Анализ природы следа памяти в условной реакции пассивного избегания

ФИЗИОЛОГИЯ

УДК 612.821.6; 591.18

АНАЛИЗ ПРИРОДЫ СЛЕДА ПАМЯТИ В УСЛОВНОЙ РЕАКЦИИ ПАССИВНОГО ИЗБЕГАНИЯ

А.Н. Иноземцев

Изучалась условная реакция пассивного избегания в трехкамерной установке, состоящей из освещенного отсека, темного опасного отсека, в котором крыса получала удар током, и темного безопасного отсека, в котором она не повергалась электроболевому воздействию. Сделан вывод о том, что увеличение латентного периода реакции при тестировании обусловлено не памятью о воздействии тока в строго определенном месте и соответственно не избеганием тока в нем, а неспецифической оборонительной реакцией замирания, не соотнесенной с местом удара током.

Ключевые слова: модифицированное пассивное избегание, природа памяти.

С момента первой публикации об условной реакции пассивного избегания (УРПИ), имевшей место полвека назад, отмечается непрестанно увеличивающееся число работ, посвященных в основном испытанию новых мнемотропных субстанций [1—4]. При этом остается справедливым утверждение о дефиците работ, направленных на изучение природы ассоциативных процессов при выработке УРПИ [5].

Для изучения УРПИ чаще всего используется камера, состоящая из темного и освещенного отсеков. Помещенное в освещенную половину камеры животное в силу норкового рефлекса быстро переходит в темный отсек, где получает удар током. Это приводит к пассивному избеганию темного отсека, оцениваемому резким увеличением латентного периода (ЛП) захода в него при последующем тестировании, которое рассматривается как мера обучения. При этом исходят из предположения, что сформированный след памяти содержит характеристики места нанесения болевого раздражения. Так, Ян Буреш и коллеги считают, что приобретенная реакция "...связана с правильным определением того отсека, в котором применялся шок, и предвосхищением опасных последствий входа в него" [6]. Однако указанный постулат о роли пространственного компонента памяти в УРПИ уязвим для критики.

Во-первых, быстрое формирование УРПИ находится в разительном несоответствии с длительным процессом выработки активного избегания, когда требуется нажать на рычаг, находящийся в строго определенном положении в камере Скиннера [7], или перейти в безопасный отсек челночной камеры [8]. Во-вторых, увеличение ЛП может быть обусловлено факторами, не только влияющими на память, но и не связанными с нею (двигательная активность, эмоциональное состояние и пр.). В-третьих, фармаколо-

гические соединения сами по себе могут оказывать аверсивное влияние на животных или усиливать таковое со стороны тока, вследствие чего увеличение ЛП неправомерно объяснять положительным влиянием соединений на память. Кроме того, становится невозможно отличить влияние соединений на память от их влияния на эмоциональное состояние.

Сказанное выше привело к тому, что использование ЛП стало восприниматься как ненадежный показатель обучения и памяти, в частности при оценке влияния фармакологических препаратов [2, 9]. Это побудило модифицировать установку таким образом, чтобы обеспечить животному возможность выбора между темным опасным отсеком, в котором оно ранее получило удар током, и темным безопасным отсеком, в котором электроболевое воздействие отсутствовало [10]. В данной работе сопоставляются ЛП ухода крыс из стартового отсека и выбор безопасного отсека с целью анализа природы формируемого в УРПИ следа памяти.

Материалы и методы

Опыты проведены на половозрелых самцах белых беспородных крыс массой 180—220 г в двух установках, различным образом разделенных на 3 отсека (рис. 1). В 1-й день крыс на 5 мин по одиночке помещали в установки с открытыми дверцами. На 2-й день вырабатывали УРПИ, для чего животное помещали в освещенный отсек хвостом к отверстиям и фиксировали ЛП захода в какой-либо темный отсек. Затем закрывали дверь и через электрифицированный пол с интервалом 3 с наносили 10 одиночных ударов током (0,7 мА) длительностью 0,5 с. На 3-й день крысу помещали в освещенный отсек и тестировали УРПИ.

