БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ШТАММ БИФИДОБАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТ ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ), ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ И ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
BACTERIAL BIFIDUS BACTERIA STRAIN - FOLIC ACID PRODUCER (VERSIONS), APPLICATIONS THEREOF AND PROBIOTIC COMPOSITION

Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к бактериальным штаммам, продуцирующим фолиевую кислоту, относящимся к роду Bifidobacterium, к фармацевтическим, ветеринарным или пищевым препаратам, содержащим их, и к их применению.
В частности, изобретение относится к новым бактериальным штаммам человеческого происхождения, относящимся к роду Bifidobacterium виду adolescentis (2), роду Bifidobacterium виду breve (1) и роду Bifidobacterium виду pseudocatenulatum (2), находящимся в Депонированной германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Braunsweig-Germany) в соответствии с Будапештским соглашением от 21 июля 2004 года.
Вышеупомянутым штаммам соответственно присвоены следующие идентификационные коды:
Bifidobacterium вид adolescentis, код DSM 16594;
Bifidobacterium вид adolescentis, код DSM 16595;
Bifidobacterium вид breve, код DSM 16596;
Bifidobacterium вид pseudocatenulatum, код DSM 16597;
Bifidobacterium вид pseudocatenulatum, код DSM 16598.
Область изобретения
Фолиевая кислота представляет собой важный водорастворимый витамин В, который принимает один углерод от донорной молекулы.
Благодаря этой характеристике фолиевая кислота является центральной для большого количества важных клеточных процессов, включая, например, биогенез метильных групп и синтез нуклеотидов, витаминов и некоторых аминокислот.
В организме репликация, репарация и метилирование ДНК становятся более эффективными, поскольку увеличивается доступность фолиевой кислоты.
По этой причине ткани, демонстрирующие высокую скорость пролиферации и активный метаболизм, такие как лейкоциты, эритроциты и энтероциты, требуют большого количества фолиевой кислоты или по меньшей мере хорошую постоянную ее доступность.
У людей дефицит фолиевой кислоты ассоциирован с повышенным риском развития рака: например, эпидемиологические исследования показали, что риск развития рака молочной железы после менопаузы выше у женщин с низким потреблением фолиевой кислоты.
Напротив, высокие количества фолиевой кислоты снижают риск развития рака ободочной и прямой кишки.
Фолиевая кислота (вместе с ее солями фолатами) играет среди прочего фундаментальную роль для клеток, формирующих слизистую оболочку ободочной и прямой кишки, которая претерпевает непрерывный процесс эпителиального обновления. Роль, которую играет фолиевая кислота в предотвращении рака ободочной и прямой кишки, описана в литературе (Ссылка 1). В частности продемонстрировано, что полиморфизмы генов, ответственных за метаболизм метильной группы, ассоциированы с семейным риском рака ободочной и прямой кишки, и что действие этих генов модифицировано доступностью фолатов (Ссылка 2).
Следовательно, низкая или уменьшенная локальная доступность фолиевой кислоты может приводить в результате к гипометилированию ДНК, тем самым способствуя, например, возникновению рака толстой кишки.
Кроме того, доступность больших количеств фолиевой кислоты рекомендована для пациентов, которые страдают воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), поскольку она способствует регуляции пролиферации клеток в толстой и прямой кишке.
Таким образом, крайне важно найти средства, с помощью которых можно обеспечить организм природным нетоксичным эндогенным источником, способным непрерывно поставлять необходимое количество фолиевой кислоты, и таким образом предложить альтернативу обычным способам системного введения указанного вещества или его солей.
К сожалению, до настоящего времени не найдено никакого вида решения, удовлетворяющего этому требованию.
Хорошо известно, что толстая кишка человека колонизирована комплексом и многочисленным микробным сообществом, которое активно взаимодействует с организмом хозяина.
11
12
Концентрация бактерий в толстой кишке составляет приблизительно 10-10 бактерий на грамм содержимого кишечника.
Существует по меньшей мере 400 видов бактерий, но 30-40 видов составляют приблизительно 95-98% от общей микрофлоры.
Среди этих основных видов те виды, которые относятся к роду Bifidobacterium, представляют собой одну из основных групп микроорганизмов в кишечнике человека.
Bifidobacterium представляет собой род, известный своей целебной активностью в организме. Эта активность преобразуется, например, в следующие эффекты: способность восполнять бактериальную кишечную флору после антибиотикотерапии, поддержание баланса между различными группами микроорганизмов в кишечнике, снижение уровней холестерина в сыворотке крови, продуцирование витаминов, облегчение непереносимости лактозы и иммуномодуляция.
Таким образом, бактерии, относящиеся к роду Bifidobacterium, справедливо рассматриваются как пробиотики и обычно используются как таковые в фармацевтических, ветеринарных и/или пищевых областях.
Пробиотик по определению представляет собой живую микробную добавку, активность которой благоприятна для здоровья человека или животного.
До настоящего времени не известны пробиотические штаммы, которые продуцируют фолиевую кислоту (были описаны бактерии, продуцирующие фолиевую кислоту, относящиеся к родам Lactobacillus и Lactococcus, но они не предложены в качестве пробиотиков).
В частности, не известны пробиотические бактерии рода Bifidobacterium, развивающиеся в культуральной среде, полностью лишенной фолиевой кислоты, и продуцирующие ее в больших количествах.
