ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ 3-ГИДРОКСИГИППУРОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ И ЦЕРЕБРОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
DISODIUM SALT OF 3-HYDROXYHIPPURIC ACID, HAVING ANTIHYPOXIC AND CEREBROPROTECTIVE ACTION

Изобретение относится к новым водорастворимым производным 3-гидроксигиппуровой кислоты - динатрия 3-гидроксигиппурат (динатриевая соль N-(3-гидроксибензоил)глицина) - и его применению как антигипоксического и церебропротективного средства.
Оптимизация лечения нейродегенеративных заболеваний - одна из актуальных проблем медицины, значимость которой обусловлена широкой распространенностью, высоким процентом смертности и инвалидности пациентов [Бородкина Л.Е. Нейропротекторные свойства и механизм действия новых производных аналогов гаммааминомасляной кислоты. Дис. докт. мед. наук. - Волгоград. - 2009. - 379 с.]. Несмотря на огромные затраты государства на лечение и реабилитацию больных с нейродегенеративными заболеваниями результативность терапии остается низкой и выбор препаратов, которые могли бы положительно повлиять на прогноз, остановить прогрессирование нейродегенеративных изменений, весьма ограничен (Бурчинский С.Г., 2008; Гусев Е.И., Скворцова В.И. 2001; Елисеев Е.В., Корюкова И.В., Румянцева С.Л. и др., 2008; Кадыков А.С., Шахпаронова Н.В., 2009; Muresanu D.F., 2003, 2007).
Отечественный лекарственный препарат "Мексидол" (этилметилгидроксипиридина сукцинат) проявляет ноотропную, нейропротекторную, анксиолитическую, противогипоксическую, антистрессорную, антиалкогольную, противопаркинсоническую и противосудорожную активность и др. [Воронина Т.А. Отечественный препарат нового поколения мексидол: основные эффекты, механизм действия, применение. - М.: 2004. - 248 с.]. В исследованиях на животных установлено, что мексидол в дозе 50 мг/кг внутрь однократно не обладает антистрессорным эффектом. Однако этот эффект появляется при длительном применении препарата (30-95 дней) или при повышении дозы до 125 и 250 мг/кг (однократно). При введении мексидола в инъекциях антистрессорный эффект наблюдался при однократном введении препарата в дозе 50 мг/кг. При длительном применении мексидола регистрировалось повышение агрессивности животных (RU 2065299). В медицине натрия оксибутират (CAS 502-85-2) применяется для лечения психопатических неврозов, профилактики гипоманиакальных и маниакальных состояний, в наркологии при лечении алкогольной и опиатной зависимости, является гипнотиком метаболического действия и незаменимым препаратом в стандарте лечения судорожного статуса, обладает выраженным антигипоксическим эффектом. В настоящее время значительно повысился уровень употребления натрия оксибутирата с немедицинской целью: как допинг-средства и психоактивного вещества, что является серьезной социальной проблемой, так как данное вещество вызывает наркотическую зависимость, а также оказывает значительные побочные эффекты. Передозировка натрия оксибутирата вызывает глубокое угнетение ЦНС с остановкой дыхания, что без своевременного оказания квалифицированной медицинской помощи приводит к смерти пострадавшего [Шурыгин И.А. Оксибутират натрия: недокументированные свойства препарата (о чем молчит Машковский) / Шурыгин Е. А. // Журн. Медицина неотложных состояний. 2008. - №2. - С. 15.]. Эталонным ноотропом, который используется для восстановления нарушений интеллектуальных функций у больных при нарушении мозгового кровообращения, является пирацетам (2-оксо-1-пирролидинацетамид, CAS 932-17-2). Недостатком пирацетама как эталонного препарата является его низкая активность: уровень эффективных доз действия составляет 200-800 мг/кг, эффект пирацетама часто плохо воспроизводим (RU 2050851). Глицин (аминоуксусная кислота, CAS 56-40-6) - средство, повышающее умственную работоспособность и уменьшающее психоэмоциональное напряжение [Машковский, М. Д. Лекарственные средства: пособие для врачей. - Т. 2. - М.: Новая волна. - 2002. - С. 124].
