СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮША
METHOD OF SERUM DIAGNOSTICS OF PERTUSSIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для серологической диагностики коклюша методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Несмотря на высокий охват населения в России и за рубежом вакцинацией против коклюша заболеваемость коклюшем остается на значительном уровне, причем уровень бессимптомной заболеваемости значительно превышает уровень манифестных форм инфекции. В связи с этим, своевременная диагностика заболевания играет важную роль в борьбе с коклюшем, при этом большое значение имеют методы серологической диагностики коклюша, из которых оптимальным является метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на выявлении антител к антигенам Bordetella pertussis в сыворотках больных коклюшем.
Известен способ диагностики коклюша путем иммобилизации на 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах комплекса антигенов коклюшного микроба, добавления в них разведений исследуемых сывороток, приливания к ним пероксидазных коньюгатов моноспецифических антисывороток к IgG общему, IgM и IgA человека, затем добавления субстратной смеси (перекиси водорода и 5-аминосалициловой кислоты), измерения оптической плотности субстратной смеси на вертикальном фотометре при длине волны 450 нм, характеризующийся тем, что для выявления присоединившихся к иммуносорбенту антител используют пероксидазные конъюгаты антител к IgG общему, IgM и IgA человека, а в качестве антител в составе конъюгата используют моноспецифические антисыворотки (Е.М.Зайцев, И.К.Мазурова, М.С.Петрова, Л.И.Краснопрошина, Н.С.Захарова. Диагностическое значение IgG, IgA и IgM антител к антигенам Bordetella pertussis у больных коклюшем. Журн. микробиол., 2008, №6, с.23-26).
Известный способ основан на определении повышенных уровней противококлюшных IgG общих, IgM и IgA антител к антигенам коклюшного микроба в сыворотках крови больных коклюшем. Повышенные уровни противококлюшных антител являются серологическим маркером коклюша, однако противококлюшные IgM антитела в сыворотках больных определяются только у части больных и, главным образом, в течение короткого времени от начала заболевания, а повышенные уровни IgG общих и IgA антител также могут обнаруживаться и у практически здоровых людей. У детей младшего возраста относительно высокие уровни IgG общих антител могут быть результатом вакцинации, а у детей старшего возраста и взрослых высокие титры IgG общих и IgA антител являются результатом ранее перенесенного коклюша в бессимптомной или стертой форме. Повышенные уровни IgG общих и IgA антител могут сохраняться в течение длительного времени после выздоровления, что затрудняет серологическую диагностику коклюша. Таким образом, проблема повышения специфичности диагностики коклюша является актуальной до настоящего времени.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа диагностики коклюша методом ИФА, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью.
Технический результат заявляемого способа заключается в повышении специфичности метода серологической диагностики коклюша, позволяющей дифференцировать по иммунологическим показателям текущую коклюшную инфекцию от показателей иммунитета здоровых лиц и переболевших коклюшем.
Для достижения указанного технического результата в способе серологической диагностики коклюша путем внесения в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированным комплексом антигенов коклюшного микроба исследуемых сывороток крови человека, добавления к ним пероксидазного конъюгата антител к IgG3 человека, прибавления субстратной смеси, регистрации оптической плотности смеси и на основе оптической плотности смеси выявления титра присоединившихся к иммуносорбенту противококлюшных IgG3 антител человека, согласно изобретению в качестве субстратной смеси используют готовую форму тетраметилбензидина с перекисью водорода, выявленные титры IgG3 антител человека 1:40 принимают как соответствующие заболеванию коклюшем.
Чувствительность метода оценивают по частоте выявления повышенных уровней IgG3 антител у больных коклюшем.
Использование пероксидазного конъюгата моноклональных антител мыши к IgG3 человека для серологической диагностики коклюша основано на особенностях катаболизма и короткого периода полужизни IgG3 антител, вследствие чего повышенные уровни IgG3 антител определяются только у больных коклюшем и отсутствуют у здоровых лиц и перенесших коклюш.
Сущность изобретения поясняется на следующем примере.
Пример.
