Состав и биологическая активность хрящевой ткани гидробионтов

2003

Известия ТИНРО

Том 133

УДК 664.957:577.1

Т.Н.Пивненко, Г.Ю.Клычкова, Н.Н.Ковалев, Л.М.Эпштейн

СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ ГИДРОБИОНТОВ

Содержится анализ литературного материала, касающегося известных данных о химическом составе хрящевой ткани животных, биологической активности отдельных компонентов, таких как гексозамины, хондроитинсульфаты, коллаген, ингибиторы металлопротеиназ и др. Приведены собственные данные о составе хрящевой ткани полярной акулы (Somniosus antarcticus), ската (Bathyraja aleutica), костно-хрящевой ткани лосося (Oncorhynchus gorbuscha), хрящеподобной ткани кальмара (Ommastrephes bartrami). Проведено сравнение состава углеводных компонентов в хрящевых комплексах гидробионтов и известных лечебных препаратах. Показано наличие ингибиторов протеолитических ферментов в хрящевой ткани гидробионтов. Полученные данные свидетельствуют о видовых особенностях компонентов хрящевой ткани, что отражается на проявлении ингибиторной специфичности препаратов. Исследование углеводного состава (гексозаминов и хондроитинсульфатов) хрящевой ткани гидробионтов позволяет рекомендовать ее как источник для получения пищевых и биологически активных добавок.

Pivnenko T.N., Klychkova G.Yu., Kovalev N.N., Epshtein L.M. Structure and biological activity of cartilage tissue of hydrobionts // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 133. — P. 325-332.

The cited data are analyzed concerning chemical structure of cartilage tissue of marine animals, biological activity of its separate components, such as hexose amines, chondroitinsulfates, collagen, inhibitors of metalproteinases, and others. The conclusion is made on a lack of that data, with exclusion of sharks. Some authors' data are presented on the structure of cartilage tissue of polar shark (Somniosus antarcticus) and a slope (Bathyraja aleutica), of osteo-cartilage tissue of a salmon (Oncorhynchus gorbuscha), of cartilage-like tissue of a squid (Ommastrephes bartrami). Structure of carbohydrate components in cartilage complexes of hydrobionts was compared with well-known medical preparations. The presence of inhibitors of proteolytic enzymes in the cartilage tissue of hydrobionts is shown. The received data testify about species features of cartilage tissue components, that is reflected in inhibitors specificity of preparations. The results of this study of carbohydrate contents (hexoseamines and chondroitinsulfates) of cartilage tissue of hydrobionts allow us to recommend it as a source for reception of biologically active additives.

В настоящее время источником сложных углеводов специфического действия является хрящевая ткань крупного рогатого скота и отдельных видов акул. В научной литературе показано, что хрящевая ткань акул содержит необычные по составу и свойствам противовоспалительные компоненты, которые являются ингибиторами ферментов, отвечающих за обменные процессы в соединительной ткани (матриксные металлопротеиназы) (Alves et al., 1994; Клычкова, Пивненко, 2001; Пат. 2157695; Пат. 2161002). Для состава хрящевой ткани других видов рыб существуют разрозненные, единичные сведения. Данные по составу и свойствам хрящеподобной ткани беспозвоночных отсутствуют совсем.

Хрящевая ткань представляет собой бессосудистую соединительную ткань, в состав которой входят гликозаминогликаны, такие как хондроитинсульфаты (ХС), дерматансульфаты, гиалуроновая кислота, которые вместе с коллагеном II типа образуют сложный протеогликановый комплекс (Слуцкий, 1985; Tryggvason et al., 1987). Имеются многократные сведения о биологической активности гли-козаминогликанов и препаратов, содержащих гексозамины (Ruoslanti, 1989; Ш итов, 1992; Lafont et al., 1992). Активность гликозаминогликанов зависит от наличия в каждой дисахаридной единице хотя бы одной отрицательно заряженной карбоксильной или сульфатной группы, обеспечивающей высокую гидрофильность и поверхностно-активные свойства. Кроме этого, гликозаминогликаны являются предшественниками макромолекул суставного хряща, введение их в организм вызывает определенное стимулирующее действие и облегчает регенерацию хрящевой ткани за счет использования "готового строительного материала'' и способности накапливаться в очагах воспаления (Шитов, 1992).

