Экспресс-тест на основе ПЦР, позволяющий предсказывать чувствительность опухоли головного мозга конкретного пациента к онколитическим вирусам
EXPRESS TEST ON BASIS OF PCR, WHICH ENABLES TO PREDICT SENSITIVITY OF BRAIN TUMOR OF SPECIFIC PATIENT TO ONCOLYTIC VIRUSES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицине и касается экспресс-теста, позволяющего методом ПЦР-анализа определять экспрессии в образце опухолевой ткани головного мозга пациента ряда маркерных генов, анализ экспрессии которых можно использовать для предсказания чувствительности опухоли конкретного пациента к онколитическим вирусам. Предлагаемое изобретение может найти применение в медицине и клинической лабораторной диагностике для подбора персонифицированной терапии злокачественных новообразований головного мозга.
Уровень техники
Несмотря на достижения современной медицины, излечение пациентов со злокачественными опухолями глиального происхождения остается нерешенной задачей. Инвазивный характер и расположение в жизненно важных областях головного мозга ограничивают возможности хирургического лечения, применение химиолучевой терапии осложняется высокой устойчивостью опухолевых стволовых клеток, обуславливающей появление рецидивов заболевания, а адъювантная терапия пока также не приносит ожидаемых результатов [1, 2].
Совершенствование технологий биоселекции, а также конструирования рекомбинантных вирусов позволили создать штаммы, обладающие онколитическими свойствами в отношении глиальных опухолей. Многие штаммы прошли первую стадию клинических испытаний и продемонстрировали практическое отсутствие токсичности и высокую безопасность их использования. Несмотря на очевидную перспективность данного подхода и демонстрацию впечатляющих результатов у отдельных пациентов, терапевтическое действие существующих штаммов мало предсказуемо, что указывает на необходимость их дальнейшего совершенствования.
Злокачественные заболевания крайне индивидуальны, что обуславливает различия в чувствительности опухолей отдельных пациентов к онколитическим вирусам. Поэтому для повышения эффективности терапии требуется учитывать индивидуальные особенности опухоли, что позволит подбирать для каждого пациента наиболее эффективный для его случая набор онколитических штаммов.
Эффективность проникновения вируса в клетку, успешность его репликации и распространение зависят от ряда факторов, присутствующих в клетке-хозяине. Первым этапом взаимодействия вируса и клетки является связывание вируса с поверхностными рецепторами - молекулами, имеющими сродство к вирусу. За проникновения непатогенных энтеровирусов в клетки человека отвечают различные рецепторы. Для полиовируса - это полиовирусный рецептор (PVR, также CD155 или NECL5) [3], является трансмембранным гликопротеидом, относящимся к суперсемейству иммуноглобулинов, его внешний домен отвечает за прикрепление клетки к внеклеточному матриксу путем связывания с витронектином, а внутриклеточный домен взаимодействует с легкой цепью динеина Tctex-1/DYNLTl [4]. Для вируса Коксаки группы В - это рецептор некоторых вирусов Коксаки группы В и аденовирусов (CXADR или CAR) [5], является представителем рецепторов адгезии семейства JAM, расположен в плотных и адгезионных контактах на стыке эпителиальных клеток, контролирует в межклеточных контактах стабильность Е-кадгерина путем участия в его Src-зависимом эндоцитозе [6]. А для некоторых вирусов Коксаки группы А и ряда Эховирусов - это CD55 или DAF [7-10] поверхностный трансмембранный гликопротеин участвующий в регуляции каскада комплемента, связывание с CD55 белков комплемента ускоряет их разрушение, чем прерывает каскад и защищает клетки организма от повреждения [11-13].
2
1
Но не для всех энтеровирусов достаточно присутствие только вышеупомянутых рецепторов, но также необходимо присутствие других рецепторов или дополнительных молекул, выступающих в роли ко-рецептора. Например, установлено что ЕСН01 взаимодействует с интегрином αβ (ITGA2) [14-26]; Coxsackie А21 - с молекулой межклеточной адгезии ICAM-1 [27]; проникновение в клетки энтеровируса 71 и Coxsackie А24 зависит от присутствия молекулы клеточной адгезии Р-селектина SELPLG [28-31]; фагоцитарный рецептор SCARB2 способствует проникновению Coxsackie А7, А14, А16 и энтеровируса 71 [32,33].
