ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 1G7 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ ТИПА В
STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 1G7 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR BOTULINUM TOXIN OF TYPE B

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител к ботулиническому токсину типа В. Ботулизм представляет собой тяжелое нервно-паралитическое заболевание пищевого происхождения, обусловленное действием ботулинических нейротоксинов (BoNTs), секректируемых анаэробными микроорганизмами Clostridium botulinum [Stanker, L.H. А Monoclonal Antibody Based Capture ELISA for Botulinum Neurotoxin Serotype B: Toxin Detection in Food / L.H. Stanker, M.C. Scotcher, L. Cheng, K. Ching, J. McGarvey, D. Hodge and R. Hnasko // Toxins (Basel). - 2013. - V. 5. - P. 2212-2226].
Широкое использование домашнего консервирования, соление, копчение рыбы и мясных продуктов без соблюдения соответствующих технологий влияет на интенсивность эпидемических проявлений данной инфекции. Заражение людей происходит преимущественно в результате употребления в пищу продуктов, содержащих ботулотоксины и самих возбудителей Clostridium botulinum (пищевой ботулизм) и через поврежденные кожные покровы (травматический ботулизм) [Носкова, О.А. Клинико-эпидемиологические особенности и совершенствование лабораторной диагностики ботулизма в Иркутской области / О.А. Носкова, Т.Ю. Загоскина, Е.Н. Субычева, Е.Ю. Марков, С.Е. Лекомцева, О.Б. Бодрых, С.В. Балахонов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - №2 (90) Часть 1. - С. 102-106]. В естественных условиях BoNTs существуют в составе стабильных комплексов с другими белками. Существование в комплексе защищает ботулотоксины от агрессивной среды желудка при пищевой интоксикации и увеличивает их время жизни в кровотоке [Аббасова, С.Г. Моноклональные антитела к ботулиническим нейротоксинам типов A, B, E и F / С.Г. Аббасова, Н.В. Руденко, А.Ю. Гороховатский, М.В. Капралов, И.Д. Виноградова, Ю.В. Вертиев, В.А. Несмеянов, Е.В. Гришин // Биоорганическая химия. - 2011. - т. 37. - №3. - С. 344-353].
Существует семь различных серотипов токсинов (А-Н), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками. Наибольшую угрозу для людей представляют токсины серотипов A, B, E и F. [Cheng, L.W. Detection of Botulinum Neurotoxin Serotypes A and В Using a Chemiluminescent versus Electrochemiluminescent Immunoassay in Food and Serum / L.W. Cheng, L.H. Stanker // Agric Food Chem. - 2013. - V 61. - P. 755-760].
В общей сложности с 2001 по 2007 г. в США было зарегистрировано 139 случаев пищевого ботулизма, из них основная масса случаев, вызванных интоксикацией BoNT/A и BoNT/E, и только 10 случаев, непосредственно связанных с потреблением пищи, зараженной BoNT/B. В тот же период времени было отмечено 387 случаев BoNT/B детского ботулизма, причиной которых явилось действие BoNT/B. Хотя пищевой ботулизм, ассоциированный с серотипом B, встречается реже, тем не менее представляет собой серьезную угрозу для безопасности пищевых продуктов. Подтверждением этому являются зарегистрированные в США и Великобритании крупные вспышки ботулизма [Scotcher, М.С. Detection of botulinum neurotoxin serotype В at sub mouse LD50 levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk / M.C. Scotcher, L.W. Cheng, L.H. Stanker // PLoS ONE. - 2010. - V 5. - P. 1-10].
2
Специфические антитела широко применяются для диагностики ботулинической инфекций. Существует российский патент RU 2152036 (приоритет от 12.05.1998, правообладатель НПО «Биомед»), описывающий способ определения ботулотоксинов A и B на основе специфических F(ab)-фрагментов антител. Предложены Fab-фрагменты рекомбинантных антител, специфичных к ботулотоксинам типов A и B. Эти Fab-фрагменты могут использоваться в качестве иммуносенсоров для обнаружения ботулотоксинов в продуктах питания и для других нужд здравоохранения и министерства обороны [Пат. 5932449 США, C07K 16/12, C12P 021/04. Обнаружение ботулотоксина / The Secretary of the Army, США, №08792824, заявл. 30.01.1997]. Большинство описанных систем детекции токсинов ботулизма с применением антител основывается на классическом иммуноферментном анализе.
