МУЛЬТИПЛЕКСНОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ определения наличия или отсутствия первой и второй мишеней в образце, включающий:
(а) получение реакционной смеси путем приведения образца или его производного, предположительно содержащего первую и/или вторую мишени или их ампликоны, в контакт с:
первым и вторым замкнутыми олигонуклеотидами типа "стебель-петля", причем каждый из замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" содержит двуцепочечный стеблевой фрагмент, образованный гибридизированными нуклеотидами и соединенный с замкнутым одноцепочечным петлевым фрагментом, образованным негибридизованными нуклеотидами, причем:
количество гибридизованных нуклеотидов и/или последовательность гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" различаются, и
ферменты, способные расщеплять или разрушать одноцепочечные петлевые фрагменты первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" только при их контакте с мишенью или ее ампликоном;
(b) обработку реакционной смеси:
- в условиях, подходящих для того, чтобы ферменты индуцировали расщепление или разрушение петлевого фрагмента первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля", тем самым образуя первый и второй раскрытые олигонуклеотиды типа "стебель-петля";
- при первой температуре, при которой или выше которой цепи двуцепочечного стеблевого фрагмента первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" диссоциируют, тем самым облегчая пространственное разделение молекул флуорофора и гасителя стеблевого фрагмента первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" и обеспечивая получение первого обнаружимого сигнала, и
- при второй температуре, при которой или выше которой цепи двуцепочечного стеблевого фрагмента второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" диссоциируют, тем самым облегчая пространственное разделение молекул флуорофора и гасителя стеблевого фрагмента второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" и обеспечивая получение второго обнаружимого флуоресцентного сигнала;
причем:
первая температура ниже, чем вторая температура, и
флуорофор первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" и флуорофор второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" излучают в одной и той же цветовой области видимого спектра; и
(с) обнаружение уровней указанных первого и второго флуоресцентных сигналов при одной или более температурах, включая температуру, равную второй температуре или превышающую ее, что позволяет определять наличие или отсутствие указанных мишеней в образце.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ферменты включают многокомпонентные нуклеозимы (МНКзимы), и указанная обработка реакционной смеси включает обработку реакционной смеси в условиях, подходящих для:
связывания первого многокомпонентного нуклеозима (МНКзима) с первой мишенью или его ампликоном и гибридизации субстратных цепей указанного первого МНКзима с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", что облегчает указанное расщепление петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" первым МНКзимом с образованием первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что первая мишень представляет собой нуклеотидную последовательность или ее ампликон, способный гибридизоваться с сенсорными цепями первого МНКзима, тем самым облегчая сборку первого МНКзима.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что:
- первая мишень представляет собой анализируемое вещество, белок, соединение или молекулу;
- ферменты включают ферменты с аптамером, способным связываться с первой мишенью; и
- связывание первой мишени с аптамером способно сделать ферменты с аптамером каталитически активными.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ферменты с аптамером включают любой один или более из следующих классов соединений: апта-ДНКзимы, апта-рибозимы, апта-МНКзимы.
6. Способ по любому из пп. 2, 4 или 5, отличающийся тем, что:
- первая мишень представляет собой анализируемое вещество, белок, соединение или молекулу;
- реакционная смесь дополнительно содержит олигонуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с сенсорными цепями первого МНКзима, тем самым облегчая сборку первого МНКзима;
- первый МНКзим содержит последовательность аптамера, способную связываться с первой мишенью; и
- связывание мишени с аптамером способно сделать первый МНКзим каталитически активным.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанные замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля" не гибридизуются с указанной мишенью или ее ампликоном во время указанного расщепления или разрушения ферментами.
8. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что ферменты включают эндонуклеазы рестрикции, а указанная обработка реакционной смеси включает:
обработку реакционной смеси в условиях, подходящих для гибридизации первой мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием двуцепочечной последовательности для связывания первой эндонуклеазы рестрикции, что облегчает указанное расщепление петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что эндонуклеаза рестрикции представляет собой никующую эндонуклеазу, способную связываться с цепью петли указанной двуцепочечной последовательности для первой эндонуклеазы рестрикции и расщеплять ее.
10. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что ферменты обладают экзонуклеазной активностью (например, ферменты-полимеразы, экзонуклеазы), и указанная обработка реакционной смеси включает:
обработку реакционной смеси в условиях, подходящих для:
- гибридизации первой мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием первой двуцепочечной последовательности, содержащей первую мишень или ее ампликон,
- гибридизации первого праймера-олигонуклеотида с первой мишенью или ее ампликоном с образованием второй двуцепочечной последовательности, расположенной выше (в направлении к 5') относительно первой двуцепочечной последовательности, содержащей первую мишень или ее ампликон
- ассоциации первого фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" на конце первого праймера-олигонуклеотида или рядом с ним, и
- каталитической активности первого фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, что облегчает разрушение петлевого фрагмента первой двуцепочечной последовательности, содержащей первую мишень или ампликон, и образование первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
11. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что ферменты обладают экзонуклеазной активностью, а указанная обработка реакционной смеси включает:
обработку реакционной смеси в условиях, подходящих для:
- гибридизации первой мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием первой двуцепочечной последовательности, содержащей первую мишень или ее ампликон,
- ассоциации первого фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, с первой двуцепочечной последовательностью, содержащей первую мишень или ее ампликон, и
- каталитической активности первого фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, что облегчает разрушение петлевого фрагмента первой двуцепочечной последовательности, содержащей первую мишень или ампликон, и образование первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что ферменты включают ДНКзимы и/или рибозимы, требующие первого кофактора для проявления каталитической активности, и указанная обработка реакционной смеси включает обработку реакционной смеси в условиях, подходящих для:
- связывания указанного первого кофактора с ДНКзимом и/или связывания указанного первого кофактора с рибозимом, придающего каталитическую активность ДНКзиму и/или рибозиму,
- гибридизации ДНКзима и/или рибозима с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля",
- каталитической активности ДНКзима и/или рибозима для облегчения расщепления петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа «стебель-петля» и образования первого раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля",
причем:
первая мишень представляет собой первый кофактор.
2+
2+
2+
2+
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что первый кофактор представляет собой ион металла (например, Mg, Mn, Са, Pb).
14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что указанная обработка дополнительно включает обработку реакционной смеси в условиях, подходящих для любого одного или более из следующих процессов:
- связывания второго МНКзима со второй мишенью или его ампликоном и гибридизации субстратных цепей указанного второго МНКзима с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", что облегчает указанное расщепление петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" вторым МНКзимом с образованием второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля";
- гибридизации второй мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием двуцепочечной последовательности для связывания второй эндонуклеазы рестрикции с целью ассоциации со второй двуцепочечной последовательностью, что облегчает указанное расщепление петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
- гибридизации второй мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием второй двуцепочечной последовательности, содержащей вторую мишень или ее ампликон,
гибридизации второго праймера-олигонуклеотида со второй мишенью или ее ампликоном с образованием второй двуцепочечной последовательности, расположенной выше (в направлении к 5') относительно второй двуцепочечной последовательности, содержащей вторую мишень или ее ампликон,
ассоциации второго фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" на конце второго праймера-олигонуклеотида или рядом с ним, и
каталитической активности второго фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, что облегчает разрушение петлевого фрагмента второй двуцепочечной последовательности, содержащей вторую мишень или ампликон, и образование второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля";
- гибридизации второй мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием второй двуцепочечной последовательности, содержащей вторую мишень или ее ампликон,
ассоциации второго фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, со второй двуцепочечной последовательностью, содержащей вторую мишень или ее ампликон, и
каталитической активности второго фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, что облегчает разрушение петлевого фрагмента второй двуцепочечной последовательности, содержащей вторую мишень или ампликон, и образование второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля";
- связывания второго кофактора с ДНКзимом и/или связывания второго кофактора с рибозимом, придающего каталитическую активность ДНКзиму и/или рибозиму,
гибридизации ДНКзима и/или рибозима с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля",
каталитической активности ДНКзима и/или рибозима для облегчения расщепления петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа «стебель-петля» и образования второго раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
причем:
вторая мишень представляет собой второй кофактор.
2+
2+
2+
2+
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что второй кофактор представляет собой ион металла (например, Mg, Mn, Са, Pb).
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что вторая эндонуклеаза рестрикции представляет собой никующую эндонуклеазу, способную ассоциировать с цепью петли указанной двуцепочечной последовательности, содержащей вторую мишень или ее ампликон, и расщеплять ее.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первая и вторая эндонуклеазы рестрикции представляют собой эндонуклеазы рестрикции разного типа.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первая и вторая эндонуклеазы рестрикции представляют собой эндонуклеазы рестрикции одного и того же типа.
19. Способ по п. 14, отличающийся тем, что вторая мишень представляет собой нуклеотидную последовательность или ее ампликон, способную гибридизоваться с сенсорными цепями второго МНКзима, тем самым облегчая сборку второго МНКзима.
