Генетические конструкции и их смеси для антиВИЧ терапии
GENETIC CONSTRUCTS AND THEIR MIXTURES FOR ANTI-HIV THERAPY

Изобретение относится к медицинской и молекулярной генетике, а именно к генетическим конструкциям, содержащим микроРНК, которые направлены на ингибирование гена рецептора CCR5, и обладающим антивирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека. Изобретение может быть использовано в здравоохранении как противовирусный агент при антиВИЧ терапии.
Хемокиновый рецептор CCR5 служит одним из двух корецепторов, которые вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) использует для проникновения в клетку. В популяции был обнаружен полиморфный делетированный вариант гена CCR5Δ32, продуктом которого является нефункциональный белок, и показано, что гомозиготы по CCR5Δ32 устойчивы к заражению R5-тропным вирусом, а наличие этого варианта гена в гетерозиготном состоянии у ВИЧ-инфицированных ассоциируется с более медленным прогрессированием заболевания. При этом каких-либо патологий, сопровождающих данную мутацию корецептора, у его носителей выявлено не было.
Поэтому подавление экспрессии гена корецептора CCR5 с помощью лентивирусов, доставляющих в геном клеток-мишеней антиCCR5 микроРНК, является перспективной стратегией в генной терапии. Ранее (патент РФ №2426788, опубликован 20.08.2011; МПК C12N 15/86) была создана микроРНК, эффективно подавляющая CCR5, и состоящая из двух одинаковых тандемно повторенных микроРНК. Однако последовательное расположение в структуре лентивирусного вектора одинаковых микроРНК или любых других повторяющихся последовательностей может привести к нежелательным рекомбинационным событиям и, как следствие, генетической нестабильности вектора. По этой причине было решено найти дополнительную микроРНК, эффективно ингибирующую экспрессию CCR5, и заменить ею одну из одинаковых микроРНК.
В патенте РФ №2426788 также продемонстрировано, что комбинирование двух и более антивирусных агентов, перечисленных ниже, в одной генетической конструкции обеспечивает синергетический эффект: каждый агент по отдельности в различной степени подавляет репродукцию ВИЧ (от 50% до 90%); одновременное использование нескольких противовирусных агентов замедляет образование мутантных штаммов, а комбинация противовирусных агентов с агентами, придающими резистентность клеткам к ВИЧ, позволяет достичь 95-99% ингибирования ВИЧ и предотвратить появление устойчивых мутантов.
В статье Глазковой Д.В., и др. "Подавление экспрессии гена CCR5-рецептора человека с помощью искусственных микроРНК" //Молекулярная биология, 2013, Том 47, №3, С. 475-485 показано, что объединение нескольких микроРНК в один транскрипт (в частности, объединение двух или трех микроРНК mic131g) обеспечивало усиление ингибирования экспрессии CCR5. Из упомянутой статьи известно также, что можно использовать для ингибирования экспрессии CCR5 и комбинации нескольких различных микроРНК и что порядок расположения микроРНК в полицистроне влиял на способность получаемой кассеты ингибировать экспрессию CCR5.
В качестве документа, раскрывающего техническое решение, наиболее близкую к рассматриваемой (прототипа), может быть выбран патент РФ №2426788. Раскрываемые в нем решения являются наиболее близкими к рассматриваемым решениям. При этом авторы рассматриваемого технического решения отмечают, что последовательное расположение в структуре лентивирусного вектора согласно прототипу одинаковых микроРНК или любых других повторяющихся последовательностей является недостатком и может привести к нежелательным рекомбинационным событиям и, как следствие, генетической нестабильности вектора.
Отличие настоящего изобретения от прототипа заключается во введении дополнительной микроРНК, эффективно ингибирующей экспрессию CCR5, и замене одной из одинаковых микроРНК (обозначенной как «old» (SEQ ID NO 1) и идентичной раскрытой в прототипе последовательности) на другую последовательность - «новая микро», которая далее обозначена как «new», или SEQ ID NO 2).
