ПРИМЕНЕНИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОСТОЯЩЕЙ ИЗ АМИНОКИСЛОТ ГЛИЦИНА, АРГИНИНА, ЦИСТЕИНА И РЕСВЕРАТРОЛА, ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ТЯЖЕСТИ ДИАБЕТА И ВЫСОКОГО СОДЕРЖАНИЯ ЖИРА В ОРГАНИЗМЕ, ХОЛЕСТЕРИНА, МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ, ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ И УСКОРЕННОГО СТАРЕНИЯ У ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
USE OF A COMPOSITION CONSISTING OF THE AMINO ACIDS GLYCINE, ARGININE, CYSTEINE AND RESVERATROL TO REDUCE THE SEVERITY OF DIABETES AND HIGH CONTENT OF FAT, CHOLESTEROL, URIC ACID, BLOOD GLUCOSE AND ACCELERATED AGING IN ANIMALS AND HUMANS

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение направлено на определение фармацевтических композиций и предлагаемого способа лечения метаболического синдрома, сахарного диабета и старения. В описании раскрыты соединения и композиции природного происхождения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний, основанному на применении ответов, разработанных в клеточных системах и организмах млекопитающих (животных и человека) с фармацевтически приемлемыми дозами соединений, представляющих собой часть Состава I, таких как контроль метаболизма и рост клеток.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Метаболический синдром, ранее известный как синдром X, представляет собой промежуточное состояние между нормальным обменом веществ и сахарным диабетом 2 типа. Это новая эпидемия, которая была определена как ряд метаболических факторов риска, предрасполагающих людей к сердечно-сосудистым заболеваниям и хронической почечной недостаточности, среди других патологических состояний. Метаболический синдром связан с абдоминальным ожирением, атерогенной дислипидемией, гипертонией, провоспалительным и протромботическим состоянием, с нарушением глюкозы или без него, то есть сахарным диабетом. Симптомы связаны с высоким содержанием триглицеридов, низким содержанием липопротеинов высокой плотности, повышенным кровяным давлением или гипертонией и повышенным содержанием глюкозы, а также симптомами воспаления. Каждая из этих характеристик является значительным фактором риска развития сосудистой дисфункции и сердечно-сосудистых, почечных и печеночных заболеваний (Eckel R. H et al. в Lancet, 2005, 365: 1415). Метаболический синдром увеличивает риск преждевременной смерти, поэтому эффективные и доступные стратегии, помогающие снизить факторы кардиометаболического изменения и контролировать синдром, являются важными целями для пользы большой популяции, подвергающейся высокому риску.
В настоящее время основные подходы к лечению людей с метаболическим синдромом направлены на снижение основных причин, лечение гипертонии и других сердечно-сосудистых факторов риска, а также на контроль инсулинорезистентности. Лечение метаболического синдрома включает в себя изменение образа жизни, а также медикаментозное лечение. В дополнение к лечению метаболического синдрома, внедрению рекомендаций по питанию и адекватной физической активности для устранения многих основных механизмов метаболического синдрома, был разработан ряд лекарственных средств, предназначенных для контроля измененного содержания метаболитов, связанных с проявлением патологического состояния, включающих в себя различные биологически активные питательные соединения, направленные на достижение той же цели. Функциональные знания о воздействии питательных веществ, особенно аминокислот и полифенолов в рационе на различные молекулярные мишени, позволяют разработать композицию природных соединений для лечения ожирения, метаболического синдрома, сахарного диабета и старения. Некоторые концепции и патенты, относящиеся к предмету настоящего изобретения, описаны ниже.
Lodder и Cassis (Lodder R A and Cassis L A в патенте США 2015/9060962 от 23 июня 2015 г.) запатентовали фармацевтические композиции, содержащие D-тагатозу со стильбеном или стильбеноидом или их производными или без них, для профилактики или лечения атеросклероза, метаболического синдрома, ожирения или сахарного диабета. Стильбеноиды, такие как ресвератрол (3,5,4-тригидрокси-транс-стильбен), который представляет собой тип природного фенола и фитоалексин, производимый в растениях, применялись во время ответа на атаку патогена или другое повреждение. Большое количество ресвератрола можно найти в различных типах ягод, винограде, клюкве и т.д. (Fremont в Life Sci, 2000, 66: 663). До этого патента Baur et al. (J.A. Baur et al. в Nature, 2006, 444 (7117). 337) и Do et al. (Do GM et al. в Biochem Biophys Res Commun, 2008, 374 (1). 55) сообщили о влиянии ресвератрола на улучшение здоровья и выживаемость мышей на диетах с высоким содержанием калорий, контроль изменений уровня холестерина и другие возможности. Другое соединение, химически связанное с ресвератролом, птеростильбен, известный как 3,5-диметокси-4'-гидроксистильбен, характеризуется тем, что проявляет эффекты, аналогичные ресвератролу.
Сиртуины представляют собой ферменты с гистондеацетилазой и активностью некоторых транскрипционных факторов, которые регулируют метаболические пути, участвующие в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, старении и стрессоустойчивости (Jiang WJ Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, 373 (3): 341). Считается, что ресвератрол прямо или косвенно активирует SIRT1 (NAD-зависимую сиртуин-1-деацетилазу) и PGC-1 (коактиватор гамма-рецепторов, активируемый пролифератором пероксисом) и влияет на функционирование митохондрий (Lagouge M. et al. в Cells, 2006, 127). (6): 1109; Alcain F J and Villalba J M в Expert Opin Ther Pat, 2009, 19 (4): 403; Beher D. et al в Chem Biol Drug Des, 2009, 74 (6): 619). В клетках, обработанных ресвератролом, наблюдается усиление действия SOD2 (MnSOD) (супероксиддисмутаза 2, митохондриальная, также известная как марганецзависимая супероксиддисмутаза), снижающей супероксид, что предусматривает устойчивость к дисфункции митохондрий, переходу проницаемости и гибели путем апоптоза при некоторых заболеваниях. Было обнаружено, что ресвератрол также действует как агонист GPER (GPR30) (связанный с G-белком рецептор эстрогена 1, также известный как связанный с G-белком рецептор 30) (Prossnitz E. R. and Barton M. в Mol. Cell. Endocrin. 2014, 389 (1-2): 71). Возможный механизм действия ресвератрола может объясняться модуляцией аутофагии (аутофагоцитоз направлен на устранение компонентов дисфункционального механизма) (Ghosh H. S. et al в PLoS ONE, 2010, 5 (2). e9199). Лабораторные животные показали положительные эффекты ресвератрола в качестве противодиабетического средства (Baur J A et al. в Nature, 2006, 444 (7117): 337; Lagouge M. et al в Cells, 2006, 127 (6). 1109.). Это соединение действует в качестве гамма-агониста PPAR (гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR-γ или PPARG), также известный как рецептор глитазона, или R1C3 (подсемейство 1 ядерного рецептора, группа C, представитель 3, представляет собой ядерный рецептор типа II), рассматривается как фармакологическая мишень для лечения сахарного диабета 2 типа (L. Wang et al. в Biochem Pharmacol 2014, 92 (1): 73). Пероксисомы представляют собой органеллы, которые могут вызывать заболевания и процессы старения при неправильном функционировании. Способность стимулировать активность эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и ингибировать агрегацию тромбоцитов приписывают ресвератролу (Vita J. A. Duffy S J в Curr Opinion Lipid, 2003, 14 (1). 21; Olas B. and. Wachowicz B. в Platelets, 2005, 16 (5): 251).
Растительные экстракты могут рассматриваться как источник антиоксидантов, аналогов ресвератрола. В патенте США 2016/9278104 от 8 марта 2016 г. на имя Romero T. установлено использование экстракта листьев Nelumbo nucifera для уменьшения и/или устранения одного или нескольких факторов риска, связанных с метаболическим синдромом. Композиция учитывает наличие креатинина, который представляет собой азотсодержащую органическую кислоту, очень похожую на аминокислотную структуру, находящуюся в мышцах и нервных клетках разных живых организмов. Он синтезируется естественным образом в печени, поджелудочной железе и почках из аминокислот, таких как аргинин, глицин и метионин, в количестве один грамм креатинина в день. Он рассматривается как непосредственный и прямой вектор для транспорта АТФ и обеспечения энергии мышечных миофибрилл.