20. Способ по п. 14, отличающийся тем, что:
- вторая мишень представляет собой анализируемое вещество, белок, соединение или молекулу;
- ферменты включают ферменты с аптамером, способным связываться со второй мишенью; и
- связывание второй мишени с аптамером способно сделать ферменты с аптамером каталитически активными.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что ферменты с аптамером включают любой один или более из следующих классов соединений: апта-ДНКзимы, апта-рибозимы, апта-МНКзимы.
22. Способ по пп. 14, 20 или 21, отличающийся тем, что:
- вторая мишень представляет собой анализируемое вещество, белок, соединение или молекулу;
- реакционная смесь дополнительно содержит олигонуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с сенсорными цепями второго МНКзима, тем самым облегчая сборку второго МНКзима;
- второй МНКзим содержит последовательность аптамера, способную связываться со второй мишенью; и
- связывание второй мишени с аптамерной последовательностью второго МНКзима способно сделать второй МНКзим каталитически активным, облегчая удаление ингибирующей молекулы, связанной с аптамером второго МНКзима.
23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что флуорофор первого замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа "стебель-петля" является таким же, как флуорофор второго замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа "стебель-петля".
24. Способ по любому из пп. 14-23, отличающийся тем, что:
- реакционная смесь содержит указанные первый и второй МНКзимы; и
- последовательность петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", способного гибридизоваться с субстратными цепями первого МНКзима, отличается от последовательности петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", способного гибридизоваться с субстратными цепями второго МНКзима.
25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что флуорофор первого замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа «стебель-петля» и флуорофор второго замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа «стебель-петля» обнаруживают на одном канале флуоресцентного излучения устройства.
26. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что указанные ферменты не индуцируют расщепление или разрушение любой указанной мишени или ее ампликона.
27. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что каждый из первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" состоит из указанного двуцепочечного стеблевого фрагмента и указанного одноцепочечного петлевого фрагмента.
28. Способ по любому из пп. 1-27, дополнительно включающий определение наличия или отсутствия третьей мишени или ее ампликона в образце путем:
(d) приведения реакционной смеси, содержащей образец или его производное, в контакт с:
третьим замкнутым олигонуклеотидом типа "стебель-петля", причем указанный третий замкнутый олигонуклеотид типа "стебель-петля" содержит двуцепочечный стеблевой фрагмент гибридизированных нуклеотидов, соединенный с петлевым фрагментом замкнутого одноцепочечного олигонуклеотида, состоящего из негибридизованных нуклеотидов, причем:
количество гибрид изо ванных нуклеотидов и/или последовательность гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" отличается от количества и последовательности гибридизованных нуклеотидов в стеблевых фрагментах первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля";
двуцепочечный стеблевой фрагмент содержит молекулу флуорофора, соединенную с одной цепью, и молекулу гасителя, соединенную с противоположной цепью; и
ферменты, способные расщеплять или разрушать одноцепочечный петлевой фрагмент третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", только когда он находится в контакте с мишенью или ее ампликоном;
(e) обработку реакционной смеси:
- в условиях, подходящих для индукции расщепления или разрушения петлевого фрагмента третьего замкнутого олигонуклеотида типа «стебель-петля» ферментами, что позволяет получить третий раскрытый олигонуклеотид типа "стебель-петля";
- при третьей температуре, при которой или выше которой цепи двуцепочечного стеблевого фрагмента третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" диссоциируют, тем самым облегчая пространственное разделение молекул флуорофора и гасителя стеблевого фрагмента третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" и обеспечивая получение третьего обнаружимого флуоресцентного сигнала;
причем:
третья температура выше, чем первая и вторая температуры, и
(f) обнаружение уровней указанных первого, второго и третьего флуоресцентных сигналов при одной или более температурах, включая температуру, равную третьей температуре или превышающую ее, что позволяет определять наличие или отсутствие указанных мишеней в образце.
