ПОВЯЗКА НА РАНУ С ТРОМБИНОМ
WOUND DRESSING WITH THROMBIN

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения абсорбирующего приспособления для ухода за раной, содержащего активный агент с применением электрораспыления, и приспособлению для ухода за раной, полученного посредством указанного способа. Кроме того, изобретение относится к приспособлению для ухода за раной, содержащему тромбин и пенополиуретан, и к способу лечения кровотечения.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Нанесение некоторого количества (часто небольшого количества) активного агента на ограниченный участок абсорбирующего приспособления может быть затруднительным. В заявках на патент Великобритании № GB 2268907 и GB 2251209 раскрыт способ печати на пеноматериале. Печать наносят на носитель и затем переносят с носителя на пеноматериал посредством применения тепла и давления. Способ является очень трудоемким и не подходит для чувствительных соединений, поскольку они могут пострадать от термообработки и обработки давлением путем, например, деградации.
Документ WO 06007844 описывает приспособление для ухода за раной, в котором активный агент наносят на абсорбирующий элемент посредством покрытия напылением.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения в данном документе описывают новый способ нанесения активного агента на поверхность. Показано, что посредством электрораспыления на поверхность может быть нанесен точный рисунок и количество активного агента. Применяя технологию электрораспыления, поддерживается активность, например, ферментативно активных агентов.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1: Пример структуры рисунка для электрораспыления.
Фиг.2: Крупный план установки электрораспыления с неподвижной струйной форсункой и коллекторной пластиной, прикрепленной болтами к манипулятору робота, как применено в примере 1.
Фиг.3: Установка электрораспыления по фиг.1 с красителем, распыленным на коллекторную пластину (краситель применен для наглядности).
Фиг.4: Краситель на пеноматериале Biatain (пенополиуретан).
Фиг.5: Поперечное сечение альбумина бычьей сыворотки (BSA), электрораспыленного на Biatain. Пеноматериал имеет толщину ~3,4 мм, и белок нанесен тонким слоем сверху пеноматериала.
Фиг.6: Активность образцов тромбина с различными концентрациями (ед. NIH/мл), измеренная как поглощательная способность за минуту в течение 30 минут при 37°C.
Фиг.7: Активность экстракта из пеноматериала Biatain без тромбина.
Фиг.8 и 9: Активность двух экстрактов из пеноматериала Biatain с тромбином (образец 1, фиг.8, образец 2, фиг.9).
Фиг.10: Активность экстрактов тромбина из пеноматериала Biatain, при этом тромбин был растворен в 25% об. EtOH или в воде.
Фиг.11: Исследуемая процедура для эксперимента по остановке крови ран с применением Biatain.
Фиг.12: Повязка Biatain до применения.
Фиг.13-15: Результаты эксперимента по остановке крови в селезенке (A: надрез 0,8×0,8 см; B: надрез 1×1 см) и печени (C: надрез 1×1 см).
ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Первый аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления абсорбирующего приспособления для ухода за раной, включающему этапы:
a) предоставления приспособления для ухода за раной, содержащего абсорбирующий элемент, при этом указанный элемент содержит поверхность, контактирующую с раной, и противоположную ей тыльную поверхность;
b) предоставления активного агента и
c) нанесения активного агента посредством электрораспыления на поверхность абсорбирующего элемента, контактирующую с раной.
Данный способ предусматривает минимальные отходы во время процесса. То есть весь активный агент, вышедший из форсунки, наносится на абсорбирующую поверхность. Он является не только очень эффективным применением активного агента, некоторые из которых являются очень дорогими. Он также минимизирует риски для здоровья во время работы с активными агентами, поскольку ничего не распыляется в окружающую среду во время процесса.
Настоящий способ, кроме того, предусматривает точное дозирование активного агента. Это, в частности, важно для сильнодействующих агентов, поскольку требуются лишь небольшие количества для достижения желаемого эффекта и, например, в случаях, когда даже небольшие отклонения от надлежащей дозировки могут вызвать нежелательные побочные эффекты. Дополнительно, посредством применения электрораспыления, активный агент будет равномерно распределен контролируемым образом.
