Изучение биологического действия гемагглютинин/ протеазы холерных вибрионов на модели культур клеток

го процесса. Полученные нами данные, а также результаты зарубежных исследований могут служить доказательством того, что изучение распределения псевдогенов у возбудителя чумы может служить эффективным методом анализа преобразования генома в процессе микроэволюции вида Y. pestis.

Работа поддержана грантами РФФИ ОФИ № 06-04-08152 и № 07-04-00100-а.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

І. Куклева Л.М., Проценко О.А., Кутырев В.В. // Мол. генет. - 2002. - № 1. - С. 3-7. - 2. Льюин Б. Гены. - М.: Мир, 1987. - 543 с. - З. Руководство по профилактике чумы. / Под ред. Наумова А.В., Самойловой Л.В. - Саратов, 1992. - 4. Филиппов А. А. Мобильные генетические элементы патогенных бактерий: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. -Саратов, 2001. - 42 с. - 5. Chain P., Carniel Е., Larimer F . et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2004. - Vol. 101, N 38. -P. 13826-13831. - 6. Chain P., Hu P., Malfatti S. et al. // J. Bacteriol. - 2006. - Vol. 188. - P. 4453-4463. - 7. Deng W. , Burland V. , Plunkett G. et al. // J. Bacteriol. - 2002. -Vol. 184. - P. 4601-4611. - S. Lerat Е., Ochman H. // Nucl. Acids Res. - 2005. - Vol. 33, N 10. - P. 3125-3132. - 9. Parkhill J., Wren B., Thomson N. et al. // Nature. - 2001. - Vol. 413. -P. 523-527. - І0. Perry R., Straley S., Fetherston J. et al. //

Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 4611-4623. - 11. Skurnik M., Peippo A., Ervela E. // Mol. Microbiol. - 2000. -Vol. 37. - P. 316-330. - 12. Tong Z., Zhou D., Song Y. et al. // J. Med. Microbiol. - 2005. - Vol. 54. - P. 1-10. - 13. Wren B. // Microbiology. - 2003. - Vol. 1. - P. 55-64. - 14. Zhou D., Tong Z., Song Y. // J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186. - P. 51475152.

L.M.Koukleva, G.A.Yeroshenko, N.Yu.Shavina, A.I.Pavlova, V.V.Kutyrev

Analysis of Distribution of Pseudogenes as a Method to Study Evolutional Reorganizations in Yersinia pestis Genome

Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov

Structures of three genes (YPO1582, YPO1967, YPO4008) were comparatively studied in the infectious agents of pseudotuberculosis, sero-vars I-VI, and plague isolated in Russia and abroad. Yersinia pestis strains of minor subspecies were shown to contain wild-type gene alleles just as Yersinia pseudotuberculosis strains used in the experiments. The main subspecies strains originating both from home and foreign countries, were shown to be at different stages of inactivation of these genes suggesting an incomplete gene reduction process. Analysis of distribution of the pseudogenes may prove a very useful tool to investigate Y. pestis genome evolution processes.

Key words: infectious agent of plague, the major and minor subspecies of Y. pestis, pseudogenes, genome evolution.

Поступила 17.10.07.

УДК 616.932

О.В.Маркина, Е.В.Монахова, Л.П.Алексеева, Р.В.Писанов

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ГЕМАГГЛЮТИНИН/ПРОТЕАЗЫ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ НА МОДЕЛИ КУЛЬТУР КЛЕТОК

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Изучена биологическая активность препарата рекомбинантной гемагглютинин/протеазы (HA/P) холерных вибрионов по отношению к культурам клеток. Показана способность HA/P вызывать округление клеток линий CHO-K1, L-929, HeLa, HEp2 и McCoy и разрушение плотного монослоя MDCK и СаСо2, сопровождающееся отделением культуры от дна лунок. Обратимость реакции зависела от дозы и времени воздействия препарата. Полученные результаты согласуются с литературными данными об аналогичном влиянии на культуры клеток цитотоксина NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) и свидетельствуют в пользу высказанного нами ранее предположения о возможной идентичности этих двух факторов.

Ключевые слова: холерный вибрион, гемагглютинин/протеаза, NMDCY, культуры клеток.

