Применение пептида для лечения сердечно-сосудистых заболеваний
USE OF PEPTIDE FOR TREATMENT OF CARDIOVASCULAR DISEASES

Область техники
Изобретение относится к пептиду, включающему, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и его функционально-консервативному варианту. Настоящее изобретение также относится к пептиду, содержащему, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, а также к его функционально-консервативному варианту, для использования в лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Уровень техники
Сердечно-сосудистая патология, признак многих заболеваний, является основной причиной смерти по всему миру. Инфаркт миокарда или церебральный инфаркт, представляет собой комплексный клинический синдром, являющийся результатом вредной и повреждающей, постоянной или временной ишемии миокарда. Обычно это вызвано окклюзией коронарной/церебральной артерии, что приводит к дисбалансу между потребностью в кислороде и его поступлением.
Повреждение ткани зависит от продолжительности ишемии. При ишемии продолжительностью 5 минут, поврежденная ткань немедленно восстанавливается при возобновлении кровоснабжения, без симптомов инфаркта и летальных последствий. Однако более длительная по времени ишемия приводит к инфаркту и развитию воспалительной реакции. Более того, инфаркт ассоциируется с воспалительной реакцией, которая является предварительным условием для заживления и формирования рубца [Entman M.L., Smith C.W. Postreperfusion inflammation. A model for reaction to injury in cardiovascular disease. Cardiovasc Res 9: 1301-1311, 1994; Mehta J.L., Li D.Y. Inflammation in ischemic heart disease: response to tissue injury or a pathogenetic villain. Cardiovasc Res; 2: 291-299, 1999]. Этот ответ усиливается по величине и продолжительности даже при реперфузии ишемической ткани.
Ответ является мультифазным: первичная ишемия вызывает некроз, образование свободных радикалов кислорода, активацию комплемента и цитокиновый каскад, инициированный выбросом TNF-альфа. Фаза реперфузии ишемической зоны ассоциируется с повышенной и усиленной воспалительной реакцией, обусловленной рекрутингом лейкоцитов в место ишемии. Рекрутированные лейкоциты также участвуют в системном и in situ выбросе воспалительных медиаторов, что, в конечном счете, приводит к гиперактивированному воспалительному ответу, ответственному за патофизиологические последствия инфаркта.
Все медиаторы воспаления обладают неоднозначным действием. Более того, патофизиология инфаркта балансирует между их благоприятными и неблагоприятными эффектами. Например, TNF-альфа во время ишемии миокарда оказывает как цитопротективное действие, так и повреждающее действие [Harjot K Saini., Yan-Jun Xu., Ming Zhang., Peter Ρ Liu., Lorrie A Kirshenbaum., Naranjan SDhalla. Role of tumour necrosis factor-alpha and other cytokines in ischemia-reperfusion-induced injury in the heart. Exp Clin Cardiol. 2005 Winter; 10(4): 213-222], в зависимости от времени, продолжительности и уровня его экспрессии и выброса. Этим можно объяснить сложность терапии, основанной на блокировании воспалительных медиаторов.
Выброс медиаторов воспаления (например, цитокинов, хемокинов, ROS) и массивный рекрутинг лейкоцитов играют важную роль на всех этапах ишемического каскада, от событий раннего повреждения, запускаемых артериальной окклюзией, до поздних регенеративных процессов, лежащих в основе постишемического восстановления тканей. Многие терапевтические стратегии, воздействующие на этот воспалительный ответ, оказались совершенно неэффективными. В настоящее время очевидно, что более эффективны попытки воздействовать на петли усиления, нежели на конкретный воспалительный медиатор, выброс которого индуцирован ишемией.
Атеросклероз является причиной цереброваскулярных заболеваний и повреждения коронарных артерий, за счет медленного прогрессивного формирования очагов повреждения и сужения просвета сосудов. В результате разрыва атеросклеротической бляшки и тромбоза, указанные наиболее распространенные формы сердечно-сосудистых заболеваний манифестируют как острый коронарный синдром (ACS), инфаркт миокарда или инсульт. Исследования на животных и людях установили, что атеросклероз запускается хроническим воспалительным процессом в стенке артерии, который запускается главным образом в ответ на эндогенно модифицированные структуры, в частности, окисленные липопротеины, которые стимулируют как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ. Врожденный иммунный ответ запускается активацией как сосудистых клеток, так и моноцитов/макрофагов, что впоследствии приводит к развитию адаптивного иммунного ответа против множества потенциальных антигенов, презентируемых Т-эффекторным лимфоцитам антиген-презентирующими клетками [Ait-Oufella H, Taleb S, Mallat Ζ, Tedgui A. Recent advances on the role of cytokines in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol 31 (5): 969-979, 2011]. С помощью модельных генетически модифицированных мышей было показано, что циркулирующие моноциты рекрутируются в сосудистую стенку при помощи хемокинов, где впоследствии становятся макрофагами и нагруженными липидами ксантомными клетками. Макрофаги в сосудистой интиме запускают развитие бляшек посредством выброса цитокинов, усиления воспаления и последующую дестабилизацию бляшек за счет продукции протеаз и накопления апоптоза [Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 420 (6917): 868-874, 2002].
Моноциты/макрофаги стимулируются несколькими медиаторами, известными как PAMPs или патоген-ассоциированный молекулярный паттерн (ПАМП), которые взаимодействуют с PRRs или патогенраспознающими рецепторами. Несколько патогенраспознающих рецепторов участвуют в физиопатологии атеросклероза. Например, Toll-подобные рецепторы (TLR) экспрессируются в очагах атеросклеротического поражения у людей и животных. Ингибирование TRL подавляет развитие атеросклероза у мышей, что позволяет предположить, что воздействие на данный каскад может оказывать протективное действие в отношении развития атеросклероза [Bjorkbacka H, Kunjathoor VV, Moore KJ, Koehn S, Ordija CM, Lee MA, Means T, Halmen K., Luster AD., Golenbock DT., Freeman MW. Reduced atherosclerosis in MyD88-null mice links elevated serum cholesterol levels to activation of innate immunity signaling pathways. Nat Med 10 (4): 416-421, 2004].
Недавно было описано новое семейство рецепторов, экспрессируемых на миелоидных клетках: запускающие рецепторы, экспрессируемые на миелоидных клетках (TREMs). Среди этого семейства, TREM-1 экспрессируется на моноцитах/макрофагах и нейтрофилах. Активация TREM-1 приводит к продукции цитокинов и хемокинов (TNF-α, IL-6, IL-8, МСР-1 и МСР-3, MIP-1 α) а также к быстрой дегрануляции нейтрофилов и окислительному взрыву [Radsak MP, Salih HR, Rammensee H, Schild H. Triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in neutrophil inflammatory responses: differential regulation of activation and survival. J. Immunol; 172: 4956-4963, 2004; Hara H, Saito T. CARD9 versus CARMA1 in innate and adaptive immunity. Trends in Immunology; 30: 234-242, 2009].
Функция TREM-1 заключается в модификации/усилении, а также в активации/инициации воспаления за счет синергичного действия с TLRs, для того, чтобы запустить бурный иммунный ответ. Патофизиологическая роль TREM-1 впервые была обнаружена при изучении воспалительных заболеваний. Известно, что TREM-1 играет ключевую роль в развитии асептического воспаления, как острого (например, реперфузия при мезентериальной ишемии, геморрагический шок, панкреатит), так и хронического (например, воспалительные заболевания кишечника, ревматические болезни).
TLT-1 (Trem-подобный транскрипт-1) является членом семейства TREM, но обнаруживается только на мегакариоцитах и тромбоцитах. Сначала TLT-1 был идентицифирован как медиатор, играющий роль в процессе агрегации тромбоцитов за счет связывания фибриногена и стабилизации тромбоцитарного агрегата. Но последние открытия в научной лаборатории, изучавшей TLT-1, растворимый TLT-1 и полипептиды на основе sTLT-1, показали, что TLT-1 играет важную роль в воспалении за счет специфического ингибирования TREM-1 [Derive M, Bouazza Y, Sennoun Ν, Marchionni S, Quigley L, Washington V, Massin F, Max JP, Ford J, Alauzet C, Levy В, McVicar DW, Gibot S. Soluble TREM-like transcript-1 regulates leukocyte activation and controls microbial sepsis. J Immunol. 2012 Jun 1; 188(11): 5585-92]. Описано, что TLT-1 играет защитную роль во время воспаления, за счет усиления агрегации тромбоцитов в месте повреждения сосудов (Washington AV, Gibot S, Acevedo I, Gattis J, Quigley L, Feltz R, De La Mota A, Schubert RL, Gomez-Rodriguez J, Cheng J, Dutra A, Pak E, Chertov O, Rivera L, Morales J, Lubkowski J, Hunter R, Schwartzberg PL, McVicar DW. TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans. J Clin Invest. 2009 Jun; 119(6): 1489-501).
Краткое описание изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что пептиды, происходящие из TLT-1, оказывают терапевтическое действие при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Настоящее изобретение описывает, что TREM-1 экспрессируется: 1) эндотелиальными клетками аорты, мезентериальных артерий и микроваскулярными клетками, 2) миокардиальной тканью, при этом происходит повышающая регуляция его экспрессии в зонах инфаркта с последующей миокардиальной ишемией (постоянная миокардиальная ишемия и транзиторная миокардиальная ишемия), 3) макрофагами, рекрутированными в атероматозные бляшки.
Авторы изобретения также показали, что пептиды, происходящие как из TREM-1, так и из TLT-1, обладают способностью специфически ингибировать TREM-1 и уменьшать TREM-1-ассоциированный воспалительный ответ в зоне инфаркта миокарда, или в участках атеросклероза.
Введение указанных пептидов в острую фазу миокардиальной ишемии, как было показано на двух различных моделях (постоянной ишемии и транзиторной ишемии), обеспечивает модуляцию воспалительного ответа in situ и последующую направленную миграцию лейкоцитов, что ограничивает зону постишемического ремоделирования миокарда и сдерживает развитие поздних стадий заболевания. Более того, сердечная функция значительно улучшалась через 6 недель после постоянной ишемии, равно как и после транзиторной ишемии (ишемия-реперфузия). Это приводит к увеличению выживаемости.
Авторы изобретения также продемонстрировали способность пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, подавлять процесс формирования атеросклеротических бляшек за счет специфического ингибирования TREM-1.
Настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и к его функционально-консервативному варианту.
Кроме того, изобретение относится к пептиду, содержащему, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID ΝΟ: 1 или SEQ ID NO: 2, а также к его функционально-консервативному варианту или изолированной нуклеиновой кислоте, вектору экспрессии, клетке-хозяину и фармацевтической компзиции для использования в лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Одним объектом настоящего изобретения является пептид, содержащий, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID ΝΟ: 1 или SEQ ID NO: 2, а также его функционально-консервативный вариант, предназначенный для использования в лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанный пептид содержит последовательность из 6 аминокислот, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12, и предназначен для использования в лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, сердечно-сосудистым заболеванием является инфаркт миокарда.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, сердечно-сосудистым заболеванием является атеросклероз.
Другим объектом настоящего изобретения является пептид, содержащий, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, а также его функционально-консервативный вариант.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанный пептид содержит последовательность из 6 аминокислот, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Другим объектом настоящего изобретения является изолированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, описанный выше.
Еще одним объектом настоящего изобретения является вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, как описано выше.
Еще одним объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, как описано выше.
Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество, по крайней мере, одного пептида, или нуклеиновой кислоты, или вектора экспрессии, или клетки-хозяина, как описано выше, а также, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель.
Подробное описание изобретения.
Определения
2+
Используемый в описании термин ''TLT-1'' для ''TREM-подобный транксрипт 1'' относится к члену семейства TREM. Первичные исследования группы ученых [Washington AV, Gibot S, Acevedo I, Gattis J, Quigley L, Feltz R, De La Mota A, Schubert RL, Gomez-Rodriguez J, Cheng J, Dutra A, Pak E, Chertov O, Rivera L, Morales J, Lubkowski J, Hunter R, Schwartzberg PL, McVicar DW. TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans. J Clin Invest. 2009 Jun; 119(6): 1489-501] продемонстрировали, что TLT-1 синтезируется в избытке, является специфичным для линии тромбоцитов и мегакариоцитов и секвестирован в α гранулах тромбоцитов. После активации тромбоцитов тромбином или LPS, TLT-1 переносится на поверхность тромбоцитов. TLT-1 имеет внеклеточный домен по типу v-области Ig, трансмембранный участок и цитоплазматический хвост, который включает иммунорецепторный тирозин-содержащий ингибирующий мотив (ITIM) и пиролин-обогащенный домен. В отличие от других членов семейства TREM, TLT-1 не связывается с DAP 12 активирующей цепью, хотя для него было показано, что он усиливает передачу сигналов по Са каналам в клетках крысиного базофильного лейкоза (RBL), что позволяет предположить, что TLT-1 является рецептором коактивации. Аминокислотная последовательность TLT-1 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID ΝΟ: 1.