Gokaraju G. R. et al. в патенте США 2016/9244164 от 26 января 2016 г. определяет композицию фитохимических фракций для фармацевтического применения или в качестве биологически активной добавки, полученной из Sphaeranthus indicus и/или Garcinia mangostana. Композиция применяется для контроля, профилактики и лечения ожирения, метаболического синдрома, сахарного диабета и других метаболических нарушений, а также для регулирования расхода энергии, профилактики атеросклеротических бляшек в коронарной артерии и брюшной аорте, повышения чувствительности к инсулину, контроля содержания глюкозы, содержания триглицеридов и баланса содержания глюкозы у млекопитающих. Упоминаются экстракты, которые содержат аминокислоты среди других компонентов; однако, они не раскрыты.
Широко известно, что аминокислоты представляют собой важную часть в синтезе различных белков, участвующих в метаболизме человека. В настоящем изобретение это считается причиной, по которой композиция может быть выбрана для лечения и профилактики метаболического синдрома, ожирения, сахарного диабета и старения.
Varfolomeev S. D. and Gurevich K. G. (в Russian Chemical Bulletin, 2001, 50 (10): 1709) провели биокомпьютерный анализ, демонстрирующий, что аминокислота глицин наиболее часто обнаруживается (37,5%) в определенных положениях первичных последовательностей в различных семействах ферментов. Авторы связывают это свойство с ролью глицина в архитектуре фермента: он представляет собой аминокислоту с хиральным атомом, который обеспечивает движение и гибкость белковых цепей. Это демонстрирует важность глицина для обмена веществ. Следующими 5 аминокислотами являются аспарагиновая кислота (12,9%), цистеин (6,7%), гистидин (6,2%) и аргинин (5,5%). Цистеин отвечает за поддержание конформации различных белков за счет образования серных мостиков. Гистидин и аргинин, подобные аспарагиновой кислоте, часто встречаются в активных сайтах ферментов, играя роль в каталитическом сайте в качестве основных средств и электрофилов.
В случае аргинина (Wu G. A. B. et al в Curr Opin Clin Nutr Metabol Care, 2000, 3 (1): 59) сообщается о его способности снижать резистентность к инсулину, что позволяет уменьшить количество инсулина при лечении сахарного диабета, увеличить толерантность к глюкозе и улучшить чувствительности к инсулину при сахарном диабете 2 типа.
Цистеин представляет собой ограничивающий субстрат для синтеза глутатиона и отвечает за защиту клеток от вирусов, бактерий, грибов, канцерогенов, а также от других патологических состояний. Пероральный цистеин, применяемый без каких-либо других компонентов, не рекомендуется, поскольку он быстро катаболизирует в желудочно-кишечном тракте, переходя в токсическое состояние. Цистеин обладает антиоксидантными свойствами благодаря способности тиолов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях. Эти антиоксидантные свойства цистеина в основном выражены в трипептиде глутатионе. Доступность перорального глутатиона недостаточна, поэтому он должен быть биосинтезирован из аминокислот, которые его составляют - цистеина, глицина и глутаминовой кислоты, из которых цистеин является ограничивающим субстратом. Различные клинические исследования, дополненные лабораторными исследованиями, показали, что старение напрямую связано с прогрессирующим снижением цистеина в плазме и внутриклеточной концентрации глутатиона. Это снижение приводит к связанному с возрастом окислительному стрессу. Прием цистеина сверх нормальной диеты уменьшает различные процессы старения, помогая костной и мышечной системам, уменьшая воспаление и уровень цитокинов (L. Wang et al. в Biochem. Pharmacol. 2014, 92 (1): 73).
Контроль клеточной пролиферации необходим для правильного функционирования любого организма. Изменение этой регуляции является причиной таких заболеваний, как рак, с неограниченной и неконтролируемой пролиферацией клеток из-за генетических мутаций. И наоборот, потеря способности к клеточной пролиферации является одним из факторов, вызывающих старение.
Внеклеточный контроль клеточного деления может осуществляться митогенами клеточного цикла, несколькими факторами роста, а также факторами выживания. Митогены представляют собой белки, которые стимулируют деление клеток, противодействуя внутриклеточным механизмам остановки (Rb), которые блокируют прогрессирование цикла.
Рост любого организма или органа зависит как от роста, так и от деления клеток. Если клетки будут делиться без роста, они будут становиться меньше каждый раз. Факторы роста стимулируют рост клеток (увеличение клеточной массы), способствуя синтезу и ингибированию белков и других макромолекул. Рост клеток не зависит от клеточного цикла. Например, нервные и мышечные клетки растут особенно после деления клеток. Как и большинство митогенов, факторы роста связываются с рецепторами клеточной поверхности, которые затем активируют различные внутриклеточные сигнальные пути, которые могут вызывать: повышенный синтез белка или пониженную деградацию белка. Все это будет приводить к росту клеток.
Факторы выживания способствуют выживанию клеток, подавляя программы внутриклеточной гибели или апоптоз. Эти сигналы нужны другим клеткам для выживания, помогают клеткам выживать только тогда и там, где это необходимо. Нейроны, например, производятся в избытке, и они конкурируют друг с другом в получении факторов роста, и те, у которых наибольшее количество, будут выживать. Как митогены и факторы роста, факторы выживания имеют тенденцию связываться с рецепторами клеточных мембран, которые активируют внутриклеточные сигнальные пути, которые ингибируют гибель клеток, как правило, путем регуляции белков, принадлежащих к семейству Bcl-2. Некоторыми факторами выживания являются IL-3, SCF, IGF-1, которые в основном секретируются печенью в ответ на сигналы от гормона роста (GH).
Исходя из вышеизложенного и с целью решения вышеуказанных проблем, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить применение состава, состоящего из: ресвератрола, глицина, аргинина и цистеина, устанавливая диапазон концентраций компонентов на основе исследования модели Artemia salina. В этом случае запатентовано применение состава и способа его применения для лечения заболеваний. Состав обладает новым эффектом стимулирования пролиферации клеточных культур и лимфоцитов in vitro без доказательств генотоксичности, раскрывая способность уменьшать образование висцерального жира, наблюдаемого у здоровых лабораторных животных, индуцированного сахарным диабетом, показана управляемость гликемическим индексом с меньшим количеством инсулина или без инсулина на модели аллоксан-индуцированного сахарного диабета, цитопротекторный эффект лечения, представленный в поджелудочной железе животных, получавших аллоксан, коррекция симптомов метаболического синдрома и ожирения у пациентов, получавших лечение в течение 6-месячного периода. В примерах, описанных ниже, продемонстрировано, что состав имеет восстанавливающий ингредиент, который действует на уровне выработки энергии, восстановления метаболизма кислорода и реактивации различных ферментативных циклов, связанных с метаболизмом сахара, жирных кислот и холестерина, увеличивая энергию, доступную в клетках для повышенной функциональности и жизнеспособности, выраженной в терминах повышенной пролиферации. Примеры демонстрируют, что когда указанный состав применяют у животных и человека, измененные функции, связанные с негативными факторами сахарного диабета, ожирения и/или метаболического синдрома, нормализуются. Согласно этим примерам, лечение разработанным составом представляет собой способ контроля старения, метаболического синдрома, ожирения и сахарного диабета.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Токсичность, выраженная в показателях смертности A. salina, связанная с компонентами ресвератрола (R), глицина (G), аргинина (A) и цистеина (C), применяемыми в различных концентрациях.
Фиг. 2. Жизнеспособность A. salina в присутствии различных концентраций Состава I.
Фиг. 3. Количество лимфоцитов (вверху) и их жизнеспособность (внизу) в образцах, обработанных Составом I в различных концентрациях.
Фиг. 4. Исследование на генотоксичность Состава I, применяемого в различных концентрациях в мононуклеарных клетках (лимфоцитах), указанных выше, - планшеты для электрофореза; в середине - процент интегрированной ДНК (голова) (*р <0,05 по сравнению с белыми с RPMI); ниже - расчет, основанный на результатах образца электрофореза (конец) (*p<0,05 по сравнению с положительным контролем с 0,1 мМ H2O2).
