Метод пцр в лабораторной диагностике бруцеллеза

16. Островская Н.Н., Толмачева Т.А. Вирулентность для морских свинок L-форм бруцелл вида Abortus // Микробиология. 1974. № 6. С. 146, 147.

17. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий. - М.: Медицина. 1981. - 239 с.

18. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза: Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. - М., 2003. - 38 с.

19. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии. - М.: Медицина, 1973. - 392 с.

20. Толмачева Т.А., Кац Л.Н. Биологические свойства и ультраструктура бруцелл в процессе L-трансформации и реверсии // Микробиология. 1977. № 1. С. 90 - 93.

21. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. - Л.: Колос, 1976. - 279 с.

22. Banai M., Adams L.G., Frey M. et al. The myth of Brucella L-forms and possible involvement of Brucella penicillin binding proteins (PBPs) in pathogenicity // Vet. Microbiol. 2002. V. 90. № 1 - 4. P. 263 - 279.

23. Egwu I.N., Eveland W.C. Cytological change related to Brucella canis variants uptake in vitro // Med. Microbial. Immunol. 1979. V. 167. № 2. P. 107 - 115.

24. Joint FAO/WHO expert committee on Brucellosis sixth report World Health Organisation Technical Report Ceries. - Geneva, 1986. - 133 p.

25. Hatten B.A., Sulkin E.S. Intracellular production of Brucella L-forms. Recovex of L-forms tissue culture cells infected with Brucella // J. Bacteriol. 1966. V. 91. № 1. P. 285 - 296.

26. Nelson E.L., Pickett M.J. The covery of Brucella and their relation to Brucella phage // J. Infect. Disiase. 1951. V. 8. № 3. P 226 - 232.

Метод ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза*

Ю.К. Кулаков, М.М. Желудков (mmzhel.gamaleya@mail.ru),

Т.А. Толмачева, Л.Е. Цирельсон

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

Резюме

Цель работы заключалась в совершенствовании системы идентификации и дифференциации представителей рода Brucella и лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

ПЦР использовали для проведения родовой и видовой идентификации 131 штамма патогенных видов бруцелл разного географического происхождения, идентифицированных традиционными фенотипическими методами. Из шести синтезированных пар праймеров на специфические родовые и видовые последовательности мишеней генов белков (BruAb1_1825, BRA0378, BMEI1661, BruAb2_0168, BruAb1_0266 и

BMEII0827) только одна мишень BruAb2_0168 оказалась строго специфичной к виду B. abortus. Применение в ПЦР праймеров на остальные генные мишени позволяло идентифицировать вид у всех изолятов по наличию специфических продуктов амплификации.

Изучение диагностической эффективности ПЦР в клинических образцах 196 сывороток крови больных с подозрением на бруцеллез подтвердило возможность использования этого метода в качестве дополнительного в лабораторной диагностике бруцеллеза людей.

Ключевые слова: бруцелла, бруцеллез, полимеразная цепная реакция, диагностика

PCR in Laboratory Diagnosis of Brucellosis

Yu.K. Kulakov, М.М. Zheludkhov (mmzhel.gamaleya@mall.ru),

Т.А. Jolmacheva, L.E. Cirelson

N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Academy of Medical Sciences, Moscow Abstract

The investigation was aimed at improving tools for identification and differentiation of the genus Brucella and laboratory diagnosis of brucellosis infection using PCR.

PCR was used for the genera, species identification of 131 strains of pathogenic species of Brucella of different geographical origin, identified by traditional phenotypic methods. From the six pairs of primers synthesized on the specific sequence of target genes (BruAb1_1825, BRA0378, BMEI1661, BruAb2_0168, BruAb1_0266 and BMEII0827) only one target BruAb2_0168 was strictly specific to the species B. abortus. Application of PCR-primers for the rest of the target genes allows the species identification of all isolates by the presence of specific amplification products.

Survey on the diagnostic efficiency of PCR with clinical samples of blood sera of 196 patients with suspected brucellosis confirmed the possibility of using it as a supplementary method in the laboratory diagnosis of human brucellosis.

Key words: Brucella, brucellosis, polymerase chain reaction, diagnosis

Введение

Бруцеллез - инфекционное, особо опасное зоонозное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, которое передается от животных к человеку, характеризуется тяжелым и часто хроническим течением [1, 8]. Бруцеллез представляет актуальную проблему для здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется более 500 тыс. впервые выявленных случаев этого заболевания у людей [12], для России данный показатель составляет около 500 случаев. Что

касается хронической формы бруцеллеза, то она не имеет официального учета [2].

