АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ ПРИБОР ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МЕТОДОМ ПЦР-РВ
AUTOMATED DEVICE FOR ISOLATION, PURIFICATION AND ANALYSIS OF NUCLEIC ACIDS BY RT-PCR METHOD

Изобретение относится к приборам для качественного анализа нуклеиновых кислот (НК), в которых использован метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Такие приборы широко используются в медицинской практике и в исследовательских целях при диагностике инфекционных, онкологических и генетических заболеваний человека и животных, анализе продуктов, содержащих генетически модифицированные организмы, при мониторинге экспрессии генов и т.д.
Генетический анализ обычно включает амплификацию и обнаружение НК с использованием известных методов, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции (ЛЦР), репликации по типу катящегося кольца, амплификации со смещением цепи (SDA), лигированной активированной транскрипции (LAT), изотермической амплификации NASBA, петлевой изотермической амплификации (LAMP) и др. Большинство приборов и комплексов ориентированы на проведение анализа методами ПЦР и ПЦР-РВ. Перед анализом нуклеиновых кислот должно быть выполнено выделение НК, состоящее из следующих стадий:
- высвобождение НК путем разрушения клеточных стенок или вирусного капсида с помощью лизиса;
- отделение НК от других клеточных веществ и/или матрицы образца;
- очистка НК от ингибиторов ПЦР;
- концентрирование НК.
Существует множество вариантов выполнения этих стадий, а некоторые стадии иногда могут быть пропущены или добавлены в зависимости от метода анализа и анализируемого материала.
Лизис НК из клеток или вирусов осуществляется физическими или химическими методами. Химические методы основаны на применении различных поверхностно-активных веществ/детергентов, хаотропных и ферментных систем. Такие методы описаны в патенте США №US 5652141 А «Device and process for isolating nucleic acids from cell suspension)) (Устройство и способ выделения нуклеиновых кислот из клеточной суспензии) и патенте США №US 5856174 A «Integrated nucleic acid diagnostic device» (Интегрированное диагностическое устройство нуклеиновой кислоты). Одним из недостатков использования для лизиса агрессивных химических веществ является то, что химические вещества являются ингибирующими для последующей амплификации нуклеиновой кислоты. Поэтому, используя методы химического разрушения, обычно необходимо очистить нуклеиновую кислоту, высвобождаемую из клеток, прежде чем продолжить анализ.
Физические методы разрушения клеток часто не требуют агрессивных химических веществ, которые ингибируют амплификацию нуклеиновой кислоты. Известен метод разрушения клеток, который включает помещение клеток в раствор и нагревание раствора до кипения, что приводит к денатурации белков и их прилипанию к высвобожденной нуклеиновой кислоте. Эти белки мешают последующей амплификации нуклеиновой кислоты.
Другим физическим методом является многократное замораживание и оттаивание, повторяющееся до тех пор, пока стенки клеток не разрушатся. Этот метод зачастую не может разорвать многие структуры, в первую очередь определенные споры и вирусы, которые имеют чрезвычайно устойчивые внешние слои.
Разрушение клеток возможно за счет пропускания раствора микобактериальных микроорганизмов через отверстия небольшого диаметра под давлением. Во время прохождения через отверстия микобактерии разрываются механическими силами. Однако такая система является громоздкой, дорогой и требует охлаждения. Кроме того, прибор необходимо очищать и обеззараживать между анализами, когда обрабатывается инфекционный материал. Еще одним недостатком этой системы является то, что раствор должен содержать только частицы, имеющие, по существу, одинаковые размеры.
Также известно, что клетки можно лизировать, подвергая воздействию ультразвука. Как правило, клетки разрушаются путем помещения ультразвукового зонда непосредственно в объем жидкости, содержащей клетки. Поскольку зонд находится в непосредственном контакте с образцом жидкости, могут возникнуть контаминация и кавитационное вспенивание.
Еще один способ разрушения клеток раскрыт компанией Murphy et al. в патенте США №US 5374522 A «Method for releasing RNA and DNA from cells» (Метод выделения РНК и ДНК из клеток): растворы или суспензии клеток помещают в контейнер с небольшими шариками. Затем контейнер помещают в ультразвуковую ванну до тех пор, пока клетки не разрушатся, высвобождая их клеточные компоненты.
Существуют устройства, применяющие комбинации вышеописанных методов. Согласно патенту США №US 6440725 В1 «Method for separating analyte from a sample» (Способ отделения аналита от образца) лизис может выполняться различными способами: за счет перемалывания с помощью стеклянных или пластиковых шариков, за счет нагрева до 95°С, при повторном замораживании и оттаивании или ферментами, разрушающими стенки клетки. В устройстве по патенту США №US 9943848 В2 «Apparatus and method for cell disruption)) (Аппарат и способ разрушения клеток) лизис осуществляется за счет ультразвукового источника и источника давления в камере с шариками, имеющей гибкую стенку.
Для выделения НК разработан целый ряд методов экстракции и очистки.
Экстракции нуклеиновых кислот осуществляют жидкофазные методы, например, гель-фильтрацию на смолах типа Sepharose/Sephadex, и твердофазные методы, например, экстракция на кварцевых и стеклянных частицах и волокнах, цеолитах, пористых монолитных матрицах на основе кремния и различных полимеров и др.
