СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА CTP-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ ГОРМОНА РОСТА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ

1. Способ получения полипептида гормона роста человека (hGH), модифицированного карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека, причем указанный полипептид, состоящий из двух СТР, присоединенных к карбоксиконцу hGH и один CTP присоединен к аминоконцу hGH, где аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, способ включает стадии:
(а) стабильного трансфицирования заданного количества клеток вектором экспрессии, содержащим кодирующую часть, кодирующую указанный CTP-модифицированный hGH; где указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH;
(b) получение клеточных клонов, которые сверхэкспрессируют указанный CTP-модифицированный hGH;
(c) размножения указанных клонов в растворе до заданной величины;
(d) сбора указанного раствора, содержащего указанные клоны;
(e) фильтрования указанного раствора, содержащего указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и,
(f) очистки указанного отфильтрованного собранного раствора для получения раствора очищенного белка, имеющего желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH;
тем самым получая CTP-модифицированный hGH.
2. Способ по п.1, где указанная стадия (с) включает размножение клонов, полученных из рабочего банка клеток (WCB) или основного банка клеток (MCB), которые оптимально экспрессируют и секретируют указанный CTP-модифицированный hGH.
3. Способ по любому из пп.1-2, где на стадии (c) указанные клоны экспрессируют и секретируют CTP-модифицированный hGH на уровне по меньшей мере 600 мг/л.
4. Способ по любому из пп.1-3, где на стадии (с) указанные клоны размножаются в растворе посредством серии стадий субкультивирования до уровня производственного биореактора.
5. Способ по п.4, где указанный биореактор включает одноразовый биореактор или биореактор из нержавеющей стали, и указанный биореактор работает как биореактор с периодическим культивированием с подпиткой.
6. Способ по любому из пп.1-5, где на стадии (f) 60% очищенного CTP-модифицированного hGH в указанном отфильтрованном собранном растворе содержит форму с высоким гликозилированием указанного CTP-модифицированного hGH.
7. Способ по любому из пп.1-6, где указанная очистка (стадия f) указанного отфильтрованного собранного раствора включает последовательное выполнение следующих стадий, включающих:
(g) концентрирования и диафильтрации указанного отфильтрованного собранного раствора;
(h) получения указанного отфильтрованного собранного раствора, полученного после стадии (g) и инактивации вирусов, присутствующих в указанном отфильтрованном собранном растворе, путем инкубации в растворе, токсичном для указанных вирусов;
(i) получения указанного отфильтрованного собранного раствора со стадии (h) и очистку указанного отфильтрованного собранного раствора,
i. где указанная очистка осуществляется путем последовательного пропускания указанного отфильтрованного собранного раствора через анионообменную колонку и колонку гидрофобного взаимодействия с последующей стадией концентрирования и диафильтрации,
ii. где за указанной очисткой следует последовательное пропускание указанного отфильтрованного собранного раствора через колонку смешанного режима с гидроксиапатитом и катионообменной колонкой;
(j) получения указанного отфильтрованного собранного раствора после стадии (ii) и физического удаления указанного отфильтрованного собранного раствора от вирусов путем нанофильтрации;
(k) получения указанного отфильтрованного собранного раствора после стадии (j) и концентрирования и диафильтрации указанного отфильтрованного собранного раствора для получения максимально очищенного отфильтрованного раствора, содержащего указанный CTP-модифицированный hGH.
8. Способ по п.7, где:
a. указанная анионообменная колонка представляет собой колонку DEAE-сефарозы;
b. указанная гидрофобная колонка представляет собой колонку Фенил-HIC;
c. указанный раствор, токсичный для указанных вирусов, представляет собой 1% раствор Triton-X 100;
d. указанная катионообменная колонка представляет собой колонку SP-сефарозы; или
e. указанный вирусный клиренс показывает коэффициент логарифмического уменьшения вируса (LRF - log reduction factor) равный примерно 22.
9. Способ по любому из пп.1-8, где указанный способ обеспечивает, по меньшей мере, 20% уровень извлечения сильно гликозилированного CTP-модифицированного hGH.
10. Способ по любому из пп.1-9, где указанный способ изготовления представляет собой процесс без участия животных.
11. Способ по любому из пп.1-10, где чистота белка CTP-модифицированного hGH составляет по меньшей мере 90%.
12. Способ по любому из пп.1-11, где по меньшей мере одна из последовательностей CTP гликозилирована.
13. Способ по любому из пп.1-12, где указанный полученный СТР-модифицированный hGH сильно гликозилирован.
14. Способ по любому из пп.1-13, где шаблон гликозилирования полученного CTP-модифицированного hGH включает гликозилирование по меньшей мере трех O-связанных сайтов гликозилирования на каждом CTP.
15. Способ по любому из пп.1-14, где CTP-модифицированный hGH полипептид включает гликозилирование в пределах от 9 и 24 О-связанных сайтов гликозилирования.
16. Способ по любому из пп.1-15, где указанный полученный СТР-модифицированный hGH сильно сиалилирован.
17. Способ по любому из пп.1-16, где полипептид содержит два дисульфидных мостика.
18. Способ по п.17, где один дисульфидный мостик находится между остатком цистеина 81 и остатком цистеина 193 из SEQ ID NO: 7 и второй дисульфидный мостик находится между остатком цистеина 210 и остатком цистеина 217 из SEQ ID NO: 7.
19. Полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированного карбокси-концевым пептидом (CTP) гонадотропина хориона человека, причем указанный полипептид, состоящий из двух СТР, присоединенных к карбоксиконцу hGH и одной CTP, присоединенной к аминоконцу hGH, где аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, где указанный CTP-модифицированный полипептид hGH включает гликозилирование от 9 до 24 O-связанных сайтов гликозилирования, где указанный CTP-модифицированный полипептид hGH содержит два дисульфидных мостика и, где один дисульфидный мостик находится между остатком цистеина 81 и остатком цистеина 193 из SEQ ID NO: 7, и второй дисульфидный мостик находится между остатком цистеина 210 и остатком цистеина 217 из SEQ ID NO: 7, полученный способом по любому из пп. 1-15.
20. Способ лечения субъекта, которому требуется лечение с помощью hGH, где указанному субъекту вводят эффективное количество:
СТР-модифицированного hGH полученного в соответствии со способом по любому из пп.1-18, или
СТР-модифицированного hGH в соответствии с п.19.
21. Применение:
СТР-модифицированного hGH полученного в соответствии со способом по любому из пп.1-18, или
СТР-модифицированного hGH в соответствии с п.19,
в производстве лекарственного средства для лечения субъекта, требующего лечения с помощью hGH.