Роль неорганических и органических добавок при кристаллизации фосфатов кальция из прототипов плазмы крови

ХИМИЯ

Вестн. Ом. ун-та. 2016. № 4. С. 60-66. УДК 546.05.544.77

О.А. Голованова, Т.И. Левченко, Ю.А. Кутузова

РОЛЬ НЕОРГАНИЧЕСКИХ И ОРГАНИЧЕСКИХ ДОБАВОК ПРИ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ ИЗ ПРОТОТИПОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ*

Представлены результаты исследований процессов кристаллизации в растворах, моделирующих состав плазмы крови человека. Осуществлен синтез из прототипов плазмы крови человека в зависимости от пересыщения и времени эксперимента, и установлено, что полученные твердые фазы состоят из октакальцийфосфата, карбонатгидроксиапа-тита B-типа, витлокита. Исследовано влияние добавок (ионов магния, аланина и глицина) на процесс кристаллизации фосфатов кальция. Выяснено, что присутствие добавок в модельном растворе уменьшает размер кристаллитов и долю карбонат-гидроксиапатита в твердой фазе. Изучена биоактивность синтетических образцов, и установлены кинетические характеристики. В результате термической обработки твердых фаз в интервале температур 200-800 °C определены основные фазовые переходы.

Ключевые слова: кристаллизация, пересыщение, фосфат кальция, плазма крови, кинетика растворения, термопревращения, ионы магния, аланин, глицин.

Введение

За последние годы увеличился процент патогенного минералообразо-вания в кровеносных сосудах, сердечных клапанах [1-9]. Это связано с целым рядом факторов как экзогенного характера, так и эндогенного. Поэтому изучение процессов кристаллизации малорастворимых соединений, образующихся в организме человека, с целью профилактики и предотвращения заболеваний является перспективным направлением исследований.

Плазма крови представляет собой воду, содержащую главным образом растворенные соли и белки. Химический состав растворимых в плазме крови веществ относительно постоянен, так как существуют мощные нервные и гуморальные механизмы, поддерживающие гомеостаз (постоянство внутренней среды). Растворимые вещества плазмы отставляют около 10 % массы крови, из них на долю белков приходится около 7 %, на долю неорганических солей - 0,9 %, остальную часть образуют небелковые органические соединения [10]. В плазме имеются белки, обеспечивающие иммунитет (иммуноглобулины), и белки, участвующие в свертывании крови. Плазма также содержит гормоны, электролиты, жиры, cахар, минеральные вещества и витамины.

Функции плазмы не ограничиваются транcпортировкой клеток крови. Плазма - своего рода запас воды для организма; плазма предотвращает слипание кровеносных сосудов и их закупорку тромбами, участвует в регуляции артериального давления и обеспечивает снабжение всех органов питательными веществами и кислородом. Антитела плазмы (особая группа белков) активно защищают организм от чужеродных агентов - вирусов, бактерий, грибов и злокачественных клеток. Белки cвертывающей системы крови, находящиеся в плазме, предотвращают кровотечения. Еще одна функция плазмы - транспортировка гормонов и регулирование их влияний, а также участие в поддержании температуры тела [11].

Неорганические компоненты плазмы представлены макро- и микроэлементами. Они могут находитьcя в плазме как в ионизированной форме в виде простых (№, №+, Ca2+ и др.) и сложных (H2PO4-, HPO42-, PO43-,

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 15-29-04839 офи_м).

© Голованова О.А., Левченко Т.И., Кутузова Ю.А., 2016

НСО3-, 8042- и др.) ионов, так и в составе органических соединений - белках, белковых солях, хелатах и т. д. Неорганический состав плазмы крови достаточно хорошо изучен (табл. 1).