Используемый в описании термин ''TREM-1'' или ''запускающий рецептор, экспрессируемый на миелоидных 1 клетках'', относится к молекуле клеточной поверхности, которая была выявлена, на поверхности полиморфонуклеарных нейтрофилов и зрелых моноцитов как у людей, так и у мышей. Он принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и активирует нисходящие пути передачи сигнала при помощи адаптерного белка, называемого DAP 12. Экспрессия TREM-1 подвергается повышающей регуляции на нейтрофилах и моноцитах в присутствии таких бактерий, как Pseudomonas aeruginosa или Staphylococcus aureus, как в культуре клеток, так и в образцах тканей пациентов с инфекционными процессами. Напротив, экспрессия TREM-1 не подвергается повышающей регуляции в образцах тканей пациентов, страдающих неинфекционными воспалительными заболеваниями, такими, как псориаз, язвенный колит или васкулит, вызванный иммунными комплексами. Кроме того, когда TREM-1 связывается со своим лигандом, наблюдается синергичное действие LPS и усиленный синтез провоспалительных цитокинов, таких, как TNF-альфа, а также ингибирование продукции IL-10. Аминокислотная последовательность TREM-1 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
Пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, происходящие из TREM-1 и TLT-1, представлены в Таблице 1.
Используемый в описании термин ''функционально-консервативный вариант'' относится к пептидам, происходящим из пептида, в соответствии с настоящим изобретением, в которых определенный аминокислотный остаток в составе белка или фермента был заменен другим без изменения общей конформации и функции пептида, включая, без ограничений указанными, замещение одной аминокислоты другой с аналогичными свойствами (такими, как, например, полярность, потенциал связывания водорода, кислотность, основность, гидрофобность, ароматичность и т.д.). Аминокислоты, отличные от тех, которые обозначаются как консервативные, могут различаться в белке настолько, что процент идентичности белковой или аминокислотной последовательности двух белков с одинаковой функцией может сильно варьировать и составлять, например, от 70% до 99%, что определяется при помощи метода выравнивания, такого, как мластерный Метод, при котором идентичность последовательностей определяют при помощи алгоритма MEGALIGN. ''Функционально-консервативный вариант'' также относится к пептиду, который имеет, по крайней мере, 20% аминокислотную идентичность, что определяется при помощи алгоритмов BLAST или FASTA, предпочтительно 40%, более предпочтительно 60%, еще более предпочтительно, по крайней мере 75% идентичность, более предпочтительно, по крайней мере 85% идентичность, и еще более предпочтительно, по крайней мере 90% идентичность, а также имеет такие же или практически такие же свойства или функции, как нативный или исходный белок, с которым его сравнивают.
Используемый в настоящем описании термин ''производное'' относится к варианту петпида, в соответствии с настоящим изобретением, или к его функционально-консервативному варианту, который модифицирован другим образом, например, путем ковалентного присоединения молекулы любого типа, путем добавления химического соединения к любой аминокислоте из последовательности, с целью изменения его конформации, активности, специфичности, эффективности или стабильности in vitro или in vivo.
Используемый в настоящем описании термин ''лечение'' или ''терапия'' обозначает замедление, облегчение, ингибирование прогрессирования заболевания или патологического состояния, или предотвращение заболевания или патологического состояния, по отношению к которому используется указанный термин, а также одного или более симптомов данного заболевания или патологического состояния.
Согласно настоящему изобретению, термины ''фармацевтически'' или ''фармацевтически приемлемый'' относится к веществам и композициям, которые не оказывают какого-либо повреждающего, аллергического или другого нежелательного действия при введении в организм млекопитающего, в частности, человека, при необходимости. Фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель обозначает такой нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, растворитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное вещество для приготовления лекарственных форм любого типа.
Согласно настоящему изобретению, термин ''пациент'' или ''индивидуум'' подвергающийся лечению, относится к человеку или другому млекопитающему, такому, как грызуны (крысы, мыши), кошки, собаки, или приматы, страдающему от воспалительного заболевания или имеющему вероятность заболеть. Предпочтительно, пациентом является человек.
Пептиды.
Согласно одному аспекту, настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, а также к его функционально-консервативному варианту.
Другим аспектом настоящего изобретения является пептид, содержащий, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, а также к его функционально-консервативному варианту.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, последовательность указанного пептида не является SEQ ID NO: 1.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, последовательность указанного пептида не является SEQ ID NO: 2.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, пептид имеет длину менее 50 аминокислот, менее 40 аминокислот, менее 35, 30, 25, 20 аминокислот.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, пептид, в соответствии с настоящим изобретением, имеет длину от 6 до 20 аминокислот, или от 10 до 20 аминокислот, или от 12 до 18 аминокислот, или от 14 до 16 аминокислот.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, пептид, в соответствии с настоящим изобретением, имеет длину 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, пептид, в соответствии с настоящим изобретением, содержит 6 последовательных аминокислот, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, пептид, в соответствии с настоящим изобретением, содержит аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 8.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, пептид, в соответствии с настоящим изобретением, содержит аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 9.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, пептид, в соответствии с настоящим изобретением, имеет аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, пептид, в соответствии с настоящим изобретением, может иметь D- или L-конфигурацию.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, аминокислота на аминоконце пептида, согласно настоящему изобретению, имеет ацетилированную концевую аминогруппу, а аминокислота на карбоксильном конце имеет амидированную концевую карбоксигруппу. Таким образом, настоящее изобретение также относится к производным заявленного пептида, в которых аминоконец является ацетилированным или в которых карбоксильный конец является амидированным.
Кроме того, пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, могут подвергаться обратимым химическим модификациям для того, чтобы повысить их биодоступность (включая стабильность и жирорастворимость) и их способность проникать через гематоэнцефалический барьер и эпителиальные ткани. Примером таких обратимых химических модификаций является этерификация карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой аминокислот спиртом, что позволяет удалить отрицательный заряд аминокислоты и повысить ее гидрофобность. Такая этерификация является обратимой, поскольку сформированная эфирная связь распознается внутриклеточными эстеразами, которые ее гидролизуют, восстанавливая заряд глутаминовой и аспарагиновой аминокислот. Полезный эффект заключается в накоплении внутриклеточного пептида, поскольку интернализированный, деэтерифицированный пептид не может проходить через клеточную мембрану.
Другим примером такой обратимой химической модификации является присоединение дополнительной пептидной последовательности, что позволяет увеличить способность пептида проникать через мембрану, например, такой последовательности, как ТАТ пептид или пептид Пенетратин (Charge Dependent Translocation of the Trojan. A Molecular View on the Interaction of the Trojan Peptide Penetratin with the 15 Polar Interface of Lipid Bilayers. Biophysical Journal, Volume 87, Issue 1, 1 July 2004, p. 332-343).
Пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены при помощи стандартных способов твердофазного химического синтеза пептидов, с последующим применением Fmoc методики и/или Boc 20 методики (Pennington, M.W., Dunn, B.N. 1994. Peptide synthesis protocols. Humana Press, Totowa).
Также пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены при помощи традиционных способов, основанных на технологиях рекомбинантной ДНК, например, при помощи способа, который включает встраивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, в соответствии с настоящим изобретением, в подходящую плазмиду или вектор, трансформацию компетентных клеток под указанную плазмиду или вектор и выращивание указанных клеток при условиях, обеспечивающих экспрессию пептида, в соответствии с настоящим изобретением, и, если необходимо, выделение и необязательно очищение полученного пептида при помощи стандартных способов, известных специалистам в данной области.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, в соответствии с настоящим изобретением, может быть легко расшифрована при помощи соответствия, которое существует между аминокислотами и нуклеотидными кодонами, кодирующими соответствующие аминокислоты. Еще одним объектом настоящего изобретения является выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, в соответствии с настоящим изобретением.
th
Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей однонитевую ДНК, двухнитевую ДНК и РНК. Другими объектами настоящего изобретения являются плазмиды и векторы экспрессии, которые содержат указанную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую заявленный пептид, а также прокариотические и эукариотические клетки, экспрессирующие пептид, в соответствии с настоящим изобретением. Обзор основных принципов технологии рекомбинантной ДНК можно найти, например, в пособии ''Principles of Gene Modulation: An 5 Introduction to Gene Engineering,'' R.W. Old & S.B. Primrose, published by Blackwell Scientific Publications, 4 Edition (1989).
Как представлено в описании, настоящее изобретение также относится к пептидам, которые представляют собой функциональные эквиваленты заявленного пептида, или являются его ''функционально-консервативными вариантами''. В данном контексте используемое в описании выражение ''функциональный эквивалент'' означает, что пептид, о котором идет речь, обладает, по крайней мере, одним биологическим свойством пептида, в соответствии с настоящим изобретением, таким, как например, способность уменьшать воспалительную реакцию.
5
2
Эффект пептидов, в соответствии с настоящим изобретением, может быть продемонстрирован путем проведения простого теста, позволяющего оценить степень уменьшения воспалительной реакции в ответ на введение пептидов при сердечно-сосудистых заболеваниях. Например, 5×10 изолированных нейтрофилов или макрофагов или эндотелиальных клеток человека инкубируют в присутствии 100 нг/мл LPS и/или 10 мкг/мл анти-TREM1 mAb вместе с 20 мкг/мл полипептида (или без него) в течение 24 часов при температуре 37°С и 5% СО. Затем собирают супернатант, а концентрации TNF-α, IL-6 и GM-CSF измеряют при помощи ELISA. Если изучаемый пептид ингибирует TREM1, концентрации цитокинов должны снижаться вплоть до 30% или более по сравнению с концентрациями, измеряемыми в отсутствие пептида.
Нуклеиновые кислоты, векторы и рекомбинантные клетки-хозяева, в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей пептиды, в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая заявленный пептид, имеет последовательность, представленную SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12,
Термин ''кодирующая последовательность'' или последовательность ''кодирующая'' продукт экспрессии, такой, как РНК, пептид, белок или фермент, представляет собой последовательность нуклеотидов, которая, после экспрессии, обеспечивает продукцию этой РНК, этого пептида, белка или фермента, то есть, указанная нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность указанного пептида, белка или фермента. Кодирующая последовательность для белка может включать стартовый кодон (обычно ATG) и стоп-кодон.
Указанные молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены при помощи стандартных способов, хорошо известных специалистам в данной области, в частности, при помощи сайт-направленного мутагенеза гена, кодирующего нативный белок. Обычно указанная нуклеиновая кислота представлена молекулой ДНК или РНК, которая может быть заключена в подходящий вектор, такой, как плазмида, космида, эписома, искусственная хромосома, фаг или вирусный вектор.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является вектор или экспрессионная кассета, в которой заявленная молекула нуклеиновой кислоты связана с подходящими элементами для контроля транскрипции (в частности, промотором, энхансером и, необязательно, терминатором) и, необязательно, трансляции; а также рекомбинантные векторы, в которые встроена заявленная молекула нуклеиновой кислоты. Указанные рекомбинантные векторы могут представлять собой, например, клонирующие векторы или векторы экспрессии.
Термины ''вектор'', ''клонирующий вектор'' и ''вектор экспрессии'' обозначают носитель, при помощи которого последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген) может быть встроена в клетку-хозяин для того, чтобы трансформировать ее и обеспечить экспрессию (например, транскрипцию и трансляцию) встроенной последовательности.
Любой вектор экспрессии для животной клетки может использоваться, при условии, что ген, кодирующий заявленный пептид или его химерное производное может быть в него встроен и затем экспрессирован. Примерами подходящих векторов являются pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 бета d2-4 и им подобные.
Другими примерами плазмид являются репликационные плазмиды, содержащие область начала репликации, или интегративные плазмиды, такие, как например, pUC, pcDNA, pBR и им подобные.
