Генетические аспекты имунного ответапри врожденной инфекционной патологииу детей раннего возраста

Генетические аспекты имунного ответа

W I W

при врожденной инфекционнои патологии у детей раннего возраста

Магеррамова С.Г.

Институт генетических ресурсов НАН Азербайджана, Баку

Maherramova S.H.

Institute of Genetic Resources of NAS of Azerbaijan, Baku

Immun answer of the genetic aspect of a number pathologies in infant babies

Резюме. С применением современного молекулярного биологического комплексного метода в процессе проводимого исследования установлено молекулярное генетическое расположение 3 генетических полиморфизмов цитокинов против воспаления и воспалительного направления при развитии у детей заболеваний дыхательных органов. Полиморфизм TNF-а гена 308 G/A является протективным фактором в отношении аллергического бронхита и пневмонии у новорожденных. У детей наблюдается нарушение иммунного регулирования и ослабление в начальных этапах ответа иммунитета на корреляцию, установленную между показателями врожденного и адаптивного иммунитета. Ключевые слова: гены иммунного ответа, полиморфизм, противоинфекционная защита, дети.

Медицинские новости. — 2018. — №5. — С. 81—83. Summary. In the research, molecular genetic location of 3 genetic polimorphism of inflame matory and anti-inflammatory cytokines in the development of respiratory diseases in children has been identified by modem molecu lar-biological complex method. 308 G/A gene TNF-a polymorphism is a protective factor in respect of allergic bronchitis and pneumonia in infant babies. Correlation between childbirth and adaptive immune indicators in children shows decreasing of immune answer in initial stages and disroption of immune regulation. Keywords: genes of immune response, polymorphism, polective antiinfection immunity, children. Meditsinskie novosti. - 2018. - N5. - P. 81-83.

В последние годы все чаще появляются сведения о том, что дефекты в системе Толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor - TLR), снижение их экспрессии и функции в силу мутаций полиморфизмов или эпигенетических нарушений регуляции TLR лежат в основе развития иммунодефицитных состояний, реализации и генерализации инфекций [5]. В этой связи актуальным является изучение ключевых механизмов иммунопатогенеза врожденной цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) и вируса простой герпесной инфекции (ВПГИ), обусловливающих супрессию иммунного ответа и, следовательно, приводящих к генерализации и неблагоприятному исходу этих заболеваний.

Аллергический бронхит относится к многофакторным заболеваниям, в развитии которых принимает участие множество генов [7]. В настоящее время известны многочисленные генетические маркеры, обусловливающие развитие инфекционных заболеваний. При исследовании патологии органов дыхания большое внимание уделяется патогенетическим механизмам, происходящим на клеточном и молекулярно-генетическом уровнях, в том числе роли цитокинов в патогенезе заболевания [6]. Эти знания позволяют, с одной стороны, прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее течения,

с другой - индивидуально подобрать специальную терапию для конкретного пациента. Наиболее частым изменением структуры генов является полиморфизм единичных нуклеотидов (single nucleotide polymorphism - SNP). Именно SNP особенно важен для молекулярной диагностики болезней [1]. Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма [1, 2, 5, 8, 9].

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной клинической иммунологии является изучение врожденного иммунитета. Первым барьером иммунной защиты от патогенных микроорганизмов выступают система комплемента, цитокины, моноциты, макрофаги, нейтрофилы и т.д. [7]. Дефекты в системе TLR, нарушение процесса распознавания лигандов, экспрессии TLR [1, 2, 4], выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекционных и аутоиммунных заболеваний [1].

Становится все более актуальным поиск новых маркеров сепсиса, которые позволяли бы диагностировать заболевание на ранних стадиях, оценивать его тяжесть, осуществлять мониторинг в ходе лечения и прогнозировать исход.

Цель исследования - изучение секреции про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с анализом

полиморфизма их генов при гнойно-воспалительных заболеваниях, что, в свою очередь, может быть положено в основу разработки новых подходов к прогнозированию ее клинического течения.

Материалы и методы

Объектами исследования являются грудные дети с локальными инфекционно-воспалительными заболеваниями (ЛИВЗ) и грудные дети с сепсисом. В качестве контрольной групппы иммунометаболи-ческие параметры изучены у 40 здоровых детей грудного и раннего возраста. В ходе работы проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 111 пациентов с аллергическим бронхитом.

Под наблюдением находились дети раннего возраста (0-6 месяцев). Наблюдаемые дети (n=296) распределены на четыре группы: I группа - дети с врожденной генерализованной ЦМВИ (выделены две подгруппы: 1.1 - с типичной генерализованной формой с полной клинической симптоматикой, 1.2 - с типичной генерализованной формой с неполной клинической симптоматикой); II группа - дети с врожденной генерализованной ВПГИ; III группа - дети с аллергическим бронхитом; контрольная группа - здоровые новорожденные, родившиеся у женщин с физиологическим течением беременности.

