СПОСОБЫ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ СПОРОЦИСТ ИЗ ООЦИСТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕГУЛИРУЕМЫХ УСИЛИЙ СДВИГА
METHODS OF SPOROCYST RELEASE FROM OOCYSTS WITH USING CONTROLLED SHEAR LOADS

Настоящая заявка претендует на привилегии и приоритет предварительной патентной заявки США 60/900233, поданной 8 февраля 2007, описание которой включено в данное описание изобретения посредством ссылки, как если бы оно было изложено во всей его полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится, главным образом, к ооцистам и, более конкретно, к способам высвобождения спороцист из ооцист.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Кокцидиоз домашней птицы представляет собой заболевание, вызванное протозойными паразитами рода Eimeria. Ооцисты видов Eimeria повсеместно распространены в окружающей среде и сохраняются в течение многих месяцев в подстилке домашней птицы. Проглатывание ооцист приводит к инфицированию различных участков кишечного тракта видоспецифичным образом. Этот микроорганизм размножается в кишечнике на протяжении нескольких суток, приводя к выделению в экскрементах следующего поколения ооцист. Многократные циклы инфицирования приводят к иммунитету, и, если инфекция присутствует в стае в начале и в равномерном количестве среди стаи, иммунитет, развившийся за нескольких циклов воздействия, может быть довольно сильным.
Напротив, если у птиц не присутствует инфекция равномерным образом, могут возникать ситуации, в которых необработанные ранее птицы подвергаются внезапной массированной инфекции, что приводит к низкой продуктивности в показателях конверсии корма и прироста массы, и к высокому риску вторичных инфекций. В настоящее время наиболее распространенным способом, используемым для контроля кокцидиоза в промышленном птицеводстве, является не вакцинация, а введение в корм антикокцидиальных лекарственных средств. Низкую степень использования вакцин часто относят на счет неточности в равномерности дозирования посредством корма или воды в оборудовании кормушек, или посредством вакцинации в распылительной камере в инкубаторе, которые являются традиционными способами и временем введения. Существует возрастающий интерес к улучшению равномерности доставки вакцины при введении в инкубаторе и к обеспечению, таким образом, более равномерной защиты в стае.
В последнее время были обнаружены способы вакцинации in ovo, подходящие для введения кокцидиальной вакцины на основе живых ооцист (смотри, например, патент США 6500438; патент США 6495146 и патент США 6627205; все в Pfizer, Inc.). Путь введения in ovo обеспечивает подходящий способ доставки стандартной дозы вакцины каждому эмбриону в то время, пока он еще находится в яйце. Доставку птичьих вакцин in ovo в настоящее время практикуют для приблизительно 85% из 9 миллиардов бройлерных птиц, выращиваемых ежегодно в Соединенных Штатах, и с растущим процентом из 21 миллиардов бройлерных птиц, выращиваемых ежегодно за пределами Соединенных Штатов (смотри, например, патент США 4458630 принадлежащий правительству Соединенных Штатов). Следовательно, потенциальный рынок для живой кокцидиальной вакцины, доставляемой in ovo, значительно больше, чем сложившийся в настоящее время рынок для кокцидиальных вакцин, доставляемых после вылупления из яйца.
Ооцисты Eimeria содержат четыре спороцисты в защитной стенке ооцисты. Спороцисты можно использовать в различных целях, включая вакцины, исследование жизнеспособности, получение спорозоита и так далее. В общепринятых способах раскалывания ооцист и высвобождения спороцист используют стеклянные гранулы. Встряхивание ооцист со стеклянными гранулами вызывает раскалывание стенки ооцист и высвобождение спороцист, содержащихся в них. Однако обычно для раскалывания большого процента ооцист требуется значительное встряхивание, и длительное встряхивающее действие может разрушить уже высвободившиеся спороцисты. Аналогичные проблемы имеются у других общепринятых способов высвобождения спороцист, таких как использование измельчителя ткани для высвобождения спороцист. Спороцисты, высвобождаемые рано в этом способе, могут быть уничтожены при продолжении процесса измельчения.
2
Другие общепринятые способы высвобождения спороцист из ооцист включают химическое высвобождение спороцист из ооцист. Обычно ооцисты суспендируют в буфере, содержащем, например, газ СО. Также может быть включен цистеина гидрохлорид. Этот способ ослабляет дисульфидные связи в области микропиле ооцисты. В итоге спороцисты могут высвобождаться через разрушившуюся шапочку микропиле. К сожалению одно химическое высвобождение не всегда является эффективным способом высвобождения спороцист.
Как таковые общепринятые способы высвобождения спороцист из спорулирующих ооцист являются неэффективными, и получается только фракция потенциальных доступных жизнеспособных спороцист. Соответственно, существует необходимость в улучшенных способах высвобождения спороцист из ооцист, которые преодолевают проблемы, связанные с общепринятыми способами.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В свете вышеизложенного обсуждения предложены способы высвобождения спороцист из ооцист, где раствор ооцист подвергают воздействию регулируемых усилий сдвига, достаточных для разрушения стенок ооцист и высвобождения из них жизнеспособных спороцист. Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения, водный раствор ооцист проходит через одну или более камер процессора Microfluidizer при определенных условиях - диаметре камеры, геометрии камеры и давлении. Ооцисты ударяются о стенку камеры и подвергаются воздействию регулируемых, больших усилий сдвига, разрывающих стенку ооцист и высвобождающих неповрежденные спороцисты. Такой способ особенно эффективен для высвобождения спороцист, так как большой процент стенок ооцист может быть расколот, позволяя получить большой процент спороцист. Кроме того, повреждение, причиненное высвобождаемым спороцистам, незначительно, что обеспечивает большой процент извлеченных спороцист, остающихся жизнеспособными.
В некоторых воплощениях ооцисты обрабатывают для ослабления их стенок перед воздействием на раствор регулируемых усилий сдвига. Например, ооцисты можно термически обработать, химически обработать, ферментативно обработать или подвергнуть различным комбинациям термической, химической и ферментной обработки.
В некоторых воплощениях извлеченные спороцисты криоконсервируют для хранения. В некоторых воплощениях извлеченные спороцисты используют для получения вакцины и/или диагностического анализа.
В некоторых воплощениях спорозоиты эксцистируют из извлеченных спороцист. Такие спорозоиты можно использовать для получения вакцины и/или диагностического анализа.
Согласно воплощениям настоящего изобретения типичные ооцисты, из которых могут быть извлечены спороцисты, представляют собой ооцисты Eimeria, такие как ооцисты Eimeria, выбранные из группы, состоящей из ооцист E. maxima, ооцист E. mitis, ооцист Е. tenella, ооцист E. acervulina, ооцист E. brunetti, ооцист E. necatrix, ооцист E. ргаесох, ооцист E. mivati и любой их комбинации; ооцисты Eimeria, выбранные из группы, состоящей из ооцист Е. meleagrimitis, ооцист E. adenoeides, ооцист E. gallopavonis, ооцист E. dispersa, ооцист Е. innocua и ооцист E. subrotunda и любой их комбинации; ооцисты Eimeria, выбранные из группы, состоящей из ооцист Е. zuernii, ооцист E. bovis и любой их комбинации; ооцисты Eimeria, выбранные из группы, состоящей из ооцист Е. ahsata, ооцист E. bakuensis, ооцист E. crandallis, ооцист E. faurei, ооцист E. granulosa, ооцист E. intricate, ооцист E. marsica, ооцист Е. ovinoidalis, ооцист Е. pallida, ооцист Е. parva, ооцист Е. weybridgensis и любой их комбинации; и ооцисты Eimeria, выбранные из группы, состоящей из ооцист Е. intestinalis, ооцист Е. vejdovskyi, ооцист Е. piriformis, ооцист Е. coecicola, ооцист Е. irresidua, ооцист Е. flavescens, ооцист Е. exigua, ооцист Е. magna, ооцист Е. perforans, ооцист Е. media, ооцист Е. stiedai и любой их комбинации.

