СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR TUBERCULOSIS

Данное изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к выявлению экспрессии антигена микобактерии туберкулеза путем постановки иммуноцитогистохимической реакции.
Наиболее известным морфологическим методом выявления и диагностики туберкулеза и ближайшим аналогом является бактериоскопическое исследование мазков/соскобов из очагов поражения, клеточных осадков биологических жидкостей на предмет обнаружения в них микобактерии туберкулеза (МБТ) с окраской препарата по Циль-Нильсену - так называемая простая бактериоскопия (Приказ Минздрава РФ №109 от 21.03.2003 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"). Этот метод можно использовать и для парафиновых срезов, что имеет особую актуальность в патологической анатомии.
Методика этого способа диагностики заключается в следующем:
1. срезы/мазки помещают в дистиллированную воду;
2. погружают в раствор йодной кислоты, оставляют в ней на 10 минут;
3. промывают срезы/мазки в дистиллированной воде;
4. погружают срезы/мазки в раствор карбол-фуксина, оставляют на 30 минут;
5. промывают срезы/мазки в дистиллированной воде и просушивают при помощи фильтровальной бумаги;
6. наносят на срез/мазок 10 капель дифференцирующий кислотный буфер, оставляют на 1 минуту;
7. промывают срезы/мазки под проточной водой в течение 3 минут;
8. а. для срезов: наносят на срез 10 капель гематоксилина Майера, оставляют на 2 минуты;
б. для мазков: наносят на мазок 10 капель раствор метиленового синего и 5 капель активизирующего основного буфера, оставляют на 30 секунд;
9. промывают срезы в дистиллированной и проточной воде в течение 5 минут, мазки - под проточной водой;
10. дегидрируют в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле, заключают под покровное стекло (Приведенный пример окраски с использованием красителей фирмы ООО «БиоВитрум»).
Результат окраски: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне. Морфологические характеристики: обычно микобактерии видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. Микроорганизмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры V. Однако в случае обнаружения измененных форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтвержден дополнительными методами исследования.
Рассмотренный метод используется для массового обследования на туберкулез, в частности легких; преимущество его в быстроте получения результата и низкой стоимости исследования. Однако данный способ выявления МБТ обладает низкой чувствительностью, так как чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза способом микроскопии, в 1 мл исследуемого материала должно содержаться не менее 10000 микробных клеток. Как указывается в вышеуказанном приказе, необходимо иметь в виду, что микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудителей туберкулеза) от нетуберкулезных («атипичных») микобактерий - возбудителей микобактериозов. На основании микроскопического исследования возможно сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микобактерий. Это объясняется тем, что в природе существует большое число нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих микобактериозы, а также кислотоустойчивых сапрофитов, не вызывающих заболевания человека. Микроскопически они неотличимы от Mycobacterium tuberculosis.
Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте или других биологических материалах от пациента может содержаться меньше микобактерий, чем может выявить данное исследование. Все сказанное определяет особую актуальность разработки новых высокоспецифичных и чувствительных способов выявления микобактерии туберкулеза. В настоящий момент иммуноцитогистохимическая диагностика все шире используется в практической медицине.
Протокол постановки иммуноцитогистохимической реакции (В.Н.Эллиниди, Н.В.Аникеева, Н.А.Максимова. Практическая иммуногимтоцитохимия. Методические рекомендации. Санкт-Петербург, 2002) имеет следующие этапы:
1. А. мазки фиксируют в ацетоне 3-5 минут; сушат при комнатной температуре, рабочее поле обводят водостойким маркером со стороны мазка, с обратной стороны перманентным маркером;
Б. парафиновые срезы депарафинизируют в ксилоловом спирте 2 раза по 5 минут, затем в 96% этиловом спирте по 3 минуты 2 раза,
2. мазки/срезы промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,5);
3. мазки/срезы помещают в 3% раствор перекиси водорода - 10 минут;
4. срезы промывают в дистиллированной воде, затем помещают в теплый цитратный буфер (рН 6,0) на 3 минуты, кипятят в нем 4 минуты, остужают при комнатной температуре;
5. мазки/срезы промывают в 2 порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7,3-7,5);
6. наносят первые (специфичные) антитела;
7. инкубируют 1 час в термостате при температуре 37 градусов Цельсия;
8. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5), убирают излишки жидкости;
9. наносят систему детекции EnVision (Dako), инкубируют 45 минут при комнатной температуре;
10. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5);
11. наносят диаминобензидин на 1-2 минуты;
12. промывают в буфере (рН 7,3-7,5), затем промывают в дистиллированной воде;
13. слабо докрашивают гематоксилином;
14. срезы дегидратируют в спиртах: в 2 этиловых спиртах 96%, карбоксилоле, ксилоле, в каждом по 3 минуты;
15.заключают в бальзам или другую среду;
16. микроскопируют.
Но как показывает наш опыт, при использовании «стандартного» протокола постановки иммуноцитогистохимической реакции обнаружить антигены микобактерии туберкулеза не удается. В литературе нет данных об использовании данного метода для диагностики туберкулеза путем иммуноцитогистохимического выявления экспрессии антигена микобактерии туберкулеза.
Задача изобретения: создание способа диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования для повышения точности выявления антигена микобактерии туберкулеза и возможного его применения в практическом здравоохранении.
Для реализации этой цели впервые предложен модифицированный иммуноцитогистохимический метод исследования биологического материала (мазки/соскобы, клеточные осадки биологических жидкостей). Данный метод основан на специфической реакции антиген - антитело. Он отличается простотой постановки реакции, высокой специфичностью и чувствительностью. Препараты можно просматривать в обычном световом микроскопе и фотографировать.
