ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА
INHIBITOR OF REPRODUCTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1

Изобретение относится к ингибиторам репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа растительного происхождения и может быть использовано в медицине, вирусологии и фармакологии.
Единственным на сегодняшний день средством, препятствующим развитию ВИЧ-инфекции, прогрессированию заболевания, является антиретровирусная комбинированная терапия (АРВТ).
АРВТ направлена на подавление репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), т.е. является этиотропной терапией ВИЧ-инфекции.
До настоящего времени ВИЧ-инфекция остается неизлечимым заболеванием и добиться полной элиминации вируса из организма с помощью современных методов лечения не удается. Однако с помощью АРВ препаратов можно блокировать размножение ВИЧ и снизить содержание вируса в крови (вплоть до неопределяемого уровня). Это приводит к восстановлению субпопуляции CD4-лимфоцитов (полному или частичному), что позволяет предотвратить развитие, облегчает течение или способствует исчезновению оппортунистических заболеваний. В результате улучшается качество и увеличивается продолжительность жизни больных ВИЧ-инфекцией. Кроме того, назначение АРВ препаратов ВИЧ-позитивным беременным позволяет значительно снизить вероятность вертикальной передачи инфекции.
Несмотря на большое количество разработанных в настоящее время анти-ВИЧ препаратов, существует проблема эффективности применяемой противовирусной терапии.
Основные причины, препятствующие решению этой проблемы - это токсичность эффективных препаратов, объясняющаяся тем, что вирус в процессе своего развития использует внутриклеточные системы (Inouye M. et al. Annu. Rev. Micribiol. 1991. V.45. Р.163-186), высокая стоимость применяемых лекарственных средств и свойство ВИЧ-1 вырабатывать устойчивость к противовирусным препаратам.
Поэтому крайне актуальной остается проблема разработки эффективных и недорогих противовирусных средств, не обладающих токсическим действием на организм человека.
Известны природные соединения, оказывающие ингибирующее действие на вирус иммунодефицита человека.
Известны данные о подавлении ВИЧ-1 экстрактом гриба Trametes versicolor (Collins R.A. and Ng T.B. (1997). Polysaccaropeptide from Trametes versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type 1 infection. Life Scince, 60(25), P. 383-387).
Некоторые тритерпены гриба Ganoderma lucidum проявляют активность против вируса иммунодефицита в клеточной культуре МТ-4 (EI-Mekkawy S., Meselhy M.R., Nakamura N., Tezuki Y., Hatori M., Kakiuchi et al.(1998) Anti-HIV-1 and anti-HIV-protease substances from Ganoderma lucidum. Phytochemistry, 49, P.1651-1657).
Из вешенки устричной Pleurotus ostreatus выделен убиквитинподобный гликопротеин, который ингибировал развитие вируса иммунодефицита человека (Wang H.X. and Ng T.B. (2000). Isolation of a novel ubiquitin-like protein from Pleurotus ostrestus mushroom with anti-human immunodeficiency virus, translation-inhibitory and ribonuclease activities. Biochem Biopnys Res Commun, 256, 587-593).
Аналогичные результаты получены с экстрактами гриба Grifola frondosa (Nanba H., Kodama N., Schar D. and Turner D. 2000. Effect of Maitake (Grifola frondosa) glucan in HIV-infection patients. Mycoscience, 41, 293-295).
В американских заявках на изобретения (№20050238655, МПК А61К 35/84, опубл. 27.10.2005 г. и №20050276815, МПК А61К 35/84, опубл. 15.12.2005 г.) приводится описание активности композиции из трех видов грибов Fomitopsis officinales, Piptoporus betulinus, Ganoderma resinaceum против вирусов оспы и иммунодефицита человека.
В патенте РФ №2246500, МПК C07J 63/00, опубл. 20.02.2005 г.описывается способ получения из бетулина бетулиновой кислоты, которая может быть использована при получении антиопухолевых и анти-ВИЧ лекарственных препаратов. В описании к изобретению не приведены данные об антивирусной активности препарата.
Известно применение экстракта березового гриба Inonotus obliquus, получившего название чага, в качестве противоракового средства и способного повышать иммунитет при иммунодефицитных состояниях организма не вирусного происхождения (Заявка на изобретение Кореи №20040042119, МПК А 61 K 35/78, опубл. 20.05.2004 г.). Однако исследования на анти-ВИЧ активность данного экстракта не проводились.
