СПОСОБ ОЧИСТКИ БЕЛКА ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ VIII  И СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКА  ФАКТОРА VIII
METHOD OF PURIFYING COAGULATION FACTOR VIII PROTEIN AND METHOD OF STABILISING FACTOR VIII PROTEIN

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного белка с использованием мультимодальной смолы или смолы смешанного типа действия, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть. Интерес представляет белок, являющийся фактором свертывания, особенно в отношении очистки композиций, содержащих рекомбинантный Фактор VIII.
Предшествующий уровень техники
Человеческий Фактор VIII, известный также как антигемофильный фактор или FVIIIrC, представляет собой человеческий плазменный белок, состоящий из двух полипептидов, где молекулярный вес легкой цепи составляет 80000 дальтон, а молекулярный вес тяжелой цепи варьируется от 90000 до 220000. Его считают одним из ключевых кофакторов в каскаде свертывания крови, необходимых для превращения Фактора X в его активную форму, Фактор Ха. Фактор VIII циркулирует в плазме в виде нековалентного комплекса с Фактором фон Виллебранда (известным также как FVIII:RP). Причиной гемофилии, болезни кровотечений, является анормальный уровень Фактора VIII. Уровень Фактора VIII ниже 20% от нормы может вызвать гемофильное состояние у человека. Падение уровня Фактора VIII ниже 1% ведет к серьезному заболеванию, связанному с кровотечениями, при котором наиболее распространенным симптомом являются спонтанные кровоизлияния в суставы.
Структура и биохимия рекомбинантного фактора VIII была описана ранее.
Традиционно для выделения и очистки Фактора VIII применялись исходные материалы, полученные из плазмы (криопреципитат). Способы очистки из исходных материалов, полученных из плазмы, включают такие, в которых применеяют иммуноаффинную очистку с использованием поликлональных и моноклональных антител для очистки FVIII. Однако бывают случаи, когда эффлюент Фактора VIII содержит некоторое количество остаточных антител из-за утечки с матрицы (подложки), что может привести к антигенности в ходе конечного применения, т.е. при введении в организм человека или животного.
Для очистки фактора VIII из плазмы применялись также способы, в которых используют ионообменную хроматографию, например, на гранулах агарозы. Однако такие способы нередко имеют тот недостаток, что получаемый FVIII:C содержит определенный уровень загрязнений.
Тем не менее, очистка Фактора VIII из рекомбинантных источников, полученных с помощью генной инженерии, приобрела большое значение за последнее десятилетие. Извлечение и концентрирование белка конечного продукта имеет наибольшую важность при выделении рекомбинантных белков. Загрязняющие вещества в белке, полученном рекомбинантным способом, могут включать секретируемые в культуральной среде белки, компоненты среды, клеточные лизаты, нежелательные белки, продуцируемые клетками, и нуклеиновые кислоты.

При очистке рекомбинантного белка часто обнаруживают, что водные исходные материалы, в которых находятся интересующие полипептиды, загрязнены одним или более вирусом. Способы инактивации вирусов в полипептидных смесях известны в данной области - например, это химические методы, где применяется растворитель/растворы детергента, методы облучения или термические методы, но попытки комбинировать их с известными способами очистки полипептидов приводили к способам, имеющим множество стадий, непригодным для крупномасштабного производства. Важно также принимать меры предосторожности, чтобы используемые для инактивации вирусов агенты не были денатурирующими по отношению к белку или трудно отделимыми от интересующего белка. Если же такие агенты были денатурирующими илиих было трудно отделить от интересующего полипептида, то они требовали специальной обработки или стадии разделения. Другие традиционные способы обработки содержащих полипептид образцов на предмет возможных вирусных загрязнений, такие как нагревание или облучение, приводили и к значительной денатурации интересующего полпептида, и/или к недостаточной инактивации вирусов. Многие из коммерчески доступных препаратов рекомбинантного Фактора VIII (Advate, Helixate, Kogenate FS, ReFacto) изготовлены с применением иммуноаффинной хроматографии, включающей детергент для очистки и инактивации вирусов.
В сфере очистки терапевтических белков, полученных с помощью технологии рекомбинантной ДНК, хорошо известно, что серьезные проблемы возникают при попытке снизить содержание ДНК и белков клеток хозяина (НСР, Host Cell Protein) до желаемого очень низкого уровня.
Нордфанг и соавт.(Nordfang et al., Thrombosis and Haemostasis 58(4), 1043-1048 (1987)) описывают разделение с применением смолы с иммобилизованными антителами и буфера, содержащего 50% этиленгликоля и соль в высокой концентрации.
Очистку рекомбинантного белка, экспрессируемого в системе клеток млекопитающих, обычно проводят в несколько стадий. Различные стадии, как правило, подразделяются на стадии улавливания, промежуточные и доочистки. Стадия улавливания имеет двойную задачу: а) получить целевой белок в форме стабильного раствора и б) сократить объем (т.е. получить раствор концентрированный в смысле содержания белка, по сравнению с раствором, наносимым на колонку («загрузка»).
