Оценка патогенных свойств бактерий под действием фитосубстанций (на примере липолитической активности)

лекарственные растения

© ЗОЛОТАРЕВ п.н. - 2015

УДК: 576.8.06; 616-018-002.3: 615.322

оценка патогенных свойств бактерий под действием фитосубстанций

Павел Николаевич Золотарев (Медицинский университет «РЕАВИЗ»», Самара, ректор - д.м.н., проф. Н.А. Лысов, кафедра морфологии

и патологии, зав. - к.м.н., доц. А.А. Супильников)

Резюме. Изучена способность фитосубстанций, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды, изменять липоли-тическую активность бактерий, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания. Выявлено, что фитосубстанции оказывают на липолитическую активность бактерий как стимулирующее, так и ингибирующее влияние. Данные результаты зависят от видовой принадлежности бактерий, а также от природы фитосубстанции. Экспериментальное изучение регуляции липолитической активности микроорганизмов фитосубстанциями, показывает целесообразность применения данных фитосубстанций в клинической практике в качестве вспомогательных противомикробных средств как на этапе этиотропного лечения, так и для профилактики ряда инфекционных заболеваний.

Ключевые слова: факторы патогенности, липолитическая активность, фитосубстанции, гнойно-воспалительные заболевания.

ESTIMATE OF BACTERIA PROPERTIES uNDER THE INFLuENCE OF PHYTOSuBSTANCES

P.N. Zolotarev

Summary. Ability of phytosubstances containing flavonoids and phenylpropanoids to change lipolytic activity of bacteria causing purulent inflammatory diseases was studied. These phytosubstances can either stimulate or inhibit lipolytic activity of bacteria. These effects depend on species of bacteria and properties of phytosubstances. Experimental study of regulation of microorganisms lipolytic activity with the phytosubstances shows the usefulness of them in clinical practice as a subsidiary antimicrobial remedies both at the stage of etiotropic treatment and prevention of a number of infectious diseases.

Key words: factors of pathogenicity, lipolytic activity, phytosubstances, inflammatory diseases.

В настоящее время неоспоримым является утверждение, что факторы патогенности и персистенции бактерий приводят к развитию инфекционного процесса, а усиление их продукции - к развитию затяжных и хронических форм заболеваний [1,9,10,11].

Такая особенность изменения биологических свойств микроорганизмов требует от современных препаратов способности не только бактериостатического или бактерицидного действия, но и возможности регулирования биологического потенциала возбудителя [4,5,6,7].

Помимо данных о динамике патогенных и персистент-ных свойств микроорганизмов под действием антимикробных и патогенетических препаратов, в современной литературе приводятся и результаты воздействия фитосубстанций на патогенный потенциал микробов [2,7,8,9].

Установлено, что эфирные масла растений: пименты ветвистой, коричника, гвоздичного дерева, тимьяна обыкновенного, мускатного ореха - значительно снижали продукцию цитолизина (листериолизина О) штаммами Listeria monocytogenes и а-токсина культурами Staphylococcus aureus. Масло гвоздичного дерева также ингибировало активность фосфатидилхолин специфической фосфолипазы С у изоля-тов Listeria monocytogenes. Масла коричника и гвоздичного дерева снижали продукцию стафилококковых энтеротокси-нов А и В, масло пименты - только энтеротоксина А [15].

Челпаченко О.Е. изучила действие настоев и отваров лекарственных трав, рекомендуемых при патологии мочевыде-лительной системы, на маркеры персистенции уроштаммов возбудителей пиелонефрита [13].

Интересным представляется исследование настоев более 30 лекарственных растений на антилизоцимную активность анаэробных и аэробных бактерий, а также грибов рода Candida, высеянных при дисбиозах кишечника. Подавляющее большинство изученных лекарственных растений обладало выраженным однонаправленным ингибирующим действием на антилизоцимную активность энтеробактерий [12].

