Способ оценки начальных эффектов экотоксичности загрязненной диоксинами среды в окрестностях свалок и заводов по утилизации отходов
METHOD FOR ASSESSING THE INITIAL EFFECTS OF THE ECOTOXICITY OF A DIOXIN-CONTAMINATED ENVIRONMENT IN THE VICINITY OF LANDFILLS AND WASTE DISPOSAL PLANTS

Изобретение относится к области прикладной экологии, а именно к проблемам оценки загрязнения окружающей среды, в частности оно может быть использовано для оценки методами биомониторинга загрязнения окружающей среды диоксинами в результате выбросов со свалок и заводов по утилизации отходов.
В больших и малых городах России источники выбросов и сбросов полихлорированных соединений дибензо-п-диоксинов (ПХДД) и дибензофуранов (ПХДФ) встречаются практически повсеместно. Перенос этих веществ током воздуха и воды проявляется загрязнением обширных территорий, накоплением в тканях животных и человека токсических уровней, сохраняющих присущую им активность на протяжении жизни нескольких поколений [Стойкие органические загрязнители. Управление риском воздействия на окружающую среду и здоровье населения (под ред. Филатова Б.Н.) // Волгоград. ФМБА. 2013. 180 с; Клюев Н.А., Курляндский Б.А., Ревич Б.А., Филатов Б.Н. Диоксины в России // Москва, 2001. 212 с.]. Активными источниками диоксинов, ликвидация которых требует незамедлительных практических действий, являются свалки [Румак B.C., Умнова Н.В. Биомониторинг состояния загрязненной диоксинами среды в окрестностях свалки: к минимизации риска для здоровья населения // Химическая безопасность, 2020, Том 4, №2, С. 68-79].
Среди известных 210 соединений ПХДД/ПХДФ мониторингу подлежит 17 их представителей, характеризуемых необычайно высоким уровнем токсичности для человека. Самым токсичным среди них является канцероген прямого действия 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин (ТХДД), токсичное действие которого сопоставимо с таковым для многих боевых отравляющих веществ [Управление риском воздействия на окружающую среду и здоровье населения (под ред. Филатова Б.Н.) // Волгоград: ФМБА, 2013. 180 с.]. Вещества с подобными свойствами обозначены термином суперэкотоксиканты (СЭТ) [Кунцевич А.Д. Систематизация и оценка степени риска суперэкотоксикантов // Успехи химии, 1991, Том 60, №1, С. 530-535].
Диоксины и в первую очередь ТХДД это гормоноподобные универсальные (политропные) необычайно стойкие клеточные яды, поражающие ткани всех органов и систем организма с латентным периодом развития клинических форм интоксикации от нескольких недель до месяцев и даже лет - так называемых отдаленных медико-биологических последствий. Активный рост уровня их встречаемости стали отмечать начиная с конца XX века [Румак B.C., Позняков С.П., Умнова Н.В., Антонюк В.В., Софронов Г.А., Соколов В.Е. Основы медико-биологической оценки опасности диоксинов. В книге: Диоксины - суперэкотоксиканты XXI века. Информационный выпуск №4, под ред. Ю.М. Арского // М.: ВИНИТИ. 1998. 111 с.].
На способности диоксинов вызывать отдаленные медико-биологические последствия влияют многие внешние, внутренние и временные факторы. В первую очередь - состав совокупно воздействующих на организм биодоступных ксенобиотиков [Позняков С.П., Румак B.C., Софронов Г.А., Умнова Н.В. Диоксины и здоровье человека. Научные основы выявления диоксиновой патологии (ред. Павлов Д.С., Софронов Г.А.) // СПб.: Наука, 2006. 274 с.]. Для учета влияния реально существующих смесей загрязнителей на биоценозы и человека введено понятие экотоксичность. Присутствие в составе смесей диоксинов является безусловным фактором их экотоксичности, так как они токсичны при любых концентрациях [Софронов Г.А., Рембовский В.Р., Радилов А.С., Могиленкова Л.А. Современные взгляды на механизмы токсического действия диоксинов и их санитарно-гигиеническое нормирование // Медицинский академический журнал. 2019, 19(1). С. 17-29]. Сопутствующие вещества могут способствовать существенному увеличению токсичности диоксинов и/или приобретению канцерогенной активности ранее неканцерогенными формами.