Известны гибридомы, продуцирующие мышиные МКА к ботулиническому нейротоксину типа В, характеризующиеся стабильностью продукции антител, на основе которых разработан ряд высокочувствительных тест-систем в формате иммуноферментного анализа [Stanker, L.H. A Monoclonal Antibody Based Capture ELISA for Botulinum Neurotoxin Serotype B: Toxin Detection in Food / L.H. Stanker, M.C. Scotcher, L. Cheng, K. Ching, J. McGarvey, D. Hodge, and R. Hnasko // Toxins (Basel). - 2013. - V. 5. - P. 2212-2226]. Однако известные зарубежные штаммы гибридных клеток Mus musculus - продуценты МКА, которые можно использовать для выявления ботулинических нейротоксинов, недоступны для получения МКА и производства отечественных диагностических тест-систем. В России в настоящее время отсутствуют запатентованные штаммы-продуценты МКА к ботулотоксинам.
Диагностика ботулизма проводится на основании клинических, эпидемиологических и лабораторных данных. Применяемые в настоящее время методы лабораторной диагностики ботулизма трудоемки, затратны и требуют создания особых условий проведения анализа или использования специального дорогостоящего оборудования [Носкова, О.А. Клинико-эпидемиологические особенности и совершенствование лабораторной диагностики ботулизма в Иркутской области / О.А. Носкова, Т.Ю. Загоскина, Е.Н. Субычева, Е.Ю. Марков, С.Е. Лекомцева, О.Б. Бодрых, С.В. Балахонов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - №2 (90) Часть 1. - С. 102-106].
Разработка экспресс-методов детекции BoNTs остается актуальной проблемой как для медицины, так и для органов государственного санитарно-эпидемиологического контроля, вследствие их экстремальной токсичности и самой высокой летальности при пищевых отравлениях. Кроме того, в последнее время во всем мире внимание к данной категории токсинов возросло из-за угрозы биотерроризма [Аббасова, С.Г. Моноклональные антитела к ботулиническим нейротоксинам типов A, B, E и F / С.Г. Аббасова, Н.В. Руденко, А.Ю. Гороховатский, М.В. Капралов, И.Д. Виноградова, Ю.В. Вертиев, В.А. Несмеянов, Е.В. Гришин // Биоорганическая химия. - 2011. - т. 37. - №3. - С. 344-353].
Наиболее яркими примерами в этой области являются создание гибридомной технологии для получения моноклокнальных антител (МКА) с заданными свойствами.
Задача данного изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к ботулиническому токсину типа В и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя ботулизма.
Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1G7 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к ботулиническому токсину типа B.
Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1G7 депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ МПБ), коллекционный номер - Н-46, и используется как продуцент моноклональных антител для выявления ботулинического нейротоксина типа B.
Родословная штамма.
8
7
Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1G7 получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют 4-кратным введением рекомбинантного ботулинического токсина типа B в дозе 100 мкг/мышь. На третьи сутки после последней иммунизации проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×10 клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (1×10 клеток). В качестве сливающего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля фирмы (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.
Характеристика штамма гибридных клеток животных Mus musculus 1G7.
Морфологическая характеристика.
Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку.
Культуральные свойства.
5
5
Культивирование штамма гибридных клеток животных Mus musculus 1G7 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах ″Costar″. Пассирование клеток гибридомы 1G7 проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2 - 1:3. Посевная концентрация клеток составляет 1×10 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1×10 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).
Культивирование гибридомы 1G7 в организме животного.
Самкам мышей BALB/c 20-недельного возраста предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma, США). Через 2-4 недели культивируемые клетки штамма, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок клеток суспензируют в стерильной среде RPMI. Самкам мышей BALB/c внутрибрюшинно вводят каждой по 1 мл клеточной суспензии, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Гибридома прививается в 100% случаев. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день, на 10-21 сутки животных усыпляют и из брюшной полости извлекают 3-5 мл иммуноасцитической (ИАЖ) жидкости. Клетки из ИАЖ отделяют центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяют титр МКА с помощью иммуноферментного анализа [Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова//Т 33. - М.: Высш. Шк., 1991. - С. 174-175].
Характеристика полезного продукта.
Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1G7 продуцирует специфичные моноклональные антитела к ботулотоксину типа В, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:640000, в ИАЖ 1:1000000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяли путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, Bio Rad, США).
