Молекулярная Эпидемиология вируса клещевого энцефалита: географическая вариабельность, определяемая методом молекулярной гибридизации

Молекулярная эпидемиология вируса клещевого энцефалита: географическая вариабельность, определяемая методом молекулярной гибридизации

Т.В. Демина1, Ю.П. Джиоев1, М.М. Верхозина1, И.В. Козлова1,

С.Е. Ткачев2, Е.К. Дорощенко1, О.В. Лисак1, В.И. Злобин3

1 Институт эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ Сибирского отделения РАМН, г. Иркутск

2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

3 Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва

Резюме

С помощью панели генотип-специфических зондов методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) исследована географическая вариабельность вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Протестированы образцы РНК 273-х музейных штаммов вируса и уточнено распределение его генотипов и субгенотипов генотипа 3 на территории евро-азиатского ареала. Установлено, что в Восточной Сибири циркулируют штаммы пяти генотипов вируса. Три из них (дальневосточный, западный и урало-сибирский) общепризнаны, распространены повсеместно и имеют эпидемическое значение. Генотип 4 представлен штаммом 178-79, а генотип 5 - группой из десяти штаммов, среди которых оказался ранее выявленный как уникальный изолят 886-84. Предполагается, что структура геномов этих штаммов - результат ряда последовательных множественных рекомбинаций между геномными молекулами трех известных генотипов ВКЭ. Впервые посредством МГНК выявлены политиповые штаммы ВКЭ. РНК таких штаммов является смесью фрагментов (возможно, и полногеномных молекул) разных генотипов.

Ключевые слова: МГНК, генетическая вариабельность, генотипы ВКЭ

Abstraot

Molecular Epidemiology of Tick-Borne Encephalitis Virus: Geographic Variability Determined through the Method of Molecular Hybridization

T.V. Demina1, Yu.P. Dzhioev1, M.M. Verkhozina1, I.V. Kozlova1,

S.E. Tkachev2, E.K. Doroshchenko1, O.V. Lisak1, V.I. Zlobin3

1 Institute of Epidemiology and Microbiology, Scientific Center of Family Health and Human Reproduction Problem, SD RAMS, Irkutsk

2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division of RAS, Novosibirsk

3 D.I. Ivanovsky Institute of Virology, RAMS, Moscow (vizlobin@mail.ru) Using the method of nucleic acids molecular hybridization (MHNA) with genotype specific probes panel we researched geographic variability of tick-borne encephalitis virus (TBEV). RNA samples of 273 museum virus strains have been tested and we obtained more specific information concerning distribution of TBEV genotypes and genotype 3 subgenotypes within Euro-Asian area. Strains of five virus genotypes were found to circulate in Eastern Siberia. Three of them (Far Eastern, Western and Siberian) are universally recognized, spread everywhere and have epidemic significance. Genotype 4 is represented sole strain 178-79. Genotype 5 is represented by the group consisting of ten strains among which isolate 886-84 has been detected, earlier identified as a unique one. Its genome structure is supposed to be the result of the successive multiple recombinations among the genome molecules of the three known TBEV genotypes. For the first time using NAMH resulted in detecting TBEV polytypic strains. RNA of these strains is a mixture of fragments (and probably even of full genome molecules) of various genotypes.

Key words: MHNA, genetic variability, genotypes of TBEV

Введение

Клещевой энцефалит (КЭ) - природноочаговая вирусная инфекция ЦНС. Заболевание отличается тяжестью клинических проявлений, развитием в ряде случаев очаговых форм, высокой частотой остаточных явлений в виде парезов и параличей, а также летальностью, достигающей 30% [14].

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является типовым представителем группы флавивирусов млекопитающих, переносимых клещами, и включает три подтипа: европейский (западный), дальневосточный и сибирский [27]. В состав группы входят несколько видов, распространенных в географически удаленных друг от друга районах Европы, Азии и Америки. Эволюционные и генетические

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

взаимоотношения как между этими вирусами, так и между штаммами собственно ВКЭ остаются недостаточно ясными, что выражается в противоречивости классификационных схем, предложенных разными авторами.

Антигенные подтипы вируса КЭ, по мнению ряда исследователей, соответствуют трем основным генотипам вируса - дальневосточному (генотип 1 с прототипным штаммом Sofjin), западному (генотип 2, Neudoerfl) и урало-сибирскому (или сибирскому - генотип 3, Lesopark-11, Vasilchenko) [4, 6, 7, 18].

В результате изучения генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии небольшого участка гена Е (160 н.о.) 34 штаммов в 2001 году сделано предположение о существовании шести генотипов вируса [7, 8]. Три из них были признаны основными [4]. Штамм Turkish, описанный ранее как отдельный представитель КЭ [23] и включенный нами вместе со штаммом Vergina (описан В.В. Погодиной с соавт. в [16] как штамм ВКЭ) в состав генотипа 6, зарубежными исследователями отнесен к вариантам вируса шотландского энцефаломиелита овец (LI) [27]. Генотипы 4 и 5 представлены не группами, а одиночными штаммами - 178-79 и 886-84. Оба изолированы на территории Иркутской области и отвечают критериям выделения в самостоятельные генотипы, установленным на основании степени геномных отличий. Было высказано предположение, что другие представители этих двух генотипов пока не найдены.

Последнее предложение по пересмотру классификации ВКЭ сделано G. Grard с соавт. [24]. На основе анализа полногеномных последовательностей вирусов испанского и турецкого энцефалитов овец исследователи пришли к выводу, что ВКЭ следует разделить на четыре генетических типа: западный КЭ, восточный КЭ, турецкий КЭ овец и шотландский энцефаломиелит овец. Согласно предложенной классификационной схеме генотип 3 причисляется к восточному КЭ. Мы не можем согласиться с такой трактовкой, поскольку считаем существование генотипа 3 реальным фактом в силу наличия у него высокого процента генетических отличий от генотипов 1 и 2, присутствия специфичных для него последовательностей, обнаруживаемых у большого числа штаммов, выделенных в природе, и, наконец, широкого распространения на территории России.

Идентификация штаммов ВКЭ с помощью рутинных серологических методов из-за их тесных генетических взаимоотношений и близкого антигенного сходства является проблематичной. Тем не менее, хотя они и близкородственны, штаммы разных генотипов различаются по патогенности для людей, и следовательно, точная и быстрая идентификация вируса, изолированного от пациента, представляет большую важность. Только с появлением анализа первичной структуры РНК и ПЦР стало возможным точно идентифицировать штаммы ВКЭ. Однако эти методы из-за их высокой стоимости можно исполь-

зовать лишь для ограниченного числа образцов. В настоящем исследовании описывается альтернативный подход (молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот - МГНК) к анализу образцов РНК.

