Штамм бактерий Bacillus megaterium, обладающий способностью продуцировать пробиотические и антимикробные вещества класса органических кислот
BACILLUS MEGATERIUM BACTERIAL STRAIN WITH THE ABILITY TO PRODUCE PROBIOTIC AND ANTIMICROBIAL SUBSTANCES OF THE ORGANIC ACID CLASS

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии для производства пробиотических препаратов, а также в сельском хозяйстве для обогащения кормов.
Согласно определению ВОЗ, пробиотики - это непатогенные микроорганизмы, которые способны восстанавливать нормальную микрофлору органов, а также губительно воздействовать на патогенные и условно-патогенные бактерии. В настоящее время известны пробиотические микроорганизмы, входящие в состав различных лекарственных препаратов: Лактобактерии (Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. bulgaricus, L. lactis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. fermentum, L. jonsonii, L. gassed); Бифидобактерии (Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. longum, B. breve, B. adolescents); Непатогенные разновидности Escherichia coli; Непатогенные разновидности Bacillus (В. subtilis); Непатогенные разновидности Enterococcus (Enterococci faecium, E. salivarius); Молочнокислый стрептокок (Streptococcus thermophylus); Дрожжевые грибки Saccharomyces boulardii. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, стали использоваться и спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus (Ж. Химическая и биологическая безопасность. 2007. №2-3, с. 32-33).
Лечебный и профилактический эффект пробиотиков обусловлен высокой антагонистической активностью штаммов микроорганизмов относительно патогенной и условно-патогенной микрофлоры, повышении функциональной деятельности иммунной системы и лучшем усвоения питательных веществ корма.
Антагонистическая активность штаммов-пробиотиков определяется способностью синтезировать пробиотические вещества, к которым относятся органические кислоты, ферменты, бактериоцины, витамины группы В, незаменимые аминокислоты и другие соединения. Масляная кислота и ее эфиры стимулируют образование ворсинок клетками эпителия тонкого кишечника, тем самым улучшая усвоение пищи, повышают иммунитет, подавляют рост патогенной микрофлоры (кокцидий и др.). Пропионовая кислота подавляет развитие в кишечнике плесневых грибов и дрожжей, является консервантом. Молочная кислота подавляет рост анаэробных бактерий, стимулирует выработку ферментов поджелудочной железы, улучшает вкус продукта. Протеолитические и амилолитические ферменты улучшают перевариваемость пищи.
У пропионовокислых бактерий обнаружены уникальные пробиотически значимые свойства. Они сохраняют довольно высокую жизнеспособность в условиях агрессивной среды ЖКТ, имеют выраженную антиоксидантную активность. В отличие от молочнокислых, виды пропионовокислых бактерий характеризуются низкими ростовыми потребностями, но при этом образуют и выделяют из клеток разнообразные вещества - нутрицевтики, среди которых витамины группы В, незаменимые аминокислоты и др. В связи с этим данные штаммы все больше становятся интересны как транзиторные пробиотики, активность которых может проявляться in vivo.
Многие ингредиенты кормов перевариваются животными не полностью. Этот факт хорошо известен и представляет проблему, когда нужно обеспечить наилучшую питательную ценность рациона и структуру кормов. Включение в рационы сельскохозяйственных животных альтернативных источников белка, таких как подсолнечный, соевый или рапсовый шрот, ограничено наличием трудно перевариваемых некрахмалистых полисахаридов, антипитательных веществ и относительно низкой перевариваемостью белка (Lemme Α., Ravindran V., Bryden W. L. Ileal digestibility of amino acids in feed ingredients for broilers //World’s Poultry Science Journal. - 2004. - T. 60. - №. 4. - C. 423-438). По биологической ценности протеины шротов масличных культур значительно превосходят белки зерна злаковых, но имеют дефицит по незаменимым аминокислотам. Для повышения кормовой пригодности шротов и улучшения баланса аминокислот используют ферментацию при помощи пробиотических микроорганизмов.
Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий, обладающих способностью продуцировать пробиотические и антимикробные вещества в сочетании с протеолитической и амилолитической активностью, способных эффективно гидролизовать трудно усвояемые крахмалистые соединения в широком диапазоне температур, а также продуцирующих незаменимые аминокислоты.
Известен штамм бактерий Bacillus megaterium 501 GR, применяемый в качестве полифункционального средства для растениеводства, обладающего одновременно ростостимулирующим эффектом, улучшающего фосфорное питание растений, способствующего повышению их продуктивности, защиты растений от корневых грибных болезней, а также способствующего биоремедиации загрязненных пестицидами почв (патент RU 2558291 С1, опубл. 27.07.2015).
Известен штамм бактерий Bacillus megaterium 3, депонированный в ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 04324 в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур. Штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 был выделен из внутренних тканей черенков винограда (Vitus vinifera L.), сорта «Мускат черный». Среда культивирования: питательный агар.
Оптимальная температура для роста 32°С. Культивирование проводили в течение 48 часов (патент RU 2649359 С1, опубл. 02.04.2018).
Известен штамм бактерий Bacillus megaterium 2-06-TS1, в качестве активатора фотосинтеза и энергии прорастания растений, который используют для получения препарата для стимуляции роста растений. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12402. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов в аэробных условиях, в термостате при t° от +25°С до +36°С, 18-24 часа (патент RU 2627608 С1, опубл. 09.08.2017).
Известен штамм бактерии Bacillus megaterium ОРР-31, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером В-12463. Штамм может быть использован для создания микробного биоудобрения со свойствами регулятора роста для использования в растениеводстве, в том числе при ведении органического земледелия. Bacillus megaterium ОРР-31 является аэробной, хемоорганогетеротрофной бактерией, растет в диапазоне температур от 10°С до 40°С с оптимальным диапазоном 25-32°С, при значениях рН от 4,5 до 9,0 с оптимумом 7,5-8,0; при концентрации хлорида натрия не более 7% (патент RU 2690420 С1, опубл. 03.06.2019).
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Bacillus megaterium 874 - продуцент антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12251. Штамм Bacillus megaterium 874 выделен из почвы. Это грубая палочка грамположительная палочковидная бактерия размером (4-7)×(1,5-2) мкм. Клетки располагаются одиночно, попарно или цепочками, подвижны. Образует споры, капсул не образует, грамположительна. Аэроб. Штамм В. megaterium 874 хорошо растет на простых питательных средах в течение 18-24 часов. Оптимальная температура культивирования - 37°С. Штамм может быть добавлен в пищевые продукты для повышения иммунной резистентности организма и коррекции дисбактериозов различной этиологии (патент RU 2639569 С1, опубл. 21.12.2017).
Недостатками этого штамма является низкая устойчивость к температурным условиям, отсутствие продукции пробиотических соединений класса органических кислот, что ограничивает возможность его использования в кормопроизводстве.
Задачей изобретения является получение бактериального штамма, являющегося продуцентом протеолитических и амилолитических ферментов, а также пробиотических и антимикробных соединений класса органических кислот, устойчивого к повышенной температуре (до 60 градусов Цельсия).
Технический результат: расширение ассортимента штаммов с пробиотическими свойствами и сбалансированным аминокислотным составом белка, повышение устойчивости к температурным условиям, упрощение условий культивирования штамма.
Поставленная задача достигается получением термотолерантного штамма Bacillus megaterium 83_ICG, обладающего способностью продуцировать пробиотические и антимикробные вещества класса органических кислот, обладающего протеолитической и амилолитической активностями. Штамм бактерий Bacillus megaterium 83_ICG выделен из природного материала образца грунта на Восточном термальном поле кальдеры вулкана Узон, Камчатка, в результате целенаправленного поиска.
Полученный штамм бактерий Bacillus megaterium 83_ICG депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИХБФМ РАН (обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» (ФИЦ ПНЦБИ РАН) под регистрационным номером ВКМ B-3512D.