Другими примерами вирусных векторов являются аденовирусные, ретровирусные векторы, векторы на основе герпес-вирусов и AAV векторы. Такие рекомбинантные вирусы могут быть получены при помощи способов, хорошо известных специалистам в данной области, таких, как трансфекция упаковывающих клеток или временная трансфекция хелперными плазмидами или 30 вирусами. Типичными примерами вирус-упаковывающих клеток являются РА317 клетки, PsiCRIP клетки, GPenv+ клетки, 293 клетки и пр. Подробные протоколы получения таких репликационно-дефектных рекомбинантных вирусов могут быть найдены, например, в заявках WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 и WO 94/19478.
Примерами промоторов и энхансеров, используемых в векторах экспрессии для клеток животных являются ранний промотор или энхансер SV40 (Mizukami Т. et al. 1987), LTR промотор и энхансер вируса лейкоза мышей Молони (Kuwana Y et al. 1987), промотор (Mason JO et al. 1985) и энхансер (Gillies SD et al. 1983) H цепи иммуноглобулина и подобные.
Настоящее изобретение также относится к системам доставки генов, включающим молекулу нуклеиновой кислоты, в соответствии с настоящим изобретением, которые могут использоваться для генной терапии in vivo и ex vivo. Они включают, например, вирусные векторы переносчики, такие, как, например, векторы, полученные на основе ретровируса, аденовируса, адено-ассоциированного вируса, лентивируса, которые традиционно используются в генной терапии. Изобретение также включает системы доставки генов, содержащие заявленную молекулу нуклеиновой кислоты и генный носитель невирусной природы. Примерами генных носителей невирусной природы являются липосомы и полимеры, такие, как полиэтиленамины, циклодекстрины, гистидин/лизин (HK), полимеры и т.д.
Другим объектом настоящего изобретения является прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, генетически трансформированная, по крайней мере, одной молекулой нуклеиновой кислоты, в соответствии с настоящим изобретением.
Термин ''трансформация'' означает встраивание ''чужеродного'' (то есть постороннего или внеклеточного) гена, ДНК или РНК последовательности в клетку-хозяин таким образом, что указанная клетка-хозяин начинает экспрессировать встроенный ген или последовательность с последующим синтезом желаемого соединения, обычно белка или фермента, кодируемого, соответственно, встроенным геном или последовательностью. Клетка-хозяин, которая получает и затем экспрессирует встроенную ДНК или РНК, была подвергнута ''трансформации''.
Предпочтительно, для экспрессии и синтеза пептидов, и, в частности, пептида, в соответствии с настоящим изобретением, выбирают эукариотические клетки, в частности клетки млекопитающих, более предпочтительно, клетки человека.
Обычно используются клеточные линии, такие как СНО, BHK-21, COS-7, С127, PER.C6 или HEK293 25, поскольку они обладают способностью правильным образом осуществлять посттрансляционные модификации производных.
Конструирование векторов экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, трансформация клеток-хозяев может осуществляться при помощи стандартных методик молекулярной биологии. Например производные с-субъединицы V-АТФазы в соответствии с изобретением, могут быть получены, например, путем культивирования генетически трансформированных клеток, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, с последующим восстановлением экспрессированного указанной клеткой производного, из клеточной культуры. Затем полученные производные, если необходимо, могут быть очищены при помощи стандартных процедур, хорошо известных специалистам в данной области, например, при помощи фракционной преципитации, в частности преципитации сульфатом аммония, электрофореза, гель-фильтрации, аффинной хроматографии и т.д.
В частности, для получения белков, в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться традиционные способы получения и очистки рекомбинантных белков.
Терапевтические методы, их использование и фармацевтические композиции
Еще одим объектом настоящего изобретения является пептид, предназначенный для использования в лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Объектом настоящего изобретения также является способ лечения сердечно-сосудистых заболеваний у субъекта, нуждающегося в подобном лечении, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества пептида, описанного выше. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, указанный способ включает введение пептида, как описано выше, при этом указанный пептид ингибирует TREM-1.
Сердечно-сосудистое заболевание согласно настоящему изобретению включает, без ограничений указанными, миокардиальный или церебральный инфаркт, острый инфаркт миокарда, ишемию, болезни коронарных сосудов сердца, инсульт, аневризму, стабильную стенокардию или стенокардию напряжения, кардиомиопатию, гипертензивную кардиопатию, сердечную недостаточность (хроническую или острую), легочное сердце, сердечные аритмии, воспалительные заболевания сердца, такие, как эндокардит, миокардит, заболевания периферических артерий, ССВО (синдром системного воспалительного ответа) -ассоциированную миокардиальную и сосудистую дисфункцию, атеросклероз.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, сердечно-сосудистым заболеванием является инфаркт миокарда.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, сердечно-сосудистым заболеванием является атеросклероз.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, сердечно-сосудистым заболеванием является ССВО-ассоциированная миокардиальная или сосудистая дисфункция.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, сердечно-сосудистым заболеванием не является состояние реперфузии после мезентериального тромбоза.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, сердечно-сосудистым заболеванием не является сердечно-сосудистая протекция по время полимикробного сепсиса.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, не используются для лечения сепсиса.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, не используются для лечения ишемии и синдрома реперфузии.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, не используются для лечения пациентов с гиперкоагуляционными состояниями.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, не используются для лечения пациентов с кровоизлияниями, ассоциированными с воспалением.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, не используются для лечения острых вирусных миокардитов.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, используются для лечения сердечно-сосудистого заболевания, выбранного из группы, включающей миокардиальный или церебральный инфаркт, острый инфаркт миокарда, ишемию, болезни коронарных сосудов сердца, инсульт, аневризму, стабильную стенокардию или стенокардию напряжения, кардиомиопатию, гипертензивную кардиопатию, сердечную недостаточность (хроническую или острую), легочное сердце, сердечные аритмии, воспалительные заболевания сердца, такие, как эндокардит, миокардит, заболевания периферических артерий, ССВО (синдром системного воспалительного ответа)-ассоциированную миокардиальную и сосудистую дисфункцию и атеросклероз.
Согласно одному из вариантов осуществления, данное изобретение относится к пептиду, содержащему, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID ΝΟ: 2, к его функционально-консервативному варианту или к пептиду, содержащему, по крайней мере, 6 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или к его функционально-консервативному варианту, используемому для лечения сердечно-сосудистого заболевания.
Согласно еще одному варианту осуществления, данное изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, или к плазмиде, или к вектору экспрессии, или к клетке-хозяину, согласно изобретению, предназначенным для лечения сердечно-сосудистого заболевания.
Пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, обладают способностью лечить воспалительные состояния за счет их свойств рецепторов-ловушек.
Под термином ''рецептор-ловушка'' понимается, что полипептиды, в соответствии с настоящим изобретением (пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1) захватывают TREM-1 лиганд и предотвращают его физиологический эффект TREM-1.
Пептиды, в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться как часть комбинированного лечения (которая имеет несколько терапевтических мишеней) с целью более эффективного лечения сердечно-сосудистого заболевания.
Еще одним объектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, которая включает терапевтически эффективное количество, по крайней мере, одного пептида, в соответствии с настоящим изобретением, вместе, по крайней мере, с одним фармацевтически приемлемым наполнителем. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, указанная фармацевтическая композиция также содержит один или более (СООН) пептидов. В другом варианте, заявленная фармацевтическая композиция может включать терапевтически эффективное количество вектора, содержащего, по крайней мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, в соответствии с настоящим изобретением, вместе с адъювантом и/или фармацевтически приемлемым носителем. Указанный вектор может использоваться в генной терапии.
Под термином ''терапевтически-эффективное количество'' понимается достаточное количество химерного производного, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, для лечения сердечно-сосудистого заболевания в разумном соотношении эффект/риск, применимом для любого медицинского лечения.
Общая суточная доза соединений и композиций, в соответствии с настоящим изобретением, будет определяться лечащим врачом с учетом медицинских показаний. Специфическая терапевтически эффективная доза для каждого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая само заболевание и его тяжесть; активность специфического применяемого вещества; специфичность применяемой композиции; возраст, массу тела, общее состояние здоровья пациента, его пол и диету; время введения; способ введения, а также скорость выведения специфического применяемого вещества; продолжительность лечения; лекарственные средства, применяемые в комбинации или случайно вместе со специфическим пептидом; и подобные факторы, хорошо известные специалистам в медицине. Например, специалистам в данной области известно, что лечение надо начинать со стартовых доз соединения, которые меньше дозы, необходимой для достижения желаемого терапевтического эффекта, с последующим постепенным повышением дозировки до достижения нужного эффекта. Однако, суточная доза продуктов может широко варьировать, от 0,01 до 1,000 мг в день для взрослого человека. Предпочтительно, композиции содержат 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 25,0; 50,0; 100, 250 и 500 мг активного ингредиента для симптоматического подбора дозировки каждому конкретному пациенту, получающему терапию. Лекарственное средство обычно содержит, приблизительно, от 0,01 мг до, приблизительно, 500 мг активного ингредиента, предпочтительно, от 1 мг до, приблизительно, 100 мг активного ингредиента. Эффективное количество лекарственного средства обычно поставляется в дозировке от 0,0002 мг/кг до, приблизительно, 20 мг/кг массы тела в день, в частности, приблизительно, от 0,001 мг/кг до 7 мг/кг массы тела в день.
Активные продукты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением (пептиды, нуклеиновая кислота, плазмида, вектор экспрессии или клетка-хозяин) могут вводиться и использоваться для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Терапевтически эффективное количество активного продукта, заявленного в соответствии с настоящим изобретением [пептиды или векторы (конструкты)], вводимого в организм, а также доза заявленных пептидов и/или фармацевтических композиций, необходимая для лечения патологического состояния, будет зависеть от целого ряда факторов, включая возраст и состояние пациента, тяжесть нарушения или заболевания, способ и частоту введения конкретного используемого для лечения пептида.
Фармацевтические композиции, содержащие пептиды или векторы (конструкты), заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть представлены в любой лекарственной форме, подходящей для введения, например, твердой, жидкой или полутвердой лекарственной форме, такой, как крем, мазь, гель или раствор; при этом указанные композиции могут вводиться любым доступным способом, например, перорально, парентерально, ингаляционно или местно, поскольку они также содержат фармацевтически приемлемые наполнители, необходимые для создания нужной лекарственной формы для определенного способа введения. Обзор различных фармацевтических форм для использования в медицинских целях, а также приемлемых носителей для получения указанных форм, приведен, например, в публикации ''Tratado de Farmacia Gal nica'' (Treatise on Galenic Pharmacy). С. Faul I Trillo, 1993, Luz n 5, S.A. Ediciones, Madrid.
В фармацевтических композициях, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, для перорального, сублингвального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, трансдермального, местного, легочного или ректального введения, активный ингредиент, в отдельности или в комбинации с другим активным ингредиентом, может вводиться животным или людям в составе единичной лекарственной формы, или в качестве смеси с традиционными фармацевтическими формами. Подходящими единичными лекарственными формами являются формы для перорального введения, такие, как таблетки, гель-капсулы, порошки, гранулы и суспензии или растворы, формы для сублингвального или буккального введения, аэрозоли, импланты, а также формы для подкожного, трансдермального, местного, интраперитонеального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, трансдермального, интратекального и интраназального введения, а также формы для ректального введения.
Предпочтительно, фармацевтические композиции содержат носители, которые являются фармацевтически приемлемыми для данной вводимой лекарственной формы. Они могут представлять собой, в частности, изотонические, стерильные, солевые растворы (мононатриевый или динатриевый фосфат, натрий, калий, кальций или магний хлорид и подобные, а также смеси указанных солей), или сухие, в частности, лиофилизированные композиции, которые при добавлении, в зависимости от ситуации, стерильной воды или физиологического раствора обеспечивают создание инъекционных растворов.
К фармацевтическим лекарственным формам, подходящим для инъекционного введения, относятся стерильные водные растворы или дисперсии; лекарственные формы, содержащие кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; а также стерильные порошки для немедленного приготовления стерильного раствора для инъекций или дисперсий. Во всех случаях лекарственная форма должна быть стерильной и жидкой, для того чтобы ее удобно было набирать в шприц. Она должна оставаться стабильной в условиях производства и хранения, и должна быть защищена от загрязнения микоорганизмами, такими, как бактерии и грибы.
Растворы, содержащие вещества, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, в форме свободных оснований или фармацевтически доступных солей, могут быть приготовлены в воде, подходящим образом смешанной с сурфактантом, таким, как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть приготовлены в гликоле, жидких полиэтиленгликолях, а также их смесях в маслах. При стандартных условиях хранения и использования, указанные композиции содержат консервант, предотвращающий рост микроорганизмов.
Пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут находиться в составе композиции в нейтральном состоянии или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают кислые дополнительные соли (сформированные со свободными аминогруппами белка), а также соли неорганических кислот, таких, как например, соляная или фосфорная кислоты, или соли органических кислот, таких, как уксусная, оксалиновая, тартаровая, миндальная кислоты и им подобные. Соли, сформированные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, таких, как, например, гидроксид натрия, калия, аммония, кальция или железа, а также таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и им подобные.
Носитель также может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (глицерол, пропиленгликоль и жидкий пропиленгликоль, и им подобные соединения), подходящие смеси указанных веществ, а также овощные масла. Необходимая степень текучести может поддерживаться, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин; за счет поддержания заданного размера частиц в случае дисперсии за счет использования сурфактантов. Предотвращение попадания микроорганизмов осуществляется при помощи использования различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и им подобных соединений. Во многих случаях было бы предпочтительным включить в состав композиции изотонические агенты, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может обеспечиваться использованием в композициях агентов, замедляющих адсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные инъецируемые растворы приготавливают включением активных пептидов в требуемых количествах в подходящие растворители вместе с некоторыми из других ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. В целом, дисперсии получают включением различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильные носители, содержащие основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты, выбранные из числа указанных выше. Если требуются стерильные порошки для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительными методами являются высушивание под вакуумом и высушивание замораживанием с получением порошка активного ингредиента и любого дополнительного ингредиента из предварительно простерилизованного фильтрованием раствора.
В форме лекарственных средств растворы применяются в соответствии с установленными дозами и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Лекарственные средства вводятся в различных дозированных формах, таких как описанные выше инъецируемые растворы, капсулы, высвобождающие лекарственное средство, и тому подобное. В случае парентерального введения водного раствора, например, при необходимости, в раствор может быть добавлен подходящий буфер или же раствор делают изотоническим с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти определенные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. Стерильные водные среды, которые могут быть использованы, станут понятны специалистам из настоящего описания. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора NaCl и добавлена к 1000 мл дермолитической жидкости или инъецирована в предполагаемый сайт инфузии. Определенные вариации в дозах являются необходимыми в зависимости от состояния подлежащего лечению субъекта. Работник, ответственный за применение препарата, в любом случае, подбирает нужную дозу для индивидуального больного.
Заявленный согласно изобретению пептид может находиться в виде терапевтической смеси, содержащей от примерно 0,0001 до 1,0 мг пептида, или от примерно 0,001 до 0,1 мг пептида, или от примерно 0,1 до 1,0 мг пептида, или даже содержащей примерно 10 мг пептида на дозу или около того. Множественные дозы также могут быть использованы.
Заявленные соединения могут находиться не только в форме для парентерального применения, например, для внутримышечной или внутривенной инъекции, но и другие фармацевтически приемлемые формы могут быть использованы, скажем, таблетки или иные твердые формы для перорального применения; липосомальные формы; капсулы с постепенным высвобождением действующего начала и другие лекарственные формы, используемые в современной практике.
Как отмечалось выше, заявленные соединения могут применяться в составе комбинированной терапии для более эффективного лечения сердечно-сосудистого заболевания. В этом случае изобретение предлагает фармацевтические композиции, включающие по крайней мере один заявленный пептид, вместе с другими соединениями (другим соединением), активными (активным) в отношении сердечно-сосудистых заболеваний, например, статинами, антикоагулянтами, анти-альдостероновыми средствами, ингибиторами АСЕ (ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента) и бета-блокаторами.
Кроме того, изобретение относится к способу лечения сердечно-сосудистого заболевания млекопитающего, который заключается во введении указанному млекопитающему, страдающему от указанного сердечно-сосудистого заболевания, терапевтически эффективного количества, по крайней мере, одного заявленного пептида, или вектора, содержащего, по крайней мере, одну ДНК-последовательность, кодирующую заявленный пептид, предпочтительно, в форме фармацевтической композиции, содержащей данный пептид. Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанная фармацевтическая композиция содержит в дополнение к заявленным пептиду или пептидам один или более СООН пептидов.
Сердечно-сосудистое заболевание согласно изобретению, включает без ограничения указанным, инфаркт миокарда или церебральный инфаркт, острый инфаркт миокарда, ишемию, коронарную болезнь сердца, острый коронарный синдром, аневризму, инсульт, стабильную или эпизодическую грудную жабу, кардиомиопатию, гипертензивную болезнь сердца, сердечную недостаточность (хроническую или острую), легочное сердце, сердечную аритмию, воспалительную болезнь сердца, такую как эндокардит, миокардит, периферическую артериальную болезнь, ассоциированную миокардиальную или васкулярную дисфункцию, атеросклероз.
Изобретение далее иллюстрируется чертежами и примерами, не ограничивающими объем притязаний настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Эффективность TREM-1 модуляции происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами против сосудистой дисфункции, индуцированной in vitro альфа-TREM-1 и LPS.
Приведены кривые ответа на концентрацию фенилэфрина (А и В) и ацетилхолина (С) в кругах аорты. Аорты отбирали у здоровых крыс и стимулировали in vitro альфа-TREM-1 (5 мкг/мл) и LPS (10 мкг/мл) в присутствии или в отсутствие происходящих из TREM-1 и TLT-1 пептидов или LR12-рандомизированного пептида. В: у некоторых аорт был удален эндотелий (-Е). Данные являются репрезентативными по крайней мере для 5 различных экспериментов, значения р: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001, ns: не достоверно.
Фиг. 2. Экспрессия TREM-1 в эндотелиальных клетках проводящих и резистивных артерий.
Аорту мыши (артерия) (А) и мезентериальную артерию крысы (артерия) (В) стимулировали в присутствии или в отсутствие LPS, как указано. Экспрессию TREM-1 определяли путем qrt-PCR. Данные являются репрезентативными по крайней мере для 5 различных экспериментов, значения р: ***р<0,001, ns: не достоверно.
Фиг. 3. Конститутивная экспрессия TREM-1 и индуцибельность в эндотелиальных клетках микрососудов.
CD146+/VEGFR2+ клетки, выделенные из легкого и печени мыши (LuMECs и LiMECs), анализировали методом проточной цитометрии для выявления экспрессии TREM-1. TREM-1 конститутивно экспрессируется в клетках Li/LuMECs (А). Экспрессия TREM-1 является индуцибельной in vivo во время экспериментального сепсиса (А) или in vitro под влиянием стимуляции LPS в течение часа (В). Кинетику экспрессии TREM-1 и VEGFR2 анализировали методом проточной цитометрии (FACS) (С). LPS индуцировал зависимую от времени повышающую регуляцию (up-regulation) экспрессии TREM-1 и VEGFR2, что предотвращалось происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами. Данные являются репрезентативными по крайней мере для 10 различных экспериментов, значения p: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001.
Фиг. 4. Кинетика экспрессии TREM-1 при стимуляции LPS.
(A). In vitro LuMEC (CD146+, VEGFR2+) стимулировали LPS в течение 4 ч и 12 ч и анализировали qRT-PCR для выявления (A) TREM-1, TNFα (В) Il-6 (С) экспрессии. Данные являются репрезентативными по крайней мере для 10 различных экспериментов.
Фиг. 5. Эффекты происходящих из TREM-1 и TLT-1 пептидов на продукцию цитокинов клетками LuMEC, стимулированными в течение 24 ч LPS.
(А) концентрация белков в супернатантах LuMEC, стимулированных в течение 24 ч LPS, анализировали ELISA, значения р: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001.
(В) измерение цитокина/хемокина в клетках LuMEC, стимулированных в течение 24 ч LPS. Данные выражены как соотношение между контрольными клетками и клетками, обработанными происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами (соотношение >1 означает более высокую концентрацию в контрольных клетках по сравнению с обработанными).
Данные являются репрезентативными по крайней мере для 10 различных экспериментов.
Фиг. 6. Восстановление in vivo ослабленных васкулярных внутриклеточных сигнальных путей во время сепсиса при TREM-1 модуляции происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами.
Происходящие из TREM-1 и TLT-1 пептиды способны восстанавливать ослабленный Akt путь и Сох-1 экспрессию, а также восстанавливать повышающую регуляцию индуцибельного пути, обусловленную Сох-2 и iNOS. Этот эффект измеряют в аортах (А) и мезентериальных артериях (В).
Данные являются репрезентативными по крайней мере для 5 различных экспериментов, значения р: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001.
Фиг 7. Эффективность TREM-1 модуляции происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами против вызванной сепсисом кардиальной дисфункции.
Действие происходящих из TREM-1 и TLT-1 пептидов на крысах, служащих моделью вызванной сепсисом кардиальной дисфункции, ассоциируется с улучшением врожденной кардиальной функции при измерении с помощью катетера Миллара (FEVG, ESPVR, dpdmax/Ved, PRSW).
Данные являются репрезентативными по крайней мере для 10 различных экспериментов.
Фиг. 8. Эффективность TREM-1 модуляция происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами против вызванной сепсисом кардиальной дисфункции и гипотензии.
(А). Действие происходящих из TREM-1 и TLT-1 пептидов на мини-свиньях, служащих моделью вызванной сепсисом кардиальной дисфункции, ассоциируется с уменьшением норэпинефриновой инфузии, необходимой для поддержания стабильного значения артериального давления (85 мм ртутного столба). Действительно, MAP (среднее значение артериального давления) было постоянно выше и норэпинефриновая доза ниже в том случае, когда животным вводили происходящие из TREM-1 и TLT-1 пептиды, по сравнению с контрольными животными.
(B). Изменение кардиального индекса, индекса кардиальной силы, SvO2 и доставки кислорода. Все эти параметры были выше, когда животным вводили происходящие из TREM-1 и TLT-1 пептиды, по сравнению с контрольными животными.
(C). Развитие ацидоза и гиперлактатемия были ослаблены RL12. LR12 группа, n=6 // LR12- рандомизированная группа, n=5.
Фиг. 9. Эффективность TREM-1 модуляция происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами против вызванного сепсисом нарушения диастолического, систолического и артериального давления.
Действие происходящих из TREM-1 и TLT-1 пептидов на обезьянах, служащих моделью вызванной сепсисом кардиальной дисфункции (эндотоксемия), полностью предотвращает вызванное эндотоксином транзиторное повышение кровяного давления (значение А), систолического давления (В) и диастолического давления (С) (р<0,001 для контрольного пептида vs LR12). Среднее ±SD. N=6/группа.
Фиг. 10. Экспрессия TREM-1 в ткани миокарда и повышающая регуляция экспрессии TREM-1 в ткани миокарда при ишемии.
(A). Количественное определение с помощью q-PCR mRNA TREM-1 в миокарде (базовая линия) и в омертвевших участках через 6, 12 и 24 ч после инфаркта миокарда.
(B). Количественное определение белка TREM-1 через 24 ч после инфаркта миокарда. Данные являются репрезентативными по крайней мере для 5 различных экспериментов. Результаты представлены как среднее ±SD. Значение р: *р<0,01 (здоровые участки vs омертвевшие участки).
Фиг. 11. TREM-1 модуляция происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами, контроль рекрутинга лейкоцитов в зонах инфаркта миокарда и мобилизации лейкоцитов из удаленных компартментов.
≠
≠≠
(A). Количественная проточная цитометрия инфильтрации лейкоцитов в зонах инфаркта миокарда в различные временные точки у мышей, обработанных происходящими из TREM-1 и TLT-1 пептидами или контрольным пептидом (LR12-ser); n=5 на группу и на временную точку; *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001 vs LR12-ser, р<0,05, р<0,01 vs плацебо.
(B). Количественная проточная цитометрия подтипов лейкоцитов в костном мозге, крови и селезенке в различные временные точки после инфаркта миокарда; n=6-7 в каждую временную точку; ***р<0,001, **р<0,01, *р<0,05 vs мыши, обработанные LR12-ser;
≠≠
≠
р<0,01, р<0,05 vs мыши, получавшие плацебо.
(C). Концентрация МСР-1 и МСР-3 в плазме после инфаркта миокарда; n=5 мышей; ***р<0,001 vs мыши, обработанные LR12-ser.
Фиг. 12. Модулирование пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, за счет ингибирования TREM-1, миокардиальной воспалительной реакции во время ишемии у мышей.
Для указанных экспериментов получали миокардиальный лизат через 24 часа после индукции миокардиальной ишемии у мышей, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, или контрольный LR12-рандомизированный пептид (''контроль''). Изучали две зоны: здоровую зону, выделенную дистально от зоны инфаркта, у контрольных животных, и зону, пораженную инфарктом. Данные являются репрезентативными, по крайней мере, для 5 различных экспериментов. Результаты представлены как среднее ±SD. Значение р: *р<0,001 [LR12 vs контроль].
