Способ получения капсул на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы
METHOD FOR PRODUCING CAPSULES BASED ON BACTERIAL CELLULOSE HYDROGELS

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и фармацевтической промышленности, а именно к способу получения гидрогелевых капсул, используемых для направленной доставки лекарственных препаратов, в частности пробиотиков.
В последние годы на фоне широкого применения антибактериальных препаратов возросла актуальность создания и совершенствования способов профилактики и лечения антибиотикоассоциированных диарей. В современной медицине вопросам доставки лекарственных препаратов и пролонгированию их действия отводится большая роль. Известно достаточно много разнообразных материалов для производства капсул, в которых в основу природного происхождения или в синтетический материал включены лекарственные препараты: антибиотики, пробиотики и т.д.
В связи с чем, особенно актуально создание капсул с пролонгированным, направленным высвобождением, содержащих пробиотические культуры.
Наиболее перспективно для создания капсул использование таких микробных полисахаридов как бактериальная целлюлоза и альгинат, а также хитозана и белковых веществ.
Известен способ получения частиц микрокапсулированного фенибута в альгинате натрия, включающий получение гомогенной суспензии фенибута в 1-2 %-ном водном растворе альгината натрия, затем добавление полученной суспензии по каплям в 2 %-ный раствор хлорида кальция, что приводит к гелеобразованию и получению указанных микрокапсул (RU 2662173, МПК A61K 9/00, A61K 9/50, A61K 31/197, опубл. 24.07.2018).
Преимуществом известного решения является то, что высвобождение активного ингредиента из микрокапсул можно регулировать. Скорость выделения активного ингредиента из обычных микрокапсул с жировой матрицей, охлажденных распылением, обычно очень высока: в течение 30 мин выделяется порядка примерно 70 %. Новые микрокапсулы, предлагаемые в решении, обладают намного меньшей скоростью и/или пролонгированным выделением активных ингредиентов, поскольку большая часть активных ингредиентов выделяется, когда затвердевшая гидрофобная оболочка-матрица «расплавляется».
Недостатком альгинатных микрокапсул является то, что они неустойчивы в кислой среде, чувствительны к присутствию в среде хелатирующих агентов – цитрат-, фосфат-, лактат-ионов, которые взаимодействуют с ионами кальция, нарушая целостность оболочки.
Этот недостаток может быть устранен путем добавления других полимеров в состав оболочки, например, крахмала, хитозана и др.
Известен способ получения оболочек на основе хитозана и солей альгинатовой кислоты для микрокапсул, содержащих фосфолипидные мицеллы, в котором последовательно выдерживают ядра микрокапсул в 0,5÷1,0 %-ном (вес/объем) растворе хитозана средней или низкой вязкости в 1,0 %-ной уксусной кислоте, в 2,5÷3,0 %-ном растворе хлорида щелочноземельного металла, в 0,5÷1,0 %-ном (вес/объем) растворе альгината натрия и повторно в 2,5÷3,0 %-ном растворе хлорида щелочноземельного металла и направлено на создание оболочки для микрокапсул на основе хитозана и солей альгиновой кислоты, через которую фосфолипидные мицеллы проникают с определенной скоростью за счет использования хитозана различной вязкости и разной природы катиона, образующего соль с альгиновой кислотой (RU 2411077, МПК B01J 13/10, B01J 13/20, C08L 5/04, A61K 9/50, опубл. 10.02.2011).
В известном решении на поверхности ядер микрокапсул образуется двухслойная оболочка. Наружный слой альгината кальция или бария устойчив к растворению в условиях желудка и уменьшает потери фосфолипидных мицелл  вследствие их выхода в желудке. В слабощелочной среде кишечника наружный слой растворяется (альгинат кальция) или становится рыхлым (альгинат бария), обнажая второй слой оболочки из хитозан-альгината. Хитозан устойчив к растворению в средах с pH>7,0, поэтому быстрого растворения альгинатных ядер микрокапсул не происходит, а фосфолипидные мицеллы выходят из ядер микрокапсул во внешнюю среду с определенной скоростью, зависящей от вида используемого хитозана.
Известны микрокапсулы с Са-альгинатным покрытием, содержащие липофильные компоненты (WO 03/018186, МПК В01O 13/02, опубл. 06.03.2003).
