СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ПУПОВИНЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ

1. Способ выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, включающий культивирование ткани пуповины в культуральной среде, содержащей DMEM (среду Игла, модифицированную по Дульбекко), F12 (среду Хэма F-12), М171 (среду 171) и ФБС (фетальную бычью сыворотку).
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит DMEM в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно от 5 до 15% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно от 15 до 30% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации приблизительно от 1 до 8% (об./об.).
3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит DMEM в конечной концентрации приблизительно от 57,5 до 62,5% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно от 7,5 до 12,5% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно от 17,5 до 25,0% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации от приблизительно 1,75 до 3,5% (об./об.).
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит DMEM в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 23,6% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации приблизительно 2,5% (об./об.).
5. Способ по любому из пп. 1-4, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит эпидермальный фактор роста (EGF) в конечной концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл.
6. Способ по любому из пп. 1-5, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит EGF в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл.
7. Способ по любому из пп. 1-6, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит инсулин в конечной концентрации приблизительно от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл.
8. Способ по любому из пп. 1-7, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит все три из аденина, гидрокортизона и натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).
11. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что указанная культуральная среда содержит аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевая соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий культивирование ткани пуповины до тех пор, пока разрастание клеток мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны не достигнет конфлюентности приблизительно 70-80%.
13. Способ по п. 12, включающий извлечение мезенхимальных стволовых клеток из контейнера для культивирования, применяемого для культивирования.
14. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что извлечение мезенхимальных стволовых клеток из контейнера для культивирования осуществляют ферментативной обработкой.
15. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что ферментативная обработка включает трипсинизацию.
16. Способ по любому из пп. 13-15, характеризующийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки переносят для субкультивирования в контейнер культивирования для субкультивирования.
6
17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что мезенхимальные клетки суспендируют для субкультивирования в концентрации 1,0×10 клеток/мл.
18. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки субкультивируют в культуральной среде как определено в любом из пп. 1-10.
19. Способ по п. 18, характеризующийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки субкультивируют до тех пор, пока мезенхимальные стволовые клетки не достигнут конфлюентности приблизительно 70-80%.
20. Способ по любому из пп. 16-19, характеризующийся тем, что субкультивирование осуществляют в автономном биореакторе.
21. Способ по п. 20, характеризующийся тем, что биореактор выбирают из группы, состоящей из биореактора с параллельными пластинами, биореактора с полыми волокнами и микрожидкостного биореактора.
22. Способ по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что ткань пуповины представляет собой кусок всей пуповины или амниотической мембраны пуповины.
2
23. Способ по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что культивирование проводят в инкубаторе для культивирования клеток с СО при температуре 37°С.
24. Способ по п. 23, включающий извлечение мезенхимальных стволовых клеток из контейнера для культивирования, применяемого для субкультивирования.
25. Способ по п. 24, характеризующийся тем, что извлечение мезенхимальных стволовых клеток из контейнера для культивирования осуществляют ферментативной обработкой.
26. Способ по п. 25, характеризующийся тем, что ферментативная обработка включает трипсинизацию.
27. Способ по п. 26, дополнительно включающий сбор выделенных мезенхимальных стволовых клеток.
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют следующие маркеры: CD73, CD90 и CD105.
29. Способ по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся тем, что по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток не экспрессируют следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR (антиген лейкоцитов человека - D-родственный антиген).
30. Способ по любому из пп. 28 или 29, характеризующийся тем, что приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR.
31. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий консервацию выделенных стволовых клеток/клеток-предшественников для дальнейшего применения.
32. Способ по п. 31, характеризующийся тем, что сохранение выполняется путем криоконсервации.
33. Выделенная популяция мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, в которой по меньшей мере приблизительно 97% или более клеток выделенной популяции стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют каждый из CD34, CD45 и HLA-DR.
34. Популяция мезенхимальных стволовых клеток по п. 33, характеризующаяся тем, что по меньшей мере, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют каждый из CD34, CD45 и HLA-DR.
35. Популяция мезенхимальных стволовых клеток по любому из пп. 33, 34, характеризующаяся тем, что популяция может быть получена способом, определенным в любом из пп. 1-30.
