СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ АУТОАНТИТЕЛА К МУСКАРИНОВОМУ М2-РЕЦЕПТОРУ
SYNTHETIC ANTIGEN HAVING ABILITY TO FIX AUTOANTIBODIES TO MUSCARINE M2-RECEPTOR

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к иммунологии, и служит для определения аутоантител, специфичных к мускариновому М2-рецептору, которое может быть использовано для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма.
Фатальные нарушения ритма и проводимости сердца являются одной из главных причин внезапной сердечной смерти в развитых странах ([1] - Zheng Z., Croft J., Giles W., MensahG. Sudden cardiac death in the United States, 1989 to 1998. Circulation 2001; 104: 2158-2163). Наиболее часто встречающейся формой нарушения ритма сердца является мерцательная аритмия (МА), которая обычно возникает как осложнение различных заболеваний сердечно-сосудистой системы. Однако в 10-30% случаев даже при тщательном клинико-инструментальном обследовании пациентов с аритмиями и блокадами сердца выявить причину подобных нарушений не удается, т.е. МА проявляется у пациентов без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы ([2] - Бекбосынова М.С. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М: ФГУ РКНПК, 2007). В этих случаях аритмию принято квалифицировать как «идиопатическую». В ряде исследований показана вероятность развития у таких пациентов вторичной, аритмогенно обусловленной, кардиомиопатии с ухудшением сократительной функции миокарда, которая восстанавливается при хирургическом или медикаментозном устранении аритмии ([3] - Ардашев А.В., Склярова Т.Ф., Шаваров А.А. Особенности центральной гемодинамики у пациентов с идиопатическими нарушениями ритма сердца из области выходного тракта правого желудочка до радиочастотной катетерной аблации и в течение года после нее. Кардиология 2009; 3: 4-9, [4] - Chugh S.S., Shen W - K., Luria D.M. First evidence of premature ventricular complex-induced cardiomyopathy: a potentially reversible cause of heart failure. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 2000; 11: 328-329). Есть клинические описания развития аритмогенной дисплазии правого желудочка через 15 лет от момента выявления у пациентов «идиопатической» желудочковой экстрасистолии ([5] - Kuhn А., Kottkamp Н., Thiele Н. Idiopathic right ventricular tachycardia or arrythmogenic right ventricular tachycardia? Dtsch. Med. Woch. 2000; 25 (22): 692-697). Эти и другие данные позволяют предположить, что «идиопатические» нарушения ритма могут быть первым, наиболее ранним проявлением заболеваний сердца.
1
В настоящее время установлено, что аутоантитела, обнаруженные в сыворотках крови больных с аритмиями и острой сердечной недостаточностью, являются антителами к собственным антигенам, целому ряду рецепторов, в частности к β-адренорецептору, белку мускаринового М2-рецептора и др., что свидетельствует об аутоиммунном характере данного спектра заболеваний ([6] - Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy.// Artificial Organs. - 2004.- V.28(2).-P.171-181). Большинство аутоантител является иммуноглобулинами класса G (IgG) с молекулярной массой около 150 кДа.
Опубликованые данные свидетельствуют о том, что у больных с постоянной формой «идиопатической» МА антитела к мускариновому М2-рецептору присутствуют в 3 раза чаще, чем у здоровых лиц ([7] - Chiale Р.А, et al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001;103(13):1765-71). Добавление сыворотки крови, содержащей антитела к мускариновому М2-рецептору к изолированным сердцам лабораторных животных и куриным эмбрионам, вызывало снижение частоты сердечных сокращений и индукцию суправентрикулярных аритмий ([8] - Baba A., Yoshikawa Т., Fukuda Y., Sugiyama Т. et al. Autoantibodies against M2-muscarinic acetylcholine receptors: new upstream targets in atrial fibrillation in patients with dilated cardiomyopathy.// Eur. Heart. J. 2004; 25: 1108-1115). Таким образом, есть основания полагать, что аутоиммунные механизмы, в частности, действие аутоантител к мускариновому М2-рецептору, могут способствовать возникновению и сохранению МА у пациентов без органического заболевания сердца.
В связи с вышесказанным, определение уровня антител к мускариновому М2-рецептору чрезвычайно важно для диагностики нарушений ритма и проводимости сердца у больных без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы.
