Влияние композиции, состоящей из АРУЦ, таурина и триптофана на фонд свободных аминокислот печени при хронической алкогольной интоксикации

ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОСТОЯЩЕЙ ИЗ АРУЦ, ТАУРИНА И ТРИПТОФАНА НА ФОНД СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

РАЗВОДОВСКИЙ Ю.Е., СМИРНОВ В.Ю.

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Резюме. Исследовано влияние композиции АРУЦ, таурина и триптофана на пул свободных аминокислот печени крыс при хронической алкогольной интоксикации (ХАИ). Установлено, что ХАИ вызывает снижение в печени крыс уровней валина, треонина, фенилаланина, лизина, пролина, цитруллина, оксипролина, аргинина и Р-аланина. Введение на фоне ХАИ аминокислотной композиции привело к контрольному уровню концентрации валина, треонина и лизина, нормализовало метаболизм серусодержащих аминокислот, а также повысило долю незаменимых аминокислот.

Ключевые слова: аминокислоты, хроническая алкогольная

интоксикация, плазма крови, таурин, триптофан, АРУЦ.

Abstract. In present study we investigated effect of composition of BCAA, taurine and tryptophan on the blood plasma amino acids pool of rats under chronically alcohol intoxication. Chronic ethanol intoxication led to decrease levels of valine, treonine, phenylalanine, lysine, proline, citruline, oxiproline, arginine and P-alanine in the liver of rats. Administration of composition of BCAA, taurine and tryptophan was found to normalize the levels of valine, treonine, lysine, metabolism of sulfur containing amino acids, and increased the share of essential amino acids.

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, г.Гродно, 230009, ул. Горького, 80, Гродненский государственный медицинский университет - Разводовский Ю.Е.

Хроническая алкогольная интоксикация сопровождается выраженными метаболическими нарушениями, которые становятся причиной поражения практически всех органов и систем [8, 14]. Несмотря на интенсивное изучение патогенетических аспектов алкоголизма, до настоящего времени не разработан комплексный терапевтический подход, учитывающий особенности сопутствующего хронической алкогольной интоксикации метаболического дисбаланса.

Изучение фонда свободных аминокислот плазмы крови больных алкоголизмом, поступивших на лечение в состоянии алкогольного абстинентного синдрома показало, что даже после проведения полного курса стандартной терапии остаются стойкие нарушения аминокислотного обмена [6, 8]. Аминокислотный дисбаланс, сопутствующий хронической

алкогольной интоксикации обусловлен недостаточным поступлением с пищей и ухудшением всасывания незаменимых аминокислот, а также нарушением функции печени [8].

Большинство аминокислот при введении их в организм в более высоких дозах, чем они поступают с пищей, вызывают специфические фармакологические эффекты [8, 14]. Поскольку аминокислоты являются биологически активными соединениями природного происхождения, то созданные на их основе препараты выгодно отличаются отсутствием побочных эффектов.

Конечный продукт превращений серосодержащих аминокислот таурин является высокоактивным природным соединением, обладающим антиоксидантными, мембраностабилизирующими и адаптогенными свойствами [7]. Результаты экспериментальных и клинических исследований, проведенных в последние годы, позволяют рассматривать это соединение как эффективное средство метаболической коррекции широкого спектра патологических состояний. В частности, в экспериментальной модели алкоголизма по Мя)сЬго,шс2, было показано, что внутрижелудочное введение таурина предотвращает развитие аминокислотного дисбаланса в

плазме крови и печени [1, 13]. Комплексное клинико-биохимическое исследование больных алкогольной зависимостью, поступивших в клинику в состоянии алкогольного абстинентного синдрома показало, что у пациентов, получавших дополнительно к стандартной терапии таурин уже к 7 суткам достоверно снижалась активность АЛТ и ГГТП, а также концентрация общего билирубина в плазме крови. В тоже время в контрольной группе активность ферментов снизилась только к 14 суткам лечения, а содержание общего билирубина к этому сроку оставалось повышенным [9].

