ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К АМИЛОИДУ БЕТА

1. Химерное антитело или его фрагмент, гуманизированное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются по меньшей мере с одним эпитопом β-амилоидного белка, причем эпитоп включает по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, преимущественно участвующих в связывании с антителом, причем по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка выбраны из группы, состоящей из:
а) -Lys-Leu-, встроенный в следующую коровую последовательность (SEQ ID NO: 10):
Xaa1-Хаа2-Lys-Leu-Хаа3, в которой
Xaa1 обозначает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из His, Asn, Gln Lys и Arg,
Хаа2 обозначает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Asn и Gln, и
Хаа3 обозначает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile
и б) Phe-Phe-встроенный в следующую коровую последовательность (SEQ ID NO: 9):
Хаа3-Phe-Phe-Хаа4-Хаа5-Хаа6, в которой
Хаа3 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, норлейцина, Met, Phe и Ile,
Хаа4 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala, Val, Leu, Ser и Ile,
Хаа5 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,
и Хаа6 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp,
причем указанное химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент включают вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с областью Fc дикого типа таким образом, что такая указанная молекула обладает модифицированной эффекторной функцией по сравнению с областью Fc дикого типа.
2. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которое специфически связывается по меньшей мере с двумя эпитопами β-амилоидного белка, причем каждый из двух указанных эпитопов включает по меньшей мере два последовательно расположенных аминокислотных остатка, преимущественно вовлеченных в связывание антитела, которыми являются -Phe-Phe- и -Lys-Leu- соответственно, причем указанные по меньшей мере два отличающихся связывающих сайта характеризуются аминокислотной последовательностью -Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-, показанную в SEQ ID NO: 7, и аминокислотной последовательностью His-Gln-Lys-Leu-Val- показанную в SEQ ID NO: 8 соответственно.
3. Гуманизированное антитело или его фрагмент, включающие в вариабельной области по меньшей мере одну область CDR, происходящую не от человека, и одну или несколько областей каркасных участков, происходящих не от человека, и необязательно константную область, производную от антитела человека или примата, причем указанное гуманизированное антитело или его фрагмент способны специфически связывать β-амилоидный белок, β-амилоидный мономерный пептид, полимерные растворимые амилоидные пептиды, включающие множество β-амилоидных мономерных единиц, β-амилоидных волокон, фибрилл или филаментов, и β-амилоидный полимерный пептид отдельно или в качестве части β-амилоидной бляшки, по эпитопу, включающему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 11):
Xaa1-Хаа2-Lys-Leu-Хаа3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Хаа6, в которой
Xaa1 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из His, Asn, Gln, но особенно His,
Хаа2 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Asn и Gln, но особенно Gln, и
Хаа3 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Val, Leu, и Ile, но особенно Val,
Хаа4 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Ala и Val, но особенно Ala,
Хаа5 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, но особенно Glu, и
Хаа6 обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Glu и Asp, но предпочтительно Asp.
4. А гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые включают вариабельные области с областями каркасных участков, производных от человека или примата, и по меньшей мере одну область CDR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 1, представляющей область CDR1, последовательности SEQ ID NO: 2, представляющей область CDR2, и последовательности SEQ ID NO: 3, представляющей область CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, и последовательности SEQ ID NO: 4, представляющей область CDR1, SEQ ID NO: 5, представляющей область CDR2, и последовательности SEQ ID NO: 6, представляющей область CDR3 вариабельной области легкой цепи.
5. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент, в которых по меньшей мере одна из аминокислот области CDR легкой цепи и тяжелой цепи, представленной последовательностями SEQ ID NO: 1-6, замещена путем консервативного замещения таким образом, что антитело полностью сохраняет свою функциональность.
6. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.5, у которого в аминокислотной последовательности области CDR2 вариабельной области легкой цепи, представленной в виде последовательности SEQ ID NO: 5, Lys в положении 50 по нумерации Kabat замещен на Arg, Gln или Glu, но предпочтительно на Arg, и/или Ser в положении 53 по нумерации Rabat замещен на Asn или Thr, но предпочтительно на Asn, и/или Asn в положении 53 по нумерации Kabat замещен на Ala, Val, Leu, Ser и Ile, но предпочтительно на Ser.
7. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, в котором по меньшей мере одна из аминокислот каркасного участка, производного от каркасного участка человека или примата, изменена путем замещения на аминокислоту из соответствующего участка антитела АСI-01-Ab7C2 мыши или на соответствующее ей консервативное замещение.
8. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, в котором гумманизированное антитело или его фрагмент включает каркасные участки вариабельных областей, производные от каркасных участков человека или примата, и в котором Leu в положении 47 по нумерации Kabat в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, производном от каркасного участка человека или примата, представленным в виде последовательности SEQ ID NO: 15, замещен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из норлейцина, Ile, Val, Met, Ala и Phe, предпочтительно на Leu, и/или
Ser в положении 98 по нумерации Kabat в каркасном участке вариабельной области тяжелой цепи, производном от каркасного участка человека или примата, представленным в виде последовательности SEQ ID NO: 15, замещен на аминокислоту Ser, и/или
Tyr в положении 92 по нумерации Kabat в каркасном участке вариабельной области легкой цепи, производном от каркасного участка человека или примата, представленным в виде последовательности SEQ ID NO: 12, замещен на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Phe, Leu, Val, Ile и Ala, предпочтительно на Leu и Phe, но особенно предпочтительно на Phe.
9. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, в котором вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, особенно на 95%, особенно предпочтительно на 98%, еще более предпочтительно на 100%, идентична последовательности, представленной в виде последовательностей SEQ ID NO: 15 и 16, соответственно.
10. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, в котором вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, которая на 90%, предпочтительно на 95%, особенно предпочтительно на 98%, еще более предпочтительно на 100%, идентична последовательности, представленной в виде последовательностей SEQ ID NO: 12 и 13, соответственно.
11. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, в котором по меньшей мере две, но особенно три области CDR вариабельной области тяжелой цепи имеют аминокислотную последовательность, которая на 90%, предпочтительно на 95%, особенно предпочтительно на 98%, еще более предпочтительно на 100% идентична соответствующей области CDR, представленной далее в виде последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
12. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, в котором по меньшей мере две, но особенно три области CDR вариабельной области легкой цепи имеют аминокислотную последовательность, которая на 90%, предпочтительно на 95%, особенно предпочтительно на 98%, еще более предпочтительно на 100% идентична соответствующей области CDR, представленной далее в виде последовательностей SEQ ID NO: 4-6.
13. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые способны ингибировать агрегирование А β мономеров и дезагрегировать полимерные фибриллы или филаменты, особенно полимерные фибриллы или филаменты, соединяясь с высокой сретенью конформационной чувствительности.
14. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые при совместном инкубировании с β-амилоидным мономерным пептидом, выбранным из Аβ мономерных пептидов 1-39, 1-40, 1-41 и 1-42, и/или с полимерным растворимым β-амилоидным пептидом, включающим множество указанных Аβ мономерных пептидов, и предпочтительно с Аβ1-42 мономерным пептидом и/или Аβ полимерным растворимым амилоидным пептидом, включающим множество Аβ1-42 мономерных пептидов, ингибируют агрегирование Аβ мономеров в высокомолекулярные полимерные фибриллы или филаменты, и при совместном инкубировании с заранее сформированными высокомолекулярными полимерными фибриллами или филаментами, сформированными путем агрегирования β-амилоидных мономерных пептидов, выбранных из Аβ мономерных пептидов 1-39, 1-40, 1-41, и 1-42, и предпочтительно путем агрегирования Аβ1-42 мономерных пептидов, способны к дезагрегированию ранее сформированных полимерных фибрилл или филаментов.
15. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые существенным образом связываются с агрегированным Аβ в мозге субъекта, выбранного из млекопитающего животного и человека.
16. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые снижают нагрузку Аβ бляшек в мозге млекопитающего животного или человека.
17. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, или нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, представляющие области, определяющие комплементарность, CDR 2 и 3 вариабельной области тяжелой цепи соответственно, последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 4, представляющую область CDR 1 вариабельной области легкой цепи, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи SEQ ID N0: 22, последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 22, и константную область легкой цепи SEQ ID NO: 23, последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 и константную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 26.
18. Вектор экспрессии, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.17.
19. Клетки, включающие вектор экспрессии по п.18.
20. Композиция, включающая антитело по п.1, в том числе какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части в терапевтически эффективном количестве и необязательно также включающая фармацевтически приемлемый носитель.
