НАЦЕЛЕННЫЕ НА uPARAP КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО
AIMED AT UPARAP ANTIBODY-DRUG CONJUGATES

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к молекулярным конъюгатам, нацеленным на рецептор uPARAP, в частности конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), направленные против uPARAP, и их применению при доставке активных средств к клеткам и тканям, экспрессирующим uPARAP. Настоящее изобретение также относится к применению указанных ADC для лечения заболеваний, включающих в себя экспрессирующие uPARAP клетки, такие как некоторые виды злокачественных опухолей.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Связанный с рецептором активатора плазминогена урокиназного типа белок (uPARAP), также известный как CD280, Endo180 и маннозный рецептор 2 С-типа, представляет собой представителя семейства макрофагальных маннозных рецепторов трансмембранных гликопротеинов. uPARAP представляет собой мембранный белок, вовлеченный в матриксный обмен при ремоделировании тканей, особенно при захвате и внутриклеточной деградации коллагена.
Рецептор uPARAP активируется в опухолевых клетках конкретных видов злокачественных опухолей, включая в себя саркому и глиобластому на поздней стадии. Кроме того, рецептор чаще всего активируется в стромальных клетках, окружающих солидные опухоли, и в некоторых публикациях предполагается высокая экспрессия uPARAP в костных метастазах от злокачественных опухолей предстательной железы (Caley et al., 2012, J. Pathol 5: 775-783). У здоровых взрослых людей рецептор демонстрирует ограниченный профиль экспрессии (Melander et al., 2015, Int J Oncol 47: 1177-1188).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) представляют собой новый класс высокоэффективного биофармацевтического лекарственного средства, разработанного в качестве целевой терапии, в частности для лечения злокачественной опухоли. ADC представляют собой сложные молекулы, состоящие из антитела (целого моноклонального антитела или фрагмента антитела), связанного через стабильный химический линкер, который может обладать лабильными связями, с биологически активным лекарственным средством или цитотоксическим соединением. Путем объединения уникальных нацеливающих возможностей антител со способностью цитотоксических лекарственных средств уничтожать клетки, конъюгаты антитело-лекарственное средство допускают чувствительную дискриминацию между здоровой и больной тканью на основе экспрессии антигена антитела. Это означает, что, в отличие от традиционных химиотерапевтических средств, конъюгаты антитело-лекарственное средство активно нацеливаются и атакуют злокачественные клетки, так что здоровые клетки с небольшой или отсутствующей экспрессией антигена страдают менее серьезно. На сегодняшний день три ADC получили одобрение на рынке и несколько ADC в настоящее время проходят клинические испытания.
В публикации международной заявки WO 2010/111198 раскрыты конъюгаты, содержащие антитело к uPARAP, и предложено применение таких конъюгатов при доставке терапевтических средств в клетки, которые экспрессируют uPARAP.
В настоящее время существуют способы лечения для большинства типов злокачественных опухолей. Однако в большинстве случаев с неудовлетворительной эффективностью или с пагубными побочными эффектами из-за отсутствия специфичности лечения. Таким образом, существует потребность в более эффективном лечении с повышенной специфичностью.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC) на основе антител к uPARAP, способных связываться с N-концевой областью рецептора uPARAP. Описанные в настоящем документе ADC способны специфически нацеленно воздействовать на клетки и ткани, экспрессирующие uPARAP, и обладают превосходной эффективностью in vitro и in vivo без каких-либо зарегистрированных побочных эффектов.
В частности, настоящее раскрытие относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему:
а. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с:
I. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 37 (домены CysR-FN-II-CTLD-1 в uPARAP),
II. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 38 или 39 (домены CysR-FN-II в uPARAP),
III. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 41 (домены FN-II-CTLD-1 в uPARAP),
IV. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 30 или 31 (богатый цистеином домен (CysR) uPARAP),
V. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32 или 33 (фиронектиновый домен типа II (FN-II) uPARAP) и/или
VI. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 34 или 35 (лектиноподобный домен 1 С-типа (CTLD 1) uPARAP),
b. активное средство и, необязательно,
с. линкер, который связывает a) с b).
Кроме того, настоящее раскрытие относится к применению определенного выше ADC для лечения заболеваний и/или нарушений, связанных с экспрессией рецептора uPARAP.
Описание графических материалов
Фиг. 1: Схематическое изображение четырех представителей семейства белков семейства маннозных рецепторов, включая в себя uPARAP. Все белки характеризуются одинаковой общей композицией домена с N-концевым сигнальным пептидом, за которым следует богатый цистеином домен, фибронектиновый домен II типа (домен FN-II), 8-10 лектиноподобных доменов С-типа (CTLD), трансмембранная спиральная область и небольшой цитоплазматический хвост (по материалам Melander et al., 2015 Int J Oncology 47: 1177-1188).
Фиг. 2: Схематическая иллюстрация направленного на uPARAP ADC в виде нацеливающего антитела, конъюгированного с конструкцией линкер-токсин малеимидокапроил-валин-цитруллин-п-аминобензоилоксикарбонил-монометиларистатин E (MC-VC-PAB-MMAE). Нацеливающее антитело специфично к рецептору uPARAP, который, как установлено, сильно экспрессируется при некоторых типах злокачественных опухолей. Конструкция линкер-токсин прикрепляется посредством малеимидной химии к тиолам свободных цистеинов или восстановленным межцепочечным дисульфидным мостикам (N = 1-10 токсинов на антитело). Линкерная область валин-цитруллин с пептид/амидной связью со спейсерным объектом является субстратом для лизосомальных протеаз, таких как катепсин В, но достаточно стабильна во внеклеточной среде, чтобы обеспечить высвобождение конъюгированного лекарственного средства только тогда, когда его захватывают клетки, экспрессирующие целевой антиген. Конъюгированное лекарственное средство представляет собой высокоактивный ингибитор тубулина в форме монометил ауристатина E (MMAE). В качестве блока (mAb-vc-MMAE) эта конструкция ADC обеспечивает специфическую доставку лекарственного компонента только к клеткам, экспрессирующим антиген uPARAP, а также внутриклеточное высвобождение конъюгированного лекарственного средства в этих клетках.
Фиг. 3: Клеточный захват моноклонального антитела 2h9, помеченного флуорофором (AlexaFluor 647, AF647), с использованием способа, аналогичного процедуре конъюгации, описанной на фигуре, приведенной на фиг. 2 (частичное восстановление с последующей реакцией с модифицированным малеимидом реагентом AlexaFluor 647), в положительные по uPARAP клеточные линии, измеренный проточной цитометрией. MFI: средняя интенсивность флуоресценции. Коэффициент специфичности: отношение сигналов 2h9-AF647/aTNP-AF647, при этом aTNP является ненацеленным контрольным моноклональным антителом. Эти числа демонстрируют специфическое поглощение 2h9-AF647 и подтверждают, что моноклональное антитело 2h9 захватывается положительными в отношении uPARAP клетками после такого способа конъюгации.
Фиг. 4: A. Восстанавливающий ДСН-ПААГ нацеливающего антитела (2h9), ADC mAb-vc-MMAE с умеренным соотношением лекарственное средство-антитело (DAR) ~ 4-5 и ADC mAb-vc-MMAE с DAR ~ 8-10. Видно, что конъюгированные моноклональные антитела проявляют пониженную подвижность в геле и что умеренно конъюгированные виды ADC предпочтительно конъюгируют через тяжелые цепи моноклональных антител, тогда как ADC с более высоким DAR конъюгируют как с тяжелой, так и с легкой цепью. B. Восстанавливающий ДСН-ПААГ, показывающий, что инкубация ADC с активированным рекомбинантным катепсином B (+rh катепсин B) возвращает подвижность в геле ADC обратно к немодифицированному нацеливающему антителу и, таким образом, что линкерная область действительно расщепляется лизосомными протеазами, такими как катепсин B. C. Анализ ELISA, показывающий сохранение аффинности моноклонального антитела 2h9 к uPARAP после стадии восстановления процедуры конъюгации, а также в форме ADC. В целом эти данные показывают, что ADC 2h9-vc-MMAE ведет себя так, как ожидалось, в отношении подвижности в геле и аффинности к целевому рецептору после конъюгации.
Фиг. 5: Анализы жизнеспособности клеток in vitro, основанные на воздействии ADC в серии разбавлений. Разбавление начинается с 10 мкг/мл ADC (компонент моноклонального антитела), за которым следует серия 4-кратных разведений ADC. Клетки инкубировали в течение 72 часов, прежде чем анализировать с помощью колориметрического анализа жизнеспособности. В настоящем документе анализ показывает специфическое снижение общей жизнеспособности после инкубации с направленным на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE по сравнению с ненацеленным ADC (aTNP-vc-MMAE) в четырех клеточных линиях, экспрессирующих целевой рецептор (клетки U937, THP-1, HT1080 и KNS42), тогда как отрицательная в отношении рецептора клеточная линия (CHO-K1) остается незатронутой. Это демонстрирует специфическое для рецепторов снижение жизнеспособности положительных в отношении uPARAP клеточных линий после инкубации с ADC 2h9-vc-MMAE.
Фиг. 6: Анализ распределения клеточного цикла четырех положительных в отношении uPARAP клеточных линий (U937, THP-1, HT1080 или KNS42) после 3-дневной инкубации в присутствии 1 мкг/мл направленного на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE или контрольного ADC aTNP-vc-MMAE, или 50 нМ свободного токсина MMAE. Поскольку MMAE представляет собой ингибитор тубулина, лекарственный эффект может приводить к увеличению доли клеток либо в фазе Sub-G1 (в конечном счете приводящей к апоптозу), либо в фазе G2-M (ингибирование геномной сегрегации после репликации ДНК). Черточка указывает, что количество клеток слишком низкое для регистрации из-за широкомасштабной гибели клеток и распада. Видно, что все четыре линии клеток отображают специфическую чувствительность к направленному на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE (и свободному MMAE), что видно из сдвига в распределении клеточного цикла в фазах Sub-G1 и G2/M в этих образцах.
Фиг. 7: Конкурентный анализ, показывающий, что клетки U937 инкубируют в течение 3 дней в присутствии 1 мкг/мл направленного на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE при одновременном присутствии разных концентраций неконъюгированного нацеленного антитела (2h9), другого антитела, нацеленного на uPARAP (5f4), или ненацеленного контрольного антитела (aTNP). Видно, что только молярный избыток (1+ мкг/мл конкурирующего моноклонального антитела) неконъюгированного нацеленного антитела 2h9 может конкурировать за эффект ADC, тем самым спасая клетки от опосредованной ADC гибели клеток. Таким образом, показано, что взаимодействие между uPARAP и нацеленным антителом 2h9 имеет решающее значение для наблюдаемого цитотоксического эффекта.
Фиг. 8: Показано, что предварительная инкубация клеток U937 в присутствии ингибитора лизосомных протеаз широкого спектра (E64D) приводит к полному аннулированию цитотоксического эффекта направленного на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE. Таким образом, показано, что лизосомальное высвобождение конъюгированного лекарственного средства имеет решающее значение для получения цитотоксического эффекта.
3
Фиг. 9: Исследование in vivo эффективности направленного на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE в борьбе с положительной в отношении uPARAP подкожной ксенотрансплантатной опухолью, введенной путем инъекции клеточной линии U937 мышам CB17 SCID. Мышей лечили посредством подкожной (sc) инъекции вблизи опухоли либо направленного на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE (N=10), либо контрольного ADC aTNP-vc-MMAE (N=9), неконъюгированного моноклонального антитела 2h9 (N=5) или физиологического раствора (PBS, N=5). Все виды лечения проводят в дозах 3 мг/кг/инъекции компонента моноклонального антитела, в виде всего 4 доз, каждые 4 дня. День 0 отмечает день первой инъекции, начатый после того, как опухоль достигла осязаемого размера 50-100 мм, а на графике показан средний размер опухоли по каждой группе воздействия. Видно, что лечение ADC 2h9-vc-MMAE приводит к резкому снижению роста опухоли, тогда как все другие группы лечения достигают точки умерщвления в течение 10-12 дней после начала лечения. Это демонстрирует, что направленный на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE эффективен при ингибировании роста предварительно приживленной положительной в отношении uPARAP опухоли in vivo. Кроме того, данные из обработанной 2h9-vc-MMAE группы представляют частоту стойкого выздоровления 50% (смотрите также фиг. 10).
Фиг. 10: Более подробный анализ роста опухоли в группе, обработанной 2h9-vc-MMAE, описанной на фиг. 9, показывающий, что эта группа включала мышей, страдающих от неполного лечения и рецидива опухоли, а также мышей, которые потеряли опухолевую нагрузку полностью и не обнаружили рецидива опухоли. Из 10 мышей, получавших 2h9-vc-MMAE, у 5 наблюдался почти немедленный рецидив роста опухоли после лечения, быстро достигающий точки умерщвления, тогда как оставшиеся 5 мышей потеряли все признаки опухоли и у них не наблюдался рост опухоли в период 90 дней, что дает общую частоту стойкого выздоровления 50% для мышей, подвергнутых лечению 2h9-vc-MMAE, после подкожного введения.
3
Фиг. 11: Исследование in vivo эффективности направленного на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE в борьбе с положительной в отношении uPARAP подкожной ксенотрансплантатной опухоли, приживленной путем инъекции клеточной линии U937 мышам CB17 SCID. Мышам вводили внутривенную (iv) инъекцию через хвостовые вены либо направленного на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE (N=10), контрольного ADC aTNP-vc-MMAE (N=10), неконъюгированного моноклонального антитела 2h9 (N=5) или физиологического раствора (PBS, N=5). Все виды лечения проводят в дозах 5 мг/кг/инъекцию компонента моноклонального антитела, в виде всего 3 доз, каждые 4 дня. День 0 отмечает день первой инъекции, как только опухоль достигла осязаемого размера 50-100 мм, и график показывает средний размер опухоли в каждой группе лечения. В этих условиях лечение направленным на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE приводит к полному аннулированию опухолевой нагрузки у всех 10 мышей, что дает общую частоту стойкого выздоровления 100% мышей после внутривенного введения этого ADC, что еще раз демонстрирует эффективность ADC 2h9-vc-MMAE в борьбе с солидными положительными в отношении uPARAP опухолями.
Фиг. 12: Анализы жизнеспособности клеток in vitro, показывающие специфическое снижение общей жизнеспособности после инкубации либо с направленным на uPARAP ADC 2h9-vc-MMAE, либо с направленным на uPARAP ADC 5f4-vc-MMAE по сравнению с ненацеленным ADC (aTNP-vc-MMAE), в клеточной линии U937. Данные показывают, что ADC на основе 5f4 характеризуются сравнимой эффективностью с ADC на основе антитела 2h9.
Фиг. 13: Иммуногистохимическое окрашивание различных сарком (липосаркома, миксофибросаркома, выбухающая дерматофибросаркома (DFSP) и лейомиосаркома (LMS)). Способ окрашивания показывает тканевую экспрессию uPARAP в виде темно-красновато-коричневого цвета. Экспрессия uPARAP очевидна в срезах ткани злокачественной опухоли (опухолевой), тогда как срезы незлокачественной ткани лишены uPARAP, демонстрируя повышенные уровни экспрессии uPARAP, обнаруженные в саркомах. Полосы шкалы: 20 мкм.
