ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ОЛИГОПЕПТИДЫ
IMMUNOMODULATING OLIGOPEPTIDES

Изобретение принадлежит к областииммунологии, а именно относится к иммуномодулирующим олигопептидам.
Исследования биологически активных коротких полипептидных последовательностей (олигопептидов) начались с конца 1970-х, когда были обнаружены первые создаваемые тимусом пептиды, влияющие на иммунную систему.
37
34
-
Один такой пептид представляет собой трипептид Tyr-Gly-Gly (YGG) (также известный под названием Imreg; патент США 4699898), который является слабым тимомиметиком. Другими примерами являются Tuftsin (также называемый Tafcin) и его близкий аналог Rigin, с последовательностью Thr-Lys-Pro-Arg (TKPR) и Gly-Gln-Pro-Arg (GQPR), соответственно, см., например, Biondi и другие, Int. J. Int. J. Peptide Protein Res. , 112121, 1991 и Verdini и другие, J. Med. Chem. , 3372-3379, 1991. Tuftsinи его аналоги представляют собой фрагменты иммуноглобулина G (IgG), например, найденные в составе тяжелой цепи лейкокинина. Tuftsin является известным активатором макрофагов и, как известно, стимулирует активность природных киллеров (NK). Другие фрагменты представляют собой пентапептид тимопентин, Arg-Lys-Asp-Val-Tyr (RKDVY) или его тетрапептид Arg-Lys-Asp-Val (RKDV) и его аналог спленопептин Arg-Lys-Glu-Val-Туг (RKEVY) (США 5091510; Audhya и другие, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2847-2849, 1984). Они являются тимомиметиками слабой активности, вызывающими фенотипическую дифференциацию T-клеток и увеличивающими выработку интерлейкина 2 (IL-2). Из коричневых морских водорослей выделяют eisenin, L-pyroGlu-L-Gln-L-Ala (Kojima и другие, J. Immunother. 13, 36-42, 1993), который показывает иммунологическую активность, увеличивающую природную цитотоксичность периферийных лимфоцитов крови (PBLs) человека.
1
2
3
4
1
2
3
4
2
1-6
Олигопептиды, согласно общей схеме X-R-R-R-R-Y, в которой X выбирают из группы, состоящей из H или ацетила; R выбирают из группы, состоящей из D- или L-лизина, аргинина, орнитина и гистидина; R выбирают из группы, состоящей из D- или L-аспарагина, аланина, пролина, глутамина, серина, треонина и валина; R выбирают из группы, состоящей из D- или L-пролина, аланина, аспарагина, глутамина, серина, треонина, валина и глицина; R выбирают из группы, состоящей из D- или L-тирозина, цистеина, серина, треонина, фенилаланина, триптофана и гистидина; и Y выбирают из группы, состоящей из ОH, NH и OCалкила, описывают в Патенте США 5980913, где, в частности, упоминают несколько пептидов, включающих последовательность (D, L)Lys-Asn/Gln-Pro/Gly-Tyr (K[N/Q][P/G]Y). Эти пептиды показали, что являются эффективными при лечении иммунодифицита.
Кроме того, были описаны дипептид Glu-Trp (EW, Timogen) и трипептид или тетрапептид X-Glu-Trp-Y, в котором X и Y могут быть в основном всеми природными аминокислотами (WO 89/06134; WO 93/08815 и US 6159940). Из них трипептид Ile-Glu-Trp (IEW), также называемый Neogen, использовали в терапии для лечения иммунных и/или кровообразующих нарушений.
Несколько олигопептидов, среди которых имеются вышеупомянутые, которые, как известно, имеют биологическую функцию, перечислены в Таблице 1. Они могут быть разделены на три главных группы по их происхождению:
1. Выделяются из тимуса, селезенки или миелоидных тканей, которые являются, по-видимому, пептидами, которые применяют в иммунной системе при различных стадиях роста иммунной клетки и функциональной дифференциации.
2. Продукты деградации белка (такого как из казеинового молока, иммуноглобулинов и т.д.), которые обладают иммуномодулирующими функциями, как правило, связанными с функциями макрофагов.
3. Нейромодулирующие пептиды, которые через сложные взаимодействия между иммунной и неврологической системами влияют на иммунологические реакции организма.
