Определение содержания углеводов и спиртов в полупродуктах спиртовых производств с использованием биосенсоров

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 2. С. 247-255

Химия

УДК 602.4:547.455.623:007.573.6

Определение содержания углеводов и спиртов в полупродуктах спиртовых производств с использованием биосенсоров *

В.А. Алферов, В.А. Арляпов, С.С. Каманин

Аннотация. Разработаны ферментные биосенсоры амперометрического типа для анализа содержания этанола, глюкозы и крахмала в полупродуктах брожения, определены их характеристики. Показана что биосенсор на основе фермента глюкозоксидазы позволяет проводить анализ глюкозы в диапазоне 0,5—2,5 мМ, а биосенсор на основе алкогольоксидазы позволяет проводить анализ этанола в диапазоне 0,7 - 12,3 мМ. Проведен анализ образцов полупродуктов брожения. Показано, что результаты анализа этанола, глюкозы и крахмала в полупродуктах брожения методом с использованием биосенсора совпадают с результатами, полученными референтными методами (титриметрия, поляриметрия, газовая хроматография).

Ключевые слова: биосенсоры, глюкоза, этанол, крахмал, глюко-зоксидаза, алкогольоксидаза, производство спирта.

Введение

Среди ключевых параметров технологического процесса производства спирта важное место занимает содержание глюкозы, метилового спирта и крахмала [1,2]. Дифференциальная оценка содержания указанных компонентов на различных стадиях позволяет оптимизировать технологический процесс брожения и снижать материальные затраты, приводя в соответствие качество исходного сырья с качеством применяемых ферментов и дрожжевой массы [3, 4, 5]. Традиционные методы определения метанола и этанола либо отличаются недостаточной точностью, либо трудоемки, дороги и характеризуются длительным временем анализа, что не позволяет использовать их при постоянном мониторинге содержания указанных компонентов [6]. Наиболее часто концентрацию спиртов определяют с помощью ареометра (спиртометра), однако этот метод является не точным, так как наличие в

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (гос. контракты № 02.740.11.0296, № П551) и программы РФФИ «Мобильность молодых ученых» (проект № 10-03-90728-моб_ст.).

растворе различных солей, углеводов и других примесей искажают результаты замера. Газовая хроматография, представляющая стандартный метод оценки спиртов, является довольно дорогостоящим методом и требует наличия квалифицированного персонала. Те же недостатки можно отнести и к методу высокоэффективной жидкостной хроматографии, используемой для определения глюкозы и других углеводов в водных растворах. Эти методы могут быть эффективно применены для контроля качества готовой продукции, однако они не могут быть использованы для экспресс-анализа ферментационных сред.

В связи с этим актуальным направлением исследований является разработка метода анализа, который позволил бы упростить и удешевить процедуру определения указанных компонентов без потери точности и специфичности, а так же обеспечить возможность их постоянного мониторинга в реальных объектах. Перспективным подходом является развитие биосенсор-ных технологий [7]. В последнее время исследования в области биосенсорной детекции открывают широкие возможности для конструирования биоанали-тических систем, отличающихся невысокой стоимостью. К преимуществам таких биосенсоров можно отнести короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца [8].

Таким образом, целью настоящей работы являлось: определение содержания этилового спирта, глюкозы и крахмала на различных стадиях процесса брожения с использованием ферментных биосенсоров.

Материалы и методы

Модельный процесс брожения и получение сброженной массы.

Образец пшеничной муки растворяли в теплой дисстилированной воде, после чего колбу нагревали в термостате до 90°C. В полученную массу добавляли ферментный препарат Termamyl и ставили обратно в термостат при перемешивании на 2 часа. После истечения времени отбирали первую пробу, колбу охлаждали до 60°C и добавляли фермент SAN Super 360L, и ставили обратно в термостат при перемешивании на 2 часа. После этого отбирали вторую пробу, охлаждали колбу до 30° C, добавляли дрожжевой препарат и ставили в термостат на 120 часов для брожения. Остальные пробы отбирались через примерно одинаковые промежутки времени в процессе брожения.

Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием гальванопотенциостата IPC 2L (Кронас, Россия), интегрированного с персональным компьютером, и специализированного программного обеспечения IPC-micro (Кронас, Россия) для регистрации и обработки сигналов сенсоров. Средняя величина тока, соответствующая содержанию кислорода в дистиллированной воде 9,2 мг/дм3, составляла 30 нА при шуме 0,25 нА. Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буфер (рН 6,8), концентрация

солей составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200-1000 мкл, 20-200 мкл) («Биохит», Финляндия).

