СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЕЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ
METHOD FOR TREATMENT OF PATIENTS WITH CHRONIC LOWER LIMB ISCHEMIA

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, сосудистой хирургии и может быть использовано для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях.
Уровень техники
Доля хронической артериальной недостаточности нижних конечностей в структуре патологий сердечно-сосудистой системы атеросклеротического генеза составляет 20%, а в общей заболеваемости достигает 3% [Савельев B.C., Кошкин В.М., Каралкин A.B., Патогенез и консервативное лечение тяжелых стадий облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей // Москва: МИА. 2010; 214 с. Сударев А.М. Лечение хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей. Ангиология и сосудистая хирургия. - 2013. - Т.19, №1. - С.26-32.]. В 35-65% случаев хроническая артериальная недостаточность у больных трансформируется в хроническую критическую ишемию, представляющую собой терминальную стадию заболевания, и приводит к таким неблагоприятным последствиям, как трофические осложнения и ишемическая гангрена нижней конечности [Покровский А.В., Казаков Ю.И., Лукин И.Б. Критическая ишемия нижних конечностей. Инфраингвинальное поражение: монография. Тверской государственный университет. 2018; 225.].
.
Савельев B.C., Кошкин В.М., Каралкин A.B., Па тогенез и консервативное лечение тяжелых стадий облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей // Москва: МИА. 2010; 214 с. Петухов А.В. Современное состояние проблемы лечения критической ишемии нижних конечностей. Новости хирургии. №4, 2006 97-106
Червяков Ю.В., Власенко О.Н. , Ха Х.Н. Пятилетние результаты консервативной терапии больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей в стадии критической ишемии. Пермский медицинский журнал. 2017. Т.34. №5 с. 20-27
Norgen L, Hiatt WR, Dorandy JA, Nehler MR, Harris KA, Fowkes FG. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). J Vasc Surg. 2007;45(SupplS):S5-S67. PMID: 17223489 https://doi.org/10.1016/j.jvs.2006.12.037
Несмотря на развитие сосудистой и эндоваскулярной хирургии, сегодня далеко не всем пациентам можно выполнить прямую реваскуляризацию. Так, при хронической критической ишемии доля пациентов, которым технически возможно выполнить реконструктивную сосудистую операцию или эндоваскулярную интервенцию, составляет 35-55% [Зубова Е.С., Вавилов В.Н., Артюшин Б.С., Мовчан К.Н., Крутиков А.Н., Романенков Н.С., Исхаков Р.Б. Возможности применения гемопоэтических клеток моноцитарного ряда в лечении больных критической ишемией нижних конечностей //  Современные проблемы науки и образования. 2019. №3]При отсутствии возможности хирургической реваскуляризации 75-90% больным с ишемией нижних конечностей проводят консервативную терапию. []. Однако эффективность консервативной терапии крайне низкая, так прогрессирование заболевания на ее фоне отмечено у 76,5% пациентов с хронической ишемией нижних конечностей в течение 4 лет. В случае достижения стадии хронической критической ишемией эффект от консервативного лечения кратковременный, либо вовсе отсутствует []. До 40% таких пациентов, у которых не удается достичь достаточной степени реваскуляризации тканей, теряют конечность в первые 6 месяцев. В течение первого года данный показатель возрастает до 90% [].
С учетом изложенного выше, необходим поиск альтернативных путей реваскуляризации и улучшения микроциркуляции в нижних конечностях.
Одним из подходов коррекции расстройства микроциркуляции в нижних конечностях при хронической артериальной недостаточности является терапевтический ангиогенез. Стойкий клинический эффект может быть достигнут за счёт формирования в области ишемии коллатерального кровообращения. Это снижает степень ишемии, что, в свою очередь, способствует заживлению трофических язв и снижает риск ранней ампутации у пациентов.
Лебедев С.В., Карасев А.В., Кунгурцев В.В., Лохонина А.В., Клейменова Е.Б. Клеточная терапия критической ишемии нижних конечностей (проблемы и перспективы) // Вестник Российской академии медицинских наук. 2013. Т. 68. № 3. С. 33-44
Ю.А. Борзилова Л.А. Болдырева, И.В. Шлык Васкулоэндотелиальные факторы роста (VEGF): роль и место в патологических процессах
Большим потенциалом обладают стволовые клетки. Механизм биологического действия стволовых клеток основан на их способности к миграции в ишемизированный участок, пролиферации, и к синтезу ряда факторов роста. При этом достижение клинического эффекта применения стволовых клеток осуществляется преимущественно за счет паракринного действия на микроокружение биологически активных молекул []. Ключевым аспектом в лечении стволовыми клетками является локальное увеличение в мягких тканях фактора VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), который играет ведущую роль в регуляции ангиогенеза. [].
low
Суковатых Б.С., Орлова А.Ю. Стимуляция ангиогенеза клетками костного мозга при экспериментальной ишемии конечности // Ангиология и сосудистая хирургия. 2017. Т.23. №1. С.43-50
В частности, известен способ лечения хронической ишемии нижних конечностей с использованием клеточной терапии, согласно которому, проводят периартериальное введение CD45CD34+аутологичных гемопоэтических стволовых клеток. Стволовые клетки способны активировать резидентные эндотелиальные клетки действием ангиогенных факторов. Положительное действие клеток костного мозга показано в ряде исследований. В частности, установлено увеличение объёмного кровотока, снижение степени ишемии и улучшение качества жизни у пациентов, которым вводили клетки костного мозга []. Однако необходимость мобилизации таких клеток из костного мозга в периферическую кровь с применением гранулоцитарных колониестимулирующих факторов, процедуры аппаратного лимфоцитафереза и иммуномагнитной сепарации для получения концентрата стволовых клеток обусловливает высокую стоимость данного метода и требует поиска альтернативных источников факторов роста.
