БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ СВИНЕЙ
BACTERIAL STRAINS ISOLATED FROM PIGS

Настоящее изобретение относится к бактериальным штаммам, выделенным из свиней. Конкретнее, настоящее изобретение относится к выделению лактобактерий из выращиваемых на органических кормах свиней. Заявленные лактобактерий имеют полезные применения в качестве пробиотиков и терапевтические применения.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
На состав бактериальной флоры свиней, функционирование врожденной иммунной системы пищеварительного тракта у них и возможную подверженность инфицированию оказывает огромное влияние среда, в которой их выращивают в начале жизни (Mulder et al, 2009). Выращиваемые на открытом воздухе свиньи, как правило, имеют более развитую иммунную систему пищеварительного тракта, демонстрируют более хорошие результаты и здоровее, чем соответствующие им свиньи, выращиваемые в помещении. Среда за пределами помещения оказывает сильное влияние на разнообразие микроорганизмов в пищеварительном тракте и связана с высокими уровнями Firmicutes, в частности лактобактерий [LAB].
LAB включают клад грамположительных, с низким содержанием GC, кислотоустойчивых, обычно неспорообразующих, анаэробных бактерий, которые объединены некоторыми общими характеристиками метаболизма и физиологическими характеристиками. LAB являются палочковидными бациллами или кокками, которые характеризуются повышенной устойчивостью к диапазону более низких значений pH. LAB продуцируют молочную кислоту в качестве основного конечного продукта метаболизма - ферментации углеводов и находятся среди самых важных групп микроорганизмов, используемых в пищевой промышленности.
Lactobacilli являются преобладающими во флоре пищеварительного тракта выращиваемых на органических кормах (на открытом воздухе) свиней. Напротив, количество этих бактерий является низким у свиней, выращиваемых в помещении, а уровни потенциально патогенных филотипов являются высокими (Mulder et al, 2009). Кроме того, известно, что развитие и функционирование иммунной системы пищеварительного тракта у свиней, выращиваемых в помещении, отклоняется от нормы. В частности, экспрессия генов интерферонов типа 1, главного комплекса гистосовместимости класса I и нескольких хемокинов, как известно, является увеличенной (Mulder et al, 2009).
Лактобактерии могут модифицировать структуру и функцию флоры и пищеварительного тракта несколькими способами (Cotter et al, 2005; Ohashi and Ushida, 2009). Например, они могут конкурировать с вредными бактериями за основные питательные вещества или места прикрепления к стенке пищеварительного тракта, что приводит к их исключению. Альтернативно, они могут продуцировать биоактивные вещества, которые способствуют или стимулируют колонизацию полезными бактериями, или уничтожать/препятствовать росту потенциально вредные(ых) или патогенные(ых) бактерии(й). Альтернативно, эти биоактивные факторы могут быть иммуномодуляторами, которые способствуют развитию иммунной системы и целостности барьера - стенки пищеварительного тракта. Биологическая активность штаммов LAB варьируется в значительной степени. Настоящее изобретение пытается обеспечить штаммы LAB, которые обладают терапевтически полезными свойствами. Конкретнее, настоящее изобретение пытается обеспечить штаммы LAB, способные к стимуляции развития пищеварительного тракта и иммунной системы и к способствованию их здоровому состоянию, которые обладают в силу этого значительным терапевтическим потенциалом в качестве пробиотиков.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Автор настоящего изобретения установил, что в микробиоте выращиваемых на открытом воздухе свиней содержатся штаммы LAB, которые продуцируют сильнодействующие и специфические противомикробные или модулирующие клеточный/иммунный ответ биоактивные факторы.
Аспекты настоящего изобретения, вместе с предпочтительными вариантами осуществления, изложены в сопроводительной формуле изобретения.
Первый аспект настоящего изобретения относится к штамму лактобактерий из свиней, причем указанный бактериальный штамм характеризуется одним или более из следующих свойств:
(i) способностью к демонстрации противомикробной активности, направленной против Е. coli;
(ii) способностью к демонстрации противомикробной активности, направленной против S. enteritidis;
(iii) способностью к подавлению в клетках IPEC (клетках кишечного эпителия свиньи) воспаления, вызванного 12-O-тетрадекабоилфорбол-13-ацетатом (РМА);
(iv) способностью к блокированию прикрепления к клеткам IPEC S. enteritidis или проникновения в них S. enteritidis;
(v) способностью к блокированию прикрепления к клеткам IPEC Е. coli или проникновения в них Е. coli;
(vi) отсутствием устойчивости к одному или более антибиотиков, выбираемых из следующих: ампициллина; цефотаксима; хлорамфеникола; эритромицина; гентамицина; тетрациклина; ванкомицина; метронизадола; налидиксовой кислоты и канамицина; и
(vii) способностью к демонстрации термостабильности при подвергании воздействию трех циклов нагревания, при этом каждый цикл включает нагревание при температуре, равной 70°С, в течение периода времени, составляющего 15 минут.
Второй аспект относится к композиции, включающей один или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.
Третий аспект относится к пробиотической композиции, включающей один или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением.
Четвертый аспект относится к одному или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением для применения в медицине.
Пятый аспект относится к одному или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением для применения для лечения кишечного расстройства у субъекта.
Шестой аспект относится к применению одного или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением для приготовления лекарственного средства для лечения кишечного расстройства у субъекта.
Седьмой аспект относится к способу лечения кишечного расстройства у субъекта, включающему введение субъекту фармацевтически эффективного количества одного или более штаммов лактобактерий или композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Восьмой аспект настоящего изобретения относится к одному или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением для улучшения микробиоты кишечника.
Девятый аспект настоящего изобретения относится к способу улучшения микробиоты кишечника у субъекта, включающему введение субъекту одного или более штаммов лактобактерий или композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Десятый аспект относится к кормовому материалу, включающему один или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением.
Одиннадцатый аспект относится к продукту питания, включающему один или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением.
Двенадцатый аспект относится к пищевой добавке, включающей один или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением.
Тринадцатый аспект относится к добавке к пищевому продукту, включающей один или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением.
Четырнадцатый аспект относится к способу продуцирования пробиотика, включающему культивирование штамма лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением.
Пятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу получения штамма лактобактерий из свиней, включающему получение фекалий от выращиваемой на органических кормах свиньи и выделение одного или более штаммов лактобактерий из свиней из указанных фекалий.
Шестнадцатый аспект настоящего изобретения относится к одному или более штаммов лактобактерий из свиней, полученных или получаемых с помощью описанного выше способа.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как отмечено выше, настоящее изобретение относится к одному или более штаммов лактобактерий из свиней. Этот штамм лактобактерий характеризуется одним или более из следующих свойств:
(i) способностью к демонстрации противомикробной активности, направленной против Е. coli;
(ii) способностью к демонстрации противомикробной активности, направленной против S. enteritidis;
(iii) способностью к подавлению в клетках IPEC воспаления, вызванного 12-O-тетрадекабоилфорбол-13-ацетатом (РМА);
(iv) способностью к блокированию прикрепления к клеткам IPEC S. enteritidis или проникновения в них S. enteritidis;
(v) способностью к блокированию прикрепления к клеткам IPEC Ε. coli или проникновения в них Е. coli;
(vi) отсутствием устойчивости к одному или более антибиотиков, выбираемых из следующих: ампициллина; цефотаксима; хлорамфеникола; эритромицина; гентамицина; тетрациклина; ванкомицина; метронизадола; налидиксовой кислоты и канамицина; и
(vii) способностью к демонстрации термостабильности при подвергании воздействию трех циклов нагревания, при этом каждый цикл включает нагревание при температуре, равной 70°С, в течение периода времени, составляющего 15 минут.
Используемый здесь термин «свиной» означает «от свиньи или имеющий отношение к свинье», т.е. от любого из нескольких млекопитающих семейства Suidae, особенно одомашненной свиньи, Sus scrofa domesticus, или Sus domesticus, когда она является молодой или относительно небольшого размера, или имеющий отношение к нему.
Предпочтительно, когда возраст свиньи составляет менее 3 месяцев, предпочтительно менее 2 месяцев.
Предпочтительно, когда штамм лактобактерий из свиней имеет отношение к выращиваемой на органических кормах свинье. В связи с этим, предпочтительно, когда свиней выращивают на свободном выгуле, на открытом воздухе (с подверганием воздействию почвы) и в отсутствие антибиотиков, активаторов роста и/или усилителей роста.
Предпочтительно, когда штамм лактобактерий из свиней имеет отношение к выращиваемой на открытом воздухе свинье. Предпочтительно, когда свиней выращивают на открытом воздухе в течение по крайней мере 60% их жизни. Более предпочтительно, когда животных выращивают вне помещения в течение по крайней мере 80% их жизни, более предпочтительно - по крайней мере 90% их жизни, даже еще предпочтительнее - 100% их жизни.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий выбирают из L. johnsonii, L. reuteri, L. plantarum, L. gasseri, L. pentosus, L. acidophilus, L. vaginalis и L. mucosae.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий выбирают из L johnsonii, L. reuteri и L. plantarum.
В другом предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий находится в форме популяции живых бактерий, популяции лиофилизированных бактерий, препарата нежизнеспособных бактерий или их клеточных компонентов. Предпочтительно, когда бактериальный штамм находится в форме препарата нежизнеспособных бактерий, его выбирают из убитых с помощью нагревания бактерий, подвергнутых облучению бактерий и лизированных бактерий.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий находится в форме живой бактерии, мертвой бактерии или ее клеточных компонентов.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий находится в выделенной форме. Используемый здесь термин «выделенный» означает выделенный от своего природного окружения.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий находится в биологически чистой форме. Используемый здесь термин «биологически чистый» относится к штамму бактерий в форме лабораторной культуры, которая по существу не содержит другие виды организмов. Предпочтительно штамм лактобактерий находится в форме культуры одного вида организма.
Используемый здесь термин «штамм лактобактерий» также охватывает мутанты указанного штамма лактобактерий. Используемый здесь термин «мутант» включает производные штаммы бактерий, имеющие полинуклеотидные последовательности, гомологичные на по крайней мере 93%, предпочтительно на по крайней мере 96%, более предпочтительно на 98% полинуклеотидной последовательности ссылочного штамма, а в остальном включающие мутации в других последовательностях в бактериальном геноме. Мутанты можно получить с помощью методов генной инженерии, подразумевающие изменение генетического материала штаммов по настоящему изобретению или подразумевающие рекомбинацию генетического материала штаммов по настоящему изобретению с другими молекулами. Типично для получения таких мутантных штаммов квалифицированный в данной области специалист может использовать стандартные методы мутагенеза, такие как ультрафиолетовое облучение или подвергание воздействию мутагенных химических продуктов.
Используемый здесь термин «мутации» включает природные или индуцированные мутации, включающие по крайней мере точечные мутации, включающие делеции, вставки, трансверсии и другие модификации, известные квалифицированным в данной области техники специалистам, в том числе генетическую модификацию, введенную в исходную нуклеотидную или аминокислотную последовательность при сохранении составляющей по крайней мере 50% гомологии с исходной последовательностью. Предпочтительно, когда последовательность, включающая мутацию или мутации, гомологична на по крайней мере 60%, более предпочтительно на по крайней мере 75%, еще более предпочтительно на 85% исходной последовательности. Как здесь используется, «гомологию» последовательности можно определить, используя стандартные методы, известные квалифицированным в данной области техники специалистам. Например, гомологию можно определить, используя диалоговую программу «BLAST», в которой используется алгоритм для вычисления гомологии, общедоступную на сайте http://www.ncbi. nlra.nih.gov/BLAST/.
Используемый здесь термин «штамм лактобактерий» также охватывает гомологии штаммов лактобактерий. Используемый здесь термин «гомолог» относится к штамму лактобактерий, имеющему нуклеотидную последовательность со степенью идентичности или гомологии с нуклеотидной последовательностью исходного штамма лактобактерий (ниже называемую «гомологичной последовательностью(ями)»). Здесь термин «гомологичный» означает объект с некой гомологией с рассматриваемой нуклеотидной последовательностью. Здесь термин «гомология» может быть приравнен к «идентичности».
В контексте настоящего изобретения гомологичная последовательность, как считается, включает нуклеотидную последовательность, которая может быть идентична на по крайней мере 50, 60, 70, 75, 80, 85 или 90%, предпочтительно идентична на по крайней мере 95%, 97%, 98% или 99% нуклеотидной последовательности исходного штамма лактобактерий (рассматриваемой последовательности).
Сравнения для определения гомологии можно выполнить на глаз, или обычнее с помощью легкодоступных программ для сравнения последовательностей. С помощью этих имеющихся в продаже компьютерных программ можно рассчитать % гомологии между двумя или более последовательностей. % гомологии можно рассчитать на протяжении соприкасающихся последовательностей, т.е. одну последовательность совмещают с другой последовательностью, и каждую аминокислоту в одной последовательности непосредственно сравнивают с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, один остаток за раз. Это называется совмещением «без внесения пропусков». Типично такие совмещения без внесения пропусков выполняют только на протяжении относительно короткого числа остатков.
Хотя это очень простой и логичный способ, в нем не учитывается, что, например, в других отношениях идентичной паре последовательностей одна вставка или делеция будет вызывать сбивание совмещения последующих аминокислотных остатков, таким образом потенциально приводя к большому уменьшению % гомологии при выполнении общего совмещения.
Следовательно, для расчета максимального % гомологии, во-первых, необходимо создание оптимального совмещения, учитывая штрафы за внесение пропусков. Подходящей компьютерной программой для выполнения такого совмещения является Vector NTI (Invitrogen Corp.). Примеры программного обеспечения, с помощью которого можно выполнить сравнения последовательностей, включают, но без ограничения, пакет программ BLAST (см. Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), BLAST 2 (cm. FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) и AlignX, например. По крайней мере BLAST, BLAST 2 и FASTA имеются в распоряжении для исследования в автономном режиме и режиме онлайн (см. Ausubel et al 1999, страницы 7-58 - 7-60).
Предпочтительно, степень идентичности в отношении нуклеотидной последовательности определяют на протяжении по крайней мере 20 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 30 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 40 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 50 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 60 следующих друг за другом нуклеотидов, предпочтительно на протяжении по крайней мере 100 следующих друг за другом нуклеотидов. Предпочтительно степень идентичности в отношении нуклеотидной последовательности можно определить на протяжении всей последовательности.
Традиционная идентификация бактерий на основе фенотипических характеристик, является, как правило, не настолько точной как идентификация на основе генотипических методов. Сравнение последовательности гена 16S рРНК бактерии возникло в качестве предпочтительного генетического метода и создает возможность для идентификации новых штаммов посредством сравнения последовательностей с известными бактериальными последовательностями ДНК, используя BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Последовательность гена 16S рРНК является универсальной у бактерий, а значит, взаимосвязи можно определить между множеством различных бактерий. В общем, сравнение последовательности 16S рРНК позволяет дифференцировать организмы на уровне рода по всем основным филумам бактерий, в дополнение к тому, что оно позволяет классифицировать штаммы на множестве уровней, в том числе на уровне вида и подвида. Последовательность гена 16S рРНК была определена для большого числа штаммов. GenBank, самый большой банк данных, касающихся нуклеотидных последовательностей, содержит свыше 20 миллионов депонированных последовательностей, из которых свыше 90000 являются последовательностями генов 16S рРНК. Это значит, что существует множество ранее депонированных последовательностей, с которыми можно сравнить последовательность неизвестного штамма.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий содержит последовательность гена 16S рРНК, выбираемую из SEQ ID NO: 1-87, или ее гомолог или вариант. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к штамму лактобактерий, который включает последовательность гена 16S рРНК, выбираемую из SEQ ID NO: 1-87, или ее гомолог или вариант. Предпочтительные применения/способы распространяются на этой аспект с необходимыми изменениями.
Термин «гомолог» определен выше. Используемый здесь термин «вариант» включает любую вариацию, в случае которой: (а) один или более нуклеотидов заменен другим нуклеотидом или делетирован, (b) порядок следования двух или более нуклеотидов изменен на противоположный порядок, (с) присутствуют вместе и (а), и (b). Предпочтительно, варианты проистекают из одного из (а), (b) или (с). Более предпочтительно, когда один или более нуклеотидов заменены или делетированы. Даже более предпочтительно, когда один нуклеотид заменен на другой.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм лактобактерий характеризуется способностью к демонстрации противомикробной активности, направленной против Е. coli. Противомикробная активность отмечается благодаря, скорей всего, противомикробным веществам, продуцируемым штаммами лактобактерий по настоящему изобретению, хотя природа этих противомикробных веществ не была определена.
Применительно к настоящему изобретению способность к демонстрации противомикробной активности, направленной против Е. coli, можно определить с помощью определения ингибирования роста Е. coli в in vitro анализе диффузии из лунки. Дополнительные подробности в отношении анализа диффузии из лунки изложены в сопроводительных примерах. Анализ проводят с использованием Escherichia coli K88 на агаре MacConkey №3, инкубируя чашки в течение 16 часов при 37°С. Конкретнее, к агару добавляют Escherichia coli K88 (1 мл разведения 1:1000 ночной культуры Escherichia coli K88 к 200 мл агара для обеспечения эквивалента 106 колониеобразующих единиц (CFU)/мл). Агар выливают в чашки Петри, и позволяют ему твердеть. Чашки разделяют на секторы, и в каждом секторе вырезают лунку диаметром приблизительно 5 мм. В лунки добавляют аликвоту (60 мкл) кондиционированной среды или бульона MRS. Чашки закрывают крышкой и инкубируют в течение 16 часов при 37°С. Их фотографируют, используя цифровой фотоаппарат. Изображения переносят в Photoshop, и определяют диаметр лунки и зоны ингибирования, используя инструментальное средство для измерения.
В связи с убиванием Е. coli в изложенном выше анализе диффузии из лунки предпочтительно, когда штамм лактобактерий по настоящему изобретению демонстрирует <20000 единиц ингибирования, более предпочтительно 20000-40000 единиц, даже более предпочтительно 40000-60000 единиц, более предпочтительно 60000-80000 единиц, более предпочтительно 80000-100000 единиц ингибирования, даже еще предпочтительнее >100000 единиц ингибирования.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм лактобактерий характеризуется способностью к демонстрации противомикробной активности, направленной против S. enteritidis. Вновь, противомикробная активность отмечается благодаря, скорей всего, противомикробным веществам, продуцируемым штаммами лактобактерий по настоящему изобретению, хотя природа этих противомикробных веществ не была определена.
