СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЖИВОРОЖДЕНИЯ В ПРОГРАММАХ ЭКО У ЖЕНЩИН ПОЗДНЕГО РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ ФАКТОРОМ БЕСПЛОДИЯ
METHOD FOR PREDICTION OF LIVE BIRTH IN IVF PROGRAMS IN WOMEN OF LATE REPRODUCTIVE AGE WITH TUBAL-PERITONEAL INFERTILITY FACTOR

Изобретение относится к области медицины, в частности к патологической анатомии и гинекологии, и может быть использовано при подготовке к программам экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин позднего репродуктивного возраста при бесплодии трубного происхождения для прогноза живорождения.
Изобретение обеспечивает возможность персонализации подготовки пациенток к вспомогательным репродуктивным технологиям с целью повышения их результативности.
Достижения последних лет значительно улучшили показатели беременности и живорождения при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (Farquhar, Marjoribanks, 2018). Получение здорового перинатального исхода стало новым направлением репродуктивной медицины (Kushnir et al., 2017). Однако, данные о влиянии эндометриального паттерна на показатель живорождения в программах ЭКО/ИКСИ немногочисленны, представлены фрагментарно (Herington et al., 2017;Lv et al., 2020).
К числу ключевых регуляторов процессов рецептивности эндометрия, предопределяющих фертильность, принадлежат гены НОХА и кодируемые ими белки (Taylor HS et al., 1997, 2000; Jaslow C.R, 2014; Xu В et al., 2014; Du H et al., 2015; Ashary N et al., 2020). В последние годы гинекологические заболевания, в том числе и ассоциированные с бесплодием, нарушения имплантации все чаще начинают рассматриваться как результат нарушения работы генов (Szczepanska М. et al., 2011; Kulp J. et al, 2012; Alizadeh Z et al., 2013; Jana S.K et al., 2013; Önder Ģelik et al., 2015; Unlu С et al., 2016; Piltonen T. et al., 2016; Margioula-Siarkou С et al., 2016; Makker A., et al., 2017 Özcan C. et al., 2019; Kara M. et al., 2019; Choux, С et al., 2020; Ben Rafael Z., 2021; Deryabin et al., 2021). Рецепторы витамина D (VDR), помимо классических органов-мишеней (кости, кишечник), широко распространены и в других тканях, в том числе репродуктивной системы: яичниках, миометрии, эндометрии, что не исключает их важную роль в рецептивности последнего (Wagner C.L., Taylor S.N., Dawodu A., et al., 2012; Franasiak JM, Molinaro ТА, Dubell EK. et al., 2015; Громова O.A. и др., 2016; Zhao J et al., 2018; Князева E.A., 2020; Guo J. et al, 2020; Deiyabin, P et al., 2021).
Полученные данные свидетельствуют о потенциальной роли VDR, НОХА-11 в процессах имплантации и указывают на необходимость их дальнейшего изучения, как вероятных эндометриальных детерминант исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий.
На момент подачи заявки из свободных источников было известно о следующих наиболее близких аналогах.
Из патента RU 2734840, 23.10.2020 г. (Оразов М.Р., Краснопольская К.В., Михалева Л.М., Хамошина М.Б., Волкова С.В., Хованская Т.Н., Шустова В.Б., Абитова М.З.) известен способ оценки имплантационного потенциала эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии. В период «окна имплантации» в эндометрии определяют уровень экспрессии НОХА10, ERα, ERβ, PR-А в стромальном компартменте эндометрия и PR-B в железистом. Если экспрессия НОХА10≤21%, присваивают «1 балл», если >21% - «0 баллов». Если экспрессия ERα≥25%, присваивают «1 балл», если <25% - «0 баллов». Если экспрессия ERβ≥20%, присваивают «1 балл», если <20%, - «0 баллов». Если экспрессия PR-A≤23%, присваивают «1 балл», если >23%, - «0 баллов». Если экспрессия PR-B≥47%, присваивают «1 балл», если <47%, - «0 баллов». Полученные баллы суммируют. При сумме баллов «4-5 баллов» определяют наличие экстремально низкого имплантационного потенциала эндометрия, указывающего на отрицательный прогноз имплантации. При сумме баллов «2-3 балла» определяют наличие низкого имплантационного потенциала эндометрия, указывающего на отрицательный прогноз имплантации. При сумме баллов «0-1 балл» определяют наличие высокого имплантационного потенциала эндометрия, указывающего на положительный прогноз имплантации. Недостатком метода является трудоемкость способа. Кроме того, установленная модель с целью прогнозирования имплантационных нарушений базируется только на анализе эндометриального паттерна у женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием, не учитывает показатель живорождения.
