227
Комплексные соединения, содержащие в своем составе радионуклид Th, а также бисфосфонатный фрагмент, способы их получения, а также потенциальное применение в качестве действующего вещества в составе остеотропного радиофармацевтического лекарственного препарата
227
COMPLEX COMPOUNDS CONTAINING RADIONUCLIDE Th, AS WELL AS BISPHOSPHONATE FRAGMENT, METHODS FOR THEIR PRODUCTION, AS WELL AS POTENTIAL USE AS ACTIVE SUBSTANCE IN COMPOSITION OF OSTEOTROPIC RADIOPHARMACEUTICAL DRUG

227
Настоящее изобретение относится к ядерной медицине и раскрывает структуру молекулы (комплексного соединения радионуклида Th с транспортной молекулой – производной золедроновой кислоты) –действующего вещества в составе потенциального остеотропного терапевтического радиофармацевтического лекарственного препарата.
Одним из неблагоприятных последствий онкологических заболеваний различной локализация является губительное поражение костей: либо в виде нарушения нормального костеобразования (костная резорбция), либо за счет образования костных метастазов. В любом случае, кости подвергаются разрушению, приводящему к снижению уровня жизни пациентов.
В настоящее время в мировой клинической практике золотым стандартом при различных как доброкачественных, так и злокачественных заболеваниях, связанных с избыточной или нарушенной резорбцией костной ткани, является применение бисфосфонатов - специфических фосфорсодержащих соединений, представляющих собой стабильные аналоги природных неорганических пирофосфатов.
Механизмы, посредством которых бисфосфонаты ингибируют резорбцию костной ткани, пока не полностью выяснены. Установлено, что бисфосфонаты обладают высоким сродством к связыванию с гидроксиапатитными кристаллами костной ткани, способностью снижать обновление и резорбцию костной ткани, снижать уровни гидроксипролина или щелочных фосфатаз в крови и, кроме того, ингибировать образование, рекруитмент, активацию и активность остеокластов.
В настоящее время существует три поколения бисфосфонатов, нашедших свое применение в клинической практике (таблица 1):
Таблица 1: бисфосфонаты, применяемые в клинической практике:
<b>Бисфосфонаты:</b>
<b>Первое поколение:</b>
этидронат
клодранат
тилудронат
<b>Второе поколение:</b>
памидронат
алендронат
<b>Третье поколение:</b>
ибандронат
золедронат
Бисфосфонатом, проявляющим наибольшую антирезорбционную активность является молекула золедроновой кислоты. На территории Российской Федерации зарегистрировано по меньшей мере десять лекарственных препаратов на её основе в различных лекарственных формах.
Именно эта молекула была взята за основу в раскрываемом изобретении, т.к. имеет возможность селективно накапливаться в патологических очагах костной ткани, проявляя при этом с одной стороны свой терапевтический эффект (снижение резорбции костной ткани), с другой стороны - является потенциальным вектором (транспортной молекулой) для доставки радионуклида в непосредственную близость к патологическому очагу.
99m
188
99m
188
Данное решение – доставка радионуклида к костным метастазам с использованием золедроновой кислоты не ново. В патенте RU2407746 от 29.09.2008 раскрывается радиофармацевтическое средство для диагностики и лечения костных поражений скелета. В основе данной разработки лежит комплекс золедроновой кислоты с радионуклидами: Tc или Re. Основным недостатком данной разработки является тот факт, что активные центры молекулы золедроновой кислоты, ответственные за связывание с гидроксиапатитными кристаллами костной ткани, вовлечены в комплексообразование с радионуклидами Tc или Re, что, в свою очередь, может не лучшим образом сказаться на in vivo стабильности комплекса золедроновой кислоты с радионуклидом, другими словами, если бы радионуклид входил в состав молекулы золедроновой кислоты, не участвуя в комплексоообразовании с активными центрами молекулы золедроновой кислоты (фосфонатными фрагментами), ответственными за взаимодействие с костной тканью, можно было бы предположить, что in vivo стабильность такого радиофармпрепарата и величина связывания такого радиофармпрепарата с костной тканью были бы выше, чем в вышеуказанной разработке. Именно эта гипотеза и легла в основу заявляемой на защиту разработки.
