КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНА, СПОСОБНЫЕ КОНТРОЛИРОВАТЬ КРОВОТЕЧЕНИЕ И/ИЛИ ЗАМЕЩАТЬ ТРОМБОЦИТЫ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ СИНДРОМАХ
COLLAGEN-BASED INJECTIONS CAPABLE OF CONTROLLING HAEMORRHAGE AND/OR REPLACING PLATELET IN HAEMORRHAGIC SYNDROMES

Область техники
Изобретение относится к композиции для инъекций на основе коллагена, предназначенной для лечения геморрагий. Композиция для инъекций состоит из белков и пептидов, полученных из коллагена, которые способны индуцировать адгезию и активацию тромбоцитов и даже их агрегацию. Настоящее изобретение также относится к экстренному введению системным/общим путем белков и пептидов, полученных из коллагена, пациентам, получающим лечение антитромбоцитарными лекарственными препаратами, в неотложных ситуациях (геморрагия, хирургическая операция).
Предшествующий уровень техники
Геморрагию определяют как вытекание крови за пределы нормального кровотока. Она может быть простым кровотечением или становиться массивной в некоторых ситуациях, в частности - при травме, и приводить к состоянию геморрагического шока, сопровождающемуся падением кровяного давления.
Различные клинические ситуации приводят к риску геморрагии, такие как хирургическая операция, травма, лечение, тромбоцитопения или конституциональные или функциональные нарушения (такие как гемофилия) (Spahn D. et al., Critical Care, 2013, 17:R6). При сильной геморрагии наблюдается коагулопатия. Коагулопатия соответствует дефициту тромбоцитов и факторов коагуляции. Жизненно важным является лечение, и от него зависит результат геморрагии. В настоящее время используют различные стратегии лечения.
Один из подходов состоит в использовании трансфузионной поддержки, основанной на свежезамороженной плазме (FFP; от англ. fresh frozen plasma), эритроцитарной массе или тромбоцитах. Однако успех подхода, основанного на использовании тромбоцитов, ограничен несколькими факторами, включающими доступность тромбоцитов, короткий срок их хранения (в среднем 5 дней), проблемы, связанные с условиями хранения, риск загрязнения некоторых типов образцов, их стоимость и риск неэффективности или даже непереносимости, обусловленной аллоиммунизацией.

Другой подход основан на использовании концентратов факторов коагуляции, таких как концентраты фибриногена и концентраты протромбинового комплекса (факторы II, VI, IX и X). В исследованиях также было предложено использование фактора VIIa (NovoSeven). Однако использование этого последнего фактора не рекомендовано из-за высокой частоты индуцированных тромбозов.
Наконец, еще один подход в экстренных ситуациях заключается в использовании транексамовой кислоты, которая является мощным антагонистом активации плазминогена и поэтому действует как антифибринолитик (Fries D., Transfusion, 2013, 53:91S-95S).
Ни один из подходов, предложенных к настоящему времени, не обеспечивает индукцию активации и агрегации тромбоцитов во время геморрагического эпизода, хотя они являются ключевыми стадиями процесса прекращения кровотечения. Если повреждение сосудов приводит к кровотечению, то имеет место ряд стадий, называемых первичным гемостазом. В нем участвуют тромбоциты - клетки в форме двояковыпуклых дисков, не содержащие ядер, с диаметром, лежащим в диапазоне от примерно 2 мкм до 5 мкм. В этом процессе принимают участие различные факторы, которые приводят к формированию гемостатического сгустка. Первая фаза, называемая адгезией, обеспечивает рекрутинг циркулирующих тромбоцитов к месту повреждения. Эта стадия включает фактор Виллебранда, коллаген и рецепторы тромбоцитов, называемые рецепторами коллагена (GpVI и α2β1). Вторая фаза, называемая активацией тромбоцитов, включает высвобождение проагрегантных факторов и экспрессию на поверхности тромбоцитов таких белков, как Р-селектин. За этой фазой следует фаза, называемая агрегацией, которая, в частности, включает фибриноген и рецептор тромбоцитов GpIIb/IIIa и экспозицию на мембране прокоагулянтных фосфолипидов, обеспечивающих фиксацию факторов коагуляции на месте повреждения и в конечном итоге образование фибринтромбоцитарного сгустка и прекращение кровотечения.
В настоящее время хорошо известно, что активация тромбоцитов во время процесса гемостаза приводит к появлению двух популяций тромбоцитов, называемых проагрегантными и прокоагулянтными. Последние характеризуются поверхностной экспрессией фосфатидилсерина, лежащего в основе образования тромбина. Их называют суперактивированными тромбоцитами. Поэтому мы говорим о суперактивационном потенциале тромбоцитов для описания способности каждого индивидуума генерировать эту популяцию тромбоцитов в ответ на агонисты, такие как тромбин и коллаген. Недавние исследования показали, что любая терапевтическая стратегия, целью которой является индукция появления этой популяции активированных тромбоцитов, обладает большим потенциалом для лечения геморрагических ситуаций (Mazepa М. et al. ATVB, 2013, 33(8):1747-52). Кроме того, интерес к ним подкреплен данными, подтверждающими, что гемостатический эффект перелитых тромбоцитов зависит от этой популяции. Однако предложенные к настоящему времени подходы не основаны на инъекции в кровоток физиологических или природных активаторов тромбоцитов, таких как коллаген или белки и пептиды, полученные из коллагена, которые заявлены в настоящем изобретении.
Центральная роль тромбоцитов в остановке кровотечения стала основой для недавней работы, целью которой была разработка продуктов, полученных из тромбоцитов или имитирующих тромбоциты (синтетические тромбоциты). Среди предложенных подходов существует различие между подходами, основанными на продуктах, полученных из клеток, таких как тромбоэритроциты и тромбосомы, и подходами, использующими частицы микрометрового размера, покрытые пептидами, полученными из белков, участвующих в каскаде активации тромбоцитов, такие как синтоциты или Fibrocaps™, основанные на пептидах, полученных из фибриногена (RGD-пептиды или додекапептид Н12), или покрытые пептидами, связывающимися с фактором Виллебранда, с коллагеном или с GpIIb/IIIa (Lashof-Sullivan М. et al. Nanoscale, 2013, 5, 10719-10728). Описан гемостатический эффект этих частиц, покрытых пептидами, связывающимися с фактором Виллебранда, с коллагеном или с GpIIb/IIIa, который позволяет предположить возможность их применения в геморрагическом контексте. Однако этот подход создает большую проблему с промышленным производством такого типа продукта, который объединяет несколько пептидов в одной частице, в связи с необходимостью изучить и определить такие параметры, как скорость связывания и соотношение всех пептидов, а также стабильность продукта после инъекции, помимо того факта, что в настоящее время необходимо вводить очень высокие дозы (порядка нескольких десятков миллиграммов на килограмм) (Modery-Pawlowski С. et all., Biomaterials, 2013, 516-541).
Поэтому существует потребность в новых средствах лечения геморрагии, которые можно было бы вводить в кровоток для обеспечения их доступности. Предпочтительно они должны быть такими, чтобы их можно было легко производить промышленным способом, и чтобы их можно было использовать в низких концентрациях.
В связи со старением населения врачи все чаще и чаще встречаются с пациентами, получающими лечение антикоагулянтами и антитромбоцитарными лекарственными препаратами. Хотя стратегия временной отмены этих средств четко определена для запрограммированных интервенций (отмена на период от 5 до 7 дней перед использованием новых антитромбоцитарных препаратов и отмена на 5 дней перед использованием новых антикоагулянтов), они серьезно осложняют неотложную терапию пациентов в геморрагических ситуациях (хирургическая операция или травма, в частности - черепа) (Bonhomme F. et al., Eur. J. Intern. Med., 2014 Mar; 25(3):213-20). Предложены различные стратегии реверсии в неотложных ситуациях, однако в случае новых антитромбоцитарных лекарственных средств они в основном ограничены трансфузией тромбоцитов (Beynon C. et al., Crit. Care, 2012 Jul 26; 16(40:228). Существует потребность в новых гемостатических продуктах для инъекций, которые были бы способны обеспечивать восстановление функции тромбоцитов во время геморрагических эпизодов независимо от механизма действия этих новых антитромбоцитарных лекарственных средств. Факт, состоящий в том, что коллагензависимый путь активации тромбоцитов является наиболее физиологичным и в настоящее время не модифицируется ни одним из антитромбоцитарных лекарственных средств, имеющихся на рынке, усиливает интерес к введению белков или пептидов, полученных из коллагена, системным путем в этих ситуациях. Хорошо известно, что связывание GPVI с коллагеном или белками или пептидами, полученными из коллагена по настоящему изобретению, приводит к интенсивной внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах.
