СОЕДИНЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
FLAVONOID COMPOUNDS AND USE THEREOF

Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно предварительной патентной заявке Австралии №2005901214, поданной 11 марта 2005 года, содержание которой введено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым соединениям, композициям, содержащим эти соединения, способам их получения и применению указанных соединений. В особенности, настоящее изобретение относится к соединениям флавоноидов, способам получения соединений флавоноидов, композициям, содержащим соединения флавоноидов, и способам их применения.
Предшествующий уровень техники
2
2
Немедленная реперфузия ишемической ткани является особенно важной для восстановления нормального функционирования. Однако это восстановление кровотока может парадоксальным образом вызывать прогрессирующее разрушение обратимо поврежденных клеток, тем самым, приводя к дисфункции ткани и инфаркту. Это "реперфузионное повреждение" обладает многофакторными причинами заболевания, однако, вероятно, оно в значительной степени связано с воспалительной реакцией; при восстановлении кровотока могут возникать определенные воспалительные процессы, усиливающие ишемическое повреждение, включая адгезию и инфильтрацию лейкоцитов, и высвобождение реакционноспособных окислительных остатков (ROS), таких как представители свободных радикалов кислорода и пероксидов, например HO.
Вероятно, значительная часть этой воспалительной реакции опосредуется интерлейкинами (IL), многофункциональным подклассом цитокинов. Лейкоциты (белые клетки крови), вероятно, также играют важную роль в реперфузионном повреждении. Кроме повреждения эндотелия и нейронов, лейкоциты могут непосредственно препятствовать микроциркуляции. Закупорка капилляров лейкоцитами также может являться основным механизмом "феномена невосстановленного кровотока". Таким образом, в областях паренхимы, которые еще являются жизнеспособными при восстановлении кровотока, не происходит адекватной реперфузии, и в конечном итоге они погибают. В особенности, обширную закупорку капилляров вызывает ишемия миокарда.
Ишемия, и особенно реперфузия, обладают свойством способствовать повышенному высвобождению ROS из лейкоцитов, что приводит к дальнейшему повреждению ткани. Одним из наиболее повреждающих типов свободных радикалов являются супероксид-анионы, которые действуют, нарушая эндотелиальную функцию и активность оксида азота (NO). Это дополнительно ухудшает процесс закупорки капилляров, поскольку было показано, что NO ингибирует агрегацию тромбоцитов и предотвращает адгезию лейкоцитов к эндотелию.
Степень восстановления ткани, достигаемая после ишемии и реперфузии, зависит от природы ткани и тяжести повреждения.
Ишемия может быть обусловлена множеством состояний. Например, ишемию могут вызывать острые случаи, такие как удар, инфаркт миокарда или механическая травма, и хронические состояния, такие как атеросклероз, болезнь периферических сосудов и диабет. Другим видом заболевания, приводящим к ишемии, является гипертензия.
После острого случая, такого как инфаркт миокарда, обусловленный закупоркой коронарной артерии, пораженному инфарктом миокарда индивидууму внутривенно вводят различные лекарственные средства, чтобы способствовать устранению любой закупорки кровеносных сосудов, тем самым, восстанавливая кровоток, что приводит к реперфузии тканей. Однако этот вариант лечения не направлен на предотвращение или ослабление связанного с реперфузией повреждения ткани. Создание окружающих условий для реперфузии для возникновения и восстановления снабжения ткани кислородом может приводить к повышенному повреждению ткани вследствие увеличения продукции свободных радикалов.
В этом отношении общепринятые методы лечения индивидуумов, обладающих ишемией или риском развития ишемии, не соответствуют требованиям.
Было предположено, что различные вещества улучшают состояние и функционирование сосудов и что популяции с диетой, богатой фруктами и овощами, обладают более низкой частотой возникновения коронарного артериального заболевания. Этот эффект был связан с благоприятными эффектами флавоноидов, представляющих собой полифенольные соединения, которые находятся во фруктах и овощах.
Флавоноиды представляют собой очень большую и широко распространенную группу получаемых из растений соединений, которые, как предполагают, оказывают множество биологических эффектов, включая снижение уровней липопротеинов низкой плотности в плазме, ингибирование агрегации тромбоцитов, удаление свободных радикалов и снижение пролиферации клеток, а также модуляцию тонуса сосудов.
Было выявлено большое количество флавоноидов, и они отличаются друг от друга ориентацией гидроксилирования или метилирования, положением бензоидного заместителя, степенью ненасыщенности и типами присоединенных заместителей. Общая трехкольцевая структура (кольца A, B и C) многих флавоноидов основана на структуре 2-фенил-4H-1-бензопиран-4-она.
основная структура флавоноида
in vitro
Например, синтетический флавоноид, 3',4'-дигидроксифлавонол (DiOHF), имеет гидроксильную группу в положениях 3,3' и 4', и для него в ходе исследований  было показано ослабление инфаркта и повреждения, связанного с ишемией миокарда и реперфузией (Shen Wang, Gregory Dusting, Give May and Owen Woodman, British Journal of Pharmacology (2004) 142, 443-452).
Однако фармакокинетика многих флавоноидов в значительной степени ограничивала их терапевтическую эффективность. Для синтетических флавоноидов свойственна высокая растворимость молекул в липидах и, следовательно, свойственна недостаточная водорастворимость, что приводит к проблемам при введении в качестве терапевтического средства. Такие характеристики ограничивают применимость флавоноидов в способах лечения, в которых желательно срочное парентеральное введение, например при сосудорасширяющих способах лечения.
Учитывая описанные выше проблемы, остается необходимость в разработке синтетических производных флавоноидов с улучшенной водорастворимостью и фармакокинетикой в сравнении с известными флавоноидами.
Сущность изобретения
I
В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической и/или ветеринарной композиции, содержащей фармацевтически и/или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель вместе с по меньшей мере одним соединением общей формулы
где
обозначает одинарную или двойную связь; и
1
2
3
4
5
R, R, R, R, R независимо выбирают из H, OH или группы формулы (Ia)
где
O представляет собой кислород;
L представляет собой линкерную группу, которая ковалентно связана с кислородом и D, если присутствует, или ковалентно связана с кислородом и E, или отсутствует;
D представляет собой спейсерную группу с длиной цепи, эквивалентной приблизительно от 1 до 20 атомам углерода, или отсутствует; и
E представляет собой солюбилизирующую группу;
1
2
3
4
5
при условии, что по меньшей мере один из R, R, R, R, R отличается от H или OH.
Предпочтительно, E выбирают из сложного эфира, карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты, фосфоновой кислоты, сложного фосфатного эфира, сульфамата, сложного сульфонового эфира, фосфамата, сложного фосфонатного эфира, сульфоната, цвиттер-ионного остатка, аминокислоты, аминофосфоната, ациклического амина, циклического амина, катиона четвертичного аммония, полиэтиленгликоля, олигосахарида или дендримера.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления E выбирают из сложного эфира, карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты, фосфоновой кислоты, сложного фосфатного эфира, полиэтиленгликоля, олигосахарида или дендримера.
Предпочтительно, E выбирают из сложного эфира, карбоновой кислоты или сложного фосфатного эфира.
В особенно предпочтительном варианте осуществления E представляет собой группу формулы (Ib)
где
-
-
W представляет собой O, NH, S, O-, NH или S; и
X представляет собой H, моно- или двухвалентную катионную соль или катионную соль аммония.
Предпочтительно, W представляет собой O и/или X представляет собой H.
В другом варианте осуществления E представляет собой сложный эфир формулы (Ic)
где
Q представляет собой замещенный или незамещенный алкилен, алкенилен, алкинилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами;
-
-
-
W представляет собой O, NH, S, O, NH или S; и
X представляет собой H, замещенный или незамещенный алкил, алкилбензил, моно- или двухвалентную катионную соль или катионную соль аммония.
Предпочтительно, Q представляет собой замещенный или незамещенный низший алкилен.
В другом варианте осуществления E представляет собой сложный фосфатный эфир формулы (Id)
где
-
-
-
Y представляет собой O, NH, S, O, NH или S;
Z представляет собой O или S; и
6
7
R и R независимо выбирают из H, замещенного или незамещенного алкила, моно- или двухвалентной катионной соли или катионной соли аммония.
Предпочтительно, Y и Z представляют собой O.
1
2
3
4
5
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один из R, R, R, R и R представляет собой сложный фосфатный эфир формулы (Ie)
6
7
где R и R независимо выбирают из H, моно- или двухвалентной катионной соли или катионной соли аммония.
В одном из вариантов осуществления L присутствует и выбран из -CO-, сложного эфира, фенола, сложного фосфонатного эфира, карбамата, карбоната или основания Манниха. В более предпочтительном варианте осуществления L представляет собой -CO-.
В другом варианте осуществления D присутствует и выбран из замещенного или незамещенного алкилена, алкенилена, алкинилена, необязательно прерываемых одним или несколькими гетероатомами, арила, гетероарила, циклоалкила или гетероциклоалкила.
В предпочтительном варианте осуществления D представляет собой замещенный или незамещенный алкилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами, предпочтительно, низший алкилен.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической и/или ветеринарной композиции, содержащей фармацевтически и/или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель вместе с по меньшей мере одним соединением общей формулы II
где
---
обозначает одинарную или двойную связь; и
1
2
3
R, R и R являются такими, как указано выше.
III
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической и/или ветеринарной композиции, содержащей фармацевтически и/или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель вместе с по меньшей мере одним соединением общей формулы
3
где R является таким, как указано выше.
IV
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической и/или ветеринарной композиции, содержащей фармацевтически и/или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель вместе с по меньшей мере одним соединением общей формулы
где
Q представляет собой замещенный или незамещенный алкилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами;
X представляет собой H, моно- или двухвалентную катионную соль или катионную соль аммония.
Предпочтительно, Q представляет собой замещенный или незамещенный низший алкилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, выбранному из группы
3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона;
3-гидроксифлавон-3-гемиадипата;
4'-(бензилокси)-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона; 4'-гидроксифлавон-3-гемиадипата;
3',4'-дибензилокси-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона;
3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата;
3,4'-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона;
флавон-3,4'-бис(гемиадипата);
3,7-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона;
3,7-дигидроксифлавон-3,7-бис(гемиадипата);
4'-гидрокси-3-гидроксифлавон-3-четвертичного аммониевого сложного эфира;
4'-(бензилокси)-3-(дибензилоксифосфорилокси)флавона и динатриевой соли 3-гидроксифлавон-3-фосфата.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической и/или ветеринарной композиции, содержащей фармацевтически и/или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель вместе с по меньшей мере одним соединением, выбранным из группы, содержащей
3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон;
3-гидроксифлавон-3-гемиадипат;
4'-(бензилокси)-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон; 4'-гидроксифлавон-3-гемиадипат;
3',4'-дибензилокси-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон;
3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипат;
3,4'-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон;
флавон-3,4'-бис(гемиадипат);
3,7-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон;
3-(дибензилоксифосфорилокси)флавон;
3,7-дигидроксифлавон-3,7-бис(гемиадипат);
4'-гидрокси-3-гидроксифлавон-3-четвертичный аммониевый сложный эфир;
динатриевую соль флавон-3-фосфата;
4'-(бензилокси)-3-(дибензилоксифосфорилокси)флавон или
динатриевую соль 3-гидроксифлавон-3-фосфата.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения у индивидуума заболевания(й), связанного(ых) с наличием реакционноспособных окислительных остатков (ROS), где способ включает:
введение эффективного количества по меньшей мере одного указанного выше соединения.
Предпочтительно, индивидуум при необходимости такого лечения обладает риском развития ишемии. Более предпочтительно, индивидуум страдает ишемией и/или реперфузионным повреждением, как результат острого или хронического состояния.
В конкретном варианте осуществления хроническое состояние выбирают из рака, цереброваскулярного заболевания, сосудистого заболевания легких, атеросклероза, заболевания артерий, застойной сердечной недостаточности, коронарного заболевания сердца, болезни периферических сосудов, диабета, гипертензии, мигрени, ожогов, хронического обструктивного заболевания легких и заболевания сосудов сетчатки.
В другом варианте осуществления острое состояние выбирают из удара, инфаркта миокарда, повреждения вследствие механической травмы или хирургического вмешательства. Предпочтительно, хирургическое вмешательство представляет собой сосудистое хирургическое вмешательство. Более предпочтительно, сосудистое хирургическое вмешательство представляет собой шунтирование сердца и/или трансплантационное хирургическое вмешательство.
В конкретном варианте осуществления соединение вводят индивидууму до и/или в ходе хирургического вмешательства.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики, задержки развития и/или замедления развития атеросклероза и/или коронарного заболевания сердца у индивидуума, где способ включает:
введение эффективного количества по меньшей мере одного указанного выше соединения.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к терапевтическому и/или профилактическому способу предупреждения и/или лечения у индивидуума заболевания(й), связанных с наличием реакционноспособных окислительных остатков (ROS), где способ включает:
введение эффективного количества по меньшей мере одного указанного выше соединения.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или по меньшей мере ослабления у индивидуума нарушения, вызываемого ишемией и/или реперфузионным повреждением, где способ включает:
введение эффективного количества по меньшей мере одного указанного выше соединения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или по меньшей мере ослабления у индивидуума нарушения, вызываемого введением терапевтического средства, где способ включает совместное введение индивидууму:
i) терапевтического средства и
ii) введение эффективного количества по меньшей мере одного указанного выше соединения.
Предпочтительно, терапевтическое средство представляет собой окислительное терапевтическое средство.
В конкретном варианте осуществления терапевтическое средство представляет собой противораковое средство. Предпочтительно, противораковое средство представляет собой антрациклин и его производные.
В конкретных вариантах осуществления соединение вводят перорально, местно, подкожно, парентерально, внутримышечно, внутриартериально и/или внутривенно.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения, как указано выше, с получением лекарственного средства.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению общей формулы I
где
обозначает одинарную или двойную связь; и
1
2
3
4
5
R, R, R, R, R независимо выбирают из H, OH или группы формулы (Ia)
где
O представляет собой кислород;
L представляет собой линкерную группу, которая ковалентно связана с кислородом и D, если присутствует, или ковалентно связана с кислородом и E, или отсутствует;
D представляет собой спейсерную группу с длиной цепи, эквивалентной приблизительно от 1 до 20 атомам углерода, или отсутствует; и
E представляет собой солюбилизирующую группу;
1
2
3
4
5
при условии, что по меньшей мере один из R, R, R, R, R отличается от H или OH,
при условии, что соединение не представляет собой
флавон-3'-гидроксиацетат; флавон-4'-гидроксиацетат;
флавон-3-гидроксиацетат; (±)4,1-ацетоксифлаванон;
флаванон-3,4',7-тригидрокси-3-ацетат;
3,7-бис(ацетилокси)-2,3-дигидро-2-фенил-(2R-транс)-4H-1-бензопиран-4-он;
(±)-7-(ацетилокси)-2-[4-(ацетилокси)фенил]-2,3-дигидро-4H-1-бензопиран-4-он; (+)4',7-диацетоксифлаванон;
(2S,3S)-3,7-дигидроксифлаванондиацетат;
флавонон-3,4'-дигидроксидиацетат;
флаванон-3',4'-дигидроксидиацетат;
флаванон-3,7-дигидроксидиацетат;
3,7-бис(ацетилокси)-2-(3,4-дигидроксифенил)-2,3-дигидро-(2R-транс)-4H-1-бензопиран-4-он;
флавон-3,3'-дигидроксидиацетат; флавон-4',7-дигидроксидиацетат;
флавон-3,7-дигидроксидиацетат;
флавон-3,3',7-тригидрокситриацетат;
флавон-3,3',4'-тригидрокситриацетат;
7-(ацетилокси)-2-[3,4-бис(ацетилокси)фенил]-4H-1-бензопиран-4-он; флавон-3,4',7-тригидрокситриацетат;
флаванон-3',4',7-тригидрокситриацетат;
7-(ацетилокси)-2-[3,4-бис(ацетилокси)фенил]-2,3-дигидро-(S)-4H-1-бензопиран-4-он; флавонон-3,4',7-тригидрокситриацетат;
транс-(t)-флаванон-3,4',7-тригидрокситриацетат;
3,7-бис(ацетилокси)-2-[3-4-бис(ацетилокси)фенил]-4H-1-бензопиран-4-он; фустинтетраацетат;
3,7-бис(ацетилокси)-2-[3,4-бис(ацетилокси)фенил]-2,3-дигидро-(2R-транс)-4H-1-бензопиран-4-он;
3,7-бис(ацетилокси)-2-[3,4-бис(ацетилокси)фенил]-2,3-дигидро-транс-4H-1-бензопиран-4-он;
флаванон-3,3',4',7-тетрагидрокситетраацетат;
3-(1-оксопропокси)-2-фенил-4H-1-бензопиран-4-он;
2-метил-4-оксо-2-фенил-4H-1-бензопиран-3-иловый эфир пропановой кислоты;
2,2-диметил-4-оксо-2-фенил-4H-1-бензопиран-3-иловый эфир пропановой кислоты;
4-оксо-2-фенил-4H-1-бензопиран-3-иловый эфир бензолуксусной кислоты;
4-оксо-2-фенил-4H-1-бензопиран-3-иловый эфир бензолпропановой кислоты;
a-фенил-4-оксо-2-фенил-4H-1-бензопиран-3-иловый эфир бензолуксусной кислоты;
o-[4-[3-[(диэтоксифосфинтиоил)окси]-4-оксо-4H-1-бензопиран-2-ил]фенил]-o,o-диэтиловый эфир тиофосфорной кислоты;
o-[3-[3-[(диэтоксифосфинтиоил)окси]-4-оксо-4H-1-бензопиран-2-ил]фенил]-o,o-диэтиловый эфир тиофосфорной кислоты;
диэтил-4-(4-оксо-4H-1-бензопиран-2-ил)фениловый фосфорной кислоты;
2-фенил-3-(фосфонокси)-4H-1-бензопиран-4-он;
диаммониевую соль флавон-3-гидроксидигидрофосфата;
пентагидрат магниевой соли 2-фенил-3-(фосфонокси)-4H-1-бензопиран-4-она (1:1);
2-[3-гидрокси-4-(фосфонокси)фенил]-4H-1-бензопиран-4-он;
3',4'-дигидроксифлавон-4'-фосфат;
натриевую соль 3',4'-дигидроксифлавон-4'-β-D-глюкопиранозида;
натриевую соль 3',4'-дигидроксифлавон-4'-β-D-рибофуранозида;
и их фармацевтически и/или ветеринарно приемлемые соли и сольваты.
