МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФАКТОР IX, А ТАКЖЕ КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В КЛЕТКИ, ОРГАНЫ И ТКАНИ

1. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок человеческого фактора IX, где указанная нуклеиновая кислота содержит уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению с последовательностью дикого типа, кодирующей человеческий фактор IX.
2. Вектор или плазмида экспрессии, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок человеческого фактора IX, где указанная нуклеиновая кислота содержит уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению с нативной последовательностью, кодирующей человеческий фактор IX, и/или где указанные вектор или плазмида могут содержать одну или несколько последовательностей, вспомогательных по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX, причем указанные вспомогательные последовательности необязательно содержат уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению с нативной последовательностью или последовательностью дикого типа.
3. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок человеческого фактора IX по п.1, вектор или плазмида экспрессии по п.2, или композиция по п.3, дополнительно содержащие интрон, элемент, регулирующий экспрессию, один или несколько инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или филлерную полинуклеотидную последовательность, необязательно, где указанный интрон, элемент, регулирующий экспрессию, инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат уменьшенное число динуклеотидов CpG по сравнению с соответствующими нативными последовательностями или последовательностями дикого типа элемента, регулирующего экспрессию, инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или филлерной полинуклеотидной последовательности.
4. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок человеческого фактора IX по п.4, где интрон находится в последовательности, кодирующей белок человеческого фактора IX, или где элемент, регулирующий экспрессию, функционально связан с последовательностью, кодирующей белок человеческого фактора IX, или где ITR AAV фланкирует 5'- или 3'-конец последовательности, кодирующей человеческий фактор IX, или где филлерная полинуклеотидная последовательность фланкирует 5'- или 3'-конец последовательности, кодирующей белок человеческого фактора IX.
5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 1-5 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
6. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 5-10 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
7. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 10-15 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
8. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 15-20 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
9. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 20-25 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
10. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 26-30 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
11. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 30-40 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
12. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность содержат на 40-55 динуклеотидов CpG меньше, чем нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX.
13. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, интрон, элемент, регулирующий экспрессию, ITR и/или филлерная полинуклеотидная последовательность совсем не содержат динуклеотиды CpG.
14. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, содержит последовательность, на 80% или более идентичную SEQ ID NO: 10, и кодирует функциональный фактор IX согласно анализу свертывания крови.
15. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, содержит последовательность, на 90% или более идентичную SEQ ID NO: 10, и кодирует функциональный фактор IX согласно анализу свертывания крови.
16. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, содержит последовательность, на 95% или более идентичную SEQ ID NO: 10, и кодирует функциональный фактор IX согласно анализу свертывания крови.
17. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, содержит SEQ ID NO: 10, 25 или 26.
18. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где нативная последовательность, кодирующая человеческий фактор IX, содержит последовательность, описанную в SEQ ID NO: 11.
19. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где интронная последовательность содержит последовательность, описанную в SEQ ID NO: 17.
20. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит энхансерную последовательность, содержащую последовательность, описанную в SEQ ID NO: 14.
21. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит промоторную последовательность, содержащую последовательность, описанную в SEQ ID NO: 15.
22. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где последовательность одного или нескольких инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) содержит последовательность, описанную в SEQ ID NO: 13 и/или SEQ ID NO: 20.
23. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где филлерная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность, описанную в SEQ ID NO: 21.
24. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, обладает пониженной способностью индуцировать иммунный ответ.
25. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, экспрессируется на уровнях, превышающих уровень, или сравнимых с уровнем нативной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX, не содержащий уменьшенное число динуклеотидов CpG.
26. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок человеческого фактора IX, по любому из пп.1-5, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит конститутивный или регулируемый контролирующий элемент, или тканеспецифический элемент, регулирующий экспрессию, или промотор.
27. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок человеческого фактора IX, по любому из пп.1-5, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит элемент, обеспечивающий экспрессию в печени.
28. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5, где элемент, регулирующий экспрессию, содержит промотор человеческого α1-антитрипсина (hAAT) и/или энхансер аполипопротеина E (ApoE) HCR-1 и/или HCR-2.
29. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок человеческого фактора IX, по любому из пп.1-5, дополнительно содержащая последовательность полиаденилирования, расположенную на 3'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX.
30. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок человеческого фактора IX, по п.29, где последовательность полиаденилирования, расположенная на 3'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX, содержит последовательность полиаденилирования bGH.
31. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX по п.29, где последовательность полиаденилирования, расположенная на 3'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий фактор IX, содержит последовательность полиаденилирования, содержащую все динуклеотиды CpG, удаленные из нее.
32. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по п.31, где последовательность полиаденилирования содержит последовательность, описанную в SEQ ID NO: 19.
33. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по п.4 или 5, где филлерная полинуклеотидная последовательность расположена на 3'-конце последовательности, кодирующей человеческий белок FIX.
34. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по п.4 или 5, где ITR AAV фланкируют 3'-конец последовательности, кодирующей человеческий белок FIX.
35. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по п.34, где филлерная полинуклеотидная последовательность расположена на 3'-конце ITR AAV, фланкирующих 3'-конец последовательности, кодирующей человеческий белок FIX.
36. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий белок FIX, по п.4 или 5, где филлерная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность фага лямбда.
37. Плазмидная последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок FIX, по любому из пп.1-36, и дополнительно содержащая одну или несколько точек начала репликации и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую устойчивость к антибиотику.
38. Плазмидная последовательность, кодирующая человеческий белок FIX, содержащая SEQ ID NO: 12 или 26.
39. Вирусный вектор, содержащий последовательность, кодирующую человеческий белок FIX, или вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий белок FIX, по любому из пп.1-5.
40. Вирусный вектор по п.39, где указанный вирусный вектор представляет собой ленти- или аденовирусный вектор.
41. Вирусный вектор по п.39, где указанный вирусный вектор представляет собой вектор, полученный из аденоассоциированного вируса (AAV).
42. Вектор AAV по п.41, содержащий последовательность ITR любого из серотипов AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.
43. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит капсидную последовательность VP1, VP2 и/или VP3, на 90% или более идентичную последовательности VP1, VP2 и/или VP3 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.
44. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит капсидную последовательность VP1, VP2 или VP3, выбранную из любого из серотипов AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.
45. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит последовательность VP1, на 90% или более идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, или содержит 1-50 аминокислотных замен, делеций или добавлений по отношению к указанной последовательности; последовательность VP2, на 90% или более идентичную последовательности SEQ ID NO: 2, или содержит 1-50 аминокислотных замен, делеций или добавлений по отношению к указанной последовательности; и/или последовательность VP3, на 90% или более идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, или содержит 1-50 аминокислотных замен, делеций или добавлений по отношению к указанной последовательности.
46. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит аминокислотную замену в одном из аминокислотных положений 195, 199, 201 или 202 капсидной последовательности VP1, описанной в SEQ ID NO: 1, или аминокислотную замену аргинина на лизин в капсидной последовательности VP1, описанной в SEQ ID NO: 1.
47. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит остатки одной из аминокислот A, V, P или N в одном из аминокислотных положений 195, 199, 201 или 202 капсидной последовательности VP1, описанной в SEQ ID NO: 1.
48. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит остаток A в аминокислотном положении 195; остаток V в аминокислотном положении 199, остаток P в аминокислотном положении 201 или остаток N в аминокислотном положении 202 капсидной последовательности VP1, описанной в SEQ ID NO: 1.
49. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит два, три или четыре остатка А в аминокислотном положении 195; остаток V в аминокислотном положении 199, остаток P в аминокислотном положении 201 или остаток N в аминокислотном положении 202 капсидной последовательности VP1, описанной в SEQ ID NO: 4.
50. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит капсидную последовательность VP1, на 90% или более идентичную одной из последовательностей SEQ ID NO: 4-9.
51. Вектор AAV по п.41, где капсидная последовательность вектора содержит капсидную последовательность VP1, содержащую одну из последовательностей SEQ ID NO: 4-9.
52. Фармацевтическая композиция, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий белок FIX, по любому из пп.1-38, и/или вирусный вектор по любому из пп.39-51.
53. Фармацевтическая композиция по п.52, дополнительно содержащая пустой капсид AAV.
54. Фармацевтическая композиция по п.53, где пустой капсид выбран из капсидов серотипов AAV AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAV11.
55. Вектор экспрессии, содержащий SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 25.
56. Вектор экспрессии по п.55, который дополнительно содержит энхансерную последовательность, содержащую последовательность, описанную в SEQ ID NO: 14.
