ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT AND/OR PREVENTION OF MALIGNANT TUMORS

Область техники
[0001]
Настоящее изобретение относится к новому медицинскому использованию антител к MCEMP1 или их фрагментов, например, в качестве терапевтических и/или профилактических средств для злокачественной опухоли.
Уровень техники
[0002]
В последние годы появились различные антительные лекарственные средства для лечения злокачественных опухолей, которые направлены на антигенные белки на клетках злокачественной опухоли. Антительные лекарственные средства, используемые в качестве специфичных терапевтических средств злокачественных опухолей, проявляют лекарственный эффект в определенной степени, и, таким образом, они привлекают внимание. Однако многие целевые антигенные белки также экспрессированы на многих нормальных клетках. В результате введения антител можно повреждать не только клетки злокачественной опухоли, но также нормальные клетки, на которых экспрессирован целевой антиген, тем самым вызывая побочный эффект, который становится проблемой. Таким образом, ожидают, что, если становится возможным идентифицировать антигены, злокачественной опухоли, которые специфически экспрессированы на поверхности клетки злокачественной опухоли, и использовать антитела, направленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, то можно реализовать лечение антительными лекарственными средствами, которые вызывают меньшие побочные эффекты.
[0003]
Сообщалось о том, что экспрессированный на тучных клетках мембранный белок 1 (MCEMP1), трансмембранный белок 2 типа, экспрессирован на клеточных мембранах таким образом, который специфичен для тучных клеток, что предполагает возможность того, что белок участвует в дифференцировке, иммунном ответе и аллергическом ответе тучных клеток (непатентная литература 1). Однако ни в одном из предыдущих сообщений не показано, что белок MCEMP1 обладает индуцирующей иммунитет активностью против клеток злокачественной опухоли и, тем самым, полезен для лечения или предотвращения злокачественных опухолей.
Литература известного уровня техники
Непатентная литература
[0004]
Непатентная литература 1: Kang Li. et al. Genomics, 86:68-75 (2005)
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0005]
Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы идентифицировать антигенные белки злокачественной опухоли, специфично экспрессируемые на поверхности клеток злокачественной опухоли, и обеспечивать использование антител, направленных на такие белки, в качестве терапевтических и/или профилактических средств для злокачественной опухоли.
Решение проблемы
[0006]
В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения теперь получили кДНК, кодирующую белок, который связывается с антителом, присутствующим в сыворотке от опухоленесущего организма, с помощью способа SEREX, используя библиотеки кДНК, полученные из ткани семенника собаки, и сыворотки от собак с лейкозом. С использованием полученных генов собаки и гомологов генов от человека, кошки и мыши теперь получены белки MCEMP1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, и антитела против белков MCEMP1. Кроме того, авторы настоящего изобретения теперь обнаружили, что MCEMP1 специфически экспрессирован в клетках лейкоза, миелодиспластического синдрома, остеосаркомы, тимомы, мастоцитомы или перианальной аденокарциномы и что части белков MCEMP1 специфично экспрессированы на поверхности таких клеток злокачественной опухоли. Кроме того, авторы настоящего изобретения теперь обнаружили, что антитела против частей MCEMP1, экспрессированных на клеточных поверхностях злокачественной опухоли, могут повреждать клетки злокачественной опухоли, экспрессирующие MCEMP1. Эти находки привели к выполнению настоящего изобретения.
[0007]
Следовательно, настоящее изобретение включает следующие аспекты.
(1) Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с белком MCEMP1, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью или с фрагментом белка MCEMP1, содержащим 7 или больше последовательных аминокислот.
(2) Фармацевтическая композиция в соответствии с (1), которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с полипептидом, содержащим часть внеклеточной области белка MCEMP1, полипептидом, представляющим полипептид, состоящий из 7 или больше последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID № 10, 12, 14 или 16, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.
(3) Фармацевтическая композиция в соответствии с (1) или (2), где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую MCEMP1 на клеточной поверхности.
(4) Фармацевтическая композиция в соответствии с любым одним из (1)-(3), где злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из лейкоза, миелодиспластического синдрома, остеосаркомы, тимомы, мастоцитомы и перианальной аденокарциномы.
(5) Фармацевтическая композиция в соответствии с любым одним из (1)-(4), в которой антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.
(6) Фармацевтическая композиция в соответствии с любым одним из (1)-(5), в которой антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.
(7) Антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с полипептидом, содержащим часть внеклеточной области белка MCEMP1, полипептида, представляющего собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID № 10, 12, 14 или 16, или аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.
(8) Антитело или его фрагмент в соответствии с (7) или (8), в где антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело.
(9) Фармацевтическая комбинация для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит фармацевтическую композицию в соответствии с любым одним из (1)-(6) и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство.
(10) Способ лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, который включает введение, субъекту, антитела или его фрагмента, обладающих иммунологической реактивностью с белком MCEMP1, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью или со фрагментом белка MCEMP1, содержащим 7 или больше последовательных аминокислот.
[0008]
Это описание включает целиком или частично содержание, раскрытое в японской патентной заявке № 2016-064035, в отношении которой в настоящей заявке испрашивают приоритет.
Полезные эффекты изобретения
[0009]
Антитела против MCEMP1, используемые в настоящем изобретении, повреждают клетки злокачественной опухоли. Следовательно, такие антитела против MCEMP1 можно использовать для лечения или предотвращения злокачественных опухолей.
Краткое описание фигур
[0010]
На фиг. 1 представлены профили экспрессии идентифицированного гена MCEMP1 собаки в опухолевых тканях собаки.
На фиг. 2 представлены профили экспрессии идентифицированного гена MCEMP1 в каждой из тканей и клеточных линий злокачественных опухолей человека. На фиг. 2A представлены профили экспрессии ген MCEMP1 человека в каждой из тканей человека. На фиг. 2B представлены профили экспрессии гена MCEMP1 человека в каждой из клеточных линий злокачественных опухолей человека.
На фиг. 3 представлены профили экспрессии идентифицированного гена MCEMP1 мыши в каждой из клеточных линий злокачественных опухолей мыши.
На фиг. 4 представлена цитотоксическая активность поликлональных антител к MCEMP1 (поликлональное антитело против MCEMP1) против клеточной линии лейкоза (U937) и клеточной линии миелодиспластического синдрома (MDS92), экспрессирующих ген MCEMP1. На этой фиг. контроль-1 показывает цитотоксическую активность против клеток U937 после добавления контрольного поликлонального антителоа, против MCEMP1-1 показывает цитотоксическую активность против клеток U937 после добавления поликлонального антитела против MCEMP1. Контроль-2 показывает цитотоксическую активность против клеток MDS92 после добавления контрольного поликлонального антитела, MCEMP1-2 показывает цитотоксическую активность против клеток MDS92 после добавления поликлонального антитела против MCEMP1.
Описание вариантов осуществления
[0011]
Настоящее изобретение относится к использованию антитела или его фрагмента (предпочтительно антигенсвязывающего фрагмента) к белку MCEMP1 или его фрагменту для лечения и/или предотвращения злокачественных опухолей.
[0012]
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с белком MCEMP1, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей (предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей, более предпочтительно 95% или большей и особенно предпочтительно 99% или большей, например, 99,5% или большей) идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью или с фрагментом белка MCEMP1, содержащим 7 или больше (от 7 до каждой полноразмерной последовательности, предпочтительно от 7 до 150 и более предпочтительно от 7 до 50) последовательных аминокислот.
[0013]
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с частичным полипептидом белка MCEMP1, частичный полипептид представляет собой полипептид, состоящий из 7 или больше (от 7 до каждой полноразмерной последовательности, предпочтительно от 7 до 40, более предпочтительно от 7 до 20, например, от 7 до 12 или от 8 до 11) последовательных аминокислот аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID с четными номерами №№ с 10 до 24, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей (предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей, более предпочтительно 95% или большей и особенно предпочтительно 97% или большей) идентичностью последовательностей с определенной аминокислотной последовательностью.
[0014]
Противоопухолевая активность антитела или его фрагмента к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или ко фрагменту полипептида, используемых в настоящем изобретении, можно оценивать посредством проверки ингибирования опухолевого роста in vivo у животного-опухоленосителя или, как описано ниже, посредством проверки in vitro, проявляется ли или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.
[0016]
Аналогичным образом, противоопухолевая активность антитела или его фрагмента против полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID с четными номерами №№ с 10 до 16, или фрагмента полипептида, используемых в настоящем изобретении, можно оценивать посредством проверки in vivo ингибирования опухолевого роста у животного-опухоленосителя или, как описано ниже, посредством проверки in vitro, проявляется ли или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.
[0016]
Кроме того, нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих белки, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID №№ 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16, представлены в SEQ ID №№ 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15, соответственно.
[0017]
Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 4 в списке последовательностей, раскрытом в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой аминокислотную последовательность MCEMP1, которую выделяли, посредством способа SEREX с использованием библиотек кДНК, полученных из ткани семенника собаки, и сывороток от собак с лейкозом, в качестве полипептида, способного к связыванию с антителами, специфично существующими в сыворотках от опухоленесущих собак; аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 2, представляет собой аминокислотную последовательность MCEMP1, выделенную в качестве гомолога человека для указанного полипептида собаки; аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 6, представляет собой аминокислотную последовательность MCEMP1, выделенную в качестве гомолога кошки для указанного полипептида собаки; и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID № 8, представляет собой аминокислотную последовательность белка MCEMP1, выделенную в качестве гомолога мыши для указанного полипептида собаки (см. пример 1, описанный далее).
[0018]
В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно используют антитело, которое связывается с частью, экспрессированной на поверхностях клеток злокачественной опухоли, в белке MCEMP1. Его конкретные примеры включают аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 10 (человек), 12 (собака), 14 (кошка) или 16 (мышь), которая представляет собой полипептид, содержащий часть внеклеточной области белка MCEMP1, ее или фрагменты (предпочтительно, каждый фрагмент состоит из 7 или больше последовательных аминокислот из любой одной из аминокислотных последовательностей), или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей, предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей, более предпочтительно 95% или большей и особенно предпочтительно 99% или большей идентичностью последовательностей с любым одним из этих полипептидов. Антитела по настоящему изобретению включают все антитела, способные связываться с вышеуказанными полипептидами и обладающие противоопухолевой активностью.
[0019]
2
Антитела к MCEMP1, которые можно использовать в настоящем изобретении, как описано выше, могут относиться к любым их типам, пока они могут проявлять противоопухолевую активность. Их примеры могут включать моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFV). Антитела, используемые в настоящем изобретении, также включают фрагменты антител, например, антигенсвязывающие фрагменты, такие как Fab и F(ab'). Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, известными специалистам в данной области. В настоящем изобретении желательны антитела или их фрагменты, способные специфично связываться с белком MCEMP1. Такие антитела предпочтительно представляют собой моноклональные антитела; однако до тех пор, пока можно стабильно получать гомогенные антитела, поликлональные антитела также можно использовать. Кроме того, если субъектом является человек, антитело человека или гуманизированное антитело является желательным, чтобы избегать или ингибировать иммунное отторжение.
[0020]
Фраза «специфически связывается с белком MCEMP1 или его фрагментами», как используют в настоящем описании, обозначает, что антитело, представляющее интерес, специфически связывается с белком MCEMP1 или его фрагментами и по существу не связывается с другими белками.
[0021]
Противоопухолевую активность антитела, используемого в настоящем изобретении, можно оценивать посредством проверки in vivo ингибирования опухолевого роста у животного-опухоленосителя или, как описано ниже, проверки in vitro, проявляется ли или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.
[0022]
Кроме того, субъектами, нуждающимися в лечении и/или предотвращении злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением, являются млекопитающие, такие как человек, домашние животные, сельскохозяйственные животные, спортивные животные или экспериментальные животные. Предпочтительным субъектом является человек.
[0023]
Получение антигенов, получение антител и фармацевтических композиций, относящихся к настоящему изобретению, объяснены далее.
[0024]
<Получение антигенов, используемых для получения антител >
Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антител к MCEMP1, используемые в настоящем изобретении, не ограничены в отношении их происхождения, например, животных, включая, например, человека, собаку, кошку, мышь, корову, лошадь, крысу и курицу. Однако такие белки или их фрагменты предпочтительно выбирают ввиду совместимости с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Получаемые от млекопитающих белки в целом являются предпочтительными и получаемые от человека белки являются особенно предпочтительными. Например, если MCEMP1 представляет собой MCEMP1 человека, можно использовать белок MCEMP1 человека, его частичный полипептид или клетки, способные экспрессировать MCEMP1 человека.
[0025]
Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности MCEMP1 человека и его гомологов можно получать посредством, например, обращения к веб-сайту GenBank (NCBI, USA) и использования алгоритма, такого как BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).
