КОМБИНАЦИЯ ТАСКВИНИМОДА ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМОЙ СОЛИ И ИНГИБИТОРА PD-1 И/ИЛИ PD-L1 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА
COMBINATION OF TASQUINIMOD OR ITS PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALT AND PD-1 AND/OR PD-L1 INHIBITOR FOR USE AS A MEDICINAL AGENT

Настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1 для применения в качестве лекарственного средства. Также оно относится к фармацевтической композиции, набору и способу лечения, включающим тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1.
Уровень техники
Рак мочевого пузыря представляет собой один из нескольких типов злокачественной опухоли, возникающих из эпителиальной выстилки (т.е. уротелия) мочевого пузыря. Реже мочевой пузырь вовлекается в неэпителиальные злокачественные опухоли, такие как лимфома или саркома. Он представляет собой заболевание, при котором аномальные клетки бесконтрольно увеличиваются в количестве в мочевом пузыре. Наиболее распространенный тип рака мочевого пузыря воспроизводит нормальную гистологию уротелия и известен как карцинома переходных клеток или вернее карцинома из уротелиальных клеток. Показатели пятилетней выживаемости в США составляют приблизительно 77% (SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. NCI, Retrieved 18 June 2014). Рак мочевого пузыря находится на 9-ом месте среди основных случаев злокачественной опухоли, причем в 2012 году произошло 430000 новых случаев (World Cancer Report 2014. World Health Organization, 2014, pp. Chapter 1.1., ISBN 9283204298) и 165000 смертей.
За последние 30 лет не произошло существенных достижений в лечении метастазирующего уротелиального рака мочевого пузыря (UBC). Химиотерапия все еще является стандартном лечения. Исходы у пациентов, особенно у пациентов, у которых химиотерапия является неэффективной или плохо переносится, остаются плохими (Choueiri, T. K. et al. Double-blind, randomized trial of docetaxel plus vandetanib versus docetaxel plus placebo in platinum-pretreated metastatic urothelial cancer. J. Clin. Oncol. 30, 507-512 (2012); Bellmunt, J. et al. Phase III trial of vinflunine plus best supportive care compared with best supportive care alone after a platinum-containing regimen in patients with advanced transitional cell carcinoma of the urothelial tract. J. Clin. Oncol., 27, 4454-4461(2009)).
Одним из отличительных признаков UBC является наличие высоких частот соматических мутаций (Cancer Genome Atlas Research Network., Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma, Nature 507,315-322 (2014); Lawrence, M. S. et al., Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes, Nature 499, 214-218 (2013); Kandoth, C. et al. Mutational landscape and significance across 12 major cancer types, Nature 502,333-339 (2013)). Эти изменения могут усиливать способность иммунной системы хозяина распознавать опухолевые клетки как чужеродные вследствие увеличенного количества антигенов (Chen, D. S. & Mellman, I.Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle, Immunity39, 1-10 (2013)).
Однако эти злокачественные опухоли также могут ускользать от иммунного надзора и уничтожения посредством экспрессии лиганда 1 белка запрограммированной клеточной смерти (PD-L1; также называемый CD274 или B7-H1) в микроокружении опухоли (Chen et al., Molecular pathways: next-generation immunotherapy-inhibiting programmed death-ligand 1 and programmed death-1. Clin. Cancer Res., 18, 6580-6587 (2012); Van Rooij, N. et al., Tumor exome analysis reveals neoantigen-specific T-cell reactivity in an ipilimumab-responsive melanoma, J. Clin. Oncol. 31, e439-e442 (2013)).
PD-L1 является отрицательным регулятором иммунной активации посредством ингибирования эффективной функции T-клеток. Коингибирующий рецептор 1 белка запрограммированной клеточной смерти (PD-1) и его лиганды являются ключевыми регуляторами широкого спектра иммунных ответов и играют ключевую роль в аутоиммунитете и аутотолерантности, а также в иммунологии злокачественной опухоли. Накопленные данные указывают на то, что злокачественные клетки могут использовать каскад PD-1/PD-лиганд (PDL) для ускользания от противоопухолевого иммунитета. Исходя из этих данных, в настоящее время проводится ранняя фаза клинических испытаний у человека, нацеленных на каскад PD-1/PDL, для многих злокачественных опухолей человека. Антитело против PD-L1 находится на фазе II разработки против метастазирующего рака мочевого пузыря (Powles et al., MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer, Nature. 2014 Nov 27;515 (7528):558-62. doi: 10.1038/nature13904.; Errico A., Immunotherapy: PD-1-PD-L1 axis: efficient checkpoint blockade against cancer, Nat Rev Clin Oncol. 2015 Feb;12(2):63. doi: 10.1038/nrclinonc.2014.221. Epub 2014 Dec 23.; Muenst Set al., The PD-1/PD-L1 pathway: biological background and clinical relevance of an emerging treatment target in immunotherapy., Expert Opin Ther Targets., 2015 Feb;19(2):201-11. doi: 10.1517/14728222.2014.980235., Epub 2014 Dec 10; M. S. Soloway. Intravesical and systemic chemotherapy in the management of superficial bladder cancer. Urol.Clin.North Am. 11 (4):623-635, 1984).
Тасквинимод (иногда обозначаемый как TasQ), являющийся аналогом хинолин-3-карбоксиамида, ингибирует взаимодействие белка, называемого S100A9, с различными рецепторами TLR4, RAGE, EMMPRIN). Тасквинимод имеет иммуномодулирующую, антиангиогенную и антиметастатическую активность. Путем нацеливания на S100A9 тасквинимод модулирует супрессивные миелоидные клетки, в том числе супрессивные клетки миелоидного происхождения и макрофаги (Shen Let al., Tasquinimod Modulates Suppressive Myeloid Cells and Enhances Cancer Immunotherapies in Murine Models., Cancer Immunol Res. 2014 Nov 4.; Jennbacken Ket al., Inhibition of metastasis in a castration resistant prostate cancer model by the quinoline-3-carboxamide tasquinimod (ABR-215050), Prostate. 2012 Jun 1; 72(8):913-24, doi: 10.1002/pros.21495. Epub 2011 Oct 5; Isaacs et al., Identification of ABR-215050 as lead second generation quinoline-3-carboxamide anti-angiogenic agent for the treatment of prostate cancer, Prostate. 2006 Dec 1; 66(16):1768-78). Тасквинимод находится на фазе III клинической разработки против рака предстательной железы и других солидных опухолей.
Тасквинимод нацелен на микроокружение опухоли и модулирует регуляторную функцию миелоидных клеток, демонстрируя иммуномодулирующие, антиангиогенные и антиметастатические свойства. Тасквинимод также может подавлять гипоксический ответ опухоли, участвуя в его эффектах на микроокружение опухоли.
В Isaacs et al. (Cancer Res. 73(4) February 15, 2013) описано, на основе доклинических моделей, что тасквинимод является эффективным в качестве монотерапии против ксенотрансплантатов опухолей предстательной железы, молочной железы, мочевого пузыря и толстого кишечника человека, причем его эффективность может быть далее усилена путем комбинирования с направленным пролекарством тапсигаргином (G202), которое селективно уничтожает эндотелиальные клетки опухоли.
Авторы изобретения неожиданно продемонстрировали, что тасквинимод или его фармацевтически приемлемая соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1 блокируют пролиферацию опухоли синергичным образом, и их можно использовать вместе в качестве лекарственного средства, в частности, для лечения злокачественной опухоли и, более конкретно, для лечения рака мочевого пузыря.
Описание изобретения
Таким образом, изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, для применения в качестве лекарственного средства.
В одном варианте осуществления ингибитор PD-1 и/или PD-L1 выбран из антитела и пептида.
Также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и антитело против PD-1 и/или PD-L1, для применения в качестве лекарственного средства.
Также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, который не является антителом, для применения в качестве лекарственного средства. Предпочтительно, изобретение также относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и пептид в качестве ингибитора PD-1 и/или PD-L1, для применения в качестве лекарственного средства.
В одном варианте осуществления изобретения ингибитор, антитело или пептид ингибирует PD-L1. В другом варианте осуществления ингибитор, антитело или пептид ингибирует PD-1.
Также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, для применения для лечения злокачественной опухоли.
Также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и антитело против PD-1 и/или PD-L1, для применения для лечения злокачественной опухоли.
Также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, который не является антителом, для применения для лечения злокачественной опухоли. Предпочтительно, также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и пептид в качестве ингибитора PD-1 и/или PD-L1, для применения для лечения злокачественной опухоли.
В одном варианте осуществления комбинация предназначена для применения для лечения развернутой злокачественной опухоли. Развернутая злокачественная опухоль может быть выбрана, например, из развернутой метастазирующей злокачественной опухоли или злокачественной опухоли поздней стадии.
В частности, указанная злокачественная опухоль выбрана из рака мочевого пузыря, меланомы, рака легкого, такого как NSCLC (немелкоклеточный рак легкого), рака ободочной и прямой кишки, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, почечноклеточного рака, гематологических злокачественных опухолей, в частности, развернутых гематологических злокачественных опухолей, рака яичника, в частности, резистентного к платине рака яичника, нейроэндокринных опухолей (NET) и нейроэндокринных опухолей из желудочно-кишечного тракта или поджелудочной железы (GEP-NET). Злокачественная опухоль, которую лечат комбинацией по настоящему изобретению, может иметь любую стадию, например, раннюю стадию или позднюю стадию. В некоторых вариантах осуществления лечение приводит к длительному ответу у индивидуума после прекращения лечения. В некоторых вариантах осуществления лечение вызывает полный ответ, частичный ответ или стабильное заболевание у индивидуума.
В предпочтительном варианте осуществления также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, в частности, антитело против PD-1 и/или PD-L1, для применения для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака мочевого пузыря, меланомы, рака легкого, рака предстательной железы, почечноклеточного рака, гематологических злокачественных опухолей, в частности, развернутых гематологических злокачественных опухолей, рака яичника, в частности, устойчивого к платине рака яичника, нейроэндокринных опухолей (NET), в частности, нейроэндокринных опухолей из желудочно-кишечного тракта или поджелудочной железы (GEP-NET).
В предпочтительном варианте осуществления также изобретение относится к комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, в частности, антитело против PD-1 и/или PD-L1, для применения для лечения злокачественной опухоли, выбранной из рака мочевого пузыря, рака предстательной железы и почечноклеточного рака.
Более конкретно, комбинация для применения, как упоминалось выше, предназначена для лечения рака мочевого пузыря, в частности, не проникающего в мышечный слой рака мочевого пузыря, проникающего в мышечный слой рака мочевого пузыря и метастазирующего и уротелиального рака мочевого пузыря.
В одном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой рак мочевого пузыря.
Рак мочевого пузыря определяется стадийной системой, которая является стандартным способом описания группой по лечению злокачественной опухоли того, насколько злокачественная опухоль распространилась. Стадийная система, наиболее часто используемая для рака мочевого пузыря, представляет собой систему TNM от American Joint Committee on Cancer (AJCC), которая основана на 3 ключевых фрагментах данных:
- T описывает, насколько далеко главная (первичная) опухоль проросла через стенку мочевого пузыря, и наличие прорастания в близлежащие ткани.
- N указывает на какое-либо распространение злокачественной опухоли в лимфатические узлы вблизи мочевого пузыря.
- M указывает на то, распространилась ли (метастазировала ли) злокачественная опухоль в отдаленные области, такие как другие органы или лимфатические узлы, которые не находятся вблизи мочевого пузыря.
Номера или буквы после T, N и M предоставляют больше деталей, касающихся каждого из этих факторов. Более высокие номера означают, что злокачественная опухоль является более развернутой.
Более конкретно, категория T описывает, насколько далеко главная опухоль проросла в стенку мочевого пузыря (или за ее пределы).
Стенка мочевого пузыря имеет 4 основных слоя.
- Самая внутренняя выстилка называется уротелием или переходным эпителием.
- Под уротелием находится тонкий слой соединительной ткани, кровеносных сосудов и нервов.
- Далее находится толстый мышечный слой.
- Снаружи этой мышцы слой жирной соединительной ткани отделяет мочевой пузырь от близлежащих органов.
Практические все опухоли рака мочевого пузыря начинаются в уротелии. По мере роста злокачественной опухоли в или через другие слои мочевого пузыря, он становится более развернутым.
- TX: основная опухоль не может быть оценена вследствие недостаточной информации
- T0: нет признаков первичной опухоли
- Ta: неинвазивная папиллярная карцинома
in situ
- Tis: неинвазивная плоская карцинома (плоская карцинома  или CIS)
- T1: опухоль проросла из слоя клеток, выстилающих мочевой пузырь, в нижележащую соединительную ткань. Она не проросла в мышечный слой мочевого пузыря.
- T2: опухоль проросла в мышечный слой.
- T2a: опухоль проросла только во внутреннюю половину мышечного слоя.
- T2b: опухоль проросла в наружную половину мышечного слоя.
- T3: опухоль проросла через мышечный слой мочевого пузыря в слой жировой ткани, которая окружает его.
- T3a: распространение в жировую ткань можно видеть только с использованием микроскопа.
- T3b: распространение в жировую ткань является достаточно большим, чтобы его было видно на визуализирующих исследованиях или чтобы его видел или ощущал наощупь хирург.
- T4: опухоль распространилась за пределы жировой ткани в близлежащие органы или структуры. Она может прорастать в любой из следующих: строма (основная ткань) предстательной железы, семенные пузырьки, матка, влагалище, стенка таза или брюшная стенка.
- T4a: опухоль распространилась в строму предстательной железы (у мужчин) или в матку и/или влагалище (у женщин).
- T4b: опухоль распространилась на стенку таза или стенку брюшной полости.
Рак мочевого пузыря иногда может поражать другие области мочевого пузыря в то же время. Если обнаруживается более одной опухоли, к соответствующей категории T добавляют букву m.
