Способ прогнозирования риска развития преэклампсии у беременных с синдромом задержки роста плода
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF DEVELOPMENT OF PREECLAMPSIA IN PREGNANT WOMEN WITH FETAL GROWTH RESTRICTION SYNDROME

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования риска развития преэклампсии у беременных с синдромом задержки роста плода, являющихся уроженками Центрального Черноземья, русской национальности и не имеющих отягощенного семейного анамнеза по преэклампсии.
Задержка роста плода (ЗРП) - это недостаточное достижение плодом показателей массы и роста в соответствии с гестационным сроком с учетом пола и этнической принадлежности [Intrauterine Growth Restriction: Antenatal and Postnatal Aspects [Text]. Sharma D, Shastri S, Sharma P. Clinical Medicine Insights: Pediatrics. 2016;10:67-83]. В основе патогенеза ЗРП лежат повреждения плаценты или же ее дисфункция, возникающая в первом или втором триместрах беременности, как следствие дефекта инвазии трофобласта в спиральные артерии [Железова М.Е., Зефирова Т.П., Канюков С.С. Задержка роста плода: современные подходы к диагностике и ведению беременности. Практическая медицина. 2019;17(4):8-14], что является благоприятным фоном для развития преэклампсии (ПЭ) на поздних сроках гестации.
Преэклампсия характеризуется развитием артериальной гипертензии, протеинурии, отеков и сопровождается дисфункцией различных органов и систем женщины [Адамян ЛВ, Артымук НВ, Белокриницкая ТЕ, Беломестнов СР, Братищев ИВ, Вученович ЮД, и др. Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия. Клинические рекомендации (протокол) утв. МЗ РФ 7 июня 2016 №15-4/10/2-3484. М., 2016.].  У женщин с ПЭ в анамнезе в 2-4 раза повышается риск возникновения хронической артериальной гипертензии, в 2 раза увеличивается смертность от сердечно-сосудистых осложнений, а также в 1,5 раза повышается риск возникновения инсульта [NICE. National Institute for Health and Care Excellence. NICE guideline. Hypertension in pregnancy: diagnosis and management (NG133). 2019. Available at: www.nice.org.uk/guidance/ng133]. Также у женщин с ПЭ повышается риск развития: преждевременных родов, отслойки плаценты, дистресс-синдрома плода, что еще больше увеличивает вероятность неблагоприятных перинатальных исходов для плода, уже страдающего ЗРП [Долгополова Е.Л., Ломова Н.А., Караваева А.Л., Зубков В.В., Шмаков Р.Г. Тяжелая преэклампсия и задержка роста плода: отдаленные прогнозы для матерей и потомства. Акушерство и гинекология. 2020; 12: 100-107].
ПЭ является мультифакториальным заболеванием и ее развитие обусловлено как генетическими, так и средовыми факторами [Adu-Bonsaffoh K, Antwi DA, Gyan B, Obed SA. Endothelial dysfunction in the pathogenesis of pre-eclampsia in Ghanaian women. BMC Physiol. 2017;17(1):5] Доказано, что вклад генетических факторов в формирование ПЭ составляет более 50% [Фролова Н.И., Белокриницкая Т.Е., Колмакова К.А. Молекулярные маркеры и эпигенетические факторы риска преэклампсии в эпоху предиктивной медицины. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2019; 18(4): 95-103].  Однако следует отметить, что имеющиеся молекулярно-генетические  исследования не дают однозначного ответа о роли конкретных полиморфных локусов различных групп генов в формировании ПЭ. Поэтому остается актуальным поиск генетических маркеров для ранней диагностики ПЭ, особенно у беременных с ЗРП.
