КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА НИТЧАТЫХ ГРИБОВ
CULTURE MEDIUM FOR PRODUCTION OF THREAD FUNGI

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области фитосанитарных агентов.
В частности, изобретение относится к культуральной среде для нитчатых грибов (гифомицетов), более конкретно к грибам-нематофагам.
Известный уровень техники
В настоящее время все более широкое применение находят микроорганизмы и прежде всего грибы в качестве фитосанитарных агентов.
В продаже уже имеются продукты на основе грибов, предназначенные для борьбы с насекомыми, фитопатогенными грибами и другими паразитами, характерными для сельскохозяйственных культур.
Например, в патенте US 5811092 описаны агенты-нематофаги, применяемые для борьбы с нематодами, относящимися к родам Meloidogyne, Hetherodera и Ditylenchus, которые представляют собой в основном штаммы нитчатого гриба Arthrobotrys conoides Dreschsler.
Указанные нематоды вызывают серьезные поражающие растительность и обусловливающие грибами заболевания и наносят большой экономический ущерб, что приводит к потере 50-70% урожая.
Применение грибов-нематофагов в качестве альтернативы общепринятым антипаразитическим химическим средствам (таким, например, как метилбромид, трихлорнитрометан, дихлорпропен и т.д.) для внесения в почву до ее обработки или карбаматов, которые наносят непосредственно на культуры, позволяет избежать серьезных проблем, таких как необходимость стерилизации почвы, нарушение экологического баланса и потенциальная токсичность для человека и животных.
Таким образом, грибы-нематофаги особенно пригодны для применения в «органическом земледелии», однако это является относительно дорогостоящим вследствие трудностей получения их в больших количествах в промышленном масштабе.
Следовательно, существует необходимость в создании более дешевых грибов-нематофагов, которые можно применять в сельском хозяйстве.
В основу настоящего изобретения была положена задача разработать культуральную среду для нитчатых грибов и прежде всего для грибов-нематофагов, которая дает возможность получать такие микроорганизмы с высоким выходом в промышленном масштабе и в течение коротких периодов времени, что позволяет существенно снизить стоимость конечного продукта.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно изобретению такую проблему решают с помощью культуральной среды для нитчатых грибов, которая содержит по меньшей мере один источник углерода, выбранный из группы, включающей мелассу, солодовый экстракт и сахарозу, и по меньшей мере один источник органического азота, выбранный из группы, включающей дрожжевой экстракт и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания.
Предпочтительно на долю вышеуказанного по меньшей мере одного источника углерода приходится от 70 до 85 мас.% сухой массы культуральной среды, а на долю вышеуказанного по меньшей мере одного источника органического азота приходится от 15 до 30 мас.% культуральной среды.
Культуральная среда, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать также источник минерального азота, представляющий собой нитраты аммония или соли. Вышеуказанный источник минерального азота, как правило, добавляют в культуральную среду постепенно в течение периода роста грибов в количестве, составляющем не более 10 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды и, как правило, в количестве от 5 до 8 мас.%.
Предпочтительно в состав культуральной среды, предлагаемой в настоящем изобретении, входит солодовый экстракт в количестве от 75 до 85 мас.% и дрожжевой экстракт в количестве от 15 до 25 мас.% (проценты даны, как указано в конце настоящего описания, в виде мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды).
В состав другой предпочтительной культуральной среды, предлагаемой в изобретении, входит меласса в количестве от 60 до 65%, сахароза в количестве от 10 до 15%, жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 10 до 15% и дрожжевой экстракт в количестве от 10 до 15%. Предпочтительно в состав такой культуральной среды входит также источник минерального азота в количестве от 5 до 8%, прежде всего вторичный кислый фосфат аммония.
В состав еще одной предпочтительной культуральной среды, предлагаемой в изобретении, входят два источника углерода, т.е. солодовый экстракт в количестве от 25 до 30% и меласса в количестве от 40 до 45%, а также жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 25 до 30%.
