СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ СЕРДЕЧНЫХ ЯВЛЕНИЙ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF SEVERE ADVERSE CARDIAC EVENTS

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти у индивидуума, который страдает острым инфарктом миокарда, заключающийся в том, что:
- определяют уровень протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и
- устанавливают корреляцию указанного уровня протахикинина или его фрагментов, или входящих в состав протахикинина пептидов с риском возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти, при этом повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти.
Понятие «повышенный уровень» означает уровень, находящийся выше определенного порогового уровня.
Вещество Р (SP) представляет собой нейропептид, а именно, ундекапептид, функционирующий в качестве нейромедиатора и нейромодулятора. Он относится к нейропептидам семейства тахикининов. Вещество Р и его близкородственный нейропептид нейрокинин A (NKA) образуются из полипротеина-предшественника после дифференциального сплайсинга гена препротахикинина А. В ЦНС вещество Р участвует в системе передачи боли.
SP играет роль в восприятии и передаче боли, воспалении, экстравазации плазмы, агрегации тромбоцитов и лейкоцитов в посткапиллярных венулах и хемотаксической миграции лейкоцитов через стенки сосудов (Otsuka М., Yoshioka K., Neurotransmitter functions of mammalian tachykinins. Physiol Rev.; 73(2), апрель 1993 г., cc. 229-308).
Рецепторы нейрокинина (NK) присутствуют в основном в коронарных сосудах и внутрисердечных ганглиях и не присутствуют в миокарде желудочков и предсердия (Hoover D.B., Chang Y., Hancock J.С, Zhang L., Actions of tachykinins within the heart and their relevance to cardiovascular disease. Jpn J Pharmacol.; 84(4), декабрь 2000 г., cc. 367-373.). Непосредственное воздействие на рецептор NK1 в коронарных артериях может вызывать NO-опосредованную вазодилатацию (Otsuka М., Yoshioka K., Neurotransmitter functions of mammalian tachykinins. Physiol Rev.; 73(2), апрель 1993 г., cc. 229-308), хотя это воздействие может нарушаться у пациентов с заболеванием коронарных артерий (Bossaller С, Habib G.B., Yamamoto Н., Williams С, Wells S., Henry P.D., Impaired muscarinic endothelium-dependent relaxation and cyclic guanosine 5’-monophosphate formation in atherosclerotic human coronary artery and rabbit aorta. J Clin Invest.; 79(1), январь 1987 г., cc. 170-174), приводя к доминантному NK2-опосредованному сужению сосудов. SP и нейрокинин А представляют собой отрицательные инотропные и хронотропные агенты, оказывающие воздействие через холинергические нейроны (Hoover D.B., Chang Y., Hancock J.С, Zhang L., Actions of tachykinins within the heart and their relevance to cardiovascular disease. Jpn J Pharmacol.; 84(4), декабрь 2000, cc. 367-373). На созданных на крысах моделях инфаркта миокарда (AMI) установлено, что в отличие от них, антагонисты NK1 повышают инотропию и лузитропию, хотя SP ослабляет позитивное инотропное действие норэпинефрина (Wang L.L., Guo Z., Han Y., Wang P.F., Zhang R.L., Zhao Y.L., Zhao F.P., Zhao X.Y., Implication of Substance P in myocardial contractile function during ischemia in rats. Regul Pept.; 167(2-3), 11 апреля 2011, cc. 185-191). Установлено, что SP (действующее через рецептор NK1) участвует в нарушении сократительной функции («оглушении») миокарда после AMI у морских свинок (Chiao Н., Caldwell R.W., The role of substance P in myocardial dysfunction during ischemia and reperfusion. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.; 353(4), март 1996 г., cc. 400-407).
Однако некоторые воздействия SP потенциально могут оказаться благоприятными в случае AMI. Установлено, что SP участвует в ишемическом посткондиционировании (Ren J.Y., Song J.X., Lu M.Y., Chen H., Cardioprotection by ischemic postconditioning is lost in isolated perfused heart from diabetic rats: Involvement of transient receptor potential vanilloid 1, calcitonin gene-related peptide and substance P. Regul Pept.; 169(l-3), 8 августа 2011 г., cc. 49-57.), и антагонисты NK1 могут обусловливать тенденцию к увеличению размера AMI на моделях с использованием животных (Zhang R.L., Guo Z., Wang L.L., Wu J., Degeneration of capsaicin sensitive sensory nerves enhances myocardial injury in acute myocardial infarction in rats. Int J Cardiol.; 160(1), 20 сентября 2012 г., cc. 41-47). Восприятие болевых воздействий нервными центрами при ишемии может приводить к мобилизации экспрессирующих рецептор NK1 клеток-предшественников костного мозга, которые могут играть роль в ангиогенезе в области ишемии (Amadesi S., Reni С, Katare R., Meloni M., Oikawa A., Beltrami A.P., Avolio E., Cesselli D., Fortunato O., Spinetti G., Ascione R., Cangiano E., Valgimigli M., Hunt S.P., Emanueli C, Madeddu P., Role for substance p-based nociceptive signaling in progenitor cell activation and angiogenesis during ischemia in mice and in human subjects. Circulation.; 125(14), 10 апреля 2012 г., cc. 1774-1786, S 1-19).
На моделях AMI с использованием животных было выявлено повышение уровней SP в миокарде (Моrrеу С, Brazin J., Seyedi N., Corti F., Silver R.B., Levi R., Interaction between sensory C-fibers and cardiac mast cells in ischemia/reperfusion: activation of a local renin-angiotensin system culminating in severe arrhythmic dysfunction. 1. J Pharmacol Exp Ther.; 335(1), октябрь 2010 г., cc. 76-84.) и легких (Guo Z., Wang X.P., Wang J.P., Zhou R.H., Wang L.L., Wu J., Up-regulation of substance P in the lungs during acute myocardial ischemia and infarction in rats. Regul Pept.; 160(1-3), 25 февраля 2010 г., cc. 160-167), что свидетельствует о его роли при AMI.
Было продемонстрировано, что вещество Р посредством стимуляции NK-1-R обладает способностью снижать индуцируемый TNF-α апоптоз человеческих теноцитов (Br J Sports Med doi:10.1136/bjsports-2013-092438).
Проведению исследований на людях препятствовало очень короткое время полужизни SP (12 мин) (Conlon J.M., Sheehan L., Conversion of substance P to C-terminal fragments in human plasma. Regul. Pept.; 7, 1983, cc. 335-345). Разработанный в последние годы анализ стабильного РТА (N-концевое провещество Р; которое ранее обозначали также как N-концевой протахикинин А или NT-РТА), являющийся суррогатом лабильного SP (Ernst A., Suhr J., Kohrle J., Bergmann A., Detection of stable N-terminal protachykinin A immunoreactivity in human plasma and cerebrospinal fluid. Peptides; 29, 2008, cc. 1201-1206.), позволяет изучать роль указанной тахикининовой системы в заболеваниях человека. Фрагмент протахикинина РТА 1-37 может служить в качестве суррогатного маркера вещества Р.
