Способ определения мельдония в моче человека
METHOD FOR MELDONIUM DETERMINATION IN HUMAN URINE

Изобретение относится к способу определения мельдония в биологической жидкости (моче), который может найти применение в клинической диагностике и допинговом контроле.
2
Известен способ определения мельдония в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (Lv, Y.-F. Determination of mildronate in human plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry / Y.-F. Lv, X. Hu, K.-S. Bi // J. Chromatogr. B. 2007. V. 852. P. 35-39). В качестве аппаратурного оформления использовали систему высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, состоящую из тройного квадрупольного масс-спектрометра API 3000 (Applied Biosystem, США) с нагреваемым источником электрораспылительной ионизации и жидкостного хроматографа HP 1100 (Agilent Technologies, США), состоящего из дегазатора, бинарного градиентного насоса, автоматического дозатора проб и термостата. Для хроматографического разделения использовали колонку Intersil NH (250 мм × 4.6 мм, 5 мкм). B качестве подвижной фазы использовали двухкомпонентную систему - метанол : вода. В качестве внутреннего стандарта использовали левокарнитин.
Подготовку проб осуществляли путем добавления к аликвоте мочи 10 мкл раствора внутреннего стандарта и последующим центрифугированием. Супернатант вводили в систему ВЭЖХ. Анализ вели при скорости потока подвижной фазы 0.5 мл/мин.
К недостаткам предложенного способа относятся использование левокарнитина в качестве внутреннего стандарта, поскольку данное соединение является эндогенным, в результате чего получаемый результат будет невоспроизводимым.
Известен также способ определения мельдония в плазме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (Cai, L.-J. Determination of Mildronate in Human Plasma and Urine by UPLC-Positive Ion Electrospray Tandem Mass Spectrometry / L.-J. Cai, J. Zhang, W.-X. Peng, R.-H. Zhu, J. Yang, G. Cheng, X.-M. Wang // Chromatogr. 2011. V. 73. P. 659-665). В качестве аппаратурного оформления использовали систему ультра высокоэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, состоящую из тройного квадрупольного масс-спектрометра Micro mass Quattro micro TM API (Waters, США) с нагреваемым источником электрораспылительной ионизации и жидкостного хроматографа Acquity UPLC (Waters, США), состоящего из дегазатора, бинарного градиентного насоса, автоматического дозатора проб и термостата. Для хроматографического разделения использовали колонку ACQUTY UPLC ВЕН HILIC (50 мм × 2.1 мм, 1.7 мкм). В качестве подвижной фазы использовали двухкомпонентную систему - 0.08% раствор муравьиной кислоты в 30 мМ ацетате аммония : ацетонитрил. В качестве внутреннего стандарта использовали карбахол.
Образцы исследуемой плазмы, объемом 300 мкл вносили в пробирку эппендорф, объемом 1.5 мл, добавляли 750 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, перемешивали, после чего центрифугировали при 120000 об/мин в течение 5 минут.50 мкл супернатанта переносили в стеклянные виалы, разбавляли 950 мкл ацетонитрила и вводили в систему УВЭЖХ. Анализ вели при скорости потока подвижной фазы 0.25 мл/мин.
Недостатком указанного способа является ограниченность его применения из-за использования плазмы в качестве объекта анализа, поскольку отбор крови для получения плазмы представляет собой инвазивную процедуру, сопряженную со стрессом и требующую привлечения квалифицированного медицинского персонала, в то время как отбор мочи является неинвазивной процедурой.
Известен также способ определения мельдония в плазме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (Peng, Y. Determination of mildronate by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in healthy Chinese volunteers / Y. Peng, J. Yang, Z. Wang, J. Wang, Y. Liu, Z. Luo, A. Wen // J. Chromatogr. B. 2010. V. 878. P. 551-556). В качестве аппаратурного оформления использовали систему высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, состоящую из тройного квадрупольного масс-спектрометра Agilent 6410 (Agilent Technologies, США) с нагреваемым источником электрораспылительной ионизации и жидкостного хроматографа Agilent 1200 (Agilent Technologies, США), состоящего из дегазатора, бинарного градиентного насоса, автоматического дозатора проб и термостата. Для хроматографического разделения использовали колонку Shim-pack VP-ODS C18(150 мм × 4.6 мм, 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовали двухкомпонентную систему - метанол: 10 мМ ацетат аммония. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетаминофен.
Подготовку проб осуществляли следующим образом: к аликвоте плазмы добавляли 50 мкл раствора внутреннего стандарта и 750 мкл метанола, после чего центрифугировали 10000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант вводили в систему ВЭЖХ. Анализ вели при скорости потока подвижной фазы 0,4 мл/мин.
