Воздействие даларгина на функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови при остром экспериментальном панкреатите

Б. В. БАЛАЧЕВСКИЙ, А. Н. КУРЗАНОВ, А. А. СЛАВИНСКИЙ

ВОЗДЕЙСТВИЕ ДАЛАРГИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОМЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАНКРЕАТИТЕ

Кубанский государственный медицинский университет

Нейтрофильные лейкоциты обладают высоким биологическим потенциалом, который проявляется при их активации в ответ на повреждение клеток организма или воздействие цитокинов [10]. Это сопровождается активизацией ключевых ферментов «респираторного взрыва» - НАДФН-оксидазы и миелопероксиды (МПО), участвующих в генерации активных форм кислорода [3]. Избыточная активность НЛ приводит к повреждению близлежащих клеток [5, 7], что способствует более тяжелому течению ряда заболеваний [6, 2], в том числе острого панкреатита [8]. Опиоидные пептиды способны оказывать протекторное действие на поджелудочную железу при остром панкреатите. Аналог лей-энкефалина даларгин обладает иммуномодулирующим, противовоспалительным и цитопротекторым эффектами, ускоряет процессы репарации [1]. В этой связи представляет интерес исследование влияния да-ларгина на функциональную активность нейтрофилов при остром экспериментальном панкреатите.

Методика исследования

Для проведения эксперимента 28 самцов крысы (Sprague Dawley) разделили на четыре группы. В первый день эксперимента в I (контрольной) и II группах животным производили лапаротомию с последующим ушиванием раны. В III и IV группах моделировали острый экспериментальный панкреатит, вызванный глубоким охлаждением обеих поверхностей поджелудочной железы хлорэтилом. В послеоперационном периоде животным II и IV групп производили подкожные инъекции раствора даларгина в дозе 50 мкг/кг 3 раза в сутки ежедневно. На седьмые сутки эксперимента была проведена эвтаназия согласно требованиям AWMA Report on Euthanasia 2000 в СО2-камере с последующим вскрытием и изъятием кусочков ткани ПЖ для гистологического исследования. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

О способности НЛ к активации судили по активности НАДФН-оксидазы и МПО. Активность НАДФН-оксидазы оценивали с помощью НСТ-теста в модификации И. В. Нестеровой [4], а МПО - бензидиновым методом по

А. Sato [9]. Кровь для исследования брали из кончика хвоста в первые сутки до выполнения операции, затем на третьи и седьмые сутки эксперимента. Компьютерный анализ изображения клеток выполняли с помощью телевизионной системы с программным пакетом «Cito». Цветной аналоговой камерой производили захват и перенос изображения нейтрофилов в память компьютера с последующим определением геометрических и оптических параметров продукта реакции. Результаты оценивали с помощью интегрального цитохимического показателя, который представляет собой произведение суммарной площади продукта реакции и его оптической плотности.

Результаты исследования

На третьи сутки эксперимента в группе животных без моделирования панкреатита введение даларгина привело к увеличению активности НАДФ-Н-оксидазы1 в 1,23 раза (р<0,05), МПО - в 1,16 раза (р<0,01) (таблица) по сравнению с контрольной группой. В группе животных с острым экспериментальным панкреатитом реакцией на повреждение поджелудочной железы стало повышение активности НАДФ • Н-оксидазы в 4,05 раза (р<0,01) и снижение активности МПО в 5 раз (р<0,01) (таблица) в сравнении с показателями контрольной группы. Гистологическое изучение ткани поджелудочной железы выявило признаки генерализации ферментной аутоагрессии с вовлечением в патологический процесс дуоденальной зоны железы. В селезеночном сегменте отмечались крупные участки незавершенного некроза ацинарной ткани и дольки с неполноценной протоковой регенерацией, а также жировые некрозы с нагноением.

