Способ количественного определения алоэнина в свежих листьях алоэ древовидного
METHOD FOR QUANTIFYING ALOENIN IN FRESH KRANTZ ALOE LEAVES

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа содержания алоэнина в листьях алоэ древовидного.
Действующая система контроля качества требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих дифференцированно определять конкретные БАС.
Aloe arborescens
in vivo
in vitro
Алоэ древовидное (лат.  Mill.) и препараты на его основе обладают широким спектром биологической активности (1-3). В исследованиях  и  показано, что листья алоэ древовидного и лекарственные препараты из листьев алоэ древовидного обладают антиоксидантным, противовоспалительным, слабительным, ранозаживляющим действием и другими видами активности (1-4). В России разрешены к применению алоэ экстракт жидкий, алоэ сок, алоэ линимент, которые оказывают противовоспалительное, ранозаживляющее действие, разрабатываются другие лекарственные формы (5,6).
β
В ходе ранее проведенных исследований установлено, что одним из доминирующих БАС листьев и препаратов алоэ древовидного является алоэнин (4-метокси-6-(2′--D-глюкопиранозил-4′-гидрокси-6′-метилфенил)-2-пирон), для которого выявлены выраженные противовоспалительные, антигистаминные свойства, а также способность ингибировать секрецию желудочного сока (1). На фиг. 1 представлена структурная формула алоэнина.
Для количественного определения алоэнина в сырье и препаратах алоэ древовидного используются спектрофотометрические, хроматографические (высокоэффективная тонкослойная хроматография с последующим денситометрическим определением, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с детекцией в УФ/видимой области, масс-спектрометрической детекцией, газовая хроматография с масс-спектрометрической детекцией и др.) методы (1, 2, 7).
4
4
Наиболее близкой к предлагаемому способу является разработанная Олейниковым Д.Н. и соавт. методика количественного определения алоэнина в листьях алоэ древовидного с использованием микроколоночной ВЭЖХ, которая была взята нами в качестве прототипа. Методика предусматривает экстракцию алоэнина из сырья 80 % этанолом, ВЭЖХ-анализ с градиентным режимом элюирования с использованием в качестве элюентов 4,1 М LiClO/0,1 M HClO(5:95)и ацетонитрила. Продолжительность хроматографического анализа составляет 18 мин. Содержание алоэнина в исследуемых образцах свежих листьях алоэ древовидного составило 0,287 % ± 0,005 % (8,9).
Известно, что при градиентном режиме корректировка условий является более критичной, может привести к некорректной идентификации пиков, их наложению или сдвигам, при которых интересующие вещества могут выйти после указанного времени регистрации хроматограммы (10).
Таким образом, целью изобретения является разработка способа анализа алоэнина в свежих листьях алоэ древовидного методом микроколоночной ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования.
Техническим результатом является повышение воспроизводимости и уменьшение продолжительности способа количественного определения алоэнина в листьях алоэ древовидного.
Технический результат достигается тем, что способ осуществляют путем извлечения алоэнина из лекарственного растительного сырья алоэ древовидного водно-спиртовыми смесями с концентрацией этилового спирта в диапазоне 40-70 %, ВЭЖХ-анализа полученных извлечений в изократическом режиме элюирования с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и 1% раствора уксусной кислоты в воде в соотношении 25:75 и с детекцией при длине волны 306 нм. Содержание алоэнина (Х в процентах) в пересчете на абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:
где:
–
высота пика алоэнина на хроматограмме испытуемого раствора;
–
высота пика алоэнина на хроматограмме стандартного раствора;
– точная навеска анализируемого образца;
st
m- точная навеска стандарта алоэнина;
– потеря в массе при высушивании, %.
При анализе известных решений в научной литературе не было обнаружено результатов исследований по количественной оценке алоэнина методом микроколоночной ВЭЖХ в изократическом режиме.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что алоэнин во многом определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из свежих листьев алоэ древовидного. Алоэнин имеет максимум поглощения при 306±2 нм, которая и была выбрана нами для детекции при проведении ВЭЖХ-анализа.
Способ осуществляют следующим образом. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл этилового спирта с концентрацией 40-70%. Колбу закрывали пробкой и взвешивали на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждали в течение 30 мин, закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр (синяя полоса) и затем дополнительно фильтровали через мембранный фильтр Milipore (0,45 мкм) (испытуемый раствор).
ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), подвижная фаза – ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 25:75, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента - 1500 мкл. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 306 нм. Объемы инжектируемых проб: 2 мкл (стандартный раствор алоэнина), 3 мкл (испытуемый раствор).