В WO 2010/128071 описана стратификация индивидуумов, страдающих острым или хроническим заболеванием, таких как пациенты, перенесшие инфаркт миокарда, на респондеров и нереспондеров на лечение с использованием таких лекарственных средств, как ингибиторы АСЕ, диуретики и бета-блокаторы, и тех, у которых возникают нежелательные действия при приеме лекарственного средства. В качестве биомаркера применяют вазоактивные гормоны, которые воздействуют на эндотелиальную функцию/дисфункцию или коррелируют с ней. При низких уровнях вазоактивных гормонов введение лекарственного средства (за исключением тромболитических лекарственных средств, когда гормон представляет собой про-ANP) оказывает неблагоприятное действие на пациента, страдающего инфарктом миокарда, в то время как при более высоких уровнях введение лекарственных средств оказывает положительное воздействие на пациента, страдающего инфарктом миокарда. Это означает согласно WO 2010/128071, что пониженные уровни биомаркера (за исключением про-ANP) свидетельствуют о повышенном риске для пациента, так как введение лекарственного средства (за исключением тромболитических лекарственных средств, когда гормон представляет собой про-ANP) оказывает неблагоприятное действие на пациента, страдающего инфарктом миокарда. И, кроме того, согласно WO 2010/128071 повышенные уровни биомаркера (за исключением про-ANP) свидетельствуют о пониженном риске для пациента, так как введение лекарственного средства (за исключением тромболитических лекарственных средств, когда гормон представляет собой про-ANP) оказывает положительное действие на пациента, страдающего инфарктом миокарда.
Эффективное лечение и ведение пациентов, страдающих от кардиологических заболеваний, требует наличия системы стратификации риска. Соответствующие средства известны (NTproBNP, балльные оценки риска), но они являются несовершенными. Таким образом, существует необходимость в альтернативных или дополнительных средствах, позволяющих усовершенствовать существующие в настоящее время методы стратификации риска.
Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти у индивидуума, который страдает острым инфарктом миокарда (AMI), заключающийся в том, что:
- определяют уровень протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и
- устанавливают корреляцию указанного уровня протахикинина или его фрагментов, или входящих в состав протахикинина пептидов с риском возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти, при этом повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти у индивидуума, который страдает острым инфарктом миокарда, заключающийся в том, что:
- определяют уровень протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, при этом применяют по меньшей мере одну связывающую молекулу, которая связывается с РТА 1-37, SEQ ID NO: 2,
7
-1
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA, и где указанная связывающая молекула характеризуется аффинностью связывания с РТА 1-37, составляющей по меньшей мере 10 М; и
- устанавливают корреляцию указанного уровня протахикинина или его фрагментов, или входящих в состав протахикинина пептидов с риском возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти, при этом повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти.
- таким образом, повышенный уровень протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов, или повышенный уровень фрагментов, которые определяют, для чего применяют меньшей мере одну связывающую молекулу, которая связывается с РТА 1-37, SEQ ID NO: 2, EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA, свидетельствует о повышенном риске возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанное прогнозирование, предлагаемое в настоящем изобретении, не является прогнозированием того, что у указанного индивидуума будет проявляться неблагоприятное действие, вызванное лечением, или того, что указанный индивидуум является респондером или нереспондером на лечение. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения прогнозирование, предлагаемое в настоящем изобретении, не является прогнозированием того, что у указанного индивидуума будет проявляться неблагоприятное действие, вызванное тромболитическим лекарственным средством, или того, что указанный индивидуум является респондером или нереспондером на тромболитическое лекарственное средство.
Так, в одном из конкретных вариантов осуществления изобретения из объема изобретения исключена стратификация индивидуумов на респондеров на лекарственное средство, нереспондеров на лекарственное средство и индивидуумов, у которых возникают неблагоприятные действия после приема указанного лекарственного средства. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное лекарственное средство представляет собой тромболитическое лекарственное средство. В одном из вариантов осуществления изобретения причина возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти у индивидуума, страдающего от острого инфаркта миокарда (AMI), согласно настоящему изобретению не зависит от лекарственного средства, в частности не зависит от действий тромболитических лекарственных средств.
Прогнозирование риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти не есть то же самое, что и установление диагноза заболевания или состояния, или явления. Прогнозирование риска означает, что на основе биомаркера прогнозируют или определяют риск возникновения явления или состояния, которое может случиться в будущем и которое не имеет места в момент измерения и прогнозирования, в то время как установление диагноза означает определение наличия явления или состояния, которое уже произошло. Существуют многочисленные биомаркеры, которые пригодны в качестве диагностического маркера, но не обладают никаким прогностическим потенциалом, поскольку они изменяются только в том случае, когда явление уже произошло. Существуют многочисленные прогностические маркеры, которые не обладают никаким диагностическим потенциалом. В любом случае невозможно заранее предсказать, может ли биомолекула обладать каким-либо диагностическим или прогностическим потенциалом.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанное тяжелое нежелательное сердечное явление представляет собой острое тяжелое нежелательное сердечное явление, выбранное из группы, включающей инфаркт миокарда, «удар», острую сердечную недостаточность и смерть. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения прогнозируют риск возникновения указанного острого нежелательного явления в течение последующих 6 месяцев или 2 лет. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения указанный AMI имел место в пределах последних 24 ч до взятия образца общей воды организма у указанного пациента. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения указанный AMI имел место в пределах последнего месяца до взятия образца общей воды организма у указанного пациента. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения указанный AMI имел место в пределах последних 2 месяцев до взятия образца общей воды организма у указанного пациента.
В конкретном варианте осуществления изобретения способ прогнозирования риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти у индивидуума, который страдает острым инфарктом миокарда, заключается в том, что:
- определяют уровень протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума; и
- устанавливают корреляцию указанного уровня протахикинина или его фрагментов, или входящих в состав протахикинина пептидов с риском возникновения тяжелых нежелательных сердечных явлений или наступления смерти, при этом повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска возникновения тяжелых нежелательных сердечных явлений или наступления смерти.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения у индивидуума отсутствует сердечная недостаточность в момент взятия образца общей воды организма и/или в момент определения уровня протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума.
Основная составная конечная точка согласно настоящему изобретению представляет собой тяжелые нежелательные сердечные явления (МАСЕ), включая смертность от всех причин, госпитализацию по поводу сердечной недостаточности (HF) или рецидив AMI (pe-AMI), которые оценивали в пределах периода времени, составляющего 2 года. Это означает, что в одном из вариантов осуществления изобретения тяжелые нежелательные сердечные явления выбирают из группы, включающей смертность от всех причин, госпитализацию по поводу сердечной недостаточности (HF) или рецидив AMI (pe-AMI). В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения тяжелые нежелательные сердечные явления выбирают из группы, включающей смертность от всех причин, госпитализацию по поводу сердечной недостаточности (HF) или рецидив AMI (pe-AMI) в пределах периода времени, составляющего 2 года.
Госпитализацию по поводу HF определяли как повторную госпитализацию, основной причиной для которой являлась HF, требующая лечения с применением в высоких дозах диуретиков, инотропов или внутривенного введения нитрата. Рецидив AMI диагностировали на основе универсального определения (Thygesen K., Alpert J.S., White H.D.; Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation; 116, 2007, cc. 2634-2653). Вторичные конечные точки представляли собой комбинации наступления смерти и/или pe-AMI и наступления смерти и/или повторной госпитализации по поводу HF, и только pe-AMI. Конечную точку, представляющую собой наступление смерти и/или pe-AMI в течение 6 месяцев, использовали в анализах с применением балла по шкале GRACE, поскольку указанный момент времени использовали при разработке баллов риска. Конечные точки получали путем анализа локальных баз данных госпиталей и Регистра Бюро Национальной Статистики, и на основе телефонных звонков пациентам. Это означает, что в одном из вариантов осуществления изобретения тяжелые нежелательные сердечные явления выбирают из группы, включающей комбинации наступления смерти и/или pe-AMI и наступления смерти и/или повторной госпитализации по поводу HF, и только pe-AMI. В одном конкретном варианте осуществления изобретения тяжелые нежелательные сердечные явления выбирают из группы, включающей комбинации наступления смерти и/или pe-AMI и наступления смерти и/или и наступления смерти и/или повторной госпитализации по поводу HF, и только pe-AMI в течение шести месяцев.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения тяжелые нежелательные сердечные явления представляют наступление смерти и/или pe-AMI. В одном конкретном варианте осуществления изобретения тяжелые нежелательные сердечные явления представляют наступление смерти и/или pe-AMI в течение 6 месяцев.
