Возможная функция гена ribT Bacillus subtilis: теоретическое предсказание, клонирование и экспрессия

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 577.322.4

Возможная функция гена ribT Bacillus subtilis: теоретическое предсказание, клонирование и экспрессия

А. П. Якимов1,2, Т. А. Серегина3, А. А. Холодняк3, Р. А. Кренева1, А. С. Миронов3,

Д. А. Перумов]1, А. Л. Тимковский1,2*

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова НИЦ Курчатовский институт, 188300, Ленинградская обл., Гатчина, Орлова роща

2Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, 195251, Санкт-Петербург, ул. Политехническая, 29

3Государственный институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Москва, 1-й Дорожный пр., 1 *E-mail: alt@AT1660.spb.edu Поступило в редакцию 24.04.2014

РЕФЕРАТ Полная расшифровка функций и взаимодействия элементов оперона биосинтеза рибофлавина (rib-оперон) у Bacillus subtilis необходима для создания сверхпродуцентов этого важнейшего витамина. Функция гена ribT, замыкающего оперон, до сих пор не определена. В представленной работе проведен поиск гомологов гипотетической аминокислотной последовательности продукта этого гена в базах данных, а также анализ гомологий, теоретически предсказано распределение элементов вторичной структуры, предложена третичная структура белка RibT. Нуклеотидная последовательность гена ribT была ампли-фицирована и клонирована в стандартный мультикопийный экспрессионный вектор pET15b, а затем экспрессирована после индукции ИПТГ в клетках Escherichia coli BL21(DE3), содержавших индуцибельный ген РНК-полимеразы фага Т7. Экспрессия гена ribT подтверждена электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Белковый продукт экспрессии очищен с помощью аффинной хроматографии. Таким образом, показана принципиальная возможность получения белка RibT в количествах, достаточных для дальнейшего изучения его структуры и функциональной активности.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА биоинформатика, индуцибельная экспрессия, клонирование гена, поиск гомологий, про-теомика, теоретическая структура белка.

Основные этапы биосинтеза рибофлавина в клетках Bacillus subtilis были выяснены ранее. Оказалось, что этот процесс определяется двумя участками генома: rib-опероном и геном бифункциональной флавокиназы/FAD-синтазы ribC, входящим в состав оперона truB-rpsO [1, 2]. В состав rib-оперона, контролирующего весь путь образования рибофлавина, начиная с гуанозин-5'-трифосфата (стартовый предшественник), входят пять неперекрывающихся генов. Это четыре последовательно расположенных структурных гена: ribG (кодирует бифункциональную ами-нопиримидиндезаминазу/урацилредуктазу), ribB (ген рибофлавинсинтазы), ribA (ген GTP-циклогидролазы), ribH (ген люмазинсинтазы), а также замыкающий оперон - ген ribT, функция которого до настоящего времени не определена. Кроме того, этот оперон содержит три регуляторных элемента: регуляторную зону ribO с основным промотором Р1 и два дополнительных внутренних промотора Р2 и Р3.

Ранее нами была определена относительная функциональная активность всех трех промоторов оперона [3]. При этом обнаружилось парадоксальное явление: промоторы Р2 и Р3 при их испытании порознь в составе соответствующих фрагментов оперона значительно различались по транскрипционной активности. Промотор Р3, регулирующий транскрипцию гена ггЬТ, в несколько раз превосходил по активности основной промотор Р1. Промотор Р2, наоборот, был в десятки раз слабее Р1. При этом ни Р2, ни Р3 не регулируются флавинами, однако известно, что при транскрипции всего ггЬ-оперона под контролем основного промотора Р1 все элементы этого опе-рона транскрибируются согласованно с образованием полицистронной мРНК [4]. И это несмотря на наличие нескольких промоторов, различающихся по транскрипционной активности и механизму регуляции.