В то же время известно, что в тромбоцитах в большом количестве содержатся факторы роста, стимулирующие неоваскулогенез, главными из которых являются фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF),тромбоцитарный фактор роста (PDGF),трансформирующий фактор роста (TGF), сосудистыйфактор проницаемости (VPF), эпидермальный фактор роста (ЕGF) [C.E.Martínez, P.C.Smith and V.A. Palma Alvarado. The influence of platelet-derived products on angiogenesis and tissue repair: a concise update. Front Physiol. 2015 Oct 20;6:290. doi: 10.3389/fphys.2015.00290. eCollection 2015. https://www.frontiersin.org/ October 2015|Volume6|Article290]. Их местное применение в лечении, например, ран, стимулирует неоангигенез.
Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является способ лечения облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей путем увеличения количества коллатералей в мягких тканях нижних конечностей с помощью аутокрови (RU 2319492). Аутокровь забирают у пациента в количестве 400-600 мл, разделяют ее с помощью тромбоцитофереза на равные объемы эритромассы и аутоплазмы, содержащей тромбоциты в количестве, в 1,5-2,5 раза превышающем содержание тромбоцитов в аутокрови, после чего эритромассу инфузионно возвращают пациенту, а для увеличения коллатералей обогащенную тромбоцитами аутоплазму вводят в мягкие ткани голени и стопы, начиная с верхней трети голени, за один сеанс, веерообразно и диффузно распределяя препарат в тканях.
Однако данному способу, как на этапе получения препарата, так и его применения присущ ряд недостатков. В частности, одномоментный забор 400-600 мл венозной крови эквивалентен потере 10% среднего объема циркулирующей крови, что у пациентов с хроническими заболеваниями требует восполнения с использованием крови, крове- и плазмозаменителей. Помимо этого, для исключения рисков отрицательного влияния процедуры на соматическое состояние пациента требуется выполнение предварительного тщательного обследования. При этом у пациентов с хроническими заболеваниями высокая вероятность выявления противопоказаний к донации указанного объема крови, что исключает возможность их лечения описанным способом. Отдельно стоит отметить и низкую эффективность выделения тромбоцитов из забранного объема крови - в итоге после тромбоцитофереза объем препарата составляет 200-300 мл, а концентрация тромбоцитов возрастает всего в 1,5-2,5 раза. К недостаткам способа относится и использование недегранулированных тромбоцитов. В этом случае реализация биологического эффекта может быть отложена и менее выраженной как из-за несинхронной активации тромбоцитов, так и из-за сохранения недегранулированными части клеток. В свою очередь веерообразное и диффузное распределение препарата по мягким тканям голени и стопы без учёта локализации и объема поражения, является нерациональным. При этом введение 200-300 мл (объем тромбоконцентрата) подразумевает выполнение либо большого количества инъекций, либо нагнетание значительного количества препарата при каждом уколе. В обоих случаях это сопровождается болевым синдромом, может провоцировать воспалительную реакцию.
Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является разработка способа лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей, устраняющего перечисленные выше недостатки, характерные для аналогов и прототипа, путем использования аутологичного бесклеточного препарата, содержащего ростостимулирующие факторы тромбоцитов, полученного из относительно небольшого объема венозной крови.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом изобретения является формирование тканевого кровотока и инволюция инфильтративно-некротических изменений мягких тканей у больных с хронической ишемией нижних конечностей при лечении аутологичным бесклеточным препаратом, содержащим ростостимулирующие факторы тромбоцитов при обеспечении безопасности такого лечения. Формирование тканевого кровотока и инволюция инфильтративно-некротических изменений мягких тканей достигается через увеличение в ишемизированных тканях коллатеральных сосудов капиллярного типа путем стимуляции васкуло- и ангиогенеза после внутримышечного введения аутологичного бесклеточного препарата, содержащего ростостимулирующие факторы тромбоцитов. В свою очередь, увеличение безопасности лечения достигается как забором кратно меньшего количества крови и, соответственно,  отсутствием необходимости её восполнения без риска негативного влияния на соматическое состояние пациента, так и селективным применением препарата минимального объема.
Показанием для проведения лечения заявляемым способом является наличие клинических признаков хронической ишемии нижних конечностей, подтверждённых инструментальными или аппаратными методами исследования.
9
3
Поставленная задача решается способом лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей 2Б - 4 степени по Фонтену-Покровскому, включающим  получение препарата из аутокрови, содержащего факторы роста, с последующим его введением в мягкие ткани голени. В качестве препарата, содержащего факторы роста, используют лизат тромбоцитов в бесплазменной среде, полученной из тромбоконцентрата с клеточностью не менее 1000*10/л и содержанием функционально полноценных клеток не менее 38%, при этом лизат тромбоцитов для введения используют из расчета не менее 0,05 мл на 1 смзоны с обедненным кровоснабжением (или объем ишемизированной зоны), а введение препарата осуществляют с равномерным распределением препарата по ишемизированной зоне. Зоны с обедненным кровоснабжением (или объем ишемизированной зоны) могут быть определены методом сцинтиграфии.
Получение аутологичного бесклеточного препарата, путем выделения из крови, концентрации и разрушения (лизиса) тромбоцитов в среде, не содержащей плазму крови, например,  физиологическом растворе 0,9% NaCl, обеспечивает содержание в нем в наибольших концентрациях ростостимулирующих факторов VEGF,  EGF, FGF, PDGF. Внутримышечное введение бесплазменного лизата тромбоцитов (аутологичного бесклеточного препарата) позволяет поднять в тканях концентрацию указанных факторов роста существенно выше физиологических уровней, тем самым способствовать васкуло- и ангиогенезу. Реализация указанных биологических процессов проявляется в увеличении количества сосудов в единице объема ткани и сопровождается увеличением тканевого кровотока, в том числе, с инволюцией инфильтративно-некротических изменений мягких тканей (вызванных хронической ишемией).
