Штамм Streptococcus pneumoniae серотип 15F
STRAIN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTYPE 15F

Область техники
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Выделенный штамм Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3 серотип 15F используется для получения полисахаридного антигена, который играет основную роль в вирулентности штамма. На основании этого полисахаридного антигена возможно производство вакцинных и иммунобиологических препаратов.
Описание уровня техники
Streptococcus pneumoniae (стрептококки пневмонийные) представляет собой бактериальную культуру, являющуюся возбудителем группы инфекционных заболеваний человека. Тяжелыми формами развития пневмококковой инфекции являются пневмония, менингит и сепсис. Частота развития тяжелых форм достаточно высока. Среди населения наиболее часто пневмококковой инфекцией болеют дети от шести месяцев до шести лет, смертность составляет около 5%. Streptococcus pneumoniae является вторым (после Haemophilus influenzae) по распространенности и важности пневмотропным микроорганизмом в микробном спектре при хронических бронхолегочных заболеваниях у детей в периоде обострения.
Для снижения заболеваемости рекомендованы вакцины на основе пневмококкового антигена. Как правило, в таких вакцинах в качестве антигена используется капсульный полисахарид штаммов пневмококка. В зависимости от химического строения капсульного полисахарида пневмококки подразделяют на серологические типы, кроме того, химический состав капсулы определяет вирулентность и патогенность микроорганизма. Вирулентность колеблется в пределах серологических типов из-за генетического разнообразия. В настоящее время известно более 90 серотипов, из них идентифицированы следующие серогруппы/серотипы пневмококка, которые могут входит в состав вакцины: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17, 18C, 19F, 15F, 20, 22F, 23F, 33F. В состав вакцины, как правило, входят капсулярные полисахариды, полученные от разных серотипов диких или рекомбинантных штаммов пневмококка. Дикие типы выделяют из природных источников или доступных источников (например, смывы со слизистых ротоглотки/носоглотки пациентов). Для повышения выходов полисахарида, снижения примесей или повышения вирулентности штаммы Streptococcus pneumoniae модифицируют рекомбинантными методами.
Так, известно несколько штаммов Streptococcus pneumoniae. Например, в патенте RU 2601158 (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, дата подачи 12.05.2012) раскрыты штаммы Streptococcus pneumoniae серотипов 6В, 10 А и 19F. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 296, 297 и 298, соответственно. Штаммы предназначены для получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью. При этом не изучалась продуктивность штаммов в отношении полисахаридов, и штаммы позволяют получать белковые фракции пневмококка. Однако, для конструирования полисахаридной конъюгированной вакцины необходимы штаммы, синтезирующие достаточное количество полисахаридов. Штамм S. pneumoniae серотипа 6В выделен от больного в г. Москве в 2005 г. в ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 296.
Таким образом, необходимо получение штаммов Streptococcus pneumoniae различных серотипов с повышенной продуктивностью капсулярного сахарида для производства антигена для вакцины, при этом желательно, чтобы данный штамм культивировался на твердых и жидких питательных средах, с высоким выходом капсульного полисахарида. Также при работе со штаммом необходимо, чтобы получаемый штамм при получении посевной культуры можно было хранить в лиофилизированном виде без потери его технологических свойств.
Описание изобретения
Согласно изобретению, предложен бактериальный штамм Streptococcus pneumoniae серотип 15F. Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В-9846 и предназначен для получения полисахарида, используемого в качестве антигена.
Данный штамм может быть использован или храниться в форме биологически чистой культуры, в форме жизнеспособных клеток или в форме лиофилизата.
Данный штамм был выделен из смыва или мазка с носоглотки или горла.
Справка о депонировании прилагается.
Описание фигур
Фиг. 1. Идентификационная таблица тест-системы STREPTOtest 24.
Подробное описание изобретения
Согласно изобретению, предложен бактериальный штамм Streptococcus pneumoniae серотип 15F. Данный штамм может быть использован или храниться в форме биологически чистой культуры, в форме жизнеспособных клеток или в форме лиофилизата. Кроме того, данный штамм был выделен из смыва или мазка с носоглотки или горла, в частности, от больного ребенка ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней», ФМБА России, г. Санкт-Петербург.
Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В-9846 и предназначен для получения полисахарида, используемого в качестве антигена, дата депонирования 28.03.2022 г. Данный штамм является высокоактивным продуцентом капсульного полисахарида пневмококка, используемый в качестве промышленного при изготовлении вакцин.
Примеры
Пример 1
Получение и выделение Streptococcus pneumoniae серотип 15F
Штамм был выделен из смыва с носоглотки инфицированного пациента, в стационаре ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней», ФМБА России, г. Санкт-Петербург.
