Способ прогнозирования инфекционных осложнений критических состояний
METHOD OF PREDICTING INFECTIOUS COMPLICATIONS OF CRITICAL CONDITION

Область техники
Изобретение относится к области медицины в частности, к анестезиологии-реаниматологии и предназначено для прогнозирования развития инфекционного процесса (пневмонии или сепсиса) и вероятности летального исхода в течение 28 дней у пациентов реаниматологического профиля. Результатом использования изобретения является повышение прогностической ценности концентрации внеклеточной ДНК (вкДНК) как предиктора критического состояния (КС) путем вычисления индекса защиты (ИЗ) - отношения количества модифицированных окислением остатков гуанозина - 8-oxodG на миллион нуклеотидов в составе вкДНК к концентрации вкДНК в плазме крови, определяемых однократно при поступлении в отделение реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ).
Инфекционные осложнения КС, в частности сепсис, в том числе септический шок (СЕПСИС-3, 2016) остаются ведущей причиной смертности в ОРИТ [1]. Предотвращение летального исхода сепсиса требует разработки новых стратегий персонализации лечения, нуждающихся в надежных и высокоинформативных прогностических биомаркерах. Раннее использование таких биомаркеров в медицине КС позволяет своевременно стратифицировать пациентов по группам риска неблагоприятного течения и летального исхода. Последнее способствует принятию оптимального решения о лечении пациента, в том числе о целесообразности использования высокотехнологичных методов и индивидуализации доз препаратов [2]. К перспективным маркерам прогноза течения и предикции исхода заболеваний и патологических состояний, в том числе КС, относится количество вкДНК в плазме крови [3-7]. На сегодняшний день основным рассматриваемым критерием количества вкДНК для прогнозирования исходов патологических состояний является ее концентрация в плазме крови [8-14]. Однако гетерогенность нозологических форм и сопутствующая коморбидность могут быть источником вариабельности по содержанию вкДНК, что ограничивает ее информативную ценность как предиктора исхода КС, и, в частности, сепсиса [14].
Уровень техники
В настоящее время известен ряд способов прогнозирования развития внутрибольничной инфекции и исходов инфекционных осложнений у пациентов реаниматологического профиля.
1. Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома. Авторы: Казали Мари-Анжелик, Лепал Ален, Моннере Гийом, Мужен Брюно, Пашо Александр (RU 2663724). Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к определению прогноза развития сепсиса у пациентов с течением инфекционного процесса, и может быть использовано в медицине. Известный способ позволяет по сверхэкспрессии гена-мишени S100A9 по отношению к определенной пороговой величине определить прогноз развития сепсиса у пациента. Для определения экспрессии гена авторы известного способа предлагают исследовать цельную кровь у пациентов реаниматологического профиля с уже развившимся септическим шоком, либо у пациентов перенесшим это состояние. Таким образом, данный способ позволяет прогнозировать исходы инфекции и сепсиса у пациентов реаниматологического профиля.
Однако использование данного способа не позволяет прогнозировать развитие инфекционного процесса в отличие от заявляемого способа, который позволяет уже в первый день поступления пациента в ОРИТ прогнозировать развитие инфекции, в частности пневмонии или сепсиса, и исходы этих состояний, в частности вероятности летального исхода в течение 28 дней.
2. Ранняя диагностика и прогнозирование синдрома системной воспалительной реакции и сепсиса у пациентов с бессимптомным течением на основании определения IL-6. Авторы: Grueb Susanne; Smolle-Juttner Freyja-Maria; Neuboeck Nicole; Weinberg Annelie-Martina (WO 2011116872). Известный способ относится к области медицины и предназначен для ранней диагностики и прогнозирования синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) и сепсиса у пациентов хирургического профиля с бессимптомным течением. Изобретение основано на определении концентрации интерлейкина 6 (IL-6) в крови пациентов в динамике: до и после операции. Такой показатель позволяет за несколько суток до развития клинических проявлений системной воспалительной реакции и сепсиса выявить эти состояния. Однако, данный способ позволяет прогнозировать развитие инфекции, системного воспалительного ответа и сепсиса только у пациентов хирургического профиля путем многократного определения IL-6.