В одном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению этап электрораспыления включает:
i) наличие неподвижно заряженной струйной форсунки с активным агентом и
ii) наличие противолежащего неподвижного нейтрального элемента,
при этом поверхность абсорбирующего элемента, контактирующая с раной, перемещается между струйной форсункой и нейтральным элементом. Данная конфигурация минимизирует колебания, вызванные перемещением абсорбирующей поверхности, таким образом, что образуется стабильная струя из струйной форсунки. Таким образом увеличивается точность процесса и, кроме того, даже отходы материалов еще более ограничиваются.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения струйная форсунка отрицательно заряжена.
В зависимости от типа активного агента может быть особенно предпочтительным, если активный агент находится в водном растворе. Однако альтернативно могут быть предпочтительными водные эмульсии.
Фраза «поверхность абсорбирующего элемента, контактирующая с раной», как это применяется в данном документе, имеет целью обозначение внешней поверхности абсорбирующего элемента, которая является поверхностью, находящейся в непосредственном контакте с раной, когда приспособление для ухода за раной находится в употреблении. Дополнительно, термин «поверхность» абсорбирующего элемента имеет целью обозначение внешней поверхности, в отличие от внутренней части абсорбирующего элемента. Соответственно, когда тонкий слой активного агента наносится на поверхность, он не распространяется в материале, и, например, когда материалом является абсорбирующий пеноматериал, он не впитывается в пеноматериал, но остается на поверхности.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем растворения активного агента, такого как, например, тромбин, в водном растворе, содержащем, по меньшей мере, воду и этанол, достигается более стабильная струя из струйной форсунки. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения активный агент растворен в водно-спиртовом растворе, т.е. содержащем, по меньшей мере, воду и один или более спиртов, предпочтительно спирты могут быть выбраны из метанола, этанола, пропанола и изопропанола, более предпочтителен водно-этаноловый раствор, т.е. содержащий, по меньшей мере, воду и этанол. Альтернативно или в дополнение к одному или более спиртам, водный раствор может содержать воду и ацетон.
В зависимости от типа активного агента количество спирта, присутствующего в водном растворе, может изменяться. Количество спирта в водном растворе предпочтительно находится в диапазоне от 0,01 до 40% об., таком как, например, от 0,10 до 40% об., от 1 до 40% об., от 5 до 35% об., от 10 до 30% об., от 15 до 30% об., более предпочтительно в диапазоне от 15 до 30%, таком как, например, 25% об.
Активным агентом может быть любой подходящий фармацевтически или биологически активный агент, такой как, например, антибактериальный, антисептический, белки, ферменты, ингибиторы фермента, дезодорирующий, обезболивающий и т.д. или их комбинации. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активный агент выбран из группы ферментов, белков, пептидов и т.п.; более предпочтительно из группы ферментов и белков.
Несмотря на прогресс недавних лет в получении белков, особенно рекомбинантных белков, подобные активные агенты все еще имеют тенденцию быть дорогими. Таким образом, данный способ особенно удобен, если активным агентом является белок, особенно рекомбинантный белок. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активный агент выбран из тромбина, протромбина и активных производных тромбина или лекарственных форм любого из них, более предпочтительно тромбина или протромбина, даже более предпочтительно тромбина. Тромбин или протромбин могут быть различных степеней и уровней активности. Способ согласно настоящему изобретению может быть применен для нанесения любой из этих различных степеней.
Настоящий способ доказал, что ферментативная активность поддерживается во время процесса получения. Таким образом избегают необязательных потерь активного агента, часто наблюдаемых в связи с агрессивными химическими и физическими состояниями. Таким образом, настоящее изобретение особенно подходит, когда активным агентом является ферментативно активный агент, особенно тромбин, такой как рекомбинатный человеческий тромбин.
Неожиданно было обнаружено, что несмотря на то, что давно известно, что белки подвержены денатурации, когда они подвержены влиянию спиртов, способ согласно настоящему изобретению при применении к белку типа тромбина и применении водно-спиртового раствора не влияет на ферментативную активность в сколько-нибудь значительной степени. Как показывают примеры, включенные в данное описание, белок, примером которого является тромбин, может быть высвобожден из абсорбирующего элемента приспособления для ухода за раной. При этом он не только высвобождается, но активность тромбина поддерживается, как измерено путем корреляции с образцом тромбина, растворенным в воде (см. пример 5).
