Медиаторный биосенсор на основе дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii для определения БПК

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 3. С. 199-209 Химия

УДК 544.6:57

Медиаторный биосенсор на основе дрожжевых клеток ПеЬатуотусев Напвепп для определения БПК *

Е. Е. Бабкина, В. А. Арляпов, А. В. Беленьких, В. А. Алферов

Аннотация. Разработанный макет амперометрического биосенсора на основе дрожжей Debaryomyces hansenii и двухмедиаторной системы (гексацианоферрат (III) калия — 1,4-нафтохинон) был применен для определения БПК полупродуктов брожения. Биосенсор позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

Ключевые слова: амперометрический биосенсор, Debary-

omyces hansenii, медиаторы переноса электронов, биохимическое потребление кислорода.

При оценке состояния окружающей среды зачастую важно определение не столько конкретного ксенобиотика, сколько всего пула поллютантов — то есть оценка комплексных показателей состояния окружающей среды, например, биохимического потребления кислорода (БПК) — важного показателя, применяемого для мониторинга органических загрязнений поверхностных, грунтовых и сточных вод. Традиционный способ определения БПК является достаточно сложным и трудоемким и занимает до 5 суток. Вместе с тем, применение биосенсорного подхода позволяет сократить время анализа с 5 дней до одного часа и менее. Биоматериал, используемый в рецепторном элементе БПК-биосенсора должен обладать широкой субстратной специфичностью, что характерно для целых клеток микроорганизмов. В большинстве случаев при разработке целоклеточных биосенсоров в рецепторных элементах используются бактерии. Так, описаны медиаторные биосенсоры для определения БПК на основе Pseudomonas fluorescens [1], Escherichia coli [2], Proteus vulgaris [3].

В работе [4] в качестве биокатализатора в биосенсоре на основе кислородного электрода были использованы дрожжи Debaryomyces hansenii. Показана перспективность использования данного микроорганизма в

* Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (госконтракт №16.740.11.0766).

биосенсорах в силу широкой субстратной специфичности и устойчивости при хранении.

С целью создания амперометрических биосенсоров, измерения с помощью которых не будут зависеть от содержания кислорода в среде, применяют медиаторы переноса электронов от ферментных систем клеток на электрод.

Целью данной работы являлась разработка медиаторного биосенсора на основе дрожжевых клеток В. 110,486411 для определения БПК.

1. Материалы и методы

Рабочий электрод формировался из пластиковой трубки наполненной пастой «графитовая пудра-минеральное масло-медиатор (в случае иммобилизованного медиатора)». Пластиковая трубка содержала серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита. Растворимый медиатор добавлялся буферный раствор, в котором проводили измерения.

Клетки микроорганизмов В. }шп8бпп иммобилизуются следующим образом: на поверхность пасты, заполняющей шприц, наносится 3 мкл суспензии клеток (200 мг/мл) и подсушивается при комнатной температуре в течение 15 мин. На поверхности электрода при помощи пластикового кольца закрепляется диализная мембрана.

Регистрацию ответов биосенсоров проводиллась по двухэлектродной схеме. Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод (площадь поверхности 6,3 мм2) с иммобилизованными клетками дрожжей В. Ноп8бпп, электродом сравнения — насыщенный хлоридсеребряный. Измерения проводилсь в фосфатном буферном растворе с рН 6,8 при постоянном потенциале 400 мВ, объем ячейки — 4 мл. Измерения велись при непрерывном перемешивании раствора, находящегося в электролитической ячейке, при помощи магнитной мешалки (300 об/мин). После установления постоянного уровня тока в ячейку микропипеткой вводилось необходимое для получения заданной концентрации количество 1 М или 0,1 М раствора субстрата. После каждого измерения производилась промывка ячейки (3-4 мл буферного раствора).

