ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО
ANTIVIRAL AGENT

Изобретение относится к противовирусным средствам, а именно к синтетическим биологически активным производным, и может быть использовано в фармацевтической промышленности, медицине, растениеводстве и в биотехнологиях.
Заявленное вещество имеет выраженную противовирусную активность, направленную против различных просто- и сложноустроенных вирусов, содержащих РНК или ДHK, и способно инактивировать эти вирусы в свободном внеклеточном положении.
Вирусные инфекции представляют одну из наиболее серьезных проблем современной медицины. Большинство вирусных инфекций или вообще не имеют средств для их лечения, или крайне плохо поддаются лечению. Это связано с недостаточной эффективностью существующих препаратов и изменчивостью возбудителей, приводящей к появлению устойчивых форм. Схожие проблемы актуальны для ветеринарии и сельского хозяйства. Еще меньше существует препаратов, способных действовать на вирусы вне клеток, что объясняется полным отсутствием у вирусов метаболизма, который является основной мишенью противомикробных препаратов.
Вирусы, состоящие из органических молекул, не являются живыми организмами, не имеют клеточного строения, лишены метаболизма, что делает их максимально устойчивыми к различным воздействиям, в том числе химических веществ и лекарственных препаратов.
Число вирусов, вызывающих болезни человека, животных и растений непрерывно увеличивается, в основном за счет совершенствования методов их выявления, а также распространения в связи с экономической деятельностью человека (освоение новых территорий, преимущественно в Африке) и формирования новых вариантов уже известных вирусов (изменчивость вирусов гриппа и др.). Число общедоступных антисептиков для промышленности, медицины, ветеринарии и сельского хозяйства является явно недостаточным. Большая часть существующих препаратов имеет ряд выраженных недостатков и прежде всего токсичность, неприятный запах, малую эффективность. Наблюдается формирование и распространение устойчивых вирусных клонов. Все это повышает актуальность создания новых препаратов, способных действовать на вирусные частицы.
Известно, что инактивировать вирусы могут некоторые дезинфицирующие вещества, которые обладают достаточно высокой токсичностью, в связи с чем их нельзя использовать непосредственно у человека. Известно средство, которое обладает антивирусной активностью при сравнительно низкой токсичности - хлоргексидина биглюконат (ХГ). Имеются неоднозначные данные разных авторов о действии ХГ на разные вирусы как по их спектру, так и времени воздействия. Так указывают, что ХГ активен только против сложноустроенных вирусов, имеющих дополнительную липидно-белковую оболочку, Denton G.W. 1991. Chlorhexidine, p.274-289. In Block S.S..(ed), Disinfection, sterilization and preservation, 4th ed. Lea and Fibiger, Philadelphia, PA. J. clin. Path., 1972, 25, 76-78.
ХГ эффективен против вируса герпеса при 10 минутном действии, снижая количество его частиц на 5-6 порядков, и в этих же условиях практически не действовал на простоустроенные вирусы, лишенные дополнительной оболочки, аденовирусы и поливирусы. Нет надежных данных об активности ХГ против вирусов бактерий - бактериофагов. Несмотря на очевидные недостатки ХГ на сегодня является самым распространенным средством воздействия на вирусные частицы с целью их инактивации.
Известно противовирусное средство на основе меланина, содержащее водорастворимый меланин в концентрации от 0,002 мг/мл до 25 мг/мл, полученный экстракцией из базидиального гриба Inonotus obliquus и обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа, простого герпеса 2-го типа, иммунодефицита (ВИЧ-1) и осповакцины, RU 2480227, опубл. 27.04.2013.
Недостатком данного средства является узкий спектр действия.
60
Известно противовирусное средство на основе производного фуллерена C КВ-517, имеющего структурную формулу:
в качестве микробицидного противовирусного средства для ингибирования вирусов простого герпеса и цитомегаловируса, RU 2012130924 A, опубл. 27.01.2014.
Эффективность этого средства весьма мала, предположительно, оно может быть использовано в профилактических целях.
