Кинетика клеточной популяции кишечного эпителия

УДК 502.211+576.538+611.341

Вестник СЛ16ГУ. Сер. 10, 2006, вып. 1

И. Б. Токин, М. В. Толстая, Г. Ф. Филимонова

КИНЕТИКА КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ КИШЕЧНОГО ЭПИТЕЛИЯ

1. Введение. Проблемы регуляции клеточного деления и тканевого роста чрезвычайно важны для теории и практики биологии и медицины. В начале 1970-х годов были выяснены основные этапы структурной реорганизации клегок и тканей при репарации пострадиационных повреждений и проведена компартментализация процессов повреждения и восстановления, учитывающая процессы дедифференцировки, репара-тивного и митотического биосинтеза [1]. Различные аспекты этой проблемы отражены в монографии И. Б. Токина [2].

Большое внимание многими исследователями было уделено изучению клеточной пролиферации, оно стимулировалось также тем, что потеря контроля над процессом деления ведет к злокачественному росту. Для исследования сложных регуляторных механизмов поддержания тканевого гомеостаза прекрасной моделью является кишечный эпителий, относящийся к быстро обновляющимся тканевым системам; он интересен как пример клеточной популяции, самообновляющейся на основе общего предшественника - стволовой клетки. Кроме того, клеточная популяция эпителия тонкой кишки обладает мощными механизмами защиты от негативных воздействий. К ним относятся: задержка клеточного деления (митоза), дающая время для репарации повреждений в клетках; компенсация погибших клеток в ткани благодаря пролиферации; изменение механизма дифференцирования клеток, направленное на скорейшее восстановление популяции стволовых клегок; увеличение численности клеток, проявляющих клоноген-ные свойства [3, 4]. Наряду с программой, регулирующей клегочное деление, действуег также программа, реализация которой при определенных условиях приводит клетку к гибели - апоптозу. В криптах эпителия тонкой кишки обнаружены две формы апоп-тоза: спонтанный апоптоз в интактных клетках здоровых особей и апоптоз, вызванный повреждениями [5]. В обоих случаях он гарантирует элиминацию из эпителия крипты тонкой кишки избыточных либо генетически поврежденных клеток. Открытие феномена апоптоза имело исключительное значение для теории клеточных популяций, так как ему принадлежит ключевая роль в поддержании клеточного гомеостаза (steady state), нарушение которого лежит в основе различных патологических процессов, развивающихся при радиационных поражениях и онкогенезе.

Кишечный эпителий - тканевая система, обладающая свойствами самовосстановления и выхода в стационарное состояние при возмущениях, т. е. свойством целостности и устойчивого самосохранения. Структура и функции кишечного эпителия детально изучены. Установлены, в частности, как общая численность клеток в системе «крипта - ворсинка», так и количественные соотношения различных типов энтероци-тов. Определена продолжительность митогического цикла и выявлено 60 основных позиций, соответствующих уровню дифференцированное™ стволовых и столбчатых клеток. Подсчитана продукция главных линий клеточных элементов кишечного эпителия, развивающихся из стволовых клеток. Наконец, известны физические параметры различных позиций крипты [5—11]. Эти обстоятельства облегчают интерпретацию экспериментальных данных и делают возможным математическое моделирование. Одну

© И. Б. Токин, М. В. Толстая, Г. Ф. Филимонова, 2006

из первых моделей предложили Ренехэн, Бут и Поттен [12]. Позднее она была существенно модифицирована [13] за счет введения обратной связи между ворсинкой и криптой, осуществляемой кейлоном (вещество, выделяемое функциональными и зрелыми клетками и препятствующее делению стволовых клеток и клеток крипты), и учета механизма контроля размеров популяции стволовых клеток, действующих на уровне клеток, которые расположены в непосредственной близости. Основные различия между моделями связаны с неодинаковыми представлениями исследователей о механизмах регуляции клеточной динамики и роли отдельных клеточных субпоиуляций. Созданные модели обычно ограничиваются регулированием процессов клегочной динамики на уровне либо стволовых клеток, либо зрелых. Применение математического моделирования для разработки теории клеточных популяций подробно рассмотрено в работе [14].

