Иммунометаболические эффекты протеолитических ферментов и жирорастворимых витаминов при острой кровопотере

могла бы найти применение в клинической

практике с целью сокращения сроков реабилитации больных с кожными ранами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Акмаев И.Г. Современные представления о взаимодействиях регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной // Успехи физиол. наук. - 1996. - Т. 27, № 1. - С. 3-20.

2. Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность // Киев, 1991. - 168 с.

3. Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хоти-нян В.Ф. Лечение ран в управляемой абакте-риальной среде. - М., 1981. - 157 с.

4. Матусис З.Е., Пылаева С.И. К методике определения индекса завершенности фагоцитоза // Лаб. дело. - 1972. - № 4. - С. 237-240.

5. Медведев А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. -1991. - № 2. - С. 19-20.

6. Чеснокова И.Г. Изменения в иммунной системе при травматической болезни // Иммунопатология и клиническая иммунология. -2000. - № 6. - С. 39-42.

7. Щербаков В.И. Применение НСТ-теста для оценки чувствительности нейтрофилов к стимуляторам // Лаб. дело. - 19S9. - № 1. -С.30-33.

S. Maquart F.X., Pickart L., LaurentM. et al. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ // FEBS Lett. - 19SS. -Vol. 23S, N 2. - Р. 343-34б.

9. Pickart L. A synthetic tripeptide which increases survival of normal liver cells, and stimulates growth in hepatoma cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1973. - Vol. 54, N 2. -P. 5б2-5бб.

10. Trackhy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H. The hair follicle-stimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice // Ann. N.-Y. Acad. Sci. - 1991. - Vol. б42, N 10. -P.46S-469.

11. Wang Y., Wang X.M., Han J.S. Inhibition of the expression of delta opioid receptor mRNA by long-term exposure of NG-10S-15 cell line to delta opioid agonists // Sheng Li Xue Bao. -199S. - Vol. 50, N 2. - P. 217-221.

12. Werner S., Grose R. Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines // Physiol Rev. - 2003. - Vol. S3 - P. S35-S70.

УДК 616-097:616-005.1

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ ПРИ ОСТРОЙ КРОВОПОТЕРЕ

© Лазарев А.И., Бровкина И.Л., Рыбников В.Н., Прокопенко Л.Г.

Кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета

В работе в условиях экспериментальной острой кровопотере выявлены иммунометаболические эффекты, вызываемые протеолитическими ферментами (папаином и террилитином) и их сочетанием с жирорастворимыми витаминами (менадионом, ретинола ацетатом и токоферола ацетатом). Установлено, что иммуномодулирующие эффекты совместного применения террилитина и жирорастворимых витаминов в норме и при кровопотере опосредуются эритроцитами.

Ключевые слова: протеолитические ферменты, жирорастворимые витамины, острая кровопотеря, иммунные и метаболические эффекты.

IMMUNE AND METABOLIC EFFECTS OF PROTEOLYTIC ENZYMES AND LIPOSOLUBLE

VITAMINS IN THE ACUTE BLEEDING Lazarev A.I., Brovkina I.L., Rybnikov V.N., Prokopenko L.G.

Biochemistry Department of the Kursk State Medical University

In the research the immune and metabolic effects of proteolytic enzymes (papain and terrilytinum) and lipo-soluble vitamins (menadionum, retinolum acetate and tocopherol acetate) are established in the experimental acute bleeding. It has been established, that the immunomodulating effects of applying terrilytinum and liposoluble vitamins in norm and in the acute bleeding are mediated by erythrocytes.

Key words: proteolytic enzymes, liposoluble vitamins, acute bleeding, immune and metabolic effects.

Исследования последних десятилетий позволили сформулировать представление о важной роли протеолитических ферментов в регуляции обмена веществ и физиологических функций, в процессах развития и старения организма. Наиболее полно изучено физиологическое значение ограниченного про-теолиза, являющегося пусковым механизмом многих процессов, обеспечивающих сохранение гомеостаза при действии на организм экологических, генетических и онтогенетических факторов. Ограниченный протеолиз лежит в основе образования многих физиологически активных соединений - соматотропина, инсулина, глюкагона, адренокортикотропина, паратгормона, гастрина, эндорфинов и обеспечивает функционирование ряда физиологических систем - свертывающей, фибриноли-тической, калликреин-кининовой, ренин-ангиотензинной, системы комплемента [2, 6].

Протеолитические ферменты оказывают выраженное влияние на процессы фагоцитоза, являющиеся у высших организмов основной формой защиты от патогенных микробов и составной частью многих физиологических и патологических реакций. Они изменяют

структуру рецепторного аппарата лимфоцитов периферической крови и лимфоидных органов и вызывают глубокие изменения клеточного метаболизма [13].

