СПОСОБЫ, НАБОРЫ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК

1. Способ размножения популяции клеток in vitro, включающий приведение образца, содержащего популяцию клеток, в контакт с реагентом для мультимеризации,
где на реагенте для мультимеризации обратимо иммобилизовано (связано с ним) первое средство, которое передает первичный активационный сигнал клеткам; где реагент для мультимеризации содержит по меньшей мере один связывающий участок Z1 для обратимого связывания первого средства,
где первое средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С1, где партнер по связыванию С1 способен обратимо связываться со связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации посредством обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, и
где первое средство связывается с рецепторной молекулой на поверхности клеток, передавая тем самым первичный активационный сигнал клеткам и активируя тем самым клетки.
2. Способ по п. 1, где на средстве для мультимеризации обратимо иммобилизовано (связано с ним) второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток,
где второе средство содержит партнера по связыванию С2, где партнер по связыванию С2 способен обратимо связываться со связывающим участком Z2 реагента для мультимеризации, где второе средство связано с реагентом для мультимеризации с помощью обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2,
где второе средство связывается со вспомогательной молекулой на поверхности клеток, стимулируя тем самым активированные клетки.
3. Способ по п. 1 или 2, где популяция клеток представляет собой популяцию лимфоцитов.
4. Способ по п. 3, где популяция лимфоцитов представляет собой популяцию В-клеток, популяцию Т-клеток, популяцию естественных клеток-киллеров или их смесь.
5. Способ по п. 4, где популяция Т-клеток представляет собой популяцию антиген-специфических Т-клеток, популяцию Т-клеток-хелперов, популяцию цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти, регуляторных Т-клеток или естественных Т-клеток-киллеров.
6. Способ по п. 5, где первое средство содержит комплекс МНС-I:пептид, или где первое средство стимулирует передачу сигнала, связанную с комплексом TCR/CD3, в Т-клетках.
7. Способ по п. 6, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD3.
8. Способ по п. 6 или 7, где вспомогательная молекула на Т-клетке представляет собой CD28 или CD137.
9. Способ по п. 8, где второе средство, которое связывается со вспомогательной молекулой, представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD28 или CD137, или где второе средство представляет собой смесь двух различных типов связывающих реагентов, оба из которых специфически связываются с CD28 или CD137.
10. Способ по любому из пп. 7, 9, где
указанное первое средство, которое специфически связывается с CD3, выбрано из группы, включающей антитело к CD3, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD3, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD3 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD3, и/или где
второе средство, которое специфически связывается с CD28, выбрано из группы, включающей антитело к CD28, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD28, антитело к CD137, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD137, лиганд 4-1ВВ и любую их смесь.
2
11. Способ по п. 10, где бивалентный фрагмент антитела представляет собой (Fab)'-фрагмент или бивалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
12. Способ по п. 10, где моновалентный фрагмент антитела выбран из группы, включающей Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
13. Способ по п. 10, где белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD3, CD28 или CD137, выбрана из группы аптамера, мутантного варианта белка на основе полипептида из семейства липокалинов, аналога антитела на основе глутатион-S-трансферазы, белка на основе анкиринового каркаса, белка на основе кристаллического каркаса, аднектина и авимера.
14. Способ по п. 4, где популяция клеток представляет собой популяцию В-клеток, и первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD40 или CD137.
15. Способ по п. 14, где первый связывающий реагент, который специфически связывается с CD40 или CD137, выбран из группы, включающей антитело к CD40, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD40, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD40 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD40, или антитело к CD137, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD137, и лиганд CD40 (CD154).
2
16. Способ по п. 15, где бивалентный фрагмент антитела представляет собой (Fab)'-фрагмент или бивалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
17. Способ по п. 15, где моновалентный фрагмент антитела выбран из группы, включающей Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
18. Способ по п. 15, где белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD40, или белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD137, выбрана из группы аптамера, мутантного варианта белка на основе полипептида из семейства липокалинов, аналога антитела на основе глутатион-S-трансферазы, белка на основе анкиринового каркаса, белка на основе кристаллического каркаса, аднектина и авимера.
19. Способ по любому из пп. 14-18, где вспомогательная молекула на В-клетке представляет собой CD40.
20. Способ по п. 19, где второе средство представляет собой лиганд CD40 (CD154) или CD137.
21. Способ по любому из пп. 2, 4-7, 9, 11-18, 20, где связывающие участки Z1 и Z2 реагента для мультимеризации являются идентичными.
22. Способ по п. 21, где применяют один реагент для мультимеризации.
23. Способ по любому из пп. 1-2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, где реагент для мультимеризации иммобилизован на твердой поверхности.
24. Способ по п. 23, где твердая поверхность выбрана из группы, включающей магнитную гранулу, полимерную гранулу, планшет для культуры клеток, титрационный микропланшет, мембрану, полое волокно и их комбинации.
