Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов GSTP1 и GSTM1 с выживаемостью больных циррозом печени вирусной и алкогольной этиологии

Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов GSTP1 и GSTM1 с выживаемостью больных циррозом печени вирусной

и алкогольной этиологии

Рачковский М.И.\ Гончарова И.А.2, Белобородова Э.И.\ Белобородова Е.В.\ Груздева Е.Г.3, Алексеева А.С.3, Пузырёв В.П.2

Analysis of association of polymorphic variants of genes GSTP1 and GSTM1 with survival rate sick of liver cirrhosis of a virus and alcoholic etiology

Rachkovskiy M.I., Goncharova I.A., Beloborodova E.I., Beloborodova Ye.V., Gruzdeva Ye.GAlekseyeva A.S., Puzyryov V.P.

С целью изучения ассоциации полиморфных вариантов генов глутатион^-трансферазы пи и мю (GSTP1 и GSTM1) с выживаемостью больных циррозом печени (ЦП) проведено одномоментное проспективное исследование 189 больных ЦП вирусной (гепатиты В, С, В и С) и алкогольной этиологии. Проведено сравнение частоты распределения полиморфных вариантов генов GSTP1 и GSTM1 между умершими и выжившими больными за 4 года. С большей выживаемостью больных ЦП ассоциировались наличие генотипа АА гена GSTP1 (критерий х2 Пирсона, р = 0,008) и нулевой генотип GSTM1 (критерий х2 Пирсона, р = 0,027). Шансы развития летального исхода у больных ЦП с наличием генотипов gg и ag по гену GSTP1 в 2,5 раза выше, чем у больных с генотипом АА. Наличие активной копии гена GSTM1 увеличивает шансы развития летального исхода в 2 раза.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости учета генетических факторов в прогнозе ЦП.

Ключевые слова: полиморфизм генов, цирроз печени, прогноз.

With the purpose of studying of association of polymorphic variants of genes glutathione S-transferases pi and mu (GSTP1 and GSTM1) with survival rate sick of liver cirrhosis (LC), it is lead uniinstantly research of 189 sick of LC of a virus (HBV, hcv, нВv+нСv) and an alcoholic etiology. Have been compared a frequencies of allocation of polymorphic variants of genes GSTP1 and GSTM1 between the died and persisted patients for the season 4 years. With greater survival rate of sick of LC associated: presence of genotype АА of gene GSTP1 (X2 Pearson, р = 0,008) and «null» genotype GSTM1 (X2 Pearson, р = 0,027). Chances of development of a lethal outcome at sick of LC with presence of genotypes GG and AG on gene GSTP1 in 2,5 times above, than at patients with genotype АА. Presence of active gene replica GSTM1 enlarges chances of development of a lethal outcome in 2 times.

The received results testify to necessity of the count of genetical factors for the forecast of LC.

Key words: polymorphism genes, liver cirrhosis, forecast.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

НИИ медицинской генетики СО РАМН, г. Томск

ОГУЗ «Томская областная клиническая больница», г. Томск

© Рачковский М.И., Гончарова И.А., Белобородова Э.И. и др.

УДК 616.36-004-02-036:575.13]-07

Введение

печени, включая цирроз печени (ЦП), уделяется генетическим факторам. В частности, изучаются полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, поскольку в этио-

В настоящее время большое значение в исследовании патогенеза и прогноза заболеваний

Рачковский М.И., Гончарова И.А., Белобородова Э.И. и др, GSTP1 и GSm1...