Фиг. 5. Влияние различных концентраций Состава I на жизнеспособность культуры клеток эмбриональной почки человека HEK-293 (выше) и культуры клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero).
Фиг. 6. Графическое представление значений параметров химического состава крови у животных при лечении Составом I и без него: выше - самцы кроликов; ниже - самцы крыс, до применения однократной дозы и через 14 дней после применения дозы 1000 мг/кг.
Фиг. 7. Динамика изменения массы (вверху) и концентрации глюкозы (капиллярная гликемия) (внизу) у разных животных групп зайцеобразных, подвергнутых лечению: I - инсулином и дозой 50, 70, 90 мг/кг Состава I.
Фиг. 8. Динамика изменения массы (вверху) и концентрации глюкозы (капиллярная гликемия) (внизу) у разных групп грызунов, подвергнутых лечению: I - инсулином и дозой 50, 70, 90 мг/кг Состава I.
Фиг. 9. Сравнение гистологических изменений, наблюдаемых на уровне поджелудочной железы у кроликов с индуцированным сахарным диабетом, которых подвергали лечению Составом I и инсулином и не лечили. Выше - гистологический срез ткани, удаленной из поджелудочной железы самки, подвергаемой лечению только инсулином, продемонстрировано полное разрушение органа: были обнаружены только жировая ткань с перегруженными кровеносными сосудами и два лимфатических узла с реактивными изменениями, выполняли преднамеренный поиск без идентификации допустимой ткани поджелудочной железы. Ниже - гистологический срез (10×) ткани поджелудочной железы самки, подвергаемой лечению только Составом I (слева), идентифицирующий экскреторную часть поджелудочной железы с сохранением долек без связанных гистологических изменений, однако эндокринный компонент не идентифицирован (островковые клетки); изображение (40×) соответствует подходу к интеграции выделительной части поджелудочной железы (долька) (справа).
Фиг. 10. Сравнение гистологических изменений, наблюдаемых на уровне почек у кроликов с индуцированным сахарным диабетом, которых подвергали лечению Составом I и инсулином и не лечили. Вверху - гистологический срез ткани почки подвергнутой лечению только инсулином самки: на уровне клубочков с увеличением мезангиальных клеток без атипии, очаговое утолщение стенки кровеносных сосудов без образования склеротических узелков, что соответствует ранней диабетической нефропатии, характеризующейся небольшим мезангиальным увеличением (слева); срез почки самца, подвергнутого лечению только инсулином, с хорошей сохранностью коркового слоя, обильными клубочками с хорошей клеточностью с небольшим застоем, без изменений склероза. В тубулярном компоненте имеются изменения посредством коагуляционного некроза и пикноза ядер (справа). В середине - гистологический срез почки самки, подвергнутой лечению инсулином и Составом I в дозе 90 мг/кг, демонстрирующий хорошую консервацию коркового слоя, идентификацию обильных клубочков с хорошей клеточностью с очень небольшим скоплением, без склеротических изменений. В трубчатом компоненте начальные изменения видны посредством коагуляционного некроза и пикноза ядер. Ниже - гистологический срез застойной ткани почек у самцов, подвергаемых лечению Составом I в дозе 70 мг/кг (слева, 10×) с транссудацией эритроцитов (микроскопическое кровотечение) в мозговом веществе и коре, с выявлением структур, показывающих увеличение клубочковых мезангиальных клеток без атипии, небольшое перегруженности; рисунок соответствует приближению застойных клубочков (справа - при 40×).
Подробное описание настоящего изобретения
Характерные детали настоящего изобретения состоят из определения Состава I, определения его применения, биологических эффектов в живых системах на разных уровнях (клеточный, здоровые животные или с индуцированным сахарным диабетом, организм человека). В следующих параграфах описана цель определения настоящего изобретения, проиллюстрирована новизна и полезность настоящего изобретения, но это не ограничивает его объем и не предназначено для его чрезмерного ограничения. Следующие примеры основаны на исследованиях, проводимых для определения Состава I, а также на исследовании их воздействия на системы in vitro и in vivo.
Описание состава, содержащего основные композиции и препарат в свете настоящего изобретения, согласно настоящему изобретению приведено в Таблице 1.
Таблица 1Состав I
Размер дозы
5 г - 17 г
Доза на пакет
1 пакет
Пакетов в коробке
90
Компонент
Диапазон доз (мин-макс)
Чистота (%)
Глицин*
3000-7000 мг
98,5-101,5%
L-аргинин HCl*
300-5000 мг
98,5%
L-цистеин HCl*
200-2500 мг
98,5-101,5%
Ресвератрол*
100-2500 мг
98%
*Суточные значения в рационе не установленыОриентировочные количества на индивидуума массой 70 кг
Композиция в соответствии с п. 1 дополнительно характеризуется тем, что она содержит одно из вариантов осуществления потенциальных комбинаций соединений по настоящему изобретению с более высоким терапевтическим эффектом в случае прогрессирующих заболеваний, а также интеграцию варианта осуществления наночастиц, снижающих режим дозирования.
Таблица 2
Размер дозы
6 г-19 г
Доза на пакет
1 пакет
Пакетов в коробке
90
Компонент
Диапазон доз (мин-макс)
Чистота (%)
L-глицин*
3000-7000 мг
98,5-101,5%
L-аргинин HCl*
2000-5000 мг
98,5%
L-цистеин HCl*
1000-2500 мг
98,5-101,5%
L_метионин*
500-1500 мг (500 мг в наночастицах)
98,5-101,5%
Витамин B6(пиридоксин-HCl)
500-1500 мг
98,5-101,5%
Ресвератрол*
500-1500 мг (500 мг в наночастицах)
98%
*Суточные значения в рационе не установлены**20 мг представляет собой 100% суточной потребности
Пример 1
Анализ проводили для оценки токсичности компонентов, предложенных для Состава I (ресвератрол, глицин, аргинин и цистеин) на науплиусах Artemia salina. Artemia salina представляет собой ракообразное, чувствительное к широкому кругу соединений с биологической активностью и очень разными химическими структурами. Michael et al. (Michael A. S. et al в Science, 1956, 123: 464) и Vanhaecke et al. (Vanhaecke et al в Ecotoxicol Environ Saf 1981, 5:382) предложили использовать его для исследования токсичности. Это исследование позволяет практически и экономически эффективно проводить исследования токсичности различных природных веществ. Наблюдалась очень хорошая корреляция с другими специфическими исследованиями на цитотоксичность. Эта модель принята FDA (Управлением по контролю за пищевыми продуктами) и EPA (Агентством по охране окружающей среды в 2002 году) в качестве теста для оценки токсичности и экотоксичности фармацевтических и/или пищевых продуктов.
Анализ проводили в соответствии со способом, стандартизованным с использованием различных разведений каждого из компонентов Состава I. В выводном устройстве Artemia salina 0,5 г цист Artemia salina вылуплялись в искусственной морской воде в количестве 37 г/л при температуре 27°C с постоянной аэрацией в течение 24 часов. В каждые 5 лунок 96-луночного планшета 0,1 мл искусственной морской воды (37 г/л) вносили одноканальной пипеткой десять науплиусов, отделяли от выводного устройства и считали по одному для достижения точного разделения 10 науплиусов. Из 2000 ppm исходного раствора ресвератрола, глицина, аргинина и цистеина получали серийные разведения. Используя многоканальную микропипетку, добавляли 0,1 мл растворов, приготовленных в планшете, достигая конечной концентрации 62,5, 125, 250, 500 и 1000 ppm на пять лунок науплиусов. Для холостых образцов 10 необработанных науплиусов помещали в 0,2 мл объема искусственной морской воды (37 г/л). Микропланшет инкубировали при температуре 25°С в течение 24 часов. После инкубационного периода живые и мертвые науплиусы A. salina подсчитывали с помощью стереоскопического микроскопа и определяли % смертности. Токсичность состава выражали в процентах смертности науплиусов A. salina: 0-10% нетоксичен, умеренно токсичен 11-50%, 51-90% высокотоксичен и 100% чрезвычайно токсичен, учитывая шкалу Gualdron et al. (Gualdron R. и др. в Chem Rev. Col. Farm, 1997, 26: 15-19). Растворы компонентов Состава I исследовали 5-кратно. Данные анализировали с помощью пакета программ обработки статистических данных Graph Pad Prism версии 6 с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) и множественных сравнений Тьюки (р <0,05).