Известно применение экстракта мицелиальной культуры клеток гриба Fuscoporia oblique (Fr.) Aoshima (японская чага), выращенных на искусственной жидкой питательной среде, в качестве активного ингредиента, ингибирующего вирус иммунодефицита человека (Заявка США №20040105859, МПК А61 K 35/78, опубл. 03.06.2004 г.).
Однако данный экстракт обладает только профилактическим эффектом (экстракт добавляют к клеткам МТ-4 и инкубируют до адсорбции вируса на клетках) и имеет низкий терапевтический эффект (слабо действует на вирус при его проникновении в клетки МТ-4).
Одним из наиболее близких аналогов (прототипом) является применение экстракта черной наружной части нароста гриба Fuscoporia oblique (Fr.) Aoshima в качестве активного ингредиента, ингибирующего вирус иммунодефицита человека (Заявка Японии №9191891, МПК А61К 35/84, С12Р 1/02, опубл. 29.07.1997 г.). Указанный гриб растет на древесине японской березы двух видов Betula platyphyla Sukatchev var. japonica и Betula ermanii.
Однако запасы гриба Fuscoporia oblique в Японии очень ограничены и не имеют перспективы использования в качестве сырья для получения лечебно-профилактического средства против ВИЧ-инфекции даже в этой стране. Данный гриб не встречается на территории Российской Федерации, что затрудняет его использование в качестве лечебного противовирусного средства в РФ и других странах.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение спектра источников сырья на основе грибов базидиомицетов, обладающих ингибирующим действием в отношении вируса иммунодефицита человека первого типа.
Указанный технический результат достигается за счет обнаружения новых свойств гриба Inonotus obliquus, заключающихся в ингибировании репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа, т.е. объектом изобретения является применение базидиального гриба Inonotus obliquus(Pers.)Pil. в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа.
Ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа содержит природные биологически активные вещества из базидиального гриба Inonotus obliquus, растворимые в воде, или спирте (содержание спирта 70% и более), или водно-спиртовых растворах.
Причем содержание в ингибиторе репродукции вируса иммунодефицита человека природных биологически активных веществ из базидиального гриба Inonotus obliquus составляет в концентрации не менее 156 нг/мл.
В предлагаемом изобретении водные, спиртовые и водно-спиртовые экстракты гриба Inonotus obliquus исследовались и отбирались с использованием вирусной модели - культуры клеток перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4, инфицированной различными штаммами ВИЧ-1, в частности штаммами, репродуцирующимися по типу острой и хронической инфекции. Такой подход позволяет проводить исследования, приближенные к реальным процессам развития ВИЧ-инфекции в организме. Применение лабораторных штаммов ВИЧ-1 дает возможность оценивать влияние препаратов на естественный пул вирусной популяции, заведомо обладающий генетическим разнообразием. Это также допускает проведение более объективной оценки противовирусной эффективности препаратов.
Терапевтическим результатом считалось полное подавление вируса иммунодефицита человека 1-го типа в перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4, как при одновременном внесении с вирусом в культуру клеток, так и после адсорбции вируса (профилактическое и терапевтическое действие препарата).
Это предполагает использование в дальнейшем препаратов на основе природных соединений гриба Inonotus obliguus для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов после соответствующих клинических испытаний.
Анализ уровня техники
В описании к заявке США №20040105869 отмечено (по тексту заявки пункт [0012]), что активность против ВИЧ-инфекции экстрактов из клеток гриба Fuscoporia oblique (Fr.) Aoshima, полученных как из природного сырья (заявка Японии №9191891), так и выращенных на искусственных питательных средах (заявка США №20040105869) практически одинакова. Однако предпочтительно использовать искусственно выращенные клетки гриба Fuscoporia oblique (Fr.) Aoshima, т.к. природного сырья в Японии недостаточно.
По сравнению с аналогом (Заявка США №20040105869) и прототипом (Заявка Японии №9191891) для препарата, полученного из гриба Inonotus obliquus, показано, что 50% и 100% эффект подавления репродукции ВИЧ-1 на культуре клеток человека достигается при более низких концентрациях препарата. Так, 50% подавление ВИЧ-1 при использовании наиболее эффективных препаратов, полученных в указанном аналоге, достигается при использовании более чем 35000 нг/мл препарата. Для препарата из гриба Inonotus obliquus, заявленного авторами, 50% подавление ВИЧ-1 достигается при концентрации препарата, меньшей 156 нг/мл. 100% подавление ВИЧ-1 достигается при добавлении 312 нг/мл препарата гриба Inonotus obliquus, тогда как для достижения аналогичного ингибирующего эффекта препарата на основе культур клеток гриба Fuscoporia oblique необходима концентрация 218750-875000 нг/мл.