6
Применительно к настоящему изобретению способность к демонстрации противомикробной активности, направленной против S. enteritidis, можно определить с помощью определения способности к ингибированию роста S. enteritidis в in vitro анализе диффузии из лунки. Дополнительные подробности в отношении анализа диффузии из лунки изложены в сопроводительных примерах. Анализ проводят с использованием Salmonella enteritidis S1400 на агаре XLD, инкубируя чашки в течение 16 часов при 37°С. Агар XLD готовят в соответствии с инструкциями производителя и охлаждают до 45°С. К агару XLD добавляют Salmonella enteritidis S1400 (1 мл разведения 1:1000 ночной культуры Salmonella enteritidis S1400 к 200 мл агара для обеспечения эквивалента 10 CFU/мл). Агар XLD выливают в чашки Петри, и позволяют ему твердеть. Чашки разделяют на секторы, и в каждом секторе вырезают лунку диаметром приблизительно 5 мм. В лунки добавляют аликвоту (60 мкл) кондиционированной среды или бульона MRS. Чашки закрывают крышкой и инкубируют в течение 16 часов при 37°С, и данные анализируют, как описано выше для анализа с использованием Е. coli.
В связи с убиванием Salmonella enteritidis в изложенном выше анализе диффузии из лунки предпочтительно, когда штамм лактобактерий по настоящему изобретению демонстрирует <20000 единиц ингибирования, более предпочтительно 20000-40000 единиц, даже более предпочтительно 40000-60000 единиц, более предпочтительно 60000-80000 единиц, более предпочтительно 80000-100000 единиц ингибирования, даже еще предпочтительнее >100000 единиц ингибирования.
В альтернативном варианте осуществления способность к демонстрации противомикробной активности, направленной против S. enteritidis, можно определить с помощью определения способности к ингибированию S. enteritidis in vivo у мышей С3Н/HeN или C57BI/6. Дополнительные подробности в отношении соответствующих in vivo анализов изложены в сопроводительных примерах.
Конкретно, мышей С3Н/HeN и C57BI/6 подвергают воздействию штамма лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением до и после заражения Salmonella enteritidis. Мышей подвергают эвтаназии и вскрывают через 6 (C57BI/6) или 10 (С3Н/HeN) дней после инфицирования, и выявляют жизнеспособные сальмонеллы в соматических тканях (например, кишечном лимфатическом узле, печени и селезенке), в кишечнике (например, слепой кишке, ободочной кишке) и в фекалиях по сравнению с соответствующими контролями. In vivo активность штамма лактобактерий по настоящему изобретению можно также определить с помощью определения уровня миелопероксидазы [МРО], маркера для нейтрофилов, в кишечнике мышей С3Н/HeN, подвергнутых воздействию сальмонелл или сальмонелл плюс LAB. МРО в кишечнике сильно увеличивается при инфицировании сальмонеллами, вследствие накопления нейтрофилов в кишечнике - части ответной реакции хозяина на инфицирование. Совоздействие штамма лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением уменьшает активность МРО в кишечнике инфицированных сальмонеллами мышей, что указывает на то, что воспалительные реакции в кишечнике на инфицирование являются уменьшенными у этих животных, относительно контрольных экспериментов.
2
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм лактобактерий характеризуется способностью к подавлению в клетках IPEC воспаления, вызванного 12-O-тетрадекабоилфорбол-13-ацетатом (РМА). Применительно к настоящему изобретению это относится к способности штамма лактобактерий к блокированию экспрессии гена интерферона-8 (IL-8), инициируемой РМА. Конкретнее, это можно определить посредством измерения подавления в клетках IPEC-J2 воспаления, вызываемого РМА при инкубации в течение 2 часов при 37°С, 5% СО, 95% влажности. После выделения РНК и обратной транскрипции, ПЦР в режиме реального времени выполняют в системе 7500 Fast Realtime PCR, управляемой с помощью программного обеспечения 7500 Fast System ν 1.4.0 Sequence Detection Software версии 1.4 (Applied Biosystem), используя праймеры для свиного IL-8 и TNF-α (приготовленные Sigma Aldrich). Реакционная смесь представляет собой: 10 мкл смеси Power Sybergreen Master, 2,5 мкл прямого праймера, 2,5 мкл обратного праймера и 5 мкл кДНК. ПЦР в режиме реального времени затем выполняют в соответствии с протоколом Standard 7500 (95°С, 10 мин, 1 цикл. 95°С, 15 сек, 40 циклов. 60°С, 1 мин, 40 циклов. 95°С, 15 сек, 1 цикл. 60°С, 1 мин, 1 цикл. 95°С, 15 сек, 1 цикл. 60°С, 5 сек, 1 цикл). Экспрессию генов IL-8 и TNF-α анализируют и сравнивают с таковой гена «домашнего хозяйства» - β-актина. Для сравнения, значения определяются в виде отношения IL-8 и TNF-α к β-актину или кратного изменения. Дополнительные подробности в отношении этого анализа изложены в сопроводительных примерах.
2
2
8
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм лактобактерий характеризуется способностью к блокированию прикрепления к клеткам IPEC S. enteritidis или проникновения в них S. enteritidis. Это можно определить с помощью анализа, изложенного в сопроводительных примерах. Конкретно, монослои клеток IPEC-J2 формируют за 3 дня после достижения конфлюентности в 24-луночных планшетах и синхронизируют добавлением среды DTS за 24 часа до использования. Ночные культуры свиных LAB (10 мл) подвергают центрифугированию, и бактерии ресуспендируют в забуференном фосфатом солевом растворе [PBS]. В лунки добавляют аликвоту (50 мкл) LAB. Планшеты инкубируют в течение 2 часов при 37°С, 5% CO, 95% влажности. Ночную культуру Salmonella entérica серовара Enteritidis S1400 [S. enteritidis S1400] подвергают субкультивированию (0,5 мл в 10 мл) в среде Лурия Бертани (LB) и инкубируют в аэробных условиях в течение 2-3 часов при 37°С до достижения ею оптической плотности (560 нм), равной 0,8 (концентрации, эквивалентной 1×10 CFU/мл). Культуру подвергают центрифугированию, и бактерии ресуспендируют в PBS. Аликвоту (50 мкл) добавляют в лунки с клетками IPEC-J2. Планшеты инкубируют в течение еще 2 часов при 37°С, 5% CO, 95% влажности. Монослои клеток IPEC-J2 промывают HBSS. В каждую лунку добавляют раствор (0,5 мл) PBS, содержащего Triton-X100 (10 мл/литр), монослои соскабливают и диспергируют. Оценку жизнеспособных сальмонелл осуществляют на чашках с агаром XLD (подвергнутых инкубированию в течение 24 часов при 37°С) с помощью способа Майлса и Мисра. Лактобактерий определяют с помощью той же процедуры (инкубируют в аэробных условиях в течение 48 часов при 37°С).
Предпочтительно, когда в связи с адгезий/проникновением к(в) клеткам(и) IPEC S. enteritidis штамм лактобактерий по настоящему изобретению демонстрирует 0-20% ингибирования адгезии/проникновения, более предпочтительно 20-4 0%, даже более предпочтительно 40-60%, еще более предпочтительно 60-80%, даже еще предпочтительнее 80-100% ингибирования адгезии/проникновения, как определено с помощью изложенного выше анализа.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм лактобактерий характеризуется способностью к блокированию прикрепления к клеткам IPEC Е. coli или проникновения в них Е. coli. Это можно определить с помощью анализа, схожего с таковым, который описан выше для S. enteritidis, и изложенного в сопроводительных примерах.
Предпочтительно, когда в связи с адгезий/проникновением к(в) клеткам(и) IPEC Е. coli K88 штамм лактобактерий по настоящему изобретению демонстрирует 0-20% ингибирования адгезии/проникновения, более предпочтительно 20-40%, даже более предпочтительно 40-60%, еще более предпочтительно 60-80%, даже еще предпочтительнее 80-100% ингибирования адгезии/проникновения, как определено с помощью изложенного выше анализа.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм лактобактерий характеризуется отсутствием устойчивости к одному или более антибиотиков, выбираемых из следующих: ампициллина; цефотаксима; хлорамфеникола; эритромицина; гентамицина; тетрациклина; ванкомицина; метронизадола; налидиксовой кислоты и канамицина. Применительно к настоящему изобретению устойчивость к антибиотикам можно определить посредством определения эффекта содержащих различные антибиотики дисков на культуру штамма лактобактерий в чашках с агаром MRS, после помещения в анаэростат и инкубирования в течение 24 часов при 37°С. Дополнительные подробности в отношении этого анализа изложены в сопроводительных примерах. Конкретнее, свиные LAB [0,5 мл разведения 1:100 ночной культуры] распределяют по поверхности чашки с агаром MRS и высушивают. Чашки разделяют на 4 сектора, и в каждом секторе размещают диски, содержащие антибиотики [Ампициллин, 10 мкг. Цефотаксим, 30 мкг. Хлорамфеникол, 10 мкг. Эритромицин, 15 мкг. Гентамицин, 10 мкг. Канамицин, 30 мкг. Метронизадол, 50 мкг.Налидиксовая кислота, 30 мкг. Тетрациклин, 30 мкг. Ванкомицин, 30 мкг]. Чашки закрывают крышкой, помещают в анаэростат и инкубируют в течение 24 часов при 37°С. Чашки фотографируют, используя цифровой фотоаппарат. Изображения переносят в Photoshop, и определяют диаметр зоны ингибирования, используя инструментальное средство для измерения. Для каждого антибиотика запретную зону для исследуемого штамма измеряют и делят на максимальную запретную зону, полученную для этого антибиотика.
Предпочтительно, когда LAB по настоящему изобретению характеризуются отсутствием устойчивости к антибиотикам: ампициллину; цефотаксиму; хлорамфениколу; эритромицину; гентамицину; тетрациклину; ванкомицину; метронизадолу; налидиксовой кислоте и канамицину. Более предпочтительно, когда LAB по настоящему изобретению характеризуются отсутствием устойчивости к антибиотикам: ампициллину; цефотаксиму; хлорамфениколу; эритромицину; гентамицину; тетрациклину и ванкомицину.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штамм лактобактерий характеризуется способностью к демонстрации термостабильности при подвергании воздействию трех циклов нагревания, при этом каждый цикл включает нагревание при температуре, равной 70°С, в течение периода времени, составляющего 15 минут. Дополнительные подробности в отношении исследований термостабильности изложены в сопроводительных примерах. Конкретнее, в связи с настоящим изобретением термостабильность определяют посредством центрифугирования ночной культуры (10 мл) выделенных свиных LAB и ресуспендирования осадка в свежем бульоне MRS (10 мл). Аликвоту (1 мл) нагревают при 70°С в течение 15 мин, а затем высевают (0,5 мл) на агар MRS и инкубируют в анаэростате в течение 48 часов при 37°С. Небольшое число колоний обнаруживают, отбирают, засевают в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубируют в течение 48 часов при 37°С. Эту культуру подвергают центрифугированию, ресуспендируют в бульоне MRS, снова нагревают при 70°С в течение 15 мин, высевают на агар MRS, инкубируют в анаэростате в течение 48 часов при 37°С, колонии отбирают, засевают в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубируют в течение 4 8 часов при 37°С. Эту культуру подвергают центрифугированию, ресуспендируют в бульоне MRS, снова нагревают при 70°С в течение 5 мин, высевают (0,5 мл) на агар MRS, инкубируют в анаэростате в течение 48 часов при 37°С, колонии отбирают, засевают в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубируют в течение 48 часов при 37°С.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий обладает любыми двумя из характеристических свойств, выбираемыми из группы, состоящей из (i), (il), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii), описанной выше.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий обладает любыми тремя из характеристических свойств, выбираемыми из группы, состоящей из (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii), описанной выше.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий обладает любыми четырьмя из характеристических свойств, выбираемыми из группы, состоящей из (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii), описанной выше.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий обладает любыми пятью из характеристических свойств, выбираемыми из группы, состоящей из (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii), описанной выше.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий обладает любыми шестью из характеристических свойств, выбираемыми из группы, состоящей из (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii), описанной выше.
В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий обладает всеми семью характеристическими свойствами (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii), описанными выше.
В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, (A), штамм лактобактерий характеризуется свойствами (i) и (ii), описанными выше.
В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, (B), штамм лактобактерий характеризуется свойствами (iv) и (v), описанными выше.
В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, (С), штамм лактобактерий характеризуется свойствами (iv) и (v), описанными выше.
В одном особенно предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий характеризуется свойствами, названными (D)-(G), указанными ниже:
(D) (i) и (iv); или (Ε) (i) и (v); или
(F) (ii) и (iv); или
(G) (ii) и (v).
Более предпочтительно, когда штамм лактобактерий, кроме того, характеризуется свойством (vi) помимо тех свойств, которые перечислены в любом из вариантов осуществления (A)-(G), изложенных ниже.
Даже более предпочтительно, когда штамм лактобактерий, кроме того, характеризуется свойством (iii) помимо тех свойств, которые перечислены в любом из вариантов осуществления (А)-(G), изложенных ниже.
Даже еще предпочтительнее, когда штамм лактобактерий, кроме того, характеризуется свойством (vii) помимо тех свойств, которые перечислены в любом из вариантов осуществления (А)-(G), изложенных ниже.
Депонирования биологических материалов
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к штамму лактобактерий, выделенному из фекалий выращиваемых на органических кормах свиней и выбираемому из группы, состоящей из штаммов, депонированных 2 7 июня 2011 по условиям Будапештского соглашения в Национальные коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) в NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Великобритания, AB21 9YA, под следующими идентификационными номерами:
NCIMB 41846: Lactobacillus reuteri GGDK31;
NCIMB 41847: Lactobacillus plantarum/pentosus/paraplantarum GGDK161;
NCIMB 41848: Lactobacillus johnsonii/taiwanensis/acidophilus/gasseri GGDK255;
NCIMB 41849: Lactobacillus plantarum/pentosus/helveti cus/paraplanta rum GGDK2 58;
NCIMB 41850; Lactobacillus johnsonii GGDK266.
Вышеуказанные депонирования NCIMB 41846, NCIMB 41847, NCIMB 41848, NCIMB 41849 и NCIMB 41850 были сделаны Dr George Grant из Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Greenburn Road, Aberdeen, AB21 9SB от имени заявителя, GT Biologies Limited.
Последующие исследования, проведенные заявителем, показали, что штамм, депонированный как NCIMB 41847, представляет собой смесь Lactobacillus paraplantarum и Lactobacillus reuteri. Последующие исследования, проведенные заявителем, показали, что штамм, депонированный как NCIMB 41850, представляет собой смесь Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus reuteri. Последующие исследования, проведенные заявителем, показали, что штамм, депонированный как NCIMB 41848, представляет собой Lactobacillus reuteri. Впоследствии были депонированы штаммы, выделенные ради соответствующих компонентов штаммов NCIMB 41847 и NCIMB 41850 (см. ниже).
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к штамму лактобактерий, выделенному из фекалий выращиваемых на органических кормах свиней и выбираемому из группы, состоящей из штаммов, депонированных 12 июля 2012 по условиям Будапештского соглашения в Национальные коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) в NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, UK, AB21 9YA, под следующими идентификационными номерами:
NCIMB 42008 Lactobacillus johnsonii;
NCIMB 42009 Lactobacillus reuteri;
NCIMB 42010 Lactobacillus plantarum;
NCIMB 42011 Lactobacillus reuteri;
NCIMB 42012 Lactobacillus reuteri.
Вышеуказанные депонирования NCIMB 42008, NCIMB 42009, NCIMB 42010 и NCIMB 42011, и NCIMB 42012, были сделаны профессором Denise Kelly из GT Biologies Limited, с/о Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen, Foresterhill, Aberdeen, Aberdeensshire, AB25 2ZD, Великобритания, от имени заявителя, GT Biologies Limited.
Настоящим изобретением также охватываются мутантные штаммы, которые можно получить исходя из указанных штаммов, и штаммы, демонстрирующие составляющую по крайней мере 70% гомологию между ДНК-ДНК и/или составляющую по крайней мере 99,5% идентичность по 16S РНК со штаммом, выбираемым из тех, которые были депонированы под вышеуказанными идентификационными номерами.
Используемый здесь термин «идентичность по 16S рРНК» относится к проценту идентичности с известным бактериальным штаммом. В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий идентичен по 16S рРНК на по крайней мере 85% или по крайней мере 90%, или по крайней мере 95, 96, 97, 98 или 99% со штаммом, выбираемым из тех, которые были депонированы под вышеуказанными идентификационными номерами. В одном очень предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий идентичен по 16S рРНК на по крайней мере 99,5% со штаммом, выбираемым из тех, которые были депонированы под вышеуказанными идентификационными номерами.
В контексте настоящего изобретения термин «гомология между ДНК-ДНК» относится к тому, насколько близкородственными друг к другу являются две или более отдельных цепей ДНК, на основе их нуклеотидной последовательности. Типично это определяют в виде % идентичности. В одном предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий характеризуется ДНК-ДНК гомологией, составляющей по крайней мере 70%, со штаммом, выбираемым из тех, которые были депонированы под вышеуказанными идентификационными номерами, более предпочтительно гомологией, составляющей по крайней мере 80% или по крайней мере 85%, еще более предпочтительно по крайней мере 90, 95, 97, 98 или 99%, со штаммом, выбираемым из тех, которые были депонированы под вышеуказанными идентификационными номерами.
В одном очень предпочтительном варианте осуществления штамм лактобактерий характеризуется ДНК-ДНК гомологией, составляющей по крайней мере по крайней мере 70%, и идентичностью по 16S рРНК, составляющей по крайней мере 99,5%, со штаммом, выбираемым из тех, которые были депонированы под вышеуказанными идентификационными номерами.
Композиции
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции, включающей один или более штаммов лактобактерий, описанных выше, и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель. Подходящие наполнители, разбавители, носители описаны ниже.