Рис. 1. Схемы установок: вверху — установка 1, внизу — установка 2

В первой установке опыт заканчивали после захода животного в любой отсек или по истечении 5 мин (табл. 1). Во второй установке при переходе

крысы в "безопасный" отсек (в котором ее не било током) опыт с ней заканчивали; при переходе в "опасный" отсек крысе повторно наносили удары током (в том же режиме, что и накануне); остальным животным по истечении 5 мин наносили удары током в исходном отсеке, чтобы попытаться вызвать реакцию избавления и выяснить возможное предпочтение безопасного отсека (табл. 1, тест 2). На следующий день проводили тестирование (тест 3). По его окончании крысам, оставшимся в освещенном отсеке, наносили удары током и снова тестировали возможный выбор безопасного отсека (тест 4).

Мы анализировали также влияние удара током в установке, в которой вырабатывалась УРПИ, на по-

ведение крыс в челночной камере. Для этого у 10 крыс в течение 5 мин изучали двигательную активность в челночной камере, а на второй день их помещали во вторую установку (рис. 1) и при заходе в темный отсек подвергали удару током. Через 24 ч в течение 5 мин наблюдали за их поведением в челночной камере.

Животные содержались в стандартных лабораторных условиях при свободном доступе к корму и воде. При проведении исследований соблюдались правила, предусмотренные директивой № 86/309 ЕЕС от 24 ноября 1986 г. Совета Европейского Сообщества.

Для оценки УРПИ помимо ЛП регистрировали выбор одного из темных отсеков. Статистическую значимость возрастания ЛП при тестировании относительно исходной величины определяли с помощью парного критерия Вилкоксона, значимость частоты заходов в отсеки — с помощью критерия согласия частот событий.

Результаты и обсуждение

Удар током при выработке УРПИ привел к многократному увеличению ЛП данной реакции при тестировании как в первой, так и во второй установках (табл. 2). Это говорит о том, что с точки зрения общепринятого показателя выработки УРПИ, каким является ЛП, обучение имеет место в обеих установках. Однако это не привело к предпочтению заходов в безопасный отсек. В 1-й установке больше трети животных осталось в стартовом отсеке, в опасный отсек перешли 32,7%, а в безопасный — 30,8%. Во 2-й установке в стартовом отсеке осталось больше половины, а в безопасный отсек перешло всего около четверти животных (рис. 2, тест 1).

Как было указано выше, перешедшие в опасный отсек и оставшиеся в стартовом отсеке животные подверглись электроболевому воздействию. Наблюдения показали, что почти две трети оставшихся в стартовом отсеке крыс снова не покинули его, несмотря на продолжающиеся удары током, а из перешедших большая доля пришлась на опасный отсек (рис. 2, тест 2).

Проведенное через сутки тестирование показало, что дополнительное обучение (удары током при за-

Таблица 2

Латентные периоды УРПИ

Установки, n Выработка Тестирование Р

n II 5 11,3 ± 2,2 110,0 ± 18,0 0

2, n = 25 22,6 ± 4,5 198,2 ± 26,8 0,0001

Примечание. Представлены средние, ошибки средних и уровень значимости отличия от исходных величин.

Таблица 1

Последовательность экспериментальных процедур

Установки Дни

1 2 3 3 4 4

Установка 1 ознакомление n = 52 выработка n = 52 тест 1 n = 52

Установка 2 ознакомление n = 25 выработка n = 25 тест 1 n = 25 тест 2 n = 14 тест 3 n = 17 тест 4 n = 9

ЧК-установка 2-ЧК ознакомление n = 10 выработка n = 10 ЧК n = 10

Примечание. ЧК — челночная камера; n — число животных.

Рис. 2. Частота предпочтения отсеков при тестировании УРПИ.

По ординате — число крыс, %. *, ** — р < 0,05 и р < 0,01 соответственно, относительно частоты предпочтения стартового отсека. Черный прямоугольник — частота заходов в опасный отсек; серый — в безопасный отсек; белый — предпочтение стартового отсека

ходе в опасный темный отсек) и усиление аверсив-ности стартового отсека за счет электроболевого воздействия в нем не привели к усилению предпочтения безопасного отсека (рис. 2, тест 3). В освещенном отсеке осталась существенная часть животных, поведение которых в основном характеризовалось замиранием.

Дополнительные удары током в исходном отсеке по окончании предыдущего тестирования привели к тому, что из оставшихся в нем крыс большинство снова никуда не перешли (рис. 2, тест 4). Из этого следует, что у крыс отсутствует не только избегание возможного удара током в опасном отсеке с помощью захода в безопасный отсек, но и избавление от наличного тока.

