Штамм суспензионной культуры клеток полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) под обозначением NEFU-Avul-1 в условиях in vitro - для получения биомассы клеток
STRAIN OF SUSPENSION CELL CULTURE OF WORMWOOD (ARTEMISIA VULGARIS L.) UNDER THE DESIGNATION NEFU-AVUL-1 UNDER IN VITRO CONDITIONS - TO OBTAIN CELL BIOMASS

Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности, суспензионному культивированию клеток растения на основе каллусных клеток дикорастущего представителя полыни обыкновенной, и может быть использовано в качестве растительного лекарственного сырья для получения вторичных метаболитов.
Artemisia vulgaris
in vitro
Штамм NEFU-Avul-1 суспензионных культур клеток полыни обыкновенной ( L.), полученный в условиях , идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Института физиологии растений РАН, регистрационный номер 117.
in
vitro
,
(Artemisia
vulgaris
Заявленное изобретение представляет собой способ получения и выращивания суспензионной культуры клеток  на основе каллусных культур клетокполученных от стерильных проростков на основе семян дикорастущего растения полыни обыкновеннойL.), произрастающего в условиях криолитозоны.
in vitro
Клеточные технологии дают возможность получения альтернативного растительного сырья в виде каллусов и суспензий клеток растений (лекарственных, редких, уникальных и еще не исследованных видов), аккумулирующих биологически активные вещества (БАВ) (вторичные метаболиты), которые могут храниться длительное время в лиофильно высушенном состоянии без потери фитохимического состава и физиологической активности (см. Янг Й., Асякина Л.К., Бабич О.О., Дышлюк Л.С., Сухих С.А., Попов А.Д., Костюшина Н.В. Изучение физико-химических свойств и биологической активности экстрактов из высушенной биомассы каллусных, суспензионных клеток и корневых культур  // Техника и технология пищевых производств. - 2020. - Т. 50. №3. С. 480-492.).
in vitro
Dracocephalum palmatum
Суспензионная культура клеток растений  представляет собой гомогенную биомассу популяций клеток, выращенную в специальной жидкой питательной среде с добавлением регуляторов роста и при соответствующих условиях перемешивания, температурного и газового режимов, рН среды и других внешних факторов. Известно, что северные и арктические растения богаты вторичными метаболитами с антибактериальной, фунгистатической и противораковой активностью, что показано в исследованиях, проведенных А.А. Макаровым и другими исследователями (см. Сивцева С. В., Охлопкова Ж.М. Фунгистатическая активность экстрактов из некоторых дикорастущих растений Якутии // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. - 2016. -№6. - С. 106-113.; Чирикова Н.К., Оленников Д.Н. Фитохимические исследования дикорастущих лекарственных растений Якутии // Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Севере: сборник материалов III научно-практической конференции с международным участием и Научной школы по клеточной биотехнологии, Якутск, 04-08 июня 2018 года. - Якутск: Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова, 2018. - С. 23-25.; Lee S.E., Okhlopkova Z., Lim C. and Cho S. (2020).  Stephan extract induces apoptosis in human prostate cancer cells via the caspase-8-mediated extrinsic pathway. Chinese Journal of Natural Medicines 18(10), 793-800. https://doi.org/10.1016/S1875-5364(20)60019-X).
Artemisia vulgaris
Artemisia vulgaris
Gaultheria fragrantissima
Artemisia vulgaris
Полынь обыкновенная ( L.) довольно известна своим многовековым опытом применения в народной медицине как слабительное, потогонное, мочегонное, глистогонное средство, кроме того, проявляет хорошую антиоксидантную и антибактериальную активность (см. Pandey B.P., Thapa R. and Upreti A. (2017). Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities of essential oil and methanol extract of  and  collected from Nepal. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 10, 952-959. https://doi.org/10.1016/j.apjtm.2017.09.005). Однако, в современной фармацевтической промышленности полынь обыкновенная ( L.) используется редко. Исследования последних лет показали наличие противовоспалительных, гиполипидемических, антималярийных, противоопухолевых, бронхорасширяющих и противосудорожных свойств (см. Давлатова М.С., Кароматов И.Д. Полынь обыкновенная // Биология и интегративная медицина. - 2017. - №5. - С.101-108.; Кароматов И.Д., Аминова М.З., Авезова Х.Ж. Противомалярийные средства растительного происхождения в народной и научной фитотерапии // Биология и интегративная медицина. - 2018. - №11, С.81-92.; Кароматов И.Д., Давлатова М.С.Лекарственные растения с противогельминтной и противоэхиноккозной активностью // Биология и интегративная медицина. - 2018. - №11. - С.116-130.).