Композицией может быть любая композиция, но предпочтительно она является композицией, которую вводятся перорально, энтерально или ректально. Например, композицией может быть съедобная композиция. «Съедобный» означает материал, который санкционирован для потребления людьми или животными.
Другой аспект настоящего изобретения относится к пробиотической композиции, включающей штамм лактобактерий, описанный выше.
Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации из двух или более штаммов лактобактерий, описанных здесь. В особенно предпочтительном варианте осуществления такие комбинации проявляют синергетическую функциональность, например, комбинация является синергетической, т.е. результирующий эффект превышает простые аддитивные эффекты, относимые за счет отдельных, являющихся лактобактериями компонентов в комбинации.
Один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к комбинации из двух, трех, четырех или пяти различных лактобактерий, более предпочтительно двух, трех или четырех различных лактобактерий, более предпочтительно двух или трех различных лактобактерий. Если настоящее изобретение относится к комбинации из более чем одного штамма лактобактерий, отдельные компоненты комбинации могут присутствовать в любом соотношении.
Еще более предпочтительно, когда настоящее изобретение относится к комбинации из двух различных лактобактерий. Предпочтительно, когда две различные лактобактерий присутствуют в весовом соотношении от 1/99,9 до 99,9/1, например, от 1/99 до 99/1 или от 10/90 до 90/10, или от 20/80 до 80/20, или от 30/70 до 70/30 и т.п.
В одном очень предпочтительном варианте осуществления комбинация представляет собой смесь Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus reuteri. Даже более предпочтительно, когда комбинация представляет собой NCIMB 41850: Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus reuteri GGDK266, описанную выше. На удивление, эта конкретная комбинация лактобактерий неожиданно приводит к благотворным in vivo ответным реакциям у рано отлученных от матери поросят (см. раздел «Примеры»).
В другом предпочтительном варианте осуществления комбинация представляет собой смесь Lactobacillus plantarum и Lactobacillus reuteri. Даже более предпочтительно, когда комбинация представляет собой NCIMB 41847: Lactobacillus plantarum/pentosus/paraplantarum и Lactobacillus reuteri GGDK161, описанную выше.
Используемый здесь термин «пробиотик» означает препараты клеток микроорганизмов или компоненты клеток микроорганизмов, обладающие благотворным эффектом на состояние здоровья или благополучие хозяина. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999: 10107-10).
Предпочтительно, когда пробиотическая композиция является перорально вводимой композицией метаболически активных, т.е. живых и/или лиофилизированных, или нежизнеспособных убитых с помощью нагревания бактерий, подвергнутых облучению или лизированных бактерий-пробиотиков. Пробиотическая композиция может содержать другие ингредиенты. Пробиотическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально, т.е. в форме таблетки, капсулы или порошка. Альтернативно, пробиотическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально в виде продукта питания или пищевого продукта, такого как полученный на основе сбраживания молока или сыворотки молочной продукт, или в виде фармацевтического продукта.
3
11
7
10
6
10
6
12
8
10
Подходящая суточная доза бактерий-пробиотиков составляет от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (CFU), более предпочтительно от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 CFU, более предпочтительно от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 CFU. В одном предпочтительном варианте осуществления композиция содержит бактериальные штаммы и/или их клеточные компоненты, в качестве активных ингредиентов, в количестве от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 CFU/r, относительно веса композиции, предпочтительно от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 CFU/r. Дозой может быть доза, равная 1 г, 3 г, 5 г и 10 г, в качестве примера.
Типично пробиотик необязательно объединен с по крайней мере одним подходящим соединением-пребиотиком. Пребиотиком является обычно неперевариваемый углевод, такой как олиго- или полисахарид, или сахароспирт, который не расщепляется или не абсорбируется в верхних отделах пищеварительного тракта. Известные пребиотики включают имеющиеся в продаже продукты, такие как инулин и трансгалактоолигосахариды.
Предпочтительно, когда композиция по настоящему изобретению включает пребиотик в количестве от приблизительно 1 до 30% в весовом отношении, по отношению к общему весу композиции, предпочтительно от 5 до 20% в весовом отношении. Предпочтительные углеводы выбирают из: фруктоолигосахаридов (или FOS), короткоцепочечных фруктоолигосахаридов, инулина, изомальтоолигосахаридов, пектинов, ксилоолигосахаридов (или XOS), хитозан-олигосахаридов (или COS), бета-глюканов, аравийской камеди, модифицированных и устойчивых крахмалов, полидекстрозы, D-тагатозы, волокон акации, рожкового дерева, овса и волокон цитрусовых. Особенно предпочтительными пребиотиками являются короткоцепочечные фруктоолигосахариды (для простоты указанные ниже как FOSs-c.c); указанные FOSs-c.c. представляют собой неперевариваемые глюциды, обычно получаемые при переработке сахарной свеклы и включающие молекулу сахарозы, с которой связаны три молекулы глюкозы.
Приготовление лактобактерий
Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу продуцирования пробиотика, включающему культивирование штамма лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением. Квалифицированный в данной области техники специалист будет осведомлен о стандартных методах и условиях, подходящих для культивирования бактериального штамма в соответствии с настоящим изобретением.
Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления одного или более бактериальных штаммов в соответствии с настоящим изобретением, включающему стадии:
(i) получения фекалий от выращиваемой на органических кормах свиньи;
(ii) замораживания фекалий и диспергирования в подходящем разжижителе;
(iii) нанесения диспергированных фекалий, полученных на стадии (ii), на подходящий агар, необязательно в присутствии дополнительных углеводов молозива свиньи, и (iv) инкубации в анаэробных условиях;
(v) отбора отдельных колоний бактерий, образованных во время стадии (iv), и засева в подходящий бульон, необязательно в присутствии дополнительных углеводов молозива свиньи;
(vi) инкубации засеянных колоний, полученных на стадии (v).
Подходящие агары включают, например, чашки с агаром MRS или LAMVAB. Однако другие подходящие агары могут также использоваться и, вероятно, известны квалифицированному специалисту.
Подходящие бульоны включают, например, бульон MRS. Однако другие подходящие бульоны могут также использоваться и, вероятно, известны квалифицированному специалисту.
Предпочтительно стадия (iii) включает в себя инкубацию агара в течение по крайней мере 72 часов при температуре, составляющей приблизительно 37°С.
Предпочтительно стадия (vi) включает в себя инкубацию засеянных колоний в течение по крайней мере 48 часов при температуре, составляющей приблизительно 37°С.
Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу получения штамма лактобактерий из свиней, включающему получение фекалий от выращиваемой на органических кормах свиньи и выделение одного или более свиных штаммов лактобактерий из указанных фекалий.
Предпочтительно, когда способ включает стадии:
(i) получения фекалий от выращиваемой на органических кормах свиньи;
(ii) замораживания фекалий и диспергирования в подходящем разжижителе;
(iii) нанесения диспергированных фекалий, полученных на стадии (ii), на подходящий агар, необязательно в присутствии дополнительных углеводов молозива свиньи, и (iv) инкубации в анаэробных условиях;
(v) отбора отдельных колоний бактерий, образованных во время стадии (iv), и засева в подходящий бульон, необязательно в присутствии дополнительных углеводов молозива свиньи;
(vi) инкубации засеянных колоний, полученных на стадии (v).
Другой аспект настоящего изобретения относится к свиному штамму лактобактерий, полученному или получаемому с помощью описанного выше способа.
Терапевтические применения
Другой аспект настоящего изобретения относится к одному или более штаммов лактобактерий, определенных выше, для применения в медицине.
Другой аспект настоящего изобретения относится к одному или более штаммов лактобактерий, определенных выше, для применения для лечения кишечного расстройства.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению одного или более штаммов лактобактерий или композиции, которые определены выше, для приготовления лекарственного средства для лечения кишечного расстройства.
Термин «лекарственное средство», как здесь используется, охватывает лекарственные средства для применения и для людей, и для животных в медицине и ветеринарии. Кроме того, термин «лекарственное средство», как здесь используется, означает любое вещество, которое обеспечивает терапевтический и/или благотворный эффект. Термин «лекарственное средство», как здесь используется, необязательно ограничивается веществами, для которых требуется разрешение продажи на рынке страны, а могут включать вещества, которые могут использоваться в косметических средствах, БАД, продуктах питания (в том числе пище и напитках, например), культурах пробиотиков и лекарственных средствах природного происхождения. Кроме того, термин «лекарственное средство», как здесь используется, охватывает продукт, предназначенный для включения в корм для животных, например, корм для домашнего скота и/или корм для любимых домашних животных.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения кишечного расстройства у субъекта, включающему введение субъекту фармацевтически эффективного количества одного или более штаммов лактобактерий или фармацевтической композиции или пробиотической композиции, описанных выше.
Предпочтительно кишечное расстройство выбирают из синдрома разраженного кишечника (IBS), воспалительного расстройства кишечника (IBD), функциональной диспепсии, функционального запора, функциональной диареи (в том числе связанной с приемом антибиотиком диареи, диареи путешественников и диареи у детей), функциональной боли в животе, функционального вздутия, болевого синдрома в эпигастральной области, постпрандиального дистресс-синдрома, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (GERD), аллергий, атопических заболеваний, например, атопического дерматита, некротизирующего энтероколита, других инфекционных заболеваний и их комбинаций.
В одном предпочтительном варианте осуществления кишечным расстройством является IBS. Остается выяснить точную патофизиологию IBS. В недавних исследованиях отмечены воспаление слизистой оболочки и изменения в микробиоте кишечника у пациентов с IBS и корреляция заболевания с кишечными инфекциями.
В одном очень предпочтительном варианте осуществления расстройством является сальмонеллез. Сальмонеллез является заболеванием, вызываемым различными штаммами сальмонелл, которое характеризуется лихорадкой и кишечными расстройствами.
Другой аспект настоящего изобретения относится к одному или более штаммов лактобактерий, определенных выше, для улучшения микробиоты кишечника.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу улучшения микробиоты кишечника у субъекта, включающему введение субъекту композиции, включающей один или более штаммов лактобактерий, или фармацевтической композиции, или пробиотической композиции в соответствии с настоящим изобретением.
Штаммы лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением могут также использоваться для профилактических применений. При профилактических применениях композиции в соответствии с настоящим изобретением вводят пациенту, подверженному, или же подверженному риску развития, конкретного заболевания, в количестве, достаточном для по крайней мере частичного уменьшения риска развития заболевания. Устанавливается, что такое количество является «профилактически эффективной дозой». Точные количества зависят от ряда специфических для пациента факторов, таких как состояние здоровья и вес пациента.
Штаммы лактобактерий и пробиотические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также использоваться при кормлении животных (например, при кормлении свиней), особенно в период после раннего отлучения от матери и в период доращивания и откорма. Пробиотики, как полагают, усиливают функционирование иммунной системы, ослабляют и предупреждают инфекционные заболевания, выгодно изменяют состав микробиоты, и усиливают рост и улучшают характеристики животных, например, благодаря увеличенной эффективности трансформации корма. Термин «животное» включает всех животных, в том числе людей. Примерами животных являются нежвачные и жвачные животные. Жвачные животные включают, например, овцу, козу и крупный рогатый скот, например, корову, такую как убойный скот и молочные коровы. В конкретном варианте осуществления животным является нежвачное, животное. Нежвачные животные включают домашних животных, например, лошадей, кошек и собак; животных с однокамерным желудком, например, свиней (в том числе, но без ограничения, поросят, растущих свиней и свиноматок); домашнюю птицу, такую как индюки, утки и куры (в том числе, но без ограничения, бройлерные цыплята, куры-несушки); рыб (в том числе, но без ограничения, лосось, форель, тилапию, сома и карпа) и ракообразных (в том числе, но без ограничения, креветок и пильчатую креветку).
Кормовые материалы/продукты
Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к продуктам питания, пищевым добавкам, БАДам, молочным смесям для питания, напиткам и лекарственным средствам, содержащим один или более бактериальных штаммов в соответствии с настоящим изобретением.
В одном предпочтительном варианте осуществления композиция включает, кроме того, по крайней мере один другой вид подходящей для пищевых продуктов бактерии, причем подходящую для пищевых продуктов бактерию предпочтительно выбирают из группы, состоящей из лактобактерий, бифидобактерий, пропионибактерий или их смесей.
Один аспект настоящего изобретения относится к продукту питания, включающему один или более штаммов лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением. Термин «продукт питания», как предполагается, охватывает все потребляемые продукты, которые могут быть твердыми, застуденевшими или жидкими. Подходящие продукты питания могут включать, например, функциональные продукты питания, пищевые смеси, корм для домашних животных, корм для домашнего скота, диетические продукты, кормовые материалы и т.п. В одном предпочтительном варианте осуществления продуктом питания является диетический продукт.
Используемый здесь термин «функциональный продукт питания» означает пищевой продукт, который способен обеспечить не только питательный эффект, но также способен обеспечить дополнительный благотворный эффект на потребителя. Соответственно, функциональными пищевыми продуктами являются обычные продукты питания, которые содержат включенные в них компоненты или ингредиенты (такие как те, которые здесь описаны), которые придают продукту питания специфическую функцию - например, терапевтическое и физиологическое преимущество - отличную от исключительно питательного действия.
Примеры конкретных продуктов питания, которые применимы для настоящего изобретения, включают продукты на основе молока, готовые десерты, порошки для восстановления влагосодержания с помощью, например, молока или воды, шоколадно-молочные напитки, солодовые напитки, готовые блюда, быстро приготовляемые блюда или напитки для людей или пищевые смеси, представляющие собой полный или частичный рацион, предназначенные для домашних животных или домашнего скота.
В одном предпочтительном варианте осуществления композицией в соответствии с настоящим изобретением является продукт питания, предназначенный для людей, домашних животных или домашнего скота. Композиция может предназначаться для животных, выбираемых из группы, состоящей из собак, кошек, свиней, крупного рогатого скота, лошадей, коз, овец или домашней птицы. В предпочтительном варианте осуществления композицией является продукт питания, предназначенный для взрослых особей, в частности взрослых людей.
В настоящем изобретение «продукт на основе молока» означает любой жидкий или полутвердый продукт на основе молока или сыворотки с различным содержанием жира. Продуктом на основе молока может быть, например, коровье молоко, козье молоко, овечье молока, снятое молоко, цельное молоко, молоко, рекомбинированное из порошкового молока и сыворотки без какой-либо переработки, или переработанный продукт, такой как йогурт, простокваша, творог, кислое, свернувшееся молоко, кислое, свернувшееся цельное молоко, кефир и другие молочнокислые продукты. Другая важная группа включает молочные напитки, такие как напитки из молочной сыворотки, сквашенное молоко, сгущенное молоко, молоко для грудных детей или детей; молоко с вкусовыми добавками, мороженное; содержащий молоко пищевой продукт, такой как конфеты.
Один аспект настоящего изобретения относится к кормовому материалу или корму для животных, включающему один или более бактериальных штаммов в соответствии с настоящим изобретением.
Кормовым материалом может быть добавка к пищевому продукту, кормовой премикс или корм для животных. Конкретные примеры кормовых материалов в соответствии с настоящим изобретением включают следующие: добавку к корму для животных, включающую (а) свиные лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением, (b) по крайней мере один жирорастворимый витамин, (с) по крайней мере один водорастворимый витамин, (d) по крайней мере один микроэлемент и/или по крайней мере один макроэлемент; кормовую смесь для животных, включающую свиные лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением и корм с содержанием сырого протеина 50-88 г/кг. Так называемые премиксы являются примерами добавок к корму для животных по настоящему изобретению. Премикс обозначает предпочтительно однородную смесь одного или более микроингредиента с разбавителем и/или носителем. Премиксы используются для способствования равномерному диспергированию микроэлементов в большом объеме смеси.
Кроме того, необязательными, добавляемыми к кормам ингредиентами являются красители, например, каротеноиды, такие как бета-каротин, астаксантин и лютеин; ароматические соединения; стабилизаторы; противомикробные пептиды; полиненасыщенные жирные кислоты; формы для образования активного кислорода и/или по крайней мере один фермент, выбираемый из фитазы (ЕС 3.1.3.8 или 3.1.3.2 6); ксиланазы (ЕС 3.2.1.8); галактаназы (ЕС 3.2.1.89); альфа-галактозидазы (ЕС 3.2.1.22); протеазы (ЕС 3.4.), фосфолипазы A1 (ЕС 3.1.1.32); фосфолипазы А2 (ЕС 3.1.1.4); лизофосфолипазы (ЕС 3.1.1.5); фосфолипазы С (ЕС 3.1.4.3); фосфолипазы D (ЕС 3.1.4.4); амилазы, такой как, например, альфа-амилаза (ЕС 3.2.1.1); и/или бета-глюканазы (ЕС 3.2.1.4 или ЕС 3.2.1.6).
Примерами полиненасыщенных жирных кислот являются C18, С20 и С22 полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота, докозагексаноевая кислота, эйкозапентаноевая кислота и гамма-линолевая кислота.
Примерами форм для образования активного кислорода являются такие химические вещества, как перборат, персульфат или перкарбонат; и такие ферменты, как оксидаза, оксигеназа или синтетаза.
Обычно жиро- и водорастворимые витамины, а также микроэлементы образуют часть так называемого премикса, предназначенного для добавления к корму, тогда как макроэлементы добавляют к корму обычно отдельно. Тот или другой из этих типов композиций, после обогащения лактобактериями из свиней в соответствии с настоящим изобретением, является добавкой к корму для животных в пределах объема настоящего изобретения.
Не исчерпывающими перечнями примеров этих соединений являются следующие перечни. Примерами жирорастворимых витаминов являются витамин А, витамин D3, витамин Ε и витамин K, например, витамин K3. Примерами водорастворимых витаминов являются витамин В12, биотин и холин, витамин В1, витамин В2, витамин В6, ниацин, фолиевая кислота и пантотенат, например, Ca-D-пантотенат. Примерами микроэлементов являются марганец, цинк, железо, медь, иод, селен и кобальт. Примерами макроэлементов являются кальций, фосфор и натрий.
