СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СЕПСИСА
LABORATORY DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR SEPSIS

Способ может быть использован в медицинской практике для постановки диагноза сепсиса (генерализованной бактериальной инфекции) у больных с гипертермией неясной этиологии, при ухудшении состояния больных в условиях стационара, у пациентов отделения интенсивной терапии, а также при послеоперационных осложнениях в хирургии - для дифференциальной диагностики сепсиса от других заболеваний и состояний.
Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может быть использовано в клинической практике при анализе цельной крови для диагностики и дифференциальной диагностики генерализованной бактериальной инфекции (сепсиса).
На сегодняшний день проблема лабораторной диагностики сепсиса не решена. В соответствии с международными нормами диагноз сепсис принято ставить по совокупности клинико-лабораторных показателей, включающих наличие гнойного очага или бактериемии в сочетании с признаками синдрома системного воспалительного ответа, а именно - с тахикардией, тахипноэ, гипертермией, лейкоцитозом и сдвигом лейкоцитарной формулы до незрелых форм нейтрофилов (American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis Chest 1992; 101: 1644-55). Диагностика сепсиса представляет значительные сложности для клиницистов, так как перечисленные выше симптомы неспецифичны и встречаются при самых разных заболеваниях и состояниях.
Поиск лабораторных маркеров сепсиса ведется преимущественно в области изучения высокомолекулярных структур полипептидной природы (про- и противовоспалительные интерлейкины, тумор-некротизирующий фактор и др.). В последнее время в качестве лабораторного критерия наиболее часто рекомендуется использовать тест на прокальцитонин - олигопептид, предшественник гормона кальцитонина, повышение содержания которого в сыворотке крови выше 2 нг/мл коррелирует с бактериальной нагрузкой, характерной для септического состояния (Assicot М., Gendrel D., Carsin H., Raymond J., Guilbad J., Bohuon C. High serum procalcitonin concentrations in patienys with sepsis and infection. Lancet 1993 Vol.341 P.515-518). Однако до сих пор природа повышения содержания прокальцитонина в крови больных не ясна, более того, повышенный уровень прокальцитонина наблюдается у тяжелых больных с полиорганной недостаточностью, вне связи с сепсисом. Для диагностики анаэробных гнойно-воспалительных процессов используют определение низкомолекулярных соединений, представляющих собой метаболиты анаэробных бактерий, такие как летучие жирные кислоты (ЛЖК-пропионовая, масляная, валериановая, капроновая и их изомеры), однако тест на ЛЖК не входит в набор методик для диагностики сепсиса, так как последний чаще ассоциируется с аэробной микрофлорой.
Одним из лабораторных критериев генерализованной инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями, является высокий уровень липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови. Данный тест используется в научно-экспериментальных исследованиях, т.к. его диагностическая значимость в клинике не подтверждена. Сепсис в большинстве случаев является микст-инфекцией, обусловленной не только грамотрицательными, но и грамположительными микроорганизмами.
Предлагаемый способ предусматривает в качестве маркеров сепсиса использовать низкомолекулярные химические соединения - фенилкарбоновые кислоты, являющиеся непосредственно продуктами метаболизма бактерий, причем как грамотрицательных, так и грамположительных. (1. А.М.Jenner, J.Rafter, В.Halliwell Human fecal water content of phenolics: The extent of colonic exposure to aromatic compounds Free Radical Biology & Medicine 2005, V.38, P.763-772; 2. A.R.Rechner, М.A.Smith, G.Kuhnle, G.R.Gibson, E.S.Debnam, S.K.S.Srai, K.P.Moore, C.A.Rice-Evans Colonic metabolism of dietary polyphenols: Influence of structure on microbial fermentation products Free Radical Biology & Medicine 2004, V.36, No.2, P.212-225; 3. H.Ch.Lee, A.М.Jenner, Ch.S.Lowa, Y.K.Lee, Effect of tea phenolics and their aromatic fecal bacterial metabolites on intestinal microbiota Research in Microbiology 2006, V.157, P.876-884).
Наиболее близким к предлагаемому методу является определение микробных маркеров в стерильных биологических средах, основанное на хромато-масс-спектрометрическом детектировании химических веществ, являющихся структурными компонентами микробных клеток (Патент РФ №2146368 Осипов Георгий Андреевич, Белобородова Наталья Владимировна. Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма, заявка №97117426, дата поступления 21.10.1997, приоретет 21.10.1997, зарегистрирован в Государственном реестре 10.03.2000).