Категории N для рака мочевого пузыря
Категория N описывает распространение только в лимфатические узлы вблизи мочевого пузыря (в малом тазу) и лимфатические вдоль кровеносного сосуда, называемого общей подвздошной артерией. Эти лимфатические узлы называют регионарными лимфатическими узлами. Любые другие лимфатические узлы считаются отдаленными лимфатическими узлами. Распространение в отдаленные узлы считается метастазом (описываемым в категории M). Обычно для поиска распространения злокачественной опухоли в лимфатические узлы требуется хирургическая операция, поскольку его нечасто видно при визуализирующих исследованиях.
- NX: регионарные лимфатические узлы нельзя оценить вследствие недостаточной информации.
- N0: отсутствуют распространение в регионарные лимфатические узлы.
- N1: злокачественная опухоль распространилась в единичный лимфатический узел в малом тазу.
- N2: злокачественная опухоль распространилась в 2 или более лимфатических узлов в малом тазу.
- N3: злокачественная опухоль распространилась в лимфатические узлы вдоль общей подвздошной артерии.
Категории M для рака мочевого пузыря
- M0: отсутствуют признаки отдаленного распространения.
- M1: злокачественная опухоль распространилась в отдаленные части организма (наиболее распространенными областями являются отдаленные лимфатические узлы, кости, легкие и печень)
Стадии рака мочевого пузыря
После определения категорий T, N и M эту информацию комбинируют для определения общей стадии злокачественной опухоли. Стадии рака мочевого пузыря определяют с использованием 0 и римских цифр I-IV (1-4). Стадия 0 является наиболее ранней стадией, в то время как стадия IV является наиболее развернутой.
- Стадия 0a (Ta, N0, M0)
Злокачественная опухоль представляет собой неинвазивную папиллярную карциному (Ta). Она растет в направлении полого центра мочевого пузыря, но не растет в соединительную ткань или мышцу стенки мочевого пузыря. Она не имеет распространения в близлежащие лимфатические узлы (N0) или отдаленные области (M0).
- Стадия 0is (Tis, N0, M0)
in situ
Злокачественная опухоль представляет собой плоскую неинвазивную карциному (Tis), также известную как плоская карцинома  (CIS). Злокачественная опухоль растет только в слой внутренней выстилки мочевого пузыря. Она не растет внутрь в направлении полой части мочевого пузыря, а также не проникает в соединительную ткань или мышцу стенки мочевого пузыря. Она не распространяется в близлежащие лимфатические узлы (N0) или отдаленные области (M0).
- Стадия I (T1, N0, M0)
Злокачественная опухоль растет в слой соединительной ткани под выстилающим слоем мочевого пузыря, но не достигает слоя мышцы в стенке мочевого пузыря (T1). Злокачественная опухоль не распространилась в близлежащие лимфатические узлы (N0) или в отдаленные области (M0).
- Стадия II (T2a или T2b, N0, M0)
Злокачественная опухоль растет в толстый мышечный слой стенки мочевого пузыря, но не проходит полностью через мышцу и не достигает слой жировой ткани, который окружает мочевой пузырь (T2). Злокачественная опухоль не распространяется в близлежащие лимфатические узлы (N0) или в отдаленные области (M0).
- Стадия III (T3a, T3b или T4a, N0, M0)
Злокачественная опухоль проросла в слой жировой ткани, которая окружает мочевой пузырь (T3a или T3b). Она может распространяться в предстательную железу, мтку или влагалище, но не растет в стенку таза или брюшной полости (T4a). Злокачественная опухоль не распространяется в близлежащие лимфатические узлы (N0) или в отдаленные области (M0).
- Стадия IV
Выполняется одно из следующих:
T4b, N0, M0: злокачественная опухоль проросла через стенку мочевого пузыря и в стенку таза или брюшной полости (T4b). Злокачественная опухоль не распространяется в близлежащие лимфатические узлы (N0) или в отдаленные области (M0).
или
любой T, N1-N3, M0: злокачественная опухоль распространилась в близлежащие лимфатические узлы (N1-N3), но не в отдаленные области (M0).
или
любой T, любой N, M1: злокачественная опухоль распространилась в отдаленные лимфатические узлы или области, такие как кости, печень или легкие (M1).
Комбинация по изобретению предназначена для лечения рака мочевого пузыря, имеющего любую из определенных выше категорий или стадий. Предпочтительно, она предназначена для применения для лечения рака мочевого пузыря стадии I или выше, или стадии II или выше, или stage III.
В одном варианте осуществления комбинация для применения согласно изобретению повышает выживаемость без прогрессирования и/или продолжительность жизни.
В одном варианте осуществления комбинации согласно изобретению тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1 вводят по отдельности, последовательно или одновременно.
В одном варианте осуществления комбинации согласно изобретению тасквинимод, или его фармацевтически приемлемую соль и антитело против PD-1 и/или PD-L1 вводят по отдельности, последовательно или одновременно.
В одном варианте осуществления комбинации согласно изобретению тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и пептид, используемый в качестве ингибитора PD-1 и/или PD-L1, вводят по отдельности, последовательно или одновременно.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и антитело против PD-1 и/или PD-L1.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и пептид в качестве ингибитора PD-1 и/или PD-L1.
В частности, указанная фармацевтическая композиция, кроме того, содержит фармацевтически приемлемый эксципиент.
Настоящее изобретение также относится к продуктам, содержащим тасквинимод или его фармацевтически приемлемыую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, в частности, антитело против PD-1 и/или PD-L1, в качестве комбинированного препарата для одновременного применения, отдельного применения или применения, разделенного во времени (т.е. последовательного применения), для лечения злокачественной опухоли, в частности, рака мочевого пузыря. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к продуктам, содержащим тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и пептид в качестве ингибитора PD-1 и/или PD-L1, в качестве комбинированного препарата для одновременного применения, отдельного применения или применения, разделенного во времени, для лечения злокачественной опухоли, в частности, рака мочевого пузыря, включая, например, не проникающий в мышечный слой рак мочевого пузыря, проникающий в мышечный слой рак мочевого пузыря и метастазирующий уротелиальный рак мочевого пузыря и рак мочевого пузыря любой категории или стадии, как описано выше. Предпочтительно, рак мочевого пузыря представляет собой рак мочевого пузыря стадии I или выше, или стадии II или выше, или стадии III.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, в частности, рак мочевого пузыря, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества комбинации, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, в частности, антитело против PD-1 и/или PD-L1 или пептид в качестве ингибитора PD-1 и/или PD-L1.
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему тасквинимод и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, для лечения или замедления прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью. Набор может содержать ингибитор PD-1 и/или PD-L1 и вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по применению тасквинимода в комбинации с ингибитором PD-1 и/или PD-L1 для лечения или замедления прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуума. Также набор может содержать ингибитор PD-1 и/или PD-L1 и вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по применению ингибитора PD-1 и/или PD-L1 в комбинации с тасквинимодом для лечения или замедления прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью. Также набор может содержать тасквинимод и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, и вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по применению тасквинимода и ингибитора PD-1 и/или PD-L1 для лечения или замедления прогрессирования злокачественной опухоли у индивидуума.
На вкладыше в упаковке будет указана злокачественная опухоль, подлежащая лечению с использованием набора. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак мочевого пузыря включает, например, не проникающий в мышечный слой рак мочевого пузыря, проникающий в мышечный слой рак мочевого пузыря и метастазирующий уротелиальный рак мочевого пузыря и рак мочевого пузыря любой категории или стадии, как описано выше. Предпочтительно, рак мочевого пузыря представляет собой рак мочевого пузыря стадии I или выше, или стадии II или выше, или стадии III.
T
Тасквинимод, также известный как 4-гидрокси-5-метокси-N,1-диметил-2-оксо-N-[4-(трифторметил)фенил]-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамид (номер CAS 254964-60-8), представляет собой соединение формулы (I):
T
(I).
Это соединение, также как и подобные тасквинимоду соединения и способ их получения, описаны в патентной заявке WO00/03991 (в частности, в примере 8), содержание которой включено в качестве ссылки.
Подобные тасквинимоду соединения представляют собой, например, соединения общей формулы (I):
(I)
где
A
A выбран из водорода и -COR, где A выбран из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, трет-бутила, неопентила, фенила, бензила и фенэтила;
2
R выбран из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и аллила;
3
x
y
R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, брома, трифторметила и -OCHF, где x=0-2, y=1-3 при условии, что x+y=3, и при условии, что R' не является водородом, когда R представляет собой метил;
4
4
R выбран из водорода, фтора и хлора при условии, что R выбран только из фтора и хлора, когда R' выбран из фтора и хлора;
1
x
y
2
x
y
Rвыбран из метила, этила, н-пропила, изопропила, метокси, этокси, хлора, брома, трифторметила, диметиламино, -OCHF и -OCHCHF, где x=0-2, y=1-3, при условии, что x+y=3;
или любой их таутомер и/или любые их фармацевтически приемлемые соли.
Примерами таких соединений являются следующие: N-этил-N-(3-фторфенил)-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид; N-метил-N-(2,4-дифторфенил)-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид; N-метил-N-(2,5-дифторфенил)-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид; N-этил-N-(3-метоксифенил)-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-этил-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид; N-метил-N-(2,5-дифторфенил)-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-метокси-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид; N-метил-N-(4-трифторметил-фенил)-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-метокси-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид или N-метил-N-(2,4-дифторфенил)-1,2-дигидро-4-гидрокси-5,6-метилендиокси-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид.
Подобные тасквинимоду соединения предпочтительно представляют собой соединения формулы (Ia)
(Ia)
или их фармацевтически приемлемую соль, где
1
Rвыбран из H, метила, этила, н-пропила, изопропила, метокси, этокси, фтора, хлора, брома, трифторметила и трифторметокси;
2
1
4
R представляет собой C-C алкил;
3
R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, брома, трифторметила и трифторметокси;
4
4
3
R выбран из водорода, фтора и хлора при условии, что R выбран только из фтора и хлора, когда R выбран из фтора и хлора; или их фармацевтически приемлемые соли.
1
4
Термин "C-C алкил" относится к разветвленной или неразветвленной алкильной группе, имеющей 1, 2, 3 или 4 атома углерода, т.е. метилу, этилу, н-пропилу, изопропилу, н-бутилу, втор-бутилу, изобутилу или трет-бутилу.
1
1
1
1
В некоторых вариантах осуществления Rвыбран из метила, этила, н-пропила, изопропила, метокси, этокси, фтора, хлора, брома, трифторметила и трифторметокси. В некоторых других вариантах осуществления Rвыбран из этила, н-пропила, изопропила, метокси, этокси, хлора, брома, трифторметила и трифторметокси. В других вариантах осуществления R выбран из этила, метокси, хлора и трифторметила. В некоторых конкретных вариантах осуществления R представляет собой метокси.
2
1
4
2
1
3
2
2
Часть R представляет собой C-C алкильный радикал, который может быть разветвленным или линейным. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой C-C алкильный радикал. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой метил или этил. В некоторых конкретных вариантах осуществления R представляет собой метил.
3
3
3
Часть R выбрана из метила, метокси, фтора, хлора, брома, трифторметила и трифторметокси. В некоторых вариантах осуществления R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, трифторметила и трифторметокси. В некоторых конкретных вариантах осуществления Rпредставляет собой трифторметил.
4
4
3
4
4
R выбран из водорода, фтора и хлора при условии, что R выбран только из фтора и хлора, когда R выбран из фтора и хлора. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой водород или фтор. В некоторых конкретных вариантах осуществления R представляет собой водород.
В некоторых конкретных вариантах осуществления в соединении формулы (Ia)
1
4
R и R являются такими, как определено в настоящем описании выше;
2
R представляет собой метил или этил, в частности метил; и
3
R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, трифторметила и трифторметокси.
В некоторых других конкретных вариантах осуществления в соединении формулы (Ia)
1
R является таким, как определено в настоящем описании выше;
2
R представляет собой метил или этил, в частности метил;
3
4
R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, трифторметила и трифторметокси; и R представляет собой H.
3
В некоторых вариантах осуществления R находится в пара-положении, т.е. соединения формулы (Ia) могут соответствовать формуле (Ib)
(Ib)
1
2
3
4
где R, R, R и R являются такими, как определено в настоящем описании выше.
Например, в некоторых вариантах осуществления соединения формулы (Ib)
1
4
R и R являются такими, как определено в настоящем описании выше;
2
R представляет собой метил или этил, в частности метил; и
3
R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, трифторметила и трифторметокси.
В некоторых других конкретных вариантах осуществления в соединении формулы (Ib)
1
R является таким, как определено в настоящем описании выше;
2
R представляет собой метил или этил, в частности метил;
3
R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, трифторметила и трифторметокси; и
4
R представляет собой H.
4
Как отмечается в настоящем описании выше, в некоторых вариантах осуществления R представляет собой водород. В этих вариантах осуществления соединение формулы (Ia) может соответствовать формуле (Ic)
(Ic)
1
2
3
где R, R и R являются такими, как определено в настоящем описании выше.
Например, в некоторых вариантах осуществления соединения формулы (Ic)
2
R представляет собой метил или этил, в частности метил;
3
R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, трифторметила и трифторметокси;
1
и R является таким, как определено в настоящем описании выше.
3
4
В некоторых конкретных вариантах осуществления соединения формулы (Ia) R находится в пара-положении и R представляет собой H, и соединение, как определено в настоящем описании, может соответствовать формуле (Id)
(Id)
1
2
3
где R, R и R являются такими, как определено в настоящем описании выше.
2
3
1
В некоторых конкретных вариантах осуществления соединения формулы (Id) R представляет собой метил или этил, в частности метил; R выбран из метила, метокси, фтора, хлора, трифторметила и трифторметокси; и R является таким, как определено в настоящем описании.