1
2
3
4
5
Предпочтительно, R, R, R, R и R являются такими, как указано выше.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению общей формулы (II)
где
---
обозначает одинарную или двойную связь; и
1
2
3
R, R и R являются такими, как указано выше.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению общей формулы (III)
3
где R является таким, как указано выше.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению общей формулы (IV)
где
Q представляет собой замещенный или незамещенный алкилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами;
X представляет собой H, моно- или двухвалентную катионную соль или катионную соль аммония.
Предпочтительно, Q представляет собой замещенный или незамещенный низший алкилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению общей формулы V
3
5
где R и R являются такими, как указано выше.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения соединений, как указано выше.
В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы
где
обозначает одинарную или двойную связь; и
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
R, R, R, R, R независимо выбирают из H, OH, замещенных или незамещенных алкоксигрупп, арилоксигрупп, сложных эфиров, сложных карбонатных эфиров, простых эфиров, сложных фосфатных эфиров и простых α-ацилоксиалкиловых эфиров, при условии, что по меньшей мере один из R, R, R, R, R отличается от H или OH;
и их фармацевтически приемлемым солям или сольватам.
3
Предпочтительно, по меньшей мере R выбирают из замещенных или незамещенных сложных эфиров, сложных карбонатных эфиров, простых эфиров, сложных фосфатных эфиров и простых α-ацилоксиалкиловых эфиров.
1
2
3
4
5
Предпочтительно, по меньшей мере один из R, R, R, R, R выбирают из:
i) фосфата общей формулы
-
-
-
где Y представляет собой O, NH, S, O, NH или S;
Z представляет собой O или S; и
6
7
каждый из R и R независимо выбирают из замещенного или незамещенного алкила, H, моно- или двухвалентной катионной соли или катионной соли аммония;
ii) сложного эфира общей формулы
8
где R представляет собой замещенный или незамещенный низший алкил, низшую алкилалкоксигруппу;
iii) сложного эфира общей формулы
где Q представляет собой замещенный или незамещенный низший алкилен, низший алкенил и алкинил;
-
-
-
W представляет собой O, NH, S, O, NH или S; и
X представляет собой H, замещенный или незамещенный алкил, алкилбензил, моно- или двухвалентную катионную соль или катионную соль аммония,
и их фармацевтически приемлемых солей или сольватов.
В конкретных вариантах осуществления изобретения Y и Z оба представляют собой O.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к соединению общей формулы
где
---
обозначает одинарную или двойную связь; и
1
2
3
1
2
3
R, R или R независимо выбирают из H, OH, замещенных или незамещенных алкоксигрупп, арилоксигрупп, сложных эфиров, сложных карбонатных эфиров, простых эфиров, сложных фосфатных эфиров и простых α-ацилоксиалкиловых эфиров, при условии, что по меньшей мере один из R, R или R отличается от H или OH;
и их фармацевтически приемлемым солям или сольватам.
1
2
3
Предпочтительно, по меньшей мере один из R, R или R выбирают из:
i) фосфата общей формулы
-
-
-
где Y представляет собой O, NH, S, O, NH или S;
Z представляет собой O или S; и
6
7
каждый из R и R независимо выбирают из замещенного или незамещенного алкила, H, моно- или двухвалентной катионной соли или катионной соли аммония;
ii) сложного эфира общей формулы
8
где R представляет собой замещенный или незамещенный низший алкил, низшую алкилалкоксигруппу;
iii) сложного эфира общей формулы
где Q представляет собой замещенный или незамещенный низший алкилен, низший алкенилен, алкинилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами;
-
-
-
W представляет собой O, NH, S, O, NH или S; и
X представляет собой H, замещенный или незамещенный алкил, алкилбензил, моно- или двухвалентную катионную соль или катионную соль аммония;
и их фармацевтически приемлемых солей или сольватов.
Предпочтительно
1
R представляет собой H или OH;
2
R представляет собой H или OH; и
3
R выбирают из
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению общей формулы
где
9
R представляет замещенную или незамещенную алкоксигруппу, арилоксигруппу, сложный эфир, сложный карбонатный эфир, простой эфир или группу формулы , где U представляет собой замещенный или незамещенный алкилен, необязательно прерываемый одним или несколькими гетероатомами.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению общей формулы
где n равен целому числу от 2 до 6, предпочтительно, n равно 4.
Подразумевают, что указанные в настоящем описании формулы включают все возможные геометрические и оптические изомеры и их рацемические смеси.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам получения соединений формулы I, формулы II, формулы III или формулы IV, где R, R, R, R, R, R, R, R, R, U, Q, W, X, Y, Z, n имеют такое же значение, как указано выше, или их фармацевтически приемлемой соли или сольватов.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической и/или ветеринарной композиции, содержащей фармацевтически и/или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель вместе по меньшей мере с одним соединением формулы I, формулы II, формулы III или формулы IV, где R, R, R, R, R, R, R, R, R, U, Q, W, X, Y, Z, n имеют такое же значение, как указано выше, или его фармацевтически приемлемой солью или сольватами.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или по меньшей мере ослабления у индивидуума нарушения, обусловленного введением терапевтического средства, где способ включает совместное введение индивидууму:
i) терапевтического средства; и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ii) эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы I, формулы II, формулы III, формулы IV или формулы V, где R, R, R, R, R, R, R, R, R, U, Q, W, X, Y, Z, n имеют такое же значение, как указано выше, или его фармацевтически приемлемой соли или сольватов.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения заболевания(й), связанного(ых) с наличием реакционноспособных окислительных остатков (ROS), где способ включает введение эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы I, формулы II, формулы III, формулы IV или формулы V, где R, R, R, R, R, R, R, R, R, U, Q, W, X, Y, Z, n имеют такое же значение, как указано выше, или его фармацевтически приемлемой соли или сольватов.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения заболевания(й), связанного с наличием реакционноспособных окислительных остатков (ROS), где способ включает введение эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы I, формулы II, формулы III или формулы IV, где R, R, R, R, R, R, R, R, R, U, Q, W, X, Y, Z, n имеют такое же значение, как указано выше, или его фармацевтически приемлемой соли или сольватов.
Как правило, индивидуумом при необходимости такого лечения является индивидуум с риском развития ишемии. Альтернативно, индивидуумом может являться индивидуум, который в настоящее время страдает ишемией и/или реперфузией в результате острого или хронического состояния.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
В еще дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или по меньшей мере ослабления у индивидуума нарушения, обусловленного ишемией и/или реперфузией, где способ включает введение эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы I, формулы II, формулы III или формулы IV, где R, R, R, R, R, R, R, R, R, U, Q, W, X, Y, Z, n имеют такое же значение, как указано выше, или его фармацевтически приемлемой соли или сольватов.
Предпочтительно, солюбилизирующая группа придает соединению по меньшей мере частичную растворимость, и более предпочтительно, полную растворимость в водном растворе, предпочтительно воде.
in vivo
Предпочтительно, соединения по изобретению обладают по меньшей мере одним заместителем, расщепляемым ферментом .
in vivo
Предпочтительно, расщепляемый ферментом  заместитель представляет собой группу, ионизируемую при физиологическом pH.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена схема синтеза динатриевой соли 3-гидроксифлавон-3-фосфата (5).
На фиг.2 представлена схема синтеза 3',4'-дигидроксифлавон-3-фосфата (10).
На фиг.3 представлена схема синтеза 3-гидроксифлавон-3-гемисукцината (15) через монобензиловый эфир янтарной кислоты.
На фиг.4 представлена схема синтеза 3-гидроксифлавон-3-гемиадипата (19) через монобензиловый эфир адипиновой кислоты.
На фиг.5 представлена схема синтеза 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21).
2
-4
На фиг.6 представлены эффекты носителя (dHO), флавон-3-гемиадипата (19) (F3HA), в присутствии и отсутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 1000 ед./л) и DiOHF (10М), на уровень супероксид-анионов, образуемых в аорте крысы в присутствии NADPH, выраженный в процентах от контроля.
2
-6
-4
-4
На фиг.7 представлены эффекты носителя (dHO), 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) (DiOHF3HA, 10М-10М), в присутствии и отсутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 1000 ед./л) и DiOHF (10М), на уровень супероксид-анионов, образуемых в аорте крысы в присутствии NADPH, выраженный в процентах от контроля.
2+
-4
2+
-3
На фиг.8 представлены кривые концентрация-ответ на Ca в присутствии носителя или 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) (DiOHF3HA, 10М), в присутствии и отсутствие BuCHE, в сравнении с DiOHF в эндотелии неповрежденных колец аорты, выделенных у крыс. Величину сокращения выражают как процент от исходной реакции на Ca (3×10М), наблюдаемой до лечения DiOHF3HA.
2
-8
-4
-4
На фиг.9 представлены эффекты носителя (dHO), флавон-3-фосфата (F3P, 10М-10М) в присутствии фосфатазы (1000 ед./л) и DiOHF (10М) на уровень супероксид-анионов, образуемых в аорте крысы в присутствии NADPH, выраженный в процентах от контроля.
2+
-8
-4
2+
-3
На фиг.10 представлены кривые концентрация-ответ для Ca в присутствии носителя или флавон-3-фосфата (F3P, 10M-10М), в присутствии и отсутствие фосфатазы (P, 1000 ед./л), в эндотелии неповрежденных колец аорты, выделенных у крыс. Величину сокращения выражают как процент от исходной реакции на Ca (3×10М), наблюдаемой до лечения флавон-3-фосфатом.
-4
-4
-4
-4
На фиг.11 представлен прямой расслабляющий эффект носителя, 1000 ед./л BuCHE, DiOHF3HA (10М), DiOHF3HA (10М) плюс 1000 ед./л BuCHE. На сосуды, предварительно суженные PE, носитель, 1000 ед./л BuCHE и DiOHF3HA (10М) эффекта не оказывали. DiOHF3HA (10М) плюс 1000 ед./л BuCHE оказывали значительный эффект на сосудистый тонус аорты крыс, предварительно суженной PE.
На фиг.12(a) представлено зависящее от дозы снижение MAP (мм рт.ст.), которое указывает на расширение сосудов в ответ на DiOHF3HA у анестезированных крыс.
На фиг.12(b) представлено зависящее от дозы снижение HR (удары/минута) в ответ на DiOHF3HA.
На фиг.13 представлено снижение MAP (мм рт.ст.), указывающее на расширение сосудов в ответ на ACh у анестезированных крыс, где расширяющая реакция на ACh была усилена предварительной обработкой в течение 30 минут с использованием 3 мг/кг DiOHF3HA. Повышение MAP (мм рт.ст.) указывает на сужение сосудов в ответ на PE у анестезированных крыс, где суживающие реакции на PE были снижены предварительной обработкой в течение 30 минут с использованием 3 мг/кг DiOHF3HA.
На фиг.14 представлены кривые концентрация-ответ для PE, полученные в присутствии контроля, DiOHF3HA в присутствии и отсутствие BuCHE и DiOHF в кольцах аорты крыс. Для DiOHF3HA в присутствии BuCHE и DiOHF наблюдали ингибирование реакции на PE зависящим от концентрации образом.
<b>Максимальное сужение</b>
<b>(процент 3 мМ Ca</b><sup>2+</sup><b>)</b>
контроль
101±1
DiOHF3HA 10<sup>-4</sup>М
101±1
DiOHF3HA 10<sup>-4</sup>М+BuCHE
35±6
DiOHF 10<sup>-4</sup>М
18±2
-5
-4
На фиг.15 представлен эффект фосфатазы (1000 ед./л) и флавон-3-фосфата (F3P) (10М-10М) плюс фосфатаза на кривые концентрация-ответ для ACh в эндотелии неповрежденных колец аорты крыс (n=5). Было очевидно, что отдельно фосфатаза не влияла на расслабляющую реакцию на ACh, однако в сравнении с контрольными кольцами расслабляющие реакции на ACh были усилены в присутствии F3P плюс фосфатаза при обеих тестируемых концентрациях.
<b>pEC</b><sub>50</sub>
<b>R</b><sub>макс.</sub>
контроль
7,31±0,03
100±3
фосфатаза 10<sup>-4</sup>М (P)
7,30±0,04
100±1
F3P 10<sup>-5</sup>М+P
7,80±0,06
100±1
F3P 10<sup>-4</sup>М+P
7,70±0,07
100±1
На фиг.16a представлено зависящее от дозы снижение MAP (мм рт.ст.) в ответ на F3P и DiOHF у анестезированных крыс.
На фиг.16b представлено зависящее от дозы снижение HR (удары/минута) в ответ на F3P и DiOHF у анестезированных крыс.
*
На фиг.17 представлена область миокарда, связанная с риском (левая панель), и размер инфаркта миокарда (правая панель) для контрольных образцов (n=4), обработанных DiOHF (2 мг/кг, n=2 и 5 мг/кг, n=3) и DiOHF3HA (2-7 мг/кг, n=3 и 6,6 мг/кг, n=4) групп анестезированных овец. AR/LV%=связанная с риском область, которую выражают как процент от общего объема левого желудочка. IS/AR%=размер инфаркта, выраженный как процент от области миокарда, связанной с риском.  указывает значимое различие размера инфаркта между контрольными животными и животными, обработанными адипатом (6,6 мг/кг).
На фиг.18 представлено время задержки при подаче (A и C) и прекращении (B и D) стимулирующего воздействия на контралатеральную переднюю конечность в сравнении с ипсилатеральной передней конечностью, которое оценивают через 24, 48 и 72 часа после индуцированного ET-1 удара и обработки носителем (A и B) или DiOHF3HA (15 мг/кг/сутки) (C и D) у крыс с ударом, от незначительной до умеренной степени тяжести.
На фиг.19 представлен эффект отсроченного введения DiOHF3HA (15 мг/кг/сутки) или носителя на область инфаркта в коре головного мозга (A) и полосатом теле (B) у крыс с ударом, от незначительной до умеренной степени тяжести.
Определения
Как использовано в настоящем описании, термин "алкил" включает разветвленные или неразветвленные углеводородные цепи, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, октадецил и 2-метилпентил. Эти группы могут быть незамещенными или незамещены одной или несколькими функциональными группами, обычно присоединяемыми к таким цепям, такими как гидроксильная, бром, фтор, хлор, йод, меркапто или тио, циано, алкилтио, гетероциклил, карбоксил, карбалкоил, алкил, алкенил, нитро, амино, алкоксил, амидо и т.п., с образованием таких алкильных групп, как трифторметил, 3-гидроксигексил, 2-карбоксипропил, 2-фторэтил, карбоксиметил, цианобутил и т.п.
Как использовано в настоящем описании, термин "низший" включает линейную или разветвленную цепь с 1-6 атомами углерода.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
Термин "алкилен" относится к двухвалентному алкилу, как указано выше, такому как метилен (-CH-), пропилен (-CHCHCH-), хлорэтилен (-CHClCH-), 2-тиобутен (-CHCH(SH)CHCH-), 1-бром-3-гидроксил-4-метилпентен (-CHBrCHCH(OH)CH(CH)CH-), метилэтилен, триметилен, пропилен-1, пропилен-2, тетраметилен, 1-метилтриметилен, 2-метилтриметилен, 3-метилтриметилен, 1-этилэтилен, 2-этилэтилен, пентаметилен, 1-метилтетраметилен, 2-метилтетраметилен, 3-метилтетраметилен, 4-метилтетраметилен и гексаметилен и т.п.
Термин "алкенил" включает разветвленные или неразветвленные углеводородные цепи, содержащие одну или несколько двойных углерод-углеродных связей.
Термин "алкинил" включает разветвленные или неразветвленные углеводородные цепи, содержащие одну или несколько тройных углерод-углеродных связей.
"Арил" означает ароматическую карбоциклическую группу с одним кольцом (например, фенил), множеством колец (например, бифенил) или множеством конденсированных колец, из которых по меньшей мере одно является ароматическим, (например, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, нафтил), которые необязательно являются моно-, ди- или тризамещенными. Как использовано в настоящем описании, арильные группы являются незамещенными или, как указано, замещены различными группами в одном или нескольких способных к замещению положениях.