29. Способ по любому из пп. 1-27, дополнительно включающий определение наличия или отсутствия третьей мишени или ее ампликона в образце путем:
(d) приведения реакционной смеси, содержащей образец или его производное, в контакт с:
третьим замкнутым олигонуклеотидом типа "стебель-петля", причем указанный третий замкнутый олигонуклеотид типа "стебель-петля" содержит двуцепочечный стеблевой фрагмент гибридизированных нуклеотидов, соединенный с петлевым фрагментом замкнутого одноцепочечного олигонуклеотида, состоящего из негибридизованных нуклеотидов, причем:
количество гибридизованных нуклеотидов и/или последовательность гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" совпадает с количеством и последовательностью гибридизованных нуклеотидов в стеблевых фрагментах первого или второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля";
двуцепочечный стеблевой фрагмент содержит молекулу флуорофора, соединенную с одной цепью, и молекулу гасителя, соединенную с противоположной цепью, причем молекула флуорофора, соединенная с третьим раскрытым олигонуклеотид ом типа "стебель-петля", излучает в другой области видимого спектра по сравнению с флуорофором первого и/или второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля"; и
ферменты, способные расщеплять или разрушать одноцепочечный петлевой фрагмент третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", только когда он находится в контакте с мишенью или ее ампликоном;
(e) обработку реакционной смеси:
- в условиях, подходящих для индукции расщепления или разрушения петлевого фрагмента третьего замкнутого олигонуклеотида типа «стебель-петля» ферментами, что позволяет получить третий раскрытый олигонуклеотид типа "стебель-петля";
- при третьей температуре, при которой цепи двуцепочечного стеблевого фрагмента третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" диссоциируют, тем самым облегчая пространственное разделение молекул флуорофора и гасителя стеблевого фрагмента третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля" и обеспечивая получение третьего обнаружимого флуоресцентного сигнала;
(f) обнаружение уровней указанных первого, второго и третьего флуоресцентных сигналов при одной или более температурах, включая температуру, равную третьей температуре или превышающую ее, что позволяет определять наличие или отсутствие указанных мишеней в образце.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что третья температура отличается от первой и/или второй температур.
31. Способ по любому из пп. 28-30, отличающийся тем, что указанный способ включает обработку реакционной смеси в условиях, подходящих для любого одного или более из следующих процессов:
- связывания третьего МНКзима со третьей мишенью или его ампликоном и гибридизации субстратных цепей указанного третьего МНКзима с петлевым фрагментом третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", что облегчает указанное расщепление петлевого фрагмента третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" третьим МНКзимом с образованием третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля";
- гибридизации третьей мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием двуцепочечной последовательности для связывания третьей эндонуклеазы рестрикции с целью ассоциации со второй двуцепочечной последовательностью, что облегчает указанное расщепление петлевого фрагмента третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля";
- гибридизации третьей мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием третьей двуцепочечной последовательности, содержащей третью мишень или ее ампликон,
гибридизации третьего праймера-олигонуклеотида с третьей мишенью или ее ампликоном с образованием третьей двуцепочечной последовательности, расположенной выше (в направлении 5') относительно третьей двуцепочечной последовательности, содержащей третью мишень или ее ампликон, ассоциации третьего фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, с петлевым фрагментом третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" на конце третьего праймера-олигонуклеотида или рядом с ним, и
каталитической активности третьего фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, что облегчает разрушение петлевого фрагмента третьей двуцепочечной последовательности, содержащей третью мишень или ампликон, и образование третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля";
- гибридизации третьей мишени или ее ампликона с петлевым фрагментом третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" с образованием третьей двуцепочечной последовательности, содержащей третью мишень или ее ампликон,
ассоциации третьего фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, с третьей двуцепочечной последовательностью, содержащей третью мишень или ее ампликон, и
каталитической активности третьего фермента, обладающего экзонуклеазной активностью, что облегчает разрушение петлевого фрагмента третьей двуцепочечной последовательности, содержащей третью мишень или ампликон, и образование третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля";
- связывания третьего кофактора с ДНКзимом и/или связывания третьего кофактора с рибозимом, что придает каталитическую активность ДНКзиму и/или рибозиму,
гибридизации ДНКзима и/или рибозима с петлевым фрагментом третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля",
каталитической активности ДНКзима и/или рибозима для облегчения расщепления петлевого фрагмента третьего замкнутого олигонуклеотида типа «стебель-петля» и образования третьего раскрытого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
причем:
третья мишень представляет собой третий кофактор.
2+
2+
2+
2+
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что кофактор представляет собой ион металла (например, Mg, Mn, Са, Pb).
33. Способ по п. 31, отличающийся тем, что третья эндонуклеаза рестрикции представляет собой никующую эндонуклеазу, способную ассоциировать с цепью петли указанной двуцепочечной последовательности, содержащей третью мишень или ее ампликон, и расщеплять ее.