В некоторых воплощениях предложены способы высвобождения спорозоитов из ооцист, где раствор ооцист подвергают воздействию регулируемых усилий сдвига, достаточных для разрушения стенок ооцист и высвобождения из них спорозоитов. Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения водный раствор ооцист пропускают через одну или более камер процессора Microfluidizer при определенных условиях - диаметре камеры, геометрии камеры и давлении. Ооцисты ударяются о стенку камеры и подвергаются воздействию регулируемых, больших усилий сдвига, разрывающих стенку ооцист и высвобождающих неповрежденные спорозоиты.
Воплощения настоящего изобретения имеют преимущества по сравнению с общепринятыми способами. Например, воплощения настоящего изобретения обеспечивают воспроизводимые, постоянные выходы спороцист. В отличие от этого, на общепринятые способы с использованием стеклянных гранул и измельчителя ткани влияют отклонения в способе их выполнения оператором и они могут приводить к непостоянным выходам спороцист. Кроме того, воплощения настоящего изобретения можно масштабировать, что позволяет экономически выгодно производить спороцисты в крупном масштабе. В отличие от этого, общепринятые способы со стеклянными гранулами и измельчителем ткани не являются легко адаптируемыми к крупномасштабному производству.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг.1-2 представляют собой блок-схемы операций высвобождения спороцист из ооцист согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения.

