Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов CCND1 и PPARGC1A
MINIMALLY INVASIVE METHOD FOR DIAGNOSING METASTATIC LESIONS OF REGIONAL LYMPH NODES IN PATIENTS WITH CERVICAL CANCER BASED ON THE COPY NUMBER OF THE CCND1 AND PPARGC1A GENES

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для малоинвазивной диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки.
Рак шейки матки является наиболее частой злокачественной опухолью женской репродуктивной системы (см. Кечерюкова М.М., Снежко А.В., Вереникина Е.В., Меньшенина А.П., Адамян М.Л., Арджа А.Ю., Кечерюкова Т.М. Комплексная молекулярная характеристика рака шейки матки: маркеры метастазирования. Современные проблемы науки и образования. 2020; 2: URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29769). Примерно 50% больных РШМ являются кандидатами на хирургическое лечение в объеме радикальной гистерэктомии III типа. В результате подобных операций образуется обширная раневая поверхность и в забрюшинных пространствах малого таза в значительных количествах скапливается раневой экссудат, что может приводить к осложнениям, угрожающим жизни больных (см. Дигай Л.К., Шаназаров Н.А., Васьковская О.В., Асабаева Р.И. Клинико-экономический анализ диагностики и лечения больных раком шейки матки. Медицинская наука и образование Урала. 2012; 4 (72): 15-17.; Kenter G.G., Heintz A.P. Surgical treatment of low stage cervical carcinoma: back to the old days? Int J Gynecol Cancer. 2002;12(5):429-34). В настоящее время все неинвазивные диагностические методы не дают 100% точности в оценке распространенности опухоли. Основной проблемой является диагностика микро-метастазов в лимфоузлах размерами до 10 мм (см. Трухачёва Н.Г., Фролова И.Г., Коломиец Л.А., Усова А.В., Григорьев Е.Г., Величко С.А., Чернышова А.Л., Чуруксаева О.Н. Оценка степени распространенности рака шейки матки при использовании МРТ. Сибирский онкологический журнал. 2015;1(2):64-70).
Для эффективной и одновременно малоинвазивной ранней диагностики регионарных метастазов большим потенциалом обладает определение молекулярных маркеров во внеклеточной ДНК плазмы крови. К внеклеточной ДНК (внДНК) относится ядерная и митохондриальная ДНК из соматических и опухолевых клеток, подвергшихся апоптозу или некрозу; ДНК из клеток крови, вирусная и бактериальная ДНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Чубарян А.В., Туркин И.Н., Водолажский Д.И., Николаева Н.В., Лысенко И.Б. Изменение относительной копийности генетических локусов во внеклеточной ДНК у пациентов с аденокарциномой легкого. Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2017. № 3-2 (195-2). С. 74-82).
CCND1 и PPARGC1A
Анализ баз данных TCGA и многоэтапный лабораторный скрининг позволил выделить гены (), показатель копийности которых можно использовать для малоинвазивной диагностики регионарных метастазов
Показатель копийности генов (Copy Number Variation (CNV)) - генетический полиморфизм, приводящий к изменению числа копий определенного гена, и, следовательно, уровня продукта этого гена - белка или не кодирующей РНК (см. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Карнаухов Н.С., Кит О.И. Изменение копийности генов в опухолевых клетках и внеклеточной ДНК у больных аденокарциномой лёгкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. 167(6). С. 731-738). Показатель CNV может выступать в качестве высокоспецифичного биологического маркера, позволяющего осуществлять как раннюю диагностику, так и молекулярное типирование опухолей (см. Колесников Е.Н., Максимов А.Ю., Кит О.И., Кутилин Д.С. Зависимость общей и без рецидивной выживаемости больных от молекулярно-генетического подтипа плоскоклеточного рака пищевода. Вопросы онкологии. 2019. 65(5). С. 691-700).