57. Вектор экспрессии по п.55, который дополнительно содержит промоторную последовательность, содержащую последовательность, описанную в SEQ ID NO: 15.
58. Вектор экспрессии по п.55, дополнительно содержащий вышестоящий и/или нижестоящий ITR AAV2, как описано в SEQ ID NO: 12 или 26, где указанный вышестоящий ITR находится на 5'-конце энхансера и/или указанный нижестоящий ITR AAV2 находится на 3'-конце экзонов 2-8 hFIX, как описано в SEQ ID NO: 12 или 26.
59. Вектор экспрессии по п.55, дополнительно содержащий последовательность полиA, расположенную на 3'-конце экзонов 2-8 hFIX, как описано в SEQ ID NO: 12 или 26, и на 5'-конце нижестоящего ITR AAV2.
60. Вектор AAV, содержащий вектор экспрессии по любому из пп.55-59.
61. Вектор AAV по п. 60, где капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1, содержащую одну из последовательностей SEQ ID NO: 4-9.
62. Способ доставки или переноса нуклеотидной последовательности в клетку, включающий приведение нуклеотидной последовательности, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп.1-61 в контакт с указанной клеткой млекопитающего в условиях, обеспечивающих трансдукцию указанной клетки, тем самым обеспечивая доставку или перенос нуклеотидной последовательности в клетку млекопитающего.
63. Способ доставки или переноса нуклеотидной последовательности в организм или клетку млекопитающего, включающий введение нуклеотидной последовательности, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп.1-61 в организм или клетку указанного млекопитающего, тем самым обеспечивая доставку или перенос нуклеотидной последовательности в организм или клетку млекопитающего.
64. Способ лечения млекопитающего, нуждающегося в белке фактора IX, включающий: (a) получение нуклеотидной последовательности, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп.1-61; и (b) введение млекопитающему количества нуклеотидной последовательности, вектора экспрессии или вирусного вектора по любому из пп.1-61, где указанный фактор IX экспрессируется в организме млекопитающего.
65. Способ по любому из пп.62-64, где указанный белок фактора XI экспрессируется в клетке, ткани или органе указанного млекопитающего.
66. Способ по п.65, где клетка включает секреторную клетку.
67. Способ по п.65, где клетка включает эндокринную клетку.
68. Способ по п.65, где клетка включает гепатоцит, нейронную клетку, глиальную клетку, клетку сетчатки, эпителиальную клетку, клетку легкого или тотипотентную, плюрипотентную или мультипотентную стволовую клетку.
69. Способ по п.65, где ткань или орган указанного млекопитающего включает печень, головной мозг, центральную нервную систему, спинной мозг, глаз, сетчатку или легкое.
70. Способ по любому из пп.62-69, где млекопитающее продуцирует недостаточное количество белка фактора IX, или дефектный или аберрантный белок фактора IX.
71. Способ по любому из пп.62-69, где млекопитающее страдает от гемофилии B.
72. Способ по любому из пп.62-69, где нуклеотидную последовательность, вектор экспрессии или вирусный вектор доставляют млекопитающему внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, перорально, путем интубации, через катетер, дермально, интракраниально, посредством ингаляции, внутрь полости или через слизистую оболочку.
73. Способ по любому из пп.62-69, где млекопитающее представляет собой человека.
74. Способ по любому из пп.62-69, где млекопитающее является сероположительным или сероотрицательным по серотипу AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или AAV-Rh74.
75. Способ по любому из пп.62-69, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV.
76. Способ по любому из пп.62-69, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и/или AAV-Rh74.
77. Способ по любому из пп.62-69, дополнительно включающий введение пустого капсида AAV, который относится к тому же серотипу, что и вектор AAV.
78. Способ по любому из пп.62-69, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающего на уровнях, обеспечивающих терапевтический эффект у млекопитающего.
79. Способ по любому из пп.62-69, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающего на уровнях, обеспечивающих терапевтический эффект в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, недель или месяцев.
80. Способ по любому из пп.62-69, где указанный белок фактора IX присутствует в организме млекопитающего на уровнях, соответствующих примерно 20% активности FIX или более 20% активности, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
10
11
11
12
12
13
13
14
81. Способ по любому из пп.62-69, где вирусный вектор вводят в дозе, находящейся в диапазоне примерно 1×10-1×10, 1×10-1×10, 1×10-1×10, или 1×10-1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) млекопитающего.
