Способ определения белка свертываемости крови у животных
METHOD FOR DETERMINING BLOOD COAGULATION PROTEIN IN ANIMALS

Изобретение относится, к иммуногистохимическим исследованиям в медицине, и может быть использовано при изучении проблем ангиологии и «эндотелиальной дисфункции» сердечно-сосудистой системы позвоночных животныхи человека в норме и патологии.
Известно, что методы иммуногистохимии (ИГХ) занимают важное место среди методов морфологической диагностики. Их разработка и совершенствование важны как для научных работников, так и для практикующих специалистов здравоохранения. Исчерпывающая информация о применении некоторых современных методических приемов изложена в серии руководств, изданных в последние годы под редакцией профессора РАН Д.Э. Коржевского (2014).
Прототипом нашего изобретению можно считать работу группы американских авторов Lee Ann Sporn, Stephen l. Chavin, Victor J. Marder, Denisa D. Wagner. Название их статьи: «Biosyntesis of von Willebrand Protein by Human Megakaryocytes». Она опубликована в The American Society for Clinical Investigation. 1985. Vol. 76. P. l102-1106. В статье описывается клинический случай 39-летней женщины, у которой была диагностирована хроническая миелогенная лейкемия. В исследовании использовали изоляты тромбоцитов и культуру эндотелиальных клеток из пупочной вены, а также мазки крови из костного мозга пациентки. Для определения фВ использовали меченые флуорохромами антитела к данному белку а для визуализации иммунофлуоресцентный метод. В работе приведены иллюстративные материалы. На микрофотографиях представлены фВ+ специфически окрашенные форменные элементы крови больной: «микромегакариоциты», различных размеров тромбоциты и эндотелиальные клетки. К сожалению, в работе описывается только один случай с больной острой лейкимией. Следует отметить, что в морфологическом отношении в этой работе интенсивность ИГХ реакции недостаточно выражена во всех элементах, кроме ядер микромегариоцитов.
Техническим результатом является быстрота обработки, оценки и анализа полученных результатов (фактов) на световом микроскопе по сравнению с исследованиями, выполненными на клеточных культурах, с помощью электронной микроскопии или спектрофотометрии.
Технический результат достигается тем, что в качестве иммуногистохимического маркера применяют фактор Виллебранда (фВ), который путем аппликации капли раствора с антителами к данному белку наносят только на одну половину мазка периферической крови, оставляя вторую в качестве контроля, затем после окончания иммунной реакции мазок докрашивают азур-эозином, проводят классическую гистологическую обработку материала, накрывают препарат покровным стеклом и после этого с помощью микроскопа определяют по преципитатам маркера присутствие белка фВ среди форменных элементов крови животного. Способ обладает выраженной простотой по сравнению с аналогами, не требует дорогостоящего оборудования (как при использовании спектрофотометрии, электрофореза или конфокальной лазерной микроскопии).
Сущность способа поясняется фотографиями,
где на Фиг 1а - среди форменных элементов крови видны преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов, б - отрицательный контроль. Докраска азур-эозином. Ув.: ×400
где на Фиг 2а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов; б -отрицательный контроль. Ув.: ×100
где на Фиг 3а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов; б - отрицательный контроль. Ув.: ×400 Осуществление способа проводили следующим образом:
1. Мазки периферической крови от животных, приготовленные на предметных стеклах и фиксированные 96% спиртом, после 5-минутной промывки в дистиллированной воде переносили в 3%-ный водный раствор перекиси водорода на 10 мин при комнатной температуре для блокирования эндогенной пероксидазы.
2. Смывали перекись водорода дистиллированной водой и стекла с мазками помещали в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ) с рН 7,4 на 5-10 мин.
3. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг мазка (для образования сухого поля), обводили две области мазка гидрофобным фломастером DakoPen (Dako, Дания) и наносили необходимое количество (для покрытия мазков) блокировочного раствора 5%-го бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma, США) на 10 мин при комнатной температуре.