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
Как использовано в настоящем описании, термин "циклоалкил" относится к насыщенным карбоциклическим радикалам, содержащим от трех до двенадцати атомов углерода. Циклоалкил может быть моноциклическим или представлять собой полициклическую объединенную систему. Примеры таких радикалов включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил. Как использовано в настоящем описании, циклоалкильные группы являются незамещенными или, как указано, замещены различными группами в одном или нескольких способных к замещению положениях. Например, такие циклоалкильные группы могут быть необязательно замещены C-Cалкилом, C-Cалкоксигруппой, галогеном, гидрокси-, циано-, нитро-, амино-, моно(C-C)алкиламино-, ди(C-C)алкиламиногруппой, C-Cалкенилом, C-Cалкинилом, C-Cгалогеналкилом, C-Cгалогеналкоксигруппой, амино(C-C)алкилом, моно(C-C)алкиламино(C-C)алкилом или ди(C-C)алкиламино(C-C)алкилом.
Термин "ацил" включает группу -C(O)R, где R представляет собой алкил или арил, как указано выше, например формил, ацетил, пропионил или бутирил.
Термин "алкокси" включает -OR-, где R представляет собой алкил. Термин "низшие алкоксирадикалы" может означать линейные и разветвленные алкоксигруппы с 1-6 атомами углерода, такие как метокси-, этокси-, пропокси-, изопропокси-, бутокси-, изобутокси-, втор-бутокси-, трет-бутокси-, пентилокси-, изопентилокси-, гексилокси- и изогексилоксигруппы.
Термин "амидо" включает амидную связь: -C(O)NR- (где R представляет собой водород или алкил).
Термин "амино" означает аминную связь: NR-, где R представляет собой водород или алкил.
Термин "карбоксил" означает -C(O)O-, и термин "карбонил" означает -C(O)-.
Термин "карбонат" означает -OC(O)O-.
2
-
Термин "сульфонат" означает -S(O)O.
Термин "карбоновая кислота" означает -C(O)OH.
2
Термин "сульфоновая кислота" означает -S(O)OH.
2
Термин "фосфоновая кислота" означает -P(O)(OH).
4
-
Термин "фосфамат" означает -Ar-NHPO .
2
Термин "сложный фосфатный эфир" означает -O-P(O)(OR).
3
Термин "сульфамат" означает -Ar-NHSO-.
2
Термин "сложные сульфоновые эфиры" означает -S(O)-OR.
2
Термин "сульфонат" означает -S(O)O-.
2
Термин "сложный фосфонатный эфир" означает R-P(O)(OR).
Термин "карбоновая кислота" означает -C(O)OH.
2
Термин "сульфоновая кислота" означает -S(O)OH
2
Термин "фосфоновая кислота" означает -P(O)(OH).
4
Термин "фосфамат" означает -Ar-NHPO-.
Термин "карбамат" означает -NHC(O)O-.
Углеводородные цепи могут быть необязательно прерваны одним или несколькими гетероатомами.
Когда присутствует, линкерная группа может представлять собой любую из числа таких известных в данной области молекул, которые описаны в настоящем описании.
Как понятно из приведенного выше описания, спейсерная группа D может отсутствовать. Также из приведенного выше описания понятно, что может отсутствовать линкерная группа.
Описание вариантов осуществления
Настоящее изобретение относится к производным флавоноидов и к композициям, содержащим производные флавоноидов, а также к способам их применения.
2
2
2
2
·
-·
·
·
Было показано, что наличие реакционноспособных окислительных остатков (ROS) в живой ткани связано с множеством заболеваний у животных. Реакционноспособные окислительные вещества могут содержать как азот, так и кислород или только атомы кислорода. Некоторые примеры молекул ROS включают синглетный O, HO, свободные радикалы, такие как OH, O , NO и ROO. Многие из указанных остатков образуются в ходе обычной метаболической активности, но величины их концентраций могут быть повышены в условиях окислительного стресса, связанного с хроническим воспалением, инфекциями и другими заболеваниями.
-
Множество молекул ROS образуется в результате естественных процессов, таких как метаболизм кислорода и воспалительные процессы. Например, если клетки используют кислород с получением энергии, то свободные радикалы образуются как следствие продукции ATP митохондрией. Физическая нагрузка может повышать уровни свободных радикалов так же, как и воздействие окружающей среды, такое как ионизирующее излучение (обусловленное промышленностью, воздействием солнечного излучения, космическим излучением и медицинским рентгеновским излучением), токсины из окружающей среды, измененные атмосферные условия (например, гипоксия и гипероксия), озон и оксид азота (в основном из выхлопных газов автомобилей, лечебных средств). Также известно, что на уровни свободных радикалов воздействуют такие стрессорные факторы образа жизни, как курение сигарет и избыточное потребление алкоголя. Радикалы могут соединяться, образуя другие, вызывающие большее повреждение или более токсичные вещества, такие как пероксинитрит ONOO, продукт реакции супероксид-радикала и радикала оксида азота.
Другим источником ROS являются некоторые терапевтические средства, такие как противораковые лекарственные средства. Производные антрациклина представляют собой высокоэффективные противораковые средства для лечения опухолевых заболеваний, таких как острый лейкоз, злокачественная лимфома и т.д. Однако нежелательной особенностью их применения может быть окислительное повреждение ткани, способное приводить к кардиомиопатии и возможной сердечной недостаточности. Таким образом, присутствие терапевтического средства может вызывать развитие застойной сердечной недостаточности (CHF). Эта особенность некоторых терапевтических средств может ограничивать их эффективность, и целесообразно разработать соответствующую схему совместного введения.
Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или по меньшей мере ослабления у индивидуума нарушения, обусловленного введением терапевтического средства, где способ включает совместное введение индивидууму:
i) терапевтического средства; и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ii) эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы I, формулы II, формулы III или формулы IV, где R, R, R, R, R, R, R, R, R, U, Q, W, X, Y, Z, n имеют такое же значение, как указано выше, или их фармацевтически приемлемой соли или сольватов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или по меньшей мере ослабления повреждения кожи индивидуума в результате УФ-облучения, где способ включает введение терапевтически эффективного количества композиции по изобретению. Предпочтительно, в данном аспекте композицию составляют в виде солнцезащитного вещества. Композицию можно местно наносить на кожу. Композиция может содержать смягчающие вещества и увлажнители.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или предотвращения развития эффектов старения, снижения выраженного образования морщин и/или лечения или профилактики сухой кожи.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума с заболеванием или нарушением, включающим окислительное повреждение, где способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества композиции по изобретению.
Предпочтительно, заболевание или нарушение, включающее окислительное повреждение, выбирают из группы, состоящей из рака, заболевания сердца, неврологических заболеваний, аутоиммунных заболеваний, повреждения в результате ишемии и реперфузии, осложнений при диабете, септического шока, гепатита, атеросклероза, болезни Альцгеймера и осложнений, возникающих в результате ВИЧ или гепатита, включая гепатит B.
В конкретном варианте осуществления индивидуумом является животное. Животное может быть выбрано из группы, включающей человека, не относящихся к человеку приматов, крупный рогатый скот, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек, птиц, цыплят или другую домашнюю птицу, уток, гусей, фазанов, индюков, перепелок, морских свинок, кроликов, хомяков, крыс и мышей.
В некоторых аспектах изобретения одно или несколько производных флавоноидов вводят одновременно, отдельно или последовательно вместе с одним или несколькими терапевтическими средствами.
При использовании в таком сочетании одно или несколько терапевтических средств и одно или несколько производных флавоноидов по настоящему изобретению можно вводить в виде отдельных средств в одно и то же или различное время или их можно составлять в виде единой композиции, содержащей оба соединения.
Свободные радикалы реагируют с ключевыми органическими субстратами в клетках, например с липидами, белками и ДНК. Окисление таких биомолекул может повредить их, нарушая нормальные функции, и может способствовать множеству болезненных состояний. Было отмечено, что определенные системы органов предрасположены к более высоким степеням окислительного стресса или нитрозирующего стресса. Эти наиболее чувствительные к повреждению системы органов представляют собой легочную систему (подвергающуюся воздействию высоких уровней кислорода), головной мозг (проявляющий интенсивную метаболическую активность, но обладающий более низкими уровнями эндогенных антиоксидантов), глаза (постоянно подвергающиеся повреждающему воздействию УФ-облучения), сердечно-сосудистую систему (страдающую от изменений уровней кислорода и оксида азота) и репродуктивные системы (подверженные риску в результате интенсивной метаболической активности сперматозоидов).
Примеры соответствующих острых нарушений, обусловленных продукцией ROS, включают ишемическую реперфузию, удар, инфаркт миокарда или повреждение вследствие механической травмы или хирургического вмешательства. Некоторые из видов хирургического вмешательства, например шунтирование сердца или трансплантационная хирургия, неизбежно вызывают ишемию и реперфузию ткани. Как правило, индивидууму до и/или в ходе хирургического вмешательства вводят одно или несколько производных флавоноидов по настоящему изобретению.
Хронические заболевания могут быть выбраны из группы, включающей рак, цереброваскулярное заболевание, атеросклероз, заболевание артерий, включая коронарное заболевание сердца, болезнь периферических сосудов (включая повреждение, обусловленное такими заболеваниями, как диабет), гипертензию, легочную гипертензию, хроническую непроходимость дыхательных путей, эмфизему, неврологические заболевания, аутоиммунные заболевания, осложнения диабета, септический и гиповолемический шок, ожоги, гепатит и осложнения, возникающие в результате гепатита и ВИЧ. Другое хроническое заболевание может быть выбрано из осложнений, возникающих в результате использования гипербарической атмосферы или атмосферы с высоким давлением кислорода, что часто применяют, чтобы способствовать дыханию, особенно у недоношенного ребенка, включая повреждение сетчатки или другого повреждения глаз. Индивидуумов с риском соответствующих хронических заболеваний можно диагностировать посредством анализа симптомов, диагностического тестирования, ферментов-маркеров или посредством генетического тестирования для выявления генетической предрасположенности. Предрасположенность к определенным острым заболеваниям, таким как инфаркт миокарда или удар, также может быть выявлена генетическим тестированием и может являться указанием для профилактического применения одного или нескольких производных флавоноидов для подверженного риску индивидуума. Индуцируемые лекарственным средством заболевания, которые обусловлены ROS, представляют собой, например, индуцируемое лекарственным средством застойное заболевание сердца.
Если заболевание или нарушение представляет собой удар или риск развития удара, то описанную выше композицию предпочтительно вводят до развития удара в качестве профилактики для снижения риска развития удара или в течение двенадцати часов (предпочтительно, в течение четырех часов) после возникновения удара.
Примером патологического состояния с вовлечением ROS является ишемия, где недостаток притока крови к определенной области организма приводит к недостаточной перфузии ткани кислородом. Ишемия вызывает повреждение ткани, где тяжесть повреждения зависит от периода времени, в течение которого ткань лишена кислорода, и от того, происходит ли надлежащая реперфузия кислородом после ишемического события.
По меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению можно вводить множеством различных способов, например местно, перорально, подкожно, внутримышечно, внутриартериально и/или внутривенно.
Синтез соединений
Настоящее изобретение относится к соединениям флавоноидов формулы I, II, III или IV, V и к способам синтеза таких соединений.
Производные флавоноидов
Фосфатные производные флавоноидов получают селективным способом защита/снятие защиты.
Динатриевая соль 3-гидроксифлавон-3-фосфата (5)
Синтез динатриевой соли 3-гидроксифлавон-3-фосфата представлен со ссылкой на фиг.1. 3-гидроксифлавон (1) подвергали фосфитилированию, затем обрабатывали дибензил-N,N-диизопропилфосфорамидитом и промежуточный фосфат непосредственно окисляли м-хлорпербензойной кислотой (mCPBA) до его соответствующего защищенного фосфата. Сложный фосфатный эфир очищали флэш-хроматографией с последующей перекристаллизацией с выходом 45%.
Сложный фосфатный эфир подвергали гидрогенолизу в этаноле с гидроксидом палладия с образованием фосфата, который сразу преобразовывали в его динатриевую соль путем добавления незначительного избытка 0,1М раствора гидроксида натрия. Снятие защиты путем гидрогенолиза обеспечивало чистый образец динатриевой соли 3-гидроксифлавон-3-фосфата с выходом 73%.
Соответствующую диаммониевую соль получали ионообменной хроматографией с использованием диэтиламиноэтиловой колонки (DEAE) соединения (5).
3',4'-дигидроксифлавон-3-фосфат (в виде динатриевой соли) (10)
Аналогичную методику применяли для синтеза аналога тригидроксифлавона, как представлено на фиг.2.
Таким образом, 3',4'-дибензилокси-3-гидроксифлавон (6) подвергали фосфотилированию диизопропил-N,N-дибензилоксифосфорамидитом в присутствии 1H-тетразола с образованием сложного 3',4'-дибензилоксифлавон-3-фосфитдибензилоксиэфира (7), который окисляли mCPBA до защищенного сложного фосфатного эфира, сложного 3',4'-дибензилоксифлавон-3-фосфатдибензилоксиэфира (8). В результате этих двух стадий получали желаемое соединение с выходом 40% после перекристаллизации.
Затем сложный фосфатный эфир подвергали гидрогенолизу в этаноле с палладием с образованием желаемого 3',3'-дигидроксилфлавон-3-фосфата (9), который преобразовывали добавлением NaOH в соответствующую динатриевую соль, динатриевую соль 3',4'-дигидроксилфлавон-3-фосфата (10).
Сложноэфирные производные флавоноидов
3-гидроксифлавон-3-гемисукцинат (15)
3-гидроксифлавон-3-гемисукцинат (15) получали реакцией, представленной на фиг.3. В результате взаимодействия янтарного ангидрида (11) и бензилового спирта (12) в присутствии 4-диметиламинопиридина (DMAP) и пиридина в дихлорметане получали монобензиловый эфир янтарной кислоты (13) в виде белых кристаллических хлопьев с выходом 77%. Полученное защищенное производное янтарной кислоты подвергали сочетанию с 3-гидроксифлавоном (1) в присутствии DCC и DMAP, образуя сложный монобензиловый эфир флавон-3-гемисукцината в виде желтого или коричневого масла, затвердевающего при стоянии, с выходом продукта вплоть до 96%.
2
С получением желаемого 3-гидроксифлавон-3-гемисукцината (15) проводили реакцию более крупного масштаба, снятие защиты со сложного монобензилового эфира с образованием соответствующего гемисукцината с использованием Pd(OAc) в системе растворителей ТГФ:EtOH:уксусная кислота.
3-гидроксифлавон-3-гемиадипат (19)
3-гидроксифлавон-3-гемиадипат (19) синтезировали в соответствии с методикой, аналогично описанной выше для гемисукцината, как представлено на фиг.4.
Монобензиловый эфир адипиновой кислоты (17) получали из адипиновой кислоты и бензилового спирта в присутствии п-TsOH, получая желаемый продукт в виде бесцветного масла с выходом 34%.
2
Затем защищенную адипиновую кислоту подвергали связыванию DCC с 3-гидроксифлавоном (1) с образованием сложного монобензилового эфира флавон-3-гемиадипата в виде желтой/коричневой смолы с выходом 59%. Гидрирование полученного соединения в присутствии катализатора Pd(OH) с использованием системы растворителей на основе ТГФ (9:1 ТГФ:EtOH+0,05% уксусная кислота) приводило к гидрогенолизу сложного монобензилового эфира с образованием флавон-3-гемиадипата в виде желтого твердого вещества с выходом 89%.
3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипат (21)
Схема синтеза 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) представлена на фиг.5. В соответствии с указанным выше способом 3',4'-дибензилокси-3-гидроксифлавон (6) и монобензиловый эфир адипиновой кислоты (17) подвергали связыванию DCC с получением сложного монобензилового эфира гемиадипата в виде коричневой смолы с выходом 59%.
Снятие защиты посредством гидрогенолиза в малом масштабе (100-500 мг) проводили постепенно до завершения в течение 3-5 часов, получая 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипат (21) с выходом 33%.
Композиции и способы
Соединения по настоящему изобретению можно составлять в композиции во множестве носителей и систем доставки. Количество подлежащего введению терапевтического соединения и концентрация соединения зависят от выбранного носителя или устройства, клинического состояния пациента, побочных эффектов и стабильности соединения в препарате. Таким образом, врач использует соответствующий препарат, который содержит терапевтическое соединение в соответствующей концентрации, и выбирает количество вводимого препарата в зависимости от клинического опыта в отношении рассматриваемого пациента или в отношении сходных пациентов.
Кроме того, в препарат можно включать эксципиенты. Примеры включают вспомогательные растворители, поверхностно-активные вещества, масла, увлажнители, смягчающие вещества, консерванты, стабилизаторы и антиоксиданты. Можно использовать любой фармакологически приемлемый буфер, например трис-буфер или фосфатный буфер. Эффективные количества разбавителей, добавок и эксципиентов представляют собой такие количества, которые эффективны с получением препарата, фармацевтически приемлемого в отношении растворимости, биологической активности и т.д.