Ген  ITGB3 кодирует мембранный гликопротеин - бета-3 субъединицу интегрина, который известен так же как тромбоцитарный гликопротеин IIIа (platelet glycoprotein GPIIIa). Бета-3 субъединица интегрина, взаимодействуя с альфа-субъединицей интегрина (GPIIb), образует на мембране тромбоцитов комплекс, который является тромбоцитарным рецептором фибриногена. Находясь на поверхности тромбоцитов, данный рецептор взаимодействует с фибриногеном, обусловливает быструю агрегацию тромбоцитов, что имеет ключевое значение в процессе свертывания крови, результатом которого является образование тромбов. Активизация тромбообразования, обусловленное в т.ч. наследственными тромбофилиями, может приводить к различным осложнениям беременности (внутриутробная гибель плода, плацентарная недостаточность, задержка роста плода, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, преэклампсия и др.) [Simcox LE, Ormesher L, Tower C, Greer IA. Thrombophilia and Pregnancy Complications. Int J Mol Sci. 2015 Nov 30;16(12):28418-28.].
Полиморфный локус  rs5918 гена  ITGB3 продемонстрировал связь с выкидышами (полиморфный генетический вариант С у женщин с выкидышами встречался в 7 раз чаще в сравнении с женщинами без выкидышей) [Goncharova IA, Babushkina NP, Minaĭcheva LI, et al. Prevalence of alleles of polymorphic variants Leu33Pro and Leu66Arg gene ITGB3 among inhabitants of Siberia. Genetika. 2013;49(8):1008-12. (Russian).], привычным невынашиванием беременности (гетерозиготный генотип ТС является фактором риска) [Karami F., Askari M., Modarressi MH. Investigating Association of rs5918 Human Platelets Antigen 1 and rs1800790 Fibrinogen в Chain as Critical Players with Recurrent Pregnancy Loss. Med Sci (Basel). 2018;6(4):98.], ранней потерей плода (отношение шансов  для аллеля С составляет 2,7) [Ruzzi L, Ciarafoni I, Silvestri L, et al. Association of PLA2 polymorphism of the ITGB3 gene with early fetal loss. Fertil Steril. 2005;83(2):511-2.] и др. однако, следует отметить, что связь между полиморфизмом rs5918 ITGB3 и развитием ПЭ у беременных с ЗРП в нашем исследовании выявлена впервые.
В Российской Федерации исследования вовлеченности гена тромбоцитарного гликопротеина IIIа (ITGB3) в формирование предрасположенности к развитию преэклампсии у беременных с синдромом задержки роста плода немногочисленны, а данные о роли полиморфного локуса rs5918 ITGB3 в формировании ПЭ у беременных с ЗРП  отсутствуют.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития преэклампсии у беременных с синдромом задержки роста плода и не имеющих  отягощенного семейного анамнеза по ПЭ на основе данных о полиморфизме  rs5918 ITGB3.
Из области техники известен патент № 2730958  «Способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных» по заявке № 2019122327, от 16.07.2019. Способ включает определение в плазме крови беременной  концентрации внеклеточной ДНК (вк ДНК), число копий рибосомальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк рДНК), число копий митохондриальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк мтДНК), нуклеазную активность ДНКазы 1; в ядерной ДНК лейкоцитов определяют число копий геномной рибосомальной ДНК (геном рДНК), число копий геномной митохондриальной ДНК (геном мтДНК) и при вк ДНК более 1000 нг/мл, вк рДНК более 1000, вк мтДНК более 200, отношении вк рДНК к геном рДНК более 2, отношении вк мтДНК к геном мтДНК более 1,64, нуклеазной активности ДНКазы 1 более 10 ед/мл - диагностируют тяжелую преэклампсию. Недостатками метода являются возможность прогнозирования только тяжелого течения преэклампсии, дороговизна исследований, а также проведение большого количества сложных манипуляций и расчетов.
