СПОСОБ АНАЛИЗА ОЛИГОСАХАРИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ
METHOD OF BLOOD PLASMA OLIGOSACCHARIDE ANALYSIS

Настоящее изобретение относится к способу анализа олигосахаридов, составляющих гепарины с низкой молекулярной массой и гепарины с очень низкой молекулярной массой, в плазме крови.
Гепарины представляют собой биологически активные соединения группы гликозаминогликанов, которые обладают особенно полезными свойствами антикоагулянтов. Гепарины с низкой молекулярной массой (HBPM) и гепарины с очень низкой молекулярной массой (HTBPM) получают разрезанием длинных полисахаридных цепочек гепарина на более короткие цепочки с низкой молекулярной массой.
Олигосахариды, составляющие HBPM и HTBPM обычно характеризуются макроскопическими параметрами, такими как их средняя молекулярная масса или биологическая активность, такая как, например, активность анти-Xa (МЕ/мг). Упомянутая активность, которую определяют по взаимодействию с антитромбином III, является наиболее часто используемой.
Однако измерение таких макроскопических параметров или такой биологической активности не позволяет отвечать на многие важнейшие вопросы. В частности, на основе таких критериев невозможно производить анализ фармакокинетических профилей различных олигосахаридов, составляющих HBPM и HTBPM. Например, при использовании активности анти-Xa учитываются только виды, обладающие сродством к AT III, то есть приблизительно только 20% смеси; следовательно, содержание 80% олигосахаридов не может быть измерено. Более того, вклад каждого вида, составляющего аффинную смесь, также не может быть определен.
Таким образом, невозможно точно определить плазматическую концентрацию каждого олигосахарида и, по более веским причинам, его фармакокинетический профиль простым измерением его активности анти-Xa. Однако такие профили могли бы дать очень ценную информацию для улучшения посологии лекарственных средств на основе HBPM и HTBPM.
et
al.,
, Biochim. Biophys.
Для того чтобы иметь возможность анализировать содержание различных олигосахаридов, составляющих HBPM или HTBPM, в плазме крови, необходимо иметь возможность отделять полностью и воспроизводимо такие олигосахариды от других компонентов плазмы, в частности от протеинов. В способах, описанных в предшествующем уровне техники, прибегают к непрерывной обработке протеазами (Volpi  1995Acta., 1243 (1):49-58).
12
9
Способы хроматографии или электрофореза позволяют производить анализ различных компонентов HBPM. Например, капиллярный электрофорез (EC) используют для разделения олигосахаридов гепарина (Guerrini et al., Glycobiology, 2002, : 713-719; Linhardt et al., BioMethods, 1997, : 183-197). Однако селективность EC является значительно меньшей по сравнению с жидкостной хроматографией. Представляется также возможным, в некоторых случаях, для анализа гепариновых олигосахаридов использовать масс-спектрофотометрию MALDI-TOF, но и она не может применяться для анализа сложных смесей, не говоря уже о высоких затратах на нее.
Вследствие этого анализ сульфатированных олигосахаридов, таких как олигосахариды, составляющие HBPM и HTBPM, производят, главным образом, способом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Недавно был описан способ анализа HBPM, состоящий из ферментативной деполимеризации, сочетаемой, при необходимости, с последующим восстановлением, и количественного анализа способом ВЭЖХ (WO 2004/027087). В недавней европейской заявке (EP 04290789.9) описан способ количественного анализа олигосахаридов, составляющих HBPM и HTBPM, способом анионообменной хроматографии CTA-SAX. В упомянутом способе используется анионообменная хроматография, проводимая с солью четвертичного аммония, в частности цетилметиламмония, адсорбированной в динамических условиях на колонке с диоксидом кремния в качестве обращенной фазы и сохраняющей четкий и постоянный положительный заряд при pH в интервале от 2 до 12. В таком способе может требоваться предварительная обработка, деполимеризация или разделение эксклюзионной хроматографией, перед анализом HBPM и HTBPM способом ВЭЖХ на колонке CTA-SAX.