Из уровня техники известны синтезированные пептиды из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, соответствующие линейным участкам 171-182 и 168-192 данного белка, которые были использованы для изучения активности антител к мускариновому М2-рецептору ([9] - Elies R. et al. Immunochemical and functional characterization of an agonist-like monoclonal antibody against the M2 acetylcholine receptor. //Eur. J. Biochem. l998; 251:659-666). Также использовался для наработки антипептидных антител и скриннинга сывороток больных с различными сердечно-сосудистыми патологиями пептид, соответствующий последовательности 169-193 второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора ([8], [10] - Fu L.X. et al. Localization of a Functional Autoimmune Epitope on the Muscarinic Acetylcholine Receptor-2 in Patients with Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. // J. Clin.Invest. 1993; 91:1964-1968).
Подробное исследование ИФА с использованием пептида, соответствующего последовательности 169-193 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, дано в статье [8]. Показано, что в ИФА с использованием данного пептида антитела к мускариновому М2-рецептору были обнаружены у 40% пациентов с дилатационной кардиомиопатией и 23% пациентов с идиопатическими нарушениями ритма.
Таким образом, наиболее близким к заявляемому синтетическому антигену является индивидуальный пептид, соответствующий последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора [8, 10].
Недостатком используемого пептида является его ограниченная специфичность, так как с данным пептидом могут реагировать только аутоантитела, направленные к соответствующей этому пептиду антигенной детерминанте 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора. В то же время у больных с идиопатическими патологиями сердца аутоантитела могут быть направлены как к 1-й, так и ко 2-й петлям, а также к комплексу двух петель, сближенных в природной молекуле мускаринового М2-рецептора ([11]. - Johren К., Holtje H.-D. A model of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor.// J. Comp. - Aided Mol.Design. 2002; 16:795-801). Таким образом, ограниченная антигенная специфичность последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, в свою очередь, объясняет заниженную чувствительность (количество положительных ответов) ИФА крови больных с использованием данного пептида. Кроме того, данный пептид характеризуется плохой растворимостью в водных буферных системах, обусловленной присутствием кластера гидрофобных аминокислотных остатков, что также может отрицательно сказываться на чувствительности к данному пептиду.
Задачей и техническим результатом изобретения является создание конформационного антигена, обладающего более высокой специфичностью к аутоантителам и лучшей растворимостью в водных буферных системах, а также способов диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма с использованием созданного антигена.
Изобретение поясняется диаграммой (фиг.1), на которой представлен уровень аутоантител у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы к антигенам мускаринового М2-рецептора.
96
176
Поставленная задача решается тем, что синтетический антиген, обладающий способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающий пептид, соответствующий аминокислотной последовательности из второй внеклеточной петли белка мускаринового М2-рецептора, согласно изобретению содержит пептид, соответствующий аминокислотной последовательности из первой внеклеточной петли белка мускаринового М2-рецептора, сшитый с пептидом второй внеклеточной петли дисульфидной связью. При этом линейная аминокислотная последовательность из первой петли белка содержит Cys, а линейная аминокислотная последовательность из второй петли белка содержит Cys. Наилучший результат достигается при использовании линейной аминокислотной последовательности из первой внеклеточной петли белка, содержащей фрагмент (83-98), и линейной аминокислотной последовательности из второй внеклеточной петли белка, содержащей фрагмент (171-182).
Поставленная задача решается также созданием способа получения синтетического антигена, обладающего способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающего синтез пептидов из первой и второй внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, и сшивку синтезированных пептидов посредством реакции тиол-дисульфидного обмена. При этом реакцию тиол-дисульфидного обмена осуществляют взаимодействием тиола пептида последовательности 83-98 и S-пиридинсульфенильного производного пептида последовательности 171-182 в водно-органической среде при рН 8-8.5.
Поставленная задача решается также созданием набора для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающий указанный синтетический антиген и сорбент для нанесения антигена.
Поставленная задача решается также разработкой способа диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающего исследование крови пациента с использованием указанного набора для диагностики методом ИФА.