Последняя стадия (уменьшение объема) является критической для того, чтобы облегчить проведение последующих стадий очистки. Стадию улавливания обычно осуществляют, применяя хроматографию с ионообменной смолой. Недостаток применения ионообменной хроматографии заключается в том, что требуется доводить электропроводность и/или рН загрузки (наносимого раствора). Доведение электропроводности, в большинстве случаев - в сторону уменьшения, осуществляют путем добавления воды, что увеличивает объем исходного материала и делает его непригодным для последующих стадий и в целом неудобным для производственных целей. Кроме того, доведение рН часто приводит к образованию агрегатов, которые могут помешать при осуществлении стадий очистки.
После стадии улавливания может следовать промежуточная стадия очистки, в ходе которой удаляется большая часть значительных загрязнений, включая ДНК, вирусы и эндотоксины. Эти загрязнения могут быть также удалены (или их содержание снижено) на стадии улавливания. Стадия доочистки относится к окончательной стадии очистки, в ходе которой удаляют следовые количества загрязняющих веществ и примесей, а на выходе получают активный биологический продукт. Загрязняющие вещества, удаляемые в ходе доочистки, часто представляют собой конформеры целевой молекулы или предполагаемые продукты утечки.
В данной области до сих пор существует потребность в улучшенных способах очистки, которые являются быстрыми и эффективными и при которых активность Фактора VIII в существенной степени сохраняется.
Способ по настоящему изобретению является более выигрышным, поскольку он в ходе единственной стадии обеспечивает сокращение объема и значительное увеличение специфической активности. Таким образом, этот способ в одном этапе совмещает стадии улавливания и очистки.
Настоящее изобретение также предоставляет эффективный способ получения высококонцентрированного и очень чистого раствора рекомбинантного Фактора VIII, где белок Фактора VIII стабилизирован по отношению к деградации. Настоящее изобретение позволяет объединить стадии улавливания и очистки без риска серьезной дестабилизации молекул Фактора VIII и, в ходе единственной стадии, осуществить начальную очистку исходного образца, осуществить значительное сокращение объема (облегчая при этом дальнейшие стадии очистки), а также получить значительный коэффициент очистки (увеличение специфической активности FVIII) и получить конечный раствор (улавливающий пул, "capture pool"), в котором белок стабилизирован по отношению к деградации.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к новому и эффективному способу очистки рекомбинантных белков, главным образом, фактора свертывания VIII. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что применение мультимодальных (multimodal) колонок для улавливания молекул фактора VIII из культуральной жидкости клеток млекопитающих является удивительно быстрым и эффективным способом очистки для удаления загрязняющих веществ из белка FVIII, полученного в культуре, без потери активности белка.
В одном из аспектов изобретение предоставляет способ очистки белка Фактора свертывания VIII, содержащего одно или более загрязняющих веществ, включающий стадии, на которых:
(a) приводят в контакт белок Фактора VIII с мультимодальной смолой, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть;
(b) элюируют указанный белок Фактора VIII с помощью элюирующего буфера, содержащего по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, а также ионы кальция.
В других воплощениях этот способ включает также стадию (с), где собирают содержащий Фактор VIII раствор, получаемый в ходе стадии (b); и/или способ включает также стадию (а1), где через колонку после стадии (а) и перед стадией (b) пропускают один или более промывочный буфер(ы).
4
4
2
4
3
2
4
В различных его воплощениях один (или более) указанный буфер(ы) содержит от 10 мМ до 1000 мМ соли и/или элюирующий буфер на стадии (b) содержит по меньшей мере 2 М соли и по меньшей мере 45% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, например: 2,3-2,6 М соли и 48-52% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси; и/или соль в составе элюирующего буфера на стадии (b) представляет собой, по выбору: NaCl, NHCl, KCl, (NH)SO, CHCONH или комбинацию двух или более из этих солей.
В другом аспекте изобретение предоставляет одностадийный способ очистки белка Фактора VIII, содержащего одно или более загрязняющих веществ, включающий стадии:
a) приведение в контакт белка с мультимодальной смолой, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть;
b) элюирование указанного белка с помощью элюирующего буфера, содержащего по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, а также ионы кальция; причем с помощью указанного способа достигается примерно 250-кратное сокращение объема колонки.
В другом аспекте изобретение предоставляет одностадийный способ очистки белка Фактора VIII, содержащего одно (или более) загрязняющее вещество, включающий стадии:
a) приведение в контакт белка с мультимодальной смолой, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть;
b) элюирование указанного белка с помощью элюирующего буфера, содержащего по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, а также ионы кальция; причем с помощью указанного способа достигается примерно 30-кратный «коэффициент очистки».
В еще одном аспекте изобретение предоставляет способ стабилизации белка Фактора VIII, включающий стадии:
a) приведение в контакт белка с мультимодальной смолой, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть;
b) элюирование указанного белка с помощью элюирующего буфера, содержащего по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, а также ионы кальция.
Краткое описание графических материалов
На Фиг.1А представлена хроматограмма, где показаны УФ-абсорбция при 280 нм, электропроводность и рН в ходе очистки на стадиях уравновешивания, загрузки, промывки и элюирования.
На Фиг.2 представлен результат SDS-электрофореза в геле, окрашенном серебром, который наглядно представляет степень очистки, достигаемую при использовании колонки Capto ММС на стадиях очистки: загрузки, смывания (FT, flow through) и элюирования. Дорожка 1: стандарт молекулярных весов (MW); дорожка 2: клеточная культуральная среда; дорожка 3: Пусто; дорожка 4: Смыв (не связавшийся материал) с колонки Capto ММС; дорожка 5: Пусто; дорожка 6: Улавливающий пул (белковый материал, связавшийся и элюированный с колонки Capto ММС).