В качестве повреждающего агента чаще всего использовали ионизирующее излучение, однако, несмотря на многочисленные радиобиологические исследования, механизмы, вовлеченные в процесс регенерации после лучевого повреждения, остаются не до конца выясненными.

Цели данной работы - создание и исследование математической модели кинетики кишечного эпителия в пертурбационном состоянии, а также моделирование постради-ационнох о восстановления этой системы.

2. Модель репарации клеточной популяции эпителия. 2.1. Построение модели. При построении модели репарации клеточной популяции эпителия крипты и ворсинки тонкой кишки после острого 7-облучения было рассмотрено действие низких (0—0,5 Гр) и средних (0,5—9 Гр) доз облучения, не приводящих к массовой стерилизации крипт [8, 9, 11]. Примем, что облучение происходит в нулевой момент времени и длительность облучения —> 0. Облучение приводит к гибели только стволовых, транзитных и панетовских клеток. После облучения жизнеспособные клетки всех субпопуляций, кроме зрелых клеток крипты и клеток ворсинки, делятся на два типа: клетки, неповрежденные облучением или способные к нормальной жизнедеятельности после репарации; клетки, теряющие способность к нормальной жизнедеятельности и погибающие в течение суток. Введем следующие обозначения.

Среднее число клеток, находящихся в момент времени в г-й субпопуляции, - А^.

Жизнеспособные клетки, участвующие в процессе обновления эпител'ия: N1 -среднее число стволовых клеток (5); N2 - среднее число панетовских клеток (Р); ЛГ3-Nб - среднее число транзитных клеток 1-4-го поколений соответственно (Т1-Т4); 1\Т7 -среднее число зрелых клеток крипты (М); А« - среднее число клеток ворсинки (У).

Нежизнеспособные клетки, не участвующие в процессе обновления эпителия: Дг9 - среднее число потенциальных апоптических клеток, проявляющих как спонтанный, так и вызванный облучением апоптоз; N10 - среднее число апоптических 5-клеток; Мц-Ыха - поврежденные облучением 5-, Р-, Т1-, Т2-, Т3- и Г4-клегки соответственно; N17 - некротические клетки.

Введем понятие «интенсивность перехода клеток» для характеристики доли клеток субпопуляции, переходящих в другую субпопуляцию за единицу времени в процессе жизнедеятельности клеточной популяции, т. е. части клеток множества А^, которая переходит во множество Nj в процессе функционирования системы. Примем такие обозначения: с*1 - интенсивность самообновления 5-клеток; а2~оц - интенсивности переходов 5-клеток в субпопуляции Р-, Т1~ и потенциальных апоптических клеток

Жизнеспособные клетки

Погибающие клетки

Рис. 1. Блок-схема кинетики клеточной популяции в пертурбационном состоянии.

соответственно; (3\ - интенсивность самообновления субпопуляции Т1, а /32 ~ интенсивность перехода Т1-клеток в субпопуляцию Т2; </э, ри'ф - интенсивности деления Т2-Т4-клеток соответственно; я - интенсивность дегенерации Р-клеток; и\ - интенсивность проявления апоптоза потенциальными апоптическими клетками; х ~ интенсивность перехода М-клеток на ворсинку; 5 - интенсивность удаления клеток с ворсинки; г^ — -интенсивности проявления признаков некроза поврежденными клетками соответствующих субпопуляций; ш, т] - интенсивности удаления апоптических и дегенеративных клеток; Ь - количество крипт, участвующих в обновлении эпителия одной ворсинки.

Схема модели представлена на рис. 1.

