Разделение оптически активных аминокислот и изомеров их производных на макроциклическом антибиотике “Тикопланин”

УДК 543.544

РАЗДЕЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ АМИНОКИСЛОТ И ИЗОМЕРОВ ИХ ПРОИЗВОДНЫХ НА МАКРОЦИКЛИЧЕСКОМ АНТИБИОТИКЕ «ТИКОПЛАНИН»

И. А. Ананьева, Е. Н. Шаповалова, О. А. Шпигун, Д. В. Армстронг

Изучено хроматографическое поведение аминокислот и изомеров их производных на сили-кагеле, модифицированном макроциклическим антибиотиком «Тикопланин». Установлено, что на удерживание и селективность разделения производных аминокислот влияет, главным образом, гидрофобность модификатора. Показана возможность разделения рацемических смесей большого числа аминокислот без их предварительной дериватизации.

В настоящее время известно большое количество хи-ральных неподвижных фаз для жидкостной хроматографии. Наиболее часто для этого используются - аминокислоты и производные аминокислот, белки, циклодекст-рины и производные циклодекстринов, полисахариды и их производные [1].

Важным достижением в создании новых хиральных селекторов было создание Армстронгом и сотрудниками [2] неподвижных фаз на основании макроциклических антибиотиков, что открыло широкие возможности для разделения различных классов энантиомеров благодаря сложному механизму распознавания на хиральной поверхности, включающему образование водородных связей, п-п-комплексов, комплексов включения, дипольных, ионных и стерических взаимодействий.

Проблема разделения оптических изомеров аминокислот и производных аминокислот очень актуальна, так как эти соединения присутствуют в биологических жидкостях живых организмов, причем Б- и Ь-изомеры выполняют различные функции. Для решения проблем фармакологии, синтеза и анализа белков, геохимического анализа, анализа пищевых продуктов необходимо определять в различных объектах не только содержание аминокислот, но и соотношение их энантиомеров [3].

В качестве новой неподвижной хиральной фазы для разделения оптических изомеров аминокислот и производных аминокислот нами изучен макроциклический антибиотик «Тикопланин». Новый хиральный селектор проявляет широкие возможности для разделения энантиоме-ров и его использование представляется перспективным для разделения аминокислот и производных аминокислот с различными модификаторами: 5-диметиламинонафта-лен-1-сульфонилом (дансил), М-9-флуоренилметоксикарбо-нилом (ФМОК), 2,4-динитрофенилом (ДНФ), фталилом (Фталил), бензоксикарбонилом (КБЗ), о-фталевым альдегидом (ОФА), бензоилом (Бензоил).

Экспериментальная часть

Работу выполняли на жидкостном хроматографе «8Ышаё2и» ЬС-6А со спектрофотометрическим детектором (К = 254 нм), (К=220 нм - для аминокислот) и интегратором «8Ышаё2и» СЯ601. Использовали стальные

колонки размером (4,6х250) мм «Тикопланин» («Chirobiotic T», Адвансд Сепарейшн Текнолоджи, США). Работу выполняли при комнатной температуре.

Для приготовления буферных растворов использовали триэтиламин и уксусную кислоту квалификации «для хроматографии». Для приготовления подвижной фазы применяли метанол и этанол квалификации «для хроматографии».