В отличие от аналога (Заявка США №20040105869) и прототипа (заявка Японии №9191891), в настоящем заявляемом изобретении показан не только профилактический (добавление препарата к клеткам и инкубация до адсорбции вируса на клетках), но и значительный терапевтический эффект препарата чаги. Авторами настоящей заявки на изобретение продемонстрировано, что даже при внесении 312 нг/мл препарата гриба Inonotus obliquus в культуру клеток после адсорбции вируса достигается 100% ингибирование ВИЧ-1.
Гриб Inonotus obliquus развивается в виде темных наростов на стволах живых берез и некоторых других пород деревьев, издавна применяется в народной медицине (чага с берез) для лечения желудочно-кишечных заболеваний и при раке различной локализации.
В целом, природные вещества чаги (гриба Inonotus obliquus} имеют очень широкий спектр различных соединений, которые формируются при тесном взаимодействии березы и гриба (Чага и ее лечебное применение / Под ред. проф. П.К.Булатова, проф. М.П.Березиной, проф. П.А.Якимова / Медгиз, Ленинградское отделение, 1959). В Сибири и в целом в РФ этот гриб развивается на березе бородавчатой и березе белой (Betula pendula Roth и Betula alba L.), имеет широкий ареал распространения.
После разносторонних клинических и химических исследований гриб Inonotus obliquus разрешен Фармакологическим комитетом Министерства Здравоохранения СССР к использованию в 1955 году. На основании фармакопейной статьи ФС 42-53-72 готовое сырье гриба Inonotus obliquus имеет следующие показатели:
- экстрактивные вещества - не менее 20%;
- хромогенный комплекс - не менее 50% массы общего сухого остатка экстрактивных веществ;
- влаги - не более 14%;
- золы - не более 14%.
Гриб Inonotus obliquus содержит широкий спектр различных БАВ: водорастворимые пигменты в большом количестве (20%), которые образуют хромогенный полифенолкарбоновый комплекс, проявляющий противоопухолевую активность, обусловленную тем, что фенольные соединения регулируют активность цитоплазматических и митохондриальных АТФ-аз и понижают образование АДФ, а поскольку магнилизированные клетки в большей степени, чем нормальные, зависят от гликолиза, то нарушение этого процесса негативно отражается на их развитии; птерины (производные птеридина), наличием которых обусловливается цитостатическое действие чаги; полисахариды (6-8%); агарициновая и гуминоподобная чаговые кислоты (до 60%); органические кислоты, суммарное содержание которых составляет 0,5-1,3% (щавелевая, уксусная, муравьиная, ванилиновая, сиреневая, п-оксибензойная, а также 2 тритерпеновые кислоты из группы тетрациклических тритерпенов - инонотовая и обликвиновая); липиды (ди- и триглицериды); стероидные вещества (стерины - эргостерол, а также тетрациклические тритерпены - ланостерол иинотодиол, проявляющий антибластическую активность); лигнин; клетчатка; свободные фенолы; флавоноиды; кумарин пеуцеданин; целлюлоза; смолы; следы алкалоидов невыясненной структуры; зола (12,3%), богатая марганцем, который, возможно, имеет значение в лечебном действии чаги как активатора энзимов; другие микроэлементы в виде оксидов: медь, барий, цинк, железо, кремний, алюминий, кальций, магний.
Препараты гриба Inonotus obliquus нашли широкое применение в медицине, в частности:
- при заболеваниях ЖКТ: дискинезии ЖКТ с преобладанием атонии, хронические гастриты с пониженной секреторной функцией и анацидные гастриты, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, полипозы желудка и кишечника, гастралгия, энтералгия, заболевания печени и селезенки;
- при низком тонусе кишечника;
- при злокачественных новообразованиях разной локализации в иноперабельных случаях и невозможности проведения лучевой терапии: рак желудка, кишечника, поджелудочной железы, печени, пищевода, легких и других хорошо васкуляризованных органов, менее эффективна чага при локализации опухолей в костях, мозге и на коже;
- для профилактики возникновения злокачественных образований (при постоянном употреблении настоя чаги процент заболеваний раком значительно ниже);
- при лучевой лейкопении и для предупреждения ее развития при лучевой терапии, возобновления формулы крови и для улучшения кровообращения;
- в оториноларингологической практике как вспомогательное средство при лечении опухолей гортани в виде ингаляций. При этом улучшается общее состояние больных, нормализуется процесс глотания, уменьшается осиплость голоса, улучшается дыхание, уменьшается сопутствующий воспалительный процесс;
- при бессоннице, для успокоения нервной системы;
- при нарушении каталазного и протеазного обменов веществ;
- после перенесенных тяжелых заболеваний и операций как общеукрепляющее средство;
- для повышения сопротивляемости организма к инфекционным заболеваниям;
- в небольших концентрациях как заменитель чая (возобновляет силы, придает бодрость, повышает аппетит, снимает головную боль);
- в стоматологии для лечения пародонтоза (вводят в десенные карманы и принимают внутрь);
- при псориазе, экземе и других кожных заболеваниях.
