ВЕКТОР ДЛЯ ДОСТАВКИ НУКЛЕАЗ В ЭУКАРИОТИЧЕСКУЮ КЛЕТКУ

1. Вектор, вирусные продукты которого необходимы для репликации и интеграции, обеспечиваются по транс-схеме, а к цис-действующим вирусным последовательностям, необходимым вектору для эффективной репликации, относятся: оба LTR и сигнальная последовательность, расположенная вблизи от 5'LTR, все остальные последовательности могут быть заменены, поскольку их утраченные функции легко комплементируются по транс-схеме, отличающийся тем, что последовательности в векторе кодируют нуклеазы представленные эндо- и экзонуклеазами, в кодируемых белках должны отсутствовать транспортные сигналы для того, чтобы они оставались в цитозоле, нуклеазы должны иметь массу более 60 кДа, в качестве РНК вектора используется эукариотическая мРНК 5', конец которой должен быть кэпирован, а 3' конец этой цепи должен быть полиаденилирован, длина кэпированного 3' конца будет определять количество нуклеаз, синтезированных одним вектором, синтез РНК вектора выполняется in vitro на ДНК матрице методом синтеза РНК зондов с дальнейшей трансфекцией в клетки мишени, или хелперные клетки, синтезирующие белки вируса, в который будет упакован вектор, синтез ДНК матрицы выполняется по методу приготовления космидных векторов.
2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что цис-действующие последовательности, используемые в ретровирусных векторах, не содержат сайтов прикрепления тРНК затравки - 18 нуклеотидов, примыкающих справа к U5, служащей для инициации синтеза цепи ДНК, а Роly(А) - участок, расположенный на 3' концевой R-последовательности, представляющий собой посттранскрипционную модификацию РНК, определяет количество синтезируемых вектором нуклеаз и может быть увеличен до 200 нуклеотидов и более, трансфекция хелперных клеток цис-действующими последовательностями осуществляется по истечении времени, достаточного для накопления этими клетками белков, необходимых для дальнейшей упаковки вектора.
3. Вектор по п.1, отличающийся тем, что для увеличения массы нуклеаз они могут объединяться глициновыми сшивками, длина которых не будет препятствовать работе нуклеаз 50-60 аминокислотных остатков, или за счет нефункциональных увеличивающих массу аминокислотных последовательностей, включенных в состав нуклеазы.
4. Вектор по п.1, отличающийся тем, что в наборе нуклеаз имеется нуклеаза, специфичная к разрушению самого вектора.
5. Вектор по п.1, отличающийся тем, что используется полицистронная мРНК с сигналом для белка трансактиватора, на место основного белка встраивают ген нуклеазы для разрушения вирусного генома в цитозоле, а на место белка транслируемого после присоединения трансактиватора, встраивают ген нуклеазы, направленный на разрушение генома вируса в месте его размножения ядро или эндоплазматический ретикулум.
6. Вектор по п.1, отличающийся тем, что нуклеазы кодируются в виде полипротеида, состоящего из нуклеаз, способных к подавлению синтеза белка, или разрушению генома вируса и клетки, где разделены свитами специфичными к разрезанию вирусной протеазой, против которого они направлены.
7. Вектор по п.6, отличающийся тем, что в качестве вектора используется сам полипротеид, который с помощью трансфекции попадает в клетку.