Таким образом, вопрос изменения биологических свойств микроорганизмов под действием фитообразцов

остается открытым и актуальным, что в последующем должно послужить основой для создания новых антимикробных лекарственных форм.

Цель исследования: изучить модификацию липолитической активности (ЛипА) микроорганизмов, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания под действием фито-субстанций.

Материалы и методы

Материалом для исследования явился 51 штамм бактерий, выделенных из ран при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей (абсцесс, флегмона, панариций, фурункул, карбункул и другие заболевания), а также музейные штаммы.

Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили на автоматическом бактериологическом анализаторе.

Для изучения влияния фитосубстанций на липолитическую активность культивирование бактерий проводили в питательных бульонах с субингибирующими концентрациями субстанций.

Микроорганизмы культивировались в течение 18-24 час. при 37оС. Для исключения вероятности воздействия фито-субстанций на компоненты методик центрифугированием культур в течение 15 мин. при 3000 об/мин. отделяли от клеток надосадочную жидкость, содержащую препараты. К осадку, содержащему живые микроорганизмы, добавляли питательные бульоны, вновь культивировали в вышеописанных режимах и изучали на липолитическую активность.

Перед воздействием субингибирующих концентраций фитосубстанций на микроорганизмы все исследуемые штаммы определялись на липолитическую активность. Штаммы, обладающие этими свойствами, были изучены в экспериментах.

Видовой состав был представлен следующими бактериями: Staphylococcus aureus - 23 штамма; Streptococcus pyogenes - 8 штаммов; Escherichia coli - 11 штаммов; Pseudomonas aeruginosa - 9 штаммов.

Липолитическую активность (ЛипА) определяли чашеч-

ным методом. Состав питательный среды состоял из 10 г бактопептона, 5 г хлорида натрия, 0,1 г хлорида кальция и 15 г агар-агара (на один литр дистиллированной воды). В качестве жирового субстрата использовали Твин-80 (BDMS), который вносили в среду после автоклавирования из расчета 5 мл твина на один литр среды. Полученную среду разливали по стерильным чашкам Петри (20 мл на одну чашку). После подсушивания чашек на поверхность среды «пятачками» наносили исследуемые культуры и инкубировали в термостате при температуре 37±0,1оС в течение 18-24 часов [14].

О наличии липолитической активности штаммов судили по появлению вокруг колонии зон помутнения различного диаметра, за счет образования в агаре нерастворимых соединений жирных кислот с кальцием. У липолитически неактивных микроорганизмов помутнение среды вокруг «пятачка» отсутствовало.

Между исследуемыми культурами проводили сравнение коэффициента, который высчитывался следующим образом: к (ед) = диаметр зоны липолитической активности исследуемого штамма / диаметр зоны выросшей колонии исследуемого штамма.

Данные, полученные в ходе исследований, были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде доверительного интервала (M±m). О значимости различий судили с помощью критерия (t) Стьюдента. Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости р<0,05. Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью пакета прикладных программ StatSoft Statistica v.6.0 и Ехсе1 2000 (MS Office 2000, USA) [3].

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования было установлено, что из всех представленных фитообразцов максимальным снижающим воздействием на ЛипА Staphylococcus aureus (снижение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) обладают: мелиссы настойка, тополя почек настойка, лимонника плодов настойка, эфирное масло аниса, эфирное масло гвоздики, углекислотный экстракт гвоздики и все его фракции.

Особенно следует выделить углекислотный экстракт гвоздики и все его фракции, которые ингибировали признак у 78,26-91,30% штаммов, причем степень подавления ЛипА достигала 95,49%.

Помимо снижения ЛипА Staphylococcus aureus рядом фи-тосубстанций, необходимо отметить, что такие фитообраз-цы, как ивы остролистной экстракт и экстракт элеутерококка жидкий, существенно повышали данный признак. Так, ивы остролистной экстракт стимулировал ЛипА у 91,30% штаммов на 62,33%.