В патенте США №US 5057426 A «Method for separating long-chain nucleic acids)) (Способ разделения длинноцепочечных нуклеиновых кислот) описаны выделение и очистка нуклеиновых кислот с помощью гель-фильтрации.
В патенте США №US 6310199 В1 «рН dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids)) (Ионообменная матрица и способ использования при выделении нуклеиновых кислот) предложено применять ионообменные матрицы.
Известны решения выделения нуклеиновых кислот с применением хроматографии (патент США №US 6475388 B1 «Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography)) (Метод и система для анализа РНК с помощью согласованной ионно-полинуклеотидной хроматографии)).
В патенте США №US 5155018 A «Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources)) (Процесс и набор для выделения и очистки РНК из биологических источников) для выделения РНК из биологических образцов используются сорбенты на основе микрочастиц кремния.
Известны способы выделения НК с использованием металлических магнитных частиц, таких как частицы железа, цинка и др., содержащие носители, которые способны специфически сорбировать НК. Магнитные частицы с адсорбированной НК осаждаются под действием магнитного поля. Увеличение сорбционной емкости частиц достигается путем модификации их поверхности (патент США №US 4923978 A «Process for purifying nucleic acids» (Процесс очистки нуклеиновых кислот) и патент США №US 6255477 В1 «Particles having a magnetic core and outer glass layer for separating biological material)) (Частицы для разделения биологического материала, имеющие магнитный сердечник и внешний стеклянный слой)).
Компанией Qiagene получен патент Европейского союза №ЕР 1633869 А1 «Method for sequentially isolating DNA and RNA from the same nucleic acid-containing sample» (Метод последовательного разделения ДНК и РНК из одного и того же образца)), включающий добавление к образцу хаотропного агента, осаждение НК спиртом, взаимодействие с функциональной НК-связывающей поверхностью и последовательную элюцию ДНК и РНК. Метод основан на различии в кинетике связывания и элюции ДНК и РНК. Связывающей поверхностью могут являться, например, стеклянные шарики или магнитные частицы.
Известна платформа для выделения НК из разных клинических образцов, которая включает запатентованную технологию гомогенизации и лизиса трудных для разрушения клеток перед извлечением и очисткой НК на основе пористой монолитной связывающей матрицы TruTip, в платформе применяется сочетание вращающегося магнитного диска с немагнитными частицами (заявка на изобретение США №US 20180148712 Al «Method and Test Kit For Rapid Isolation of Nucleic Acids Using Rough Surfaces)) (метод и набор для изолирования нуклеиновых кислот с использованием неровных поверхностей)).
При работе с широким спектром проб, содержащих нуклеиновые кислоты, качество пробоподготовки является определяющим фактором для чувствительности и надежности последующего специфического анализа. В настоящее время развитие и совершенствование методов пробоподготовки можно условно разделить на два подхода:
- увеличение производительности аппаратно-программного комплекса (АПК), путем создания полностью автоматизированных станций и узлов, обеспечивающих выделение, очистку и концентрирование ДНК/РНК из поступивших проб, чаще всего подобные решения реализуются на базе планшетов и подложек открытого или полуоткрытого типа;
- создание закрытых одноразовых картриджей (чипов) для обработки одной пробы, с получением инактивированного, сконцентрированного очищенного препарата НК на выходе.
Первый подход характерен для решения задач по пробоподготовке для массового анализа генетического материала с ограниченным набором различных видов поступивших проб, как правило, крови, лимфы, воды или мокроты.
Второй подход представляется наиболее перспективным, так как способен обеспечить высокий уровень надежности, безопасности и производительности, защиту от контаминации образцов и высокую чувствительность для дальнейшего специфического анализа ДНК/РНК.
Известны достаточно простые устройства для обработки биологических образцов и выделения НК на основе микрофлюидных систем:
- микрофлюидное устройство для выделения геномной ДНК из лейкоцитов человека, в котором ДНК из образца связывается с поверхностью канала, модифицированного ДНК-связывающим реагентом (заявка на изобретение США №US 20090029867 A1 «DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces)) (Очистка и анализ ДНК на наноспроектированных поверхностях));
- микрочип, в котором очистка ДНК происходит путем последовательного прохождения через серию хроматографических микроколонок, селективно сорбирующих примесные вещества, такие как белки, пептиды, липиды, пектины и др., а последняя колонка селективно связывает ДНК (международный патент №WO/2008/058204 «DNA purification in a multi-stage, multi-phase microchip» (Очистка ДНК в многоступенчатом, многофазном чипе)).
Недостатками таких устройств являются низкий выход НК, а также необходимость ручного введения реагентов на разных стадиях выделения и очистки.
Компанией Siemens предложен плоский картридж для автоматического анализа ДНК или белков, содержащий систему микроканалов и емкости для сухих реагентов, а также предложен способ его изготовления методом литья под давлением (патент Европейского союза №ЕР 1807208 В1 «Arrangement for integrated and automated DNA or protein analysis in a single-use cartridge, method for producing such a cartridge and operating method for DNA or protein analysis using such a cartridge» (Устройство для комплексного и автоматизированного анализа ДНК или белка в одноразовом картридже, способ изготовления такого картриджа и метод работы для анализа ДНК или белка с использованием такого картриджа)). Сухие реагенты вносятся в открытые каналы, которые после этого заклеиваются пленкой. Картридж является одноразовым устройством. Образец вносится в готовый к анализу картридж, результаты получают в полностью автоматическом режиме при помещении картриджа в считывающее устройство прибора.
