, опухолевые клетки BrCCh4e-134 являются чувствительной моделью для исследования цитотоксической активности таргетных препаратов, нацеленных на PSMA- положительные опухоли человека.
Пример 3. Использование клеточной линии BrCCh4e-134 для оценки антиметастатического потенциала клеточного препарата Cyto-CAR-YT-Lact.
Для оценки антиметастатической активности клеток Cyto-CAR-YT-Lact использовали обе модели метастазирования опухолевых клеток BrCCh4e-134 - трансплантацией опухолевых клеток в венозный кровоток или в режиме спонтанного метастазирования солидных опухолей, сформированных трансплантированными опухолевыми клетками. Модель спонтанного метастазирования позволяет также оценивать и противоопухолевое действие исследуемого препарата.
4
6
Эксперименты на мышах проводили согласно рекомендациям по использованию лабораторных животных (ЕСС Directive 86/609/ЕЕС). Для моделирования метастазирования самкам мышей SCID (SHO-PRKDC SCID HR/HR1EW 43375) в хвостовую латеральную вену вводили суспензию опухолевых клеток BrCCH4e-134 (2×10 кл/мл) в объеме 300 мкл. Мышей с трансплантированными внутривенно опухолевыми клетками сразу делили на экспериментальные группы. Через 24 дня животным внутривенно вводили эффекторные клетки Cyto-CAR-YT-Lact (6×10 кл/мл) в объеме 500 мкл и физиологический раствор животным контрольной группы. При вскрытии животных через 14 дней после введения Cyto-CAR-YT-Lact клеток было обнаружено, что у 100% животных контрольной группы присутствовали метастазы, преимущественно в лимфоузлах средостения, а также печени и почках. В группе животных, получавших лечение препаратом клеток Cyto-CAR-YT-Lact, метастазов обнаружено не было (Табл. 1).
7
3
6
Для моделирования спонтанного метастазирования самкам мышей NOD/SCID (NOD. SCID CB17Prkdcscid/NcrCr1) подкожно вводили суспензию клеток BrCCH4e-134 (4×10 кл/мл) в смеси PBS:Matrigel™ (BD Bioscience, (2:1) в объеме 100 мкл. Размеры опухолей дважды в неделю измеряли штангенциркулем и по достижении в среднем размера 0.03 см животных рандомизированно разделяли на группы и вводили внутривенно эффекторные клетки (6×10 кл/мл) в объеме 500 мкл или 500 мкл раствора PBS животным контрольной группы. По окончании эксперимента животные подвергались эвтаназии, проводился полный патоморфологический осмотр внутренних органов, выявленные метастатические узлы измеряли, извлекали и фиксировали для последующего гистологического анализа. При вскрытии животных у 4х из 8 ми животных контрольной группы были обнаружены крупные метастазы в лимфоузлах средостения и небольшие очаги в печени, тогда как у животных, получавших лечение Cyto-CAR-YT-Lact клетками метастазов обнаружено не было (Табл. 1).
Таким образом показано, что введение клеточного препарата Cyto-CAR-YT-Lact оказывает стойкий антиметастатический эффект как в модели внутривенной трансплантации опухолевых клеток, так и в модели спонтанного метастазирования клеток BrCCh4e-134. Следовательно, клетки линии BrCCh4e-134 могут быть использованы для формирования модели метастазирования на мышах и оценки антиметастатической активности PSMA-нацеленных препаратов.
Использование предлагаемой клеточной линии BrCCh4e-134 позволит более эффективно оценивать антиметастатический потенциал препаратов, направленных на PSMA-положительные опухоли.
Источники информации.
1. Damber J.-E., Aus G. Prostate cancer // The Lancet. - 2008. - V. 371. - №9625. - P. 1710-1721.
2. Mannweiler S., Amersdorfer P., Trajanoski S., et al. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis // Pathol. Oncol. Res. - 2009. - V. 15. - №2. - P. 167-172.
3. Sobel R.E., Sadar M.D. Cell lines used in prostate cancer research: A Compendium of old and new lines -Part 1 // Journal of Urology. - 2005. - V. 173. - №2. - P. 342-359.
4. Gade T.P.F., Hassen W., Santos E., et al. Targeted elimination of prostate cancer by genetically directed human T lymphocytes // Cancer Res. - 2005. - V. 65. - №19. - P. 9080-9088.