Наиболее сильное подавление ЛипА Streptococcus pyogenes (снижение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) наблюдалось под действием лимонника настойки, лимонника плодов настойки, тополя почек настойки, зверобоя настойки, полыни эстрагон настойки, эфирного масла аниса, гвоздики, углекислотного экстракта гвоздики, аниса и всех четырех фракций углекислотного экстракта гвоздики.

100% частота снижения ЛипА Streptococcus pyogenes отмечалась под действием таких фитосубстанций, как лимонника плодов настойка, тополя почек настойка, прополиса настойка, углекислотного экстракта аниса и гвоздики, а также второй и третьей фракции углекислотного экстракта гвоздики. Интересно отметить, что степень изменения активности варьировалась от 36,84% (прополиса настойка) до 91,43% (тополя почек настойка).

При анализе увеличения ЛипА Streptococcus pyogenes установлено, что данные штаммы увеличивают активность так же, как и Staphylococcus aureus, под действием ивы остро-

листной экстракта (у 87,5% штаммов на 64,21%) и экстракта элеутерококка жидкого (у 100% штаммов на 74,59%).

Данные об изменении ЛипА Escherichia coli свидетельствуют о том, что значительное подавление ЛипА (снижение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) вызывали тополя почек настойка, берёзы настойка, полыни эстрагон настойка, эфирное масло гвоздики, углекислотный экстракт гвоздики и все его фракции. Также важно отметить, что помимо фитосубстанций, снижающих ЛипА, были определены и фитообразцы, повышающие данный признак. Так, под действием ивы остролистной экстракта и родиолы экстракта жидкого у 81,82% и 90,91% штаммов Escherichia coli увеличивалась ЛипА на 58,33% и на 64,82%.

Изменение ЛипА Pseudomonas aeruginosa отмечено как в сторону ингибирования, так и в сторону стимулирования. Так, установлено, что максимальной ингибирующей активностью (снижение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) обладают мелиссы настойка, тополя почек настойка, зверобоя настойка, берёзы настойка, расторопши экстракт жидкий, эфирное масло гвоздики, углекислотный экстракт гвоздики и все его фракции, тогда как стимулирующими свойствами (увеличения признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) обладал только родиолы экстракт жидкий (увеличения признака у 100,00% штаммов на 76,39%).

Таким образом, подводя итог изучению динамики ли-политической активности бактерий, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей фитосубстанци-ями, выявлено, что данные образцы оказывают как стимулирующее, так и ингибирующее влияние на данную активность. Разнонаправленное действие зависит как от видовой принадлежности бактерий, так и от природы фитосубстанций.

Установлено, что из всех представленных фитообраз-цов максимальным снижающим воздействием на ЛипА Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa (снижение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) обладают мелиссы настойка, лимонника настойка, лимонника плодов настойка, тополя почек настойка, зверобоя настойка, полыни эстрагон настойка, настойка берёзы, расторопши экстракт жидкий, эфирное масло аниса, гвоздики, углекислотный экстракт аниса, гвоздики и все его фракции.

В эксперименте также было установлено, что максимальное стимулирование ЛипА у Staphylococcus aureus, Streptococcuspyogenes, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa (увеличение признака у 60-100% исследуемых штаммов на 50% и более) было отмечено под действием только ивы остролистной экстракта (у 87,5% штаммов на 64,21%) и экстракта элеутерококка жидкого (у 100% штаммов на 74,59%).

Экспериментальное изучение регуляции ЛипА микроорганизмов фитосубстанциями, содержащими фенилпро-паноиды и флавоноиды, показывает целесообразность применения данных фитосубстанций в клинической практике в качестве вспомогательных противомикробных средств как на этапе этиотропного лечения, так и для профилактики ряда инфекционных заболеваний.

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Прозрачность исследования. Исследование не имело спонсорской поддержки. Исследователь несёт полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.

Декларация о финансовых и иных взаимодействиях. Автор разрабатывал концепцию и дизайн исследования и готовил рукопись. Окончательная версия рукописи была им одобрена. Автор не получал гонорар за исследование.