Цель данного исследования - оценка возможностей использования набора генотип-специфических дезоксиолигонуклеотидных зондов для изучения природного генетического разнообразия возбудителя клещевого энцефалита, проведения молекулярно-эпидемиологического мониторинга эндемичной территории и совершенствования средств идентификации.

Материалы и методы

Для дифференциации штаммов ВКЭ сформирована панель из зондов, мишенью для которых послужили все десять вирусных генов (табл. 1). Зонды подбирали на основе анализа данных GenBank по состоянию на 2004 год, с учетом требований по дизайну праймеров [28] и опыта предыдущих гибридизаций [6, 9, 33]. В составе панели 40 дезок-сиолигонуклеотидных последовательностей. Из них одна последовательность видоспецифична (зонд sh5 [33]); 36 являются генотип-специфическими -по 12 на каждый из трех генотипов; два зонда субгенотип-специфичны - дифференцируют штаммы внутри урало-сибирского генотипа (предполагаемые субгенотипы Vasilchenko и Zausaev, для краткости обозначенные нами как 3а и 3б) и один зонд является штаммоспецифичным.

Панель использовали для тестирования в реакции МГНК образцов РНК 273 штаммов вируса КЭ из коллекции вирусов Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН (г. Иркутск), выделенных с 1937 по 2006 год. Штаммы вируса КЭ выделяли и поддерживали путем внутримозгового заражения белых мышей и хранили в лиофилизированном виде на уровне 3 - 7-го пассажей.

В составе выборки: 169 штаммов из Восточной Сибири (Читинская область - 8, Республика Бурятия - 55, Иркутская область - 91, Красноярский край и Республика Хакасия - 15) и 104 штамма с остальной эндемичной территории, куда вошли Дальний Восток - 15 штаммов, Западная Сибирь -25, Предуралье - 23, Центральная и СевероЗападная Россия - 20, зарубежная Восточная Европа - 18, Центральная Азия (Монголия) - 2, Средняя Азия (Киргизия) - 1.

Штаммы изолированы из различных биологических объектов: от клещей рода Ixodes - 217, клещей рода Dermacentor - 10, грызунов - 25, насекомоядных - 1, птиц - 1, из молока коровы - 2, из секционного материала, крови и спинномозговой жидкости людей, больных клещевым энцефалитом, - 17 штаммов.

Выделение суммарной РНК, нанесение ее на капроновые или нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию с дезоксиолигонуклеотидными зондами осуществляли по общепринятой методике

Таблица 1.

Генотип-специфические дезоксиолигонуклеотидные зонды и их локализация на геноме ВКЭ

Шифр зонда Последовательность нуклеотидов от 5’-конца к 3’-концу (количество звеньев) Расчетная температура гибридизации (°С) Локализация на геноме*

ген генотип/субгенотип/штамм

Е Универс.** CACAATGCTGCCTTTTCCAAATAATCC (27) 71 1156 - 1182

С 1 GGGTGCTCACTGCCTTCTTA (20) 57 234 - 253

С 2 CGTCATCCCCAACAGAGTAA (20) 55 323 - 342

С 3 CAGCAAGACAGTGACAAC(18) 49 316 - 333

м 1 GCACTGTGGCTGCAAGT G(18) 53 341 - 358

м 2 AGGCTCTTCTCCTTGATC (18) 49 508 - 525

м 3 CCTTCCCGCCTTACTGTTG (19) 55 350 - 368

Е 1 GAGTCTCATTAGCAGCGACG (20) 57 1290 - 1309

Е 2 ACTATGTGTCTCGTTTGC (18) 47 1297 - 1314

Е 3 CAGTGGCCTTCTTCTTCG (18) 51 1208 - 1225

Е 1'*** CCACCAGTAGAGCCAAAATC (20) 55 2105 - 2123

Е 2' TCCCAATTGAACTCAGAAAGC (21) 55 2123 - 2143

Е 3' AGTCTCTCGATGCCCTTCC (19) 55 2060 - 2078

NS1 1 TCTTTCCCCTTCTTTAGC (18) 47 2643 - 2660

NS1 2 TAGTCAGTGGGGTCAAAC (18) 49 2604 - 2621

NS1 3 AAGAACCACAACGCCTC(17) 47 3497 - 3513

NS2A 1 CCTCGAATCAGTTTCCAG(18) 49 3939 - 3956

NS2A 2 CTGGAGTAGCATCAAGG (17) 47 3614 - 3630

NS2A 3 TCCCCTGATCAATCTCC (17) 47 3941 - 3957

NS2B 1 ATCTTCGAGCCGTTCTC (17) 47 4452 - 4468

NS2B 2 TCAGACCTTCGGGATGA (17) 47 4456 - 4472

NS2B 3 CAAGCCCAGCAAGTAAC (17) 47 4368 - 4384

NS3 1 CACTGCCCCTATCCTCCTA (19) 55 4836 - 4854

NS3 2 IIIIAGGCCAIIICCGIAIAGC (22) 57 4920 - 4941

NS3 3 GTATTGCTCCCATCTTTCTCC (21) 57 4835 - 4856

NS4A 1 ACCAAACGACGCCAAGAG(18) 51 6521 - 6538

NS4A 2 CATCTCAACCATAGTCAG(18) 47 6484 - 6501

NS4A 3 TCACCTCCACCATCGTGAG(18) 51 6484 - 6501

NS4B 1 TCCCTCTCCAAATGGATTG (19) 51 7242 - 7260

NS4B 2 ATGAGGCACAACACTGTG (18) 49 7308 - 7325

NS4B 3 CTCTCAAGGAACCCCATC (18) 51 6783 - 6800

NS5 1 CTCTCCTGAGGAGTTCC (17) 49 7656 - 7672

NS5 2 TCCTCTTCTGAGCAACTC (18) 49 7657 - 7674

NS5 3 CCTTCCTTAGCAGCTCT (17) 47 7656 - 7672

NS5 1' TTCGAGAAGCCAACCGAATG (20) 55 9622 - 9641

NS5 2' GTGGTTGCCAATTGTTTG (18) 47 9219 - 9236

NS5 3' CAGCTGTTCAGTCTCTGT(18) 49 7574 - 7591

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Шифр зонда Последовательность нуклеотидов от 5’-конца к 3’-концу (количество звеньев) Расчетная Локализация

ген генотип/субгенотип/штамм температура гибридизации (°С) на геноме*

Е За ACAATCCGCAGTGATTGC (18) 49 1145 - 1162

Е Зб AAGGCGCCACCGAGAAC(17) 5З 2158 - 2174

Е 4 TACCCCTTCGTGTCTCC (17) 49 1520 - 15З6

Примечания:

* Нумерация дана по кодирующей части генома.