Формирование рецепторного элемента. Ферментные препараты ал-когольоксидазы и глюкозоксидазы разбавляли определённым количеством раствора буфера до концентрации 30 мг/см3. Полученную смесь наносили на стекловолоконный фильтр (Whatman GF/A, Sigma) в количестве 3 мкл. Элемент (3x3 мм) подсушивали на воздухе в течение 15 минут при 20° C. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки.

Хроматографический анализ спиртов. Определение содержания спиртов и других летучих полярных соединений проводили методом газовой хроматографии на хроматографе марки «Кристалл 5000.2» («СКБ Хроматэк», Россия) в соответствии со стандартными методиками. Условия хроматографирования: колонка DB-FFAP (США) 50м x0,32мм х0,50мкм; газ-носитель — гелий; температура термостата — 75°С; температура испарителя (инжектора) — 200°С.; детектор ионизации в пламени (ДИП), температура детектора 250°С; скорость потока газа-носителя — 0,144 дм3/ч.

Определение содержания крахмала поляриметрическим методом. Для анализа был использован поляриметр круговой СМ-3 (ЗОМЗ, Россия) с кюветой с длинной оптического пути 100 мм. Для измерения 10 мл пробы помещали в мерную колбу на 100 мл, добавляли 50 мл хлороводородной кислоты. Колбу помещали на кипящую водяную баню на 15 мин. В колбу добавляли холодную дистиллированную воду и охлаждали струёй водопроводной воды примерно до 20°C. Для осветления жидкости в колбу добавляли 3 мл раствора молибдата натрия. Доводили дистиллированной водой до метки, перемешивали и фильтровали через складчатый фильтр. Прозрачный фильтрат помещали в поляриметрическую кювету и измеряли угол вращения плоскости поляризации.

Определение содержания глюкозы в пробах титриметрическим методом. Для проведения анализа в колбу помещали 10 мл анализируемой пробы, добавляли 25 мл раствора йода. При непрерывном перемешивании из бюретки приливали 30 мл раствора гидроксида натрия. Колбу закрывали пробкой, помещали в затемнённое место на 15 мин, затем подкисляли 35 мл раствора серной кислоты. Титровали раствором тиосульфата натрия до слабо-жёлтой окраски. При добавлении крахмала раствор приобретал синюю окраску. Далее титровали до обесцвечивания раствора.

Результаты и обсуждение

В работе были проведены исследования по определению содержания крахмала, этанола и глюкозы в сброженной массе в процессе спиртового брожения. Содержание крахмала определяли, используя для этого биосен-

сорный и поляриметрический (в качестве референтного) методы. Содержание этилового спирта определяли, используя биосенсорный метод и метод газовой хроматографии. Содержание глюкозы определяли с использованием биосенсорного и титриметрического методов.

Образцы проб полупродуктов брожения были приготовлены из пшеничного сырья с использованием промышленных ферментных препаратов Ter-mamyl, SAN Super 360L и дрожжевого препарата SuperStart. Первую пробу для анализа отбирали перед добавлением ферментного препарата SAN Super 360L, вторую — перед добавлением дрожжевого препарата, остальные пробы отбирались через примерно одинаковые промежутки времени в процессе брожения.

Для анализа этанола и глюкозы в пробах полупродуктов производства спирта были использованы биосенсоры на основе ферментов глюкозоксида-зы и алкогольоксидазы. Для биосенсоров на основе обоих ферментов была получена градуировочная зависимость ответа биосенсора от концентрации субстрата. Биорецепторы на основе иммобилизованных ферментов являются биорецепторами каталитического типа, поэтому их градуировочные зависимости хорошо описываются уравнением типа Михаэлиса-Ментен:

Rmax\S ]

R

km [

где Rmax — максимальная скорость потребления кислорода иммобилизованными ферментами, достигаемая при [5] ^ то; Км — эффективная константа Михаэлиса, т.е. концентрация субстрата, при которой R = Rmax/2.

Согласно этому уравнению концентрация аналита будет пропорциональна отклику биосенсора только при концентрациях, гораздо меньших Км. Тогда уравнение приобретает следующий вид:

0 Лтах[5 ]

Л -

Км

Для снижения ошибок анализа, как правило, определение концентрации компонентов проводят на линейном участке калибровочной зависимости, ограниченном Км (рис. 1).

Было проведено определение характеристик используемых биосенсоров (табл. 1). В качестве субстрата для биосенсора на основе алкогольоксидазы был использован этиловый спирт, а для биосенсора на основе глюкозоксида-зы — глюкоза.

