Современные методы исследования резистентности к инсектицидам в популяциях колорадского жука

7. Caridi Zoccali C., Enia G. La misura oscillometrica della pressione al polso: Confronto con il metodo sfigmomanometrico classico e valutazione dell errore di posizione del polso col paziente supino// G. ital. nefrol. - 2003. - V 20.

- № 6. - Р. 589-591.

8. Jovanovic J. Blood pressure, heart rate and lipids in professional handball and water polo players [Tekst] / J. Jovanovic // Med. Pregl. - 2005. - V 58.

- P. 168-174.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ИНСЕКТИЦИДАМ В ПОПУЛЯЦИЯХ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА1

© Удалов М.Б.*

Учреждение РАН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа

В работе рассмотрены современные методы исследования резистентности к инсектицидам в популяциях колорадского жука. Приведены конкретные примеры использования данных методов для выявления резистентности колорадского жука к препаратам различных химических классов.

Одна из главных проблем в современном сельском хозяйстве - регулирование численности насекомых-вредителей. Для этого наиболее широко используется химический метод, подразумевающий применение инсектицидов различного типа. При всех плюсах, использование инсектицидов привело к развитию резистентности к ним у вредителей.

В настоящее время резистентность к пестицидам разных химических классов установлена в популяциях более 600 видов насекомых-«вреди-телей». Можно отметить, что применение любого препарата способно привести к развитию резистентности. Так, широкое применение пиретро-идных препаратов уже привело к формированию устойчивых к ним популяций колорадского жука [1-6]. Как следствие, становится невозможным дальнейшее повсеместное использование пиретроидов для контроля численности вредителя. Появившиеся в последние годы новые группы инсектицидов - биопрепараты, нереистоксины, хлорникотиноиды, неоникоти-ноиды и фенилпиразолы [7-10] рекомендованы для обработок резистентных к фосфорорганическим и пиретроидным препаратам популяций насекомых, однако нет гарантий от возникновения резистентности и к препа-

1 Работа выполнена в рамках проекта, поддержанного грантом РФФИ (проект № 09-04-00391-а). Автор будет благодарен всем коллегам за возможность получить образцы колорадского жука из различных частей его ареала.

* Научный сотрудник, кандидат биологических наук

ратам этих классов. Развитие резистентности к инсектицидам в популяциях насекомых является важнейшей проблемой, так как она приводит к увеличению норм расхода препаратов и количеству обработок [11-13].

Среди методов, которыми в настоящее время проводится мониторинг резистентности в популяциях колорадского жука, можно выделить токсикологические, фенетические и биохимические. В последние десятилетия в связи с развитием методов молекулярной биологии появилась возможность использовать молекулярные маркеры (фрагменты ДНК) для различного рода исследований, от филогении и систематики до анализа количественных признаков, внутри- и межвидового полиморфизма. Возможен и мониторинга резистентности. Однако работы, посвященные изучению полиморфизма ДНК колорадского жука, до сих пор немногочисленны [1425]. Основная группа данных методом основаны на полимеразной цепной реакции. В ходе ПЦР, или PCR (polymerase chain reaction) происходит синтез in vitro определённых участков ДНК (которые в дальнейшем и считаются маркёрами), ограниченных используемыми праймерами - небольшими затравочными фрагментами ДНК. Полученные в ходе первых циклов реакции, PCR-продукты служат матрицами в последующих циклах синтеза, вследствие чего число копий амплифицируемой последовательности увеличивается в геометрической прогрессии. Таким образом, присутствие в образце интересующей нас последовательности даже в минимальном количестве (одна или несколько копий), легко выявляются с помощью метода PCR. PCR-маркёры различаются длиной амплифицирован-ных последовательностей. Продукты амплификации разделяют в агароз-ном или полиакриламидном геле, окрашивают бромистым этидием и фотографируют в ультрафиолетовом свете. PCR-маркёры различаются длиной амплифицированных последовательностей. В зависимости от типов используемых праймеров различают несколько видов PCR-анализа.

Метод RAPD-PCR (randomly amplified DNA polymerase chain reaction) заключается в синтезе в ходе полимеразной цепной реакции фрагментов ДНК, ограниченных используемыми праймерами. При RAPD-анализе используют стандартные наборы праймеров. Электрофоретические спектры полученных при RAPD-PCR фрагментов позволяют (после должной статистической обработки) получить информацию об уровне генетического полиморфизма популяции. Этот метод позволяет проанализировать весь геном изучаемого объекта, очень прост в техническом исполнении. При проведении RAPD не нужно заранее знать, какие конкретно последовательности ДНК предстоит амплифицировать.

