КОМПОЗИЦИИ ИММУНОГЕННЫХ/ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ГЛИКОКОНЪЮГАТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
COMPOSITIONS OF IMMUNOGENIC/THERAPEUTIC GLYCOCONJUGATES AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к композициям и способам для иммунотерапии злокачественных опухолей и иммуногенным/терапевтическим гликоконъюгатам, в частности способным вызывать иммунный ответ против злокачественных опухолей.
[0002] ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Углеводный антиген Globo-H (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc) впервые выделен из клеток рака молочной железы MCF-7 в качестве связанного с церамидом гликолипида и идентифицирован в 1984 Hakomori et al. (Bremer E G, et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:14773-14777). Дальнейшие исследования с моноклональными антителами к Globo-H продемонстрировали, что Globo-H присутствовал на множестве других злокачественных опухолей, включая рак предстательной железы, желудка, поджелудочной железы, легкого, яичника и толстого кишечника, и только на минимальном уровне экспрессировался на люминальной поверхности нормальной секреторной ткани, которая не является легкодоступной для иммунной системы. (Ragupathi G, et al. (1997) Angew. Chem. Int. Ed. 36:125-128). Кроме того, установлено, что сыворотка пациента, страдающего раком молочной железы, содержит высокий уровень антител к Globo-H. (Gilewski T et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(33):11661-11666). Пациенты с положительными по Globo-H опухолями демонстрировали более короткий период выживания по сравнению с пациентами с отрицательными по Globo-H опухолями. (Chang, Y-J, et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(25):10299-10304). Эти изыскания сделали Globo-H, гексасахаридный эпитоп, привлекательным опухолевым маркером и пригодной мишенью для разработки вакцины против злокачественных опухолей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Несмотря на то, что разработаны вакцины для вызова гуморального ответа к Globo-H, их эффективность против злокачественных опухолей является неудовлетворительной вследствие низкой антигенности Globo-H. Существует необходимость в новых вакцинах, способных к вызову высоких уровней иммунного ответа, направленного на Globo-H.
2
[0004] KLH содержит гликозилированные полипептидные субъединицы, которые могут собираться с формированием декамерных (10-мерных), дидекамерных (20-мерных) и более крупных частиц. Эти мультимерные структуры охарактеризованы способами ультрацентрифугирования, в которых определили коэффициенты седиментации 11-19S для диссоциированных субъединиц и 92-107S для дидекамерных мультимеров. На распределение размеров гемоцианинов моллюсков, включая KLH, может влиять ряд факторов. Эти факторы включают ионную силу, pH, температуру, pO и доступность определенных двухвалентных катионов, а именно кальция и магния.
[0005] Авторы настоящего изобретения разработали композицию с неожиданно увеличенной эффективностью, которая преимущественно содержит димеры, тримеры, а также другие мультимеры KLH, связанные с множеством молекул Globo-H.
[0006] Таким образом, настоящее изобретение в основном относится к терапевтическим и/или профилактическим композициям, содержащим Globo-H, а также, иммунотерапевтическим средствам, вакцинам, лекарственным формам, наборам и способам их производства и обработки.
[0007] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному терапевтическому конъюгат, содержащему молекулу Globo-H, связанную с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH). В определенных вариантах осуществления связь представляет собой ковалентную связь.
[0008] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному терапевтическому конъюгату, содержащему молекулу Globo-H, ковалентно связанную с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH), где KLH представляет собой дериватизированный KLH. Как используют в настоящем документе термин "ковалентно связанный", когда он относится к Globo-H и KLH означает: Globo-H непосредственно ковалентно связана с KLH, или Globo-H ковалентно связана с дериватизированным KLH (как указано в настоящем документе), или Globo-H ковалентно связана с KLH посредством линкерной группы (как указано в настоящем документе), или Globo-H ковалентно связана с KLH посредством линкерной группы и с дериватизированным KLH.
[0009] В определенных иллюстративных вариантах осуществления дериватизированный KLH по изобретению обладает следующей структурой:
[0010] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному терапевтическому конъюгату, содержащему молекулу Globo-H, ковалентно связанную с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH) посредством линкерной молекулы.
[0011] В одном из вариантов осуществления молекулы Globo-H связаны с остатком лизина субъединицы молекулы KLH.
[0012] В одном из вариантов осуществления всего на субъединице молекулы KLH находятся точно или приблизительно 145, 146, 147, 148, 149,150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 суммарных остатков лизина, которые доступны или фактически прямо или опосредовано связаны с молекулой Globo-H.
N
[0013] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному терапевтическому конъюгату, содержащему молекулу Globo-H, ковалентно связанную с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH) посредством линкерной группы 4-(4--малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид (MMCCH). Линкер MMCCH по изобретению обладает следующей структурой:
[0014] В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному терапевтическому конъюгату следующей общей структуры:
где n представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 160. В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 160 молекул Globo-H. Специалисту в данной области понятно, что структуры проиллюстрированы в виде гидрохлорида имина, но они также могут существовать или сосуществовать в форме имина. Таким образом, настоящее изобретение относится к имину, а также его солям, например, включая гидрохлорид имина. В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 125 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 100 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH может содержать от 1 до приблизительно 75 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 50 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 25 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 10 молекул Globo-H.
[0015] В определенных вариантах осуществления молекулы Globo-H ковалентно конъюгированы с определенными остатками аминокислот молекулы KLH. В определенных вариантах осуществления остатки аминокислот могут включать или не включать аргинин, лизин, гистидин, аспарагин, пролин, глутамин или их сочетание.
[0016] В другом варианте осуществления молекулы Globo-H связаны с лизиновыми участками конъюгации на мономерной субъединице молекулы KLH.
[0017] В другом варианте осуществления на каждой мономерной субъединице молекулы KLH доступными для связывания или фактически связанными с молекулой Globo-H являются точно или приблизительно 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 или 110 лизиновых участков конъюгации. В другом варианте осуществления на каждой субъединице молекулы KLH находятся 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100 таких лизиновых участков конъюгации.
[0018] В определенных вариантах осуществления терапевтических композиций, содержащих смесь молекулярных субъединиц (например, KLH1 и KLH2 или их варианты), суммарное количество доступных остатков лизина (для обеих субъединиц), которые подсчитывают вместе по субъединицам различного типа, может составлять или равно приблизительно 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 или 310. В таких вариантах осуществления в различных субъединицах (например, KLH1 и KLH2 или их вариантах) всего находятся точно или приблизительно 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 или 160 лизиновых участков конъюгации. В других таких вариантах осуществления находятся 136, 137, 141, 140, 143, 147 или 155 лизиновых участках конъюгации.
[0019] В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному иммуногенному/терапевтическому конъюгату следующей общей структуры:
где n независимо представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 3000, и m независимо представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 20. В определенных вариантах осуществления, когда m составляет более 1, молекулы KLH могут агрегировать с формированием мультимерных структур. В определенных вариантах осуществления агрегация представляет собой ковалентную связь. В других определенных вариантах осуществления агрегация не является ковалентной связью (например, агрегация сформирована водородными связями или гидрофобными взаимодействиями). В определенных вариантах осуществления мономерная молекула KLH (например, когда m=1) может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 160 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления димерная молекула KLH (например, когда m=2) может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 300 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления тримерная молекула KLH (например, когда m=3) может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 450 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления тетрамерная молекула KLH (например, когда m=4) может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 600 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления пентамерная молекула KLH (например, когда m=5) может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 750 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления гексамерная молекула KLH (например, когда m=6) может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 900 молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления дидекамерная молекула KLH (например, когда m=20) может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 3000 молекул Globo-H.
[0020] В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному иммуногенному/терапевтическому конъюгату следующей общей структуры:
где n независимо представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 150, и m независимо представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 20.
[0021] В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному терапевтическому конъюгату следующей общей структуры:
где n независимо представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 160, и где m независимо представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 20. В определенных вариантах осуществления m представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 5. В определенных вариантах осуществления m представляет собой целое число приблизительно от 1 до приблизительно 3. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 1. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 2. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 3. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 4. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 5. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 6. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 7. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 8. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 9. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 10. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 11. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 12. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 13. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 14. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 15. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 16. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 17. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 18. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 19. В определенных вариантах осуществления m представляет собой 20. В определенных вариантах осуществления для любых из указанных выше вариантов осуществления, когда m составляет от 1 до 20, каждый из n составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 или 160, соответственно.
[0022] В определенных вариантах осуществления присутствует более одной молекулы Globo-H, связанной с каждой из мономерных молекул KLH. В определенных иллюстративных вариантах осуществления более одной молекулы Globo-H, связанной с каждой из молекул KLH, связаны посредством линкера. В других иллюстративных вариантах осуществления более одной молекулы Globo-H, связанной с каждой из молекул KLH, связаны посредством линкера и связаны с дериватизированной молекулой KLH.
[0023] В другом варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 1. В другом варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 10. В другом варианте осуществления отношение молекул Globo-H к молекуле KLH составляет по меньшей мере 25. В другом варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 50. В дополнительном варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 100. В дополнительном варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 150. В еще одном варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 500. В еще одном дополнительном варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 750. В другом варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 1000. В другом варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 1500. В другом варианте осуществления отношение молекул Globo-H к субъединицам молекулы KLH составляет по меньшей мере 2000.
[0024] В различных вариантах осуществления настоящее изобретение включает от одного мономера KLH до нескольких субъединиц KLH (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20), где с каждой связано несколько молекул Globo-H. В определенных вариантах осуществления отношение молекул Globo-H к молекуле KLH является одинаковым. В других вариантах осуществления отношение молекул Globo-H к молекуле KLH является различным.
[0025] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции, содержащей по меньшей мере две молекулы KLH. Например, дериватизированную молекулу KLH в форме димера. В другом варианте осуществления по меньшей мере две молекулы KLH являются одинаковыми. В другом варианте осуществления по меньшей мере две молекулы KLH являются различными. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере двух молекул KLH является одинаковым. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере двух молекул KLH является различным.
[0026] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере три молекулы KLH, например, дериватизированную молекулу KLH в форме тримера. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере три молекулы KLH являются одинаковыми. В другом варианте осуществления по меньшей мере три молекулы KLH не являются одинаковыми. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере трех молекул KLH является одинаковым. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере трех молекул KLH является различным.
[0027] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере четыре молекулы KLH, например, дериватизированную молекулу KLH в форме тетрамера. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере четыре молекулы KLH являются одинаковыми. В другом варианте осуществления по меньшей мере четыре молекулы KLH не являются одинаковыми. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере четырех молекул KLH является одинаковым. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере четырех молекул KLH является различным.
[0028] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере пять молекул KLH, например, дериватизированную молекулу KLH в форме пентамера. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере пять молекулы KLH являются одинаковыми. В другом варианте осуществления по меньшей мере пять молекулы KLH не являются одинаковыми. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере пяти молекул KLH является одинаковым. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере пяти молекул KLH является различным.
[0029] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере шесть молекул KLH, например, дериватизированную молекулу KLH в форме гексамера. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере шесть молекулы KLH являются одинаковыми. В другом варианте осуществления по меньшей мере шесть молекулы KLH не являются одинаковыми. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере шести молекул KLH является одинаковым. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере шести молекул KLH является различным.
[0030] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере двадцать молекул KLH, например, дериватизированную молекулу KLH в форме дидекамера. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере двадцать молекулы KLH являются одинаковыми. В другом варианте осуществления по меньшей мере двадцать молекулы KLH не являются одинаковыми. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере двадцати молекул KLH является одинаковым. В дополнительном варианте осуществления отношение молекулы Globo-H к субъединице молекулы KLH по меньшей мере двадцати молекул KLH является различным.
[0031] В одном из вариантов осуществления молекула Globo-H содержит (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc). В дополнительном варианте осуществления субъединица молекулы KLH представляет собой молекулу KLH-1 или молекулу KLH-2 или их сочетание. Как используют в настоящем документе, термин "KLH" относится к KLH-1, KLH-2 и/или к их сочетанию.
[0032] В другом варианте осуществления субъединица молекулы KLH по меньшей мере на 99% идентична соответствующей природной субъединице молекулы KLH.
[0033] В другом варианте осуществления субъединица молекулы KLH по меньшей мере на 95% идентична соответствующей природной субъединице молекулы KLH.
[0034] В другом варианте осуществления субъединица молекулы KLH по меньшей мере на 90% идентична соответствующей природной субъединице молекулы KLH.
[0035] В другом варианте осуществления субъединица молекулы KLH по меньшей мере на 80% идентична соответствующей природной субъединице молекулы KLH.
[0036] В другом варианте осуществления субъединица молекулы KLH по меньшей мере на 70% идентична соответствующей природной субъединице молекулы KLH.
[0037] В другом варианте осуществления субъединица молекулы KLH по меньшей мере на 60% идентична соответствующей природной субъединице молекулы KLH.
N
N
[0038] В другом варианте осуществления молекула Globo-H ковалентно связана с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH) посредством линкера. В еще одном дополнительном варианте осуществления молекула Globo-H ковалентно связана с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH) посредством линкера 4-(4--малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид (MMCCH). В другом дополнительном варианте осуществления молекула Globo-H ковалентно связана с дериватизированной субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH) и связана посредством линкера 4-(4--малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид (MMCCH).
[0039] В другом варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата на основе мономера KLH с молекулярной массой приблизительно от 350 кДа до приблизительно 400 кДа составляет по меньшей мере или приблизительно 150. В другом варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата составляет по меньшей мере или приблизительно 100. В дополнительном варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата составляет по меньшей мере или приблизительно 75. В дополнительном варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата составляет по меньшей мере или приблизительно 50. В еще одном дополнительном варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата составляет по меньшей мере или приблизительно 25. В другом варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата составляет по меньшей мере или приблизительно 15. В другом варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата составляет по меньшей мере или приблизительно 5. В другом варианте осуществления эпитопное отношение выделенного терапевтического конъюгата составляет по меньшей мере или приблизительно 1.
[0040] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей субъединицы молекулы KLH, где каждая субъединица молекулы KLH содержит одну или более молекул Globo-H, ковалентно связанных с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH). В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит димеры по меньшей мере двух субъединиц молекулы KLH, где каждая из субъединиц молекулы KLH содержит одну или более молекул Globo-H, ковалентно связанных с субъединицей молекулы KLH. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит тримеры по меньшей мере трех субъединиц молекулы KLH, где каждая из субъединиц молекулы KLH содержит одну или более молекул Globo-H, ковалентно связанных с субъединицей молекулы KLH. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере четыре субъединицы молекулы KLH, где каждая из субъединиц молекулы KLH содержит одну или более молекул Globo-H, ковалентно связанных с субъединицей молекулы KLH. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит смесь из субъединиц молекулы KLH (например, мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров и т.д.), где каждая из субъединиц молекулы KLH содержит несколько молекул Globo-H, ковалентно связанных с субъединицей молекулы KLH.
[0041] Другой аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры или их сочетания молекул KLH, где каждая KLH содержит одну или более молекул Globo-H, ковалентно связанных с субъединицей молекулы гемоцианина морского блюдца (KLH).
[0042] В одном из вариантов осуществления изобретения эпитопные отношения терапевтических конъюгатов в композиции находятся в диапазоне приблизительно от 1 до 3000. В дополнительном варианте осуществления эпитопные отношения терапевтических конъюгатов в композиции находятся в диапазоне приблизительно от 75 до 2000. В другом варианте осуществления эпитопные отношения терапевтических конъюгатов в композиции находятся в диапазоне приблизительно от 100 до 1000. В еще одном дополнительном варианте осуществления среднее эпитопное отношение терапевтических конъюгатов в композиции находится в диапазоне приблизительно от 150 до 500.
[0043] В другом варианте осуществления приблизительно от 1% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции являются мономерами KLH. В дополнительном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции являются димерами KLH. В другом варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции являются тримерами KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции являются тетрамерами KLH. В дополнительном варианте осуществления приблизительно от 1% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции являются пентамерами KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 6 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 7 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 8 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 9 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 10 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 11 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 12 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 13 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 14 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 15 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 16 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 17 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 18 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 19 субъединиц KLH. В еще одном варианте осуществления приблизительно от 0% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции содержат 20 субъединиц KLH. В другом варианте осуществления приблизительно от 1% до 99% терапевтических конъюгатов в композиции являются мономерами, димерами, тримерами, тетрамерами или их сочетаниями. В другом варианте осуществления приблизительно 99% терапевтических конъюгатов в композиции являются мономерами, димерами, тримерами, тетрамерами или их сочетаниями.
[0044] В определенных вариантах осуществления определенные иллюстративные варианты композиций и способы их применения могут включать или исключать (например, они изъяты) любое одно или более из других иллюстративных вариантов соединений и/или композиций, описываемых в настоящем документе.
[0045] В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит адъювант. Как используют в настоящем документе, термины "иммунологический адъювант" относится к веществу, используемому в сочетании с иммуногеном, которое усиливает или модифицирует иммунный ответ на иммуноген. Конкретно, термины "адъювант" и "иммуноадъювант" используют в настоящем изобретении взаимозаменяемо, и они относятся к соединению или смеси, которые могут не являться иммуногенными при введении хозяину отдельно, но которые усиливают иммунный ответ хозяина на другой антиген при введении совместно с этим антигеном. Опосредуемое адъювантом усиление и/или продление длительности иммунного ответа можно оценивать любым известным в данной области способом, включая в качестве неограничивающих примеров один или более из следующих: (i) увеличение количества антител, продуцируемых в ответ на иммунизацию комбинацией адъювант/антиген по сравнению с количеством антител, продуцируемых в ответ на иммунизацию только антигеном; (ii) увеличение количества T-клеток, распознающих антиген или адъювант; и (iii) увеличение уровня одного или более цитокинов I типа.
Escherichia coli
Corynebacterium parvum
[0046] Адъювант можно вводить в виде фармацевтической или вакцинной композиции, содержащей антиген, или в виде отдельного состава, который вводят совместно со второй композицией, содержащей антиген. В любой из этих композиций гликосфинголипиды (GSLs) можно комбинировать с другими адъювантами и/или эксципиентами/носителями. Эти другие адъюванты в качестве неограничивающих примеров включают адъюванты на основе масляных эмульсий и эмульгаторов, такие как полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, MF59 или SAF; минеральные гели, такие как гидроксид алюминия (квасцы), фосфат алюминия или фосфат кальция; получаемые из микробов адъюванты, такие как холерный токсин (CT), токсин коклюша, термолабильный токсин (LT) , мутантные токсины (например, LTK63 или LTR72), бациллу Кальмета-Герена (BCG), , CpG-мотивы ДНК, мурамилдипептид или монофосфориллипид A; дисперсные адъюванты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), липосомы, биоразлагаемые микросферы или сапонины (например, QS-21); цитокины, такие как IFN-γ, IL-2, IL-12 или GM-CSF; синтетические адъюванты, такие как неионные блок-сополимеры, аналоги мурамилпептида (например, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин [thr-MDP], N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-[1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси]-этиламин), полифосфазены или синтетические полинуклеотиды и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы-плюроники, полианионы, пептиды, углеводородные эмульсии или гемоцианины морского блюдца (KLH), молекулы Toll-подобных рецепторов, LPS, липопротеины, липопептиды, флагеллин, двухцепочечная РНК, вирусная ДНК, неметилированные CpG-островки, левамизол, бацилла Кальмета-Герена, изопринозин, задаксин, антагонисты PD-1, антитела к PD-1, антагонисты CTLA, антитела к CTLA, интерлейкин, цитокины, GM-CSF, гликолипид, основная соль алюминия, фосфат алюминия, квасцы, гидроксид алюминия, липосомы, агонисты TLR2, липопептид, наночастицы, монофосфориллипид A, сапонин OBI-821, сапонин, адъювант OBI-834, адъювант C34, наноэмульсии масло-в-воде и подобные бактериям частицы. Предпочтительно эти дополнительные адъюванты также являются фармацевтически приемлемыми для применения у людей.
[0047] В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит цитокин, выбранный из группы, состоящей из IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF и TGF-β. В дополнительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит хемокин.
[0048] В дополнительном варианте осуществления иммуногенное/терапевтическое средство вводят в виде фармацевтической композиции.
[0049] В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональные антитела, химиотерапевтические средства, гормональные терапевтические средства, модуляторы ретиноидных рецепторов, цитотоксические/цитостатические средства, антинеопластические средства, антипролиферативные средства, средства против mTOR, средства против Her2, средства против EGFR, ингибиторы пренилпротеинтрансферазы, ингибиторы HMG-КоА-редуктазы, азотистые иприты, нитрозокарбамиды, ингибиторы ангиогенеза, бевацизумаб, ингибиторы клеточной пролиферации и пути передачи сигнала выживания, индуцирующие апоптоз средства, средства, блокирующие контрольные точки клеточного цикла, средства, блокирующие рецепторы тирозинкиназы (RTK), блокаторы интегринов, НПВП, агонисты PPAR, ингибиторы наследственной множественной лекарственной устойчивости (MDR), противорвотные средства, средства, пригодные при лечении анемии, средства, пригодные при лечении нейтропении, усиливающие иммунологический ответ лекарственные средства, биофосфонаты, ингибиторы ароматазы, средства, индуцирующие конечную дифференцировку неопластических клеток, ингибиторы γ-секретазы, вакцины против злокачественных опухолей (например, активная иммунотерапия), моноклональные терапевтические средства (например, пассивная иммунотерапия) и любое их сочетание.
[0050] В другом варианте осуществления терапевтические композиции по изобретению могут дополнительно содержать ингибиторы PD-1/PD-L1 (иммунотерапия цитотоксическими T-лимфоцитами (CTL)), средства для иммунотерапии CTLA-4, ингибиторы CDK4/6 (направленная терапия), ингибиторы PI3K (направленная терапия), ингибиторы mTOR (направленная терапия), ингибиторы AKT (направленная терапия), панингибиторы Her (направленная терапия). Также эти ингибиторы можно модифицировать с получением соответствующих моноклональных антител. Такие антитела можно включать в терапевтические композиции по изобретению.
[0051] В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против злокачественной опухоли. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию формулируют для подкожного введения. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию формулируют для внутримышечного введения. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию формулируют для внутриартериального введения. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию формулируют для внутривенного введения.
[0052] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества терапевтической композиции, содержащей Globo-H и KLH. В одном из вариантов осуществления у пациента диагностировано или предполагается наличие злокачественной опухоли. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой эпителиальную злокачественную опухоль. В дополнительном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество молекулы Globo-H в фармацевтической/терапевтической композиции может находиться в диапазоне приблизительно от 0,001 мкг/кг до приблизительно 250 мг/кг. В еще одном дополнительном варианте осуществления терапевтически эффективное количество молекулы Globo-H в фармацевтической/терапевтической композиции составляет приблизительно от 10 мкг/кг до приблизительно 50 мкг/кг одного терапевтического конъюгата на дозу. В еще одном дополнительном варианте осуществления терапевтически эффективное количество молекулы Globo-H в фармацевтической/терапевтической композиции составляет приблизительно от 0,10 мкг/кг до приблизительно 0,75 мкг/кг одного терапевтического конъюгата на дозу.
[0053] В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество комплекса Globo-H-KLH в терапевтической композиции может находиться в диапазоне приблизительно от 0,001 мкг/кг до приблизительно 250 мг/кг. В еще одном дополнительном варианте осуществления терапевтически эффективное количество комплекса Globo-H-KLH в терапевтической композиции составляет приблизительно от 10 мкг/кг до приблизительно 50 мкг/кг одного терапевтического конъюгата на дозу. В еще одном дополнительном варианте осуществления терапевтически эффективное количество комплекса Globo-H-KLH в терапевтической композиции составляет приблизительно от 0,60 мкг/кг до приблизительно 4,50 мкг/кг одного терапевтического конъюгата на дозу.
[0054] В другом варианте осуществления с применением способа можно продлевать продолжительность существования без прогрессирования по сравнению с контролем плацебо на период приблизительно или по меньшей мере 1 неделю. В другом варианте осуществления с применением способа можно продлевать продолжительность существования без прогрессирования по сравнению с контролем плацебо на период приблизительно или по меньшей мере 2 недели. В другом варианте осуществления с применением способа можно продлевать продолжительность существования без прогрессирования по сравнению с контролем плацебо на период приблизительно или по меньшей мере 1 месяц. В другом варианте осуществления с применением способа можно продлевать продолжительность существования без прогрессирования по сравнению с контролем плацебо на период приблизительно или по меньшей мере 3 месяца. В другом варианте осуществления с применением способа можно продлевать продолжительность существования без прогрессирования по сравнению с контролем плацебо на период приблизительно или по меньшей мере 6 месяцев. В еще одном варианте осуществления с применением способа можно продлевать или поддерживать общее существование по сравнению с контролем плацебо на период приблизительно или по меньшей мере 12 месяцев.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0055] Более полное понимание изобретения можно получить при обращении к сопровождающим чертежам, рассматриваемым в сочетании с следующим ниже подробным описанием. Варианты осуществления, проиллюстрированные на чертежах, предназначены только для иллюстрации изобретения, и их не следует рассматривать, как ограничивающие изобретение иллюстрируемыми вариантами осуществления.