Исторически, направление развития таких соединений было основано и все еще в значительной степени основывается на поиске и дальнейшем развитии пептидов природного происхождения с биологической активностью. Некоторые попытки создания коротких биологических пептидов были сделаны несколькими исследовательскими группами, пытающимися идентифицировать самые короткие функциональные фрагменты в цитокинах, адгезивных белках и некоторых поверхностных рецепторах.
Кроме этого, сейчас была предпринята попытка выполнить обширный скрининг олигопептидов, демонстрирующих необходимые биологические свойства. Предполагается, что все еще существует потребность в альтернативных пептидных иммуномодуляторах.
Сущность изобретения
В ходе программы скрининга настоящие изобретатели нашли новый класс иммуноактивных олигопептидов.
Таким образом, изобретение относится к олигопептиду, который представляет собой трипептид общей формулой X-Pro-Tyr (X-P-Y), в которой X может быть выбран из группы, состоящей из Ile (I), Val (V), Ala (A), Trp (W), Pro (P), Leu (L),Phe (F), Gly (G), Glu (E) и Asn (N), в которой все аминокислоты могут быть в D- или L-конфигурации. В частности, предпочтительным является олигопептид I-P-Y.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к олигопептиду, включающему при N-конце вышеупомянутый трипептид.
В частности, изобретение относят к олигопептиду, выбранному из группы, состоящей из:
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
IPYKTTKS, KTTKSIPY, IPYVGVAPG, VGVAPGIPY, IPYVGV, VGVIPY, IPYIEW, IEWIPY, EWIPY, IPYKE, KEIPY, IPYKPR, KPRIPY, IPYTEPR, TEPRIPY, IPYKD, KDIPY, IPYKNPY, KNPYIPY, IPYKNPW, KNPWIPY, IPYTKPR, IPYGQPR, IPYTAEEK, IPYALTTE, IPYRKEVY, GPAIPY, KDIPIPY, TQPIPY, GQPIPY, TAEIPY, ALTIPY, RKEIPY, IPYEKX EKXIPY, IPYXEK XEKIPY, IPYEWX, EWXIPY IPYXVY, XVYIPY, IPYXPY, XPYIPY, IPYPRX, и PRXIPY, в которых Xвыбирают из группы, состоящей из A, V, G, I, P, W, F, N, Q, T, R, K, E, D и Y. В частности, предпочтительным является олигопептид IEWIPY.
В другом варианте осуществления вышеупомянутые олигопептиды ацетилируются по N-концу, конъюгируются с пальмитиновой кислотой или представляют собой пальмитиновые кислоты вышеупомянутых олигопептидов.
Вышеупомянутые олигопептиды согласно настоящему изобретению или конъюгат согласно настоящему изобретению полезны в терапии, предпочтительно при активации T-клеток и/или стимулировании выделения цитокинов, и/или увеличении T-клеточной гуморальной зависимости и/или клеточного иммунного ответа, и/или ингибировании аутоиммунных ответов.
Другим вариантом осуществления является фармацевтическая композиция, включающая олигопептид или конъюгат согласно настоящему изобретению и фармацевтически подходящий носитель. Эта фармацевтическая композиция может быть использована в тех же терапевтических целях, как упомянуто выше.
С другой стороны, это изобретение включает применение олигопептида или конъюгата согласно настоящему изобретению для получение лекарственного средства для использования в качестве иммуномодулятора, предпочтительно для использования при активации T-клеток и/или стимулировании выделения цитокинов, и/или увеличении T-клеточной гуморальной зависимости и/или клеточного иммунного ответа, и/или ингибировании аутоиммунных ответов. Также вакцину, включающую олигопептид или конъюгат настоящего изобретения, включают в изобретение.
Также часть изобретения представляет собой способ улучшения иммуногенности вакцины при добавлении фармацевтической композиции изобретения к вышеупомянутой вакцине.
Дополнительной частью настоящего изобретения является способ лечения млекопитающего животного с фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, в котором вышеупомянутое млекопитающее животное предпочтительно выбирают из группы, состоящей из людей, рогатого скота, свиней, овец, собак, котов и животных зоопарка.