Artemisia vulgaris
Artemisia annua
Artemisia
Artemisia
Недавние исследования китайских ученых установили высокий антивирусный потенциал полыни обыкновенной ( L.) против коронавирусной инфекции (см. Haq F.U., Roman M., Ahmad K., Rahman S.U., Shah S.M.A., Suleman N., Ullah S., Ahmad I. and Ullah W. (2020). : Trials are needed for COVID-19. Phytotherapy Research 34(10), 2423-2424. https://doi.org/10.1002/ptr.6733; Orege J.I., Adeyemi S.B., Tiamiyu B.B., Akinyemi T.O., Ibrahim, Y.A. & Orege O.B. (2021).  and -based products for COVID-19 management: current state and future perspective. Advances in Traditional Medicine. Springer.; Jia S., Luo H., Liu X., Fan X., Huang Z., Lu S., Shen L., Guo S., Liu Y., Wang Z., Cao L., Cao Z., Zhang X., Zhou W., Zhang J., Li J., Wu J., Xiao W. (2021). Dissecting the novel mechanism of reduning injection in treating Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) based on network pharmacology and experimental verification. Journal of Ethnopharmacology 273. https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.113871; Benkhaira N., Koraichi S.I. and Fikri-Benbrahim K. (2021). Ethnobotanical survey on plants used by traditional healers to fight against covid-19 in fez city, northern morocco. Ethnobotany Research and Applications 21. https://doi.org/10.32859/era.21.27.1-18).
Artemisia absinthium
A. sieversiana
A. jacutica
Artemisia glabella
Artemisia
На лекарственные свойства полыни во многом влияют содержащиеся в них эфирные масла и сесквитерпеновые лактоны (см. Сальникова Е.Н., Калинкина Г.И., Дмитрук С.Е. Химическое исследование флавоноидов полыни горькой ( L.), П. сиверса ( Willd.) и П. якутской ( Drob.) // Химия растительного сырья. - 2001. - №3. - С.71-78). Эти свойства демонстрируют большую перспективность для дальнейшего использования в медицине, к примеру, противоопухолевый препарат «Арглабин» был разработан на основе сесквитерпенового γ-лактон - арглабина, выделенного из полыни гладкой ( Kar.et Kir), эндемика Казахтанской флоры (см. Adekenov S. M. Artemisiaglabella Kar. Et Kir. - a source of the new antitumor preparation «Arglabin» // Phytomedicine. 2000. Vol.7. P. 103.; Randalova T.E., Atazhanova G.A., Adekenov S.M., Zhigzhitzhapova S.V., Radnaeva L.D. A the Chemical Composition of Plants of the Genus  containing Arglabin of Russian (Buryatia) and Kazakhstan’s floras // Czech Chem. Soc. Symp.Ser. - 2015. - N13. - P.163-173.). Кроме того, растения богаты фенольными соединениями, а именно флавоноидами, обладающими широким диапазоном биологической активности.