В исследованиях in vivo показано, что ХС обладает противовоспалительной активностью, стимулирует синтез гиалуроновой кислоты и протеогликанов и ингибирует действие протеолитических ферментов. Как компоненты лекарственных средств хондроитинсульфаты стимулируют пролиферацию эндотелия роговицы глаза (Пат. 2077328), репарацию кожи (Пат. 2092156), эффективны при профилактике циститоподобных сиптомов (Пат. US 6083933) и при лечении старческого слабоумия (Пат. WO 9605851). В клинических исследованиях продемонстрирована эффективность ХС в отношении влияния на болевой синдром и функциональное состояние суставов (Пат. ЕР 9914130).

В норме процессы синтеза и расщепления гликозаминогликанов и коллагена находятся в равновесии. При воспалениях, таких как артрит, происходит деполимеризация хрящевой ткани интерстициальными ферментами, сопровождаемая болезненным состоянием суставов. Для лечения заболеваний опорно-двигательной системы рекомендуют препараты, содержащие гликозаминогликаны: артепарон, румалон, структум, мукартрин глюкозаминосульфат, хонсурид (Маш-ковский, 1997). Препараты являются высокомолекулярными продуктами переработки хрящевой и костной ткани крупного рогатого скота. По своей химической природе это фрагменты протеогликанов, получаемые путем экстракции или сублимации хрящевой ткани. Основными действующими веществами являются гли-козаминогликаны, такие как хондроитинсульфаты, дерматансульфат, гиалуроно-вая кислота.

Количественно преобладающим белком протеогликанового комплекса хрящевой ткани является коллаген, обеспечивающий главным образом такое биомеханическое свойство, как прочность на растяжение и разрыв. Первоначально существовало мнение, что коллаген выполняет механические функции и имеет очень медленный метаболический оборот. Однако это касается только его нерастворимой фракции, между тем как молодые несвязанные в цепи фракции имеют очень короткий биологический период полураспада, всего несколько десятков часов. Было установлено, что коллаген играет очень важную роль в дифференциации клеток, их пролиферации и клеточной активности вообще (Слуцкий, 1985). Из этих представлений также исходит применение диеты, богатой колла-генным гидролизатом, при остеопорозе (Пат. WO 9605851), хрящевых нарушениях (Пат. US 6025327), ревматоидном артрите (Пат. US 5856446).

Известно, что экстракты из хряща акул в своем составе содержат низкомолекулярные белки, ингибирующие коллагеназу, которая относится к металло-протеиназам матрикса (Lee and Langer, 1983). Металлопротеиназы способны разрушать все компоненты внеклеточного матрикса. Активатором металло-протеиназ считают плазминоген, образующийся под влиянием тканевого активатора плазминогена, который синтезируется хондроцитами или клетками синовиальной жидкости. Хондроциты выделяют также тканевые ингибиторы ме-

таллопротеиназ (ТИМП) и активатора плазминогена, которые обладают анти-ангиогенным действием, препятствуют активации ферментов и их разрушительному действию на ткань хряща. Полагают, что причиной остеоартроза является нарушение баланса между указанными факторами, которое приводит к повышенному разрушению матрикса или снижению его восстановления. У больных остеоартрозом отмечали повышенную концентрацию металлопротеи-наз в ткани хряща (Murphy et al., 1989; Murphy, 1991; Woessner, 1994). Л итера-турные данные свидетельствуют, что размеры антиангиогенного фактора акульих хрящей могут варьировать в пределах от 1 до 20 кДа. И так как акулий хрящ способен проявлять активность при энтеральном введении, то размер антиангиогенного фактора должен быть таким, чтобы он мог проникать через мембрану. Считают, что мембраны, в свою очередь, проницаемы для макромолекул размером не более 50 кДа (Warshaw, 1979). Одна из групп таких биологически активных тканевых ингибиторов включает низкомолекулярные кати-онные белки с молекулярной массой в пределах от 11 до 40 кДа (Kuettner et al., 1976; Langer et al., 1976; Tryggvason et al., 1987).

