Регуляция апоптоза с помощью альтернативного сплайсинга матричной РНК

УДК 616.65-006.6-074:547.96

O.V. Utkin, V.V. Novikov

APOPTOSIS REGULATION BY ALTERNATIVE SPLICING PRE^RNA

Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

ABSTRACT

In the review the molecular mechanisms of apoptosis regulation via alternative splicing have been shown. The relevance of the problem is observed due correlation between disorders in the regulation of alternative splicing, apoptotic processes and cancer development. The main pathways of apoptosis regulation by alternative mRNA precursor splicing are described. Different variants of apoptotic program modulation by splicing factors have been shown. The review gives the evaluation of some splicing factors role in apoptotic signals regulation.

Key words: apoptosis, alternative splicing.

О.В. Уткин, В.В. Новиков

РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА С ПОМОЩЬЮ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА

МАТРИЧНОЙ РНК

ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

РЕЗЮМЕ

В обзоре представлены молекулярные механизмы регуляции апоптоза факторами, участвующими в реализации альтернативного сплайсинга матричной РНК. Актуальность проблемы определяется взаимосвязью между нарушениями регуляции апоптоза с помощью альтернативного сплайсинга мРНК и развитием онкологических заболеваний. В обзоре рассматриваются основные пути регуляции апоптотического каскада и альтернативного сплайсинга. Показаны различные варианты модуляции апоптотической программы разнообразными факторами сплайсинга. Дана оценка роли отдельных факторов сплайсинга в регуляции апоптоти-ческих сигналов.

Ключевые слова: апоптоз, альтернативный сплайсинг.

ВВЕДЕНИЕ

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК является универсальным механизмом регуляции экспрессии генов и функционального разнообразия белковых продуктов. В настоящее время установлено, что почти половина генов человека подвергаются альтернативному сплайсингу, в том числе и гены, участвующие в реализации апоптоза. В связи с исключительной важностью событий альтернативного сплайсинга в реализации разнообразных функций клетки нарушения его регуляции часто сопровождаются развитием заболеваний. Дефекты регуляции альтернативного сплайсинга апоптоз-специфических генов могут участвовать в развитии онкологических заболеваний.

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ АПОПТОЗА

Программа апоптотической гибели клеток инициируется множеством разнообразных стимулов [2]. Рецептор-опосредованный путь передачи апоптотиче-

ского сигнала (внешний путь) осуществляется при участии представителей суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли и их лигандов, локализованных на поверхностной мембране клеток. Взаимодействие рецепторов смерти и их лигандов приводит к олигомеризации рецептора, ассоциации адапторных молекул и активации инициаторных каспаз. Впоследствии инициаторные каспазы протеолитически активируют эффекторные каспазы, которые вызывают деградацию клеточных субстратов (рис. 1, А).

Митохондриальный (внутренний) путь требует непосредственного участия митохондрий и взаимодействия целого ряда проапоптотических факторов. В реакциях на апоптотические стимулы действие представителей семейства Bcl-2 белков вызывает пермеа-билизацию внешней митохондриальной мембраны и выход цитохрома С. В дальнейшем цитохром С связывает адапторный белок Apaf-1, индуцируя его кон-формационные взаимодействия, необходимые для

присоединения инициаторной прокаспазы-9. В результате формируется каспазо-активирующий комплекс (апоптосома), в составе которого активируется каспаза-9. Активная каспаза-9 инициирует активацию эффекторной каспазы-3, что способствует развитию апоптотической программы (рис.1, Б).

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭФФЕКТОРЫ АПОПТОЗА

Индукция апоптоза и активация проапоптотиче-ских белков ведет к активации каспаз (цистеиновых аспартат-специфичных протеиназ). Различают ини-циаторные и эффекторные каспазы [9]. Инициаторные каспазы протеолитически активируют эффекторные каспазы, которые вызывают деградацию специфических субстратов клетки с образованием в конечном итоге апоптотических телец.

Важными регуляторами апоптотического каскада являются представители белкового семейства Bcl-2. Члены этого семейства характеризуются наличием от 1 до 4 консервативных BH (Bcl-2-homology) доменов [2; 36]. Антиапоптотические факторы семейства Bcl-2 имеют в своем составе все 4 домена. К ним относятся Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1. Проапоптотические члены этого семейства делят на 2 группы. 1-я группа включает мультидоменные белки Bax, Bak, Bok, содержащие в своем составе BH1, BH2 и BH3 домены. 2-я группа включает молекулы, содержащие только домен BH3, например Bid, Bad, Bim, Bik, Noxa, Puma. Во время реализации апоптотической программы представители разных групп семейства Bcl-2 функционируют как ионные каналы, стабилизируя или нейтрализуя барьерную функцию митохондриальной мембраны и соответственно ингибируя или стимулируя апоптотический каскад.