Для оценки противовирусной активности в отношение ВИЧ-1 использовали весь спектр водо- и спирторастворимых природных соединений, содержащихся в сухих наростах березового гриба - чаги Inonotus obliguus.
В случае использования высушенных наростов гриба Inonotus obliguus их измельчали до порошкообразного состояния. Навеску измельченного гриба аптечного производства или полученного нами порошка суспендировали в стерильной дистиллированной воде.
Для экстракции водорастворимых веществ в некоторых случаях смесь прогревали на водяной бане 20 мин или встряхивали на качалке при температуре 28-30°С в течение 18 часов со скоростью перемешивания 120 об/мин.
Для испытаний на вирусах использовали как только что приготовленные образцы, так и длительно хранившиеся при температурах 6-8°С или при минус 20°С.
Были использованы также аптечные препараты бефунгин и настойка чаги.
Пример 1. Оценка терапевтического и профилактического действия препаратов гриба Inonotus obliquus, полученных в результате водной экстракции, на репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре клеток МТ-4.
Навеску измельченного гриба Inonotus obliquus из аптеки (производства г.Москва) 5 г суспендируют в 100 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживают 7-14 дней при температуре 6-8°С, освобождают от осадка (образцы 08-11, 07-05).
6
Исследование противовирусной активности соединений в отношении ВИЧ-1 проводят на перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4. Клетки культивируют на среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. Используют клетки после 3 пассажа, на 3 сутки культивирования, в логарифмической фазе роста. После микроскопирования и оценки морфологии подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом исключения трипанового синего. Для эксперимента используют клетки с концентрацией не менее 2,0×10 клеточных частиц в миллилитре и жизнеспособностью не менее 90%.
Для заражения используют супернатант клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 штамм ГКВ 4046 и штамм ГКВ 4005, хранившиесяся в жидком азоте. Множественность заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку.
6
Исследуют токсичность соединений. Для этого суспензию клеток МТ-4, разведенную до посевной концентрации 0,5×10 клеток в миллилитре питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина помещают в лунки 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. К клеткам добавляют растворы исследуемых соединений (по 20 мкл в лунку) до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…1:1280. Используют по 3 лунки на каждую дозу. Контролем служат клетки, в которые вместо исследуемого соединения добавляют то же количество растворителя (среда RPMI-1640 без сыворотки и антибиотиков). Планшеты инкубируют в термостате при 37°С. На 3-и сутки культивирования подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом прижизненного окрашивания клеток МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Разведение, не оказывающее токсического действия на клетки МТ-4 (при котором клетки сохраняли 50% и 100% жизнеспособность), определяют по графику зависимости оптической плотности (фильтр 450 нм) от концентрации и жизнеспособности клеток.
Профилактическое действие препаратов оценивается по подавлению вируспродукции в клетках МТ-4 при добавлении препарата при адсорбции вируса.
В суспензию клеток МТ-4 добавляют вируссодержащий материал и немедленно разносят ее по лункам 96-луночных планшетов. Сразу же добавляют препараты, разведенные в среде RPMI-1640, до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80… (по три лунки на каждую дозу). Планшеты инкубируют в течение часа при 37°С для адсорбции вируса. Затем клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, содержащей соответствующие дозы препаратов.
Терапевтическое действие препаратов оценивается по подавлению продукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при добавлении препарата гриба чаги после адсорбции вируса на поверхности клетки.
2
В суспензию чувствительных клеток вносят вируссодержащий материал и инкубируют в течение часа при 37°С в атмосфере 5% СО при постоянном перемешивании содержимого для адсорбции вируса.