** Ранее использовавшийся зонд sh5 [33].

*** Символ «штрих» означает отличие одного из двух зондов от другого на один и тот же ген одного и того же генотипа.

[15]. Гибридизацию со всеми зондами проводили при 45 - 47 °С.

Для образцов РНК трех штаммов проводили реакцию обратной транскрипции с набором реактивов РЕВЕРТА-R-IOO, содержащим случайные гексануклеотиды (производство фирмы «Амплисенс», Москва). Амплификацию выполняли с праймерами, соответствующими фрагментам гена E (позиции 1089 - 1108 и 2367 - 2386 на геноме ВКЭ штамма Sofjin-HO (AB062064)) или фрагментам генов E и NS1 (позиции 2216 - 2236 и 3364 - 3383 на геноме ВКЭ штамма Sofjin-HO), синтезированными в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Эти праймеры были выбраны на основании последовательностей участков геномов, максимально консервативных для прототипов трех генотипов ВКЭ (штаммы Sofjin, Neudoerfl и Vasilchenko). Одно- и двухраундовую ПЦР проводили с использованием данных олигонуклеотидов в качестве праймеров в соответствии с рекомендациями производителя («Биосан», г. Новосибирск).

Определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответствующих фрагментам генов E и NS1 ВКЭ, выполняли с помощью наборов BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) с применением автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США) в Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск).

Оценку филогенетических взаимоотношений ВКЭ на основе фрагментов генома и полноразмерных генов 23 штаммов (Sofjin [31], Sofjin-HO (AB062064), 205 (DQ989336), Oshima5-

10 (AB062063), Senzhang (AY182009), MDJ-01 (AY217093), Glubinnoe (DQ862460), Primorye-69 (EU816453), Primorye-86 (EU816455), Primorye-94 (EU816454), Primorye-212 (EU816450), Primorye-253 (EU816451), 178-79 (EF469661), 886-84 (EF469662), Primorye-270 (EU816452), Neudoerfl (TEU27495), 263 (TEU27491), Hypr (TEU39292), K23 (AM600965), Salem (FJ572210), Vasilchenko (L40361), Zausaev (AF527415), Ek-328 (DQ486861)) и вируса омской геморрагической лихорадки - OHF (NC_005062) осуществляли с помощью программ Mega 4.0 [30] и TreeCon [34].

Результаты и обсуждение

Результаты апробации зондов

В ходе тестирования штаммы разделились на четыре группы. 268 штаммов вошли в состав трех групп, соответствующих трем основным генотипам (табл. 2). В группе генотипа 1 оказалось 49 штаммов (18%), генотипа 2 - 21 (8%) и в группе генотипа 3 - 198 штаммов (74%). Пять штаммов составили четвертую группу: три штамма содержали специфичные участки геномов всех трех генотипов вируса, а в двух других обнаружено одновременное присутствие фрагментов РНК дальневосточного и урало-сибирского генотипов в определенных соотношениях (табл. 3).

Анализ эффективности реагирования генотип-специфических зондов с РНК однозначно типиро-ванных 268 штаммов (см. табл. 2) показал:

• генотип-специфические зонды взаимодействовали, за редким исключением, со штаммами одноименных генотипов;

• зонды, специфичные в отношении двух субгенотипов генотипа 3, реагировали только со штаммами генотипа 3. При этом все штаммы данного генотипа разделились на три группы: 1) штаммы субгенотипа 3а (реагирующие с соответствующим зондом); 2) штаммы субгенотипа 3б (также реагирующие с одноименным зондом); 3) штаммы «ни 3а, ни 3б» (не реагирующие ни с одним из этих двух субгенотип-специфических зондов);

• зонд, комплементарный фрагменту генома штамма 178-79, гибридизовался только с РНК этого штамма.

Результаты типирования штаммов ВКЭ

Несмотря на то, что тестированные штаммы прошли от трех до семи лабораторных пассажей с момента выделения из природного очага, четко прослеживается географическая привязка к месту их изоляции. Это проявляется в сходстве паттернов гибридизации РНК штаммов, изолированных из одного и того же локального очага. Отмечается также сходство паттернов у штаммов, выделенных из одного очага в разные годы. Эти факты позволяют использовать полученные нами данные для оценки особенностей природных популяций ВКЭ.

Наша выборка охватывает весь ареал, но, будучи сформированной на основе региональной музейной коллекции, она оказалась в большей мере представлена восточно-сибирскими штаммами.

Таблица 2.

Эффективность гибридизации генотип-специфических олигонуклеотидных зондов с РНК однозначно типированных штаммов ВКЭ

Шифр зонда Штаммы генотипа 1 Штаммы генотипа 2 Штаммы генотипа 3

ген генотип / субгенотип / штамм P/N* %** P/N % P/N %

Е Универсальный 39/49 80 16/21 76 185/195 95

С 1 44/49 90 0/21 0 111/198 56

М 1 33/49 67 0/21 0 1/198 1

Е 1 35/49 71 0/21 0 2/198 1

Е 1'*** 32/49 65 0/21 0 1/198 1

NS1 1 25/49 51 0/21 0 9/198 5

NS2A 1 34/49 69 1/21 5 9/198 5

NS2B 1 37/49 76 0/21 0 6/198 3

NS3 1 48/49 98 0/21 0 26/198 13

NS4A 1 29/49 59 1/21 5 0/198 0

NS4B 1 34/49 69 0/21 0 4/198 2

NS5 1 18/49 37 0/21 0 1/198 1

NS5 30/49 61 0/21 0 18/198 9

С 2 0/49 0 21/21 100 0/198 0

М 2 0/49 0 21/21 100 21/198 11

Е 2 0/49 0 21/21 100 1/198 1

Е 2' 0/49 0 11/21 52 0/198 0

NS1 2 0/49 0 14/21 67 0/198 0

NS2A 2 0/49 0 17/21 81 2/198 1

NS2B 2 0/49 0 1/21 5 10/198 5

NS3 2 0/49 0 19/21 90 0/198 0

NS4A 2 1/49 2 11/21 52 2/198 1

NS4B 2 1/49 2 6/21 29 2/198 1

NS5 2 0/49 0 21/21 100 0/198 0

NS5 2' 0/49 0 21/21 100 9/198 5

С 3 0/49 0 0/21 0 19/198 10

М 3 0/49 0 0/21 0 60/198 30

Е 3 0/49 0 0/21 0 131/198 66

Е 3' 0/49 0 0/21 0 193/198 97

NS1 3 0/49 0 0/21 0 145/198 73

NS2A 3 1/49 2 0/21 0 121/198 61

NS2B 3 1/49 2 0/21 0 78/198 39

NS3 3 1/49 2 0/21 0 169/198 85

NS4A 3 0/49 0 0/21 0 86/198 43

NS4B 3 2/49 4 0/21 0 140/198 71

NS5 3 0/49 0 0/21 0 156/198 79

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Шифр зонда Штаммы генотипа 1 Штаммы генотипа 2 Штаммы генотипа 3

ген генотип / субгенотип / штамм P/N* %** P/N % P/N %

NS5 3' 1/49 2 1/21 5 111/198 56

Е 3а (Vasilchenko) О/49 О О/21 О 44/198 22

Е 3b (Zausaev) О/49 О О/21 О 44/198 22

Е 4 1/49 2 О/21 О О/198 О

Примечания:

* Число позитивных реакций / число тестированных образцов.

