СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГА
METHOD OF PRODUCING BACTERIOPHAGE

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения продукции, содержащей бактериофаги.
Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода с последующим лизисом (после внутриклеточной репликации) клетки-хозяина - вирулентные фаги, или интегрированием в бактериальный геном с образованием лизогенов - умеренные фаги (Adams Н.М. Bacteriophages. - New York: Interscience Publishers, Inc., London: Interscience Publishers ltd., 1959. - 592 p.). По многочисленным данным литературы, фаги могут быть использованы в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур (Alisky J., Iczkowski K., Rapoport, A., Troitsky N. Bacteriophages show promise as antimicrobial agents // The Journal of infection. - 1998. - Vol. 36, №1. P. 5-15; Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience // Microbiology. - 2005. - Vol. 151, pt. 7. - P. 2133-2140; Бондаренко B.M. Клинический эффект и пути рационального использования лечебных бактериофагов в медицинской практике // Приложение к Журналу инфектологии. - 2011. - Т. 3, №3. - С. 15-19). Ряд авторов допускают возможность практического применения бактериофагов как средств деконтаминации в пищевой промышленности как безопасной для человека и безвредной для окружающей среды альтернативы химическим и физическим методам элиминации бактерий (Greer G.G. Bacteriophage control of foodborne bacteria // Journal of food protection. - 2005. - Vol. 68, №5. - P. 1102-1111; Lang L.H. FDA approves use of bacteriophages to be added to meat and poultry products // Gastroenterology. - 2006. - Vol. 131, №5. - P. 1370-1372; Алешкин A.B., Зейгарник M.B. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания // Вопросы диетологии. - 2012. - Т. 2, №4. - С. 24-34).
Одним из приоритетных показателей производства фагосодержащей продукции является получение фаголизатов с исходно высоким титром бактериофагов (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С. 17-19).
Известным, предложенным для различных бактериофагов способом получения фаголизатов с высоким титром бактериофагов является культивирование бактерий штамма-хозяина с бактериофагом на плотной питательной среде с последующим получением суспендированного фаголизата с поверхности плотной питательной среды (SU 64612, 30.04.1945; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А. Способ быстрого получения сибиреязвенных фагов в высоких концентрациях // Лабораторное дело. - 1967. - №12. - С. 741-743).
12
14
Основными недостатками данных аналогов заявляемого изобретения являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и отсутствие или недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении фаголизата с титром бактериофага 10-10 БОЕ/мл.
11
12
Также известным аналогом является способ получения концентрированных препаратов фага, заключающийся в посеве на чашки с агаром смеси из концентрированной культуры бактерий и фага в количестве, достаточном для получения сплошного лизиса. После инкубации при 37°C в течение 12-18 часов в чашки наливают 3-5 мл бульона и оставляют на 20 минут. Затем бульон сливают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают. Согласно прототипу приготовленный таком образом фаг может содержать 10-10 частичек на 1 мл (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С. 18).
12
14
Основными недостатками данного аналога являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 10-10 БОЕ/мл.
8
9
5
6
2
Наиболее близким аналогом-прототипом является способ получения бактериофага, согласно которому бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 10-10 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 10-10 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с рН 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об/мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину (RU 2525141, 10.08.2014). После центрифугирования можно смешивать надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги, затем стерилизовать смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускать полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. В качестве сосуда для культивирования можно использовать стеклянный микробиологический матрац.
Основным недостатком прототипа является зависимость стабильности достижения высокого титра бактериофага при получении фаголизата от соблюдения как постоянства рецептуры питательной среды, так и небольшого размаха варьирования значений показателей культивирования штамма-хозяина и бактериофага, что затрудняет промышленное применение известного способа получения бактериофага с использованием плотной питательной среды.
12
14
Главной задачей заявляемого изобретения является обеспечение стабильности достижения высокого титра бактериофага (10-10 БОЕ/мл) при получении фаголизатов в условиях изменения как рецептур питательных сред, так и увеличения размаха варьирования значений показателей культивирования штамма-хозяина и бактериофага.