Известно антивирусное средство с общей структурной формулой:
где Y выбран из группы, состоящей из арила, гетероарила, замещенного арила и замещенного гетероарила;
НЕТ выбран из группы, состоящей из шестичленного ариленового цикла, шестичленного гетероариленового цикла, содержащего один, два или три гетероатома из N, О или S, WO 2008008912 A1, опубл. 17.01.2008.
Данное средство активно практически только в отношении вирусов семейства Flaviviridae, вызывающих цирроз и рак печени у человека и животных.
2,6
8,10
2,6
8,10
Наиболее близким к заявленному средству с точки зрения структуры является противовирусное средство, так же, как и заявленное, содержащее гидразиновые группы и карбонильные фрагменты: противовирусное средство на основе 4-{3,5-Диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]додец-11-ен-4-ил}-4-азатетрацикло [5.3.2.0.0]додец-11-ен-3,5-дион формулы:
обладающее активностью в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека и животных, RU 2423359 С1, опубл. 10.07.2011.
Его недостатком, как и приведенных выше аналогов, является узкий спектр действия, невысокая эффективность особенно в отношении вирусов в свободном внеклеточном положении.
Задачей настоящего изобретения является создание противовирусного средства широкого спектра действия, обладающего активностью в отношении вирусов как во внутриклеточном, так и во внеклеточном положении.
Согласно изобретению задача решается противовирусным средством на основе поли-N1-гидразино(имино)метил-1,6-гександиамин-поли-N1-амино(имино)метил-1,6-гександиамина общей формулы:
где: HX - кислота, n=3-20, m=4-20, обладающее активностью в отношении просто- и сложноустроенных, содержащих РНК или ДHK вирусов человека, животных, растений, бактерий и грибов.
Заявителем не выявлены какие-либо технические решения, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию патентоспособности «Новизна».
При n×m<12 активность препарата недостаточна, при n×m>400 вещество становится малорастворимым в воде и биологических средах и потому малоэффективным.
Примеры получения противовирусного средства.
Пример 1: n=5, m=6.
В трехгорлую колбу вместимостью 1 л, снабженную трубкой для подачи инертного газа, термометром и газоотводной трубкой, загружали 95,5 г (1 моль) иминомочевины гидрохлорида (46,8 масс.%), 103,4 г (0,89 моль) 1,6-диаминогексана (ДГ) (50,7 масс.%) и 5,0 г (0,1 моль) гидразингидрата (2,5 масс.%), после чего колбу продували азотом. Содержимое колбы перемешивали и помещали в воздушный термостат, а газоотводную трубку подсоединяли к приемнику для улавливания аммиака. Затем при продувании азотом со скоростью 30-40 мл/мин нагревали реакционную смесь и в течение 1 ч доводили температуру массы до 200°C с постепенной отгонкой воды и аммиака. Выдерживали 30 мин при 200°C, после чего повышали температуру до 210°C и выдерживали еще 1 ч, продувая систему азотом. После этого охлаждали систему до 160°C и горячую сиропообразную массу выливали на металлический противень, охлаждали и получили 169,9 продукта в виде твердого, практически бесцветного прозрачного стекловидного вещества.
Пример 2. Противовирусное средство получали аналогично примеру 1, при этом n=10, m=10, ДГ=0,50 моль, ГГ=0,1 моль. Температуры и время выдержки приведены в таблице 1 (см. ниже).
Пример 3. Получение вещества осуществляли аналогично примеру 1, n=28, m=20, ДГ=1,8 моль, ГГ=0,1 моль, температуры и время выдержки приведены в таблице 1.
Образующийся полимер является нестереорегулярным, то есть взаимное расположение чередующихся звеньев гидразина и 1,6-диаминогексана в полимерной цепочке может быть любым. Но усредненное количественное соотношение этих звеньев, задаваемое пропорцией исходных реагентов, в каждом примере имеет постоянное значение.
