Исследование механизмов действия озона на злокачественные клетки

К.Н. Конторщикова1,2, А.В. Алясова1, И.Г. Терентьев1, С.Н. Цыбусов1, К.А.Шахова1, Е.С.Макарова1, С.П. Перетягин1

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ОЗОНА НА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫЕ КЛЕТКИ

1 Нижегородская государственная медицинская академия

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород, Россия

В эксперименте изучалось влияние химиопрепарата доксорубицина и озона на жизнеспособность нормальных Chang liver (Ch.l.) и злокачественных SK-HEP-1 клеток печени в культуре. Установлено сходное повышение свободнорадикального окисления при действии озона и доксорубицина как изолированно, так и в сочетании. Показано, что наибольшей цитотоксичностью обладает доксорубицин в отношении как нормальных, так и злокачественных клеток. Озон как изолированно, так и в комбинации с доксорубицином также проявлял выраженную цитотоксичность. Под действием озона изменяется содержание фермента каспазы сходно с доксорубицином. Под действием озона внутри клеток образуются пероксиды.

Ключевые слова: озон, злокачественные клетки, каспаза, пероксид.

We studied the effect of ozone and Doxorubicin on viability of normal and malignant liver cells in culture. It found similar increase in free-radical oxidation action of ozone and doxorubicin both alone and in combination. It demonstrated that doxorubicin has the highest cytotoxicity against both normal and malignant cells. Ozone both alone and in combination with doxorubicin cytotoxicity also exhibited pronounced. Under the influence of ozone varies. The content of the enzyme caspase similar to doxorubicin. Under the influence of ozone inside the cells will be delighted peroxide.

Key words: ozone, malignant cells, caspase, peroxide.

В наших экспериментальных исследованиях, выполненных на лабораторных животных с перевитой опухолью молочной железы показано, что действие озона на патоморфоз злокачественных клеток сопоставим с действием известного химиопрепарата доксорубицина. [1, 3]. Для уточнения механизмов действия озона необходимым явился переход от экспериментов на целостном организме животного к культуре злокачественных клеток.

Цель работы - провести сравнительное изучение влияния доксорубицина и озона на жизнеспособность нормальных и злокачественных клеток человека.

Материалы и методы

Эксперименты проводились на культивированных клетках:

1. нормальной печени человека Chang liver (Ch.l.);

2. аденокарциномы печени человека SK-HEP-1.

Испытуемые среды готовили следующим образом: в 50 мл среды для выращивания клеток, вводили:

а) доксорубицин в дозе 0,004 мг;

б) 150 мл кислорода; в) 150 мл озоно-кислородной смеси с концентрацией озона 25 мг/л;

г) среда с кислородом + доксорубицин 0,004 мг;

д) среда с озоно-кислородной смесью + доксорубицин 0,004 мг.

Озоно - кислородная газовая смесь поступала со скоростью 1 л/мин в течение 5 минут из генератора озона Квазар (Нижний Новгород). Среду, на которой выращивались клетки, заменяли на среды, соответственно а, б, в, г, д.

Проверку клеток на жизнеспособность проводили по восстановлению солей тетразолия МТТ (Sigma,США) [2, 4]. Концентрацию фермента каспазы -3 определяли методом иммуноферментного анализа Human -Caspase-3 Instant ELISA.

Полученные результаты статистически обработаны с помощью пакета прикладных программ Biostat.

Результаты

Жизнеспособность клеток напрямую связана с активностью ферментов оксидоредуктаз. Снижение активности данных ферментов указывает на выраженную цитотоксичность доксорубицина в отношении нормальных клеток печени (показатель жизнеспособности 3,5%) и особенно злокачественных клеток печени (показатель жизнеспособности 1,56%). Введение в культуральную среду озоно-кислородной смеси вызывало образование продуктов взаимодействия озона с биоорганическими соединениями (озониды). Эти продукты, по всей видимости, повреждали клеточные мембраны и подавляли активность оксидоредуктаз, что проявлялось снижением показателей жизнеспособности (4,54% - для нормальных клеток и 16,5% - для злокачественных клеток печени). Количественные различия нормальных и злокачественных клеток можно объяснить более мощной антиоксидантной защитой злокачественных клеток. Сочетанное использование доксорубицина и кислорода показало, что применение двух агентов оказывает более выраженное действие на нормальные клетки, а не на злокачественные, имеющие более выраженную антиоксидантную систему защиты. Сочетание доксорубицина и озона сопровождалось снижением жизнеспособности как нормальных клеток до 7,9%, так и злокачественных до 2,6%. Отличие этих показателей от тех, что получено при действии изолированного введения доксорубицина и окислителей связано, по всей видимости,

с взаимодействием этих факторов между собой и компонентами клеток, в том числе и с антиоксидантами.