Продуктивность штамма гибридных клеток животных Mus musculus 1G7.
Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro при непрерывном культивировании. Контаминация штамма гибридных клеток животных Mus musculus 1G7. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.
Режим криоконсервации и отогрева.
Среда для замораживания содержит фетальной сыворотки - 90%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре - 70°C и затем опускают в жидкий азот.
Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°C. Клетки разводят средой RPMI 1640 («HyClone», США) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80%. Каждая ампула содержит не менее 10 млн/мл клеток.
Свойства полезного продукта. Гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG1 подклассу иммуноглобулинов мыши.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
Фиг. 1 Дот-блот с МКА 1G7. Определение специфической активности в отношении микроорганизмов рода Clostridium.
Фиг. 2 Дот-блот с МКА. 1G7. Определение чувствительности МКА 1G7 в отношении штаммов Clostridium botulinum, содержащих ботулинический нейротоксин типа В.
Фиг. 3 Дот-блот с МКА 1G7. Определение чувствительности МКА 1G7 в отношении рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа В.
Фиг. 4 Определение подклассовой принадлежности МКА 1G7.
Фиг. 5. SDS-PAGE электрофорез МКА 1G7.
Фиг. 6. Иммуноферментный анализ. Выявление ботулотоксина В методом иммуноферментного анализа.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Получение штамма гибридных клеток 1G7
Иммунизация
В качестве антигена для иммунизации использовали рекомбинантный белок, состоящий из фрагментов тяжелой цепи ботулинического токсина В. Для создания суперпродуцентов фрагментов тяжелых цепей ботулинического токсина В, последовательности ДНК, кодирующие С-концевые фрагменты этих токсинов, образующие домен НС50 В (аминокислоты N853 - Е1291 белка-предшественника ботулотоксина В), были получены ПЦР-амплификацией с геномной ДНК возбудителя, клонированы в экспрессионный вектор pET22b(+) (Novagen, США). Полученные экспрессионные конструкты были трансформированы в клетки Е. coli штамма BL21(DE3), наработка бактериальной биомассы и продукция белка проводилась при температуре +300°C и 1 мм ИПТГ [Рябко, А.К. Разработка метода детекции ботулинического нейротоксина на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией / А.К. Рябко, А.Е. Хлынцева, А.В. Колесников, О.Н. Красавцева, И.Г. Шемякин, Т.И. Комбарова, И.В. Жарникова, А.В. Козырь // Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития: Материалы VI Международной научно-практической конференции (20.11.2012). - М.: Издательство «Спутник+». - 2012. - 70 с.].
Штамм гибридных клеток Mus musculus получают следующим образом. Самок мышей BALB/c иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице.
Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после последней инъекции антигеном в концентрации 100 мкг согласно Animal protocol № Ρ 02-19 стр. 7.
Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.
Гибридизация.
8
7
Для слияния используют селезеночные клетки мышей и клетки мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 в количестве 1×10 и 1×10 соответственно. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ в течение 1 мин. Смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Затем клетки растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют 96-луночные микропланшеты (Costar, США) на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c, по 50 мкл в лунку.
Селекция.
Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ («ПанЭко», Россия), состоящей из питательной среды RPMI, в которую добавлены 20% фетальной сыворотки коров, 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина. Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде RPMI - 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 MM/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.
Скрининг гибридных клонов.
Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА).
2
2
Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1 мкг/лунку рекомбинантного болулинического нейротоксина типа В и выдерживают при температуре 37°C в течение 2 часов или при 4°C в течение 18 часов. После инкубации лунки промывают 3-5 раз фосфатно-солевым буфером pH 7,4, содержащим 0,05% твин-20 (Sigma). (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. Три раза отмывают ФСБ-Т. Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 1 ч при 37°C. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа, затем 6 раз отмывают лунки раствором ФСБ-Т. Далее планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию: в лунки вносят по 100 мкл субстрат -индикаторного раствора (10 мкл 30% HO и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-нитратного буфера pH 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят на фотометре (xMark, Microplate Spectrophotometr, Bio-Rad, США) для ИФА при длине волны 492 нм.
4
Клонирование гибридных клеток 1G7 проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 1×10 клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.
Культивирование.
Культивирование штамма гибридных клеток 1G7 ведут при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.
Криоконсервация.
Клоны гибридомы 1G7 криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.