Недостатком описанного метода является то, что производится оценка микробной нагрузки на основе количественного определения большого перечня веществ, содержащихся в клеточных стенках микроорганизмов (разветвленных жирных кислот, изокислот, гидрооксикислот, спиртов, фенолов и др). При этом суммируются не только химические соединения живых микроорганизмов, непосредственно участвующих в септическом процессе, но и структурные компоненты фагоцитированных, потерявших активность, погибших и даже полностью разрушенных бактерий.
Заявляемый метод характеризуется наличием признаков, отличающих его от известного метода определения микробных маркеров в крови тем, что оценивается уровень содержания метаболитов, т.е. продуктов жизнедеятельности живых микроорганизмов.
Метод может быть реализован с использованием стандартного лабораторного оборудования с привлечением персонала, квалификация которого не превосходит уровень специалиста в области химического, биохимического, иммуноферментного анализа.
Для диагностики сепсиса производится количественное определение фенилкарбоновых кислот, а именно n-гидроксифенилмолочной (ГФМК), фенилмолочной (ФМК), n-гидроксифенилуксусной (ГФУК) гомованилиновой (ГВК) кислот в образцах сыворотки крови. При сепсисе уровни концентраций указанных соединений существенно превышают фоновые концентрации (у здоровых людей) и концентрации при других заболеваниях и состояниях.
В отличие от методов классической микробиологической диагностики (посев крови), предложенный метод не требует культивирования бактерий на питательных средах, что существенно сокращает время диагностики. Исходным материалом анализа является сыворотка венозной крови, которая подвергается процессу пробоподготовки (разбавлению, подкислению, введению внутреннего стандарта, экстракции в диэтиловый эфир, упариванию, силилированию) с последующим хромато-масс-спектральным анализом триметилсилильных производных фенилкарбоновых кислот.
Методика количественного определения содержания фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови
а) приготовление раствора внутреннего стандарта.
5
5
16 мг безводной D-бензойной кислоты растворяют в 1 мл 96% этилового спирта. 10 мкл полученного раствора разбавляют 96% этиловым спиртом до объема 4 мл. Содержание D-бензойной кислоты в конечном растворе составляет 40 нг/мкл или 40 мкг/мл. В процессе пробоподготовки в образец вводят 10 мкл конечного раствора (абсолютное содержание стандарта 400 нг).
б) Пробоподготовка
5
2 мл цельной венозной крови центрифугируют в течение 15 минут при скорости вращения ротора центрифуги 3000 об/мин. Отбирают два параллельных образца по 0,2 мл полученной таким образом сыворотки, которые затем обрабатывают одновременно и независимо. Сыворотку помещают в пробирку вместимостью 10 мл, разбавляют 0,8 мл воды для инъекций, добавляют 20 мкл 50% серной кислоты (до рН 2) и 10 мкл спиртового раствора, содержащего 400 нг D-бензойной кислоты (внутреннего стандарта). Затем полученную смесь дважды экстрагируют порциями по 1 мл диэтилового эфира. Полученные эфирные вытяжки объединяют и упаривают при температуре 40°С досуха. Сухой остаток обрабатывают 20 мкл N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида (BSTFA) в течение 15 минут при 80°С в замкнутом объеме (в герметично закрытом сосуде). Полученный силилированный продукт (ТМС-производное) разбавляют 80 мкл н-гексана (квалификации «о.с.ч.»), переносят во вставку в виал для проведения хромато-масс-спектральномого анализа (ГХ-МС).
в) ГХ-МС анализ. Хромато-масс-спектральное определение фенилсодержащих карбоновых кислот проводят с использованием газового хроматографа Agilent Technologies 6890, оснащенного масс-спектральным детектором Agilent Technologies 5973. Хроматорафическое разделение компонентов прводят на кварцевой капиллярной колонке HP5MS диаметром 0,2 мм, длиной 25 м, толщиной слоя 0,33 мкм.