8
12
7
10
2
Задача решена тем, что суспензию бактериальных клеток быстро растущего штамма-хозяина в титре 10-10 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на плотную питательную среду с толщиной слоя от 3 мм до 25 мм, культивируют при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 5 мм до 50 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, через 30-120 мин после начала культивирования каждые 30-60 мин с поверхности плотной питательной среды делают мазки, которые окрашивают интеркалирующим красителем и микроскопируют в флуоресцентном микроскопе, прекращают культивирование штамма-хозяина при достижении не менее 10% по отношению к общему количеству клеток доли клеток с неоднородным окрашиванием флуоресцирующей цитоплазмы, а именно: парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов или клеток шаровидной и эллипсоидной формы со слабо флуоресцирующим центральным сечением, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 10-10 БОЕ/мл, культивируют в течение 13-15 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 5 мм до 50 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с рН 7,0-7,4 в количестве 0,04-0,05 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды, полученный фаголизат отсасывают в стерильную емкость и очищают. После отсасывания фаголизата в стерильную емкость его можно очищать стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,45 мкм. После отсасывания фаголизата в стерильную емкость его можно очищать центрифугированием в течение 30-60 мин при 3000-6000 об/мин и стерилизующей фильтрацией надосадочной жидкости через фильтр с диаметром пор 0,2-0,45 мкм. После отсасывания фаголизата в стерильную емкость его можно очищать добавлением хлороформа, выдерживая в течение 15-45 мин при непрерывном шуттелировании, центрифугированием в течение 30-60 минут при 3000-6000 об/мин и стерилизующей фильтрацией надосадочной жидкости через фильтр с диаметром пор 0,2-0,45 мкм. После отсасывания фаголизата в стерильную емкость его можно очищать фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45-1,0 мкм и стерилизующей фильтрацией полученного фильтрата через фильтр с диаметром пор 0,2-0,45 мкм. После стерилизующей фильтрации можно пропускать полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. Перед стерилизующей фильтрацией можно смешивать жидкости, содержащие бактериофаги, а затем стерилизовать смесь жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,45 мкм. После стерилизующей фильтрации можно пропускать полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. В качестве сосуда для культивирования можно использовать стеклянный микробиологический матрац.
Очистка фаголизата предназначена главным образом для удаления живых нелизированных клеток штамма-хозяина. Кроме того, очистка фаголизата позволяет избавиться от обломков лизированных клеток штамма-хозяина, экзополисахаридов, токсинов и других производных и метаболитов штамма-хозяина. Очистку фаголизата можно осуществлять как одним этапом, так и несколькими этапами.
Под термином «быстро растущий штамм-хозяин» авторы имеют ввиду штаммы бактерий, колонии или сплошной рост которых можно обнаружить визуально через 6-48 часов культивирования на плотной питательной среде, используемой при культивировании бактериофагов.
Для окрашивания мазков могут быть использованы любые окрашивающие ДНК интеркалирующие красители, диапазон длин волн возбуждения у которых подходит для флуоресцентной микроскопии. В качестве таких интеркалирующих красителей могут быть использованы, например: бромистый этидий (Mansour J.D., Schram J.L., Schulte Т.Н. Fluorescent staining of intracellular and extracellular bacteria in blood // Journal of Clinical Microbiology. - 1984. - Vol. 19, №4. - P. 453-456), SYBR Green I (Noble R.T., Fuhrman J.A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria // Aquatic Microbial Ecology. - 1998. - Vol. 14. - P. 113-118; Patel A., Noble R.T., Steele J.A., Schwalbach M.S., Hewson I., Fuhrman J.A. Virus and prokaryote enumeration from planktonic aquatic environments by epifluorescence microscopy with SYBR Green I // Nature Protocols. - 2007. - Vol. 2, №2. - P. 269-276), SYBR Gold (Shibata A., Goto Y., Saito H., Kikuchi Т., Toda Т., Taguchi S. Comparison of SYBR Green I and SYBR Gold stains for enumerating bacteria and viruses by epifluorescence microscopy // Aquatic Microbial Ecology. - 2006. - Vol. 43. - P. 223-231), SYBR Safe (Clauβ M., Springorum A.C., Hartung J. Comparison of different fluorescence and non-fluorescence staining techniques for rapid detection of airborne micro-organisms collected on room temperature vulcanizing (RTV) silicones from generated aerosols and from ambient air // Aerosol Science and Technology. - 2012. - Vol. 46, №7. - P. 818-827) и другие.
В качестве способа окрашивания мазка интеркалирующим красителем может быть использован любой из описанных в литературе (в том числе в указанной выше литературе) вариантов, обеспечивающих достаточную для реализации заявленного способа флуоресценцию цитоплазмы бактериальных клеток.