21. Композиция, включающая химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, включая какое-либо функционально эквивалентное антитело или его функциональные части, и необязательно также включающая дополнительное биологически активное вещество в терапевтически эффективном количестве, и/или фармацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент, причем дополнительное биологически активное вещество выбрано из соединений, используемых в лечении амилоидоза, соединений против окислительного стресса, анти-апоптических соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, например пирензепина и метаболитов, 3-амино-1-пропансульфоновой кислота, 1,3-пропандисульфоната, активаторов α-секретазы, ингибиторов β- и γ-секретазы, тау белков, нейротрансмиттеров, нарушителей β-слоев, аттрактантов для амилоида бета очищающих/истощающих клеточных компонентов, ингибиторов усеченного по N-концу амилоида бета, включая амилоид бета 3-42 в форме пироглутамата, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы, например такрина, ривастигмина, донепезила и/или галантамина, агонистов M1 и других лекарственных средств, включая какой-либо амилоид или тау модифицированное лекарственное средство и пищевые добавки, а также необязательно фрамацевтически приемлемый носитель, и/или растворитель, и/или эксципиент.
22. Способ предупреждения, лечения или облегчения воздействия одного или нескольких амилоидоз-родственных заболеваний, выбранных из амилоидоза, неврологических расстройств, например болезнь Альцгеймера (БА), болезнь диффузных поражений телец Леви, синдром Дауна, наследственное цереброспинальное кровоизлияние с амилоидозом (типа Dutch), комплекс паркинсонизм-деменция о.Гуам, прогрессирующий супрануклеарный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейсфельда-Якоба, болезнь Паркинсона, слабоумие, связанное со СПИД, амиотропный латеральный склероз, диабет взрослых, старческий кардиальный амилоидоз, эндокринные опухоли и дегенерация желтого пятна у субъекта, нуждающегося в этом, включая введение химерного антитела или его фрагмента, или гуманизированного антитела или его фрагмента, и/или их функциональной части согласно п.1, субъекту, имеющему указанное расстройство, в терапевтически эффективном количестве.
23. Способ по п.22, согласно которому лечение субъекта, в частности млекопитающего или человека с амилоид-ассоциированным состоянием, характеризующимся утратой когнитивного объема памяти, приводит к повышению сохранения когнитивного объема памяти или его полному восстановлению.
24. Способ диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний или состояний у субъекта, включающий:
(а) приведение образца ткани, или специфической части тела, или области тела субъекта, предположительно содержащих амилоидный белок, в контакт с антителом по п.1,
(б) предоставление возможности для антитела связать амилоидный белок,
(в) выявление антитела, связанного с белком, и
(г) корреляцию наличия или отсутствия связывания антитела с наличием или отсутствием амилоидного белка в образце, или специфической части тела, или области.
25. Способ определения степени нагрузки амилоидогенных бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта, включающий:
(а) получение образца, представляющего ткань и/или жидкости тела исследуемого субъекта,
(б) исследование в указанном образце наличия амилоидного белка с антителом по п.1,
(в) определение количества антитела, связанного с белком, и
(г) подсчет нагрузки бляшек в ткани и/или жидкостях тела субъекта.
26. Тест-набор для выявления и диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний и состояний, включающий антитело по п.1 и необязательно дополнительно включающий инструкции для применения антител с целью связывания амилоидного белка для формирования иммунологического комплекса и выявления формирования таким образом, что наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с наличием или отсутствием амилоидного белка.
27. Выделенная вариабельная область легкой цепи, включающая каркасные участки, производные от каркасного участка человека или примата, и по меньшей мере одну область CDR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
28. Выделенная вариабельная область тяжелой цепи, включающая каркасные участки, производные от каркасного участка человека или примата, и по меньшей мере одну область CDR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.
29. Вариабельная область легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 12.
30. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, причем антитело или его фрагмент существенным образом связывают Аβ мономеры, и/или Аβ волокна, фибриллы или филаменты и/или растворимый полимерный амилоид бета, причем антитело или его фрагмент не проявляют какой-либо существенной перекрестной реакционной способности в отношении предшественника амилоидного белка.
-7
-12
-8
-11
-8
-10
-8
-8
-7
-12
-8
-11
-9
-10
-9
-9
31. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.30, причем указанное антитело или фрагмент связываются с Аβ мономером со связывающим сродством, представленным величиной KD в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из диапазонов: по меньшей мере примерно от 1×10 М до по меньшей мере примерно 1×10 М, по меньшей мере от примерно 1×10 М до по меньшей мере примерно 1×10 М, от по меньшей мере примерно 1×10 М до по меньшей мере примерно 1×10 М, и от по меньшей мере примерно 1×10 М до по меньшей мере примерно 5×10 М, и указанное антитело или его фрагмент связываются с Аβ волокном, фибриллами или филаментами со связывающим сродством, представленным величиной KD в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из диапазонов: по меньшей мере примерно от 1×10 М до по меньшей мере примерно 1×10 М, по меньшей мере от примерно 1×10 М до по меньшей мере примерно 1×10 М, от по меньшей мере примерно 1×10 М до по меньшей мере примерно 1×10 М, и от по меньшей мере примерно 2×10 М до по меньшей мере примерно 8×10.
32. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.30, причем антитело имеет повышенное сродство с растворимым полимерным амилоидом бета и Аβ волокнами, фибриллами или филаментами, по сравнению с Аβ мономерами.
33. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.32, причем указанное антитело или его фрагмент проявляет связывающее сродство с Аβ волокнами, фибриллами или филаментами, которое по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 15 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, и особенно по меньшей мере в 25 раз выше связывающего сродства с мономером Аβ.
34. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые существенным образом связываются с агрегированными Аβ, Аβ бляшками и/или растворимыми волокнами у млекопитающего, особенно в мозге человека, но предпочтительно не показывают какой-либо перекрестной способности вступать в реакцию с предшественником амилоидного белка.
35. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые способны сдвигать равновесие между растворимой и агрегированной формой Аβ в сторону его растворимой формы путем дезагрегирования волокон до состояния растворимых поли- и мономерных форм путем индукции сдвига конформации и стабилизации дезагрегированных и растворимых Аβ форм в ткани и/или тканевых жидкостях, особенно в мозге.
36. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.35, которые способны индуцировать переход конформации β-слоя в α-спираль и/или конформацию произвольной спирали, предпочтительно в конформацию произвольной спирали, еще более предпочтительно в конформацию произвольной спирали в данном расположении в молекуле, особенно в окружении Tyr 10 и Val12 белка Аβ, что приводит к повышению конформации произвольной спирали за счет конформации β-слоя и повышенной растворимости заранее сформированных высокомолекулярных полимерных амилоидных фибрилл или филаментов.
37. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.36, причем снижение степени конформации β-слоя по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 35%, и более предпочтительно по меньшей мере на 40% и более по сравнению с соответствующими ранее сформированными амилоидными полимерными фибриллами или филаментами, инкубированными в буфере (контроль).
38. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.35, которые существенным образом связываются с полимерными растворимыми типами белка Аβ, и/или менее агрегированными растворимыми типами белка Аβ, и/или мономерным растворимым белком Аβ, таким образом, модифицируя периферическое очищение и катаболизм этих типов белка Аβ и редуцируя их токсические эффекты.
39. Способ по п.23, в котором гуманизированное антитело или его фрагмент связывают агрегированный амилоид бета вне мозга.
40. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые способны сдвигать равновесие между растворимой и агрегированной формой Аβ в сторону его растворимой формы путем дезагрегирования волокон до состояния растворимых поли- и мономерных форм.
41. Химерное антитело или его фрагмент, или гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, которые существенным образом не связываются с Аβ в ткани и/или тканевых жидкостях человека особенно в мозге, но способны сдвигать равновесие между растворимой и агрегированной формой Аβ в сторону его растворимой формы путем дезагрегирования волокон до состояния растворимых поли- и мономерных форм путем индукции сдвига конформации и связывания и стабилизации дезагрегированных и растворимых Аβ форм в ткани и/или тканевых жидкостях, особенно в мозге.
42. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, причем указанное антитело или его фрагмент проявляет связывающее сродство, которое по меньшей мере в 5 раз, 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 15 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, и особенно по меньшей мере в 100 раз выше связывающего сродства мышиного антитела.
43. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, причем сродство, специфичность и стабильность указанного антитела или его фрагмента модифицированы путем изменения профиля гликозилирования.
44. Антитело по п.1, в котором модификация аминокислоты приводит к пониженной эффекторной функции.
45. Антитело или его фрагмент по п.44, в которых аминокислотная модификация области Fc включает изменение одной или нескольких аминокислот по положениям 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 или 439.
46. Антитело или его фрагмент по п.44, в котором аминокислотная модификация области Fc включает аминокислотную мутацию D265A.
47. Антитело, включающее по меньшей мере одну вариабельную область, представленную последовательностью SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 29, или ее вариант.
48. Линия клеток, экспрессирующих антитело по п.47.
49. Способ дезагрегирования заранее сформированных бета-амилоидных волокон, включающий взаимодействие антитела hC2 с заранее сформированными бета-амилоидными волокнами.
50. Гуманизированное антитело или его фрагмент по п.1, причем указанное антитело или его фрагмент защищает нейроны от Абета-индуцированного разрушения.
51. Способ предупреждения Abeta-индуцированного разрушения нейронов, включающий лечение нейронов эффективным количеством гуманизированного антитела или его фрагмента по п.1.
52. Антитело или его фрагмент по п.1, в котором вариант области Fc является вариантом области Fc IgG1.