Синтез и изучение модифицированных фрагментов гастрина

Оригинальные статьи

63

синтез и изучение модифицированных фрагментов гастрина

л.П. Сушинина, А.П. Смирнова, С.В. Устинкина, л.и. Смирнова, Т.А. Сидорова, м.П. киселева,

л.м. Борисова, З.С. Шпрах

ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Контакты: Людмила Ивановна Смирнова chemlab@ronc.ru

Введение. Работа посвящена поиску новых соединений с высокой избирательностью противоопухолевого действия на опухоли желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в ряду аналогов пептидного гормона гастрина.

Цель исследования — синтез 2 аналогов гастрина, 1 из которых содержит цитотоксическую группу; изучение их цитоток-сической и противоопухолевой активности.

Материалы и методы. Синтез пептидов осуществляли классическими методами пептидной химии. Цитотоксическую активность изучали на культуре клеток линии НСТ116. Противоопухолевую активность аналогов гастрина оценивали на моделях перевиваемых опухолей мышей: аденокарциноме тонкой кишки АКАТОН и аденокарциноме толстой кишки АКАТОЛ. Результаты. Синтезированы 2 аналога гастрина (октапептиды), 1 из которых содержит цитотоксическую группу. Обнаружена цитотоксическая активность аналога гастрина, в химической структуре которого присутствует цитотоксическая группа. Изучена противоопухолевая активность 2 аналогов гастрина на перевиваемых опухолях ЖКТ мышей: АКАТОЛ и АКАТОН. Установлена противоопухолевая активность цитотоксического и нецитотоксического аналогов гастрина на аденокарциноме тонкой кишки АКАТОН: 74 и 84 % торможения роста опухоли соответственно. На аденокарциноме толстой кишки мышей АКАТОЛ исследованные аналоги гастрина противоопухолевого действия не показали. Выводы. Терапевтический эффект 2 аналогов гастрина на аденокарциноме тонкой кишки АКАТОН, вероятно, связан с экспрессией рецепторов гастрина ССК2 в этой опухоли.

Ключевые слова: аналоги гастрина, синтетические пептиды, цитотоксическая активность, противоопухолевая активность

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-3-63-68

SYNTHESIS AND INVESTIGATION OF MODIFIED GASTRIN FRAGMENTS

L.P. Sushinina, A.P. Smirnova, S. V. Ustinkina, L.I. Smirnova, T.A. Sidorova, M.P. Kiseleva, L.M. Borisova, Z.S. Shprakh

N.N. Blokhin National Medical Research Oncology Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia

Background. The purpose of this investigation is the search of new compounds with high selectivity of antitumor action on the tumor of the gastrointestinal tract (GIT) in the series of analogues of the peptide hormone gastrin.

Objective: synthesis of 2 analogues of gastrin, 1 of which contains the cytotoxic group, the study of their cytotoxic and antitumor activity. Materials and methods. Synthesis of peptides was carried out by classical methods of peptide chemistry. Cytotoxic activity was studied on the cell culture HCT116. Antitumor activity of analogues of gastrin were studied on transplanted tumors of the GIT of mice AKATOL and AKATON.

Results. Two analogues of gastrin (octapeptide) were synthesized, 1 of which contains a cytotoxic group. Analogue containing cytotoxic group revealed the cytotoxic activity. Antitumor activity of two analogues of gastrin were studied on transplanted tumors of the GIT of mice AKATOL and AKATON. The cytotoxic and non-cytotoxic analogues of gastrin showed antitumor activity only on AKATON. Inhibition of tumor growth is 74 and 84 %, respectively.

Conclusions. The therapeutic effect of two analogues of gastrin on adenocarcinome AKATON, probably, is associated with the expression of gastrin receptors CCK2 in this tumor.

