ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ОПТИМИЗАЦИИ ВХОДНЫХ УСЛОВИЙ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Способ идентификации оптимальных условий разделения ионообменной хроматографии для анализа множества композиций, где каждая композиция содержит полипептид и одну или более примесей, причем способ включает
a) построение кривой суммарного заряда против pH при выбранной температуре на основе аминокислотного состава полипептидов двух или более композиций, и
b) определение точки перегиба кривой суммарного заряда против pH при или вблизи нейтральных значений pH путем определения второй производной графиков стадии a);
где оптимальные условия разделения ионообменной хроматографии представляют собой pH приблизительно на уровне общей точки перегиба для полипептида(ов) одной или более композиций.
2. Способ по п.1, где, если суммарный заряд в точке перегиба является положительным, то для ионообменной хроматографии используют катионообменный материал.
3. Способ по п.2, где катионообменный хроматографический материал представляет собой сульфонированный хроматографический материал или карбоксилированный хроматографический материал.
4. Способ по п.1, где, если суммарный заряд в точке перегиба является отрицательным, для хроматографии используют анионообменный материал.
5. Способ по п.4, где анионообменный хроматографический материал представляет собой хроматографический материал на основе четвертичного амина или хроматографический материал на основе третичного амина.
6. Способ по п.1, где для хроматографии используют хроматографический материал смешанной формы.
7. Способ по п.6, где ионообменный материал смешанной формы представляет собой смесь последовательно упакованного сульфонированного хроматографического материала или карбоксилированного хроматографического материала и хроматографического материала на основе четвертичного амина или хроматографического материала на основе третичного амина.
8. Способ по любому из пп.1-7, дополнительно включающий
c) определение изменения pH точки перегиба кривой суммарного заряда против pH при изменении температуры (dIP/dT) для полипептидов двух или более композиций,
d) выбор буфера для применения в хроматографии, где изменение константы кислотной диссоциации буфера при изменении температуры (dpKa/dT) является по существу таким же, как и dIP/dT полипептидов.
9. Способ по п.8, где буфер обеспечивает эффективную буферную емкость при pH точки перегиба.
10. Способ по любому из пп.1-7, где dIP/dT полипептидов одной или более из композиций составляет приблизительно -0,02 единицы pH.
11. Способ по любому из пп.1-7, где изменение температуры составляет от приблизительно 20°C до приблизительно 70°C.
12. Способ по любому из пп.1-7, где изменение температуры составляет от приблизительно 20°C до приблизительно 50°C.
13. Способ по п.8, где dpKa/dT=dIP/dT±50%.
14. Способ по п.8, где суммарный заряд полипептида в буфере, выбранном на стадии d), изменяется менее чем на 0,5 на протяжении 30°C.
15. Способ по п.8, где буфер, выбранный на стадии d), используют в хроматографии при концентрации в диапазоне от приблизительно 5 мМ до приблизительно 250 мМ.
16. Способ по любому из пп.1-7, где композиции буфера дополнительно содержат соль.
4
2
4
2
4
17. Способ по п.16, где соль представляет собой NaCl, KCl, (NH)SO или NaSO.
18. Способ по п.16, где концентрация соли находится в диапазоне от приблизительно 1 мМ до приблизительно 1M.
19. Способ по любому из пп.1-7, где полипептид представляет собой антитело или иммуноадгезин, или их фрагмент.
20. Способ по любому из пп.1-7, где полипептид представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент.
21. Способ по п.19, где антитело представляет собой антитело человека.
22. Способ по п.19, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
23. Способ по п.19, где антитело представляет собой химерное антитело.
24. Способ по п.19, где антитело представляет собой фрагмент антитела.
25. Способ по любому из пп.1-7, где примесь представляет собой вариант полипептида.
26. Способ по любому из пп.1-7, где примесь представляет собой продукт деградации полипептида.
27. Способ по любому из пп.1-7, где примесь представляет собой зарядовый вариант полипептида.
28. Способ идентификации оптимальных условий разделения ионообменной хроматографии для анализа композиции, содержащей полипептид и одну или более примесей, причем способ включает
a) построение кривой суммарного заряда против pH при выбранной температуре на основе аминокислотного состава полипептида, и
b) определение точки перегиба кривой суммарного заряда против pH при или вблизи нейтральных значений pH путем определения второй производной графиков стадии a);
где оптимальные условия разделения для ионообменной хроматографии представляют собой pH приблизительно в точке перегиба для полипептида.
29. Способ по п.28, где, если суммарный заряд в точке перегиба является положительным, для ионообменной хроматографии используют катионообменный материал.
30. Способ по п.29, где катионообменный хроматографический материал представляет собой сульфонированный хроматографический материал или карбоксилированный хроматографический материал.
31. Способ по п.28, где, если суммарный заряд в точке перегиба является отрицательным, то для хроматографии используют анионообменный материал.