В другом варианте осуществления изобретение содержит способ для придания пептиду свойства иммунореактивности или увеличения иммунореактивности пептида при объединении вышеупомянутого пептида с пептидом настоящего изобретения.
Описание фигур
Фиг.1 показывает влияние В134 (трипептид Ile-Pro-Tyr; темно-серая линия) и B211 (олигопептид IEWIPY, светло-серая линия) на концентрацию иммуноглобулина (соответственно IgG1, IgG2a, IgG2b и IgM) в сыворотке мыши после иммунизации по сравнению с контролем (черная линия).
Фиг.2 показывает изменения в экспрессии иммунного ответа родственных генов (интерлeйкины, цитокины и рецепторы цитокина) в результате совакцинации либо с В134 (темно-серые столбцы) либо B211 (светло-серые столбцы). Контрольная экспрессия устанавливается при 0.
Подробное описание изобретения
Олигопептид согласно настоящему изобретению представляет собой химическое соединение, состоящее из аминокислот, связанных посредством пептидных связей с максимальной длиной в 9 аминокислот. Олигопептид может состоять из аминокислот природного происхождения (см. список Таблицы 2) или аминокислот неприродного происхождения, таких как норлейцин, орнитин, норвалин, статин, десмозин, ГАМК, саркозин, изодесмозин, алло-изолейцин, бета-аланин и их производных, таких как 2-аминоадипиновая кислота, 3- аминоадипиновая кислота, 2-аминомасляная кислота, пиперидиновая кислота, 6-аминокапроновая кислота, 2-аминоэнантовая кислота, 2-аминоизомасляная кислота, 3-аминоизомасляная кислота, 2-аминопимелиновая кислота, 2,4-диаминомасляная кислота, 2,2'-диаминопимелиновая кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота, N-этилглицин, N-этиласпарагин, полностью гидроксильный лизин, гидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, N-метилизолейцин, 6-N-метиллизин, N-метилвалин и других (см. для дополнительных примеров, например, Hunt S. The non-protein amino acids. In: Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids. Barrett, G.C. (ed.), Chapman and Hall, London, 1985). Кроме того, олигопептид может иметь все L-аминокислоты, или все D-аминокислоты или их комбинации. Также включенными являются соли олигопептидов, особенно соль пальмитиновой кислоты, и дополнительно включенными являются также конъюгаты олигопептида с пальмитиновой кислотой.
В этой заявке пептиды определяются их трехбуквенным кодом или их однобуквенным ИЮПАК кодом согласно следующей Таблице:
Таблица 2Список аминокислот природного происхождения
аланин
Ala
A
аргинин
Arg
R
аспарагины
Asn
N
аспарагиновая кислота
Asp
D
цистеин
Cys
С
глутамин
Gln
Q
глутаминовая кислота
Glu
E
глицин
Gly
G
гистидин
His
H
изолейцин
Ile
I
лейцин
Leu
L
лизин
Lys
К
метионин
Met
М
фенилаланин
Phe
F
пролин
Pro
P
серин
Ser
S
треонин
Thr
T
триптофан
Trp
W
тирозин
Tyr
Y
валин
Val
V
Когда указывают D- или L-изостереомеры, то подразумевают именно их, а если указания не дают, то аминокислота может быть или L-или D-изомером.
Было найдено, что трипептиды, имеющие общую формулу X-Pro-Tyr (X-P-Y), в которой X может быть выбран из группы, состоящей из Ile (I), Val (V), Ala (A), Trp (W), Pro (P), Leu (L), Phe (F), Gly (G), Glu (E) и Asn (N), и в которой все аминокислоты могут по отдельности быть в D- или L-конфигурации, имеют иммуномодулирующие свойства. Предпочтительно, трипептид представляет собой IPY, который был тщательно исследован (см. экспериментальную часть).