[0056] На фигуре 1A представлена химическая структура Globo-H, а также несколько иллюстративных аналогов Globo-H. Glc обозначает глюкозу, Gal обозначает галактозу, GalNAc обозначает N-ацетилгалактозамин, и Fuc обозначает фукозу. На фигуре 1B представлена иллюстративная субъединица Globo-H-KLH, конъюгированная посредством линкера MMCCH.
[0057] На фигуре 2A представлен иллюстративный путь синтеза конъюгата Globo-H-субъединицы KLH. На фигуре 2B представлены димеры и тримеры Globo-H-KLH по изобретению по сравнению с конъюгатами Globo-H, описанными в Slovin et al (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5710-5 и Gilewski et al (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3270-5.
[0058] На фигуре 3 представлен результат спектрометрии углового рассеяния лазерного излучения (MALS) природного KLH (8,3 МДа).
[0059] На фигуре 4A представлен результат эксклюзионной хроматографии KLH с использованием спектрометрии углового рассеяния лазерного излучения (MALS) в качестве детектора. На фигуре 4B представлен анализ распределения масс KLH. На фигуре 4C представлен результат эксклюзионной хроматографии гликоконъюгата Globo-H-KLH (№ партии OBI-822 14001) с использованием спектрометрии углового рассеяния лазерного излучения (MALS) в качестве детектора. На фигуре 4D представлен анализ распределения масс гликоконъюгата Globo-H-KLH.
+
+
+
p
p
p
[0060] На фигуре 5A представлен рост популяций B-клеток у крыс Lewis, иммунизированных иллюстративным гликоконъюгатом Globo-H-KLH (7,5 мкг и 25 мкг), в течение времени. На фигуре 5B представлен рост популяций CD3-T-клеток у крыс Lewis, иммунизированных иллюстративным гликоконъюгатом Globo-H-KLH (7,5 мкг и 25 мкг), в течение времени. На фигуре 5C представлен рост популяций CD4-T-клеток у крыс Lewis, иммунизированных иллюстративным гликоконъюгатом Globo-H-KLH (7,5 мкг и 25 мкг), в течение времени. На фигуре 5D представлен рост популяций CD8-T-клеток у крыс Lewis, иммунизированных иллюстративным гликоконъюгатом Globo-H-KLH (7,5 мкг и 25 мкг), в течение времени. Данные представлены в виде процента количества клеток в указанной группе, нормализованного на процент количества клеток группы с PBS. Множественные сравнения анализировали с использованием двухстороннего ANOVA, с последующими апостериорными поправками Бонферрони. *, <0,05, **, <0,01 и ***, <0,001 по сравнению с PBS.
[0061] На фигуре 6A приведены хронологические изменения реципрокных титров антител IgM в крови крыс Lewis, иммунизированных иллюстративным гликоконъюгатом Globo-H-KLH (7,5 мкг и 25 мкг). На фигуре 6B представлены хронологические изменения реципрокных титров антитела IgG в крови крыс Lewis, иммунизированных иллюстративным гликоконъюгатом Globo-H-KLH (7,5 мкг и 25 мкг).
[0062] На фигуре 7 представлены титры антител IgM у мышей в ответ на определенные конъюгационные отношения между Globo-H и KLH (0,17:1 и 0,07:1).
[0063] На фигуре 8 проиллюстрирована иммуногенность у мышей C57BL/6, которых иммунизировали PBS, гликоконъюгатом Globo-H-KLH+адъювант сапонин (OBI-822+OBI-821) и гликоконъюгатом Globo-H-KLH+адъювант C34 (OBI-822+OBI-834). Сыворотки собирали на сутки 42 для анализа ELISA с определением продукции антител IgM и IgG к Globo-H. На фигуре 8A представлена продукция IgM. На фигуре 8B представлена продукция IgG. Подкожное (п/к) введение гликоконъюгата Globo-H-KLH составляло 2 мкг, а адъюванта - 20 мкг.
6
[0064] На фигуре 9 проиллюстрированы шесть групп иммунокомпетентных (возраст 6-8 недель), стерильных (SPF) самок мышей C57BL/6, которым в объеме 0,1 мл инъецировали 5,0×10 клеток карциномы легких Льюиса (LL/2, ATCC CRL-1642), сингенных мышам C57BL/6, которые инъецировали подкожно в брюшную область в направлении бока экспериментальных мышей, на сутки 16. Три тестируемых фактора (только PBS, OBI-822+адъювант OBI-821 и OBI-822+адъювант OBI-834) вводили подкожно по 0,2 мл/мышь (в левый и правый брюшной участки, 0,1 мл/участок) или интраперитонеально в объеме дозирования 10 мл/кг на сутки 0, 5, 11, 19, 29, 34 и 39. После умерщвления на сутки 42 получены по три изображения опухоли с целым телом.
6
[0065] На фигуре 10 проиллюстрирован рост опухоли LL/2 (линия клеток карциномы легких Льюиса) у иммунизированных гликоконъюгатом Globo-H-KLH мышей C57BL/6, которых подкожно вакцинировали PBS, OBI-822+адъювант OBI-821 и OBI-822+адъювант OBI-834 на сутки 0, 5, 11, 19, 29, 34 и 39. Клетки LL/2 (5,0×10 in 0,1 мл) подкожно инъецировали каждой мыши на сутки 16. Размеры опухолей определяли на сутки 16, 19, 23, 26, 30, 34, 37, 40 и 42.
W
W
W
W
W
W
[0066] На фигуре 11 проиллюстрирована химическая структура производного Globo-H. На фигуре 11A проиллюстрировано производное Globo-H [химическая формула: C(56)H(91)N(5)O(33)S(1), добавление моноизотопной M: 1393,5317 Да]. На фигуре 11B проиллюстрирован формы с потерей нейтральных частиц производного Globo-H. Химическая формула 1: C(18)H(28)N(4)O(4)S(1), добавление моноизотопной M: 396,1831 Да; химическая формула 2: C(24)H(38)N(4)O(9)S(1), добавление моноизотопной M: 558,2360 Да; химическая формула 3: C(30)H(48)N(4)O(14)S(1), добавление моноизотопной M: 720,2888 Да; химическая формула 4: C(36)H(58)N(4)O(19)S(1), добавление моноизотопной M: 882,3416 Да; химическая формула 5: C(44)H(71)N(5)O(24)S(1), добавление моноизотопной M: 1085,4210 Да.
W
W
[0067] На фигуре 12 проиллюстрирована химическая структура производного MMCCH. На фигуре 12A проиллюстрирована химическая структура производного MMCCH [химическая формула: C(16)H(24)N(4)O(3)S(1), добавление моноизотопной M: 352,1569 Да]. На фигуре 12B проиллюстрирован дезаминированное производное MMCCH [химическая формула: C(16)H(22)N(2)O(4)S(1), добавление моноизотопной M: 338,1300 Да].
[0068] На фигуре 13 приведена обобщенная информация об идентификации производных пептидов с Globo-H и MMCCH по остаткам лизина
[0069] На фигуре 14 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 1 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0070] На фигуре 15 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 2 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0071] На фигуре 16 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 3 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0072] На фигуре 17 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 4 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0073] На фигуре 18 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 1 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0074] На фигуре 19 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 2 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0075] На фигуре 20 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 3 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0076] На фигуре 21 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H по остаткам лизина пептидов для образца 4 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0077] На фигуре 22 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 1 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0078] На фигуре 23 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 2 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0079] На фигуре 24 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 3 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0080] На фигуре 25 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 4 (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0081] На фигуре 26 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 1 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0082] На фигуре 27 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 2 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0083] На фигуре 28 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 3 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0084] На фигуре 29 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с MMCCH по остаткам лизина пептидов для образца 4 (2 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
На фигуре 30 приведена обобщенная информация об идентификации конъюгированных с Globo-H участков лизина для (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B); (2 LC-MS/MS) для KLH1 (C) и KLH2 (D).
[0085] На фигуре 31 приведена обобщенная информация об идентификации конъюгированных с MMCCH участков лизина для (1 LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B) и (2 LC-MS/MS) для KLH1 (C) и KLH2 (D).
[0086] На фигуре 32 приведена обобщенная информация об анализе конъюгации с Globo-H в первом (A) и втором (B) проходах LC-MS/MS.
[0087] На фигуре 33 приведена обобщенная информация об идентификации иллюстративных производных пептидов с Globo-H и MMCCH по остаткам гистидина (H), аспарагина (N), пролина (P), глутамина (Q) и аргинина (R).
[0088] На фигуре 34 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H и MMCCH пептидов по остаткам HNPQR для образца 1 (LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0089] На фигуре 35 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H и MMCCH пептидов по остаткам HNPQR для образца 2 (LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0090] На фигуре 36 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H и MMCCH пептидов по остаткам HNPQR для образца 3 (LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0091] На фигуре 37 проиллюстрированы данные идентификации конъюгированных с Globo-H и MMCCH пептидов по остаткам HNPQR для образца 4 (LC-MS/MS) для KLH1 (A) и KLH2 (B).
[0092] На фигуре 38 приведена обобщенная информация об анализе иллюстративных производных с Globo-H и MMCCH по остаткам гистидина (H), аспарагина (N), пролина (P), глутамина (Q) и аргинина (R).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
nd
[0093] Если не указано иначе, в практическом осуществлении настоящего изобретения используют общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие способы полностью описаны в литературе. См., например, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2 Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); монографии Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) и Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).
[0094] Использование синтетических конъюгатов с углеводами для вызова образования антител впервые продемонстрировано Goebel и Avery в 1929 году. (Goebel, W. F., and Avery, O. T., J. Exp. Med., 1929, 50, 521; Avery, O. T., and Goebel, W. F., J. Exp. Med., 1929, 50, 533.) Углеводы связывали с белками-носителями посредством бензолдиазониевых гликозидов. Иммунизация кроликов синтетическими антигенами приводила к получению поликлональных антител. Другие исследователи (Allen, P. Z., and Goldstein, I. J., Biochemistry, 1967, 6, 3029; Rude, E., and Delius, M. M., Carbohydr. Res., 1968, 8, 219; Himmelspach, K., et al., Eur. J. Immunol., 1971, 1, 106; Fielder, R. J., et al., J. Immunol., 1970, 105, 265) разработали сходные способы конъюгации углеводов с белками-носителями.
[0095] Гликоконъюгаты можно использовать в активной иммунотерапии, осуществляемой на основе вакцинаций для специфического поражения опухолевых клеток известными поражающими средствами. В норме ответ на углеводные антигены не включает использование T-клеток, которые содействуют отторжению опухоли организмом. Хотя полагают, что вероятность полного отторжения опухоли в результате вакцинации конъюгатом является низкой, такое лечение повышает иммунный надзор и можно снизить вероятность рецидива новых опухолевых колоний. (Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K. O., in Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50-58). Toyokuni и Singhal описали синтетический гликоконъюгат (Toyokuni, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 395), стимулирующий измеряемые титры IgG, результат который является важный, так как ответ IgG, как правило, ассоциирован с привлечением хелперных T-клеток.
[0096] Показано, что синтетическая вакцина Globo-H в комбинации с иммунологическим адъювантом в основном индуцирует антитела IgM и в меньшей степени IgG у пациентов, страдающих раком предстательной железы и метастатическим раком молочной железы. В фазе I клинических испытаний вакцина также продемонстрировала минимальную токсичность с временными местными кожными реакциями в участке вакцинации. (Gilewski T et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew. Chem. Int. Ed. 36:125-128; Slovin S F et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5710- 5715). Слабые гриппоподобные симптомы, наблюдаемые у некоторых пациентов, вероятно, ассоциированы с побочным действием QS-21. Опубликовано, что пентавалентная вакцина, содержащая пять ассоциированных с раком предстательной железы и молочной железы углеводных антигенов, Globo-H, GM2, STn, TF и Tn, конъюгированных с модифицированных малеинимидом белком-носителем KLH, продуцирует сыворотку против Globo-H с более высокими титрами IgG, чем IgM, определяемыми в анализах ELISA. (Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131(26):9298-9303).
[0097] Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуногенным/терапевтическим соединениям, композициям и/или композициям фармацевтических составов, направленным на Globo-H/опосредуемых им, а также иммунотерапевтическим средствам, вакцинам, лекарственным формам, наборам на их основе и способам их производства и лечения с их использованием.
[0098] Использование форм единственного числа в сочетании с выражением "содержащий" в формуле изобретения и/или в описании может означать "один", а также это согласуется со значениями "один или более", "по меньшей мере один" и "один или более одного".
[0099] На всем протяжении настоящей заявки термин "приблизительно" используют для указания на то, что значение включает, например, неотъемлемый разброс вследствие погрешности измеряющего устройства, способа, применяемого для определения значения, или разброс, который существует у исследуемых индивидуумов. Как правило, термин предназначен для включения вариабельности приблизительно или менее 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% в зависимости от ситуации.
н
изо
н
изо
трет
[0100] Как используют в настоящем документе, термин "алкил" относится к неразветвленному или разветвленному одновалентному углеводороду, содержащему, если не указано иначе, 1-20 атомов углерода, например, C1-C8 или C1-C4, которые могут являться замещенными или незамещенными. Примеры алкила в качестве неограничивающих примеров включают метил, этил, -пропил, -пропил, -бутил, -бутил и -бутил.
[0101] Термин "или" в формуле изобретения используют для обозначения "и/или" если явно не указано обозначение исключительно альтернатив или альтернативы не являются взаимоисключающими, хотя в описании поддерживается определение, которое относится к взаимоисключающим альтернативам и "и/или".
[0102] Как используют в этом описании и в формуле изобретения, слова "составляющий" (и любая форма термина содержащий, такая как "составляют" и "составляет"), "обладающий" (и любая форма термина обладающий, такая как "содержат" и "содержит"), "включающий" (и любая форма термина включающий, такая как "включает" и "включают") или "содержащий" (и любая форма термина содержащий, такая как "содержат" и "содержит") являются включительными или не ограничивающими и не исключают дополнительных, необязательных элементов или этапов способов. Предусмотрено, что любой вариант осуществления, описанных в настоящем описании, можно использовать в отношении любых способа или композиции по изобретению и наоборот. Кроме того, композиции по изобретению можно использовать для осуществления способов по изобретению.
[0103] "Лечение" по настоящему документу относится к введению терапевтической композиции индивидууму с целью лечения, облегчения, ослабления, излечения, предотвращения или улучшение состояния нарушения, симптомов нарушения, болезненного состояния, вторичного относительно нарушения или предрасположенности к нарушению.
[0104] "Эффективное количество" представляет собой количество терапевтической композиции, которое может обеспечивать у подвергаемого лечению индивидуума желательный с медицинской точки зрения результат, как описано в настоящем документе. Желательный с медицинской точки зрения результат может являться объективным (например, измеряемым посредством определенного теста или маркера) или субъективным (например, индивидуум предоставляет инморфации или чувствует действие).
[0105] Как используют в настоящем документе, "заболевание, подлежащее лечению терапевтической композицией" означает любые последовательности этапов, патологические состояния, нарушения, недомогания и/или заболевания, которые можно лечить посредством введения терапевтических композиций, описываемых в настоящем документе.
[0106] "Пролиферативное нарушение" представляет собой нарушение, при котором происходит продукция слишком большого количества клеток определенного типа, что приводит к ухудшению здоровья. Пролиферативные нарушение могут являться доброкачественными или злокачественными. Пролиферативные нарушения могут включать, например, злокачественные опухоли.
[0107] Как используют в настоящем документе, "злокачественная опухоль", которую можно лечить терапевтическими композициями, описываемыми в настоящем документе, включает клетки в состоянии аномального роста. Злокачественные клетки можно охарактеризовать потерей нормальных механизмов контроля, и, таким образом, они способны непрерывно размножаться, прорастать в окружающие ткани, мигрировать в отдаленные участки организма и стимулировать рост новых кровеносных сосудов, из которых клетки получают питательные вещества. Как используют в настоящем документе, злокачественная опухоль может являться злокачественной или доброкачественной. Злокачественная опухоль может развиваться из любой ткани организма. По мере роста и размножения клеток они формируют массу ткани, называемую опухолью. Термин опухоль может включать аномальные рост или массу. Опухоли могут являться злокачественными или незлокачественными (доброкачественными). Злокачественные опухоли могут прорастать в соседние ткани или распространяться по всему организму (метастазировать). Однако доброкачественные опухоли, как правило, не прорастают в соседние ткани и не распространяются по всему организму. Злокачественные опухоли можно разделить на опухоли крови и кровеобразующих тканей (лейкозы и лимфомы) и "солидные" опухоли. "Солидные" опухоли могут включать карциномы или саркомы.
[0108] Злокачественные опухоли, которые можно лечить терапевтическими композициями по изобретению, включают злокачественные опухоли, классифицируемые по участку, включая злокачественные опухоли полости рта и глотки (губ, языка, слюнных желез, дна полости рта, десен и других частей полости рта, носоглотки, миндалины, ротоглотки, гортанной части глотки, других частей полости рта/глотки); злокачественные опухоли пищеварительной системы (пищевода; желудка; тонкой кишки; толстой кишки и прямой кишки; ануса, заднепроходного канала и аноректальной области; печени; внутрипеченочного желчного протока; желчного пузыря; других частей желчевыводящих путей; поджелудочной железы; забрюшинного пространства; брюшины, сальника и брыжейки; других частей пищеварительной системы); злокачественные опухоли дыхательной системы (полости носа, среднего уха и носовых пазух; гортани; легких и бронхов; плевры; трахеи, средостения и других частей дыхательной системы); злокачественные опухоли мезотелиомы; костей и суставов и мягких тканей, включая сердце; раки кожи, включая меланомы и другие неэпителиальные злокачественные опухоли кожи; саркому Капоши и рак молочной железы; злокачественные опухоли женской половой системы (шейки матки; тела матки; матка, яичника; влагалища; наружных половых органов и других частей женской половой системы); злокачественные опухоли мужской половой системы (предстательной железы; семенника; полового члена и других частей мужской половой системы); злокачественные опухоли мочевыделительной системы (мочевого пузыря; почек и почечных лоханок; мочеточника и других частей мочевыделительной системы); злокачественные опухоли глаз и глазных орбит; злокачественные опухоли головного мозга и нервной системы (головного мозга и других частей нервной системы); злокачественные опухоли эндокринной системы (щитовидной железы и других частей эндокринной системы, включая тимус); лимфомы (болезнь Ходжкина и неходжкинские лимфомы), множественную миелому и лейкоз (лимфоцитарный лейкоз; миелолейкоз; моноцитарный лейкоз и другие виды лейкоза).
[0109] Другие злокачественные опухоли, классифицируемые по гистологическому типу, которые могут являться подходящими мишенями для терапевтических композиций по настоящему изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают неоплазию, злокачественную; карциному, неуточненную; карциному, недифференцированную, неуточненную; гигантоклеточную и веретеноклеточную карциному; мелкоклеточную карциному, неуточненную; папиллярную карциному, неуточненную; плоскоклеточную карциному, неуточненную; лимфоэпителиальную карциному; базально-клеточную карциному, неуточненную; карциному пиломатрикса; переходноклеточную карциному, неуточненную; папиллярную переходноклеточную карциному; аденокарциному, неуточненную; гастриному, злокачественную; холангиокарциному; печеночноклеточную карциному, неуточненную; комбинированную печеночноклеточную карциному и холангиокарциному; трабекулярную аденокарциному; аденокистозную карциному; аденокарциному в аденоматозном полипе; аденокарциному, семейный полипоз кишечника; солидную карциному, неуточненную; карциноидную опухоль, злокачественную; бронхиолоальвеолярную аденокарциному; папиллярную аденокарциному, неуточненную; хромофобную карциному; ацидофильную карциному; оксифильную аденокарциному; базофильную карциному; светлоклеточную аденокарциному, неуточненную; гранулярноклеточную карциному; фолликулярную аденокарциному, неуточненную; папиллярную и фолликулярную аденокарциному; неинкапсулирорванную склерозирующую карциному; карциному коры надпочечника; эндометриоидную карциному; карциному производных кожи; апокринную аденокарциному; аденокарциному сальных желез; церуминальную аденокарциному; мукоэпидермоидную карциному; цистаденокарциному, неуточненную; папиллярную цистаденокарциному, неуточненную; папиллярную серозную цистаденокарциному; слизистую цистаденокарциному, неуточненную; слизистую аденокарциному; перстневидноклеточную карциному; инфильтративно-протоковую карциному; медуллярную карциному, неуточненную; лобулярную карциному; воспалительную карциному; болезнь Педжета, молочной железы; ацинарноклеточную карциному; аденосквамозную карциному; аденокарциному w/ плоскоклеточную метаплазию; тимому, злокачественную; овариальную стромальную опухоль, злокачественную; текому, злокачественную; гранулезноклеткочную опухоль, злокачественную; андробластому, злокачественную; карциному клеток Сертоли; опухоль клеток Лейдига, злокачественную; липидноклеточную опухоль, злокачественную; параганглиому, злокачественную; экстрамаммарную параганглиому, злокачественную; феохромоцитому; гломангиосаркому; злокачественную меланому, неуточненную; беспигментную меланому; поверхностно распространяющуюся меланому; злокачественную меланому в гигантском пигментированном невусе; эпителиоидноклеточную меланому; меланоформный невус, злокачественный; саркому, неуточненную; фибросаркому, неуточненную; фиброзную гистиоцитому, злокачественную; миксосаркому; липосаркому, неуточненную; лейомиосаркому, неуточненную; рабдомиосаркому, неуточненную; эмбриональную рабдомиосаркому; альвеолярную рабдомиосаркома; стромальную саркому, неуточненную; смешанную опухоль, злокачественную, неуточненную; смешанную опухоль мюллерова протока; нефробластому; гепатобластому; карциносаркому, неуточненную; мезенхимому, злокачественную; опухоль Бреннера, злокачественную; листовидную цистосаркому, злокачественную; синовиальную саркому, неуточненную; мезотелиома, злокачественную; дисгерминому; эмбриональную карциному, неуточненную; тератому, злокачественную, неуточненную; струму яичника, злокачественную; хориокарциному; мезонефрому, злокачественную; гемангиосаркому; гемангиоэндотелиому, злокачественную; саркому Капоши; гемангиоперицитому, злокачественную; лимфангиосаркому; остеосаркому, неуточненную; юкстакортикальную остеосаркому; хондросаркому, неуточненную; хондробластому, злокачественную; мезенхимальную хондросаркому; гигантоклеточную опухоль кости; саркому Юинга; одонтогенную опухоль, злокачественную; амелобластическую одонтосаркому; амелобластому, злокачественную; амелобластическую фибросаркому; пинеалому, злокачественную; хордому; глиому, злокачественную; эпендимому, неуточненную; астроцитому, неуточненную; протоплазматическую астроцитому; фибриллярную астроцитому; астробластому; глиобластому, неуточненную; олигодендроглиому, неуточненную; олигодендробластому; примитивную нейроэктодермальную опухоль; саркому мозжечка, неуточненную; ганглионейробластому; нейробластому, неуточненную; ретинобластому, неуточненную; ольфакторную нейрогенную опухоль; менингиому, злокачественную; нейрофибросаркому; шванному, злокачественную; гранулярноклеточную опухоль, злокачественную; злокачественную лимфому, неуточненную; болезнь Ходжкина, неуточненную; парагранулему Ходжкина, неуточненную; злокачественную лимфому, мелкоклеточную лимфоцитарную; злокачественную лимфому, крупноклеточную, диффузную; злокачественную лимфому, фолликулярную, неуточненную; грибовидный микоз; другие специфические неходжкинские лимфомы; злокачественный гистиоцитоз; множественную миелому; саркому тучных клеток; иммунопролиферативная болезнь тонкого кишечника; лейкоз, неуточненный; лимфоидный лейкоз, неуточненный; плазмацитарный лейкоз; эритролейкоз; лимфосаркому; миелолейкоз, неуточненный; базофильный лейкоз; эозинофильный лейкоз; моноцитарный лейкоз, неуточненный; лейкоз тучных клеток; мегакариобластный лейкоз; миелоидную саркому и волосатоклеточный лейкоз.
[0110] Как определено в настоящем документе, "эпителиальные злокачественные опухоли" относится к злокачественным опухолям, которые развиваются из эпителия или родственных тканей кожи, полых органов и других органов. Эпителиальные злокачественные опухоли в качестве неограничивающих примеров включают рак молочной железы, рак легких, рак печени, буккальный рак, рак желудка, рак толстого кишечника, рак носоглотки, рак кожи, рак почки, рак головного мозга, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак эндометрия, рак кишечника, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.
[0111] Как используют в настоящем документе, "пациент" или "индивидуум" относится к индивидууму, принадлежащему млекопитающим, с диагнозом или подозрением наличия или развития пролиферативного заболевания, такого как злокачественная опухоль. Иллюстративные пациенты могут представлять собой людей, обезьян, собак, свиней, крупный рогатый скот, кошек, лошадей, коз, овец, грызунов и других млекопитающих, у которых могут успешно развиваться пролиферативные заболевания, такие как злокачественные опухоли.
