Влияние трансглутаминазы на состав тяжелых цепей миозинов скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб

2007

Известия ТИНРО

Том 148

УДК 597-1.05

£.П. Караулова, С.В. Леваньков, Е.В. Якуш

ВЛИЯНИЕ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЫ НА СОСТАВ ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНОВ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ГЛУБОКОВОДНЫХ РЫБ

Исследован состав тяжелых цепей миозинов скелетных мышц трех видов глубоководных рыб. Установлено, что активность мышечной трансглутаминазы (ТГ) скелетных мышц глубоководных рыб изменяется от 2,5 отн. ед. для пепельного макруруса до 13,5 отн. ед. для малоглазого макруруса. Показана связь между активностью ТГ и составом тяжелых цепей миозина. При активности ТГ 0,5 ед./100 мг миозина образуется максимальное количество белка с м.м. 480 кДа и минимальное — минорных компонентов МТЦ и белка с м.м. 180 кДа.

Karaulova E.P., Levan'kov S.V., Yakush Ye.V. Transglutaminase influence on myosin heavy chains composition from skeletal muscles of some deep-sea fish species // Izv. TINRO. — 2007. — Vol. 148. — P. 306-313.

Composition of myosin heavy chains (MHC) from skeletal muscles of three deep-sea fish species is investigated. Proper activity of the tissue transglutaminase varied from 2.5 units for Coryphaenoides cinereus to 13.5 units for Albatrossia pectoralis. MHC composition depended on activity of transglutaminase: the maximal amount of protein with molecular weight 480 kDa and the minimal amounts of MHC minor components and protein with molecular weight 180 kDa formed under the transglutaminase activity about 0.5 units/100 mg of myosin.

Традиционные технологические схемы для переработки сырья глубоководного происхождения не позволяют выпускать продукцию удовлетворительного качества. Причиной низкой используемости этих объектов является особенность их технохимических свойств: данные виды отличаются высоким содержанием воды и низким содержанием белков (Мельникова, 1976; Швидкая, 1980; Одинцов, 2002).

В последнее время в мировом вылове возросла доля мелких рыб и рыб пониженной товарной ценности, малопригодных для производства высококачественных пищевых продуктов по традиционным технологиям. Одним из перспективных путей их использования является производство белковых продуктов, например рыбного фарша, и изготовление на их основе различных кулинарных изделий. Традиционно кроме минтая, таким образом используют путассу, мерланга, карася, катрана, сайду, морского языка, акул и др. (Борисочкина, 1986; Рехина и др., 1986). Однако для получения эластичных структур на основе мышечной ткани глубоководных рыб необходимы исследования, касающиеся структурирования мышечных белков.

Определение основных физико-химических факторов, влияющих на структурирование мышечных белков в живом организме, может помочь при разработке и создании новых пищевых продуктов из глубоководных гидробионтов с применением специальных технических средств, технологических процессов и приемов биотехнологии. Не исключено, что полученные данные помогут разрабо-

306

тать общие методы, позволяющие получать структурированные белковые системы с заданными свойствами из сырья с повышенным содержанием воды.

Основным структурным компонентом миофибрилл живых организмов является миозин (Поглазов, 1965; Wong et al., 1985). Кроме того, важную роль в формировании структуры мышечного волокна играют сопутствующие белки (ферменты). Традиционно в качестве структурообразователей используют биополимеры белковой или углеводной природы. К ним относят казеин, макроглобулин, агар, каррагинан и др. (Dickinson, 2003). Их роль при производстве пищевых продуктов заключается в поглощении избыточной воды, которая образуется в результате применения тех или иных технологических приемов.

В настоящее время в качестве ферментов-структурообразователей используют микробиологическую ТГ, которая катализирует образование изопептидных связей внутри или между полипептидными цепями (Lorand, Conrad, 1984; Willemijn, 2002). При этом происходит ковалентное сшивание белков за счет образования поперечной е-(у-глутамил)-лизиновой связи между двумя молекулами белка (Folk, 1980; Aeschlimann, Paulsson, 1994).

