Применение высокоскоростной противоточной хроматографии в анализе лекарственного растительного сырья

УДК 582.734.3:[615.074:543.544]

Э.Н. Бекболатова, З.Б.Сакипова, А.Т. Кабденова, Л.Н. Ибрагимова, Ф. Бойлан

Факультет фармации и технологии фармацевтического производства, Казахский Национальный медицинский университет имени

С.Д. Асфендиярова, Алматы, Казахстан Школа фармации и фармацевтических наук, Тринити Колледж Дублин, Ирландия

ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКОСКОРОСТНОЙ ПРОТИВОТОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В АНАЛИЗЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО

СЫРЬЯ

В настоящей работе описан метод высокоскоростной противоточной хроматографии (ВСПХ) и результаты его применения в анализе растительного сырья цветков боярышника алматинского (Crataegus almaatensis Pojark). ВСПХ широко применяется в анализе соединений природного происхождения, синтетических продуктов, а также в исследованиях аминокислот, белков, пептидов и т.д. Из объекта исследования выделено флавоноидное соединение, которое идентифицировано на ядерно-магнитно резонансном спектрометре как витексин 2"-О- рамнозид.

Ключевые слова. Боярышник алматинский, высокоскоростная противоточная хроматография, флавоноиды, лекарственное растительное сырье.

В настоящее время ученые во всем мире предпочитают применение тех методов, которые минимально воздействуют на структуру и стабильность изучаемого соединения. Одним из таких методов является высокоскоростная противоточная хроматография (ВСПХ), основанная на распределении растворенного вещества между двумя несмешивающимися жидкостями. Согласно литературным данным ВСПХ применяется в 89% случаях анализа природных соединений [1]. Метод ВСПХ применяется в различных областях науки, такие как разделение и очищение продуктов природного происхождения, неорганических соединений, красителей, лекарственных средств, в агропромышленности, в анализе синтетических продуктов, аминокислот, пептидов, протеинов и т.д. Применения ВСПХ может варьировать от аналитических до промышленных масштабов (мг до кг) [2]. Противоточная хроматография разработана в начале 1970-х годов учеными National Institutes of Health (США). Yoichiro Ito и его коллеги внедрили капельное противоточное хроматографирование, которое заключалось в пропускании капелек мобильной фазы через стационарную фазу, для

обеспечения распределения исследуемого вещества между двумя несмешивающимися жидкостями. Стационарная фаза удерживалась с помощью гравитационной силы. Однако, данный метод ограничивался использованием жидкостей, имеющих свойства формировать капли определенных размеров и скорости. При этом время разделения веществ достигает нескольких дней. Современные виды противоточной хроматографии разработаны в начале 1980х годов, в которых внедрено дополнительное воздействие центробежной силы на поток жидкости (гидростатичные и гидродинамичные ВСПХ). В принципе работы гидростатичной ВСПХ лежит гравитационное поле, образующееся при вращении единственного механизма, вращающего через свою ось. Гидродинамичная ВСПХ основана на двухосевом механизме вращения и ротации не уплотненной колонки, которые создают вариабельную гравитационную и центробежную силы. Ввиду планетарного движения (рисунок 1) многослойной катушки, центробежная сила меняет свое направление и интенсивность, тем самым создает участки смешивания и стабилизации жидкостей и анализируемого вещества [2,3].

Рисунок 1 - Планетарное движение катушки ВСПХ. Достоинства ВСПХ [3,4,5,6]

Жидкая стационарная фаза. Отсутствие взаимодействия между стационарной фазой и исследуемым веществом, тем самым обеспечение высокой степени регенерации введенного образца, с минимальными потерями и сохранением биологической активности молекулы. Не требуется проведение сложных процессов проба подготовки и очистки экстрактов при введении в аппарат. Переменчивость: применение двух и более несмешивающихся жидкостей, позволяет модифицировать систему, как в начале, так и во время хроматографирования, в зависимости от природы анализируемых веществ. Использование широкого спектра растворителей в качестве стационарной и мобильной фазы в сравнении с

высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Многие ВЭЖХ аппараты ограничены в пределах рН 2-8. Возможность загрузки большей массы образца, так как природа жидкости имеет высокую степень погрузки. Стационарная фаза занимает до 90% от общего объема колонки.