Измеряемым параметром сигнала сенсора являлась амплитуда изменения силы тока, определяемая как разность между конечным и начальным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Взаимодействие ферментных систем дрожжевых клеток

О. Напввпп с медиаторами электронного транспорта. Выбор эффективного медиатора переноса электронов от ферментных систем микроорганизмов на электрод является одной из важных задач при

разработке биосенсора. Способность микроорганизмов взаимодействовать с медиаторами электронного транспорта определяется доступностью ферментных систем для этих соединений и зависит как от природы клеток, так и от строения и свойств медиатора. Описано применение в качестве медиаторов в биосенсорах на основе бактериальных клеток соединений различного строения и свойств: гексацианоферрата (III) калия (ГЦФ), хинонов различного строения, ферроцена и его производных, 2,6-дихлорфенолиндофенола и др. [1, 5, 6].

Следует отметить, что дрожжи Б. Ьашепп относятся к эукариотам и обладают более сложным строением по сравнению с бактериальными клетками. Кроме того, ферментные системы окисления углеводов и спиртов в дрожжевых клетках локализованы внутри клетки (в цитоплазме или органеллах), что, вероятно, затрудняет их взаимодействие с медиаторами переноса электронов. Следовательно, актуальной задачей является изучение взаимодействия с медиаторами эукариотических клеток — дрожжей В. Ь0П86ПП.

Медиаторы в биосенсорах можно условно разделить на две группы: водорастворимые медиаторы, которые добавляются непосредственно в буферный раствор, и нерастворимые (или малорастворимые) в водных средах медиаторы, которые иммобилизуют на электрод (часто такой медиатор замешивается в графитовую пасту, из которой формируется электрод).

В литературе описано применение системы из двух медиаторов в биосенсоре на основе целых дрожжевых клеток Боссоготусб8 сбГбУ18гоб [7]. Показано, что при использовании системы из двух медиаторов — 2-метил-1,4-нафтохинона (малорастворимый иммобилизованный медиатор) и ГЦФ (растворимый медиатор) наблюдается повышение генерируемого сенсором тока при добавлении медиаторов и субстрата. Было выдвинуто предположение, что 2-метил-1,4-нафтохинон (МНХ), как липофильное соединение, способен проникать через липидную мембрану внутрь клетки, взаимодействовать с восстановленной формой фермента, забирать от нее электроны и, проникая через оболочку клетки, передавать их из клетки на второй (водорастворимый) медиатор — ГЦФ, который передает электроны на электрод (рис. 1).

Подобная двухмедиаторная система была применена при разработке биосенсора на основе дрожжей В. Ьоп8бпгг. В качестве водорастворимого медиатора использовался ГЦФ, а в качестве второго медиатора, который добавлялся в графитовую пасту, использованы малорастворимые хиноны различного строения: 1,4-нафтохинон (1,4-НХ), 1,2-нафтохинон (1,2-НХ), 2,5-дибром-1,4-дибромхинон (ДБХ), 2-метил-1,4-хинон (МХ) и ферроцен (ФЦ). Полученные данные представлены на рис. 2 и суммированы в таблице

1.

Из данных, представленных в таблице 1 следует, что наибольший ток сенсор на основе дрожжевых клеток В. }шп8бпп генерирует при

оболочка

внеклеточная среда клетки цитоплазма

Рис. 1. Схематическая модель окисления субстрата клетками дрожжей с использованием двухмедиаторной системы иммобилизованный медиатор (М/МН2) — растворимый медиатор ГЦФ ([Ее(СМ)б]3_/[Ре(СМ)б]4_), Я —

субстрат

Момент

6000 5000 * 4000

СЗ 14

I 3000

ч я

и 2000 1000 0

0 100 200 300 400 500 600

Время измерения, с

Рис. 2. Типичные ответы сенсора на основе дрожжей D. hansenii и двухмедиторной системы: первый медиатор — растворимый ГЦФ (концентрация в буферном растворе 10 мМ, добавляется в момент времени 0 сек); второй медиатор — иммобилизованный (1 — 1,4-НХ, 2 — ФЦ, 3 — ДБХ, 4 — МБХ, концентрация в графитовой пасте 10%). Субстрат (глюкоза 25 мМ) вводится в кювету в 200 сек от начала измерения

