Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего 1L-1β в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus), и набор для его осуществления
METHOD FOR DETERMINING EXPRESSION LEVEL OF GENE CODING 1L-1β IN RABBIT EYE TISSUES (ORYCTOLAGUS CUNICULUS), AND KIT FOR IMPLEMENTATION THEREOF

Изобретение относится к области медицины, а именно, иммунологии и молекулярной биологии, и касается способа определения уровня транскрипции гена, кодирующего IL-1β в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus) с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени и может быть использовано в экспериментальной офтальмологии, а также на этапе доклинических исследований, в частности, при тестировании противовоспалительных препаратов.
IL-1β - цитокин провоспаления, относящийся к семейству IL-1, известному своей главной ролью в инициировании воспалительных реакций на стресс - включая как инфекционные, так и стерильные сигналы опасности.
Получены многочисленные доказательства участия IL-1β в патогенезе воспалительных, пролиферативных и дегенеративно-деструктивных заболеваний глаз. Согласно современной литературе, активация воспаления и последующая продукция IL-1β представляют собой двухэтапный процесс.
Первый этап включает NF-κВ-опосредованное повышение экспрессии целого ряда генов, кодирующих провоспалительные цитокины в ответ на сигналы воспаления. Наличие, сила воспалительного стимула, а также эффективность воздействия противовоспалительных средств могут быть определены с помощью выявления и оценки уровней транскрипции генов медиаторов воспаления, в частности, IL-1β.
Метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени повсеместно используется в лабораторной диагностике инфекционных болезней, молекулярной генетике и других областях медицины. Определение уровня экспрессии генов, кодирующих иммунорегуляторные пептиды (цитокины, факторы роста, хемоаттрактантные белки) относительно новое и весьма перспективное направление ПЦР- исследований. Реакция ОТ-ПЦР в режиме реального времени является наиболее чувствительным и специфичным методом молекулярной диагностики, позволяющим за сравнительно короткий промежуток времени сделать вывод о характере экспрессируемого профиля цитокинов в исследуемой ткани.
Постановка ОТ-ПЦР включает несколько основных этапов: выделение молекул мРНК в гомогенизированном образце ткани глаза, обработку ДНКазой проб с мРНК, синтез молекул кДНК при помощи обратной транскриптазы, определение уровня экспрессии исследуемого гена методом ПЦР, проверку специфичности ПЦР-продукта с помощью электрофореза и анализ полученных результатов.
Количество кДНК в анализируемом образце зависит не только от искомого уровня мРНК, но и от количества клеток в исследуемом биоматериале, наличия веществ, ингибирующих обратную транскрипцию, а также скорости разрушения мРНК. Для учета этих факторов и их влияния на ход реакции ОТ-ПЦР требуется параллельное измерение уровня экспрессии нормировочного гена - гена домашнего хозяйства (housekeeping gene). Известно более 10 генов домашнего хозяйства, обычно используемых для нормализации, из которых наиболее стабильной экспрессией обладают гены гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT), глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), b- актина [Foss D.L., Baarsch М.J., Murtaugh М.Р. Regulation of hypoxanthine phosphoribosyltransferase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin mRNA expression in porcine immune cells and tissues. // Anim Biotechnol. - 1998. - N1. - P.67-78.], а так же субъединицы А сукцинатдегидрогеназы [Nachar W., Busseuil D., Shi Y., Mihalache-Avram Т., Mecteau M.,  E., Tardif J.C. Optimisation of reference genes for gene-expression analysis in a rabbit model of left ventricular diastolic dysfunction. PLoS One. 2014 Feb 18;9(2)].
Известен способ оценки уровня экспрессии гена, кодирующего провоспалительный цитокин МСР-1 человека методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени [RU 2522801 С2, МПК C12N 15/10, 2012], предлагающий использование сразу нескольких нормировочных генов для получения более достоверных значений уровня экспрессии генов сравнения. Однако для этого необходим расчет «нормировочного коэффициента» - среднего геометрического или арифметического от значения относительного количества кДНК всех генов домашнего хозяйства. Выяснение уровня экспрессии всех нормировочных генов требует многократной постановки ОТ-ПЦР, большого количества реагентов, а главное больших объемов биоматериала, что не всегда рационально, а иногда и невозможно, особенно, когда проведение исследования планируется в малом объеме биологического материала, например, в тканях оболочек глаза экспериментальных животных.
Постановка мультиплексной ПЦР, где используется одновременно несколько пар праймеров к нескольким генам сравнения, требует синтеза гибридизационных зондов меченых флуорохромом, индивидуально специфичных для каждого из исследуемых генов. Это усложняет постановку реакции и существенно увеличивает финансовые затраты на ее проведение.