Авторы заявленного способа предлагают проводить подготовку, окрашивание мазков и микроскопирование следующим образом: на поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю объемом 5-20 мкл водного раствора интеркалирующего красителя в концентрации, превышающей в 50-500 раз концентрацию этого же интеркалирующего красителя, используемую для окрашивания ДНК при проведении горизонтального электрофореза в агарозном геле, затем стерильной бактериологической петлей забирают материал с поверхности плотной питательной среды и растирают в капле интеркалирующего красителя, дают мазку высохнуть, на высушенного поверхность мазка наносят каплю нефлуоресцирующего иммерсионного масла и проводят флуоресцентное микроскопирование при увеличении не менее ×1000 с использованием светофильтра возбуждения, пропускающего свет в диапазонах длин волн, которые подходят для конкретного применяемого интеркалирующего красителя.
12
14
В результате впервые проведенных нами исследований был определен новый оригинальный отличительный признак, обеспечивающий решение поставленной задачи (стабильности достижения высокого титра бактериофага (10-10 БОЕ/мл) при получении фаголизатов в условиях изменения как состава и качества ингредиентов питательной среды, так и увеличения размаха варьирования значений показателей культивирования штамма-хозяина и бактериофага) - критерий окончания культивирования быстро растущего штамма-хозяина на основании флуоресцентной микроскопии окрашенных интеркалирующим красителем мазков с поверхности плотной питательной среды - достижение не менее 10% по отношению к общему количеству клеток доли клеток с неоднородным окрашиванием флуоресцирующей цитоплазмы, а именно парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов или клеток шаровидной и эллипсоидной формы со слабо флуоресцирующим центральным сечением. На основе использования данного нового отличительного признака установлен увеличенный размах варьирования значений показателей культивирования штамма-хозяина и маточного бактериофага (в том числе титров засеваемой суспензии бактериальных клеток штамма-хозяина и засеваемого маточного бактериофага, толщины слоя плотной питательной среды, толщины слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды) с расширением перечня рецептур питательных сред, включающих ингредиенты различных производителей.
Из патентно-технической литературы и практики производства фагосодержащей продукции неизвестно о способе получения бактериофага, включающего культивирование бактериальных клеток штамма-хозяина и бактериофага на плотной питательной среде при отсутствии посторонней микрофлоры, получение фаголизата при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды, а также очистку фаголизата осаждением и/или фильтрацией, который был бы идентичен заявляемому.
Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».
12
14
Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - обеспечения стабильности достижения высокого титра бактериофага (10-10 БОЕ/мл) при получении фаголизатов в условиях изменения как рецептур питательных сред, так и увеличения размаха варьирования значений показателей культивирования штамма-хозяина и бактериофага.
Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ может быть реализован многократно с использованием присущих ему существенных признаков, а значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».
Заявляемое изобретение апробировано при получении вариантов очищенного фаголизата, содержащего различные бактериофаги. Ниже приводятся результаты этой апробации. При этом приведенные примеры получения бактериофагов показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.
8
Пример 1. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Enteritidis, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Enteritidis - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на плотную питательную среду (ГМФ-агар) с толщиной слоя 3 мм.
7
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 5 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 30 минут после начала культивирования каждые 30 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 10% по отношению к общему количеству клеток доли парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов. Затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Enteritidis засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 13 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 5 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
12
Полученный очищенный фаголизат в виде фильтрата содержал бактериофаги в титре 10 БОЕ/мл при отсутствии бактерий и ингредиентов использованной питательной среды.
10
Пример 2. Для получения бактериофага, активного в отношении Escherichia coli О104:Н4, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Escherichia coli К12 С600 - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на плотную питательную среду (мясо-пептонный агар) с толщиной слоя 10 мм.
9
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 15 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 60 минут после начала культивирования каждые 45 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 16% по отношению к общему количеству клеток доли парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов. Затем на полученный газон культуры Escherichia coli К12 С600 засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 14 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 15 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с рН 7,0 в количестве 0,045 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об/мин и стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
13
Полученный очищенный фаголизат в виде фильтрата содержал бактериофаги в титре 10 БОЕ/мл при отсутствии бактерий и ингредиентов использованной питательной среды.
12
Пример 3. Для получения бактериофага, активного в отношении Staphylococcus aureus, бактериальную культуру штамма-хозяина - Staphylococcus aureus - в титре 10 КОЕ/мл засевали в стеклянный микробиологический матрац на плотную питательную среду (агар LB) с толщиной слоя 25 мм.
10
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 25 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 120 минут после начала культивирования каждые 60 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 55% по отношению к общему количеству клеток доли клеток шаровидной и эллипсоидной формы со слабо флуоресцирующим центральным сечением. Затем на полученный газон культуры Staphylococcus aureus засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 15 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 25 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с рН 7,2 в количестве 0,05 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали добавлением к нему хлороформа, выдерживанием в течение 15 мин при непрерывном шуттелировании, центрифугированием в течение 60 мин при 3000 об/мин и стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
14
Полученный очищенный фаголизат в виде фильтрата содержал бактериофаги в титре 10 БОЕ/мл при отсутствии бактерий и ингредиентов использованной питательной среды.