Объектом настоящего изобретения является способ анализа олигосахаридов в плазме крови, отличающийся тем, что его осуществляют в две следующие стадии:
- обработка пробы плазмы крови;
- количественный анализ способом ВЭЖХ.
В таком способе не требуется использование ни ферментативной деполимеризации, ни фракционирования эксклюзионной хроматографией олигосахаридов, присутствующих в пробе плазмы крови, перед количественным анализом способом ВЭЖХ. Наоборот, согласно этому способу пробу плазмы крови обрабатывают фильтрованием таким образом, чтобы отделить олигосахариды, переходящие в фильтрат, от веществ, загрязняющих плазму, в частности от протеинов, которые остаются в концентрате.
Таким образом, более предпочтительно объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, в котором пробу плазмы крови обрабатывают фильтрованием. Более предпочтительно объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что молекулы, молекулярная масса которых превышает 30 кДа, остаются в концентрате.
Для того чтобы обеспечить возможность количественного определения при таком способе обработки пробы плазмы крови и проверить воспроизводимость такой обработки с разными пробами, в пробу вводят, при необходимости, внутренний стандарт. Таким стандартом должен быть олигосахарид, который является как можно более близким структурно к анализируемому количественно соединению и который добавляют к плазме непосредственно перед фильтрованием.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является также способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что олигосахарид-свидетель прибавляют к пробе плазмы непосредственно перед фильтрованием.
Хотя большей частью олигосахариды и отделяются от протеинов фильтрованием, также возможно, что некоторая их часть захватывается концентратом вследствие электростатического взаимодействия с ним. В таком случае необходимо осуществлять одну или несколько промывок концентрата солевым раствором.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является также способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что концентрат промывают по меньшей мере один раз солевым раствором.
По настоящему изобретению солевой раствор представляет собой предпочтительно раствор хлорида калия.
Более предпочтительно объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что концентрация солевого раствора после добавления к концентрату превышает или равна 1 M, в частности, способ, в котором концентрация соли превышает или равна 2 M.
После одной или нескольких промывок солевым раствором концентрат промывают, при необходимости, водой. Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, в котором после по меньшей мере одной промывки концентрата солевым раствором предусматривается стадия промывки водой.
Первичный фильтрат объединяют с фильтратами, образующимися при промывках, и совокупность фильтратов разбавляют в 5 раз водой. Такое разбавление позволяет сконцентрировать совокупность олигосахаридов после введения в хроматографическую колонку, избегая уширения пиков, вызываемого очень высокой солевой концентрацией. Непосредственно перед введением значение pH раствора доводят до 3 добавлением 1 N раствора HCl.
В способе по настоящему изобретению общий объем фильтрата и, при необходимости, фильтратов после промывки прямо вводят и анализируют способом ВЭЖХ.
Анионообменная ВЭЖХ представляет собой способ разделения, лучше приспособленный к такой сложной смеси. В частности, для ВЭЖХ применяют анионообменную колонку с прививкой четвертичного аммония за счет ковалентной связи. Такой тип колонки обладает преимуществом в виде возможности использования в качестве подвижной фазы раствора перхлората, что является невозможным с колонкой CTA-SAX по причине образования прочного комплекса перхлората и CTA.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является также способ, такой как определено ранее, в котором олигосахариды количественно анализируют способом анионообменной ВЭЖХ. Более предпочтительно объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, в котором олигосахариды количественно анализируют способом ВЭЖХ на анионообменной колонке с прививкой четвертичного аммония за счет ковалентной связи.
Могут быть использованы колонки типа IonPAc AS11 (Dionex) с гранулометрическим составом 9-13 мкм и длиной 25 см. Могут быть использованы колонки любого общепринятого диаметра в интервале от 1 до 4,6 мм, но предпочтительно используют колонки диаметром 2 мм. В более общем случае могут быть использованы колонки меньшего диаметра, например 1 мм, использование которых требуется вследствие малого количества плазмы и обеспечения также повышения чувствительности анализа.