Задачей настоящего изобретения является создание эффективных противовирусных средств нового поколения, предназначенных для лечения ВИЧ-инфекции.
Технические результаты:
- повышение стабильности вектора, ингибирующего экспрессию CCR5, и как следствие, повышение эффективности анти-ВИЧ терапии указанным агентом;
- расширение арсенала противовирусных средств нового поколения, предназначенных для лечения ВИЧ-инфекции.
Поставленная задача решается, а технический результат достигается путем создания генетической конструкции для антиВИЧ терапии, которая содержит две или более искусственных микроРНК, которые ингибируют экспрессию гена рецептора человека CCR5.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический результат также достигается тем, что:
- упомянутая конструкция содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4;
- экспрессия искусственных микроРНК регулируется промотором РНК полимеразы II человека;
- промотор РНК полимеразы II человека выбран из списка, включающего промотор гена фактора элонгации EFα, промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK), промотор гена β-актина, убиквитиновый промотор UbC, гистоновый промотор Н2 В (ТН2В), промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, промотор гена Т-клеточного рецептора, промотор гена β-интерферона, промотор гена CD4 человека, промотор гена рецептора CCR5 человека, промотор гена рецептора IL2, генов МНС класса II, гена α-фетопротеина, гена γ-глобина, гена β-глобина, генов кодирующих α- и β-субъединицы гемоглобина человека, гена альбумина, гена коллагеназы, гена металлотионеина (MTII), гена эластазы I, гена c-HA-ras, гена инсулина, промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) (см. Wagner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 1441); цитомега-ловирусный промотор (CMV), самый ранний промотор цитомегаловируса (IE1) (см. Karasuyama et al., J. Exp. Med., 1989, 169: 13); промотор вируса саркомы Рауса (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 1980, 22:787); главный поздний промотор аденовируса (Yamada et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 3567) или их аналоги;
- промотор РНК полимеразы II является регулируемым промотором, причем упомянутый промотор выбран из списка, включающего тетрациклин регулируемый промотор, LacZ регулируемый промотор, экдизон регулируемый промотор;
- упомянутая конструкция находится в составе вектора;
- в качестве вектора используется лентивирусный вектор на основе одного или нескольких из лентивирусов, выбранных из группы, включающей ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВИО, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, лентивирус артрита-энцефалита коз, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек, и/или вирус болезни Джембрана, или вектор, созданный на основе спумавируса;
- в качестве вектора используется невирусный вектор, созданный на основе векторной системы транспозон/транспозаза;
- в качестве вектора используется аденоассоциированный вектор или его производные;
- упомянутая конструкция фланкирована последовательностями, имеющими гомологию с последовательностями в заданном участке хромосомы человека и может быть встроена за счет внесения разрыва в этот заданный участок хромосомы с помощью специфической эндонуклеазы, и последующей гомологичной рекомбинации между фланкирующими последовательностями и прилегающими к разрыву участками хромосомы.
Поставленная задача решается также созданием смеси генетических конструкций для антиВИЧ терапии, включающей генетическую конструкцию для антиВИЧ терапии, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4, и одну или более генетические конструкции, содержащие последовательности, выбранные из группы последовательностей, включающей:
последовательности, кодирующей связанный с мембранной ингибитор слияния С46 [Hildinger М et al. // J Virol. 2001; 75(6): 3038-3042, Egelhofer M et al. // J Virol. 2004; 78(2):568-75.] (SEQ ID NO 7),
последовательности, кодирующей неиммуногенный ингибитор слияния V2O (Brauer F., et al. // Antimicrob Agents Chemother. 2013, 57(2), 679-688),
последовательности, кодирующей модифицированный белок из семейства Trim (Chan Е, et al. // Hum. Gene Ther. 2012, 23(11): 1176-85; Yap M.W., et al. // J. Virol. 2006, 80(8): 4061-4067; Turrini F., et al. // DNA and Cell Biology. 2014, 33(4): 191-197; Tabah A.A., et al. // J. Gen. Virol. 2014, 95(Pt 4): 960-967).