Таблица 1
Пример №
Температура реакции, °C
Время реакции, ч
Средний молекулярный вес продукта (формула)
Данные элементного анализа, %
С
Н
N
Сl
1
190
0,5
2544(C<sub>95</sub>H<sub>224</sub>Cl<sub>15</sub>N<sub>46</sub>)
44,71
8,83
25,48
20,98
2
210
1
13445(C<sub>505</sub>H<sub>1171</sub>Cl<sub>80</sub>N<sub>241</sub>)
45,0
8,79
25,17
21,08
3
210
4,5
26769(C<sub>1010</sub>H<sub>2339</sub>Cl<sub>160</sub>N<sub>481</sub>)
45,03
8,77
25,08
20,09
Субстанция противовирусного средства имеет наноструктуру.
Наноструктура определена методами динамического рассеяния света с использованием анализатора размера частиц Malvern Instruments Nanosizer Nano-ZS и с использованием просвечивающего электронного микроскопа FEI Tecnai G212Cryol12 с возможностью охлаждения образцов по температуре кипения жидкого азота.
Методом динамического рассеяния света установлено, что при концентрации препарата 0,05 мг/мл в растворе содержатся глобулы размером 10-15 нм. При электронно-микроскопическом исследовании также были выявлены глобулы 10-15 нм.
Ниже приведены примеры использования заявленного противовирусного средства.
Пример 1
Изучение действия противовирусного средства на простоустроенный РНК-содержащий полиовирус - вирус, вызывающий полиомиелит, относящийся к семейству Picornaviridae, вызывающий заболевания людей.
Противовирусное средство использовали в виде 1,0% водного раствора. Время выдержки вируса со средством составило 0,5-2,0 минут при температуре 20±2°C.
50
Вирусы человека выращивали на культуре клеток. Противовирусную активность определяли методом инактивации на поверхности искусственной кожи. В экспериментах использован нейтрализатор (сыворотка крупного рогатого скота). Репродукцию вируса в клетках оценивали по вирусиндуцированному цитопатическому эффекту по степени ингибирования инфекционного титра вируса, измеряемого в lg ТЦИД (50%-тканевая цитопатическая инфекционная доза). Для работы с вирусом полиомиелита использовали перевиваемую культуру клеток почки зеленых мартышек Vero.
Таблица 1
Исследование вирулицидной активности средства при обработке тест-объектов, инфицированных вирусом полиомиелита 1,0% раствором противовирусного средства
Тест
Время обеззараживания, мин
Степень ингибирования, lg ТЦИД<sub>50</sub>
Способ обработки
Искусственная кожа
0,5
3,2
Протирание
1,0
4,0
2,0
4,5
2,5×2 раза
4,5
Таким образом, противовирусное средство обладает вирулицидной активностью по отношению к простоустроенному РНК-содержащему вирусу.
Пример 2
50
Изучение действия противовирусного средства на простоустроенных ДНК-содержащих аденовирусах. Аденовирусы различных серотипов вызывают инфекционные болезни человека и животных (крупного рогатого скота, птиц, овец, собак). Инфекционные болезни животных, вызываемые аденовирусами, характеризуются поражением слизистых оболочек органов дыхания, кишечника, глаз, а также лимфоидной ткани. Для работы с аденовирусом использовали перевиваемую линию клеток человека HeLa. Репродукцию вирусов в клетках оценивали по вирусиндуцированному цитопатическому эффекту по степени ингибирования инфекционного титра вируса, измеряемого в lg ТЦИД.
Противовирусное средство использовали в виде 0,5% водного раствора. Время выдержки вируса со средством составило 0,5-2,0 минут при температуре 20±2°C.
Таблица 2
Исследование вирулицидной активности противовирусного средства при обработке тест-объектов, инфицированных аденовирусами 0,5% раствором
Тест
Время обеззараживания, мин
Степень ингибирования, lg ТЦИД<sub>50</sub>
Способ обработки
Искусственная кожа
0,5
3,4
Протирание
1,0
4,0
2,0
4,0
1,5×2 раза
4,0
Таким образом, испытуемое средство обладает вирулицидной активностью по отношению к простоустроенным ДНК-содержащим аденовирусам человека и животных.