Данный способ является достаточно близким аналогом заявленного изобретения, однако в нем речь не идет о контролированном высвобождении инкапсулированного вещества в условиях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
B. bifidum
В. bifidum
8
Наиболее близким решением к заявленному изобретению является способ получения капсул, содержащих бактерии  (бифидумбактерин сухой в капсулах), в котором сущность состоит в выращивании биомассы бактерий, получении концентрированной биомассы, добавлении защитной среды; лиофилизации замороженного продукта, смешивании с предварительно простерилизованным наполнителем, который выполняет одновременно роль защитного вещества и источника энергии для роста бактерий , в качестве которого используют лактозу и фасовки смеси в жесткие разъемные желатиновые капсулы с последующим их размещением в герметичную упаковку и получением конечного продукта со степенью активности бифидобактерий на уровне не менее 2·10(RU 2123343, МПК A61K 35/74, A61K 9/48, опубл. 20.12.1998).
В. bifidum
В известном решении осуществляется разработка способа капсулирования лиофилизированной биомассы бактерий , позволившего повысить терапевтическую эффективность препарата бифидобактерина.
Таким образом, проведенный анализ патентных документов выявил наличие лишь косвенных аналогов предлагаемого способа получения капсул с пробиотиками. Контроль скорости высвобождения необходим в случае использования капсулированных лекарственных препаратов пролонгированного действия или обладающих возможностью адресной доставки действующего вещества на различные участки ЖКТ.
В основу настоящего изобретения положена задача создания технологического процесса, реализация которого позволяет получить капсулы на основе альгината кальция, хитозана, а также разлагаемых белковых компонентов, оказывающих влияние на относительный процент выхода препаратов из ядра капсул в средах, имитирующих условия ЖКТ человека. Кроме того, капсулы содержат бактериальную целлюлозу, которая обладает не только большой связывающей способностью, но и может использоваться в качестве полезных пищевых волокон, улучшающих работу ЖКТ.
Технический результат заключается в расширении ассортимента капсул, причем полученные капсулы содержат компоненты, как полисахаридной природы, так и белковой, что помогает доставлять лекарственные препараты в нужный отдел ЖКТ, сохранять и высвобождать лекарственные препараты с определенной скоростью.
Komagataeibacter sucrofermentans
9
10
Сущность изобретения заключается том, что способ получения капсул на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы включает получение гель-пленки бактериальной целлюлозы путем культивирования бактерии  ВКПМ В-11267 в статических условиях на среде с мелассой, получение композита путем смешения гидрогеля бактериальной целлюлозы и альгината в соотношении 4:1 или путем смешения гидрогеля бактериальной целлюлозы, альгината и желатина в соотношении 2:1:3 с суспензией пробиотических бактерий, содержащей не менее 10-10 колониеобразующих единиц, затем гидрогель обрабатывают ультразвуковыми колебаниями при частоте 20 кГц и мощности ультразвуковых колебаний 500 Вт в течение 3 мин,  для получения капсул полученный гидрогель вносят в 5 %-ный раствор хлорида кальция и выдерживают в течение 30 мин. Полученные капсулы помещают  в 2 %-ный раствор хитозана и выдерживают в течение 1 ч, а затем капсулы помещают в 20 %-ный раствор трансглютаминазы и выдерживают в течение 15 мин.
Gluconacetobacter xylinus
Komagataeibacte
Komagatabacter
K. xylinus, K. hansenii, K. europaeus, K. oboediens, K. intermedius, K. swingsii, K. rhaeticus, K. saccharivorans, K. nataicola, K. kombuchae, K. sucrofermentans, K. kakiaceti, K. medellinensis, K. maltaceti
В настоящее время бактерии группы  перенесены в новый род r, первоначально названный  () (Yamada et al., 2012; Yamada, 2014; Ревин, 2020).
Komagataeibacter sucrofermentans
Komagataeibacter sucrofermentans
Komagataeibacter sucrofermentans
В качестве продуцента бактериальной целлюлозы в заявленном изобретении использовали штамм Н-110, который был выделен на кафедре биотехнологии, биоинженерии и биохимии ФГБОУ «МГУ им. Н.П. Огарёва» из чайного гриба с последующей селекцией на основе естественного отбора. Штамм бактерии  Н-110 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ: В-11267. Штамм H-110 ВКПМ В-11267 описан в патенте RU 2523606, МПК С12N 1/20, C12P 19/04, C12R 1/01, опубл. 20.07.2014. Штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасности по другим причинам.
Альгинаты являются полиуроновыми кислотами и состоят из двух структурных единиц: остатков D-маннуроновой кислоты и L-гулуроновой кислоты, связанных 1,4-гликозидными связями. Соли альгината натрия и калия легко растворяются в воде и дают высоковязкие растворы; с двухвалентными катионами альгиновые кислоты образуют гели или нерастворимые альгинаты. Альгинаты широко применяются как желирующие и стабилизирующие агенты в пищевой промышленности. Важной областью их применения является использование в качестве носителей при иммобилизации клеток, ферментов и лекарств. Для иммобилизации пробиотиков широко используется поперечносшитый кальция хлоридом альгинат кальция. Альгинатные микрокапсулы имеют ряд преимуществ – легко формируют оболочку вокруг бактериальной клетки, нетоксичны для организма, дешевы, обладают хорошими технологическими характеристиками (температура гелеобразования), легко высвобождают микроорганизмы в кишечнике.