Математическая модель описывается нелинейной системой дифференциальных уравнений 17-го порядка вида

' йЫх/м = е3{г, А ]У8)(2(75(лг1) - 7£?) - ад,

<Ш2/<И = 2о2(<,Д - (1/Т2)^2,

Шз/Л = 2а3(г, АЛ^Л^Лда Д ^8)(2г1(ЛГ1) - 1)7У3,

¿ЛГ4/<Й = 2/?2(*, £>, - Г>)ЛГ4,

ад/л = 2 - 5,

ад/<Й = 2р

ад/Л = 0, 5хЬЛГ7 - ад, ад/<& = 2а4(«,Г',]У1,ЛГ8)лг1 - ^ЛГв,

<гЛГю/Л = //1ЛГ9 - и;ЛГ10,

ад/<й = г = 11, • • • , 16,

_ 16 ¿Л^/Л - (1/Г2)^2 + £ ^ - П ^17. ¿=11

Коэффициент 2 в правых частях 2—7 и 9 уравнений системы (1) отражает факт образования двух новых клеток при делении одной клетки. В 8-м уравнении коэффициент 0,5 показывает, что клетки из крипты переходят на две ворсинки.

Введем обозначения: Ni - среднее количество клеток г-й субпопуляции в устойчивом состоянии; Т,(г = 1, • - • ,6) - длительность клеточного цикла г-й субпопуляции; Т8 - длительность транзита клетки от основания ворсинки до ее вершины в условиях отсутствия негативного внешнего воздействия.

2.2. Коэффициенты модели, отражающие изменение динамики клеток в пертурбационном состоянии.

2.2.1. Митотическая задержка. Отсутствие деления клеток во время митотической задержки для г-й субпопуляции вводится выражением

a{t - T3adep0ICKU(D)) = a(t - ai exp(-bD)D) = a{t - tzx{D)D),

где Тза()ерэкки— длительность митотической задержки; tZi(D) - коэффициент пропорциональности; а - начальный уровень коэффициента пропорциональности; Ь - положительная константа;

0, если х ^ 0;

1, в других случаях.

а(х) =

2.2.2. Интенсивности переходов S- и Т1-к леток. Интенсивности переходов ¿'-клеток представляют собой произведение скорости деления S-клеток (величина, обратно пропорциональная длительности клеточного цикла) на долю дочерних клеток, переходящих в соответствующую субпопуляцию. Аналогично рассматриваются и интенсивности переходов из блока Т1.

Скорость деления S- и Т1-клеток. При определении длительности клеточного цикла 5- и П-клеток использовалось предположение о двойном механизме регулирования: на уровне стволовых клеток и на уровне клеток ворсинки. Для скорости деления 5-клеток (вs (t, D, N\,N8)) введем данное предположение следующей зависимостью: es(t, D,NuNa) = ait - tzx(D)D) щ^щ =

a(t — tzi(D)D)—^, если T, (j^)* exp (fi(N8/N8 - 1)) ^

*(t-tzAD)D)T-Uxp(NJNs/-8_i)y в других случаях.

Аналогичная зависимость использована и для скорости деления Т1-клеток: 9T1(t, D,Ni,Ng) — a(t - tzz{D)D)T3{N\ Ns) =

( a(t-tz3(D)D)^1r, если T3 exp (p(N8/N8 - 1)) ^ T3mi<\

\ ^(i-^PJilprJ^, в других случаях,

где Т"пп и Тз"ш - минимально возможная длительность клеточных циклов S- и Т1-кле-ток соответственно; ц - положительная константа.

Распределение дочерних стволовых клеток. На распределение дочерних стволовых клеток оказывает влияние численность S- и Т1-клеток. На основании этого положения определим доли дочерних стволовых клеток, переходящих в ту или иную субпопуляцию.

Доля дочерних стволовых клеток, остающихся в субпопуляции S-клеток (75):

7s ТО =

7™аХ! если «(1-^)+0>5 + 7вр>7§»«>

+ 7ар' в других случаях, здесь 5 - коэффициент чувствительности, 7™ах - максимально допустимая доля дочерних клеток, остающихся стволовыми.