Незаменимая аминокислота Ь-триптофан является предшественником ряда биологически активных соединений: никотиновой кислоты, серотонина, некоторых алкалоидов [14]. Недостаток триптофана в рационе является причиной нарушения синтеза белков, снижения содержания серотонина в мозге и других тканях. Триптофан обладает снотворным и антидепрессивным действием [3, 4]. Было также установлено, что

внутримышечное введение Ь-триптофана уменьшает продолжительность бокового положения крыс на 35%, а продолжительность этанол-индуцированного сна на 26% [10]. Кроме того, курсовое введение Ь-триптофана в дозе 100 мг/кг на фоне хронической алкогольной интоксикации способно частично корригировать аминокислотный дисбаланс в плазме крови и печени [2]. В этой связи представляется обоснованным включение триптофана в состав аминокислотной композиции, предназначенной для коррекции метаболических нарушений, сопутствующих хронической алкогольной интоксикации.

Терапевтическое действие аминокислот с разветвленной углеводородной цепью (АРУЦ) - Ь-изолейцина, Ь-валина и Ь-лейцина при хронических заболеваниях печени и осложняющей их печеночной энцефалопатии основано на незаменимости АРУЦ для организма человека и органоспецифичности метаболических превращений [8]. Показано, что назначение аминозолей, адаптированных к требованиям, предъявляемым для больных со здоровой печенью, может провоцировать негативные изменения

обмена аминокислот, которые ведут к развитию печеночной энцефалопатии у лиц с изначально имеющейся печеночной недостаточностью [14]. Поэтому для парентерального введения таким больным разработаны специальные смеси, содержащие повышенные количества АРУЦ (более 50%). Обогащенные АРУЦ растворы аминокислот вводят больным с нарушением функции печени с целью коррекции аминокислотного дисбаланса и связанных с ним нарушений деятельности ЦНС [6, 8, 14].

Исходя из вышеизложенного актуальной задачей представляется разработка аминозоля на основе АРУЦ, таурина и триптофана, предназначенного для метаболической терапии сочетанного поражения печени и головного мозга алкогольной этиологии.

Целью настоящей работы было исследование влияния внутрижелудочного введения композиции, состоящей из АРУЦ, таурина и триптофана, на пул свободных аминокислот и их производных в печени крыс при хронической алкогольной интоксикации.

Методы

В эксперименте использовано 20 белых беспородных крыс-самцов массой 180-200 г, содержащихся на стандартном рационе вивария. Раствор этанола (25% об/об) вводили внутрижелудочно равными объемами в дозе 14 мл/кг два раза в сутки на протяжении 28 суток. Композицию, состоящую из лейцина, валина, изолейцина, таурина и триптофана в соотношении 4:1:1:2:1,6, вводили в виде водного раствора внутрижелудочно (20 мл/кг) через 30 мин после каждого введения этанола на протяжении последних 10 дней алкоголизации, последнее введение препаратов за 1 ч до забоя. Суммарная суточная доза препарата составляла 600 мг/кг, а этанола - 7 мл/кг массы животных. Контрольные животные получали внутрижелудочно воду в эквиобъемных количествах.

После забоя животных ткань печени гомогенизировались в 0.2 М хлорной кислоте с норлейцином (0.25 мМ) в качестве внутреннего стандарта в соотношении 1:10 по массе, полученные гомогенаты центрифугировались

при 20000 g в течение 15 мин при температуре 5°С. Затем экстракты немедленно отделялись от белкового осадка. Содержание свободных аминокислот и их производных определяли методом ионообменной хроматографии на автоматическом анализаторе аминокислот T-339M [4]. Регистрация и обработка хроматограм осуществлялась с помощью программно-аппаратного комплекса "МультиХром-1".

Уровни цистина, цистеата, триптофана, аспартата, аспарагина, оксипролина, цитруллина, цистатионина, метионина, в-аланина, ГАМК и аргинина определялись методом обращенно-фазной ВЭЖХ после предколоночной дериватизации с о-фталевым альдегидом, 3-

меркаптопропионовой кислотой и флуоренилметиохлороформатом (FMOC), с градиентным элюированием и детектированием по флуоресценции или поглощнению (для цистина). Определение проводили с помощью хроматографа Agilent 1100, управление прибором и обработку данных - с помощью программы ChemStation A10.01. Статистическая обработка данных (t-статистика, дисперсионный и корреляционный анализ) реализована при помощи программы Statistica 7.0.

Результаты и их обсуждение В печени крыс ХАИ вызвала снижение концентраций валина, треонина, фенилаланина, лизина, пролина, цитруллина, оксипролина, аргинина, Р-аланина, Р-аминомасляной кислоты и а-аминоадипиновой кислоты. При этом снизилась в суммарном пуле свободных аминокислот печени доля незаменимых аминокислот (табл.1).

