Штамм Cadophora malorum ВКМ F-4708D для активизации биодеструкции твердых парафинов и полициклических ароматических соединений в воде, жидких шламах, сточной воде, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и для трансформации углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов с целью получения биодизеля
CADOPHORA MALORUM STRAIN VKM F-4708D TO ACTIVATE BIODEGRADATION OF SOLID PARAFFINS AND POLYCYCLIC AROMATIC COMPOUNDS IN WATER, LIQUID SLUDGE, SEWAGE CONTAMINATED WITH OIL AND OIL PRODUCTS AND FOR TRANSFORMATION OF HYDROCARBON XENOBIOTICS INTO BIOMASS OF LIPID METABOLITES IN ORDER TO OBTAIN BIODIESEL

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма гриба - штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D для активизации биодеструкции твердых парафинов и полициклических ароматических соединений в воде, жидких шламах, сточной воде, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и для трансформации углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов с целью получения биодизеля.
Известен штамм Pseudomonas putida 36, обладающий способностью к биодеградации нефти и нефтепродуктов [Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. 1990, №9. С. 148-151].
Известен штамм Bacillus species 739 [Авторское свидетельство СССР №1743019, 1989.] и полученный на его основе бактериальный препарат «Бациспецин» [Патент РФ №2077397, опубл. 1997], используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.
Известен способ очистки воды и почвы от нефти, нефтепродуктов и полимерных добавок в буровом растворе, включающий внесение микроорганизмов, отличающийся тем, что из микроорганизмов используют ассоциацию штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-1339D, Bacillus subtilis ВКМ B-1742D и Pseudomonas putida ВКМ 1301 [Патент РФ №2093478, опубл. 20.10.1997].
Известен консорциум микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes sp. Г0401ВТ №17, Micrococcus nishomyaensis Г0402ВТ №16, Brevibacterium iodinum Г0403ВТ №15, Pseudomonas aeruginosa Г0404ВТ №14, Pseudomonas facilis Г0405ВТ №13, Brevibacterium linens Г0406ВТ №12, Bacillus subtilis Г0407ВТ №11, Flavobacterium aquatile Г0408ВТ №10, Clostridium butyricum Г0409ВТ №9, используемый для очистки природных и сточных вод, почв и почвогрунтов от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности [Патент РФ №2376084, опубл. 20.12.2009].
Известен консорциум штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp. ВКМ B-2753D и Ochrobactrum sp. ВКМ B-2754D, обладающий нитрогеназной активностью. Консорциум способен к фиксации атмосферного азота и обладает высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам при их высоком содержании в субстрате [Патент РФ №2553540, опубл. 20.06.2015].
Известен способ обработки нефтяного шлама [Патент РФ №2198747, опубл. 2000], заключающийся в том, что нефтяной шлам смешивают с микроорганизмами и биостимулятором. Для этого в нефтяной шлам добавляют чистую почву и древесные опилки в массовом соотношении 1:2:1, в качестве микроорганизмов используют штамм бактерий Bacillus sp. ВНИИСХМ 132, а в качестве биостимулятора - белковую кормовую добавку «Биотрин», после периода инкубации микроорганизмов (не менее 50 суток) проводится дополнительная обработка почвы биостимулятором.
Известен способ обезвреживания грунтов от нефтепродуктов [Патент РФ №2075447, опубл. 1997], в котором производится сбор зараженного грунта, разделение и переработка шлама культивированными биологическими штаммами аэробных и анаэробных микроорганизмов.
Основные заявленные способности штаммов и консорциумов микроорганизмов, в представленных патентах, это очистка почв, сточных вод, почвогрунтов, шламонакопителей от нефтепродуктов с утратой энергетического ресурса (без выхода вторичного сырья).
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности относится микробиологический способ увеличения содержания светлых и масляных фракций в нефти, в нефтепродуктах и другом углеводородном сырье с одновременной изомеризацией бензиновой фракции [Патент РФ №2405825, 10.12.2010]. Предложенное изобретение позволяет улучшить качество получаемых нефтепродуктов за счет увеличения содержания светлых и масляных углеводородных фракций, снижения содержания темных фракций, мазута и кокса, что в свою очередь обеспечивает улучшение качества и эксплуатационных характеристик получаемых нефтяных фракций.
Таким образом, в данных патентах заявленных свойств у известных штаммов и консорциумов микроорганизмов - трансформация углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов не обнаружено.
Задача изобретения - получение штамма Cadophora malorum (Kidd et Beaumont 1924) W. Gams 2000 ВКМ F-4708D, обеспечивающего активизацию биодеструкции твердых парафинов и полиароматических соединений в воде, жидких шламах, в сточной воде, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и способного трансформировать углеводородные ксенобиотики в биомассу липидных метаболитов с целью получения биодизеля.
В этом состоит технический результат.
3
2
4
2
4
2
4
2
Для достижения технического результата из твердого нефтешлама были получены накопительные культуры почвенных грибов на синтетической среде следующего состава, г/л: KNO - 4.0; КНРО - 0.6; NaHPO×HO; MgSO×HO; вода дистиллированная; рН среды 7.0 [Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1976. 307 c.]. В колбы на 250 мл вносили среду 100 мл указанного состава и инокулировали небольшим количеством нефтезагрязненной почвы. Накопительные культуры получали в инкубаторе при перемешивании 220 об/мин и при 24°С в течение 7 суток. Из накопительных культур была выделена чистая культура Cadophora malorum ВКМ F-4708D методом посева на агаризованную подкисленную среду Чапека [Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: МГУ, 1991. 304 с.]. Идентификацию гриба проводили по определителям [Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.: Наука, 1967. 302 c.; Милько А.А. Определитель мукоральных грибов. Киев: Наукова думка, 1974. 303 c.; Кириленко Т.С. Атлас родов почвенных грибов (Ascomycetes и Deuteromycetes). Киев: Наукова думка, 1977. 126 c.; Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Киев: Наукова думка, 1988. 203 с.; Александрова А.В., Великанов Л.Л., Сидорова И.И. Ключ для определения видов рода Trichoderma // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40. Вып. 6. С. 457-468; Domsh К.Н. / Domsh К.Н., Gams W., Anderson T.-H. Compendium of soil fungi. IHW-Verlag, 1993. Vol. I. 859 p.; Domsh K.H. Gams W., Anderson T.-H. Compendium of soil fungi. IHW-Verlag Eching, 2007. 672 p.].
Характеристика выделенного гриба.
Cadophora malorum (Kidd et Beaumont 1924) W. Gams 2000 ВКМ F-4708D. На 7-е сутки на среде Чапека образует колонии 2-3 см в диаметре темно-оливкового цвета. Колонии стелющиеся, распростертые, бархатистые. Гифы изогнутые, бесцветные, стелющиеся, ветвящиеся, септированные. Конидиеносцы в виде боковых коротких веточек, большей частью стелющиеся, септированные. Конидии одиночные, верхушечные, эллиптические, муральные (с 2 или 3 поперечными и несколькими продольными перегородками), бородавчатые, бурые, при полном созревании непрозрачные, 17.5-22×11-13.5 мк.
Для накопления культуры использовали жидкую питательную среду Чапека. Исходное значение рН среды составляло 6.0 без дальнейшего регулирования в процессе культивирования. Колбы с 100 мл питательной среды засевали соответствующей культурой смывом стерильной дистиллированной водой с поверхности скошенной агаризованной среды. Засев опытной колбы для получения смешенной культуры производили с расчетом, чтобы количество конидий грибов разных видов было примерно одного порядка. Культивирование проводили при перемешивании 220 об/мин и постоянной температуре 24°С в течение 7 суток.
После 7 суток культивирования в жидкой питательной среде были отобраны пробы для определения общего количества конидий, которое подсчитывали с помощью камеры Горяева-Тома [Практикум по микробиологии / под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский дом «Академия», 2005. 608 с.] (табл. 1).
Режим хранения культуры - кратковременное хранение на скошенной агаризованной среде Чапека при 4°C (для подготовки биомассы с целевым использованием). Периодические пересевы.
Нефтеокисляющую способность штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D изучали в лабораторных экспериментах с модельной нефтезагрязненной средой. Способность штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D к разложению нефтепродуктов в липидные метаболиты изучали в лабораторных экспериментах с модельной нефтезагрязненной водной средой. Результаты приведены в примерах ниже.
Пример 1.
Исследован штамм Cadophora malorum ВКМ F-4708D на изменение содержания алканов, ПАУ в условиях жидкофазного культивирования на среде Чапека, обогащенной нефтью.
3
2
4
4
2
В колбы на 250 мл готовили неагаризованную среду Чапека без сахарозы, следующего состава: на 1000 мл воды - NaNO - 3.0 г; KHPO - 1.0 г; KCl - 0.5 г; MgSO×5HO - 0.5 г, стерилизовали. Добавляли нефть по весу и 5 мл наработанного штамма. Культивировали в течение 7 суток в инкубаторе при 24°С и при 220 об/мин. В качестве контроля было определено содержание ПАУ, алканов в среде Чапека с добавлением нефти без биомассы штамма.
По истечении семи суток нефть извлекали из ферментационных колб экстракцией гексаном и анализировали алкановую, полиароматическую фракции углеводородов. Разделение экстрактов проводили методом колоночной хроматографии. На колонке с оксидом алюминия отделяли фракцию н-алканов и полициклических ароматических соединений (фракция F1) от полярных соединений. Далее на колонке с силикагелем фракцию F1 разделяли на фракции н-алканов (F2) и полициклических, ароматических соединений (F3).
3
Качественное и количественное определение содержания н-алканов проводили на хромато-масс-спектрометре Trace DSQ (Thermo) в режиме селективной регистрации ионов (SIM) при энергии электронов 70 эВ. Сканирование в режиме SIM вели по трем ионам с массами 57, 71 и 85, характерным для предельных углеводородов [Габов Д.Н., Безносиков В.А., Кондратенок Б.М., Груздев И.В. Насыщенные углеводороды в фоновых и загрязненных почвах Предуралья // Почвоведение. 2010. №10. С. 1-7]. Идентификацию н-алканов на хроматограмме проводили предварительно в режиме полного ионного тока по их стандартным растворам. Методом внутреннего стандарта (внутренний стандарт - н-декан, 0.05 мг/см) исследовали количественное содержание н-алканов.
В основу определения ПАУ в почве положена методика М 03-04-2002 - измерение массовой доли бенз[а]пирена в пробах почв, грунтов донных отложений и твердых отходов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием анализатора "Флюорат-02" в качестве флуориметрического детектора [Габов Д.Н., Безносиков В.А., Кондратенок Б.М., Яковлева Е.В. Закономерности формирования полициклических ароматических углеводородов в почвах Северной и Средней тайги // Почвоведение. 2008. №11. С. 1334-1343].
Краткое описание фигуры 1
Фигура 1 представляет собой график изменения структуры алкановой фракции нефти после семисуточной ферментации с культурой штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D.
Как видно на Фиг. 1, в присутствии культуры исследуемого штамма по сравнению с контролем происходит изменение структуры алкановой фракции, где очевидно снижение массовой доли парафинов С18 - С30. О разложении твердых парафинов также свидетельствует незначительное повышение массовой доли парафинов С15 - С17. Данные позволяют отнести данный штамм к алканотрофным видам.
Краткое описание Фигуры 2
Фигура 2 - это изменение количества вещества ПАУ в присутствии штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D по сравнению с контролем.
Внесение культуры испытуемого штамма после семидневной инкубации показало значительное снижение количества вещества трехядерных ПАУ - флуорена и фенантрена. Причем речь идет именно о разложении данных соединений, т.к. не происходило достоверных изменений в балансе соединений с четырьмя и более ядрами.
Пример 2.
3
2
4
4
2
Исследован штамм Cadophora malorum ВКМ F-4708D на изменение жирнокислотного состава в условиях культивирования на среде Чапека, обогащенной нефтью. В колбы на 250 мл готовили неагаризованную среду Чапека без сахарозы, следующего состава: на 1000 мл воды - NaNO - 3.0 г; KHPO - 1.0 г; KCl - 0.5 г; MgSO×5HO - 0.5 г, стерилизовали. Добавляли нефть по весу и 5 мл наработанного штамма. Культивировали в течение 7 суток в инкубаторе при 24 градусах и при 220 об/мин. В качестве контроля было определено содержание жирных кислот в накопленной биомассе штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D на среде Чапека без добавления нефти, а также содержание жирных кислот в среде Чапека с добавлением нефти (табл. 2). Жирные кислоты выделяли по методу Синяка с соавторами [Авторское свидетельство №542932 СССР, G01N 1/28, 1977, Бюл. №2].
Жирнокислотный состава липидов штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D проведен с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (Smartline, Knauer, Германия) и газовой хроматографии (газовый хроматограф Кристалл 2000 М (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Идентификацию липидов осуществляется методом хромато-масс-спектрометрии на приборе Finnigon Trase DSQ Thermo-Electron (США). Эти современные методы анализа дают качественное и количественное определение жирных кислот даже при низких концентрациях лимитирующих компонентов.
Получаемое биотопливо - биодизель состоит из смеси эфиров жирных кислот [Atadashi, I.M. High quality biodiesel and its diesel engine application: A review/ I.M. Atadashi, M.K. Aroua, A. Abdul Aziz // Renewable Sustainable Energy Rev. - 2010. - V. 14. - P. 1999-2008]. Оптимальную работу современных дизельных двигателей обеспечивают дизельные топлива с цетановым числом от 45 до 55. При цетановом числе меньше 40 резко возрастает задержка горения (время между началом впрыскивания и воспламенением топлива) и скорость нарастания давления в камере сгорания, увеличивается износ двигателя. Стандартное топливо характеризуется цетановым числом 48-51, а топливо высшего качества (премиальное) имеет цетановое число 51-55. Согласно российским стандартам цетановое число летнего и зимнего дизтоплива должно быть не менее 48 единиц [ГОСТ 305-82. Топливо дизельное. ГОСТ Р 52709]. Содержание пальмитиновой кислоты (С 16:0) указывает на объемную долю цетана. Из таблицы 3 видно, что при наработке биомассы штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D на среде Чапека с добавлением нефти цетановое число относит топливо к премиальным. А при суммировании пальмитиновой и стеариновой кислот (94.1%) получаемый биодизель на основе наработки штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D на нефти можно охарактеризовать как биодизель высшего качества.