25. Способ по п. 24, где реагент для мультимеризации выбран из группы, включающей стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, аналог авидина, который обратимо связывается с биотином, реагент, содержащий по меньшей мере две хелатные группы К, где по меньшей мере две хелатные группы способны к связыванию с ионом переходного металла, тем самым делая компонент А способным к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, мультимерной глутатион-S-трансферазой, мультимерным кальмодулином и биотинилированным белком-носителем.
26. Способ по любому из пп. 1-2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, где реагент для мультимеризации находится в растворимой форме.
27. Способ по п. 26, где реагент для мультимеризации содержит олигомер или полимер стрептавидина, олигомер или полимер авидина, олигомер или полимер аналога стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, олигомер или полимер аналога авидина, который обратимо связывается с биотином, реагент, содержащий по меньшей мере две хелатные группы К, где по меньшей мере две хелатные группы способны к связыванию с ионом переходного металла, тем самым делая реагент способным к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, мультимерной глутатион-S-трансферазой, мультимерным кальмодулином и биотинилированным белком-носителем.
28. Способ по п. 27, где стрептавидин, авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином, сшиты при помощи полисахарида, или где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, получены с помощью сшивания посредством бифункционального линкера.
29. Способ по п. 27 или 28, где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, содержат три или более мономеров стрептавидина.
30. Способ по любому из пп. 1-2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, 24, 25, 27, 28, где
(a) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат биотин, и указанный реагент для мультимеризации содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином,
(b) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным аналогом биотина, или
(c) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
44
45
46
47
44
45
46
47
31. Способ по п. 30, где указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат стрептавидин-связывающий пептид Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys, и указанный реагент для мультимеризации содержит аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Val-Thr-Ala-Arg в положениях 44-47 последовательности стрептавидина дикого типа, или аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Ile-Gly-Ala-Arg в положениях 44-47 последовательности стрептавидина дикого типа.
32. Способ по любому из пп. 1-2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, 24, 25, 27, 28, 31, где связывание между указанными партнером по связыванию С1 и партнером по связыванию С2, соответственно, и указанными связывающими участками Z1 и Z2, соответственно, указанного реагента для мультимеризации происходит в присутствии бивалентного катиона.
33. Способ по п. 32,
где указанные партнер по связыванию С1 и партнер по связыванию С2 независимо друг от друга содержат кальмодулин-связывающий пептид, и указанный реагент для мультимеризации содержит кальмодулин, или
где указанный партнер по связыванию С содержит пептид FLAG, и указанный реагент для мультимеризации содержит антитело, связывающееся с пептидом FLAG, или
где указанный первый партнер по связыванию С содержит олигогистидиновую метку, и указанный реагент для мультимеризации содержит антитело, связывающееся с олигогистидиновой меткой.
34. Способ по п. 11 или 12, где связывание между указанным партнером по связыванию С и указанными связывающими участками Z указанного реагента для мультимеризации разрушают с помощью хелатирования ионов металлов.
35. Способ по п. 34, где хелатирование металлов осуществляют с помощью добавления EDTA или EGTA.
36. Способ по любому из пп. 2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, 24, 25, 27, 28, где партнеры по связыванию С1 и С2 являются различными.
37. Способ по любому из пп. 2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, 24, 25, 27, 28, где партнеры по связыванию С1 и С2 являются идентичными.
38. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 33, 35, дополнительно включающий нарушение связывания между указанным партнером по связыванию С1 первого средства и/или указанным партнером по связыванию С2 второго средства и указанными связывающими участками Z1 и/или Z2 указанного реагента для мультимеризации.
39. Способ по п. 38, где нарушение связывания между указанным партнером по связыванию С1 первого средства и/или указанным партнером по связыванию С2 второго средства и указанными связывающими участками Z1 и/или Z2 указанного реагента для мультимеризации вызывает прекращение стимуляции клеток.
d
-2
-13
40. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 33, 35, 39, где константа диссоциации (K) для обратимого связывания между указанным связывающим участком Z1 и указанным партнером по связыванию С1 и/или для обратимого связывания между указанным связывающим участком Z2 и указанным партнером по связыванию С2 находится в диапазоне от 10 М до 10 М.
41. Способ по любому из пп. 1, 2, 4-7, 9, 11-18, 20, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 33, 35, 39, где указанную обратимую связь между указанным партнером по связыванию С1 первого средства и/или указанным партнером по связыванию С2 второго средства и указанными связывающим участком Z1 и/или связывающим участком Z2 указанного реагента для мультимеризации разрушают с помощью приведения указанной популяции клеток в контакт с первым партнером по связыванию С1 в свободной форме или аналогом указанного первого партнера по связыванию С1, способным к разрушению связи между первым партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, и/или с указанным вторым партнером по связыванию С2 в свободной форме или аналогом указанного второго партнера по связыванию С2, способным к разрушению связи между вторым партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2.
42. Способ по п. 41, где первый партнер в свободной форме и/или второй партнер в свободной форме представляет собой соединение, не являющееся вредным для клеток.