Таким образом, композиция по изобретению содержит терапевтическое соединение, которое можно составлять вместе с общепринятыми фармацевтически приемлемыми носителями для местного, перорального или парентерального введения. Также препараты могут содержать небольшие количества адъювантов, таких как буферы и консерванты, для поддержания изотоничности, физиологической стабильности и стабильности pH.
Введение
Соединения по изобретению можно вводить как человеку, так и животным.
Соединения по настоящему изобретению можно вводить в композиции, где активное соединение тщательно смешано с одним или несколькими инертными ингредиентами, также необязательно включая один или несколько дополнительных активных ингредиентов. Соединения можно использовать в любой композиции, известной специалистам в данной области для введения человеку и животным.
Композицию по изобретению можно вводить надлежащим способом в соответствии с дозированной формой. Например, инъекцию можно осуществлять внутривенным, внутриартериальным, подкожным, внутримышечным введением и т.п.
Для орального введения можно получать твердые или жидкие единичные дозированные формы. Водорастворимые формы можно растворять в водном носителе вместе с сахаром, ароматизаторами и консервантами с образованием сиропа. Эликсир получают с использованием водно-спиртового носителя (например, этанол) с приемлемыми подсластителями, такими как сахар и сахарин, вместе с ароматизатором. Суспензии можно получать вместе с водным носителем, используя суспендирующее средство, такое как камедь, трагакант, метилцеллюлоза и т.п. Также синтетические соединения флавоноидов по настоящему изобретению можно составлять вместе со стабилизаторами, например хелатирующими металл восстанавливающими средствами, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), или восстанавливающим средством, таким как метабисульфит натрия.
Соответствующие композиции для парентерального применения очевидны практикующим специалистам в данной области.
Как правило, терапевтическое соединение получают в виде водного раствора с концентрацией приблизительно от 1 до приблизительно 100 мг/мл. Обычно концентрация составляет приблизительно от 10 до 60 мг/мл или приблизительно 20 мг/мл. В некоторых случаях могут быть необходимы концентрации ниже 1 мг/мл в зависимости от растворимости и активности соединения, выбранного для использования. Стерильный состав приемлем для различных способов парентерального введения, включая внутрикожное, внутрисуставное, внутримышечное, внутривенное, ингаляционное и подкожное введения.
Композиции по настоящему изобретению можно составлять в виде солнцезащитных средств, композиций для ухода за кожей, смягчающего средства для увлажнителей.
Для обеспечения непрерывно или длительно существующего источника терапевтического соединения вместе с описанными в настоящем описании композициями можно использовать системы доставки с замедленным или длительным высвобождением, включая любой из числа биополимеров (системы с биологической основой), системы с применением липосом и полимерные системы доставки, например дендримеры. Такие системы с замедленным высвобождением пригодны для препаратов для местного, глазного, орального и парентерального применения.
Также синтетическое соединение(я) флавоноидов по настоящему изобретению можно составлять в виде нутрифармацевтического или нутрицевтического средства. Например, синтетическое соединение(я) флавоноидов можно составлять в виде продуктов питания, таких как крупяная каша, напитков, таких как фруктовый сок, алкогольных напитков, хлеба и т.д. для орального применения.
Сосудорасширяющая и антиоксидантная активность производных флавоноидов
-8
-4
-4
Эффекты носителя, флавон-3-гемиадипата (10-10М) и DiOHF (10М) на уровень супероксид-анионов, образующихся в аорте крыс в присутствии NADPH, определяли и выражали как процент от контроля. Очевидно, что присутствие флавон-3-гемиадипата в любой концентрации не оказывает эффекта на продукцию супероксида.
-4
in vitro
Эффекты носителя, флавон-3-гемиадипата (F3HA) в присутствии и отсутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 1000 ед./л) и DiOHF (10М) на уровень супероксид-анионов, образующихся в аорте крыс в присутствии NADPH, выраженные в процентах от контроля, проиллюстрированы со ссылкой на фиг.6. В отсутствие эстеразы наблюдают отсутствие эффекта на продукцию супероксида. В присутствии холинэстеразы наблюдают зависящий от концентрации ингибирующий эффект флавон-3-гемиадипата. Это соответствует удалению гемиадипатной группы  с образованием свободного гидроксильного производного, 3-гидроксифлавона. Подавление продукции супероксида путем включения как флавон-3-гемиадипата (19), так и эстеразы выгодно отличается от активности DiOHF (3',4'-дигидроксифлавонола). Снижение концентрации супероксида и других ROS связывали с возможным уменьшением повреждения миокарда, индуцируемого присутствием указанных радикалов.
2+
-8
-4
-8
-5
2+
-4
Определяли кривые концентрация-ответ на Ca в присутствии носителя или возрастающих концентраций флавон-3-гемиадипата (15) (F3HA, 10М-10М) в эндотелии неповрежденных колец аорты, выделенных у крыс. При более низких концентрациях (10М-10М) флавон-3-гемиадипат не оказывал эффекта на сокращение кольца аорты вследствие Ca. При более высоком тестируемом уровне, 10 М, флавон-3-гемиадипат оказывает определенный ингибирующий эффект, вероятнее всего, вследствие наличия эстеразы в ткани аорты крысы.
2
-8
-4
-4
Эффекты носителя (dHO), 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) (DiOHF3HA, 10М-10М) и DiOHF (10М) на уровень супероксид-анионов, образующихся в аорте крыс в присутствии NADPH, выражали как процент от контроля. Концентрация супероксида оставалась постоянной на протяжении всего исследуемого диапазона концентрации DiOHF3HA, следовательно, DiOHF3HA не оказывал на образование супероксида.
-6
-4
-4
Эффекты носителя, 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) (DiOHF3HA, 10М-10М) в присутствии и отсутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 1000 ед./л) на уровень супероксид-анионов, образующихся в аорте крыс в присутствии NADPH, выраженные как процент от контроля, проиллюстрированы со ссылкой на фиг.7. Для сравнения также представлены выраженные как процент от контроля результаты использования DiOHF (10М) в отношении уровня супероксид-анионов, образующихся в аорте крыс в присутствии NADPH. В отношении присутствия холинэстеразы было выявлено зависящее от концентрации ингибирование уровней супероксида.
2+
-6
-4
2+
-3
-4
2+
Определяли кривые концентрация-ответ для Ca в присутствии носителя или возрастающих концентраций 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) (DiOHF3HA, 10М-10М) в эндотелии неповрежденных колец аорты, выделенных у крыс. Величины сужения выражены как процент от исходной реакции на Ca (3×10М), наблюдаемой до обработки DiOHF3HA. Для DiOHF3HA при 10М наблюдали незначительно ингибирующее действие на Ca. Возможно, этот эффект обусловлен наличием некоторого количества эстеразы в ткани аорты крысы.
2+
-4
2+
-3
Со ссылкой на фиг.8 проиллюстрировано сравнение кривых концентрация-ответ для Ca в присутствии носителя или 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) (DiOHF3HA, 10М), в присутствии и отсутствие BuCHE, с DiOHF в эндотелии неповрежденных колец аорты, выделенных у крыс. Величины сужения выражены как процент от исходной реакции на Ca (3×10М), наблюдаемой до обработки DiOHF3HA. Наличие холинэстеразы значительно усиливало ингибирующий эффект DiOHF3HA.
-8
-4
-4
На фиг.9 представлены выраженные как процент от контроля эффекты носителя, флавон-3-фосфата (F3P, 10М-10М), в присутствии фосфатазы (1000 ед./л) и DiOHF (10М) на уровень супероксид-анионов, образующихся в аорте крыс в присутствии NADPH. Наличие флавон-3-фосфата вызывало зависящее от концентрации снижение уровней супероксида. Этот эффект противоречит предшествующим исследованиям, в которых было показано, что наличие 3',4'-дигидроксильной группы в кольце B является определяющим в снижении уровней супероксида.
2+
-6
-4
Определяли кривые концентрация-ответ для Ca в присутствии носителя или возрастающих концентраций флавон-3-фосфата (F3P, 10М-10М) в эндотелии неповрежденных колец аорты, выделенных у крыс. При наивысшей концентрации флавон-3-фосфат вызывал частичное ингибирование сужения, индуцируемого кальцием.
2+
-8
-4
2+
-3
Со ссылкой на фиг.10 представлены кривые концентрация-ответ на Ca в присутствии носителя или флавон-3-фосфата (F3P, 10М-10М) в присутствии и отсутствие фосфатазы (P, 1000 ед./л) в эндотелии неповрежденных колец аорты, выделенных у крыс. Величины сужения выражены как процент от исходной реакции на Ca (3×10М), наблюдаемой до обработки флавон-3-фосфатом. Наличие фосфатазы значительно усиливало ингибирующие эффекты флавон-3-фосфата.
Изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Синтез производных флавоноидов
3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
5,6
6,7
7,8
5,7
6,7
7,8
5,7
3
2
2
2
2
2
2
42
36
8
28
24
6
1
13
+
+
К раствору монобензилового эфира адипиновой кислоты (0,168 г, 0,754 ммоль) в дихлорметане (10 мл) добавляли 3-гидроксифлавон (0,105 г, 0,442 ммоль), дициклогексилкарбодиимид (0,193 г, 0,933 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (9,80 мг, 0,0802 ммоль) и смесь перемешивали в течение 19 часов при комнатной температуре в атмосфере N. Добавляли воду (50 мкл), полученную смесь перемешивали в течение 10 минут и затем добавляли простой диэтиловый эфир (10 мл). Смесь фильтровали, фильтрат концентрировали и очищали флэш-хроматографией (15-40% EtOAc в толуоле) с получением сложного монобензилового эфира в виде желтой смолы (0,16 г, 80%). Небольшую порцию перекристаллизовывали из смеси EtOAc/уайт-спирит с получением бесцветного порошка; т.пл.=74-76ºC; H ЯМР (399,7 МГц, CDCl) δ 1,60-1,75 (м, 4H, COCHCH); 2,31 (т, J=6,8 Гц, 2H, COCH); 2,55 (т, J=6,8 Гц, 2H, COCH); 5,02 (с, 2H, CHPh); 7,20-7,28, 7,39-7,45 (2м, H, PhCH, H3', 4', 5'); 7,34 (дд, 1H, J=8,0 Гц, J=7,6 Гц, H6); 7,46 (д, 1H, J=8,0 Гц, H8); 7,62 (ддд, 1H, J=1,6 Гц, J=7,6 Гц, J=8,0 Гц, H7); 7,73-7,77 (м, 2H, H2', 6'); 8,16 (дд, 1H, J=1,6 Гц, H5). C ЯМР (100,5 МГц, CDCl) δ 25,29 (2C, COCHCH); 34,62, 34,91 (2C, COCH); 67,30 (1C, CHPh); 119,21, 124,68, 126-29, 127,17, 129,29, 129,40, 129,63, 129,75, 131,05, 132,36, 134,72, 135,06, 137,03, 156,7I, 157,45 (20C, Ar); 171,54, 173,27, 174,16 (3C, C=O). Элементный анализ: C, 73,54; H, 5,27; CHO вычислено C, 73,67; H, 5,30%, HRMS (ESI) m/z 479,1469, CHNaO [M+Na] вычислено 479,1471.
3-гидроксифлавон-3-гемиадипат
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
5,6
6,7
7,8
5,7
6,7
7,8
5,6
5,7
3
2
2
2
2
2
21
18
6
21
18
6
1
13
+
+
Смесь 3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона (312 мг, 0,7 ммоль) и Pd(OH) (49,4 мг) в смеси 9:1 ТГФ:EtOH+0,05% уксусная кислота (15 мл) обрабатывали H в течение 5 часов. Неочищенный продукт фильтровали (целит), фильтрат концентрировали и осадок очищали флэш-хроматографией (10-25% EtOAc в толуоле+1% уксусная кислота) с получением гемиадипата в виде светло-желтого твердого вещества (0,211 г, 89%). Небольшую порцию перекристаллизовывали из смеси EtOAc/уайт-спирт с получением бесцветного порошка; т.пл.=118-121ºC; H ЯМР (399,7 МГц, CDCl) δ 1,66-1,83 (м, 4H, CHCHCO); 2,38 (т, J=6,8 Гц, 2H, CHCO); 2,63 (т, J=6,8 Гц, 2H, COCH); 7,42 (дд, 1H, J=8,0 Гц, J=8,0 Гц, H6); 7,47-7,53 (м, 3H, H3', 4', 5'); 7,54 (д, 1H, J=8,4 Гц, H8); 7,70 (ддд, 1H, J=1,6 Гц, J=8,0 Гц, J=8,4 Гц, H7); 7,81-7,86 (м, 2H, H2', 6'); 8,24 (дд, 1H, J=8,0 Гц, J=1,6 Гц, H5). C ЯМР (100,5 МГц, CDCl) δ 25,01, 25,20 (2C, COCHCH); 34,57 (2C, COCH); 119,20, 124,66, 126,33, 127,21, 129,41, 129,76, 131-04, 132,40, 134,70, 135,10, 156,74, 157,60 (14C, Ar); 171,52, 173,38, 179,36 (3C, C=O). Элементный анализ: C, 68,89; H, 4,91; CHO вычислено C, 68,85; H, 4,95%, HRMS (ESI) m/z 389,1000, CHNaO [M+Na] вычислено 389,1001).
4'-(бензилокси)-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон
3
4
3
2
2
2
2
2
2
5,7
6,7
7,8
3
2
2
35
30
7
1
13
-1
К раствору 4'-бензилокси-3-гидроксифлавона (1,00 г, 2,90 ммоль), монобензилового эфира адипиновой кислоты (1,30 г, 5,50 ммоль) и DMAP (354 мг, 2,89 ммоль) в дихлорметане (110 мл) добавляли дихлорэтан (EDC) (843 мг, 4,40 ммоль) и перемешивали смесь в течение ночи при комнатной температуре. Затем реакционную смесь концентрировали и осадок растворяли в этилацетате. Органическую фазу промывали водой (×3), 1М HCl (×3), насыщенным NaHCO (×3), насыщенным раствором соли (×3), сушили (MgSO) и концентрировали. Осадок очищали флэш-хроматографией (50% EtOAc/бензин) с получением сложного бензилового эфира в виде коричневого масла, которое кристаллизовали из смеси EtOAc/уайт-спирит с получением бесцветного твердого вещества (900 мг, 55%); т.пл. 93ºC; H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 1,77-1,83 (м, 4H, CHCH), 2,42 (т, 2H, J=7,5 Гц, CHCO), 2,67 (т, 2H, J=6,5 Гц, CHCO), 5,13 (с, 2H, CHPh), 5,15 (с, 2H, CHPh), 7,09 (д, 1H, J7,8=8,5 Гц, H8), 7,35 (кажущийся, д, 2H, J=8,5 Гц, H2',6'), 7,40-7,46 (м, 11H, 2×Ph, H6), 7,69 (ддд, 1H, J=1,5, J=7,0, J=8,5 Гц, H7), 7,85 (кажущийся, д, 2H, J=8,5 Гц, H3',5'), 8,25 (4 1H, J=8 Гц, H5); C ЯМР  (125 МГц, CDCl) δ 24,2 (×2), 33,6, 33,8 (4C, CH), 66,2, 70,1 (2C, CHPh), 115,0, 117,9, 122,4, 123,5, 125,0, 126,0, 127,4, 128,1, 128,2, 128,5, 128,7, 130,0, 133,0, 133,7, 135,9, 136,2, 155,5, 156,1, 161,1 (AT), 170,4, 172,0, 173,0 (3C, C=O); ИК (тонкая пленка) 2937, 1760, 1730, 1646, 1602, 1507, 1468, 899 см; Элементный анализ: C, 74,67; H, 5,29, CHO вычислено C, 74,72; H, 5,37%.
4'-гидроксифлавон-3-гемиадипат
2
6
2
2
2
2
6,7
7,8
5,6
6,7
5,6
6
2
21
19
7
1
13
-1
+
+
Смесь 4'-(бензилокси)-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона (400 мг, 0,711 ммоль) и Pd(OH) (56 мг) в ТГФ (10 мл), этаноле (1,2 мл) и AcOH (100 мкл) обрабатывали водородом (50 фунт/кв.дюйм) в течение 18 часов. Затем реакционную смесь фильтровали (слой целлита) и слой промывали ТГФ. Фильтрат концентрировали, очищали твердый осадок флэш-хроматографией (70% ТГФ/толуол+1% AcOH) и полученное твердое вещество перекристаллизовывали из смеси ТГФ/уайт-спирит с получением кислоты в виде бесцветного твердого вещества (150 мг, 55%); т.пл. 177-180ºC; H ЯМР (500 МГц, d-ДМСО) δ 1,56-1,66 (м, 4H, CHCH), 2,25 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,64 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 6,96 (кажущийся, д, 2H, J=8,5 Гц, H2',6'), 7,52 (т, 1H, J=J=7,5 Гц, H7), 7,80 (кажущийся, д, 2H, J=7,5 Гц, H3',5'), 7,78 (м, 1H, H8), 7,85 (т, 1H, J=J=7,5 Гц, H6), 8,06 (д, 1H, J=8,0 Гц, H5); C ЯМР (125 МГц, d-ДМСО) δ 23,8, 23,9, 32,9, 33,3 (4C, CH), 115,9, 118,5, 119,7, 122,7, 125,0, 125,6, 130,1, 131,9, 134,5, 154,9, 155,8 160,6 (Ar), 170,4 170,9, 174,3 (3C, C=O); ИК 3257, 2944, 2869, 1765, 1706, 1595, 854 см; HRMS (ESI) m/z 383,1123, CHO (M+H] вычислено 383,1131.