4
На Фиг.3 представлена гистограмма, показывающая выход в процентах рекомбинантного Фактора VIII, очищенного с применением смолы Capto ММС с помощью различных элюирующих буферов, содержащих различные концентрации NaCl или NHCl и этиленгликоля.
На Фиг.4 показано влияние повторных циклов заморозки/оттаивания на стабильность Фактора VIII в улавливающем пуле.
Описание изобретения
Настоящий способ очистки фактора свертывания VIII осуществляют с применением мультимодальной (multimodal) хроматографии, где используются смолы, являющиеся одновременно гидрофобными и отрицательно заряженными. Раствор белка, подлежащий очистке, например, содержащий белок супернатант, полученный при культивировании клеток млекопитающих, обрабатывают с помощью мультимодальной смолы путем пропускания раствора через хроматографическую колонку, содержащую указанную смолу. Данный раствор (загрузка) обычно фильтруют (например, с помощью тупиковой (dead-end) или динамической (cross flow) фильтрации) и/или центрифугируют для того, чтобы удалить клетки и частицы до загрузки на смолу. Стадия загрузки не требует доведения рН или электропроводности. После стадии загрузки колонку, как правило, промывают с помощью одного или нескольких промывочных буферов, один из которых содержит соль в высокой концентрации. В одном воплощении колонку после стадии загрузки промывают уравновешивающим буфером, с последующей возможной промывкой вторым буфером с высокой концентрацией соли.
Для извлечения адсорбировавшихся веществ проводят элюирование путем пропускания через колонку элюирующего буфера, включающего соль в высокой концентрации и органический растворитель.
Изобретение обеспечивает примерно 250-кратное сокращение объема колонки (CV), по сравнению с (и рассчитанное из) объемом наносимого образца, что является превосходным показателем уменьшения объема. Под «сокращением объема» понимают уменьшение объема содержащего белок элюата по сравнению с объемом содержащего белок наносимого раствора (например, осветленного неочищенного образца, полученного в ходе ферментации).
Способ очистки по изобретению обеспечивает также выход белка 70-100%, а коэффициент очистки (увеличение специфической активности) составляет вплоть до 100 раз. Получаемый очищенный белок стабилен в элюирующем буфере по меньшей мере 2 месяца при -70°С.
Кроме того, способ по изобретению предоставляет стабильный раствор фактора VIII: собранный элюат можно замораживать и оттаивать по меньшей мере 3 раза без существенной потери активности.
В изобретении применяются мультимодальные хроматографические смолы для отделения интересующего белка фактора VIII от загрязняющих веществ. Мультимодальная (multimodal) хроматография, где два или более различных, но действующих совместно сайтов взаимодействуют с целевой молекулой, была определена как подходящий способ для очистки белка фактора VIII. Хроматографическая смола, используемая для очистки рекомбинантного белка в настоящем исследовании, является коммерчески доступной, например: Capto ММС™ (GE Healthcare) или MBI HyperCel™ (Pall, ранее BioSepra).
Смола Capto ММС содержит лиганд с мультимодальной функциональностью, которая обеспечивает иную селективность, по сравнению с традиционными ионообменниками, а также обеспечивает возможность связывания белков при концентрациях соли от 0,5 М до 1,0 М. Здесь лиганд проявляет различные функциональности для взаимодействия с целевой молекулой и, таким образом, обеспечивает ионное взаимодействие, водородную связь и гидрофобное взаимодействие. В одном из воплощений изобретения в качестве мультимодальной смолы применяется Capto ММС™.
3-
MBI HyperCel™ (Pall) - еще один вид мультимодальной (multimodal) хроматографии, которая эффективна для преодоления трудностей, связанных со стабильностью и утечкой лиганда с аффинных колонок, содержащих иммобилизованный белок. В частности, MBI HypercelR™ (Pall), адсорбент, который включает лиганды меркапто-бензимидазол-сульфоновой кислоты, обеспечивает как гидрофобные, так и ионные взаимодействия с конкретным белком. Предполагается, что гидрофобные взаимодействия осуществляются за счет системы ароматического кольца, тогда как ионные взаимодействия следует отнести на счет заместителя SO, который, как известно, является сильным катионообменником. Кроме того, атомы азота в ароматической системе лиганда MBI могут при определенных условиях нести заряд, и, следовательно, могут обеспечивать ионные взаимодействия с отрицательно заряженными группами.
В предпочтительном воплощении загрязняющие вещества адсорбируются на мультимодальных лигандах, и в ходе последующего элюирования можно получить фракцию фактора свертывания VIII с высокой степенью чистоты. Стадия улавливания обеспечивает коэффициент очистки (увеличение специфической активности), равный по меньшей мере 80, например от 80 до 100, от 90 до 100 или 100-160.
Получаемый улавливающий пул включает белок фактора VIII, который имеет чистоту по меньшей мере равную 10%, например, по меньшей мере 20% или примерно от 30% до 60%, например от 30% до 50%. Чистота определяется как доля белка фактора VIII в % (вес/вес) (например, определенная в ходе ELISA) от общего количества белка.