Нормы содержания в пище этих соединений (примеры которых приведены в случае домашней птицы и поросят/свиней) приведены в таблице A WO 01/58275. Норма содержания в пище означает, что эти компоненты должны быть обеспечены в рационе в указанных концентрациях. В качестве альтернативы, добавка к корму для животных по настоящему изобретению включает по крайней мере один из отдельных компонентов, определенных в таблице A WO 01/58275. По крайней мере один означает то или другое: один или более, один или два, или три, или четыре и так далее вплоть до всех тринадцати, или вплоть до всех пятнадцати отдельных компонентов. Конкретнее, этот по крайней мере один отдельный компонент включен в добавку по настоящему изобретению в таком количестве, которое дает концентрацию в корме в пределах диапазона, указанного столбце четыре или столбце пять, или столбце шесть таблицы A WO 01/58275.
Кормовые смеси для животных или корма для них типично характеризуются относительно высоким содержанием белка. Корма для домашней птицы и свиней можно охарактеризовать, как указано в таблице В WO 01/58275, столбцах 2-3. Корма для рыб можно охарактеризовать, как указано в столбце 4 этой таблицы В. Кроме того, такие корма для рыб обычно характеризуются содержанием сырого жира, составляющим 200-310 г/кг. WO 01/58275 соответствует US 09/77 9334, который включен таким образом посредством ссылки.
Кормовая смесь для животных в соответствии с настоящим изобретением типично характеризуется содержанием сырого протеина, составляющим 50-800 г/кг, и, кроме того, включает лактобактерии из свиней в соответствии с настоящим изобретением, описанные и/или заявленные здесь.
Кроме того, или в качестве альтернативы (содержанию сырого протеина, указанному выше), кормовая смесь для животных по настоящему изобретению может характеризоваться содержанием метаболизируемой энергии, составляющим 10-30 мДж/кг; и/или содержанием кальция, составляющим 0,1-200 г/кг; и/или содержанием доступного фосфора, составляющим 0,1-200 г/кг; и/или содержанием метионина, составляющим 0,1-100 г/кг; и/или содержанием метионина плюс цистеин, составляющим 0,1-150 г/кг; и/или содержанием лизина, составляющим 0,5-50 г/кг.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления содержание метаболизируемой энергии, сырого протеина, кальция, фосфора, метионина, метионина плюс цистеин и/или лизина находится в пределах любого из диапазонов 2, 3, 4 или 5 в таблице В WO 01/58275 (R. 2-5). Сырой протеин рассчитывают как азот (Ν), умноженный на коэффициент 6,25, т.е. сырой протеин (г/кг)=N (г/кг) ×6,25. Содержание азота определяют с помощью метода Кьельдаля (А.О.А.С, 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC). Метаболизируемую энергию можно рассчитать на основе потребностей в пище у свиньи в публикации NRC (Комитета по исследованию питания), девятое переработанное издание 1988, Подкомитет по питанию свиней, Комитет по питанию животных, Министерство сельского хозяйства, Национальный научно-исследовательский совет, National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, и Европейской таблицы энергетической ценности кормовых материалов для домашней птицы, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.
Содержание кальция, доступного фосфора и аминокислот в полном рационе животных рассчитывают на основе таблиц кормов, таких как Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
В одном предпочтительном варианте осуществления кормовая смесь для животных по настоящему изобретению содержит по крайней мере один растительный белок или источник белка. Она может также содержать белок животного происхождения, такой как мясокостная мука и/или рыбная мука, типично в количестве, составляющей 0-25%. Используемый здесь термин «растительные белки» относится к любому соединению, композиции, препарату или смеси, которое(ая) включает по крайней мере один белок, происходящий из растения, включая модифицированные белки и производные белков. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления содержание растительных белков составляет по крайней мере 10, 20, 30, 40, 50 или 60% (в весовом отношении).
Растительные белки могут происходить из источников растительных белков, таких как растения из семейства бобовые и зерновые, например, материалов растений семейств Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae и Poaceae, таких как соевая мука, люпиновая мука и мука из семян рапса. В конкретном варианте осуществления источником растительного белка является материал одного или более растений семейства Fabaceae, например, сои, люпина, гороха или бобов. Другими примерами источников растительных белков являются семена рапса, семена подсолнечника, семена хлопчатника и капуста. Другими примерами источников растительных белков являются зерновые, такие как ячмень, пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, тритикале и сорго.
Корма для животных можно, например, изготовить в виде мешанки (не гранулированной) или гранулированного корма. Типично измельченные кормовые материалы смешивают, и добавляют достаточные количества незаменимых витаминов и элементов в соответствии со спецификациями для соответствующего вида. Лактобактерий из свиней в соответствии с настоящим изобретением могут добавляться в виде твердых или жидких препаратов.
Композиции по настоящему изобретению могут представлять собой добавки к продукту питания, также называемые здесь пищевыми добавками или добавками к пищевому продукту, или могут добавляться к ним. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к пищевой добавке или добавке к пищевому продукту, включающей один или более бактериальных штаммов в соответствии с настоящим изобретением.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению описанного выше кормового материала для улучшения характеристик роста животных, определяемых по ежедневному приросту массы и/или коэффициенту трансформации корма.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам применения кормового материала, включающего одну или более лактобактерий из свиней в соответствии с настоящим изобретением, в корме для животных для увеличения ежедневного прироста массы, уменьшения коэффициента трансформации корма (FCR) и/или для модуляции микрофлоры пищеварительного тракта.
В альтернативных предпочтительных вариантах осуществления кормовой материал, включающий одну или более лактобактерий из свиней в соответствии с настоящим изобретением, улучшает усвояемость пищи животными и/или поддерживает здоровое состояние животных, способствуя надлежащему пищеварению и/или поддерживая функционирование иммунной системы.
FCR можно определить на основе исследования роста поросят, включающего первое воздействие, при котором кормовой материал, включающий лактобактерий из свиней в соответствии с настоящим изобретением, добавляют к корму для животных в соответствующей концентрации на кг корма, и второе воздействие (контрольное) без добавления лактобактерий из свиней в соответствии с настоящим изобретением к корму для животных. В контексте настоящего изобретения термин «коэффициент трансформации корма», или FCR, и термин «трансформация корма» используют как синонимы. FCR рассчитывают как потребление корма в г/животное к приросту массы в г/животное. Как это общеизвестно, улучшенный FCR ниже контрольного FCR. В конкретных вариантах осуществления FCR улучшается (т.е. уменьшается) по сравнению с контрольным на по крайней мере 1,0%, предпочтительно на по крайней мере 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4% или на по крайней мере 2,5%.
Используемый здесь термин «пищеварительный тракт» обозначает желудочно-кишечный или пищеварительный тракт (также называемый пищеварительным трактом), и он относится к системе органов у многоклеточных животных, которая поглощают пищу, переваривает ее для извлечения энергии и питательных веществ и удаляет остающиеся отходы.
Используемый здесь термин «микрофлора» пищеварительного тракта относится к природным культурам микроорганизмов, находящимся в пищеварительном тракте и поддерживающим здоровое состояние посредством способствования надлежащему пищеварению и/или поддержания функционирования иммунной системы.
Используемый здесь термин «модулировать» в связи с микрофлорой пищеварительного тракта обычно означает изменять, манипулировать, вносить изменения или регулировать ее функцию или состояние у здорового и нормально функционирующего животного, т.е. нетерапевтическое применение.
Разбавители, наполнители и носители
Как отмечено выше, настоящее изобретение также относится к композициям, более предпочтительно фармацевтическим композициям, включающим штамм лактобактерий в соответствии с настоящим изобретением. Штаммы лактобактерий по настоящему изобретению, как правило, вводят в смеси с фармацевтическим носителем, наполнителем или разбавителем, в частности, для лечения людей. Фармацевтические композиции могут предназначаться для применения для людей или животных в медицине и ветеринарии.
nd
Примеры таких наполнителей, подходящих для различных форм фармацевтических композиций, описываемых здесь, можно найти в "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2 Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller.
Приемлемые для терапевтического применения носители или разбавители хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985).
Примеры подходящих носителей включают лактозу, крахмал, глюкозу, метилцеллюлозу, стеарат магния, маннит, сорбит и т.п. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.
Выбор фармацевтического носителя, наполнителя или разбавителя можно сделать, принимая во внимание намеченный путь введения и стандартную фармацевтическую практику. Фармацевтические композиции могут включать в качестве носителя, наполнителя или разбавителя, или помимо них, любой подходящий буфер(ы), смазывающее вещество(а), суспендирующий агент(ы), вещество(а) для покрытия, солюбилизатор(ы).
Примеры подходящих связующих веществ включают крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза, безводная лактоза, сыпучая лактоза, бета-лактоза, сахаристые вещества из кукурузы, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу и полиэтиленгликоль.
Примеры подходящих смазывающих веществ включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п.
Консерванты, стабилизаторы, красители и даже корригенты могут быть предусмотрены в фармацевтической композиции. Примеры консервантов включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и эфиры пара-гидроксибензойной кислоты. Могут также использоваться антиоксиданты и суспендирующие агенты.
Введение
Композиции по настоящему изобретению можно адаптировать для перорального, ректального, вагинального, парентерального, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутриартериального, подоболочечного, внутрибронхиального, подкожного, внутрикожного, внутривенного, назального, трансбуккального или подъязычного путей введения. Предпочтительно, когда композиции по настоящему изобретению адаптированы для перорального, ректального, вагинального, парентерального, назального, трансбуккального или подъязычного путей введения.
В случае перорального введения под конкретным применением понимают прессованные таблетки, пилюли, таблетки, желатиновые капсулы, капли и капсулы.
Другие формы введения включают растворы или эмульсии, которые можно вводить внутривенно, внутриартериально, подоболочечно, подкожно, внутрикожно, внутрибрюшинно или внутримышечно, и которые готовят из стерильных или стерилизуемых растворов. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также быть в форме суппозиториев, вагинальных суппозиториев, суспензий, эмульсий, лосьонов, мазей кремов, гелей, аэрозолей, растворов или присыпок.
Альтернативный способ чрескожного введения осуществляют, используя трансдермальный пластырь. Например, активный ингредиент может быть включен в крем, состоящий из водной эмульсии полиэтиленгликолей или жидкого парафина. Штамм лактобактерий может также быть включен в мазь, состоящую из основы в виде белого воска или белого мягкого парафина вместе с такими стабилизаторами и консервантами, которые могут потребоваться.
Композиции могут быть приготовлены в стандартной лекарственной форме, т.е. в форме дискретных частей, содержащих стандартную дозу, или их множество, или субъединицу стандартной дозы.
Доза
Специалист со средним уровнем квалификации в данной области техники может без труда определить соответствующую дозу одной из композиций по настоящему изобретению для введения субъекту без чрезмерного экспериментирования. Типично врач определит фактическую дозу, которая будет наиболее подходящей для отдельного пациента, и она будет зависеть от ряда факторов, включающих активность конкретного используемого бактериального штамма, метаболической стабильности и продолжительности действия этого штамма, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, рациона, способа и времени введения, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств, тяжести конкретного состояния и подвергания индивидуума терапии. Раскрытые здесь дозы являются примерами среднего случая. Конечно, могут быть отдельные случая, когда диапазоны более высоких или более низких доз являются преимущественными, и они находятся в пределах объема этого изобретения.
3
11
7
11
6
10
Обычная эффективная суточная доза для людей или животных составляет от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10, более предпочтительно от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10, даже более предпочтительно от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 CFU.
Комбинации
В одном предпочтительном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению вводят в любой комбинации, например, две или более лактобактерий могут быть введены в любой комбинации или соотношении.
В другом, особенно предпочтительном, варианте осуществления композиции по настоящему изобретению вводят в комбинации с одним или более других активных агентов. В таких случаях композиции по настоящему изобретению могут вводиться друг за другом, одновременно или последовательно с одним или более других активных агентов.
Изоляция и характеристика бактериальных штаммов
Штаммы LAB, выделенные (всего из 4 36 отборов отдельных колоний) из фекалий, выращиваемых на органических кормах свиней, были, главным образом, штаммами L. reuteri, L. johnsonii, L. gasseri, L. pentosus, с небольшим числом L. plantarum, L. acidophilus, L. vaginalis, одним L. mucosae и несколькими некультивируемыми штаммами.
Большинство LAB продуцировали вещества, которые могли ингибировать рост S. enteritidis и/или Е. coli K88 in vitro. Сила этих противопатогенных эффектов весьма варьировала между отдельными бактериальными штаммами.
Некоторые штаммы были отобраны на основе противомикробной активности, определяемой in vitro. Эти бактерии были в дальнейшем подвергнуты скринингу на предмет их способности к блокированию адгезии к клеткам кишечного эпителия свиньи (IPEC) патогенов/проникновения в них патогенов in vitro и их чувствительности к антибиотикам.
Некоторые штаммы были исследованы в отношении диапазона субстратов и субстратной специфичности и их способности к подавлению воспаления в клетках IPEC in vitro. Исходя из них, были идентифицированы четырнадцать LAB (5 L. johnsonii, 6 L. reuteri и 3 L. plantarum) с подходящими свойствами. Два из этих штаммов [GGDK266 и GGDK31] были приготовлены в большом количестве для in vivo оценки на недавно отлученных от матери поросятах. Другие потенциально важные кандидаты находились в этом ряду из 14 LAB.
Небольшие уменьшения жизнеспособности были очевидны при лиофилизации и хранении LAB, высушенных в сухом обезжиренном молоке. Комбинация сухого обезжиренного молока и моносахаридов была немного более эффективной, но трудно сохраняемой. Крупноразмерные препараты GGDK2 66 и GGDK31 были подвергнуты лиофилизации и хранились в этой среде.
Было получено пять кондиционированных с использованием термообработки культур LAB. Однако термообработка оказывала неблагоприятное влияние на биологические свойства in vitro и пробиотический потенциал трех их этих штаммов. Однако у двух из этих бактерий сохранялись биологические свойства природных, не подвергнутых термообработке форм.
Подвергание с помощью перорального введения мышей воздействию свиных LAB (L. reuteri или L. mucosae) значительно уменьшало патогенность S. enteritidis при острой (в случае мыши C57BI/6) и хронической (в случае мыши С3Н/HeN) формах сальмонеллеза.
Данные указывают на то, что LAB из выращиваемых на органических кормах свиней обладают значительным потенциалом в качестве источника новых и сильных пробиотиков.
Исследования, проведенные заявителем, включали в себя изоляцию большого числа LAB от выращиваемых на органических кормах свиней и скрининг на предмет штаммов LAB - сильных пробиотиков посредством оценки их биологической активности и механизма действия как in vitro, так и in vivo.
Конкретнее, были выполнены эксперименты для установления культур LAB, происходящих из фекалий выращиваемых на органических кормах свиней. Штаммы LAB скринировали на предмет противомикробной активности, направленной против ряда патогенов, in vitro. Были выполнены эксперименты для определения того, могут ли штаммы LAB блокировать прикрепление патогенов к свиным эпителиальным клеткам in vitro. Также были выполнены исследования для оценки способности LAB к блокированию воспалительных реакций в свиных эпителиальных клетках in vitro. Штаммы, демонстрирующие хороший профиль биоактивности in vitro, были отобраны и подвергнуты культивированию в большом количестве для высокомасштабного исследования in vivo.
Дополнительные подробности в отношении экспериментальных методов описаны в сопроводительном разделе «Примеры». Вкратце, штаммы LAB выделяли из фекалий свиней и культивировали, используя селективные микробиологические среды. Отдельные бактериальные колонии выделяли, и исследовали последовательности гена 16S рРНК для обеспечения генотипической идентификации бактериальных штаммов. После определения адгезии, антибактериальной и противовоспалительной активностей, устойчивости к антибиотикам и, наконец, термостабильности, кроме того, определяли фенотипическую характеристику потенциальных пробиотиков. Антибактериальную активность кондиционированных LAB сред оценивали, используя анализы диффузии из лунки, для определения эффективности уничтожения кишечных патогенов Salmonella enteritidis и Ε. coli K88. Также оценивали способность штаммов LAB к блокированию или препятствованию адгезии к свиным эпителиальным клеткам (IPEC)/проникновения в них S. enteritidis и Ε. coli K88, как и их способность к подавлению воспаления, вызванного 12-O-тетрадекабоилфорбол-13-ацетатом [РМА], в клетках IPEC [РМА]. Кроме того, в дальнейшем определяли метаболические свойства штаммов LAB (с использованием набора API СН 50) и их чувствительность к антибиотикам. Система ранжирования, основанная на количественной оценке биологических свойств LAB, была установлена и использовалась для отбора штаммов LAB-кандидатов для оценки в качестве пробиотиков in vivo.
Дополнительные подробности в отношении результатов вышеизложенных выше экспериментов описаны в сопроводительных примерах.
LAB (436 отборов отдельных колоний), выделенные из фекалий выращиваемых на органических кормах свиней, были, главным образом, L. johnsonii или родственными L. johnsonii штаммами и L. reuteri или родственными L. reuteri штаммами, с небольшим числом родственных L. plantarum штаммов и некультивируемых штаммов. Это представляло собой намного более узкий диапазон связанных со свиньями LAB, чем тот, о котором сообщали другие (Martin et al, 2009; Yun et al, 2009; Lahteinen et al, 2010; Yao et al, 2011). Однако по сравнению с традиционно/интенсивно выращиваемыми свиньями свиньи, выращиваемые на открытом воздухе, на органических кормах, имели высокие уровни LAB и функционирование более развитой иммунной системы кишечника (Mulder et al, 2009). Данные, касающиеся бактерий по настоящему изобретению, указывают на то, что штаммы L. johnsonii и L. reuteri особенно важны для надлежащего развития пищеварительного тракта и иммунной системы у молодых свиней. Кроме того, добавление других лактобактерий, происходящих из пищеварительного тракта или фекалий выращиваемых на органических кормах свиней, в частности, Lactobacillus delbrueckii и Lactobacillus amylovorous, может усилить иммуногомеостатические свойства Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum и Lactobacillus johnsonii.
Все выделенные свиные LAB продуцировали вещества, которые могли убивать или предотвращать рост S. enteritidis в анализе диффузии из лунки, и большая их часть уничтожала или подавляла рост Е. coli K88. Сила противомикробных активностей весьма варьировала между отдельными колониями, независимо от того, были ли они L. reuteri, L. johnsonii или L. plantarum. Не было общей корреляции между активностями, направленными против сальмонелл и E. coli K88, каждой из LAB. Известно, что LAB продуцируют ряд активных факторов, в том числе органические кислоты, небольшие противомикробные соединения и антибактериальные пептиды (Cintas et al, 2001). Природа этих противомикробных веществ, продуцируемых LAB от выращиваемых на органических кормах свиней, не была установлена.
