Особенности межбактериальных взаимодействий при гриппе

Особенности межбактериальных взаимодействий при гриппе

А.С. Паньков, к.м.н., Оренбургская ГМА

Для обеспечения колонизационной резистентности макроорганизма необходимо изучить причины и механизмы изменчивости микрофлоры, среди которых важная роль отводится межмикробным взаимодействиям [1].

Межмикробные взаимодействия могут определяться как направленностью, так и характером (эффектом) действия. По направленности можно выделить взаимодействия представителей индигенной микрофлоры между собой, с условно-патогенной и патогенной микрофлорой; взаимодействия патогенных микроорганизмов между собой и с условно-патогенной микрофлорой.

По характеру взаимодействия микроорганизмов различают антагонистические, синергид-ные и индифферентные (нейтральные) связи. Вырабатывая микробные продукты в процессе жизнедеятельности, одни микроорганизмы могут действовать на другие по принципу синергизма, способствуя их росту, размножению [2, 3], экспрессии факторов патогенности [4], либо антагонистически, что проявляется в подавлении роста, размножения и факторов патогенности ассоцианта-конкурента [5, 6].

Цель исследования: изучить особенности изменения факторов патогенности и персистенции микроорганизмов в условиях межбактериальных взаимодействий на слизистой оболочке носа и миндалин больных гриппом.

Для исследования брался мазок со слизистой оболочки носа и слизистой оболочки миндалин. Забор проводился у больных гриппом утром натощак стерильным ватным тампоном, смоченным в стерильном физиологическом растворе. Исследуемый материал доставляли в лабораторию

в течение 30 минут от момента забора, затем осуществляли посев на 5%-ный кровяной агар в чашке Петри. Посевной материал втирали прокатыванием тампона по поверхности среды у края чашки. Дно чашки расчерчивали на секторы, затем прокаленной в пламени спиртовки петлей проводили рассев параллельными штрихами по поверхности среды в каждом секторе. Посевы инкубировали в термостате при t = 37 ^ в течение 24 часов. Оценку показателя микробной обсемененности каждого симбионта, а также общего показателя микробной обсемененности биотопа проводили по количеству подсчитанных колоний на секторах с использованием таблицы Ю.М. Фельдмана и соавт. (1984 г.) [7]. Бактерии идентифицировали по общепринятым схемам, используя тест-системы фирмы «Lachema» (Чехия). У выделенных микроорганизмов были определены гемолитическая (ГА), лецитовителлазная (ЛецА) [8], лизоцимная (ЛА) и антилизоцимная (АЛА) активности чашечным методом [9].

При изучении модификации факторов патогенности в условиях межбактериальных взаимодействий был использован чашечный метод перекрёстного посева штаммов-симбионтов [10].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Biostat», «Statistica 6,0», «SPSS 11.0».

Варианты взаимодействия микроорганизмов в ассоциациях оценивались в двух микросимбиоце-нозах верхних дыхательных путей (группах сравнения): больных гриппом, здоровых людей. По направлению взаимодействия выделялись пары с односторонним усилением либо подавлением признака и пары с взаимным усилением либо подавлением признака. Характер взаимодействия микроорганизмов в ассоциациях оценивали следующим образом: взаимное усиление факторов в

паре симбионтов (синергизм), однонаправленное усиление факторов (один симбионт усиливает экспрессию факторов у другого), взаимное подавление факторов в паре симбионтов (антагонизм), однонаправленное подавление факторов (один симбионт подавляет экспрессию фактора у другого). Все представленные микроорганизмы находились в ассоциациях, и у них были изучены факторы патогенности и персистенции в условиях межбактериальных взаимодействий. В качестве критерия бактериальных ассоциаций рассматривались корреляционные связи между частотой встречаемости ассоциантов и показателем микробной обсеменённости [11]. Учёту подлежали связи с коэффициентом корреляции (г) более 0,35.