1
1
2
2
3
3
44
47
55
62
64
67
66
67
68
89
86
90
90
99m
111
135
159
149
160
161
165
166
166
175
177
186
188
213
225
227
227
223
223
227
223
В зарубежной разработке – патенте EP3206720 с датой приоритета 17.10.2014 заявляется молекула V, пригодная для комплексообразования изотопов металлов, содержащая хелатор X и один или несколько конъюгированных с ним таргетирующих векторов со структурой –L-R-L-R-L-R, а также фармацевтический препарат, состоящий из соединения V и образующего с ним комплекс изотопа металла M (Sc, Sc, Со, Cu, Cu, Cu,Ga, Ga, Ga, Zr Y, Y, Nb, Tc, In, Sm, Gd, Tb, Tb, Tb, Er, Dy, Ho, Yb, Lu, Re,  Re, Bi и Ac). В данной разработке активные центры молекулы золедроновой кислоты, ответственные за взаимодействие с костным матриксом не участвуют в комплексообразовании с радионуклидами металлов, а для этих целей происходит модификация молекулы золедроновой кислоты, заключающаяся во включении в её состав хелатообразователя, способного образовывать устойчивые комплексы с радионуклидами металлов, однако, в данной разработке не рассматривается возможность образования комплекса молекулы V с радионуклидом Th, а именно этот радионуклид является одним из ключевых параметров выносимого в настоящей заявке на защиту решения. Дополнительно стоит отметить, что основная цель разработки из патента EP3206720 – это создание остетропного препарата, проявляющего свой терапевтический эффект за счет доставки радионуклида к патологическому очагу и последующего распада радионуклида в составе комплекса с образованием α- или β-частицы, обладающей цитотоксическим эффектом, в выносимом же на защиту решении из радионуклида Th за счет α-распада тоже образуется α-частица, также обладающая цитотоксическим эффектом, но также дочерним продуктом распада является радионуклид Ra, выходящий из состава комплекса с модифицированной молекулой золедроновой кислоты, имеющий сродство к костной ткани, способный инкорпорировать в состав костного матрикса уже вне комплекса с модифицированной молекулой золедроновой кислоты и являющийся также α-эмиттером. Таким образом, основным отличием выносимого на защиту решения от патента EP3206720 является не просто использование терапевтического радионуклида в составе комплекса с модифицированной молекулой золедроновой кислоты, продукты распада которого обладают цитотоксическим эффектом, а также обеспечение образования радионуклида Ra в непосредственной близости от патологического очага с возможностью дальнейшего включения в костный матрикс и как следствие - потенциальное усиление терапевтического эффекта (большинство радионуклидов, описанных в патенте EP3206720 при распаде образуют стабильный нуклид), таким образом, комплекс радионуклида Th с модифицированной молекулой золедроновой кислоты, помимо своих терапевтических свойств, дополнительно является in vivo генератором радионуклида Ra в непосредственной близости от патологического очага. При этом, EP3206720 является наиболее близкой по своему содержанию разработкой к выносимому в рамках настоящей заявки на защиту решению.
227
Применение фосфорсодержащих хелатирующих агентов для комплексообразования с радионуклидом Th с целью таргетной доставки к костным патологическим очагам уже рассматривалось ранее, например, в патенте EA004899 с датой приоритета 04.07.2000. В данном патенте описывается применение молекул DTMP (диэтилентриамин-N,N’,N”-пентамитиленфосфоновая кислота) и DOTMP (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраметиленфосфоновая кислота) в комплексообразовании с радионуклидами актиния или тория с целью создания остеотропного хелата. При этом, в данном патенте активные центры молекулы комплексообразователя (в данном случае хелатора), участвующие в образовании связи с радионуклидом тория или актиния являются также активными центрами, участвующими во взаимодействии с костным матриксом, что является недостатком. Также в данном патенте рассматривается возможность получения хелата актиния или тория с последующим конъюгированием с молекулой, имеющей сродство к костной ткани, однако, в описании изобретения упоминаются лишь фосфорсодержащие хелаты, которые уступают в устойчивости амидным, либо кислотным хелаторам (например TCMC (1,4,7,10- тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраацетамид) или DOTA(1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота)).
