СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF OBTAINING BOTULINUM NEUROTOXIN (VERSIONS)

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
Данная заявка истребует приоритет заявки на патент США 12/502181 от 13 июля 2009 г., полное описание которой включено сюда во всей своей полноте посредством отдельной ссылки.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение описывает системы и способы для получения нейротоксина клостридий, способы получения фармацевтической композиции из такого нейротоксина, а также терапевтическое и косметическое применение полученной таким образом композиции. В частности, данное изобретение описывает быстрый, не содержащий белка животных способ и систему хроматографии для получения высокоактивного, с высокой степенью очистки и большим выходом биологически активного ботулинического нейротоксина.
Фармацевтическая композиция, подходящая для введения человеку или животному в лечебных, диагностических, исследовательских или косметических целях, включает активное действующее вещество и одно или несколько вспомогательных веществ, буферы, носители, стабилизаторы, средства для корректировки тоничности, консерванты и/или объемообразующие агенты. Активное действующее вещество в фармацевтической композиции может иметь биологическое происхождение и быть представлено, например, ботулиническим нейротоксином. Известные способы (такой как способ Шанца) для получения ботулинического нейротоксина, используемого в качестве активного действующего вещества в фармацевтической композиции, представлены многонедельным культивированием, ферментацией и способами очистки с применением белков животного происхождения, таких как мясной бульон и казеин (в питательной среде и среде для ферментации), а также ферментов для очистки животного происхождения. Введение пациенту фармацевтической композиции при использовании продукции животного происхождения может повлечь за собой риск введения патогенов или инфекционного агента, такого как прион. Кроме того, известные способы получения ботулинического токсина, не предполагающие применения животных белков, также требуют временных затрат (т.е. для завершения необходимо более одной недели), включая многочисленные подготовительные (культивирование и ферментация) и заключительные (очистка) стадии, и кроме того, приводят к получению ботулинического нейротоксина с определяемыми примесями.
Ботулинический токсин
Род Clostridium насчитывает более ста двадцати семи видов, группированных по морфологическим и функциональным признакам. Анаэробные, грамположительные бактерии Clostridium botulinum вырабатывают сильный полипептидный нейротоксин, ботулинический токсин (синонимически «токсин»), который приводит к нейропаралитическому заболеванию у человека и животных, известному как ботулизм. Симптомы интоксикации ботулиническим нейротоксином могут прогрессировать от трудностей при ходьбе, глотании и речи до паралича дыхательных мышц и смерти.
50
1
Одна единица ботулинического токсина определяется как LD при интраперитонеальной инъекции самкам мышей линии Swiss Webster весом примерно 18-20 грамм каждая. Одна единица ботулинического токсина представляет собой количество ботулинического токсина, которое приводит к гибели 50% группы самок мышей линии Swiss Webster. Было охарактеризовано семь иммунологически различных ботулинических нейротоксинов, и их соответствующие серотипы А, В, C, D, Е, F и G отличаются по нейтрализации типоспецифических антител. Различные серотипы ботулинического токсина различаются у видов животных, которых они поражают, а также степени тяжести и продолжительности вызываемого ими паралича. Ботулинические токсины связываются с высокой аффинностью с холинэргическими двигательными нейронами, перемещаются в нейроне и блокируют пресинаптическое высвобождение ацетилхолина.
Ботулинические токсины использовали в клинической практике для лечения, например, нейромышечных расстройств, характеризующихся гиперактивностью скелетных мышц. Ботулинический токсин типа А был утвержден Управлением США по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных препаратов (FDA) для лечения эссенциального блефароспазма, косоглазия и гемифациального спазма у пациентов старше 13 лет, цервикальной дистонии, межбровных (лицевых) морщин, а также для лечения гипергидроза. FDA также утвердило ботулинический токсин типа В для лечения цервикальной дистонии.
1
Несмотря на то, что все серотипы ботулинического токсина ингибируют высвобождение нейропередатчика ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе, такая функция возможна при воздействии на различные нейросекреторные белки и/или расщепление таких белков в различных участках. Ботулинический токсин типа А представлен эндопептидазой цинка, которая может специфическим образом гидрозилировать пептидную связь внутриклеточного, везикуло-ассоциированного белка (VAMP, также называется синаптобревин) 25 кДа синаптосомально-ассоциированного белка (SNAP-25). Ботулинический токсин типа Е также расщепляет SNAP-25, но направлен на другие аминокислотные последовательности данного белка в сравнении с ботулиническим токсином типа А. Ботулинические токсины типов В, D, F и G воздействуют на VAMP, причем каждый серотип расщепляет белок в различном месте. Наконец, было показано, что ботулинический токсин типа С расщепляет синтаксин и SNAP-25. Такие различия в механизме действия могут влиять на относительную активность и/или длительность действия различных серотипов ботулинического токсина.
1
Молекулярный вес белковой молекулы активного ботулинического токсина (также известного как «чистого токсина» или «нейротоксического компонента») из комплекса ботулинического токсина для всех семи известных серотипов ботулинического токсина составляет примерно 150 кДа. Интересно, что ботулинические токсины высвобождаются бактерией-клостридией в виде комплексов, включающих нейротоксический компонент 150 кДа вместе с одним или несколькими связанными нетоксичными белками. Таким образом, комплекс ботулинического токсина типа А может вырабатываться бактерией-клостридией в виде форм 900 кДа, 500 кДа и 300 кДа (примерный молекулярный вес). Типы ботулинического токсина В и С вырабатываются только в виде комплекса 500 кДа. Ботулинический токсин типа D вырабатывается в виде комплексов 300 кДа и 500 кДа. Наконец, ботулинический токсин типов Е и F вырабатывается только в виде комплексов примерно 300 кДа. Комплексы (т.е. с молекулярным весом более чем примерно 150 кДа) содержат белки гемагглютинин (НА) и нетоксический белок, не являющийся гемагглютинином (NTNH). Таким образом, комплекс ботулинического токсина может включать молекулу ботулинического токсина (нейротоксический компонент) и один или несколько белков НА и/или белок NTNH. Такие два типа нетоксичных белков (которые вместе с молекулой ботулинического токсина могут составлять соответствующий комплекс нейротоксина) могут обеспечивать молекуле ботулинического токсина стабильность относительно денатурации и защиту от кислот пищеварительного сока при проглатывании токсина. Кроме того, возможно, что большие (молекулярный вес более чем примерно 150 кДа) комплексы ботулинического токсина могут приводить к более медленной скорости диффузии ботулинического токсина из места внутримышечной инъекции комплекса ботулинического токсина. Успех ботулинического токсина типа А в лечении целого ряда клинических состояний породил интерес к другим серотипам ботулинического токсина. Таким образом, в клинической практике для лечения человека использовали, по меньшей мере, такие типы ботулинического токсина, как А, В, Е и F. Кроме того, в Европе на рынке представлена лекарственная форма нейротоксического компонента (т.е. без связанных нетоксичных белков) под торговой маркой КСЕОМИН (Merz Pharmaceuticals, Frankfurt, Germany).
Ботулинический токсин типа А растворим в водных растворах при pH 4-6,8. При pH выше примерно 7, стабилизирующие нетоксичные белки диссоциируют из нейротоксина, что приводит к постепенной потере токсичности, в частности, при повышении значения pH и температуры (Schantz E.J., et al Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (in particular pages 44-45), being chapter 3 of Jankovic, J., et al, Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc, 1994).
Как и для всех других ферментов, биологическая активность ботулинических токсинов, являющихся внутриклеточными пептидазами, зависит, по меньшей мере, частично, от их трехмерной конформации. Разведение токсина от количества в миллиграммах до раствора, содержащего нанограммы на миллилитр, представляет собой значительные трудности, такие как, например, тенденция токсина осаждаться на поверхности, что приводит к снижению количества доступного токсина. Поскольку токсин может использоваться спустя месяцы или годы после разработки фармацевтической композиции, включающей токсин, токсин стабилизируют с использованием стабилизирующего агента, такого как белок, сахароза, трегалоза и/или желатин.
Представленная на рынке фармацевтическая композиция, содержащая ботулинический токсин, продается под торговой маркой БОТОКС (комплекс нейротоксина, включающий очищенный ботулинический токсин типа А) от компании Allergan, Inc., Irvine, California. Каждая ампула со 100 единицами препарата БОТОКС состоит из примерно 5 нг комплекса очищенного ботулинического токсина типа А, 0,5 мг сывороточного альбумина человека и 0,9 мг натрия хлорида; содержимое представлено в виде высушенного в вакууме порошка и предназначено для восстановления стерильным физиологическим раствором без консерванта (инъекция 0,9% натрия хлорида). Другие представленные на рынке и содержащие ботулинический токсин фармацевтические композиции включают Диспорт (комплекс токсина Clostridium botulinum типа А и гемагглютинина с сывороточным альбумином человека и лактозой в фармацевтической композиции с ботулиническим токсином), представленный Ipsen Limited, Berkshire, U.K. в виде порошка для восстановления 0,9% натрия хлоридом перед использованием, а также MyoBloc™ (раствор для инъекций, включающий ботулинический токсин типа В, сывороточный альбумин человека, натрия сукцинат и натрия хлорид при pH примерно 5,6, представлен Solstice Neurosciences of San Diego, California). Комплексы нейротоксического компонента (молекула токсина 150 кДа) и ботулинического токсина (от 300 кДа до 900 кДа) могут быть получены, например, у List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osaka, Japan), a также у Sigma Chemicals (St Louis, Missouri).
Способы получения ботулинического нейротоксина, не содержащие животных белков, и/или способы хроматографии описаны в патентах США 7445914; 7452697; 7354740; 7160699; 7148041 и 7189541. Кроме того, интерес представляют заявки на патент США 11/609449 под названием «Среда для бактерий рода Clostridium» от 12 декабря 2006 г.; 12/098896 под названием «Среда, не содержащая животный продукт, и способы для получения ботулинического токсина» от 7 апреля 2008 г.; 11/932689 под названием «Способ и система хроматографии для очистки ботулинического токсина» от 31 октября 2007 г.; 11/932789 под названием «Способ и система хроматографии для очистки ботулинического токсина» от 31 октября 2007 г.; и 12/234537 под названием «Среда, не содержащая животный продукт, и способы для получения ботулинического токсина» от 19 сентября 2008 г.
Ботулинический токсин для использования в фармацевтической композиции может быть получен путем анаэробной ферментации Clostridium botulinum и известного способа Шанца (см., например, Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 Mar; 56(1): 80-99; Schantz E.J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, chapter 3 in Jankovic J, ed. Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxin (1994), New York, Marcel Dekker; 1994, pages 41-49, и; Schantz E.J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research, in: Lewis GE Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) New York, Academic Press, pages 143-50). Способ Шанца для получения ботулинического токсина предполагает использование продуктов животного происхождения, например, в виде реагентов и части питательной и ферментативной среды.
Для получения фармацевтической композиции клостридиального токсина, подходящей для введения человеку или животному для терапевтических, диагностических, исследовательских или косметических целей, необходим ряд этапов. Такие этапы могут включать получение очищенного токсина клостридий с последующим приготовлением очищенного клостридиального токсина. Первый этап может заключаться в высевании и выращивании колоний бактерий-клостридий, обычно на чашках с кровяным агаром, в среде, способствующей росту анаэробных бактерий, такой как, например, теплая анаэробная атмосфера. Этот этап позволяет получить колонии клостридий с необходимой морфологией и другими характеристиками. На втором этапе выбранные колонии клостридий могут быть ферментированы в первой подходящей среде и, при необходимости, во второй ферментативной среде. После определенного периода ферментации, бактерии-клостридии обычно лизируют и высвобождают токсин клостридий в среду. На третьем этапе среда может быть очищена с получением общего количества токсина. Обычно очистка среды для получения общего количества токсина проводится с использованием, кроме других реагентов, ферментов животного происхождения, таких как ДНКаза и РНКаза, которые используют для деградации и облегчения высвобождения нуклеиновых кислот. Получаемое общее количество токсина может быть представлено токсином высокой очистки, обладающим отдельной специфической активностью. После стабилизации в подходящем буфере, токсин может быть соединен с одним или несколькими вспомогательными веществами для получения фармацевтической композиции токсина клостридий, подходящей для введения человеку. Фармацевтическая композиция клостридиального токсина может включать клостридиальный токсин в виде активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Фармацевтическая композиция также может включать одно или несколько вспомогательных веществ, буферы, носители, стабилизаторы, консерванты и/или объемообразующие агенты.
Этап ферментации клостридиального токсина может привести к получению раствора среды ферментации, содержащего целые бактерии р. Clostridium, лизированные бактерии, питательные вещества среды и побочные продукты ферментации. Фильтрация такого раствора среды, а также удаление основных элементов, таких как целые и лизированные бактерии, приводит к образованию подготовленной/очищенной среды. Очищенная среда включает клостридиальный токсин и целый ряд примесей и служит для получения концентрированного клостридиального токсина, называемого нерасфасованным токсином.
Способы ферментации и очистки для получения нерасфасованного клостридиального токсина с использованием одного или нескольких продуктов животного происхождения (таких как, например, казеин, получаемый в результате расщепления молока, ДНКаза и РНКаза) известны. Примером известного способа, не предусматривающего использование продуктов неживотного происхождения («NAPF») для получения комплекса ботулинического токсина, является способ Шанца и его модификации. Способ Шанца (от исходного высевания, культивирования клеток до ферментации и очистки токсина) предполагает использование целого ряда продуктов, полученных из животных источников, таких как, например, среда с отварным мясом в пробирке с культурой, чашки с колумбийским кровяным агаром для роста и селекции колоний, а также казеин в среде для ферментации. Кроме того, способ Шанца для очистки нерасфасованного токсина предполагает использование ДНКазы и РНКазы, полученных из крупного рогатого скота, для гидролиза нуклеиновых кислот, присутствующих в содержащей токсин ферментативной среде. Были выражены определенные опасения относительно потенциала развития вирусной и трансмиссивной губчатой энцефалопатии (ТГЭ), такой как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭКРС), заражения при использовании продуктов животного происхождения в способе получения АФИ и/или способе получения (составления) фармацевтической композиции с использованием такого АФИ.
Способ ферментации для получения столбнячного анатоксина, предполагающий использование пониженных количеств продуктов животного происхождения (указаны как способы ферментации, не содержащие продуктов животного происхождения, или ферментационные «APF»-способы; «APF» обозначает отсутствие животного белка) известен (см., например, патент США 6558926). Ферментативный APF-способ для получения клостридиального токсина обладает потенциальным преимуществом в снижении (и так очень низкой) возможности контаминации получаемого общего количества токсина вирусами, прионами или другими нежелательными элементами, которые затем сопровождают активный фармацевтический ингредиент, клостридиальный токсин, в составе фармацевтической композиции для введения человеку.
Хроматография, такая как, например, колоночная хроматография, может использоваться для выделения отдельного белка (такого как ботулинический нейротоксин) из смеси белков, нуклеиновых кислот, остатков клеток и т.д., в ходе способа, известного как фракционирование или очистка. Смесь белков обычно пропускают через стеклянную или пластиковую колонку, содержащую, например, твердую, часто пористую среду (часто указываемую как гранулы или смола). Различные белки и другие соединения проходят через среду с различной скоростью, основываясь на их специфических химических свойствах и способа, с помощью которого такие характерные свойства позволяют им взаимодействовать с отдельной используемой хроматографической средой.
Выбор среды определяет тип химической характеристики, на котором основано фракционирование белков. Существует четыре основных типа колоночной хроматографии: ионообменная, гель-фильтрация, аффинная и гидрофобное взаимодействие. Ионообменная хроматография сопровождается фракционированием, основанным на поверхностном электростатическом заряде с использованием колонки, наполненной небольшими гранулами, несущими положительный или отрицательный заряд. При гель-фильтрации белки фракционируют на основе их размера. В ходе аффинной хроматографии белки разделяют на основе их способности связываться со специфическими химическими группами (лигандом), присоединенными к гранулам в среде колонки. Лиганды могут быть биологически специфическими относительно белка-мишени. Хроматография с гидрофобным взаимодействием сопровождается фракционированием на основе поверхностной гидрофобности.
Широко известна колоночная хроматография для очистки (фракционирования) клостридиального токсина. См., например, следующие публикации:
1. Ozutsumi К., et al, Rapid, simplified method for production and purification of tetanus toxin, App & Environ Micro, Apr. 1985, p 939-943, vol 49, no. 4. (1985) раскрывает использование гель фильтрации высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для очистки столбнячного токсина.
2. Schmidt J.J., et al., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography, Anal Biochem 1986 Jul; 156(1): 213-219 раскрывает использование гель-проникающей хроматографии или ионообменной хроматографии для очистки ботулинического токсина типа Е. Также раскрыто использование протамина сульфата вместо рибонуклеазы (РНКазы).
3. Simpson L.L., et al., Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins
Simpson LL; Schmidt JJ; Middlebrook JL, In: Harsman S, ed. Methods in Enzymology. Vol. 165, Microbial Toxins: Tools in Enzymology San Diego, CA: Academic Press; vol 165: pages 76-85 (1988) раскрывает очистку ботулинического нейротоксина с использованием жидкостной хроматографии с колонками "gravity flow", высокоэффективной жидкостной хроматографии, этапов улавливания с использованием аффинности смолы, гель-хроматографии, ионообменной (катион и анион) хроматографии, включающей применение двух разных ионнообменных колонок. Раскрыты различные колонки Sephadex, Sephacel, Trisacryl, S и Q.
4. Zhou L, et al., Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain, Biochemistry 1995; 34(46): 15175-81 (1995) раскрывает использование колонки с амилозой при аффинной хромотографии для очистки легкой цепи рекомбинантных белков ботулинического нейротоксина.
5. Kannan К., et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B), Mov Disord 2000; 15 (Suppl 2): 20 (2000) раскрывает использование гель-проникающей хроматографии для анализа ботулинического токсина типа В.
6. Wang Y-c, The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002;58 (2002) раскрывает применение ионообменной хроматографии для очистки ботулинического токсина типа А. Также в документе раскрыта комбинация осадительных и хроматографических способов.
7. Johnson S.K., et al., Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment С of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003) раскрывает использование ионообменных колонок и колонок гидрофобного взаимодействия для очистки рекомбинантного фрагмента тяжелой цепи ботулинического токсина типа F.
8. Опубликованная заявка на патент США 2003 0008367 А1 (Oguma) описывает применение ионообменных колонок и колонок с лактозой для очистки ботулинического токсина.
Обобщенные выше способы очистки относятся к мелкомасштабной очистке нейротоксического компонента комплекса ботулинического токсина (т.е. молекулы нейротоксина примерно 150 кДа) или специфического компонента нейротоксического компонента, в отличие от очистки всего комплекса ботулинического токсина 900 кДа.
Кроме того, существующие способы, включая способы производственного масштаба, для получения ботулинического токсина, подходящего для приготовления фармацевтической композиции ботулинического токсина, обычно включают серию этапов преципитации для разделения комплекса токсина и примесей, сопровождающих ботулинический токсин с момента способа ферментации. Примечательно, что способы преципитации широко используются в биофармацевтической промышленности для очистки ботулинического токсина. Например, для удаления белков плазмы используют фракционирование холодным спиртом (способ Коэна) или преципитацию. К несчастью, используемые ранее способы преципитации для очистки ботулинического токсина обладают недостатками: низкое разрешение, низкая продуктивность, сложность работы, трудности в контроле и/или валидации, и/или затруднения в уменьшении/повышении масштабности. Опубликованная ранее заявка на патент США No. 11/452570 от 12 октября 2006 г. описывает этапы, такие как центрифугирование, осаждение кислотой, осаждение этанолом, этапы ацидификации и осаждения в сульфате аммония, используемые в ходе различных не содержащих животных белков и NAPF-способов (подробное описание представлено в опубликованной заявке на патент США 2006/0228780 (включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки)). В тексте данной заявки представлены некоторые различия между способами, не содержащими белки неживотного происхождения, и способами, не содержащими белки животного происхождения, для получения ботулинического нейротоксина.
Следовательно, необходимо наличие быстрых, относительно мелкомасштабных, но высокопроизводительных систем и способов для получения ботулинического нейротоксина высокой активности и высокой степени очистки, который может использоваться в исследовательских целях и/или для получения фармацевтической композиции.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение удовлетворяет таковой потребности и описывает ботулинический нейротоксин высокой активности и высокой степени очистки, полученный с использованием быстрых, мелкомасштабных, используемых в промышленности, высокопроизводительных и не содержащих животных белков систем и способов хроматографии. Получаемый ботулинический нейротоксин используют для приготовления фармацевтической композиции. Клостридиальный токсин, полученный по изобретению, является преимущественно ботулиническим нейротоксином и, более преимущественно, комплексом ботулинического нейротоксина А (примерно 900 кДа) или нейротоксическим компонентом 150 кДа. Наше изобретение не требует использование реагентов NAPF, таких как ДНКаза и РНКаза.
Определения
Представленные ниже слова и термины, используемые в изобретении, обладают следующими значениями.