96
176
Таким образом, поставленная задача решается за счет создания искусственного конформационного антигена, который включает в себя пептидные фрагменты из двух внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, сшитые дисульфидной связью, и который способен связывать аутоантитела к данному рецептору с чувствительностью, превышающей таковую для линейного прототипа или механической смеси данных линейных пептидных фрагментов. При этом синтетический антиген представляет собой индивидуальное химическое соединение, содержащее пептид, соответствующий последовательности 1-й внеклеточной петли и пептид из 2-й внеклеточной петли, соединенные дисульфидной связью между остатками Cys и Cys.
Заявляемый синтетический антиген может быть использован для создания диагностического набора для выявления антител к мускариновому М2-рецептору в крови пациентов с идиопатическими аритмиями методом ИФА, подробное описание которого представлено ниже. При этом в качестве сорбента может быть применен стандартный 96-луночный полистироловый планшет.
96
176
Заявляемое техническое решение характеризуется неочевидностью, т.к. в ряду пептидов и их аналогов не существует четкой взаимосвязи между структурой и активностью, поэтому способность заявляемого синтетического антигена связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору не является очевидной. В случае линейных эпитопов, в частности прототипа, антигенность можно предсказать, используя компьютерные программы для анализа аминокислотной последовательности белка ([12] - Норр N., Woods К. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 72. 72. P.3824-3828). Для поиска конформационных антигенных эпитопов используют сложную и дорогостоящую технологическую методологию, сопряженную с синтезом, выделением и тестированием десятков полипептидов ([13] - Евстигнеева Р.П., Палькеева М.Е. Методы поиска антигенных детерминант для белков с известной первичной структурой// Биоорг. химия. 2000, 26(4):243-262). Заявляемый конформационный антиген получают методологически значительно более простым способом. Он представляет собой искусственную конструкцию, не являющуюся линейным эпитопом, включающую в себя 2 фрагмента мускаринового М2-рецептора (например, 83-98 и 171-182), далеко отстоящие друг от друга и соединенные в одну молекулу с помощью направленного замыкания дисульфидного мостика между фрагментами 83-98 и 171-182 мускаринового М2-рецептора. Дисульфидная связь в заявляемом антигене образована между остатками цистеина 96 и 176. По данным наших исследований, любые пептиды из данных петель, содержащие остатки Cys и Cys, способны связывать антитела к мускариновому М2-рецептору, в той или иной степени воспроизводя свойства белка. Наиболее оптимальный результат был достигнут при выборе последовательности 83-98, соответствующей 1-й внеклеточной петле т.к., с одной стороны, данный фрагмент состоит из 16-ти аминокислотных остатков, и синтез его легко осуществим; а, с другой стороны, меньшая длина пептида сопряжена с его пониженной иммуногенностью. Выбор последовательности 171-182 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, близкой к прототипу, обусловлен тем, что этот фрагмент лишен того кластера гидрофобных аминокислотных остатков, который есть в пептиде-прототипе, что повышает растворимость антигена в водных буферных системах, применяемых в тестах. В пользу такой оптимальной конструкции искусственного антигена говорит тот факт, что синтезированный конформационный антиген оказался значительно лучше растворим в водных буферных системах, чем пептид-прототип, практически нерастворимый в воде, и чем пептиды - составные части искусственного антигена.
Синтез пептидов последовательности 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (гексадекапептид) и последовательности 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (додекапептид), может быть осуществлен по стандартной технологии синтеза на твердой фазе ([14] - Barany G., Merrifild R.B. Solid phase synthesis.// The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology. V 2. Special Methods in Peptide Synthesis. Part. A. // Ed. E. Gross, J. Meienhofer. - New York; Academic Press, 1980, P. 3-254) с использованием Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил) - методологии на полимере Ванга.
Ниже представлено подробное описание синтеза пептидов последовательности 83-98 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (гексадекапептид) и последовательности 171-182 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора. Для синтеза пептидов были использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIPEA (N-изопропил-N-этиламин), НОВТ (1-гидроксибензотриазол), TBTU (N, N, N', N'-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил) урония тетрафторборат), TIB S (триизобутилсилан) фирмы Fluka (Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, 4-метилпиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту (Applied Biosystems, США). DMF (N,N-диметилформамид) очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутияъную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильных функций серина, треонина и тирозина; тритильную (Trt) группу для карбоксамидной функции глутамина и сульфгидрильной функции цистеина. Аминокислотную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная с С-конца, с использованием в качестве конденсирующего реагента TBTU с добавкой 1-гидроксибензотриазола в присутствии DIPEA.