С помощью метода RAPD был проанализирован генетический полиморфизм L. decemlineata [17]. Были получены наборы RAPD-фрагментов, различающихся по частоте распределения в исследованных популяциях. В выборке из одного района уровень полиморфизма оказался на порядок ниже,

чем в других. Так как эта выборка была собрана на площадях, обрабатываемых инсектицидами, снижение уровня генетического полиморфизма связывается с гибелью части особей, более чувствительных к ядохимикатам.

В отличие от RAPD, метод PASA (PCR amplification of specific alleles) позволяет идентифицировать аллели определённых генов. Известно, что один из основных механизмов резистентности насекомых к фосфорорга-ническим инсектицидам (ФОИ) - снижение чувствительности к действию препаратов мутантной формы ацетилхолинэстеразы (AChE) [20]. У колорадского жука обнаружен нуклеотидный полиморфизм 980А > G в гене AChE, приводящий к аминокислотной замене Ser291Gly [16]. Также было показано, что kdr-подобная резистентность к пиретроидам является результатом нуклеотидного полиморфизма в гене электрончувствительного натриевого канала ZöVsscl (замена нуклеотида С на Т, что привело к аминокислотной замене лейцин на фенилаланин) [21, 22].

В настоящее время существует несколько групп методов, в той или иной степени применяемых для мониторинга резистентности в популяциях насекомых - токсикологические, биохимические и молекулярно-биоло-гические. Данные методы представляют разные возможности раскрытия тех или иных аспектов мониторинга резистентности. Традиционные методы позволяют установить наличие и оценить уровень резистентности к препаратам определённого типа, тогда как биохимические и молекулярно-биологические - определить конкретные механизмы, приводящие к развитию резистентности. При этом лишь молекулярно-биологические методы при оценке каждой особи в выборке позволяют установить, присутствуют ли в её генотипе факторы, определяющие потенциальную резистентность и выявить долю резистентных особей в популяции, то есть оценить соотношение чувствительных / резистентных генотипов. Характер изменений этого соотношения после одного - двух сезонов обработки позволит определить начавшую развиваться резистентность и задолго до критического (почти всегда необратимого момента) принять необходимые меры - провести ротацию препаратов или перейти к иному способу регуляции численности насекомых вредителей.

Мишени действия инсектицидов на уровне аминокислотных последовательностей являются высокогомологичными у многих видов насекомых. Так же, резистентность к инсектицидам проявляется на уровне ДНК в сходных мутациях у разных видов. Всё это позволяет расширить область исследований, перенеся уже отработанные методы на другие, интересующие нас объекты. Только комплексное использование разных подходов к мониторингу резистентности может дать полную картину её состояния. Мы уверены, что современные молекулярно-биологические методы, основанные на применении ДНК-технологий, найдут своё место в системе мониторинга резистентности к инсектицидам в популяциях насекомых.

Список литературы:

1. Яковлева И.Н., Мешков Ю.И., Сучалкин Ф.А. Характер изменений чувствительности к пиретроидам колорадского жука Leptinotarsa dece-mlineata Say. на территории европейской части РФ // Современное состояние проблемы резистентности вредителей, возбудителей болезней и сорняков к пестицидам в России и сопредельных странах на рубеже XXI века. Материалы девятого совещания (20, 22 декабря 2002 г., Санкт-Петербург). - СПб. 2000. - С. 28-30.

2. Коваленков В.Г., Тюрина Н.М., Соколов М.С. Проблема резистентности фитофагов к пиретроидным инсектицидам и пути её решения (на примере Северо-Кавказского региона) // Агрохимия. - 1998. - № 10. - С. 24-32.

3. Быховец С. Л. Положение с резистентностью колорадского жука к пиретроидным инсектицидам в Белоруссии и пути её преодоления // Современное состояние проблемы резистентности вредителей, возбудителей болезней и сорняков к пестицидам в России и сопредельных странах на рубеже XXI века. Материалы девятого совещания (20, 22 декабря 2002 г., Санкт-Петербург). - СПб. 2000. - С. 27-28.