Источник движения в рассмотренных устройствах может находиться как в приборе, так и на картридже. Он может быть выполнен в виде электронасоса, расположенного внутри жидкостного контура. Или, как вариант, движение жидкости обеспечивается за счет давления пружины или шагового двигателя на отсек с реагентами, которое заставляет жидкость поступать из отсека в жидкостный контур. Также возможно обеспечение движения за счет избыточного давления, или, наоборот, разрежения, создаваемого компрессором, который может находиться в картридже или приборе.
Реагенты могут быть введены в картридж через герметичные отверстия или заложены в процессе производства в сухом (леофилизированном) или жидком виде. Высушенные реагенты могут быть включены в мембраны из целлюлозы, нитроцеллюлозы, поликарбоната, нейлона и других материалов. Добавки, такие как простые сахара, спирта, метилцеллюлозы и наполнители белков, могут быть добавлены к реагенту перед леофилизацией для повышения стабильности.
Начальная стадия лизиса клеток и последующая экстракция и выделение нуклеиновой кислоты может осуществляться посредством твердофазной среды, связывающей нуклеиновую кислоту (фильтровальная бумага Whatman FTA™), которая включена в камеру ПЦР. Химический состав бумаги Whatman FTA вызывает лизис клеток, денатурацию белков и защиту нуклеиновых кислот от окислителей и повреждения ультрафиолетом. Нанесение пробы вызывает лизис мембран клетки и органелл. Высвобожденные НК затем собираются на волокнах матрицы, где в неподвижном состоянии сохраняются для последующей обработки. Это решение использовано в патенте США №US9409166 B2 integrated PCR reactor for cell lysis, nucleic acid isolation and purification, and nucleic acid amplication related applications)) (Интегрированный ПЦР-реактор для лизиса клеток, выделения и очистки нуклеиновых кислот и его применений, связанных с амплификацией нуклеиновой кислоты). При этом, стадии лизиса, экстракции и ПЦР выполняются в одной реакционной камере за счет отделения ПЦР-реагентов слоем парафина и высвобождения реагентов перед проведением реакции ПЦР путем нагрева слоя парафина.
После лизиса происходит этап промывки, перед этим может происходить подача воздуха с целью высушивания. Промывка производится элюирующим раствором. При этом для повышения эффективности элюирования происходит нагрев (например, резистивными нагревателями) до температуры от 60 до 95°С.
После стадии пробоподготовки следует стадия ПЦР. Существующие методы проведения ПЦР с использованием коммерчески доступного оборудования, как правило, основаны на применении полимерных пробирок, которые устанавливаются в металлические нагревательные блоки. Высокая термическая масса стандартных нагревательных блоков с установленными в них пробирками и образцами, невысокая теплопроводность материала стенок пробирок ограничивают скорость нагрева и охлаждения образца, а также могут приводить к высокой неоднородности температурного поля в образцах, находящихся в пробирках. При использовании обычных лабораторных приборов, предназначенных для выполнения ПЦР в полимерных пробирках или планшетах, рекомендуемое время поддержания температуры для одного температурного цикла составляет 2 или более минут. В результате, ПЦР процесс из 40 циклов с использованием обычного оборудования при объеме пробы 20-50 мкл может занять 2 и более часов.
Для сокращения времени, затрачиваемого на один цикл, было предложено много методов проведения ПЦР в миниатюрных реакционных контейнерах. Для ускорения времени, требуемого на переход между температурными уровнями, в подобных устройствах была существенно уменьшена масса нагревательного элемента, масса контейнеров и объем образцов, что позволило сократить термическую массу, применяются материалы с высокими коэффициентами теплопроводности и повышается соотношение площади поверхности образца к его объему.
Применение микрочиповых технологий позволяет существенно сократить время цикла ПЦР, соответственно сократить время анализа методом ПЦР и увеличить производительность.
Автоматическая амплификация нуклеиновых кислот в микрожидкостном картридже впервые была предложена несколько десятилетий назад (патенты на изобретение США №US 5304487 А «Обработка жидкости в мезомасштабных аналитических устройствах» (Fluid handling in mesoscale analytical devices) и №US 5635358 А «Обработка жидкости в мезомасштабных аналитических устройствах» (Fluid handling methods for use in mesoscale analytical devices)).
Известны различные способы обеспечения заданных тепловых режимов исследуемых образцов. При этом, чаще всего нагрев обеспечивается или резистивными нагревателями (например, патент США №US 8124033 В2 ((Apparatus for regulating the temperature of a biological and/or chemical sample and method of using the same»), или элементами Пельтье.
В патенте США №US 9963739 В2 ((Polymerase chain reaction systems» (Системы для проведения полимеразной цепной реакции) термоциклирование обеспечивается за счет перемещения исследуемого образца жидкости между зонами с соответствующими температурами, тем самым увеличивая скорость изменения температуры образца. При этом должна быть обеспечена высокая скорость перемещения образца.