Противоэпидемические мероприятия включают определение возбудителя инфекции и источника его распространения. Одним из наиболее информативных показателей является выделение возбудителя заболевания. При выделении культуры микроорганизмов в первую очередь необходимо их идентифицировать и дифференцировать с применением традиционных методов (длительных, трудоемких, дорогостоящих и небезопасных), основан-

* Докладывалось на Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней-(к 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о природной очаговости болезней), ноябрь 2009 г., Омск.

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

ных на фенотипических особенностях представителей рода Brucella [3].

В последние годы для идентификации, дифференциации бруцелл и лабораторного подтверждения диагноза используют молекулярногенетические методы исследования, в частности полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [2, 6, 10, 14]. ПЦР позволяет в короткие сроки определить наличие специфической последовательности ДНК бру-целл в пробах как клинического, так и полевого материала.

Цель наших исследований заключалась в совершенствовании системы идентификации и дифференциации представителей рода Brucella и лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции с помощью ПЦР.

Материалы и методы

Молекулярно-генетический метод был применен для проведения родовой и видовой идентификации бруцелл. В работе использовали 131 штамм патогенных видов бруцелл разного географического происхождения, полученных из лаборатории бруцеллеза НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных ВГНКИ (Москва), Академии ветеринарной медицины (Санкт-Петербург), Городской ветеринарной лаборатории (Санкт-Петербург), лаборатории диагностики бруцеллеза ВНИИБТЖ (Омск), лаборатории бруцеллеза Ставропольского НИИПЧИ, Центра гигиены и эпидемиологии в Челябинской области, Института ветеринарной медицины (Улан-Батор, Монголия).

Предварительно изоляты были изучены общепринятыми фенотипическими методами идентификации и дифференциации бруцелл [3] и фаготипи-рования с применением вирулентных бруцеллезных фагов Tb, Wb, Bk, Fi, M51, S-708, JP32A3 [4]. Для сравнительного анализа параллельно использовали референтные штаммы B. abortus 544, B. suis 1330, B. melitensis 16M, B. melitensis 63/9, B. melitensis Ether (S-форма) и B. canis RM6/66 (R-форма).

Генотипирование бруцелл до уровня вида и био-вара проводили в ПЦР с праймерами на родо- и видоспецифические дифференцирующие мишени генов белков бруцелл [7, 9, 13]. Использовали родовые и видовые праймеры на дифференцирующие последовательности иммуноглобулинсвязывающе-го белка EIBE (BruAb1_1825), белка неизвестной функции (BRA0378), рекомбиназы (BMEI1661), наружного белка-транспортера (BruAb2_0168), белка неизвестной функции (BruAb1_0266) и глюко-зофосфаттрансферазного белка (BMEII0827), которые были синтезированы в ЗАО «Синтол», Россия.

Для детекции ДНК бруцелл в сыворотках крови людей использовали родоспецифические праймеры, синтезированные на основе последовательности гена BCSP31, кодирующего поверхностный

белок наружной мембраны B. abortus размером 31 кД. Были синтезированы последовательности из 19 нуклеотидов, фланкирующие фрагмент в 260 нуклеотидных пар: прямой праймер Br1 5' -AGT CAG ACG TTG CCT ATT G-3' и обратный праймер Br2 5'- GTG TTC AGC CTT GAT ATC G-3' [11].

Выделение ДНК из микробных клеток проводили с использованием сорбента Silica (SiO2) по ранее описанной методике [5], а для детектирования ДНК бруцелл в клинических образцах сывороток и крови нами была разработана модификация этой методики.

В каждую пробирку с 500 мкл лизирующего буфера (6 M GuSCN (гуанидин-тиоцианат), 20 ммоль ЭДТА, 10 ммоль трис-HCl (pH 6,5), 2% Triton X-100) вносили 100 мкл сыворотки или 40 мкл крови и перемешивали на вортексе до полного растворения материала (1 - 3 минуты). Добавляли 20 мкл ре-суспендированного 4% сорбента Silica («Хеликон», Россия). Содержимое пробирок перемешивали на вортексе в течение 30 секунд и осаждали сорбент-центрифугированием при 1000 об./мин в течение 20 секунд. Осадок отмывали последовательно: в 500 мкл отмывочного буфера 1 (6 M GuSCN, 20 ммоль ЭДТА, 10 ммоль трис-HCl (pH 6,5)), дважды в 500 мкл отмывочного буфера 2 (25% изопропанола, 25% этанола, 100 ммоль NaCl и 10 ммоль трис-HCl (pH 8,0)) и в заключение - в 500 мкл отмывочного раствора 3 (70% этанола, 10 ммоль NaCl). В пробирки с высушенным при комнатной температуре сорбентом добавляли 40 мкл элюирующего ТЕ-буфера (10 ммоль трис-HCl (pH 8,0), 1 ммоль ЭДТА). Элюацию ДНК с сорбента проводили в водяной бане 10 минут при 65 °С, встряхивая несколько раз на вортексе в процессе прогрева, после центрифугирования при 10 000 об./мин в течение 5 минут супернатант содержал очищенную ДНК, служившую матрицей при постановке ПЦР.