43. Способ по любому из пп. 25, 27, 28, 31, 33, 35, 39, 42, где обратимую связь разрушают с помощью приведения клеток в контакт с биотином или аналогом биотина, если
(a) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат биотин, и указанный реагент для мультимеризации содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином,
(b) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным аналогом биотина, или
(с) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
44. Способ по любому из пп. 25, 27, 28, 31, 33, 35, 39, где обратимую связь разрушают с помощью приведения клеток в контакт с металлохелатором, если связывание между указанными партнером по связыванию С1 и партнером по связыванию С2, соответственно, и указанными связывающими участками Z1 и Z2, соответственно, указанного реагента для мультимеризации происходит в присутствии бивалентного катиона.
45. Способ размножения популяции клеток in vitro, включающий приведение образца, содержащего популяцию клеток, в контакт с реагентом для мультимеризации,
где реагент для мультимеризации находится в растворимой форме и на нем иммобилизовано (связано с ним) первое средство, которое передает первичный активационный сигнал клеткам;
где реагент для мультимеризации содержит по меньшей мере один связывающий участок Z1 для связывания первого средства,
где первое средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С1, где партнер по связыванию С1 способен связываться со связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации посредством связи, образующейся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, и
где первое средство связывается с рецепторной молекулой на поверхности клеток, передавая тем самым первичный активационный сигнал клеткам и активируя тем самым клетки.
46. Способ по п. 45, где на средстве для мультимеризации иммобилизовано (связано с ним) второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток,
где второе средство содержит партнера по связыванию С2, где партнер по связыванию С2 способен связываться со связывающим участком Z2 реагента для мультимеризации, где второе средство связано с реагентом для мультимеризации посредством связи, образующейся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2,
где второе средство связывается со вспомогательной молекулой на поверхности клеток, стимулируя тем самым активированные клетки.
47. Способ по п. 45 или 46, где связь, образующаяся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, является необратимой, и/или связь, образующаяся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2, является необратимой.
48. Способ по п. 45 или 46, где связь, образующаяся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, является обратимой, и/или связь, образующаяся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2, является обратимой.
d
-2
-13
49. Способ по п. 48, где константа диссоциации (K) для обратимого связывания между указанным связывающим участком Z1 и указанным партнером по связыванию С1 и/или для обратимого связывания между указанным связывающим участком Z2 и указанным партнером по связыванию С2 находится в диапазоне от 10 М до 10 М.
50. Способ по любому из пп. 45, 46, 49, где популяция клеток представляет собой популяцию лимфоцитов.
51. Способ по п. 50, где популяция лимфоцитов представляет собой популяцию В-клеток, популяцию Т-клеток или популяцию естественных клеток-киллеров.
52. Способ по п. 51, где популяция Т-клеток представляет собой популяцию антиген-специфических Т-клеток, популяцию Т-клеток-хелперов, популяцию цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти, регуляторных Т-клеток или естественных Т-клеток-киллеров.
53. Способ по п. 52, где первое средство содержит комплекс МНС-I:пептид, или где первое средство стимулирует передачу сигнала, связанную с комплексом TCR/CD3, в Т-клетках.
54. Способ по п. 53, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD3.
55. Способ по п. 53 или 54, где вспомогательная молекула на Т-клетке представляет собой CD28.
56. Способ по п. 55, где второе средство, которое связывается со вспомогательной молекулой, представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD28.
57. Способ по любому из пп. 54, 56, где
указанный первый связывающий реагент, который специфически связывается с CD3, выбран из группы, включающей антитело к CD3, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD3, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD3 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD3, и/или где
второе средство, которое специфически связывается с CD28, выбрано из группы, включающей антитело к CD28, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD28 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD28.
2
58. Способ по п. 57, где бивалентный фрагмент антитела представляет собой (Fab)'-фрагмент или бивалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
59. Способ по п. 57, где моновалентный фрагмент антитела выбран из группы, включающей Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
60. Способ по п. 59, где белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD3 или CD28, выбрана из группы аптамера, мутантного варианта белка на основе полипептида из семейства липокалинов, аналога антитела на основе глутатион-8-трансферазы, белка на основе анкиринового каркаса, белка на основе кристаллического каркаса, аднектина и авимера.
61. Способ по п. 51, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD40 или CD137.
62. Способ по п. 61, где первый связывающий реагент, который специфически связывается с CD40 или CD137, выбран из группы, включающей антитело к CD40, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD40, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD40 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD40, или антитело к CD137, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD137 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD137.
2
63. Способ по п. 62, где бивалентный фрагмент антитела представляет собой (Fab)'-фрагмент или бивалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
64. Способ по п. 62, где моновалентный фрагмент антитела выбран из группы, включающей Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
65. Способ по п. 62, где белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD40, или белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD137, выбрана из группы аптамера, мутантного варианта белка на основе полипептида из семейства липокалинов, аналога антитела на основе глутатион-S-трансферазы, белка на основе анкиринового каркаса, белка на основе кристаллического каркаса, аднектина и авимера.
66. Способ по любому из пп. 51 и 61-65, где вспомогательная молекула на В-клетке представляет собой CD40.
67. Способ по п. 66, где второе средство представляет собой лиганд CD40 (CD154) или CD137.