4. Сливали излишек блокировочного раствора и на одну из областей мазка наносили необходимое количество первичных поликлональных кроличьих антител к фВ (1:250)(Dako, Дания). На вторую область мазка (которая служила отрицательным контролем) наносили ФСБ. Помещали предметные стекла во влажную камеру (например, в чашки Петри) и ставили в термостат с температурой 27°С на 24 ч.
5. Смывали антитела ФСБ и затем помещали стекла в сосуд со свежей порцией буфера на 5-10 мин.
6. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг мазка, наносили необходимое количество реагента EnVision+/HRP-Anti-Rabbit (Dako, Дания) (вторичные антитела) и ставили в термостат с температурой 27°С на 35 мин. Смывали антитела ФСБ (5-10 мин).
+
7. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг мазка, наносили необходимое количество рабочего раствора 3,3-диаминобензидина (DAB, Dako, Дания). В течение 1-3 мин происходило образование окрашенного продукта гистохимической реакции (преципитатов). Этот процесс контролировали под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона.
8. Смывали раствор хромогена и промывали препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 3-5 мин в каждой.
Мазки докрашивали азур-эозином по Май-Грюнвальду или по Романовскому. После обезвоживания в спиртах восходящей крепости, препараты просветляли в ксилоле и заключали в полистерол.
+
В результате проведения реакции фВструктуры окрашиваются в коричневый цвет.
Пример 1.
Из хвоста крысы брали каплю венозной крови, наносили ее на предметное стекло и изготавливали мазок. После фиксации мазка в 96% спирте (40 мин) проводили ИГХ реакцию. Для этого достаточное количество раствора с антителами к фактору Виллебранда наносили на одну половину мазка, оставляя вторую в качестве контроля. После окончания иммунной реакции мазок докрашивали азур-эозином, обезвоживали и заключали в полистерол под покровное стекло.
а - среди форменных элементов крови видны преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов, б - отрицательный контроль. Ув.: ×400;
Пример 2.
Из вены собаки брали каплю венозной крови, наносили ее на предметное стекло и изготавливали мазок. После фиксации мазка в 96% спирте (40 мин) проводили ИГХ реакцию. Для этого достаточное количество раствора с антителами к фактору Виллебранда наносили на одну половину мазка, оставляя вторую в качестве контроля. После окончания иммунной реакции мазок обезвоживали и заключали в полистерол под покровное стекло.
2а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов; б -отрицательный контроль. Ув.: ×100
Пример 3.
Из вены ягненка брали каплю крови, наносили ее на предметное стекло и изготавливали мазок. После фиксации мазка в 96% спирте (40 мин) проводили ИГХ реакцию. Для этого достаточное количество раствора с антителами к фактору Виллебранда наносили на одну половину мазка, оставляя вторую в качестве контроля. После окончания иммунной реакции мазок докрашивали азур-эозином, обезвоживали и заключали в полистерол под покровное стекло.
а - преципитаты белка фВ (черно-коричневого цвета) в виде мелкой зернистости и многочисленных агглютинированных тромбоцитов, б -отрицательный контроль. Ув.: ×400
Преимущества предлагаемого способа.
В отличие от представленного выше метода, наш метод имеет следующие преимущества:
1. позволяет проводить иммунную реакцию на фВ на мазке периферической крови, используя гистологическую технику приготовления препарат и изучать светооптически;
2. позволяет проводить одновременную сравнительную оценку на одном и том стекле иммуногистохимической реакции и гистологической окраски мазка классическим методом (азур-эозином), что позволяет изучать взаимоотношения белка свертываемости крови с форменными элементами крови;
3. позволяет одновременно на одном и том же стекле определять иммунопозитивную и иммунонегативную реакцию, которая служит отрицательным контролем;
4. способ обладает выраженной простотой по сравнению с аналогами, не требует дорогостоящего оборудования (как при использовании спектрофотометрии, электрофореза или конфокальной лазерной микроскопии);
5. способ позволяет получать результат достаточно быстро (по сравнению с исследованиями на электронном или конфокальном лазерном микроскопах). Достаточно обладать только световым микроскопом;
6. перечисленные преимущества указывают на то, что метод может быть использован для диагностики в клинике.