Протахикинин и его фрагменты или входящие в состав протахикинина пептиды можно применять в качестве суррогатного маркера высвободившегося вещества Р и/или высвободившегося нейрокинина, поскольку вещество Р/нейрокинин и протахикинин и его фрагменты или входящие в состав протахикинина пептиды высвобождаются в эквимолярных количествах из протахикинина. В одном из вариантов осуществления изобретения определяют уровень протахикинина и его фрагментов или входящих в состав протахикинина пептидов за исключением вещества Р или нейрокинина. В другом варианте осуществления изобретения определяют уровень вещества Р или нейрокинина. Уровень конкретного пептида или пептидного фрагмента можно определять с помощью любого доступного аналитического метода, например, с использованием по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с указанным протахикинином и его фрагментами или входящими в состав протахикинина пептидами. Такая связующая молекула может представлять собой антитело. Указанный уровень можно определять, например, с помощью масс-спектроскопии.
В одном из вариантов указанных выше способов повышенный уровень протахикинина, его сплайсинговых вариантов или фрагментов представляет собой уровень находящийся выше определенного порогового значения, где указанное пороговое значение составляет (примерно) 100 пмолей/л или более 100 пмолей/л, предпочтительно (примерно) 80 пмолей/л или более 80 пмолей/л, предпочтительно (примерно) 70 пмолей/л или более 70 пмолей/л.
Пороговые значения следует рассматривать в контексте применяемого метода калибровки, а указанные выше величины следует рассматривать в контексте анализов и методов калибровки, которые применяли в представленных в настоящем описании примерах 1, 2 и 3. При использовании метода калибровки описанного в примере 1, который применяли при создании настоящего изобретения, было установлено, что медианный уровень протахикинина у здоровых индивидуумов составляет 53 пмоля/л.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанное тяжелое нежелательное сердечное явление представляет собой тяжелое нежелательное сердечное явление, выбранное из группы, которая включает инфаркт миокарда, «удар», острую сердечную недостаточность.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный образец общей воды организма указанного индивидуума брали в течение определенного временного интервала после того, как произошел AMI, указанный временной интервал составлял 2 месяца, более предпочтительно 1 месяц, более предпочтительно 1 неделю, наиболее предпочтительно находился в пределах 24 ч.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления или наступления смерти в течение последующих 6 месяцев или в течение последующих 2 лет.
В настоящем описании понятия протахикинин и протахикинин А (РТА) используют в качестве синонимов. Понятие включает все сплайсинговые варианты протахикинина А, а именно αРТА, βРТА, γРТА и δРТА. Следует иметь в виду, что в употребляемое в описании понятие фрагменты протахикинина включает также вещество Р и нейрокинин, если не указано иное.
Понятие «определение уровня протахикинина, его сплайсинговых вариантов или фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, включая вещество Р и нейрокинин» означает, что, как правило, определяют иммунореактивность в отношении области, присутствующей в указанных выше молекулах. Это означает, что необязательно избирательно оценивать определенный фрагмент. Подразумевается, что связывающая молекула, которую применяют для определения уровня протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, включая вещество Р и нейрокинин, связывается с любым фрагментом, который содержит область, связывающуюся с указанной связывающей молекулой. Указанная связывающая молекула может представлять собой антитело или фрагмент антитела, или не-IgG-каркас.
Это означает, что употребляемое в описании и формуле изобретения понятие «определение уровня протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов» эквивалентно понятию «определение иммунореактивности в отношении области, присутствующей в указанных выше молекулах» и эквивалентно понятию «определение уровня связывающей молекулы, например, антитела, которая связывается с областью, содержащейся в протахикинине или его фрагментах, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидах».
Понятие «индивидуум», употребляемое в настоящем описании, относится к живому человеку или организму кроме человека. Предпочтительно в настоящем описании индивидуум представляет собой человека.
Корреляция между уровнем протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и риском возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления является непрерывной, т.е., чем выше уровень, тем больше риск. Это можно видеть из данных, представленных, например, в таблице 2. По сравнению с первым квартилем второй, третий и четвертый квартили соответственно характеризуются более высокими рисками.
Из соображений целесообразности специалист в данной области может применять понятие «пороговое(ые) значение(я)».
Так, понятие «повышенный уровень» может означать уровень, находящийся выше порогового уровня.
Общую воду организма можно выбирать из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (СМЖ) и слюну.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанное сердечнососудистое заболевание, которое имеет место в момент взятия образца общей воды организма у указанного индивидуума, представляет собой острый инфаркт миокарда (AMI). В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения указанный AMI представляет собой STEMI (инфаркт миокарда с подъемом ST-сегмента) или NSTEMI (инфаркт миокарда без подъема ST-сегмента). В одном из вариантов осуществления изобретения указанный индивидуум имеет AMI, при котором в одном из вариантов осуществления изобретения у указанного пациента уровень сердечного тропонина находится выше 99-го процентиля и имеет место по меньшей мере один из следующих симптомов: продолжительность боли в грудной клетке >20 мин или диагностированные серийные изменения электрокардиограммы, заключающиеся в появлении новых патологических Q-волн или изменений ST-сегмента и Т-волны.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения прогнозирование нежелательного явления у индивидуума или идентификацию индивидуума, имеющего повышенный риск возникновения другого нежелательного явления после того, как произошел AMI, улучшают путем дополнительного определения и использования уровня по меньшей мере одного дополнительного маркера, выбранного из группы, включающей: тропонин I, тропонин Т, CRP, LpLA2, цистатин С и натрийуретические пептиды А- и В-типа, а также их предшественники и фрагменты, включая ANP, proANP, NT-proANP, MR-proANP, BNP, proBNP, NT-proBNP, триглицериды, холестерин ЛПВП или его субфракции, холестерин ЛПНП или его субфракции, GDF15, ST2, копептин, и любого балла, такого, например, как балл риска по шкале PURSUIT, TIMI, GRACE и FRISC (Backus В.Е., Six A.J., Kelder J.H., Gibler W.B., Moll F.L. и Doevendans P.A., Risk Scores for Patients with Chest Pain: Evaluation in the Emergency Department, Curr Cardiol Rev.; 7(1), февраль 2011, cc. 2-8).
В более конкретном варианте способа, предлагаемого в изобретении, в дополнение к уровню протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, или входящих в состав протахикинина пептидов определяют и используют уровень следующего маркера: proBNP или его фрагментов или предшественников, состоящих по меньшей мере из 12 аминокислот, и/или CRP.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей: возраст, систолическое кровяное давление, диастолическое кровяное давление, лечение с использованием гипотензивных лекарственных средств, индекс массы тела, наличие сахарного диабета, курение в настоящее время.