В логистически ограниченном контексте, например - во время военных операций на морских театрах военных действий, при лечении геморрагии руководствуются концепцией «damage control resuscitation» («гемостатической реанимации»), включающей, в частности, трансфузию (эритроцитарной массы, плазмы и тромбоцитов). Однако эта ситуация характеризуется труднодоступностью этих препаратов крови, в частности - тромбоцитов, и требует модифицированного лечения, обозначаемого термином «remote damage control resuscitation» («отдаленная гемостатическая реанимация»), принципиальным отличием которого является использование цельной крови (Jenkins D.H. et al., Shock, 2014 May; 41 Suppl. 1:3-12). Эта стратегия перспективна, хотя и связана с риском заражения, но в настоящее время она остается ограниченной сферой военной медицины (Murdock A.D. et al., Shock, 2014 May; 41 Suppl. 1:62-9).
Поэтому настоящее изобретение относится к интересу к внутривенному введению активирующих тромбоциты белков или пептидов, полученных из коллагена, в качестве новых гемостатических композиций для инъекций в трех ситуациях, включающих геморрагию:
во время эпизода массивного кровотечения, в частности - непережимаемого кровотечения, требующего способности активировать тромбоциты в кровотоке;
- в качестве адъюванта во время трансфузионной реанимации вдали от медицинского центра в качестве дополнения к подходу, основанному на трансфузии, в частности, цельной крови или тромбоцитов;
- в качестве реверсивного средства для новых антитромбоцитарных лекарственных средств (например, прасугреля, тикагрелора), которые в настоящее время находятся на рынке без антидотов, в случае хирургической операции или геморрагии, в частности - интракраниальной.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции для инъекций, предназначенной для применения при лечении геморрагий, содержащей:
- частицы или волокна длиной менее 10 мкм, причем эти частицы или волокна содержат белки или пептиды, индуцирующие адгезию и активацию тромбоцитов или даже их агрегацию; и
- по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 демонстрирует результаты измерения посредством динамического рассеяния света (DLS; от англ.: dynamic light scattering) размеров частиц белкового экстракта полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 после концентрирования в 50 раз.
Фиг. 2 демонстрирует полученный посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA; от англ.: enzyme-linked immunosorbent assay) результат, относящийся к связыванию очищенного фактора Виллебранда (Willfactin, LFB), использованного в конечной концентрации, равной 2 МЕ/дл, с полипептидами с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц различного размера, использованными в конечной концентрации, равной 2 мкг/мл, и с коллагеном I типа (коллаген SIRCOL, позитивный контроль), использованным в концентрации, равной 10 мкг/мл.
Фиг. 3А представляет типичный профиль экспресии Р-селектина на поверхности тромбоцитов для полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 и для коллагена I типа (Horm), полученный посредством проточной цитометрии.
Фиг. 3В представляет средние интенсивности флуоресценции, полученные для различных агонистов.
Фиг. 4 демонстрирует результат агрегации, полученной с использованием полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц.
Фиг. 5 демонстрирует макромолекулярную структуру полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц в сравнении с коллагеном I типа (Horm), полученную с использованием различных способов микроскопии.
Фиг. 6 представляет средние интенсивности флуоресценции, полученные посредством проточной цитометрии, для экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов, выделенных после инъекции мышам полипептида с последовательностью SEQ ID N0 1 и коллагена I типа (Horm).
Фиг. 7 демонстрирует результаты внутривенной инъекции мышам в присутствии эпинефрина коллагена I типа (Horm) в фибриллярной форме и полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц в случае модели индуцированной тромбоэмболии легочной артерии у мышей.
Фиг. 7А демонстрирует результаты по смертности у мышей после инъекции, а Фиг. 7В демонстрирует биораспределение макроагрегатов альбумина, меченого технецием, который ввели по меньшей мере через 5 минут после введения различных испытанных коллагенов.
Фиг. 8 демонстрирует результаты инъекции мышам полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в модели индуцированного кровотечения из хвоста у мышей.
Описание последовательностей
Последовательность SEQ ID NO 1: полипептид, кодирующий рекомбинантный белок, способный индуцировать адгезию и активацию тромбоцитов.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции для инъекций, предназначенной для применения при лечении геморрагий, содержащей:
- частицы или волокна длиной менее 10 мкм, причем эти частицы или волокна содержат белки или пептиды, индуцирующие адгезию и активацию тромбоцитов; и
- по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
Композиции для инъекций по настоящему изобретению обеспечивают стимуляцию активности тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения частицы или волокна содержат белки или пептиды, индуцирующие адгезию и активацию тромбоцитов, а также агрегацию тромбоцитов после введения их в кровоток. Последние можно также использовать в качестве адъюванта для предварительной активации тромбоцитов во время трансфузии концентратов тромбоцитов или цельной крови.
Белки или пептиды, индуцирующие адгезию, активацию и даже агрегацию тромбоцитов
Белки или пептиды, входящие в состав композиций по настоящему изобретению, обладают способностью индуцировать адгезию и активацию тромбоцитов или даже агрегацию тромбоцитов. Следует понимать, что эти два или три вида активности являются свойствами одного и того же белка или пептида. Эти белки или пептиды находятся в форме частиц или волокон, имеющих длину менее 10 мкм.
Волокна предпочтительно имеют длину менее 9 мкм, 8 мкм, 7 мкм, 6 мкм, 5 мкм, 4 мкм, 3 мкм, 2 мкм, 1 мкм или 0,5 мкм. Более предпочтительно волокна имеют длину, лежащую в диапазоне от 0,5 мкм до 9 мкм, от 1 мкм до 5 мкм или от 2 мкм до 4 мкм.
Эти белки или пептиды способны связывать или активировать фактор Виллебранда, ответственный за адгезию тромбоцитов, и индуцировать поверхностную экспрессию Р-селектина или фосфатидилсерина - маркеров активации тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белки или пептиды способны индуцировать in vitro агрегацию в плазме, обогащенной тромбоцитами, или в цельной крови.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белки или пептиды способны стимулировать тромбоциты и индуцировать остановку кровотечения без обязательной способности индуцировать активацию коагуляции, которая зависит от экспрессии фосфатидилсерина на поверхности тромбоцитов, формирования так называемой прокоагулянтной поверхности и результирующего образования тромбина. Это обеспечивает ограничение риска тромбоза, индуцируемого после системной инъекции композиции. Тем не менее, активация этой субпопуляции активированных тромбоцитов, называемых прокоагулянтными тромбоцитами, имеет место, но ее уровни ниже уровней, необходимых для образования протромбина, обнаружимого классическими анализами.
Семейство белков, называемых коллагенами, обладает способностью индуцировать три указанных вида активности из-за присутствия в последовательности некоторых коллагенов, принципиально - коллагенов типов I и III, пептидных последовательностей, способных связываться с циркулирующим фактором Виллебранда и с двумя видами рецепторов тромбоцитов - GpVI и α2β1. Это приводит к адгезии тромбоцитов, к их активации и затем к их агрегации. Таким образом, белки, входящие в состав композиций по настоящему изобретению, могут быть выбраны из коллагенов, в частности - из коллагенов типов I и III.