В научной литературе описан способ определения экспрессии генов провоспалительных цитокинов CXCL8, CXCR1 и CXCR2 в сетчатке кролика [Expression of CXCL8, CXCR1, and CXCR2 in neurons and glial cells of the humanand rabbit retina. - Goczalik I., Ulbricht E., Hollborn M., Raap M., Uhlmann S, Weick M., Pannicke Т., Wiedemann P., Bringmann A., Reichenbach A, Francke M. - Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 Oct; 49(10):4578-89. doi: 10.1167/iovs.08-1887. Epub 2008 Jun 14.], однако данный способ имеет ряд недостатков, т.к. базируется в первую очередь на методе полуколичественной ОТ-ПЦР в реальном времени, подразумевающем использование препаратов с высокой степенью очистки, а также содержащих заведомо высокое количество нуклеиновой кислоты, требующем соблюдения «идеальных» условий для постановки реакции. Авторами не раскрывается полный перечень реагентов, их количество, а также способ подбора оптимальной температуры отжига. Для фиксации флуоресценции используется достаточно большой объем SYBR Green (10 мкл на пробу), что является нерациональным и существенно повышает финансовые затраты на проведение реакции.
Исследование, выполненное в модели первичной открытоугольной глаукомы на кроликах с целью оценки профибротической активности препарата розиглитазона также основано на данных экспрессии соответствующих белков [Rosiglitazone Treatment Prevents Postoperative Fibrosis in a Rabbit Model of Glaucoma Filtration Surgery. - Zhang F., Liu K., Cao M., Qu J., Zhou D., Pan Z., Duan X., Zhou Y. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2019 Jun 3; 60 (7): 2743-2752. doi: 10.1167/iovs. 18-26526.]
Экспрессия генов кодирующих профибротические белки αSMA, CTGF, SP1, а также нормировочного гена GAPDH измерялась при помощи количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Однако в работе не представлен протокол пробоподготовки, постановки реакции, не указан состав реакционной смеси, а также не приведены расчеты результатов ОТ-ПЦР, что не позволяет использовать данные авторов в качестве руководства на этапе доклинических исследований. Фиксация флуоресценции в описанном исследовании осуществляется с помощью интеркалирующего красителя SYBR green expression master mix производства Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, дорогостоящей и не всегда доступной марки для потребителей.
Задачей настоящего изобретения является разработка простого, доступного, легко воспроизводимого и экономичного способа оценки экспрессии гена IL-1β в малом объеме биологического материала кроликов.
Техническим результатом является получение протокола пробоподготовки, постановки и расчетов результатов ОТ-ПЦР с оптимально подобранным для этого комплектом реагентов, позволяющих с высокой точностью воспроизвести реакцию в условиях ПЦР-лабораторий, для дальнейшего использования в экспериментальной офтальмологии на этапе доклинических исследований, и в частности, при испытании противовоспалительных лекарственных средств.
Технический результат достигается за счет:
1) Подбора оригинальных пар праймеров для IL-1β и GAPDH, обеспечивающих специфическую амплификацию без образования побочных структур.
2) Определения компонентов реакционной смеси - концентраций пары прямого и обратного праймеров, установки оптимальных температур элонгации, денатурации и отжига (методом градиента) и количества циклов амплификации.
3) Использования одного нормировочного гена GAPDH, как наиболее универсального, стабильно экспрессируемого практически всеми клетками организма.
4) Подбора наиболее доступных и экономичных реагентов, их минимального количества без потери эффективности реакции.
5) Снижения временных затрат для каждого этапа постановки.
При выборе пар праймеров в электронной базе данных NCBI Gen Bank с использованием программного обеспечения: Primer-BLAST, OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator и Standard Nucleotide BLAST отбирались наиболее перспективные последовательности олигонуклеотидов для исследуемых генов. Выбранные последовательности праймеров синтезировались на автоматическом синтезаторе ДНК («Евроген»). В результате были получены по 2 пары олигонуклеотидов для измерения экспрессии IL-1β и GAPDH.
Последовательность и молекулярная масса праймеров требуют индивидуального подбора количества вспомогательных компонентов реакции, а также определения параметров постановки амплификации (элонгация, отжиг и т.д.).
Для получения оптимальных условий проведения реакции осуществлялся ряд постановок с разной компоновкой реагентов по концентрации и количеству, из которых опытным путем выбран наиболее удачный и эффективный вариант. Требуемая температура отжига олигонуклеотидных праймеров и продолжительность этапов реакции определялись в режиме выполнения температурного градиента, где ряд пробирок с одинаковым содержимым подвергался одновременной амплификации, но с индивидуальной температурой отжига для каждой пробы, отличающихся между собой на 0,5°С.
Для проведения ОТ-ПЦР использовался термоциклер с оптическим блоком для детекции флуоресценции в режиме реального времени (амплификатор) CFX96 Touch (Bio-Rad). Реакция проводилась в течение 2 часов, одновременно фиксировался флуоресцентный сигнал, полученные данные, обработанные в программе Bio-Rad CFX Manager, в дальнейшем представлялись в таблицах и графиках.
Эффективность реакции амплификации определялась построением калибровочной кривой.
Изобретение осуществляется следующим образом.
Материал исследования - ткани глаза кролика забираются в чистые эппендорфы и замораживаются в камере глубокой заморозки при температуре -70°С.
Для получения мРНК замороженная ткань глаза предварительно доводится до однородного дисперсного состояния на гомогенизаторе (например, Silent Crusher S (Heidolph) в течение 90 секунд при скорости 45000 об./мин. мРНК из образцов ткани выделяется по протоколу (Part 1) коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Затем к образцам добавляется 1 мкл ингибитора РНКаз RNase Inhibitor (Qiagen) и обрабатывается ДНКазой DNase Max Kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя.