Предложенный метод отличается тем, что:
1. Перед нанесением перекиси водорода мазки обрабатываются 1% раствором бихромата калия, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран и большей доступности выявляемого антигена для антител.
2. На мазки/соскобы в качестве первых (специфических) антител наносят моноклональные мышиные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза (производства Vector Laboratories), адаптированные нами для постановки иммуноцитогистохимической реакции: разведение первых антител 1:20, инкубация осуществляется при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов.
3. В качестве вторых антител используется система детекции Dako REAL™ EnVision™ Detection Sistem. Длительность инкубации в растворе вторых антител 1 час при комнатной температуре. Используемая система (ЕnVision) основана на HRP-меченом полимере, который конъюгирован с вторичными антителами. Меченый полимер не содержит авидин или биотин. Следовательно, неспецифическое окрашивание при взаимодействии авидина с эндогенным биотином в исследуемой ткани исключено или значительно снижено. Эта система является высокочувствительной и, как следствие, оптимальное разведение первичных антител в 20 раз выше, чем при традиционном использовании РАР-способа, и в несколько раз больше, чем те, которые традиционно использовались для традиционных ABC или LSAB-методов.
В рамках предложенного проекта впервые используются антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза, адаптированные нами для постановки иммуноцитогистохимической реакции. Обработка раствором бихромата калия, пролонгированное время инкубации при низкой температуре первых антител и использование в качестве системы детекции EnVision позволило получить высокоспецифичный и надежный метод выявления антигена микобактерии туберкулеза. Проводимая при этом оценка локализации антигена микобактерии туберкулеза, с учетом характерных патогистологических изменений дает возможность значительно повысить точность и объективность диагностики туберкулеза.
Предложенный впервые новый подход к способу выявления микобактерии туберкулеза и комплекс методических приемов, выполняемых в процессе иммуноцитогистохимического выявления микобактерии, является обязательным. Невыполнения их не дает объективных результатов или искажает конечный результат исследований, не позволяет провести соответствующую интерпретацию полученных данных.
Предложенный способ осуществляется следующим образом:
1. мазки/соскобы фиксируют в ацетоне 3-5 минут; сушат при комнатной температуре, рабочее поле обводят водостойким маркером со стороны мазка, с обратной стороны перманентным маркером;
2. мазки/соскобы промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,5);
3. обрабатывают 1% раствором бихромата калия 3-4 минуты;
3. мазки/соскобы помещают в 3% раствор перекиси водорода - 20 минут;
4. мазки/соскобы промывают в 2 порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7,3-7,5);
5. наносят моноклональные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20;
6. инкубируют 12 часов при температуре 3-5 градусов Цельсия;
7. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5), убирают излишки жидкости;
8. наносят систему детекции EnVision (вторые антитела), инкубируют 60 минут при комнатной температуре;
9. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5);
10. наносят диаминобензидин на 1-2 минуты;
11. промывают в буфере (рН 7,3-7,5), затем промывают в дистиллированной воде;
12. слабо докрашивают гематоксилином;
13. заключают в бальзам или другую среду;
14. микроскопируют.
Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.
Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят буфер (результаты должны быть отрицательными).
Оценка продукта реакции: антиген микобактерии туберкулеза выявляется в виде тонких или более утолщенных, изогнутых и извитых палочек коричневого цвета различной интенсивности окраски, разных размеров. Микобактерии могут располагаться одиночно или группами, принимая различные геометрические формы, иногда имеют сходство с кокками или в виде утолщенных образований, напоминающих мицелий грибов. Микобактерии могут располагаться в цитоплазме клеток, на клеточной оболочке и между клетками (свободно лежащие), в таком случае результат трактуется как положительный, при отсутствии продукта реакции результат трактуется как отрицательный.
Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения. Было проведено исследование мазков с операционного материала от 16 больных с остеомиелитом, в 9 случаях был выявлен антиген микобактерии туберкулеза. В качестве примера приводим иммуноцитохимическое исследование мазка с операционного материала от больного Жданова А.А., 19.06.08 г.р., № и/б 2086, находившегося на лечении в период с 17.02.10. по 19.01.11 г. с диагнозом: туберкулезный (БЦЖ по клинико-лабораторным данным) остит проксимального эпиметафиза левой плечевой кости, осложнившийся абсцессом. Данный случай интересен тем, что при наличии клинико-лабораторных данных, свидетельствующих о развитии туберкулезного процесса, при микроскопии мазков операционного материала, окрашенных по Циль-Нильсену, микобактерии туберкулеза не были выявлены. В связи с этим было проведено иммуноцитогистохимическое исследование для уточнения этиологии заболевания. В результате проведенной нами иммуноцитогистохимической окраски мазков с операционного материала от данного больного были выявлены микобактерии туберкулеза, представленные на рисунке 1 и 2, где позиция 1 - микобактерии туберкулеза.
Положительный эффект от использования заявляемого изобретения заключается в следующем:
Иммуноцитогистохимический способ диагностики туберкулеза позволяет обнаружить антиген микобактерии туберкулеза в тех случаях, когда рекомендуемые способы, в частности бактериоскопия с окраской по Циль-Нильсену, не позволяет выявить возбудителя. Положительная иммуноцитогистохимическая реакция дает возможность говорить о наличии только микобактерии туберкулеза. Данный способ выявляет даже единичные микобактерии. Докраска гематоксилином помогает оценить локализацию антигена, характер морфологических изменений, что также способствует повышению точности диагностики.
Исследование надежно, специфично, чувствительно. Метод достаточно прост, возможно, его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого выявления микобактерии туберкулеза и, соответственно, своевременного назначения этиологической и патогенетической (противотуберкулезной) терапии.
Предлагаемый способ имеет экономическую значимость, т.к. при этом не требуется применения дополнительного лабораторного оборудования.