Key words: gastrin analogues, synthetic peptides, cytotoxic activity, antitumor activity

Введение

Работа направлена на поиск новых соединений в ряду аналогов пептидного гормона гастрина с высокой избирательностью противоопухолевого дей-

ствия на опухоли желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

Актуальность поиска определяется отсутствием в клинической практике препаратов с избирательным

3'2017 том 16 i vol. 16

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY

64 Оригинальные статьи

действием на опухоли ЖКТ, плохо поддающиеся нее продемонстрировано, что такое замещение уве-лекарственной терапии. Открытие рецепторов га- личивает биологическую активность [10, 11]. С-кон-стрина в опухолях ЖКТ также оправдывает направ- цевой фенилаланин оставили без замены, так как ление поиска. показана необходимость его наличия в структуре Биологические эффекты гастрина реализуются лиганда для связывания с рецепторами ССК2 чело-через 2 типа рецепторов, принадлежащих к семейству века [12]. холецистокининовых рецепторов: ССК1 и ССК2, В качестве цитотоксического агента использова-которые идентифицированы и клонированы [1, 2]. ли п-ди (2-хлорэтил) аминофенилуксусную кислоту Рецептор ССК2 взаимодействует с фрагментами гас- (ClPhe). Цитотоксическая группа алкилирующего трина, чем и обусловлен биологический эффект типа п-ди (2-хлорэтиламин) была использована при С-концевых коротких фрагментов гастрина [3]. создании высокоактивных противоопухолевых преданные о том, что гастрин и его аналоги стиму- паратов сарколизин и цифелин [13, 14]. лируют рост нормальных и опухолевых клеток, при- Цитотоксические агенты в силу их гидролитиче-вели к исследованию его роли в развитии опухолей ской неустойчивости включали на последней стадии [4, 5]. Были синтезированы модифицированные синтеза на N-конце, где они не предотвращают вза-С-концевые аналоги гастрина, способные подавлять имодействие пептидного носителя с рецептором индуцированную нативным гастрином секрецию соля- мишени. ной кислоты и проявлять свойства антагонистов га- Синтезированные аналоги гастрина, 1 из кото-стрина [6, 7]. Некоторые антагонисты гастрина были рых содержит цитотоксическую группу, исследованы использованы при лечении рака желудка [7]. Этот на цитотоксическую и противоопухолевую активности. эффект также реализовывался через рецепторы ССК2. Возможно, что высокие избирательность и срод- Материалы и методы ство, характеризующие взаимодействие полипептид- Синтез. Синтез пептидов осуществляли класси-ного гормона с его рецептором, могут быть исполь- ческими методами пептидной химии в условиях, зованы при разработке противоопухолевых лекарств сводящих возможность рацемизации отдельных ами-при условии, что опухоли-мишени содержат рецеп- нокислот к минимуму. Ключевые стадии стыковки торы этого гормона. При этом цитотоксические фрагментов осуществляли азидным методом. При агенты могут конъюгироваться с пептидом. Этот синтезе фрагментов использовали метод смешанных подход был использован для получения цитотокси- ангидридов и метод активированных эфиров. ческих аналогов пептидных гормонов люлиберина Выбор защитных групп определялся требованием и соматостатина [8]. сведения к минимуму нежелательных побочных ре-Адресная доставка цитотоксических агентов акций при удалении №-защитных группировок на прок опухолям и метастазам при помощи различных межуточных стадиях синтеза. носителей позволяет увеличивать их дозу, снижать Для защиты а-аминогрупп на всех стадиях син-токсичность и улучшать результаты лечения [9]. теза применяли трет-бутилоксикарбонильную группу Нативный гастрин имеет в своем составе 17 ами- (Вос). Карбоксильные группы С-концевых амино-нокислот: кислотных остатков фрагментов (11—13) защищали этерификацией (метиловые эфиры). Для защиты ре-1 2 3 4 5 6-10 11 12 13 14 15 16 17 акционноспособных групп в боковых цепях трифунк-Pyr-Gly-Pro-Trp-Met-(Glu)5-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 циональных аминокислот использовали бензильную защиту (Bzl) гидроксильной группы в остатке Tyr12 Наименьшим фрагментом, сохраняющим специ- и b-карбоксила в остатке Asp16. фическую активность молекулы гастрина, является Для удаления бензильных защитных групп боко-С-концевой тетрапептид с последовательностью вых цепей тирозина и аспарагиновой кислоты ис-14—17. Сродство к рецепторам аналогов гастрина пользовали метод каталитического гидрогенолиза увеличивается по мере удлинения аминокислотной в присутствии палладиевой черни. Трет-бутилокси-последовательности. Мы остановили свой выбор карбонильную группу удаляли ацидолизом [14]. на последовательности гастрина 10—17 с целью ее Для очистки и выделения защищенных пептидов модификации и дальнейшего использования в каче- использовали колоночную хроматографию на сили-стве носителя цитотоксической группы. кагеле. Нативные фрагменты С-концевого гастрина мо- Для тонкослойной хроматографии пептидов дифицировали следующим образом: Met15 заменили применяли пластинки с тонким слоем силикагеля, на Leu15 для предотвращения окисления, а Gly13 используя следующие системы растворителей: хло-на Pro13 для стабилизации конформации, которая роформ—метанол (5:2); н-бутанол—уксусная кисло-предпочтительна для рецепторов ССК2, так как ра- та—вода (4:1:1).