[0112] Как используют в настоящем документе, "в значительной степени очищенная" или "по существу выделенная" относится к молекуле (например, соединению) в состоянии, которое отделено по существу от всех остальных молекул, в норме ассоциированных с ней в природном состоянии. Предпочтительно, в значительной степени очищенная молекула представляет собой преобладающую молекулу в препарате. Конкретно, в значительной степени очищенная молекула может являться более чем на 60%, предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 90%, а наиболее предпочтительно - на 95% очищенной от других молекул (за исключением растворителя), находящихся в природной смеси. Термин "в значительной степени очищенная" или "по существу выделенная" не предназначен для включения молекул или веществ, находящихся в их природном состоянии. В определенных вариантах осуществления термин "в значительной степени очищенная" или "по существу выделенная" включает очистку одной молекулы KLH от другой молекулы KLH (например, в значительной степени очищенная или по существу отделенная молекула димера KLH от молекулы тримера KLH). В другом варианте осуществления термин "в значительной степени очищенная" или "по существу выделенная" не включает очистку одной молекулы KLH от другой молекулы KLH (например, димеры KLH и тримеры KLH включены в очищенную в значительной степени или по существу выделенную композицию), но примеси в значительной степени удалены.
[0113] "Введение" относится в настоящем документе к предоставлению терапевтической композиции по изобретению пациенту. В качестве примера, а не ограничения, введение композиции, например, инъекцию, можно проводить посредством внутривенной (в/в) инъекции, подкожной (п/к) инъекции, интрадермальной (и/д) инъекции, интраперитонеальной (и/п) инъекции или внутримышечной (в/м) инъекции. Можно использовать один или более таких маршрутов. Парентеральное введение можно проводить, например, посредством болюсной инъекции или посредством постепенной инфузии с течением времени. Альтернативно, или одновременно, введение можно проводить пероральным маршрутом. Кроме того, введение также можно осуществлять посредством хирургического введения одноразовой дозы или размещения медицинского устройства.
[0114] "Пациент, нуждающийся в этом" в настоящем документе обозначает пациента, с диагнозом или подозрением наличия пролиферативного нарушения. В одном из вариантов осуществления у пациента присутствует злокачественная опухоль или существует вероятность ее развития.
[0115] Как используют в настоящем документе, термин "антиген" определяют как любое вещество, способное вызывать иммунный ответ с помощью или без помощи белка-носителя и/или адъюванта. Предпочтительно антиген композиций по изобретению включает углевод и более предпочтительно - гликановый антиген, а наиболее предпочтительно - молекулу Globo-H.
[0116] Как используют в настоящем документе, термин "иммуногенность" относится к способности иммуногена, антигена или вакцины стимулировать иммунный ответ.
[0117] Как используют в настоящем документе, термин "иммунотерапия" относится к множество стратегий лечения на основе концепции модуляции иммунной системы для достижения профилактической и/или терапевтической цели.
[0118] Как используют в настоящем документе, термин "эпитоп" определяют как части молекулы антигена, которые контактируют с антигенсвязывающим участком антител или T-клеточных рецепторов.
2
3
[0119] "Терапевтические композиции" по изобретению включают "иммуногенные конъюгаты и/или терапевтические конъюгаты" и/или "терапевтические антитела". Терапевтические конъюгаты включают по меньшей мере один антиген, связанный с носителем. Предпочтительно, эта связь в терапевтическом конъюгате является ковалентной. В одном из вариантов осуществления терапевтического конъюгата антиген представляет собой гликан, такой как молекула Globo-H, а носитель представляет собой молекулу KLH и/или субъединицу молекулы KLH. По существу, термин терапевтический конъюгат включает одну или более субъединиц молекул KLH, связанных с одной или более молекулами Globo-H. В одном из вариантов осуществления термин терапевтический конъюгат включает одну или более молекул KLH, связанны приблизительно или по меньшей мере с 1, 10, 10 или 10 молекулами Globo-H. В другом варианте осуществления термин терапевтический конъюгат включает одну или более молекул KLH, связанных приблизительно с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 или более молекулами Globo-H. Другой вариант осуществления включает выделенные димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры или гексамеры таких связанных с Globo-H субъединиц молекул KLH или их сочетания.
[0120] В одном из вариантов осуществления терапевтический конъюгат представляет собой: Fucα(1→2)Galβ(1→3)GalNAcβ(1→3)Galα(1→4)Galβ(1→4)Gluβ(1-O-этилгидразил-1-карбонилциклогексил-4-(метил-N-малеимидо)-3-(тиобутилимидил)-гемоцианин морского блюдца (KLH), также обозначаемый как OBI-822.
[0121] "Терапевтические антитела" определены как антитела (как дополнительно определено ниже), которые специфически связывают терапевтические конъюгаты по изобретению и предпочтительно часть молекулы Globo-H терапевтических конъюгатов.
[0122] Как используют в настоящем документе, термин "вакцина" относится к терапевтической композиции, которая содержит терапевтический конъюгат, который используют для обеспечения иммунитета против заболевания, ассоциированного с антигеном. Вакцины против злокачественных опухолей разрабатывают для стимуляции природной способности организма защищать себя посредством иммунной системы от рисков, обеспечиваемых поврежденными или аномальными клетками, такими как злокачественные клетки. Протективный иммунный ответ представляет собой иммунный ответ, который снижает тяжесть заболевания, включая в качестве неограничивающих примеров, профилактику заболевания, задержку начала заболевания, сниженную тяжесть симптомов, сниженную заболеваемость и отсроченную смертность. Предпочтительно вакцина способна активировать гуморальный иммунный ответ (например, стимуляция продукции антител B-лимфоцитами) и клеточный иммунный ответ (например, иммунный ответ, опосредуемый T-лимфоцитами и/или другими клетками, такими как NK клетки и макрофаги). Для определения иммунного ответа разработаны стандартные анализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), проточная цитометрия, анализ клеточной пролиферации, анализы CTL и анализы ADCC/CDC.
[0123] Как используют в настоящем документе, термин "гликан" относится к полисахариду или олигосахариду. Гликан также используют в настоящем документе для обозначения углеводной части гликоконъюгата, такого как гликопротеин, гликолипид, гликопептид, гликопротеом, пептидогликан, липополисахарид или протеогликан. Как правило, гликаны содержат между моносахаридами исключительно O-гликозидные связи. Например, целлюлоза представляет собой гликан (или более конкретно глюкан), составленный из связанной β-1,4 связями D-глюкозы, а хитин представляет собой гликан, составленный из связанного β-1,4 связями N-ацетил-D-глюкозамина. Гликаны могут представлять собой гомо- или гетерополимеры остатков моносахаридов и могут являться неразветвленными или разветвленными. Гликаны можно выявлять связанными с белками как в гликопротеинах и протеогликанах. Как правило, они находятся на внешних поверхностях клеток. O- и N-связанные гликаны являются очень частыми у эукариот, но также их можно найти, хотя и менее часто, у прокариот. N-связанные гликаны часто связаны с азотом (N) R-группы аспарагина в секвоне. Секвон представляет собой последовательность Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина. Предпочтительным гликаном является молекула Globo-H.
[0124] Globo-H представляет собой гексасахарид, который представляет собой представителя семейства антигенных углеводов, который высоко экспрессированы на различных типах злокачественных опухолей, особенно злокачественных опухолей молочной железы, предстательной железы, поджелудочной железы, желудка, яичника, кишечника и легких. В иллюстративных вариантах осуществления у определенных пациентов на нулевой момент времени не выявляли никаких уровней антител к Globo-H, а после иммунизации терапевтической композицией по изобретению детектировали высокие титры. В других иллюстративных вариантах осуществления у определенных пациентов на нулевой момент времени выявляли определенные уровни антител к Globo-H, и после иммунизации терапевтической композицией по изобретению детектировали высокие титры. В определенных вариантах осуществления антитело к Globo-H экспрессировано на клеточной поверхности злокачественной опухоли в виде гликолипида и возможно в виде гликопротеина. В других вариантах осуществления сыворотка пациента, страдающего раком молочной железы, содержит высокие уровни антител к эпитопу Globo-H. В определенных вариантах осуществления к этому эпитопу в иммуногистохимических исследованиях также направлены моноклональные антитела Mbr1, VK9 и антитела к SSEA-3. Хотя определенные нормальные ткани также реагируют с Mbr1, включая нормальные ткани молочной железы, поджелудочной железы, тонкой кишки и предстательной железы, антиген в этих тканях преимущественно локализован на секреторных границах, куда доступ иммунной системе ограничен.
[0125] "Молекула Globo-H" определена в настоящем документе как гликан (т.е., молекула, содержащая молекулы сахара), который представляет собой Globo-H или его фрагмент или аналог. Globo-H представляет собой гликан, содержащий гексасахаридный эпитоп (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc) и необязательно, не являющуюся сахаром молекулу. Его фрагмент представляет собой гликан, содержащий фрагмент гексасахаридного эпитопа и, если применимо, не являющуюся сахаром молекулу. Эти олигосахариды можно получать общепринятыми способами. (См. Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006)). При желании их можно связывать с не являющейся сахаром молекулой. Патентная заявка США с серийным № 12/485546 относится к способу получения антител, специфичных к Globo-H или его фрагменту, посредством введения не являющемуся человеком млекопитающему (например, мыши, кролику, козе, овце или лошади) иммунной композиции, описанной выше, и выделения у млекопитающего антител, которые связываются с Globo-H или его фрагментом.
[0126] Аналоги Globo-H можно получать с использованием микропанели гликанов, и они включают гликаны, описанные в Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2008 August 19; 105(33): 11661-11666 и представленные на фигуре 1.
D,поверхн.
D,поверхн.
набл.
[0127] Аналоги Globo-H предпочтительно связываются с антителами VK-9, Mbr1 и антителами к SSEA-3. Предпочтительно, аналоги Globo-H связываются с конкретной константой диссоциации (K). Для анализа кривых связывания можно использовать изотерму Ленгмюра с получением констант диссоциации на поверхности (K). В условиях равновесия при инкубации средняя флуоресценция точек репликатов (F) можно описать посредством:
макс.
D,поверхн.
D,поверхн.
где F представляет собой максимальную интенсивность флуоресценции, меру количества активного углевода на поверхность, [P] представляет собой общую концентрацию антитела, и K представляет собой равновесную константу диссоциации для поверхности углевода и антитела. Как описано в Wang et al. В определенных вариантах осуществления предпочтительная (K) аналогов Globo-H в отношении антител VK-9, Mbr1 и антител к SSEA-3, описанных в Wang et al., составляет по меньшей мере, приблизительно или точно 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 или 1,6 нМ.
Megathura crenulata
Megathura crenulata
[0128] "Гемоцианин морского блюдца" (KLH) представляет собой большой, содержащий несколько субъединиц, несущий кислород металлопротеин, выявленный в гемолимфе гигантского морского блюдца, . KLH представляет собой гетерогенный гликозилированный белок, состоящий из субъединиц с молекулярной массой приблизительно от 350000 до приблизительно 390000 в агрегатах с молекулярными массами приблизительно от 400 кДа (например, мономер KLH) до приблизительно 8000 кДа (например, дидекамер KLH). Каждый домен субъединицы KLH содержит два атомы меди, которые вместе связывают одну молекулу кислорода. Когда с гемоцианином связан кислород, молекула принимает характерную прозрачную, опалесцирующую синюю окраску. В определенных вариантах осуществления белок KLH является очень иммуногенным, но при этом безопасным для людей. В определенных вариантах осуществления KLH можно выделять из гемолимфы  посредством ряда этапов, который, как правило, включает осаждение сульфатом аммония и диализ и может включать хроматографическую очистку для получения наибольшей чистоты. В определенных вариантах осуществления очистка KLH также может включать удаление эндотоксина, но этот этап может являться необязательным, так как эндотоксин при инъекции для продукции антител может служить в качестве адъюванта. Предпочтительно, высококачественный препарат KLH с четкой опалесцирующей синей окраской является наилучшим индикатором растворимости KLH. В определенных вариантах осуществления мономерные единицы KLH собираются в более крупный мультимер (декамер или дидекамер) с общей молекулярной массой приблизительно от 4000 кДа до 8000 кДа. "Молекула гемоцианина морского блюдца" или "молекула KLH" определена в настоящем документе как белок KLH1 (SEQ ID NO. 1) или KLH2 (SEQ ID NO. 2) или белок по существу идентичным им или их смеси. По существу идентичный в этом контексте означает, что каждая молекула KLH содержит последовательность аминокислот по меньшей мере, приблизительно или точно на 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76 или 75 процентов идентичную последовательности природного KLH дикого типа. В определенных вариантах осуществления KLH по изобретению обладает увеличенной иммуногенной активностью, в частности, увеличенной противоопухолевой активностью. В определенных вариантах осуществления KLH в композиции по настоящему изобретению содержит интактные неразрушенные субъединицы молекулярной массой приблизительно 400000. В других вариантах осуществления KLH по изобретению содержит мультимеры KLH более высокого порядка.
[0129] В определенных вариантах осуществления мультимеры KLH более высокого порядка обладают молекулярными массами приблизительно 8-10 миллионов с коэффициенты седиментации приблизительно 92-107S. Количество присутствующих мультимеров KLH более высокого порядка основано на анализах седиментационного равновесия и/или скорости седиментации при ультрацентрифугировании. В других вариантах осуществления KLH по изобретению демонстрирует увеличенную иммуногенную активность, в частности увеличенную противоопухолевую активность. Увеличенную иммуногенную активность наблюдают, например, но не ограничиваясь этим, (a) при инъекции KLH (без адъюванта), (b) при KLH, используемом в качестве адъюванта, (c) с KLH, используемым в качестве иммуногенного носителя для гаптенов или слабо иммуногенных антигенов, и (d) с KLH, используемым в качестве противоопухолевого средства. Композиция KLH по изобретению демонстрирует увеличенную противоопухолевую активность для многих опухолей, включая в качестве неограничивающих примеров опухоли мочевого пузыря, молочной железы, яичника и т.д. В определенных вариантах осуществления две молекулы KLH могут формировать димер посредством ковалентной связи между мономерами KLH. Не ограничиваясь теорией, полагают, что ковалентная связь между молекулами KLH формируется посредством дисульфидной связи. В определенных вариантах осуществления две или более молекулы KLH могут формировать димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер и т.д. посредством ковалентной связи между мономерами, димерами, тримерами и т.д. KLH. Не ограничиваясь теорией, полагают, что ковалентная связь между молекулами KLH формируется посредством дисульфидной связи.
N
[0130] Существует ряд способов связывания молекулы KLH с антигеном, включая прямую конъюгацию и конъюгацию с бифункциональной линкерной группой, такой как 4-(4--малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид (MMCCH). Такие способы связывания описаны в патенте США № 6544952. В определенных вариантах осуществления для получения терапевтических конъюгатов по изобретению, например, аллилгликозид Globo-H преобразуют в альдегид посредством озонолиза, и альдегидную группу связывают с NH-группами на кросслинкере MMCCH, получая Globo-H-MMCCH; белок-носитель, KLH, подвергают тиолированию с получением KLH-SH; и затем сульфгидрильные группы на тиолированном KLH связывают с малеинимидной группой на MMCCH, получая конъюгаты Globo-H-KLH.
N
[0131] В одном из вариантов осуществления аллилгликозид Globo-H получают посредством химического синтеза. Также используют тиолирующий реагент, 2-иминотиолан и KLH степени cGMP и линкер 4-(4--малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилгидразид (MMCCH). В определенных вариантах осуществления проводят следующие этапы: (1) преобразование аллилгликозида Globo-H в альдегид Globo-H; (2) связывание альдегида Globo-H с MMCCH с получением Globo-H-MMCCH, отдельно; (3) химическое тиолирование KLH; (4) конъюгация Globo-H-MMCCH с тиолированным KLH и (5) очистка гликоконъюгата Globo-H-KLH (OBI-822). Путь конъюгации Globo-H-субъединица KLH представлен на фигуре 2A.
[0132] В определенных вариантах осуществления при конъюгации молекулы Globo-H с молекулой белка KLH, молекула белка KLH в определенных вариантах осуществления демонстрирует снижение молекулярной массы по сравнение с интактной молекулой предпочтительно вследствие диссоциации субъединиц молекулы Globo-H. В других вариантах осуществления способы конъюгации, описываемые в настоящем документе, приводит к диссоциации субъединиц KLH, не описанной ранее. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что высокий уровень гликозилирования конъюгатов молекула Globo-H-субъединица молекулы KLH по изобретению приводит к формированию водородных связей между молекулами Globo-H. Поэтому в определенных вариантах осуществления силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия между субъединицами молекулы KLH замещаются водородными связями Globo-H, и это приводит к разделению субъединиц молекулы KLH. После конъюгации, субъединицы молекулы KLH конъюгата молекула Globo-H-молекула KLH предпочтительно агрегируют с формированием новых мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров или любого их сочетания. Получаемые в результате иллюстративные терапевтические конъюгаты молекула Globo-H-молекула KLH с неожиданно большим эпитопным отношением обладают необычными и неожиданными превосходными иммуногенными свойствами. В определенных вариантах осуществления молекулы Globo-H конъюгированы с остатками лизина на KLH1 и KLH2. В других вариантах осуществления молекулы Globo-H не конъюгированы с остатками лизина на KLH1 и KLH2. В определенных вариантах осуществления при анализе пептидного картирования выявляют, что конъюгированные с Globo-H участки с остатками лизина являются преобразованными, что позволяет предполагать, что композиция гликоконъюгата Globo-H-KLH является уникальной по своей структуре.
[0133] В одном из вариантов осуществления терапевтические композиции по изобретению содержат одну или более субъединиц молекулы KLH, где по меньшей мере одна такая субъединица конъюгирована по меньшей мере, приблизительно или точно 1, 10, 100 или 1000 раз: с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 или 160 или более молекулами Globo-H.
[0134] Авторы изобретения с использованием масс-спектроскопического анализа выявили, что молекулы Globo-H конъюгированы с остатками лизина KLH. Таким образом, в определенных вариантах осуществления предпочтительно, чтобы молекулы Globo-H были конъюгированы с остатками лизина.
[0135] В одном из вариантов осуществления в субъединице молекулы KLH всего существует точно или приблизительно 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 остатков лизина. В другом варианте осуществления в субъединице молекулы KLH существует точно или приблизительно 150 или 156 остатков лизина. В другом варианте осуществления на каждой субъединице молекулы KLH доступных для связывания или фактически связанных с молекулой Globo-H существует точно или приблизительно 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 или 110 участков конъюгации лизина. В другом варианте осуществления на каждой субъединице молекулы KLH существует 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100 таких участков конъюгации лизина. Участки конъюгации лизина представляют собой остатки лизина в молекуле KLH, которые доступны для связывания или фактически связаны с молекулой Globo-H и/или линкер для молекулы Globo-H, например, таким как линкер MMCCH.
[0136] В определенных терапевтических вариантах осуществления содержащих смесь субъединиц молекулы (например, KLH1 и KLH2 или их вариантов), суммарное количество доступных остатков лизина (для обеих субъединиц), как насчитывается вместе в субъединицах различного типа, может составлять или равно приблизительно 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 или 310. В таких вариантах осуществления вместе в различных субъединицах (например, KLH1 и KLH2 или их вариантах) существует или может существовать точно или приблизительно 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 или 160 участков конъюгации лизина. В других таких вариантах осуществления, существует 136, 137, 141, 140, 143, 147 или 155 участков конъюгации лизина.
[0137] В наиболее предпочтительном варианте осуществления из общего количества 306 остатков лизина в KLH1/KLH2 присутствует 136, 137, 140, 141, 143, 147 или 155 участков конъюгации лизина.
[0138] В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции по изобретению содержат смесь конъюгатов субъединица молекулы KLH-молекула Globo-H, где такие конъюгаты остаются мономерами или формируют димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры или любое их сочетание. В другом варианте осуществления терапевтические композиции по изобретению содержат выделенные мономеры, димеры, тримеры или тетрамеры или их комбинации конъюгата субъединица молекулы KLH-молекула Globo-H. В дополнительном варианте осуществления терапевтическая композиции по изобретению содержит только димеры и тримеры конъюгата субъединица молекулы KLH-молекула Globo-H.
x
x
a
a
y
[0139] В другом варианте осуществления терапевтические композиции содержат по меньшей мере две субъединицы молекулы KLH, где каждая из двух субъединиц молекулы KLH связана с различными гликанами. Другие ассоциированные с опухолями гликановые антигены, способные к связыванию с субъединицами молекулы KLH в качестве неограничивающих примеров могут включать GM2, GD2, GD3, фукозил, GM1, sTn, сиалил-антиген Льюиса, антиген Льюиса, сиалил-антиген Льюиса, антиген Льюиса, sTn, TF, полисиаловую кислоту, антиген Льюиса, муцины, T-антиген и т.п. В определенных вариантах осуществления только по меньшей мере или приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 процентов субъединиц молекулы KLH в терапевтической композиции связаны с молекулами Globo-H, тогда как оставшиеся субъединицы молекулы KLH в терапевтической композиции связаны с другими ассоциированными с опухолями гликановыми антигенами.
[0140] Как используют в настоящем документе, "эпитопное отношение" в отношении терапевтических конъюгатов, описываемых в настоящем документе, относится, например, к отношению антигенных эпитопов к молекулам носителя в терапевтическом конъюгата. Предпочтительно, это относится к отношению молекул Globo-H к молекулам KLH. Наиболее предпочтительно эпитопное отношение терапевтического конъюгата рассчитывают с использованием следующей формулы=(фактическая масса молекул Globo-H/молекулярная масса молекулы Globo-H)/(фактическая масса молекулы KLH/молекулярная масса молекулы KLH) комбинации. Специалист в данной области легко определит эпитопные отношения. Предпочтительно, массы Globo-H определяют, например, посредством высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD).
[0141] Предпочтительно эпитопные отношения терапевтических конъюгатов по изобретению составляют приблизительно, по меньшей мере или точно: 1, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2025, 2050, 2075, 2100, 2125, 2150, 2175, 2200, 2225, 2250, 2275, 2300, 2325, 2350, 2375, 2400, 2425, 2450, 2475, 2500, 2525, 2550, 2575, 2600, 2625, 2650, 2675, 2700, 2725, 2750, 2775, 2800, 2825, 2850, 2875, 2900, 2925, 2950, 2975 или 3000.
[0142] В одном из вариантов осуществления терапевтические композиции по изобретению содержат смесь терапевтических конъюгатов с определенным диапазоном эпитопных отношений. В одном из вариантов осуществления диапазон, среднее или медиана эпитопных отношений терапевтических конъюгатов в терапевтической композиции составляет приблизительно от 10 до приблизительно 3200, приблизительно от 800 до приблизительно 2500, приблизительно от 1000 до приблизительно 2000, приблизительно от 1250 до приблизительно 1750 или приблизительно от 1400 до приблизительно 1600. В другом варианте осуществления диапазон, среднее или медиана эпитопных отношений терапевтических конъюгатов в терапевтической композиции составляет приблизительно от 10 до приблизительно 150, приблизительно от 40 до приблизительно 125, приблизительно от 50 до приблизительно 100, приблизительно от 62 до приблизительно 87 или приблизительно от 70 до приблизительно 80. В другом варианте осуществления диапазон, среднее или медиана эпитопных отношений терапевтических конъюгатов в терапевтической композиции составляет приблизительно от 20 до приблизительно 300, приблизительно от 80 до приблизительно 250, приблизительно от 100 до приблизительно 200, приблизительно от 125 до приблизительно 175 или приблизительно от 140 до приблизительно 160. В другом варианте осуществления диапазон, среднее или медиана эпитопных отношений терапевтических конъюгатов в терапевтической композиции составляет приблизительно от 30 до приблизительно 450, приблизительно от 120 до приблизительно 375, приблизительно от 150 до приблизительно 300, приблизительно от 185 до приблизительно 260 или приблизительно от 210 до приблизительно 240. В определенных фармацевтических композициях по меньшей мере или приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 или 100% терапевтических конъюгатов существуют в виде мономеров или в виде димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров или их сочетаний.
АНТИТЕЛА К ТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ КОНЪЮГАТАМ
[0143] В определенных иллюстративных вариантах осуществления изобретение также относится к выделенным терапевтическим антителам, которые специфически связывают терапевтические конъюгаты, описываемые в настоящем документе, с определенной аффинностью, а также их использованию при лечении и/или диагностике пролиферативных заболеваний.
2
[0144] Как используют в настоящем документе, термины "антитело" и "антитела" (иммуноглобулины) включает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) сформированные по меньшей мере из двух интактных антитела, антителам человека, гуманизированным антителам, камелизированным антителам, химерным антителам, одноцепочечным Fv (scFv), одноцепочечным антителам, однодоменным антителам, доменным антителам, фрагментам Fab, фрагментам F(ab'), фрагментам антител, которые демонстрируют желаемую биологическую активность, связанным дисульфидами Fv (sdFv) и антиидиотипическим (анти-Id) антителам (включая, например, анти-Id к антителам по изобретению), интраантителам и связывающимся с эпитопами фрагментам любого из указанного выше. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е., молекулы, содержащие антигенсвязывающие участки молекул иммуноглобулинов, могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.