Фиг. 14: Различные антитела, направленные против N-концевой части uPARAP, могут быть использованы для эффективной доставки лекарственных средств в формате ADC. ADC с композицией mAb-vc-MMAE получали, как описано в легенде на фиг. 2, с использованием трех различных антител, направленных против эпитопов в трех N-концевых доменах uPARAP (моноклональное антитело 2h9, моноклональное антитело 5f4 и моноклональное антитело 9b7). Для сравнения, ADC получали таким же образом, но с использованием антитела к uPARAP, направленного против эпитопа за пределами трех N-концевых доменов (моноклональное антитело 11c9). Затем анализы жизнеспособности клеток in vitro с клетками U937 выполняли, как описано в легенде на фиг. 5, используя все эти ADC. Все ADC приводят к определенному снижению общей жизнеспособности клеток, но с клеточной чувствительностью к 2h9-vc-MMAE, 5f4-vc-MMAE и 9b7-vc-MMAE выше, чем чувствительность к 11c9-vc-MMAE.
Фиг. 15: Различные токсины могут использоваться в формате ADC, нацеленного на N-терминальную часть uPARAP. ADC с моноклональным антителом 2h9 в качестве компонента антитела получали, как описано в легенде на фиг. 2, но с использованием следующих блоков линкер-цитотоксин вместо VC-PAB-MMAE: VC-PAB-MMAF (с MMAF, являющимся монометил ауристатином F, карбоксильный вариант MMAE) и PEG4-va-PBD (с PEG4, относящимся к спейсеру полиэтиленгликоля, va, представляющим собой валин-аланин, и PBD, относящимся к димерному пирролобензодиазепину). Полученные в результате ADC (обозначенные как 2h9-vc-MMAF и 2h9-va-PBD, соответственно) использовали для анализов жизнеспособности клеток in vitro с клетками U937, выполненных, как описано в легенде на фиг. 5. Клетки U937 отображали очень сильную чувствительность к 2h9-vc-MMAF и более умеренную чувствительность к 2h9-va-PBD.
Фиг. 16: ADC с моноклональным антителом 2h9 в качестве компонента антитела получали, как описано в легенде на фиг. 2, но с использованием следующего блока линкер-цитотоксин вместо VC-PAB-MMAE: PEG4-vc-дуокармицин SA (с PEG4, относящимся к полиэтиленгликольному спейсеру, и vc, являющемуся валин-цитруллином). Полученный ADC (называемый 2h9-vc-DuocSA) использовали для анализа жизнеспособности клеток in vitro с клетками U937, выполненному, как описано в легенде на фиг. 5. Клетки U937 отображали низкую, но измеримую чувствительность к 2h9-vc-DuocSA.
Фиг. 17: ADC с моноклональным антителом 2h9 или aTNP в качестве компонента-антитела получали, как описано в легенде на фиг. 2, с использованием следующих блоков линкер-цитотоксин: VC-PAB-MMAE или VC-PAB-MMAF. Полученные ADC (называемые 2h9-vc-MMAE, 2h9-vc-MMAF, aTNP-vc-MMAE и aTNP-vc-MMAF) использовали для анализа жизнеспособности клеток in vitro с использованием клеток эксплантатов глиобластомы человека и выполняли, как описано в легенде на фиг. 5. Эти клетки эксплантата глиобластомы показали высокую степень специфической чувствительности к направленным на uPARAP ADC, основанным как на токсине MMAE, так и MMAF.
Фиг. 18: Рекомбинантный продукт моноклонального антитела 2h9, обозначенный как «клонированный 2h9», производили в клетках CHO, трансфицированных вектором экспрессии, включающим в себя последовательности ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепь моноклонального антитела 2h9 ([SEQ ID NO: 1] и [SEQ ID NO: 5], соответственно). Реакционную способность этого продукта анализировали в Вестерн-блоттинге и сравнивали с моноклональным антителом 2h9, полученным посредством гибридомной клеточной культуры («исходное 2h9»). Для Вестерн-блоттинга анализировали детергентный клеточный лизат, полученный из положительных в отношении uPARAP клеток остеосаркомы человека MG63, используя идентичные концентрации «клонированного 2h9» и «исходного 2h9» в качестве первичных антител. Оба продукта антитела демонстрируют идентичную реакцию и оба специфически реагируют с белком uPARAP. Никакой реакции не наблюдается при отсутствии первичного антитела (отрицательный контроль).
Последовательности
SEQ ID NO
Описание
SEQ ID NO: 1
Полноразмерная аминокислотная последовательность легкой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 2
Полноразмерная CDR1 легкой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 3
Полноразмерная CDR2 легкой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 4
Полноразмерная CDR3 легкой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 5
Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 6
Полноразмерная CDR1 тяжелой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 7
Полноразмерная CDR2 тяжелой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 8
Полноразмерная CDR3 тяжелой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 9
Аминокислотная последовательность 1-214 легкой цепи Fab 2h9
SEQ ID NO: 10
Аминокислотная последовательность 1-224 тяжелой цепи Fab 2h9
SEQ ID NO: 11
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 12
CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 13
CDR2 вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 14
CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 15
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 16
CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 17
CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 18
CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 19
Аминокислотная последовательность 1-214 легкой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 20
Аминокислотная последовательность 8-214 легкой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 21
CDR1 легкой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 22
CDR2 легкой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 23
CDR3 легкой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 24
Аминокислотная последовательность 1-221 тяжелой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 25
Аминокислотная последовательность 9-221 тяжелой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 26
CDR1 тяжелой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 27
CDR2 тяжелой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 28
CDR3 тяжелой цепи Fab 9b7
SEQ ID NO: 29
Полноразмерная последовательность человеческого uPARAP (GenBank: AAI53885.1)
SEQ ID NO: 30
Домен CysR, представленный в NCBI (аминокислоты (aa) 46-161 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 31
Домен CysR, предсказанный посредством инструмента SMART (простой инструмент исследования модульной структуры), в EMBL (http://smart.embl-heidelberg.de/) {Schultz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp. 5857-5864, May 1998} (аминокислоты (aa) 41-161 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 32
Домен FN-II, представленный в NCBI (аминокислоты 181-228 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 33
Домен FN-II, предсказанный посредством SMART (аминокислоты 180-228 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 34
Домен CTLD-1, представленный в NCBI (аминокислоты 247-361 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 35
Домен CTLD-1, предсказанный посредством SMART (аминокислоты 235-360 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 36
CysR-FN-II-CTLD-1, представленный в NCBI (аминокислоты 46-361 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 37
CysR-FN-II-CTLD-1, предсказанный посредством SMART (аминокислоты 41-360 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 38
CysR-FN-II, представленный в NCBI (аминокислоты 46-228 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 39
CysR-FN-II, предсказанный посредством SMART (аминокислоты 41-228 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 40
FN-II-CTLD-1, представленный в NCBI (аминокислоты 181-361 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 41
FN-II-CTLD-1, предсказанный посредством SMART (аминокислоты 180-360 полноразмерного человеческого uPARAP)
SEQ ID NO: 42
Предсказанный посредством Paratome ABR1 легкой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 43
Предсказанный посредством Paratome ABR2 легкой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 44
Предсказанный посредством Paratome ABR3 легкой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 45
Предсказанный посредством Paratome ABR1 тяжелой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 46
Предсказанный посредством Paratome ABR2 тяжелой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 47
Предсказанный посредством Paratome ABR3 тяжелой цепи моноклонального антитела 2h9
SEQ ID NO: 48
Предсказанный посредством Paratome ABR1 легкой цепи моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 49
Предсказанный посредством Paratome ABR2 легкой цепи моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 50
Предсказанный посредством Paratome ABR3 легкой цепи моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 51
Предсказанный посредством Paratome ABR1 тяжелой цепи моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 52
Предсказанный посредством Paratome ABR2 тяжелой цепи моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 53
Предсказанный посредством Paratome ABR3 тяжелой цепи моноклонального антитела 5f4
SEQ ID NO: 54
Предсказанный посредством Paratome ABR1 легкой цепи моноклонального антитела 9b7
SEQ ID NO: 55
Предсказанный посредством Paratome ABR2 легкой цепи моноклонального антитела 9b7
SEQ ID NO: 56
Предсказанный посредством Paratome ABR3 легкой цепи моноклонального антитела 9b7
SEQ ID NO: 57
Предсказанный посредством Paratome ABR1 тяжелой цепи моноклонального антитела 9b7
SEQ ID NO: 58
Предсказанный посредством Paratome ABR2 тяжелой цепи моноклонального антитела 9b7
SEQ ID NO: 59
Предсказанный посредством Paratome ABR3 тяжелой цепи моноклонального антитела 9b7
Определяющие комплементарность области (CDR) предсказывали в соответствии со схемой определения Kabat et al. как указано в ссылках Kabat et al. (1983), Kabat et al. (1991) и Wu and Kabat (2008), с использованием компьютеризированной программы нумерации Kabat, опубликованной в публикации Dunbar and Deane (2016). Антигенсвязывающие области (ABR) в соответствии с алгоритмом Paratome также предсказывали, как указано в ссылках Kunik et al. (2012a и b). ABR представляют собой альтернативные CDR описанных в настоящем документе антител.
Полные области, участвующие в распознавании и связывании антигена, могут немного отклоняться от указанных CDR и ABR, и данные всех последовательностей, включенные в вариабельные области или фрагменты Fab, указанные в настоящем документе, рассматриваются как потенциально способствующие связыванию антигена. Способы или алгоритмы, отличные от используемых в настоящем документе, могут быть использованы для идентификации потенциальных областей связывания/распознавания. Поэтому в дополнение к предсказанным CDR, представленным в настоящем документе, настоящее изобретение охватывает любые аминокислотные последовательности, предсказанные для представления CDR или ABR в моноклональных антителах 2h9, 5f4 и 9b7 на основе соответствующих областей Fab и вариабельных областей (SEQ ID NO: 9, 10, 11, 15, 20 и 25, соответственно), с использованием таких способов или алгоритмов. Примеры дополнительных способов и алгоритмов для предсказания CDR включают в себя, без ограничения, систему IMGT (LeFranc et al., (2003)).
Из-за положения областей праймера во время секвенирования легких и тяжелых цепей Fab 9B7 в N-концевой области этих последовательностей ожидается некоторая неопределенность. Таким образом, первые 7 аминокислот SEQ ID NO: 19 могут быть неточными. То же самое относится к аминокислотам 1-8 в SEQ ID NO: 24. SEQ ID NO: 20 и 25 соответствуют SEQ ID NO: 19 и 24, соответственно, без неопределенных N-концевых аминокислот.
Подробное описание настоящего изобретения
Нацеленный на uPARAP конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению содержит
а) антитело, способное связываться с богатым цистеином доменом (CysR), фибронектиновым доменом типа II (FN-II) и/или с лектиноподобным доменом 1 С-типа (CTLD 1) в uPARAP,
b) активное средство и
c) необязательно линкер, который связывает a) с b).
Согласно конкретному аспекту нацеленный на uPARAP конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению содержит
а. антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с:
I. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 37 (домены CysR-FN-II-CTLD-1 в uPARAP),
II. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 38 или 39 (домены CysR-FN-II в uPARAP),
III. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 41 (домены FN-II-CTLD-1 в uPARAP),
IV. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 30 или 31 (богатый цистеином домен (CysR) в uPARAP)
V. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32 или 33 (фибронектиновый домен типа II (FN-II) в uPARAP) и/или
VI. аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 34 или 35 (лектиноподобный домен 1 С-типа (CTLD 1)в  uPARAP),
b. активное средство и, необязательно,
с. линкер, который связывает a) с b).
Антитело, направленное против uPARAP
Антитело к uPARAP по настоящему изобретению интернализуется при связывании с uPARAP на клеточной поверхности, что позволяет проводить внутриклеточные действия активного средства комплекса ADC. Известно, например, из публикации международной заявки WO 2010/111198, что не все антитела, способные связываться с uPARAP, интернализуются с той же скоростью или в том же количестве. Действительно, некоторые антитела к uPARAP вообще не интернализуются и поэтому не подходят для использования в ADC.
Рецептор uPARAP состоит из N-концевого богатого цистеином домена (CysR), фибронектинового домена типа II (FN-II) и восьми лектиноподобных доменов C-типа (CTLDs 1-8), пример на фиг. 1. Короткие аминокислотные последовательности соединяют отдельные домены. Представленные в настоящем документе данные показывают, что антитела к uPARAP, нацеленные на три наиболее N-концевых домена uPARAP, очень эффективны для использования в ADC.
Таким образом, антитело к uPARAP по настоящему изобретению предпочтительно связывается с N-концевой областью uPARAP, более предпочтительно с эпитопом, расположенным в трех наиболее N-концевых доменах uPARAP, который представляет собой богатый цистеином домен, фибронектиновый домен типа II и/или лектиноподобный домен 1 C-типа, включая в себя линкерные последовательности, связывающие эти домены uPARAP.
Таким образом, антитело к uPARAP по настоящему изобретению способно связываться с пептидом, содержащим или состоящим из богатого цистеином домена (CysR) (SEQ ID NO: 30 или 31), фибронектинового домена II (FN-II) (SEQ ID NO: 32 или 33) и/или лектиноподобного домена 1 C-типа (CTLD 1) (SEQ ID NO: 34 или 35) uPARAP.
Богатый цистеином домен, фибронектиновый домен типа II и лектиноподобный домен 1 C-типа, включая в себя линкерные последовательности, связывающие эти домены, перечисленные NCBI, соответствуют аминокислотам 46-361 полноразмерного человеческого uPARAP. Таким образом, согласно одному варианту осуществления эпитоп для антитела к uPARAP находится в аминокислотах 46-361 SEQ ID NO: 29 (полноразмерный человеческий uPARAP). Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению связывается с эпитопом, расположенным в аминокислотах 31-365 SEQ ID NO: 29, более предпочтительно в аминокислотах 46-361 SEQ ID NO: 29, соответствующем SEQ ID NO: 36. SMART предсказывает CYSR-FN-II-CTLD1, включая в себя линкерные последовательности, связывающие эти домены с аминокислотами 41-360 SEQ ID NO: 29. Таким образом, согласно одному варианту осуществления эпитоп для антитела к uPARAP расположен в аминокислотах 41-360 SEQ ID NO: 29, что соответствует SEQ ID NO: 37.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению связывается с доменом CysR и/или с доменом CTLD-1.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению связывается с CysR-доменом, который согласно прогнозу NCBI состоит из аминокислот 46-161 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 30 в настоящем документе, и согласно SMART состоит из аминокислот 41-161 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 31. Т.е. согласно одному варианту осуществления он связывается с эпитопом, расположенным в аминокислотах 46-161 или 41-161 SEQ ID NO: 29.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению связывается с доменом FN-II, который согласно прогнозу NCBI состоит из аминокислот 181-228 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 32 в настоящем документе, и согласно SMART состоит из аминокислот 180-228 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 33. Т.е. согласно одному варианту осуществления он связывается с эпитопом, расположенным в аминокислотах 181-228 или 180-228 SEQ ID NO: 29.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению связывается с доменом CTLD-1, который согласно прогнозу NCBI состоит из аминокислот 247-361 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 34 в настоящем документе, и согласно SMART состоит из аминокислот 235-360 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 35. Т.е. согласно одному варианту осуществления он связывается с эпитопом, расположенным в аминокислотах 247-361 или 235-360 SEQ ID NO: 29.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению способно связываться с пептидом, содержащим или состоящим из домена CysR и FN-II, включая в себя линкерные последовательности, связывающие эти домены, который согласно прогнозу NCBI состоит из аминокислот 46-228 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 38, и согласно SMART состоит из аминокислот 41-228 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 39. Т.е. согласно одному варианту осуществления он связывается с эпитопом, расположенным в аминокислотах 46-228 или 41-228 SEQ ID NO: 29.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению способно связываться с пептидом, содержащим или состоящим из домена FN-II и CTLD-1, включая в себя линкерные последовательности, связывающие эти домены, который согласно прогнозу NCBI состоит из аминокислот 181-361 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 40, и согласно SMART состоит из аминокислот 180-360 полноразмерного человеческого uPARAP, соответствующего SEQ ID NO: 41. Т.е. согласно одному варианту осуществления он связывается с эпитопом, расположенным в аминокислотах 180-361 или 181-360 SEQ ID NO: 29.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению представляет собой мышиное моноклональное антитело IgG1κ клона 2.h.9:F12, коммерчески доступное от Merck Millipore (http://www.merckmillipore.com/DK/en/product/Anti-UPAR-Associated-Protein-Antibody%2C-clone-2.h.9%3AF12,MM_NF-MAB2613?cid=BI-XX-BRC-P-GOOG-ANTI-B302-1075), или его функциональный фрагмент или его вариант, такой как химерная или гуманизированная версия. Клон 2.h.9:F12 моноклонального антитела IgG1κ мыши упоминается в настоящем документе как антитело «2h9» или «моноклональное антитело 2h9». Антитело 2h9 реагирует как с uPARAP человека, так и мыши и поэтому хорошо подходит как для доклинических, так и для клинических исследований.