У пациентов с аллергическим бронхитом изучен полиморфизм генов ин-

ШВИ Средние значения содержания про- и противовоспалительных цитокинов в раннем неонатальном периоде

Показатель I группа II группа

1.1

IFN-а, пг/мл 8,3±0,9* 10,7±1,1* 9,1±6,2* 15,9±2,1

IL-12, пг/мл 1,5+0,9 2,0±0,8 0,7±0,01* 1,1±0,3

МСР-1, пг/мл 1083,2±258,4* 783,5±223,1 1187,2±342,4* 600,5±53,9

IL-6, пг/мл 25,8±5,2* 18,3±4,2* 33,6±10,8* 9,0±1,6

IL-8, пг/мл 71,3±5,8*А 40,7±11,3 30,1±8,2 26,3±7,7

IFN-y, пг/мл 42,1 ±9,7*  86,5±21,9 44,9±9,5* 100,8±27,4

IL-4, пг/мл 264,9±24,2*  138,9±41,1 298,4±51,8* 74,1±24,8

Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с таковыми в группе контроля, р<0,05;  - достоверность различий показателей по сравнению с таковыми в группе 1.2, р<О,05.

терлейкинов IL4 (C-589T), IL10 (G-1082A) и факторы некроза опухолей (TNF -а) (H-308A) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме real-time. Концентрацию IL4, IL-6, интерфенона (IFN-y), TFN-а в сыворотке крови определяли методом ИФА с помощью набора реагентов «Протеиновый контур» (Россия), IL8 - с использованием тест-систем Bender Medsystems (Австрия), IL12 - с помощью тест-систем Biosource (США). Для определения содержания МСР-1 применяли тест-системы Bender Medsystems (Австрия).

С образцом выделенной ДНК параллельно проводили 2 реакции амплификации с двумя парами аллелей - специфичными праймерами. Исследование полиморфизма генов осуществляли в 3 этапа: 1) выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови; 2) проведение ПЦР (амплификация); 3) детекция продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза. ЦМВИ и ВПГИ диагностировали при выявлении ДНК-вирусов в крови. Анализ экспрессии генов TLR2, TLR4 проводили на приборе Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System. Смесь для реакции готовили по инструкциям к реагентам Tagman Gene Expresión Master Mix (Applied Biosystems, США).

Для статической обработки полученных результатов использовали пакет программ STATISTICA 6. Различия сравниваемых величин признавали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ результатов исследования уровня IFN-а в сыворотке крови показал, что в раннем неонатальном периоде у детей с ЦМВИ в подгруппе 1.1 и 1.2 отмечено его достоверное снижение по сравнению с показателем в контрольной группе. У детей с ВПГИ уровень IFN-а был в 1,7 раза ниже по сравнению с таковым в контрольной группе (р<0,05), что может быть следствием установленного нами значительно более низкого уровня экспрессии TLR2.

Анализ уровня IFN-y показал, что у детей с ЦМВИ подгруппы 1.1 его концентрация в раннем неонаталь-ном периоде была в 2,4 раза ниже по сравнению с таковой в контрольной группе. У детей II группы с генерализованной ВПГИ уровень IFN-y был в 2,2 раза ниже по сравнению с показателем в контрольной группе. В нашем исследовании как в подгруппе 1.1 и 1.2 при ЦМВИ, так и при ВПГИ во II группе,

содержание 1Ь6 достоверно превысило показатели контрольной группы. Данные изменения могут приводить к сдвигу дифференцировки Т-хелперов в направлении Т112, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа. У детей подгруппы 1.1 уровень 11-8 был в 2,7 раза выше по сравнению с показателем в контрольной группе и в 1,8 раза выше, чем в подгруппе 1.2. Выявлена прямая корреляционная зависимость содержания 11-8 с уровнем вирусной нагрузки. Снижение уровеня 11-12 у новорожденных во II группе приводит к нарушению формирования связи между механизмами неспецифической защиты и специфического иммунитета. Уровень 11-4 у детей подгруппы 1.1 и II группы был выше по сравнению с таковым в контрольной группе в 3,6 и 4,0 раза соответственно, что отражает доминирование противовоспалительных цитокинов и ведет к снижению противо-инфекционной защиты. В динамике заболевания у детей с ЦМВИ в подгруппе 1,1 к первому месяцу жизни по сравнению с показателем в раннем неонатальном периоде произошло снижение И-8. Только к трем месяцам жизни повысился ровень IFN-a, снизился уровень И-4, И-6 (табл. 1).