Но проникновение вируса в клетку не может в полной мере обеспечить репликацию вируса из-за присутствия в клетках определенных механизмов противовирусной защиты, в том числе механизмов интерферонового ответа. Клетки опухоли в ходе злокачественной прогрессии утрачивают многие механизмы противовирусной защиты и поэтому становятся привлекательными мишенями для вирусного онколиза [34, 35]. В системе индукции интерферона существует множество сигнальных путей, подавление которых может способствовать репликации и распространению определенных онколитических вирусов. К таким молекулам мишеням можно отнести регуляторные факторы интерферонов (IRF); митохондриальный антивирусный сигнальный белок (MAVS); переносчик сигналов и фактор транскрипции (STAT); Nod-подобный рецептор XI (NLRX1) и другие [36].
Наиболее подходящим методом для быстрого определения уровня экспрессии небольшого числа генов - биомаркеров, является ПЦР в реальном времени (рвПЦР). В ходе проведения рвПЦР количество амплифицированной ДНК определяется после каждого цикла амплификации («в реальном времени») за счет прямой детекции флуоресценции в пробирке, уровень которой прямо пропорционален количеству ПЦР-продукта. Такой анализ является весьма быстрым и не требует проведения дополнительных процедур детекции продуктов амплификации (электрофорез и визуализация), что в значительной мере уменьшает риск контаминации и число ложноположительных результатов [37-40].
Для определения динамики наработки ампликонов могут быть использованы интеркалирующие красители или флуоресцентно меченные олигонуклеотидные пробы. При использовании флуоресцентномеченых олигонуклеотидных проб, олигонуклеотид (зонд), комплементарный амплифицируемому фрагменту, связывают с флуорофором и гасителем (тушителем) флуоресценции. Когда флуорофор и тушитель связаны с зондом, кванты света флуорофора эффективно поглощаются тушителем и наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5-3' экзонуклеазной активности Taq-полимеразы олигонуклеотидный зонд гидролизуется, флуоресцентная метка освобождается и переходит в раствор, создавая флуоресцентный сигнал [39-42].
Метод позволяет достоверно регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определенной последовательности. В связи со значительным разнообразием флуорофоров (со значительно отличающимся спектром флуоресценции), возможно параллельное использование сразу нескольких зондов, комплементарных нескольким последовательностям - мультиплексная ПЦР (МПЦР) в реальном времени. Мультиплексная полимеразная реакция - вариант проведения ПЦР, при котором в реакционном объеме одновременно присутствует смесь нескольких пар праймеров, специфичных в отношении разных мРНК, что позволяет проводить одновременную амплификацию соответствующих участков. Этот подход активно внедряется в разных областях ПЦР диагностики [43-47]. Переход от моноплексного формата к мультиплексному повышает минимально выявляемое количество мРНК примерно в 3-4 раза (с 6 копий/реакции до 20 копий/реакции). Тем не менее, значительно повышается воспроизводимость результатов анализа и намного сокращает время проведения процедуры [48, 49].
Таким образом, исходя из уровня техники, существует потребность в создании экспресс-теста на основе ПЦР, позволяющего предсказывать чувствительность опухоли головного мозга конкретного пациента к онколитическим вирусам и подбирать персонифицированную терапию.
Раскрытие сущности изобретения
Задачами настоящего изобретения являются: 1) определение перечня генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам 2) разработка схемы мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам.
Первая техническая задача решается за счет того, что путем анализа и сопоставления данных литературы, данных транскриптомного секвенирования опухолевых клеток головного мозга, данных по определению чувствительности опухолевых клеток к онколитическим вирусам был сформирован перечень генных маркеров, связанных с чувствительностью клеток к онколитическим вирусам. Формирования окончательного перечня генных маркеров чувствительности опухолевых клеток головного мозга к онколитическим вирусам производится с помощью верификации связи генных маркеров путем выключения экспрессии этих маркеров с помощью специфической РНК интерференции, либо гиперэкспрессии этих маркеров с использованием метода лентивирусной трансдукции.
