СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЬБЕНДАЗОЛОМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОГО РЕЦИДИВА ЦИСТНОГО ЭХИНОКОККОЗА
METHOD FOR PREDICTION OF EFFECTIVENESS OF PREVENTION BY ALBENDAZOLE OF POSTOPERATIVE RECURRENT OF CISTIC ECHINOCOCCOSIS

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития рецидивных эхинококковых кист при профилактическом лечении альбендазолом.
Известно, что после операции по поводу цистного эхинококкоза, проведенной даже с применением высокотехнологичной современной хирургической помощи, могут развиться рецидивные кисты. С 1996 года по настоящее время широко применяют препарат «альбендазол» для противорецидивного лечения с эффективностью 40-70% [Назыров Ф.Г., Девятов А.В., Акбаров М.М., Махмудов У.М., Бабаджанов А.Х. Химиотерапия и проблемы рецидивного эхинококкоза печени. Анналы хирургической гепатологии. 2011. - Т. 16. - №4 - С. 19-24; Руководство по хирургии очаговых паразитарных заболеваний печени / Н.В. Мерзликин, Альперович Б.И., Бражникова Н.А. и др.; под ред. Н.В. Мерзликина. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2013. - 468 с]. Абсолютной (100%) результативности химиотерапии цистного эхинококкоза альбендазолом добиться до сих пор не удается.
Большинство лекарственных средств, попадая в организм человека, не оказывают прямого биологического эффекта, а вначале подвергаются биотрансформации. В первой фазе биотрансформации участвуют ферменты суперсемейства цитохромов Р450, локализованных в основном на мембранах клеток печени и легких. Гены, кодирующие синтез цитохромов Р450, отличаются значительным полиморфизмом [Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины / под ред. B.C. Баранова. - СПб. : Изд-во Н-Л, 2009. - 528 с].
Почти все аллели генов цитохромов, в зависимости от влияния на метаболизм лекарств, подразделяются на группы: быстрых, промежуточных и медленных метаболайзеров. У медленных метаболайзеров, в отличие от быстрых и промежуточных, часто наблюдается существенно более длительный период полувыведения. Появление «быстрого» аллеля, приводящего к повышению активности фермента, вызывает усиление биотрансформации, быстрое выведение и поэтому слабый терапевтический эффект. В настоящее время известно, что в организме человека альбендазол метаболизируется в альбендазол-сульфоксид, обладающий противогельминтным действием, а затем в альбендазол-сульфон, не имеющий биологической активности. Превращение в альбендазол-сульфон осуществляет изоформа цитохрома Р450 CYP1A2 [Клиническая фармакология по Гудману и Гилману / под ред. А.Г. Гилмана // Изд. «Практика», 2006]. Ген, контролирующий синтез CYP1A2, имеет несколько полиморфизмов, один из наиболее функционально значимых - *1F(163A/C). Генотип CYP1A2F1*A/A этого гена, соответствующий «быстрому» метаболизму, а значит и непродолжительному терапевтическому действию, встречается с частотой 33% (у представителей европейской популяции) и 61% (у представителей азиатской популяции) [Анализ ассоциации полиморфного варианта С-163А гена у больных раком легкого в РС(Я) В.М. Николаев, Ф.Г. Иванова, П.М. Иванова, Е.Н. Александрова и др. // Сибирский онкологический журнал. 2013. - Приложение №2. - С.52].
Таким образом, генетическое тестирование полиморфизма *1F(163A/C) гена CYP1A2 у больных цистным эхинококкозом позволит прогнозировать слабый лечебный эффект альбендазола у носителей «быстрого» аллеля, а значит большую вероятность развития послеоперационной рецидивной кисты.
Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности способа прогнозирования эффективности химиотерапии альбендазолом для профилактики рецидива у больных цистным эхинококкозом.
Техническим результатом изобретения является получение критериев для прогнозирования повышенного риска рецидива у больных цистным эхинококкозом на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.