Для целей настоящего изобретения любое упоминание соединения формулы (I) также следует понимать как указание на соединение любой из формул (Ia), (Ib) (Ic) и (Id), если нет иных указаний или если иное не очевидно из контекста.
Предполагается, что любые и все из соединений, подобных тасквинимоду, как определено выше в формулах (I), (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), демонстрируют синергический эффект в комбинации с ингибитором PD-1 и/или PD-L1 для лечения злокачественной опухоли. Таким образом, изобретение также относится к комбинации подобного тасквинимоду соединения и ингибитора PD-1 и/или PD-L1 для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения при злокачественной опухоли, и более конкретно для применения при раке мочевого пузыря. Все варианты осуществления, описанные в настоящем описании для комбинации тасквинимода с ингибитором PD-1 и/или PD-L1, в равной степени применимы для комбинации подобного тасквинимоду соединения и ингибитора PD-1 и/или PD-L1. Аналогично, все варианты осуществления, описанные в настоящем описании для фармацевтических композиций, продуктов, наборов, способов лечения и применения, в равной степени применимы для комбинации подобного тасквинимоду соединения и ингибитора PD-1 и/или PD-L1.
Remington's Pharmaceutical Sciences
th
Под "фармацевтически приемлемой солью" тасквинимода или подобного тасквинимоду соединения подразумевают, что соединение модифицировано посредством образования его кислотных или основных солей. Фармацевтически приемлемые соли включают общепринятые нетоксичные соли или четвертичные аммонийные соли соединения, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, такие общепринятые нетоксичные соли включают соли, образованные из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и т.п.; и соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, виннокаменная, лимонная, метансульфоновая, бензолсульфоновая, глюкуроновая, глутаминовая, бензойная, салициловая, толуолсульфоновая, щавелевая, фумаровая, малеиновая и т.п. Кроме того, аддитивные соли включают соли аммония, такие как трометамин, меглумин, эполамин и т.д., соли металлов, таких как натрий, калий, кальций, цинк или магний. Фармацевтически приемлемые соли тасквинимода можно синтезировать из исходного соединения общепринятыми химическими способами. Как правило, такие соли можно получать путем реакции форм свободной кислоты или основания этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, или в их смеси. Как правило, предпочтительными являются неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечни подходящих солей могут быть найдены в , 17 ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418.
PD-1 представляет собой трансмембранный белок типа I суперсемейства иммуноглобулинов (Ishida et al., Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J 1992; 11(11):3887-95), структура которого включает внеклеточный домен, сходный с вариабельной областью иммуноглобулина, за которым следует трансмембранная область и цитоплазматическая хвостовая часть (Zhang et al., Structural and functional analysis of the costimulatory receptor programmed death-1. Immunity 2004; 20(3):337-4).
Он связывает два лиганда, известных как PD-L1 (B7-H1, CD274) и PDL2 (B7-DC, CD273), которые принадлежат семейству белка B7. PD-L1 известен как белок кластера дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 B7 (B7-H1), он представляет собой белок, который у человека кодируется геном CD274. PD-L1 представляет собой трансмембранный белок 1 типа размером 40 кДа, который, согласно предположениям, играет существенную роль в подавлении иммунной системы в ходе определенных событий, таких как беременность, аллотрансплантация тканей, аутоиммунное заболевание и другие болезненные состояния, такие как гепатит. Обычно иммунная система реагирует на чужеродные антигены, когда происходит некоторое накопление их в лимфатических узлах или селезенке, которое запускает пролиферацию антигенспецифических CD8+ T-клеток. Образование комплекса рецептор PD-1/PD-L1 или рецептор B7.1/лиганд PD-L1 передает ингибирующий сигнал, который снижает пролиферацию этих CD8+ T-клеток в лимфатических узлах, и в дополнение к этому PD-1 также способен контролировать накопление специфичных к чужеродному антигену T-клеток в лимфатических узлах посредством апоптоза, который, кроме того, опосредуется подавлением гена Bcl-2 (Chemnitz et al., (July 2004)., SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation, Journal of Immunology 173 (2): 945-54).
Под "ингибитором PD-1" подразумевают любой ингибитор или антагонист биологического эффекта PD-1, т.е. молекулу, которая блокирует взаимодействие между PD-1 и его лигандами, PD-L1 и PDL2.
Под "ингибитором PD-L1" подразумевают любой ингибитор или антагонист биологического эффекта PD-L1, т.е. молекулу, которая блокирует взаимодействие между PD-L1 и его рецептором или рецепторами, например PD-1 и/или B7.1 (CD80).
Ингибитор PD-1 и/или PD-L1 может представлять собой, например, низкомолекулярное соединение, пептид, белок, антитело, нуклеиновую кислоту-антагонист, такую как миРНК, мкРНК, антисмысловая РНК и т.п.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в комбинации для применения согласно изобретению, или в фармацевтической композиции согласно изобретению, или в продуктах или наборах согласно изобретению, ингибитор PD-1 и/или PD-L1 выбран из антитела или пептида.
+
Специалисту в данной области известно, как определить то, является ли соединение ингибитором PD-1 и/или PD-L1, посредством исследования его в подходящем анализе. Связывание ингибиторов с PD-1, и/или PD-L1, и/или PDL2 можно измерять, например, в способах анализа типа ELISA, которые хорошо известны в данной области. Биоанализы для измерения биологического эффекта ингибирования PD-1, и/или PD-L1, и/или PDL2 хорошо известны специалисту в данной области. Например, описан анализ, называемый "реакцией смешанных лимфоцитов (MLR)" (Poster LB-266, presented at the 2014 conference of the American Association of Cancer Research, AACR 2014). В этом анализе выделенные моноциты периферической крови донора-человека подвергают дифференцировке в дендритные клетки (DC), а затем смешивают с CD4 T-клетками, выделенными от второго донора. Через 48 часов измеряют уровни IL-2 в присутствии или в отсутствие возрастающих концентраций ингибитора PD-1 и/или PD-L1 и сравнивают с соответствующим контролем, таким как изотипический контроль, если ингибитор представляет собой антитело.
Примерами подходящих ингибиторов PD-L1, которые представляют собой пептиды, являются, например, пептиды, описанные в WO 2013/144704, в частности, пептид, называемый AUR-012, который описан в Proceedings: AACR Annual Meeting 2014; April 5-9, 2014; San Diego, CA, и который является антагонистом активности как PD-L1, так и PLD2.
Под "антителом против PD-1 и/или PD-L1" подразумевают антитело, способное блокировать каскад PD-1 и/или PD-L1, предпочтительно путем препятствования связыванию между PD-1 и PD-L1. Такие антитела известны специалисту в данной области. Примерами могут быть ниволумаб, торговое название Opdivo, также известный как ONO-4538, BMS-936558 или MDX1106 (Bristol-Myers Squibb). Ниволумаб представляет собой IgG4, и он ингибирует PD-1. Следующими примерами являются пембролизумаб, также известный как MK-3475 (Merck & Co.), пидилизумаб, также известный как CT-011 (CureTech), оба из которых также ингибируют PD-1. Примерами антител против PD-L1 являются, например, BMS936559, полностью гуманизированное IGG4-антитело, или MPDL3280A или MEDI4736, оба из которых являются IgG1-антителами человека. AMP-224 представляет собой слитый белок B7-DC-Fc, который может конкурентно блокировать рецептор PD-1. Слитые белки, такие как AMP-224, являются ингибиторами PD-1 и/или PD-L1, которые можно использовать в комбинации, фармацевтической композиции, продукте, наборе или способе лечения по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор PD-1 и/или PD-L1 представляет собой антитело против PD-1 (например, антитело человека, гуманизированное антитело или химерное антитело). В некоторых вариантах осуществления антитело против PD-1 выбрано из группы, состоящей из ниволумаба (MDX-1106), пембролизумаба (Merck 3475) и CT-011. В некоторых вариантах осуществления ингибитор PD-1 и/или PD-L1 представляет собой иммуноадгезин, например, такой как иммуноадгезин, содержащий внеклеточную или связывающую PD-1 часть PD-L1 или PDL2, слитую с константной областью, такой как Fc-область последовательности иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления ингибитор PD-1 и/или PD-L1 представляет собой AMP-224. В некоторых вариантах осуществления связывающий PD-L1 антагонист представляет собой антитело против PD-L1. В некоторых вариантах осуществления ингибитор PD-1 и/или PD-L1 выбран из группы, состоящей из YW243.55.S70, MPDL3280A (атезолизумаб) и MDX-1105. MDX-1105, также известный как BMS-936559, представляет собой антитело против PD-L1, описанное в WO2007/005874. Антитело YW243.55.S70 представляет собой антитело против PD-L1, описанное в WO 2010/077634. MDX-1106, также известный как MDX-1106-04, ONO-4538 или BMS-936558, представляет собой антитело против PD-1, описанное в WO2006/121168. Merck 3745, также известный как MK-3475 или SCH-900475, представляет собой антитело против PD-1, описанное в WO2009/114335. CT-011, также известный как hBAT или hBAT-1, представляет собой антитело против PD-1, описанное в WO2009/10161 1. AMP-224, также известный как B7-DCIg, представляет собой слитый растворимый рецептор PDL2-Fc, описанный в WO2010/027827 и WO2011/066342. Атезолизумаб (MPDL3280A) представляет собой предпочтительное антитело для применения в рамках настоящего изобретения, поскольку оно продемонстрировало обнадеживающие результаты при метастазирующем раке мочевого пузыря. В частности, компания Roche, производитель атезолизумаба, опубликовала в июле 2015 года, что:
- более половины (57%) людей с наиболее высокими уровнями экспрессии PD-L1 на этой фазе 1a испытания были живы через 1 год;
- полные ответы (CR) наблюдали у 20 процентов человек; и
- результаты показали, что экспрессия PD-L1 коррелировала с тем, насколько хорошо проходило предшествующее лечение атезолизумабом людей с метастсазирующим раком мочевого пузыря.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения в комбинации для применения согласно изобретению, или в фармацевтической композиции согласно изобретению, или в продуктах согласно изобретению, или в способах согласно изобретению предпочтительными антителами против PD-1 и/или PD-L1 являются пембролизумаб и ниволумаб. Другим предпочтительным антителом для применения в объеме настоящего изобретения является атезолизумаб.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация для применения согласно изобретению, или фармацевтическая композиция согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, или способы согласно изобретению включают тасквинимод или любые его фармацевтически приемлемые соли и пембролизумаб в качестве антитела против PD-1/PD-L1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация для применения согласно изобретению, или фармацевтическая композиция согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, или способы согласно изобретению включают тасквинимод или любые его фармацевтически приемлемые соли, и пидилизумаб в качестве антитела против PD-1/PD-L1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация для применения согласно изобретению, или фармацевтическая композиция согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, или способы согласно изобретению включают тасквинимод или любые его фармацевтически приемлемые соли, и ниволумаб в качестве антитела против PD-1/PD-L1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация для применения согласно изобретению, или фармацевтическая композиция согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, или способы согласно изобретению включают тасквинимод или любые его фармацевтически приемлемые соли, и атезолизумаб (MPDL3280A) в качестве антитела против PD-1/PD-L1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация для применения согласно изобретению, или фармацевтическая композиция согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, или способы согласно изобретению включают тасквинимод или любые его фармацевтически приемлемые соли, и BMS 936559 в качестве антитела против PD-1/PD-L1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинация для применения согласно изобретению, или фармацевтическая композиция согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, или способы согласно изобретению включают тасквинимод или любые его фармацевтически приемлемые соли, и AUR-012 в качестве ингибитора PD-1/PD-L1.
"Антитело" может представлять собой природное или обычное антитело, в котором две тяжелых цепи связаны друг с другом дисульфидными связями и каждая тяжелая цепь связана с легкой цепью дисульфидной связью. Существует два типа легкой цепи: лямбда (l) и каппа (k). Существует пять основных классов тяжелых цепей (или изотипов), которые определяют функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, которые имеют тяжелые цепи, обозначаемые как α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Классы γ и α далее подразделяют на подклассы, исходя из относительно меньших различий в последовательности и функции CH, например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Каждая цепь содержит домены с определенной последовательностью. Легкая цепь включает два домена или области: вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). Тяжелая цепь включает четыре домена: вариабельный домен (VH) и три константных домена (CH1, CH2 и CH3, в совокупности, обозначаемые как CH). Вариабельные области как легких (VL), так и тяжелых (VH), цепей определяют распознавание при связывании и специфичность к антигену. Домены константной области легких (CL) и тяжелых (CH) цепей сообщают важные биологические свойства, такие как связывание цепей антител, секреция, трансплацентарная проходимость, связывание комплемента и связывание с Fc-рецепторами (FcR). Fv-фрагмент представляет собой N-концевую часть Fab-фрагмента иммуноглобулина, и он состоит из вариабельных частей одной легкой цепи и одной тяжелой цепи. Специфичность антитела состоит в структурной комплементарности между антигенсвязывающим центром антитела и антигенной детерминантой. Антигенсвязывающие центры антител состоят из остатков, которые в основном происходят из гипервариабельных или определяющих комплементарность областей (CDR). Иногда, остатки из негипервариабельных или каркасных областей (FR) влияют на общую доменную структуру, и, таким образом, активный центр. Определяющие комплементарность области или CDR относятся к аминокислотным последовательностям, которые вместе определяют аффинность и специфичность связывания природной Fv-области нативного связывающего центра иммуноглобулина. Легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов имеют по три CDR, обозначаемых как CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L и CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, соответственно. Таким образом, антигенсвязывающий центр обычного антитела включает шесть CDR, содержащих набор CDR из V-области как тяжелой, так и легкой цепи.
"Каркасные области" (FR) относятся к аминокислотным последовательностям, расположенным между CDR, т.е. к тем частям вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, которые являются относительно консервативными среди различных иммуноглобулинов у одного вида. Легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов имеют по четыре FR, обозначаемых как FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, и FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, соответственно.