Хитозан – это катионный аминополисахарид природного происхождения, сополимер глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, получение которого осуществляют путем частичного деацетилирования хитина.
Желатин – природный полимер белковой природы, продукт неполного гидролиза коллагена, содержащегося в коже, соединительных тканях и костях животных. Желатин благодаря высоким гелеобразующим свойствам используют для изготовления мазей, суппозиториев, желатиновых капсул. Он может использоваться для микрокапсулирования пробиотиков как самостоятельно, так и в смеси с другими полимерами.
Способ осуществляют следующим образом.
Пример 1. Способ получения капсул на основе гидрогеля «бактериальная целлюлоза –  альгинат»
Komagataeibacter sucrofermentons
Бактерии ВКПМ В-11267 культивируют в статических условиях на среде с мелассой при температуре 28±2 °C в течение 5 сут. Полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы отделяют от культуральной среды и обрабатывают 0,5 %-ным раствором гидроксида натрия при температуре 80 °С в течение 60 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывают дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Гель-пленку бактериальной целлюлозы стерилизуют при температуре 120 °C в течение 20 мин. Для проведения измельчения бактериальной целлюлозы получают гидромодуль с соотношением 1:3. Механическое измельчение очищенной бактериальной целлюлозы проводят при помощи ножевой мельницы в течение 10 мин. Альгинат натрия растворяют в дистиллированной воде до достижения концентрации 2 % (мас./об.) при комнатной температуре до достижения гелеобразного раствора.
Для получения композита «бактериальная целлюлоза – альгинат» смешивают гидрогель бактериальной целлюлозы и альгината в соотношении 4:1 для получения гомогенной дисперсии. Затем гидрогель обрабатывают ультразвуковыми колебаниями для дегазации при частоте 20 кГц и мощности ультразвуковых колебаний 500 Вт в течение 3 мин в ледяной бане.
Bacillus
9
10
Готовят суспензию пробиотических бактерий, например, рода , входящих в состав лекарственного препарата Биоспорин, содержащую не менее 10-10 колониеобразующих единиц (КОЕ). Полученную суспензию вносят в гидрогель «бактериальная целлюлоза – альгинат» и перемешивают на магнитной мешалке до гомогенного состояния.
Для получения капсул полученный гидрогель «бактериальная целлюлоза – альгинат», содержащий суспензию бактерий, вносят в виде капель в 5 %-ный раствор хлорида кальция. Полученные капсулы выдерживают в растворе в течение 30 мин.
Пример 2. Способ получения капсул на основе гидрогеля «бактериальная целлюлоза –  альгинат – желатин»
Komagataeibacter sucrofermentans
Бактерии  ВКПМ В-11267 культивируют в статических условиях на среде с мелассой в концентрации                   45 г/л с pH 4,5 при температуре 28±2 °C в течение 5 сут. Полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы отделяют от культуральной среды и обрабатывают 0,5 %-ным раствором гидроксида натрия при температуре                      80 °С в течение 60 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывают дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Гель-пленку бактериальной целлюлозы стерилизуют при температуре 120 °C в течение 20 мин. Для проведения измельчения бактериальной целлюлозы получают гидромодуль с соотношением 1:3. Механическое измельчение очищенной бактериальной целлюлозы проводят при помощи ножевой мельницы в течение 10 мин. Альгинат натрия растворяют в дистиллированной воде до достижения концентрации 2 % (мас./об.) при комнатной температуре до достижения гелеобразного раствора. Готовят 10 % раствор желатина в воде при постоянном перешивании и поддержании температуры от 30 °C до 60 °C.
Для получения композита «бактериальная целлюлоза – альгинат – желатин» смешивают растворы альгината и желатина 1:3. Затем суспензию обрабатывают ультразвуковыми колебаниями для дегазации при частоте 20 кГц и мощности ультразвуковых колебаний 500 Вт в течение 3 мин в ледяной бане. К полученной смеси добавляют 20 % раствор трансглютаминазы и перемешивают в течение 2 мин при поддержании температуры 45-55 °C. Далее в раствор вносят бактериальную целлюлозу в количестве, сохраняющем соотношение смеси «бактериальная целлюлоза – альгинат – желатин» 2:1:3 и перемешивают до гомогенного состояния на магнитной мешалке.
Bacillus
9
10
Готовят суспензию пробиотических бактерий, например, рода , входящих в состав лекарственного препарата Биоспорин, содержащую не менее 10-10 колониеобразующих единиц (КОЕ). Полученную суспензию вносят в полимерный гель и перемешивают на магнитной мешалке до гомогенного состояния.