Результаты анализа данных выражали как среднее ± стандартное отклонение и они представлены на фиг. 1. Глицин, аргинин и цистеин не токсичны в любой из исследованных концентраций, что позволяет предположить, что если токсичность может возникнуть, она может быть только выше чем при 1000 ppm (фиг. 1). В случае ресвератрола в растворе 62,6 ppm смертность составляла 38% (умеренная токсичность), в то время как LC50 (летальная концентрация 50% науплиусов) была оценена в 89,48 ppm, что свидетельствует о высокой токсичности ресвератрола. Эти данные принимаются во внимание для определения Состава I: концентрацию ресвератрола выбрали ниже LC50; в случае аминокислот может использоваться любая концентрация ниже 1000 ppm.
Пример 2
В качестве примера Состава I в настоящем документе рассматривается следующая композиция биологически активных компонентов: 5,7 мг ресвератрола, 74,3 мг глицина, 5,7 мг аргинина и 2,9 мг цистеина/кг массы или кг растворителя для применения у млекопитающих (включая в себя человека) или на клеточных культурах, соответственно. Концентрацию ресвератрола выбирали с учетом результатов, определенных в примере 1, то есть приблизительно в 15 раз меньше, чем его LC50, для предотвращения проявления токсичности. Массу аргинина брали эквивалентную массе ресвератрола, цистеина примерно в 2 раза меньше, чем ресвератрола, а глицина - в 13 раз больше массы ресвератрола. Состав I представляет собой пример смеси биологически активных компонентов, которая не должна ограничивать объем настоящего изобретения. В этом случае доза Состава I определяется как 88,6 мг/кг.
С использованием Состава I проводили анализ, аналогичный описанному в примере 1, для определения диапазона его токсичности. Результаты представлены на фиг. 2. Показано, что при концентрации, составляющей 500 ppm или ниже 100% науплиусов A. salina остаются живыми, а при концентрации 1000 ppm Состава I живы только 58%. Это указывает на то, что в соответствии с применяемой моделью Состав I не токсичен при концентрации до 500 ppm, но при более высоких концентрациях до 1000 ppm показано умеренно токсичное поведение. Это демонстрирует, что при использовании Состава I его концентрация может варьировать в широком диапазоне концентраций и доз с учетом отсутствия токсичности.
Пример 3
Состав I применяли к исследованию для определения воздействия на клетки человека, то есть для стимуляции эффектов роста (митогенный эффект) или способствования гибели клеток (цитотоксический эффект).
Для анализа использовали биологическую систему in vitro, использующую культуру мононуклеарных клеток из мононуклеарных клеток периферической крови, представляющих собой периферические лимфоциты человека. Система была выбрана потому, что клетки составляют от 25 до 35% лейкоцитов и представляют собой основные клетки, способствующие иммунному ответу, поскольку они распознают чужеродные антигены и активируют медиаторы клеточного иммунного ответа, вызывая явления пролиферации или подавления на эндогенные или экзогенные стимулы. Эти культуры широко используются в исследованиях для оценки воздействия различных соединений (Marti-Centelles R. et al в J. Med Chem Eur, 2015, 103: 488). Оценивали влияние на пролиферацию клеток и определяли LC50 и LC100 (концентрации, которые уменьшается количество живых клеток на 50 и 100%, соответственно) Состава I на лимфоцитах человека in vitro. В качестве положительного контроля проводили исследование с конканавалином А (Con A), который представляет собой глобулярный белок растительного происхождения, который индуцирует митоз в лимфоцитах, вызывая пролиферацию клонов (Ganem and Martin Gonzalez Baez F A O. в Universo Diagnóstico, 2000, 1 (1):1). Анализ с RPMI-1640 (среда без обработки) проводили в качестве холостой пробы. Эффект Состава I, применяемого в диапазоне концентраций от 200 до 2000 ppm, оценивали путем подсчета общего количества клеток и мертвых клеток, окрашенных красителем трипановым синим.
Готовили 1 л среды для культивирования RPMI-1640 (SIGMA) с добавлением 10% FBS, добавляя 1 мл 1-кратного раствора стрептомицина и амфотерицина B (SIGMA), стерилизованного через стерильные фильтрационные установки (Corning) с использованием мембран 0,22 микрона. Готовили серийные разведения из исходного раствора 2000 ppm Состава I в виде 200, 400, 600, 800, 1000 и 2000 ppm.
3
Получали 30 мл периферической крови от здоровых добровольных доноров путем венопункции, которую собирали в пластиковые пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта. Затем получали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенные с помощью градиента плотности Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich) центрифугированием при 1200 оборотах в минуту (об/мин) в течение 30 минут при температуре 25°C. РВМС дважды промывали 1-кратным PBS, осадок клеток в конце ресуспендировали в культуральной среде. РВМС состоят из моноцитов и лимфоцитов. Моноцитарные клетки характеризуются тем, что являются адгезивными клетками, у которых отсутствует пролиферативный потенциал. В противном случае они представляют собой лимфоциты, которые представляют собой клетки в суспензии, способные размножаться после эндогенного или экзогенного стимула. Чтобы отделить моноциты от лимфоцитов, полученные PBMC горизонтально культивировали в камерах 25 см, так что моноциты прилипали к поверхности в течение 5 часов при температуре 37°C с увлажненной атмосферой в атмосфере с 5% CO2. По истечении времени инкубации лимфоциты, оставшиеся в суспензии клетки, разделяли в стерильных пробирках объемом 1,5 мл и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут (Eppendorf Centrifuge 5810-R), затем 1 мл культуральной среды добавляли в набор клеток. В пробирках Эппендорфа готовили суспензию 500000 клеток/мл, в которую добавляли различные концентрации Состава I (200, 400, 600, 800, 1000 и 2000 ppm), добавляя в культуральную среду 1,25 мг/мл положительного контроля конканавалина А, индуктора клеточной пролиферации, и необработанные клетки в качестве холостой пробы. Образцы инкубировали при температуре 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО2 в течение 48 часов, достаточных для того, чтобы лимфоциты завершили деление клеток, демонстрируя аналогичную положительному контролю (Con A) пролиферацию с помощью продукта или иным образом вызванной клеточной токсичности. По окончании инкубации пробирки Эппендорфа, которые содержали разные образцы, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут, супернатант декантировали и набор клеток ресуспендировали в 1 мл RPMI-1640.
Использовали оптический световой микроскоп с объективом с 40-кратным увеличением. Клетки подсчитывали в камере Нойбауэра с использованием 0,05 мл суспензии каждого ресуспендированного образца в 0,4 мл 1-кратного PBS и 0,05 мл трипанового синего. Анализ выполняли в трех экземплярах в трех независимых событиях. Результаты анализированы с помощью теста дисперсионного анализа (ANOVA) с SPSS версии 16, а затем применяли тест Даннета для определения наличия различий между контрольной и экспериментальной обработками, принимая значения р<0,05 как значимые.
На фиг. 3 показаны результаты исследования. Эффект Состава I, примененного в дозе 200 ppm для увеличения концентрации клеток составляет явно (число клеток на миллилитр) до 15% достоверно (р<0,05) по сравнению с необработанной холостой пробой: 6372333 и 5518333 клеток/мл, соответственно. Что касается конканавалина А, в котором подсчитано увеличение числа клеток до 65%, получив 9101667 клеток/мл (фиг. 3), это подтверждает его митогенную активность. С другой стороны, в присутствии концентраций 1000 и 2000 ppm Состава I наблюдалось уменьшение числа клеток: 4291667 и 3540333 клеток/мл, соответственно.