Как используют в рамках изобретения, "каркасная область человека" представляет собой каркасную область, которая по существу идентична (приблизительно на 85% или более, в частности, на 90%, 95%, 97%, 99% или 100%) каркасной области встречающегося в природе антитела человека.
Как используют в рамках изобретения, термин "антитело" обозначает обычные антитела и их фрагменты, а также однодоменные антитела и их фрагменты, в частности, вариабельную область тяжелой цепи однодоменных антител, и химерные, гуманизированные, биспецифические и мультиспецифические антитела.
Camelidae
Как используют в рамках изобретения, антитело или иммуноглобулин также включает "однодоменные антитела", которые были описаны относительно недавно и которые представляют собой антитела, определяющие комплементарность области которых являются частью однодоменного полипептида. Примеры однодоменных антител включают антитела из тяжелых цепей, антитела, естественным образом лишенные легких цепей, однодоменные антитела, происходящие из обычных антител с четырьмя цепями, сконструированные однодоменные антитела. Однодоменные антитела могут происходить из любого вида, включая, но не ограничиваясь ими, мышь, человека, верблюда, ламу, козу, кролика и быка. Однодоменные антитела могут представлять собой встречающиеся в природе однодоменные антитела, известные как антитела из тяжелых цепей, лишенные легких цепей. В частности, у видов , например верблюда, дромедара, ламы, альпаки и гуанако, продуцируются антитела из тяжелых цепей, естественным образом лишенные легких цепей. Антитела из тяжелых цепей животных семейства верблюжьих также лишены CH1-домена.
in vitro,
Вариабельная область тяжелой цепи этих однодоменных антител, лишенных легких цепей, известна в данной области как "VHH" или "наноантитела". Аналогично обычным VH-доменам, VHH содержит четыре FR и три CDR. Наноантитела имеют преимущества над общепринятыми антителами: они приблизительно в десять раз меньше, чем молекулы IgG, и, следовательно, надлежащим образом свернутые функциональные наноантитела можно получать посредством экспрессии  достигая высокого выхода. Более того, наноантитела являются в высокой степени стабильными и устойчивыми к действию протеаз. Свойства и продукция наноантител рассмотрены Harmsen и De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov; 77(1): 13-22).
Антитело по изобретению может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антитело. Указанное моноклональное антитело может быть гуманизированным. В другом примере антитело может представлять собой фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, диантител и VHH.
Термин "моноклональное антитело" или "mAb", как используют в рамках изобретения, относится к молекуле антитела с индивидуальным аминокислотным составом, которая направлена против специфического антигена, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Моноклональное антитело может продуцироваться единичным клоном B-клеток или гибридомы, а также может быть рекомбинантным, т.е. продуцированным посредством белковой инженерии.
Термин "химерное антитело" относится к сконструированному антителу, которое в его наиболее широком значении содержит одну или несколько областей из одного антитела и одну или несколько областей из одного или нескольких другого антитела(антител). В частности, химерное антитело содержит VH-домен и VL-домен антитела, происходящий из не являющегося человеком животного, связанный с CH-доменом и CL-доменом другого антитела, в частности, антитела человека. В качестве не являющегося человеком животного можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик и т.п. Химерное антитело также может обозначать мультиспецифическое антитело, обладающее специфичностью по меньшей мере к двум различным антигенам. В одном варианте осуществления химерное антитело имеет вариабельные домены мыши и константные домены человека.
Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, которое первоначально полностью или частично не является человеческим и которое модифицировано путем замены определенных аминокислот, в частности, в каркасных областях тяжелых и легких цепей, во избежание или для минимизации иммунного ответа у человека. Константные домены гуманизированного антитела в большинстве случаев представляют собой домены CH и CL человека. В одном варианте осуществления гуманизированное антитело имеет константные домены человека.
"Фрагменты" антител содержат часть интактного антитела, в частности, антигенсвязывающую область или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, диантитела, биспецифические или мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагмент антитела также может представлять собой однодоменное антитело, такое как антитело из тяжелых цепей или VHH.
Термин "Fab" обозначает фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу приблизительно 50000 Да и активность связывания антигена, в котором приблизительно половина N-концевой стороны H-цепи и целая L-цепь, среди фрагментов, получаемых путем обработки IgG протеазой папаином, связаны через дисульфидную связь.
Термин "F(ab')2" относится к фрагменту антитела, имеющему молекулярную массу приблизительно 100000 Да и активность связывания антигена, который имеет несколько больший размер, чем Fab и связан через дисульфидную связь в шарнирной области, среди фрагментов, получаемых обработкой IgG протеазой пепсином.
Термин "Fab'" относится к фрагменту антитела, имеющему молекулярную массу приблизительно 50000 Да и активность связывания антигена, который получен путем расщепления дисульфидной связи шарнирной области F(ab')2.
2
Одноцепочечный полипептид Fv ("scFv") представляет собой ковалентно связанный гетеродимер VH:VL, который обычно экспрессируется со слитого гена, включающего гены, кодирующие VH и VL, связанные кодирующим пептид линкером. Фрагмент scFv человека по изобретению включает CDR, которые удерживаются в соответствующей конформации, в частности, с использованием способов рекомбинации генов. Двухвалентные и поливалентные фрагменты антител могут образовываться либо самопроизвольно посредством ассоциации одновалентных scFv, либо их можно получать путем связывания одновалентных scFv пептидным линкером, как например, двухвалентный sc(Fv). "dsFv" представляет собой гетеродимер VH:VL, стабилизированный дисульфидной связью.
"(dsFv)2" обозначает два dsFv, связанных пептидным линкером.
Термин "биспецифическое антитело" или "BsAb" обозначает антитело, которое объединяет антигенсвязывающие центры двух антител в одной молекуле. Таким образом, BsAb способны связывать два различных антигена одновременно. Генную инженерию все чаще используют для конструирования, модификации и продуцирования антител или производных антител с желаемым набором связывающих свойств и эффекторных функций, как описано, например, в EP 2 050 764 A1.
Термин "мультиспецифическое антитело" означает антитело, которое объединяет антигенсвязывающие центры двух или более антител в одной молекуле.
Термин "диантитела" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими центрами, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL), в одной полипептидной цепи (VH-VL). С использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить образование пар между двумя доменами на одной цепи, домены вынуждают образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и формировать два антигенсвязывающих центра.
Как правило, антитела получают с использованием общепринятой методологии. Моноклональные антитела можно получать с использованием способа Kohler и Milstein (Nature, 256:495, 1975). Для получения моноклональных антител, пригодных в рамках настоящего изобретения, мышь или другое подходящее животное-хозяина иммунизируют с подходящими интервалами (например, два раза в неделю, раз в неделю, два раза в месяц или раз в месяц) соответствующими формами антигенов. Животному можно проводить конечную "вспомогательную иммунизацию" антигеном за одну неделю до умерщвления. Часто является желательным использование в ходе иммунизации иммунологического адъюванта. Подходящие иммунологические адъюванты включают полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, квасцы, адъювант Ribi, Hunter's Titermax, адъюванты на основе сапонина, такие как QS21 или Quil A, или CpG-содержащие иммуностимулирующие олигонуклеотиды. В данной области хорошо известны другие подходящие адъюванты. Животных можно иммунизировать подкожным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутривенным, интраназальным или другими путями. Данное животное можно иммунизировать множеством форм антигена различными путями.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые включают гуманизированные формы антител. Способы гуманизации включают, но не ограничиваются ими, способы гуманизации, описанные в патентах США № 4816567, 5225539, 5585089, 5693761, 5693762 и 5859205, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. В описанных выше патентах США № 5585089 и 5693761, и WO 90/07861 также предлагается четыре возможных критерия, которые можно использовать при конструировании гуманизированных антител. Первым предложением было предложение для акцептора, состоящее в том, чтобы использовать каркасную область из конкретного иммуноглобулина человека, который является необычно гомологичным донорному иммуноглобулину, подлежащему гуманизации, или использовать консенсусную каркасную область из многих антител человека. Второе предложение состояло в том, что, если аминокислота в каркасной области иммуноглобулина человека является необычной и донорная аминокислота в этом положении является типичной для последовательностей человека, тогда можно выбирать аминокислоту донора, а не акцептора. Третье предложение состояло в том, что в положениях, непосредственно соседних с 3 CDR в гуманизированной цепи иммуноглобулина, можно выбирать донорную аминокислоту, а не акцепторную аминокислоту. Четвертым предложением было использовать донорный аминокислотный остаток в положениях каркасной области, в которых аминокислота, согласно прогнозам, имеет атом боковой цепи в пределах 3A от CDR в трехмерной модели антитела и, согласно прогнозам, способна взаимодействовать с CDR. Описанные выше способы являются только иллюстративными для некоторых из способов, которые специалист в данной области может использовать для получения гуманизированных антител. Специалисту в данной области будут известны другие способы гуманизации антител.
J
Mol. Biol.
В одном варианте осуществления гуманизированных форм антител, некоторые, большинство или все из аминокислот вне областей CDR заменяют аминокислотами из молекул иммуноглобулинов человека, но где некоторые, большинство или все аминокислоты в одной или нескольких областях CDR являются неизмененными. Допустимы небольшие вставки, делеции, инсерции, замены или модификации аминокислот при условии, что они не нарушат способность антитела связывать данный антиген. Подходящие молекулы иммуноглобулина человека включают молекулы IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgM. "Гуманизированное" антитело сохраняет антигенную специфичность, сходную с исходным антителом. Однако с использованием определенных способов гуманизации можно повышать аффинность и/или специфичность антитела, таких как способы "направленного изменения", как описано Wu et al., . 294:151, 1999, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Полностью человеческие моноклональные антитела также можно получать путем иммунизации мышей, трансгенных по большим фрагментам локусов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека. См., например, патенты США № 5591669, 5598369, 5545806, 5545807, 6150584 и ссылки в них, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Этих животных генетически модифицировали так, что происходила функциональная делеция продукции эндогенных антител (например, мыши). Животных далее модифицировали так, чтобы они содержали весь или часть локуса гена иммуноглобулина эмбрионального типа человека, так что иммунизация этих животных приводила к продукции полностью человеческих антител к представляющему интерес антигену. После иммунизации этих мышей (например, XenoMouse (Abgenix), мыши HuMAb (Medarex/GenPharm)), можно получать моноклональные антитела с использованием стандартной технологии гибридом. Эти моноклональные антитела будут иметь аминокислотные последовательности иммуноглобулинов человека и, таким образом, они не будут вызывать ответы антител человека против антител мыши (KAMA) при введении человеку.
in vitro
in vitro
Также существуют способы  для получения антител человека. Они включают технологию фагового дисплея (патенты США № 5565332 и 5573905) и стимуляцию B-клеток человека  (патенты США № 5229275 и 5567610). Содержание этих патентов включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном варианте осуществления антитело по изобретению модифицировано для снижения или ингибирования способности антитела опосредовать функциональность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) (т.е. антитело со сниженной эффекторной функцией Fc). В частности, антитела по настоящему изобретению не имеют участка Fc или имеют участок Fc, который не связывает FcyRI и C1q. В одном варианте осуществления участок Fc антитела не связывает FcyRI, C1q или FcyRIII. Антитела с такой функциональностью обычно известны. Существуют нативные такие антитела, такие как антитела с Fc-областью IgG4. Также существуют антитела с участками Fc, генетически или химически измененными для устранения функциональности антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC).
Термины "лечить", "проведение лечения", "подвергнутый лечению" или "лечение", как используют в рамках изобретения, относятся к терапевтическому лечению, где задачей является устранение или уменьшение симптомов. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, устранение симптомов, смягчение симптомов, уменьшение степени состояния, стабилизированное (т.е. без ухудшения) состояние, отсрочивание или замедление прогрессирования состояния.
Как используют в рамках изобретения и если не определено иначе, "злокачественная опухоль" относится к росту, делению или пролиферации аномальных клеток в организме. Злокачественные опухоли, которые можно лечить комбинациями, фармацевтическими композициями, продуктами и способами, описанными в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, рак мочевого пузыря, меланому, рак легкого, такой как NSCLC (немелкоклеточный рак легкого), рак ободочной и прямой кишки, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, почечноклеточный рак, гематологические злокачественные опухоли, в частности, развернутые гематологические злокачественные опухоли, рак яичника, в частности, устойчивый к платине рак яичника, нейроэндокринные опухоли (NET) и нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта или поджелудочной железы (GEP-NET). В частности, и как упоминалось ранее, одна из злокачественных опухолей, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой рак мочевого пузыря, например, не проникающий в мышечный слой рак мочевого пузыря, проникающий в мышечный слой рак мочевого пузыря и метастазирующий уротелиальный рак мочевого пузыря.
Изобретение относится к лечению любой из категорий и/или стадий рака мочевого пузыря, как подробно описано выше, в частности, стадии I или более развернутого, или стадии II или более развернутого, или стадии III.
Как показано в примере 2 ниже, данные из экспериментальной модели опухоли указывают на то, что лечение злокачественной опухоли тасквинимодом может увеличивать уровни PD-L1 на миелоидных клетках, что может ослаблять противоопухолевый эффект тасквинимода. Таким образом, добавление ингибитора PD-1/PD-L1 к тасквинимоду может усиливать противоопухолевую активность тасквинимода.
С учетом этих данных, также изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего злокачественной опухолью, при которой злокачественные клетки экспрессируют поддающийся обнаружению или увеличенный уровень PD-1, и/или PD-L1, и/или PDL2 путем введения терапевтически эффективного количества комбинации тасквинимода и ингибитора PD-1 и/или PLD1 пациенту, нуждающемуся в этом.
