Способ диагностики преэклампсии по аминокислотному профилю плазмы крови
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR PREECLAMPSIA BY AMINO ACID PROFILE OF BLOOD PLASMA

Изобретение относится к области медицины, а именно - к акушерству, к способу диагностики преэклампсии с помощью анализа содержания аминокислот в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии. Может быть использовано для оценки возможности развития преэклампсии в ходе лабораторного анализа плазмы крови в качестве дополнения/замены симптоматической диагностики.
На сегодняшний день установлено, что преэклампсия (ПЭ) является достаточно распространенным осложнением беременности - наблюдается у 5-7% беременных во всем мире [1]. ПЭ оказывает неблагоприятные долгосрочные эффекты на здоровье матери, а также увеличивает риск заболеваний ребенка во взрослом возрасте. Несмотря на то, что уже изучены многочисленные патофизиологические механизмы развития ПЭ, нет точного способа ее диагностики. Вместе с тем выявление беременных на раннем сроке развития преэклампсии является приоритетным направлением для разработки комплекса профилактических мер.
Имеются данные о ряде факторов, предрасполагающих развитию ПЭ, однако этиология этой мультисистемной патологии остается по большей части неизвестной, поэтому ПЭ считают болезнью теорий. Развитие ранней, до 34 недели, ПЭ, вероятно, представляет собой двухстадийный процесс [2-5]. Первая стадия протекает бессимптомно. Она начинается после имплантации и связана с нарушениями в процессе плацентации [3-6]. Вторая стадия, при которой возникает клиническое проявление заболевания, обычно начинается после 20-ой недели гестации и является следствием секреции плацентарных факторов вследствие оксидативного стресса и/или гипоксии в материнский кровоток, что обусловливает системный воспалительный ответ. Эти факторы воспаления приводят к эндотелиальной дисфункции, которая проявляется в повреждении различных органов матери и проявляется такими симптомами, как артериальная гипертензия, протеинурия, в тяжелых случаях - эпигастральные боли, нарушение зрения, головная боль, одышка и судороги [7].Возможно, патофизиология включает и факторы плаценты или плода, и материнские: аномальная плацентация, системная эндотелиальная дисфункция или клеточная активация и дисбаланса между про- и антиангиогенными белками с преобладанием последних [8].
С учетом общего числа систем организма, затрагиваемых развитием гипертензивных осложнений беременности и, в частности, преэклампсии, молекулярная диагностика представляется наиболее информативным и надежным методом, так как симптоматика настолько разнообразна и неоднозначна, что постановка диагноза превращается в сложную задачу. Одним из самых перспективных подходов для развития более точных методов дифференциации этих состояний на сегодняшний день является метаболомный анализ, осуществляемый методами масс-спектрометрии.
Метаболомный подход включает комбинированное использование хроматографических, спектрометрических, спектроскопических методов анализа образцов совместно со статистической и биоинформатической обработкой экспериментальных данных. Анализ и интерпретация данных предполагают методы создания мультипараметрических классификационных моделей для проверки прогностической способности определенных биомаркеров [9]. Несколько проведенных исследований метаболомного профилирования свидетельствуют о большом потенциале этого подхода для понимания ПЭ и разработки пренатальной идентификации биомаркеров [10-14]. К сожалению, на сегодняшний день отсутствуют адекватные способы диагностики ПЭ, поэтому очевидна необходимость разработки неинвазивных и объективных методов пренатальной диагностики и мониторинга.
В качестве прототипа предлагаемого метода взят способ, описанный в [14], согласно которому методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (в положительной и отрицательной моде) был проведен полуколичественный анализ низкомолекулярного состава сыворотки крови 20 пациенток с ПЭ и 20 пациенток контрольной группы, и на его основании идентифицированы 8 потенциальных маркеров преэклампсии (включая мочевую кислоту, 2-оксоглутарат, глутамат и аланин). Для каждого из данных маркеров проведен ROC-анализ. Относительным недостатком данного метода является применение полуколичественного подхода, а не таргетного количественного метода с меченными внутренними стандартами для каждого вещества, имеющего значительно более высокую точность. Кроме того, комбинация нескольких биомаркеров в классификаторе позволила бы добиться стабильности диагностики, в отличие от использования единственного биомаркера, обладающего высокой вариативностью.