Запуск биологических механизмов (патогенеза) развития отдаленных медико-биологических последствий длительного хронического воздействия на организм малых субтоксичных доз (концентраций) диоксинов, загрязняющих среду, характеризуют выраженные сверхкумулятивные эффекты. Накопление тканями этих веществ достаточно быстро создает условия для запуска механизмов ответных реакций со стороны генома, которые проявляются экспрессией специфических и неспецифических генов. Токсикология рассматривает такую экспрессию как проявление специфических и неспецифических эффектов, соответственно. Специфический эффект характеризует наработка внутриклеточного рецепторного белка (AhR, арилгидрокарбоновый или диоксиновый рецептор). Активация этого белка диоксинами и сопутствующими им ксенобиотиками приводит к экспрессии широкого спектра неспецифических генов, продукты которых контролируют соответствующий спектр клеточных реакций, прежде всего связанных с делением клетки и ее судьбой. Здесь важно отметить, что высокий уровень экспрессии неспецифических генов - неспецифические эффекты, может способствовать активному превращению диоксинов и ряда других сопутствующих им ксенобиотиков в более реакционноспособные продукты, часто необычайно токсичные и мутагенные, приводящие к утрате присущей ДНК стабильности и, в конечном итоге, развитию отдаленных медико-биологических последствий [Рембовский В.Р., Могиленкова Л.А. Процессы детоксикации при воздействии химических веществ на организм // СПб. Изд-во Политехнического ун-та, 2017. 384 с.]. Важной особенностью проявления неспецифических эффектов в ответ на воздействие СЭТ является их выраженная мозаичность. Ее определяет появление среди экспонированного населения индивидуумов с очень высокими (многократно более высокими относительно максимально возможных в условиях контроля) характеристиками уровня экспрессии генов ферментной системы цитохром Р-450 [Осташевский В.А., Герасимов К.Е., Цырлов И.Б., Румак B.C. Исследование ферментов монооксигеназного окисления в лимфоцитах и печени людей, подвергавшихся воздействию хлорфеноксигербицидов // Известия РАН, Сер. биол. 1, 1994. С. 56-63]. Клиническую значимость таких эффектов обычно связывают с появлением дополнительных случаев отдаленных медико-биологических последствий, имеющих много сходств с полигенной экологозависимой патологией. В том числе с сосудистыми поражениями сердца и сосудов, различными формами диабета и рака, нарушениями детородной функции и развития детей, и другими [Румак B.C., Умнова Н.В., Ким А.И. Суперэкотоксиканты и экологическая безопасность. Учебно-методическое пособие с основами молекулярной токсикологии для обучающихся бакалавриата и магистратуры направлений подготовки «Биология» и «Экология и природопользование» // М.: Товарищество научных изданий КМК, 2021. 126 с.]. Поэтому обоснованная оценка начальных эффектов экотоксичности загрязненной диоксинами среды должна эту мозаичность непременно учитывать. Между тем, современными нормами допустимого поступления диоксинов в организм и гигиеническими нормативами их содержания в средах (воздухе, воде, почве и т.д.) эти особенности не учтены, что предполагает немаловажность скорейшего создания необходимого для этого решения.
При разработке новых способов оценки экотоксичности диоксинов предполагается ориентироваться на внутриклеточный уровень организации биосистем, так как он имеет очевидные преимущества. Дело в том, что токсические эффекты, возникающие на молекулярном и субмолекулярном уровне (начальные токсические эффекты), обычно носят обратимый характер. Тогда как серьезным препятствием для решения задач по оценке экотоксичности низких доз диоксинов на основе принципа предупреждения рисков методами эпидемиологических исследований экологозависимых заболеваний может быть не только трудная их излечимость, но и невозможность учета признаков (параметров или характеристик) мозаичности их встречаемости [Епифанцев А.В. Диоксины и здоровье человека // Современные проблемы токсикологии, 2006, №1. С. 14-26].
Анализ основных направлений развития методической базы оценки эффектов экотоксичности среды обитания показал, что ее основным трендом является биомониторинг [EFSA Scientific Committee. Guidance on harmonized methodologies for human health, animal health and ecological risk assessment of combined exposure to multiple chemicals // EFSA Journal 2019; 17 (3):5634]. При формировании алгоритма методов оценки этих эффектов важно принимать во внимание, что достоверность получаемых с его помощью данных зависит от возможностей практики диагностировать вызываемые этими веществами токсические эффекты (биомониториг эффектов) во взаимосвязи с мерами их воздействия (поглощения и накопления) на организм (биомониторинг воздействия) [Румак B.C., Умнова Н.В., Софронов Г.А. Молекулярные и клеточные аспекты токсичности диоксинов // Вестник РАМН, 2014, №3-4. С. 77-84].