34. Способ по п. 31, отличающийся тем, что третья мишень представляет собой нуклеотидную последовательность или ее ампликон, способную гибридизоваться с сенсорными цепями третьего МНКзима, тем самым облегчая сборку третьего МНКзима.
35. Способ по п. 31, отличающийся тем, что:
- мишень представляет собой анализируемое вещество, белок, соединение или молекулу;
- ферменты включают ферменты с аптамером, способным связываться с третьей мишенью; и
- связывание третьей мишени с аптамером способно сделать ферменты с аптамером каталитически активными.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что ферменты с аптамером включают любой один или более из следующих классов соединений: апта-ДНКзимы, апта-рибозимы, апта-МНКзимы.
37. Способ по п. 31, отличающийся тем, что:
- третья мишень представляет собой анализируемое вещество, белок, соединение или молекулу;
- реакционная смесь дополнительно содержит олигонуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться с сенсорными цепями третьего МНКзима, тем самым облегчая сборку третьего МНКзима;
- третий МНКзим содержит последовательность аптамера, способную связываться с третьей мишенью; и
- связывание третьей мишени с последовательностью аптамера третьего МНКзима способно сделать третий МНКзим каталитически активным, облегчая удаление ингибирующей молекулы, связанной с аптамером третьего МНКзима.
38. Способ по любому из пп. 31 или 33-37, отличающийся тем, что:
- реакционная смесь содержит указанный третий МНКзим и один или оба из указанных первого и второго МНКзимов; и
- последовательность петлевого фрагмента третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", способного гибридизоваться с субстратными цепями третьего МНКзима, отличается от:
последовательности петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", способного гибридизоваться с субстратными цепями первого МНКзима, и/или
последовательности петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", способного гибридизоваться с субстратными цепями первого МНКзима.
39. Способ по любому из пп. 28 или 31-38, отличающийся тем, что: количество гибридизованных нуклеотидов и/или последовательность
- гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" отличается от количества и последовательности гибридизованных нуклеотидов в стеблевых фрагментах первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля";
- третья температура отличается от первой и второй температур; и
- флуорофор третьего замкнутого и раскрытого олигонуклеотида типа «стебель-петля» излучает в той же цветовой области видимого спектра, что и флуорофоры первого и второго замкнутых и раскрытых олигонуклеотидов типа «стебель-петля».
40. Способ по любому из пп. 28 или 31-39, отличающийся тем, что флуорофор третьего замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа "стебель-петля" является таким же, как флуорофор первого и/или второго замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа "стебель-петля".
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что флуорофор третьего замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа «стебель-петля» и флуорофор первого замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов и/или флуорофор второго замкнутого и раскрытого олигонуклеотидов типа «стебель-петля» обнаруживают на одном и том же канале излучения флуоресценции устройства.
42. Способ по любому из пп. 28-38 или 39, отличающийся тем, что:
- флуорофор первого замкнутого и раскрытого олигонуклеотида типа «стебель-петля» излучает в той же цветовой области видимого спектра, что и флуорофор второго замкнутого и раскрытого олигонуклеотида типа «стебель-петля»; и
- флуорофор третьего замкнутого и раскрытого олигонуклеотида типа «стебель-петля» излучает в цветовой области видимого спектра, отличающейся от области излучения флуорофора первого и второго замкнутых и раскрытых олигонуклеотидов типа «стебель-петля».
43. Способ по любому из пп. 28-42, отличающийся тем, что первая температура отличается от первой температуры и/или второй температуры более чем на: 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С, 10°С, 11°С, 12°С, 13°С, 14°С, 15°С, 16°С, 17°С, 18°С, 19°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С, 40°С, 45°С, 50°С, 55°С, 60°С, 65°С, 70°С, 75°С, 80°С.
44. Способ по любому из пп. 28-43, отличающийся тем, что обнаружение третьего флуоресцентного сигнала при третьей температуре указывает на присутствие третьей мишени в образце, а невозможность обнаружения третьего флуоресцентного сигнала при третьей температуре указывает на отсутствие третьей мишени в образце.
45. Способ по любому из пп. 1-44, отличающийся тем, что:
(i) определение наличия первого флуоресцентного сигнала при первой температуре указывает на присутствие первой мишени в образце, а определение отсутствия первого флуоресцентного сигнала указывает на отсутствие первой мишени в образце; и
(ii) определение наличия второго флуоресцентного сигнала при второй температуре указывает на присутствие второй мишени в образце, а определение отсутствия второго флуоресцентного сигнала указывает на отсутствие второй мишени в образце.