Не только то что ферментативная активность поддерживается на том же уровне, показывает, что данный процесс не наносит вреда белку, это также показывает, что данный процесс нанесения активного агента на поверхность абсорбирующего элемента таков, что весь активный агент высвобождается при контакте с физиологическим раствором. Пример 3 показывает, что весь нанесенный активный агент высвобождается в течение 1 минуты экстракции с PBS. Таким образом, в отличие от многих трансдермальных пластырей, в которых достигается замедленное высвобождение в течение часов или дней, данная повязка обеспечивает быстрое высвобождение. Это особенно важно, когда приспособление для ухода за раной подлежит применению при лечении кровоточащих ран.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения активным агентом является белок в водно-спиртовом растворе; более предпочтительно в водно-этаноловом растворе; даже более предпочтительно в водно-этаноловом растворе, имеющем содержанием этанола в диапазоне от 5 до 35% об.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения активным агентом является тромбин в водно-этаноловом растворе, имеющем содержание этанола в диапазоне от 5 до 35% об., более конкретно от 10 до 30% об., еще более конкретно от 15 до 30% об.
2
2
2
Когда активный агент в водном растворе или водно-спиртовом растворе нанесен на абсорбирующий элемент, желаемая концентрация активного агента на поверхности конечного приспособления для ухода за раной может быть получена посредством варьирующихся различных параметров. В частности, может быть отрегулирована концентрация активного агента, напорный поток и скорость, с которой поверхность абсорбирующего элемента, контактирующая с раной, перемещается между струйной форсункой и нейтральным элементом. Например, высокая концентрация активного агента может требовать более низкого напорного потока и/или более высокой скорости, чем менее концентрированный раствор активного агента, для того, чтобы достичь той же концентрации активного агента на абсорбирующем элементе. Она может быть измерена, например, в мг/см, мкг/см или ед. NIH/см в зависимости от конкретного нанесенного активного агента.
2
2
В общем способ согласно настоящему изобретению может быть применен для нанесения концентрированных растворов активных агентов, например способ хорошо подходит для нанесения 5% вес/об. раствора альбумина (альбумин применен в качестве тестовой смеси, см. пример 2 в данном документе). Предусматривается, что способ согласно настоящему изобретению может быть применен для нанесения 1 ед. NIH/см - 1000 ед. NIH/смтромбина. Ниже предоставлены дополнительные подробности относительно желаемых количеств тромбина для лечения кровоточащих ран и, следовательно, предпочтительных количеств, примененных согласно способу настоящего изобретения.
Абсорбирующий элемент может быть приготовлен из любого абсорбирующего материала, который подходит для применения в приспособлении для ухода за раной. Предпочтительно абсорбирующий элемент выбран из группы пеноматериала, альгинатов, полисахаридов, хитозанов, сверхвпитывающих материалов или их комбинаций. Дополнительно или факультативно, абсорбирующий элемент может быть получен из этиленвинилового ацетата (EVA), капролактона, mPEG-PLGA (PLGA = сополимер молочной и гликолевой кислот) или их сополимеров. Предпочтительным является, если абсорбирующим элементом является элемент из гидрофильного абсорбента, такой как пеноматериал, получаемый при применении пенополиуретана. Примеры 2 и 4 в данном документе показывают, как способ электрораспыления эффективно обеспечивает пенополиуретан тонким активным слоем на поверхности пеноматериала.
Толщина абсорбирующего элемента может быть такой, какая необходима для конкретной цели, например, варьируясь в диапазоне от 0,5 мм до 20 мм, такой как, например, от 1 мм до 10 мм или от 1,5 мм до 6 мм. Как видно из примеров, предоставленных в данном документе, способ согласно изобретению предоставляет абсорбирующий элемент с тонким слоем на поверхности без проникновения в пеноматериал (см. пример 2, фиг.5). Дополнительно активный агент может легко быть снова высвобожденным, дополнительно подтверждая присутствие на поверхности (см. примеры 3 и 5). Толщина абсорбирующего элемента может таким образом быть выбранной из критериев, помимо высвобождения активного агента, такого как, например, сколько наличествует раневого экссудата и/или сколько крови окружает место раны. Абсорбирующий элемент может предпочтительно быть толщиной от 0,5 мм до 6 мм, более предпочтительно от 0,75 мм до 5 мм, даже более предпочтительно от 1,5 мм до 4,5 мм.