Адаптор Apaf-1 Анти- и проапоптотические ^ члены семейства Bcl-2

Лиганд

Рецептор смерти

Цитохром

Адаптор

Апоптосома

Инициаторная каспаза

Эффекторная каспаза

Эффекторная каспаза

Инициаторная каспаза

Субстрат

Субстрат

Рис. 1. Апоптотические пути в клетках млекопитающих:

А - внешний (рецептор-опосредованный) путь апоптоза. Взаимодействие рецепторов смерти и их лиган-дов приводит к олигомеризации рецептора, ассоциации адапторных молекул и активации инициаторных кас-паз (каспазы-8,10). Впоследствии инициаторные каспазы протеолитически активируют эффекторные каспазы, которые вызывают деградацию клеточных субстратов.

Б - внутренний (митохондриальный) путь апоптоза. В реакциях на апоптотические стимулы действие Вс1-2 белков приводит к повышению проницаемости внешней митохондриальной мембраны и выход цито-хрома С. В дальнейшем цитохром С связывает адапторный белок АраМ, индуцируя его конформационные взаимодействия, необходимые для присоединения инициаторной прокаспазы-9. В результате формируется каспазо-активирующий комплекс (апоптосома), в составе которого активируется каспаза-9. Активная каспаза-9 инициирует активацию эффекторной каспазы-3, что способствует развитию апоптотической программы.

Другая группа белков, участвующих в реализации внешнего сигнального пути, включает рецепторы смерти и их природные лиганды [40; 41]. Рецепторы принадлежат суперсемейству рецепторов TNF, к которому относятся Fas-рецептор, TNF-рецептор (TNF-R1) и рецепторы для TNF-родственных апоптоз-индуцирующих лигандов (TRAIL). Они характеризуются наличием внутриклеточного домена смерти, который участвует в передаче апоптотического сигнала, взаимодействуя с внутриклеточными адапторными молекулами. Адапторные белки также содержат домен смерти (DD). Кроме того, в их состав входит кас-пазо-связывающий домен CARD, участвующий во взаимодействии с другими апоптотическими молекулами. С белками семейства рецепторов TNF (TNFR) взаимодействуют также белки, осуществляющие их связь с различными сигнальными путями клетки, включая NF-kB и JNK-сигнальные пути. Эти белки составляют семейство TNFR-ассоциированных факторов (TRAF).

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

Регуляция апоптотической программы имеет многоуровневую структуру и осуществляется при участии множества факторов, действующих согласованно или в антагонизме по отношению друг к другу. Альтернативный сплайсинг является посттранскрипционным механизмом регуляции экспрессии генов и приводит к образованию различных изоформ белков [32; 39]. Баланс сигналов смерти/выживания напрямую зависит от регуляции альтернативного сплайсинга мРНК белковых факторов апоптоза.

В генах эукариот кодирующие последовательности (экзоны) перемежаются некодирующими последовательностями (интронами). В ядре клетки гены транскрибируются от начала до конца с образованием первичного РНК-транскрипта (пре-мРНК). В дальнейшем участки пре-мРНК, соответствующие интро-нам, вырезаются, а кодирующие участки соединяются в определенном порядке с образованием зрелой мРНК. Такой процесс назван сплайсингом. Сплайсинг осуществляется в особых структурах, называемых сплайсосомами. Они состоят из пре-мРНК, малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП) и целого комплекса вспомогательных белков. Функция сплай-сосомы заключается в правильном вырезании интро-нов из первичного РНК-транскрипта [13].

Характерной чертой интронов является наличие специфических последовательностей вблизи их 5' и 3' концов (т.е. на стыках интронов и экзонов или в сайтах сплайсинга). Такие последовательности являются консервативными и участвуют в формировании и работе сплайсосомы [14]. Важную роль в сплайсинге пре-мРНК играет остаток аденозина вблизи 3' конца интрона (так называемая точка ветвления).

На 1-м этапе сплайсинга происходит расщепление фосфодиэфирной связи молекулы РНК в 5' сайте сплайсинга с образованием 2 продуктов: свободного 5'

экзона и лассоподобного интрона, связанного с 3' экзо-ном (рис. 2). На 2-м этапе осуществляется расщепление фосфодиэфирной связи РНК в 3' сайте сплайсинга. В дальнейшем происходит лигирование (сшивание) 2 экзонов и высвобождение интрона [17].