3',4'-дибензилокси-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон
2
3
4
3
2
2
2
2
2
2
2
7,8
5,7
6,7
7,8
5,5
5,7
3
2
2
2
2
2
2
42
36
8
42
36
8
1
13
+
+
К перемешиваемому раствору 3',4'-дибензилоксифлавонола (1,21 г, 2,68 ммоль) в сухом дихлорметане (100 мл) добавляли монобензиловый эфир адипиновой кислоты (1,91 г, 5,04 ммоль), затем гидрохлорид EDC (0,764 г, 3,98 ммоль) и DMAP (0,324 г, 2,65 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре в атмосфере N. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и ресуспендировали в этилацетате (100 мл). Затем суспензию промывали водой (3×50 мл), 1М HCl (3×50 мл), насыщенным NaHCO (3×50 мл) и насыщенным раствором соли (3×50 мл). Органический экстракт сушили (MgSO), фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и кристаллизовали желтый осадок из смеси EtOAc/уайт-спирит с получением сложного бензилового эфира в виде рыхлого желтого твердого вещества (1,58 г, 88%); т.пл.=84-85ºC; H ЯМР (399,8 МГц, CDCl) δ 1,70-1,80 (м, 4H, CHCH); 2,38 (т, 2H, J=6,8 Гц, CHCO); 2,55 (м, 2H, CHCO); 5,10 (с, 2H, CHPh); 5,20 (с, 2H, CHPh); 5,24 (с, 2H, CHPh); 7,01 (д, 1H, J=8,4 Гц, H8); 7,26-7,49 (м, 19H, Ar, H6, 2', 5 6'); 7,62 (ддд, 1H, J=1,2 Гц, J=7,2 Гц, J=8,4 Гц, H7); 8,22 (дд, 1H, J=7,6 Гц, J=1,2 Гц, H5). C ЯМР (100,5 МГц, CDCl) δ 25,33 (2C, CHCHCO); 34,59, 34,93 (2C, CHCO); 67,30, 71,91, 72,59 (2C, CHPh); 114,77, 115,84, 119,06, 123,76, 123,84, 124,60, 126,19, 127,12, 128,25, 128,36, 129,15, 129,29, 129-64, 129,73, 130,12, 134,23, 134,89, 137,05, 137,54, 137,85, 149,61, 152,64, 156,53, 157,00 (32C, Ar); 171,49, 173,12, 174,18 3C, C=O). Элементный анализ: C, 75,39; H, 5,47; CHO вычислено C, 75,43; H, 5,43%, HRMS (ESI) m/z 691,2303, CHNaO [M+Na] вычислено 691,2308.
3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипат
2
2
3
2
2
2
2
5',6'
2',6'
5',6'
7,8
5,7
6,7
7,8
5,6
5,7
6
2
2
2
2
2
21
18
6
21
18
6
1
13
+
+
Смесь 3',4'-дибензилокси-3-(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона (2,12 г, 3,16 ммоль) и Pd(OH) (107 мг) в смеси 9:1 ТГФ:EtOH, содержащей 0,05% уксусную кислоту (50,0 мл), обрабатывали в течение 5 часов H при высоком давлении. Реакционную смесь фильтровали (целит) и концентрировали с получением темно-зеленого твердого вещества. Зеленый осадок очищали флэш-хроматографией (30-90% ТГФ/толуол+1% уксусная кислота) с последующей кристаллизацией из смеси ТГФ/уайт-спирит с получением чистого гемиадипата в виде светло-коричневого твердого вещества (0,70 г, 56%); т.пл.=194-197ºC; H ЯМР (399,8 МГц, CDCl) δ 1,44-1,62 (м, 4H, CHCH); 2,10 (т, 2H, J=6,8 Гц, CHCO); 2,44 (т, 2H, J=6,8 Гц, CHCO); 6,73 (д, 1H, J=8,4 Гц, H5'); 7,09 (дд, 1H, J=2,0 Гц, J=8,4 Гц, H6'); 7,16-7,22 (м, 2H, H6, 2'); 732 (д, 1H, J=8,0 Гц, H8); 7,48 (ддд, 1H, J=1,6 Гц, J=6,8 Гц, J=8,0 Гц, H7); 7,94 (дд, 1H, J=8,4 Гц, J=1,6 Гц, H5). C ЯМР (100,5 МГц d-ДМСО) δ 25,30, 25,62 (2C, CHCHCO); 34,43, 34,81 (2C, CHCO); 116,59, 117,42, 119,98, 121,41, 122,06, 124,13, 126,51, 127,07, 133,32, 136,04, 146,97, 150,65, 156,35, 157,27 (14C, Ar); 171,97, 173,46, 179,95 (3C, C=O). Элементный анализ: C, 68,89; H, 4,91; CHO вычислено C, 68,85; H, 4,95 %, HRMS (ESI) m/z 389,1000, CHNaO [M+Na] вычислено 389,1001.
3,4'-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон
3
4
3
2
2
2
2
2
2
2
2
5,6
6,7
7,8
6,7
7,8
7,5
5,6
5,7
3
2
41
38
10
1
13
-1
К раствору 3,4'-дигидроксифлавона (500 мг, 1,97 ммоль), монобензилового эфира адипиновой кислоты (1,86 г, 7,88 ммоль) и DMAP (481 мг, 3,94 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляли дихлорэтан (1,13 г, 5,91 ммоль) и смесь перемешивали в течение 50 минут при комнатной температуре. Затем реакционную смесь концентрировали и осадок растворяли в этилацетате. Органическую фазу промывали водой (×3), 1М HCl (×3), насыщенным NaHCO (×3), насыщенным раствором соли (×3), сушили (MgSO) и концентрировали. Осадок очищали флэш-хроматографией (50% EtOAc/бензин) с получением сложного диэфира в виде бесцветного масла, которое кристаллизовали из EtOAc/уайт-спирит с получением бесцветного твердого вещества (850 мг, 62%); т.пл. 79ºC; H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 1,76-1,82 (м, 8H, 2×CHCH), 2,42 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,45 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,62 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,65 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 5,12 (с, 2H, CHPh), 5,14 (с, 2H, CHPh), 7,25 (д, 2H, J=8,5 Гц, H2',6'), 7,31-7,37 (м, 10H, 2×Ph), 7,44 (т, 1H, J=J=8,5 Гц, H6), 7,55 (д, 1H, J=8,5 Гц, H8), 7,72 (тд, 1H, J=J=8,5, J=1,5 Гц, H7), 7,89 (д, 2H, J=8,5 Гц, H3',5'), 8,25 (дд, 1H, J=8,5, J=1,5 Гц, H8); C ЯМР (125 МГц, CDCl) δ 24,16, 24,17, 24,21, 33,5, 33,8, 33,9, 66,1, 66,3 (CH), 118,0, 121,9, 123,5, 125,2, 126,1, 127,4, 128,1, 128,18, 128,22, 128,49, 128,53, 129,7, 133,7, 134,0, 135,9, 136,0, 152,8, 155,4, 155,5 (Ar), 170,3, 171,2, 172,1, 173,97, 173,0 (5C, C=O); ИК 2943, 1765, 1732, 1652, 1501, 1465, 902 см; Элементный анализ: C, 71,30; H, 5,56, CHO вычислено C, 71,29; H, 5,55%.
Флавон-3,4'-бис(гемиадипат)
2
6
2
2
2
2
2
2
5,6
6,7
7,8
6,7
7,8
5,7
5,6
5,7
6
27
25
10
1
13
-1
-
-
Смесь 3,4'-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона (435 мг, 0,629 ммоль) и Pd(OH) (50 мг) в EtOAc (5 мл) обрабатывали в течение 2 часов водородом, получая серый осадок. Для растворения осадка добавляли ТГФ и смесь фильтровали (слой целита). Слой промывали ТГФ и концентрировали фильтрат. Твердый осадок перекристаллизовывали из смеси ТГФ/уайт-спирит с получением бис(гемиадипата) в виде бесцветного твердого вещества (183 мг, 50%); т.пл. 133ºC; H ЯМР (500 МГц, d-ДМСО) δ 1,55-1,70 (м, 8H, CHCH), 2,24 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,27 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,63 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,64 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 7,37 (кажущийся, д, 2H, J=9,0 Гц, H3',5'), 7-55 (дд, 1H, J=8,5, J=7,5, Гц, H6), 7,80 (д, 1H, J=8,5 Гц, H8), 7,88 (ддд, 1H, J=7,5, J=8,5, J=1,5 Гц, H7), 7,96 (кажущийся, д, 2H, J=9,0 Гц, H2',6'), 8,08 (дд, 1H, J=8,5, J=1,5 Гц, H5); C ЯМР (125 МГц, d-ДМСО) δ 23,77, 23,82, 32,6, 33,2, 33,3; 44,3 (CH2), 118,7, 122,5, 122,6, 122,7, 125,1, 126,8, 129,7, 132,9, 134,8, 152,7, 154,9, 155,1 (Ar), 170,4, 171,1, 171,4, 174,3, 174,3 (5C, C=O); ИК 3059, 2940, 2873, 1768, 1706, 1504, 759 см; HRMS (ESI) m/z 509,1441, CHO [M -H] вычислено 509,1442.
3,7-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавон
3
4
3
2
2
2
2
2
5,6
3
2
41
38
10
1
13
-1
К раствору 3,7-дигидроксифлавона (250 мг, 0,983 ммоль), монобензилового эфира адипиновой кислоты (921 мг, 3,90 ммоль) и DMAP (220 мг, 1,80 ммоль) в дихлорметане (25 мл) добавляли дихлорэтан (EDC) (517 мг, 2,7 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем реакционную смесь концентрировали и осадок растворяли в этилацетате. Органическую фазу промывали водой (×2), 1М HCl (×2), насыщенным NaHCO (×2), насыщенным раствором соли (×2), сушили (MgSO) и концентрировали. Осадок фильтровали через слой оксида кремния, элюируя смесью 50% EtOAc/уайт-спирит, с получением твердого вещества, которое перекристаллизовывали из смеси EtOAc/уайт-спирит с получением сложного диэфира в виде бесцветного твердого вещества (565 мг, 91%); т.пл. 58ºC; H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 1,74-1,82 (м, 8H, CHCH×2), 2,39 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,45 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,62-2,64 (м, 4H, CHCO×2), 7,15-7,17 (м, 2H, H2', 6'), 7,30-7,36 (м, 10H, 2×Ph), 7,39 (д, 1H, J6,8=1,6 Гц, H8), 7,48-7,51 (м, 2H, H3', 5'), 7,81-7,83 (м, 2H, 4' H6) 8,25 (д, 1H, J=9, H5); C ЯМР (125 МГц, CDCl) δ 24,1, 24,20, 24,21, 33,5, 33,80, 33,82, 34,0, 44,7, 66,2, 66,3, (CH), 111,0, 119,5, 121,5, 172,5, 128,19, 128,22, 128,3, 128,5, 128,6, 128,7, 129,8, 131,3, 133,7, 135,9, 136,0, 154,8, 156,1, 156,6 (Ar), 170,3, 170,8, 171,5, 172,96, 173,0 (5C, C=O); ИК 3071, 3035, 2944, 2876, 1760, 1726, 1615, 848 см; Элементный анализ: C, 71,34; H, 5,60%, CHO вычислено C, 71,29; H, 5,55%.
3,7-дигидроксифлавон-3,7-бис(гемиадипат)
2
6
2
2
2
2
2
6,8
5,6
6
2
27
26
10
1
13
-1
Смесь 3,7-ди(бензилоксикарбонилбутилкарбонилокси)флавона (565 мг, 0,818 ммоль) и Pd(OH) (65 мг) в EtOAc (10 мл) обрабатывали водородом в течение 3 часов. Образовывался серый осадок, и добавляли ТГФ до тех пор, пока осадок не растворится. Смесь фильтровали (слой целита), слой промывали ТГФ и фильтрат концентрировали. Твердый осадок перекристаллизовывали из смеси ТГФ/уайт-спирит с получением двухосновной кислоты в виде бесцветного твердого вещества (311 мг, 76%); т.пл. 128ºC; H ЯМР (400 МГц, d-ДМСО) δ 1,55-1,74 (м, 8H, CHCH×2), 2,23 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,28 (т, 2H, J=7,0 Гц, CHCO), 2,61-2,68 (м, 4H, CHCO×2), 734 (м, 1H, H4'), 7,58-7,61 (м, 3Н, H6, H2', 6'), 7,68 (д, 1H, J=1,6 Гц, H8), 7,87-7,89 (м, 2H, H3', 5'), 8,12 (д, 1H, J=8,8, H5); C ЯМР (100 МГц, d-ДМСО) δ 23,7, 23,76, 23,78, 23,9, 32,9, 33,19, 33,24, 33,28 (CH), 111,9, 120,5, 120,6, 126,6, 128,1, 129,0, 129,2, 131,7, 133,0, 154,9, 155,6, 155,9 (Ar), 170,4, 170,6, 171,1, 174,2, 174,3 (5C, C=O); ИК 3035, 2952, 2920, 1762, 1708, 1112 см; Элементный анализ: C, 63,64; H, 5,14%, CHO вычислено C, 63,53; H, 5,13%.
Получение фосфатов флавонола
3-(дибензилоксифосфорилокси)флавон
2
2
2
4
3
4
3
2
7,8
5,7
6,7
7,8
5,6
5,7
3
2
C,P
3
29
23
6
29
23
6
1
13
31
+
+
К раствору 3-гидроксифлавона (3,00 г, 12,6 ммоль) в сухом дихлорметане (150 мл) добавляли дибензилдиизопропилфосфорамидит (12,5 мл, 38,0 ммоль) и 1H-тетразол (74,0 мл, 31,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре в атмосфере N. Затем смесь охлаждали до -78°C и добавляли m-CPBA (8,72 г, 50,6 ммоль). Смеси давали вернуться к комнатной температуре и перемешивали в течение дополнительных 45 минут. Реакционную смесь промывали 0,25М NaSO (3×100 мл), насыщенным NaHCO (3×100 мл) и водой (2100 мл). Органический экстракт сушили (MgSO), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного белого твердого вещества. Неочищенное вещество очищали флэш-хроматографией (20-50% EtOAc в толуоле) с последующей кристаллизацией из смеси EtOAc/уайт-спирит с получением защищенного фосфата в виде белого рыхлого твердого вещества (5,28 г, 84 %); т.пл.=85-88ºC; H ЯМР (399,7 МГц, CDCl) δ 5,09-5,17 (м, 4H, CHPh); 7,22-7,30, 7,38-7,47 (2×м, 14H, Ar, H3', 4', 5',6'); 7,51 (д, J=8,5 Гц, H8); 7,69 (ддд, J=1,5 Гц, J=7,2 Гц, J=8,5 Гц, 1H, H7); 7,93-7,96 (м, 2H, H2',6'); 8,29 (дд, J=7,5 Гц, J=1,5 Гц, 1H, H5). C ЯМР (100,5 МГц, CDCl) δ  78,13 (2C, CHPh); 119,13, 124,86, 126,23, 127,22, 128,90, 129,36, 129,48, 129,62, 130,06, 131,03, 132,29, 135,06, 157,03, 157,10 (25C, Ar); 136,89 (1C, J=8,0 Гц, C-O-фосфат); 173,87 (1C, C=O), P ЯМР (161,8 МГц, CDCl) δ -7,45 (с, P=O). Элементный анализ: C, 69,81; H, 4,60; CHOP вычислено C, 69,88; H, 4,65%, HRMS (ESI) m/z 521,1126, CHNaOP [M+Na] вычислено 521,1130].
Динатриевая соль 3-гидроксифлавон-3-фосфата
2
2
5,6
5,7
7,8
5,7
6,7
7,8
5,6
5,7
2
2
15
11
2
6
1
13
31
Раствор 3-(дибензилоксифосфорилокси)флавона (2,05 г, 4,09 ммоль) и палладия на углероде (10%, 0,25 г) в смеси EtOH:вода (4:1, 250 мл) обрабатывали в течение 3,5 часов H при атмосферном давлении. Реакционную смесь фильтровали (целит) и фильтрат обрабатывали NaOH (0,50 г в 100 мл воды). Водную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем кристаллизовали из смеси вода/ацетон с получением фосфата в виде светло-желтых кристаллов (1,03 г, выход 87%). H ЯМР (499,7 МГц, DO) δ 7,33 (дд, 1H, J=8,0 Гц, J=1,2 Гц, H6); 7,40-7,46 (м, 3H, H3', 4', 5'); 7,52 (д, 1H, J=8,5 Гц, H8); 7,64 (ддд, 1H, J=1,2 Гц, J=7,5 Гц, J=8,5 Гц, H7); 7,97 (дд, 1H, J=8,0 Гц, J=1,2 Гц, H5); 8,10 (м, 2H, H2', 6'). C ЯМР (100,5 МГц, DO) δ 118,29, 122,92, 124,97, 125,06, 128,50, 129,15, 130,92, 131,33, 134,22, 155,06, 156,68 (13C, Ar); 136,11 (1C, JC, P=6,8 Гц, C-O-P); 177,15 (1C, C=O), P ЯМР (161,8 МГц, DO) δ 2,98 (с, P), Элементный анализ: C, 49,68; H, 2,51; CHNaOP вычислено C, 49,74; H, 2,50%.