Тридцать три свиных штамма LAB, отобранных на основе противопатогенной активности, были проверены в отношений способности к блокированию прикрепления к клеткам IPEC/проникновения в них S. enteritidis и Е. coli K88. Все они были способны к значительному уменьшению прикрепления к клеткам IPEC/проникновения в них сальмонелл. Большинство могло также блокировать Е. coli K88. Как в случае уничтожения патогенов, не было общей корреляции между способностями LAB к блокированию сальмонелл и E. coli K88. Без желания ограничиться какой-либо теорией, полагают, что LAB могут ограничивать доступ патогенов к эпителиальному слою в результате занятия мест связывания на клеточном монослое или в результате продукции факторов, которые препятствуют прикреплению патогена к эпителиальным клеткам, таких как блокирующие места связывания на поверхности адгезины (Ljungh and Wadstrom, 2006; Blandino et al, 2008; Williams, 2010).
Свиные LAB могу также блокировать или подавлять экспрессию связанного с воспалением гена (интерлейкина-8, IL-8), инициируемую РМА в клетках IPEC. Отдельные культуры сильно варьировали по их способности к оказанию влияния на воспаление, но пять штаммов (RINH флаконы 29, 30, 31, 86 и 266) обладали сильными противовоспалительными активностями. Известно, что некоторые штаммы LAB обладают иммуномодулирующими или противовоспалительными свойствами (Cotter et al, 2005; Blandino et al, 2008; Ohashi and Ushida, 2009; Elmadfa et al, 2010; Liu et al, 2010). Втянутые механизмы остаются неясным, но они, вероятно, включают в себя модуляцию молекулярных систем передачи сигналов с помощью биоактивных факторов, продуцируемых LAB.
Устойчивость к антибиотикам является растущей проблемой и может распространяться между бактериями с помощью переноса генов (Korhonen et al, 2007; Gousia et al, 2011; Nicolau, 201 1). В идеальном варианте пробиотики-кандидаты должны не обладать или обладать незначительной устойчивостью к антибиотикам для минимизации риска переноса генов устойчивости во флору хозяина. Свиные LAB (33 штамма) были подвергнуты скринингу на предмет устойчивости к 10 отдельным антибиотикам. Один штамм (RINH флакон 266) был чувствительным ко всем проверенным антибиотикам. Большинство было чувствительным к ампициллину, цефотаксиму, хлорамфениколу, эритромицину, гентамицину, тетрациклину и ванкомицину. Однако большинство продемонстрировало устойчивость к метронизадолу, налидиксовой кислоте и в меньшей степени к канамицину. Эта относительно низкая частота устойчивости к антибиотикам среди этих изолятов LAB может быть связана со средой, в которой поросят в качестве источника выращивали [выращивали на открытом воздухе, на органических кормах] (Mulder et al, 2009).
L. johnsonii, L. reuteri и L. plantarum, как и ожидалось, продемонстрировали штаммоспецифические общие профили реакций с субстратами, при исследовании с использованием набора API СН 50. Однако большинство штаммов генотипа продемонстрировали тонкие различия в реактивности с субстратами. Это означало, что они были уникальными индивидуальными штаммами генотипа.
На основе их биологических активностей in vitro, четырнадцать LAB [4 родственных L. plantarum штамма, 3 родственных L. johnsonii штамма и 1 L. reuteri] были идентифицированы как штаммы, обладающие потенциалом для проверки in vivo. Два из этих штаммов LAB [GGDK266 и GGDK31] были получены в большом количестве. Примечательно, что 7 из четырнадцати LAB (RINH флаконы 85, 86, 131, 230, 255, 266) были выделены из селективных в отношении LAB агаров, дополненных углеводными фракциями из молозива свиньи. Профиль роста и биоактивности LAB зависит, частично, от углеводного субстрата, в котором его выращивают (Gopal et al, 2001; Tzortzis et al, 2004). Данные по настоящему изобретению могут означать, что некоторые из LAB являются адаптированными к хозяевам и нуждаются в некоторых, связанных со свиньями углеводах для оптимального роста или биоактивности.
Выгодно, если LAB могут выдерживать лиофилизацию для допуска манипулирования ими и их производства в качестве пробиотиков. Однако их жизнеспособность может сильно уменьшаться во время замораживания и высушивания (Tomas et al, 2009; Strasser et al, 2009; Reddy et al, 2009). Сухое обезжиренное молоко, отдельно или в комбинации с моносахаридами, часто используется в качестве криопротектора для сохранения жизнеспособности бактерий (Tomas et al, 2009; Strasser et al, 2009). В настоящем исследовании, небольшие уменьшения жизнеспособности были очевидны при высушивании и хранении свиных LAB только в сухом обезжиренном молоке. Сахароза или лактоза в комбинации с сухим обезжиренным молоком была немного более протективной. Однако продукт был гигроскопичным и трудно сохраняемым или манипулируемым. По этой причине было решено высушивать и хранить свиные LAB в сухом обезжиренном молоке.
Дополнительные корма для животных часто продают в виде гранул, производство которых включает в себя высокие температуры (De Angelis et al, 2006). По этой причине LAB, добавляемые к кормам для животных, должны обладать значительной степенью термостабильности для минимизации потери жизнеспособности во время производства. В настоящем исследовании пять LAB были подвергнуты трижды нагреванию в течение 15 минут при 70°С. Все бактерии, которые были получены после третьей термообработки, были жизнеспособными и в большинстве случаев росли со скоростями, схожими с таковыми для природных форм бактерий. У двух из бактерий сохранялись биологические свойства природных, не подвергнутых термообработке форм. Однако один из подвергнутых термообработке штаммов утратил способность к блокированию прикрепления патогена к эпителиальным клеткам in vitro, а другой обладал значительно уменьшенной блокирующей активностью. Следующий штамм был неспособен к блокированию вызываемого РМА воспаления в эпителиальных клетках in vitro, хотя природная форма была сильным супрессором воспаления. Таким образом, термообработка может по-разному влиять на биологические свойства отдельных LAB. Это необходимо учитывать при рассмотрении добавления LAB к гранулированным кормам для животных.
Эксперименты показали, что патогенность S. enteritidis была аттенуированной, если мышей подвергали совоздействию LAB, происходящих от выращиваемых на органических кормах свиней. RINH флакон 323 (L. mucosae) значительно уменьшал способность S. enteritidis к проникновению, распространению и пролиферации в соматических тканях при остром (в случае мыши C57BI/6) и хроническом (в случае мыши С3Н/Hen) сальмонеллезе. Кроме того, RINH флакон 31 [GGDK31], RINH флакон 32, RINH флакон 46 или RINH флакон 47 (все L. reuteri) уменьшали колонизацию S. enteritidis толстой кишки, их проникновение и системное распространение и пролиферацию у мышей С3Н/HeN. В целом, RINH флакон 31 [GGDK31] и RINH флакон 32 были самыми эффективными в этой модели хронического сальмонеллеза. Эти LAB обладают потенциалом в качестве новых пробиотиков для способствования здоровому состоянию пищеварительного тракта или увеличения устойчивости к инфицированию in vivo.
Инфицирование сальмонеллами является многофакторным процессом (Naughton and Grant, 2005). S. enteritidis колонизируют весь желудочно-кишечный тракт, движутся через слой слизи и прикрепляются к слизистой оболочке. Толстая кишка функционирует в качестве резервуара для патогена, но проникновение, главным образом, происходит через М-клетки, присутствующие в пейеровых бляшках подвздошной кишки. Большая часть проникших сальмонелл распространяется в кишечные лимфатические узлы, а затем из них в печень и селезенку (Naughton and Grant, 2005). Без желания ограничиться какой-либо теорией, полагают, что LAB могли бы блокировать сальмонеллы на различных стадиях инфекции (Cintas et al, 2001; Cotter et al, 2005; Ohashi and Ushida, 2009). В результате конкуренции за питательные вещества, уничтожения патогена или блокирования мест прикрепления LAB могли бы ограничить количество сальмонелл в резервуаре - толстой кишке. LAB могут также предотвращать прикрепление к клеткам слизистой оболочки подвздошной кишки, способом, подобным тому, который здесь был отмечен в случае клеток IPEC-J2 и клеток Caco-2 (Neeser et al, 2000), и тем самым ограничивать проникновение.
Альтернативно, LAB могут непосредственно модулировать ответные реакции хозяина на инфицирование, в частности, подавлять воспаление. В результате ограничения повреждения пищеварительного тракта и сохранения целостности барьера (Smith et al, 2008; Schreiber et al, 2009) способность сальмонелл к проникновению и распространению будет, вероятно, значительно уменьшаться.
Настоящее изобретение далее описано в качестве неограничивающего примера и со ссылкой на следующие неограничивающие фигуры, где:
На фиг. 1 продемонстрирован анализ антибактериальной активности кондиционированных лактобактериями сред.
В верхней части Фигуры 1 продемонстрировано следующее:
В нижней ее части отражено следующее:
На фиг. 2а и b продемонстрирована ингибиторная активность, направленная против S. enteritidis S1400, (представленная в виде площади ингибирования в анализе диффузии из лунки) сред, кондиционированных всякими отдельными LAB, подвергнутыми культивированию, из фекалий, выращиваемых на органических кормах свиней.
На фиг. 3а и b продемонстрирована ингибиторная активность, направленная против Е. coli K88 (представленная в виде площади ингибирования в анализе диффузии из лунки) сред, кондиционированных всякими отдельными LAB, подвергнутыми культивированию, из фекалий, выращиваемых на органических кормах свиней.
На фиг. 3с и d продемонстрирована ингибиторная активность (представленная в виде площади ингибирования в анализе диффузии из лунки) сред, кондиционированных всякими отдельными LAB, подвергнутыми культивированию, из фекалий, выращиваемых на органических кормах свиней.
На фиг. 4а, b, с продемонстрировано ингибирование прикрепления (a) S. enteritidis S1400 и (b) Е. coli K88 к клеткам IPEC в культуре с помощью LAB, подвергнутых культивированию, из фекалий, выращиваемых на органических кормах свиней; (с) сравнение между ингибированием S. enteritidis S1400 и (b) Е. coli K88.
2
На фиг. 5 представлен анализ чувствительности к антибиотикам лактобактерий, используя диски, пропитанные определенным количеством антибиотика, где незаштрихованным кругом указана площадь ингибирования пR ампициллином, цефотаксимом, хлорамфениколом, эритромицином, тетрациклином, ванкомицином, гентамицином, канамицином, метронизадолом, налидиксовой кислотой.
На фиг. 6 представлена оценка профиля реактивности с субстратами LAB, используя набор API СН 50 [49 субстратов, бледный цвет указывал на положительную реакцию, за исключением 25, в случае которого положительная реакция является черной, темный цвет означает отсутствие реакции].
На фиг. 7 представлено ΔCt (а), отношение (b) и кратное изменение (с) для экспрессии гена IL-8 в клетках IPEC, подвергнутых обработке РМА и свиными LAB.
На фиг. 8 продемонстрирована стабильность свиных LAB после лиофилизации в сухом обезжиренном молоке (SKP, (100 г/л), SKP + лактоза (оба в концентрации 100 г/л), SKP + сахароза (оба в концентрации 100 г/л) или SKP (200 г/л).
На фиг. 9 продемонстрированы стабильность выделенных LAB к термообработке (а), отношение (b) и кратное изменение (с) для экспрессии гена IL-8 в клетках IPEC, обработанных РМА и не подвергнутыми или подвергнутыми термообработке свиными LAB; (d) чувствительность к антибиотикам не подвергнутого или подвергнутого термообработке RINH флакона 31.
На фиг. 10 представлен протокол исследования на мышах С3Н/HeN для оценки эффективности штамма из флакона 323 (L. mucosae) в противодействии инфицированию сальмонеллами in vivo.
На фиг. 11а-с представлено распределение S. enteritidis S1400 в тканях через 10 дней после инфицирования у мышей С3Н/HeN, которые были или не были подвергнуты совоздействию штамма из флакона 323 (L. mucosae, LM).
На фиг. 12а-b представлены вес селезенки (мг/100 г веса тела) и миелопероксидаза кишечника (подвздошной кишки) (мкг) через 10 дней после инфицирования у мышей С3Н/HeN, которые были или не были подвергнуты совоздействию штамма из флакона 323 (L. mucosae).
На фиг. 13 представлен протокол исследования на мышах C57BI/6 для оценки эффективности штамма из флакона 323 (L. mucosae) в противодействии острой инфекции, вызванной сальмонеллами, in vivo.
На фиг. 14а-с представлено распределение S. enteritidis S1400 в тканях через 6 дней после инфицирования у мышей C57BI/6, которые были или не были подвергнуты совоздействию штамма из RINH флакона 323.
На фиг. 15 представлен вес селезенки (мг/100 г веса тела) через 6 дней после инфицирования у мышей C57BI/6, которые были или не были подвергнуты совоздействию штамма из флакона 323 (L. mucosae).
На фиг. 16 представлен протокол исследования на мышах С3Н/HeN для оценки эффективности отобранных LAB из фекалий, выращиваемых на органических кормах свиней в противодействии инфекции, вызванной сальмонеллами, in vivo.
На фиг. 17а и b продемонстрирована экскреция S. enteritidis в фекалиях через 7-8 дней после инфицирования мышами С3Н/HeN, которые были или не были подвергнуты совоздействию отобранных LAB.
На фиг. 18а-b представлено распределение S. enteritidis (Log10 CFU/г) в подвздошной кишке (а), слепой кишке (b) и ободочной кишке (с) через 10 дней после инфицирования мышей С3Н/HeN, которые были или не были подвергнуты совоздействию отобранных LAB.
На фиг. 19а-с представлено распределение S. enteritidis (Log 10 CFU/r) в кишечном лимфатическом узле (а), печени (b) и селезенке (с) через 10 дней после инфицирования мышей С3Н/HeN, которые были или не были подвергнуты совоздействию отобранных LAB.
На фиг. 20 представлены характеристики свиней, которым давали с кормом GGDK266 и GGDK31, в сравнение с контролем (ежедневный прирост массы, DWG, в г/день) в течение дней 0-7, 7-14 и 0-14.
На фиг. 21 продемонстрировано исследование разнообразия микроорганизмов, используя электрофорез в градиентном геле в денатурирующих условиях (DGGE; исследование 1). DGGE с использованием универсальных праймеров не выявил различий в разнообразии всех микроорганизмов между воздействиями и плацебо. Полосы в геле визуализированы с помощью окрашивания серебром.
На фиг. 22 продемонстрировано исследование разнообразия микроорганизмов, используя DGGE. DGGE с использованием специфических для лактобактерий (LAB) праймеров выявил значительные различия в разнообразии LAB между воздействием GGDK266 и плацебо в образцах как слепой кишки, так и подвздошной кишки. Полосы в геле визуализированы с помощью окрашивания серебром.
На фиг. 23 продемонстрировано исследование разнообразия микроорганизмов, используя DGGE. DGGE с использованием специфических для лактобактерий (LAB) праймеров выявил значительные различия в разнообразии LAB между воздействием GGDK2 66 и плацебо в образцах подвздошной кишки. Полосы в геле визуализированы с помощью окрашивания серебром.
На фиг. 24 продемонстрировано исследование разнообразия микроорганизмов, используя DGGE. DGGE с использованием специфических для лактобактерий (LAB) праймеров выявил значительные различия в разнообразии LAB между воздействием 2 66 и плацебо в образцах слепой кишки. Полосы в геле визуализированы с помощью окрашивания серебром.
На фиг. 25 представлены биологические процессы из генной онтологии (GO), значительно уменьшенные при пероральном введении GGDK266.
На фиг. 26 продемонстрированы изменения иммунного ответа и ответа на стимулы у животных, подвергнутых воздействию GGDK266, в сравнение с животными, подвергнутых воздействию плацебо (процент генов в зависимости от ряда различных аннотаций, имеющих отношение к генной онтологии (GO)).
На фиг. 27 представлены биологические процессы из генной онтологии (GO), значительно улучшенные при пероральном введении GGDK266.
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы
Материалы: В этих исследованиях использовали образцы фекалий свиней, собранные в ходе исследования выращиваемых на свежем воздухе и в помещении свиней (Mulder et al, 2009). Коллекция культур основывалась в основном на LAB, полученных из замороженных образцов 411, 412 и 416, которые происходили от выращиваемых на открытом воздухе свиней с особенно высокими уровнями LAB в их фекалиях. Премикс для бульона MRS, агар и ванкомицин, газогенераторные пакеты для анаэробов и термостат, и диски с антибиотиками покупали у Oxoid, катализатор для создания анаэробных условий - у Fisher Scientific, а цистеин-НС1, бромкрезоловый зеленый и сухое обезжиренное молоко - у Sigma-Aldrich. Углеводные фракции молозива свиньи были получены как часть программы SMART 163 D. Kelly. Наборы для экстракции ДНК покупали у MP Biomedicals, а реагенты для ПЦР и наборы для очистки - у Promega. Наборы API СН 50 покупали у Biomerieux UK Ltd.
Стандартные среды: Бульон MRS и агар MRS готовили в соответствии с инструкциями производителя. Агар LAMVAB готовили в соответствии со способом Jackson и др. (2002). Чашки с агаром готовили непосредственно перед использованием. Бульон MRS переливали (10 мл на пробирку) в стерильные пробирки Хангейта в анаэробных условиях и хранили при комнатной температуре.
Дополненные углеводами среды: Полученные с использованием сульфата аммония преципитаты молозива свиньи SMART 163: преципитированные при 0, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55 или 65% насыщения или растворимые при 65% насыщения - развешивали пропорциально количествам, извлеченным из 15 мл или 50 мл молозива. Каждую углеводную фракцию диспергировали в 15 мл агара MRS или LAMVAB, сохраняли при 45°С, а затем отдельные чашки были залиты для каждой фракции. Их также диспергировали в бульоне MRS (50 мл), и дополненный бульон переливали в восемь (6 мл/пробирку) стерильных пробирок Хангейта в анаэробных условиях.