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 3'2017 том 16 |vol. 16

Оригинальные статьи 65

Температуру плавления определяли на анализа- Оценку противоопухолевой активности синтези-торе температуры плавления с цифровым термоме- рованных аналогов гастрина проводили на моделях тром (Sanyo Gallenkamp, Япония). перевиваемых опухолей мышей: аденокарциноме Удельное вращение измеряли на поляриметре тонкой кишки АКАТОН и аденокарциноме толстой Unipol L (Schmidt + Haensch, Германия). кишки АКАТОЛ. Опухоль АКАТОЛ выбрана в качестве Чистоту полученных соединений и содержание модели сравнения, так как предполагается, что в этой примесей определяли методом высокоэффективной опухоли рецепторов гастрина ССК2, через которые жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматогра- работают аналоги гастрина, недостаточно или они от-фе Shimadzu. Колонка: Reprosil-Pur Basic C18, 5 мкм, сутствуют. Известно, что рецепторы к гастрину имеют-250 х 4,6 мм. Условия: линейный градиент AB — 5 % B ся в тонкой кишке и поджелудочной железе [15]. (0 мин) — 100 % B (20 мин). A — 0,01 % трифтор- АКАТОЛ и АКАТОН трансплантировали живот-уксусная кислота в воде, B — 0,01 % трифторуксусная ным подкожно по стандартной методике. При перекислота в ацетонитриле. вивке опухолевую ткань измельчали ножницами Цитотоксическая активность. Вещества растворя- до гомогенной консистенции, добавляли среду 199 ли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (100 %), концент- до соотношения 1:10 и 0,5 мл полученной суспензии рация веществ в исходных растворах была 5 х 10-33 М. (около 50 мг опухолевых клеток) вводили подкожно Для тестирования цитотоксической активности в область правой подмышечной впадины. Лечение использовали культуру клеток аденокарциномы ки- начинали через 48 ч после трансплантации опухоли шечника человека линии НСТ116, в которых, соглас- [16, 17]. но данным литературы, экспрессируются рецепторы ПГ-132 и ПГ-131 растворяли в ДМСО и разводи-гастрина. Для определения цитотоксической актив- ли физиологическим раствором до 10 % концентра-ности исследуемых веществ использовали МТТ-тест. ции ДМСО. В качестве количественного критерия цитотоксич- Синтезированные аналоги гастрина изучали при ности тестируемых препаратов был использован ежедневном подкожном введении в течение 5 дней. индекс IC50 — концентрация соединений, вызываю- Аналог ПГ-132, содержащий цитотоксическую группу щая гибель 50 % клеток в течение 72—96 ч инкуба- (хлорфенацил), исследовали в дозах 5, 10 и 20 мг/кг. ции. За 100 % принимали выживаемость клеток, Нецитотоксический аналог ПГ-131 вводили в дозах инкубированных без препаратов (контроль). 3,9; 7,9 и 15,8 мг/кг, эквимолярных дозам ПГ-132 Противоопухолевая активность. Исследование по содержанию аминокислот. противоопухолевой активности аналогов гастрина Противоопухолевый эффект во всех исследова-проводили на мышах-самках линии ВАЬВ/с массой ниях оценивали по следующим критериям: торможе-18—20 г, полученных из разведения эксперименталь- ние роста опухоли (ТРО, %) и увеличение продолжи-но-биологической лаборатории (вивария) НМИЦ тельности жизни (УПЖ, %) леченых животных по онкологии им. Н.