Из патента RU 2732430, 16.09.2020 г. (Чистякова Г.Н., Гришкина А.А., Ремизова И.И., Данькова И.В., Щедрина И.Н., Михельсон А.Н. ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ оценки рецептивности эндометрия у женщин с первичным бесплодием и миомой матки. На этапе прегравидарной подготовки к программам высокотехнологичных репродуктивных технологий (ВРТ) в период «окна имплантации» проводят оценку экспрессии маркеров VEGFr3 и PTEN с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле PI=(-0,045)×Х1+(-0,06)×Х2+0,27×Х3+3,38. При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины с первичным бесплодием и миомой матки в программу ВРТ. При PI менее 0 прогнозируют низкую рецептивность эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач. Недостатком метода является его применение только у женщин с первичным бесплодием и миомой матки 3-6 классов по FIGO, без учета итогового исхода программ ВРТ.
Из патента RU 2732432, 16.09.2020 г. (Гришкина А.А., Чистякова Г.Н Башмакова Надежда Васильевна Ремизова И.И., Данькова И.В., Филатова Алена Сергеевна ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ оценки эндометриальной дисфункции у женщин с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием. На 20-22 день менструального цикла производят пайпель-биопсию эндометрия и определяют экспрессию PTEN и р53 с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле PI=X1×-0,54+0,233×Х2-0,165×Х3+29,2. При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ. При PI менее 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ. Изобретение позволяет с высокой долей вероятности определять восприимчивость эндометрия к имплантации бластоцисты в период «имплантационного окна» у женщин с первичным бесплодием, обусловленным эндометриозом. Недостатком метода является то, что способ прогнозирования основан только на исследовании пациенток с первичным эндометриоз-ассоциированным бесплодием, ограничен этапом имплантации.
Из патента RU 2731203, 31.08.2020 г. (Чистякова Г.Н., Гришкина А.А., Ремизова И.И., Мелкозерова О.А. ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ оценки рецептивности эндометрия в секреторную фазу у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия на основании иммуногистохимического исследования уровня экспрессии в эндометрии (Т-лимфоцитов - CD3+, р53 - маркера индукции апоптоза и PTEN - фосфотазы с двойной субстратной специфичностью), с последующим вычислением прогностического индекса (PI). по формуле PI=Х1×-0,69+0,59×Х2+0,99×Х3+0,37×Х4-69,3. При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу высокотехнологичных репродуктивных технологий (ВРТ). При PI менее 0 прогнозируют низкую рецептивность эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия. Недостатком метода является его применение только у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия, без учета других форм и причин бесплодия, показателя живорождения.
Наиболее близким к предлагаемому является способ из патента RU 2636527, 28.10.2016 г (Бурменская О.В., Трофимова Д.Ю., Смольникова В.Ю., Корнеева И.Е., Межевитинова Е.А.Ю., Донников А.Е., Сухих Г.Т. ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ) известен способ определения персонального "окна имплантации" у женщин на основе анализа транскрипционного профиля генов. Способ определения персонального «окна имплантации» у женщин включает измерение уровней экспрессии мРНК функциональных генов человека РАЕР, DPP4, HLA-DOB, MSX1 в образцах тканей эндометрия, полученных путем пайпель-биопсии на 7-8 день после пика лютеинизирующего гормона. Далее полученные значения уровней экспрессии мРНК используют для вычисления индекса рецептивности эндометрия. Если значение индекса рецептивности эндометрия менее или равно пороговому значению, делают заключение о несоответствии эндометрия стадии «окна имплантации»; если значение индекса рецептивности эндометрия больше порогового значения, делают заключение о соответствии эндометрия стадии «окна имплантации», при этом пороговое значение определяют исходя из экспериментальных данных с помощью ROC-анализа. Недостатком данного метода является исключение из исследования женщин старше 39 лет, измерение уровней экспрессии нескольких мРНК генов, измерение уровней экспрессии мРНК методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, требующих особых условий для подготовки и сохранения гистологического материала, отсутствие данных изучаемого параметра для программ ВРТ, завершившихся и незавершившихся родами живым плодом(ами).
Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования живорождения в программах ЭКО у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием методом иммуногистохимического исследования эутопического эндометрия с определением экспрессии VDR, НОХА 11 в стромальных клетках эндометриального паттерна.
Техническим результатом предлагаемого способа является прогнозирование живорождения в программах ЭКО у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия.
Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования живорождения в программах ЭКО включает иммуногистохимическое исследование эндометрия с определением экспрессии VDR, НОХА 11 в клетках стромы с последующим расчетом вероятности (Р) живорождения по формуле:
1
2
где x - значение экспрессии НОХА11, x - значение экспрессии VDR
Отличие способа заключается в том, что проведено принудительное включение в формулу модели логистической регрессии значений экспрессий VDR, НОХА 11 в стромальных клетках эндометрия, которые согласно проведенному собственному исследованию продемонстрировали высокую статистическую значимость для исходов программ ЭКО по показателю живорождения, р=0,009 и р=0,005, соответственно.
При Р более 0,19, делают заключение о благоприятном прогнозе для живорождения; при Р менее 0,19, делают заключение о несоответствии эндометрия благоприятному прогнозу живорождения. Вероятность (Р) определена на основе формулы модели логистической регрессии.
Осуществление изобретения.
С целью разработки формулы модели логистической регрессии на основе проспективного когортного исследования женщин (n=68) позднего репродуктивного возраста (с 36 до 44 лет) с трубно-перитонеальным бесплодием при подготовке к ВРТ, определены экспрессии VDR, НОХА 11 в клетках стромы эндометрия женщин с программами ВРТ, завершившимися родами живым плодом(ами) и с программами ВРТ, незавершившимися родами живым плодом(ами).
В период «окна имплантации» проводят пайпель - биопсию эндометрия в цикле, предшествующем проведению ЭКО. Полученные образцы эндометрия обрабатывают по стандартной методике с получением парафиновых блоков. Иммуногистохимическое исследование проводят на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 5 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода и применением стандартных наборов поликлональных антител фирмы GeneTex, США (кроличьи поликлональные антитела VDR, НОХА 11). Для визуализации первичных антител использована система детекции N-Histofine DAB (nichirei biosciences ins. Japan). Морфологическое исследование проведено с использованием микроскопа Primo Star производство Karl Zeiss. Диапазон рабочих увеличений 200-400. Фотографирование произведено с помощью цветной камеры Pixera Pro 150ES (переходник 0,5х). Для оценки морфофункционального состояния использовано лицензированное программное обеспечение «Морфология 5.2.».
Результаты реакции VDR, НОХА 11 идентифицированы при подсчете и процентном выражении относительной плотности окрашенных клеток.
Для создания математической модели, позволяющей прогнозировать имплантацию, применялся множественный регрессионный анализ с принудительным включением двух переменных: экспрессии VDR, НОХА11 клеток стромы (таблица 1).
Уравнение модели
1
2
где x - экспрессия НОХА11, x - экспрессия VDR.
Полученная модель является статистически значимой (р<0,001). Чувствительность модели 86%, специфичность 70%, процент правильно классифицированных 78,6%. Обладает высокой прогностической способностью. Площадь под ROC-кривой модели 0,831 (0,736; 0,925), р<0,001.
Если вероятность, рассчитанная по модели (уравнению) >0,19, прогнозируются благоприятный прогноз для живорождения. Предлагаемый способ расширяет возможности прогнозирования живорождения на прегравидарном этапе у пациенток позднего репродуктивного возраста с бесплодием трубного происхождения.
Клинические примеры (таблица 2):
Пример 1. Пациентка И. 39 лет, вторичное бесплодие 10 лет. В анамнезе лапароскопия, 2 стороняя тубэктомия (2 сторонний сактосальпинкс), секторальная резекция левой молочной железы (фиброаденома). Менархе с 11 лет, цикл 28 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5 дней, характер менструаций умеренный. АМГ - 0,8 нг/мл, ФСГ 10,1 мМЕ/мл. Раннее 3 безуспешные попытки ЭКО. Ответ бедный. Рекомендована программа с ДО. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 4,9%, НОХА11 4,6% в строме эндометрия. Р=0,45. После медикаментозной подготовки эндометрия перенос 2 эмбрионов хорошего качества. Толщина эндометрия 7,9 мм. ХГЧ 1682 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки дихориальная, диамниотическая двойня. Своевременные роды живыми плодами.