Существенные признаки, характеризующие перечень генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам согласно настоящему изобретению:
1) Перечень генных маркеров чувствительности с указанием направленности связи для каждого онколитического вируса. Перечень представлен в Табл. 1.
2) Коэффициент ранговой корреляции Спирмена между уровнем экспрессии маркерных генов, вошедших в определяемый перечень генных маркеров, и чувствительности к онколитическим вирусам в отношении органных культур злокачественных опухолей головного мозга равен, либо больше . Коэффициенты корреляции Спирмена уровней экспрессии маркерных генов и чувствительности к онколитическим вирусам в отношении органных культур злокачественных опухолей головного мозга представлены на Фиг. 1.
3) В перечень вошли генные маркеры со степенью несоответствия результатов вычисления коэффициентов ранговой корреляции Спирмена, выявленной в результате верификации связи генных маркеров путем выключения экспрессии этих маркеров с помощью специфической РНК интерференции, либо гиперэкспрессии этих маркеров с использованием метода лентивирусной трансдукции, равной менее 0,5. Степень несоответствия, выявленная в ходе верификации связи генных маркеров в определении чувствительности к конкретным онколитическим вирусам представлена на Фиг. 2.
Способ определения списка генных маркеров представлен в Примере 1. Перечень генных маркеров представлен в Табл. 1. На Фиг. 1. представлены коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между уровнями экспрессии маркерных генов в злокачественных опухолях головного мозга и их чувствительностью к онколитическим вирусам, а на Фиг. 2 степень несоответствия, выявленная в ходе верификации связи генных маркеров, в определении чувствительности к конкретным онколитическим вирусам.
Вторая техническая задача решается за счет того, что был проведен дизайн специфических последовательностей праймеров и зондов для амплификации участков определяемых маркерных генов и генов «домашнего хозяйства», подходящих для проведения мультиплексного ПЦР в режиме реального времени, а также разработана схема проведения ПЦР.
Существенные признаки, характеризующие разработку схемы мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам согласно настоящему изобретению:
1) Специфические праймеры для амплификации участков генов маркеров и генов «домашнего хозяйства», подходящие для проведения мультиплексной ПЦР. Последовательность праймеров представлена в Табл. 2.
2) Специфические зонды для детекции амплификации участков маркерных генов и генов «домашнего хозяйства», подходящие для проведения мультиплексной ПЦР. Последовательность праймеров представлена в Табл. 3.
3) Комбинирование генных маркеров и генов «домашнего хозяйства» для определения в одном анализе Схема представлена на Фиг. 3.
Схема мультеплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим представлена в Примере 2. Комбинации генов для детекции в одной реакции представлены на Фиг. 3.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 демонстрирует коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между уровнями экспрессии маркерных генов в злокачественных опухолях головного мозга и их чувствительностью к онколитическим вирусам.
Фиг. 2 демонстрирует степень несоответствия, выявленную в ходе верификации связи генных маркеров в определении чувствительности к конкретным онколитическим вирусам.
Фиг. 3 демонстрирует группы генных маркеров, которые определяются совместно в одной реакции.
Фиг. 4 демонстрирует изменения генного профиля злокачественных опухолей головного мозга человека под воздействием онколитических вирусов.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает экспресс-тест, позволяющий методом ПЦР-анализа определять экспрессии в образце опухолевой ткани головного мозга пациента ряда маркерных генов, анализ экспрессии которых можно использовать для предсказания чувствительности опухоли конкретного пациента к онколитическим вирусам. Экспресс-тест представляет собой тест-систему для определения уровня экспрессии генных маркеров чувствительности в злокачественных опухолях головного мозга к онколитической виротерапии методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.