На удивление также было найдено, что этот трипептид поддерживает свою иммуномодулирующую активность при соединении с другим пептидом, причем этот пептид либо также имеет иммуномодулирующую активность, либо нет. Если он имеет иммуномодулирующую активность (такой как пептид IEW), то гексапептиды IEWIPY или IPYIEW покажут повышенную иммуноактивность относительно исходного соединения IEW. Как оказалось, не имеет большого значения, расположен ли трипептид IPY при N-конце или при C- конце пептида, к которому его присоединяют. Однако, предпочтительной группой является группа пептидов, которые имеют IPY при их N-конце. Это даже осложнено в настоящем изобретении тем, что трипептид не должен быть расположен на конце пептида, с которым его соединяют, а также было бы возможно создать трипептид в составе пептидной последовательности, с условием, что его поместят в положении, в котором на него может воздействовать окружающая среда и, таким образом, проявляется его функция. Кроме того, конечно, введение трипептида в другой пептид должно оставить исходную функцию другого пептида неповрежденной, при желании.
При присоединении к пептиду антигена или антигенной детерминанты будет усиливаться иммунная система для начала пролиферации антител к вышеупомянутому антигену или антигенной детерминанте. Таким образом, трипептид является идеальным вспомогательным лекарственным средством для реиммунизации иммунных ответов на вакцинацию, и для простоты введения и устойчивости, трипептид может быть присоединен к антигену/антигенной детерминанте, если он напоминает белок.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Конкретными примерами олигопептидов, которые содержат трипептид изобретения являются IPYKTTKS, KTTKSIPY, IPYVGVAPG, VGVAPGIPY, IPYVGV, VGVIPY, IPYIEW, IEWIPY, EWIPY, IPYKE, KEIPY, IPYKPR, KPRIPY, IPYTEPR, TEPRIPY, IPYKD, KDIPY, IPYKNPY, KNPYIPY, IPYKNPW, KNPWIPY, IPYTKPR, IPYGQPR, IPYTAEEK, IPYALTTE, IPYRKEVY, GPAIPY, KDIPIPY, TQPIPY, GQPIPY, TAEIPY, ALTIPY, RKEIPY, IPYEKX EKXIPY, IPYXEK XEKIPY, IPYEWX, EWXIPY IPYXVY, XVYIPY, IPYXPY, XPYIPY, IPYPRX, и PRXIPY, в которых Xвыбираютиз группы, состоящей из A, V, G, I, P, W, F, N, Q, T, R, К, Е, D и Y. Специалист в этой области заметит, что многие из перечисленных олигомеров (преимущественно гексапептидов) встречаются в списке Таблицы 1, то есть они являются известными олигопептидами, которые доказали иммунологические эффекты. Хотя вышеупомянутый список только указывает комбинации с IPY, как правило, все комбинации, в которых IPY заменяют трипептидами изобретения, то есть те, которые имеют общую формулу X-Pro-Tyr (X-P-Y), в которой X может быть выбран из группы, состоящей из Val (V), Ala (A), Trp (W), Pro (P), Leu (L), Phe (F), Gly (G), Glu (E) и Asn (N), и в которой все аминокислоты могут быть по отдельности в D- или L-конфигурации, имеют иммуномодулирующие свойства. В случае этих комбинаций пептидов получающийся в результате пептид не должен быть олигопептидом. Это предусмотрено, особенно в случаях, когда трипептид присоединяют к антигену, так что получающийся в результате пептид может быть любой длины.
Пептиды или производные пептида настоящего изобретения могут быть произведены синтетически или, при необходимости, рекомбинантно стандартными способами. Конкретные варианты осуществления олигопептидов подробно описаны в экспериментальной части дальше. Предпочтительно, олигопептиды изобретения готовят стандартно известными химическими способами синтеза, такими как, например, описывает Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:2149-2154).
E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces,
Saccharomyces, Schizophyllum
C другой стороны, (олиго)пептиды настоящего изобретения могут быть произведены с помощью способов клонирования и экспрессии рекомбинантной ДНК в микроорганизм-хозяин или клетку, несущей фрагмент ДНК, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую один из вышеописанных пептидов. Нуклеиновая кислота, кодирующая последовательности, может быть приготовлена синтетически, или может быть получена из существующих последовательностей нуклеиновых кислот сайт-специфическим мутагенезом. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут после этого быть клонированы в подходящем экспрессирующем векторе и преобразованы или трансфицированы в подходящую клетку хозяина, такую как клетки млекопитающих (такие как CHO, HEK или COS-1 клетки), дрожжи (например, ), клетки насекомых или вирусные системы экспрессии, такие как системы бакуловируса. Специалист, квалифицированный в этой области техники, узнает способы создания последовательностей нуклеиновых кислот и обеспечения средств для обеспечения возможности их экспрессии.
et al.,
et al.