Фиг.3 представляет собой блок-схему процессора Microfluidizer согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения.
Фиг.4 представляет собой блок-схему операций обработки высвобождаемых спороцист согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения.
Фиг.5 представляет собой блок-схему операций обработки высвобождаемых спороцист и эксцистирования спорозоитов из высвобождаемых спороцист согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение ниже описано более полно со ссылкой на прилагаемые графические материалы, где показаны предпочтительные воплощения изобретения. Настоящее изобретение может, однако, быть воплощено во множестве разных форм и не должно быть истолковано как ограниченное воплощениями, изложенными здесь; точнее, данные воплощения предложены с тем, чтобы данное изложение сущности изобретения было всесторонним и полным, и полностью показывало область изобретения для специалистов в данной области техники.
Одинаковые цифры относятся к одинаковым элементам по всему описанию. На фигурах толщина некоторых линий, слоев, компонентов, элементов или характерных деталей может быть увеличена для ясности. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном описании изобретения, включены в данное описание изобретения посредством ссылки во всей их полноте.
Терминология, использованная в данном описании изобретения, служит только для описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения изобретения. При использовании в данном описании изобретения предполагается, что формы единственного числа также включают формы множественного числа, если контекст ясно не указывает иное. Кроме того, следует понимать, что термины "содержит" и/или "содержащий", при использовании в данном документе, указывают на присутствие определенных признаков, стадий, операций, элементов и/или компонентов, но не исключают присутствия или добавления одной(ого) или более других признаков, стадий, операций, элементов, компонентов и/или их групп. При использовании в данном описании изобретения термин "и/или" включает любые и все комбинации одного или более ассоциированных перечисленных объектов. При использовании в данном описании изобретения следует понимать, что такие фразы, как "от Х до Y" и "от примерно Х до Y" включают Х и Y. При использовании в данном описании изобретения такие фразы, как "от примерно Х до Y", означают "от примерно Х до примерно Y." При использовании в данном описании изобретения такие фразы, как "от примерно Х до Y", означают "от примерно Х до примерно Y."
Если не определено иное, все термины (включая технические и научные термины), использованные в данном описании изобретения, имеют такое значение, которое обычно подразумевается специалистом в данной области техники, к которой данное изобретение принадлежит. Кроме того, следует понимать, что термины, например определенные в обычно используемых словарях, следует понимать как имеющие значение, которое согласуется с их значением в контексте данной заявки и соответствующей области техники и не следует понимать в идеализированном или слишком формальном значении, если только именно это не определено в данном описании изобретения. Хорошо известные функции или конструкции для краткости и/или ясности могут быть не описаны подробно. Последовательность операций (или стадий) не ограничена порядком, представленным в формуле изобретения или фигурах, если иное конкретно не указано.
Воплощения настоящего изобретения пригодны для высвобождения спороцист из ооцист для применений в медицине и ветеринарии, а также для диагностических и/или исследовательских целей. Ооцисты могут быть из простейших, которые инфицируют любое животное, включая млекопитающих и птиц. Термины "животное" и "животные" включают, без ограничения ими, млекопитающих и/или птиц. Подходящие млекопитающие включают, без ограничения ими, приматов (например, людей и приматов, отличных от человека, такие как обезьяна), свиней, коров (например, крупный рогатый скот), коз, лошадей, кошек, овец, собак, мышей (например, мышь, крысу) и зайцеобразных.
Предполагается, что термины "птичий" и "птицы " (например "птица" и "птицы"), при использовании в данном описании изобретения, включают самцов и самок любых видов птиц, но в первую очередь, как предполагается, охватывают домашнюю птицу, которую выращивают в промышленных масштабах для получения яиц, мяса или в качестве домашних животных. Таким образом, предполагается, что термины "птичий" и "птичьи" конкретно включают, без ограничения ими, цыплят, индеек, уток, гусей, перепелок, фазанов, длиннохвостых попугайчиков, попугаев, какаду, австралийских попугаев, обыкновенного страуса, эму и тому подобное. В конкретных воплощениях птица представляет собой курицу или индюшку. При использовании в данном описании изобретения "птичий" или "птица" может относиться к эмбриону птицы in ovo или птице после вылупления.
Термины "криоконсервировать" и "криоконсервирование" понятны специалистами в области техники настоящего изобретения и относятся к сохранению клеток и другого материала с помощью замораживания и хранения при очень низких температурах.
Настоящее изобретение относится главным образом к способам высвобождения спороцисты из протозойных ооцист. Такие способы находят применение, например, в методиках изготовления вакцин. Многие простейшие имеют стадию жизненного цикла, называемую "ооциста." Изобретение можно практически использовать для высвобождения спороцист из ооцист любых видов простейших, содержащих спороцисты, включая, без ограничения ими, Eimeria, Cyclospora, Toxoplasma, Neospora и Isospora.
Настоящее изобретение также может относиться к способам высвобождения спорозоитов из протозойных ооцист. Некоторые простейшие образуют стадию жизненного цикла, называемую "ооциста", но могут содержать спорозоиты в ооцисте и не продуцировать спороцисты. Такие способы находят применение, например, в методах высвобождения спорозоитов из ооцист, включая, но без ограничения ими, инфицирование клеточной линии, анализы инфекционности, изготовление вакцин или диагностические анализы. Изобретение можно практически использовать для высвобождения спорозоитов из ооцист любых видов паразитов, которые содержат спорозоиты в ооцисте, включая, но без ограничения ими, Cryptosporidium и Plasmodium.
Термины "простейшие", "ооциста", "спороциста", "спорозоит" и "мерозоит" имеют свои, общепринятые в данной области техники, значения. Если не указано иное, предполагается, что эти термины относятся к живым (то есть жизнеспособным) простейшим, ооцистам, спороцистам, спорозоитам и мерозоитам, включая аттенуированные формы, хотя специалистам в данной области техники очевидно, что вакцины могут быть приготовлены в виде препарата, используя убитые простейшие, ооцисты, спороцисты, спорозоиты и мерозоиты. Специалистам в данной области техники понятно, что убитые вакцины обычно получают с помощью предварительного очищения живого организма. Также включены в данное описание изобретения генетически модифицированные простейшие, ооцисты, спороцисты, спорозоиты и мерозоиты.
Термин "Eimeria" обозначает один или более видов рода Eimeria. Термин "Eimeria" включает, без ограничения ими, штаммы или виды Eimeria, которые инфицируют птиц (например, цыплят, индеек) или виды млекопитающих (например, крупный рогатый скот, овец или кроликов). Такие виды Eimeria включают те, которые обнаружены у цыплят, включая, без ограничения ими, Е. tenella, Е. acervulina, Е. maxima, Е. necatrix, Е. mitis, Е. ргаесох, Е. mivati и E. brunetti; и также те, которые обнаружены у индеек, включая, без ограничения ими, Е. meleagrimitis, Е. adenoeides, Е. gallopavonis, Е. dispersa, Е. innocua, и E. subrotunda, и те, которые инфицируют крупный рогатый скот, такие как, без ограничения ими, Е. bovis и E. zuernii; виды Eimeria, которые инфицируют овец, такие как, без ограничения ими, E. ahsata, Е. bakuensis, Е. crandallis, Е. faurei, Е. granulosa, Е. intricata, Е. marsica, Е. ovinoidalis, Е. pallida, Е. parva, Е. weybridgensis; и виды Eimeria, которые инфицируют кроликов, включая, без ограничения ими, E. intestinalis, E. vejdovskyi, E. piriformis, E. coecicola, E. irresidua, E. flavescens, E. exigua, E. magna, E. perforans, E. media и E. stiedai. Кроме того, термин "Eimeria" включает все штаммы вышеуказанных видов Eimeria включая, без ограничения ими, дикие штаммы, рано развивающиеся или иным образом отобранные штаммы, аттенуированные штаммы и ооцисты, которые были аттенуированы, например, посредством облучения, химической обработки и подобного. Кроме того термин "Eimeria" также включает любые вновь открытые штаммы или виды Eimeria. Наконец, термин "Eimeria" охватывает живые и инактивированные Eimeria, хотя предполагается для живых Eimeria, если не указано иное.
Композиции, содержащие ооцисты Eimeria, находят применение в методах иммунизации птиц против кокцидиоза. Способы вакцинации птиц против кокцидиоза известны в данной области техники, и включают способы вакцинации in ovo (например, патент США 6500438; патент США 6495146 и патент США 6627205; Pfizer Inc.) и после вылупления (например патент США 3147186 в Auburn Research Foundation; патент США 5055292 и патент США 4438097, оба в National Research Development Corporation).
Термин "простейшие" включает дикие штаммы, рано развивающиеся или иным образом селектированные штаммы, аттенуированные штаммы и ооцисты, которые были аттенуированы, например, посредством облучения, химической обработки и тому подобного. Кроме того, термин "простейшие" также включает любые вновь открытые штаммы или виды простейших. Наконец, термин "простейшие" охватывает как живые, так и убитые простейшие, хотя предполагается для живых простейших, если не указано иное. Термины "продуцировать", "продуцирование" или "продукция" ооцист и тому подобного обычно относятся к процессу получения ооцист из животного и очищения ооцист из фекального вещества.
Способы получения ооцист, таких как ооцисты Eimeria, известны в данной области техники (смотри, например, патент США 3147186 в Auburn Research Foundation; патент США 4544548 в Internationale Octrooi Maatschappij "Octropa" B.V.; патент США 4863731 в Unilever Patent Holdings; международные патентные публикации WO 00/50072 в Pfizer, Inc.; WO 03/020917 в Embrex, Inc.; и WO 02/37961 в Novus International, Inc.; Hammond et al., (1944) Amer. J. Vet. Res. 5:70; Hill et al., (1961) J. Parasit. 47:357; Jackson, (1964) Parasitology 54:87; Lotze et al, (1961) J. Parasit. 47:588; Schmatz et al., (1984) J. Protozool. 31:181; Whitlock, (1959) Aust. Vet. J. 35:310); Kowalik et al., (1999) Parasitol. Res. 85:496-499).
Затем, со ссылкой на Фиг.1-2, будут обсуждаться способы высвобождения спороцист из спорулирующих ооцист согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения. Вначале спорулирующие ооцисты можно предварительно обработать термически, и/или химически, и/или ферментативно для ослабления стенок ооцист (Блок 100). Ослабление, вызванное термической, химической и/или ферментной обработкой, служит причиной того, что стенки ооцист становятся более подверженными разрушению посредством усилий сдвига, приложенных к ним впоследствии. Типичные термические обработки включают, без ограничения ими, нагревание ооцист до 37-41°С в течение от 0,5 до 2 часов. Типичные химические обработки включают, без ограничения ими, раствор гипохлорита или водные растворы, содержащие растворенный диоксид углерода и цистеина гидрохлорид, а также тауродезоксихолевую кислоту. Типичные ферментные обработки включают, без ограничения ими, например, пепсин и различные фосфолипазы. Предварительно термически, химически и/или ферментативно обработанные спорулирующие ооцисты являются возможными вариантами и не требуются в воплощениях настоящего изобретения. Более того, для конкретных типов спорулирующих ооцист может не требоваться предварительной обработки для ослабления их стенок. Можно использовать различные комбинации термической, химической и/или ферментативной обработки.
Получают водный раствор, содержащий спорулирующие ооцисты, суспендированные в нем (Блок 110). Типичные водные растворы включают, без ограничения ими, сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS), фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), среду RPMI, среду DMEM (среда Игла в модификации Дулбекко) или вышеуказанные растворы в комбинации с белком, таким как казеин, или белковым гидролизатом, таким как гидролизат казеина или белковый гидролизат сои. Затем водный раствор подвергают воздействию усилий сдвига, достаточному для разрыва стенок ооцист и высвобождения из них спороцист (Блок 120). Высвободившиеся спороцисты извлекают из водного раствора (Блок 130). Извлеченные спороцисты можно отправить на последующую обработку (Блок 140) и/или можно криоконсервировать (Блок 150).