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный технический результат также достигается тем, что:
- последовательностью, кодирующей модифицированный белок человека из семейства Trim, является последовательность, кодирующая модифицированный белок TRIM5a человека (SEQ ID NO 8) (см. патенты РФ №№2426788 и 2533817, а также Jung U., et al. // Human Gene Therapy, 2015, 26(10): 664-679; Stremlau M., et al. // J. Virol, 2005, 79(5): 3139-3145; Neagu M.R., et al. // J. Clin. Invest. 2009, 119(10): 3035-3047);
- экспрессия упомянутых конструкций регулируется промотором РНК полимеразы II человека;
- промотор РНК полимеразы II человека выбран из списка, включающего промотор гена фактора элонгации EFα, промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK), промотор гена β-актина, убиквитиновый промотор UbC, гистоновый промотор Н2В (ТН2В), промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, промотор гена Т-клеточного рецептора, промотор гена β-интерферона, промотор гена CD4 человека, промотор гена рецептора CCR5 человека, промотор гена рецептора IL2, генов МНС класса II, гена α-фетопротеина, гена γ-глобина, гена β-глобина, генов кодирующих α- и β-субъединицы гемоглобина человека, гена альбумина, гена коллагеназы, гена металлотионеина (MTII), гена эластазы I, гена c-HA-ras, гена инсулина, промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV), цитомегаловирусный промотор (CMV), самый ранний промотор цитомегаловируса (IE1), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), главный поздний промотор аденовируса или их аналоги;
- промотор РНК полимеразы II является регулируемым промотором, причем упомянутый промотор выбран из списка, включающего тетрациклин регулируемый промотор, LacZ регулируемый промотор, экдизон регулируемый промотор;
- упомянутые конструкции находятся в составе вектора;
- в качестве вектора используется лентивирусный вектор на основе одного или нескольких из лентивирусов, выбранных из группы, включающей ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВИО, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, лентивирус артрита-энцефалита коз, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек, и/или вирус болезни Джембрана, или вектор, созданный на основе спумавируса;
- в качестве вектора используется невирусный вектор, созданный на основе векторной системы транспозон/транспозаза;
- в качестве вектора используется аденоассоциированный вектор или его производные;
- упомянутые конструкции фланкированы последовательностями, имеющими гомологию с последовательностями в заданном участке хромосомы человека и могут быть встроены за счет внесения разрыва в этот заданный участок хромосомы с помощью специфической эндонуклеазы, и последующей гомологичной рекомбинации между фланкирующими последовательностями и прилегающими к разрыву участками хромосомы.
Раскрытие изобретения
Сконструирована комбинация двух различных искусственных микроРНК, выключающих экспрессию рецептора CCR5. Показано, что новая комбинация обладает более высокой активностью по сравнению с двойной комбинацией, исследованной ранее. В отличие от комбинации, состоящей из одинаковых микроРНК, новая конструкция не подвергалась перестройкам и делециям.
Поскольку выключения только одного рецептора CCR5 может быть недостаточно для ингибирования репликации ВИЧ, по крайней мере, по причине возможного переключения тропности вируса на другой рецептор (CXCR4), необходимо создавать препарат комбинированного действия, в частности, путем объединения нескольких антиВИЧ генов в один вектор либо путем создания смеси (коктейля) вирусных векторов. Поэтому разработанная конструкция микроРНК планируется для лечения ВИЧ-инфекции как самостоятельно, так и в комплексе с другими конструкциями, в частности, ген С46 (ингибитор слияния) и модифицированный ген TPIM5a.
Последовательности, исследуемые в настоящем изобретении:
- Последовательность, кодирующая искусственную микроРНК (обозначена как SEQ ID NO 1, а также как mic131g или "old"), идентичная последовательности SEQ ID NO 10 в прототипе, экспрессия которой приводит к образованию короткой интерферирующей РНК, направленной против гена рецептора человека CCR5 (miRNA3 CCR5).
Новая последовательность, кодирующая искусственную микроРНК (обозначена как SEQ ID NO 2, а также как "new" и mic1002).