46. Способ по любому из пп. 1-44, отличающийся тем, что указанное определение наличия или отсутствия первой и второй мишеней включает анализ кривой плавления с использованием указанных первого и второго флуоресцентных сигналов.
47. Способ по любому из пп. 1-44, отличающийся тем, что часть (с) включает обнаружение уровней указанного первого и второго флуоресцентных сигналов при:
- температуре, равной или превышающей вторую температуру; и
- температуре, равной или превышающей первую температуру, и не достигающей второй температуры.
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что часть (с) дополнительно включает обнаружение уровней указанного первого и второго флуоресцентных сигналов при температуре, не достигающей второй температуры.
49. Способ по п. 47 или 48, отличающийся тем, что часть (с) включает обнаружение уровней указанного первого и второго флуоресцентных сигналов во время и/или по завершении реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
50. Способ по любому из пп. 47-49, дополнительно включающий получение флуоресцентного сигнала положительного контроля первой мишени с использованием известной концентрации первой мишени и/или известной концентрации первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
51. Способ по любому из пп. 47-50, дополнительно включающий получение флуоресцентного сигнала положительного контроля первой мишени путем повторного выполнения указанного способа на отдельном контрольном образце, содержащем указанную первую мишень.
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что контрольный образец, содержащий первую мишень, содержит первую мишень в известной концентрации.
53. Способ по п. 51 или 52, отличающийся тем, что контрольный образец, содержащий первую мишень, дополнительно содержит указанную вторую мишень.
54. Способ по любому из пп. 46-53, дополнительно включающий получение флуоресцентного сигнала положительного контроля второй мишени путем повторного выполнения указанного способа на отдельном контрольном образце, содержащем указанную вторую мишень.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что контрольный образец, содержащий вторую мишень, содержит вторую мишень в известной концентрации.
56. Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что контрольный образец дополнительно содержит указанную первую мишень.
57. Способ по любому из пп. 46-53, дополнительно включающий получение флуоресцентного сигнала объединенного положительного контроля путем повторного выполнения указанного способа на отдельном контрольном образце, содержащем указанную первую и указанную вторую мишени.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что объединенный контрольный образец содержит первую мишень в известной концентрации и/или вторую мишень в известной концентрации.
59. Способ по любому из пп. 50-58, дополнительно включающий нормировку указанного первого флуоресцентного сигнала и/или указанного второго флуоресцентного сигнала с использованием любого указанного флуоресцентного сигнала положительного контроля.
60. Способ по любому из пп. 46-59, дополнительно включающий получение флуоресцентного сигнала отрицательного контроля путем повторного выполнения способа по любому из пп. 1-3 на отдельном отрицательном контрольном образце, не содержащем:
(i) указанной первой мишени; или
(ii) указанной второй мишени; или
(iii) указанной первой мишени или указанной второй мишени.
61. Способ по п. 60, дополнительно включающий нормировку указанного первого флуоресцентного сигнала и/или указанного второго флуоресцентного сигнала с использованием указанного флуоресцентного сигнала отрицательного контроля.
62. Способ по любому из пп. 46-61, дополнительно включающий сравнение указанного первого и/или второго флуоресцентных сигналов с пороговым значением, причем:
- пороговое значение генерируется с использованием флуоресцентных сигналов, полученных из серии образцов, испытанных в соответствии со способом по любому из пп. 1-3, и содержащих любой один или несколько из:
(i) контроля, не содержащего матрицы, и первой мишени
(ii) контроля, не содержащего матрицы, и второй мишени
(iii) контроля, не содержащего матрицы, первой мишени и второй мишени
что позволяет определить указанное наличие или отсутствие первой и второй мишеней в образце.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что серию образцов тестируют с использованием указанного первого замкнутого олигонуклеотида "стебель-петля" в известной концентрации и/или указанного второго замкнутого олигонуклеотида "стебель-петля" в известной концентрации.
64. Способ по любому из пп. 1-63, отличающийся тем, что первая температура отличается от второй температуры более чем на: 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С, 10°С, 11°С, 12°С, 13°С, 14°С, 15°С, 16°С, 17°С, 18°С, 19°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С, 40°С, 45°С, 50°С, 55°С, 60°С, 65°С, 70°С, 75°С, 80°С.