Также для нагревания используются способы бесконтактного подвода тепла к образцам. Например, прибор RapidCycler (Idaho Technologies, Inc., США) позволяет относительно быстро изменять температуру ПЦР смеси при переходе между температурными уровнями и обеспечивает относительно эффективный перенос тепла от нагревателя к образцам: образцы находятся в специальных капиллярах, обдуваемых потоками воздуха. В этом устройстве 30 циклов ПЦР-РВ могут быть проведены за 10 минут.
В патенте Индии №1215/CHFA2010 «Non contact real time micro polymerase chain reaction system and method thereof)) (Бесконтактная система для проведения ПЦР и метод для ее проведения) описана бесконтактная микросистема для проведения ПЦР. Нагрев пробы осуществляется индукционным нагревом, охлаждение происходит за счет обдува воздухом от вентилятора. Для измерения и регулирования температуры пробы используется инфракрасный датчик.
В патенте США №US 9901923 В2 «Mobile molecular diagnostics system with wireless communication)) (Мобильная система молекулярной диагностики с беспроводной связью) описана возможность использования сверхбыстрого фотонного метода ПЦР, который сочетает в себе использование тонкой золотой пленки в лунках в качестве преобразователя световой энергии в тепловую и светоизлучающих диодов в качестве источника теплоты.
Однако реализация ПЦР-РВ в микрофлюидных устройствах сталкивается с определенными трудностями. Увеличение соотношения площади поверхности между микрореактором и образцом к объему вызывает снижение активности и даже необратимую деактивацию фермента полимеразы. На поверхностях таких материалов, как кремний, металлы, кварц, стекло, наблюдается необратимая сорбция ДНК, фермента и других компонентов реакции. Для устранения указанных ограничений требуется добавление в реакционную смесь дополнительных веществ, предотвращающих сорбцию и деактивацию компонентов ПЦР, например введение аминокислот, белков и поверхностно-активных веществ (патент США №US 7892819 В2 «Mesoscale polynucleotide amplification devices)) (Мезомасштабные устройства для амплификации полинуклеотидов)). В этом же патенте раскрываются способы, позволяющие создавать защитное покрытие поверхностей микрореакторов, в которых проводится ПЦР. Подобные покрытия предотвращают адсорбцию и ингибирование компонентов ПЦР, что позволяет достичь высокой чувствительности ПЦР анализа.
Одной из известных для специалистов проблем при проведении ПЦР является испарение образцов при термоциклировании. Так как температура денатурации ДНК близка к температуре кипения водных растворов, интенсивное испарение ПЦР смеси во время реакции может препятствовать протеканию ПЦР, что в стандартных устройствах, как правило, устраняется либо путем изолирования водной поверхности смеси от атмосферы при помощи жидкости, несмешивающейся с водой, например минерального масла, либо путем препятствия конденсации жидкости при помощи нагреваемой крышки.
В закрытых каналах микрофлюидных чипов возможно герметизировать микрореакторы при помощи клапанов в микроканале (патент США №US 9643178 В2 «Microfluidic device and methods of using same» (Микрожидкостное устройство и способ его применения)). Реализация подобного способа герметизации технически сложна и увеличивает стоимость анализа с использованием такого микрочипа.
Устройство ПЦР по патенту Кореи №2003-10729 «Polymerase chain reaction device and method of regulating opening and closing of inlet and outlet of the polymerase chain reaction device» (Устройство для проведения ПЦР, способ регулирования входного и выходного отверстий устройства для проведения ПЦР) включает в себя золь-гель-трансформируемый материал, который переходит в состояние геля при температуре ниже, чем температура отжига, и выше, чем комнатная температура. В качестве такого геля может использоваться, например, метилцеллюлоза или парафин. Парафин является удобным материалом для изготовления фазово-изменяемых клапанов благодаря тому, что у него удобно подбирается температура плавления. Твердый же парафин может выдерживать большие давления около 276 кПа без последствий и протечек. Однако такой клапан можно использовать только один раз для предварительного перекрывания потока жидкости в одноразовых чипах.
Для микрочипов, содержащих открытые реакционные ячейки, известны способы изоляции реакционной смеси от атмосферы, заключающиеся в нанесении на поверхность водного раствора реакционной смеси несмешивающейся с водой жидкости, например минерального или силиконового масла (патент Японии №JP 3120453 В2 «Method of holding the microdroplets, the reaction method» (Способ удерживания микрокапель, метод проведения реакции)), для предотвращения испарения образцов при термоциклировании. Однако в описанном устройстве для ввода рабочей ПЦР смеси и образцов многократно задействована струйная система, что может привести к неконтролируемой деградации ПЦР реактивов и взаимному загрязнению образцов в процессе нанесения.