** Эффективность гибридизации в процентах.

*** Символ «штрих» означает отличие одного из двух зондов на один и тот же ген одного и того же генотипа.

Таблица 3.

Результаты гибридизации зондов с РНК исследуемых штаммов

Шифр зонда Штаммы

ген генотип / субгенотип / штамм прототипные политиповые «группа 886» 178- 79

1 2 3 262- 74 618- 87 765- 87 Красный Яр-1 Лесопарк-10

Sofjin 256* Vasil- chenko ЭК- 328

Е Универс. +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++

C 1 +++ - - - +++ +++ +++ ++ ++ ++ +++

M 1 +++ - - - +++ +++ +++ ++ + - +++

E 1 +++ - - - +++ +++ +++ ++ + - +++

E 1’** + - - - ++ - +++ ++ + - -

NS1 1 +++ - - - +++ +++ +++ - + +++ +++

NS2A 1 +++ - - - +++ ++ +++ ++ - - -

NS2B 1 +++ - - - +++ ++ +++ ++ - - +++

NS3 1 +++ - - - ++ + ++ +++ + +++ +++

NS4A 1 +++ - - - + - ++ ++ - - -

NS4B 1 +++ - - - +++ + +++ ++ + - -

NS5 1 +++ - - - +++ - +++ - - - -

NS5 +++ - - - - ++ +++ ++ + - -

C 2 - +++ - - - + ++ - - - -

M 2 - +++ - - +++ ++ +++ - - - -

E 2 - +++ - - +++ + + - - - -

E 2’ - +++ - - - + - - - - -

NS1 2 - +++ - - + - - - - - -

NS2A 2 - +++ - - ++ + +++ - - - -

NS2B 2 - + - - ++ + + - - - -

NS3 2 - +++ - - +++ ++ - - - - -

NS4A 2 - +++ - - - - + - - - -

NS4B 2 - + - - +++ - ++ - - - -

NS5 2 - +++ - - + ++ + - - - -

Шифр зонда Штаммы

ген генотип / субгенотип / штамм прототипные политиповые «группа 886» 178- 79

1 2 3 262- 74 618- 87 765- 87 Красный Яр-1 Лесопарк-10

Sofjin 256* Vasil- chenko ЭК- 328

NS5 2' - +++ - - ++ +++ + - - - +++

C 3 - - + - ++ +++ +++ - - - -

M 3 - - + - +++ +++ ++ ++ - - -

E 3 - - +++ +++ +++ +++ +++ ++ - - -

E 3' - - +++ +++ - + ++ ++ +++ - -

NS1 3 - - +++ - - + - +++ +++ - -

NS2A 3 - - + - +++ - + +++ ++ - -

NS2B 3 - - +++ - - +++ +++ ++ - - -

NS3 3 - - + +++ +++ ++ ++ +++ +++ - -

NS4A 3 - - +++ +++ - + +++ - +++ - -

NS4B 3 - - +++ - - - +++ ++ +++ - -

NS5 3 - - ++ - +++ ++ - ++++ +++ - -

NS5 3' - - ++ ++ - - +++ - +++ - -

Е 3а - - +++ - - - + - +++ - -

Е 3б - - - - - +++ ++ +++ - - -

Е 4 - - - - + +++ ++ - - - +++

Примечания:

Уровень гибридизации: +++ - высокий, ++ - средний, + - низкий, — отсутствие гибридизации.

* Штамм описан в литературе как представитель генотипа 2 [22] и использован в данной работе в качестве прототипного. ** Штрих означает отличие одного из двух зондов от другого на один и тот же ген одного и того же генотипа.

Поэтому мы сопоставили данные по двум группам штаммов, обозначенным нами как две условные популяции: «весь ареал» (все 268 однозначно типи-рованных штаммов) и «Восточная Сибирь» (165 мо-нотиповых штаммов). На рисунке 1 данные по этим двум условным популяциям представлены в диаграммах, заключенных в квадраты.

Генотипический состав ВКЭ всего обследуемого ареала соответствует картине, характерной для Восточной Сибири (18% составляют штаммы генотипа 1, 3% - генотипа 2 и 79% - генотипа 3, см. рис. 1). В обеих популяциях циркулируют три основных генотипа вируса, а их распределение по разным территориям согласуется с данными литературы [4]. Так, штаммы генотипа 2 выявляются преимущественно в зарубежной Восточной Европе (пять из 18 в составе европейской части ареала на рис. 3) и на Алтае (пять из восьми в составе Западной Сибири), редко - в Восточной Сибири (пять из 165) и не обнаружены на Дальнем Востоке. Генотип 1 встречается повсеместно, но преобладает на Дальнем Востоке. То есть доля генотипа 2 уменьшается с продвижением с запада на восток до нуля, в то время как доля генотипа 1 доходит до максимума (53%). При этом доминирует на боль-

шей части всего обследованного ареала генотип 3 и доля его на территории Восточной Сибири максимальна (79%).

При сравнении распределения субгенотипов генотипа 3 по всему обследованному ареалу (всего 198 штаммов) и в Восточной Сибири (131 штамм, рис. 2) выявляется, что доля субгенотипа 3а достигает максимума в европейской части ареала (44%), а именно в зарубежной Восточной Европе (девять штаммов из 13), а генотипа 3б - на Дальнем Востоке (71%). При этом субгенотип 3а на Дальнем Востоке отсутствует (или пока не выявлен, возможно, из-за малости выборки). Штаммы из группы «ни 3а, ни 3б» превалируют в центральной части ареала, и в частности в Восточной Сибири (59%). Вместе с тем в каждом отдельном очаге наблюдается преобладание или отсутствие либо субгенотипа 3а, либо субгенотипа 3б, либо группы «ни 3а, ни 3б».

По своеобразию генотипического и субгенотипи-ческого составов в Восточной Сибири выделяются четыре очага. Они расположены на территориях Би-чурского и Баргузинского районов Бурятии, Крас-ночикойского района Читинской области и Эхирит-Булагатского района Иркутской области (см. рис. 1).