использовании двухмедиаторной системы ГЦФ — 1,4-НХ. Если принять гипотезу, что хиноны проникают через мембраны дрожжей внутрь клетки и затем взаимодействуют с восстановленной формой фермента, то из полученных данных можно сделать вывод, что 1,4-НХ легче проникает сквозь мембрану, что, скорее всего, связанно с его большей гидрофобностью по сравнению с другими использованными хинонами.

При использовании системы медиаторов ГЦФ — 1,2-НХ не наблюдалось роста тока сенсора при введении субстрата, свидетельствующего о

Таблица 1

Ответы биосенсоров на основе дрожжей D. hansenii на глюкозу при использовании двухмедиаторной системы ГЦФ — иммобилизованный

медиатор

Растворимый

медиатор

Иммобилизованный медиатор Ответ сенсора, нА

1,4-нафтохинон 1900 ± 100

1,2-нафтохинон 0

2,5-дибром-1,4- дибромхинон 230 ± 70

2-метил-1,4-хинон 90 ± 50

ферроцен 280 ± 80

Гексацианоферрат (III) калия Кз[Ре(СМ)е]

протекании биоэлектрокаталитического процесса. Это указывает на то, что 1,2-НХ не способен взаимодействовать с ферментами, катализирующими окисление глюкозы в дрожжах В. Напввпіі и не может служить переносчиком электронов от биомолекул на электрод в биосенсорах на основе этих дрожжей. Неспособность 1,2-НХ служить переносчиком электронов в системах с интактными клетками объясняется отличием его структуры от убихинона — компонента цепи переноса электронов, который является

1,4-хиноном.

Из данных, представленных на рис. 3 следует, что сенсор на основе дрожжей В. Ьапвепгг с использованием двух медиаторов генерирует более высокие токи по сравнению с сенсорами с использованием одного медиатора. Ответ сенсора на основе двухмедиаторной системы почти в 10 раз выше, чем суммарный ответ одномедиаторных систем на основе ГЦФ или на основе 1,4-НХ, что свидетельствует, об эффективности применения двухмедиаторной системы в сочетании с целыми клетками В. Напввпіі.

Таким образом, для дальнейшей работы была выбрана система на основе дрожжей В. Напввпіі в сочетании с двухмедиаторной системой ГЦФ — 1,4-НХ.

2.2. Рабочие параметры медиаторного биосенсора на основе дрожжей О. Напввип. При разработке биосенсоров важным этапом является определение рабочих параметров. Величина тока, генерируемого биосенсором в присутствии определяемого вещества, может изменяться в зависимости от условий (pH, концентрация медиатора), в которых проводятся измерения.

При исследовании зависимости величины сигналов биосенсора на основе дрожжей В. Иапввпіі от рН среды использовали фосфатный буферный раствор с различными значениями рН в диапазоне от 5,4 до 8,0. Для

8000 7000 6000 5000

оЗ

03

к 3000 и

2000 1000 0

0 100 200 300 400 500 600

Время измерения, с

Рис. 3. Типичный ответ сенсора на основе целых дрожжевых клеток D.

hansenii: 1 — графитовая паста без медиатора, ГЦФ 10 мМ; 2 — графитовая паста с 15% 1,4-НХ; 3 — графитовая паста с 15% 1,4-НХ, ГЦФ 10 мМ. 1,4-НХ вмешан в графитовую пасту, ГЦФ добавляется в буферный раствор в момент времени 0 с, субстрат — глюкоза (12,5 мМ) вводится в буферный раствор через 200 с от начала измерения

биосенсора на основе целых дрожжевых клеток D. hansenii максимальный сигнал получен при рН=6,8. (рис.4).

Были получены зависимости ответа сенсора от концентрации медиаторов при постоянной концентрации глюкозы.