- Новая последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic1002 + микроРНК mic131g, обозначенная как "new+old" (SEQ ID NO 3).
- Новая последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic131g + микроРНК mic1002, обозначенная как "old+new" (SEQ ID NO 4).
- Последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic131g + микроРНК mic131g, обозначенная как "old+old" или mic131g*2, или "old*2" (SEQ ID NO 5).
- Последовательность, кодирующая искусственную микроРНК mic131g + микроРНК mic131g + микроРНК mic131g, обозначенная как "old*3" (SEQ ID NO 6).
Далее приводятся примеры осуществления изобретения со ссылками на прилагаемые фигуры.
На фиг. 1 приведены схемы лентивирусных векторов, использованных в данной работе, где:
LTR - длинный концевой повтор,
ψ - упаковочный сигнал лентивирусов,
RRE - элемент, отвечающий за связывание белка rev,
сРРТ - центральный полипуриновый тракт,
MCS - множественный сайт клонирования.
На фиг. 2 показана оценка целостности структуры новых векторов, где:
1 - "old+old",
2 - "new+old",
3 - "old+new",
4 - отрицательный контроль-вектор, не содержащий микроРНК.
На фиг. 3 показано подавление экспрессии CCR5 конструкциями, содержащими различные микроРНК. Векторы, кодирующие короткие шпилечные РНК (далее - кшРНК), включая sh131g, обозначенный как "sh old", и sh1005, обозначенный как "sh new", были использованы как положительные контроли. Вектор, состоящий из трех mic131g (из трех "old" последовательностей), обозначен как "old*3". Отрицательный контроль - вектор, не содержащий микроРНК, обозначен как "К".
На фиг. 4 показан количественный анализ коротких микроРНК методом ПЦР в реальном времени, совмещенный с обратной транскрипцией.
На фиг. 4А - ПЦР с праймерами к микроРНК "old".
На фиг. 4Б - ПЦР с праймерами к микроРНК "new".
** - р<0.01, n=3.
На фиг. 5 показаны результаты измерения количества рецептора CCR5 на клетках MAGI, трансдуцированных лентивирусом с соответствующей микроРНК, с помощью проточной цитометрии.
Стрелками обозначено:
По оси ординат - увеличение флуоресценции, соответствующее увеличению количества рецептора CCR5.
По оси абсцисс - увеличение флуоресценции, соответствующее увеличению количества флуоресцентного маркера EGFP.
АнтиCCR5 а/т - клетки, окрашенные флуоресцентно меченными антителами к CCR5.
Неокрашенные клетки - клетки без окраски антителами. Исследованные образцы клеток:
«Нет вектора» - клетки MAGI-CCR5, не трансдуцированные вектором.
«GFP only» - те же клетки, трансдуцированные контрольным вектором, содержащим только EGFP маркер
«old*2», «old+new», «new+old» - клетки, трансдуцированные соответствующими векторами, содержащими микроРНК «old*2», «old+new», «new+old».
На фиг. 6 в виде гистограммы представлены данные по количеству CCR5 на поверхности GFP + клеток, нормированные на значение, полученное для клеток GFP only. Эти количественные данные получены при обработке данных проточного цитометра, пример которых представлен на фиг. 5.
«MFI* % мод. клеток» - это средняя интенсивность флуоресценции белка EGFP, умноженная на процент модифицированных клеток.
На фиг. 7 представлена динамика вирусной нагрузки ВИЧ в культурах клеток, трансдуцированных различными лентивирусными векторами.
На фиг. 8 представлена динамика вирусной нагрузки ВИЧ в культурах первичных CD4 + лимфоцитов человека.
На фиг. 9 представлена динамика вирусной нагрузки ВИЧ в культурах клеток MAGI, трансдуцированных различными лентивирусными векторами.
«Control cells» - нетрансдуцированные клетки MAGI, используемые в качестве контроля.
