СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ФАКТОРА ФОН ВИЛЛЕБРАНДА

1. Способ продуцирования гликопротеина, содержащего N-гликаны с увеличенным сиалилированием, при этом способ включает (i) обеспечение клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий усеченный фактор фон Виллебранда (VWF), и (ii) культивирование указанных клеток при температуре меньшей, чем 36,0°C.
2. Способ продуцирования димера гликопротеина, содержащего усеченный фактор фон Виллебранда (VWF), или увеличения димеризации указанного гликопротеина, при этом способ включает (i) обеспечение клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность гликопротеина, и (ii) культивирование указанных клеток при температуре меньшей, чем 36,0°C.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клетки дополнительно содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую сиалилтрансферазу, предпочтительно α-2,6-сиалилтрансферазу или α-2,3-сиалилтрансферазу.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором перед стадией (ii) клетки культивируют при температуре 37,0±1,0°C, и стадия (ii) включает культивирование клеток при температуре 34,0±2,0°C.
5. Способ продуцирования гликопротеина, содержащего N-гликаны с увеличенным сиалилированием, который включает (i) обеспечение клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий усеченный фактор фон Виллебранда (VWF), и рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую α-2,6-сиалилтрансферазу, и (ii) культивирование клеток в условиях, которые обеспечивают экспрессию гликопротеина и α-2,6-сиалилтрансферазы.
in vitro
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий (i) подвергание гликопротеина, полученного в любом одном из предшествующих пунктов, ионообменной хроматографии, посредством которой гликопротеин с высокой степенью сиалилирования отделяют от гликопротеина с низкой степенью сиалилирования; и сбор фракций, элюируемых из ионообменной колонки, имеющих высокую степень сиалилирования; или (ii) контактирование гликопротеина, полученного в любом одном из предшествующих пунктов, с сиалилтрансферазой и донорной сиаловой кислотой .
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где, в среднем, по меньшей мере 75% N-гликанов полученного гликопротеина содержат по меньшей мере один фрагмент сиаловой кислоты.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где, в среднем, по меньшей мере 50% полученного гликопротеина присутствуют в виде димера.
9. Гликопротеин, получаемый способом по любому из предшествующих пунктов
10. Гликопротеин, содержащий усеченный фактор фон Виллебранда (VWF), в котором указанный усеченный VWF обладает способностью к связыванию с Фактором VIII (FVIII), и где указанный гликопротеин содержит N-гликаны
i) где по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85% указанных N-гликанов содержат, в среднем, по меньшей мере один фрагмент сиаловой кислоты и/или
ii) где менее чем 35% указанных N-гликанов содержат, в среднем, два или более концевых и несиалилированных остатков галактозы и/или
iii) где менее чем 6% указанных N-гликанов содержат, в среднем, три или более концевых и несиалилированных остатков галактозы.
11. Гликопротеин по п. 10, в котором по меньшей мере 70% указанных N-гликанов содержат, в среднем, по меньшей мере один фрагмент α-2,6-сиаловой кислоты или по меньшей мере один фрагмент α-2,3-сиаловой кислоты.
12. Гликопротеин по любому из пп. 9-11, в котором усеченный VWF содержит (a) аминокислоты от 776 до 805 из SEQ ID NO:9 или (b) аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере с 90% аминокислот от 776 до 805 из SEQ ID NO:9.
13. Гликопротеин по любому из пп. 9-12, в котором усеченный VWF содержит (a) аминокислоты от 764 до 1242 из SEQ ID NO:9, (b) аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере с 90% аминокислот от 764 до 1242 из SEQ ID NO:9, или (c) фрагмент (a) или (b).
14. Гликопротеин по любому из пп. 9-13, дополнительно содержащий продлевающий время полужизни гетерологичный полипептид, гибридизированный с VWF, и/или продлевающий время полужизни фрагмент, конъюгированный с гликопротеином.
15. Гликопротеин по любому из пунктов 9-14, в котором гликопротеин является димером.
16. Димерный гликопротеин по п. 15, в котором аффинность указанного димерного гликопротеина к FVIII является более высокой, чем аффинность мономерного гликопротеина к указанному FVIII, в котором указанный мономерный гликопротеин имеет такую же аминокислотную последовательность как димерный гликопротеин.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая гликопротеин по любому из пп. 9-16 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
18. Фармацевтическая композиция по п. 17, в которой по меньшей мере 50% гликопротеинов в композиции присутствуют в виде димеров.
19. Гликопротеин по любому из пп. 9-16 для применения при лечении расстройства свертывания крови, указанное лечение включает введение субъекту эффективного количества указанного гликопротеина и эффективного количества FVIII, где гликопротеин вводят внутривенно или подкожно, и FVIII вводят внутривенно или подкожно.
20. Гликопротеин для применения по п. 19, где среднее время удержания (MRT) FVIII увеличивается и/или выведение FVIII уменьшается посредством совместного введения гликопротеина, в сравнении с лечением с использованием одного FVIII; и/или, где частота введения FVIII снижается в сравнении с лечением с использованием одного FVIII.
21. Фармацевтический набор, содержащий (i) FVIII и (ii) гликопротеин по любому из пп. 9-16, для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении расстройства свертывания крови.