Используемым прибором может быть хроматограф, обеспечивающий создание градиента элюирования и снабженный УФ-детектором. Предпочтительно используют детектор, снабженный диодно-матричным чувствительным элементом, который позволяет получать УФ-спектры компонентов и регистрировать сложные сигналы, являющиеся разностью значений поглощения при 2 различных длинах волн и позволяющие обнаруживать ацетилированные олигосахариды среди соединений плазматического происхождения. Использование подвижной фазы, прозрачной до 200 нм, позволяет облегчить дифференциацию компонентов. Используемая в настоящем изобретении подвижная фаза представляет собой предпочтительно раствор перхлората натрия, но также могут быть использованы метансульфонаты или фосфаты.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что используют подвижную фазу, прозрачную до 200 нм. В частности, объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что подвижная фаза представляет собой раствор перхлората натрия, метансульфоната или фосфата. Более предпочтительно объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что подвижная фаза представляет собой раствор перхлората натрия.
Значение pH, рекомендуемое при разделении, находится в интервале от 2 до 6,5. Предпочтительно значение pH составляет около 3. Такое значение pH может быть получено добавлением соли, такой как фосфат, способной образовывать буферный раствор с pH=3 более лучшим образом, чем перхлораты.
В качестве примера далее приведены стандартные условия хроматографического разделения:
2
4
3
4
- растворитель A: NаHPO, 2,5 мM, доведенный до pH=2,9 добавлением HPO;
4
2
4
3
4
- растворитель B: NaClO, 1 N - NaHPO, 2,5 мM, доведенный до pH=3,0 добавлением HPO.
Градиент элюирования может быть следующим:
T=0 мин: B=3%; T=40 мин: B=60%; T=60 мин: B=80%.
Для колонки диаметром 2 мм могут быть выбраны, например, скорость подачи 0,22 мл/мин и температура колонки 40°C.
Олигосахариды, присутствующие в образцах фильтрованной плазмы, детектируют по УФ-спектру. Так как неацетилированные полисахариды обладают, при данном значении pH, почти идентичным УФ-спектром, то возможно селективно детектировать ацетилированные сахара, принимая в качестве сигнала разность значений поглощения при двух длинах волн, выбранных таким образом, что поглощение неацетилированных сахаридов вычитается.
В следующем далее случае выбирают длины волн 202 и 230 нм в качестве референтных и регистрируют сигналы при 202-230 нм. Для специалиста в данной области техники очевидно, что выбор длины волны будет зависеть от значения pH подвижной фазы, при этом подстройка на несколько нм может быть необходимой для обеспечения оптимума упомянутых условий. Наиболее приемлемым для такой методики детектором является диодно-матричный детектор DAD компании Agilent Technologies. В таком случае осуществляют двойную детекцию каждой пробы при 234 нм, с одной стороны, и при 202-230 нм, с другой стороны. Можно также осуществлять тройную детекцию, измеряя, кроме того, поглощение каждой пробы при 280 нм, что позволяет проверить, что сигнал не искажен протеиновыми остатками.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что способ детекции позволяет селективно детектировать ацетилированные сахара.
Объектом настоящего изобретения является также способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что способ селективной детекции ацетилированных сахаров осуществляют, принимая в качестве сигнала разность значений поглощения при двух длинах волн, выбранных таким образом, что поглощение неацетилированных сахаридов вычитается.
Таким образом, объектом настоящего изобретения более предпочтительно является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что способ селективной детекции ацетилированных сахаров осуществляют, измеряя поглощение при 202-230 и 234 нм.
Таким образом, объектом настоящего изобретения более предпочтительно является способ, такой как определено ранее, отличающийся тем, что способ селективной детекции ацетилированных сахаров осуществляют, измеряя поглощение при 202-230, 234 и 280 нм.
Способ, определенный ранее, позволяет более предпочтительно анализировать любые β-ненасыщенные олигосахариды. Более предпочтительно способ применяют для анализа олигосахаридов, составляющих эноксапарин, октапарин, бемипарин и тинзапарин.
Экспериментальный пример
Mетодика
Обработка плазмы
Отбирают пробы плазмы объемом в интервале от 100 до 1000 мкл и, при необходимости, к ним прибавляют внутренний стандарт.
