Сигнальный путь р-катенина и устойчивость клеток рака молочной железы к гипоксическим условиям

and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis. Cancer Res. 2004; 64 (19): 7099-109.

19. Liu L., Cao Y., Chen C., Zhang X., McNabola A., Wilkie D. et al. Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway, inhibits tumor an-giogenesis, and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006; 66 (24): 11851-58.

20. Chen K.F., Tai W.T., Liu T.H., HuangH.P, Lin Y.C., Shiau C.W. et al. Sorafenib overcomes TRAIL resistance of hepatocellular carcinoma cells through the inhibition of STAT3. Clin. Cancer Res. 2010; 16: 5189-99.

21. Fernando J., Sancho P., Fernandez-Rodriguez C.M., Lledo J.L., Caja L. et al. Sorafenib sensitizes hepatocellular carcinoma cells to physiological apoptotic stimuli. J. Cell. Physiol. 2012; 227 (4): 1319-25.

22. Rosmorduc O., Desbois-Mouthon C. Targeting STAT3 in hepatocellular carcinoma: Sorafenib again. J. Hepatol. 2011; 55: 957-59.

23. He G., Karin M. NF-kappaB and STAT3 - key players in liver inflammation and cancer. Cell Res. 2011; 21: 159-68.

24. He G., Yu G.Y., Temkin V., OgataH., Kuntzen C., Sakurai T. et al. He-patocyte IKKbeta/NF-kappaB inhibits tumor promotion and progression by preventing oxidative stress-driven STAT3 activation. Cancer Cell. 2010; 17 (3): 286-97.

25. Tai W.T., Cheng A.L., Shiau C.W., Huang H.P., Huang J.W., Chen P.J. et al. Signal transducer and activator of transcription 3 is a major kinase-independent target of sorafenib in hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 2011; 55 (5): 1041-48.

26. CervelloM., McCubrey J.A., Cusimano A., LampiasiN., AzzolinaA., Montalto G. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma: novel agents on the horizon. Oncotarget. 2012; 3 (3): 236-60.

27. Serova M., de Gramont A., Tijeras-Raballand A., Dos Santos C., Riveiro M.E., Slimane K. et al. Benchmarking effects of mTOR, PI3K, and dual PI3K/mTOR inhibitors in hepatocellular and re-

nal cell carcinoma models developing resistance to sunitinib and sorafenib. Cancer Chemother. Pharmacol. 2013; 71 (5): 1297-307.

28. Blivet-Van EggelpoëlM.J., Chettouh H., Fartoux L., Aoudjehane L., Barbu V., Rey C. et al. Epidermal growth factor receptor and HER-3 restrict cell response to sorafenib in hepatocellular carcinoma cells. J. Hepatol. 2012; 57 (1): 108-15.

29. Castillo J., Erroba E., PerugorríaM.J., Santamaría M., Lee D.C., Prieto J. et al. Amphiregulin Contributes to the Transformed Phenotype of Human Hepatocellular Carcinoma Cells. Cancer Res. 2006; 66: 6129-38.

30. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011; 144 (5): 646-74.

31. ЛазаревичН.Л. Молекулярные механизмы прогрессии опухолей печени. Успехи биологической химии. 2004; 44: 365-418.

32. van ZijlF., MallS., Machat G., Pirker C., ZeillingerR., Weinhaeusel A. et al. A human model of epithelial to mesenchymal transition to monitor drug efficacy in hepatocellular carcinoma progression. Mol. Cancer Ther. 2011; 10 (5): 850-60.

33. Lazarevich N.L., Shavochkina D.A., Fleishman D.I., Kustova I.F., Morozova O.V., Chuchuev E.S. et al. Deregulation of hepatocyte nuclear factor 4 (HNF4)as a marker of epithelial tumors progression. Exp. Oncol. 2010; 32 (3): 167-71.