Таблица 1

Данные для приготовления модельного раствора

Компонент ион Среднеезначение концентрации (ммоль/л) Значение концентрации (ммоль/л) Для пересыщения 3

Ca2+ 2,35 3,94

Na+ 143 26

K+ 4,35 4,52

Mg2+ 0,95 0,95

NH4+ 0,04 0,04

Cl- 103 4,89

SO42- 0,45 -

CO32- 26 26

PO43- 1,3 2,28

В крови постоянно содержится некоторое количество свободных аминокислот. Часть из них экзогенного происхождения, т. е. попадает в кровь из пищеварительного тракта, другая часть аминокислот образуется в результате распада белков ткани. Почти пятую часть содержащихся в плазме аминокислот составляют аланин и глутамин. Содержание свободных аминокислот в сыворотке и плазме крови практически одинаково, но отличается от уровня их в эритроцитах.

Таким образом, на данный момент существуют достаточно обширные данные о составе плазмы крови, что позволяет проводить моделирование процессов, протекающих в исследуемой среде.

По результатам исследования поражения коронарных артерий авторами [12] выделены три независимых фазы атеросклеротического поражения коронарных артерий, сопряженные с кальцификацией атеросклеротической бляшки: а) фиброзные участки бляшки с незначительным содержанием липидов; б) заключительная стадия формирования некротических очагов; в) кровоизлияние и тромбооб-разование. Кальцификаты указанных зон ате-росклеротической бляшки имеют собственные характерные морфологические и композиционные особенности. При этом единственной кристаллизованной фазой кальцификатов является гидроксиапатит, а начальной стадией петрификации являются скопления микро- и наночастиц гидроксиапатита, при этом механизмы их формирования в толще атеросклеро-тической бляшки и на поверхности при тром-богенезе различны. Не исключено, что минерализация участков, непосредственно контактирующих с кровью, является пассивным физико-химическим процессом.

Кальцификаты являются типичными биогенными минералами, тесно связанными пространственно, генетически, структурно и морфологически с составляющими тканей

организма. Степень дефектности его всегда высока и зависит в большей степени от локальных процессов, чем от состояния организма в целом. Соотношение Са/Р в кальци-натах, по литературным данным, варьирует в значительных пределах. В матричных везикулах это соотношение может быть около 0,66, а в зрелом апатите доходит до 2. Размер кристаллов в процессе созревания биоапатита увеличивается от наноразмерных до 100 и даже более микрон. Патогенный апатит не имеет такой тесной связи с обменными процессами в организме, как физио-генный. Отсюда можно сделать вывод, что кристаллохимия природного неорганического апатита невероятно сложна, а структура биоапатита имеет ряд дополнительных особенностей, при этом минерализация тканей изучена недостаточна.

Именно из-за кальцификации сроки функционирования трансплантатов сердечных клапанов ограничены. В связи с этим возникает настоятельная необходимость в исследовании механизма инициации кальци-ноза как коллагеновых и мышечных тканей, так и трансплантатов клапанов сердца с целью разработки на основе полученных представлений способов его предотвращения.

Цель работы - изучение кристаллизации фосфатов кальция из прототипов плазмы крови человека в присутствии неорганических и органических добавок, исследование их свойств (биоактивность, термическая деградация) .

Экспериментальная часть

Для расчета состава модельных растворов использовали значения средней концентрации неорганических ионов, входящих в плазму крови человека (табл. 1). Выбор исходных реагентов и их соотношение в растворе определяли таким образом, чтобы концентрации ионов и ионная сила раствора были максимально приближены к параметрам плазмы крови человека.

В качестве исходных реагентов использовали соли марки ч.д.а. и х.ч. и дистиллированную воду. Для каждой серии экспериментов были приготовлены растворы, содержащие катионы и анионы, при совместном присутствии которых в данных условиях не образуются малорастворимые соединения (отдельно катионы и анионы, которые являются осадкообразующими). В каждом из исходных растворов производили корректировку значений рН до физиологического значения (7,4 ± 0,01) путем добавления 30 %-го раствора NaOH или HCl (конц.) и ионной силы до значения 0,146. После смешения эквивалентных объемов растворов получали раствор с заданным пересыщением относительно произведения растворимости гидрофосфата кальция и рассчитанной концентрацией исходных компонентов (табл. 1). Все опыты проводили при температуре 25 0С, в

отсутствии перемешивания. Время синтеза составляло: 2, 4 ^ = 50, 100); 8, 10, 12 ^ = 25, 50, 100) недель. По окончанию опыта раствор отфильтровывали и высушивали осадок в сушильном шкафу при температуре ~ 80 °С до полного удаления воды [13].