9
В свою очередь, такое свойство бесплазменного лизата тромбоцитов, полученного из тромбоконцентрата с клеточностью не менее 1000 кл*10/л и содержанием функционально полноценных клеток не менее 38%, как увеличение пролиферации клеток не менее чем на 20% при дозе от 5 мкл бесплазменного лизата тромбоцитов на 1 мл культуральной среды (данные получены при исследовании на культуре клеток ростостимулирующего эффекта бесплазменного лизата тромбоцитов) позволяет, исходя из объема поражения, рассчитать оптимальное количество препарата и произвести забор у пациента минимального, но достаточного для получения препарата, количества венозной крови. Это, в совокупности с рациональным применением препарата только в зоне ишемии, позволяет избежать рисков, связанных с указанными инвазивными процедурами и, соответственно, увеличить безопасность лечения.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется иллюстративным материалом, где:
на фиг. 1 представлены результаты сцинтиграфии с 99mТс-пирфотехом, тканевая фаза, где на изображении А) показаны линии измерения для расчетов объема тканей голени с признаками ишемии;
на фиг. 2 представлен график изменения количества клеток в лунке при культивировании в среде, содержащей лизат тромбоцитов. По оси Х представлена доза препарата (мкл/мл), добавленная в лунку с клетками. По оси Y представлена разница между исходным количеством клеток в лунке и количеством  клеток через 3 суток культивирования;
на фиг. 3  представлен результат исследования пациента по примеру 1 - исходная трехфазная сцинтиграфия с 99mTc-пирфотехом, тканевая и костная фазы (передняя и задняя проекции): определяются инфильтративно-некротические изменения мягких тканей верхней трети левой голени;
на фиг. 4 представлен результат исследования пациента по примеру 1 - исходная трехфазная сцинтиграфия с 99mTc-пирфотехом, костная фазы (передняя и задняя проекции): определены размеры наиболее крупных очагов формирующихся инфильтративно-некротических изменений;
на фиг. 5 представлен результат исследования пациента по примеру 1 - трехфазная сцинтиграфия с 99mTc-пирфотехом через 4 месяца после применения бесплазменного лизата тромбоцитов, тканевая и костная фазы (передняя и задняя проекции): по сравнению с исходным исследованием отмечаются существенное увеличение коэффициента относительного накопления 99mTc-пирфотехом в тканевую фазу и снижение коэффициента относительного накопления 99mTc-пирфотехом в костную фазу, что свидетельствует об увеличении тканевого (коллатерального) кровотока и инволюции инфильтративно-некротических изменений мягких тканей верхней трети левой голени, соответственно;
на фиг. 6 представлен результат исследования пациента по примеру 2 - исходная трехфазная сцинтиграфия с 99mTc-пирфотехом, тканевая и костная фазы (передняя и задняя проекции): определяется  диффузное снижение тканевого кровотока без очагов инфильтративно-некротические изменения мягких тканей на уровне верхней и средней третей левой голени;
на фиг. 7 представлен результат исследования пациента по примеру 2 - исходная трехфазная сцинтиграфия с 99mTc-пирфотехом, костная фазы (передняя и задняя проекции):  определены размеры зоны диффузного снижения тканевого кровотока на уровне верхней и средней третей левой голени.
на фиг. 8 представлен результат исследования пациента по примеру 2 - трехфазная сцинтиграфия с 99mTc-пирфотехом через 2 месяца после применения бесплазменного лизата тромбоцитов, тканевая и костная фазы (передняя и задняя проекции): по сравнению с исходным исследованием отмечается увеличение коэффициента относительного накопления 99mTc-пирфотехом в тканевую фазу, что свидетельствует об увеличении тканевого (коллатерального) кровотока.
Осуществление изобретения
Способ лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей включает три этапа, на первом из которых с помощью сцинтиграфии определяют объем области сниженного кровотока, по которому рассчитывают количество аутологичного бесклеточного препарата, необходимое для введения пациенту; на втором этапе осуществляют забор крови и приготовление препарата, содержащего факторы роста; на третьем этапе - введение препарата в мягкие ткани голени в области сниженного кровотока.
Далее представлено более детальное описание заявляемого изобретения, не ограничивающее его сущность, представленную в формуле изобретения.
99m
На первом этапе у пациента с хронической ишемией нижних конечностей 2Б-4 ст. по Фонтену-Покровскому определяют локализацию и объем зоны со сцинтиграфическими признаками обеднения тканевого кровотока (зона ишемии). С этой целью его обследуют методом трёхфазной сцинтиграфии с остеотропным радиофармпрепаратом (РФП) Тс-пирфотехом (доза 500 МБк, лучевая нагрузка - 2,85 мЗв). Определение объема ишемизированной зоны может быть проведено с использованием известных из уровня техники способов, например, опубликованных в следующих источниках информации: Радионуклидная диагностика для практических врачей / Под ред. Ю.Б. Лишманова, В.И. Чернова. - Томск: STT, 2004. - 394 с., Патент RU2504331. Исследование включает 3 этапа: первая фаза - фаза магистрального кровотока (первое прохождение РФП); вторая - тканевая фаза (фаза кровенаполнения); третья фаза - костная. Полученные результаты обрабатывают на рабочей станции с программным обеспечением, например, XELERIS или аналогичной. На планарных сцинтиграфических изображениях, отражающих вторую фазу исследования - тканевой кровоток, в мягких тканях определяют визуальные признаки, характерные для областей со сниженным кровотоком - зоны снижения или отсутствия накопления РФП. Затем на планарных сцинтиграфических изображениях, отражающих третью фазу исследования -  костную, в мягких тканях определяют визуальные признаки, характерные для формирующихся некротических изменений -  гиперфиксация РФП в области зон со сниженным кровотоком, определенных на второй фазе. Локализацию выявленных зон характеризуют относительно верхней, средней, либо нижней трети голени (условно разделяя голень на три части). За нижнюю границу массива икроножной мышцы принимают её переход в ахиллово сухожилие (определяют по сцинтиграфическому изображению контралатеральной нижней конечности). Затем с помощью встроенных в программу измерительных функций (линейки) по планарным сцинтиграфическим изображениям устанавливают размеры зон гипоперфузии, в том числе, с признаками инфильтративно-некротических изменений. Измерения проводят в сантиметрах.