Работа поступила в редакцию: 20.06.2015 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Билев А.Е., Золотарев П.Н. Патогенные (гноеродные) кокки: учебное пособие для обучающихся лечебного факультета. - Самара: Медицинский университет «Реавиз», 2015. -60 с.

2. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. и др. Механизмы выживания бактерий. - М.: Медицина, 2005. -367 с.

3. Грошовый Т.А. Маркова Е.В, Головкин В.А. Математическое планирование эксперимента. - Киев: Вища школа, 1992. - 185 с.

4. Жестков А.В., Мизина П.Г., Куркин В.А. и др. Антимикробная лекарственная мембрана / Патент РФ № 66198 на полезную модель от 10.09.2007 г. (приоритет от 03.04.2007 г.). Бюллетень №25. - 2007 г.

5. Золотарев П.Н. Динамика антибиотикочувствитель-ности микроорганизмов под действием фитосубстанций // Аспирантский вестник Поволжья. - 2007. - Прил. - С.21-25.

6. Золотарев П.Н. Оценка антибактериальной активности лекарственных пленок, содержащих II фракцию углекис-лотного экстракта цветков гвоздики (Caryophyllus aromaticus L.) // Вестник СамГУ Естественнонаучная серия. - 2006. -№9. - С.145-154.

7. Золотарев П.Н., Жестков А.В., Куркин А.В. и др. Динамика гемолитической активности бактерий, вызывающих гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей под действием фитосубстанций // Известия Самарского научного центра Российской академии наук.- 2007. - Т. 2 - С.163-167.

8. ЗыковаЛ.С. Факторы персистенции уропатогенов в диагностике, прогнозировании и лечении пиелонефрита у детей: Автореф. дис. ...д-ра мед. наук. - Оренбург, 1998. - 22 с.

9. Карташова О.Л., Уткина Т.М., Жестков А.В. и др. Влияние фитосубстанций, обладающих антиоксидантной активностью, на персистентные свойства микроорганизмов // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т. 54. №9-10. -С.16-18.

10. Колпакова С.Д., Лавров О.В. Инфекция и иммунитет. -Самара: Содружество плюс, 2001. - 90 с.

11. Суздальцев А.А., Жестков А.В., Роганова И.В. и др. Диагностика и лечение инфекционных заболеваний (стандарты). - Самара: Содружество Плюс, ГОУ ВПО «СамГМУ», 2005. - 114 с.

12. Тарасевич А.В. Регуляция антилизоцимной активности энтеробактерий эндогенными факторами желудочно-кишечного тракта и разработка рациональных подходов к диагностике и коррекции дисбиоза кишечника: Дис. ... канд. мед. наук. - Оренбург. 2004. - 174 с.

13. Челпаченко О.Е. Патогенетическое значение микро-биоциноза кишечника у детей с синдромом дисплазии соединительной ткани и возможные пути коррекции: Дис. ... д-ра мед. наук. - Оренбург, 2003. - 348 с.

14. Slifkin M. Tween 80 capacity test responses of various Candida species // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38. №12. -Р.4626-4628.

15. Smith-Palmer A., Stewartt J., FyfeL. Inhibition oflisteriolysin O and phosphatidylcholine-specific production in Listeria monocytogenes by subinhibitory concentration of plant essential oils // J. Med. Microbiol. - 2002. - Vol. 51. №7. - P.567-574.

REFERENCES

1. Bilev A.E., Zolotarev P.N. Pathogens

2. Buharin O.V., GincburgA.L., Romanova Ju.M., etal. Survival mechanisms of bacteria.- Moscow: Meditsina, 2005. - 367 p.

3. Groshovyj T.A. Markova E.V, Golovkin V.A. Mathematical experiment planning. - Kiev: Vishha shkola, 1992. - 185 p.

4. Zhestkov A.V., Mizina P.G., Kurkin V.A., et al. Antimicrobial drug membrane / Patent RF № 66198 na poleznuju model' ot 10.09.2007 g.