68. Набор реагентов для размножения популяции клеток, при этом набор содержит
(i) реагент для мультимеризации,
где реагент для мультимеризации содержит по меньшей мере один связывающий участок Z для обратимого связывания первого средства,
(ii) первое средство, которое связывается с рецепторной молекулой на поверхности клеток, передавая тем самым первичный активационный сигнал клеткам и активируя тем самым клетки,
где первое средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С1, где партнер по связыванию С1 способен обратимо связываться со связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации посредством обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, и
(iii) второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток,
где второе средство содержит партнера по связыванию С2, где партнер по связыванию С2 способен обратимо связываться со связывающим участком Z2 реагента для мультимеризации, где второе средство связано с реагентом для мультимеризации посредством связи, образующейся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2,
где второе средство связывается со вспомогательной молекулой на поверхности клеток, стимулируя тем самым активированные клетки.
69. Набор по п. 68, где популяция клеток представляет собой популяцию лимфоцитов.
70. Набор по п. 69, где популяция лимфоцитов представляет собой популяцию В-клеток, популяцию Т-клеток или популяцию естественных клеток-киллеров.
71. Набор по п. 70, где популяция Т-клеток представляет собой популяцию антиген-специфических Т-клеток, популяцию Т-клеток-хелперов, популяцию цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти, регуляторных Т-клеток или естественных Т-клеток-киллеров.
72. Набор по любому из пп. 68-71, где первое средство содержит комплекс МНС-I:пептид, или где первое средство стимулирует передачу сигнала, связанную с комплексом TCR/CD3, в Т-клетках.
73. Набор по п. 72, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD3.
74. Набор по любому из пп. 71, 73, где вспомогательная молекула на Т-клетке представляет собой CD28.
75. Набор по п. 74, где второе средство, которое связывается со вспомогательной молекулой, представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD28.
76. Набор по любому из пп. 73, 75, где
указанный первый связывающий реагент, который специфически связывается с CD3, выбран из группы, включающей антитело к CD3, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD3, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD3 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD3, и/или где
второе средство, которое специфически связывается с CD28, выбрано из группы, включающей антитело к CD28, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD28 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD28.
77. Набор по п. 68, где средство для мультимеризации иммобилизовано на твердой поверхности.
78. Набор по п. 77, где твердая поверхность выбрана из группы, включающей магнитную гранулу, полимерную гранулу, планшет для культуры клеток, титрационный микропланшет, мембрану, полое волокно и их комбинации.
79. Набор по п. 78, где реагент для мультимеризации представляет собой реагент для мультимеризации, выбранный из группы, включающей стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, аналог авидина, который обратимо связывается с биотином, реагент, содержащий по меньшей мере две хелатные группы К, где по меньшей мере две хелатные группы способны к связыванию с ионом переходного металла, тем самым делая компонент А способным к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, мультимерной глутатион-S-трансферазой, мультимерным кальмодулином и биотинилированным белком-носителем.
80. Набор по п. 68, где реагент для мультимеризации находится в растворимой форме.
81. Набор по любому из пп. 69-71 или пп. 73, 75, 77-79, 80, где реагент для мультимеризации выбран из группы, включающей стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, аналог авидина, который обратимо связывается с биотином, реагент, содержащий по меньшей мере две хелатные группы К, где по меньшей мере две хелатные группы способны к связыванию с ионом переходного металла, тем самым делая реагент способным к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, мультимерной глутатион-S-трансферазой, мультимерным кальмодулином и биотинилированным белком-носителем.
82. Набор по п. 81, где стрептавидин, авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином, сшиты при помощи полисахарида, или где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, получены с помощью сшивания посредством бифункционального линкера.
83. Набор реагентов для размножения популяции клеток, при этом набор содержит
(i) реагент для мультимеризации,
где реагент для мультимеризации находится в растворимой форме и содержит по меньшей мере один связывающий участок Z для обратимого связывания первого средства,
(ii) первое средство, которое связывается с рецепторной молекулой на поверхности клеток, передавая тем самым первичный активационный сигнал клеткам и активируя тем самым клетки,
где первое средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С1, где партнер по связыванию С1 способен связываться со связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации посредством обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1.
84. Набор реагентов по п. 83, дополнительно содержащий:
(iii) второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток,
где второе средство содержит партнера по связыванию С2, где партнер по связыванию С2 способен связываться со связывающим участком Z2 реагента для мультимеризации, где второе средство связано с реагентом для мультимеризации посредством связи, образующейся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2.
85. Набор по любому из пп. 83-84, где популяция клеток представляет собой популяцию лимфоцитов.
86. Набор по п. 85, где популяция лимфоцитов представляет собой популяцию В-клеток, популяцию Т-клеток или популяцию естественных клеток-киллеров.
87. Набор по п. 86, где популяция Т-клеток представляет собой популяцию антиген-специфических Т-клеток, популяцию Т-клеток-хелперов, популяцию цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти, регуляторных Т-клеток или естественных Т-клеток-киллеров.
88. Набор по любому из пп. 83-84, 86-87, где первое средство содержит комплекс МНС-I:пептид, или где первое средство стимулирует передачу сигнала, связанную с комплексом TCR/CD3, в Т-клетках.