До настоящего времени не предлагали использовать коллаген для лечения геморрагий. Это можно объяснить тем фактом, что из нативных коллагенов только коллагены, находящиеся в фибриллярной форме, были описаны как способные индуцировать адгезию, активацию и агрегацию тромбоцитов (Clementson K., Thrombosis Research, 2012, 129, 220-224). Однако эта фибриллярная форма с волокнами, которые могут достигать нескольких микрометров в длину, не совместима с инъекцией в кровоток. Специфические формы по настоящему изобретению совместимы с инъекцией в кровоток.
Специфические формы коллагена, такие как микросферы, микроволокна и дендримеры, можно получить такими способами, как описанные Pires М. и Chmielewski J. J. Am. Chem. Soc, 2009, 131, 2706-2712; Przybyla D. et al. J. Am. Chem. Soc, 2013, 135, 3418-3422; Kojima C. et al. J. Am. Chem. Soc, 2009, 131, 30652-6053; Slatter D. et al. Peptides, 2012, 36, 86-93; Kar et al. Journal of Biological Chemistry, 2006, vol. 281, no. 44, 33283-33290. Для получения этих специфических форм использовали различные подходы, основанные, в частности, на использовании металлов или солей, на добавлении цистеина (дисульфидные мостики) или ароматических аминокислот в пептидную последовательность или на соотношении аминокислот различной природы (полярных, неполярных, кислых, щелочных).
Кроме коллагенов, белки, входящие в состав композиции по настоящему изобретению, могут быть рекомбинантными белками, например, такими, которые описаны в заявке на международный патент WO 2010/034718. Эти рекомбинантные белки, полученные из коллагена, способны индуцировать агрегацию тромбоцитов эквивалентно нативному коллагену. Другими белками, которые могут быть использованы в настоящем изобретении и полученными из коллагена, являются белки, описанные в заявке на европейский патент ЕР 2013/071816. Эти белки способны связываться с фактором Виллебранда, то есть способны к связыванию, которое участвует в первоначальной адгезии тромбоцитов в месте повреждения сосудов.
Таким образом, белки, входящие в состав композиций по настоящему изобретению, могут быть выбраны из нативных коллагенов, таких как коллагены I и III типов, или рекомбинантных белков, последовательность которых включает по меньшей мере один полипептид, выбранный из:
- полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1;
- полипептида, содержащего последовательности, образованные посредством повторения триплетов GXY, где G обозначает глицин, а X и Y обозначают любую аминокислоту, которые повторены n раз, причем n больше или равно 2;
- полипептида, содержащего последовательность с положения 25 до положения 184 из последовательности SEQ ID NO 1;
- полипептида, обладающего по меньшей мере 70%-ной идентичностью по всей его длине с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1 или с полипептидом, содержащим последовательность с положения 25 до положения 184 из последовательности SEQ ID NO 1.
Кроме того, природные или синтетические пептиды или полипептиды, которые содержат последовательность с глицином среди каждых 3 аминокислот можно считать производными коллагенов (An В. et al. Frontiers in chemistry. 2014 June; 2, article 40). Эта первичная структура цепи индуцирует подтверждение пептидной цепи, сходной с цепью коллагена, в присутствии аминокислот (например, цистеина) или пептидных последовательностей, обеспечивающих формирование мультимерных структур (например, доменов тримеризации белков MBL (лектинов, связывающих маннозу; от англ.: mannose-binding lectin)).
Пептид с последовательностью от положения 1 до положения 24 из последовательности SEQ ID NO 1 соответствует сигнальному пептиду, обеспечивающему секрецию рекомбинантного белка клеткой-хозяином. Этот сигнальный пептид может отсутствовать или быть замененным другим сигнальным пептидом способами, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Специалист в данной области техники сможет выбрать гомологичный или гетерологичный сигнальный пептид, который подходит для экспрессии и секреции полипептидов в различных прокариотических или эукариотических системах экспрессии. Предпочтительно, полипептиды продуцируются в эукариотических клетках или организмах, и в частности - в клетках млекопитающих. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полипептиды содержат сигнальный пептид, обеспечивающий их секрецию во внеклеточную среду. В другом варианте осуществления настоящего изобретения зрелый полипептид получают после отщепления сигнального пептида.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность рекомбинантных белков содержит по меньшей мере один полипептид, содержащий следующие пептидные последовательности:
1
2
1
2
- GXXGER, в которой X и Х независимо друг от друга обозначают аминокислоту, выбранную из A, R, N, D, Q, Е, G, Н, I, K, М, F, Р, S, Т, W, Y, V и О;
3
n
3
- (GPX), где n лежит в диапазоне от 4 до 10, а Х обозначает Р или О; и
4
5
4
5
- GPRGQXGVMGFX, где Х Х независимо друг от друга обозначают Р или О.
Р обозначает пролин, а О обозначает гидроксипролин.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность рекомбинантных белков содержит по меньшей мере один полипептид, содержащий следующие пептидные последовательности:
- GAPGER,
- KPGEPGPK,
n
- (GPP), где n лежит в диапазоне от 4 до 10,
- RGD.
Таким образом, рекомбинантные белки содержат:
(a) пептидные последовательности, содержащие по меньшей мере один повтор 4 GPO триплетов;
(b) пептидные последовательности, обладающие связывающей активностью в отношении различных рецепторов тромбоцитов и присутствием нативной последовательности коллагенов; и
(c) связывающими последовательностями, образованными в результате повторения триплетов GXY между последовательностями (а) и (b), в которых G обозначает глицин, а X и Y обозначают любую аминокислоту.
Рекомбинантные белки, входящие в состав композиций по настоящему изобретению, могут содержать последовательность, включающую по меньшей мере один полипептид, обладающий по меньшей мере 70%-ной идентичностью по всей своей длине с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1 или с полипептидом, содержащим последовательность с положения 25 до положения 184 последовательности SEQ ID NO 1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды обладают по меньшей мере 70%-ной, 80%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной и, предпочтительно, по меньшей мере 99%-ной идентичностью с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1. Процент идентичности означает процентное содержание идентичных аминокислот (аминокислот, которые являются инвариантными или неизменяющимися в двух последовательностях). Эти полипептиды могут содержать делецию, вставку или замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1.
Способы измерения процента идентичности полипептидов известны специалистам в данной области техники. Можно использовать вектор NTi 9.1.0, программа выравнивания AlignX (алгоритм Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). Предпочтительно используют стандартные параметры.
Рекомбинантные белки могут быть выработаны бактериями или клетками млекопитающих с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, в частности - способов, описанных в публикациях W0 2010/034718 и ЕР 2013/071816.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белки также способны связываться с коллагеном, присутствующим в поврежденных участках сосудов, в частности - за счет наличия в последовательности GPO-последовательности, повторенной n раз, где n лежит в диапазоне от 3 до 10.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белки могут быть ПЭГилированы (модификация полиэтиленгликолем) или ПАСилированы (добавление аминокислот пролина, аланина и серина n раз).
Пептиды, входящие в состав композиций по настоящему изобретению, могут быть пептидами, описанными выше. Таким образом, пептиды могут быть выбраны из:
- полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1;
- полипептида, содержащего последовательности, образованные посредством повторения GXY триплетов, где G обозначает глицин, а X и Y обозначают любую аминокислоту, причем число повторов равно n при n большем или равном 2;
- полипептида, содержащего последовательность от положения 25 до положения 184 из последовательности SEQ ID NO 1;
или
- полипептида, обладающего по меньшей мере 70%-ной идентичностью вдоль всей длины с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1 или с полипептидом, содержащим последовательность от положения 25 до положения 184 из последовательности SEQ ID NO 1.
Полипептиды выделяют или очищают из естественной среды. Полипептиды могут быть получены с использованием различных способов. Этими способами являются, в частности, продукция рекомбинантных полипептидов соответствующими клетками-хозяевами с последующей их очисткой, получение посредством химического синтеза или, наконец, сочетание этих различных подходов. Эти различные способы получения полипептидов известны специалистам в данной области техники. Предпочтительно полипептиды продуцируются прокариотическими или эукариотическими рекомбинантными клетками. Соответственно, полипептиды могут синтезироваться в бактериях или клетках млекопитающих.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды являются гликозилированными. Полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, в частности, содержит сайты О-гликозилирования на аминокислотах лизинах, находящихся в положениях 102 и 141 (на месте трех GXY триплетов). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения остаток аспарагина в положении 93 полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 гликозилирован.
Белки в фибриллярной Форме
Белки, входящие в состав композиций для инъекций по настоящему изобретению, могут иметь структуру в форме волокон с длиной менее 10 мкм. Фибриллярные формы, которые включают волокна с длиной более 10 мкм, и которые могут достигать длины, равной нескольким микрометрам, несовместимы с инъекцией в кровоток.
Длину волокон можно измерить способами, известными специалистам в данной области техники, в частности - посредством микроскопии, например - посредством атомно-силовой микроскопии (AFM; от англ.: atomic force microscopy).
Частицы
Частицы, входящие в состав композиций по настоящему изобретению, могут включать белки или пептиды или состоять из белков или пептидов, индуцирующих адгезию и активацию тромбоцитов или их агрегацию. Белки и пептиды являются такими, как описано выше.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения частицы могут быть получены посредством адгезии белков или пептидов к основе. При этом частицы, входящие в состав композиций по настоящему изобретению, включают основы, к которым присоединены белки или пептиды, индуцирующие адгезию, активацию или агрегацию тромбоцитов.
Основами могут быть органические или неорганические микрочастицы. Примерами микрочастиц являются альбумин, липиды, металлы, такие как золото, титан, железо, серебро или их оксиды, графен, диоксид кремния или полимеры.
Адгезию белков или пептидов к основам можно обеспечить за счет ковалентного связывания с функциональными группами, присутствующими на поверхности частицы, или через бифункциональный спейсер или бифункциональный полимер. Бифункциональный спейсер или бифункциональный полимер обеспечивают функционализацию микрочастиц. На одном конце он содержит функциональную группу, которая позволяет ему ковалентно связываться с поверхностью микрочастиц, а на другом конце он содержит функциональную группу, которая позволяет ему ковалентно связываться с белками или пептидами.
Бифункциональный полимер предпочтительно является гетеробифункциональным полимером. Наличие двух различных функциональных групп позволяет ограничить нежелательные связи, например - присоединение обоих концов полимера к микрочастицам. Сродство между терминальными функциональными группами полимера предпочтительно также является слабым, чтобы ограничить самоконденсацию полимера за счет взаимодействия между этими двумя концами.
Для функционализации микрочастиц можно использовать различные типы бифункциональных полимеров. При этом бифункциональные полимеры могут быть выбраны из полиэтиленгликоля (PEG; от англ.: polyethylene glycol), сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA; от англ.: poly(lactic-co-glycolic acid)/поликапролактона (PLCL; от англ.: poly(caprolactone)), полимолочной кислоты (PLA; от анл.: polylactic acid), полимеров гликолида (PGA; от англ. polyglycolic acid), хитозана, декстрана и т.д. Предпочтительно полимер является бифункциональным полиэтиленгликолем, предпочтительно - гетеробифункциональным. Молекулярная масса полимера обычно варьируется от 500 Да до 10000 Да, предпочтительно - от 2000 Да до 8000 Да, более предпочтительно - около 5000 Да. Молекулярная массу полимера в характерном случае выбирают такой, чтобы при прикреплении белка или пептида к микрочастице через бифункциональный полимер, полимерная цепь имела достаточную длину для того, чтобы свойства белка или пептида не были нарушены из-за присутствия микрочастицы.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения частицы могут быть получены посредством самосборки белков или пептидов. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения частицы не содержат основы, а состоят исключительно из белков или пептидов. Самосборку можно осуществить различными способами, например - посредством коацервации или посредством агрегации, например - посредством преципитации, концентрации, добавления металлов или солей или изменения температуры.
Частицы по настоящему изобретению могут иметь средний диаметр, лежащий в диапазоне от 0,05 мкм до 6 мкм, или от 1 мкм до 5 мкм, или от 2 мкм до 4 мкм, по результатам измерения посредством динамического светорассеяния (DLS; от англ.: dynamic light scattering). Предпочтительно средний диаметр частиц по настоящему изобретению может лежать в диапазоне от 0,02 мкм до 0,05 мкм, например - от 0,025 мкм до 0,045 мкм, или, например, он может быть равным 0,035 мкм.
Если частицы содержат рекомбинантные белки или состоят из рекомбинантных белков, последовательность которых включает по меньшей мере один полипептид, выбранный из:
- полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1;
- полипептида, содержащего последовательность от положения 25 до положения 184 из последовательности SEQ ID NO 1;
или
- полипептида, обладающего по меньшей мере 70%-ной идентичностью вдоль всей длины с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1 или с полипептидом, содержащим последовательность от положения 25 до положения 184 из последовательности SEQ ID NO 1,
и если они имеют средний диаметр более 2 мкм по результатам измерения посредством DLS, то они способны индуцировать адгезию, активацию и агрегацию тромбоцитов. Этот эффект также обнаружен у молекул, средний диаметр которых меньше 2 мкм, например - лежит в диапазоне от 0,02 мкм до 1 мкм, от 0,05 мкм до 0,5 мкм или от 0,1 мкм до 0,3 мкм.
Фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель
Фармацевтически приемлемые носители или наполнители по настоящему изобретению, то есть носители или наполнители, введение которых индивидууму не сопровождается значимыми неблагоприятными эффектами, известны специалистам в данной области техники.
Примерами фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей являются, но не ограничиваются ими, растворители, глиданты, суспензирующие средства, стабилизаторы, консерванты, буферы, антиоксиданты и хелатирующие агенты.
Композиции для инъекций по настоящему изобретению можно приготовить способами, известными специалистам в данной области техники.
Композиции для инъекций по настоящему изобретению способны контролировать кровотечение за счет активации тромбоцитов и/или за счет замещения тромбоцитов в случае геморрагических синдромов.
Поэтому настоящее изобретение относится к способам лечения геморрагии, которые включают введение посредством инъекции эффективного количества композиции, определенной выше, в кровоток индивидуума.
Поэтому очевидно, что в контексте настоящего изобретения термин «инъекция» является синонимом системного введения, иногда называемого общим введением, композиции по настоящему изобретению пациенту.
Наконец, настоящее изобретение относится к применению композиции, определенной выше, для приготовления лекарственного средства для лечения геморрагии.
ПРИМЕРЫ
Получение коллагена и его самосборка в частицы (способ определения размера частиц посредством DLS)
2
5
Перед трансфекцией выполнили 3-недельное предварительное культивирование клеток CHO-S (Invitrogen). Клетки выдерживали в специфической среде для клеток СНО (Power-CHO, EXCEL 302, proCHO4, proCHO5 и т.п.) с добавлением 4 мМ L-глутамина (Lonza) и 1Х proHT (Lonza) в качалочной колбе объемом 125 мл при перемешивании (80 об/мин) в инкубаторе при 37°C с 5% CO. За два дня до трансфекции клетки высеяли в концентрации, равной 5×10жизнеспособных клеток/мл, с полной заменой среды и культивировали в 12,5 мл комплементированной среде, специфичной для клеток СНО, в качалочной колбе объемом 125 мл.
6
6
6
2
В день трансфекции 5×10 жизнеспособных клеток отделили посредством центрифугирования (5 мин при 1000 g), затем перенесли в 5 мл среды RPMI (Lonza), комплементированной 4 мМ L-глутамина (Lonza) и 1Х proHT (Lonza). После этого 4 мл суспензии разделили между четырьмя качалочными колбами объемом 25 мл (по 1 мл на колбу), содержащими 9 мл комплементированной среды RPMI (1×10жизнеспособных клеток на качалочную колбу). Затем клетки CHO-S трансфицировали вектором, содержавшим последовательность, кодирующую полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, описанный выше. Позитивный контроль трансфекции выполнили посредством трансфекции клеток вектором pMAX-GFP, а два негативных контроля трансфекции выполнили посредством клеток вектором, который не переносил гены устойчивости и не обеспечивал лечения. Трансфекцию провели с использованием трансфицирующего агента Fecturine (PolyPlus Transfection) или любого другого подходящего трансфицирующего агента согласно оптимизированному коммерческому протоколу продукта. В случае Fecturine выбранные условия трансфекции были следующими: 6 мкг ДНК на 12 мкл Fecturine (отношение ДНК/трансфицирующий агент составляет ) на 10 жизнеспособных клеток. Специалистам в данной области техники известно, как определить наиболее подходящие трансфицирующие агенты для транзиторной трансфекции или для стабильной трансфекции. Независимо от того, был ли режим трансфекции транзиторным или стабильным, клетки инкубировали в присутствии трансфекционных комплексов в статических условиях при 37°С и 5% CO. Через четыре часа после трансфекции клетки повторно суспензировали в комплементированной среде, специфичной для клеток СНО, и возвратили в условия с перемешиванием. Через 24 часа после трансфекции выполнили измерение эффективности трансфекции на аликвотах позитивных и негативных контролей трансфекции посредством проточной цитометрии.
Для получения полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в транзиторном режиме начальный образец супернатанта взяли в день D+3 (DO соответствовал дню трансфекции), затем культивирование прекратили в день D+5. Супернатант культуры, содержавший полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, секретированный клетками, отделили посредством центрифугирования при 3000 g в течение 10 минут, что позволило удалить клетки и клеточный дебрис, затем заморозили при -20°С.
5
6
Для получения полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в стабильном режиме через 48 часов после трансфекции выполнили подсчет клеток. Затем клетки центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут, после чего засеяли в концентрации 3×10 жизнеспособных клеток/мл в комплементированную среду, специфичную для клеток СНО плюс 700 мкг/мл генетицина (G418 Merck) (селекционное давление). Затем культуру клеток поддерживали посредством пересева всех клеток в конечный объем, равный 12,5 мл полной среды плюс 700 мкг/мл G418, в качалочных колбах объемом 125 мл. На первой неделе культивирования под селекционным давлением наблюдали снижение концентрации клеток и/или жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток снова возрастала через 2-3 недели пребывания под селекционным давлением, однако лишь у клеток, трансфицированных вектором, содержащим последовательность, кодирующую полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 или пустой вектор. Жизнеспособность нетрансфицированных клеток продолжала снижаться до тех пор, пока не становилась равной нулю. Как только жизнеспособность культуры достигла более чем 95%, выполнили криоконсервацию 5×10 жизнеспособных клеток/ампулу (в 10 ампулах). Клетки заморозили в комплементированной среде, специфичной для клеток СНО плюс 10% ДМСО (диметилсульфоксид; DMSO; от англ.: dimethylsulphoxide).
2
5
Для получения полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 клетки, генетически модифицированные для получения полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1, разморозили и хранили в соответствующей среде. Клетки перенесли в 12,5 мл конечной среды и поместили в качалочной колбе объемом 125 мл в перемешивающее устройство  LabTherm при 80 об/мин, в которой были установлены концентрация CO, равная 5%, и влажность в диапазоне от 40% до 80%. Клетки сохраняли при концентрации, равной 3×10 жизнеспособных клеток/мл, в течение одной или двух недель. Затем клетки амплифицировали, чтобы получить количество, необходимое для производства. Амплификация состоит в перенесении клеток в большие объемы при каждой замене среды с целью сохранения всех клеток в жизнеспособном состоянии.
5
После получения количества клеток, необходимого для производства, можно было начать производство. Клетки засеяли в концентрации, равной 3×10жизнеспособных клеток/мл. Производство можно осуществить в различном оборудовании: в качалочной колбе, помещенной в перемешивающее устройство  LabTherm, Cultibag RM 20/50 (Sartorius), CellReady (Merck Millipore), BioBundle (Applikon) или в другом эквивалентном оборудовании такого же или большего масштаба. Субкультивирование выполняли в течение 5 дней или более, максимум в течение 10 дней, в соответствии с условиями культивирования. Ежедневно культивировали производственные параметры, концентрацию клеток и жизнеспособность клеток. Во время производства можно добавить такие компоненты, как аминокислоты, витамины, глюкозу или любые другие элементы, представляющие интерес для производства или для клеток. В этом случае культура является «подпитываемой культурой» или «полунепрерывной культурой», которая позволяет культивировать клетки в течение не более чем 21 дня. Если во время культивирования не добавляют никаких соединений, то это «порционная» или «периодическая» культура.
2
4
2
2
4
2
2
4
2
2
4
2
2
4
2
2
4
2
2
4
2
2
4
2
Очистку полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 можно выполнить, например, с использованием метки очистки, такой как tag-6(His), присутствующей в его последовательности. При этом клетки и клеточный дебрис, присутствующие в среде, содержащей полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, удаляют посредством центрифугирования, глубокой фильтрации (Merck Millipore POD Millistak+ или любой другой тип технической поддержки) или тангенциальной фильтрации на мембране с отсечкой на уровне 0,2 мкм. Полученный таким образом супернатант очистили посредством аффинной хроматографии на колонке с иммобилизированным металлом, таким как никель, кобальт, цинк или медь. Для того чтобы повысить присоединение полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1, к супернатанту добавили буферный раствор, содержащий от 0 мМ до 50 мМ имидазола, от 0 мМ до 500 мМ NaCl, от 5 мМ до 20 мМ (NaHPO⋅2HO) и от 5 мМ до 20 мМ (NaHPO⋅HO), и довели до pH в диапазоне от 7 до 8. Выделение полипептида по настоящему изобретению осуществляли либо в градиенте с использованием смеси двух буферных растворов (буфер 1: 500 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 10 мМ (NaHPO⋅2HO) и 10 мМ (NaHPO⋅HO); буфер 2: 20 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 10 мм (NaHPO⋅2HO) и 10 мМ (NaHPO⋅HO) или изократически с использованием буферного раствора, содержавшего от 50 мМ до 500 мМ имидазола, от 0 мМ до 500 мМ NaCl, от 5 мМ до 10 мМ (NaHPO⋅2HO) и от 5 мМ до 10 мМ (NaHPO⋅HO). Можно добавить другие стадии очистки, чтобы повысить степень чистоты полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1. Это могут быть стадии фильтрации, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, эксклюзионной хроматографии или любого другого типа хроматографии.

Фракции элюата, представлявшие интерес, поместили для миграции на гель для электрофореза в нативных условиях и окрасили красителем кумасси синим до сбора в соответствии с их профилем и диализировали в воде, фосфатном буфере или любом другом буферном растворе, подходящем для хранения полипептида по настоящему изобретению. Концентрацию полипептида определили с использованием набора Sircol (TebuBio) в соответствии с инструкциями производителей или посредством теста Бредфорда или любого другого теста, подходящего для количественного определения полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1.
Полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 концентрировали множество раз (50 раз) относительно его первоначального объема посредством ультрафильтрации, которая позволяет получить концентрацию белка, достаточную для того, чтобы индуцировать самосборку полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 и образование частиц. Белковый экстракт, содержащий полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, концентрируют таким образом на колонках для ультрафильтрации с отсечкой на уровне 10000 Да (Vivaspin 4, Sartorius) посредством многократного центрифугирования, выполняемого при 4°С и 4000 об/мин. После того как раствор сконцентрировали, было проведено измерение полученных таким образом частиц, способом динамического светорассеяния (DLS) с использованием наноприбора Malvern Zetasizer. Измерение DLS является способом неразрушающего спектроскопического анализа, который обеспечивает возможность измерения размера частиц, находящихся в жидкости в форме суспензии; в частности, он пригоден для измерения самосборки или агрегации белков, таких как полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1.
На Фиг. 1 приведен характерный результат измерения размера частиц посредством DLS после концентрирования в 50 раз белкового экстракта полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1. Наблюдается серия пиков, соответствующих различным размерам частиц, содержащихся в растворе. Выдающимися являются три пика: они соответствуют размеру частиц, равному 1,25 мкм, 3 мкм и 5,5 мкм. Для того чтобы связать биологическую активность полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 с размером полученных таким образом частиц, к раствору добавили соляную кислоту до конечной концентрации, равной 20 мМ. Три первоначально измеренных пика после этого исчезли, и появились два пика, соответствовавших примерно 500 нм и 1,8 мкм. Визуально фракция выглядела «чистой», изменив свой внешний вид от зернистого до прозрачного.
Измерение способности к связыванию фактора Виллебранда как функции размера частиц
Композиция, основанная на полипептиде с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц, обладает способностью связывать фактор Виллебранда. Измерение способности к связыванию фактора Виллебранда полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 способом ELISA было выполнено на 96-луночных планшетах (Nunc Maxisorp). Для этого в каждую ячейку поместили объем, равный 100 мл, раствора, содержавшего полипептид в концентрации, равной 2 мкг/мл, в фосфатном буфере или любом другом подходящем буферном растворе и инкубировали от 18 часов до 20 часов при 22°С. После трех промывок 200 мкл фосфатного буферного раствора с добавлением 0,05% Tween в каждую лунку добавили 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA; от англ.: bovine serum albumin) (Euromedex, профильтрованный через фильтр с размером ячеек, равным 0,45 мкм) и инкубировали в течение двух часов при температуре окружающей среды (22°С). После трех промывок 200 мкл фосфатного буферного раствора с добавлением 0,05% Tween в каждую лунку добавили 100 мкл растворов очищенного фактора Виллебранда (Wilfactin 100 МЕ/мл, LFB) с различными концентрациями (выраженными в МЕ/дл) и/или плазмы пациентов, разбавленной фосфатным буфером или любым другим подходящим буферным раствором, и инкубировали в течение 1 часа 30 минут при температуре окружающей среды (22°С). После следующих трех промывок добавили по 100 мкл раствора, содержавшего первичное антитело к фактору Виллебранда, конъюгированное с пероксидазой хрена (антитело кролика к VWF человека/пероксидаза хрена, DAKO), разбавленного в соотношении 1:8000 фосфатным буфером или любым другим подходящим буферным раствором, и инкубировали в течение часа при 22°С; затем выполнили четыре промывки, как описано выше. Затем добавили по 125 мкл раствора тетраметилбензидина (ТМВ, Sigma) в качестве субстрата для пероксидазы; планшеты инкубировали не дольше чем в течение периода от 10 минут до 45 минут в темноте. Реакцию погасили добавлением 125 мкл 2N HCl (Sigma). Сразу же измерили оптическую плотность при длине волны 450 нм в спектрофотометре (Wallacvictor 3). Холостую пробу получили посредством замены очищенного фактора Виллебранда (vWF; от англ.: von Willebrand factor) или плазмы фосфатным буферным раствором или любым другим подходящим буферным раствором.
Фиг. 2 демонстрирует результат, полученный посредством ELISA, по связыванию очищенного фактора Виллебранда (Willfactin, LFB), использованного в конечной концентрации, равной 2 МЕ/дл, с полипептидами с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц различного размера, использованными в конечной концентрации, равной 2 мкг/мл, и коллагеном I типа (коллаген SIRCOL, позитивный контроль), использованным в концентрации, равной 10 мкг/мл.
Результаты показывают, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, содержащий большую часть частиц, размер которых превышает 2 мкм, способен связывать фактор Виллебранда эквивалентно коллагену I типа. Способность к связыванию фактора Виллебранда значительно возрастает, если полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 находится в форме частиц с размером менее 2 мкм. Этот последний результат свидетельствует о том, что самосборка полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в более крупные частицы уменьшает число сайтов распознавания фактора Виллебранда, которые, по-видимому, «замаскированы» внутри крупных частиц. Этот результат показывает, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, структурированный в форме частиц с размером в диапазоне от 1 мкм до 5 мкм, действительно способен связывать фактор Виллебранда.
Измерение поверхностной экспрессии Р-селектина, индуцированной коллагеном, как функции размера частиц
Композиция на основе полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц обладает способностью индуцировать активацию тромбоцитов. Эту активацию можно определить в цельной крови посредством измерения экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов посредством проточной цитометрии. В покоящихся тромбоцитах Р-селектин хранится в форме гранул, называемых альфа-гранулами. Когда тромбоциты активируются различными агонистами, Р-селектин выделяется из этих гранул, и его можно обнаружить на поверхности тромбоцитов.
Пробу крови отбирали в пробирку с цитратом (BD Vacutainer, BD Biosciences), затем стабилизировали за один час до использования. В стеклянных пробирках 50 мкл крови добавляли к 50 мкл фосфатного буферного раствора, содержавшего полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 в концентрации, равной 40 мкг/мл (конечная концентрация 25 мкг/мл); смесь инкубировали в течение 10 минут при температуре окружающей среды.
Затем реакцию стабилизировали посредством добавления 500 мкл фосфатного буфера в каждую пробирку. Затем в цитометрических пробирках 20 мкл ранее описанной реакционной смеси добавили к 20 мкл раствора, содержавшего либо первичные антитела к CD62P, конъюгированные с флуоресцеина изотиоцианатом (FITC; от англ.: fluorescein isothiocyanate) (соединенные с FITC антитела мыши к CD62P человека, BD Biosciences), или изотипичные контрольные антитела, конъюгированные с FITC (конъюгированные с FITC антитела IgG1 мыши к изотипичному контролю, BD Biosciences), и инкубировали в течение 10 минут при температуре окружающей среды в темноте. Затем в каждую пробирку добавили 2 мл фосфатного буфера. Немедленно измерили среднюю интенсивность флуоресценции (MFI; от англ.: mean fluorescence intensity) при длине волны 520 нм с использованием проточного цитометра (LSRII, BD Biosciences). Негативный контроль осуществили посредством замены полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 фосфатным буфером. Два позитивных контроля были выполнены посредством замены полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 полученным из тромбина активатором тромбоцитов TRAP (набор для клинической диагностики у людей: PLT Gp/Receptors Kit, Biocytex) или ионофорным активатором А23187 (Calbiochem, Merck; Streptomyces chartreusensis). Стандарт был получен посредством замены полипептида коллагеном I типа (Horm), использованным в концентрации 50 мкг/мл.
Фиг. 3А соответствует изображению характерного профиля экспресии Р-селектина на поверхности тромбоцитов для полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 и для коллагена 1 типа (Horm), полученного посредством проточной цитометрии. Таблица на Фиг. 3В демонстрирует средние интенсивности флуоресценции, полученные при использовании различных агонистов. В качестве позитивных контролей активации использованы TRAP и ионофор кальция.
Полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 с размером частиц более 2 мкм способен индуцировать активацию тромбоцитов, характеризующуюся поверхностной экспрессией Р-селектина. Эта активации эквивалентна активации, индуцированной фибриллярным коллагеном I типа (волокна более 1 мкм), использованным в той же концентрации. Полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 с размером частиц менее 2 мкм (последовательность SEQ ID NO 1 плюс 20 мкМ HCI) также способен вызывать экспрессию Р-селектина и поэтому активацию тромбоцитов, но в меньшем объеме (MFI, равная 47,3, против MFI, равной 70,4).