Инъекции даларгина животным с острым панкреатитом привели к снижению активности НАДФН-окси-дазы в 1,99 раза (р<0,01) и повышению активности МПО в 2,71 раза (р<0,01) (таблица) по сравнению с группой животных с острым панкреатитом без введения пептида. При гистологическом исследовании поджелудочной железы было обнаружено, что даларгин предотвращал увеличение участков некроза в селезеночном сегменте и распространение поражения аци-нарной паренхимы на дуоденальный сегмент. Репарация некротизированных тканей проходила путем неполноценной регенерации в виде протоковой трансформации без нагноения с последующим склерозом атрофированной ткани и четким отграничением от сохраненной жизнеспособной ацинарной ткани. На седьмые сутки эксперимента в группе животных с панкреатитом активность НАДФ • Н-оксидазы была выше контрольного значения в 2,96 раза (р<0,01). По сравнению со значением на третьи сутки эксперимента активность МПО увеличилась в 3,07 раза, но оставалась ниже контрольной группы в 1,65 раза (р<0,01) (таблица). При исследовании поджелудочной железы наблюдалось склерозирование поврежденных долек с еще сохраняющимся воспалением. Незавершенная регенерация жировых интерстициальных некрозов приводила к формированию в органе крупных очагов воспалительных лейкоцитарных инфильтратов, отграниченных фиброзной капсулой, а также образованию спаек с окружающими органами.

В группе животных с панкреатитом, леченных да-ларгином, наблюдались снижение активности НАДФН-оксидазы в 2,44 раза (р<0,01) и увеличение активности МПО в 1,26 раза (р<0,01) (таблица) по сравнению с группой животных, не получавших лечения. Морфологические изменения в поджелудочной железе значительно отличались от таковых в группе с панкреатитом

УДК 616.37-002.001.6-018+612.112.91-08

Активность НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы нейтрофилов при остром экспериментальном панкреатите

Aктивнoсть HAДФH-oксидазы

День N группы I II III IV

экспери- X±m X±m X±m X±m

мента п=5 п=5 n=9 n=9

Первый 0,б8±0,04 0,б7±0,03 0,б8±0,03 0,б3±0,03

р>0,б р>0,б р>0,б

Третий 0,б6±0,03 0,69±0,04 2,27±0,32 1,14±0,0б

р<0,0б p<0,01 p<0,01

Седьмой 0,б6±0,04 0,70±0,02 1,66±0,0б 0,68±0,02

p<0,02 p<0,01 р<0,б

Aктивнoсть миелопероксидазы

День N группы I II III IV

экспери- X±m X±m X±m X±m

мента п=5 п=5 n=9 n=9

Первый 0,63±0,01 0,61±0,02 0,6б±0,01 0,63±0,02

р>0,б р>0,б р>0,б

Третий 0,70±0,01 0,81±0,02 0,14±0,01 0,38±0,01

p<0,01 p<0,01 p<0,01

Седьмой 0,71±0,01 0,80±0,02 0,43±0,02 0,б4±0,01

p<0,02 p<0,01 p<0,01

р - доверительная вероятность различий однотипных показателей в разных сериях эксперимента по отношению к контрольной группе.

без лечения. Не прогрессировали и не нагнаивались жировые некрозы. Кроме того, были выражены процессы репарации и замещения участков деструкции соединительной тканью.

Обсуждение

Таким образом, даларгин оказывает стимулирующее действие на нейтрофилы животных без панкреатита, о чем свидетельствует увеличение активности исследуемых ферментов. Острый экспериментальный панкреатит сопровождается повышением активности только НАДФ • Н-оксидазы, активность миелопероксидазы в нейтрофилах снижается. Увеличение активности НАДФН-оксидазы указывает на активацию нейтрофилов. Снижение активности миелопероксидазы может быть следствием дегрануляции нейтрофилов в результате их гиперактивации с истощением этой ферментной системы. Такие изменения согласуются с литературными данными, поскольку параллельно снижению активности миелопероксидазы в нейтрофилах наблюдается ее повышение в паренхиме поджелудочной железы при развитии панкреатита [11]. При моделировании острого экспериментального панкреатита максимальные деструктивные изменения и воспалительная реакция в органе наблюдаются на третьи сутки эксперимента с постепенным развитием процессов склерозирования железы на седьмые сутки заболевания. Введение даларгина вызвало положительное воздействие на течение панкреатита: усиление процессов репарации, уменьшение зон некроза со снижением лейкоцитарной инфильтрации железы. Модулирующее воздействие пептида на нейтрофильные лейкоциты проявляется нормализацией активности ферментов в клетках.