Рис. 2. Этапы реализации альтернативного сплайсинга:

Экзоны показаны как прямоугольники с разным типом штриховки, интроны представлены линиями. Стрелками указаны направления разрывов фосфодиэфирной связи в соответствующих сайтах сплайсинга. На 1-м этапе осуществляется разрыв фосфодиэфирной связи в 5' сайте сплайсинга с образованием свободного 5' экзона и лассоподобного интрона, связанного с 3' экзоном. Лассо содержит выполнивший переход аденозин, соединяющийся через обычные 5' и 3' связи, а также через 2'-5' связь с первым остатком интрона. На 2-м этапе осуществляется расщепление фосфодиэфир-ной связи РНК в 3' сайте сплайсинга. В дальнейшем происходит лигирование (сшивание) двух эк-зонов и высвобождение лассоподобного интрона.

В ряде случаев интроны имеют несколько сайтов сплайсинга, и тогда возможен альтернативный сплайсинг [32; 39]. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК является универсальным механизмом регуляции экспрессии генов и функционального разнообразия белковых продуктов. Альтернативному сплайсингу подвергаются многие первичные транскрипты [31]. Их кодирующие белок участки соединяются разными

способами, в результате образуются изоформы белков без изменения организации кодирующего гена.

Альтернативный сплайсинг контролируется специфическими факторами, экспрессия которых строго ограничена стадией развития или типом ткани организма [50]. Факторы могут действовать кооперативно или в антагонизме друг с другом.

РЕЦЕПТОРЫ СМЕРТИ И ИХ ЛИГАНДЫ

Как упоминалось ранее, внешний, рецептор-опосредованный путь апоптоза инициируется в результате взаимодействия рецепторов из семейства TNFR с соответстующими лигандами. Лиганды смерти обычно являются трансмембранными белками II типа (С-конец локализован экстраклеточно). Они обнаружены также в растворимой форме. Примером служит растворимый Fas-лиганд (FasL), который образуется в результате протеолитического шеддинга (схода с поверхности клетки) специфическими метал-лопротеиназами или за счет альтернативного сплайсинга мРНК [4; 23]. Растворимые изоформы характеризуются отсутствием трансмембранного, внутриклеточного и части внеклеточного доменов. Вне зависимости от механизма образования растворимый FasL проявляет антиапоптотическую активность.

Рецептор-опосредованная гибель клетки также регулируется путем образования различных изоформ рецептора. Так, мононуклеарные клетки периферической крови и некоторые опухолевые клетки экспрес-сируют мембранную и несколько растворимых изо-форм Fas-антигена, образующихся в результате альтернативного сплайсинга мРНК [7; 33]. Мембранная форма участвует в передаче апоптотического сигнала внутрь клетки, тогда как альтернативные растворимые формы модулируют его передачу. Механизмы действия растворимых изоформ Fas-антигена могут варьировать. Это обусловлено разной структурой растворимых белковых молекул [8; 11]. Мономерная форма растворимого Fas-антигена ингибирует апоптоз, тогда как ее олигомерная форма участвует в инициации апоптотического сигнала [34].

Результаты собственных исследований свидетельствуют о том, что при раке молочной железы обнаружено исчезновение присутствующих в норме отдельных вариантов мРНК Fas-антигена, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Продемонстрировано, что опухолевый процесс, а также проводимая химиотерапия и лучевая терапия приводили к изчезновению минорных вариантов мРНК растворимого Fas-антигена с сохранением доминирующей формы этого антигена. Обнаруженные изменения транскриптома сопровождались нарушением сывороточной концентрации мономерной формы растворимого Fas-антигена при неизменной концентрации оли-гомерной формы этого белка [1].

Другим представителем рецепторов смерти является лимфоцит-ассоциированный рецептор смерти (LARD), вызывающий апоптоз Т-лимфоцитов [42]. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК LARD приво-

дит к образованию 11 изоформ, представленных мембранной и растворимыми молекулами. Продукция изоформ LARD находится под контролем альтернативного сплайсинга и изменяется во время активации Т-клеток.

Альтернативный сплайсинг мРНК рецепторов смерти участвует в модуляции гомеостаза опухолевых клеток. Так, при кожной Т-клеточной лимфоме в опухолевых клетках экспрессируется альтернативная форма Fas антигена, образующаяся в результате неполного сплайсинга интрона 5. Эта изоформа характеризуется отсутствием трансмембранного домена, домена смерти и свойственна этой лимфоме [12].