Количество полученной мРНК оценивается при помощи спектрофотометра длине волны 260 нм; в нашем случае - спектрофотометр марки Cytation 5 imaging reader (Biotek). Набор iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) используется для следующего этапа - синтеза кДНК при помощи обратной транскрипции. Для этого в эппендорфе смешивается: 9 мкл воды свободной от нуклеаз (Nuclease-free water) 4 мкл 5х iScript Reaction Mix 1 мкл iScript Reverse Transcriptase 5 мкл мРНК 1 мкл RNase Inhibitor (Qiagen).
Общий объем смеси (20 мкл) обрабатывается по протоколу производителя набора iScript cDNA Synthesis Kit на амплификаторе, в нашем случае используется CFX96 Touch (Bio-Rad).
Амплификация кДНК гена IL-1β проводится так же с помощью термоциклера. Флуоресценция регистрируется за счет добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя SYBR Green I (Евроген).
Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл содержит:
- вода дистиллированная 9,4 мкл
- буфер 1,5 мкл (Евроген)
- прямой праймер IL-1β_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,68 г/моль) 1 мкл
- обратный праймер IL-1β_1R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,81 г/моль) 1 мкл
- dNTP 0,5 млк
- кДНК 1 млк
- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл
- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)
Для амплификации используются праймеры IL-1β прямой - 5'-AATCTGTACCTGTCCTGCGTG-3' обратный - 5'-GGTTGGGGTCTACACTCTCC-3'.
Амплификация кДНК гена GAPDH проводится в объеме 15 мкл, реакционная смесь содержит:
- вода дистиллированная 9,4 мкл
- буфер 1,5 мкл (Евроген)
- прямой праймер GAPDH_1F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл
- обратный праймер GAPDH_1R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл
- dNTP 0,5 мкл
- кДНК 1 мкл
- SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл
- Taq- полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан)
Для амплификации используются олигонуклеотиды GAPDH прямой - 5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3', обратный - 5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'.
Протокол реакции:
- первичная денатурация- 2 минуты 30 секунд 95°С
- амплификационный цикл (х55)
- денатурация - 15 секунд 95°С
- отжиг праймеров - 20 секунд 62,7°С
- элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 секунд 72°С
Дополнительный контроль амплификации осуществлеяют методом электрофореза в 2% агарозном геле, куда вносят 10 мкл ампликонов смешанных с 6-кратным буфером для загрузки.
Анализ результатов ОТ-ПЦР.
t
Всего проанализировано 16 образцов тканевого комплекса сетчатка - хориоидея кроликов, 12 из которых были получены при моделировании атрофии ретинального пигментного эпителия. Пробоподготовка осуществлялась, как описано выше. Для каждой из тест-проб при помощи программы Bio-Rad CFX Manager определяется пороговый цикл (C), при котором количество кДНК во всех реакционных пробирках достигало одинаковой пороговой величины (задавалась программным обеспечением).
Воспроизводимость реакции амплификации исследуемого и референсного гена оценивалась постановкой каждой пробы в тройном повторе, где разница между пороговыми циклами составляет не более 0,5 цикла.
Для определения реакционной эффективности праймеров репрезентативный образец пятикратно последовательно разводился в 4 раза, с последующим измерением количества кДНК в каждом разведении при помощи спектрофотометра (например, Cytation 5 imaging reader (Biotek) (фиг. 1). Эффективность амплификации образцов, отраженная в калибровочной кривой, рассчитывалась в программе Bio-Rad CFX Manager согласно формулам:
[-1/m]
E=10, Е%=(Е-1)×100%, где Е-эффективность, m - наклон стандартной кривой.
t
В уравнении калибровочной кривой показана логарифмическая зависимость значения порогового цикла (C) пяти образцов разведения репрезентативной пробы от количества кДНК в каждом образце. На фиг. 2 приведены калибровочная кривая (А) и графики изменения интенсивности свечения пробы (Б) при амплификации гена IL-1β для 5 образцов с последовательно уменьшающейся в 4 раза концентрацией кДНК в зависимости от цикла реакции.
Анализ результатов исследования выполнен методом расчета относительной величины (ΔС) исследуемого образца (IL-1β) по формуле:
Где:
Е - эффективность набора праймеров и зондов.
t (контроля)
t
C - среднее значение C для нормировочного гена (GAPDH)
t (образца)
t
C - среднее значение C исследуемого образца (IL-1β)
Нормированная экспрессия (ΔΔС) - относительная величина экспрессии исследуемого гена нормированная к величине экспрессии референсного гена в образце биоматериала, вычислялась по формуле:
Полученное в ходе расчетов значение ΔΔС использовано для оценки экспрессии гена IL-1β.
IL1β_F     aatctgtacctgtcctgcgtg
IL1β_R    ggttggggtctacactctcc
GAPDH_F     gattgtcagcaacgcatcctg
GAPDH_R    ctccacaatgccgaagtggt