Способ выявления микобактерии туберкулеза из резецированной ткани легкого
METHOD FOR DETECTING MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS FROM RESECTED LUNG TISSUE

Изобретение относится медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза.
Большинство проб клинического материала, поступающего в микробиологическую лабораторию для культурального исследования на туберкулез, в различной степени загрязнены быстрорастущими бактериями, бурный рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию (обеззараживание), то есть гибель сопутствующей микрофлоры. Все препараты, используемые в настоящее время для деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий. Чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущую Gr+/-микрофлору, грибы рода Candida, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий [Приказ МЗ РФ №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации». Приложение 11 «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза» IV. Культуральные методы исследования микобактерий комплекса М. Tuberkulosis 257-258].
Известен способ выявления микобактерий туберкулеза из мокроты, получаемой от больных, включающий гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его с равным количеством 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия с амплитудой 0,5-2,5 мм и частотой 40-60 Гц в течение 10-20 мин, инкубацию исследуемого материала в течение 18-20 ч, выделение осадка, нейтрализацию его карбоновой кислотой до достижения 6,8>рН>7,0 с последующим повторным выделением осадка и его посев на питательную среду (патент RU 2069698, 3.07.09.1993, оп. 27.11.1996).
Нейтрализация осадка карбоновой кислотой является более щадящей обработкой по сравнению с нейтрализацией более сильными кислотами. Однако она приводит лишь к изменению рН исследуемого материала и тем самым сохраняет жизнеспособность микобактерий. Высокая концентрация фосфорнокислого натрия трехзамещенного обусловлена видом исходного материала - мокротой, являющейся по своей структуре раствором, снижающим при гомогенизации его концентрацию.
Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ выявления микобактерий туберкулеза из резецированной ткани легкого, при котором обрабатывают исследуемый материал от посторонней микрофлоры раствором тринатрий фосфата, который берут в концентрации 4-4,7%. Получают осадок, нейтрализуют его кислотой и делают посев на питательную среду. В качестве кислоты берут раствор аминоуксусной кислоты в концентрации 0,8±0,2%. При этом раствор тринатрий фосфата и кислоту берут в соотношении 1:1 (патент RU 2415944, з. 11.06.2009, оп. 10.04.2011).
Недостатком способа является длительность процесса деконтаминации биологического материала, низкая выживаемость микобактерий туберкулеза, токсичность используемых реагентов.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение точности микробиологической диагностики, сокращение сроков лабораторных исследований и снижение затрат.
Техническим результатом является повышение жизнеспособности и снижение количественных потерь микобактерий в исследуемом материале при лабораторной диагностике туберкулеза.
Для решения поставленной задачи в способе выявления микобактерий туберкулеза из резецированной ткани легкого, включающем обработку исследуемого материала от посторонней микрофлоры, согласно изобретению обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры производят путем помещения исследуемого материала на 45 минут в 0,9%-й озонированный раствор NaCl, нагретый до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин, после обработки материала его центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок засевают поровну в пробирки с питательными средами.
Выбранная методика обработки исследуемого материала обусловлена следующими факторами. Для эффективного абациллирования, вызванного Gr+/- микрофлорой, грибами рода Candida, раствором хлорида натрия, насыщенного озоно-кислородной смесью, требуется обработка раневой полости в течение не менее 45 минут.Автором произведены измерения окислительно-восстановительного потенциала, который является главным показателем активности раствора, в результате которых выявлено: необходимый уровень окислительно - восстановительного потенциала озонированного физиологического раствора хлорида натрия - не ниже 600 мВ - сохраняется при температуре 21°С не более 1 минуты после прекращения насыщения озоно-кислородной смесью.
В связи с этим, обеспечение непрерывного насыщения раствора хлорида натрия озоно-кислородной смесью позволяет поддерживать требуемую концентрацию раствора в течение всего времени обработки исследуемого материала, что обеспечивает достоверный бактерицидный эффект, вызывает гибель Gr+/- микрофлоры и грибов рода Candida.
Использование озоно-кислородной смеси позволяет подавить быстрорастущую Gr+/- микрофлору, грибы рода Candida, максимально сохранив жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий туберкулеза.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве исследуемого материала используют резецированную ткань легкого. Резецированный материал гомогенизируют и растирают со стеклянными бусами или битым стеклом. Производят обработку исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры. Для этого исследуемый материал помещают на 45 минут в объем 0,9% озонированного раствора NaCl, нагретого до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин.
После материал центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок засевают поровну в пробирки с питательными средами (например, со средами Левенштейна-Иенсена и "Новая").
Заявляемый способ позволяет повысить точность лабораторной диагностики при выявлении микобактерий туберкулеза при одновременном сокращении времени лабораторных исследований за счет сохранения жизнеспособности и снижения количественных потерь микобактерий в исследуемом материале.
Клинический пример.
Больной П. 38 лет. Поступил на лечение с диагнозом инфильтративный туберкулез в\доли правого легкого. Выполнено хирургическое лечение -торакотомия слева, резекция в\доли правого легкого. Резецированный материал гомогенизирован в условиях лаборатории. Произведена обработка исследуемого материала от сопутствующей микрофлоры. Исследуемый материал помещен на 45 минут в объем 0,9% озонированного раствора NaCl, нагретого до температуры 21°С, который непрерывно насыщают озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 10000 мкг/л/мин.
После материал центрифугирован при скорости 3000 об/мин в течение 20 мин, надосадочная жидкость слита, осадок засеян поровну в три пробирки с питательными средами "Новая". Получен рост микобактерий туберкулеза: в первой пробирке на 19-е сутки, во второй пробирке на 21-е сутки, в третьей пробирке на 20-е сутки. Признаков роста неспецифической микрофлоры не выявлено.