Протахикинин может иметь следующую(ие) последовательность(и):
SEQ ID NO: 1 (протахикинин А (1-107) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDA DSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYE RRR
Фрагменты протахикинина, которые можно определять в общей воде организма, можно выбирать, например, из группы следующих фрагментов:
SEQ ID NO: 2 (протахикинин 1-37, Р37) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA
2
SEQ ID NO: 3 (вещество P) RPKPQQFFGLM(-NH)
SEQ ID NO: 4 (нейропептид K) DADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLM (-NH2)
SEQ ID NO: 5 (нейропептид гамма) GHGQISHKRHKTDSFVGLM (-NH2)
2
SEQ ID NO: 6 (нейрокинин-1) HKTDSFVGLM(-NH)
SEQ ID NO: 7 (С-концевой фланкирующий пептид, РТА 1 92-107) ALNSVAYERSAMQNYE
SEQ ID NO: 8 (изоформа альфа РТА) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDA DSSIEKQVALLKALYGHGQISHKMAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO: 9 (изоформа бета РТА) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDA DSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO: 10 (изоформа дельта РТА) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDA GHGQISHKMAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO: 11 (изоформа гамма РТА) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDA GHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRRSEQ
SEQ ID NO: 12 (PTA3-22) GANDDLNYWSDWYDSDQIK
SEQ ID NO: 13 (РТА 21-36) IKEELPEPFEHLLQRI
Определение уровня РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов может означать, что определяют иммунореактивность в отношении РТА или его фрагментов, включая вещество Р и нейрокинин. Связывающая молекула, которую применяют для определения РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов, в зависимости от области связывания может связываться более чем с одной из указанных выше молекул. Это должно быть очевидно специалисту в данной области.
В более конкретном варианте осуществления способа, предлагаемого в настоящем изобретении, определяют уровень Р37 (РТА 1-37, SEQ ID NO: 2,
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA). В еще более конкретном варианте осуществления способа, предлагаемого в настоящем изобретении, применяют по меньшей мере одну или две связывающие молекулы, которые связываются с РТА 1-37, SEQ ID NO: 2,
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA, в случае использования более чем одной связывающей молекулы они предпочтительно связываются с двумя различными областями в РТА 1-37, SEQ ID NO: 2,
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA. Указанная(ые) связывающая(ие) молекула(ы) предпочтительно может(гут) представлять собой антитело или его связывающий фрагмент.
В еще более конкретном варианте осуществления изобретения для определения РТА, его вариантов и фрагментов применяют связывающую(ие) молекулу(ы), которая(ые) связывается(ются) с одной или обеими из следующих областей в РТА 1-37 соответственно:
В конкретном варианте осуществления изобретения уровень РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов измеряют с помощью иммуноанализа с использованием антител или фрагментов антител, которые связываются с РТА, его сплайсинговыми вариантами или его фрагментами. Иммуноанализ, который можно применять для определения уровня РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, может включать стадии, описанные в примере 1. Все пороговые значения и величины должны рассматриваться в контексте теста и калибровки, которые применяли в примере 1. Специалисту в данной области должно быть известно, что абсолютная величина порогового значения может зависеть от применяемой калибровки. Это означает, что все величины и пороговые значения, представленные в настоящем описании, следует рассматривать в контексте использованной в настоящем описании калибровки (пример 1).
В более конкретном варианте осуществления способа, предлагаемого в настоящем изобретении, определяют уровень протахикинина.
Согласно изобретению диагностическую связывающую молекулу, которая связывается с РТА или другими дополнительными биомаркерами, выбирают из группы, включающей антитела, например, IgG, как правило, полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере вариабельный (Fv) домен тяжелой и/или легкой цепи, такие, например, как химически сшитые антитела (антигенсвязывающие фрагменты), включая (но, не ограничиваясь только ими) Fab-фрагменты, включая миниантитела в виде Fab, антитело в виде одноцепочечного Fab, одновалентное антитело в виде Fab с эпитопными метками, например, Fab-V5S×2; двухвалентный Fab (мини-антитело), димеризованный с помощью СН3-домена; двухвалентный Fab или многовалентный Fab, например, образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации dHLX-доменов, например, Fab-dHLX-FS×2; Р(аb')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные многовалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические димерные антитела (диабоди), BITE (биспецифический активатор Т-клеток), трифункциональные антитела, многовалентные антитела, например, класса, отличного от G-класса; однодоменные антитела, например, наноантитела, происходящие из верблюжьих или рыбьих иммуноглобулинов.
В конкретном варианте осуществления изобретения уровень РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов, или других дополнительных биомаркеров измеряют с помощью анализа с использованием связывающих молекул, выбранных из группы, включающей аптамеры, He-Ig-каркасы, как более подробно описано ниже, которые связываются с РТА, его сплайсинговыми вариантами или его фрагментами, или альтернативно этому с дополнительными биомаркерами.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
Связывающая молекула, которую можно применять для определения уровня протахикинина (РТА), его сплайсинговых вариантов или его фрагментов, характеризуется константой аффинной к РТА, его сплайсинговым вариантам или его фрагментам, составляющей по меньшей мере 10M, предпочтительно 10М, предпочтительно константа аффинности превышает 10М, наиболее предпочтительно превышает 10М. Специалисту в данной области известно, что для компенсации пониженной аффинности можно рассматривать применение соединений в более высокой дозе, и этот подход не выходит за рамки объема изобретения. Аффинность связывания можно определять с помощью метода Biacore, доступного в виде сервисного анализа, например, на сайте фирмы Biaffin, Кассель, Германия (http://www.biaffin.com/de/), см. также выше.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
Связывающая молекула, которую можно применять для определения уровня РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов, характеризуется константой аффинности к РТА, его сплайсинговым вариантам или его фрагментам, составляющей по меньшей мере 10М, предпочтительно 10М, предпочтительно константа аффинности превышает 10М, наиболее предпочтительно превышает 10М. Специалисту в данной области известно, что для компенсации пониженной аффинности можно рассматривать применение соединений в более высокой дозе, и этот подход не выходит за рамки объема изобретения. Аффинность связывания можно определять с помощью метода Biacore, доступного в виде сервисного анализа, например, на сайте фирмы Biaffin, Кассель, Германия (http://www.biaffin.com/de/).
Константы аффинности
Для оценки аффинности антител определяли кинетические характеристики связывания РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов с иммобилизованным антителом с помощью поверхностного плазмонного резонанса без применения метки с использованием системы Biacore 2000 (фирма GE Healthcare Europe GmbH, Фрейбург, Германия). Обратимую иммобилизацию антител осуществляли с использованием антитела к мышиной Fc-области, ковалентно сшитого с высокой плотностью с поверхностью сенсора СМ5, согласно инструкциям производителя (набор для захвата мышиного антитела; фирма GE Healthcare) (Lorenz и др., «Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy»; Antimicrob Agents Chemother., 55(1), январь 2011 г., cc. 165-173).
Контрольный образец человеческого РТА можно получать от фирмы ICI-Diagnostics, Берлин, Германия (http://www.ici-diagnostics.com/). При проведении анализа калибровку можно осуществлять с использованием синтетического (для экспериментов, проведенных при создании настоящего изобретения, применяли синтетический Р37, SEQ ID NO: 2) или рекомбинантного РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ осуществляют более одного раза для мониторинга риска возникновения тяжелого нежелательного сердечного явления у индивидуума или для мониторинга процесса лечения. В одном конкретном варианте осуществления изобретения указанный мониторинг проводят для оценки ответа указанного индивидуума на предпринимаемые профилактические и/или терапевтические меры.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ применяют для стратификации указанных индивидуумов на группы риска.