Ацил производные глицина являются метаболитами жирных кислот в организме. N-(3-гидроксибензоил)глицин (3-гидроксигиппуровая кислота, CAS 1637-75-8) - метаболит рутина и других полифенолов [Liebich H.M., Forst C. Basic profiles of organic acids in urine. J Chromatogr. 1990; 525(1): 1-14. Pubmed: 2338430] - в медицине не используется. Производные 3-гидроксигиппуровой кислоты с гетероциклическим фрагментом действуют как ингибиторы стеарил-CoA десатуразы (US 20110046134). Производные 3-гидроксибензойной кислоты и аминоадамантана (CID 4030213) демонстрируют противовирусную активность [Martoglio В, Graf R, Dobberstein В. Signal peptide fragments of preprolactin and HIV-1 p-gp160 interact with calmodulin. ЕМВО J., 1997; 16(22): 6636-45].
Цель изобретения заключается в получении высокоэффективного водорастворимого производного 3-гидроксигиппуровой кислоты, сочетающего основные эффекты, присущие антигипоксическим и церебропротективным средствам, не уступающие или превосходящие таковые у натрия оксибутирата, глицина, пирацетама и мексидола.
Сущность изобретения заключается в синтезе динатрия 3-гидроксигиппурата формулы
и использования его в качестве антигипоксического и церебропротективного средства.
Пример 1. Динатриевая соль N-(3-гидроксибензоил)глицина (динатрия 3-гидроксигиппурат)
-
6
4
В реактор, снабженный мешалкой, помещают глицин и 50 мл ДМФА. По каплям приливают хлорангидрид 3-гидроксибензойной кислоты в течение 1,5 часа. Реакцию проводят при охлаждении 1,5 часа. Затем, полученную реакционную смесь перемешивают еще 2,5 часа (при охлаждении), контролируя pH среды (pH>7). Для поддержания среды добавляют 6 н раствор гидроксида натрия. Полученную смесь выливают в лед и подкисляют хлороводородной кислотой до рН 5, выпавшие кристаллы N-(3-гидроксибензоил)глицина отфильтровывают и сушат.Выход 73%. Tпл=167-170°C, Rf=0.785 (пропанол-1 : вода = 7:3). M+195 (хроматомасс-спектрометр «Saturn-2100», Varian). Затем полученный N-(3-гидроксибензоил)глицин (3-гидроксигиппуровая кислота) смешивают с этилатом натрия (мольное соотношение 1:2) и кипятят в среде бензола в течение 60 минут. После охлаждения продукт отделяют фильтрованием, промывают небольшим количеством спиртового раствора гидроокиси натрия и сушат. Получают белое кристаллическое вещество (выход 91%) с температурой плавления 320°C с разл. ИК-спектр, см-1: 1559.65 (-COO); 1267.55, 1254.70, 1242.65 (C-O); 3382.91(-CONH-); 1555-1424 (CH). Вычислено, %: С 45.20; H 2.95; Na 19.23; Ν 5.86; O 26,76. Найдено, %: C 45.56; H 2.89; Na 19.20; Ν 5.99; O 26.36.
Пример 2. Исследование антигипоксической активности динатрия 3-гидроксигиппурата
Исследование выполнено на мышах-самцах 18-20 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария с соблюдением всех правил лабораторной практики. Антигипоксическое действие заявляемого соединения и препаратов сравнения изучалось на моделях «нормобарической гипоксии с гиперкапнией» и «гемической гипоксии, вызванной нитритной интоксикацией».