ИНГИБИТОРЫ АПОПТОЗА

Ингибиторами апоптоза являются IAP-белки [2; 36]. Все IAP-белки на N-конце содержат от 1 до 3 специфических повторов, называемых BIRs (примерно по 70 аминокислот в каждом). Одним из представителей семейства IAP-белков является белок сурви-вин (survivin), участвующий в ингибировании каспаз. Его экспрессия значительно повышается в опухолевых клетках. Обнаружено несколько изоформ сурви-вина, образующихся в результате альтернативного сплайсинга [5]. Некоторые из них способны образовывать гетеродимеры, обладающие антиапоптотиче-ским потенциалом. Уровень экспрессии изоформ сур-вивина коррелирует с прогрессией опухолей. Например, повышение экспрессии AEx3 изоформы сурвиви-на происходит при прогрессировании гепатоцеллю-лярной карциномы [45]. Вторичные митохондриаль-ные активаторы каспаз (Smac-белки) связывают IAP-белки (ингибиторы каспаз), элиминируя их негативный по отношению к каспазам эффект [16]. Следует отметить, что альтернативный сплайсинг характерен и для этой группы белков, вызывая образование изо-форм, обладающих проапоптотическим потенциалом.

Среди значительного количества белков, ингиби-рующих апоптоз, известны протеины, замедляющие активацию прокаспазы-8. Они получили название FLICE-ингибирующие белки (с-FLIP) [2; 36]. Основной их характеристикой является наличие 2 N-концевых DED-доменов (доменов связывания эффекторов смерти) и отсутствие DD-домена (домена смерти). Это позволяет им присоединяться к FADD (Fas-ассоциированный домен смерти) или каспазе-8 и препятствовать формированию DISC (смерть-индуцирующий сигнальный комплекс). В настоящее время обнаружено большое количество изоформ мРНК с-FLIP, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Однако на белковом уровне идентифицированы только 3 варианта: c-FLIPS, c-FLIPr, c-FLIPl [19]. Несмотря на общеизвестный факт антиапоптотической направленности c-FLIP, их роль во время апоптоза противоречива. Так, c-FLIPL способен активировать каспазу-8, а c-FLIPS обладает антиапопто-тической активностью. Таким образом, экспрессия тех или иных изоформ ^FLIP-белков может приводить к различным эффектам и влиять на апоптотические процессы.

КАСПАЗЫ И ФАКТОРЫ ТРАНСКРИПЦИИ

Представители семейства каспаз конститутивно присутствуют в клетках, что позволяет быстро индуцировать апоптоз. В рамках реализации апоптотиче-ской программы каспазы выполняют многочисленные функции, активируя сигнальные белки или вызывая их деградацию. При этом разные варианты каспаз, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга, часто выполняют антагонистические функции [22]. Например, альтернативные изоформы каспазы-8 могут разнонаправленно регулировать апоптоз, обеспечивая передачу апоптотического сигнала или снижая чувствительность клеток к Fas-опосредованному апоптозу [21; 24].

Хорошо известно, что белок р53 является онко-супрессором, препятствующим злокачественному изменению клеток [6]. Он задерживает клетку в фазе перехода Gi/S. Выступая в качестве транскрипционного фактора, р53 активирует экспрессию генов систем репарации ДНК. Если репарационным системам не удается ликвидировать возникающих в опухолевых клетках повреждений ДНК, то осуществляется индукция апоптоза. Альтернативный вариант р53 (р47), образующийся в результате делеции N-концевого участка белка, вызывает супрессию транскрипционной активности р53 дикого типа и ингибирует ростовой потенциал опухоли [18]. Таким образом, исследование экспрессии изоформ р53 открывает важные аспекты механизмов опухолевого роста.

ЧЛЕНЫ СЕМЕЙСТВА BCL-2 И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЛИГАНДЫ

Наиболее многочисленная группа регуляторов апоптоза представлена семейством Bcl-2. Ряд белков этого семейства синтезируются с участием альтернативного сплайсинга мРНК с образованием различных изоформ. Смещение баланса между изоформами приводит к модуляции апоптотического потенциала клетки и вносит вклад в развитие опухолевого процесса.

Одним из представителей семейства является белок Bcl-x. Регуляция его экспрессии включает возможность альтернативного сплайсинга пре-мРНК, приводящего к образованию 2 белковых изоформ Bcl-x (рис. 3). Так использование вышележащего (upstream) 5' сайта сплайсинга (5'сс) в экзоне 2 приводит к образованию проапоптотического варианта молекулы (Bcl-xS), тогда как использование нижележащего (downstream) 5' сайта сплайсинга способствует образованию антиапоптотического варианта (Bcl-xL). «Длинная» форма (Bcl-xL) содержит 4 BH домена и проявляет антиапоптотические свойства. «Короткая» форма (Bcl-xS) не содержит BH1 и BH2 доменов и участвует в реализации апоптоза [40]. Оба варианта требуются для нормального функционирования клетки. Вместе с тем их экспрессия отличается в разных типах клеток и тканей. Так, в опухолевых клетках преобладает экспрессия Bcl-xL, тогда как в тимусе и селезенке - Bcl-xS. Соотношение экспрессии изоформ

Bcl-x находит отражение в регуляции апоптотической программы. Например, при раке молочной железы наблюдается повышение экспрессии Bcl-xL, что является возможной причиной развития метастазов [29].

Наиболее уникальным представителем семейства Bcl-2 является белок Bid, содержащий только домен BH3, участвующий в интеграции внешнего (опосредованного рецепторами смерти) и внутреннего (мито-хондриального) сигнальных путей. После стимуляции соответствующих рецепторов смерти активированная каспаза-8 расщепляет Bid с образованием усеченной формы (tBid), взаимодействующей с факторами мито-хондриального пути передачи апоптотического сигнала. Альтернативный сплайсинг приводит к образованию нескольких изоформ Bid, отличающихся по экспрессии, клеточной локализации и апоптотической активности [38]. Эти изоформы участвуют в регуляции работы tBid, а их экспрессия изменяется в ответ на разные апоптотические сигналы.

Одним из белков, участвующих в модуляции апоптотической программы, является внутриклеточный лиганд для CD27 антигена Siva, экспрессирую-щийся в лимфоидных клетках [35]. Его экспрессия инициирует активацию каспаз и требует участия митохондрий. Этот лиганд существует в виде 2 альтернативных изоформ (Siva-1 и Siva-2), проявляющих апоптотическую активность. Важной особенностью полноразмерной молекулы Siva-1 является наличие домена смерти в центральной части молекулы. У белка Siva-2 такой домен отсутствует. При этом обе изо-формы сохраняют способность индуцировать апоптоз. Показана возможность Siva-1 взаимодействовать с Bcl-xL и нейтрализовывать антиапоптотический эффект последнего.

Экэвн 1 ЭюОн 2 3

llcl-nL Bcl-x5

Рис. 3. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК Bcl-x:

Использование альтернативных 5'сайтов сплайсинга экзона 2 приводит к образованию двух изоформ, проявляющих разные функциональные свойства. Так использование вышележащего (upstream) 5' сайта сплайсинга (5'сс) в экзоне 2 приводит к образованию «короткого» варианта молекулы (Bcl-xS), характеризующегося отсутствием BH1 и BH2 доменов, проявляющего проапоптотические свойства. Использование нижележащего (downstream) 5' сайта сплайсинга способствует образованию «длинной» формы (Bcl-xL), содержащей 4 BH домена и проявляющей антиапопто-тические свойства.

РЕГУЛЯЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА ВО ВРЕМЯ АПОПТОЗА

В осуществлении и регуляции альтернативного сплайсинга пре-мРНК принимает участие множество белков. Совокупность регуляторных белковых факторов, сложным образом взаимодействующих друг с другом, обусловливает выбор сшиваемых в процессе сплайсинга экзонов. Концентрация и активность регу-ляторных белков варьирует в зависимости от типа ткани и клетки и меняется при нарушении гомеоста-тического равновесия, в том числе при онкопатологии [43; 44]. Нарушение механизма альтернативного сплайсинга в опухолевых клетках характеризуется синтезом множества минорных форм мРНК, неполным сплайсингом (сохранение интрона в составе транскрипта), появлением антисмысловых РНК, образованием нефункциональных белков [25; 26].

Факторами, регулирующими сплайсинг пре-мРНК, являются SR-белки и их антагонисты hnRNP [11; 43]. SR-белки имеют 1 или 2 РНК-связывающих домена и RS-домен, содержащий в своем составе аминокислотные повторы аргинина и серина. Обратимое фосфорилирование сериновых остатков регулирует функциональную активность SR-белков [20]. Недавние исследования показали, что церамид индуцирует дефосфорилирование SR-белков, которое вызывает альтернативный сплайсинг мРНК Bcl-x и каспазы-9. Кроме того, этопозид-индуцированный альтернативный сплайсинг каспазы-2 также происходит в результате синтеза эндогенного церамида [3]. Подобная взаимосвязь событий сплайсинга и сигнальных путей образования церамида обеспечивает дополнительную регуляцию апоптоза.