Задачей, решаемой изобретением, является способ ранней диагностики преэклампсии по содержанию аминокислот в плазме крови, отличающийся тем, что методом хромато-масс-спектрометрии количественно определяют концентрацию 3 аминокислот (карнозин, аргинин и этаноламин) в плазме крови; вычисляют значение оценочного параметра (Y) по формуле (1), при значении Y≥-0,59 делают вывод о развитии преэклампсии, при Y<-0,59 делают вывод, что беременность протекает в рамках индивидуальной физиологической нормы.
Поставленная задача решается предлагаемым способом, состоящим в подготовке образцов плазмы крови к исследованию осаждением белков; анализе приготовленных образцов с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в режиме положительных ионов с регистрацией транзитных переходов, соответствующих исследуемым аминокислотам (карнозин, аргинин и этаноламин); расчете концентраций аминокислот по отношению площадей их хроматографических пиков к площадям пиков внутренних стандартов; расчете оценочного параметра (Y) по формуле (1):
1
2
3
где x - концентрация этаноламина в плазме крови, x - аргинина, х - карнозина.
На Фиг. 1 показана схема предлагаемого способа: получение хроматограмм аминокислот приготовленных образцов плазмы крови для последующего статистического анализа.
На Фиг. 2 приведены примеры хроматограмм ионного тока транзитных переходов аминокислот, зарегистрированных в режиме положительных ионов.
На Фиг. 3 приведена бокс-диаграмма десятичного логарифма концентрации 22 аминокислот плазмы крови в группах нормы и преэклампсии. Границами бокса служат первый и третий квартили, линия в середине бокса - медиана; концы усов - разность первого квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния, сумма третьего квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния. * - p-value ≤0,05; ** - р-value ≤0,01; *** - p-value ≤0,001.
На Фиг. 4 приведены результаты анализа ROC-кривой уровня аминокислоты карнозин в плазме крови для дифференциации группы пациенток с ПЭ и контрольной группы.
На Фиг. 5 приведены результаты анализа ROC-кривой расчетного оценочного параметра (Y) для дифференциации группы пациенток с ПЭ и контрольной группы.
Способ был реализован на масс-спектрометре с тройным квадрупольным масс-анализатором 6470ATripleQuadrupole (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) с источником ионов с ионизацией электрораспылением ESI, Agilent JetStream (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) и жидкостном хроматографе Agilent 1290 Infinity II (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США). Подготовка образцов плазмы следующая: к 50 мкл плазмы добавляли 50 мкл раствора смеси внутренних стандартов, перемешивали в течение 5 секунд, добавляли 700 мкл метанола, перемешивали повторно 15 сек, центрифугировали 3 минуты при 3000G, после чего переносили надосадочную жидкость в хроматографическую виалу для последующего анализа. Для стабильного электрораспыления образцов необходимо установить оптимальные параметры, которые зависят от модели прибора, скорости входящего в источник потока и типа анализируемого соединения. В случае масс-спектрометра 6470А TripleQuadrupole и исследуемого набора аминокислот использовались параметры, приведенные в Таблице 1. В Таблице 2 приведены условия хроматографического разделения образцов.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R в RStudio. Статистическую значимость отличия концентраций исследуемых метаболитов между группами оценивали по значению p-value теста Манна-Уитни. При величине p-value ≤ 0,05 отличие принимали за статистически значимое, при p-value ≤ 0,01 - за очень значимое, при p-value ≤ 0,001 - за максимально значимое.
Возможность реализации заявляемого метода с получением заявленного технического результата иллюстрируют нижеследующие примеры анализа плазмы крови для демонстрации воспроизводимости метода, выявления аминокислот, дифференцирующих пациенток с ПЭ и возможности классификации пациенток с ПЭ.
В качестве ПРИМЕРА 1, демонстрирующего воспроизводимость метода были проанализированы 50 образцов плазмы крови. На Фиг. 2 приведены характерные хроматограммы транзитных переходов положительных ионов аминокислот. Обнаруживаются воспроизводимые концентрации аминокислот.