В то же время заявляемый способ позволяет прогнозировать развитие инфекции, развитие пневмонии или сепсиса и исходы этих состояний у пациентов реаниматологического профиля, перенесших инсульт, в первый день поступления в ОРИТ путем однократного определения ИЗ-отношения интенсивности окисления вкДНК и концентрации общей вкДНК.
3. Методы прогнозирования риска развития сепсиса или SIRS. Авторы: Nguyen Catherine, Labiad Yasmine, Costello  (WO 2019110706). Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для прогнозирования риска развития сепсиса или SIRS. Известный способ основан на использовании высокопроизводительного транскрипционного и биоинформатического анализа. В исследование вошел 21 пациент с диагнозом множественная миелома или лимфома, поступившие в отделение для трансплантации костного мозга. Образцы крови забирались до химиотерапии, по ее окончанию и на стадии нейтропении. Авторы известного способа показали, что экспрессия одиннадцати генов в периферических мононуклеарах была различна (CHAT, CNN3, ANKRD42, LOC100505725, EDAR, GPAT2, ENST00000390425, MTRM8, C6orfl92, LOC 10289230, XLOC-005643). Ha основании чего предсказали развитие SIRS или сепсиса за 48-162 часа до возникновения таких состояний. Несмотря на полученные результаты, данный способ применим только для пациентов, подготовленных к трансплантации костного мозга. Интерпретация и использование обнаруженных генов на всех пациентов реаниматологического профиля сомнительна в виду специфического воздействия на иммунные клетки (химиотерапия с комбинацией лекарственных средств), приводящая к подавлению их образования и гибели костного мозга.
Заявляемый способ позволяет прогнозировать развитие инфекции, развитие пневмонии или сепсиса и исходы этих состояний у пациентов реаниматологического профиля, перенесших инсульт, в первый день поступления в ОРИТ путем однократного определения ИЗ-отношения интенсивности окисления вкДНК к концентрации общей вкДНК.
4. Инструмент оценки риска для пациентов с сепсисом. Авторы: Liaw Patricia, Fox-Robichaud Alison, Selvaganapathy Ponnambalam Ravi, Liaw Kao-lee, Dwivedi Dhruva, Mcdonald Ellen (WO 2019006561). Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования 28-дневной летальности пациентов с сепсисом. Для прогнозирования 28-дневной летальности авторы известного способа используют следующую комбинацию показателей: концентрация вкДНК, С-реактивного белка, лактата, креатинина, количество тромбоцитов, а также учитывают Шкалу комы Глазго у пациентов реаниматологического профиля в первый день при манифестации сепсиса. Известный способ прогнозирования 28-дневной летальности пациентов с сепсисом не позволяет оценивать риск развития тяжелой пневмонии или сепсиса, при этом прогноз у септических больных делается на основании динамических изменений исследуемых показателей. Принят в качестве прототипа.
Заявляемый способ позволяет по однократному определению ИЗ в первый день поступления в ОРИТ прогнозировать не только 28-дневную летальность у пациентов реаниматологического профиля, перенесших инсульт, но также развитие инфекции, включая развитие пневмонии или сепсиса.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе не обнаружено способа прогнозирования развития инфекционного процесса и 28-дневной летальности у пациентов реаниматологического профиля, перенесших инсульт на основании однократного определения отношения количества 8-oxodG на миллион нуклеотидов в составе вкДНК к концентрации вкДНК в плазме крови.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи прогнозирования наступления и исхода инфекционных осложнений, в частности пневмонии или сепсиса, а также вероятности летального исхода в течение 28 дней у пациентов реаниматологического профиля.
Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет персонализировать подход к лечению пациентов с жизнеугрожающими состояниями за счет повышения прогностической ценности определения концентрации вкДНК как предиктора КС путем определения ИЗ-отношения количества 8-oxodG на миллион нуклеотидов в составе вкДНК к концентрации вкДНК в плазме крови, при однократном определении ИЗ пациенту в течение первых суток поступления в ОРИТ.
Указанные технические (диагностические) результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что также как в известном способе, осуществляют определение концентрация вкДНК в плазме периферической крови (С) пациентов реаниматологического профиля.
6
Особенность заявляемого способа заключается в том, что дополнительно определяют интенсивность (И) окисления вкДНК в виде количества окисленных дезоксигуанозинов 8-oxodG в составе вкДНК на 1 млн нуклеотидов, и вычисляют индекс защиты (ИЗ) по формуле ИЗ=И/С×100, где ИЗ - индекс защиты, И - интенсивность окисления вкДНК - количество 8-oxodG на 10 нуклеотидов, С - концентрация вкДНК в плазме, нг/мл.
Указанные анализы осуществляют однократно в течение первых суток после поступления пациента в ОРИТ.
Раскрытие сущности изобретения
Для улучшения исходов жизнеугрожающих состояний - сепсиса, тяжелых травм, сосудистых катастроф ведется поиск биомаркеров, которые позволили бы уже в ранние сроки нахождения пациента в ОРИТ выбирать оптимальные методы терапии, по возможности персонализируя лечение. Одним из перспективных в этом отношении биомаркеров является содержание вкДНК в плазме крови.
Уровень содержания и изменения в динамике концентрации фрагментов циркулирующей ДНК, в том числе органоспецифической фракции вкДНК, на сегодняшний день могут иметь значение для оценки степени повреждения интересующего органа, вероятности осложненного течения и прогноза исходов неотложного/критического состояния у пациентов ОРИТ. Источниками вкДНК, циркулирующих в кровотоке, могут быть ядра погибающих клеток органов и тканей, поврежденные митохондрии, пул которых обновляется в результате митофагии, а также микроорганизмы.
ВкДНК является биомаркером клеточного повреждения при различных состояниях. Повышение концентрации общей вкДНК наблюдается при КС, таких как тяжелая травма, сепсис, сосудистые катастрофы, а также при физиологических и пограничных состояниях, в том числе при физической нагрузке и остром и хроническом психоэмоциональном стрессе [5-15].
ДНК подвержена окислительным повреждениям, приводящим к образованию различных окисленных нуклеозидов. Одним из наиболее распространенных и изученных структурных повреждений вкДНК является образование 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (8-oxodG), количественное содержание которого в циркуляции крови обнаруживают в виде отдельных молекул или в составе вкДНК с помощью иммунологических методов и анти-8-oxodG-антител, или при использовании жидкостной хроматографии высокого давления, ассоциированной с масс-спектрометрией [16]. Однако, несмотря на то, что КС сопровождаются окислительным стрессом и интенсивность окисления вкДНК может возрастать, в настоящий момент отсутствуют данные о связи окисленной вкДНК с исходами КС, развитием инфекционных осложнений, в том числе - жизнеугрожающего состояния - сепсиса. Авторами изобретения установлено, что фрагменты вкДНК, модифицированные окислением, интенсивно проникают в клетки, вызывая более выраженную стимуляцию экспрессии генов антиокислительной системы и аутофагии (Hmox1 и Becn1) по сравнению с неокисленной формой вкДНК. Авторы заявляемого способа предположили, что соотношение содержания окисленных фрагментов ДНК с выраженным цитопротективным эффектом к общему содержанию вкДНК, обладающей повреждающим действием на клетки, может быть информативным для прогноза клинического течения КС: чем выше соотношение (ИЗ), тем более благоприятен исход КС и тем меньше жизнеугрожающих осложнений, характерных для таких пациентов (инфекции, включая тяжелую пневмонию или сепсис). Это положение было проверено в ОРИТ нейрореанимационного профиля при использовании биоматериала (плазма крови) пациентов с ишемическим инсультом.
Сущность изобретения заключается в том, что на основании однократного совместного определения концентрации вкДНК, интенсивности ее окисления в плазме периферической крови пациентов реаниматологического профиля в течение первых суток после поступления в ОРИТ и расчета количественного соотношения содержания молекул 8-oxodG в составе циркулирующей вкДНК к общему содержанию вкДНК в плазме пациентов с КС, именуемого ИЗ, становится возможным уже в первый день госпитализации выявлять пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением КС - ишемического инсульта. Авторами заявляемого способа была обнаружена высокая информативность рассчитанного ИЗ для прогноза развития инфекционного процесса, включая пневмонию или сепсис, а также для предсказания исхода лечения госпитализированных пациентов - вероятность 28-дневной летальности.