34. Xin H.W., Ambe C.M., Hari D.M., Wiegand G.W., Miller T.C., Chen J.Q. et al. Label-retaining liver cancer cells are relatively resistant to sorafenib. Gut; 2013; Feb 14. Available at: http://gut.bmj.com/con-tent/early/2013/02/13/gutjnl-2012-303261.abstract?sid=1d0cf7c2-dfdd-4e10-9b2d-b4e4f8f433b7

35. Majumdar A., Curley S.A., Wu X., Brown P., Hwang J.P., Shetty K. et al. Hepatic stem cells and transforming growth factor ß in hepatocellular carcinoma. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2012; 9 (9): 530-8.

36. MarquardtJ.U., ThorgeirssonS.S. Stem cells in hepatocarcinogenesis: evidence from genomic data. Semin. Liver Dis. 2010; 30 (1): 26-34.

Поступила 01.07.13

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2013

УДк 618.19-006.6:616-008.1-008.64]-07

А.М. Щербаков, Л.Б. Стефанова, И.А. Якушина, М.А. Красильников

СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ В-КАТЕНИНА И УСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ К ГИПОКСИЧЕСКИМ УСЛОВИЯМ

ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва

Ранее мы показали, что в клетках рака молочной железы HBL-100, устойчивых к гипоксии, происходит активация белка-регулятора эпителиально-мезенхимального перехода Snail. Задачей настоящей работы являлось оценить роль сигнального пути в-катенина в поддержании устойчивости клеток рака молочной железы к гипоксии. В работе использовали клетки рака молочной железы MCF-7 и HBL-100; клеточная линия HBL-100 характеризуется повышенной устойчивостью к гипоксии.

Мы продемонстрировали, что в условиях гипоксии происходит активация транскрипционного фактора в-катенина, которая поддерживается белком-регулятором эпителиально-мезенхимального перехода Snail. В свою очередь активированный в-катенин регулирует экспрессию генов ответа клеток на гипоксию и соответственно поддерживает устойчивость рака молочной железы к пониженному содержанию кислорода. Координированная активация системы белков Snail/в-катенин/HIF-1a в клетке может рассматриваться как важный фактор, определяющий устойчивость опухоли к гипоксии.

Ключевые слова: эпителиально-мезенхимальный переход, рак молочной железы, в-катенин, гипоксия, HIF-1a

Одним из ключевых факторов, определяющих развитие опухоли, является гипоксия. Дефицит кислорода в микроокружении опухолевых клеток способствует развитию резистентности рака молочной железы (РМЖ) к

Для корреспонденции:

Щербаков Александр Михайлович, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. клин. биохимии

Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24 E-mail: alex. scherbakov@gmail.ru

химио- и гормонотерапии, что подтверждается большим количеством клинических данных [1-3]. Опухолевые клетки способны быстро адаптироваться к гипоксии и их защитные реакции направлены на активацию ряда внутриклеточных сигнальных путей, поддерживающих рост в условиях пониженного уровня кислорода [4]. В целом, опухоли, развивающиеся в условиях гипоксии, характеризуются более высокой степенью злокачественности и выраженной способностью к автономному, нерегулируемому росту [4].

•<— ß-катенин

-<— а-тубулин

MCF-7

HBL-100

MCF-7 3 si-scramled

HBL-100 Ü si-Snail

Рис. 1. Snail и активность р-катенина в клетках рака молочной железы. а - экспрессия р-катенина в клетках РМЖ MCF-7 и HBL-100 (результаты иммуноблоттинга); б - влияние малых интерферирующих РНК Snail (si-Snail) на активность р-катенина в клетках MCF-7 и HBL-100 (анализ активности люцеферазы).