Обращаясь к Фиг.2, согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения, воздействие на водный раствор ооцист усилий сдвига, достаточное для разрыва стенок ооцист и высвобождения из них спороцист (Блок 120), осуществляют путем пропускания водного раствора под давлением (например, от примерно 2000 фунтов на кв. дюйм (13,8 МПа) до примерно 6000 фунтов на кв. дюйм (41,37 МПа)) через камеру процессора Microfluidizer (Блок 122). Процессоры Microfluidizer можно приобрести у Microfluidics Corporation, 30 Ossipee Road, Newton, MA. Процессоры Microfluidizer позволяют потокам растворов с высоким давлением сталкиваться при сверхвысоких скоростях в точно определенных микроканалах или камерах. (Можно использовать другое устройство для разрушения клеток, включая, без ограничения ими, Constant Cell Disruption System, производимую Constant Systems Ltd., Daventry, Northants, NN11 4SD, England, UK.) Воплощения настоящего изобретения не ограничиваются применением камер процессора Microfluidizer.

В камерах процессора Microfluidizer раствор, протекающий через них, подвергается комбинированному воздействию усилий сдвига и удара. Каждую камеру конструируют с фиксированной геометрией и придают ей форму для ускорения потока продукта до высоких скоростей. Конфигурация с фиксированной геометрией позволяет точно регулировать прилагаемые усилия сдвига и следить за ними.
Регулирование усилий сдвига достигается за счет использования определенных комбинаций геометрии камеры, диаметра камеры и прилагаемого давления. Другие аспекты регулируемого процесса могут включать свойства и композицию используемого раствора, включая такие параметры, как вязкость, удельная плотность, химическое строение, осмотическое давление, рН и температура. Оптимизированные условия могут быть определены специалистом в данной области техники с использованием обычных методик. Стабильность процесса может быть обеспечена путем выполнения пробных прогонов в определенных условиях, используя только буфер и определяя скорость потока. Отслеживание скорости потока с помощью такого тестирования в течение длительного времени дает значение коэффициента износа оборудования или другой неисправности в системе, и может потребоваться корректирующее воздействие для возвращения системы к стандартным рабочим условиям.