4'-(бензилокси)-3-(дибензилоксифосфорилокси)флавон
2
2
3
3
4
3
2
2
2
5,6
6,7
7,8
6,7
7,8
7,8
6,8
3
2
3
35
29
7
1
13
31
-1
К смеси 4'-бензилокси-3-гидроксифлавона (1,00 г, 2,72 ммоль), дибензил-N,N-диизопропилфосфорамидита (1,5 мл, 1,6 г, 4,4 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляли 1H-тетразол (483 мг, 6,89 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Добавляли дополнительный дибензил-N,N-диизопропилфосфорамидит (1,0 мл, 1,1 г, 1,5 ммоль) и реакционную смесь дополнительно перемешивали в течение 1 часа. Затем реакционную смесь охлаждали до -78°C и добавляли m-CPBA (3,00 г, 12,1 ммоль, 70% масс./масс.). Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 45 минут. Органический слой промывали 0,25М NaSO (×3), насыщенным NaHCO (×3), насыщенным раствором соли (×3), сушили (MgSO) и концентрировали. Осадок очищали флэш-хроматографией (50% EtOAc/бензин) с получением желтого твердого вещества, которое перекристаллизовывали из смеси EtOAc/уайт-спирит с получением фосфата в виде бесцветного твердого вещества (1,01 г, 58%); т.пл. 101ºC; H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 5,02 (с, 2H, CHPh), 5,16 (с, 2H, CHPh), 5,17 (с, 2H, CHPh), 6,97 (кажущийся, д, 2H, J=8,8 Гц, H3',5'), 7,29-7-36 (м, 15H, 3×Ph), 7,41 (т, 1H, J=J=8,0 Гц, H6), 7,51 (д, J=8,5 Гц, H8), 7,68 (дд, 1H, J=8,0, J=8,5 Гц, H7), 7,96 (кажущийся, д, 2H, J=8,8, H2',6'), 8,30 (дд, 1H, J=8,5, J=1,5 Гц, H8); C ЯМР (100 МГц, CDCl) δ 69,9, 70,0 (CH), 144,7, 117,9, 122,3, 123,7, 125,0, 126,1, 127,4, 127,8, 128,2, 128,4, 128,7, 130,7, 133,8, 135,8, 135,9, 136,1, 155,2, 155,7, 161,0 (Ar), 172,6 (1C, C=O); P ЯМР (162 МГц, CDCl) δ -5,3 (с, P); ИК 3063, 3031, 1647, 1601, 1506, 983 см; Элементный анализ: C, 72,60; H, 5,05%, CHOP вычислено C, 71,52; H, 4,83%.
Динатриевая соль флавон-3-фосфата
2
2
5,6
6,7
7,8
6,7
7,8
5,6
2
3
15
10
7
1
13
31
-1
-
Смесь 4'-(бензилокси)-3-(дибензилоксифосфорилокси)флавона (1,00 г, 1,65 ммоль) и Pd(OH) (120 мг) в ТГФ (10 мл) и воде (15 мл) обрабатывали водородом в течение 3 суток. Смесь фильтровали (слой целита), слой промывали ТГФ и водой и фильтрат концентрировали. Твердый осадок растворяли в ТГФ (20 мл), добавляли воду (10 мл) и триэтиламин (600 мкл, 4,3 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь концентрировали и осадок растворяли в воде. Нерастворимое вещество удаляли фильтрованием и раствор пропускали через ионообменную колонку. Элюент концентрировали с получением твердого вещества, которое перекристаллизовывали из смеси ацетон/вода с получением фосфата в виде коричневого твердого вещества (226 мг, 36%); т.пл. 182-184ºC; H ЯМР (500 МГц, DO) δ 7,07 (кажущийся, д, 2H, J=8,5 Гц, H3', 5'), 7,62 (т, 1H, J=J=7,5 Гц, H6), 7,72 (д, J=8,5 Гц, H8), 7,92 (т, 1H, J=J=7,5 Гц H7), 8,18 (д, 1H, J=7,5 Гц, H5) 8,19 (кажущийся, д, 2H, J=8,5, H2',6'); C ЯМР (100 МГц, DO) δ 118,4, 122,5, 122,6, 124,9, 125,3, 131,2, 134,4, 155,0, 157,1, 157,2, 15S,5 (Ar), 176,3 (1C, C=O); P ЯМР (162 МГц, CDCl) δ 0,60 (с, P); ИК 3281, 1597, 1579, 1542, 1393, 903 см; HRMS (ESI-) m/z 333,0160, CHOP [M+H] вычислено 333,0159.
Хлорид 4'-(бензилокси)-3-(триметиламмониилпропилкарбонилокси)флавона
2
3
2
2
3
2
2
7,8
5,6
1
Смесь карбоксипропилтриметиламмонийхлорида (0,5 г, 2,7 ммоль) и тионилхлорида (2 мл), 3,26 г, 27 ммоль) перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель выпаривали, осадок растворяли в нитробензоле (2 мл) и добавляли 4'-бензилоксифлавонол (344 мг, 1,00 ммоль). Раствор перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре и затем в течение 5 часов при 65°C. Удаляли при пониженном давлении нитробензол (водяная баня 80°C) и осадок очищали фильтрованием через слой оксида кремния (7:2:1 EtOAc:MeOH:HO). Осадок промывали ТГФ и перекристаллизовывали из смеси этанол/уайт-спирит с получением желтого порошка (30 мг); H ЯМР (399,7 МГц, CDCl) δ 2,01-2,13 (2H, м, CH), 2,78 (2H, д, J=6,8 Гц, CH), 3,09 (9H, с, NMe), 3,25-3,35 (2H, м, CHN), 5,21 (2H, м, CHPb), 7,24 (2H, кажущийся, д, J=9,2 Гц, H2',6'), 7,33-7,49 (м, 5H, Ph), 7,54 (1H, дд, J=8,0, 8,0 Гц, H6), 7,81 (1H, д, J 8,4 Гц, H8), 7,88 (1H, д, J=8,0, 8,4 Гц, H7), 7,92 (2H, кажущийся, д, J=9,2 Гц, H3',5'), 8,07 (1H, д, J=8,0 Гц, H5).
Хлорид 4'-(гидрокси)-3-(триметиламмониилпропилкарбонилокси)флавона
Смесь флавона (30 мг) и Pd/C (5%, 5 мг) в EtOH (5 мл) перемешивали в течение 2 часов в атмосфере водорода. Смесь фильтровали и выпаривали растворитель с получением желтого твердого вещества.
Сосудорасширяющая и антиоксидантная активность производных флавоноидов
Эффект производных флавоноидов на сокращение, индуцируемое Ca
2+
2+
2+
+
2+
2+
2+
2+
-3
2+
2+
-5
-3
-8
-4
2+
Для определения эффекта флавоноидов в ответ на поступление внеклеточного Ca исследовали сократительные реакции на экзогенное введение Ca в присутствии флавоноидов в растворе с высоким содержанием K (60 мМ, KPSS), не содержащем Ca. Сначала кольца аорты в течение 45 минут уравновешивали при напряжении покоя величиной 1 г в обычном PSS, не содержащем Ca. Затем жидкую среду на 45 минут заменяли KPSS, не содержащим Ca, для определения контрольной величины сокращения в ответ на Ca (3×10М). Через 30-минутный период повторного уравновешивания с PSS, не содержащим Ca, определяли совокупные сократительные реакции на Ca (10-3×10М) в KPSS в присутствии носителя, 3',4'-дигидроксифлавонола, 3-гидроксифлавон-3-гемиадипата, 3',4'-дигидрокси-3-гемиадипата, 3-гидроксифлавон-3-фосфата в диапазоне концентраций (10-10М). Перед исследованием реакций на Ca флавоноиды выдерживали в течение 20-минутного периода инкубации.
Расслабление, обусловленное производными флавоноидов
-8
-7
-9
-8
-8
-4
α
α
2α
После тестирования целостности эндотелия кольца многократно промывали и повторно уравновешивали в течение 30 минут перед добавлением PE (10-2×10М) и 9,11-дидезокси-9,11-эпоксиметанпростагландина F (U46619, 10-10М) с получением действующей силы в диапазоне 40-60% от величины сокращения, индуцируемого KPSS. Степень предварительного сокращения для различных групп согласовывали путем доведения концентраций PE и U46619. Получали суммарные кривые концентрация-ответ в диапазоне 10-10М для 3',4'-дигидроксифлавонола, 3-гидроксифлавон-3-гемиадипата, 3',4'-дигидрокси-3-гемиадипата, 3-гидроксифлавон-3-фосфата.
Эксперименты проводили в присутствии эстеразы, бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 1000 ед./л) в случае производных гемиадипата и фосфатазы (1000 ед./л) в случае фосфатных производных.
Эффекты производных флавоноидов на уровни супероксида в анализе in vitro
2
4
4
2
3
2
2
-3
-4
-4
-8
-4
-5
-8
-4
Продукцию супероксид-анионов в участках аорты, выделенной у крысы, определяли с использованием хемилюминесценции люцигенина. Кольца аорты получали, как описано выше, и затем помещали в охлажденный на льду Кребс-N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновую кислоту] (буфер HEPES) (состав (мМ); NaCl 99,0, KCl 4,7, KHPO 1,0, MgSO·7HO 1,2, D-глюкоза 11,0, NaHCO 25,0, CaCl·2HO 2,5, Na-HEPES 20,0). Кольца аорты предварительно инкубировали в течение 45 минут при 37°C и pH 7,4 в буфере Кребс-HEPES, содержащем диэтилтиокарбаминовую кислоту (DETCA, 10М) для инактивации супероксиддисмутазы и β-никотинамид-аденин-динуклеотидфосфат (NADPH, 10М) в качестве субстрата для NADPH-оксидазы, а также 3',4'-дигидроксифлавонол (10М) в качестве положительного контроля, носитель, 3-гидроксифлавон-3-гемиадипат, 3',4'-дигидрокси-3-гемиадипат, 3-гидроксифлавон-3-фосфат (10-10М). Фоновое испускание фотонов измеряли в течение 12 циклов в 96-луночном планшете Optiplate, содержащем в каждой лунке по 0,3 мл буфера Кребс-HEPES плюс люцигенин (5×10М) и носителем или флавоноидом (10-10М). Каждый цикл подсчитывали каждую минуту. После завершения считывания фоновой величины инкубируемые кольца аорты переносили в соответствующие лунки и повторно подсчитывали испускание фотонов, как описано выше. Затем ткань помещали на 48 часов в сушильный шкаф при 65°C для предоставления возможности нормализации продукции супероксида в соответствии с сухой массой ткани.
Эффекты производных флавоноидов на уровни супероксида в анализе in vitro в присутствии или отсутствие эстеразы
-8
-4
-4
Эффекты носителя, 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (21) (DiOHF3HA, 10-10М) и DiOHF (10М) в присутствии и отсутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 100, 300 и 1000 ед./л) на уровень супероксид-анионов, образующихся в выделенных у крыс участках аорты в присутствии NADPH, выражали как процент от контроля. Используемый способ был таким, как описано выше, за исключением добавления бутирилхолинэстеразы.
Эффекты производных флавоноидов на уровни супероксида в анализе in vitro в присутствии или отсутствие фосфатазы
-8
-4
Выражаемый как процент от контроля эффект носителя, 3-гидроксифлавон-3-фосфата (10-10М), в присутствии или отсутствие фосфатазы (1000 ед./л) на уровень супероксид-анионов, образующихся в аорте крыс в присутствии NADPH, определяли, как описано выше для 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата. Поддающийся измерению эффект на образование супероксид-анионов наблюдали при использовании 3-гидроксифлавон-3-фосфата в отсутствие фосфатазы. Предполагали, что это происходит вследствие присутствия природных фосфатаз в выделенной у крыс ткани.
Исследование эффектов производных флавоноидов на функционирование сосудов крысы in vivo
Группе анестезированных самцов крыс Sprague Dawley внутривенно вводили единичную дозированную форму водного раствора 3-гидроксифлавон-3-гемиадипата (15) и в течение определенного периода времени оценивали артериальное давление.
in vivo
У крыс было выявлено значительное снижение артериального давления, что означает расширение сосудов , обусловленное производным флавоноидов. При введении второй группе крыс водного раствора эффекта не наблюдали.
Эксперимент повторяли с водными растворами других синтезированных производных флавоноидов, которые также приводили к различному снижению артериального давления у крыс.
Скрининг по активности и фармакокинетическим параметрам
Получение аорты крыс
Быстро иссекали у крыс нисходящий участок грудной аорты и помещали в Кребс-бикарбонатный раствор. Удаляли поверхностную соединительную ткань и жировую ткань, окружающие аорту, а аорту иссекали на участки длиной 2-3 мм и помещали в емкости для органов.
Эффект флавоноидов на расслабление ACh и SNP
После промывания и повторного уравновешивания в течение 30 минут кольца аорты далее предварительно сокращали до субмаксимальной степени посредством PE и U46619, которые использовали с получением действующего напряжения величиной 45-60% от максимального сокращения, индуцируемого KPSS. При исследовании эффектов флавоноидов, флавонола, флавон-3-гемиадипата (F3HA), 3',4'-дигидроксифлавона, 3',4'-дигидроксифлавонола, 3',4-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (DiOHF3HA) и флавон-3-фосфата (F3P) на сосудорасширяющие реакции кольца инкубировали вместе с одним из соединений в течение 20 минут перед их предварительным сокращением до субмаксимальной степени, получая затем суммарную кривую концентрация-ответ для ACh (100 нМ-10 мкМ) или SNP (10 пМ-1 мкМ). В случае экспериментов с использованием F3P в некоторых экспериментах для расщепления фосфата использовали фосфатазу 1000 ед./л. Некоторые эксперименты проводили в присутствии и отсутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 1000 ед./л) для расщепления адипата в DiOHF3HA и F3HA.
Эффект флавонолов и флавонов на сокращение, индуцируемое PE
-7
-4
-9
-5
Кольца в течение 20 минут инкубировали вместе с DiOHF3HA в диапазоне концентраций (10-10М) или с носителем (0,1% диметилсульфоксид, ДМСО). Затем получали кривую концентрация-ответ для (10-10М) в кольцах аорты с неповрежденным эндотелием (EI). Эксперименты проводили в присутствии и отсутствие BuCHE (1000 ед./л) для расщепления адипата в DiOHF3HA.
Эффект флавонолов на сокращение, индуцируемое Ca
2+
2+
2+
+
+
2+
2+
+
2+
2+
2+
2+
-5
-3
+
-7
-4
2+
Для определения эффекта флавоноидов в ответ на поступление внеклеточного Ca исследовали сократительные реакции на экзогенное введение Ca в присутствии флавоноидов в растворе с высоким содержанием K (60 мМ, K-PSS), не содержащем Ca. Сначала кольца аорты в течение 45 минут уравновешивали в PSS, не содержащем Ca, при напряжении покоя величиной 1 г. Затем жидкую среду на 45 минут заменяли K-PSS, не содержащим Ca, для определения контрольной величины сокращения в ответ на добавляемый Ca (3 мМ). Через 30 минут периода повторного уравновешивания PSS, не содержащим Ca, определяли совокупные сократительные реакции на Ca (10-3×10М) в KPSS в присутствии носителя (0,1% ДМСО) или 3-гидроксифлавонола, F3HA, DiOHF3HA или F3P в диапазоне концентраций (10-10М). Перед исследованием реакций на Ca флавоноиды выдерживали в течение 20-минутного периода инкубации. Эксперименты проводили в присутствии и отсутствие BuCHE (1000 ед./л) для расщепления адипата в F3HA и DiOHF3HA. В случае экспериментов с использованием F3P в некоторых экспериментах для расщепления фосфата использовали фосфатазу (1000 ед./л).
Расслабление, обусловленное флавоноидами
-8
-7
-9
-8
-7
-4
α
α
α
После тестирования целостности эндотелия кольца многократно промывали и повторно уравновешивали в течение 30 минут перед добавлением PE (10-2×10М) и 9,11-дидезокси-9,11-эпоксиметанпростагландина F2 (U46619, 10-10М) с получением действующей силы в диапазоне 40-60% от величины сокращения, индуцируемого KPSS. Получали совокупные кривые концентрация-ответ в диапазоне 10-10М для носителя, 3'-гидроксифлавонола, F3HA, DiOHF3HA, F3P. Эксперименты проводили в присутствии и отсутствие 1000 ед./л BuCHE для расщепления адипата в F3HA и DiOHF3HA. В случае экспериментов с использованием F3P в некоторых экспериментах для расщепления фосфата использовали фосфатазу 1000 ед./л.