Второй аспект настоящего изобретения относится к приспособлению для ухода за раной, получаемому посредством способа, описанного в первом аспекте настоящего изобретения, включая различные варианты осуществления и предпочтительные особенности, указанные в данном документе.
Третий аспект настоящего изобретения относится к приспособлению для ухода за раной с тромбином на поверхности пенополиуретана, контактирующей с раной.
Приспособление для ухода за раной может дополнительно содержать защитный слой. Защитный слой может предпочтительно быть водонепроницаемым, но паропроницаемым. Дополнительные подробности приспособления для ухода за раной являются такими, как описаны для первого аспекта настоящего изобретения.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу остановки кровотечения у людей, включающему этап прикладывания к кровоточащей ране приспособления для ухода за раной, содержащего абсорбирующий элемент, содержащий на поверхности, контактирующей с раной, слой тромбина. Дополнительные подробности приспособления для ухода за раной могут быть такими, как описаны для первого аспекта настоящего изобретения. Абсорбирующим элементом может предпочтительно быть пенополиуретан. Приспособление для ухода за раной может предпочтительно быть получено посредством способа согласно изобретению.
Рана может быть любой кровоточащей раной, например наружной раной на поверхности кожи или внутренней раной во время хирургической операции.
Как показано на примере 3, тромбин, нанесенный на поверхность раневой повязки, моментально высвобождается. Таким образом, кровотечение будет остановлено за считанные минуты после нанесения повязки в соответствии с настоящим изобретением. Пример 6 в данном документе показывает, как приспособление для ухода за раной в соответствии с настоящим изобретением остановит кровотечение после надреза в селезенке и печени соответственно. Если повязка дополнительно содержит абсорбирующий элемент, кровь впитается в абсорбирующий элемент.
Остановка кровотечения может быть даже дополнительно ускорена путем применения сжатия повязки после ее прикладывания к ране. Поскольку пеноматериалы (предпочтительно пенополиуретан), применяемые для повязок на рану, в целом являются мягкими, подобное сжатие не нанесет вреда ране или не доставит раненому еще больше боли. Соответственно, способ согласно четвертому аспекту настоящего изобретения может дополнительно содержать этап применения сжатия к приспособлению для ухода за раной. Сжатие может, например, быть применено в течение периода времени в 15 секунд - 5 минут, таком как, например, 30 секунд, 45 секунд, 1 минуту, 2 минуты, 3 минуты, 4 минуты или 5 минут. Во многих случаях будет целесообразно применить сжатие на 15 секунд - 2 минуты. Пример 6 в данном документе приводит пример применения сжатия и показывает, как сжатие в течение 1 минуты является достаточным для остановки кровотечения во время первой минуты сжатия (t=0).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения приспособление для ухода за раной в соответствии с первым, вторым, третьим и четвертым аспектом настоящего изобретения содержит на своей поверхности, контактирующей с раной, некоторое количество тромбина в диапазоне от 1 до 200 ед. NIH/см, таком как, например, 1-150 ед. NIH/см, 5-150 ед. NIH/см, 10-125 ед. NIH/см, 15-100 ед. NIH/см или 15-90 ед. NIH/см. Применяемая в данном документе единица измерения «ед. NIH» - это единица активности NIH, и количество тромбина, следовательно, обозначено его активностью. Количество тромбина на приспособлении для ухода за раной может варьироваться в зависимости от планируемого количества продукта, чем сильнее кровотечение, тем выше желаемая концентрация тромбина. Соответственно, количество тромбина находится в диапазоне от 10 до 125 ед. NIH/см, предпочтительно в диапазоне от 15 до 100 ед. NIH/см и даже более предпочтительно в диапазоне от 20 до 90 ед. NIH/см. Предусмотрено, что количество в 75 ед. NIH/см в приспособлении может быть подходящим для остановки сильных кровотечений. Пример 6 в данном документе показывает, как приспособление с примерно 30 ед. NIH/см остановит кровотечения из небольшого надреза в органе.
Для некоторых условных обозначений касательно единиц измерения активности, использованных в литературе о тромбине, может потребоваться перевод из одних условных обозначений в другие: 1 ед. IOWA = 0,83 ед. NIH; 1 ед. WHO = 0,56 ед. NIH; 1 ед. NIH = 0,324 +/- 0,073 мкг; и 1 ед. NIH = 1 ед. USP.