В одном воплощении настоящего способа раствор, наносимый на мультимодальную хроматографическую смолу, представляет собой содержащую фактор VIII среду, полученную при культивировании клеток млекопитающих. В одном из таких воплощений, указанную культуральную среду фильтруют и/или центрифугируют для удаления клеток и частиц; в другом воплощении культуральную среду вносят в смолу без какого-либо доведения рН или электропроводности наносимого раствора.
Настоящее изобретение охватывает, в частности, способ, где стадия загрузки включает загрузку содержащего белок загрузочного раствора в смолу при рН и электропроводности, равных таковым в содержащей фактор VIII среде, полученной при культивировании клеток млекопитающих, например, в фильтрованной среде.
Это обеспечивает больший выигрыш на начальной стадии улавливания за счет исключения того объема, который иначе был бы необходим для доведения (снижения) проводимости загрузочного раствора.
В одном воплощении содержащую Фактор VIII культуральную среду стабилизируют путем добавления имидазола (например, 1-10 ммоль имидазола на л среды). Из-за малого количества и объема добавляемого имидазола, по сравнению с объемом культуральной среды, изменениями в рН и/или электропроводности можно пренебречь. В еще одном воплощении, культуральную среду далее (i) фильтруют и/или центрифугируют для удаления клеток и частиц и (ii) вносят в смолу без дополнительного внесения химических веществ.
Способ по изобретению обычно осуществляют в несколько стадий: уравновешивание колонки, загрузку и элюирование. Могут быть включены одна или более стадия промывки после загрузки и перед элюированием. Стадию(ии) промывки обычно проводят с использованием по меньшей мере одного буфера, содержащего соль в высокой концентрации. В одном воплощении на стадии промывки используют буфер, содержащий от 10 мМ до 1000 мМ соль, например, 100-1000 мМ, или 250-1000 мМ, или 500-1000 мМ, или 500-800 мМ соль. В другом воплощении способ включает стадию промывки, где после стадии загрузки колонку сначала промывают уравновешивающим буфером, а затем промывают вторым промывочным буфером, содержащим соль в высокой концентрации.
2
В одном воплощении уравновешивающий буфер включает буферный агент (такой как, например, имидазол в диапазоне от 5 мМ до 100 мМ, например, 20 мМ имидазол), соль Са (от 1 мМ до 100 мМ, например, 10 мМ CaCl), детергент (такой как, например, Tween™ 80 в диапазоне от 0,001% до 0,1%, например, 0,02% (вес/объем) Tween™ 80) и соль (от 10 мМ до 1000 мМ, например, 50 мМ NaCl). Значение рН уравновешивающего буфера поддерживают в переделах от 6,0 до 8,0; желательно значение рН держать в пределах от 7,3 до 7,5. Специалисту в данной области понятно, что белок фактора VIII, который приведен здесь в качестве примера, стабилен при рН от 6,0 до 8,0, поэтому рН уравновешивающего буфера имеет значение 7,3-7,5, более предпочтительно 7,5.
2
В одном воплощении промывочный буфер включает буферный агент (такой как, например, имидазол в диапазоне от 5 мМ до 100 мМ, например, 20 мМ имидазол), соль Са (от 1 мМ до 100 мМ, например, 10 мМ CaCl), детергент (такой как, например, Tween™ 80 в диапазоне от 0,001% до 0,1%, например, 0,02% (вес/объем) Tween™ 80) и соль (например, NaCl в диапазоне от 50 мМ до 1000 мМ).
2
Стадию элюирования проводят с помощью элюирующего буфера, содержащего по меньшей мере 1,5 М соли и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, а также ионы кальция (от 1 мМ до 100 мМ, например, 10 мМ CaCl). Элюирующий буфер имеет рН от 6,0 до 8,0; желательно выдерживать значение рН в пределах от 7,3 до 7,5. Для поддержания желаемого значения рН в элюирующий буфер включают также буферный агент.
Понятие "буферный агент" охватывает такие реагенты, которые способны поддерживать рН раствора в желаемых границах - применительно к данному изобретению, в пределах от 6,0 до 8,0, например, от 7,3 до 7,5. Диапазон концентраций буфера выбирают таким образом, чтобы он поддерживал желаемое значение рН раствора. Буферный агент может представлять собой также смесь по меньшей мере двух буферных агентов, причем смесь способна обеспечивать значение рН в заданном интервале.
Буферные агенты могут включать (но не ограничиваться ими) цитрат (натрия или калия), ацетат (аммония, натрия или кальция), гистидин (L-гистидин), фосфат (натрия или калия), винную кислоту, янтарную кислоту, MES, HEPES, имидазол, Трис, этаноламин или смесь двух или более названных веществ. В одном воплощении используемым буферным агентом является имидазол в интервале концентраций от 5 мМ до 100 мМ.
4
4
2
4
3
2
4
4
4
Предпочтительными солями являются NaCl, NHCl, KCl, (NH)SO, CHCONH (ацетат аммония, NHAC) или смесь двух или более указанных солей. В одном воплощении элюирующий буфер содержит примерно 2,5 М соль и по меньшей мере 40% гликоль; в другом воплощении элюирующий буфер содержит примерно 2,5 М соль и примерно 50% гликоль. В одном воплощении солью является NaCl; в другом солью является NHCl. В одном воплощении гликоль - это этиленгликоль; в другом гликоль - это пропиленгликоль. В еще одном воплощении элюирующий буфер включает NaCl и этиленгликоль.