Функция гена ггЬТ (по другим номенклатурам ургК) до настоящего времени остается совершен-

Conf llllllllllllll lllllllllll II Pred

Pied CCCCCCCKHKKKHHHHHCCCCCCCCHKHHHHHHHHHHCCC AA

10 20 30 40

Conf

Pred

Pred

AA

Conf

Pred

Pred

AA

IiiIIIIIiIIbIIIIIIIIIiIIIIIIIIIIiIIIUIIE

CCEEEEEEECCCEEEEEEEEEECCEEEEEEEEECCCCCCC

DRQLFLWKEDEDIVGAIGVEKKDSEVEIRHISVNPSHRHQ

50

60

70

80

<L

-q:

CHHHHHHHHHHHHCCCCEEECCHHHHHHHHHHCCCCCCCC

GIGKQMMDALKHLFKTQVLVPNELTQSFFERCQGQQDQDI

90

100

110

120

Рис. 1. Предсказание элементов вторичной структуры продукта гена ribT. СоП - надежность предсказания, Pred - расчетные данные, АА - аминокислота

но неясной. Получены косвенные указания на то, что мутации в гене ггЪТ небезразличны для работы гЪ-оперона и накопления рибофлавина. Так, Перкинс и соавт. [5] показали, что инактивация гена гЪТ не приводит к ауксотрофии по рибофлавину, но существенно снижает выход рибофлавина у штаммов-продуцентов. Из этого следует, что функция гена гЪТ важна для биосинтеза рибофлавина, но может быть лимитирующей при предельном повышении интенсивности биосинтеза рибофлавина.

Таким образом, выяснение функции продукта гена гЪТ может дать дополнительные возможности для создания промышленно перспективных сверхпродуцентов рибофлавина - одного из важнейших витаминов.

На основании известной нуклеотидной последовательности гена гЪТ была выведена аминокислотная последовательность его белкового продукта. Гипотетический белок состоит из 124 аминокислот и имеет молекулярную массу 14.5 кДа. При помощи сервиса PSIPRED [6] получено предсказание участков, с большой вероятностью образующих элементы вторичной структуры (рис. 1).

Затем по этой последовательности был осуществлен поиск гомологий и с использованием программы С1ш1а1 [5] проведено множественное выравнивание последовательности белкового продукта гена пЪТ только среди белков, структуры которых представлены в банке PDB [7] (рис. 2).

Из них были выбраны Ш71, 3FRM, 2G3A, ^4Г, 3EY5, 2К5Т, 3BLN, и по гомологии построена структура, представленная на рис. 3. Так как в некото-

рых кристаллических структурах белков-гомологов присутствует ацетил-СоА, с использованием программного комплекса Molsoft ICM Pro [8] был проведен докинг данного лиганда в нашу гипотетическую структуру.

Поскольку большинство выбранных белков-гомологов (за исключением 3FRM, чья функция неизвестна) относятся к ацетилтрансферазам, можно предположить, что гипотетический продукт гена ribT также принадлежит к ферментам этого класса.

Мы предположили, что роль белкового продукта данного гена может заключаться в ацетилировании атома N(5) флавинов, что приводит к образованию их восстановленных форм и поддерживает высокий уровень транскрипции rib-оперона. Ранее с нашим участием был установлен механизм ингибирования транскрипции путем непосредственного взаимодействия флавинов с лидерной последовательностью мРНК [9]. Логичность нашего предположения подтверждается данными в пользу того, что ингибирующее транскрипцию взаимодействие с лидерной последовательностью сенсорной РНК осуществляет окисленная форма FMN [10]. Поэтому ацетильное восстановление, осуществляемое продуктом гена ribT, может быть важным для поддержания синтеза рибофлавина на высоком уровне. Это предположение требует прямой экспериментальной проверки.

Отсюда следует задача дальнейших исследований, а именно, осуществление полного цикла экспрессии гена ribT в препаративном режиме, получение достаточных количеств очищенного нативного белкового продукта и прямая проверка in vitro его функциональной (ферментативной) активности.