Пример 3
Изучение действия противовирусного средства на сложноустроенных ДНК-содержащих вирусах простого герпеса. Вирусы герпеса различных серотипов вызывают инфекционные болезни человека и животных. Инфекции этих вирусов проявляются поражениями слизистых, кожи, злокачественной трансформацией клеток.
50
Для работы с вирусом герпеса использовали перевиваемую культуру клеток почки зеленых мартышек Vero. Репродукцию вируса в клетках оценивали по вирусиндуцированному цитопатическому эффекту по степени ингибирования инфекционного титра вируса, измеряемого в lg ТЦИД.
Противовирусное средство использовали в виде 1,0% водного раствора. Время выдержки вируса со средством составило 0,5-4,0 минут при температуре 20±2°C.
Таблица 3
Исследование вирулицидной активности средства при обработке тест-объектов, инфицированных вирусом простого герпеса 1,0% раствором
Тест
Время обеззараживания, мин
Степень ингибирования, lg ТЦИД<sub>50</sub>
Способ обработки
Суспензионный тест
1,0
1,0
Смешивание вирус:средство (1:9)
Искусственная кожа
0,5
2,0
Протирание
1,0
2,5
2,0
3,0
1,5×2 раза
4,0
Таким образом, испытуемое средство обладает вирулицидной активностью по отношению к сложноустроенным ДНК-содержащим вирусам.
Пример 4
Изучение действия противовирусного средства на сложноустроенный РНК-содержащий вирус гепатита C, относящийся к семейству Flaviviridae, вызывающий заболевания людей, а также приматов и собак.
Противовирусное средство использовали в виде 0,5% водного раствора. Время выдержки вируса со средством составило 0,5-4,0 минут при температуре 20±2°C.
50
Вирусы гепатита C выращивали на культуре клеток. Противовирусную активность определяли методом инактивации на поверхности искусственной кожи. В экспериментах использован нейтрализатор (сыворотка крупного рогатого скота). Репродукцию вируса в клетках оценивали по вирусиндуцированному цитопатическому эффекту по степени ингибирования инфекционного титра вируса, измеряемого в lg ТЦИД. Для работы с вирусом гепатита C использовали культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).
Таблица 4
Исследование вирулицидной активности средства при обработке тест-объектов, инфицированных вирусом гепатита C 0,5% раствором
Тест
Время обеззараживания, мин
Степень ингибирования, lg ТЦИД<sub>50</sub>
Способ обработки
Суспензионный тест
0,5
3,5
Смешивание вирус: средство (1:9)
1,0
4,5
Искусственная кожа
1,0
4,2
Протирание
Таким образом, испытуемое средство обладает вирулицидной активностью по отношению к сложноустроенному РНК-содержащему вирусу гепатита C.
Пример 5
Изучение действия противовирусного средства на сложноустроенные РНК-содержащие вирусы иммунодефицита человека. Вирусы иммунодефицита человека различных серотипов вызывают инфекционные болезни человека и животных (обезьяны).
50
Для работы с вирусом иммунодефицита использовали лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Репродукцию вируса в клетках оценивали по вирусиндуцированному цитопатическому эффекту по степени ингибирования инфекционного титра вируса, измеряемого в lg ТЦИД.
Противовирусное средство использовали в виде 1,0% водного раствора. Время выдержки вируса со средством составило 0,5-4,0 минут при температуре 20±2°C.
Таблица 5
Исследование вирулицидной активности средства при обработке тест-объектов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека 1,0% раствором
Тест
Время обеззараживания, мин
Степень ингибирования, lg ТЦИД<sub>50</sub>
Способ обработки
Суспензионный тест
1,0
3,5
Смешивание вирус:средство (1:9)
Искусственная кожа
0,5
4,0
Протирание
1,0
4,0
2,0
4,5
1,5×2 раза
5,0
Таким образом, испытуемое средство обладает вирулицидной активностью по отношению к сложноустроенному РНК-содержащему вирусу иммунодефицита человека и животных.
Пример 6
Изучение действия противовирусного средства на сложноустроенный РНК-содержащий вирус гриппа A, вызывающий заболевания людей и животных (птиц, свиней, лошадей).