Проведенные исследования показали, что доксорубицин обладает выраженной цитотоксичностью и в отношении нормальных клеток печени, и особенно злокачественных клеток печени. Применение кислорода в монорежиме не изменяет состав среды для клеточной культуры и не мешает пролиферации клеток. Введение в культуральную среду озоно-кислородной смеси проявляется снижением показателей жизнеспособности для злокачественных клеток печени. Сочетанное использование доксорубицина и кислорода оказывает более выраженное действие на нормальные клетки, а не на злокачественные, имеющие более выраженную антиоксидантную систему защиты. Сочетание доксорубицина и озона сопровождается снижением жизнеспособности и нормальных клеток и злокачественных клеток.

Ферментами, способными вызывать апоптоз клеток, являются каспазы. В нашем исследовании оценивалось содержание каспазы-3. В нормальных клетках печени изменений концентраций каспазы-3 не установлено. Самая высокая концентрация отмечалась при воздействии на злокачественные клетки доксорубицином 4,760 + 0,06 pg/ml, в 30 раз выше, чем в контроле. Это подтверждало высокую апоптотическую активность данного цитостатика. Введение озонированной среды увеличивало количество каспазы в 11 раз и составляло 2,672+0,02 pg/ml. При смене среды для выращивания клеток на среду, содержащую доксорубицин и озон, количество каспазы увеличивалось в 13 раз (2,043+ 0,03 pg/ml), доксорубицин и кислород в 16,6 раз (2,672+0,02pg/ml).

Во втором экперименте использовались клетки линии цервикальной карциномы человека HeLa Kyoto, экспрессирующие сенсор пероксида водорода HyPer2 (линия HeLa-Kyoto-HyPer2). Сенсор HyPer2 чувствителен как к изменениям уровня H2O2, так и уровня рН внутри клеток. Для того, чтобы исключить вероятное влияние изменений рН на флуоресцентные свойства HyPer2, все эксперименты дублировались на такой же клеточной линии, экспрессирующей сенсор рН SypHer2, представляющий собой H2O2-нечувствительный аналог HyPer2 (линия HeLa Kyoto-SypHer2). HyPer2 и SypHer2 Эксперимент проводился на установке лазерной сканирующей микроскопии Carl Zeiss LSM 510 на базе инвертированного микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200 M Флуоресцентные изображения регистрировались каждые 5 минут в течение 7 часов. Реакция сенсора наблюдалась только при добавлении клеткам предварительно озонированной среды. Это подтверждает рост уровня пероксида под влиянием озона. Отсюда, эффект озона на апоптоз злокачественных клеток может проявиться как через действие пероксида, так и через активацию под действием пероксида синтеза каспазы.

Список литературы

1. Алясова А.В., Конторщикова К.Н., Терентьев И.Г. с соавт. Влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на патоморфоз опухоли в эксперименте // ^временные технологии в медицине. 2010. №4. С. 27-31.

2. Аникина Л.В., Пухов С.А., Добровская Е.С. с соавт. Сравнительное определение жизнеспособности клеток с помощью ММТ и ресазурин // Фундаментальные исследования. 2014. №12-7. С. 1423-1427.

3. Бойко Н.Н., Сенькив Ю.В., Шляхтина Е.А. Действие доксорубицина, доставленного в опухолевые клетки in vitro и in vivo новым наноразмерным функционализированным олигоэлектролитным носителем // Biotechnologia Acta. T.6 ,N22, С. 53-62.

4. Mosmann T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays // J. Immunol. Methods. 1983. Vol. 65. P. 55-63.