Пул последних формируется за счет гидролиза эндогенных и экзогенных белков, поэтому вполне закономерно, что потребление этанола, как изокалорийного заменителя пищи, вызывает снижение поступления белка в организм, и, как следствие, обеднение пула незаменимых аминокислот.

Анализ корреляционных связей между уровнями аминокислот в печени позволяет предположить возникновение при ХАИ ряда нарушений метаболизма аминокислот.

Таблица 1

Содержание свободных аминокислот и их производных в печени крыс после внутрижелудочного введения композиции аминокислот, состоящей из АРУЦ, таурина и триптофана, на фоне хронической алкогольной интоксикации

Контроль ХАИ ХАИ + композиция аминокислот

СА 50,6 ± 2,6 42,5 ± 7,2 54,1 ± 2,9

Таи 1583 ±325 1191±121 1621±137

РЕА 1920±421 1247±165 990± 101*

игеа 1577±161 1350±159 3114±1061|

А8р 2246 ±197 2339±164 1854 ± 184

НРго 48,6 ± 3,5 25,7 ± 3,4* 26,2 ± 6,2*

ТЪг 372 ± 70 208 ± 22* 230 ± 79

8ег 2269±158 2459±180 3135±247*|

А8И 246 ± 20 208,5 ± 7,7 234 ± 27

аи 4223 ± 264 4884±293 5231±271*

01п 5309±378 5090 ± 244 4684±319

аААА 21,5 ± 2,9 6,76 ± 2,80* 3,27 ± 0,23*

Рго 261 ± 25 183 ± 23* 117±25*

01у 2390±116 2284±133 3155±237*|

А1а 1996± 183 1907±113 2647±188*|

С1х 46,9 ± 5,9 33,3 ± 3,1* 29,9 ± 1,9*

аАВА 119,3 ± 13,0 100,4 ± 5,8 62,1 ± 10,4*|

Уа1 279 ± 18 220±13* 239 ± 11

Су8 145,4 ± 23,1 122,8 ± 9,7 160,6 ± 12,5|

Ме1 45,3 ± 11,4 49,6 ± 6,4 36,7 ± 4,8

Оп 20,5 ± 1,6 20,3 ± 2,8 51,8 ± 26,3

11е 141,0 ± 8,4 118,2 ± 6,5 117,7 ± 11,9

Ьеи 487 ± 36 391 ± 71 696±41*|

Туг 139,1 ± 19,5 106,9 ± 9,3 71,7 ± 12,5*

РЬе 146,3 ± 9,0 113,2 ± 5,3* 117,1 ± 5,1*

РА1а 288 ± 10 229± 16* 186±26*

РАВА 45,0 ± 3,6 26,0 ± 7,4* 8,58 ± 2,36*|

ЕА 892 ± 61 1144± 85 1773± 167*|

ОД 5467± 686 5973 ± 1473 5220± 1038

Огп 358 ± 21 314 ± 31 294 ± 12

Ьу8 354 ± 46 191±34* 214 ± 61

Н18 626 ± 24 612 ± 36 518±29*

1-МН18 8,56 ± 0,36 9,04 ± 1,2 9,17 ± 0,81

Аге 53,0 ± 3,0 34,6 ± 5,4* 36,1 ± 1,2*

Тгр 13,7 ± 1,1 12,3 ± 0,56 24,6 ± 5,3*|

Сумма прот. АК 21742±596 20699 ± 1273 23520±251*

АРУЦ/ААК 3,08 ± 0,11 3,16 ± 0,32 5,04 ± 0,36*|

ЗА /НА 8,00 ± 0,71 10,84 ± 0,73* 9,74 ± 0,34

ГА / КА 25,3 ± 2,77 36,9 ± 5,15* 24,7 ± 2,1|

Условные обозначения: р<0,05 при сравнении с группами: * - контроль; | - ХАИ.

Так, с одной стороны, накапливающийся при введении этанола ацетальдегид тормозит треонинальдолазную реакцию образования глицина, поэтому наблюдаемое снижение уровня треонина свидетельствует об активации альтернативных путей его деградации (вероятнее всего, дегидратазного пути до а-кетомасляной кислоты или декарбоксилирования, хотя повышение уровня этаноламина и не было достоверным. Возникновение положительной корреляции между уровнями глицина и серина может говорить о снижении вероятности превращения последнего в глицин (табл. 2). Снижение уровня лизина, наблюдаемое в аналогичных условиях и в плазме крови [3], может быть объяснено связыванием образующегося из экзогенного этанола ацетальдегида с аминогруппами лизина. Появление отрицательных корреляций между уровнем метионина с одной стороны и уровнями его метаболитов (цистином, таурином и цистеатом) - с другой, говорит об ускорении синтеза цистеина и стимуляции катаболизма серусодержащих аминокислот в целом (табл. 2).