2
В другом воплощении для элюирования белка используется также NH4CI в концентрации 2,5 М с этиленгликолем. В еще одном воплощении элюирующий буфер содержит также детергент. В конкретном воплощении данного способа, элюент представляет собой 20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, 0,02% (объем/объем) Tween 80, 2,5 М NaCl и 8 М этиленгликоля при рН 7,5.
2
4
В другом воплощении для очистки Фактора VIII применяют смолу MBI HyperCel™. В одном воплощении связывание рекомбинантного Фактора VIII с использованием колонки MBI HyperCel™ проводят после добавления 100 мМ NaSO к культуральной среде, а элюирование осуществляют с помощью 1 М NaCl и 5 М глицерина.
В конкретном воплощении изобретения способ включает следующие стадии:
a) приведение в контакт фактора VIII с мультимодальной смолой, содержащей лиганды, которые включают гидрофобную часть и отрицательно заряженную часть;
2
2
b) пропускание через колонку уравновешивающего буфера, содержащего 20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, 0,02% (вес/объем) Tween 80 и 50 мМ NaCl и промывочного буфера, содержащего 20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, 0,02% (вес/объем) Tween 80 и 1,5 М NaCl;
2
с) элюирование указанного белка с помощью элюирующего буфера, содержащего 20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, 0,02% (объем/объем) Tween 80, 2,5 М NaCl и 8 М этиленгликоля.
На первой стадии очистки рекомбинантного белка, экспрессируемого в клетках млекопитающих, в большинстве стандартных случаев имеют дело с большими объемами при загрузке. Для коммерческой очистки белка важно сократить объем до такого уровня, чтобы с ним было удобно оперировать. Кроме того, стадия очистки должна иметь значительный выход, чтобы сделать процесс экономичным для коммерческих или иных целей. На первой стадии очистки белка обычно стремятся достичь от 20 до 100-кратного сокращения объема, причем последнее значение считается хорошим сокращением объема.
В одном воплощении загружаемый объем, в котором содержится очищаемый белок, составляет порядка 500 объемов колонки (CV). При элюировании белка достигается более чем 100-кратное сокращение конечного объема. Настоящее изобретение имеет дела с объемами для загрузки порядка 50-600 CV. Сокращение объема предпочтительно составляет 100-300 раз. В одном воплощении наносимый объем составляет около 500 CV или около 450-600 CV, а белок Фактора VIII элюируется в объеме порядка 2CV, что составляет примерно 250-кратное сокращение объема.
В другом воплощении стадию улавливания можно комбинировать с одним или более агентом, инактивирующим вирусы, таким как, например Triton Х-100 (например, в концентрации около 1% (вес/объем)). Агент, инактивирующий вирусы, можно добавлять, например, к одному или более из используемых буферов.
Скорости потока устанавливают в интервале 300-950 см/ч на всех стадиях очистки, за исключением стадий элюирования и «очистки на месте» (CIP, clean-in-place), где скорости потока находятся в интервале 30-350 см/ч. В одном воплощении скорость потока при загрузке составляет 450 см/ч; во время элюирования и CIP скорость потока уменьшают до 30 см/ч. В одном воплощении изобретения скорость потока при загрузке составляет около 450-600 см/ч.
В одном из аспектов изобретение также касается образца, включающего:
(i) белок Фактора VIII; и (ii) буфер, содержащий по меньшей мере 1,5 М соль и по меньшей мере 40% (вес/объем) этиленгликоля, пропиленгликоля или их смесь, а также ионы кальция;
где Фактор VIII имеет чистоту от 30% до 60%.
Определения
В настоящем изобретении подразумевается, что "белок Фактора VIII" включает полноразмерный фактор VIII, FVIII:C, а также делеционные производные полноразмерного фактора VIII, имеющие свертывающую активность. Под делеционными производными понимают фактор VIII, где весь В-домен или его часть отсутствует, в то время как свертывающая активность сохраняется. Подобные формы Фактора VIII с делецией В-домена описаны, например, в WO 91/09122. Структура и биохимия Фактора VIII в целом была описана Кауфманом (Kaufman, Trends in Biotechnology, 9, p.353-359 (1991); Hematology, 63, p.155-165 (1991)). Сюда входят также варианты последовательностей и производные фактора VIII, в том числе ПЭГ-илированные, ацилированные и полисиалированные формы фактора VIII, сохраняющие характерную биологическую активность фактора VIII. Фактор VIII может быть получен рекомбинантным способом. В одном воплощении фактор VIII есть рекомбинантно полученный фактор VIII. В одном воплощении Фактор VIII есть полноразмерный Фактор VIII; в другом воплощении Фактор VIII есть Фактор VIII с делецией В-домена. В еще одном воплощении Фактор VIII есть ПЭГ-илированный, ацилированный или полисиалированный Фактор VIII.
Концентраты Фактора VIII, полученные из человеческой плазмы, содержат несколько фрагментированных, полностью активных форм Фактора VIII, как описывают Андерсон и соавт.(Andersson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p.2979-2983 (1986)). Самая маленькая активная форма имеет молекулярный вес 170 кДа и состоит из двух цепей 90 кДа и 80 кДа, скрепленных между собой ионом(ами) металла (см., например, ЕР 197901). Подобные фрагменты Фактора VIII также включены сюда - очистка таких фрагментов представляет одно из воплощений настоящего изобретения.