Доля дочерних стволовых клеток, дифференцирующихся в панетовские (7р):

1P(N3) - <

7р"\ . если £ ^ 1,

7™ах, если 7™5п + «я ~ 1) ^ 7рах,

7рш + зр - , в других случаях,

где вр - коэффициент чувствительности; 7рш - обычный для необлученной крипты уровень (7р); 7р^* - максимально допустимая доля дочерних клеток, дифференцирующихся в Р-клетки (7рах ^ 1 — 7™ах).

Доля дочерних стволовых клеток, дифференцирующихся в транзитные (7x1): значение (77т) в зависимости от значения вектора переменных N в каждый момент времени £ будет 7т1(^1, N3) = 1 - 75(^1) - 7_р(Лг3).

Доля дочерних стволовых клеток, имеющих какие-либо повреждения (потенциальные апоптические клетки) (7ар) сохраняет постоянное значение.

Итоговые интенсивности переходов клеток из субпопуляции 5-клеток будут иметь вид

а3(«, Д N3, ТУ8) = М*, А ^ь ^8)7т1(ЛГг, 7У3),

Распределение клеток, образующихся в результате деления Т1-клеток.

Доля дочерних клеток, остающихся в субпопуляции Т1, определяется зависимостью

2i(iV:) =

О, если Sri ( 1 - ) ^ О,

Z!max, если srx (1 - f-

ST1 (l - j^j, в других случаях, в которой S74 - коэффициент чувствительности; ,г™ах - максимально допустимое значение zi(Ni).

Долю дочерних клеток, переходящих в субпопуляцию Т2, получаем из равенства Z2 (iVi) = 1 — ^i(iVi). Итоговые интенсивности переходов из субпопуляции Т1 представлены в виде уравнений

ßl(t,D,Nl7NB) = eT1(t,D,N1,Ns)zi{N1), ß2{t,D,NuN8) = eTi{t,D,N1,Ns){l-z1(N1)).

2.2.3. Интенсивности переходов транзитных клеток 2-4-г о поколений. При определении интенсивностей переходов транзитных клеток 2—4-го поколений учтены митотическая задержка и длительность клеточного цикла соответствующих субпопуляций:

<p(t,D)=a(t-tZ4(D))/Ti, p(t,D)=*(t-tz6(D))/T6, if,(t,D) = a(t-tz6(D))/Te.

2.2.4. Интенсивности переходах, х, ш, т] считаем постоян-

ными, независимыми от времени и вектора переменных величинами, принадлежащими интервалу [0, 1].

3. Результаты и обсуждение. На основе кинетического подхода с применением аппарата дифференциальных уравнений была построена модель дозово-временной зависимости динамики клеточной популяции эпителия тонкой кишки, описываемая нелинейной системой дифференциальных уравнений 17-го порядка с кусочно-непрерывными коэффициентами.

В отличие от большинства предлагавшихся ранее моделей, включавших лишь один из механизмов обратной связи между клетками популяции разных типов, в построенной модели изучены два механизма - регуляция на уровне стволовых клеток и регуляция на уровне зрелых клеток, что дает лучшее соответствие экспериментальным кривым. Кроме того, учтено наличие в криптах тонкой кишки клоногенных клеток - транзитные клетки 1-го поколения рассматриваются как клетки, способные проявлять клоногенные способности при больших снижениях численности популяции. Принято также во внимание отсутствие клеточного пополнения во время митотической задержки делящихся клеток при продолжающейся миграции зрелых клеток.

При решении системы (1) использовали вектор начальных условий, имеющий следующий вид:

= к? = здхда (¿ = 2,--11б),

N« = N1, N$ = N8, N$ = 1(0)^+1^, Л^о = N10, ,,

7У? = (1 (г = 12, • • • , 16), N?7=N17,

где -/V? = N{(1 — 0); £¿(.0) - доля клеток г-й субпопуляции, выживающих после облучения дозой Б] — доля неподверженных некрозу стволовых клеток; 1(Б) - доля стволовых клеток, проявляющих апоптоз, инициированный облучением.