Объектом настоящего изобретения является также анализ для определения РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов в образце, включающий применение двух связывающих молекул, которые связываются с двумя различными областями в области РТА, которая содержит аминокислоты 3-22 (GANDDLNYWSDWYDSDQIK, SEQ ID NO: 12) и аминокислоты 21-36 (IKEELPEPFEHLLQRI, SEQ ID NO: 13), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов анализов для определения РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов в образце, согласно настоящему изобретению аналитическая чувствительность указанного анализа позволяет количественно оценивать уровень РТА, его сплайсинговых вариантов или РТА-фрагментов у здоровых индивидуумов и составляет <20 пмолей/л, предпочтительно <10 пмолей/л и более предпочтительно <5 пмолей/л.
p
o
c
В одном из вариантов анализов для определения РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов в образце, согласно настоящему изобретению такой анализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно полностью автоматический анализ. Он может представлять собой ELISA, полностью автоматический анализ или выполняемый вручную анализ. Он может представлять собой так называемый РОС-тест (анализ по месту лечения, oint-f-are). Примерами автоматических или полностью автоматических анализов являются анализы, которые можно применять с использованием одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, Biomerieux Vidas, Alere Triage. Примеры форматов тестов представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению уровня РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов в образце по меньшей мере одну из указанных двух связывающих молекул метят для целей обнаружения. Примеры меток представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов в образце по меньшей мере одну из указанных двух связывающих молекул связывают с твердой фазой. Примерами твердых фаз являются магнитные гранулы, полистироловые пробирки или микропланшеты. В одном из вариантов осуществления изобретения применяют гомогенный анализ, а именно, применяют технологии усиленного излучения криптата с временным разрешением (Time Resolved Amplified Cryptate Emission (TRACE)).
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению уровня РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов в образце указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку, представляющую собой радиоактивный йод.
Другим объектом настоящего изобретение является набор, содержащий систему анализа, предлагаемого в настоящем изобретении, где компоненты указанной системы анализа могут содержаться в одном или нескольких контейнерах.
В конкретном варианте способа, предлагаемого в изобретении, определяют дополнительно по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое кровяное давление, диастолическое кровяное давление, лечение с использованием гипотензивных лекарственных средств (АНТ), индекс массы тела, окружность талии, соотношение окружность талии/окружность бедер, курение в настоящее время, наследственная предрасположенность к диабету и предшествующее сердечно-сосудистое заболевание (CVD).
Кроме того, объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска возникновения серьезного нежелательного сердечного явления у индивидуума, страдающего от AMI, или идентификации индивидуума, страдающего от AMI, который имеет повышенный риск возникновения серьезного нежелательного сердечного явления согласно изобретению, в котором применяют уровень протахикинина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, либо индивидуально, либо в сочетании с другими пригодными для прогнозирования лабораторными или клиническими параметрами для прогнозирования риска возникновения серьезного нежелательного сердечного явления у индивидуума с помощью способа, который можно выбирать из следующих альтернатив:
- сравнение с медианой уровня РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов или входящих в состав протахикинина пептидов в совокупности заранее определенных образцов, взятых из популяции «здоровых» или «по-видимому, здоровых» индивидуумов,
- сравнение с квантилем уровня РТА, его сплайсинговых вариантов или его фрагментов или входящих в состав протахикинина пептидов в совокупности заранее определенных образцов, взятых из популяции «здоровых» или «по-видимому, здоровых» индивидуумов,
- расчет на основе анализа пропорциональных рисков Кокса или расчетов коэффициентов риска, таких как NRI (чистый коэффициент переклассификации, Net Reclassification Index) или IDI (интегральный индекс дискриминации, Integrated Discrimination Index).
В одном из вариантов способа, предлагаемого в изобретении, указанный способ осуществляют более одного раза для мониторинга риска возникновения серьезного нежелательного сердечного явления у индивидуума, страдающего от AMI.
В другом варианте способа, предлагаемого в изобретении, указанный мониторинг осуществляют для оценки ответа указанного индивидуума, страдающего от AMI, на предпринимаемые профилактические и/или терапевтические меры.
В другом варианте способа, предлагаемого в изобретении, указанный способ осуществляют для стратификации указанных индивидуумов, страдающих от AMI, на группы риска.
Под объем настоящего изобретения подпадает также устройство для анализа по месту лечения для осуществления способа, предлагаемого в изобретении.
Под объем настоящего изобретения подпадает также анализ и/или набор для осуществления способа, предлагаемого в изобретении.
Описание чертежей
На чертежах показано:
На фиг. 1 - типичная кривая доза РТА/сигнал; стандартная кривая для РТА;
На фиг. 2 - профиль уровней РТА в плазме в течение 5 дней после AMI у индивидуумов с (красный цвет) или без (зеленый цвет) МАСЕ в течение 2 лет;
На фиг. 3 - график переклассификации, на котором проиллюстрирована повышающая и понижающая переклассификация вероятностей событий для выживших пациентов и пациентов, у которых была зарегистрирована конечная точка, представляющая собой наступление смерти и/или возникновение MI в течение 6 месяцев;
На фиг. 4 - дерево классификации для конечной точки, представляющей собой наступление смерти и/или возникновение MI в течение 6 месяцев;
На фиг. 5 - деревья классификации, построенные с использованием РТА в качестве начального классификатора, для конечных точек, представляющих собой наступление смерти и/или возникновение MI в течение 6 месяцев;
На фиг. 6: - график Каплана-Мейера, иллюстрирующий зависимость событий, представляющих собой смерть и/или MI, от времени, стратифицированных по уровню РТА в плазме, находящемуся ниже или выше 72,1 пмолей/л. Функции выживаемости;
На фиг. 7 - Результаты оценки пределов средних значений MEASURE_1.
Примеры
Пример 1
РТА-иммуноанализ
Создание антител к РТА
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Пептиды, предназначенные для иммунизации, синтезировали (фирма JPT Technologies, Берлин, Германия) с включением дополнительного N-концевого остатка цистеина для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Пептиды ковалентно сшивали с БСА с использованием сульфо-SMCC (фирма Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру сочетания осуществляли согласно руководству фирмы Perbio.
Антитела создавали согласно следующему методу:
Мышей линии ВALB/c иммунизировали путем введения 100 мкг конъюгата пептид-БСА (эмульгированный в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) в дни 0 и 14 и 50 мкг (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда) в дни 21 и 28. За три дня до осуществления эксперимента по слиянию животному вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкг физиологического раствора, путем одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Осуществляли слияние спленоцитов иммунизированной мыши с клетками миеломы линии SP2/0 с использованием 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде ГАТ (питательная среда RPMI 1640, дополненная 20% сыворотки плода коровы и ГАТ-добавкой (гипоксантин, аминоптерин, тимидин)). Через две недели среду ГАТ заменяли средой ГТ и после осуществления трех пересевов возвращали в стандартную среду для клеточных культур.
Через три недели после осуществления слияния проводили первичный скрининг супернатантов клеточной культуры в отношении антигенспецифических антител IgG-типа. Позитивные по данным теста микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования осуществляли клонирование и повторное клонирование отобранных культур с применением метода серийных разведений и определяли изотипы (Lane R.D. «А short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas», J. Immunol. Meth. 81, 1985, cc. 223-228; Ziegler В. и др., «Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies», Horm. Metab. Res. 28, 1996, cc. 11-15).
Получение моноклональных антител
Антитела получали согласно стандартным методам получения антител (Marx и др., Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 1997, с. 121) и очищали с помощью хроматографии на белке А. Чистота антител составляла >95% по данным электрофоретического анализа на геле в присутствии ДСН.