Примеры осуществления изобретения и реализации назначения
Пример 1. Конструирование новой искусственной микроРНК mic1002 и новых комбинаций микроРНК
Новая искусственная микроРНК (далее - amiPHK) mic1002, обозначенная как SEQ ID NO 2, а также как "new", была создана на основе эндогенной человеческой микроРНК mir-20, входящей в состав полицистрона mir-17-92, путем замещения нативной антисмысловой цепи mir-20 на антиССК5 последовательность. Антисмысловая последовательность была выбрана на основании данных литературы, в которых была описана короткая шпилечная РНК (кшРНК sh1005), эффективно подавляющая CCR5 и обладающая низкой токсичностью (Shimizu S. et al., Genetic Vaccines and Therapy, 2009, 7:8, https://gvt-journal.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-0556-7-8). Данная кшРНК комплементарна области + 1001 п. н. от стартового кодона, практически в самом конце рамки считывания гена CCR5. На ту же самую область и нацелена новая amiPHK mic1002 (+1002 п. н. от стартового кодона).
Далее авторами были созданы конструкции, объединяющие в своем составе две разные amiPHK - mic131g (из прототипа) и mic1002. В таблице 1 кратко охарактеризованы обе amiPHK. Каждая из них содержит часть микроРНК предшественника, которая комплементарна мРНК CCR5 и связывается с мРНК, так называемая зрелая микроРНК. Остальные последовательности в составе исходной микроРНК нужны для правильного процессирования исходной микроРНК. Всего было создано 2 новых конструкции, содержащих разные amiPHK.
Конструкции "new+old" (SEQ ID NO 3) и "old+new" (SEQ ID NO 4) отличаются друг от друга порядком расположения микроРНК - mic1002 + mic131g и mic131g + mic1002, соответственно. На фиг. 1 показаны схемы всех использованных в данном описании лентивирусных конструкции. Все они содержат маркерный ген: ген устойчивости к пуромицину, который позволяет вести в культуре только те клетки, которые содержат трансген, либо ген флюоресцентного белка EGFP.
Промотор для экспрессии amiPHK - промотор РНК полимеразы II (например, CMV или Ef1a).
Промотор для контрольных кшРНК - промотор РНК полимеразы III (например, H1).
Использование сильного промотора в конструкциях, содержащих кшРНК, обеспечивает высокий уровень экспрессии и, соответственно, возможность использовать такие вектора как положительные контроли в экспериментах по нокдауну CCR5 гена. Таким образом, новые конструкции не содержат в своем составе двух одинаковых amiPHK, как это было в случае с лентивектором mic131g + mic131g ("old+old", или SEQ ID NO 5).
Пример 2. Оценка целостности вектора, встроенного в геном Чтобы выяснить, действительно ли структура новых конструкций "old+new" и "new+old" остается неизменной после того, как были заменены повторяющиеся микроРНК, проведена амплификация с праймерами, фланкирующими область микроРНК, геномной ДНК, выделенной из клеток, трансдуцированных векторами "old+old", "old+new", "new+old".
На фиг. 2 можно видеть, как в ампликоне вектора "old+old" (1) появляется дополнительный фрагмент меньшего размера, соответствующий вектору с одной микроРНК "old", который образовался в результате утраты одной из двух микроРНК. В образцах "old+new" и "new+old" такого не наблюдается, в связи с чем можно заключить, что наличие двух разных микроРНК способствует сохранению целостности вектора, что, безусловно, положительно сказывается на его свойствах (в частности, на стабильности).
Пример 3. Оценка эффективности новых конструкций
С целью оценить эффективность, с которой полученные конструкции способны подавлять CCR5, клетки HT1080-CCR5-EGFP (созданные ранее индикаторные клетки, которые содержат трансген, позволяющий им экспрессировать химерный белок CCR5-EGFP (Глазкова Д.В. и др., Молекулярная биология, 2013, Т. 47, №3, С.475-485) были трансдуцированы лентивирусными частицами, кодирующими кшРНК или микроРНК. Значение MOI (multiplicity of infection, множественность заражения) при этом составило 0,1. Низкое значение MOI было необходимо, чтобы трансдуцированные клетки в итоге содержали одну копию вектора на клетку. После трансдукции клетки отбирались на пуромицине, поскольку все конструкции содержат ген устойчивости к данному антибиотику.