Способность опиоидного пептида даларгина оказывать разнонаправленное действие в зависимости от функционального состояния нейтрофилов и благоприятно влиять на течение панкреонекроза может быть

обоснованием для использования препарата в патогенетической терапии острого панкреатита.

Поступила 29.09.2006 ЛИТЕРАТУРА

1. Курзанов А. Н., Титова Г. П., Виноградов В. А., Алейник В. А., Герасимов Н. Ф. Морфофункциональные изменения поджелудочной железы под влиянием даларгина в норме и при экспериментальном панкреатите // Бюл. эксп. биол. и мед. 1988. № 4. С. 445-447.

2. Лищенко О. В., Никитина Г. В., Славинский А. А. Активность щелочной фосфатазы и ее распределение в нейтрофилах крови при инфаркте миокарда // Клин. лаб. диагн. 2002. № 10. С. 12-13.

3. Маянский А. Н., Невмятуллин А. Л. Функциональное зондирование нейтрофилов: проблемы и перспективы // Клин. лаб. диагн. 1997. № 5. С. 24.

4. Нестерова И. В. Клинико-диагностическое значение NBT-теста при стафилококковых пневмониях у детей // Педиатрия. 1980. № 5. С. 50.

5. Славинский А. А., Никитина Г. В., Лищенко О. В. Цитохимические признаки активации нейтрофилов крови в начальном периоде инфаркта миокарда // Проблемы гематологии и переливания крови. 2002. № 1. С. 81.

6. Assimakopoulos S. F., Vagianos C. E., Zervoudakis G., Filos K. S., Georgiou C., Nikolopoulou V., Scopa C. D. Gut regulatory peptides bombesin and neurotensin reduce hepatic oxidative stress and histological alterations in bile duct ligated rats // Regul. Pept. 2004. V. 15, № 120 (1-3). Р. 185-193.

7. Ikeda Y., Young L. H., Scalia R., Ross C. R., Lefer A. M. PR-39, a proline/arginine-rich antimicrobial peptide, exerts cardioprotective effects in myocardial ischemia-reperfusion // Cardiovasc. Res. 2001. V. 49, № 1. Р. 69-77.

8. Osman M. O., Jensen S. L. Acute pancreatitis: the pathophysiological role of cytokines and integrins. New trends for treatment? // Dig. Surg. 1999. V. 16, № 5. Р. 347-362.

9. Sato A. Normal leukocytes as they appear under the peroxidase reaction // J. lab. clin. med. 1928. V. 13. P. 1058-1064.

10. Schratzberger P., Reinisch N., Kahler C. M., Wiedermann C. J. Deactivation of chemotaxis of human neutrophils by priming with secretogranin II-derived secretoneurin // Regul. Pept. 1996. V. 63, № 2-3. Р. 65-71.

11. Wang X. P., Wu L. Y., Wu K., Zhang R. L., Dong Y. W. The role of lipopolysacchride-binding protein in the pathogenesis of animal model of acute necrotizing pancreatitis // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2003. V. 83, № 18. Р. 1619-1623.

B. V. BALACHEVSKIY, A. N.KURZANOV, A. A. SLAVINSKIY

INFLUENCE DALARGIN ON IS FUNCTIONAL-METABOLIC ACTIVITY NEUTROPHILS OF BLOOD AT THE ACUTE EXPERIMENTAL PANCREATITIS

Hyperactivity neutrophil leukocytes can promote to additional damage of a pancreas at a acute pancreatitis. By us it is established, that dalargin normalizing an effect has on activity neutrophils, reduces damage, and strengthens reparation of pancreas.

