Характеристика микрофлоры промышленных сточных вод, участвующей в круговороте азота

УДК 579.66

Д. Р. Хуснутдинова, Т. В. Григорьева

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД, УЧАСТВУЮЩЕЙ В КРУГОВОРОТЕ АЗОТА

Ключевые слова: промышленные сточные воды, минеральный азот, биологическая очистка.

Определена возможность биологических превращений соединений азота в условиях нефтехимических сточных вод и охарактеризованы.

Keywords: industrial wastewater, mineral nitrogen, biotreatment.

The possibility of biological transformations of nitrogen compounds under petrochemical wastewater conditions was investigated.

Проблема эвтрофикации водоёмов известна во всём мире. Большой вклад в её возникновение вносят промышленные сточные воды, большинство которых имеет превышение норм по минеральным формам азота после очистки. С подобной проблемой столкнулся и крупнейший нефтехимический завод ОАО «Нижнекамскнефтехим». Применяемая технология производства стирола и окиси пропилена (СОП) ведёт к образованию большого количества сточных вод (СВ). Отличительная особенность сточной воды данного цеха это высокие концентрации органических соединений, выраженные в значениях ХПК (химическое потребление кислорода) от 6000 до 16000 мг/л, и, кроме того, специфический химический состав. В поступающей на очистное сооружение сточной воде

периодически,

в небольшом количестве обнаруживались бактерии, до 102 КОЕ на мл. В смешанной жидкости реакторов количество достигало 108 КОЕ/мл.

С помощью посева проб сточной воды на различные питательные среды было выделено 73 штамма микроорганизмов. Большинство выделены со сред МПА и Эшби. Филогенетический анализ изолятов проведён на основании нуклеотидных последовательностей 168 рРНК, результаты на рисунке 1.

10%

18%

I DD 5 - Citrobacter amalonaticus 'DD17b- Citrobacter amalonaticus DD2 - Citrobacter amalonaticus

i DD9 - Morganelia morganii

DD4b - Paracoccus versutus

DDT- Pseudomonas putida

ODS S - BurMioUeria vietnamunsbi

DD 17 - LysinibacOus  > ,'( miß

DOS? - Stsnatrephomonas maltophiUa

DD30 - RaoulteUa planticola

Рис. 1 - Состав сообщества сточной воды

Таким образом, совокупность

микробиологических и молекулярно-генетических элементов анализа микробного сообщества, указывает, что основной вклад в очистку стоков данного производства вносят в основном

протеобактерии (по большей части Gamma-, а также Beta- и Alphaproteobacteria).

Показана способность бактериального сообщества, осуществляющего предочистку нефтехимических стоков производства СОП (ХПК в среднем около 11000 мг/л), фиксировать молекулярный азот из воздуха. При росте на минеральной полужидкой среде без источника азота сообщество бактерий фиксировало азот из фтмосферы со скоростью 1405 г К/м3/д. Такое большое значение получено в результате создания благоприятных условий, способствующих раскрытию полного потенциала сообщества микроорганизмов к фиксации молекулярного азота. Из всего сообщества выделены виды, способные к фиксации азота: DD75 - Achromobacter denitrificans, DD74 - Citrobacter amalonaticus, DD73 -Stenotrophomonas maltophilia и DD68 - Burkholderia cepacia. Проверку осуществляли на основании двух параметров: рост на безазотистой среде и оценка нитрогеназной активности ацетиленовым методом на газовом хроматографе.

Таким образом, впервые показана возможность существования азотфиксирующих микроорганизмов в условиях очистки высокотоксичных нефтехимических сточных вод. Это позволит рационализировать эксплуатацию очистного сооружения, так как биологическая фиксация азота снизит концентрацию сбрасываемого аммонийного и других форм азота до минимума, поступление азота будет регулироваться микрофлорой в зависимости от уровня органических загрязнений.