После этого клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с сывороткой и антибиотиками и разносят по лункам 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. В каждую лунку добавляют аликвоты исследуемых соединений, разведенных в среде RPMI-1640 без добавок, до конечных разведений 1:10, 1:20,1:40,…1:64000.
2
Контролями служат инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления препаратов. Планшеты инкубируют при 37°C в атмосфере 5% CO в течение 3-х суток.
Анти-ВИЧ активность препаратов оценивают по подавлению накопления вирусного белка р24 в инфицированных клетках с использованием количественного определения р24 методом прямого иммуноферментного анализа. Подавление прироста вирусспецифического белка р24 различными разведениями исследуемых препаратов при внесении вируса и препарата (50% и 100% инактивация вируса) определяют по графикам зависимости оптической плотности (фильтр 490 нм) от концентрации р24, пересчитывая концентрацию р24 по графику для стандартного антигена. Суммарные данные по оценке токсичности и эффективности в отношении ВИЧ-1 препаратов гриба Inonotus obliquus представлены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1ПОДАВЛЕНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИЧ-1 В КЛЕТКАХ МТ-4 ПРИ ВНЕСЕНИИ ПРЕПАРАТОВ ГРИБА INONOTUS OBLIQUUS ДО И ПОСЛЕ АДСОРБЦИИ ВИЧ-1 НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК И ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТОВ
Препарат
Разведение препарата, ингибирующее репродукцию ВИЧ-1 (при одновременном внесении с вирусом)
Разведение препарата, ингибирующее репродукцию ВИЧ-1 (при внесении препарата после адсорбции вируса)
Нетоксичные разведения препарата
На 50%
На 100%
На 50%
На 100%
Для 50% клеток
Для 100% клеток
07-05
>1:25600
>1:12800
>1:12800
>1:8000
1:40
1:320
08-11
>1:32000
>1:25600
>1:32000
1:25600
1:80
1:640
При добавлении препаратов гриба Inonotus obliquus (07-05 и 08-11) одновременно с адсорбцией вируса показано полное подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при разведении препаратов 1:12800 и 1:25600. При добавлении препаратов гриба Inonotus obliquus (07-05 и 08-11) после адсорбции вируса показано полное подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при разведении препаратов 1:8000 и 1:25600. При этом в разведении более чем 1:640 препараты не проявляют токсичных для клеток человека свойств.
Пример 2. Оценка терапевтического и профилактического действия препаратов гриба Inonotus obliquus, полученных в результате водной экстракции на водяной бане при температуре 98°С, на репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре клеток МТ-4.
Навеску измельченного нароста гриба Inonotus obliquus (Сибирь) и измельченного гриба из аптеки (производства г.Москва) 3 г и 5 г, соответственно, суспендируют в 100 мл стерильной дистиллированной воды и прогревают на кипящей водяной бане 20 мин, освобождают от осадка (образец 07-45 и 08-10).
6
Исследование противовирусной активности соединений в отношении ВИЧ-1 проводят на перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4. Клетки культивируют на среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. Используют клетки после 3 пассажа, на 3 сутки культивирования, в логарифмической фазе роста. После микроскопирования и оценки морфологии подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом исключения трипанового синего. Для эксперимента используют клетки с концентрацией не менее 2,0×10 клеточных частиц в миллилитре и жизнеспособностью не менее 90%.
Для заражения используют супернатант клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4046 и штамм ГКВ 4005), хранившиеся в жидком азоте. Множественность заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку.
6
Исследуют токсичность соединений. Для этого суспензию клеток МТ-4, разведенную до посевной концентрации 0,5×10 клеток в миллилитре питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, помещают в лунки 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. К клеткам добавляют растворы исследуемых соединений (по 20 мкл в лунку) до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…1:1280. Используют по 3 лунки на каждую дозу. Контролем служат клетки, в которые вместо исследуемого соединения добавляют то же количество растворителя (среда RPMI-1640 без сыворотки и антибиотиков). Планшеты инкубируют в термостате при 37°С. На 3-и сутки культивирования подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом прижизненного окрашивания клеток МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Разведение, не оказывающее токсического действия на клетки МТ-4 (при котором клетки сохраняли 50% и 100% жизнеспособность), определяют по графику зависимости оптической плотности (фильтр 450 нм) от концентрации и жизнеспособности клеток.