Для изучения влияния неорганических и органических веществ в модельную систему добавляли соответствующие компоненты: ионы магния в концентрациях, превышающих физиологическую в 2, 4, раза; глицин, аланин - в физиологической концентрации и превышающей физиологическую в 10 и 50 раз (табл. 2).

Таблица 2 Концентрация исследуемых добавок

Вещество Концентрация, ммоль/л

Сфиз Сфиз'10 Сфиз'50

Аланин 0,495 4,95 24,75

Глицин 0,250 2,500 12,5

Магний-ионы Сфиз Сфиз*2 Сфиз*4

0,95 1,9 3,8

Фазовый состав полученных осадков исследован с помощью РФА (ДРОН-3) и ИК-спектроскопии (спектрофотометре «ФТ-02»). Идентификация пиков на дифрактограммах проводилась с помощью картотеки JCPDS и программных пакетов DifWin4.0 и Crystallographica Search-Match. Содержание присутствующих фаз в образцах определяли по методу корундовых чисел (метод Чанга, программа Crystallographica Search-Match). Размеры области когерентного рассеяния (ОКР, минимальные размеры кристаллитов) твердых фаз определены по формуле Дебая-Шеррера [14]. Параметры и объем элементарной ячейки кристаллов были вычислены по формулам для гексагональной сингонии ГА.

Для изучения энергетики процессов термического разложения полученных твердых фаз проводился термогравиметрический анализ (ТГА). Навеску образца массой 0,2000 ± 0,0005 г помещали в керамические тигли и нагревали в муфельной печи от 200 0С до 1000 ос, с шагом 200 ос. Затем пробу с осадком охлаждали до комнатной температуры взвешивали на аналитических весах. Эксперимент проводили в трех кратной повторности.

Изучение резорбции (растворимости) полученных образцов проводилось путем их динамического растворения при постоянном перемешивании в растворе 0,9 %-го хлорида натрия (рН«7), в ацетатном (pH = 4,75) и трис-буфере (pH = pH=7,4) при температуре 18-20 °C. Через определенные промежутки времени (т = 0-90 мин) с помощью прямой потенциометрии фиксировали значение кислотности среды и показателя концентрации ионов кальция в растворе. На заключительном этапе эксперимента проводилось взвешивание высушенной нерастворившейся

твердой фазы. На основе полученных экспериментальных данных были получены кинетические кривые и проведена их математическая обработка по алгоритму, описанному в работе [15].

Результаты экспериментов и их обсуждение

Результаты РФА показали, что все образцы, синтезируемые в среде модельного раствора плазмы крови человека при варьировании пересыщений и времени синтеза, представляют собой смесь из гидроксилапа-тита (ГА), октокальцийфосфата (ОКФ) и вит-локита, при этом пики максимальной интенсивности находятся близко и накладываются друг на друга, что затрудняет расшифровку. Линиям ОКФ соответствуют пики по шкале 20:28,3;34,4;36,7, линиям ГА соответствуют пики по шкале 20:26,3;33,9;34,6, а линиям витлокита соответствуют пики по шкале 20:17,4;30,2;33,7, причем с увеличением пересыщения и времени синтеза содержание ГА увеличивается (рис. 1).

б

Рис. 1. Дифрактограмма образцов: а) 8 недель S = 10; б) 8 недель S = 100

По параметрам наиболее разрешенных пиков была произведена оценка размера

кристаллитов по формуле Дебая-Шеррера (табл. 3).

Таблица 3 Значения размеров кристаллитов твердых фаз

Время синтеза Пересыщение Размер кристаллитов, нм

8 недель S=25 7,41

S=50 7,50

S=75 7,55

S=100 7,62

10 недель S=25 7,36

S=50 7,56

S=75 7,84

S=100 8,01

12 недель S=25 7,29

S=50 7,48

S=75 7,72

S=100 8,16

Из табл. 4 видно, что при пересыщении равном 25 наблюдается уменьшение размеров кристаллитов в зависимости от времени эксперимента, это связано со снижением фазы ОКФ в составе осадка. Для остальных пересыщений размер кристаллитов растет с увеличение продолжительности синтеза, что связано с увеличением фазы ГА в конечном продукте.

Таблица 4 Сравнение скоростей растворения в исследуемых растворителях

Растворитель Ацетатный буфер Трис-буфер

Пересыщение V, мкмоль/лмин V, мкмоль/лмин

25 2,0048 0,5023

50 1,1279 0,0910

75 1,1633 0,0999

100 0,5432 0,1203

Установлено, что в ИК-спектре всех исследованных образцов в области 1000-1200 см-1 проявляются валентные ассиметричные колебания связей Р-О иона РО43- в области 920980 см-1 - валентные симметричные колебания связей Р-О иона РО43-; в области 500-650 см-1 -деформационные асимметричные колебания связей Р-О в ионе РО4-3. Так же в ИК-спектрах образцов регистрируются полосы поглощения в спектральных областях 1400-1500 и 850900 см-1, относящихся соответственно к валентным и деформационным колебаниям связей С-О карбонат-ионов. Видно, что интенсивность характерная для гидроксилапатита полос колебания ОН- в области 3500 см-1 очень мала. Отсюда можно сделать вывод, что осадок содержит карбонатгидроксилапатит В-типа. Таким образом, в составе полученных твердых фаз обнаружена смесь соединений: карбонатгидроксилапатита В-типа, витлокита и октакальцийфосфата.

Кинетические данные по биоактивности полученных образцов были обработаны и определен порядок реакции графическим методом. Для каждой пробы он был равен нулю, что характерно для гетерогенных реакций ионного обмена, протекающих в растворе. Так же для каждого образца была определена скорость реакции и выявлено, что с увеличением пересыщения скорость растворения изменяется не монотонно, что объясняется различием и сменой в фазовом составе твердых порошков.

Анализ временной зависимости исследуемых образцов общих тенденций для двух растворителей не выявил. Установлено, что наибольшая скорость растворения образцов зафиксирована в ацетатном буферном растворе (табл. 4), по нашему мнению, это связанно с кислой средой данного раствора.

' ' '  ' ' " 'а:: ' ' ' ' 1 ' ' ' ' 1 =г1: ' ' -¿с ' ' 1 -й:

Волновое число.сыт1 Рис. 2. ИК-спектр образца с Б = 100, время синтеза -12 недель

На следующем этапе проводился термогравиметрический анализ (ТГА), для пробы с временем синтеза 12 недель и S = 100. Проанализировав полученные результаты, можно заметить, что наблюдается непрерывная потеря массы исследуемого вещества (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость убыли массы твердых образцов после термопревращений

Установлено, что в интервале температур от 200-400 °С наблюдается наибольшее уменьшение массы, что согласуется с данными [13]. Такое уменьшение связано с удалением адсорбционной и кристаллизационной воды. В интервале от 600-800 °С происходит удаление карбонат-ионов из структуры карбонатгидроксилапатита (табл. 5).

Таблица 5 Основные фазовые превращения продуктов кристаллизации при термообработке

аТ,°С Процессы вызывающие убыль образца

200 Удалением адсорбционной и кристаллизационной воды: Са8(НРО4)2(РО4)4'5Н2О ^ ^Саю(РО4)б(ОН)2 + СаНРО4

400 Плавка монетита с образованием пирофосфата кальция: 2 Саю(РО4)б(ОН)2 + 3СаНРО4 ^ Саю(РО4)б(ОН)2 + 3/2у-Са2Р2От

600-800 Удаление карбонат-ионов из структуры КГА: Са9(РО4)б-х-у(НРО4)у(СОз)х(ОН)2-у ^ Саз(РО4)2+ хСО2 +2у Н2О

Результаты кристаллизации из прототипов плазмы крови человека в присутствии Мg2+

Рентгенофазовый анализ твердых фаз, синтезированных из прототипа плазмы крови в при использовании в качестве добавки ионы магния (табл. 2), показал, что в составе осадка содержится гидроксилапа-тит, вилокит и октакальцийфосфат. Полуколичественный анализ показал преобладание витлокита. При сравнении размеров полученных кристаллов (табл. 6) наблюдается уменьшение размеров при введении в раствор добавки ионов Мg2+, а при увеличении её концентрации размер кристаллитов закономерно уменьшается. Это, по нашему мнению, связанно как с замедлением образования фосфатов кальция в присутствии ионов

Мg2+, так и с незначительном (менее 5 %) образованием малорастворимого соединения магния, Mgз(PO4)2 (рПР = 13).

