Питательная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa
NUTRIENT MEDIUM FOR PSEUDOMONAS AERUGINOSA RELEASE

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии и может быть использовано для обнаружения бактерий рода Pseudomonas при исследовании различного биологического материала, а также объектов окружающей среды с целью выделения бактерий рода Pseudomonas - возбудителей инфекционных заболеваний человека.
Синегнойная палочка способна вызывать различные заболевания, картина заболевания и симптоматика зависят от локализации инфекции. Характерной особенностью всех заболеваний, вызванных Pseudomonas aeruginosa, является длительное течение при хронической форме и острая форма, которая лечится так же трудно, как и хроническая, поскольку бактерия обладает высокой резистентностью к антимикробным препаратам. Так, она может стать возбудителем энцефалита, цистита, пневмонии или остеомиелита. Она способна размножаться в кишечнике, среднем ухе, абсцессах и ранах.
Лабораторная диагностика синегнойной палочки не представляет трудностей, поскольку синегнойная палочка хорошо растет на различных питательных средах.
Выделение на питательной среде чистых культур микроорганизмов с характерными для псевдомонад культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами требует постановки целого ряда подтверждающих тестов, а, следовательно, значительного времени и материальных затрат.
Быстрота получения результатов при микробиологических исследованиях в значительной степени влияет на диагностику, проведение терапевтических и противоэпидемических мероприятий.
Алгоритм бактериологического исследования инфекций синегнойной палочки соответствует той же схеме, что и при заболеваниях, вызванных энтеробактериями. При нецеленаправленном исследовании выявления псевдомонад посев производят на любую из общепринятых питательных сред: 1,5% питательный агар, 5% кровяной агар, агар Эндо, и инкубируют посевы при температуре 37°С в течение 18-24 часов.
Известны питательные среды для дифференциации псевдомонад, принцип действия которых основан на способности P. aeruginosa синтезировать феназиновый пигменты - пиоцианин, флуоресцеин или пиовердин, а также другие пигменты (пиорубин, пиомеланин, аоксифеназин), но, не обладающие выраженным ингибирующим эффектом в отношении микробов ассоциантов, и, следовательно, не могут быть использованы для одноэтапного выделения псевдомонад.
В частности, среда Кинг А используется для дифференциации синегнойной палочки и усиления способности продуцировать сине-зеленый пигмент пиоцианин и образования некоторыми штаммами синегнойной палочки другого пигмента - пиорубина, дающий красное окрашивание [Методические рекомендации «Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала», Методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)»].
Среда Хью-Лейфсена с глюкозой применяется для определения способности псевдомонад окислять глюкозу до глюконовой кислоты только в аэробных условиях. При положительной реакции происходит порозовение среды в столбике среды в аэробных условиях, при отсутствии роста и изменения цвета среды в анаэробных условиях [Методические рекомендации «Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала»,Методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonasaeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)»].
Среда с ацетамидом так же является дифференциальной средой для синегнойной палочки, основанный на ее способности использовать ацетамид в качестве единственного источника азота и углерода [Методические рекомендации «Выделение и идентификация штаммов синегнойной палочки из клинического материала», Методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)»].
Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является питательная среда для выделения синегнойной палочки (ЦДХ агар) производства «Микроген» на основе пептона, с сульфатами калия и магния, углекислым натрием, фенозан-кислотой, цетилпиридинием хлористым и агаром, обеспечивающая рост псевдомонад и продуцирование пиоцианина (феназиновый пигмент, окрашивающий питательную среду в сине-зеленый цвет), а также ингибицию ряда сопутствующих грамположительных и грамотри цательных микроорганизмов. [ПРИКАЗ от 22 апреля 1985 года N 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», ГФ XIV т. 1 (ОФС. 1.2.4.0002.18].
Биохимические характеристики коммерческой сухой питательной среды (производства «Микроген») для выделения синегнойной палочки представлены в таблице 2.