Указанный технический результат достигается способом прогнозирования эффективности профилактики альбендазолом послеоперационного рецидива цистного эхинококкоза, характеризующимся тем, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма *1F(163A/C) гена CYP1A2, кодирующего изоформу цитохрома Р450, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, и при обнаружении генотипа CYP1A2F1*C/C прогнозируют высокую эффективность профилактики альбендазолом послеоперационного рецидива цистного эхинококкоза у обследуемого, а при обнаружении генотипа CYP1A2F1 *А/А - низкую эффективность профилактики.
Способ доступен по реактивам и оборудованию и осуществляется следующим образом.
Материалом для исследования служат образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови у больных эхинококкозом методом фенольно-хлороформной экстракции, описанным Mathew С.С. (The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. J.M. Walker.- New York., London. - 1984,- Vol. 2. - P. 31-34).
1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трисНСl (рН 7,6).
2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4 000 об./мин.
3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0 и суспензируют.
4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.
Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.
1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0.5 мл 5 М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисНСl до рН 7,8.
2. Смесь центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин.
3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.
4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.
5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.
2
6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной HO; раствор хранят при t -20°C.
В дальнейшем полученную ДНК используют для исследования генного полиморфизма CYP1A2*1F(163A/C) методом ПЦР-ПДРФ анализа (полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции синтеза ДНК) в стандартных условиях по ранее описанной методике [Sachsa С, Bhambra U., Smith G., Lightfoot T.J. et al. Polymorphisms in the cytochrome P450 CYP1A2 gene in colorectal cancer patients and controls: allele frequencies, linkage diequilibrium and influence on caffeine metabolism/ Br. J. Clin. Pharmacol. 2003. V.55(l). P68-76.]. Для амплификации нужного фрагмента применяют локусспецифические олигонуклеотидные праймеры: F5′ TGAGGCTCCTTTCCAGCTCTCA3′ и R5′AGAAGCTTGTGGCCGAGAAGG3′ с температурой отжига 57°С.
После амплификации ПЦР-продукты подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции ApaI в стандартных условиях. Для этого 5 мкл амплификата смешивают с 5 ед фермента в соответствующем буфере, смесь инкубируют при температуре согласно инструкциям производителей («Сибэнзим», Новосибирск) на протяжении 12 часов. Фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7-8% ПААГ, окрашивают раствором бромида этидия и анализируют в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.
При обнаружении фрагментов ДНК размером 265 пн диагностируют генотип CYP1A2F1*A/A «быстрого» метаболайзера альбендазол-сульфоксида; при выявлении фрагментов длиной 265, 211 и 54 пн - генотип CYP1A2F1*A/C «промежуточного»; и при обнаружении фрагментов ДНК размерами 211 и 54 пн - генотип CYP1A2F1*C/C «медленного» метаболайзера.
Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациент А., обратился в клинику с жалобами на боли в области правого подреберья. При УЗИ органов брюшной полости в правой доле печени (сегмента VIII) выявлено объемное образование размерами 71x62 мм неоднородной структуры, смешанной эхогенности, с четкими контурами. При осмотре и физикальном исследовании по системам органов других патологических изменений не выявлено. Больной оперирован, выполнена эхинококкэктомия. Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем генотипа CYP1A2F1*A/A «быстрого» метаболайзера. В отношении эффективности профилактики альбендазолом развития рецидивных эхинококковых кист у обследуемого прогноз неблагоприятный.
Через 2 года пациент обратился с теми же жалобами. При УЗИ в правой доле печени (сегмента VIII) выявлено объемное образование размерами 30×25 мм.
Пример 2. Пациент С., обратился в клинику с жалобами на боли в области правого подреберья. При УЗИ органов брюшной полости в правой доле печени (сегмента VIII) выявлено объемное образование размерами 75×55 мм неоднородной структуры, смешанной эхогенности, с четкими контурами. При осмотре и физикальном исследовании по системам органов других патологических изменений не выявлено. Больной оперирован, выполнена эхинококкэктомия. Проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем генотипа CYP1A2F1*C/C «медленного» метаболайзера. В отношении эффективности профилактики альбендазолом рецидивных эхинококковых кист прогноз благоприятный. Через 3 года у пациента при диспансерном наблюдении кист не обнаружено.