227
223
223
223
227
223
Помимо использования радионуклида Th в составе комплексов для терапии костных заболеваний, был предложен на защиту метод терапии мягких тканей, при котором происходит образование Ra - патент US2006/0228297. Данная разработка схожа с заявляемым на защиту в рамках данной заявки решением, однако, образование радионуклида Ra в непосредственной близости от мягких тканей обладает некоторыми негативными последствиями, а именно: за счет своего достаточно длительного периода полураспада (11,4 суток), радионуклид Ra, образовавшийся за счет распада материнского радионуклида Th, с большой долей вероятности успеет локализоваться в костях, что может привести к необоснованным лучевым нагрузкам при отсутствии необходимости создания цитотоксической дозы ионизирующего излучения в костном матриксе. В разработке, которая выносится на защиту в рамках настоящей заявки – радионуклид Ra образуется уже в непосредственной близости от патологического очага, в меньшей степени диффундирует по организму.
Вышеописанные четыре патента наиболее близки по своему уровню техники к заявляемой на защиту разработке, однако, уступают в некоторых аспектах, описанных выше.
227
227
Первым объектом, выносящимся на защиту является комплексное соединение Y общей структуры Th-Chel-Zoledron, в котором радионуклид Th входит в состав соединения Y благодаря образованию устойчивых координационных связей с фрагментом Chel. Фрагмент Chel соответствует одному из бифункциональных хелатирующих агентов (DOTA; DOTAGA; TETA; TETPA; HEHA; PEPA; DTPA; CHX-DTPA; p-SCN-Bn-DOTA; p-SCN-Bn-CHX-A-DTPA; -p-SCN-Bn- DTPA;p-SCN-Bn-TCMC; p-SCN-Bn-TETA; p-SCN-Bn-TETPA; p-SCN-Bn-HEHA; p-SCN-Bn-PEPA) и ковалентно связан с аминогруппой фрагмента Zoledron (таблица 2).
227
227
Все вышеуказанные фрагменты –Chel-Zoledron способны образовывать устойчивые комплексы с радионуклидами, в частности с радионуклидом Th, формируя комплексное соединение Y общей структуры Th-Chel-Zoledron (таблица 3):
227
227
223
Таким образом, заявляемое на защиту комплексное соединение Y представляет из себя молекулу, состоящую из фрагмента – Zoledron, содержащего в своем составе участок, соответствующий золедроновой кислоте, за счет которого осуществляется инкорпорирование комплексного соединения Y в состав костного матрикса, а также потенциальное антирезобрционное действие, фрагмента –Chel, соответствующего одному из бифункциональных хелатирующих агентов, представленных в таблице 2, и обеспечивающего включение в состав комплексного соединения Y радионуклида Th и радионуклида Th, эмиттирующего α-частицы и распадающегося в радионуклид Ra с периодом полураспада 18,7 суток.
Заявляемое на защиту комплексное соединение Y может быть получено двумя разными способами:
227
1. взаимодействием бифункционального хелатирующего агента Chel с аминогруппой молекулы, соответствующей фрагменту Zoledron, с образованием молекулы Chel-Zoledron с последующим её радиомечением радионуклидом Th;
227
227
2. радиомечением радионуклидом Th молекулы бифункционального хелатирующего агента Chel с образованием молекулы Th-Chel с последующим её взаимодействием с аминогруппой молекулы, соответствующей фрагменту Zoledron.
Способ получения фрагмента Zoledron с последующим формированием молекулы Chel-Zoledron с возможным использованием различных бифункциональных хелатирующих агентов Chel подробно описан в патенте EP3206720, схема синтеза приведена ниже (Рисунок 1).
