СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ОНКОГЕННЫХ СЛИТЫХ БЕЛКОВ, ОСНОВАННЫЕ НА АНАЛИЗЕ БЛИЗКОГО ВЗАИМНОГО РАСПОЛОЖЕНИЯ

1. Способ определения уровня или анионного состояния онкогенного слитого белка, который включает:
(a) контактирование клеточного экстракта с первой связывающей молекулой, специфичной к первому домену полноразмерного первого белка в условиях, подходящих для преобразования первого полноразмерного белка, присутствующего в клеточном экстракте, в комплекс, включающий первый полноразмерный белок и первую связывающую молекулу, причем первый домен первого полноразмерного белка отсутствует в соответствующем онкогенном слитом белке, содержащем второй, другой домен первого полноразмерного белка, слитый с первым доменом второго, другого полноразмерного белка;
(b) удаление из клеточного экстракта комплекса из стадии (а) с получением клеточного экстракта, лишенного первого полноразмерного белка;
(c) контактирование клеточного экстракта из стадии (b) со второй связывающей молекулой, специфичной ко второму, другому домену первого полноразмерного белка в условиях, подходящих для преобразования онкогенного слитого белка, присутствующего в клеточном экстракте, в комплекс, содержащий онкогенный слитый белок и вторую связывающую молекулу; и
(d) определение уровня или активационного состояния комплекса из стадии (с), тем самым определяя уровень или активационное состояние онкогенного слитого белка.
2. Способ по п.1, в котором клеточный экстракт включает экстракт клеток, выделенных из образца.
3. Способ по п.2, в котором образец выбирается из группы, состоящей из цельной крови, сыворотки, плазмы, мочи, мокроты, смывной жидкости бронхов, слез, аспирата из сосков, лимфы, слюны, тонкоигольного аспирационного биоптата (FNA) и их комбинаций.
4. Способ по п.2, в котором выделенные клетки выбираются из группы, состоящей из циркулирующих раковых клеток, лейкоцитов и их комбинаций.
5. Способ по п.2, в котором выделенные клетки не подвергаются отмывке перед лизисом для получения клеточного экстракта.
6. Способ по п.1, в котором онкогенный слитый белок выбирается из группы, состоящей из BCR-ABL, DEK-CAN, E2A-PBX1, RARα-PML, IREL-URG, CBFβ-MYH11, AML1-MTG8, EWS-FLI, LYT-10-Cα1, HRX-ENL, HRX-AF4, NPM-ALK, IGH-MYC, RUNX1-ETO, TEL-TRKC, TEL-AML1, MLL-AF4, TCR-RBTN2, COL1A1-PDGF, E2A-HLF, PAX3-FKHR, ETV6-NTRK3, RET-PTC, TMRSS-ERG, TPR-MET и их комбинаций.
7. Способ по п.1, в котором онкогенный слитый белок представлен BCR-ABL.
8. Способ по п.7, в котором первый полноразмерный белок представлен BCR.
9. Способ по п.8, в котором первый домен первого полноразмерного белка включает С-концевой участок BCR (BCR-C).
10. Способ по п.9, в котором второй, другой домен первого полноразмерного белка включает N-концевой участок BCR (BCR-N).
11. Способ по п.7, в котором второй, другой полноразмерный белок представлен ABL.
12. Способ по п.11, в котором первый домен второго, другого полноразмерного белка включает С-концевой участок ABL (ABL-C).
13. Способ по п.1, в котором онкогенный слитый белок представлен BCR-ABL, a активационное состояние представлено состоянием фосфорилирования.
14. Способ по п.1, дополнительно включающий определение уровня или активационного состояния одной или нескольких молекул сигнальной трансдукции.
15. Способ по п.14, в котором одна или несколько молекул сигнальной трансдукции представлены субстратом BCR-ABL.
16. Способ по п.15, в котором субстрат BCR-ABL выбирается из группы, состоящей из CRKL, JAK2, STAT5, VAV, ВАР-1 и их комбинаций.
17. Способ по п.1, в котором стадии (с) и (d) включают ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), метод проточной цитометрии или метод сортировки по тегам.
18. Способ по п.1, в котором стадии (с) и (d) включают метод двойного детектирования сближения.
19. Способ по п.18, в котором стадия (с) дополнительно включает:
(с') контактирование клеточного экстракта из стадии (b) с третьей связывающей молекулой и четвертой связывающей молекулой в условиях, подходящих для преобразования онкогенного слитого белка, присутствующего с клеточном экстракте, в комплекс, включающий онкогенный слитый белок и вторую, третью и четвертую связывающие молекулы,
причем третья связывающая молекула помечена содействующей молекулой и специфична к одному из следующего: (i) первому домену второго, другого полноразмерного белка; (ii) второму, другому домену первого полноразмерного белка; или (iii) месту слияния между вторым, другим доменом первого полноразмерного белка и первым доменом второго, другого полноразмерного белка,
причем четвертая связывающая молекула помечена первым членом пары амплификации сигнала и специфична к первому домену второго, другого полноразмерного белка, и
при этом содействующая молекула вырабатывает окислитель, который канализируется к и реагирует с первым членом пары амплификации сигнала;
а стадия (d) дополнительно включает:
(d') инкубирование комплекса из стадии (с') со вторым членом пары амплификации сигнала с генерированием амплифицированного сигнала; и
(d'') детектирование амплифицированного сигнала, генерированного первым и вторым членами пары амплификации сигнала.