Список определяемых генных маркеров, позволяющих предсказывать чувствительность опухолевых клеток к действию онколитического вируса, должен включать в себя генные маркеры со значением коэффициента ранговой корреляции Спирмена между уровнем экспрессии маркерных генов и чувствительностью к онколитическим вирусам равным, либо большим  (Фиг. 1). Кроме этого проводилась верификация связи генных маркеров с чувствительностью с помощью получения и тестирования клеточных линий с измененным уровнем экспрессии (нокдаун или гиперэксспресия гена). На основе этих данных определяли степень несоответствия результатов вычисления коэффициентов ранговой корреляции Спирмена. Перечень определяемых генных маркеров должен включать в себя, только те генные маркеры, у которых степень несоответствия ниже или равна 0,5 (Фиг. 2). Окончательный список генных маркеров, определение уровня экспрессии которых позволяет предсказывать чувствительность злокачественных опухолей головного мозга пациента к терапевтическому действию онколитических вирусов, представлен в Табл. 1.
Для обеспечения оптимальных условий мультиплексной ПЦР в режиме реального времени необходимо использовать специфические праймеры и олигонуклеотидные зонды, меченные флуорофором. Выбор последовательности праймеров, используемых для проведения ПЦР, является важнейшим этапом разработки тест-системы. К праймерам для рвПЦР выдвигаются следующие основные требования:
- длина - 18-30 п.н
- GC-состав - 40-60%
т
- температура отжига (Т) - 50-65°С
- длина ампликона - 90-150 п.н.
т
Желательно, чтобы Т праймеров была близка между собой (Espy et al., 2006), в то же время температура плавления зондов должна быть на 5-10°С выше (при этом примерно одинакова для всех зондов). Это условие диктуется необходимостью взаимодействия зонда с ампликоном до того, как полимераза начнет синтезировать комплементарную цепь ДНК. Только в этом случае будет обеспечено эффективное разрушение зонда за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы (пик 5'-экзонуклеазной активности - около 60°С). Для исключения возможности формирования димеров праймеров, как минимум четыре 3'-концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому праймеру, праймеру в паре или зонду. Желательно, чтобы последовательность не содержала повторов и протяженных участков из одного типа нуклеотидов (более 4-5 азотистых оснований одного типа подряд).
Для проведение детекции продуктов амплификации в мультиплексной схеме ПЦР были выбраны 4 пары флуорофор-тушитель флуоресценции. А все генные маркеры и гены «домашнего хозяйства» были разделены на группы по 3-4 гена (Фиг. 3). Было проведено компьютерное моделирование взаимодействия всех праймеров и зондов с последовательностями кДНК и между собой для исключения возможности неспецифической гибридизации и соответственно получения ложноположительных результатов. Последовательности специфичных праймеров и зондов представлены в Табл. 2 и 3.
Примеры осуществления настоящего изобретения.
Пример 1. Способ определения списка генных маркеров
Проанализировав данные литературы, были выбраны 23 гена (PVR, CD55, CXADR, ICAM1, ITGAV, ITGB1, ITGA2, ITGB3, SELPLG, TMPRSS2, TMPRSS4, TMPRSS9, TMPRSS11D, EIF2AK2, IFIH1, MAVS, IRF-3, IRF-9, STAT1, STAT2, NLRX1, SCARB2, RARRES3), необходимые для эффективного проникновения в клетки, онколиза и продукции вирусного потомства панели исследуемых онколитических вирусов. С помощью количественного ПЦР в реальном времени был получен экспрессионный профиль этих 23 генов в 238 органных культурах злокачественных опухолей головного мозга.
Каждая органная культура тестировалась на чувствительность к онколитическим вирусам. Из органных культур, для изучения изменения уровня относительной экспрессии панели генов под воздействием вирусов, были выбраны по 60 образцов на каждый вирус (с разной чувствительностью к вирусу). Отобранные органные культуры инфицировались соответствующим вирусом и через 5 часов проводили выделение тотальной РНК и количественную ртПЦР. Изменения генного профиля злокачественных опухолей головного мозга человека под воздействием онколитических вирусов представлена на Фиг. 4.
