ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ НА ОСНОВЕ CYAA, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ИНДУКЦИИ ИМУННОГО ОТВЕТА

1. Полинуклеотид, кодирующий белок на основе CyaA, включающий или состоящий из:
1) фрагмента белка CyaA Bordetella pertussis, представленного в SEQ ID NO: 2, причем последовательность указанного фрагмента начинается с первого остатка SEQ ID NO: 2 и заканчивается остатком, расположенным от положения 183 до положения 227 SEQ ID NO: 2, или варианта, обладающего по меньшей мере 95% сходством с указанным фрагментом, слитого с
2) фрагментом белка CyaA Bordetella pertussis, представленного в SEQ ID NO: 2, причем последовательность указанного фрагмента начинается с остатка, расположенного от положения 321 до положения 387 в SEQ ID NO: 2, и заканчивается последним остатком в SEQ ID NO: 2, или вариантом, обладающим по меньшей мере 95% сходством с указанным фрагментом.
2. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что указанный белок на основе CyaA выбран из группы, состоящей из:
1) полипептида, включающего или состоящего из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10, или его варианта с по меньшей мере 95% сходством с указанным полипептидом;
2) полипептида, включающего или состоящего из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12, или его варианта с по меньшей мере 95% сходством с указанным полипептидом;
3) полипептида, включающего или состоящего из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19, или его варианта с по меньшей мере 95% сходством с указанным полипептидом;
4) полипептида, включающего или состоящего из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 20, или его варианта с по меньшей мере 95% сходством с указанным полипептидом.
3. Полинуклеотид по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный белок на основе CyaA включает или состоит из:
1) полипептида, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 13;
2) полипептида, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 14;
3) полипептида, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 15;
4) полипептида, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 16;
5) полипептида, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 17; или
6) полипептида, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18.
4. Химерный полинуклеотид, кодирующий химерный белок, причем указанный полинуклеотид включает или состоит из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент белка CyaA Bordetella pertussis, представленный в SEQ ID NO: 2, причем последовательность указанного фрагмента начинается с первого остатка SEQ ID NO: 2 и заканчивается остатком, расположенным между положениями 183 и 227 в SEQ ID NO: 2, или варианта, обладающего по меньшей мере 95% сходством с указанным фрагментом, (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид, и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент белка CyaA Bordetella pertussis, представленный в SEQ ID NO: 2, причем последовательность указанного фрагмента начинается с остатка, расположенного между положениями 321 и 387 SEQ ID NO: 2, и заканчивается последним остатком SEQ ID NO: 2, или варианта, обладающего по меньшей мере 95% сходством с указанным фрагментом.
5. Химерный полинуклеотид по п. 4, выбранный из группы, состоящей из:
1) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-227 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 321-1706 SEQ ID NO: 2, 4 или 6;
2) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-227 в SEQ ID NO: 8; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 321-1705 SEQ ID NO: 8;
3) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-183 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 387-1706 SEQ ID NO: 2, 4 или 6;
4) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-183 SEQ ID NO: 8; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 387-1705 SEQ ID NO: 8;
5) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-227 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 387-1706 SEQ ID NO: 2, 4 или 6;
6) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-227 SEQ ID NO: 8; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 387-1705 SEQ ID NO: 8;
7) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-183 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 321-1706 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; и
8) полинуклеотида, включающего или состоящего из, в направлении от 5' к 3', (а) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 1-183 SEQ ID NO: 8; (b) полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; и (с) полинуклеотида, кодирующего фрагмент полипептида, состоящий из остатков 321-1705 SEQ ID NO: 8;
6. Полинуклеотид по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что указанный вариант белка на основе CyaA способен связываться с клетками-мишенями и/или транслоцировать свой аденилатциклазный домен в цитозоль клетки-мишени.
7. Химерный полинуклеотид по п. 4 или 5, отличающийся тем, что указанный вариант белка на основе CyaA способен связываться с клетками-мишенями и/или транслоцировать свой аденилатциклазный домен в цитозоль клетки-мишени.