Известен способ оценки загрязнения диоксинами окружающей среды выбросами свалок и заводов по утилизации отходов путем биомониторинга, включающий использование в качестве объекта биомониторинга рыжую полевку летнего и зимнего сезонов, при этом осуществляют в заданный период времени пробоотбор целых тушек животных для трех проб, причем каждая проба содержит не менее 3 тушек особей рыжей полевки, и определяют в них методом хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения наличие высокотоксичных для человека конгенеров диоксинов, при этом загрязненность региона определяют по разнице - превышению концентраций в пробах тушек рыжей полевки летнего сезона, отобранных в период года - августе, относительно условно-фоновых значений диоксинов в пробах тушек рыжей полевки зимнего сезона, отобранных в период года после схода снежного покрова. Техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала технических средств и способов, предназначенных для оценки с высокой степенью достоверности загрязнения окружающей среды диоксинами, производимыми выбросами свалок и заводов по утилизации отходов [RU 2743498, 19.02.2021]. Недостатками данного способа является невозможность оценки начальных эффектов экотоксичности загрязненной диоксинами среды в окрестностях свалок и заводов по утилизации отходов.
Данный источник информации рассмотрен в качестве ближайшего аналога.
Анализ достижений науки и практики в области молекулярной токсикологии диоксинов [Румак B.C., Умнова Н.В., Софронов Г.А., Павлов Д.С.Молекулярная токсикология диоксинов. СПб.: Наука, 2013. 63 с.] с целью создания на их основе качественно нового методического обеспечения для биомониторинга эффектов воздействия на организм малых субтоксичных доз (концентраций) диоксинов, загрязняющих среду, позволил обосновать ключевые требования к его дизайну.
Основой методической базы должны быть сравнительные натурно-экспериментальные исследования, позволяющие выявлять проявления начальных токсических эффектов экотоксичности диоксинов у млекопитающих (биомониторинг эффектов) в условиях максимально жесткой экспозиции особей, обитающих на территориях с высоким уровнем загрязнения среды против условно контрольных условий обитания.
Доступным практике модельным видом на территории средней полосы Евразии для выполнения таких исследований является рыжая полевка - Clethrionomys glareolus. При постановке исследований важно учитывать, что наилучший результат можно получить при обследовании животных из функциональной группировки летнего сезона, так как уровни загрязнения их тканей отражают максимально жесткие условия экспозиции особей, обитающих в условиях высокого уровня загрязнения среды.
Технический результат заключается в повышении достоверности оценки начальных эффектов экотоксичности загрязненной диоксинами окружающей среды.
Технический результат достигается тем, что оценку начальных эффектов экотоксичности загрязненной диоксинами окружающей среды проводят путем биомониторинга, где в качестве объекта исследования используют выборку животных из природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus), при этом у особей выборки из функциональной группировки природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) летнего сезона из загрязненного района при жесткой их экспозиции и особей выборки природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из условно контрольного района при условно-контрольной их экспозиции определяют параметры для оценки начальных эффектов экотоксичности, а именно уровни экспрессии гена диоксинового рецептора AhR и члена суперсемейства ферментов цитохрома Р450 гена CYP1A2, а также транскрипции ретротранспозонов SINE В1 и LINE1, уровни которых измеряют в матричной РНК рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) путем синтеза комплементарной ДНК и последующей количественной полимеразной цепной реакции; затем полученные значения для уровней экспрессии генов диоксинового рецептора AhR и гена CYP1A2, а также транскрипции ретротранспозонов SINE В1 и LINE1 сравнивают между выборками, принимая за каждую точку отсчета максимальные их значения для животных из условно-контрольной выборки (Тмакс), и при появлении значений уровней выше Тмакс в выборке животных, обитающих в загрязненном районе в условиях жесткой их экспозиции, оценивают данные показатели как свидетельство развития ответных реакций внутриклеточных биосистем на действие диоксинов и сопутствующих им ксенобиотиков, и запуска начальных эффектов экотоксичности загрязненной диоксинами окружающей среды.
Способ осуществляется следующим образом.
Основой методической базы для осуществления способа является комплекс методов и алгоритм их применения, позволяющий обоснованно решать задачи по выявлению, идентификации и оценке у млекопитающих проявлений начальных эффектов экотоксичности малых субтоксичных доз (концентраций) диоксинов, загрязняющих среду. Условия для этого предоставляют сравнительные натурно-экспериментальные исследования проявлений этих эффектов у половозрелых животных обоего пола среди случайной выборки из экспонированной диоксинами функциональной группировки летнего сезона природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus -экспонированная выборка) против условно контрольной выборки. Условно контрольную выборку могут представлять рыжие полевки из незагрязненных диоксинами регионов, включая виварную линию живой коллекции ИПЭЭ РАН. Численность выборки особей из загрязненного района при жесткой их экспозиции и особей выборки природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из условно контрольного района при условно-контрольной их экспозиции должна быть не менее 5 особей в каждой выборке.