В одном варианте осуществления пациента сначала лечат тасквинимодом в течение первого периода времени, а затем лечат комбинацией в соответствии с настоящим изобретением в течение второго периода времени. Первый период времени может представлять собой, например, период, в ходе которого злокачественные клетки от пациента не экспрессируют поддающиеся обнаружению уровни PD-1, и/или PD-L1, и/или PDL2. Второй период может представлять собой, например, период, в ходе которого злокачественные клетки от пациента экспрессируют поддающиеся обнаружению уровни PD-1, и/или PD-L1, и/или PDL2.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к комбинации для применения согласно изобретению, или к фармацевтической композиции согласно изобретению, или к продуктам (в том числе к наборам) согласно изобретению для применения для лечения злокачественной опухоли, при которой злокачественные клетки экспрессируют поддающийся обнаружению или увеличенный уровень PD-1, и/или PD-L1, и/или PDL2. Например, комбинацию по изобретению можно использовать для лечения рака мочевого пузыря, при котором злокачественные клетки экспрессируют поддающиеся обнаружению уровни PD-L1.
Кроме того, изобретение относится к способу идентификации пациента, страдающего злокачественной опухолью, например, раком мочевого пузыря, для которого наиболее вероятно будет полезным лечение комбинацией, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, причем указанный способ включает:
i) определение в образце, полученном от пациента, уровня экспрессии PD-1, или PD-L1, или PDL2 злокачественными клетками;
где поддающийся обнаружению или увеличенный уровень PD-1, или PD-L1, или PDL2 в образце, полученном от пациента, по сравнению с эталонной величиной указывает на то, что для пациента наиболее вероятно будет полезным лечение указанной комбинацией.
Уровень экспрессии PD-1, или PD-L1, или PDL2 можно определять, например, любым способом, известным специалисту в данной области, например, посредством анализа экспрессии РНК способом ПЦР, например, таким как количественная ПЦР в реальном времени, или посредством иммуноанализа, например, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), или посредством проточно-цитометрических способов анализа (FACS), например, способом, таким ак масс-спектрометрия (MS), масс-спектрометрия с капиллярным электрофорезом (CE-MS), жидкостная хроматография, сопряженная с масс-спектрометрии (LC-MS, LC-MS/MS).
Термин "иммуноанализ", как используют в соответствии с настоящим изобретением, включает конкурентную прямую реакцию или анализ сэндвич-типа. Такой анализ включает, но не ограничивается ими, тест агглютинации, иммуноанализы с мечением ферментом или опосредуемые ферментом иммуноанализы, такие как ELISA, анализ типа биотин/авидин, радиоиммунный анализ, иммуноэлектрофорез и иммунопреципитация, и они в большей степени родственны ELISA.
Все из масс-спектрометрии (MS), масс-спектрометрии с капиллярным электрофорезом (CE-MS), жидкостной хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией (LC-MS/MS), являются способами анализа, хорошо известными специалисту в данной области.
Способы, цитированные выше, описаны в качестве подходящих способов для измерения уровня PD-1, или PD-L1, или PDL2, однако объем изобретения не ограничивается этими примерами. Для обнаружения уровня экспрессии PD-1, или PD-L1, или PDL2, можно использовать любой другой способ, известный специалисту в данной области.
Как используют в рамках изобретения, термин "образец" означает материал биологического происхождения. Примеры биологических образцов включают, но не ограничиваются ими, кровь, плазму, сыворотку, биоптат или слюну. Биологический образец согласно изобретению можно получать от индивидуума любыми подходящими способами взятия образцов, известными специалисту в данной области.
Для определения уровня экспрессии PD-1, или PD-L1, или PDL2 в злокачественных клетках образец предпочтительно представляет собой биоптат опухоли, например, опухоли мочевого пузыря.
Предпочтительно эталонную величину измеряют в образце ткани того же происхождения, что и образец пациента на стадии i) вышеупомянутого способа.
Предпочтительно "эталонная величина" соответствует нормальному уровню PD-1, или PD-L1, или PDL2.
Как подразумевается в настоящем описании, "нормальный уровень" PD-1, или PD-L1, или PDL2 означает, что уровень PD-L1 в образце находится в пределах нормальных пороговых величин для PD-1, или PD-L1, или PDL2. Норма зависит от типа образца и от способа, используемого для измерения уровня PD-1, или PD-L1, или PDL2 в образце. В частности, эталонная величина PD-1, или PD-L1, или PDL2, таким образом, может соответствовать отсутствию или исходному уровню экспрессии PD-1, или PD-L1, или PDL2 в нормальных клетках.
Поддающийся обнаружению уровень экспрессии считается статистически значимым, если уровень экспрессии PD-1, или PD-L1, или PDL2 в биологическом образце пациента увеличился от не поддающихся обнаружению до поддающихся обнаружению уровней PD-1, или PD-L1, или PDL2. Увеличенный уровень экспрессии считается статистически значимым, если уровень экспрессии PD-1, или PD-L1, или PDL2 в биологическом образце пациента увеличен по меньшей мере приблизительно на 10, или 15, или 20, или 25, или 30, или 35, или 40, или 45, или 50% по сравнению с эталонной величиной уровня экспрессии.
В этом контексте, способ идентификации пациента, страдающего злокачественной опухолью, например, раком мочевого пузыря, для которого наиболее вероятно будет полезным лечение комбинацией, содержащей тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, можно проводить с использованием набора. Набор может содержать, например, средство для обнаружения PD-1 и/или PD-L1 в образце пациента. Ингибитор PD-1 и/или PD-L1 предпочтительно представляет собой антитело. Образец пациента выбран из любого подходящего образца опухоли, которую намереваются лечить, например, крови, мочи или биоптата, например, стенки мочевого пузыря. Кроме того, набор может содержать тасквинимод и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, который можно использовать для лечения пациента.
Как используют в рамках изобретения, термин "пациент" относится к теплокровному животному, такому как млекопитающее, в частности, человек, мужчина или женщина, который страдает или имеет вероятность возникновения одного или нескольких заболеваний и состояний, описанных в настоящем описании.
Как используют в рамках изобретения, "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое является эффективным для снижения, устранения, лечения или контроля симптомов описанных в настоящем описании заболеваний и состояний. "Эффективное количество" представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию, требуемую для достижения поддающегося количественному определению улучшения или предупреждения конкретного нарушения. Эффективное количество в рамках настоящего изобретения варьируется в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела пациента и способность антитела индуцировать желаемый ответ у индивидуума. Эффективное количество также представляет собой количество, в котором любые токсические или вредоносные эффекты лечения перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают такие результаты, как устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или замедление возникновения заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие в ходе развития заболевания. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как снижение одного или нескольких симптомов заболевания, повышение качества жизни индивидуумов, страдающих заболеванием, снижение дозы других лекарственных средств, требуемой для лечение заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства, например, посредством нацеливания на заболевания, замедление прогрессирования заболевания и/или продление выживания. В случае злокачественного заболевания или опухоли, эффективное количество лекарственного средства может иметь эффект снижения количества злокачественных клеток; уменьшения размера опухоли; ингибирования (т.е. замедления до некоторой степени или желательно остановки) инфильтрации злокачественных клеток в периферические органы; ингибирования (т.е. замедления до некоторой степени и желательно остановки) метастазирования опухоли; ингибирования до некоторой степени роста опухоли и/или смягчения до некоторой степени одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением. Эффективное количество можно вводить посредством одного или нескольких введений. Для целей настоящего изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции или их комбинации представляет собой количество, достаточное для проведения профилактического или терапевтического лечения либо прямо, либо непрямо. "Эффективное количество" в контексте введения более чем одного лекарственного средства также относится к количеству одного средства, если, совместно с одним или несколькими другими средствами, может быть достигнут или достигается желаемый результат.
Термин "контроль" относится ко всем процессам, в которых может происходить замедление, отсрочивание, прерывание, приостановка или остановка прогрессирования заболеваний и состояний, описанных в настоящем описании, однако, он не обязательно указывает на полное устранение всех симптомов заболевания и состояния, и он включает профилактическое лечение и длительное применение.
Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемый эксципиент" относится к молекулярным структурам и композициям, которые не вызывают неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении млекопитающему, особенно человеку, соответствующим образом. Фармацевтически приемлемый эксципиент относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или добавке в состав любого типа.
В одном варианте осуществления комбинацию для применения согласно изобретению, или фармацевтическую композицию согласно изобретению, или продукты согласно изобретению используют для лечения рака мочевого пузыря у пациентов, которым химиотерапия еще клинически не показана.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к комбинации для применения согласно изобретению, или к фармацевтической композиции согласно изобретению, или к продуктам согласно изобретению, для применения для лечения злокачественной опухоли, в частности, рака мочевого пузыря, в качестве терапии 1-й линии.
Таким образом, оно относится к способу лечения согласно изобретению, где комбинация, содержащая тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор PD-1 и/или PD-L1, в частности, антитело, представляет собой терапию 1-й линии.
Под "лечением 1-й линии" или "терапией 1-й линии" в контексте изобретения подразумевают первое лечение, назначаемое для лечения злокачественной опухоли, в частности, рака мочевого пузыря. Оно может быть частью стандартного набора способов лечения, таких как хирургическая операция и лучевая терапия. Его можно использовать отдельно. Его также можно называть индуцирующей терапией или первичной терапией.
В другом варианте осуществления комбинацию для применения согласно изобретению, или фармацевтическую композицию согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, используют для лечения злокачественной опухоли, в частности, рака мочевого пузыря, у пациентов, у которых другие способы терапии показаны в качестве предшествующих способов лечения. Такие способы терапии включают хирургическую операцию, химиотерапию, такую как химиотерапия митомицин C, химиотерапия на основе цисплатина, гемцитабин плюс цисплатин или метотрексат, винфлунин, винбластин или доксорубицин, или лучевую терапию.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к комбинации для применения согласно изобретению, или к фармацевтической композиции согласно изобретению, или к продуктам согласно изобретению для применения для лечения злокачественной опухоли, в частности, рака мочевого пузыря, в качестве терапии 2-й, 3-й или 4-й линии.
Также оно относится к способу лечения согласно изобретению, где комбинация, содержащая тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль, и антитело против PD-1 и/или PD-L1 представляет собой лечение 2-й, 3-й или 4-й линии.
Под "лечением 2-й линии" или "терапией 2-й линии" подразумевают лечение, которое назначают, когда первоначальное лечение, такое как химиотерапевтическое лечение (лечение 1-й линии) не действует или прекращает действовать.
Под "лечением 3-й линии" или "терапией 3-й линии" подразумевают лечение, которое назначают, когда как первоначальное лечение, такое как химиотерапевтическое лечение (лечение 1-й линии), так и последующее лечение (лечение 2-й линии) не действует или прекращает действовать.
Под "лечением 4-й линии" или "терапией 4-й линии" подразумевают лечение, которое назначают, когда как первоначальное лечение, такое как химиотерапевтическое лечение (лечение 1-й линии), так и последующее лечение (лечение 2-й и 3-й линии) не действует или прекращает действовать.
В одном варианте осуществления комбинация для применения согласно изобретению состоит из тасквинимода или его фармацевтически приемлемой соли и антитела против PD-1/PD-L1PD-1 и/или PD-L1, в частности, пембролизумаба (Keytruda, MK-3475, Merck) или ниволумаба (Opdivo, Bristol-Myers Squibb) или атезолизумаба (MPDL3280A).
Соединения комбинаций, фармацевтических композиций и продуктов по изобретению можно получать различными способами синтеза. Реагенты и исходные материалы являются коммерчески доступными или без труда синтезируются способами, хорошо известными специалисту в данной области.
Идентификация индивидуумов, которые нуждаются в лечении описанных в настоящем описании заболеваний и состояний, входит в пределы способности и знаний специалиста в данной области. Специалист в области клинической медицины может без труда идентифицировать с использованием клинических тестов, физикального обследования и медицинского/семейного анамнеза, индивидуумов, которые нуждаются в таком лечении.
Терапевтически эффективное количество может без труда определить лечащий врач или специалист по диагностике, являющийся специалистом в данной области, с использованием общепринятых способов и путем наблюдения результатов, полученных в аналогичных обстоятельствах. При определении терапевтически эффективного количества лечащим врачом или специалистом по диагностике учитывается ряд факторов, включая, но не ограничиваясь ими: вид индивидуума; его размер, возраст и общее состояние здоровья; конкретное вовлеченное заболевание; степень вовлечения или тяжесть заболевания; ответ отдельного индивидуума; конкретное вводимое соединение; способ введения; биодоступность, характерная для вводимого препарата; выбранный режим дозирования; использование сопутствующего лечения и другие значимые обстоятельства.
Количество каждого соединения в комбинациях, фармацевтических композициях и продуктах по изобретению, которое требуется для достижения желаемого биологического эффекта, варьируется в зависимости от ряда факторов, включая дозировку вводимого лекарственного средства, химические характеристики (например, гидрофобность) используемых соединений, эффективность соединений, тип заболевания, болезненное состояние пациента и путь введения.
В частности, комбинации для применения согласно изобретению, или фармацевтические композиции согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, содержат дозу, известную в качестве активной для ингибитора PD-1 и/или PD-L1 при подвергаемом лечению заболевании, в частности, при злокачественной опухоли.
В частности, комбинации для применения согласно изобретению, или фармацевтические композиции согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, содержат от 0,001 до 50, более конкретно от 0,01 до 20, и в предпочтительном варианте осуществления от 0,1 до 5 мг/сутки тасквинимода или его фармацевтически приемлемой соли. В одном варианте осуществления тасквинимод используют в количестве, равном или приблизительно равном 0,25 мг, или в количестве, равном или приблизительно равном 0,5 мг, или в количестве, равном или приблизительно равном 1,0 мг, предпочтительно каждые сутки и предпочтительно перорально, в рамках настоящего изобретения.
Более конкретно, комбинации для применения согласно изобретению, или фармацевтические композиции согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, содержат от 0,1 до 1 или 5 мг/сутки тасквинимода или его фармацевтически приемлемой соли и дозу, соответствующую активной дозе ингибитора PD-1 и/или PD-L1 при подвергаемом лечению заболевании и, в частности, злокачественной опухоли.