Мечение антител и их применение для сенсибилизации
Все антитела метили с использованием сложного эфира акридиния согласно следующей процедуре:
Несущее метку соединение (трейсер, антитело к РТА 3-22): 100 мкг (100 мкл) антитела (1 мг/мл в ЗФР, рН 7,4), смешивали с 10 мкл сложного NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, фирма InVent GmbH, Германия) (ЕР 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое антитело очищали с помощью ЖХВР-гель-фильтрации на Bio-Sil SEC 400-5 (фирма Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное меченое антитело разводили в 300 ммолей/л фосфата калия, 100 ммолей/л NaCl, 10 ммолей/л Na-ЭДТК, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0. Конечная концентрация меченого соединения соответствовала примерно 800000 относительных световых единиц (RLU) (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию сложного эфира акридиния измеряли с помощью устройства AutoLumat LB 953 (фирма Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Антитело на твердой фазе (применяемое для сенсибилизации антитело):
Твердая фаза: Полистироловые пробирки (фирма Greiner Bio-One International AG, Австрия) сенсибилизировали (в течение 18 ч при комнатной температуре) антителом к РТА 22-36 (1,5 мкг антитела на 0,3 мл буфера, содержащего 100 ммолей/л NaCl, 50 ммолей/л Трис/HCl, рН 7,8). После блокирования с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина, пробирки промывали ЗФР, рН 7,4 и сушили в вакууме.
Иммуноанализ РТА:
С помощью пипетки вносили по 50 мкл образца (или калибратора) в сенсибилизированные пробирки, после добавления меченого антитела (200 мкл) пробирки инкубировали в течение 2 ч при 18-25°С. Несвязанный трейсер удаляли путем 5-кратной промывки (используя каждый раз по 1 мл) промывочным раствором (20 ммолей/л ЗФР, рН 7,4, 0,1% Тритон Х-100). Связанное с пробиркой меченое антитело оценивали с использованием люменометра LB 953, фирма Berthold, Германия.
Калибровка:
2
4
При проведении анализа калибровку осуществляли с использованием разведений синтетического Р37, разведенного в растворе, содержащем 20 мМ KРO, 6 мМ ЭДТК, 0,5% БСА, 50 мкМ амастин, 100 мкМ леупептин, рН 8,0. Содержащую РТА контрольную плазму получали от фирмы ICI-diagnostics, Берлин, Германия.
Аналитическая чувствительность анализа (медианная величина сигнала, полученная для 20 определений 0-калибратора (без добавления РТА)+2SD (2 стандартных отклонения), соответствующую концентрацию РТА рассчитывали с использованием стандартной кривой) составляла 4,4 пмоля/л.
Пример 2 - Исследования на пациентах с острым инфарктом миокарда
Исследуемая популяция:
При создании изобретения проводили исследования на 1148 STEMI- (т.е. имеющих инфаркт миокарда с подъемом ST-сегмента (ST-segment Elevation Myocardial Infarction)) и NSTEMI- (т.е. имеющих инфаркт миокарда без подъема ST-сегмента (Non-ST-segment Elevation Myocardial Infarction)) пациентах, поступивших в университетские госпитали Leicester NHS trust в период между августом 2004 г. и апрелем 2007 г. Это обсервационное групповое исследование проводилось согласно правилам Хельсинской декларации и было утверждено местным комитетом по этике; от пациентов были получено письменное информированное согласие. Диагноз AMI устанавливали в том случае, когда у пациента уровень тропонина I находился выше 99-го процентиля и при этом присутствовал по меньшей мере один из следующих симптомов: продолжительность боли в грудной клетке >20 мин или диагностированные серийные изменения электрокардиограммы, заключающиеся в появлении новых патологических Q-волн или изменений ST-сегмента и Т-волны (Thygesen K., Alpert J.S., White H.D.; Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation; 116, 2007, cc. 2634-2653). Исключали пациентов с известным злокачественным заболеванием, а также тех, которых в предшествующий месяц подвергали почечной заместительной терапии или хирургическому вмешательству. Расчетную скорость клубочковой фильтрации (eGFR) оценивали согласно упрощенной формуле Модификации диеты при почечном заболевании (Smilde T.D., van Veldhuisen D.J., Navis G., Voors A.A., Hillege H.L., Drawbacks and prognostic value of formulas estimating renal function in patients with chronic heart failure and systolic dysfunction. Circulation; 114, 2006, cc. 1572-1580). Всех пациентов подвергали стандартному медицинскому лечению и осуществляли реваскуляризацию по решению лечащего врача.
Образцы плазмы:
Образцы крови (обработанной антикоагулянтами ЭДТК и апротинином) брали после нахождения в состоянии покоя в положении лежа в течение 15 мин непосредственно после установления диагноза и в пределах 36 ч после возникновения симптомов. Плазму хранили при -80°С до проведения анализа в виде одной партии для определения вслепую уровней РТА и NTproBNP в плазме.
Эхокардиография:
При учетной индексной госпитализации для 895 (77,9%) пациентов осуществляли трансторакальную эхокардиографию с использованием либо устройства Sonos 5500, либо устройства IE 33 (фирма Philips Medical Systems, Рейгат, Великобритания). Осуществляли 16-ти сегментную балльную оценку движения стенок левого желудочка (LVWMI) на основе метода Американского общества эхокардиографии (Schiller N.B., Shah P.M., Crawford M. и др., Recommendations for quantitation of the left ventricle by two-dimensional echocardiography. American Society of Echocardiography Committee on Standards, Subcommittee on Quantitation of Two-Dimensional Echocardiograms. J Am SocEchocardiogr.; 2, 1989, cc. 358-367). Для соответствующих пациентов рассчитывали фракцию выброса левого желудочка (LVEF) по формуле на основе двухплоскостного метода (совмещенных) дисков. Определяли, что имеет место систолическая дисфункция левого желудочка (LVSD), когда либо LVEF <40%, либо LVWMI >1,8.
Оценка согласно Глобальному регистру острых коронарных явлений (GRACE):
На основе международной обсервационной базы данных о пациентах с острым коронарным синдромом можно рассчитывать баллы по шкале GRACE при первом обследовании для прогнозирования внутрибольничной смертности (Granger С.В., Goldberg R.J., Dabbous О. и др., Global Registry of Acute Coronary Events Investigators. Predictors of hospital mortality in the global registry of acute coronary events. Arch Intern Med.; 163, 2003, cc. 2345-2353) или тяжелых неблагоприятных сердечных событий (MACE), представляющих собой наступление смерти и/или ре-MI, в течение 6 месяцев (Eagle K.A., Lim M.J., Dabbous О.Н. и др., A validated prediction model for all forms of acute coronary syndrome: estimating the risk of 6-month post discharge death in an international registry. JAMA; 291, 2004, cc. 2727-2733). При создании настоящего изобретения использовали баллы по шкале GRACE при выписке для сравнения со случаями смерти и/или pe-AMI в течение 6 месяцев.
Конечные точки:
Основная конечная точка представляла собой тяжелые нежелательные сердечные явления (МАСЕ), включая смертность от всех причин, госпитализацию по поводу сердечной недостаточности (HF) или рецидив AMI (pe-AMI), которые оценивали в пределах 2-лет. Госпитализацию по поводу HF определяли как повторную госпитализацию, основной причиной для которой являлась HF, требующая лечения с применением в высоких дозах диуретиков, инотропов или внутривенного введения нитрата. Рецидив AMI диагностировали на основе универсального определения (Thygesen К., Alpert J.S., White H.D.; Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction. Universal definition of myocardial infarction. Circulation; 116, 2007, cc. 2634-2653). Вторичные конечные точки представляли собой комбинации наступления смерти и/или pe-AMI и наступления смерти и/или повторной госпитализации по поводу HF, и только pe-AMI. Конечную точку, представляющую собой наступление смерти и/или pe-AMI в течение 6 месяцев, использовали в анализах с применением балла по шкале GRACE, поскольку указанный момент времени использовали при создании балльной оценки риска. Конечные точки получали путем рассмотрения локальных баз данных госпиталей и Регистра Бюро Национальной Статистики, и на основе телефонных звонков пациентам.
