Калориметрическое исследование денатурации гемоглобина человека с диметилсульфоксидом

89 НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ | •! | Серия Естественные науки. 2014. № 3 (174). Выпуск 26

УДК 536.6:612.111.11:547.569.2

КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕНАТУРАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА С ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДОМ

В данной работе методом дифференциальной сканирующей адиабатической калориметрии исследовано влияние диметилсульфоксида концентрацией от о до 50% на термоденатурацию гемоглобина человека. Проведен термодинамический и кинетический расчет параметров денатурации белка с данным криопротектором. Повышение концентрации диметилсульфоксида приводит к понижению значений энергии активации, температуры и калориметрической энтальпии денатурации гемоглобина. Такие изменения термодинамических и кинетических параметров денатурации белка в присутствии диметилсульфоксида можно объяснить разрыхлением молекул гемоглобина и, как следствие, снижением их термостабильности и степени кооперативности.

Ключевые слова: гемоглобин, термоденатурация, диметилсуль-фоксид, дифференциальная сканирующая калориметрия.

Введение

Консервирование биологических систем с использованием низких температур в последние десятилетия получило широкое развитие [1]. Начальным этапом криоконсервирования биообъектов является инкубирование их с криозащитными средами. Так, инкубирование белков с криопротекторами может вызывать определенные изменения в пространственной организации белков, что отражается на их функциональных свойствах. Например, исследование гемоглобина на этапах криоконсервирования является актуальным в связи с важным его функциональным свойством - участием в процессе дыхания. В настоящей работе в качестве криопротектора был выбран диметилсульфоксид (ДМСО), широко применяющийся в последние десятилетия при криоконсервировании различных биологических объектов, таких как эритроциты, эмбрионы, спермии и другие [1, 2]. Одним из прямых экспериментальных подходов в исследовании изменения пространственной организации белков по их термоденатурации является дифференциальная сканирующая калориметрия, позволяющая оценить термодинамические и кинетические параметры денатурации макромолекул [3]. Исследование влияния данного криопротектора на термоденатурацию гемоглобина человека с помощью метода ДСК, а также расчет термодинамических и кинетических параметров плавления данного белка с криопротектором не проводился, что и явилось целью данной работы.

Материалы и методы

Гемоглобин (HbA) получали из отмытых эритроцитов донорской крови: 1 мл цельной крови и 10 мл физиологического раствора NaCl смешивали и центрифугировали при I500g в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляли. Процедуру отмывания проводили 3 раза. Полученную эритромассу гемолизировали в гипотоническом растворе (5 мМоль фосфатный буфер, pH 7.8) и центрифугировали при 27500g в течение 15 мин. Концентрацию гемоглобина определяли спектрофотометрическим методом. Концентрация белка в калориметрической ячейке составляла около 5 мМоль. В данной работе использовался диметилсульфосид марки х.ч. (Реахим, Россия). Растворы криопротекторов готовили взвешиванием на аналитических весах.

Термограммы регистрировали на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (СКБ БП Пущино, Россия). Область сканирования - от 25 до 80°C при избыточном давлении 2.5 атм. Скорость нагрева - 1 град./мин. Термограммы обрабатывали с помощью программного пакета Microsoft Office Excel. Данные интерпретировали согласно [3, 4]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета Origin 7.5 (OriginLab Corporation, США). Данные в таблице для AHcal и Еа приведены как среднее значение ± стандартное отклонение.

А.В. Зинченко,

Ю.С. Говорова

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Украина, 61015, г. Харьков, ул. Переяславская, 23

E-mail:ju-st7@yandex.ua, alexa-zin@mail.ru

Кинетический анализ данных ДСК

Как указано в работах [5, 6], процесс денатурации гемоглобина необратимый и подчиняется двустадийной модели Ламри-Эйринга. На первой стадии происходит обратимая диссоциация тетрамера на протомеры, на второй - кинетический необратимый переход в развернутое состояние (анфолдинг). В данной работе мы проводим кинетический анализ второй стадии, модель которой можно представить в виде: U-k-> D, где U - нативное состояние белка; D - денатурированное состояние белка; k - константа скорости процесса денатурации.

Для проверки обратимости или необратимости процесса денатурации нами была проведена процедура повторного прогрева образца: после регистрации пика денатурации гемоглобина, образец охлаждали, затем заново снимали зависимость теплоемкости от температуры. При повторном сканировании поглощение тепла не наблюдалось, что указывает на необратимость процесса денатурации гемоглобина.