Предыдущие исследования показывают, что эпитоп для антитела 2h9 расположен в трех наиболее N-концевых доменах uPARAP, особенно в домене CysR или домене CTLD-1. Растворимый рекомбинантный белок, состоящий из трех N-концевых доменов uPARAP (CysR, FN-II и CTLD-1), связывается с иммобилизованным 2h9 в установке BIAcore, ограничивая положение связывания моноклональным антителом 2h9 этими тремя N-концевыми доменами (Jürgensen et al., 2011, JBC 286 (37): 32736-48). Кроме того, замена домена FN-II uPARAP на домен FN-II других представителей того же семейства рецепторов не влияет на связывание моноклонального антитела 2h9, что указывает на то, что домен FN-II вряд ли содержит эпитоп для моноклонального антитела 2h9 (Jürgensen et al., 2014, JBC 289 (11): 7935-47). Это эффективно ограничивает связывание моноклонального антитела 2h9 либо с доменом CysR, либо с доменом CTLD-1.
Предсказанные CDR вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина моноклонального антитела 2h9 соответствуют SEQ ID NO: 2-4, а предсказанные CDR вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина моноклонального антитела 2h9 соответствуют SEQ ID NO: 6-8.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению представляет собой антитело, соответствующее антителу 2h9 или его функциональному фрагменту или варианту, выбранному из группы, состоящей из:
а. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 9 или последовательности, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней и/или
II. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или 10 или последовательности, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней,
b. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с тем же эпитопом, что и антитело a),
с. гуманизированной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента a) или гуманизированной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента b),
d. химерной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента а) или химерной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента b),
е. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. одну или несколько аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7 и 8 или
II. аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, 3 и 4 и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6, 7 и 8,
f. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. одну или несколько аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46 и 47 или
II. аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 42, 43 и 44 и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 45, 46 и 47.
Чтобы сохранить антигенное распознавание описанных в настоящем документе антител, несоответствие последовательностей, как правило, отсутствует в CDR или ABR. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления любое изменение последовательности расположено вне CDR или ABR. Все раскрытые в настоящем документе варианты антител и антигенсвязывающих фрагментов сохраняют способность связываться с uPARAP.
Например, антитело по настоящему изобретению может содержать
а. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 9 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. CDR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 2,
II. CDR2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 3,
III. CDR3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 4 и
b. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или 10 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. CDR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 6,
II. CDR2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 7,
III. CDR3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 8,
причем любое несоответствие последовательностей находится вне CDR.
Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может содержать
а. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 9 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. ABR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 42,
II. ABR 2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 43,
III. ABR 3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 44 и
b. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или 10 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. ABR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 45,
II. ABR 2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 46,
III. ABR 3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 47,
причем любое несоответствие последовательностей находится вне ABR.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению представляет собой мышиное моноклональное антитело 5f4 или его функциональный фрагмент или вариант. Антитело 5f4 представляет собой IgG1κ.
Исследования показали, что эпитоп для 5f4 расположен в домене FN-II uPARAP. В публикации Jürgensen et al., 2014 показано, что антитело 5f4 способно связываться с uPARAP дикого типа и с искусственными представителями семейства маннозных рецепторов, где домен FN-II дикого типа переключен с таковым uPARAP. 5f4 не способен связываться с другими представителями белков семейства маннозных рецепторов в их форме дикого типа или с uPARAP, где домен FN-II дикого типа переключен с эквивалентными доменами из других представителей семейства маннозных рецепторов (Jürgensen et al. ., 2014, JBC 289 (11): 7935-47).
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению представляет собой антитело, соответствующее антителу 5f4 или его функциональному фрагменту или варианту, выбранному из группы, состоящей из
а. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 или последовательности, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и/или
II. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или последовательности, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней,
b. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с тем же эпитопом, что и антитело a),
с. гуманизированной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента a) или гуманизированной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента b),
d. химерной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента а) или химерной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента b),
е. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. одну или несколько аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17 и 18 или
II. аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12, 13 и 14 и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 16, 17 и 18.
f. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. одну или несколько аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52 и 53 или
II. аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 48, 49 и 50 и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 51, 52 и 53.
Чтобы допускать некоторое несоответствие последовательностей вне CDR, антитело по настоящему раскрытию может содержать
а. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. CDR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 12,
II. CDR2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 13,
III. CDR3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 14 и
b. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. CDR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 16,
II. CDR2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 17,
III. CDR3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 18,
причем любое несоответствие последовательностей находится вне CDR.
Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может содержать
а. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. ABR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 48,
II. ABR 2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 49,
III. ABR 3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 49 и
b. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. ABR 1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 51,
II. ABR 2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 52,
III. ABR 3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 53,
причем любое несоответствие последовательностей находится вне ABR.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению представляет собой мышиное моноклональное антитело 9b7 (моноклональное антитело 9b7) или его функциональный фрагмент или вариант. Предыдущие исследования показывают, что эпитоп для антитела 9b7 расположен в трех наиболее N-концевых доменах uPARAP. Когда растворимый рекомбинантный белок, состоящий из трех N-концевых доменов uPARAP (CysR, FN-II и CTLD-1), иммобилизуют в установке BIAcore, моноклональное антитело 9b7 связывается с этой конструкцией.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP выбрано из группы, состоящей из
а. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 или 20 или последовательности, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и/или
II. вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 или 25 или последовательности, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней,
b. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с тем же эпитопом, что и антитело a),
с. гуманизированной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента a) или гуманизированной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента b),
d. химерной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента а) или химерной версии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента b),
е. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. одну или несколько аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 21, 22, 23, 26, 27 и 28 или
II. аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23 и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 26, 27 и 28.
f. антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего
I. одну или несколько аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58 и 59 или
II. аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 54, 55 и 56 и/или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 57, 58 и 59.
Согласно одному варианту осуществления антитело по настоящему изобретению может содержать
а. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 или 20 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. CDR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 21,
II. CDR2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 22,
III. CDR3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 23, и
b. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или 25 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. CDR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 26,
II. CDR2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 27,
III. CDR3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 28,
причем любое несоответствие последовательности находится вне CDR.
Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может содержать
а. вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 или 20 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. ABR1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 54,
II. ABR 2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 55,
III. ABR 3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 56, и
b. вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или 25 или последовательность, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70% по отношению к ней, такой идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к ней, например, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90% по отношению к ней, и дополнительно содержащую
I. ABR 1, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 57,
II. ABR 2, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 58,
III. ABR 3, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID NO: 59,
причем любое несоответствие последовательности находится вне ABR.
Под «антителом» авторы настоящего изобретения предусматривают по существу интактные молекулы антител, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых и/или легких цепей антител и антигенсвязывающие фрагменты и их производные.
Под «антигенсвязывающим фрагментом» авторы настоящего изобретения подразумевают функциональный фрагмент антитела, который способен связываться с uPARAP.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP в соответствии с настоящим изобретением выбирают из мышиного антитела, химерного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела, гуманизированного антигенсвязывающего фрагмента, фрагмента Fab, фрагмента Fab’, фрагмента F(ab’)2, фрагмента Fv, одноцепочечного антитела (SCA), такого как scFv, вариабельной части тяжелой и/или легкой цепей или миниантител Fab, причем эти фрагменты или модифицированные антитела могут быть полученных из мышиных, химерных, человеческих или гуманизированных антител.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP представляет собой гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантное антитело.
Антитело к uPARAP по настоящему изобретению может быть любого класса иммуноглобулина, включая в себя IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и любой их подкласс. Подклассы IgG также хорошо известны специалистам в настоящей области техники и включают в себя, без ограничения, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека. Согласно одному варианту осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело IgG. Согласно одному варианту осуществления антитело представляет собой IgG1κ.
Согласно одному варианту осуществления антитело к uPARAP представляет собой антигенсвязывающий фрагмент.
Преимущества применения фрагментов антител, а не целых антител, многоаспектны. Меньший размер фрагментов может привести к улучшению фармакологических свойств, таких как лучшее проникновение в ткани. Более того, антигенсвязывающие фрагменты могут быть экспрессированы и секретированы из E. coli или других клеток-хозяев немлекопитающих, что позволяет легко производить большие количества указанных фрагментов.
Fab представляет собой фрагмент, который содержит моновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела, который может быть получен путем расщепления целого антитела ферментом папаин или другими специфическими средствами протеолиза с получением легкой цепи и части тяжелой цепи.
F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела, который может быть получен путем обработки целого антитела ферментом пепсином или другими специфическими средствами протеолиза с получением двухвалентного антигенсвязывающего фрагмента без последующего восстановления; F(ab')2 представляет собой димер двух Fab-фрагментов, удерживаемых двумя дисульфидными связями.
Fv представляет собой полученный посредством генной инженерии фрагмент, содержащий вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, экспрессированные в виде двух цепей.
Одноцепочечное антитело (SCA) представляет собой полученную посредством генной инженерии молекулу, содержащую вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, связанные подходящим полипептидным линкером в виде генетически слитой одноцепочечной молекулы, включая в себя scFv.
Способы производства антител и фрагментов антител хорошо известны в настоящей области техники. Например, антитела могут быть получены с помощью любого из нескольких способов, которые используют индукцию производства in vivo молекул антител, скрининг библиотек иммуноглобулинов или производство молекул моноклональных антител клеточными линиями в культуре. Они включают в себя, без ограничения, способ гибридомы, способ гибридомы В-клеток человека и способ гибридомы вируса Эпштейна-Барра (EBV).
Аналогично, фрагменты антител могут быть получены с использованием способов, хорошо известных в настоящей области техники. Например, фрагменты антител в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены путем протеолитического гидролиза антитела с различными ферментами или посредством экспрессии в клетках E. coli или млекопитающих (например, клеточной культуре яичника китайского хомячка или других белковых системах экспрессии) ДНК, кодирующей фрагмент. Альтернативно, фрагменты антител могут быть получены путем расщепления пепсином или папаином целых антител обычными способами.
Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что для терапии или диагностики людей предпочтительно используются человеческие или гуманизированные антитела. Гуманизированные формы отличных от человеческих антител (например, мышиных) представляют собой генетически модифицированные химерные антитела или фрагменты антител, имеющие предпочтительно минимальные части, полученные из отличных от человеческих антител. Гуманизированные антитела включают в себя антитела, в которых определяющие комплементарность области (CDR) человеческого антитела (антитела-реципиенты) заменяются остатками из определяющей комплементарность области отличного от человеческого вида (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик, имеющего желаемую функциональность. В некоторых случаях каркасные остатки Fv человеческого антитела заменяются соответствующими отличными от человеческих остатками. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в импортированных CDR или каркасных последовательностях. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все определяющие комплементарность области соответствуют по меньшей мере одному из отличных от человеческих антител и все или практически все каркасные области соответствуют тем, которые соответствуют соответствующей консенсусной последовательности человека. Гуманизированные антитела оптимально также включают в себя по меньшей мере часть константной области антитела, такую как область Fc, как правило, полученную из человеческого антитела.
Способы гуманизации отличных от человеческих антител хорошо известны в настоящей области техники. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти отличные от человеческих аминокислотные остатки, часто упоминаемые как импортированные остатки, как правило, берут из импортируемого вариабельного домена. Гуманизация может быть по существу выполнена, как описано путем замены человеческих CDR соответствующими отличными от человеческих CDR. Соответственно, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу менее чем интактный вариабельный домен человека был заменен соответствующей последовательностью от отличных от человеческих видов. На практике гуманизированные антитела могут, как правило, представлять собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые каркасные остатки замещены остатками из аналогичных сайтов в отличных от человеческих антителах.
Человеческие антитела также могут быть идентифицированы с использованием различных способов, известных в настоящей области техники, включая в себя библиотеки фагового дисплея.
После получения подходящих антител они могут быть исследованы на антигенную специфичность, например, с помощью ELISA.
Активное средство
ADC к uPARAP по настоящему изобретению содержит активное средство, т.е. лекарственное средство, которое может быть доставлено внутриклеточно к клеткам, экспрессирующим uPARAP на своей поверхности. Активное средство может представлять собой, например, терапевтическое средство, цитотоксическое средство, радиоизотоп или обнаруживаемую метку. Согласно предпочтительному варианту осуществления активное средство представляет собой терапевтическое средство.
Согласно одному варианту осуществления активное средство представляет собой химиотерапевтическое средство. Классы химиотерапевтических средств включают в себя алкилирующие средства, антрациклины, антиметаболиты, антимикротрубочковые/антимитотические средства, ингибиторы гистондезацетилазы, ингибиторы киназы, пептидные антибиотики, противоопухолевые средства на основе платины, ингибиторы топоизомеразы и цитотоксические антибиотики.
Согласно предпочтительному варианту осуществления активное средство представляет собой цитотоксическое средство, позволяющее эффективно уничтожать клетки, экспрессирующие uPARAP.
Согласно одному варианту осуществления активное средство представляет собой антимитотическое средство, такое как монометил ауристатин E (MMAE), монометил ауристатин F (MMAF), таксан (например, паклитаксел или доцетаксел), алкалоид барвинка (например, винбластин, винкристин, виндезин или винорелбин), колхицин или подофиллотоксин.
Согласно одному варианту осуществления цитотоксическое средство представляет собой монометил ауристатин E (MMAE). Из-за своей высокой токсичности MMAE, который ингибирует деление клеток путем блокирования полимеризации тубулина, не может использоваться в качестве химиотерапевтического лекарственного средства с одним средством. Однако было установлено, что комбинация MMAE, связанная с моноклональным антителом к CD30 (брентуксимаб ведотин, торговое название Адцетрис™), является стабильной во внеклеточной жидкости, расщепляемой катепсином и безопасной для терапии.
Согласно одному варианту осуществления цитотоксическое средство представляет собой монометил ауристатин F (MMAF). MMAF представляет собой антимикротрубочковое/антимитотическое средство и карбоксильный вариант MMAE.
Согласно одному варианту осуществления цитотоксическое средство представляет собой такое сшивающее ДНК средство, как пирролбензодиазепин или димерное производное пирролбензодиазепина.
Согласно одному варианту осуществления цитотоксическое средство представляет собой алкилирующее ДНК средство, такое как дуокармицин SA.