Постановку ИФА осуществляют в 96-луночных полистироловых планшетах с плоским дном. В лунки планшетов вносят по 0,1 мл раствора комплекса антигенов коклюшного микроба в концентрации 40 мкг/мл в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 и выдерживают планшеты в течение 2 ч при температуре 37 град. С, а затем в течение 16-18 ч при температуре 4-6 град. С. После этого лунки планшетов трижды промывают 0,3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора pH 7,4 с 0,005% твина-20. Далее в лунки планшетов вносят серийные разведения исследуемых сывороток 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 в 0,1 М фосфатном буферном растворе pH 7,4 с 0,005% твина-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина. Планшеты выдерживают 1 ч при 37 град. С и трижды промывают лунки 0,3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора pH 7,4 с 0,005% твина-20. После этого в лунки планшетов вносят по 0,1 мл рабочего разведения пероксидазного конъюгата моноклональных антител мыши к IgG3 человека в 0,1 М фосфатном буферном растворе pH 7,4 с 0,005% твина-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина. Планшеты выдерживают в течение 1 ч при 37 град. С, после чего лунки планшетов трижды промывают 0,3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора pH 7,4 с 0,005% твина-20 и добавляют в них по 0,1 мл готовой субстратной смеси тетраметилбензидина с перекисью водорода. Планшеты выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре в недоступном для света месте и добавляют в лунки по 0,1 мл 2 М серной кислоты. При взаимодействии пероксидазы из пероксидазного конъюгата с субстратной смесью и с серной кислотой появляется желтое окрашивание смеси, которое регистрируют как значения оптической плотности на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм.
Титры IgG3 антител 1:40 принимают соответствующие заболеванию коклюшем. За титр сывороток принимают величины, обратные их максимальным разведениям, при которых значения оптической плотности не менее чем на 50% превышают значения оптической плотности в лунках с контролем реагентов (адсорбированный антиген - пероксидазный конъюгат - субстратная смесь).
С помощью заявляемого способа в сравнении с известным были исследованы 184 сыворотки больных коклюшем, 140 сывороток здоровых детей 3-5 лет и 115 сывороток здоровых детей 9-11 лет с целью выявления заболевания коклюшем и оценки специфичности заявляемого метода. Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Изучение чувствительности заявляемого и известного способов серологической диагностики коклюша
Обследованные
Отношение обследованных, давших положительную реакцию, к общему числу обследованных
IgA
IgG общий
IgG3
Больные коклюшем n=184
Абс.
%
Абс.
%
Абс.
%
155/184
84,2
159/184
86,4
168/184
91,3
Как следует из данных, представленных в таблице 1, исследование чувствительности заявляемого метода показало наличие заболевания у 168 больных коклюшем из 184 исследованных больных, что составляло 91,3%, в то время как с помощью известного метода с определением IgA и IgG общих антител наличие заболевания было определено у 155 из 184 больных и у 159 из 184 больных соответственно, что составляло 84,2% и 86,4% соответственно. Таким образом, чувствительность заявляемого метода была высокой, не уступала и даже несколько превышала чувствительность известного метода.
Сравнительное изучение специфичности заявляемого и известного методов (Таблица 2) показало преимущество заявляемого метода, поскольку при обследовании сывороток 140 здоровых детей 3-5 лет заявляемым способом только 2 ребенка дали неспецифическую реакцию, что составляло 1,4%, при исследовании сывороток 115 здоровых детей 9-11 лет - 2 ребенка дали неспецифическую реакцию, что соответствовало 1,7% и свидетельствовало о высокой специфичности заявляемого способа, в то время как при исследовании сывороток этих же групп детей с определением IgA антител неспецифическую реакцию дали 8 детей в первой группе и 14 детей во второй группе, что соответствовало 5,7% и 12,2%, а с IgG общими антителами 23 ребенка в первой группе и 13 детей во второй группе, что составляло 16,4% и 11,3% соответственно. Таким образом, заявляемый способ диагностики высоко специфичен, так как выявляет повышенные титры IgG3 антител только у больных коклюшем (% неспецифических реакций был низок и не превышал 1,7%), в то время как при диагностике известным способом % неспецифических реакций был значительно выше и достигал 16,4%. Различия между заявляемым и известным методом статистически достоверны (при р<0,05).
Таблица 2
Изучение специфичности заявляемого и известного способов серологической диагностики коклюша
Обследованные
Отношение обследованных, давших положительную реакцию, к общему числу обследованных
IgA
IgG общий
IgG3
Абс.
%
Абс.
%
Абс.
%
Здоровые дети 3-5 лет (группа 1) N=140
8/140
5,7
23/140
16,4
2/140
1,4
Здоровые дети 9-11 лет (группа 2) n=115
14/115
12,2
13/115
11,3
2/115
1,7
Преимущество изобретения заключается в том, что разработан метод серологической диагностики коклюша, обладающий высокой чувствительностью и по специфичности превосходящий известный метод и позволяющий по иммунологическим показателям выявлять текущую коклюшную инфекцию у больных. Метод может быть использован для диагностики коклюшной инфекции.