Для создания «нормобарической гипоксии с гиперкапнией» животных помещали в герметически замкнутые камеры объемом 80 куб.см и регистрировали латентный период наступления апноэ. Увеличение продолжительности жизни животных в условиях гипоксии (по сравнению с контролем) под влиянием изучаемого соединения свидетельствует о наличии у него противогипоксического эффекта
«Гемическую гипоксию» вызывали путем однократного подкожного введения нитрита натрия в дозе 250 мг/кг. Об антигипоксическом действии исследуемого соединения судили по увеличению времени наступления апноэ у мышей опытных групп по сравнению с контрольной группой животных. В обеих сериях заявляемое соединение и препараты сравнения вводили внутрибрюшинно (в левую подвздошную область) за 40 мин до моделирования экспериментальной гипоксии в следующих дозах: динатрия 3-гидроксигиппурат - 8 мг/кг, глицин - 10 мг/кг, натрия оксибутират - 100 мг/кг, мексидол - 100 мг/кг. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.
В таблице 1 представлены результаты исследования антигипоксической активности динатрия 3-гидроксигиппурата.
При воспроизведении нормобарической гипоксии с гиперкапнией и гемической гипоксии введение всех соединений в различной степени способствовало увеличению времени наступления апноэ, при этом динатрия 3-гидроксигиппурат оказывал сопоставимое с мексидолом антигипоксическое действие, незначительно уступая по эффективности препарату сравнения - натрия оксибутирату (таблица 1).
ПРИМЕР 3. Влияние динатрия 3-гидроксигиппурата на выживаемость животных и степень их неврологического дефицита при неполной ишемии головного мозга, воспроизводимой путем необратимой одномоментной билатеральной окклюзией общих сонных артерий
Исследование выполнено на беспородных крысах-самцах 180-200 г, 3,5-4-х месячного возраста, содержавшихся в стандартных условиях вивария с соблюдением всех правил лабораторной практики (животные получены из питомника ФГУП "НИИ ГТП" ФМБА России). В качестве экспериментальной модели неполной ишемии головного мозга была выбрана одномоментная двусторонняя перевязка общих сонных артерий (ОСА) [Мирзоян P.C. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени // Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / Под. ред. А.Н. Миронова Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].
Для оценки влияние динатрия 3-гидроксигиппурата на выживаемость животных и степень их неврологического дефицита при неполной ишемии головного мозга были сформированы следующие группы: 1) ЛО (ложнооперированные) крысы - с данной группой животных выполнялись все манипуляции как и с группой контроль-ишемия, однако после подведения лигатур под общие сонные артерии они не затягивались; 2) контроль-ишемия - крысы, которым выполняли одномоментную двустороннюю окклюзию общих сонных артерий (ОСА) и получавшие физиологический раствор; 3) ишемия + динатрия 3-гидроксигиппурат - животные с двусторонней ОСА, получавшие динатрия 3-гидроксигиппурат в дозе 8 мг/кг; 4) ишемия + пирацетам - животные с двусторонней ОСА, получавшие соединение пирацетам в дозе 800 мг/кг; 5) ишемия + глицин - животные с двусторонней ОСА, получавшие соединение глицин в дозе 10 мг/кг. Каждая группа состояла из 20 крыс. Введение животным динатрия 3-гидроксигиппурата/пирацетама/глицина/физиологического раствора проводили за 30 минут до наложения лигатур на сонные артерии и через 2 часа после окончания хирургических манипуляций.
Регистрацию количества выживших животных проводили через 6, 12, 24, 48 и 72 часа после операции по моделированию неполной ишемии. Выраженность неврологического дефицита определяли по бальной шкале McGrow в модификации Ганнушкиной И.В. Оценку поведенческой активности, когнитивных функций животных проводили в стандартных психоневрологических тестах: «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ), «Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ), «Открытое поле».
Тест «открытое поле» (ОП) (Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982) предназначен для изучения поведения грызунов в новых условиях. При проведении теста животное помещается в центр круглой белой арены хвостом к экспериментатору. Визуальный контроль за поведением животного проводили в течение 3-х минут, фиксируются следующие показатели: число пересеченных секторов, количество стоек (учитывали и закрытые и открытые стойки), количество обследованных отверстий-норок. Об ориентировочно-исследовательской активности судят по сумме стоек и заглядываний в отверстия, а по количеству пересеченных секторов - о спонтанной двигательной активности.
