ПЛЕНОЧНЫЙ ТВЕРДОКОНТАКТНЫЙ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК И ЕЕ ИНТЕРКАЛЯТОРОВ

Заявленное техническое решение относится к области аналитической химии и фармакологии, а именно к устройствам для определения ДНК и лекарственных препаратов, и может быть использовано для определения ДНК и ее интеркаляторов в водных растворах.
Определение интеркаляторов ДНК, в том числе антибиотиков, имеет большое научное и промышленное значение. Недостатком применяемых в настоящее время устройств для ДНК-диагностики является громоздкость и высокая стоимость. Устройства для быстрой и простой ДНК-диагностики требуются в медицине, фармакологии и ветеринарии. Большинство известных электрохимических сенсоров для определения ДНК основаны на использовании дауномицина [M.Pividori, A.Merkoci, S.Alegret, Biosens.Bioelectron. 15 (2000) 291, M.Mascini, I.Palchetti, G.Marrazza, Fresenius J Anal Chem, 369 (2001) 15]. Недостатком данных сенсоров является высокая токсичность дауномицина.
Известно устройство для чувствительного определения вируса гепатита В, имеющее в своем составе однонитевые олигонуклеотиды [A.Erdem, K.Kerman, B.Meric, U.S.Acarca, M.Ozsoz, Anal.Chim.Acta, 422 (2000) 139, В.Meric, K.Kerman, D.Ozkan, P.Kara, S.Erensoy, U.S.Acarsa, M.Mascini, M.Ozsos, Talanta, 56 (2002) 837]. Устройство состоит из угольно-пастового электрода, на поверхности которого иммобилизованы 21- и 24-мерные однонитевые олигонуклеотиды, комплементарные к специфическим участкам ДНК вируса. Устройство функционирует следующим образом. Пробу генетического материала, полученную после полимеразной цепной реакции, на основе реальных образцов сыворотки крови больных, помещают на поверхность сенсора и после гибридизации измеряют сигнал окисления интеркалятора метиленового синего с помощью квадратноволновой вольтамперометрии. В присутствии ДНК вируса происходит снижение тока пика, пропорциональное содержанию нуклеиновых кислот в пробе. Устройство позволяет получать хорошо воспроизводимый сигнал при требуемом объеме пробы 10 мкл. К недостаткам данных сенсоров следует отнести необходимость иммобилизации ДНК или олигонуклеотидов на поверхности электродов, что усложняет изготовление сенсора и повышает его стоимость.
Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа по наибольшему количеству совпадающих признаков и достигаемому техническому результату, являются мембранные электроды на основе ионообменника динонилнафталинсульфоната (ДННС) для титриметрического определения нативной ДНК на уровне 2.4-20 мг/л с использованием протамина в качестве титранта [N.Durust, M.E.Meyerhoff, 602 (2007) 138-141]. Композитная мембрана данного электрода состоит из 49.5% нитрофенилоктилового эфира, 1% ДННС и 49.5% полиуретана. Общим недостатком пленочных электродов с полимерными мембранами является сложность достижения однородной толщины мембраны и равномерного распределения в ней компонентов, что не позволяет получать хорошо воспроизводимый и стабильный сигнал. Процедура изготовления поверхностного слоя многостадийна и проводится обычно вручную. Это снижает воспроизводимость характеристик сенсора и его сигнала. Кроме того, данное устройство не позволяет контролировать присутствие веществ, взаимодействующих с ДНК и влияющих на ее связывание с протамином.
Технической задачей создания данной полезной модели являются повышение надежности, точности и простоты работы устройства для определения ДНК и ее интеркаляторов, а также исключение использования токсичных реагентов в составе сенсора и при проведении измерения.
Заявленное техническое решение устраняет недостатки, присущие наиболее близкому аналогу, и обеспечивает реализацию поставленной задачи. Технический результат заключается в снижении продолжительности анализа, в повышении точности и надежности определения ДНК, в обеспечении возможности определения лекарственных препаратов - интеркаляторов ДНК, в возможности работы в широком диапазоне рН, а также в исключении токсичных реагентов из состава сенсора и при проведении измерения.
Пленочный потенциометрический сенсор для определения ДНК титриметрическим методом, характеризующийся тем, что сенсор состоит из полимерной пленки и стеклоуглеродного электрода, выполненного из тефлонового корпуса и стеклоуглеродного стержня внутри корпуса, контактирующего с медным токосъемником. В качестве полимерной пленки используется полимерная форма метиленового синего. Полимерная пленка получается путем электрополимеризации метиленового синего в нейтральной или слабощелочной среде.