Вестерн-блот лизатов миокардиальной ткани анализировали с помощью антител к фосфо (р)-р38, (p)-ERK1/2, iNOS, Сох2, (p)-Akt, (p)-GSK3β, Socs3.
Фиг. 13. Эффекты пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, на продукцию цитокинов тканью миокарда во время ишемии у мышей.
Для указанных экспериментов получали миокардиальный лизат через 6, 24 и/или 96 ч после индукции миокардиальной ишемии у мышей, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, или контрольный LR12-рандомизированный пептид (''контроль''). Изучали продукцию цитокина/хемокина в зонах инфаркта. Данные являются репрезентативными, по крайней мере, для 5 различных экспериментов. Значение р: *р<0,001 [LR12 vs контроль].
(A). Продукцию цитокина/хемокина измеряли в зоне инфаркта миокарда через 24 ч после индукции ишемии. Данные выражены как соотношение между контрольными животными и животными, получавшими происходящие из TREM-1 и TLT-1 пептиды (соотношение >1 означает более высокую концентрацию у контрольных животных по сравнению с обработанными животными).
(B). Экспрессия цитокинов TNF-α, Il-6 и уровень мРНК IL-10 в ткани миокарда, подвергшейся инфаркту, через 6, 24 и 96 ч после индукции ишемии.
Фиг. 14. Уменьшение протеазной активности в зонах инфаркта миокарда пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, за счет ингибирования TREM-1.
Для указанных экспериментов получали миокардиальный лизат через 6, 24 и/или 96 ч после индукции миокардиальной ишемии у мышей, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, или контрольный LR12-рандомизированный пептид (''контроль''). Анализировали зоны инфаркта. Данные являются репрезентативными, по крайней мере, для 5 различных экспериментов.
(A). Количественная Q-PCR мРНК Mmp9;
(B). Timp-1 и
(C). Репрезентативная зимография в геле, отражающая Mmp-9 желатиназную активность на базовой линии, через 12, 24 и 96 ч после инфаркта миокарда. Вверху : животные, получавшие контрольный пептид; внизу: животные, получавшие RL12.
Фиг. 15. Увеличение выживаемости мышей после инфаркта миокарда пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, за счет ингибирования TREM-1.
Взрослые мыши Balb/c (20-23 г) были подвергнуты индукции миокардиальной ишемии и произвольным образом разделены на группы (10-15 животных на группу), которые получали пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1 (100 мкг в 0,2 мл 0,9% NaCl один раз в день в течение 5 дней), рандомизированный LR12 ((100 мкг в 0,2 мл 0,9% NaCl один раз в день в течение 5 дней) или 10 мкг mAb против TREM-1 в 0,2 мл 0,9% NaCl путем интраперитонеальных инъекций. Выживаемость оценивали через 1 неделю и анализировали в тесте Log Rank. (Через 5 дней гибели мышей не было). Данные являются репрезентативными, по крайней мере, для 15 различных экспериментов.
Фиг. 16. Улучшение кардиальной функции после миокардиальной ишемической реперфузии у крыс пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, за счет ингибирования TREM-1.
Взрослые крысы Wistar были подвергнуты индукции миокардиальной ишемической реперфузии и произвольным образом разделены на группы (10 животных на группу), которые получали пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1 (100 мкг в 0,2 мл 0,9% NaCl один раз в день в течение 5 дней), рандомизированный LR12 ((100 мкг в 0,2 мл 0,9% NaCl один раз в день в течение 5 дней). Через шесть недель после повреждения миокарда исследовали сердечную функцию под анестезией с использованием проводящего катетера. Функции Emax, ESPVR и PRSW были повышены у животных, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, по сравнению с контрольными крысами. Все значения р<0,02 [контроль vs LR12].
Фиг. 17. Улучшение систолической и диастолической функции после инфаркта миокарда у крыс пептидами, происходящие из TREM-1 и TLT-1, за счет ингибирования TREM-1.
Взрослые крысы Wistar были подвергнуты миокардиальной ишемии и затем произвольным образом разделены на группы (n=20), которые повторно получали пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1 (3 мг/кг в 0,2 NaCl 0.9% один раз в день в течение 5 дней) или рандомизированный-LR12 (3 мг/кг в 0,2 NaCl 0.9% один раз в день в течение 5 дней). Через шесть недель после повреждения миокарда оценивали сердечную функцию под анестезией с использованием проводящего катетера. Все изучаемые параметры были лучше у животных, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, по сравнению с контрольными животными (все значения р<0,01 [контроль vs LR12]).
Фиг. 18. Атеросклеротические бляшки в аортальном синусе у ароЕ-/- мышей, получавших ежедневно PBS (слева) и LR12 (справа) путем интраперитнеальных инъекций в течение 4 недель.
2
2
Лечение пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, снижает развитие атеросклероза в аортальном синусе, что оценивалось при помощи окрашивания красным маслом: 103318 мкм при лечении LR12 vs 146736 мкм при введении только носителя, Ρ=0,02. Данные являются репрезентативными по меньшей мере для 15 различных экспериментов.
Фиг. 19. Окрашивание макрофагов (анти-МОМА2, красный) в атеросклеротической бляшке.
Лечение пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, ароЕ-/- мышей приводит к уменьшению инфильтрации макрофагами атеросклеротических бляшек (р=0,004) на 27% по сравнению с контрольными животными, что подтверждается иммунофлуоресцентным окрашиванием и иммуногистохимией (анти-МОМА2).
Фиг. 20. Индуцирование уменьшения популяции циркулирующих неклассических моноцитов на 7 день пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, за счет ингибирования TREM-1.
+
+
high
Циркулирующие мышиные CD115 Grllow и CD115Grl моноциты, взятые у мышей, которые являются моделью атеросклероза, подсчитывали после окрашивания проточной цитометрией на 7 день. Данные являются репрезентативными по меньшей мере для 5 различных экспериментов. (Р<0,05).
Фиг. 21. Снижение количества лейкоцитов на 28 день пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, за счет ингибирования TREM-1.
+
+
high
Циркулирующие CD115 Grllow и CD115 Grl моноциты подсчитывали после окрашивания при помощи проточной цитометрии на 28 день у модельных мышей с атеросклерозом. Данные являются репрезентативными по меньшей мере для 5 различных экспериментов. *р<0,05; **р<0,001.
Фиг. 22. Лечение пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, приводит к уменьшению лейкоцитарной инфильтрации в очагах повреждения.
Моноциты были помечены in vivo за сет ретроорбитальной IV инъекции 1 мкмоль обычных микросфер, окрашенных зеленым флуоресцирующим веществом Fluoresbrite, разведенных в стерильном PBS 1:4. Количество флуоресцентно-меченых бусин в очагах повреждения отражает рекрутинг моноцитов. Данные являются репрезентативными по меньшей мере для 5 различных экспериментов. р<0,05.
Примеры.
Материалы и Методы
Пептиды
На основании последовательностей TLT-1 и TREM-1, полученных в GemBank|EMBL|DDBJ (номера доступа AY078502, AF534822, AF241219 и AF287008), были сконструированы пептиды TREM-1 и TLT-1, имитирующие различные части их внеклеточных доменов (TREM-LP17, TREM1-LP12, TREM1-LP6-1, TREM1-LP6-2, TREM1-LP6-3, TLT1-LR17, TLT1-LR12, TLT1-LR6-1, TLT1-LR6-2 и TLT1-LR6-3). Их синтезировали при помощи химического синтеза (Pepscan Presto BV, Lelystad, The Netherland) как Cter-амидированные пептиды для in vivo исследований. Корректные пептиды получали с выходом >99%, они были гомогенными после препаративной очистки, что подтверждалось при помощи масс-спектрометрии и аналитической жидкостной хроматографии высокого разрешения с обратной фазой. Указанные пептиды не содержали эндотоксина. Соответствующие рандомизированные пептиды были аналогичным образом синтезированы и сохранены в качестве контрольных пептидов.
Животные
Все эксперименты осуществлялись в соответствии с международными руководствами по проведению экспериментов с животными. Мышей и крыс получали в лаборатории Charles River (Страсбург, Франция).
Выделение грудной аорты и мезентериальной артерии у крыс.
Животным давали наркоз путем интраперитонеальной инъекции фенобарбитала натрия. Осуществляли срединный абдоминальный доступ, грудную клетку открывали, чтобы обнажить грудной отдел аорты (у мышей) или мезентериальную артерию (у крыс). Сосуды освобождали от крови и инкубировали в течение 20 часов в среде RPMI, обогащенной 10% бычьей фетальной сывороткой и антибиотиками. Произвольным образом создавали следующие условия: 1) контрольный сосуд 2) сосуд, инкубированный ex vivo с LPS (10 мкг/мл) 3) обработка LPS и пептидами 4) агонистический αTREM-1 (5 мкг/мл) 5) деэндотелиализированные сосуды, инкубированные с LPS, обработка пептидами.
В некоторых экспериментах общую РНК и пептиды выделяли из сосудов после стимуляции.
Реактивность сосудов
2
Васкулярную реактивность аорты изучали при помощи проводного миографа (EMKA Technologies, France). Эксперименты осуществляли при 37°С в физиологическом солевом растворе (PSS) с использованием следующей композиции: 119 ммоль/л NaCl, 4,7 ммоль/л KCl, 14,9 ммоль/л NaHCO3-, 1,2 ммоль/л MgSO42-, 2,5 ммоль/л CaCl, 1,18 ммоль/л KH2PO4- и 5,5 ммоль/л глюкозы, с непрерывным барботированием 95% O2 b 5% CO2. После периода уравновешивания (по крайней мере 20 минут) при оптимальном пассивном натяжении, использовали два последовательных сокращения в ответ на комбинацию KCl деполяризации (100 мМ) и 10 мкм фенилэфрина (Phe) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Falavier, France) для изучения максимальной сократительной способности сосудов. После периода отмывания в течение 20 минут, выводили кривые концентрация-ответ на кумулятивное введение РЕ - агониста вазоконстрикции (от 1 нМ до 100 мкМ). После следующего периода отмывания оценивали расслабление сосудов, обусловленное эндотелием, путем изучения расслабляющего действия ацетилхолина (ACh) (1 нМ до 100 мкМ; Sigma, St Louis, МО, USA) после предшествующего сокращения, обусловленного 1 мкМ фенилэфрина (Phe). Наличие функционального эндотелия подтвержалось при помощи ацетилхолина (1 мкМ), введение которого вызывало расслабление сосуда более 50%.
Выделение микроваскулярных эндотелиалъных клеток легких и печени (LuMEC и LiMEC)
Мышей умерщвляли под глубоким наркозом (фенобарбитал) для выделения легких и печени. Выделение микроваскулярных эндотелиальных клеток легких и печени мышей осуществляли согласно описанному выше протоколу [Daqing et al., 1998] с некоторыми модификациями. Вкратце, органы отмывали в 10% FBS-DMEM, нарезали на кусочки размером 1-2 мм и расщепляли коллагеназой 1 типа (2 мг/мл, Gibco) при 37°С в течение 1 часа с периодическим встряхиванием. Клеточный продукт расщепления фильтровали через 70 мкм клеточный фильтр, центрифугировали при 1500 об/мин, клетки переносили на покрытые желатином планшеты, содержащие среду DMEM/F12 (Gibco), обогащенную 20% FBS, 100 мкг/мл ECGS (BD Biosciences) и антибиотиками. На 1 день удаляли плавающие клетки, отмывали PBS и добавляли свежую культуральную среду. Через 5 дней осуществляли первую очистку указанных клеток с использованием набора MicroBead CD146. После трипсинизации клетки ресуспендировали в питательной среде и помещали на свежие покрытые желатином планшеты. Через 15 дней клетки подвергали второй очистке при помощи той же процедуры. Подтверждали чистоту (>85%) и жизнеспособность эндотелиальных клеток. Дополнительно оценивали клеточный фенотип при помощи FACS анализа, за счет определения экспрессии VEGFR2 и CD146 проточной цитометрией.
Мониторинг индуцированной сепсисом гипотензии и сердечной дисфункции у мини-свинок.