CCR5-EGFP трансген - белок, состоящий из слитых друг с другом рамок считывания белка CCR5 и белка EGFP. МикроРНК, подавляющие экспрессию CCR5, снижают количество мРНК CCR5-EGFP, вследствие чего подает экспрессия зеленого флуоресцентного белка, что можно измерить с помощью проточной цитометрии. Клетки с таким трансгеном - удобная модель для оценки эффективности микроРНК. В статье Глазковой Д.В. и др. (Глазкова Д.В. и др., Молекулярная биология, 2013, Т. 47, №3, С. 475-485) описано получение последовательности, кодирующей химерный белок, и получение индикаторных клеток.
Как видно из диаграммы на фиг. 3, обе новые созданные конструкции ("old+new" и "new+old") достаточно эффективно подавляют экспрессию трансгена CCR5-EGFP, и это подавление сопоставимо с конструкцией "old+old". Лентивекторы, содержащие sh131g и sh1005, использовали в качестве положительных контролей в данных экспериментах. Сама по себе новая микроРНК mic1002 ("new") демонстрирует не очень высокую эффективность, но ее комбинации с mic131g ("old"), позволяет снижать экспрессию CCR5-EGFP на 75%. Конструкция "old+new" показала наибольшую ингибирующую способность.
Также новые конструкции были охарактеризованы с точки зрения эффективности процессинга коротких микроРНК. Данные эффекторные короткие микроРНК (длиной около 23 н.) процессируются из шпилечного предшественника. Известно, что его положение в конструкции, а также характер образованных вторичных структур влияют на конечный выход коротких микроРНК. ПЦР в реальном времени, совмещенная с обратной транскрипцией, использовалась как один из способов оценить количество коротких микроРНК. В данном методе для реверсии используется специфичный для каждой микроРНК праймер, длиной около 50 п. н., обладающий вторичной структурой, и позволяющий, таким образом, амплифицировать даже такие короткие матрицы, как микроРНК. На рис. 4 представлены результаты по измерению экспрессии микроРНК "new" и "old", а также "old+new" и "new+old".
Было обнаружено, что по процессингу обеих микроРНК конструкция "old+new" немного превосходит другую конструкцию, где микроРНК расположены в другом порядке - "new+old". Обнаруженные различия по критерию Манна-Уитни являются статистически достоверными.
Следует обратить внимание еще на тот факт, что конструкция "old+new" содержит лишь одну копию микроРНК "old", но при этом уровень экспрессии коротких РНК данного типа обнаруживается на том же самом уровне, что и у конструкции с двумя "old" последовательностями ("old+old"). Обнаруженный эффект, по всей видимости, связан с более эффективным процессингом за счет присутствия последовательности "new".
Пример 4. Оценка способности новых конструкций подавлять экспрессию CCR5 Была оценена способность новых конструкций подавлять экспрессию CCR5 путем непосредственного измерения количества корецептора на поверхности клеток MAGI-CCR5 с помощью моноклональных антител и проточной цитометрии (клетки MAGI CCR5 были получены из США по программе «NIH AIDS Research and Reference Reagent Program»). Эти клетки экспрессируют нативный корецептор CCR5 со встроенного трансгена. Результаты представлены на фиг. 5 и фиг. 6.
В результате получилось, что обе новые конструкции "old+new" и "new+old" превосходят (статистически значимо) по своим ингибирующим свойствам конструкцию "old+old".