Литературные данные позволяют заключить, что хрящевая ткань акул и крупного рогатого скота (КРС), обладающая рядом особенностей, содержит не только белковые активные молекулы, но и углеводные компоненты, которые немаловажны в процессах клеточного взаимодействия, регуляции и многих других функций. Однако, как утверждают исследователи (Пат. WO 96/23512), важным является содержание белковых ингибиторов ММП, в то время как корреляция других компонентов допускается.

Таким образом, в настоящее время существует большое количество препаратов на основе природных соединений для лечения заболеваний опорно-двигательной системы, связанных с деструкцией соединительной ткани, основными источниками которых являются хрящи крупного рогатого скота и в ряде случаев акулы. Хрящевая ткань гидробионтов может значительно расширить сырьевую базу подобных препаратов и обеспечить рациональное использование рыбного сырья, в частности его отходов, не используемых в пищу.

Цель работы заключалась в изучении состава и ингибиторной активности препаратов из хрящевой ткани гидробионтов с перспективой выявления и использования новых видов рыбного сырья и неиспользуемых ранее органов и тканей.

Материалом исследований являлась хрящевая ткань гидробионтов: полярной акулы (Somniosus antarcticus), ската (Bathyraja aleutica), костно-хряще-вая ткань лосося (Oncorhynchus gorbuscha), хрящеподобная ткань кальмара (Om-mastrephes bartrami).

Для анализа ингибиторной специфичности использовали следующие ферментные препараты: пилорин из пилорических придатков тихоокеанских лососей и гепатопанкреатин из гепатопанкреаса камчатского краба, полученные в ТИНРО-центре по ранее разработанному методу (Пивненко, 1997), а также хи-мопсин из поджелудочной железы крупного рогатого скота производства завода медпрепаратов г. Санкт-Петербург. В качестве субстратов использовали: казеин по Гаммерстену (НПО "Биолар", Латвия), коллаген из гольевого порошка (НПО "Биолар", Латвия), этиловый эфир N-бензоил^-тирозина (БТЭЭ), метиловый э фир ^тозил^-аргинина (ТАМЭ) ("Sigma", США), NL-бензоил-DL-аргинин-р-нитроанилид гидрохлорид (БАрНА) ("Aldrich. Chem. Co", США).

Определение общей протеолитической активности ферментов основано на установлении количества низкомолекулярных растворимых белковых компонентов, образующихся при ферментативном гидролизе субстрата. Использовали 2 %-ный раствор казеина при рН 8,0. Время реакции 10 мин при 30 °С. Единица активности соответствует увеличению оптической плотности на 1 г препарата за 1 мин.

Определение коллагенолитической активности ферментов основано на установлении количества низкомолекулярных белковых компонентов, образующихся при ферментном гидролизе субстратов, определяемых спектрофотометри-чески. Использовали 0,5 %-ную суспензию коллагена при рН 8,0. Время реакции 4 ч при 37 °С. Единица активности соответствует увеличению оптической плотности на 1 г препарата за 1 мин.

Определение эстеразной активности ферментов проводили по методу Шверта и Такенаки (Shwert, Takenaka, 1955). Принцип метода состоит в том, что под действием испытуемого ферментного раствора происходит расщепление субстрата с образованием спирта и производных аминокислот, которые имеют более высокое, чем исходный э фир, значение оптической плотности при известных длинах волн.