Авторами заявляемого способа эмпирически установлено, что при значении ИЗ менее 450 повышается вероятность возникновения инфекционного процесса, а при более низком значении ИЗ - менее 223 - летального исхода. Изобретение обеспечивает эффективное прогнозирование развития инфекционного процесса и 28-дневной летальности у пациентов, перенесших инсульт, путем совместного определения концентрации вкДНК и интенсивности ее окисления в плазме периферической крови.
Приводимые ниже статистически обработанные результаты исследований подтверждают прогностическую значимость указанных критериев.
Прогнозирование развития пневмонии
Определение ИЗ достоверно прогнозировало развитие пневмонии у пациентов реаниматологического профиля, перенесших инсульт.
Шансы развития пневмонии у пациентов ОРИТ с ИЗ при поступлении меньше 450 выше в 11 раз (р=0,0007, отношение шансов (OR)=11,053 (95% CI: 2,261-54,018) чувствительность 59,6%, специфичность 88,2%, при отсечке значения ИЗ=450).
Прогнозирование развития инфекционного процесса (пневмонии или урологической инфекции)
Определение ИЗ достоверно прогнозировало развитие инфекции у пациентов реаниматологического профиля.
Шансы развития инфекционного процесса у пациентов ОРИТ с ИЗ при поступлении меньше 450 выше в 11,4 раза (р=0,0002, соотношение шансов (OR)=11,4 (95% CI: 2,891-44,946) чувствительность 64,3%, специфичность 86,4%, при отсечке 450).
Прогнозирование развития сепсиса
Определение ИЗ достоверно прогнозировало развитие сепсиса у пациентов реаниматологического профиля.
Шансы развития инфекционного процесса у пациентов ОРИТ с ИЗ при поступлении менее 450 выше в 7,1 раза (р<0,005, соотношение шансов (OR)=7,105 (95% CI: 1,8-28,013) чувствительность 58,7%, специфичность 83,3%, при отсечке 450)
Прогнозирование 28-дневной летальности у пациентов с инфекционным процессом, перенесших инсульт.
Определение ИЗ достоверно прогнозировало 28 дневную летальность у пациентов реаниматологического профиля с течением инфекционного процесса, перенесших инсульт.
Риск летального исхода пациентов реаниматологического профиля, перенесших инсульт, при развитии инфекционного процесса значительно выше при значении ИЗ более 223: соотношение шансов (OR)=9,1 (95% CI: 2,72-30,269), площадь под кривой AUC=0,801, чувствительность 77,8%, специфичность 80,4%, при отсечке 223; Р=0,0001, метод log-rank.
Осуществление изобретения
Способ прогнозирования развития инфекционных осложнений, в том числе течения инфекционного процесса, развития пневмонии, развития сепсиса, прогнозирования исходов у пациентов с сепсисом включает:
- забор венозной крови при поступлении в ОРИТ;
- определение концентрации вкДНК в плазме периферической крови;
6
- определение интенсивности окисления вкДНК (количество окисленного дезоксигуанозина на 1 млн оснований (8-oxodG/10 нуклеотидов), циркулирующей в плазме периферической крови;
- определение вероятности риска развития инфекционных осложнений, в частности сепсиса или пневмонии, для КС по формуле: ИЗ = интенсивность окисления / общая концентрация вкДНК × 100, где ИЗ - индекс защиты.
Выделение вкДНК из плазмы и определение ее концентрации осуществляют согласно методическим приемам, описанным ранее [16].
Забор венозной крови производят в течение суток после поступления пациента в ОРИТ (согласно критериям СЕПСИС-3) в пробирки VACUETTE TUBE K3EDTA, Greiner bioone, Австрия). Для получения плазмы из цельной крови образцы центрифугируют при 22°С, 400 g, в течение 10 минут. Супернатант отбирают и перемещают в чистую пробирку. С целью определения количественного содержания в плазме ДНК выделяют методом экстракции органическими растворителями. Осадок ДНК растворяют в 40 мкл деионизованной воды. Концентрацию вкДНК (нг/мл) в плазме измеряют методом флюоресценции с интеркалирующим красителем PicoGreen (Invitrogen, США) с использованием планшетного спектрофлюориметра EnSpire (Perkin Elmer, Финляндия) при длине волны возбуждения 480 и длине волны эмиссии 520 нм.