логии ЦП одной из ведущих причин выступает алкоголь, также являющийся ксенобиотиком. Кроме этого, при ЦП уменьшаются возможности организма по обезвреживанию токсинов, поскольку печень является ключевым органом, участвующим в процессах биотрансформации ксенобиотиков. Можно предположить, что у больных ЦП, имеющих более высокий уровень биотрансформации ксенобиотиков, определяющийся активностью ферментов этого процесса, в меньшей степени будет происходить повреждение печени и других органов экзогенными и эндогенными токсинами и, соответственно, будет лучше прогноз. Активность ферментов определяется экспрессией генов, их кодирующих. Поскольку эти гены имеют полиморфные варианты, то и ферменты будут отличаться по последовательности аминокислот или пространственной конфигурации белковых молекул, а это будет приводить к различной активности ферментов. Названные обстоятельства определяют интерес к изучению полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков.

Особое внимание гепатологов в последнее время привлекает изучение ферментов семейства глутатион^-трансфераз ^эт), осуществляющих конъюгацию сульфгидрильной ^ю группы глутатиона с ксенобиотиками или их метаболитами, образовавшимися в первой фазе биотрансформации ксенобиотиков. Данная реакция играет ведущую роль в защите клеток от свободных радикалов [1]. Микросомальная Gsт тесно связана с цитохром Р450-системой, что служит для быстрой инактивации активных метаболитов, включая алкоголь [2].

Существуют несколько классов Gsт в зависимости от метаболизируемого субстрата и органной принадлежности ферментов. Примерно 10% всего пула Gsт организма содержится в печени [1]. Растворимые и мембраносвязанные формы Gsт кодируются двумя различными суперсемействами генов. В настоящее время идентифицированы восемь различных классов цитоплазматических GST: альфа, каппа, мю, омега, пи, сигма, тета и дзета [12]. GSTM1 является одним из генов, кодирующих ферменты класса

мю. Ген локализован на первой хромосоме 1р1з.з и состоит из 10 экзонов [12]. Класс тета кодируется геном GSTT1, который картирован на хромосоме 2 2q11.23 и содержит 6 экзонов [12]. Ген GSTP1 кодирует класс ферментов пи, локализован на хромосоме 11q13 и состоит из 9 экзонов [12]. Среди многочисленных генов семейства GST гены GSTM1, GSTT1, GSTP1 наиболее часто изучаются в связи с предрасположенностью к развитию различных онкологических заболеваний, с их течением и исходами. Наиболее частым полиморфным вариантом для генов GSTT1 и GSTM1 является их делеция (нулевой генотип), которая ассоциирована с полным отсутствием ферментативной активности этих глутатион^-трансфераз и ослаблением защиты клеток от повреждающего действия метаболитов и свободных радикалов и увеличением в связи с этим цитогенетических повреждений [4, 9]. Для европеоидов частота нулевого генотипа гена GSTM1 колеблется от 42 до 60%, гена GSTT1 — от 13 до 26% [12].

Предполагается, что gst защищает печень от патологических процессов, вызванных вирусом гепатита В и С, которые выражаются в обширных повреждениях ДНК в результате окислительного стресса [12]. При злоупотреблении алкоголем пониженная активность GST может приводить к повышению концентрации токсичных метаболитов, вызывающих повреждение печени. Проведено множество исследований, посвященных выявлению ассоциации ЦП алкогольной этиологии с полиморфизмами генов GST. В некоторых работах нулевые генотипы GSTM1 и GSTT1 ассоциировались с развитием алкогольного ЦП, а в других такой ассоциации не выявлялось [11]. При изучении ассоциации полиморфизмов GST с вирусными ЦП получены интересные данные. Так, hbv ЦП ассоциировался с нулевым генотипом GSTM1 и генотипом Val/Val полиморфного варианта iie105Vai гена GSTP1 [6, 8].

Таким образом, определена потенциальная роль полиморфизмов генов GST в развитии заболеваний печени, поэтому перспективными являются исследования этих генов как факторов, влияющих на течение и прогноз патологии пе-

чени в различных популяциях. Данные об ассоциации полиморфизмов генов GST с выживаемостью больных ЦП в литературе не встретились, что определило актуальность настоящего исследования.

Цель исследования — изучить прогностическое значение полиморфных вариантов генов GSTP1 и GSTM1 у больных циррозом печени вирусной и алкогольной этиологии.