В подгруппе 1.2 уже к первому месяцу жизни показатели ^-а достоверно превышали его уровень по сравнению с показателем в раннем неонатальном периоде, произошло снижение продукции И-8, И-6. Показатель FN-y прогрессивно нарастал к трем месяцам. У детей с ВПГИ во II группе к первому месяцу жизни по сравнению с показателями в раннем неонатальном периоде произошло повышение IFN-a,

IL-12 (р<0,05), IL-6, IL-4 (р<0,05). При анализе частот полиморфизмов генов TLR при генерализованной ЦМВИ в зависимости от тяжести состояния было обнаружено, что в подгруппе детей с полной клинической симптоматикой ЦМВИ (подгруппа 1.1) по сравнению с подгруппой детей с неполной клиникой (подгруппа 1.2) частота генотипа Ser/Pro гена TLR6 встречалась достоверно чаще (68,4% и 12,5% соответственно), а генотипа Pro/Pro гена TLR6 - достоверно реже (26,3% и 81,3% соответственно). Таким образом, у носителей аллеля Ser/Pro гена TLR6 риск развития более тяжелого течения ЦМВИ выше, а генотип Pro/Pro является протективным в отношении тяжести протекания ЦМВИ. В группе детей с ВПГИ (II группа) получено достоверное различие в распределении генотипа Arg753Gln гена TLR2 по сравнению с показателем в контрольной группе (26,3% и 3,8% соответствено). Таким образом, аллельные варианты гена TLR2 в точках полиморфизма Arg753Gln могут являться генетическими маркерами риска развития тяжелой генерализованной формы ВПГИ у новорожденных детей.

Установлено, что полиморфизм С-590Т гена IL-4 ассоциирован с риском развития острой легочной патологии у детей в зависимости от возраста. Полиморфизм G-308A гена TNF -а является протективным фактором в отношении аллергического бронхита и пневмонии у детей грудного возраста. Наиболее часто встречается генотип CT IL4 (C-589T) - y 54,05%, GA IL-10 (G-1082A) - y 70,27%. Мутантная гомозигота выделена с генотипом ТТ гена IL4 (C-589T) всего у 6 (5,41%) детей, с генотипом АА гена 11=10

МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ

№ 5 • 2018

82

лиШВ Частота встречаемости генотипов цитокинов ^-4, ^-10 и TNF-а при аллергическом бронхите у детей грудного возраста

Показатель IL4

абс. % абс. % абс. %

Нормальная гомозигота 45 40,54 30 27,03 90 81,08

Гетерозигота 60 54,05* 78 70,27 18 16,22

Мутантная гомозигота 6 5,41** 3 2,70** 3* 2,70

Всего 111 100 111 100 111 100

Примечание: * - достоверность частоты встречаемости гетерозиготы и му-тантной гомозиготы, p<0,05; ** - достоверность частоты встречаемости нормози-готы и мутантной гомозиготы, p<0,05.

(й-1082А) - у 3 (2,70%) и с генотипом ТМ АА (0-308А) - у 3 (2,70%) больных. Реже наблюдался нормозиготный генотип по всем изучаемым видам цитокинов: в 1,35 раза - 11-4, в 2,5 раза - 11-10. При изучении генотипа TNFa наблюдали другую тенденцию: нормозигота GG (0-308А) встречалась в 5 раз чаще, чем гетерозигота GА (0-308А). Доля выявления мутантной гомозиготы для 11-4, 11-10 и TNF -а была доставлена по всем видам цитокинов, хотя и встречалась реже по всем видам цитокинов по сравнению с другими генотипами. Мутантная гомозигота выделена по 11-4 ТТ (С-589Т) всего у 6 (5,41%) больных, по 11-10 ТТ (0-1082А) - у 3 (2,70%) и по TNF-a (0-308А) - у 3 (2,70%) детей. Изучение уровня интерлейкинов у новорожденных с врожденными инфекциями выявило наличие дисбаланса в цитокиновом профиле и преобладание ТМ-компонента иммунного ответа. Это подтверждалось повышением уровня провоспалительных цитокинов (11-1 р, 11-6, 11-18) и снижением уровня противовоспалительного цитокина (И-10) в сравнении с показателями контрольной группы (табл. 2).

Полученные нами данные свидетельствуют об ассоциации аллельных вариантов гена 11-6 с внутриутробными инфекциями, в особенности в позициях -572G/C (0^) и -1740/0 (0^). Носители аллельного варианта -5720 и -1740 гена 11-6 имеют повышенный риск к инфекциям по сравнению с вариантом 0/0 в этих локусах. Определение нуклеотидных последовательностей С и Т в регуляторной части промотора гена 11-1 р за исключением позиции -511 не показало ассоциации с внутриутробными инфекциями.