Термин «примерно» обозначает, что единица, параметр или термин, квалифицированные таким образом, охватывают диапазон плюс/минус десять процентов от указанной единицы, параметра или термина.
Термины «введение» или «ввести» обозначает этап принятия (т.е. введения) фармацевтической композиции или активного ингредиента субъекту. Описанные здесь фармацевтические композиции вводят «локально», например, с использованием таких путей введения, как внутримышечное (в/м), интрадермальное, подкожное введение, интратекальное введение, интракраниальное, интраперитонеальное введение (и/п), топическое (трансдермальное) введение и имплантация (т.е. использование устройства с замедленным высвобождением, такого как полимерный имплант или миниосмотический насос).
Термины «не содержащий продуктов животного происхождения (APF)» или «по существу не содержащий продуктов животного происхождения», соответственно, и термины «не содержащий белков животного происхождения» или «по существу не содержащий белков животного происхождения» обозначают отсутствие или практическое отсутствие продуктов или соединений, полученных из крови, смешанной крови и других продуктов или соединений животного происхождения. Термин «животное» обозначает млекопитающее (такое как человек), птицу, рептилию, рыбу, насекомое, паука или другие виды животных. Термин «животное» исключает микроорганизмы, такие как бактерии. Таким образом, в контексте данного изобретения среда APF или способ, или по существу среда APF или способ могут включать ботулинический токсин или бактерию Clostridial botulinum. Например, способ APF или по существу способ APF обозначает способ, который по существу не содержит или по существу не содержит или полностью не содержит белков животного происхождения, таких как иммуноглобулины, мясной бульон, мясные субпродукты, а также продукты молока или молочные продукты, или продукты расщепления.
2
3
Термин «ботулинический токсин» или «ботулинический нейротоксин» обозначает нейротоксин, выработанный Clostridium botulinum, а также модифицированные, рекомбинантные, гибридные и химерные ботулинические токсины. Рекомбинантный ботулинический токсин может иметь легкую цепь и/или тяжелую цепь, полученные рекомбинантным образом с использованием других видов, кроме клостридий. В контексте данного изобретения термин «ботулинический токсин» охватывает серотипы ботулинического токсина А, В, С, D, Е, F и G. В контексте данного изобретения термин «ботулинический токсин» также охватывает комплекс ботулинического токсина (т.е. комплексы 300, 600 и 900 кДа), а также чистый ботулинический токсин (т.е. нейротоксическую молекулу примерно 150 кДа), которые могут использоваться при применении данного изобретения на практике. Термин «очищенный ботулинический токсин» обозначает чистый ботулинический токсин или комплекс ботулинического токсина, который изолирован или по существу изолирован от других белков и примесей, которые могут сопровождать ботулинический токсин в ходе его получения способом культивирования или ферментации. Таким образом, очищенный ботулинический токсин может содержать, по меньшей мере, 90%, преимущественно более 95%, и более преимущественно более 99% ботулинического токсина при удалении белков, не являющихся белками ботулинического токсина, и примесей. Не будучи нейротоксинами, ботулинические цитотоксины С и С, исключены из области данного изобретения.
Термин «клостридиальный нейротоксин» обозначает нейротоксин, полученный или присущий бактерии-клостридии, такой как Clostridium botulinum, Clostridium butyricum или Clostridium beratti, и, кроме того, клостридиальный нейротоксин получают рекомбинантным образом у видов, не являющихся клостридиями.
Термин «практически не содержащий» (в терминологии «состоящий из») обозначает, что вещество не может быть определено или его присутствие не может быть подтверждено в диапазоне определения используемого инструмента или способа.
Термин «по существу не содержащий» (в терминологии «в основном состоящий из») обозначает, что могут быть определены только следовые количества вещества.
Термин «модифицированный ботулинический токсин» обозначает, что ботулинический токсин характеризуется удалением, модификацией или заменой, по меньшей мере, одной из своих аминокислот в сравнении с нативным ботулиническим токсином. Кроме того, модифицированный ботулинический токсин может быть представлен полученным рекомбинантным образом нейротоксином, или производным или фрагментом полученного рекомбинантным образом нейротоксина. Модифицированный ботулинический токсин сохраняет, по меньшей мере, одну биологическую активность нативного ботулинического токсина, такую как способность связываться с рецептором ботулинического токсина или способность ингибировать высвобождение нейропередатчика из нейрона. Один пример модифицированного ботулинического токсина представлен ботулиническим токсином, в которой легкая цепь получена из одного серотипа (такого как серотип А) ботулинического токсина, а тяжелая цепь получена из другого серотипа ботулинического токсина (такого как серотип В). Другой пример модифицированного ботулинического токсина представлен ботулиническим токсином, соединенным с нейропередатчиком, таким как вещество Р.
1
Термин «фармацевтическая композиция» обозначает композицию, в которой активное действующее вещество может быть представлено ботулиническим токсином. Термин «композиция» обозначает, что существует, по меньшей мере, один дополнительный ингредиент (такой как, например (не ограничиваясь), альбумин [такой как сывороточный альбумин человека или рекомбинантный человеческий альбумин] и/или натрия хлорид) в фармацевтической композиции в добавление к активному действующему веществу ботулиновому нейротоксину. Таким образом, фармацевтическая композиция представляет собой композицию, подходящую для диагностического, терапевтического или косметического введения (например, путем внутримышечной или подкожной инъекции или путем введения депо или имплантата) субъекту, такому как пациент-человек. Фармацевтическая композиция может быть представлена в виде лиофилизированного или высушенного в вакууме порошка, раствора, образованного после восстановления фармацевтической композиции в виде лиофилизированного или высушенного в вакууме порошка физиологическим раствором или водой, или в виде раствора, не требующего восстановления. Активное действующее вещество может быть представлено серотипами ботулинического токсина А, В, C, D, Е, F или G или ботулиническим токсином, при этом такие виды токсина получают естественным образом с использованием бактерий-клостридий. Как уже указано, фармацевтическая композиция может быть жидкой или твердой, например, высушенным в вакууме порошком. Типичные способы приготовления фармацевтической композиции с активным действующим веществом ботулиническим токсином описаны в опубликованной заявке на патент США 20030118598 от 5 ноября 2002 г. (включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Термин «по существу не содержащий» обозначает присутствие на уровне или менее одного процента по весу питательной среды, среды ферментации, фармацевтической композиции или другого материала, в котором оценивают процент весового содержания вещества (такого как продукт животного происхождения, белок животного происхождения или продукт или белок животного происхождения).
Термин «терапевтическая композиция» обозначает композицию, которая может использоваться для лечения и, следовательно, снижения степени тяжести нарушения или заболевания и/или связанного симптома, такого как нарушение или заболевание, характеризующееся гиперактивностью (например, спастичностью) периферической мышцы или железы (например, потовой железы).
Термин «терапевтически эффективное количество» обозначает уровень, количество или концентрацию агента (например, такого как ботулинический токсин или фармацевтическая композиция, включающая ботулинический токсин), необходимый для лечения заболевания, нарушения или состояния без вызова значительных отрицательных или нежелательных побочных явлений.
Термины «лечить» или «лечение» обозначают снижение степени тяжести или уменьшение (что включает незначительное снижение, существенное снижение, по существу полное снижение и полное снижение), разрешение или предотвращение (постоянное или временное) заболевания, нарушения или состояния, такого как деформация ягодиц, в результате чего достигается необходимый терапевтический или косметический результат, такой как заживление поврежденной или пораженной ткани, или изменение, усиление, улучшение, снижение степени тяжести и/или улучшение существующего или выявленного заболевания, нарушения или состояния. Эффект лечения, такой как снижение степени тяжести при введении ботулинического нейротоксина, может не отмечаться клиническим образом в течением 1-7 дней после введения ботулинического нейротоксина пациенту, и может иметь продолжительность от примерно 1 месяца до примерно 1 года или любой другой диапазон времени, например, в зависимости от состояния и отдельного случая, подвергнутого лечению.
Процентные показатели основываются на весе в единицу объема, если иное не указано отдельным образом.
APF обозначает не содержащий продукта/белка животного происхождения.
КО обозначает объем колонки.
ДФ обозначает диафильтрацию.
ИФА обозначает иммуноферментный анализ.
IAPF в контексте «система IAPF» или «способ IAPF» обозначает «улучшенную и не содержащую белка животного происхождения» систему или способ. Система или способ IAPF включает использование двух хроматографических сред или трех хроматографических сред для очистки ботулинического токсина или компонента нейротоксина, как это подробно описано в тексте данной заявки. Хроматографическая среда включает хроматографические смолы, что хорошо известно в науке. Партии ботулинического нейротоксина, полученные путем использования двух хроматографических сред, указаны в тексте данной заявки как IAPF.
FAPF в контексте «система FAPF» или «способ FAPF» обозначает «дополнительно улучшенную и не содержащую белка животного происхождения» систему или способ. В соответствии с этим, FAPF является способом IAPF, и система или способ FAPF обозначает использование трех хроматографических сред для очистки ботулинического токсина или компонента нейротоксина. Партии ботулинического нейротоксина, полученные путем использования трех хроматографических сред, указаны в тексте данной заявки как FAPF.
NAPF обозначает не содержащий белка неживотного происхождения.
Гель-электрофорез обозначает гель-электрофорез в присутствии полиакриламида натрия додецилсульфата.
ЭХ обозначает эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию.
УФ обозначает ультрафильтрацию.
В одном варианте воплощения изобретения описан по существу APF-способ хроматографии для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, и такой способ включает следующие этапы: (а) предоставление среды ферментации (по существу APF); (б) ферментация бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации; и (в) восстановление биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации путем контакта среды ферментации с анионообменной хроматографической средой с последующим контактом элюента, полученного в ходе анионообменной хроматографии, с катионообменной хроматографической средой, в результате чего получают биологически активный ботулинический нейротоксин в ходе способа хроматографии (по существу APF). В отдельных вариантах воплощения изобретения способ может приводить к образованию ботулинического нейротоксина, который включает менее чем одну часть на миллион (м.д.) остаточной нуклеиновой кислоты, составляющей один нанограмм или менее остаточной нуклеиновой кислоты на каждый миллиграмм полученного ботулинического нейротоксина. В еще одном варианте воплощения изобретения способ проводят в течение одной недели или менее.
В одном примере среда с соотношением 3:1:1 обозначает культуру ботулинического токсина/среды ферментации, содержащей 3% HySoy, 1% HyYeast и 1% глюкозы. HySoy (номер по каталогу Quest 5X59022) является источником пептида, полученным путем ферментативного гидролиза сои. HyYeast (HyYest, номер по каталогу Quest 5Z10102 или 5Z10313) является экстрактом пекарских дрожжей. В другом примере среда с соотношением 5:1:1 обозначает культуру ботулинического токсина/среды ферментации, содержащей 5% HySoy, 1% HyYeast и 1% глюкозы.
4
4
7
Другой вариант воплощения изобретения описывает способ хроматографии (по существу APF) для получения комплекса биологически активного ботулинического нейротоксина типа А, и такой способ состоит из следующих последовательных этапов: культивирование бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF); ферментация бактерий Clostridium botulinum из питательной среды в примерно от 2 л до примерно 75 л среде ферментации (по существу APF), более преимущественно в примерно от ферментации составляет от примерно 6,5 до примерно 8,0, более преимущественно от примерно 6,8 до примерно 7,6 в начале этапа ферментации. В отдельном варианте воплощения изобретения этап культивирования проводят до достижения значения оптической плотности среды при примерно 540 нанометров (нм) при поглощении от примерно 0,8 единиц поглощения (ЕП) до примерно 4,5 ЕП. Этап культивирования преимущественно инициируют путем введения рабочего банка клеток Clostridium botulinum APF в питательную среду, при этом рабочий банк клеток включает, по меньшей мере, примерно 1×10 колониеобразующих единиц, преимущественно от примерно 1×10 до примерно 5×10 колониеобразующих единиц Clostridium botulinum на миллилитр рабочего банка клеток, при этом бактерии Clostridium botulinum в рабочем банке клеток имеют по существу однородную морфологию. В еще одном варианте воплощения изобретения этап ферментации проводят в течение примерно 60-80 часов и до достижения снижения значения оптической плотности среды ферментации при примерно 890 нм от примерно 0,05 ЕП до примерно 0,7 ЕП. В одном аспекте изобретения ботулинический нейротоксин, полученный в ходе способа хроматографии (по существу APF), включает менее чем 1 м.д. остаточной нуклеиновой кислоты, и способ проводят в течение одной недели или менее.
7
7
7
7
В еще одном варианте воплощения изобретения описан APF-способ, включающий хроматографию для получения биологически активного ботулинического нейротоксина и состоящий из последующих этапов: (а) добавление бактерий Clostridium botulinum из APF-рабочего банка клеток в питательную APF-среду; (б) культивирование бактерий Clostridium botulinum в питательной среде; (в) ферментация бактерий Clostridium botulinum из этапа (б) в APF-среде ферментации до возникновения лизиса клеток Clostridium botulinum; (г) сбор культуры ферментации для получения собранной среды ферментации; (д) концентрирование собранной среды ферментации путем фильтрации; (е) разведение профильтрованной среды ферментации путем добавления буфера для получения разведенной среды ферментации; (ж) первый этап контакта, в ходе которого разведенная среда ферментации контактирует с хроматографической средой, и такая хроматографическая среда 2 л до примерно 50 л среде ферментации (по существу APF), и даже более преимущественно в примерно от 2 л до примерно 30 л среде ферментации (по существу APF) (в некоторых вариантах воплощения изобретения описана, по меньшей мере, одна питательная среда и среда ферментации, включая растительный белок и/или производное растительного белка, например, гидролизированный растительный белок); сбор среды ферментации путем удаления остатков клеток, присутствующих в среде ферментации, с использованием фильтрации или центрифугирования; концентрирование собранной среды ферментации путем фильтрации, такой как ультрафильтрации (УФ); разведение концентрированной среды ферментации путем добавления буфера. После разведения буфером, проводится первый этап контакта, в ходе которого разбавленная собранная среда ферментации контактирует с анионообменной средой, таким образом, биологически активный ботулинический нейротоксин захватывается анионообменной средой; затем идет элюирование захваченного ботулинического нейротоксина из анионообменной среды с получением первого элюента, содержащего ботулинический токсин; после этого идет второй этап контакта, в ходе которого первый элюент контактирует с катионообменной средой для удаления примесей из первого элюента с получением второго элюента, содержащего ботулинический токсин; вслед за этим идет этап обработки второго элюента диафильтрацией (ДФ) и фильтрация обработанного второго элюента, в результате чего получают комплекс биологически активного ботулинического нейротоксина типа А с использованием способа хроматографии (по существу APF). Полученный комплекс ботулинического нейротоксина типа А обладает активностью примерно 2,0×10 единиц/мг до примерно 6,0×10 единиц/мг комплекса ботулинического нейротоксина типа А. В отдельных примерах может быть получен комплекс ботулинического нейротоксина типа А с активностью от примерно 2,4×10 единиц/мг до примерно 5,9×10 единиц/мг.
В отдельном варианте воплощения изобретения способ использует среду ферментации, включающую не более чем примерно 5% в/о производного белка растительного происхождения, не более чем примерно 2% в/о экстракта дрожжей и не более чем примерно 2% в/о глюкозы, при этом уровень pH среды представлена анионообменной средой; (3) второй этап контакта, в ходе которого элюент из первого этапа контакта контактирует с катионообменной средой; и (и) фильтрация элюента из второго этапа контакта, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин в ходе улучшенного APF-способа, при этом полученный ботулинический нейротоксин содержит 1 м.д. остаточной нуклеиновой кислоты или менее чем 1 м.д. остаточной нуклеиновой кислоты, и способ проводят в течение одной недели или менее.
7
В одном аспекте изобретения описана по существу не содержащая продукт животного происхождения (APF) система хроматографии для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, которая включает среду ферментации (по существу APF), бактерии Clostridium botulinum для ферментации в среде ферментации, анионообменную хроматографическую среду для восстановления биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации, а также катионообменную хроматографическую среду для дополнительного восстановления активного ботулинического нейротоксина из элюента, полученного из анионообменной хроматографической среды, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин в ходе способа хроматографии (по существу APF). В отдельных конфигурациях система может дополнительно включать первый аппарат для анаэробного культивирования бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF), и может дополнительно включать второй аппарат для анаэробной ферментации бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации (по существу APF), при этом бактерии Clostridium botulinum получают из первого аппарата. Пояснение: система может включать аппарат для сбора оставшихся остатков клеток из среды ферментации, полученной из второго аппарата, что позволяет получить собранную среду ферментации. Собранная среда ферментации может быть пропущена через аппарат концентрирования и разведения для концентрирования и последовательного разведения собранной среды ферментации. В отдельном примере система также может включать среду для гидрофобного взаимодействия для дальнейшего восстановления очищенного биологически активного ботулинического нейротоксина из элюента, полученного из среды в ходе катионообменной хроматографии. Кроме того, фильтрационный аппарат для снижения биологической нагрузки в полученном биологически активном ботулиновом нейротоксине также может включать систему для снижения биологической нагрузки биологически активного ботулинического нейротоксина, полученного путем использования двух или трех хроматографических сред. В специфическом примере может использоваться анаэробная камера со встроенным высокоэффективным воздушным фильтром для культивирования бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF). Типичные системы могут обеспечивать получение ботулинического нейротоксина с активностью, по меньшей мере, примерно 2,0×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, и полученный ботулинический нейротоксин включает 1 нг или менее чем 1 нг остаточной нуклеиновой кислоты на каждый мг полученного ботулинического нейротоксина. В отдельных вариантах воплощения изобретения питательная среда (по существу APF) может быть получена в количестве от примерно 2 л до примерно 75 л; при этом используют от примерно 200 мл до примерно 1 л питательной среды (по существу APF).
7
7
7
В другом аспекте нашего изобретения описана система (по существу APF) с использованием хроматографии для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, и такая система состоит из следующего: первый аппарат для культивирования бактерий Clostridium botulinum, способный включать питательную среду (по существу APF); второй аппарат для ферментации бактерий Clostridium botulinum, которые были культивированы в первом аппарате, и такой второй аппарат способен включать среду ферментации (по существу APF); третий аппарат для сбора среды ферментации; четвертый аппарат для концентрирования собранной среды ферментации и разведения профильтрованной среды ферментации; пятый аппарат для проведения первой очистки ботулинического нейротоксина из собранной среды, при этом такой пятый аппарат включает анионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный ботулинический нейротоксин; шестой аппарат для проведения второй очистки ботулинического нейротоксина из собранной среды, при этом такой пятый аппарат включает катионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный ботулинический нейротоксин; при этом полученный ботулинический нейротоксин обладает активностью, по меньшей мере, от примерно 2,0×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина до примерно 5,9×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, и полученный ботулинический нейротоксин включает 1 нг или менее чем 1 нг остаточной нуклеиновой кислоты на каждый мг полученного ботулинического нейротоксина, и способ проводят в течение одной недели или менее. В отдельном варианте воплощения изобретения полученный ботулинический нейротоксин обладает активностью, по меньшей мере, 4,4×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина. В отдельном варианте воплощения изобретения описана система, которая может дополнительно включать седьмой аппарат для проведения дополнительной очистки ботулинического нейротоксина, полученного из шестого аппарата, при этом такой седьмой аппарат содержит среду для гидрофобного взаимодействия, что позволяет получить ботулинический нейротоксин третьей очистки. В дополнительном варианте воплощения изобретения система может дополнительно включать восьмой аппарат, включающий мембрану для фильтрации элюента из седьмого аппарата.
7
7
7
Другой аспект нашего изобретения включает по существу хроматографическую APF-среду для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, включающую следующее: первый аппарат для анаэробного культивирования бактерий Clostridium botulinum, способный включать от примерно 200 мл до примерно 1 л питательной среды (по существу APF); второй аппарат, включающий анаэробную камеру и встроенный высокоэффективный воздушный фильтр в камере, способной содержать первый аппарат; третий аппарат для анаэробной ферментации бактерий Clostridium botulinum, которые были культивированы в первом аппарате, и такой третий аппарат способен включать от примерно 2 л до примерно 75 л среды ферментации (по существу APF), преимущественно от примерно 2 л до примерно 30 л среды ферментации (по существу APF), и включать, по меньшей мере, один одноразовый датчик, выбранный из группы, состоящей из окислительно-восстановительного датчика, pH-датчика и датчика для определения вязкости; четвертый аппарат для сбора среды ферментации; пятый аппарат для концентрирования собранной среды ферментации и разведения профильтрованной среды ферментации; шестой аппарат для проведения первой очистки ботулинического нейротоксина, полученного из собранной среды ферментации, и такой шестой аппарат включает анионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный первый раз ботулинический нейротоксин; седьмой аппарат для проведения второй очистки ботулинического нейротоксина, и такой седьмой аппарат включает катионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный второй раз ботулинический нейротоксин; восьмой аппарат для проведения третьей очистки очищенного второй раз ботулинического нейротоксина, включающий среду для гидрофобного взаимодействия, что позволяет получить очищенный третий раз ботулинический нейротоксин; а также девятый аппарат для фильтрации очищенного третий раз ботулинического нейротоксина, включающий фильтрующую мембрану, и такой полученный ботулинический нейротоксин обладает активностью от примерно 2,4×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина до примерно 5,9×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, и полученный ботулинический нейротоксин включает 1 нг или менее чем 1 нг остаточной нуклеиновой кислоты на каждый мг полученного ботулинического нейротоксина, и способ проводят в течение одной недели или менее. В соответствии с такими способами, получают биологически активный ботулинический нейротоксин, и в отдельных примерах полученный ботулинический нейротоксин имеет активность, по меньшей мере, примерно 4,4×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина.