Материал и методы

Проведено обсервационное одномоментное проспективное исследование с включением 189 больных (85 мужчин и 104 женщины) ЦП вирусной (гепатиты В, С, В и С), алкогольной и смешанной (алкогольно-вирусной) этиологии с оценкой конечной твердой точки — наступления летального исхода от ЦП или его осложнений. Период наблюдения — 4 года. Возраст больных — от 18 до 75 лет (медиана Me = 51 год). Момент включения в исследование — верификация в стационаре Томской областной клинической больницы ЦП или поступление в стационар в связи с декомпенсацией ЦП.

Диагноз ЦП подтвержден морфологически (лапароскопия с биопсией) у 35 больных, у остальных — выставлен на основании наличия признаков диффузного повреждения печени, наличия синдрома печеночно-клеточной недостаточности и синдрома портальной гипертен-зии ( варикозное расширение вен желудка и пищевода, асцит). Этиология ЦП определена указанием в анамнезе на многолетнее злоупотребление алкоголем и данными вирусологического исследования сыворотки крови на маркеры вирусов гепатита В (HBsAg, антитела классов м и g к HBcorAg, ДНК hbv), С (антитела классов м и g к hcv, РНК hcv) и d (антитела к hdv). У всех больных в момент включения в исследование произведен забор венозной крови из кубиталь-ной вены в объеме 5 мл для проведения генетических исследований.

Выделение ДНК проводили по стандартной неэнзиматической методике [7]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20 °С до проведения генотипирования.

Изучены полиморфный вариант A313G (iieio5v-ai) гена GSTP1 и делеционный полиморфизм гена GSTM1.

Изучение полиморфных вариантов исследуемых генов проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в геномной базе данных (gdb) и литературе [5, 9]. ПДРФ-анализ проводили с помощью рестрикции амплифици-рованных участков генома соответствующими рестриктазами (BstMA 1 для гена GSTP1) фирмы «Сибэнзим» (г. Новосибирск). Генотипирование выполняли путем разделения рестрицированных продуктов ПЦР в з%-м агарозном геле в течение зо—4о мин. Окрашивание проводили бромистым этидием. Фрагменты визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на установке фирмы BioRad (США). Исследования выполнены на базе НИИ медицинской генетики СО РАМН (г. Томск).

Больные были распределены на две группы (умершие и выжившие) по отношению к развитию летального исхода в течение 4 лет. При изучении влияния полиморфных вариантов генов на выживаемость больных ЦП необходимым условием было нахождение пациентов с различными полиморфными вариантами одного гена на одной стадии заболевания. Это условие было подтверждено тем, что больные с различными полиморфными вариантами каждого исследуемого гена были сопоставимы по классам Чайлда-Пью, т.е. находились на одной стадии заболевания, кроме этого, они были сопоставимы по полу и возрасту.

Статистическая обработка данных выполнялась с помощью программы Statistica 6.0 (StatSoft, США). Сопоставимость групп по полу, возрасту и классам Чайлда-Пью проводилась при помощи непараметрического критерия Манна—Уитни. Статистически значимыми считались отличия при p < 0,05.

Проведен анализ частот распределения изучаемых полиморфных вариантов генов в группах умерших и выживших больных ЦП. Проверка нулевой гипотезы об отсутствии раз-

Рачковский М.И., Гончарова И.А., Белобородова Э.И. и др, GSTP1 и GSm1...

личий между умершими и выжившими больными по частотам распределения полиморфных вариантов генов осуществлялась с использованием критерия х2 Пирсона. Нулевая гипотеза об отсутствии различий между группами отвергалась при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

По гену GSTР1 были три варианта генотипа: АА, GG и AG. По гену GSTМ1 — два варианта генотипа: М1 + (присутствует ген) и М1- (делеция гена). Изучение влияния полиморфных вариантов генов GSTP1 и GSTM1 на выживаемость выявило их ассоциацию с летальностью у больных ЦП. Абсолютные частоты распределения генотипов полиморфных вариантов изучаемых генов в сравниваемых группах и результаты статистического анализа представлены в таблице.