SR-белки подвергаются посттрансляционным модификациям во время апоптоза, что выражается в снижении уровня фосфорилирования этих белков. В опухолевых клетках связывание FasL приводит к активации SR-протеинкиназы-1 (SRPK1), которая фос-форилирует SR-белки [48]. Церамид действует как вторичный мессенджер, который регулирует клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз, активируя разнообразные сигнальные каскады. Некоторые внеклеточные стимулы инициируют активацию кислых сфингомиелиназ и вызывают образование це-рамида de novo. Эндогенный церамид модулирует уровень фосфорилирования SR-белков и регулирует альтернативный сплайсинг Bcl-x и каспазы-2 и 9, Fas-антигена и ряда других эффекторов апоптоза [3; 10].

Белок TIA-1, участвующий в реализации апопто-тической программы, также регулирует альтернативный сплайсинг мРНК проапоптотических белков, способствуя образованию сплайсосом [15]. При этом изменение экспрессии TIA-1 оказывает влияние на выбор конкретного сайта сплайсинга. В результате TIA-1 обеспечивает накопление транскриптов, кодирующих проапоптотические белки, и предотвращает образование белков, проявляющих антиапоптотический эффект. Известны другие примеры регуляции сплайсин-

га мРНК, кодирующих белки, участвующие в апопто-тических процессах. TIA-1-родственный фактор (TIAR) регулирует альтернативный сплайсинг Fas-антигена, контролируя образование мембранной формы рецептора [46]. Взаимодействие Fas/FasL приводит к активации серин/треониновой киназы FAST, которая вызывает фосфорилирование TIA-1, изменяя его активность как регулятора сплайсинга пре-мРНК Fas-антигена [3; 47].

Заметим, что FAST локализуется на внешней ми-тохондриальной мембране, взаимодействует с Bcl-xL, модулируя активность последнего [27; 28]. Кроме того, FAST повышает экспрессию эндогенных ингибиторов апоптоза. Предполагается, что FAST нейтрализует негативный эффект TIA-1, направленный на снижение транскрипции мРНК, кодирующих ингибиторы апоптоза. Таким образом, FAST функционирует в качестве репрессора апоптотической программы гибели клеток. В свою очередь, TIA-1 ингибирует этот эффект. В соответствии с этой моделью FAST и TIA-1 являются функциональными антагонистами, которые взаимодействуют друг с другом, определяя уровень экспрессии белка и восприимчивость клеток к апоптозу.

Регуляторной системой более высокого порядка являются антисмысловые транскрипты. Механизм действия антисмысловых транскриптов включает образование двуцепочечных РНК, участвующих в посттранскрипционной регуляции гена [25]. Такие двуцепочечные РНК вызывают посттранскрипционное снижение экспрессии гена. Этот процесс включает образование малых интерферирующих РНК (siRNA) из двуцепочечных РНК-предшественников с помощью рибонуклеазы III [30].

Обнаружено, что недавно идентифицированный антисмысловой транскрипт Saf, принадлежащий к категории длинных некодирующих РНК, участвует в регуляции экспрессии Fas-антигена на посттранскрипционном уровне. Saf повышает экспрессию растворимых молекул Fas и не влияет на образование мембранных форм. Saf модулирует сплайсинг пре-мРНК Fas-антигена, изменяя соотношение транскриптов, кодирующих растворимые и мембраносвязанные молекулы, и ингибирует Fas-опосредованный апоптоз. Его экспрессия наблюдается в разных типах клеток, включая различные линии опухолевых клеток [49]. Предполагается, что эндогенный антисмысловой транскрипт Saf регулирует экспрессию альтернативных изоформ Fas-антигена на уровне сплайсинга пре-мРНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, множественные события, происходящие на уровне регуляции альтернативного сплайсинга пре-мРНК, способны воздействовать на апопто-тические процессы в клетке, что необходимо учитывать при создании новых биотерапевтических препаратов. Изучение механизмов регуляции альтернативного сплайсинга пре-мРНК, кодирующей апоптотиче-ские факторы, позволит создать подходы к направ-

ленному изменению соотношения изоформ апоптоти-ческих белков. Кроме того, соотношение белковых изоформ может выступать в качестве одного из мониторинговых показателей развития опухолевого процесса и эффективности проводимой терапии [37].

ЛИТЕРАТУРА

1. Новиков В.В., Алясова А.В., Уткин О.В. и др. Растворимые антигены CD38 и CD95 при раке молочной железы // РБЖ. - 2005. - Т. 4, № 3. - С. 46-51.

2. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // РБЖ. - 2002. -Т. 1, № 3. - С. 5-11.

3. Aratake K., Kamachi M., Iwanaga N. et al. A cross-talk between RNA splicing and signaling pathway alters Fas gene expression at post-transcriptional level: Alternative splicing of Fas mRNA in the leukemic U937 cells // J. Lab. Clin. Med. - 2005. - Vol. 146, №3. - P. 184-91.