Современные тенденции развития отечественной и зарубежной пищевой технологии свидетельствуют о возрастающей роли ферментов-структурообразо-вателей в производстве продуктов заданных структуры и физических свойств. В последнее время ТГ нашли широкое применение в пищевой промышленности при производстве эластичных структурированных продуктов (Niwa, 1992). Использование ТГ может стать перспективным при получении пищевых продуктов с эластичными свойствами из мышечной ткани глубоководных рыб.

ТГ обнаружена в мышцах большого количества гидробионтов (Araki, Seki, 1993; Nowsad et al., 1995). Установлено, что её активность существенно зависит от вида рыбы. В литературе встречается информация о том, что активность тканевой ТГ у морских рыб изменяется от 0,3 (мелкопятнистая макрель) до 2,0 отн. ед. (дальневосточная сардина) (Nowsad et al., 1995). Для пресноводного карпа активность фермента составляет 2,8-3,7 отн. ед. (Kishi et al., 1991). Сведений об активности собственной тканевой ТГ в мышцах глубоководных рыб не найдено.

Показано, что тканевая ТГ играет существенную роль в структурообразова-нии миофибриллярных белков (Niwa, 1992). В результате действия мышечных ТГ образуются полимеры миозина тяжелых цепей (МТЦ). Их наличие, по литературным данным, связывают с формированием у систем мышечных белков прочных и эластичных свойств (Nowsad et al., 1995).

В настоящей работе сделана попытка определить связь между активностью тканевой ТГ и составом миофибрилл глубоководных рыб. Необходимо было выявить общие и отличительные закономерности между содержанием воды, белка и составом основных структурных белков миофибрилл пелагических и глубоководных рыб. Полученные закономерности могут помочь в понимании процессов стабилизации мышечной структуры исследуемых глубоководных объектов в условиях среды обитания, а также исследовать способность миозинов мышц глубоководных рыб полимеризоваться под действием внесенной тканевой ТГ.

Объектами исследования служили белые скелетные мышцы макрурусов — малоглазого (Albatrossia pectoralis) и пепельного (Coryphaenoides cinereus) — и лемонемы (Laemonema longipes).

Выделение миофибрилл проводили по методу Като с соавторами (Kato et al., 1977). Миозин выделяли по методу Брагманна и Дженни (Bruggmann, Jenny, 1975).

Качественный состав белков исследовали методом диск-ДСН-электрофоре-за в полиакриламидном геле. Использовали разделяющий гель с постоянной концентрацией полиакриламида 5 %. Разделение вели при силе тока 5 мА и напряжении 100-110 В.

Активность тканевой ТГ скелетных мышц глубоководных рыб определяли методом Секи (Takeda, Seki, 1996).

Для полимеризации миозинов исследуемых видов глубоководных рыб использовали фермент — тканевую ТГ, выделенную из печени морской свинки (Sigma).

Проведенные исследования показали, что все виды обладают трансглутами-назной активностью. Причем активность ТГ скелетных мышц глубоководных рыб различна и в среднем изменяется от 2,5 отн. ед. для пепельного макруруса до 13,5 отн. ед. для малоглазого макруруса. Эти значения выше, а для малоглазого макруруса значительно выше, чем для других объектов (рис. 1). Как видно на рис. 1, для пелагических рыб относительные величины активности ТГ близки и не превышают 1. Для сравнения на рис. 1 приведены величины активности следующих пелагических рыб: дальневосточная сардина (Sardinops sarax mela-nosticta), японская ставрида (Trachurus japonicus), кета (Oncorhynchus keta), мелкопятнистая макрель (Scomberomorus niphonius), южный одноперый терпуг (Pleurogrammus monopterygius), белокорый палтус (Hippoglossus hippoglossus), желтоперая камбала (Limanda aspera), тихоокеанский минтай (Theragra chalco-gramma), малоротая корюшка (Hypomesus japonicus).