Таблица 6 Сравнение размеров полученных кристаллитов твердых фаз в присутствии Мд2+

Концентрация Физиологическая Мд2+ *2 Мд2+ *4

Пересыщение Размер кристаллитов, нм

25 7,29 2,36 2,28

50 7,48 2,52 2,41

75 7,72 2,64 2,52

100 8,16 2,71 2,60

По данным ИК-спектров полученных твердых фаз в присутствии Мg2+ отмечены аналогичные закономерности, приведенные выше (рис. 2).

Результаты кристаллизации из прототипов плазмы крови человека в присутствии аланина

Рентгенофазовый анализ твердых фаз, синтезированных из прототипа плазмы крови, показал, что в составе осадка содержится гидроксилапатит, вилокит и октакаль-цийфосфат. Полуколичественный анализ показал преобладание гидроксилапатита. При сравнении размеров полученных кристаллов (табл. 7) наблюдается уменьшение размеров при введении в раствор добавки аланина, также при увеличении концентрации добавки размер кристаллитов закономерно уменьшается. По нашему мнению, органические добавки могут оказывать двустороннее влияние: образовывать комплексные соединения с ионами кальция, а также адсорбироваться на гранях образующихся критсалли-тах, тем самым отравляя их и замедляя рост.

Таблица 7 Сравнение размеров полученных кристаллитов твердых фаз в присутствии аланина

Концентрация Физиологическая Аланин физ. Аланин* 10 0 ю X $ аАл

Пересыщение Размер кристаллитов, нм

25 7,29 6,10 6,08 6,00

50 7,48 6,24 6,14 6,09

75 7,72 6,51 6,29 6,17

100 8,16 6,63 6,32 6,35

По данным ИК-спектроскопии видно (рис. 4), что у всех исследованных образцов в области 471-605 см-1 проявляются деформационное колебание О-Р-О в РО43-; в области 960-1081 см-1 валентное колебание Р-О в РО43-. Области 1650-1500 см-1 и 27002250 см-1 определяются деформационными колебаниями аминогруппы, в остальном ИК-спектр соответствует рис. 2.

Волновое числс^сгл

Рис. 4. ИК-спектр образца с добавкой аланина Б = 100, время синтеза -12 недель

Результаты кристаллизации из прототипов плазмы крови человека в присутствии глицина

Рентгенофазовый анализ твердых фаз, синтезированных из прототипа плазмы крови, с участием глицина показал, что в составе осадка содержится гидроксилапатит, вилокит и октакальцийфосфат. Полуколичественный анализ показал преобладание гид-роксилапатита.

По параметрам наиболее разрешенных пиков была произведена оценка размера кристаллитов (табл. 8), видно, что при введении в систему добавок размер кристаллов уменьшается.

Таблица 8 Сравнение размеров полученных кристаллитов твердых фаз в присутствии исследуемых добавок

Добавки Без добавок Аланин физ Глицин Мg2+

Пересыщение Размер кристаллитов, нм

25 7,29 6,10 5,50 2,36

50 7,48 6,24 5,61 2,52

75 7,72 6,51 5,73 2,64

100 8,16 6,63 6,08 2,71

Сравнение полученных результатов размера кристаллитов синтезированных твердых фаз в присутствие добавок позволил предложить ряд по увеличению их ингибиру-ющего действию на процессы кристаллизации из прототипа плазмы крови человека: аланин < глицин < ионы магния.