Н. Блохина. Все животные были сравнению с контрольными. здоровы, имели ветеринарный сертификат качества ТРО вычисляли по формуле о состоянии здоровья. Мышей содержали в специальных просторных ТРО = (V, — VQ) / V х 100 %, клетках по 5 особей при температуре воздуха 20—23 °С и относительной влажности 60—65 % в условиях где V, и Vq — средний объем опухолей (мм3) в конт-естественного освещения и принудительной вен- рольной и опытной группах соответственно. тиляции на подстилке из древесных стружек, сте- УПЖ вычисляли по формуле рилизованных в сухожаровом шкафу. Для кормления животных использовали стандартный промышлен- УПЖ = (СПЖо — СПЖк) / СПЖк х 100 %, ный и сертифицированный брикетированный корм для грызунов с установленным сроком год- где СПЖк и СПЖо — средняя продолжительность жиз-ности. Кормление проводили в одно и то же время. ни животных (дни) в контрольной и опытной группах Сырую питьевую воду, помещенную в закрытые соответственно. поилки, мыши получали в неограниченном коли- Минимальные критерии активности — ТРО >50 %, честве. Для питья использовали поилки на 250 мл УПЖ >25 % [16, 17]. с конической пробкой из нержавеющей стали с от- Полученные данные обрабатывали статистиче-верстием в центре. ски с использованием доверительных интервалов Перед лечением мышей распределяли по груп- средних сравниваемых величин по стандартному пам. Число животных в контрольной группе состав- методу Стьюдента. Для оценки достоверности раз-ляло 10, в опытных группах было по 8 мышей. На- личий определяли t-критерий, значимыми считали блюдение за животными проводили до их гибели. различия приp <0,05.

3'2017 том 16 | vol. 16 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL 0F BiOTHERAPY

Результаты и обсуждение

Синтез пептидов осуществляли классическими методами пептидной химии по схеме, представленной на рисунке.

При синтезе фрагментов (10—13) и (14—17) использовали метод ступенчатого наращивания пептидной цепи на 1 аминокислотный остаток методом смешанных ангидридов. При синтезе фрагмента (10—13) исходными веществами являлись метиловый эфир пролина, п-нитрофениловый эфир №-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил-тирозина и №-трет-бутилоксикарбонил-аланин. Полученный защищенный фрагмент (I) далее превращали в защищенный тетрапептидгидразид (II).

При синтезе фрагмента (14—17) исходными веществами были амид фенилаланина, №-трет-бу-тилоксикарбонил-р-бензил-аспарагиновая кислота, №-трет-бутилоксикарбонил-лейцин и №-трет-бутилоксикарбонил-триптофан. Путем постепенного наращивания пептидной цепи, начиная с амида фенил-аланина, методом смешанных ангидридов получили тетрапептид (III).

В результате азидной конденсации защищенных тетрапептидов (II и III) получили защищенный ок-тапептид (IV). Очистку пептида проводили с использованием колоночной хроматографии на силикагеле. Выделенный после очистки октапептид подвергали удалению защитных групп каталитическим гидрированием.