Биосенсоры на основе обоих ферментов позволяют анализировать достаточно низкие концентрации глюкозы и этанола и могут быть использованы для анализа полупродуктов брожения.

Для проверки результатов анализа содержания компонентов в полупродуктах брожения разработанными биосенсорами были использованы референтные методы анализа. Наиболее известным и широко используемым методом анализа спиртов является газо-жидкостная хроматография, об-

О 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014

Концентрация субстрата, моль/л

Рис. 1. Зависимость ответа биосенсоров на основе алкогольоксидазы и глюкозоксидазы от концентрации субстрата

Таблица 1

Характеристики биосенсоров на основе глюкозоксидазы и алкогольоксидазы

Основа рецепторного элемента Операционная стабильность (Относительное стандартное отклонение %) Чувствительность нА-дм3/ мин-моль Длитель- ность одиночного измерения, мин Линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от концентрации субстрата, моль/дм3

Алкого- льоксидаза 5 2517 5-10 0,0007-0,0123

Глюкозоок- сидаза 4 92 515 5-10 0,0005-0,0025

ладающая высокой чувствительностью, селективностью, точностью и возможностью одновременной идентификации и количественного определения различных веществ. Недостатками этого метода являются дорогостоящее оборудование и необходимость в высококвалифицированном персонале. Метод газовой хроматографии был использован в качестве референтного для анализа этилового спирта в образцах бродильных сред

Для анализа глюкозы в качестве референтного метода был использован метод йодометрического титрования. Метод основан на окислении альдоз

щелочным раствором йода. После окончания реакции избыток йода, не вступивший в реакцию, оттитровывали раствором тиосульфата натрия.

В качестве референтного метода для анализа крахмала в пробах был использован поляриметрический метод. Поляриметрический метод определения крахмала основан на переводе крахмала в растворимое состояние и измерении плоскости поляризации полученного раствора. Поляриметрические методы определения крахмала удобны в исполнении и не требуют проведения дополнительных реакций. Однако для обеспечения точности определения необходимо удалять все содержащиеся в анализируемых средах оптически активные соединения, которые могут оказать влияние на результат анализа. В табл. 2 представлены результаты анализа этанола, глюкозы и крахмала в полупродуктах брожения.

Таблица 2

Результаты анализа этанола, глюкозы и крахмала в пробах методом с использованием биосенсора и рефереентными методами

Время про- цесса, ч Концентрация этанола в пробе, моль/л Концентрация глюкозы в пробе, моль/л Концентрация крахмала в пробе, г/л

Метод с использованием биосенсора Метод ГХ Метод с использованием биосенсора Титримет- рический метод Метод с использованием биосенсора Поля- римет- риче- ский метод

2 0 0 0,062± ±0,005 0,066± ±0,003 47 ± 3 47 ± 4

4 0 0 0,23 ± 0,02 0,23 ± 0,01 29 ± 2 29 ± 3

18 0 0,001±0,001 0,27 ± 0,02 0,28 ± 0,01 22 ± 2 23 ± 2

23 0,02±0,01 0,015±0,003 0,28 ± 0,02 0,27 ± 0,01 21 ± 1 23 ± 2

28 0,07±0,02 0,068±0,005 0,28 ± 0,02 0,28 ± 0,01 21 ± 2 21 ± 2

42 0,14 ± 0,03 0,15 ± 0,01 0,29 ± 0,03 0,29 ± 0,01 20 ± 1 19 ± 3

67 0,25 ± 0,04 0,25 ± 0,02 0,26 ± 0,02 0,27 ± 0,01 18 ± 1 18 ± 2

91 0,35 ± 0,05 0,33 ± 0,02 0,22 ± 0,01 0,224± ±0,009 18 ± 1 17 ± 2

114 0,43 ± 0,07 0,46 ± 0,03 0,16 ± 0,01 0,163± ±0,008 18 ± 1 17 ± 2

Таким образом, значения концентрации этанола, глюкозы и крахмала в образцах полупродуктов брожения, определенных методом с использованием биосенсора совпадают со значениями концентрации этих компонентов, определенных референтными методами.

На основе полученных результатов был построен график зависимости концентрации этанола и глюкозы в пробах от времени процесса, который представлен на рис. 2.

Рис. 2. Зависимость содержания глюкозы и этанола от времени процесса

Из представленных данных видно, что концентрация глюкозы продолжает расти даже после завершения процесса осахаривания. По всей вероятности 4 часа является недостаточно для полного гидролиза содержащегося в образце крахмала, поэтому параллельно процессу брожения идет процесс осахаривания остатков крахмала.