После удара током в установке, использованной для выработки УРПИ, ЛП первого перехода в другой отсек челночной камеры увеличился в 3,7 раза (р < 0,05), а число переходов уменьшилось в 2,9 раза относительно исходного уровня (р < 0,05).

Из представленных данных следует, что в результате однократного обучения происходит резкое увеличение ЛП, отражающее угнетение свойственной грызунам реакции ухода из открытого освещенного пространства в темное. В то же время не только однократное, но и повторное обучение не привело к выбору безопасного отсека.

Это означает, что рассмотренный выше постулат неверен и неверно данное в нем объяснение содержания следа памяти, формируемого в процессе выработки УРПИ. Простота предложенного объяснения оказалась обманчивой, и проблема, по-видимому, является более сложной, чем представлялось ранее. В этой связи уместно привести мнение Конорско-го [11], который считал, что объяснение механизма пассивного избегания менее ясно, чем активного.

Сопоставление величин ЛП пассивного избегания и заходов в безопасный отсек говорит о том, что процессы обучения, которые обусловливают за-

держку двигательной реакции и выбор безопасного отсека, имеют различную ассоциативную природу. Ранее установлено, что эти процессы подчиняются различным количественным закономерностям [10]. Величины ЛП в процитированной работе линейно зависели от силы электроболевого воздействия. Предпочтение безопасного отсека, напротив, меньше всего наблюдалось при большем воздействии, и при этом было больше всего животных, оставшихся в стартовом отсеке, что указывает на углубление замирания по мере увеличения воздействия.

Кроме того, различным было и влияние пира-цетама на эти величины: препарат не влиял на ЛП, но увеличивал предпочтение безопасного отсека. Выявленное положительное влияние препарата только на пространственный компонент памяти согласуется с улучшением ноотропами пространственной переделки реакции избегания у крыс [8] и ускорением решения пространственной задачи в лабиринте Морриса [12].

В основе быстрого формирования следа памяти, обусловливающего угнетение рассматриваемой реакции, лежат, по-видимому, несколько причин. Прежде всего таковой служит условная реакция страха, которая, по Конорскому [11], образуется уже после одного сочетания удара током и экспериментальной установки. Отметим, что увеличение ЛП сопровождается уменьшением двигательной активности. Еще одной причиной считают страх темноты [2]. Однако ЛП реакции увеличивается и у крыс, помещенных после процедуры выработки УРПИ в челночную камеру, в которой нет темного отсека. Следовательно, ассоциация "ток-темнота" не играет существенной роли в формировании и реализации следа памяти в УРПИ, а основное значение принадлежит воздействию тока как какового безотносительно к темному отсеку.

Доказательство роли страха в увеличении ЛП предоставляет также экспериментальная психофармакология. Анксиолитики, предназначенные для уменьшения страха и тревоги, уменьшают последствия стрессогенных воздействий в различных тестах [13]. Они увеличивают число переходов и время пребывания в освещенном отсеке в светло-темной камере; уменьшают замирание и увеличивают двигательную активность в открытом поле; редуцируют анксиоген-ное состояние животных в тесте стартл-реакции, вызываемое сильным звуковым воздействием и током, что уменьшает замирание.

Именно эта способность анксиолитиков уменьшать страх и тревогу объясняет, что анксиолитик диазепам уменьшает ЛП в УРПИ [4, 14]. В отличие от этого ноотропы, механизм действия которых напрямую не связан с уменьшением страха и тревоги, не уменьшают и ЛП [1—3, 10]. Таким образом, уменьшение страха приводит к уменьшению ЛП, а при отсутствии уменьшения страха не уменьшается и ЛП.

Следует учесть, что помимо классического ассоциативного процесса страх может быть обусловлен

инструментальным путем, поскольку ток следует за реакцией животного. Было показано, что ЛП увеличился больше у крыс, которым ток давался при заходе в темный отсек, чем у крыс, которым ток давался безотносительно к этой реакции [5]. Эти опыты доказали роль инструментального обусловливания, а возможно, и роль запоминания места нанесения тока. Но значение этого фактора достаточно ограничено, поскольку отмеченное превышение ЛП имеет место только при силе тока большей, чем 1,8 mA. Следует также добавить, что при большем электроболевом воздействии меньше всего выборов безопасного отсека [10].