Присутствие остатка триптофана в положении 14 в пептидах также наложило определенные ограничения на условия удаления защитных групп каталитическим гидрированием. В результате исследований подобраны условия для удаления бензильных групп тирозина и аспарагиновой кислоты. Защищенный пептид (IV) подвергали каталитическому гидрированию в присутствии палладиевой черни в растворе диметилформамида (ДМФА) в течение 4 ч. Выделение синтезированных пептидов после гидрирования проводили концентрированием растворов в вакууме.

В результате получили октапептид со свободными функциональными группами (V) — амид глутамил-аланилтирозилпролилтриптофиллейциласпартил-фенилаланина

Ии

Ъ Ъ

ъ ъ н

А1а

С1РИе-

С1РИе-

Вос -

Вос  Вг1

- он н

- Вг1

Вг1

Вг1

Вг1

Вос Вос

онн

Туг Вг1

он н

Рго

Тгр

Ьеи

АБр

РИе

II

-Вг1

• Вг1

Вг1

Вг1

Вг1

- ОСНз

- ОСНз оС нз

- ОСНз

" ОСНз Вос

ОС нз Вос

_ №Нз Н IV

V

VI

VII

Вос Вос - ОН Н

Вос Вос ОН Н

/

ОН Н

III

10 11 12 13 14 15 16 17

Схема синтеза аналогов гастрина. ClPhe — хлорфенацил

/

Вг1

Вг1

Вг1

Вг1

/

/

Вг1

Вг1

Вг1

№ МН2 Ш2 КН 2 МН2 КН 2 КН2 КН2

I

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN J0URNAL 0Р BI0THERAPY

3'2017 том 16 | voL. 16

Оригинальные статьи 67

H-Glu-Ala-Tyr-Pro-Trp-Leu-Asp-Phe-NH2 (ПГ-131),

Rf 0,2 (хлороформ—метанол (5:2)); Rf 0,75 (бутанол— уксусная кислота—вода (4:1:1)); [а]с — 32° (С = 1, ДМФА); содержание основного вещества 97,0 % (ВЭЖХ).

Цитотоксический аналог гастрина получили по аналогичной схеме.

В результате азидной конденсации защищенного тетрапептида QPhe-Glu(Bzl)-Ala-Tyr(Bzl)-Pro-N2H3 и ранее синтезированного тетрапептида (III) был получен защищенный октапептид с цитотоксической группой на Оконце (VI).

Пептид (VI) подвергали каталитическому гидрированию в присутствии палладиевой черни в растворе ДМФА в течение 4 ч. Полученный пептид подвергали очистке на колонке с силикагелем в градиенте хлороформ—метанол. В результате получен цитоток-сический аналог гастрина со свободными функциональными группами (VII) — амид п-ди(2-хлорэтил) аминофенилацетилглутамилаланилтирозилпролил-триптофиллейциласпартилфенилаланила

aPhe-Glu-Ala-Tyr-Pro-Tl•p-Leu-Asp-Phe-NH2 (ПГ-132),

C64H79Cl2N 11O14

ской структуре которого присутствует цитотоксиче-ская группа, оказался активным.

Противоопухолевая активность. Сравнительную оценку противоопухолевой активности синтезированных аналогов гастрина проводили на перевиваемых опухолях ЖКТ мышей АКАТОЛ и АКАТОН, обладающих разным рецепторным статусом к аналогам гастрина.

Данные, представленные в табл. 1, показывают, что оба аналога гастрина оказались неэффективными на аденокарциноме толстой кишки мышей АКАТОЛ, что связано с недостаточным количеством рецепторов гастрина ССК2 в этой опухоли.