Соединения комбинаций согласно изобретению можно вводить по отдельности, последовательно или одновременно. При одновременном введении, соединения комбинаций по изобретению можно составлять, например, в качестве одной фармацевтической композиции. Альтернативно, каждое соединение можно составлять и вводить независимо.
Таким образом, изобретение, кроме того, относится к комбинации для применения, как определено выше, где тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор PD-1 и/или PD-L1 вводят по отдельности, последовательно или одновременно.
При последовательном введении порядок введения является нестрогим. Например, ингибитор PD-1 и/или PD-L1 можно вводить до введения тасквинимода или его фармацевтически приемлемой соли. Альтернативно введение тасквинимода или его фармацевтически приемлемой соли может предшествовать введению ингибитора PD-1 и/или PD-L1.
В одном варианте осуществления комбинация по изобретению содержит приблизительно 0,5 мг тасквинимода и приблизительно 5 мг/кг ингибитора PD-1 и/или PD-L1, например, такого как ниволумаб, имилимумаб или атезолизумаб.
В одном варианте осуществления комбинация по изобретению содержит приблизительно 0,25 мг тасквинимода и приблизительно 3 мг/кг ингибитора PD-1 и/или PD-L1, например, такого как ниволумаб, ипилимумаб и атезолизумаб.
В другом варианте осуществления комбинация по изобретению содержит приблизительно 0,1 мг тасквинимода и приблизительно 1 мг/кг ингибитора PD-1 и/или PD-L1, такого как ниволумаб, ипилимумаб или атезолизумаб.
При введении по отдельности, их можно вводить одним и тем же или различными путями введения. Примеры путей введения включают перентеральное, например, подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, а также пероральное введение. В одном варианте осуществления изобретения ингибитор PD-1 и/или PD-L1 вводят парентерально и тасквинимод вводят перорально.
В другом варианте осуществления комбинации для применения согласно изобретению, или фармацевтические композиции согласно изобретению, или продукты согласно изобретению, предназначены для перорального введения.
The Science and Practice of Pharmacy
th
Независимо от того, вводят ли комбинации, фармацевтические композиции и продукты, как определено выше, по отдельности, последовательно или одновременно, композиции, комбинации и продукты могут иметь различные формы. Их можно получать любым из способов, хорошо известных в фармацевтической области, например, как описано в Remington: , 20 ed.; Gennaro, A. R., Ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. В качестве части композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связующие вещества и/или адъювантные материалы. Пероральные композиции, как правило, включают инертный разбавитель, носитель или пищевой носитель. Их можно вводить в единичных дозированных формах, где термин "единичная доза" означает однократную дозу, которую можно вводить пациенту, и которую можно без труда перерабатывать и упаковывать, и она остается как физически, так и химически стабильной единичной дозой, содержащей активное соединение либо непосредственно, либо в качестве фармацевтически приемлемой композиции, как описано в настоящем описании.
Соединения, описанные в настоящем описании, можно составлять в фармацевтические композиции путем смешения с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Такие композиции можно получать для применения путем перорального введения, в частности, в форме таблеток или капсул, в частности, в качестве распадающихся в полости рта (lyoc) таблеток; или путем парентерального введения, в частности, в форме жидких растворов, суспензий или эмульсий.
В частности, антитело против PD-1 и/или PD-L1 составляют в форме для инъекций. В частности, антитело против PD-1 и/или PD-L1 вводят раз в две или три недели. Например, пембролизумаб составляют в виде лиофилизированного порошка для инъекций и вводят в дозе 2 мг/кг каждые три недели. Ниволумаб составляют в жидкой форме для инъекций и вводят в дозе 3 мг/кг каждые две недели.
В частности, тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль составляют в форме таблетки или твердых желатиновых капсул, более конкретно, содержащих от 0,1 до 10 мг, еще более конкретно от 0,2 до 1,5 мг тасквинимода или его фармацевтически приемлемой соли, например, в таблетке с 0,25, 0,5 или 1 мг указанного соединения. В частности, тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль вводят два раза в сутки.
Таблетки, пилюли, порошки, капсулы, лепешки и т.п. могут содержать один или несколько из следующих любых ингредиентов или соединений сходной природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза или трагакантовая камедь; разбавитель, такой как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как крахмал и производные целлюлозы; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; вещество, способствующее скольжению, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или вкусовая добавка, такая как мята перечная или метилсалицилат. Капсулы могут иметь форму твердой капсулы или мягкой капсулы, которые обычно состоят из желатиновых смесей, необязательно с пластификаторами, а также крахмальной капсулы. Кроме того, единичные дозированные формы могут содержать различные другие материалы, которые модифицируют физическую форму дозированной единицы, например, покрытия из сахара, шеллака или кишечно-растворимых веществ. Другие пероральные дозированные формы, сироп или эликсир, могут содержать подсластители, консерванты, пигменты, красители и вкусовые добавки. Кроме того, активные соединения могут быть включены в быстрорастворимые препараты и составы, препараты и составы с модифицированным высвобождением или препараты и составы с замедленным высвобождением, и где такие составы с замедленным высвобождением предпочтительно являются бимодальными.
Например, тасквинимод или его фармацевтически приемлемую соль можно составлять в форме таблетки или твердых желатиновых капсул.
Например, ингибитор PD-1 и/или PD-L1 можно составлять в форме жидкости или лиофилизированного порошка, восстанавливаемого и/или разбавляемого для введения путем инъекции.
Жидкие препараты для введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Жидкие композиции также могут включать связующие вещества, буферы, консерванты, хелатирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и красители, и т.п. Неводные растворители включают спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, акрилатные сополимеры, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают смеси спиртов и воды, гидрогели, забуференные среды и физиологический раствор. В частности, биосовместимый биодеградируемый полимер лактида, сополимер лактид/гликолид или сополимеры полиоксиэтилен-полиоксипропилен могут быть пригодными эксципиентами для контроля высвобождения активных соединений. Внутривенные носители могут включать жидкости и средства для восполнения питательных веществ, средства для восполнения электролитов, такие как средства на основе декстрозы Рингера и т.п.
Комбинация для применения, фармацевтическая композиция, продукт, набор или способ лечения по настоящему изобретению, кроме того, могут быть комбинированы с дополнительным подходящим способом лечения злокачественной опухоли, например, рака мочевого пузыря, такого как развернутый рак мочевого пузыря, например, таким как химиотерапия или цистэктомия.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими чертежами и примерами.
Краткое описание чертежей
Фигура 1:
Комбинация тасквинимода и антитела против PD-1/PD-L1 синергично усиливает противоопухолевый эффект по сравнению с монотерапией.
Фигура 2
: Определение профиля экспрессии генов в опухолях MBT-2, полученных от мышей, которым вводили 30 мг/кг п/о тасквинимода два раза в сутки, начиная с 10 суток после инокуляции опухоли. Введение тасквинимода проводили в течение 10 суток. Данные представлены в качестве кратности изменения для опухолей, которые подвергали лечению, по сравнению с контрольными опухолями.
Фигура 3:
Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) PD-L1 в CD11b+ клетках, полученных от мышей, имеющих опухоли, которые лечили тасквинимодом. Мышам вводили 30 мг/кг п/о тасквинимода два раза в сутки, начиная с 10 суток после инокуляции опухоли. Лечение тасквинимодом проводили в течение 7 суток. Этот анализ проводили посредством цитометрии.
Фигура 4
: лечение тасквинимодом не имело эффекта на рост развернутой опухоли MBT-2 и индуцировало изменение профиля оси PD-1/PD-L1. (A) Кривые роста и (B) масса опухоли для опухолей MBT-2, которые лечили тасквинимодом в дозе 30 мг/кг (пероральный зонд, два раза сутки) после рандомизации на 11 сутки после инокуляции опухолевых клеток (n=12). Мышей умерщвляли. Опухоли извлекали, расщепляли, а затем подвергали поверхностному окрашиванию. (C) Экспрессия PD-L1 на миелоидных клетках, обработанных носителем (контролем), или тасквинимодом, 30 мг/кг на 15 сутки. (D) Количественные данные о средней интенсивности флуоресценции PD-L1, гейтированного на инфильтрирующих миелоидных клетках CD11b+ (*, P<0,05; критерий Манна-Уитни, n=5 мышей на группу).
Фигура 5
6
: 10 клеток MBT-2 инъецировали подкожно мышам C3H/HeNRj. Животным вводили антитело против PD-L1 или его изотипическое антитело (IgG2B) в дозе 200 мкг посредством внутрибрюшинной инъекции. Введение начинали (A) на 1 сутки (критерий Стьюдента; левая панель: *, P=0,0223), или (B) на 11 сутки после инокуляции опухолевых клеток. Соответствующее среднее значение±SEM для массы опухоли представлено на правых панелях: (A) 1 сутки: антитело против PD-L1-448±258,3 мг против IgG2B - 1535±289,9 мг (критерий Стьюдента; правая панель: *, P=0,0188); (B) 11 сутки: антитело против PD-L1-806±400,2 мг против IgG2B - 1180±367,4 мг.
Фигура 6
3
: Комбинация тасквинимода с терапией антителом против PD-L1 синергично снижает рост опухоли. (A) Схема исследования: подкожным опухолям MBT-2 позволяли расти до достижения среднего размера от 50 до 100 мм (8 сутки). Мышам (n=16) вводили IgG2B (контроль), антитело против PD-L1, тасквинимод или комбинацию тасквинимод+антитело против PD-L1. (B) Кривые роста опухоли соответствуют серийным измерениям толщиномером. Планки погрешностей указывают на среднее значение±SEM (односторонний ANOVA; **, P<0,005, ***, P<0,001). Массы опухолей в конечный момент времени (15 сутки) представлены в (C) (критерий Крускала-Уоллиса; *, P<0,05, **, P<0,005, ***, P<0,001). Эксперименты повторяли по меньшей мере четыре раза. Показаны результаты репрезентативного эксперимента.
Фигура 7
: Комбинация тасквинимода с антителом против PD-L1 повышает активность цитотоксических T-клеток. (A) Количественные данные о проценте инфильтрирующих опухоль CD8+ клеток на 15 сутки после введения (n=6). (B) Левая панель: репрезентативные изображения, демонстрирующие иммунное окрашивание на гранзим B (коричневый цвет) в опухолях из контрольных групп и групп, в которых проводили введение. Первоначальное увеличение: X200, вставка: изображение опухоли. Масштабная метка: 50 мкм. Правая панель: количественное определение положительных по гранзиму B клеток на срезах опухоли, выраженное в качестве процента от всех клеток, с использованием антитела против гранзима B (критерий Крускала-Уоллиса; *, P=0,0326). (C) Уровни концентраций (пг/мл) следующих цитокинов: IL-1β, IL-7, IL-12(p70) и IL-15 в лизате опухоли из каждой группы количественно определяли с использованием технологии Luminex (n=5). (D) Спленоциты (n=5) из каждой группы стимулировали PMA/иономицином в присутствии брефелдина A. Продукцию IL-2, TNF-α и IFN-γ изучали посредством внутриклеточного окрашивания. Репрезентативные данные (средние значения±SEM) продемонстрировали процент различных цитокинов вклетках, гейтированных по CD8+, проанализированных посредством проточной цитометрии. Звездочки обозначают статистическую значимость с использованием одностороннего ANOVA (*, P<0,05; **, P<0,005). (E) Планки соответствуют концентрациям IFN-γ в сыворотке 10 мышей из каждой группы введения. Значения P вычисляли на основе критерия Крускала-Уоллиса между различными группами (*, P<0,05; **, P<0,005).
Фигура 8
: Комбинация модулятора инфильтрирующих миелоидных клеток и ингибитора оси PD-1/PD-L1 усиливает пролиферацию T-клеток и продукцию T-клетками IFN-γ. Миелоидные клетки CD11b+ выделяли из опухолей с использованием BD FACSAria II (BD Biosciences). T-клетки выделяли из селезенки наивных мышей с использованием набора для выделения общих T-клеток мыши (Miltenyei). Меченные CFSE T-клетки стимулировали гранулами CD3/CD28 в соотношении 1:1 (Life Technologies). Стимулированные T-клетки культивировали с CD11b+ (в соотношении CD11b:T-клетки 1:1) и инкубировали в течение 72 часов при 37°C. (A) Репрезентативные гистограммы, полученные посредством FACS-анализа, демонстрирующие интенсивность флуоресценции CFSE-T-клеток, гейтированных по CD8+. (B) Показан процент пролиферирующих CD8+ клеток из различных групп введения. (C) Секрецию IFN-γ в супернатанте сокультуры измеряют через 72 часа после инкубации при 37°C с использованием технологии Luminex. Эксперименты повторяли два раза (критерий Крускала-Уоллиса, *, P<0,05).
Фигура 9
: Опухолевые клетки MBT-2 инъецировали ортотопически самкам мышей C3H/HeJ. В кратком изложении, после периода лишения воды, составляющего 4 часа, мышей подвергали анестезии с использованием смеси кетамина и ксилазина. Катетер (ref: 381212 24G, BD Insyte) устанавливали в мочевой пузырь через уретру и 30 мкл 1 Н HCl инъецировали в течение 15 секунд, затем ее заменяли 30 мкл 0,1 Н NaOH в течение 15 секунд. Опухолевые клетки MBT-2 (2×106) вливали в мочевой пузырь в течение 45 минут. Лечение начинали на 3 сутки. Тасквинимод вводили в дозе 30 мг/кг посредством перорального зонда два раза в сутки в течение 21 последовательных суток. Антитело против PD1 (клон: RMP1-14) или его изотипический контроль (клон 2A3) инъецировали внутрибрюшинным путем в дозе 10 мг/кг два раза в неделю в течение двух последовательных недель (на D4, D7, D11 и D14). Выживание мышей, имеющих опухоль MBT-2, которым вводили антитело против PD1, тасквинимод, комбинацию или контрольный IgG, представлена на фиг.9 (n=13). Для сравнения общей выживаемости между группами использовали критерий Даннетта-Сюй.