Условия хроматографирования:
газ-носитель - гелий, скорость потока - 24 мл/мин, скорость потока через колонку - 1,2 мл/мин; температура испарителя - 280°С; режим работы термостата - программируемый: начальная температура термостата колонки - 80°С, время выдержки - 4 мин, далее нагрев до 240°С со скоростью 7°/мин, до 320°С со скоростью 15°/мин, затем термостатирование при 320°С до конца анализа; объем анализируемой пробы - 2 мкл, время анализа - 35 мин, время задержки работы детектора - 4 мин режим работы детектора - режим полного сканирования.
Идентификация фенилсодержащих кислот производится в соответствии с временами удерживания основного и подтверждающего ионов (m/z), приведенных в табл.1.
Таблица 1
Времена удерживания, интенсивности основного и подтверждающего ионов (m/z) в хроматограммах и масс-спектрах фенилсодержащих карбоновых кислот
№
Вещество
Время удерж. ТМС-производного, мин
Осн. ион, m/z (инт. отн. ед.)
Подтв. ион, m/z
1
D<sub>5</sub>-Бензойная кислота (стандарт)
10.45
184 (999)
110
2
n-Гидроксифенилмолочная кислота
22.02
179 (999)
147
3
Фенилмолочная кислота
17.12
193 (999)
147
4
n-Гидроксифенилуксусная кислота
18.04
179 (256)
296
5
Гомованилиновая кислота
20.05
209 (338)
326
г) обработка результатов
Для расчетов используют хроматограммы, полученные в режиме тока селективных ионов (SIM).
Проводят идентификацию пиков, соответствующих определяемым веществам по временам удерживания (табл.1). Наличие вещества считается доказанным в случае присутствия в хроматограмме пиков для основного и подтверждающего ионов (m/z) с относительными интенсивностями, близкими к ним в масс-спектре из базы данных NIST-02. Интегрирование (определение площади) пиков проводят по сигналу основного иона (m/z).
i
i
ri
st
max
st
rst
s
i
Массовую концентрацию (в нг/мл) фенилсодержащих кислот вычисляют методом внутреннего стандарта по формуле , где c - концентрация i-го компонента (нг/мл), S - площадь пика i-го компонента, определенная по основному иону (m/z), M - молекулярная масса i-го компонента, m - масса вводимого стандарта (400 нг), I - высота пика самого интенсивного иона (m/z) в масс-спектре ТМС-производного i-го компонента (999), S - площадь пика стандарта, M - молекулярная масса стандарта (127), V - объем образца (0,2 мл), I - - относительная интенсивность (высота) пика основного иона (m/z) в масс-спектре ТМС-производного i-го компонента. Масс-спектральные данные (m/z и относительные интенсивности пиков) взяты из международной базы данных масс спектров NIST-02.
Проведено детальное изучение содержания в сыворотке крови ГМФК, ФМК, ГФУК, ГВК при сепсисе и в контрольных группах: у здоровых лиц, у больных с заболеваниями сердца неинфекционной природы, при локальных инфекционно-воспалительных процессах (пневмония). Установлено, что уровни фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови при сепсисе многократно превышают уровни во всех группах сравнения. Так, содержание ГМФК, ФМК, ГФУК, ГВК в сыворотке крови у больных сепсисом было не менее чем в 5 раз выше, чем у здоровых людей.
Пример 1. Исследовано содержание микробных метаболитов в сыворотке крови 76 пациентов, принадлежащих к 4 клиническим группам: здоровые доноры (16 человек), пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями (36 человек), пациенты с диагнозом пневмония (10 человек) и пациенты с диагнозом сепсис (14 человек). Проведен полный цикл пробоподготовки и количественного определения фенилкарбоновых кислот. Полученные данные статистически обработаны и приведены в табл.2.
Таблица 2
Медианы и интерквартильные размахи содержания фенилкарбоновых кислот (нг/мл) в сыворотке крови при сепсисе и в группах сравнения
Вещество
Параметр
Группы пациентов
Доноры
Пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями
Пациенты с диагнозом пневмония
Пациенты с диагнозом сепсис
ГФМК
Медиана
195
254
465
1153
Интерквартильный размах 25%
159
134
314
570
Интерквартильный размах 75%
371
373
836
2505
ФМК
Медиана
47
58
112
367
Интерквартильный размах 25%
37
37
89
206
Интерквартильный размах 75%
64
93
177
849
ГФУК
Медиана
72
114
465
2121
Интерквартильный размах 25%
62
53
344
541
Интерквартильный размах 75%
93
220
667
2694
ГВК
Медиана
8
42
948
1393
Интерквартильный размах 25%
3
13
357
356
Интерквартильный размах 75%
10
118
3493
2749
Полученные данные подтверждают наличие достоверных различий в уровне содержания фенилкарбоновых кислот (ГФМК, ФМК, ГФУК, ГВК) у больных сепсисом по сравнению со здоровыми людьми и пациентами с другими заболеваниями.