Для проверки возможности экспрессии ген ribT амплифицировали с хромосомной ДНК B. subtilis с помощью праймеров RibT10 - 5'-CGCCATATGT-TAATTCGTTATAAAAAATCGTTT-3' и RibT11 -5'-cGccTcGAGTAATTATTGTATGAAATGTcT-TGATc-3' (олигонуклеотиды, использованные в работе, синтезированы фирмой «Евроген»). Первый олигонуклеотид комплементарен проксимальной, а второй - дистальной области гена ribT. ПЦР проводили в амплификаторе MyCycler фирмы BioRad по следующей схеме: сначала клетки разрушали при 95°С в течение 3 мин, затем проводили 25 циклов амплификации, которые включали денатурацию ДНК при 95°С в течение 30 с, отжиг праймеров при 60°С в течение 30 с и достройку ДНК при 72°С в течение 30 с. На последнем этапе проводили достройку ДНК при 72°С в течение 2 мин. В результате был синтезирован фрагмент длиной 372 п.н., содержащий структурную область гена ribT, фланкированную сайтами узнавания рестриктаз NdeI и XhoI. После электрофоретического разделения продуктов ПЦР искомый

RibT v f:.KiYYY.; fe fffyfill..; fyf nefffkqfqyfi коїеті:':/^ efyv

3ЕУ5 : ff Y;:j;Y”Fx;Y':!1FYF як;' ff кук^і.ііньк FFTiY-: f.-.aff : : y  iff:

2K5T -•. і i-: fy' Я и ч: f >: і ffi.: к : л fe '-'Я ' і;:-; і yy;-і-'гл: y-'-a-:•.

3FRM N 'J yffyyfffa как yffyaffvkff: yffy-iy. : ; к--. av. :: f-fy

3BLN с : fffffyfiffy- yy; Y l.;r-yyikhf . к:-p. y:vfe; ffff .

2G3a vyfdf^afaeaexaF'-dff, y ayi;i,a ffyef: ! і a : f -fy -yfy-:'

IZ4R 1 GIIEFiKVIGNSLTPKANRRVLLWLVGLQNVFSH-QLP--RM--------------------PKEYI--ARLVFDPKHKTLALIKD-GRVI 64

IN7I v y.,fyy yyf yfkfffyfffff ее yyfy.fae к yffyyyf ff layaavyy ffyy

Конс. HI g 7:3

RibT  yayffyf-'f  ff. efkpfy^f^iffiy^yfffyffaxf;;- , v t;fyf./ f

3ЕУ5  'FFTYYViTY  Y;-VYVKK?ATNr ALFNAf;YAKF^LEH:.C'F-LY Sr:v:.F7FFr

2K5T  aff.ffyff ' fff fali: fei,.yf:eytfefyf'ffyffy:eff. f;fy- -v  yy'-yf аг;

3FRm  yffffffff: ууті e iefeyfy.eefohfyiyfe y^ayfyy.xaf e; f.y fffffaf - .

3BLN  i/fyftye f. ,тг:,:ллг\^;р'!,крі:ксїл.:;;а.г,',ул!.,;н,а- a-F''A":";f -

2G3A :A.YF:a;: fv;LFYY FFFYf:4YYYY.f;..G FFY'FFF.AX.AFEFYYY F.. : a..f I ;; ...... ......

IZ4R   yf; yyyyyyy'Y ;:.-;yy fy^ fayfffypf.)Yfyyyffa:Yyhf?F'Yfy fff . yff : y ffff :

IN7I  -.YY'FAIF^. Y Y'YF',EFKFLYYFF;Y:FKYr;.iYYI-:E\Y;YFFKEVA..:-'A; ,ay;y:f: i.FF ' Y . r F : .

