ВАРИАНТ АЛЛЕРГЕНА ГРУППЫ I ИЗ Роасеае, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЙСЯ СНИЖЕННОЙ АЛЛЕРГЕННОСТЬЮ И СОХРАНЕННОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ РЕАКТИВНОСТЬЮ (ВАРИАНТЫ), КОДИРУЮЩАЯ ЕГО МОЛЕКУЛА ДНК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
VERSION OF GROUP I Poaceae ALLERGEN CHARACTERISED BY LOWER ALLERGENICITY AND MAINTAINED T-CELL RESPONSIVENESS (VERSIONS), CODING DNA MOLECULE AND APPLICATION THEREOF

Настоящее изобретение относится к получению и применению вариантов аллергенов группы 1 Роасеае (зубровка душистая), которые характеризуются сниженной IgE реактивностью по сравнению с известными аллергенами дикого типа и в то же время в основном сохраненной реактивностью с Т-лимфоцитами. Эти гипоаллергенные варианты аллергенов могут быть использованы для специфической иммунотерапии (гипосенсибилизации) пациентов, имеющих аллергии на пыльцу растений, или для профилактической иммунотерапии аллергий на пыльцу. Предпочтительное воплощение данного изобретения относится к вариантам основного аллергена PhI p 1 из пыльцы тимофеевки луговой (Phleum pratense).
Предпосылки создания изобретения
Аллергии типа 1 имеют значение мирового масштаба. До 20% населения в промышленно развитых странах страдают от заболеваний, таких как аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальная астма. Эти аллергии вызываются аллергенами, присутствующими в воздухе (аэроаллергены), которые выделяются источниками различного происхождения, такими как пыльца растений, клещи, коты или собаки. До 40% из упомянутых пациентов, страдающих от аллергии типа 1, в свою очередь показывают специфическую IgE реактивность с пыльцевыми аллергенами (Freidhoff и др., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78: 1190-2002). Вещества, которые вызывают аллергию типа 1, представляют собой белки, гликопротеины или полипептиды. После поглощения через слизистые оболочки эти аллергены взаимодействуют с IgE молекулами, прикрепленными к поверхности мастоцитов у субъектов с повышенной чувствительностью. Перекрестное связывание двух IgE молекул одной с другой с помощью аллергена приводит к высвобождению медиаторов (например, таких как гистамин, простагландины) и цитокинов эффекторной клеткой и таким образом к соответствующим клиническим симптомам.
В зависимости от относительной частоты, с которой отдельные молекулы аллергена взаимодействуют с IgE антителами пациентов, страдающих от аллергии, проводят различия между основными и второстепенными аллергенами.
В случае тимофеевки луговой (Phleum pratense), PhI p 1 (Petersen и др., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), PhI p 5 (Matthiesen и Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen и др., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), PhI p 6 (Petersen и др., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). PhI p 2/3 (Dolecek и др., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), PhI p 4 (Haavik и др., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta и др., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) и PhI p 13 (Suck и др., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck и др., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402) до настоящего времени идентифицировались как основные аллергены.
Доминантные основные аллергены тимофеевки луговой (Phleum pratense) представляют собой PhI p 1 и PhI p 5. Так как основные аллергены трав из семейства Роасеае являются высокогомологичными одни с другими и поэтому имеют очень сходные биохимические и иммунологические свойства, эти родственные белки группируют вместе как аллергены группы 1 и группы 5. Аллергены группы 1 взаимодействуют с IgE антителами у более чем 95% пациентов, страдающих от пыльцевой аллергии, и таким образом представляют собой доминантные основные аллергены пыльцы растений.
Аллергены группы 1 представляют собой гликопротеины, которые имеют молекулярную массу приблизительно 32 kDa и локализуются в цитоплазме пыльцевых зерен. Как контакт пыльцевых зерен со слизистой оболочкой верхних дыхательных путей, так и увлажнение этих пыльцевых зерен дождем приводит к быстрому высвобождению этих аллергенов. Быстрое высвобождение аллергенов группы 1 также в форме субклеточных микрочастиц обеспечивает проникновение в нижние дыхательные пути, которое может привести к инициированию тяжелых приступов астмы.
Были идентифицированы кДНК-ы аллергенов группы 1 из Phleum pratense (Laffer и др., 1994, J. Allergy din. Immunol. 94: 689 - 698), Lolium perenne (Perez и др., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16210-16250), Holcus lanatus (Schramm и др., 1997. J. Allergy Clin. Immunol. 1999: 781-787), Poa pratensis (Sturaro u. Viotti, 1998. NCBI GenBank, Ace. No. A J131850), Cynodon dactylon (Smith и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 331-343), Phalaris aquatica (Suphioglu и др., 1995, Clin. Exp. Allergy 25: 853-865) и Oryza sativa (Xu и др., 1995, Gene 164: 255-259).