Гемагглютинин/протеаза

[7] обладает целым рядом свойств, позволяющих предположить, что он идентичен HA/P [1]. Основным свойством NMDCY, которому он обязан своим названием, является способность вызывать округление клеток линий СНО, HeLa и Vero, не сопрово-

ждающееся повреждением наружной мембраны. Показано, что его действие на данные культуры может быть обратимым в обратно пропорциональной зависимости от дозы токсина и времени его воздействия [7]. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение морфологических изменений, вызываемых препаратом HA/P в культурах клеток линий CHO-К!, L-929, HeLa, HEp2, McCoy, MDCK и СаСо2.

Материалы и методы

Частично очищенный препарат HA/P, полученный нами ранее из рекомбинантного штамма-проду-цента E. coli Jm103pHP61 [2], хранили в лиофили-зированном состоянии в запаянных ампулах. Непосредственно перед опытами готовили раствор с концентрацией общего белка 1 мг/мл. HA/P находилась

в зрелой форме с молекулярной массой 32 кДа благодаря самопроцессингу и сохраняла все описанные для нее свойства: гемагглютинирующую активность по отношению к куриным эритроцитам и протеоли-тическую - по отношению к целому ряду белков, включая способность к процессингу холерного токсина, термолабильного токсина кишечной палочки и гемолизина вибрионов эльтор (pro-HlyA) [2].

Для оценки биологической активности HA/P использовали культуры клеток эпидермоидной карциномы гортани человека HEp2 (Институт вирусологии им. Ивановского, Москва), овариальных клеток китайского хомячка CHO-К!, подкожной соединительной ткани мыши L-929, эпителиоидной карциномы шейки матки M-HeLa, фибробластов мыши McCoy, почки собаки MDCK (NLB) и эпителия тонкого кишечника человека Ca^2 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).

Клетки MDCK и CaCo2 культивировали в течение 2-5 сут в среде DMEM (Sigma) с 10 % сыворотки плода коровы в 9б-луночных панелях (Costar) до образования плотного монослоя, остальные - в среде RPMI-1640 (Sigma) с 10 % сыворотки плода коровы в течение 1-2 сут. Непосредственно перед опытом ростовую среду удаляли и вносили в лунки по 100 мкл соответствующих сред, содержащих 1 % сыворотки и 100 мкг/мл гентамицина.

Испытуемый препарат добавляли к культурам в двукратных разведениях, начиная с 25 мкг на лунку, и инкубировали в С02-инкубаторе (Sanjo) при 37 °С. Для проверки способности сахаров ингибировать HA/P препарат перед внесением в лунки с клетками инкубировали с D-маннозой, L-фукозой и L-арабино-зой, как описано для NMDCY [7]. Морфологическое изучение культур проводили через определенные промежутки времени (от 0,5 ч до суток) с помощью инвертированного микроскопа (Reichert). Для фотографирования клетки фиксировали формалином и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Результаты и обсуждение

Препарат HA/P вызывал существенные морфологические изменения во всех исследованных нами культурах, что выражалось в разрушении плотного монослоя и округлении клеток. Эти изменения зависели от дозы и времени воздействия препарата.

Так, в культурах CHO-K1, L-929, HeLa, HEp2 и McCoy (рис. 1) после внесения препарата в количестве б-25 мкг на лунку полное округление всех клеток происходило в пределах 40-60 мин; 1,5-3 мкг -спустя 3-4 ч; 0,75 мкг - только на следующие сутки. Наиболее чувствительной оказалась линия HeLa, клетки которой округлялись под действием дозы 0,35 мкг препарата. В культуре CHO-K1 наблюдалась гибель некоторой части округлившихся клеток, особенно при воздействии высоких доз. Описанная активность HA/P не ингибировалась моносахарами, что соответствует данным P.K.Saha et al. [7] по NMDCY.

Изменения, наблюдаемые нами в культурах MDCK и CaCo2 (рис. 2) под действием препарата HA/P, в целом совпадали с описанными Z.Wu et al.