Биологическую активность Фактора VIII определяли, например, как описано в Экспериментальной части (см. ниже).
Термин "элюент" употребляется в его традиционном значении, как его определяют в данной области, и означает буфер или буферы с рН и/или ионной силой, подходящими для высвобождения одного или более белков или соединений с разделяющей матрицы.
Используемый здесь термин «соль» на стадии элюирования относится к соли щелочно-земельного или щелочного метала, или аммония, т.е. это соль, имеющая катион элементов щелочно-земельного или щелочного металла или катион аммония, а также имеющая неорганический или органический (основанный на углеводороде) анион. Примеры таких солей включают: хлорид натрия, хлорид аммония, цитрат натрия, цитрат калия, хлорид калия, хлорид магния, хлорид кальция, фосфат натрия, фосфат кальция, фосфат аммония, фосфат магния, фосфат калия, сульфат натрия, сульфат аммония, сульфат калия, сульфат магния, сульфат кальция и т.д. Соли, которые предпочтительны здесь - это хлориды или сульфаты. Наиболее предпочтительной здесь солью является хлорид натрия.
Термин "мультимодальный хроматографический лиганд" относится к лиганду, способному предоставлять два различных, но действующих совместно сайта, взаимодействующих с белком, который нужно связать. Один из сайтов обеспечивает взаимодействие «заряд-заряд» по типу притяжения между лигандом и интересующим соединением. Другой сайт, как правило, обеспечивает донорно-акцепторное взаимодействие и/или гидрофобное и/или гидрофильное взаимодействие. Настоящее изобретение направлено в особенности на гидрофобные взаимодействия. Электронные донорно-акцепторные взаимодействия включают такие, как водородная связь, тт-тт взаимодействия, катион-тт взаимодействия, перенос заряда, диполь-диполь, индуцированный диполь и т.п. Мультимодальные хроматографические лиганды (multi-modal chromatography ligand), как используется здесь или где-либо еще, известны также как хроматографические лиганды смешанного типа действия ("mixed mode" chromatography ligand).
Термин "стадия улавливания" относится, в контексте жидкостной хроматографии, к начальной стадии процедуры разделения. В наиболее общем случае стадия улавливания включает осветление, концентрирование, стабилизацию и значительную очистку от растворимых загрязняющих веществ. За стадией улавливания может следовать промежуточная стадия очистки, в ходе которой удаляется большинство значительных загрязнений, включая ДНК, вирусы и эндотоксины. Эти загрязнения также могут быть удалены (или их содержание уменьшено) в ходе улавливания.
Термин "стадия доочистки" относится к финальной стадии очистки, в ходе которой удаляются следовые количества примесей и загрязняющих веществ, а на выходе получают активный биологический продукт. Загрязняющие вещества, удаляемые в ходе стадии доочистки, часто являются конформерами целевой молекулы или ожидаемыми продуктами утечки.
Термин "объем колонки", как известно в сфере хроматографии, относится к геометрическому объему части трубки, которая содержит упакованный материал. В отношении настоящего изобретения, загружаемый объем составляет около 50 объемов колонки (CV) или более, или же менее 300-600 CV или 450-600 CV. Белок, элюируемый на конечной стадии очистки, содержится приблизительно в 2-5 CV, что составляет сокращение объема примерно от 100 до 350 раз, например, в 250 раз.
"Коэффициент очистки" определяется как увеличение специфической активности: это величина, выраженная в Ед/мг белка, до стадии очистки, по сравнению к таковой в Ед/мг белка после стадии очистки.

Специфическую активность фактора свертывания VIII можно измерить с помощью коммерчески доступных наборов для анализа активности, например, с помощью CoaTest Chromogenix™ (Instrumentation Laboratory, Бельгия) согласно инструкции производителя или как описано ниже в Экспериментальной части.
Термин "одностадийный метод" относится к способу очистки белка Фактора VIII, содержащего одно или более загрязняющих веществ, с помощью которого достигается как сокращение объема, так и возрастание специфической активности (коэффициент очистки >1).
В одном воплощении настоящего изобретения данный способ обеспечивает (i) сокращение объема колонки примерно в 250 раз и (ii) "коэффициент очистки" по меньшей мере равный 30.
Изобретение становится более понятным, если обратиться к следующим примерам. Однако не следует истолковывать эти примеры как ограничивающие данное изобретение.
Примеры
Структура и биохимия рекомбинантного фактора VIII были описаны ранее (см., например, Trends in Biotechnol. 1991, 9:353-359, Transfus. Med. Rev. 1992, 6:235-246).
Кроме того, в данной области были описаны как выделение фактора VIII, так и рекомбинантная продукция фактора VIII (полноразмерной формы и его вариантов/укороченных форм).