Таблица 2

Коэффициенты корреляции между уровнями свободных аминокислот

Контроль ХАИ ХАИ + композиция аминокислот

Met-CA -0,7118 -0,8929* 0,9238*

Met-Tau 0,1808 -0,7211(*) -0,3621

Met-Cys 0,2644 -0,6375 -0,143

Cys-Tau 0,9947* 0,9199* 0,9266*

Met-Ser -0,8304* -0,6679 -0,651

Phe-Tyr 0,941* 0,9154* 0,6884

Ile-Val 0,9764* 0,8159* 0,5453

Leu-Val 0,6696 0,0633 -0,2688

Leu-Ile 0,618 -0,3637 0,0157

* - достоверные с уровнем Р<0,05 коэффициенты корреляций.

Обращает на себя внимание нарушение при ХАИ сопряженности изменений уровня лейцина и концентраций ароматических аминокислот (ААК) (табл. 2). Вероятно, действие ХАИ на уровень лейцина в печени опосредовано в большей степени через влияние на его метаболизм, чем на общие для этих аминокислот (АРУЦ и ААК) транспортные системы (участие АРУЦ в элиминации аммиака также не должно влиять в этой ситуации на их

уровень вследствие отсутствия зависимости между их уровнями и содержанием глутамата и глутамина).

Внутрижелудочное введения композиции аминокислот предотвращает снижение в печени уровней валина, треонина и лизина. Концентрации остальных соединений, сниженных при ХАИ, остается таковым и после введения исследуемой композиции. Кроме этого, происходит повышение уровней аланина, серина, глутамата, глицина, лейцина, этаноламина и триптофана (концентрация последнего, а также уровень цистина повышается также по отношению к группе хронической алкогольной интоксикации). С другой стороны, в печени наблюдается снижение концентраций фосфоэтаноламина, а-аминомасляной кислоты, тирозина и гистидина. Рост концентрации глицина может быть следствием снижения его утилизации, в том числе в синтезе парных желчных кислот. Очень вероятно также, учитывая повышенный уровень серина, усиление наработки глицина в метилтрансферазной реакции.

Несмотря на то, что уровни серусодержащих аминокислот в печени при введении аминокислотной композиции практически не изменяются (отмечается только повышение концентрации цистина), появление положительной корреляции между уровнями метионина и цистеата, а также ослабление (по сравнению с ХАИ) отрицательной корреляции таурин-метионин может свидетельствовать о торможении катаболизма серусодержащих аминокислот под действием введения композиции и, в то же время, о сохранении повышенной наработки цистеина из метионина. Такая ситуация может быть обусловлена действием таурина в составе композиции.

Повышение уровней АРУЦ в печени может быть результатом транспорта в гепатоциты входящих в состав препарата аминокислот и сохранением повышенного их уровня через час после последнего введения. Кроме того, исчезновение положительной корреляции тирозин-

фенилаланин, позволяет предположить торможение синтеза тирозина, что объясняет снижение его уровня в печени.

Введение композиции увеличивает суммарное содержание протеиногенных аминокислот и нормализует соотношение заменимых и незаменимых аминокислот (ЗА/НА, табл. 1) в печени. Так как большинство кетогенных аминокислот являются незаменимыми, то закономерным является рост соотношения гликогенных и кетогенных аминокислот (ГА/КА, табл. 1) в печени при ХАИ и нормализация этого соотношения под действием композиции.

Еще одним эффектом введения аминокислотной композиции является рост соотношения уровней АРУЦ и ароматических аминокислот (т.н. индекса Фишера), что в сочетании со снижением уровня а-аминомасляной кислоты (маркера поражения печени) может свидетельствовать о ее гепатопротекторном действии.

Влияние исследуемой композиции на фонд аминокислот в печени можно оценить с помощью дискриминантного анализа. По значению показателя лямбда Уилкса (0,005) можно судить о хорошей дискриминации, а на основании классификационной матрицы можно сделать вывод о 100% корректности обучающих выборок для всех групп. Наиболее значимыми соединениями согласно значению критерия Фишера (вносящими наибольший вклад в общую дисперсию), были уровни следующих соединений: Lys (F=20), Cys (F=15.9), aAAA (F=14.9), Ser (F=13.7), Leu (F=13.6).