D
d
D
d
50
D
[0145] "Аффинность" антител к эпитопу, например, молекуле Globo-H терапевтического конъюгата, для применения при лечении, описанном в настоящем документе, представляет собой термин, хорошо понимаемый в данной области, и означает меру или силу связывания антител с эпитопом. Аффинность можно измерять и/или выражать рядом способов, известных в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров равновесную константу диссоциации (K или K), кажущуюся равновесную константу диссоциации (K' или K') и IC (количество, необходимое для осуществления 50% ингибирования в конкурентном анализе). Следует понимать, что для целей настоящего изобретения аффинность представляет собой среднюю аффинность данной популяции антител, которые связываются с эпитопом. Значения K' приводимые в настоящем документе в единицах мг IgG на мл или мг/мл означают количество мг Ig в мл сыворотки, хотя также можно использовать плазму. Когда аффинность антитело используют в качестве основы для проведения способов лечения, описываемых в настоящем документе, или для выбора для способов лечения, описываемых в настоящем документе, аффинность антител можно измерять до и/или в течение лечения, и полученные значения клинический работник может использовать для оценки того, что представляющий собой человека пациент является подходящим кандидатом для лечения.
-6
-7
-8
[0146] Как используют в настоящем документе, термин "специфическое связывание" относится к взаимодействию между связывающимися парами (например, антителом и антигеном). В различных случаях специфическое связывание может осуществляться при константе аффинности по меньшей мере или приблизительно 10 моль/литр, приблизительно 10 моль/литр или приблизительно 10 моль/литр или менее.
[0147] Иллюстративные антитела к Globo-H можно получать, собирая жидкости организма у иммунизированного индивидуума, исследованных на увеличение количества желаемых антител, такие как сыворотка, и выделяя сыворотку из крови любым общепринятым способом.
[0148] Как правило, антитела индуцируют несколькими инъекциями соответствующего антигена и адъюванта. Пригодным может являться конъюгация соответствующего антигена с белком, который является иммунногенным у иммунизируемых видов, например, с гемоцианином морского блюдца.
[0149] Способы иммунизации животных антигенами известны в данной области. Стандартным способом иммунизации млекопитающих является интраперитонеальная инъекция или подкожная инъекция антигенов. Более конкретно, антигены можно разбавлять и суспендировать в подходящем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS), физиологического солевого раствора и т.д. При желании, суспензию антигена можно смешивать с подходящим количеством адъюванта, а затем вводить индивидууму.
[0150] В определенных вариантах осуществления индивидуумов можно стимулировать до достижения плато титра посредством нескольких введений антигена, смешанного с подходящим количеством адъюванта. Также для иммунизации можно использовать подходящий носитель. После иммунизация, как указано выше, сыворотку проверяют способом для определения увеличения количества желаемых антител.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ
[0151] В одном из вариантов осуществления при введении пациенту терапевтические композиции, содержащие терапевтические конъюгаты по изобретению, способны индуцировать титры антител к Globo-H по меньшей мере или приблизительно в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000 или 5000 раз выше, чем титры тех же антител к Globo-H до введения (т.е., титры на исходном уровне до обработки) в том же эксперимента. В определенных вариантах осуществления антитела к Globo-H представляют собой антитела IgM. В другом варианте осуществления антитела к Globo-H представляют собой антитела IgG.
+
+
+
[0152] Терапевтические композиции по изобретению способны к индукции у индивидуума гуморального и клеточного ответа. В определенных вариантах осуществления вакцинная композиция по изобретению индуцирует продукцию специфичных к молекуле Globo-H антител IgG и IgM и размножение B-клеток и T-клеток (например, CD3T-клеток, CD4T-клеток и/или CD8T-клеток). Как правило, этот иммунный ответ хронологически происходит после введения. В конкретном примере после введения продукцию B-клеток выявляют приблизительно на сутки 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 или 60 с последующей продукцией антител IgG и IgM приблизительно на сутки 10, 20, 30, 60 или 90 и последующей продукцией T-клеток приблизительно на сутки 24, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150 или 180. Вакцинная композиция по изобретению потенциально обеспечивает длительное иммунологическое защитное действие, которое может предотвращать рост небольших количеств злокачественных клеток, таким образом, являясь идеальной для минимального остаточного заболевания так, чтобы достичь стабилизации заболевания и улучшения выживаемости.
in vitro
in vivo
[0153] "Антителозависимая клеточная цитотоксичность" и "ADCC" относятся к опосредуемой клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки (например, клетки естественных киллеров (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишень, а затем вызывают лизис клетки-мишени. В одном из вариантов осуществления такие клетки представляют собой клетки человека. Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом действия, эти цитотоксические клетки, которые опосредуют ADCC, как правило, экспрессируют рецепторы Fc (FcR). Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII, FcγRIII и/или FcγRIV. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках обобщенно описана в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC молекулы можно проводить анализ ADCC , такой как анализ, описанный в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Подходящие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и клетки естественных киллеров (NK). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC терапевтических конъюгатов по изобретению можно оценивать , например, в модели на животных, такой как модель, описанная в Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998).
[0154] В определенных вариантах осуществления введение фармацевтической композиции может обеспечивать иммунный ответ, включая образование антител, которые специфически связываются с Globo-H. В определенных вариантах осуществления разработаны антитела к одному или более из GloboH, экспрессируемых на поверхности злокачественных клеток, и запускающие CDC и/или ADCC с уничтожением этих клеток. В определенных вариантах осуществления антитела преимущественно включают антитела IgG. В определенных вариантах осуществления иммуногенные композиции, предоставляемые по настоящему документу, в основном включают IgG1, IgG2b, IgG2c и IgG3.
[0155] "Обусловленная комплементом цитотоксичность" или "CDC" относится к способности терапевтического конъюгата инициировать активацию комплемента и лизировать мишень в присутствии комплемента. Инициация пути активации комплемента происходит при связывании первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с распознаваемым антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
[0156] В другом варианте осуществления при введении пациенту терапевтические композиции, содержащие терапевтические конъюгаты по изобретению, способны индуцировать продукцию у пациента/индивидуума иммунной сыворотки против Globo-H, которая специфически связывается с положительными по Globo-H линиями злокачественных клеток, например, с клетками MCF-7.
КОМБИНАЦИИ
[0157] Терапевтические композиции могут содержать другие лекарственные средства против злокачественных опухолей/антипролиферативные лекарственные средства, а также адъюванты и другие иммуномодулирующие молекулы, такие как цитокины или хемокины. В определенных вариантах осуществления комбинация может представлять собой совместное введение отдельных средств/композиций или совместный состав. Эти средства можно доставлять в наборе совместно в раздельных контейнерах или в одном контейнере. Средства можно комбинировать в момент введения или по меньшей мере или приблизительно за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 минуты, часа или сутки до введения.
[0158] Адъюванты представляют собой фармакологические или иммунологические средства, которые модифицируют действие других средств. Они могут представлять собой неорганические или органические химические вещества, макромолекулы или целые злокачественные клетки или их части, которые усиливают иммунный ответ на данный антиген. Адъюванты включают полный и неполный адъювант Фрейнда, молекулы Toll-подобных рецепторов и их миметики, LPS, липопротеины, липопептиды, флагеллин, двухцепочечную РНК, неметилированные островки CpG, левамизол, бациллу Кальмета-Герена, октреотид, изопринозин и задаксин, различные формы ДНК и РНК, как правило, высвобождаемые бактериями и вирусами, антагонисты PD-1 и антагонисты CTLA. В одном из вариантов осуществления адъювант представляет собой сапониновый адъювант.
[0159] В определенном варианте осуществления сапониновый адъювант представляет собой сапонин OBI-821, который является по существу чистым. В других вариантах осуществления сапонин OBI-821 представляют его биологически активные фрагменты. Адъювант также может включать загрязненные формы сапонинов OBI-821. Очищенные сапонины OBI-821 демонстрируют увеличенное адъювантное действие при введении с вакциной, описываемой в настоящем документе, или смещивании с другим по существу чистым сапонином или несапониновыми адъювантами.
Quillaja saponaria
[0160] Сапонины OBI-821 представляют собой природные гликозиды, с высокой чистотой выделяемые из коры дерева  Molina посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), жидкостной хроматографии низкого давления с диоксидом кремния и жидкостной хроматографии на основе гидрофильного взаимодействия (HILIC), как описано, например, в патенте США № 5057540 и патенте США № 6524584, содержащие которых полностью включено в качестве ссылки. Анализ жидкостной хроматографии высокого давления продемонстрировал, что OBI-821 представляют собой смесь структурно родственных изомерных соединений. Идентифицированы и описаны в настоящем документе различные очищенные изомерные соединения сапонинов OBI-821.
[0161] В определенных вариантах осуществления сапонин OBI-821 содержит по меньшей мере одно выделенное соединение формулы I, как указано ниже:
где
1
R представляет собой β-D-апиозу или β-D-ксилозу; и
2
3
R и R независимо представляют собой H, алкил,
(ацильную группу жирной кислоты для соединения 1989) или
(ацильную группу жирной кислоты для соединения 1857).
[0162] Также сапонин OBI-821 может содержать выделенное соединение формулы I, где
1
2
3
(i) R представляет собой β-D-апиозу, R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1989, изображенную выше, и R представляет H (соединение 1989 V1A);
1
2
3
(ii) R представляет собой β-D-апиозу, R представляет собой H, и R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1989, изображенную выше (соединение 1989 V1B);
1
2
3
(iii) R представляет собой β-D-ксилозу, R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1989, изображенную выше, и R представляет собой H (соединение 1989 V2A); или
1
2
3
(iv) R представляет собой β-D-ксилозу, R представляет собой H, и R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1989, изображенную выше (соединение 1989 V2B). Обобщенно, соединение 1989 V1A, соединение 1989 V1B, соединение 1989 V2A и соединение 1989 V2B называют "смесь соединений 1989".
[0163] В таблице 1 приведены функциональные группы соединений 1989 и молярный % каждого соединения 1857 в смеси соединений 1857.
Таблица 1
<b>Молярный %</b>
<b>R</b><sup><b>1</b></sup>
<b>R</b><sup><b>2</b></sup>
<b>R</b><sup><b>3</b></sup>
Соединение 1989 V1A 64,5%
<img file="00000011.jpg" he="50" wi="24" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000012.jpg" he="86" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
Соединение 1989 V1B 1,5%
<img file="00000013.jpg" he="33" wi="24" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
<img file="00000014.jpg" he="83" wi="51" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Соединение 1989 V2A 33,3%
<img file="00000015.jpg" he="37" wi="25" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000016.jpg" he="86" wi="51" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
Соединение 1989 V2B 0,7%
<img file="00000015.jpg" he="37" wi="25" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
<img file="00000016.jpg" he="86" wi="51" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[0164] Сапонин OBI-821 может содержать выделенное соединение формулы I, где:
1
2
3
(i) R представляет собой β-D-апиозу, R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1857, изображенную выше, и R представляет собой H (соединение 1857 V1A);
1
2
3
(ii) R представляет собой β-D-апиозу, R представляет собой H, и R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1857, изображенную выше (соединение 1857 V1B);
1
2
3
(iii) R представляет собой β-D-ксилозу, R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1857, изображенную выше, и R представляет собой H (соединение 1857 V2A); или
1
2
3
(iv) R представляет собой β-D- Ксилоза, R представляет собой H, и R представляет собой ацильную группу жирной кислоты для соединения 1857, изображенную выше (соединение 1857 V2B). Обобщенно, соединение 1857 V1A, соединение 1857 V1B, соединение 1857 V2A и соединение 1857 V2B называют "смесь соединений 1857".
[0165] В таблице 2 приведены функциональные группы соединений 1857 и молярный % каждого из соединений 1857 в смеси соедининий 1857. ВЭЖХ.
Таблица 2
<b>Молярный %</b>
<b>R</b><sup><b>1</b></sup>
<b>R</b><sup><b>2</b></sup>
<b>R</b><sup><b>3</b></sup>
Соединение 1857 V1A 64,7%
<img file="00000017.jpg" he="26" wi="29" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000018.jpg" he="60" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
Соединение 1857 V1B 1,3%
<img file="00000019.jpg" he="31" wi="29" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
<img file="00000020.jpg" he="62" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Соединение 1857 V2A 33,4%
<img file="00000021.jpg" he="30" wi="27" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000020.jpg" he="62" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
Соединение 1857 V2B 0,6%
<img file="00000021.jpg" he="30" wi="27" img-content="undefined" img-format="jpg" />
H
<img file="00000020.jpg" he="62" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[0166] Сапонин OBI-821 содержит одно или более из следующих соединений:
(i) соединение 1857 V1A;
(ii) соединение 1857 V1B;
(iii) соединение 1857 V2A;
(iv) соединение 1857 V2B;
(v) соединение 1989 V1A;
(vi) соединение 1989 V1B;
(vii) соединение 1989 V2A; или
(viii) соединение 1989 V2B.
[0167] Процентное содержание смеси соединений 1857 и смеси соединений 1989 в сапонине OBI-821 может находиться в диапазона, как указано ниже:
(i) приблизительно от 1 молярного % до приблизительно 15 молярных % OBI-821 содержит смесь соединений 1857; и
(ii) приблизительно от 85 молярных % до приблизительно 99 молярных % OBI-821 содержит смесь соединений 1989.
[0168] Все молярные % могут варьировать на величину 0,1% (например, приблизительно от 87% до приблизительно 90%, приблизительно от 90,5% до приблизительно 97%, приблизительно от 3,5% до приблизительно 11%, приблизительно от 10% до приблизительно 14%).
[0169] Смесь соединений 1989 может содержать приблизительно 60-70 молярных % соединения 1989 V1A; приблизительно 1-5 молярных % соединения 1989 V1B; приблизительно 30-40 молярных % соединения 1989 V2A и приблизительно 0,1-3 молярных % соединения 1989 V2B. Все молярные % могут варьировать на величину 0,1 (например, 65%, 2,5%, 35,6%).
[0170] Смесь соединений 1857 может содержать приблизительно 60-70 молярных % соединения 1857 V1A; приблизительно 1-5 молярных % соединения 1857 V1B; приблизительно 30-40 молярных % соединения 1857 V2A и приблизительно 0,1-3 молярных % соединения 1857 V2B. Все молярные % могут варьировать на величину 0,1 (например, 65%, 2,5%, 35,6%).
Quillaja saponaria
[0171] В другом варианте осуществления по существу чистое OBI-821 очищают из неочищенного экстракта , где указанное OBI-821 характеризуется единственным преобладающим пиком, который составляет 90% или более всей области всех пиков хроматограммы, исключая пик растворителя, при анализе на ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке Symmetry C18 с размером частиц 5 мкм, порами 100 Å, 4,6 мм ВД × 25 см длины с программой элюции, включающей подвижную фазу A:B 95%:5% до 75%:25% в течение 11 минут, где подвижная фаза A представляет собой дистиллированную воду с 0,1% трифторуксусной кислотой, а подвижная фаза B представляет собой ацетонитрил с 0,1% трифторуксусной кислотой, при скорости потока 1 мл/мин.
[0172] В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция содержит соединение формулы (I)
где,
1
R представляет собой β-D-апиозу или β-D-ксилозу; и
2
3
R и R независимо представляют собой H, алкил, или
(ацильную группу жирной кислоты для соединения 1857), и фармацевтически приемлемый носитель.
[0173] Вакцина может содержать углеводный антиген или его иммуногенный фрагмент и сапонин OBI-821. В еще одном варианте осуществления вакцина содержит углеводный антиген или его иммуногенный фрагмент; белок-носитель и сапонин OBI-821. В другом варианте осуществления вакцина содержит углеводный антиген, выбранный из Globo-H, KLH и сапонин OBI-821. Неограничивающие примеры белка-носителя включают KLH.
[0174] Термины "α-галактозилцерамид" и "α-GalCer" относятся к гликолипиду, который стимулирует естественные киллерные T-клетки в направлении продукции цитокинов T хелперов 1 (TH1) и TH2, как описано в патенте США № 8268969, содержание которого полностью включено в качестве ссылки. В определенном варианте осуществления адъювант OBI-834 (известный как C34) характеризуется следующей иллюстративной структурой:
[0175] Как используют в настоящем документе, термин "цитокин" относится к любому из многочисленных низкомолекулярных, секретируемых белков, которые регулируют интенсивность и длительность иммунного ответа, влияя на процессы дифференцировки иммунных клеток, как правило, включающие изменения в экспрессии генов, вследствие чего клетки-предшественники становятся определенным специализированным типом клеток. Цитокины различным образом называют лимфокинами, интерлейкинами и хемокинами на основе их предполагаемой функции, секреции клетками или мишени действия. Например, определенные типичные интерлейкины в качестве неограничивающих примеров включают IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF и TGF-β.
[0176] Как используют в настоящем документе, термин "хемокин" относится к любому из различных низкомолекулярных хемотаксический цитокинов, высвобождаемых в участке инфекции, которые обеспечивают средства для мобилизации и активации лимфоцитов. Хемокины привлекают лейкоциты к участкам инфекции. Хемокины содержат консервативные остатки цистеина, которые позволяют разделять их на четыре группы. Группы с типичными хемокинами представляют собой C-C-хемокины (RANTES, MCP-1, MIP-1α и MIP-1β), C-X-C-хемокины (IL-8), C-хемокины (лимфотактин) и CXXXC хемокины (фракталкин).
[0177] Терапевтические композиции по изобретению могут дополнительно содержать ингибиторы PD-1/PD-L1 (иммунотерапия цитотоксическими T-лимфоцитами (CTL)), средства для иммунотерапии CTLA-4, ингибиторы CDK4/6 (направленная терапия), ингибиторы PI3K (направленная терапия), ингибиторы mTOR (направленная терапия), ингибиторы AKT (направленная терапия), панингибиторы Her (направленная терапия). Также эти ингибиторы можно модифицировать с получением соответствующих моноклональных антител. Такие антитела можно включать в терапевтические композиции по изобретению.
[0178] Терапевтические композиции могут содержать другие средства против злокачественных опухолей/антипролиферативные или химиотерапевтические средства. В определенных вариантах осуществления примеры таких средств можно найти в Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Такие средства против злокачественных опухолей в качестве неограничивающих примеров включают следующее: гормональные терапевтические средства (например, селективные модуляторы рецепторов эстрогенов, модуляторы рецепторов андрогенов), препараты моноклональных антител, химиотерапевтические средства, модуляторы ретиноидных рецепторов, цитотоксические/цитостатические средства, антинеопластические средства, антипролиферативные средства, ингибиторы пренилпротеинтрансферазы, ингибиторы HMG-КоА-редуктазы, азотистые иприты, нитрозокарбамиды, ингибиторы ангиогенеза (например, бевацизумаб), ингибиторы клеточной пролиферации и пути передачи сигнала выживания, индуцирующие апоптоз средства, средства, блокирующие контрольные точки клеточного цикла, средства, блокирующие рецепторы тирозинкиназы (RTK), мишени млекопитающий ингибиторов рапамицина (mTOR), ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста 2 (HER2) человека, ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), блокаторы интегринвов, НПВП, агонисты PPAR, ингибиторы наследственной множественной лекарственной устойчивости (MDR), противорвотные средства, средства, пригодные при лечении анемии, средства, пригодные при лечении нейтропении, усиливающие иммунологический ответ лекарственные средства, биофосфонаты, ингибиторы ароматазы, средства, индуцирующие конечную дифференцировку неопластических клеток, ингибиторы γ-секретазы, вакцины против злокачественных опухолей и любое их сочетание.
СОСТАВЫ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ
[0179] Как правило, терапевтические композиции (также указываемые в настоящем документе как фармацевтические композиции) содержат фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в настоящем документе, формулировка "фармацевтически приемлемый носитель" включает растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие всасывание средства и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. В композиции также можно вводить дополнительные активные соединения. Фармацевтическую композицию формулируют так, чтобы она была совместима с назначенным маршрутом введения. Примеры маршрутов введения включают парентеральное, например, внутривенное, интрадермальное, подкожное, внутримышечное, внутриартериальное, пероральное (например, ингаляция), трансдермальном (местное), трансмукозальное и ректальное введения. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, интрадермального или подкожного применений могут содержать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, буферизированный Tris солевой раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль, или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регулировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Значение pH можно регулировать кислотами или основаниями, такими как соляная кислота или гидроксид натрия. Парентеральный препарат можно помещать в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для нескольких доз, полученные из стекла или пластика.
[0180] Фармацевтические композиции, подходящие для применения в качестве инъекций, включают стерильные водные растворы (при условии водорастворимости) или дисперсии и стерильные порошки для получаемых перед введением препаратов стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Подходящие для внутривенного введения носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, кремофор EL (BASF, Parsippany, N.J.) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкостью в такой степени, чтобы существовала хорошая проходимость через иглу. Она должна оставаться стабильной в условиях производства и хранения и быть предохраненной от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Должную текучесть можно поддерживать, например, используя покрытие, такое как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсии и используя поверхностно-активные вещества. Предотвращение действия микроорганизмов можно добиваться различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, аскорбиновой кислотой, тимеросалом и т.п. Во многих случаях предпочтительно включать в композиции средства придания изотоничности, например, сахара, полиспирты, такие как манит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированного всасывания инъецируемых композиций можно добиваться включением в композиции средств, задерживающих всасывания, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0181] Стерильные инъецируемые растворы можно получать, добавляя требуемое количество активного соединения в подходящий растворитель, содержащий при необходимости один или комбинацию ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают, добавляя активное соединение в стерильный носитель, который содержит основную диспергирующую среду и другие требуемые ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов способы получения включают вакуумную сушку и лиофилизацию, которыми получают порошок активного ингредиента с любыми дополнительными желаемыми ингредиентами из ранее простерилизованного фильтрованием их раствора.
[0182] Как правило, пероральные композиции содержат инертный разбавитель или съедобный носитель. С целью перорального терапевтического введения активное соединение можно добавлять в эксципиенты и использовать в форме таблетки, пастилки или капсулы, например, желатиновой капсулы. Пероральные композиции также можно получать с использованием жидкого носителя для применения в качестве ополаскивателя для рта. В качестве части композиции можно включать фармацевтически совместимые связывающие средства или вспомогательные материалы. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений сходного характера: связывающее средство, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза, дезинтегрирующее средство, такое как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазочное средство, такое как стеарат магния или Sterotes; способствующее скольжению средство, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновая вкусо-ароматическая добавка.
[0183] Кроме того, для перорального введения составы по изобретению могут принимать форму, например, таблеток или капсул, получаемых общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазочные средства (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтегранты (например, картофельный крахмал или крахмалгликолят натрия); или средства для смачивания (например, лаурилсульфат натрия). На таблетки можно наносить покрытия хорошо известными в данной области способами. Композиции по изобретению также можно добавлять в микросферы или микрокапсулы, например, получаемые из полигликолевой кислоты/молочной кислоты (PGLA) (см., патенты США №№ 5814344; 5100669 и 4849222; публикации PCT №№ WO 95/11010 и WO 93/07861). Жидкие препараты для перорального введение могут принимать форму, например, растворов, сиропов, эмульсий или суспензий, или их можно предоставлять в виде сухого продукта для восстановления перед применением водой или другим подходящим носителем. Такие жидкие препараты можно получать общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Также препараты при необходимости могут содержать буферные соли, вкусо-ароматические добавки, красители и подсластители. Препараты для перорального введения можно соответствующим образом формулировать с обеспечением контролируемого высвобождения активного соединения.
[0184] Для введения посредством ингаляции соединения доставляют в форме распыляемого аэрозоля из контейнера или распределителя под давлением, содержащего подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода, или ингалятора.
[0185] Системное введение также может являться трансмукозальным или трансдермальным. Для трансмукозального или трансдермального введения в составе используют обеспечивающие проникновение вещества, подходящие для барьера, через который необходимо обеспечить проникновение. Такие обеспечивающие проникновение вещества, как правило, известны в данной области и включают, например, для трансмукозального введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Трансмукозальное введение можно проводить посредством использования назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения формулируют в мази, бальзамы, гели или кремы, как широко известно в данной области. Соединения также можно получать в форме суппозиториев (например, с общепринятыми основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или удерживающая клизма для ректальной доставки.
[0186] В соответствии с реализациями активные соединения получают с носителями, которые защищают соединение от быстрого выведения из организма, такими как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов очевидны специалистам в данной области. Материалы также можно получать на коммерческой основе. Также в качестве фармацевтически приемлемых носителей можно использовать суспензии липосом (включая липосомы, направляемые к инфицированным клеткам моноклональными антителами к специфичным для клеток антигенам). Их можно получать способами, известными специалистам в данной области, например, как описано в патенте США № 4522811, включенном в настоящий документ в качестве ссылки.
[0187] Для простоты введения и равномерности дозирования предпочтительно формулировать пероральные или парентеральные композиции в стандартные лекарственные формы. Как используют в настоящем документе, стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для индивидуума, подвергаемого лечению; где каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное так, чтобы оказывать желаемое терапевтическое действие, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем.
[0188] Иммуногенные составы по изобретению можно доставлять парентерально, т.е., посредством внутривенного (в/в), подкожного (п/к), интраперитонеального (и/п), внутримышечного (в/м), субдермального (с/д) или интрадермального (и/д) введения, посредством прямой инъекции, например, посредством болюсной инъекций, непрерывного вливания или генной пушки (например, для введения индивидууму векторной вакцины, такой как голая ДНК или РНК). Составы для инъекций можно предоставлять в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в контейнерах для нескольких доз с добавлением консерванта. Композициям можно придавать такие формы, как эксципиенты, суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и они могут содержать формулирующие средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для восстановления перед применением подходящим носителем, например, стерильной не содержащей пирогенов водой.
[0189] По настоящему изобретению также предусмотрены различные стратегии вакцинации через слизистые.