Недостатками ЦПХ агара (производства «Микроген»)являются:
- отсутствие отечественного производства фенозана и его производных, и высокая стоимость импортного препарата;
- слабые селективные свойства в отношении сопутствующей микрофлоры (сальмонелл, протея и клебсиелл)
- сниженная чувствительность среды в отношении псевдомонад, ввиду высокой концентрации N-цетилпиридиния хлористого.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для выделения псевдомонад, обладающей высокой чувствительностью, стабильностью результатов по ростовым, дифференцирующим и ингибирующим свойствам с целью обеспечения доступности и получения объективных результатов бактериологического контроля, сокращающих время и материальные затраты при лабораторных исследованиях.
Технический результат достигается тем, что предложена питательная среда, содержащая в качестве источника азотистого питания панкреатический гидролизат рыбной муки, сульфаты калия и магния, фосфаты калия и натрий углекислый в качестве стабилизатора рН, N-цетилпиридиний хлористый в качестве ингибитора, комплекс антиоксидантов - фенозан кислота и бутилгидрокситолуол, агар бактериологический при следующем содержании компонентов:
- Панкреатический гидролизат рыбной муки
20,0±3,0 г
- Калий сернокислый
7,6±0,76 г
- Магний сернокислый 7-водный
2,4±0,24 г
- Калий фосфорнокислый однозамещенный
1,0±0,1 г
- Калий фосфорнокислый двузамещенный
1,0±0,1 г
- Фенозан-кислота
0,025±0,0025 г
- Бутилгидрокситолуол
0,075±0,0075 г
- N-цетилпиридиний хлористый 1 водн (ЦПХ)
0,2±0,05 г
- Агар бактериологический
9,0±2,0 г
- Натрий углекислый
0,2±0,05 г
- Дистиллированная вода
1000 мл
Питательная среда для выделения синегнойной палочки представляет собой смесь сухих компонентов из расчета, г/л.
Совокупность компонентов, входящих в состав среды обеспечивает питательные потребности для роста псевдомонад с образованием пигментов. N-цетилпиридиний хлористый в предложенной концентрации 0,2 г/л (в среде прототипе 0,3 г/л) подавляет рост возможных бактерий ассоциантов и при этом не влияет на чувствительность среды и способность псевдомонад к пигментообразованию. Комплекс антиоксидантов (фенозан кислота и бутилгидрокситолуол) предотвращает окисление жирорастворимых витаминов А и Е, помогает вырабатывать больше необходимой клеткам энергии, способствует накоплению биомассы. При изучении селективных свойств среды без добавления N-цетилпиридиния хлористого и мягкой стерилизации кипячением было отмечено, что на среде с комплексом антиоксидантов в отличие от одного фенозана, полностью подавляется возможный поверхностный и глубинный пророст микрофлоры, присутствующей в сырье. Среда стерилизуется кипячением до полного расплавления агара.
Проведены исследования по определению оптимума рН среды, влиянию на выделение псевдомонад фенозан-кислоты и бутилгидрокситолуола, влиянию магния сернокислого, калия сернокислого на пигментообразование, влиянию различных концентраций N-цетилпиридиния хлористого совместно с комплексом антиоксидантов на ростовые и ингибирующие свойства предлагаемой питательной среды.
По результатам работ составлена пропись питательной среды для выделения синегнойной палочки и установлено количественное содержание компонентов в г.
Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование комплекса антиоксидантов и фосфатов калия, уменьшенная концентрация N-цетилпиридиния хлористого. Технический результат достигается также сбалансированностью компонентного состава среды в экспериментально установленных концентрациях. Доказана возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ), в качестве белковой питательной основы. Количественное соотношение компонентов питательной среды, рН, обеспечивают сохранение хороших ростовых и ингибирующих свойств. Готовая среда сохраняет стерильность не менее 10 суток.
Пример 1. Способ получения питательной среды.
Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:
- Панкреатический гидролизат рыбной муки
17,0
- Калий сернокислый.........
6,84
- Магний сернокислый 7-водный.........
2,16
- Калий фосфорнокислый однозамещенный......
0,9
- Калий фосфорнокислый двузамещенный......
0,9
- Фенозан-кислота......
0,0225
- Бутилгидрокситолуол...
0,0675
- N-цетилпиридиний хлористый 1 водн....
0,15
- Агар бактериологический.........
7,0
- Натрий углекислый......