Конс. 76 „ s s . § о 150

RibT . YEFFF. [• ff;,,;_ YFFFF.FJ F FYF:J •

3ЕУ5 YEEX.AXl FYYPY..EY F FY 1 FY' FF YYgFP^ YKF’FFY FY 7 YFYFY.FFJ'' ’ \FFFYE ’f’’ :":Y’FYF’.Fr . '

2K5T YEF SfinrM'-.-! FYFFYE faf •

3FRM fyyfcxyfky fyyf.-f ;,:! y. f ky

3BLN FY.YYY'YAY :;F--F ’YTN TFY, F ' PF : - v"f rY :

2G3A AFP.TYFPF:- Y-"F F F  :iL -PFF :.YFF--P • .

IZ4R . EFAY:FFFPY. IFF:'’ I'Vtl’SS’F FYT - Г FY '!F M F F:

IN7I  Y.F :дм: F'-YY'YEFYEFL iY-FFYFH AFS’Y'F ;;.,VA.'; ; J tFY F

' . ліsa. I * Ц Ц § Ц 5Ш,

ПЛХ HFM Щ

Рис. 2. Множественное выравнивание аминокислотной последовательности белкового продукта гена ribT с предполагаемыми гомологами (цветовая схема описана по адресу http://www.jalview.org/help/html/ colourSchemes/clustal.html). Конс. - консервативная последовательность; ПЛХ - плохо; НРМ - нормально, удовлетворительно; ХОР - хорошо

фрагмент ДНК элюировали из геля с помощью набора GeneClean фирмы Fermentas. Ген ribT клонировали в мультикопийный экспрессионный вектор pET15b, содержащий промотор фага Т7, индуцируемый изопропил-Р-О-1-тиогалактопиранозидом (ИПТГ), по сайтам эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI. Вектор pET15b содержит нуклеотидные последовательности для His-Tag перед сайтом узнавания рестриктазы NdeI и для сайта-мишени тромбина. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки штамма Escherichia coli TG1. Отбор трансформантов проводили на агаризованной среде LB, содержащей ампициллин в качестве селективного маркера. Скрининг рекомбинантных клонов проводили методом ПЦР с использованием плазмидных праймеров pT7P - 5'-TAATACGACTCACTATAG-GGG-3' и pT7T - 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCG-

GT-3'. Из отобранных трансформантов выделяли плазмидную ДНК и при помощи рестрикционного анализа определяли наличие вставки в гибридных плазмидах. Этими плазмидами, обозначенными как pET15b/ribT, трансформировали клетки штамма E. coli BL21(DE3), содержащего индуцибельный ген РНК-полимеразы бактериофага Т7.

Синтез белка RibT индуцировали, добавляя в ростовую среду ИПТГ в конечной концентрации 1 мМ. Экспрессию гена ribT определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) общего белка клеток E. coli BL21(DE3), содержащих плазмиду pET15b/ribT. В качестве контроля использовали лизат клеток штамма BL21(DE3), содержащего плазмиду pET15b без вставки (рис. 4А).

В клеточном лизате штамма BL21(DE3), содержащего плазмиду pET15b/ribT, после опосредованной

Рис. 3. Предполагаемая третичная структура продукта гена ribT в комплексе с ацетил-СоА

ИПТГ-индукции появляется дополнительная фракция белка с молекулярной массой приблизительно 14.5 кДа, что согласуется с расчетной молекулярной массой белка RibT (см. выше).

Меченный His-Tag рекомбинантный белок RibT выделяли с использованием TALON Magnetic Beads (Clontech, США). Клетки штамма E. coli BL21(DE3), содержащего плазмиду pET15b/ribT, выращенные в присутствии 1 мМ ИПТГ, собирали центрифугированием. Биомассу ресуспендировали в буфере следующего состава: 20 мМ натрий фосфат, рН 7.0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол. Клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали в течение 20 мин при 14000 об/мин. Супернатант инкубировали вместе с TALON Magnetic Beads в течение 1 ч при 4°С. Далее смолу промывали четырьмя объемами того же буфера. Элюцию белка проводили буфером: 20 мМ натрий фосфат, рН 7.0, 300 мМ NaCl, 300 мМ имида-зол. Элюированные фракции белка анализировали с помощью SDS-PAGE-электрофореза (рис. 4Б). Полосы 7-10 принадлежали целевому белку с достаточно высокой степенью чистоты и молекулярной массой

1 2 3 4 123456789 10

Рис. 4. Электрофоретический анализ (SDS-PAGE) экспрессии гена ribT и очистки рекомбинантного белка RibT. А — фракция общего белка из клеток E. coli BL21(DE3). 1 — белковый маркер; 2 — фракция белков клеток BL21(DE3), содержащих плазмиду pET15b без вставки ribT; 3 — фракция белков клеток BL21(DE3), содержащих плазмиду pET15b/r/'bT, выращенных без добавления ИПТГ; 4 — индукция белка RibT в клетках BL21(DE3), содержащих плазмиду pET15b/r/'bT, в присутствии 1 мМ ИПТГ. Б - белковая фракция из клеток BL21(DE3) pET15b/r/'bT до и после аффинной сорбции на TALON Magnetic Beads. 1 -белковый маркер; 2 - фракция общего белка клеток BL21(DE3) pET15b/ribT после индукции ИПТГ; 3—6 -фракции, содержащие не связавшиеся белки; 7—10 -последовательная элюция фракций белка RibT, меченного His-Tag, в присутствии 300 мМ имидазола

около 14.5 кДа, что хорошо согласуется с теоретическим предсказанием.

ВЫВОДЫ

Теоретическая аминокислотная последовательность и анализ гомологий продукта гена пЪТ в банке PDB позволили осуществить молекулярное моделирование и предсказать возможную трехмерную структуру этого белка. Экспериментально осуществлена экспрессия гена пЪТ и доказана принципиальная возможность получения белка ИіЬТ в количествах, достаточных для дальнейшего изучения его структуры и функциональной активности. •

Работа поддержана РФФИ (грант № 11-04-00476).

СПИСОК ЛИТЕPAТУPЫ

1. Чикиндас М.Л., Миронов В.Н., Лукьянов Е.В., Борецкий Ю.Р., Aрутюнова Л.С., Рабинович П.М., Степанов A.K // Молекул. генет. микробиол. вирусол. 1987. Т. 4. № 1. С. 22-2б.

2. Миронов В.Н., Перумов Д-A., Краев A.C, Степанов A.K, Скрябин К.Г. // Молекул. биология. 1990. Т. 24. № 3. С. 25б-2б1.

3. Склярова CA., Кренева P.A., Перумов ДА., Миронов A.C // Генетика. 2012. Т. 48. № 10. С. 1-9.

4. Mironov V.N., Kraev A.S., Chikindas M.L., Chernov B.K., Stepanov A.L.. Skryabin K.G. // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 242. № 2. P. 201-208.

5. Perkins J.B., Sloma A., Hermann Т., Theriault K., Zachgo E., Erdenberger T., Hannett N., Chatterjee N.P., Williams II V.,

Rufo Jr. G.A., et al. // J. Industr. Microbiol. Biotechnol. 1999.

V. 22. P. 8-18.

6. Jones D.T. // J. Mol. Biol. 1999. V. 292. P. 195-202.

7. Bernstein F.C., Koetzle T.F., Williams G.J., Meyer Jr. E.E.,

Brice M.D., Rodgers J.R., Kennard O., Shimanouchi T., Tasumi M. // J. Mol. Biol. 1977. V. 112. P. 535.

8. Abagyan R.A., Totrov M.M., Kuznetsov D.N. // J. Comp. Chem. 1994. V. 15. P. 488-506.

9. Mironov A.S., Gusarov I., Rafikov R., Errais Lopez L.,

Shatalin K., Kreneva R.A., Perumov D.A., Nudler E. // Cell. 2002. V. 111. № 4. P. 747-756.

10. Serganov A., Huang L., Patel D.J. // Nature. 2009. V. 458.

P. 233-237.