36. Популяция мезенхимальных стволовых клеток по любому из пп. 33, 34, характеризующаяся тем, что популяция получена способом, определенным в любом из пп. 1-30.
37. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенную популяцию мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, характеризующаяся тем, что по меньшей мере 97% или более клеток популяции стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD34, CD45 и HLA-DR.
38. Фармацевтическая композиция по п. 37, характеризующаяся тем, что фармацевтическая композиция адаптирована для системного или местного применения.
39. Фармацевтическая композиция по п. 37 или 38, дополнительно включающая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
40. Способ получения культуральной среды, пригодной для выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, включающий смешивание для получения конечного объема 500 мл культуральной среды следующих компонентов:
i. 250 мл DMEM
ii. 118 мл М171
iii. 118 мл DMEM/F12
iv. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (конечная концентрация 2,5%)
41. Способ по п. 40, дополнительно включающий добавление
v. 1 мл исходного раствора EGF (5 мкг/мл) для достижения конечной концентрации 10 нг/мл)
vi. инсулина, 0,175 мл исходного раствора (14,28 мг/мл) до конечной концентрации 5 мкг/мл.
42. Способ по п. 40 или 41, дополнительно включающий добавление к DMEM одной или нескольких следующих добавок: аденина, гидрокортизона, натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), для получения общего объема 500 мл культуральной среды.
43. Способ по п. 41, характеризующийся тем, что конечная концентрация добавок в DMEM является следующей:
приблизительно от 0,05 до 0,1 мкг/мл аденина, например, приблизительно 0,025 мкг/мл аденина,
приблизительно от 1 до 10 мкг/мл гидрокортизона,
приблизительно от 0,5 до 5 нг/мл натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), например 1,36 нг/мл натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).
44. Клеточная культуральная среда, которую можно получить способом по любому из пп. 40-43.
45. Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, включающий культивирование ткани амниотической мембраны в культуральной среде, приготовленной способом, определенным в любом из пп. 40-43.
46. Клеточная культуральная среда, содержащая:
- DMEM в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.),
- F12 в конечной концентрации приблизительно от 5 до 15% (об./об.),
- М171 в конечной концентрации приблизительно от 15 до 30% (об./об.) И
- ФБС в конечной концентрации приблизительно от 1 до 8% (об./об.).
47. Клеточная культуральная среда по п. 46, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда содержит DMEM в конечной концентрации приблизительно от 57,5 до 62,5% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно от 7,5 до 12,5% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно от 17,5 до 25,0% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации от приблизительно 1,75 до 3,5% (об./об.).
48. Клеточная культуральная среда по п. 47, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда содержит DMEM в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), М171 в конечной концентрации, приблизительно 23,6% (объем/объем) и ФБС в конечной концентрации приблизительно 2,5% (объем/объем).
49. Клеточная культуральная среда по любому из пп. 46-48, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит эпидермальный фактор роста (EGF) в конечной концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл.
50. Клеточная культуральная среда по любому из пп. 46-49, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда содержит EGF в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл.
51. Клеточная культуральная среда по любому из пп. 46-50, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда содержит инсулин в конечной концентрации приблизительно от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл.
52. Клеточная культуральная среда по п. 51, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда содержит инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.
53. Клеточная культуральная среда по любому из пп. 46-52, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).
54. Клеточная культуральная среда по п. 53, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда включает все три из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).
55. Клеточная культуральная среда по п. 53 или 54, характеризующаяся тем, что указанная культуральная среда содержит аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденин, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизон и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L- тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.
56. Клеточная культуральная среда по п. 46, характеризующаяся тем, что 500 мл этой клеточной культуральной среды содержат:
i. 250 мл of DMEM
ii. 118 мл М171
iii. 118 мл DMEM/F12
iv. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (конечная концентрация 2,5%)
57. Клеточная культуральная среда по п. 56, дополнительно содержащая
v. EGF в конечной концентрации 10 нг/мл
vi. Инсулин в конечной концентрации 5 мкг/мл.
vi. Инсулин 0,175 мл (конечная концентрация 5 мкг/мл)
58. Клеточная культуральная среда по п. 56 или 57, дополнительно содержащая аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.
59. Применение клеточной культуральной среды по любому из пп. 46-58 для выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины.
60. Применение клеточной культуральной среды по любому из пп. 46-58 для культивирования мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины.