Действие бактериальных сериновых протениназ на перевиваемые культуры клеток животных

Действие бактериальных сериновых протениназ на перевиваемые культуры клеток животных

Ю.М. Кириллова, Ю.И. Данилова, М.Р. Шарипова Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

The action of bacterial serine proteases on cultured animal cell lines

J.M. Kirillova, J.I. Danilova, M.R. Sharipova Kazan (Volga region) Federal University, Kazan

Изучено действие сериновых протеиназ (субтилизино-подобная протеиназа и глутамилэндопептидаза) бацилл на перевиваемые линии клеток животных. Установлено, что се-риновые протеиназы бацилл способны оказывать цитотокси-ческое действие на перевиваемые линии клеток животных. Исследуемые клеточные линии различаются по степени чувствительности к ферментам. К субтилизиноподобной про-теиназе наиболее чувствительной оказались линии ЛЭК и НГУК, к глутамилэндопептидазе — линия клеток Уего.

Ключевые слова: субтилизиноподобная протеиназа, глутамилэндопептидаза, цитотоксичность, перевиваемые линии клеток, жизнеспособность.

Исследования последних лет показали, что про-теолитические ферменты не только участвуют в белковом круговороте, но и играют фундаментальную роль во внутриклеточной регуляции на посттрансля-ционном уровне [1]. Более того, протеолитические белки традиционно активно применяются в медицине, фармакологии и промышленности [2]. Особенно перспективным является применение ферментов бактерий, так как бактерии обладают широким набором различающихся по субстратной специфичности протеаз.

Установлено, что бактерии Bacillus pumilus 3-19 секретируют в среду протеиназы, среди которых детально изучены сериновые: субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза [3]. Гены ферментов клонированы и секвенированы, последовательности зарегистрированы в Международной базе данных (субтилизиноподобная протеиназа AprBi AN AY 754946, глутамилэндопептидаза GseBi AN Y15136). Изучена экспрессия обоих генов в рекомбинантном штамме B. subtilis [4]. Соответствующие белки выделены и охарактеризованы [5, 6, 7]. Способность ферментов к расщеплению фибрина, а также высокая устойчивость в широком интервале рН и температуры, позволяют провести поисковые исследования для их применения в медицине.

Цель работы заключалась в определении действия бактериальных сериновых протеиназ на перевиваемые линии клеток животных.

Материал и методы

Объектом исследования служили сериновые проте-иназы: глутамилэндопептидаза и субтилизиноподоб-ная сериновая протеиназа. Глутамилэндопептидаза получена из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis JB 2036 А58.21, у которого плазмида А58.21 имела вставку размером 2.6 тыс.

e-mail: polyana_travinka@hotmail.com

Our research is direct to determination of serine proteases (subtilisin and glutamyl endopeptidaseJ action at establish cell lines. We determined that the serine proteases of bacillus are capable cytotoxic action at establish cell lines of animals. The cell lines are differentiating by sensitivity to proteins. The cell lines LEK and NGUK were more sensitive to subtilisin, and line Vero — glutamyl endopeptidase.

Key words: subtilisin, glutamyl endopeptidase, cytotoxicity, establish cell lines, viability.

пар оснований и содержала ген глутамилэндопеп-тидазы B. pumilis 3-19 (плазмида А58.21 любезно предоставлена для работы проф. С.В. Костровым).

Субтилизиноподобная сериновая протеиназа очищена из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis. Штамм получен путем трансформации плазмиды pCS9 в протеазо-дефицитный штамм B. subtilis JB 2036, из хромосомы которого делетированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф. Ю. Йоманта-сом). Мультикопийная плазмида pCS9, сконструированная на основе вектора pCB22, несет полный ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы B. pumilis 3-19 под собственным промотором (плазмида pCS9 предоставлена проф. С.В. Костровым). Изучали действие ферментов на перевиваемые линии клеток животных: легкие эмбриона коровы (ЛЭК), почки африканской зеленой мартышки (Vero), почки свиньи (РК-15) и невринома Гассерова узла крысы (НГУК). Культивирование клеток проводили по стандартной методике [8] на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, инактивированной 30 мин при +56°С. Для всех экспериментов клетки высевали в стандартной концентрации 2х105 кл/мл на 24-луночные планшеты и инкубировали 24 ч при 37°С и 5% СО2 в инкубаторе фирмы BINDER. После формирования 80% монослоя ростовую среду тщательно удаляли и заменяли раствором Хэнкса. Раствор Хэнкса служил основной средой для приготовления разведений фермента, который добавлялся непосредственно в лунки с клеточным монослоем. Проводили визуальное наблюдение изменения морфологии клеток и клеточного монослоя до и после обработки.

Цитотоксическое действие ферментов (ЦТД) определяли по степени дегенерации клеточного монослоя, а также по соотношению количества мертвых

и живых клеток (подсчет в камере Горяева с использованием красителя трипановый синий). Через 24 ч производили подсчет выживших клеток в процентах, принимая количество клеток в лунках без образца за 100%.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены как средние арифметические со стандартным отклонением. Статистическую значимость различий определяли по критерию Стьюдента (уровень значимости р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Исследовали действие бактериальных сериновых протеиназ — субтилизиноподобной протеиназы и эндопептидазы — на клеточные культуры путем наблюдения за изменением морфологии клеток и клеточного монослоя до и после их обработки белками. Показано, что внесение субтилизиноподобной про-теиназы в концентрациях в 270 мкг/мл и 135 мкг/мл через 2 ч инкубации с ферментом приводило к округлению клеток и зернистости цитоплазмы перевиваемых линий ЛЭК, Vero, РК-15, НГУК. Причем в линии Vero этот эффект выражен в большей степени. Через 24 ч культивирования с ферментом монослой линий ЛЭК и НГУК в присутствии концентраций фермента 270 мкг/мл и 135 мкг/мл полностью разрушался либо имел характерные деструктивные изменения (рис. 1, рис. 2, соответственно). В концентрации 27 мкг/мл фермент не оказывал заметного действия. Монослой клеточных линий Vero, РК-15 (рис. 3) полностью разрушался в присутствии всех исследуемых концентраций субтилизиноподоб-ной протеиназы.

При исследовании действия другой сериновой протеиназы — глутамилэндопептидазы на те же перевиваемые линии ЛЭК, Vero, РК-15, НГУК установлено, что уже через 2 ч после внесения фермента в концентрации 130 мкг/мл наблюдалось округление клеток, вакуолизация цитоплазмы клеток все линий.

В лунках, в которые фермент вносился в меньших концентрациях, морфология клеток не изменялась. Показано, что через 24 ч инкубации с глутамилэн-допептидазой в концентрациях 130 мкг/мл наиболее чувствительными оказались линии ЛЭК (рис. 4) и Veгo, их монослой бы полностью разрушен. Фермент в концентрации 65 мкг/мл вызывал вакуолизацию клеток данных линий, действие меньших концентраций не проявлялось. Линии НГУК и РК-15 оказались менее чувствительны к ферменту, и даже концентрация 130 мкг/мл не изменяла клеточного монослоя данных линий.

В результате добавления бактериальных белков в ростовую среду прикрепленные клетки открепляются и образуют агрегаты, но не погибают. Мы провели определение жизнеспособности клеток, для этого использовали прием изучения целостности мембраны путем окрашивания трипановым синим.

\' , StfV :

< о.;

iV>

t: . ecv >

*7 *5#

e у * . я -•

\Ж'ХМ

Г *  . '• : х 9 -ь і

І . » С/ а./\Л' _

— ЛіЯ* —1 rogr-~p —

R I

I R I

я

M

Рис. 2.

Культура перевиваемой линии клеток НГУК через 24 ч после внесения субтилизиноподобной протеиназы в концентрациях:

А - 270 мкг/мл;

Б - 135 мкг/мл;

В - 27 мкг/мл.

Ув.:х100

-

'Я

' :

.'fV;

: Її-:-..

Рис. 1.

Культура перевиваемой линии клеток ПЭК через 24 ч после внесения субтилизиноподобной протеиназы в концентрациях:

А - 270 мкг/мл;

Б - 135 мкг/мл;

В - 27 мкг/мл.

Ув.:х100

Рис. 3.

Культура перевиваемой линии клеток РК-15 через 24 ч после внесения субтилизиноподобной протеиназы в концентрациях:

А - 270 мкг/мл;

Б - 135 мкг/мл;

В - 27 мкг/мл.

Ув.:х100

При определении жизнеспособности клеток показано, что деструктивные изменения монослоя линий ЛЭК, НГУК и РК-15 при внесении субтилизиноподоб-ной протеиназы в концентрации 270 мкг/мл сопровождались снижением числа живых клеток на 60%, 86% и 35% соответственно (рис. 5). В меньших дозах (130 мкг/мл и 27 мкг/мл) фермент оказывал менее разрушающее действие на клетки данных линий (снижение количества живых клеток на 10—20%). Внесение субтилизиноподобной протеиназы во всех исследуемых концентрациях приводило к полному разрушению клеточного монослоя линии Veгo, тем не менее, это не влияло на общее количество живых клеток (см. рис. 5).

Наиболее чувствительной линией к глутамилэн-допептидазе в концентрации 130 мкг/мл оказалась линия клеточных культур Veгo, количество живых клеток в этом случае снижалось на 40% (рис. 6). Несмотря на то, что клеточный монослой линии ЛЭК так же полностью разрушался через 24 ч инкубации с ферментом, как и монослой линии Veгo, количество живых клеток ЛЭК оставалось выше (см. рис. 6).

А

100-

80

60-

40-

20-

Б

120

100

80

60

40

20

К 1 2 3

мкг/мл

К

мкг/мл

В

120

100

80

60

40

20

г

180

160

140

н 120

о

0

1 100

ю

о

ё 80

£ 60

«о

£ 40 20 0

К

мкг/мл

К

мкг/мл

Рис. 5. Жизнеспособность клеток линий ПЭК [а], Vero (б), РК-15 (в), НГУК (г) через 24 ч. инкубации с субтилизиноподобной протеиназой в концентрациях [мкг/мл]:

К - контроль; 1 - 270,2 - 135, 3 - 27

0

0

2

3

0

2

3

2

3

мкг/мл мкг/мл

Рис. 6. Жизнеспособность клеток линий ЛЭК (а), Уего (б), РК-15 (в), НГУК [г] через 24 ч инкубации с глутамилэндопептидазой в концентрациях (мкг/мл):

К - контроль; 1 - 130; 2 - 65; 3 - 13

На остальные клеточные линии глутамилэндопеп-тидаза во всех исследуемых концентрациях не оказывала значительного цитотоксического действия.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить следующее. Сериновые протеиназы бацилл способны оказывать цитотоксическое действие на перевиваемые линии клеток животных, однако не всегда разрушение клеточного монослоя сопровождается гибелью клеток. Исследуемые клеточные линии различаются по степени чувствительности к ферментам. К субтилизиноподобной протеиназе наиболее чувствительными оказались линии ЛЭК и НГУК, к глутамилэндопептидазе — линия Veгo. Способность клеток по-разному реагировать на присут-

ствие ферментов может быть связана со структурными особенностями в строении клеточных мембран.

Благодарности

Выполнение данного научного исследования финансируется за счёт государственного контракта ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации № П323 от 07.05.2010. Работа частично выполнена на оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Chevance F.F., Hughes K.T. Coordinating assembly of a bacterial macromolecular machine. Nat. Rev. Microbiol. 2008; 6: 455—65.

2. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С. Изучение препарата внеклеточных протеиназ грибов Aspergillus ochraceus 513 и Aspergillus alliaceus 7 dN 1 Микробиология 2001; 6.

3. Шарипова М. Р., Шакиров Е.В., Балабан Н.П. и др. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius. Микробиология 2000; 69(5): 660—7.

4. Sharipova M.R., Shagimardanova E.I., Chastukhina I.B. et al. The expression of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant. Mol. Biol. Rep. 2007; 34: 79—87.

5. Sharipova M.R., Balaban N.P, Kayumov A.R. et al.The expression

of the serine proteinase gene of Bacillus intermedius in Bacillus subtilis. Microbiological Research 2008; 163: 39—50.

6. Михайлова Е.О. Субтилизинподобная протеиназа Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [диссертация]. Казанский (Приволжский) федеральный: Казань; 2007.

7. Шамсутдинов Т.Р. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [диссертация]. Казанский (Приволжский) федеральный: Казань; 2009.

8. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир; 1983.

Поступила 15.08.2012