Как уже упоминалось, сточная вода данного производства содержит большие концентрации органических соединений, поэтому в таких условиях способны существовать только гетеротрофные бактерии. Считалось, что осуществлять процесс нитрификации способны только автотрофные микроорганизмы, однако многочисленные исследования в этой области показали, что осуществлять данный процесс могут и гетеротрофы. Так например, Bacillus sp., выделенный из мембранного биореактора, использует органический углерод в качестве источника энергии. При его росте на среде с глюкозой и хлоридом аммония происходило образование окисленного азота. Через

24 дня инкубации, эффективность снижения ХПК составляла 71.7%.

В ходе экспериментов определена способность микроорганизмов осуществлять процесс нитрификации (табл. 1). При росте на сульфатно-аммонийной среде сообщество бактерий осуществляло процесс окисления аммония до нитритов, а затем до нитратов. Такой вывод можно сделать по наличию розовой окраски с реактивом Грисса и синей - с дифениламином. Также была определена способность к нитрификации у отдельных штаммов, выделенных из сообщества сточной воды, включая 10 доминирующих. Результаты представлены на рисунке 2.

Таблица 1 - Нитрифицирующая способность изолятов

№ изолята Видовое название no2- NO3-

DD2 Citrobacter amalonaticus + +

DD9 Morganella morganii + +

DD1' Pseudomonas putida + +

DD68 Burkholderia cepatia - +

DD4b Paracoccus versutus - +

DD30 Raoultella planticola - -

DD22 Kocuria rosea + -

DD17b Citrobacter amalonaticus - -

DD5 Citrobacter amalonaticus - -

DD52 Stenotrophomonas maltophilia + +

DD40 Achromobacter ruhlandii + -

DD3b Alcaligenes faecalis + -

DD16b Pseudomonas mendocina + +

DD47 Pseudomonas aeruginosa + -

ВСЁ СООБЩЕСТВО + +

Таким образом, можно предположить, что в условия биореактора некоторые микроорганизмы способны снизить концентрацию аммонийного азота в сточной воде.

В результате процесса нитрификации на выходе из биореактора, в сточной воде будет содержаться большое количество нитритов и нитратов, которые токсичны для живых организмом. Уменьшить содержание данных веществ можно при помощи восстановления их в молекулярный азот. Исходя из этого нами была изучена денитрифицирующая активность сообщества. При росте сообщества микроорганизмов на среде Гильтая, было зафиксировано окрашивание среды в синий цвет, что свидетельствует о присутсвии

денитрификаторов. Далее анализ проводили с 15 изолятами, выделенными из сточной воды, среди которых 10 доминирующих. Среди рассмотренных изолятов денитрифицирующая способность была обнаружена только у Лс^отоЬа^ег ёвтМАсат. Его способность к восстановлению нитритов в молекулярный азот доказана во многих исследованиях.

Исходя из анализа результатов, можно сказать, что в микробном сообществе сточной воды присутствуют представители, способные к превращению минеральных форм азота.

Для оценки микробного потенциала в условиях биоректора проводили моделирование на аппарате BIOSTAT Aplus. Для создания модели использовали минеральную среду следующего состава: (NH4^SO4 - 1 г/л; MgSO4 - 0.25 г/л; KH2PO4 - 3 г/л; Na2HPO4.12H2O - 4.5 г/л, а также 10 доминирующих изолятов, выделенных из исследуемой сточной воды: Pseudomonas putida DD1, Citrobacter amalonaticus DD2, DD5, DD 17b, Paracoccus versutus DD4b, Morganella morganii DD9, Lysinibacillus fusiformis DD 17, Raoutella planticola DD30, Stenotrophomonas maltophilia DD52, Burkholderia cepacia DD68. Основные технические характеристики процесса были приближены к параметрам используемого биореактора на предприятии ОАО «Нижнекамскнефтехим»: ХПК -5 г/л, фосфор - 3.75 г/л, температура - 28-30°С, скорость перемешивания - 30-40об/мин, скорость потока - 260 мл/день, скорость подачи воздуха - 10 мл/сек.