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Рисунок 1.

Соотношение генотипов вируса КЭ на территории всего обследованного ареала и в разных его частях

Рисунок 2.

Соотношения субгенотипов генотипа 3 вируса КЭ на территориях всего обследованного ареала и Восточной Сибири по результатам типирования 268 штаммов с помощью панелей генотип-специфических дезоксиолигонуклеотидных зондов

Рисунок 3.

Филогенетические схемы

Различия между штаммами внутри групп и между группами по фрагменту генома в 2194 н.о.

Генотип 1 178-79 «группа МБ» Генотип 2 Генотип 3

генотипі 4,7

178-79 12,4 -

«группа 886» 12,8 13,0 0,85

Генотип 2 16Д 16,4 16,3 2,2

Генотип 3 14,8 14,3 13,1 15,6 6,7

ОНГ 19,9 20,6 19,6 19,1 20,0

Различия между штаммами внутри групп и между группами по фрагменту генома в 160 н.о.

Генотип 1 178-79 «группа 886» Генотип 2 Генотип 3

Генотип 1 6,1

178-79 14,2 -

«Группа 886» 13,5 15,0 0,9

Генотип 2 17,0 18,3 15,0 2,3

Генотип 3 15,1 16,7 11,8 14,1 5,8

ОНГ 23,6 25,0 21,7 21,2 24,0

Примечание: Ромбами помечены штаммы, нуклеотидные последовательности которых получены в данной работе.

Здесь обнаружились штаммы, предварительно типи-рованные как «дальневосточные с необычной картиной гибридизации» - с 25%-ной реактивностью с зондами генотипа 1 (с РНК этих штаммов реагируют три из 12-ти генотип-специфических зондов генотипа 1, см. табл. 3), хотя по всему обследованному ареалу циркулируют штаммы генотипа 1, обладающие реактивностью с соответствующими зондами в пределах от 42 до 100%. Поскольку среди штаммов, гибридизующихся в 25% случаев с зондами генотипа 1, оказался ранее выявленный нами как уникальный штамм 886-84, мы назвали их «группой 886» (см. рис. 1, табл. 3). В состав «группы 886», помимо прототипного штамма, вошли два штамма, изолированные от красно-серой полевки (Clethrionomys rufocanus) (740-84, 711-84), и семь

- от клещей I. persulcatus (418-90, 712-89, 60890, 617-90, 636-90, 691-90 и 287-83). Годы изоляции: 1983, 1984, 1989 и 1990.

Для штаммов 617-90, 740-84 и 711-84 были получены фрагменты геномов длиной 2194 н.о., кодирующие большую часть белков Е (1322 н.о.) и NS1 (872 н.о.) (Еи878283, Еи878282, Еи878281). При сравнении этих фрагментов с соответствующим участком генома штамма 886-84 ^469662) выявлен высокий уровень гомологии (99,3 -99,8%) всех четырех последовательностей. Отличия на участке в 160 н.о. (фрагмент гена Е, упо-

минавшийся выше и в [7, 8]) между штаммами из «группы 886» и штаммами, относящимися к трем генотипам, составили не менее 12% (см. рис. 3), что соответствует критериям генотипирования, изложенным в [8].

Очаг клещевого энцефалита на территории Эхирит-Булагатского района необычен еще и тем, что в нем, помимо штамма 886-84, обнаружены представители всех трех генотипов и разных субгенотипов, а также политиповые штаммы (262-74, 618-87) и уникальный штамм 178-79 - единственный из 268 штаммов, прореагировавший с зондом, сконструированным на его основе, и с зондом генотипа 2 на ген NS5 (см. табл. 3).

Своеобразие этих двух восточно-сибирских изо-лятов - 886-84 и 178-79 - проявляется при любом способе построения филогенетических схем, на основе любого участка кодирующей части генома достаточной протяженности. Для проведения такого анализа мы использовали фрагменты генома разной длины (от нескольких десятков нуклеотидных оснований до полногеномных структур) и различной локализации - результат был однозначен. Эти два штамма отличались не только тем, что каждый из них располагался особо на отдельной ветке филогенетического дерева, но и тем, что в зависимости от местоположения анализируемого фрагмента эти ветки примыкали то к кластеру ге-

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

нотипа 2, то к кластеру генотипа 3, но чаще группировались со штаммами генотипа 1. Например, на рисунке 4 видно, что на деревьях, выстроенных на основе структур трех из десяти генов вируса КЭ, оба штамма из Восточной Сибири отличаются от других штаммов ВКЭ (числом 21), которые однозначно группируются в три кластера, вне зависимости от того, какой ген использован для построения схемы филогенетических отношений. Филогенетические деревья, выстроенные по структурам остальных семи генов, на рисунке не показаны, но их порядок ветвления аналогичен схеме дерева, заключенного в квадрат.

Результаты исследования показывают, что в масштабах всего изученного ареала и в разное время (с 1937 по 2006 г.) наблюдается циркуляция достаточно стабильного набора генетических вариантов ВКЭ, а предложенный способ генотипирования вируса с помощью панели молекулярных зондов позволяет оценивать генетические особенности вирусных популяций на различных участках ареала. Сходство паттернов гибридизации РНК штаммов, относящихся к одному и тому же генотипу, из очагов, расположенных на территориях западной

и восточной окраин евро-азиатского ареала, разделенных расстоянием около 10 000 км, свидетельствует о его единстве. Это означает, что мозаичное распределение природных очагов ВКЭ сочетается, по всей вероятности, с постоянным и достаточно интенсивным обменом между ними. То есть генетические варианты вируса разного географического происхождения могут относительно свободно «перекачиваться» по единой очаговой системе в любом направлении.

Сопоставимость генотипических картин всего обследованного ареала с генетической структурой штаммов Восточной Сибири (см. рис. 1), возможно, объясняется достаточной представительностью региональной выборки, а скорее всего - расположением этого региона в центральной части ареала, где, по всей вероятности, чаще, чем в западных и восточных частях ареала, «перемешиваются» вирусы, относящиеся к разным генотипам. Полученная панорамная информация о генетической гетерогенности возбудителя КЭ по всему обследованному ареалу подтверждает ранее сделанный вывод о том, что каждый из трех генотипов вируса обладает собственным ареалом, где он доминирует [4].

Рисунок 4.

Сравнение филогенетических деревьев, построенных на основе анализа полноразмерных генов С, NS4А, NS4В и кодирующей части полноразмерных геномов 22 штаммов ВКЭ с помощью программы ТгееСоп

Ген NS4a

Генотип 2

Ген NS4b

Примечание: Кластер генотипа 1 представлен штаммами: Sofjin, Sofjin-HO, 205, 0shima5-10, Senzhang, MDJ-01, Glubinnoe, Primorye-69, Primorye-86, Primorye-94, Primorye-212, Primorye-253, Primorye-270; генотипа 2 - Neudoerfl, 263, Hypr, K23, Salem; генотипа 3 - Vasilchenko, Zausaev, ЭК-328.