Сопоставление активности ТГ с содержанием белка в мышцах глубоководных и пелагических рыб позволило установить, что между этими величинами имеется связь экспоненциального характера (рис. 1). Ранее установлено, что основным белком, на который оказывает влияние ТГ, является миозин. Нами показано, что аналогичная экспоненциальная связь имеется между количеством миозина мышц и активностью собственной тканевой ТГ (рис. 1). Главные белки миофибрилл — миозин и актин. Соотношение этих белков в актомиозине, как правило, используется для характеристики их способности к гелеобразованию. Считается, что оптимальным для образования эластичной и прочной структуры является соотношение миозин/актин от 3 до 4 (Foegeding et al., 1991), поэтому мы попытались установить связь между активностью ТГ и данным соотношением в мышцах рыб. Как видно (рис. 1), при увеличении активности ТГ соотношение миозин/актин снижается экспоненциально.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что даже при незначительном изменении содержания воды или белка в мышцах малоглазого макруруса активность ТГ может значительно изменяться. Этот факт был подтвержден экспериментально. Для мышц малоглазого макруруса наблюдали различие в величинах активности ТГ в зависимости от вида сырья (сроки и районы вылова, размерно-массовые характеристики). Такая зависимость прослеживается и для лемонемы и пепельного макруруса, но в меньшей степени. Это позволило сделать предположение о возможной роли ТГ в формировании стабильной структуры скелетных мышц глубоководных рыб и в первую очередь о влиянии ТГ на состав тяжелых цепей миозина.

Чтобы изучить влияние ТГ на состав МТЦ были исследованы субъединичный состав основного структурного компонента миофибрилл — миозина — и его изменение под действием фермента ТГ.

Основным компонентом миофибрилл является мономерная форма миозина с м.м. 180-220 кДа (Поглазов, 1965; Kato et al., 1977). В мышцах некоторых рыб в следовых количествах обнаружен димер миозина с м.м. 360-440 кДа (Ohsura, Inoue, 1979; Wong et al., 1985). Показано, что под действием тканевой ТГ в миофибриллах накапливается димерная форма миозина и образуется ряд других высокомолекулярных полимеров миозина — тримерная и тетрамерная формы (Niwa, 1992; Takeda, Seki, 1996).

В результате проведенных исследований установлено, что в составе МТЦ всех трех исследуемых глубоководных рыб присутствуют два основных белка. Один из них имеет молекулярную массу 180 кДа, другой — 480 кДа (рис. 2). Белок с м.м. 180 кДа является мономерной формой миозина тяжелых цепей (МТЦ-1). Следовало ожидать, что димерная форма этого белка должна иметь м.м. 360 кДа. Однако такой белок в миофибриллах глубоководных рыб не обна-

308

СО

о

СП

е. р

и

С

Лакрурус 1алоглазы 7А

/

1 /

/

/

"......_______л. .АЛемон ^Макруру ;ма с пепепьш

• ^¿г -а

& и

О М й

60

65

70

75

85

90

95

Вода, %

АМакр фус мал оглазьп : в

; \

\

\

Ма1 рурус^ шепьнь й

-Л 6 к т 3 _•

, , Я

2,5

3,5 4 4,5 5 5,5 6 Содержание миозина, г мышечной ткани

6,5

Рис. 1. Зависимость активности тканевой транс-глутаминазы от физико-хими-ческих характеристик мышц рыб: воды (А), белка (Б), содержания миозина (В), соотношение миозин/актин (Г): 1 — дальневосточная сардина; 2 — японская ставрида; 3 — кета; 4 — мелкопятнистая макрель; 5 — южный одноперый терпуг; 6 — белокорый палтус; 7 — желтоперая камбала; 8 — тихоокеанский минтай; 9 — ма-лоротая корюшка

Fig. 1. Dependence of activity tissue TGase on chemical characteristics of muscle of fish: water contain (A), protein contain (Б), myosin contein (B), myosin/actin ratio (Г); 1 — Sardinops sa-gax melanosticta; 2 — Tra-churus japonicus; 3 — On-corhynchus kema; 4 — Scomberomorus niphonius; 5 — Pleurogrammus mono-pterygius; 6 — Hippoglossus hippoglossus; 7 — Limanda asp era; 8 — Thera-gra chalcogramma; 9 — Hypomesus japonicus