Синтез пептидов проводили с С-конца в соответствии с нижеприведенным протоколом твердофазного синтеза. Синтез проводили в ручном режиме, исходя из 0.6 ммоль Fmoc-аминоацилполимера (Bachem, Швейцария). Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, с размером частиц 200-400 меш фирмы Bachem (Швейцария). В Таблице 1 представлен Протокол твердофазного синтеза пептидов с описанием последовательности реализуемых стадий.
Таблица 1
Протокол твердофазного синтеза пептидов
№
Операция
Реагент
Время обработки
Цикл 1 - n
1
Промывка
5×DMF или 5×DMF/NMP (N-метилпирролидон) (1:1)
3 мин
2
Деблокирование α-аминогрупп
25% 4-Ме Pip/DMF или DMF/NMP (1:1)
10 мин
3
Промывка
5×DMF или 5×DMF/NMP (1:1)
3 мин
4
Активация
1 ммоль Fmoc-AA+1 ммоль TBTU+1 ммоль НОВТ+2 ммоль DIPEA в NMP/DMF
20 мин
5
Конденсация
1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP/DMF
90 мин
6
Промывка
5×NMP
3 мин
7
Тест Кайзера с нингидрином на наличие незамещенных аминогрупп
3% раствор нингидрина в бутаноле, 100°С
5 мин
8
При наличии в пептидилполимере свободных аминогрупп операции 4-6 повторяются
Отщепление и деблокирование пептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции. Линейные гексадекапептид и тридекапептид очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография) до 97-98% чистоты. Аналитическую ВЭЖХ проводили на проводили на хроматографах (Gilson, Франция) и Knauer (ФРГ). Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе Applied Biosystems (Германия), пептиды детектировали при 226 нм. Пептиды элюировали градиентом концентрации ацетонитрила в 0.1% TFA (трифторуксусная кислота). Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил и изопропиловый спирт фирмы Раnrеас (Испания).
Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонках Диасорб С16 (РФ) и Spherisorb ODS (США) (4,6×250 мм) с сорбентами С18 с размером пор порядка 100А - Nucleosil С18 и Kromasil 100-5 С18, на хроматографе фирмы Gilson (Франция). Для анализа синтетического антигена кроме этих сорбентов использовали Vydac С18 с размером пор 300А. В качестве элюентов использовали буфер А - 0,1% TFA, рН 2.0, буфер Б - 80% ацетонитрила или изопропанола в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А со скоростью потока 1 мл/мин.
1
1
Синтезированные пептиды характеризовали данными Н-ЯМР-спектроскопии (Н-ЯМР- спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d (d6 - дейтерированный диметилсульфоксид) при 300°К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл, химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана) и масс-спектрометрии (масс-спектры регистрировали на приборе VISION 2000, Termobioanalysis corp., Finnigan, США).
176
96
Синтез заявляемого синтетического антигена осуществляли с помощью реакции тиол-дисульфидного обмена между предшественниками - гексадекапептидом (83-98) и додекапептидом (171-182), взятыми в эквимолярном соотношении. При этом Cys додекапептида (171-182) защищали временной 2-пиридинсульфенильной (PyS) защитной группой ([15] - Andreu D., Albericio F., Sole N.A., Munson M.C., Ferrer M., Barany G. // Peptide Synthesis Protocol. Eds. M.W. Pennington, B.M. Dunn. New Jersey, Totowa: Humana Press Inc. 1994. P. 91-169; [16] - Сидорова M.В., Палькеева M.E., Молокоедов А.С, Азьмуко А.А., Секридова А.В., Овчинников М.В., Левашов П.А., Афанасьева О.И., Берестецкая Ю.В., Афанасьева М.И., Разова О.А., Беспалова Ж.Д., Покровский С.Н., Синтез и свойства нового конформационного антигена, моделирующего внеклеточную часть β1-адренорецептора // Биоорг. химия. 2009, 35 (3): 311-322), которая снимается при действии тиольной группы Cys гексадекапептида (83-98) с образованием дисульфида.
Реакция тиол-дисульфидного обмена, использованная для получения заявляемого синтетического антигена, ранее была предложена для замыкания внутримолекулярных дисульфидных связей в линейных пептидах в водных средах [15]. При синтезе заявляемого антигена данный способ был использован для сшивки разных пептидных фрагментов, удаленных друг от друга в белке, а также была проведена данная реакция в водно-органической среде при рН 8-8.5.