Кроме этих первых описаний последовательности в базах данных были опубликованы дополнительные последовательности аллергена группы 1, которые отличаются от исходных последовательностей в отдельных положениях. Такие изоформы также известны для других пыльцевых аллергенов.
Благодаря их гомологии аллергены группы 1 зубровки душистой (Роасеае) имеют высокую перекрестную реактивность с IgE антителами человека (Laffer и др., 1996, Mol. Immunology 33: 417-426). Эта иммунологическая перекрестная реактивность основана на очень подобной аминокислотной последовательности, как показано с помощью сравнения последовательности PhI p 1, аллергена группы 1 из тимофеевки луговой (Phleum pratense), с молекулами группы 1 из выбраных видов на фигуре 1.
Гомологичные области последовательности в других аллергенах группы 1 Роасеае существуют как для областей последовательности делеций PhI p 1 аминокислотной последовательности, описанных здесь в структуре гипоаллергенных вариантов, так и для областей их фланкирующей последовательности. Кроме того, сохраняются как число, так и окружающие области последовательности цистеинов аллергенов группы 1 Роасеае. Благодаря гомологии последовательности аллергены группы 1 Роасеае классифицированы в белковом семействе β-экспанзинов (Cosgrove D. J., 2000 Nature 407: 321-6).
Классический подход к эффективному терапевтическому лечению аллергий заключается в специфической иммунотерапии или гипосенсибилизации (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339: Bousquet и др., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562), при которых экстракты природных аллергенов вводят подкожно пациенту с возрастающими дозами. Однако в этом способе существует риск аллергических реакций или даже анафилактического шока. Для того чтобы минимизировать эти риски, используют новейшие препараты в форме аллергоидов. Они представляют собой химически модифицированные экстракты аллергена, которые имеют значительно сниженную IgE реактивность, но идентичную Т-клеточную реактивность, сравнимую с необработанным экстрактом. Эти Т-клеточные эпитопы имеют решающее значение для терапевтического действия аллергенных препаратов в гипосенсибилизации (Fiebig., 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).
Большая степень оптимизации терапии была бы возможна с аллергенами, полученными с помощью рекомбинантных способов. Определенные смеси высокочистых аллергенов, полученные с помощью рекомбинантных способов, при желании согласующихся с индивидуальными сенсибилизационными моделями пациентов, могли бы заменить экстракты аллергенов природного происхождения, так как последние в добавок к различным аллергенам содержат относительно большое количество иммуногенных, но неаллергенных сопутствующих белков.
Реальные перспективы, которые могут привести к безопасной гипосенсибилизации с помощью продуктов рекомбинантной экспрессии, предложены специфически мутированными рекомбинантными аллергенами, в которых IgE эпитопы специфически удаляют без повреждения Т-клеточных эпитопов, которые являются важными для терапии (Schramm и др., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414).
Другая концепция для гипосенсибилизации основывается на том факте, что защитный иммунный ответ вызывается, в частности, IgG4 антителами с блокирующим действием. В соответствии с этой гипотезой были описаны фрагменты рекомбинантного PhI p 1, которые, как говорят, должны быть подходящими для вызова защитного IgG4 ответа (Ball и др., 1999, FASEB J. 13: 1277-1290).
Эта концепция полностью отлична от концепции гипоаллергенных вариантов аллергенов, имеющих сниженную IgE реактивность и сохраненную Т-клеточную реактивность.
Другой возможностью для влияния на нарушенный баланс Т хелперных клеток у пациентов, страдающих от аллергий, с помощью терапевтических способов является лечение с помощью экспресирующейся ДНК, которая кодирует релевантные аллергены (иммунотерапевтическая ДНК вакцинация). Экспериментальное подтверждение аллерген-специфического эффекта на иммунный ответ было получено на грызунах с помощью инъекции аллерген-кодирующей ДНК (Hsu и др., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).
Цель, на которой основано настоящее изобретение, заключается в обеспечении новых вариантов аллергенов группы 1 из Роасеае на белковом и ДНК уровне, которые отличаются сниженной IgE активностью с существенным сохранением Т-клеточной реактивности, и поэтому подходят для лечебной и профилактической специфической иммунотерапии и иммунотерапевтической ДНК вакцинации.
Фигуры
Фигура 1: Блок выстроенных в линию PhI p 1-гомологичных аминокислотных последовательностей (последовательностей зрелых белков, полученных из кДНК последовательностей) из Роасеае видов: Род pratensis (Poa p), Holcus lanatus (Hol I), Lolium perenne (Lol p), Cynodon dactylon (Cyn d), Oryza sativa (Ory s) и Phalaris aquatica (Pha а), последовательностей белков, полученных из кДНК последовательностей из "Gen-Bank" базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information) (NCBI, Bethesda, USA), нумерация: положения аминокислот зрелых белков, отмечено подчеркиванием: аминокислоты, которые отличаются от PhI p 1 последовательности, «черный ящик»: цистеины.