Измерение агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном, как функции размера частиц
9
Композиция на основе полипептида с последовательностью SEQ ID N0 1 в форме частиц обладает проагрегантной активностью в отношении тромбоцитов крови человека, обнаруживаемой с помощью тромбоагрегометра (Soderel, Florange, Франция) согласно стандартному способу (Born, 1962). Обогащенную тромбоцитами плазму (PRP; от англ.: platelet-rich plasma) привели в контакт с агонистом (10 мкл в 290 мкл PRP), и просветление среды (связанное с образованием агрегатов) контролировали в реальном времени (кривая агрегации). В отсутствие агрегации тромбоцитов сигнал остается стабильным (среда остается мутной). Можно подтвердить наличие или отсутствие агрегатов посредством исследования пробирки в конце измерения. Оценку реакции в тесте на агрегацию тромбоцитов производили при 37°С и непрерывном перемешивании (1000 об/мин). Прибор был стандартизован следующим образом: 0% агрегации в обогащенной тромбоцитами плазме (препарат, полученный посредством медленного центрифугирования и концентрирования, с концентрацией тромбоцитов, доведенной до 300×10/л) и 100% агрегации в обогащенной тромбоцитами плазме (препарат, полученный посредством быстрого центрифугирования). Качество препаратов тромбоцитов валидировали посредством подтверждения реакции на стандартные агонисты (5 мкМ АДФ и 1 мкг/мл коллагена), использованные для разработки антитромбоцитарных процедур. Белок признают проагрегантным агонистом, если он способен вызывать необратимую агрегацию, превышающую 40%.
Фиг. 4 демонстрирует результат агрегации, полученный с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц. Линия 1 демонстрирует, что препарат полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 с размером частиц более 2 мкм способен индуцировать агрегацию тромбоцитов менее чем за 1 минуту способом, эквивалентным коллагену I типа (Horm) - стандартному коллагену в волокнистой форме. В противоположность этому, полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 с размером частиц менее 2 мкм не способен вызывать агрегацию тромбоцитов (линия 2) даже через 10 минут. Это отсутствие активности не связано с присутствием в растворе 20 мМ HCl, поскольку линия 3 демонстрирует нормальную агрегацию тромбоцитов при стимуляции коллагеном I типа, добавленным через шесть минут, в присутствии 20 мМ HCl.
Этот результат показывает, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 необходимо структурировать в форме частиц, размер которых превышает 2 мкм, для получения проагрегантной активности.
В заключение отметим, что эти различные примеры показали, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 способен самостоятельно структурироваться в форме частиц с размером, лежащим в диапазоне от 1 мкм до 6 мкм, что эти частицы обладают способностью связываться с фактором Виллебранда для индуцирования активации тромбоцитов (поверхностная экспрессия Р-селектина) и (только в том случае, если размер частиц превышает 2 мкм) способностью вызывать агрегацию тромбоцитов.
Исследование структуры полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц посредством сравнения с фибриллярным коллагеном I типа (Horm) с использованием различных способов микроскопии
Существуют различные способы микроскопии, которые позволяют визуализировать макромолекулярную структуру молекул с различными разрешениями и увеличениями. Фиг. 5 демонстрирует изображения, полученные тремя способами микроскопии (трансмиссионная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия и атомно-силовая микроскопия), которые позволяют увидеть структуру белков коллагенового типа.
Для изучения посредством трансмиссионной микроскопии коллаген I типа или полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 осадили на предметное стекло в течение 2 часов при 37°С перед исследованием с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа производства компании ZEISS с 60-кратным объективом. Изображения получили с использованием камеры ZEISS AxioCamlCc 1.
-1
Для наблюдения посредством сканирующей электронной микроскопии поверхностью, выбранной для осаждения, был монокристаллический кремний (100). Этот материал, являющийся полупроводником и атомарно плоским, является очевидным выбором для исследования коллагенов этим способом. Подготовку образца осуществили посредством помещения капли объемом 10 мкл с фибриллярным коллагеном I типа или полипептидом с последовательностью SEQ ID NO 1, которые были сконцентрированы до 200 мкг⋅мл, на поверхность кремния на шесть часов. Затем поверхность промыли дистиллированной водой и высушили под азотом. Высушенную поверхность металлизировали посредством напыления золота в аппарате для нанесения покрытия напылением Edwards S150 (ток, равный 25 мА, в атмосфере аргона под давлением 0,3 мПа в течение 2 минут). Поверхность образца исследовали с использованием сканирующего электронного микроскопа JEOL 6500F с потенциалом эмиссии, равным 20 кэВ, и токами эмиссии, равными 60 мкА.
-1
-1
-1
Для исследования посредством атомно-силовой микроскопии (AFM; от англ.: atomic force microscopy) поверхностью, на которой исследовали коллаген I типа и полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, были террасы на поверхности поликристаллического золота (Au(111)), полученные посредством эпитаксии слюды, PHASIS, ссылка 20020022). Осаждение провели ex situ при потоке с концентрацией 25 мкг⋅мл и скорости сдвига, равной 300 с, в течение 30 минут. Для обеспечения этой функционализации потока микропроточную ПДМС-ячейку прижали к поверхности золота и подали раствор белка на поверхность через перистальтический насос ISMATEC IPC-4. Образы исследовали с помощью атомно-силового микроскопа Nanoscope IV Multimode (Digital Instrument, Veeco Inc., Санта Барбара, Калифорния), оборудованного точечными контактами FESPA (Bruker) с коэффициентом жесткости k, равным Н⋅м, резонансной частотой f составляющей от 50 до 100 кГц и длиной рычага L составляющей от 200 до 250 мкм. Захват осуществили в режиме Bruker PeakForce QNM - динамическом полуконтактном режиме, который обеспечивает низкошумовой захват силового взаимодействия с этими биологическими образцами. Частота сканирования была зафиксирована на уровне 1 Гц. Полученные изображения обработали с использованием программы WS×M для получения высокого разрешения за счет применения функций уплощения и эквализации.
Результаты, показанные на Фиг. 5, подтверждают результаты, полученные посредством DLS, и демонстрируют структуру в форме частиц полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1, в отличие от фибриллярной структуры коллагена I типа. Размер обнаруженных частиц был порядка нескольких десятков нанометров в экспериментальных условиях, использованных для их изучения.
Измерение экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов после инъекции мышам полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц и коллагена I типа (Horm) в фибриллярной форме
Композиция на основе полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц или фибриллярного коллагена I типа обладает способностью ex vivo индуцировать активацию тромбоцитов в цельной крови, что показывает экспресия Р-селектина на поверхности тромбоцитов, измеренная посредством проточной цитометри. Для того чтобы подтвердить то, что эти препараты действительно способны индуцировать такую же активацию после инъекции в кровоток, пробу крови взяли в пробирку с цитратом (BD Vacutainer, BD Biosciences) у мыши через 15 минут после введения 400 мкг/кг коллагена I типа или 2 мг/кг полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 или в момент появления первых признаков эмболизма (удушья). По 50 мкл крови поместили в стеклянные пробирки, затем стабилизировали 250 мкл фосфатного буфера. В цитометрические пробирки добавили 20 мкл вышеописанной реакционной смеси к 20 мкл раствора, содержавшего либо первичные антитела к CD62P, конъюгированные с FITC (FITC Mouse anti-Human CD62P, BD Biosciences) или изотипичные контрольные антитела, конъюгированные с FITC (FITC Mouse IgG1 isotype control, BD Biosciences), и инкубировали в течение 10 минут при температуре окружающей среды в темноте. Затем в каждую пробирку добавили 2 мл фосфатного буфера. Сразу же измерили среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) при 520 нм с помощью проточного цитометра (LSRII, BD Biosciences).
Фиг. 6 демонстрирует экспрессию Р-селектина тромбоцитами, измеренную в крови, взятой у мыши после инъекции фибриллярного коллагена I типа и полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 с двумя размерами частиц и в присутствии эпинефрина или без него. Можно отметить, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 действительно вызывает активацию тромбоцитов через 15 минут после его введения мыши или в момент появления первых признаков эмболии (удушья), независимо от размера частиц. Эта активация не модулируется одновременным введением эпинефрина, в отличие от фибриллярного коллагена I типа, активация которым резко усиливается эпинефрином. Этот результат подтверждает, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 действительно способен индуцировать активацию тромбоцитов после введения в кровоток, что показано ex vivo.