Сравнительный анализ биологической активности заявляемого синтетического антигена, пептида-прототипа последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, а также пептидов - предшественников I и II, являющихся составными частями заявляемого синтетического антигена, проводили в одинаковых условиях унифицированным непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА) ([17] - Principles and practice of immunoassay, Sec. edition, ed. Price C.P., Newman D.J., London, Macmillan Reference Ltd, 1997), используя клинически охарактеризованную панель сывороток пациентов. Методика и условия постановки ИФА были аналогичны описанным в литературе [8-10]. Антиген-пептид сорбировали на твердую фазу - полистироловый планшет для ИФА. Аутоантитела, содержащиеся в исследуемой сыворотке крови, после взаимодействия с антигеном на твердой фазе определяли с помощью моноклональных антител к иммуноглобулинам человека, ковалентно меченых ферментом-пероксидазой из хрена. Ферментативная активность, определяемая в колориметрической реакции пероксидазы с хромогеном, была прямо пропорциональна концентрации определяемых антител. Ниже, в Примере 4, представлено подробное описание иммуноферментного анализа связывания заявляемых пептидных синтетических антигенов с аутоантителами к мускариновому-М2 рецептору и полученных результатов сравнительного анализа биологической активности заявляемого синтетического антигена и пептида-прототипа.
Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1. Синтез додекапептида последовательности 83-98 из 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (предшественник I).
Твердофазный синтез H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (предшественник I) проводили, исходя из 1.0 г Fmoc-Leu-полимера, содержащего 0.75 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом.
2
Заключительное деблокирование и отщепление гексадекапептида (I) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего гексадекапептидилполимера смесью 20 мл TFA, 0.5 мл НO, 0.5 мл TIBS и 0.5 мл 2-меркаптоэтанола в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой холодный эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.65 г сырого продукта (I), содержащего, по данным ВЭЖХ, 54% целевого пептида.
+
87
127
17
22
1
Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Applied Biosystems (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.25 г (21% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (I). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%. Аминокислотный состав по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии: Туг 2, Thr 1, Не 1, Val 3, Gly 2, Pro 2, Leu 2, Asp 1, Trp 1, Cys 1. Масс-спектр: m/z: 1794.5 [M+H], вычислено 1795.7, для CHNOS.
121
176
182
Pys
Пример 2. Синтез додекапептида последовательности 171-182 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II).
t
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II) проводили, исходя из 1.0 г Fmос-Sеr(Вu)-полимера, содержащего 0.6 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом.
Заключительное деблокирование и отщепление додекапептида (II) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего гексадекапептидилполимера смесью 20 мл TFA, 0.5 мл Н2О, 0.5 мл TIBS в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой холодный эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.63 г сырого продукта (II), содержащего, по данным ВЭЖХ, 82% целевого пептида.
1
+
65
89
13
22
Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Applied Biosystems (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.22 г (24.9% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (II). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 95%. Аминокислотный состав по данным Н-ЯМР-спектроскопии: Val 1, Glu 2, Asp 1, Gly 1, Cys 1, Туr 1, He 1, Gin 1, Phe 2, Ser 1. Масс-спектр: m/z 1436.4, 1474.3 [M+K], вычислено 1436.6 для CHNOS.
PyS
Стадия 2. Получение додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II).
2
PyS
2
PyS
К раствору 0.02 г (0.016 ммоль) додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (II) в 8 мл смеси ацетонитрила и 0.1% водного раствора трифторуксусной кислоты (8:2) прибавляли раствор 10 мг (Pys) в 2 мл ацетонитрила и выдерживали 16 ч при 20°С. Исчезновение исходного пептида контролировали с помощью аналитической ВЭЖХ на колонке Kromasil 4.6×250 мм, размер зерна сорбента 5 мкм; подвижная фаза - буфер А: 0.1% TFA, буфер Б: 80% ацетонитрил в буфере А; пептиды элюировали градиентом Б в А от 30 до 90% за 30 мин со скоростью 1 мл/мин, детекция при 226 нм. Время удерживания (I) - 13.56 мин, время удерживания (II) - 14.21 мин). Реакционную смесь упаривали досуха, для удаления избытка (PyS) и пиридин-тиола (контроль ВЭЖХ), остаток несколько раз растирали с сухим эфиром, эфир декантировали. Полученный продукт хроматографировали на колонке с колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS, 10×250 мм, в условиях, описанных для стадии 1. Получено 0.015 г Н-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II) с чистотой 98%.