244
Также возможно включить аминокислоты неприродного происхождения (как D- аминокислоты) в пептиды через способы генной инженерии. Это было подробно описано в Noren Science :182 (1989) и Ellman Meth. Enzymol. 202:301 (1991).
Затем, пептид может быть отделен от культуры клеток хозяина. Это может быть достигнуто общей очисткой белка и способами выделения, которые являются доступными в уровне техники. Такие способы могут, например, включать иммуноадсорбцию или хроматографию. Также возможно обеспечить пептиды меткой (такой как гистидиновая метка) во время синтеза, который обеспечивает быстрое связывание и очистку, после которой метку ферментативно удаляют для получения активного пептида.
Если пептид не может быть закодирован или экспрессирован, но при этом является очень похожим на пептид, который может быть закодирован или экспрессирован, то может быть применен способ для приготовления пептида, на который похож пептид, с последующей одной или более стадиями, в которых вышеупомянутый пептид модифицируют химическими или ферментативными способами для приготовления конечного пептида.
Олигопептиды также могут быть получены расщеплением олигопептида от большего пептида, используя протеолитические ферменты, как пепсин, папаин и т.д.
Некоторые более полные сущности способов, которые могут быть применены в получении пептидов, описаны в: W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152, 8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89.
Новые пептиды по любому из пунктов формулы изобретения 1-3 могут быть быстро сделаны специалистом, квалифицированным в этом уровне техники.
16
32
2
Специальный вариант осуществления текущего изобретения формируют конъюгатами любого из олигопептидов изобретения с пальмитиновой кислотой (гексадекановой кислотой, CHO) или солями, образованными с помощью реакции олигопептида и пальмитиновой кислоты. Такое конъюгирование дает лучшее проникновение пептидов изобретения через кожу и другие эпителиальные ткани. Аналогично, может быть ацетилирована аминокислота при N-конце. Таким образом, также предпочтительной частью изобретения является трипептид IPY, в котором изолейциновую часть ацетилируют, или в которой вышеупомянутый пептид конъюгируют с пальмитиновой кислотой или пептидом в форме соли эфира пальмитиновой кислоты.
Фармацевтическая композиция изобретения включает терапевтически эффективные количества одного или более олигопептидов или конъюгатов настоящего изобретения. Однажды составленные фармацевтические композиции изобретения могут быть непосредственно введены в объект, который нуждается в этом, в терапевтически эффективном количестве.
Прямую доставку препаратов будут, как правило, осуществлять с помощью местного применения или других форм введения, или перорально, парентерально, подкожно, под язык, интраназально, внутрь пораженных тканей, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, пульмонально, или доставлять во внутритканевые пустоты.
Фармацевтическая композиция может также включать подходящий фармацевтически приемлемый носитель или разжижитель и может находиться в форме желатиновой капсулы, таблетки,таблетки для рассасывания, драже, пилюли, капли, свеч, порошка, спрея, вакцины, мази, пасты, крема, ингалятора, пластыря, аэрозоля и подобного типа. В качестве фармацевтически приемлемого носителя может быть использован любой растворитель, разжижитель или другое жидкое транспортное средство, средство дисперсии или суспензии, поверхностно активное вещество, изотоничное вещество, средство загустения или эмульгирования, консервант, обволакивающее вещество, твердое связующее вещество или смазка, которые являются наиболее подходящими для определенной лекарственной формы и которые являются смешанными с пептидом или конъюгатом пептида.