[0026]
В соответствии с настоящим изобретением, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID № 1) или аминокислотную последовательность (SEQ ID № 2) MCEMP1 человека используют в качестве основной последовательности, целевыми являются нуклеиновые кислоты или белки, каждое состоит из последовательности, обладающей от 70% до 100%, предпочтительно от 80% до 100%, более предпочтительно от 90% до 100% и более предпочтительно от 95% до 100% (например, от 97% до 100%, от 98% до 100%, от 99% до 100% или от 99,5% до 100%) идентичностью последовательностей с нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью ORF или зрелой части основной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности. Термин «% идентичности последовательностей», как используют в настоящем описании, обозначает процентную долю (%) числа идентичных аминокислот (или нуклеотидов) от общего числа аминокислот (или нуклеотидов) в случае, когда две последовательности выравнивают так, что максимального сходства можно достичь при введении пропусков или без него.
[0027]
Фрагменты белка MCEMP1 имеют длины в диапазоне от длины эпитопа в аминокислотах (или антигенной детерминанты), которая является наименьшей единицей антигена, распознаваемой антителом, до меньше чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих и предпочтительно у человека. Наименьшая единица эпитопа состоит из приблизительно от 7 до 12 аминокислот и, например, от 8 до 11 аминокислот. Его конкретный пример представляет собой полипептид, состоящих из аминокислотной последовательности, обладающей 80% или большей, предпочтительно 85% или большей, более предпочтительно 90% или большей и более предпочтительно 95% или большей идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью белка MCEMP1.
[0028]
Полипептиды, содержащие указанный выше белок MCEMP1 человека, и его частичные пептиды можно синтезировать в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (способ с флуоренилметилоксикарбонилом) или способ tBoc (способ с т-бутилоксикарбонилом) (Japanese Biochemical Society (ред.), «Biochemical Experimentation Course (Seikagaku Jikken Koza) 1», Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Kagaku-dojin Publishing Company, Inc. (Japan), 1981). Также их можно синтезировать общими способами, используя различные коммерчески доступные пептидные синтезаторы. Кроме того, полипептиды, представляющие интерес, можно получать посредством получения полинуклеотидов, кодирующих вышеуказанные полипептиды, встраивания каждого из полинуклеотидов в экспрессирующий вектор и введения вектора в клетку-хозяина, тем самым позволяя клетке-хозяину продуцировать полипептид, используя известные способны генной инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2-е изд., Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3-е изд, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, и т. д.).
[0029]
2+
Полинуклеотиды, кодирующие указанные выше полипептиды, можно легко получать с помощью известных способов генной инженерии или общих способов, используя коммерчески доступные синтезаторы нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID № 1, можно получать посредством ПЦР с использованием библиотеки ДНК или кДНК хромосом человека в качестве матрицы и пары праймеров, разработанных для того, чтобы сделать возможной амплификацию нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID № 1. Условия ПЦР можно определять надлежащим образом. Например, такие условия могут включать проведение 30 циклов из стадий реакции (в качестве одного цикла), состоящих из: 94°C, 30 с (денатурация); 55°C, от 30 с до 1 минуты (отжиг); и 72°C, 1 минута (элонгация) с использованием термостабильной ДНК полимеразы (например, полимеразы Taq) и Mg-содержащего ПЦР буфера, после чего следует реакция при 72°C в течение 7 минут после завершения 30 циклов. Однако условия ПЦР не ограничены условиями ПЦР, приведенными выше в качестве примера. Способы и условия ПЦР описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3-е изд., A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, гл. 15).
[0030]
Кроме того, желаемую ДНК можно выделять посредством получения подходящих зондов и праймеров на основании информации о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, представленных в SEQ ID №№ с 1 до 8 в списке последовательностей в заявке, и скрининга библиотеки кДНК, например, человека с использованием таких зондов и праймеров. Предпочтительно, такую библиотеку кДНК получают из клетки, органа или ткани, в которой экспрессирован белок с SEQ ID № 2, 4, 6 или 8. Примеры клетки или ткани включают, но не ограничиваясь этим, клетки или ткани из злокачественных опухолей или опухолей, например, костного мозга, мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), лейкоза, миелодиспластического синдрома, остеосаркомы, тимомы, мастоцитомы и перианальной аденокарциномы. Операции, такие как получение зондов или праймеров, конструирование библиотек кДНК, скрининг библиотек кДНК и клонирование генов, представляющих интерес, как описано выше, известны специалистам в данной области, и их можно осуществлять, например, в соответствии со способами, описанными в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2-е изд., Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (там же). ДНК, кодирующую белок MCEMP1 человека и его частичные пептиды, можно получать из ДНК, полученной таким образом.
[0031]
Описанные выше клетки-хозяева могут представлять собой любые клетки до тех пор, пока они могут экспрессировать описанные выше полипептиды. Пример прокариотической клетки-хозяина включает, но не ограничиваясь этим, Escherichia coli. Примеры эукариотических клеток-хозяев включают, но не ограничиваясь этим, клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны (COS1), клетки яичника китайского хомяка (CHO), линия клеток почки эмбриона человека (HEK293) и линия клеток кожи эмбриона мыши (NIH3T3), дрожжевые клетки, такие как клетки почкующихся дрожжей и делящихся дрожжей, клетки тутового шелкопряда и клетки яиц Xenopus laevis.
[0032]
Когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, можно использовать экспрессирующий вектор, предпочтительно имеющий точку начала репликации в прокариотических клетках, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ауксотрофный комплементарный ген, репортерный ген или тому подобное. В качестве примеров экспрессирующих векторов для Escherichia coli можно привести векторы pUC, pBluescriptII, экспрессирующие системы pET, экспрессирующие системы pGEX и т. п. ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид, встраивают в такой экспрессирующий вектор, прокариотическую клетку-хозяина трансформируют вектором и затем полученную таким образом трансформированную клетку культивируют с тем, чтобы можно было экспрессировать полипептид, кодируемый с помощью ДНК, в прокариотической клетке-хозяине. В этот момент полипептид также можно экспрессировать в виде слитого белка с другим белком.
[0033]
6
10
Когда эукариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, можно использовать экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, предпочтительно имеющие промотор, область сплайсинга, сайт добавления поли(A) или тому подобное. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3.1, pSecTag (A, B, C) и pYES2. С помощью процедур, схожих с теми, которые указаны выше, ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, встраивают в такой экспрессирующий вектор, эукариотическую клетку-хозяина трансформируют вектором и затем полученную таким образом трансформированную клетку культивируют с тем, чтобы можно было экспрессировать полипептид, кодируемый вышеуказанной ДНК, в эукариотической клетке-хозяине. Когда pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобное используют в качестве экспрессирующего вектора, вышеуказанный полипептид можно экспрессировать в виде слитого белка с меткой, такой как метка His (например, от (His) до (His)), метка FLAG, метка myc, метка HA или GFP.
[0034]
Для введения экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно использовать хорошо известные способы, такие как электропорация, способ с фосфатом кальция, липосомный способ, способ с DEAE декстраном, микроинъекция, вирусная инфекция, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.
[0035]
Выделение и очистку полипептида, представляющего интереса, из клеток-хозяев можно осуществлять с использованием известных способов выделения в комбинации. Примеры способов выделения и очистки включают, но не ограничиваясь этим, обработку с использованием денатурирующего средства, такого как мочевина, или поверхностно-активного средства, обработки ультразвуком, ферментативного расщепления, высаливания, фракционирования растворителей и преципитации, диализа, центрифугирования, ультрафильтрования, гель-фильтрации, SDS-PAGE, электрофореза с изоэлектрическим фокусированием, ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, аффинной хроматографии и хроматографии с обращенной фазой.
[0036]
<Структура антитела>
В целом, антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Между тем, другой класс антител, за исключением IgM, представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины (приблизительно 150 кДа), каждый содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью через одну ковалентную дисульфидную связь. Однако число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая из тяжелой цепи и легкой цепи также имеет внутрицепную дисульфидную связь(и). Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном ее конце, с которым последовательно связаны несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном ее конце и имеет одну константную область на ее противоположном конце. Константная область легкой цепи выравнивается с первой константной областью тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи выравнивается с вариабельным доменом тяжелой цепи. Специфичная область вариабельного домена антитела, которую называют «определяющей комплементарность областью (CDR)», проявляет специфичную вариабельность с тем, чтобы придавать антителу специфичность связывания. Относительно консервативную часть в вариабельной области называют «каркасной областью (FR)». Полный вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи содержит 4 FR, соединенные друг с другом через 3 CDR. Такие CDR называют «CDRH1», «CDRH2» и «CDRH3», соответственно, в таком порядке от N-конца в тяжелой цепи. Аналогичным образом, для легкой цепи их называют «CDRL1», «CDRL2» и «CDRL3», соответственно. CDRH3 играет наиболее важную роль в отношении специфичности связывания антитело-антиген. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживается с помощью областей FR в состоянии, когда они очень близки друг к другу, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающих участков антитела вместе с CDR в соответствующей цепи. Константные области не вносят непосредственного вклада в связывание антитело-антиген. Однако они проявляют различные эффекторные функции, такие как связь с антителозависимой цитотоксичностью (активность ADCC), фагоцитозом через связывание с рецептор Fcγ, временем полужизни/уровнем клиренса через неонатальный рецептор Fc (FcRn) и комплемент-зависимой цитотоксичностью (активность CDC) через компонент C1q в каскаде комплемента.
[0037]
<Получение антител >
Термин «антитело против MCEMP1», используемый в настоящем изобретении, относится к антителу, обладающему иммунологической реактивностью с полноразмерным белком MCEMP1 или его фрагментом, описанным выше.
[0038]
Термин «иммунологическая реактивность», используемый в настоящем описании, указывает на характеристики связывания антитела in vivo или in vitro с антигеном MCEMP1. Функция повреждения опухоли или опухолевых клеток (например, гибель, ингибирование или регрессия) может проявляться в виде результата такого связывания. В частности, антитело любого типа можно использовать в настоящем изобретении до тех пор, пока антитело может связываться с белком MCEMP1, чтобы повреждать опухоль, предпочтительно злокачественную опухоль, экспрессирующую (или имеющую) белок MCEMP1 на клеточной поверхности, такую как лейкоз, миелодиспластический синдром, остеосаркома, тимома, мастоцитома или перианальная аденокарцинома.
[0039]
2
Примеры таких антител включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела. Примеры таких антител также включают фрагменты антител (например, фрагменты, такие как Fab и F(ab')). Кроме того, антитела могут относиться к любому классу молекул иммуноглобулинов, таких как IgG, IgE, IgM, IgA, IgD и IgY, или любому их подклассу, такому как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
[0040]
В дополнение к гликозилированию, антитела дополнительно можно модифицировать через ацетилирование, формилирование, амидирование, фосфорилирование или пегилирование (PEG).
[0041]
Примеры получения для различных антител описаны далее.
[0042]
Поликлональные антитела, которые можно использовать в настоящем изобретении, можно получать описанным далее образом.
[0043]
Сыворотку получают посредством иммунизации небольших животных, таких как мыши, продуцирующие антитело человека мыши или кролики, с использованием встречаемого в природе белка MCEMP1, рекомбинантного белка MCEMP1, который экспрессировали в виде белка, слитого с GST или тому подобным, в микроорганизме, таком как Escherichia coli, или его частичного пептида. Сыворотку очищают через преципитацию с сульфатом аммония, колоночную хроматографию на белке A/белке G, DEAE ионообменную хроматографию, аффинную колоночную хроматографию с использованием колонки, с которой связан белок MCEMP1 или синтетический пептид, или тому подобное, для получения поликлональных антител. В примерах, описанных далее, получали поликлональное антитело мыши против домена, экспрессированного на поверхностях клеток злокачественной опухоли в аминокислотной последовательности белка MCEMP1, и подтверждали его противоопухолевых эффекты.
[0044]
Другие примеры антител, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают моноклональные антитела. Например, моноклональные антитела можно получать таким образом, который описан далее. Например, клетки, экспрессирующие белок MCEMP1 на своих поверхностях (такие как клеточная линия лейкоза U937 или подобное), вводят мышам для иммунизации, после чего следует извлечение селезенок у мышей. Клетки выделяют из каждой селезенки и затем сливают с миеломными клетками мыши. Клоны, способные продуцировать антитело, обладающее действием ингибирования роста клеток злокачественной опухоли, выбирают из полученных слитых клеток (гибридом). Продуцирующую моноклональное антитело гибридому, обладающую действием ингибирования роста клеток злокачественной опухоли, выделяют и культивируют. Антитело, представляющее интерес, можно получать через очистку от культурального супернатанта с помощью общего способа аффинной очистки.
[0045]
Также продуцирующую моноклональное антитело гибридому можно получать, например, описанным далее образом. Сначала животное иммунизируют сенсибилизирующим антигеном с помощью известного способа. В общем способе иммунизацию осуществляют посредством интраперитонеальной или подкожной инъекции сенсибилизирующего антигена млекопитающему. В частности, сенсибилизирующий антиген разводят или суспендируют в PBS (фосфатно-солевой буфер), физиологическом растворе или тому подобном до подходящего получаемого количества. При желании, при этом смешивают подходящее количество стандартного адъюванта (например, полного адъюванта Фрейнда). После эмульсификации получаемое вводят млекопитающему несколько раз каждые от 4 до 21 суток. Кроме того, можно использовать подходящий носитель для иммунизации сенсибилизирующим антигеном.