b
a
с
1
1
2
2
1
с
2
a
b
2=
a
b
2
2
В одном из вариантов осуществления изобретения при выявлении одной общей зоны обедненного кровотока (фиг.1а) устанавливают её вертикальный размер (h) (протяженность) и определяют следующие размеры в зоне ишемических изменений: горизонтальный размер на уровне верхнего края ишемических изменений (d), наибольший (d) и наименьший (d) горизонтальные размеры зоны обедненного кровотока. Полученные размеры используют для расчёта объема зоны ишемии по формуле объема усеченного конуса: V=1/3 · π · h · (r+ r· r + r), где h - вертикальный размер, r - половина наименьшего горизонтального размера голени (d) в зоне сниженного кровотока, а r- половинасреднего арифметического значения для наибольшего горизонтального размера голени в зоне ишемии (d) и горизонтального размера по верхнему краю области ишемических изменений (d), т.е. r ((d+d)/2)/2. Кроме этого, по передней и задней проекциям сцинтиграфических изображений определяют группы мышц, вовлеченных в зону ишемических изменений, которые используют в качестве анатомических ориентиров локализации зоны ишемии при распределении точек инъекций.
,
2
При выявлении очаговых ишемических изменений (фиг. 1б), по планарным сцинтиграммам определяют наибольший (D) и наименьший (d) размеры каждого из очагов ишемических, в том числе, формирующихся инфильтративно-некротических изменений, в сантиметрах. По полученным размерам определяют объем очагов используя формулу объема эллипсоида: V=4/3 π R r, где R - половина наибольшего размера очага (D), r - половина наименьшего размера очага (d).
9
3
преп
преп
кровь
кровь
преп
На основании полученных данных проводят расчёт объема суспензии тромбоцитов (с концентрацией не менее 1000*10кл/л и долей функционально полноценных клеток не менее 38%; V, мл) для приготовления аутологичного бесклеточного препарата - лизата в бесплазменной среде по формуле V = «объем ишемизированной зоны» *0,05, где 0,05 - доза препарата в мл на каждые 1 см объема ишемизированной зоны (данные получены при исследовании на культуре клеток ростостимулирующего эффекта бесплазменного лизата тромбоцитов). Затем вычисляют количество венозной крови пациента (V, мл), необходимое для формирования суспензии рассчитанного ранее объема, по эмпирической формуле V=V*10.
кровь
преп
9
9
На втором этапе готовят аутологичный бесклеточный препарат, насыщенный факторами роста, полученными из тромбоцитов в бесплазменной среде, (например, способом,  представленным в материалах изобретения по патенту  RU2739515). Для этого у пациента из кубитальной вены забирают кровь в стерильные пробирки с ЭДТА в ранее рассчитанном объеме (V). Тромбоциты выделяют по стандартной методике с двумя центрифугированиями при 300 и 700g, соответственно. После формирования осадка тромбоцитов из пробирки полностью удаляют обеднённую плазму и вносят стерильный физиологический раствор 0,9% NaCl в количестве, эквивалентном рассчитанной дозе препарата (V). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и обследуют на концентрацию тромбоцитов. В случае концентрации тромбоцитов менее 1000 кл*10/л - образец дополнительно центрифугируют 17 минут с ускорением 700g после чего удаляют излишек супернатанта. При достижении целевой концентрации тромбоцитов не менее  1000 кл*10/л суспензию замораживают при температуре -40°С. Размораживание тромбоцитов в бесплазменной среде производят при +4°С в течение 12 часов. После размораживания пробирку центрифугируют при 3000 g в течение 20 минут. Бесклеточный супернатант отбирают для внутримышечного введения.
Третьим этапом является введение препарата. Пациента укладывают в положение на животе и в проекции зоны ишемии широко обрабатывают кожу по правилам асептики и антисептики. Исходя из объема препарата, определяют количество инъекций - в среднем 1 мл препарата вводят за два-три укола. Полученное количество точек инъекций равномерно распределяют таким образом, чтобы ввести препарат как в ишемизированные, так и пограничные ткани. При этом точки введения препарата предпочтительно располагают на расстоянии друг от друга не менее 2 см. Введение препарата проводят шприцем через иглу, при этом могут использовать способ «опережающего введения», «ретроградного введения» или их последовательное комбинирование. При «опережающем введении» иглу сначала проводят через кожу, поверхностную фасцию и подкожножировую клетчатку к мышцам и только затем начинают непрерывно, но медленно вводить препарат, одновременно быстро продвигая иглу на глубину до 3,0 см. При «ретроградном введении» иглу сначала вводят в мышечную ткань на глубину до 3 см и только затем приступают к непрерывному медленному введению препарата, одновременно извлекая иглу из мышечной ткани. При комбинировании способов - препарат непрерывно медленно вводят как при проведении иглы через мышечные ткани, так и при её извлечении. Таким образом, обеспечивается относительно равномерное распределение препарата по тканям ишемизированной зоны, а также его доставка к глубокому листку фасции голени, в межфасциальные пространства, где располагаются магистральные сосуды. При этом введение за одну инъекцию не более 0,5 мл препарата позволяет существенно снизить болезненность процедуры. Тем самым проводится стимулирование как васкулогенеза, так ангиогенеза (спрутинга).