Известен способ и устройство (патент Сингапура №2007/000047 ((Apparatus for regulating the temperature of a biological and/or chemical sample and method of using the same» (Аппарат для регулирования температуры биологического и/или химического образца и метод его использования)), в котором используется микрочип с нанесенными на поверхность подложки реакционными объемами, представляющими собой каплю несмешивающейся с водой жидкости, в которую помещена ПЦР смесь. Однако в этом способе реакционная смесь отделена от нагреваемой поверхности подложки слоем несмешивающейся с водой жидкости, как правило, обладающей невысокой теплопроводностью, что замедляет процесс нагрева и охлаждения. Кроме того, в этом способе реакционные объемы могут неконтролируемо перемещаться, т.к. вся поверхность теплопроводящей подложки изотропна, что потенциально может приводить к пространственному несовпадению нагреваемой зоны и нагреваемого образца в процессе ввода пробы и термоциклирования, что приведет к недостоверным результатам анализа методом ПЦР.
Еще одним недостатком, общим для известных микрофлюидных устройств, является повышенная трудоемкость смешивания образцов с реактивами ПЦР до ввода в микрочип. Кроме того, эта процедура требует затрат на дополнительные расходные материалы (пластиковые наконечники, пробирки) и практически нереализуема в обычных пробирках при объеме манипулируемых жидкостей меньше 1 мкл из-за повышенной вероятности испарения реактивов и образцов во время смешивания.
Известны способы, позволяющие иммобилизовать в микрореакторе один или несколько компонентов реакционной смеси, необходимых для проведения ПЦР, для того, чтобы затем заполнить микрореактор водным раствором, содержащим нуклеиновые кислоты и недостающие компоненты ПЦР смеси (патент США №US 7118910 В2 «Microfluidic device and methods of using same» (Микрофлюидное устройство и методы его использования)). Однако указанный способ трудоемок и нелегко поддается контролю при производстве, так как требует нанесения биологических реагентов непосредственно в процессе изготовления микрочипа, что повышает опасность негативного воздействия последующих технологических процессов на нанесенные реактивы (воздействие повышенной температуры, химических соединений, излучения).
Известны способы лиофильного высушивания подготовленной ПЦР смеси (патент РФ №RU 2259401 С1 «Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения ПЦР анализа», патент США №US 6153412 A «Lyophilized reagent for polymerase chain reaction)) (Лиофилизированные реагенты для полимеразной цепной реакции)). Эти способы могут быть реализованы практически в любой микрореакторной системе с открытыми реакторами.
В современных устройствах осуществляется не только анализ ПЦР, но и ПЦР-РВ. Существуют различные системы детектирования, но чаще всего используется детектирование флуоресценции красителей, интеркалирующих в двуцепочечных молекулах ДНК или модифицированных олигонуклеотидов (ДНК-зондов), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК. У различных детектирующих термоциклеров по-разному устроена оптическая система. Так, для передачи световых потоков используется или геометрическая оптика (линзы, зеркала), или оптоволоконные технологии. В одних приборах для возбуждения флуорохромов используется лазерный источник света, в других применяются галогеновые лампы или светодиоды, а регистрация свечения производится с помощью ФЭУ, ПЗС-матриц или фотодиодов.
Британской фирмой Atlas Genetics была изобретена и разработана платформа Atlas Genetics io Reader, в которой применяется запатентованный метод электрохимического обнаружения продуктов (патент на изобретение США №US 10094800 В2 «Анализы и аппаратура для обнаружения электрохимически активных маркеров в электрическом поле» (Assays and apparatus for detecting electrochemical active markers in an electric field). Метод основан на эффекте связывание зонда с ДНК-мишенью и взаимодействии с ферментом, помогающим высвободить электрохимическую метку, которая регистрируется.
В системе Nanomix, состоящей из портативного считывателя и интегрированного автономного картриджа (патент на изобретение США №US 9103775 В2 «Nano-electronic sensors for chemical and biological analytes, including capacitance and bio-membrane devices» (Наноэлектронные датчики для химических и биологических аналитов, включая емкостные и биомембранные устройства), используется сигнал изменения электропроводности углеродной нанотрубки, покрытой участками ДНК, последовательность которых дополняет последовательность определяемой мутации. При связывании комплементарных участков ДНК наблюдается падение электропроводности углеродной нанотрубки.
В устройстве по патенту Германии №DE 102015001998 В3 «Microfluidic cartridge for detecting biomolecules» (Микрофлюидный картридж для детектирования биомолекул) применяется электрохимическое детектирование: каждый из тестовых участков генерирует электрический сигнал, величина которого является мерой концентрации нуклеиновой кислоты в детектируемом объеме жидкости. Стоит отметить, что в этом патенте химические реагенты для ПЦР предварительно находятся под защитой слоя воска. В начале амплификации слой воска плавится путем повышения температуры, и за счет этого химические реагенты добавляются к раствору пробы в реакционной камере. Аналогичное решение приведено в патенте США №US 9409166 В2 «Integrated PCR reactor for cell lysis, nucleic acid isolation and purification, and nucleic acid amplication related applications)) (Интегрированный ПЦР-реактор для лизиса клеток, выделения и очистки нуклеиновых кислот и его применений, связанных с усилением нуклеиновой кислоты).
Далее приведены аналоги разработанного технического решения.
Внутри сменного микрофлюидного модуля по патенту РФ №RU 2380418 С1 «Сменный микрофлюидный модуль для автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов и способ выделения и очистки нуклеиновых кислот с его использованием» в процессе выделения и очистки НК происходит фильтрация биологического образца через мембрану, лизис микроорганизмов и вирусов, задержанных на мембране, пропускание лизата через микроколонку, содержащую твердофазный сорбент, связывание нуклеиновых кислот с сорбентом в присутствии хаотропного агента в высокой концентрации с последующей отмывкой от белков и кристаллов соли и элюция нуклеиновых кислот с микроколонки в отдельную пробирку.