[0046]
Как описано выше, после иммунизации млекопитающего и подтверждения увеличения до желаемого уровня антитела в сыворотке, иммуноциты собирают у млекопитающего и подвергают слиянию клеток. Особенно предпочтительными примерами иммуноцитов являются спленоциты.
[0047]
Миеломные клетки млекопитающих используют в качестве релевантных родительских клеток, подвергаемых слиянию с вышеуказанными иммуноцитами. Для таких миеломных клеток предпочтительно используют следующие различные примеры известных клеточных линий: P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3 × 63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3 × 63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).
[0048]
В основном, слияние клеток иммуноцитов и миеломных клеток, описанных выше, можно осуществлять в соответствии с известным способом, таким как способ Kohler и Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
[0049]
Более конкретно, слияние клеток, описанное выше, осуществляют, например, в присутствии ускорителя слияния клеток в культуральном растворе, содержащем стандартные питательные вещества. Примеры ускорителя слияния, подлежащего использованию, включают полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай (HVJ: японский гемагглютинирующий вирус). При желании, адъювант, такой как диметилсульфоксид, дополнительно можно добавлять для повышения эффективности слияния.
[0050]
Долю используемых иммуноцитов относительно используемых миеломных клеток можно определять произвольно. Например, соотношение иммуноцитов и миеломных клеток предпочтительно составляет от 1:1 до 10:1. Примеры культурального раствора, который можно использовать для слияния клеток, описанных выше, включает культуральный раствор RPMI1640 и культуральный раствор MEM, достаточные для роста вышеуказанных линий миеломных клеток, а также другие стандартные культуральные растворы, используемые для клеточных культур этого типа. Кроме того, заменитель сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка (FCS), можно использовать в комбинации с ними.
[0051]
Для слияния клеток, вышеуказанные иммуноциты и миеломные клетки достаточно смешивают в предварительно определяемых количествах в культуральном растворе. Раствор PEG (например, усредненная молекулярная масса: приблизительно от 1000 до 6000), который предварительно нагревали приблизительно до 37°C, добавляют туда в концентрации в целом от 30% до 60% (масс./об.), после чего следует смешивание. Это ведет к формированию гибридом, представляющих интерес. Впоследствии, последовательное добавление подходящего культурального раствора и удаление супернатанта через центрифугирование повторно осуществляют для того, чтобы удалять средство(а) для слияния клеток и т. п., которые не являются предпочтительными для роста гибридом.
[0052]
Полученные таким образом гибридомы культивируют в стандартном культуральном растворе для отбора, таким как культуральный раствор HAT (культуральный раствор, содержащий гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для отбора. Культивирование в таком культуральном растворе HAT осуществляют непрерывно в течение достаточного периода времени (в целом от нескольких суток до нескольких недель) для гибели клеток (не слитых клеток), отличных от гибридом, представляющих интерес. Затем стандартный способ предельного разведения используют для скрининга гибридом, продуцирующих антитела, представляющие интерес, и осуществления одиночного клонирования.
[0053]
Кроме того, подобно получению вышеуказанных гибридом через иммунизацию не относящихся к человеку животных с использованием антигенов, также возможно получать гибридомы, которые продуцируют антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, активность ингибирования клеточного роста), посредством сенсибилизации лимфоцитов человека (например, лимфоцитов человека, инфицированных вирусом EB) in vitro с использованием белка, экспрессирующих белок клеток или их лизата и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с происходящими от человека миеломными клетками, обладающими способностью перманентно делиться, например, U266 (№ доступа TIB196).
[0054]
Продуцирующие моноклональное антитело гибридомы, получаемые как указано выше, можно пассировать в стандартный культуральный раствор. Кроме того, их можно сохранять в жидком азоте в течение длительного периода времени.
[0055]
В частности, иммунизацию осуществляют с использованием желаемого антигена или клеток, экспрессирующих желаемый антиген, в качестве сенсибилизирующего антигена(ов) в соответствии со стандартным способом иммунизации. Получаемые иммуноциты сливают с известными родительскими клетками с помощью стандартного способа слияния клеток. Затем осуществляют скрининг продуцирующих моноклональное антитело клеток (гибридом) с помощью стандартного способа скрининга. Таким образом, можно осуществлять получение антитела.
[0056]
Известная продуцирующая антитело человека мышь, используемая в настоящем описании, представляет собой, например, KM Mouse (Kirin Pharma/Medarex) или XenoMouse (Amgen) (например, WO02/43478 и WO02/092812). Когда таких мышей иммунизируют белками MCEMP1 или их фрагментами, из крови можно получать полные поликлональные антитела человека. Кроме того, полные моноклональные антитела человека можно получать с помощью способа слияния спленоцитов, собранных у иммунизированных мышей, с миеломными клетками.
[0057]
Получение антигена можно осуществлять в соответствии со способом, таким как способ с использованием клеток животного (публикация патента JP (Kohyo) № 2007-530068) или способ с использованием бакуловируса (например, WO98/46777). Если иммуногенность антигена низка, антиген связывают с макромолекулой, обладающей иммуногенностью, такой как альбумин. Затем антиген можно использовать для иммунизации.
[0058]
Кроме того, возможно использовать генетически рекомбинатное антитело, получаемое посредством клонирования гена антитела из гибридомы, встраивания клона в подходящий вектор, введения вектора в организм-хозяин и использования способа генетической инженерии (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, опубликовано в Соединенном королевстве в MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). В частности, кДНК вариабельной области (V-области) антитела синтезируют из мРНК гибридомы с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующей V-область антитела, представляющего интерес, такую ДНК лигируют в желаемую ДНК, кодирующую константную область антитела (C-область). Получаемое встраивают в экспрессирующий вектор. Альтернативно, ДНК, кодирующую V-область антитела, можно встраивать в экспрессирующий вектор, содержащий ДНК C-области антитела. Такую ДНК встраивают в экспрессирующий вектор таким образом, что ее экспрессируют под управлением области управления экспрессией, такой как энхансер или промотор. Затем клетки-хозяева трансформируют таким экспрессирующим вектором, тем самым делая возможно экспрессию антитела.
[0059]
Моноклональные антитела включают моноклональные антитела человека и моноклональные антитела животных, не относящихся к человеку (например, моноклональные антитела мыши, моноклональные антитела крысы, моноклональные антитела кролика и моноклональные антитела курицы). Моноклональные антитела можно получать посредством культивирования гибридом, получаемых через слияние миеломных клеток и спленоцитов от млекопитающих, не относящихся к человеку (например, мышей или продуцирующих антитело человека мышей), иммунизированных белками MCEMP1 или их фрагментами.
[0060]
Химерное антитело представляет собой антитело, продуцируемое посредством объединения последовательностей от различных животных. Примером этого является антитело, состоящее из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела мыши и константных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека. такое химерное антитело можно получать с помощью известного способа. Например, химерное антитело можно получать посредством лигирования ДНК, кодирующей V-область антитела, с ДНК, кодирующей C-область антитела человека, встраивания получаемого в экспрессирующий вектор, введения вектора в организм-хозяин и предоставления организму-хозяину возможности продуцировать антитело.
[0061]
Поликлональные антитела включают антитела, получаемые посредством иммунизации продуцирующих антитело человека животных (например, мышей) белками MCEMP1 или их фрагментами.
[0062]
Гуманизированное антитело представляет собой сконструированное антитело, и его иногда обозначают как «реконструированное антитело человека». Гуманизированное антитело конструируют посредством трансплантации CDR антитела, полученного у иммунизированного животного, в определяющие комплементарность области антитела человека. Также для этого известны общие способы генетической инженерии.
[0063]
В частности, последовательность ДНК, разработанная для лигирования CDR антитела мыши с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют способом ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, полученных так, чтобы иметь части, перекрывающиеся друг с другом на своих концах. Гуманизированное антитело можно получать посредством лигирования ДНК, полученной выше, с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, встраивания получаемого в экспрессирующий вектор, введения вектора в организм-хозяин и предоставления организму-хозяину возможности продуцировать продуцирование антитела (см. EP-A-239400 и WO96/02576). FR антитела человека, подлежащие лигированию друг с другом через CDR выбирают при условии, что определяющие комплементарность области могут формировать хороший антигенсвязывающий участок. В случае необходимости, аминокислоты в каркасных областях вариабельной области антитела можно замещать таким образом, что определяющие комплементарность области в реконструированном антителе человека формируют подходящих антигенсвязывающий участок (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Кроме того, каркасные области можно замещать на каркасные области из различных антител человека (см. WO99/51743).
[0064]
После получения химерного антитела или гуманизированного антитела аминокислоты в вариабельной области (например, FR) или константной области, например, можно заменять на другие аминокислоты.
[0065]
Здесь замена аминокислоты представляет собой замену, например, меньше чем 15, меньше чем 10, не больше чем 8, не больше чем 7, не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3 или не больше чем 2 аминокислот, предпочтительно от 1 до 5 аминокислот и более предпочтительно 1 или 2 аминокислот. Антитело с заменой должно быть функционально эквивалентно незамещенному антителу. Замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену, которая представляет собой замену между аминокислотами, обладающими схожими характеристиками в отношении заряда, боковых цепей, полярности, ароматичности и т. п. Например, аминокислоты, обладающие схожими характеристиками, можно разделять на следующие типы: основные аминокислоты (аргинин, лизин и гистидин); кислые аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); незаряженные полярные аминокислоты (глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин); неполярные аминокислоты (лейцин, изолейцин, аланин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); аминокислоты с разветвленной цепью (треонин, валин, изолейцин); и ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан и гистидин).
[0066]
Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой модифицированные антитела. Примером модифицированного антитела является антитело, связанное с такой молекулой, как полиэтиленгликоль (PEG). В отношении модифицированного антитела по настоящему изобретению, вещества, которые связывают с антителом, не ограничены. Такое модифицированное антитело можно получать посредством химической модификации полученного антитела. Способ такой модификации уже признан в области, связанной с настоящим изобретением.
[0067]
Выражение «функционально эквивалентный», используемое в настоящем описании, указывает на ситуацию, в которой антитело, представляющее интерес, обладает биологической или биохимической активностью, схожими с таковыми у антитела по настоящему изобретению. В частности, такое антитело имеет функцию повреждения опухолей и по существу не вызывает реакцию отторжения при применении у человека. Примером такой активности является активность ингибирования клеточного роста или связывающая активность.
[0068]
Известным способом получения полипептида, функционально эквивалентного заданному полипептиду, который хорошо известен специалистам в данной области, является способ, который включает введение мутации в полипептид. Например, специалист в данной области может в достаточной мере вводить мутацию в антитело по настоящему изобретению с использованием способа сайт-специфического мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; или Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) или тому подобное. Таким образом, можно получать антитело, функционально эквивалентное антителу по настоящему изобретению.
[0069]
Вышеуказанное антитело, способное распознавать эпитоп белка MCEMP1, распознаваемый антителом против MCEMP1, можно получать способом, известным специалистам в данной области. Например, его можно получать с помощью: способа, включающего определение эпитопа белка MCEMP1, распознаваемого антителом против MCEMP1, с помощью общего способа (например, картирования эпитопов) и получение антитела с использованием полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, содержащуюся в эпитопе, в качестве иммуногена; или способа, включающего определение эпитопа продуцируемого антитела с помощью общего способа и отбор антитела, имеющего эпитоп, идентичный эпитопу антитела против MCEMP1. Здесь термин «эпитоп» относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих и предпочтительно у человека. Его наименьшая единица состоит из приблизительно от 7 до 12 аминокислот и предпочтительно от 8 до 11 аминокислот.
[0070]
7
-1
8
-1
8
-1
9
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
13
-1
Константа сродства Ka (kon/koff) антитела по настоящему изобретению предпочтительно составляет по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M или по меньшей мере 10 M.
[0071]
Антитело по настоящему изобретению можно конъюгировать с противоопухолевым средством. Связывание между антителом и противоопухолевым средством можно осуществлять через спейсер, имеющий группу, способную реагировать с аминогруппой, карбоксильной группой, гидроксигруппой, тиоловой группой, или тому подобное (например, имидилсукцинатную группу, формильную группу, 2-пиридилдитиогруппу, малеимидильную группу, алкоксикарбонильную группу или гидроксигруппу).
[0072]
Примеры противоопухолевых средств включают следующие противоопухолевые средства, известные из источников или тому подобного: паклитаксел, доксорубицин, даунорубицин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, тиотепа, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, бриостатин, каллистатин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтаминоксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихимицин, динемицин, клодронат, эсперамицин, аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, деторбицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, адриамицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, роторубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглютетимид, митотан, трилостан, фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамида гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиния ацетат, эпотилон, этоглуцид, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцин, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, ризоксин, шизофиллан, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, роридин A, ангуидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, доцетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин, винбластин, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, ингибитор топоизомеразы, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, капецитабин и их фармакологически приемлемые соли или производные.
[0073]
211
131
125
90
186
188
153
212
32
175
176
Альтернативно также возможно связывать радиоактивный изотоп, такой как At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Lu или Lu, известные из источников и т. п., с антителом по настоящему изобретению. Желательно, чтобы такие радиоактивные изотопы были эффективны для лечения или диагностирования опухолей.