Изучение действия аналогов гастрина было продолжено на аденокарциноме тонкой кишки мышей АКАТОН, экспрессирующей рецепторы к гастрину. Как видно из табл. 2, оба аналога гастрина (ПГ-132

Таблица 1. Противоопухолевая активность аналогов гастрина на аденокарциноме толстой кишки мышей АКАТОЛ

вычислено, %: Cl 5,47; найдено, %: Cl 6,1; Rf 0,12 (хлороформ—метанол (5:2)); Rf 0,65 (бутанол—уксусная кислота—вода (4:1:1)); содержание основного вещества 96,0 % (ВЭЖХ).

Цитотоксическая активность. В предварительных экспериментах была выбрана величина исходной плотности посева клеток аденокарциномы человека линии НСТ116, позволяющая культивировать их в течение 72—96 ч в 96-луночных планшетах. Такому критерию соответствовала плотность посева 3 х 103 клеток/100 мкл среды/лунку. При исследовании цитотоксической активности веществ ПГ-131 и ПГ-132 было выявлено, что пролиферативная активность клеток аденокарциномы человека линии НСТ116 изменяется при их длительной инкубации (96 ч) с аналогами гастрина. При этом активность аналога, содержащего цитотоксическую группу (ПГ-132), была выше. При максимально возможной в экспериментах in vitro концентрации веществ (5 х 10-5 М) из-за их умеренной растворимости в среде жизнеспособность клеток в присутствии ПГ-132 снижалась на 40 %, в этих же условиях в присутствии ПГ-131 рост клеток замедлялся лишь на 15 %. Снижение концентрации сыворотки в среде инкубации до 1 % не повлияло на цитотоксическую активность исследуемых веществ.

Таким образом, исследование цитотоксической активности аналогов гастрина ПГ-131 и ПГ-132 на культуре клеток аденокарциномы кишечника человека линии НСТ116 показало, что аналог, в химиче-

*Доза 3,9 мг/кг эквимолярна дозе 5мг/кг по содержанию аминокислот;

**знак «+» означает стимуляцию роста опухоли.

Таблица 2. Противоопухолевая активность аналогов гастрина на аденокарциноме тонкой кишки мышей АКАТОН

Аналог гастрина Доза, мг/кг дни введения ТРО, %, после окончания лечения

1-й день 7-й день 10-й день 16-й день

5 2-6 3 8 7 7

ПГ-132 10 2-6 12 22 4 +7

20 2-6 +27** 10 4 +11

3,9* 2-6 + 13 14 0 8

ПГ-131 7,9 2-6 31 6 +4 +11

15,8 2-6 + 14 21 14 12

Аналог гастрина Доза, мг/кг Дни введения ТРО, %, после окончания лечения УПЖ, %

1-й день 7-й день 11-й день

5 2-6 74* 27 3 13

ПГ-132 10 2-6 60* 18 5 18

20 2-6 70* 23 3 13

3,9* 2-6 84* 39 12 22

ПГ-131 7,9 2-6 34 26 7 8

15,8 2-6 69* 18 12 14

*р <0,05 по отношению к контролю.

3'2017 том 16 | vol. 16

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY

и ПГ-131) проявили максимальный противоопухолевый эффект сразу после окончания лечения в наименьших дозах — 5 и 3,9 мг/кг соответственно. При этом для ПГ-132 ТРО составило 74 %, а для ПГ-131 - 84 %. Зависимости противоопухолевого эффекта от величины введенной дозы не отмечалось.

При наблюдении за мышами во всех опытных группах в указанные сроки гибели животных не отмечалось.

Заключение

Классическими методами пептидной химии синтезированы 2 модифицированных аналога гастрина (октапептиды), 1 из которых содержит цитотоксиче-скую группу, представленную хлорфенацилом.

Показана цитотоксическая активность аналога гастрина ПГ-132, в химической структуре которого присутствует цитотоксическая группа, на культуре клеток аденокарциномы кишечника человека линии НСТ116.