Фармацевтическая композиция может таким образом содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" также включает носитель для введения терапевтического средства, такого как антитела или полипептид, гены, и другие терапевтические средства. Термин относится к любому фармацевтическому носителю, который не работает самостоятельно, имеет любой иммунологический эффект, и который может быть введен без неспецифической токсичности. Подходящие носители могут быть большими, медленно усваиваемыми макромолекулами, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолиевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислоты и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известнысредним специалистам, квалифицированным в уровне техники.
ex vivo
Соли олигопептидов или конъюгатов получают известными способами, которые, как правило, включают смешивание пептида или конъюгата либо с фармацевтически приемлемой кислотой с образованием соли присоединения кислоты, либо с фармацевтически приемлемым основанием с образованием соли присоединения основания. Является ли кислота или основание фармацевтически приемлемыми, может быть легко решено специалистом, квалифицировнным в данной области техники, после принятия во внимание определенного предполагаемого использования соединения. Например, не все кислоты и основания, которые являются приемлемыми дляприменений, могут быть использованы для фармацевтических композиций, и не все кислоты и основания, которые являются подходящими для локального использования, могут быть применены парентерально. В зависимости от предполагаемого использования, фармацевтически приемлемые кислоты включают органические и неорганические кислоты, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, гликолевая кислота, щавелевая кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, коричневая кислота, серная кислота, соляная кислота, бромистоводородная кислота, азотная кислота, хлорная кислота, фосфорная кислота и тиоциановая кислота, которые образуют соли аммония со свободными аминогруппами пептидов и конъюгатов. Особенно предпочтительной является, таким образом, пальмитиновая кислота для производства солей олигопептидов изобретения. Фармацевтически приемлемые основания, которые образуют соли карбоксилатов со свободными карбоксильными группами пептидов и функциональными эквивалентами, включают этиламин, метиламин, диметиламин, триэтиламин, изопропиламин, диизопропиламин и другие моно-, ди- и триалкиламины, так же как ариламины. Кроме того, также включены фармацевтически приемлемые сольваты.
Фармацевтически приемлемые соли могут быть использованы в изобретении, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Полное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей доступно в Фармацевтических Науках Ремингтона (Mack Pub. Co., N. J. 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в фармацевтических композициях могут содержать жидкости, такие как воду, соляной раствор, глицерин и этанол. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как увлажнитель или эмульгирующие вещества, вещества создающие pH, и т.п., могут присутствовать в таких средах для лекарства. Как правило, парентеральные фармацевтические композиции готовят в качестве инъекций, или в качестве жидких растворов или суспензий; твердые формы, подходящие для растворения или образования суспензии в жидких средах для лекарства, могут также быть приготовлены до инъекции. Липосомы включены в определение фармацевтически приемлемого носителя.
Для терапевтического воздействия олигопептид или конъюгат могут быть получены как описано выше и применены к объекту, который нуждается в этом. Пептид или конъюгат пептида могут быть введены в объект любым подходящим способом, предпочтительно в форме фармацевтической композиции, приспособленной к такому способу и в дозировке, которая является эффективной для предполагаемого лечения.
Фармацевтические композиции этого изобретения могут содержать другие активные агенты, такие как антигены или антигенные детерминанты (как например, используемые в обычных вакцинах) или другие иммунологически активные вещества, такие как любой пептид из Таблицы 1. Также рассмотрены в изобретении комбинации с антивирусными средствами (таким как AZT), противоанемичными лекарствами (как GM-CSF EPO). Наиболее предпочтительны пептиды изобретения, которые вводят совместно с вакциной. Как отмечено выше, пептиды могут также быть конъюгатами или иным способом связанными с вышеописанными иммунологически активными соединениями.
Терапевтически эффективные дозы пептида или конъюгата пептида, требуемые, чтобы вызвать иммуномодулирующую реакцию в теле человека или подопытного животного, могут легко быть определены специалистом, например, при использовании экспериментальных моделей на животных.
Термин "терапевтически эффективное количество" для целей настоящего описания относится к количеству лекарства,то есть олигопептида или конъюгата пептида согласно настоящему изобретению, для проявления иммуномодулирущей реакции. Специалист, квалифицированный в уровне техники, сможет определить количества пептида, необходимого для проявления иммуномодулирующего действия с помощью определения иммунного гуморального ответа, или активации клетки активацией различных генов, как демонстрируется в настоящих примерах. Точное эффективное количество для объекта будет зависеть от размера объекта и здоровья, природы и области условий, и лекарств или комбинации лекарств, отобранных для введения. Таким образом, бесполезно определять точное эффективное количество предварительно. Однако эффективное количество для данной ситуации может быть определено обычным проведением эксперимента и находиться в заключении врача-консультанта или экспериментатора. Определенно, препараты настоящего изобретения могут быть использованы для усиления иммунной реакции в млекопитающем, предпочтительно в человеке, или домашнем животном, таком как собака, кот, свинья, корова и т.д., с помощью активации T-клеток и/или стимулирования выделения цитокинов и/или увеличения T-клеточной гуморальной зависимости и/или клеточного иммунного ответа и/или уменьшения иммунной реакции, например, с помощью ингибирования аутоиммунных ответов. Способы, которые позволяют врачу-консультанту установить начальные дозировки, известны из уровня техники. Дозировки, определенные для введения, должны быть безопасными и эффективными.