[0074]
Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью с MCEMP1, или антитело, способно специфически распознавать MCEMP1. Такое антитело должно представлять собой антитело, имеющее структуру, которая позволяет субъекту-животному, которому вводят антитело, полностью или почти полностью избегать реакции отторжения. Если субъектом-животным является человек, примеры таких антител включают антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела (например, химерные антитела человека-мыши), одноцепочечные антитела и биспецифические антитела. Такое антитело представляет собой рекомбинантное антитело, имеющее вариабельные области, полученные из тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека, рекомбинантное антитело, имеющее вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, каждая состоит из определяющих комплементарность областей (CDR1, CDR2 и CDR3), полученных из антитела животного, не относящегося к человеку, и каркасных областей, полученных из антитела человека, или рекомбинантное антитело, имеющее вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, полученные из антитела животного, не относящегося к человеку, и константные области тяжелой цепи и легкой цепи, полученные из антитела человека. Первые два антитела являются предпочтительными.
[0075]
Вышеуказанное рекомбинантное антитело можно получать описанным далее образом. ДНК, кодирующую моноклональное антитело против MCEMP1 человека (например, моноклональное антитело человека, моноклональное антитело мыши, моноклональное антитело крысы, моноклональное антитело кролика или моноклональное антитело курицы) клонируют из антителопродуцирующей клетки, такой как гибридома. ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи антитела получают посредством способа RT-ПЦР или тому подобного, используя полученный клон в качестве матрицы. Затем, последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи или последовательности CDR1, CDR2, и CDR3 определяют с помощью системы нумерации Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).
[0076]
Кроме того, такую ДНК, кодирующую вариабельные области, или ДНК, кодирующую CDR, получают способом генетической инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) или с помощью синтезатора ДНК. Здесь вышеуказанную гибридому, продуцирующую моноклональное антитело человека, можно получать посредством иммунизации продуцирующего антитело человека животного (например, мыши) с использованием MCEMP1 человека и слияния спленоцитов из селезенки, удаленной у животного, с миеломными клетками. В дополнение к вышеуказанному, в случае необходимости, ДНК, кодирующую вариабельные области, полученные из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека, и константные области получают способом генетической инженерии или с помощью синтезатора ДНК.
[0077]
В случае гуманизированного антитела, получают ДНК, в которой кодирующие CDR последовательности в ДНК, кодирующей вариабельную область, полученную из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека, заменены на соответствующие кодирующие CDR последовательности антитела от животного, не относящегося к человеку (например, мыши, крысы или курицы). ДНК, получаемую, как указано выше, лигируют с ДНК, кодирующей константную область, полученную из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека. Таким образом, можно получать ДНК, кодирующую гуманизированное антитело.
[0078]
В случае химерного антитела, ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи антитела от не относящегося к человеку животного (например, мыши, крысы или курицы) лигируют с ДНК, кодирующей константную область, полученную из легкой цепи или тяжелой цепи антитела человека. Таким образом, можно получать ДНК, кодирующую химерное антитело.
[0079]
4
3
Одноцепочечное антитело представляет собой антитело, в котором вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи линейно лигируют друг с другом через линкер. ДНК, кодирующую одноцепочечное антитело, можно получать посредством лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, ДНК, кодирующей линкер, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи, вместе. Здесь вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи представляют собой таковые из антитела человека или таковые из антитела человека, в которых только CDR заменены на CDR антитела от животного, не относящегося к человеку (например, мыши, крысы или курицы). Кроме того, линкер состоит из 12-19 аминокислот. Его примером является (GS), состоящий из 15 аминокислот (G. -B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).
[0080]
Биспецифическое антитело (диатело) представляет собой антитело, способное к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами. ДНК, кодирующую биспецифическое антитело, можно получать посредством, например, лигирования ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи A, ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи B, ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи B, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи A вместе, в таком порядке (при условии, что ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи B, и ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи B, лигируют друг с другом через ДНК, кодирующую линкер, описанный выше). Здесь и вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи представляют собой таковые из антитела человека или таковые из антитела человека, в котором только CDR заменены на CDR антитела от животного, не относящегося к человеку (например, мыши, крысы или курицы).
[0081]
Рекомбинантную ДНК, получаемую как указано выше, встраивают в один или множество подходящих векторов. Каждый такой вектор вводят в клетку-хозяина (например, клетку млекопитающего, клетку дрожжей или клетку насекомого) для (совместной) экспрессии. Таким образом, можно получать рекомбинантное антитело. См., P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice., 1993 ACADEMIC PRESS.
[0082]
Вышеуказанные антитела предпочтительно обладают цитотоксической активностью, тем самым проявляя противоопухолевые эффекты.
[0083]
Кроме того, получают гибридому, способную продуцировать другое антитело человека или антитело животного, не относящегося к человеку, (например, антитело мыши) против MCEMP1 человека. Собирают моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой. Затем определяют, является ли или нет полученное антитело антителом, представляющим интерес, используя, в качестве индикаторов, активность иммунологического связывания с MCEMP1 человека и цитотоксическую активность. Таким образом, идентифицируют продуцирующую моноклональное антитело гибридому, представляющую интерес. После этого, как описано выше, ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела, представляющего интерес, получают из гибридомы и секвенируют. ДНК используют для получения различных антител.
[0084]
Кроме того, вышеуказанное антитело по настоящему изобретению может представлять собой одно из антител, имеющих замену, делецию или добавление одной или нескольких (и предпочтительно 1 или 2) аминокислот, в частности, в последовательности каркасной области и/или последовательности константной области, до тех пор, пока оно обладает специфичным свойством специфического распознавания MCEMP1. Здесь, термин «несколько аминокислот» обозначает 2-5 и предпочтительно 2 или 3 аминокислоты.
[0085]
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, также предусмотрена ДНК, кодирующая вышеуказанное антитело по настоящему изобретению, ДНК, кодирующая тяжелую цепь или легкую цепь антитела, или ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела.
[0086]
Определяющие комплементарность области (CDR), кодируемые с помощью ДНК вышеуказанных последовательностей, представляют собой области, которые определяют специфичность антитела. Следовательно, последовательности, кодирующие другие области (т. е. константные области и каркасные области) в антителе, могут представлять собой последовательности из другого антитела. Здесь различные антитела включают антитела из организмов, не относящихся к человеку. Однако, ввиду снижения побочных эффектов, происходящие от человека антитела являются предпочтительными. То есть, в вышеуказанном случае, области ДНК, кодирующие каркасные области и константные области тяжелых и легких цепей, предпочтительно содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие релевантные аминокислотные последовательности из антитела человека.
[0087]
ДНК по настоящему изобретению можно получать с помощью, например, указанных выше способов или следующих способов. Сначала получают общую РНК из гибридомы для антитела по настоящему изобретению, с использованием коммерчески доступного набора для экстрагирования РНК. Затем синтезируют кДНК с использованием обратной транскриптазы и случайных праймеров и тому подобного. Затем кДНК, кодирующую антитело, амплифицируют с помощью способа ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды, имеющие последовательности, консервативные в вариабельных областях известных генов тяжелой цепи и легкой цепи антитела мыши. Последовательности, кодирующие константные области, можно получать посредством амплификации известных последовательностей с помощью способа ПЦР. Нуклеотидную последовательность ДНК можно определять с помощью общего способа, включающего, например, встраивание в плазмиду или фаг для определения последовательности.
[0088]
Полагают, что противоопухолевые эффекты антитела против MCEMP1, используемого в настоящем изобретении, оказываемые на MCEMP1-экспрессирующие клетки злокачественной опухоли, проявляются через опосредованную эффекторными клетками активность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) против MCEMP1-экспрессирующих клеток или активность комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) против MCEMP1-экспрессирующих клеток.
[0089]
Соответственно, активность антитела против MCEMP1, используемого в настоящем изобретении, можно оценивать через определение in vitro активности ADCC или активности CDC в отношении MCEMP1-экспрессирующих клеток злокачественной опухоли, как конкретно описано в примерах, приведенных далее.
[0090]
Антитело против MCEMP1, используемое в настоящем изобретении, связывается с MCEMP1-белком на клетке злокачественной опухоли и проявляет противоопухолевые эффекты на основании вышеуказанной активности. Следовательно, полагают, что такое антитело можно использовать для лечения или предотвращения злокачественных опухолей. В частности, в соответствии с настоящим изобретением, предоставлена фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело против MCEMP1. Когда антитело против MCEMP1 используют с целью введения антитела человеку (лечение антителом), его предпочтительно используют в форме антитела человека или гуманизированного антитела для того, чтобы снижать иммуногенность.
[0091]
7
-1
8
-1
8
-1
9
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
13
-1
Кроме того, поскольку аффинность связывания между антителом против MCEMP1 и белком MCEMP1 на поверхности клеток злокачественной опухоли становится выше, антитело против MCEMP1 может проявлять более сильную противоопухолевую активность. Следовательно, если можно получать антитело против MCEMP1, обладающее высокой аффинностью связывания с белком MCEMP1, можно ожидать проявления еще более сильных противоопухолевых эффектов. Соответственно, становится возможным использовать такое антитело в качестве фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли. Как описано выше, для высокой аффинности связывания, константа сродства Ka (kon/koff) предпочтительно составляет по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M, по меньшей мере 5 × 10 M, по меньшей мере 10 M или по меньшей мере 10 M.
[0092]
<Связывание с клетками, экспрессирующими антиген>
Способность антитела к связыванию с MCEMP1 можно определять через анализ связывания с использованием, например, ELISA, способа Вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции или анализа проточной цитометрии, как описано в примерах.
[0093]
<Иммуногистохимическое окрашивание>
Антитело, которое распознает MCEMP1, можно тестировать в отношении реакционной способности с MCEMP1 посредством иммуногистохимического способа, общеизвестного специалистам в данной области, используя замороженный тканевой срез, фиксированный параформальдегидом или ацетоном, или погруженный в парафин тканевой срез, фиксированный параформальдегидом. Такой срез получают из ткани, получаемой от пациента во время хирургического вмешательства, ткани костного мозга, лимфатического узла или клеток периферической крови пациента или ткани, получаемой от животного, несущего ткань ксенотрансплантата, которое инокулировали клеточной линией, которая экспрессирует MCEMP1 естественно или после трансфекции им.
[0094]
Для иммуногистохимического окрашивания антитело, иммунологически реактивное к MCEMP1, можно окрашивать различными способами. Например, его можно визуализировать посредством реакции с антителом козы против мыши или антителом козы против кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена.
[0095]
<Фармацевтическая композиция>
Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию (или лекарственное средство), содержащую антитело по настоящему изобретению, т. е. антитело против MCEMP1 или его фрагмент (предпочтительно антигенсвязывающий фрагмент), описанные выше. Фармацевтическая композиция (или лекарственное средство) по настоящему изобретению обычно содержит эффективное количество антитела против MCEMP1 или его фрагмента (предпочтительно, антигенсвязывающего фрагмента), описанных выше.
[0096]
Мишень фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли по настоящему изобретению конкретно не ограничена до тех пор, пока мишень представляет собой злокачественную опухоль (клетку), экспрессирующую ген MCEMP1.
[0097]
Оба термина «опухоль» и «злокачественная опухоль», используемые в настоящем описании, относятся к озлокачествленному новообразованию, и, таким образом, их используют взаимозаменяемым образом.
[0098]
Злокачественная опухоль, которая может быть мишенью в настоящем изобретении, представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую ген, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или частичную последовательность, состоящую из 7 или больше последовательных аминокислот из указанной аминокислотной последовательности, и предпочтительно представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую такой полипептид на клеточной поверхности. Злокачественная опухоль, которая может быть мишенью в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, остеосаркому, тимому, мастоцитому или перианальную аденокарциному. Примеры этих конкретных злокачественных опухолей включают, но не ограничиваясь этим, острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, T-клеточный лейкоз взрослых, алейкемический лейкоз, лейкоцитемический лейкоз, базофильный лейкоз, бластный лейкоз, коровий лейкоз, хронический миелолейкоз, гемодермию, эмбриональный лейкоз, эозинофильный лейкоз, лейкоз Гросса, лейкоз с клетками Ридера, лейкоз Шиллинга, стволовоклеточный лейкоз, сублейкемический лейкоз, лейкоз с недифференцированнымми клетками, волосатоклеточный лейкоз, гемобластный лейкоз, гемоцитобластный лейкоз, гистиоцитарный лейкоз, стволовоклеточный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, лейкопенический лейкоз, лимфатический лейкоз, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, лимфотропный лейкоз, лимфоидный лейкоз, лейкоз с клетками лимфосаркомы, тучноклеточный лейкоз, мегакариоцитарный лейкоз, микромиелобластный лейкоз, моноцитарный лейкоз, миелобластный лейкоз, миелолейкоз, миелоидный гранулоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, лейкоз Негели, лейкоз с плазматическими клетками, плазмоцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, рефракторную анемию (RA), рефракторную анемию с кольцевидным сидеробластами (RARS), рефракторную анемию с избыточными бластами (RAEB), RAEB в трансформации (RAEB-T), предлейкоз и хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML), стандартную центральную остеосаркому и подвиды остеосаркомы (внутрикостная высокодифференцированная остеосаркома, круглоклеточная остеосаркома, поверхностая остеосаркома, паростальная остеосаркома, периостальная остеосаркома и поверхностная остеосаркома высокой степени малигнизации), тимому, мастоцитому, перианальную аденому и перианальную аденокарциному.