4. Ayroldi E., D Adamio F., Zollo O. et al. Cloning and expression of a short Fas ligand: a new alternatively spliced product of the mouse Fas ligand gene // Blood. -1999. - Vol. 94. - P. 3456-67.

5. Caldas H., Jiang Y., Holloway M.P. et al. Sur-vivin splice variants regulate the balance between the proliferation and cell death // Oncogene. - 2005. - Vol. 24. -P. 1994-2007.

6. Carson D.A. Cancer progression and p53 // Lancet. - 1995. - Vol. 346. - P. 1009-11.

7. Cascino I., Fiucci G., Papoff G., Ruberti G. Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing // J. Immunol. - 1995. - Vol. 154. - P. 2706-13.

8. Cascino I., Papoff G., De Maria R. et al. Fas/Apo-1 (CD95) receptor lacking the intracytoplasmic signaling domain protects tumor cells from Fas-mediated apoptosis // J. Immunol. - 1996. - Vol. 156. - P. 13-7.

9. Chang H. I., Yang X. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases // Microbiol. Mol. Biol. - 2000. - Vol. 64, № 4. - P. 821-46.

10. Chalfant C., Rathman K., Pinkerman R.L. et al. De novo ceramide regulates the alternative splicing cas-pase-9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277, № 15. - P. 12587-95.

11. Cheng J., Liu C., Koopman W.J., Mountz J.D. Characterization of human Fas gene // J. immunol. -1995. - Vol. 154. - P. 1239-45.

12. Doorn R., Dijkman R., Vermeer M.H. et al. A novel splice variant of the Fas gene in patients with cutaneous T-cell lymphoma // Cancer Res. - 2002. - Vol. 62. - P. 5389-92.

13. Dreyfuss G., Hentze M., LamondA. I. From transcript to protein // Cell. - 1996. - Vol. 85. - P. 963-72.

14. Farrer T., Roller A.B., Kent W.J., Zahler A.M. Analysis of the role of Caenorhabditis elegans GC-AG introns in regulated splicing // Nucl. Acids. Res. - 2002. -Vol. 30, № 15. - P. 3360-7.

15. Forch P., Puig O., Kedersha N. et al. The apop-tosis-promoting factor TIA-1 is a regulator of alternative

pre-mRNA splicing // Mol. Cell. - 2000. - Vol. 6. - P. 1089-98.

16. Fu J., Jin Y., Arend L.J. Smac3, a novel Smac/DIABLO splicing variant, attenuates the stability and apoptosis-inhibiting activity of X-linked inhibitor of apoptosis protein // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. -P. 52660-72.

17. Garcia-Blanco M.A. Messenger RNA reprogramming by spliceosome-mediated RNA trans-splicing // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol. 112. - P. 474-80.

18. Ghosh A., Stewart D., Matlashewski G. Regulation of human p53 activity and cell localization by alternative splicing // Mol. Cell Biol. - 2004. - Vol. 24, № 18.

- P. 7987-97.

19. Golks A., Brenner D., Fritsch C. et al. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280, № 15. - P. 14507-13.

20. Graveley B.R. Sorting out the complexity of SR protein functions // RNA. - 2000. - Vol. 6. - P. 1197-211.

21. Himeji D., Horiuchi T., Tsukamoto H. et al. Characterization of caspase-8L: a novel isoform of cas-pase-8 that behaves as an inhibitor of the caspase cascade // Blood. - 2002. - Vol. 99, № 11. - P. 4070-8.

22. Ho P., Hawkins J. Mammalian initiator apoptotic caspases // FEBS J. - 2005. - Vol. 272. - P. 5436-53.

23. Kayagaki N., Kawasaki A., Ebata T. et al. Metal-loproteinase-mediated release of human Fas ligand // J. Exp. Med. - 1995. - Vol. 182. - P. 1777-83.

24. Kisenge R.R., Toyoda H., Kang J. et al. Expression of short-form caspase 8 correlates with decreased sensitivity to Fas-mediated apoptosis in neuroblastoma cells // Cancer Sci. - 2003. - Vol. 94, № 7. -P. 598-605.

25. Kumar M., Carmichael G.G. Antisense RNA: Function and fate of duplex RNA in cells of higher eu-karyotes // Microbiol. And Mol. Biol. - 1998. - Vol. 62, №4. - P. 1415-34.

26. Lewis B.P., Green R.E., Brenner S.E. Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated RNA decay in humans // Genetics. -2003. - Vol. 100, № 1. - P. 189-92.

27. Li W., Kedersha N., Chen S. et al. FAST is Bcl-xL-associated mitochondrial protein // BBRC J. - 2004. -Vol. 318. - P. 95-102.