Рисунок 1: схема синтеза соединения,соответствующего фрагменту Zoledron:
Все бифункциональные хелатирующие агенты, соответствующие фрагменту –Chel, коммерчески доступны и в самостоятельном синтезе не нуждаются, хотя это осуществимо при необходимости. Для формирования молекулы Chel-Zoledron возможно применение эфиров бифункциональных хелатирующих агентов –Chel, защищенных, либо нет – зависит от условий реакции, в любом случае, выбор подходящего метода синтеза зависит от временных рамок, необходимых условий, доступности реагентов и требуемого выхода реакции, конечный продукт, в любом случае, будет одинаков и соответствовать структуре -Chel-Zoledron (Таблица 4).
227
227
227
о
223
227
Дальнейшее радиомечение радионуклидом Th, соединений, соответствующих структуре Chel-Zoledron проводилось. Th для радиомечения находился в растворе 0,2 М HCl (для очистки. Th от продуктов распада использовалась анионообменная колонка 2х30 мм, содержащая 50-90 мг анионообменной смолы нитратной формы) в объеме 100-200 мкл, к этому объему добавляли 400-800 мкг соединения Chel-Zoledron, 3 мг аскорбиновой кислоты, 10-20 мг тетраметиламмоний ацетата, либо другой буферной соли для достижения pH приблизительно 5,5. Флакон с вышеописанным содержимым помещался в термошейкер на 100 оборотов в минуту при 60 С на час. Конечный продукт растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия 0,9%. Перед растворением в изотоническом растворе возможна очистка от Ra при необходимости. Подтверждение подлинности продукта реакции, соответствующего структуре комплексного соединенияTh-Chel-Zoledron проводили по характеристическим гамма-линиям тория-227. Выход реакции радиомечения проверяли методом тонкослойной хроматографии с гамма-детектором.
227
227
227
Возможен и иной путь получения комплексного соединения Th-Chel-Zoledron, где на первой стадии проводится радиомечение бифункционального хелатирующего агента Chel с последующимя присоединением образованного комплекса к молекуле Zoledron, однако этот способ имеет ряд недостатков – в первую очередь из-за долгого времени формирования связи Chel-Zoledron (более 6 часов), что приводит к увеличению потерь радионуклида Th за счет распада, а также увеличению деструктивных процессов за счет радиолиза. Этот путь получения комплексного соединения Th-Chel-Zoledron менее актуален, однако возможен.
227
Основным целевым использованием комплексного соединения Th-Chel-Zoledron является применение в качестве действующего вещества в составе потенциального остеотропного радиофармацевтического лекарственного препарата.
Более 80% онкологических больных страдают костными метастазами, развивающимися преимущественно при раке молочной железы, предстательной железы или лёгких. Метастазы костной ткани губительно влияют на структуру костей, их минеральный обмен, приводят к повышению гиперкальциемии, а также негативно сказываются на качестве жизни больного, вызывая неврологические симптомы, приводящие к сильным болевым ощущениям [1].
Локальная лучевая терапия может быть использована при локальных метастазах, системная радиотерапия в сочетании с гормональными препаратами также может быть эффективна на ранних стадиях, однако не исключены серьезные побочные эффекты [2]. Для снижения резорбции костной ткани и как следствие – возможное снижение болевого синдрома в последнее время применяются производные дифосфоновых кислот [3]. При этом, вышеперечисленные методы являются малоэффективными на поздних стадиях заболевания.
В последние десятилетия широкое применение в клинической практике находит использование остеотропных РФЛП при:
• множественных метастазах в кость;
• болевом синдроме, вызванном костными метастазами;
• прогрессировании костных метастазов на фоне лечения [4].
Остеотропные РФЛП представляют собой радиоактивный раствор, содержащий терапевтический радионуклид (α или β-эмиттер),  способный избирательно накапливаться в патологических очагах – костном матриксе (за счет тропности радионуклида к костной ткани, либо за счет использования комплекса молекулы-носителя с радионуклидом, обладающего повышенной тропностью к костной ткани).