Противовирусное средство использовали в виде 0,5% водного раствора. Время выдержки вируса со средством составило 0,5-4,0 минут при температуре 20±2°C.
50
Вирусы выращивали на культуре клеток. Противовирусную активность определяли методом инактивации на поверхности искусственной кожи. В экспериментах использован нейтрализатор (сыворотка крупного рогатого скота). Репродукцию вируса в клетках оценивали по вирусиндуцированному цитопатическому эффекту по степени ингибирования инфекционного титра вируса, измеряемого в lg ТЦИД. Для работы с вирусом гриппа A использовали клетки почки собаки (MDCK).
Таблица 6
Исследование вирулицидной активности средства при обработке тест-объектов, инфицированных вирусом гриппа A 0,5% раствором
Тест
Время обеззараживания, мин
Степень ингибирования, lg ТЦИД<sub>50</sub>
Способ обработки
Суспензионный тест
1,0
4,0
Смешивание вирус:средство (1:9)
Искусственная кожа
1,0
4,2
Протирание
2,0
4,7
1,5×2 раза
5,0
Таким образом, испытуемое средство обладает вирулицидной активностью по отношению к сложноустроенному РНК-содержащему вирусу гриппа, вызывающему заболевания людей и животных.
Пример 7
Действие противовирусного средства на вирусы бактерий (бактериофаги)
Для исследования использовали коммерческий комплекс бактериальных вирусов, используемый для лечения кишечных инфекций, вызванных бактериями родов Shigella, Escherichia, Salmonella Proteus, Pseudomonas Staphylococcus.
Тестирование проводили на штамме Shigella flexneri 2a VT-13-678. P. aeruginosa VT-900, P.vulgaris VT-12-445 S. aureus VT-209. Бактериофаги помещали в 0,5% раствор противовирусного средства на 60 секунд, осаждали на миллипоровых фильтрах, промывали изотоническим раствором хлорида натрия, после чего смывали бактериофаги и определяли их титр методом агаровых слоев.
Таблица 7
Обработка вирусов бактерий противовирусным средством
Тест-микроб
Титр вируса до обработки
Титр вируса после 30 секунд воздействия
Титр вируса после 60 секунд воздействия
Shigella flexneri 2a
10<sup>5</sup>/мл
10
0
Р. aeruginosa VT-900
10<sup>5</sup>/мл
10
0
P. vulgaris VT-12-445
10<sup>4</sup>/мл
0,5
0
S. aureus VT-209
10<sup>6</sup> мл
40
0
Таким образом, за одну минуту происходит полная инактивация использованной смеси вирусов-бактериофагов.
Пример 8
Подавляющее большинство вирусов растений является РНК-содержащими, простоустроенными вирусами. Таковым является и использованный в исследовании X-вирус картофеля (Potato virus X, PVX).
Вирусы картофеля помещали в 1,0% раствор противовирусного средства на 60 секунд, осаждали на миллипоровых фильтрах, промывали изотоническим раствором хлорида натрия, после чего смывали вирусы, готовили и заражали клетки в условиях микроклонального черенкования in vitro.
При первом черенковании проводили анализ на пораженность вирусами методом иммуноферментного анализа с фиксированием результатов анализов фотометром. Результаты исследования показали, что обработка X-вируса картофеля противовирусным препаратом полностью подавляет вирусную инфекцию.
Результаты испытаний заявленного средства показали, что оно обладает вирулицидным действием на различные, в том числе неродственные просто- и сложноустроенные, ДНК и РНК-содержащие вирусы человека, животных, растений и бактерий.
Таблица 8
Пораженность вирусом
Испытуемое растение
Поглощение при 490 нм
7 дней
14 дней
Положительный контроль
0,09
0,850
Отрицательный контроль
0,07
0,09
Противовирусное средство
0,07
0,08
Результаты исследования показали, что обработка X-вируса картофеля противовирусным препаратом полностью подавляет вирусную инфекцию.
Результаты испытаний заявленного средства показали, что оно обладает вирулицидным действием на различные, в том числе неродственные просто- и сложноустроенные, ДНК и РНК-содержащие вирусы человека, животных, растений и бактерий.