Простота применения: разделение компонентов основано на распределении веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.

Экономичность: расход меньшего количества растворителей в сравнении с традиционными методами хроматографирования.

332

Вестник КазНМУ №3-2017

Относительная быстрота разделения веществ: разделение может быть достигнуто в течение не более 2-3 часов. ВСПХ применяется для различных соединений с широким спектром полярности, является оптимальным методом в выделении и очистки флавоноидов из растительного сырья [1].

Целью настоящей работы является выделение БАВ методом ВСПХ из растительного сырья цветки боярышника алматинского (Crataegus almaatensis Pojark - б. алматинский). Известно содержание фенольных соединений, в том числе флавоноидов в объекте исследования. [7]. В данной работе представлен часть результатов научной работы, проведенной совместно со Школой Фармации и фармацевтических наук, Тринити Колледж Дублин, Ирландия.

Материалы и методы. Растворители гексан, этанол, этилацетат, метанол приобретены в Тринити колледж

Дублин. Ацетонитрил, хлороформ приобретены в Sigma Aldrich. Этанольный экстракт цветков боярышника алматинского получен на базе лаборатории Школы Фармации и фармацевтических наук, Тринити колледж Дублин на аппарате Soxhlet. Система хроматографирования на ВСПХ: гексан:этилацетат:метанол:вода (HEMWat). Идентификация БАВ проведены методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и ядерно-магнитной резонансной спектроскопии (ЯМР).

Результаты. Объект исследования экстракт цветков боярышника алматинского подвергли высокоскоростному противоточному хроматографированию. Собранные растворы объединены в 14 фракций по идентичности Rf значении пиков на пластинке тонкослойной хроматограммы (рисунок 2).

Рисунок 2 - ТСХ 14 фракций экстракта цветков боярышника алматинского

Фракция 9 выбрана для дальнейшего исследования. Структура вещества во фракции 9 идентифицировали на ЯМР спектрометре (рисунок 3).

Рисунок 3 - ЯМР спектр фракции 9

Обсуждение.

При ВСПХ экстракта цветков боярышника алматинского полученные растворы объединены в 14 фракций согласно идентичности пиков на пластинке тонкослойной хроматограммы. Из полученных результатов фракция 9 выбрана для дальнейшего очищения и идентификации.

Согласно полученному ЯМР спектру и литературным данным, вещество идентифицировано как витексин 2"-О-рамнозид представляющее собой желтое кристаллическое соединение. Тем самым, доказано наличие флавоноида -витексин 2"-О-рамнозид (рисунок 4) в эндемическом растительном сырье б. алматинский.

Рисунок 4 - Витексин 2"-0 - раснозид

Выводы.

В настоящее время ВСПХ является оптимальным и наиболее распространенным методом в анализе химического состава и выделении БАВ из продуктов растительного происхождения. В представленной работе методом ВСПХ исследован химический состав сырья б. алматинского. Флавоноид витексин 2"- О - рамнозид изолирован в течение короткого времени (3 часа) в достаточном количестве для

дальнейшей идентификации на ЯМР спектрометре. Тем самым, доказано возможность применения ВСПХ для анализа, выделения, очистки БАВ из объекта исследования. Продолжаются работы по качественному и количественному изучению химического состава сырья б. алматинского с целью дальнейшего биологического анализа выделенных активных веществ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Fernanda das Neves Costa, Gilda Guimara Leitao. Strategies of solvent system selection for the isolation of flavonoids by countercurrent chromatography // Journal of separation Science. - 2010. - №33. - С. 336-347.