Картина географического распространения предполагаемых субгенотипов генотипа 3 (3а и 3б) ВКЭ (см. рис. 2) была получена после обработки результатов гибридизации РНК исследуемых штаммов с одноименными зондами. Вывод о существовании этих субгенотипов на основе анализа гомологии участков вирусного генома был сделан в 1999 году в работе [2]. Отмечалось, что каждому из шести генотипов ВКЭ, описанных в [7, 8], соответствует определенное сочетание аминокислот в позициях 206, 228 и 232

- 234 (по белку Е). Две группы штаммов уралосибирского генотипа (5 и 12 из 21) отличались друг от друга и от групп штаммов других генетических вариантов по аминокислоте в позиции 234 (Q или H). Среди представителей с аминокислотой Q234 оказался прототипный для уралосибирского генотипа штамм Vasilchenko, полная структура генома которого была расшифрована самой первой (1993 г.) [25]. К периоду завершения работы над дизайном представленных в настоящем исследовании зондов (2004 г.) был расшифрован геном штамма Zausaev [26]. Он пополнил группу представителей генотипа 3 с маркером Н234 (по белку Е). Обе группы отличались друг от друга не только по маркерной аминокислоте, но и по нуклеотидному составу, на основании чего и были выведены консенсусы субгенотип-специфических зондов Е3а и Е3б (см. табл. 1). Среди протестированных методом МГНК штаммов оказался эстонский изолят ЭК-328 (см. табл. 3), который вошел в группу «ни 3а, ни 3б» и геномная структура которого полностью дешифрована к настоящему времени [32]. Штамм ЭК-328, как и представители группы Zausaev, имеет маркерную аминокислоту Н234, но не реагирует с зондами Е3а и Е3б (см. табл. 3). Штаммы группы «ни 3а, ни 3б» более многочисленны и, по-видимому, более гетерогенны, чем групп Vasilchenko и Zausaev.

Похожую схему дифференциации генотипа 3, выведенную на основе сравнительного анализа 19 штаммов ВКЭ по фрагменту гена Е длиной 211 н.о., предлагают В.В. Погодина с соавт. [17]. Согласно этой схеме, субгенотипу Zausaev соответствует подгруппа H234Za (азиатский топовариант-1), субгенотипу Vasilchenko - подгруппа H234VS (азиатский топовариант-2), группе «ни 3а, ни 3б» - подгруппа Н234ЯР (европейский топовариант) с про-тотипным штаммом Jaroslavl-2.

На фоне традиционных представлений о генотипах ВКЭ особого внимания заслуживают штаммы 178-79 и 886-84, изолированные из одного очага в Восточной Сибири.

Впервые их необычность выявлена при изучении серологических свойств, а затем - при расшифровке фрагмента гена Е длиной 160 н.о. [35, 5, 7, 8]. Так, в 1989 году А.Г. Трухиной был сделан вывод о том, что штамм 886-84 занимает промежуточное положение между двумя серотипами

вируса КЭ - восточно-сибирским и восточным (дальневосточным) и обладает свойствами обоих серотипов [5]. М.М. Верхозиной в 2000 году было показано, что в реакции диффузной преципитации в агаре (РДПА) с перекрестно адсорбированными штаммоспецифическими сыворотками этот штамм проявлял одинаковую степень родства со всеми подтипами вируса КЭ [5]. Штамм 178-79, отнесенный В.В. Погодиной с соавт. в 1981 году к группе Айна-подобных штаммов (урало-сибирский генотип, по современной классификации) [19], по данным В.И. Злобина с соавт. (1996 г.), четко дифференцировался от представителей других антигенных подтипов как в РДПА, так и в реакции нейтрализации [35]. При сравнении структур 160-звенного фрагмента гена белка Е у 34 штаммов ВКЭ эти штаммы не вошли ни в одну из групп, соответствующих трем основным генотипам, а при анализе аминокислотных последовательностей изученного фрагмента оказалось, что штамм 886-84 примыкает к генотипу 3, а штамм 178-79 - к генотипу 1 [4].

К настоящему времени полностью расшифрованы нуклеотидные последовательности геномов обоих упомянутых изолятов [10, 11]. На основе филогенетического анализа полногеномной последовательности авторы пришли к выводу о том, что штамм 178-79 в большей, а 886-84 - в меньшей степени примыкают к дальневосточному генотипу. Кроме того, отмечено своеобразие того и другого штаммов, проявляющееся в чередовании аминокислот, характерных для двух и трех генотипов, в пределах одного гена.

Своеобразие этих штаммов проявилось в представленном исследовании также в виде нетипичной для генотипа 1 картины гибридизации (см. табл. 3). Обнаружение штаммов «группы 886» не только подтверждает, но и значительно усиливает сделанное нами ранее предположение [7, 8] о возможности выделения в самостоятельный генотип ВКЭ (генотип 5) единственного обнаруженного тогда своеобразного штамма 886-84. В пользу правомерности наделения штаммов «группы 886» статусом генотипа свидетельствуют следующие факты:

• штаммы из «группы 886» имеют необычную для генотипа 1 картину гибридизации;

• среди них присутствует штамм 886-84, который:

а) на основании расшифровки структуры фрагмента гена Е (160 н.о.) типирован как уникальный;

б) по аминокислотному составу этого же фрагмента отнесен к генотипу 3;

в) по серологическим свойствам охарактеризован как занимающий промежуточное положение между двумя серотипами вируса КЭ - восточно-сибирским и дальневосточным или как обладающий свойствами обоих серотипов;

• уровень гомологии фрагментов генома исследованных штаммов из «группы 886» длиной

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009

2194 н.о. составляет более 99% (см. рис. 3А), а отличия от других групп штаммов (генотипов

1, 2 и 3) на участке в 160 н.о. - не менее 12% (рис. 3Б), что соответствует ранее установленным критериям генотипирования [8];

• штаммы «группы 886» выделены из разных источников (грызуны и клещи) в разные годы (1983 - 1990) с разных территорий Восточной Сибири, то есть занимают определенный ареал. Выявление целой группы штаммов генотипа 5 ВКЭ ставит вопрос о том, имеет ли этот генотип эпидемическое значение и если да, то какое. Ранее мы уже обращали внимание на то, что в литературе описаны тяжелые клинические случаи КЭ именно в тех очагах, где обнаружены дальневосточные штаммы с необычной картиной гибридизации (25% гомологии с генотипом 1 по исследованным участкам генома), то есть штаммы из «группы 886» [3]. Эти очаги располагаются в Бичурском районе Бурятии и Красночикойском районе Читинской области [1, 13, 21]. Недавно появилось сообщение о случае менингоэнцефа-лита с летальным исходом в Монголии, вызванного изолятом ВКЭ, гомологичным штамму 886-84 [29]. Идентификация вируса проведена посредством ОТ-ПЦР с последующим секвенировани-ем. При сравнении расшифрованного фрагмента гена Е ВКЭ длиной 281 н.о. с соответствующим участком генома штамма 886-84 выявлен высокий уровень гомологии - 98,5% [29]. Заражение данного человека произошло на территории Булганского аймака Монголии, примыкающего с юга к четырем очагам «группы 886» (см. рис. 1).