[0099]
Кроме того, субъект-животное по настоящему изобретению представляет собой млекопитающее. Его примеры включают млекопитающих, таких как приматы, домашние животные, сельскохозяйственные животные, спортивные животные и экспериментальные животные. Человек, собаки и кошки особенно предпочтительны.
[0100]
Когда антитело, используемое в настоящем изобретении, используют в качестве фармацевтической композиции, его можно формулировать с помощью способа, известного специалистам в данной области. Например, его можно использовать парентерально в форме парентеральной инъекции асептического раствора, содержащего воду или фармакологически приемлемый неводный раствор, или жидкой суспензии. Например, в одном возможном случае его можно формулировать при комбинированном использовании фармакологически приемлемого носителя или среды или добавки и, в частности, стерилизованной воды, физиологического раствора, растительного масла, эмульсификатора, суспензии, поверхностно-активного средства, стабилизатора, ароматизатора, эксципиента, носителя, консерванта или связывающего средства подходящим образом посредством смешивания в стандартной дозированной форме, необходимой для общепринятого фармацевтического состава. Количество активного ингредиента в составе определяют так, что можно достичь подходящей дозы в указанном диапазоне.
[0101]
Асептическую композицию для инъекционных целей можно формулировать в соответствии с общей практикой формулирования с использованием носителя, такого как дистиллированная вода для инъекционных целей.
[0102]
(TM)
Примеры водного раствора для инъекционных целей включают физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия. Такой раствор можно использовать с подходящим способствующим растворению средством. Примеры такого способствующего растворению средства включают спирты, такие как этанол и многоатомный спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, и неионные поверхностно-активные средства, такие как полисорбат 80 и HCO-60.
[0103]
Примеры маслянистой жидкости включают сезамовое масло и соевое масло. Такую маслянистую жидкость можно использовать в комбинации со способствующим растворению средством, таким как бензилбензоат или бензиловый спирт. Кроме того, ее можно смешивать с буферным средством, таким как раствор фосфатного буфера, раствор натрий-ацетатного буфера, успокаивающим средством, таким как прокаина гидрохлорид, стабилизатором, таким как бензиловый спирт, фенол или антиоксидант. В целом, сформулированный инъекционный раствор вводят в достатке.
[0104]
Вышеуказанную фармацевтическую композицию вводят перорально или парентерально. Предпочтительно, ее вводят парентерально. Конкретные примеры дозированных форм включают инъецируемую дозированную форму, интраназально вводимую дозированную форму, транспульмонально вводимую дозированную форму и чрескожно вводимую дозированную форму. Например, инъецируемую дозированную форму можно вводить системно или локально через внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию или подкожную инъекцию. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению можно вводить непосредственно в опухоль с помощью местного введения, такого как инъекция, инфузия или имплантация состава с замедленным высвобождением, в опухоль.
[0105]
Кроме того, способ введения можно надлежащим образом определять в зависимости от возраста, массы, пола и симптомов пациента. Однократную дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, можно выбирать в диапазоне, например, от 0,0001 мг до 1000 мг на кг массы тела. Альтернативно, дозу можно выбирать в диапазоне, например, от 0,001 до 100000 мг на организм пациента; однако она не обязательно ограничена этим. Дозу и способ введения меняют в зависимости от возраста, массы, пола и симптомов пациента. Однако специалисты в данной области могут надлежащим образом выбирать дозу и способ.
[0106]
Злокачественную опухоль, описанную выше, в частности, злокачественную опухоль, экспрессирующую MCEMP1 на клеточной поверхности, предпочтительно лейкоз, миелодиспластический синдром, остеосаркому, тимому, мастоцитому или перианальную аденокарциному, можно лечить и/или предотвращать посредством введения субъекту антитела по настоящему изобретению или его фрагмента или фармацевтической композициий, содержащей его.
[0107]
Кроме того, способ лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, который включает введение, субъекту, фармацевтической композиции (или лекарственного средства) по настоящему изобретению в комбинации с противоопухолевым средством, как перечислено выше, или фармацевтической композиции (или лекарственного средства), содержащей противоопухолевое средство, также включен в настоящее изобретение. Целевая злокачественная опухоль представляет собой то же, что и выше. Антитело или его фрагмент в соответствии с настоящим изобретением и противоопухолевое средство можно вводить субъекту параллельно или отдельно. В случае их отдельного введения, любую из фармацевтических композиций можно вводить первой или последней, и их интервалы дозирования, дозы, пути введения и число доз может надлежащим образом выбирать врач-специалист. В случае их параллельного введения, например, в настоящее изобретение также включена фармацевтическая композиция в дозированной форме, получаемой посредством смешивания антитела или его фрагмента в соответствии с настоящим изобретением и противоопухолевего средства в фармакологически приемлемом носителе (или среде) для состава. Описание прописи, состава, путей введения, доз, злокачественных опухолей и т. д., касающихся фармацевтических композиций и дозированных форм, содержащих антитела по настоящему изобретению можно, применять ко всем фармацевтическим композициям и дозированным формам, содержащим противоопухолевые средства.
[0108]
Соответственно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической комбинации для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и фармацевтическую композицию, содержащую противоопухолевое средство, как перечислено выше, и способу лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, который включает их введение. Кроме того, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит антитело по настоящему изобретению или его фрагмент и противоопухолевое средство вместе с фармакологически приемлемым носителем и/или добавкой.
Примеры
[0109]
Настоящее изобретение далее описано более подробно со ссылкой на следующие примеры, хотя объем настоящего изобретения не ограничен этим.
[0110]
Пример 1: идентификация нового антигенного белка злокачественной опухоли способом SEREX
(1) Конструирование библиотеки кДНК
Общую РНК экстрагировали из ткани семенника здоровой собаки способом с кислым гуанидинием-фенолом-хлороформом и затем очищали полиA РНК в соответствии с протоколами, включенными в Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).
[0111]
6
Фаговую библиотеку кДНК семенника собаки синтезировали с использованием полученной таким образом мРНК (5 мкг). Фаговую библиотеку кДНК конструировали с использованием cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit и ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE) в соответствии с протоколами, включенными в наборы. Размер сконструированной таким образом фаговой библиотеки кДНК составлял 1 × 10 БОЕ/мл.
[0112]
(2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки
Иммунный скрининг осуществляли с использованием сконструированной выше фаговой библиотеки кДНК семенника собаки. В частности, организм-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') инфицировали фагом на чашке с агарозой NZY (Φ90 × 15 мм) с тем, чтобы получать приблизительно 2500 клонов. Клетки E. coli культивировали при 42°C в течение от 3 до 4 часов для того, чтобы формировать бляшки. Чашку накрывали нитроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science), импрегнированной с использованием IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид), при 37°C на 4 часа с тем, чтобы индуцировать, экспрессировать и затем перенести белок на мембрану. Потом брали мембрану и затем погружали в TBS (10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl и pH 7,5), содержащий 0,5% порошковое снятое молоко, после чего следовало встряхивание в течение ночи при 4°C, и тем самым подавляли неспецифическую реакцию. Проводили реакцию фильтра с 500-кратно разведенной сывороткой пациента-собаки при комнатной температуре в течение от 2 до 3 часов.
[0113]
3
В качестве вышеуказанной сыворотки пациента-собаки использовали сыворотку, собранную у пациента-собаки с лейкозом. Эти сыворотки хранили при -80°C и затем подвергали предварительной обработке незамедлительно перед использованием. Способ предварительной обработки сыворотки представляет собой следующее. В частности, организм-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') инфицировали с использованием фагаλ ZAP Express, в который не вставляли чужеродный ген, и затем культивировали в течение ночи на среде NZY для чашек при 37°C. Впоследствии в чашку добавляли буфер (0,2 M NaHCO и pH 8,3), содержащий 0,5 M NaCl, чашку оставляли стоять при 4°C в течение 15 часов, и затем собирали супернатант в виде экстракта Escherichia coli/фага. Затем собранный таким образом экстракт Escherichia coli/фага наносили на NHS-колонку (GE Healthcare Bio-Science) с тем, чтобы иммобилизовать белок, полученный из Escherichia coli•фага. Сыворотку пациента-собаки наносили на колонку с иммобилизованным белком для реакции и затем антитело, адсорбированное на Escherichia coli и фаге, удаляли из сыворотки. Фракцию сыворотки, которая проходила через колонку, разводили 500-кратно в TBS, содержащем 0,5% порошковое снятое молоко. Получаемое использовали в качестве материала иммунного скрининга.
[0114]
4
Вышеуказанную мембрану, на которую переносили промакиванием обработанную сыворотку и белок, промывали 4 раза в TBS-T (0,05% Tween20/TBS) и затем проводили реакцию с IgG козы против собаки (Goat anti-Dog IgG-h+L HRP conjugated (BETHYL Laboratories)), разведенным 5000-кратно в TBS, содержащем 0,5% порошковое снятое молоко, в качестве вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре. Обнаружение осуществляли через ферментативную цветную реакцию с использованием реакционного раствора NBT/BCIP (Roche). Колонии, которые соответствовали участкам, положительным по цветной реакции, собирали с чашки с агарозой NZY (Φ90 × 15 мм) и затем лизировали в 500 мкл буфера SM (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO, 50 мМ Tris-HCl, 0,01% желатин и pH 7,5). Пока не унифицировали колонии, положительные по цветной реакции, вторичный скрининг и третичный скрининг повторяли с тем, чтобы осуществлять скрининг приблизительно 10000 фаговых клонов, реагирующих с IgG сыворотки, с помощью способа, схожего с приведенным выше. Таким образом, выделяли 1 положительный клон.
[0115]
(3) Поиск гомологии для выделенного гена антигена
Для анализа нуклеотидной последовательности 1 положительного клона, выделенного вышеуказанным способом, осуществляли процедуру превращения из фаговых векторов в плазмидные векторы. В частности, получали 200 мкл раствора, содержащего организм-хозяин Escherichia coli (XL1-Blue MRF') с тем, чтобы поглощение OD600 составляло 1,0. Раствор смешивали со 100 мкл раствора очищенного фага и затем с 1 мкл хелперного фага ExAssist (STRATAGENE), после чего следовало 15 минут реакции при 37°C. Добавляли три (3) мл среды LB и затем осуществляли культивирование при 37°C в течение от 2,5 до 3 часов. Незамедлительно после культивирования температуру раствора поддерживали на 70°C с помощью водяной бани в течение 20 минут, осуществляли центрифугирование при 4°C и 1000 ×g в течение 15 минут и затем супернатант собирали в виде раствора фагмиды. Впоследствии получали 200 мкл раствора, содержащего организм-хозяин фагмиды Escherichia coli (SOLR) с тем, чтобы поглощение OD600 составляло 1,0. Раствор смешивали с 10 мкл раствора очищенного фага, после чего следовало 15 минут реакции при 37°C. Раствор (50 мкл) высевали на агаровую среду LB, содержащую ампициллин (конечная концентрация 50 мкг/мл) и затем культивировали в течение ночи при 37°C. Собирали одну трансформированную SOLR колонию и затем осуществляли культивирование в среде LB, содержащей ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл), при 37°C. ДНК плазмиды, содержащей вставку, представляющую интерес, очищали с использованием QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN).
[0116]
Очищенную плазмиду подвергали анализу последовательности полноразмерной вставки с помощью способа прогулки праймеров, используя праймер T3 с SEQ ID № 17 и праймер T7 с SEQ ID № 18. В результате анализа последовательности получали последовательность гена SEQ ID № 3. Осуществляли программу поиска идентичности последовательностей, поиск BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), с использованием нуклеотидной последовательности генов и ее аминокислотной последовательности. В результате этого поиска идентичности последовательностей в известных генах обнаружено, что полученный ген представлял собой ген MCEMP1. Идентичность последовательностей с MCEMP1 человека, гомологом человека для MCEMP1 собаки, составляла 70% в отношении нуклеотидной последовательности и 51% в отношении аминокислотной последовательности. Идентичность последовательностей с MCEMP1 кошки составляла 83% в отношении нуклеотидной последовательности и 64% в отношении аминокислотной последовательности. Идентичность последовательностей с MCEMP1 мыши, гомологом мыши для MCEMP1 собаки, составляла 65% в отношении нуклеотидной последовательности и 47% в отношении аминокислотной последовательности. Нуклеотидная последовательность MCEMP1 человека представлена в SEQ ID № 1 и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID № 2. Нуклеотидная последовательность MCEMP1 кошки представлена в SEQ ID № 5 и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID № 6. Нуклеотидная последовательность MCEMP1 мыши представлена в SEQ ID № 7 и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID № 8.