Определение амидазной активности ферментов осуществляли по методу Эрлангера. Принцип метода состоит в том, что под действием фермента на субстрат ^Ь-бензоил^Ь-аргинин-р-нитроанилид гидрохлорид (БАрНА)) происходит высвобождение р-нитроанилида, имеющего более высокое значение оптической плотности при длине волны 405 нм (Erlanger et al., 1961).

Влияние препаратов на активность протеолитических ферментов определяли по изменению эстеразной, коллагено- и казеинолитической активности в указанных выше ферментных препаратах при инкубации в присутствии различных концентраций хрящевых препаратов через определенные промежутки времени.

Для определения ингибиторной активности гидролизата и сублимированного хряща использовали смеси растворов фермента и исследуемого препарата в соотношениях 1,0: 0,1; 1,0: 0,25; 1,0: 0,5; 1: 1; 1: 5; 1: 8; 1: 10. Смесь растворов выдерживали в течение 30, 60, 120 мин при температуре 4 °С.

Количественное определение гексозаминов проводили спектрофотомет-рически согласно указаний Фармакопейной статьи № 42-1286-99. Количество гексозаминов рассчитывали по калибровочному графику, построенному по глю-козамингидрохлориду.

Количественное определение хондроитинсульфатов осуществляли согласно указаниям той же Фармакопейной статьи по концентрации сульфат-ионов.

Определение содержания коллагена проводили по методу, описанному у Н.Н.Крыловой и Ю.Н.Лясковской (1965), основанному на количественном анализе оксипролина. По калибровочному графику определяли концентрацию ок-сипролина в объеме жидкости, находившейся в пробирке после добавления пара-диметиламинобензальдегида.

В работе были исследованы исходная хрящевая ткань гидробионтов и препараты из нее, полученные с помощью ферментативного гидролиза. Было показано, что метод ферментативного гидролиза, первоначально разработанный для хрящевой ткани акул, может быть использован при переработке хрящевой ткани скатов, костно-хрящевого остова лососей, хрящеподобной ткани кальмара. Полученные препараты характеризовали по содержанию гексозаминов, хондроитин-сульфатов, коллагена, общего азота (табл. 1) и по проявлению ингибиторной активности (рис. 1 и 2).

В проведенном исследовании состава углеводных компонентов хрящевых тканей гидробионтов нами использовалась методика той же Фармакопейной статьи на препарат "Хонсурид", согласно которой условия гидролиза соответствуют пределу оптимального режима. Данный метод позволяет относительно быстро и просто определять содержание гексозаминов в ферментативных гид-ролизатах. По сравнению с широко применяемой методикой Элсона и Моргана (цит. по: Кочетков и др., 1967) продолжительность определения сокращается в 2 раза. Количественное содержание гексозаминов, определенное обоими способами, практически совпадает.

Таблица 1

Характеристика состава хрящевой ткани гидробионтов и известных препаратов, % от сухой массы

Table 1

Characteristics of cartilage tissue of hydrobionts and known preparations, % from dry wt.

Исследуемая ткань и препарат Гексо-замины Сульфат-ионы Коллаген ^общ

Хрящевая ткань

полярной акулы 2,78 (2,4)* 6,48 4,1 11,13

ската 6,3 Н.о Н.о Н.о

кальмара 1,0 6,36 8,4 11,42

лососевых 1,1 6,2 6,0 12,84

Известные препараты:

Структум 12,0 11,5 - -

Глюкозаминосульфат 38,4 10,36 - -

Хондрамин 0 18,0 - -

Хонсурид 18,05 7,5 - -

Гиалуроновая кислота 12,9 5,7 - -

* По методу Элсона и Моргана.