Примеры дополнительных алкилирующих средств включают в себя тиотепу и циклофосфамид CYTOXAN; такие алкилсульфонаты, как бусульфан, имсульфан и пиросульфан; такие азиридины, как бензодопа, карбокон, метудопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая в себя альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая в себя синтетический аналог топотекана (HYCAMTIN), CPT-I l (иринотекан, CAMPTOSAR), ацетиламптотецин, скополект и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая в себя синтетические аналоги адозелезина, карцелезина и бизелезина); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая в себя синтетические аналоги, KW-2189 и CBl-TMl); элейтеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; такие азотистые иприты, как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенстерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый нитрит; такие нитрозомочевины, как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; такие антибиотики, как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II, динемицин, включая в себя динемицин А, эсперамицин, неокарзиностатин хромофор и связанные с ним хромофоры хромопротеиновых ендииновых антибиотиков), аклациномицины, актиномицин, автрамицин, азасерин, блемомицины, каминомицин, карбабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая в себя ADRIAMYCIN, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, липосомная инъекция доксорубицина HCl (DOXIL) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, такие митомицины, как митомицин С, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептомигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; такие антиметаболиты, как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR), тегафур (UFTORAL), капецитабин (XELODA), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); такие аналоги фолиевой кислоты, как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; такие аналоги пуринов, как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; такие аналоги пиримидинов, как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флуксуридин; такие андрогены, как каластоун, пропионат дромоностанола, эпитиотонол, мепитиостан, тестолактон; такие угнетающие функцию надпочечников средства, как аминоглютетимид, митотан, трилостан; такой заменитель фолиевой кислоты, как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиний ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; такие майтансиноиды, как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин, трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин), уретан, виндезин (ELDISINE, FILDESIN), дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипроброман, гацитозин; арабинозид («Ara-C»), тиотепу, таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL), композицию наночастиц с альбумином паклитаксела (ABRAXANE™) и доксетаксел (TAXOTERE), хлоранбуцил, 6-тиогуанин, меркаптопурин; метотрексат, такие аналоги платины, как цисплатин и карбоплатин, винбластин (VELBAN), платина, этопозид (VP-16), ифосфамид, митоксантрон, винкристин (ONCOVIN), оксалиплатин, лейковин, винорелбин (NAVELBINE), новатрон, эдатрексат; дауномицин, аминоптерин, ибандронат, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторметилорнитин (DMFO), такой ретиноид, как ретиноевая кислота, фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше, а также комбинации двух или более из вышеуказанных, такие как CHOP, сокращение для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращение для схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN) в сочетании с 5-FU и лейковивином.
Антигормональные средства действуют, чтобы регулировать, уменьшать, блокировать или ингибировать действие гормонов, которые могут способствовать росту злокачественной опухоли, и часто вводятся в виде системного лечения. Они могут представлять собой сами гормоны. Примеры включают в себя антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), включая в себя, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX), ралоксифен (EVISTA), дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LYl 17018, онпристон и торемифен (FARESTON); антипрогестероны; редукторы рецепторов эстрогена (ERD); средства, которые функционируют для подавления или выключения яичников, например, такие агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH), как ацетат лейпролида (LUPRON и ELIGARD), ацетат гозерелина, ацетат бусерелина и триптерилин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалютамид; и такие ингибиторы ароматазы, как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, мегестролацетат (MEGASE), экземестан (AROMASIN), форместание, фадрозол, ворозол (RIVISOR), летрозол (FEMARA) и анастрозол (ARIMIDEX). Кроме того, такие бисфосфонаты, как клодронат (например, BONEFOS или OSTAC), этидронат (DIDROCAL), NE-58095, золедроновая кислота/золедронат (ZOMETA), алендронат (FOSAMAX), памидронат (AREDIA), тилудронат (SKELID) или ризедронат (ACTONEL); а также трокацитабин (аналог 1,3-диоксоланнуклеозидного цитозина); миРНК, рибозим и антисмысловые олигонуклеотиды, особенно те, которые ингибируют экспрессию генов в сигнальных путях, участвующих в аберрантной пролиферации клеток; такие вакцины, как вакцина THERATOPE и генотерапевтические вакцины, например, вакцина ALLOVECTIN, вакцина LEUVECTIN и вакцина VAXID; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN); rmRH (например, ABARELIX); лапатиниб дитозилат (низкомолекулярный ингибитор двойной тирозинкиназы ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016); такие ингибиторы COX-2, как целекоксиб (CELEBREX, 4-(5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)-1H-пиразол-1-ил)бензолсульфонамид и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанного.
Согласно одному варианту осуществления активное средство представляет собой нуклеотид, такой как олигонуклеотид, например, миРНК или микроРНК.
Могут быть одна или несколько единиц лекарственного средства на молекулу антитела. Соотношение между количеством молекул лекарственного средства на антитело обозначается как отношение лекарственного средства к антителу (DAR). Согласно одному варианту осуществления DAR составляет от 1 до 10, т.е. от 1 до 10 единиц лекарственного средства на молекулу антитела. Согласно одному варианту осуществления DAR составляет от 2 до 8, например, от 3 до 6, например, 4 или 5.
Линкер
Стабильная связь между антителом и активным средством представляет собой важный аспект технологии ADC. Линкеры могут, например, быть основаны на химических мотивах, включая в себя дисульфиды, гидразоны или пептиды (расщепляемые) или тиоэфиры (нерасщепляемые), и контролировать распределение и доставку цитотоксического средства в клетку-мишень. Было доказано, что расщепляемые и нерасщепляемые типы линкеров являются безопасными в доклинических и клинических испытаниях. Например, брентуксимаб ведотин содержит чувствительный к ферменту расщепляемый линкер, который доставляет мощное и высокотоксичное антимикротрубочковое средство монометил ауристатин E (MMAE), синтетическое противоопухолевое средство, в клетки.
Трастузумаб эмтанзин, еще один одобренный ADC, представляет собой комбинацию ингибитора образования микротрубочек мертансина (DM-1), производного майтансина, и антитела трастузумаба (Герцептин™, Genentech/Roche), прикрепленного стабильным нерасщепляемым линкером.
Тип линкера, расщепляемый или нерасщепляемый, придает определенные свойства доставленному лекарственному средству. Например, расщепляемые линкеры могут, например, расщепляться ферментами в клетке-мишени, что приводит к эффективному внутриклеточному высвобождению активного средства, например, цитотоксического средства. Напротив, ADC, содержащий нерасщепляемый линкер, не имеет механизма высвобождения лекарственного средства и должен полагаться на такие механизмы, как деградация целевого антитела, для высвобождения лекарственного средства. Кроме того, как понятно специалистам в настоящей области техники, композиция линкера может влиять на критические факторы, такие как растворимость и фармакокинетические свойства ADC в целом.
Для обоих типов линкеров высвобождение лекарственного средства имеет решающее значение для получения клеточного эффекта. Лекарственные средства, которые могут свободно диффундировать через клеточные мембраны, могут выходить из нацеленной клетки и в процессе, называемом «неспецифический цитолиз», также атаковать соседние клетки, такие как злокачественные клетки, вблизи экспрессирующей uPARAP целевой клетки.
Согласно предпочтительному варианту осуществления ADC, нацеленный на uPARAP, как раскрыто в настоящем документе, содержит линкер, который связывает антитело к uPARAP и активное средство. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Согласно одному варианту осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер, обеспечивающий внутриклеточное высвобождение активного средства внутри экспрессирующих uPARAP клеток.
Расщепляемые группы включают в себя дисульфидную связь, амидную связь, замещенную амидную связь в виде пептидной связи, тиоамидную связь, сложноэфирную связь, тиоэфирную связь, вицинальную диольную связь или полуацеталь. Эти или другие расщепляемые связи могут включать в себя ферментативно расщепляемые связи, такие как пептидные связи (расщепляемые пептидазами), фосфатные связи (расщепляемые фосфатазами), связи нуклеиновых кислот (расщепляемые эндонуклеазами) и сахарные связи (расщепленные гликозидазами).
Линкер может представлять собой, например, полипептидный линкер, пептидный линкер или линкер нуклеиновой кислоты.
Согласно конкретным вариантам осуществления линкер представляет собой пептидный линкер. Выбор пептидной последовательности имеет решающее значение для успеха конъюгата. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер устойчив к сывороточным протеазам, но расщепляется лизосомными ферментами в целевой клетке. В неограничивающем примере линкер представляет собой пептид, выбранный из протамина, фрагмента протамина, (Arg)9, биотина-авидина, биотина-стрептавидина и пептида антеннапедии. Другие ненуклеотидные линкеры включают в себя алкильные или арильные цепи, содержащие от приблизительно 5 до приблизительно 100 атомов. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер представляет собой нуклеотидный линкер.
Согласно одному варианту осуществления линкер представляет собой расщепляемый ферментом пептидсодержащий линкер, такой как расщепляемый катепсином пептидсодержащий линкер. Катепсин может быть одним из нескольких типов катепсинов, представляя собой одну из групп лизосомальных протеаз.
Согласно одному варианту осуществления линкер содержит или состоит из дипептида, такого как валин-цитруллин (VC) или валин-аланин (ВА), который может быть дополнительно связан через амидную связь с другими структурными элементами. Линкеры на основе валина-цитруллина, в которых цитруллин-карбоксильная функция модифицирована до замещенного амида, могут быть расщеплены лизосомальными катепсинами, тогда как линкеры на основе валина-аланина, в которых аланин-карбоксильная функция модифицирована до замещенного амида, могут быть расщеплены другими лизосомальными протеазами, включая в себя другие катепсины.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему раскрытию дополнительно содержит спейсер. Спейсер может, например, соединять линкер и активное средство. Согласно одному варианту осуществления спейсер представляет собой парааминобензойную кислоту (ПАВ).
Согласно одному варианту осуществления спейсер содержит или включает в себя спейсер из полиэтиленгликоля, такой как спейсер PEG4.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему раскрытию дополнительно содержит объект прикрепления. Объект прикрепления может, например, связывать антитело и расщепляемый линкер, где объект прикрепления представляет собой продукт реакции между боковой цепью аминокислоты антитела и реакционноспособной группой прикрепления в предшественнике линкера. Согласно одному варианту осуществления эта группа реактивного прикрепления содержит или состоит из малеимида и капроновой кислоты (МС), где малеимид предпочтительно взаимодействует с тиолами цистеина во время связывания. Согласно другим вариантам осуществления группа прикрепления содержит или состоит из N-гидроксисукцинимида, азидов или алкинов.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению содержит раскрытое в настоящем документе антитело к uPARAP и комплекс линкер-лекарственное средство ведотин. Ведотин представляет собой комплекс линкер-лекарственное средство, содержащий цитотоксическое средство MMAE, спейсер (парааминобензойную кислоту), расщепляемый катепсином линкер (дипептид валин-цитруллин) и группу прикрепления, состоящую из капроновой кислоты и малеимида. Ведотин представляет собой MC-VC-PAB-MMAE. Брентуксимаб ведотин (торговое название Адцетрис™) представляет собой пример одобренного FDA содержащего ведотин ADC.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению содержит раскрытое в настоящем документе антитело к uPARAP и блок линкер-спейсер-токсин, представляющий собой VC-PAB-MMAF.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению содержит раскрытое в настоящем документе антитело к uPARAP и блок линкер-спейсер-токсин, представляющий собой PEG4-VA-PBD.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению содержит раскрытое в настоящем документе антитело к uPARAP и блок линкер-спейсер-токсин, представляющий собой PEG4-VC-дуокармицинSA.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению содержит описанный в US 2006/074008 комплекс линкер-лекарственное средство, который полностью включен посредством ссылки.
Конструкция линкер-лекарственное средство может, например, быть прикреплена к антителу к uPARAP с помощью малеимидной химии к тиолам восстановленных межцепочечных или внутрицепочечных дисульфидных мостиков.
Терапевтическое применение
Описанные в настоящем документе ADC, направленные против uPARAP, применимы для доставки активных средств, таких как терапевтические или цитотоксические средства, к экспрессирующим uPARAP клеткам и, таким образом, для лечения ряда заболеваний и нарушений, характеризующихся экспрессией uPARAP, в частности сверхэкспрессией uPARAP.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем раскрытии предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество описанного в настоящем документе ADC к uPARAP вместе с фармацевтически приемлемым буфером, разбавителем, носителем, адъювантом или вспомогательным веществом.
Фармацевтические композиции могут быть получены способом, известным в настоящей области техники, который достаточно устойчив к хранению и подходит для введения людям и/или животным. Например, фармацевтические композиции могут быть лиофилизированы, например, путем сушки вымораживанием, распылительной сушки, распылительного охлаждения или путем применения образования частиц из образования сверхкритических частиц.
Под «фармацевтически приемлемым» подразумевается нетоксичный материал, который не снижает эффективность ADC к uPARAP. Такие фармацевтически приемлемые буферы, носители или вспомогательные вещества хорошо известны в настоящей области техники (смотрите Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) и справочник Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), раскрытие которых включено в настоящий документ посредством ссылки).
Термин «буфер» подразумевает водный раствор, содержащий кислотно-основную смесь с целью стабилизации рН. Фармацевтически приемлемые буферы хорошо известны в настоящей области техники.
Термин «разбавитель» подразумевает водный или неводный раствор с целью разбавления средства в фармацевтическом препарате.
Термин «вспомогательное лекарственное средство» подразумевает любое добавленное к составу соединение для усиления биологического действия средства по настоящему изобретению. Вспомогательное лекарственное средство может представлять собой одно или несколько из солей цинка, меди или серебра с различными анионами, например, но без ограничения, фторид, хлорид, бромид, йодид, тиоцианат, сульфит, гидроксид, фосфат, карбонат, лактат, гликолят, цитрат, борат, тартрат и ацетаты различной ацильной композиции. Вспомогательное лекарственное средство может также представлять собой катионные полимеры, такие как простые эфиры катионной целлюлозы, эфиры катионной целлюлозы, деацетилированную гиалуроновую кислоту, хитозан, катионные дендримеры, такие катионные синтетические полимеры, как поливинилимидазол, и такие катионные полипептиды, как полигистидин, полилизин, полиаргинин и содержащие эти аминокислоты пептиды.
Вспомогательное вещество может представлять собой один или несколько углеводов, полимеров, липидов и минералов. Примеры углеводов включают в себя лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит и циклодекстрины, которые добавляют к композиции, например, для облегчения лиофилизации. Примерами полимеров являются крахмал, простые эфиры целлюлозы, карбоксиметилцеллюлоза целлюлозы, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, карагенаны, гиалуроновая кислота и их производные, полиакриловая кислота, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза и поливинилпирролидон с различной молекулярной массой, которые добавляются к композиции, например, для контроля вязкости, для достижения биоадгезии или для защиты липида от химической и протеолитической деградации. Примерами липидов являются жирные кислоты, фосфолипиды, моно-, ди- и триглицериды, церамиды, сфинголипиды и гликолипиды, все различной длины и насыщенности ацильной цепи, яичный лецитин, соевый лецитин, гидрированный яичный и соевый лецитин, которые добавляются к композиции по тем же причинам, что и для полимеров. Примерами минералов являются тальк, оксид магния, оксид цинка и оксид титана, которые добавляются в композицию для получения преимуществ, таких как уменьшение накопления жидкости или выгодных свойства пигмента.
ADC по настоящему изобретению могут быть составлены в любой фармацевтической композиции любого типа, известной в настоящей области техники, подходящей для ее доставки.
ADC по настоящему изобретению или содержащие ADC фармацевтические композиции можно вводить посредством любого подходящего пути, известного специалистам в настоящей области техники. Таким образом, возможные пути введения включают в себя парентеральный (внутривенный, подкожный и внутримышечный), местный, глазной, назальные, легочный, буккальный, пероральный, вагинальный и ректальный. Также возможно введение имплантатов.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления фармацевтические композиции вводят парентерально, например, внутривенно, интрацеребровентрикулярно, внутрисуставно, внутриартериально, внутрибрюшинно, интратекально, интравентрикулярно, внутривенно, интракраниально, внутримышечно или подкожно или их можно вводить с помощью инфузионных способов. Их удобно использовать в виде стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество солей или глюкозы, чтобы сделать раствор изотоническим с кровью. При необходимости водные растворы должны быть соответствующим образом забуферены. Получение подходящих парентеральных составов в стерильных условиях легко осуществляется стандартными фармацевтическими способами, хорошо известными специалистам в настоящей области техники.