Для получения капсул полученный гидрогель «бактериальная целлюлоза – альгинат– желатин», содержащий суспензию бактерий, вносят в виде капель в 5 %-ный раствор хлорида кальция. Полученные капсулы выдерживают в растворе в течение 30 мин.
Пример 3. Способ получения капсул на основе гидрогеля «бактериальная целлюлоза –  альгинат» и хитозана
Komagataeibacter sucrofermentans
Бактерии  ВКПМ В-11267 культивируют в статических условиях на среде с мелассой в концентрации 45 г/л с pH 4,5 при температуре 28±2 °C в течение 5 сут. Полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы отделяют от культуральной среды и обрабатывают 0,5 %-ным раствором гидроксида натрия при температуре                80 °С в течение 60 мин для удаления клеток и компонентов культуральной среды. От раствора щелочи бактериальную целлюлозу отмывают дистиллированной водой, 0,5 %-ным водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Обработку повторяют 3 раза. Гель-пленку бактериальной целлюлозы стерилизуют при 120 °C в течение 20 мин. Для проведения измельчения бактериальной целлюлозы получают гидромодуль с соотношением 1:3. Механическое измельчение очищенной бактериальной целлюлозы проводят при помощи ножевой мельницы в течение 10 мин. Альгинат натрия растворяют в дистиллированной воде до достижения концентрации 2 % (мас./об.) при комнатной температуре до достижения гелеобразного раствора.
Для получения композита «бактериальная целлюлоза – альгинат» смешивают суспензию бактериальной целлюлозы и альгината в соотношении 4:1 для получения гомогенной дисперсии. Затем суспензию обрабатывают ультразвуковыми колебаниями для дегазации при частоте 20 кГц и мощности ультразвуковых колебаний 500 Вт в течение 3 мин в ледяной бане.
Bacillus
9
10
Готовят суспензию пробиотических бактерий, например, рода , входящих в состав лекарственного препарата Биоспорин, содержащую не менее 10-10 колониеобразующих единиц (КОЕ). Полученную суспензию вносят в полимерный гель «бактериальная целлюлоза – альгинат» и перемешивают на магнитной мешалке до гомогенного состояния.
Для получения капсул полученный гидрогель «бактериальная целлюлоза – альгинат», содержащий суспензию бактерий, вносят в виде капель в 5 %-ный раствор хлорида кальция. Полученные капсулы выдерживают в растворе в течение 30 мин.
Для получения двухслойной оболочки капсулы, устойчивой к воздействию факторов среды ЖКТ, используют раствор хитозана. Готовые капсулы помещают в 2 %-ный раствор хитозана и выдерживают в течение                1 ч. Для наилучшего связывания хитозана капсулы помещают в 20 %-ный раствор трансглютаминазы, которая катализирует образование ковалентных связей между свободными аминогруппами, и выдерживают в течение 15 мин.
Bacillus
Проведены исследования полученных капсул в модельных жидкостях: в физиологическом растворе, 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной, растворе натрия гидрокарбоната (pH от 7,5 до 8,0). Поведение в модельных жидкостях позволяет предположить, что полученные капсулы будут в среде кишечника высвобождать препарат. Оценку биологической активности (биологической концентрации) препаратов на основе иммобилизованных бактерий, проводили путем определения биологической концентрации микроорганизмов методом высева на плотную питательную среду. Полученные результаты свидетельствуют о том, что капсулирование пробиотических бактерий рода , входящих в состав лекарственного препарата Биоспорин, повышает их выживаемость в условиях, моделирующих желудочно-кишечный тракт, и позволяет осуществлять направленную доставку препарата в необходимый отдел ЖКТ без раннего высвобождения.
Исследования показали, что полученные капсулы обладают высокой сорбционной способностью, могут включать в себя и в дальнейшем высвобождать большое количество бактерий, а кроме того не разрушаются в кислой среде.
Капсулы можно использовать как носитель (матрицу) для транспортировки лекарственных препаратов, пробиотиков и других веществ, обладающих лечебным и профилактическим действием. Наиболее важными характеристиками капсул являются: вместимость, способность защитить доставляемое вещество от воздействия внутренних условий организма, доставить препарат в необходимый отдел ЖКТ без раннего высвобождения, и в то же время сохранить активность препарата, пролонгировать его действие.
По сравнению с известным решением предлагаемое изобретение позволяет расширить ассортимент капсул. Полученные капсулы содержат компоненты, как полисахаридной природы, так и белковой, что поможет доставлять лекарственные препараты в нужный отдел ЖКТ, сохранять и высвобождать лекарственные препараты с определенной скоростью.