Рис. 1. Остаточная активность ферментов (1 мг/мл): ряд 1 — гепатопанкреатин, ряд 2 — пилорин; в присутствии хрящевых комплексов (1 мг/мл): 1 — акула, 2 — скат, 3 — кальмар, 4 — лосось. Субстрат: а — коллаген, б — казеин

Fig. 1. Residual activity of enzymes (1 mg/ml): 1 line — hepatopancreatin, 2 line — pilorine; in presence of cartilage complexes (1 mg/ml): 1 — shark, 2 — skate , 3 — squid , 4 — salmon. Substrate: a — collagen, б — cazein

Полученные результаты свидетельствуют, что по содержанию гексоз препараты из хрящевой ткани хрящевых рыб в три раза превосходят таковые из костно-хрящевой ткани лосося и хрящеподобной ткани кальмара. Препарат из хрящевой ткани ската отличается наибольшим содержанием гексозаминов.

Известно, что гексозамины всегда сопутствуют коллагенам, поскольку кислые гексозаминогликаны, в составе которых находятся аминосахара, принимают участие в образовании фибрилл, стабилизируя структуру коллагена. Коллаген, в свою очередь, обладает необычным составом и последовательностью аминокислот. Количество пролина и лизина в коллагене значительно выше, чем в других

белках. В исследуемых препаратах содержание коллагена варьирует от 4,1 до 8,4 % в зависимости от вида сырья. При этом содержание общего азота по Кьель-далю составляет 1113 %.

Рис. 2. О статочная активность химотрипси-на (а) и трипсина (б) (препарат химопсин 0,05 мг/мл) в присутствии хрящевых комплексов гидробионтов (1 мг/мл): 1 — акула, 2 — скат, 3 — кальмар, 4 — лосось

Fig. 2. Residual activity of chymotrypsin (a) and trypsin (б) (chy-mopsin 0.05 mg/ml) in presence of cartilage complexes hydrobionts (1 mg/ml): 1 — shark, 2 — skate , 3 — squid, 4 — salmon

Исследование элементного состава (табл. 2), проведенное в лаборатории прикладной экологии и токсикологии, показало, что содержание тяжелых металлов в препаратах из хрящевой ткани данных видов гидробионтов не превышает пределы установленных норм. Следует отметить повышенное содержание кальция, магния, железа, цинка, калия. Соотношение кальция и магния должно составлять и составляет не менее 2: 1, что очень важно для лучшего усвоения обоих элементов.

Таблица 2

Средние концентрации макро- и микроэлементов в хрящевой ткани гидробионтов,

мкг/г сухого препарата

Table 2

Mean concentrations of macro- and microelements in cartilage tissue of hydrobionts,

mkg/g dry wt.

Гидробионт Fe Cu Pb Cr Mn Zn Cd Co Ni Ca K Mg

Акула 383 29 О,S S 3 93 2 О,3 4,7 1О83 5ООО 45О

Лосось 117 2 О б 2 22 О,4 О 2,7 21б7 25ОО 317

Кальмар SS 2О О б О 7О О,3 О 3,7 51бб 25ОО 15ОО

Ранее нами было установлено, что сублимированная хрящевая ткань и ферментативный гидролизат хрящевой ткани полярной акулы, а также отдельные его фракции проявляют ингибиторную активность. На данном этапе было решено исследовать ингибиторную специфичность препаратов из хрящевой ткани других видов гидробионтов. Влияние препаратов на активность протео-литических ферментов устанавливали по изменению амидазной, эстеразной,

коллагено- и казеинолитической активности при инкубации в присутствии препаратов из хрящевой ткани гидробионтов через определенные промежутки времени. Ранее установлено, что после обработки экзогенными ферментами активные компоненты хрящевой ткани полярной акулы не теряют активность, а в некоторых случаях даже превосходят эффект компонентов исходной ткани (Клычкова, Пивненко, 2001).