Опыты гибридизации предложенного набора зондов с РНК политиповых штаммов выявили наличие в них смеси фрагментов (возможно, и полногеномных молекул) разных генотипов и субгенотипов. РНК штамма 765-87, выделенного от грызуна, взаимодействует одновременно с зондами Е3а и Е3б, а также со штаммоспецифическим зондом Е4, как и образцы 262-74 и 618-87, изолированные, подобно большинству изученных штаммов, из пулов клещей (см. табл. 3). Напомним, что у 268-ми однозначно типированных штаммов (монотиповых) участок, комплементарный зонду Е4, был обнаружен только в геноме одного прототипного штамма - 178-79 (см. табл. 2). На сегодня в GenBank депонировано более двухсот расшифрованных нуклеотидных последовательностей, перекрывающих этот участок, но штаммов, аналогичных 178-79, не выявлено.

Вопрос о происхождении штаммов 178-79 и 886-84 представляется весьма важным и требует отдельного исследования. Полученные данные позволяют сделать следующее предположение: структура геномов этих штаммов - результат ряда последовательных множественных рекомбинаций между геномными молекулами трех генотипов ВКЭ. Такой механизм преобразования генома выглядит достаточно вероятным, если принять во внимание наличие по крайней мере двух обстоятельств (предпосылок):

• длительного совместного пребывания (перемешивания) трех генотипов вируса на одной и той же территории (в данном случае на территории Восточной Сибири);

• возможности совместной репродукции вирусов, относящихся к разным генотипам, в организме одного и того же животного (штамм 765-87 и три штамма из «группы 886» изолированы от грызунов в природных очагах).

В литературе также имеются генетические доказательства существования политиповых штаммов (или микст-штаммов). Так, В.В. Погодина с со-авт. сообщают о пяти случаях заболевания людей КЭ, связанных с микст-штаммами возбудителя [20], а С.Ю. Ковалев с соавт. с помощью генотип-специфической ОТ-ПЦР обнаружили геномные последовательности двух генотипов вируса в одном клеще [12].

Можно предположить, что множественная рекомбинация - достаточно частое событие при репродукции ВКЭ, но все рекомбинанты проходят очень жесткий отбор.

Если сделанное предположение верно, это означает, что рекомбинации вносят существенный вклад в видообразование ВКЭ. Отсюда становится понятной и возможная причина противоречивости классификационных схем переносимых клещами флавивирусов млекопитающих.

Выводы

1. На основе выявления вариабельных участков всех структурных и неструктурных генов вируса клещевого энцефалита создана панель дезок-сиолигонуклеотидных зондов для изучения генетической вариабельности и генотипирования штаммов ВКЭ методом МГНК.

2. Получена панорамная информация, позволяющая детализировать межпопуляционные и вну-трипопуляционные отличия вируса по всему обследованному ареалу.

3. С помощью МГНК обнаружены политиповые и «полигенотиповые» штаммы ВКЭ (штамм 178-79 и «группа 886»). РНК политиповых штаммов является смесью фрагментов (а возможно, и полногеномных молекул) разных генотипов. РНК «полигенотиповых» - это однородные геномные молекулы, имеющие структуру, в которой уникальные последовательности нуклеотидных оснований перемежаются специфическими последовательностями трех известных генотипов.

4. Ранее сделанное нами предположение о существовании генотипа 5 ВКЭ подтверждено выявлением группы штаммов с высоким уровнем гомологии, имеющих отличия от штаммов трех основных генотипов, - «группы 886».

5. Предложена гипотеза, объясняющая происхождение штаммов 178-79 и 886-84: структура их геномов - результат ряда последовательных множественных рекомбинаций между геномными молекулами трех основных генотипов ВКЭ. ш

Литература

1. Горин О.З., Мунгалова Н.П., Леонов В.А. и др. Ситуация по клещевому энцефалиту на западе Читинской области // Этиология, эпидемиология и диагностика инфекционных заболеваний Восточной Сибири: Сб. науч. работ ИЭМ СО РАМН. - Иркутск, 1992. С. 44 - 53.

2. Демина Т.В. Характеристика генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии участков вирусного генома: Дис. ... к.б.н. - Иркутск, 1999. - 157 с.

3. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М. и др. Изучение возбудителя клещевого энцефалита с помощью зондирования генома // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2007. № 3. С. 94 - 98.

4. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. - Иркутск: РИО ВСНЦ СО РАМН, 2003. - 271 с.

5. Злобин В.И., Борисов В.А., Верхозина М.М. и др. Клещевой энцефалит в Восточной Сибири. - Иркутск: РИО ВСНЦ СО РАМН, 2002. - 183 с.

6. Злобин В.И., Газо М.Х., Беликов С.И. и др. Молекулярные зонды для генетического типирования вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 2001. № 4. С. 43 - 47.

7. Злобин В.И., Демина Т.В., Беликов С.И. и др. Генетическое типирова-ние штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии фрагмента гена белка оболочки // Вопр. вирусол. 2001. № 1. С. 16 - 21.

8. Злобин В.И., Демина Т.В., Мамаев Л.В. и др. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е // Вопр. вирусол. 2001. № 1. С. 2 - 16.

9. Злобин В.И., Шаманин В.А., Плетнев А.Г. и др. Специфическая реактивность кДНК- и дезоксиолигонуклеотидных зондов, комплементарных геному вируса клещевого энцефалита, с РНК штаммов различного географического происхождения // Вопр. вирусол. 1992. № 5 - 6. С. 248 - 252.

10. Карань Л.С., Браславская С.И., Мязин А.Е. Развитие методов детекции и генотипирования вируса клещевого энцефалита на основе ампли-фикационных технологий // Вопр. вирусол. 2007. № 6. С. 17 - 22.

11. Карань Л.С., Маленко Г.В., Бочкова Н.Г. и др. Применение молекулярногенетических методик для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита // Бюл. СО РАМН. 2007. № 4. С. 34 - 40.