В патенте № 2699974 (по заявке 2018142290 от 30.11.2018) описан способ прогнозирования риска развития преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией». Способ включает забор венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и исследование полиморфизма гена альдостеронсинтазы CYP11B2 С(-344)Т и ангиотензиногена AGT T704C, оценивают уровень среднего артериального давления при первой явке в женскую консультацию до 12 недель беременности, учитывают факт наличия или отсутствия регулярной антигипертензивной терапии до наступления беременности и рассчитывают дискриминантную функцию (Y) по формуле:  Y=0,21×Ф1+0,18×Ф2+0,31×Ф3+0,29×Ф4, где  Ф1 - присутствие в генотипе женщины аллеля AGT 704С: да - 1 балл, нет - 0 баллов;  Ф2 - присутствие в генотипе женщины аллеля CYP11B2 (-344)Т: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф3 - наличие среднего артериального давления при первой явке в женскую консультацию до 12 недель беременности выше 95 мм рт. ст.: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф4 - регулярная антигипертензивная терапия до наступления беременности: отсутствие - 1 балл, наличие - 0 баллов, и при значении Y, равном 0,68 или более, прогнозируют повышенный риск развития преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией, уроженок Центрального региона России. Недостатком данного способа является возможность его применения только у ограниченной группы пациенток, а именно, у женщин с хронической артериальной гипертензией, установленной до наступления беременности.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода на основе данных о полиморфном локусе  rs5918 гена  тромбоцитарного гликопротеина IIIа (ITGB3).
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья и не имеющих отягощенного семейного анамнеза по ПЭ.
Предложенный способ  включает:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизма гена тромбоцитарного гликопротеина IIIа rs5918 ITGB3;
- прогнозирование высокого риска развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья и без отягощенного семейного анамнеза по ПЭ при выявлении в генотипе аллеля С полиморфного локуса rs5918 гена ITGB3.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья и без отягощенного семейного анамнеза по ПЭ на основе данных о полиморфном локусе  rs5918 гена  тромбоцитарного гликопротеина IIIа (ITGB3)
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфизма rs5918 ITGB3 проводят методом ПЦР-синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (2 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 30 сек при t=60°С; денатурация - 10 сек при t=94°С. При проведении ПЦР в амплификаторе (CFX96) с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции). Для rs5918 ITGB3 зонд с флуоресцентным красителем VIC соответствует аллелю C, зонд с красителем FAM - аллелю Т (фиг.1).
Изобретение характеризуется чертежом.
Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ITGB3 (rs5918):  - ТТ,   - ТС,  - СС, ♦ - отрицательный контроль.
Для анализа ассоциации изучаемого полиморфного локуса с риском развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода и без отягощенного семейного анамнеза по ПЭ проведен расчет показателей отношения шансов (ОШ) и их 95% доверительного интервала (95% ДИ). Вычисления выполнялись методом логистической регрессии в статистическом пакете программы PLINK  (размещен на электронном ресурсе http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/) согласно четырех генетических моделей (аллельная, аддитивная, рецессивная, доминантная) с введение поправок на ковариаты (возраст и индекс массы тела женщины до беременности) и множественные сравнения (применялся  адаптивный пермутационный тест). В качестве статистически значимого уровня использовали значение  pperm<0,05.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода подтверждает анализ результатов наблюдений 272 беременных: 76 с сочетанием ПЭ и ЗРП (средний возраст -27,39 ±5,22 лет, индекс массы тела женщины до беременности - 24,63±5,59) и 196 с ЗРП (26,63±4,41 лет, индекс массы тела женщины до беременности - 22,68±3,39). При диагностике ПЭ учитывалось наличие артериальной гипертензии, протеинурии и генерализованных отеков. Несоответствие расчетного веса плода (ниже 10-го процентиля для рассматриваемого гестационного возраста) являлось основанием для постановки диагноза ЗРП.
В группу для исследования включались женщины на сроке беременности 37-40 недель, русского этноса, родившиеся и проживающие в Центральном Черноземье РФ, не имеющие родственных связей и отягощенного семейного анамнеза по ПЭ. Из исследования исключались женщины на сроке беременности менее 37 недель и  более 40 недель, с многоплодной беременностью, нерусской национальности, родившиеся и проживающие вне Центрального Черноземья РФ, имеющие другую патологию беременности (изолированную форму ПЭ, аномалии прикрепления и расположения плаценты, ВПР плода) и тяжелую соматическую патологию (АГ, СД и др.), а также отказавшиеся от участия в исследовании. При включении в исследование женщина давала добровольное информированное согласие. На проведение исследования было получено разрешение этического комитета медицинского института НИУ БелГУ.
