СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR PRODUCING VACCINE AGAINST PORCINE CIRCOVIRUS (OPTIONS)

Изобретение относится к области ветеринарии, ветеринарной биотехнологии и касается применения штамма цирковируса свиней 2 типа для производства профилактических препаратов, используемый в научно-исследовательских институтах и предприятиях биологической промышленности при конструировании биопрепаратов, в частности вакцин против цирковируса свиней 2 типа.
Известен способ получения вакцины против цирковируса свиней, включающий получение вируссодержащего материала из штамма вируса и смешиванием его с адъювантом [Патент РФ №2493254, Способы и композиции для иммунизации свиней против свиного цирковируса, МПК C12N15/34; C12N7/00; А61К39/12; C12Q 1/68; опубликовано: 27.01.2012, Бюл. №3].
Недостатком данной вакцины является ее недостаточный срок хранения с сохранением качества целевого продукта.
Техническим решением предлагаемого изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения его иммуногенности против цирковируса свиней 2 типа.
Предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом с достижением единого технического результата.
50
Поставленная задача решается в способе получения вакцины против цирковируса свиней, включающем получение вируссодержащего материала из штамма вируса и смешиванием его с адъювантом тем, что в качестве вируссодержащего материала вакцина содержит вируссодержащий материал из штамма «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД/см3, который перед смешиванием с адъювантом инактивируют добавлением 4-5% раствора аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001-0,005% при рН 7,6-7,8 и температуре 35-39°С в течение 20-22 часов с периодическим перемешиванием, а в качестве адъюванта используют масляный адъювант, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Инактивированный вируссодержащий материал из штамма
цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
50,00-60,0
Масляный адъювант
остальное.
50
Поставленная задача решается также в способе получения вакцины против цирковируса свиней, включающем получение вируссодержащего материала из штамма вируса и смешиванием его с адъювантом с тем, что в качестве вируссодержащего материала вакцина содержит вируссодержащий материал из штамма «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД/см3, который перед смешиванием с адъювантом инактивируют добавлением 4-5% раствора аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001-0,005% при рН 7,6-7,8 и температуре 35-39°С в течение 20-22 часов с периодическим перемешиванием, а в качестве адъюванта используют масляный адъювант, дополнительно содержит стабилизатор хитозан, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Хитозан
5,0-10,0
Смесь инактивированного вируссодержащего материала из
штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup> и масляного адъюванта,
взятых в соотношении 1:1-1,5, соответственно
остальное.
Поставленная задача решается также в способе получения вакцины против цирковируса свиней по п. 1 и 2, тем, что в качестве адъюванта используют масляный адъювант ISA 201 VG, или ISA 206 VG, или масляный адъювант ВНИИЗЖ.
Известен штамм «PCV2/SHBC» цирковируса свиней, семейства Circoviridae, депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» под №2845, для производства профилактических и диагностических препаратов (см. приложение - удостоверение). Вирус выделен из суспензии клеток селезенки свиньи в 2015 году в частном хозяйстве Владимирской области. Штамм является новым, ранее неизвестным, выделен в Российской Федерации.
Известен аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) [Патент РФ №2214276, Инактивированная эмульсионная вакцина против парвовирусной инфекции свиней, МПК А61К39/23, C12N7/00, опубликовано: 20.10.2003 Бюл. №29].
Известен масляный адъювант ВНИИЗЖ (Патент РФ №2236253, Вакцина эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, МПК А61К39/23, C12N7/00, опубликовано: 20.09.2004, Бюл. №26).
Известен также масляный адъювант ISA 201 VG и ISA 206 VG («The comparison of the efficacy of swine FMD vaccine emulsified with oil adjuvant of ISA 201 VG or ISA 206 VG", Journal of Biosciences and Medicines 01(03):22-25-January 2013 with 203 Rea).
В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию изобретения «новизна».
Заявленная композиция решает актуальную проблему ветеринарии - профилактики цирковируса свиней, т.е. предложение «промышленно применимо».
В отечественной литературе не известно, что использование штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» для получения вакцины против цирковируса свиней. Нами впервые показано, что сочетанное использование вышеуказанных отличительных признаков, взятых в определенных соотношениях компонентов, увеличивает сроки хранения целевого продукта с сохранением его иммуногенности против цирковируса свиней, что приводит к достижению технического результата. Следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется на следующих примерах:
Пример 1. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации в полученную композицию добавляют 4% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001% при рН 7,6 и температуре 35°С в течение 20 часов с периодическим перемешиванием.
50
К 50 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0 lg ТЦИД/см3 добавляют 50 кг масляного адъюванта ISA 206 VG, получая состав 1 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Инактивированный вируссодержащий материал из штамма
цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
50,00
Масляный адъювант
остальное
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 2. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 5% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,005% при рН 7,8 и температуре 39°С в течение 22 часов с периодическим перемешиванием
50
3
К 60 кг полученного инактивированного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД/см добавляют 40 кг масляного адъюванта ISA 206 VG, получая состав 2 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Инактивированный вируссодержащий материал из штамма
цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью
4,0-7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
60,0
Масляный адъювант
остальное
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 3. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 4% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001% при рН 7,6 и температуре 35°C в течение 20 часов с периодическим перемешиванием.
50
3
К 50 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0 lg ТЦИД/см добавляют 50 кг масляного адъюванта ISA 201 VG, получая состав 3 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Инактивированный вируссодержащий материал из штамма
цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
50,00
Масляный адъювант
остальное
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 4. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N5/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 5% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,005% при рН 7,8 и температуре 39°С в течение 22 часов с периодическим перемешиванием.