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ
50
50
50
50
[0190] Токсичность и терапевтическую эффективность таких терапевтических композиций можно определять стандартными фармацевтическими способами в культурах клеток или у экспериментальных животных, например, определяя LD (летальную дозу для 50% популяции) и ED (терапевтически эффективную дозу у 50% популяции). Отношение доз при токсическом и терапевтическом действии представляет собой терапевтический индекс и его можно выражать в виде отношения LD/ED. Предпочтительными являются терапевтические композиции, демонстрирующие высокие терапевтические индексы. Хотя соединения, демонстрирующие токсические побочные эффекты, можно использовать, необходимо принимать меры для разработки системы доставки, которая направляет такие соединения к участку повреждения для минимизации потенциального повреждения неинфицированных клеток и, таким образом, снижения побочных эффектов.
50
50
[0191] Данные, получаемые на основе анализов культур клеток и исследований на животных, можно использовать для формулирования диапазона доз для применения у людей. Дозировки таких соединений предпочтительно находятся в пределах диапазона циркулирующих концентраций, который включает ED с минимальной или отсутствующей токсичностью. В пределах этого диапазона дозировка может варьировать в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого маршрута введения. Для любого соединения, используемого в способе по изобретению, терапевтически эффективную дозу исходно можно рассчитать на основе анализов в культуре клеток. Дозу можно формулировать в моделях на животных с достижением диапазона циркулирующей плазматической концентрации, который включает IC (т.е., концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается половина максимального ингибирования симптомов), как определяют в культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения подходящих доз у людей. Уровни в плазме можно определять, например, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.
[0192] Описываемые композиции, антиген и адъювант, предоставлены в иммуногенно эффективных количествах. Для каждого конкретного антигена оптимальное иммуногенно эффективное количество необходимо определять экспериментально (принимая во внимание конкретные особенности данного пациента и/или тип лечения). Как правило, это количество находится в диапазоне 0,01 мкг-250 мг антиген на кг массы организма. Для определенного иллюстративного адъюванта по настоящему изобретению иммуногенно эффективное количество может находиться в диапазоне 10-250 мкг адъюванта на кг массы организма.
[0193] В определенных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество терапевтической композиции (т.е., эффективная доза) может находиться в диапазоне приблизительно от 0,001 мкг/кг до приблизительно 250 г/кг, от 0,01 мкг/кг до 10 г/кг или от 0,1 мкг/кг до 1 г/кг или приблизительно или по меньшей мере: 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009; 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09;0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225 или 250 грамм или микрограмм на килограмм масса тела пациента, или в любом диапазоне между любыми из чисел, перечисленных в этом абзаце, или в других диапазонах, которые очевидны и понятны специалистам без излишнего экспериментирования. Специалисту в данной области понятно, что на дозировку и временные параметры, необходимые для эффективного лечения индивидуума могут влиять определенные факторы, включая в качестве неограничивающих примеров тяжесть заболевания или нарушения, предыдущие способы лечения, общее состояние здоровья или возраст индивидуума и другие присутствующие заболевания.
[0194] В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество молекулы Globo-H в терапевтической композиции (например, эффективная доза) может находиться в диапазоне приблизительно от 0,001 мкг/кг до приблизительно 250 г/кг, от 0,01 мкг/кг до 10 г/кг или 0,1 мкг/кг до 1 г/кг или приблизительно или по меньшей мере: 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009; 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09;0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225 или 250 грамм или микрограмм на килограмм массы тела пациента, или в любом диапазоне между любыми из чисел, перечисленных в этом абзаце, или в других диапазонах, которые очевидны и понятны специалистам без излишнего экспериментирования. Специалисту в данной области понятно, что на дозировку и временные параметры, необходимые для эффективного лечения индивидуума могут влиять определенные факторы, включая в качестве неограничивающих примеров тяжесть заболевания или нарушения, предыдущие способы лечения, общее состояние здоровья или возраст индивидуума и другие присутствующие заболевания.
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
[0195] В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции, описываемые в настоящем документе, содержат или ассоциированы, по меньшей мере с одним терапевтическим конъюгатом или терапевтическим антителом, в соответствии с чем каждый из по меньшей мере одного терапевтического конъюгата или терапевтического антитела присутствует в однократной дозе в концентрации приблизительно, по меньшей мере или более чем: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99, где каждое число умножено на 10, 10, 10, 10,10, 10, 10, 10, 10, моль на дозу. Предпочтительно, терапевтический конъюгат присутствует в однократной дозе в концентрации приблизительно от: 1-100, 2- 60, 3-50, 4-40, 5-30, 6-20, 7-15, 8-10, 2-18, 3-16, 4-14, 5-12, 6-10 или 7-8 мкМ или в любом диапазоне между любыми из чисел, перечисленных в этом абзаце.
-3
-2
-1
[0196] В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции, описываемые в настоящем документе, содержат или ассоциированы по меньшей мере с одним терапевтическим конъюгатом или терапевтическим антителом, в соответствии с чем каждый из по меньшей мере одного терапевтического конъюгата или терапевтического антитела присутствует в однократной дозе в концентрации приблизительно, по меньшей мере или более чем: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99, где каждое число умножено на 10, 10, 10 или10 микрограмм. В определенных вариантах осуществления в дозу присутствует приблизительно или по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250 или более микрограмм одного терапевтического конъюгата или терапевтического антитела.
[0197] В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции, описываемые в настоящем документе, вводят в дозе приблизительно, или по меньшей мере, или более чем: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 раза в сутки, неделю или месяц в течение периода приблизительно, или по меньшей мере, или более чем: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 суток, недель, месяцев или лет.
[0198] Эффективная доза и оценка безопасности
[0199] Способами по настоящему изобретению фармацевтические и вакцинные композиции, описываемые в настоящем документе, вводят пациенту в иммуногенно эффективных дозах, предпочтительно с минимальной токсичностью. Как перечислено в разделе, озаглавленном "Определения", "иммуногенно эффективная доза" или "терапевтически эффективная доза" описываемых составов относится к такому количеству антигена и/или адъюванта, которого достаточно для обеспечения эффективного иммунного ответа у подвергаемого лечению индивидуума и, таким образом, достаточно для обеспечения оздоравливающего действия у указанного индивидуума.
НАБОРЫ
[0200] По другому аспекту специалистом в данной области предусмотрены один или более наборов частей, наборов частей для проведения по меньшей мере оного из способов, описанных в настоящем документе, где набор частей, содержит один или более терапевтических конъюгатов, средств против злокачественных опухолей/антипролиферативных средств, адъювантов, цитокинов и/или хемокинов. Терапевтические композиции, содержащие, отдельно или в комбинации, эффективное количество терапевтических композиций, описаны в настоящем документе, в соответствии по меньшей мере с одним из указанных выше способов. Указанные выше средства могут поступать в отдельном контейнере или в различных контейнерах в наборе.
[0201] При желании композиции можно предоставлять в упаковке или раздаточном устройстве, которые могут содержать один или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент (т.е., антиген и/или содержащий гликосфинголипиды (GSL) адъювант). Например, упаковка может, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или раздаточное устройство могут сопровождаться инструкциями по введению. Также можно получать композиции по изобретению, сформулированные в совместимом фармацевтическом носителе, помещать в подходящий контейнер и маркировать для лечения указанного патологического состояния.
[0202] Наборы по возможности также содержат идентификаторы биологического события или другие соединения, идентифицируемые специалистом после прочтения настоящего описания. Набор также может содержать по меньшей мере одну композицию, содержащую эффективное количество терапевтических композиций, описываемых в настоящем документе. Терапевтические композиции из наборов для осуществления по меньшей мере одного способа по настоящему документу описаны в соответствии со способом, определяемым специалистом в данной области.
[0203] Описание также включает способы лечения пролиферативных заболеваний с использованием терапевтических композиций, описываемых в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления способы включают лечение злокачественной опухоли, например, рака молочной железы. Как правило, способы включают предоставление терапевтических композиций, описываемых в настоящем документе, нуждающемуся в этом пациенту в количестве, эффективном для лечения пролиферативного нарушения.
[0204] В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции по изобретению вводят нуждающемуся в этом индивидууму (например, индивидууму со злокачественной опухолью, такой как рак молочной железы) способом, который в среднем увеличивает продолжительность существования без прогрессирования или общую длительность существования по сравнению с контролем плацебо, например, плацебо в виде фосфатно-солевого буфера, на период приблизительно или по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 суток, недель, месяцев или лет.
[0205] В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции вводит подкожно на неделе 0-2, 6, 14 и 26 в отсутствие неприемлемой токсичности или прогрессирования заболевания.
[0206] В определенных вариантах осуществления терапевтические композиции по изобретению вводят нуждающемуся в этом индивидууму (например, индивидууму со злокачественной опухолью, такой как рак молочной железы) способом, который в среднем уменьшает объем опухоли у пациента относительно контроля плацебо, например, плацебо в виде фосфатно-солевого буфера, на период приблизительно или по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 74 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 или более процентов в течение периода 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 суток, недель, месяцев или лет.
[0207] В определенных вариантах осуществления можно точно определять объемы опухолей по меньшей мере в одном измерении (необходимо зарегистрировать наибольший диаметр в плоскости измерения) с минимальным размером 10 мм посредством сканирования КТ (рекомендованная толщина среза при сканировании КТ составляет от 2,5 мм до 5 мм).
СПОСОБЫ СИНТЕЗА КОМПОЗИЦИЙ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ
[0208] Часть гексасахарида Globo-H терапевтических композиций по изобретению химически синтезировали в виде аллилгликозида, а затем подготавливали для конъюгации с KLH.
[0209] В одном из иллюстративных вариантов осуществления химический синтез Globo-H включает следующие основные этапы:
[0210] KLH обрабатывали 2-иминотиоланом в водном буфере. Затем тиолированный KLH отделяли от непрореагировавшего 2-иминотиолана посредством колонки для эксклюзионной хроматографии Sephadex G-15. Тиолированный KLH содержали в атмосфере инертного газа (азота или аргона) и использовали непосредственно для конъюгации с Globo-H-MMCCH.
ПРИМЕРЫ
[0211] Пример 1: Получение гликоконъюгата по изобретению (Globo-H-KLH)
3
[0212] Аллилгликозид Globo-H (коммерчески доступный) преобразовывали в альдегид посредством озонолиза. Альдегид Globo-H подвергали реакции с линкером MMCCH и NaCNBH с получением Globo-H-MMCCH. Смесь очищали посредством колонки с получением Globo-H-MMCCH. Во фракциях подтверждали наличие Globo-H-MMCCH посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а затем объединяли вместе. KLH растворяли в буфере для тиолирования и в реакционную смесь порционно добавляли 2-иминотиолан. Реакционную смесь инкубировали до завершения реакции, а затем KLH-SH очищали посредством колонки. Globo-H-MMCCH и KLH-SH комбинировали. Реакционную смесь перемешивали до завершения реакции. Затем гликоконъюгат Globo-H-KLH очищали с получением конечного продукта.
[0213] Пример 2: Анализ массового отношения Globo-H и KLH в гликоконъюгате
[0214] Массовое отношение Globo-H и KLH в получаемом гликоконъюгате подтверждали посредством высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD). Результат представлен в таблице 3.
[0215] Таблица 3: Массовое отношение Globo-H и KLH в гликоконъюгате
Эпитопное отношение гликоконъюгата (M<sub>W</sub> дидекамера KLH: 8600000 Да)
Эпитопное отношение (M<sub>W</sub> мономера KLH: 400 кДа)
Масса Globo-H к массе молекулы KLH (мг/мг)
3000
150
0,368
1950
97,5
0,239
1500
75
0,184
1050
52,5
0,129
300
15
0,037
100
5
0,012
20
1
0,002
[0216] Пример 3: Анализ эпитопного отношения Globo-H к KLH в гликоконъюгате
[0217] Молекулярная масса дидекамера KLH (природной агрегированной формы) составляет приблизительно 7,5 МДа-8,6 МДа, как описано в литературе, такой как Micron 30 (1999) 597-623. Природный KLH подтверждали эксклюзионной хроматографией и спектрометрией углового рассеяния лазерного излучения (MALS) с получением молекулярной массы приблизительно 8,6 МДа (см. фигуру 3).
[0218] Распределение масс KLH и гликоконъюгата Globo-H-KLH (OBI-822, № партии 14001) определяли и получали посредством эксклюзионной хроматографии с использованием спектрометр многоуглового рассеяния лазерного излучения (SEC-MALS). Молекулярную массу рассчитывали на основе содержания белка (ε=1,39) (см. фигуру 4). На фигуре 4A можно наблюдать дидекамер (n=20) и мультидекамер (n>20) KLH. На фигуре 4B продемонстрировано, что площадь пика дидекамера составляла 74,3%, а мультидекамера - 25,7%. На фигуре 4C, можно наблюдать от мономера до гексамера (n=1-6) и мультимер (n>7-20) гликоконъюгата Globo-H-KLH (OBI-822). На фигуре 4D представлено, что основным компонентом являлась площадь пика от мономера до гексамера (n=1-6) (>97%), а мультимер (n>7-20) составлял только небольшое количество (2,2%). Итоги анализа распределения масс KLH и олигомера OBI-822 приведены в таблице 4.
[0219] Таблица 4: Итоги анализа распределения масс KLH и олигомера OBI-822
<b>Распределение масс</b>
<b>Диапазон 1 (%)</b>
<b>Диапазон 2 (%)</b>
<b>Диапазон 3 (%)</b>
<b>Диапазон 4 (%)</b>
<b>Диапазон 5 (%)</b>
Начало M<sub>W</sub> (кДа)<sup>*</sup>Конец M<sub>W</sub> (кДа)
0850
8501400
14003000
30008000
800020000
Олигомер<sup></sup>KLH <sup>**</sup>
Дидекамер n=20
Мультидекамер n>20
Количество KLH (%)
0
0
0
74,3%
25,7%
Олигомер OBI-822<sup>***</sup>
От мономера до димера n=1-2
Тример n=3
От тетрамера до гексамера n=4-6
Мультимер n>7-20
Олигомер n>20
Количество OBI-822, партия 14001 (%)
39,7%
45,9%
12,3%
2,2%
0
W
W
*Начало/Конец M: Диапазон молекулярных масс (M) в кДа
**Для KLH, расчетная масса мономера составляет приблизительно 350-400 кДа
***Для OBI-822, расчетная масса мономера составляет приблизительно 400-500 кДа
[0220] Результаты продемонстрировали, что гликоконъюгат по изобретению демонстрировал сниженную молекулярную массу по сравнению с природными агрегированными дидекамерами KLH. Молекулярное отношение рассчитывали как в таблице 5.
[0221] Таблица 5: Расчет молекулярного отношения Globo-H и KLH
<b>Экспериментальная молекулярная масса Globo-H-KLH (кДа)</b>
<b>Масса 75 Globo-H на субъединицу KLH в Globo-H-KLH: 75 кДа</b>
<b>Масса субъединицы KLH: 400 кДа</b>
<b>Предположение о (Globo-H)-(мультимер KLH) на основе экспериментальных данных</b>
8000
75×20=1500
400×20=8000
1500+8000=9500KLH после конъюгации Globo-H-KLH формирует <b>дидекамер</b>.
3000
75×6=450
400×6=2400
450+2400=2850KLH после конъюгации Globo-H-KLH формирует <b>гексамер</b>.
1400
75×3=225
400×3= 1200
225+1077=1425KLH после конъюгации Globo-H-KLH формирует <b>тример</b>.
850
75×2=150
400×2=800
150+800=950KLH после конъюгации Globo-H-KLH формирует <b>димер</b>.
* Указанное выше молекулярное отношение рассчитывают на основе приведенной ниже формулы:
** Молекулярная масса KLH зависит от форм димера, тримера, тетрамера, пентамера, гексамера-дидекамера
[0222] Учитывая указанное выше, в определенных вариантах осуществления гликоконъюгатов по изобретению мономерные единицы KLH после конъюгации с Globo-H формируют мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры и/или гексамеры.
[0223] Пример 4: Получение вакцинных композиций и иммунизация крыс
[0224] Различные образцы гликоконъюгатов (Globo-H-KLH), как получено в примере 1, хранили при 4°C и смешивали с сапониновым адъювантом в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Полученные вакцинные композиции помещали на лед и транспортировали в виварий для последующей иммунизации.
[0225] Иммунизировали три группы крыс Lewis различными вакцинными композициями, как представлено в таблице 6.
[0226] Таблица 6: Группы иммунизированных крыс
<b>Группа</b>
<b>Вакцинные композиции</b>
<b>Количество животных</b>
<b>Маршрут</b>
I
Globo-H-KLH<sup>*</sup> (25 мкг)+сапониновый адъювант (25 мкг)
8
подкожная инъекция
II
Globo-H-KLH<sup>*</sup> (7,5 мкг)+сапониновый адъювант (25 мкг)
4
III
PBS (Фосфатно-солевой буфер)
4
*Globo-H:KLH=0,17:1 (масс./масс.)
[0227] Крыс иммунизировали на сутки 0, 7, 14 и 21. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и плазму собирали на сутки 0, 3, 10, 17, 24 и 31. Селезенки, лимфоузлы и перитонеальные смывы собирали на сутки 31.
[0228] Пример 5: Анализы на индукцию гуморального и клеточного иммунного ответа у крыс
[0229] Пример 5.1: Анализ субпопуляций иммунных эффекторных клеток посредством проточной цитометрии
3
[0230] У животных выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), а затем посредством проточной цитометрии идентифицировали различные субпопуляции иммунных эффекторных клеток с использованием специфичных антител к различным клеточным маркерам. PBMC, выделенные у иммунизированных крыс на сутки 0, 3, 10, 17, 24 и 31, окрашивали различными конъюгированными с флуоресцентным соединением (FITC) антителами и помещали на лед на период 30 минут. После инкубации, клетки отмывали отмывочным буфером (1% бычий сывороточный альбумин (Sigma) и 0,1% NaN (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (UniRegion Biotech) и центрифугировали при 350 g в течение 5 минут. Клетки ресуспендировали в отмывочном буфере для определение флуоресценции посредством FACS Canto (BD Bioscience). Данные анализировали посредством программного обеспечения BD FACSDiva (BD Bioscience). Результаты демонстрируют, что у иммунизированных гликоконъюгатом по настоящему изобретению крыс по сравнению с контрольной группой, которой вводили PBS, B-клетки и T-клетки значимо увеличивались в количестве. Конкретно, популяцию B-клеток впервые выявляли на сутки 3, а последующие клетки CD3T, CD4T и CD8T выявляли на сутки 24. См. фигуры от фигуры 5A до фигуры 5D.
[0231] Пример 5.2: Тестирование специфичных к Globo-H антител посредством ELISA
[0232] Продукцию специфичных к Globo-H антител в плазме иммунизированных крыс определяли посредством анализа ELISA. Результаты продемонстрировали, что титры специфичных к Globo-H IgG начинали подниматься на 10 сутки и достигали пика через 17 суток после иммунизации. Подобные схемы наблюдали для продукции специфичных к Globo-H антител IgM. См. фигуры от фигуры 6A до фигура 6B. Ответа специфичными антителами к Globo-H IgG и IgM у крыс, обработанных только PBS, не наблюдали.
[0233] В итоге у иммунизированных крыс продукцию B-клеток выявляли на сутки 3 с последующей продукцией антител IgM и IgG к Globo-H, которую выявляли на 10 и последующими клетками CD3T, CD4T и CD8T, которые выявляли на сутки 24. Гликоконъюгат (Globo-H-KLH) по изобретению эффективно индуцировал гуморальный и клеточный ответ.
[0234] Пример 6: Иммунизация мышей и тестирование антител посредством ELISA
[0235] Различные образцы гликоконъюгатов (Globo-H-KLH) хранили при 4°C и смешивали с сапониновым адъювантом в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Полученные вакцинные композиции помещали на лед и транспортировали в виварий для последующей иммунизации.
[0236] Мышам Balb/c в возрасте приблизительно восемь недель посредством подкожной инъекции раз в неделю в течение четырех недель (сутки 0, 7, 14 и 21) вводили гликоконъюгат Globo-H-KLH с различными отношениями углевода и белка (Globo-H:KLH). Образцы крови собирали из ретроорбитальной или лицевой вены без антикоагулянта до иммунизации или на сутки 0 и через трое суток после каждой вакцинации (сутки 10, 17 и 24). Затем образцы центрифугировали для разделения сыворотки и эритроцитов. Сыворотку собирали и хранили при -20°C и позже анализировали посредством ELISA. Для статистического анализа использовали t-критерий Манна-Уитни.
[0237] Как представлено на фигуре 7, продемонстрировано, что гликоконъюгат (Globo-H-KLH) в комбинации с сапониновым адъювантом по изобретению в модели на животных по сравнению с контрольной группой, которой вводили PBS, значимо индуцировал ответ специфичными к Globo-H антителами IgM. Конкретно, гликоконъюгат с массовым отношением 0,17: 1 (Globo-H:KLH) индуцировал лучший титр антител, чем гликоконъюгат с массовым отношением 0,07:1 (Globo-H:KLH).
[0238] В итоге гликоконъюгат Globo-H-KLH (OBI-822) в комбинации с надлежащим адъювантом по изобретению в модели на животных продемонстрировал индукцию неожиданно сильного гуморального и клеточного иммунного ответа, в частности, рост B-клеток и T-клеток, включая ответы CTL и IgM и IgG, которые являются важными при иммунотерапии злокачественных опухолей.
[0239] Пример 7: Исследование иммуногенности Globo-H-KLH с различными адъювантами у мышей
6
[0240] Исследовали способность композиции Globo-H по изобретению при спаривании с различными адъювантами (OBI-821/OBI-834) вызывать иммунный ответ у мышей. Жизнеспособные клетки карциномы легких Льюиса (LL/2, ATCC CRL-1642) (предоставленные Eurofins Panlabs Taiwan Ltd., 5,0 × 10 в 0,1 мл), сингенные мышам C57BL/6, подкожно инъецировали в брюшную область в направление бока экспериментальных мышей на сутки 16. Шесть групп самок мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель подкожно иммунизировали Globo-H-KLH (OBI-822) и различными адъювантами. Уровни дозирования OBI-822 являлись равными по количеству в каждой группе. Каждая инъекция содержала дозы, равные 2,0 мкг вакцины (OBI-822) и 20 мкг адъювантов (OBI-821/OBI-834), вводимых подкожно в 0,2 мл/мышь (в правую и левую стороны брюшных областей, 0,1 мл/область). Иммунизацию проводили на сутки 0, 5, 11, 19, 29, 34 и 39, а сыворотку собирали на сутки 0 (перед инъекцией) и сутки 42 для сравнительного анализа посредством ELISA. Серологический ответ определяли посредством ELISA с определением титра антител IgM и IgG к Globo-H.
[0241] Как представлено на фигуре 8, у мышей, обработанных фосфатно-солевым буфером (PBS), ответа не наблюдали. В отличие от этого, у мышей, обработанных OBI-822+OBI821 и OBI-822+OBI-834 наблюдали ответ со значительными титрами IgM к Globo-H (фигура 8A). Однако средние титры IgG были ниже, чем IgG (фигура 8B). Это означало, что адъюванты OBI-821 и OBI-834 могли индуцировать иммуногенность Globo-H-KLH (OBI-822). Показано, что вакцинация Globo-H-KLH и адъювантом у самок мышей C57BL/6 вызывала ответ IgG и IgM к Globo-H.
3
2
[0242] Как представлено на фигуре 9, у шести групп мышей C57BL/6 проверяли массу тела и размер опухоли на сутки 16, 19, 23, 26, 30, 34, 37, 40 и 42. Изображения, где приведена опухоль с целым телом, получены после умерщвления на сутки 42. Как представлено на фигуре 10, объем опухоли (мм) расчитывали по формуле для сплющенного эллипсоида: длина (мм) × [ширина (мм)] × 0,5. Рост опухоли у обработанных соединением животных рассчитывали как T/C (обработка/контроль) × 100%; для определения значимого ингибирования роста опухоли, демонстрирующего противоопухолевую активность, использовали односторонний ANOVA с последующим критерием Даннетта или непарным критерием Стьюдента. Уровень ингибирования опухоли OBI-822+OBI-821 на сутки 42 составлял приблизительно 35%, а OBI-822+OBI-834 приблизительно составлял 22%. По-видимому, оба адъюванта, OBI-821 и OBI-834, могли ингибировать рост опухоли с Globo-H-KLH (OBI-822).