В соответствии с описанными здесь способами и системами можно получить биологически активный ботулинический нейротоксин. В отдельных вариантах воплощения изобретения биологически активный ботулинический нейротоксин, полученный в ходе описанных здесь способов и систем, имеет молекулярный вес примерно 900 кДа.
7
7
7
Наше изобретение дополнительно включает способ получения фармацевтической композиции (APF), в которой активный ингредиент представлен биологически активным ботулиническим нейротоксином, и такой способ состоит из следующих этапов: (а) получение биологически активного ботулинического нейротоксина путем (i) предоставления среды ферментации, которая по существу не содержит продуктов животного происхождения; (ii) ферментации бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации; и (iii) восстановление биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации с использованием анионообменной хроматографической среды с последующим использованием катионообменной хроматографической среды, при этом восстановленный ботулинический нейротоксин обладает активностью., по меньшей мере, от примерно 2,4×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина до примерно 5,9×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, в некоторых вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, 4,4×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, и ботулинический нейротоксин включает 1 нг или менее чем 1 нг остаточной нуклеиновой кислоты на каждый мг полученного ботулинического нейротоксина, и этапы (i)-(iii) проводят в течение одной недели или менее; и (б) составление композиции из ботулинического нейротоксина, по меньшей мере, с одним подходящим вспомогательным веществом, что позволяет получить фармацевтическую композицию (по существу APF). В отдельном варианте воплощения изобретения этап составления композиции включает этап высушивания ботулинического нейротоксина в ходе способа, выбранного из группы способов, состоящей из высушивания сублимацией, лиофилизации и высушивания в вакууме, а соответствующее вспомогательное вещество выбирают из группы, состоящей из альбумина, человеческого сывороточного альбумина, рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина, желатина, сахарозы, трегалозы, гидроксиэтилового крахмала, коллагена, лактозы, сахарозы+натрия хлорида, полисахарида, каприлата, поливинилпирролидона и натрия. В соответствии с этим, один аспект нашего изобретения также описывает фармацевтические композиции (по существу APF), образованные путем соединения биологически активного ботулинического нейротоксина, полученного в ходе описанных способов и систем.
Кроме того, наше изобретение также включает способ лечения состояния пациента, и такой способ включает этап введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, в которой активный ингредиент представлен биологически активным ботулиническим нейротоксином, полученным в ходе описанных здесь APF-способов (т.е. IAPF- и FAPF-способов). Примеры состояний, которые могут быть подвергнуты лечению, выбирают из группы, состоящей из головной боли, мигрени, тензионной головной боли, синусовой головной боли, цервикогенной головной боли, нарушения потоотделения, гипергидроза подмышечных впадин, гипергидроза ладоней, гипергидроза стоп, синдрома Фрея, гиперкинетики кожи, морщин лица, межбровных морщин, гусиных лапок, вертикальных морщин от уголков рта к подбородку, носогубной складки, нарушения кожи, ахалазии, косоглазия, хронической анальной трещины, блефароспазма, мышечно-скелетной боли, фибромиалгии, панкреатита, тахикардии, расширения простаты, простатита, задержки мочи, недержания мочи, гиперактивного мочевого пузыря, гемифациального спазма, тремора, миоклонуса, нарушений желудочно-кишечного тракта, диабета, гиперсаливации, детрузорно-сфинктерной диссинергии, спастичности после инсульта, заживления раны, ювенильного церебрального паралича, спазма гладкой мускулатуры, рестеноза, фокальной дистонии, эпилепсии, цервикальной дистонии, нарушения щитовидной железы, гиперкальцемии, обсессивно-компульсивного расстройства, артритной боли, синдрома Рейно, растяжек кожи, перитонеальной адгезии, вазоспазмов, ринореи, миогенной контрактуры, пораженной мышцы, гортанной дистонии, писчего спазма и туннельного синдрома запястья.
7
В одном варианте воплощения изобретения описан способ для лечения состояния пациента, включающий этап местного введения пациенту эффективного количества фармацевтической композиции (по существу APF), полученной в ходе способа, включающего следующие этапы: (а) получение биологически активного ботулинического нейротоксина путем (i) обеспечения среды ферментации, по существу не содержащей продукта животного происхождения; (ii) ферментации бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации и (iii) восстановления биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации с использованием анионообменной хроматографической среды с последующим использованием катионообменной хроматографической среды, при этом восстановленный ботулинический нейротоксин обладает активностью, по меньшей мере, 2,0×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, и ботулинический нейротоксин содержит 1 нг или менее чем 1 нг остаточной нуклеиновой кислоты на каждый мг ботулинического нейротоксина, и этапы (i)-(iii) проводят в течение одной недели или менее; и (б) соединение ботулинического нейротоксина, по меньшей мере, с одним подходящим вспомогательным веществом, что позволяет получить фармацевтическую композицию (по существу APF), при этом местное введение фармацевтической композиции (по существу APF) приводит к излечению состояния.
Местное введение терапевтически эффективных количеств фармацевтических композиций, включающих биологически активный ботулинический нейротоксин при условии использования описанных здесь IAPF способов/систем/способа, может быть повторено с интервалом, например, от примерно 2 месяцев до примерно 6 месяцев, или с интервалом от примерно 2 месяцев до примерно 3 месяцев. Типичные используемые дозы для местного введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции (по существу APF), получаемого в соответствии с текстом данной заявки, могут иметь количества единиц ботулинического нейротоксина от примерно 0,01 единицы до примерно 10000 единиц. В отдельных случаях ботулинический нейротоксин вводят в количестве от примерно 0,01 единицы до примерно 3000 единиц. В отдельных вариантах воплощения изобретения биологически активный ботулинический нейротоксин, являющийся активным фармацевтическим ингредиентом в фармацевтической композиции, представлен, например, ботулиническим нейротоксином типа А или типа В.
1
Наше изобретение описывает способ (по существу APF), использующий хроматографию, для получения биологически активного ботулинического нейротоксина. Способ может включать последующие этапы предоставления среды ферментации (по существу APF) с последующей ферментацией бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации и восстановлением биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации с использованием анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин в ходе способа хроматографии (по существу APF). Этап восстановления также может включать использование среды с гидрофобным взаимодействием после использования катионообменной среды для хроматографии. Полученный биологически активный ботулинический нейротоксин может быть представлен комплексом ботулинического нейротоксина или нейротоксическим компонентом ботулинического нейротоксина, выделенным из комплекса ботулинического нейротоксина, с молекулярным весом примерно 150 кДа и не содержащим комплексообразующих белков из комплекса ботулинического нейротоксина. APF-способ (с использованием 2 колонок (IAPF), например, анионообменной, затем катионообменной хроматографии; или 3 колонок (FAPF), например, анионообменной, затем катионообменной хроматографии и среды для гидрофобного взаимодействия) может использоваться для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, такого как ботулинический нейротоксин типов А, В, C, D, Е, F и G. Полученный ботулинический нейротоксин является комплексом ботулинического нейротоксина типа А.
В одном аспекте нашего изобретения количество используемой среды для ферментации может включать от примерно 2 л до примерно 75 л среды ферментации (по существу APF), преимущественно от примерно 2 л до примерно 30 л среды ферментации (по существу APF). В качестве примера: в ходе способа может быть получено от примерно 100 мг до примерно 5 г, преимущественно от примерно 100 мг до примерно 3 г, более преимущественно от примерно 100 мг до примерно 1 г биологически активного ботулинического нейротоксина. Например, может быть получено от примерно 20 мг до примерно 100 мг или от примерно 20 мг до примерно 80 мг биологически активного ботулинического нейротоксина на 1 л используемой среды для ферментации.
Среда для ферментации может включать, например, белковый продукт растительного происхождения, экстракт дрожжей и глюкозу. Например, среда для ферментации может содержать примерно 5% в/о или менее белкового продукта растительного происхождения. Еще один пример: среда для ферментации может включать примерно 2% в/о или менее экстракта дрожжей. В еще одном варианте воплощения изобретения среда для ферментации может включать примерно 2% в/о или менее глюкозы. В отдельном примере среда для ферментации может включать примерно 5% в/о или менее белкового продукта растительного происхождения, примерно 2% в/о или менее экстракта дрожжей, примерно 2% в/о или менее глюкозы, при этом белковый продукт растительного происхождения, экстракт дрожжей и глюкоза находятся в любом соотношении в соответствии с указанными процентными значениями в/о. В некоторых вариантах воплощения изобретения этап ферментации продолжается в течение от примерно 60 часов до примерно 80 часов.
В одном варианте воплощения изобретения способ (по существу APF) с использованием хроматографии для получения биологически активного ботулинического нейротоксина заключается в следующих последовательных этапах: культивирование бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF), затем ферментация бактерий Clostridium botulinum из питательной среды в от примерно 2 л до примерно 75 л среды ферментации (по существу APF), более преимущественно от примерно 2 л до примерно 30 л среды ферментации (по существу APF), при этом, по меньшей мере, одна питательная среда (по существу APF) и среда ферментации (по существу APF) включает растительный белок, затем производят сбор среды ферментации путем удаления остатков клеток, присутствующих в среде ферментации, и концентрирование собранной среды ферментации путем фильтрации, и разведение концентрированной среды ферментации путем добавления буфера. После буферизации, проводят первый этап контакта, в ходе которого разведенная собранная среда ферментации контактирует с анионообменной средой таким образом, что биологически активный ботулинический нейротоксин связывается с анионообменной средой, затем элюирование уловленного ботулинического нейротоксина из анионообменной среды с получением первого элюента, затем получение второго элюента, потом идет этап фильтрации второго элюента, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин с использованием способа (по существу APF), включающего хроматографию.
В качестве примера: время завершения способа, от культивирования бактерий до получения биологически активного ботулинического нейротоксина, может составлять от примерно 50 часов до примерно 150 часов, более преимущественно от примерно 80 часов до примерно 120 часов. В отдельных вариантах воплощения изобретения питательная среда включает не более чем примерно 4% в/о белкового продукта растительного происхождения, в другом варианте воплощения изобретения питательная среда включает не более чем примерно 2% в/о экстракта дрожжей, и еще в одном варианте воплощения изобретения питательная среда включает не более чем примерно 2% в/о глюкозы. Питательная среда может включать белковый продукт растительного происхождения, дрожжевой экстракт и глюкозу в любом соотношении в соответствии с указанными количествами в/о. В отдельном примере уровень pH питательной среды на момент завершения этапа культивирования может составлять от примерно 6,5 до примерно 8,0, преимущественно от примерно 6,8 до примерно 7,6, более преимущественно 7,3. Этап культивирования может проводиться в течение от примерно 8 часов до примерно 14 часов, от примерно 10 часов до примерно 12 часов, преимущественно примерно 11 часов, при температуре от примерно 33°C до примерно 37°C, преимущественно при примерно 34,5°C, в анаэробной камере. В отдельном примере анаэробная камера для проведения культивирования может состоять из встроенного высокоэффективного воздушного фильтра. Этап ферментации может проводиться в течение от примерно 60 часов до примерно 80 часов, преимущественно примерно 72 часа, при температуре от примерно 33°C до примерно 37°C, преимущественно при 35°C. В соответствии с одним аспектом нашего изобретения этап сбора может приводить к удалению, по меньшей мере, примерно 80% РНК или ДНК, содержащихся в среде ферментации, а анионообменная среда может приводить к удалению всех измеряемых количеств оставшихся РНК и ДНК (ниже предела определения) в собранной среде ферментации. В другом аспекте изобретения этап сбора может проводиться в течение от примерно 1 часа до примерно 3 часов, преимущественно примерно 2,5 часа. В отдельных примерах этап сбора может проводиться до тех пор, пока не будет собрано 75% от исходного объема среды ферментации. В одном аспекте изобретения этап концентрирования может проводиться в течение от примерно 30 минут до примерно 2 часов, преимущественно примерно 0,75 часа. В другом аспекте изобретения этап разведения состоит в разведении собранной среды ферментации до начального веса среды ферментации по завершении этапа сбора. Первый этап контакта может проводиться, например, в течение от примерно 4 часов до примерно 5 часов. В одном примере первый элюент из анионообменной смолы собирают при показателях спектрофотометра от примерно 150 мЕП или более, до тех пор, пока показатели спектрофотометра при 280 нм от вершины пика будут составлять примерно 150 мЕП. Второй этап контакта может проводиться в течение от примерно 1 часа до примерно 3 часов, преимущественно примерно 2 часа. Такой второй элюент может быть собран из катионообменной смолы при показателях спектрофотометра от примерно 100 мЕП или более, пока показатели спектрофотометра при 280 нм от вершины пика будут составлять примерно 100 мЕП. Этап обработки второго элюента путем концентрирования и диафильтрации может проводиться в течение от примерно 1 часа до примерно 2 часов, преимущественно в течение 1,5 часа. В отдельном варианте воплощения изобретения этап фильтрации включает снижение биологической нагрузки путем пропуска второго элюента через фильтр для снижения биологической нагрузки. Фильтр для снижения биологической нагрузки может иметь размер пор от примерно 0,1 мкм до примерно 0,3 мкм, преимущественно 0,2 мкм. В отдельных вариантах воплощения изобретения способ может дополнительно включать третий этап контакта после второго этапа контакта, заключающийся в контакте второго элюента со средой для гидрофобного взаимодействия для дополнительного удаления примесей из второго элюента для получения третьего элюента. Такой второй этап контакта может проводиться в течение от примерно 1 часа до примерно 3 часов, преимущественно примерно 2 часа. Третий элюент может быть собран из среды для гидрофобного взаимодействия при показателях спектрофотометра от примерно 50 мЕП или более, пока показатели спектрофотометра от вершины пика будут составлять примерно 50 мЕП. Если предполагается использование третьего этапа контакта, этап обработки путем концентрирования и диафильтрации применим к третьему элюенту и проводят в течение от примерно 2 часов до примерно 4 часов. Снижение биологической нагрузки путем пропуска элюента, который подвергают концентрированию и диафильтрации (с использованием способа из 2 или 3 колонок), с использованием фильтра для снижения биологической нагрузки может быть выполнено соответствующим образом. В отдельных вариантах воплощения изобретения способ дополнительно включает этап замораживания полученного биологически активного ботулинического нейротоксина.
4
5
7
В отдельных вариантах воплощения изобретения питательная среда (по существу APF) включает объем от примерно 100 мл до примерно 500 мл. Отдельные этапы культивирования инициируют путем введения от примерно 100 мкл до примерно 500 мкл среды (APF) с рабочим банком клеток Clostridium botulinum в питательную среду (по существу APF). Затем может проводиться этап культивирования в анаэробной камере в течение, по меньшей мере, 8 часов, преимущественно примерно 11 часов, при температуре примерно 34,5°C±1°C. В одном примере среда с рабочим банком клеток может иметь количество жизнеспособных клеток, по меньшей мере, 1×10 колониеобразующих единиц/мл среды рабочего банка клеток, например, от примерно 1×10 до примерно 5×10 колониеобразующих единиц/мл среды рабочего банка клеток, и бактерия Clostridium botulinum в рабочем банке клеток может быть подвергнута селекции для получения по существу однородной морфологии.
В одном варианте воплощения изобретения среда с рабочим банком клеток включает примерно 20% по объему глицерина, например, стерильного глицерина. Среда с рабочим банком клеток может быть получена путем (а) выращивания бактерии Clostridium botulinum в среде APF, содержащей примерно 2% в/о соевого пептона, примерно 1% в/о экстракта дрожжей и примерно 1% в/о глюкозы, в анаэробной камере при температуре примерно 34,5 °C±1°C до достижения значения оптической плотности аликвоты, измеренного при длины волны примерно 540 нм, примерно 2,5±1,0 ЕП; и добавления глицерина для получения концентрации глицерина в среде примерно 20%, что позволяет получить рабочий банк клеток. Форма хранения рабочего банка клеток может быть получена путем замораживания рабочего банка клеток, например, при температуре ниже -135°C. Форма хранения рабочего банка клеток для использования в типичном способе в соответствии с текстом данной заявки может быть оттаяна при комнатной температуре и использована для начала этапа культивирования.
Этап культивирования может проводиться в течение от примерно 8 часов до примерно 14 часов, преимущественно, примерно 11 часов, при температуре от примерно 33°C до примерно 37°C, преимущественно при 34,5°С, в анаэробной камере, такой как, например, анаэробная камера/шкаф с интегрированным высокоэффективным воздушным фильтром (НЕРА), преимущественно в его рабочем пространстве. Этап ферментации может проводиться в течение от примерно 20 часов до примерно 80 часов, преимущественно от примерно 60 часов до примерно 80 часов, более преимущественно примерно 72 часа, при температуре от примерно 33°С до примерно 37°С, преимущественно при примерно 35°С.Способ может дополнительно включать, например, и перед этапом культивирования, этап окислительного восстановления питательной среды (по существу APF) путем воздействия на среду атмосферой в анаэробной камере. Способ также может включать, например, и перед этапом ферментации, этап окислительного восстановления среды ферментации (по существу APF) путем воздействия на среду ферментации атмосферой в анаэробной камере. В качестве примера: этап окислительного восстановления питательной среды (по существу APF) может проводиться в течение от примерно 10 часов до примерно 14 часов в анаэробной камере. Подобным образом, этап окислительного восстановления среды ферментации (по существу APF) может проводиться в течение от примерно 10 часов до примерно 14 часов перед началом этапа ферментации.
7
7
В одном варианте воплощения изобретения описан APF-способ, включая хроматографию, для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, включающий следующие последовательные этапы: добавление бактерий Clostridium botulinum из рабочего банка клеток (APF) в питательную среду (APF); культивирование бактерий Clostridium botulinum в питательной среде; ферментация бактерий Clostridium botulinum из этапа культивирования в среде ферментации (APF) до момента возникновения лизиса клеток Clostridium botulinum; сбор культуры ферментации (APF) для получения собранной среды ферментации; концентрирование собранной среды ферментации способом фильтрации; разведение профильтрованной среды ферментации путем добавления буфера для получения разведенной среды ферментации; первый этап контакта, в ходе которого разведенная среда ферментации контактирует с улавливающей хроматографической средой, при этом такая улавливающая хроматографическая среда представлена анионообменной средой; второй этап контакта, в ходе которого элюент из первого этапа контакта контактирует с очищающей хроматографической средой, при этом такая очищающая хроматографическая среда представлена катионообменной средой; фильтрация элюента из второго этапа контакта, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин путем улучшенного APF-способа. В отдельных вариантах воплощения изобретения способ может дополнительно включать этап проведения третьего этапа контакта после второго этапа контакта и до этапа фильтрации путем контакта элюента из второго этапа контакта со средой для гидрофобного взаимодействия. Фаза лизиса Clostridium botulinum может возникнуть в период от примерно 35 часов до примерно 70 часов после завершения этапа ферментации. Среда ферментации может иметь объем от примерно 2 л до примерно 75 л, от примерно 2 л до примерно 30 л, или от примерно 2 л до примерно 20 л среды ферментации. Весь способ может проводиться в течение от примерно 50 часов до примерно 150 часов, более преимущественно от примерно 80 часов до примерно 120 часов. Полученный таким образом ботулинический нейротоксин может иметь активность от примерно 2,4×10 до примерно 5,9×10 единиц/мл биологически активного ботулинического нейротоксина.
В соответствии с одним аспектом изобретения, на конец ферментации может быть получено от примерно 40 мг до примерно 85 мг ботулинического нейротоксина на 1 л среды ферментации. После различных этапов обработки (фильтрация/хроматография/фильтрация) может быть получено от примерно 30 мг до примерно 60 мг ботулинического нейротоксина на 1 л среды ферментации; от примерно 5 мг до примерно 25 мг ботулинического нейротоксина на 1 л среды ферментации; от примерно 6 мг до примерно 20 мг ботулинического нейротоксина на 1 л среды ферментации.