Относительное стандартное отклонение концентраций составляет менее 7% для одного образца плазмы.
В качестве ПРИМЕРА 2, демонстрирующего возможности работы метода для выявления аминокислот со статистически значимо отличающимися концентрациями между группой нормы и ПЭ приведена бокс-диаграмма десятичного логарифма концентраций аминокислот в группах нормы и преэклампсии(Фиг. 3). Данные результаты получены в рамках проспективного исследования «случай-контроль». Объект исследования: группа 1 (основная) - 13 беременных женщин с ПЭ, диагностированной на основе клинического обследования и результатов функциональных методов исследования, группа 2 (сравнение) - 21 беременная женщина без ПЭ по данным клинического обследования, результатам функциональных методов исследования и данным, полученным после рождения. Группы были сопоставимы по исходной клинической характеристике. Отбор пациенток проводился по обращаемости. Диагностика ПЭ основывалась на Международной статистической классификации болезней (МКБ) и соответствовала критериям, разработанным Европейским обществом по изучению артериальной гипертензии (АГ) - существовавшая ранее АГ; гестационная АГ; преэклампсия; существовавшая ранее АГ с гестационной гипертензией и протеинурией; неподдающаяся классификации АГ. ПЭ - гипертензия (давление > 140/90 мм рт. ст.) и протеинурия (содержание белка выше 0,3 г в суточной моче). Степень тяжести ПЭ оценивали на основании объективных показателей и клинического состояния пациентки.
Критерии включения беременных в группы исследования: 1. Срок беременности 22-40 недель. 2. Возраст беременных от 18 до 45 лет. 3. Одноплодная беременность. 4. Информированное согласие на участие в исследовании.
Критерии исключения: 1. Тяжелая экстрагенитальная патология. 2. Многоплодная беременность. 3. Использование донорской яйцеклетки. 4. Пороки развития плода. 5. Генетические заболевания матери. 6. Острые инфекционные заболевания матери. 7. Миома матки больших размеров.
Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить 22 аминокислоты, концентрации которых статистически значимо отличались при преэклампсии (Таблица 3, Фиг. 3): 3-метилгистидин, аланин, ансерин, аргинин, аспартат, карнозин, цистин, этаноламин, глутамат, глутамин, глицин, гистидин, гомоцитруллин, лизин, метионин, норвалин, О-фосфорилэтаноламин, орнитин, фенилаланин, серии, треонин, тирозин.
В качестве ПРИМЕРА 3 для демонстрации возможности предлагаемого метода был проведен анализ ROC-кривых, который показал, что карнозин, аргинин и этаноламин являются потенциально чувствительными и специфическими биомаркерами для диагностики и прогнозирования преэклампсии (для карнозина AUC=0,85 (95% ДИ 0,72-0,97), чувствительностью 62%, специфичностью 97%; аргинина с AUC=0,79 (95% ДИ 0,65-0,93), чувствительностью 77%, специфичностью 82%; и этаноламина с AUC=0,77 (95% ДИ 0,61-0,93), чувствительностью 85%, специфичностью 68%) (Фиг. 4).
В качестве ПРИМЕРА 4 для демонстрации диагностического потенциала изобретения был проведен регрессионный анализ для трех аминокислот плазмы крови высоким диагностическим потенциалом (карнозин, аргинин и этаноламин), получена формула (1)для расчета оценочного параметра Y. Последующий ROC-анализ для оценочного параметра Y, подтвердил более высокую диагностическую ценность комплексного параметра (Y), включающего уровни трех аминокислот, в сравнении с каждой из них в отдельности: площадь под ROC-кривой составила AUC=0,86 (95% ДИ 0,70-0,97), с чувствительностью 69% и специфичностью 89% при пороговом значении Y равном -0.59 (Фиг. 5).
