СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ИЗ ЛИШАЙНИКА РОДА CLADONIA, ОБЛАДАЮЩЕГО БАКТЕРИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ
METHOD FOR EXTRACT OBTAINING FROM CLADONIA LICHEN WITH BACTERICIDE PROPERTIES

Изобретение относится к медицине, а именно к фармации, и предназначено для получения экстракта (смеси лишайниковых кислот и лихенинов), обладающего бактерицидными свойствами, из лишайника рода Cladonia Hill ex P. Browne.
Органические специфические гипоаллергенные вещества лишайников (лихенины, или, лишайниковый крахмал, и лишайниковые кислоты), не синтезирующиеся другими организмами, потенциально являются перспективными для поиска и получения новых биологически активных веществ, способных подавлять рост и снижать жизнеспособность болезнетворных и постоянно мутирующих микроорганизмов, приспособившихся к уже известным видам антибиотических средств [Муравьева Д.А. Фармакогнозия. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.]. Лишайниковые вещества практически не имеют побочных эффектов, не вызывают аллергических реакций, раздражения и ожогов кожных покровов, не несут раздражающего эффекта для ЦНС. Их применение не ограничено хроническими заболеваниями печени и почек, желудочно-кишечного тракта, ОРЗ, ОРВИ [Аньшакова В.В. Разработки на основе лишайникового сырья (твердофазные биопрепараты) / В.В. Аньшакова, А.В. Степанова, А.Ш. Смагулова и др. // Вестник спортивной науки. – 2013. - №6. - С. 28-30; Грибова Н.А. Применение новой пищевой добавки для приготовления кондитерских изделий / Н.А. Грибова, Н.Л. Султаева // Сервис в России и за рубежом. – 2014. - №2 (49). - С. 109-115; Степанова А.В. Токсикологическая и гигиеническая оценка БАД «Ягель Детокс» / А.В. Степанова, В.В. Аньшакова // Фундаментальные исследования. Биологические науки. - №9. - 2014. - С. 105-109].
Известно несколько способов получения экстрактов, обладающих бактерицидными свойствами, из слоевищ лишайников различных видов.
2
5
Известен способ получения экстракта из дубового мха (Evernia prunastri (L.) Ach.), включающий измельчение сырья, экстракцию гексаном и этиловым спиртом, однократное настаивание в течение 5 часов при температуре кипения этилового спирта, фильтрацию, 2-3-кратное промывание отработанного сырья СНОН и концентрирование [Патент 2348683 РФ, МПК С11В 1/10, С11В 9/02, бюл. №7, 10.03.2009 г. Способ получения экстракта из дубового мха].
2
5
Недостатками данного способа являются его нерентабельность и малый выход конечного продукта - смеси органических кислот, фосфолипидов и глицеридов с побочными продуктами экстракции. Использование гексана в больших количествах по отношению к массе обрабатываемого сырья повышает себестоимость предложенного способа, а малый выход экстракта не предполагает промышленное внедрение. На втором этапе обработки лишайникового сырья требуется большое количество этилового спирта (соотношение массы сырья к объему спирта составляет 1:9) и последующая промывка СНОН, что также повышает себестоимость данного способа.
Известен способ получения сухого экстракта Cetraria islandica (L.) Ach. этиловым спиртом с концентрацией от 35% до 45% [Патент 2321419 РФ, МПК А61K 36/09, А61K 9/20, бюл. №10, 10.04.2008 г. Экстракт Cetraria islandica (L.) Ach. сухой, таблетированная форма].
К недостатку данного способа следует отнести сложность его выполнения, поскольку заморозка и разморозка, повышающая конечный продукт экстракции, являются достаточно энергоемкими процессами.
Наибольшее влияние на процесс извлечения оказывают степень измельчения сырья, время и количество экстракций. С увеличением времени и кратности этилового спирта заметна тенденция к уменьшению доли полисахаридов в экстрактивных веществах. Интенсификация процесса ведет к неконтролируемому изменению нативного комплекса биологически активных веществ за счет разрушения гемицеллюлоз, так экстракция 70% и 96% растворами этанола приводит к увеличению токсичности раствора. Поэтому способ не является достаточно универсальным и в каждом разном случае дает разный выход экстрактивных веществ.