Описание изобретения
Заявитель неожиданно обнаружил, что штаммы пробиотических бактерий человеческого происхождения, относящиеся к роду Bifidobacterium, являются продуцентами фолиевой кислоты.
Идентифицированы штаммы, продуцирующие фолиевую кислоту, относящиеся к следующим видам, например: Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adoloscentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium angutatum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium denticolens, Bifidobacterium inopinatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis.
Среди этих штаммов бактерий показано, что виды Bifidobacterium adoloscentis, Bifidobacterium breve и Bifidobacterium pseudocatenulatum представляют особенный интерес, как подробно описано ниже и в формуле изобретения.
Более конкретно, в предпочтительном аспекте изобретения, как подробно описано ниже и в формуле изобретения, заявитель выделил и депонировал в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Braunsweig-Germany) 21 июля 2004 года пять новых бактериальных штаммов человеческого происхождения, относящихся к роду Bifidobacterium. Из этих пяти новых бактериальных штаммов два относятся к виду Bifidobacterium adoloscentis, один к виду Bifidobacterium breve и два к виду Bifidobacterium pseudocatenulatum. Указанным штаммам соответственно были присвоены следующие идентификационные коды:
DSM 16594;
DSM 16595;
DSM 16596;
DSM 16597;
DSM 16598.
Указанные бактериальные штаммы были охарактеризованы таксономически и технологически, как описано ниже, и продемонстрировано, что они продуцируют большие количества фолиевой кислоты.
Фактически, указанные штаммы способны развиваться в культуральной среде, лишенной фолиевой кислоты.
В частности, указанные штаммы способны продуцировать соответственно следующие количества фолиевой кислоты: 56-62, 16-20, 6-9, 14-16 и 14-19 нг/мл культуральной среды.
Кроме того, неожиданно обнаружили, что биосинтез фолиевой кислоты бактериальными штаммами по изобретению не подвержен какой-либо регуляции по механизму негативной регуляции (отрицательной обратной связи) частью получающегося в результате продукта или любого другого продукта, уже присутствующего в культуральной среде.
Другими словами, при физиологических условиях продуцирование фолиевой кислоты остается постоянным вне зависимости от того, присутствует ли последняя в окружающей среде. Наконец, также обнаружено, что изменения рН, типичные для экосистемы толстой кишки (значения рН, варьирующие приблизительно между 7 и 5, рассматривают вероятно в связи с некоторыми патологиями или типом питания), не оказывают отрицательного влияния на продуктивность штаммов по настоящему изобретению.
Таким образом, микроорганизмы этого типа способны сочетать их известные пробиотические характеристики (таким образом, благоприятные для организма) со способностью продуцирования фолиевой кислоты in situ (например, в толстой кишке).
Следовательно, эти штаммы неожиданно представляются сами по себе как желаемое решение технической проблемы по настоящему изобретению, как изложено выше.
Фактически, указанные микроорганизмы представляют собой идеальный природный нетоксичный эндогенный источник фолиевой кислоты.
Таким образом, применение подходящих препаратов, содержащих бифидобактерии, продуцирующие фолиевую кислоту, по настоящему изобретению может обеспечить непрерывное продуцирование фолиевой кислоты in situ.
Пробиотические бактерии по настоящему изобретению могут быть введены множеством путей в соответствии с потребностями пациента или потребителя.
В предпочтительном аспекте настоящее изобретение направлено на фармацевтические, ветеринарные и/или пищевые препараты, включающие по меньшей мере один из бактериальных штаммов по настоящему изобретению или их смесь.
Особенно предпочтительны препараты, включающие по меньшей мере один из штаммов DSM 16594, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 и DSM 16598 или любую их комбинацию.
В еще одном предпочтительном аспекте штаммы по настоящему изобретению также могут быть приготовлены в виде препаратов в комбинации с другими пробиотическими бактериальными штаммами, обладающими взаимодополняющими характеристиками, то есть различными присущими им свойствами.
Пример таких препаратов, который не следует рассматривать как ограничивающий объем изобретения, может быть представлен по меньшей мере одним из бактериальных штаммов по настоящему изобретению в подходящей смеси с пробиотическим бактериальным штаммом, обладающим свойством сильной адгезии к слизистой оболочке кишечника.
Штаммы по настоящему изобретению также могут быть приготовлены в виде препаратов в комбинации с другими штаммами, которые в дополнение к присущим им благоприятным характеристикам, ассоциированным с родом бактерий, к которому принадлежат эти штаммы, демонстрируют другие специфические характеристики, полезные для здоровья организма хозяина.
Указанные смешанные препараты способны объединить множество пробиотических свойств в одном препарате, таким образом обеспечивая организм множеством преимуществ, а также возникающими в результате потенциальными синергическими свойствами при одном введении.
В свете вышеприведенных рассуждении очевидно, что специалист в данной области техники способен разработать множество комбинаций пробиотических бактерий, основываясь на своем собственном опыте.
Такие комбинации, таким образом, также находятся в объеме настоящего изобретения.
В качестве примера, не ограничивающего объем изобретения, указанные пробиотические бактерии могут быть выбраны среди других из рода Lactobacillus, включая такие виды, как Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei подвид rhamnosus, Lactobacillus casei подвид paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius подвид salivarius и Lactobacillus pentosus, или из рода Streptococcus, включая такие виды, как Streptococcus delbrueckii подвид Thermophilus.