Пример 1: Синергический эффект комбинации тасквинимода и антитела против PD-1/PD-L1 на уменьшение объема опухоли в модели злокачественной опухоли у мышей
Первоначальное исследование для оценки эффекта комбинации тасквинимода и антитела против PD-1/PD-L1 проводили следующим образом.
Методики эксперимента
Мыши и клеточная линия
Urol.Clin.North Am.
Самцов мышей C3H/HeN в возрасте от шести до семи недель приобретали от JANVIER Labs. MBT-2, клеточная линия рака мочевого пузыря мыши (M. S. Soloway., Intravesical and systemic chemotherapy in the management of superficial bladder cancer, 11 (4):623-635, 1984), была предоставлена JCRB Cell Bank, ее культивировали в минимальной поддерживающей среде Игла (Life Technologies), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой.
Рост опухоли и лечение
6
3
1×10клеток инъецировали подкожно в бок мышей, и им позволяли расти до тех пор, пока опухоли не достигали объема от 40 до 130 мм (приблизительно на 10-11 после инокуляции опухолевых клеток). Затем животных с опухолями случайным образом распределяли на 4 различных группы, как указано в таблице 1.
Таблица 1
: группа животных, включенных в исследование.
Группа
Количество животных
Лечение
1
10-12
Носитель+IgG2B (контроль)
2
10-11
Тасквинимод+IgG2B
3
10-11
Носитель+антитело против PD-1/PD-L1
4
10-11
Тасквинимод+антитело против PD-1/PD-L1
3
2
Объемы опухоли в мм оценивали путем измерения с помощью толщиномера, и их вычисляли по формуле=(ширина)×длина/2.
per os
Как упоминалось в таблице 2, мышам вводили тасквинимод (30 мг/кг) п/о (, т.е. пероральное введение) два раза в сутки. Для блокады PD-L1, 200 мкг антитела против PD-1/PD-L1 (клон 10F.9G2; Bio-XCell) вводили в/б (внутрибрюшинно) мышам каждые 3 суток. Все исследования были одобрены Комитетом по биоэтике IPSEN (CE2A) и ветеринарными службами French Ministry of Agriculture and Fisheries.
Таблица 2
: Перечень применяемого лечения и соответствующие дозы.
Лечение
Справочная информация
Введение на животное
Антитело против PD-1/PD-L1 (клон 10F.9G2:IgG2b крысы)
BioXCell BE0101
200 мкг (в/б)
IgG2b крысы(клон LTF-2)
BioXCell BE0090
200 мкг (в/б)
Тасквинимод(Партия 62)
30 мг/кг в 10 мл/кг (п/о)
носитель
Вода (pH=8,8-9,2)
10 мл/кг в 10 мл/кг (п/о)
Результаты
Антитело против PD-1/PD-L1 или тасквинимод отдельно имели небольшое незначительное воздействие на рост опухолей MBT-2 (см. таблицу 3 и фиг.1).
Однако лечение мышей комбинацией обоих соединений эффективно контролировало рост опухоли.
Таблица 3
3
: Среднее значение объемов опухолей±SEM (стандартная ошибка среднего значения) (мм) в различных группах введения. Значения P соответствуют T-критерию в каждой группе по сравнению с контрольной группой.
Сутки после инокуляции опухолевых клеток
0
10
11
13
14
15
17
4
Тасквинимод+антитело против PD-1/PD-L1
Среднее значение SEM P
0
46
68
99
156
188
238
0
9
7
19
31
24
47
0,665
0,796
0,004
0,046
0,003
0,013
3
Тасквинимод
Среднее значение SEM P
0
49
61
180
225
309
390
0
6
7
41
56
65
97
0,402
0,403
0,676
0,558
0,171
0,417
2
Антитело против PD-1/PD-L1
Среднее значение SEM P
0
47
70
158
229
318
400
0
7
9
25
38
63
85
0,550
0,930
0,247
0,506
0,194
0,425
1
Контроль
Среднее значение SEM
0
41
71
201
266
440
493
0
7
9
25
39
65
76
Заключение
Как показано выше, лечение комбинацией тасквинимода и антитела против PD-1/PD-L1 синергично стимулирует противоопухолевую активность у мышей.
Пример 2: Определение профиля экспрессии генов в опухолях и экспрессия PD-L1 в миелоидных клетках, полученных из мышей, которым вводили тасквинимод
Способы
Количественная ПЦР в реальном времени (кОТ-ПЦР)
Мышам проводили введение, как описано в примере 1. После введения тасквинимода в течение 10 суток, т.е. через 20 суток после инокуляции опухоли, РНК опухолей выделяли из 100-мкм залитых OCT криосрезов опухоли с использованием реагента Trizol (LifeTechnologies). Концентрацию РНК и чистоту определяли путем измерения соотношений A260/A280 с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000. Целостность РНК проверяли с использованием устройства для анализа Agilent 2100 Bioanalyzer. кДНК получали с использованием набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (LifeTechnologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. К-ПЦР проводили с использованием трехстадийного протокола ПЦР (95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 1 мин) с использованием набора для анализа экспрессии генов Taqman (LifeTechnologies). Уровни экспрессии вычисляли в качестве нормализованных величин экспрессии ΔCt между геном-мишенью и двумя генами "домашнего хозяйства", Hmbs и геном циклофилина A, для технологии Taqman. Данные были представлены в качестве кратности индукции (2ΔΔCt) для опухолей, для которых проводили лечение, по сравнению с контрольными опухолями. Зонды, использованные в этих экспериментах, являются следующими:
Гены мыши
Ссылка на анализ (lifetechnologies)
Il12b
Mm00434174_m1
Mrc1
Mm00485172_m1
Nos2
Mm00440502_m1
Cd274
Mm00452054_m1
Ppia
Mm03302254_g1
Hmbs
Mm01143545_m1
FACS-анализ
Мышам проводили введение, как описано в примере 1. После лечения в течение 7 суток тасквинимодом, т.е. через 17 суток после инокуляции опухоли, из опухолей получали суспензии отдельных клеток путем инкубации опухолей, нарезанных на небольшие фрагменты, в 8 мг/мл коллагеназы типа IV (lifetechnologies) и 0,1% ДНК-азе (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) в течение 45 минут при 37°C. Опухоли пропускали через сито с ячейками размером 70 мкм. Клетки блокировали Fc-блокаторами (клон 2.4G2; BD Biosciences), а затем окрашивали CD11b APC (клон M1/70) и CD274 PE Cy7 (клон MIH5), приобретенными от BD Biosciences (San Jose, CA) и eBioscience, соответственно. Клетки анализировали посредством Fortessa X-20 (BD Biosciences).
Результаты
Наблюдали снижение экспрессии CD206, маркера макрофагов M2, и повышение экспрессии nos2 и Il-12b, оба из которых, как известно, высвобождаются макрофагами M1 (фиг.2). Это переключение фенотипов макрофагов с M2 на M1, индуцированное тасквинимодом, было ассоциировано с повышением экспрессии мРНК Cd274 в микроокружении опухоли. Интересно и неожиданно, что авторы настоящего изобретения также обнаружили увеличение средней интенсивности флуоресценции PD-L1, экспрессированного на миелоидных клетках мышей, имеющих опухоли, при которых вводили тасквинимод (фиг.3). Данные авторов настоящего изобретения строго показывают, что тасквинимод индуцирует локальную провоспалительную среду в опухолях, которая в свою очередь может индуцировать экспрессию PD-L1. Это повышение уровня PD-L1 после лечения тасквинимодом может снижать его противоопухолевый ответ и дает основание для комбинирования тасквинимода со антителом против PD-L1 при агрессивном раке мочевого пузыря для усиления противоопухолевой активности.
Пример 3: Экспрессия PD-L1 возрастает в опухолевой ткани после введения тасквинимода
Также авторы настоящего изобретения исследовали, способен ли тасквинимод ингибировать прогрессирование развернутых опухолей, когда его вводят в более поздний момент времени после имплантации опухоли. Для этого животным проводили лечение, когда опухоли MBT-2 достигали объема опухоли в диапазоне от 50 до 100 мм3 (фиг.4A и B). В этих условиях, неожиданно, тасквинимод (30 мг/кг) утрачивал его способность ингибировать рост опухоли. Несмотря на иммуностимулирующие эффекты тасквинимода, которые все еще сохранялись (таблица S1), оптимальная активация адаптивного иммунного ответа для устранения первичных опухолей, по-видимому, снижалась. Авторы настоящего изобретения предположили, что эта устойчивость к лечению тасквинимодом может быть следствием индукции T-клеточных ингибиторных путей, таких как ось PD-1/PD-L1. Действительно, было обнаружено, что экспрессия мРНК PD-L1 была увеличена в опухолях MBT-2, при которых вводили тасквинимод (таблица S1). Кроме того, авторы настоящего изобретения наблюдали повышение экспрессии PD-L1 в клетках, гейтированных по CD11b+, включая моноцитарные MDSC, происходящие из опухолей MBT-2 (фиг.4C и D). Уровень экспрессии PD-1 не изменялся в результате лечения тасквинимодом (не показан). Эти данные указывают на то, что изменение экспрессии PD-L1 может быть ответственным за недостаточность ингибирования роста опухоли при развернутых опухолях MBT-2, при которых проводили лечение тасквинимодом. Данные авторов настоящего изобретения идентифицировали повышенную экспрессию PD-L1 на миелоидных клетках в качестве потенциального механизма устойчивости, посредством которого опухоли ускользают от эффектов лечения тасквинимодом. Эти данные указывают на то, что применение комбинированного режима лечения, включающего тасквинимод и блокаду оси PD-L1/PD-1, может преодолеть эту устойчивость.
Таблица S1: Дифференциальная экспрессия мРНК после введения тасквинимода
Относительную экспрессию мРНК различных генов исследовали в опухолях MBT-2 животных, подвергнутых лечению тасквинимодом, по сравнению с контрольной группой. Лечение начинали на 11 сутки после инокуляции опухолевых клеток и анализ кОТ-ПЦР проводили на 15 сутки. Результаты представлены в качестве средней кратности изменений по сравнению с контролем. Значения P оценивали с использованием критерия Стьюдента.
Гены
Кратность изменений тасквинимод/контроль
p
Il-12b
1,71
0,09
Nos2
1,76
0,03
Cxcl11
1,63
0,08
Cxcl5
2,31
0,003
Cxcl9
0,80
0,45
Ifng
1,53
0,34
Tnf
1,19
0,33
Mrc1/CD206
0,90
0,46
Ccl2
0,86
0,11
CCL5
0,88
0,25
CCL7
0,90
0,37
Serpinb2
3,65
0,0001
Cd274/PD-L1
1,46
0,03
Пример 4: Лечение комбинацией тасквинимод/антитело против PD-L1 усиливает противоопухолевые эффекты в случае BCa
3
3
3
Как наблюдали для лечения тасквинимодом в модели с опухолью MBT-2, антитело против PD-L1 препятствовало развитию опухоли при введении в качестве единственного средства на 1 сутки после инокуляции опухолевых клеток (фиг.5A). Однако противоопухолевая активность средства против PD-L1 отдельно утрачивалась при лечении развернутых опухолей, потенциально вследствие увеличения опухолевой нагрузки (фиг.6B и 5A). Таким образом, авторы настоящего изобретения исследовали, может ли комбинация модулятора функций миелоидных клеток и ингибитора иммунной точки контроля усиливать противоопухолевый ответ (фиг.6A). Результаты показали, что мыши, которых лечили тасквинимодом в комбинации с антителом против PD-L1, продемонстрировали значительное замедление роста опухоли (фиг.6B; контроль 413±51 мм; антитело против PD-L1 325±52 мм; тасквинимод 343±67; комбинация 129±15 мм) и уменьшение массы опухоли (фиг.6C) по сравнению с отдельными способами лечения или контрольной группой. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что комбинация была лучше монотерапии любым из средств в отношении достижения противоопухолевого ответа.
Пример 5: Комбинация способов лечения повышает активацию T-клеток
Далее авторы настоящего изобретения исследовали, могут ли комбинированные способы лечения активировать адаптивный иммунный ответ. Они проанализировали процент TIL и их способность высвобождать эффекторные цитокины. Комбинация тасквинимода со средством против PD-L1 индуцировала повышение в 2,7 раза уровня CD8+ TIL (фиг.7A). Параллельно, также в группе лечения комбинацией наблюдали значимое повышение процента лимфоцитов, продуцирующих гранзим B, по сравнению с контролем (фиг.7B). Также авторы изобретения проанализировали профиль экспрессии цитокинов в опухолях, при которых проводили лечение в течение 7 суток (фиг.7C). Было описано, что IL-7 и IL-15, оба из которых принадлежали суперсемейству IL-2, повышали выживаемость и цитотоксические эффекты T-клеток в большей степени, чем IL-2.31. Неожиданно, значительное увеличение продукции IL-7, IL-15 и IL-12 было обнаружено в опухолях, при которых проводили лечение комбинацией тасквинимода и средства против PD-L1, по сравнению с контролем (фиг.7C). Уровни этих цитокинов не возрастали на значимом уровне в группах лечения по отдельности.
Для дальнейшего исследования иммунных ответов, которые индуцировались комбинацией тасквинимода с антителом против PD-L1 в модели с опухолью MBT-2, авторы настоящего изобретения выделили спленоциты от имеющих опухоль мышей, и подвергли их стимуляции посредством PMA/иономицина в течение 4 ч. Повышение внутриклеточной экспрессии IL-2, IFN-γ и TNF-α в клетках, гейтированных по CD8+, было обнаружено в группе лечения комбинацией по сравнению с контрольной группой (фиг.7D). Уровень CD8+ клеток, продуцирующих IFN-γ, также возрастал в опухолях, при которых проводили лечение только антителом против PD-L1. Кроме того, были обнаружены высокие количества IFN-γ в сыворотке мышей, которых лечили комбинированной терапией, по сравнению со средствами по отдельности или с контрольной группой (фиг.7E). Все эти данные вместе указывают на то, что комбинация тасквинимода с лечением антителом против PD-L1 активировала адаптивную иммунную систему для осуществления цитотоксического иммунного ответа.