Микроорганизмы в ассоциациях преимущественно усиливали свойства в парах после их взаимодействия. Нами выявлено взаимное усиление (синергизм) ГА в ассоциативных парах, выделенных от больных гриппом, причём в сравнении с ассоциативными парами от здоровых людей частота усиления признака была в 8 раз выше (26,7+2,1% против 3,4±1,6%, p<0,01). Однонаправленное усиление ГА преобладало также в ассоциациях от больных гриппом людей в 4 раза чаще, чем в ассоциациях от здоровых (13,3+1,6% против 3,4+1,6%, p<0,01). Синергизм в модификации ЛецА в ассоциациях от больных гриппом выявлен в 3,9 раза чаще, чем в ассоциациях от здоровых людей (6,7+1,2% против 1,7+1,2%, p<0,05). Одностороннее усиление ЛецА отмечено в парах здоровых людей, у больных гриппом такой вариант не встречался. Взаимное усиление ЛА и АЛА выявлено только в ассоциациях от больных гриппом людей. Одностороннее усиление АЛА в ассоциациях от больных гриппом в 3,9 раза чаще, чем в ассоциациях от здоровых людей (6,7+1,2% против 1,7+1,2%, p<0,05).

Активность микроорганизмов по модификации факторов патогенности и персистенции проявилась у больных гриппом в определённых парах штаммов-симбионтов (табл. 1).

Во взаимном усилении ГА в ассоциациях от больных гриппом людей отмечены пары между условно-патогенным и индигенным микроорганизмами: E. coli — S. mitis (11,4+1,5%), S. hyicus — S. mitis (5,1+1,0%); между патогенным и индигенным микроорганизмами: S. aureus — S. oralis (6,3+1,1%); между индигенными микроорганизмами: S. mutans — S. saprophyticus (3,8+0,9%). Одностороннее усиление ГА при гриппе выявлено как в парах патогенный — индигенный микроорганизм — S. aureus усиливал ГА S. mitis (10,1+1,4%), так и парах индигенных микроорганизмов: S. hominis усиливал ГА S. agalactiae (3,2+0,8%). Взаимное усиление ЛецА при гриппе обусловлено патогенными микроорганизмами

S. pyogenes и S. aureus (6,7±1,2%). Взаимное усиление ЛА и АЛА установлено только при гриппе. ЛА — в ассоциациях патогенный — индигенный микроорганизмы: S. aureus — S. mitis (6,7±1,2%), а АЛА в парах индигенных микроорганизмов: S. mutans — S. saprophyticus (6,7±1,2%). При гриппе индигенный микроорганизм S. oralis усиливал АЛА патогенного S. aureus (6,7±1,2%).

Кроме усиления факторов патогенности и персистенции, в ассоциациях отмечено подавление факторов, причём из изученных — только ГА и АЛА. Как видно из таблицы 1, взаимное подавление ГА обнаружено между условно-патогенным микроорганизмом E. coli и индигенным микроорганизмом S. haemolyticus в 6,7±1,2%. Индигенный микроорганизм S. mutans подавлял ГА условно-патогенного E. coli (7,7±1,2%), а индигенный микроорганизм S. salivarius подавлял ГА патогенного S. aureus (10,3±1,4%). Условно-патогенные микроорганизмы, напротив, подавляли ГА индигенных микроорганизмов: так, E. faecalis подавлял ГА S. haemolyticus (6,3±1,1%), а E. coli подавлял ГА S. warneri (2,4±0,7%). Взаимно подавляли АЛА условно-патогенные и индигенные микроорганизмы: E. coli — S. haemolyticus (6,7±1,2%) и S. hyicus — S. mitis (6,7±1,2%). Однонаправленное подавление АЛА отмечено у индигенного микроорганизма S. mitis под влиянием патогенного микроорганизма S. aureus (6,7±1,2%), а также среди патогенных микроорганизмов: у S. aureus под влиянием S. pyogenes (6,7±1,2%).