Все микробиологические работы проводили в соответствии с требованиями санитарных правил СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
Streptococcus pneumoniae
2
2
Культуры  выращивали в CO-инкубаторе (5% CO) при 37°C в течение двух суток на плотных питательных средах: Blood Agar Base с добавлением 5% бараньей крови и №1 ГРМ с добавлением 5% сыворотки крови крупного рогатого скота. Рост наблюдался слабый. Колонии культур 23 3-H-3 - мелкие (1-2 мм в диаметре), округлые, блестящие, полупрозрачные с ровным краем, мягкой консистенции.
Пример 2
Идентификация выделенного штамма
Выросшие на плотной питательной среде колонии были исследованы с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF Biotyper (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Для этого проводили экстракцию белков последовательной обработкой микробной взвеси этиловым спиртом, муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила. В качестве вещества, обеспечивающего процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения, использовали MALDI-матрицу (насыщенный водный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, содержащий 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Анализ проводили в автоматическом режиме. Результат идентификации представлен в таблице 1.
Таблица 1 - Идентификация с использованием системы MALDI Biotyper
Название штамма
Идентификация
Показатель подобия
степень достоверности
23 3-H-3 серотип 15F
<i>Streptococcus pneumoniae</i>
2,135
+
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus
23 3-H-3 - предположительная идентификация до рода .
Далее, изучение культур проводили с помощью тест-системы STREPTOtest 24 (Erba LaChema s.r.o., Karasek, Brno, CZ) в соответствии с инструкциями производителя. Культуру Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3 проверили на ряд параметров ниже для установления биохимических свойств и дополнительной идентификации культуры. Полученные результаты биохимических тестов представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты идентификации культуры Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3
Условное обозначение
ТЕСТ
Реакция
NAG
Ацетилглюкозаминидаза
+
LAP
Лейцинаминопептидаза
+
bMN
β-маннозидаза
-
GLR
β-глюкуронидаза
-
bGL
β-глюкуронидаза
-
bGA
β-галактозидаза
+
aGA
α-галактозидаза
+
PHS
Фосфатаза
-
ESL
Эскулин
-
INU
Инулин
+
MAN
Маннитол
-
SOR
Сорбитол
-
MLB
Мелибиоза
-
RIB
Рибоза
-
LAC
Лактоза
+
PUL
Пуллулан
+
ARG
Аргининдигидролаза
-
NCL
Рост с 6,5 % NaCl
-
aMG
α-метилглюкозидаза
-
TGT
Тагатоза
-
MLT
Мальтоза
+
RAF
Раффиноза
+
TRE
Трегалоза
+
SOE
Сорбоза
-
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Биохимические свойства культур  23 3-H-3 соответствуют идентификационной таблице  для тест-системы STREPTOtest 24 (Фиг. 1).
Выделение тотальной ДНК из бактериальной культуры
Для выделения ДНК 2-3 петли бактериальной культуры переносили в микроцентрифужную пробирку «Eppendorf» с 400 мкл буферного раствора 1×ТЕ (10 mM Tris, pH 8,0 и 1 mM EDTA). Затем в пробирку добавляли 50 мкл лизоцима (10 мг/мл) и инкубировали в течение двух часов при 37°C. К полученной суспензии добавляли 75 мкл раствора SDS/протеиназа К (70 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы К), 100 мкл 5M NaCl и 100 мкл раствора CTAB/NaCl (4,1 г NaCl, 10 г CTAB, 80 мл дистиллированной воды). Полученную смесь трясли до молочно-белой консистенции и инкубировали в течение 10 минут при 65°C. После инкубации в пробирку добавляли 750 мкл хлороформ/изоамиловый спирта (24:1), трясли 10 секунд и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут. Затем надосадочную жидкость, содержащую ДНК, отбирали в новую пробирку, добавляли 450 мкл изопропилового спирта и инкубировали в течение 10 минут на льду. Далее пробирку центрифугировали 15 минут при комнатной температуре при 14000 об/мин и супернатант удаляли при помощи автоматической пипетки. Далее к осадку добавляли 1 мл 70% перегнанного этанола и центрифугировали в течение 15 минут при +4°C при 12000 об/мин. Супернатант удаляли, осадок высушивали при комнатной температуре и растворяли в 20 мкл дистиллированной воды.
Полногеномное секвенирование
Streptococcus pneumoniae
Полногеномное секвенирование  осуществлено на платформе MGI (MGI Tech Co., Ltd), Lt, с использованием наборов MGIEasy FS DNA Library Prep Kit и MGI-Seq 2000RS High-throughput sequencing kit PE150, согласно рекомендациям производителя. В результате сформировано три архива сырых ридов.
Также был проведен биоинформационный анализ (метагеномный анализ).