Технология рекомбинантой ДНК позволила конструировать плазмиды, которые управляют экспрессией гибридных продуктов белка Фактора VIII в трансфицированных клетках млекопитающих. О рекомбинантной продукции Фактора VIII в культуре клеток сообщали Вуд и соавт.(Wood et al, см. Nature, 1984, 312:330-337). Активные варианты и аналоги белка и кодирующие их последовательности ДНК Фактора VIII также были описаны (US 4868112, ЕР 0786474, WO 86/06101, and WO 87/07144). Различные манипуляции с генетическими последовательностями показали, что В-домен Фактора VIII не является критичным для его прокоагуляционной активности, и может быть экспрессирован активный прокоагуляционный белок при экспрессии нуклеотидного участка, кодирующего Фактор VIII, в котором отсутствует В-домен. Важные модификации в подобных вариантах и аналогах включают такие, где отсутствует весь В-домен или его часть и/или модифицированы специфические позиции аминокислот: например, те, что обычно являются лабильными по отношению к протеазам сайтами, становятся устойчивыми к протеолизу, например, с помощью тромбина или активированного протеина С.Другие аналоги включают модификацию на одном или более остатках лизина и/или тирозина. Укороченная форма белка представляет собой гликопротеин массой 170 кДа, состоящий из 1438 аминокислот.Этот белок с делецией В-домена представляет посттрансляционную модификацию Фактора VIII плазменного происхождения, и его антигемолитическая активность сравнима с таковой у родительской молекулы.
Анализ активности Фактора VIII
Методы анализа, позволяющие оценить биологическую активность фактора VIII, хорошо известны квалифицированному специалисту, и подобные наборы для анализа коммерчески доступны у ряда производителей.

Активность очищенного Фактора VIII можно анализировать, например, с помощью набора CoaTest Chromogenix™ (Instrumentation Laboratory, Бельгия), согласно инструкциям производителя.
Пример 1.
Рекомбинантная продукция Фактора VIII хорошо известна в данной области; можно сослаться, например, на US 5633150 (Genentech) и US 7138505 (Novo Nordisk/Novartis).
Рекомбинантный Фактор VIII был экспрессирован в клетках СНО в коммерчески доступной бессывороточной среде. Содержащая белок культуральная среда, полученная в ходе ферментации, была далее использована для очистки.
Пример 2. Очистка рекомбинантного Фактора VIII
Для очистки рекомбинантного белка использовали смолу Capto ММС (GE Healthcare, Уппсала, Швеция). Колонку упаковывали так, чтобы высота наполнителя составляла 12 см, а его объем - 24 мл.
2
2
В качестве первой стадии процесс очистки включал загрузку, где культуральную среду, полученную с помощью ферментации, наносили на колонку. Колоночный объем (CV) для загрузки составил 450 CV (Таблица 1). После этого через колонку пропускали уравновешивающий буфер, содержащий 20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, 0,02% (объем/объем) Tween 80 и 50 мМ NaCl. рН уравновешивающего буфера доводили до 7,5. Далее колонку промывали с помощью промывочного буфера (20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, 0,02% (объем/объем) Tween 80 и 1,5 М NaCl) при рН, равном рН уравновешивающего буфера, т.е. 7,5. Колоночные объемы стадий уравновешивания и промывки составили 3 CV (Таблица 1).
Таблица 1
Колоночные объемы (CV), использованные на разных стадиях очистки Фактора VIII
Стадия
Буфер
Колоночный объем
Уравновешивание
Уравновешивающий буфер
3
Загрузка
Загрузка
450
Промывка 1
Уравновешивающий буфер
3
Промывка 2
Промывочный буфер
3
Элюирование
Элюирующий буфер
5
CIP
CIP
3
2
Элюирование проводили путем пропускания элюирующего буфера через колонку. Элюирующий буфер содержал 20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, 0,02% (объем/объем) Tween 80 и 2,5 М NaCl и 8 М этиленгликоля.
Скорость потока поддерживали на уровне 450 см/ч на каждой стадии очистки, за исключением элюирования и CIP, где скорость потока составляла 30 см/ч.
На Фиг.1 представлена хроматограмма, отображающая УФ-абсорбцию при 280 нм в ходе очистки при уравновешивании, загрузке, промывке и элюировании.
Пример 3.
Анализ активности

Активность очищенного Фактора VIII измеряли модифицированным способом с помощью набора CoaTest SP.

2
Были использованы реагенты и готовые буферные растворы из набора CoaTest SP. Температура всех реагентов была доведена до комнатной перед началом эксперимента. Образцы разбавляли буфером для анализа CoaTest (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 1% BSA, рН 7,3, с консервантом) до приблизительно 2 мЕд/мл. Плазму сравнения разбавляли буфером для анализа до 5-0,5 мЕд/мл. Образцы разбавляли буфером для анализа до 12 и 9 Ед/мл, затем в 10 раз плазмой, лишенной FVIII с VWF (Dade Behring) и, наконец, в 10 и 20 раз буфером для анализа CoaTest (получая по 4 разведения для каждого образца). Образцы, стандарты и буферный отрицательный контроль объемом по 50 мкл наносили в дублях на 96-луночные планшеты для микротитрования (Nunc). Смешивали реагент «фактор IXa/фактор X», фосфолипидный реагент и CaCl из набора CoaTest SP в соотношении 5:1:3 (объем/объем/объем) и добавляли по 75 мкл полученной смеси в лунки. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре добавляли по 50 мкл смеси «субстрат фактора Ха S-2765/ингибитор тромбина 1-2581» и проводили реакцию в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего добавляли по 25 мкл 2% лимонной кислоты. Измеряли абсорбцию при 415 нм на ридере планшетов для микротитрования Spectramax (Molecular Devices), причем в качестве волны сравнения использовали абсорбцию при 620 нм. Значение, полученное для отрицательного контроля, вычитали из значений для всех образцов и калибровочной кривой, построенной методом линейной регрессии величин абсорбции, нанесенных против концентрации FVIII в мЕд/мл.