Взрослых мини-свинок мужского пола (Suc scrofa domestica, вьетнамские вислобрюхие мини-свинки, 30-40 кг) получали в лаборатории Elevage Ferry (Вогезы, Франция). Накануне хирургического вмешательства свинок держали голодными в течение ночи, но со свободным доступом к воде. Премедикацию осуществляли путем внутримышечного введения кетамина (10 мг/кг) и мидазолама (0,1 мг/кг). Введение в наркоз и его поддержание осуществляли за счет внутривенного введения фенобарбитала (стартовый болюс: 10 мг/кг, затем 6-8 мг/кг в час), периодического введения суфентанила (10 мкг) и панкурония (4 мг), при необходимости. Животные находились на искусственной вентиляции легких [дыхательный объем 8 мл/кг, PEEP (положительное давление в конце выдоха) 5 см H2O, FiO2 0,21, дыхательный ритм 14-16 дыхательных движений в минуту, что поддерживает нормокапнию]. Выделяли левую яремную вену и вставляли в нее трехпросветный катетер. Правую яремную вену также катетеризировали, устанавливали катетер Swan-Ganz, позволяющий постоянно регистрировать сердечный выброс, SvO2, а также давление в правом предсердии и легочной артерии. Для постоянного измерения артериального давления устанавливали катетер в правую сонную артерию. Мочевой пузырь также катетеризировали для сбора мочи.
После подготовки инструментов осуществляли срединную лапаротомию для удаления каловых масс из левой ободочной кишки: 1,5 г/кг суспендировали в 200 мл 0,9% NaCl и инкубировали при 38°С в течение 2 часов. После хирургического вмешательства устанавливали трубку для индукции перитонита и дренирования асцита.
После хирургического вмешательства, животным давали возможность отдохнуть в течение 2 часов, после чего проводили основные измерения (обозначены как ''Н0''). На протяжении исследования постоянно вводили физиологический солевой раствор (10 мл/кг в час). Температуру тела поддерживали постоянной (±1°С) с использованием нагревающих подушек или охлаждения.
После сбора исходных данных (Н0) индуцировали перитонит путем введения аутологичных каловых масс через абдоминальную трубку, которую затем держали закрытой. Через два часа (Н2) животных произвольным образом разделяли на группы, получавшие LR12 (группа LR12, n=6) или только носитель (физиологический раствор), контрольная группа (n=5). В течение 30 минут внутривенно вводили болюс в дозе 5 мг/кг (в 60 мл), затем на протяжении всего исследования продолжали инфузию в дозе 1 мг/кг в час (15 мл/ч).
Затем врач-реаниматолог осуществлял необходимый уход за животными, строго следуя следующим указаниям на протяжении всего периода исследования:
i) Гемодинамическая цель заключалась в поддержании среднего артериального давления (MAP) выше 85 мм рт. ст. Для достижения указанной цели и поддержания давления обеспечивали введение 0,9% NaCl (7 мл/кг в час), гидроксиэтилированного крахмала (вплоть до 20 мл/кг за весь период исследования) (HES 130/0,4, Voluven , Fresenius), таким образом центральное венозное давление (CVP) и давление окклюзии в легочной артерии (РАОР) составляло <18 мм рт. ст. Когда достигался максимальный объем введения гидроксиэтилированного крахмала, начинали непрерывную инфузию норэпинефрина в дозе вплоть до 10 мкг/кг в минуту.
ii) Респираторная цель заключалась в поддержании соотношения PaO2/FiO2>300 и артериального PaCO2 на уровне 35-45 мм рт. ст. Таким образом параметры вентиляции могут быть изменены за счет повышения соотношения вдох/выдох до 1:1, PEEP до 15 см H2O, а дыхательного ритма до 30 движений в минуту.
iii) Температура тела должна поддерживаться постоянной (±1°С) при помощи нагревающих подушек или охлаждения.
iv) Для поддержания гликемии на уровне 5-7 ммоль/л при необходимости должна осуществляться внутривенная инфузия глюкозы.
2
Постоянно осуществляли мониторинг гемодинамических параметров, включая MAP, среднее давление в легочной артерии (MPAP), давление в правом предсердии (RAP), сердечный выброс (СО), сердечный индекс (CI) и SvO2. Системное поступление кислорода (DO2) и системное поглощение кислорода (VO2) рассчитывали при помощи монитора Swan-Ganz. Индекс мощности сердца (W/m) рассчитывали как MAP × CI/451 (24).
Мониторинг индуцированной сепсисом гипотензии и сердечной дисфункции у обезьян.
В исследовании использовали яванских макак мужского пола (Macaca fascicularis) (от 2,8 до 3,5 кг, возраст 24 месяца, Le Tamarinier, La Route Royale, Tamarin, Mauritius). Накануне стимуляции LPS животных держали голодными, но со свободным доступом к воде. Этический комитет Франции CIToxLAB (СЕС) изучил и одобрил весь план исследования (Nr СЕС:02221).
Введение лекарств и стимуляция LPS in vivo.
Жизненно важные функции и вес регистрировали за день перед стимуляцией LPS. На следующее утро собирали основные клинические лабораторные образцы и протоколировали основной набор жизненно важных функций. Лекарственное средство вводили в цефальную или подкожную вену при помощи катетера Teflon. Контрлатеральную вену использовали для введения LPS.
Обезьян произвольным образом разделяли на группы, получавшие LR12 или плацебо (n=6). Создавали дополнительную группу из 4 животных, получавшую только носитель (NaCl 0,9%), которую использовали в качестве контрольной.
Во временной точке 0 начинали внутривенное введение LR12 или плацебо со скоростью 12 мл/ч (5 мг/кг, 10 минут, 2 мл), которое осуществляли при помощи откалиброванной шприцевой помпы (Harvard Apparatus). Затем продолжали инфузию еще в течение 8 часов со скоростью 2 мл/ч (1 мг/кг/ч, 8 часов, 16 мл). Непосредственно перед введением лекарства, внутривенно болюсно в контрлатеральный катетер вводили LPS (10 мкг/кг) в течение 10 минут. Животных оставляли бодрствовать в вертикальном положении в смирительных креслах и на протяжении всего исследования оставляли голодными.
Частоту сердечных сокращений и кровяное давление измеряли каждые 15 минут в течение 1 часа, затем каждые 30 минут в течение 7 часов.
Мышиная модель инфаркта миокарда
Все исследования проводили на мышах мужского пола линии C57BL/C, возрастом от 6-8 недель. Мышей вводили в наркоз интраперитонеальным введением ксилазина (60 мг/кг) и фиксировали в положении на спине. Интубировали трахею и осуществляли искусственную вентиляцию (дыхательный объем 200 мкл/25 г, частота дыхания 120 движений в минуту). После левосторонней торакотомии выделяли левую коронарную артерию и перевязывали ее проленовой хирургической нитью 8-0 на 1,0 мм дистальнее верхушки левого предсердия. Окклюзия LAD (передней нисходящей ветви левой коронарной артерии) подтверждалась изменением цвета миокарда от красного до белого в зоне ишемии (левый желудочек). Грудную клетку закрывали, кожу зашивали шелковой хирургической нитью 6-0. Животных возвращали в клетки, где их наблюдали до полного восстановления.
После хирургического вмешательства оценивали смертность мышей. Мышей произвольным образом разделили на две группы, группу, получавшую пептиды (ежедневная интраперитонеальная инъекция в течение 5 дней, 5 мг/кг), и группу, не получавшую лечение, и изучали выживаемость. Альтернативно, мышей умерщвляли через 6 ч, 24 ч, 96 ч (n=6 на группу) посредством наркоза с последующим введением смертельной дозы фенобарбитала. Осуществляли срединную стернотомию с последующим удалением сердца и иссечением ишемических и здоровых участков. Для последующего RT-PCR, WB, иммуногистологии и ELISA анализа осуществляли экстракцию РНК и белков.
Проточная цитометрия
Микроваскулярные эндотелиальные клетки (MECs) от здоровых C57BL/6 и больных сепсисом (CLP) мышей выделяли, как описано выше, и инкубировали с антимышиным VEGFR2 и анти-TREM1, конъюгированным с FITC и РЕ, в течение 20 минут при 4°С. Затем клетки отмывали дважды PBS и фиксировали в 0,1% формальдегиде с последующим анализом на проточном цитометре. В качестве контроля использовали изотип IgG2a мышей в той же концентрации.
В других экспериментах MECs стимулировали или не стимулировали LPS (0.1 мкг/мл) в течение 2 ч и 6 ч перед FACS анализом.
Для получения суспензии клеток одного типа из инфарктной ткани, у животных удаляли сердца, измельчали их тонкими ножницами; помещали в смесь из коллагеназы I, коллагеназы XI, ДНКазы I и гиалуронидазы (Sigma-Aldrich); и взбалтывали при 37°С в течение 1 ч. Затем клетки измельчали и центрифугировали (15 мин, 500 г, 4°С).
Селезенки удаляли, измельчали в HBSS при 4°С при помощи конца 3-мм шприца и фильтровали через 70-мкм нейлоновые фильтры (BD). Клеточную суспензию центрифугировали при 300 g в течение 10 минут при 4°С. Красные кровяные клетки лизировали (раствор для лизиса эритроцитов, Miltenyi), а спленоциты отмывали HBSS и ресуспендировали в HBSS, обогащенном 0,2% (вес/объем) BSA. Периферическую кровь выпускали посредством сердечной пункции с использованием раствора цитрата в качестве антикоагулянта, а красные кровяные клетки лизировали. Наконец, получали суспензии клеток костного мозга путем выделения их из бедренной кости, промывания 1 мл HBSS, фильтрации через 70-мкм нейлоновые фильтры и центрифугирования при 300 g в течение 10 минут при 4°С. Общее количество жизнеспособных клеток определяли в аликвотах с помощью гемацитометра при окрашивании трипановым синим (BioRad).
Клеточные суспензии инкубировали в смеси mAbs против CD4+ или CD8+ Т-клеток (CD4- или CD8-APC, CD3ε-PE, CD45-FITC), В-клеток (CD19-PE, CD45-FITC), гранулоцитов (CD45-FITC, Ly-6G-APC), субпопуляций моноцитов (CD115-РЕ, Ly-6C-APC, CD45-FITC); все антитела получены от Miltenyi Biotech. Охарактеризованное количество клеток вычисляли как общее число живых клеток (общее количество жизнеспособных лейкоцитов на мл) и процент клеток в пределах выбранных значений и выражали в расчете на мг ткани (сердце), органа (бедро и селезенка) и мл (кровь). Данные были получены на цитометре FC500 (Beckman Coulter).
Выделение РНК и анализ с помощью полимеразной цепной реакции
2
2
Общую РНК выделяли из клеток или участков ишемии и участков здоровых тканей с использованием RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Courtaboef, France) и подсчитывали с помощью NanoDrop (ThermoScientific) перед ретротранскрипцией с использованием iScript cDNA synthesis kit (BioRad) и подсчитывали с помощью количественной ПЦР с доступными зондами Qiagen (Quantitect Primers) для mTREM-1, mTNF-α, mIL-6, mMMP-9, mTIMP-1 и mActB. Альтернативно, общая РНК была ретротранскрибирована с помощью RT First Strand Kit (SABiosciences, Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, France) для ПЦР (Mouse Innate Immune/Endothelial Cells RT Profiler PCR Arrays, SABiosciences). Все анализы ПЦР осуществляли на MyiQ Thermal Cycler и подсчитывали с помощью программного обеспечения iQ5 (Qiagen). Генная экспрессия была нормализована с помощью ActB.
Анализ фосфорилирования белков
Ткани из ишемических и неповрежденных участков или MECs лизировали экстрагирующим реагентом PhosphoSafe (Novagen) и центрифугировали в течение 5 минут при 16,000 g при 4°С для получения супернатанта. Концентрацию белков определяли по методу Bradford's (Pierce). Затем лизаты анализировали при помощи вестерн-блоттинга (Criterion XT Bis-Tris Gel, 4-12%, BioRad и PVDF мембраны, Millipore), выявляли с помощью анти-фосфо-р38, -pEPK1/2, -pAKT, -pGSK3β, -iNOS, -COX2, -SOCS3, -TREM1 и соответствующего вторичного антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (Cell Signaling) и субстратом SuperSignal West Femto (Pierce). Анти-р38, -ERK1/2, -AКT, -GSK3β или -Тубулин использовали для нормализации. Панель множественных фосфорилированных белков также изучали при помощи иммуноблоттинга (фосфокиназная матрица; R&D Systems). Опознавание и анализ плотности количественных сигналов осуществляли при помощи аппарата для визуализации LAS-4000 и программного обеспечения Multi-Gauge (Фуджифильм).