Таким образом, одной из ключевых задач при поиске, разработке и оценке терапевтических свойств потенциального остеотропного РФЛП является выбор радионуклида с оптимальными ядерно-физическими характеристиками, а также (при необходимости их использования) специфических молекул-носителей для селективной доставки радионуклида к патологическому очагу.
32
32
P был первым радионуклидом, использованным для паллиативного лечения костных метастазов [5]. Патологические костные очаги поглощают  P приблизительно в пять раз эффективнее, чем здоровый костный матрикс. Использование данного радионуклида приводило к снижению болевого синдрома приблизительно через неделю после введения препарата и эффект длился на протяжении нескольких месяцев.
89
89
32
Другим радионуклидом, обладающим сродством к патологическому костному очагу является Sr [6], У 60-80% пациентов снижение болевой симптоматики происходит приблизительно через 2-4 недели после введения препарата и эффект продолжается в среднем в течение 3-5 месяцев. Что обусловлено большим периодом полураспада Sr по сравнению с P.
153
188
Вышеописанные радионуклиды обладают существенным недостатком – отсутствием γ-компоненты при распаде, что затрудняет контроль in vivo распределения препарата в организме пациента и следовательно – дозиметрический контроль. Этого недостатка лишены радионуклиды Sm и Re [7,8], имеющие γ-компоненту в спектре излучения, а также более короткие периоды полураспада, однако не обладающие повышенной  тропностью к костной ткани, что приводит к необходимости использования этих радионуклидов в составе комплекса с молекулами-носителями (производными фосфоновых кислот).
153
188
Sm нашел свое применение в составе комплекса с оксабифором [9]. А радионуклид Re в составе комплекса с бисфосфонатом последнего поколения - золедроновой кислотой, применяемой отдельно в качестве лекарственного препарата, способствующего снижению резорбционных процессов в костной ткани, а также обладающей рядом преимуществ по сравнению с другими производными фосфоновых кислот в качестве молекулы-носителя радионуклида [10].
Таблица 5: ядерно-физические характеристики вышеописанных β-эмиттеров, используемых в составе остеотропных РФЛП [1].
Радионуклид
Максимальная E<sub>β </sub>(МэВ)
Средняя E<sub>β </sub>(МэВ)
Пробег в костной ткани (мм)
E<sub>γ</sub>(МэВ)
T<sub>1/2</sub>
<sup>32</sup>P
1,71
0,695
2,7
-
14,3сут.
<sup>89</sup>Sr
1,49
0,583
2,4
-
50,5 сут.
<sup>153</sup>Sm
0,81
0,224
0,55
0,103 (28%)
46,7 ч.
<sup>188</sup>Re
2,12
3,2
0,155 (15%)
17 ч.
При всём многообразии вышеописанных остеотропных препаратов, все они в своем составе имеют β-эмиттеры, уступающие α-эмиттерам по терапевтической эффективности и некоторым показателям безопасности [11].
223
Единственным используемым в клинической практике на территории России остеотропным РФЛП на основе α-эмиттера является дихлорид радия-223. Радионуклид Ra обладает тропностью к костной ткани и избирательно накапливается в ней. Применяется без использования молекулы-носителя. И зарекомендовал себя в качестве эффективного средства при терапии костных метастазов при раке простаты [12].
227
227
227
223
Золедроновая кислота – бисфосфонат последнего поколения, обладающая сродством к костной ткани и проявляющая свою фармакологическую активность за счет ингибирования резорбции костной ткани. При образовании комплекса молекулы производной золедроновой кислоты Chel-Zoledron с радионуклидом Th достигается синергетический терапевтический эффекта золедроновой кислоты и α-эмиттера Th (помимо терапевтического эффекта, молекула производной золедроновой кислоты проявляет свойства транспортной молекулы), испускающего α-частицы в непосредственной близости к патологическому очагу, которые, в свою очередь, за счет высокой величины линейной передачи энергии (ЛПЭ) и малой длины пробега в биологической ткани (по сравнению с β-частицами) оказывают высокий локальный цитотоксический эффект при минимальном повреждении здорового тканевого окружения. Дочерним радионуклидом Th является радионуклид Ra, испускающий α-частицы, обладающий сродством к костной ткани, выходящий из состава комплекса с молекулой – производной золедроновой кислоты, способный к дальнейшей сорбции костной тканью и обладающий фармакологической активностью по отношению к костным метастазам.