Ранее мы показали, что высокий уровень белка-регулятора эпителиально-мезенхимального перехода Snail является одним из факторов, поддерживающих выживаемость клеток рака молочной железы в условиях гипоксии; при этом активация Snail может быть обусловлена, как минимум частично, снижением активности рецептора эстрогенов (ERa), связанного со Snail системой негативной регуляции [5-7]. Ряд данных литературы свидетельствует о взаимосвязи сигнальных путей Snail и Wnt/p-катенина [8-10], что позволило нам предложить гипотезу о возможной координированной регуляции системы Snail/p-катенина в клетках РМЖ HBL-100-устойчивых к гипоксии.

Основной целью настоящей работы явилось оценить роль сигнального пути Р-катенина в поддержании устойчивости клеток рака молочной железы к гипоксическим условиям.

Материалы и методы. Клетки рака молочной железы человека линии MCF-7 и HBL-100 культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 7% эмбриональную сыворотку телят («HyClone», США) и гентамицин (50 ед/мл) («ПанЭко», Россия) при 37°С и 5% СО2. Линии клеток MCF-7 и HBL-100 получены из коллекции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Для моделирования условий гипоксии клетки культивировали в двухгазовом СО2-инкубаторе «Binder» (Германия) с поддержанием концентрации О2 в пределах 1%.

В трансфекционных экспериментах по определению активности HIF-1a использовалась плазмида HRE-люц., содержавшая ген люциферазы под контролем гипоксиреспонсивного элемента (предоставлена Dr. Giovanni Melillo) [11]. Репортерная лентивирусная конструкция, содержащая ген люциферазы под контролем Р-катенинчувствительного промотора, и химические соединения CHIR 99021 и ICG-001 [12] предоставлены В. Татарским.

Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции плазмиды HRE-люц. применялась котрансфекция клеток плазмидой, содержавшей ген Р-галактозидазы. Расчет активности лю-циферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактози-дазы в исследованных образцах).

Для трансфекции малых (коротких) интерферирующих РНК (siRNA) использовали олигонуклеотиды следующих последовательностей: scrambled siRNA (sense 5'-CAGUCGCGUUUGCGACUGGdTdT -3'), Snail

siRNA (sense 5'-AGGCCUUCAACUGCAAAUAdTdT -3'), ß-катенин siRNA (sense 5'-AGCUGAUAUUGAUG-GACAGdTdT-3'), а также соответствующие антисмысловые олигонуклеотиды («Синтол», Россия). Транс-фекцию клеток полученными олигонуклеотидами и плазмидой HRE-люц. [11] проводили в течение 4 ч с использованием реагента Metafectene Pro («Biontex Laboratories GmbH», Германия) при 37°C и 5% СО2. Конечная концентрация siRNA составляла 50 нМ.

Для проведения иммуноблоттинга клетки на стадии формирования 80% монослоя снимали с чашек в 1,2 мл фосфатного буфера. Далее из полученных образцов выделяли клеточные экстракты для последующего электрофореза и иммуноблоттинга, как описано ранее [13]. Использовались антитела к ß-катенину, а-тубулину («Cell Signaling Technology", США).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы Origin 6. Во всех случаях статистические критерии считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Сигнальный путь ß-катенина и Snail. Белок ß-катенин является одним из ключевых транскрипционных ко-факторов, участвующих в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода, отчасти благодаря взаимодействию со Snail [10, 14]. На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии ß-катенин в клеточных линиях РМЖ MCF-7 и HBL-100. Ранее мы показали, что клетки MCF-7 более чувствительны к гипоксии, чем клетки HBL-100, и что в поддержании устойчивости к гипоксии клеток HBL-100 принимает участие Snail-сигнальный путь [5]. Оказалось,

12000-1

i 10000-1 I-

0 8000-

З' 2

г т s

I £ I

со.

60004000 20000

MCF-7 Контроль

HBL-100 | Гипоксия

Рис. 2. Влияние гипоксии на активность ß-катенина в клетках MCF-7 и HBL-100.