50
3
К 60 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД/см добавляют 40 кг масляного адъюванта ISA 201 VG, получая состав 4 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Инактивированный вируссодержащий материал из штамма
цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
60,0
Масляный адъювант
остальное
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 5. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201966, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N5/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 4% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001% при рН 7,6 и температуре 35°С в течение 20 часов с периодическим перемешиванием.
50
3
К 50 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0 lg ТЦИД/см добавляют 50 кг масляного адъюванта ВНИИЗЖ, получая состав 5 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Инактивированный вируссодержащий материал из штамма
цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
50,00
Масляный адъювант
остальное
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 6. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 5% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,005% при рН 7,8 и температуре 39°С в течение 22 часов с периодическим перемешиванием.
50
3
К 60 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД/см добавляют 40 кг масляного адъюванта ВНИИЗЖ, получая состав 6 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Инактивированный вируссодержащий материал из штамма
цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0-7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
60,0
Масляный адъювант
остальное
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 7. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 4% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001% при рН 7,6 и температуре 35°С в течение 20 часов с периодическим перемешиванием
50
3
К 90 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0 lg ТЦИД/см и масляного адъюванта ISA 206 VG, взятых в соотношении 1:1, соответственно, добавляют 5,0 кг хитозана, получая состав 7 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Хитозан
5,0
Смесь инактивированного вируссодержащего материала из
штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup> и масляного адъюванта,
взятых в соотношении 1:1, соответственно
остальное,
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 8. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 5% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,005% при рН 7,8 и температуре 39°С в течение 22 часов с периодическим перемешиванием
50
3
К 90-95 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦИД/см и масляного адъюванта ISA 206 VG, взятых в соотношении 1,5, соответственно, добавляют 10,0 кг хитозана, получая состав 8 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Хитозан
10,0
Смесь инактивированного вируссодержащего материала из
штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup> и масляного адъюванта,
взятых в соотношении 1,5, соответственно
остальное,
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
50
3
Пример 9. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 4% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001% при рН 7,6 и температуре 35°С в течение 20 часов с периодическим перемешиванием К 90 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0 lg ТЦИД/см и масляного адъюванта ISA 201 VG, взятых в соотношении 1:1, соответственно, добавляют 5,0 кг хитозана, получая состав 9 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Хитозан
5,0
Смесь инактивированного вируссодержащего материала из
штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup> и масляного адъюванта,
взятых в соотношении 1:1, соответственно
остальное,
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 10. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 5% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,005% при рН 7,8 и температуре 39°С в течение 22 часов с периодическим перемешиванием
50
3
К 90-95 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦИД/см и масляного адъюванта ISA 201 VG, взятых в соотношении 1,5, соответственно, добавляют 10,0 кг хитозана, получая состав 10 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Хитозан
10,0
Смесь инактивированного вируссодержащего материала из
штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup> и масляного адъюванта,
взятых в соотношении 1,5, соответственно
остальное,
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 11. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 4% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,001% при рН 7,6 и температуре 35°С в течение 20 часов с периодическим перемешиванием
50
К 90 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 4,0 lg ТЦИД/см3 и масляного адъюванта ВНИИЗЖ, взятых в соотношении 1:1, соответственно, добавляют 5,0 кг хитозана, получая состав 11 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Хитозан
5,0
Смесь инактивированного вируссодержащего материала из
штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 4,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup> и масляного адъюванта,
взятых в соотношении 1:1, соответственно
остальное,
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
Пример 12. Вируссодержащий материал готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 [Патент РФ №2201960, Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa рк-15/a11, используемый для вирусологических исследований, МПК C12N5/06, C12N7/00, опубликовано: 10.04.2003 Бюл. №10] известным способом. Для инактивации к вируссодержащему материалу добавляют 5% раствор аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации 0,005% при рН 7,8 и температуре 39°С в течение 22 часов с периодическим перемешиванием.
50
3
К 90-95 кг полученного вируссодержащего материала штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной активностью 7,0 lg ТЦИД/см и масляного адъюванта ВНИИЗЖ, взятых в соотношении 1,5, соответственно, добавляют 10,0 кг хитозана, получая состав 12 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Хитозан
10,0
Смесь инактивированного вируссодержащего материала из
штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» с инфекционной
активностью 7,0 lg ТЦИД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup> и масляного адъюванта,
взятых в соотношении 1,5, соответственно
остальное,
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.
3
Пример 13. Иммуногенную активность полученной вакцины определяли на подсвинках живой массой 20-25 кг 6-8 недельного возраста, свободных от антител к вирусу PCV2. Вакцину вводили по 2,0 см внутримышечно в области шеи. Были сформированы 14 групп животных по 10 голов: из них опытных (с первого по двенадцатый номер) - 12 групп, которым вводили вакцины 1-12, полученные по примерам 1-12) и две группы контрольные (контрольная группа 1 - невакцинированные животные, контрольная группа 2 - вакцинированные вакциной-прототипом). У животных до вакцинации и через 21 день после вакцинации были отобраны пробы крови и исследованы в ИФА набора «ИФА тест-набор для определения антител к Цирковирусу свиней PCV2» («Semi-quantitative ELISA for detection of all antibodies induced by the different Porcine Circovirus type 2 strains») производства «BioChek» (Нидерланды) на наличие специфических антител. Их оценка проводилась по значению величины s/p против цирковируса свиней (см. данные таблицы 1).
Таким образом, полученная вакцина инактивированная эмульсионная из штамма цирковируса свиней «PCV2/SHBC» является стерильным, безвредным препаратом и обладает высокой иммуногенной активностью. Однократное введение вакцины обеспечивает высокий уровень антител в сыворотке крови у привитых животных (уровень антител в группах опытных животных в 2,3-3,35 раза выше, чем в группе животных, которым вводили известную вакцину). Процент заражения после применения предлагаемой вакцины снижается на 36%.