ружен. С другой стороны, в значительных количествах присутствует белок с м.м. 480 кДа. Для краткости изложения он назван МТЦ-2. Кроме того, в зоне тяжелых цепей миозина были обнаружены минорные белковые компоненты с м.м. 270-380 кДа (рис. 2). Наблюдаемые различия молекулярных масс мономера и димера, по-видимому, можно объяснить участием в формировании МТЦ-2 не только МТЦ-1, но и других белковых компонентов. Вероятно, в ходе реакции происходит не полимеризация двух молекул мономера миозина, а присоединение молекулы мономера и одной или нескольких молекул минорных белков зоны МТЦ. Возможна также реакция, при которой к двум молекулам мономера МТЦ присоединяется еще один небольшой фрагмент с м.м. порядка 120 кДа. В результате этой реакции образуется белок с м.м. 480 кДа (МТЦ-2): МТЦ-1 + МТЦ-1 ф МТЦ-2; МТЦ-1 + МБ (270-380 кДа) = МТЦ-2; МТЦ-1 + МТЦ-1 + 120 кДа = МТЦ-2. МБ — минорные белки с м.м. 270-380 кДа.

1 2 3

Рис. 2. Электрофореграмма зоны миозинов тяжелых цепей глубоководных рыб. 5 %-ный полиакриламидный гель: 1 — макрурус малоглазый, 2 — лемонема, 3 — макрурус пепельный

Fig. 2. Electrophoretic mobility of myosin heavy chains deep-sea fish. Concentration of polyacrylamide 5 %: 1 — A. pectoralis, 2 — L. longipes, 3 — C. cinereus

Чтобы оценить разницу между полимеризацией тяжелых цепей миозина под действием ТГ в миофибриллах глубоководных и пелагических рыб, мы рассчитывали отношение количества димера МТЦ-2 к количеству мономера МТЦ-1. В миофибриллах пелагических рыб доля МТЦ-2 всегда значительно ниже доли МТЦ-1, следовательно, соотношение димер/ мономер всегда меньше единицы (Ohsura, Inoue, 1979; Wong et al., 1985). Установлено, что в МТЦ скелетных мышц глубоководных рыб при низкой активности ТГ (менее 2,0 отн. ед.) соотношение димер/мономер становится меньше единицы. При этом более низкому соотношению основных белков МТЦ-2/МТЦ-1 соответствует большая доля минорных компонентов зоны МТЦ (рис. 3).

На состав тяжелых цепей миозина может оказывать влияние не только тканевая ТГ. В последнее время в технологической практике нашла широкое применение микробиальная ТГ (Atsumi et al., 1995). В биохимических экспериментах широко используется ТГ, выделенная из печени морской свинки (Abe et al., 1996). Установлено, что в результате действия внесенной тканевой или микробиальной ТГ образуются полимеры миозина состава МТЦ-2, МТЦ-3, МТЦ-4, поэтому мы посчитали возможным проследить влияние внесенной тканевой ТГ на состав МТЦ миофиб-рилл глубоководных рыб. При этом необходимо было исследовать связь между активностью данного фермента и составом МТЦ рассматриваемых видов глубоководных рыб, сравнить полученные данные с таковыми для других гидробионтов.

Рис. 3. Изменение доли минорных компонентов (270-380 кДа) при увеличении соотношения димер/мономер миозина тяжелых цепей скелетных мышц глубоководных рыб

Fig. 3. Changing in fraction of minor protein (270-380 kDa), under increasing ratio of dimmer/monomer of myosin heavy chains skeletal muscle of deep-sea species

Соотношение димер/мономер, отн. ед.

Было исследовано изменение состава тяжелых цепей миозина мышц глубоководных рыб при внесении ТГ из печени морской свинки. Предварительно установлено, что характер изменения состава МТЦ под действием собственной и внесенной ТГ для миозинов скелетных мышц исследованных глубоководных рыб совпадает.