В целях настоящего изобретения, эффективная доза будет приблизительно от 0,01 мг/кг до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг олигопептида или конъюгата пептида на человека или животное, в которое его вводят. Дозировки для достижения терапевтических эффектов фармацевтической композиции, согласно настоящему описанию, могут быть легко определены специалистом.
Несмотря на это, в другом альтернативном варианте осуществления, олигопептид или конъюгат пептида или препараты изобретения могут быть введены из контролируемого или замедленного высвобождения матрикса, введенного в тело объекта.
Также может быть эффективным введение соединения изобретения в трансмукозальной лекарственной форме. Этот способ введения является неинвазивным и безвредным для пациента; и, особенно в лечении порезов и ожогов, это может привести к улучшенному бионакоплению соединения по сравнению с пероральным введением, особенно если соединение не устойчиво в жидкостях пищеварительной системы, или если слишком большое, чтобы быть эффективно адсорбированным из кишечника. Трансмукозальное введение возможно, например, через назальную, буккальную, сублингвальную, гингивальную или вагинальную лекарственные формы, но особенно исследованным в этой заявке является нанесение на открытые раны для улучшения эффекта заживления раны. Эти лекарственные формы могут быть приготовлены известными способами; они могут быть составлены для описания каплей для носа или аэрозолей, пластинок, пленок, пластырей, гелей, мазей или таблеток. Предпочтительно наполнители, используемые для трансмукозальной лекарственной формы, включают одно или более веществ, обеспечивающих слизистую адгезию, продлевая, таким образом, время контакта лекарственной формы с участком абсорбции и, следовательно, потенциально увеличивая степень абсорбции.
В дополнительном варианте осуществления соединения вводят пульмональным способом, используя измеренную дозу пульверизатора, распылителя, распыляемого аэрозоля или ингалятора сухого порошка. Эти виды лекарственных форм введения превосходно применяют в случае прививки. Соответствующие композиции могут быть приготовлены известными способами и методиками. В некоторых случаях также может быть подходящим трансдермальное, ректальное или офтальмологическое введение.
Можно эффективно использовать современную доставку лекарства или способы направленной доставки, чтобы доставить соединения изобретения более эффективно. Например, если выбирают непарентеральный способ введения, соответствующая лекарственная форма может содержать средство, улучшающее бионакопление, которое может быть любым веществом или смесью веществ, которая увеличивает накопление соединения. Это может быть достигнуто, например, защитой соединения от разрушения, такого как ингибитором фермента или ингибитором окислительных реакций. Более предпочтительно, усиливающее средство увеличивает бионакопление соединения, увеличивая проходимость барьера абсорбции, который является, как правило, слизистой оболочкой. Проникновение усиливающих агентов может действовать через различные механизмы; некоторые увеличивают разжижения слизистой оболочки мембран, в то время как другие открывают или расширяют щелевидное соединение между клетками слизистой оболочки. Однако другие уменьшают вязкость слизи, покрывающей слой клеток слизистой оболочки. Среди предпочтительных средств, усиливающих бионакопление, находятся амфифильные вещества, такие как производные холевой кислоты, фосфолипиды, этанол, жирные кислоты, олеиновая кислота, производные жирных кислот, EDTA, карбомеры, поликарбофил и хитозан.
Было найдено, как показано в Примерах, что олигопептиды настоящего изобретения имеют сильное иммуномодулирующее действие, связанное с активацией иммунной системы с помощью увеличения уровня иммунного гуморального ответа через активацию генов, связанную с нормальным течением иммунного ответа на Т-хелперзависимые антигены.