4. Кахаров К.Х., Сухорученко Г.И., Резистентность против колорадско -го жука Leptinotarsa decemlineata Say. к инсектицидам в Зеравшанской долине Таджикистана // Современное состояние проблемы резистентности вредителей, возбудителей болезней и сорняков к пестицидам в России и сопредельных странах на рубеже XXI века. Материалы девятого совещания (20, 22 декабря 2002 г., Санкт-Петербург). - СПб. 2000. - С. 35.

5. Рославцева С. А. Проблема резистентности насекомых к инсектоа-карицидам // Агрохимия. - 1997. - № 3. - С. 89-92.

6. Рославцева С.А. Новые инсектоакарициды // Агрохимия. - 1997. -№ 4. - С. 87-90.

7. Леонова И.Н. Биохимические механизмы резистентности насекомых к инсектицидам и пути её преодоления: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Новосибирск, 1986. - С. 15.

8. Неделькина С.В., Соломенникова И.В, Волкотруб Э.Н. и др. Механизм резистентности колорадского жука к перметрину // Агрохимия. -1987. - № 4. - С. 103-106.

9. Azeredo-Espin A. M.L., Schroder R.F.W., Roderick G.K., Sheppard W.S. Intraspecific Mitochondrial DNA Variation in the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae) // Biochemical Genetics. -1996. - Vol 34. - No. 7/8. - P. 253-268.

10. Zhu Y.K., Lee S.H., Clark J.M. A point mutation of acetylcholinesterase associated with azinphosmethyl resistance and reduced fitness in colorado potato beetle // Pesticide biochemistry and physiology. - 1996. - No 55. - P. 100-108.

11. Zhu K.Y., Clark J.M. Validation of a point mutation of acetylcholinesterase in colorado potato beetle by polymerase chain reaction coupled to enzyme inhibition assay // Pesticide biochemistry and physiology. - 1997. - No 57. - P. 28-35.

12. Сидоренко А.П., Березовская О.П., Созинов А. А. Оценка генетического полиморфизма в популяциях колорадского жука Leptinotarsa decem-lineata (Say) по RAPD-маркёрам // Генетика. - 2000. - № 5. - С. 651-656.

13. Сидоренко А.П., Березовская О.П. Индивидуальный полиморфизм по RAPD-маркёрам в весенней генерации колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) // Генетика. - 2001. - Т. 37. - № 10. - С. 1348-1352.

14. Сидоренко А.П., Березовская О.П. Генетическая структура популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomeli-dae) // Генетика. - 2002. - Т. 38. - № 11. - С. 1485-1491.

15. Kim H.J., Hawthorne D.J., Peters T., Dively G.P., Clark J.M. Application of DNA-based genotyping techniques for the detection of kdr-like pyre-throid resistance in field populations of Colorado potato beetle // Pesticide Biochemistry and Physiology. - 2005. - No 81. - Р. 85-96.

16. Grapputo A., Boman S., Lindstrom., Lyytinen A., Mappes J. The voyage of an invasive species across continents: genetic diversity of North American and European Colorado potato beetle population // Molecular Ecology. - 2005. - No 14. - P. 4207-4219.

17. Grapputo A. Development and characterization of microsatellite markers in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata // Molecular Ecology Notes. - 2006. - No 6. - Р. 1177-1179

18. Беньковская Г.В., Удалов М.Б., Хуснутдинова Э.К. Генетическая основа и фенотипические проявления резистентности колорадского жука к фосфорорганическим инсектицидам // Генетика. - 2008. - Т. 44. - № 5. -С. 638-644.

19. Udalov M.B., Benkovskaya G.V. Application of bi-PASA and development of PCR-REN for detection of point mutation 980A>G in AChE gene of Colorado Potato Beetle in South Ural's local population // Resistant Pest Management Newsletter. - 2008. - Vol. 17. - No. 2. - P. 15-16.

20. Zhu K.Y., Clark J.M. Comparison of kinetic properties of acetylcholi-nesterase purived from azinphosmethyl-susceptible and resistant strains of colorado potato beetle // Pest. biochem. physiol. - 1995. - № 51. - Р. 57-67.

21. Lee S.H., Dunn J.B., Clark J.M. et al. Molecular analysis of kdr-like resistance in a permetrin-resistant strain of colorado potato beetle // Pesticide biochemistry and physiology. - 1999. - № 63. - Р. 63-75.

22. Clark J.M., Lee S.H., Kim H.J., Yoon K.S., Zhang A. DNA-based genotyping techniques for the detection of point mutation associated with insecticide resistance in Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata // Pest Management Science. - 2001. - No 57. - Р. 968-974.