Одним из критериев соответствия экспериментальных данных обсуждаемой модели денатурации белка является совпадение значений энергии активации (Ea), вычисленной различными способами [3, 7]. Для определения значений энергии активации термоденатурации гемоглобина из экспериментальных кривых использовали два подхода Sanchez-Ruiz и соавт. [7]. В первом случае Ea вычисляли из формулы:

E = eRCex T2 / АН,

a p max

где Ea - энергия активации; Cpex - избыточная теплоемкость; R - универсальная газовая постоянная; АН - энтальпия денатурации, которая определяется как площадь под кривой зависимости избыточной теплоемкости от температуры; T - текущая температура.

Во втором случае - отношение Ea/R определяли как тангенс угла наклона зависимости ln (v Cpex/(AHcai - Q)) от l/T, где Q - текущее количество теплоты, поглощаемое в процессе денатурации, v - скорость нагрева [7].

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлены типичные термограммы денатурации гемоглобина в присутствии ДМСО различной концентрации. Эндотермический пик на термограммах отображает процесс денатурации Hb. Форма пика денатурации для нативного гемоглобина хорошо согласуется с данными, указанными в литературе [5, 8]. Температура денатурации нативного гемоглобина составляет 344 К.

На основании анализа полуширины и формы пиков плавления можно судить о степени кооперативности данного процесса [3, 4]. Денатурация нативного гемоглобина представляет собой высококоперативный переход. В присутствии ДМСО значения полуширины пиков возрастают, что говорит о понижении кооперативности процесса денатурации белка.

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

310 315 320 325 330 335 340

Температура, К

345

350

355

Рис. 1. Термограммы гемоглобина в присутствии ДМСО: 1 - нативный; 2 - 20% ДМСО;

3 - 40% ДМСО

3

0

На основе данных термограмм были построены зависимости температуры (1) и изменения калориметрической энтальпии (2) денатурации гемоглобина от концентрации ДМСО (сдмсо) (рисунок 2 и таблица). При добавлении криопротектора температура денатурации монотонно убывает и близка к линейной, что подтверждает литературные данные о линейной зависимости стабильности белка от концентрации осмолита [9]. В то время как зависимость ДН от концентрации ДМСО носит более сложный характер, так, на общем фоне снижения калориметрической энтальпии от концентрации криопротектора в диапазоне от 5 до 20% ДМСО наблюдается минимум калориметрической энтальпии, возможно, связанный с разрыхлением молекул гемоглобина и ослабление связей гема с глобином. При 20% ДМСО рост калориметрической энтальпии, вероятно, обусловлен стабилизацией молекул гемоглобина и вызван некоторой модификацией гидратной оболочки глобиновой части молекул белка.

Таблица

Температуры, калориметрические энтальпии и энергии активации процесса денатурации гемоглобина в присутствии различных концентраций ДМСО

сдмсо, масс. % н ДН, кДж/моль Еа1, кДж/моль Еа2, кДж/моль

0 344±о.2 15б±10 360.4*17 3б2±12

5 342±0.2 150±10 383.9±17 37б±12

10 341±о.2 121±10 343-2±17 323±12

20 335±0.2 159±10 300.4*17 317±12

40 327±0.2 113±9 292.9*17 327±12

50 321±0.2 94±8 266.9*16 293±11

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Концентрация ДМСО, масс.%

Рис. 2. Зависимости температуры (1) и изменения энтальпии (2) денатурации

от концентрации ДМСО

На рисунке 3 представлены зависимости 1п (у ср” /(ДН - Q)) от 1/Т анфолдинга гемоглобина с добавлением ДМСО. Линейность графиков в данных координатах [3] указывает на пригодность используемой нами модели денатурации Ламри-Эйринга в данном эксперименте. Нами были также рассчитаны значения энергии активации для процесса денатурации гемоглобина с ДМСО концентрацией от о до 50%. Энергия активации для нативного гемоглобина составляет 361 кДж/моль.

Значения энергии активации, вычисленные с использованием подходов, рассмотренных выше (см. Кинетический анализ данных ДСК), представлены в таблице, и совпадают в пределах погрешности эксперимента, что говорит о применимости используемой нами модели денатурации для гемоглобина с ДМСО. В таблице Е а1 — энергия активации вычислена с использованием формулы -1 подход, Еа2 — определен по тангенса угла наклона (см. рис. 3) — 2 подход.