Измерение тромботического риска, связанного с инъекцией в кровоток полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1, в модели тромбоэмболии легочной артерии, индуцированной у мышей
Настоящее изобретение описывает применение белков или пептидов, полученных из коллагена, для лечения геморрагии по механизму, зависимому от активации тромбоцитов. Для того чтобы определить, связана ли с риском тромбоза, независимо от геморрагического контекста, активация тромбоцитов in vivo, индуцированная инъекцией этих белков или пептидов, полученных из коллагена, в форме частиц, использовали модель тромбоэмболии легочной артерии, индуцированной у мышей посредством введения коллагена и эпинефрина. Задача состояла в том, чтобы показать, что активация тромбоцитов, индуцированная белками или пептидами, полученными из коллагена, по настоящему изобретению, не является вредной сама по себе из-за индуцирования тромбоза после инъекции. Для того чтобы охарактеризовать потенциально тромботический эффект этого введения, радиоактивную метку, которую можно визуализировать посредством изотопной визуализации (SPECT), использовали в качестве экспериментального критерия, в дополнение к критерию, традиционно используемому в этой модели, который состоит в измерении времени, необходимого животному для гибели вследствие тромбоэмболии легочной артерии. После внутривенной инъекции макроагрегаты человеческого альбумина, меченого технецием-99m, циркулируют в кровотоке и позволяют получить сцинтиграммы легких или некоторых вен. Если имеются тромботические фокусы, то нормальное распределение этой метки в легких нарушает, и изотопная визуализация показывает снижение содержания или отсутствие метки в легких.
Для этой модели тромбоэмболии легочной артерии использовали самцов мышей с массой тела от 25 г до 30 г. Мыши в течение всего эксперимента находились под изофлурановой анестезией. Вначале обнажили две яремные вены перед инъекцей смеси полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 (1 мг/кг) и эпинефрина (60 мкг/кг) или смеси фибриллярного коллагена I типа (400 мкг/кг) и эпинефрина (60 мкг/кг) в конечном объеме, равном 150 мкл, в одну из вен. Если возникает тромбоэмболия легочной артерии, мышь начинает задыхаться и погибает в течение 10 минут после инъекции. Считается, что у мышей, выживающих в течение более чем 15 минут, тромбоэмболии легочной артерии нет. Для того чтобы выполнить SPECT-оценку, макроагрегаты человеческого альбумина, меченого технецием-90m (30 мКи на мышь в конечном объеме, равном 100 мкл), ввели в другую яремную вену сразу же после остановки сердца мышам с тромбоэмболией легочной артерии или через 15 минут выжившим мышам. Затем выполнили сканирование и 15-минутную оценку посредством изотопной визуализации.
Таблица на Фиг. 7А демонстрирует результаты, полученные после введения мышам фибриллярного коллагена I типа и полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц в присутствии эпинефрина, выраженные как процент животных, у которых развилась тромбоэмболия легочной артерии, и среднее время до появления признаков этой эмболии. Результаты показывают, что 100% животных погибли в среднем через 5 мин 30 с после инъекции фибриллярного коллагена I типа. В противоположность этому, ни у одного из животных не развилась тромбоэмболия легочной артерии после инъекции полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1, даже если его использовали в концентрации в 2,5 раза более высокой (1 мг/кг против 400 мкг/кг). Фиг. 7В демонстрирует изображения, полученные после инъекции меченых радиоактивным изотопом макроагрегатов альбумина, которые подтверждают наличие массивной тромбоэмболии легочной артерии у мышей, которым был введен фибриллярный коллаген I типа, и нормальное распределение радиоактивной метки в легких у мышей, которым был введен полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1, что свидетельствует об отсутствии индуцированного тромбоза.
Этот результат подтверждает, что из двух белков коллагенового типа, обладающих одинаковой активностью в отношении активации тромбоцитов, после инъекции в кровоток, только белки в форме частиц можно использовать без риска индукции тромбоза.
Измерение эффекта инъекции полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 в модели индуцированного кровотечения из хвоста у мышей
Результаты, представленные выше, подтверждают, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц действительно способен индуцировать активацию тромбоцитов после введения в кровоток мышей, и что эта активация не оказывает тромбогенного эффекта, в отличие от фибриллярного коллагена I типа. Для подтверждения того, что инъекция в кровоток белка или пептида, полученного из коллагена, по настоящему изобретению действительно обеспечивает индукцию остановки кровотечения по механизму, зависимому от активации тромбоцитов, эффект введения полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 на кровопотерю оценили на модели индуцированного кровотечения из хвоста у мышей.
Для этой модели кровотечения из хвоста использовали самцов мышей SWISS с массой тела от 25 г до 30 г. В течение всего эксперимента мыши находились под изофлурановой анестезией.
4
3
Вначале перед инъекцией различных молекул, разведенных фосфатным буфером, обнажали одну из двух яремных вен. Хвост рассекали на расстоянии 1,5 см от конца так, чтобы рассечь 3 артерии и вену. Рассечение производили через 10 минут после инъекции фосфатного буфера (контроль с носителем) или полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 (1,6 мг/кг) и через 20 минут после инъекции гепарина (антикоагулянт, позитивный контроль кровотечения, 60 МЕ/кг). После рассечения хвост поместили в 50 мл физиологического раствора при 37°С для сбора крови в течение 16 минут без повреждения эритроцитов. Пробирки оставили для осаждения на один час при температуре окружающей среды, после чего произвели центрифугирование в течение 15 минут при 250 g. Супернатант отбросили, а осадок эритроцитов перенесли в 3 мл специфического лизирующего буфера (8,3 г/л NHCl, 1 г/л KHCO и 37 мг/л ЭДТА). Оптическую плотность 200 мкл лизата при длине волны 550 нм определили с помощью спектрофотометра для чтения планшетов.
Построили калибровочный график для определения объема потерянной крови. Для этого у самцов мышей SWISS с массой тела от 25 г до 30 г взяли кровь из брюшной аорты. Кровь собрали в пробирки с цитратом для предотвращения коагуляции. Серию объемов крови приготовили в пробирках, содержавших по 50 мл физиологического раствора. Затем произвели обработку крови, как описано выше (см. Фиг. 8А).
Результаты, приведенные на Фиг. 8В, подтверждают, что полипептид с последовательностью SEQ ID NO 1 в форме частиц, действительно способен индуцировать остановку кровотечения в этой модели, причем как в нативной форме, так и в концентрированной форме. Средний объем крови, потерянной до остановки кровотечения, в присутствии полипептида с последовательностью SEQ ID NO 1 составил 11,6 плюс/минус 2,4 мкл (не концентрированный полипептид) и 12,6 плюс/минус 6,1 мкл (концентрация в 10 раз) против 42 плюс/минус 18,4 мкл у необработанных мышей. Поэтому снижение кровопотери составляет примерно 70% по сравнению с контрольными мышами. В противоположность этому, кровопотеря в присутствии гепарина значительно увеличивается, и средний объем потерянной крови достигает 257,9 плюс/минус 87,5 мкл. Поэтому увеличение кровопотери составляет 514% по сравнению с контрольными мышами, что валидирует модель.
Ссылки
Spahn D et al. Critical Care 2013, 17:R76
Fries D. Transfusion 2013; 53:91S-95S
Lashof-Sullivan M et al. Nanoscale 2013, 5, 10719-10728
Modery-Pawlowski С et al. Biomaterials 2013: 516-541
Clementson K. Thrombosis Research 2012 129 220-224
Pires M and Chmielewski J. J. Am. Chem. Soc. 2009 131, 2706-2712
Przybyla D et al. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 3418-3422
Kojima С et al. J. Am. Chem. Soc. 2009 131, 30652-6053
Slatter D et al. Peptides 2012 36, 86-93
Kar et al. Jounal of Biological Chemistry 2006 vol 281, n°44 33283-33290
Mazepa M et al. ATVB 2013, 33(8):1747-52
Bonhomme F et al. Eur. J. Intern. Med. 2014, 25(3):213-20
Beynon С et al. Crit. Care. 2012 Jul 26; 16(4):228
Jenkins DH et al Shock. 2014 May; 41 Suppl 1:3-12
Murdock AD et al. Shock. 2014 May; 41 Suppl 1:62-9
An В et al. Frontiers in chemistry. 2014 June; 2 article 40