Пример 2. Выращивание культуры С. botulinum в условиях продукции токсина
Выбранные хорошо изолированные, типичные колонии С. botulinum, выросшие на твердой питательной среде (клостридиальный агар - 25,25 г, 1 г дрожжевого экстракта, 2 г агара, 475 мл дистиллированной воды) инкубированной в анаэробных условиях в течение 48 ч при 35°C, суспендировали в физиологическом растворе (до оптической плотности 4 по Мак Фарланду) и прогревали в течение 10 минут при 80°C для инактивации вегетативных клеток.
Прогретую культуру (1 мл) вносили в свежеприготовленную среду для продукции токсина (casein enzymic hydrolysate - 10 г/л, pepton aus Casein C/ESX Enzymatich for Tocingenwennung - 10 г/л, sodium thioglycollate - 0,25 г/л, дрожжевой экстракт - 10 г/л, дистиллированная вода - 500 мл), пробирки с 9 мл среды, соотношение 1/10. Инкубацию проводили при 35°C в течение 5 дней в анаэробных условиях, полученных в анаэростате при помощи газогенерирующего пакета (GasPak EZ, «BD», США).
Пример 3. Определение специфической активности в отношении микроорганизмов рода Clostridium.
Для проведения данного исследования использовали панель из 24 микроорганизмов, включающую микроорганизмы рода Clostridium и другие (таблица 2).
Таблица 2
Панель микроорганизмов для определения специфической активности МКА 3F11.
Ряд A
Ряд B
Ряд C
A1. Clostridium botulinum №311, тип В
B1. Clostridium perfringens АТСС 10543
C1. Salmonella paratyphi A 225
A2. Clostridium botulinum №312, тип В
B2. Clostridium difficile 2652 К
C2. Shigella flexneri 1a 8516
A3. Clostridium botulinum №364, тип В
B3. Escherichia coli O157:H7 5999
C3. Shigella sonnei 4385
A4. Clostridium botulinum АТСС 19697 тип А
B4. Escherichia coli O86 Orskow
C4. Yersinia enterocolitica 287
A5. Clostridium botulinum №345 тип А
B5. Escherichia coli 675
C5. Yersinia pseudotuberculosis III
A6. Clostridium coccoides АТСС 29263
B6. Escherichia coli О6 25922 ATCC
C6. Brucella abortus 544
A7. Clostridium histolyticum ATCC19501
B7. Salmonella typhi 65
C7. Escherichia coli 4879
A8. Clostridium novyi ATCC 19402
B8. Salmonella typhimurium 21
C8. Proteus vulgaris
6
2
2
На нитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare Life Sciences, Amersham, Germany) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбировали инактивированные микробные клетки в концентрациях 1×10 клеток/лунку. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 1G7 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0,05% диаминобензидина (Sigma, США), 0,015% HO, 0,01 Μ фосфатно-солевой буфер, pH-7,4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
Как показал проведенный анализ, МКА 1G7 специфически взаимодействовали со штаммами Clostridium botulinum, содержащими ботулинический нейротоксин типа В, и не давали перекрестных реакций с другими микроорганизмами (фиг. 1).
Пример 4. Определение чувствительности MICA 3F11 в отношении штаммов Clostridium botulinum, содержащих ботулинический нейротоксин типа В
8
5
Была проведена проверка чувствительности КЖ гибридом 3F11 в отношении ботулотоксина типа В методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали штаммы Clostridium botulinum типа В с начальной концентрацией 1×10 м.кл/мл и титровали двукратным шагом до конечной концентрации 1×10 м.кл/мл (1 ряд - штамм Clostridium botulinum №311, тип В, 2 ряд - Clostridium botulinum №312, тип В, 3 ряд - Clostridium botulinum №364, тип В).
2
2
Далее мембрану блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 3F11 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% HO, 0,01 Μ фосфатно-солевой буфер, pH-7,4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
5
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 3F11 выявляют ктетки штаммаов Clostridium botulinum типа В до 1×10 м.кл/мл (фиг. 2).
Пример 5. Определение чувствительности МКА 1G7 в отношении рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа В
2
2
Была проведена проверка специфической активности КЖ гибридом 1G7 в отношении ботулинического нейротоксина типа В методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали ботулотоксин В с начальной концентрацией 0,5 мкг/мл и титровали двукратным шагом. Далее мембрану блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 1G7 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0,015% HO, 0,01 Μ фосфатно-солевой буфер, pH-7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.