[0117]
(4) Анализ экспрессии генов в каждой ткани
6
Экспрессию гена, полученного вышеуказанным способом, в различных нормальных тканях, различных опухолевых тканях и различных клеточных линиях злокачественных опухолей собаки, человека и мыши исследовали с помощью способа RT-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Реакцию обратной транскрипции осуществляли следующим образом. В частности, общую РНК экстрагировали из каждой ткани (от 50 мг до 100 мг) и каждой клеточной линии (от 5 до 10 × 10 клеток) с использованием реактива TRIZOL (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколами, приложенными к нему. кДНК синтезировали с использованием общей РНК и Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколами, включенными в набор. Gene Pool cDNA (Thermo Fisher Scientific), QUICK-Clone cDNA (Clontech Laboratories, Inc.) и Large-Insert cDNA Library (Clontech Laboratories, Inc.) использовали как кДНК из нормальных тканей человека (головного мозга, семенника, ободочной кишки и плаценты). ПЦР осуществляли следующим образом с использованием праймеров со специфичностью к полученному гену (праймеры собаки: SEQ ID №№ 19 и 20, праймеры человека: SEQ ID №№ 21 и 22, праймеры мыши: SEQ ID №№ 23 и 24). В частности, ПЦР осуществляли посредством повторения 30 раз цикла из 94°C/30 с, 55°C/30 с и 72°C/1 минута с использованием Thermal Cycler (BIO RAD), и реакционный раствор корректировали до общего количества 25 мкл через добавление каждого реактива и приложенного буфера (0,25 мкл образца кДНК, полученной с помощью реакции обратной транскрипции, вышеуказанные праймеры (2 мкМ каждого), dNTP (0,2 мМ каждого) и 0,65 Ед полимеразы ExTaq (Takara Shuzo)). В результате, как показано на фиг. 1, наблюдали сильную экспрессию гена MCEMP1 собаки в мастоцитоме и перианальной аденокарциноме в случае опухолевых тканей собаки (фиг. 1). Кроме того, экспрессию гена MCEMP1 человека не наблюдали почти во всех здоровых тканях человека. С другой стороны, сильную экспрессию гена MCEMP1 человека наблюдали в клеточных линиях лейкоза, миелодиспластического синдрома и остеосаркомы в случае клеток злокачественных опухолей человека (фиг. 2). Кроме того, экспрессию гена MCEMP1 мыши обнаруживали в клеточных линиях лейкоза, меланомы и нейробластомы (фиг. 3).
[0118]
Пример: 2 получение белка MCEMP1 человека
(1) Клонирование полноразмерной кДНК, кодирующей MCEMP1 человека, и кДНК, кодирующей внеклеточную область MCEMP1 человека
Полноразмерную кДНК, кодирующую MCEMP1 человека, клонировали с помощью следующего способа на основании гена с SEQ ID № 1, полученного в примере 1. ПЦР осуществляли посредством повторения 30 раз цикла из 98°C/10 с, 55°C/15 с и 72°C/1 минута с использованием Thermal Cycler (BIO RAD), и реакционный раствор корректировали до общего количества 50 мкл через добавление каждого реактива и приложенного буфера (1 мкл кДНК (каждая из различных кДНК, извлеченных из тканей/клеток, которые получали в примере 1, и для которых наблюдали экспрессию с помощью RT-ПЦР), праймеров 2 типов (0,4 мкМ каждого; SEQ ID №№ 25 и 26), содержащих последовательности расщепления рестрикционных ферментов EcoRI и NotI, 0,2 мМ dNTP, 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo)). Вышеуказанные праймеры 2 типов использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность с SEQ ID № 2. После ПЦР, амплифицированную таким образом ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и затем фрагмент ДНК приблизительно 0,6 т. п. о. очищали с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Полученный таким образом продукт ПЦР амплификации вставляли в pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific) (далее в настоящем описании получаемое обозначают как MCEMP1 человека/pcDNA3.1). Продукт амплификации также подтверждали посредством секвенирования с использованием секвенатора ДНК, чтобы иметь последовательность кДНК, кодирующую MCEMP1 человека. Последовательность, представленная в SEQ ID № 1, представляет собой нуклеотидную последовательность гена MCEMP1 человека, а последовательность, представленная в SEQ ID № 2, представляет собой аминокислотную последовательность белка MCEMP1 человека.
[0119]
Кроме того, осуществляли ПЦР на основании SEQ ID № 1 посредством повторения 30 раз цикла из 98°C/10 с, 55°C/15 с и 72°C/30 с, используя Thermal Cycler (BIO RAD), и реакционный раствор корректировали до общего количества 50 мкл через добавление каждого реактива и приложенного буфера (праймеры 2 типов (0,4 мкМ каждого; SEQ ID №№ 27 и 28), содержащие последовательности расщепления рестрикционных ферментов KpnI и EcoRI, 0,2 мМ dNTP, 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo)). Вышеуказанные праймеры 2 типов использовали для амплификации области, кодирующей SEQ ID № 10, содержащей аминокислотную последовательность внеклеточной области белка MCEMP1, в SEQ ID № 1. После ПЦР, амплифицированную таким образом ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и затем фрагмент ДНК приблизительно в 0,3 т. п. о. очищали с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Полученный таким образом продукт ПЦР амплификации лигировали в pSecTagB (Thermo Fisher Scientific), имеющую вставку кДНК, кодирующей белок IgG2a Fc мыши, чтобы получать экспрессирующий вектор, кодирующий внеклеточную область MCEMP1 человека/слитый белок IgG2a Fc мыши (далее в настоящем описании обозначают как hMCEMP1ECD-mIgG2aFc) (далее в настоящем описании получаемый экспрессирующий вектор обозначают как hMCEMP1ECD-mIgG2aFc). Продукт амплификации также подтверждали посредством секвенирования с использованием секвенатора ДНК, чтобы иметь последовательность кДНК, кодирующую hMCEMP1ECD-mIgG2aFc. Последовательность, представленная в SEQ ID № 29, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую hMCEMP1ECD-mIgG2aFc, и последовательность, представленная в SEQ ID № 30, представляет собой аминокислотную последовательность hMCEMP1ECD-mIgG2aFc.
[0120]
(2) Получение hMCEMP1ECD-mIgG2aFc
hMCEMP1ECD-mIgG2aFc получали в качестве иммунизирующего антигена для получения антител к MCEMP1.
[0121]
Экспрессирующий вектор pSecB-hMCEMP1ECD-mIgG2aFc вводили способом липофекции в линию клеток почки эмбриона человека HEK293 и осуществляли очистку hMCEMP1ECD-mIgG2aFc от культурального супернатанта, получаемого через 7 суток после введения. Культуральный супернатант наносили на колонку Hi Trap Protein A HP (GE Healthcare Bio-Science), которую затем промывали связывающим буфером (20 мМ фосфат натрия (pH 7,0)), после чего следовало элюирование с использованием элюирующего буфера (0,1 M глицин-HCl (pH 2,7)). Элюаты незамедлительно нейтрализовали посредством элюирования в пробирку с добавлением буфера для нейтрализации (1 M Tris-HCl (pH 9,0)). Затем буфер в элюатах, полученных вышеуказанным способом, заменяли на физиологический фосфатный буфер (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), используя ультрафильтрование NANOSEP 10K OMEGA (PALL). Стерильное фильтрование осуществляли с использованием 0,22-мкм HT Tuffryn Acrodisc (PALL) и затем получаемое использовали для следующих экспериментов.
[0122]
Пример 3: получение поликлонального антитела, связывающегося со внеклеточной областью MCEMP1
(1) Получение поликлонального антитела к MCEMP1
Для получения антитела, связывающегося со внеклеточной областью MCEMP1, hMCEMP1ECD-mIgG2aFc (0,1 мг), полученную как описано выше, в качестве антигена смешивали с раствором полного адъюванта Фрейнда (CFA) в количестве, эквивалентном ей. Смесь подкожно вводили мыши 4 раза каждые 2 недели. Впоследствии кровь собирали с тем, чтобы получать антисыворотку, содержащую поликлональное антитело. Кроме того, антисыворотку очищали с использованием носителя белка G (GE Healthcare Bio-Sciences) и затем получали поликлональное антитело против hMCEMP1ECD-mIgG2aFc. Кроме того, антитело, полученное посредством очистки сыворотки мышей, которым не вводили антиген, с использованием носителя белка G, описанным выше образом, обозначали как контрольное антитело.
[0123]
(2) Создание клеток, стабильно экспрессирующих полноразмерный MCEMP1 человека
MCEMP1 человека/pcDNA3.1, полученную как описано выше, вводили способом липофекции в клетки CHO-K1 (ATCC) и затем осуществляли отбор с использованием 500 мкг/мл G418 (Nacalai Tesque, Inc.) для создания клеточной линии CHO, стабильно экспрессирующей полноразмерный MCEMP1 человека (CHO-MCEMP1 человека). Клетки, полученные посредством введения экспрессирующего вектора (далее в настоящем описании обозначаемого как emp/pcDNA3.1), не имеющего вставки кДНК, кодирующей MCEMP1, и последующего проведения отбора описанным выше образом, обозначали как контрольные клетки (далее в настоящем описании обозначаемые как CHO-emp).
[0124]
(3) Анализ экспрессии антигенного белка на клеточной поверхности
6
Затем исследовали, реагировало ли или нет поликлональное антитело, полученное выше в (1), специфически с MCEMP1, экспрессированным на поверхностях клеток, созданных выше в (2). Клетки CHO-MCEMP1 человека или клетки CHO-emp (10 кажджых клеток) центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Туда добавляли поликлональное антитело против MCEMP1 (2 мкг) (5 мкл), полученное выше в (1). Получаемое дополнительно суспендировали в PBS, содержащем 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, получаемое суспендировали в PBS, содержащем FITC-меченное антитело козы против IgG мыши (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (5 мкл) и 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (FBS) (95 мкл) и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Между тем, процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли с использованием контрольного антитела, полученного выше в (1), вместо поликлонального антитела против MCEMP1, чтобы получать контроль. Как результат, обнаруживали увеличение интенсивности флуоресценции 208% в клетках CHO-MCEMP1 человека, к которым добавляли антитело против MCEMP1 человека, по сравнению с контролем. Между тем, процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли для клеток CHO-emp. Как результат, обнаруживали увеличение интенсивности флуоресценции 0% в клетках CHO-emp, к которым добавляли антитело против MCEMP1 человека, по сравнению с контролем. На основании вышеуказанного, обнаружено, что антитело против MCEMP1 человека способно специфично связываться с белком MCEMP1, экспрессированным на поверхностях клеточных мембран. Кроме того, степень увеличения интенсивности флуоресценции представляют с помощью степени увеличения средней интенсивности флуоресценции (значение MFI) в клетках. Ее вычисляли с помощью следующего уравнения.
[0125]
Степень увеличения средней интенсивности флуоресценции (степень увеличения интенсивности флуоресценции) (%)=((значение MFI для клеток, реагировавших с антителом против MCEMP1 человека) - (контрольное значение MFI))/(контрольное значение MFI) × 100
[0126]
6
Затем исследовали, экспрессирован ли или нет белок MCEMP1 на клеточных поверхностях клеточных линий лейкоза 2 типов (U937 и THP-1) и клеточной линии миелодиспластического синдрома 1 типа (MDS92), у которых экспрессию гена MCEMP1 убедительно подтверждали. Каждую клеточную линию человека (10 клеток), в которой экспрессию гена подтверждали, как описано выше, центрифугировали в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Туда добавляли поликлональное антитело против MCEMP1 (2 мкг) (5 мкл), полученное выше в (1). Получаемое дополнительно суспендировали в PBS, содержащем 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (95 мкл) и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, получаемое суспендировали в PBS, содержащем FITC-меченное антитоело козы против IgG мыши (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (5 мкл) и 0,1% эмбриональную телячью сыворотку (FBS) (95 мкл), и затем оставляли стоять на льду в течение 1 часа. После промывания в PBS, интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Между тем, процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли с использованием контрольного антитела, полученного выше в (1), вместо поликлонального антитела против MCEMP1, чтобы получать контроль. Как результат, обнаруживали, что интенсивность флуоресценции была по меньшей мере на 30% сильнее во всех клетках, к которым добавляли антитело против MCEMP1 человека, чем в контрольных клетках. В частности, подтверждали следующее увеличение интенсивности флуоресценции: U937: 175%, THP-1: 123% и MDS92: 137%. На основании вышеуказанного подтверждено, что белок MCEMP1 экспрессирован на поверхностях клеточных мембран вышеуказанных клеточных линий злокачественных опухолей человека.
[0127]
Кроме того, степень увеличения интенсивности флуоресценции представляют с помощью степень увеличения средней интенсивности флуоресценции (значение MFI) в клетках. Ее вычисляли с помощью следующего уравнения.