При создании изобретения последующее наблюдение осуществляли в 100% случаев.
Статистический анализ:
2
Статистические анализы осуществляли с использованием программ SPSS, версия 20 (фирма SPSS Inc, Чикаго, шт. Иллинойс) и Stata 12.1 (шт. Техас, США). Если предположить, что частота событий составляет 15% и что на долю ковариат приходится вплоть до 30% дисперсии биомаркера, то размер выборки, равный 600 пациентам, должен обеспечивать (статистическую) мощность, составляющую 90% при р<0,05, для выявления коэффициента риска биомаркера, равного 1.5. Уровни биомаркеров подвергали log10-преобразованию и поэтому соотношения рисков соответствовали десятикратному увеличению уровней указанных маркеров. Баллы по шкале GRACE использовали в качестве исходных баллов. Для негауссовских данных применяли непараметрические критерии (U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса и корреляции Спирмена (rs)). Независимые предикторы уровней РТА оценивали с использованием одновариантных общих линейных моделей. Для оценки прогностического потенциала биомаркеров создавали «основную» модель с использованием анализа выживаемости Кокса, которая включала переменные, которые были значимо (р<0,10) ассоциированы с одной из исследуемых конечных точек по данным одновариантного анализа (возраст, пол, предшествующая история ишемической болезни сердца (IHD), гипертензия или диабет, класс по шкале Killip, eGFR и log уровня тропонина I). К этой основной модели добавляли биомаркеры (NTproBNP, РТА) для оценки относительного прогностического потенциала каждого из них со всеми входящими в модель переменными одновременно. Вторую «сравнительную» модель Кокса использовали для оценки относительного прогностического потенциала указанных биомаркеров и балла по шкале GRACE. Дополнительный по отношению к баллу по шкале GRACE прогностический потенциал РТА оценивали на основе анализа методом переклассификации с расчетом независимого от категории чистого индекса переклассификации (NRI), описанного у Pencina и др., (Pencina М.J., D'Agostino R.B. Sr., Steyerberg E.W., Extensions of net reclassification improvement calculations to measure usefulness of new biomarkers. Stat Med.; 30, 2011, cc. 11-21). При создании настоящего изобретения строили деревья классификации с использованием основанного на χ-критерии метода автоматического обнаружения взаимодействия (Chi-squared Automatic Interaction Detection (CHAID), т.е. анализа, осуществляемого с использованием SPSS), в котором на каждом шаге выбирают биомаркер, который характеризуется наиболее сильным взаимодействием с зависимой переменной.
Характеристики пациентов
Характеристики исследуемой популяции представлены в таблице 2 в зависимости от квартилей уровней РТА. Пациенты с более высокими уровнями РТА представляли собой индивидуумов более старшего возраста, среди них было больше женщин, индивидуумов с предшествующей историей гипертензии, IHD, диабетом, HF и более высокими баллами по шкале GRACE, уровнями NTproBNP и глюкозы. Они имели также более сильные нарушения сердечной и почечной функций.
Представлены характеристики 1148 страдающих AMI пациентов в зависимости от квартилей уровней РТА в момент выписки. Численные данные представлены в виде n (%). P-значения приведены для дисперсионного анализа (F-статистика) или критериев Крускала-Уоллиса для непрерывных или категориальных переменных соответственно. Данные представлены в виде чисел (%) или средних величин ±С.К,O.
Корреляционный анализ
Анализ с использованием критерия Спирмена (rs) выявил значимую корреляцию уровня РТА с возрастом (0,521), eGFR (-0,555), диастолическим кровяным давлением (BP) (-0,178), NTproBNP (0,428), фракцией выброса (-0,175) (во всех случаях Р<0,0005) и частотой сердечных сокращений (0,100, Р<0,001). Уровень РТА не коррелировал с уровнем тропонина или пиковым уровнем креатининкиназы.
Одновариантная общая линейная модель позволила выявить следующие независимые предикторы уровня РТА, перечисленные ниже в порядке уменьшения вклада, вносимого в дисперсию в этой модели (таблица 3): eGFR, возраст, предыстория диабета и IHD, класс по шкале Killip выше 1, балл движения стенок LV, женский пол и диастолическое BP. eGFR вносила наибольший вклад в дисперсию (20,7%).
Одновариантная общая линейная модель позволила выявить независимые предикторы уровней РТА
Изменение уровня РТА в течение нескольких дней
В распоряжении исследователей были образцы плазмы, взятые в течение 5 последовательных дней у 110 пациентов, из которых у 29 имело место МАСЕ в пределах 2-летнего периода времени. На фиг. 2 представлен соответствующий профиль в плазме, а также данные, полученные с использованием общей линейной модели с повторными измерениями, которые демонстрируют значимые (р<0,001) изменениях уровня РТА в зависимости от времени и то, что более высокие уровни наблюдаются у пациентов с МАСЕ (р<0,03). Апостериорный анализ показал, что уровни РТА в день 1 были выше, чем в дни 3, 4 или 5 (р<0,001, 0,004 и 0,002 соответственно, поправка Бонферрони для множественных сравнений). Уровни РТА в дни 1 и 2 оказались сходными. Не было выявлено статистически значимой зависимости временного профиля уровней РТА от МАСЕ.
Анализ выживаемости
В течение последующего периода наблюдения, составлявшего 2 года, было установлено, что среди пациентов с повышенными уровнями РТА (уровень подвергали log10-трансформации и рассматривали в качестве непрерывной переменной) имело место большее количество случаев МАСЕ, смертей и повторных госпитализаций по поводу HF или pe-AMI (таблица 2). В таблице 4 представлены одновариантные и многовариантные коэффициенты риска для различных факторов, которые оказывали влияние на исход МАСЕ в течение 2-летнего периода времени.
Регрессионный анализ методом Кокса МАСЕ для 2-летнего периода после AMI. Представлены результаты многовариантного анализа с использованием модели 1, которая включала переменные и биомаркеры, которые были выявлены как значимые при одновариантном анализе в отношении прогнозирования МАСЕ (за исключением GRACE и систолической дисфункции LV). Многовариантные модели 2 и 3 предназначены для прогнозирования составных конечных точек, представляющих собой наступление смерти и/или ре-MI (модель 2) и наступление смерти и/или повторной госпитализации по поводу HF (модель 3). Представлены только значимые коэффициенты риска.
В многовариантном анализе для прогнозирования МАСЕ в течение 2 лет значимые независимые предикторы включали возраст, класс по шкале Killip выше 1, терапию с использованием статинов, применение АСЕ/ARB (ангиотензинпревращающий фермент/блокатор ангиотензинового рецептора) и диуретики, и уровень РТА. В других моделях для прогнозирования вторичных составных конечных точек, представляющих собой наступление смерти и/или ре-MI (модель 2) и наступление смерти и/или повторной госпитализации по поводу HF (модель 3), уровень РТА оставался независимым предиктором (р<0,0005 и р<0,002 соответственно). В моделях для (прогнозирования) МАСЕ и каждой из указанных вторичных составных конечных точек, которые включали эхокардиографически установленную LVSD (данные не представлены), уровень РТА оставался значимым независимым предиктором (Р<0,005 во всех случаях) наряду с LVSD (р-значения находились в пределах от 0,015 до 0,025).
В таблице 5 представлены одновариантные и многовариантные коэффициенты риска для конечной точки, представляющей собой pe-AMI в течение 2 лет.