[0243] Пример 8: Анализ LC-MS/MS участков конъюгации Globo-H (лизина) на KLH
[0244] Участки конъюгации Globo-H в четырех образцах KLH идентифицировали с использованием расщепления несколькими ферментами и LC-MS/MS. Четыре образца конъюгированного с Globo-H KLH сначала расщепляли четырьмя различными ферментами, а затем анализировали посредством LC-MS/MS и поиска в базе данных Mascot. Идентифицировали два типа производных: производное Globo-H (Globo-H+MMCCH) и производное MMCCH (только MMCCH). Производное Globo-H и его формы с потерей нейтральных частиц учитывали для идентификации участков конъюгации Globo-H. Форму MMCCH и ее дезаминированную форму учитывали для идентификации участков конъюгации MMCCH. Учитывали только пептиды с высоким качеством спектров MS/MS и высоким индексом Mascot. При анализе конъюгации Globo-H в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13001-DP (образец 1) наблюдали 31 и 28 конъюгированных остатков лизина; в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13002-DP (образец 2) наблюдали 19 и 21 конъюгированных остатков лизина; в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13003-DP (образец 3) наблюдали 10 и 11 конъюгированных остатков лизина; в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13004-DS (образец 4) наблюдали 18 и 19 конъюгированных остатков лизина. При анализе конъюгации MMCCH в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13001-DP (образец 1) наблюдали 155 и 141 конъюгированных остатков лизина; в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13002-DP (образец 2) наблюдали 143 и 137 конъюгированных остатков лизина; в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13003-DP (образец 3) наблюдали 147 и 143 конъюгированных остатков лизина; в двух повторениях анализа LC-MS/MS OBI-822-13004-DS (образец 4) наблюдали 140 и 136 конъюгированных остатков лизина.
[0245] Пример 8 Материалы и способы:
[0246] Ниже перечислены сокращения:
W
K=Лизин; LC-MS/MS=жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия; DTT=Дитиолтреитол; IAM=йодацетамид; ACN=ацетонитрил; FA=муравьиная кислота; Glu-C=эндопротеиназа Glu-C; ABC=бикарбонат аммония; RT=комнатная температура; M=молекулярная масса.
[0247] Четыре образца KLH, образец 1-4, сначала обрабатывали с заменой буфера на 50 мМ буферный раствор бикарбоната аммония посредством фильтров Amicon Ultra Centrifugal Filters с границей пропускания 100 кДа и денатурировали 6 M мочевиной. Затем образцы восстанавливали 10 мМ DTT при 37°C в течение 1 часа, алкилировали с использованием 50 мМ IAM в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре и гасили 50 мМ DTT при комнатной температуре в течение 5 минут. Полученные белки разбавляли до концентрации мочевина 1 M и подвергали расщеплению в растворе различными ферментами, как описано в следующем разделе
[0248] Расщепление в растворе различными ферментами проводили в следующих условиях расщепления: (1) расщепление трипсином при 37°C в течение 24 часов (белок:фермент=40:1) (2) расщепление Glu-C при 37°C в течение 24 часов (белок:фермент=25:1); (3) расщепление химотрипсином при комнатной температуре в течение 24 часов (белок:фермент=25:1); (4) расщепление термолизином при 37°C в течение 24 часов (белок:фермент=25:1).
[0249] Реакции расщепления останавливали добавлением муравьиной кислоты и все четыре расщепленных образца подвергали анализу LC-MS/MS. Образцы анализировали на масс-спектрометре Q Exactive (Thermo Scientific), соединенным с системой RSLC Ultimate 3000 (Dionex). Разделение при LC проводили с использованием колонки C 18 (Acclaim PepMap RSLC, 75 мкм x 150 мм, 2 мкм, 100 Å) с градиентом, представленным в таблице 7.
[0250] Таблица 7: Градиент для разделения при LC
<b>Время (минуты)</b>
<b>Подвижная фаза A</b><sup><b>*</b></sup><b>%</b>
<b>Подвижная фаза B</b><sup><b>**</b></sup><b>%</b>
<b>Поток (мкл/мин)</b>
0
99
1
0,25
5
99
1
0,25
35
90
10
0,25
67
65
35
0,25
77
15
85
0,25
82
99
1
0,25
90
99
1
0,25
*Подвижная фаза A: 5% ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота
**Подвижная фаза B: 95% ацетонитрил/0,1% муравьиная кислота
[0251] CID в источнике устанавливали на 45 эВ. Полное MS сканирование проводили в диапазоне массы/заряда 350-2000, и десять ионов с наибольшей интенсивностью после MS сканирования подвергали фрагментации с получением спектров MS/MS. Необработанные данные обрабатывали с получением списка пиков посредством Proteome Discoverer 1.4 для поиска в базе данных Mascot.
[0252] Поиск в базе данных проводили с использованием Mascot версии 2.4.1 и Thermo Proteome Discoverer версии 1.4 по последовательности KLH1 (SEQ ID NO. 1) и последовательности KLH2 (SEQ ID NO. 2). Используемые параметры являлись следующими:
Фермент: трипсин, Glu-C, химотрипсин и термолизин в соответствии со способом расщепления; фиксированная модификация: карбамидометил (C);
Вариабельные модификации для производных MMCCH (только MMCCH): дезаминированные (NQ), окисление (M), dK_MMCCH-1 (K), dK_MMCCH-2 (K);
Вариабельные модификации для производных Globo-H (Globo-H+MMCCH): дезаминированные (NQ), окисление (M), Globo_H_MMCCH (K), dK_MMCCH_NL997 (K), dK_MMCCH_NL835 (K), dK_MMCCH_NL673 (K), dK_MMCCH_NL511 (K), dK_MMCCH_NL308 (K);
Допуск по массе пептида: ± 10 м.д.; допуск по массе фрагмента: ± 0,05 Да; максимум пропущенных расщеплений: 5; тип устройства: ESI-TRAP; граница отсечения ионов: 13.
W
[0253] "dK_MMCCH-1" в параметрах поиска означает конъюгированный с MMCCH лизин с добавлением M 352,1569 Да.
W
[0254] "dK_MMCCH-2" в параметрах поиска означает дезаминированную форму конъюгированного с MMCCH лизина с добавлением M 338,1300 Да.
W
[0255] "Globo_H_MMCCH (K)" в параметрах поиска означает конъюгированный с Globo-H лизин с добавлением M 1393,5317 Да.
W
[0256] "dK_MMCCH_NL997" в параметрах поиска означает форму с потерей нейтральных частиц конъюгированного с Globo-H лизина с добавлением M 396,1831 Да.
W
[0257] "dK_MMCCH_NL835" в параметрах поиска означает форму с потерей нейтральных частиц конъюгированного с Globo-H лизина с добавлением M 558,2360 Да.
W
[0258] "dK_MMCCH_NL673" в параметрах поиска означает форму с потерей нейтральных частиц конъюгированного с Globo-H лизина с добавлением M 720,2888 Да.
W
[0259] "dK_MMCCH_NL511" в параметрах поиска означает форму с потерей нейтральных частиц конъюгированного с Globo-H лизина с добавлением M 882,3416 Да.
W
[0260] "dK_MMCCH_NL308" в параметрах поиска означает форму с потерей нейтральных частиц конъюгированного с Globo-H лизина с добавлением M 1085,4210 Да.
W
[0261] "Добавление M" означает добавление молекулярной массы по сравнению с интактным остатком лизина.
[0262] Результаты примера 8:
[0263] Способы на основе LC-MS/MS являются важным инструментом для идентификации белков и характеристики модификаций аминокислот. Посредством оценки ионов фрагментов, обеспечиваемой спектрами MS/MS, можно получать подробную информацию о пептидных последовательностях и участках модификации. Mascot представляет собой систему поиска, и ее основанный на вероятностях алгоритм оценки хорошо зарекомендован. Оценка Mascot принята в настоящем исследовании как эталон надежности для секвенирования белка и идентификации участков конъюгации Globo-H или MMCCH. Для интенсивного анализа распределения участков конъюгации Globo-H или MMCCH в образцах 1-4, эти образцы расщепляли несколькими ферментами с последующим анализом LC-MS/MS.
W
[0264] Ожидаемая химическая структура производного Globo-H (Globo-H+MMCCH) представлена на фигуре 11A и в результатах можно наблюдать соответствующее добавление M 1393,53 Да в содержащих лизин пептидах. Кроме этого, у лабильных полисахаридов существует тенденция к уменьшению вследствие потери нейтральных частиц при ионизации распылением в электрическом поле в анализе LC-MS. Таким образом, у гликоконъюгированных пептидов также можно наблюдать добавление молекулярной массы 396,18 Да, 558,24 Да, 720,29 Да, 882,34 Да и 1085,42 Да, являющееся результатом потери нейтральных частиц, как представлено на фигуре 11B. Все дериватизированные формы рассматривали как идентификацию участков конъюгации Globo-H.
W
[0265] Кроме того, в этих конъюгированных с Globo-H образцах KLH также наблюдали производное MMCCH (MMCCH отдельно). Ожидаемые химические структуры производного MMCCH и его дезаминированной формы представлены на фигуре 12A и фигуре 12B, а соответствующее добавление M 352,16 Да и 338,13 Да, соответственно, в содержащих лизин пептидах можно наблюдать в результатах. Обе дериватизированные формы считали идентификацией участков конъюгации MMCCH. Преобразование из производного Globo-H в MMCCH не очевидно, но полагают, что оно происходит при обработке образца.
[0266] В качестве критериев идентификации белка и интерпретации спектров использовали точность определения массы ± 10 м.д. для иона-предшественника и ± 0,05 Да для иона фрагмента. Производное Globo-H, а также его формы с потерей нейтральных частиц выбраны в качестве вариабельной модификации для идентификации участков конъюгации Globo-H, и производное MMCCH, а также его дезаминированная форма выбраны в качестве вариабельной модификации для идентификации участков конъюгации MMCCH. Поиск в базе данных проводили по последовательности KLH1 (SEQ ID NO. 1) и KLH2 (SEQ ID NO. 2). В отчете перечислены только пептиды с высоким качеством спектром MS/MS (оценка ионов ≥ 13, p < 0,05).
[0267] Для демонстрации воспроизводимости результатов анализ LC-MS/MS проводили дважды с последующим отдельным поиском в базе данных Mascot для идентификации участков конъюгации Globo-H и идентификации участков конъюгации MMCCH, как обобщено на фигуре 13A и фигуре 13B.
[0268] В анализе участков конъюгации Globo-H для образца 1 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 31 и 28 остатков лизина; для образца 2 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 19 и 21 остатков лизина; для образца 3 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 10 и 11 остатков лизина; для образца 4 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 18 и 19 остатков лизина. Данные идентификации приведены на фигурах 14-21. В анализе конъюгации MMCCH для образца 1 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 155 и 141 остатков лизина; для образца 2 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 143 и 137 остатков лизина; для образца 3 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 147 и 143 остатков лизина; для образца 4 в 1 LC-MS/MS и 2 LC-MS/MS соответственно выявлено 140 и 136 остатков лизина. Данные идентификации приведены на фигурах 22-29.
[0269] Участки конъюгации Globo-H экспериментов с несколькими ферментами обобщены на фигуре 30 и участки конъюгации MMCCH обобщены на фигуре 31. Общие результаты анализа участков конъюгации для конъюгированных с Globo-H образцов обобщены на фигуре 32.
[0270] Выводы примера 8:
[0271] Масс-спектрометрические сигналы конъюгированных с производными Globo-H пептидов являлись более слабыми, чем масс-спектрометрические сигналы конъюгированных с MMCCH пептидов вследствие нескольких форм с потерей нейтральных частиц и меньшей эффективностью ионизации полисахарида, что делает прямую идентификацию конъюгации Globo-H более трудной. Это объясняет большее количество идентифицированных пептидов в анализе конъюгации MMCCH. Таким образом результаты анализа MMCCH можно использовать для представления конъюгации Globo-H.
[0272] Анализ участков конъюгации позволяет предполагать, что из общего количества 306 остатков лизина в KLH1/KLH2 для образцов 1-4 идентифицировано 155, 143, 147 и 140 участков конъюгации лизина, соответственно. В повторном анализе для образцов 1-4 идентифицировано 141, 137, 143 и 136 участков конъюгации, соответственно.
[0273] Пример 9: Анализ LC-MS/MS участков конъюгации Globo-H (гистидин, аспарагин, пролин, глутамин и аргинин) в KLH
[0274] Исследовали два типа производных по пяти остаткам, H, N, P, Q, R: GMd (Globo-H+линкер MMCCH+производное лизина) и Md (линкер MMCCH+производное лизина).
[0275] Анализ модификаций по HNPQR (GMd и Md) выявил 6 и 13 конъюгированных участков HNPQR в KLH1 и KLH2, соответственно, для OBI-822-13001-DP (образец 1); 11 и 10 конъюгированных участков HNPQR в KLH1 и KLH2, соответственно, для OBI-822-13002-DP (образец 2); 13 и 9 конъюгированных участков HNPQR в KLH1 и KLH2, соответственно, для OBI-822-13003-DP (образец 3); и 8 и 10 конъюгированных участков HNPQR в KLH1 и KLH2, соответственно, для OBI-822-13004-DS (образец 4).
[0276] Пример 9 Материалы и способы:
[0277] Ниже перечислены сокращения:
W
K=лизин; H=гистидин; N=аспарагин; P=пролин; Q=глутамин; R=аргинин; LC-MS/MS=жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия; M=молекулярная масса.
[0278] Поиск в базе данных проводили с использованием Mascot версии 2.4.1 по последовательности KLH1 (SEQ ID NO. 1) и последовательности KLH2 (SEQ ID NO. 2). Используемые параметры являлись следующими:
Фермент: трипсин, Glu-C, химотрипсин и термолизин в соответствии со способом расщепления;
Фиксированная модификация: Карбамидометил (C);
Вариабельная модификации: окисление(M), дезаминирование (NQ);
1. OBI822_GMd (HKNPQR), GMd_NL997 (HKNPQR);
2. OBI822_Md (HKNPQR), Md_дезаминированный (HKNPQR);
Допуск по массе пептида: ± 10 м.д.; допуск по массе фрагмента: ± 0,05 Да; максимум пропущенных расщеплений: 5; тип устройства: ESI-TRAP; граница отсечения ионов: 13.
W
[0279] "OBI822_GMd" в параметрах поиска означает конъюгированные с GMd остатки (HKNPQR) с добавлением M 1393,5317 Да.
W
[0280] "GMd_NL997" в параметрах поиска означает форму с потерей нейтральных частиц конъюгированных с GMd остатков (HKNPQR) с добавлением M 396,1831 Да.
W
[0281] "OBI822_Md" в параметрах поиска означает конъюгированные с Md остатки (HKNPQR) с добавлением M 352,1569 Да.
W
[0282] "Md_дезаминированный" в параметрах поиска означает дезаминированную форму конъюгированных с Md остатков (HKNPQR) с добавлением M 338,1300 Да.
[0283] Результаты примера 9:
[0284] Способы на основе LC-MS/MS являются важным инструментом для идентификации белков и характеристики модификаций аминокислот. Посредством оценки ионов фрагментов, обеспечиваемой спектрами MS/MS, можно получать подробную информацию о пептидных последовательностях и участках модификации. В настоящее время Mascot является наиболее популярным системой поиска с хорошо зарекомендованным алгоритмом поиска на основе вероятностей. Для идентификации различных модификаций по лизину (K) и другим конкретным остаткам (HNPQR) в образцах 1-4 все результаты поиска подвергали последующей ручной проверке для отбора только пептидов с высоким качеством спектров MS/MS.
[0285] При поиске в MASCOT модификаций GMd (Globo-H+линкер MMCCH+производное лизина) и Md (линкер MMCCH+производное лизина) по остаткам HNPQR, идентифицированы ложные пептиды. Если определенный участок модификации располагался близко к остатку лизина, вероятно, что действительным участком модификации являлся лизин. Эти пептиды исключали из списков идентификации. Если поблизости нет остатка лизина, модификацию по HNPQR можно подтвердить. Как представлено на фигуре 38, анализ участков модификации GMd выявил для образцов 1-4, соответственно, 1, 2, 2 и 3 конъюгированных участков HNPQR в KLH1 и, соответственно, для образцов 1-4 4, 4, 2 и 3 конъюгированных участков HNPQR в KLH2. Анализ участков модификации Md выявил для образцов 1-4, соответственно, 5, 9, 11 и 5 конъюгированных участков HNPQR в KLH1 и, соответственно, для образцов 1-4 9, 6, 7 и 7 конъюгированных участков HNPQR в KLH2.
[0286] Выводы примера 9:
[0287] В этих четырех образцах анализ модификаций GMd и Md по конкретным остаткам (HNPQR) позволяет предполагать, что для образцов 1-4, соответственно, существует 6, 11, 13 и 8 конъюгированных участков HNPQR в KLH1 и, соответственно, для образцов 1-4 13, 10, 9 и 10 конъюгированных участков HNPQR в KLH2.
[0288] Если не определено иначе, все технические и научные термины и любые сокращения, используемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые обычно понимает специалист в области настоящего изобретения. Хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать любые композиции, способы, наборы и средства передачи информации, сходные или эквивалентные описываемым в настоящем документе, в настоящем документе описаны предпочтительные композиции, способы, наборы и средства передачи информации.
[0289] Все цитируемые в настоящем документе ссылки включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме допустимом законами. Описание их библиографии предназначено исключительно для обобщения заключений, сделанных их авторами. Не сделано никаких допущений, что любая из ссылок (или часть любой из ссылок) является соответствующим предшествующим уровнем техники. Заявители сохраняют за собой право оспорить точность и уместность любой из цитируемых ссылок.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  OBI PHARMA, INC.
<120>  КОМПОЗИЦИИ ИММУНОГЕННЫХ/ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ГЛИКОКОНЪЮГАТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  G3004-00401
<140>  TBD
<141>  2015-09-15
<150>  US 62/050,567
<151>  2014-09-14
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  3125
<212>  Белок
<213>  Megathura crenulata
<400>  1
Met Thr Pro Glu Glu Leu Lys Thr Tyr Leu Asp Glu Arg Ser Ser Arg
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Phe Ala Ser Phe Arg Leu Lys Gly Phe Gly Gly Ser Ala
20                  25                  30
Asn Val Phe Val Tyr Val Cys Ile Pro Asp Asp Asn Asp Arg Asn Asp
35                  40                  45
Asp His Cys Glu Lys Ala Gly Asp Phe Phe Val Leu Gly Gly Pro Ser
50                  55                  60
Glu Met Lys Trp Gln Phe Tyr Arg Pro Tyr Leu Phe Asp Leu Ser Asp
65                  70                  75                  80
Thr Val His Lys Met Gly Met Lys Leu Asp Gly His Tyr Thr Val Lys
85                  90                  95
Ala Glu Leu Phe Ser Val Asn Gly Thr Ala Leu Pro Asp Asp Leu Leu
100                 105                 110
Pro His Pro Val Val Val His His Pro Glu Lys Gly Phe Thr Asp Pro
115                 120                 125
Pro Val Lys His His Gln Ser Ala Asn Leu Leu Val Arg Lys Asn Ile
130                 135                 140
Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Val Leu Asn Leu Arg Glu Ala Phe His
145                 150                 155                 160
Lys Phe Gln Glu Asp Arg Ser Val Asp Gly Tyr Gln Ala Thr Ala Glu
165                 170                 175
Tyr His Gly Leu Pro Ala Arg Cys Pro Arg Pro Asp Ala Lys Asp Arg
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Cys Val His Gly Met Pro Ile Phe Pro His Trp His Arg
195                 200                 205
Leu Phe Val Thr Gln Val Glu Asp Ala Leu Val Gly Arg Gly Ala Thr
210                 215                 220
Ile Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Glu Pro
225                 230                 235                 240
Met Thr His Ile Pro Gly Leu Ala Gly Asn Lys Thr Tyr Val Asp Ser
245                 250                 255
His Gly Ala Ser His Thr Asn Pro Phe His Ser Ser Val Ile Ala Phe
260                 265                 270
Glu Glu Asn Ala Pro His Thr Lys Arg Gln Ile Asp Gln Arg Leu Phe
275                 280                 285
Lys Pro Ala Thr Phe Gly His His Thr Asp Leu Phe Asn Gln Ile Leu
290                 295                 300
Tyr Ala Phe Glu Gln Glu Asp Tyr Cys Asp Phe Glu Val Gln Phe Glu
305                 310                 315                 320
Ile Thr His Asn Thr Ile His Ala Trp Thr Gly Gly Ser Glu His Phe
325                 330                 335
Ser Met Ser Ser Leu His Tyr Thr Ala Phe Asp Pro Leu Phe Tyr Phe
340                 345                 350
His His Ser Asn Val Asp Arg Leu Trp Ala Val Trp Gln Ala Leu Gln
355                 360                 365
Met Arg Arg His Lys Pro Tyr Arg Ala His Cys Ala Ile Ser Leu Glu
370                 375                 380
His Met His Leu Lys Pro Phe Ala Phe Ser Ser Pro Leu Asn Asn Asn
385                 390                 395                 400
Glu Lys Thr His Ala Asn Ala Met Pro Asn Lys Ile Tyr Asp Tyr Glu
405                 410                 415
Asn Val Leu His Tyr Thr Tyr Glu Asp Leu Thr Phe Gly Gly Ile Ser
420                 425                 430
Leu Glu Asn Ile Glu Lys Met Ile His Glu Asn Gln Gln Glu Asp Arg
435                 440                 445
Ile Tyr Ala Gly Phe Leu Leu Ala Gly Ile Arg Thr Ser Ala Asn Val
450                 455                 460
Asp Ile Phe Ile Lys Thr Thr Asp Ser Val Gln His Lys Ala Gly Thr
465                 470                 475                 480
Phe Ala Val Leu Gly Gly Ser Lys Glu Met Lys Trp Gly Phe Asp Arg
485                 490                 495
Val Phe Lys Phe Asp Ile Thr His Val Leu Lys Asp Leu Asp Leu Thr
500                 505                 510
Ala Asp Gly Asp Phe Glu Val Thr Val Asp Ile Thr Glu Val Asp Gly
515                 520                 525
Thr Lys Leu Ala Ser Ser Leu Ile Pro His Ala Ser Val Ile Arg Glu
530                 535                 540
His Ala Arg Gly Lys Leu Asn Arg Val Lys Phe Asp Lys Val Pro Arg
545                 550                 555                 560
Ser Arg Leu Ile Arg Lys Asn Val Asp Arg Leu Ser Pro Glu Glu Met
565                 570                 575
Asn Glu Leu Arg Lys Ala Leu Ala Leu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Ala
580                 585                 590
Gly Gly Phe Gln Gln Leu Gly Ala Phe His Gly Glu Pro Lys Trp Cys
595                 600                 605
Pro Ser Pro Glu Ala Ser Lys Lys Phe Ala Cys Cys Val His Gly Met
610                 615                 620
Ser Val Phe Pro His Trp His Arg Leu Leu Thr Val Gln Ser Glu Asn