Пример 3. Синтетический антиген, включающий в себя гексадекапептид (83-98) и додекапептид (171-182) из последовательности мускаринового М2-рецептора, соединенные дисульфидной связью.
PyS
К раствору 0.015 г додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (II) 2.5 мл смеси 0.1 М ацетата аммония рН 6.8 и изопропилового спирта (4:1) прибавляли раствор 0.015 г гексадекапептида H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (I) в 4 мл смеси того же буфера и спирта (1:1), доводили рН до 8-8.5 раствором гидроокиси аммония и выдерживали при 20°С 5-8 ч. Для контроля происходящих превращений использовали тест на свободную SH-группу с реактивом Эллмана и аналитическую ВЭЖХ.
4
152
216
30
44
2
+
По окончании реакции рН реакционной смеси доводили до 4 уксусной кислотой, спирт упаривали, остаток хроматографировали на колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS, 10×250 мм, размер зерна сорбента - 10 мкм, подвижная фаза: буфер А - 0.1М NHOAc, рН 6.8, буфер Б - 40% водный изопропиловый спирт. Целевой продукт элюировали градиентом буфера Б в буфере А от 0 до 30% за 10 мин, далее от 30 до 90% за 60 мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, собирали, спирт упаривали, остаток лиофилизировали. Получено 0.01 мг (37.3%) синтетического антигена. Масс-спектр, m/z: 3228.5 [М+Н]. Вычислено 3228.8 для CHNOS.
Пример 4. Описание методики проведения иммуноферментного анализа пептидных антигенов.
Перед проведением анализа выдерживали компоненты набора при комнатной температуре (18-25°С) не менее 30 мин.
1. Для иммобилизации пептидных антигенов на планшетах для проведения ИФА пептид растворяли в концентрации 2 мМ в КББР (0,05 М Na-карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,6). Вносили в лунки планшетов по 100 мкл раствора пептида и инкубировали 16-20 часов при +20-25°С.
Для удаления несвязанных антигенов и блокирования неспецифических реакций лунки планшета промывали ФСБ-Т (0,01М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20) с БСА (бычьим сывороточным альбумином) в концентрации 5 г/л.
3. Вносили пипеткой во все лунки планшета по 80 мкл буферного раствора для разведения образцов.
4. Вносили пипеткой в соответствующие лунки по 20 мкл подготовленных образцов. Закрывали планшет крышкой и инкубировали его в термостате при температуре 37°С в течение 60±2 мин.
5. Промывали планшет раствором для отмывки с помощью устройства для отмывки планшета не менее 4-х раз.
6. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора коньюгата, индивидуально подобранного для каждого антигена.
7. Закрывали планшет крышкой и инкубировали его в термостате при температуре 37°С в течение 30±2 мин.
8. Промывали планшет раствором для отмывки с помощью устройства для отмывки планшета не менее 4-х раз.
9. Вносили в лунки по 100 мкл свежеприготовленной субстратной смеси. Субстратная смесь готовилась непосредственно перед внесением в лунки. К 7 объемам субстратного буферного раствора добавляли 1 объем раствора ТМБ (тетраметилбензидина), тщательно перемешивали полученную смесь. Данный раствор хранили при комнатной температуре не более 5 мин.
10. Закрывали планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 20±1 мин.
11. Вносили в лунки по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности и тем же методом, каким вносили субстратную смесь.
12. В течение 5 мин после добавления стоп-реагента просчитывали планшет на фотометре для ИФА при длине волны 450 нм.
крит
Положительными образцами считались образцы, оптическая плотность (ОП.) которых была равна или более суммы среднего значения оптической плотности плюс удвоенное значение стандартного отклонения по выборке с исключенными значениями, выходящими за рамки нормального распределения:
крит
cред
ОП=ОП+2×станд. откл
450
крит
Уровень аутоантител представлен в результатах как отношение оптической плотности (ОП) А иммуноферментной реакции исследуемого образца к ОП.