Показано, что особенно предпочтительные штаммы среди них включают, например, следующие:
- Lactobacillus acidophilus LMG Р-21381 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 31 января 2002 года);
- Lactobacillus casei подвид paracasei LMG P-21380 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 31 января 2002 года);
- Lactobacillus plantarum LMG P-21021 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 16 октября 2002 года);
- Lactobacillus pentosus LMG P-21019 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 16 октября 2002 года);
- Lactobacillus plantarum LMG P-21020 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 16 октября 2002 года);
- Lactobacillus plantarum LMG P-21022 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 16 октября 2002 года);
- Lactobacillus plantarum LMG P-21023 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 16 октября 2002 года);
- Bifidobacterium lactis LMG P-21384 (депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, BCCM LMG Collection) 31 января 2002 года);
- Streptococcus delbrueckii подвид thermophilus DSM 16506 (депонированный в DSMZ 18 июня 2004 года);
- Streptococcus delbrueckii подвид thermophilus DSM 16507 (депонированный в DSMZ 18 июня 2004 года);
- Bifidobacterium longum DSM 16603 (депонированный в DSMZ 20 июля 2004 года);
- Bifidobacterium breve DSM 16604 (депонированный в DSMZ 20 июля 2004 года);
- Lactobacillus casei подвид rhamnosus DSM 16605 (депонированный в DSMZ 20 июля 2004 года).
Следовательно, особенно предпочтительные смешанные препараты по изобретению включают по меньшей мере один из бактериальных штаммов с DSM 16594 по DSM 16598 или любую их смесь, подходящим образом приготовленную в виде препарата в комбинации с по меньшей мере одним из перечисленных выше пробиотических бактериальных штаммов или любой их смесью.
Предпочтительно указанные пробиотические бактериальные штаммы выбраны из группы, включающей:
- Lactobacillus acidophilus LMG P-21381;
- Lactobacillus casei subsp. paracasei LMG P-21380;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21021;
- Lactobacillus pentosus LMG P-21019;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21020;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21022;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21023;
- Bifidobacterium lactis LMG P-21384;
- Streptococcus delbrueckii подвид thermophilus DSM 16506;
- Streptococcus delbrueckii подвид thermophilus DSM 16507;
- Bifidobacterium longum DSM 16603;
- Bifidobacterium breve DSM 16604;
- Lactobacillus casei подвид rhamnosus DSM 16605.
Количество и тип бактериальных штаммов, которые объединяют в указанных смешанных препаратах, определяет специалист в данной области техники в соответствии с типом и тяжестью патологии, которую лечат или предотвращают, или типом пробиотического пищевого продукта, который желают получить.
В еще одном предпочтительном аспекте бактериальные штаммы по настоящему изобретению, используемые по отдельности или в комбинации с другим и/или другими пробиотическими бактериальными штаммами, могут быть дополнительно приготовлены в виде препарата в комбинации с другими веществами, обладающими пребиотическими характеристиками.
Предпочтительно, указанные вещества, обладающие пребиотическими характеристиками, включают, в частности, углеводы, которые не перевариваются и не всасываются у человека и таким образом достигают толстой кишки полностью интактными, где они избирательно стимулируют развитие и активность множества полезных групп микроорганизмов, в частности бифидобактерий.
Особенно предпочтительны среди указанных пребиотических углеводов те, которые выбраны из группы, включающей: фрукто-олигосахариды (ФОС), в частности инулин, изомальто-олигосахариды, резистентный крахмал, пектин, галакто-олигосахариды (ГОС), арабиногалактан, ксило-олигосахариды (КОС), хитозан-олигосахариды (ХОС) и глюкоманнан.
В качестве примера, не ограничивающего объем изобретения, предпочтительные препараты включают по меньшей мере один из бактериальных штаммов с DSM 16594 по DSM 16598 или любую их смесь, подходящим образом приготовленную в виде препарата в комбинации с по меньшей мере одним из веществ, обладающих пребиотическими характеристиками, выбранных, например из перечисленных выше, то есть фрукто-олигосахаридов (ФОС), в частности инулина, изомальто-олигосахаридов, резистентного крахмала, пектина, галакто-олигосахаридов (ГОС), арабиногалактана, ксило-олигосахаридов (КОС), хитозан-олигосахаридов (ХОС) и глюкоманнана.
Предпочтительные препараты по изобретению подобным образом включают по меньшей мере один из бактериальных штаммов с DSM 16594 по DSM 16598 или любую их смесь, подходящим образом приготовленную в виде препарата в комбинации с по меньшей мере одним из пробиотических бактериальных штаммов, перечисленных выше, или любой их смесью, и с по меньшей мере одним из веществ, обладающих пребиотическими характеристиками, выбранных, например, из перечисленных выше, то есть фрукто-олигосахаридов (ФОС), в частности инулина, изомальто-олигосахаридов, резистентного крахмала, пектина, галакто-олигосахаридов (ГОС), арабиногалактана, ксило-олигосахаридов (КОС), хитозан-олигосахаридов (ХОС) и глюкоманнана.