32. Способ по п.31, где анионообменный хроматографический материал представляет собой хроматографический материал на основе четвертичного амина или хроматографический материал на основе третичного амина.
33. Способ по п.28, где для хроматографии используют хроматографический материал смешанной формы.
34. Способ по п.33, где ионообменный материал смешанной формы представляет собой смесь последовательно упакованного сульфонированного хроматографического материала или карбоксилированного хроматографического материала и хроматографического материала на основе четвертичного амина или хроматографического материала на основе третичного амина.
35. Способ по любому из пп.28-34, дополнительно включающий
c) определение изменения pH точки перегиба кривой суммарного заряда против pH при изменении температуры (dIP/dT) для полипептида,
d) выбор буфера для применения в хроматографии, где изменение константы кислотной диссоциации буфера при изменении температуры (dpKa/dT) является по существу таким же, как и dIP/dT полипептида.
36. Способ по п.35, где буфер обеспечивает эффективную буферную емкость при pH точки перегиба.
37. Способ по любому из пп.28-34, где dIP/dT полипептидов одной или более композиций составляет приблизительно -0,02 единицы pH.
38. Способ по любому из пп.28-34, где изменение температуры составляет от приблизительно 20°C до приблизительно 70°C.
39. Способ по любому из пп.28-34, где изменение температуры составляет от приблизительно 20°C до приблизительно 50°C.
40. Способ по любому из пп.28-34, где dIP/dT=dpKa/dT±50%.
41. Способ по любому из пп.28-34, где суммарный заряд полипептида в буфере, выбранном на стадии d), изменяется менее чем на 0,5 на протяжении 30°C.
42. Способ по любому из пп.28-34, где буфер, выбранный на стадии d), используют в хроматографии при концентрации в диапазоне от приблизительно 5 мМ до приблизительно 50 мМ.
43. Способ по любому из пп.28-34, где композиция буфера дополнительно содержит соль.
4
2
4
2
4
44. Способ по п.43, где соль представляет собой NaCl, KCl, (NH)SO или NaSO.
45. Способ по п.43, где концентрация соли находится в диапазоне от приблизительно 10 мМ до приблизительно 1 M.
46. Способ по любому из пп.28-34, где полипептид представляет собой антитело или иммуноадгезин, или их фрагмент.
47. Способ по любому из пп.28-34, где полипептид представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент.
48. Способ по п.46, где антитело представляет собой антитело человека.
49. Способ по п.46, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
50. Способ по п.46, где антитело представляет собой химерное антитело.
51. Способ по п.46, где антитело представляет собой фрагмент антитела.
52. Способ по любому из пп.28-34, где примесь представляет собой вариант полипептида.
53. Способ по любому из пп.28-34, где примесь представляет собой продукт деградации полипептида.
54. Способ по любому из пп.28-34, где примесь представляет собой зарядовый вариант полипептида.
55. Способ анализа композиции, где композиция содержит полипептид и одну или более примесей, где способ эффективно отделяет полипептид от примесей, причем способ включает
a) определение оптимальных условий pH и температуры ионообменного разделения для множества композиций, причем каждая композиция содержит заданный полипептид и одну или более примесей в соответствии со способом по п.1,
b) связывание полипептида и одной или более примесей композиции с ионообменным хроматографическим материалом с использованием загрузочного буфера, где загрузочный буфер включает буфер, идентифицированный способом по любому из пп.8-15;
c) элюирование полипептида и одной или более примесей с ионообменного хроматографического материала с использованием градиента элюирующего буфера, где элюирующий буфер содержит буфер и соль, где градиент концентрации соли возрастает с течением времени, где полипептид и одна или более примесей разделяются градиентом; и
d) выявление полипептида и одной или более примесей.
56. Способ анализа композиции, содержащей полипептид и одну или более примесей, где способ эффективно отделяет полипептид от примесей, причем способ включает
a) связывание полипептида и одной или более примесей с ионообменным хроматографическим материалом с использованием загрузочного буфера, где загрузочный буфер содержит буфер, и где pH и температура хроматографии оптимизированы для множества заданных полипептидов посредством
i) построения кривой суммарного заряда против pH при выбранной температуре, где кривая основана на аминокислотном составе полипептида для двух или более заданных полипептидов, и
ii) определения точки перегиба кривой суммарного заряда против pH путем определения второй производной графиков стадии i);
где оптимальные условия ионообменной хроматографии представляют собой pH в общей точке перегиба для двух или более заданных полипептидов;
b) элюирование полипептида и одной или более примесей с ионообменного хроматографического материала с использованием градиента элюирующего буфера, где элюирующий буфер содержит буфер и соль, где полипептид и одна или более примесей разделяются градиентом; и
c) выявление полипептида и одной или более примесей.
57. Способ по п.56, где выбранная температура представляет собой температуру окружающей среды.