5. Zolotarev P.N. Dynamics of antibiotic microorganisms under the action fitosubstancij // Aspirantskij vestnik Povolzh'ja. - 2007. - Suppl. - P.21-25.

6. Zolotarev P.N. Evaluation of antibacterial activity of medicinal films containing II carbon dioxide fraction extract flowers Pinks

7. Zolotarev P.N., Zhestkov A.V., Kurkin A.V., et al. Dynamics of the hemolytic activity of bacteria causing Pyo-inflammatory diseases of soft tissues under the influence of fitosubstancij // Izvestija Samarskogo nauchnogo centra Rossijskoj Akademii Nauk. - 2007. - Vol. 2. - P.163-167.

8. Zykova L.S. The persistence of uropatogenov factors in the diagnosis, prediction and treatment of pyelonephritis in children:

Thesis DSc

9. Kartashova O.L., Utkina T.M., Zhestkov A.V., et al. Influence of fitosubstancij possessing antioxidant activity, persistent properties of microorganisms // Antibiotiki i himioterapija. -2009. - Vol. 54. №9-10. - P.16-18.

10. Kolpakova S.D., Lavrov O.V. Infection and immunity. -Samara: Sodruzhestvo pljus, 2001. - 90 p.

11. Suzdalcev A.A., Zhestkov A.V., Roganova I.V., et al. Diagnosis and treatment of infectious diseases

12. Tarasevich A.V. Regulation of antilizocimnoj activity of enterobacteria endogenous factors of the gastrointestinal tract and the development of sustainable approaches to diagnostics and correction of disbiosis intestines: Thesis PhD

13. Chelpachenko O.E. Pathogenetic significance of microbiocinosis bowel syndrome in children with syndrome of connective tissue dysplasia and ways of correction: Thesis DSc

14. Slifkin M. Tween 80 capacity test responses of various Candida species // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38. №12. -P.4626-4628.

15. Smith-Palmer A., Stewartt J., Fyfe L. Inhibition of listeriolysin O and phosphatidylcholine-specific production in Listeria monocytogenes by subinhibitory concentration of plant essential oils // J. Med. Microbiol. - 2002. - Vol. 51. №7. - P.567-574.

Информация об авторе:

Золотарев Павел Николаевич - к.м.н., доцент кафедры морфологии и патологии ЧУООВО «Медицинский университет «РЕАВИЗ», 443001, г. Самара, ул. Чапаевская, 227, e-mail: zolotareff@list.ru.

Information About the Author:

Zolotarev Pavel Nikolaevich - candidate of science, Associate Professor of Department of Pathology and morphology Medical University "REAVIZ", 227 Chapaevskaya str., Samara, 443001, Russia, e-mail: zolotareff@list.ru

© РАЗУВАЕВА Я.Г., НИКОЛАЕВА С.М., АЮШЕВА В.В., ВЕРЛАН Н.В., УБЕЕВА И.П., ДЫМШЕЕВА Л.Д. - 2015 УДК 615.322

оценка репродуктивной токсичности растительного средства «атерофит»

Янина Геннадьевна Разуваева1,3, Сергей Матвеевич Николаев1,2,3, Виктория Валерьевна Аюшеева1, Надежда Вадимовна Верлан2, Ираида Поликарповна Убеева2,3, Лариса Доржиевна Дымшеева3 ('Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ, директор - д.б.н., проф. Л.Л. Убугунов; 2Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, г. Иркутск, директор -д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра клинической фармакологии, зав. - д.м.н., проф. Н.В. Верлан; 3Бурятский государственный университет, Улан-Удэ, и.о. ректора - д.т.н., проф. Н.И. Мошкин, Медицинский институт,

г. Улан-Удэ, директор - д.м.н., проф. В.Е. Хитрихеев)

Резюме. В рамках исследования возможного негативного влияния комплексного средства «Атерофит» на репро-

132