На протяжении 32-ух дневного

эксперимента было отобрано 8 проб воды, анализ которых показал что: применение используемой на предприятии дозы азота приводило к превышению ПДК в очищенной воде. При этом деградация органических соединений находилась на уровне от 60 до 85% для фенола и 100% для гликолей. При двукратном уменьшении дозы происходило заметное снижение аммония в очищенной воде. Начиная с середины эксперимента добавление дополнительного азота было прекращено, представив возможность осуществлению процесса азотфиксации. С этого момента начался спад концентрации ионов аммония в воде, достигнув практически нуля, но затем вновь начал увеличиваться, оставаясь при этом в пределах допустимой. Возможно, это произошло в результате частичной гибели популяции.

Рис. 2 - Мониторинг минеральных форм азота

Если предположить, что с момента последнего добавления аммонийного азота,

микроорганизмы израсходовали его в течение 5-7 дней, то можно сказать, что с 22-24 дня начинается работа азотфиксирующих бактерий. Возможность осуществления азотфиксации показана в лабораторной диагностике с активным илом, очищающим промышленные сточные воды с ХПК 3321 мг/л (образующиеся при термомеханической обработке целлюлозы), при 30°С, концентрации растворенного кислорода 15% и дозировке биогенных соединений в соответствии с С:№Р 100:0.7:0.4, происходил процесс азотфиксации. При этом скорость процесса в среднем была 4046 мг К/м3/д и изменялась в соответствии с колебаниями ХПК поступающей сточной воды. Концентрация аммонийного и окисленного азота на выходе была в районе 0.1 и 0.0 мг/л, соответственно. Очистка составила 87% по ХПК и 95% по БПК.

Что касается содержания окисленных форм азота, то тут видна общая тенденция к его увеличению. Из этого можно предположить, что в биореакторе происходил процесс нитрификации, хоть и с небольшой активностью.

Таким образом, продемонстрирована возможность вовлечения микробиологических процессов превращения азота в технологию очистки

сточных вод, обеспечивающих не только допустимое содержание аммония на выходе, но и высокие показатели очистки по органическим загрязнениям.

Литература

1. Теппер Е. 3., Шильникова В. К., Переверзева Г. И. Практикум по микробиологии // 4-е изд., перераб. и доп. М.: Колос. - 1993. - С. 175.

2. Dandie C.E., Burton D.L., Zebarth B.J., Trevors J.T., Goyer C. Analysis of denitrfication genes and comparison of nosZ, cnorB and 16S rDNA from culturable denitrifying bacteria in potato cropping systems // Syst Appl Microbiol. - 2007. - V.30 - P.128-138.

3. Eckford Ruth, Cook Fred D., Saul David, Aislabie Jackie, and Foght Julia Free-Living Heterotrophic Nitrogen-Fixing Bacteria Isolated from Fuel-Contaminated Antarctic Soils // Applied and environmental microbiology. - 2002. - V. 68 -N. 10. - P. 5181-5185.

4. Slade A. H., Anderson S. M., Evans B. G. Nitrogen fixation in the activated sludge treatment of thermomechanical pulping wastewater: effect of dissolved oxygen // Water Science & Technology. - 2003. - V48 -P.1-8

5. Yan. L., He Y., Kong H., Tanaka S., Lin Y. Isolation of a new heterotrophic nitrifying Bacillus sp. strain // Journal of Environmental Biology - 2006. - V.27. - P.323

© Д. Р. Хуснутдинова - лаборант Междисциплинарного центра протеомных исследований Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университетаД1уа-11шп@гатЫег.га; Т. В. Григорьева - к.б.н, доцент кафедры технологии пищевых производств КНИТУ, tatabio@inbox.ru.

© D. R. Khusnutdinova - assistant of Interdisciplinary Center proteomic studies of the Institute of Basic Medicine and Biology, KFU, dilya-husn@rambler.ru; T. V. Grigoreva - Candidate of Sciences (Ph.D.) in Biology, Docent (Associate Professor) of the Department of Technology of Food Productions from Faculty of Food Technology in KNRTU, tatabio@inbox.ru.