Рассчитывали процент относительной жизнеспособности клеток (VCR) и обнаружили, что в присутствии концентраций 200, 400 и 600 ppm 97% клеток были живы, как в холостом, так и в положительном контролях. При 800 ppm, а также 1000 и 2000 ppm состава I жизнеспособность лимфоцитов человека значительно снижалась (фиг. 3 ниже) со следующими процентами: 90,58%, 84,38% и 64,96%, соответственно. LC50 и LC100 для Состава I оценили в 2726,8 ppm и 5165,82 ppm, соответственно. Это значение значительно выше, чем определенное в исследовании с A. saline, и доказывает, что Состав I не характеризуется цитотоксичностью в применяемых дозах. В дозах 50-90 ppm состав I не является цитотоксичным в обоим исследованиях. Эти дозы находятся в диапазоне стимулирования пролиферации лимфоцитов, подтверждая его важный эффект для способа лечения старения.
Пример 4
Следующий пример показывает, что пролиферативный эффект и ингибирующий эффект, показанные в примере 3, не связаны с уровнем повреждения ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Для этой цели был разработан анализ ДНК-комет, быстрый, чувствительный, простой и поддающийся количественному измерению способ измерения степени повреждения на уровне дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Этот анализ принят в качестве инструмента для исследования соединений или вредных воздействий на репарацию ДНК (Azqueta A. and A. R. Arch Toxicol Collins, 2013, 87: 949). Он используется в системах in vivo, in vitro, ex vivo в различных научных дисциплинах для исследований на генотоксичность, доклинических и клинических исследованиях, генетического тестирования в экотоксикологии, цитогенетики, фотогенотоксичности и т.п.
6
4
Мононуклеарные клетки и лимфоциты периферической крови человека разделяли в соответствии с той же методикой, которая описана в примере 3. С использованием культуральной среды концентрацию клеток доводили до 1×10 клеток/мл. Полученные клетки высевали во флаконы Эппендорфа с плотностью 3×10 клеток/мл и инкубировали при температуре 37°С и 5% СО2 в течение 24 часов для стабилизации. Затем флаконы центрифугировали при 1250 об/мин в течение 5 минут при температуре 22°С и супернатант заменяли растворами Состава I в дозе 7,81, 15,63, 31,25, 62,50, 125, 250, 500 и 1000 ppm (n=4 каждый). Исследуемые клетки холостой пробы ресуспендировали в культуральной среде (n=8), а другие с 0,1 мМ перекиси водорода (положительный контроль, n=8). Клетки инкубировали в течение 24 часов для последующего осаждения центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 минут и обрабатывали 0,1 мл трипсина (0,25%) в течение 3 минут при температуре 37°C и 5% CO2. Клетки ресуспендировали в 1 мл среды RPMI 1640 и снова центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут, супернатант отбрасывали и клетки инкубировали с 1 мл лизисного раствора (NaCl 2,5 М, Na2EDTA 100 мМ, Трис HCl 10 мМ и 1% тритон) при температуре 4°С в течение 24 часов. Через 24 часа флаконы центрифугировали при 1200 об/мин при температуре 4°С. Супернатант отбрасывали и клетки обрабатывали 1 мл нейтрализующего буфера (0,4 М Трис, рН 7,5) в течение 5 минут при температуре 4°С. Флаконы центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут при температуре 4°С, клетки ресуспендировали в 0,02 мл загрузочного буфера (бромфеноловый синий 0,25%, глицерин 50%, трис-HCl 10 мМ и 50 мМ Na2EDTA). Агарозные гели готовили растворением 1% в физиологическом фосфатном буфере (PBS) при нагревании планшета при температуре 100°C. После растворения и при температуре 60°C добавляли 0,01 мл Gelred (соединение ДНК с флуоресцентным окрашиванием). Эту смесь помещали в горизонтальную камеру электрофореза на 60 мин. Лизированные клетки наносили на агарозные гели и инкубировали с раствором для электрофореза (1 мМ Na2EDTA и 300 мМ NaOH при рН 13,5) в течение 20 минут при температуре 4°С. Электрофоретический прогон проводили при 25 В и 300 мА в течение 30 минут при температуре 4°С. Гели удаляли из камеры для электрофореза и проявляли в камере для анализа флуоресцентного сигнала. Сгенерированные изображения получали с помощью цифровой камеры высокого разрешения (фиг. 4, выше) и анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant TL v8.1. Площадь головки кометы, представляющей собой интактную ДНК, количественно определяли денситометрическим анализом и наносили на график в процентах по сравнению с отрицательным контролем (культуральная среда) (фиг. 4, в середине). Хвост кометы, представляющий собой поврежденную ДНК, измеряли в миллиметрах и представляли в процентах от положительного контроля (H2O2). Данные выражали в виде среднего ± стандартное отклонение среднего (фиг. 4, ниже). Полученные данные анализировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием, в случае каких-либо различий, апостерического теста Тьюки с использованием программного обеспечения GraphPad Prism v6.0 при p<0,05.
Результаты (фиг. 4) показывают, что мононуклеарные клетки периферической крови человека, обработанные различными концентрациями Состава I в культуральной среде RPMI 1640, дополненной 10% FBS, не показали повреждения в дцДНК (дцДНК). Видимое повреждение не было получено в головке кометы (неповрежденная ДНК) (фиг. 4, посередине). Напротив, перекись водорода (0,1 мМ), которая, как известно, оказывает генотоксическое действие, демонстрирует поведение, при котором обнаруживается гораздо более быстрая диффузия дцДНК (фиг. 4, вверху и внизу), что является признаком генотоксичности, и из-за этого явления область измерения считываний намного выше по сравнению с холостой пробой (фиг. 4, ниже). Поведение образцов, обработанных Составом I, было схожим с холостой пробой, что указывает на то, что обработка ним в течение 24 часов не оказывает вредного воздействия на ДНК мононуклеарных клеток периферической крови (фиг. 4). Кроме того, воспроизводили генотоксический эффект, вызванный перекисью водорода (Azqueta A. and A. R. Collins в Arch Toxicol, 2013, 87: 949), что указывает на то, что в экспериментальных условиях разработанная методология является чувствительной и заслуживающей доверия. Состав I оказывает влияние на рост клеток, не вызывая вредных воздействий на ДНК мононуклеарных клеток человека.
Пример 5
Эффект различных концентраций Состава I оценивали на клеточной линии эмбриональной почки человека (HEK-293) и клеточной линии Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) с использованием анализа микроразведений с 3-(4,5-диметил-2)-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолий (МТТ) (Mosmann T. в J. Immunol Methods, 1983, 65 (1-2.): 55). Способ МТТ, основанный на восстановлении 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида, представляет собой анализ, который отражает метаболическую функцию клеток. МТТ представляет собой желтый краситель, восстанавливаемый до формазана (синего красителя) митохондриальными дегидрогеназами, которые представляют собой часть дыхательной цепи жизнеспособных клеток (Hwa et al., 2015). Он используется в способе количественного колориметрического микроразведения, применяемого для определения выживаемости и пролиферативной способности клеток млекопитающих (Mosmann T. в J. Immunol Methods, 1983, 65 (1-2): 55). Он представляет собой подходящий тест in vitro для оценки пролиферации и цитотоксичности клеток, потому что он простой, эффективный, экономичный, воспроизводимый, чувствительный, безопасный и эффективный в отношении жизнеспособной клеточной популяции.