12
82. Способ по любому из пп.62-69, где вирусный вектор вводят в дозе, составляющей менее 1×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) тела млекопитающего, причем указанный белок фактора IX продуцируется в организме млекопитающего на уровнях, соответствующих примерно 20% активности или более 20% активности, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
11
83. Способ по любому из пп.62-69, где вирусный вектор вводят в дозе, составляющей менее 5×10 векторных геномов на килограмм (вг/кг) тела млекопитающего, причем указанный белок фактора IX продуцируется в организме млекопитающего на уровнях, соответствующих примерно 20% активности или более 20% активности, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
84. Способ по любому из пп.62-69, где указанная нуклеотидная последовательность, вектор экспрессии или вирусный вектор при введении млекопитающему не вызывают значительного иммунного ответа против белка фактора IX и/или вирусного вектора.
85. Способ по любому из пп.62-69, в котором значительный иммунный ответ против белка фактора IX и/или вирусного вектора не индуцируется в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
86. Способ по любому из пп.62-69, где у млекопитающего отсутствует значительный иммунный ответ против белка фактора IX.
87. Способ по п.62-69, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ против белка фактора IX, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX.
88. Способ по любому из пп.62-69, где у млекопитающего не развивается значительный иммунный ответ против белка фактора IX, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
89. Способ по любому из пп.62-69, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ против белка фактора IX, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
90. Способ по любому из пп.62-69, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ на вектор AAV, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX.
91. Способ по любому из пп.62-69, где у указанного млекопитающего не развивается иммунный ответ на вектор AAV, достаточный для уменьшения или блокирования терапевтического эффекта белка фактора IX, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
92. Способ по любому из пп.62-69, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающим в количествах или на уровнях активности, обеспечивающих терапевтический эффект в отношении млекопитающего без введения иммуносупрессорного средства (например, стероида).
93. Способ по любому из пп.62-69, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающим в количествах или на уровнях активности, обеспечивающих терапевтический эффект в отношении млекопитающего без введения иммуносупрессорного средства (например, стероида), в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней, недель или месяцев.
94. Способ по любому из пп.62-69, где у указанного млекопитающего не наблюдаются аномально высокие уровни ферментов печени ALT, AST и/или LDH в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
95. Способ по любому из пп.62-69, где у указанного млекопитающего не наблюдаются аномально высокие, требующие использования иммуносупрессорного средства (например, стероида), уровни ферментов печени ALT, AST и/или LDH в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
96. Способ по любому из пп.62-69, где указанный белок фактора IX экспрессируется у млекопитающего на уровнях, превышающих уровни FIX в кровотоке, необходимые для уменьшения продолжительности, тяжести или частоты спонтанных суставных кровотечений или мозгового кровотечения, в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев.
97. Способ по любому из пп.62-69, где указанный белок фактора IX экспрессируется в организме млекопитающего в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 непрерывных дней, недель или месяцев на уровнях, позволяющих избежать применения или введения рекомбинантного белка FIX после введения вектора AAV.
98. Рекомбинантный вектор AAV для лечения гемофилии B, содержащий капсид и геном, где указанный капсид содержит белок VP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; а указанный геном является одноцепочечным и содержит следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:
(a) первый ITR AAV2,
(b) энхансер ApoE HCR-1,
(c) промотор AAT,
(d) кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая человеческий фактор IX Padua, где нуклеиновая кислота не содержит по меньшей мере один динуклеотид CpG, который в противном случае присутствует,
(e) последовательность полиаденилирования; и
(f) второй ITR AAV2.
99. Вектор rAAV по п.98, где
(a) нуклеотидная последовательность первого ITR AAV2 состоит из нуклеотидов 1-141 последовательности SEQ ID NO: 12,
(b) нуклеотидная последовательность указанного энхансера ApoE HCR-1 состоит из нуклеотидов 152-472 последовательности SEQ ID NO: 12,
(с) нуклеотидная последовательность указанного промотора АТТ состоит из нуклеотидов 482-878 последовательности SEQ ID NO: 12,
(d) нуклеотидная последовательность указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант человеческого фактора IX Padua, состоит из нуклеотидов 908-3731 последовательности SEQ ID NO: 12,
(e) нуклеотидная последовательность указанной последовательности полиаденилирования состоит из нуклеотидов 3820-4047 последовательности SEQ ID NO: 12; и
(f) нуклеотидная последовательность указанного второго ITR AAV2 состоит из нуклеотидов 4097- 4204 последовательности SEQ ID NO: 12.