Причиной увеличения ЛП после воздействия тока может служить также открытая И.М. Сеченовым зависимость реакций организма от состояния ЦНС, названная позже переключением. Это явление характеризует древний приспособительный механизм, который обеспечивает неспецифическое реагирование в соответствии с полученной информацией о среде. Подобная зависимость прослеживается у животных начиная с достаточно ранних этапов эволюции. Мы наблюдали, в частности [15], что после однократного действия тока нереисы (Nereis pelagica) начинают реагировать на вибрационный раздражитель как на аверсивный (сокращением, отдергиванием головного конца), а после пищи — движением вперед, характерным для поиска пищи, хотя вибрация не сопровождалась ни током, ни пищей.

Следует добавить, что П.В. Симонов в связи с гипотезой о креатогенезе рассматривал ряд возможностей первичного замыкания временных связей, чье соответствие реальной действительности выясняется лишь позднее, в частности способность доминантного очага придавать явлениям действительности и их следам объективно не присущее им значение [16].

С этой точки зрения увеличение ЛП может быть обусловлено не памятью о воздействии тока в строго определенном месте и соответственно не избеганием тока в нем, а неспецифической оборонительной реакцией (замиранием), отражающей способность животных реагировать в соответствии с воздействием биологически значимых раздражителей. Этот древний механизм существен для обучения и может составить точку приложения для ноотропов на ранних этапах филогенеза. Подтверждением этому служит влияние пирацетама на обучение и память насекомых [17].

Как показывают полученные данные, быстрое формирование эмоциональной реакции страха, обеспечивающей угнетение врожденного поведения, не приводит к быстрому формированию следа памяти, отражающего пространственные характеристики экс-

периментальной ситуации. Запоминание места нанесения тока, пространственная дифференцировка, выбор безопасного отсека представляют собой более сложный процесс и более трудную задачу, чем формирование классического условного рефлекса. Так, при выработке избегания в камере Скиннера сначала возникает реакция на ток в виде замирания, затем на условный раздражитель в виде вздрагивания и перемещений по камере безотносительно к рычагу, нажатие на который выключает ток, и только значительно позже появляются избавление и избегание, подкреплением для которых служат выключения тока и условного раздражителя, следующие за реакцией [18]. Это согласуется с двухфакторной теорией обучения избеганию [19], согласно которой сначала на основе классического принципа сочетания условного и безусловного раздражителей формируется условная реакция страха, а инструментальная оборонительная реакция возникает в ходе дальнейшего обучения.

На наш взгляд, именно большая сложность определения безопасного отсека объясняет, почему пира-цетам более эффективен в условиях пространственного выбора в предлагаемой модификации методики [10]. На самом деле известно, что для выявления ноотропной активности субстанций прибегают к различным воздействиям, затрудняющим обучение [4, 14]. Так, определению ноотропных свойств пирацетама способствует усложнение задачи с помощью изменения местоположения отверстия в челночной камере и рычага в ящике Скиннера [8]. С другой стороны, влияние пирацетама на выбор безопасного отсека при отсутствии такового на ЛП ухода из освещенного отсека [10] указывает на большую сложность пространственной дифференцировки относительно формирования условной реакции страха.

Таким образом, проведенное исследование позволяет заключить, что увеличение ЛП ухода из освещенного отсека происходит уже после однократного обучения, в то время как предпочтение темного безопасного отсека, в котором животное не подвергалось электроболевому воздействию, отсутствует даже при повторном обучении. Увеличение ЛП, уменьшение двигательной активности и замирание, отмечаемое у крыс после однократного обучения, наблюдается также в камере, в которой они не подвергались электрошоку и в которой нет темного отсека. Следовательно, увеличение ЛП обусловлено не памятью о воздействии тока в строго определенном месте и соответственно не избеганием тока в нем, а неспецифической оборонительной реакцией замирания, не соотнесенной с местом нанесения тока.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ghelardini C, Galeotti N, Gualtieri F, Romanelli M.N, Bucherelli C, Baldi E., Bartolini A. DM235 (sunifiram): a no-

vel nootropic with potential as a cognitive enhancer // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2002. Vol. 365. N 6. P. 419—426.

2. Misztal M., Danysz W. Comparison of glutamate antagonists in continuous multiple-trial and single-trial dark avoidance // Behav. Pharmacol. 1995. Vol. 6. N 5—6. P. 550—561.