Эффект флавонолов и флавонов на расширение сосудов в ответ на ACh при наличии окислительного стресса
-5
-6
-4
-5
Контрольные величины суммарной расширяющей реакции на ACh сравнивали с величинами, получаемыми для колец аорты с неповрежденным эндотелием, которые обрабатывали пирогаллолом (2×10М). Также определяли эффекты носителя (0,1% ДМСО), фосфатазы (1000 ед./л) или F3P (10-10М) в ответ на ACh в выделенных у крыс кольцах аорты, на которые воздействовали пирогаллолом (2×10М). Когда кольца аорты достигали стабильной величины сокращения с PE и U44619 на уровне от 50 до 70% от величины напряжения, индуцируемого KPSS, добавляли пирогаллол и выдерживали в течение 10 минут перед определением суммарных кривых концентрация-ответ для ACh. В некоторых экспериментах с использованием F3P для расщепления фосфата использовали фосфатазу 1000 ед./л.
Эффект DiOHF3HA и F3P у анестезированных крыс
-1
Самцов крыс Sprague-Dawley (250-350 г) анестезировали пентобарбитоном натрия (60 мг кг, внутрибрюшинно). Выделяли трахею и канюлировали полиэтиленовой трахеальной трубкой (I.D. 2,0 мм) и крысе предоставляли возможность самопроизвольного дыхания.
Измерения артериального давления и частоты сердечных сокращений
Канюлировали правую сонную артерию и соединяли с канюлей, заполненной гепаринизированным солевым раствором (O.D. 0,75, I.D. 0,58 мм), и присоединяли к датчику давления. Среднее и фазовое артериальное давление непрерывно измеряли и регистрировали на многоканальном самописце. Значение частоты сердечных сокращений получали из величины фазового артериального давления с использованием тахометра.
Антиоксидантные и сосудистые эффекты флавонола и дигидроксифлавона
Флавонол и дигидроксифлавон (DiOHFne) вызывали зависящее от концентрации снижение уровней супероксида, образующегося в кольцах аорты крыс. При наивысшей тестируемой концентрации (0,1 мМ) и флавонол, и DiOHFne снижали уровни супероксида до 36±3% от контроля. Флавонол не влиял на расслабляющие эффекты ACh или SNP. DiOHFne вызывал зависящее от концентрации расслабление аорты крыс, которое было слабее, чем эффект DiOHF. Флавонол вызывал зависящее от концентрации снижение сокращения колец аорты крыс, индуцируемого кальцием, которое было относительно слабее в сравнении с предыдущими наблюдениями для DiOHF.
Антиоксидантные и сосудистые эффекты флавон-3-гемиадипата (F3HA)
-7
-4
F3HA (10-10М) не оказывал ингибирующего эффекта на образование супероксида в аорте крыс, однако присутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 100-1000 ед./мл) обуславливало зависящее от концентрации усиление ингибирующего эффекта F3HA (фиг.6). F3HA только при наивысшей концентрации (0,1 мМ) ингибировал сократительные реакции на возрастающие концентрации внеклеточного кальция.
Антиоксидантные и сосудистые эффекты дигидроксифлавон-3-гемиадипата (DiOHF3HA)
-7
-4
DiOHF3HA (10-10М) не оказывал ингибирующего эффекта на образование супероксида в аорте крыс, однако присутствие бутирилхолинэстеразы (BuCHE, 1000 ед./мл) приводило к зависящему от концентрации ингибирующему эффекту. DiOHF3HA отдельно не оказывал эффекта на расслабляющие реакции в ответ на ACh или SNP. В отличие от этого, в присутствии BuCHE (1000 ед./мл) DiOHF3HA значительно усиливал восприимчивость расслабляющий реакции на SNP. Аналогично, DiOHF3HA отдельно оказывал незначительный эффект на индуцируемое кальцием сокращение аорты крыс, однако в присутствии BuCHE (1000 ед./мл) DiOHF3HA (0,1 мМ) оказывал ингибирующий эффект, эквивалентный DiOHF. Это позволяет предположить, что когда адипат удаляли посредством эстеразы, гемиадипат был активен в такой же степени, как и исходный DiOHF. Также было выявлено, что DiOHF3HA вызывает непосредственное расслабление предварительно сокращенных колец аорты крыс только в присутствии эстеразы (фиг.11).
DiOHF3HA (0,1, 0,3, 1, 3 мг/кг) вводили внутривенной инъекцией, обеспечивая по меньшей мере 30 минутный перерыв между инъекциями, и определяли изменения максимальных значений среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений. DiOHF3HA вызывал зависящее от дозы снижение артериального давления (фиг.12a) и частоты сердечных сокращений (фиг.12b). В отдельной группе экспериментов ACh (0,3 мг/кг внутривенно) и фенилэфрин (PE, 30 мг/кг внутривенно) вводили инъекцией до и через 30 минут после DiOHF3HA (3 мг/кг внутривенно), время, за которое артериальное давление и частота сердечных сокращений возвращались на контрольный уровень. DiOHF3HA значительно усиливал депрессорную реакцию на ACh и ослаблял индуцируемое PE повышение артериального давления (фиг.13).
В кольцах аорты крыс, в отсутствие или присутствии холинэстеразы, DiOHF3HA (0,1 мМ), не оказывал эффекта на зависящее от эндотелия расслабление в ответ на кальциевый ионофор A23187 или на изопреналин. Вводимый отдельно DiOHF3HA (0,1 мМ) не оказывал эффекта на сокращение, индуцируемое PE, но вызывал значительное ингибирование в присутствии эстеразы. Степень ингибирования была аналогична степени, наблюдаемой в ответ на присутствие DiOHF в той же концентрации (0,1 мМ).
Антиоксидантные и сосудистые эффекты флавон-3-фосфата (F3P)
-5
F3P или фосфатаза (1000 ед./л) не оказывали эффекта на образование супероксида в участках аорты крыс, однако в присутствии фосфатазы F3P вызывал зависящее от концентрации ингибирование уровней супероксида. F3P в присутствии фосфатазы повышал восприимчивость колец аорты крыс к расслаблению, обусловленному ACh, но не SNP. Окислительный стресс, вызываемый присутствием пирогаллола (2×10М), значительно снижал максимальную реакцию на ACh, однако реакция восстанавливалась в результате присутствия F3P вместе с фосфатазой. На ответ на SNP не воздействовал никакой из указанных вариантов обработки. F3P вызывал незначительное ингибирование сокращения, индуцируемого кальцием, однако присутствие фосфатазы значительно усиливало эффект.
F3P (0,1, 0,3, 1, 3, 10 мг/кг) вводили внутривенной инъекцией, обеспечивая по меньшей мере 30 минутный период между инъекциями, и определяли изменения максимальных значений среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений (фиг.16a). DiOHF3HA вызывал зависящее от дозы снижение артериального давления и частоты сердечных сокращений (фиг.12a и 12b), однако депрессорная реакция в сравнении с DiOHF (1 мг/кг внутривенно) была незначительной.
Обобщенные результаты
Данные исследования заключались в оценке сосудистой и антиоксидантной активности флавонолов, 3',4'-дигидроксифлавона (DiOHFne), 3',4'-дигидроксифлавонола (DiOHF), флавон-3-гемиадипата (F3HA), 3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипата (DiOHF3HA) и флавон-3-фосфата.
Сам флавон-3-гемиадипат (F3HA) не обладал антиоксидантной или сосудистой активностью при использовании отдельно, однако в присутствии холинэстеразы, расщепляющей адипат в случае замещения, наблюдали способность F3HA ингибировать индуцируемое кальцием сокращение.
Дигидроксифлавон-3-гемиадипат (DiOHF3HA) при использовании отдельно не обладал антиоксидантной или сосудистой активностью, однако в присутствии холинэстеразы, расщепляющей адипат в случае замещения, наблюдали способность DiOHF3HA ингибировать уровни супероксида, образующегося в аорте крыс, ингибировать индуцируемое кальцием сокращение и вызывать непосредственное расслабление колец аорты крыс. В присутствии эстеразы уровень активности DiOHF3HA был аналогичен DiOHF. У анестезированной крысы DiOHF3HA вызывал зависящее от концентрации снижение артериального давления и частоты сердечного сокращения.
Флавон-3-фосфат (F3P) один не обладал антиоксидантной или сосудистой активностью, однако в присутствии фосфатазы, расщепляющей фосфат в случае замещения, наблюдали способность F3P ингибировать уровни супероксида, образующегося в аорте крыс, ингибировать индуцируемое кальцием сокращение и усиливать зависящее от эндотелия расслабление при наличии окислительного стресса. В присутствии фосфатазы уровень активности F3P был аналогичен DiOHF. У анестезированной крысы F3P вызывал только незначительное снижение артериального давления и частоты сердечного сокращения, зависящее от концентрации. Эффекты были намного слабее, чем наблюдаемые для DiOHF.
Кардиозащитное действие 3',4'-дигидроксифлавоноладипата (DiOHF3HA) после ишемии-реперфузии миокарда
Оценивали способность синтетического флавонола, 3',4'-дигидроксифлавоноладипата (DiOHF3HA), предотвращать ишемию миокарда и реперфузионное повреждение у анестезированных овец. В отличие от исходного соединения DiOHF адипатное производное являлось растворимым в водном растворе, особенно в воде.
DiOHF3HA, вводимый в водном растворе, вызывал зависящее от дозы уменьшение размера очага инфаркта, сходное с уменьшением, обусловленным аналогичной молярной дозой DiOHF при растворении в ДМСО.
Внутривенная инфузия DiOHF3HA не изменяла показателей гемодинамики (артериальное давление, частота сердечных сокращений, конечное диастолическое давление в левом желудочке (LV-EDP)).
in vivo
Поскольку после ишемически-реперфузионного повреждения сердца у анестезированных овец DiOHF3HA оказывал кардиозащитный эффект в степени, эквивалентной исходному соединению, эти данные подтверждают гипотезу, что это новое производное соединение эффективно преобразуется  в исходное соединение.
Хирургическая обработка
Исследовали пять групп анестезированных взрослых мериносов (кастрированные бараны, 35-45 кг):
(1) Контроль (n=5)
(2) DiOHF (2 мг/кг, n=2)
(3) DiOHF3HA (2,7 мг/кг, n=3)
(4) DiOHF (5 мг/кг, n=3)
(5) DiOHF3HA (6,6 мг/кг, n=4)
Анестезию вызывали внутривенным введением тиопентона натрия (15 мг/кг) и поддерживали последующей интубацией трахеи с использованием изофлурана (1,5-2%). Для забора образца артериальной крови и регистрации артериального давления вводили катетер в правую лицевую артерию. Внутривенные инфузии проводили через катетер, введенный в яремную вену. Воздействие на сердце осуществляли вскрытием левой части грудной клетки, проводимым в четвертом межреберном пространстве. Для измерения давления в левом желудочке (LVP) в левый желудочек через левое предсердие вводили манометр с наконечником-катетером 4F. Дополнительную силастиковую канюлю вводили в ушко левого предсердия для инъекции лигнокаина и для инфузии синего красителя Эванса. Из эпикарда иссекали левую переднюю нисходящую коронарную артерию (LAD) непосредственно дистально в отношении ее второй диагональной ветви и около нее помещали датчик времени прохода 2 мм, регистрирующий поток, для наблюдения кровотока в LAD. На LAD, проксимально по отношению к датчику, накладывали шелковый шов, и оба конца шелковой нити продевали через пластиковую трубку для формирования сосудистой петли.
Схема эксперимента
Животным давали возможность стабилизировать состояние в течение 10-15 минут после завершения хирургической процедуры. Затем овец случайным образом подразделяли на различные группы обработки. Для всех овец проводили регистрацию исходного уровня в течение 30 минут с последующей ишемией в течение 1 часа и реперфузией в течение 3 часов.
2
3
В ходе эксперимента измерения гемодинамики регистрировали через 5-минутные интервалы и образцы крови отбирали в заранее назначенные моменты времени. После 30-минутной ишемии проводили обработку флавонолом. DiOHF растворяли в 2 мл ДМСО плюс 14 мл смеси полиэтиленгликоль:вода (1:1). DiOHF3HA растворяли в 20 мл 0,1М NaCO. Лекарственные средства вводили внутривенно, при 1 мл/минута. Выбирали две дозы DiOHF3HA (2,7 мг/кг и 6,6 мг/кг) для достижения молярных доз, эквивалентных исходному соединению DiOHF (при 2 мг/кг и 5 мг/кг соответственно). Контрольным животным никаких растворов внутривенно не вводили. По мере необходимости для ослабления аритмий использовали лигнокаин.
Определение подверженной риску области и размера очага инфаркта
-1
Границы подверженной риску области миокарда и размер очага инфаркта определяли путем окрашивания синим красителем Эванса и трифенилтетразолийхлоридом (TTC). После реперфузии в течение 3 часов повторно закупоривали LAD в участке исходной закупорки. Непосредственно после внутривенной инъекции пентобарбитона (100 мг кг), останавливающей сокращение сердца, в левое предсердие вводили инъекцией синий краситель Эванса (1,5%, 40 мл) для определения подверженного риску миокарда. Сердце быстро удаляли и левый желудочек иссекали на поперечные срезы толщиной приблизительно 1 см. На тех же препаратах очерчивали неокрашенную область, подверженную риску. Затем срезы в течение 20 минут (37°C, pH 7,4) инкубировали в содержащем 1% TTC 0,1М буфере фосфата натрия. На срезах очерчивали область, пораженную инфарктом. Подверженную риску область миокарда и размер очага инфаркта измеряли компьютеризированной планиметрией. Подверженную риску область миокарда выражали как процент от конечного объема левого желудочка (AR/LV%), а размер очага инфаркта выражали как процент от подверженной риску области миокарда (IS/AR%).
Маркеры инфаркта миокарда в плазме
Отбирали в охлажденные пробирки с гепарином образцы артериальной крови (5 мл) в исходный временной момент, в течение ишемии и в три временных момента в ходе периода реперфузии (через 1 час, 2 часа и 3 часа). После центрифугирования при 4°C образцы плазмы хранили при -20°C до измерения, определяющего уровни лактатдегидрогеназы и креатининкиназы.
Результаты
В следующем описании итоговых результатов указаны размеры очага инфаркта миокарда для 5 групп с различными вариантами обработки. Учитывая эффективность наивысшей дозы DiOHF3HA, изменения всех остальных параметров указаны только в отношении сравнения контрольной группы животных и группы животных DiOHF3HA (6,6 мг/кг).
В контрольной группе одна из овец погибла вследствие фибрилляции желудочков в первые 10 минут реперфузии. Поэтому контрольные данные основаны на количестве овец n=4.
Размер очага инфаркта миокарда
В данном исследовании в 5 группах овец с различными вариантами обработки область левого желудочка, подвергавшаяся ишемии (AR), была одинаковой (11%-20%, фиг.17, левая панель). В отличие от этого нормализованный по AR размер очага инфаркта в группах, обработанных DiOHF и DiOHF3HA, был меньше по сравнению с контрольными животными (фиг.17, правая панель). Конкретно, размер очага инфаркта, нормализованный относительно подверженной риску области (IS/AR), был снижен до величины от 83±4% у контролей до 49±8% для DiOHF3HA (6,7 мг/кг) и до 47±8% для DiOHF (5 мг/кг). При более низких дозах DiOHF3HA (2,7 мг/кг) и DiOHF (2 мг/кг) IS/AR составлял 64% и 73% соответственно.
Поток в LAD
Исходная величина потока в LAD (7-9 мл/минута) была одинаковой в контрольной группе овец и в группе DiOHF3HA (6,6 мг/кг). В течение ишемии у всех животных поток в LAD снижался до нуля. В течение ранней стадии реперфузии у всех овец возникала коронарная гиперреперфузия. Как правило, это временное возрастание потока в LAD возвращалось к исходным уровням через 30-60 минут реперфузии. Возвращение величины потока к прежнему состоянию оказывалось более быстрым в группе DiOHF3HA.
Гемодинамическая реакция на ишемию/реперфузию
Исходное артериальное давление в двух группах овец не отличалось (средняя величина в течение 30 минут ~80 мм рт.ст.). В отличие от этого HR покоя у контрольных овец (90±4 ударов в минуту) было ниже (P<0,05) в сравнении с овцами, обработанных DiOHF3HA (105±3 ударов в минуту). Это различие оставалось на протяжении всего хода эксперимента. Как MAP, так и HR были неизменны в течение 20-минутной инфузии при введении DiOHF3HA. Кроме того, ни в какой из групп овец не наблюдали значительных изменений артериального давления или HR в течение ишемии миокарда и реперфузии.
макс.
макс.
макс.
LV-EDP в двух группах овец не отличалось (~11 мм рт.ст.), однако максимальная положительная величина первой производной LVP (dP/dt) у контрольных овец (1454±62 мм рт.ст./секунда) была меньше (P<0,05) в сравнении с овцами, обработанных DiOHF3HA (1967±103 мм рт.ст./секунда). Это различие оставалось на протяжении всего хода эксперимента. Как LV-EDP, так и dP/dt были неизменны в течение 20-минутной инфузии при введении DiOHF3HA. Кроме того, ни в какой из групп овец не наблюдали значительного изменения LV-EDP и dP/dt в течение ишемии-реперфузии миокарда. Благоприятные эффекты лекарственного средства на гемодинамику более отчетливо проявлялись через 24 часа реперфузии.