Фигура 2: Блок выстроенных в линию аминокислотных последовательностей обработанного PhI p 1 белка дикого типа и вариант PhI p 1 NoCys, PhI p 1 Wt (дикий тип): последовательность белков, полученных из кДНК последовательности (регистрация Z27090 в "GenBank" базе данных Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI), Bethesda, USA), нумерация: положения аминокислот зрелых белков, подчеркнуто черным: аминокислотные замещения цистеина на серин в белке PhI p 1 NoCys.
Фигура 3: Блок выстроенных в линию аминокислотных последовательностей гипоаллергенных вариантов PhI р 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220, показанных с помощью примера, нумерация: положения аминокислот, отмечено подчеркиванием: делеции.
Фигура 4: SDS-PAGE и сравнение идентичности рекомбинантных вариантов PhI р 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220
A: SDS-PAGE
В: Вестерн-блоттинг с aPhI р 1 антителами (Allergopharma)
1. Маркерные белки
2. nPhI p 1*
3. rPhI p 1 Wt (-His-tag)*
4. Маркерные белки
5. PhI p 1 NoCys (+His-tag)
6. PhI p 1 NoCys D 213-220 (+His-tag)
7. PhI p 1 NoCys D 1-6, 115-119, 213-220 (+His-tag)
8. Маркерные белки
* Образцы восстановленные (дитиотреитол)
Фигура 5: Полосковый тест для сравнения IgE связующей способности PhI p 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 в неденатурирующих условиях.
1) rPhI p 1 Wt
2) PhI p 1 NoCys
3) PhI p 1 NoCys D 213-220
4) PhI p 1 NoCys D 1-6, 115-119,213-220
5) rPhI p 1 Wt
TP: общее белковое окрашивание
P: сыворотка пациентов, страдающих от клинически определенной аллергии на пыльцу.
Фигура 6: Определение сниженной IgE реактивности PhI p I NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 с помощью EAST теста на ингибирование с четырьмя типичными сыворотками четырех пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу (Р).
Фигура 7: Определение гипоаллергенности PhI p 1 NoCys с помощью теста активации базофилов с базофилами четырех пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу (Р).
Фигура 8: Определение гипоаллергенности PhI p 1 NoCys Δ 213-220 с помощью теста активации базофилов с базофилами четырех пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу (Р).
Фигура 9: Определение гипоаллергенности PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 с помощью теста активации базофилов с базофилами четырех пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу (P).
Работу, ведущую к найденным вариантам, проводили, используя PhI p 1 как модель аллергена. Из выстроенных блоков последовательностей, показанных на фиг.1, становится понятно, что благодаря высокой гомологии в пределах группы 1 были бы получены те же результаты, если исходной точкой взять другой аллерген группы 1.
Таким образом, необходимо также допустить, что результаты, представленные выше и ниже, также могут быть применены к Sec с 1 из Secale cereale или могли бы быть получены, используя Sec с 1, хотя последовательность все еще является неизвестной для этого аллергена группы 1.
Кроме того, настоящее изобретение относится к вариантам аллергенов группы 1 из Роасеае, которые характеризуются сниженной IgE реактивностью по сравнению с известными аллергенами дикого типа и в то же время сохраненной реактивностью с Т-лимфоцитами. Эти аллергены группы 1 представляют собой преимущественно PhI p 1, Роа р 1, Hol p 1, Lol p 1, Cyn d 1, Ory s 1 и Pha a 1 из Phleum pratense, Lolium perenne, Роа pratensis, Holcus lanatus, Cynodon dactylon, Oryza saliva и Phalaris aquatica. Большее предпочтение отдается PhI p 1, Роа p 1, Hol p 1, Lol p 1 или Pha a 1 и особое предпочтение отдается PhI p 1.
Исходной точкой для построения гипоаллергенных вариантов аллергенов группы 1 является кДНК PhI p 1 дикого типа, которую выделяют с помощью специфических праймеров (затравок) путем полимеразной цепной реакции (PCR) из общей кДНК из пыльцы Phleum pratense ("GenBank" регистрация Z27090; NCBI, Bethesda, USA) (SEQ ID NO 1).
Аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2 получают из кДНК последовательности дикого типа PhI р 1.
PhI p 1, который состоит из 240 аминокислот и является гликозилированным в природной форме, подобно всем аллергенам группы 1 (см. фиг.1), характеризуется существованием семи цистеинов в зрелой молекуле. За исключением Cyn din Ory s 1 эти положения аминокислот имеют номера 41, 57, 69, 72, 77, 83 и 139 у всех аллергенов группы 1 (Petersen и др., 1995, J. Allergy Clin. Immunol 95: 987-994).
PhI p 1 был экспрессирован в Е. coli как не-гликозилированный белок. Рекомбинантный белок дикого типа (rPhI р 1 wt) взаимодействует с IgE антителами пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу, которые имеют реактивность с природным очищенным PhI р 1 (nPhI p 1) (Petersen и др., 1998, Clin. Exp.Allergy 28: 315-321).