Типичные камеры процессора Microfluidizer, которые можно использовать согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения, включают камеры с "Y-образной" и "Z-образной" конфигурацией. Y-образные камеры включают две входящие линии потока, которые сходятся в одной точке и выходят в виде одного потока. Z-образные камеры имеют одну линию потока с Z-образной линией. Конфигурации камеры для оптимального извлечения спороцист могут варьироваться. Соответственно, разные конфигурации камеры могут быть выбраны для разных типов ооцист. Кроме того, камеры процессора Microfluidizer могут быть расположены последовательно.

Кроме того, камеры процессора Microfluidizer могут иметь разные диаметры. Например, можно использовать диаметры от примерно 75 микрон (мкм) до примерно 500 мкм. Камеры процессора Microfluidizer с разными диаметрами также можно располагать последовательно.
5
-1
6
-1
Заявителями обнаружено, что камеры, имеющие диаметр, который по существу равен или больше диаметра ооцист в растворе, являются особенно эффективными. Например, для ооцист E. maxima, которые обычно имеют диаметр примерно 20 мкм - 40 мкм, предпочтительна реакционная камера с диаметром примерно 300 мкм. Однако также можно использовать диаметры в интервале от примерно 75 мкм до примерно 400 мкм. Обычно используемая линия потока имеет Z-конфигурацию, хотя также можно использовать Y-конфигурацию или другую конфигурацию. Скорости потоков обычно варьируются от примерно 500 мл в минуту до примерно 2000 мл в минуту при давлении, в интервале от 1000 фунтов на кв. дюйм (6,895 МПа) до 5000 фунтов на кв. дюйм (34,46 МПа). Величина усилия сдвига, требующегося обычно для высвобождения спороцист из ооцист E. maxima, варьируется от примерно 3,00×10 сек в минуту до примерно 1,50×10 сек в минуту.

6
-1
6
-1
Для ооцист Е. tenella, которые обычно имеют диаметр от примерно 15 мкм до 25 мкм, и Е. acervulina, которые обычно имеют диаметр от примерно 10 мкм до 15 мкм, предпочтительной является реакционная камера процессора Microfluidizer с диаметром 100 мкм. Однако также можно использовать диаметры в интервале от примерно 75 мкм до примерно 400 мкм. Обычно используемая линия потока имеет Z-конфигурацию, хотя также можно использовать Y-конфигурацию или другую конфигурацию. Скорости потоков обычно варьируются от примерно 100 мл в минуту до примерно 250 мл в минуту при давлениях в интервале от 6,9 до 27,6 МПа. Величина усилия сдвига, обычно требующегося для высвобождения спороцист из ооцист E. tenella или Е. Acervulina, составляет от примерно 1,00×10 сек в минуту до примерно 3,00×10 сек в минуту.
Для любых видов ооцист Eimeria для высвобождения спороцист из ооцист можно использовать условия, приводящие к более низким усилиям сдвига, особенно если ооцисты были предварительно обработаны термически, химически или ферментативно. Хотя можно использовать многократное прохождение через камеру, предпочтительным является однократное прохождение.
Воплощения настоящего изобретения не ограничены конкретным диаметром камеры для конкретной ооцисты. В воплощениях настоящего изобретения можно использовать камеры, имеющие все типы конфигураций и диаметры.

На Фиг.3 показан процессор Microfluidizer 200. Показанный процессор Microfluidizer 200 включает входной резервуар 202, содержащий водный раствор спорулирующих ооцист. Водный раствор находится под давлением и перекачивается с помощью насоса 204 (например, насоса-усилителя постоянного давления и так далее) через камеру 206 (например, Y-образную, Z-образную камеру, и так далее). Оооцисты в находящемся под давлением водном растворе подвергают воздействию усилий сдвига и удара в камере 206, что приводит к высвобождению спороцист из стенок ооцист. Водный раствор, содержащий высвобождаемые спороцисты, собирают в выходном резервуаре 208.
Возвращаясь обратно к Фиг.1, согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения, может быть определено процентное содержание спороцист, высвобождаемых и извлеченных из ооцист (то есть выход спороцист) (Блок 160). Выход спороцист можно оценить, например, посредством микроскопии. Спороцисты, считающиеся извлеченными, согласно микроскопии, могут быть как жизнеспособными, так и нежизнеспособными, или их смесь. Однако статус жизнеспособности не может быть определен с помощью одной микроскопии. Таким образом, также можно выполнить определение процентного содержания высвобождаемых спороцист, которые являются жизнеспособными (например, жизнеспособного выхода). Для определения жизнеспособного выхода может требоваться методика in vivo. Подходящие методики in vivo могут включать введение препаратов спороцист птицам посредством перорального чреззондового питания и сравнения полученного выхода ооцист с выходом, полученным при введении равного количества неповрежденных ооцист.
Обращаясь к Фиг.4, извлеченные спороцисты могут быть обработаны различными способами и для различных целей. Например, вакцины могут быть получены из извлеченных спороцист (Блок 141) и криоконсервированы для хранения (Блок 142). Обращаясь к Фиг.5, согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения, извлеченные спороцисты можно обрабатывать, чтобы высвободить (например, эксцистировать) из них спорозоиты (Блок 143). Высвобождаемые спорозоиты можно использовать для получения вакцин (Блок 144) или можно использовать для какой-нибудь другой цели. Вакцины, полученные из эксцистированных спорозоитов, можно криоконсервировать для хранения (Блок 145).
Любой тип ооцист можно обрабатывать согласно воплощениям настоящего изобретения. Особенно подходящие ооцисты представляют собой ооцисты Eimeria, включая, но без ограничения ими, ооцисты E. maxima, ооцисты E. mitis, ооцисты Е. tenella, ооцисты E. acervulina, ооцисты Е. brunetti, ооцисты E. necatrix, ооцисты Е. ргаесох, ооцисты E. mivati и любые их комбинации, ооцисты Е. meleagrimitis, ооцисты E. adenoeides, ооцисты E. gallopavonis, ооцисты E. dispersa, ооцисты E. innocua и ооцисты E. subrotunda, и любые их комбинации, ооцисты E. zuernii, Е. бычьи ооцисты и любые их комбинации, ооцисты E. ahsata, ооцисты E. bakuensis, ооцисты E. crandallis, ооцисты E. faurei, ооцисты E. granulosa, ооцисты E. inthcata, ооцисты E. marsica, ооцисты E. ovinoidalis, ооцисты E. pallida, ооцисты E. parva, ооцисты Е. Weybridgensis и любые их комбинации, ооцисты E. intestinalis, ооцисты E. vejdovskyi, ооцисты E. piriformis, ооцисты Е. coecicola, ооцисты Е. irresidua, ооцисты Е. flavescens, ооцисты Е. exigua, ооцисты Е. magna, ооцисты Е. perforans, ооцисты Е. media, ооцисты Е. stiedai и любые их комбинации.
После описания настоящее изобретение более подробно пояснено в следующих примерах, которые включены в данное описание изобретения только для иллюстративных целей и которые не предназначены для ограничения изобретения.
Пример 1
8
5