6000-,

у/7?//

4000-1

2000-

9

J

2 Ç

ш о: х

3000-

+ICG-001

si-scrambled si-ß-катенин

+CHIR 99021

| Контроль |§ Гипоксия

Контроль Щ Гипоксия (1%02

Рис. 3. HIF-1a и сигнальный путь ß-катенина в клетках HBL-100. Влияние химического ингибитора ß-катенина (ICG-001) (а) и малых интерферирующих РНК ß-катенина (si-ß-катенин) (б) на активность HIF-1a в клетках HBL-100.

Рис. 4. Влияние химического активатора ß-катенина (CHIR 99021) на активность HIF-1a в клетках HBL-100.

что по данным иммуноблоттинга уровень экспрессии ß-катенина в этих линиях не различается (рис. 1, а). Для оценки активности ß-катенина использовали трансфекцию в клетки лентивирусной конструкции, содержавшей ген люциферазы под контролем ß-катенинчувствительного промотора. Эксперименты по оценке влияния Snail на активность ß-катенина проводили в присутствии 2-10-6 M CHIR 99021 (Tocris) - специфичного индуктора ß-катенина. Мы показали, что специфичное подавление Snail с помощью малых интерферирующих РНК Snail (siRNA Snail) приводит к снижению активности ß-катенина как в клеточной линии MCF-7, так и в HBL-100 (рис. 1, б).

Активация ß-катенина в гипоксических условиях. Мы обнаружили, что культивирование клеток в условиях гипоксии (1% кислорода) вызывает значительный рост активности ß-катенина в клетках HBL-100, тогда как в MCF-7 не было выявлено достоверных изменений этого показателя (рис. 2). Как было отмечено выше, в предыдущей работе мы показали повышенную устойчивость клеток HBL-100 к гипоксии [5]. Роль ß-катенина в формировании устойчивости клеток к гипоксии оценивали с помощью двух подходов: подавления ß-катенина с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA ß-катенин) и с использованием специфического ингибитора ß-катенина ICG-001. Обнаружено, что как siRNA ß-катенин, так и химический ингибитор ICG-001, эффективно снижают в клетках HBL-100 активность HIF-1а, основного белка, отвечающего за реакцию и молекулярный ответ клеток на гипоксию (рис. 3, а, б). C другой стороны, стимуляция ß-катенина в присутствии CHIR 99021 приводила к дополнительной индукции HIF-1a в клетках HBL-100 (рис. 4). Полученные результаты свидетельствуют об непосредственном участии ß-катенина в сигнальных путях, активируемых в клетках РМЖ при гипоксии, и указывают на прямую взаимосвязь ß-катенина с HIF-1a и/или его эффекторами.

Важная роль ß-катенина в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода и выживаемости клеток в гипоксии прослеживается и на других клеточных моделях. Так, в последней работе Q. Zhang и соавт. исследовано влияние Wnt/ß-катенинсигнального пути на регуляцию эпителиально-мезенхимального перехода, индуцированного гипоксией в клетках гепатоцеллюлярной карциномы [15]. Авторы показали не только увеличение активности ß-катенина в гипоксии, что подтверждено в наших экспериментах на клеточной линии HBL-100, но и выявили, что инкубация клеток Huh-7 в условиях гипоксии в

течение 96 ч приводит к увеличению содержания белка Р-катенин (по данным иммуноблоттинга). Кроме того, методом иммунопреципитации в клетках Huh-7 обнаружено связывание белков HIF-1a и Р-катенин, что указывает на прямое взаимодействие между этими белками. В целом, Q. Zhang и соавт. продемонстрировали, что, стимулируя HIF-1a, Р-катенин регулирует гипоксииндуцированный эпителиально-мезенхимальный переход и повышает выживаемость клеток [15].