Установлена противоопухолевая активность цито-токсического (ПГ-132) и нецитотоксического (ПГ-131) аналогов гастрина на опухоли АКАТОН в дозах 5 и 3,9 мг/кг соответственно при ежедневном подкожном введении в течение 5 дней. ТРО непосредственно после окончания лечения составляло 74 и 84 % соответственно.

Аналоги гастрина ПГ-132 и ПГ-131 не обнаружили противоопухолевого действия на аденокарциноме толстой кишки мышей АКАТОЛ при аналогичных дозах, режиме и способе введения.

Вывод

Противоопухолевая активность представленных аналогов гастрина ПГ-132 и ПГ-131 определяется, вероятно, их действием на рецепторы гастрина ССК2, которые экспрессированы только в опухолевых клетках аденокарциномы тонкой кишки мышей АКАТОН, и не зависит от наличия или отсутствия в химической структуре цитотоксической группы.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Lee Y.M., Beinborn M., McBride E.W. et al. The human brain cholecysto-kinin-B/gastrin receptor. Cloning and characterization. J Biol Chem 1993;268(11):8164-9.

PMID: 7681836.

2. Wank S.A., Harkins R., Jensen R.T. et al. Purification, molecular cloning and functional expression of the cholecysto-kinin receptor from rat pat pancreas. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89(7):3125-9. PMID: 1313582.

3. Ahmed S., Budai B., Heredi-Szabo K. et al. High and low affinity receptors mediate growth effects of gastrin and gastrin-Gly on DLD-1 human colonic carcinoma cells. FEBS Lett 2004; 556(1-3):199-203. PMID: 14706850.

4. Rehfeld J. Gastrin and colorectal cancer: a never-ending dispute? Gastroenterology 1995;108(4):1307-10. PMID: 7698599.

5. Watson S., Durrant L., Morris D. Gastrin: growth enhancing effects

on human gastric and colonic tumour cells. Br J Cancer 1989;59(4):554-8. PMID: 2713241.

6. Methods in Molecular Biology. Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols. Ed. by

M.W. Dunn. Totowa, N.J.: Humana Press Inc., 1994. Pp. 1-73.

7. Martinez J., Rodriguez M., Bali J., Laur J. Phenylethylamide derivatives

of the C-terminal tetrapeptide of gastrin. J Med Chem 1986;29(11):220-7. PMID: 3818170.

8. Schally A.V., Nagy A. Cancer chemotherapy based on targeting

of cytotoxic peptide conjugates to their receptors on tumors. Eur J Endocrinol 1999;141(1):1-14. PMID: 10407215.

9. Magrath I.T. Targeted approaches to cancer therapy. Int J Cancer 1994;56(2):163-6. PMID: 7906250.

10. Morley J.S. Inhibitory effects of some amino acid. Proc R Soc Lond B 1968;170:97.

11. Wunsch E., Moroder L., Gohring W. et al. Synthesis of human des-tryptophan-1, norleucine-12-minigastrin-II and its biological activities. FEBS Lett 1986;206(2):203-7. PMID: 3758347.

12. Ahmed S.I., Wibowo F., Gembitsky D.S. et al. Importance of the C-terminal phenylalanine of gastrin for binding

to the human CCK (2) receptor.

J Pept Res 2001;58(4):332-7. PMID: 11606218.

13. Оборотова Н.А., Смирнова Л.И., Круглова Г.В. и др. Средство для лечения миеломной болезни. Патент РФ № 2066183. 1996.

14. Хайдуков Е.Я., Оборотова Н.А., Смирнова Л.И. и др. Способ получения сарколизина для внутривенных инъекций. Патент РФ № 2060031. 1996.

15. Немцов Л.М. Патофизиологическое и клинико-диагностическое значение холецистокинина при билиарной патологии. Обзор. Вестник ВГМУ 2014;13(4):11-20.

16. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова и др. М.: Гриф и К, 2012. С. 642-57.

17. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США.

М.: Медицина, 1980. С. 71-112.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY

3'2017 том 16 | vol. 16