Серии экспериментов выполняли для планирования выделения спороцист и раскалывания ооцист в большом диапазоне значений параметров. В каждом эксперименте использовали суммарно приблизительно 2×10спорулирующих ооцист в 500 мл HBSS (4×10 спорулирующих ооцисты в мл); субобразец отбирали для определения количества перед обработкой на процессоре Microfluidizer. Диаметры камеры, подлежащие исследованию, варьировались согласно видам: 1) Е. maxima: диаметр камер 200, 300, 400 микрон; 2) Е. tenella: диаметр камер 200, 300 микрон; 3) диаметр камеры Е. acervulina: 125 микрон. Использовали способ однократного пропускания. Использовали давление в интервале от 2000 фунтов на кв. дюйм (13,8 МПа) до 6000 фунтов на кв. дюйм (41,4 МПа) в зависимости от исследования. После пропускания через процессор Microfluidizer общий объем доводили до 1 л с помощью HBSS, образец перемешивали, и отбирали субобразец для определения количества. Обычно выполняли три повторных прогона, используя каждую комбинацию условий.
Процент извлеченных спороцист и процент расколотых ооцист определяли для каждого эксперимента, используя гемоцитометрический подсчет. В идеале, как процентное содержание извлеченных спороцист, так и процент расколотых ооцист должны составлять 100%.
Таблица 1
Высвобождение спороцист Е acervulina с использованием процессора Microfluidizer<sup></sup>
Диаметр камеры (мкм)
Давление
Избыточное давление 5000 фунтов на кв. дюйм (34,5 МПа)
Избыточное давление 6000 фунтов на кв. дюйм (41,4 МПа)
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
125 Y
54,26
48,18
49,46
75,61

Выводы для экспериментов с E. acervulina 1 на Microfluidizer:
1) Используя камеру 125 микрон, наблюдали увеличение процентного содержания расколотых ооцист Е. acervulina при увеличении давления.
2) Лучшие результаты по извлечению спороцист достигались с использованием камеры 125 микрон при избыточном давлении 5000 фунтов на кв. дюйм (34,5 МПа) (54%-ное извлечение).
Таблица 2
Высвобождение спороцист E. maxima 1 с использованием процессора Microfluidizer<sup></sup>
Диаметр камеры (мкм)
Давление
Избыточное давление 2000 фунтов на кв. дюйм (13,8 МПа)
Избыточное давление 3000 фунтов на кв. дюйм (20,7 МПа)
Избыточное давление 4000 фунтов на кв. дюйм (27,6 МПа)
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
200 Z
96,83
47,55
131,06
64,34
119,50
83,45
300 Z
109,55
79,07
106,03
89,91
95,33
93,98
400 Z
96,69
55,73
116,93
80,90
129,85
87,74
Значения представляют собой среднюю величину из по меньшей мере трех повторных прогонов однократного пропускания.

Выводы для экспериментов с Е. maxima 1 на Microfluidizer:
1) Процесс высвобождения спороцист проходил достаточно хорошо почти для всех исследуемых комбинаций диаметра камеры и давления.

2) Комбинация камеры 300 микрон и избыточного давления 3000 фунтов на кв. дюйм (20,7 МПа) обеспечивала подходящие исходные стандартные условия для получения спороцист Е. Maxima 1 с использованием процессора Microfluidizer.
Таблица 3
Высвобождение спороцист E. maxima 2 с использованием процессора Microfluidizer<sup></sup>
Диаметр камеры (мкм)
Давление
Избыточное давление 2000 фунтов на кв. дюйм (13,8 МПа)
Избыточное давление 3000 фунтов на кв. дюйм (20,7 МПа)
Избыточное давление 4000 фунтов на кв. дюйм (27,6 МПа)
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
200 Z
114,18
93,99
104,58
87,07
73,71
95,23
300 Z
93,47
85,95
115,43
91,01
110,31
92,80
400 Z
98,12
86,63
110,04
94,24
111,32
97,84
Значения представляют собой среднюю величину из по меньшей мере трех повторных прогонов однократного пропускания.

Выводы для экспериментов с E. maxima 2 на процессоре Microfluidizer:
1) Процесс высвобождения спороцист проходил достаточно хорошо почти для всех исследуемых комбинаций диаметра камеры и давления.
2) Комбинация камеры 300 микрон и избыточного давления 3000 фунтов на кв. дюйм (20,7 МПа) считается оптимальной.
Таблица 4
Высвобождение спороцист Е. tenella 1 с использованием процессора Microfluidizer<sup></sup>
Диаметр камеры (мкм)
Давление
Избыточное давление 2000фунтов на кв. дюйм (13,8МПа)
Избыточное давление 3000фунтов на кв. дюйм (20,7МПа)
Избыточное давление 4000фунтов на кв. дюйм (27,6МПа)
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
% Извлеченных спороцист
% Расколотых ооцист
125 Y
50,33
54,16
68,46
71,88
98,18
84,04
200 Z
19,86
13,95
43,80
39,74
56,30
62,03
Значения представляют собой среднюю величину из по меньшей мере трех повторных прогонов однократного пропускания.