ПЦР для дифференциации бруцелл проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 ммоль трис-НС! (рН 8,6), 2,5 ммоль MgCl2, 16,6 ммоль ^Н4)2 SO4, 0,2 ммоль каждого из дНТФ, по 6 пмоль каждого праймера и 1,5 ед. Tag-полимеразы («Силекс», Россия) - с 1 - 10 нг ДНК каждого изолята. В качестве положительного контроля использовали по 10 нг ДНК референтных штаммов бруцелл.

ПЦР с целью выявления ДНК бруцелл в сыворотках крови проводили в пробирках объемом

0,5 мл в 50,0 мкл той же реакционной смеси с 10 мкл выделенной ДНК.

Амплификацию осуществляли при следующих температурных режимах:

94 °С - 90 секунд - один цикл, 94 °С - 20 секунд, 54 °С - 40 секунд, 72 °С - 40 секунд - 35 циклов и 72 °С - 5 минут. Использовали амплифика-тор МС-2 Терцик («ДНК-Технология», Россия).

В ячейку 1,5% агарозного геля на 1 х ТАЕ (трис-ацетатном буфере) вносили 3 - 5 мкл ам-пликона (ДНК из культур бруцелл) или 20 мкл

(ДНК из сывороток крови). Электрофорез проводили при напряжении 8 В/см в течение двух часов. Результаты ПЦР учитывали после окрашивания раствором этидия бромида (0,5 мкг/мл), фотографирования геля под ультрафиолетовым излучением при длине волны 254 нм и сравнения размеров длины ампликонов с ДНК-маркером O'Gene Ruler 100 н.п. фирмы Fermentas (Литва) и размерами ампликонов референтных штаммов.

В образцах сывороток крови определяли специфические антитела по общепринятым методикам [3] с помощью реакций: агглютинации в пробирках Райта (РА), агглютинации на стекле Хедль-сона (РХ), антиглобулиновой пробы Кумбса (РК), иммуноферментного анализа (ИФА).

Результаты и обсуждение

Наличие уникальных видоспецифических инсер-ций и делеций для каждого вида делает возможным их использование в качестве мишеней в ПЦР для проведения дифференциации видов бруцелл [7, 9, 13].

Результаты ПЦР с ДНК 108 полевых изолятов бруцелл разного географического происхождения (26 - B. melitensis, 35 - B. abortus, 34 - B. canis, 12 - B. ovis и один - B. suis), а также 17 референтных и шести вакцинных штаммов бруцелл представлены в таблице 1. Показано, что только одна пара праймеров для генетического маркера № 4 была строго специфична к виду B. abortus. Генетический маркер № 2 оказался специфичным к B. suis первого биовара, B. neotomae и всем изоля-там B. canis. Генетический маркер № 3 специфичен к B. melitensis первого и третьего биоваров, а также к B. neotomae. Генетический маркер № 5 отсутствовал к B. suis и всем изолятам B. canis, а мар-

кер № 6 отсутствовал только к B. abortus первого биовара. Размер ампликона и специфичность ПЦР соответствовали предсказанным по сиквенсу для каждого вида и определенным по фенотипу.

Результаты проведенных исследований позволили предложить алгоритм генотипирования бруцелл до уровня вида и биовара в ПЦР с праймерами на родо- и видоспецифические дифференцирующие мишени генов белков бруцелл.

Таким образом, полученные нами результаты показали возможность проведения генетического типирования бруцелл до уровня вида и биовара с помощью быстрой рутинной ПЦР.

В настоящее время диагностика многих инфекционных заболеваний, в том числе и бруцеллеза, ввиду их выраженного полиморфизма невозможна без объективного лабораторного подтверждения. В качестве наиболее чувствительных, а самое главное, специфичных рассматриваются молекулярногенетические методы, и в частности полимеразная цепная реакция.