Методика оценки условного рефлекса пассивного избегания» (УРПИ) является базисной моделью для выявления специфической ноотропной активности веществ. Она используется для оценки влияния веществ на формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения. Данная методика выполнялась следующим образом:
1) формирование рефлекса пассивного избегания - крысу помещали в освещенный отсек (лампа мощность 100 Вт) в центральную зону, хвостом к отверстию в темный отсек, обследовав светлый отсек крыса переходила в темный, через электрический пол которого подавался ток 40 В, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с, тем самым животное получало электроболевое раздражение. За животным наблюдали в течение 3-х минут, если оно вновь заходило в темный отсек, электроболевое раздражение наносили повторно, крысы, которые не заходили, из эксперимента исключались. Фиксировались следующие показатели: латентный период (ЛП) первого захода в темный отсек (время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек) и количество заходов в него;
2) контроль выработки рефлекса - все животные повторно не должны заходить в темный отсек установки, зашедшие животные исключались из эксперимента;
3) воспроизведение навыка пассивного избегания - на данном этапе в отличие от этапа обучения, если животное заходило в темный отсек, то электроболевое раздражение не наносили. Регистрировались аналогичные показатели, что и при обучении плюс общее время, проведенное в темном отсеке.
«Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ) предназначен для изучения когнитивных функций грызунов в условиях аверсивной среды и позволяет оценить: индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути активного избавления из аверсивной среды). Фиксировался ЛП подныривания (время от момента погружения животного в воду до подныривания под края цилиндра). Так же как и тест, УРПИ методика включает в себя этап обучения навыка (выработка рефлекса избавления) и этапа его воспроизведения через 24 часа. Животные, не решающие задачу за время наблюдения на этапе обучения, исключаются из опыта.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel и BioStat 2008 5.2.5.0. с использованием критерия Краскела-Уоллеса с последующим тестом по Данну, точного критерия Фишера.
Установлено, что при моделировании у экспериментальных животных неполной ишемии головного мозга к 72-му часу после перевязки ОСА, показатель летальности был достоверно ниже у тех животных, которые получали динатрия 3-гидроксигиппурат по отношению к группе животных, получавших физиологический раствор (таблица 2). Оказываемое им церебропротективное действие было сопоставимо с таковым у пирацетама и превосходило у глицина.
При оценке неврологического дефицита у животных с экспериментально вызванной ишемий головного мозга установлено, что динатрия 3-гидроксигиппурат достоверно препятствовал нарастанию у крыс неврологической симптоматики, что выражалось в снижении балла по шкале неврологического дефицита McGrow (таблица 3). Наименьшие неврологические отклонения через 72-часа после моделирования патологии были отмечены у животных, получавших динатрия 3-гидроксигиппурат в дозе 8 мг/кг.
Патентуемое соединение в дозе 8 мг/кг препятствовало возникновению выраженных нарушений локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности животных, уменьшало нарушения памяти, вызванные неполной и преходящей ишемией (таблица 4).
Таким образом, учитывая, что динатрия 3-гидроксигиппурат увеличивает выживаемость животных и снижает выраженность у них неврологических нарушений по сравнению с группой контроль-ишемия в условиях неполной ишемии головного мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий, заявленное соединение может найти применение при создании новых лекарственных препаратов для лечения заболеваний нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического генеза.
Пример 4. Определение острой токсичности
Острую суточную токсичность при однократном введении изучали на мышах-самцах массой 20-24 г. Соединение в дистиллированной воде вводили животным внутрибрюшинно в различных возрастающих дозах однократно. Наблюдение за животными проводили в течение суток, отмечая количество погибших животных. Расчет LD50 проводили методом проб и анализа.
Исследования острой токсичности показали, что по классификации токсичности веществ при их введении под кожу и в брюшную полость животных (К.К. Сидорова, 1973) заявляемое вещество относится к классу малотоксичных (таблица 5).