Предпочтительно, указанные пробиотические бактериальные штаммы выбраны из группы, включающей:
- Lactobacillus acidophilus LMG P-21381;
- Lactobacillus casei подвид paracasei LMG P-21380;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21021;
- Lactobacillus pentosus LMG P-21019;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21020;
- Lactobacillus plantarum LMG P-21022;
- Lactobadllus plantarum LMG P-21023;
- Bifidobacterium lactis LMG P-21384;
- Streptococcus delbrueckii подвид thermophilus DSM 16506;
- Streptococcus delbrueckii подвид thermophilus DSM 16507;
- Bifidobacterium longum DSM 16603;
- Bifidobacterium breve DSM 16604;
- Lactobacillus casei подвид rhamnosus DSM 16605.
Предпочтительные воплощения настоящего изобретения включают препараты, в которых штаммы по изобретению предпочтительно используют в лиофилизированной форме.
Штаммы по изобретению предпочтительно приготовлены в виде препаратов в комбинации с подходящими носителями, эксципиентами, корригентами, стабилизаторами и добавками, такими как аминокислоты, витамины, антиоксиданты и ферменты, обычно используемыми при приготовлении фармацевтических и/или пищевых препаратов.
Исключительно в качестве примера, не ограничивающего объем изобретения, среди особенно предпочтительных добавок могут быть упомянуты глутамин, аргинин, супероксиддисмутаза и глутатион.
Препараты по настоящему изобретению могут быть введены перорально, с суппозиториями или вагинальными таблетками или капсулами, сами по себе или в комбинации с пищевыми продуктами, такими как, например, молоко, йогурт, производные молока или ферментированные молочные продукты, для лечения и/или профилактики желудочно-кишечных расстройств (диарея, антибиотикотерапия, ВЗК, профилактика рака толстой кишки), при которых желательно вводить соответствующее количество фолиевой кислоты.
Как указано выше, препараты по настоящему изобретению также могут быть введены после или во время антибиотикотерапии для восполнения и восстановления баланса непатогенной кишечной флоры.
Особенно предпочтительные препараты представляют собой препараты, которые вводят перорально, при помощи суппозиториев или вагинальных капсул или таблеток.
Типичные формы препарата включают, например, капсулы, растворы или суспензии для перорального введения, порошки, содержащиеся в пакетах, или аналогичные формы, таблетки, суппозитории и пессарии.
5
11
6
11
7
10
Относительно дозы, каждый препарат обычно содержит от 10 до 10клеток каждого бактериального штамма на разовую дозу, предпочтительно от 10 до 10 бактерий на дозу, наиболее предпочтительно от 10 до 10 бактерий на дозу.
8
11
9
10
Как правило, концентрация активного действующего вещества или смеси активных действующих веществ может находиться в диапазоне от 10 клеток бактериального(ых) штамма(ов) на грамм препарата до 10 клеток на грамм (г); предпочтительно от 10 клеток на г до 10 клеток на г препарата.
Один из примеров потенциальных применений по настоящему изобретению, который никоим образом не ограничивает объем изобретения, относится к случаю, при котором штаммы по изобретению вводили взрослому пациенту, принимающему антибиотикотерапию.
В течение всей продолжительности антибиотикотерапии и в течение пяти суток после ее прекращения указанный пациент получал по два пакетика в сутки лиофилизированного препарата DSM 16594 и DSM 16595 в комбинации с пробиотическими штаммами DSM 16506 и LMG Р-21380 и с глутамином.
10
Содержимое каждого пакета, вводимого в форме суспензии для перорального введения в воде, включало приблизительно 10 клеток каждого бактериального штамма и в качестве эксципиентов крахмал, твин, диспергирующие агенты, мандариновый ароматизатор, ацесульфам, сахарин, аскорбиновую кислоту и метилпарабен.
Также продемонстрировано, что бактериальные штаммы по настоящему изобретению особенно полезны для увеличения пищевой ценности продуктов питания.
Особенно предпочтительные продукты питания представляют собой продукты, получаемые из молока и/или его производных, например йогурт и ферментированное молоко, а также наполнителей для закусок, мороженого и так далее.
Подробное описание изобретения
- ВЫДЕЛЕНИЕ ШТАММОВ
Штамм Bifidobacterium adolescentis DMS 16594 выделили из фекалий взрослого субъекта, который в течение 3 месяцев перед выделением не принимал ни антибиотические, ни пробиотические препараты.
10% суспензию свежих фекалий готовили в анаэробном бульоне по Вилкинсу-Чалгрену (Oxoid Limited, Basingstoke, Hampshire, England, UK) в концентрации 0,5х, а именно путем приготовления разведения 1:1 среды, приготовленной в соответствии с инструкциями на упаковке.
-9
Серийные разведения до 10 готовили из гомогената (разведения 1:10, полученные путем разведения 1 мл предыдущего разведения в 9 мл той же самой среды).
-6
-9
Аликвоты по 0,1 мл разведений от 10 до 10 высевали в селективной среде для бифидобактерий, агар RB (Ссылка 3).
Чашки инкубировали в анаэробной среде при 37°С в течение 48 часов.
2
2
2
Все препараты готовили в анаэробной камере (оборудование: Anaerobic System, Mod. 2028, Forma Scientific Co., Marietta, ОН) в следующей атмосфере: N 85%, CO 10%, H 5%.
Колонию, соответствующую бактериальному штамму DMS 16594, выделяли из колоний, продуцирующих желтый ореол вследствие подкисления среды и изменения окраски индикатора.