Пример 2. Пациентка К. 41 год, вторичное бесплодие 8 лет. Соматически - здорова. Менархе с 12 лет, цикл 30 дней, регулярный, продолжительность менструаций 4 дня, характер менструаций умеренный. АМГ - 1,1 нг/мл, ФСГ 12,1 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 7,8%, НОХА11 4,2% в строме эндометрия. Р=0,26. Протокол стимуляции длинный с агонистами, длительность стимуляции 11 дней, курсовая доза гонала 1650 ME и мериоферт (75 ME ФСГ + 75 ME ЛГ) 750 ME. Получено 7 ооцитов, ЭКО, 5 эмбрионов, перенос 2 эмбриона отличного качества на 5 сутки. Толщина эндометрия 10 мм. ХГЧ 1000 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо. Своевременные роды живым и здоровым плодом.
Пример 3. Пациентка Б. 38 лет, первичное бесплодие в течение 18 лет. Соматически - узловой нетоксический зоб. Эутиреоз. Менархе с 13 лет, цикл 28 дней, регулярный, продолжительность менструаций 3-4 дня, характер менструаций умеренный. АМГ - 3,67 нг/мл, ФСГ 9,3 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR в строме эндометрия 4,9%, НОХА11 8,3%. Р=0,21. Протокол стимуляции короткий с агонистами длительностью 10 дней, курсовая доза гонала 1200 ME и менопура 1500 ME. Получено 11 ооцитов, ЭКО, 11 эмбрионов, перенос 2 эмбрионов отличного качества на 5 сутки. ХГЧ 1062,8 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо. Своевременные роды живым и здоровым плодом.
Пример 4. Пациентка А. 37 лет, вторичное бесплодие в течение 5 лет. Соматически - аутоиммуный тиреоидит. Эутиреоз. Менархе с 12 лет, цикл 32 дня, регулярный, продолжительность менструаций 5 дней, характер менструаций умеренный. АМГ - 3,61 нг/мл, ФСГ 6,3 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR в строме эндометрия 5,8%, НОХА11 7,7%. Р=0,18. Протокол стимуляции с антагонистами длительностью 12 дней, курсовая доза гонала 1650 ME. Получено 20 ооцитов, ЭКО, 10 эмбрионов, перенос 2 эмбрионов отличного качества на 5 сутки. ХГЧ 192,2 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо. Самопроизвольный выкидыш на сроке 9-10 недель.
Пример 5. Пациентка Т. 40 лет, вторичное бесплодие 6 лет. 2 рубца на матке. Соматическая патология: АИТ. Гипотиреоз (медикаментозная компенсация). Менархе с 14 лет, цикл 27 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5 дней, характер менструаций умеренный. АМГ - 1,66 нг/мл, ФСГ - 7,95 мМЕ/мл. Попытка ЭКО первая. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 2,4%, НОХА11 14,8% в строме эндометрия. Р=0,074. Протокол с антагонистами, длительность стимуляции 11 дней, курсовая доза гонала 2475 ME и цетротид №4. Получено 5 ооцитов, ЭКО, 4 эмбрионов. Перенесен на 5 сутки 1 эмбрион хорошего качества. Толщина эндометрия 9 мм. ХГЧ через 14 дней менее 1,0 мМЕ/мл. При УЗИ плодное яйцо в полости матки не обнаружено.
Пример 6. Пациентка М. 40 лет, первичное бесплодие 12 лет. Соматически - здорова. Менархе с 16 лет, цикл 28 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5-6 дней, характер менструаций умеренный. АМГ - 2,1 нг/мл, ФСГ 5,4 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR 7,1%, НОХА11 10,2% в строме эндометрия. Р=0,064. Протокол стимуляции короткий с агонистами, длительность стимуляции 13 дней, курсовая доза гонала 1800 ME и мериоферт (75 ME ФСГ + 75 ME ЛГ) 975 ME. Получено 8 ооцитов, ЭКО,5 эмбрионов, перенос 2 эмбриона отличного качества на 5 сутки. Толщина эндометрия 10 мм. ХГЧ менее 1,0 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо не обнаружено.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Челябинской области в рамках научного проекта №20-415-740014