3
3
Использовали модифицированную Дульбекко минимальную поддерживающую культуральную среду Игла /F12 (DMEM/F12), дополненную 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) и 1 мл смеси антибиотиков (200000 МЕ пенициллина и 0,5 г стрептомицина). Готовили раствор трипсина (Difco) в концентрации 0,25%. Готовили серийные разведения из исходного раствора Состава I из 2000 ppm и тритона Х-100 в качестве растворителя DMEM/F12. 1 мл каждого разведения готовили для получения концентраций 1,95, 3,91, 7,81, 15,63, 31,25, 62,50, 125, 250, 500 и 1000 ppm. Клетки каждой клеточной культуры выращивали с использованием культуральных планшетов 25 см с DMEM/F12 до тех пор, пока не был получен слитый монослой на поверхности планшета. Условия, используемые для культивирования клеток, представляли собой следующие: температура 37°С, увлажненная атмосфера с 5% СО2. Монослой слитых клеток снимали с планшетов объемом 25 см с использованием 0,25% трипсина. Это делали следующим образом: среду DMEM/F12 удаляли, затем монослой промывали 1–3 раза 1-кратным физиологическим раствором с фосфатным буфером, затем добавляли 0,5 мл 0,25% трипсина и содержимое инкубировали при температуре 37°С в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 5 мин. К снятым клеткам добавляли 3 мл DMEM/F12, клетки ресуспендировали с помощью микропипетки 0,1-1 мл и помещали в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. DMEM/F12 удаляли из конической пробирки. 3 мл DMEM/F12 добавляли к набору клеток, клетки ресуспендировали и проводили подсчет в камере Нойбауэра. Затем готовили суспензию клеток 250000 клеток/мл. 0,1 мл суспензии клеток 250000 клеток/мл на лунку микропланшета добавляли во все лунки 96-луночного микропланшета, микропланшет инкубировали при температуре 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 24 часов. Среду DMEM/F12 из каждой лунки удаляли в вакууме, поддерживая монослой на дне каждой лунки, затем готовили 0,1 мл каждого разведения из Состава I и тритона X-100 (1,95, 3,91, 7,81, 15,63, 31,25, 62,50, 125, 250, 500, 1000 и 2000 ppm). Кроме того, оставляли 8 лунок с необработанными клетками, используемыми в качестве контроля жизнеспособности клеток (среда для культивирования клеток без обработки - холостая проба), в которые добавляли 0,1 мл DMEM/F12. Затем микропланшет инкубировали при температуре 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 24 часов. Затем среду DMEM/F12 удаляли с образцами Состава I и тритона X-100, лунки промывали один раз физиологическим раствором с фосфатным буфером. 0,02 мл добавляли к раствору МТТ в концентрации 5 мг/мл и содержимое инкубировали при температуре 37°С в течение 2 ч, чтобы провести полный процесс восстановления МТТ до формазана с помощью митохондриальных дегидрогеназ живых клеток. Впоследствии раствор МТТ удаляли, сохраняя образовавшиеся соли формазана, затем добавляли 0,1 мл изопропилового спирта и измеряли оптическую плотность при 540 нм в устройстве считывания микропланшетов Synergy HT со встроенным программным обеспечением GEN 5. При расчете процента жизнеспособности клеток обнаруженную оптическую плотность в лунках с клетками, размноженными в необработанной культуральной среде, рассматривали как 100% живых клеток. Растворы Состава I исследовали в пяти повторах, а растворы положительного контроля исследовали в трех повторах. Клиническое испытание проводили в трех отдельных событиях. Данные по LC50 Состава I и тритона X-100 оценивали с использованием пакета программ обработки статистических данных Graph Pad Prism версии 6 по критерию Стьюдента (р<0,05). Результаты анализа данных выражали в виде среднего значения ± стандартное отклонение (фиг. 5).
Было показано, что для Состава I в концентрациях ниже 500 ppm наблюдалась стимуляция пролиферации и митохондриальной активности клеточных линий HEK-293 и Vero. Увеличение линии HEK-293 составило 140% при 1,95 ppm и более 40% при концентрации 62,5 ppm, тогда как в случае клеток Vero только 10% по сравнению с холостой пробой. Результаты подтверждают эффект Состава I на стимулирование пролиферации клеток.
Дозозависимый цитотоксический эффект наблюдался при дозе выше чем 500 ppm, поскольку при увеличении концентрации Состава I наблюдалось снижение жизнеспособности клеток (фиг. 5).
В обеих клеточных линиях положительный контроль (тритон X-100) показал дозозависимый эффект, так как при увеличении концентрации этого вещества наблюдалось уменьшение поглощения в соответствии с ожидаемым, поскольку оно представляет собой цитотоксическое соединение, без какого-либо увеличения в жизнеспособности (значения, превышающие 100%) в любой из исследованных концентраций, но было обнаружено уменьшение в поглощающей способности по сравнению с холостой пробой (без обработки).
LC50 для Состава I и тритона X-100 были оценены со значениями 2417,00 ± 65,77 и 764,10 ± 21,93 ppm для клеточной линии HEK-293 и 4289,00 ± 289,90 и 42,80 ± 1,60 ppm для клеточной линии Vero, соответственно.
Полученные результаты доказывают, что цитотоксичность Состава I не наблюдается в диапазоне концентраций 50-90 ppm. При этой дозе наблюдается стимуляция клеточного метаболизма. Наблюдаемое явление аналогично описанному в примере 3 и демонстрирует, что Состав I следует рассматривать как промотор фактора роста и клеточного метаболизма.
Пример 6
Эффект Состава I наблюдали у здоровых лабораторных животных, таких как модели грызунов и заячьих (крысы линии Вистар и новозеландские кролики), в анализе острой токсичности (однократное применение, мониторинг в течение 14 дней) с высокими дозами - выше, чем LC50 анализа A. salina, описанного в примере 2 (1000 и 1350 мг/кг) и исследовании на субхроническую токсичность (ежедневное применение два раза в день для доз, составляющих 50, 70 и 90 мг/кг в течение девяноста дней). Те же самые процедуры добавления плацебо (очищенной воды), измерения массы и гликемии проводили параллельно у животных отрицательного контроля каждого вида животных.
Во всех испытаниях, проведенных на лабораторных животных, лечение вводили перорально в зависимости от массы через орогастральную канюлю после обычного потребления корма для грызунов и заячьих (Комиссия Европейских сообществ в Off. J. Eur. Comm (L 383 A), 1992, 35: 110), соответственно.
Животных содержали в отдельных клетках, и их непрерывно наблюдали в течение первых 24 ч после введения Состава I, продолжая наблюдение и промежуточную ветеринарную помощь, необходимую для каждого периода испытания, записывая в журнале учета реакции любого животного. Массу тела определяли и регистрировали в начале и в конце эксперимента. Также в случае кроликов клинические лабораторные исследования проводили до и после каждого исследования: биометрия крови, химический состав крови и активность ферментов трансаминаз: аспартатаминотрансферазы (AST), аланинаминотрансферазы (TGP) и гамма-глутамилтрансаминазы (GGT). У крыс эти параметры определяли только в конце исследования для предотвращения кровопотери. Наконец, авторы настоящего изобретения приступали к стадии эвтаназии животных с применением серии анестетиков и хлористого калия (KCl). Впоследствии проводили макроскопическое исследование органов и основных тканей и вскрытие, в основном включая в себя сердце, почки, селезенку, поджелудочную железу, легкие, печень, яичники и семенники, в зависимости от каждого случая. Взятые образцы отправляли для гистопатологического исследования.
Максимальная доза, проверенная в анализе острой токсичности, составила 1350 мг/кг, поскольку максимальный объем, применяемый для орогастральной канюли, составляет 1 или 3 мл для грызунов и заячьих, соответственно, а использование более высоких доз приводило к получению более вязкого раствора, испытывающего затруднения при прохождении орогастральной канюли. При исследуемых концентрациях какой-либо гибели лабораторных животных не наблюдалось, поэтому значение LD50 не определяли. Что касается настоящего изобретения, было показано, что большинство оцениваемых параметров, включая в себя массу и активность ферментов печени и биометрию крови, не показало существенных различий до и после лечения и по сравнению с холостой пробой (без лечения). Однако у подвергнутых лечению животных было определено снижение содержания глюкозы, уменьшение мочевой кислоты и холестерина (фиг. 6). Поскольку эти параметры связаны с метаболическим синдромом, подагрой и сахарным диабетом, результаты исследования показывают, что применение одной высокой дозы Состава I приводит к более высокому снижению содержания метаболитов и подтверждает влияние применения этого лечения на указанные патологии.