В ассоциациях от здоровых людей установлена редкая модификация факторов патогенности и персистенции в отдельных парах штаммов-симбионтов (табл. 2). Взаимное усиление ГА выявлено в отдельных парах индигенных микроорганизмов: S. bovis — S. haemolyticus (1,7±1,2%), S. sanguis — S. acidominimus (1,7±1,2%). Однонаправленное усиление ГА выявлено в ассоциациях: A. viridans усиливал ГА S. hyicus (1,7±1,2%), а S. caseolyticus усиливал ГА S. pneumoniae (1,7±1,2%). Взаимное усиление ЛецА отмечено у индигенных микроорганизмов в паре S. bovis и S. haemolyticus (1,7±1,2%). В микросимбиоценозе здоровых людей в отдельных парах установлено однонаправленное усиление ЛецА. Так, условнопатогенный микроорганизм S. hyicus усиливал ЛецА индигенного микроорганизма A. viridans (1,7±1,2%), а индигенный микроорганизм S. sanguis усиливал ЛецА другого индигенного микроорганизма — S. acidominimus (1,7± 1,2%). В модификации АЛА условно-патогенный микроорганизм K. oxytoca усиливал АЛА индигенного микроорганизма S. warneri (1,7±1,2%). Подавление ГА в ассоциациях микросимбио-ценоза верхних дыхательных путей здоровых людей встречалось в отдельных ассоциациях. Так, условно-патогенные микроорганизмы

1. Наиболее активные пары штаммов-симбионтов по модификации факторов патогенности и персистенции у больных гриппом

Пары симбионтов Частота модификации

ГА ЛецА ЛА АЛА

усиление подавление усиление усиление усиление подавление

S.mutans - S. saprophyticus 3,8±0,9 6,7±1,2

S. hyicus - S. mitis 5,1±1,0 6,7±1,2

E. coli - S. mitis 11,4±1,5

E. coli - S.haemolyticus 6,7±1,2 6,7±1,2

S. aureus - S. oralis 6,3±1,1

S. pyogenes - S. aureus 6,7±1,2

S. aureus - S. mitis 6,7±1,2

S. oralis ^ S. aureus 6,7±1,2

S. hominis ^ S. agalactiae 3,2±0,8

S. aureus ^ S. mitis 10,1±1,4 6,7±1,2

S. mutans ^ E. coli 7,7±1,2

S. salivarius ^ S. aureus 10,3±1,4

E. faecalis ^ S. haemolyticus 6,3±1,1

E. coli ^ S. warneri 2,4±0,7

S. pyogenes ^ S. aureus 6,7±1,2

(—) — взаимное изменение признака у штаммов-симбионтов;

(^) — однонаправленное изменение признака у штамма-симбионта.

2. Наиболее активные пары штаммов-симбионтов по модификации факторов патогенности и персистенции у здоровых людей

Пары симбионтов Частота модификации

ГА АЛА

Усиление Подавление Усиление Подавление

S. bovis - S. haemolyticus 1,7±1,2

S. sanguis - S. acidominimus 1,7±1,2

A. viridans ^ S. hyicus 1,7±1,2

S. caseolyticus ^ S. pneumoniae 1,7±1,2

K. oxytoca ^ S. warneri 1,7±1,2

S. arlettae ^ S. caseolyticus 1,7±1,2

E. faecium ^ S. salivarius 1,7±1,2

E. coli ^ A. viridans 1,7±1,2

E. agglomerans ^ S. mitis 1,7±1,2

(—) — взаимное изменение признака у штаммов-симбионтов;

(^) — однонаправленное изменение признака у штамма-симбионта.

подавляли ГА индигенных микроорганизмов: E. faecium подавлял ГА S. salivarius (1,7±1,2%), E. coli подавлял ГА A. viridans (1,7±1,2%), E. agglomerans подавлял ГА S. mitis (1,7±1,2%), иногда подавление ГА выявлено среди инди-генных микроорганизмов. Например, в паре S. arlettae подавлял ГА S. caseolyticus (1,7±1,2%).