Составы, подходящие для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать в себя суспендирующие средства и загустители. Составы могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, в герметичных ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед применением. Приготовленные для немедленного применения инъекционные растворы и суспензии могут быть получены из описанных ранее стерильных порошков, гранул и таблеток.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению вводят внутривенно.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению вводят подкожно.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению вводят интракраниально или интрацеребрально.
Фармацевтические композиции вводят пациенту в фармацевтически эффективном количестве. Используемые в настоящем документе термины «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество», или «терапевтически эффективный» относятся к тому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения. Это предопределенное количество активного вещества, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемой добавкой и разбавителем, т.е. носителем или несущей средой введения. Кроме того это подразумевает количество, достаточное для уменьшения и наиболее предпочтительно предотвращения клинически значимого дефицита в активности, функции и реакции хозяина. Альтернативно, терапевтически эффективное количество является достаточным, чтобы вызвать улучшение клинически значимого состояния у хозяина. Как понятно специалистам в настоящей области техники, количество соединения может варьировать в зависимости от его специфической активности. Подходящие дозировочные количества могут содержать заранее определенное количество активной композиции, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым разбавителем. Терапевтически эффективное количество может быть определено квалифицированным медицинским или ветеринарным работником на основании характеристик пациента, таких как возраст, масса, пол, состояние, осложнения, другие заболевания и т.д. Как хорошо известно в настоящей области техники, введение фармацевтически эффективной дозы может быть осуществлено как путем однократного введения в виде индивидуальной однократной дозы, так и нескольких меньших однократных доз, а также путем множественного введения разделенных доз через определенные интервалы времени. Альтернативно, дозу можно вводить в виде непрерывной инфузии в течение длительного периода.
Специалистам в настоящей области техники будет понятно, что описанные в настоящем документе нацеленные на uPARAP ADC можно вводить отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами. Например, описанные в настоящем документе нацеленные на uPARAP ADC можно вводить в комбинации с рядом противоопухолевых средств, таких как антиметаболиты, алкилирующие средства, антрациклины и другие цитотоксические антибиотики, алкалоиды барвинка, антимикротрубочковые/антимитотические средства, ингибиторы гистондезацетилазы, ингибиторы киназы, пептидные антибиотики, противоопухолевые средства на основе платины, этопозид, таксаны, ингибиторы топоизомеразы, антипролиферативные иммунодепрессанты, кортикостероиды, половые гормоны и антагонисты гормонов, цитотоксические антибиотики и другие терапевтические средства.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению вводят в сочетании с дополнительными реагентами и/или терапевтическими средствами, которые могут увеличить функциональную эффективность ADC, такими как установленные или новые лекарственные средства, которые увеличивают проницаемость лизосомной мембраны, тем самым облегчая проникновение молекул из внутренней области лизосомы в цитоплазму, или лекарственные средства, которые увеличивают проницаемость гематоэнцефалического барьера.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем раскрытии предусмотрен содержащий описанный в настоящем документе нацеленный на uPARAP ADC набор или его фармацевтическая композиция. Набор может необязательно дополнительно содержать средство для введения ADC субъекту и инструкции по применению.
Согласно одному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу доставки активного средства в экспрессирующую uPARAP клетку у субъекта, предусматривающему введение субъекту направленного на uPARAP ADC или композиции, содержащей описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC таким образом, что активное средство доставляется в указанную клетку.
Согласно одному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к направленному на uPARAP ADC или композиции, содержащей указанный описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC, для применения при доставке активного средства в экспрессирующую uPARAP клетку у субъекта, предусматривающей введение субъекту направленного на uPARAP ADC или композиции, содержащей описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC, так что активное средство доставляется в указанную клетку.
Согласно одному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу лечения заболевания или нарушения, характеризующегося наличием у субъекта экспрессирующих uPARAP клеток, предусматривающему введение субъекту направленного на uPARAP ADC или описанной в настоящем документе композиции, содержащей направленный на uPARAP ADC, указанному субъекту.
Согласно одному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к направленному на uPARAP ADC или композиции, содержащей указанный описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC для применения при лечении заболевания или нарушения, характеризующегося наличием экспрессирующих uPARAP клеток.
Согласно одному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу ингибирования роста клетки, экспрессирующей uPARAP in vivo или in vitro, предусматривающему введение направленного на uPARAP ADC или композиции, содержащей описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC. Это ингибирование роста может предусматривать гибель клеток или может предусматривать ингибирование роста без гибели клеток.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления экспрессирующая uPARAP клетка представляет собой опухолевую клетку и/или связанную с опухолью клетку, и настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у субъекта, предусматривающему введение субъекту направленного на uPARAP ADC или композиции, содержащей описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC, указанному субъекту.
К связанным с опухолью клеткам относятся, без ограничения, активированные фибробласты, миофибробласты, новообразованные сосуды и инфильтрирующие клетки линии макрофагов-моноцитов или другие типы лейкоцитарных клеток, а также клетки стромальной ткани, окружающей опухоль.
Согласно одному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу ингибирования прогрессирования опухоли у субъекта, предусматривающему введение субъекту направленного на uPARAP ADC или композиции, содержащей описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC, указанному субъекту. Это ингибирование прогрессирования опухоли может предусматривать полное или неполное уничтожение опухолей или может предусматривать остановку роста без гибели клеток.
Согласно одному варианту осуществления настоящее раскрытие относится к способу ингибирования, снижения или исключения метастатической способности опухоли у субъекта, предусматривающему введение субъекту направленного на uPARAP ADC или композиции, содержащей описанный в настоящем документе направленный на uPARAP ADC, указанному субъекту.
Согласно одному варианту осуществления опухолевые клетки экспрессируют или сверхэкспрессируют uPARAP.
Согласно одному варианту осуществления связанные с опухолью клетки экспрессируют или сверхэкспрессируют uPARAP.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем раскрытии предусмотрен способ индуцирования гибели клеток и/или ингибирования роста и/или пролиферации клеток, экспрессирующих uPARAP, предусматривающий стадию введения индивидууму эффективного количества описанного в настоящем документе нацеленного на uPARAP ADC или фармацевтической композиции, содержащей описанный в настоящем документе нацеленный на uPARAP ADC.
Лечение предпочтительно индуцирует гибель клеток и/или ингибирует рост и/или пролиферацию экспрессирующих uPARAP клеток, таких как опухолевые клетки или связанные с опухолью клетки.
Согласно одному варианту осуществления лечение является благоприятным.
Согласно одному варианту осуществления лечение приводит к исцелению.
Согласно одному варианту осуществления в настоящем раскрытии предусмотрен описанный в настоящем документе нацеленный на uPARAP ADC для получения лекарственного средства для индуцирования гибели клеток и/или ингибирования роста и/или пролиферации клеток, экспрессирующих uPARAP, таких как опухолевые клетки или связанные с опухолью клетки.
Экспрессия и роль uPARAP в злокачественной опухоли были исследованы несколькими исследовательскими группами; смотрите обзор Melander et al (Melander et al., 2015, Int J Oncol 47: 1177-1188) и статью Engelholm et al (Engelholm et al., 2016, J. Pathol. 238, 120-133).
Согласно одному варианту осуществления злокачественная опухоль представляет собой солидную опухоль, в которой опухолевые клетки и/или связанные с опухолью клетки экспрессируют uPARAP.
Согласно одному варианту осуществления злокачественная опухоль представляет собой солидную опухоль, в которой опухолевые клетки экспрессируют uPARAP.
Примеры злокачественных опухолей, характеризующихся повышенной экспрессией uPARAP, включают в себя, без ограничения, саркому, включая в себя остеосаркому (Engelholm et al., 2016, J Pathol 238 (1): 120-33), а также другие саркомы, глиобластому (Huijbers et al. ., 2010, PLoS One 5 (3): e9808), злокачественную опухоль предстательной железы и метастазы в кости от злокачественной опухоли предстательной железы (Kogianni et al., 2009, Eur J Cancer 45 (4): 685-93), злокачественную опухоль молочной железы и, в частности, «базально-подобный» рак молочной железы (Wienke et al., 2007, Cancer Res 1, 67 (21): 10230-40), и злокачественную опухоль головы и шеи (Sulek et al., 2007, J Histochem Cytochem 55 (4): 347- 53).
Согласно одному варианту осуществления злокачественная опухоль представляет собой саркому, такую как остеосаркома, липосаркома, миксофибросаркома, дерматофибросаркома (DFSP) и/или лейомиосаркома (LMS).
Согласно одному варианту осуществления злокачественная опухоль представляет собой глиобластому.
Согласно одному варианту осуществления злокачественная опухоль представляет собой солидную опухоль, в которой опухолевые клетки экспрессируют uPARAP. Когда uPARAP экспрессируется клетками, связанными с опухолью, считается, что терапевтический эффект опосредуется посредством так называемого «побочного» эффекта и/или путем восстановления и/или элиминации опосредованной стромальными клетками стимуляции роста и распространения опухоли.
Примеры злокачественных опухолей, характеризующихся сверхэкспрессией uPARAP в связанных с опухолью клетках, включают в себя, без ограничения, злокачественную опухоль молочной железы (Schnack et al., 2002, Int J Cancer 10; 98 (5): 656-64), злокачественную опухоль головы и шеи (Sulek et al., 2007, J Histochem Cytochem 55 (4): 347-53) и несколько других солидных злокачественных опухолей.
Согласно одному варианту осуществления злокачественная опухоль не представляет собой солидную опухоль. Например, ADC по настоящему раскрытию может, например, применяться для лечения экспрессирующего uPARAP лейкоза, например, из линии макрофагов-моноцитов.
Согласно другим вариантам осуществления заболевание или нарушение, характеризующееся наличием экспрессирующих uPARAP клеток, не представляет собой злокачественную опухоль.
uPARAP участвует в росте кости и гомеостазе (Madsen et al., 2013, PLoS One 5; 8 (8): e71261). Таким образом, согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению может применяться для лечения заболевания, характеризующегося деградацией кости, при этом деградацию кости опосредуют незлокачественные клетки, например, остеопороза.
Из-за своей роли в накоплении коллагена роль uPARAP также проявлялась при фиброзе (Madsen et al., 2012, J Pathol 227 (1): 94-105). Таким образом, согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению может применяться для лечения фиброза, например, почек, легких и печени.
Согласно одному варианту осуществления ADC по настоящему изобретению может применяться для лечения заболеваний и нарушений, связанных с макрофагами, включая в себя атеросклероз и хроническое воспаление.
Ссылки
Kabat, E. A., Wu, T. T., Bilofsky, H., Reid-Miller, M., Perry, H. (1983) Sequence of proteins of immunological interest. Bethesda: National Institute of Health.
Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K. and Foeller, C.  (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242.
Wu, T.T., Kabat, E. A. (2008) Pillars article: an analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med. 132, 211-250. J. Immunology 180, 7057-7096.
Dunbar, J., Deane, C. M. (2016) ANARCI: antigen receptor numbering and receptor classification. Bioinformatics, 32, 298-300.
Lefranc MP, Pommié C, Ruiz M, Giudicelli V, Foulquier E, Truong L, Thouvenin-Contet V, Lefranc G. (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, 55-77.
Kunik V, Ashkenazi S, Ofran Y. (2012a) Paratome: an online tool for systematic identification of antigen-binding regions in antibodies based on sequence or structure.
Nucleic Acids Res. 40(Web Server issue):W521-4. doi: 10.1093/nar/gks480. Epub 2012 Jun 6.
Kunik V, Peters B, Ofran Y. (2012b) Structural consensus among antibodies defines the antigen binding site. PLoS Comput Biol. 8(2):e1002388.
Пример 1. Эффективность in vitro и in vivo ADC, направленного против N-концевой области uPARAP
Материалы и способы
Получение и оценка ADC mAb-vc-MMAE
Моноклональные антитела (mAb) к uPARAP или против тринитрофенола (TNP) получали и производили с использованием гибридомного способа после иммунизации мышей в соответствии с известными в настоящей области техники способами. В случае моноклональных антител к uPARAP мыши-хозяева для иммунизации являлись гендефицитными по отношению к uPARAP, что приводило к появлению антител, реагирующих как с человеческим, так и с мышиным антигеном. ADC получали обычным используемым способом конъюгации, описанным ранее в настоящей области техники (Doronina et al. 2003 Nature biotechnology 21(7):778-84; Francisco et al., 2003. Blood 102(4):1458-65; Hamblett et al., 2004. Clinical cancer research 10(20):7063-70).
248nm
280nm
MAX
248nm
280nm
Антитела подвергали мягкому восстановлению путем 10-минутной инкубации при температуре 37°С в присутствии 10 мМ DTT в 50 мМ борате натрия, 50 мМ NaCl, рН 8,0 буфера при концентрации 5 мг/мл с последующим удалением DTT путем буферного обмена с использованием 30 кДа центрифужных фильтров NMWL до свежего PBS pH 7,4 с помощью 1 мМ ЭДТА, затем доводили до концентрации 2 мг/мл. Затем следовало немедленное конъюгирование с 5-10-кратным молярным избытком малеимидокапроил-валин-цитруллин-п-аминобензоилоксикарбонил-монометилауристатина E (MC-VC-PAB-MMAE, то есть ведотина), растворенного в воде без ДМСО до конечного содержания ДМСО 10% об./об. во время конъюгации в течение 2 часов при температуре 37°С. Полученные ADC mAb-vc-MMAE очищали гель-фильтрацией на обессоливающих колонках PD-10. Среднее соотношение между лекарственными средствами и антителами (DAR) полученных ADC определяли на основе коэффициента поглощения очищенных образцов конъюгата при λ = 248 нм и λ = 280 нм. Немодифицированные моноклональные антитела отображают отношение A/A 0,43, а A при λ = 248 нм MMAE приводит к более высокому отношению A/A для ADC mAb-vc-MMAE, что, как было показано, отражает DAR полученных ADC (Hamblett et al., 2004. Clinical cancer research 10(20):7063-70; Sanderson et al., 2005. Clinical Cancer Research 11:843-852).
Клеточные линии
2
Все клетки U937, THP-1 и HT1080 получали из АТСС. Клетки KNS42 были любезно предоставлены Lara Perryman, Центр исследований и инноваций Biotech (BRIC), Копенгагенский университет. Клетки CHO-K1 получали в Invitrogen. Все клетки поддерживали в соответствующей среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в инкубаторе при температуре 37°С с атмосферой 5% CO.
Анализ ДСН-ПААГ конъюгатов
Восстанавливающий ДСН-ПААГ проводили путем разгона 4-12% NuPAGE Bis-Tris ДСН-ПААГ геля, загружая 5 мкг общего белка на полосу, восстанавливали кипячением в течение 3 минут в буфере для образцов в присутствии 40 мМ DTT. Гели окрашивали с использованием стандартного 0,1% кумасси синего. Для анализа расщепления линкера катепсином В образцы обрабатывали человеческим  рекомбинантным (rh) катепсином В в соответствии с инструкциями изготовителя, используя 100 нг активированного rh катепсина В до 20 мкг ADC (компонент-моноклональное антитело), в 25 мМ MES, буфер рН 5,0 и инкубацию при температуре 37°С в течение ночи.