Пример 5. Оценка устойчивости трансдуцированных клеток MAGI CCR5 к ВИЧ Клетки MAGI CCR5, экспрессирующие CCR5 на своей поверхности, чувствительны к заражению R5-тропным ВИЧ. По этой причине данная клеточная линия может быть использована в вирусологических экспериментах по оценке устойчивости модифицированных клеток к вирусу. Для трансдукции использовали лентивектора, содержащие конструкции "old+new" и "new+old" и ген EGFP в качестве маркера. Трансдуцированные лентивекторами конструкции "old+new" и "new+old" клетки MAGI CCR5 были заражены R5-тропным ВИЧ. Для инфекции использовали макрофаг тропный вирус NL(AD8) (Freed, Е.О., et al. // J. Virol. 1995, 69(6): 3949-3954). В течение опыта измерялась вирусная нагрузка в зараженных культурах. В результате было обнаружено, что все исследуемые конструкции - "old+new", "new+old" и "old+old" - способны ограничивать рост вируса в культуре (см. фиг. 7), причем подавление вируса при использовании конструкций "old+new" и "new+old" более выражено, чем при использовании конструкции old+old".
Пример 6. Оценка устойчивости трансдуцированных CD4+ лимфоцитов человека к ВИЧ
Клетки CD4+ лимфоцитов человека были получены из крови здоровых доноров. Полученные клетки были трансдуцированы лентивекторами конструкций "old+new" или "old+old", содержащими ген EGFP в качестве маркера или контрольным вектором К, содержащим только EGFP, при MOI=10. В результате были получены культуры, содержащие 38%, 39% и 48% трансдуцированных клеток соответственно. Далее культуры лимфоцитов были заражены R5-тропным вирусом NL(AD8). В течение опыта измерялась вирусная нагрузка в зараженных культурах. В результате было обнаружено, что конструкция "old+new" более эффективно подавляет рост вируса в культуре, чем конструкция "old+old" (см. фиг. 8).
Пример 7. Приготовление смесей генетических конструкций
Используя исходные суспензии индивидуальных векторов "old+new", модифицированный Trim5a и С46, были приготовлены две смеси лентивирусных векторов. Суспензии векторов были очищены с помощью ультрацентрифугирования на сахарозе, для каждой суспензии, был измерен титр. Смеси приготавливались непосредственно после размораживания очищенных суспензий.
Приготовление смеси №1:
8
7
4
3 мкл суспензии вектора "old+new" (титр 5,4*10) смешали с 36 мкл суспензии вектора, кодирующего модифицированный Trim5a человека (титр 4,0*10). 13 мкл смеси №1 использовали для трансдукции 5*10 клеток MAGI CCR5.
Приготовление смеси №2:
8
8
4
3 мкл суспензии вектора "old+new" (титр 5,4*10) смешали с 9 мкл суспензии вектора, кодирующего белок С46 (титр 1,7*10). 4 мкл смеси №2 использовали для трансдукции 5*10 клеток MAGI CCR5.
Пример 8. Оценка эффективности смесей генетических конструкций на клетках MAGICCR5
4
4
Клетки MAGI CCR5, экспрессирующие CCR5 на своей поверхности, были трансдуцированы или лентивектором "old+new", или лентивектором, кодирующим модифицированный белок Trim, или лентивектором, кодирующим белок С46 с множественностью инфекции равной 20 (MOI=20). Параллельно была проведена трансдукция клеток MAGI CCR5 смесью векторов №1, содержащих вектор "old+new" 10 MOI и вектор, кодирующий модифицированный ген Trim 10 MOI (13 мкл смеси на 5*10 клеток), или смесью векторов №2, содержащих вектор "old+new" 10 MOI и вектор, кодирующий белок С46 10 MOI (4 мкл смеси на 5*10 клеток). Трансдуцированные клетки MAGI CCR5 были заражены R5-тропным вирусом NL(AD8) и далее раз в два дня отбирали часть питательной среды для измерения РНК ВИЧ, и вместо нее добавляли свежую питательную среду.
Результаты измерения вирусной нагрузки приведены на фиг. 9. Было показано, что в клетках, трансдуцированных смесью векторов №1 и 2, подавление роста вируса более выражено, чем в клетках, трансдуцированных отдельными векторами. Причем подавление вирусной нагрузки было почти в 10 раз эффективнее с помощью смесей векторов по сравнению с отдельным вектором "old+new".