В работе использовали растворы производных аминокислот (Aldrich, Sigma) 10 мг/мл, приготовленные по точной навеске: КБЗ-БЬ-аланин, КБЗ-БЬ-метионин, КБЗ-DL-норлейцин, КБЗ-DL-лейцин, КБЗ-DL-валин, КБЗ-DL-лизин, КБЗ-DL-фенилаланин, КБЗ-DL-тирозин, КБЗ-DL-триптофан, Бензоил-DL-валин, Бензоил-DL-аланин, Бензоил-DL-фени-лаланин, Бензоил-DL-аргинин, Дансил-DL-норлейцин, Дан-сил-DL-лейцин, Дансил-DL-норвалин, Дансил-DL-валин, Дансил-DL-серин, Дансил-DL-фенилаланин, Дансил-DL-триптофан, Дансил-DL-a-аминомасляная кислота, ФМОК-DL-валин, ФМОК-DL-лейцин, ФМОК-DL-норлейцин, ФМОК-DL-метионин, ОФА-DL-лейцин, ОФА-DL-норлей-цин, ОФА-DL-тирозин, ОФА-DL-фенилаланин, ОФА-метил-DL-триптофан, ОФА-DL-глутамин, ОФА-DL-аргинин, ОФА-DL-аспарагин, ОФА-DL-гистидин, Фталил-DL-валин, Фта-лил-DL-метионин, ДНФ-DL-норвалин, ДНФ-DL-метионин, ДНФ-DL-этионин, ДНФ-DL-норлейцин и растворы аминокислот (Aldrich, Sigma) 20 мг/мл, приготовленные по точной навеске: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норва-лин, аланин, метионин, треонин, серин, изосерин, лизин, гистидин, аспарагин, аргинин, глутамин, ДОФА, тирозин, фенилаланин.

Результаты и их обсуждение

Как известно из литературных данных [2,4], макроцик-лические антибиотики проявляют высокую хиральную активность как в обращенно-фазовом и нормально-фазовом режимах жидкостной хроматографии, так и при элюировании полярными органическими растворителями. Выбор режима работы определяется природой разделяемых веществ.

В работе изучены закономерности удерживания производных аминокислот на хиральной неподвижной фазе «Ти-копланин» в варианте обращенно-фазовой хроматографии.

Т а б л и ц а 1

Хроматографические параметры разделения энантиоселек-тивных производных аминокислот на макроциклическом антибиотике «Тикопланин»