[0128]
Степень увеличения средней интенсивности флуоресценции (степень увеличения интенсивности флуоресценции) (%)=((значение MFI клеток, реагировавших с антителом против MCEMP1 человека) - (контрольное значение MFI))/(контрольное значение MFI) × 100
[0129]
Пример 4: противоопухолевые эффекты (активность ADCC) поликлонального антитела против MCEMP1 на клетках злокачественной опухоли
6
3
5
Далее исследовали, способно ли или нет поликлональное антитело против MCEMP1 повреждать MCEMP1-экспрессирующие опухолевые клетки. Оценку осуществляли с использованием поликлонального антитела против MCEMP1 человека, полученного в примере 3. Клеточную линию лейкоза U937 и клеточную линию миелодиспластического синдрома MDS92 человека (10 каждых клеток), в которых подтверждали экспрессию MCEMP1, отдельно собирали в 50 мл центрифужную пробирку. Туда добавляли хром-51 (100 мкКи), после чего следовала инкубация при 37°C в течение 2 часов. После этого клетки промывали 3 раза в среде RPMI1640, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку, и добавляли в лунки (10 клеток на лунку) в 96-луночные планшеты с V-образным дном. Туда добавляли вышеуказанное поликлональное антитело против MCEMP1 человека (1 мкг на лунку). Кроме того, туда добавляли лимфоциты, выделенные из периферической крови мыши (2 × 10 клеток на лунку), после чего следовало культивирование в условиях 37°C и 5% CO2 в течение 4 часов. После культивирования, в каждом культуральном супернатанте определяли уровень хрома (Cr) 51, высвобождаемого из поврежденных опухолевых клеток. Затем вычисляли активность ADCC поликлонального антитела против MCEMP1 человека в отношении клеток злокачественной опухоли. В результате подтверждали активности ADCC против клеток U937 (18,1%) и клеток MDS92 (17,3%) (см. фиг. 4). Между тем, по существу не наблюдали активность против каждой клеточной линии в случае, когда процедуру, схожую с вышеуказанным, осуществляли с использованием контрольного антитела, полученного из периферической крови мыши, которую не иммунизировали антигеном (пример 3), или в случае, когда антитело не добавляли (см. фиг. 4). Соответственно, обнаружено, что MCEMP1-экспрессирующие опухолевые клетки можно повреждать посредством индукции активности ADCC с использованием антитела против MCEMP1.
[0130]
3
Кроме того, для цитотоксической активности (активности ADCC) на фиг. 4, антитело против MCEMP1, используемое в настоящем изобретении, лимфоциты мыши и 10 клеток вышеуказанных клеточных линий, содержащих хром 51, смешивали вместе и культивировали в течение 4 часов и затем определяли уровень хрома-51, высвобождаемого в среду, как описано выше. Затем цитотоксическую активность клеточной линии лейкоза вычисляли с помощью следующих уравнений.
*Уравнение: цитотоксическая активность (%)=[(уровень хрома-51, высвобождаемого из U937, к которым добавляли антитело против MCEMP1 и лимфоциты мыши)/(уровень хрома-51, высвобождаемого из целевых клеток, к которым добавляли 1 Н соляную кислоту)] × 100
Промышленная применимость
[0131]
Антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предотвращения злокачественных опухолей.
[0132]
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  TORAY INDUSTRIES, INC.
<120>  ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
<130>  PH-6864-PCT
<150>  JP 2016-064035
<151>  2016-03-28
<160>  30
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  1326
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  CDS
<222>  (26)..(589)
<400>  1
tggacaaatt tgcgggctgg ggacc atg gaa gtg gag gaa atc tac aag cac         52
Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His
1               5
cag gaa gtc aag atg caa gca cca gcc ttc agg gac aag aaa cag ggg        100
Gln Glu Val Lys Met Gln Ala Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly
10                  15                  20                  25
gtc tca gcc aag aat caa ggt gcc cat gac cca gac tat gag aat atc        148
Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile
30                  35                  40
acc ttg gcc ttc aaa aat cag gac cat gca aag ggt ggt cat tca cga        196
Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg
45                  50                  55
ccc acg agc caa gtc cca gcc cag tgc agg ccg ccc tca gac tcc acc        244
Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr
60                  65                  70
cag gtc ccc tgc tgg ttg tac aga gcc atc ctg agc ctg tac atc ctc        292
Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu
75                  80                  85
ctg gcc ctg gcc ttt gtc ctc tgc atc atc ctg tca gcc ttc atc atg        340
Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met
90                  95                  100                 105
gtg aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag        388
Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu
110                 115                 120
ctt tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag        436
Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys
125                 130                 135
aga ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag        484
Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys
140                 145                 150
att gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca        532
Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr
155                 160                 165
aag gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca        580
Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser
170                 175                 180                 185
cct caa taa atgagaggac attgtggcag ccaaagccac aacttggaag                629
Pro Gln
atggggctgc acctgccaac gaagacggga aatgaccccc cccccccagc ctagtgtgaa      689
cctgcccctc gtcccacgta tagaaaaacc tcgagtcatg gtgaatgagt gtctcggagt      749
tgctcgtgtg tgtgtacacc tgcgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgcgcgtg tgttcgtgta      809
tgtgcgtgtg tgcgtgcgcg tgtgtgtgca ttttgcaaag ggtggacatt tcagtgtatc      869
tcccagaaag gtgatgaatg aataggactg agagtcacag tgaatgtggc atgcatgcct      929
gtgtcatgtg acatatgtga gtctcggcat gtcacggtgg gtggctgtgt ctgagcacct      989
ccagcagatg tcactctgag tgtgggtgtt ggtgacatgc attgcacggg cctgtctccc     1049
tgtttgtgta aacatactag agtatactgc ggcgtgtttt ctgtctaccc atgtcatggt     1109
gggggagatt tatctccgta catgtgggtg tcgccatgtg tgccctgtca ctatctgtgg     1169
ctgggtgaac ggctgtgtca ttatgagtgt gccgagttat gccaccctgt gtgctcaggg     1229
cacatgcaca cagacattta tctctgcact cacattttgt gacttatgaa gataaataaa     1289
gtcaagggaa aacagcgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa                              1326
<210>  2
<211>  187
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His Gln Glu Val Lys Met Gln Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly
20                  25                  30
Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln
35                  40                  45
Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala
50                  55                  60
Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu
85                  90                  95
Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met Val Lys Asn Ala Glu Met Ser
100                 105                 110
Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser
115                 120                 125
Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln
130                 135                 140
Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr
145                 150                 155                 160
Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu
165                 170                 175
Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro Gln
180                 185
<210>  3
<211>  1124
<212>  ДНК
<213>  Canis familiaris
<220>
<221>  CDS
<222>  (66)..(689)
<400>  3
ctcatctgcc atgacacctt ccggtgggtg gggatgtgtg tgggtaaact ggcccactgg       60
gaacc atg gag tct gag gaa atc tac acg aat cag aag gtc gag atg cag      110
Met Glu Ser Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Gln Lys Val Glu Met Gln
1               5                   10                  15
gca gcc ttc aaa gac aag aaa cag agg gtc cca gct gat aag gaa ggt        158
Ala Ala Phe Lys Asp Lys Lys Gln Arg Val Pro Ala Asp Lys Glu Gly
20                  25                  30
gca gat aac cct gac tat gag aat atc acc ttg gcc ttc aga aac cag        206
Ala Asp Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Gln
35                  40                  45
gac cag cca aag ggc agc cat tta cca ccc aag aat cag agc aag cag        254
Asp Gln Pro Lys Gly Ser His Leu Pro Pro Lys Asn Gln Ser Lys Gln
50                  55                  60
cca cct gcc agg aca cat cac acg gcc ttg gga ggg gcc cac gtc cca        302
Pro Pro Ala Arg Thr His His Thr Ala Leu Gly Gly Ala His Val Pro
65                  70                  75
acc ctg tct agg ctg ccc tca gac tct ggc cag ctc ccc cgt tgt ctg        350
Thr Leu Ser Arg Leu Pro Ser Asp Ser Gly Gln Leu Pro Arg Cys Leu
80                  85                  90                  95
cac aga gtc atc atg agc ctg tac atg ctc ctc gcc ctg tcc tgc atc        398
His Arg Val Ile Met Ser Leu Tyr Met Leu Leu Ala Leu Ser Cys Ile
100                 105                 110
att ctc tta gtc ttg gtc ctc atg aag aat ctg gag atg tcc cag gag        446
Ile Leu Leu Val Leu Val Leu Met Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu
115                 120                 125
ttg ctg gcc ctg aaa agg gag ctc tgg aat gtg tcc gtc tcg gtg caa        494
Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln
130                 135                 140
gag tgc cag gag cag cag aat cag ggc tgg agc acc gtc cgg cag ctc        542
Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu
145                 150                 155
ctg gtg gag gcc aag cgt gac att tcc atg gtc ggg aga aat gcc cag        590
Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln
160                 165                 170                 175
ctt gcg agt gag aag gtg aag acg ctg aca gca gac ata agc cat atc        638
Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile
180                 185                 190
aag agt aag tta cag gaa atc tcc aag atg ctg gag aag cca aag cca        686
Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro
195                 200                 205
tag acctcaacat acgcgaggac atcgaagccc tggctgcagc ttggcggacg             739
gggctgcgcc tcccagtgaa gatggccacg tgtgtgcacc acgtgtgttg tgagcctaag      799
gcgtgacaca gtgggtggct gtgtcagcag ggaccacgaa agtgtgtcag cgtgttgttg      859
gcagcatgtg tagcaccgtg aacgcgtgtg actgtcctgt ggtatgttgt gtgtaaatgt      919
gtcacggcag agccgtggcg ggggcacccc acgtgtcact gtaattgtgg gtgccctgtc      979
actacctgtg ttggtgtgaa caggtgtctg ccaacgagcg actgaggatg tcacggaggg     1039
ggttcggagc atgtacacat gtatgtccat ttgttcccgc gctcacgttg tgtgatttgt     1099
gaagataaag gccgatggaa aagaa                                           1124
<210>  4
<211>  207
<212>  Белок
<213>  Canis familiaris
<400>  4
Met Glu Ser Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Gln Lys Val Glu Met Gln Ala
1               5                   10                  15
Ala Phe Lys Asp Lys Lys Gln Arg Val Pro Ala Asp Lys Glu Gly Ala
20                  25                  30
Asp Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Gln Asp
35                  40                  45
Gln Pro Lys Gly Ser His Leu Pro Pro Lys Asn Gln Ser Lys Gln Pro
50                  55                  60
Pro Ala Arg Thr His His Thr Ala Leu Gly Gly Ala His Val Pro Thr
65                  70                  75                  80
Leu Ser Arg Leu Pro Ser Asp Ser Gly Gln Leu Pro Arg Cys Leu His
85                  90                  95
Arg Val Ile Met Ser Leu Tyr Met Leu Leu Ala Leu Ser Cys Ile Ile
100                 105                 110
Leu Leu Val Leu Val Leu Met Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu Leu
115                 120                 125
Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu
130                 135                 140
Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu
145                 150                 155                 160
Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu
165                 170                 175
Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys
180                 185                 190
Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro
195                 200                 205
<210>  5
<211>  1416
<212>  ДНК
<213>  Felis catus
<220>
<221>  CDS
<222>  (24)..(641)
<400>  5
tctgcttgaa tcaggaggtc agg atg caa gca gca gac ttc aaa ggc aag aaa       53
Met Gln Ala Ala Asp Phe Lys Gly Lys Lys
1               5                   10
cag agg gcc cca gac cat aag gaa ggt tcg gta cct caa ggt gca gac        101
Gln Arg Ala Pro Asp His Lys Glu Gly Ser Val Pro Gln Gly Ala Asp
15                  20                  25
cct gac tat gag aat atc acc ttg acc ttc aga aac cag gag caa cca        149
Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Thr Phe Arg Asn Gln Glu Gln Pro
30                  35                  40
agg ggc agc cat tca cca ccc aag aat cga ggc aag cag cca cct gcc        197
Arg Gly Ser His Ser Pro Pro Lys Asn Arg Gly Lys Gln Pro Pro Ala
45                  50                  55
agc ccg cac ctc aca gcc tcg gga ggg gcc cct gtc cca gcc tgg tcg        245
Ser Pro His Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Ala Trp Ser
60                  65                  70
aag cag gcc cca gac tct gcc cag gtc cct cgt tgg ctg cac aga gtc        293
Lys Gln Ala Pro Asp Ser Ala Gln Val Pro Arg Trp Leu His Arg Val
75                  80                  85                  90
acc ctg agc ctg tac atc ctc ctt gcc ctg ttc tgc atc gtt ctc ttg        341
Thr Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Phe Cys Ile Val Leu Leu
95                  100                 105
gcc ttg gtc ctg gtg aag aat tct gag gtg tcc cag gag ctg ctg gtc        389
Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val
110                 115                 120
gtg aaa agg gag ctc cag aat gtc tcc atc tcg gga caa cag tgt cag        437
Val Lys Arg Glu Leu Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln
125                 130                 135
gag gag cag aaa cag ggc tgg agc agc gtc cag cag ctc atc acg gag        485
Glu Glu Gln Lys Gln Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu
140                 145                 150
gcc agg cag gac att gac atg atc aag aga aat gtc cac atc ggg aac        533
Ala Arg Gln Asp Ile Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn
155                 160                 165                 170
gag aaa gtg aag acg ctg tca aca gac tta agc caa atc aag act aaa        581
Glu Lys Val Lys Thr Leu Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys
175                 180                 185
tta cat gaa atc tcc aag ata cta gag aag aag ccg cag cca cag ccc        629
Leu His Glu Ile Ser Lys Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro
190                 195                 200
aca gct caa taa atgagaagac attgacaccc aggctgcagc ttggaggacg            681
Thr Ala Gln
205
gggctgcact tccccgtgaa gacggccgca tgtgtgcctc atggtgtcac gggagcgata      741
acacatgata cagtgggcgg ctgtgtcagc aaggaccgca gaagtgtgtc agcctgggcg      801
cgggtgttgg taacacgtgt tgcactgtga acacgtgtga atgtcctgtg gtatgttgtg      861
tgtgaatgtc atggagctgt gtgtgtgtgt gcgcgtgcgt gtgtgtgtgt ggagcacccc      921
ctacatcact gtaactgcgg gtgttgaggg tgtaccccgt cactccctgt gttgtgtgaa      981
caggtgggtg tcagtgtgtg actgattatg tcaccgaggg tgtgcagagc gggtacattt     1041
gtgcgttccc ttgtttctgc actcacgttt tgtgatttgt gacgataaag gccaatggga     1101
aagaatgtgg ctttcagatc tgttcctggg agcatctggg ggtgggggtg gggacccggt     1161
ggcggagggt ctgcaagtat taagggatga ggaaagtcac acagcaagca cgcggacgtg     1221
ataaccagga gccctggggg cacgagtgtg tgtgagcatg aatgccctga atgggtcctt     1281
ttgtgcccat gaacttgtac ccagcaagga acagtctccg tgtctgagac tgtgtgccca     1341
gcagggtttg tggcccgaga tatacactgt ttccctaagt ggggctcctg ggtggctcag     1401
tcggttaagc gtccg                                                      1416
<210>  6
<211>  205
<212>  Белок
<213>  Felis catus
<400>  6
Met Gln Ala Ala Asp Phe Lys Gly Lys Lys Gln Arg Ala Pro Asp His
1               5                   10                  15
Lys Glu Gly Ser Val Pro Gln Gly Ala Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile
20                  25                  30
Thr Leu Thr Phe Arg Asn Gln Glu Gln Pro Arg Gly Ser His Ser Pro
35                  40                  45
Pro Lys Asn Arg Gly Lys Gln Pro Pro Ala Ser Pro His Leu Thr Ala
50                  55                  60
Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Ala Trp Ser Lys Gln Ala Pro Asp Ser
65                  70                  75                  80
Ala Gln Val Pro Arg Trp Leu His Arg Val Thr Leu Ser Leu Tyr Ile
85                  90                  95
Leu Leu Ala Leu Phe Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Val Leu Val Lys
100                 105                 110
Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val Val Lys Arg Glu Leu Gln
115                 120                 125
Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln Glu Glu Gln Lys Gln Gly
130                 135                 140
Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu Ala Arg Gln Asp Ile Asp
145                 150                 155                 160
Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr Leu
165                 170                 175
Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser Lys
180                 185                 190
Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln
195                 200                 205
<210>  7
<211>  1132
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  CDS
<222>  (21)..(572)
<400>  7
acgtgaatca accaagcaga atg cat gca tca gcc tcc cag gat aag aac cgg       53
Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg
1               5                   10
agg aag cca ggt cat gat gaa ggt gct cac aat cct gac tac gag aat        101
Arg Lys Pro Gly His Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn
15                  20                  25
ata acc ttg gcc ttc aga aac aag gac caa ctc aaa ctc agc caa tca        149
Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser
30                  35                  40
aca ccc aca aaa caa gcc aag ttc aag aca tcc ctg gac cca gct gag        197
Thr Pro Thr Lys Gln Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu
45                  50                  55