Установлено также, что при увеличении активности ТГ от 0,4 до 0,5 ед./100 мг миозина происходит накопление доли белка с м.м. 480 кДа (зона 1 на рис. 2), а доля минорных компонентов МТЦ снижается. Дальнейшее увеличение активности фермента от 0,5 до 2,4 ед./100 мг миозина приводит к снижению доли белка с м.м. 480 кДа и увеличению количества минорных компонентов и белка с м.м. 180 кДа (мономер МТЦ) (рис. 4). Наибольшее снижение происходит при увеличении активности ТГ с 0,5 до 0,7 ед./100 мг миозина. При дальнейшем увеличении активности ТГ от 2,4 до 3,0 ед./100 мг миозина количество минорных компонентов белков МТЦ и белка с м.м. 480 кДа снижается, а доля белка с м.м. 180 кДа (мономер МТЦ) увеличивается (рис. 4). Данная зависимость характерна для мышц всех трех исследуемых глубоководных рыб, но не характерна для пелагических рыб, у которых при увеличении активности ТГ происходит накопление димера миозина МТЦ-2 и образуется ряд высокомолекулярных полимеров состава МТЦ-3, МТЦ-4 (Niwa, 1992; Takeda, Seki, 1996).

Зависимости, полученные для миофибрилл глубоководных рыб, подтверждают предположение о том, что в ходе реакции полимеризации МТЦ не происходит полимеризации двух молекул МТЦ-1. Также характерным отличием глубоководных рыб от пелагических является протекание двух процессов (полимеризации и деполимеризации) под действием собственной тканевой ТГ. Увеличение активности фермента выше 0,5 ед./100 мг миозина приводит к деполимеризации белков под действием ТГ, которая действует в этом случае как изопептидаза, т.е. расщепляет глутамин-лизиновые связи. Такая принципиальная возможность гидролиза е-(у-глутамил)-лизиновой связи под действием ТГ была показана ранее (Fesus, Piacentini, 2002).

Известно, что увеличение количества высокомолекулярных полимеров МТЦ приводит к улучшению реологических и прочностных характеристик белковых продуктов на основе рыбных фаршей (Abe et al., 1996). Найденные нами зависимости состава МТЦ от активности ТГ для глубоководных рыб, позволяют сделать важный технологичекий вывод: при повышении концентрации ТГ до 0,5 ед./100 мг миозина происходят процессы полимеризации МТЦ, что потенциально улучшает эластические свойства продуктов из глубоководных рыб. Дальнейшее увеличение активности ТГ нецелесообразно, поскольку приводит к сни-

- i s —Ш- МНС-1

1 A

1

- . » » ' ---4

• h" Ж

\

\

; 1 r

0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 2,1 2,3 2,5 2,7 2,9 Активность трансглутаминазы, ед./100 мг миозина мышечной ткани

Рис. 4. Изменение состава тяжелых цепей миозина мышц глубоководных рыб при увеличении активности тканевой трансглутаминазы

Fig. 4. Changing in myosin heavy chains composition of deep-sea fish under increasing of activity tissue TGase

жению концентрации высокомолекулярных полимеров миозина тяжелых цепей и эластичных свойств получаемых белковых систем.

Таким образом, для низкобелковых объектов с высокой активностью тканевой ТГ, например для малоглазого макруруса, целесообразно увеличивать общую концентрацию мышечного белка до 17-20 %. При этом направление реакции полимеризации МТЦ будет смещаться в сторону образования большого количества димера с м.м. 480 кДа. Для объектов, имеющих высокое содержание белка и низкую активность ТГ, следует увеличивать активность фермента до значений не выше 0,5 ед./100 мг миозина.

Полученные нами данные доказывают возможность регулирования состава МТЦ в зависимости от величины активности тканевой ТГ в мышцах глубоководных рыб, что в свою очередь позволит получить структурированные белковые продукты заданной прочности и эластичности.

Литература

Борисочкина Л.И. Современные направления в технологии приготовления и использования пищевого рыбного фарша // Рыб. хоз-во. — 1986. — № 4. — С. 68-71.

Мельникова О.М. Пищевое использование некоторых глубоководных рыб // Рыб. хоз-во. — 1976. — № 9. — С. 54-56.