Такая же тенденция наблюдалась в случае результатов исследования субхронической токсичности. Снижение содержания глюкозы, холестерина, мочевой кислоты, креатинина и ферментов печени наблюдалось при применении Состава I в различных дозах. Однако статистически доказанное различие получали только с контролем глюкозы, тогда как изменение других параметров характеризуется большим стандартным отклонением, связанным с индивидуальностью субъекта у исследуемых животных. Увеличение массы тела у подвергаемых лечению животных было ниже, чем у контрольных. Кроме того, наблюдалось многократное снижение активности ферментов печени, что можно рассматривать как свидетельство влияния Состава I на улучшение активности печени. Характерным наблюдением при проведении вскрытий было то, что у животных, которых лечили Составом I, при макроскопической оценке наблюдалось значительное мышечное развитие и незначительное развитие жира в организме, так же как у них не было стеатоза печени. Все это наблюдалось не смотря на то, что проводилось в течение 90 дней с очень небольшим перемещением животных внутри клеток, то есть без упражнений, и нормальным потреблением пищи в зависимости от массы и возраста. Эти результаты также подтверждают, что применение Состава I позволяет контролировать массу, опосредованную снижением количества жировой ткани, контролем содержания глюкозы и иногда другими характеристиками химического состава крови, без изменения биометрии крови и функции печени у здоровых млекопитающих.
Пример 7
Кроме того, проводили исследование на крысах и кроликах с индуцированным аллоксаном сахарным диабетом. В этом исследовании, а также в исследовании субхронической токсичности, лечение применяли в трех дозах Состава I (50, 70 и 90 мг/кг). Обследовали 5 групп животных, получавших лечение (инсулин плюс состав I в трех указанных дозах, состав I в дозе 70 мг/кг и только инсулин). Инсулин гларгин вводили подкожно в дозе 0,7 Ед/кг за одно утреннее введение каждые 24 часа.
Сравнение результатов анализа химического состава крови у кроликов с индуцированным сахарным диабетом в начале и в конце анализа показало, что даже при лечении гликемия проявляется на высоком уровне. Наблюдается увеличение мочевины и креатинина, что подтверждает повреждение почек. Однако в случае кроликов, получавших Состав I, наблюдалось снижение уровня мочевой кислоты и холестерина.
Результаты биометрии крови кролика до применения лечения и через 21 день после показали снижение параметров, связанных с наличием моноцитов и тромбоцитов и гемоглобина в результате индуцированного сахарного диабета у животных. Моноцитоз представляет собой состояние, при котором наблюдается увеличение наличия типа белых клеток крови, известных как моноциты. Моноциты образуются в костном мозге и играют важную роль в нормальном функционировании иммунной системы. Тромбоциты участвуют в свертывании крови, помогая остановить кровотечение в случае травмы. Наблюдаемые изменения указывают на то, что во время лечения индуцированного аллоксаном сахарного диабета образовались заболевания крови или костного мозга.
Во время клинического мониторинга несколько представителей кроликов показали потерю массы, связанную с изменениями в потреблении пищи и воды (периоды анорексии с полидипсией), ожидаемые клинические данные в любом диабетическом организме. У некоторых кроликов из группы животных, получавших лечение в виде 90 мг/кг Состава I и инсулина, потеря массы не была обнаружена, как у всех других животных, даже имеются доказательства увеличения массы, что показывает, что Состав I проявляет органическую защиту. На фиг. 7 (выше) показана тенденция изменения массы у разных групп животных, протестированных в исследовании. Понятно, что применение Состава I приводит к меньшей потере массы. Для групп, получавших лечение в виде Состава I и инсулина, большее увеличение массы наблюдается в группе с применением дозы 90 мг/кг. Это показывает, что эффект зависит от дозы.
Аналогичным образом, все представители, получавшие лечение инсулином и Составом I, подтвердили, что он показывает гипогликемический эффект, как в примерах 5 и 6. На фиг. 7 (ниже) показаны средние значения содержания глюкозы в капиллярах в разные дни применения лечения. Видно, что эффект варьирует с различными дозами и является выше при 50 и 70 мг/кг по сравнению с 90 мг/кг.
На фиг. 8 (выше) показаны средние значения изменения массы на группу крыс с индуцированным сахарным диабетом. В случае групп животных, которых лечили чистым инсулином (I), тенденция снижения массы намного более заметна по сравнению с другими исследуемыми группами, подвергнутых лечению животных. На фиг. 8 (ниже) представлены средние значения изменения концентрации глюкозы (капиллярная глюкоза). У крыс, получавших только инсулин, увеличение капиллярной глюкозы наблюдается до 19 дней лечения. Понятно, что в этот период повышенное содержание глюкозы контролируется более эффективно только с применением Состава I в дозе 70 мг/кг. Наибольшее снижение содержания глюкозы у животных с сахарным диабетом 1 типа наблюдается при дозах 70 мг/кг.
При клиническом мониторинге крыс с индуцированным сахарным диабетом (сахарный диабет типа 1) представители групп, получавших только инсулин или Состав I, показали изменения в потреблении корма и воды (периоды анорексии с полидипсией), как у кроликов, эти клинические данные ожидаются в любом организме с сахарным диабетом. Тем не менее, группы, подвергаемые лечению Составом I плюс инсулин, не показывали эти клинические данные так заметно, т.е. применение способов лечения помогло улучшить качество жизни животных, а совместное лечение инсулином могло улучшить клиническое состояние животных с сахарным диабетом, демонстрируя заявленный в настоящем изобретении эффект.
Содержание глюкозы у крыс, получавших дозы 50 и 70 мг/кг Состава I плюс инсулин (гларгин), имело тенденцию к нормализации (фиг. 8, ниже). Что касается мониторинга в группе, получавшей дозу 90 мг/кг и инсулин (гларгин), хотя гликемия имела тенденцию не нормализоваться в этот короткий период воздействия, наблюдались очень схожие данные с данными, полученными для видов заячьих с такими же дозами лечения (фиг. 7). В обоих случаях результаты демонстрируют, что Состав I демонстрирует органическую защиту млекопитающих от сахарного диабета.
Сравнение результатов анализа химического состава крови среди различных групп крыс в испытании доказывает, что при лечении гликемия все еще проявляется на высоких уровнях и наблюдаются высокие значения мочевины и креатинина, что подтверждает повреждение почек. Результаты биометрии крови не показывают существенных различий между различными группами.
В макроскопическом исследовании после вскрытия кроликов и крыс с сахарным диабетом I типа в группах, получавших только добавку или инсулин, наблюдались наиболее серьезные изменения поджелудочной железы, что было подтверждено в гистопатологических срезах (фиг. 9). Таким образом, аллоксан, как индуктор сахарного диабета, воздействует на этот орган, и изменение ожидалось у всех животных. Однако животные, получавшие Состав I и инсулин, не показали макроскопически выявляемых изменений. Известно влияние ресвератрола на повышение чувствительности рецепторов инсулина (Chachay V. S. et al. в Br J Clin Pharmacol, 2011, 72 (1): 27). Однако в описании настоящего изобретения Состав I также демонстрирует дополнительный цитопротекторный эффект на органы животных и эффект восстановления поврежденных тканей при действии в присутствии инсулина.
Согласно результатам гистопатологии, выполненным на образцах животных с индуцированным сахарным диабетом, наблюдается повреждение почек (результат, соответствующий анализу химического состава крови). Однако в образцах групп, подвергавшихся лечению инсулином и Составом I, наблюдалось меньшее повреждение почек, чем в образцах, подвергавшихся лечению только Составом I или только инсулином. Вместе с результатами контроля массы и капиллярной гликемии эти результаты свидетельствуют о том, что в течение испытательного периода (21 день) лечение, применяемое с Составом I вместе с инсулином, приводит к защите органов, таких как почка и поджелудочная железа, от изменений, вызванных сахарным диабетом.
Приведенные в настоящем документе примеры подтверждают способность Состава I защищать органы млекопитающих с сахарным диабетом 1 типа от повреждения при применении с инсулином. Кроме того, отмечается способность контролировать уровень сахара в крови, который усиливается в присутствии инсулина, и эффект, как видно, поддерживает увеличение массы, снижение содержания холестерина и мочевой кислоты.