Ранее нами было показано, что высокие чувствительность и специфичность ПЦР обеспечивают возможность не только верификации диагноза на всем протяжении инфекционного процесса (в острой, подострой и хронической стадиях болезни), но и выявления активности течения заболевания, в том числе у длительно болеющих хроническим бруцеллезом [2].

В исследованиях мы использовали ПЦР в обыденной лабораторной диагностике бруцеллеза при поступлении образцов крови из различных медицинских учреждений.

Оценку эффективности ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза осуществляли при исследовании 196 образцов сывороток крови людей с по-

Таблица 1.

Генотипирование референтных, вакцинных и полевых штаммов бруцелл до уровня вида и биовара с использованием праймеров на дифференцирующие генетические маркеры

№ дифференцирующих праймеров, специфичность Генетические маркеры 2 S ю «B eo о . 1 1 dû с Q а CÛ 0 s .2 vo 5 ю со ^ S 1 1 OQ 1- С B. abortus B. melitensis qT a m to o ф 1- = и OQ с fco ° II 0Q с

B. abortus B. melitensis B. suis 1 биовар, n = 34 3 ш со 0>и ч- 1 ¡5 II мос 1 биовар, n = 8 2биовар, n = 18 3 биовар, n = 3

1. Brucella Chr. I (S1) BruAb1_1825 w S B0 BR1846 + + + + + + + + +

2. B. suis Chr. I (S2) IncP BRA0378 + + - - - - - + -

3. B. melitensis Chr. I (M1) BMEI 1661 - - - - + - + + -

4. B. abortus Chr. I (A1) BruAb2_0168 - - + + - - - - -

5. B. melitensis, B. abortus Chr. I (MA1) BruAb1_0266 BMEI 1681 - - + + + + + + +

6. Brucella Chr. II (SM2) BMEI I0827 BRA0439 + + - + + + + + +

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Таблица 2.

Сравнительное изучение эффективности ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза у людей

Больные РА РК ИФА РХ ПЦР % положит.

% положит. ср.* титр % положит. ср.* титр % положит. ср.* титр % сомнит. % положит.

С подозрением на бруцеллез, п = 196 20,9 ± 2,9 1:128 45,9 ± 3,6 1:160 66,8 ± 3,4 1:1600 35,1 ± 3,4 38,8 ± 3,5 27,0 ± 3,2

Из них: больные хронической формой, п = 81 33,3 ± 5,3 1:160 70,4 ± 5,1 1:160 95,1 ± 2,4 1:1280 43,2 ± 5,5 53,1 ± 5,6 38,3 ± 5,4

Примечание: * Среднее геометрическое титров; положит. - результат положительный; сомнит. - результат сомнительный

дозрением на бруцеллез и больных хронической формой заболевания. Образцы сывороток крови тестировали с помощью ПЦР и серологических реакций: агглютинации в пробирках Райта, агглютинации на стекле Хедльсона, в антиглобулиновой пробе Кумбса и иммуноферментном анализе. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.

При исследовании образцов сывороток крови людей в 45 (23,0 ± 3,0%) случаях были получены отрицательные результаты по всем используемым лабораторным тестам, что позволило исключить подозрение на бруцеллез.

ПЦР была положительной у 27,0% обследованных лиц с подозрением на бруцеллез. Наибольшее совпадение положительных результатов лабораторных тестов отмечено между ПЦР и ИФА (90,6 ± 4,1%), затем - между ПЦР и РХ (сомнительный и положительный результат) - 84,9 ± 4,9%, ПЦР и РК - 62,3 ± 6,7%, а между ПЦР и РА - только 24,5 ± 6,0%.

При тестировании 81 сыворотки крови больных хронической формой бруцеллеза, которые были обследованы в этой группе, ПЦР была положительной в 38,3% случаев. Совпадение положительных результатов выявлено между ПЦР и ИФА в 93,5 ± 4,5% случаев, ПЦР и РХ (сомнительный и положительный результат) - тоже в 93,5 ± 4,5%, ПЦР и РК - в 58,1 ± 9,0%, а между ПЦР и РА -только в 32,3 ± 8,5% случаев. Уровень специфических антител в ИФА (средний титр 1:1280) значительно превышал таковой в РК и РА (1:160), что свидетельствует о высокой чувствительности этого метода при диагностике хронических форм заболевания.

Ранее нами было показано, что наличие ДНК бруцелл в крови в совокупности с клиническими проявлениями и результатами других лабораторных тестов свидетельствует об активности течения заболевания. Положительный результат ПЦР у 38,8% больных хронической формой бруцеллеза указывает на наличие возбудителя в макроорганизме, что является ценной информацией для лечащего врача при определении тактики лечения этих больных и назначении антибактериальной терапии.