625                 630                 635                 640
Ala Leu Arg Arg His Gly Tyr Asp Gly Ala Leu Pro Tyr Trp Asp Trp
645                 650                 655
Thr Ser Pro Leu Asn His Leu Pro Glu Leu Ala Asp His Glu Lys Tyr
660                 665                 670
Val Asp Pro Glu Asp Gly Val Glu Lys His Asn Pro Trp Phe Asp Gly
675                 680                 685
His Ile Asp Thr Val Asp Lys Thr Thr Thr Arg Ser Val Gln Asn Lys
690                 695                 700
Leu Phe Glu Gln Pro Glu Phe Gly His Tyr Thr Ser Ile Ala Lys Gln
705                 710                 715                 720
Val Leu Leu Ala Leu Glu Gln Asp Asn Phe Cys Asp Phe Glu Ile Gln
725                 730                 735
Tyr Glu Ile Ala His Asn Tyr Ile His Ala Leu Val Gly Gly Ala Gln
740                 745                 750
Pro Tyr Gly Met Ala Ser Leu Arg Tyr Thr Ala Phe Asp Pro Leu Phe
755                 760                 765
Tyr Leu His His Ser Asn Thr Asp Arg Ile Trp Ala Ile Trp Gln Ala
770                 775                 780
Leu Gln Lys Tyr Arg Gly Lys Pro Tyr Asn Val Ala Asn Cys Ala Val
785                 790                 795                 800
Thr Ser Met Arg Glu Pro Leu Gln Pro Phe Gly Leu Ser Ala Asn Ile
805                 810                 815
Asn Thr Asp His Val Thr Lys Glu His Ser Val Pro Phe Asn Val Phe
820                 825                 830
Asp Tyr Lys Thr Asn Phe Asn Tyr Glu Tyr Asp Thr Leu Glu Phe Asn
835                 840                 845
Gly Leu Ser Ile Ser Gln Leu Asn Lys Lys Leu Glu Ala Ile Lys Ser
850                 855                 860
Gln Asp Arg Phe Phe Ala Gly Phe Leu Leu Ser Gly Phe Lys Lys Ser
865                 870                 875                 880
Ser Leu Val Lys Phe Asn Ile Cys Thr Asp Ser Ser Asn Cys His Pro
885                 890                 895
Ala Gly Glu Phe Tyr Leu Leu Gly Asp Glu Asn Glu Met Pro Trp Ala
900                 905                 910
Tyr Asp Arg Val Phe Lys Tyr Asp Ile Thr Glu Lys Leu His Asp Leu
915                 920                 925
Lys Leu His Ala Glu Asp His Phe Tyr Ile Asp Tyr Glu Val Phe Asp
930                 935                 940
Leu Lys Pro Ala Ser Leu Gly Lys Asp Leu Phe Lys Gln Pro Ser Val
945                 950                 955                 960
Ile His Glu Pro Arg Ile Gly His His Glu Gly Glu Val Tyr Gln Ala
965                 970                 975
Glu Val Thr Ser Ala Asn Arg Ile Arg Lys Asn Ile Glu Asn Leu Ser
980                 985                 990
Leu Gly Glu Leu Glu Ser Leu Arg  Ala Ala Phe Leu Glu  Ile Glu Asn
995                 1000                 1005
Asp Gly  Thr Tyr Glu Ser Ile  Ala Lys Phe His Gly  Ser Pro Gly
1010                 1015                 1020
Leu Cys  Gln Leu Asn Gly Asn  Pro Ile Ser Cys Cys  Val His Gly
1025                 1030                 1035
Met Pro  Thr Phe Pro His Trp  His Arg Leu Tyr Val  Val Val Val
1040                 1045                 1050
Glu Asn  Ala Leu Leu Lys Lys  Gly Ser Ser Val Ala  Val Pro Tyr
1055                 1060                 1065
Trp Asp  Trp Thr Lys Arg Ile  Glu His Leu Pro His  Leu Ile Ser
1070                 1075                 1080
Asp Ala  Thr Tyr Tyr Asn Ser  Arg Gln His His Tyr  Glu Thr Asn
1085                 1090                 1095
Pro Phe  His His Gly Lys Ile  Thr His Glu Asn Glu  Ile Thr Thr
1100                 1105                 1110
Arg Asp  Pro Lys Asp Ser Leu  Phe His Ser Asp Tyr  Phe Tyr Glu
1115                 1120                 1125
Gln Val  Leu Tyr Ala Leu Glu  Gln Asp Asn Phe Cys  Asp Phe Glu
1130                 1135                 1140
Ile Gln  Leu Glu Ile Leu His  Asn Ala Leu His Ser  Leu Leu Gly
1145                 1150                 1155
Gly Lys  Gly Lys Tyr Ser Met  Ser Asn Leu Asp Tyr  Ala Ala Phe
1160                 1165                 1170
Asp Pro  Val Phe Phe Leu His  His Ala Thr Thr Asp  Arg Ile Trp
1175                 1180                 1185
Ala Ile  Trp Gln Asp Leu Gln  Arg Phe Arg Lys Arg  Pro Tyr Arg
1190                 1195                 1200
Glu Ala  Asn Cys Ala Ile Gln  Leu Met His Thr Pro  Leu Gln Pro
1205                 1210                 1215
Phe Asp  Lys Ser Asp Asn Asn  Asp Glu Ala Thr Lys  Thr His Ala
1220                 1225                 1230
Thr Pro  His Asp Gly Phe Glu  Tyr Gln Asn Ser Phe  Gly Tyr Ala
1235                 1240                 1245
Tyr Asp  Asn Leu Glu Leu Asn  His Tyr Ser Ile Pro  Gln Leu Asp
1250                 1255                 1260
His Met  Leu Gln Glu Arg Lys  Arg His Asp Arg Val  Phe Ala Gly
1265                 1270                 1275
Phe Leu  Leu His Asn Ile Gly  Thr Ser Ala Asp Gly  His Val Phe
1280                 1285                 1290
Val Cys  Leu Pro Thr Gly Glu  His Thr Lys Asp Cys  Ser His Glu
1295                 1300                 1305
Ala Gly  Met Phe Ser Ile Leu  Gly Gly Gln Thr Glu  Met Ser Phe
1310                 1315                 1320
Val Phe  Asp Arg Leu Tyr Lys  Leu Asp Ile Thr Lys  Ala Leu Lys
1325                 1330                 1335
Lys Asn  Gly Val His Leu Gln  Gly Asp Phe Asp Leu  Glu Ile Glu
1340                 1345                 1350
Ile Thr  Ala Val Asn Gly Ser  His Leu Asp Ser His  Val Ile His
1355                 1360                 1365
Ser Pro  Thr Ile Leu Phe Glu  Ala Gly Thr Asp Ser  Ala His Thr
1370                 1375                 1380
Asp Asp  Gly His Thr Glu Pro  Val Met Ile Arg Lys  Asp Ile Thr
1385                 1390                 1395
Gln Leu  Asp Lys Arg Gln Gln  Leu Ser Leu Val Lys  Ala Leu Glu
1400                 1405                 1410
Ser Met  Lys Ala Asp His Ser  Ser Asp Gly Phe Gln  Ala Ile Ala
1415                 1420                 1425
Ser Phe  His Ala Leu Pro Pro  Leu Cys Pro Ser Pro  Ala Ala Ser
1430                 1435                 1440
Lys Arg  Phe Ala Cys Cys Val  His Gly Met Ala Thr  Phe Pro Gln
1445                 1450                 1455
Trp His  Arg Leu Tyr Thr Val  Gln Phe Gln Asp Ser  Leu Arg Lys
1460                 1465                 1470
His Gly  Ala Val Val Gly Leu  Pro Tyr Trp Asp Trp  Thr Leu Pro
1475                 1480                 1485
Arg Ser  Glu Leu Pro Glu Leu  Leu Thr Val Ser Thr  Ile His Asp
1490                 1495                 1500
Pro Glu  Thr Gly Arg Asp Ile  Pro Asn Pro Phe Ile  Gly Ser Lys
1505                 1510                 1515
Ile Glu  Phe Glu Gly Glu Asn  Val His Thr Lys Arg  Asp Ile Asn
1520                 1525                 1530
Arg Asp  Arg Leu Phe Gln Gly  Ser Thr Lys Thr His  His Asn Trp
1535                 1540                 1545
Phe Ile  Glu Gln Ala Leu Leu  Ala Leu Glu Gln Thr  Asn Tyr Cys
1550                 1555                 1560
Asp Phe  Glu Val Gln Phe Glu  Ile Met His Asn Gly  Val His Thr
1565                 1570                 1575
Trp Val  Gly Gly Lys Glu Pro  Tyr Gly Ile Gly His  Leu His Tyr
1580                 1585                 1590
Ala Ser  Tyr Asp Pro Leu Phe  Tyr Ile His His Ser  Gln Thr Asp
1595                 1600                 1605
Arg Ile  Trp Ala Ile Trp Gln  Ser Leu Gln Arg Phe  Arg Gly Leu
1610                 1615                 1620
Ser Gly  Ser Glu Ala Asn Cys  Ala Val Asn Leu Met  Lys Thr Pro
1625                 1630                 1635
Leu Lys  Pro Phe Ser Phe Gly  Ala Pro Tyr Asn Leu  Asn Asp His
1640                 1645                 1650
Thr His  Asp Phe Ser Lys Pro  Glu Asp Thr Phe Asp  Tyr Gln Lys
1655                 1660                 1665
Phe Gly  Tyr Ile Tyr Asp Thr  Leu Glu Phe Ala Gly  Trp Ser Ile
1670                 1675                 1680
Arg Gly  Ile Asp His Ile Val  Arg Asn Arg Gln Glu  His Ser Arg
1685                 1690                 1695
Val Phe  Ala Gly Phe Leu Leu  Glu Gly Phe Gly Thr  Ser Ala Thr
1700                 1705                 1710
Val Asp  Phe Gln Val Cys Arg  Thr Ala Gly Asp Cys  Glu Asp Ala
1715                 1720                 1725
Gly Tyr  Phe Thr Val Leu Gly  Gly Glu Lys Glu Met  Pro Trp Ala
1730                 1735                 1740
Phe Asp  Arg Leu Tyr Lys Tyr  Asp Ile Thr Glu Thr  Leu Asp Lys
1745                 1750                 1755
Met Asn  Leu Arg His Asp Glu  Ile Phe Gln Ile Glu  Val Thr Ile
1760                 1765                 1770
Thr Ser  Tyr Asp Gly Thr Val  Leu Asp Ser Gly Leu  Ile Pro Thr
1775                 1780                 1785
Pro Ser  Ile Ile Tyr Asp Pro  Ala His His Asp Ile  Ser Ser His
1790                 1795                 1800
His Leu  Ser Leu Asn Lys Val  Arg His Asp Leu Ser  Thr Leu Ser
1805                 1810                 1815
Glu Arg  Asp Ile Gly Ser Leu  Lys Tyr Ala Leu Ser  Ser Leu Gln
1820                 1825                 1830
Ala Asp  Thr Ser Ala Asp Gly  Phe Ala Ala Ile Ala  Ser Phe His
1835                 1840                 1845
Gly Leu  Pro Ala Lys Cys Asn  Asp Ser His Asn Asn  Glu Val Ala
1850                 1855                 1860
Cys Cys  Ile His Gly Met Pro  Thr Phe Pro His Trp  His Arg Leu
1865                 1870                 1875
Tyr Thr  Leu Gln Phe Glu Gln  Ala Leu Arg Arg His  Gly Ser Ser
1880                 1885                 1890
Val Ala  Val Pro Tyr Trp Asp  Trp Thr Lys Pro Ile  His Asn Ile
1895                 1900                 1905
Pro His  Leu Phe Thr Asp Lys  Glu Tyr Tyr Asp Val  Trp Arg Asn
1910                 1915                 1920
Lys Val  Met Pro Asn Pro Phe  Ala Arg Gly Tyr Val  Pro Ser His
1925                 1930                 1935
Asp Thr  Tyr Thr Val Arg Asp  Val Gln Glu Gly Leu  Phe His Leu
1940                 1945                 1950
Thr Ser  Thr Gly Glu His Ser  Ala Leu Leu Asn Gln  Ala Leu Leu
1955                 1960                 1965
Ala Leu  Glu Gln His Asp Tyr  Cys Asp Phe Ala Val  Gln Phe Glu
1970                 1975                 1980
Val Met  His Asn Thr Ile His  Tyr Leu Val Gly Gly  Pro Gln Val
1985                 1990                 1995
Tyr Ser  Leu Ser Ser Leu His  Tyr Ala Ser Tyr Asp  Pro Ile Phe
2000                 2005                 2010
Phe Ile  His His Ser Phe Val  Asp Lys Val Trp Ala  Val Trp Gln
2015                 2020                 2025
Ala Leu  Gln Glu Lys Arg Gly  Leu Pro Ser Asp Arg  Ala Asp Cys
2030                 2035                 2040
Ala Val  Ser Leu Met Thr Gln  Asn Met Arg Pro Phe  His Tyr Glu
2045                 2050                 2055
Ile Asn  His Asn Gln Phe Thr  Lys Lys His Ala Val  Pro Asn Asp
2060                 2065                 2070
Val Phe  Lys Tyr Glu Leu Leu  Gly Tyr Arg Tyr Asp  Asn Leu Glu
2075                 2080                 2085
Ile Gly  Gly Met Asn Leu His  Glu Ile Glu Lys Glu  Ile Lys Asp
2090                 2095                 2100
Lys Gln  His His Val Arg Val  Phe Ala Gly Phe Leu  Leu His Gly
2105                 2110                 2115
Ile Arg  Thr Ser Ala Asp Val  Gln Phe Gln Ile Cys  Lys Thr Ser
2120                 2125                 2130
Glu Asp  Cys His His Gly Gly  Gln Ile Phe Val Leu  Gly Gly Thr
2135                 2140                 2145
Lys Glu  Met Ala Trp Ala Tyr  Asn Arg Leu Phe Lys  Tyr Asp Ile
2150                 2155                 2160
Thr His  Ala Leu His Asp Ala  His Ile Thr Pro Glu  Asp Val Phe
2165                 2170                 2175
His Pro  Ser Glu Pro Phe Phe  Ile Lys Val Ser Val  Thr Ala Val
2180                 2185                 2190
Asn Gly  Thr Val Leu Pro Ala  Ser Ile Leu His Ala  Pro Thr Ile
2195                 2200                 2205
Ile Tyr  Glu Pro Gly Leu Gly  Asp His His Glu Asp  His His Ser
2210                 2215                 2220
Ser Ser  Met Ala Gly His Gly  Val Arg Lys Glu Ile  Asn Thr Leu
2225                 2230                 2235
Thr Thr  Ala Glu Val Asp Asn  Leu Lys Asp Ala Met  Arg Ala Val
2240                 2245                 2250
Met Ala  Asp His Gly Pro Asn  Gly Tyr Gln Ala Ile  Ala Ala Phe
2255                 2260                 2265
His Gly  Asn Pro Pro Met Cys  Pro Met Pro Asp Gly  Lys Asn Tyr
2270                 2275                 2280
Ser Cys  Cys Thr His Gly Met  Ala Thr Phe Pro His  Trp His Arg
2285                 2290                 2295
Leu Tyr  Thr Lys Gln Met Glu  Asp Ala Leu Thr Ala  His Gly Ala
2300                 2305                 2310
Arg Val  Gly Leu Pro Tyr Trp  Asp Gly Thr Thr Ala  Phe Thr Ala
2315                 2320                 2325
Leu Pro  Thr Phe Val Thr Asp  Glu Glu Asp Asn Pro  Phe His His
2330                 2335                 2340
Gly His  Ile Asp Tyr Leu Gly  Val Asp Thr Thr Arg  Ser Pro Arg
2345                 2350                 2355
Asp Lys  Leu Phe Asn Asp Pro  Glu Arg Gly Ser Glu  Ser Phe Phe
2360                 2365                 2370
Tyr Arg  Gln Val Leu Leu Ala  Leu Glu Gln Thr Asp  Phe Cys Gln
2375                 2380                 2385
Phe Glu  Val Gln Phe Glu Ile  Thr His Asn Ala Ile  His Ser Trp
2390                 2395                 2400
Thr Gly  Gly Leu Thr Pro Tyr  Gly Met Ser Thr Leu  Glu Tyr Thr
2405                 2410                 2415
Thr Tyr  Asp Pro Leu Phe Trp  Leu His His Ala Asn  Thr Asp Arg
2420                 2425                 2430
Ile Trp  Ala Ile Trp Gln Ala  Leu Gln Glu Tyr Arg  Gly Leu Pro
2435                 2440                 2445
Tyr Asp  His Ala Asn Cys Glu  Ile Gln Ala Met Lys  Arg Pro Leu
2450                 2455                 2460
Arg Pro  Phe Ser Asp Pro Ile  Asn His Asn Ala Phe  Thr His Ser
2465                 2470                 2475
Asn Ala  Lys Pro Thr Asp Val  Phe Glu Tyr Ser Arg  Phe Asn Phe
2480                 2485                 2490
Gln Tyr  Asp Asn Leu Arg Phe  His Gly Met Thr Ile  Lys Lys Leu
2495                 2500                 2505
Glu His  Glu Leu Glu Lys Gln  Lys Glu Glu Asp Arg  Thr Phe Ala
2510                 2515                 2520
Ala Phe  Leu Leu His Gly Ile  Lys Lys Ser Ala Asp  Val Ser Phe
2525                 2530                 2535
Asp Val  Cys Asn His Asp Gly  Glu Cys His Phe Ala  Gly Thr Phe
2540                 2545                 2550
Ala Ile  Leu Gly Gly Glu His  Glu Met Pro Trp Ser  Phe Asp Arg
2555                 2560                 2565
Leu Phe  Arg Tyr Asp Ile Thr  Gln Val Leu Lys Gln  Met His Leu
2570                 2575                 2580
Glu Tyr  Asp Ser Asp Phe Thr  Phe His Met Arg Ile  Ile Asp Thr
2585                 2590                 2595
Ser Gly  Lys Gln Leu Pro Ser  Asp Leu Ile Lys Met  Pro Thr Val
2600                 2605                 2610
Glu His  Ser Pro Gly Gly Lys  His His Glu Lys His  His Glu Asp
2615                 2620                 2625
His His  Glu Asp Ile Leu Val  Arg Lys Asn Ile His  Ser Leu Ser
2630                 2635                 2640
His His  Glu Ala Glu Glu Leu  Arg Asp Ala Leu Tyr  Lys Leu Gln
2645                 2650                 2655
Asn Asp  Glu Ser His Gly Gly  Tyr Glu His Ile Ala  Gly Phe His
2660                 2665                 2670
Gly Tyr  Pro Asn Leu Cys Pro  Glu Lys Gly Asp Glu  Lys Tyr Pro
2675                 2680                 2685
Cys Cys  Val His Gly Met Ser  Ile Phe Pro His Trp  His Arg Leu
2690                 2695                 2700
His Thr  Ile Gln Phe Glu Arg  Ala Leu Lys Lys His  Gly Ser His
2705                 2710                 2715
Leu Gly  Ile Pro Tyr Trp Asp  Trp Thr Gln Thr Ile  Ser Ser Leu
2720                 2725                 2730
Pro Thr  Phe Phe Ala Asp Ser  Gly Asn Asn Asn Pro  Phe Phe Lys
2735                 2740                 2745
Tyr His  Ile Arg Ser Ile Asn  Gln Asp Thr Val Arg  Asp Val Asn
2750                 2755                 2760
Glu Ala  Ile Phe Gln Gln Thr  Lys Phe Gly Glu Phe  Ser Ser Ile
2765                 2770                 2775
Phe Tyr  Leu Ala Leu Gln Ala  Leu Glu Glu Asp Asn  Tyr Cys Asp
2780                 2785                 2790
Phe Glu  Val Gln Tyr Glu Ile  Leu His Asn Glu Val  His Ala Leu
2795                 2800                 2805
Ile Gly  Gly Ala Glu Lys Tyr  Ser Met Ser Thr Leu  Glu Tyr Ser
2810                 2815                 2820
Ala Phe  Asp Pro Tyr Phe Met  Ile His His Ala Ser  Leu Asp Lys
2825                 2830                 2835
Ile Trp  Ile Ile Trp Gln Glu  Leu Gln Lys Arg Arg  Val Lys Pro
2840                 2845                 2850
Ala His  Ala Gly Ser Cys Ala  Gly Asp Ile Met His  Val Pro Leu
2855                 2860                 2865
His Pro  Phe Asn Tyr Glu Ser  Val Asn Asn Asp Asp  Phe Thr Arg
2870                 2875                 2880
Glu Asn  Ser Leu Pro Asn Ala  Val Val Asp Ser His  Arg Phe Asn
2885                 2890                 2895
Tyr Lys  Tyr Asp Asn Leu Asn  Leu His Gly His Asn  Ile Glu Glu
2900                 2905                 2910
Leu Glu  Glu Val Leu Arg Ser  Leu Arg Leu Lys Ser  Arg Val Phe
2915                 2920                 2925
Ala Gly  Phe Val Leu Ser Gly  Ile Arg Thr Thr Ala  Val Val Lys
2930                 2935                 2940
Val Tyr  Ile Lys Ser Gly Thr  Asp Ser Asp Asp Glu  Tyr Ala Gly
2945                 2950                 2955
Ser Phe  Val Ile Leu Gly Gly  Ala Lys Glu Met Pro  Trp Ala Tyr
2960                 2965                 2970
Glu Arg  Leu Tyr Arg Phe Asp  Ile Thr Glu Thr Val  His Asn Leu
2975                 2980                 2985
Asn Leu  Thr Asp Asp His Val  Lys Phe Arg Phe Asp  Leu Lys Lys
2990                 2995                 3000
Tyr Asp  His Thr Glu Leu Asp  Ala Ser Val Leu Pro  Ala Pro Ile
3005                 3010                 3015
Ile Val  Arg Arg Pro Asn Asn  Ala Val Phe Asp Ile  Ile Glu Ile
3020                 3025                 3030
Pro Ile  Gly Lys Asp Val Asn  Leu Pro Pro Lys Val  Val Val Lys
3035                 3040                 3045
Arg Gly  Thr Lys Ile Met Phe  Met Ser Val Asp Glu  Ala Val Thr
3050                 3055                 3060
Thr Pro  Met Leu Asn Leu Gly  Ser Tyr Thr Ala Met  Phe Lys Cys
3065                 3070                 3075
Lys Val  Pro Pro Phe Ser Phe  His Ala Phe Glu Leu  Gly Lys Met
3080                 3085                 3090
Tyr Ser  Val Glu Ser Gly Asp  Tyr Phe Met Thr Ala  Ser Thr Thr
3095                 3100                 3105
Glu Leu  Cys Asn Asp Asn Asn  Leu Arg Ile His Val  His Val Asp
3110                 3115                 3120
Asp Glu
3125
<210>  2
<211>  3421
<212>  Белок
<213>  Megathura crenulata
<400>  2
Met Trp Thr Ile Leu Ala Leu Leu Thr Ala Thr Leu Leu Phe Glu Gly
1               5                   10                  15
Ala Phe Ser Val Asp Thr Val Val Arg Lys Asn Val Asp Ser Leu Ser
20                  25                  30
Ser Asp Glu Val Leu Ala Leu Glu Lys Ala Leu Asp Asp Leu Gln Gln
35                  40                  45
Asp Asp Ser Asn Gln Gly Tyr Gln Ala Ile Ala Gly Tyr His Gly Val
50                  55                  60
Pro Thr Met Cys Val Asp Lys His Glu Lys Asn Val Ala Cys Cys Leu
65                  70                  75                  80
His Gly Met Pro Ser Phe Pro Leu Trp His Arg Leu Tyr Val Val Gln
85                  90                  95
Leu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Lys Lys Ala Thr Ile Ser Ile Pro Tyr
100                 105                 110
Trp Asp Trp Thr Ser Glu Leu Thr His Leu Pro Glu Leu Val Ser His
115                 120                 125
Pro Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly Gly Lys Ala His Asp Asn Ser Trp
130                 135                 140
Tyr Arg Ala Asp Ile Thr Phe Leu Asn Lys Lys Thr Ser Arg Ala Val
145                 150                 155                 160
Asp Asp Arg Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Gly His His Thr Arg Leu
165                 170                 175
Met Glu Gly Ile Leu Asp Ala Leu Glu Gln Asp Glu Phe Cys Lys Phe
180                 185                 190
Glu Ile Gln Phe Glu Leu Ala His Asn Ala Ile His Tyr Leu Val Gly
195                 200                 205
Gly Arg His Thr Tyr Ser Met Ser His Leu Glu Tyr Thr Ser Tyr Asp
210                 215                 220
Pro Leu Phe Phe Leu His His Ser Asn Thr Asp Arg Ile Phe Ala Ile
225                 230                 235                 240
Trp Gln Arg Leu Gln Gln Leu Arg Gly Lys Asp Pro Asn Ser Ala Asp
245                 250                 255
Cys Ala His Asn Leu Ile His Thr Pro Met Glu Pro Phe Asp Arg Asp
260                 265                 270
Thr Asn Pro Leu Asp Leu Thr Arg Glu His Ala Lys Pro Ala Asp Ser
275                 280                 285
Phe Asp Tyr Gly Arg Leu Gly Tyr Gln Tyr Asp Asp Leu Ser Leu Asn
290                 295                 300
Gly Met Ser Pro Glu Glu Leu Asn Val Tyr Leu Gly Glu Arg Ala Ala
305                 310                 315                 320
Lys Glu Arg Thr Phe Ala Ser Phe Ile Leu Ser Gly Phe Gly Gly Ser
325                 330                 335
Ala Asn Val Val Val Tyr Val Cys Arg Pro Ala His Asp Glu Ile Ser
340                 345                 350
Asp Asp Gln Cys Ile Lys Ala Gly Asp Phe Phe Leu Leu Gly Gly Pro
355                 360                 365
Thr Glu Met Lys Trp Gly Phe Tyr Arg Ala Tyr His Phe Asp Val Thr
370                 375                 380
Asp Ser Val Ala Ser Ile Asp Asp Asp Gly His Gly His Tyr Tyr Val
385                 390                 395                 400
Lys Ser Glu Leu Phe Ser Val Asn Gly Ser Ala Leu Ser Asn Asp Ile
405                 410                 415
Leu Arg Gln Pro Thr Leu Val His Arg Pro Ala Lys Gly His Phe Asp
420                 425                 430
Lys Pro Pro Val Pro Val Ala Gln Ala Asn Leu Ala Val Arg Lys Asn
435                 440                 445
Ile Asn Asp Leu Thr Ala Glu Glu Thr Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Met
450                 455                 460