На гистограммах отображена остаточная активность ферментов в присутствии исследуемых препаратов. Полученные результаты показали, что ферментативные гидролизаты из хрящевой ткани кальмара, лосося ингибируют коллаге-нолитическую активность гепатопанкреатина и пилорина (рис. 1, а, б). Наибольшую антиколлагенолитическую активность проявил гидролизат из хрящевой ткани кальмара (91-96 %), акулы (90-100 %). Протеолитическая активность (рис. 1, б) гепатопанкреатина в присутствии препаратов из хрящевой ткани хрящевых рыб снижалась незначительно (на 15-20 %). Более эффективными в этом отношении оказались препараты из хрящеподобной ткани кальмара и лосося. Определение специфичности ингибиторного действия компонентов хрящевой ткани гидробионтов по трипсин- и химотрипсинспецифичным синтетическим субстратам (рис. 2) показало, что гидролизаты из хрящевой ткани кальмара, лосося обладают как антитрипсин-, так и антихимотрипсинспецифичным эффектом по отношению к протеазам краба, лосося и быка, в отличие от компонентов хрящевой ткани полярной акулы, не проявляющих активность на трипси-ноподобные ферменты быка. Определено, что компоненты хрящевой ткани кальмара и лосося обладают сходной антихимотрипсин- и антитрипсинспецифичной активностью.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о видовых особенностях компонентов хрящевой ткани, что отражается на проявлении ингибиторной специфичности препаратов. Исследование углеводного состава (гексозаминов и хондроитинсульфатов) хрящевой ткани гидробионтов позволяет рекомендовать ее как источник для получения пищевых и биологически активных добавок. В хрящевой ткани исследуемых видов гидробионтов после ферментативной деструкции установлено присутствие ингибиторов, обладающих антиколлагенолити-ческой и общей антипротеолитической активностью. Определено, что компоненты хрящевой ткани лосося, кальмара проявляют ингибиторную специфичность к химотрипсинам и трипсинам, следовательно, хрящевую ткань данных видов гид-робионтов можно рекомендовать в качестве сырья при получении препаратов.

Литература

Клычкова Г.Ю., Пивненко Т.Н. Ингибиторная активность хрящевой ткани акул и ее изменение под действием ферментативного гидролиза // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 74-81.

Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А. и др. Химия углеводов. — М.: Химия, 1967. — 560 с.

Крылова Н.Н., Лясковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. — М.: Пищ. пром-сть, 1965.

Машковский М.Д. Лекарственные средства. — Т. 2. — М., 1997.

Пат. № 2077328 РФ. Вещество для стимуляции пролиферации эндотелия роговицы человека / Федоров С.Н., Ронкина Т.И., Золоторевский А.В. и др. — Опубл. в БИ № 11, 1997.

Пат. № 2092156 РФ. Раствор для стимуляции репарации кожи "коллагель'' / Багров С.Н., Л арионов Е .В., Маклакова И.А., Панасюк А .Ф. — О публ. в Б И № 28, 1997.

Пат. № 2157695 РФ. Экстракты хрящей акулы, способ их получения и применения / Дюпон Э. (СА), Бразо П. (СА), Жюно К. (СА) и др. — Заявлено 30.10.1995; Опубл. 20.10.2000; Бюл. № 29.

Пат. № 2161002 РФ. Пищевой общеукрепляющий лечебно-профилактический продукт из хрящевой ткани акул и способ его получения / Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.М. и др. — Заявлено 30.07.1999; Опубл. 27.12.2000; Бюл. № 36.

Пат EP № 686397. Применение хондроитинсульфат-протеогликанов для защиты нейронов / Mueller H.W. — Опубл. в ИСМ № 9, 1998.

Пат. EP № 991413. Препарат, содержащий гидролизованный коллагеновый белок и гликозамин, для лечения артроза / Myers A.E. — Опубл. в ИСМ №7, 2001.

Пат. US № 5856446. Способ лечения ревматоидного артрита низкой дозой коллагена типа II / Weiner H.L., Hafler D.A., Trentham D.E. — Опубл. в ИСМ № 1, 2000.

Пат. US № 6025327. Порошкообразные препараты гидролизованного коллагена типа II и их применение / Alkayali A. — Опубл. в ИСМ № 4, 2001.