Детальное описание изобретения
Получение и характеристика гипоаллергенных вариантов PhI р 1
Исходя из описанных rPhI р 1 wt кДНК, получают рекомбинантные варианты PhI р 1, модифицированного с помощью генной инженерии.
Аминокислотная последовательность рекомбинантного варианта PhI p 1 NoCys (SEQ ID NO 4) имеет семь сериновых остатков вместо семи цистеинов, встречающихся у дикого типа (фиг.2). Вариант PhI p 1 NoCys служит как исходная точка для построения различных вариантов с делецией. В них в каждом случае были удалены отдельные участки, имеющие длину от 15 до 90 bp или комбинации этих участков кДНК кодирования для PhI p 1 NoCys, что приводит к соответствующим делециям аминокислот 1-6, 1-30, 92-104, 115-119, 175-185 и 213-220 в полипептидных цепях белков, экспрессированных в Е. coli: PhI р 1 NoCys Δ 1-6 (SEQ ID NO 5 и 6), PhI p 1 NoCys Δ 1-30 (SEQ ID NO 7 и 8), PhI р 1 NoCys Δ 92-104 (SEQ ID NO 9 и 10), PhI р 1 NoCys Δ 115-119 (SEQ ID NO 11 и 12), PhI р 1 NoCys Δ 175-185 (SEQ ID NO 13 и 14), PhI р 1 NoCys Δ 213-220 (SEQ ID NO 15 и 16), так е как и PhI р 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 (SEQ ID NO 17 и 18).
Рекомбинантные белки были экспрессированы как гистидин-гибридные белки в Escherichia coli. Иммунологическую характеристику проводили с гибридными белками этого типа.
Сначала после иммобилизации на нитроцеллюлозной мембране рекомбинантные варианты исследовали на способность связывания IgE антителами типичного сывороточного пула и IgE антителами индивидуальной сыворотки пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу (полосковый тест). В этом способе неожиданно наблюдается сниженное связывание IgE антител с PhI р 1 NoCys. Этот результат подтверждается с помощью IgE теста на ингибирование (EAST), в котором исследуется IgE связывающая способность неиммобилизированного белка на IgE антитела в растворе.
Более того, настоящее изобретение относится, в частности, к вариантам аллергена группы 1, в которых цистеины в аминокислотных положениях 41, 57, 69, 72, 77, 83 и 139 в соответствии со зрелым PhI р 1 белком удаляют или заменяют на другую аминокислоту. Особое предпочтение отдается в этом описании соответствующим вариантам PhI р 1, Роа р 1, Hol р 1, Lol р 1 или Pha a 1, в особенности PhI р 1.
Сниженное связывание IgE антител достигается, если по крайней мере два из 7 цистеинов удалены без замещения или заменены другой аминокислотой. Предпочтительно, однако, если все 7 цистеинов заменены на серин.
Эффекты сниженной IgE связующей способности PhI р 1 NoCys на функциональное действие в течение перекрестного связывания мембрано-связанных IgE эффекторных клеток и их активацию in vitro исследовали с помощью теста активации базофильных гранулоцитов пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу. PhI р 1 NoCys показал значительно более низкую активацию базофильных гранулоцитов в этом тесте по сравнению с rPhI р 1 wt и таким образом функционально сниженную аллергенность.
Различные мутанты с делецией, полученные на основе PhI р 1 NoCys, были исследованы на IgE связующую способность (полосковый тест, EAST) и функциональное действие (активацию базофилов) тем же методом. Неожиданно мутанты с делецией показали особенно сильные гипоаллергенные свойства.
Поэтому настоящее изобретение, кроме того, относится к вариантам аллергенов группы 1, в которых необязательно в добавление к описанным выше вариантам с удаленным или замещенным Cys, по крайней мере, одного участка или комбинации участков, которые соответствуют аминокислотам 1-6, 1-30, 92-104, 115-119, 175-185 и 213-220 первичной последовательности зрелого PhI p 1 белка, не хватает по сравнению с аллергеном дикого типа.
Особое предпочтение отдается в этом описании соответствующим мутантам с делецией аллергенов группы 1 PhI p 1, Poa p 1, HoI p 1, Lol p 1 и Pha a 1. Даже более особое предпочтение отдается соответствующим PhI p 1 вариантам.
Особое предпочтение отдается и настоящее изобретение поэтому также относится, к вариантам аллергенов группы 1, в которых не хватает только аминокислот 213-220 или одновременно аминокислот 1-6 и 115-119 в соответствии со зрелой PhI p 1 последовательностью. Большее предпочтение снова отдается в этом описании аллергенам PhI p I, Poa p I, Hol p 1, Lol p 1 и Pha a 1, где PhI p 1 является особенно предпочтительным.