Подбор вектора начальных условий (2) модели облученной популяции произведен на основании выбора статистической модели выживаемости облученных клеток, наилучшим образом аппроксимирующей экспериментальную кривую. На соответствие проверялись модели многих одноударных мишеней, линейно-квадратичная модель и двухкомпонентная модель. Наилучшую аппроксимацию экспериментальной кривой получили, минимизируя функционал правдоподобия по векторам соответствующих каждой модели параметров. Кроме того, при подборе вектора начальных условий было использовано предположение о связи длительности митотической задержки и выживаемости клеток. Полагаем, что выживаемость клеток двух разных субпопуляций при одинаковой длительности митотической задержки, одинакова, т. е. если тэадерЖКи^в^ = цадержкир^ т() = 52(Д2); ЗДвСЬ $(£>,")- ВЫЖИВаеМОСТЬ

клеток г-й субпопуляции при облучении дозой Бг Модель дает возможность заложения в векторе начальных условий индивидуальных особенностей организма на момент облучения. Физические параметры модели идентифицированы на примере экспериментальных данных для стандартной лабораторной ВБИ мыши в возрасте 12—14 недель [7, 8, 11]. Значения большинства параметров модели получены из независимых измерений или предположений. Для оставшихся неопределенными параметров модели (А4) 7Гх, 7™ах5б'п) решали задачу идентификации параметров: определение неизвестных параметров модели по имеющимся экспериментальным соотношениям. Задача идентификации при этом формулируется как задача поиска минимума функционала

Доля клеток от

Рис. 2. Сравнение экспериментальных данных (1) [7, 8] и результатов моделирования при оптимизированном векторе параметров £ (2) для пролиферирующих (а) и функциональных (б) клеток крипты после облучения в дозе 9 Гр.

правдоподобия определяемого простой дифференциальной подзадачей для сис-

темы уравнений модели.

Для решения задачи минимизации <?(£) использовался метод вращения осей Розен-брока (модифицированный метод покоординатного спуска); при подборе параметров модели рассматривались шесть временных экспериментальных кривых поведения клеточной популяции после облучения на временном промежутке [0, 120] ч с шагом 1 ч. Модель показывает хорошее соответствие экспериментальным данным в дозовом интервале от 0 до 9 Гр. Результаты сравнения двух из шести использованных кривых экспериментальных данных и соответствующих модельных кривых для оптимального вектора параметров £ показаны на рис. 2 и 3.

Построенная модель дает возможность проследить дозово-временную динамику как

Доля клеток от контр, значения

24 48 72 96 120

Время после облучения, ч

Рис. 3. Сравнение экспериментальных данных (1) [7, 8] и результатов моделирования при оптимизированном векторе параметров £ (2) для панетовских клеток (а) и клеток ворсинки (б) клеток крипты после облучения в дозе 9 и 8 Гр соответственно.

жизнеспособных клеток различных субпопуляций, так и апоптических и некротических клеток.

Асимптотическая устойчивость ненулевого положения равновесия системы (1), доказанная при проведении качественного исследования модели, позволяет сделать вывод о полном восстановлении популяции до нормального состояния после действия низких (0—0,5 Гр) и средних (0,5—9 Гр) доз облучения, не приводящих к массовой стерилизации крипт. На рис. 4 в качестве примера представлена зависимость числа стволовых клеток от дозы облучения и времени после облучения, полученная методом Рунге-Кутта с помощью математического пакета Mathcad 2003 Professional. На рисунке хорошо видна сходимость величины переменной к значению равновесия на всем исследуемом дозовом интервале.

4. Заключение. Построенная модель может быть использована для изучения ди-

Рис. 4 Зависимость количества стволовых клеток от дозы облучения и времени после обработки.