Недостатком указанного способа является использование обращенно-фазового варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии, при котором мельдоний, являясь сильнополярным соединением, практически не удерживается на колонке и элюируется в мертвом времени, что не позволяет говорить о точном и надежном анализе ввиду большого количества мешающих влияний.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ определения мельдония в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (, C. Mildronate (Meldonium) in professional sports - monitoring doping control urine samples using hydrophilic interaction liquid chromatography - high resolution / high accuracy mass spectrometry/ C. , S. Guddat, J. Dib, H. Geyer, W. , M. Thevis // DrugTest. Anal. 2015. DOI 10.1002/dta.1788). В качестве аппаратурного оформления использовали систему ультра высокоэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, состоящую из тройного квадрупольного масс-спектрометра в сочетании с орбитальной ловушкой Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, Германия) с нагреваемым источником электрораспылительной ионизации и жидкостного хроматографа, состоящего из бинарного градиентного насоса Accela 1250 (Thermo Fisher Scientific, Германия), автоматического дозатора проб и термостата Thermo PAL (Thermo Fisher Scientific, Германия). Для хроматографического разделения использовали колонку Nucleodur HILIC (100 мм × 2.0 мм, 1.8 мкм). В качестве подвижной фазы использовали трехкомпонентную систему - вода : ацетонитрил : 200 мМ ацетат аммония. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерированный мельдоний.
К образцам исследуемой мочи объемом 270 мкл добавляли 30 мкл раствора внутреннего стандарта, 700 мкл ацетонитрила и 100 мкл 100 мМ ацетата аммония. Подготовленные таким образом пробы мочи перемешивали. Супернатант вводили в систему УВЭЖХ. Анализ вели при скорости потока подвижной фазы 0,25 мл/мин.
Ионизацию при атмосферном давлении осуществляли электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре 4000 В; температура капилляра 350°C; температура в камере ионизации 300°C.
Недостатками указанного способа является необходимость получения дейтерированного внутреннего стандарта и применение тандемного масс-спектрометра высокого разрешения, что приводит к существенному росту материалоемкости методики, высоким требованиям к квалификации оператора, а также лаборатории, в которой установлен прибор (ввиду его конструктивных особенностей).
Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение способа, сокращение времени анализа от момента получения пробы и до выдачи конечного результата, снижение трудоемкости и материалоемкости, а также повышение точности и надежности определения мельдония в моче.
Заявляемый технический результат достигается тем, что в способе определения мельдония в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием используют систему ультра высокоэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, состоящую из тройного квадрупольного масс-спектрометра с нагреваемым источником электрораспылительной ионизации и жидкостного хроматографа, включающего бинарный градиентный насос, автоматический дозатор проб и термостат. Для хроматографического разделения используют аналитическую колонку, позволяющую работать с соединениями, обладающими высокой полярностью и имеющими небольшую молекулярную массу. В качестве подвижной фазы используют двухкомпонентную систему, а именно ацетонитрил: 10 мМ ацетат аммония, скорость потока подвижной фазы поддерживают постоянной равной 0.3 мл/мин. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме мониторинга множественных реакций относительно внутреннего стандарта, в качестве которого выбран габапентин. Пробоподготовку осуществляют, добавляя к образцам исследуемой мочи ацетонитрил, содержащий внутренний стандарт, перемешивают, после чего центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Ионизацию осуществляют при атмосферном давлении, при напряжении на капилляре 3000 В; температуре капилляра 320°C электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов.
Подготовленные таким образом образцы мочи могут быть использованы при прямом способе введения пробы в систему масс-спектрометрического детектирование без предварительного хроматографического разделения, что обеспечивает возможность экспересс-анализа образцов мочи на предмет наличия либо отсутствия мельдония.
Отличительными признаками заявляемого способа от наиболее близкого аналога, взятого за прототип, являются:
- использование габапентина в качестве внутреннего стандарта;
- использование в качестве подвижной фазы двухкомпонентной системы, что представляет собой менее трудоемкую процедуру.
На рисунке 1 показано изучение параметров удерживания аналитов на колонке Phenomenex Kinetex HILIC (100 мм × 2.1 мм, 2.6 мкм) при следующих условиях: 1a) - скорость потока подвижной фазы 0.6 мл/мин, температура термостата 45°C, состав подвижной фазы - ацетонгитрил: 0.1% муравьиная кислота; 1б) - скорость потока подвижной фазы 0.4 мл/мин, температура термостата 45°C, состав подвижной фазы - ацетонгитрил: 0.1% муравьиная кислота; 1в) - скорость потока подвижной фазы 0.3 мл/мин, температура термостата 30°C, состав подвижной фазы - ацетонгитрил: 10 мМ ацетат аммония. На рисунке 2 представлены хроматограммы результатов анализа проб мочи, полученных от добровольцев после приема мельдония в дозе 500 мг, через: 12 часов - 2а), - 24 часа - 2б).