Выбор препарата был сделан на основании результатов ранее проведённой  сравнительной характеристики лизатов тромбоцитов, полученных как с сохранением плазмы крови, так и в бесплазменной среде (патент РФ № 2739515). При этом лизис тромбоцитов и среда, в которой это происходит, являются принципиальными особенностями препарата.
Так предварительный лизис клеток позволяет к моменту применения препарата перевести цитокины во внеклеточную форму и тем самым ускорить их взаимодействие с соответствующими рецепторами, тогда как для начала реализации эффекта препаратов с недегранилированными клетками (богатая тромбоцитами плазма) необходимо время для их активации и высвобождения ростовых факторов.
9
В лизатах, полученных из суспензий тромбоцитов с концентрацией 1000-1100 х 10/л и долей полноценных клеток 38%, с помощью мультиплексного анализа на платформе Luminex 200 (технология xMAP) определяли концентрацию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста эндотелия (EGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF) в пг/мл. Исследование показало что регистрируемая концентрация VEGF в конечном бесплазменном лизате тромбоцитов была больше в 2,7 раза, FGF - в 3 раза, EGF - в 6,1, PDGF - в 4,2  раза соответственно (р<0,05) по сравнению с лизатом тромбоцитов в плазме крови. Таким образом, разрушение клеток в среде, не содержащей плазму крови, позволяет получить в препарате большую концентрацию факторов роста, в том числе VEGF, чем лизис в плазме крови (таблица 1).
Таблица 1. Содержание факторов роста в препаратах тромбоцитов
Препарат тромбоцитов
Концентрация факторов роста пг/мкл
VEGF
EGF
FGF2
PDGF
Лизат тромбоцитов в плазме крови
145(116; 161)
812(805; 926)
237(150; 298)
967(534; 984)
Лизат тромбоцитов в бесплазменной среде
387(116; 549)
4297(4213; 8465)
724(388; 1443)
4110(2769; 5369)
3
2
Оценка ростстимулирующего эффекта лизатов тромбоцитов проводилась на культуре ММСК, посеянных с плотностью 10000 клеток в лунку. В каждую лунку сначала вносили от 10 до 500 мкл лизата тромбоцита, которые затем разводили до 2 мл средой DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США). Тем самым в 1 см объема среды содержалось от 5 до 250 мкл лизата. Помимо этого отдельно засевали «контрольные» лунки, в которые вносили только культуральную среду, без добавления лизата. Клетки культивировали при 37°С и концентрации CO 5% в течение 3 суток, затем подсчитывали с помощью светового микроскопа. В лунках, куда добавляли лизат тромбоцитов, полученный в бесплазменной среде, даже при минимальной дозе 5 мкл/мл, пролиферация была существенно выше, чем в контрольных образцах, а максимальные значения (увеличение на 40%) регистрировались в дозах от 10 мкл/мл до 250 мкл/мл. В то же время в лунках, куда вносили лизаты тромбоцитов в плазме, наблюдали иную ситуацию. Так, при дозах 5 и 10 мкл/мл пролиферация клеток была интенсивнее, чем в контроле. Однако в случае внесения большего количества препарата сначала происходило сокращение разницы между опытными и контрольными образцами до 10% (доза 25 мкл), а затем - не только угнетение пролиферации, но и сокращение популяции клеток (дозы от 50 до 250 мкл/мл). Результаты проведенного исследования представлены на фиг.2.
Таким образом, лизат тромбоцитов в бесплазменной среде не только увеличивает пролиферацию клеток в дозе от 5 мкл на 1 мл культуральной среды, но и обладает более широким терапевтическим диапазоном, чем лизат тромбоцитов в плазме крови. В этой  связи для реализации в полном объеме эффекта ростовых факторов, содержащихся в тромбоцитах, при терапевтическом ангиогенезе целесообразно использовать лизат в бесплазменной среде.
3
Соответственно, расчёт количества аутологичного бесклеточного препарата основан на дозе бесплазменного лизата тромбоцитов, обеспечивающей стимуляцию пролиферации (5 мкл/мл) и экстраполяцииэтих данных на единицу объема ткани. При этом существенное большее количество клеток в ткани нивелируется 2 факторами - во-первых, тем, что подавляющая доля из них не являются целевыми для VEGF, EGF, FGF2, PDGF и на прямую не участвуют в васкуло- и ангиогенезе (в частности - мышечными). И во вторых, тем, что введённый препарат должен не формировать объем в ткани, а равномерно распределиться по межклеточному веществу, емкость которого существенно ограничена плотным расположением мышечных фибрилл. Совокупный учет представленных особенностей строения мышечной ткани позволяет считать целесообразным увеличение дозы препарата на порядок - до 50 мкл/мл или 0,05 мл/см.
преп
преп
кровь
кровь
преп
9
Таким образом, для формирования тканевого кровотока и инволюции инфильтративно-некротических изменений мягких тканей у больных с хронической ишемией нижних конечностей путем внутримышечного введения лизата тромбоцитов в бесплазменной среде (V), полученного из тромбоконцентрата с клеточностью не менее 1000 кл*10/л и содержанием функционально полноценных клеток не менее 38%,  следует проводить расчет количества препарата по формуле V = «объем ишемизированной зоны» *0,05, где 0,05 - доза препарата в мл. Расчёт количества венозной крови пациента (V, мл), необходимого для формирования препарата, проводят по эмпирической формуле V=V*10.
Пример 1
Пациент С., 73 лет. Проходил лечение с диагнозом: «Атеросклероз. Окклюзия левой бедренной артерии, окклюзия подколенной артерии, артерий голени справа. Хроническая критическая ишемия левой нижней конечности».