Представлены результаты многовариантного анализа с использованием модели 1, которая включала переменные и NTproBNP, которые выявлены как значимые при одновариантном анализе (за исключением GRACE и систолической дисфункции LV). Многовариантная модель 2 позволяла получать коэффициенты риска после добавления про-SP к модели 1. Многовариантная модель 3 позволяла получать коэффициенты риска после добавления установленной с помощью эхокардиографии LVSD к модели 2. Представлены только значимые коэффициенты риска.
При применении модели 1, которая включала значимые одновариантные предикоторы и NTproBNP, выявлена тенденция к статистической значимости (р=0,055) фактора, представляющего собой предысторию IHD. Добавление РТА к этой модели позволило установить, что РТА является значимым предиктором pe-AMI (модель 2, таблица 5). При добавлении установленной с помощью эхокардиографии LVSD была выявлена тенденция РТА к статистической значимости (модель 3, таблица 5).
Сравнение с баллами по шкале GRACE
Широко применяемая балльная оценка риска по шкале GRACE (Eagle K.А., Lim M.J., Dabbous О.Н. и др., A validated prediction model for all forms of acute coronary syndrome: estimating the risk of 6-month post discharge death in an international registry. JAMA; 291, 2004, cc. 2727-2733) первоначально была разработана для прогнозирования наступления смерти и/или MI в течение 6 месяцев. Установлено, что баллы по шкале GRACE и биомаркеры NTproBNP и РТА являлись предикторами МАСЕ при одновариантном анализе (таблица 6).
Одновариантный HR относится к МАСЕ, имевшему место в течение 6 месяцев. Многовариантные модели включают балл по шкале GRACE и биомаркеры для прогнозирования МАСЕ (модель 1), наступления смерти и/или MI (модель 2) и наступления смерти и/или HF (модель 3). Представлены только значимые коэффициенты риска.
При многовариантном анализе МАСЕ, наступления смерти и/или MI и наступления смерти и/или HF в течение 6 месяцев баллы по шкале GRACE и уровень РТА оставались предикторами, в то время как NTproBNP оставался предиктором только в модели для прогнозирования МАСЕ и наступления смерти и/или HF (модели 1 и 3 в таблице 6).
При анализе наступления смерти и/или MI и наступления смерти и/или HF в течение 6 месяцев с использованием кривой операционной характеристики приемника (ROC) площадь под кривой (AUC) увеличивалась с 0,695 (95% CI 0,649-0,741) в случае учета только баллов по шкале GRACE до 0,722 (0,677-0,768) в случае добавления РТА (Р=0,016 при сравнении с учетом только баллов по шкале GRACE). При добавлении NTproBNP к указанной ROC не происходило дополнительного увеличения AUC (0,722 (0,676-0,768)), хотя указанная AUC была значимо больше, чем в случае использования только баллов по шкале GRACE (Р=0,027).
Применяли бескатегориальный анализ переклассификации, описанный у Pencina и др. (Pencina M.J., D'Agostino R.B. Sr., Steyerberg E.W., Extensions of net reclassification improvement calculations to measure usefulness of new biomarkers. Stat Med.; 30, 2011, cc. 11-21) для расчета NRI (>0), при этом для анализа не выбирали произвольные отсекающие вероятности. На фиг. 3 представлен график переклассификации, предложенный Steyerberg (Steyerberg E.W., Vickers A.J., Cook N.R., Gerds Т., Gonen M., Obuchowski N., Pencina M.J., Kattan M.W., Assessing the performance of prediction models. A framework for traditional and novel measures. Epidemiology; 21, cc. 128-138), на котором по одной оси отложены вероятности событий, полученные с использованием только балльной оценки по шкале GRACE, а по другой оси отложены вероятности событий, полученные с использованием балльной оценки по шкале GRACE, скорректированные с учетом РТА. Вероятности, скорректированные с учетом РТА, для пациентов без неблагоприятного исхода подверглись понижающей классификации (т.е. они находились ниже диагонали на фиг. 3). NRI для пациентов, у которых не была достигнута конечная точка, представляющая собой наступление смерти и/или MI в течение 6 месяцев, составлял 22,3 (95% CI 15,6-29,0, Р<0,0005), а для тех, у которых была достигнута конечная точка, он составлял 9,3 (95%СI -6,7-25,3, P=NS), при этом общий NRI (>0) составлял 31,6 (95%СI 14,3-49,0, Р<0,0005), это позволяет предположить, что учет РТА улучшает стратификацию риска по сравнению с использованием балльной оценки по шкале GRACE преимущественно посредством понижающей классификации для пациентов, у которых не были достигнуты конечные точки (таблица 7).
Анализ переклассификации с использованием непрерывной переклассификации, тертилей или 2 конкретных пороговых рисков, равных 0,05 и 0,1, продемонстрировал, что добавление РТА к классификации с использованием только балльной оценки по шкале GRACE приводит к улучшению чистого индекса переклассификации (NRI) и значимости NRI для конечной точки, представляющей собой наступление смерти и/или MI в течение 6 месяцев.
Когда в качестве двух отсекающих значений для вероятностей наступления смерти и/или MI в течение 6 месяцев выбирают тертили, то анализ переклассификации продемонстрировал, что учет РТА приводит к понижающей классификации в основном в тех случаях, когда конечная точка отсутствует, при этом чистый NRI является значимым (9,8, Р<0,025).
Когда выбирали два отсекающих значения для вероятностей наступления смерти и/или MI в течение 6 месяцев (5% и 10%), то для пациентов без конечной точки, представляющей собой наступление смерти и/или MI в течение 6 месяцев, NRI составлял 11,7 (Р<0,0005), а для тех, у которых была достигнута конечная точка, NRI не являлся значимым, в результате чего общий NRI составлял 9,0 (Р<0,005).
Анализ дерева принятия решений
Для определения оптимальных отсекающих точек для биомаркеров при создании изобретения конструировали деревья принятия решений (с использованием уровней РТА и NTproBNP и баллов по шкале GRACE) для классификации пациентов на выживших или тех, у которых зарегистрированы конечные точки. Для конечной точки, представляющей собой наступление смерти и/или MI в течение 6 месяцев (фиг. 4), уровень РТА ниже 82,8 пмолей/л позволил отобрать из числа тех, у которых NTproBNP был ниже 2256 пмолей/л и балл по шкале GRACE был меньше 137, подгруппу (n=583, 50,8% от общего количества) пациентов, имевших низкий риск наступления смерти и/или MI (6,3% по сравнению с 15,5% для исходной популяции).
При анализе с помощью деревьев принятия решений с использованием РТА в качестве исходного классификатора (фиг. 5) уровень РТА ниже 72,08 пмолей/л и балл по шкале GRACE меньше 137 определяли группу пациентов низкого риска (n=512, 44,6% от общего количества), для которой частота события составляла 6,8%. Из их числа только 3 пациента (0,26%) умерли в течение 6 месяцев, и 1 (0,09%) умер в течение 30 дней. Уровни РТА выше 121,6 пмолей/л позволили отобрать группу пациентов высокого риска, для которой коэффициент смертности/MI составлял 37,7% и коэффициент смертности составлял 30,7% (фиг. 5).
Анализ методом Каплана-Мейера
Анализ выживаемости по методу Каплана-Мейера с использованием в качестве отсекающего значения 72,1 пмолей/л, для составной конечной точки, включающей наступление смерти и/или MI, продемонстрировал наличие значимой разницы между пациентами, у которых уровни находились ниже (n=689, 60% от общего количества) или выше указанного отсекающего значения (Р-значение для log-рангового критерия <0,0005) (фиг. 6).