Вещество к'1 а К2 Подвижная фаза

Дансил-ВЬ-валин 4,15 1,19 1,42 5320 МеОН/ТЕАА*

Дансил-ВЬ- 4,32 1 ,40 2,43 5252 20/80

-норвалин

Дансил-ВЬ- 4,32 1 ,27 1,50 5611

-лейцин

Дансил-ВЬ- 5,67 1 ,45 2,52 5400

-норлейцин

Дансил-ВЬ-серин 2,36 1 ,21 1,45 5754

Дансил-ВЬ-а- 3,58 1 ,20 1,50 5635

-амино-масляная

кислота

Дансил-ВЬ- 5,83 1 ,1 6 1,62 5341

-фенилаланин

Дансил-ВЬ- 7,12 1,14 1,20 4985

-триптофан

КБЗ-ВЬ-лейцин 1,48 2,67 3,36 6580

КБЗ-ВЬ- 1,72 3,16 5,03 6782

-норлейцин

КБЗ-ВЬ-аланин 0,87 4,53 3,86 7105

КБЗ-ВЬ-валин 1,06 1 ,98 2,83 7004

КБЗ-ВЬ- 1,68 3,02 4,61 6528

-метионин

КБЗ-ВЬ-лизин 1,02 2,84 4,28 7059

КБЗ-ВЬ - тирозин 2,26 2,14 5,03 5257

КБЗ-ВЬ- 2,84 2,12 3,95 4852

-фенилаланин

КБЗ-ВЬ- 4,44 1 ,95 3,38 4958

-триптофан

Бензоил-ВЬ- 1,01 3,20 3,79 6520

-валин

Бензоил-ВЬ- 0,79 2,80 3,51 6743

-аланин

Бензоил-ВЬ- 2,08 1 ,97 1,62 5834

-фенилаланин

Бензоил-ВЬ- 1,78 1 ,41 0,72 4538

- аргинин

ФМОК-ВЬ-валин 5,62 2,25 5,32 7541

ФМОК-ВЬ- 8,03 3,17 7,40 8250

-лейцин

ФМОК-ВЬ- 9,71 3,36 7,56 8432

-норлейцин

ФМОК-ВЬ- 9,49 3,12 6,82 8186

-метионин

Фталил-ВЬ - валин 0,87 1 ,65 1,54 5841

Фталил-ВЬ- 2,06 1 ,43 2,01 5963

-метионин

ДНФ-ВЬ- 7,53 3,38 6,42 8698

-норвалин

ДНФ-ВЬ- 5,01 2,11 5,40 8887

-норлейцин

ДНФ-ВЬ- 10,59 3,46 6,51 8957

метионин

ДНФ-ВЬ-этионин 12,54 3,12 6,23 8752

ОФА-ВЬ-лейцин 3,51 1,09 0,50 4562 МеОН/ТЕАА**

ОФА-ВЬ- 4,32 1 ,22 1,20 4845 10/90

-фенилаланин

ОФА-ВЬ-тирозин 3,73 1 ,20 1,20 5101

ОФА-метил-ВЬ- 5,32 1 ,40 2,05 5687

-триптофан

ОФА-ВЬ- 1,86 1 ,21 1,21 5420

глутамин

ОФА-ВЬ-аргинин 3,49 1 ,36 1,41 5525

ОФА-ВЬ- 1,29 1 ,42 1,41 5874

-аспарагин

ОФА-ВЬ- 3,09 1 ,08 0,40 4236

-гистидин

0,002 A

J

20

40 Г^ мин

Рис.

фаза:

1. Хроматограмма КБЗ-DL-триптофана

0,002 А

5 10 Г^ мин

Рис. 2. Хроматограмма DL-метионина (подвижная фаза: этанол - вода (50/50); Скорость потока 1,0 мл/мин;

Я = 220 нм)

Сорбаты элюировали смесями метанола и буферного раствора ацетата триэтиламина с рН 4,1, за исключением производных аминокислот с о-фталевым альдегидом, которые неустойчивы при рН < 7,0. Установлено, что для всех производных аминокислот Ь-изомер элюируется первым.

В табл. 1 представлены хроматографические параметры производных аминокислот, к которым «Тикопланин» проявил хиральную селективность.

Анализ полученных данных (табл. 1) показывает, что удерживание сорбатов растет с увеличением числа циклов и при наличии акцепторных заместителей в структуре модификатора аминокислоты в ряду:

Бензоил < ОФА < Фталил < КБЗ < ДНФ < Дансил < ФМОК

Таким образом, структура модификатора аминокислоты играет важную роль в удерживании и хиральном распознавании изомеров. Полученные закономерности хорошо согласуются с тем, что при удерживании сорбатов на макроциклических антибиотиках одним из определяющих является возникновение на поверхности неподвижной фазы сильных гидрофобных взаимодействий. Высокое удерживает ДНФ-производных говорит о заметном вкладе образования п-п-комплексов между сорбатоми и неподвижной фазой.

Т а б л и ц а 2

Хроматографические параметры разделения изомеров аминокислот на макроциклическом антибиотике «Тикопла-

нин»

Вещество k'1 Rs N2 Подвижная фаза

Лейцин 1,55 1,81 1,65 27548 EtOH/H2O

Изолейцин 1,53 1,66 1,53 28657 50/50

Норлейцин 1,59 2,12 2,35 28359

Валин 1,48 1,40 1,62 29635

Норвалин 1,56 2,33 2,28 28103

Аланин 1,54 1,57 1,54 29876

Метионин 1,69 1,80 1,58 28687

Треонин 0,81 1,49 1,27 30199

Серин 0,87 1,52 1,32 30297

Изосерин 0,91 1,23 1,40 31257

Лизин 1,05 1,42 1,61 31080

Аспарагин 1,69 1,37 1,49 29352

Аргинин 2,52 1,31 1,37 27863

Глутамин 1,64 1,32 1,46 28547

Тирозин 1,67 1,48 1,38 29870

Фенилаланин 2,01 1,40 1,48 29658

ДОФА 1,73 1,74 2,11 31100

Гистидин 11,27 1,28 1,35 28505

1 - Коэффициент емкости для первого элюируемого

2 Л

энантиомера; - число теоретических тарелок на метр; * -1%-й буфер ацетат триэтиламина

Среди изученных соединений наиболее высокая селективность разделения была достигнута для КБЗ-, ДНФ- и ФМОК-производных аминокислот и составила от 1,95 для КБЗ-БЬ-триптофана до 4,53 для КБЗ-БЬ-аланина, от 2,11 для ДНФ-БЬ-норлейцина до 3,46 для ДНФ-БЬ-метионина, от 2,25 для ФМОК-БЬ-валина до 3,36 для ФМОК-БЬ-нор-лейцина. Высокая селективность разделения производных аминокислот со столь разными структурами еще раз доказывает сложность механизма взаимодействия сорбатов с хиральной поверхностью.