Затем были вычислены коэффициенты ранговой корреляции с целью выявления наиболее значимых предсказательных маркеров. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена - это непараметрический метод, используемый для статистического изучения связи между явлениями, отражающий фактическую степень параллелизма между двумя количественными рядами изучаемых признаков. Именно такой метод дает наиболее точную оценку тесноты установленной связи с помощью количественно выраженного коэффициента.
Коэффициент корреляции Спирмена вычисляется по формуле 1:
Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена между уровнями экспрессии маркерных генов в злокачественных опухолях головного мозга и их чувствительностью к онколитическим вирусам представлены на Фиг. 1.
Далее проводили работу по созданию сублиний клеток с подавлением экспрессии генных маркеров с помощью специфической РНК интерференции, либо гиперэкспрессии этих маркеров с использованием метода лентивирусной трансдукции. Изменение экспрессии подтверждали с помощью ПЦР в режиме реального времени. Полученные линии тестировали на чувствительность к онколитическим вирусам и сравнивали с исходной чувствительностью. Затем проводили верификацию генных маркеров и вычисляли степени несоответствия, которые представлены на Фиг. 2. В перечень вошли генные маркеры со степенью несоответствия результатов вычисления коэффициентов ранговой корреляции Спирмена, выявленной в результате верификации связи генных маркеров, равной 0,5 или меньше. Итоговый список генных маркеров представлен в Табл. 1.
Пример 2. Схема мультеплексной ПЦР в режиме реального времени для детекции генных маркеров чувствительности к онколитическим вирусам
Для оптимизации времени проведения анализа, а также повышения его информативности, 23 анализируемых маркерных гена должны были быть разбиты на группы для совместного анализа путем проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени. Некоторые из исследуемых генов обладали существенной гомологией, что, очевидно, могло сказаться на специфичности разработанного ПЦР-теста. Кроме этого, на эффективность протекания реакции могли повлиять такие явления, как образование димеров праймеров.
После проведения компьютерного моделирования мультиплексной ПЦР в реальном времени со всеми возможными комбинациями анализируемых маркеров по группам, а также экспериментальной проверки результатов моделирования с использованием 24 образцов кДНК, полученных из биоптатов злокачественных опухолей головного мозга, в качестве наилучшей схемы была выбрана схема, изображенная на Фиг. 3.
Были сформированы 8 групп генов:
1 группа: ITGAV, SCARB2, RARRES3
2 группа: PVR, CD55,1С AMI
3 группа: STAT1, TMPRSS1 ID, NLRX1
4 группа: IRF9, ITGB3, CXADR
5 группа: ITGA2, TMPRSS2, EIF2AK2
6 группа: IFIH1, TMPRSS4, MAVS
7 группа: ITGB1, IRF3, STAT2
8 группа: TMPRSS9, SELPLG
Каждая из указанных групп может быть дополнена одним «хаускиперным» геном. Олигонуклеотидные зонды в каждой анализируемой группе должны быть связаны различными парами флуорофоров-тушителей (например: FAM-BHQ1; TAMRA- BHQ2; JOE- BHQ1; Су5- BHQ2 и др.).
Из анализируемых образцов кДНК готовятся 3 10-кратных разведения, после чего в 3х повторностях наносят на лунки с лиофилизованными праймерами и зондами на соответствующие анализируемые маркерные гены. Также для каждой анализируемой группы предусмотрено по 3 лунки, внесение образца кДНК в которые не предполагается: две для отрицательного контроля (обозначенные «-») и одна, содержащая контрольные образцы кДНК, для положительного контроля (обозначена «+»).
Список литературы
1. Mirimanoff R.O., Gorlia Т., Mason W., Van den Bent M.J., Kortmann R.D., Fisher В., Reni M., Brandes A.A., Curschmann J., Villa S., Cairncross G., Allgeier A., Lacombe D., Stupp R. Radiotherapy and temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: recursive partitioning analysis of the EORTC 26981/22981-NCIC CE3 phase III randomized trial. // J Clin Oncol. - 2006. - V. 24. - P. 2563-2569.
