Биотехнологические подходы в изучении грибов-патогенов пшеницы (Pyrenophora tritici-repentis и Cochliobolus sativus)

6. Li and Zhang. DNA Methylation in Mammals. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;6:a019133.

7. Miranda TB, Jones PA.DNA methylation: the nuts and bolts of repression. J Cell Physiol. 2007;213(2):384-90.

8. Prendergast, G.C.; Lawe, D.; Ziff, E.B. Association of Myn, the murine homolog of Max, with c-Myc stimulates methylation-sensitive DNA binding and Ras co-transformation. Cell. 1991; 65,395-407.

9. Rodrigues JA, Zilberman D. Evolution and function of genomic imprinting in plants. Genes Dev. 2015;15;29(24):2517-31.

10. Wilkinson, L.S.; Davies, W.; Isles, A.R. Genomic imprinting effects on brain development and function. Nat. Rev. Neurosci. 2007; 8: 832-843.

К. М. Костюхина, Ф. Б. Ганнибал, Н. В. Мироненко

Биотехнологические подходы в изучении грибов-патогенов пшеницы

Пшеница является одной из древних культур, возделываемых человеком, и самым распространенным культурным растением в мире. Она выращивается в любых климатических зонах, практически на всех континентах. Популярность этой зерновой культуры объясняется разносторонностью применения зерна. Оно используется для продовольственных, кормовых и технических целей. Одним из лимитирующих факторов получения высоких урожаев пшеницы в основных зонах его возделывания являются болезни, вызываемые фитопатогенными грибами. Причиной различных заболеваний пшеницы являются грибы, причем в этом процессе принимают участие представители систематических классов, порядков, семейств, находящихся на разных ступенях эволюционного развития.

К числу опасных болезней пшеницы относятся желтая и темно-бурая пятнистости листьев. Вредоносность болезней состоит как в потери урожая из-за снижения фотосинтеза растений, так и в ухудшении качества зерна, что иногда делает его непригодным для получения круп и муки.

В последнее время желтая и темно-бурая пятнистости листьев пшеницы стали появляться на территории России заметно чаще и вызывать снижение качества и количества зерна. Традиционные методы защиты растений, применяемые против других грибных болезней, не всегда дают желаемые результаты. В связи с этим необходимо разработать новые подходы к решению наиболее актуальных проблем защиты растений, в особенности защиты зерновых культур. Используя современные достижения биотехнологии, необходимо разработать молекулярные методы изучения, маркиро-

вания и идентификации популяций фитопатогенных грибов - возбудителей болезней пшеницы.

Желтая пятнистость листьев - одно из широко распространенных заболеваний пшеницы. Эпифитотии этой болезни наблюдаются в разных странах мира, потери зерна у восприимчивых сортов достигают 65 %. Возбудителем желтой пятнистости листьев (желто-коричневая пятнистость, пиренофороз, tanspot, yellowspot) является фитопатогенный гриб - Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler.

Симптомы заболевания проявляются на обеих сторонах листа на проростках и взрослых растениях. Первичные симптомы на чувствительных сортах - мелкие желто-коричневые пятна, которые постепенно увеличиваются, принимая линзообразную форму; они могут быть окружены небольшой желтой зоной. В длину пятна достигают 12 мм. По мере развития повреждения пятна срастаются, листья желтеют и отмирают. Некроз часто начинает развиваться вблизи верхушки листа и распространяется к его основанию. На мелких пятнах споруляция гриба не наблюдается. Конидии часто обнаруживают на крупных (более 0,5 * 0,2 см) пятнах и нижних отмерших листьях. На более устойчивых сортах развиваются мелкие желтые или коричневые повреждения [3].

Морфология гриба: гриб имеет серо-белый мицелий; вертикальные одиночные оливково-черные конидиеносцы в изобилии образуются на листовых пятнах и на стебле, их размеры 7-8 * 100300 мкм [4]. На искусственных средах гриб образует темные и белые колонии, на картофельно-декстрозном агаре часто происходит изменение цвета колонии на бело-розовую или светло-оранжевую, обычно это сопровождается замедлением роста. Конидии почти прозрачные, цилиндрические.

Еще одной группой опасных заболеваний пшеницы является темно-бурая листовая пятнистость, обыкновенная корневая гниль и черный зародыш, вызываемые грибом Cochliobolus sativus (S. Ito & Kurib.) Drechsler ex Dastur. Фитопатогенный гриб поражает практически все зерновые культуры (пшеницу, ячмень, рожь) и злаковые травы.