Абсолютные частоты распределения полиморфных вариантов генов у больных ЦП

Полиморфные варианты генов Генотип Умершие больные ЦП Выжившие больные ЦП Уровень статистической значимости p

ДД 34 65

GSTP1 Д313С

ее 7 6 0,008

Дв 43 32

GSTМ1 М1+ М1- 60 26 55 48 0,027

Проведено вычисление шансов наступления летального исхода в течение 4 лет у больных ЦП с различными генотипами по GSTP1 и GSTM1.

Поскольку статистически значимых отличий по распределению частот генотипов GG и AG между группами умерших и выживших больных ЦП выявлено не было, то для оценки шансов развития летального исхода при данных генотипах по сравнению с генотипом АА они были объединены. Шансы умереть у больных ЦП в группе с генотипами GG и AG по гену GSTP1 50/38 = 1,32. Шансы умереть у больных ЦП с генотипом АА по гену GSTP1 34/65 = 0,52. Отношение шансов (ОШ) 1,32/0,52 = 2,54. Это означает,

что шансы развития летального исхода в течение 4 лет у больных ЦП с наличием генотипов GG и AG по гену GSTP1 в 2,5 раза выше, чем у больных с генотипом АА по этому гену.

Шансы умереть у больных ЦП с наличием гена GSTМ1 60/55 = 1,09. Шансы умереть у больных ЦП с делецией гена GSTМ 1 26/48 = 0,54. Отношение шансов (ОШ) 1,09/0,54 = 2,02. Это свидетельствует о том, что шансы развития летального исхода в течение 4 лет у больных ЦП с наличием активной копии гена GSTМ1 в 2 раза выше, чем у больных с отсутствием обеих копий этого гена. Логичнее предположить, что отсутствие GSTM1 будет приводить к снижению активности процессов 2-й фазы биотрансформации ксенобиотиков и ухудшать прогноз при ЦП. Однако полученные данные свидетельствуют об обратном. Объяснить эту ситуацию можно, предполагая, что в процессе биотрансформации ксенобиотиков с участием GSTM1 образуются более токсичные вещества, чем исходные продукты. Указания на такую возможность имеются в литературе [1]. Остается установить предполагаемый ксенобиотик, для чего необходимо проведение углубленных химических исследований биологических жидкостей больных. Поскольку у большинства пациентов этиология ЦП была алкогольной, можно предположить, что в суррогатах алкоголя, которые они употребляли, содержалось вещество, биотрансформация которого с участием GSTM1 приводила к образованию более токсичного продукта. Не исключается эндогенная природа искомого вещества. В связи с этим необходимо проведение дальнейшего изучения данной проблемы.

Выводы

1. Генотип АА по гену GSTP1 ассоциируется с большей выживаемостью больных ЦП вирусной и алкогольной этиологии по сравнению с генотипами GG и AG.

2. Делеция гена GSTМ1 ассоциируется с большей выживаемостью больных ЦП вирусной и алкогольной этиологии.

Заключение

Полученные результаты очень важны для прогнозирования ЦП, поскольку в наиболее широко используемых прогностических моделях — Чайлда-Пью и meld (модель терминальной стадии болезни печени) не учитываются генетические факторы, а сами модели имеют пределы прогностической точности [з]. Разработка прогностических моделей ЦП важна для распределения очередности пациентов в листе ожидания на трансплантацию печени и получения другого дорогостоящего лечения, а также решения социальных вопросов в связи с неблагоприятным прогнозом. Изучение генетических прогностических факторов в комплексе с клиническими и разработка на их основе новых прогностических моделей являются очень перспективными и важными направлениями современной гепатологии.

Литература

1. Куценко С.А. Основы токсикологии. СПб.: Фолиант,

2002. 720 с.