- ОТНЕСЕНИЕ К РОДУ Bifidobacterium и к видам Bifidobacterium adolescentis
С целью отнесения DMS 16594 к роду Bifidobacterium осуществляли специфическую для рода амплификацию с использованием 16S рДНК-нацеленных праймеров Bif164/Bif662, из которых получен скорректированный ампликон из 523 пар оснований (п.о.). Параллельно осуществляли биохимический анализ для идентификации ключевого фермента метаболизма углеводов бифидобактерий, то есть фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы.
Вид adolescentis идентифицировали путем ДНК-ДНК гибридизации в соответствии с тем, как описано в статье Scardovi et al. (Ссылка 4).
- ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММА DMS 16594
Происхождение: человеческое
Возраст: 39. Пол: Ж
Род: Bifidobacterium
Вид: adolescentis
Морфология: искривленные палочки, временами раздвоенные по форме, с выпячиваниями и вздутиями.
Продуцирование фолиевой кислоты: от 56 до 62 нг/мл
Плазмиды: отсутствуют
Другие бактериальные штаммы, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 и DSM 16598 выделяли с использованием способа, аналогичного описанному выше.
- ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММА DSM 16595
Происхождение: человеческое
Возраст: 37. Пол: Ж
Род: Bifidobacterium
Вид: adolescentis
Морфология: искривленные палочки, временами раздвоенные по форме, с выпячиваниями и вздутиями.
Продуцирование фолиевой кислоты: от 16 до 20 нг/мл
Плазмиды: отсутствуют
- ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММА DMS 16596
Происхождение: человеческое
Возраст: 39. Пол: Ж
Род: Bifidobacterium
Вид: breve
Морфология: короткие искривленные палочки
Продуцирование фолиевой кислоты: от 6 до 9 нг/мл
Плазмиды: отсутствуют
- ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММА DMS 16597
Происхождение: человеческое
Возраст: 56. Пол: М
Род: Bifidobactehum
Вид: pseudocatenulatum
Морфология: искривленные палочки
Продуцирование фолиевой кислоты: от 14 до 16 нг/мл
Плазмиды: присутствуют, одна приблизительно 9 п.о.
- ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММОВ DMS 16598
Происхождение: человеческое
Возраст: 56. Пол: М
Род: Bifidobacterium
Вид: pseudocatenulatum
Морфология: искривленные палочки
Продуцирование фолиевой кислоты: от 14 до 19 нг/мл
Плазмиды: присутствуют, одна приблизительно 9 п.о.
- УСЛОВИЯ РАЗВИТИЯ ШТАММОВ
Предпочтительные бактериальные штаммы по настоящему изобретению DSM 16594, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 и DSM 16598 хранили в культурах с введением материала прокалыванием, то есть культуры, внесенной уколом в столбик агара (пробирки объемом 10 мл, содержащие 10 мл 0,9% агаризованной среды) или в жидких культурах MRS (Bacto Lactobacilli MRS Broth [0881-17] Difco Laboratories, Division of Becton Dickinsons and Company, Sparks, Maryland 21152 USA), в которые добавлен цистеин (0,05%).
Среду, приготовленную в соответствии с инструкциями на упаковке, стерилизовали при 110°С в течение 30 минут.
При выращивании штаммов в условиях окружающей среды без фолиевой кислоты используют так называемую минимальную синтетическую среду; ее идентифицируют как №7 и она имеет состав, описанный ниже.
Указанную среду готовят путем смешивания компонентов и растворов указанной последовательности при встряхивании при комнатной температуре. Каждый раз готовят свежую среду.
МИНИМАЛЬНАЯ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА №7
Глюкоза
20 г/л
Казаминовые кислоты для анализа витаминов
(Vitamin Assay Casaminoacids)
(DIFCO Laboratories, США [0288-17]
5 г/л
Мочевина
2 г/л
Цистеин
0,5 г/л
Раствор А
700 мл/л
Раствор Б
1 мл/л
Раствор В
1 мл/л
Раствор Г
5 мл/л
Растворы А, Б, В и Г имеют следующий состав:
Раствор А
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
10 г
Ацетат натрия
10 г
Аскорбиновая кислота
10 г
КН<sub>2</sub>РО<sub>4</sub>
1 г
MgSО<sub>4</sub>
0,7 г
NaCl
0,2 г
Твин 80
1 мл
Твин 80 растворяют в 700 мл кипящей дистиллированной воды; после чего последовательно добавляют все остальные компоненты.
Раствор Б
Борная кислота
25 мг
CuSO<sub>4</sub>
2 мг
Кl
5 мг
FeCl<sub>3</sub>
10 мг
MnSO<sub>4</sub>
20 мг
Молибдат натрия
10 мг
ZnSO<sub>4</sub>
20 мг
Эти компоненты последовательно растворяют в 50 мл дистиллированной воды при комнатной температуре.
Раствор В
Биотин
0,2 мг
Пантотенат кальция
40 мг
Ниацин
40 мг
Парааминобензойная кислота
20 мг
Пиридоксин
40 мг
Рибофлавин
20 мг
Тиамин
40 мг
Эти компоненты растворяют в 100 мл дистиллированной воды при комнатной температуре.
Раствор Г
FeSO<sub>4</sub>
50 мг
Соль растворяют в 25 мл дистиллированной воды.
