СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН

1. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:
а) протеазный домен;
b) протеазный сайт расщепления;
c) транслокационный домен; и
Clostridium botulinum
d) модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В(B-Hc), содержащий одну или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранным из группы, состоящей из:
E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации.
c
2. Полипептид BoNT по п. 1, отличающийся тем, что модифицированный (B-H) содержит одну мутацию по типу замены, соответствующую мутации по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранную из группы, состоящей из E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P.
c
3. Полипептид BoNT по п. 2, отличающийся тем, что модифицированный (B-H) содержит мутацию по типу замены, соответствующую E1191C в серотипе B штамма 1.
c
4. Полипептид BoNT по п. 2, отличающийся тем, что модифицированный (B-H) содержит мутацию по типу замены, соответствующую E1191V в серотипе B штамма 1.
c
5. Полипептид BoNT по п. 1, отличающийся тем, что модифицированный (B-H) содержит две мутации по типу замены.
6. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:
а) протеазный домен;
b) протеазный сайт расщепления;
c) транслокационный домен; и
Clostridium botulinum
c
d) модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В(B-H), содержащий две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, при этом одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из:
E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, и E1191Y.
7. Полипептид BoNT по п. 6, отличающийся тем, что другая из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1.
8. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-7, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.
9. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1.
10. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1.
11. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1.
12. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1.
13. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1.
14. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1.
15. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1.
16. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1.
17. Полипептид BoNT по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.
c
18. Полипептид BoNT по п. 6, отличающийся тем, что модифицированный (B-H) содержит три мутации по типу замены.
19. Полипептид BoNT по п. 18, отличающийся тем, что три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1.
20. Полипептид BoNT по п. 19, отличающийся тем, что три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.
21. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:
а) протеазный домен;
b) протеазный сайт расщепления;
c) транслокационный домен; и
Clostridium botulinum (
c
d) модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В B-H), содержащий мутацию по типу замены в положении, соответствующем S1199 или S1201 серотипа B штамма 1.
c
22. Полипептид BoNT по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что модифицированный B-H содержится в штамме 1.
23. Полипептид BoNT по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу, выбранному из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F, G и их комбинаций.
24. Полипептид BoNT по п. 23, отличающийся тем, что протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу B штамма 1.
25. Полипептид BoNT по п. 23, отличающийся тем, что протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу А штамма 1.
Clostridium botulinum (
c
26. Полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа ВB-H), содержащий одну или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранным из группы, состоящей из:
E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации.
c
27. Полипептид по п. 26, отличающийся тем, что модифицированный (B-H) содержит две мутации по типу замены.
Clostridium botulinum (
c
28. Полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа ВB-H), содержащий две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, причем одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L и E1191Y.
29. Полипептид по п. 26, отличающийся тем, что одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1.
30. Полипептид по любому из пп. 27-29, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.
31. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1.
32. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1.
33. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1.
34. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1.
35. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1.
36. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1.
37. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1.
38. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1.
39. Полипептид по любому из пп. 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.
c
40. Полипептид по п. 30, отличающийся тем, что модифицированный (B-H) содержит три мутации по типу замены.
41. Полипептид по п. 40, отличающийся тем, что три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1.
42. Полипептид по п. 41, отличающийся тем, что три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.
c
43. Полипептид по любому из пп. 26-42, отличающийся тем, что модифицированный B-H содержится в штамме 1.
Clostridium botulinum (
c
c
44. Химерная молекула, содержащая первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа ВB-H), связанную со второй частью, причем модифицированный B-H содержит одну или более мутаций по типу замены, выбранных из группы, состоящей из
E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации.
c
45. Химерная молекула по п. 44, отличающаяся тем, что модифицированный (B-H) содержит две мутации по типу замены.
Clostridium botulinum
c
c
46. Химерная молекула, содержащая первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B  (B-H), связанную со второй частью, причем модифицированный B-H содержит две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, при этом одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из:
E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, и E1191Y.
47. Химерная молекула по п. 46, отличающаяся тем, что одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1.
48. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q, в серотипе B штамма 1.
49. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1.
50. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1.
51. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1.
52. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1.
53. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1.
54. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1.
55. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1.
56. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1.
57. Химерная молекула по любому из пп. 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.
c
58. Химерная молекула по любому из пп. 45 или 46, отличающаяся тем, что модифицированный (B-H) содержит три мутации по типу замены.
59. Химерная молекула по п. 58, отличающаяся тем, что три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1.
60. Химерная молекула по п. 59, отличающаяся тем, что три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.
c
61. Химерная молекула по любому из пп. 44-60, отличающаяся тем, что модифицированный B-H содержится в штамме 1.
62. Химерная молекула по любому из пп. 44-61, отличающаяся тем, что первая часть и вторая часть связаны ковалентно.
63. Химерная молекула по любому из пп. 46-61, отличающаяся тем, что первая часть и вторая часть связаны нековалентно.
64. Химерная молекула по любому из пп. 44-61, отличающаяся тем, что вторая часть выбрана из группы, состоящей из малой молекулы, нуклеиновой кислоты, короткого полипептида и белка.
65. Химерная молекула по п. 64, отличающаяся тем, что вторая часть представляет собой биоактивную молекулу.