Из графиков зависимости ответа сенсора от концентрации медиатора видно, что при увеличении концентрации медиаторов (ГЦФ до 10 мМ и

1,4-НХ до 15 %) ответы биосенсора возрастают, что является типичным для ферментативных реакций. Высокие концентрации каждого медиатора уменьшают ответ сенсора на субстрат (рис. 5-а,б). В случае с 1,4-НХ это может быть связано с ингибированием медиатором ферментных систем клеток, т.к. предполагается, что нафтохинон проникает непосредственно внутрь клетки.

Таким образом, максимальный ответ сенсора на основе дрожжей D. hansenii достигается при концентрациях ГЦФ в кювете 10 мМ и 1,4-нафтохинона в графитовой пасте 15%.

Важным параметром для практического применения биосенсоров являются операционная и долговременная стабильность. Операционная стабильность для биосенсоров на основе целых клеток D. hansenii измерялась в течение дня при концентрации глюкозы 12,5 мМ (рис.6-а). Стандартное отклонение для 15 измерений составило 4%.

Рис. 4. Зависимость величины ответа сенсора на глюкозу

а)

Концентрация медиатора і б)

Рис. 5. Зависимость ответов сенсора на основе Б. Наиввип на глюкозу

Была изучена долговременная стабильность биосенсора на основе Б. НапввпИ Из полученных данных (рис. 6-б) можно сделать вывод, что ответ сенсора за 15 суток падает до нуля, что может быть связано не только с гибелью микроорганизмов, но так же с вымыванием 1,4-НХ из графитовой пасты.

Для применения медиаторных биосенсоров в анализе реальных растворов большое значение имеет субстратная специфичность. Была изучена субстратная специфичность биорецепторного элемента на основе дрожжей Б. НапввпИ Результаты представлены на рис. 7.

а) б)

Рис. 6. Операционная (а) и долговременная (б) стабильность биосенсора на основе целых дрожжевых клеток В. Напввпп. Концентрация глюкозы 12,5 мМ, ГЦФ 10мМ, содержание в пасте 15% 1,4-нафтохинона

Рис. 7. Субстратная специфичность биорецепторного элемента на основе В. Напввпп (за 100% принят ответ сенсора на глюкозу). Концентрация 1,4-НХ 15%, ГЦФ 10 мМ, субстрата 25 мМ

Из представленного графика видно, что биосенсор, основанный на дрожжах Б. Напввпп и двухмедиаторной системе дает высокие ответы на моносахариды и спирты нормального строения. Стоит так же заметить, что биосенсор основанный на дрожжевых клетках Б. Напввпп, дает ответ на глюкозу, фруктозу, этанол и глицерин, которые могут присутствовать в реальных образцах сточных вод пищевых производств, но не дает ответ

на глутамат, который входит в состав стандарта для определения БПК (глюкозо-глутаматная смесь).

2.3. Определение БПК микробным медиаторным биосенсором на основе дрожжей О. Напввпп. Для создания макета микробного биосенсора для определения БПК использована двухмедиаторная система (ГЦФ — 1,4-НХ) в сочетании с дрожжевыми клетками Б. Напввпп. В качестве модельной смеси для определения зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата использована смесь, содержащая равные массы глюкозы и глутаминовой кислоты (ГГС). Применение ГГС в качестве стандарта при анализе БПК определено в нормативных документах [8]. Из теоретического соотношения БПК5 = 0, 68-С [8], где С — концентрация ГГС (мг/л), проведен пересчет концентрации ГГС в значения БПК5. Линейный участок градуировочной зависимости ответов микробных биосенсоров от индекса БПК анализируемого раствора представлен на рис. 8.