Частота аллеля С в 11-1 р позиции -511 была выше у больных новорожденных по сравнению со здоровыми. Частота

аллеля Т и генотипа ТТ гена 11-1 р была выше у здоровых детей. Исследование полиморфизма промотора гена 1Н8 в позиции -656 выявило однонуклео-тидные замещения у новорожденных с внутриутробными инфекциями. У инфицированных детей в позиции -656 гена 11-18 наблюдалась низкая частота аллеля Т по сравнению со здоровыми детьми (соответственно 31% и 52,6%), гомозигот с генотипом ТТ также было на 30% больше в группе здоровых. Обратная зависимость наблюдалась по аллельному варианту 0. Носителей ал-леля 0 в контрольной группе было 47,4%, в группе больных - 69%. Таким образом, выявлено статистически значимое повышение частоты аллеля 0 (Т^0) в позиции -656 у новорожденных с внутриутробными инфекциями. Определение аллельных вариантов полиморфизма промотора гена 11-18 в позиции -137 показало снижение частоты встречаемости аллеля 0 (65%) и генотипа 00 (52%) у больных детей по сравнению с контрольной группой -79,6% и 68,7% соответственно. Достоверной разницы в позиции +105 гена 11-18 между инфицированными и здоровыми новорожденными не отмечено. Носители гаплотипа 0Т0 в группе здоровых детей составляли 7,9%, в то время как у больных этот гаплотип не встречался. Аналогичная картина отмечена при сравнении гаплотипа АТ0/0Т0, который не был выявлен у больных, в то время как у здоровых составлял 15,8%. Выявленная ассоциация продукции 11-18 с аллельными вариантами промоторного региона гена II 18 в позициях -656 и -137 свидетельствует о генетической детерминированности уровня синтеза этого интерлейкина.

Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружены

функционально значимые полиморфизмы в промоторном регионе гена IL-10 в позициях - 592 А/С, - 819 Т/С, возникшие в результате одиночных нуклеотидных замен. Выявленная ассоциация уровня цитокинов с аллельными вариантами промоторных регионов генов интерлейкинов свидетельствует о генетической детерминированности их продукции. Выводы:

1. Генетические факторы играют важную роль в развитии аллергического бронхита. Анализ полиморфизма генов цитокинов у больных детей показал, что наиболее часто встречаются генотипы CT гена IL4 (C-589T) - у 54,05%, GA гена 11=10 (G-1082A) - у 70,27% пациентов.

2. У детей при генерализованной ЦМВИ с полной клинической симптоматикой и генерализованной ВПГИ отмечается снижение содержания IFN-a, IFN-y и IL-6 и смещение цитокинового баланса в сторону продукции противовоспалительного цитокина IL-4, при ЦМВИ с неполной клинической симптоматикой имеет место только снижение концентрации IFN-a и повышение IL6.

3. Выявленные корреляционные зависимости между показателями врожденного и адаптивного иммунитета отражают угнетение ранних этапов иммунного ответа и нарушение иммунной регуляции у детей при генерализованной ЦМВИ и ВПГИ.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Ганковская О.А., Бахарева И.В., Ганковская Л.В. и др. // Российский иммунологический журнал. -2011. - №1. - С.26-33.

2. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Никонова А.С. и др. // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология. - 2010. - №1. - С.45-50.

3. Спивак Н.Я., Белоцкий С.М., Карлов В.А. Сепсис: иммунология и иммунокоррекция. -Киев, 2007. - 304 с.

4. Chen YC., Hsiao C.C., Chen C.J., et al. // BMC Med. Genet. - 2010. - Vol.11, N6. - Р.12-17.

5. Chiang C., Veckman V, Limmer K., David M. //J. Biol. Chem. - 2012. - Vol.287. - Р.3704-3709.

6. Howell M.D., Novak N., Bieber T, et al. // J. Invest. Dermatol. - 2005. - Vol.125. - Р.738-745.

7. Kumar H., Kawai T., Akira S. // Int. Rev. Immunol. -2011. - Vol.30. - Р.16-34.

8. Qi R., Hoose S., Schreiter J., et al. // J. Biol. Chem. - 2010. - Vol.285, N47. - Р.36635-36644.

9. Shibuya E., Meguro A., Ota M., et al. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2008. - Vol.49. - Р.4453-4457.

10. Shibata T., Motoi Y, Tanimura N., Yamakawa N., Akashi-Takamura S., Miyake K. // Int. Immunol. -2011. - Vol.23. - Р.503-510.

Поступила 05.02.2018г. Статья размещена на сайте www.mednovosti.by (Архив МН) и может быть скопирована в формате Word.