66. Химерная молекула по п. 64 или 65, отличающаяся тем, что вторая часть представляет собой терапевтический полипептид или неполипептидный лекарственный препарат.
c
c
67. Полипептид BoNT, полипептид или химерная молекула по любому из пп. 1-66, который демонстрирует значительно усиленное связывание модифицированного B-H с человеческим SytII и/или значительно уменьшенное связывание модифицированного B-H с человеческим Syt I по сравнению с идентичной молекулой, не содержащей мутацию(ии) по типу замены.
68. Полипептид BoNT, полипептид или химерная молекула по любому из пп. 1- 66, отличающийся тем, что мутация по типу замены дает значительно усиленное связывание с Syt II человека и/или значительно усиленное связывание с Syt I человека по сравнению с идентичной молекулой, не содержащей мутацию(ии) по типу замены.
69. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид или химерную молекулу по любому из пп. 1- 68.
70. Вектор нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 69.
71. Клетка, содержащая вектор нуклеиновой кислоты по п. 70 или нуклеиновую кислоту по п. 69.
72. Клетка, экспрессирующая полипептид или химерную молекулу по любому из пп. 1- 68.
73. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) по любому из пп. 1-25, 67 или 68 или химерную молекулу по любому из пп. 44-66 или вектор нуклеиновой кислоты по п. 70 или нуклеиновую кислоту по п. 69.
74. Фармацевтическая композиция по п. 73, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
75. Набор, содержащий фармацевтическую композицию по п. 73 или 74 и инструкции для терапевтического введения фармацевтической композиции.
76. Способ получения полипептида ботулинического нейротоксина (BoNT), включающий стадии культивирования клетки по п. 72 в условиях, в которых продуцируется полипептид BoNT.
77. Способ по п. 76, дополнительно включающий одну или более из следующих стадий:
- извлечения полипептида BoNT из культуры,
- очистку полипептида BoNT,
- активацию полипептида BoNT, и/или
- создание препарата на основе полипептида BoNT.
78. Способ лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью, включающий введение терапевтически эффективного количества полипептида BoNT по любому из пп. 1-25, 67 или 68 субъекту, чтобы таким образом обеспечивать контакт с одним или более нейронами, проявляющими нежелательную нейронную активность, чтобы таким образом лечить патологическое состояние.
79. Способ по п. 78, отличающийся тем, что патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из спастической дисфонии, спастической кривошеи, дистонии мышц гортани, oромандибулярной дистонии, лингвальной дистонии, цервикальной дистонии, графоспазма, блефароспазма, косоглазия, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, фокальной спастичности и других нарушений речи, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, тика, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии и других нарушений мышечного тонуса и других расстройств, характеризующихся непроизвольными движениями мышечных групп, лакримации, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерных желудочно-кишечных выделений, секреторных расстройств, боли от мышечных спазмов, головной боли, мигрени, и дерматологических или эстетических/косметических патологических состояний.
80. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) по любому из пп. 1-25, 67 или 68, фармацевтическая композиция по любому из пп. 73 или 74 или химерная молекула по любому из пп. 44-66 или полипептид по любому из пп. 26-43, для применения в медицине.
81. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) по любому из пп. 1-25, 67 или 68, фармацевтическая композиция по одному из пп. 73 или 74 или химерная молекула по любому из пп. 44-66 или полипептид по любому из пп. 67-43, для применения при лечении патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью.
82. Способ идентификации модифицированного рецептор-связывающего домена ботулинического нейротоксина для связывания с рецептором включающий:
а) экспрессию модифицированного рецептор-связывающего домена в качестве первого гибридного белка с субъединицей T18 бактериальной аденилатциклазы в 2-гибридном анализе и экспрессию рецептора в качестве второго гибридного белка с субъединицей T25 бактериальной аденилатциклазы в 2-гибридном анализе;
E. coli
b) анализ клональной колонии , которая экспрессирует как первый, так и второй гибридный белок на наличие положительного признака выше отрицательного контроля; и
c) идентификацию модифицированного рецептор-связывающего домена, экспрессируемого колонией, демонстрирующей положительный признак в виде связывания с рецептором.
83. Способ по п. 82, отличающийся тем, что положительный признак представляет собой появление окраски.
84. Способ по любому из пп. 82-83, дополнительно включающий стадию анализа колонии на положительный признак против слабоположительного контроля и дальнейшую идентификацию модифицированного рецептор-связывающего домена, экспрессируемого колонией, проявляющей выше слабоположительного контроля в виде связывания с рецептором с высокой аффинностью.
85. Способ по пп. 82-84, который осуществляют с использованием библиотеки модифицированных рецептор-связывающих доменов, каждый из которых экспрессирован в соответствующих колониях.
86. Способ по любому из пп. 82-85, отличающийся тем, что рецептор является человеческим.
87. Способ по любому из пп. 82-86, отличающийся тем, что модифицированный рецептор-связывающий домен содержит одну или более мутаций по типу замены, при этом одна из мутаций по типу замены соответствует мутации в серотипе B штамма 1, выбранном из группы, состоящей из: E1191M, E1191 Q, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199F, S1199L W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и S1199Y.