Недостаток этого сменного микрофлюидного модуля и способа выделения и очистки нуклеиновых кислот заключается в отсутствии описания способа изготовления мембраны для задерживания на ней клеток микроорганизмов и/или вирусных частиц и твердофазного сорбента для связывания нуклеиновых кислот. Другим недостатком этого сменного микрофлюидного модуля является отсутствие технических решений для перемещения растворов между резервуарами и для обеспечения анализа нуклеиновых кислот.
В патенте РФ №RU 2595374 С2 «Способ автоматизированного выделения с одновременной очисткой нуклеиновых кислот из нескольких биологических образцов» описан способ, характерный тем, что выделение и очистка НК осуществляется в одноразовых модулях, изолированных от внешней среды и содержащих резервуары со всеми реагентами, необходимыми для разрушения клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистки и элюции НК.
Модули располагаются на вращающейся платформе. Перемещение жидкостей внутри модулей может осуществляться либо под действием сил, возникающих при вращении платформы, либо при создании разницы давлений в соответствующих резервуарах модулей. Выделение и очистка НК внутри модулей включает следующие стадии:
а) лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием сухой реакционной смеси первого лизирующего буфера, содержащего лизоцим;
б) лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием сухой реакционной смеси второго лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, представляющий собой гуанидинтиоцианат или гуанидингидрохлорид в концентрации 3-6 моль / л, протеолитический фермент, представляющий собой протеиназу К или субтилизин, и детергент, представляющий собой Тритон Х-100 или N-лаурилсаркозил;
в) добавление спирта, представляющего собой этанол или изопропанол, к полученному лизату биологического образца;
г) связывание нуклеиновых кислот на твердофазном сорбенте, выбираемом из группы сорбентов, включающей силикагели, стекловолоконные фильтры, химически модифицированное стекло;
д) растворение сухой реакционной смеси промывочного буфера, содержащего хаотропный агент, представляющий собой гуанидинтиоцианат или гуанидингидрохлорид в концентрации 3-6 моль / л, смесью «этанол-вода»;
е) отмывка НК, связанных с твердофазным сорбентом, от примесей последовательным пропусканием раствора промывочного буфера и смеси «этанол-вода»;
ж) элюция НК с твердофазного сорбента пропусканием элюирующего раствора.
Перемешивание растворов в резервуарах модуля может осуществляться с использованием электромагнитных мешалок, с помощью перемешивающего устройства типа шейкера или любыми другими способами. Нагревание может осуществляться элементами Пельтье, лампами накаливания, потоками горячего воздуха или любыми другими способами.
Недостаток этого способа автоматизированного выделения с одновременной очисткой нуклеиновых кислот заключается в трудностях сопряжения одноразовых модулей, расположенных на вращающейся платформе, с внешним устройством анализа нуклеиновых кислот.
В патенте США №US 9931636 В2 «Apparatus and method for integrated sample preparation, reaction and detection)) (Прибор и метод для встроенной подготовки образца, реакции и обнаружения) описаны прибор и метод для пробоподготовки, проведения ПЦР и детектирования результатов. Эффективность лизиса увеличивается за счет нагрева. Движение жидкости внутри обеспечивается за счет передвижения поршней, причем каждый поршень обеспечивает выполнение определенного перемещения пробы или реактивов в соответствии с алгоритмом проведения пробоподготовки и ПЦР-РВ.
Недостатком изобретения является использование множества насосов для обеспечения движения и объемных соединений, что увеличивает сложность устройства и уменьшает его надежность. Другим недостатком изобретения является необходимость многократных промывок.
В патенте США №US 9731297 В2 «Assay cartridges and methods of using the same)) (Картриджи для проведения анализа и методы их использования) описан картридж для проведения операций лизиса, очистки и элюирования, обратной транскрипции, амплификации, связывания детектирующего реагента и обнаружения. Реакция ПЦР обеспечивается путем перемещения пробы между двумя температурными зонами.
Недостатки технических решений этого патента:
- анализируется образец только для обнаружения одной нуклеиновой кислоты;
- реакция ПЦР обеспечивается за счет перемещения подготовленной пробы между термическими зонами, что негативно сказывается на качестве проведения ПЦР, при этом необходимо выделение отдельной зоны для детектирования результатов реакции ПЦР;
- невозможность проведения ПЦР-РВ.
В устройстве по патенту Великобритании №GB 2531616 A instrument for performing a diagnostic test on a fluidic cartridge)) (Прибор для проведения диагностического теста на жидкостном картридже) реагенты для обнаружения нуклеиновых кислот включают зонды, имеющие ферроценовую метку. Эти зонды способны гибридизоваться с амплифицированными нуклеиновыми кислотами. После гибридизации зондов с амплифицированными нуклеиновыми кислотами зонды гидролизуются двухцепочечной специфической нуклеазой, которая приводит к освобождению метки от остальной части зонда. Освобождение метки от остальной части зонда вызывает заметное изменение электрического сигнала от метки.