7
7
7
В одном варианте воплощения изобретения значение pH среды ферментации может быть приведено от примерно 6,0 до примерно 8, преимущественно от примерно 6,8 до примерно 7,6 на завершение этапа ферментации, более преимущественно примерно 7,3. В качестве другого примера: описан способ хроматографии (по существу APF) для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, включающий этапы получения среды ферментации (по существу APF), содержащей ботулинический нейротоксин, контакта среды с анионообменной хроматографической смолой для получения очищенного элюента, состоящего из ботулинического нейротоксина, контакта элюента с катионообменной хроматографической смолой для получения дополнительно очищенного элюента, а также фильтрации дополнительно очищенного элюента для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, очищенного в ходе способа хроматографии (по существу APF). В отдельных конфигурациях может использоваться анионообменная хроматографическая колонка, содержащая от примерно 600 мл до примерно 800 мл анионообменной хроматографической смолы. Анионообменная хроматографическая колонка может иметь диаметр от примерно 8 см до примерно 10 см, и толщина слоя анионообменной хроматографической смолы в колонке может составлять от примерно 9 см до примерно 16 см. Скорость потока среды ферментации через анионообменную хроматографическую смолу может составлять от примерно 140 см/час до примерно 250 см/час или от примерно 150 см/час до примерно 160 см/час. В другом аспекте изобретения в способе может использоваться от примерно 150 мл до примерно 300 мл катионообменной хроматографической смолы в хроматографической колонке, при этом катионообменная хроматографическая колонка имеет диаметр от примерно 5 см до примерно 8 см и толщина слоя катионообменной хроматографической смолы в колонке может составлять от примерно 5 см до примерно 11 см. Способ может включать, по меньшей мере, один этап диафильтрации и/или этап снижения биологической нагрузки. На этапе снижения биологической нагрузки может использоваться капсульный фильтр. Диафильтрация очищенного элюента преимущественно выполняется перед этапом снижения биологической нагрузки. В качестве одного примера: этап диафильтрации дополнительно очищенного элюента предшествует или выполняют после корректировки концентрации прошедшего диафильтрацию и дополнительно очищенного элюента, который затем пропускают через фильтр снижения биологической нагрузки. Способ позволяет получить ботулинический нейротоксин с активностью (определена в ходе биологического анализа LD50 мыши), по меньшей мере, примерно 2,0×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина, например, от примерно 2,4×10 до примерно 6,0×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина. Типичное восстановление от примерно 4 мг до примерно 25 мг ботулинического токсина по завершении способа может проводиться, например, на 1 л среды ферментации.
7
7
В другом варианте воплощения изобретения способ (по существу APF) для очистки биологически активного ботулинического нейротоксина может включать этапы получения от примерно 2 л до примерно 30 л среды ферментации (APF), включающей ботулинический нейротоксин; сбор среды ферментации (APF); выполнение анионообменной хроматографии собранной среды ферментации (APF) с получением первого элюента; контакт элюента, полученного в ходе анионообменной хроматографии, со средой катионообменной хроматографии для проведения катионообменной хроматографии и получения второго элюента; фильтрация второго элюента, полученного в ходе катионообменной хроматографии, с получением очищенного ботулинического нейротоксина, и полученный ботулинический нейротоксин обладает активностью от примерно 2,4×10 до примерно 5,9×10 единиц/мг биологически активного ботулинического нейротоксина, и полученное количество может составлять от примерно 4 мг до примерно 25 мг на 1 л используемой среды ферментации (APF).
7
7
1
Наше изобретение также описывает способ получения фармацевтической композиции (по существу APF), в которой активный ингредиент представлен биологически активным ботулиническим нейротоксином, и такой способ включает этапы получения биологически активного ботулинического нейротоксина путем (i) использования среды ферментации, по существу не содержащей продуктов животного происхождения; (ii) ферментации бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации, и (iii) восстановления биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации с использованием анионообменной хроматографической среды с последующим использованием катионообменной хроматографической среды; а затем соединения ботулинического нейротоксина, по меньшей мере, с одним подходящим вспомогательным веществом, с получением фармацевтической композиции (по существу APF). В одном примере способ включает этап высушивания композиции с ботулиническим нейротоксином и, по меньшей мере, одним подходящим вспомогательным веществом, для получения устойчивой формы для доставки или хранения путем сушки сублимацией или лиофилизации, или высушивания в вакууме, и в такой композиции активный ингредиент представлен биологически активным ботулиническим нейротоксином, а среда ферментации включает белковый продукт растительного происхождения. Растение, из которого может быть получен белковый продукт, может быть представлено соей, кукурузой или хмелем, семенами Lupinus campestris с удаленной горечью или гидролизированными продуктами таких семян. Полученный ботулинический нейротоксин может иметь активность от примерно 2,0×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина до примерно 6,0×10 единиц/мг ботулинического нейротоксина. ботулинический нейротоксин выбирают из группы, включающей типы А, В, С, D, Е, F и G ботулинического нейротоксина, преимущественно ботулинический нейротоксин типа А. В отдельных случаях ботулинический нейротоксин получают в виде нейротоксического компонента ботулинического токсина с молекулярным весом примерно 150 кДа, не содержащего комплексообразующих белков комплекса ботулинического токсина. В отдельных вариантах воплощения изобретения подходящее вспомогательное вещество выбирают из группы, состоящей из белка, человеческого сывороточного альбумина, рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина, желатина, сахарозы, трегалозы, гидроксиэтилового крахмала, коллагена, лактозы, сахарозы, аминокислоты, натрия хлорида, калия хлорида, полисахарида, каприлата, поливинилпирролидона и натрия цитрата. Получение биологически активного ботулинического нейротоксина может дополнительно включать этап использования среды для гидрофобного взаимодействия с последующим использованием катионообменной среды. В отдельных примерах вакуумную сушку проводят при температуре от примерно 20°C до примерно 25°C. В некоторых вариантах воплощения изобретения сушка в вакууме производится при давлении от примерно 70 мм рт. ст.до примерно 90 мм рт. ст. Время для сушки в вакууме может составлять от примерно 4 часов до примерно 5 часов.
Отдельные аспекты данного изобретения направлены на предоставление фармацевтической композиции, которая, например, может включать комплекс биологически активного ботулинического нейротоксина и вспомогательного вещества, которое выбирают из группы, состоящей из белка, человеческого сывороточного альбумина, рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина, желатина, сахарозы, трегалозы, гидроксиэтилового крахмала, коллагена, лактозы и сахарозы, при этом фармацевтическая композиция по существу не содержит нуклеиновой кислоты.
7
7
В отдельных примерах описана фармацевтическая композиция, включающая биологически активный ботулинический нейротоксин, при этом полученный ботулинический нейротоксин имеет активность от примерно 2,0×10 единиц/мг биологически активного ботулинического нейротоксина до примерно 6,0×10 единиц/мг биологически активного ботулинического нейротоксина, и, по меньшей мере, одно вспомогательное вещество, при этом композиция включает менее чем примерно 12 м.д. нуклеиновой кислоты, преимущественно менее чем 1 м.д. нуклеиновой кислоты на 1 мг комплекса ботулинического нейротоксина.
В отдельном варианте воплощения изобретения способ хроматографии (по существу APF) для получения биологически активного ботулинического нейротоксина включает следующие последовательные этапы: культивирование бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF) в течение от примерно 10 часов до примерно 12 часов, или до тех пор, пока биомасса в питательной среде не достигнет значения оптической плотности при длине волны 540 нанометров (нм) от примерно 0,8 ЕП до примерно 4,5 ЕП; ферментация бактерий Clostridium botulinum из питательной среды в среде ферментации (по существу APF) в течение от примерно 65 часов до примерно 75 часов, или до момента, когда на завершение ферментации биомасса не достигнет значения оптической плотности при длине волны примерно 890 нм от примерно 0,05 ЕП до примерно 0,7 ЕП (измерено с использованием интерактивного датчика для биомассы); сбор среды ферментации в течение примерно 2,5 часов, при этом удаляют остатки клеток из среды ферментации, а вес среды ферментации снижают примерно на три четверти от ее начального веса на начало этапа сбора; концентрирование собранной среды ферментации путем фильтрования тангенциальным потоком до примерно одной четверти от начального объема среды на начало этапа сбора; разведение концентрированной среды ферментации путем добавления буфере, при этом этапы концентрирования и разведения проводят в течение от примерно 0,5 часов до примерно 2 часов, и во время концентрирования количество среды ферментации снижают до примерно одной четвертой части от ее начального веса на начало этапа сбора, и затем такую среду разводят путем добавления буфера до начального объема среды на момент начала этапа сбора; контакт разведенной среды ферментации с улавливающей хроматографической средой для улавливания биологически активного ботулинического нейротоксина в течение периода от примерно 4 часов до примерно 5 часов; контакт элюента из улавливающей хроматографической среды с первой очищающей хроматографической средой для проведения первой очистки для удаления примесей в течение периода от примерно 1,5 часа до примерно 2,5 часов; проведение второго этапа очистки путем пропускания элюента из очищающей хроматографической среды через среду для гидрофобного взаимодействия в течение времени от примерно 1,5 часа до примерно 2,5 часов; обработка элюента из среды для гидрофобного взаимодействия путем диафильтрации в течение времени от примерно 1 часа до примерно 4 часов; фильтрация обработанного элюента через фильтр для снижения биологической нагрузки в течение примерно 0,5 часов, что позволяет получить биологически активный ботулинический нейротоксин.
В другом аспекте описана система хроматографии (по существу APF) для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, и такая система включает следующее: первый аппарат для культивирования бактерий Clostridium botulinum, способного включать питательную среду (по существу APF); второй аппарат для ферментации бактерий Clostridium botulinum, которые были культивированы в первом аппарате, и такой второй аппарат способен включать среду ферментации (по существу APF); третий аппарат для сбора среды ферментации; четвертый аппарат для концентрирования собранной среды ферментации и разведения среды ферментации, включающий фильтрацию тангенциальным потоком (ФТП); пятый аппарат для проведения первой очистки ботулинического нейротоксина из концентрированной и разведенной среды, при этом такой пятый аппарат включает анионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный ботулинический нейротоксин; шестой аппарат включает катионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить второй очищенный ботулинический нейротоксин.
В отдельном варианте воплощения изобретения система может дополнительно состоять из седьмого аппарата для проведения дополнительной очистки путем очистки второго очищенного ботулинического нейротоксина, полученного из шестого аппарата, и такой седьмой аппарат включает среду для гидрофобного взаимодействия, что позволяет получить очищенный в третий раз ботулинический нейротоксин. Система также может включать восьмой аппарат с фильтрационной мембраной для фильтрации элюента из шестого или седьмого аппарата.
В еще одном варианте воплощения изобретения хроматографическая колонка с анионообменной хроматографической средой имеет диаметр от 8 см до 15 см и толщину слоя в колонке от примерно 8 см до примерно 15 см. В еще одном варианте воплощения изобретения четвертый аппарат системы включает хроматографическую колонку, которая работает при скорости потока от примерно 125 см/час до примерно 200 см/час, и колонка имеет колоночный объем от примерно 500 мл до примерно 1 л. В одном аспекте изобретения пятый аппарат может иметь объем колонки от примерно 50 мл до примерно 500 мл, а также толщину слоя от примерно 8 см до примерно 15 см. В некоторых примерах хроматографическая колонка пятого аппарата имеет диаметр от примерно 2 см до примерно 10 см. Хроматографическая колонка пятого аппарата может иметь типичную скорость потока от примерно 100 см/час до примерно 200 см/час. Седьмой аппарат системы может включать фильтрующую мембрану.
В другом варианте воплощения изобретения система может дополнительно включать девятый аппарат, состоящий из анаэробной камеры для обеспечения анаэробной атмосферы, при этом также система включает пятый аппарат для культивирования бактерий Clostridium botulinum. Такой девятый аппарат преимущественно включает интегрированный высокоэффективный воздушный фильтр (НЕРА), расположенный в камере/рабочем пространстве аппарата. Второй аппарат системы (для ферментации) может включать, по меньшей мере, один датчик для определения окислительно-восстановительного потенциала, pH или оптической плотности. В отдельном примере, по меньшей мере, один одноразовый датчик выбирают из группы, состоящей из окислительно-восстановительного датчика, датчика pH и датчика вязкости. Восьмой аппарат системы может включать аппарат с фильтрацией тангенциальным потоком для концентрирования и замены буфера. В дополнительном варианте воплощения изобретения система может включать десятый аппарат, состоящий из аппарата для снижения биологической нагрузки. В одном примере аппарат для снижения биологической нагрузки включает фильтр с размером пор от примерно 0,1 мкм до примерно 0,3 мкм, преимущественно 0,2 мкм. Система может также включать одиннадцатый аппарат для использования после получения ботулинического нейротоксина вторичной очистки для хранения очищенного ботулинического нейротоксина. В одном примере такой аппарат для хранения обеспечивает температуру хранения от примерно -25°С до примерно -80°С.
7
7
В другом аспекте изобретения биологически активный ботулинический токсин получают в ходе APF-способа, включающего следующие этапы: предоставление среды ферментации (по существу APF); ферментация бактерий Clostridium botulinum в среде ферментации; восстановление биологически активного ботулинического нейротоксина из среды ферментации с использованием анионообменной хроматографической среды с последующим использованием катионообменной хроматографической среды, при этом получаемый биологически активный ботулинический токсин имеет активность от примерно 2,0×10 единиц/мг биологически активного ботулинического нейротоксина до примерно 6,0×10 единиц/мг биологически активного ботулинического нейротоксина. В одном варианте воплощения изобретения способ дополнительно включает этап дополнительной очистки ботулинического нейротоксина путем использования среды для гидрофобного взаимодействия с последующим использованием катионообменной среды.
В соответствии с другим аспектом изобретения описан способ лечения состояния пациента с использованием фармацевтической композиции, включающей ботулинический нейротоксин, полученный в соответствии с описанными здесь способами. Состояние может включать заболевание, недомогание, слабость, косметическую деформацию или внешний вид. В одном примере способ лечения состояния у пациента включает этап введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей ботулинический нейротоксин и, по меньшей мере, одно подходящее вспомогательное вещество, при этом ботулинический токсин обладает активностью примерно 1 единица ≥ примерно 0,02 пикограмм для лечения состояния пациента.
В отдельном примере ботулинический нейротоксин для лечения таких состояний может быть получен в ходе способа, включающего следующее: культивирование бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF); получение среды ферментации (по существу APF), содержащей ботулинический нейротоксин; контакт среды с анионообменной хроматографической средой для получения очищенного элюента, содержащего ботулинический нейротоксин; контакт элюента с катионообменной хроматографической средой для получения дополнительно очищенного элюента; фильтрация дополнительно очищенного элюента для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, очищенного в ходе способа хроматографии (по существу APF).
В одном варианте воплощения изобретения описана система хроматографии (по существу APF) для получения биологически активного ботулинического нейротоксина, которая включает следующее: первый аппарат для анаэробного культивирования бактерий Clostridium botulinum, способный включать от примерно 200 мл до примерно 1 л питательной среды (по существу APF); второй аппарат для ферментации бактерий Clostridium botulinum, которые были культивированы в первом аппарате, и такой второй аппарат способен включать от примерно 2 л до примерно 30 л среды ферментации (по существу APF) и включать, по меньшей мере, один одноразовый датчик, выбранный из группы, состоящей из окислительно-восстановительного датчика, датчика pH и датчика вязкости; девятый аппарат для предоставления анаэробной атмосферы, включающий анаэробную камеру с интегрированным высокоэффективным воздушным фильтром, и указанная камера может включать первый аппарат для анаэробного культивирования бактерий Clostridium botulinum; третий аппарат для сбора среды ферментации; четвертый аппарат для концентрирования собранной среды ферментации и разведения среды ферментации; пятый аппарат для проведения первой очистки ботулинического нейротоксина из четвертого аппарата, при этом такой пятый аппарат включает анионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный первично ботулинический нейротоксин; шестой аппарат включает катионообменную хроматографическую среду, что позволяет получить очищенный вторично ботулинический нейротоксин; седьмой аппарат для проведения третьей очистки очищенного вторично ботулинического нейротоксина, и такой седьмой аппарат включает среду для гидрофобного взаимодействия, что позволяет получить очищенный третично ботулинический нейротоксин; восьмой аппарат, включающий мембрану для ФТП.
1
В отдельных примерах среда ферментации включает не более чем примерно 5% в/о белкового продукта растительного происхождения, не более чем примерно 2% в/о экстракта дрожжей и не более чем примерно 2% в/о глюкозы, при этом уровень pH среды ферментации составляет от примерно 6,8 до примерно 7,6, преимущественно примерно 7,3, на начало этапа ферментации в течение примерно 72 часов. В другом варианте воплощения изобретения способ может дополнительно включать этап контакта дополнительно очищенного элюента со средой для гидрофобного взаимодействия для получения дополнительно очищенного элюента, содержащего ботулинический нейротоксин. В отдельном примере способ лечения состояний может заключаться в использовании ботулинического нейротоксина, полученного в виде нейротоксического компонента ботулинического токсина с молекулярным весом примерно 150 кДа, не содержащего комплексообразующих белков комплекса ботулинического токсина. Типичные этапы введения могут быть выбраны из группы путей введения, состоящей из внутримышечного, интрадермального, подкожного, интрагландулярного, интратекального, ректального, перорального и трансдермального введения, а ботулинический нейротоксин выбирают из группы, состоящей из ботулинического токсина типа А, В, С, D, Е, F или G. Преимущественно, ботулинический нейротоксин представлен ботулиническим нейротоксином типа А.
В некоторых случаях система может облегчать способ получения нейротоксического комплекса биологически активного ботулинического нейротоксина для использования в качестве компонента фармацевтической композиции, включающей менее чем примерно 12 нг нуклеиновой кислоты на 1 мг комплекса ботулинического нейротоксина, преимущественно менее 1 нг нуклеиновой кислоты на 1 мг комплекса ботулинического нейротоксина, более преимущественно не содержащей измеряемых количеств нуклеиновой кислоты (например, ниже предела определения).
ГРАФИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ
На Фигуре 1А представлена технологическая схема, отображающая основные этапы способа NAPF, описанного в Примере 1. На Фигуре 1В представлена технологическая схема, отображающая основные этапы способа IAPF, описанного в Примере 2, при этом этапы хроматографического улавливания и очистки могут предполагать использование 2 колонок (анионообменной, затем катионообменной) или 3 колонок (FAPF) (анионообменной, затем катионообменной и колонки для гидрофобного взаимодействия).
ОПИСАНИЕ
Наше изобретение основано на открытии того, что биологически активный клостридиальный нейротоксин с высокой активностью и высокой степенью чистоты, такой как ботулинический нейротоксин, может быть получен путем использования простой, быстрой и экономичной APF-системы и способа хроматографии. В значительной степени, использование нашей системы и способа может привести к получению очищенного ботулинического нейротоксина, включающего 1 нг (или менее 1 нг) примесей нуклеиновой кислоты (РНК и ДНК) на 1 мг полученного очищенного ботулинического нейротоксина, и для очистки ферментированного ботулинического нейротоксина не используют ферментов животного происхождения, таких как РНКаза и ДНКаза. Например, использование нашей системы и способа может привести к получению очищенного ботулинического нейротоксина, включающего менее чем примерно 0,6 нг примесной нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) на 1 мг полученного очищенного ботулинического нейротоксина. Полученный ботулинический нейротоксин может быть представлен комплексом ботулинического токсина типа А, такого как комплекса 300 кДа, 500 кДа или 900 кДа (примерные значения молекулярного веса) или его смеси. Полученный ботулинический нейротоксин также может быть представлен нейротоксическим компонентом ботулинического токсина (т.е. без комплексообразующих белков) с молекулярным весом примерно 150 кДа. Ботулинический нейротоксин может иметь любой серотип А, В, С, D, Е, F или G или представлен смесью таких серотипов. Кроме того, относительно рекомбинантного, гибридного, химерного или модифицированного ботулинического токсина (легкая цепь, тяжелая цепь или обе цепи) могут использоваться улучшенные системы и способы.
Важный аспект нашего изобретения представляет собой использование анионообменной (улавливающей) хроматографической среды с последующим использованием катионообменной (очищающей) хроматографической среды для очистки ботулинического нейротоксина из среды ферментации APF, в которой были ферментированы бактерии Clostridium botulinum. Нами было выявлено, что использование анионообменной хроматографической среды и дальнейшее использование катионообменной хроматографической среды обеспечивает эффективный и быстрый способ получения ботулинического нейротоксина высокой степени чистоты и с высоким выходом. Ранее считалось, что использование анионообменной хроматографии имеет отрицательное влияние на характер исчерченности геля ботулинического нейротоксина, что препятствует использованию анионообменной хроматографии для очистки ботулинического нейротоксина. См., например, патент США 7452697 (столбец 55, строки 53-57).