В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 1G7 выявляют до 0,5 нг/мл ботулотоксина В (фиг. 3).
Пример 6. Определение подклассовой принадлежности МКА, продуцируемых гибридомой 1G7
Подклассы полученных МКА определяют с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США). В культуральную жидкость объемом 500 мкл погружают иммунохроматографическую полоску для определения изотипов мышиных моноклональных антител не глубже чем на 1,5 см на 5 минут. После проявления контрольной полосы и полосы, соответствующей тестируемым Ig, определяют с помощью контрольной иммунохроматографической полоски (прилагается к набору для определения изотипов мышиных моноклональных антител) подкласс антител.
Определение подкласса полученных МКА показало, что штамм гибридных клеток 1G7 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG1 подклассу иммуноглобулинов мыши (фиг. 4).
Пример 7. Выделение и очистка МКА 1G7
3
Выделение МКА из асцитической жидкости проводят путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Клеточные компоненты из культуральной и асцитической жидкостей удаляют центрифугированием (2000 g ×20 мин), pH культуральной жидкости доводят до 8,6 при помощи 1 N раствора NaOH, асцитическую жидкость разводят 1:1 посадочным буфером (0,05 Μ трис, 0,15 Μ NaCl, 0,02% NaN, pH 8,6). Колонку уравновешивают посадочным буфером и проводят нанесение образцов со скоростью 10 мл/ч при комнатной температуре. После нанесения образцов колонку отмывают от не связавшихся компонентов и проводят элюцию иммуноглобулинов 0,05 Μ глициновым буфером, 0,15 Μ NaCl, pH 2,3. Контроль выхода фракции иммуноглобулинов осуществляют при помощи УФ детектора («Pharmacia LKB», Швеция).
Выделенные иммуноглобулины концентрируют осаждением при помощи сухого сульфата аммония (до 50% насыщения) и переводят в фосфатно-солевой буферный раствор методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (PD-10, «Pharmacia LKB», Швеция) емкостью 10 мл. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях по методу Laemmli [Laemmli, U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685]. В результате были получены очищенные препараты иммуноглобулинов (фиг. 5).
Пример 8. Определение методом ИФА специфического взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штамма Mus musculus с ботулиническим нейротоксином типа В
МКА 1G7 в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4 с начальной концентрацией 5 мкг/лунку титровали двукратным шагом по вертикали до конечной концентрации 0,035 мкг/лунку (по 100 мкл/лунку в ФСБ). Для титрования использовали 96-луночные стрипованные планшеты для ИФА. В первый вертикальный ряд планшета вносили положительные (К+) и отрицательные контроли (К-) контроли. Лунку А1 с отрицательным контролем использовали как бланк. Планшет с антителами инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°C, затем 4 раза промывали ФСБ-Т. Участки неспецифического связывания блокировали добавлением в лунки по 160 мкл молока 0,5% жирности, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°C, и промывали 3 раза ФСБ-Т. Рекомбинантный ботулинический токсин титровали двукратным шагом по горизонтали с начальной концентрацией 0,5 мкг/мл в ФСБ до конечной концентрации 0,0002 мкг/мл в ФСБ (по 100 мкл/лунку в ФСБ), инкубировали при тех же условиях, после чего промывали планшет 4 раза в ФСБ-Т. Биотинилированные МКА 3F11 (фракция №3-1,4 мг/мл) вносили заведомо в избытке (разведение 1:500) по 100 мкл/лунку в ФСБ, инкубацию и промывку планшета проводили четырехкратно, как описано выше. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена («Имтек», Россия) в разведении 1:5000 (согласно инструкции по применению) в ФСБ. После инкубации и четырехкратной отмывки планшета во все лунки вносили по 50 мкл субстрата (готовый раствор 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина). Планшет помещали на 3-5 минут в темное место, затем останавливали реакцию 4N серной кислотой (50 мкл/лунку).
Планшет помещали на 3-5 мин в защищенное от света место при комнатной температуре. Учет результатов проводили с помощью планшетного спектрофотометра xMark («Bio-Rad», США) при длине волны 450 нм.
В результате проведенного анализа было установлено, что с использованием иммобилизованных МКА 1G7 предел обнаружения ботулотоксина В составил 0,4 нг/мл (таблица 2, фиг 6).