СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КОНСТИТУТИВНОГО АНДРОСТАНОВОГО РЕЦЕПТОРА
METHOD FOR INCREASING AMOUNT OF CONSTITUTIVE ANDROSTANE RECEPTOR

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для индуцирования конститутивного андростанового рецептора (CAR).
Конститутивный андростановый рецептор (СAR) – член суперсемейства ядерных рецепторов, который активирует экспрессию ряда ферментов цитохромов Р450 (изоформы CYP 3A4, CYC 2A6, CYP2Cs, CYP 2B), ферментов II фазы биотрансформации (глутатион-S-трансферазы, сульфотрансферазы, уридиндифосфатглюкуронозилтрансферазы)) и белков-транспортеров ((белок множественной лекарственной устойчивости 1, Р-гликопротеин, полипетид 1, транспортирующий органические анионы). Изменение количества СAR в эксперименте in vitro может применяться для изучения роли данного рецептора в фармакокинетике лекарственных веществ.
Известно, что 2,4,6трифенилдиоксан1,3 (TPD) активирует CAR и его ген-мишень СYР2В у крыс [Pustylnyak, V., Pivovarova, E., Slynko, N., Gulyaeva, L., and Lyakhovich, V. (2009) Life Sciences, 85, 815–821]. Показано, что при воздействии фенобарбитала происходит увеличение количества мРНК гена Cyp2b10 у мышей и повышается связывание рецептора CAR в составе гетеродимера с RXR с последовательностью в промоторной области гена, кодирующего Cyp2b10 [Honkakoski, P., Zelko, I., Sueyoshi, T., and Negishi, M. (1998) Mol. Cell. Biol., 18, 5652–5658]. Выявлено, что ацетаминофен, билирубин, трифенилфосфат, фенитоин, 17β-эстрадиол, триpметилфенилфосфат, трифенилфосфат являются активаторами CAR [Е.М. Качайло, В.О. Пустыльняк, В.В. Ляхович, Л.Ф. Гуляева Конститутивный андростановый рецептор (CAR): ксеносенсор и терапевтическая мишень. Биохимия, 2011, Т. 76, № 10, С. 1335 – 1347].
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и экономичного способа повышения количества конститутивного андростанового рецептора в эксперименте in vitro.
2
2
С данной целью было выполнено исследование на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки высеивали в 6-луночные планшеты («Сorning», США) и культивировали в течение 21 сут. в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) («Sigma-Aldrich», Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) («Sigma-Aldrich», Германия), 15% бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина («Sigma-Aldrich», Германия) соответственно, поскольку при данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в клетки подобные энтероцитам тонкого кишечника, экспрессирующим CAR. После чего для активации CAR в культуральную среду добавляли пероксид водорода НО («Sigma-Aldrich», Германия) до достижения его концентрации в среде 0,1; 0,5; 1; 5; 10, 50 мкМ с инкубацией в течение 3, 24 и 72 ч. Смену среды проводили каждые 24 ч. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения.
0
7
После окончания экспозиции, клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, «Sigma-Aldrich», Германия), трижды промывали раствором фосфатного буфера («Bio Rad», США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo («ThermoFisher Scientific», США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (аминоэтилбензенсульфонил флуорида гидрохлорид (AEBSF) 2 мМ, апротинин 0,3 мкМ, бестатин 130 мкМ, ЭДТА 1мМ, эпоксисукциниллейцингуанидинобутиламид (Е-64) 14 мкМ, лейпептин 1мкМ, «Sigma-Aldrich», Германия) в течение 30 минут при +4С и постоянном перемешивании из расчета 10 клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут («Avanti JXN-3», «Beckman coulter», США). В супернатанте определяли относительного количество CAR с помощью метода вестерн-блот.
Полученные результаты анализировали с помощью программ «StatSoft Statistica 13.0» (США, номер лицензии JPZ811I521319AR25ACD-W). Результаты представлены в виде M±SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
2
2
Установлено, что воздействие НОв течение 3 часов и 24 часов во всех протестированных концентрациях (0,1; 0,5; 1, 5, 50 мкМ) достоверно не влияло на количество CAR.
2
2
В то же время увеличение экспозиции с перекисью водорода до 72 ч приводило к статистически значимому повышению количества CAR относительно контрольных значений при концентрации НО 5; 10 и 50 мкМ на 21,9±11,2 % (р=0,03), на 46,7±7,5 % (р=0,0005), на 36,8±6,8 % (р=0,003) соответственно (фиг. 1).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1.  - Экспрессия CAR в клетках линии Сасо-2 в условиях моделирования окислительного стресса в течение 72 ч и концентрации перекиси водорода 0,1-100 мкМ.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1 – контроль; 2 – НО0,1 мкМ; 3 - НО 0,5 мкМ;  4 - НО 1 мкМ;  5 - НО5 мкМ;  6 - НО10 мкМ;  7 - НО50 мкМ, * - статистически значимые отличия от контроля, р<0,05.
Таким образом, при добавлении в Дульбекко модифицированную среду Игла пероксида водорода до достижения его концентрации в среде 5; 10, 50 мкМ с последующей инкубацией в течение 72 часов отмечается увеличение количества конститутивного андростанового рецептора.