При первой госпитализации предъявлял жалобы на сильные боли в покое в левой нижней конечности (н/к) в покое, чувство онемения и похолодания в ней. Локальный статус: левая н/к бледной окраски, стопа с застойной гиперемией, прохладная на ощупь. Движения и чувствительность сохранены. Икроножные мышцы несколько болезненные при пальпации. Пульсация магистральных артерий определяется на уровне паховой складки, где ослаблена, дистальнее не определяется. Правая н/к нормальной окраски теплая на ощупь. Движение и чувствительность сохранены. Икроножные мышцы безболезненные при пальпации. Пульсация магистральных артерий определяется в скарповском треугольнике.
В соответствии с МЭС пациенту проведено стандартное консервативное лечение, включавшее антиагреганты (Шабунин А. В., Матвеев Д. В., Кузнецов М. Р., Матвеев А. Д. Консервативное лечение хронической ишемии нижних конечностей в практике амбулаторного хирурга. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2019;(3):98-104. https://doi.org/10.17116/hirurgia201903198). Однако значимого улучшения получено не было. Исходя из этого, пациенту было предложено проведение процедуры терапевтического ангиогенеза.
99m
После получения добровольного информированного согласия в рамках подготовки к получению аутологичноро бесклеточного препаратата, содержащего ростостимулирующие факторы тромбоцитов, 25.03.2020 выполнена трёхфазная сцинтиграфия мягких тканей и костей 25.03.2020 (исходная) с остеотропным радиофармпрепаратомTc-пирфотех 562 МБк в/в; л/н 3,2 мЗв.
Протокол исследования.В гемодинамическую фазу: магистральный кровоток н/к на осмотренном уровне (бедро до коленного сустава) слева прослеживается на всем протяжении, ослаблен, справа сохранен до уровня верхней трети бедра, дистальнее - резко снижен и замедлен.  В тканевую и костную фазу: обе нижние конечности визуализируется на всем протяжении в обе фазы. На уровне бедер кровоток симметричный. Справа в мягкотканевую фазу отмечается умеренная диффузная гипофиксация РФП на уровне голеностопного сустава и стопы. Слева в обе фазы исследования отмечается диффузно-повышенное накопление РФП (КОН = 1,3 в тканевую и 2,0 в костную фазу), на фоне которого на уровне верхней трети левой голени в проекции задней группы мышц регистрируется зона очаговой гиперфиксации РФП с КОН 1,9 в тканевую фазу с нарастанием до 5,7 в костную (формирующиеся некротические изменения).
Заключение:  СПРАВА: тканевой кровоток прослеживается на всем протяжении, диффузно снижен на уровне голеностопного сустава и в стопе. СЛЕВА: тканевой кровоток левой н/к прослеживается на всем протяжении, в мышцах голени определяются инфильтративно-некротические изменения.
2
2
3
2
3
3
Далее по планарным сцинтиграммам на рабочей станции с программным обеспечением XELERIS произведена разметка и расчет объемов двух наиболее крупных ишемических очагов, локализующихся в верхней и средней третях левой голени, в проекции задней группы мышц. Расчет проводили по формуле объема эллипсоида V=4/3× π×R×r. Так, объем более крупного очага, с длинным размером 11.9см и коротким размером 3.06 см, составил V=4/3×3.14×(11.9/2)×(3.06/2)= 57 см.Объем второго (меньшего) очага, с длинным размером 7.55 см и коротким размером 2.43 см, составил V=4/3×3.14×(7.55/2)×(2.43/2)=23 см. Таким образом, оба очага локализованы в верхней и средней трети левой голени, в проекции задней группы мышц, их расчетный объем составил 57 и 23 см.
3
3
3
9
преп
кровь
Исходя из суммарного объема очагов ишемии (80 см = 57 см (очаг 1) + 23 см (очаг 2), для проведения терапевтического ангиогенеза была определена доза аутологичного бесклеточного препарата (V, мл), которая составила 80*0,05 мл=4 мл. Количество венозной крови пациента (V), необходимое для формирования препарата, составило 40 мл. Далее у пациента был произведен забор 40 мл крови с сохранением стерильности из кубитальной вены в пробирки с антикоагулянтом EDTA. Тромбоциты выделяли по стандартной методике с двумя центрифугированиями при 300 и 700g, соответственно. После формирования осадка тромбоцитов из пробирки полностью удаляли обеднённую плазму и вносили стерильный физиологический раствор 0,9% NaCl в объеме 4 мл. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и обследовали на концентрацию тромбоцитов. Поскольку концентрация тромбоцитов в суспензии составила 1075 кл*10/л (что укладывалось в диапазон целевых значений), она была сразу заморожена при температуре -40°С. Размораживание тромбоцитов в бесплазменной среде производили при +4°С в течение 12 часов. После размораживания пробирку центрифугировали 20 минут с ускорением 3000g. Бесклетоный супернатант отбирали для внутримышечного введения.
Для введения препарата пациента уложили в положение на животе, кожу в верхней трети левой голени, в проекции задней группы мышц широко обработали в соответствии с правилами асептики и антисептики. Исходя из 4 мл объема препарата, рассчитали  количество инъекций - 10=4(мл)*2,5(среднее количество инъекций для введения 1 мл препарата). Полученное количество точек инъекций равномерно распределяют таким образом, чтобы ввести препарат как в ишемизированные, так и пограничные ткани. При этом точки введения препарата предпочтительно располагают на расстоянии друг от друга не менее 2 см. Введение препарата проводили шприцем через иглу. В каждой точке иглу сначала проводили через мягкие ткани к мышцам и только затем начинали непрерывно медленно вводить препарат, быстро продвигая иглу вглубь до 3,0 см. При достижении целевой глубины переходили к извлечению иглы, но при этом продолжали медленное введение препарата. После выполнения всех инъекций накладывали асептическую повязку.