8. Применение полинуклеотида, кодирующего белок на основе CyaA согласно любому из пп. 1-3 или 6 для получения химерного белка, включающего или состоящего из указанного белка на основе CyaA и гетерологичного полипептида, причем полинуклеотид, кодирующий указанный гетерологичный полипептид, клонирован между указанными фрагментами 1) и 2) CyaA, как описано по п. 1.
9. Химерный полинуклеотид по любому из пп. 4-5, дополнительно включающий на 3'-конце полинуклеотид, кодирующий белок CyaC штамма Bordetella, в частности, штамма Bordetella pertussis.
10. Вектор, предпочтительно плазмида, включающий полинуклеотид по любому из пп. 1-3 и 6 или химерный полинуклеотид по любому из пп. 4-5 и 7, 9 и последовательности, контролирующие экспрессию, и, необязательно, дополнительно включающий кодирующую последовательность cyaC штамма Bordetella.
11. Культура клеток, предпочтительно культура штамма Е. coli, содержащих полинуклеотид по любому из пп. 1-3 и 6 или химерный полинуклеотид по любому из пп. 4-5 и 7, 9, или содержащих вектор по п. 10.
12. Белок на основе CyaA, кодируемый полинуклеотидом по любому из пп. 1-3 и 6 или химерным полинуклеотидом по любому из пп. 4-5 и 7, 9, экспрессируемый с вектора по п. 10 или продуцируемый культурой клеток по п. 11.
13. Химерный белок, кодируемый химерным полинуклеотидом по любому из пп. 4-5 и 7, 9, экспрессируемый с вектора по п. 10 или продуцируемый культурой клеток по п. 11.
14. Химерный белок, включающий или состоящий из, от N-конца к С-концу, (а) фрагмента белка CyaA Bordetella pertussis, представленного в SEQ ID NO: 2, причем последовательность указанного фрагмента начинается с первого остатка SEQ ID NO: 2 и заканчивается остатком, расположенным от положения 183 до положения 227 SEQ ID NO: 2, или варианта, обладающего по меньшей мере 95% сходством с указанным фрагментом, (b) гетерологичного полипептида, и (с) фрагмента белка CyaA Bordetella pertussis, представленного в SEQ ID NO: 2, причем последовательность указанного фрагмента начинается с остатка, расположенного от положения 321 до положения 387 SEQ ID NO: 2, и заканчивается последним остатком SEQ ID NO: 2, или варианта, обладающего по меньшей мере 95% сходством с указанным фрагментом.
15. Химерный белок по п. 14, выбранный из группы, состоящей из:
1) белка, включающего или состоящего из, от N-конца к С-концу, (а) фрагмента, включающего остатки 1-227 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; (b) гетерологичного полипептида; и (с) фрагмента, включающего остатки 321-1706 SEQ ID NO: 2, 4 или 6;
2) белка, включающего или состоящего из, от N-конца к С-концу, (а) фрагмента, включающего остатки 1-227 SEQ ID NO: 8; (b) гетерологичного полипептида; и (с) фрагмента, включающего остатки 321-1705 SEQ ID NO: 8;
3) белка, включающего или состоящего из, от N-конца к С-концу, (а) фрагмента, включающего остатки 1-183 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; (b) гетерологичного полипептида; и (с) фрагмента, включающего остатки 387-1706 SEQ ID NO: 2, 4 или 6; и
4) белка, включающего или состоящего из, от N-конца к С-концу, (а) фрагмента, включающего остатки 1-183 SEQ ID NO: 8; (b) гетерологичного полипептида; и (с) фрагмента, включающего остатки 387-1705 SEQ ID NO: 8.
+
+
16. Химерный белок по п. 14 или п. 15, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полипептид несет по меньшей мере один эпитоп(ы), предпочтительно, по меньшей мере один эпитоп(ы) CD8 и/или по меньшей мере один эпитоп(ы) CD4.
17. Химерный белок по любому из пп. 14-15, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полипептид включает один или несколько вирусных или клеточных или бактериальных или грибковых или паразитарных антигенов или эпитопов.
18. Химерный белок по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что размер указанного гетерологичного полипептида находится в диапазоне от 9 до 500 или от 20 до 500 или от 50 до 500 или от 100 до 500 аминокислотных остатков.