намики клеточной популяции эпителия тонкой кишки при фракционном облучении, а также для выбора наиболее благоприятного для дальнейшего нормального функционирования популяции режима облучения. Весьма перспективным представляется математическое моделирование процессов, происходящих в стволовых клетках. Необходимо также создание модели, объединяющей процессы клеточной и тканевой репарации.

Summary

Tokin I. В., Tolstaya М. V., Filimonova G. F. Cell population kinetics in intestinal epithelium.

The problems of cell division regulation and tissue growth are very important for the theory and practice of medicine and biology. The main way of the problem solution is uncovering the mechanisms regulating the cell proliferation. The aim of this work is the creation and analysis of the mathematical model of rapidly renewal tissue at perturbation state and its reparation after irradiation. As a sample of cell population, we selected the intestinal epithelium. This tissue is very interesting due to its high radio sensitivity; the intestinal epithelium renewal on the base of stem cells is well studied. In addition, this tissue is very interesting for modeling because of the presence of a special genetic program - apoptosis, which leads under distinct conditions to cell death. To create the mathematical model of cell population dynamics we used the kinetic approach based on differential computation. For the model construction, we used the assumption that there exists double mechanism of the feedback between the cells of the population: at the level of stem cells of crypt and at the level of the column cells of villus. The constructed model showed its good correspondence with data received in experiments under sharp and fractionated irradiation in dose range from 0 to 10 Gy.

Литература

1. Токин И. Б. Электронномикроскопический анализ дифферешщровки и дедифференци-ровки клеток // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1972. Т. 62, № 6. С. 46-62.

2. Токин И. Б. Проблемы радиационной цитологии. Л.: Медицина, 1974. 319 с.

3. Tokin I. В. Model of cells reorganization after irradiation // Proc. 10th Intern. Congress on Radiation Research. Wurzburg, 1995. P. 138-140.

4. Токин И. Б., Самышкина H. Д. Проблемы математического моделирования живых систем при внешних воздействиях. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 1996. 84 с.

5. Potten С. S. Radiation, the ideal .cytotoxic agent for studying the cell biology of tissues such as the small intestine // Radiat. Res. 2004. Vol. 161, N 2. P. 123-136.

6. Britton N. F., Wright N. A., Murray J. D. A mathematical model for cell population kinetics in the intestine // J. Theor. Biol. 1982. Vol. 98. P. 531-541.

7. Paulus U., Potten C. S., Loeffler M. A model of the control of cellular regeneration in the intestinal crypt after perturbation based solely on local stem cell regulation // Cell Prolif. 1992. Vol. 25. P. 559-578.

8. Potten C. S. Differential regeneration of cells after irradiation // Intern. J. Radiat. Biol. 1975. Vol. 27, N 5. P. 413-424.

9. Potten C. S., Booth C., Hargreaves D. The small intestine as a model for evaluating adult tissue stem cell drug targets // Cell Prolif. 2003. Vol. 36, N 3. P. 115-129.

10. Sato F., Muramatsu S., Tsuchihashi S., Shiragai M. Radiation effect on cell population in the intestinal epithelium of mice and its theory // Cell Tissue Kinet. 1972. Vol. 5. P. 227-235.

11. Wright N. A. Epithelial stem cell repertoire in the gut: clues to the origin of cell lineages, proliferative units and cancer // Intern. J. Exp. Path. 2000. Vol. 81, N 1. P. 117-143.

12. Renehan A. G., Booth C., Potten C. S. What is apoptosis, and why is it important? // Brit. Med. J. 2001. Vol. 322, N 7301. P. 1536-1538.

13. Sacher G. A., Trucco E. The stochastic theory of mortality // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1962. Vol. 96. P. 985-1007.

14. Токип И. В., Толстая M. В., Токин И. И., Филимонова Г. Ф. Кишечный эпителий: процессы пролиферации, регуляции и алоптоза. Математические модели. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 1997. 80 с.

Статья поступила в редакцию 24 ноября 2005 г.