5. Bastide C, Bagnis C, Mannoni P., et al. A Nod Scid mouse model to study human prostate cancer // Prostate Cancer Prostatic Dis. - 2002. - V. 5. - №4. - P. 311-315.
6. Bubendorf L., Schopfer A., Wagner U., et al. Metastatic patterns of prostate cancer: An autopsy study of 1,589 patients // Human Pathology. - 2000. - V. 31. - №5. - P. 578-583.
7. Ren D., Yang Q., Dai Y., et al. Oncogenic miR-210-3р promotes prostate cancer cell EMT and bone metastasis via NF-κВ signaling pathway // Mol. Cancer. - 2017. - V. 16. - №1. - P. 117.
8. Padalecki S.S., Weldon K.S., Reveles X.T., el al. Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases // Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. - 2003. - V. 21. - №5. - P. 366-373.
9. Kasoha M., Unger C, Solomayer E.-F., et al. Prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in breast cancer and its metastases // Clin. Exp. Metastasis. - 2017. - V. 34. - №8. - P. 479-490.
10. Neuman B.P., Eifler J.B., Castanares M., et al. Real-time, near-infrared fluorescence imaging with an optimized dye/light source/camera combination for surgical guidance of prostate cancer // Clinical Cancer Research. - 2015. - V. 21. - №4. - P. 771-780.
11. Kingston R.E., Chen C.A., Rose J.K. Calcium phosphate transfection // Current Protocols in Molecular Biology. - 2003. - V. 63. - №1. - P. 9.1.1-9.1.11.
12. Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol. 1997; 15:871-5.
13. O'Doherty U., Swiggard W.J., Malim M.H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding // Journal of Virology. - 2000. - V. 74. - №21. - P. 10074-10080.
--->
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)
<120> Рекомбинантная клеточная линия рака молочной железы человека BrCCh4e-134, экспрессирующая простат-специфический мембранный антиген человека
<160> 1
<210> 1
<211>9671
<212> DNA
<400> 1
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca        60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta       120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga       180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct       240
ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa       300
gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc       360
tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc       420
ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg       480
cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt       540
ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg       600
agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa       660
ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg       720
ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca       780
ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa       840
aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa       900
agtaagacca ccgcacagca agcggccact gatcttcaga cctggaggag gagatatgag       960
ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt      1020
agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg      1080
agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac      1140
gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct      1200
gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct      1260
ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg      1320
gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa      1380
taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa      1440
caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa      1500
tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac      1560
aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag      1620
aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc      1680
gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga      1740
aggtggagag agagacagag acagatccat tcgatcggtt aacttttaaa agaaaagggg      1800
ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa      1860
ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt atcgatacta gtggatctgc      1920
gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg      1980
gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa      2040
agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt      2100
gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acagctgaag      2160
cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg ccgccatcca      2220
cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac tgcgtccgcc      2280
gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct cccttggagc      2340
ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca actctacgtc      2400
tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc gcctactcta      2460
gagctagcga attcgaattt aaatcggatc tgccaccatg tggaatctcc ttcacgaaac      2520
cgactcggct gtggccaccg cgcgccgccc gcgctggctg tgcgctgggg cgctggtgct      2580
ggcgggtggc ttctttctcc tcggcttcct cttcgggtgg tttataaaat cctccaatga      2640
agctactaac attactccaa agcataatat gaaagcattt ttggatgaat tgaaagctga      2700
gaacatcaag aagttcttat ataattttac acagatacca catttagcag gaacagaaca      2760
aaactttcag cttgcaaagc aaattcaatc ccagtggaaa gaatttggcc tggattctgt      2820
tgagctagca cattatgatg tcctgttgtc ctacccaaat aagactcatc ccaactacat      2880
ctcaataatt aatgaagatg gaaatgagat tttcaacaca tcattatttg aaccacctcc      2940
tccaggatat gaaaatgttt cggatattgt accacctttc agtgctttct ctcctcaagg      3000
aatgccagag ggcgatctag tgtatgttaa ctatgcacga actgaagact tctttaaatt      3060
ggaacgggac atgaaaatca attgctctgg gaaaattgta attgccagat atgggaaagt      3120
tttcagagga aataaggtta aaaatgccca gctggcaggg gccaaaggag tcattctcta      3180
ctccgaccct gctgactact ttgctcctgg ggtgaagtcc tatccagatg gttggaatct      3240
tcctggaggt ggtgtccagc gtggaaatat cctaaatctg aatggtgcag gagaccctct      3300
cacaccaggt tacccagcaa atgaatatgc ttataggcgt ggaattgcag aggctgttgg      3360
tcttccaagt attcctgttc atccaattgg atactatgat gcacagaagc tcctagaaaa      3420
aatgggtggc tcagcaccac cagatagcag ctggagagga agtctcaaag tgccctacaa      3480
tgttggacct ggctttactg gaaacttttc tacacaaaaa gtcaagatgc acatccactc      3540
taccaatgaa gtgacaagaa tttacaatgt gataggtact ctcagaggag cagtggaacc      3600
agacagatat gtcattctgg gaggtcaccg ggactcatgg gtgtttggtg gtattgaccc      3660
tcagagtgga gcagctgttg ttcatgaaat tgtgaggagc tttggaacac tgaaaaagga      3720
agggtggaga cctagaagaa caattttgtt tgcaagctgg gatgcagaag aatttggtct      3780
tcttggttct actgagtggg cagaggagaa ttcaagactc cttcaagagc gtggcgtggc      3840
ttatattaat gctgactcat ctatagaagg aaactacact ctgagagttg attgtacacc      3900
gctgatgtac agcttggtac acaacctaac aaaagagctg aaaagccctg atgaaggctt      3960
tgaaggcaaa tctctttatg aaagttggac taaaaaaagt ccttccccag agttcagtgg      4020