Заключение

Таким образом, хроническая алкогольная интоксикация на протяжение 28 суток сопровождается дисбалансом в пуле свободных аминокислот печени, который проявляется снижением доли незаменимых аминокислот и ростом соотношения гликогенных и кетогенных аминокислот. Внутрижелудочное введение аминокислотной композиции, содержащей АРУЦ, таурин и триптофан при ХАИ в отношении фонда

свободных аминокислот и их производных в печени характеризуется нормализацией концентраций валина, треонина и лизина, метаболизма серусодержащих аминокислот, повышением доли незаменимых аминокислот и индекса Фишера. Актуальной задачей является дальнейшее исследование эффектов аминокислотной композиции, содержащей АРУЦ, таурин и триптофан в контексте перспективы ее использования в качестве препарата метаболической терапии алкогольной зависимости.

Литература

1. Аминокислоты и их производные в патогенезе и лечении поражений печени / Л. И. Нефёдов [и др.] // Весщ АН Беларусь Сер. х1м. навук. - 1997. -№ 2. - С.39-48.

2. Влияние смеси аминокислот с разветвленной углеводородной цепью, таурина и триптофана на структуру печени и фонд свободных аминокислот у крыс при субхронической алкогольной интоксикации и синдроме отмены этанола / Ю. Е. Разводовский [и др.]. // Новости науки и техники. Сер. Мед. Вып. Алкогольная болезнь / ВИНИТИ. - 2001. - № 12. - С. 4-10.

3. Влияние триптофана и таурина на формирование фонда свободных аминокислот в плазме крови при синдроме отмены этанола / Ю. Е. Разводовский [и др.]. // Материалы науч.-практич. конф. посвящ. 40-летию ГрГМУ. - Гродно, 1998. - С. 50-51.

4. Козловский, А. В. Нарушения обмена аминокислот при алкоголизме / А. В. Козловский, Ю. Е. Разводовский, С. Ю. Островский // Материалы науч.-практич. конф., посвящ. 40-летию ГрГМУ. - Гродно, 1998. - С. 37.

5. Нефедов , Л . И . Биологическая роль таурина / Л . И . Нефедов // Вести АН Беларуси. - 1992. - № 3-4. - С. 99-106.

6. Островский, Ю. М. Аминокислоты в патогенезе, диагностике и лечении алкоголизма / Ю. М. Островский, С. Ю. Островский. - Минск. Наука и техника, 1995. - С. 278.

7. Применение таурина в комплексном лечении алкоголизма / Ю. Е. Разводовский [и др.]. // Актуальные вопросы современной медицины. - Гродно, 2002. - С. 327-330.

8. Разводовский, Ю. Е. Влияние L-триптофана на продолжительность этанол-индуцированного сна / Ю. Е. Разводовский // Материалы науч.-практич. конф. молодых ученых и студентов, посвящ. памяти академика Ю.М. Островского. - Гродно, 2003. - С. 185.

9. Разводовский, Ю. Е. Влияние таурина на содержание в ЦНС нейроактивных соединений при синдроме отмены этанола / Ю. Е. Разводовский, Е. М. Дорошенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007. - Т.70, № 5. - С. 38-43.

10. Смирнов, В. Ю. Влияние таурина на фонд свободных аминокислот при синдроме отмены этанола / В. Ю. Смирнов, Ю. Е. Разводовский, Е. М. Дорошенко // Журнал ГрГМУ. - 2004. - № 1. - С. 24-26.

11. Шейбак, В. М. Обмен свободных аминокислот и кофермента А при алкогольной интоксикации / В. М. Шейбак. - Гродно, 1998. - С. 152.

12. Bell, C. Tryptophan depletion and its implications for psychiatry / C. Bell, J. Abrams, D. Nutt // British Journal of Psychiatry. - 2001. - Vol. 178. - P. 399-405.

13. The effect of L-tryptophan on daytime sleep latenty in normals: correlation with blood levels / C. F. George [et al.] // Sleep. - 1989. - Vol. 12, N.

4. - P.345-353.

14. Sandyk, R. L-tryptophan in neuropsychiatric disorders: a review / R. Sandyk // Int. J. Neurosci. - 1992. - Vol. 67, N. 1-4. - P. 127-144.