PPARGC1A
Ген  (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) является основным регулятором глюконеогенеза в печени, вызывающим повышенную экспрессию генов, участвующих в энергетическом метаболизме (см. Klein M.A., Denu J.M. Biological and catalytic functions of sirtuin 6 as targets for small-molecule modulators. Journal of Biological Chemistry. 2020; 295 (32):11021-11041). Это ген также является главным регулятором в митохондриального биогенеза. Кодируемый им белок влияет на поляризацию макрофагов посредством STAT6/PPAR и ингибирование образования провоспалительных цитокинов (см. Zago G., Saavedra P.H.V., Keshari K.R., Perry J.S.A. Immunometabolism of Tissue-Resident Macrophages - An Appraisal of the Current Knowledge and Cutting-Edge Methods and Technologies. Front Immunol. 2021; 12: 665782).
CCND1
Ген кодирует белок циклин D1. Циклины действуют как регуляторы циклин-зависимых киназ (CDK). Данный циклин образует комплекс и функционирует как регуляторная субъединица CDK4 или CDK6, активность которой необходима для межфазового перехода G1/S клеточного цикла. Мутации, амплификация и сверхэкспрессия этого гена часто наблюдаются в различных опухолях и могут способствовать онкогенезу (см. Musgrove E.A., Caldon C.E., Barraclough J., Stone A., Sutherland R.L.Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nature Reviews. Cancer. 2011, 11 (8): 558-72) Сверхэкспрессия циклина D1 коррелирует с более короткой выживаемостью больных раком и увеличением метастазов (см. Jares P., Colomer D., Campo E. Genetic and molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma: perspectives for new targeted therapeutics. Nature Reviews. Cancer. 2007, 7 (10): 750-62).
CCND1 и PPARGC1A
Поэтому, в качестве маркеров для малоинвазивной диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки допустимо использование показателя относительной копийности генов .
Из патентных источников известны следующее изобретения:
(19)
(11)
(13)
1. «Способ визуализации "сторожевых" лимфатических узлов при раке эндометрия» (см. патент RU2705433C1 от 7.11.2019). Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, гинекологии и лучевой диагностике, и может быть использовано для визуализации «сторожевых» лимфатических узлов при эндометриоидной аденокарциноме. Способ обеспечивает повышение точности, информативности и доступности визуализации «сторожевых» лимфатических узлов при раке эндометрия путем введения радиофармацевтического препарата на основе меченного технецием-99m наноколлоида гамма-оксида алюминия в шейку матки в две или четыре точки накануне операции, совмещения изображений ОЭКТ и МРТ и интраоперационного поиска «сторожевых» лимфатических узлов с помощью лапароскопического гамма-сканера.
(19)
(11)
(13)
2. «Способ прогнозирования неблагоприятного течения местнораспространенных форм рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека» (см. патент RU2504326C1 от 20.01.2014). Изобретение относится к области медицины, а именно к онкогинекологии. Определяют иммунологические показатели: абсолютное количество лимфоцитов (лим_аб), TNFα (TNFα_к) и IL-10 (IL-10_к) в периферической крови, а также TNFα (TNFα_c) и IL-4 (IL-4_c) в цервикальной слизи. На основании полученных данных вычисляют показатель F(x): F(x)=9,265+1,749×(лим_аб)+0,013×(IL-4_c)+0,005×(IL-10_к)-0,410×(TNFα_к)-0,206×(TNFα_c). При значении F(x) больше 0,555 прогнозируют неблагоприятное течение опухолевого процесса, а если меньше - благоприятное течение.
Однако, описанные выше способы принципиально отличаются от нашего, обладают меньшей точностью, чувствительностью и специфичностью, чем предлагаемый нами.
CCND1
PPARGC1A».
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов  и
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для малоинвазивной диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки.
