ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЙ СКРИНИНГ-АНАЛИЗ ИОННОГО КАНАЛА TRPM5

1. Способ высокопроизводительного скринингового анализа для отбора потенциальных усилителей активности ионного канала TRPM5, включающий:
a) приведение клетки, экспрессирующей TRPM5, в контакт с субоптимальной концентрацией вещества, которое увеличивает концентрацию кальция внутри клетки, причем в клетку предварительно был введен флуоресцентный краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала;
b) приведение указанной клетки в контакт с потенциальным активирующим соединением;
c) применение оптического детектора, измеряющего интенсивность флуоресценции указанной клетки в присутствии указанного потенциального активирующего соединения; и
d) сравнение измеренной интенсивности флуоресценции с интенсивностью флуоресценции другой клетки, экспрессирующей TRPM5, в присутствии оптимальной концентрации вещества, которое увеличивает концентрацию кальция внутри клетки.
2. Способ по п.1, который дополнительно включает выбор одного или нескольких тестируемых соединений, которые усиливают активность TRPM5.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки помещают в многолуночный сосуд.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит до 96 лунок.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит больше 96 лунок.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 384 лунок.
7. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 1536 лунок.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное вещество, которое увеличивает концентрацию кальция, выбирают из группы, включающей тромбин, аденозинтрифосфат (АТФ), карбахол, ионофоры кальция и агонисты эндогенных молекул рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCRs).
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанное вещество представляет собой тромбин.
10. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанное вещество представляет собой АТФ.
11. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанное вещество представляет собой карбахол.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный флуоресцентный краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала, представляет собой краситель, применяемый для определения мембранного потенциала с помощью флуориметрического планшетного анализатора (FMP).
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный оптический детектор выбирают из группы, включающей флуориметрический планшетный анализатор (FLIPR), FLEXStation, анализатор напряжения/ионов в пробах (VIPR), флуоресцентный микроскоп и камеру с прибора с зарядовой связью (ПЗС) и Pathway НТ.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный оптический детектор представляет собой FLIPR.
15. Способ высокопроизводительного скринингового анализа для определения, является ли тестируемое соединение специфическим модулятором ионного канала TRPM5, включающий:
a) приведение клетки, которая экспрессирует TRPM5, и в которую ввели флуоресцентный краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала, в контакт с тестируемым соединением в присутствии хлорида калия;
b) применение оптического детектора, измеряющего интенсивность флуоресценции указанной клетки в присутствии указанного потенциального модулирующего соединения;
c) сравнение измеренной интенсивности флуоресценции, определенной на стадии (b), с интенсивностью флуоресценции другой клетки, которая экспрессирует TRPM5 и в которую был введен флуоресцентный краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала, в присутствии хлорида калия и в отсутствие тестируемого соединения; и
d) оценку, может ли тестируемое соединение представлять собой специфический модулятор TRPM5, путем определения, составляет ли отношение интенсивности флуоресценции в присутствии хлорида калия и тестируемого соединения кинтенсивности в присутствии хлорида калия, но в отсутствие тестируемого соединения, меньше или больше 1.
16. Способ по п.15, который включает дополнительно выбор тестируемого соединения, которое усиливает активность TRPM5.
17. Способ по п.15, который включает дополнительно выбор тестируемого соединения, которое подавлеяет активность TRPM5.
18. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанные клетки помещают в многолуночный сосуд.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит до 96 лунок.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит более 96 лунок.
21. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 384 лунок.
22. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 1536 лунок.
23. Способ по п.15, отличающийся тем, указанное вещество, которое увеличивает концентрацию кальция, выбирают из группы, включающей тромбин, аденозинтрифосфат (АТФ), карбахол, ионофоры кальция и агонисты эндогенных молекул рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCRs).
24. Способ по п.23, отличающийся тем, указанное вещество представляет собой тромбин.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, указанное вещество представляет собой АТФ.
26. Способ по п.23, отличающийся тем, указанное вещество представляет собой карбахол.
27. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный флуоресцентный краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала, представляет собой краситель, применяемый для определения мембранного потенциала с помощью флуориметрического планшетного анализатора (FMP).
28. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный оптический детектор выбирают из группы, включающей флуориметрический планшетный анализатор (FLIPR), FLEXStation, анализатор напряжения/ионов в пробах (VIPR), флуоресцентный микроскоп и камеру прибора с зарядовой связью (ПЗС) и Pathway НТ.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный оптический детектор представляет собой FLIPR.
30. Способ высокопроизводительного скринингового анализа для определения, является ли тестируемое соединение специфическим модулятором ионного канала TRPM5, включающий:
a) приведение клетки, которая экспрессирует TRPM5, и в которую ввели краситель, чувствительный к уровню кальция внутри клетки, в контакт с тестируемым соединением и субоптимальной концентрацией вещества, модулирующего кальций, которое увеличивает концентрацию внутриклеточного кальция;
b) применение оптического детектора, измеряющего интенсивность флуоресценции указанной клетки в присутствии соединения, модулирующего кальций;
c) сравнение измеренной интенсивности флуоресценции, определенной на стадии (b), с интенсивностью флуоресценции другой клетки, которая экспрессирует TRPM5, и в которую был введен краситель, чувствительный к уровню кальция внутри клетки, в присутствии субоптимальной концентрации вещества, модулирующего кальций, и в отсутствие тестируемого соединения; и
d) оценку, может ли тестируемое соединение представлять собой специфический модулятор TRPM5, путем определения, составляет ли отношение интенсивности флуоресценции в присутствии субоптимальной концентрации вещества, модулирующего кальций, и тестируемого соединения, к интенсивности в присутствии субоптимальной концентрации вещества, модулирующего кальций, но в отсутствие тестируемого соединения, меньше или больше 1.