Пример 2. Пациентка К. 42 года, ист. бол. №54314/08, поступила в стационар 27.08.2008. Основной диагноз: ревматизм, митральный стеноз и недостаточность, сопутствующая патология - сахарный диабет, атрофический гастрит, операция 27.08.2008, в послеоперационном периоде развилась гипертермия, лейкоцитоз, бактериемия, пневмония, сепсис, полиорганная недостаточность. Этой больной с документированным сепсисом, развившимся в послеоперационном периоде, проведено исследование содержания фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови в динамике. Данные приведены в табл.3.
Таблица 3
Динамика содержания фенилкарбоновых кислот (в нг/мл) в сыворотке пациента К. с документированным сепсисом
Дата
ГФМК
ФМК
ГФУК
ГВК
12.09.2008
2599
300
1460
2696
13.09.2008
4149
510
1795
2869
14.09.2008
2189
330
913
1668
30.09.2008
967
240
792
1905
02.10.2008
2378
310
2598
3618
03.10.2008
236
72
670
740
06.10.2008
633
151
1113
1450
08.10.2008
754
99
327
660
10.10.2008
501
63
219
417
13.10.2008
6510
610
527
2178
Мониторинг фенилкарбоновых кислот демонстрирует стойкое повышение их содержания во всех образцах сыворотки крови в течение месяца у пациентки с сепсисом. Отмечались относительно небольшие колебания на фоне меняющегося общего состояния и терапии, причем более высокие концентрации регистрировались в момент нарастания клинико-лабораторных признаков сепсиса. Максимально высокие концентрации ГФМК, ФМК и ГФУК, ГВК отмечены 13.10.08, когда больная находилась уже в терминальном состоянии.
Пример 3. Для сравнения диагностической значимости предложенного метода и метода-прототипа проведено исследование содержания микробных метаболитов (ГФМК, ФМК, ГФУК, ГВК) и компонентов клеточных стенок бактерий (3h14, i14, а19) у больных сепсисом (n=10) и здоровых доноров (n=11). Результаты исследований обработаны статистически и представлены в табл.4.
Таблица 4
Медианы и интерквартильные размахи содержания фенилкарбоновых кислот и компонентов клеточных стенок бактерий (нг/мл) пациентов, принадлежащих к разным группам
Вещество
Параметр
Группы пациентов
Доноры
Пациенты с диагнозом сепсис
ГФМК
Медиана
373
2492
Интерквартильный размах 25%
182
840
Интерквартильный размах 75%
505
4370
ФМК
Медиана
84
505
Интерквартильный размах 25%
42
325
Интерквартильный размах 75%
107
1182
ГФУК
Медиана
99
804
Интерквартильный размах 25%
6
187
Интерквартильный размах 75%
120
2119
ГВК
Медиана
14
1358
Интерквартильный размах 25%
2
853
Интерквартильный размах 75%
26
1932
3h14*
Медиана
13
26
Интерквартильный размах 25%
8
15
Интерквартильный размах 75%
15
33
i14**
Медиана
64
88
Интерквартильный размах 25%
44
73
Интерквартильный размах 75%
107
126
a19***
Медиана
257
344
Интерквартильный размах 25%
223
215
Интерквартильный размах 75%
320
575
* 3h14 - 3-гидрокситетрадекановая кислота
** i14 - <u>изо</u>-тетрадекановая кислота
*** а19 - антиеизо-нонадекановая кислота
Сравнительный анализ статистических данных в группе доноров и в группе пациентов с диагнозом сепсис, полученных при исследовании сыворотки крови одних и тех же пациентов двумя методами, показывает, что различия по уровню фенилкарбоновых кислот (ГФМК, ФМК, ГФУК, ГВК) между группами существенно выше, чем по уровню компонентов клеточных стенок бактерий (3h14, i14, а19). Таким образом, предложенный метод существенно повышает достоверность постановки диагноза сепсис по сравнению с прототипом.