20. Способ по п.1, который дополнительно включает:
(e) контактирование клеточного экстракта с пятой связывающей молекулой, специфичной ко второму домену второго, другого полноразмерного белка в условиях, подходящих для преобразования второго, другого полноразмерного белка, присутствующего в клеточном экстракт, в комплекс, включающий второй, другой полноразмерный белок и пятую связывающую молекулу, причем второй домен второго, другого полноразмерного белка отсутствует в онкогенном слитом белке; и
(f) удаление из клеточного экстракта комплекса из стадии (е) для получения клеточного экстракта, лишенного второго, другого полноразмерного белка,
причем стадия (е) проводится до, во время или после стадии (а).
21. Способ оптимизации терапии и/или снижения токсичности у субъекта, страдающего раком и получающего курс терапии для лечения рака, который включает:
(a) выделение раковых клеток после введения противоракового препарата;
(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;
(c) измерение уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка в клеточном экстракте в соответствии со способом по п.1;
(d) сравнение измеренного уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка с уровнем экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка, измеренным ранее во время курса терапии; и
(e) определение последующей дозы в курсе терапии для субъекта или же того, следует ли назначить субъекту другой курс лечения, исходя из сравнения на стадии (d).
22. Способ по п.21, в котором в клеточном экстракте измеряется и уровень экспрессии, и уровень активации онкогенного слитого белка.
23. Способ по п.22, в котором стадия (с) дополнительно включает вычисление отношения активированного к общему уровню онкогенного слитого белка.
24. Способ по п.23, в котором стадия (d) включает сравнение рассчитанного отношения активированного к общему уровню онкогенного слитого белка с отношением активированного к общему уровню онкогенного слитого белка, рассчитанным для субъекта ранее.
25. Способ по п.23, в котором рассчитанное отношение активированного к общему уровню онкогенного слитого белка коррелирует со степенью ингибирования активированного онкогенного слитого белка при лечении противораковым препаратом.
26. Способ по п.21, в котором стадии (с)-(е) альтернативно включают:
(с') измерение в клеточном экстракте уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка и одной или нескольких молекул сигнальной трансдукции в этом пути;
(d') сравнение измеренного уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка и молекул сигнальной трансдукции с уровнем экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка и молекул сигнальной трансдукции, измеренным ранее во время курса терапии; и
(е') определение последующей дозы в курсе терапии для субъекта или же того, следует ли назначить субъекту другой курс терапии, исходя из сравнения на стадии (d').
27. Способ выбора подходящего противоракового препарата для лечения рака, который включает:
(a) выделение раковых клеток после введения противоракового препарата или перед инкубацией с противораковым препаратом;
(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;
(c) определение в клеточном экстракте уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка в соответствии со способом по п.1; и
(d) определение того, подходит или не подходит противораковый препарат для лечения рака путем сравнения выявленного уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка с контрольным профилем экспрессии и/или активации, полученным в отсутствие противоракового препарата.
28. Способ определения реакции рака на лечение противораковым препаратом, который включает:
(a) выделение раковых клеток после введения противоракового препарата или перед инкубацией с противораковым препаратом;
(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;
(c) определение в клеточном экстракте уровня экспрессии и/или активации (например, фосфорилирования) онкогенного слитого белка в соответствии со способом по п.1; и
(d) идентификацию рака как реагирующего или не реагирующего на лечение противораковым препаратом путем сравнения выявленного уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка с контрольным профилем экспрессии и/или активации, полученным в отсутствие противоракового препарата.
29. Способ предсказания реакции субъекта, страдающего раком, на лечение противораковым препаратом, который включает:
(a) выделение раковых клеток после введения противоракового препарата или перед инкубацией с противораковым препаратом;
(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;
(c) определение в клеточном экстракте уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка в соответствии со способом по п.1; и
(d) предсказание вероятности того, что субъект будет реагировать на лечение противораковым препаратом, путем сравнения выявленного уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка с контрольным профилем экспрессии и/или активации, полученным в отсутствие противоракового препарата.
30. Способ определения того, что субъект, страдающий раком, не поддается лечению противораковым препаратом, который включает:
(a) выделение раковых клеток после введения противоракового препарата или перед инкубацией с противораковым препаратом;
(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;
(c) определение в клеточном экстракте уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка в соответствии со способом по п.1; и
(d) определение того, что субъект не поддается или поддается лечению противораковым препаратом, путем сравнения выявленного уровня экспрессии и/или активации онкогенного слитого белка с контрольным профилем экспрессии и/или активации полученным в отсутствие противоракового препарата или в присутствии противоракового препарата в более раннее время.