700 г 600

О

К

<D

н 300

<D

CQ

Н

° 200 100 0

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Индекс БПК, мг кислорода/л

Рис. 8. Зависимость величины ответов биосенсора на основе D. hansenii и двухмедиаторной системы (ГЦФ — 1,4-нафтохинон) от значений индекса

бпк5

По полученным данным были рассчитаны аналитические характеристики: диапазон определяемых концентраций 375-1400 мг O2/л, коэффициент чувствительности 0, 40 ± 0, 01 нА-л/мг O2.

В качестве образца для определения индекса БПК5 с помощью медиаторного биосенсора использована полученная в лабораторных условиях бродильная смесь на основе пшеничной муки, имитирующая состав сточных вод бродильных производств с известным значением БПК5, определенным стандартным методом (табл. 2).

Таблица 2

Значения индексов БПК5 бродильной смеси на основе пшеничной муки после процесса брожения, полученные с помощью медиаторного биосенсора и стандартным методом разбавления

Значение БПК5, определенное стандартным методом, г 02/л Значение БПК5, определенное с помощью биосенсора на основе D. hansenii, г 02/л

49 ± 5 45 ± 4

Полученные результаты определения индекса БПК5 в образцах с помощью биосенсора согласуются с данными, полученными стандартным методом разбавления.

Таким образом, разработанный макет медиаторного биосенсора на основе дрожжей D. hansenii можно использовать для определения индекса БПК стоков бродильных производств, предприятий пищевой и биотехнологической промышленности, содержащих углеводы и спирты.

Список литературы

1. Yoshida N, Yano K., Morita T. A mediator-type biosensor as a new approach to biochemical oxygen demand estimation // Analyst. 2000. №125. P.2280-2284.

2. Yoshida N, Hoashi J., Morita T. Impruvement of a mediator-type biochemical oxygen demand sensor for on-site measurement // Journal of Biotechnology. 2001. №88. P.269-275.

3. Pasco N, Baronian K. MICREDOX — development of a ferricyanide-mediated rapid biochemical oxygen demand method using an immobilized Proteus vulgaris biocomponent // Biosensors and Bioelectronics. 2004. №20. P.524-532.

4. Биосенсор для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода на основе дрожжевых микроорганизмов родов Candida и Debaryomyces / О.Н. Понаморева [и др.] // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2010. Т.6, №3. C.5-12.

5. Improved selectivity of microbial biosensor using membrane coating. Application to the analysis of ethanol during fermentation / J. Tkac [et al.] // Biosensors and bioelectronics. 2003. №18. Р.1125-1134.

6. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter oxydans. Evaluation of water-insoluble mediator efficiency / E. Babkina [et al.] // Electroanalysis. 2006. V.18, №19-20. P.2023-2029.

7. Heiskanen A, Yakovleva J., Spegel C. Amperometric monitoring of redox activity in living yeast cells: comparison of menadione and menadione sodium bisulfite as electron transfer mediators // Electrochemistry Communications. 2004. №6. C.219-224.

8. ПНД Ф 14. 1:2:3:4.1 23-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после п-дней инкубации (БПКполн.) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997, 25 с.

Бабкина Елена Евгеньевна (babkinael@rambler.ru), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Арляпов Вячеслав Алексеевич, к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Беленьких Анна Владимировна, студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Алферов Валерий Анатольевич, к.х.н., профессор, зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Mediated biosensor based on yeast cells Debaryomyces hansenii for BOD estimation

E. E. Babkina, V. A. Arlyapov, A. V. Belyenkih, V. A. Alferov

Abstract. The developed model of a biosensor based on the Debaryomyces hansenii and bimediated system hexacyanoferrat (III) — 1,4-naphtoquinone have applied to an estimation of BOD index of semiproducts and a waste of ethanol fermentation. The developed biosensor allows obtaining data with high correlation to a standard method.

Keywords: amperometric biosensor, Debaryomyces hansenii, electron transfer mediator, biochemical oxygen demand.

Babkina Elena (babkinael@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.

Arlyapov Vyacheslav, candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.

Belyenkih Anna, student, department of chemistry, Tula State University.

Alferov Valeriy, candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 12.09.2011