Основным недостатком этого прибора является сложность, поскольку в приведенном примере используется 9 сильфонных клапанов, для их движения необходимы внешние управляемые порты для соединения с двумя насосами, сконфигурированными для подачи положительных и отрицательных давлений.
При этом возникают трудности при обеспечении герметичности в управляемых портах и исключении проблемы контаминации и попадания пробы во внешнюю среду при смене картриджа.
Решение проблемы контаминации затрудняется использованием складных блистеров (герметичных пузырей) для хранения реактивов, поскольку сложение блистеров при извлечении реактивов в жидкостные каналы выполняется проколом иглой или путем разрушения их внешним давлением.
Сложность этого прибора также определяется применением электрохимических детекторов: для обнаружения каждой из нуклеиновых кислот в исследуемом образце необходим отдельный электрохимический детектор (в приведенном примере имеется 2 детектора). Недостатком электрохимического детектора является его низкая избирательность по сравнению с флуоресцентным детектором. В частности в приборе отсутствует техническое решение для анализа РНК.
Ближайшим из известных по технической сущности и назначению является патент США №US 9943848 В2 «Apparatus and method for cell disruption)) (Устройство и способ разрушения клеток).
В изобретении предложено устройство и способ разрушения клеток. Устройство имеет картридж с камерой для удержания клеток или вирусов с гибкой стенкой. За счет влияния на эту стенку импульсов давления клетки исследуемой пробы в камере могут быть разрушены.
Устройство также включает в себя преобразователь, такой как ультразвуковой генератор, для создания импульсов динамического давления или волн давления в камере путем воздействия на внешнюю поверхность гибкой стенки и источник для увеличения давления в камере с целью обеспечения эффективного соединения между преобразователем и гибкой стенкой.
Картридж содержит камеру, имеющую отверстие для добавления жидкого образца. Поток образца направляется в канал с плоским дном, что обеспечивает легкое оптическое обнаружение присутствия жидкости в канале. Путь потока образца продолжается через фильтровальную камеру в камеру для лизиса, а далее - в вентилированную камеру для отходов.
Картридж также включает в себя промывочную камеру для удержания промывочного раствора и камеру для хранения реагента для лизиса. Камеры соединены между собой клапанами. Образцы компонентов образца (например, клетки или вирусы) захватываются в фильтре и лизируются для выделения из компонентов образца целевого аналита.
Перенос аналита для выполнения химической реакции и оптического обнаружения обеспечивается каналом, проходящим от камеры для лизиса в реакционный сосуд. Реакционный сосуд включает в себя отверстие для добавления реакционной смеси и отверстие для выхода жидкостей (например, воздуха или избыточной реакционной смеси) из сосуда.
Картридж также включает в себя 6 портов давления. Эти порты подключаются к камерам клапанами, которые с помощью соленоидов и исполнительных механизмов обеспечивают движение жидкости по соединительным каналам.
В формуле патента определена основная новизна изобретения: разрушение клеток или вирусов обеспечивается с помощью волн давления, для этого внешняя поверхность стенки камеры для хранения клеток или вирусов имеет механический контакт с преобразователем с частотой колебаний от 20 до 40 кГц.
Недостатком этого устройства является его сложность:
- для открытия и закрытия каждого из 9 клапанов используется исполнительный механизм с отдельным соленоидом;
- картридж включает в себя шесть внешних портов давления, при этом возникают трудности при обеспечении их герметичности и исключении проблемы контаминации в биологическом анализе при смене картриджа;
- в приведенном примере картридж содержит одну реакционную камеру, при увеличении количества реакционных камер сложность устройства дополнительно увеличивается.
Предлагаемое изобретение решает задачу расширения функциональных возможностей и упрощения конструкции.
Указанная задача решается за счет того, что автоматизированный прибор для выделения, очистки и анализа нуклеиновых кислот методом ПЦР-РВ, содержащий картридж, имеющий в своем составе соединенные между собой микрожидкостными каналами ячейки для реагентов, устройство для лизиса, клапаны, устройство выделения нуклеиновых кислот,
реакционные ячейки, насосы и ячейку для отходов, а также содержащий устройство управления и получения информации, имеющее в своем составе термостаты, устройства переключения клапанов, устройства управления насосами, детекторы, устройство для ввода пробы и персональный компьютер, отличается тем, что картридж имеет в своем составе соединенные между собой микрожидкостными каналами несколько модулей ячеек для реагентов, несколько модулей клапанов, несколько реакционных ячеек ДНК и РНК и каналы трех перистальтических насосов, а устройство управления и получения информации имеет в своем составе два термостата, два циклических термостата, механические устройства переключения клапанов, флуоресцентные детекторы и микропроцессорное устройство управления.
Клапаны картриджа могут быть выполнены в виде трех модулей, при этом модуль клапанов 1 имеет соединения с помощью микрожидкостных каналов с модулем для реагентов 1, устройством для лизиса, устройством выделения нуклеиновых кислот и реакционными ячейками для ДНК и РНК.
Модуль клапанов 2 может иметь соединения с помощью микрожидкостных каналов с модулем для реагентов 2 и реакционными ячейками для ДНК.
Модуль клапанов 3 может иметь соединения с помощью микрожидкостных каналов с модулем для реагентов 3 и реакционными ячейками для РНК.