Примеры
Пример 1: Применение водного раствора красителя на пеноматериале Biatain, толщиной 2 мм.
Модель для применения высокоактивных веществ.
Сущность
Разработан способ, в котором водный раствор, содержащий активный агент, может быть нанесен на гидрофильную поверхность очень аккуратно и с очень малыми потерями материала. Раствор закачивают посредством шприцевого насоса и наносят электрораспылением на пеноматериал с применением XYZ-координатного робота.
В данном случае способ представлен с применением метиленового синего на пеноматериале Biatain (пенополиуретане).
Способы и материалы
0,5%(вес/об.) метиленового синего (aq)
Робот и контроллер Fisnar I&J 9000
Шприцевой насос NE-300 (New Era Pump System)
Монтажный кронштейн POM и алюминиевый приемный датчик с размерами 250×250×3 мм (изготовленный фирмой Pilot)
Струйная форсунка
Высоковольтный источник питания (Ultravolt)
Экспериментальная разработка
Робот запрограммирован для осуществления формы распыла, как на фиг.1. Робот установлен в исходном положении, подается напряжение, и запускают шприцевой насос. Когда струя стабильна, запускается программа. Роботизированную установку можно увидеть на фиг.2, а результат с красителем на коллекторной пластине - на фиг.3.
Были применены следующие параметры
Расстояние форсунка/коллектор: 2 см
Напряжение коллектора: 0 кВ (заземление)
Напряжение форсунки: 10 кВ
Чистую воду было несколько сложно распылить, возможно, из-за поверхностного натяжения, так что вместо нее был применен 25% раствор этанола (об. %). С применением такого раствора стало возможным получение стабильной струи маленьких капель.
Скорость: 10%
Расход: 6 мл/ч
Дистанция (за один проход): 3870 мм
Время (за один проход): 3 мин 7,24 сек
Объем (за один проход): 312 мкл
Эксперимент над Biatain позволил точное нанесение красителя на пеноматериал. Затем пеноматериал был просушен в течение 15 минут в вакуумном эксикаторе. Результат с красителем на пеноматериале Biatain можно увидеть на фиг.4.
Результаты и обсуждение
Электрораспыление
В первоначальных экспериментах форсунка была смонтирована на роботе, но вскоре стало очевидно, что процесс электрораспыления является чувствительным к вибрациям. Когда робот был неподвижен, могла быть сформирована стабильная струя, но как только робот приходил в движение, струйная форсунка начинала разбрызгивать. Установка была изменена таким образом, чтобы струйная форсунка была неподвижна и коллекторная пластина была прикреплена болтами к роботу, т.е. коллекторная пластина перемещается под струйной форсункой с целью формирования формы распыла. Затем стало возможным получить стабильную струю и достаточную точность и даже нанесение красителя.
Заключение
С применением электрораспыления возможно аккуратное нанесение водного раствора на пеноматериал Biatain. Электрораспыление может быть применено для нанесения высокоактивных веществ.
2
Пример 2: Изготовление повязок Biatain с тромбином (75 ед. NIH/см).
Сущность
Тромбин наносится электрораспылением на пеноматериал Biatain, как описано в примере 1. Из-за низкой активности применяемого тромбина (68 ед. NIH/мг) следует наносить много жидкости на пеноматериал. Это вызывает некоторую деформацию продукта при сушке.
Способы и материалы
Тромбин, Calbiochem cat# 605157, lot# D00106223, активность 68 ед. NIH/мг, 1 тыс. ед. NIH/пузырек, 30 пузырьков (ед. NIH = единицы NIH). Тромбин растворен до 10 мл водой и помещен в пластиковый шприц 10 мл.
Biatain 3,4 мм, 50×100 мм
Экспериментальная разработка
Робот запрограммирован для реализации желаемой структуры. Biatain размещен в предварительно отмеченном положении на коллекторе, робот подготовлен, запускают шприцевой насос и подают напряжение. Когда струя стабильна, программа запускается.
Расстояние форсунка/коллектор: 20 мм
Напряжение коллектора: 0 кВ (заземление)
Напряжение форсунки: -13,47 кВ
Напорный поток: 6,15 мл/ч
Время распыления/продукт: (12 мин 10 сек)
Результаты и обсуждение
Электрораспыление
Первоначальные эксперименты были сделаны с 5% вес/об. раствором альбумина бычьей сыворотки (aq) для подтверждения того, что распыление сильного раствора белка является возможным. Поперечный срез этого эксперимента можно увидеть на фиг.5.