Среду распределяют по пробиркам объемом 10 мл и стерилизуют при 100°С в течение 30 минут.
- МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ, ПРОДУЦИРУЕМОЙ ШТАММОМ DSM 16594
Количество фолиевой кислоты, продуцируемой при ферментации штаммом DSM 16594, а также другими штаммами по изобретению, определяли путем микробиологического анализа.
Культуры, используемые для определения продуктивности фолиевой кислоты пересевали по меньшей мере 3 раза в минимальной среде №7, не содержащей фолиевую кислоту.
Анализ основан на турбидиметрическом определении развития Enterococcus hirae ATCC 8043, которое изменяется в зависимости от количества фолиевой кислоты, присутствующей в культуральной жидкости.
Калибровочную кривую, необходимую для количественного определения продуцируемой фолиевой кислоты, строят путем культивирования Enterococcus hirae ATCC 8043 в среде Bacto Folic AOAC (Difco, США [0967-15]).
В указанную среду, содержащую все питательные вещества, необходимые для развития, за исключением фолиевой кислоты, добавляют возрастающие количества фолиевой кислоты (0, 1, 2, 4, 6 и 8 нг на пробирку, содержащую 10 мл культуральной жидкости).
Параллельно Enterococcus hirae ATCC 8043 инокулируют в пробирки со средой Bacto Folic AOAC, в которые добавлены различные количества супернатанта ферментационного раствора штамма DSM 16594.
После инкубации всех пробирок при 37°С в течение 16-18 часов проводят турбидиметрическое измерение образцов при 600 нм и строят линейный график в полулогарифмическом масштабе путем нанесения на график логарифма концентрации фолиевой кислоты в зависимости от оптической плотности образца.
Приготовление стандартного раствора (с.р.) фолиевой кислоты в концентрации 2 мкг/л, то есть 2 нг/мл
2
2
2
2
Растворяют 50 мг фолиевой кислоты в приблизительно 30 мл 0,01 н. NaOH и 300 мл HO. pH доводят до 7,5 с использованием разбавленной HCl (0,1 н.) и объем доводят до 500 мл путем добавления НO. Добавляют 2 мл вышеописанного раствора к 50 мл HO, pH доводят до 7,5 и объем доводят до 100 мл путем добавления НO (с.р. 2 мкг/мл).
2
1 мл этого раствора разбавляют НО до 1 литра, так чтобы получить с.р. 2 нг/мл (2 мкг/л).
Приготовление пробирок, содержащих среду Bacto Folic Acid
2
2
11 г исходного порошка растворяют в 100 мл НO. Для полного растворения компонентов среду кипятят в течение 2-3 минут. Аликвоты объемом 5 мл распределяют в пробирки после того, как их несколько раз ополаскивают дистиллированной водой. Добавляют различные аликвоты супернатанта ферментационного раствора или с.р. фолиевой кислоты (2 нг/мл) и затем добавляют HO для доведения конечного объема в каждой пробирке до 10 мл. Стерилизуют при 121°С в течение 5 минут.
нг фолиевой кислоты на пробирку
0
1
2
4
6
8
10
мл с.р. 2 нг/мл
0
0,5
1
2
3
4
5
мл Н<sub>2</sub>O
5
4,5
4
3
2
1
0
мкг фолиевой кислоты на л
0
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1
4 мл воды и 1 мл супернатанта ферментационного раствора, полученного путем центрифугирования и фильтрации через фильтр 0,22 мкм с последующим подходящим разведением, добавляют в 2 другие пробирки.
Пробирку, не содержащую фолиевую кислоту, готовят в виде контрольного образца; ее не инокулируют.
Приготовление инокулята
За два дня до анализа свежую культуру Enterococcus hirae ATCC 8043 с материалом, введенным прокалыванием, инокулируют в пробирку, содержащую жидкую среду М17 (Bacto M17 Broth, Difco Laboratories, США [1856-17]). Для приготовления культуры, которую используют в качестве инокулята, культуру в M17 подвергают стерильному центрифугированию, супернатант удаляют и клетки трижды промывают 9 мл физиологического раствора. Клеточный осадок снова суспендируют в 9 мл физиологического раствора и 1 мл этой бактериальной суспензии добавляют к 100 мл стерильного физиологического раствора, содержащегося в колбе Эрленмейера. Одну каплю этой суспензии добавляют в пробирку со средой Bacto Folic AOAC, к которой также добавляют 10 нг фолиевой кислоты, и пробирку инкубируют при 37°С без встряхивания.
В день проведения теста культуру, приготовленную в соответствии с вышеописанным способом, используют для приготовления тестируемого инокулята: культуру стерильно центрифугируют, супернатант удаляют и клетки трижды промывают 9 мл физиологического раствора. Клетки снова суспендируют в 9 мл физиологического раствора и 1 мл этой бактериальной суспензии добавляют к 100 мл стерильного физиологического раствора, содержащегося в колбе Эрленмейера. Для инокуляции тестируемых пробирок 1 каплю этой суспензии добавляют во все пробирки, стерилизованные при 121°С в течение 5 минут.
Пробирки затем инкубируют при 37°С в течение 16-18 часов.
- ПРОДУКТИВНОСТЬ В ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЕ
Количество фолиевой кислоты, продуцируемой штаммом DSM 16594 в минимальной среде №7, составляет 56-62 нг/мл.