2. van den Bent M.J., Hegi M.E., Stupp R. Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumours. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). - 2006. - V. 42. - P. 582-588.
3. Mendelsohn C, Johnson В., Lionetti K.A., Nobis P., Wimmer E., Racaniello V.R. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1986. - V. 83. - P. 7845-7849.
4. Strauss M., Filman D.J., Belnap D.M., Cheng N., Noel R.T., Hogle J.M. Nectin-like interactions between poliovirus and its receptor trigger conformational changes associated with cell entry. // J Virol. - 2015. - V. 89. - P. 4143-4157.
5. Bergelson J.M., Cunningham J.A., Droguett G., Kurt-Jones E.A., Krithivas A., Hong J.S., Horwitz M.S., Crowell R.L., Finberg R.W. Isolation of a common receptor for Coxsackie В viruses and adenoviruses 2 and 5.11 Science. - 1997. - V. 275. - P. 1320-1323.
6. Morton P.E., Hicks A., Nastos Т., Santis G., Parsons M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. // Scientific reports. - 2013. - V. 3. - P. 2889.
7. Ward Т., Pipkin P.A., Clarkson N.A., Stone D.M., Minor P.D., Almond J.W. Decay-accelerating factor CD55 is identified as the receptor for echovirus 7 using CELICS, a rapid immuno-focal cloning method. // EMBO J. - 1994. - V. 13. - P. 5070-5074.
8. Bergelson J.M., Mohanty J.G., Crowell R.L., St John N.F., Lublin D.M., Finberg R.W. Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor (CD55). // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 1903-1906.
9. Clarkson N.A., Kaufman R., Lublin D.M., Ward Т., Pipkin P.A., Minor P.D., Evans D.J., Almond J.W. Characterization of the echovirus 7 receptor: domains of CD55 critical for virus binding. // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 5497-5501.
10. Shafren D.R., Bates R.C., Agrez M.V., Herd R.L., Burns G.F., Barry R.D. Coxsackieviruses Bl, B3, and B5 use decay accelerating factor as a receptor for cell attachment. // J Virol. - 1995. - V. 69. - P. 3873-3877.
11. Mikesch J.H., Buerger H., Simon R., Brandt B. Decay-accelerating factor (CD55): a versatile acting molecule in human malignancies. // Biochim Biophys Acta. - 2006. - V. 1766. - P. 42-52.
12. Mikesch J.H., Schier K., Roetger A., Simon R., Buerger H., Brandt B. The expression and action of decay-accelerating factor (CD55) in human malignancies and cancer therapy. // Cell Oncol. - 2006. - V. 28. - P. 223-232.
13. Spendlove I., Ramage J.M., Bradley R., Harris C., Durrant L.G. Complement decay accelerating factor (DAF)/CD55 in cancer. // Cancer immunology, immunotherapy: CII. - 2006. - V. 55. - P. 987-995.
14. Vuorinen Т., Vainionpaa R., Heino J., Hyypia T. Enterovirus receptors and virus replication in human leukocytes. // J Gen Virol. - 1999. - V. 80 (Pt 4). - P. 921-927.
15. Triantafilou K., Triantafilou M. A biochemical approach reveals cell-surface molecules utilised by Picornaviridae: Human Parechovirus 1 and Echovirus 1. // Journal of cellular biochemistry. - 2001. - V. 80. - P. 373-381.
16. Triantafilou M., Wilson K.M., Triantafilou K. Identification of Echovirus 1 and coxsackievirus A9 receptor molecules via a novel flow cytometric quantification method. // Cytometry. - 2001. - V. 43. - P. 279-289.
17. Marjomaki V., Pietiainen V., Matilainen H., Upla P., Ivaska J., Nissinen L., Reunanen H., Huttunen P., Hyypia Т., Heino J. Internalization of echovirus 1 in caveolae. // J Virol. - 2002. - V. 76. - P. 1856-1865.
18. Pietiainen V., Marjomaki V., Upla P., Pelkmans L., Helenius A., Hyypia T. Echovirus 1 endocytosis into caveosomes requires lipid rafts, dynamin II, and signaling events. // Mol Biol Cell. - 2004. - V. 15. - P. 4911-4925.
19. Xing L., Huhtala M., Pietiainen V., Kapyla J., Vuorinen K., Marjomaki V., Heino J., Johnson M.S., Hyypia Т., Cheng R.H. Structural and functional analysis of integrin alpha2I domain interaction with echovirus 1. // J Biol Chem. - 2004. - V. 279. - P. 11632-11638.
20. Heikkila O., Susi P., Stanway G., Hyypia T. Integrin alphaVbeta6 is a high-affinity receptor for coxsackievirus A9. // J Gen Virol. - 2009. - V. 90. - P. 197-204.
21. Jokinen J., White D.J., Salmela M., Huhtala M., Kapyla J., Sipila K., Puranen J.S., Nissinen L., Kankaanpaa P., Marjomaki V., Hyypia Т., Johnson M.S., Heino J. Molecular mechanism of alpha2betal integrin interaction with human echovirus 1. // EMBO J. - 2010. - V. 29. - P. 196-208.
22. Merilahti P., Koskinen S., Heikkila O., Karelehto E., Susi P. Endocytosis of integrin-binding human picornaviruses. // Adv Virol. - 2012. - V. 2012. - P. 547530.
23. Rintanen N., Karjalainen M., Alanko J., Paavolainen L., Maki A., Nissinen L., Lehkonen M., Kallio K., Cheng R.H., Upla P., Ivaska J., Marjomaki V. Calpains promote alpha2betal integrin turnover in nonrecycling integrin pathway. // Mol Biol Cell. - 2012. - V. 23. - P. 448-463.
24. Shakeel S., Seitsonen J.J., Kajander Т., Laurinmaki P., Hyypia Т., Susi P., Butcher S.J. Structural and functional analysis of coxsackievirus A9 integrin alphavbeta6 binding and uncoating. // J Virol. - 2013. - V. 87. - P. 3943-3951.
25. Siljamaki E., Rintanen N., Kirsi M., Upla P., Wang W., Karjalainen M., Ikonen E., Marjomaki V. Cholesterol dependence of collagen and echovirus 1 trafficking along the novel alpha2betal integrin internalization pathway. // PLoS One. - 2013. - V. 8. - P. e55465.
26. Huttunen M., Waris M., Kajander R., Hyypia Т., Marjomaki V. Coxsackievirus A9 infects cells via nonacidic multivesicular bodies. // J Virol. - 2014. - V. 88. - P. 5138-5151.
27. Shafren D.R., Dorahy D.J., Ingham R.A., Burns G.F., Barry R.D. Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry. // Journal of Virology. - 1997. - V. 71. - P. 4736-4743.
28. Lin H.Y., Yang Y.T., Yu S.L., Hsiao K.N., Liu C.C., Sia C., Chow Y.H. Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71 infection. // J Virol. - 2013. - V. 87. - P. 9064-9076.
29. Nishimura Y., Shimojima M., Tano Y., Miyamura Т., Wakita Т., Shimizu H. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. // Nat Med. - 2009. - V. 15. - P. 794-797.
30. Mistry N., Inoue H., Jamshidi F., Storm R.J., Oberste M.S., Arnberg N. Coxsackievirus A24 variant uses sialic acid-containing O-linked glycoconjugates as cellular receptors on human ocular cells. // J Virol. - 2011. - V. 85. - P. 11283-11290.
31. Nilsson E.C., Jamshidi F., Johansson S.M., Oberste M.S., Arnberg N. Sialic acid is a cellular receptor for coxsackievirus A24 variant, an emerging virus with pandemic potential. // J Virol. - 2008. - V. 82. - P. 3061-3068.
32. Dang M., Wang X., Wang Q., Wang Y., Lin J., Sun Y., Li X., Zhang L., Lou Z., Wang J., Rao Z. Molecular mechanism of SCARB2-mediated attachment and uncoating of EV71. // Protein Cell. - 2014. - V. 5. - P. 692-703.
33. Yamayoshi S., Iizuka S., Yamashita Т., Minagawa H., Mizuta K., Okamoto M., Nishimura H., Sanjoh K., Katsushima N., Itagaki Т., Nagai Y., Fujii K., Koike S. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. // J Virol. - 2012. - V. 86. - P. 5686-5696.
34. Heiber J.F., Barber G.N. Evaluation of innate immune signaling pathways in transformed cells. // Methods Mol Biol. - 2012. - V. 797. - P. 217-238.
35. Stojdl D.F., Lichty В., Knowles S., Marius R., Atkins H., Sonenberg N., Bell J.C. Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus. // Nat Med. - 2000. - V. 6. - P. 821-825.
36. Singh, K., Poteryakhina, A., Zheltukhin, A., Bhatelia, K., Prajapati, P., Sripada, L., Tomar, D., Singh, R., Singh, A.K., Chumakov, P.M. and Singh, R., 2015. NLRX1 acts as tumor suppressor by regulating TNF-a induced apoptosis and metabolism in cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 1853(5), pp. 1073-1086.
37. Ребриков Д.В. и др. ПЦР в реальном времени // М.: Бином. Лаборатория знаний. - 2009. - Т. 115.
38. Oliveira D.C., Lencastre Н. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2002. - V. 46. P. 2155-2161.
39. Sung R.Y., Chan P.K., Tsen Т., Li A.M., Lam W.Y., Yeung A.C., Nelson E.A. Identification of viral and atypical bacterial pathogens in children hospitalized with acute respiratory infections in Hong Kong by multiplex PCR assays. // J. Med. Virol. - 2009. - V. 81.- P. 153-159.
40. Suntoke T.R., Hardick A., Tobian A.A., Mpoza В., Laeyendecker O., Serwadda D., Opendi P., Gaydos C.A., Gray R.H., Wawer M.J., Quinn T.C., Reynolds S.J. Evaluation of multiplex real-time PCR for detection of Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum,herpes simplex virus type 1 and 2 in the diagnosis of genital ulcer disease in the Rakai District, Uganda. // Sex. Transm. Infect. - 2009. - V. 85. - P. 97-101.
41. Tomaso H., Reisinger E.C., Al Dahouk S., Frangoulidis D., Rakin A., Landt O., Neubauer H. Rapid detection of Yersinia pestis with multiplex real-time PCR assays using fluorescent hybridisation probes. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2003. - V. 38. - P. 117-126.
42. Chao D.Y., Davis B.S., Chang G.J. Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes. // J. Clin. Microbiol. - 2007. - V. 45. - P. 584-589.
43. Chong S., Luinstra K., Petrich A., Smieja M. Multiplex PCR tests sentinel the appearance of pandemic influenza viruses including H1N1 swine influenza. // J. Clin. Virol. - 2009. - V. 45.- P. 200-202.
44. Wagner A., Blackstone N., Cartwright P., Dick M., Misof В., Snow P., Wagner G.P., Bartels J., Murtha M., Pendleton J. Surveys of gene families using polymerase chain reaction: PCR selection and PCR drift. // Syst. Biol. - 1994. - V. 43. - P. 250-261.
45. Dieffenbach C.W., Lowe T.M.J., Dveksler G.S. General conception for PCR primer design. // PCR Methods Appl. - 1993. - V. 3. - P. S30-S37.
46. Mutter G.L., Boynton K.A. PCR bias in amplification of androgen receptor alleles, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies. // Nucleic. Acids. Res. - 1995. - V. 23. - P. 1411-1418
47. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR. // Appl. Environ. Microbiol. - 1996. - V. 62. - P. 625-630.
48. Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. //Clin. Microbiol. Rev. - 2000. - V. 13. - №4. - P. 559-570.
49. Markoulatos P., Siafakas N., Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. // J. Clin. Lab. Anal. - 2002. - V. 16. - P. 47-51.