Таким образом, мы показали, что в условиях гипоксии происходит активация транскрипционного фактора Р-катенин, которая (отчасти) поддерживается белком-регулятором эпителиально-мезенхимального перехода Snail. В свою очередь активированный Р-катенин регулирует экспрессию генов ответа клеток на гипоксию и соответственно поддерживает устойчивость клеток РМЖ к пониженному содержанию кислорода. В целом, координированная активация системы белков Snail/p-катенин/ HIF-1a в клетках может рассматриваться как важный фактор, определяющий устойчивость опухоли к гипоксии.

Полученные результаты мы рассматриваем как базу для дальнейших исследований, целью которых является изучение молекулярного механизма адаптации клеток РМЖ к гипоксии и новых подходов к повышению чувствительности злокачественных опухолей к химиотерапии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Ми-нобрнауки РФ (Соглашение №8104), РФФИ (гранты № 13-04-00284, 12-04-00992 и 11-04-00257) и благотворительного фонда «Протек».

ЛИТЕРАТУРА

1. Generali D., Berruti A., Brizzi M.P., Campo L., Bonardi S., Wigfield S., Bersiga A., Allevi G., Milani M., Aguggini S., Gandolfi V., Do-gliottiL., Bottini A., HarrisA.L., Fox S.B. Hypoxia-inducible factor-1alpha expression predicts a poor response to primary chemoen-docrine therapy and disease-free survival in primary human breast cancer. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2006; 12 (15): 4562-8.

2. Generali D., Buffa F.M., Berruti A., Brizzi M.P., Campo L., Bonardi S., Bersiga A., Allevi G., Milani M., Aguggini S., Papotti M., Do-gliotti L., Bottini A., Harris A.L., Fox S.B. Phosphorylated ERalpha, HIF-1alpha, and MAPK signaling as predictors of primary endocrine treatment response and resistance in patients with breast cancer. J. Clin. Oncol. 2009; 27 (2): 227-34.

3. SpanP.N., BussinkJ., MandersP., BeexL.V., Sweep C.G. Carbonic an-hydrase-9 expression levels and prognosis in human breast cancer: association with treatment outcome. Br. J. Cancer. 2003; 89 (2): 271-6.

4. Milani M., Harris A.L. Targeting tumour hypoxia in breast cancer. European journal of cancer. 2008; 44 (18): 2766-73.

5. Стефанова Л.Б., Щербаков А.М., Сорокин Д.В., Шатская В.А., Красильников М.А. Механизм устойчивости к гипоксии клеток эстрогеннезависимого рака молочной железы: роль белков эпителиально-мезенхимального перехода Snail и бета-катенина. Молекулярная медицина. 2013; 1: 26-30.

6. Щербаков А.М., Стефанова Л.Б., Андреева О.Е., Сорокин Д.В., Красильников М.А. Роль Snail-сигнального пути в развитии устойчивости к гипоксии клеток рака молочной железы. Технологии живых систем. 2012; 9 (9): 63-7.

7. ScherbakovA.M., AndreevaO.E., Shatskaya V.A., Krasil'nikov M.A. The relationships between snail1 and estrogen receptor signaling in breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 2012; 113 (6): 2147-55.

8. Weis W.I., Nelson W.J. Re-solving the cadherin-catenin-actin conundrum. J. Biol. Chem. 2006; 281 (47): 35593-7.

9. Jin T., George Fantus I., Sun J. Wnt and beyond Wnt: multiple mechanisms control the transcriptional property of beta-catenin. Cell Signal. 2008; 20 (10): 1697-1704.

10. Lee S.Y., Jeon H.M., Ju M.K., Kim C.H., Yoon G., Han S.I., Park H.G., KangH.S. Wnt/Snail signaling regulates cytochrome C oxidase and glucose metabolism. Cancer research. 2012; 72 (14): 3607-17.

11. Rapisarda A., Uranchimeg B., Sordet O., Pommier Y., Shoemaker

R.H., Melillo G. Topoisomerase I-mediated inhibition of hypoxia-inducible factor 1: mechanism and therapeutic implications. Cancer Res. 2004; 64 (4): 1475-82.