Профилактическое действие препаратов оценивается по подавлению вируспродукции в клетках МТ-4 при добавлении препарата при адсорбции вируса.
В суспензию клеток МТ-4 добавляют вируссодержащий материал и немедленно разносят ее по лункам 96-луночных планшетов. Сразу же добавляют препараты, разведенные в среде RPMI-1640, до конечных разведенй 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…(по три лунки на каждую дозу). Планшеты инкубируют в течение часа при 37°С для адсорбции вируса. Затем клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, содержащей соответствующие дозы препаратов.
Терапевтическое действие препаратов оценивается по подавлению продукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при добавлении препарата гриба чаги после адсорбции вируса на поверхности клетки.
2
В суспензию чувствительных клеток вносят вируссодержащий материал и инкубируют в течение часа при 37°С в атмосфере 5% СО при постоянном перемешивании содержимого для адсорбции вируса.
После этого клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с сывороткой и антибиотиками и разносят по лункам 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. В каждую лунку добавляют аликвоты исследуемых соединений, разведенных в среде RPMI-1640 без добавок, до конечных разведений 1:10, 1:20,1:40…1:64000.
2
Контролями служат инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления препаратов. Планшеты инкубируют при 37°C в атмосфере 5% СО в течение 3-х суток.
Анти-ВИЧ активность препаратов оценивают по подавлению накопления вирусного белка р24 в инфицированных клетках с использованием количественного определения р24 методом прямого иммуноферментного анализа. Подавление прироста вирусспецифического белка р24 различными разведениями исследуемых препаратов при внесении вируса и препарата (50% и 100% инактивация вируса) определяют по графикам зависимости оптической плотности (фильтр 490 нм) от концентрации р24, пересчитывая концентрацию р24 по графику для стандартного антигена. Суммарные данные по оценке токсичности и эффективности в отношении ВИЧ-1 препаратов гриба чаги Inonotus obliquus представлены в таблице 2.
ТАБЛИЦА 2ПОДАВЛЕНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИЧ-1 В КЛЕТКАХ МТ-4 ПРИ ВНЕСЕНИИ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА ГРИБА INONOTUS OBLIQUUS ДО И ПОСЛЕ АДСОРБЦИИ ВИЧ-1 НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК И ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТОВ
Препарат
Разведение препарата, ингибирующее репродукцию ВИЧ-1 (при одновременном внесении с вирусом)
Разведение препарата, ингибирующее репродукцию ВИЧ-1 (при внесении препарата после адсорбции вируса)
Нетоксичные разведения препарата
На 50%
На 100%
На 50%
На 100%
Для 50% клеток
Для 100% клеток
07-45
>1:64000
1:16000
1:32000
1:16000
1:40
1:320
08-10
>1:64000
>1:32000
>1:64000
1:32000
1:80
1:320
При добавлении препаратов гриба Inonotus obliquus (07-45 и 08-10) одновременно с адсорбцией вируса показано полное подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при разведении препаратов 1:16000 и 1:32000 соответственно. При добавлении препаратов после адсорбции вируса показано полное подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при разведении препаратов 1:16000 (для 07-45) и 1:32000 (для 08-10). При этом в разведении более чем 1:320 препараты не проявляют токсичных для клеток человека свойств.
Пример 3. Оценка профилактического и терапевтического действия препарата гриба Inonotus obliquus (Бефунгин) на репродукцию ммунодефицита человека в культуре клеток МТ-4.
Бефунгин, представляющий полугустой экстракт из нароста гриба с добавлением солей кобальта (кобальта хлорида 0,175% или кобальта сульфата 0,2%) на 100 мл, разбавляют в дистиллированной воде 1:10 (образец 08-08).
6
Исследование противовирусной активности соединений в отношении ВИЧ-1 проводят на перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4. Клетки культивируют на среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. Используют клетки после 3 пассажа, на 3 сутки культивирования, в логарифмической фазе роста. После микроскопирования и оценки морфологии подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом исключения трипанового синего. Для эксперимента используют клетки с концентрацией не менее 2,0×10 клеточных частиц в миллилитре и жизнеспособностью не менее 90%.
Для заражения используют супернатант клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 штамм ГКВ 4046 и штамм ГКВ 4005, хранившиеся в жидком азоте. Множественность заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку.