89. Набор по п. 88, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD3.
90. Набор по любому из пп. 87, 89, где вспомогательная молекула на Т-клетке представляет собой CD28.
91. Набор по п. 90, где второе средство, которое связывается со вспомогательной молекулой, представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD28.
92. Набор по любому из пп. 89, 91, где
указанный первый связывающий реагент, который специфически связывается с CD3, выбран из группы, включающей антитело к CD3, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD3, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD3 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD3, и/или где
второе средство, которое специфически связывается с CD28, выбрано из группы, включающей антитело к CD28, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD28 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD28.
93. Набор по любому из пп. 83-84, 86-87, 89, 91, где реагент для мультимеризации выбран из группы, включающей стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, аналог авидина, который обратимо связывается с биотином, реагент, содержащий по меньшей мере две хелатные группы К, где по меньшей мере две хелатные группы способны к связыванию с ионом переходного металла, тем самым делая реагент способным к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, мультимерной глутатион-S-трансферазой, мультимерным кальмодулином и биотинилированным белком-носителем.
94. Набор по п. 93, где стрептавидин, авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином, сшиты при помощи полисахарида, или где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, получены с помощью сшивания посредством бифункционального линкера.
95. Способ серийного размножения популяции лимфоцитов in vitro, где популяция лимфоцитов содержит Т-клетки, при этом способ включает:
приведение образца, который содержит популяцию лимфоцитов, содержащую Т-клетки, в контакт с реагентом для мультимеризации,
где реагент для мультимеризации находится в растворимой форме, и на нем обратимо иммобилизовано (i) первое средство, которое передает первичный активационный сигнал Т-клеткам, и (ii) второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности Т-клеток,
где реагент для мультимеризации содержит по меньшей мере один связывающий участок Z1 для обратимого связывания первого средства,
где первое средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С1, причем партнер по связыванию С1 способен обратимо связываться со связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации посредством обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1,
где реагент для мультимеризации содержит по меньшей мере один связывающий участок Z2 для обратимого связывания второго средства,
где второе средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С2, причем партнер по связыванию С2 способен обратимо связываться со связывающим участком Z2 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации посредством обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2,
где первое средство связывается с рецепторной молекулой на поверхности Т-клеток, передавая тем самым первичный активационный сигнал клеткам и активируя тем самым Т-клетки,
где второе средство связывается со вспомогательной молекулой на поверхности Т-клеток, стимулируя тем самым активированные клетки, при этом первое средство и второе средство тем самым совместно индуцируют размножение Т-клеток.
96. Способ по п. 95, где приведение образца, который содержит популяцию лимфоцитов, содержащую Т-клетки, в контакт с реагентом для мультимеризации, на котором иммобилизованы первое и второе средство, приводит к специфичному связыванию Т-клеток с реагентом для мультимеризации.
97. Способ по п. 95 или 96, дополнительно включающий разделение Т-клеток, связанных со средством для мультимеризации, и несвязанных клеток из популяции лимфоцитов.
98. Способ по любому из пп. 95-96, где приведение образца, который содержит популяцию лимфоцитов, содержащую Т-клетки, в контакт с реагентом для мультимеризации, на котором иммобилизованы первое и второе средство, осуществляют в биореакторе, таком как культуральный планшет, половолоконный биореактор или биореактор в виде пластикового мешка.
99. Способ по любому из пп. 95-96, дополнительно включающий приведение популяции лимфоцитов (реакционной смеси, содержащей Т-клетки, связанные с реагентом для мультимеризации с помощью первого средства и второго средства) в контакт с (i) первым партнером по связыванию С1 в свободной форме или его аналогом, способным к разрушению связи между первым партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, и (ii) вторым партнером по связыванию С2 в свободной форме или его аналогом, способным к разрушению связи между вторым партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2,
где указанную обратимую связь между указанным партнером по связыванию С1 первого средства и указанными связывающими участками Z1, а также обратимую связь между указанным партнером по связыванию С2 второго средства и указанным связывающим участком Z2 указанного реагента для мультимеризации разрушают с отделением тем самым Т-клеток от растворимого реагента для мультимеризации, а также первого средства и второго средства и остановкой размножения Т-клеток.
100. Способ по п. 99, включающий сбор элюата, который содержит отделенные Т-клетки, растворимый реагент для мультимеризации, первое средство и/или второе средство, партнера по связыванию С1 в свободной форме или его аналог и партнера по связыванию С2 в свободной форме или его аналог.
101. Способ по любому из пп. 95, 96, 100, где связывающие участки Z1 и Z2 реагента для мультимеризации являются идентичными.
102. Способ по п. 101, где применяют один реагент для мультимеризации.