CCND1 и PPARGC1A
GAPDH
ген мишень
референсный ген
-ΔCt
-3
-3
-3
-3
t
t
t
CCND1
PPARGC1A
CCND1
PPARGC1A
Технический результат достигается тем, что проводят определение показателя копийности генетических локусов относительно референсного гена  методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и высокспецифичных праймеров на матрице выделенной внДНК, рассчитывают относительную копийности гена (rC) по формуле rC =2, где Ct - медиана сигналов флюоресценции, ΔC =C() – C(), и сравнивают полученные значения rC с прогностическим интервалом копийности, и при значениях rC >(2,5±0,19)*10 и rC<(4,1±0,02)*10диагностируют у пациентки метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов, а при значениях rC<(0,5±0,01)*10 и rC>(6,9±0,72)*10у пациентки диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов.
º
-ΔCt
-3
-3
-3
-3
CCND1, PPARGC1A
GAPDH
ген мишень
референсный ген
2
t
t
t
CCND1
PPARGC1A
CCND1
PPARGC1A
Сущность способа заключается в том, что образцы крови (8 мл крови и 2 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 600 g и 18С. Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для локусов и , анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле , где ΔC =C() – C(). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях rC>(2,5±0,19)*10 и rC<(4,1±0,02)*10диагностируют у пациентки метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов, а при значениях rC<(0,5±0,01)*10 и rC>(6,9±0,72)*10у пациентки диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов (чувствительность 90%, специфичность 95%).
CCND1 и PPARGC1A
GAPDH
Заявленный анализ основан наопределении количества копий генов относительно референсного гена  во внДНК плазмы крови больных раком шейки матки, и последующем сравнении полученных значений интервалов копийности rC для этих генов с характерными для рака шейки матки с метастатическим поражением лимфоузлов или без поражения.
Заявленный способ включает следующие приёмы:
• выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;
CCND1 и PPARGC1A
• определение относительной копийности генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной внДНК;
• анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;
• расчёт относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,
стандарт
• сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности rC, определенными для больных раком шейки матки с метастатическим поражением лимфоузлов или без поражения.
CCND1, PPARGC1A и GAPDH.
Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов Дизайн праймеров (см. таблица 1) осуществлялся с использованием программы Primer-BLAST и базы данных NCBI GenBank.
Таблица 1
CCND1
PPARGC1A
Праймеры для малоинвазивного способа диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком шейки матки на основании показателя копийности генов  и
Наименование праймеров
Последовательность
№ID
CCND1_FCCND1_R
TGAGGGACGCTTTGTCTGTC GCCTTTGGCCTCTCGATACA
SEQ ID №1SEQ ID №2
PPARGC1A_FPPARGC1A_R
CCGAGAGTTTCCGTTCCCTTAAGAGGGTGTCTTCCGACAG
SEQ ID №3SEQ ID №4
GAPDH_FGAPDH_R
GCTGAACGGGAAGCTCACTGCAGGTTTTTCTAGACGGCAG
SEQ ID №5SEQ ID №6
Заявленный способ осуществляется следующим образом:
º
На первом этапе образцы крови (8 мл крови и 2 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 600 g и 18С.
0
º
º
Из плазмы крови внДНК выделяют фенол-хлороформным методом в модификации: к плазме крови добавляют равный объем лизирующего буфера (10 мМ TrisHCl pH=8.0, 1мМ ЭДТА, 2% SDS, 1,5% меркаптоэтанол) и 50 мкл протеиназы К, инкубируют в термостате при 58С 30 минут; к полученному лизату добавляют равный объем щелочного фенола и хлороформа (соотношение 1:1), центрифугируют 30 минут 3000 об/мин при 18ºС. После разделения фаз отбирают водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляют равный объем 95% изопропилового спирта и раствор 5М NaCl до концентрации 100 mM, пробирку охлаждают до -20С и инкубируют при этой температуре 45 минут. Далее центрифугируют 20 минут при 12700 об/мин и -10С, декантируют супернатант, а осадок промывают 80% этиловым спиртом, центрифугированием удаляют остатки этанола, высушивают осадок в твердотельном термостате и растворяют в 10 мМ ТЕ-буфере. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 0,3 нг/мкл.
2
Амплификацию проводят в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 1,5 нг внДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl, 1х ПЦР-буфер, 1х краситель EvaGreen, 0,2 е.а./мкл ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и по 400 нМ прямого и обратного праймеров для референсного локуса или гена-мишени.