Методика определения интенсивности окисления вкДНК (Дот иммуноблоттинг на 8-окси-дезоксигуанозин).
Определение интенсивности окисления вкДНК осуществляют согласно методическим приемам, описанным ранее [16]. Количественное определение 8-окси-дезоксигуанозина проводят методом дот-иммуноблоттинга с использованием нитроцеллюлозного фильтра (0.45 мкм) OPTITRAN BA-S 85 (Sigma-Aldrich, США, каталог Z750697) и раствора антител к 8-окси-дезоксигуанозину (SantaCruz, США, каталог №66036) в разведении 1:50.
Клинические примеры
Пример №1
Пациентка К., 66 лет, находилась в ОРИТ с основным диагнозом: ишемический инсульт в бассейне правой средней мозговой артерии. Сопутствующие заболевания: сахарный диабет 2-го типа, атеросклеротический кардиосклероз. При поступлении определены: И=1289, С=227; ИЗ=1289/227×100=569. За время наблюдения инфекционный процесс не выявлен. На третьи сутки пациентка переведена в профильное отделение для дальнейшего наблюдения и реабилитации. Летальный исход в течение 28 суток от момента госпитализации не зарегистрирован.
Пример №2
Пациент Д., 67 лет, находился в ОРИТ с основным диагнозом: ишемический инсульт в бассейне правой средней мозговой артерии. Сопутствующие заболевания: атеросклеротический кардиосклероз, постоянная форма фибрилляции предсердий. При поступлении определены: И=1069, С=308; ИЗ=1069/308×100=347. За время наблюдения у пациента на фоне развития инфекции мочевыводящих путей, диагностирован сепсис. Летальный исход в течение 28 суток от момента госпитализации не зарегистрирован.
Пример №3.
Пациент А., 59 лет, находился в ОРИТ с основным диагнозом: ишемический инсульт в бассейне левой средней мозговой артерии. Сопутствующие заболевания: атеросклеротический кардиосклероз, хроническая болезнь почек. При поступлении определены: И=509, С=213; ИЗ=509/213×100=239. За время наблюдения у пациента на фоне развития пневмонии и инфекции мочевыводящих путей, диагностирован сепсис. Через 7 суток переведен в профильное отделение для дальнейшего наблюдения и реабилитации. Летальный исход в течение 28 суток от момента госпитализации не зарегистрирован.
Пример №4.
Пациентка С. 87 лет находилась в ОРИТ с основным диагнозом: ишемический инсульт в бассейне левой средней мозговой артерии. Сопутствующие заболевания: атеросклеротический кардиосклероз, постоянная форма фибрилляции предсердий. При поступлении определены: И=1175, С=835; ИЗ=1175/835×100=141. За время наблюдения у пациента на фоне развития пневмонии диагностирован сепсис. На 21-е сутки нахождения в ОРИТ наступила смерть.
Список литературы:
1. А.Н. Кузовлев, А.В. Гречко. Ингаляционные антибиотики в реаниматологии: состояние проблемы и перспективы развития. Общая реаниматология. 2017; 13 (5): 69-84. Doi: 10.15360/1813-9779-2017-5-69-84.
2. В.А. Востриков, А.Н. Кузовлев. Общедоступная дефибрилляция при внезапной остановке сердца. Общая реаниматология. 2018; 14 (1): 58-67. Doi: 10.15360/1813-9779-2018-1-58-67
3. Iwashyna TJ, Ely EW, Smith DM, Langa KM. Long-term Cognitive Impairment and Functional Disability Among Survivors of Severe Sepsis. JAMA. 2010 Oct 27; 304(16): 1787-1794. doi: 10.1001/jama.2010.1553 PMID: 20978258
4. Gaudry S, Messika J, Ricard JD, et al. Patient-important outcomes in randomized controlled trials in critically ill patients: a systematic review. Ann Intensive Care. 2017 Dec; 7(1):28. PMID: 28271450. PMCID: PMC5340787. DOI: 10.1186/s13613-017-0243-z.