Анализ ELISA связывания uPARAP моноклональными антителами
2
4
96-луночный планшет ELISA покрывали 25 нг/лунку растворимым усеченным белком uPARAP, содержащим первые 3 N-концевых домена uPARAP человека, с интактным эпитопом для моноклонального антитела 2h9. В качестве первичного антитела затем использовали необработанные моноклональные антитела (2h9 или aTNP), те же моноклональные антитела, которые были подвергнуты процедуре восстановления конъюгации (смотрите выше), или ADC 2h9-vc-MMAE или aTNP-vc-MMAE, с последующим конъюгированным с HRP кроличьим вторичным антителом к мышиному Ig. Наконец добавляли раствор субстрата, содержащего о-фенилендиаминдигидрохлорид, и цветную реакцию останавливали добавлением 1 М HSO. Планшеты считывали при 492 нм с помощью планшетного ридера.
Цитотоксичность in vitro ADC - анализ жизнеспособности клеток
3
Исследуемые клетки высевали при низкой плотности (слияние 20-25%, как правило, 5-10×10 клеток на лунку) в 96-луночном планшете в 90 мкл среды и инкубировали в течение ночи. На следующий день конъюгаты mAb-vc-MMAE на основе моноклонального антитела 2h9, моноклонального антитела 5f4 или ненацеленного контрольного моноклонального антитела aTNP получали в виде серийного разведения (1:4) в PBS и добавляли в объемах 10 мкл к каждой лунке с конечной максимальной концентрацией ADC, составляющей 10 мкг/мл моноклонального антитела. Клетки инкубировали в течение 72 часов, затем добавляли 20 мкл CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS, Promega) и инкубировали в течение подходящего времени для образования цвета (как правило, 1 час). Затем планшеты считывали при 490 нм с вычитанием фона при 630 нм с использованием планшетного ридера.
Цитотоксичность in vitro ADC - анализ клеточного цикла
Анализ клеточного цикла проводили с использованием системы Nucleocounter NC-3000 (ChemoMetec Denmark) с использованием стандартного протокола производителей для анализа распределения клеточного цикла популяции клеток на основе содержания ДНК в каждой клетке. Процент клеток в фазах клеточного цикла суб-G1, G1, S или G2/M устанавливали из анализа гистограммы с использованием программного обеспечения NucleoView NC-3000.
Конкуренция рецепторов и ингибирование лизосомной протеазы
Для конкурентного анализа рецепторов, анализа истощения рецепторов и анализа ингибирования лизосомальных протеаз были выбраны клетки U937, как для анализа жизнеспособности клеток (смотрите выше). Для конкурентного анализа рецепторов постоянную концентрацию 2h9-vc-MMAE 1 мкг/мл моноклонального антитела поддерживали во всех лунках, а немодифицированное конкурентное моноклональное антитело одновременно добавляли в серии разбавления (1:2), начиная с концентрации 8 мкг/мл конкурентоспособного моноклонального антитела. Клетки затем подвергали 72-часовому анализу цитотоксичности-жизнеспособности клеток (смотрите выше). Для анализа ингибирования лизосомальных протеаз клетки U937 предварительно инкубировали с 20 мкМ ингибитора протеазы E64D в течение 2 часов перед началом 72-часового анализа цитотоксичности-жизнеспособности клеток (смотрите выше).
Эксперименты на животных
3
2
Все эксперименты на животных проводили по официальному утверждению Датского управления ветеринарии и пищевых продуктов. Все реагенты и клеточные линии, используемые для экспериментов на животных, исследовали в отношении отрицательности наличия мышиных вирусов, бактерий, микоплазмы и грибов. За животными производился стандартный уход, и их умерщвляли при любом из следующих признаков: потеря более 10% массы тела, видимое страдание или заболевание, нарушение приема пищи или воды или дефекации, признаки сильного воспаления вблизи опухолей, или рост опухоли, который превышал объем 1000 мм или нарушал свободное перемещение животных. Рост опухоли измеряли с использованием электронных калиперов, а объемы опухолей рассчитывали по формуле Объем = (L×W)/2, причем L представляет собой самый длинный размер опухоли, а W - ширина в перпендикулярном направлении.
Лечение модели подкожной положительной в отношении uPARAP ксенотрансплантатной опухоли U937 у мышей с помощью подкожной инъекции
6
3
Для введения опухоли у мышей сбривали бок и вводили подкожную инъекцию 1 × 10 клеток U937, а затем тщательно контролировали для наблюдения развитие солидных опухолей. При образовании осязаемых опухолей объемом 50-100 мм мышей начинали лечить в одной из четырех групп лечения: 2h9-vc-MMAE (N=10), aTNP-vc-MMAE (N=9), немодифицированное моноклональное антитело 2h9 (N=5) или контрольное несущее средство PBS (N=5). Все воздействия в общей сложности составляли 4 подкожные дозы 3 мг/кг компонента-моноклонального антитела в области опухоли с интервалом 4 дня. Инъекции проводили при кратковременной изофлурановой анестезии, чтобы избежать рисков для специалиста по работе с животными. Во время лечения опухоли оценивали каждые два дня до достижения момента умерщвления. Мышей, которые полностью потеряли любую опухолевую нагрузку, проверяли два раза в неделю в течение 3 месяцев после прекращения лечения.
Лечение модели подкожной положительной в отношении uPARAP ксенотрансплантатной опухоли U937 у мышей с помощью внутривенной инъекции
6
3
Для введения опухоли у мышей сбривали бок и вводили подкожную инъекцию 1 × 10 клеток U937, а затем тщательно контролировали для наблюдения развитие солидных опухолей. При образовании осязаемых опухолей объемом 50-100 мм мышей начинали лечить в одной из четырех групп лечения: 2h9-vc-MMAE (N=10), aTNP-vc-MMAE (N=10), немодифицированное моноклональное антитело 2h9 (N=5) или контрольное несущее средство PBS (N=5). Все воздействия в общей сложности составляли 3 внутривенные дозы 5 мг/кг компонента-моноклонального антитела в хвостовые вены мышей с интервалом 4 дня. Во время лечения опухоли оценивали каждые два дня, до достижения момента умерщвления. Мышей, которые полностью потеряли любую опухолевую нагрузку, проверяли два раза в неделю в течение 3 месяцев после прекращения лечения.
Статистика
Все образцы проводили в трех повторах. Шкалы ошибок: стандартное отклонение.
Результаты и выводы
Коллагеновый рецептор uPARAP активируется в опухолевых клетках конкретных видов злокачественных опухолей, включая в себя саркому и позднюю стадию глиобластомы. Кроме того, рецептор чаще всего активируется в стромальных клетках, окружающих солидные опухоли. У здоровых взрослых людей рецептор проявляет ограниченную экспрессию, что делает его потенциальной мишенью для лечения посредством ADC.
С этой целью авторы настоящего изобретения выбрали моноклональное антитело, 2h9, полученное после иммунизации мыши с дефицитом гена uPARAP, и получили направленный на uPARAP ADC (2h9-vc-MMAE) с использованием хорошо установленного способа конъюгации. Было показано, что нацеливающее антитело 2h9 хорошо переносит процедуру конъюгации при незначительной потере сродства. Было показано, что полученный в результате ADC является высокоспецифичным при уничтожении или индуцировании остановки роста в положительных по uPARAP клетках in vitro, причем клетки U937 являются наиболее чувствительной клеточной линией. uPARAP представляет собой конститутивно рециркулирующий рецептор, направляющий свой груз в лизосомный отсек. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективность ADC в высокочувствительных клетках, таких как клетки U937, полностью зависела от расщепления линкеров, поскольку зависимая от uPARAP цитотоксичность отменялась после ингибирования лизосомных катепсинов с E64D. Поэтому авторы настоящего изобретения предполагают, что лизосомная способность к расщеплению линкера способствует различиям в чувствительности ADC между различными типами клеток в сотрудничестве с полными различиями в чувствительности к конъюгированному цитотоксину.
Для исследований in vivo авторы настоящего изобретения использовали быстрорастущую модель подкожной ксенотрансплантатной опухоли с клетками U937 у мышей CB17 SCID. Используя эту модель, было установлено, что ADC 2h9-vc-MMAE является высокоэффективным при уничтожении солидных опухолей U937 in vivo. После лечения местным подкожным введением 5 мышей оставались без опухолей через 90 дней после окончания схемы лечения, следовательно, составляя 50%-ную частоту выздоровления. Что более важно, после лечения внутривенным введением авторы настоящего изобретения наблюдали мощный эффект, приводящий к 100%-ной частоте выздоровления. Примечательно, что эту ликвидацию опухолей получали без каких-либо очевидных неблагоприятных эффектов при регулярном обследовании подвергнутых воздействию мышей. Важно отметить, что антитело 2h9 является реактивным против человеческого и мышиного uPARAP, перекрестная реактивность обеспечивается использованием дефицитной в отношении uPARAP мыши для иммунизации при индуцировании антитела. Поэтому в этой ксенотрансплантатной модели помимо полезных противоопухолевых эффектов, были бы выявлены любые потенциальные вредные побочные эффекты на хозяина, но никаких признаков пагубных эффектов не было обнаружено.
Эпитоп для антитела 2h9 расположен в первых трех N-концевых доменах uPARAP, более конкретно в домене CysR или CTLD-1. Представленные в настоящем документе исследования in vitro показывают, что другой ADC, содержащий антитело к uPARAP, нацеленный на первые три N-концевых домена uPARAP, а именно 5f4, столь же эффективен, как и ADC, содержащие антитело 2h9. Эпитоп для антитела 5f4 находится в домене FN-II uPARAP. Таким образом, авторы настоящего изобретения предполагают, что ADC, содержащие антитела к uPARAP, направленные против эпитопов в первых трех N-концевых доменах uPARAP, являются особенно эффективными в качестве ADC.
В заключение, представленные в настоящем документе данные очень сильно поддерживают понятие коллагенового рецептора uPARAP как универсальной мишени в терапии злокачественных опухолей посредством ADC на основе картины экспрессии и молекулярной функции. Кроме того, эти данные показывают, что ADC, содержащие антитела, направленные против первых трех N-концевых доменов uPARAP, такие как ADC 2h9-vc-MMAE, являются высокоэффективными для нацеленного воздействия на экспрессирующие uPARAP клетки in vitro и in vivo.
Пример 2. Эффективность in vitro ADC на основе MMAE
В дополнение к ADC примера 1 создавали следующие MMAE-ADC: 9b7-vc-MMAE и 11c9-vc-MMAE.
Моноклональное антитело 2h9, моноклональное антитело 5f4 и моноклональное антитело 9b7 направлены против эпитопов в трех N-концевых доменах uPARAP, тогда как моноклональное антитело 11c9 представляет собой антитело к uPARAPм, направленное против эпитопа вне N-концевых трех доменов uPARAP.
Анализы жизнеспособности клеток in vitro с клетками U937 выполняли, как описано в примере 1, используя все эти ADC. Все ADC приводят к определенному снижению общей жизнеспособности клеток, но с клеточной чувствительностью к 2h9-vc-MMAE, 5f4-vc-MMAE и 9b7-vc-MMAE, которая значительно выше, чем чувствительность к 11c9-vc-MMAE (фиг. 14).
Таким образом, авторы настоящего изобретения заключают, что ADC, содержащие антитела к uPARAP, способные связываться с эпитопами в трех наиболее N-концевых доменах uPARAP, представляют собой очень эффективные ADC.
Пример 3. Эффективность in vitro ADC, содержащего различные линкеры, спейсеры и токсины
Различные токсины могут применяться в формате ADC, нацеленном на N-терминальную часть uPARAP. ADC с моноклональным антителом 2h9 в качестве компонента антитела получали, как описано выше, но с использованием следующих блоков линкер-цитотоксин вместо VC-PAB-MMAE:
- VC-PAB-MMAF (с MMAF, представляющим собой монометил ауристатин F, карбоксильный вариант MMAE)
- PEG4-va-PBD (с PEG4, относящимся к полиэтиленгликолевому спейсеру, va, представляющим собой валин-аланин, и PBD, относящимся к димерному пирролобензодиазепину)
- PEG4-vc-дуокармицин SA (с PEG4, относящимся к полиэтиленгликолевому спейсеру, и vc, представляющим собой валин-цитруллин)
Полученные ADC (обозначенные как 2h9-vc-MMAF, 2h9-va-PBD и 2h9-vc-DuocSA, соответственно) использовали для анализа жизнеспособности клеток in vitro с описанными выше клетками U937. Клетки U937 отображали очень сильную чувствительность к 2h9-vc-MMAF, более умеренную чувствительность к 2h9-va-PBD и низкую, но измеримую чувствительность к 2h9-vc-DuocSA. Результаты показаны на фиг. 15 и 16.
Пример 4. Эффективность in vitro ADC на клетках эксплантатов глиобластомы человека
ADC 2h9-vc-MMAE и 2h9-vc-MMAF исследовали посредством анализов жизнеспособности клеток in vitro, выполненных, как описано в примере 1, на их способность специфично убивать клетки эксплантатов глиобластомы человека. Клетки эксплантатов глиобластомы представляют собой, например, описанные в Staberg et al., 2017, Cell Oncol. 40: 21-32. Эти клетки проявляли очень сильную и специфическую чувствительность как к ADC 2h9-vc-MMAE, так и к ADC 2h9-vc-MMAF, что демонстрирует высокую эффективность этих ADC в борьбе с клетками глиобластомы человека. Результаты показаны на фиг. 17.