Каналы перистальтического насоса 1 могут соединяться с устройством выделения нуклеиновых кислот и ячейкой для слива.
Каналы перистальтического насоса 2 могут соединяться с реакционными ячейками для ДНК, а каналы перистальтического насоса 3 соединены с реакционными ячейками для РНК.
Устройство для лизиса и устройство выделения нуклеиновых кислот могут быть выполнены в виде двух змеевиков, имеющих соответственно тепловой контакт с первым и вторым термостатом, которые имеют электрические соединения с микропроцессорным устройством управления.
Реакционные ячейки для ДНК и реакционные ячейки для РНК имеют соответственно тепловой контакт с первым и вторым циклическим термостатом, которые имеют электрические соединения с микропроцессорным устройством управления.
Устройства переключения клапанов имеют механические соединения с модулями клапанов и электрические соединения с микропроцессорным устройством управления.
Каждое устройство переключения клапанов выполнено в виде набора кулачков, положение которых регулируется с помощью шагового двигателя и микропроцессорного устройства управления.
Механические устройства управления насосами имеют механические соединения с насосами и электрические соединения с микропроцессорным устройством управления.
Детекторы имеют оптический контакт с реакционными ячейками для ДНК и реакционными ячейками для РНК и электрические соединения с микропроцессорным устройством управления.
Микропроцессорное устройство управления имеет электрические соединения с персональным компьютером.
Каналы трех перистальтических насосов расположены в одной горизонтальной плоскости.
Устройство выделения нуклеиновых кислот расположено в магнитном поле магнита.
В ячейках модуля РНК с помощью реактивов и циклического термостата выполняется режим обратной транскрипции.
Реакционные ячейки для ДНК и РНК выполняют функции положительного и отрицательного контроля.
Изобретение поясняется чертежами, на которых представлены:
на фиг. 1 - функциональная схема предлагаемого прибора;
на фиг. 2 - функциональная схема картриджа.
Предлагаемый прибор (фиг. 1) содержит картридж, устройство управления и получения информации, устройство для ввода образца и персональный компьютер.
Картридж имеет в своем составе соединенные между собой микрожидкостными каналами ячейки для реагентов, устройство для лизиса, клапаны, устройство выделения нуклеиновых кислот, реакционные ячейки, насосы и ячейку для отходов, а также несколько модулей ячеек для реагентов, несколько модулей клапанов, несколько реакционных ячеек ДНК и РНК и каналы трех перистальтических насосов.
Устройство управления и получения информации имеет в своем составе термостаты, устройства переключения клапанов, устройства управления насосами и детекторы, а также два термостата, два циклических термостата, механические устройства переключения клапанов, флуоресцентные детекторы и микропроцессорное устройство управления.
Предлагаемый прибор работает следующим образом.
Исследуемый образец с помощью устройства ввода пробы помещается в устройство для лизиса. Смесь анализируемого образца и лизирующего буфера проходит через устройство для лизиса, выполненного в виде змеевика, в котором с помощью термостата 1 происходит нагрев до 65°С в течение заданного времени.
Из модуля для реагентов 1 с помощью модуля клапанов 1 и насоса 1 обеспечивается перемещение осаждающего реагента с магнитными частицами в устройство выделения НК, выполненного в виде змеевика, где магнитные частицы оседают под действием постоянных магнитов.
После лизиса исследуемый образец с помощью модуля клапанов 1 и насоса 1 переносится в устройство выделения НК, где происходит выделение целевого продукта: нуклеиновые кислоты осаждаются на магнитных частицах. Остатки клеток и результаты нескольких промывок буфером с помощью насоса 1 удаляются в ячейку для отходов.
Далее с помощью термостата 2 в устройстве выделения НК происходит сушка сорбента нагретым воздухом при температуре 65°С в течение заданного времени.
Осажденные на магнитных частицах нуклеиновые кислоты и насоса 1 переносятся в раствор элюирующего буфера. Для этого насос 1 создает разряжение и элюирующий буфер из ячейки модуля для реагентов 1 через модуль клапанов 1 прокачивается через устройство выделения НК, где происходит извлечение искомого продукта в элюирующий буфер.
Разбавительный буфер из ячеек модуля с реагентами 2 и 3 поступает в реакционные ячейки ДНК и РНК с лиофилизированными реагентами, где происходит растворение этих реагентов.
Под воздействием насосов элюирующий буфер с нуклеиновыми кислотами поступает в реакционные ячейки ДНК и РНК.
Включаются циклический термостат 1 и детектор 1.
Реакционные ячейки РНК с помощью модуля клапанов 3 и насоса 3 заполняются реагентами для обратной транскрипции из модуля для реагентов 3. Включается циклический термостат 2 для выполнения режима для обратной транскрипции. После завершения режима обратной транскрипции циклический термостат 2 включается в режиме ПЦР, и включается детектор 2.
С помощью микропроцессорного устройства сигналы ПЦР детекторов 1 и 2 передаются в реальном времени в персональный компьютер для обнаружения сигналов ПЦР, соответствующих содержанию НК в исследуемом образце.
Предложенные технические решения устройства позволяет упростить конструкцию устройства и расширить его функциональные возможности.