12. Eguchi M., Nguyen C., Lee S.C., Kahn M. ICG-001, a novel small molecule regulator of TCF/beta-catenin transcription. Med. Chem. 2005; 1 (5): 467-72.

13. Lobanova Y.S., Scherbakov A.M., Shatskaya V.A., Evteev V.A., Krasil'nikov M.A. NF-kappaB suppression provokes the sensitization of hormone-resistant breast cancer cells to estrogen apoptosis. Molecular and cellular biochemistry. 2009; 324 (1-2): 65-71.

14. Zheng H., Li W., Wang Y., Liu Z., Cai Y., Xie T., Shi M., Wang Z., Jiang B. Glycogen synthase kinase-3 beta regulates Snail and beta-catenin expression during Fas-induced epithelial-mesenchymal transition in gastrointestinal cancer. European journal of cancer. Epub 9 April 2013.

15. Zhang Q., BaiX., Chen W., Ma T., Hu Q., Liang C., Xie S., Chen C., Hu L., Xu S., Liang T. Wnt/beta-catenin signaling enhances hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via crosstalk with hif-1alpha signaling. Carcinogenesis. 2013; 34 (5): 962-73.

nocTymna 01.07.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.831-006.04-074

Н.В. Любимова, М.Г. Томс, Р.Г. Фу, Ю.В. Бондаренко

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЯМИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва

Представлены данные сравнительного определения нейроспецифических белков S-100 и GFAP в сыворотке крови 145 нейроонкологических больных и 69 практически здоровых людей. Для больных с глиобластомами (01У) было установлено выраженное высокодостоверное увеличение концентрации S-100 и GFAP по сравнению с пациентами с анапластически-ми астроцитомами (GШ), доброкачественными менингиомами (GI), метастатическими поражениями головного мозга и контрольной группы. При этом концентрации S-100 в сыворотке крови больных с анапластическими астроцитомами, доброкачественными менингиомами и метастатическими поражениями головного мозга достоверно не различались между собой, а по отношению к контрольной группе было установлено достоверное повышение содержания белка только в группе больных с церебральными метастазами. Характерной отличительной особенностью GFAP была максимально высокая частота его выявления у больных с глиобластомой (83%) по сравнению с другими группами нейроонкологических больных, а также практически здоровыми донорами, у которых белок практически не определялся. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования GFAP как маркера глиобластомы, а S-100 в качестве дополнительного биохимического критерия поражения ГМу онкологических больных.

Ключевые слова: S-100, GFAP, сыворотка крови, опухоли головного мозга

Дифференциальная диагностика первичных и метастатических опухолей головного мозга (ГМ) остается одной из актуальных проблем современной нейроонкологии. Информативность и специфичность основных, используемых в настоящее время методов нейровизуализации (КТ, МРТ) часто оказываются недостаточными для надежной дифференци-ровки новообразований ГМ разной этиологии [1]. В связи с этим существует необходимость поиска дополнительных

Для корреспонденции:

Любимова Нина Васильевна, д-р биол. наук, проф., вед. науч. сотр. лаб. клин. биохимии

Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24 E-mail: biochimia@mtu-net.ru

неинвазивных способов их выявления и дифференцировки на самом раннем этапе диагностического исследования. Известно, что в процессе развития интракраниальных опухолей ЦНС, в частности глиом, головной мозг подвергается как механическому, так и токсическому воздействию со стороны растущей опухоли. При этом реакция мозговых структур, в частности глии и астроцитов, может определять состав ней-роспецифических белков (НСБ), которые экспрессируются нормальными и опухолевыми клетками в крови. Кроме того, некроз самой опухоли также может оказывать влияние на представительство этих белков в циркуляторном русле, однако точный механизм этого процесса до сих пор остается неизвестным. Повышенные уровни таких нейроспецифических белков, как основной белок миелина (МВР), S-100, нейронспецифическая енолаза (№Е) и глиофибриллярный