Пример 8
2
У 48-летнего мужчины наблюдался дискомфорт в груди, и впоследствии у него был диагностирован метаболический синдром. Медицинское обследование показало тучного человека с массой тела 87 кг, ростом 170 см, с ИМТ 32 кг/м. Артериальное давление (АД) составляло 160/110 мм рт.ст., содержание глюкозы в плазме натощак (GA) составляло 150 мг/дл, триглицеридов (Tg) 215 мг/дл, общего холестерина (TC) 320 мг/дл, LDL-C 212 мг/дл, HDL-C 37 мг/дл и HbAlc 8,46%. Пациент подвергался лечению Составом I, как описано в примере 2, три раза в день после каждого приема пищи в течение следующих 6 месяцев. Форму применения Состава I готовили в стакане воды или суспензии сока. Периодические оценки проводили для оценки подобной терапии и предотвращения любых побочных эффектов. После этого периода лечения Составом I авторы настоящего изобретения приступили к проведению биохимических исследований. Определяли следующие значения: GA 115 мг/дл, HbAlc 6,69%, TC 235 мг/дл, LDL-C 123,7 мг/дл, HDL-C 40 мг/дл, Tg 119 мг/дл, и его масса снизилась до 74 кг. Содержание 11-дегидротромбоксана В2 и агрегация тромбоцитов снизились, соответственно, на 75% и 90%, по сравнению с исходным уровнем. Ответ на терапию составил 100%. С этой процедурой у пациента была значительная модификация факторов риска метаболического синдрома.
Наконец, следует понимать, что использование глицина, цистеина, аргинина и ресвератрола для лечения и профилактики метаболического синдрома, сахарного диабета, ожирения и в качестве средства против старения не ограничивается Составом I и описанными выше вариантами осуществления, и специалисты в настоящей области техники будут обучены изложенным в настоящем документе идеям для внесения изменений в композицию для лечения по настоящему изобретению, объем которой будет установлен исключительно формулой настоящего изобретения.
ССЫЛКИ:
Alcaín, F. J., Villalba, J. M. (2009). “Sirtuin activators”. Expert Opin Ther Pat., 19(4): 403-414. doi:10.1517/13543770902762893. PMID 19441923.
Azqueta, A., Collins A. R. (2013). “The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair”. Archives of toxicology, 87: 949-968.
Baur, J. A. et al., (2006). “Resveratrol improves health and survival of mice on a high calorie diet”. Nature, 444 (7117): 337-342.
Beher, D., Wu, J., Cumine, S., Kim, K. W., Lu, S. C., Atangan, L., Wang, M. (2009). “Resveratrol is not a direct activator of SIRT1 enzyme activity”. Chem Biol Drug Des., 74 (6): 619-624. doi:10.1111/j.1747-0285.2009.00901.x.PMID 19843076.
Chachay, V. S, Kirkpatrick, C. M. J., Hickman, I. J., Ferguson, M., Prins, J. B., Martin, J. M. (2011). “Resveratrol—pills to replace a healthy diet?” Br J Clin Pharmacol. 72(1): 27-38.
Commission of the European Communities. (1992). “Annex to Commission Directive 92/69/EEC of 31 Jul. 1992 adapting to technical progress for the seventeenth time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances. B.1 Acute toxicity (oral)”. Off. J. Eur. Comm. (L 383 A) 35: 110-112.
Do, G. M. et al., (2008). “Long-term effects of resveratrol supplementation on suppression of atherogenic lesion formation and cholesterol synthesis in apo E-deficient mice”. Biochem. Biophys. Res. Commun., 374(1): 55-59.
Duffy, S. J., Vita, J. A. (2003). “Effects of phenolics on vascular endothelial function”. Current Opinion in Lipidology, 14 (1): 21-27. doi:10.1097/01.mol.0000052857. 26236.f2, PMID 12544657.
Eckel, R. H., Grundy, S. M., Zimmet, P. Z. (2005). “The metabolic syndrome”. Lancet, 365: 1415-1428.
Environmental Protection Agency (2002). “Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms”. Fifth Edition. U.S. Environmental Protection Agency Office of Water (4303T) 1200 Pennsylvania Avenue, NW Washington, D.C. 20460 PP. 178-184.
Fremont, L. (2000). “Biological effects of resveratrol”. Life Sci., 66: 663-673.Ganem Baez, F. A., Martin Gonzalez, O. (2000). “Lectina concanavalina A: obtención y purificación”. Universo Diagnóstico. 1(1):1-41.
Ghosh, H. S., McBurney, M., Robbins, P. D., McBurney, R. (2010). “SIRT1 negatively regulates the mammalian target of rapamycin”. PLoS ONE 5 (2): e9199. Bibcode:2010PLoSO.  5.9199G. doi:10.1371/journal.pone.0009199.PMC 2821410.PMID 20169165.
Gokaraju G. R., Gokaraju, R. R., Golakoti, V. K. R. R., Bhupathiraju, T., Sengupta, K., Alluri, K., Raju, V. K. (2016). Composition from Sphaeranthus indicus and Garcinia mangostana for the control of metabolic syndrome. Patent US 2016/9,241,964, Jan. 26, 2016.
Gualdrón, R., López, S., Sanabria, A. (1997). Estudio fitoquímico preliminar y letalidad sobre Artemia salina de plantas colombianas. Rev. Col. Quím. Farm. 26:15-19.
Jiang, W. J. (2008). “Sirtuins: novel targets for metabolic disease in drug development”. Biochem. Biophys. Res. Commun. 373(3): 341-344.
Lagouge, M., Argmann, C., Gerhart-Hines, Z., Meziane, H., Lerin, C., Daussin, F., Messadeq, N., Milne, J., Lambert, P., Elliott, P., Geny, B., Laakso, M., Puigserver, P., Auwerx, J. (2006). “Resveratrol improves mitochondrial function and protects against metabolic disease by activating SIRT1 and PGC-1alpha”. Cell 127 (6): 1109-1122. doi:10.1016/j.cell.2006.11.013. PMID 17112576.
Lodder, R. A., Cassis L. A. (2016). D-tagatose-based compositions and methods for preventing and treating atherosclerosis, metabolic syndrome, and symptoms thereof. Patent US 2015/9,060,962, Jun. 23, 2015.
Martí-Centelles, R., Falomir, E., Murga, J., Carda, M., Marco, J. A. (2015). Inhibitory effect of cytotoxic stilbenes related to resveratrol on the expression of the VEGF, hTERT and c-Myc genes. Eur J Med Chem. 103: 488-496.
Michael, A. S., Thompson, C. G., Abramovitz, M. (1956). Artemia salina as test organims for a bioassay. Science. 123: 464.
Mosmann, T. (1983). Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65(1-2): 55-63.
Olas, B., Wachowicz, B. (2005). “Resveratrol, a phenolic antioxidant with effects on blood platelet functions”. Platelets 16 (5): 251-260.
Prossnitz, E. R., Barton, M. (2014). “Estrogen biology: New insights into GPER function and clinical opportunities”. Molecular and Cellular Endocrinology. 389 (1-2): 71-83. doi: 10.1016/j.mce.2014.02.002. ISSN 0303-7207.
Romero, T. (2016). Methods and materials for reducing multiple risk factors associated with the metabolic syndrome. Patent US 2016/9,278,104, Mar. 8, 2016.
Vanhaecke, P., Persoone, G., Claus, C., Sorgeloos, P. (1981). “Proposal for a short-term toxicity test with Artemia nauplii”. Ecotoxicol Environ Saf. 5: 382-387.
Varfolomeev, S. D., Gurevich, K. G. (2001). Enzyme active sites: bioinformatics, architecture, and mechanisms of action. Russian Chemical Bulletin. 50 (10): 1709-1717.
Wang, L., Waltenberger, B., Pferschy-Wenzig, E. M., Blunder, M., Liu, X., Malainer, C., Blazevic, T., Schwaiger, S., Rollinger, J. M., Heiss, E. H., Schuster, D., Kopp, B., Bauer, R., Stuppner, H., Dirsch, V. M., Atanasov, A. G. (2014). “Natural product agonists of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ): a review”. Biochem Pharmacol 92 (1): 73-89. doi: 10.1016/j.bcp.2014.07.018. PMC 4212005. PMID 25083916.
Wu, G. A. B., Meininger, C. J., Knabe, D. A., Baze, F. W. A., Rhoads, J. M. (2000) “Arginine nutrition in development, health and disease”. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 3 (1): 59-66.