Данный первоначальный эксперимент показал:
1. Возможным является распыление 5% вес/об. раствора белка.
2. Белок наносится тонким слоем сверху пеноматериала, в отличие от включения в пеноматериал.
3. Поскольку количество воды, необходимой для нанесения BSA, довольно высокое (1,2 мл), продукт имеет тенденцию испытывать деформацию при сушке.
Этого деформирования можно избежать посредством распыления меньшего количества воды.
Эксперимент был повторен с тромбином, который был распылен на пеноматериал с описанными выше параметрами, просушен в вакууме в течение 4 ч и заключен в металлизированную пленку с осушителем (1 г молекулярного сита).
Заключение
2
Тромбин был нанесен в качестве тонкого слоя на повязки Biatain 50×100 мм с активностью 75 ед. NIH/см.
Пример 3: Измерение тромбина в Biatain
Цель
Целью настоящего эксперимента было измерить, будет ли тромбин, присоединенный к поверхности Biatain, снова высвобождаться и поддерживает ли он свою активность. Активность тромбина была применена в качестве меры количества.
Способы и материалы
96-луночная плашка была покрыта 0,1% ПЭГ 20000 при комнатной температуре в течение 3 часов, после чего плашку просушили при 37°C.
Буфер для анализа: 50 мМ Трис-HCl с pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,1% PEG. Основной раствор хромозима: (Sigma T1637) 1,51 мМ с pH до 4,0 разведен до 500 мкм в буфере для анализа.
Бычий, свободный от плазминогенов, тромбин (Calbiochem CAL605160) был разведен до следующей концентрации 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 и 1,5625 ед. NIH/мл (ед. NIH = ед. NIH).
2
Два образца Biatain (1см) с 200 ед. NIH тромбина и один образец Biatain без тромбина были экстрагированы в физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) в течение 1 мин. Каждый экстракт должен был содержать 200 ед. NIH/мл и был разбавлен до тех же концентраций, что и образцы тромбина.
Анализ был произведен в покрытой 96-луночной плашке посредством добавления разведений тромбина или Biatain в раствор хромозима. Ферментная активность отслеживалась посредством измерения реакции при 405 нм каждую минуту в течение 30 минут при 37°C с перемешиванием перед каждым измерением.
Результаты
Как показано на фиг.6-9, два образца Biatain (Biatain образец 1 (фиг.8) и образец 2 (фиг.9)) с тромбином имеют практически одинаковые кривые и, следовательно, одинаковую активность, поскольку образец тромбина означает, что Biatain высвободил весь добавленный тромбин. Это также означает, что процесс добавления тромбина в Biatain не влияет на активность тромбина. Экстракт Biatain без тромбина не имеет никакого эффекта на анализе (фиг.7).
Заключение
Тромбин, добавленный на поверхность Biatain, может быть экстрагирован с PBS. Активность экстракта была в том же диапазоне, как и добавленного на Biatain, что означало, что процесс добавления тромбина в Biatain не оказывает уменьшающего влияния на активность.
2
Пример 4: Изготовление повязок Biatain с тромбином (27 ед. NIH/см).
Сущность
Тромбин наносят электрораспылением на пеноматериал Biatain, как описано в примере 2, но с более низкой концентрацией и с этанолом в растворе.
Способы и материалы
Тромбин, Calbiochem cat# 605157, lot# D00106223, активность 68 ед. NIH/мг, 1 тыс. ед. NIH/пузырек, 2 пузырька (ед. NIH = единицы NIH). Тромбин растворен до 5,0 мл с 25% (об. %) EtOH(aq) и помещен в пластиковый шприц 10 мл.
Раствор распыляют на листы Biatain толщиной 2 мм и пятна с тромбином вырезают из листа после сушки (1,6×1,6 см).
Экспериментальная разработка
Робот запрограммирован для покрытия поверхности 1,6×1,6 см. Запускают шприцевой насос и подают напряжение, и когда впрыск стабильный, программа запускается.