103. Способ по любому из пп. 100, 102, дополнительно включающий проведение в отношении элюата хроматографии на подходящей неподвижной фазе, при этом неподвижная фаза представляет собой матрицу для гель-фильтрации и/или матрицу для аффинной хроматографии, где матрица для гель-фильтрации и/или аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, где аффинный реагент содержит связывающий участок Z1 и/или Z2, с которым специфически связывается партнер по связыванию С1 и/или С2, содержащийся в первом средстве или втором средстве, с иммобилизацией тем самым первого средства, второго средства, первого партнера по связыванию С1 или его аналога и/или второго партнера по связыванию С2 в свободной форме или его аналога на неподвижной фазе.
104. Способ по любому из пп. 95, 96, 100, 102, где неподвижная фаза находится в жидкостном соединении с биореактором.
105. Способ по п. 104, где разделяют Т-клетки и растворимый реагент для мультимеризации.
106. Способ по п. 104, где смесь, содержащую Т-клетки и реагент для мультимеризации, подвергают хроматографии на подходящей неподвижной фазе, при этом неподвижная фаза представляет собой матрицу для гель-фильтрации и/или матрицу для аффинной хроматографии, где матрица для гель-фильтрации и/или аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, где аффинный реагент содержит партнера по связыванию D, который (специфически) связывается со связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации с иммобилизацией тем самым реагента для мультимеризации на неподвижной фазе.
107. Способ по любому из пп. 95, 96, 100, 102, 105, 106, где первое средство стимулирует передачу сигнала, связанную с комплексом TCR/CD3, в Т-клетках.
108. Способ по п. 107, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD3.
109. Способ по любому из пп. 95, 96, 100, 102, 105, 106, 108, где вспомогательная молекула на Т-клетке представляет собой CD28.
110. Способ по п. 109, где второе средство, которое связывается со вспомогательной молекулой, представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD28.
111. Способ по любому из пп. 108, 110, где
указанное первое средство, которое специфически связывается с CD3, выбрано из группы, включающей антитело к CD3, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD3, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD3 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD3, и/или где
второе средство, которое специфически связывается с CD28, выбрано из группы, включающей антитело к CD28, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD28 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD28.
2
112. Способ по п. 111, где бивалентный фрагмент антитела представляет собой (Fab)'-фрагмент или бивалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
113. Способ по п. 112, где моновалентный фрагмент антитела выбран из группы, включающей Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
114. Способ по любому из пп. 95, 96, 100, 102, 105, 106, 108, 110, 112, 113, где реагент для мультимеризации содержит олигомер или полимер стрептавидина, олигомер или полимер авидина, олигомер или полимер аналога стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, олигомер или полимер аналога авидина, который обратимо связывается с биотином.
115. Способ по п. 114, где стрептавидин, авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином, сшиты при помощи полисахарида, или где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, получены с помощью сшивания посредством бифункционального линкера.
116. Способ по п. 115, где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, содержат три или более мономеров стрептавидина.
117. Способ по любому из пп. 95, 96, 100, 102, 105, 106, 108, 110, 112, 113, 115, 116, где
(a) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат биотин, и указанный реагент для мультимеризации содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином,
(b) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным аналогом биотина, или
(c) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
44
45
46
47
44
45
46
47
118. Способ по п. 117, где указанный партнер по связыванию С содержит стрептавидин-связывающий пептид Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys, и указанный реагент для мультимеризации содержит аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Val-Thr-Ala-Arg в положениях 44-47 последовательности стрептавидина дикого типа, или аналог стрептавидина, содержащий аминокислотную последовательность Ile-Gly-Ala-Arg в положениях 44-47 последовательности стрептавидина дикого типа.
d
-2
-13
119. Способ по любому из пп. 95, 96, 100, 102, 105, 106, 108, 110, 112, 113,115, 116, 118, где константа диссоциации (K) для обратимого связывания между указанным связывающим участком Z1 и указанным партнером по связыванию С1 и/или для обратимого связывания между указанным связывающим участком Z2 и указанным партнером по связыванию С2 находится в диапазоне от 10 М до 10 М.
120. Способ по любому из пп. 100, 102, 105, 106, 108, 110, 112, 113, 115, 116, 118, где первый партнер в свободной форме и/или второй партнер в свободной форме представляет собой соединение, не являющееся вредным для клеток.
121. Способ по п. 120, где обратимую связь разрушают с помощью приведения клеток в контакт с биотином или аналогом биотина.
122. Способ по любому из пп. 105, 106, 108, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 121, где Т-клеточный рецептор или химерный антигенный рецептор вводят в Т-клетки после размножения или в ходе размножения.
123. Способ по п. 122, где Т-клетки стимулируют третьим средством, которое связывается с введенным Т-клеточным рецептором или химерным антигенным рецептором.
124. Способ по любому из пп. 95-96, 100, 102, 105, 106, 108, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 121, 123, где популяция лимфоцитов, содержащая Т-клетки, представляет собой популяцию мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или обогащенную или очищенную популяцию Т-клеток.