19. Химерный белок по любому из пп. 14 или 15, отличающийся тем, что указанный гетерологичный полипептид несет отрицательный электростатический заряд или включает фрагмент, от 10 до 40% размера которого несет отрицательный электростатический заряд.
20. Химерный белок по любому из пп. 14-15, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид обладает последовательностью SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 или SEQ ID NO: 74.
21. Композиция, включающая химерный белок по любому из пп. 14-20 и подходящий фармацевтический носитель и, необязательно, по меньшей мере один адъювант.
22. Химерный белок по любому из пп. 14-15 или композиция по п. 21 для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в индукции профилактического иммунного ответа или терапевтического иммунного ответа.
23. Химерный белок по любому из пп. 14-15 или композиция по п. 21 для применения в профилактике или лечении инфекции, вызванной патогеном, или онкогенного нарушения.
24. Химерный белок по любому из пп. 14-15 или композиция по п. 21 для применения (i) в иммунотерапевтическом лечении первого установленного патологического состояния(й), диагностированного у хозяина-млекопитающего, путем стимуляции Т-клеточного иммунного ответа против первой группы эпитопов, содержащихся в указанном полипептиде(ах), и (ii) в профилактике второго установленного патологического состояния(й) у того же хозяина-млекопитающего путем стимуляции иммунного ответа Т-клеток памяти против второй группы эпитопов, содержащихся в указанном полипептиде(ах), причем указанные иммунные ответы получают после введения химерного белка или композиции указанному хозяину, причем указанная профилактика второго установленного патологического состояния(й) не наблюдается в случае отсутствия второй группы эпитопов в указанном введенном полипептиде(ах) в составе вектора.
25. Способ получения химерного белка, включающий:
(a) делецию из полинуклеотида, кодирующего CyaA Bordetella, представленный в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, нуклеотидного фрагмента, первые три нуклеотида которого кодируют аминокислотный остаток, расположенный от остатка 184 до остатка 228 SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, а последние 3 нуклеотида которого кодируют аминокислотный остаток, расположенный от остатка 320 до остатка 386 SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8;
(b) инсерцию в полинуклеотид, полученный на этапе (а), на место делетированного нуклеотидного фрагмента, полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид; причем этапы (а) и (b) можно проводить в любом порядке или одновременно;
(c) экспрессии в клетке полинуклеотида, полученного на этапе (b); и
(d) выделение указанного экспрессированного химерного белка.
26. Способ по п. 25, включающий этап объединения в составе химерной полинуклеотидной конструкции полинуклеотида, полученного на этапе (b), и полинуклеотида, кодирующего белок CyaC, в частности, химерная полинуклеотидная конструкция включает полинуклеотид, полученный на этапе (b), и полинуклеотид, кодирующий белок CyaC, в результате чего после указанного объединения полученный химерный полинуклеотид включает или включает, от 5'-конца к 3'-концу, полинуклеотидную конструкцию из этапа (b), а затем полинуклеотидную конструкцию, кодирующую белок CyaC штамма Bordetella, в частности, штамма Bordetella pertussis.
27. Способ по п. 25 или 26, отличающийся тем, что указанный этап (а) состоит из делеции из полинуклеотида, кодирующего CyaA Bordetella, представленный в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, нуклеотидного фрагмента, кодирующего остатки 228-320 SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, или нуклеотидного фрагмента, кодирующего остатки 184-386 SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, или нуклеотидного фрагмента, кодирующего остатки 228-386 SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, или нуклеотидного фрагмента, кодирующего остатки 184-320 SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, или отличающийся тем, что указанный этап а) состоит из делеции из полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7, или в SEQ ID NO: 69, нуклеотидного фрагмента, состоящего из нуклеотидов 682-960 SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7, или SEQ ID NO: 69, или нуклеотидного фрагмента, состоящего из нуклеотидов 550-1158 SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7, или SEQ ID NO: 69, или нуклеотидного фрагмента, состоящего из нуклеотидов 682-1158 SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7, или SEQ ID NO: 69, или нуклеотидного фрагмента, состоящего из нуклеотидов 550-960 SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7 или SEQ ID NO: 69.