Измерение концентрации цитокинов
Содержание цитокинов в миокардиальных лизатах (из зон ишемии и здоровых зон) и MECs в супернатантах измеряли при помощи ELISA (Mouse Quantikine ELISA kits, R&D systems) и панели исследования цитокинов (Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit, Panel A, R&D systems) в соответствии с рекомендациями производителя.
Зимография
2
Ферментативную активность ММР-9 в экстрактах тканей определяли при помощи SDS-PAGE зимографии в желатине. ММР-9 в случае его присутствия в тканевых экстрактах разрушает желатиновую матрицу, оставляя чистую полосу после окрашивания геля на белок. Гомогенизированные и нормализованные образцы тканей были денатурированы без реагента-восстановителя и разделены путем электрофореза в 7,5% геле SDS-PAGE, содержащем желатин. Затем образцы инкубировали в присутствии Triton х-100 (для ренатурации белка) при комнатной температуре в течение 2 ч и затем при 37°С в течение ночи в буфере, содержащем 10 мМ CaCl, 0,15 М NaCl и 50 мМ Tris (рН 7,5). Затем образцы окрашивали 0,25% кумасси голубым. Анализ и подсчет полос осуществляли при помощи денситометрии.
Крысиная модель постоянной ишемии миокарда
Использовали взрослых крыс Wistar (360-380 г). Всех крыс вводили в наркоз кетамином (100 мг/кг, внутримышечно) и осуществляли искусственную вентиляцию легких. После левосторонней торакотомии выделяли левую коронарную артерию и перевязывали ее проленовой хирургической нитью 6-0. Окклюзия LAD (передней нисходящей ветви левой коронарной артерии) подтверждалась изменением цвета миокарда от красного до белого в зоне ишемии (левый желудочек). Грудную клетку закрывали, кожу зашивали шелковой хирургической нитью 6-0. Животных возвращали в клетки, где их наблюдали до полного восстановления. Уровень послеоперационной смертности крыс составил 20%.
После хирургической окклюзии LAD выраженность зоны ишемии оценивали при помощи микро-ПЭТ визуализации. Затем животных произвольным образом разделяли на группы, получавшие пептид (5 мг/кг) каждые 24 ч в течение 5 дней, или плацебо (носитель).
Дополнительную оценку осуществляли на 6 неделе при помощи микро-ПЭТ визуализации и проводящего катетера (Millar) для того, чтобы изучить лечебный эффект пептидов на ремоделирование миокарда и миокардиальную функцию.
Крысиная модель реперфузии после ишемии миокарда
Животным проводили хирургическое вмешательство аналогичное тому, которое осуществляли для моделирования постоянной ишемии, но с реперфузией зоны ишемии за счет снятия лигатуры с LAD через 60 минут ишемии. Затем использовали тот же протокол, что и в предыдущем эксперименте.
МикроПЭТ визуализация
18
Всем животным за 60 минут до начала ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография) внутривенно вводили приблизительно 70 мБк F-FDG (в объеме 0,3-0,5 мл) под быстрой анестезией (ингаляция 1,5-2,5% изофлурана). Данные регистрировали под продолжающейся анестезией изофлураном с использованием специально предназначенной компактной ПЭТ системы (Inveon, Siemens, Knoxville, TN, USA). Животных помещали в положение лежа на животе на нагревательную подушку для поддержания температуры тела в пределах нормы. Животных подсоединяли к стандартному ЭКГ аппарату посредством трех электродов, установленных на внутренней поверхности конечностей. Время регистрации для эмиссии 18F составляло 20 минут, для трансмиссии 57°С - 6 минут. Временное окно совпадений устанавливали на уровне 3,4 нс, а канал регистрации излучения между 350 и 650 кэВ. Изображения реконструировали в 16 сердечных интервалах, обеспечивая временное разрешение 11-15 мкс для стандартных значений частоты сердечных сокращений. В этих условиях аксиальное пространственное разрешение составляло менее 1,5 мм. Кроме того, на фантомных изображениях левого желудочка крыс (LV), полученных при помощи стереолитографии, точное определение актуального объема просвета желудочка обеспечивалось ФДГ-ПЭТ изображениями на уровне выше 100 мкл, что соответствует нижней границе для эндосистолического объема LV у взрослых.
Исследования при помощи проводящего катетера
Крыс вводили в наркоз изофлураном и в левый желудочек через правую сонную артерию устанавливали 2 F катетер высокоточного микроманометра (SPR-407, Millar Insitute, Houston, ТХ, USA). Катетер Millar присоединяли к системе Harvard Data Acquisition, снабженной PC интерфейсом с программным обеспечением AcqKnowledge (ACQ 3,2).
Атеросклероз у мышей
Мышей АроЕ-/- мужского пола возрастом 12- недель помешали на жировую диету (жиры 15%), холестерин 1,25%, отсутствие холата) и ежедневно интраперитонеально вводили им пептиды (100 мкг/день) или PBS. Через 4 недели жировой диеты мышей умерщвляли для последующего исследования.
Атеросклеротические бляшки окрашивали красным маслом и подсчитывали их количество в аортальном синусе. При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуногистохимии анализировали состав бляшек. В довершение изучали эффект лечения пептидами на рекрутинг моноцитов в атеросклеротические бляшки при помощи методики импульсного окрашивания, разработанной Potteaux et al. Вкратце, моноциты метили in vivo путем ретрорбитальной i.v. инъекции 1 мкл простых зеленых флуоресцирующих микросфер Fluoresbrite, разведенных в стерильном PBS в соотношении 1:4 [Potteaux et al., 2001]. Количество флуоресцирующих микросфер в очагах повреждения отражает рекрутинг моноцитов.
Результаты
1. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, улучшают LPS-индуцированную сократительную и эндотелиальную дисфункцию аорты
Для того чтобы установить, может ли модуляция TREM-1 влиять непосредственно на вазомоторную функцию эндотелия, ex vivo стимулировали сосуды или деэндотелиализированные сосуды, выделенные из организма нормальных крыс, LPS, αTREM-1 (агонист TREM-1), пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, а также контрольным рандомизированным LR-12 пептидом. Сначала LPS, также как и αTREM-1 индуцировал вазомоторную дисфункцию (Фиг. 1А и С). Затем введение пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, приводило к восстановлению LPS-ассоциированной вазомоторной дисфункции (Фиг. 1В и С). Наконец, все пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, теряли свой благоприятный эффект при удалении эндотелия (Фиг. 1В).
2. TREM-1 экспрессируется в эндотелиальных клетках аорты и мезентериальной артерии:
Для того чтобы определить, экспрессируется ли TREM-1 в эндотелиальных клетках аорты мышей и мезентериальной артерии крыс, стимулировали сосуды (как с эндотелием, так и без) LPS в течение 6 ч (100 нг/мл). Экспрессия TREM-1 подвергалась повышающей регуляции при стимуляции LPS только в присутствии эндотелия, как в мышиной аорте (Фиг. 2А), так и в мезентериальной артерии крыс (Фиг. 2В).
Также впервые продемонстрировано, что TREM-1 экспрессируется в эндотелиальных клетках аорты мышей и мезентериальной артерии крыс.
3. TREM-1 экспрессируется в микроваскулярных эндотелиальных клетках легких и печени (LuMEC и LiMEC).
TREM-1 постоянно экспрессируется в микроваскулярных эндотелиальных клетках легких и печени; его экспрессия подвергается повышающей регуляции во время сепсиса и при LPS стимуляции (Фиг. 3). Эти результаты были дополнительно подтверждены при помощи RT-PCR в реальном времени (Фиг. 3С).
Экспрессия TREM-1 сильно увеличивалась после 4-часовой стимуляции LPS и после ее прекращения уменьшалась. Для TNF-α и IL-6 была показана аналогичная кинетика (Фиг. 4).
Как и ожидалось, стимуляция клеток LPS в течение 24 ч приводила к активной продукции различных цитокинов, концентрация которых снижалась при введении пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1 (Фиг. 5).
Таким образом, лечение пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, способствует уменьшению продукции провоспалительных цитокинов эндотелиальными клетками.
4. Модуляция TREM-1 улучшает индуцированную сепсисом сердечно-сосудистую недостаточность
Мышиная модель: Введение пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, поддерживает среднее артериальное давление и сдерживает развитие лактоацидоза во время септического шока у мышей. Исследование васкулярных сигнальных путей показало, что Akt каскад во время сепсиса подавляется, также как и экспрессия Сох-1 параллельно с повышающей регуляцией Сох-2 и iNOS. Указанные нарушения, характеризующие сосудистую дисфункцию, восстанавливаются TREM-1 модуляцией (Фиг. 6).
Крысиная модель: Изучение внутренней сердечной деятельности (Фиг. 7, Таблица 2) показало, что модуляция TREM-1 посредством пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, ассоциируется с улучшением нескольких кардиологических параметров: ESPVR (зависимость между конечно-систолическим давлением и объемом), PRSW (работа сердца по перекачиванию объема преднагрузки), (dP/dt)max/Ved (скорость нарастания давления в левом желудочке в ранней фазе систолы, маркер давления в левом желудочке) и LVEF (фракция выброса левого желудочка).
Модель на мини-свинках: На модели сепсиса у мини-свинок введение пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, уменьшает сердечно-сосудистую недостаточность. Перитонит вызывает быстрое снижение MAP (Фиг. 8А), несмотря на восполнение объема циркулирующей крови (7750±540 мл для контрольной группы vs 6500±800 мл для группы, получавшей LR12, р=0,137). Следовательно, для поддержания MAP>85 мм рт ст, начинали введение норэпинефрина на Н12 у 4/5 и 1/6 контрольных животных и животных, получавших LR12, соответственно. Скорость инфузии норэпинефрина, необходимая для поддержания кровяного давления, была существенно ниже у животных, получавших LR12, по сравнению с контрольной группой (Фиг. 8А).
В связи с гипотензией в контрольной группе отмечалось падение, как сердечного индекса, так и индекса мощности сердца (считается, последний лучше отражает функцию сердца). Это приводило к прогрессивному снижению SvO2 и DO2 (Фиг. 8В). Введение LR12 оказывает существенное благоприятное действие при сердечной недостаточности. В обеих группах развивался прогрессирующий лактоацидоз (Фиг. 8С), который в значительной степени купировался введением LR12 (р=0,0005).
Модельные обезьяны: При введении эндотоксина обезьянам введение пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, уменьшает сердечно-сосудистую недостаточность. Частота сердечных сокращений быстро увеличивалась после введения LPS, в то время как инфузия LR12 (не показано) не оказывала какого-либо эффекта. Стимуляция LPS приводила к незначительному повышению температуры тела, в особенности между H1 и Н2, однако отличия между группой, получавшей плацебо (LR12scr), и группой, получавшей LR1112, были незначительными (не показано).
Даже если использовались малые дозы LPS, в группе, получавшей плацебо, быстро развивалась гипотензия: систолическое артериальное давление снижалось вплоть до 25% к 180 мин, а диастолическое артериальное давление вплоть до 50% (р<0,001 vs LR12 или контрольной группы). В противоположность этому, у обезьян, получавших LR12, никогда не развивалась гипотензия, а их артериальное давление не отличалось от давления животных из контрольной группы (Фиг. 9).
5. TREM-1 экспрессируется в ткани миокарда и его экспрессия подвергается повышающей регуляции во время ишемии.
Для того чтобы определить, экспрессируется ли TREM-1 в сердечной ткани, брали образцы миокарда у мышей до перевязки коронарной артерии и затем через 6, 24 и 96 часов после инфаркта миокарда (MI), из здоровых и пораженных инфарктом участков. Исходная экспрессия TREM-1 была очень низкой, при этом ишемия индуцировала прогрессирующую повышающую регуляцию экспрессии TREM-1 с максимальным ее уровнем через 24 ч после MI (Фиг. 10А). Аналогичная кинетика уровней белка наблюдалась и при осуществлении вестернблота (Фиг. 10В). В противоположность этому, экспрессия TREM-1 оставалась низкой в не пораженных инфарктом (здоровых) участках во всех временных точках (данные не представлены).
6. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, модулируют рекрутинг лейкоцитов во время MI у мышей и регулируют мобилизацию лейкоцитов из удаленных компартментов:
high
low
high
low
У мышей, и возможно у человека тоже, существует два различных подтипа моноцитов: Ly-6C моноциты являются потенциальными медиаторами воспаления, в то время как Ly-6C моноциты оказывают противоположный эффект [NAHRENDORF et al., 2007]. Модуляция Trem-1 за счет введения пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, полностью прекращает инфильтрацию миокарда Ly-6C моноцитами, однако быстро увеличивает рекрутинг Ly-6C моноцитов. Инфильтрация PMN также блокируется введением LR12 (Фиг. 11А). Хотя TREM-1 не экспрессируется лимфоцитами, модуляция Trem-1 влияет на мобилизацию В и Т-клеток: уменьшалась инфильтрация В- и CD8+ лимфоцитами, в то время как рекрутинг CD4+ клеток увеличивался у мышей, получавших LR12.
Поскольку Trem-1 является важным элементом регуляции рекрутинга лейкоцитов в зону инфаркта миокарда, был изучен его эффект на мобилизацию из удаленных компартментов. После инфаркта миокарда моноциты выходят из селезенки в течение 24 часов и инфильтрируют сердце (SWIRSKI et al). Этот феномен наблюдали и авторы изобретения, при этом содержание моноцитов в селезенке прогрессивно уменьшалось в течение 1 недели после MI. Параллельно отмечалось выраженное увеличение количества циркулирующих моноцитов через 72 ч одновременно с прогрессирующим накоплением в костном мозге (ВМ) (Фиг. 11В). Делеция Trem-1 или его модуляция практически полностью прекращают истощение моноцитов селезенки, а также моноцитоз крови.
Количество нейтрофилов в периферической крови увеличивалось через 72 ч и постепенно снижалось до исходного уровня в течение 7 дней. Указанная нейтрофилия, однако, не наблюдалась у мышей, нокаутированных по Trem-1, или получавших LR12. Селезенка существенным образом не участвует в продукции нейтрофилов и их высвобождении, поскольку их содержание в селезенке едва ли изменялось. Также наблюдалось прогрессивное и умеренное их накопление в ВМ, однако, без существенных различий между группами (Фиг. 11В).
Количество В-, CD4+-, CD8+ лимфоцитов в селезенке резко уменьшалось через 24 ч после MI, с сопутствующей CD4+ и CD8+ лимфопенией. Затем повышенный уровень циркулирующих лимфоцитов наблюдался через 72 ч, после чего постепенно возвращался до исходного уровня в течение 7 дней после MI. Блокирование Trem-1 препятствует развитию указанных изменений кинетики лимфоцитов (Фиг. 11В).
high
low
Моноцитарный хемотаксический протеин 1 (МСР-1 или CCL2), CX3CL1 (или Фракталкин) и МСР-3 (или CCL7) являются важными хемокинами, участвующими в рекрутинге соответствующих Ly-6C, Ly-6C моноцитов и лимфоцитов в очаги воспаления. Концентрация МСР-1, CX3CL1 и МСР-3 в плазме увеличивалась через 24 ч после MI. Концентрация МСР-1 и МСР-3 быстро снижалась у мышей, получавших лечение (Фиг. 11С).
7. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, модулируют миокардиальную воспалительную реакцию во время MI у мышей.
Было изучено, может ли модуляция TREM-1 за счет пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, регулировать активацию инфильтрующих воспалительных клеток. Воспалительные клетки, активированные фосфорилированием р38 MAPК и ERK1/2 и повышающей регуляцией экспрессии iNOS и СОХ2, быстро инфильтрируют миокард после MI. Указанная активация частично блокируется введением пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1 (Фиг. 12). При анализе кинетики фосфорилирования/экспрессии указанных белков, было отмечено уменьшение их концентрации при введении пептидов во всех случаях (не показано). В противоположность указанному, некоторые белки вовлеченные в выживаемость (AКT) или известные как ослабляющие проведение сигналов (SOCS3) подвергалась повышающей регуляции всеми пептидами. Например, киназа гликогенсинтазы 3 (GSK3β) играет центральную роль в регуляции продукции про- и анти-воспалительных цитокинов. В естественных иммунных клетках инактивация GSK3β (посредством фосфорилирования) подавляет продукцию цитокинов и, как известно, улучшает выживаемость кардиомиоцитов. В данном случае продемонстрировано, что фосфорилирование GSK3β увеличивалось при введении пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, по сравнению с контролем.
Поскольку клеточная провоспалительная активность модулируется введением пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, авторы изобретения также исследовали, будет ли это приводить к снижению продукции цитокинов/хемокинов.
Среди 168 генов, участвующих в естественном иммунном ответе и функционировании эндотелия, авторы изобретения отметили изменение экспрессии гена 156 в миокарде после перевязки коронарной артерии, наиболее выраженное через 24 ч после MI. Введение LR12 индуцирует активацию генов при инфаркте миокарда.
Как и ожидалось, MI приводит к быстрой продукции различных цитокинов (IL6, IL13, IL17, IL27, IFNγ) и хемокинов (MIP2, JE). Концентрация указанных белков снижалась при введении пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1 (Фиг. 13А). Количественная ПЦР подвердила указанные результаты на генном уровне (Фиг. 13В), в частности, через 6 ч после MI.
Таким образом, введение пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, способно модулировать MI-воспалительную реакцию в участках инфаркта.
8. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, снижают активность протеаз в тканях миокарда, пораженных инфарктом.
Инфильтрирующие нейтрофилы и макрофаги экспрессируют матричную металлопротеиназу 9 (Mmp-9) в миокарде, пораженном инфарктом. Активность Mmp-9 может быть уравновешена тканевым ингибитором металлопротеиназы-1 (Timp-1). Поддержание тонкого баланса между двумя указанными белками играет ключевую роль в профилактике ремоделирования желудочка, которое приводит к сердечной недостаточности. Продемонстрировано, что экспрессия Mmp-9 и Timp-1 мРНК повышалась в зонах инфаркта у контрольных мышей. В противоположность этому, экспрессия Mmp-9 оставалась низкой у животных, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, в то время как экспрессия Timp-1 существенно повышалась (Фиг. 14А, В). Таким образом, соотношение Mmp-9/Timp-1 было существенно выше у контрольных мышей. Желатиназная активность Mmp-9 в зонах инфаркта была существенно выше в контрольной группе, чем у мышей, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1 (Фиг. 14С).
Полученные результаты подтверждают, что пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, могут оказывать благоприятный эффект на сохранение структуры миокарда и препятствовать ремоделированию миокарда после MI.
9. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, улучшают выживаемость мышей после MI
Далее было исследоано, оказывает ли введение пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, протективное действие во время MI. Взрослым мышам Balb/c мужского пола произвольным образом отобранным интраперитонеально вводили повторяющиеся дозы (100 мкл ежедневно в течение 5 дней) пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, или LR-12-рандомизированный пептид, введение начинали через 60 минут после необратимой перевязки коронарной артерии. Все животные кроме одного из группы, получавшей LR12, выжили (Фиг. 15), в то время как 40% животных из контрольной группы погибли (Long-Rank teat; p<0,01). Аналогичные результаты были получены с другими пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1.
Для того чтобы определить, насколько длительная TREM-1 нагрузка может оказывать неблагоприятное действие, мышам вводили агонистичное mAb анти-TREM-1. Такое лечение приводило к значительному увеличению смертности животных, только 20% из них выжили.
10. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, улучшают сердечную функцию после миокардиальной ишемии и последующей реперфузии у крыс.
Для лучшего понимания роли пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, была использована показательная модель MI с временной перевязкой коронарной артерии (модель ишемия-реперфузия: IR) у крыс. После произвольного отбора животным проводили микро-ПЭТ под анестезией и вводили пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1 (3 мг/кг ежедневно в течение 5 дней, интраперитонеально) или LR12-рандомизированный пептид. Затем повторяли визуализацию через 6 недель после чего исследовали сердечную функцию при помощи проводящего катетера.
На первый день сразу после IR, сравнивали обе группы. Зоны инфаркта были выражены умеренно, а сердечные функции незначительно изменены. К 6 неделе все крысы выздоровели с почти полным заживлением зон инфаркта без выраженного ремоделирования желудочка (Таблица 3, в которой сведены физиологические параметры при миокардиальной ишемии-реперфузии у крыс). Таким образом, пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, не оказывали влияния на параметры, исследуемые с помощью микро-ПЭТ. В противоположность указанному, при изучении сердечной функции с помощью проводящего катетера, было отмечено что пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, существенно улучшали важнейшие систолические параметры, такие, как Emax или PRSW (Фиг. 16, Таблица 4).
Таким образом, при использовании модели относительно умеренной миокардиальной ишемии, было показано, что введение пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, способствует восстановлению систолической сердечной функции.
11. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, улучшают систолическую и диастолическую функции после инфаркта миокарда у крыс
С целью исследования, приводит ли модуляция воспалительного ответа, обусловленная пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, к улучшению сердечных функций после тяжелого MI, осуществляли постоянную перевязку коронарной артерии у крыс перед их произвольным разделением на группы и последующей визуализацией, как описано выше.
На 1-й день состояние животных из обеих групп было полностью одинаковым. К 6-й неделе имело место выраженное ремоделирование миокарда, подтвержденное наличием выраженного расширения желудочка. Указанное ремоделирование миокарда, по крайней мере, частично изменялось после введения пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1 (Таблица 5, в которой сведены физиологические параметры при миокардиальной ишемии-реперфузии у крыс). Непрямым маркером сердечной недостаточности является прибавка веса у животных из контрольной группы, по сравнению с крысами, получавшими все пептиды.
При исследовании сердечной функции при помощи проводящего катетера обнаружено, что введение пептидов, происходящих из TREM-1 или TLT-1, приводило к выраженному улучшению систолических и диастолических параметров, таких, как Emax, ESPVR, PRSW, dP/dTmin, dP/dTmax и Ved (Фиг. 17). Взятые в совокупности, полученные данные подтверждают протективное действие пептидов, происходящих из TREM-1 и TLT-1, в отношении развития ремоделирования миокарда и сердечной недостаточности после инфаркта.
12. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, препятствуют развитию атеросклероза у мышей.
2
2
Атеросклеротические бляшки в аортальном синусе окрашивали красным маслом и подсчитывали. Что интересно, лечение пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, индуцировало значительное (30%) уменьшение очагов повреждения в аортальном синусе (103318 мкм vs 146736 мкм, Ρ=0,02) (Фиг. 18). Этот результат был подтвержден в последующих экспериментах.
13. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, изменяют клеточный состав атеросклеротических бляшек.
При помощи иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуногистохимии анализировали состав бляшек. Не было отмечено каких-либо существенных отличий, касающихся лимфоцитарной инфильтрации (анти-CD3 антитело) и накопления коллагена (сириус красный), между двумя группами. Однако было обнаружено значительное уменьшение (27%) инфильтрации макрофагами очагов повреждения у мышей, получавших лечение пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1 (Фиг. 19).
14. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, изменяют популяцию лейкоцитов в крови у мышей с атеросклерозом.
При помощи проточной циометрии анализировали популяции лейкоцитов крови. Классические моноциты имели фенотип CD115+Grlhigh, а неклассические моноциты имели фенотип CD115+Grllow. У ароЕ-/-мышей, находящихся на диете, только неклассические моноциты экспрессировали TREM. Диета с высоким содержанием жиров приводила к увеличению экспрессии TREM-1 на неклассических моноцитах (данные не представлены).
Затем анализировали популяции лейкоцитов крови во время лечения. На 7-й день было отмечено существенное снижение концентрации неклассических моноцитов в крови у мышей, получавших пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1 (Фиг. 20). На 28 день было отмечено существенное снижение концентрации как классических, так и неклассических моноцитов в крови (Фиг. 21).
15. Пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, уменьшают рекрутинг моноцитов в атеросклеротические бляшки.
Исследовали эффект лечения пептидами, происходящими из TREM-1 и TLT-1, на рекрутинг моноцитов в атеросклеротические бляшки. Была использована методика импульсного окрашивания, предложенная Potteaux et al. Вкратце, моноциты метили in vivo путем ретрорбитальной i.v. инъекции 1 мкл простых зеленых флуоресцирующих микросфер Fluoresbrite, разведенных в стерильном PBS в соотношении 1:4 [Ait-Oufella H, Taleb S, Mallat Ζ, Tedgui Α. Recent advances on the role of cytokines in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasс Biol 31 (5): 969-979, 2011]. Количество флуоресцирующих микросфер в очагах повреждения отражает рекрутинг моноцитов. Микросферы вводили за 24 часа до умерщвления ароЕ-/- мышей, получивших лечение. Что интересно, было обнаружено, что в группе, получавшей пептиды, происходящие из TREM-1 и TLT-1, происходило уменьшение моноцитарной инфильтрации по сравнению с контрольной группой (Фиг. 22).