Artemisia vulgaris
Artemisia
Artemisia
Asteraceae
Известно, что в условиях Якутии биомасса полыни обыкновенной на сырой вес содержит: эфирное масло до 0,61%, аскорбиновую кислоту до 175 мг %, а также каротин, кумарины, сапонины и немного дубильных веществ. Листья содержат: до 130 мг % аскорбиновой кислоты и 11 мг % каротина, в них содержание эфирного масла достигает до 0,04-0,05%. В состав эфирного масла входят, в %: камфора (38,05), борнеол (6,21), окись кариофиллена (5,47), β-панасинсен (4,81), гермакрен D (4,49), α-пинен (0,81), камфен (3,75-5,25), неоинтермедиол (3,79-5,55) п-цимол (0,63), 1,8-цинеол (2,13), линалоол (0,71), транс-сабиненгидрат (0,37), терпинеол-4 (3,15), пиперитон (1,68), борнилацетат (1,43), лонгипинен (1,53), α-копаен (0,91), кариофиллен (1,16), β-селинен (2,09), пресилферфолан-9-α-ол (3,04), спатуленол (6,82-10,70), гексадеканаль (1,10), β-пинен (0,53), п-цимола (0,6), транс-β-оцимена (0,23) (см. Жигжитжапова С. В., Соктоева Т.Э., Раднаева Л.Д., Тараскин В.В., Намзалов Б.-Ц.Б. Фитохимическая характеристика полыни обыкновенной  L., произрастающей на территории Бурятии // Вестник Бурятского государственного университета. Философия. - 2012. - №SC. С.74-77. doi:10.24412/Fgkb_GAP538; Жигжитжапова С. В., Намзалов Б.-Ц.Б., Дыленова Е.П., Раднаева Л.Д. Состав эфирных масел полыней рода  секции  (семейство ), произрастающих в республике Бурятия // Химия растительного сырья. - 2018. - №2. - С.45-54.).
Artemisia vulgaris
Выделяемое эфирное масло жидкое, обладает светло-желтым цветом и слабым запахом (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии. - Якутск: Якутское кн. изд-во, 1970. -178 с.). В фитомассе полыни обыкновенной также было обнаружено содержание артемизина - вещества, обладающего антиоксидантными свойствами (см. Федоров А.А., Ефремова М.И., Чирикова Н.К. Химический состав Уерэ ото ( L.) как пищевого и лекарственного растения Якутии // Фундаментальные исследования. - 2014. - №11. - С. 1981-1983; Демидова Е.И., Кисилева А.Н., Стрелычева К.А., Коган Е.Г. Отдельное фармакогностическое изучение нефармакопейных лекарственных растений: белокопытник гибридный и полынь обыкновенная // Смоленский медицинский альманах. - 2017. - №1. С. 108-112).
Artemisia vulgaris
При этом из открытых источников технические решения в области культивирования суспензионной культуры  L. и получаемому штамму не выявлены.
Tribulus terrestris
Phlojodicarpus sibiricus
Косвенными аналогами можно считать: 1) суспензионный штамм культивируемых клеток растения якорцы стелющиеся ( L.) (см. RU №2617956, кл. C12N 5/14, А01Н 5/00, опубл. 28.04.2017); 2) штамм суспензионных культур клеток вздутоплодника сибирского ( (Steph.) К.-Pol.) (см. RU №2729981, кл. А01Н 4/00, опубл. 13.08.2020). Известные штаммы характерны относительно низким индексом роста.
Artemisia
Artemisia
vulgaris
Задачей настоящего изобретения является получение суспензионной культуры клеток представителя рода  L. -  L., в условиях мульти-шейкера с устойчивыми морфологическими и ростовыми характеристиками.
Artemisia vulgaris
in vitro
Поставленная задача решена тем, что получен штамм суспензионной культуры  L. (NEFU-Avul-1) в условиях .
Artemisia vulgaris
in vitro
Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм суспензионной культуры  L. (NEFU-Avul-1) впервые получен в условиях .
Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, включая оптимизацию питательной среды, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик.
in vitro
Artemisia vulgaris
Предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу были взяты 5-недельные каллусы, полученные из листовых эксплантов стерильных проростков , индуцированные из семян центрально-якутской популяции дикорастущего представителя  L.
Artemisia vulgaris
Заявленное решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре показана графическая схема в нормальной системе координат кривой роста суспензионной культуры  L. при выращивании в колбах объемом 250 мл.