370

го 360

!Р«

350 ч: ю го О

л § 340

330

320

310

2

1

Рис. 3. Зависимости ln (v Cpex /(ДИ - Q)) от обратной температуры для гемоглобина с добавлением ДМСО: 1 - без ДМСО; 2 - 20% ДМСО; 3 - 40% ДМСО

Полученные значения энергии активации для нативного гемоглобина хорошо согласуются с данными, приведенными в литературе [5]. В присутствии криопротектора происходит понижение значений энергии активации, что свидетельствует о понижении термостабильности белка [10] и подтверждает предположение о разрыхлении молекул гемоглобина человека.

Таким образом, ДМСО в диапазоне концентрацией 0-50% не влияет на необратимость процесса денатурации белка и приводит к разрыхлению молекул гемоглобина человека и понижению его термостабильности и степени кооперативности.

Литература

1. Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины / Под ред. акад. НАН Украины А.Н. Гольцева. - Х.: Райдер, 2012. - 768 с.

2. Долгосрочное хранение эритроцитов методом замораживания при умеренно низких (-б0ОА-40°С) температурах / Н.Т. Терехов, М.М. Петров, М.П. Буденная, Н.В. Тимченко // Метод. реком. -К.: Здоров'я, 1986. - 16 с.

3. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии // Успехи биол. химии. - 2000. - Т. 40. - С. 43-84.

4. Зинченко А.В., Соловьева А.С. Сравнение микрокалориметрического плавления гемоглобина из донорской и кордовой крови до и после низкотемпературного воздействия // Проблемы криобиологии. - 2000. - №1. - С. 32-35.

5. Differential scanning microcalorimetry study of the thermal denaturation of haemoglobin / A. Michnik, Z. Drzazga, A. Kluczewska, K. Michalik // Biophys. Chem. - 2005. - Vol. 118, №2-3. - Pp. 93-101.

6. Sengupta Bidisa, Swenson Jan. Properties of normal and glycated human hemoglobin in presence and absence of antioxidant // Biochem. and Biophys. Res. Com. - 2005. - Vol. 334, №3. - Рз. 954-959.

7. Sanchez-Ruiz Jose M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry // Biophys. J. - 1992. - Vol. 61. - Рз. 921-935.

8. Термостабильность и функциональнее свойства гемоглобина человека в присутствии алифатических спиртов / Е.А. Лапшина, И.Б. Заводник, В.А. Игнатенко, И.И. Степуро / / Мол. биол. - 1992. - Т. 26, №2. - С. 315-320.

9. Daniel Harries and Jorg Rosgen. A Practical Guide on How Osmolytes Modulate Macromolecular Properties // Meth. in Cell Biol. - 2008. - Vol. 84. - P. 679-735.

10. Patricia S. Santiago, Jose Wilson P. Carvalho, Marco M. Domingues, Nuno C. Santos, Marcel Tabak Thermal stability of extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus: determination of activation parameters by optical spectroscopic and differential scanning calorimetric studies // Biophys. Chem. - 2010. - Vol. 152. -Pp. 128-138.

CALORIMETRIC RESEARCH OF HUMAN HEMOGLOBIN DENATURATION WITH DIMETHYL SULFOXIDE

A.V. Zinchenko, Yu.S. Govorova

InstituteforProblems of Criobiology and Criomedicine of the Na tional Academy of Sciences of Ukraine,

23 Pereyaslavskaya St, Kharkov,

61015, Ukraine

E-mail: ju-st7@yandex.ua, alexa-zin@mail.ru

The effect of 0 to 50% dimethyl sulfoxide concentration on thermal denaturation of human hemoglobin was studied by the method of differential scanning adiabatic calorimetry. The thermodynamic and kinetic calculation was done. Increase of dimethyl sulfoxide concentration results in decrease activation energy values, temperature and calorimetric enthalpy of hemoglobin denaturation. Such changes of thermodynamic and kinetic parameters of protein denaturation in the presence of dimethylsulfoxide can be explained by loosening of hemoglobin molecules and as a result, decrease of their thermal stability and degree of cooperativity.

Key words: hemoglobin, thermal denaturation, dimethyl sulfoxide, differential scanning calorimetry.