100. Вектор rAAV по п.99, где геном содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидам 1-4204 последовательности SEQ ID NO: 12.
101. Способ лечения человека, страдающего от гемофилии В, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества вектора rAAV по любому из пп.98 или 99.
102. Способ по п.101, где индивидуум страдает от тяжелой гемофилии В, и где указанное лечение приводит к эффективному уменьшению симптомов гемофилии от тяжелой до умеренной или легкой формы гемофилии B.
103. Способ по п.101, где указанное лечение является эффективным в отношении достижения уровня активности FIX в плазме, составляющего по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% от нормальной активности FIX.
104. Способ по п.103, где указанное лечение является эффективным в отношении достижения уровня активности FIX в плазме в течение продолжительного периода времени, составляющего по меньшей мере 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года, 3,5 года, 4 года, 4,5 года или 5 лет.
105. Способ по п.104, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 1% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
106. Способ по п.104, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 5% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
107. Способ по п.104, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 10% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
108. Способ по п.104, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 20% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
109. Способ по п.104, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 30% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
110. Способ по п.104, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 40% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
111. Способ по п.104, где указанное лечение является эффективным для достижения по меньшей мере 20% активности FIX в плазме в течение длительного периода, составляющего по меньшей мере 6 месяцев.
11
112. Способ по п. 111, где терапевтически эффективное количество указанного вектора AAV составляет примерно 5,0×10 вг/кг.
113. Способ по п.101, где лечение приводит к эффективному уменьшению частоты, с которой среднему человеку с тяжелой гемофилией B требуется заместительная терапия белком FIX для поддержания адекватного гемостаза, примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
114. Способ по п.101, где лечение эффективно уменьшает частоту спонтанных кровотечений в суставах человека с тяжелой гемофилией В примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% по сравнению со средним человеком с тяжелой гемофилией B, не получающим лечение.
115. Способ по п.103, где указанный вектор AAV индуцирует титр антител против капсида, который не превышает 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15 или 1:20 при определении, по меньшей мере, через 4 недели после введения.
116. Способ по п.103, где указанный вектор AAV индуцирует Т-клеточный иммунный ответ против капсида, который при измерении с помощью анализа ELISPOT соответствует не более 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 пятнообразующим единицам на 1 млн РВМС, если анализ проводят не менее чем через 4 недели после введения.
117. Способ по п.103, где указанный вектор AAV индуцирует повышение уровня фермента печени не более чем на 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 100%, 200%, 300%, 400% или 500% от верхнего предела нормального (ULN) значения для фермента.
118. Способ по п.117, где указанный фермент представляет собой аланинаминотрансферазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST) или лактатдегидрогеназу (LDH).
119. Способ по п.101, где указанное лечение является эффективным для достижения средней активности FIX в плазме, которая составляет по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30% или 40% от нормальной, со стандартным отклонением менее 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, при измерении по меньшей мере через 8 недель после введения вектора.
120. Способ по любому из пп.101-119, где указанный вектор AAV вводят в составе фармацевтической композиции, содержащей пустые капсиды, где указанные пустые капсиды содержат белок VP1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
121. Способ по п.120, где отношение пустых капсидов к указанному вектору AAV составляет примерно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1.
122. Клетка-хозяин, содержащая непрерывную нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 1-4204 последовательности SEQ ID NO: 12.
123. Клетка-хозяин по п.122, дополнительно содержащая белок rep AAV, капсидный белок AAV и аденовирусный хелперный белок (белки).
124. Клетка-хозяин по п.123, где капсидный белок AAV содержит последовательность SEQ ID NO: 4, или последовательность, идентичную ей на 90% или более.
125. Клетка-хозяин по п.123, где клетка-хозяин экспрессирует белок FIX Padua.
126. Способ получения вектора AAV, содержащего нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1-4204 SEQ ID NO: 12, который включает культивирование клетки-хозяина по п.123 в условиях, обеспечивающих упаковку нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидов 1-4204 SEQ ID NO: 12, в частицы AAV, с получением вектора AAV.
127. Способ по п.126, дополнительно включающий очистку или выделение полученного таким образом вектора AAV.
128. Вектор AAV, полученный способом по п.126.
129. Выделенный или очищенный вектор AAV, полученный способом по п.127.