СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АЛЛЕРГЕНА
METHOD FOR PRODUCING DIAGNOSTIC ALLERGEN

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностических аллергенов из синантропных насекомых, таких как: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Neuphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis), паук домовый (Tegenaria derhami), комар обыкновенный (Culex pipiens), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhan).
Известен способ получения клещевого аллергена для постановки диагностической пробы и лечения, включающий водно-солевую экстракцию исходного сырья и обработку его формальдегидом, в качестве исходного сырья используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус, экстрагирование раствором гидрокарбоната аммония, центрифугирование в течение 45 мин, фильтрацию экстракта, проведение диализа в течение 52 ч при температуре 6±2°C, дважды по 24 ч против 0,002 M раствора гидрокарбоната аммония и один раз в течение 4 ч против дистиллированной воды, центрифугирование диализованного экстракта в течение 1 ч, фильтрацию его через бумажный фильтр, проведение лиофильного высушивания до остаточной влажности не более 4%, растворение сухого остатка в стерильных условиях в 0,1 M фосфатном буфере с pH 7,5, добавление 1%-ного раствора формальдегида, проведение стерилизующей фильтрации, выдерживание формалинизированного аллергоида в течение 32 суток при температуре 32°C с последующим проведением диализа при температуре 6±2°C против 0,1 M фосфатного буферного раствора с pH 7,5 до получения готовой формы аллергена для диагностики (RU 2265450, A61K 39/00, 2005 г.).
Недостатком известного способа является ограниченность действия полученного аллергена.
Основной причиной круглогодичных респираторных аллергозов (бронхиальная астма, аллергические бронхиты, аллергические конъюктивиты и др.) являются аллергены жилища человека. В состав основного из них - домашней пыли - входят продукты жизнедеятельности различных организмов, спутников биоценоза человека: клещи, насекомые, домашние животные и др. Последнее десятилетие исследователями обращено внимание, как на причину аллергозов, на синантропных насекомых, которые встречаются в жилище человека во всех регионах мира. Показано, что 60-80% больных бронхиальной астмой сенсибилизировано к тараканам, в 10-29% случаев регистрируются положительные кожные пробы на экстракт мух. Аллергические реакции на укусы кровососущих насекомых возникают у 17-20% лиц. Максимальные цифры приводятся для США и Японии, несколько ниже для стран Ближнего Востока, Израиля.
На территории СНГ подобных исследований не проводилось, имеются лишь косвенные данные о высокой частоте встречаемости IgE-антител к тараканам у детей, однако они получены с помощью зарубежных тест-систем. Основная причина этого - отсутствие отечественных препаратов аллергенов. С другой стороны - препараты дальнего зарубежья носят преимущественно разовый характер и нуждаются в более подробной физико-химической характеристики и стандартизации. Такая работа в настоящее время активно проводится за рубежом.
Для диагностики повышенной чувствительности к синантропным насекомым необходимы препараты аллергенов, которые можно использовать как для постановки кожных проб, так и для использования в реакциях ин витро. Таких препаратов аллергенов в отечественной аллергологической практике нет.
Расширение номенклатуры производимых препаратов для диагностики аллергических состояний является актуальной задачей практического здравоохранения. К препаратам, которые необходимы для решения данной проблемы, относятся аллергены из синантропных насекомых, разработанные в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.
Техническим результатом изобретения является расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективных препаратов для диагностики заболеваний, вызванных сенсибилизацией к синантропным насекомым, таким как: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Neuphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis), паук домовый (Tegenaria derhami), комар обыкновенный (Culex pipiens), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhan).
Для достижения указанного технического результата в способе получения диагностического аллергена, включающем щелочную экстракцию исходного сырья, центрифугирование, фильтрование и стерилизующую фильтрацию до получения готовой формы диагностического аллергена, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют замороженных синантропных насекомых, измельчают исходное сырье на размеры частиц 1-3 мм, обезжиривают измельченное сырье путем добавления в сырье этилового эфира в соотношении 1:3-4, выдерживают сырье в этиловом эфире в течение 15-20 мин с последующим удалением эфира фильтрованием смеси, повторно обезжиривают сырье этиловым эфиром, высушивают его до полного удаления эфира, измельчают полностью обезжиренное сырье до порошкообразного состояния, а экстрагирование полученного порошка проводят в два этапа, на первом из которых заливают порошок экстрагирующей жидкостью 1:1 и перемешивают до гомогенной суспензии, а на втором этапе полученную суспензию смешивают с экстрагирующей жидкостью в соотношении 2:1 и перемешивают путем встряхивания суспензии трижды по 30 минут с интервалом между встряхиваниями в течение 1,5 часа при температуре 2-10°C в течение 3 суток с ежедневной коррекцией pH аллергенного экстракта до 7,0-7,2.
Используют отдельно каждый вид следующих замороженных синантропных насекомых: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Neuphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis), паук домовый (Tegenaria derhami), комар обыкновенный (Culex pipiens), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhan).
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах.
Пример 1. Получают диагностический аллерген из синантропных насекомых: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Neuphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis), паук домовый (Tegenaria derhami), комар обыкновенный (Culex pipiens), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhan), разработаны в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.
Для получения диагностических аллергенов в качестве исходного сырья используют смесь замороженных насекомых каждого вида отдельно.