Известен способ получения усниновой кислоты экстракцией смеси лишайников родов Usnea и Cladonia органическими растворителями (хлороформом, четыреххлористым углеродом, ацетоном, гексаном, петролейным эфиром, нефрасом и смесью перечисленных растворителей) с последующим выделением целевого продукта путем упаривания органического растворителя и осаждения из экстракта в системе хлороформ-спирт (1:10) или из гексана [Патент 2317076 РФ, МПК А61K 31/343, А61К 36/09, бюл. №5, 20.02.2008 г. Способ получения усниновой кислоты].
К недостатку данного способа следует отнести то, что исходное сырье - сумма из более чем 10 видов лишайников родов Usnea и Cladonia - собрано в разных экотопах, и установление того вида лишайника, который является главным источником основного действующего вещества, что будет экскретироваться, весьма затруднительно, а сбор всех, задействованных в способе видов, в других экологических условиях практически невозможен. Использование нескольких органических растворителей и последующее их выпаривание делает способ затратным.
2
3
Наиболее близким к заявляемому является способ получения лихенина [Патент 2129159 РФ, МПК С12Р 19/02, С12Р 19/04, С08В 37/00, Бюл. №5, 20.04.1999 г. Способ получения лихенина из лишайника], включающий стадии очистки лишайника от механических примесей, измельчение его до частиц размером 10-15 мм, отстаивание слоевища лишайника в воде при комнатной температуре в течение 24 часов и нейтрализацию лишайниковых кислот раствором NaCO, промывку растительной массы водой до нейтральной реакции и повторное измельчение таллома до частиц размером 3-5 мм. После этого лихенин экстрагируют, фильтруют, очищают и сушат распылением или сублимацией. Данный способ взят за прототип.
2
3
Общим с заявляемым способом является получение лихенина, а именно очистка лишайника от механических примесей, измельчение слоевища лишайника, настаивание с карбонатом натрия (NaCO), кипячение раствора и фильтрация.
2
3
К недостаткам прототипа следует отнести продолжительность его исполнения. В общей сложности на проведение экстрагирования требуется 2 суток, а для нейтрализации лишайниковых кислот требуется 20-кратный по отношению к массе сырья объем NaCO в трех повторностях, после чего этот раствор сливают и больше не используют, что повышает себестоимость способа. В итоге полученный экстракт содержит только растворенный лехинин без лишайниковых кислот и не обладает бактерицидными свойствами.
Задачей предлагаемого способа является получение экстракта (смеси лишайниковых кислот и лихенинов) из лишайника рода Cladonia Hill ex P. Browne, обладающего бактерицидными свойствами.
2
3
Поставленную задачу достигают тем, что слоевище лишайника предварительно промывают проточной водой, измельчают до порошкообразного состояния, кипятят в течение 1 часа в 10-кратном по отношению к полученной массе измельченного лишайника объеме 96% этилового спирта, затем полученный раствор охлаждают и засыпают измельченным NaCO в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы, затем настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С, после настаивания раствор нагревают до кипения и фильтруют в горячем виде.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. Сухой лишайник, предварительно очищенный от механических примесей, и слоевище которого промыто, измельчают до порошкообразного состояния.
2
3
Измельченную лишайниковую массу заливают 10-кратным по отношению к массе объемом 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа для экстракции спирторастворимых лишайниковых кислот. Так как не все кислоты способны растворятся в спиртовой среде и большинство из них (усниновая, эверновая, физодовая, атранорин и др.) растворяются в бензоле, хлороформе, амиловом спирте, ледяной уксусной кислоте, едких щелочах и барите, то для преобразования лишайниковых кислот в водорастворимые формы без потери их бактерицидных свойств получают их натриевые соли. Для этого спиртовой раствор после кипячения охлаждают в холодильнике до 17°С и засыпают измельченным NaCO в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы. Реакция проходит на холоде, поэтому раствор настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С. Так как натриевые соли и лихенины хорошо растворяются в горячем этиловом спирте, далее раствор нагревают до кипения и в горячем виде фильтруют.