Т-клеточная реактивность гипоаллергенных вариантов PhI p 1, которая образует основу для эффективности специфической иммунотерапии, была проверена in vitro путем теста на пролиферацию с помощью PhI p 1-специфических Т-лимфоцитов пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу. Модифицированные аллергены показали существенно сохраненную Т-клеточную реактивность, которая дает возможность иммунотерапевтического применения гипоаллергенных вариантов PhI p 1.
Гипоаллергенные варианты в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены исходя из клонированной ДНК последовательности с помощью способов генетической инженерии. В принципе, однако, также могут быть использованы и химические модификации природного экстракта аллергена (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382). Дополнительные модификации в разных положениях, например, для того, чтобы повысить гипоаллергенность, являются, конечно, также возможными, помимо вариаций аллергенов группы 1, описанных в настоящей патентной заявке. Эти модификации могут, например, представлять собой аминокислотные включения, делеции и замещения, расщепление белка на фрагменты и слияние белка или его фрагментов с другими белками или пептидами. Более того, данное изобретение относится к ДНК молекуле, кодирующей вариант аллергена, описанного выше, рекомбинантному экспрессирующему вектору, содержащему эту ДНК молекулу, и организму-хозяину, трансформированному с помощью указанной ДНК молекулы или указанного экспрессирующего вектора. Подходящими организмами-хозяевами могут быть про- или эукариотические, одно- или многоклеточные организмы, такие как бактерии или дрожжи. Организмом-хозяином, который является предпочтительным в соответствии с данным изобретением, является Е. coli.
Более того, настоящее изобретение относится к способу получения варианта аллергена в соответствии с данным изобретением путем культивирования указанного организма-хозяина и выделения соответствующего варианта аллергена из культуры.
Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам аллергена, ДНК молекулам и экспрессирующим векторам, описанным выше, в их свойстве в качестве лекарственных средств.
Более того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые включают, по крайней мере, один из этих вариантов аллергена или соответствующую ДНК молекулу или соответствующий экспрессирующий вектор и необязательно дополнительные активные соединения и/или вспомогательные лекарственные вещества для лечения аллергий, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 1 из Роасеае, или для иммунотерапевтической вакцинации пациентов, имеющих аллергии, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 1 из Роасеае, и/или для предупреждения таких аллергий.
Если фармацевтические композиции являются второго типа (которые включают, по крайней мере, одну ДНК молекулу или экспрессирующий вектор), эти композиции предпочтительно дополнительно включают гидроксид алюминия, иммуностимулирующий CpG-содержащий олигонуклеотид или комбинацию этих двух в качестве вспомогательных лекарственных веществ.
Для целей данного изобретения фармацевтические композиции могут быть использованы в качестве терапевтических агентов при лечении людей или в ветеринарной медицине. Подходящими наполнителями являются органические или неорганические вещества, которые подходят для парэнтерального применения и не взаимодействуют с вариантами аллергенов группы 1 в соответствии с данным изобретением. Подходящими для парэнтерального применения являются, в частности, растворы, предпочтительно масляные или водные растворы, кроме того, суспензии, эмульсии или импланты. Варианты аллергенов в соответствии с данным изобретением также могут быть лиофилизированы и полученные лиофилизаты использованы, например, для получения инъекционных препаратов. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или могут включать вспомогательные лекарственные вещества, такие как лубриканты, консерванты, стабилизаторы и/или смачивающие агенты, эмульсификаторы, соли для модифицирования осмотического давления, буферные вещества и/или множество дополнительных активных соединений.
Кроме того, препараты с замедленным высвобождением могут быть получены путем соответствующего рецептирования вариантов аллергенов в соответствии с данным изобретением, например путем адсорбции на гидроксиде алюминия.
И наконец, настоящее изобретение относится к применению, по крайней мере, одного варианта аллергена в соответствии с данным изобретением или ДНК молекулы в соответствии с данным изобретением или экспрессирующего вектора в соответствии с данным изобретением для получения лекарственного средства для лечения аллергий, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 1 из Роасеае, или для иммунотерапевтической вакцинации пациентов, имеющих аллергии, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 1 из Роасеае, и/или для предупреждения таких аллергий.
Получение вариантов PhI p 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 (фиг.3) и их иммунологическая характеристика описаны ниже с помощью примера для гипоаллергенных вариантов PhI p 1 с модификациями генной инженерии, описанными выше.
Экспрессия и очистка рекомбинантных вариантов PhI p 1
2+
Рекомбинантные белки были экспрессированы как гистидин-гибридные белки (экспрессирующий вектор pProExHT; Invitrogen, Carlsbad, USA) в Escherichia coli (штамм JM109). rPhI р 1 wt и варианты сначала очищали путем специфического связывания N-терминальных гистидиновых остатков с Ni-хелатными матрицами (аффинная хроматография с иммобилизированным ионом металла, IMAC) и далее путем препаративной гель-хроматографии (эксклюзионная хроматография, SEC). Чистоту илюируемых белков контролировали с помощью SDS-PAGE и аналитической SEC (фиг.4,а). Идентичность очищенных белков показали путем связывания PhI p 1-специфического моноклонального антитела (фиг.4,b).