Острая кровопотеря приводит к нарушению баланса протеолитического и антипро-теолитического потенциала крови. Равновесие между этими параметрами сдвигается в сторону преобладания активности антипро-теолитических белков, что может стать причиной ослабления регулирующего влияния на гомеостаз и угнетения функциональной активности клеток крови, участвующих в развитии иммунологических процессов -нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов [10].

Целью исследования явилось изучение иммунометаболических эффектов, вызываемых протеолитическими ферментами и их сочетанием с жирорастворимыми витаминами при острой кровопотере.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на крысах Ви-стар массой 190-210 г. Острую кровопотерю

вызывали одномоментным кровопусканием из бедренной артерии в объеме 1% от массы тела. Через 6 часов после кровопускания определяли фагоцитарно-метаболичес-кую активность (ФМА) нейтрофилов (фагоцитарное число (ФЧ) и фагоцитарный индекс (ФИ), показатели спонтанного (НСТ-сп.) и стимулированного (НСТ-стим.) НСТ-теста, индекс активности фагоцитов и окислительный резерв нейтрофилов). В эритроцитах устанавливали активность антиоксидантных ферментов (супероксидисмутазы (СОД) и каталазы (Кат)), активность Ка+-К+-АТФазы и М§2+-АТФазы), содержание продуктов перекисно-го окисления липидов (ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА)), концентрацию макроэргических соединений (2,3-бисфосфоглицерата (БФГ) и аденозин-трифосфата (АТФ)) [1, 3, 7, 9, 14].

Через 1 час после кровопотери крыс внут-рибрюшинно, однократно иммунизировали

£

эритроцитами барана (10 клеток/кг). Через 5 суток определяли выраженность гуморального иммунного ответа (по количеству антите-лобразующих клеток в селезенке (АОК) и антителозависимой клеточной цитотоксичности спленоцитов (АЗКЦ)) и гиперчувствительности замедленного типа (по разнице массы (РМЛ) и числа ядросодержащих клеток (РКЛ) в регионарных и контралатеральных лимфатических узлах), устанавливали также выраженность антителозависимой цитотоксично-

сти [4, 8, 15]. Эритроциты получали через 6 часов после кровопотери фракционированием в градиенте плотности яичного альбумина и определяли их иммуномодулирующие свойства путем их трехкратного введения алло-

у

генным животным (по 107 клеток/кг с интервалом 12 часов).

Животным вводили папаин (1 мг/кг), тер-рилитин (5 МЕ/кг), токоферола ацетат (10 мг/кг), ретинола ацетат (15 мг/кг), менадион (2 мг/кг). Все препараты вводили внутримышечно 5-кратно с интервалом 12 часов, первую инъекцию проводили непосредственно после кровопускания.

Результаты подвергали статистической обработке, для оценки существенности различий средних величин пользовались критериями Стьюдента и Вилкоксона-Манна и Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У интактных животных введение папаина снижало ФМА нейтрофилов, угнетало развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа (ГИО и ГЗТ) (рис. 1). Использование токоферола ацетата и менадиона, также как и ретинола ацетата, не влияло на выраженность угнетения ФМА лейкоцитов и иммунологическую реактивность животных, получавших папаин.

ФЧ

Рис. 1. Влияние папаина и террилитина на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс.

Обозначения: 1 - контроль (без введения ферментов); 2 ----------- введение папаина; 3 - —  —  — - введе-

ние террилитина; 4 - # - р<0,05 относительно контроля.

Таблица 1

Влияние эритроцитов здоровых крыс, получавших папаин и террилитин,

на развитие ГИО и ГЗТ

Группы животных АОК РMЛ

1. Контроль 22,0±1,б з,з±0,з

2. Легкие эритроциты крыс, получавших папаин 11,2±0,В*1 3,1±0,2*1

3. Тяжелые эритроциты крыс, получавших папаин 14,3±0,9*1,2 4,4±0,3*1,2

4. Легкие эритроциты крыс, получавших террилитин 27,1±1,В*2,3 З,З±0,3*2,3

5. Тяжелые эритроциты крыс, получавших террилитин 49,б±2,7*1-4 В,4±0,З*1-4

Примечания: здесь и в последующих таблицах, рисунках звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (р<0,05); цифры рядом со звездочкой - по отношению к показателям какой группы эти различия.

Инъекции папаина интактным животным индуцировали появление выраженной имму-носупрессорной активности у легких и слабо выраженной иммуносупрессорной активности у тяжелых эритроцитов (табл. 1). Токоферола ацетат и менадион не влияли на свойства клеток, а ретинола ацетат ослаблял (но не отменял) иммуносупрессирующую активность легких клеток и отменял аналогичную активность тяжелых эритроцитов.