Далее представлено описание способа выявления аутоантител к мускариновому рецептору.
Для доказательства способности синтетического антигена, не являющегося линейным эпитопом, как описанный прототип, связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору было проведено определение уровня аутоантител IgG и IgM классов на большой панели больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Результаты чувствительности ИФА для определения аутоантител представлены в таблице 2.
Таблица 2
Уровень аутоантител к антигенам мускаринового М2-рецептора у пациентов с органическими заболеваниями сердца
Антиген
Аутоантитела IgG класса
Аутоантитела IgM класса
Количество образцов
% позитивных результатов
Количество образцов
% позитивных результатов
Пептид последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (прототип)
611
6,5
578
10,0
Синтетический антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью
150
9,0*
150
16,8*
Представленные результаты показывают, что чувствительность ИФА с использованием в качестве антигена синтетического пептида, включающего в себя предшественники I и II, сшитые дисульфидной связью, достоверно выше (вероятность F-тест *р<0,05), чем в случае использования линейного пептида с последовательностью 168-192 (прототипа). Это различие показано как для аутоантител IgG класса, так и для аутоантител IgM класса.
Литературные данные [8-10] свидетельствуют о возможности применения пептидов, соответствующих последовательностям 168-192 (прототип) и 169-193 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора для диагностики повышения уровня аутоантител к мускариновому М2-рецептору у больных кардиомиопатией, патологией с выраженными органическими поражениями. Об этом же свидетельствуют результаты собственных исследований авторов, приведенные в таблице 2. Однако важно было сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом последовательности 168-192 (прототипом) для определения уровня антител IgG-класса к мускариновому М2-рецептору у больных с аритмиями без признаков органического заболевания сердца. Сравнительный анализ биологической активности прототипа и заявляемого синтетического антигена проводили в унифицированных условиях. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Аутоантитела у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы.
Антиген
Аутоантитела IgG класса
Количество образцов
%позитивных результатов
Пептид последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (прототип)
91
18,7
Синтетический антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью
126
25,4*
Как видно из приведенных результатов, заявляемый синтетический антиген, включающий в себя пептиды-предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью, позволяет обнаружить достоверно (вероятность F-тест *р<0,05) большее число пациентов с повышенным уровнем аутоантител по сравнению с пептидом последовательности 168-192 из 2-й петли мускаринового М2-рецептора (прототипом).
При этом заявляемый антиген более специфичен при определении аутоантител к фрагментам мускаринового М2-рецептора у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердца, чем у больных с установленными сердечно-сосудистыми заболеваниями, поскольку позволяет с большой долей достоверности (вероятность F-тест р<0,001) определять большее число пациентов с повышенным уровнем аутоантител - 25,4% против 9% (таблица 2).
Прямым подтверждением влияния структурных особенностей заявляемого антигена на способность к связыванию аутоантител является следующий модельный эксперимент. В описанном ИФА методе на планшет сорбировали: 1) пептид-предшественник I, 2) пептид-предшественник II 3) механическую смесь пептидов-предшественников I и II, 4) заявляемый антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью. Для сорбции антигены брали в концентрации 2 мМ, в механической смеси пептидов I и II брали по 1 мМ каждого пептида. Уровень IgG аутоантител определяли у 16 больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Результаты эксперимента представлены на диаграмме (фиг.1). На диаграмме представлены следующие обозначения: 1 - предшественник I, 2 - предшественник II, 3 - механическая смесь предшественников I и II, 4 - заявляемый антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью, р* - вероятность сходства с заявляемым пептидом по F-тесту.
Таким образом, модельный эксперимент наглядно подтверждает, что заявляемый антиген обладает принципиально иными функциональными свойствами, нежели механическая смесь его составных структур, что подтверждает предположение о том, что антитела более специфичны к конформационным эпитопам, образованным линейными эпитопами, сближенными в молекуле белка благодаря дисульфидной связи. Кроме того, лучшая по сравнению с прототипом растворимость заявляемого синтетического антигена позволяет использовать его для создания более точных диагностических наборов для обнаружения аутоантител к мускариновому М2-рецептору в крови больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Заявляемый синтетический антиген может быть использован для ранней диагностики сердечно-сосудистых заболеваний.