Полученные результаты показали, что усиление факторов патогенности и персистенции преобладало в ассоциативных парах от больных гриппом людей, причём дисбаланс микрофлоры привёл к изменению патогенных и персистентных характеристик как патогенной, условнопатогенной, так и индигенной микрофлоры. У здоровых людей усиление признаков было единичным, зачастую обусловленным односторонним усилением фактора под влиянием условнопатогенного либо патогенного микроорганизма.

Антагонистический характер изменения ГА и АЛА преобладал в ассоциациях при гриппе и был обусловлен преимущественно подавлением ГА и АЛА, с одной стороны, у индигенного микроорганизма под влиянием условно-патогенного или патогенного, а также у патогенного микроорганизма под влиянием другого патогена, что ведёт к снижению колонизационной резистентности и селекции преобладающего микроорганизма, с которым связано бактериальное осложнение при гриппе. С другой стороны, индигенные микроорганизмы при гриппе сами начинают мобилизоваться и подавлять ГА и АЛА ассоцианта. Наиболее активные пары на усиление ГА: E. coli (условно-патогенный микроорганизм) — S. mitis (индигенный микроорганизм) и S. aureus (патогенный микроорганизм) — S. mitis (10,1—11,4%). Наиболее активная пара на подавление ГА:

S. salivarius (индигенный микроорганизм) > S. aureus (10,3%)- У здоровых людей антагонизм в микросимбиоценозе обусловлен преимущественным подавлением ГА и АЛА условно-патогенного или патогенного микроорганизма под влиянием индигенного микроорганизма.

Микросимбиоценоз верхних дыхательных путей при гриппе складывается из преимущественного взаимодействия в ассоциациях патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. У здоровых людей микросимбиоценоз стабильный и представлен разнообразными вариантами взаимодействия индигенных микроорганизмов. При гриппе, на фоне общего преобладания патогенной и условно-патогенной микрофлоры, в ассоциациях создаются условия, благодаря которым индигенная микрофлора также вовлекается в патологический процесс, приобретая патогенный потенциал, что усиливает дисбиоз и способствует бактериальным осложнениям.

Литература

1. Бабич Е.Н. Типы взаимодействия микрофлоры ротоглотки с менингококками // Микробиологический журнал (Украина). 1995. Т.57. №5. С. 57-63.

2. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусо-логическим методам исследования. М.: Медицина, 1982. 462 с.

3. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999. 365 с.

4. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В. и др. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург: УрО РАН. 2007. 264 с.

5. Вельский В.В. Взаимное влияние возбудителей при смешанной инфекции ожоговой травмы // Микробиология. 1999. №4. С. 3-7.

6. Матусков С.И. Об антагонизме и синергизме стафилококков и стрептококков в эксперименте // Вестник дерматологии и венерологии. 1966. №9. С. 41—44.

7. Несвижский Ю.В., Воробьев А.А., Белоносов С.С. и др. Анализ простых межмикробных взаимоотношений в микробиоценозе толстой кишки человека // Вестник РАМН. 1997. №3. С, 23-26.

8. Погорелов В.И., Пинигин А.Ф., Марамович А.С. Изучение взаимодействия холерных вибрионов с инфузориями // Микробиология. 1995. №2. С. 22-26.

9. ФельдманЮ.М., Маханева Л.Г., Шапиро А.В. и др. Количественное определение бактерий в клинических материалах // Лабораторное дело. 1984. №10. С. 616—619.

10. Хуснутдинова Л.М. Межбактериальные взаимодействия на слизистой оболочке миндалин человека: автореф. дис. ... к.м.н. Оренбург, 2004.

11. Parrot М., Caufield P.W., Lavoie М.С. Preliminary characterization of four bacteriocins from Streptococcus mutans // Canada J ournal Microbiol. 1990. V36. №2. P. 123-130.