После гомогенизации получающийся раствор вводят в патрон для ультрафильтрации Ultrafree05, 30 кДа (Millipore), предварительно промытый 250 мкл воды при центрифугировании в течение 5 минут при 10000 об/мин. Плазму вводят в верхнюю часть патрона за 1 или 2 приема, если количество, подлежащее фильтрованию, превышает 500 мкл.
Патрон центрифугируют при 10000 об/мин в течение от 1 до 2 часов, затем отбирают фильтрат. При необходимости, вторую часть плазмы, подлежащей фильтрованию, вводят в верхнюю часть патрона и снова центрифугируют. Точное количество вводимой плазмы определяют взвешиванием. Патрон центрифугируют до тех пор, пока протеиновый остаток в верхней части патрона не составит приблизительно не более 10% от первоначального количества. Отбирают фильтрат и к концентрату прибавляют 210 мкл 3 M раствора KCl на мл фильтрованной плазмы.
После гомогенизации патрон центрифугируют при 10000 об/мин в течение от 1 до 4 часов. Патрон центрифугируют до тех пор, пока протеиновый остаток в верхней части патрона не составит приблизительно не более 10% от первоначального количества.
Отбирают второй фильтрат и к концентрату второй раз прибавляют 210 мкл 3 M раствора KCl на мл фильтрованной плазмы. После гомогенизации патрон центрифугируют при 10000 об/мин в течение от 1 до 4 часов. Патрон центрифугируют до тех пор, пока протеиновый остаток в верхней части патрона не составит приблизительно не более 10% от первоначального количества.
Отбирают третий фильтрат и прибавляют 250 мкл воды на мл фильтрованной плазмы.
После гомогенизации патрон центрифугируют при 10000 об/мин в течение от 1 до 4 часов. Патрон центрифугируют до тех пор, пока протеиновый остаток в верхней части патрона не составит приблизительно не более 10% от первоначального количества.
Фильтраты объединяют, разбавляют в 5 раз водой и все количество прямо вводят при анионообменной ВЭЖХ.
Непосредственно перед введением значение pH вводимого раствора доводят до 3 добавлением 1 N раствора HCl.
Способ ВЭЖХ
Фильтрованную плазму анализируют способом ионообменной ВЭЖХ. Используемые колонки представляют собой колонки IonPAc As11 (Dionex) длиной 25 см и внутренним диаметром 2 мм. Используемый детектор представляет собой УФ-спектрофотометр, снабженный диодно-матричным чувствительным элементом.
Ввод общего объема осуществляют после доведения значения pH до 3 добавлением 1 N раствора HCl. Выбирают скорость подачи 0,22 мл/мин и температуру колонки 40°C.
Элюирование осуществляют в градиентном режиме. Используют два раствора:
2
4
3
4
- растворитель A: NаHPO, 2,5 мM, доведенный до pH=2,9 добавлением HPO;
4
2
4
3
4
- растворитель B: NaClO, 1 N, NaHPO, 2,5 мM, доведенный до pH=3,0 добавлением HPO.
Градиент элюирования является следующим:
T=0 мин: B=3%; T=40 мин: B=60%; T=60 мин: B=80%.
Пример 1
IIs
IIs
IIs
1,6-anhydro
Далее представлено изменение смеси трех октасахаридов в крови собак-самцов породы бигль. Упомянутые 3 октасахарида, обозначаемые ΔIIaIsIs, ΔIsIIaIs и ΔIIaIsIs, являются главными октасахаридами, аффинными с фракциями октасахаридов Lovenox. Они обладают сильным сродством к AT III и, следовательно, антитромботической активностью.
Смесь вводят подкожно 3 собакам-самцам породы бигль с целевой дозой по каждому из 3 таких компонентов 0,5 мг/кг. Вводимый раствор представляет собой раствор смеси 3 октасахаридов с целевой концентрацией 0,5 мг/мл в 0,9%-ном растворе NaCl.