[8]. Происходило увеличение межклеточного про-

странства, сопровождающееся образованием в монослое многочисленных «дыр» и округлением отдельных клеток. Клетки МБСК вначале слегка удлинялись, а СаСо2, напротив, проявляли тенденцию к ретракции. Обе культуры отделялись от дна лунок пластами, которые сворачивались по краям, однако полного отделения клеток друг от друга не происходило. Под действием 12-25 мкг препарата НА/Р отделение пласта культуры и образование «дыр» наблюдалось в пределах 1-1,5 ч, под действием 6 мкг - 3-5 ч; 0,75-3 мкг - на следующие сутки. Доза 0,35 мкг к этому времени вызывала только округление единичных клеток, более низкие дозы не вызывали никаких изменений.

Для изучения обратимости описанной реакции через определенные промежутки времени (после завершения округления всех клеток либо отделения культуры от дна лунок) среду, содержащую НА/Р,

Рис. 1. Округление клеток CHO-K1 (A), L-929 (Б), Hela (B), HEp2 (Г) и McCoy (Д под действием препарата HA/P.

Слева - контроль, справа - опыт.

Ув. 10x15, окраска по Романовскому-Гимза

А

Рис. 2. Действие препарата НА/Р на культуры клеток СаСо2 (А) и МБСК (Б):

1, 7 - контроль; 2 - ретракция клеток СаСо2 и 8 - удлинение МЭСК в первые часы воздействия НА/Р; 3-5 и 9-11 - образование «дыр» в монослое; 6 и 12 - открепление и «сворачивание» края культуры. Ув. 10x15. окраска по Романовскому-Гимза

удаляли и заменяли на свежую, не содержащую препарата. В экспериментах использовали клетки линий СНО-К1, НеЬа и МБСК.

Клетки СНО-К1 оказались наименее устойчивыми к действию НА/Р: только спустя сутки после замены среды в лунках, содержащих 0,75-1,5 мкг препарата, наблюдалось восстановление морфологии клеток, которые прикреплялись ко дну лунок и продолжали делиться. После воздействия более высоких доз препарата лишь единичные клетки возвращались к исходной форме, что также зависело от дозы НА/Р и времени экспозиции. При замене среды через 1 ч после округления клеток под действием 12-25 мкг НА/Р реакция была необратимой в течение суток наблюдения, отдельные клетки прикреплялись ко дну лунок, однако их морфология не восстанавливалась и деления не происходило; если же среда с такими дозами была заменена через 34 ч, то клетки совсем не прикреплялись. При замене среды через 3-4 ч после воздействия 3-6 мкг НА/Р отдельные клетки восстанавливали морфологию в течение первых 1-2 ч, однако на следующие сутки картина не изменялась.

В культуре НеЬа замена среды с 6-25 мкг НА/Р на свежую через 1 ч приводила к полному восстановлению морфологии клеток и монослоя, однако, если среду заменяли через 3-4 ч, клетки не прикреплялись ко дну лунок. В лунках с более низкими дозами независимо от времени их воздействия по-

сле замены среды наблюдалось полное восстановление монослоя в течение 1-4 ч.

Таким образом, результаты изучения биологического действия препарата HA/P на модели культур CHO и HeLa полностью соответствуют данным, полученным P.K.Saha et al. [7] при исследовании на этих же моделях активности NMDCY и обратимости вызываемых им эффектов.

В культуре MDSK среду заменяли на свежую по достижении отделения монослоя от дна лунок. После воздействия высоких доз HA/P (12-25 мкг) в течение 1-4 ч культуры быстро (в течение 1-2 ч после замены среды) восстанавливали морфологию клеток и способность прикрепляться к пластику, однако после контакта с такими же дозами HA/P в течение суток реакция становилась необратимой. Воздействие 3-6 мкг HA/P было обратимым в плане прикрепления, но культура продолжала расти в виде отдельных островков. После воздействия низких доз (1,5 мкг и меньше) независимо от времени замена среды приводила к быстрому восстановлению монослоя.