5. Jickling GC, Sharp FR. Blood biomarkers of ischemic stroke. Neurotherapeutics. 2011 Jul; 8(3):349-60. PMID: 21671123. PMCID: PMC3250275. DOI: 10.1007/s13311-011-0050-
6. Roca E, Nescolarde L,  J et al. The Dynamics of Cardiovascular Biomarkers in non-Elite Marathon Runners. J Cardiovasc Transl Res. 2017 Apr; 10(2):206-208. PMID: 28382580. DOI: 10.1007/s12265-017-9744-2.
7. O'Connell GC, Petrone AB, Tennant CS et al. Circulating extracellular DNA levels are acutely elevated in ischaemic stroke and associated with innate immune system activation. Brain Inj. 2017; 31(10):1369-1375. PMID: 28585898 DOI: 10.1080/02699052.2017.1312018.
8. Tsai NW, Lin TK, Chen SD et al. The value of serial plasma nuclear and mitochondrial DNA levels in patients with acute ischemic stroke. Clin Chim Acta. 2011 Feb 20; 412(5-6):476-9. PMID: 21130757 DOI: 10.1016/j.cca.2010.11.036.
9. Конорова И.Л., Максимова М.Ю., Смирнова И.Н и др. Циркулирующая в плазме крови внеклеточная ДНК в патогенезе ишемического инсульта: роль транскрибируемой области рибосомного повтора. Патологическая физиология и экспериментальная медицина. 2014 апр-июнь; (2):13-23. PMID: 25318157.
10. Hummel ЕМ, Hessas Е,  S et al. Cell-free DNA release under psychosocial and physical stress conditions Transl Psychiatry. 2018 Oct 29; 8(1):236. doi: 10.1038/s41398-018-0264-x.
11. Rannikko J, Seiskari T, Huttunen R et al. Plasma cell-free DNA and qSOFA score predict 7-day mortality in 481 emergency department bacteraemia patients. J Intern Med. 2018 Oct; 284(4):418-426. PMID: 29687943 DOI: 10.1111/joim.12766.
12. Schneck E, Samara O, Koch С et al. Plasma DNA and RNA differentially impact coagulation during abdominal sepsis-an explorative study. J Surg Res. 2017 Apr; 210:231-243. PMID: 28457334 DOI: 10.1016/j.jss.2016.11.044.
13. Jackson Chornenki NL, Coke R, Kwong AC, Dwivedi DJ et al. Comparison of the source and prognostic utility of cfDNA in trauma and sepsis. Intensive Care Med Exp. 2019 May 22; 7(1):29. PMID: 31119471. PMCID: PMC6531595. DOI: 10.1186/s40635-019-0251-4.
14. Писарев B.M., Чумаченко А.Г., Филев А.Д., Ершова Е.С., Костюк С.В., Вейко Н.Н., Григорьев Е.К., Елисина У.В., Черпаков Р.А., Тутельян А.В. Комбинация молекулярных биомаркеров ДНК в прогнозе исхода критических состояний. Общая реаниматология. 2019; 15(3):31-47. Doi: 10.15360/1813-9779-2019-3-31-47.
15. Filev AD, Shmarina GV, Ershova ES, Veiko NN, Martynov AV, Borzikova MA, Poletkina AA, Dolgikh OA, Veiko VP, Bekker AA, Chirkov AV, Volynshchikov ZN, Deviataikina AS, Shashin DM, Puretskiy VK, Tabakov VJ, Izhevskaya VL, Kutsev SI, Kostyuk SV, Umriukhin PE. Oxidized Cell-Free DNA Role in the Antioxidant Defense Mechanisms under Stress. Oxid Med Cell Longev. 2019 Jul 8; 2019:1245749. PMID: 31360293. PMCID: PMC6644271. DOI: 10.1155/2019/1245749.
16. Костюк С.В., Вейко Н.Н., Шмарина Г.В., Ершова Е.С., Умрюхин П.Е., Умрюхин А.Е. Характеристики внеклеточной ДНК в норме и при патологических состояниях. Учебно-методическое пособие для студентов медицинских и биологических ВУЗов, обучающихся на кафедрах нормальной физиологии и генетики. ФГАУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) - Москва, Издательство Сеченовского Университета. - 2019 г. - 44 с.