125. Система из биореактора и (первой) неподвижной фазы для хроматографии,
где биореактор подходит для размножения клеток,
где (первая) неподвижная фаза подходит для разделения клеток и удаления реагентов,
при этом неподвижная фаза представляет собой матрицу для гель-фильтрации и/или матрицу для аффинной хроматографии, где матрица для гель-фильтрации и/или аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, где аффинный реагент содержит связывающий участок Z1, с которым специфически связывается партнер по связыванию С1, содержащийся в первом средстве, и/или аффинный реагент содержит связывающий участок Z2, с которым специфически связывается партнер по связыванию С2, содержащийся во втором средстве, и тем самым подходит для иммобилизации на неподвижной фазе первого средства и/или второго средства, первого партнера по связыванию С1 и/или второго партнера по связыванию С2 в свободной форме,
где биореактор и неподвижная фаза находятся в жидкостном соединении.
126. Система по п. 125, где первая неподвижная фаза содержится в хроматографической колонке или представляет собой плоскую неподвижную фазу.
127. Система по п. 126, дополнительно содержащая вторую неподвижную фазу, при этом вторая неподвижная фаза находится в жидкостном соединении с первой неподвижной фазой.
128. Система по п. 127, где вторая неподвижная фаза представляет собой матрицу для гель-фильтрации и/или матрицу для аффинной хроматографии, где матрица для гель-фильтрации и/или аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, где аффинный реагент содержит партнера по связыванию D, который (специфически) связывается со связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации и тем самым подходит для иммобилизации реагента для мультимеризации на неподвижной фазе.
129. Система по п. 128, где вторая неподвижная фаза и биореактор находятся в жидкостном соединении друг с другом.
130. Устройство для очистки и размножения целевых клеток, при этом устройство содержит по меньшей мере одну систему из биореактора и по меньшей мере одной неподвижной фазы для хроматографии по любому из пп. 125-129.
131. Устройство по п. 130, содержащее входной канал для образца, находящийся в жидкостном соединении с биореактором системы из биореактора и по меньшей мере одной неподвижной фазы для хроматографии.
132. Устройство по любому из п. 130 или 131, содержащее выходной канал для образца очищенных и размножившихся целевых клеток, при этом выходной канал для образца находится в жидкостном соединении с неподвижной фазой системы из биореактора и по меньшей мере одной неподвижной фазы для хроматографии.
133. Устройство по любому из пп. 130-131, где устройство представляет собой функционально закрытую систему.
134. Реагент для мультимеризации, способный к обеспечению размножения популяции клеток,
где реагент для мультимеризации находится в растворимой форме и содержит по меньшей мере один связывающий участок Z1 для обратимого связывания первого средства, которое передает первичный активационный сигнал клеткам, где на реагенте для мультимеризации обратимо иммобилизовано (связано с ним) указанное первое средство, которое передает первичный активационный сигнал клеткам;
где первое средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С1, где партнер по связыванию С1 способен обратимо связываться по меньшей мере с одним связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации с помощью обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1.
135. Реагент для мультимеризации по п. 134,
где реагент для мультимеризации дополнительно содержит по меньшей мере один связывающий участок Z2 для обратимого связывания второго средства, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток, где на реагенте для мультимеризации обратимо иммобилизовано (связано с ним) указанное второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток,
где второе средство содержит партнера по связыванию С2, где партнер по связыванию С2 способен связываться по меньшей мере с одним связывающим участком Z2 реагента для мультимеризации, где второе средство связано с реагентом для мультимеризации посредством связи, образующейся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2.
136. Реагент для мультимеризации по п. 134 или 135, где реагент для мультимеризации способен к обеспечению размножения популяции лимфоцитов.
137. Реагент для мультимеризации по п. 136, где подлежащая размножению популяция лимфоцитов представляет собой популяцию В-клеток, популяцию Т-клеток или популяцию естественных клеток-киллеров.
138. Реагент для мультимеризации по п. 137, где популяция Т-клеток представляет собой популяцию антиген-специфических Т-клеток, популяцию Т-клеток-хелперов, популяцию цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти, регуляторных Т-клеток или естественных Т-клеток-киллеров.
139. Реагент для мультимеризации по п. 138, где первое средство содержит комплекс МНС-I:пептид или стимулирует передачу сигнала, связанную с комплексом TCR/CD3, в Т-клетках.
140. Реагент для мультимеризации по п. 139, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD3.
141. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 135, 137-140, где второе средство, которое связывается со вспомогательной молекулой, представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD28 или CD137.
142. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 139-140, где
указанное первое средство, которое специфически связывается с CD3, выбрано из группы, включающей антитело к CD3, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD3, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD3 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD3, и где
второе средство, которое специфически связывается с CD28 или CD137, выбрано из группы, включающей антитело к CD28, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD28, белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD28, антитело к CD137, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD137, лиганд 4-1ВВ и любую их смесь.
2
143. Реагент для мультимеризации по п. 142, где бивалентный фрагмент антитела представляет собой (Fab)'-фрагмент или бивалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
144. Реагент для мультимеризации по п. 142, где моновалентный фрагмент антитела выбран из группы, включающей Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
145. Реагент для мультимеризации по п. 144, где белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD3, CD28 или CD137, выбрана из группы аптамера, мутантного варианта белка на основе полипептида из семейства липокалинов, аналога антитела на основе глутатион-S-трансферазы, белка на основе анкиринового каркаса, белка на основе кристаллического каркаса, аднектина и авимера.