Животные: Самок мышей С3Н/HeN и C57BI/6 (возрастом 5-6 недель) покупали у Harlan UK. Их помещали группами или парами в стандартные клетки в изоляторах из FlexFilm с высокоэффективным сухим воздушным фильтром, расположенных в лаборатории с уровнем защиты класса 2. Они имели свободный доступ к корму для грызунов высокого качества и стерильной деионизированной воде все время, и допускали их акклиматизацию в течение 7-10 дней до начала экспериментов. Rowett Institute of Nutrition and Health (RINH) дано разрешение в соответствии с Актом, касающимся животных (научно-исследовательских процедур) Великобритании 1986. Исследования здесь проводились на базе лицензии на работу от Министерства внутренних дел, выдача которой разрешена персоналом, имеющим необходимую персональную лицензию от Министерства внутренних дел (как определено и изложено в Акте, касающемся животных (научно-исследовательских процедур) Великобритании 1986), и были проверены и разрешены Комитетом по этике RINH.
Методы
Культивирование LAB: В первоначальных исследованиях небольшое количество замороженных фекалий (100 мг) диспергировали в 1 мл разжижителя для максимального извлечения (MRD). Были сделаны два дополнительных последовательных десятикратных разведения. Все три суспензии использовали для посева штрихом на чашки с агаром MRS или LAMVAB. В последних исследованиях образцы фекалий диспергировали в 5 мл MRD, далее разводили (1:40) в MRD, и 0,5 мл этого разведения распределяли по поверхности чашек с агаром MRS или LAMVAB с дополнительными углеводами из молозива свиньи или без них. Во всех случаях чашки инкубировали в анаэростате в течение 72 часов при 37°С. Отдельные колонии (по крайней мере 8 на чашку) отбирали из чашек с агаром и засевали в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS или, в соответствующих случаях, бульон MRS, содержащий углеводы молозива свиньи. Пробирки инкубировали в течение 4 8 часов при 37°С.
2
Замороженный сток: Аликвоту (0,7 мл) каждой культуры отбирали с помощью стерильного шприца и иглы и переносили в пластмассовую пробирку, которая была обработана струей СО и содержала 0,3 мл глицерина и 2 мг L-цистеина. Пробирку герметично закрывали пластмассовой пробкой, маркировали, содержимое перемешивали, замораживали и хранили при -80°С.
Кондиционированная среда: Остальную культуру переносили в 15-мл центрифужную пробирку Corning, подвергали центрифугированию при 1000g × 5 мин при комнатной температуре, супернатант сливали, распределяли по аликвотам и замораживали. Осадки или сразу же экстрагировали для исследования гена 16S рРНК, или замораживали.
2
2
Исследование гена 16S рРНК (Clarridge, 2004): Бактериальную ДНК экстрагировали, используя набор для обработки на центрифуге FastDNA для почвы вместе с системой Fastprep 120 BeadBeater, в соответствии с протоколом, поставляемым вместе с набором. Выполняли ПЦР (реакционная смесь: буфер, 10 мкл; dNTP (2 мМ), 5 мкл; праймер 27F (20 пмоль/мкл), 2 мкл; праймер 1492R (20 пмоль/мкл), 2 мкл; полимераза Go Taq Flexi, 0,5 мкл; MgCl, 5 мкл; HO, 23,5 мкл; и 2 мкл экстрагированной ДНК), используя термоциклер MJ Research РТС-200 Peltier Thermal Cycler, проходящий 35 циклов из 95°С в течение 3 минут, 95°С в течение 30 секунд, 57°С в течение 30 секунд и 72°С в течение двух минут. Праймер: 27F (FOI) AGAGTTTGATCCTGGCTC7AG; 1492R (RP2) ACGGCTACCTTGTTACGACTT. Очистку продукта ПЦР осуществляли с использованием геля Wizard SV и набора для очистки продукта ПЦР (Promega), используемых в соответствии с инструкциями производителя. 16S-продукты ПЦР секвенировали с использованием полностью автоматизированных генетических анализаторов, основанных на технологии капиллярного электрофореза (Genomics Section, RINH, UoA), используя обратный и прямой праймеры 519R и 926F. Бактериальные штаммы идентифицировали посредством сравнения последовательностей с известными бактериальными последовательностями ДНК, используя BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
6
Антибактериальная активность: Агар XLD готовили в соответствии с инструкциями производителя и охлаждали до 45°С. К агару XLD добавляли Salmonella enteritidis S1400 (1 мл разведения 1:1000 ночной культуры сальмонелл к 200 мл агара XLD для обеспечения эквивалента 10 CFU/мл). Агар выливали в чашки Петри, и позволяли ему твердеть. Чашки разделяли на 4 сектора, и в каждом секторе вырезали лунку диаметром приблизительно 5 мм. В лунки добавляли аликвоту (60 мкл) кондиционированной среды или бульона MRS. Чашки закрывали крышкой и инкубировали в течение 16 часов при 37°С. Их фотографировали, используя цифровой фотоаппарат. Изображения переносили в Photoshop, и определяли диаметр лунки и зоны ингибирования, используя инструментальное средство для измерения. Значения рассчитывали и хранили в электронной таблице Excel. Эту же процедуру использовали для Escherichia coli K88, за исключением того, что использовали агар MacConkey №3.
Чувствительность к антибиотикам: Свиные LAB [0,5 мл разведения 1:100 ночной культуры] распределяли по поверхности чашки [90 мм] с агаром MRS и высушивали. Чашки разделяли на 4 сектора, и в каждом секторе размещали диск, содержащий антибиотик [Ампициллин, 10 мкг. Цефотаксим, 30 мкг. Хлорамфеникол, 10 мкг. Эритромицин, 15 мкг. Гентамицин, 10 мкг. Канамицин, 30 мкг. Метронизадол, 50 мкг. Налидиксовая кислота, 30 мкг. Тетрациклин, 30 мкг. Ванкомицин, 30 мкг]. Чашки закрывали крышкой, помещали в анаэростат и инкубировали в течение 24 часов при 37°С. Чашки фотографировали, используя цифровой фотоаппарат. Изображения переносили в Photoshop, и определяли диаметр зоны ингибирования, используя инструментальное средство для измерения. Значения рассчитывали и хранили в электронной таблице Excel.
2
2
8
Предотвращение адгезии/проникновения сальмонелл in vitro: Монослои клеток IPEC-J2 формировали за 3 дня после достижения конфлюентности в 24-луночных планшетах и синхронизировали добавлением среды DTS за 24 часа до использования. Ночные культуры свиных LAB (10 мл) подвергали центрифугированию [100Og × 5 мин при комнатной температуре], и бактерии ресуспендировали в 1 мл забуференного фосфатом солевого раствора [PBS]. В лунки добавляли аликвоту (50 мкл) LAB. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С, 5% CO, 95% влажности. Ночную культуру Salmonella enterica серовара Enteritidis S1400 [S. enteritidis S1400] подвергали субкультивированию (0,5 мл в 10 мл) в среде Лурия Бертани (LB) и инкубировали в аэробных условиях в течение 2-3 часов при 37°С до достижения ею оптической плотности (560 нм):, равной 0,8. Это обеспечивало концентрацию, эквивалентную 1×10 CFU/мл). Культуру подвергали центрифугированию [1000g × 5 мин при комнатной температуре], и бактерии ресуспендировали в PBS. Аликвоту (50 мкл). добавляли в лунки с клетками IPEC-J2. Лунки, обработанные PBS, использовали в качестве контролей. Планшеты инкубировали в течение еще 2 часов при 37°С, 5% СО, 95% влажности. Монослои клеток IPEC-J2 промывали 5 раз HBSS. В каждую лунку добавляли раствор (0,5 мл) PBS, содержащего Triton-Х100 (10 мл/литр), монослои соскабливали и диспергировали. Оценку жизнеспособных сальмонелл осуществляли на чашках с агаром XLD [подвергнутых инкубированию в течение 24 часов при 37°С] с помощью способа Майлса и Мисра [Robertson et al, 2003]. LAB определяли с помощью той же процедуры [инкубировали в аэробных условиях в течение 48 часов при 37°С].
2
Ингибирование воспалительных реакций: Монослои клеток IPEC-J2 формировали за 3 дня после достижения конфлюентности в 24-луночных планшетах и синхронизировали добавлением среды DTS за 24 часа до использования. Ночные культуры свиных LAB (10 мл) подвергали центрифугированию [1000g × 5 мин при комнатной температуре], и бактерии ресуспендировали в 1 мл PBS. В каждую лунку [3 лунки для каждого образца] добавляли аликвоту (50 мкл) LAB вместе с 220 нг 12-O-тетрадекабоилфорбол-13-ацетата [РМА] на лунку. Только РМА или PBS служили в качестве контролей. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С, 5% СО, 95% влажности. Культуральную среду удаляли из планшетов, и клетки дважды промывали PBS. В каждую лунку добавляли буфер RLT (0,5 мл), содержащий меркаптоэтанол, клетки соскабливали и переносили в пробирку Eppendorf [для каждого образца объединяли соскобы с 3 лунок]. Экстракцию РНК осуществляли, используя набор RNeasy Mini в соответствии с протоколами производителя, а обратную транскрипцию - с использованием набора для высокоэффективной обратной транскрипции для получения кДНК (Applied Biosystems). ПЦР в режиме реального времени выполняли в системе 7500 Fast Real-time PCR, управляемой с помощью программного обеспечения 7500 Fast System v 1.4.0 Sequence Detection Software версии 1.4 (Applied Biosystem). Праймеры для свиного IL-8 и TNF-α [IPEC-J2, SY100604186-096 IL-8-2 обратный, SY100604186-090 TNF-α обратный, SY100604186-095 IL-8 2 прямой, SY100604186-089 TNF-α прямой, и SY100604186-093] были приготовлены Sigma Aldrich. Реакционная смесь представляла собой: 10 мкл смеси Power Sybergreen Master, 2,5 мкл прямого праймера, 2,5 мкл обратного праймера и 5 мкл кДНК. ПЦР в режиме реального времени затем выполняли в соответствии с протоколом Standard 7500 (95°С, 10 мин, 1 цикл. 95°С, 15 сек, 40 циклов. 60°С, 1 мин, 40 циклов. 95°С, 15 сек, 1 цикл. 60°С, 1 мин, 1 цикл. 95°С, 15 сек, 1 цикл. 60°С, 5 сек, 1 цикл). Экспрессию генов IL-8 и TNF-α анализировали и сравнивали с таковой гена «домашнего хозяйства» - β-актина. Для сравнения, значения определялись в виде отношения IL-8 и TNF-α к β-актину или кратного изменения.
Например:
a. Рассчитать ΔCt (2 ч) для IL-8 [Ct IL-8 минус Ct β-актина]
b. Рассчитать ΔCt (2 ч) для РМА [Ct РМА минус Ct β-актина]
c. Разделить ΔCt (IL-8) на ΔCt (РМА)
d. Округлить в большую сторону до целого числа
Реактивность с субстратами: Реактивность отдельных LAB с углеводами определяли, используя набор API СН 50 (Biomerieux UK Ltd). Анализы выполняли в соответствии с инструкциями производителя, и реакции фиксировали после инкубации в течение 24 и 48 часов при 37°С. Существует 50 капсул в форме API СН 50. Они содержат различные потенциальные субстраты и отрицательные контроли. Диапазон субстратов является следующим: моносахариды 16, моносахариды/спирты 4, дисахариды 8, трисахариды 2, полисахариды 3, спирты 6, другие 7. Для каждой группы субстратов подсчитывают число положительных реакций. Его делят на максимально возможное число для установления ранга для этой группы субстратов. Сумма всех оценок субстратов дает общую ранговую оценку бактерии. Высокая ранговая оценка означает широкий спектр реактивности с субстратами.
Термообработка LAB: Небольшое количество замороженных фекалий (100 мг) диспергировали в 5 мл разжижителя для максимального извлечения (MRD). Допускали осаждение осадка, и верхний слой сливали в пробирки Eppendorf (1 мл/пробирку). Пробирки нагревали при 50°С, 60°С или 70°С в течение 10 мин. Аликвоту (0,4 мл) из каждой высевали на агар MRS и инкубировали в анаэростате в течение 72 часов при 37°С. Небольшое число колоний обнаруживали после нагревания при 70°С. Отдельные колонии отбирали, засевали в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубировали в течение 48 часов при 37°С.
Во втором исследовании небольшое количество замороженных фекалий (100 мг) диспергировали в 5 мл разжижителя для максимального извлечения (MRD). Допускали осаждение осадка, и верхний слой сливали в пробирки Eppendorf (1 мл/пробирку). Пробирки нагревали при 50°С в течение 20 мин, 50°С в течение 20 мин плюс 60°С в течение 20 мин или 50°С в течение 20 мин плюс 60°С в течение 20 мин плюс 70°С в течение 20 мин. Аликвоту (0,5 мл) из каждой высевали на агар MRS и инкубировали в анаэростате в течение 48 часов при 37°С. Небольшое число колоний обнаруживали, отбирали, засевали в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубировали в течение 48 часов при 37°С.
В третьем исследовании ночную культуру (10 мл) выделенных свиных LAB подвергали центрифугированию (1000g × 5 мин при комнатной температуре), осадок ресуспендировали в свежем бульоне MRS (10 мл). Аликвоту (1 мл) нагревали при 70°С в течение 15 мин, а затем высевали (0,5 мл) на агар MRS и инкубировали в анаэростате в течение 48 часов при 37°С. Небольшое число колоний обнаруживали, отбирали, засевали в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубировали в течение 4 8 часов при 37°С. Эту культуру подвергали центрифугированию, ресуспендировали в бульоне MRS, снова нагревали при 70°С в течение 15 мин, высевали на агар MRS, инкубировали в анаэростате в течение 48 часов при 37°С, колонии отбирали, засевали в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубировали в течение 48 часов при 37°С. Как и раньше, эту культуру подвергали центрифугированию, ресуспендировали в бульоне MRS, снова нагревали при 70°С в течение 5 мин, высевали (0,5 мл) на агар MRS, инкубировали в анаэростате в течение 48 часов при 37°С, колонии отбирали, засевали в пробирки Хангейта, содержащие бульон MRS, и инкубировали в течение 48 часов при 37°С.
Стабильность лиофилизированных бактерий: Ночные культуры LAB подвергали центрифугированию (1000g × 5 мин при комнатной температуре). Осадки ресуспендировали в 2 мл стерильного PBS и вновь подвергали центрифугированию. Последующие осадки затем ресуспендировали в 5 мл раствора для замораживания [сухого обезжиренного молока (SKP), 100 г/л; SKP + лактоза, оба в концентрации 100 г/л; SKP + сахароза, оба в концентрации 100 г/л; или SKP, 200 г/л]. Образцы замораживали при -20°С (в течение 2-3 часов), а затем хранили при -80°С в течение ночи. Их подвергали лиофилизации в течение 48 часов, и высушенный материал хранили при комнатной температуре. Жизнеспособные бактерии в образцах определяли через 0 и приблизительно 40 и 80 дней после окончания лиофилизации. Их высевали на агар MRS и инкубировали в анаэробных условиях в течение 48 часов при 37°С.
2
Крупноразмерное приготовление GGDK31 и G6DK266: Два 500-мл замеса бульона MRS были приготовлены в 500-мл склянках с завинчивающимися крышками, подвергнуты автоклавированию, и допускали их охлаждение до комнатной температуры (вблизи от газового пламени) при обработке струей CO. Четыре мл 24-часовой культуры GGDK31 или GGDK266 добавляли в каждую склянку с MRS, и крышки слегка завинчивали. Склянки помещали в анаэростат и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Культуру центрифугировали [1000g × 5 мин при комнатной температуре] в 6 стерильных 50-мл центрифужных пробирках. Супернатант отбрасывали, пробирки вновь наполняли культурой и вновь центрифугировали до извлечения всех бактерий. Каждая из 6 пробирок содержала почти равные количества бактерий. Бактерии в каждой пробирке ресуспендировали в 40 мл стерильного PBS, вновь центрифугировали, и супернатант отбрасывали. Бактерии в каждой пробирке ресуспендировали в 20 мл SKM (100 г/л), замораживали при -20°С (в течение 2-3 часов), а затем в течение ночи при -80°С, подвергали лиофилизации в течение 48-72 часов и хранили при 4°С. Для оценки жизнеспособных бактерий в образце, лиофизированный материал в одной пробирке ресуспендировали в 20 мл бульона MRS, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, разводили, высевали на агар MRS и инкубировали в анаэробных условиях в течение 48 часов при 37°С.
9
8
In vivo исследование 1 L. mucosae: Шестнадцати (возрастом 6 недель) самкам мышей С3Н/HeN назначали дозу ночной культуры из флакона 323 (L. mucosae; 50 мкл; >10 CFU) в день -7, -4, -2 и 0 и ежедневно после этого вплоть до дня +9. Дополнительным 16 мышам (контролям) назначали среду. В день 0, восьми мышам (подвергнутым воздействию L. mucosae) и восьми контрольным мышам вводили, через желудочный зонд, одну дозу Salmonella enteritidis S1400 (50 мкл; ≥10 CFU). Кроме того, восьми мышам (подвергнутым воздействию L. mucosae) и восьми контрольным мышам вводили одну дозу культуральной среды. За весом тела и оценкой состояния здоровья следили дважды в день после инфицирования сальмонеллами. Мышей подвергали эвтаназии (с помощью чрезмерной дозы изофлурана и обескровливания) и вскрывали через 10 дней после инфицирования сальмонеллами. Желудок, репрезентативные части тощей кишки и подвздошной кишки, слепой кишки плюс содержимое, ободочной кишки плюс содержимое, селезенку и печень и одну почку и кишечный лимфатический узел собирали в почти асептических условиях для микробиологии. Репрезентативные части верхней части тощей кишки, срединной части тощей кишки, подвздошной кишки, слепой кишки и восходящей и нисходящей части ободочной кишки помещали в нейтральный забуференный формалин или RNA-later и хранили для дальнейшего анализа.
9
7
In vivo исследование 2 L. mucosae: Пяти (возрастом 6 недель) самкам мышей C57BI/6 назначали дозу ночной культуры из флакона 323 (L. mucosae; 50 мкл; >10 CFU) в день -7, -4, -2 и 0 и ежедневно после этого вплоть до дня +5. Дополнительным 5 мышам назначали среду. В день 0, всем десяти мышам вводили, через желудочный зонд, одну дозу Salmonella enteritidis S1400 (50 мкл; ≥10 CFU). Мышей подвергали эвтаназии и вскрывали в день 6, в соответствии с процедурой для исследования 1.