Пример 5. Рекомбинантное антитело
Белок, кодируемый синтетической ДНК, содержащей [SEQ ID NO: 1] (легкая цепь моноклонального антитела 2h9 к uPARAP) и [SEQ ID NO: 5] (тяжелая цепь того же антитела), экспрессировали в клетках СНО. Полученный продукт рекомбинантного антитела очищали и с помощью вестерн-блоттинга показали специфическое распознавание uPARAP таким же образом, что и у моноклонального антитела 2h9, производимого культурой клеток гибридомы (фиг. 18).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Rigshospitalet
Копенгагенский университет
<120>  Нацеленные на uPARAP конъюгаты антитело-лекарственное средство
<130>  P4124DK01
<160>  59
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ala Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Glu Phe Phe Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Gly Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  2
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  2
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  3
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  3
Ala Ala Thr Thr Leu Thr Asp
1               5
<210>  4
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  4
Gln Glu Phe Phe Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210>  5
<211>  446
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Met Ile His Pro Ser Asn Asp Glu Lys Arg Ile Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Val Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Asp Tyr Val Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Phe Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115                 120                 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
130                 135                 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
195                 200                 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210                 215                 220
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245                 250                 255
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
275                 280                 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
290                 295                 300
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
305                 310                 315                 320
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
340                 345                 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
355                 360                 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
405                 410                 415
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
420                 425                 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  6
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  6
Ser Tyr Trp Met Asn
1               5
<210>  7
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  7
Met Ile His Pro Ser Asn Asp Glu Lys Arg Ile Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210>  8
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  8
Gly Gly Gly Asp Tyr Val Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Phe
1               5                   10
<210>  9
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ala Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Glu Phe Phe Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  10
<211>  224
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Met Ile His Pro Ser Asn Asp Glu Lys Arg Ile Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Val Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Asp Tyr Val Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Phe Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115                 120                 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
130                 135                 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
195                 200                 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210                 215                 220
<210>  11
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Ala Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  12
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  12
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Val
1               5                   10
<210>  13
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  13
Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser
1               5
<210>  14
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  14
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu Ala
1               5
<210>  15
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  15
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Ala
20                  25                  30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg His Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35                  40                  45
Leu Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  16
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  16
Asn Ala Tyr Tyr Trp Asn
1               5
<210>  17
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  17
Tyr Ile His Ser Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>  18
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  18
Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Phe Pro Tyr
1               5                   10
<210>  19
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(7)
<223>  с учетом потенциальной неоднозначности из-за положения области
праймера в определении последовательности
<400>  19
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Tyr
20                  25                  30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Asn Ser Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  20
<211>  207
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  20
Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
1               5                   10                  15
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Tyr Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys
20                  25                  30
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Phe
35                  40                  45
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe
50                  55                  60
Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe
65                  70                  75                  80
Cys Gln Gln Tyr His Asn Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
85                  90                  95
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
100                 105                 110
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
115                 120                 125
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
130                 135                 140
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
145                 150                 155                 160
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
165                 170                 175
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
180                 185                 190
Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
195                 200                 205
<210>  21
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  21
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Tyr Val Val
1               5                   10
<210>  22
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  22
Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser
1               5
<210>  23
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  23
Gln Gln Tyr His Asn Ser Pro Leu Thr
1               5
<210>  24
<211>  221
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(8)
<223>  с учетом потенциальной неоднозначности из-за положения области
праймера в определении последовательности
<400>  24
Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Gly Val Ser Thr Tyr Ala Ala Glu Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Gln Tyr Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195                 200                 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210                 215                 220
<210>  25
<211>  213
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  25
Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala
1               5                   10                  15
Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Asp Tyr Gly Met His Trp Val Lys Gln Ala
20                  25                  30
Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Gly
35                  40                  45
Val Ser Thr Tyr Ala Ala Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu
50                  55                  60
Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn
65                  70                  75                  80
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Gln
85                  90                  95
Tyr Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
100                 105                 110
Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala
115                 120                 125
Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
130                 135                 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
145                 150                 155                 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
165                 170                 175
Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr
180                 185                 190
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
195                 200                 205
Val Pro Arg Asp Cys
210
<210>  26
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  26
Asp Tyr Gly Met His
1               5
<210>  27
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  27
Ser Ile Asn Thr Lys Ser Gly Val Ser Thr Tyr Ala Ala Glu Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  28
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  28
Pro Pro Tyr Tyr Ser Gln Tyr Gly Ser Tyr
1               5                   10
<210>  29
<211>  1479
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Met Gly Pro Gly Arg Pro Ala Pro Ala Pro Trp Pro Arg His Leu Leu
1               5                   10                  15
Arg Cys Val Leu Leu Leu Gly Cys Leu His Leu Gly Arg Pro Gly Ala
20                  25                  30
Pro Gly Asp Ala Ala Leu Pro Glu Pro Asn Val Phe Leu Ile Phe Ser
35                  40                  45
His Gly Leu Gln Gly Cys Leu Glu Ala Gln Gly Gly Gln Val Arg Val
50                  55                  60
Thr Pro Ala Cys Asn Thr Ser Leu Pro Ala Gln Arg Trp Lys Trp Val
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asn Arg Leu Phe Asn Leu Gly Thr Met Gln Cys Leu Gly Thr
85                  90                  95
Gly Trp Pro Gly Thr Asn Thr Thr Ala Ser Leu Gly Met Tyr Glu Cys
100                 105                 110
Asp Arg Glu Ala Leu Asn Leu Arg Trp His Cys Arg Thr Leu Gly Asp
115                 120                 125
Gln Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala Arg Thr Ser Asn Ile Ser Lys Pro
130                 135                 140
Gly Thr Leu Glu Arg Gly Asp Gln Thr Arg Ser Gly Gln Trp Arg Ile
145                 150                 155                 160
Tyr Gly Ser Glu Glu Asp Leu Cys Ala Leu Pro Tyr His Glu Val Tyr
165                 170                 175
Thr Ile Gln Gly Asn Ser His Gly Lys Pro Cys Thr Ile Pro Phe Lys
180                 185                 190
Tyr Asp Asn Gln Trp Phe His Gly Cys Thr Ser Thr Gly Arg Glu Asp
195                 200                 205
Gly His Leu Trp Cys Ala Thr Thr Gln Asp Tyr Gly Lys Asp Glu Arg
210                 215                 220
Trp Gly Phe Cys Pro Ile Lys Ser Asn Asp Cys Glu Thr Phe Trp Asp
225                 230                 235                 240
Lys Asp Gln Leu Thr Asp Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Phe Gln Ser Thr
245                 250                 255
Leu Ser Trp Arg Glu Ala Trp Ala Ser Cys Glu Gln Gln Gly Ala Asp
260                 265                 270
Leu Leu Ser Ile Thr Glu Ile His Glu Gln Thr Tyr Ile Asn Gly Leu
275                 280                 285
Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Thr Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp Leu Asp
290                 295                 300
Thr Ser Gly Gly Trp Gln Trp Ser Asp Asn Ser Pro Leu Lys Tyr Leu
305                 310                 315                 320
Asn Trp Glu Ser Asp Gln Pro Asp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly
325                 330                 335
Val Ile Arg Thr Glu Ser Ser Gly Gly Trp Gln Asn Arg Asp Cys Ser
340                 345                 350
Ile Ala Leu Pro Tyr Val Cys Lys Lys Lys Pro Asn Ala Thr Ala Glu
355                 360                 365
Pro Thr Pro Pro Asp Arg Trp Ala Asn Val Lys Val Glu Cys Glu Pro
370                 375                 380
Ser Trp Gln Pro Phe Gln Gly His Cys Tyr Arg Leu Gln Ala Glu Lys
385                 390                 395                 400
Arg Ser Trp Gln Glu Ser Lys Lys Ala Cys Leu Arg Gly Gly Gly Asp
405                 410                 415
Leu Val Ser Ile His Ser Met Ala Glu Leu Glu Phe Ile Thr Lys Gln
420                 425                 430
Ile Lys Gln Glu Val Glu Glu Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp Leu Lys
435                 440                 445
Leu Gln Met Asn Phe Glu Trp Ser Asp Gly Ser Leu Val Ser Phe Thr
450                 455                 460
His Trp His Pro Phe Glu Pro Asn Asn Phe Arg Asp Ser Leu Glu Asp
465                 470                 475                 480
Cys Val Thr Ile Trp Gly Pro Glu Gly Arg Trp Asn Asp Ser Pro Cys
485                 490                 495
Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ile Cys Lys Lys Ala Gly Gln Leu Ser Gln
500                 505                 510
Gly Ala Ala Glu Glu Asp His Gly Cys Arg Lys Gly Trp Thr Trp His
515                 520                 525
Ser Pro Ser Cys Tyr Trp Leu Gly Glu Asp Gln Val Thr Tyr Ser Glu
530                 535                 540
Ala Arg Arg Leu Cys Thr Asp His Gly Ser Gln Leu Val Thr Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asn Arg Phe Glu Gln Ala Phe Val Ser Ser Leu Ile Tyr Asn Trp Glu
565                 570                 575
Gly Glu Tyr Phe Trp Thr Ala Leu Gln Asp Leu Asn Ser Thr Gly Ser
580                 585                 590
Phe Phe Trp Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Tyr Thr His Trp Asn Arg
595                 600                 605
Asp Gln Pro Gly Tyr Ser Arg Gly Gly Cys Val Ala Leu Ala Thr Gly
610                 615                 620
Ser Ala Met Gly Leu Trp Glu Val Lys Asn Cys Thr Ser Phe Arg Ala
625                 630                 635                 640
Arg Tyr Ile Cys Arg Gln Ser Leu Gly Thr Pro Val Thr Pro Glu Leu
645                 650                 655
Pro Gly Pro Asp Pro Thr Pro Ser Leu Thr Gly Ser Cys Pro Gln Gly
660                 665                 670
Trp Ala Ser Asp Thr Lys Leu Arg Tyr Cys Tyr Lys Val Phe Ser Ser
675                 680                 685
Glu Arg Leu Gln Asp Lys Lys Ser Trp Val Gln Ala Gln Gly Ala Cys
690                 695                 700
Gln Glu Leu Gly Ala Gln Leu Leu Ser Leu Ala Ser Tyr Glu Glu Glu
705                 710                 715                 720
His Phe Val Ala Asn Met Leu Asn Lys Ile Phe Gly Glu Ser Glu Pro
725                 730                 735
Glu Ile His Glu Gln His Trp Phe Trp Ile Gly Leu Asn Arg Arg Asp
740                 745                 750
Pro Arg Gly Gly Gln Ser Trp Arg Trp Ser Asp Gly Val Gly Phe Ser
755                 760                 765
Tyr His Asn Phe Asp Arg Ser Arg His Asp Asp Asp Asp Ile Arg Gly
770                 775                 780
Cys Ala Val Leu Asp Leu Ala Ser Leu Gln Trp Val Ala Met Gln Cys
785                 790                 795                 800
Asp Thr Gln Leu Asp Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg Gly Thr Asp Val
805                 810                 815
Arg Glu Pro Asp Asp Ser Pro Gln Gly Arg Arg Glu Trp Leu Arg Phe
820                 825                 830
Gln Glu Ala Glu Tyr Lys Phe Phe Glu His His Ser Thr Trp Ala Gln
835                 840                 845
Ala Gln Arg Ile Cys Thr Trp Phe Gln Ala Glu Leu Thr Ser Val His
850                 855                 860
Ser Gln Ala Glu Leu Asp Phe Leu Ser His Asn Leu Gln Lys Phe Ser
865                 870                 875                 880
Arg Ala Gln Glu Gln His Trp Trp Ile Gly Leu His Thr Ser Glu Ser
885                 890                 895
Asp Gly Arg Phe Arg Trp Thr Asp Gly Ser Ile Ile Asn Phe Ile Ser
900                 905                 910
Trp Ala Pro Gly Lys Pro Arg Pro Val Gly Lys Asp Lys Lys Cys Val
915                 920                 925
Tyr Met Thr Ala Ser Arg Glu Asp Trp Gly Asp Gln Arg Cys Leu Thr
930                 935                 940
Ala Leu Pro Tyr Ile Cys Lys Arg Ser Asn Val Thr Lys Glu Thr Gln
945                 950                 955                 960
Pro Pro Asp Leu Pro Thr Thr Ala Leu Gly Gly Cys Pro Ser Asp Trp
965                 970                 975
Ile Gln Phe Leu Asn Lys Cys Phe Gln Val Gln Gly Gln Glu Pro Gln
980                 985                 990
Ser Arg Val Lys Trp Ser Glu Ala  Gln Phe Ser Cys Glu  Gln Gln Glu
995                 1000                 1005
Ala Gln  Leu Val Thr Ile Thr  Asn Pro Leu Glu Gln  Ala Phe Ile
1010                 1015                 1020
Thr Ala  Ser Leu Pro Asn Val  Thr Phe Asp Leu Trp  Ile Gly Leu
1025                 1030                 1035
His Ala  Ser Gln Arg Asp Phe  Gln Trp Val Glu Gln  Glu Pro Leu
1040                 1045                 1050
Met Tyr  Ala Asn Trp Ala Pro  Gly Glu Pro Ser Gly  Pro Ser Pro
1055                 1060                 1065
Ala Pro  Ser Gly Asn Lys Pro  Thr Ser Cys Ala Val  Val Leu His
1070                 1075                 1080
Ser Pro  Ser Ala His Phe Thr  Gly Arg Trp Asp Asp  Arg Ser Cys
1085                 1090                 1095
Thr Glu  Glu Thr His Gly Phe  Ile Cys Gln Lys Gly  Thr Asp Pro
1100                 1105                 1110
Ser Leu  Ser Pro Ser Pro Ala  Ala Leu Pro Pro Ala  Pro Gly Thr
1115                 1120                 1125
Glu Leu  Ser Tyr Leu Asn Gly  Thr Phe Arg Leu Leu  Gln Lys Pro
1130                 1135                 1140
Leu Arg  Trp His Asp Ala Leu  Leu Leu Cys Glu Ser  His Asn Ala
1145                 1150                 1155
Ser Leu  Ala Tyr Val Pro Asp  Pro Tyr Thr Gln Ala  Phe Leu Thr
1160                 1165                 1170
Gln Ala  Ala Arg Gly Leu Arg  Thr Pro Leu Trp Ile  Gly Leu Ala
1175                 1180                 1185
Gly Glu  Glu Gly Ser Arg Arg  Tyr Ser Trp Val Ser  Glu Glu Pro
1190                 1195                 1200
Leu Asn  Tyr Val Gly Trp Gln  Asp Gly Glu Pro Gln  Gln Pro Gly
1205                 1210                 1215
Gly Cys  Thr Tyr Val Asp Val  Asp Gly Ala Trp Arg  Thr Thr Ser
1220                 1225                 1230
Cys Asp  Thr Lys Leu Gln Gly  Ala Val Cys Gly Val  Ser Ser Gly
1235                 1240                 1245
Pro Pro  Pro Pro Arg Arg Ile  Ser Tyr His Gly Ser  Cys Pro Gln
1250                 1255                 1260
Gly Leu  Ala Asp Ser Ala Trp  Ile Pro Phe Arg Glu  His Cys Tyr
1265                 1270                 1275