12. Ковалев С.Ю., Умпелева Т.В., Снитковская Т.Э. и др. Молекулярноэпидемиологическая характеристика вируса клещевого энцефалита на территории Свердловской области на основе генотипспецифиче-ской ОТ-ПЦР // Вопросы вирусологии. 2008. № 2. С. 27 - 31.

13. Лохов М.Г., Блинникова И.А. К структурно-функциональной характеристике очагов клещевого энцефалита в Бичурском районе Бурятской АССР // Природноочаговые инфекции Восточной Сибири. Сб. науч. тр. - Иркутск: Иркутский мединститут, 1986. С. 44 - 52.

14. Львов Д.К. Медицинская вирусология: Руководство. - М.: МИА, 2008. - 656 с.

15. Молекулярная клиническая диагностика: методы / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. - М.: Мир, 1999. - 558 с.

16. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Злобин В.И. и др. Генетическая характеристика серотипа Вергина вируса клещевого энцефалита... // Вопр. вирусол. 1993. № 4. С. 158 - 163.

17. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др. Мониторинг популяции вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России. Практические аспекты проблемы // Биопрепараты. 2004. № 2 (14). С. 7 - 13.

18. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и ази-

атских регионах России: генетическая и антигенная характеристика штаммов // Вопр. вирусол. 2004. № 3. С. 20 - 25.

19. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С. и др. Иммунологические и некоторые этиологические аспекты изучения серотипа Айна/1448 вируса КЭ // Вопр. вирусол. 1981. № 6. С. 735 - 741.

20. Погодина В.В., Карань Л.С., Колясникова Н.М. и др. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя // Вопр. вирусол. 2007. № 5. С. 16 - 21.

21. Шасаитов Ш.Ш., Домаев Ю.А. К вопросу о клещевом энцефалите в Читинской области / Тез. докл. зональн. конф. МЗ РСФСР «Влияние природно-климатических факторов на функциональное состояние человека». - Чита, 1980. С. 97 - 99.

22. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J. Gen. Virol. 1999. V. 80. P. 179 - 185.

23. Gao G.F., Hussain M.H., Reid H.W., Gould E.A. Classification of a new member of the TBE flavivirus subgroup by its immunological, pathogenetic and molecular characteristics: identification of subgroup-specific pentapeptides // Virus Res. 1993. V. 30. Р. 129 - 144.

24. Grard G., Moureau G., Charrel R.N. et al. Genetic characterization of tick-borne flaviviruses: new insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy // Virology. 2007. V. 361. P. 80 - 92.

25. Gritsun T.S., Frolova T.V., Pogodina V.V. et al. Nucleotide and deduced amino acid sequence of the envelope gene of the Vasilchenko strain of TBE virus; comparison with other flaviviruses // Virus Res. 1993. V. 27. P. 201 - 209.

26. Gritsun T.S., Frolova T.V., Zhankov A.I. et al. Characterization of a Siberian virus isolatied from a patient with progressive chronic tick-borne encephalitis // J. Virol. 2003. V. 77. № 1. P. 25 - 36.

27. Heinz F.X., Collet M.S., Puteell R.H. et al. Family Flaviviridae / In: Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Commettee on Taxonomy of Viruses / M.H. Rogenmortel, C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop et al. (eds.). -San Diego: Academic Press, 1999. P. 858 - 878.

28. Innis M.A., Gelfand D.H. Optimization of PCRs / In: PCR Protocols / M.A. Innis, D.H. Gelfand, Sninsky and White (eds.). - New York: Academic Press, 1990. P. 3 - 12.

29. Khasnatinov M.A., Danchinova G.A., Unursaikhan U. et al. Chracterization of tick-borne encephalitis virus that caused the lethal meningoencephalitis human in Mongolia // Inter. Conference Zoonotic infections desease and tourism. - Ulaanbaatar, 2009. Р. 88 - 93.

30. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. 2004. № 5. P. 150 - 163.

31. Pletnev A.G., Yamshikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus // Virology. 1990. V. 174. P. 250 - 263.

32. Romanova L.I., Gmyl A.P., Dzhivanyan T.I. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation // Virology. 2007. V. 362 (1). P. 75 - 84.

33. Shamanin V.A., Pletnev A.G., Rubin S.G., Zlobin V.I. Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization // J. Gen. Virol. 1990. V. 71. P. 1505 - 1515.

34. Van de Peer Y., De Wachter Y. A software package for the construction and drawing of evolutionary trees // Comp. Appl. Biosci. 1994. V. 44. P. 271 - 280.

35. Zlobin V.I., Mamaev L.V., Dzhioev Yu.P. et al. Molecular biological data confirm the genetic independence of East Siberian subtype of tick borne encephalitis virus (prototype strain Aina/1448) // Tick-borne viral, rickettsial and bacterial infections. Int. sci. conf. Abstract book. - Irkutsk 1996. P. 58, 59.

короткой строкой

Перспективы профилактики врожденной цитомегаловирусной инфекции

Врожденная инфекция, вызванная цитомегаловирусом (ЦМВ), представляет собой одну из причин нарушений слуха и психомоторного развития у новорожденных. На основании оценки экономической эффективности разработка вакцины для профилактики врожденной ЦМВ-инфекции входит в число первоочередных задач в Соединенных Штатах в течение последнего десятилетия. Первые попытки создания подобной вакцины предпринимались уже 30 лет назад, однако эффективное средство профилактики до настоящего времени не разработано. В опубликованных исследованиях продемонстрировано, что после перенесенной ЦМВ-инфекции приобретенный иммунитет не обеспечивает надежной защиты от реинфекции, что справедливо и в отношении передачи вируса от матери к плоду. В связи с этим сделано заключение, что вакцинопрофилактика ЦМВ-инфекции крайне затруднительна.

В 1990-х годах была разработана вакцина на основе оболочечного гликопротеина В ЦМВ с новым адъювантом MF59 (водная эмульсия сквалена).

Препарат прошел клинические испытания, в которых была продемонстрирована иммуногенность вакцины при приемлемой частоте поствак-цинальных осложнений и побочных реакций, обладает способностью снижать частоту материнской и врожденной инфекции, вызванной вирусом цитомегалии. Как правило, инфекционный процесс вызывает выработку нейтрализующих антител к гликопротеину В. Разработанная вакцина также способствует выработке антител к данному антигену, при этом напряженность иммунного ответа после вакцинации существенно выше, чем вследствие перенесенной инфекции.

По мнению исследователей, длительность защитного эффекта вакцины и его взаимосвязь с уровнем выработки антител к гликопротеину В требуют дальнейшего изучения.

Источник:

Pass R.F. et al. Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection. // NEJM. 2009; 360:1191 -1999. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/.

Цитируется по Medline-абстракт.

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (46)/2009