Расстояние форсунка/коллектор: 12 мм
Напряжение коллектора: 0 кВ (заземление)
Напряжение форсунки: -10 кВ
Напорный поток: 5,25 мл/ч
2
Время распыления: 120 с/(1,6×1,6 см)
Настоящий эксперимент приводит к меньшему разбрызгиванию и более стабильной струе электрораспыления, чем в эксперименте 2. Продукт сушат в вакууме и заключают в фольгированные пакеты с 2 г молекулярного ситового осушителя в атмосфере азота.
Пример 5: Измерение тромбина в Biatain
Цель
Целью настоящего эксперимента было измерить, будет ли тромбин, растворенный в 25% EtOH и электрораспыленный на Biatain, иметь ту же активность, как и тромбин, растворенный в воде.
Материалы и способы
96-луночная плашка была покрыта 0,1% ПЭГ 20000 при комнатной температуре в течение 3 часов, после чего плашка была высушена при 37°C. Буфер для анализа: 50 мМ Трис-HCl с pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,1% ПЭГ. Основной раствор хромозима: (Sigma T1637) 1,51 мМ с pH до 4,0, разведенный до 500 мкм в буфере для анализа.
Бычий, свободный от плазминогенов, тромбин (Calbiochem CAL605160) был разведен до следующей концентрации 25, 12,5, 6,25 и 3,125 ед. NIH/мл в EtOH (ед. NIH = ед. NIH) и сравнен с тромбином от HTI (Haematologic Technologies Inc.), растворенным в воде, разведенным до тех же концентраций. Тромбин от HTI был единственным тромбином, который был разведен в воде, но он был застарелым разведенным раствором, который мог потерять некоторую активность.
2
Два образца Biatain (1 см) с 10 ед. NIH тромбина, нанесенным посредством электрораспыления в соответствии с настоящим изобретением, были экстрагированы в физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) в течение 1 мин. Каждый экстракт должен содержать 10 ед. NIH/мл.
Анализ был осуществлен в покрытой 96-луночной плашке посредством добавления разведений тромбина или экстракта с Biatain в раствор хромозима. Ферментная активность отслеживалась посредством измерения реакции при 405 нм каждую минуту в течение 30 минут при 37°C с перемешиванием перед каждым измерением.
Результаты
Тромбин, растворенный в EtOH и в воде, имеет одинаковые кривые в различных разведениях, исключая при 25 ед. NIH/мл, при этом EtOH имеет шаговые кривые, показывающие более высокую активность. Все другие разведения были одинаковыми в воде и в EtOH, что показывает, что могла иметь место ошибка разведения. Это означает, что тромбин может быть разведен в EtOH.
Заключение
Тромбин, растворенный в EtOH и нанесенный на Biatain посредством электрораспыления имеет такую же активность, как и при растворении в воде.
Пример 6: Остановка кровотечения ран при применении Biatain с тромбином
2
2
Повязки Biatain, изготовленные в примере 4, содержащие нанесенный электрораспылением тромбин с ~30 ед. NIH/см (27 ед. NIH/см), были применены в эксперименте для остановки кровотечения в селезенке и печени свиней.
Рассматриваемую процедуру можно увидеть на фиг.11, и она состоит из следующих этапов:
1) образования раны путем надреза в селезенке (A: 0,8×0,8 см и B: 1×1 см) или печени (C: 1×1 см);
2
2
2) прикладывание повязки Biatain площадью ~2×2 см (1,6×1,6 см);
3) применения сжатия в течение 1 мин;
4) определения остановки кровотечения сразу же (t=0) и после 1 и 5 мин.
Сравнение сделано с контрольным образцом: идентичной повязкой Biatain без тромбина.
Повязку Biatain перед прикладыванием можно увидеть на фиг.12. Эксперимент A и B с селезенкой можно увидеть на фиг.13 и 14 соответственно. Эксперимент C с печенью можно увидеть на фиг.15.
Заключение
Как можно увидеть на фиг.12-15, контрольные повязки не имеют кровоостанавливающего эффекта и отталкиваются от раны кровью, т.е. под контрольными повязками продолжается кровотечение. Повязки с тромбином обеспечивают кровоостанавливающий эффект, при T=0 присутствует небольшое кровотечение в центре повязки, которое не увеличивается в сравнении с контрольным образцом. Кровь, видимая на краях повязок с тромбином, обуславливается окружающей средой. В заключение повязки, полученные с применением электрораспыления тромбина, обеспечивают хороший кровоостанавливающий эффект.