Матричную рибонуклеиновую кислоту (РНК) выделяют из образца печени массой 30-40 мкг, который отбирают сразу после эвтаназии полевок из созданных выборок. Выбор печени определен ее выраженной способностью к активному накоплению диоксинов и метаболизму этих веществ.
Из матричной РНК методом обратной транскрипции получают комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК). Методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах кДНК измеряют уровни экспрессии генов, отражающих специфические (AhR) и неспецифические (CYP1A2) эффекты, а показатели нестабильности ДНК оценивают по результатам анализа транскрипции ретротранспозонов SINE B1 и LINE1. Расчет экспрессии генов и уровней транскрипции ретротранспозонов осуществляется ΔCt методом [Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Real-time PCR handbook/ https://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-handbook-life-technologies-update-flr.pdf]. Затем результаты измерения уровня экспрессии генов и транскрипции ретротранспозонов, полученные при обследовании выборки особей из природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus), обитающих в загрязненном районе в условиях жесткой их экспозиции и выборки природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из условно контрольного района, при условно-контрольной их экспозиции, сравнивают между собой, принимая за точку отсчета максимальные их значения для природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из условно контрольной выборки (Тмакс).
Появление в выборке природной популяции рыжих полевок (Clethrionomys glareolus), обитающих в загрязненном районе в условиях жесткой их экспозиции, особей со значениями величин выше Тмакс рассматривают как свидетельство развития ответных реакций внутриклеточных биосистем на действие диоксинов и сопутствующих им ксенобиотиков - запуска начальных механизмов токсического процесса.
Особей из проанализированной выборки природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus), обитающих в загрязненном районе в условиях жесткой их экспозиции, со значениями уровня экспрессии гена CYP1A2 выше Тмакс рассматривают как чувствительных к токсическому действию диоксинов и сопутствующих им ксенобиотиков. Увеличение уровня транскрипции ретротранспозонов SINE B1 и LINE1 в данной выборке выше Тмакс рассматривают как проявления нестабильности генома, способствующей развитию экологозависимой патологии. Особей из проанализированной выборки природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus), обитающих в загрязненном районе в условиях жесткой их экспозиции, у которых уровень экспрессии гена CYP1A2 и уровень транскрипции ретротранспозонов SINE B1 и LINE1 не превышает Тмакс, рассматривают как резистентных.
Пример осуществления способа
Выборка мелких млекопитающих из загрязненного района при жесткой их экспозиции (Саларьево) была создана из половозрелых особей обоего пола, представляющих функциональную группировку летнего сезона природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus). Животных отловили в августе 2021 года на загрязненных малыми субтоксичными концентрациями диоксинов территориях в окрестностях свалки «Саларьево». Эффект сверхкумуляции диоксинов подтвержден результатами специальных исследований [Roumak VS, Levenkova ES, Umnova NV, Popov VS, Turbabina KA, Shelepchikov AA. The content of dioxins and furans in soils, bottom sediments of water bodies, and tissues of small mammals near the landfill site with municipal solid wastes (Moscow, Russia) // Environmental Science and Pollution Research. 2018. 25:29379-29386]. Выборка из условно контрольного района при условно-контрольной экспозиции животных (Черноголовка) была создана из рыжих полевок (Clethrionomys glareolus) виварной линии живой коллекции ИПЭЭ РАН через 3 дня после отлова выборки из загрязненного района при жесткой их экспозиции. Выборка загрязненного района при жесткой экспозиции состояла из 13 особей, выборка из условно контрольного района при условно-контрольной экспозиции - из 7 особей.
Образец печени, который был получен сразу после эвтаназии животных в количестве 30-40 мкг, фиксировали раствором IntactRNA фирмы «Евроген». Такая фиксация обеспечивала длительное сохранение тотальной матричной РНК, которую выделяли из образца печени с помощью реактива ExtractRNA фирмы «Евроген» по протоколу фирмы производителя. Для очистки выделенной матричной РНК от геномной ДНК использовали дезоксирибонуклеазу I (DNase I) фирмы Thermo Fisher Scientific. Уровни содержания транскриптов генов AhR, CYP1A2 и ретротранспозонов SINE B1, LINE1 в тотальной матричной РНК оценивали путем синтеза комплементарной ДНК из матричной РНК и последующей количественной полимеразной цепной реакцией с нормированием этих уровней относительно референсных значений гена beta-actin. Реакции осуществляли с использованием наборов "MMLV RT kit" и qPCRmix-HS SYBR фирмы «Евроген».