Введение здоровым крысам террилитина повышало величины всех показателей, характеризующих ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ (рис. 1). Террилитин индуцировал появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов (табл. 1). Таким образом, влияние папаина и террилитина у ин-тактных животных на специфическую и иммунологическую резистентность было противоположным - папаин действовал как иммуносупрессор, террилитин - как иммуностимулятор.

После кровопотери в эритроцитах снижалась концентрация макроэргических соединений (БФГ и АТФ), активность ионных насосов (Ка+-К+-АТФазы и, особенно, М§2+-АТФазы), антиоксидантных ферментов (СОД и Кат), возрастала концентрация продуктов перекисного окисления липидов (АГП и

МДА) (рис. 2). Значительное снижение ак-

2+

тивности М§ -АТФазы, вероятно, играет основную роль в снижении содержания макро-эргических соединений, так как этот насос обеспечивает поступление в эритроциты ионов магния, являющихся кофактором большинства ферментов гликолиза, основного энергодонорного метаболического пути эритроцитов [5]. Снижение активности двух ключевых ферментов антиоксидантной си-

стемы и обусловленное этим повышение содержания в эритроцитах продуктов перекис-ного окисления липидов приводит к снижению вязкости билипидного слоя мембраны клеток, нарушению конформации и архитектоники белков, интегрированных в каркас мембраны. Следствием этого, возможно, является нарушение функции АТФаз мембраны, ограничение генерации макроэргических соединений и дальнейшее угнетение АТФаз-ной активности ионных переносчиков.

Введение крысам папаина после кровопо-тери не влияло на иммуносупрессирующую активность легких эритроцитов и на свойства тяжелых эритроцитов, не изменяло величину показателей, характеризующих иммуносу-прессирующий потенциал плазмы, энергетический и антиоксидантный статус эритроцитов, не оказывало существенного влияния на ФMА лейкоцитов и иммунологическую реактивность организма (рис. 2, 3, 4). Террилитин, в отличие от папаина, значительно уменьшал выраженность изменений параметров имму-нометаболического статуса плазмы и эритроцитов, индуцировал появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов, повышал ФMА лейкоцитов, усиливал выраженность ГИО и ГЗТ (рис. 2, 3, 4).

Введение здоровым крысам террилитина и препаратов жирорастворимых витаминов по отдельности не оказывало влияния на ФMА лейкоцитов и развитие ГИО и ГЗТ. Сочетанное введение террилитина и ретинола ацетата вызывало существенное повышение величин показателей, характеризующих функции лейкоцитов и иммунологическую реактивность. В отличие от этого, совместное применение террилитина и токоферола ацетата не влияло на ФMА нейтрофилов, развитие

БФГ

Рис. 2. Влияние протеолитических ферментов на энергетический и антиоксидантный статус эритроцитов крыс после кровопотери.

Обозначения: 1 - радиус окружности - контроль (1 группа); 2 - -------- - кровопотеря (2 группа); 3 -

-------------- кровопотеря + папаин (3 группа); 4 - —  —  — - кровопотеря + террилитин (4 группа); З - % -

p<0^ относительно контроля; различия между 3 и 2 группами недостоверны ф>0,0З), а между 4 и 2 группами различия достоверны (p<0,05).

ФЧ

Рис. 3. Влияние протеолитических ферментов на ФMА лейкоцитов, ГИО и ГЗТ у крыс после кровопотери.

Обозначения: 1 - радиус окружности - контроль (1 группа); 2 - ---------- - кровопотеря (2 группа); 3 -

------------- кровопотеря + папаин (3 группа); 4--- —  — - кровопотеря + террилитин (4 группа); З - ф -

p<0^ относительно контроля; различия между 3 и 2 группами недостоверны (p>0,05), а между 4 и 2 группами различия достоверны (p<0,05).

бо

50

4о

30

20

10

А

0

*1-б

*

*2

*

*1

*2,4

*

*1,3

Т—---------—I—---- I --------—г

і —і

1 2 3 4 5 6 7

9

s

7

б

5

4

3

2

1

0

Б

*2

*1

*

*1,3

rbi

1-б

[Ь

*2,4

4,3,5

Т----------------1---------------1---------------1---------------1---------------г

1 2 3 4 5 б 7

Рис. 4. Влияние эритроцитов крыс, получавших после кровопотери протеолитические ферменты, на развитие ГИО и ГЗТ.