ELISA
Антиген Фактора VIII определяли с помощью коммерческого ELISA-набора VisuLize Factor VIII Antigen Kit, Lot AG8-0006 (Affinity Biologicals), в основном, как описано производителем.
Рекомбинантный Фактор VIII был очищен из культуральной среды, полученной в ходе ферментации, как описано выше в Примере 2. Коэффициент очистки и выход белка Фактора VIII определяли с помощью СоА и ELISA, как описано выше.
Как видно из приведенных выше результатов, можно сконцентрировать содержащую FVIII среду с 11000 мл до 45 мл (в 244 раза), и в то же время достичь увеличения специфической активности с 55 Ед/мг до 5300 Ед/мг, т.е. получить коэффициент очистки равный 96, определенный при измерении активности.
Как видно из приведенных выше результатов, можно сконцентрировать содержащую FVIII среду с 11000 мл до 45 мл (в 244 раза), и в то же время достичь увеличения специфической активности от 0,0046 мг Фактора VIII/мг общего белка до 0,6 мг Фактора VIII/мг общего белка, т.е. получить коэффициент очистки равный 130, определенный с помощью ELISA.
Пример 4. Белковый гель-электрофорез

SDS-электрофорез в геле проводили с использованием 7% трис-ацетатного геля (NuPage) с трис-ацетатом в качестве подвижного буфера, в основном, как описано производителем (Invitrogen). Вкратце, электрофорез в геле проводили в течение 50 мин при 150 вольт, и окрашивали образцы с помощью набора для окрашивания SilverQuest (Invitrogen), как описано в инструкции производителя. Использованные стандарты молекулярных весов (MW) - Mark 12 (Invitrogen).
Как видно на Фиг.2, результаты показывают чрезвычайно высокую степень обогащения улавливающего пула рекомбинантным Фактором VIII, о чем говорит присутствие интенсивных полос тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) (обозначенных стрелками на Фиг.2).
Пример 5. Очистка, визуализированная с помощью SDS-электрофореза в геле

Образцы белка для электрофореза денатурировали и восстанавливали при 70°С в течение 10 мин в буфере для образцов LDS (Invitrogen), содержащем 50 мМ DTT. Разделяющие гели представляли собой 7% трис-ацетат (ТА) полиакриламидный гель Pre-Cast Novex (Invitrogen), а электрофорез проводили в течение 60 мин при ограничивающем напряжении 150 V и с применением буфера трис-ацетат (Invitrogen) в качестве и анодного, и катодного буфера. Окраску серебром проводили с помощью SilverQuest (Invitrogen) согласно инструкции производителя.
Результаты электрофореза показывают значительную степень очистки, достигнутую благодаря применению колонки Capture ММС.Клеточная среда содержит ряд белков. Значительная часть этих белков проходит сквозь колонку, тогда как Фактор VIII сильно концентрируется в улавливающем пуле с колонки.
Пример 6. Условия элюирования
2
Были опробованы различные условия элюирования для смолы Capto ММС. К культуральной среде, содержащей рекомбинантный Фактор VIII, добавляли глицерин до конечной концентрации 5% и CHAPS до 5 мМ. Проводили уравновешивание с помощью уравновешивающего буфера, содержащего 20 мМ имидазола, 10 мМ CaCl, Tween 80 (0,2% объем/объем), 50 мМ NaCl, 5 мМ CHAPS и 5% глицерина при рН 7,5.
2
4
4
4
4
4
4
4
Были использованы различные элюирующие буферы, содержащие 20 мМ этаноламина, 10 мМ CaCl, Tween 80 (0,2% объем/объем) при рН 8,3, с различными концентрациями соли и этиленгликоля, включая: (а) Без добавления; (b) 1М NHCl; (с) 2,5 М NHCl; (d) ЗМ этиленгликоль; (е) 1М NHCl+3М этиленгликоль; (f) 2,5М NHCl+3М этиленгликоль; (g) 8М этиленгликоль; (h) 1М NHCl+8М этиленгликоль; (i) 2,5М NHCl+8М этиленгликоль; 2,5М NaCl+8М этиленгликоль. Условия элюирования были определены на основании выхода (в процентах). Фиг.3 показывает, что при концентрациях 2,5М NHCl или 2,5М NaCl и 8М этиленгликоля выход белка был максимальным (Фиг.3).
Пример 7. Устойчивость улавливающего пула к заморозке/оттаиванию

Аликвоты улавливающего пула, элюированного со смолы Capto ММС, как описано в Примере 2, подвергали нескольким циклам заморозки/оттаивания, при этом заморозку проводили в течение ночи при - 80°С с последующим оттаиванием при 4°С на следующий день. В конце эксперимента измеряли активность Фактора VIII сразу во всех образцах в ходе СоА-анализа (CoaTest Chromogenix™, как описано в Примере 3).
Таблица 4
Специфическая активность Фактора VIII в улавливающем пуле после повторных циклов заморозки/оттаивания
Цикл заморозки / оттаивания 0
Цикл заморозки / оттаивания 1
Цикл заморозки / оттаивания 2
Цикл заморозки / оттаивания 3
Активность FVIII (мЕд/мл)
2
2,2
1,9
2,3