9
8
Новые свиные LAB in vivo: Четырем (возрастом 6 недель) самкам мышей С3Н/HeN назначали дозу ночной культуры из RINH флакона 31 (L. reuteri; 50 мкл; >10 CFU), четырем - из RINH флакона 32 [L. reuteri), четырем - из флакона 323 (L. mucosae), четырем - из RINH флакона 4 6 (L. reuteri), четырем - из RINH флакона 47 (L. reuteri) и восьми - MRS. Это осуществляли в день -6, -4, -2 и 0 и ежедневно после этого вплоть до дня +9. В день 0, всем мышам, подвергнутым воздействию лактобацилл, и четырем контрольным мышам вводили, через желудочный зонд, одну дозу Salmonella enteritidis S1400 (50 мкл; ≥10 CFU). Кроме того, остальным четырем контрольным мышам вводили одну дозу культуральной среды. Мышей подвергали эвтаназии и вскрывали в день 10, в соответствии с процедурой для исследования 1.
Микробиология: Ткани гомогенизировали [1:100 в отношении веса к объему] в MRD, используя гомогенизатор для тканей Janke-Kunkel Ultra-Turrax Т25 при 20000 об./мин в течение 30 секунд, как и содержимое тощей кишки и подвздошной кишки. Вплоть до восьми последовательных разведений (1:10 в объемном отношении) первичных гомогенатов делали, высевали на агар XLD и агар MacConkey №3 и инкубировали в течение ночи при 37°С. Количество жизнеспособных бактерий оценивали как и раньше [Robertson et al, 2003].
Статистический анализ: В соответствующих случаях данные сначала оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) относительно результата воздействия. Если ANOVA указывал на то, что между всеми группами существуют значимые различия (p<0,05), данные затем анализировали с использованием критерия множественных сравнений Тьюки-Крамера или критерия множественных сравнений Крускала-Уоллиса в зависимости от ситуации. Это выполняли, используя пакет программ Instat Statistical Package (GraphPad Software Inc., San Diego, США).
На основе результатов, полученных с использованием критериев множественных сравнений, средние значения в таблицах и на графиках отмечались надписанными буквами. У средних значений, которые значительно отличались друг от друга (p<0,05), размещали отличные надписанные буквы. У средних значений, которые не отличались значительно друг от друга, размещали общие надписанные буквы.
Результаты
1. Изоляция LAB
Фекалии выращиваемых на органических кормах свиней высевали на селективные агары и инкубировали в анаэробных условиях. Исходя из всех исследований, всего 436 отдельных колоний лактобактерий [LAB] были отобраны, высеяны в бульон MRS и подвергнуты инкубации в анаэробных условиях. Каждой культуре присвоен уникальный номер RINH флакона, и аликвоту замораживали в среде MRS, содержащей 30% глицерина и L-цистеин (~2 мг/мл) и хранили при -80°С. Было проведено исследование генов 16S рРНК, и бактериальные штаммы были идентифицированы посредством сравнения последовательностей с известными последовательностями ДНК бактерий (таблица 1).
Большинство подвергнутых культивированию колоний LAB было L. johnsonii или родственными L. johnsonii штаммами [L. johnsonii, L. johnsonii/gasseri, L. johnsonii/taiwanensis] (240/436) и L. reuteri или родственными L. reuter штаммами [L. reuteri, L. reuteri/pontis, L. reuteri/vaginalis, L. reuteri/acidophilus (169/436)]. Было 7 колоний L. plantarum/pentosus, 19 других видов и 5 некультивируемых штаммов.
2. Направленная против сальмонелл активность in vitro
Среды, кондиционированные выделенными LAB, подвергали скринингу на предмет антибактериальной активности, направленной против Salmonella enteritidis S1400, используя анализ диффузии из лунки (фиг. 1). Направленная против S. enteritidis активность сред, кондиционированных отдельными колониями LAB, весьма варьировала (фиг.2а). Она не зависела от штамма. Диапазон направленных против сальмонелл активностей среди L. johnsonii был схож с таковым среди L. reuteri. Условно культуры были разделены на группировки на основе их способности к ингибированию сальмонелл in vitro (фиг. 2b). Группа 1 продемонстрировала <20000 единиц ингибирования, группа 2 - 20000-40000 единиц ингибирования, группа 3 - 40000-60000 единиц ингибирования, группа 4 - 60000-80000 единиц ингибирования, группа 5 - 80000-100000 единиц ингибирования, а группа 6 - >>100000 единиц ингибирования (фиг. 2b). Группа 1 состояла из 14 штаммов (3,4% от всех), группа 2 - из 95 штаммов (22,8%), группа 3 - из 99 штаммов (23,7%), группа 4 - из 99 штаммов (23,7%), группа 5 - из 86 штаммов (20,6%), а группа 6 - из 24 штаммов (5,8%). Последняя группа состояла из семнадцати L. johnsonii и родственных L. johnsonii штаммов, шести L. reuteri или родственных L. reuteri штаммов и одного некультивируемого штамма.
3. Направленная против Е. coli K88 активность in vitro
Среды, кондиционированные LAB, были также подвергнуты скринингу на предмет активности, направленной против Escherichia coli K88, с помощью анализа диффузии из лунки. Как и в случае сальмонелл, активность, направленная против Е. coli K88, весьма варьировала между отдельными колониями LAB (фиг. 3а). Диапазон и вариация активности были схожими между штаммами L. johnsonii и L. reuteri. В общем, не было прямой корреляции между активностью, направленной против сальмонелл, и активностью, направленной против Е. coli K88, в случае любой отдельной LAB (фиг. 3с, 3d). Однако из десяти штаммов в группе 5 с активностью против Е. coli K88 (фиг. 3b) семь обладали относительно высокими активностями против обоих патогенов, два обладали высокой активностью против Е. coli K88, но средней активностью против сальмонелл, а один был активен в основном против Е. coli K88.
4. Первоначальный отбор LAB-кандидатов
Для дальнейшей проверки in vitro было идентифицировано тридцать три штамма (таблица 2). Они включали 18 L. johnsonii и родственных L. johnsonii штаммов, 11 L. reuteri или родственных L. reuteri штаммов и 4 L. plantarum и родственных L. plantarum штаммов (таблица 2а).
5. Прикрепления к кишечным эпителиальным клеткам [IPEC-J2] свиньи/проникновение в них
Была оценена способность LAB к блокированию прикрепления к клеткам IPEC/проникновения в них S. enteritidis и Е. coli K88 (фиг. 4а, 4b, 4с). Все LAB-кандидаты весьма уменьшали прикрепление сальмонелл к клеткам IPEC и их проникновение в эти клетки. Большинство из них было также очень эффективным против Е. coli K88. Однако 3 из штаммов оказывали лишь ограниченные эффекты на прикрепление Е. coli K88 к клеткам IPE/ проникновение в них Ε. coli K88.
6. Чувствительность LAB к антибиотикам.
Была оценена чувствительность LAB-кандидатов к ряду антибиотиков (таблица 4, фиг. 5). Все кроме одного штамма (RINH флакон 266) продемонстрировали некоторую степень устойчивости к отдельным антибиотикам. Все были чувствительны к ампициллину (10 мкг), цефотаксиму (30 мкг) и хлорамфениколу (10 мкг). Большинство было чувствительно к эритромицину (15 мкг), гентамицину (10 мкг), тетрациклину (30 мкг) и ванкомицину (30 мкг). Большинство штаммов было устойчиво к метронизадолу (50 мкг) и налидиксовой кислоте (30 мкг) и в меньшей степени к канамицину (30 мкг).
7. Улучшенный отбор LAB-кандидатов
Для дальнейшей проверки in vitro было идентифицировано двадцать три штамма с высокими ранговыми оценками.
8. Субстратная специфичность LAB
LAB-кандидаты были подвергнуты скринингу на предмет реактивности с субстратами, используя набор API СН 50 (таблица 5, 6, фиг. 6). Каждый из L. johnsonii, L. reuteri и L. plantarum продемонстрировал штаммоспецифический общий профиль реакций с субстратами. Кроме того, большинство штаммов каждого генотипа продемонстрировало тонкие различия в их реактивности с субстратами, что служит указанием на то, что они были уникальными индивидуальными штаммами.
9. Подавление воспаления в кишечных эпителиальных клетках [IPEC-J2] свиньи
Была проверена способность LAB-кандидатов к блокированию или подавлению воспалительных реакций, инициируемых 12-O-тетрадекабоилфорбол-13-ацетатом [РМА] в клетках IPEC (фиг. 7; таблица 7). Способности к блокированию экспрессии гена интерлейкина-8 (IL- 8), запускаемой РМА, штаммов-кандидатов значительно варьировали. Пять штаммов (RINH флаконы 29, 30, 31 86 и 266) оказывали сильные противовоспалительные эффекты.
10. Конечный отбор LAB-кандидатов
Было идентифицировано четырнадцать штаммов, обладающих активностями уничтожения и блокирования сальмонелл и Е. coli K88, чувствительностью к антибиотикам, реактивностью с углеводами и способностью к подавлению воспаления in vitro. Семь из них были особенно предпочтительными. Последняя совокупность включала 4 родственных L. plantarum штамма, 3 родственных L. johnsonii штамма и один L. reuteri. Два из этих штаммов LAB [GGDK266 и GGDK31] были получены в большом количестве для оценки в исследовании с использованием недавно отлученных от матери поросят (таблица 8).
11. Лиофилизация и хранение LAB
Была оценена выживаемость и жизнеспособность LAB после лиофилизации в сухом обезжиренном молоке [SKP], SKP плюс лактоза или SKP плюс сахароза (фиг. 8). Небольшие уменьшения жизнеспособности были несомненны при хранении в течение 42 и 84 дней при комнатной температуре образцов, высушенных в SKP. Это было менее заметно в случае использования сухого обезжиренного молока и Сахаров в комбинации. Однако 24 последних препарата, как правило, были гигроскопичными и трудно сохраняемыми. По этой причине крупноразмерные препараты GGDK2 66 и GGDK31 были получены посредством высушивания бактерий в сухом обезжиренном молоке [1000 г/л] (таблица 8).
12. Исследования с использованием термообработок
Суспензии фекалий, выращиваемых на органических кормах свиней, подвергали термообработке в течение варьирующих периодов времени при 50-70°С, высевали на агар MRS, колонии отбирали и культивировали в бульоне MRS [RINH флакон 417-506]. Выделяемые типы штаммов были жизнеспособными, а виды Clostridium составляли высокий процент, выделяемые штаммы оставались термочувствительными.
Выделенные культуры LAB подвергали нагреванию три раза в течение 15 минут при 70°С (фиг. 9). Количество жизнеспособных бактерий уменьшалось на порядок 3-4 log после термообработки в первый раз. Однако выживающие бактерии обладали некоторой степенью термоустойчивости. За одним исключением, потери жизнеспособных бактерий были меньшими, когда бактерии вновь подвергали культивированию и вновь нагревали еще два раза.
Термообработка три раза при 70°С изменяла биологические активности штаммов (фиг. 9). RINH флакон 521 (флакон 255, подвергнутый термообработке) не был способен к блокированию прикрепления патогенов к клеткам IPEC, а способность RINH флакона 520 (флакона 230, подвергнутого термообработке) к предотвращению прикрепления была уменьшенной. Способность RINH флакона 517 (флакона 31, подвергнутого термообработке) к отмене воспалительных реакций, инициируемых в клетках IPEC, была аннулированной. Напротив, биологические свойства RINH флакона 518 (флакона 85, подвергнутого термообработке) и RINH флакона 519 (флакона 86, подвергнутого термообработке) были схожими с таковыми природных штаммов.
13. Исследования инфекций у мышей
13.1 L. mucosae (RINH флакон 323)
У мышей С3Н/HeN развивается хроническая, но нелетальная, кишечная и системная инфекция, которая обладает множеством характеристик основной формы сальмонеллеза у людей, после заражения высокими уровнями Salmonella enteritidis S1400. В отличие от них, у мышей C57BI/6 развивается тяжелая, в основном системная, инфекция, напоминающая острую инфекцию у людей, после заражения этим же патогеном. Для оценки способности L. mucosae (флакона 323) к уменьшению интенсивности сальмонеллеза, мышей С3Н/HeN и C57BI/6 подвергали воздействию L. mucosae до и после заражения Salmonella enteritidis (фиг. 10, 13). Мышей подвергали эвтаназии и вскрывали через 6 (C57BI/6) или 0 (С3Н/HeN) после инфицирования.
Соматические ткани: Воздействие с использованием перорального введения L. mucosae ограничивало способность S. enteritidis к вызову системной инфекции и у мышей С3Н/HeN, и у мышей C57BI/6 (фиг. 11а-с; 14а-с). Большое количество жизнеспособных сальмонелл выявлялось в кишечном лимфатическом узле, печени и селезенке мышей. Напротив, количество, присутствующее в этих тканях, значительно уменьшалось, если мыши подвергались совоздействию штамма из RINH флакона 323 (L. mucosae). Инфицирование сальмонеллами приводило к увеличению селезенки (фиг. 12а; 15). Эта ответная реакция ткани была значительно уменьшенной у мышей, подвергнутых воздействию как штамма из RINH флакона 323 (L. mucosae), так и сальмонелл.
Кишечник: Кишечную миелопероксидазу [МРО], маркер для нейтрофилов, определяли у мышей С3Н/HeN, подвергнутых воздействию сальмонелл или сальмонелл плюс RINH флакон 323 (L. mucosae). МРО в кишечнике была сильно увеличенной при инфицировании сальмонеллами, вследствие накопления нейтрофилов в кишечнике - части ответной реакции хозяина на инфицирование (фиг. 12b). Совоздействие штамма из RINH флакона 323 (L. mucosae) уменьшало активность МРО в кишечнике инфицированных сальмонеллами мышей, что указывает на то, что воспалительные реакции в кишечнике на инфицирование были уменьшенными у этих животных.
13.2 Новые свиные LAB
Были отобраны четыре LAB: RINH флакон 31, RINH флакон 32, RINH флакон 46 и RINH флакон 47 (все L. reuteri; LR31, LR32, LR36 и LR47, соответственно). Для оценки их эффективности в ослаблении инфицирования патогеном мышей С3Н/HeN подвергали воздействию этих LAB или штамма из RINH флакона 323 (L. mucosae, LM] до и после заражения Salmonella enteritidis (фиг. 16). Мышей подвергали эвтаназии и вскрывали через 10 дней после инфицирования. Экскреция с фекалиями S. enteritidis была уменьшенной, если мышей подвергали совоздействию LAB (фиг. 17а, b). LR31 и LR32, как правило, оказывали наибольшие эффекты на выходы сальмонелл с фекалиями.
Кишечник: Воздействие LR31, LR32, LM, LR4 6 или LR4 7 значительно уменьшало количество сальмонелл в слепой кишке (фиг. 18а). Кроме того, LR31, LR32, LR46 и LR47, но не LM понижали количество сальмонелл в подвздошной кишке (фиг. 18b). Уменьшения были, как правило, большими в случае LR31 и LR32. В отличие от толстой кишки, LAB не оказывали значительные эффекты на количество сальмонелл в тонкой кишке.
Соматические ткани: Воздействие LR31, LR32, LM, LR4 6 или LR47 значительно уменьшало количество сальмонелл, выявляемых в селезенке и печени (фиг. 19а-с). Уменьшениями были более заметными в случае LR31 и LR32, чем в случае LM, LR46 или LR47. Количество сальмонелл в кишечном лимфатическом узле было пониженным после воздействия LR31, LR32 и LR46, не после воздействия LM или LR47.
Обсуждение
Штаммы LAB (всего 436 отборов отдельных колоний), выделенные из фекалий выращиваемых на органических кормах свиней, были, главным образом, штаммами L. reuteri, L. johnsonii, L. gasseri, L pentosus, с небольшим числом L. plantarum, L. acidophilus, L. vaginalis, одним L. mucosae и несколькими некультивируемыми штаммами. Большинство LAB продуцировали вещества, которые могли ингибировать S. enteritidis и/или Е. coli K88 in vitro. Сила этих противопатогенных эффектов весьма варьировала между отдельными бактериальными штаммами. Часть LAB обладала высокой активностью против S. enteritidis, но низкой активностью против Е. coli K88, и наоборот, но большинство обладало схожими активностями против обоих патогенов.
Тридцать три штамма были отобраны на основе противомикробной активности, определяемой in vitro. Эти бактерии были в дальнейшем подвергнуты скринингу на предмет их способности к блокированию прикрепления к свиным кишечным эпителиальным клеткам (IPEC)/проникновения в них патогенов in vitro и их чувствительности к антибиотикам.
Двадцать три штамма были исследованы в отношении диапазона субстратов и субстратной специфичности и их способности к подавлению воспаления в клетках IPEC in vitro. Исходя из них, были идентифицированы четырнадцать LAB (5 L. johnsonii, 6 L. reuteri и 3 L. plantarum) с подходящими свойствами.
Два штамма LAB [GGDK266 и GGDK31] были приготовлены в большом количестве для in vivo оценки на недавно отлученных от матери поросятах. В этом ряду из 14 LAB находились другие потенциально важные штаммы-кандидаты.
Была также оценена выживаемость и жизнеспособность LAB после лиофилизации в различных растворах. Небольшие уменьшения жизнеспособности были несомненны при длительном хранении образцов, высушенных вместе с сухим обезжиренным молоком. Это было менее заметно в случае использования сухого обезжиренного молока и Сахаров. Однако последние препараты были гигроскопичными и трудно сохраняемыми. По этой причине было решено использовать суспензию сухого обезжиренного молока для лиофилизации и хранения LAB. Крупноразмерные препараты GGDK2 66 и GGDK31 были подвергнуты лиофилизации в этой среде.
Термостабильность является полезным свойством для LAB, используемых в гранулированных кормах для животных. Было получено пять жизнеспособных штаммов выделенных свиных LAB, кондиционированных с использованием нагревания. Однако термообработка оказывала неблагоприятное влияние на биологические свойства in vitro и пробиотический потенциал трех из этих штаммов. Однако у двух из этих бактерий сохранялись биологические свойства их природных, не подвергнутых термообработке форм.