Другим важным аспектом нашего изобретения является то, что оно позволяет получить ботулинический нейротоксин высокой степени чистоты (т.е. ≤1 нг нуклеиновой кислоты/мг полученного ботулинического нейротоксина), как это указано выше. Дополнительный важный аспект нашего изобретения заключается в том, что для системы и способа по данному изобретению для всех этапов культивирования, ферментации и очистки необходима одна неделя или менее, в отличие от известного способа Шанца, для которого требуется несколько недель (т.е. обычно от примерно 18 до примерно 22 дней) для культивирования, ферментации и очистки ботулинического нейротоксина. В преимущественном варианте воплощения нашего изобретения все этапы культивирования, ферментации и очистки могут быть завершены в течение шести дней или менее. В еще более преимущественном варианте воплощения нашего изобретения все этапы культивирования, ферментации и очистки могут быть завершены в течение примерно четырех дней или менее (например, в течение от примерно 80 до примерно 144 часов или в течение указанного времени/диапазона). Нами был изобретен данный быстрый вариант воплощения изобретения путем разработки способа из восьми или девяти этапов (а также системы для выполнения данного способа), а также путем обнаружения того, что каждый из восьми или девяти этапов в отдельном варианте воплощения изобретения может быть завершен в течение установленных ниже периодов времени:
от примерно 8 часов до примерно 14 часов для культивирования;
от примерно 60 часов до примерно 80 часов для ферментации;
примерно 2,5 часа для сбора;
от примерно 2 часов до примерно 4 часов для концентрирования и разведения;
от примерно 4 часов до примерно 6 часов для анионообменной хроматографии (включает время для элюирования уловленного ботулинического токсина);
примерно 2 часа для катионообменной хроматографии;
примерно 2 часа для необязательного третьего этапа хроматографии (т.е. хроматографии с гидрофобным взаимодействием);
от примерно 2 часов до примерно 4 часов для концентрирования и диафильтрации; и
примерно ½ часа для дополнительной фильтрации. Таким образом, общее время, необходимое для завершения наших 8 или 9 этапов в ходе быстрого и наиболее предпочтительного варианта воплощения нашего изобретения, составляет от примерно 75 часов до примерно 150 часов.
Наше изобретение более эффективно и экономит время. В одном аспекте изобретения наш новый способ предполагает использование предварительно выбранных и утвержденных клеточных линий, и это устраняет необходимость этапов высевания и выращивания клеток, используемые в способе Шанца, а также выбора и сбора колоний, увеличение линии клеток в собранных колониях (перед этапами культивирования и ферментации), которые были необходимы для культивирования и дальнейшей инокуляции среды ферментации. В одном аспекте начальный этап нашего изобретения предусматривает культивирование предварительно выбранных клеток для инокуляции в питательную APF-среду, что экономит время и сокращает количество этапов способа.
В ходе проведения экспериментов нами были разработаны системы из двух хроматографических колонок («IAPF») и трех хроматографических колонок («FAPF»/«FIAPF») и способы для очистки ботулинического нейротоксина, присутствующего в среде ферментации, получаемой в результате APF-ферментации бактерий Clostridium botulinum. Что особенно важно, в то время как APF-способ ферментации может снизить или элиминировать использование продуктов растительного происхождения (таких как казеин или мясной бульон), т.к. такие питательные вещества используют для культивирования и ферментации бактерий клостридий, после известных APF-способов ферментации обычно следует один или несколько этапов очистки, предполагающих использование продуктов животного происхождения, таких как ферменты ДНКаза и РНКаза. Наши системы и способы для очистки ботулинического нейротоксина, присутствующего в среде ферментации APF, не предполагают использование продуктов животного происхождения.
Наше изобретения может охватывать загрузку собранной среды ферментации (например, очищенной путем фильтрации) в анионообменную колонку, такую как POROS 50HQ с анионообменной хроматографической смолой, предоставленную Applied Biosystems. В одном аспекте изобретения может использоваться сильная анионообменная среда с основной матрицей в виде полистирена/дивинилбензена и диаметром частиц примерно 50 мкм, а также динамической нагрузкой (БСА, мг/мл) примерно 60-70. Анионообменная колонка улавливает клостридиальный нейротоксин (такой как комплекс ботулинического токсина) и снижает уровни примесей. Было выявлено, что анионообменная колонка обеспечивает эффективный захват комплекса ботулинического токсина из собранной среды ферментации с сохранением биологической активности комплекса ботулинического токсина при одновременном разделении множества примесей, присутствующих в ботулиновом токсине в среде ферментации. Для элюирования уловленного (связанного) клостридиального нейротоксина из анионообменной колонки используют подходящий буфер.
В двухколоночном варианте воплощения нашего изобретения элюент (содержащий ботулинический нейротоксин) из анионообменной колонки загружают в катионообменную колонку для дополнительной очистки ботулинического нейротоксина от примесей. Катионообменная колонка может быть представлена колонкой POROS 20HS с катионообменной смолой от Applied Biosystems. В одном аспекте изобретения может использоваться сильная катионообменная среда с основной матрицей в виде полистирена/дивинилбензена и диаметром частиц примерно 20 мкм, а также динамической нагрузкой (БСА, мг/мл) примерно >75. В трехколоночном варианте воплощения нашего изобретения (FAPF) элюент из катионообменной колонки загружают в колонку для гидрофобного взаимодействия с такой смолой, как Phenyl Sepharose HP от GE Healthcare, для дополнительной очистки ботулинического нейротоксина. В одном аспекте изобретения может использоваться матрица с гранулами агарозы, соединенных в высокой степени поперечными связями с размером частиц примерно 34 мкм, которые были получены с использованием фенильных групп с параметром динамического связывания (химотрипсиноген, мг/мл) примерно 45.
После завершения двухколоночного или трехколоночного способа, элюент из последней колонки может быть подвергнут дальнейшей обработке для получения нерасфасованного комплекса ботулинического токсина с высокой степенью очистки. Этапы обработки после хроматографии могут включать концентрирование и обмен буфера путем ультрафильтрации и диафильтрации, стерильной фильтрации и приготовления раствора очищенного комплекса ботулинического токсина (в отличие от суспензии, что использовали раньше), преимущественно в калия цитрате, и в одном примере - при концентрации калия цитрата 10 мМ при pH примерно 6,5.
В определенных преимущественных вариантах воплощения изобретения среда для выращивания (анаэробного культивирования и анаэробной ферментации) Clostridium botulinum и получение ботулинического токсина может включать полученные из сои продукты для замены продуктов животного происхождения, таким образом, используемая среда по существу или по существу не содержит продуктов животного происхождения. Этап культивирования повышает количество микроорганизмов для последующей ферментации. Культивирование позволяет использовать находящиеся в состоянии покоя, предварительно замороженные бактерии для восстановления в активно растущие культуры. Кроме того, объем и количество жизнеспособных микроорганизмов, используемых для инокуляции среды ферментации, могут быть проконтролированы более точно с использованием активно растущей среды, полученной из подвергнутого хранению, не размножающегося банка клеток Clostridium botulinum. Таким образом, образец рабочего банка клеток в APF-среде подвергают оттаиванию и помещают в выбранную питательную APF-среду. После достижения подходящего уровня роста бактерий, питательная среда используется для инокуляции среды ферментации. В одном примере для инокуляции среды ферментации используют от примерно 1% до примерно 5%, или значение между указанным диапазоном питательной среды, содержащей Clostridium botulinum в фазе роста. Ферментацию проводят для получения максимального количества клеток микроорганизмов в широкомасштабной анаэробной среде (Ljungdahl et al., Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986), edited by Demain et al, American Society for Microbiology, Washington, D.C. page. 84). С другой стороны, рост Clostridium botulinum в среде ферментации может отмечаться при добавлении образца рабочего банка клеток непосредственно в среду ферментации.
j
Ранее рост бактерий Clostridium botulinum в питательной среде отмечался в два этапа: первый этап высевания клеток с последующим ростом колонии, селекции и роста, и второй этап инокуляции питательной среды;(обычно двухстадийное повышение культуры) и инокуляции среды ферментации с получением ботулинического токсина. Преимущественно, рост в питательной среде на любой стадии не приводит к лизису клеток до инокуляции среды ферментации с финальным ростом в питательной среде. Таким образом, до разработки нашего изобретения, перед началом этапа ферментации требовалось примерно четыре дня для культивирования бактерий Clostridium botulinum. Согласно нашему изобретению, мы способны завершить все стадии культивирования в течение только 8-14 часов, поскольку нет необходимости в применении используемых ранее этапов выращивания клеток с последующим выжиданием времени для роста колонии в чашках с кровяным агаром, селекцией колоний из чашек для роста в небольших объемах культуры (например, 8-9 мл) и инокуляцией питательной среды. Согласно одному аспекту нашего изобретения, предварительно отобранные клетки непосредственным образом используют для инокуляции питательной среды, которую затем используют для инокуляции широкомасштабной среды ферментации, в результате чего ботулинический токсин проходит очистку, что позволяет устранить выращивание, образование колоний, селекцию и этапы ступенчатого повышения, которые использовали ранее для выращивания клеток, которые инокулировали в питательную среду с дальнейшей инокуляцией в среду ферментации.
Питательные среды животного происхождения (не-APF или «NAPF») обычно включают сердечно-мозговой бульон (BHI), бакто-пептон, NaCl и глюкозу. Питательная среда по данному изобретению представлена питательной APF-средой. Например, основанный на сое продукт можно использовать вместо BHI и бакто-пептона в питательной среде и среде ферментации. Преимущественно, основанный на сое продукт растворим в воде и включает гидролизированную сою, однако Clostridium botulinum могут расти в среде, содержащей нерастворимую сою. Любой источник основанных на сое продуктов может использоваться в соответствии сданным изобретением. Преимущественно, соя представлена гидролизированной соей, и такой гидролиз осуществляется с использованием ферментов неживотного происхождения. Источники гидролизированной или растворимой сои включают Hy-Soy (Quest International), Soy peptone (Gibco), Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals) и SE50MK (DMV).
ПРИМЕРЫ
Представленные ниже примеры описывают отдельные варианты воплощения изобретения и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. Если иное не указано в примерах, термины «токсин» или «ботулинический токсин» обозначает комплекс ботулинического токсина типа А с молекулярным весом примерно 900 кДа. Описанные здесь системы и способ для очистки комплекса ботулинического токсина типа А с молекулярным весом примерно 900 кДа обладают готовой применимостью относительно очистки токсинов с молекулярным весом примерно 150 кДа, примерно 300 кДа, примерно 500 кДа, а также другими значениями молекулярного веса, комплексов, серотипов ботулинического токсина и нейротоксического компонента ботулинического токсина.
Пример 1
Способ получения ботулинического токсина без APF (способ Шанца)
Данный пример описывает использование установленного ранее способа Шанца для получения ботулинического нейротоксина. Способ не является APF-способом, и в ходе такого способа применяют среды и реагенты животного происхождения (т.е. чашки с мясным кровяным агаром для культивирования, казеин в среде ферментации, а также использование ферментов РНКазы и ДНКазы для очистки ботулинического нейротоксина). На Фигуре 1А представлена схема основных этапов способа Шанца. Способ Шанца включает от примерно 16 до 20 этапов, в производственных масштабах используют ферментер объемом 115 л, и способ занимает примерно 3 недели. Способ Шанца начинается с оттаивания ампулы с маточным банком клеток (МБК) Clostridium botulinum (не APF) до комнатной температуры с четырьмя последующими этапами культивирования. Вначале отбирают колонии с подходящей морфологией: аликвоты из оттаянной ампулы с МБК были высеяны способом штриха на чашках с предварительно восстановленным колумбийским кровяным агаром (СВА), которые инкубировали в анаэробных условиях в течение 30-48 часов при температуре 34°C±1°C. Затем выбранные колонии инокулировали в тест-пробирки 9 мл, содержащие среду для роста с казеином в течение 6-12 часов при температуре 34°C. Содержимое пробирки 9 мл с более быстрым ростом и большей плотностью (этап отбора роста) затем было дополнительно культивировано в двух анаэробных инкубаторах (третий и четвертый этап культивирования) в течение 12-30 часов при температуре 34°C во флаконах для культивирования 600 мл - 1 л с последующим культивированием в ферментере 15-25 л, содержащим среду роста с казеином в течение 6-16 часов при температуре 35°C. Такие двухэтапные культивирования проводили в питательной среде, содержащей 2% гидролизата казеина (продукт расщепления казеина [белка молока]), 1% экстракта дрожжей и 1% глюкозы (декстрозы) в воде при pH 7,3.
После поэтапного культивирования следовало дополнительное культивирование в течение 60-96 часов при температуре 35°C в ферментере для использования в промышленном производстве (т.е. объемом 115 л) в среде, содержащей казеин, и в контролируемой анаэробной атмосфере. Рост бактерий обычно завершается спустя 24-36 часов, и во время этапа ферментации, проводимого в течение от примерно 65 до примерно 72 часов, большая часть клеток лизировала и высвобождала ботулинический нейротоксин. Считается, что токсин высвобождается в ходе лизиса клеток и активируется протеазами, присутствующими в среде. Фильтрат питательной среды может быть получен с использованием однослойного погруженного фильтра для удаления основных примесей (т.е. целых и разрушенных клеток), что позволяет получить прозрачный раствор, указываемый как очищенная культура. Сбор ботулинического нейротоксина из очищенной культуры сопровождался понижением pH очищенной культуры до 3,5 с использованием 3М серной кислоты для осаждения сырого токсина при температуре 20°C (кислотное осаждение). Затем сырой ботулинический нейротоксин концентрируют (для достижения снижения объема) путем ультрамикрофильтрации (микрофильтрации) (обозначается как МФ или УФ) с последующей диафильтрацией (ДФ). Для этапа микрофильтрации использовали фильтр 0,1 мкм.
Собранный необработанный или сырой токсин затем был перенесен в сосуд для ферментации и стабилизирован путем добавления ингибитора протеазы (бензамидина гидрохлорида). Для расщепления (гидролизации) нуклеиновых кислот были добавлены РНКаза и ДНКаза. Гидролизированные нуклеиновые кислоты и примеси с низким молекулярным весом затем были удалены в ходе дополнительных этапов УФ и ДФ. Затем был выделен токсин с использованием фосфатного буфера pH 6,0, а остатки клеток были удалены путем очистки. После этого было проведено три последовательных этапа осаждения (в холодном этаноле, соляной кислоте и аммония сульфате). Очищенный комплекс ботулинического нейротоксина (общий токсин) хранили в виде суспензии в буфере натрия фосфат/аммония сульфат при температуре от 2°C до 8°C.
7
260
278
Завершение такого способа Шанца (не APF) Примера 1, включая этапы сбора и очистки, занимает от примерно двух до примерно трех недель. Полученный общий ботулинический нейротоксин был представлен в виде высококачественной суспензии 900 кДа, комплекса ботулинического токсина типа А, полученного из штамма Clostridium botulinum Hall А со специфической активностью ≥2×10 Е/мг, А/А менее 0,6 и отличительной манерой связывания при гель-электрофорезе, и подходит для использования в составлении фармацевтической композиции ботулинического токсина.
Ботулинический нейротоксин также может быть получен в ходе другого способа (APF), не являющимся хроматографией, как это описано в Примере 7 патента США 7452697, и весь такой нехроматографический APF-способ (от начала культивирования до завершения всех этапов очистки и обработки) занимает от примерно двух до трех недель. С другой стороны, ботулинический нейротоксин также может быть получен в ходе другого способа хроматографии (APF), как это описано в Примере 16 патента США 7452697, и весь такой APF-способ хроматографии (от начала культивирования до завершения всех этапов очистки и обработки) занимает одну неделю или более.
Пример 2
Двухколоночные и трехколоночные APF-системы и способы хроматографии для получения ботулинического нейротоксина Нами были разработаны быстрые, основанные на анион-катионной хроматографии системы и способы (APF) для получения ботулинического нейротоксина высокой степени чистоты с большим выходом. Способ данного Примера 2 включает только 8-10 основных этапов, для производственных целей (т.е. для получения граммовых количеств ботулинического нейротоксина) использовали сосуд-ферментер 20 л, и весь способ занимает всего лишь 4-7 дней, преимущественно от примерно 4 до примерно 6 дней, для завершения всех этапов способа от начала культивирования до завершения окончательной очистки и хранения токсина. Описанные в системах аппараты обсуждаются ниже. Был разработан способ хроматографии из двух и трех сред, и такие способы описаны в тексте данной заявки. В способе из двух сред используют анионообменную хроматографию с последующей катионообменной хроматографией. В способе из трех сред используют анионообменную хроматографию с последующей катионообменной хроматографией, а затем хроматографией с гидрофобным взаимодействием (ХГВ). ХГВ позволяет дополнительно удалить примеси, такие как примеси 49 кДа (которые представляют собой глюкозофосфат изомеразу клетки-хозяина, как это описано ниже).
Приготовление рабочего банка клеток
Нами был разработан новый банк клеток Clostridium botulinum (для использования для начала этапа культивирования) без использования чашек с колумбийским кровяным агаром, что устраняет необходимость в отборе колонии перед культивированием, а также устраняет необходимость в проведении этапа из способа Шанца, т.е. культивирования в пробирке и многочисленных этапов высевания (культивирования).
Для этой цепи разработанный ранее маточный банк клеток (МБК) из способа Шанца использовали для создания APF-банка клеток для исследования (БКИ), из которого были получены новый APF-маточный банк клеток (МБК) и последующий рабочий банк клеток (РБК). Банк клеток для исследования (БКИ) был получен из колонии МБК способа Шанца (NAPF). Для удаления белка животного происхождения из пробирки с МБК, клетки были промыты дважды в APF-среде, содержащей 2% в/о SPTII (соевый пептон типа II), 1% в/о экстракта дрожжей и 1% в/о глюкозы. Клетки были высеяны на APF-среде при строгих анаэробных условиях с использованием анаэробной камеры с контролируемой системой регулируемой атмосферы (MACS). В дальнейшем изолированная колония была увеличена и хранилась в APF-среде, содержащей примерно 20% глицерина при температуре менее -135°C.
540
APF-МБК был приготовлен в условиях надлежащей медицинской практики путем увеличения БКИ в не содержащей кислорода APF-среде (200 мл, восстановление в течение, по меньшей мере, 12 часов в анаэробной камере) с последующим культивированием в анаэробной камере MACS при температуре 34,5°C±1°C (перемешивание при 60 об/мин) до тех пор, пока OD культуры не достигнет 2,5±1,0 ЕП. В полученную культуру был добавлен стерильный глицерин до финальной концентрации примерно 20%, после чего смесь была перенесена в криопробирки в концентрации 1 мл/пробирка (пробирки с APF-МБК). Через пробирки в условиях заморозки был пропущен жидкий азот, а затем пробирки хранили замороженными при температуре ниже -135°C. APF-МБК был получен при условиях надлежащей медицинской практики и увеличен в соответствии с представленным выше описанием. Полученные APF-банки клеток были охарактеризованы на предмет идентичности, чистоты, жизнеспособности и генетической стабильности.
Подготовительные этапы (культивирование и ферментация) Способ данного Примера 2 имеет два основных этапа: подготовительный и заключительный этап. Подготовительный этап включает увеличение исходной линии клеток (рост и размножение бактерий Clostridium botulinum в питательной среде (по существу APF)), ферментацию, рост, сбор (удаление клеточных остатков) для обеспечения очищенной, собранной культуры, которая затем подвергается концентрированию и разведению. Таким образом, в данном примере девять этапов двухколоночного способа включают культивирование, ферментацию, фильтрацию собранной культуры, концентрирование, улавливание (анионообменную хроматографию), очистку (катионообменную хроматографию), замену буфера, снижение биологической нагрузки и наполнение пробирки.
Подготовительная стадия включает использование питательной среды в сосуде 1 л, содержащем 400 мл восстановленной (в анаэробной камере) питательной APF-среды для засевания (2% в/о SPTII, 1% в/о экстракта дрожжей (pH скорректирован до 7,3 с использованием 1N натрия гидроксида и/или 1N соляной кислоты перед автоклавированием)), 1% в/о стерильной глюкозы, которая была добавлена после автоклавирования питательной среды). Питательная среда для засевания была инокулирована 400 мл оттаянного РБК Clostridium botulinum. Инкубация/культивирование происходило при температуре 34,5°C±1,0°C с перемешиванием при 150 об/мин в анаэробной камере.
3
При достижении значения оптической плотности питательной среды при 540 нм 1,8±1,0 ЕП, все содержимое сосуда 1 л (примерно 400 мл) было перемещено в ферментер 20 л для получения продукции, содержащей APF-среду ферментации, значение pH которой было скорректировано до 7,3 с использованием 1 N натрия гидроксида и/или 1 N соляной кислоты после стерилизации паром, и такая среда ферментации состояла из 3,25% в/о SPTII, 1,2% в/о экстракта дрожжей, 1,5% в/о стерильной глюкозы (добавленной после стерилизации; стерилизацию проводили при примерно 122°C в течение 0,5 часа). Температуру и перемешивание контролировали при температуре 35°C±1°C и значении 70 об/мин, соответственно. Введение слоя азота проводили при 0,0002 м/с (12 ст.л/мин), а давление свободного пространства было установлено на значение 34,48 кПа (5 фунтов на кв. дюйм) для поддержания анаэробной среды для роста клеток. Значение pH для ферментации и плотность клеток контролировали с использованием датчиков pH и вязкости, соответственно. Три фазы ферментации продукции включают экспоненциальный рост, стационарную фазу и фазу аутолиза. Аутолиз клеток, приводящий к высвобождению активного комплекса BoNT/A в питательной среде, отмечался постоянным образом в период от 35 часов и до завершения ферментации. По окончании ферментации культура была охлаждена до 25°C для сбора.