2
3
Возможность осуществления заявляемого способа показана следующим примером. Сухой лишайник из рода Cladonia (Cl. arbuscula (Wallr.) Hale et WL Culb.) в количестве 10 грамм, предварительно очищенный от механических примесей и промытый в проточной воде, измельчают до порошкообразного состояния. Измельченную лишайниковую массу заливают 100 мл 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа для экстракции спирторастворимых лишайниковых кислот и лихенинов, после чего раствор охлаждают в холодильнике до 17°С. Для исчерпывающей экстракции нерастворимых лишайниковых кислот в приготовленный охлажденный раствор добавляют 10 грамм измельченного NaCO для получения растворимых натриевых солей лишайниковых кислот. После пятичасового настаивания при температуре 5-7°С раствор нагревают до кипения для максимального извлечения солей лишайниковых кислот из слоевища. Далее в горячем виде фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Полученный таким способом экстракт - смесь натриевых солей лишайниковых кислот и лихенинов, обладающий бактерицидными свойствами - имеет темно-коричнево-зеленый цвет из-за растворенных в спирте пигментов слоевища лишайника, не обезвоживается и хранится в герметично закрытой посуде в холодильнике. Используется в разведенном виде в соотношении 5 мл экстракта на 250 мл дистиллированной воды.
2
3
Для подтверждения бактерицидных свойств полученного экстракта было проведено опрыскивание изолированных помещений одинаковых по площади (18 м) и объему пространства (54 м), но различающихся обсемененностью микроорганизмами. По степени биологического загрязнения воздуха помещения условно были разделены на три группы: сильный, средний и незначительный уровни загрязнения.
Высев микроорганизмов в изолированной среде проводили по методу Коха в чашки Петри, по пять чашек на каждое исследуемое нами помещение (первую чашку использовали как контроль, четыре последних - экспериментальные), после чего культивировали в течение 3 суток в термостате при температуре 37°С.
После добавления полученных нами экстрактов лишайника по 15, 20, 25, 30 мл в каждую из экспериментальных чашек Петри, полученных из исследуемых нами помещений, и культивировании высевов сразу всех чашек каждого помещения (4 экспериментальных и 1 контрольная) в термостате при температуре 37°С еще в течение 3 суток, было замечено подавление развития и частичное уменьшение размера колоний микроорганизмов в каждой из экспериментальных чашек по сравнению с контролем (табл. 1).
Полученные данные сравнивали с результатами аналогичного эксперимента, в котором использовали экстракт, полученный согласно способа прототипа [Патент 51708 Украина. МПК А01В 79/00, бюл. №14, 26.07.2010 г. Способ аэросанации изолированной среды с помощью экстрактов лишайников].
3
После приготовления экстракта лишайника Cladonia arbuscula, из жидкостного пневматического распылителя (производительность которого составляет 20 мл/мин) было проведено опрыскивание исследуемых помещений (из расчета 2,5-3,0 мл экстракта на 1 м помещения) и повторный высев микроорганизмов из воздуха каждые 2, 24, 36, 48 часа дезинфекционной выдержки. Полученные результаты представлены в таблицах 2, 3.
Таким образом, проведенные нами исследования доказывают тот факт, что предлагаемый способ получения экстракта из лишайника рода Cladonia Hill ex P. Browne, смеси лишайниковых кислот и лихенинов, является наиболее эффективным по сравнению с известными аналогами, и позволяет проводить исчерпывающую экстракцию веществ, обладающих повышенными бактерицидными свойствами и сразу готовых к применению. Положительный эффект предлагаемого способа заключается в его дешевизне, простоте и минимизации времени осуществления экстракции. Способ может быть использован для производства санирующих средств.