Выводы для экспериментов с E. tenella 1 на процессоре Microfluidizer:
1) Как и ожидалось, наблюдалось увеличение процента высвобождения спороцист и процента расколотых ооцист Е. tenella при увеличении давления для обеих исследуемых камер.
2) Лучшие результаты получали, используя камеру 125 микрон при избыточном давлении 4000 фунтов на кв. дюйм (27,6 МПа).
В воплощениях настоящего изобретения предлагается повторяемая, масштабируемая альтернатива извлечению спороцист по сравнению с общепринятыми способами с использованием тканевого измельчителя, стеклянных гранул и химического высвобождения. Предложено по существу количественное извлечение спороцист из E. maxima 1 и E. maxima 2. Наблюдалось почти количественное извлечение спороцист E. tenella. Высвобождение ооцист E. acervulina составляет примерно 40-50%.
Пример 2
Использование оборудования для разрушения клеток для высвобождения спороцист требует оптимизации условий высвобождения для гарантии жизнеспособности высвобождаемых спороцист. Жизнеспособность можно оценить путем введения дозы спороцист птицам и путем подсчета ассоциированного выхода ооцист в результате инфицирования. В варьирующихся условиях геометрии камеры устройства для клеточного разрушения и давления возможно эффективно высвобождать спороцисты из ооцист в условиях, не обеспечивающих нежизнеспособность. То есть инфекция, вызванная у птиц посредством введения спороцист, может быть уменьшена по сравнению с инфекцией, полученной с использованием спороцист, высвобождаемых обычными способами, такими как стеклянные гранулы. Условия геометрии камеры и давления следует определять с большой аккуратностью, чтобы обеспечить получение жизнеспособных спороцист.

Спороцисты высвобождали из ооцист Е. acervulina, используя или стеклянные гранулы или процессор Microfluidizer, с конфигурацией камеры 100Z при давлении 2000 фунтов на кв. дюйм (13,8 МПа) или 5000 фунтов на кв.дюйм (34,5 МПа). Спороцисты высвобождали посредством каждого способа, затем вводили цыплятам в модели дозозависимого ответа, используя 1000, 3000 и 5000 спороцист на дозу. Для каждой обработки использовали три копии загонов, по девять птиц на копию. Контроль ооцист при 1250 спорулирующих ооцист на дозу, представляющую 5000 спороцист, также включали в данное исследование. С 4 по 7 сутки после чреззондового кормления ооцисты собирали в раствор 10% лимонной кислоты, 0,75% перекиси водорода и 0,25% пропионовой кислоты в воде. Экскременты, содержащий ооцисты, приводили к одинаковому объему, используя воду, перемешивали и отбирали субобразцы.
Ооцисты подсчитывали, используя способ Мак-Мастера. Результаты показаны в таблице ниже:
Таблица 5
Влияние давления на жизнеспособность спороцист E. acervulina
Доза
Обработка
Средний выход оцист на птицу
1250
Спорулирующие ооцисты (контроль)
5,18×10<sup>7</sup>
1000
Microfluidizer<sup></sup> при 2000 фунт/кв.дюйм (13,8 МПа)
1,22×10<sup>7</sup> cd
Microfluidizer<sup></sup> при 5000 фунт/кв.дюйм (34,5 МПа)
2,85×10<sup>6</sup> e
Стеклянные гранулы
1,58×10<sup>7</sup> с
3000
Microfluidizer<sup></sup> при 2000 фунт/кв.дюйм (13,8 МПа)
3,93×10<sup>7</sup> b
Microfluidizer<sup></sup> при 5000 фунт/кв.дюйм (34,5 МПа)
6,07×10<sup>6</sup> de
Стеклянные гранулы
5,30×10<sup>7</sup> ab
5000
Microfluidizer<sup></sup> при 2000 фунт/кв.дюйм (13,8 МПа)
1,00×10<sup>8</sup> ab
Microfluidizer<sup></sup> при 5000 фунт/кв.дюйм (34,5 МПа)
7,61×10<sup>6</sup> cd
Стеклянные гранулы
1,11×10<sup>8</sup> a
Статистические сравнения выполняли среди обработок с получением спороцист.
Разные буквы в общем случае представляют собой значимое различие до р=0,05.

Результаты показывают, что спороцисты, полученные с использованием процессора Microfluidizer при 2000 фунт/кв.дюйм (13,8 МПа), при каждой дозе были такими же жизнеспособными, как и спороцисты, полученные с применением обычного способа использования стеклянных гранул, в то время как среди спороцист, полученных при 5000 фунт/кв.дюйм (34,5 МПа) с использованием процессора Microfluidizer, при каждой дозе было значительно меньше жизнеспособных, чем среди полученных с применением способа использования стеклянных гранул. Диапазон давления, который дает жизнеспособные спороцисты, следует, таким образом, определять экспериментально.
Пример 3

Наблюдалось, что более мелкие виды Eimeria, включая Е. acervulina (размер ~12 микрон) и E. tenella (размер ~20 микрон), меньше подвержены воздействию усилий сдвига, чем более крупные виды E. maxima (размер ~40 микрон). Создание более высоких уровней сдвига путем повышения давления в системе Microfluidizer может улучшать микроскопический выход спороцист из ооцист для любых видов, но особенно требуется для эффективного высвобождения из мелких видов; однако увеличение давления также может снижать жизнеспособность. Снижение давления для улучшения жизнеспособности существенно снижает выход. Предварительные обработки были разработаны, чтобы привести стенки ооцист в состояние, обеспечивающее как улучшенный микроскопический выход, так и улучшенную жизнеспособность.
Исследование выполняли для изучения влияния предварительной обработки ооцист с использованием комбинации соли желчной кислоты (тауродезоксихолевой кислоты (TDCA)), анаэробной окружающей среды (барботирование углекислым газом) и немного повышенной температуры (37°С в течение 1 ч). Целью исследования являлось определение in vitro извлечения (посредством микроскопирования) и in vivo жизнеспособности (через выход ооцист) высвобождаемых спороцист.