Повторная госпитализация через 4 месяца. При госпитализации: Жалобы на боли в левой нижней конечности при прохождении 200 м. Локальный статус: Левая н/к нормальной окраски, тёплая на ощупь. Движения и чувствительность сохранены. Икроножные мышцы безболезненные при пальпации. Пульсация магистральных артерий определяется в на уровне паховой складки, где ослаблена, дистальнее не определяется. Правая н/к нормальной окраски теплая на ощупь. Движение и чувствительность сохранены. Икроножные мышцы безболезненные при пальпации. Пульсация магистральных артерий определяется в скарповском треугольнике.
99m
Трёхфазная сцинтиграфия мягких тканей и костейс Tc-пирфотехом28.07.2020(422 МБк в/в; л/н 2,4 мЗв):
Протокол исследования
В гемодинамическую фазу: магистральный кровоток на осмотренном уровне (от середины бедра до верхней трети голени) справа прослеживается на всем протяжении, слева - не определяется. В тканевую и костную фазу: обе нижние конечности визуализируется на всем протяжении в обе фазы. На уровне бедер кровоток симметричный. Справа в мягкотканевую фазу отмечается умеренная гиперфиксация РФП в мягких тканях икроножной области с уменьшением захвата РФП в костную фазу (с 1,42 до 1,28), отмечается умеренная диффузная гипофиксация РФП на уровне голеностопного сустава. В области коленного сустава умеренная гиперфиксация РФП, что, вероятно, связано с инфильтративными изменениями.  Слева в верхней половине голени в проекции задней группы мышц гиперфиксация РФП в тканевую фазу (КОН = 2,7) без нарастания в костную фазу (КОН 1,7) - инфильтративные изменения. Зон отсутствия микроциркуляции не определяется.
Заключение: СПРАВА: Тканевой кровоток сохранен на всем протяжении, инфильтративные изменения мягких тканей икроножной области.  СЛЕВА: Нарушение магистрального кровотока на уровне нижней половины бедра и верхней трети голени. Тканевой кровоток левой н/к сохранен на всем протяжении, инфильтративные изменения в мышцах голени. В сравнении с результатами от 25.03.20  отмечена положительная динамика - увеличение КОН в тканевую фазу с 1,9 до 2,7, что свидетельствует о формирование тканевого кровотока, а также уменьшение КОН с 5,7 до 1,7 в костную фазу, что свидетельствует о инволюции инфильтративно-некротических изменений (Таблица 2).
Таблица 2. Полуколичественные показатели по данным трёхфазной сцинтиграфии
КОН1
КОН2
ТФ
КФ
ТФ
КФ
1,9
5.7
2,7
1,7
КОН1 - коэффициент относительного накопления, исходные данные;
КОН2 - коэффициент относительного накопления, контроль через 4 месяца;
ТФ - тканевая фаза, КФ - костная фаза.
Таким образом, у пациента с хронической ишемией нижних конечностей при лечении аутологичным бесклеточным препаратом, содержащим ростостимулирующие факторы тромбоцитов, через 4 месяца отмечены клинические и сцинтиграфические признаки формирования тканевого кровотока и инволюция инфильтративно-некротических изменений мягких тканей в зоне ишемии.
Пример 2
Пациент К., 53 лет. Проходил лечение с диагнозом: «Атеросклероз. Окклюзия левой поверхностной бедренной артерии. Окклюзия левой подколенной артерии. Хроническая ишемия левой нижней конечности».
При первой госпитализации предъявлял жалобы на похолодание и боли в левой нижней конечности  в покое, чувство онемения в стопе. Локальный статус: Левая стопа бледно-розовой окраски, прохладнее правой на ощупь. Подкожные вены на стопе заполнены слабо. Движения в стопе сохранены. Чувствительность в стопе снижена. Икроножные мышцы не напряжены, при пальпации слабоболезненны. Пульсация магистральных артерий определяется в бедренном треугольнике, дистальнее отсутствует. В нижней трети левого бедра имеется послеоперационный рубец - область рубца без особенностей. Правая нижняя конечность нормальной окраски, теплая на ощупь. Движения и чувствительность сохранены. Икроножные мышцы не напряжены, при пальпации безболезненны.  Пульсация магистральных артерий определяется на всех уровнях
В соответствии с МЭС пациенту проведено стандартное консервативное лечение, включавшее антиагреганты. Однако значимого улучшения получено не было. Исходя из этого, пациенту было предложено проведение процедуры терапевтического ангиогенеза.
99m
После получения добровольного информированного согласия в рамках подготовки к получению аутологичноро бесклеточного препарата, содержащего ростостимулирующие факторы тромбоцитов, 09.12.2020 выполнена трёхфазная сцинтиграфия мягких тканей и костей (исходная) с остеотропным радиофармпрепаратомTc-пирфотех 516 МБк в/в; л/н 2.9 мЗв (рисунок).
Протокол исследования. В сосудистую фазу: магистральный артериальный кровоток на осмотренном уровне (со средней трети бедра до средней трети голени) справа сохранен на осмотренном уровне, слева - кровоток коллатерального типа.  В тканевую и костную фазы: Обе нижние конечности визуализируются на всех уровнях.   Накопление РФП на уровне бедер симметричен. Слева, с области коленного сустава нижней конечности и дистальнее отмечается умеренное снижение накопления РФП (КОН 0,8-0,87) в тканевую фазу с нарастанием КОН в костную фазу до 0,85-0,92.  На уровне предплюсны левой стопы  - накопление индикатора умеренно повышено в обе фазы (КОН - 1,17).  Очагов некроза и зон отсутствия кровотока не определяется.
Заключение: Магистральный артериальный кровоток справа сохранен на осмотренном уровне (средняя треть бедра до средней трети голени), слева - кровоток на осмотренном уровне коллатерального типа. Умеренное нарушение тканевого кровотока левой н/конечности с уровня коленного сустава, преимущественно в стопе. Умеренные инфильтративные изменения на уровне предплюсны левой стопы.  Полученные данные соответствуют ишемии левой н/конечности 1-2А степени.