146. Реагент для мультимеризации по п. 137, где первое средство представляет собой связывающий реагент, который специфически связывается с CD40 или CD137, и где популяция клеток представляет собой популяцию В-клеток.
147. Реагент для мультимеризации по п. 146, где первый связывающий реагент, который специфически связывается с CD40 или CD137, выбран из группы, включающей антитело к CD40, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD40, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD40 и белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD40, или антитело к CD137, бивалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, моновалентный фрагмент антитела из антитела к CD137, белковую молекулу с антителоподобными свойствами связывания, связывающуюся с CD137, и лиганд CD40 (CD154).
2
148. Реагент для мультимеризации по п. 147, где бивалентный фрагмент антитела представляет собой (Fab)'-фрагмент или бивалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.
149. Реагент для мультимеризации по п. 147, где моновалентный фрагмент антитела выбран из группы, включающей Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
150. Реагент для мультимеризации по п. 147, где белковая молекула с антителоподобными свойствами связывания, связывающаяся с CD40, или белковая молекула, связывающаяся с CD137, выбрана из группы аптамера, мутантного варианта белка на основе полипептида из семейства липокалинов, аналога антитела на основе глутатион-S-трансферазы, белка на основе анкиринового каркаса, белка на основе кристаллического каркаса, аднектина и авимера.
151. Реагент для мультимеризации по п. 137, где вспомогательная молекула на В-клетке представляет собой CD40, или CD137, или их смесь.
152. Реагент для мультимеризации по п. 151, где второе средство представляет собой лиганд CD40 (CD154), CD137 или их смесь, и популяция клеток представляет собой популяцию В-клеток.
153. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 135, 137-140, 143-152, где связывающие участки Z1 и Z2 реагента для мультимеризации являются идентичными.
154. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 135, 137-140, 143-152, где реагент для мультимеризации содержит олигомер или полимер стрептавидина, олигомер или полимер авидина, олигомер или полимер аналога стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, олигомер или полимер аналога авидина, который обратимо связывается с биотином, реагент, содержащий по меньшей мере две хелатные группы К, где по меньшей мере две хелатные группы способны к связыванию с ионом переходного металла, тем самым делая реагент способным к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, мультимерной глутатион-S-трансферазой, мультимерным кальмодулином и биотинилированным белком-носителем.
155. Реагент для мультимеризации по п. 154, где стрептавидин, авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином, сшиты при помощи полисахарида, или где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, получены с помощью сшивания посредством бифункционального линкера.
156. Реагент для мультимеризации по п. 155, где сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина, авидина или аналога стрептавидина или авидина, которые обратимо связываются с биотином, содержат три или более мономеров стрептавидина.
157. Реагент для мультимеризации по любому из пп. 134, 135, 137-140, 143-152, 155, 156, где
(a) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат биотин, и указанный реагент для мультимеризации содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, которые обратимо связываются с биотином,
(b) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным аналогом биотина, или
(c) указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и указанный реагент для мультимеризации содержит стрептавидин, или авидин, или аналог стрептавидина, или аналог авидина, которые обратимо связываются с указанным стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
44
45
46
47
44
45
46
47
158. Реагент для мультимеризации по п. 157, где указанные партнеры по связыванию С1 и С2 независимо друг от друга содержат стрептавидин-связывающий пептид Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys, и указанный реагент для мультимеризации содержит аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Val-Thr-Ala-Arg в положениях 44-47 последовательности стрептавидина дикого типа, или аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Ile-Gly-Ala-Arg в положениях 44-47 последовательности стрептавидина дикого типа.
159. Композиция, способная к обеспечению размножения популяции клеток, содержащая:
(i) первый реагент для мультимеризации,
где первый реагент для мультимеризации находится в растворимой форме и содержит по меньшей мере один связывающий участок Z1 для обратимого связывания первого средства, которое передает первичный активационный сигнал клеткам,
где на первом реагенте для мультимеризации обратимо иммобилизовано (связано с ним) указанное первое средство, которое передает первичный активационный сигнал клеткам;
где первое средство содержит по меньшей мере одного партнера по связыванию С1, где партнер по связыванию С1 способен обратимо связываться по меньшей мере с одним связывающим участком Z1 реагента для мультимеризации, где первое средство связано с реагентом для мультимеризации посредством обратимой связи, образующейся между партнером по связыванию С1 и связывающим участком Z1, и
(ii) второй реагент для мультимеризации,
где второй реагент для мультимеризации находится в растворимой форме и содержит по меньшей мере один связывающий участок Z2 для обратимого связывания второго средства, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток,
где на реагенте для мультимеризации обратимо иммобилизовано (связано с ним) указанное второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток,
где второе средство содержит партнера по связыванию С2, где партнер по связыванию С2 способен связываться по меньшей мере с одним связывающим участком Z2 реагента для мультимеризации, где второе средство связано с реагентом для мультимеризации посредством связи, образующейся между партнером по связыванию С2 и связывающим участком Z2.