Одинцов А.Б. Технохимический состав и промышленное использование некоторых видов глубоководных рыб // Изв. вузов. Сер. Пищ. технол. — 2002. — № 1. — С. 25-28.

Поглазов Б.Ф. Структура и функции сократительных белков. — М.: Мир, 1965. — 354 с.

Рехина Н.И., Новикова М.В., Агапова С.А. Получение пищевого фарша из мелких мезопелагических рыб // Рыб. хоз-во. — 1986. — № 2. — С. 71-74.

Швидкая З.П. Влияние жесткости тепловой обработки на структурные свойства мышечной ткани рыб с повышенным содержанием влаги // Исслед. по технол. новых объектов промысла. — Владивосток: ТИНРО, 1980. — С. 45-48.

Abe Y., Yasunaga K., Kitakami S. et al. Quality of kamaboko gels from walley pollack frozen surimis of different grades on applying additive containing TGase // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1996. — Vol. 3. — P. 439-445.

Aeschlimann D., Paulsson М. Transglutaminases: protein cross-linking enzymes in tissues and body fluids // Thromb. Haemost. — 1994. — Vol. 71. — P. 402-415.

Araki H., Seki N. Comparison of reactivity of transglutaminase to various fish acto-myosins // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1993. — Vol. 59(4). — P. 711-716.

Atsumi T., Wakameda A., Noguchi S. Frozen storade of containing microbial transglutaminase made from various kinds of fish species // Fish. Sci. — 1995. — Vol. 61. — P. 458-463.

Bruggmann S., Jenny E. The immunological specificity of myosins from cross-strained muscles as revealed by quantitative microcomplement fixation and enzyme inhibition by antisera // Biochem. Biophys. — 1975. — Vol. 412. — P. 39-49.

Dickinson E. Hydrocolloids at interfaces and the influence on the properties of dispersed systems // Food Hydrocolloids. — 2003. — Vol. 17. — P. 25-39.

Fesus L., Piacentini M. Transglutaminase 2: an enigmatic enzyme with diverse function // Trends in Biochem. Sci. — 2002. — Vol. 27. — P. 534-539.

Foegeding E.A., Brekke C.J., Xiong Y.L. Gelation of miofibrillar protein // Interaction of food proteins. — American Chemical Society, 1991. — P. 257-267.

Folk J. Transglutaminases // Annu. Rev. Biochem. — 1980. — Vol. 49. — P. 517-531.

Kato N., Uchiyama H., Tsukamoto S., Arai K. Biochemical study on fish myofibrillar ATPase // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1977. — Vol. 43. — P. 857-867.

Kishi H., Nozawa H., Seki N. Reactivity of muscle transglutaminase on carp myofibrils and myosin B // Nippon Suisan Gakkaishi. — 1991. — Vol. 57(6). — P. 1203-1210.

Lorand L., Conrad S. Transglutaminases // Molec. Cell. Biol. — 1984. — Vol. 58. — P. 9-35.

Niwa E. Chemistry of surimi gelation // Surimi Techology. — N.Y.: Marcel Dekker Inc., 1992. — P. 167-179.

Nowsad A., Kanoh S., Niwa E. Contribution of transglutaminase on the setting of various actomyosin pastes // Fish. Sci. — 1995. — Vol. 61(1). — P. 79-81.

Ohsura K., Inoue A. Identification of myosin in a flowering plant Egeria densa // J. Biochem. — 1979. — Vol. 85. — P. 375-378.

Takeda H., Seki N. Enzyme-catalyzed cross-linking and degradation of myosin heavy chain in Walley Pollack surimi paste during setting // Fish. Sci. — 1996. — Vol. 62 — P. 462-467.

Willemijn L. Specificity of tissue transglutaminase explains cereal toxicity in coeliac disease // J. Exp. Med. — 2002. — Vol. 195. — P. 643-649.

Wong A.J., Kiehart D.P., Pollard T.D. Myosin from human erythrocytes // J. Biol. Chem. — 1985. — Vol. 260. — P. 46-49.

Поступила в редакцию 15.12.06 г.