1
1
2
2
1
с
a
b
2=
a
b
2
2
3
Далее по планарным сцинтиграммам на рабочей станции с программным обеспечением XELERIS произведена разметка и расчет объемов зоны ишемического поражения (фиг.7). Расчет проводили по формуле объема усеченного конуса: V=1/3 · π · h · (r+ r· r + r). Так, объем зоны ишемии рассчитан исходя из следующих параметров: вертикальный размер (h) 14 см, половина наименьшего горизонтального размера зоны ишемии (r=1/2 d) 3,5 см, половина среднего арифметического значения для наибольшего горизонтального размера голени в зоне ишемии (d), горизонтальный размер по верхнему краю области ишемических изменений (d), т.е. r ((d+ d)/2)/2=5. Объем зоны ишемии составил V=1/3 × 3,14 × 14 × (12,3+ 17,5 + 25) = 803см.
3
Таким образом, очаг локализован в верхней и средней трети левой голени, в проекции задней группы мышц, его расчетный объем составил 803 см.
3
9
9
преп
кровь
Исходя из объема очага ишемии 803 см, для проведения терапевтического ангиогенеза была определена доза аутологичного бесклеточного препарата (V, мл), которая составила 803*0,05= 40 мл. Количество венозной крови пациента (V), необходимое для формирования препарата в соответствии с эмпирической формой составило 400 мл. Однако в связи с тем, что концентрация тромбоцитов в крови у пациента составляла  390 кл*10/л с долей полноценных 49%, принято решение о заборе всего 200 мл количества крови. Далее пациенту была проведена предварительная инфузионная терапия в объеме 200 мл, после которой произвели забор 200 мл крови с сохранением стерильности из кубитальной вены в пробирки с антикоагулянтом EDTA. Тромбоциты выделяли по стандартной методике с двумя центрифугированиями при 300 и 700g, соответственно. После формирования осадка тромбоцитов из пробирки полностью удаляли обеднённую плазму и вносили стерильный физиологический раствор 0,9% NaCl в объеме 40 мл. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и обследовали на концентрацию тромбоцитов. Поскольку концентрация тромбоцитов в суспензии составила 1096 кл*10/л (что укладывалось в диапазон целевых значений), она была сразу заморожена при температуре -40°С. Размораживание тромбоцитов в бесплазменной среде производили при +4°С в течение 12 часов. После размораживания пробирку центрифугировали 20 минут с ускорением 3000g. Бесклетоный супернатант отбирали для внутримышечного введения.
Для введения препарата пациента уложили в положение на животе, кожу в верхней трети левой голени, в проекции задней группы мышц широко обработали в соответствии с правилами асептики и антисептики. Исходя из 40 мл объема препарата, рассчитали  количество инъекций - 100=40(мл)*2,5(среднее количество инъекций для введения 1 мл препарата). Полученное количество точек инъекций равномерно распределяют таким образом, чтобы ввести препарат как в ишемизированные, так и пограничные ткани. При этом точки введения препарата предпочтительно располагают на расстоянии друг от друга не менее 2 см. Введение препарата проводили шприцем через иглу. В каждой точке иглу сначала проводили через мягкие ткани к мышцам и только затем начинали непрерывно медленно вводить препарат, быстро продвигая иглу вглубь до 3,0 см. При достижении целевой глубины переходили к извлечению иглы, но при этом продолжали медленное введение препарата. После выполнения всех инъекций накладывали асептическую повязку.
Повторная госпитализация через 2 месяца. При госпитализации: Жалобы на боли в левой нижней конечности при прохождении 40-50 м. Локальный статус: Левая н/к нормальной окраски, тёплая на ощупь. Движения и чувствительность сохранены. Икроножные мышцы безболезненные при пальпации. Пульсация магистральных артерий определяется  на уровне паховой складки, где ослаблена, дистальнее не определяется. Правая н/к нормальной окраски теплая на ощупь. Движение и чувствительность сохранены. Икроножные мышцы безболезненные при пальпации. Пульсация магистральных артерий определяется в скарповском треугольнике.
Трёхфазная сцинтиграфия мягких тканей и костей  с 99mTc-пирфотехом 26.01.21 (500 МБк в/в; л/н 2,8 мЗв): Протокол. В сосудистую фазу: магистральный артериальный кровоток на осмотренном уровне (на уровне бедра) справа прослеживается на всем уровне, слева кровоток сохранен на уровне верхней половины, дистальнее - коллатерального типа. В тканевую и костную фазы: слева и справа накопление РФП определяется на всех уровнях до стоп включительно. Распределение РФП достаточно симметричное (КОН 0,97 - 1,0). Зон отсутствия  микроциркуляции и очагов гиперфиксации РФП (очагов некроза) не определяется.
Заключение: Магистральный артериальный кровоток на уровне бедра справа сохранен, слева определяется только на уровне верхней половины, дистальнее коллатеральный. Тканевой кровоток обеих нижних конечностей сохранен на всех уровнях до стоп включительно. Очагов некроза не определяется. В сравнении с результатами от 09.12.20 отмечена положительная динамика - увеличение КОН в тканевую фазу с 0,8 до 1, что свидетельствует оформировании тканевого кровотока (Таблица 3). При этом уменьшена разница накопления РФП в мышцах голени между больной и здоровой голенью.
Таблица 3  Полуколичественные показатели по данным трёхфазной сцинтиграфии
КОН1
КОН2
ТФ
ТФ
0.8
1.0
КОН1 - коэффициент относительного накопления, исходные данные;
КОН2 - коэффициент относительного накопления, контроль через 2 месяца;
ТФ - тканевая фаза.
Таким образом, у пациента с хронической ишемией нижних конечностей при лечении аутологичным бесклеточным препаратом, содержащим ростостимулирующие факторы тромбоцитов, через 2 месяца отмечены клинические и сцинтиграфические признаки формирования тканевого кровотока в зоне ишемии.
.