Отбор проб крови по 5 мл осуществляют в моменты времени 0; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 24; 30 и 48 ч после введения. Пробы крови собирают в пробирки, содержащие 400 мкл смеси CTAD (цитрат, теофиллин, аденозин, дипиридамол). После гомогенизации раствор центрифугируют при 3000×g в течение 15 мин при 15°C. Плазматический супернатант выделяют и хранят при -20°C до использования.
Для обработки плазмы перед ВЭЖХ отбирают приблизительно 1 мл плазмы и взвешивают, затем к ней прибавляют 50 мкл раствора внутреннего стандарта с концентрацией приблизительно 0,02 г/л.
Внутренний стандарт выбирают таким образом, чтобы он был как можно более близким структурно к соединениям, подлежащим анализу. Его структура представлена далее.
Используемый тетрасахарид позволяет корректировать потенциальное влияние изменения степени экстракции. Плазму обрабатывают и анализируют способом ВЭЖХ.
Полученные результаты представлены в таблице 1. Соответствующие хроматограммы представлены на фиг.1.
Пример 2
HTBPM со средней молекулярной массой 2500 Да вводят с целевой дозой 1,4 мг/кг добровольцам. Отбор проб крови осуществляют в моменты времени 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12; 14 и 24 ч после введения.
Поскольку используемый HTBPM представляет собой сложную смесь олигосахаридов, в исследовании ограничились только некоторыми элементами, выбранными из упомянутой смеси.
С другой стороны, так как не был найден внутренний стандарт, который не взаимодействует на стадии хроматографирования ни с одним из компонентов смеси, количественный анализ осуществляли, принимая в качестве коэффициента мольного отклика коэффициент, полученный в примере 1 с аффинными октасахаридами.
Результаты выявляют очень большую разницу в содержании олигосахаридов, составляющих исследованный гепарин с низкой молекулярной массой. Олигосахариды, обладающие активностью анти-Xa, проявляют кинетику выведения значительно более медленную, чем другие сульфатированные олигосахариды, что не обнаруживается, исходя из контроля активности анти-Xa.
Полученные результаты представлены в таблице 2. Соответствующие хроматограммы представлены на фиг.2.
<b>Таблица 2</b>Изменение плазматической концентрации (мкM) главных олигосахаридов в зависимости от времени после введения
<b>Время, часы</b>
<b>ΔIs</b>
<b>ΔIsIIs</b>
<b>ΔIsIs</b>
<b>ΔIIa<u>IIs</u>Is</b>
<b>ΔIsIsIs</b>
<b>ΔIIa<u>IIs</u>IsIs</b>
0
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,25
0,24
0,20
0,16
0,05
0,02
0,01
0,5
0,30
0,30
0,24
0,10
0,04
0,03
0,75
0,26
0,26
0,21
0,10
0,03
0,02
1
0,23
0,26
0,20
0,10
0,04
0,03
1,25
0,20
0,23
0,19
0,12
0,04
0,04
1,5
0,19
0,22
0,19
0,11
0,03
0,04
2
0,16
0,18
0,15
0,11
0,03
0,04
2,5
0,11
0,13
0,10
0,09
0,02
0,03
3
0,10
0,10
0,09
0,08
0,02
0,03
3,5
0,08
0,10
0,07
0,09
0,02
0,04
4
0,07
0,07
0,07
0,10
0,01
0,02
4,5
0,06
0,06
0,06
0,10
0,01
0,04
5
0,04
0,05
0,05
0,09
0,01
0,03
6
0,03
0,04
0,04
0,08
0,01
0,02
7
0,03
0,03
0,03
0,10
0,01
0,04
8
0,02
0,02
0,02
0,07
0,00
0,02
9
0,01
0,01
0,01
0,07
0,00
0,02
10
0,01
0,01
0,01
0,07
0,00
0,02
12
0,00
0,00
0,01
0,08
0,00
0,03
14
0,00
0,00
0,00
0,07
0,00
0,02
24
0,05
0,01
Фиг.1
Хроматографический контроль фармакокинетики 3 октасахаридов у собаки 1.
Фиг.2
Хроматографический контроль главных олигосахаридов, составляющих гепарин с очень низкой молекулярной массой, в зависимости от времени после введения.