Навеску одного из указанных видов синантропных насекомых из морозильной камеры переносят в фарфоровую ступку и мелко нарезают ножницами до размера частиц 1 мм.
Проводят обезжиривание измельченного сырья путем добавления в сырье этилового эфира в соотношении 1:4, выдерживания сырья в эфире в течение 15 мин. Смесь фильтруют через бумажный фильтр и оставляют в вытяжном шкафу до полного испарения эфира.
Измельчают частично обезжиренное сырье в фарфоровой ступке, растирая до порошкообразного состояния. Полученный порошок подвергают вторичному обезжириванию, которое производят в стеклянных банках с притертыми пробками, используя на 60 грамм сырья 240 мл эфира.
Полностью обезжиренное сырье рассыпают на эмалированные лотки с фильтровальной бумагой и сушат в вытяжном шкафу до полного испарения эфира.
Порошок помещают в фарфоровую ступку и добавляют жидкость для экстрагирования в соотношении 1:1. Порошок растирают пестиком до гомогенной суспензии и переносят в бутыль, в которую затем добавляют еще экстрагирующей жидкости, в состав которой входят хлорид натрия, гидрофосфат калия и натрия при pH 7,0-7,2, в соотношении 2:1. Содержимое бутыли осторожно перемешивают и оставляют на 30-40 мин, после чего контролируют значение pH. Коррекцию pH проводят добавлением 1,0 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты до значения pH 7,0-7,2. В последующие три дня для более полного извлечения белково-полисахаридных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа.
В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться в холодильной камере при температуре от 2 до 10°C. Ежедневно проводят коррекцию pH аллергенного экстракта до 7,0-7,2. После окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование на рефрижераторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр. Далее проводят стерилизующую фильтрацию. В день проведения данной операции необходимо контролировать значение pH аллергенного экстракта. Проводят контроль маточного раствора аллергена: в тот же или на следующий день с соблюдением всех правил асептики отбирают из бутыли пробы для контроля: посев на стерильность, проверку значения pH, который должен иметь величину 7,0-7,2. Визуально оценивают физические свойства: препарат должен быть прозрачным, без посторонних включений, светло-коричневого цвета. Содержание единиц белкового азота определяют по методу Несслера. Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических биологических свойств выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 100°C. В тех случаях, когда содержание единиц белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 10000 PNU/мл, маточный раствор аллергена разводят стерильной экстрагирующей жидкостью.
После разлива аллергена получают готовую форму препарата.
Полученный препарат изучали с учетом поставленных целей и задач.
Оценку специфической активности экстракта проводили в непрямом тесте дегрануляции тучных клеток (ДТК) перитональной жидкости крыс с сыворотками больных бронхиальной астмой, имеющих в анамнезе контакт с насекомыми и связывающих свое заболевание с ними.
Средний показатель ДТК с сыворотками сенсибилизированных крыс и препаратами аллергенов из разных насекомых представлены в таблице.
Инсектный аллерген
Число дегранулированных тучных клеток (%)
Пепельный таракан
45
Рыжий таракан
29
Черный таракан
48
Американский таракан
37
Домашняя муха
44
Моль
32
Клоп
30
Муравей
32
Паук
28
Комар
27
Кожеед
18
Эти данные свидетельствуют о том, что сенсибилизация аллергенами из разных видов насекомых сопровождается появлением в сыворотке животных реагиновых антител, которые участвуют в реакциях немедленного типа.
Структурный состав полученных препаратов аллергенов изучался методом электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli.
Результаты электрофореза показали, что исследуемые препараты представляют гетерогенную смесь различных белков.
При электрофоретическом разделении аллергенов различных насекомых определялись следующие фракции:
для рыжего таракана фракции с мол. весом от 18 до 60 кД;
черный таракан 20-35 кД и 65кД
американский таракан до 20кД и более интенсивно окрашенная 45 кД
пепельный таракан 20-40 кД  и 65 кД
муха фракция 31 кД
моль группа фракций от 20 до 40 кД
кожеед 20 кД
паук наиболее интенсивно окрашенные фракции 26, 35, 38, 110 кД
клоп 40-60 кД
муравей 18, 24 и слабоокрашенная группа с Мм от 45 и выше кД.
Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что навеску одного из указанных видов синантропных насекомых из морозильной камеры переносят в фарфоровую ступку и мелко нарезают ножницами до размера частиц 3 мм. Проводят обезжиривание измельченного сырья путем добавления в сырье этилового эфира в соотношении 1:3 и выдерживания сырья в эфире в течение 20 мин.
Испытание диагностической ценности препарата проводили по программе, утвержденной Комитетом по медицинским иммунобиологическим препаратам, на взрослых и детях 12-15 лет в медицинских учреждениях города Москвы и Реутова.
Исследования препаратов аллергенов из разных видов насекомых методом твердофазного иммуноферментного анализа показали его высокую специфическую активность. Специфическую активность аллергенов из насекомых изучали в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием конъюгата моноклональных анти-Ig-Е-антител с пероксидазой корня хрена.
Группу исследования составили 40 атопических больных в возрасте 12 лет и старше с клинически выявленной сенсибилизацией к аллергену домашней пыли и клещей домашней пыли.
Результаты исследования показали, что аллергенспецифические IgE-антитела к аллергенам из разных видов насекомых выявлялись у 30% обследованных больных, что свидетельствует о высокой специфической активности разработанных препаратов аллергенов из разных видов насекомых.