Glu Arg Phe Gln Asn Asp Lys Ser Val Asp Gly Tyr Gln Ala Thr Val
465                 470                 475                 480
Glu Phe His Ala Leu Pro Ala Arg Cys Pro Arg Pro Asp Ala Lys Asp
485                 490                 495
Arg Phe Ala Cys Cys Val His Gly Met Ala Thr Phe Pro His Trp His
500                 505                 510
Arg Leu Phe Val Thr Gln Val Glu Asp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Ser
515                 520                 525
Thr Ile Gly Leu Pro Asn Trp Asp Trp Thr Met Pro Met Asp His Leu
530                 535                 540
Pro Glu Leu Ala Thr Ser Glu Thr Tyr Leu Asp Pro Val Thr Gly Glu
545                 550                 555                 560
Thr Lys Asn Asn Pro Phe His His Ala Gln Val Ala Phe Glu Asn Gly
565                 570                 575
Val Thr Ser Arg Asn Pro Asp Ala Lys Leu Phe Met Lys Pro Thr Tyr
580                 585                 590
Gly Asp His Thr Tyr Leu Phe Asp Ser Met Ile Tyr Ala Phe Glu Gln
595                 600                 605
Glu Asp Phe Cys Asp Phe Glu Val Gln Tyr Glu Leu Thr His Asn Ala
610                 615                 620
Ile His Ala Trp Val Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Met Ser Ser Leu
625                 630                 635                 640
His Tyr Thr Ala Phe Asp Pro Ile Phe Tyr Leu His His Ser Asn Val
645                 650                 655
Asp Arg Leu Trp Ala Ile Trp Gln Ala Leu Gln Ile Arg Arg Gly Lys
660                 665                 670
Ser Tyr Lys Ala His Cys Ala Ser Ser Gln Glu Arg Glu Pro Leu Lys
675                 680                 685
Pro Phe Ala Phe Ser Ser Pro Leu Asn Asn Asn Glu Lys Thr Tyr His
690                 695                 700
Asn Ser Val Pro Thr Asn Val Tyr Asp Tyr Val Gly Val Leu His Tyr
705                 710                 715                 720
Arg Tyr Asp Asp Leu Gln Phe Gly Gly Met Thr Met Ser Glu Leu Glu
725                 730                 735
Glu Tyr Ile His Lys Gln Thr Gln His Asp Arg Thr Phe Ala Gly Phe
740                 745                 750
Phe Leu Ser Tyr Ile Gly Thr Ser Ala Ser Val Asp Ile Phe Ile Asn
755                 760                 765
Arg Glu Gly His Asp Lys Tyr Lys Val Gly Ser Phe Val Val Leu Gly
770                 775                 780
Gly Ser Lys Glu Met Lys Trp Gly Phe Asp Arg Met Tyr Lys Tyr Glu
785                 790                 795                 800
Ile Thr Glu Ala Leu Lys Thr Leu Asn Val Ala Val Asp Asp Gly Phe
805                 810                 815
Ser Ile Thr Val Glu Ile Thr Asp Val Asp Gly Ser Pro Pro Ser Ala
820                 825                 830
Asp Leu Ile Pro Pro Pro Ala Ile Ile Phe Glu Arg Ala Asp Ala Lys
835                 840                 845
Asp Phe Gly His Ser Arg Lys Ile Arg Lys Ala Val Asp Ser Leu Thr
850                 855                 860
Val Glu Glu Gln Thr Ser Leu Arg Arg Ala Met Ala Asp Leu Gln Asp
865                 870                 875                 880
Asp Lys Thr Ser Gly Gly Phe Gln Gln Ile Ala Ala Phe His Gly Glu
885                 890                 895
Pro Lys Trp Cys Pro Ser Pro Glu Ala Glu Lys Lys Phe Ala Cys Cys
900                 905                 910
Val His Gly Met Ala Val Phe Pro His Trp His Arg Leu Leu Thr Val
915                 920                 925
Gln Gly Glu Asn Ala Leu Arg Lys His Gly Phe Thr Gly Gly Leu Pro
930                 935                 940
Tyr Trp Asp Trp Thr Arg Ser Met Ser Ala Leu Pro His Phe Val Ala
945                 950                 955                 960
Asp Pro Thr Tyr Asn Asp Ala Ile Ser Ser Gln Glu Glu Asp Asn Pro
965                 970                 975
Trp His His Gly His Ile Asp Ser Val Gly His Asp Thr Thr Arg Asp
980                 985                 990
Val Arg Asp Asp Leu Tyr Gln Ser  Pro Gly Phe Gly His  Tyr Thr Asp
995                 1000                 1005
Ile Ala  Lys Gln Val Leu Leu  Ala Phe Glu Gln Asp  Asp Phe Cys
1010                 1015                 1020
Asp Phe  Glu Val Gln Phe Glu  Ile Ala His Asn Phe  Ile His Ala
1025                 1030                 1035
Leu Val  Gly Gly Asn Glu Pro  Tyr Ser Met Ser Ser  Leu Arg Tyr
1040                 1045                 1050
Thr Thr  Tyr Asp Pro Ile Phe  Phe Leu His Arg Ser  Asn Thr Asp
1055                 1060                 1065
Arg Leu  Trp Ala Ile Trp Gln  Ala Leu Gln Lys Tyr  Arg Gly Lys
1070                 1075                 1080
Pro Tyr  Asn Thr Ala Asn Cys  Ala Ile Ala Ser Met  Arg Lys Pro
1085                 1090                 1095
Leu Gln  Pro Phe Gly Leu Asp  Ser Val Ile Asn Pro  Asp Asp Glu
1100                 1105                 1110
Thr Arg  Glu His Ser Val Pro  Phe Arg Val Phe Asp  Tyr Lys Asn
1115                 1120                 1125
Asn Phe  Asp Tyr Glu Tyr Glu  Ser Leu Ala Phe Asn  Gly Leu Ser
1130                 1135                 1140
Ile Ala  Gln Leu Asp Arg Glu  Leu Gln Arg Arg Lys  Ser His Asp
1145                 1150                 1155
Arg Val  Phe Ala Gly Phe Leu  Leu His Glu Ile Gly  Gln Ser Ala
1160                 1165                 1170
Leu Val  Lys Phe Tyr Val Cys  Lys His Asn Val Ser  Asp Cys Asp
1175                 1180                 1185
His Tyr  Ala Gly Glu Phe Tyr  Ile Leu Gly Asp Glu  Ala Glu Met
1190                 1195                 1200
Pro Trp  Arg Tyr Asp Arg Val  Tyr Lys Tyr Glu Ile  Thr Gln Gln
1205                 1210                 1215
Leu His  Asp Leu Asp Leu His  Val Gly Asp Asn Phe  Phe Leu Lys
1220                 1225                 1230
Tyr Glu  Ala Phe Asp Leu Asn  Gly Gly Ser Leu Gly  Gly Ser Ile
1235                 1240                 1245
Phe Ser  Gln Pro Ser Val Ile  Phe Glu Pro Ala Ala  Gly Ser His
1250                 1255                 1260
Gln Ala  Asp Glu Tyr Arg Glu  Ala Val Thr Ser Ala  Ser His Ile
1265                 1270                 1275
Arg Lys  Asn Ile Arg Asp Leu  Ser Glu Gly Glu Ile  Glu Ser Ile
1280                 1285                 1290
Arg Ser  Ala Phe Leu Gln Ile  Gln Lys Glu Gly Ile  Tyr Glu Asn
1295                 1300                 1305
Ile Ala  Lys Phe His Gly Lys  Pro Gly Leu Cys Glu  His Asp Gly
1310                 1315                 1320
His Pro  Val Ala Cys Cys Val  His Gly Met Pro Thr  Phe Pro His
1325                 1330                 1335
Trp His  Arg Leu Tyr Val Leu  Gln Val Glu Asn Ala  Leu Leu Glu
1340                 1345                 1350
Arg Gly  Ser Ala Val Ala Val  Pro Tyr Trp Asp Trp  Thr Glu Lys
1355                 1360                 1365
Ala Asp  Ser Leu Pro Ser Leu  Ile Asn Asp Ala Thr  Tyr Phe Asn
1370                 1375                 1380
Ser Arg  Ser Gln Thr Phe Asp  Pro Asn Pro Phe Phe  Arg Gly His
1385                 1390                 1395
Ile Ala  Phe Glu Asn Ala Val  Thr Ser Arg Asp Pro  Gln Pro Glu
1400                 1405                 1410
Leu Trp  Asp Asn Lys Asp Phe  Tyr Glu Asn Val Met  Leu Ala Leu
1415                 1420                 1425
Glu Gln  Asp Asn Phe Cys Asp  Phe Glu Ile Gln Leu  Glu Leu Ile
1430                 1435                 1440
His Asn  Ala Leu His Ser Arg  Leu Gly Gly Arg Ala  Lys Tyr Ser
1445                 1450                 1455
Leu Ser  Ser Leu Asp Tyr Thr  Ala Phe Asp Pro Val  Phe Phe Leu
1460                 1465                 1470
His His  Ala Asn Val Asp Arg  Ile Trp Ala Ile Trp  Gln Asp Leu
1475                 1480                 1485
Gln Arg  Tyr Arg Lys Lys Pro  Tyr Asn Glu Ala Asp  Cys Ala Val
1490                 1495                 1500
Asn Glu  Met Arg Lys Pro Leu  Gln Pro Phe Asn Asn  Pro Glu Leu
1505                 1510                 1515
Asn Ser  Asp Ser Met Thr Leu  Lys His Asn Leu Pro  Gln Asp Ser
1520                 1525                 1530
Phe Asp  Tyr Gln Asn Arg Phe  Arg Tyr Gln Tyr Asp  Asn Leu Gln
1535                 1540                 1545
Phe Asn  His Phe Ser Ile Gln  Lys Leu Asp Gln Thr  Ile Gln Ala
1550                 1555                 1560
Arg Lys  Gln His Asp Arg Val  Phe Ala Gly Phe Ile  Leu His Asn
1565                 1570                 1575
Ile Gly  Thr Ser Ala Val Val  Asp Ile Tyr Ile Cys  Val Glu Gln
1580                 1585                 1590
Gly Gly  Glu Gln Asn Cys Lys  Thr Lys Ala Gly Ser  Phe Thr Ile
1595                 1600                 1605
Leu Gly  Gly Glu Thr Glu Met  Pro Phe His Phe Asp  Arg Leu Tyr
1610                 1615                 1620
Lys Phe  Asp Ile Thr Ser Ala  Leu His Lys Leu Gly  Val Pro Leu
1625                 1630                 1635
Asp Gly  His Gly Phe Asp Ile  Lys Val Asp Val Arg  Ala Val Asn
1640                 1645                 1650
Gly Ser  His Leu Asp Gln His  Ile Leu Asn Glu Pro  Ser Leu Leu
1655                 1660                 1665
Phe Val  Pro Gly Glu Arg Lys  Asn Ile Tyr Tyr Asp  Gly Leu Ser
1670                 1675                 1680
Gln His  Asn Leu Val Arg Lys  Glu Val Ser Ser Leu  Thr Thr Leu
1685                 1690                 1695
Glu Lys  His Phe Leu Arg Lys  Ala Leu Lys Asn Met  Gln Ala Asp
1700                 1705                 1710
Asp Ser  Pro Asp Gly Tyr Gln  Ala Ile Ala Ser Phe  His Ala Leu
1715                 1720                 1725
Pro Pro  Leu Cys Pro Ser Pro  Ser Ala Ala His Arg  His Ala Cys
1730                 1735                 1740
Cys Leu  His Gly Met Ala Thr  Phe Pro Gln Trp His  Arg Leu Tyr
1745                 1750                 1755
Thr Val  Gln Phe Glu Asp Ser  Leu Lys Arg His Gly  Ser Ile Val
1760                 1765                 1770
Gly Leu  Pro Tyr Trp Asp Trp  Leu Lys Pro Gln Ser  Ala Leu Pro
1775                 1780                 1785
Asp Leu  Val Thr Gln Glu Thr  Tyr Glu His Leu Phe  Ser His Lys
1790                 1795                 1800
Thr Phe  Pro Asn Pro Phe Leu  Lys Ala Asn Ile Glu  Phe Glu Gly
1805                 1810                 1815
Glu Gly  Val Thr Thr Glu Arg  Asp Val Asp Ala Glu  His Leu Phe
1820                 1825                 1830
Ala Lys  Gly Asn Leu Val Tyr  Asn Asn Trp Phe Cys  Asn Gln Ala
1835                 1840                 1845
Leu Tyr  Ala Leu Glu Gln Glu  Asn Tyr Cys Asp Phe  Glu Ile Gln
1850                 1855                 1860
Phe Glu  Ile Leu His Asn Gly  Ile His Ser Trp Val  Gly Gly Ser
1865                 1870                 1875
Lys Thr  His Ser Ile Gly His  Leu His Tyr Ala Ser  Tyr Asp Pro
1880                 1885                 1890
Leu Phe  Tyr Ile His His Ser  Gln Thr Asp Arg Ile  Trp Ala Ile
1895                 1900                 1905
Trp Gln  Ala Leu Gln Glu His  Arg Gly Leu Ser Gly  Lys Glu Ala
1910                 1915                 1920
His Cys  Ala Leu Glu Gln Met  Lys Asp Pro Leu Lys  Pro Phe Ser
1925                 1930                 1935
Phe Gly  Ser Pro Tyr Asn Leu  Asn Lys Arg Thr Gln  Glu Phe Ser
1940                 1945                 1950
Lys Pro  Glu Asp Thr Phe Asp  Tyr His Arg Phe Gly  Tyr Glu Tyr
1955                 1960                 1965
Asp Ser  Leu Glu Phe Val Gly  Met Ser Val Ser Ser  Leu His Asn
1970                 1975                 1980
Tyr Ile  Lys Gln Gln Gln Glu  Ala Asp Arg Val Phe  Ala Gly Phe
1985                 1990                 1995
Leu Leu  Lys Gly Phe Gly Gln  Ser Ala Ser Val Ser  Phe Asp Ile
2000                 2005                 2010
Cys Arg  Pro Asp Gln Ser Cys  Gln Glu Ala Gly Tyr  Phe Ser Val
2015                 2020                 2025
Leu Gly  Gly Ser Ser Glu Met  Pro Trp Gln Phe Asp  Arg Leu Tyr
2030                 2035                 2040
Lys Tyr  Asp Ile Thr Lys Thr  Leu Lys Asp Met Lys  Leu Arg Tyr
2045                 2050                 2055
Asp Asp  Thr Phe Thr Ile Lys  Val His Ile Lys Asp  Ile Ala Gly
2060                 2065                 2070
Ala Glu  Leu Asp Ser Asp Leu  Ile Pro Thr Pro Ser  Val Leu Leu
2075                 2080                 2085
Glu Glu  Gly Lys His Gly Ile  Asn Val Arg His Val  Gly Arg Asn
2090                 2095                 2100
Arg Ile  Arg Met Glu Leu Ser  Glu Leu Thr Glu Arg  Asp Leu Ala
2105                 2110                 2115
Ser Leu  Lys Ser Ala Met Arg  Ser Leu Gln Ala Asp  Asp Gly Val
2120                 2125                 2130
Asn Gly  Tyr Gln Ala Ile Ala  Ser Phe His Gly Leu  Pro Ala Ser
2135                 2140                 2145
Cys His  Asp Asp Glu Gly His  Glu Ile Ala Cys Cys  Ile His Gly
2150                 2155                 2160
Met Pro  Val Phe Pro His Trp  His Arg Leu Tyr Thr  Leu Gln Met
2165                 2170                 2175
Asp Met  Ala Leu Leu Ser His  Gly Ser Ala Val Ala  Ile Pro Tyr
2180                 2185                 2190
Trp Asp  Trp Thr Lys Pro Ile  Ser Lys Leu Pro Asp  Leu Phe Thr
2195                 2200                 2205
Ser Pro  Glu Tyr Tyr Asp Pro  Trp Arg Asp Ala Val  Val Asn Asn
2210                 2215                 2220
Pro Phe  Ala Lys Gly Tyr Ile  Lys Ser Glu Asp Ala  Tyr Thr Val
2225                 2230                 2235
Arg Asp  Pro Gln Asp Ile Leu  Tyr His Leu Gln Asp  Glu Thr Gly
2240                 2245                 2250
Thr Ser  Val Leu Leu Asp Gln  Thr Leu Leu Ala Leu  Glu Gln Thr
2255                 2260                 2265
Asp Phe  Cys Asp Phe Glu Val  Gln Phe Glu Val Val  His Asn Ala
2270                 2275                 2280
Ile His  Tyr Leu Val Gly Gly  Arg Gln Val Tyr Ala  Leu Ser Ser
2285                 2290                 2295
Gln His  Tyr Ala Ser Tyr Asp  Pro Ala Phe Phe Ile  His His Ser
2300                 2305                 2310
Phe Val  Asp Lys Ile Trp Ala  Val Trp Gln Ala Leu  Gln Lys Lys
2315                 2320                 2325
Arg Lys  Arg Pro Tyr His Lys  Ala Asp Cys Ala Leu  Asn Met Met
2330                 2335                 2340
Thr Lys  Pro Met Arg Pro Phe  Ala His Asp Phe Asn  His Asn Gly
2345                 2350                 2355
Phe Thr  Lys Met His Ala Val  Pro Asn Thr Leu Phe  Asp Phe Gln
2360                 2365                 2370
Asp Leu  Phe Tyr Thr Tyr Asp  Asn Leu Glu Ile Ala  Gly Met Asn
2375                 2380                 2385
Val Asn  Gln Leu Glu Ala Glu  Ile Asn Arg Arg Lys  Ser Gln Thr
2390                 2395                 2400
Arg Val  Phe Ala Gly Phe Leu  Leu His Gly Ile Gly  Arg Ser Ala
2405                 2410                 2415
Asp Val  Arg Phe Trp Ile Cys  Lys Thr Ala Asp Asp  Cys His Ala
2420                 2425                 2430
Ser Gly  Met Ile Phe Ile Leu  Gly Gly Ser Lys Glu  Met His Trp
2435                 2440                 2445
Ala Tyr  Asp Arg Asn Phe Lys  Tyr Asp Ile Thr Gln  Ala Leu Lys
2450                 2455                 2460
Ala Gln  Ser Ile His Pro Glu  Asp Val Phe Asp Thr  Asp Ala Pro
2465                 2470                 2475
Phe Phe  Ile Lys Val Glu Val  His Gly Val Asn Lys  Thr Ala Leu
2480                 2485                 2490
Pro Ser  Ser Ala Ile Pro Ala  Pro Thr Ile Ile Tyr  Ser Ala Gly
2495                 2500                 2505
Glu Gly  His Thr Asp Asp His  Gly Ser Asp His Ile  Ala Gly Ser
2510                 2515                 2520
Gly Val  Arg Lys Asp Val Thr  Ser Leu Thr Ala Ser  Glu Ile Glu
2525                 2530                 2535
Asn Leu  Arg His Ala Leu Gln  Ser Val Met Asp Asp  Asp Gly Pro
2540                 2545                 2550
Asn Gly  Phe Gln Ala Ile Ala  Ala Tyr His Gly Ser  Pro Pro Met
2555                 2560                 2565
Cys His  Met His Asp Gly Arg  Asp Val Ala Cys Cys  Thr His Gly
2570                 2575                 2580
Met Ala  Ser Phe Pro His Trp  His Arg Leu Phe Val  Lys Gln Met
2585                 2590                 2595
Glu Asp  Ala Leu Ala Ala His  Gly Ala His Ile Gly  Ile Pro Tyr
2600                 2605                 2610
Trp Asp  Trp Thr Ser Ala Phe  Ser His Leu Pro Ala  Leu Val Thr
2615                 2620                 2625
Asp His  Glu His Asn Pro Phe  His His Gly His Ile  Ala His Arg
2630                 2635                 2640
Asn Val  Asp Thr Ser Arg Ser  Pro Arg Asp Met Leu  Phe Asn Asp
2645                 2650                 2655
Pro Glu  His Gly Ser Glu Ser  Phe Phe Tyr Arg Gln  Val Leu Leu
2660                 2665                 2670
Ala Leu  Glu Gln Thr Asp Phe  Cys Gln Phe Glu Val  Gln Phe Glu
2675                 2680                 2685
Ile Thr  His Asn Ala Ile His  Ser Trp Thr Gly Gly  His Thr Pro
2690                 2695                 2700
Tyr Gly  Met Ser Ser Leu Glu  Tyr Thr Ala Tyr Asp  Pro Leu Phe
2705                 2710                 2715
Tyr Leu  His His Ser Asn Thr  Asp Arg Ile Trp Ala  Ile Trp Gln
2720                 2725                 2730
Ala Leu  Gln Lys Tyr Arg Gly  Phe Gln Tyr Asn Ala  Ala His Cys
2735                 2740                 2745
Asp Ile  Gln Val Leu Lys Gln  Pro Leu Lys Pro Phe  Ser Glu Ser
2750                 2755                 2760
Arg Asn  Pro Asn Pro Val Thr  Arg Ala Asn Ser Arg  Ala Val Asp
2765                 2770                 2775
Ser Phe  Asp Tyr Glu Arg Leu  Asn Tyr Gln Tyr Asp  Thr Leu Thr
2780                 2785                 2790
Phe His  Gly His Ser Ile Ser  Glu Leu Asp Ala Met  Leu Gln Glu
2795                 2800                 2805
Arg Lys  Lys Glu Glu Arg Thr  Phe Ala Ala Phe Leu  Leu His Gly
2810                 2815                 2820
Phe Gly  Ala Ser Ala Asp Val  Ser Phe Asp Val Cys  Thr Pro Asp
2825                 2830                 2835
Gly His  Cys Ala Phe Ala Gly  Thr Phe Ala Val Leu  Gly Gly Glu
2840                 2845                 2850
Leu Glu  Met Pro Trp Ser Phe  Glu Arg Leu Phe Arg  Tyr Asp Ile
2855                 2860                 2865
Thr Lys  Val Leu Lys Gln Met  Asn Leu His Tyr Asp  Ser Glu Phe
2870                 2875                 2880
His Phe  Glu Leu Lys Ile Val  Gly Thr Asp Gly Thr  Glu Leu Pro
2885                 2890                 2895
Ser Asp  Arg Ile Lys Ser Pro  Thr Ile Glu His His  Gly Gly Asp
2900                 2905                 2910
His His  Gly Gly Asp Thr Ser  Gly His Asp His Ser  Glu Arg His
2915                 2920                 2925
Asp Gly  Phe Phe Arg Lys Glu  Val Gly Ser Leu Ser  Leu Asp Glu
2930                 2935                 2940
Ala Asn  Asp Leu Lys Asn Ala  Leu Tyr Lys Leu Gln  Asn Asp Gln
2945                 2950                 2955
Gly Pro  Asn Gly Tyr Glu Ser  Ile Ala Gly Tyr His  Gly Tyr Pro
2960                 2965                 2970
Phe Leu  Cys Pro Glu His Gly  Glu Asp Gln Tyr Ala  Cys Cys Val
2975                 2980                 2985
His Gly  Met Pro Val Phe Pro  His Trp His Arg Leu  His Thr Ile
2990                 2995                 3000
Gln Phe  Glu Arg Ala Leu Lys  Glu His Gly Ser His  Leu Gly Ile
3005                 3010                 3015
Pro Tyr  Trp Asp Trp Thr Lys  Ser Met Ile Ala Leu  Pro Ala Phe
3020                 3025                 3030
Phe Ala  Asp Ser Ser Asn Ser  Asn Pro Phe Tyr Lys  Tyr His Ile
3035                 3040                 3045
Met Lys  Ala Gly His Asp Thr  Ala Arg Ser Pro Ser  Asp Leu Leu
3050                 3055                 3060
Phe Asn  Gln Pro Gln Leu His  Gly Tyr Asp Tyr Leu  Tyr Tyr Leu
3065                 3070                 3075
Ala Leu  Ser Thr Leu Glu Glu  Asp Asn Tyr Cys Asp  Phe Glu Val
3080                 3085                 3090
His Tyr  Glu Ile Leu His Asn  Ala Val His Leu Trp  Leu Gly Gly
3095                 3100                 3105
Thr Glu  Thr Tyr Ser Met Ser  Ser Leu Ala Phe Ser  Ala Tyr Asp
3110                 3115                 3120
Pro Val  Phe Met Ile Leu His  Ser Gly Leu Asp Arg  Leu Trp Ile
3125                 3130                 3135
Ile Trp  Gln Glu Leu Gln Lys  Leu Arg Lys Lys Pro  Tyr Asn Ala
3140                 3145                 3150
Ala Lys  Cys Ala Gly His Met  Met Asp Glu Pro Leu  His Pro Phe
3155                 3160                 3165
Asn Tyr  Glu Ser Ala Asn His  Asp Ser Phe Thr Arg  Ala Asn Ala
3170                 3175                 3180
Lys Pro  Ser Thr Val Phe Asp  Ser His Lys Phe Asn  Tyr His Tyr
3185                 3190                 3195
Asp Asn  Pro Asp Val Arg Gly  Asn Ser Ile Gln Glu  Ile Ser Ala
3200                 3205                 3210
Ile Ile  His Asp Leu Arg Asn  Gln Pro Arg Val Phe  Ala Gly Phe
3215                 3220                 3225
Val Leu  Ser Gly Ile Tyr Thr  Ser Ala Asn Val Lys  Ile Tyr Leu
3230                 3235                 3240
Val Arg  Glu Gly His Asp Asp  Glu Asn Val Gly Ser  Phe Val Val
3245                 3250                 3255
Leu Gly  Gly Pro Lys Glu Met  Pro Trp Ala Tyr Glu  Arg Ile Phe
3260                 3265                 3270
Lys Tyr  Asp Ile Thr Glu Val  Ala Asn Arg Leu Asn  Met His His
3275                 3280                 3285
Asp Asp  Thr Phe Asn Phe Arg  Leu Glu Val Gln Ser  Tyr Thr Gly
3290                 3295                 3300
Glu Met  Val Thr His His Leu  Pro Glu Pro Leu Ile  Ile Tyr Arg
3305                 3310                 3315
Pro Ala  Lys Gln Glu Tyr Asp  Val Leu Val Ile Pro  Leu Gly Ser
3320                 3325                 3330
Gly His  Lys Leu Pro Pro Lys  Val Ile Val Lys Arg  Gly Thr Arg
3335                 3340                 3345
Ile Met  Phe His Pro Val Asp  Asp Thr Val Asn Arg  Pro Val Val
3350                 3355                 3360
Asp Leu  Gly Ser His Thr Ala  Leu Tyr Asn Cys Val  Val Pro Pro
3365                 3370                 3375
Phe Thr  Tyr Asn Gly Tyr Glu  Leu Asp His Ala Tyr  Ser Leu Arg
3380                 3385                 3390
Asp Gly  His Tyr Tyr Ile Ala  Gly Pro Thr Lys Asp  Leu Cys Thr
3395                 3400                 3405
Ser Gly  Asn Val Arg Ile His  Ile His Ile Glu Asp  Glu
3410                 3415                 3420
<---