2.Мазур И.А., Волошин Н.А., Чекман И.С. и др. Клиническое применение тиотриазолина в терапии //

Сучасна гастроентеролопя. 2005. Т. 25. № 5. С.

76-79.

3. Cholongitas E., Papatheodoridis G.V., Vangeli M. et

al. Systematic Review: The Model for End-Stage Liver Disease — Should it Replace Child-Pugh's Classification for Assessing Prognosis in Cirrhosis? // Aliment. Pharmacol. Ther. 2005. V. 22. № 11. Р. 1079-1089.

4. Hayes J.D., Strange R.C. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences // Pharmacology. 2000. V. 61. P. 154 —166.

5. Ishii T., Matsuse T., Teramoto S. et al. Glutathione S-

transferase P1 (GSTP1) polymorphism in patients with chronic obstructive pulmonary disease // Thorax. 1999. V. 54. P. 693-696.

6. Kandemir O., Tamer L., Tasdelen B. Effects of gsth,

GSTM1 and GSTP1 gene polymorphism on the course of hepatitis B virus infection // Hepatogastroenterology. 2008. V. 55. № 86-87. P. 1729 —1733.

7. Lahiri D.K., Bye S., Nurnberger J.I. et al. A non-organic

and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested // J. Bio-chem and Biophys. Methods. 1992. V. 25. P.193-205.

8. Mohammadzadeh Ghobadloo S., Yaghmaei B.,

Allameh A. et al. Polymorphisms of glutathione S-transferase M1, T1, and P1 in patients with HBV-related liver cirrhosis, chronic hepatitis, and normal carriers // Clin. Biochem. 2006. V. 39. № 1. P. 46-49.

9. Norppa H. Cytogenetic biomarkers and genetic polymorphisms // Toxicol. Lett. 2004. V. 149. P. 309—334.

10. Spurdle A.B., Webb P.M., Purdie D.M. et al. Polymorphisms

at the glutathione S-transfrase GSTM1, GSTT1 and GSTP1 loci: risk of ovarian cancer by histological subtype // Carcinogenesis. 2001. V. 22. P. 67-72.

11. Stickel F., Osterreicher C.H. The role of genetic polymorphisms in alcoholic liver disease // Alcohol Alcohol. 2006. V. 41. № 3. P. 209-224.

12. White D.L., Li D., Nurgalieva Z., El-Serag H.B. Genetic

Variants of Glutathione S-Transferase as Possible Risk Factors for Hepatocellular Carcinoma: A HuGE Systematic Review and Meta-Analysis // Am. J. Epidemiol. 2008. V. 167. № 4. Р. 377—389.

Поступила в редакцию 30.03.2008 г. Утверждена к печати 07.04.2009 г.

Сведения об авторах

М.И. Рачковский — канд. мед. наук, доцент кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины СибГМУ (г. Томск).

И.А. Гончарова — канд. биол. наук, научный сотрудник НИИ медицинской генетики СО РАМН (г. Томск). Э.И. Белобородова — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой терапии ФПК и ППС СибГМУ (г. Томск). Е.В. Белобородова — д-р мед. наук, профессор кафедры терапии ФПК и ППС СибГМУ (г. Томск). Е.Г. Груздева — врач-гастроэнтеролог Томской ОКБ (г. Томск).

A.С. Алексеева — канд. мед. наук, врач-гастроэнтеролог, зам. главного врача по лечебной работе Томской ОКБ (г. Томск).

B.П. Пузырёв — д-р мед. наук, профессор, академик РАМН, зав. кафедрой медицинской генетики СибГМУ, директор НИИ медицинской генетики СО РАМН (г. Томск).

Рачковский М.И., Гончарова И.А., Белобородова Э.И. и др.Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов GSTP1 и GSTM1...

Для корреспонденции

Рачковский Максим Игоревич, тел.: 8-903-950-3802, e-mail: rachkovskii@rambler.ru