Ser Phe  His Met Glu Leu Leu  Leu Gly His Lys Glu  Ala Arg Gln
1280                 1285                 1290
Arg Cys  Gln Arg Ala Gly Gly  Ala Val Leu Ser Ile  Leu Asp Glu
1295                 1300                 1305
Met Glu  Asn Val Phe Val Trp  Glu His Leu Gln Ser  Tyr Glu Gly
1310                 1315                 1320
Gln Ser  Arg Gly Ala Trp Leu  Gly Met Asn Phe Asn  Pro Lys Gly
1325                 1330                 1335
Gly Thr  Leu Val Trp Gln Asp  Asn Thr Ala Val Asn  Tyr Ser Asn
1340                 1345                 1350
Trp Gly  Pro Pro Gly Leu Gly  Pro Ser Met Leu Ser  His Asn Ser
1355                 1360                 1365
Cys Tyr  Trp Ile Gln Ser Asn  Ser Gly Leu Trp Arg  Pro Gly Ala
1370                 1375                 1380
Cys Thr  Asn Ile Thr Met Gly  Val Val Cys Lys Leu  Pro Arg Ala
1385                 1390                 1395
Glu Gln  Ser Ser Phe Ser Pro  Ser Ala Leu Pro Glu  Asn Pro Ala
1400                 1405                 1410
Ala Leu  Val Val Val Leu Met  Ala Val Leu Leu Leu  Leu Ala Leu
1415                 1420                 1425
Leu Thr  Ala Ala Leu Ile Leu  Tyr Arg Arg Arg Gln  Ser Ile Glu
1430                 1435                 1440
Arg Gly  Ala Phe Glu Gly Ala  Arg Tyr Ser Arg Ser  Ser Ser Ser
1445                 1450                 1455
Pro Thr  Glu Ala Thr Glu Lys  Asn Ile Leu Val Ser  Asp Met Glu
1460                 1465                 1470
Met Asn  Glu Gln Gln Glu
1475
<210>  30
<211>  116
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Ile Phe Ser His Gly Leu Gln Gly Cys Leu Glu Ala Gln Gly Gly Gln
1               5                   10                  15
Val Arg Val Thr Pro Ala Cys Asn Thr Ser Leu Pro Ala Gln Arg Trp
20                  25                  30
Lys Trp Val Ser Arg Asn Arg Leu Phe Asn Leu Gly Thr Met Gln Cys
35                  40                  45
Leu Gly Thr Gly Trp Pro Gly Thr Asn Thr Thr Ala Ser Leu Gly Met
50                  55                  60
Tyr Glu Cys Asp Arg Glu Ala Leu Asn Leu Arg Trp His Cys Arg Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gly Asp Gln Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala Arg Thr Ser Asn Ile
85                  90                  95
Ser Lys Pro Gly Thr Leu Glu Arg Gly Asp Gln Thr Arg Ser Gly Gln
100                 105                 110
Trp Arg Ile Tyr
115
<210>  31
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Pro Asn Val Phe Leu Ile Phe Ser His Gly Leu Gln Gly Cys Leu Glu
1               5                   10                  15
Ala Gln Gly Gly Gln Val Arg Val Thr Pro Ala Cys Asn Thr Ser Leu
20                  25                  30
Pro Ala Gln Arg Trp Lys Trp Val Ser Arg Asn Arg Leu Phe Asn Leu
35                  40                  45
Gly Thr Met Gln Cys Leu Gly Thr Gly Trp Pro Gly Thr Asn Thr Thr
50                  55                  60
Ala Ser Leu Gly Met Tyr Glu Cys Asp Arg Glu Ala Leu Asn Leu Arg
65                  70                  75                  80
Trp His Cys Arg Thr Leu Gly Asp Gln Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala
85                  90                  95
Arg Thr Ser Asn Ile Ser Lys Pro Gly Thr Leu Glu Arg Gly Asp Gln
100                 105                 110
Thr Arg Ser Gly Gln Trp Arg Ile Tyr
115                 120
<210>  32
<211>  48
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Asn Ser His Gly Lys Pro Cys Thr Ile Pro Phe Lys Tyr Asp Asn Gln
1               5                   10                  15
Trp Phe His Gly Cys Thr Ser Thr Gly Arg Glu Asp Gly His Leu Trp
20                  25                  30
Cys Ala Thr Thr Gln Asp Tyr Gly Lys Asp Glu Arg Trp Gly Phe Cys
35                  40                  45
<210>  33
<211>  49
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Gly Asn Ser His Gly Lys Pro Cys Thr Ile Pro Phe Lys Tyr Asp Asn
1               5                   10                  15
Gln Trp Phe His Gly Cys Thr Ser Thr Gly Arg Glu Asp Gly His Leu
20                  25                  30
Trp Cys Ala Thr Thr Gln Asp Tyr Gly Lys Asp Glu Arg Trp Gly Phe
35                  40                  45
Cys
<210>  34
<211>  115
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Phe Gln Ser Thr Leu Ser Trp Arg Glu Ala
1               5                   10                  15
Trp Ala Ser Cys Glu Gln Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser Ile Thr Glu
20                  25                  30
Ile His Glu Gln Thr Tyr Ile Asn Gly Leu Leu Thr Gly Tyr Ser Ser
35                  40                  45
Thr Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp Leu Asp Thr Ser Gly Gly Trp Gln
50                  55                  60
Trp Ser Asp Asn Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Asn Trp Glu Ser Asp Gln
65                  70                  75                  80
Pro Asp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Ile Arg Thr Glu Ser
85                  90                  95
Ser Gly Gly Trp Gln Asn Arg Asp Cys Ser Ile Ala Leu Pro Tyr Val
100                 105                 110
Cys Lys Lys
115
<210>  35
<211>  126
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Cys Glu Thr Phe Trp Asp Lys Asp Gln Leu Thr Asp Ser Cys Tyr Gln
1               5                   10                  15
Phe Asn Phe Gln Ser Thr Leu Ser Trp Arg Glu Ala Trp Ala Ser Cys
20                  25                  30
Glu Gln Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser Ile Thr Glu Ile His Glu Gln
35                  40                  45
Thr Tyr Ile Asn Gly Leu Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Thr Leu Trp Ile
50                  55                  60
Gly Leu Asn Asp Leu Asp Thr Ser Gly Gly Trp Gln Trp Ser Asp Asn
65                  70                  75                  80
Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Asn Trp Glu Ser Asp Gln Pro Asp Asn Pro
85                  90                  95
Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Ile Arg Thr Glu Ser Ser Gly Gly Trp
100                 105                 110
Gln Asn Arg Asp Cys Ser Ile Ala Leu Pro Tyr Val Cys Lys
115                 120                 125
<210>  36
<211>  316
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Ile Phe Ser His Gly Leu Gln Gly Cys Leu Glu Ala Gln Gly Gly Gln
1               5                   10                  15
Val Arg Val Thr Pro Ala Cys Asn Thr Ser Leu Pro Ala Gln Arg Trp
20                  25                  30
Lys Trp Val Ser Arg Asn Arg Leu Phe Asn Leu Gly Thr Met Gln Cys
35                  40                  45
Leu Gly Thr Gly Trp Pro Gly Thr Asn Thr Thr Ala Ser Leu Gly Met
50                  55                  60
Tyr Glu Cys Asp Arg Glu Ala Leu Asn Leu Arg Trp His Cys Arg Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gly Asp Gln Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala Arg Thr Ser Asn Ile
85                  90                  95
Ser Lys Pro Gly Thr Leu Glu Arg Gly Asp Gln Thr Arg Ser Gly Gln
100                 105                 110
Trp Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Glu Asp Leu Cys Ala Leu Pro Tyr His
115                 120                 125
Glu Val Tyr Thr Ile Gln Gly Asn Ser His Gly Lys Pro Cys Thr Ile
130                 135                 140
Pro Phe Lys Tyr Asp Asn Gln Trp Phe His Gly Cys Thr Ser Thr Gly
145                 150                 155                 160
Arg Glu Asp Gly His Leu Trp Cys Ala Thr Thr Gln Asp Tyr Gly Lys
165                 170                 175
Asp Glu Arg Trp Gly Phe Cys Pro Ile Lys Ser Asn Asp Cys Glu Thr
180                 185                 190
Phe Trp Asp Lys Asp Gln Leu Thr Asp Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Phe
195                 200                 205
Gln Ser Thr Leu Ser Trp Arg Glu Ala Trp Ala Ser Cys Glu Gln Gln
210                 215                 220
Gly Ala Asp Leu Leu Ser Ile Thr Glu Ile His Glu Gln Thr Tyr Ile
225                 230                 235                 240
Asn Gly Leu Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Thr Leu Trp Ile Gly Leu Asn
245                 250                 255
Asp Leu Asp Thr Ser Gly Gly Trp Gln Trp Ser Asp Asn Ser Pro Leu
260                 265                 270
Lys Tyr Leu Asn Trp Glu Ser Asp Gln Pro Asp Asn Pro Ser Glu Glu
275                 280                 285
Asn Cys Gly Val Ile Arg Thr Glu Ser Ser Gly Gly Trp Gln Asn Arg
290                 295                 300
Asp Cys Ser Ile Ala Leu Pro Tyr Val Cys Lys Lys
305                 310                 315
<210>  37
<211>  320
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Pro Asn Val Phe Leu Ile Phe Ser His Gly Leu Gln Gly Cys Leu Glu
1               5                   10                  15
Ala Gln Gly Gly Gln Val Arg Val Thr Pro Ala Cys Asn Thr Ser Leu
20                  25                  30
Pro Ala Gln Arg Trp Lys Trp Val Ser Arg Asn Arg Leu Phe Asn Leu
35                  40                  45
Gly Thr Met Gln Cys Leu Gly Thr Gly Trp Pro Gly Thr Asn Thr Thr
50                  55                  60
Ala Ser Leu Gly Met Tyr Glu Cys Asp Arg Glu Ala Leu Asn Leu Arg
65                  70                  75                  80
Trp His Cys Arg Thr Leu Gly Asp Gln Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala
85                  90                  95
Arg Thr Ser Asn Ile Ser Lys Pro Gly Thr Leu Glu Arg Gly Asp Gln
100                 105                 110
Thr Arg Ser Gly Gln Trp Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Glu Asp Leu Cys
115                 120                 125
Ala Leu Pro Tyr His Glu Val Tyr Thr Ile Gln Gly Asn Ser His Gly
130                 135                 140
Lys Pro Cys Thr Ile Pro Phe Lys Tyr Asp Asn Gln Trp Phe His Gly
145                 150                 155                 160
Cys Thr Ser Thr Gly Arg Glu Asp Gly His Leu Trp Cys Ala Thr Thr
165                 170                 175
Gln Asp Tyr Gly Lys Asp Glu Arg Trp Gly Phe Cys Pro Ile Lys Ser
180                 185                 190
Asn Asp Cys Glu Thr Phe Trp Asp Lys Asp Gln Leu Thr Asp Ser Cys
195                 200                 205
Tyr Gln Phe Asn Phe Gln Ser Thr Leu Ser Trp Arg Glu Ala Trp Ala
210                 215                 220
Ser Cys Glu Gln Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser Ile Thr Glu Ile His
225                 230                 235                 240
Glu Gln Thr Tyr Ile Asn Gly Leu Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Thr Leu
245                 250                 255
Trp Ile Gly Leu Asn Asp Leu Asp Thr Ser Gly Gly Trp Gln Trp Ser
260                 265                 270
Asp Asn Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Asn Trp Glu Ser Asp Gln Pro Asp
275                 280                 285
Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Ile Arg Thr Glu Ser Ser Gly
290                 295                 300
Gly Trp Gln Asn Arg Asp Cys Ser Ile Ala Leu Pro Tyr Val Cys Lys
305                 310                 315                 320
<210>  38
<211>  183
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Ile Phe Ser His Gly Leu Gln Gly Cys Leu Glu Ala Gln Gly Gly Gln
1               5                   10                  15
Val Arg Val Thr Pro Ala Cys Asn Thr Ser Leu Pro Ala Gln Arg Trp
20                  25                  30
Lys Trp Val Ser Arg Asn Arg Leu Phe Asn Leu Gly Thr Met Gln Cys
35                  40                  45
Leu Gly Thr Gly Trp Pro Gly Thr Asn Thr Thr Ala Ser Leu Gly Met
50                  55                  60
Tyr Glu Cys Asp Arg Glu Ala Leu Asn Leu Arg Trp His Cys Arg Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gly Asp Gln Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala Arg Thr Ser Asn Ile
85                  90                  95
Ser Lys Pro Gly Thr Leu Glu Arg Gly Asp Gln Thr Arg Ser Gly Gln
100                 105                 110
Trp Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Glu Asp Leu Cys Ala Leu Pro Tyr His
115                 120                 125
Glu Val Tyr Thr Ile Gln Gly Asn Ser His Gly Lys Pro Cys Thr Ile
130                 135                 140
Pro Phe Lys Tyr Asp Asn Gln Trp Phe His Gly Cys Thr Ser Thr Gly
145                 150                 155                 160
Arg Glu Asp Gly His Leu Trp Cys Ala Thr Thr Gln Asp Tyr Gly Lys
165                 170                 175
Asp Glu Arg Trp Gly Phe Cys
180
<210>  39
<211>  188
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Pro Asn Val Phe Leu Ile Phe Ser His Gly Leu Gln Gly Cys Leu Glu
1               5                   10                  15
Ala Gln Gly Gly Gln Val Arg Val Thr Pro Ala Cys Asn Thr Ser Leu
20                  25                  30
Pro Ala Gln Arg Trp Lys Trp Val Ser Arg Asn Arg Leu Phe Asn Leu
35                  40                  45
Gly Thr Met Gln Cys Leu Gly Thr Gly Trp Pro Gly Thr Asn Thr Thr
50                  55                  60
Ala Ser Leu Gly Met Tyr Glu Cys Asp Arg Glu Ala Leu Asn Leu Arg
65                  70                  75                  80
Trp His Cys Arg Thr Leu Gly Asp Gln Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala
85                  90                  95
Arg Thr Ser Asn Ile Ser Lys Pro Gly Thr Leu Glu Arg Gly Asp Gln
100                 105                 110
Thr Arg Ser Gly Gln Trp Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Glu Asp Leu Cys
115                 120                 125
Ala Leu Pro Tyr His Glu Val Tyr Thr Ile Gln Gly Asn Ser His Gly
130                 135                 140
Lys Pro Cys Thr Ile Pro Phe Lys Tyr Asp Asn Gln Trp Phe His Gly
145                 150                 155                 160
Cys Thr Ser Thr Gly Arg Glu Asp Gly His Leu Trp Cys Ala Thr Thr
165                 170                 175
Gln Asp Tyr Gly Lys Asp Glu Arg Trp Gly Phe Cys
180                 185
<210>  40
<211>  181
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Asn Ser His Gly Lys Pro Cys Thr Ile Pro Phe Lys Tyr Asp Asn Gln
1               5                   10                  15
Trp Phe His Gly Cys Thr Ser Thr Gly Arg Glu Asp Gly His Leu Trp
20                  25                  30
Cys Ala Thr Thr Gln Asp Tyr Gly Lys Asp Glu Arg Trp Gly Phe Cys
35                  40                  45
Pro Ile Lys Ser Asn Asp Cys Glu Thr Phe Trp Asp Lys Asp Gln Leu
50                  55                  60
Thr Asp Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Phe Gln Ser Thr Leu Ser Trp Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ala Trp Ala Ser Cys Glu Gln Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser Ile
85                  90                  95
Thr Glu Ile His Glu Gln Thr Tyr Ile Asn Gly Leu Leu Thr Gly Tyr
100                 105                 110
Ser Ser Thr Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp Leu Asp Thr Ser Gly Gly
115                 120                 125
Trp Gln Trp Ser Asp Asn Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Asn Trp Glu Ser
130                 135                 140
Asp Gln Pro Asp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Ile Arg Thr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Ser Gly Gly Trp Gln Asn Arg Asp Cys Ser Ile Ala Leu Pro
165                 170                 175
Tyr Val Cys Lys Lys
180
<210>  41
<211>  181
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Gly Asn Ser His Gly Lys Pro Cys Thr Ile Pro Phe Lys Tyr Asp Asn
1               5                   10                  15
Gln Trp Phe His Gly Cys Thr Ser Thr Gly Arg Glu Asp Gly His Leu
20                  25                  30
Trp Cys Ala Thr Thr Gln Asp Tyr Gly Lys Asp Glu Arg Trp Gly Phe
35                  40                  45
Cys Pro Ile Lys Ser Asn Asp Cys Glu Thr Phe Trp Asp Lys Asp Gln
50                  55                  60
Leu Thr Asp Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Phe Gln Ser Thr Leu Ser Trp
65                  70                  75                  80
Arg Glu Ala Trp Ala Ser Cys Glu Gln Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser
85                  90                  95
Ile Thr Glu Ile His Glu Gln Thr Tyr Ile Asn Gly Leu Leu Thr Gly
100                 105                 110
Tyr Ser Ser Thr Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp Leu Asp Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Trp Gln Trp Ser Asp Asn Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Asn Trp Glu
130                 135                 140
Ser Asp Gln Pro Asp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Ile Arg
145                 150                 155                 160
Thr Glu Ser Ser Gly Gly Trp Gln Asn Arg Asp Cys Ser Ile Ala Leu
165                 170                 175
Pro Tyr Val Cys Lys
180
<210>  42
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  42
Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1               5
<210>  43
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  43
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Thr Leu Thr Asp
1               5                   10
<210>  44
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  44
Gln Glu Phe Phe Ser Thr Pro Phe
1               5
<210>  45
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  45
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn
1               5
<210>  46
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  46
Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Asn Asp Glu Lys Arg Ile
1               5                   10
<210>  47
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  47
Arg Gly Gly Gly Asp Tyr Val Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Phe
1               5                   10
<210>  48
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  48
Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Val
1               5
<210>  49
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  49
Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser
1               5                   10
<210>  50
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  50
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu Ala
1               5
<210>  51
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  51
Tyr Ser Ile Thr Asn Ala Tyr Tyr Trp Asn
1               5                   10
<210>  52
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  52
Trp Leu Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Asp Thr Asn Tyr
1               5                   10
<210>  53
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  53
Arg Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Phe Pro Tyr
1               5                   10
<210>  54
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  54
Gln Asn Val Asp Thr Tyr Val Val
1               5
<210>  55
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  55
Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Phe Ser
1               5                   10
<210>  56
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  56
Gln Gln Tyr His Asn Ser Pro Leu
1               5
<210>  57
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  57
Tyr Ile Phe Ile Asp Tyr Gly Met His
1               5
<210>  58
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  58
Trp Met Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Gly Val Ser Thr Tyr
1               5                   10
<210>  59
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  59
Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Gln Tyr Gly Ser Tyr
1               5                   10
<---