Были созданы следующие группы обработки: (1) контроль, спорулирующие ооцисты E. acervulina; 1000 спорулирующих ооцист на дозу; (2) контроль, спороцисты, полученные с помощью стеклянных гранул; 4000 спороцист на дозу; (3) контроль, спороцисты, полученные с помощью Microfluidizer без предварительной обработки; камера 100 мкм; 2000 фунтов на кв. дюйм (13,8 МПа); 4000 спороцист на дозу; (4) спороцисты, полученные с помощью Microfluidizer с предварительной обработкой, включающей 0,75%-ную тауродезоксихолевую кислоту (TDCA) и барботирование углекислым газом при 37°С в течение 1 ч; камера 100 мкм; 2000 фунтов на кв. дюйм (13,8 МПа); 4000 спороцист на дозу; (5) спороцисты, полученные с помощью Microfluidizer с предварительной обработкой, включая 0,75% TDCA и барботирование углекислым газом при 37°С в течение 1 ч; камера 100 мкм; 3000 фунтов на кв. дюйм (20,7 МПа); 4000 спороцист на дозу; (6) спороцисты, полученные с помощью Microfluidizer с предварительной обработкой, включая 0,75% TDCA и барботирование углекислым газом при 37°С в течение 1 ч; камера 100 мкм; 4000 фунтов на кв. дюйм (27,6 МПа); 4000 спороцист на дозу. Оставшиеся неповрежденными ооцисты и оболочки ооцист удаляли из препаратов спороцист, используя Percoll. Дозы спороцист доставляли птицам в количестве 4000 спороцисты на дозу для получения доз, эквивалентных контролю 1000 ооцист на дозу, так как каждая ооциста содержит четыре спороцисты.

Извлечение спороцист из ооцист оценивали микроскопически. Результаты для веществ, полученных на Microfluidizer, сведены в таблицу ниже:
Таблица 6
Микроскопическое извлечения спороцист E. acervulina с использованием предварительной обработки
Обработка
Предварительная обработка
Давление в Microfluidizer<sup></sup>
(%) Извлеченных спороцист
3
нет
2000 фунт/кв. дюйм (13,8 МПа)
5,42
4
да
2000 фунт/кв. дюйм (13,8 МПа)
33,70
5
да
3000 фунт/кв. дюйм (20,7 МПа)
54,90
6
да
4000 фунт/кв. дюйм (27,6 МПа)
65,48
Предварительная обработка улучшала извлечение спороцист приблизительно в шесть раз при 2000 фунт/кв. дюйм (13,8 МПа), и при увеличении давления наблюдалось дополнительное улучшение при микроскопическом извлечении.
Для оценки in vivo, в каждой обработке использовали 5 копий загонов с девятью птицами на загон. Обработки вводили в зоб через пероральный зонд. Экскременты собирали в раствор 10% лимонной кислоты, 0,75% перекиси водорода и 0,25% пропионовой кислоты в воде с 4 по 7 сутки после кормления через зонд. Экскременты, содержащие ооцисты, доводили до одинакового объема, смешивали и отбирали субобразцы. Ооцисты подсчитывали, используя метод Мак-Мастера.
Жизнеспособность спороцист, полученных с использованием изложенных способов высвобождения, оценивали путем сравнения выхода ооцист на птицу по сравнению с контролем спороцист, полученных с помощью стеклянных гранул. Результаты обобщены в таблице ниже:
Таблица 7
Жизнеспособность спороцист E. acervulina, высвобождаемых из предварительно обработанных ооцист
Обработка
Стадия жизни Eimeria
Предваритель-ная обработка
Способ высвобождения
Давление в Microfluidizer<sup></sup>
Средний выход ооцистна птицу
Жизнеспособность в виде процента от контроля со стеклянным игранулами
1
Спорулирующиеооцисты
NA
NA
NA
3,00×10<sup>7</sup>
NA
2
Спороцисты
NA
Стеклянныегранулы
NA
2,97×10<sup>7</sup>
100,0
3
Спороцисты
нет
Microfluidizer<sup></sup>
2000 фунтовна кв. дюйм (13,8МПа)
2,58×10<sup>7</sup>
86,9
4
Спороцисты
да
Microfluidizer<sup></sup>
2000 фунтовна кв. дюйм (13,8МПа)
4,05×10<sup>7</sup>
136,4
5
Спороцисты
да
Microfluidizer<sup></sup>
3000 фунтовна кв. дюйм (20,7 МПа)
2,41×10<sup>7</sup>
81,1
6
Спороцисты
да
Microfluidizer<sup></sup>
4000 фунтовна кв. дюйм (27,6 МПа)
4,03×10<sup>7</sup>
136,0

Среди обработок нет достоверных отклонений в среднем выходе ооцист на птицу (р>0,05). Предварительная обработка обеспечивала улучшенную жизнеспособность высвобождаемых спороцист в широком диапазоне давления. В некоторых случаях жизнеспособность спороцист, высвобождаемых способом с использованием Microfluidizer из предварительно обработанных ооцист, была численно выше, чем у спороцист, высвобождаемых способом со стеклянными гранулами. Таким образом суммарный эффект предварительной обработки был двукратным, с улучшением как извлечения из ооцист во время стадии высвобождения, так и жизнеспособности.
Вышеизложенное иллюстрирует настоящее изобретение и не должно истолковываться в качестве его ограничения. Хотя были описаны несколько типичных воплощений данного изобретения, специалистам в данной области техники понятно, что множество модификаций является возможным в типичных воплощениях фактически без отклонения от новых идей и преимуществ данного изобретения. Соответственно, предполагается, что все такие модификации включены в объем данного изобретение, как определено в формуле изобретения. Изобретение определено следующей формулой изобретения вместе с эквивалентами притязаний, включенными в нее.