Данные, подтверждающие, что полиморфный локус rs5918 ITGB3 ассоциирован с формированием преэклампсии у беременных с задержкой роста плода согласно аллельной (ОШ = 1,76, 95% ДИ 1,06-2,93, р= 0,028, рperm=0,038, выполнено 524 пермутации) и аддитивной (ОШ = 1,77, 95% ДИ 1,04-3,01, р=0,036, рperm=0,037, выполнено 538 пермутаций) генетических моделей, приведены в таблице 1.
Таблица 1
Ассоциации полиморфного локуса rs5918 ITGB3 с формированием преэклампсии у беременных с задержкой роста плода
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что выявление аллеля С полиморфного локуса rs5918 гена ITGB3 является фактором риска развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода. Данный генетический вариант повышает риск развития этого осложнения беременности более чем в 1,8 раза.
Примеры конкретного выполнения
У беременной женщины Л., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья,  не имеющей отягощенного семейного анамнеза по ПЭ, на сроке 28 недель установлен диагноз:  задержка роста плода I степени, был произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлен генотип ТТ полиморфного локуса rs5918 гена ITGB3, что позволило отнести ее в группу с низким риском развития преэклампсии. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено клинических признаков ПЭ. Родоразрешение на сроке 40 недель.
У беременной женщины З., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья,  не имеющей отягощенного семейного анамнеза по ПЭ, на сроке 30 недель установлен диагноз:  задержка роста плода I степени, был произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлен аллель С в генотипе ТС полиморфного локуса rs5918 гена ITGB3, что позволило отнести пациентку в группу с высоким риском развития преэклампсии. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: на сроке 37 недель появились клинические признаки умеренной ПЭ (протеинурия, отеки, артериальная гипертензия). Родоразрешение на сроке 40 недель.
У беременной женщины Д., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья,  не имеющей отягощенного семейного анамнеза по ПЭ, на сроке 24 недель установлен диагноз:  задержка роста плода II степени, был произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлен аллель С в генотипе СС полиморфного локуса rs5918 гена ITGB3, что позволило отнести ее в группу с высоким риском развития преэклампсии. При дальнейшем наблюдении на сроке 32 недель появились клинические признаки ПЭ тяжелого течения (протеинурия, отеки, артериальная гипертензия). Родоразрешение на сроке 38 недель.
У беременной женщины П., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья,  не имеющей отягощенного семейного анамнеза по ПЭ, на сроке 31 недели установлен диагноз:  задержка роста плода I степени, был произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлен аллель С в генотипе СС полиморфного локуса rs5918 гена ITGB3 , что позволило отнести ее в группу с высоким риском развития преэклампсии. При дальнейшем наблюдении на сроке 37 недель появились клинические признаки умеренного течения ПЭ (протеинурия, отеки, артериальная гипертензия). Родоразрешение на сроке 39 недель.
У беременной женщины Р., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья,  не имеющей отягощенного семейного анамнеза по ПЭ, на сроке 29 недель установлен диагноз: задержка роста плода I степени, был произведен забор венозной крови, при генотипировании ДНК-маркеров выявлен генотип ТТ полиморфного локуса rs5918 гена ITGB3, что позволило отнести ее в группу с низким риском развития преэклампсии. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено клинических признаков ПЭ. Родоразрешение на сроке 40 недель.
Таким образом, предложенный способ дает возможность прогнозирования риска развития преэклампсии у беременных с задержкой роста плода, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России и не имеющих отягощенного семейного анамнеза по ПЭ, с учетом полиморфизма rs5918 гена тромбоцитарного гликопротеина IIIа (ITGB3).