catgcccagg ataagcaaat tgggatctgg aaatgatttt gaggtgttct tccaacgact      4080
tggaattgct tcaggcagag cacggtatac taaaaattgg gaaacaaaca aattcagcgg      4140
ctatccactg tatcacagtg tctatgaaac atatgagttg gtggaaaagt tttatgatcc      4200
aatgtttaaa tatcacctca ctgtggccca ggttcgagga gggatggtgt ttgagctagc      4260
caattccata gtgctccctt ttgattgtcg agattatgct gtagttttaa gaaagtatgc      4320
tgacaaaatc tacagtattt ctatgaaaca tccacaggaa atgaagacat acagtgtatc      4380
atttgattca cttttttctg cagtaaagaa ttttacagaa attgcttcca agttcagtga      4440
gagactccag gactttgaca aaagcaaccc aatagtatta agaatgatga atgatcaact      4500
catgtttctg gaaagagcat ttattgatcc attagggtta ccagacaggc ctttttatag      4560
gcatgtcatc tatgctccaa gcagccacaa caagtatgca ggggagtcat tcccaggaat      4620
ttatgatgct ctgtttgata ttgaaagcaa agtggaccct tccaaggcct ggggagaagt      4680
gaagagacag atttatgttg cagccttcac agtgcaggca gctgcagaga ctttgagtga      4740
agtagcctag atccgcggcc gcgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga      4800
agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg      4860
tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg      4920
ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt      4980
cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac      5040
cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca      5100
aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg      5160
ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg      5220
ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa      5280
cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat      5340
ggccacaacc atggcgtccg gagccaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct      5400
caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg      5460
ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag      5520
cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct      5580
ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg      5640
gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc      5700
ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgagtcgaca atcaacctct      5760
ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct      5820
atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat      5880
tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt      5940
caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat      6000
tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc      6060
ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga      6120
caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc      6180
cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga      6240
ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc      6300
tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct ggtaccttta agaccaatga      6360
cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc      6420
taattcactc ccaacgaaga taagatctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag      6480
accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat      6540
aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact      6600
agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc      6660
atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact      6720
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata      6780
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc      6840
atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag      6900
ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc      6960
cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt      7020
ttgcagagac caaattcgta atcatgtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc      7080
tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat      7140
gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc      7200
tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg      7260
ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag      7320
cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag      7380
gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc      7440
tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc      7500
agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc      7560
tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt      7620
cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg      7680
ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat      7740
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag      7800
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt      7860
ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc      7920
cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta      7980
gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag      8040
atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga      8100
ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa      8160
gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa      8220
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc      8280
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga      8340
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa      8400
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt      8460
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg      8520
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc      8580
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg      8640
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag      8700
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt      8760
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt      8820
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac      8880
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac      8940
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag      9000
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa      9060
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga      9120
gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc      9180
cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa      9240
ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct      9300
gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac      9360
aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg      9420
catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg      9480
taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag      9540
ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa      9600
ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca      9660
gtgccaagct g                                                           9671
<---