Концентрация этанола начинает активно расти после 14 часов от начала брожения, по всей вероятности это время необходимо дрожжевым клеткам на адаптацию к новым условиям окружающей среды.

На рис. 3 представлен график зависимости концентрации крахмала в пробах от времени процесса.

Из представленных данных видно, что концентрация крахмала продолжает падать даже после завершения процесса осахаривания. Это согласуется с данными по содержанию глюкозы в пробах полупродуктов брожения.

Выводы

Разработаны биосенсорные анализаторы амперометрического типа для анализа содержания этанола, глюкозы и крахмала в полупродуктах брожения, определены их характеристики. Показана что биосенсор на основе фермента глюкозоксидазы позволяет проводить анализ глюкозы в диапазоне

0,5—2,5 мМ, а биосенсор на основе алкогольоксидазы позволяет проводить анализ этанола в диапазоне 0,7-12,3 мМ.

Проведен анализ образцов полупродуктов брожения. Показано, что результаты анализа этанола, глюкозы и крахмала в полупродуктах брожения

О 20 40 60 80 100 120 140

время процесса, час

Рис. 3. Зависимость содержания крахмала от времени брожения

методом с использованием биосенсора совпадают с результатами, полученными референтными методами (титриметрия, поляриметрия, газовая хроматография).

Показано, что при проведении модельного процесса спиртового брожения частичный гидролиз остатков крахмала происходит и после завершения процесса осахаривания, а концентрация этилового спирта начинает активно расти после 14 часов от начала брожения, по всей вероятности это время необходимо дрожжевым клеткам на адаптацию к новым условиям окружающей среды.

Список литературы

1. Adamowicz E, Burstein C. L-lactate enzyme electrode obtained with immobilized respiratory chain from Escherichia coli and oxygen probe for specific determination of L-lactate in yogurt, wine and blood // Biosensors. 1987. V.3(1), P.27.

2. Guemas Y, Boujtita M., el Murr N. Biosensor for determination of glucose and sucrose in fruit juices by flow injection analysis // Appl Biochem Biotechnol. 2000. V.89(2-3). P.171.

3. Amperometric determination of total assimilable sugars in fermentation broths with use of immobilized whole cells / M. Hikuma [et al.] // Enzyme Microb. Technol. 1980. V.2. P.234.

4. Bishop B.F., Lorbert S.J. The needs for sensors in bacterial and yeast fermentations // Bioprocess Technol. 1990. V.6. P.1.

5. Becker T.M., Schmidt H.L. New ways of enzymatic two-substrate determinations in flow injection systems // Analytica Chimica Acta. 2000. V.421(1). P.7.

6. / В.А. Сибирый [и др.] // Микробиологический журнал. 2005. Т.67, №4. С.85-100.

7. Terry L.A., White S.F., Tigwell L.J. The application of biosensors to fresh produce and the wider food industry // J. Agric. Food Chem. 2005. V.53, №5. P.1309-1325.

8. Racek J. Cell-based biosensors // Lancaster. "Technomic Publishing Company, Inc."1995. P.107.

Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Арляпов Вячеслав Алексеевич (gwinbleidd@rambler.ru), ассистент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Каманин Станислав Сергеевич (i-Asc@mail.ru), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Determination of carbohydrates and alcohols in the semifinished product of alcohol production with the use of biosensors

V.A. Alferov, V.A. Arlyapov, S.S. Kamanin

Abstract. Developed amperometric biosensor analyzers such as for analyzing the content of ethanol, glucose and starch in the semifinished product of fermentation, determined by their characteristics. It is shown that the biosensor based on glucoseoxidase allows the analysis of glucose in the range 0,5—2,5 mM, and the biosensor based on alcoholoxidase allows the analysis of ethanol in the range 0.7-12.3 mM. The analysis of samples of semi-fermented. It is shown that the analysis of ethanol, glucose and starch in the semifinished product of fermentation method using a biosensor coincide with the results obtained by reference methods (titrimetry, polarimetry, gas chromatography).

Keywords: biosensors, glucose, ethanol, starch, glucoseoxidase, alcoholoxi-dase, alcohol production.

Alferov Valeriy (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, head of department, department of chemistry, Tula State University.

Arlyapov Vyacheslav (gwinbleidd@rambler.ru), assistant, department of chemistry, Tula State University.

Kamanin Stanislav (i-Asc@mail.ru), student, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 07.04.2010