Демонстрация сниженного IgE связывания рекомбинантных вариантов PhI p 1
Простым тестовым способом для определения IgE реактивности специфического IgE из сыворотки пациентов, страдающих от аллергии, на мембрано-прикрепленных тестовых белках является полосковый тест.
Для этой цели тестовые вещества прикрепляют параллельно одно к другому в одинаковой концентрации и количестве на полоску нитроцеллюлозной мембраны при не-денатурирующих условиях. Серии таких мембранных полосок могут быть инкубированы параллельно с различными сыворотками пациентов, страдающих от аллергии. После стадии промывания специфически связанные IgE антитела делают видимыми на мембране с помощью цветной реакции, промотированной с помощью античеловеческого IgE / щелочная фосфатаза конъюгата.
Результаты полоскового теста для PhI p 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220, используя сыворотку отдельных пациентов, страдающих от пыльцевой аллергии, показаны в этом описании с помощью примера для описанных модифицированных PhI p 1 молекул (фиг.5). Были использованы только сыворотки пациентов, страдающих от аллергии, имеющих сильный IgE титр против природного PhI p 1. IgE антитела этих пациентов также взаимодействуют с рекомбинантным эквивалентным rPhI p 1 wt.
Становится ясно, что PhI p 1-специфические IgE антитела сыворотки всех пациентов связывают рекомбинантный вариант PhI p I NoCys в сниженной степени, но не аллерген PhI p 1 дикого типа.
Даже большее снижение в IgE связующей способности достигается путем дополнительного удаления определенных участков последовательности, которое показано со ссылкой на вариант PhI p 1 NoCys Δ 213-220. Вариант PhI p I NoCys Δ 213-220 показывает очень сильно сниженную IgE связывающую способность со всеми протестированными сыворотками пациентов, страдающих от аллергии, по сравнению с немодифицированным рекомбинантным белком дикого типа. Дополнительное снижение в IgE связывающей способности PhI p 1 с IgE антителами из определенных сывороток может быть достигнуто путем комбинации нескольких делеций, которые являются очевидными из результата теста для варианта PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 с сывороткой Р14 пациентов, страдающих от пыльцевой аллергии (фиг.5).
Таким образом, становится понятно, что как замещение цистеинов, так и делеция специфических участков последовательности снижают IgE связывающую способность PhI p 1 молекулы.
В отличие от полоскового теста EAST тест на ингибирование (ферментный аллергосорбентный тест) позволяет провести исследование аллерген / IgE взаимодействий в растворе, обеспечивая мешающее влияние на маскирование эпитопов тестового вещества с тем, чтобы в основном исключить их путем иммобилизации на мембране. EAST тест на ингибирование проводят следующим образом. Микротитровые планшеты покрывают аллергенами, в этом описании nPhI p 1. После удаления несвязанных молекул аллергена путем промывания планшет блокируют, используя бычий сывороточный альбумин для того, чтобы предупредить более позднее неспецифическое связывание. IgE антитела пациентов, страдающих от аллергии, в качестве типичного пула индивидуальных сывороток (сывороточный пул) или в качестве индивидуальной сыворотки, инкубируют при подходящем разбавлении с аллерген-покрытыми микротитровыми планшетами. Количество аллерген-связанных IgE антител определяют фотометрически с помощью анти-hlgE / щелочная фосфатаза конъюгата путем реакции субстрата с получением окрашенного конечного продукта.
Связывание IgE антител ингибируют вещество специфически с помощью растворимого аллергена или веществ, которое необходимо протестировать (рекомбинантный модифицированный аллерген) как функцию концентрации.
Результаты теста для PhI p 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 показаны в этом описании с помощью примера для модифицированных PhI p 1 молекул, описанных по сравнению со стандартной молекулой nPhI p 1.
Типичные IgE тесты ингибирования, показанные на фиг.6, с четырьмя индивидуальными сыворотками пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу, показывают, что было достигнуто только приблизительно 20-50% максимального ингибирующего действия немодифицированного природного аллергена nPhI p1, даже с высокими концентрациями варианта PhI p 1 NoCys (до 5 мкг/мл). Более низкое максимальное эффективное действие отображает потерю IgE эпитопов.
Кривые для вариантов PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 демонстрируют даже более низкую IgE связующую способность этих PhI p 1 вариантов. Ингибирующее действие не могло быть определено с индивидуальными вариациями или только в очень маленькой степени (0-20% максимального ингибирующего действия). В соответствии с результатом полоскового теста таким образом может быть доказано, что включение дополнительных специфических делеций дополнительно снижает IgE связующую способность PhI p 1.