Для обработки данных полногеномного секвенирования образцов использовали программное обеспечение для анализа метагеномных образцов: Kraken Metagenomics version 2. Полученные результаты подтвердили видовую идентификацию Streptococcus pneumoniae: Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3. Общая длина полученных контигов (пар нуклеотидов - п.н.) и GC состав образцов соответствуют значениям размеров геномов и GC составу референсных штаммов Streptococcus pneumoniae, находящихся в базе данных NCBI Genome.
Полные данные представлены ниже:
Название штамма
23 3-H-3
Кол-во ридов
43500109
Кол-во нуклеотидов
6469144695
Кол-во контигов
77
Общая длина
2087376
Размер наибольшего контига
312915
GC %
39.54
Покрытие
3099,2
Идентификация с помощью Kraken2
92% <i>Streptococcus pneumoniae</i>
Таким образом, данный штамм можно достоверного отнести к Streptococcus pneumoniae, серотип 15F.
Пример 3
Лиофильное высушивание
6
Лиофилизацию культуры Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3 серотип 15F осуществляли с помощью лиофильной сушки EPSILON 1-4 LSC, Германия. В качестве защитной среды использовали сахарозо-желатиновую среду (10% сахароза, 1,5% желатин). С целью проведения контроля жизнеспособности после лиофилизации один флакон с высушенной культурой вскрывали, добавляли 0,5 мл физиологического раствора, готовили серию десятикратных разведений и высевали на чашки Петри со средой Blood Agar Base с добавлением 5% бараньей крови. После инкубации 48 часов, подсчитывали выросшие колонии. Концентрация бактериальных клеток во флаконе составляет не менее 10 кл/мл.
Пример 4
Получение капсульного полисахарида
2
2
Штамм клеток Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3 серотип 15F культивировали в жидкой среде, содержащей соевый пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу моногидрат, аминокислоты, хлорид холина, соли металлов. Полученный Рабочий посевной материал путем двух пассажей в колбах в СО-инкубаторе при температуре 37°С, 5% СО, засевали в лабораторный ферментер (BIOSTAT A MO UniVessel Glass 2L, Sartorius), содержащий жидкую питательную среду. Культивирование проводили при температуре (37±2)°C; рН - (7,2±0,2); скорость перемешивания - (70-100)±10 об/мин; автоматический режим поддержания параметров до достижения стационарной фазы роста культуры (от 4 до 14 ч). Далее полученную культуру инактивировали добавлением формалина до концентрации 0,20-0,25 % в промежуточном продукте при температуре (25±1)°С в течение (4±0,5) ч. Далее инактивированную культуру подвергали лизису добавлением раствора дезоксихолата натрия до концентрации 0,13% в промежуточном продукте при температуре (37±2)°С в течение 2 ч.
Далее в полученной лизированной культуре определяли выход полисахарида измерением содержания метилпентоз.
Для этого предварительно отделяли клетки культуры центрифугированием при 8900±500 g, в течение 60 мин. Супернатант сливали и готовили разбавление испытуемого образца в воде очищенной таким образом, чтобы концентрация метилпентоз составила от 5 до 80 мкг/мл. Содержание метилпентоз в испытуемых образцах определяли путем сравнения разницы оптических плотностей, полученных при построении калибровочного графика с известной концентрацией рамнозы (метилпентозы) с разницей оптических плотностей при 396 нм и 430 нм.
В качестве стандартного раствора использовали растворы L-рамнозы (концентрация 5; 10; 20; 40; 80 мкг/мл) для построения калибровочной кривой.
В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную. Пробирки со стандартными растворами, испытуемыми образцами и раствором сравнения инкубировали на водяной бане. В каждую пробирку со стандартными растворами, испытуемыми образцами и раствором сравнения по каплям с постоянным перемешиванием добавляли по 2,25 мл 15,7 М раствора серной кислоты. После перемешивания и достижения комнатной температуры, пробирки помещали на водяную баню при температуре 90°С в течение 7 минут. В каждую пробирку добавляли 50 мкл 0,2 М раствора L-цистеина гидрохлорида и перемешивали. Пробирки выдерживали в темной камере при комнатной температуре в течение 2 часов. Оценивали окрашивание растворов в пробирках: должно наблюдаться желто-зеленое окрашивание различной интенсивности в зависимости от концентрации метилпентоз. Измеряли оптическую плотность каждого раствора при двух длинах волн. Содержание метилпентоз (продуктивность штамма клеток Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3 серотип 15F) составило не менее 150 мкг/мл, но в среднем (при нескольких культивированиях) продуктивность составляла 300-500 мкг/мл.
На всех технологических этапах подлинность полисахарида подтверждали методом латексной агглютинации при помощи набора Wellcogen™ Streptococcus pneumoniae Rapid Latex Agglutination Test, Wellcogen S. pneumoniae Kit (Thermo Scientific™).