У анестезированных овец через 1 час ишемии и 3 часа реперфузии содержание лактатдегидрогеназы в плазме увеличивалось на 227±141 ед./л в контрольной группе (n=3) и на 67±32 ед./л в группе, обработанной DiOHF3HA (n=4). У данных овец содержание креатинкиназы в плазме увеличивалось на 2411±958 ед./л в контрольной группе и на 1579±936 ед./л в группе, обработанной DiOHF3HA.
Восстановление после ишемического удара у крыс, обусловленное синтетическими флавоноидами
Маркеры инфаркта миокарда в плазме
Ишемический удар исследовали у находящихся в сознании крыс, с ежесуточным наблюдением неврологической функции и посмертной морфологической оценкой инфарктов головного мозга через 72 часа после удара. Одностороннюю преходящую ишемию и реперфузию головного мозга у находящихся в сознании крыс индуцировали инъекцией активного сосудосуживающего вещества, эндотелина-1, с внешней стороны, но вблизи от правой средней мозговой артерии MCA, (через предварительно имплантированную направляющую трубку). Происходящий в результате удар классифицировали по балльной шкале от 0 до 5 в соответствии с непосредственно возникающей поведенческой реакцией, и через 3 часа после удара и в дальнейшем через временные интервалы 24 часа вводили внутривенной инъекцией предполагаемые нейрозащитные соединения.
Хирургическая обработка
Самцов крыс Hooded Wistar (280-340 г) анестезировали пентобарбитоном натрия в объеме 0,6 мл (60 мг/кг внутрибрюшинно) для введения внутривенного (i.v.) катетера в яремную вену для срочного введения лекарственного средства. Затем направляющую канюлю калибра 23 из нержавеющей стали стереотаксически имплантировали в грушевидную извилину коры головного мозга, на 2 мм дорзальнее правой MCA (0-2 мм спереди, -5,2 мм сбоку и -5,9 мм вентрально). Канюлю закрепляли зубным акрилатным цементом и в череп вставляли два небольших винта. Кожу на черепе закрывали посредством швов. Крыс содержали по отдельности в течение цикла день/ночь по 12 часов при температуре 18-22°C и давали возможность восстановить состояние в течение 5 суток перед индукцией удара.
Индукция удара
У находящихся в сознании крыс индуцировали сужение правой средней мозговой артерии (MCA) путем введения активного сосудосуживающего средства, эндотелина-1 (ET-1), (60 пмоль в 3 мкл солевого раствора в течение 10 минут) через устройство для инъекции 30 калибра, которое выступало на 2 мм выше конца ранее имплантированной стереотаксической направляющей канюли. Устройство для инъекции удерживали на месте манжетой из полимерной трубки и крысу помещали в прозрачную плексигласовую камеру для наблюдения в ходе инъекции ET-1. В течение индукции удара наблюдали вращение против часовой стрелки, сжатие и волочение контралатеральной передней лапы, что подтверждало правильное расположение канюли. Эти изменения поведения происходили в течение 2-10 минут после начала инъекции ET-1, и при использовании данной модели другими исследователями было описано сходное поведение. Была использована оценочная шкала тяжести удара, основанная на этих изменениях поведения в течение удара, и было показано, что обработанные носителем крысы, у которых определяли более высокий оценочный показатель удара, обладали более высокими объемами очага инфаркта и неврологическими расстройствами. Было предположено, что крысы, не проявлявшие какого-либо изменения поведения, не имели удара, и они были исключены из исследования. Крыс, которым вводили плацебо, подвергали имплантации канюли, но им не проводили никакой инъекции ET-1. Ректальную температуру определяли с использованием датчика термистора до развития удара и через 30- или 60-минутные интервалы в течение 3 часов после удара.
Оценка функционального исхода
Все поведенческие тесты проводили до каких-либо процедур (до хирургического вмешательства, сутки 1), непосредственно перед индуцируемой ET-1 закупорки MCA (до ишемии, сутки 6) и через 24, 48 и 72 часа после индуцируемой ET-1 закупорки MCA. Поведение каждой крысы сравнивали с поведением до удара, таким образом, каждая крыса выступала в качестве своего собственного контроля. Всех крыс обозначали шифром таким образом, чтобы исследователь не имел информации об условиях обработки. Неврологические патологии оценивали с использованием балльной шкалы неврологических расстройств, основанной на регистрации патологической позы и гемиплегии. Патологические позы оценивали путем подвешивания крыс за хвост и подсчета изгибаний грудного отдела и вытягиваний передних конечностей. Гемиплегию оценивали, помещая крыс на приподнятую платформу. Считали, что расстройства присутствовали, если задняя конечность, контралатеральная относительно пораженного инфарктом полушария головного мозга, соскальзывала с края платформы и/или если контралатеральная передняя конечность соскальзывала при отсутствии контакта морды и усов с поверхностью. Каждый вариант поведения оценивали по следующей шкале: 0 = отсутствие расстройства; 1 = незначительное; 2 = умеренное и 3 = тяжелое. Таким образом, при суммировании оценок максимальная оценка неврологического расстройства составила 12. Оценку 0 считали нормальной.
Одностороннее отсутствие чувствительности оценивали с использованием теста, состоящего из помещения клейких лент (клейкий ярлык Avery, диаметр окружности 100 мм) на дистально-радиальную область каждого запястья. Расположение первой ленты выбирали случайным образом между контралатеральной и ипсилатеральной конечностями. Ленту накладывали одновременно на обе передние конечности перед помещением животного в плексигласовую клетку и измерением секундомером, регистрируя время задержки для прикосновения и время задержки для устранения каждого стимула для контралатеральной и ипсилатеральной передних конечностей. Тест завершали через 180 секунд, если ленты еще не были удалены.
Обработка лекарственным средством
Все соединения вводили внутривенно разовой ударной дозой в виде болюса через 3 часа после удара в концентрации, достигавшей 37 мкмоль/кг. Также использовали контрольные носители, и они были специфичны для каждого соединения. После первой дозы через 3 часа после удара животным раз в сутки, через 24 и 48 часов вводили инъекцией лекарственное средство или носитель. Общий вводимый инъекцией объем каждого соединения составлял приблизительно 300 мкл в случае крысы с массой 300 г при немедленном промывании 200 мкл солевого раствора для обеспечения полного введения лекарственного средства.
Количественная оценка ишемического повреждения
Через 72 часа после ишемии крыс обезглавливали, их головной мозг удаляли и замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C. Фронтальные криостатные срезы (16 мкм) резали в восьми заранее определенных фронтальных плоскостях на протяжении головного мозга от -3,2 до 6,8 мм относительно брегмы. Очаг инфаркта оценивали в трех сериях неокрашенных срезов на основе наблюдения, что поврежденные области в неокрашенных микроскопических препаратах срезов головного мозга видны невооруженным глазом как четко очерченные матовые или темные области, тогда как нормальная ткань является преимущественно прозрачной. Вследствие применения принципа баллистического распространения света и использования простого устройства, объединенного с компьютеризированной системой анализа изображений, неокрашенные срезы на микроскопических препаратах, в которых наблюдали пораженные области, были четко видны на мониторе. Световое излучение проходило в камеру прямо через прозрачную непораженную ткань, тогда как на поврежденной ткани лучи света рассеивались. Затем области повреждения можно легко очерчивать, выбирать и регистрировать с использованием системы анализа изображений. Общий объем очага инфаркта рассчитывали интегрированием площади поперечного сечения в области повреждения на каждом стереотаксическом уровне при интервалах между уровнями. Поправку на влияние отека на площадь инфаркта вводили с использованием следующей формулы:
(площадь нормального полушария/площадь пораженного инфарктом полушария)×площадь инфаркта.
Микроскопические препараты также обозначали шифром так, чтобы исследователь не обладал информацией об условиях обработки.
Оценка удара
У крыс наблюдали характерные для удара неврологические поведенческие расстройства в течение 2-10-минутной инъекции ET-1, но не после введения отдельно равного объема солевого раствора. Эти расстройства включали специфические поведенческие реакции, такие как сжатие и неспособность вытягивания контралатеральной передней конечности и вращение в контралатеральном направлении относительно закупорки. Вращению предшествовала чистка, и ее наблюдали почти у всех крыс. Чистка происходила стереотипным образом, где за чисткой морды следовала чистка всего тела одним непрерывным движением. Другие поведенческие реакции, такие как стук зубов, кусание клетки и залегание или высовывание языка, наблюдали менее часто. Такие поведенческие реакции, наблюдаемые во время удара, можно классифицировать на основе их степени выраженности и тяжести. Также было показано, что у обработанных носителем крыс (n=40) существует положительная взаимосвязь между оценкой удара и балльной оценкой неврологических расстройств, а также оценкой удара и объемом очага инфаркта. После проведения оценки крыс с ударом объединяли в пары на основе одинаковых оценок удара таким образом, чтобы величины оценки удара были равномерно распределены между группами, обработанными носителем и лекарственным средством. Затем указанных крыс обозначали шифром таким образом, чтобы остальные оценки можно было проводить без информации о варианте обработки.
Стратифицированная обработка лекарственным средством
Для прогнозирования функционального исхода и выживаемости у людей с ударом, чтобы способствовать клиническому уходу за пациентами с ударом и правильно стратифицировать группы обработки в клинических испытаниях используют прогностические модели. Использование подобных моделей на животных с экспериментальным ударом ранее не предпринимали. В случае модели ET-1 закупорки MCA существует возможность наблюдать поведенческие реакции в ходе индукции удара и применять балльную шкалу оценки тяжести удара, основанную на этих реакциях. Поэтому можно прогнозировать, у каких животных будет тяжелая степень удара и у каких животных будет удар от мягкой до умеренной степени тяжести. Данный способ также дает возможность определенного прогнозирования области, подверженной риску, которую теоретически можно восстанавливать после удара нейрозащитными средствами. При ударе тяжелой степени для нейрозащитного действия остается незначительная подверженная риску область, поскольку очаг инфаркта занимает более 70% общего объема полушария. Однако при ударах от мягкой до умеренной степени тяжести наблюдают более обширную подверженную риску область для восстановления, и поэтому существует большая возможность для нейрозащитного действия. Действительно, в настоящее время клинические исследования пациентов посредством MRI подобным образом используют для стратификации пациентов, чтобы определить, для кого из них последующее лечение лекарственным средством с наибольшей вероятностью окажется благоприятным. По этой причине животных, которые по окончании анализа обработки лекарственным средством имели оценки 4 или 5, соответствующие тяжелой степени удара, удаляли и повторно анализировали данные в группах с ударом от мягкой до умеренной степени тяжести (оценки 1-3) для всех последующих тестируемых соединений.
3',4'-дигидроксифлавонол (DiOHF)
В исходных экспериментах, проведенных в лаборатории авторов изобретения, была оценена замедленная нейрозащитная способность DiOHF (10 мг/кг), который вводили внутривенно через 3 часа после развития удара. Каждой крысе вводили 3 ударных дозы DiOHF, растворенного в 20% ДМСО, 40% полиэтиленгликоля и 40% стерильной воды для инъекций. Введение 3',4'-дигидроксифлавонола (DiOHF) крысам с ударом умеренной степени тяжести (оценки 2-3, n=6 и 5, соединение и носитель соответственно) ослабляло неврологические расстройства через 48 и 72 часа и устраняло возрастание оценки одностороннего отсутствия сенсорной информации ("тест клейкой ленты") после удара, наблюдаемые у контрольных крыс, которым вводили эндотелин только вместе с носителем лекарственного средства. Важно отметить, что DiOHF снижал объем очага инфаркта, образующегося в коре головного мозга, и полностью предотвращал развитие инфаркта в полосатом теле головного мозга.
Обработка крыс с ударом от мягкой до умеренной степени тяжести DiOHF (10 мг/кг) значительно снижала область инфаркта на протяжении коры головного мозга и полосатого тела в сравнении с обработкой носителем. Также обработка крыс с ударом от мягкой до умеренной степени тяжести посредством DiOHF значительно улучшала неврологический исход в сравнении с крысами, обработанных носителем.
3',4'-дигидроксифлавон-3-гемиадипат (DiOHF3HA) для лечения удара
2
3
Каждой крысе вводили 3 ударных дозы DiOHF3HA (15 мг/кг/сутки внутривенно), растворенного в забуференном NaCO физиологическом растворе (0,1 М, pH 7,8) для инъекций.
<b>Носитель</b>
<b>DiOHF3HA</b>
категория №2 (n=3)
№2 (n=1)
категория №3 (n=4)
№3 (n=4)
категория №4 (n=7)
№4 (n=6)
После удара ни в одной из групп обработки не наблюдали значительной потери массы. Внутренняя температура до удара для обеих групп обработки находилась в пределах физиологической нормы. Через 30 минут после удара наблюдали значительное повышение температуры в обеих группах обработки, однако после этого времени температура возвращалась к нормальному уровню. После внутривенной инъекции носителя или DiOHF3HA в обеих группах обработки наблюдали повышение температуры, однако она значимо не отличалась от температуры до удара.
После удара у крыс из обеих групп обработки наблюдали значимо более высокие оценки неврологических расстройств через 24, 48 и 72 часа после удара при сравнении с оценками до удара. Обработка DiOHF3HA (15 мг/кг/сутки) значительно улучшала оценки неврологических расстройств через 24, 48 и 72 часа после удара при сравнении с крысами, обработанными носителем. У обработанных носителем крыс для пораженной ударом контралатеральной передней конечности наблюдали задержку реакции на устранение клейких ярлыков в сравнении с ипсилатеральной стороной (P<0,05, двухсторонний RM-ANOVA с повторением 2 факторов, часов после удара и стороны). Этот эффект прекращался после обработки DiOHF3HA (15 мг/кг/сутки).
Область инфаркта коры головного мозга после обработки DiOHF3HA (15 мг/кг внутривенно) значимо снижалась при сравнении с носителем.
В целом, обработка DiOHF3HA (15 мг/кг) значимо улучшала неврологическую функцию в тесте на одностороннее отсутствие сенсорной информации, а также уменьшала область повреждения в полосатом теле после удара в сравнении с обработкой носителем.
Эффект DiOHF3HA на удар от мягкой до умеренной степени тяжести
Исследовали выбранную группу крыс с ударом от мягкой до умеренной степени тяжести.
<b>носитель</b>
<b>DiOHF3HA</b>
категория №3 (n=4)
№2 (n=1)
категория №4 (n=3)
№3 (n=4)
В каждой из групп обработки крысы после удара от мягкой до умеренной степени тяжести не теряли массу. Внутренняя температура до удара в обеих группах обработки находилась в пределах физиологической нормы. Через 30 минут после удара от мягкой до умеренной степени тяжести наблюдали значительное повышение температуры в обеих группах обработки, однако после этого времени температура возвращалась к нормальному уровню.
В обеих группах обработки у крыс после удара от мягкой до умеренной степени тяжести наблюдали значимо более высокие оценки неврологических расстройств до удара и через 24, 48 и 72 часа после удара при сравнении с оценками до хирургического вмешательства. При сравнении с крысами, обработанными носителем, обработка DiOHF3HA (15 мг/кг/сутки) не оказывала эффекта на оценки неврологических расстройств. У обработанных носителем крыс с ударом от мягкой до умеренной степени тяжести через 24 и 48 часов наблюдали увеличенное время задержки реакции на нанесение клейких ярлыков для пораженной ударом контралатеральной передней конечности в сравнении с ипсилатеральной стороной (P<0,05, двухсторонний RM-ANOVA с повторением 2 факторов, часов после удара и стороны). У обработанных носителем крыс также наблюдали увеличенное время задержки реакции на устранение клейких ярлыков через 24 часа (P<0,05, двухсторонний RM-ANOVA с повторением 2 факторов, часов после удара и стороны). Эти эффекты прекращались после обработки DiOHF3HA (15 мг/кг/сутки) (фиг.18).
У крыс с ударом от мягкой до умеренной степени тяжести зона инфаркта коры головного мозга значимо снижалась после обработки DiOHF3HA (15 мг/кг в сутки, внутривенно) в сравнении с носителем (фиг.19). Также обработка DiOHF3HA значительно уменьшала зону инфаркта полосатого тела.
В целом, обработка DiOHF3HA (15 мг/кг) крыс с ударом от мягкой до умеренной степени тяжести значимо снижала зону инфаркта коры головного мозга и полосатого тела в сравнении с обработкой носителем. Также обработка DiOHF3HA значимо восстанавливала неврологическую функцию в тесте на одностороннее отсутствие сенсорной информации.
Если не указано иное, все величины на графиках представляют собой средние значения со стандартной ошибкой среднего, представленной вертикальными линиями.
Любое обсуждение документов, протоколов, веществ, устройств, статей или т.п., включенных в настоящее описание, предназначено только для обеспечения контекста настоящего изобретения. Это не следует рассматривать в качестве признания, что какой-либо или все указанные предметы обсуждения образуют часть основы предшествующего уровня техники или что они являлись общеизвестными знаниями в области, родственной настоящему изобретению, как если бы это существовало до даты приоритета каждого пункта прилагаемой формулы изобретения.
На протяжении настоящего описания слово "включать" или варианты, такие как "включает" или "включающий", следует понимать как обозначающие включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий.
Специалистам в данной области будет очевидно, что в отношении изобретения можно осуществлять множество изменений и/или модификаций, как показано в конкретных вариантах осуществления, не отходя от сущности или объема изобретения, как описано в широком смысле. Таким образом, настоящие варианты осуществления во всех отношениях следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие.