ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ГУМИНОВОЕ СРЕДСТВО
IMMUNOMODULATING HUMIC AGENT

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к гуминовым препаратам, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).
Гуминовые кислоты, фульвокислоты оказывают на любой живой организм мощное воздействие благодаря богатому составу. В них содержится полный набор аминокислот, макро- и микроэлементов, минералов, а также полисахариды природного происхождения, витамины, пептиды, жирные кислоты, полифенолы, кетоны, катехины и т.д. Всего около 70 полезных компонентов. Такой насыщенный состав объясняет положительные биологические эффекты гуминовой кислоты (см. https://fb.ru/article/288472/guminovyie-kislotyi-chto-eto-takoe-i-kak-oni-vliyayut-na-organizm).
Известно, что гуминовые кислоты способны стимулировать некоторые функции нейтрофилов человека. Для препаратов на основе гуминовых и гуминовоподобных веществ выявлена антивирусная активность, например, для симплексного вируса герпеса - HSV. Гуминовые соединения могут быть использованы в качестве микробиоцидов, профилактических средств против распространения ВИЧ/СПИД. Были исследованы цитотоксические и антивирусные свойства гуминовых кислот и фульвокислот, выделенных из угля и торфа. Исследования показали, что все изученные соединения были малотоксичными и обладали достаточно высоким ингибирующим эффектом в отношении ВИЧ-инфекции (А.И. ПОПОВ, В.Н. ЗЕЛЕНКОВ, Т.В. ТЕПЛЯКОВА Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект (обзор литературы). Вестник Российской Академии Наук, 2016/5, с. 9-15). Было показано, что Оксигумат повышает активность Th-1 клеток и уменьшает продукцию цитокинов Th-2 клетками [Mariette et al., 2002]. Наблюдаемая стимуляция пролиферации лимфоцитов человека была связана с повышением продукции ИЛ-2 и экспрессией ИЛ-2 рецепторов вместе с уменьшением количества ИЛ-10 под действием Оксигумата [Joone et al., 2003]. In vivo показано, что пероральный прием гуминовых веществ улучшает параметры врожденного иммунитета у экспериментальных животных: происходит усиление антибактериальной активности сыворотки крови, фагоцитарной активности, активности лизозима и бактериальной агглютинации [Sanmiguel et al., 2016]. Это делает гуминовые вещества потенциальными продуктами для разработки многомишеневых иммуноактивных микробицидов.
Исследования в области разработок новых биологически активных соединений показали, что гуминовые вещества различного генеза обладают иммуномодулирующим и противовоспалительным действиями, что позволяет использовать их для профилактики и лечения хронических дерматозов, атопических дерматитов, аллергических ринитов и других заболеваний, сопровождающихся воспалительными и аллергическими реакциями. Перспективным является применение гуминовых веществ в качестве иммуномодуляторов. (И.А. Савченко и др. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ: ПЕРСПЕКТИВЫ И ПРОБЛЕМЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ (ОБЗОР). Журнал Медиаль, №1 (23) апрель, 2019, с. 54-60, DOI: http://dx.doi.org/10.21145/2225-0026-2019-1-54-60).
Показано влияние гуминовых кислот на иммунную систему человека. Применение производных гуминовых кислот стимулирует Т-лимфоциты как хелперной так и супрессорной субпопуляции. Усиливается общий регуляторный механизм иммунного гомеостаза под влиянием нейрогуморально-гуморальных перестроек в организме, особенно систем «гипотоламус-гипофизкора надпочечников», «кора надпочечников-тимус-селезенка-лимфатические узлы», что сопровождается восстановлением ауторегуляции иммунного ответа с тенденцией к нормализации нарушенной кооперации лимфоидных клеток (Полуянова И.Е. Биологическая активность гуминовых веществ, получаемых из торфа, и возможности их использования в лечебной практике. Международные обзоры: клиническая практика и здоровье, 2017, N4, с. 114122).
Из уровня техники известно применение водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового сосново-сфагново-пушицевого вида торфа экстракцией пирофосфатом натрия, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью и стимулирующего развитие реакций Th1-зависимого типа иммунного ответа (патент RU 2662094, 23.07.2018).
Известно также применение водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, со среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, среднемассовой молекулярной массой 18755,3, полидисперсностью 3,9 и медианой 9558,3 Да, в качестве средства, стимулирующего развитие реакций Th1-зависимого типа иммунного ответа путем регулирования баланса активации провоспалительных свойств макрофагов, секретирующих цитокины ИЛ-1β, ИЛ-12 и ФНО-α, и противовоспалительных свойств макрофагов, которые продуцируют ИЛ-10 цитокины (патент RU 2716504, 12.03.2020). Недостатком известного решения является то, что содержит только узкую фракцию гуминовых кислот и не содержит других активных компонентов гуминовых веществ.
Задачей настоящего изобретения является получение гуминового средства, содержащего широкий спектр гуминовых веществ и обладающего иммуномодулирующей активностью, без использования химических реагентов.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение иммуномодулирующего гуминового средства, содержащего широкий спектр гуминовых веществ и не имеющего химических примесей, которое может быть использовано в области медицины и фармацевтики.
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявленное гуминовое средство, обладающее иммуномодулирующей активностью, содержит воду и гуминовые вещества, полученные из гуминосодержащего сырья, выбранного группы, включающей леонардит, лигнин, уголь, торф и/или сапропель, методом ультразвукового диспергирования при температуре 30-80°С и давлении 0,05-0,8 МПа, при этом масса гуминовых веществ составляет от 1 до 20 мас.%, а гуминовые вещества включают гуминовые и фульво-кислоты и их соли, а также гидрохинон в количестве не превышающем 3 мас.% от массы гуминовых веществ.
Также предлагается применение полученного гуминового средства в качестве иммуномодулирующего средства.
Для получения заявленного средства использовали предварительно измельченное сырье (леонардит, лигнин, уголь, торф, сапропель) в смеси с водой, которое помещали в ультразвуковую установку. Помещенную в ультразвуковую установку смесь гуминосодержащего сырья с водой нагревали до 30-80°С, и при достижении требуемой температуры производили обработку ультразвуком при давлении 0,05-0,8 МПа. После ультразвуковой обработки раствор охлаждали до комнатной температуры. Полученное средство разбавляли водой до содержания гуминовых веществ, составляющего от 1 до 20 мас.%.
Исследование состава полученного средства проводили методом ГХ-МС на анализаторе «Хроматэк», состоящем из газового хроматографа «Хроматэк-Кристал 5000» и жидкостного дозатора ДАЖ-2М. Для идентификации дериватов использовали автоматическую базу поиска и идентификации данных хромато-масс-спектрометрии NIST17MS Library.
Условия исследования:
Результаты исследования приведены в табл. 1
Согласно приведенным данным в состав заявленного средства, помимо гуминовых и фульвокислот, входят также фенольные производные, в частности гидрохинон, флаваноиды (хризин) и другие активные вещества. Следовательно, заявленное средство характеризуется широким спектром активных веществ.
Исследование на токсичность
Определение показателей острой токсичности включало эксперименты на мышах. Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по массе тела (±10%). Введение препарата осуществляли внутрижелудочно в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Наивысшая доза была лимитирована максимально возможным объемом введения препарата. Для исследования каждой дозы препарата использовались группы по 10 животных разного пола. Период наблюдения составлял 14 суток. При введении препарата в дозах 4000-8000 мг/кг (по гуминовой кислоте) у животных выявлено изменение реакции на взятие в руки, изменение дыхания, двигательной активности, и тонуса мускулатуры, у некоторых животных наблюдалось изменение консистенции кала. При введении препарата в дозе до 4000 мг/кг (по гуминовой кислоте) все животные выжили, при введении препарата в концентрации 6000 мг/кг (по гуминовой кислоте) погибло 5 животных из 10, а при введении препарата в дозе 8000 мг/кг (по гуминовой кислоте) погибло 8 животных из 10. Выжившие животные удовлетворительно перенесли интоксикацию и по окончании действия препарата на протяжении 14 дней наблюдения, признаков отсроченного влияния не отмечено. Признаков пролонгированной клинической интоксикации отмечено не было. Динамика массы тела опытных животных не отличалась от контроля. По окончании периода наблюдения - на 14 день, был произведен забой выживших животных с целью определения возможных патологических изменений после однократного приема препарата. Осмотр опытной и контрольных групп показал, что все животные в них были нормально упитаны, имели правильное телосложение, гладкий и блестящий волосяной покров, блестящие, обычной окраски слизистые оболочки, чистые и опрятные естественные отверстия. При макроскопическом исследовании внутренних органов каких-либо особенностей не было выявлено. Анализ величин массовых коэффициентов не выявил каких-либо достоверных отличий между группами животных, получавшими разные дозы препарата. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что полученные препарат можно отнести к V классу, т.е. практически нетоксичных лекарственных веществ.
Исследование иммуномодулирующей активности заявленного средства.
Иммуномодулирующую активность заявленного гуминового средства исследовали на линейных мышах C57BL/6 (самцы/самки) в возрасте 8-10 недель (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. 4.1., М.: Гриф и К, 2013, С. 64-79). Исследования осуществляли в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС по охране животных используемых в научных целях, ГОСТ 33215-2014 «Правила оборудования помещений и организация процедур при работе с лабораторными животными».
В качестве контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид и пирогенал, in vitro - мурамилдипептид.
2
Макрофаги получали из суспензии перитонеальных клеток, для чего животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Клетки (1,5-2,0×106/мл) помещали в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч при 37°С (в атмосфере 5% CO и абсолютной влажности) в полной культуральной среде RPMI 1640 («Sigma»), 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицин («Sigma»), 2 мМ L-глютамин («Sigma»)). Через 2 часа собирали прилипшие к пластику макрофаги, переносили их в плоскодонные 96-луночные планшеты (2,5-3,0×106 клеток/мл) и культивировали в указанных выше условиях в присутствии заявленного гуминового средства (ГС, 10 мкг/мл); 1 мкг/мл ЛПС (серотип O111:В4, «Sigma»); 10 мкг/мл мурамилдипептида (МДП, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem»). Продукцию монокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл), лимфокинов - конканавалином А (4 мкг/мл) или митогеном лаконоса (5 мкг/мл). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем: ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12 и ИФН-γ («eBioscience»), ФНО-α - («Вектор-Бэст»).
Количество цитокинов, вырабатываемых мононуклеарами периферической крови человека (Мн), определяли в супернатантах клеток. Для этого, жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 помещали в пробирки, после чего с осторожностью наслаивали цельную кровь здоровых доноров с добавлением гепарина (10 ЕД/мл). После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности, трижды отмывали их холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде, оценивали жизнеспособность. Далее Мн (2,5-3,0×106 клеток/мл) помещали в 96-луночный планшет и вносили ГС (10 мкг/мл), продукцию цитокинов стимулировали добавлением митогенов. Через 24 ч инкубации собирали бесклеточный супернатант, в котором иммуноферментным методом при помощи тест-систем определяли количество цитокинов согласно прилагаемым протоколам: ИЛ-10 и ИФН-γ («R@D Systems»), ФНО-α - («Вектор-Бэст»).
ГС вводили мышам ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней и у них определяли показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета. В предварительных экспериментах in vivo было выявлено, что для проявления иммуномодулирующего эффекта оптимальной суточной дозой заявленного ГС является концентрация 1 мг/кг массы тела, аналога ЛПС пирогенала (Филиал «Медгамал» ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия) - 5 мкг/кг в 0,1 мл физиологического раствора (ФР) и ликопида (ЗАО «Пептек», Россия) - 2 мг/кг. Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа через 5 дней от начала введения ГС животных иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией эритроцитов барана (5×107) в 0,1 мл ФР.
Для оценки действия ГС на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (108 эритроцитов барана в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,05 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Через 24 часа животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава, местную воспалительную реакцию оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап.
Влияние ГС на гуморальное звено иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титру антител в сыворотке крови в реакции гемагглютинации (РГА), выраженному величиной log2. Для этого животных, получавших курс ГС, забивали на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (на пике IgM-AOK и IgG-AOK, соответственно), выделяли селезенку и собирали сыворотку крови.
Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0. Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое (X), ошибка среднего арифметического (m), среднее арифметическое отклонение (σ). Проверка на нормальность распределения проводили с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборочных средних выполняли по критерию Даннета для сравнения нескольких экспериментальных выборок с одной контрольной в случае нормального распределения или по критерию Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к>2) и критерия Данна в случае распределения, отличающегося от нормального.
ГС согласно изобретению при культивировании с интактными МФ значительно увеличивали концентрацию ИЛ-12 - ключевого цитокина, ответственного за эффективность Т-клеточного иммунного ответа - с 0,166±0,028 пг/мл в спонтанном контроле до 5,107±0,612 пг/мл. (т.е. более чем в 30 раз). При культивировании макрофагов без добавления каких-либо стимуляторов (среда) сколько-нибудь значимых количеств данного цитокина в супернатанте обнаружено не было, а ЛПС даже снижал показатель в 1,9 раза. Активирующее действие мурамилдипептида также было значительным относительно контроля и существенно не отличалось от ГС.
Кроме того, ГС значительно, более чем в 3 раза, усиливали секрецию другого провоспалительного цитокина ИЛ-2 митогенстимулированными спленоцитами мышей с 104,023±16,957 пг/мл при стимуляции Кон А до 326,904±2,940 пг/мл при добавлении ГС. Также, под влиянием ГС концентрация ИФН-γ увеличивалась в 7,4 раза с 2,857±0,601 в контроле до 21,141±2,244 пг/мл.
При использовании другой модели (моноцитов периферической крови человека) показано, что при добавлении заявленного ГС концентрация ФНО-α резко увеличивалась с 1,486±0,92 пг/мл в контроле до 94,205±2,933 пг/мл как при культивировании с ГС, так и с МДП до 151,070±11,263 пг/мл. Активирующее действие ГС сохранялось и при оценке их влияния на продукцию ИФН-γ лимфоцитами: концентрация цитокина увеличивалась в 72,5 раза с 0,042±0,007 до 3,045±2,004 пг/мл.
Оценка влияния исследуемых веществ на секрецию ИЛ-10 показала, что ГС не влияет на спонтанную продукцию цитокина в отличие от МДП, который ее значительно, в 7,1 раза, усиливал. Более того, инкубация мононуклеаров с ГС в условиях ЛПС-моделированного воспаления приводила к существенному снижению в 4,2 раза концентрации цитокина. ГС не усиливало митогенстимулированную продукцию ИЛ-4.
Таким образом, экспериментально установлено, что ГС согласно изобретению снижают продукцию ИЛ-10 на фоне стимуляции выработки антигенпрезентирующими клетками ключевых провоспалительных цитокинов ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-γ лимфоцитами. Следует отметить, что по своему цитокин-стимулирующему действию ГС значительно превосходит препарат сравнения МДП.
Кроме того, было показано, что курсовое введение ГС изобретения животным (мышам линии C57/BL6) на фоне развития у них Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, привело к подавлению реакции ГЗТ - маркерной реакции клеточного Th1 иммунного ответа. Курсовое введение препарата сравнения - ликопида - усиливало показатель в 1,3 раза. Величина отека при применении ГС и пирогенала снижалась в 1,9 по сравнению с контролем и в 2,3-2,4 раза относительно ликопида.
Экспериментально установлено, что гуминовые активные вещества, входящие в состав заявленного гуминового средства, при прямом воздействии снижают продукцию ИЛ-10 на фоне стимуляции выработки ключевых провоспалительных цитокинов антигенпрезентирующими клетками - ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-α и лимфоцитами - ИФН-γ, как у мышей, так и у человека (ФНО-α и ИФН-γ). Курсовое введение заявленного гуминового средства снижает интенсивность реакции клеточного иммунитета и усиливает показатели гуморального иммунитета. Гуминовые вещества заявленного гуминового средства являются активаторами воспалительных свойств макрофагов по Th1-зависимому типу иммунного ответа и могут расширить арсенал малотоксичных средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах - острых, хронических, вялотекущих, рецидивирующих, на фоне онкологических заболеваний.
Таким образом, заявленное гуминовое средство имеет высокую биологическую активность, которая проявляется в способности регулирования баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Следовательно, заявленное средство может использоваться в качестве иммуномодулирующего средства, что подтверждает достижение заявленного технического результата.