Таким образом, сравнительный анализ результатов лабораторных методов исследования показал, что наиболее высокой чувствительностью при диагностике бруцеллеза обладает ИФА, который выявляет специфические антитела различной физико-химической природы и рекомендован для диагностики как острой, подострой, так и хронических форм заболевания [2]. Наличие ДНК в крови больных в комплексе с положительными серологическими реакциями и клиническими проявлениями свидетельствует о высокой активности течения инфекционного процесса.

Выводы

1. Разработан алгоритм генотипирования бруцелл до уровня вида и биовара в ПЦР с праймерами на родо- и видоспецифические дифференцирующие мишени генов белков бруцелл.

2. Подтверждено преимущество ИФА в диагностической практике бруцеллезной инфекции у людей.

3. Показано, что наиболее перспективным в лабораторной диагностике бруцеллеза людей является сочетание традиционных методов исследования с молекулярно-генетическими, к числу которых относится ПЦР.

Литература

1. Вершилова П.А. Бруцеллез. - М.: Медицина, 1972.

2. Желудков М.М. Бруцеллез в России: современная эпидемиология и лабораторная диагностика: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. - М., 2009. - 50 с.

3. Методические указания «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей» (МУ 3.1.7.1189-03). - М.: Минздрав России, 2003. - 58 с.

4. Alton G.G., Jones L.M., Angus R.D., Verger J.M. Techniques for the brucellosis laboratory / Institut National de la Recherche Agronomique. -Paris, 1988.

5. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. № 28. P 495 - 503.

6. Castaño M.J., Solera J. Chronic brucellosis and persistence of Brucella melitensis DNA // J. Clin. Microbiol. 2009. V. 47 (7). P. 2084 - 2089.

7. Chain P.S., Comerci D.J., Tolmasky M.E. et al. Whole-genome analyses of speciation events in pathogenic Brucellae // Infect. Jmmun. 2005. № 73. P. 8353 - 8361.

8. Corbel M.J. Brucellosis: an overview // Emerg. Infect. Dis. 1997. № 3. P. 213 - 221.

9. Halling S.M., Peterson-Burch B.D., Bricker B.J. et al. Completion of the genome sequence of Brucella abortus and comparison to the highly similar genomes of Brucella melitensis and Brucella suis // J. Bacteriol. 2005. № 187. P. 2715 - 2726.

10. Huber B., Scholz H.C., Lucero N., Busse H.J. Development of a PCR assay for typing and subtyping of Brucella species. // Int. J. Med. Microbiol. 2009. № 26. P 563 - 573.

11. Mayfield J.E., Bricker B.J., Godfrey H. et al. The cloning, expression, and nucleotide sequence of a gene coding for an immunogenic Brucella abortus protein // Gene. 1988. № 63. P. 1 - 9.

12. Pappas G., Papadimitriou P., Akritidis N. et al. The new global map of human brucellosis // Lancet Infect Dis. 2006. № 6. P. 91 - 99.

13. Ratushna V.G., Stugrill D.M., Ramamoorthy S. et al. Molecular targets for rapid identification of Brucella spp. // Bio. Med. Central Microbiol. 2006. № 6. P 13 - 33.

14. Surucuoglu S., El S., Ural S. et al. Evaluation of real-time PCR method for rapid diagnosis of brucellosis with different clinical manifestations // Pol. J. Microbiol. 2009. V. 58 (1). P. 15 - 19.

omms

молекулярные

диагностические

технологии

НОВИНКА!

УвАжАЕмыЕ коллЕги!

вашему вниманию предлагаются наборы реагентов для СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗОВ.

Кат. № Наименование Кол-во

#KS-040 «Иерсиниоз-ИФА-ІдА» 96 тестов

#KS-041 «Иерсиниоз-ИФА-lgM» 96 тестов

#KS-042 «Иерсиниоз-ИФА-lgG» 96 тестов

Тест-системы иммуноферментные для выявления антител

класса A (#KS-040), M (#KS-041), G (#KS-042) к возбудителям кишечного иерсиниоза (Yersinia enterocolitica) и псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis). высокая чувствительность и специфичность тестов достигаются благодаря использованию уникальной композиции рекомбинантных антигенов Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis.

ооо «омникс», 194044, г. Санкт-Петербург, Б. Сампсониевский пр-т, д. 11А Тел./факс: +7 (812) 542-01-01; тел.: +7 (812) 972-52-04, +7 (812) 294-64-35 E-mail: omnix.sales@gmail.com; www.omnix.ru

omni

*1

с\

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010