9
Пример 4. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на плотную питательную среду (агар LB) с толщиной слоя 10 мм.
8
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 40 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 30 минут после начала культивирования каждые 45 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 25% по отношению к общему количеству клеток доли парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов. Затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 14 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 40 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с рН 7,4 в количестве 0,045 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,8 мкм, стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропусканием полученного фильтрата через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.
12
Полученный фаголизат в виде элюата содержал бактериофаги в титре 10 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.
10
Пример 5. Для получения бактериофага, активного в отношении Pseudomonas aeruginosa, бактериальную культуру штамма-хозяина - Pseudomonas aeruginosa - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на плотную питательную среду (ГМФ-агар) с толщиной слоя 10 мм.
9
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 50 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 30 минут после начала культивирования каждые 30 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 14% по отношению к общему количеству клеток доли парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов. Затем на полученный газон культуры Pseudomonas aeruginosa засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 15 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 50 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с рН 7,3 в количестве 0,05 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали добавлением к нему хлороформа, выдерживанием в течение 45 мин при непрерывном шуттелировании, центрифугированием в течение 45 мин при 6000 об/мин, стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и пропусканием полученного фильтрата через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.
12
Полученный фаголизат в виде элюата содержал бактериофаги в титре 10 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.
12
Пример 6. Для получения бактериофага, активного в отношении Staphylococcus aureus, бактериальную культуру штамма-хозяина - Staphylococcus aureus - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на плотную питательную среду (ГРМ-агар) с толщиной слоя 15 мм.
9
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 35 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 60 минут после начала культивирования каждые 60 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 55% по отношению к общему количеству клеток доли клеток шаровидной и эллипсоидной формы со слабо флуоресцирующим центральным сечением. Затем на полученный газон культуры Staphylococcus aureus засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 15 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 35 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,045 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали центрифугированием в течение 40 мин при 5000 об/мин.
11
Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду (мясо-пептонный агар с добавлением глюкозы) с толщиной слоя 17 мм.
10
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 30 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 60 минут после начала культивирования каждые 30 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 12% по отношению к общему количеству клеток доли парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов. Затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 14 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 30 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+24°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с рН 7,1 в количестве 0,045 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали добавлением к нему хлороформа, выдерживанием в течение 30 мин при непрерывном шуттелировании, центрифугированием в течение 45 мин при 4500 об/мин.
Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.
Смесь надосадочных жидкостей очищали стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
13
12
Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде фильтрата содержала стафилококковый бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл при отсутствии бактерий и ингредиентов использованной питательной среды.
9
Пример 7. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Infantis, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Infantis - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на плотную питательную среду (мясо-пептонный агар) с толщиной слоя 10 мм.
8
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 15 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 30 минут после начала культивирования каждые 30 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 17% по отношению к общему количеству клеток доли парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов. Затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Infantis засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 13 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 15 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 1,0 мкм.
10
Для получения бактериофага, активного в отношении Escherichia coli O157:Н7, бактериальную культуру штамма-хозяина - Escherichia coli К12 С600 - в титре 10 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на плотную питательную среду (агар LB) с толщиной слоя 20 мм.
8
Штамм-хозяин культивировали при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 30 мм и при оптимальной температуре для его роста (+37°C). Через 60 минут после начала культивирования каждые 30 минут с поверхности плотной питательной среды делали мазки, которые окрашивали интеркалирующим красителем и микроскопировали в флуоресцентном микроскопе. Культивирование прекращали при достижении 25% по отношению к общему количеству клеток доли парных, соприкасающихся полюсами клеток в форме палочек с преимущественной флуоресценцией цитоплазмы со стороны соприкасающихся полюсов. Затем на полученный газон культуры Escherichia coli К12 С600 засевали маточный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и культивировали в течение 13 часов при отсутствии посторонней микрофлоры, при толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды 30 мм и при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C).
2
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,045 мл на 1 см поверхности плотной питательной среды.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость и его очищали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Смешивали фильтраты двух полученных фаголизатов.
Смесь фильтратов очищали стерилизующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропусканием полученного фильтрата через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.
13
12
Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала сальмонеллезный бактериофаг в титре 10 БОЕ/мл и колифаг в титре 10 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.