Выводы

В результате проделанной работы можно сделать выводы:

• Осуществлен синтез из прототипов плазмы крови человека в зависимости от пересыщения и времени синтеза. Методами РФА и ИК-спектроскопии установлено, что твердые фазы состоят из октакальцийфос-фата, карбонатгидроксиапатита В-типа и витлокита. Установлено, что увеличение времени синтеза и пересыщения исходного раствора способствует кристаллизации карбо-натгидроксиапатита В-типа.

• Исследовано влияние добавок (ионов магния, аланина и глицина) на процесс кристаллизации фосфатов кальция. Выяснено, что присутствие добавок в модельном растворе уменьшает размер кристаллитов.

• Изучено растворение синтезированных образцов в разных растворителях. Установлены кинетические закономерности и получено, что более эффективное растворение наблюдается в ацетатном буфере.

• Определены основные процессы, протекающие при термической обработке синтезированных образцов в интервале температур 200-800 °C. Установлено, что в интервале температур от 200-400 °С наблюдается наибольшее уменьшение массы.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Golovanova O. A., Frank-Kamenetskaya O. V., Pu-nin Y. O. Specific features of pathogenic mineral formation in the human body // Russian Journal of General Chemistry. 2011. № 81 (6). P. 1392-1406.

[2] Tetsuo Kodaka, Ryoichi Mori, Akihiko Hirayama, Tsuneyoshi Sano. Fine structure and mineral components of fibrous stonelike masses obtained from the human mesenteries // The Clinical Electron Microscopy Society of Japan. 2003. № 36. P. 27228.

[3] Becker А., Epple M., Мие11ег K.M., Schmitz I. A comparative study of clinically well-characterized human atherosclerotic plaques with histological, chemical, and ultrastructural methods // Journal of Inorganic Biochemistry. 2004. № 98. P. 20322038.

[4] Kazuyuki Yahagi, Frank D. Kolodgie, Fumiyuki Otsuka. Pathophysiology of native coronary, vein graft, and in-stent atherosclerosis // Nature Reviews Cardiology. 2015. № 10. Р. 1038

[5] Титов А. Т., Ларионов П. М., Щукин В. С., Зай-ковский В. И. Механизм минерализации сердечных клапанов // Поверхность, рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2001. № 3. С. 74.

[6] Kazuyuki Yahagi, Frank D. Kolodgie, Fumiyuki Otsuka Pathophysiology of native coronary, vein graft, and in-stent atherosclerosis // Nature Reviews Cardiology. 2015. № 10. Р. 1038.

[7] Lars-Fride Olsson, Karin Sandin, Rolf Odselius, and Lars Kloo In Vitro Formation of Nanocrystalline Carbonate Apatite - A Structural and Morphological Analogue of Atherosclerotic Plaques // Eur. J. Inorg. Chem. 2007. P. 4123-4127.

[8] Титов А. Т., Ларионов П.М., Зайковский В. И., Иванова А.С. Гидроксилапатит в крови человека // Поверхность, рентгеновские, синхротронные и нейронные исследования. 2000. № 7. С. 66.

[9] Ламанова Л. М. Тканевая кальцификация в сердечно-сосудистой системе // Вестн. ТГУ. 2010. № 337. С. 194-197.

[10] Марри Р. Биохимия человека : в 2 т. М. : ; БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 414 с.

[11] Березов Т. Т., Коровин М. А. Биологическая химия. М. : Медицина, 2002. 704 с.

[12] Ламанова Л. М. Тканевая кальцификация в сердечно-сосудистой системе // Вестн. ТГУ. 2010. № 337. С. 194-197.

[13] Голованова О.А., Кутузова Ю.А. Изучение характеристик фосфатовкальция, синтезированных из модельных растворов плазмы крови // Вестн. Ом. ун-та. 2016. № 1 (79). С. 56-62.

[14] Голованова О. А. Патогенные минералы в организме человека. Омск : Изд-во Ом. гос. ун-та, 2006. 400 а

[15] Измайлов Р. Р., Голованова О. А. Биорезорби-руемость гранулированного композита на основе карбонатгидроксилапатита и желатина в средах с различными значениями рН // Вестн. Ом. ун-та. 2015. № 2. С. 61-65.