Список литературы
1. Сидорова И.С., Никитина Н.А., Унанян А.Л. Преэклампсия и снижение материнской смертности в России. Акушерствоигинекология. 2018; 1: 107-12 [Sidorova I.S., Nikitina N.A., Unanyan A.L. Preeclampsia and lower maternal mortality in Russia.AkusherstvoiGinekologiya/Obstetrics and Gynecology. 2018; (1): 107-12. (in Russian)]
2. Л.В. Адамян, H.B. Артымук, H.B. Башмакова, Т.Е. Белокринницкая, С.Р. Беломестное, И.В. Братищев, Ю.Д. Вученович, В.И. Краснопольский, А.В. Куликов, А.Л. Левит, Н.А. Никитина, В.А. Петрухин, А.В. Пырегов, В.Н. Серов, И.С. Сидорова, О.С. Филиппов, З.С. Ходжаева, and A.M. Холин. (2016) Министерство здравоохранения Российской Федерации. Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия. Клинические рекомендации (Протокол лечения).
3. James М Roberts and Hilary S Gammill. Preeclampsia: recentinsights. Hypertension, 46(6): 1243-1249, 2005.
4. Ходжаева З.С, Холин A.M., Вихляева E.M. Ранняя и поздняя преэклампсия: парадигмы патобиологии и клиническая практика. Акуш и гин, 2013, №10 С. 4-11
5. Ходжаева З.С, Акатьева А.С, Холин A.M., Сафонова А.Д., Вавина О.В., Муминова К.Т. Молекулярные детерминанты развития ранней и поздней преэклампсии. Акуш и гинекол. 2014, №6, с. 14-19
6. Khodzhaeva ZS, Kogan ЕА, Shmakov RG, Klimenchenko NI, Akatyeva AS, Vavina OV, Kholin AM, Muminova KT, Sukhikh GT. Clinical and pathogenetic features of early and late onset preeclampsia. J Matern Fetal Neonatal Med. 2015 Nov 2:1-23
7. Lucilla Poston. Endothelial dysfunction in pre-eclampsia. PharmacolRep, 58(Suppl):69-74, 2006.
8. Christopher W Redman and Ian L Sargent. Latest advances in understanding preeclampsia. Science, 308(5728): 1592-1594, 2005.
9. Madsen R., Lundstedt Т., Trygg J. Chemometrics in metabolomics-A review in human disease diagnosis. AnalChimAct2010; 659: 23-33.doi: 10.1016/j.aca.2009.11.042.
10. Fanos V., Antonucci R., Barberini L., Atzori L. Urinary metabolomics in the newborn and infants. AdvClinChem2012; 58: 193-223.
11. Fanos V., Antonucci R., Barberini L., Noto A., Atzori L. Clinical application of metabolism in neonatology. J MaternFetalNeonatalMed2012; 1: 104-109.
12. Fanos V., Van den Anker J., Noto A., Mussap M, Atzori L. Metabolomics in neonatology: fact or fiction? SeminFetalNeonatalMed2013; 18: 3-12.doi: 10.1016/j.siny.2012.10.014.
13. Benton S.J., Ly C, Vukovic S., Bainbridge S.A.  award lecture: Metabolomics as an important modality to better understand preeclampsia. Placenta. 2017 Dec;60 Suppll:S32-S40. doi: 10.1016/j.placenta.2016.11.006.
14. Kenny LC, Broadhurst D, Brown M, Dunn WB, Redman CW, Kell DB, Baker PN Detection and Identification of Novel Metabolomic Biomarkers in Preeclampsia ReprodSci// Volume: 15 issue: 6, page(s): 591-597.
Фиг.1. Схема определения концентраций аминокислот в плазме крови для последующего статистического анализа.
Фиг. 2. Примеры хроматограмм транзитных переходов положительных ионов аминокислот образцов плазмы крови.
Фиг. 3. Бокс-диаграмма десятичного логарифма концентрации аминокислот в группах нормы и преэклампсии. Границами бокса служат первый и третий квартили, линия в середине бокса - медиана; концы усов - разность первого квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния, сумма третьего квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния. * - p-value <0,05; ** - p-value <0,01; *** - p-value <0,001.
Фиг. 4. Анализ ROC-кривой уровня аминокислоты карнозина в плазме крови для дифференциации группы пациенток с ПЭ и контрольной группы.
Фиг. 5. Анализ ROC-кривой расчетного оценочного параметра (Y) для дифференциации группы пациенток с ПЭ и контрольной группы.