58. Способ по п.56, где буфер идентифицируют путем
a) определения изменения pH точки перегиба кривой суммарного заряда против pH при изменении температуры (dIP/dT) для двух или более заданных полипептидов,
b) выбора буфера, для которого изменение константы кислотной диссоциации при изменении температуры (dpKa/dT) является по существу таким же, как и dIP/dT одного или более заданных полипептидов с общими точками перегиба.
59. Способ по п.58, где буфер обеспечивает эффективную буферную емкость при pH точки перегиба.
60. Способ анализа композиции, содержащей полипептид и одну или более примесей, где способ эффективно отделяет полипептид от примесей, причем способ включает
a) связывание полипептида и одной или более примесей с ионообменным хроматографическим материалом с использованием загрузочного буфера, где загрузочный буфер содержит буфер, и где pH и температура хроматографии оптимизированы для множества заданных полипептидов;
b) элюирование полипептида и одной или более примесей с ионообменного хроматографического материала с использованием градиента элюирующего буфера, где элюирующий буфер содержит буфер и соль, где полипептид и одна или более примесей разделяются градиентом; и
c) выявление полипептида и одной или более примесей.
61. Способ по п.60, где буфер представляет собой N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (ACES) или 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES).
62. Способ по пп.55-61, где концентрация буфера находится в диапазоне от приблизительно 5 мМ до приблизительно 20 мМ.
63. Способ по любому из пп.55-61, где pH буфера находится в диапазоне от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5 в диапазоне температур от приблизительно 20°C до приблизительно 70°C.
64. Способ по любому из пп.55-61, где pH буфера находится в диапазоне от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5 в диапазоне температур от приблизительно 20°C до приблизительно 50°C.
65. Способ по любому из пп.55-61, где pH буфера и полипептида в точке перегиба составляет приблизительно 7,8 при приблизительно 22°C, приблизительно 7,5 при приблизительно 37°C или приблизительно 7,2 при приблизительно 50°C.
66. Способ по любому из пп.55-61, где градиент соли представляет собой линейный градиент или ступенчатый градиент.
67. Способ по любому из пп.55-61, где градиент соли представляет собой ступенчатый градиент.
4
2
4
2
4
68. Способ по любому из пп.55-61, где градиент соли представляет собой градиент NaCl, градиент KCl, (NH)SO или градиент NaSO.
69. Способ по любому из пп.55-61, где концентрация соли в градиенте возрастает от приблизительно 0 мМ до приблизительно 1 M.
70. Способ по п.69, где концентрация соли возрастает от приблизительно 0 мМ до приблизительно 100 мМ приблизительно за 100 минут.
71. Способ по п.69, где концентрация соли возрастает от приблизительно 0 мМ до приблизительно 80 мМ приблизительно за 40 минут.
72. Способ по любому из пп.55-61, где полипептид представляет собой антитело или иммуноадгезин, или их фрагмент.
73. Способ по любому из пп.55-61, где полипептид представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент.
74. Способ по п.72, где антитело представляет собой антитело человека.
75. Способ по п.72, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
76. Способ по п.72, где антитело представляет собой химерное антитело.
77. Способ по п.72, где антитело представляет собой фрагмент антитела.
78. Способ по любому из пп.55-61, где примесь представляет собой вариант полипептида.
79. Способ по любому из пп.55-61, где примесь представляет собой продукт деградации полипептида.
80. Способ по любому из пп.55-61, где примесь представляет собой зарядовый вариант полипептида.
81. Способ по любому из пп.55-61, где хроматографический материал представляет собой катионообменный хроматографический материал.
82. Способ по п.81, где катионообменный хроматографический материал представляет собой сульфонированный хроматографический материал или карбоксилированный хроматографический материал.
83. Способ анализа множества полипептидных композиций, где каждая полипептидная композиция содержит полипептид и один или более зарядовых вариантов полипептида, где способ эффективно отделяет полипептид от его зарядовых вариантов;
для каждой композиции полипептида способ включает
a) связывание полипептида и одного или более зарядовых вариантов с ионообменным хроматографическим материалом с использованием загрузочного буфера при скорости потока приблизительно 1 мл/минута, где загрузочный буфер содержит 10 мМ буфер HEPES при приблизительно pH 7,6 при приблизительно 40°C;
b) элюирование полипептида и зарядовых вариантов с ионообменного хроматографического материала с использованием градиента элюирующего буфера, где элюирующий буфер содержит приблизительно 10 мМ буфер HEPES при приблизительно pH 7,6 и NaCl, где концентрация NaCl возрастает градиентно от приблизительно 0 мМ до приблизительно 80 мМ приблизительно за 40 минут, где полипептид и его зарядовые варианты разделяются по градиенту; и
c) выявление полипептида и одного или более зарядовых вариантов.
84. Способ по п.83, где множество полипептидных композиций содержат различные полипептиды.
85. Способ по п.83 или 84, где множество полипептидных композиций содержат полипептиды с различными pI.
86. Способ по п.83 или 84, где композиции полипептидов представляют собой композиции антител.