0
0
0
0
Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере по следующей программе: t=95С в течение 3 мин. 40 циклов: t=95С в течение 10 с, t=57С (чтение сигнала) в течение 20 с, t=72С в течение 30 с.
CCND1 и PPARGC1A
GAPDH,
ген мишень- CCND1 и PPARGC1A
референсный ген - GAPDH
t
t
t
t
2
-ΔCt
Относительная копийность локусов вычисляется следующим образом: определяют C для каждого целевого локусаи референсного  далее рассчитывается величина ΔC =C() – C() и копийность генетического локуса относительно референсного гена (rC) по формуле .
Сравниваются полученные значения rC с интервалом прогностического коэффициента копийности:
CCND1
PPARGC1A
-3
-3
• при значениях rC>(2,5±0,19)*10 и rC<(4,1±0,02)*10диагностируют у пациентки метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов,
CCND1
PPARGC1A
-3
-3
• при значениях rC<(0,5±0,01)*10 и rC>(6,9±0,72)*10у пациентки диагностируют отсутствие метастатического поражения регионарных лимфатических узлов (чувствительность 90%, специфичность 95%).
Предлагаемым способом было осуществлено обследование 100 пациенток, у которых был диагностирован рак шейки матки. Медиана возраста исследуемых составила 55,1±6,3 лет. У всех больных до хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК (как описано в способе).
CCND1
PPARGC1A
-3
-3
-3
-3
,
Для 39 пациенток значения rCнаходились в интервале от 2,31*10 до 5,11*10rCв интервале от 1,24*10до 4,08*10, что соответствует показателям rC характерным для метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. У 35 пациенток при последующих обследованиях и манипуляциях было подтверждено метастатическое поражение лимфаузлов, у 4 больных раком шейки матки при последующих обследованиях и манипуляциях метастатические поражения лимфаузлов, выявлены не были, однако по прошествии 1 года наблюдения у 3 из них были обнаружены метастазы в разных органах (печень, легкие).
CCND1
PPARGC1A
-3
-3
-3
-3
,
Для 61 пациентки значения rCнаходились в интервале от 0,11*10 до 0,501*10rCв интервале от 6,18*10до 10,02*10, что соответствует показателям rC характерным для отсутствия метастатического поражения регионарных лимфатических узлов, позже подтвержденном при последующих обследованиях и манипуляциях.
Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводим следующие примеры.
CCND1
PPARGC1A
-3
-3
Пример 1. Пациентка А., 1968 года рождения. По данным цитологического исследования злокачественная опухоль шейки матки. По данным УЗИ метастазы в регионарных лимфоузлах. До хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC=3,04*10и rC = 2,14*10, что соответствует показателям rC характерным для метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. После хирургического вмешательства получен материал для гистологического анализа (ГА). Результаты ГА - G2 плоскоклеточный рак без ороговения, с инвазией 4,5 мм., в 1 лимфоузле метастаз (T1b1N1M0).
CCND1
PPARGC1A
-3
-3
Пример 2. Пациентка С., 1977 года рождения. По данным цитологического исследования злокачественная опухоль шейки матки. По данным УЗИ метастазы в регионарных лимфоузлах отсутствуют. До хирургического вмешательства была взята кровь при помощи вакутейнера, получена плазма при помощи центрифугирования, из полученной плазмы была выделена внДНК. Были получены значения rC=0,24*10и rC = 7,75*10, что соответствует показателям rC характерным для отсутствия метастатического поражения регионарных лимфатических узлов. После хирургического вмешательства получен материал для гистологического анализа (ГА). Результаты ГА - G2 плококлеточный рак с ороговением, инвазией 12 мм., экзофитная форма (T2bNоMо).
Заявляемый способ, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданным для диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов при раке шейки матки, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с плазмой крови, занимает не более 5 часов.
Авторы:
Кутилин Денис СергеевичСнежко Александр ВладимировичКечерюкова Мадина Мажитовна