Подробное описание изобретения
Далее настоящее изобретение более подробно пояснено на примерах вариантов осуществления изобретения, приведенных с целью иллюстрации, но не ограничения его объема.
Перед описанием примеров авторы считают целесообразным дать некоторые определения, касающиеся компонентов культуральной среды, предлагаемой в изобретении.
В качестве источников углерода применяют солодовый экстракт и/или мелассу, и/или сахарозу.
Солодовый экстракт получают с помощью прорастания зерен хлебных злаков (как правило, ячменя). При прорастании образуются специфические ферменты (амилазы), которые обеспечивают превращение крахмала в сахара. В состав солодового экстракта входят мальтоза, витамины и многие микроэлементы в количестве, составляющем примерно 60%.
Меласса представляет собой побочный продукт сахарной промышленности и находится в форме коричневато-черной вязкой жидкости, содержащей воду в количестве 10%, сахарозу в количестве 35%, другие сахара в количестве 20% и золу в количестве 15%.
В качестве источников органического азота применяют дрожжевой экстракт и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания.
Дрожжевой экстракт получают путем аутолиза Saccharomyces cerevisiae и он находится в форме мелкодисперсного светло-желтого порошка, легко растворимого в воде. Дрожжевой экстракт содержит пептиды, свободные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, а также водорастворимые витамины В-группы. В дрожжевом экстракте общее содержание азота составляет 10% и содержание α-амминового азота составляет 5%.
Жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до разбухания, получают путем замачивания зерен кукурузы в течение 24-48 ч при 50°С в воде, содержащей диоксид серы. Этот реагент позволяет разрушать белковую сеть, окружающую крахмальные зерна, и дает преимущество, заключающееся в предотвращении развития нежелательных микроорганизмов в процессе замачивания. В жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, общее содержание азота составляет 7% и α-аминового азота 1,7%, в ее состав входит также сахар в количестве 5%, калий в количестве 4%, фосфор в количестве 3% и различные минералы в количестве 17%.
При создании изобретения тестировали различные культуральные среды, содержащие различные указанные выше источники углерода и азота. Эти среды можно разделить на следующие три класса:
класс 1: среды, в которых основным источником углерода является солодовый экстракт;
класс 2: среды, в которых основным источником углерода является меласса;
класс 3: среды, в которых основным источником углерода являются солодовый экстракт и меласса.
Процентное содержание источника органического азота в средах, предлагаемых в изобретении, можно снижать путем замены части такого источника органического азота на источник неорганического азота (нитраты аммония или его производные), которые постепенно добавляют в небольших количествах в процессе культивирования.
Такое добавление неорганического азота в процессе культивирования обеспечивает лучшее снабжение микроорганизма питательными веществами и в случае нитчатых грибов усиление филаментов мицелия.
Замена части источника органического азота на источник неорганического азота дает также преимущество с точки зрения снижения стоимости производства, поскольку источники органического азота (дрожжевой экстракт и жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, являются наиболее дорогостоящими компонентами культуральной среды, предлагаемой в изобретении).
Культуральную среду, предлагаемую в изобретении, особенно предпочтительно применять для получения нитчатых грибов семейства Moniliales. В приведенных ниже примерах применяли, в частности, нитчатые грибы Arthrobotrys conoides Dreschsler.
Пример 1
В этом примере описана культуральная среда класса 1.
Выращивание нитчатых грибов осуществляли в колбе Эрлена вместимостью 300 мл, содержащей 150 мл культуральной среды.
Среда содержала солодовый экстракт в концентрации 20 г/л и дрожжевой экстракт в концентрации 4 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.
Культивирование осуществляли в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.
На третий день из культуральной среды брали образцы для определения содержания сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 1.