Примечания: по оси абсцисс: 1 - контроль; 2, 3 - легкие и тяжелые эритроциты крыс, подвергнутых кровопусканию; 4, 5 - легкие и тяжелые эритроциты крыс, подвергнутых кровопусканию, получавших папаин; 6, 7 - легкие эритроциты крыс, подвергнутых кровопусканию, получавших террилитин; по оси ординат: А - АОК, тыс./селезенка; Б - РМЛ, мл.

70 б0 50 40 30 20 10 0

1-4

1

2

3

4

5

Рис. З. Влияние террилитина и жирорастворимых витаминов на развитие ГИО и ГЗТ. Примечания: по оси абсцисс: 1 - контроль; 2 - террилитин; 3 - террилитин + ретинола ацетат; 4 - террилитин + токоферола ацетат; З - террилитин + менадион; по оси ординат: А - АОК, тыс./селезенка; Б - РMЛ, мл.

ГИО и ГЗТ, а введение террилитина и мена-диона вызывало невыраженное, но статистически достоверное повышение активности лейкоцитов и иммунологической реактивности здоровых животных (рис. З).

Введение террилитина с токоферола ацетатом не приводило к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. В отличие от

этого, инъекции террилитина с ретинола ацетатом или менадионом индуцировали появление у эритроцитов иммуностимулирующих свойств.

После кровопотери совместное введение террилитина с ретинола ацетатом или токоферола ацетатом не оказывало влияния на ФMА нейтрофилов, развитие ГИО и ГЗТ, в отличие от этого, террилитин с менадионом

4б

Таблица 2

Влияние террилитина и жирорастворимых витаминов на развитие ГИО и ГЗТ

после кровопотери

Группы животных АОК РMЛ

1. Контроль 22,0±1,б з,з±0,з

2. Кровопотеря 11,1±0,7*1 2,б±0,2*1

3. Кровопотеря, введение террилитина и ретинола ацетата 12,4±0,В*1 2,З±0,2*1

4. Кровопотеря, введение террилитина и токоферола ацетата 10,8±0,9 *1 2,7±0,2*1

З. Кровопотеря, введение террилитина и менадиона 18,9±1,2*1-4 4,2±0,4*1-4

повышали, но не нормализовали, показатели ФMА нейтрофилов и иммунологической реактивности (табл. 2).

Таким образом, в норме выраженный иммуномодулирующий эффект, вызывало сочетание террилитина с ретинола ацетатом, а после кровопотери - террилитина с менадио-ном.

Имеющиеся в литературе данные позволяют считать, что введение в организм про-теолитических ферментов приводит к развитию сложной цепи взаимосвязанных реакций, оказывающих выраженное влияние на развитие различных форм иммунного ответа. По-видимому, при введении протеолитических ферментов в организме происходит активация системы "протеазы ^ модифицированные эритроциты ^ хелперные медиаторы макрофагов ^ антипротеолитические эффекты". В норме такая система функционирует на подпороговом уровне. Активация ее при введении протеолитических ферментов, возможно, способствует сохранению иммунного и структурного гомеостаза [11, 12].

Mожно предположить, что протеазы вызывают частичное расщепление мембранных белков, а вводимые совместно с ними жирорастворимые витамины модифицируют структуру и свойства двойного фосфолипид-ного слоя мембраны. Следствием этого, вероятно, является изменение взаимосвязей рецепторных, ферментных и канальных белков мембраны и возникновение иммуномодулирующих эффектов.

Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать следующие выводы.

1. Введение папаина здоровым животным снижает фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов, угнетает развитие различных форм иммунного ответа, тогда как террилитин вызывает противоположные эффекты.

2. Введение папаина после кровопотери не влияет на показатели иммунологических функций, а террилитин уменьшает выраженность их супрессии.

3. Совместное введение террилитина и ретинола ацетата эффективно корригирует иммунологические функции здоровых животных, инъекции террилитина с менадионом у животных, подвергнутых кровопусканию.

4. Иммуномодулирующие эффекты совместного применения террилитина и жирорастворимых витаминов в норме и при кровопотере опосредуются эритроцитами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бенисевич В.И., Идельсон Л.И. Образование перекисей непредельных жирных кислот в оболочке эритроцитов при болезни Mар-киафава-Mикели // Вопр. мед. химии. - 1973.

Т. 19, вып. б. - С. З9б-599.

2. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Ки-зим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. - Киев: Здоров’я, 19ВВ. - 3б0 с.

3. Виноградова И.Л., Багрянцева С.Ю., Дер-виз Г.В. Mетод одновременного определения 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах // Лаб. дело. -19S0. - № 7. - С. 424-42б.

4. Зимин Ю.И., Чуканов С.В. Выделение стимулированными лимфоцитами фактора, угнетающего миграцию К-клеток человека // Иммунология. - 19S2. - № 1. - С. 29-33.