Изобретение может быть осуществлено следующим образом.
Готовят стандартные растворы мельдония (1 мг/мл) и габапентина (1 мг/мл) путем растворения точной навески вещества в смеси вода : ацетонитрил (20:80, по объему), из которых затем готовят рабочие растворы путем последовательного разбавлением ацетонитрилом.
Проводят оптимизацию масс-спектрометрического детектирования путем напуска определяемых веществ в камеру источника с использованием шприцевого ввода, что возможно только для источников с атмосферным типом ионизации, проводят оптимизацию по следующим параметрам: энергия соударений, давление газа-мишени в ячейке соударений, напряжение на экстрагирующей линзе.
При определении наилучших условий осуществления действий, позволяющих получить технический результат, варьировали следующие параметры: скорость потока подвижной фазы от 0.2-0.6 мл/мин; температура термостата от 30°C до 45°C; изучение различных систем в качестве компонентов подвижной фазы (рис. 1).
Экспериментальным путем было установлено, что при работе на высокой скорости потока подвижной фазы, равной 0,6 мл/мин, происходит коэлюирование внутреннего стандарта и мельдония (рис. 1а)). Уменьшение скорости потока позволило разделить пики. При скорости потока подвижной фазы 0.4 мл/мин, температуре термостата - 45°C результаты были менее воспроизводимы, а форма пиков - неудовлетворительной (рис. 1б)). Установлено, что оптимальное значение скорости потока подвижной фазы равно 0,3 мл/мин (рис. 1в)), оптимальная температура - 30°C (рис. 1в)). Варьирование соотношения компонентов подвижной фазы осуществляли исходя из полярности анализируемых веществ.
Стоит отметить, что ввиду малой молекулярной массы мельдония он имеет только один характеристичный переход, что существенно осложняет обеспечение надежности его определения и требует тщательного подбора условий разделения (табл.).
После оптимизации условий разделения и детектирования мельдония проводят подготовку проб.
Образцы исследуемой мочи разбавляют ацетонитрилом, содержащим внутренний стандарт, перемешивают и центрифугируют. Супернатант переносят в стеклянные виалы и анализируют в описанных выше условиях. Предел обнаружения мельдония составляет 7.5 нг/мл.
Пример конкретного выполнения
Образцы исследуемой мочи, объемом 200 мкл вносят в пробирку эппендорф объемом 2 мл, добавляют 1800 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт (габапентин концентрацией 50 нг/мл), перемешивают, после чего центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносят в стеклянные виалы.
Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.3 мл/мин. Для разделения применяют градиентное элюирование при следующих условиях: 0 мин 5% В; 8 мин 65% В; 14 мин 65% В, 16 мин 5% В, общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 16,1 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре 3000 В; температура капилляра 320°C; давление газа-распылителя (азот) - 60 усл.ед.; давление вспомогательного газа (азот) - 10 усл.ед.; давление газа-мишени в ячейке соударений (аргон) - 1,5 мТорр; температура в камере ионизации 350°C. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме мониторинга множественных реакций. Далее проводят обработку полученных данных с применением программного обеспечения Xcalibur версии 2.2 (Thermo Scientific, США).
В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы: центрифуга (Eppendorf, Германия), одноканальные механические дозаторы с объемом дозирования 100 мкл, 250 мкл (Biohit, Финляндия), одноканальный механический дозатор с варьируемым объемом дозирования 100-1000 мкл (Eppendorf, Германия).
Предлагаемый способ позволяет определять мельдоний в моче через 12 часов (рис. 2а)) и 24 часа (рис. 2б)) после приема мельдония в дозе 500 мг.
Заявляемый способ обеспечивает возможность определения следовых количеств мельдония в моче после его употребления. Кроме того, заявленный способ является более дешевым, экспрессным и менее трудоемким по сравнению с прототипом. Следует отметить, что образцы мочи, подготовленные по предлагаемому способу, могут быть использованы для экспересс-анализа на предмет наличия либо отсутствия мельдония путем введения пробы в систему масс-спектрометрического детектирования без предварительного хроматографического разделения. Предел обнаружения составляет 20 нг/мл.
Предлагаемый способ является новым, обладает изобретательским уровнем и может широко применяться в клинической диагностике и допинговом контроле.