Пять свиных LAB (L. reuteri [4] или L. mucosae [1]) были проверены на способность к уменьшению интенсивности сальмонеллеза in vivo. Воздействие на мышей этих LAB значительно уменьшало патогенность S. enteritidis.
14. Оценка перорального введения штаммов Lactobacilli - органических пробиотиков в отношении модуляции микробиоты пищеварительного тракта и характеристик рано отлученных от матери поросят
In vivo исследования проводили на рано отлученных от матери поросятах для проверки эффекта двух штаммов-пробиотиков в соответствии с настоящим изобретением, штаммов Lactobacilli GGDK266 и GGDK31.
Дизайн исследования
Животные:
- 24 поросенка крупной белой породы × Redon
- Рано отлученные от матери (в возрасте 21 дня, ≈7-8 кг), рожденные на местной ферме
- Взвешенные, а затем распределенные поровну между различными группами
- 3 экспериментальных воздействия (n=8):
А - Основной корм + плацебо
12
В - Основной корм + пробиотик GDDK 266 - доза 10×10
12
С - Основной корм + пробиотик GDDK 31 - доза 10×10
- Период наблюдения: 14 дней
Корм:
Корма на основе ячменя, пшеницы & соевой муки (SBM)
- Состав корма
Ячмень
36,5
Пшеница
21
SBM48
19
Кукуруза
10
Соевое масло
4
Сахар
4
Картофельный протеин
2
Премикс
3,5
- корм без ограничения в гранулированной форме
Взятие образцов тканей и измерения
Взятие образцов:
День 0: Забой 6 не подвернутых воздействию поросят для получения слепой кишки. Сбор фекалий от отдельных поросят (если возможно)
День 7: Сбор фекалий от отдельных поросят во время взвешивания
День 14: Забой 24 поросят для получения:
Содержимого (5 г): желудка, тощей кишки, подвздошной кишки, слепой кишки.
Ткани (10 см): тощей кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, лимфатических узлов (на уровне дистальной части подвздошной кишки).
Хранение: Все образцы взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при 80°С.
Характеристики (1-ая стадия): Ежедневный прирост массы (DWG), потребление корма (FI) и коэффициент трансформации корма (FCR)
Исследование (2-ая стадия):
- Определение профиля микробиоты в различных образцах содержимого пищеварительного тракта с помощью метода молекулярной микробиологии - электрофореза в градиентом геле в денатурирующих условия (DGGE).
- Данные молекулярного анализа экспрессии генов, используя чипы для анализа экспрессии генов свиньи Affymetrix для определения характеров модуляции генов.
- Определение маркеров иммунитета в тканях кишечника
Анализ микроорганизмов, используя электрофорез в градиентом геле в денатурирующих условия DGGE (исследование 1)
Методология DG6E
ДНК экстрагируют из образцов фекалий или тканей, используя набор для обработки на центрифуге MP Bio FastDNA™ для образца почвы - 116560000. Затем ДНК амплифицируют, используя праймеры Muyzer, поскольку важно использовать праймеры с GC-богатой последовательностью для электрофореза в геле. Для образцов Lactobacillus использовали специфические для Lactobacillus праймеры с GC-богатой последовательностью.
Программа для ПЦР:
DGGE является методом генетического анализа, в случае которого амплифицированные с помощью ПЦР продукты разделяются под действием денатурантов формамида и мочевины в геле, на основе генетической последовательности, при различии всего лишь в одном основании. DGGE может использоваться для визуализации различий в разнообразии микроорганизмов между образцами. ДНК, получаемую из ряда образцов, например, образцов тканей и фекалий, можно использовать в DGGE. Полосы в геле визуализировали, используя окрашивание серебром.
Молекулярный анализ и профили экспрессии генов тканей свиней
Экстракция РНК и анализ с использованием микрочипов Affymetrix
РНК выделяли как ткани животного, так и из подвергнутых культивированию клеток для использования на Affymetrix GeneChips. В случае ткани животного, приблизительно 200-мг образец ткани удалили из RNAlater (Ambion) и лизировали в Trizol (Invitrogen), используя гомогенизатор Polytron. Ткань в дальнейшем гомогенизировали пропусканием лизата через шприц, оснащенной иглой 19G, 3-5 раз. Образцы инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре для допуска полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов. Затем выполняли стадии с использованием хлороформа, изопропанола и этанола в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 0,2 мл хлороформа добавляли на 1 мл Trizol, перемешивали на вортексе и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Образцы центрифугировали при 12000×g в течение 15 мин при 4°С. Получаемую в результате водную фазу переносили в новую пробирку, и РНК преципитировали добавлением 0,5 мл изопропанола на 1 мл Trizol. Пробирки энергично встряхивали ручным способом в течение 10 сек, инкубировали при 4°С в течение 10 мин и центрифугировали при 12000×g в течение 10 мин при 4°С. Преципитат РНК промывали холодным как лед 75% этанолом, добавляя по крайней мере 1 мл 75% этанола на 1 мл Trizol. Образцы встряхивали на вортексе и центрифугировали при 7400×g в течение 5 мин при 4°С. После высушивания на воздухе результирующего осадка РНК, РНК ресуспендировали в вплоть до 100 мкл не содержащей РНКазу воды. Тотальную РНК далее экстрагировали с использованием набора Rneasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя, включая стадию расщепления не содержащей РНКазу ДНКазой I (Qiagen).
Подвергнутые культивированию клетки гомогенизировали добавлением 350 мкл буфера RLT+1% β-меркаптоэтанола. Клетки соскребали с чашек для культивирования с помощью края фильтра и далее гомогенизировали пропусканием лизата через шприц, оснащенный иглой 19G, 3-5 раз. Клеточный лизат затем подвергали дальнейшей обработки, используя набор RNeasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя, включая стадию расщепления не содержащей РНКазу ДНКазой I (Qiagen).
Концентрацию и целость РНК определяли, используя инструментальное средство Nanodrop и/или Agilent Bioanalyzer, и очищенную РНК хранили при -70°С.
250 нг РНК подвергали обработке для Affymetrix GeneChips, используя набор GeneChip 3' IVT Express Kit (Affymetrix) в соответствии с инструкциями производителя. Качество РНК определяли с помощью биоанализатора Agilent 2100 Bioanalyzer. Гибридизацию с GeneChip Mouse Genome 4 30 2.0 и GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix) на GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix) выполняли в Institute of Medical Sciences Microarray Core Facility (University of Aberdeen, Великобритания). Чипы сканировали с помощью сканера Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Анализ качества изображения выполняли, используя программное обеспечение Gene Chip Operating Software (GCOS) (Affymetrix). Дальнейший анализ качества, нормализацию (gcRMA), статистический анализ и создание карты интенсивности выполняли с использованием широкодоступных пакетов программ R (http://www.r-project.org) и Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Полученные с использованием микрочипов данные предоставляли в Сборник информации, касающейся экспрессии генов, Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
Результаты
Характеристики свиней, которым давали с кормом пробиотики GGDK266 и GGDK31.
Результаты для свиней, которым давали с кормом пробиотики GGDK266 и GGDK31, представлены на фиг. 20. Ниже представлены DWG (ежедневный прирост массы), FI (потребление корма) и FCR (коэффициент трансформации корма):
Поросята, которым давали с кормом GGDK2 66, продемонстрировали значительное увеличение ежедневного прироста массы (DWG) во время первой недели после отлучения от матери по сравнению с поросятами, которым давали с кормом GGDK31 и плацебо.
Исследование разнообразия микроорганизмов, используя DGGE, (исследование 1)
DGGE с использованием универсальных праймеров не выявил различий в разнообразии всех микроорганизмов между воздействиями и плацебо (см. фиг. 21).
DGGE с использованием специфических для лактобактерий (LAB) праймеров выявил значительные различия в разнообразии LAB между воздействием GGDK266 и плацебо в образцах как слепой кишки, так и подвздошной кишки (см. фиг. 22).
DGGE с использованием специфических для LAB праймеров выявил значительные различия в разнообразии LAB между воздействием GGDK2 66 и плацебо в образцах подвздошной кишки (см. фиг. 23).
DGGE с использованием специфических для LAB праймеров выявил значительные различия в разнообразии LAB между воздействием 266 и плацебо в образцах слепой кишки (см. фиг. 24).
В целом анализ разнообразия микроорганизмов выявил значительную кластеризацию популяции LAB у поросят, которым давали с кормом GGDK266, что указывает на то, что отдельные животные после этого воздействия имеют схожую и стабильную микробиоту.
Молекулярный анализ образцов ткани подвздошной кишки: свиные ранжированные ряды Affymetrix
Уменьшение экспрессии в ответ на GGDK266 в сравнение с плацебо
Анализ онтологии дифференциально экспрессируемых генов выявил значительное уменьшение процессов, вовлеченных в функционирование иммунной системы, и провоспалительной активации в ответ на кормление молодых поросят пробиотиком GGDK2 66 по сравнению с плацебо (см. фиг. 25).
Результаты показывают, что GGDK2 66 оказывал очень специфический и нацеленный эффект на иммунную систему и функциональные группы, связанные с ответом на стимулы (см. фиг. 26).
Увеличение экспрессии в ответ на GGDK266 в сравнение с плацебо
В отличие от эффектов на иммунную систему, GGDK2 66 активировал метаболические процессы, в частности, что касается азота (см. фиг. 27). Без желания ограничиться какой-либо теорией, полагают, что эти эффекты могут объяснять увеличенный DWG у животных, которым давали с кормом GGDK2 66.
Самые дифференциально экспрессируемые гены при сравнении между GGDK266 и плацебо
Данные, касающиеся экспрессии генов, показали, что экспрессия ряда генов, в том числе генов противомикробных пептидов (например, CSTA, ВР1) и регулирующих иммунную систему генов (TIP), была значительно увеличенной. Напротив, GGDK266 уменьшал экспрессию разнообразной группы генов, вовлеченных в провоспалительные иммунные реакции (IFITM3, IL-16).
Выводы
- Клеточные и метаболические процессы, в частности, что касается азота, увеличены у животных, подвергнутых воздействию GGDK2 66 по сравнению с плацебо.
- Процессы, вовлеченные в функционирование иммунной системы, уменьшены у животных, подвергнутых воздействию GGDK2 66 по сравнению с плацебо. Примеры включают гены, относящиеся к Т-клеточным маркерам CD3 и CD8, цепям Т-клеточных рецепторов, хемокинам/цитокинам, и связанные с IFN гены.
- Животные, которым назначали GGDK266, продемонстрировали стабильную популяцию лактобактерий, выявляемую по кластеризации в бактериальном профиле индивидуума, индуцируемую при введении пробиотика GGDK2 66.
- FCR и характеристики были значительно улучшены во время первых недель жизни после отлучения от матери.
- Это улучшение характеристик роста коррелировало с уменьшением воспалительных иммунных реакций и увеличением специфического метаболического процессирования.
Квалифицированным в данной области техники специалистам будут очевидны различные модификации и вариации описанных аспектов настоящего изобретения, не выходящие за пределы объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно неоправданно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов реализации настоящего изобретения, которые будут очевидны квалифицированным в соответствующих областях специалистам, как предполагается, находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Blandino, G., Fazio, D., Di Marco, R. Probiotics: Overview of microbiological and immunological characteristics (2008). Expert Review of Anti-Infective Therapy, 6 (4), pp. 497-508.
Cintas LM, Casaus MP, Herranz C, Nes IF, Hernandez PE. Review: bacteriocins of lactic acid bacteria (2001). Food Sci Technol Int. 7(4):281-305.
Clarridge III, J.E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases (2004). Clinical Microbiology Reviews, 17 (4), pp. 840-862.
Cotter, P.D., Hill, C., Ross, R.P. Food microbiology: Bacteriocins: Developing innate immunity for food (2005). Nature Reviews Microbiology, 3 (10), pp. 777-788.
De Angelis, M., Siragusa, S., Berloco, M., Caputo, L., Settanni, L., Alfonsi, G., Amerio, M., Grandi, Α., Ragni, Α., Gobbetti, M. Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding (2006). Research in Microbiology, 157 (8), pp. 792-801
Elmadfa, I., Klein, P., Meyer, A.L. Immune-stimulating effects of lactic acid bacteria in vivo and in vitro (2010). Proceedings of the Nutrition Society, 69 (3), pp. 416-420. Gopal, P.K., Sullivan, P.A., Smart, J.B. Utilisation of galacto-oligosaccharides as selective substrates for growth by lactic acid bacteria including Bifidobacterium lactis DR10 and Lactobacillus rhamnosus DR20 (2001). International Dairy Journal, 11 (1-2), pp. 19-25.
Gousia, P., Economou, V., Sakkas, H., Leveidiotou, S., Papadopoulou, C. Antimicrobial resistance of major foodborne pathogens from major meat products (2011). Foodborne Pathogens and Disease, 8 (1), pp. 27-38.
Jackson MS, Bird AR, McOrist AL. Comparison of two selective media for the detection and enumeration of Lactobacilli in human faeces (2002). J Microbiol Methods. 51(3):313-21.65
Korhonen, J.M., Sclivagnotis, Y., Wright, A.V. Characterization of dominant cultivable lactobacilli and their antibiotic resistance profiles from faecal samples of weaning piglets (2007). Journal of Applied Microbiology, 103 (6), pp. 2496-2503.
Lähteinen, T., Malinen, Ε., Koort, J.M.K., Mertaniemi-Hannus, U., Hankimo, T., Karikoski, N., Pakkanen, S., Laine, H., Sillanpää, H., Söderholm, H., Palva, A. Probiotic properties of Lactobacillus isolates originating from porcine intestine and feces (2010). Anaerobe, 16 (3), pp. 293-300
Liu, Y., Fatheree, N.Y., Mangalat, Ν., Rhoads, J.M. Human-derived probiotic Lactobacillus reuteri strains differentially reduce intestinal inflammation (2010). American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, 299 (5), pp. G1087-G1096.
Ljungh, Α., Wadström, T. Lactic acid bacteria as probiotics (2006). Current Issues in Intestinal Microbiology, 7 (2), pp. 73-90.
Martin, R, Delgado, S, Maldonado, A, Jiménez, Ε, Olivares, M, Fernández, L, Sobrino, OJ, Rodríguez, JM. Isolation of lactobacilli from sow milk and evaluation of their probiotic potential (2009). Journal of Dairy Research, 76 (4), pp. 418-425.
Mulder IE, Schmidt B, Stokes CR, Lewis M, Bailey M, Aminov RI, Prosser JI, Gill BP, Pluske JR, Mayer CD, Musk CC, Kelly D. Environmentally-acquired bacteria influence microbial diversity and natural innate immune responses at gut surfaces (2009). BMC Biol. 7:79.
Naughton PJ; Grant G. (2005) Modelling of salmonellosis In: Microbial Ecology of the Growing Animal Holzapfel WH, Naughton PJ. (Eds). London, Elsevier, pp. 235-257 Neeser, J.-R., Granato, D., Rouvet, M., Servin, Α., Teneberg, S., Karlsson, K.-A. Lactobacillus johnsonii La1 shares carbohydrate-binding specificities with several enteropathogenic bacteria (2000). Glycobiology, 10 (11), pp. 1193-1199.
Nicolau, D.P. Current challenges in the management of the infected patient (2011).
Current Opinion in Infectious Diseases, 24 (Suppl 1), pp. S1-S10.
Ohashi, Y., Ushida, K. Health-beneficial effects of probiotics: Its mode of action (2009).
Animal Science Journal, 80 (4), pp. 361-371.
Reddy, K.B.P.K., Awasthi, S.P., Madhu, A.N., Prapulla, S.G. Role of cryoprotectants on the viability and functional properties of probiotic lactic acid bacteria during freeze drying (2009). Food Biotechnology, 23 (3), pp. 243-265.
Robertson, J.M.C., McKenzie, N.H., Duncan, M., Allen-Vercoe, E., Woodward, M.J., Flint, H.J., Grant, G. Lack of flagella disadvantages Salmonella enterica serovar Enteritidis during the early stages of infection in the rat (2003). Journal of Medical Microbiology, 52 (1), pp. 91-99.
Schreiber, O., Petersson, J., Phillipson, M., Perry, M., Roos, S., Holm, L. Lactobacillus reuteri prevents colitis by reducing P-selectin-associated leukocyte- and platelet-endothelial cell interactions (2009). American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, 296 (3), pp. G534-G542.
Smith, C.L, Geier, M.S., Yazbeck, R., Torres, D.M., Butler, R.N., Howarth, G.S. Lactobacillus fermentum BR11 and fructo-oligosaccharide partially reduce jejunal inflammation in a model of intestinal mucositis in rats (2008). Nutrition and Cancer, 60 (6), pp. 757-767.
Strasser, S., Neureiter, M., Geppl, M., Braun, R., Danner, H. Influence of lyophilization, fluidized bed drying, addition of protectants, and storage on the viability of lactic acid bacteria (2009). Journal of Applied Microbiology, 107 (1), pp. 167-177.
Tomás, M.S.J., Bru, Ε., Martos, G., Nader-Macías, M.E. Stability of freeze-dried vaginal Lactobacillus strains in the presence of different lyoprotectors (2009). Canadian Journal of Microbiology, 55 (5), pp. 544-552.
Tzortzis, G., Baillon, M.-L.A., Gibson, G.R., Rastall, R.A. Modulation of anti-pathogenic activity in canine-derived Lactobacillus species by carbohydrate growth substrate (2004). Journal of Applied Microbiology, 96 (3), pp. 552-559.
Williams, N.T. Probiotics (2010). American Journal of Health-System Pharmacy, 67 (6), pp. 449-458.
Yao, W., Zhu Wei-yun, W.-Y., Smidt, H., Verstegen, M.W.A. Cultivation-Independent Analysis of the Development of the Lactobacillus spp. Community in the Intestinal Tract of Newborn Piglets (2011) Agricultural Sciences in China, 10 (3), pp. 438-447.
Yun, J.H., Lee, K.B., Sung, Y.K., Kim, E.B., Lee, H.-G., Choi, Y.J. Isolation and characterization of potential probiotic lactobacilli from pig feces (2009). Journal of Basic Microbiology, 49 (2), pp. 220-226.