tcc ccg cct tgg ttg tac aga acc att atg atg ttg tat gtt ctc ctt        245
Ser Pro Pro Trp Leu Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu
60                  65                  70                  75
gct ctc gtc ttt tta tcc tgc atc gtc ctc tct gct ttg gtc ttg gtg        293
Ala Leu Val Phe Leu Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val
80                  85                  90
aaa aat tct gag atg tcc aag gag ctg tgg acc ttg aaa gca gag ctt        341
Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu
95                  100                 105
tcg aat gtt tca gac acg gtg tgg aat atc cgg gag ctc cag aat cag        389
Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln
110                 115                 120
caa acg agg att tgg gaa gct gcc cag ggg gac atc aag gag gtc aag        437
Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys
125                 130                 135
aag acc ctt ggc aca gtc atg agt agc atc cag act gga aac gac cgg        485
Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg
140                 145                 150                 155
ctg aag act gtg ccg gca gat ata acc caa atc aag aaa act ctt gag        533
Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu
160                 165                 170
gcg cta gaa aag aag gca cag cct cag ccc agt aca taa gaggacacca         582
Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr
175                 180
cagcagtacc tgtgaagact ccgaattgca cctgctagtg aagatggcag atgggggtgg      642
gtactgagct tgagtgtgaa cctgccgtgc atcctcatat aaaaaagatt ctccaccagg      702
gggaatgagt gttgaagagg tgtgtatgca aatgagcatt tggggtttcc atgtattcca      762
ggagaagggt ttatggtgga aagagaacat ggcagtcaca gcaggtgtta ctctttatgg      822
gccacatagg tgtatgccct ggcttatgtg agtataggca tgtcctggtt ggcagctatt      882
cccgagaagt ccccaaagtg taagtgacat gtaggacatg cctccccatt ctcttgctca      942
tgtatgtgca tctggctgtt ctgtatgtgt gtcactgaag tggtgggtga tagacatcac     1002
cctggagatg tgtcatggca tgggtcattc ctagtgtttt tggtcatgtc agcttgtgtg     1062
ttcagggcat gcacacaaat gtagccatcg atttctgcac ttgtatttat gattcaagaa     1122
gataaatgcc                                                            1132
<210>  8
<211>  183
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<400>  8
Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg Arg Lys Pro Gly His
1               5                   10                  15
Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe
20                  25                  30
Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser Thr Pro Thr Lys Gln
35                  40                  45
Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu Ser Pro Pro Trp Leu
50                  55                  60
Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu Ala Leu Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Met
85                  90                  95
Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu Ser Asn Val Ser Asp
100                 105                 110
Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln Gln Thr Arg Ile Trp
115                 120                 125
Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys Lys Thr Leu Gly Thr
130                 135                 140
Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg Leu Lys Thr Val Pro
145                 150                 155                 160
Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu Ala Leu Glu Lys Lys
165                 170                 175
Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr
180
<210>  9
<211>  249
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(249)
<400>  9
gtg aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag         48
Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu
1               5                   10                  15
ctt tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag         96
Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys
20                  25                  30
aga ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag        144
Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys
35                  40                  45
att gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca        192
Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr
50                  55                  60
aag gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca        240
Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser
65                  70                  75                  80
cct caa taa                                                            249
Pro Gln
<210>  10
<211>  82
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu
1               5                   10                  15
Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys
20                  25                  30
Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys
35                  40                  45
Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr
50                  55                  60
Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser
65                  70                  75                  80
Pro Gln
<210>  11
<211>  267
<212>  ДНК
<213>  Canis familiaris
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(267)
<400>  11
aag aat ctg gag atg tcc cag gag ttg ctg gcc ctg aaa agg gag ctc         48
Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu
1               5                   10                  15
tgg aat gtg tcc gtc tcg gtg caa gag tgc cag gag cag cag aat cag         96
Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln
20                  25                  30
ggc tgg agc acc gtc cgg cag ctc ctg gtg gag gcc aag cgt gac att        144
Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile
35                  40                  45
tcc atg gtc ggg aga aat gcc cag ctt gcg agt gag aag gtg aag acg        192
Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr
50                  55                  60
ctg aca gca gac ata agc cat atc aag agt aag tta cag gaa atc tcc        240
Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser
65                  70                  75                  80
aag atg ctg gag aag cca aag cca tag                                    267
Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro
85
<210>  12
<211>  88
<212>  Белок
<213>  Canis familiaris
<400>  12
Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu
1               5                   10                  15
Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln
20                  25                  30
Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile
35                  40                  45
Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr
50                  55                  60
Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro
85
<210>  13
<211>  285
<212>  ДНК
<213>  Felis catus
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(285)
<400>  13
aag aat tct gag gtg tcc cag gag ctg ctg gtc gtg aaa agg gag ctc         48
Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val Val Lys Arg Glu Leu
1               5                   10                  15
cag aat gtc tcc atc tcg gga caa cag tgt cag gag gag cag aaa cag         96
Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln Glu Glu Gln Lys Gln
20                  25                  30
ggc tgg agc agc gtc cag cag ctc atc acg gag gcc agg cag gac att        144
Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu Ala Arg Gln Asp Ile
35                  40                  45
gac atg atc aag aga aat gtc cac atc ggg aac gag aaa gtg aag acg        192
Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr
50                  55                  60
ctg tca aca gac tta agc caa atc aag act aaa tta cat gaa atc tcc        240
Leu Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser
65                  70                  75                  80
aag ata cta gag aag aag ccg cag cca cag ccc aca gct caa taa            285
Lys Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln
85                  90
<210>  14
<211>  94
<212>  Белок
<213>  Felis catus
<400>  14
Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val Val Lys Arg Glu Leu
1               5                   10                  15
Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln Glu Glu Gln Lys Gln
20                  25                  30
Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu Ala Arg Gln Asp Ile
35                  40                  45
Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr
50                  55                  60
Leu Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser
65                  70                  75                  80
Lys Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln
85                  90
<210>  15
<211>  279
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(279)
<400>  15
aaa aat tct gag atg tcc aag gag ctg tgg acc ttg aaa gca gag ctt         48
Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu
1               5                   10                  15
tcg aat gtt tca gac acg gtg tgg aat atc cgg gag ctc cag aat cag         96
Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln
20                  25                  30
caa acg agg att tgg gaa gct gcc cag ggg gac atc aag gag gtc aag        144
Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys
35                  40                  45
aag acc ctt ggc aca gtc atg agt agc atc cag act gga aac gac cgg        192
Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg
50                  55                  60
ctg aag act gtg ccg gca gat ata acc caa atc aag aaa act ctt gag        240
Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu
65                  70                  75                  80
gcg cta gaa aag aag gca cag cct cag ccc agt aca taa                    279
Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr
85                  90
<210>  16
<211>  92
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<400>  16
Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu
1               5                   10                  15
Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln
20                  25                  30
Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys
35                  40                  45
Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg
50                  55                  60
Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu
65                  70                  75                  80
Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr
85                  90
<210>  17
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер T3
<400>  17
aattaaccct cactaaaggg                                                   20
<210>  18
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер T7
<400>  18
taatacgact cactatagg                                                    19
<210>  19
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловая RT праймера собаки
<400>  19
ccacgtccca accctgtcta                                                   20
<210>  20
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловая RT праймера собаки
<400>  20
gtgctccagc cctgattctg                                                   20
<210>  21
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловая RT праймера человека
<400>  21
tggccttcaa aaatcaggac                                                   20
<210>  22
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловая RT праймера человека
<400>  22
aggctcagga tggctctgta c                                                 21
<210>  23
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловая RT праймера мыши
<400>  23
tccaaggagc tgtggacctt                                                   20
<210>  24
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловая RT праймера мыши
<400>  24
agtcttcagc cggtcgtttc                                                   20
<210>  25
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловая EcoRI праймера MCEMP1 человека
<400>  25
gaattcgccg ccaccatgga agtggaggaa atctacaag                              39
<210>  26
<211>  29
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловая NotI праймера MCEMP1 человека
<400>  26
gcggccgctt attgaggtga ggactgtgg                                         29
<210>  27
<211>  28
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Смысловая KpnI праймера MCEMP1ECD человека
<400>  27
ggtaccaaga atgctgagat gtccaagg                                          28
<210>  28
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Антисмысловая EcoRI праймера MCEMP1ECD человека
<400>  28
gaattcggtt gaggtgagga ctgtggc                                           27
<210>  29
<211>  960
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Fc слитый белок
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(960)
<400>  29
aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag ctt         48
Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu
1               5                   10                  15
tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag aga         96
Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg
20                  25                  30
ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag att        144
Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile
35                  40                  45
gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca aag        192
Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys
50                  55                  60
gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca cct        240
Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro
65                  70                  75                  80
caa ccg aat tct gca gat atc ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc tgt        288
Gln Pro Asn Ser Ala Asp Ile Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
85                  90                  95
cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc        336
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
100                 105                 110
ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc        384
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
115                 120                 125
ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat        432
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
130                 135                 140
gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag        480
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
145                 150                 155                 160
aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt        528
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
165                 170                 175
gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa        576
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
180                 185                 190
tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc        624
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
195                 200                 205
tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct        672
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
210                 215                 220
cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg        720
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
225                 230                 235                 240
gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac        768
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
245                 250                 255
ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct        816
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
260                 265                 270
gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac        864
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
275                 280                 285
tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg        912
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
290                 295                 300
cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga        960
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
305                 310                 315
<210>  30
<211>  319
<212>  Белок
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Fc слитый белок
<400>  30
Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu
1               5                   10                  15
Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg
20                  25                  30
Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile
35                  40                  45
Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys
50                  55                  60
Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asn Ser Ala Asp Ile Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
85                  90                  95
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
100                 105                 110
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
115                 120                 125
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
130                 135                 140
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
145                 150                 155                 160
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
165                 170                 175
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
180                 185                 190
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
195                 200                 205
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
210                 215                 220
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
225                 230                 235                 240
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
245                 250                 255
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
260                 265                 270
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
275                 280                 285
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
290                 295                 300
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
305                 310                 315
<---