Приготовление стандартного раствора алоэнина.
Точную навеску (около 0,025 г) предварительно высушенного алоэнина (содержание основного вещества ≥98 %) переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 70 % этаноле и доводили объем раствора до метки тем же растворителем.
В описанных выше условиях ВЭЖХ-анализа время удерживания пиков алоэнина на хроматограммах стандартного образца алоэнина и водно-спиртового извлечения из свежих листьев алоэ древовидного составило 3,572 ± 0,016 мин и 3,772 ± 0,020  мин соответственно. На фиг. 2 представлена ВЭЖХ-хроматограмма стандартного раствора алоэнина (обозначения: 1 – алоэнин), на фиг. 3 – ВЭЖХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения из свежих листьев алоэ древовидного (обозначения: 1 – алоэнин; 2, 3 – алоины А и В).
Расчет содержания алоэнина проводили с учетом высоты хроматографического пика, так как коэффициент корреляции для зависимости высоты пика от концентрации алоэнина в пробе составил 0,9998, что превышало значение коэффициента корреляции для зависимости площади пика от концентрации:
где:
– высота пика алоэнина на хроматограмме испытуемого раствора;
–
высота пика алоэнина на хроматограмме стандартного раствора;
–
точная навеска анализируемого образца;
st
m- точная навеска стандарта алоэнина;
– потеря в массе при высушивании, %.
Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность (открываемость), прецизионность. Специфичность методики определялась по соответствию времен удерживания стандартного образца алоэнина и соответствующего пика на ВЭЖХ-хроматограмме испытуемого раствора, а также по разрешению между наиболее близкими пиками и фактору асимметрии пиков алоэнина.
Зависимость высоты хроматографического пика от концентрации алоэнина описывалась линейной регрессией в диапазоне концентраций от 115 до 1400 мкг/мл. На фиг. 4 представлен график зависимости высоты хроматографического пика от концентрации алоэнина в испытуемом растворе.
+
Метрологические характеристики предлагаемой ВЭЖХ-методики свидетельствуют о том, что ошибка определения среднего результата содержания алоэнина в свежих листьях алоэ древовидного с доверительной вероятностью 95 % составляет 4,9 %. Правильность методики определяли методом добавок путем добавления растворов алоэнина с известной концентрацией (80 %, 100 % и 120 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент открываемости составил 99,16 % соответственно. Ошибки определения алоэнина в пробах с добавками стандартных образцов находились в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Нами было также изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода алоэнина из листьев алоэ древовидного в зависимости от концентрации экстрагента. В результате эксперимента было определено, что оптимальными экстрагентами являются водно-этанольные смеси с концентрацией спирта этилового 40-70%, так как выход действующих веществ из сырья при их использовании сопоставим.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение водно-этанольными смесями с концентрацией спирта этилового 40-70% на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50.
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1
Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 40 % этанола. Колбу закрывали пробкой и взвешивали на весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждали в течение 30 мин, закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр (синяя полоса) и затем дополнительно фильтровали через мембранный фильтр Milipore (0,45 мкм) (испытуемый раствор).
ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (№2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), подвижная фаза – ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 25:75, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента - 1500 мкл. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 306 нм. Объемы инжектируемых проб: 2 мкл (стандартный раствор алоэнина), 3 мкл (испытуемый раствор).
Рассчитывают количественное содержание алоэнина по формуле:
где:
–
= 79,56528 высота пика алоэнина на хроматограмме испытуемого раствора;
=
–
190,0568высота пика алоэнина на хроматограмме стандартного раствора;
=
–
1,0027 точная навеска анализируемого образца;
st
-
m= 0,0231 мг точная навеска стандарта алоэнина.
потеря в массе при высушивании, %.
Испытание проведено в трех повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание алоэнина составило 1,73 % ± 0,07 %.
Пример 2
Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 60 % этанола. Колбу закрывали пробкой и взвешивали на весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждали в течение 30 мин, закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр (синяя полоса) и затем дополнительно фильтровали через мембранный фильтр Milipore (0,45 мкм) (испытуемый раствор).
ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (№2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), подвижная фаза – ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 25:75, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента - 1500 мкл. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 306 нм. Объемы инжектируемых проб: 2 мкл (стандартный раствор алоэнина), 3 мкл (испытуемый раствор).
Рассчитывают количественное содержание алоэнина по формуле:
где:
–
= 73,87356 высота пика алоэнина на хроматограмме испытуемого раствора;
=
–
190,0568высота пика алоэнина на хроматограмме стандартного раствора;
=
–
1,0007 точная навеска анализируемого образца;
st
m= 0,0231 мг - точная навеска стандарта алоэнина.