Такое выполнение потенциометрического сенсора обеспечивает технический результат - простоту измерения сигнала в широком диапазоне рН, надежность работы и высокую точность определения ДНК и ее интеркаляторов - за счет использования в составе сенсора покрытия на основе полимерной формы метиленового синего. Наличие электрополимеризованной пленки обеспечивает однородность и устойчивость покрытия, характеристики которого определяются параметрами электрополимеризации и легко регулируются на стадии получения полимера. Данное покрытие сохраняет обратимость электрохимических реакций, необходимую для проведения окислительно-восстановительного титрования, в широком диапазоне рН, и обеспечивает воспроизводимость сигнала.
Конструкция потенциометрического сенсора представлена на фиг.1. Потенциометрический сенсор состоит из стеклоуглеродного электрода, состоящего из токосъемника 1, изолирующего корпуса из политетрафторэтилена 2 и стеклоуглеродного стержня 3, а также из полимерной пленки метиленового синего 4. Полимерная пленка должна иметь определенную толщину, обеспечиваемую условиями электролиза: она должна быть выполнена путем электроосаждения из раствора метиленового синего в фосфатном буферном растворе на стеклоуглеродный электрод в потенциодинамическом режиме в интервале от - 900 до 900 мВ при скорости сканирования 50-150 мВ/с. При меньшей толщине пленки снижается устойчивость покрытия и снижается воспроизводимость сигнала, а при большей толщине пленка хуже удерживается на поверхности стеклоуглеродного электрода.
Данное устройство используется для титриметрического определения ДНК и интеркаляторов ДНК. Устройство функционирует следующим образом. Для измерения сигнала потенциометрический сенсор и хлоридсеребряный электрод сравнения опускают в ячейку, содержащую 5 мл фосфатного буферного раствора при рН 6-8 и измеряют величину э.д.с. После установления постоянного значения проводят титрование 0.001 М раствором гидрохинона и определяют величину скачка титрования. Затем проводят аналогичное измерение величины э.д.с., но уже в присутствии в ячейке дезоксирибонуклеиновой кислоты в концентрации 0.075-2.5 мг/л. После установления постоянного значения приливают раствор гидрохинона в количестве, установленном в контрольном титровании в отсутствие ДНК, и определяют величину скачка титрования. Типичная кривая изменения э.д.с. во время титрования приведена на фиг.2. Рассчитывают разность величин скачка титрования в отсутствие и в присутствии ДНК (ΔЕ), которую регистрируют как сигнал потенциометрического сенсора. Полученные значения в серии измерений по одному параметру усредняют по 6 измерениям, воспроизводимость измерений определяют как среднее относительное стандартное отклонение. Воспроизводимость сигнала составляет 3.5±1.2%. При определении интеркаляторов ДНК измерение проводят аналогичным образом, но в ячейку, содержащую 5 мл фосфатного
буферного раствора, вносят фиксированный объем дезоксирибонуклеиновой кислоты и раствор интеркалятора до концентрации в ячейке 5-30 мкг/л. Полученный раствор перемешивают в течение 1-30 минут, затем приливают раствор гидрохинона в количестве, установленном в контрольном титровании, и далее измеряют скачок титрования.
Примеры использования устройства для определения ДНК и антибиотиков доксорубицина и рубомицина приведены ниже.
Пример 1. Определение нативной ДНК в растворе. Наблюдается линейная зависимость величины скачка титрования от концентрации ДНК в растворе (фиг.3). Измерения проводят при продолжительности инкубирования 10 минут.
Пример 2. Определение антибиотика доксорубицина. Определение проводят при продолжительности инкубирования 10 минут. Концентрационная зависимость линеаризуется в координатах ΔЕ - концентрация доксорубицина: ΔЕ, мВ=(15.9±1.2)+(692,2±63,6)С, мкг/мл, R=0.9976. Диапазон определяемых концентраций доксорубицина 5.0-30.0 мкг/л.
Пример 3. Определение антибиотика рубомицина. Определение проводят при продолжительности инкубирования 10 минут. Концентрационная зависимость линеаризуется в координатах ΔЕ - концентрация рубомицина: ΔЕ, мВ=(18,4±0,1)+(207,3±5,4)С, мкг/мл, R=0.9990. Диапазон определяемых концентраций рубомицина 5.0-30.0 мкг/л.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемое устройство имеет следующие преимущества:
1) отсутствует необходимость в строгом контроле кислотности среды;
2) имеются дополнительные возможности определения лекарственных препаратов - интеркаляторов ДНК;
3) изменение потенциала сенсора во времени имеет монотонный характер с выходом на стационарное значение, что позволяет вместо регистрации полной кривой титрования проводить однократное измерение потенциала при заданном объеме титранта гидрохинона, в результате существенно упрощается процедура определения ДНК и интеркаляторов ДНК;
4) повышение воспроизводимости сигнала, более надежное функционирование устройства благодаря наличию в его составе однородного электрополимеризованного покрытия.