Симптомы заболевания: на листьях появляются овальные или расплывчатые, крупные или мелкие пятна, светлые в центре с тёмной каймой. Эта форма проявления заболевания чаще встречается в условиях вегетационного сезона с большим количеством осадков и умеренными температурами [2].

Морфология гриба: мицелий гриба септированный, темно-окрашенный (коричневый, серый, оливково-серый или черный). В чистой культуре колонии гриба ватообразные, пушистые; их цвет колеблется от белого до темно-коричневого, черного в зависимости от штамма.

Конидиеносцы многоклеточные, темно-бурые, коленчато-изогнутые, выступают из субстрата одиночно или пучками по 2-3, размером 100-130 х 6-7 мкм.

Конидии образуются сбоку и на вершине конидиеносца, темно-оливковые, удлиненно-яйцевидные или веретеновидные, прямые или слегка изогнутые, с 2-13 перегородками, размером 60-134 х 17-30 мкм; прорастают полярно (из двух крайних клеток) при наличии капельной влаги.

Гриб на субстратном мицелии может образовывать хламидо-споры в виде светлых вздутий внутри гифальной оболочки; затем они приобретают собственную оболочку, которая со временем утолщается и темнеет. Хламидоспоры образуются одиночно или короткими цепочками. Они имеют округлую или продолговатую форму, размер 150-200 х 60-80 мкм [3].

Все мы всегда задумывались над тем, как можно научиться управлять природой, создавать новые, улучшенные сорта растений, а также как защитить их от вредителей и болезней. На современном этапе научно-технический прогресс в огромной степени зависит от разработки, освоения и реализации эффективных биотехнологических методов [1].

Актуальность данной работы обусловлена широким распространением указанных фитопатогенов и их большим практическим значением. Цель работы - усовершенствовать лабораторные микробиологические методы и методы молекулярной биотехнологии, позволяющие проводить исследование биоразнообразия грибов Р. Мюьгереп^ и С. sativus. Для достижения поставленной цели был изучен рост грибов на разных искусственных питательных средах и опробованно генотипирование штаммов грибов с помощью разных молекулярных SSR-маркеров.

Для подбора наиболее оптимальной среды для культивирования грибов Р. Шю'-гереп^ и С. sativus были опробованы две питательные искусственные среды: ЧЛМ и V-4. Эффективность среды для выращивания грибов оценивали по скорости роста мицелия, образованию конидиеносцев и конидий. В целях изучения популя-ционной структуры грибов оценили два SSR-маркера. Для этого была выделена ДНК из 12 изолятов грибов, полученных из Омской области. После этого была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) с праймерами (АСА)14 и (АС)12 и электрофорез в по-лиакриламидном геле, позволяющий разделить и визуализировать продукты ПЦР.

В ходе выполненной работы были получены следующие результаты. При культивировании грибов на двух средах было обнаружено, что образование большого числа конидиеносцев и конидий наблюдается на среде V-4 по сравнению со средой ЧЛМ.

На рост мицелия и на образование конидиеносцев и конидий оказывал влияние не только состав питательной среды, но и условия выращивания грибов. Так под лампами дневного света наблюдался только рост мицелия, в то время как под лампами эритемными ЛЭ-30 образовывалось большое количество конидиеносцев.

В результате использования SSR-маркеров были получены электрофореграммы, на которых было видно разнообразие продуктов амплификации ДНК грибов с праймерами (ACA)14 и (AC)12. В изученной популяции гриба было выделено четыре аллельных варианта локуса (ACA)14 и три аллельных варианта локуса (AC)12. Результаты исследования показали, что уровень полиморфизма SSR-маркеров (ACA)14 и (AC)12 для омской популяции патогена оказался низким. Для более полной характеристики популяции по ДНК-маркерам необходимо использовать и другие SSR-маркеры.

Список литературы

1. Коршунова А. Ф., Чумаков А. Е., Щекочихина Р. И. Защита пшеницы от корневых гнилей. - Л.: Колос, 1976. - 184 с.

2. Михайлова Л. А., Пригоровская Т. Г. Желтая пятнистость листьев пшеницы - Pyrenophora tritici-repentis // Микология и фитопатология. - Т. 34. -Вып. 1. - С. 7-16.

3. Хасанов Б. А. Несовершенные грибы как возбудители основных заболеваний злаков в Средней Азии и Казахстане: автореф. дис. ... д-ра биолог. наук. - М., 1992. - 20 с.

4. Hosford R. M. Jr. A form of Pyrenophora trichostoma pathogenic to wheat and other grasses // Phytopathology. 1971. - Vol. 61. - P. 28-32.