2 Foreword // Journal of Chromatography A. - 2009. - №1216. - С. 4135-4139.

3 Mahendra Rai et al. Medicinal plants. Biodiversity and drugs . - NY: Taylor and Francis group, 2012. - 642-664 с.

4 Ito Y. Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography // Journal of Chromatography A. - 2005. - №1065. - С. 145-168.

5 Leitäo GG, Leitäo SG, Vilegas W. Quick preparative separation of natural naphthopyranones with antioxidant activity by high-speed counter-current chromatography // Zeitschrift für Naturforschung C. - 2002. - №57. - С. 1051-1055.

6 Berthod, T. Maryutina et al. Countercurrent Chromatography in Analytical Chemistry / / Pure and Applied Chemistry. - 2009. - №81. - С. 355-387.

7 Bekbolatova E., Kukula-koch W, Sakipova Z Determenation of phenolic compounds in Crataegus almaatensis fruit extracts // Book of abstracts. 10th International Symposium on Chromatography of Natural Products. - Lublin: Chair and Dept. of Pharmacognosy with Medicinal Plant Unit of Medical University of Lublin, 2016. - P-14.

8 M. Blunder, A. Orthaber et al. Efficient identification of flavones, flavanones and their glycosides in routine analysis via off-line combination of sensitive NMR and HPLC experiments // Food Chemistry . - 2017. - №218. - С. 600-609.

Э.Н. Бекболатова, З.Б.Сакипова, А.Т. Кабденова, Л.Н. Ибрагимова, Ф. Бойлан

Фармация жэне фармацевтикалъщ внд!р!с технологиясы факультетI, С.Ж. Асфендияров атындагы Казац улттыцмедициналъщ

университет, Алматы, Казацстан Фармация жэне фармация гылымдары мектебI, Тринити Колледж Дублин, Ирландия

ЖОFАРFЫ ЖЫЛДАМДЬЩТЫ КЕРШЫНДЫ ХРОМАТОГРАФИЯНЫ ДЭР1Л1К 0С1МД1К ШИК1ЗАТТАРЫН ТАЛДАУДА ЦОЛДАНУ

ТYЙiн. Осы ма;алада жогаргы жылдамдьщты кер1агынды хроматография (ЖЖКХ) эдй жэне сол эдкт еймдш шиюзаттын алматылы; долана гулдерш талдауда ;олдану нэтижелер1 сипатталган. ЖЖКХ эд1й табиги ;оспаларды, синтетикалы; ешмдердь сонымен ;атар амин ;ышк;ылдарын, а;куыз, пептид тектес жэне т.б. заттарды талдауга к;олданылады. Тексершш отырган шиюзаттан таза куйшде флавоноид белшш алынды. Ядорлы-магнитт резонанс спектрометршде алынган ешм витексин-2"-О-рамнозид ретшде дэлелденд.

ТYЙiндi сездер. Алматылы; долана, жогаргы жылдамды;ты кер1агымды хроматография, флавоноид, дэртк еймдш шигазаты.

E. Bekbolatova, Z. Sakipova, A. Kabdenova, L. Ibragimova, Fabio Boylan

Pharmaceutical and pharmaceutical manufacturing technology faculty, Asfendiyarov Kazakh National medical University, Almaty, Kazakhstan School of pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College Dublin, Ireland

APPLICATION OF HIGH SPEED COUNTER CURRENT CHROMATOGRAPHY IN THE ANALYSIS OF MEDICINAL PLANTS

Resume. In the current work application of high speed counter current chromatography (HSCCC) and its usage for the analysis of herbal product Crataegus almatensis Pojark flower is described. HSCCC is widely applied for the isolation and purification of natural, synthetic products, as well as for the analysis of peptides, proteins, aminoacids and etc. From the object of interest we were able to isolate flavonoid, which was then identified by means of nuclear-magnetic resonance spectrometer as vitexin-2''-ramnoside. Keywords. Crataegus almatensis, high speed counter current chromatography, flavonoid, medicinal plant.