Как только среда ферментации была охлаждена до 25°C, остатки клеток были сепарированы от комплекса ботулинического токсина типа А, содержащего лизат, полученный способом глубокой фильтрации; вначале была проведена фильтрация через предварительный фильтр с номинальным значением удерживания 5-0,9 мкм для удаления остатков клеток, а затем через положительно заряженный фильтр с номинальным градиентом удерживания 0,8-0,2 мкм для удаления ДНК (удаление до примерно 80% ДНК). Перед использованием, оба фильтра были промыты вместе с использованием 20 л воды для инъекций (ВДИ). Для дальнейшей обработки необходимо было использованием, по меньшей мере, 15 л фильтрата, и любой избыток материала был подвержен деконтаминации после завершения отбора проб во время способа. Фильтра хранили при температуре 4°C, в противном случае его подвергали непосредственной обработке путем ультрафильтрации.
Фильтрат из этапа сбора был концентрирован с 15 л до 5±0,5 л с использованием бокса с биозащитой (BSC) и половолоконной мембраны для фильтрации тангенциальным потоком (GE Healthcare). Подверженный ультрафильтрации материал затем был разведен с использованием 10 мМ буфера натрия фосфата с pH 6,5 до финального объема 20 л. Такой материал был очищен путем использования двух хроматографических колонок (анион- и катионообменной) или трех хроматографических колонок (анион- и катионообменной, а затем гидрофобного взаимодействия). Разведенный, подвергнутый ультрафильтрации собранный материал хранили при температуре 4°C, в противном случае его подвергали непосредственной очистке.
890
В способе Шанца этап культивирования завершается, и начинается этап ферментации, основанный на времени и визуальном наблюдении за ростом культуры. В отличие от этого, определение завершения нашего способа из Примера 2 (этапа культивирования) основано на анализе оптической плотности жидкости культуры, что обеспечивает нахождение культуры в фазе логарифмического роста на момент завершения этапа ферментации, и обеспечивает снижение длительности этапа культивирования от примерно 8 часов до примерно 14 часов. Параметр ОП прекращает этап культивирования, способствуя максимальной жизнеспособности культивированных клеток, и позволяет получить робастное и обильное количество ботулинического токсина по окончании этапа ферментации. Среднее значение оптической плотности (при 540 нм) питательной среды при окончании культивирования составило 1,8 ЕП. Средняя продолжительность этапа ферментации составляет 72 часа, и среднее значение финальной вязкости (А) среды ферментации по окончании этапа ферментации составило 0,15 ЕП. Среднее количество комплекса ботулинического токсина типа А (как это определено ИФА) в 20 л среде ферментации (весь бульон) по окончании этапа ферментации составило примерно 64 мкг комплекса ботулинического токсина типа А/мл среды ферментации.
Этап сбора с использованием глубокой фильтрации для удаления остатков клеток и нуклеиновых кислот подразумевал дальнейшее использование ультрафильтрации и разведения для получения среды ферментации для следующего этапа способа. Такой этап сбора/очистки от остатков клеток фундаментально отличается от этапа сбора способа Шанца, который использует осаждение кислотой с последующей микрофильтрацией и диафильтрацией для концентрирования, а также замену буфера для дальнейшей обработки.
Завершающие этапы (очистка)
Завершающие этапы включали улавливание ботулинического нейротоксина на анионообменной колонке, элюирование из колонки и дальнейшее разделение примесей с использованием очистки на катионообменной колонке, и, преимущественно (в трехколоночном способе) пропуск элюента, содержащего необходимое количество ботулинического нейротоксина, через третью колонку, преимущественно колонку с гидрофобным взаимодействием (например, хроматографическую) с последующим концентрированием и заменой буфера с использованием фильтрацией тангенциальными потоками (ФТП) и снижение биологической нагрузки (например, путем дополнительной фильтрации с использованием фильтра 0,2 мкм) до получения финального комплекса ботулинического нейротоксина типа А, оптимизированного для хранения в холодных условиях, преимущественно, замораживания, и, наконец, составления фармацевтической композиции с комплексом ботулинического нейротоксина типа А. Такая последовательность этапов хроматографии и фильтрации была предназначена для удаления примесей к продукту и примесей, возникших в ходе способа, для удаления потенциальных занесенных агентов и контроля концентрации комплекса ботулинического нейротоксина типа А и матрицы буфера финального нейротоксина типа А для предоставления более устойчивого лекарственного вещества.
Более подробное описание варианта воплощения изобретения с трехколоночным завершительным способом представлено ниже. Очищенный (разведенный) и подвергнутый ультрафильтрации материал (20 л, как это описано выше) был пропущен через анионообменную хроматографическую смолу POROS 50HQ, уловленный ботулинический нейротоксин был элюирован из анионообменной колонки и затем пропущен через катионообменную хроматографическую смолу POROS 20HS, элюент из которой был пропущен через хроматографическую смолу Phenyl Sepharose HP. Элюент из колонки с гидрофобным взаимодействием был подвергнут фильтрации тангенциальным потоком 100 кДа с последующей фильтрацией с фильтром 0,2 мкм. Полученный комплекс ботулинического нейротоксина типа А был заморожен для хранения.
В данном Примере мы использовали в первом этапе хроматографии завершающего способа анионообменную хроматографическую смолу POROS 50HQ, упакованную в колонку с внутренним диаметром примерно 8 см и высотой колонки примерно 15 см. Вся работа с колонкой POROS 50HQ проводилась при комнатной температуре, и поток был направлен сверху вниз. Комплекс ботулинического нейротоксина типа А был элюирован из анионообменной колонки с использованием последовательного изменения значения pH, при этом компоненты с более отрицательным зарядом, такие как нуклеиновые кислоты (например, ДНК и РНК) и другие белки клеток-хозяев оставались связанными в анионообменной колонке.
280
Особенности анионообменного этапа были следующими: использованием колонки POROS 50HQ в присутствии 0,1N натрия гидроксида с минимальным временем контакта 30 минут (по меньшей мере, примерно 3 объема колонок при скорости 230 см/час). Затем колонка была приведена в состояние равновесия с использованием 50 мМ натрия фосфата, буфера с pH 6,5 (по меньшей мере, 5 объемов колонки). Затем очищенный, подвергнутый ультрафильтрации и разведению материал (т.е. обработанный лизат APF-материала ферментации) был загружен при скорости 230 см/час в анионообменную колонку POROS 50HQ с последующим промыванием, по меньшей мере, 20 объемами колонки 50 мМ натрия фосфата, pH 6,5 при 230 см/час до тех пор, пока значение поглощения при 280 нм эффлюента колонки не снизится до 0,10 ЕП, затем проводили элюирование с использованием 50 мМ натрия ацетата, pH 4,8 при 230 см/час. Полученный продукт был собран в сосуд, содержащий 1 колоночный объем 50 мМ натрия ацетата при pH 4,8, когда поглощение при 280 нм (А) повысится до, по меньшей мере, примерно 0,15 ЕП, и когда максимальный пик был равен или менее примерно 0,2 ЕП задней кромки. Такой продукт элюирования хранили при температуре от примерно 2°С до примерно 8°С в течение до 48 часов.
Второй этап хроматографии завершающего способа данного Примера 2 предполагал использование катионообменной хроматографической смолы POROS 20HS, упакованной в колонку с внутренним диаметром примерно 8 см и высотой колонки примерно 15 см. Вся работа с колонкой POROS 20HS проводилась при комнатной температуре, и поток был направлен сверху вниз. Комплекс ботулинического нейротоксина типа А связывался со смолой колонки POROS 20HS. Затем комплекс ботулинического нейротоксина типа А был элюирован из колонки с использованием пошаговой замены соли. Примеси продукта были элюированы с использованием буфера для промывания и раствора для контаминации.
3
3
2
2
280
280
Особенности катионообменного этапа были следующими: использование колонки POROS 20HS в присутствии 0,1N натрия гидроксида с минимальным временем контакта 30 минут (по меньшей мере, примерно 3 объема колонок при скорости 230 см/час). Затем колонка была приведена в состояние равновесия с использованием 50 мМ натрия ацетата, буфера с pH 4,8 (по меньшей мере, примерно 5 объемов колонки). Затем продукт, пропущенный через POROS 50HQ (собранный в соответствии с представленным выше описанием, свежий или из холодильника), был загружен в колонку POROS 20HS. Затем колонка была промыта с использованием 50 мМ натрия ацетата, буфера с pH 4,8 (по меньшей мере, 3 объема колонки), и затем промыта снова с использованием 50 мМ натрия ацетата, 150 мМ натрия хлорида, буфера pH 4,8. Комплекс ботулинического нейротоксина типа А был элюирован из колонки POROS 20HS с использованием 50 мМ натрия ацетата, 250 мМ натрия хлорида, буфера с pH 4,8 при 0,0002 м/с (200 мл/мин), элюат был направлен в резервуар для сбора биореактора (содержащий 1 колоночный объем 50 мМ NaHCO, pH 4,8), при этом значение А повышается до примерно ≥0,1 ЕП, максимальный пик А задней кромки пика снижается до значения ≤0,1 ЕП.
Продукт, пропущенный через POROS 20HS, затем хранили в резервуаре для сбора при комнатной температуре в течение примерно 6 часов.
В способе с тремя хроматографическими средами данного Примера 2 элюент из второй (катионообменной) колонки пропускают через колонку ХГВ. Используемая колонка ХГВ содержала хроматографическую смолу с гидрофобным взаимодействием Phenyl Sepharose HP, загруженную в колонку с внутренним диаметром примерно 8 см и высотой колонки примерно 5 см. Вся работа с колонкой Phenyl Sepharose HP проводилась при комнатной температуре, и поток был направлен сверху вниз. Затем комплекс ботулинического нейротоксина типа А был элюирован из колонки с использованием понижаемой пошаговой замены соли. Примеси были элюированы в течение загрузки и промыты буфером и раствором для деконтаминации.
280
280
Особенности этапа хроматографии с гидрофобным взаимодействием были следующими: колонка Phenyl Sepharose HP была изначально обработана 0,1N раствора натрия гидроксида с минимальным временем контакта 30 минут (по меньшей мере, с 3 колоночными объемами раствора 0,1N натрия гидроксида при 200 см/час). Затем устанавливают равновесие колонки с использованием, по меньшей мере, примерно 5 колоночных объемов 50 мМ натрия ацетата, 0,4 М аммония сульфата, буфера pH 4,8. Затем продукт, пропущенный через POROS 20HS (катионообменная колонка, см. выше) был скомбинирован в соотношении 1:1 с 50 мМ натрия ацетата, 0,8 М аммония сульфата, буфера pH 4,8 и загружен в колонку Phenyl Sepharose HP. Колонка была промыта с использованием, по меньшей мере, примерно 3 колоночных объемов 50 мМ натрия ацетата, 0,4 М аммония сульфата, буфер pH 4,8, и затем промыта 50 мМ натрия фосфата, 0,4 М аммония сульфата, буфер pH 6,5. Комплекс ботулинического нейротоксина типа А был элюирован из колонки с использованием 10 мМ натрия фосфата, 0,14 М аммония сульфата, буфер pH 6,5. Элюат был направлен в резервуар для сбора биореактора при повышении А до ≥0,05 ЕП. Элюат собирали до тех пор, пока значение A задней кромки пика элюирования не было снижено до значения ≤0,05 ЕП. Продукт, пропущенный через Phenyl Sepharose HP, затем хранили в резервуаре для сбора при комнатной температуре в течение 6 часов.
Система фильтрации тангенциальными потоками использовалась для концентрирования и диафильтрации продукта, полученного в ходе хроматографии с Phenyl Sepharose HP, в буфер для получения лекарственного вещества. Кассеты Pall Filtron Minimate с мембраной, отсекающей молекулярный вес 100 кДа, использовали для этапов концентрирования и диафильтрации. Полученный материал затем пропускали через фильтр Pall Mini Kleenpak 0,2 мкм для снижения потенциальной биологической нагрузки. Как было указано ранее, этап УФ/ДФ приводил к концентрированию продукта, полученного с помощью Phenyl Sepharose HP (элюент из колонки ХГВ), в комплекс BoNT/A с концентрацией 0,7 г/л, а диафильтры концентрировали материал с использованием 10 мМ калия цитрата, буфер pH 6,5.
278
278
Особенности способа ультрафильтрации/диафильтрации были следующими: аппарат УФ/ДФ и полиэфирсульфонная мембрана Pall 100 кДа вначале были промыты, по меньшей мере, 5 л воды для инъекций (ВДИ) для удаления раствора колонки, а затем промыты, по меньшей мере, 200 мл 1N раствора натрия гидроксида в условиях рециркуляции, по меньшей мере, 10 раз, преимущественно, по меньшей мере, 30 минут, для санитарной обработки аппарата УФ/ДФ. Затем мембрана и система УФ/ДФ были приведены в состояние равновесия с использованием достаточных объемов 10 мМ калия цитрата, буфера с pH 6,5, до тех пор, пока значение pH фильтрата и ретентата не достигло 6,5. После этого продукт, пропущенный через Phenyl Sepharose HP, был загружен в кассету с фильтрацией тангенциальными потоками Minimate, и элюат ХГВ был концентрирован для 0,7 г/л. После этапа концентрирования, ретентат был подвергнут диафильтрации относительно, по меньшей мере, 5 объемов диафильтрации буфера с лекарственным веществом (10 мМ калия цитрата, pH 6,5) при трансмембранном давлении 51, 71 кПа (7,5 фунтов на кв.дюйм). Затем отверстие для выпуска фильтрата было закрыто, и система УФ/ДФ была запущена, по меньшей мере, в течение 2 минут, затем система была промыта 50 мл 10 мМ калия цитрата, pH 6,5 буфера. После промывания, концентрация комплекса BoNT/A в ретентате была определена путем измерения значения А и основываясь на показателе А, и концентрация ретентата была скорректирована до 0,5 г/л с использованием 10 мМ калия цитрата, pH 6,5 буфер. Ретентат с корректированной концентрацией был подвергнут фильтрации через фильтр Pall Mini Kleenpak 0,2 мкм для снижения потенциальной биологической нагрузки. Профильтрованный ретентат с корректированной концентрацией хранили в резервуаре для сбора при температуре 2°C-8°C в течение периода до 2 дней.
Финальный полученный и очищенный комплекс ботулинического нейротоксина типа А был введен в 1 мл криопробирки Nunc в количестве 700 мкл/пробирка и хранился в замороженном виде. Процедура наполнения проводилась в боксе с биозащитой класса 100 при комнатной температуре.
Завершающий способ (включая использование 2 или 3 хроматографических колонок) был завершен всего лишь за 1-3 дня, и полученный комплекс ботулинического нейротоксина типа А хранили замороженным в калия цитрате, pH 6,5 буфере в концентрации 0,5 г/л в виде раствора. В отличие от этого, завершающий этап способа Шанца (очистка токсина) предполагает использование множественных этапов фильтрации, осаждения, экстракции и центрифугирования для очистки комплекса ботулинического нейротоксина типа А и требует для своего завершения 1-2 недели, а полученное лекарственное вещество (восстановленный ботулинический нейротоксин) хранят в холодильнике в виде суспензии аммония сульфата в концентрации примерно 2,7 г/л. Использование хроматографии вместо осаждения и сниженное время восстановления привело к по существу улучшенному, неизменному завершающему способу, как это описано в тексте данной заявки.
В соответствии с одним аспектом изобретения, концентрации продуктов растительного происхождения, таких как основанных на сое продуктов, могут быть представлены Soy Peptone Type II Hy-Soy или SE50MK (соевый пептон Кошера) в питательной среде и среде ферментации. Hy-Soy в питательной среде для высевания может иметь диапазон 10-200 г/л. Преимущественно, концентрация Hy-Soy в питательной среде для высевания варьирует от 15 до 150 г/л. Более преимущественно, Hy-Soy в питательной среде для высевания варьирует примерно от 15 до 30 г/л, или в рамках указанного диапазона. Концентрация глюкозы в питательной среде для высевания может иметь диапазон 0,1-20 г/л. Преимущественно, концентрация глюкозы варьирует от 0,5 до 15 г/л. Более преимущественно, концентрация глюкозы в питательной среде составляет примерно 10 г/л. Количество экстракта дрожжей может составлять примерно 5-20 г/л, более преимущественно примерно 10-15 г/л, или в рамках указанного диапазона. Например, pH питательной среды до роста Clostridium botulinum может составлять примерно 7,0-7,5, или в рамках указанного диапазона, преимущественно 7,3.
В качестве примера: количество Hy-Soy в среде ферментации может иметь диапазон 10-200 г/л. Преимущественно, концентрация Hy-Soy в среде ферментации варьирует от 15 до 150 г/л. Более преимущественно, концентрация Hy-Soy в среде ферментации варьирует примерно от 20 до 40 г/л, или в рамках указанного диапазона. Концентрация глюкозы в среде ферментации может иметь диапазон 0,1-20 г/л. Преимущественно, концентрация глюкозы варьирует от 0,5 до 15 г/л, или в рамках указанного диапазона. Не обязательно, но как это указано выше, глюкоза может быть подвергнута стерилизации путем автоклавирования вместе с другими компонентами среды ферментации. Уровень pH среды ферментации перед ростом может составлять 7,0-7,8, преимущественно примерно 7,0-7,5 или в рамках указанного диапазона, более преимущественно, pH 7,3.
Как это показано с правой стороны ФИГ. 1, двухколоночный APF-способ, используемый в данном Примере 2 для получения комплекса биологически активного ботулинического нейротоксина, включает следующие этапы: (а) культивирование бактерий, таких как Clostridium botulinum, из APF-ББК в резервуаре для высевания/культивирования; (б) ферментация бактерий Clostridium botulinum в ферментере (ферментер продукта токсина), содержащем APF-среду для ферментации, для увеличения линии клеток, обеспечения ферментации и выработки ботулинического токсина до достижения необходимого уровня лизиса клеток. Затем способ включает (в) сбор (например, очистка путем фильтрации) APF-среды для ферментации для получения собранной среды для ферментации; (г) концентрирование и разведение, что приводит к получению разведенной собранной среды для ферментации; (д) пропуск через улавливающую колонку для удаления примесей; (е) контакт элюента из улавливающей колонки с очищающей колонкой для дополнительного удаления примесей, и, в некоторых случаях, (ж) концентрирование и замену буфера элюента очищающей колонки; и (з) последующую фильтрацию для снижения биологической нагрузки и (и) наполнение пробирок.
В одном примере объем ферментации составляет 20 л, общее время способа для всех этапов составило только 4-6 дней, что позволило получить ботулинический нейротоксин с высоким выходом.
Ниже более детально описан отдельный вариант воплощения изобретения, включенный в данное изобретение. Этап ферментации проводили в APF-среде с использованием ферментера из нержавеющей стали 30 л.
В данном примере использовали гораздо меньший объем среды ферментации, что, однако, все еще позволяло получить высокоактивный комплекс ботулинического нейротоксина типа А с высоким выходом. В ходе использования представленного ниже протокола, необходимо только 20 л или менее APF-среды ферментации, вместо обычно используемых и больших объемов (например, 115 л) среды ферментации, необходимой для получения используемых в промышленности количеств ботулинического нейротоксина.
Анаэробная рабочая станция MACS (Don Whitley) с воздушной пробкой обеспечивала среду с обедненным количеством кислорода для работы с анаэробными организмами. Доступ и выгрузка из камеры проводилась через систему отверстий, включающих дверцы впускных и выпускных отверстий. Температура прибора контролировалась для поддержания установок пользователя в камере. Конденсационная батарея с влагорегулятором обеспечивала эффективное удаление избыточной влаги из камеры. Камера была оснащена освещением и системой подачи сигнала для оповещения о низком давлении газа, непрерывном потоке газа и потери режима работы на мощности. Камера была оснащена фильтром НЕРА для снижения уровней жизнеспособных и нежизнеспособных частиц в анаэробной камере.
Анаэробные условия поддерживались с использованием системы атмосферного вымывания «Апоюх» и Palladium Deoxo «D» Catalyst. Вода-конденсат из конденсационной батареи собиралась и отводилась во внешний резервуар, откуда она удалялась.