3. Shah J., Goyal R. Investigation of neuropsychophar-macological effects of a polyherbal formulation on the learning and memory process in rats //J. Young Pharm. 2011. Vol. 3. N 2. P. 119—124.

4. Vasudevan M., Parle M. Pharmacological evidence for the potential of Daucus carota in the management of cognitive dysfunctions // Biol. Pharm. Bull. 2006. Vol. 29. N 6. P. 1154—1161.

5. Kapp B.S., Gallagher M, Holmquist B.K., Theall C.L. Retrograde amnesia and hippocampal stimulation: dependence upon the nature of associations formed during conditioning // Behav. Biol. 1978. Vol. 24. N 1. P. 1—23.

6. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа, 1991. 399 с.

7. Inozemtsev A.N. Estudio de la sujecion de la palanca en el contexto de la evitacion discriminada // Acta Cientifica Venezolana. 1983. Vol. 34. N 2. P. 159—167.

8. Иноземцев A.H., Прагина Л.Л. Методические приемы стрессогенных воздействий для исследования ноот-ропных влияний на обучение и память // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1992. № 4. С. 23—31.

9. Sarter M, Hagan J., Dudchenko P. Behavioral screening for cognition enhancers: from indiscriminate to valid testing: Part II // Psychopharmacology (Berl). 1992. Vol. 107. N 4. P. 461—473.

10. Иноземцев A.H, Бельник А.П., Островская Р.У. Изучение условного рефлекса пассивного избегания в модифицированной трехкамерной установке // Эксп. клин. фармакол. 2007. № 2. С. 67—69.

11. Конорский Ю. Интегративная деятельность мозга. М: Высшая школа, 1970. 412 с.

12. Baranova A.I., Whiting M.D., Hamm R.J. Delayed, post-injury treatment with aniracetam improves cognitive performance after traumatic brain injury in rats // J. Neurotrauma. 2006. Vol. 23. N 8. P. 1233—1240.

13. Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитическо-го) действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П. Фесенко. М.: Ремедиум, 2000. С. 126—130.

14. Kim D.H., Kim S, Jeon S.J., Son K.H., Lee S, Yoon B.H., Cheong J.H., Ko K.H., Ryu J.H. Tanshinone I enhances learning and memory, and ameliorates memory impairment in mice via the extracellular signal-regulated kina-se signalling pathway // Br. J. Pharmacol. 2009. Vol. 158. N 4. P. 1131—1142.

15. Иноземцев A.H. Изменение поведенческих реакций нереисов на вибрацию после действия безусловных раздражителей // Журн. высш. нерв. деят. 1989. Т. 39. № 2. С. 376—378.

16. Симонов П.В. К физиологии креатогенеза // Поисковая активность, мотивация и сон / Под ред. Г.Г. Га-санова, П.В. Симонова. Баку: Элм, 1986. С. 54—60.

17. Иноземцев А.Н. На пути к эволюционной психофармакологии // Высшая нервная деятельность: вчера и сегодня. Сб. науч. трудов, посвященных 100-летию со дня рождения Л.Г. Воронина / Под ред. Р.А. Даниловой, К.А. Никольской. М.: Изд-во Моск. ун-та, 2010. С. 173—196.

18. Иноземцев А.Н. Особенности инструментальной оборонительной реакции на начальном этапе ее формирования // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 1988. № 4. С. 60—66.

19. Mowrer O.H. On the dual nature of learning: A reinterpretation of "conditioning" and "problem-solving" // Harvard Ed. Rev. 1947. N 17. P. 102—148.

Поступила в редакцию 06.03.2012

THE ANALYSIS OF THE MEMORY TRACE NATURE

IN PASSIVE AVOIDANCE RESPONSE

A.N. Inozemtsev

Passive avoidance conditioning is analyzed in a three compartment apparatus that consists of a light compartment, a dark dangerous compartment in which foot shock was delivered and a dark safe one where the rats were not punished. It is concluded that latency increase of passive response is caused not by memory of the shock in the strictly certain place and accordingly not by shock avoidance in it, but by nonspecific defensive response (freezing) being unrelated with the shock place.

Key words: modified passive avoidance, memory nature.

Сведения об авторе

Иноземцев Анатолий Николаевич — докт. биол. наук, руководитель лаборатории эволюции механизмов памяти, кафедра высшей нервной деятельности. Тел.: 8-495-939-50-01; e-mail: A_Inozemtsev@mail.ru