Эти результаты согласуются с представленными ранее данными Z.Wu et al. [8], которые работали не с препаратами, а с концентрированными супернатантами бульонных культур холерных вибрионов, но показали, что именно HA/P является агентом, ответственным за округление клеток. Ими установлено, что HA/P вызывает заметные морфологические изменения в культурах MDSK-I, HT29 и CaCo2 и может, подобно zonula occludens toxin (Zot), нарушать барьерную функцию эпителия, воздействуя на межклеточные плотные контакты (tj). Мишенью ее действия, в отличие от Zot, является белок окклюдин (компонент tj), который она расщепляет на две части. Это событие, вероятно, является сигналом для расположенного на внутренней поверхности мембраны белка ZO-1, что нарушает его организацию и структуру F-актинового цитоскелета [9]. Возможно, этим и объясняется выявленное S.T.Mel et al. [6] повышение проницаемости кишечной ткани, хотя они использовали другую культуру клеток (T84).

Так же, как и в наших опытах, в исследованиях Z.Wu et al. [8] морфологические изменения зависели от дозы и времени воздействия препарата. Разведенные в 10 раз концентрированные супернатанты проявляли активность не через 20 мин (как концентрированные), а по прошествии более 2 ч, неконцентрированные супернатанты - только спустя сутки. Когда среду для культивирования клеток заменяли на свежую, не содержащую препаратов, отделение клеток от дна прекращалось, а те, что уже открепились, прикреплялись обратно на следующие сутки, при этом продолжался их рост. Обратимость действия HA/P зависела от времени контакта: чем дольше была экспозиция, тем ниже способность клеток прикрепляться и продолжать рост после удаления препарата.

С другой стороны, I.Basu et al. [3] изучено действие NMDCY на клеточные культуры линий Int407 (клетки кишечника) и HeLa. К сожалению, авторы приводят результаты только электронно-микроскопических исследований, однако среди описанных ими изменений, вызванных препаратом NMDCY,

обращает на себя внимание ретракция клеток, которая также наблюдалась нами и 2^и et al. [8] в световом микроскопе в культуре СаСо2 под действием НА/Р. Вместе с выявленной в рамках настоящего исследования способностью НА/Р вызывать, подобно NMDCY, обратимое, не поддающееся ингибированию моносахарами округление клеток СНО и других культур эти данные свидетельствуют в пользу высказанного нами предположения [1] о возможной идентичности двух вышеназванных факторов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Монахова Е.В., Писанов Р.В. // Пробл. особо опасных инф. - 2006. - Вып. 1 (91). - С. 15-20. - 2. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова Л.А. и др. // Биотехнология. - 2006. - № 6. - С. 8-15. - 3. Basu I., Mitra R., Saha P.K. et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 1999. - Vol. 179, N 2. -P. 255-263. - 4. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. // Infect. Immun. - 1983. - Vol. 45. - P. 558560. - 5. Ghosh A., Saha D.R., Hoque K.M. et al. // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74, N 5. - P. 2937-2946. - 6. Mel S.F., Fullner K.J., Wimer-Mackin S. et al. // Infect. Immun. -2000. - Vol. 68, N 11. - P. 6487-6492. - 7. Saha P.K., Koley

H., Nair G.B. // Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64, N 8. -P. 3101-3108. - 8. Wu Z., Milton D., Nybon A. et al. // Mi-crob. Pathog. - 1996. - Vol. 21. - P. 111-123. - 9. Wu Z., Nybon A., Magnusson K.E. // Cell Microbiol. - 2000. - Vol. 2. -P. 11 -17.

O.V.Markina, E.V.Monakhova, L.P.Alekseeva, R.V.Pisanov

Investigation of the biological activity of Vibrio cholerae hemagglutinin/protease on the model of cell cultures

Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute

The biological activity of a recombinant Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/P) towards cell cultures was studied. HA/P was shown to cause cell rounding in CHO-K1, L-929, HeLa, HEp2 and McCoy and disruption of MDCK and СаСо2 dense monolayers followed by dislodgement of the cultures from the well bottom. The reversibility of the reaction was dose/time dependent. The results obtained are in accordance with the literary data on similar effects caused in cell cultures by NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) and provide evidence for our previous proposal about the possible identity of the two factors.

Key words: Vibrio cholerae, hemagglutinin/protease, NMDCY, cell cultures.

Поступила 04.06.07.