6
Исследуют токсичность соединений. Для этого суспензию клеток МТ-4, разведенную до посевной концентрации 0,5×10 клеток в миллилитре питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, помещают в лунки 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. К клеткам добавляют растворы исследуемых соединений (по 20 мкл в лунку) до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…1:1280. Используют по 3 лунки на каждую дозу. Контролем служат клетки, в которые вместо исследуемого соединения добавляют то же количество растворителя (среда RPMI-1640 без сыворотки и антибиотиков). Планшеты инкубируют в термостате при 37°С. На 3-и сутки культивирования подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом прижизненного окрашивания клеток МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Разведение, не оказывающее токсического действия на клетки МТ-4 (при котором клетки сохраняли 50% и 100% жизнеспособность), определяют по графику зависимости оптической плотности (фильтр 450 нм) от концентрации и жизнеспособности клеток.
Профилактическое действие препаратов оценивается по подавлению вируспродукции в клетках МТ-4 при добавлении препарата при адсорбции вируса.
В суспензию клеток МТ-4 добавляют вируссодержащий материал и немедленно разносят ее по лункам 96-луночных планшетов. Сразу же добавляют препараты, разведенные в среде RPMI-1640, до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…(по три лунки на каждую дозу). Планшеты инкубируют в течение часа при 37°С для адсорбции вируса. Затем клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, содержащей соответствующие дозы препаратов.
Терапевтическое действие препаратов оценивается по подавлению продукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при добавлении препарата гриба чаги после адсорбции вируса на поверхности клетки.
2
В суспензию чувствительных клеток вносят вируссодержащий материал и инкубируют в течение часа при 37°С в атмосфере 5% СО при постоянном перемешивании содержимого для адсорбции вируса.
После этого клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с сывороткой и антибиотиками и разносят по лункам 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. В каждую лунку добавляют аликвоты исследуемых соединений, разведенных в среде RPMI-1640 без добавок, до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40…(1:64000 (по три лунки на каждую дозу).
2
Контролями служат инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления препаратов. Планшеты инкубируют при 37°C в атмосфере 5% СО в течение 3-х суток.
Анти-ВИЧ активность препаратов оценивают по подавлению накопления вирусного белка р24 в инфицированных клетках с использованием количественного определения р24 методом прямого иммуноферментного анализа. Подавление прироста вирусспецифического белка р24 различными разведениями исследуемых препаратов (50% и 100% инактивация вируса) определяют по графикам зависимости оптической плотности (фильтр 490 нм) от концентрации р24, пересчитывая концентрацию р24 по графику для стандартного антигена. Суммарные данные по оценке токсичности и эффективности в отношении ВИЧ-1 препарат гриба Inonotus obliquus Бефунгин представлены в таблице 3.
ТАБЛИЦА 3ПОДАВЛЕНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИЧ-1 В КЛЕТКАХ МТ-4 ПРИ ВНЕСЕНИИ ПРЕПАРАТА ГРИБА INONOTUS OBLIQUUS (БЕФУНГИН) ДО И ПОСЛЕ АДСОРБЦИИ ВИЧ-1 НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК И ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА
Препарат Бефунгин
Разведение препарата, ингибирующее репродукцию ВИЧ-1
Нетоксичные разведения препарата
На 50%
На 100%
Для 50% клеток
Для 100% клеток
При внесении препарата до адсорбции вируса
>1:64000
>1:32000
1:32
1:100
При внесении препарата после адсорбции вируса
>1:64000
1:32000
1:32
1:100
При добавлении препарата гриба Inonotus obliquus Бефунгин до и после адсорбции вируса показано полное подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при разведении препарата 1:32000. При этом при разведении более чем 1:100 препарат не проявляет токсичных для клеток человека свойств.
Пример 4. Оценка профилактического и терапевтического действия препарата гриба Inonotus obliquus (настойка чаги) на репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре клеток МТ-4.
Настойку чаги, представляющей спиртовой (этанольный) 70% экстракт гриба, разбавляют в дистиллированной воде 1:10 (образец 08-15).
6
Исследование противовирусной активности соединений в отношении ВИЧ-1 проводят на перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4. Клетки культивируют на среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. Используют клетки после 3 пассажа, на 3 сутки культивирования, в логарифмической фазе роста. После микроскопирования и оценки морфологии подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом исключения трипанового синего. Для эксперимента используют клетки с концентрацией не менее 2,0×10 клеточных частиц в миллилитре и жизнеспособностью не менее 90%.
Для заражения используют супернатант клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 штамм ГКВ 4046 и штамм ГКВ 4005, хранившиеся в жидком азоте. Множественность заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку.