Для получения суспензионной культуры в качестве экспланта была взята каллусная культура листового происхождения, в асептических условиях при помощи пинцета в колбу с питательной средой (MS, с 0,5 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л НУК) помещали кусочек каллуса размером примерно 5-10 мм, после чего ставили их в шейкер для постоянного перемешивания при скорости 120 об/мин. Спустя 4 недели, при отсутствии признаков разрыхления каллуса до достояния суспензии, первичную суспензионную культуру пересаживают, со степенью разведения первичная культура:свежая питательная среда как 1:3. До разрыхления каллуса до состояния суспензии, среду меняют до 3-4 раз.
Artemisia vulgaris
in vitro
После перехода каллуса в суспензию, из полученной первичной суспензионной культуры, извлекали примерно 20 мл суспензии на 100 мл свежей питательной среды MS с составом гормонов 0,2 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК. При этом культивирование суспензии проводят в условиях темноты, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, на шейкере (PSU-20i, Орбитальный шейкер; BioSan, Латвия) при скорости перешивания 100±20 об/мин, цикл субкультивирования составляет 3 недели. Изобретение позволяет получить суспензионную культуру клеток полыни обыкновенной ( L.) в условиях .
Состав питательной среды представлен в таблице 1.
Artemisia vulgaris
Таким образом, получена суспензионная культура клеток  L. из каллусных культур листового происхождения. Во время процесса оптимизации питательной среды были определены цитологические и ростовые характеристики. Исходя из этих данных культивируемый штамм можно отнести к жизнестойким и интенсивно растущим (см. диаграмму роста на фигуре и параметры роста в - таблице 2). Кроме того, суспензионная культура характеризуется стабильными ростовыми характеристиками и отсутствием сезонной зависимости.
Штамм суспензионной культуры клеток имеет следующие морфологические признаки: суспензионная биомасса преимущественно неморфогенная, однородная, бледной зеленовато-бежевой окраски. Состоит из дедифференцированных агрегатов паренхимоподобных иногда меристемоподобных клеток, а также содержит одиночные паренхимоподобные и меристемоподобные клетки. Форма клеток округлая и/или вытянутая и/или червеобразно-удлиненная.
Таблица 1Состав питательной среды
(NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>)
1650 мг/л
(KNO<sub>3</sub>)
1900 мг/л
(CaCl<sub>2</sub>)
440 мг/л
(MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O)
370 мг/л
(KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>);
170 мг/л
(MnSO<sub>4</sub>x4H<sub>2</sub>O)
22,3 мг/л
(H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>)
6,2 мг/л
(ZnSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O)
8,6 мг/л
(Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>x2H<sub>2</sub>O)
0,25 мг/л
(CuSO<sub>4</sub>x5H<sub>2</sub>O);
0,025 мг/л
(CoCl<sub>2</sub> · 6Н<sub>2</sub>О)
0,025 мг/л
(KI)
0.83 мг/л
(FeSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O)
5,57 мг/л
(Na<sub>2</sub>ЭДТАx2H<sub>2</sub>O)
7,45 мг/л
Тиамин
0,1 мг/л
Пиридоксин
0,5 мг/л
Никотиновой кислота
0,5 мг/л
Сахароза
30 г/л
Инозитол
100 мг/л
Гидролизат лактальбумина
500 г/л
Нафтилуксусная кислота
0,5 мг/л
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота
0,5 мг/л
6-бензиламинопурин
0,2 мг/л
Вода
Таблица 2Ростовые характеристики суспензионной культуры<i> Artemisia vulgaris</i> L.
Продолжительность культивирования, сутки
Сырая биомасса, г/мл 100
Сухая биомасса, г/мл 100
1
1,0583
0,0473
20
38,9967
1,3582
Таблица 3Сравнение индекса роста суспензионных культур разных видов растений
Видовое название растений, номер штамма суспензионной культуры клеток
Индекс роста(по весу сухой биомассы, в г)
<i>Tribulus terrestris</i> L. (RU2617956C2)
8,1
<i>Phlojodicarpus sibiricus</i> (Steph.) К.-Pol. (RU2729981C1)
9,98
<i>Artemisia annua</i> L. (NEFU-Avul-1)
22,37