65. Способ по любому из пп. 1-64, отличающийся тем, что любой указанный ампликон получают посредством любой из полимеразной цепной реакции (ПЦР), амплификации с замещением цепи (SDA), амплификации, зависимой от хеликазы (HDA), рекомбиназно-полимеразной амплификации (RPA), петлевой изотермической амплификации (LAMP), амплификации по типу катящегося кольца (RCA), транскрипционно-опосредованной амплификации (ТМА), самоподдерживающейся репликации последовательности (3SR), амплификации на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA) или полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
66. Способ по любому из пп. 1-65, отличающийся тем, что образец представляет собой биологический образец, полученный от субъекта.
67. Способ по любому из пп. 1-65, отличающийся тем, что способ выполняют in vitro.
68. Способ по любому из пп. 1-65, отличающийся тем, что способ выполняют ех vivo.
69. Композиция, содержащая:
первый и второй замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля", причем каждый из замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" содержит двуцепочечный стеблевой фрагмент, образованный гибридизированными нуклеотидами и соединенный с одноцепочечным петлевым фрагментом, образованным негибридизованными нуклеотидами, причем:
количество гибридизованных нуклеотидов и/или последовательность гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" различаются, и
каждый из двуцепочечных стеблевых фрагментов содержит молекулу флуорофора, соединенную с одной цепью, и молекулу гасителя, соединенную с противоположной цепью,
причем молекулы флуорофора излучают в одной и той же цветовой области видимого спектра, а температура плавления (Tm) двуцепочечного стеблевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" отличается от Tm двуцепочечного стеблевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
70. Композиция по п. 69, отличающаяся тем, что одноцепочечный петлевой фрагмент первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" отличается от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
71. Композиция по п. 69 или 70, дополнительно содержащая:
первый МНКзим, содержащий субстратные цепи, способные гибридизоваться с замкнутым одноцепочечным петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля"; и
второй МНКзим, содержащий субстратные цепи, способные гибридизоваться с одноцепочечным петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля".
72. Композиция по п. 71, отличающаяся тем, что:
субстратные цепи первого МНКзима гибридизируются с одноцепочечным петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа «стебель-петля»; и
субстратные цепи второго МНКзима гибридизируются с одноцепочечным петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа «стебель-петля».
73. Композиция по п. 72, отличающаяся тем, что:
первый и/или второй МНКзимы содержат последовательность аптамера, связанную с анализируемым соединением-мишенью, белком, соединением или молекулой, и сенсорные цепи, гибридизированные с олигонуклеотидной последовательностью; и
первый МНКзим предназначен для обнаружения мишени, отличающейся от мишени второго МНКзима.
74. Композиция по п. 72, отличающаяся тем, что:
первый и/или второй МНКзимы содержат сенсорные цепи, гибридизующиеся с последовательностью-мишенью, и первый МНКзим предназначен для обнаружения мишени, отличающейся от мишени второго МНКзима.
75. Композиция по любому из пп. 69-74, дополнительно содержащая:
первую олигонуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с указанным одноцепочечным петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", тем самым образуя двуцепочечную последовательность, содержащую указанный первый олигонуклеотид;
вторую олигонуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с указанным одноцепочечным петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", тем самым образуя двуцепочечную последовательность, содержащую указанный второй олигонуклеотид;
эндонуклеазу рестрикции, ассоциированную с двуцепочечной последовательностью, включающую указанный первый олигонуклеотид, и способную расщеплять ее; и/или
эндонуклеазу рестрикции, ассоциированную с двуцепочечной последовательностью, включающую указанный второй олигонуклеотид, и способную расщеплять ее.
76. Композиция по любому из пп. 69-75, дополнительно содержащая:
первую двуцепочечную последовательность, содержащую первую олигонуклеотидную последовательность-мишень, гибридизующуюся с указанным одноцепочечным петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", тем самым образуя первую двуцепочечную последовательность, содержащую указанный первый олигонуклеотид-мишень;
вторую двуцепочечную последовательность, содержащую вторую олигонуклеотидную последовательность-мишень, гибридизующуюся с указанным одноцепочечным петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", тем самым образуя двуцепочечную последовательность, содержащую указанный второй олигонуклеотид-мишень;
первый праймер-олигонуклеотид, гибридизующийся с первым олигонуклеотидом-мишенью выше (в направлении 5') относительно указанной первой двуцепочечной последовательности, и первый фермент, обладающий экзонуклеазной активностью (например, полимераза, экзонуклеаза), ассоциированный с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" на конце первого праймера-олигонуклеотида или рядом с ним; и/или
второй праймер-олигонуклеотид, гибрид изующийся со вторым олигонуклеотидом-мишенью выше (в направлении 5') относительно указанной второй двуцепочечной последовательности, и второй фермент, обладающий экзонуклеазной активностью (например, полимераза, экзонуклеаза), ассоциированный с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" на конце второго праймера-олигонуклеотида
77. Композиция по любому из пп. 69-76, дополнительно содержащая:
первую двуцепочечную последовательность, содержащую первую олигонуклеотидную последовательность-мишень, гибридизующуюся с указанным одноцепочечным петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", тем самым образуя первую двуцепочечную последовательность, содержащую указанный первый олигонуклеотид-мишень;
вторую двуцепочечную последовательность, содержащую вторую олигонуклеотидную последовательность-мишень, гибридизующуюся с указанным одноцепочечным петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", тем самым образуя двуцепочечную последовательность, содержащую указанный второй олигонуклеотид-мишень;
причем первый фермент, обладающий экзонуклеазной активностью, ассоциирован с первой двуцепочечной последовательностью, а второй фермент, обладающий экзонуклеазной активностью, ассоциирован со второй двуцепочечной последовательностью.