Тесты дают постоянные воспроизводимые результаты, когда их проводят как в культурах в отсутствие контроля рН, так и в культурах в биореакторах с постоянным рН.
Как правило, рН веществ, содержащихся в толстой кишке, может значительно варьировать в связи с некоторыми патологиями или факторами питания. Показано, что продуцирование фолиевой кислоты штаммом DSM 16594 является постоянным (приблизительно 57-60 нг/мл) независимо от измеренного значения рН, которое в этом случае находится в диапазоне от 5,5 до 7,0.
Также было обнаружено, что штамм DSM 16594 продуцирует фолиевую кислоту, не подвергаясь действию отрицательной обратной связи, следовательно, в той степени, которая полностью не зависима от концентрации фолиевой кислоты, присутствующей в содержимом кишечника. Фактически штамм DSM 16594 также культивировали в минимальной среде №7 в присутствии возрастающих концентраций фолиевой кислоты (0, 1, 2, 5, 10 и 20 нг/мл) и обнаружили, что этот штамм всегда синтезирует и секретирует постоянные количества фолиевой кислоты (58-61 нг/мл), которые таким образом добавляются к уже присутствующему в среде количеству. Этот аспект весьма важен, поскольку свидетельствует о том, что после поглощения штамма DSM 16594 в качестве пробиотика в кишечнике возможно постоянное поступление фолиевой кислоты, представляющей собой витамин, который незаменим для быстрого метаболизма в энтероцитах. Разрегуляция метаболизма штамма DSM 16594, то есть отсутствие контрольного механизма, блокирующего биосинтез фолиевой кислоты, когда уже присутствуют достаточные количества последней, подтверждается фактом, что количество продуцируемой фолиевой кислоты по меньшей мере в 50 раз больше, чем количество, необходимое для обеспечения здорового развития бактерий, которые не синтезируют этот витамин и таким образом должны получать его из внешних источников для правильного развития.
- ОЦЕНКА ВКЛАДА ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ, ПРОДУЦИРУЕМОЙ ШТАММОМ DSM 16594 В ФЕКАЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ
Для оценки того, осуществляется ли эффективное продуцирование фолиевой кислоты штаммом DSM 16594 в смешанных культурах, то есть культурах, имитирующих состав кишечной микрофлоры, готовили фекальные культуры, то есть культуры, инокулированные разведенными образцами фекалий, которые могут быть инокулированы штаммом DSM 16594 или быть не инокулированными им; в указанных культурах определяли увеличение концентрации фолиевой кислоты.
Используемые смешанные культуры инокулировали образцами фекалий, разбавленными таким образом, чтобы имитировать нормальный микробиологический состав кишечного содержимого. Используемая культуральная среда содержит 10 нг/мл фолиевой кислоты, что составляет такое количество, которое обеспечивает развитие всей инокулированной популяции микроорганизмов. Среда также содержит пептоны, витамины и фрукто-олигосахариды (ФОС) в качестве источника углерода.
Выбор ФОС является следствием того факта, что потребление пробиотической бифидобактерии в комбинации с этим пребиотическим углеводом, то есть углеводом, который ни переваривается, ни всасывается, и таким образом способен достичь толстой кишки, где он преимущественно метаболизируется бифидобактериями, способствует колонизации кишечника как данной пробиотической бифидобактерией, так и эндогенными бифидобактериями.
- ФЕКАЛЬНЫЕ КУЛЬТУРЫ
Фекальные культуры выращивали в среде, приготовленной в соответствии со способом, описанным ранее, они имеют следующий состав:
Raftilose P95 (ФОС)
(Orafti Group, Tienen, Belgium)
20 г/л
Казаминовые кислоты для анализа витаминов
(DIFCO Laboratories, США [0288-17]
5 г/л
Цистеин
0,5 г/л
Фолиевая кислота
10 мкг/л
Раствор А
700 мл/л
Раствор Б
1 мл/л
Раствор В
1 мл/л
Раствор Г
5 мл/л
Раствор Д
10 мл/л
Раствор А
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
10 г
Ацетат натрия
10 г
Аскорбиновая кислота
10 г
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1 г
MgSO<sub>4</sub>
0,7 г
NaCl
0,2 г
Твин
80 1 мл
Твин 80 растворяют в 700 мл кипящей дистиллированной воды; затем последовательно добавляют все остальные компоненты.
Раствор Б
Борная кислота
25 мг
CuSO<sub>4</sub>
2 мг
Kl
5 мг
FeCl<sub>3</sub>
10 мг
MnSO<sub>4</sub>
20 мг
Молибдат натрия
10 мг
ZnSO<sub>4</sub>
20 мг
Эти компоненты последовательно растворяют в 50 мл дистиллированной воды при комнатной температуре.
Раствор В
Биотин
0,2 мг
Пантотенат кальция
40 мг
Ниацин
40 мг
Парааминобензойная кислота
20 мг
Пиридоксин
40 мг
Рибофлавин
20 мг
Тиамин
40 мг
Эти компоненты последовательно растворяют в 100 мл дистиллированной воды при комнатной температуре.
Раствор Г
FeSO<sub>4</sub>
50 мг
Соль растворяют в 25 мл дистиллированной воды при комнатной температуре.