227
Таким образом, основным объектом заявляемой разработки является комплексное соединение Th-Chel-Zoledron– действующее вещество в составе потенциального остеотропного РФЛП, обладающего тройным терапевтическим эффектом:
1. молекула носитель радионуклида – производная золедроновой кислоты Chel-Zoledron помимо транспортной функции выполняет метаболическую функцию (снижение резорбции костной ткани),
227
2. радионуклид Th, находящийся в непосредственной близости к патологическому очагу обеспечивает цитотоксический эффект за счет испускания α-частиц,
227
223
3. комплексное соединение Th-Chel-Zoledron является in vivo генератором радионуклида Ra, образованного в непосредственной близости к патологическому очагу, обладающего высокой тропностью к костной ткани, встраивающегося в костный матрикс и обеспечивающего цитотоксический эффект за счет испускания α-частиц,
227
223
4. имея данные о периоде полувыведения комплексного соединения Th-Chel-Zoledron можно рассчитать активность потенциального РФЛП, требуемую для поддержания приблизительно постоянной терапевтической активности  Ra в непосредственной близости от патологического очага
Y
227
A– активность комплексного соединения Th-Chel-Zoledron (Бк) в составе одной терапевтической дозы потенциального остеотропного радиофармацевтического лекарственного препарата;
Ra
223
227
A – активность радионуклида Ra, образующегося из радионуклида Th, входящего в состав комплексного соединения Y;
1/2Th
227
T– период полураспада радионуклида Th, равный 18,7 суток;
1/2Y
227
T– период полувыведения комплексного соединения Th-Chel-Zoledron из организма.
[1] В.М. Петриев, Е.Л. Афанасьева, В.Г. Скворцов/Химико-фармацевтический журнал, том 42, №5 (2008).
[2] L. Trodella, G. Ausili-Cefaro, A. Turriziani. Pain, 18, 387-396 (1984).
[3] Р.В. Орлова, Н.В. Тюкавина/VII Российская онкологическая конференция.
[4]М.С. Белозерова, Т.Ю, Кочетова, В.В. Крылов, Практические рекомендации по радионуклидной терапии при метастазах в кости/ Злокачественные опухоли, спецвыпуск, 448-454 (2015).
[5]L.J. Morin, J.C. Stevens/ J.Umi, 97, 130-132 (1967).
[6]Э.В. Краснова, Возможности стронция-89 хлорида в комплексной терапии костных метастазов/диссертация (2006).
[7]А.Ф.  Цыб, В.В. Крылов, Б.Я. Дроздовский, О.Б. Карякин, В.А. Бирюков, В.н. Медведев, И.А. Смирнов, С.Л, Воробьева/Сибирский онкологический журнал, № 3, 19 (2006).
[8]S. Dorovatovskiy, V. Petriev, V. Skvortsov, A. Zverev/ Czech Chem. Soc. Symp. Ser. 16, 234 (2018).
[9]А.О. Малышева, О.Е. Клементьева, Г.Е. Кодина, В.Н. Корсунский, М.Е. Назаренко, О.Р. Михайлов, С.В. Перминов, Н.А. Уваров, В.Е. Федоров, патент на изобретение RU2407746 от 29.09.2008.
[10]Г.Е. Кодина, Н.П. Громова, И.Н. Тронова, А.А. Инкин, Б.Я. Дроздовский, В.В. Крылов, патент на изобретение RU2162714 от 20.06.2000.
[11]L. Marcu, E. Bezak, B.J. Allen/Clinical Reviews in Oncology Hematology 123, 7-20 (2018).
[12]А.А. Костин, А.Г. Мурадян, А.О. Толкачев, С.В. Попов/ Исследования и практика в медицине, т.4, 79-88 (2017).