потеря в массе при высушивании, %.
Испытание проведено в трех повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание алоэнина составило 1,61 % ± 0,07 %.
Пример 3
Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 70 % этанола. Колбу закрывали пробкой и взвешивали на весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждали в течение 30 мин, закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр (синяя полоса) и затем дополнительно фильтровали через мембранный фильтр Milipore (0,45 мкм) (испытуемый раствор).
ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (№2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), подвижная фаза – ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 25:75, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента - 1500 мкл. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 306 нм. Объемы инжектируемых проб: 2 мкл (стандартный раствор алоэнина), 3 мкл (испытуемый раствор).
Рассчитывают количественное содержание алоэнина по формуле:
где:
–
= 78,81874 высота пика алоэнина на хроматограмме испытуемого раствора;
=
–
190,0568высота пика алоэнина на хроматограмме стандартного раствора;
=
–
1,0013 точная навеска анализируемого образца;
st
m= 0,0231 мг - точная навеска стандарта алоэнина.
потеря в массе при высушивании, %.
Испытание проведено в трех повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание алоэнина составило 1,72 % ± 0,07 %.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения алоэнина в свежих листьях алоэ древовидного методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии обладает следующими преимуществами
1. Элюирование в изократическом режиме позволяет избежать проблем (некорректная идентификация пиков, их наложение или сдвиги, при которых интересующие вещества могут выйти после указанного времени регистрации хроматограммы), возникающих при проведении хроматографического анализа в градиентном режиме.
2. Используемые параметры экстракции (экстрагент, соотношение «сырье-экстрагент», время экстракции) позволяют увеличить выход алоэнина по сравнению с прототипом.
+
3. Ошибка определения среднего результата содержания алоэнина в свежих листьях алоэ древовидного с доверительной вероятностью 95 % составляет 4,90 %, что свидетельствует о высокой воспроизводимости методики.
4. Продолжительность хроматографического анализа составляет 15 мин по сравнению с 18 мин в способе-прототипе. ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Зилфикаров, И.Н. Современные аспекты фармакогностического и биохимического изучения суккулентного сырья алоэ древовидного и каллизии душистой / И.Н. Зилфикаров, Д.Н.Оленников, Т.А. Ибрагимов, В.А. Челомбитько, В.В. Вандышев // МО, Щёлково : Издатель Мархотин П. Ю., 2013. – 192 с.
2. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). / // 4-е изд., перераб. и доп.  - Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2019. - 1278 с.
Aloe arborescens
3. Singab, A.N.B. A systemic review on  pharmacological profile: Biological activities and pilot clinical trials / A.N.B. Singab, H.M. El-Hefnawy, A. Esmat et al. // Phytother. Res. – 2015. – Vol. 29. – P. 1858–1867.
Aloe arborescens
4. Yamamoto, M. Anti-inflammatory active constituents of  Miller / M.Yamamoto, T. Masui, K. Sugiyama et al. // Agric. Biol. Chem. – 1991. – Vol. 55. – P. 1627-1629. DOI: 10.1080/00021369.1991.10870794.
5. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. Электрон. дан. 2021. URL: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx. (дата обращения: 21.04.2021 г.).
6. Глущенко, С.Н. Разработка суппозиториев на основе сока алоэ древовидного / С.Н. Глущенко, А.А. Шмыгарева, А.Н. Саньков // Аспирантский вестник Поволжья. – 2020. – № 1-2. – С. 126-130.
Aloe arborescens
7. Olennikov, D.N. Method for determining content of phenolic compounds in  / D.N. Olennikov, A.V. Rokhin, I.N. Zilfikarov // Chemistry of Natural Compounds. – 2008. – Vol. 44, No. 6. – P. 715-718. DOI: 10.1007/s10600-009-9192-6.
Aloe arborescens
8. Оленников, Д.Н. Исследование химического состава алоэ древовидного ( Mill.) / Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, Т.А. Ибрагимова / Химия растительного сырья. – 2010. – № 3. – С. 77-82.
9. Оленников, Д.Н. Применение микроколоночной ВЭЖХ для анализа алоэнина в сырье и препаратах алоэ древовидного / Д.Н. Оленников, И.Н. Зилфикаров, Т.А. Пензина / Химико-фармацевтический журнал. – 2013. – Т. 47, № 9. – С. 42-45.
10. ОФС.1.2.1.2.0001.15 Хроматография / Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. – Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2018. URL: http://www.femb.ru/femb/pharmacopea.php.