31. Способ по п.30, который включает дополнительно выбор тестируемого соединения, которое усиливает активность TRPM5.
32. Способ по п.30, который включает дополнительно выбор тестируемого соединения, которое подавляет активность TRPM5.
33. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанные клетки помещают в многолуночный сосуд.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит до 96 лунок.
35. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит больше 96 лунок.
36. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 384 лунок.
37. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 1536 лунок.
38. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанное вещество, модулирующее кальций, выбирают из группы, включающей тромбин, аденозинтрифосфат (АТФ), карбахол, ионофоры кальция и агонисты эндогенных молекул рецепторов, сопряженных с G-белком.
39. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанное вещество, модулирующее кальций, представляет собой тромбин.
40. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанное вещество, модулирующее кальций, представляет собой АТФ.
41. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанное вещество, модулирующее кальций, представляет собой карбахол.
42. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный краситель, чувствительный к уровню кальция внутри клетки, представляет собой краситель Calcium 3, применяемый при исследованиях на флуориметрическом планшетном анализаторе (FLIPR).
43. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный оптический детектор выбирают из группы, включающей флуориметрический планшетный анализатор (FLIPR), FLEXStation, анализатор напряжения/ионов в пробах (VIPR), флуоресцентный микроскоп и камеру с прибором с зарядовой связью (ПЗС) и Pathway НТ.
44. Способ по п.43, отличающийся тем, что указанный оптический детектор представляет собой FLIPR.
45. Способ высокопроизводительного скринингового анализа для скрининга потенциальных усилителей активации ионного канала TRPM5, включающий:
а) приведение клетки, которую трансфецировали как TRPM5 дикого типа, так и нефункциональным TRPM5 и в которую ввели флуоресцентный краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала, анализатор напряжения/ионов в пробах с потенциальным усилителем активации в присутствии вещества, которое увеличивает концентрацию кальция в указанной клетке;
b) применение оптического детектора, измеряющего интенсивность флуоресценции указанной клетки в присутствии указанного потенциального усилителя активации; и
c) сравнение измеренной интенсивности флуоресценции, измеренной на стадии (b), с интенсивностью флуоресценции клетки, которая экспрессирует TRPM5 дикого типа, и в которую ввели краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала, в присутствии потенциального активирующего соединения, с целью определения степени усиления активации TRPM5.
46. Способ по п.45, отличающийся тем, что нефункциональный TRPM5 содержит делецию первых 1000 пар оснований гена TRPM5.
47. Способ по п.45, отличающийся тем, что нефункциональный TRPM5 содержит делецию первых 2000 пар оснований гена TRPM5.
48. Способ по п.45, который включает дополнительно выбор соединения, которое усиливает активность TRPM5.
49. Способ по п.45, отличающийся тем, что указанные клетки помещают в многолуночный сосуд.
50. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит до 96 лунок.
51. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит больше 96 лунок.
52. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 384 лунок.
53. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанный многолуночный сосуд содержит 1536 лунок.
54. Способ по п.45, отличающийся тем, указанное вещество, которое увеличивает концентрацию кальция, выбирают из группы, включающей тромбин, аденозинтрифосфат (АТФ), карбахол, ионофоры кальция и агонисты эндогенных молекул рецепторов, сопряженных с G-белком.
55. Способ по п.54, отличающийся тем, указанное вещество представляет собой тромбин.
56. Способ по п.54, отличающийся тем, указанное вещество представляет собой АТФ.
57. Способ по п.54, отличающийся тем, указанное вещество представляет собой карбахол.
58. Способ по п.54, отличающийся тем, указанное вещество представляет собой кальциевый ионофор А23187.
59. Способ по п.45, отличающийся тем, что указанный флуоресцентный краситель, чувствительный к изменению мембранного потенциала, представляет собой краситель, применяемый для определения мембранного потенциала с помощью флуориметрического планшетного анализатора (FMP).
60. Способ по п.45, отличающийся тем, что указанный оптический детектор выбирают из группы, включающей флуориметрический планшетный анализатор (ридер) (FLIPR), FLEXStation, анализатор напряжения/ионов в пробе (VIPR), флуоресцентный микроскоп и камеру с прибором с зарядовой связью (ПЗС) и Pathway НТ.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что указанный оптический детектор представляет собой FLIPR.
62. Изолированная нуклеиновая кислота, в которой были удалены первые 1000 пар оснований гена TRPM5.
63. Выделенная нуклеиновая кислота, в которой были удалены первые 2000 пар оснований гена TRPM5.