ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ "ТВ-ГАММА-ИНТЕРФЕРОН-ТЕСТ"

Полезная модель относится к области биотехнологии и медицины, а именно к оборудованию для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), а именно к приспособлениям для диагностики аллергических заболеваний и туберкулеза.
В настоящее время иммуноферментный анализ является одним из наиболее точных методов, используемых в медицинской диагностике (Иммунологические методы. Под ред. Г.М.Фринель, М., Медицина, 1987, с.166) Как правило, для проведения иммуноферментного анализа используют различные наборы, в состав которых входят подложки для реагентов и наборы реактивов. В качестве подложки используют, в частности, специальные пластиковые планшеты с лунками, в которых помещены антигены или иные реагенты Так, планшет для анализа на аллергены (св. РФ на полезную модель №21) представляет собой горизонтальную плоскость с бортиками и размещенными по плоскости лунками, внутренняя поверхность которых имеет многослойное покрытие, содержащее смеси аллергенов, а также комплекс иммуноглобулинов IgE и сыворотки крови человека.
Комплектность набора для ИФА определяется теми задачами, которые решает данный набор. В частности, известен набор для иммуноферментного анализа, используемый для выявления в крови антител к возбудителям Torch-инфекций (RU 2298795). В состав набора входят:
- подложка из полистирола, на часть которой дополнительный слой, содержащий антигены возбудителей TORCH-инфекций или человеческие иммуноглобулины (для контроля эффективности работы конъюгата), а на свободные от них участки подложки природные или синтетические полимеры,
такие как казеин, бычий сывороточный альбумин или полиэтиленгликоль.
- емкости, содержащие конъюгат и растворы для его отмывки и разведения,
- емкость, содержащая проявитель для усиления иммунологического сигнала, (растворимую соль серебра и восстанавливающий агент);
- таблетки, содержащие сухую смесь метола и лимонной кислоты
3
- флакон, содержащий - 10%-ный раствор AgNO
Данная тест-система применяется для решения конкретной задачи и не может быть использована для определения цитокинов, в частности, гамма-интерферона (гамма-ИНТ).
Наиболее близкой по технической сущности к заявлякмому решению является тест-система для определения гамма-интерферона "Гамма-Интерферон-ИФА-Бест" (Инструкция по применению набора реагентов А-8752 "Гамма-Интерферон-ИФА-Бест" ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск. Лицензия №42/055/2001).
В состав тест-системы входят:
- планшет с иммобилизованными моноклональными антителами к гамма-ИНТ;
- флаконы с образцами гамма-ИНТ для калибровки;
- флакон с контрольным образцом гамма-ИНТ;
- флакон с конъюгатом №1 - биотинилированными антителами к гамма-ИНТ;
- флакон с конъюгатом №2 - стрептовидин-пероксидазой хрена;
- Емкость, содержащая раствор хромогена - тетраметилбензидина (ТМБ);
- флакон с растворами для разведения конъюгата;
- флакон с буферными растворами;
- флакон со стоп-реагентом.
Недостатком набора является невозможность в его помощью проведения дифференциальной диагностики туберкулезной инфекции и аллергий.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание тест-системы для дифференциальной диагностики поствакцинальной БЦЖ-аллергии и туберкулезного инфицирования.
Указанная задача была решена в результате создания тест-системы «ТВ-гамма-интерферон-ТЕСТ», которая включала в себя:
- полистироловый планшет, в лунках которого сорбированы моноклональные антитела к ИФН-γ,
- флакон, содержащий раствор рекомбинантного ИФН-у в концентрации 1600 пг/мл в 50% плазме здорового человека,
- флакон, содержащий раствор для разведения образцов,
- флакон, содержащий раствор промывочного 20-кратного раствора,
- флакон, содержащий раствор меченых биотином детектирующих моноклональных антител,
- флакон, содержащий раствор ферментного коньюгата стрептавидина и пероксидазы,
- флаконы, содержащие растворы для разведения коньюгата,
- флакон, содержащий раствор субстратного буферного раствора содержащего перекись водорода,
- флакон, содержащий раствор хромогена - тетраметилбензидин (ТМБ)
- флакон, содержащий раствор стоп-реагента (фосфорная кислота).
- стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой, содержащие контрольный физиологический раствор и стерильные растворы антигенов, а также белки ESAT-6 и CFP-I0 и о туберкулин PPD.