А. Д. БРЕЗДЫНЮК, К. М. РЕЗНИКОВ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭЛЕКТРОАКТИВИРОВАННЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ НА ЭМБРИОН И ПЛОД

Кафедра фармакологии ГОУ ВПО ВГМА им. Н. Н. Бурденко Росздрава

Введение

В настоящее время среди различных факторов внешней среды, способных вызывать отклонения в развитии плода, важная роль принадлежит лекарственным веществам. В отечественной литературе содержится обширный список лекарственных веществ для лечения в неонатальном периоде детей [10]. В то же время в литературе отсутствуют публикации о результатах рандомизированных многоцентровых испытаний, в которых была бы доказаны клиническая эффективность, полезность и, главное, безопасность такой терапии у новорожденных [8].

В лаборатории кафедры фармакологии ГОУ ВПО ВГМА им. Н. Н. Бурденко Росздрава (заведующий кафедрой - проф. К. М. Резников) в течение ряда лет ведутся исследования фармакологических свойств электроактивированных растворов (ЭАВР), в частности, католита с pH =8,8-9,2 и ОВП от -450 до -600 мВ, обладающего электродонорными свойствами и способностью восстанавливать клеточные мембраны, и анолита с pH =6,45-7,35, ОВП от +500 до +1100 мВ, обладающего сильно выраженными бактерицидными свойствами за счет наличия в нем сильных окислителей и свободных радикалов [7]. Из литературных данных известно широкое применение ЭАВР в медицине [1, 6]. Однако практическое использование анолитов и католитов значительно опережает их научное изучение, особенно с фармакологических позиций. Особое значение для их дальнейшего внедрения в практическую медицину имеют знания о действии этих растворов на эмбрион, плод и последующее развитие новорожденного. Нами было проведено такое исследование.

Методика исследования

Исследования выполнены на 18 самках-кроликах массой 2500 г, которым в течение 6 дней внутривенно вводили ЭАВР, и 473 белых беспородных крысах массой 180-200 г, которые ежедневно получали ЭАВР в течение 3 половых циклов без ограничения доступа (283 самки и 190 самцов). Все животные были отобраны по массе и возрасту и перед экспериментами проходили карантинный период продолжительностью 21 день, после этого животных распределяли на 3 равные группы: 1-я (К) - получавшие католит в течение

3 половых циклов при свободном доступе, 2-я (А) -получавшие анолит, 3-я (В) - контрольные животные, получавшие питьевую воду. Содержание и кормление животных проводились в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» (ГОСТ Р 50258-92). При проведении эксперимента на животных были соблюдены все этические правила и нормы по отношению к ним [5]. Процесс декапитации крыс проводили под общим ингаляционным наркозом, убедившись, что у животного отсутствует болевая чувствительность и утрачено сознание.

В своей работе мы использовали методы определения острой токсичности [2]. Изучение влияния элек-троактивированных водных растворов на репродуктивную систему определяли на основе морфологического и функционального анализа состояния яичников, цитологического исследования вагинального содержимого, иммунофлюоресцентного метода определения уровня ЛГ и эстрадиола в плазме крови самок-кроли-ков. Проводились оценка способности к оплодотворению и зачатию, наблюдение за беременностью и родоразрешением у крыс, за физическим и нервнопсихическим развитием детенышей, висцеральное исследование органов по Стейплсу [9].

Достоверность изменений внутри групп устанавливали с использованием критерия Стьюдента между группами с применением непараметрического критерия Т-Вилькоксона. Для оценки взаимосвязи между некоторыми качественными признаками пользовались четырехпольной таблицей и критерием X2 [3].

Результаты исследования

При исследовании острой токсичности католита и анолита при различных способах введения (подкожном, внутрибрюшинном, пероральном при свободном доступе в качестве растворов, замещающих питье) показано, что они не обладают токсическими свойствами при однократном введении, то есть не было гибели даже при введении больших доз ЭАВР. В дальнейших экспериментах, где ЭАВР использовали внутрь у самок длительностью до 30 суток, у самцов до 70 суток, также не отмечалось никаких токсических проявлений их действия.

При анализе полового цикла и его отдельных фаз

УДК 618-055.2:541.135.001.6