Штамм Bacillus megaterium 83_ICG характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки: грамположительные палочки 1x3-4 мкм, растут на средах LB-бульон, LB-arap, ΜΠΑ. При росте на агаризованной среде LB образует круглые колонии кремового цвета. Профиль колоний выпуклый, размеры варьируют от 5 до 7 мм.
Физиолого-биохимические признаки: аэроб или факультативный анаэроб, термотолерантен. Оптимальная температура роста 55-60°С. Растет в пределах рН среды от 6.0 до 10.0 с оптимумом 7.0. Штамм характеризуется способностью использовать широкий спектр субстратов: крахмал, казеин, соевый шрот, глицерин, лигнин, пептон, твин и др.
Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием.
Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций.
Штамм идентифицирован на основании анализа последовательности полного генома.
Хранение штамма осуществляют на среде LB с глицерином при температуре -70°С.
Для культивирования штамма применяют среды следующего состава: Среда LB (г/л): хлорид натрия - (5.0) 10.0; триптон - 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0.
Среда ΜΠΑ (г/л): Пептический перевар животной ткани 10.0, настой говядины 500.0, NaCl 5.0, агар-агар 25.0.
Штамм Bacillus megaterium 83_ICG продуцирует пробиотические и антимикробные вещества (масляная кислота и ее метиловый, этиловый и бутиловый эфиры, пропионовая кислота, молочная кислота). Антагонистическая активность штамма Bacillus megaterium 83_ICG по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам доказана диффузионным методом (методом агаровых блоков).
Предлагаемый штамм бактерий Bacillus megaterium 83_ICG, обладающий пробиотическими свойствами, имеет ряд преимуществ, заключающихся в следующем.
1. Предлагаемый штамм продуцирует протеазы и амилазы, способствующие лучшему перевариванию кормов.
2. Штамм бактерий Bacillus megaterium 83_ICG продуцирует органические кислоты (молочную, пропионовую и масляную), которые повышают иммунитет, стимулируют выработку ферментов поджелудочной железы, улучшают вкус продукта.
3. Штамм Bacillus megaterium 83_ICG является термотолерантным. Культура демонстрирует интенсивный рост в широком диапазоне температур: от 32 до 55°С, что позволяет использовать данный штамм как в производстве кормов, так и в составе пробиотических препаратов.
4. Штамм бактерий Bacillus megaterium 83_ICG не требует сложных условий культивирования, поскольку потребляет широкий спектр субстратов, включая распространенные компоненты корма для сельскохозяйственных животных - соевый и подсолнечный шрот.
5. Штамм Bacillus megaterium 83_ICG проявляет активный рост на широком спектре субстратов: крахмал, казеин, соевый шрот, глицерин, лигнин, является продуцентом незаменимых аминокислот, что способствует удешевлению технологии кормопроизводства.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые, и он характеризуется уникальным комплексом пробиотических свойств, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Продукция органических кислот штаммом Bacillus megaterium 83ICG.
От 100 мл жидкой культуры Bacillus megaterium 83_ICG, выращенной до экспоненциальной стадии на среде LB, отбирали пробу объемом 5,0 мл, и экстрагировали пробу 2,0 мл этилформиата.
Анализ содержания органических кислот проводили на хроматографе Agilent Technologies 6890N с кварцевой капиллярной колонкой DB-1 и квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5973N. Хроматографический масс-спектрометрический анализ образцов проводили, как для измерения полного ионного тока в режиме сканирования в диапазоне масс 10-800 а.е.м., так и в режиме селективного сканирования ионов. Индексы удерживания RI определяли с использованием данных хроматографического анализа смеси гомологичных линейных алканов (С8-С32) и рассчитывали из времен выхода пиков по известному способу (Н. van Den Dool, P. Dec. Kratz, A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography, Journal of Chromatography A, - 1963 - vol. 11. - P. 463-471). Площади пиков всех компонентов рассчитывали с помощью программы Xcalibur 2.0. Определение зарегистрированных соединений проводили согласно базы масс-спектров The NIST Mass Spectral Search Program for the NIST / EPA / NIH Mass Spectral Library Version 2.0a, а также сравнением полученных значений RI со значениями из той же базы.
ТФ
В качестве количественного стандарта для определения содержания низкомолекулярных пробиотических соединений использовали раствор 1,2,3,4-тетрафторбензобаррелена (ТФ) в этилформиате с концентрацией 1 мг/мл. Хроматография ТФ дает результатом пик при 9,420 мин с интенсивностью А=34140955 ед., что позволяет рассчитать содержание определяемых соединений по формуле:
x
x
кс
эф
ст
от
х
C=A x V x У/А x V = А х 100 ч 2 / 34140955 ч 5 = Αх/853513,
х
где С - содержание определяемого соединения;
х
А - интенсивность хроматографического пика определяемого соединения;
эф
V - объем этилформиата, взятого для экстрагирования;
кс
V - общий объем культуральной среды;
ст
А - интенсивность хроматографического пика стандартного соединения;
от
V - отобранный объем культуральной среды.
Результаты измерения содержания органических кислот приведены в Таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что среди определенных низкомолекулярных соединений 75% составляют органические кислоты, которые придают штамму Bacillus megaterium 83_ICG пробиотические свойства. 53,04% экстракта составляет молочная кислота, 19,26% масляная кислота и ее эфиры и 3,47% - пропионовая кислота.
Пример 2.
Оценка протеолитической и амилолитической активностей штамма Bacillus megaterium 83_ICG.
Для выявления амилолитической активности использовали плотную питательную среду - картофельный агар. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом на чашки Петри с картофельным агаром и инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение 2-5 суток. По окончании инкубирования выросшие культуры в чашках заливали 5 мл раствора Люголя и в течение 5 мин наблюдали за появлением прозрачных зон вокруг посевов. Среда, содержащая крахмал, окрашивалась в синий цвет.
Для определения протеолитической активности использовали плотную питательную среду с казеином. Исследуемые микроорганизмы высевали на чашки Петри с казеином и инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение 24-48 часов. По окончании инкубации в чашки наливали по 5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и наблюдали в течение 3 мин за появлением прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре.
Протеолитическая и амилолитическая активности Bacillus megaterium 83_ICG приведены в Таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что штамм Bacillus megaterium 83_ICG обладает протеолитическими и амилолитическими характеристиками, которые придают ему дополнительные пробиотические свойства.
Пример 3.
Анализ аминокислотного состава белка штамма Bacillus megaterium 83ICG.
В жидкую питательную среду, содержащую 50 г/л соевого шрота и 5 г/л NaCl была внесена культура Bacillus megaterium 83_ICG. Культивирование проводилось в конических колбах при 37°С, 250 об/мин в термошейкере. На 20-м часу культивирования в колбы было внесено 200 г/л нестерильного соевого шрота, продолжалось культивирование в термостате при тех же условиях. Через 48 часов от начала эксперимента было проведено определение содержания белка по Барнштейну. Аминокислотный состав белка соевого шрота и ферментированного соевого шрота при помощи штамма Bacillus megaterium 83_ICG, в сравнении с потребностями бройлерных кур, представлены на фиг. 1
Из фиг. 1 видно, что культивирование бактериального штамма Bacillus megaterium 83_ICG на соевом шроте приводит к коррекции аминокислотного состава белка соевого шрота. В результате бактериальной ферментации белок соевого шрота обогащается незаменимыми аминокислотами: аргинином, валином, лейцином и изолейцином, лизином и фенилаланином.
Таким образом, предлагаемый штамм обладает способностью к росту в широком диапазоне температур, а также способностью продуцировать незаменимые аминокислоты, пробиотические и антимикробные вещества класса органических кислот.