Как это описано выше, для получения APF-РБК с пробирками с банком клеток, хранившимися при температуре ниже -135°C, использовали APF-способ. Пробирка с APF-РБК была оттаяна при комнатной температуре в течение примерно 15 минут перед инокуляцией питательной среды, затем проводили один этап культивирования, как это описано выше, для получения «высеянной» культуры. Процедуру проводили в модульной системе контроля атмосферы с использованием принципов асептики для сведения к минимуму биологической нагрузки. Модульная система контроля атмосферы перед инокуляцией выращенной культуры, содержащей APF-РБК, была очищена. Питательная среда была приготовлена с использованием 1N соляной кислоты и 1N натрия гидроксида (для корректировки pH), D(+) глюкозы, ангидрида (Mallinckrodt Baker, номер по каталогу 7730, 4,00 г), соевого пептона типа II (SPTII) (Marcor, номер по каталогу 1130, 8,00 г), воды для инъекций (ВДИ) 400,0 мл и экстракта дрожжей (YE) (BD номер по каталогу 212730, 4,00 г). Соевый пептон типа II и раствор экстракта дрожжей был получен путем отмера 300 мл ВДИ в мерном цилиндре 500 мл, что впоследствии было добавлено во флакон для высевания культуры. Флакон для высевания культуры был помещен в мешалку, после чего мешалка была включена. 8,00 г. SPTII и 4,00 г экстракта дрожжей было добавлено во флакон для высевания культуры, перемешивание проводили до момента растворения. Если после перемешивания растворение было неполным, смесь подвергали нагреванию на низких температурах. Измерили значение pH и скорректировали до примерно 7,30±0,05. Раствор для высевания культуры был доведен до примерно 360 мл с использованием ВДИ. Флакон для высевания культуры содержали в условиях с надлежащей вентиляцией для обеспечения прохождения пара и газа. 10% раствор глюкозы (в/о) был приготовлен путем отмера примерно 30 мл ВДИ в мерном цилиндре 100 мл и помещен в предварительно приготовленный флакон для добавления глюкозы, который затем был помещен в мешалку, после чего мешалка была включена. В данный флакон было добавлено примерно 4,00 г глюкозы с последующим перемешиванием до растворения (при необходимости, для растворения использовали небольшое нагревание), после чего достаточное количество раствора глюкозы было доведено до 40 мл с использованием ВДИ. После добавления глюкозы флакон был закрыт вентилируемой пробкой. Флаконы с глюкозой и для высевания культуры были автоклавированы при температуре 123°C в течение 30 минут для стерилизации. После стерилизации оба флакона были извлечены из автоклава, и им дали остыть в боксе с биозащитой. После охлаждения в асептических условиях, 10% раствора глюкозы было перенесено во флакон для высевания культуры, содержащий экстракт дрожжей и раствор соевого пептона II, с последующим перемешиванием, что позволило получить полноценный флакон для высевания культуры.
Такой флакон для высевания культуры был помещен в предварительно очищенную MACS (с установленным анаэробным индикатором). Пробка флакона для высевания культуры была ослаблена. Затем флакон для высевания культуры был помещен в мешалку в пределах MACS (мешалка была включена при примерно 150 об/мин), и среда во флаконе для высевания культуры была восстановлена в течение, по меньшей мере, 12 часов при примерно 34.5°C +/- °C в пределах MACS, после чего 1 мл холостой среды был отобран для измерения оптической плотности (для определения биомассы при 540 нм). Затем флакон для высевания среды в пределах MACS (анаэробные условия) был инокулирован. Пробирка с культурой APF-РБК была получена из замороженного банка клеток и помещена в MACS. Пробирка была оттаяна в течение примерно 10-15 минут, после чего примерно 400 мкл содержимого пробирки было помещено непосредственно в среду флакона для высевания культуры. Пробка флакона для высевания культуры была полностью ослаблена, оставалась на горлышке флакона, после чего мешалка была включена на 150 об/мин. После, по меньшей мере, примерно 11 часов инкубации в MACS, продукция ферментации была получена в соответствии с представленным ниже описанием.
Датчики (например, датчик окисления-восстановления, датчик pH, датчик вязкости, например, предоставленный Broadley James and Optek) и конфигурация последовательности ферментера, такого как ферментера 30 л из нержавеющей стали, были проверены и откалиброваны, и надежно установлены в соответствующие порты ферментера. Например, ферментер может быть представлен системой ферментера АВЕС 30 L (VT), состоящей из резервуара ферментера объемом 30 л, системы запуска мешалки, трубок для подачи/отвода (CIP, чистого пара, CDA, азота, кислорода, охлажденной технической воды, биологических отходов и пара), средств контроля (рН, температуры, давления, окислительно-восстановительного потенциала, оптической плотности и потока массы), а также четырех шланговых насосов. Скорость установленной в нижней части мешалки контролировали с использованием частотно-регулируемого привода (VFD) Allen-Bradley. Полуавтоматический и автоматический контроль системы проводился с использованием Allen-Bradley ControlLogix PLC и программного обеспечения. Система была разработана для обеспечения замкнутой системы пропорционально-интегрально-дифференциального (ПИД) контроля температуры, давления, pH и окислительно-восстановительного потенциала во время процедур ферментации. Allen-Bradley DeviceNet (открытая сеть уровня устройств) используется для контроля и управления устройствами и датчиками камеры.
Для поддержания стерильности, равновесия, режимов прогона и сбора, перемешивания, температуры, давления, подача слоя азота производится при следующих параметрах.
Для поддержания стерильности и режима равновесия:
Для приготовления среды ферментации, необходимый материал включает D(+) глюкозу, ангидрид (Mallinckrodt Baker, номер по каталогу 7730, 300,0 г), соевый пептон типа II (SPTII) (Marcor, номер по каталогу 1130, 650,0 г), воду для инъекций (ВДИ, 13 л) и экстракт дрожжей (YE) (BD номер по каталогу 212730, 240,0 г), вместе с обычными весами, бутылем (например, 20 л), стеклянным флаконом (5 л), мерными цилиндрами, стержнями мешалок и мешалками. В бутыль было добавлено примерно 10 л ВДИ вместе со стержнем мешалки. Бутыль был помещен в мешалку, и мешалка была включена, после чего было добавлено примерно 650,0 г соевого пептона типа II и примерно 240,00 г YE. Среда ферментации в достаточном количестве была доведена до 13 л ВДИ, после чего бутыль был закрыт пробкой. 10% раствор глюкозы (в/о) был приготовлен путем добавления примерно 2 л ВДИ в стеклянный флакон 5 л (вместе с установленным стержнем для мешалки). Флакон был помещен в мешалку, и после включения мешалки было внесено примерно 300,00 г глюкозы, перемешано до растворения. Раствор глюкозы в достаточном количестве был доведен до 3 л ВДИ, флакон был закрыт пробкой, в результате чего был получен раствор глюкозы 10%.
Среда ферментации в бутыле была добавлена в ферментер, после чего был записан объем в ферментере до подачи газа, и была запущена последовательность операций ферментера. По окончании подачи SIP (пар на месте) (122°C, +/- °C), был отмечен объем в ферментере. Система для подачи глюкозы, состоящая из резервуара с отходящей от него трубкой и встроенным фильтром 0,2 мкм (PALL Corp.), а также шлангового насоса, была подсоединена к ферментеру, затем линия была подвергнута SIP с последующим охлаждением. Кроме того, было открыто отверстие клапана, и во флакон с глюкозой было добавлено примерно 3 л глюкозы (стерилизация фильтрацией) с соответствующим количеством ВДИ (стерилизация фильтрацией), доведя объем до 20 л, после чего проводилась подача глюкозы по этой же самой системе трубок в ферментер. Дополнительное отверстие клапана было закрыто. Значение pH среды ферментации продукции затем было скорректировано до примерно 7,3 +/- 0,05 с использованием 1N натрия гидроксида или 1N соляной кислоты, SIP дополнительных трубок (при необходимости). После этого были установлены параметры стерильности, которые сохраняли в течение примерно 12 часов перед инокуляцией. Исходная концентрация глюкозы в среде была измерена с использованием анализатора метаболита и была записана.
Как это указано выше, по окончании инкубации высеянной культуры (примерно 11±1 часов), 1 мл образца был отобран для измерения оптической плотности (ОП). Значение ОП было измерено при 540 нм с использованием спектрофотометра, и при наличии соответствующего диапазона значений ОП, культура использовалась для ферментации. Датчик вязкости в ферментере был соответствующим образом обнулен. Флакон с высеянным инокулятом из анаэробной камеры был помещен в ферментер, после чего к нему была подсоединена система трубок для передачи содержимого (флакон с питательной и высеянной APF-средой, со стерильными трубками для передачи инокулята культуры Kleenpak™ (PALL Corp.), или фильтр Millipore, заменяющий клапан ферментера, а также трубка, ведущая к Насосу 1). Давление ферментера было понижено до 13,79 кПа (2 фунтов на кв.дюйм), и весь объем флакона с высеянным инокулятом был откачан в ферментер. По окончании инокуляции, были записаны значения единиц поглощения (ЕП) для содержимого ферментера, параметры ферментера были установлены на режим ПРОГОН, и было отмечено время.
Затем проводили ферментацию (продолжительность ферментации могла составлять от примерно 60 часов до примерно 80 часов, преимущественно от примерно 68 часов до примерно 76 часов, более преимущественно примерно 72 часа), в ходе которой из ферментера отбирали образцы, например, по истечении 24 и 48 часов, при поддержании асептических условий. Тесты проводили с использованием, о меньшей мере, одного образца, отобранного во время ферментации, и включали, но не ограничивались, измерение оптической плотности, уровня глюкозы, ИФА, гель-электрофорез, вестерн-блоттинг. По окончании ферментации (например, по окончании ферментации объем бульона составил от примерно 18 до примерно 19 л) может быть отобран образец (например, для тестирования оптической плотности, уровня глюкозы, ИФА, гель-электрофореза, вестерн-блоттинга, и количественного определения ДНК/РНК).
3
По окончании ферментации были записаны значения оптической плотности, EFT (времени, потраченного на ферментацию), а также время завершения ферментации, скорость перемешивания (об/мин), температура (°C), давление (кПа, фунт кв. дюйм), введение азота (м/с (ст. л/мин)) и окислительно-восстановительный потенциал (мВ). Затем продукт ферментации подлежал сбору, т.е. продукт ферментации очищается посредством фильтрации, в ходе которой собирают, например, примерно 15 л фильтрата. Параметры ферментации были установлены на режим СБОР, и была приготовлена система фильтров для очистки (CUNO, 3М фильтрация), которая включала предварительный фильтр, глубинный фильтр и, по меньшей мере, один манометр. Предварительный фильтр и глубинный фильтр были промыты с использованием примерно 20 л воды для инъекций. После промывания, к порту сбора/отведения ферментера была присоединена система фильтров. Температура ферментера была понижена до примерно 25°C, после чего была начата очистка содержимого ферментера (было записано время начала очистки, начальная ОП, начальное pH, начальная температура и начальный объем ферментера). Давление ферментера повышали при скорости примерно 6,89 кПа (1 фунт кв.дюйм) примерно каждые 10 минут во время фильтрации до тех пор, пока не было достигнуто давление примерно 41,37 кПа (6 фунтов кв. дюйм), и такое давление удерживали до окончания сбора. Фильтр удаляет примерно 80% ДНК/РНК в APF-среде для ферментации (остаток по существу удаляют в ходе последующих этапов хроматографии, как это указано ниже), что устраняет необходимость использовавшихся ранее РНКазы и/или ДНКазы для удаления таких компонентов из ферментационного бульона. Параметры способа, такие как давление на входе предварительного фильтра, давление на входе глубинного фильтра, давление ферментера, объем перемешивания и фильтрата, подвергались мониторингу при сборе каждых 2 л фильтрата, по окончании чего было записано время завершения очистки и объем собранного фильтрата. После завершения этапа сбора, система была деконтаминирована и очищена.
Бутыль с фильтратом был предоставлен BSC для отбора проб, в результате чего было отобрано примерно ≤10 мл фильтрата для измерения ОП и других анализов (например, ИФА, гель-хроматографии, ДНК/РНК и вестерн-блоттинга).
3
Затем фильтрат был подвергнут ультрафильтрации/разведению. Была подсоединена единица для проведения фильтрации тангенциальными потоками (ФТП). Единица ФТП была промыта в течение примерно 90 минут с использованием ВДИ при преимущественной скорости примерно 2 л в минуту, а затем единица ФТП была подвергнута обработке путем пропускания через нее 0,1N натрия гидроксида (рециркуляция) в течение 60 минут, после чего был пропущен 10 мМ буфер натрия фосфата, pH 6,5 с последующим промыванием ВДИ в течение 30 минут. Фильтрат из этапа сбора (примерно 15 л) был пропущен через ФТП (проводили в боксе с биозащитой), что приводило к концентрированию фильтрата до примерно 5 л +/- 0,5 л (этап концентрирования проводили со скоростью примерно 2 л в минуту и трансмембранном давлении примерно 34,48 кПа (5 фунтов кв.дюйм)). Может быть отобран образец фильтрата, прошедшего через мембрану, для проведения, например, ИФА, определения двухцепочечной ДНК, гель-электрофореза и вестерн-блоттинга. После того, как фильтрат был сконцентрирован до примерно 5 л +/- 0,5 л, ретентат был разведен до примерно 15 л с использованием стерильного и профильтрованного 10 мМ буфера натрия фосфата, pH 6,5, и ФТП при скорости примерно 0,000033 м/с (2 л/мин). Образец для проведения, например, ИФА, определения ДНК/РНК, гель-электрофореза и вестерн-блоттинга, может быть отобран снова. Материал, подвергнутый ультрафильтрации/разведению (ретентат) хранили при 4°C.
Затем все используемые системы были подвергнуты деконтаминации с использованием 1 N натрия гидроксида или стерилизационных температур (пара) и очистке.
Для приготовления растворов, буферов и т.д. для использования в типичных способах, таких как очистка среды ферментации, полученной в ходе способов Примера 2, с целью получения очищенного комплекса ботулинического нейротоксина типа А, использовали представленные ниже материалы, оборудование и процедуры. Типичные используемые буферы (профильтрованные через 0,2 мкм вакуумный фильтр, проводимость измерена в мС/см для записей) включают следующие: 10 мМ натрия фосфат, pH 6,5; 50 мМ натрия фосфат, pH 6,5; 50 мМ натрия ацетат, pH 4,8; 50 мМ натрия ацетат, 170 мМ натрия хлорид, pH 4,8; 50 мМ натрия ацетат, 250 мМ натрия хлорид, pH 4,8; 50 мМ натрия ацетат, 1 М натрия хлорид, pH 4,8; 50 мМ натрия ацетат, pH 4,0 и 10 мМ цитрат, pH 6,5.
Ниже представлен пример операций для очистки и получения ботулинического нейротоксина типа А в ходе способов Примера 2. Все части, контактирующие с продуктом, были разработаны таким образом, чтобы обеспечить отсутствие своей реакционной способности и абсорбции. Кроме того, все оборудование было предназначено для одноразового использования, или было разработано и сконструировано таким образом, чтобы облегчить санитарную обработку и деконтаминацию в соответствии с утвержденными и задокументированными способами. Системы или фиксаторы были разработаны таким образом, чтобы не контактировать с продуктом, в то время как направляющие пути были разработаны для однократного применения, включая хроматографические колонки и все подсоединяемые трубки. Хроматографические компоненты были предоставлены AlphaBio, а компоненты для УФ/ДФ были предоставлены Scilog Inc. Система хроматографии включала шланговый насос для поставки раствора с частотно-регулируемым приводом, входной клапан, коллектор с 5 входными отверстиями, коллектор клапана колонки с матрицей из 3 автоматических клапанов, коллектор выходного клапана с 3 выходными отверстиями, прибор мониторинга эффлюента колонки, включая pH, проводимость и УФ, прибор для регистрации пиков, основанный на УФ поглощении, а также устройства контроля, необходимые для завершения этапов очистки. Система контроля включала программное и аппаратное обеспечение, разработанное для контроля способа очистки. Команды и данные вводили посредством терминала HMI (интерфейс оператора). Оператор начинал все автоматические функции способа путем подачи команд через HMI и проводил мониторинг, корректируя параметры способа, такие как скорости потока, давление, проводимость, pH, УФ поглощение и положения отдельных клапанов.
Система УФ/ДФ включала рециркуляционный насос, насос для диафильтрации, 2 весов и держатель для фильтра с тангенциальным потоком (ФТП). Насос для рециркуляции взаимодействовал с 5 одноразовыми датчиками давления и одними весами (расположенными под резервуаром для фильтрата) для контроля скорости потока для поддержания определенного трансмембранного давления и остановки, основываясь на весе резервуара с фильтратом. Насос для диафильтрации взаимодействовал со вторыми весами (расположенными под резервуаром с ретентатом) для начала и остановки, основываясь на поддержании постоянного веса резервуара с ретентатом.
После концентрирования и разведения материала ретентата из этапа сбора (сбор среды ферментации, не содержащей белок животного происхождения), материал был загружен в анионообменную колонку. Ниже описана процедура, используемая для наполнения и тестирования анионообменной колонки, применяемой в двухколоночном способе Примера 2.
Для всех трех способов хроматографии использовали предварительно наполненные колонки. Вначале материал для заполнения (собранная APF-среда, подвергнутая ультрафильтрации/разведению) была пропущена через анионообменную колонку (Poros 50HQ (ABI), как это описано выше). Для установления равновесия в анионообменной колонке (в данном примере -улавливающей колонке), использовали, по меньшей мере, 5 колоночных объемов (КО) 50 мМ натрия фосфата, pH 6,5.
После установления равновесия, был выполнен этап загрузки, когда наполняемый материал (после этапа сбора, т.е. собранный бульон ферментации, например, примерно 20 л) был загружен в анионообменную колонку при скорости примерно 200 см/час. После того, как через колонку было пропущено 0,5 колоночного объема загруженного материала, в соответствующий приемник был собран элюат, такой как резервуар с полиэфирсульфоном, при этом комплекс токсина связан с материалом анионообменной колонки. Затем проводили этап промывания, в ходе которого, по меньшей мере, 15 колоночных объемов буфера для промывания (например, 50 мМ натрия фосфата при pH 6,5) было пропущено через анионообменную колонку. Этап промывания был завершен, когда значение УФ, измеренное на выходе колонки в режиме реального времени, не снизилось до или менее примерно 80 мЕП. Объем буфера для промывания и объем элюата/объем промывания были записаны, после чего был отобран 1 мл образца элюата и подвергнут тестированию, например, на предмет концентрации токсина, содержания нуклеиновой кислоты, целых белков клеток, гель-электрофореза, кПЦР, 2D LC и ИФА.
Следующий этап был этап элюирования, когда буфер для элюирования (например, 50 мМ натрия ацетата, pH 4,8) был закачен в анионообменную колонку. Когда значение УФ на выходе из колонки в режиме реального времени повысилось до примерно 150 мЕП или более, был начат сбор элюата в контейнер, предварительно наполненный 1 КО буфера для элюирования (50 мМ натрия ацетата, pH 4,8). Сбор элюата был прекращен, когда значение УФ снизилось менее чем или до примерно 200 мЕП (объем, собранный в данной временной точке, составил от примерно 1 до примерно 2 КО). Затем система хроматографии была деконтаминирована и очищена с использованием 1 N натрия гидроксида.
Элюат из анионообменной колонки был подготовлен для добавления в катионообменную колонку. Объем элюата из анионообменной колонки, pH, проводимость и температура наполнения были записаны, после чего элюат из анионообменной колонки был разведен 1 КО 50 мМ натрия ацетата, pH 4,8.
После проведения анионообменной хроматографии, была проведена катионообменная хроматография. Равновесие катионообменной колонки (например, Poros 20HS) было установлено с использованием, по меньшей мере, 5 КО буфера для установления равновесия (50 мМ натрия ацетата, pH 4,8). После установления равновесия, разведенный элюат из анионообменной колонки был загружен в катионообменную колонку, и был записан общий загруженный объем. После того, как через катионообменную колонку было пропущено 0,5 колоночного объема загруженного разведенного элюата, был начат сбор элюата с данной колонки. Первое промывание катионообменной колонки проводили, когда через катионообменную колонку было пропущено примерно 3-5 КО 50 мМ натрия ацетата, pH 4,8 (был записан объем первого используемого буфера для промывания). Второе промывание проводили, когда через колонку было прокачано примерно 3 КО 170 мМ натрия хлорида, 50 мМ натрия ацетата, pH 4,8, и элюат был собран в новый контейнер, промаркированный «WASH 2 Peak». Сбор был начат, когда показатели УФ были повышены более чем или равны 50 мЕП. Был собран 1 КО и записан объем буфера для второго промывания.
Элюирование общего комплекса токсина из катионообменной колонки проводили с использованием буфера для элюирования (например, 250 мМ натрия хлорида в 50 мМ натрия ацетата, pH 4,8), который был прокачан через катионообменную колонку. Когда показатель УФ элюата достиг, по меньшей мере, примерно 10 мЕП, был начал сбор элюата в контейнеры, предварительно наполненные буферами для разведения (40 мл 100 мМ калия фосфата, pH 6,8 и 60 мл 10 мМ калия цитрата, pH 6,5). Сбор элюата из катионообменной колонки продолжали до тех пор, пока значения УФ не были снижены до примерно 100 мЕП или менее. Был записан общий объем элюата после разведения. Затем система катионообменной хроматографии была подвергнута деконтаминации и очистке.