Пат. US № 6083933. Лечение циститоподобных симптомов с использованием хондроитинсульфата / Hahn S.S. — Опубл. в ИСМ № 13, 2001.

Пат. WO № 69444. Применение гликозаминогликанов с М. м. 2400 для лечения старческого слабоумия / Cornelli U., De Ambrosi L. et. al. — Опубл. в ИСМ № 22, 2001.

Пат. WO № 9605851. Применение безвкусного гидролизованного коллагена и содержащий его агент / Milan A., Eggergluess B., Braeumer K., Schrieber R. — Опубл. в ИСМ № 1, 1997.

Пат. WO № 96/23512 PCT/CA 95/00617. Les laboratoires aeterna INC [CA/ CA]; 456 Marconi Street, Pare Jean-Talon, Quebec, Quebec G144A8(CA).

Пивненко Т.Н. Субстратная специфичность панкреатических сериновых протеи-наз различного происхождения // Изв. ТИНРО. — 1997. — Т. 120. — С. 14-22.

Слуцкий Л.И. Современные представления о коллагеновых компонентах хрящевой ткани: обзор // Вопр. мед. химии. — 1985. — Т. 31. — С. 10-17.

Фармакопейная статья № 42-1286-99 "Хонсурид'' // Государственная фармакопея. 11-е издание. — Вып. 2. — 1999.

Шитов Г.Г. Новые подходы к созданию лекарственных средств с хондропротек-торными свойствами // Вестн. РАМН. — 1992. — № 5. — С. 26-30.

Alves M., Straus A.,Takahashi H., Michelacci J.M. Production and characterization of monoclonal-antibodies to shark cartilage proteoglycan // Brazillian jornal of medical and biological research. — 1994. — Vol. 27. — Р. 2103-2108.

Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. — 1961. — Vol. 95. — P. 271.

Kuettner K., Judith H., Eisenstein R., Harper E. Collagenese inhibition by cationic proteins derived from cartilage and aorta // Biochemical and biophysical research communications. — 1976. — Vol. 72, № 1. — Р. 40-46.

Lafont F., Rouget M., Treller A. et al. In vitro control of neuronal polarity by glycosaminoglycans // Development. — 1992. — Vol. 144, iss. 1. — P. 17-22.

Langer R., Brem H., Falterman K. et al. Isolation of a cartilage factor that inhibits tumor neovascularisation // Science. — 1976. — Vol. 193. — P. 70-71.

Lee A. and Langer R. Shark cartilage contains inhibitors of tumor angiogenesis // Science. — 1983. — Vol. 221. — Р. 1185-1187.

Murphy G. The N-terminal domain of tissue inhibitor of metalloproteinases retains metalloproteinase inhibitory activity // Biochemistry. — 1991. — Vol. 30. — P. 8097-8102.

Murphy G., Koklitis P. and Carne A.F. Dissociation of tissue inhibitor of metallo-proteinases (TIMP) from enzyme complexes yields fully active inhibitor // Biochem. J. — 1989. — Vol. 261. — P. 1031-1034.

Ruoslahti E. Proteoglycans in cell regulation // The Journal of biological chemistry. — 1989. — Vol. 264. — Р. 13369-13372.

Shwert G.W., Takenaka J. A spectrophotometric determination of tripsin and chymotrypsin // Biochem. Biophys. Acta. — 1955. — Vol. 16. — P. 570-575.

Tryggvason K., Hoyhtya M., Salo T. Proteolytic degradation of extracellular matrix in tumor invasion // Biochem. Biophys. Acta. — 1987. — Vol. 907. — P. 191-217.

Warshaw J. Protein up take by the intestine: evidence of intact macromolecules // Gastroenterology. — 1979. — Vol. 6. — Р. 987-992.

Woessner J. The family of matrix melalloproteinases // Ann. N.Y. Acad. Sci. — 1994. — № 732. — P. 11-21.

Поступила в редакцию 15.04.03 г.