6
Исследуют токсичность соединений. Для этого суспензию клеток МТ-4, разведенную до посевной концентрации 0,5×10 клеток в миллилитре питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, помещают в лунки 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. К клеткам добавляют растворы исследуемых соединений (по 20 мкл в лунку) до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80…1:1280. Используют по 3 лунки на каждую дозу. Контролем служат клетки, в которые вместо исследуемого соединения добавляют то же количество растворителя (среда RPMI-1640 без сыворотки и антибиотиков). Планшеты инкубируют в термостате при 37°С. На 3-и сутки культивирования подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток методом прижизненного окрашивания клеток МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Разведение, не оказывающее токсического действия на клетки МТ-4 (при котором клетки сохраняли 50% и 100% жизнеспособность), определяют по графику зависимости оптической плотности (фильтр 450 нм) от концентрации и жизнеспособности клеток.
Профилактическое действие препаратов оценивается по подавлению вируспродукции в клетках МТ-4 при добавлении препарата при адсорбции вируса.
В суспензию клеток МТ-4 добавляют вируссодержащий материал и немедленно разносят ее по лункам 96-луночных планшетов. Сразу же добавляют препараты, разведенные в среде RPMI-1640, до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40, 1:80… (по три лунки на каждую дозу). Планшеты инкубируют в течение часа при 37°С для адсорбции вируса. Затем клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина и 30 мг/мл линкомицина, содержащей соответствующие дозы препаратов.
Терапевтическое действие препаратов оценивается по подавлению продукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при добавлении препарата гриба чаги после адсорбции вируса на поверхности клетки.
2
В суспензию чувствительных клеток вносят вируссодержащий материал и инкубируют в течение часа при 37°С в атмосфере 5% СО при постоянном перемешивании содержимого для адсорбции вируса.
После этого клетки разводят до посевной концентрации питательной средой RPMI-1640 с сывороткой и антибиотиками и разносят по лункам 96-луночных планшетов по 180 мкл в лунку. В каждую лунку добавляют аликвоты исследуемых соединений, разведенных в среде RPMI-1640 без добавок, до конечных разведений 1:10, 1:20, 1:40…(1:64000 (по три лунки на каждую дозу).
2
Контролями служат инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления препаратов. Планшеты инкубируют при 3°C в атмосфере 5% СО в течение 3-х суток.
Анти-ВИЧ активность препаратов оценивают по подавлению накопления вирусного белка р24 в инфицированных клетках с использованием количественного определения р24 методом прямого иммуноферментного анализа. Подавление прироста вирусспецифического белка р24 различными разведениями исследуемых препаратов (50% и 100% инактивация вируса) определяют по графикам зависимости оптической плотности (фильтр 490 нм) от концентрации р24, пересчитывая концентрацию р24 по графику для стандартного антигена. Суммарные данные по оценке токсичности и эффективности в отношении ВИЧ-1 препарата гриба Inonotus obliquus (настойка чаги) представлены в таблице 4.
ТАБЛИЦА 4ПОДАВЛЕНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИЧ-1 В КЛЕТКАХ МТ-4 ПРИ ВНЕСЕНИИ ПРЕПАРАТА ГРИБА INONOTUS OBLIQUUS НАСТОЙКА ЧАГИ ДО И ПОСЛЕ АДСОРБЦИИ ВИЧ-1 НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК И ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА
Препарат Настойка чаги
Разведение препарата, ингибирующее репродукцию ВИЧ-1
Нетоксичные разведения препарата
На 50%
На 100%
Для 50% клеток
Для 100% клеток
При внесении препарата до адсорбции вируса
>1:16000
1:12800
1:40
1:320
При внесении препарата после адсорбции вируса
>1:12800
1:8000
1:40
1:320
При добавлении препарата гриба Inonotus obliquus Настойка чаги до и после адсорбции вируса показано полное подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при разведении препаратов 1:12800 и 1:8000 соответственно. При этом при разведении более чем 1:320 препарат не проявляет токсичных для клеток человека свойств.
Оценка эффективности противовирусного воздействия различных экстрактов гриба Inonotus obliquus на культуре клеток человека МТ-4, инфицированной ВИЧ-1, показала, что при невысокой токсичности для клеток препараты чаги оказывают выраженный ингибирующий эффект в отношении вируса иммунодефицита человека I типа как при одновременном с вирусом внесении в культуру клеток, так и в постадсорбционных условиях.