После элюирования из катионообменной колонки, элюат был подвергнут фильтрации. Использовали систему фильтрации тангенциальным потоком (ФТП), а также три мембраны 100К MWCO (Sartorius AG, Goettingen, Germany), уложенные одна на другую. Был записан начальный объем элюата из катионообменной колонки, равно как и объем раствора для диафильтрации/установления равновесия и санитарной обработки. Например, раствор для диафильтрации может быть представлен 10 мМ калия цитрата, pH 6,5, а раствор для санитарной обработки может быть представлен 0,1N натрия гидроксида. Затем к системе подсоединяется одна трубка от резервуара, содержащего элюат из катионообменной колонки (IAPF) или колонки ХГВ, а содержащий ботулинический токсин элюат через насос для ультрафильтрации нагнетается к впускному отверстию мембраны для фильтрации тангенциальным потоком. Вторая трубка, отходящая от выпускного отверстия мембраны для фильтрации тангенциальным потоком, была подсоединена к контейнеру для ультрафильтрации (УФ) фильтрата. Была подсоединена трубка, отходящая от отверстия для выпуска ретентата (т.е. от мембраны для фильтрации тангенциальным потоком), и четвертая трубка с буфером для диафильтрации (ДФ), отходящая от наноса для диафильтрации, также была подсоединена к резервуару с ретентатом. Буфер для хранения системы был промыт, так же как и мембрана, при этом мембрана была промыта с использованием, по меньшей мере, примерно 720 мл воды для инъекции (ВДИ), при этом ретентат был направлен в трубку с отходами, после чего мембрана была дополнительно промыта, по меньшей мере, 4200 мл воды для инъекций, а ретентат рециркулирован обратно в резервуар. После этого была проведена санитарная обработка мембраны (при необходимости) путем промывания мембраны, по меньшей мере, примерно 200 мл 1N натрия гидроксида, при этом ретентат был направлен в трубку с отходами, после чего мембрана была промыта, по меньшей мере, примерно 200 мл 1N NaOH и ретентат рециркулирован обратно в резервуар в течение, по меньшей мере, 30 минут. Затем было установлено равновесие путем промывания мембраны буфером для установления равновесия (10 мМ калия цитрата при pH 6,5), ретентат был направлен в трубку с отходами до тех пор, пока значение pH ретентата и фильтрата не составило +/- 0,2 единиц от значения pH буфера для установления равновесия (например, в пределах +/- 0,2 единиц pH 6,5).
Концентрация материала (элюата (общего объема продукта) из катионообменной колонки) была определена для установления соответствующего разведения или концентрации (типичная обработка) (например, целевая концентрация может составлять примерно 0,7 мг/мл). Разведение сопровождалось использованием 10 мМ калия цитрата при pH 6,5. Целевой объем определяли, например, для концентрации продукта 0,7 мг/мл (целевой объем = (начальная концентрация/начальный объем)/0,7 мг/мл).
Весь объем продукта (элюат (подвергнутый/не подвергнутый соответствующей обработке) из катионообменной колонки) был загружен на мембрану, после чего была запущена рециркуляция системы (при закрытом отверстии выпуска фильтрата) (системы ФТП) в течение, по меньшей мере, 2 минут без обратного давления, после чего клапан для выпуска фильтрата был медленно открыт при одновременной коррекции обратного давления фильтрата до трансмембранного давления примерно 48,26 кПа (7 фунтов на кв.дюйм). Для разведения к целевому объему было добавлено 10 мМ калия цитрата, pH 6,5, и весь объем был перемещен для диафильтрации без ультрафильтрации; для концентрирования была начата ультрафильтрация. Для диафильтрации фильтрат был собран в новый контейнер (целевой объем для диафильтрации составляет 5Х объемов диафильтрации), и диафильтрация продолжалась с использованием, по меньшей мере, 5 объемов диафильтрации 10 мМ калия цитрата, pH 6,5. Данные способа диафильтрации собирали с минимальным интервалом 10 минут (вес фильтрата г/объем мл, давление на выходе (кПа, фунтов на кв.дюйм), давление фильтрата (кПа, фунтов на кв. дюйм) и трансмембранное давление (кПа, фунтов на кв. дюйм)). Для рециркуляции и промывания: при закрытом выпускном отверстии фильтрата система была рециркулирована/запущена в течение, по меньшей мере, 2 минут, без обратного давления, и система была промыта с использованием, по меньшей мере, 20 мл 10 мМ калия цитрата, pH 6,5. Полученный продукт включает фильтрат и раствор для промывания. Может быть отобран образец продукта, который затем может быть подвергнут верификационному анализу, включая, например, УФ при 278 нм, гель-электрофорез и ВЭЖХ, эксклюзионную ВЭЖХ, кПЦР, обращено-фазовую ВЭЖХ, нативный электрофорез в полиакриламидном геле, ППК, лизат амебоцитов мечехвоста, вестерн-блоттинг и ИФА. Для очистки после использования, система была промыта 1N натрия гидроксидом, запущена рециркуляция в течение, по меньшей мере, 10 минут, после чего система была промыта и хранилась заполненной 0,1N натрия гидроксидом.
Для хранения и разделения общего объема нейротоксина была проведена стерильная фильтрация и наполнение. Для корректировки концентрации токсина использовали 10 мМ калия цитрата, pH 6,5, и концентрация была приведена до примерно 0,5 мг/мл в сравнении с образцом после промывания. Если концентрация токсина была менее примерно 0,5 мг/мл, корректировки концентрации не требовалось.
С использованием стерильной пипетки были отобраны аликвоты 10 мл/0,75 мл в каждую стерильную пробирку для образцов 15 мл/1,5 мл.
Контейнер с продуктом был подвергнут осторожному ручному перемешиванию, и необходимое количество раствора (содержащее лекарственное вещество, т.е. ботулинический токсин) было внесено в каждую пробирку. Образцы хранили максимум 5 дней при 2°C-8°C в холодильнике, или 0,75 мл фильтрата было перенесено в криопробирки. Криопробирки хранят при -70°C +/- 5°C.
Пример 3
Способ получения композиции
Фармацевтическая композиция, подходящая для введения пациенту, может быть получена путем соединения полученного в ходе способа, описанного в Примере 2, ботулинического нейротоксина, с одним или несколькими вспомогательными веществами. Вспомогательное вещество может стабилизировать ботулинический токсин во время способа получения композиции и во время последующего периода хранения перед использованием. Вспомогательное вещество также может функционировать в качестве объемообразующего агента и/или обеспечивать определенную тоничность фармацевтической композиции. Приготовление композиции требует проведения многократного разведения полученного в ходе способа, описанного в Примере 2, ботулинического нейротоксина, смешивания с одним или несколькими вспомогательными веществами (такими как альбумин [такой как человеческий сывороточный альбумин или рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин] и натрия хлорид) для образования композиции с токсином, а также получения формы композиции токсина, устойчивой при хранении и поставке, например, путем лиофилизации, высушивания сублимацией или сушкой композиции в вакууме. Таким образом, примерно от 1,5 до 1,9 нг комплекса ботулинического токсина типа А, полученного в Примере 2, соединяют с примерно 0,5 мг рекомбинантного человеческого альбумина (Delta Biotechnologies) и примерно 0,9 мг натрия хлорида путем смешивания этих трех ингредиентов вместе с последующей сушкой в вакууме. Сушка в вакууме может проводиться при температуре от примерно 20°C до примерно 25°C и при давлении примерно 80 мм рт. ст. в течение примерно 5 часов, и к этому времени пробирки, содержащие указанные продукты, подвергнутые сушке в вакууме, запечатывают герметично в вакууме и закрывают пробкой, что позволяет получить пробирку с примерно 100 единицами комплекса ботулинического нейротоксина типа А. Полученный твердый (порошкообразный) продукт, высушенный в условиях вакуума, перед использованием восстанавливают нормальным физиологическим раствором (0,9%) и используют для лечения пациентов по различным показаниям, таким как цервикальная дистония и гипергидроз. Лиофилизация, сушка в вакууме или сублимация позволяет получить устойчивую при хранении и транспортировке композицию ботулинического нейротоксина.
Другой пример: примерно 1,5-1,9 нг ботулинического токсина типа А соединяют с примерно 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина (Baxter/lmmuno, Octapharma и Pharmacia & Upjohn) и примерно 0,9 мг натрия хлорида путем смешивания этих трех ингредиентов вместе с последующей сушкой в вакууме. Типичная сушка в вакууме может проводиться при температуре от примерно 20°C до примерно 25°C и при давлении примерно 80 мм рт. ст. в течение примерно 5 часов, и к этому времени пробирки, содержащие указанные продукты, подвергнутые сушке в вакууме, запечатывают герметично в вакууме и закрывают пробкой, что позволяет получить пробирку с примерно 100 единицами ботулинического токсина. Полученный твердый (порошкообразный) продукт, высушенный в условиях вакуума, перед использованием восстанавливают нормальным физиологическим раствором (0,9%) и используют для лечения пациентов по различным показаниям, таким как цервикальная дистония и гипергидроз. Кроме того, фармацевтическая композиция с ботулиническим токсином может содержать человеческий сывороточный альбумин и/или, например, лактозу. В одном примере примерно 1,5-1,9 нг ботулинического токсина типа А может быть соединено примерно с 125 мг человеческого сывороточного альбумина и 2,5 мг лактозы с последующей сушкой в вакууме, лиофилизацией или сушкой сублимацией, например, для устойчивости при хранении. Еще в одном примере примерно 1,5-1,9 нг ботулинического нейротоксина, полученного в ходе описанных здесь способов, может быть скомбинировано с примерно 10 мг трегалозы и примерно 0,5 мг сывороточного альбумина (такого как человеческий сывороточный альбумин, нативный или рекомбинантный), и, в некоторых случаях, с примерно 1 мг метионина для получения высушенного продукта, содержащего примерно 100 единиц ботулинического токсина. Данная композиция позднее может быть лиофилизирована и восстановлена перед применением с использованием примерно 1 мл дистиллированной стерильной воды или стерильного и не содержащего консервантов физиологического раствора (0,9% натрия хлорида для инъекций). В отдельных примерах фармацевтические композиции с ботулиническим токсином могут включать сахарозу, как, например, в типичной композиции, содержащей примерно 1,5-1,9 нг ботулинического нейротоксина, полученного в ходе описанных здесь способов, скомбинированной с 20% человеческим сывороточным альбумином и сахарозой, и такая композиция может быть дополнительно лиофилизирована для получения композиции с примерно 100 единицами ботулинического токсина типа А, которая затем может быть восстановлена с использованием не содержащего консервантов физиологического раствора (например, в объеме от примерно 0,5 мл до примерно 8,0 мл). В отдельном примере 200 единиц ботулинического нейротоксина могут быть скомбинированы примерно с 10 мг сахарозы и 2 мг человеческого сывороточного альбумина на мл, и полученная композиция помещается в пробирки с последующей сушкой сублимацией для дальнейшего восстановления перед использованием физиологическим раствором.
Кроме того, получение композиции также может предусматривать использование нейротоксического компонента (т.е. компонента комплекса ботулинического токсина типа А примерно 150 кДа, не содержащего комплексообразующих белков) комплекса ботулинического токсина типа А, полученного в ходе описанных здесь IAPF-способов. В одном способе очистки нейротоксический компонент примерно 150 кДа из связанных нетоксических белков (например, HAs, NTNH) нейротоксина типа А очищают от связанных нетоксических белков комплекса путем модификации способа по Tse et al. (1982) (Goodnough, M. С, 1994, Thesis, UW, Wis.). Комплекс ботулинического нейротоксина, полученного в ходе используемого нами IAPF-способа (предполагающего использование двухколоночной анионо-катионообменной системы или трехколоночной анионо-катионообменной и ХГВ, как это описано выше), восстанавливают с использованием колонки DEAE-Sephadex А 50 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), pH 5,5 и осаждают путем добавления 39 г твердого аммония сульфата/100 мл. Осажденный комплекс токсина собирают путем центрифугирования, диализируют относительно 25 мМ натрия фосфата, pH 7,9 и пропускают через колонку DEAE-Sephadex А50, равновесие в которой установлено с использованием такого же самого буфера. Нейротоксический компонент отделяют от нетоксических белков комплекса и элюируют из колонки с использованием линейного 0-0,5 М градиента натрия хлорида. Частично очищенный компонент нейротоксина восстанавливают из колонки DEAE-Sephadex А50 при pH 7,9 и диализируют относительно 25 мМ натрия фосфата, pH 7,0. Диализированный токсин вводят в колонку SP-Sephadex С50 (Sigma Chemical Со.) в присутствии 25 мМ натрия фосфата, pH 7,0. При таких условиях контаминирующий материал не связывается с материалом колонки. Чистый нейротоксин (компонент примерно 150 кДа) элюируют с использованием линейного градиента 0-0,25 М натрия хлорида. Чистый нейротоксин примерно 15 кДа может быть дополнительно очищен с использованием аффинной хроматографии с металлами, гель-фильтрации или других способов хроматографии белка. Как это описано выше, такой чистый нейротоксин (нейротоксический компонент комплекса ботулинического токсина примерно 150 кДа) может быть лиофилизирован, подвергнут сушке в вакууме или сублимацией с использованием различных вспомогательных веществ (например, сывороточного альбумина, сахарозы, лактозы, натрия хлорида, трегалозы и т.д.), описанных выше.
Общий объем комплекса ботулинического нейротоксина, полученный в ходе используемого нами IAPF-способа, может быть смешан в композиции различными способами. Типичные патенты, описывающие различные композиции ботулинических токсинов, содержат примеры различных полезных композиций/вспомогательных веществ, которые могут использоваться для соединения ботулинического нейротоксина, полученного в ходе IAPF-способа, и приготовления фармацевтической композиции, и такие патенты представлены следующими: патент США No. 6087327 (описывает композицию ботулинического токсина типа А и В и желатина); патент США No. 5512547 (Johnson et al) под названием «Фармацевтическая композиция ботулинического нейротоксина и способ ее получения» от 30 апреля 1996 г., формула изобретения описывает композицию из чистого ботулинического токсина типа А, включающую альбумин и трегалозу и устойчивую при хранении при 37°C; патент США No. 5756468 (Johnson et al), выданный 26 мая 1998 г. («Фармацевтические композиции ботулинического токсина или ботулинического нейротоксина и способ их получения»), формула изобретения описывает подвергнутую лиофилизации композицию ботулинического нейротоксина, включающую тиоалкил, альбумин и трегалозу, при условиях хранения от 25°C до 42°C; патент США No. 5696077 (Johnson et al) под названием «Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс ботулинического токсина типа В», выданный 9 декабря 1997 г., формула изобретения описывает высушенную сублимацией и не содержащую натрия хлорид композицию комплекса ботулинического токсина типа В, включающую комплекс типа В и белок в качестве вспомогательного вещества; а также публикация заявки на патент США №2003 0118598 (Hunt), описывающий использование различных вспомогательных веществ, таких как рекомбинантный альбумин, коллаген или крахмал, для стабилизации ботулинического токсина (все указанные документы являются опубликованными заявками на патенты США или патентами США, включенными в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
8
8
7
50
50
50
Полученный комплекс ботулинического токсина может быть элюирован из ионообменной колонки в буфере с pH 7-8 для диссоциации нетоксических белков комплекса из молекулы ботулинического токсина, что позволяет получить (в зависимости от типа подвергнутой ферментации бактерии Clostridium botulinum) нейротоксический компонент ботулинического токсина типа А с молекулярным весом примерно 150 кДа и специфической активностью 1-2×10 LD Ед/мг или более; или очищенный ботулинический токсин типа В с молекулярным весом примерно 156 кДа и специфической активностью 1-2×10 LD Ед/мг или более, или очищенный ботулинический токсин типа F с молекулярным весом примерно 155 кДа и специфической активностью 1-2×10 LD Ед/мг или более.
Наше изобретение предоставляет множество преимуществ. Во-первых, использование двух- и трехколоночных способов Примера 2 устраняет использование реагентов и сред животного происхождения (например, гидролизата казеина и колумбийского кровяного агара), что заметно снижает теоретические риски воздействия на пациентов прион-подобных агентов или других инфекционных агентов. Во-вторых, двух- и трехколоночные способы хроматографии (и взаимосвязанные системы и аппараты) Примера 2 обладает высокой воспроизводимостью, о чем свидетельствует большое постоянство от партии к партии. Такое усовершенствование обуславливает более постоянный клинический профиль у пациентов, которые нуждаются в повторном лечении представленными на рынке соединениями, содержащими ботулинический токсин, в течение нескольких лет. Аналитические исследования лекарственного вещества (ботулинического нейротоксина), полученного в ходе описанных здесь IAPF-способов (двух- и трехколоночных) выявили более низкую нагрузку белковыми примесями и примесями нуклеиновых кислот. Такая более низкая нагрузка белковыми примесями обуславливает более низкий риск иммуногенности (выработки антител). Кроме того, повышенная чистота IPAF-способа обуславливает более низкую частоту возникновения неспецифических симптомов, обычно ассоциированных с биологическими препаратами (например, назофарингита, симптомов верхних дыхательных путей, мышечноскелетные симптомы, головная боль и т.д.). Кроме того, улучшенный и уменьшенный масштаб данного способа снижает риск воздействия BoNT/A на штат лаборатории и производственной единицы.
Типичные преимущества данного изобретения включают, например, следующее:
1. Повышенная безопасность, т.к. в способе не используется ни один компонент или вещество животного происхождения (например, животного или человека), а использование ДНКазы и РНКазы, колумбийского кровяного агара и казеина не предусмотрено (например, заменено, фильтрацией через заряженный фильтр во время этапа очистки/сбора, а также современными способами хроматографии; засеванием питательной среды непосредственно клетками из рабочего банка клеток, при этом клетки предварительно отбирают, предоставляют им возможность деления/поддерживают в APF-среде; и флакон с питательной средой и средой ферментации заменен соевым пептоном типа II (SPTII) в качестве источника пептона).
2. На 10 л среды ферментации может быть получено от примерно 50 мг до примерно 200 мг высококачественного комплекса ботулинического токсина типа А.
3. Очищенный токсин получают в ходе способа, являющегося робастным, постоянным, масштабируемым, валидируемым и соответствующим надлежащей производственной практике (текущая редакция). Робастность обозначает, что способ воспроизводим даже при примерно ±10% изменении в одном или нескольких параметрах способа. Валидируемость обозначает, что воспроизводимость способа обеспечивает постоянные результаты очищенного токсина. Соответствие надлежащей производственной практике (текущая редакция) обозначает, что способ может быть с легкостью преобразован в производственный способ, соответствующий Управлению США по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных препаратов, которое требует использование текущей редакции правил надлежащей производственной практики.
4. Активность финального очищенного комплекса ботулинического токсина соответствует или превышает активность (например, как это определено анализом MLD50) комплекса очищенного ботулинического токсина, полученного в ходе способа Шанца или модифицированного способа Шанца.
5. Замена любого этапа осаждения этапами хроматографии для очистки полученного комплекса ботулинического токсина улучшает специфичность способа очистки.
6. Новый улучшенный способ облегчает уменьшение масштаба, что приводит к улучшенным результатам и достижению показателя производственного успеха >95% (например, снижение от типичных объемов, использующих 110 л-120 л среды ферментации, до примерно 10-50 л, и даже до примерно 2-30 л среды ферментации или количества в указанных пределах). Типичный используемый в настоящее время производственный масштаб для получения лекарственного вещества составляет 115 л среды ферментации (не APF), и такой масштаб в одном аспекте изобретения был снижен до 20 л среды ферментации. Такое снижение в масштабе возможно путем оптимизации синтеза и высвобождения клетками комплекса BoNT/A, а также общего выхода этапов очистки, что приводит к получению похожих количеств финального ботулинического токсина (лекарственного вещества) в сравнении с используемыми ранее способами, требующими, например, 5х или даже больших объемов ферментации (например, 115 л). Такой сниженный масштаб облегчает управление рабочим объемом ферментации и, таким образом, сводит к минимуму потенциальный риск воздействия оператора на комплекс BoNT/A, что является важным производственным преимуществом и преимуществом в плане безопасности.
7. По причине потенциально смертельной природы комплекса BoNT/A, в производственный способ были введены замкнутые системы, как это описано в тексте данной заявки. В отличие от используемых ранее способов, ни одно лекарственное вещество, произведенное в соответствии с аспектами данного изобретения, не подвергается воздействию среды во время переноса между однократными действиями; все операции полностью ограниченны.
8. Способ производства ботулинического токсина, описанный в тексте данной заявки, упрощен на всех этапах без ущерба идентичности, качеству, чистоты или активности лекарственного вещества во время производства. Для разработанного способа IAPF был устранен целый ряд этапов, используемых в способе (не APF), что снизило время производства от, например, 21 дня до 6 дней или менее.
9. Состояние хранения ботулинического токсина в виде замороженного раствора значительно улучшает устойчивость лекарственного препарата.
В тексте данной заявки приводятся ссылки на различные публикации, патенты и/или ссылки, и содержимое всех документов включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки. Группы альтернативных элементов или описанных здесь вариантов воплощения изобретения не должны рассматриваться в качестве ограничений. Каждый член группы может быть указан и заявлен отдельным образом или в любой комбинации с другими членами группы или другими описанными здесь элементами. Ожидается, что один или несколько членов группы может быть включен или удален из группы по причинам удобства и/или патентоспособности. Более того, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариациях охватывается данным изобретением, если иное не будет указано отдельным образом или не ясно четким образом из контекста.
Несмотря на то, что данное изобретение было описано подробно относительно преимущественных способов, возможно использование других вариантов воплощения изобретения, версий и модификаций в рамках объема данного изобретения. В соответствии с этим, сущность и объем представленной ниже формулы изобретения не должен ограничиваться отдельным описанием описанных выше вариантов воплощения изобретения.