На примере КБЗ-производных было изучено влияние природы аминокислоты. Установлено, что удерживание КБЗ-производных увеличивается в ряду (в скобках указаны значения коэффициентов емкости): аланин (0,87) < лизин (1,02) < валин (1,06) < лейцин (1,48) < метионин (1,68) < норлейцин(1,72) < тирозин (2,26) < фенилаланин (2,84) < триптофан (4,44).

Как видно из приведенных данных, удерживание растет с увеличением гидрофобности молекулы аминокислоты. Сравнительно небольшое удерживание КБЗ-БЬ-лизина свидетельствует о том, что наличие дополнительных полярных групп, в данном случае аминогруппы, уменьшает удерживание сорбата.

Достоинством макроциклических антибиотиков является возможность разделения аминокислот без предварительной дериватизации.

Выбор подвижной фазы проводили на основании литературных данных. При сравнении водно-органических элюентов с метанолом, этанолом и изопропанолом, пред-

почтение отдается метанолу или этанолу, причем, как отмечается, при использовании последнего удается получить более высокую селективность разделения энантио-меров [3].

Как подчеркнуто авторами [3], различия в энергиях взаимодействия между Б- и Ь-формами аминокислот и хиральной поверхностью неподвижной фазы «Тикопла-нин» настолько велики, что изменение ионной силы, рН и концентрации органического растворителя в подвижной фазе практически не влияют на хиральную селективность сорбента.

Изучено удерживание и разделение оптических изомеров аминокислот на хиральной неподвижной фазе «Ти-копланин» при использовании в качестве подвижной фазы водно-этанольных смесей. Установлено, что Ь-изо-мер для всех аминокислот элюируется первым.

Анализ экспериментальных данных (табл. 2) показывает, что на удерживание сорбатов влияет наличие полярных групп в структуре заместителя у хирального атома углерода аминокислоты. Для треонина, серина, изосерина и лизина коэффициенты удерживания меньше, чем для других аминокислот и составляют 0,81; 0,87; 0,91; 1,05 соответственно, что может быть связано с наличием гидро-кси- и вторых аминогрупп в структуре аминокислоты. Увеличение удерживания для глутамина и аспарагина обусловлено появлением карбонильной группы.

Установлено, что коэффициенты удерживания лейцина (1,55), изолейцина (1,53), норлейцина (1,59), валина (1,48), норвалина (1,56), аланина (1,54), метионина (1,69), ДОФА (1,73), тирозина (1,67) и фенилаланина (2,01) соизмеримы.

Увеличение удерживания аргинина, и еще в большей степени гистидина, вполне оправдано структурой этих соединений, поскольку наличие группы >С=К-, содержащей п-электроны и системы двойных связей, создает возможность дополнительных п-п- и дипольных взаимодействий.

Максимальное значение разделительной способности данного сорбента было достигнуто для норлейцина (2,35), норвалина (2,28) и ДОФА (2,11). Эффективность изучаемой колонки достигала 31 100 теоретических тарелок на 1 м.

Проведенное исследование показало, что хиральная неподвижная фаза «Тикопланин» проявляет широкие возможности в качестве хирального селектора для разделения производных аминокислот и самих аминокислот. Высокие селективность и эффективность, особенно при разделении аминокислот, показывают, что данный сорбент перспективен для их препаративного разделения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Armstrong D. W. // LC-GC Current Issues in HPLC Technology.

1997. №5. P. 20.

2. Armstrong D.W., Tang Y, Chen S., Zhou Y. // Anal. Chem. 1994.

66. №9. P. 1473.

3. Berthod A., Liu Y., Bagwill C., Armstrong D.W. // J. Chromatogr.

1991. 731. P. 123.

4. Armstrong D.W., Liu Y, Ekborgott K. // Chirality. 1995. 7. P. 474.

Поступила в редакцию 06.03.01