Определение гипоаллергенности рекомбинантных вариантов PhI p 1 с помощью теста активации базофилов
Функциональное снижение в аллергенности определяли in vitro с помощью теста активации базофилов. Для теста активации базофилов гепаринизированную цельную кровь пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу, инкубируют с разными концентрациями тестовых веществ. Аллергенные вещества специфически связывают с помощью FcεRI-связанных IgE антител базофилов, что приводит к перекрестному связыванию FcεRI молекул. Это вызванное аллергеном IgE-промотированное FcεRI перекрестное связывание приводит к активации базофилов. Активация представляет собой первую стадию в аллергической реакции этих эффекторных клеток. Последующая сигнальная трансдукция приводит в результате к дегрануляции эффекторных клеток и таким образом к инициированию аллергических реакций in vivo.
In vitro, вызванная аллергеном активация базофильных гранулоцитов, может быть определена путем количественного анализа экспрессии поверхностного белка (CD203c), который соединяют с сигнальной трансдукцией IgE рецепторного перекрестного связывания (Kahlert и др., 2003, Cli., Exp. Allergy 33: 1266-72). Количество экспрессированных CD203c белков на клетке и процент активированных клеток клеточного пула измеряют с высокой чувствительностью с помощью связыванияния флуоресцентно-меченного моноклонального антитела с поверхностным маркером и последующего анализа путем флуоресцентно-активированной проточной цитометрии. Стандартные вещества, использованные в этом исследовании, представляли собой очищенный природный PhI р 1 (nPhI p 1) параллельно с тестовыми веществами. Результаты для PhI р 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 показаны в этом описании с помощью примера для описанных модифицированных PhI p 1 молекул.
Типичные результаты теста для варианта PhI p 1 NoCys с базофилами четырех пациентов, страдающих от клинически определенной аллергии, показаны в виде кривых на фиг.7. Снижение в аллергенной эффективности варианта PhI p 1 NoCys по отношению к nPhI p 1 дикого типа становится очевидным по смещению в кривых активации.
В соответствии с результатами полоскового теста и IgE теста на ингибирование результаты теста для вариантов PhI р 1 NoCys Δ 213-220 и PhI р 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 показывают даже большее снижение в относительной аллергенной эффективности, как показано на фиг.8 и 9 на основании типичных кривых.
В то время как максимальную часть базофилов активировали с помощью природного аллергена в концентрационном интервале тестовых веществ 100-1000 пМ, не определили никакой или определили только очень низкую активацию базофилов при использовании модифицированных аллергенов PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220.
Аллергенная эффективность PhI p 1 NoCys Δ 213-220 была, как может быть рассчитано с помощью А50 значений кривых, снижена в ~ 100-1000 раз и аллергенная эффективность варианта PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 была снижена более чем в 1000 раз по сравнению со стандартным nPhI p 1 (A50: концентрация аллергена при 50% от максимального количества активированных базофилов).
Т-клеточная реактивность гипоаллергенных вариантов PhI p 1
Т-хелперные лимфоциты взаимодействуют с пептидными фрагментами аллергена (приблизительно 12-25 аминокислот), которые получают путем ферментативного разложения в антиген-представляющих клетках (АРС) и вводят в Т-клетки после включения подходящих пептидов в отдельные МНС молекулы класса II на поверхности АРС. Эта аллерген-специфическая активация Т-хелперных лимфоцитов является необходимым условием для пролиферации и функциональной дифференциации (ТН1 и ТН2). Влияние на аллерген-специфические Т-лимфоциты путем обработки аллергеном или производным аллергена в течение гипосенсибилизации рассматривается как ключ для терапевтической эффективности.
3
Для того чтобы исследовать Т-клеточную реактивность, олигоклональные Т-клеточные линии пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу, установлены путем общеизвестных способов со стимуляцией с помощью nPhI р 1 или rPhI p 1 wt молекул. В тесте на пролиферацию различные Т-клеточные линии стимулировали стандартными аллергенами nPhI р 1 и rPhI p 1 wt и модифицированными рекомбинантными PhI p 1 вариантами. Скорость пролиферации определяли путем включения [H]-тимидина общеизвестными способами.
Результаты теста на пролиферацию PhI р 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 показаны в этом описании с помощью примера для описанных модифицированных PhI p 1 молекул.
Результаты с Т-клеточными линиями восьми пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу, представленные в таблице 1, показывают, что можно стимулировать Т-лимфоциты для пролиферации с помощью рекомбинантных вариантов аллергенов. Т-клеточная реактивность PhI p 1 NoCys, PhI p 1 NoCys Δ 213-220 и PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 только немного снижена по сравнению с немодифицированными природными аллергенами и рекомбинантными аллергенами дикого типа, что показывает сохранение критических Т-клеточных эпитопов.
Построение гипоаллергенных вариантов PhI p 1 с помощью генной инженерии
Пример 1:PhI p 1 NoCys
Для построения варианта PhI p 1 NoCys (SEQ ID NO 3 и 4) проводят шесть PCR стадий, начиная с кДНК rPhI p 1 wt ("Gen-Bank" регистрация Z27090; NCBI, Bethesda, USA). Точечные мутации вводят, используя специфические PCR праймеры, в которых содержащиеся кодоны кодируют серии вместо праймеров для цистеина (последовательности праймеров см. в таблице 2).