28. Li W., Simarro M., Kedersha N., Anderson P. FAST is a survival protein that senses mitochondrial stress and modulates TIA-1-regulated changes in protein expression // Mol. Cell Biol. - 2004. - Vol. 24, № 24. - P. 10718-32.

29. Mercatante D.R., Mohler J.L., Kole R. Cellular response to an antisense-mediated shift of Bcl-x pre-mRNA splicing and antineoplastic agents // J. Biol. Chem.

- 2002. - Vol. 277, № 51. - P. 49374-82.

30. Milhavet O., Gary D.S., Mattson M.P. RNA interference in biology and medicine // Pharmacology. -2003. - Vol. 55, № 3. - C. 629-48.

31. Mironov A., Fickett J.W., Gelfand M.S. Frequent alternative splicing of human genes // Gen. Res. - 1999. -Vol. 9. - P. 1288-93.

32. Modrek B., Lee C. A genomic view of alternative splicing // Nature genetics. - 2002. - Vol. 30. - P. 13-9.

33. Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-terminal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. - 1996.

- Vol. 156. - P. 4622-30.

34. Proussakova O.V., RabayaN.A., Moshnikova A.B. et al. Oligomerization of Soluble Fas Antigen Induces Its Cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2003. V. 278, № 38. - P. 36236-41.

35. Py B., Slomianny C., Auberger P. et al. Siva-1 and Siva-2 an alternative splice form lacking the death domain, Siva-2, similarly induce apoptosis in T lymphocytes via a caspase-dependent mitochondrial pathway // J. Immunol. - 2004. - Vol. 172. - P. 4008-17.

36. Reed J.C., Doctor K.S., Goldzik A. The domain of apoptosis: a genomic perspective // Sci. STKE. - 2004.

- Vol. 239. - P. 1-29.

37. Reed J.C., Pellecchia M. Apoptosis-based therapies for hematologic malignancies // Blood. - 2005. -Vol. 106. - P. 408-18.

38. Renshaw S.A., Dempsey C.E., Barnes F.A. et al. Three novel Bid proteins generated by alternative splicing of the human Bid gene // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279, № 4. - P. 2846-55.

39. Roberts G.C., Smith C. Alternative splicing: combinatorial output from the genome // Chem. Biol. -2002. - Vol. 6. - P. 375-83.

40. Schwerk C., Schulze-Osthoff K. Regulation of apoptosis by alternative pre-mRNA splicing // Mol. Cell.

- 2005. - Vol. 19. - P. 1-13.

41. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M. et al. Apoptosis signaling by death receptors // Eur. J. Biochem.

- 1998. - Vol. 254. - P. 439-59.

42. Screaton G.R., Xu X., Olsen A.L. et al. LARD: A new lymphoid-specific death domain containing receptor

regulated by alternative pre-mRNA splicing // J. Immunol. - 1997. - Vol. 94. - P. 4615-9.

43. Stamm S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome // Human Mol. Genetics. - 2002. - Vol. 11, № 20. - P. 2409-16.

44. Stamm S., Ben-Ari S., Rafalska I. et al. Function of alternative splicing // Gene. - 2005. - Vol. 344. - P. 1-20.

45. Takashima H., Nakajima T., Moriguchi M. et al. In vivo expression patterns of survivin and its splicing variants in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma // Liver Intern. - 2005. - Vol. 25. - P. 77-84.

46. Taupin J., Tian Q.,Kedersha N. et al. The RNA-binding protein TIAR is translocated from the nucleus to the cytoplasm during Fas-mediated apoptotic cell death // Cell Biol. - 1995. - Vol. 92. - P. 1629-33.

47. Tian Q., Taupin J., Elledge S. et al. Fas-activated serine/threonine kinase (FAST) phosphorylates TIA-1 during Fas-mediated apoptosis // J. Exp. Med. - 1995. -Vol. 182. P - 865-74.

48. Utz P.J., Hottelet M., van Venrooij W.J., Anderson P. Association of phosphorylated ser-ine/arginine (SR) splicing factors with the U1-small ribonucleoprotein (snRNP) autoantigen complex accompanies apoptotic cell death // J. Exp. Med. - 1998. - Vol. 187. - P. 547-60.

49. Yan M., Hong C., Lai G. et al. Identification and characterization of a novel gene Saf transcribed from the opposite strand of Fas // human Mol. Genetics. - 2005. -Vol. 14, № 11. - P. 1465-74.

50. Yeo G., Holste D., Kreiman G., Burge C.B. Variation in alternative splicing across human tissues // Gen. Biol. - 2004. - Vol. 5. - Р. 15.

Поступила 22.05.2006.