Измерение с использованием тест-системы «ТВ-гамма-интерферон-ТЕСТ» проводят следующим образом. У пациента шприцом берут из вены 5 мл крови и переносят в пробирку, содержащую 50 ед. гепарина, кровь перемешивают. В четыре стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой, содержащие по 10 мкл контрольного физиологического раствора и стерильных растворов антигенов в концентрации 1 мг/мл последовательно туберкулин PPD, ESAT-6 и CFP-I0 вносили по 1 мл гепаринизированной крови, закрывали крышками и оставляли в термостате при 37°С до утра. Затем из пробирок тщательно, не смешивая, отбирали по 200-300 мкл надосадочной плазмы и проводили анализ для определения концентрации ИФН-γ с помощью иммуноферментной тест-системы либо образцы замораживали при не выше чем при температуре -20°С до использования в течение месяца.
В 2-х первых вертикальных рядах планшета, инкубируют последовательные 2-кратные разведения раствора ИФН-γ в плазме человека, по 2 лунки на каждое разведение (от 1600 пг/мл до 50 пг/мл); В последние 2 лунки вносят контрольный раствор для разведения
образцов. В остальные лунки планшета, также по 2 лунки для каждого образца вносят последовательно по 50 мкл контрольных образцов, плазму (без антигенов), плазму с туберкулином и образцы плазмы с антигенами ESAT-6 или ESAT-6 и СРР-10. Все исследуемые образцы разводят 1:1 раствором для разведения образцов. Образцы плазмы инкубируют 1 час при 37°С, отмывают 4 раза однократным моющим раствором, вносят детектирующие антитела, инкубируют 1 час при 37°С, вновь отмывают моющим раствором, вносят ферментный коньюгат, инкубируют 30 мин при 37°С, вновь отмывают и вносят субстратный буферный раствор, содержащий перекись водорода и хромоген ТМБ, инкубируют в темноте не более 20 мин и останавливают реакцию стоп-реагентом.
Реакцию анализируют с помощью специального фотометра для иммуноферментного анализа при длине 450 нм. При использовании специальной программы прибор, на основе расчета калибровочной кривой в первых 2-х рядах планшета рассчитывает концентрацию ИФН-γ в каждой лунке с анализируемыми образцами.
При определении ИФН-γ в образце плазмы инкубированной с туберкулином выше 400 пг/мл (2 ME) и ниже этого порогового уровня в образце с антигеном ESAT-6 и/или CFP-I0 делают заключение о наличии поствакцинальной БЦЖ-аллергии. При наличии индукции ИФН-γ выше порогового уровня с туберкулином и с антигеном ESAT-6 делают заключение о туберкулезной инфицированности.
Всего с помощью новой тест-системы было обследовано 175 человек Результаты обследования приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Индукция гамма-ИНТ у больных с первичной туберкулезной инфекцией
№
Диагноз
Кол-во
Концентрация ИНФ γ, пг/мл
Р (различия поанти-гену ESAT-6)
ППД
ESAT-6
1.
Ранний период туберкулезной инфекции - «вираж» реакции Манту
52
3537±255
2317±243
2.
Туберкулез внутригрудных лимфоузлов
25
3980±504
2844±427
3.
Плеврит тубэтиологии
7
2653±1192
2705±1020
4.
Туберкулин отрицательные-здоровые
31
846±182
39±33
Сравнение с группами 1,2,3<0,001
5.
Туберкулин отрицательные-неспецифические заболевания
20
908±212
43±38
Сравнение с группами 1,2,3<0,001
6.
Поствакцинная БЦЖ-аллергия (положительная р.Манту)
40
2295±274
37±26
Сравнение с группами 1,2,3<0,001
Как следует из результатов, приведенных в таблице 1, у детей с поствакцинной БЦЖ-аллергией уровень индукции интерферона-гамма с туберкулином ППД (2367±401пг/мл) статистически не отличался от детей и подростков с подтвержденной туберкулезной инфекцией - «вираж» р.Манту (3537±255 пг/мл), тогда как при использовании рекомбинантного антигена ESAT-6 уровень индукции интерферона-гамма высоко достоверно (Р<0,001) отличался (был незначительным) от группы детей с туберкулезной инфекцией и не отличался от групп здоровых и туберкулин-отрицательных детей, т.е., у которых туберкулезная инфекция отсутствовала.
Анализ полученных данных показал высокую точность, надежность и относительную простоту заявляемого способа.