Стадия 1 - Получение N-терминального ДНК фрагмента "PhI p 1 [C41S, C57S, C69S] (bp 1-212)": ДНК фрагмент, содержащий мутации C41S, C57S, C69S, генерировали путем амплификации длинных перекрывающихся олигонуклеотидов (P 1-63, Р 49-111, Р 97-158 и Р 144-212) с помощью PCR.
Стадия 2 - Получение С- терминального ДНК фрагмента "PhI p 1 [C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 193-720)": PCR PhI p 1 wt - кДНК с праймерами Р 193-261 и Р 703-720 HindIII.
Стадия 3 - Получение ДНК кодирования для "PhI p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 1-720)": PCR перекрывающихся фрагментов "PhI p 1 [C41S, C57S, C69S] (bp 1-212)" и "PhI p 1 [C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 193-720)" с праймерами Р 1-63 и Р 703-720 HindIII.
Стадия 4 - Получение N-терминального ДНК фрагмента "PhI p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S, C139S] (bp 1-428)": PCR кДНК "PhI p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 1-720)" с праймерами Р 1-63 и Р 406-428 as.
Стадия 5 - Получение С-терминального ДНК фрагмента "PhI p 1 [C139S] (bp 406-720)": PCR кДНК rPhI p 1 wt с праймерами Р 406-428s и Р 703-720 HindIII.
Стадия 6 - Получение полного ДНК кодирования для PhI р 1 NoCys: PCR перекрывающихся фрагментов "PhI p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S, C139S] (bp 1-428)" и "PhI p 1 [C139S] (bp 406-720) с праймерами Р 1-63 и Р 703-720 HindIII".
ДНК кодирование для PhI р 1 NoCys обрабатывают, используя рестрикционный фермент HindIII, и включают в экспрессирующий вектор pProExHT (Invitro-gen, Carlsbad, USA) с помощью сайтов рестрикции EheI и HindIII и далее устанавливают последовательность полностью.
Пример 2: PhI p 1 NoCys Δ 213-220
ДНК последовательность, кодирующая вариант с делецией PhI p 1 NoCys Δ 213-220 (SEQ ID NO 15 и 16), была получена с помощью PCR ДНК PhI p 1 NoCys, используя 5'-праймер Р 1-18 и 3'-праймер Р 613-720 (Δ 637-660) HindIII, специфически укороченный на область последовательности, которую необходимо удалить.
кДНК кодирование обрабатывают, используя рестрикционный фермент HindIII, и включают в экспрессирующий вектор pProExHT (Invitro-gen, Carlsbad, USA) с помощью сайтов рестрикции EheI и HindIII и далее устанавливают последовательность полностью.
Пример 3: Построение PhI p I NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 с помощью генной инженерии
ДНК последовательность, кодирующая вариант с делецией PhI p 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 (SEQ ID NO 5 и 6), была получена путем трех стадий с помощью PCR, используя олигонуклеотиды, специфически укороченные на область последовательности, которую необходимо удалить.
Стадия 1 - Получение N-терминального ДНК фрагмента "PhI р 1 NoCys Δ 1-6 (bp 1-300)": PCR кДНК PhI р 1 NoCys с праймерами Р22-63 (А1-18) и Р 250-318.
Стадия 2 - Получение С-терминального ДНК фрагмента "PhI р 1 NoCys Δ 115-119, 213-220 (bp 283-663)": PCR PhI р 1 NoCys с праймерами Р 301-384 (Δ 343-357) и Р 613-720 (Δ 637-660) HindIII.
Стадия 3 - Получение полного ДНК кодирования для PhI р 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220: PCR перекрывающихся фрагментов "PhI р 1 NoCys Δ 1-6 (bp 1-300)" и "PhI р 1 NoCys Δ 115-119, 213-220 (bp 283-663)" с праймерами Р22-63 (Δ 1-18) и Р 703-720 HindIII.
ДНК кодирование для PhI р 1 NoCys Δ 1-6, 115-119, 213-220 обрабатывают, используя рестрикционный фермент Hindm, и включают в экспрессирующий вектор pProExHT (Invitro-gen, Carlsbad, USA) с помощью сайтов рестрикции Ehel и HindIII и далее устанавливают последовательность полностью. ДНК вариантов PhI р 1 NoCys Δ 1-6 (SEQ ID NO 5 и 6), PhI p 1 NoCys Δ 1-30 (SEQ ID NO 7 и 8), PhI p 1 NoCys Δ 92-104 (SEQ ID NO 9 и 10), Phlp 1 NoCys Δ 115-119 (SEQ ID NO 11 и 12), PhI p 1 NoCys Δ 175-185 (SEQ ID NO 13 и 14) получили, клонировали и определили их последовательность соответственно.