Раствор Д
50 мг/л гемина (Sigma-Aldrich SRL. Via Gallarate. Milan. Италия [Н55331]) растворяют в 5 мл 1М NaOH и добавляют дистиллированную воду для доведения объема до 1 литра.
Способ
3
3
Аликвоты среды объемом 40 мл распределяют в колбы объемом 100 см, оборудованные прокалываемой резиновой пробкой. Резиновые пробки прокалывают иглой и колбы помещают в баню с кипящей водой. После 10 минут инкубации при 100°С пробку прокалывают второй иглой, через которую в эту колбу вдувают азот в течение 10 минут под давлением 0,15 бар (15·10 Па). После завершения вдувания обе иглы извлекают и колбы стерилизуют при 110°С в течение 30 минут.
Приготовление инокулята
2
2
2
Свежий образец фекалий переносят в анаэробную камеру (10% Н, 10% СO, 80% N).
Затем готовят 10% суспензию в описанной выше среде и гомогенизируют со стерильными стеклянными шариками, имеющими диаметр 3 мм.
Из этой суспензии готовят разведение 1:100 в той же самой среде, которая содержится в колбах. 0,4 мл последнего разведения инокулируют с использованием шприца в две стерильные колбы, содержащие по 40 мл культуральной среды.
Сравнение фолиевой кислоты, присутствующей в образцах фекалий, инокулированных или не инокулированных штаммом DSM 16594
Один из двух идентичных образцов, инокулированных разведенным образцом фекалий, также инокулируют 0,4 мл культуры штамма DSM 16594, приготовленной для развития в течение 24 часов в минимальной среде №7. Обе фекальные культуры, одна из которых также инокулирована штаммом DSM 16594, а другая из которых не инокулирована, инкубируют при 37°С в течение 24 часов.
По истечении указанного времени аликвоты обеих культур центрифугируют при 3500 g в течение 10 минут и супернатант фильтруют с использованием фильтра 0,4 мкм. Супернатанты, разведенные соответствующим образом, используют для микробиологического анализа фолиевой кислоты.
Продуктивность фолиевой кислоты в фекальных культурах
Концентрация фолиевой кислоты в фекальных культурах, не инокулированных штаммом DSM 16594, находится в диапазоне, составляющем приблизительно от 30 до 70 нг/мл.
Соответствующие культуры, инокулированные штаммом DSM 16594, демонстрировали значительное увеличение концентрации фолиевой кислоты. Указанное увеличение находилось в диапазоне от 30 до 50 нг/мл, представляя собой количество, которое таким образом добавляли к ранее указанным 30-70 нг/мл.
Это последнее обнаружение дополнительно показывает, что введение пробиотического бактериального штамма по настоящему изобретению DSM 16594 может обеспечить присутствие высоких уровней фолиевой кислоты в толстом кишечнике независимо от состояния здоровья пациента.
В результате восстановление и поддержание оптимального баланса кишечной бактериальной флоры может быть облегчено и обеспечено.
В предыдущем экспериментальном разделе подробно описано применение одного из особенно предпочтительных бактериальных штаммов по настоящему изобретению, а именно штамма DSM 16594.
Были проведены идентичные испытания в тех же самых экспериментальных условиях и с использованием тех же самых количеств реагентов также с другими четырьмя предпочтительными бактериальными штаммами по настоящему изобретению, а именно DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 и DSM 16598.
Было продемонстрировано, что эти бактериальные штаммы продуцируют фолиевую кислоту аналогичным образом и с такими же характеристиками, как и штамм DSM 16594.
Показано, что продуктивность Bifidobacterium adolescentis DSM 16595, Bifidobacterium breve DSM 16596, Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16597 и Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16598 ниже по сравнению с продуктивностью Bifidobacterium adolescentis DSM 16594.
В частности, DSM 16595 продуцирует приблизительно 30,5%, DSM 16596 приблизительно 13%, DSM 16597 25,5% и DSM 16598 28% от количества фолиевой кислоты, продуцируемой DSM 16594.
Тем не менее, также в этих случаях количество продуцируемой фолиевой кислоты (составляющей, соответственно, приблизительно 16-20 нг/мл для DSM 16595; 6-9 нг/мл для DSM 16596; 14-16 нг/мл для DSM 16597 и 14-19 нг/мл для DSM 16598) значительно выше (приблизительно в 14-16 раз выше для DSM 16595; в 5-7 раз выше для DSM 16596; в 12-13 раз выше для DSM 16597 и в 12-15 раз выше для DSM 16598) по сравнению с количеством, необходимым для обеспечения здорового развития других бактерий, которым этот витамин требуется для оптимального развития.
ССЫЛКИ
1. Fuchs C.S. et al. (2002). The influence of folate and multivitamin use on the familial risk of colon cancer in women. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 11, 227-234.
2. Ma J. et al. (1999). A polymorphism of the methionine synthase gene: association with plasma folate, vitamin В 12, homocyst(e)ine and colorectal cancer risk. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 8, 825-829.
3. Hartemink R., Kok BIFIDOBACTERIUM. Weenk G.H, Rombouts F.M. (1996). Raffinose-Bifidobacterium (RB) agar, a new selective medium for bifidobacteria J. Microbiol. Methods. 27, 33-43.
4. Scardovi V. Crociani F. (1974). Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium angulatum: three new species and their deoxyribonucleic acid homology relationships. Int. J. Syst. Bacteriol. 24, 6-20.