Таблица 1
День
рН
Сухая масса (г/л)
КОЕ/л
0
6
0
0,00
3
5,26
1,505
1,92×10<sup>8</sup>
4
5,79
3,345
1,30×10<sup>9</sup>
5
6,56
5,05
3,07×10<sup>9</sup>
6
6,11
9,895
4,43×10<sup>9</sup>
Пример 2
Тест, описанный в примере 1, повторяли в миниреакторе объемом 2 л, содержащем 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 1. Экспериментальные условия были такими же, как и в примере 1, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.
2
Используемый реактор представлял собой круглодонный контейнер, снабженный лопастной мешалкой, нагревающими и охлаждающими устройствами, устройствами для продувки воздухом, а также зондами для измерения значения рН, концентрации О и температуры.
Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 2.
Таблица 2
День
рН
Сухая масса (г/л)
КОЕ/л
0
6
0
0,00
1
5,51
1,175
2,50×10<sup>6</sup>
2
5,5
1,3825
1,80×10<sup>7</sup>
3
6,61
1,59
8,50×10<sup>7</sup>
4
5,4
4,03
9,60×10<sup>8</sup>
5
5,13
4,29
1,27×10<sup>9</sup>
6
5,08
5,625
3,10×10<sup>9</sup>
7
5,5
7,848
6,08×10<sup>9</sup>
9
В результате по истечении семи дней культивирования получали примерно 8 г грибов на литр культуральной среды, содержащих 6,08×10 отростков.
Пример 3
В данном примере описан тест, проведенный с культуральной средой, относящейся к классу 2.
Культивирование нитчатых грибов осуществляли в колбах Эрлена вместимостью 300 мл, содержащих 150 мл культуральной среды.
Среда содержала мелассу в количестве 25 г/л, сахарозу в количестве 5 г/л, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве 5 г/л и дрожжевой экстракт в количестве 5 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.
Культуру инкубировали в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.
Начиная с третьего дня, брали образцы культуральной среды для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 3.
Таблица 3
День
рН
Сухая масса (г/л)
КОЕ/л
0
5,07
0
0,0
3
4,87
1,58
3,2×10<sup>7</sup>
4
4,20
3,82
1,0×10<sup>8</sup>
5
6,46
6,76
1,0×10<sup>9</sup>
6
6,98
9,995
3,5×10<sup>9</sup>
Пример 4
Тест, описанный в примере 3, повторяли согласно методу, описанному в примере 2, в миниреакторе вместимостью 2 л, который содержал 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 3. Экспериментальные условия были такими же, что и в примере 3, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.
Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 4.
Таблица 4
День
рН
Сухая масса (г/л)
КОЕ/л
0
5,07
0
0,00
1
5,04
2,675
9,90×10<sup>7</sup>
2
5,01
3,9
3,00×10<sup>8</sup>
3
5,44
5,125
5,00×10<sup>8</sup>
4
6,11
8,295
8,20×10<sup>8</sup>
5
6,69
2,75
1,07×10<sup>9</sup>
6
7,32
3,485
2,10×10<sup>9</sup>
7
7,65
10,164
3,77×10<sup>9</sup>
Результаты, приведенные для периода времени после пятого дня, могут показаться аномальными, однако они обусловлены лишь избыточной концентрацией грибов в культуральной среде, что не позволяло далее отбирать гомогенные образцы.
Последний образец брали непосредственно из реактора.
9
В этом случае в течение семи дней получали более 10 г грибов на литр культуральной среды с содержанием отростков 3,77×10.
Пример 5
В этом примере описан тест, проведенный с использованием культуральной среды класса 3.
Культивирование нитчатого гриба осуществляли в колбе Эрлена вместимостью 300 мл, содержащей 150 мл культуральной среды.
Среда содержала мелассу в количестве 15 г/л, солодовый экстракт в количестве 10 г/л и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве 10 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.
Культуру инкубировали в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.
Начиная с третьего дня, брали образцы культуральной среды для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 5.