Пример 6: Активация клеток как врожденного, так и адаптивного, иммунитета требуется для индукции мощного иммунного ответа
Для дальнейшего понимания механизма, который лежит в основе наблюдаемого повышения продукции CD8+ клетками цитотоксических цитокинов в группах введения комбинации, авторы настоящего изобретения предположили, что миелоидные клетки, происходящие из подвергнутых лечению опухолей, могут прямо взаимодействовать с T-клетками и влиять на их функцию. В связи с этим, авторы настоящего изобретения выделили миелоидные CD11b+ клетки из опухолей и поместили их в культуру с T-клетками, происходящими из селезенки наивных мышей.
ex vivo
ex vivo
Иммунное модулирование CD11b+ клеток, происходящих из развернутых опухолей, при которых проводили лечение тасквинимодом, имеет ограниченную способность к повышению пролиферации стимулированных CD8+ T-клеток  (фиг.8A и B). Кроме того, блокада PD-L1 в CD11b+ клетках, происходящих из опухолей, при которых вводили антитело против PD-L1, также имела умеренную способность активировать T-клетки . Важно, что комбинирование модуляторов как миелоидных клеток, так и T-клеточных ингибиторных функций, значительно повышало процент пролиферирующих CD8+ клеток. Это сопровождалось выраженной секрецией IFN-γ в супернатант по сравнению контролем, тасквинимодом отдельно или антителом против PD-L1 отдельно (фиг.8C). Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация тасквинимода с антителом против PD-L1 при опухолях MBT-2 модулирует иммуносупрессивные миелоидные клетки, влияющие на пролиферацию CD8-положительных T-клеток и продукцию IFN-γ. Эти данные далее подтверждают синергическое взаимодействие между миелоидными клетками и T-клетками и указывают на терапевтические противоопухолевые взаимодействия, нацеленные на модулирование взаимодействия между популяциями клеток как врожденной, так и адаптивной иммунной системы.
Пример 7: Комбинация тасквинимода и антитела против PD-1 продлевает выживание мышей в модели опухоли в значительно большей степени, чем выживание после лечения каждым средством, используемым отдельно
Тасквинимод отдельно в дозе 30 мг/кг не был способен увеличивать среднюю выживаемость мышей (на 27 суток) по сравнению с 29 сутками для контрольных мышей (фиг.9). Однако, несмотря на способность лечения антителом против PD-1 увеличивать среднюю выживаемость мышей до 43 суток, комбинация тасквинимода с антителом против PD-1 была значительно лучшей, чем каждое из средств, использованное отдельно.
Материалы и способы
Клеточные линии
MBT-2 приобретали в JCRB Cell Bank и культивировали в EMEM (Life Technologies), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой. AY-27 были предоставлены Oncodesign (Dijon, Франция), и их поддерживали в RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клеточные линии были свободными от заражения микоплазмой. Никаких других опознавательных анализов не проводили.
Эксперименты in vivo
Самцов мышей C3H/HeNRj в возрасте от шести до семи недель приобретали от JANVIER Labs. Самок крыс Fischer 344 (F344/IcoCrl) в возрасте от пяти до шести недель приобретали от CHARLES RIVER.
6
3
Клетки MBT-2 (1×10) инъецировали подкожно в бок мышей и полученным опухолям позволяли расти в течение 21 суток. Опухоли измеряли с помощью толщиномера и объем опухоли (мм) вычисляли с использованием формулы=(ширина) 2×длина/2.
Животных лечили различными дозами тасквинимода (0,1, 1, 10 и 30 мг/кг) через пероральный зонд в объеме 10 мл/кг два раза в сутки в течение 21 суток. Для блокирования PD-L1, 200 мкг антитела против PD-L1 (10F.9G2; BioXCell) или его изотипического контроля (LTF-2; BioXCell) вводили в объеме 100 мкл внутрибрюшинным путем мышам каждые 3 суток всего в от трех до четырех инъекций для каждого эксперимента.
6
Процедуры для модели внутрипузырного рака AY-27 проводились Oncodesign (Dijon, France). Опухолевые клетки (1×10) инъецировали ортотопически во внутреннюю поверхность стенки мочевого пузыря. Лечение тасквинимодом начинали на 4 сутки в дозе 2 мг/кг два раза в сутки на протяжении 28 последовательных суток. Цисплатин (CDDP, EBEVE) вводили в дозе 2 мг/кг один раз в сутки каждые 7 суток, начиная на 4 сутки после инокуляции опухолевых клеток. Все изображения магнитно-резонансной томографии (МРТ) получали с использованием ParaVision (Bruker Biospin).
Все процедуры с использованием животных были проверены Animal Care and Use Committee of Oncodesign (Oncomet) и IPSEN (C2EA), и были одобрены French Ministry of Research.
FACS-анализ
in vitro
TM
TM
TM
Суспензии единичных клеток получали из опухолей путем инкубации опухолей, нарезанных на небольшие фрагменты, в 8 мг/мл коллагеназы IV (Life Technologies) и 0,1% ДНК-азы (Sigma-Aldrich) в течение 45 мин при 37°C. клетки блокировали блокаторами Fc (2.4G2), а затем окрашивали различными антителами против CD11b (M1/70), F4/80 (клон BM8), CD206 (C068C2), Ly6C (AL-21), Ly6G (1A8), CD4 (RM4-5), CD3ε (145-2C11), NK-1.1 (PK136) и CD8a (53-6.7), приобретенными в BD Biosciences, eBioscience и BioLegend. Для окрашивания на цитокины клетки стимулировали  коктейлем для активации лейкоцитов в течение 4 ч в присутствии GolgiPlug (BD Biosciences), повышали их проницаемость и фиксировали с использованием BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), а затем окрашивали антителами против IL-2 (JES6-5H4), против TNF-α (MP6-XT22) и против IFN-γ (XMG1.2), приобретенными от eBioscience. Проточно-цитометрический анализ проводили с использованием BD Fortessa X-20 (BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc.). Сортировку по CD11b+ проводили на BD FACSAria II (BD Biosciences) при поддержке Curie Institute core Facility (Orsay, Франция) и конечная достигаемая чистота составляла более 95%. Альтернативно CD11b+ клетки разделяли с использованием микрогранул MACS (Miltenyi). Эта процедура обеспечивала в основном CD11b+ клетки с чистотой более 80% согласно оценке посредством FACS-анализа.
Анализ пролиферации
T-клеток ex vivo
5
TM
5
T-клетки (1×10) выделяли из селезенки наивных мышей с использованием набора для выделения общих T-клеток (Miltenyi). T-клетки метили с использованием набора CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit (Life Technologies) и активировали посредством Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 (Life Technologies) при соотношении гранул и клеток 1:1. Выделенные CD11b+ клетки (1×10) из опухолей добавляли к меченым T-клеткам в соотношении CD11b:T-клетки 1:1 и инкубировали в культуре в течение 72 ч.
Анализ индукции цитокинов
6
TM
Спленоциты (1×10) стимулировали смесью PMA и иономицина в присутствии GolgiPlug в течение 4 ч (BD Biosciences). Клетки собирали и окрашивали на поверхностные маркеры, затем повышали их проницаемость, фиксировали и окрашивали в отношении внутриклеточных цитокинов с использованием антител против IL-2 (JES6-5H4), антител против TNF-α (MP6-XT22) и антител против IFN-γ (XMG1.2).
Иммунохимия
Окрашивание на S100A9 проводили на срезах тканей FFPE из микрочипа тканей человека (TMA), состоящего из множества злокачественных тканей (онкологическое обследование, Origen and Top 4 multi tumor от Asterand) или опухолей BCa (FFPE TMA, #BLC241 и срез карциномы мочевого пузыря #HuCAT416, Usbiomax). Срезы опухолей инкубировали с антителом против S100A9 (1:5000; Abcam #ab92507) после демаскирования антигена в растворе с низким значением pH (Dako) и реакции с пероксидазой/диаминобензидином. Интенсивность окрашивания оценивали полуколичественно.
Проводили взятие образцов опухолей животных, нарезали их на фрагменты и либо заливали соединением OCT, либо фиксировали погружением в формалин в течение 24 ч и заливали парафином. Срезы FFPE (5 мкм) инкубировали с гранзимом B (1:100; Abcam #ab4059), антителом против S100A9 (1:1000; R&D systems #AF2065/ Abcam #ab62227) или антителом против CD8 (1:200; AbD Serotec #MCA48R) после демаскирования антигена в растворе с низким значением pH (Dako). Окрашивание проявляли посредством реакции пероксидазы/диаминобензидина. Анализ изображений проводили на сканированных изображениях предметных стекол с использованием программного обеспечения Halo (Indica labs). Окрашенные гранзимом B клетки подсчитывали, и результат сообщали относительно общего количества клеток в срезе опухоли.
Определение цитокинов посредством мультиплексного анализа
Цитокины экстрагировали из среза толщиной 1 мм замороженных залитых соединением OCT (VWR, Франция) опухолей. После трех промываний PBS, осадок ресуспендировали в PBS+коктейль ингибиторов протеаз (Roche) и растирали посредством керамических гранул в гомогенизаторе (Fastprep, MP Biomedicals). Различные образцы анализировали в отношении концентрации белка. Уровни цитокинов измеряли с использованием мультиплексных наборов для иммуноанализа (Merck-Millipore) согласно инструкциям изготовителя. Обнаружение сигнала проводили на Luminex 200 (Luminex) и регистрировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI).
Количественная ПЦР в реальном времени (кОТ-ПЦР)
кДНК-чип для онкологического обследования приобретали от Origene, и он содержал 381 кДНК (2-3 нг/лунка) из 17 типов тканей человека, либо из нормальной области, либо из пораженной заболеванием области.
Экстракцию РНК CD11b+ клеток мыши проводили с использованием набора PicoPure RNA Isolation Kit (Life Technologies). РНК в опухолях выделяли из криосрезов толщиной 100 мкм залитых OCT опухолей с использованием реагента Trizol (Life Technologies). кДНК получали с использованием набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК из выделенных CD11b+ клеток предварительно амплифицировали (14 циклов) с использованием основной смеси TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technologies). ПЦР в реальном времени (к-ПЦР) проводили с использованием двухстадийного протокола ПЦР (95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95°C в течение 15 c и 60°C в течение 1 мин) с использованием набора для определения экспрессии генов Taqman (Life Technologies). Зонды, которые использовали, приведены в таблице S2. Hmbs использовали в качестве гена "домашнего хозяйства", экспрессию которого сопоставляли с другими количественно определенными генами домашнего хозяйства (например, циклофилин A). Уровни экспрессси вычисляли в качестве нормализованных величин экспрессии ΔCt между геном-мишенью и генами "домашнего хозяйства".
Таблица S2: зонды, использованные для кОТ-ПЦР
Обозначения генов и ссылки на соответствующие зонды, которые использовали для определения профиля экспрессии генов с использованием технологии Taqman
Обозначение гена
Вид
Обозначение зонда (Life technologies)
Arg-1
Мышь
Mm00475991_m1
Ccl2
Мышь
Mm00441242_m1
Ccl5
Мышь
Mm01302428_m1
ccl7
Мышь
Mm01308393_g1
Cd274/PDL1
Мышь
Mm00452054_m1
Cxcl11
Мышь
Mm00444662_m1
Cxcl5/LIX
Мышь
Mm00436451_g1
Cxcl9
Мышь
Mm00434946_m1
F13a1
Мышь
Mm00472334_m1
Fn1
Мышь
Mm01256734_m1
hmbs1
Мышь
Mn01143545_m1
Ifng
Мышь
Mm01168134_m1
Il12b
Мышь
Mm00434174_m1
Lgals1
Мышь
Mm00839408_g1
Mrc1/CD206
Мышь
Mm00485172_m1
Nos2
Мышь
Mm00440502_m1
PDCD1/PD1/Cd279
Мышь
Mm00435532_m1
Ppia (Cyclophilin)
Мышь
Mm03302254_g1
Serpinb2/PAI2
Мышь
Mm00440905_m1
Tgfb1
Мышь
Mm00441729_g1
Tnf
Мышь
Mm00443258_m1
Hmbs
Человек
Hs00609296_g1
S100A9
Человек
Hs00610058_m1*
Hmbs
Крыса
Rn01421873_g1
Pdcd1
Крыса
Rn01427133_m1
Cd274
Крыса
Rn01760313_m1
Cxcl11
Крыса
Rn01414027_m1
Cxcl9
Крыса
Rn00595504_m1
Cxcl5
Крыса
Rn00573587_g1
Gata3
Крыса
Rn00484683_m1
Ifng
Крыса
Rn00594078_m1
Il12b
Крыса
Rn00575112_m1
Nos2
Крыса
Rn00561646_m
Tbx21
Крыса
Rn01461633_m1
Tnf
Крыса
Rn99999017_m1
Статистика
Данные анализировали с использованием программного обеспечения Prism 6.0 (GraphPad Software), и их валидировал специалист по медицинской статистике. Эксперименты повторяли от двух до четырех раз, в зависимости от ситуации. Нормальное распределение данных оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. В этом случае значения P оценивали либо посредством t-критерия Стьюдента, либо посредством дисперсионного анализа (ANOVA). Для других распределений данных использовали критерий Манна-Уитни или критерий Крускала-Уоллиса. Значение P менее 0,05 считали статистически значимым (*, P <0,05; **, P<0,01; ***, P<0,001).