0,15
- Вода дистиллированная
1000 мл
Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют кипячением в течение 2 мин. до полного расплавления агара.
Используемые для контроля среды тест-штаммы микроорганизмов получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКГГМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.
-6
-3
-1
Готовят стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до необходимых разведений: 10, 10 и 10 и использовали для контроля среды.
Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч.
-6
-3
-1
Предлагаемая среда, обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10 Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Pseudomonas aeruginosa АТСС 10145, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Pseudomonas aeruginosa 453, Pseudomonas aeruginosa 27/99, ингибицию при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов: Escherichia coli 3912/41 (055:К59), Proteus vulgaris ИХ 19 222 из разведения 10, Staphylococcus aureus Wood-46 из разведения 10 через 48 часов инкубации посевов при температуре (37±1)°С
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3.
Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.
- Панкреатический гидролизат рыбной муки...
20,0
- Калий сернокислый......
7,6
- Магний сернокислый 7-водный......
2,4
- Калий фосфорнокислый однозамещенный......
1,0
- Калий фосфорнокислый двузамещенный......
1,0
- Фенозан-кислота...
0,025
- Бутилгидрокситолуол.................................
0,075
- N-цетилпиридиний хлористый 1 водн....
0,2
- Агар бактериологический...
9,0
- Натрий углекислый.............
0,2
- Вода дистиллированная
1000 мл
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.
- Панкреатический гидролизат рыбной муки...
23,0
- Калий сернокислый.........
8,36
- Магний сернокислый 7-водный......
2,64
- Калий фосфорнокислый однозамещенный...
1,1
- Калий фосфорнокислый двузамещенный...
1,1
- Фенозан-кислота......
0,0275
- Бутилгидрокситолуол...............
0,0825
- N-цетилпиридиний хлористый 1 водн....
0,25
- Агар бактериологический......
11,0
- Натрий углекислый............
0,25
- Вода дистиллированная
1000 мл
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.
- Панкреатический гидролизат рыбной муки...
14,0
- Калий сернокислый...............
6,08
- Магний сернокислый 7-водный......
1,92
- Калий фосфорнокислый однозамещенный...
0,8
- Калий фосфорнокислый двузамещенный......
0,8
- Фенозан-кислота...............
0,02
- Бутилгидрокситолуол...............
0,06
- N-цетилпиридиний хлористый 1 водн.
0,1
- Агар бактериологический............
5,0
- Натрий углекислый....
0,1
- Вода дистиллированная
1000 мл
Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к ухудшению ростовых свойств в отношении псевдомонад и ингибирующих свойств к микробам ассоциантам.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3.
Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.
- Панкреатический гидролизат рыбной муки......
26,0
- Калий сернокислый...............
9,12
- Магний сернокислый 7-водный.........
2,88
- Калий фосфорнокислый однозамещенный...
1,2
- Калий фосфорнокислый двузамещенный......
1,2
- Фенозан-кислота............
0,03
- Бутилгидрокситолуол............
0,09
- N-цетилпиридиний хлористый 1 водн....
0,3
- Агар бактериологический.........
13,0
- Натрий углекислый............
0,3
- Вода дистиллированная
1000 мл
Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и показывают ухудшение ростовых свойств среды для выделения псевдомонад.
Из таблиц видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает высокой чувствительностью, стабильностью ростовых свойств и пигментообразования в отношении псевдомонад, подавляет рост сопутствующих микроорганизмов. Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предлагаемой селективной среды для выделения псевдомонад.
Так, в случае приготовления среды в соответствии с примером 4 наблюдается увеличение диаметра колоний контрольных тест-штаммов псевдомонад, колонии приобретают R -форму, а также наблюдается роение протея. В случае приготовления среды в соответствии с примером 5 - снижается чувствительность среды в отношении штамма Pseudomonasa eruginosa АТСС 9027 (NCTC 12924), уменьшается размер колоний.
Таким образом, по сравнению со средой прототипом предлагаемая питательная среда является отечественной, конкурентоспособной средой для селективного выделения и дифференциации псевдомонад, обладает высокой чувствительностью и пигментообразованием, обеспечивает ингибицию сопутствующей микрофлоры