Таблица 5
День
рН
Сухая масса (г/л)
КОЕ/л
0
4,7
0
0,00
3
4,49
1,82
2,38×10<sup>7</sup>
4
4,62
3,815
1,78×10<sup>8</sup>
5
5,25
5,57
1,23×10<sup>9</sup>
6
6,03
8,555
1,35×10<sup>9</sup>
Пример 6
Тест, описанный в примере 5, повторяли согласно методу, описанному в примере 2, в миниреакторе вместимостью 2 л, который содержал 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 5. Экспериментальные условия были такими же, что и в примере 5, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.
Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 6.
Таблица 6
День
рН
Сухая масса (г/л)
КОЕ/л
0
4,7
0
0,00
1
4,61
2,905
5,60×10<sup>6</sup>
2
4,7
3,085
6,00×10<sup>7</sup>
3
4,56
3,265
1,23×10<sup>8</sup>
4
6,11
5,295
3,20×10<sup>8</sup>
5
5,99
5,88
7,00×10<sup>8</sup>
6
6,94
6,305
9,50×10<sup>8</sup>
7
7
10,026
2,22×10<sup>9</sup>
9
В течение семи дней получали более 10 г грибов на литр культуральной среды с содержанием отростков 2,22×10.
Пример 7
Культуральную среду, описанную в примере 3, модифицировали, как указано ниже, для уменьшения содержания двух источников органического азота, которые являются наиболее дорогостоящими компонентами:
25 г/л мелассы;
5 г/л сахарозы;
2,5 г/л жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до разбухания;
2,5 г/л дрожжевого экстракта.
В такой культуральной среде проводили тестирование культуры (А), с использованием указанного выше гриба с целью сравнения с результатами тестирования двух других культур (Б и В), в которых применяли такую же культуральную среду и в которые последовательно добавляли, начиная с четвертого дня, источник минерального азота.
В тесте Б. Начиная с четвертого дня (более конкретно, на четвертый, шестой и восьмой день), трижды добавляли по 0,21 г вторичного кислого фосфата аммония, так что общее количество указанного ингредиента составляло 0,63 г, а в тесте В, начиная с четвертого дня (более конкретно, на четвертый, шестой и восьмой день), трижды добавляли по 0,28 г, так что общее количество добавленного ингредиента составляло 0,84 г.
Тесты проводили в колбах Эрлена вместимостью 500 мл, содержащих 300 мл культуральной среды, которую стерилизовали перед посевом конидий.
На девятый и последний день культивирования общее содержание азота в культуральной среде (А) составляло 0,85 г/л, в то время как в средах, в которые добавляли вторичный кислый фосфат аммония (А и Б), оно составляло 1,05 г/л (А) и 1,26 г/л (Б) соответственно.
Начиная с третьего дня, из культуральных сред через каждые два дня брали образцы для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 7.
Таблица 7
День
А рН
А CM
A КОЕ
Б pН
Б CM
Б КОЕ
В рН
В CM
В КОЕ
0
5,06
0,00
0,00
5,06
0,00
0,00
5,09
0,00
0,00
3
4,92
3,94
5,50×10<sup>6</sup>
4,80
2,84
2,50×10<sup>4</sup>
4,80
3,36
2,50×10<sup>4</sup>
5
5,12
3,44
1,75×10<sup>8</sup>
4,89
4,57
4,73×10<sup>8</sup>
5,30
3,48
3,05×10<sup>8</sup>
7
6,68
6,45
1,58×10<sup>9</sup>
5,47
8,32
3,15×10<sup>9</sup>
6,39
5,48
4,00×10<sup>9</sup>
9
7,14
8,63
3,20×10<sup>9</sup>
5,44
11,30
7,25×10<sup>9</sup>
5,86
7,86
6,78×10<sup>9</sup>
CM = сухая масса (г/л)КОЕ = количество отростков/литр
Как видно из приведенной выше таблицы, добавление источника минерального азота, прежде всего в небольших количествах (тест Б), позволяет существенно увеличивать количество сухой массы, которую получают, начиная с седьмого дня культивирования, и достигать более чем 100%-ного увеличения количества отростков, полученных в течение этого же периода культивирования.