78. Композиция по любому из пп. 69-77, дополнительно содержащая:
первый ДНКзим и/или первый рибозим, гибридизующийся с петлевым фрагментом первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля",
второй ДНКзим и/или второй рибозим, гибридизующийся с петлевым фрагментом второго замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля", отличающимся от последовательности одноцепочечного петлевого фрагмента первого замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля",
кофакторы для каждого указанного ДНКзима, способные придать каждому указанному ДНКзиму каталитическую активность и, таким образом, индуцировать расщепляющую активность любого указанного ДНКзима, гибридизованного с петлевым фрагментом,
кофакторы для каждого указанного рибозима, способные придать каждому указанному рибозиму каталитическую активность и, таким образом, индуцировать расщепляющую активность любого указанного рибозима, гибридизованного с петлевым фрагментом.
79. Композиция по любому из пп. 69-78, дополнительно содержащая:
третьи замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля", причем указанные третьи замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля" содержат двуцепочечный стеблевой фрагмент из гибридизированных нуклеотидов, соединенный с одноцепочечным петлевым фрагментом, состоящим из негибридизованных нуклеотидов, причем:
количество гибридизованных нуклеотидов и/или последовательность гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте третьих замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" отличается от количества и последовательности гибридизованных нуклеотидов в стеблевых фрагментах первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля", и
двуцепочечный стеблевой фрагмент третьих замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" содержит молекулу флуорофора, соединенную с одной цепью, и молекулу гасителя, соединенную с противоположной цепью, причем молекула флуорофора третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" излучает в другой области видимого спектра по сравнению с молекулами флуорофора первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля".
80. Композиция по любому из пп. 69-78, дополнительно содержащая:
третьи замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля", причем указанные третьи замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля" содержат двуцепочечный стеблевой фрагмент из гибридизированных нуклеотидов, соединенный с одноцепочечным петлевым фрагментом, состоящим из негибридизованных нуклеотидов, причем:
количество гибридизованных нуклеотидов и/или последовательность гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте третьих замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" отличается от количества и последовательности гибридизованных нуклеотидов в стеблевых фрагментах первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля", и
двуцепочечный стеблевой фрагмент третьих замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" содержит молекулу флуорофора, соединенную с одной цепью, и молекулу гасителя, соединенную с противоположной цепью, причем молекула флуорофора третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" излучает в той же области видимого спектра по сравнению с молекулами флуорофора первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля".
81. Композиция по любому из пп. 69-78, дополнительно содержащая:
третьи замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля", причем указанные третьи замкнутые олигонуклеотиды типа "стебель-петля" содержат двуцепочечный стеблевой фрагмент из гибридизированных нуклеотидов, соединенный с одноцепочечным петлевым фрагментом, состоящим из негибридизованных нуклеотидов, причем:
количество гибридизованных нуклеотидов и/или последовательность гибридизованных нуклеотидов в стеблевом фрагменте третьих замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" совпадает с количеством и последовательностью гибридизованных нуклеотидов в стеблевых фрагментах первого или второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля", и
двуцепочечный стеблевой фрагмент третьих замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля" содержит молекулу флуорофора, соединенную с одной цепью, и молекулу гасителя, соединенную с противоположной цепью, причем молекула флуорофора третьего замкнутого олигонуклеотида типа "стебель-петля" излучает в другой области видимого спектра по сравнению с молекулами флуорофора первого и второго замкнутых олигонуклеотидов типа "стебель-петля".