Процентная частота встречаемости в выборке особей из природной популяции рыжей полевки (Clethrionomys glareolus), обитающих в загрязненном районе в условиях жесткой их экспозиции, с показателями уровня экспрессии генов AhR и CYP1A2, а также транскрипции ретротранспозонов SINE B1 и LINE1 выше Тмакс представлена на фиг. 1.
На фиг. 1 видно, что у особей из загрязненного района при жесткой экспозиции уровень экспрессии гена AhR в 92% случаев превышал Тмакс. Различия между выборками при условно-контрольной экспозиции и при жесткой экспозиции (из загрязненного района) по показателю уровня экспрессии AhR, рассчитанные общепринятым методом статистики (Mean±SD), были достоверными - 0,0078±0,0037 против 0,0262±0,0135, соответственно, при значении уровня значимости этих различий р≤0,01. Высокий уровень экспрессии этого гена свидетельствует об активном воздействии поглощенных организмом диоксинов и сопутствующих им ксенобиотиков на диоксиновый рецептор и его регуляторную активность.
По показателям процентной частоты встречаемости особей с величинами уровня экспрессии неспецифического гена (CYP1A2) и транскрипции ретротранспозонов (SINE B1 и LINE1) выше соответствующих значений Тмакс различия между выборками из условно контрольного района при условно-контрольной экспозиции и из загрязненного района при жесткой экспозиции носили качественный характер. Их характеризовало появление в выборке из природной популяции рыжих полевок (Clethrionomys glareolus), обитающих в загрязненном районе в условиях жесткой их экспозиции, 15% особей с величинами, которые не регистрировались в условно контрольном районе при условно-контрольной экспозиции. В загрязненном районе уровень экспрессии CYP1A2 достигал 5,897 при Тмакс=1,6586, а транскрипции ретротранспозонов SINE B1 и LINE1 22,0087 и 0,5987 при Тмакс 13,3614 и 0,2500, соответственно. Поэтому особей с такими характеристиками проявления начальных токсических эффектов есть все основания рассматривать как чувствительных к токсическому действию диоксинов и сопутствующих им ксенобиотиков.
Хорошая сопоставимость показателей встречаемости особей с необычайно высокими уровнями активности генов системы внутриклеточного метаболизма (экспрессия гена CYP1A2) и сниженного уровня стабильности ДНК (транскрипция ретротранспозонов SINE B1 и LINE1) свидетельствует о запуске процессов, активно влияющих на механизмы формирования и развития экологозависимой патологии.
Таким образом, анализ данных, отражающих особенности экспрессии выбранных генов и мобильных генетических элементов у рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) из функциональной группировки летнего сезона (максимально жесткая экспозиция) - Саларьево против условно контрольной выборки (условно-фоновая экспозиция) - Черноголовка, позволил предложить для практического использования следующие параметры, характеризующие модификационные изменения регистрируемых показателей:
1. Изменения уровня экспрессии специфического гена AhR, отражающие факт прямого воздействия диоксинов и сопутствующих им загрязнителей на внутриклеточные биосистемы организма, во взаимосвязи с изменениями уровня экспрессии неспецифического гена CYP1A2 и транскрипции ретротранспозонов SINE B1 и LINE1, характеризующие особенности чувствительности/резистентности особей к этим веществам;
2. Увеличение уровня экспрессии диоксинового рецептора (AhR). В этом случае у исследователя появляется твердое методическое основание для заключения о регистрации эффекта экотоксичности среды обитания. При этом необходимо учитывать и уровни транскрипции гена CYP1A2 для установления влияния других внешних факторов на гомеостаз клеток при фоновой экспозиции;
3. Согласованные изменения активности анализируемых мобильных генетических элементов (ретротранспозонов SINE B1 и LINE1), отражающих адаптационную стратегию генома в отношении многих стрессовых факторов окружающей среды. Необходимо учитывать направленность таких изменений в связи с вероятностью одновременного проявления эффектов дезадаптации.
Многолетняя апробация совокупности выбранных нами показателей для анализа и методов, применяемых для их получения на загрязненных диоксинами территориях в окрестностях свалки «Саларьево», показала перспективность их использования для обоснованного решения в целом проблем оценки начальных эффектов экотоксичности загрязненной диоксинами среды в окрестностях свалок и заводов по утилизации отходов.