Таким образом, это означает, что олигопептиды изобретения применялись бы при активации T-клеток, тем самым вызывая выделение цитокинов, тем самым затрагивая деятельность других иммунологических и неиммунологических клеточных популяций. В частности, было найдено, что олигопептиды изобретения могут активизировать пролиферацию, дифференцирование и активацию иммунологических клеточных популяций.
Одной из заявок, в которой это может быть использовано терапевтически, является заявка об эффекте на T-клетках, присущих эпителиальным тканям, в которых эти T-клетки воздействуют на процессы, такие как рост эпителиальных клеток, заживления ран и рост волос. Другая заявка должна использовать эффект на T-клетках, чтобы повысить гуморальные и клеточные иммунные ответы на внешние антигены. Это означает, что олигопептиды могут быть использованы в качестве вспомогательного вещества в вакцинах для усиления иммунного ответа. Таким образом, пептиды изобретения могут быть использованы при всех бактериальных и/или вирусных инфекциях. Это использование может быть терапевтическим, но также предусмотрено профилактическое введение пептидов изобретения. В последнем случае, будет выполнено общее увеличение иммунологической устойчивости.
Так как пептиды могут стимулировать иммунную систему, они полезны для млекопитающих, включая людей. По ветеринарным заявкам, это особенно полезно для домашних животных, таких как свиней, рогатого скота, котов, собак, лошадей и животных зоопарка.
Дополнительно олигопептиды настоящего изобретения могут играть роль в терапии аутоиммунных заболеваний.
Настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими, неограниченными примерами.
Примеры
Пример 1. Действие В134 и B211 на гуморальный иммунный ответ на Т-зависимый антиген в мышах.
Пептиды Ile-Pro-Tyr (IPY, B134) и IEWIPY (B211) представлены как примеры биологической активности для группы родственных пептидов, предусмотренных текущей заявкой.
Чтобы исследовать влияние B134, представителя группы XPY, инбредные SPF мыши (Balb/cAωNCrl, 7-8 недельного возраста, Charles River Laboratories GmbH, Германия) были иммунизированы с KLH, Т-клеточным зависимым антигеном. 3 мышам из группы были введены подкожно в присутствии полного адъюванта Фрейнда (50/50 v/v). Смесь антигена (20 мг в 100 мл) с адъювантом (Sigma, #F-5881) была эмульгированна и введена в область шеи. В тот же день 20 мг иммуномодулятора B134 или B211 в 200 мл PBS было введено внутрибрюшинно. Образцы крови (50-70 мл) были отобраны у мышей на 7, 14, 21, и 28 день из вены ноги. Сыворотка была приготовлена коагуляцией крови в течение 2 часов при 37°С, с последующими 18 часами при 8°С, и центрифугированием при 10 000 оборотов в минуту в Эппендорф-подобной центрифуге. Сыворотки хранили растворенными со стабилизатором антитела (SkyTec ABB500) при 4°С, и в то же время анализировали твердофазным иммуноферментным анализом ELISA. Для второго образца, в 96-луночные плашки для иммуноферментного анализа ELISA (Greiner, #656061) были нанесены KLH (растворимое вещество, Sigma H7017) в фосфатном буферном растворе (PBS), 0,2 мг на лунку на ночь при 4°С. Растворенные сыворотки были инкубированы с антигеном (200 мг на лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре, с последующей отмывкой клеток с PBS/0,1% Tween-20. Связывание антител мыши с KLH было определено, используя изотоп-специфические антимышиные иммуноглобулины, конъюгированные с HRP (Southern Biotechnology Ltd., антимышиный IgM #1021-05, антимышиный IgGl #1070-05, антимышиный IgG2a #1080-05, антимышиный IgG2b #1090-05) согласно протоколу изготовителя. TMB был использован в качестве субстрата. Результаты были проанализированы на Фотометре Bio-Rad для микропланшет модель 550, оптическая плотность была измерена при 595 нм.
Результаты, показанные на Фиг.1, представляют кривую титрования сыворотки экспериментальных мышей. Титры используемых сывороток находятся от 1/300 до 1/20,000 с шагом 1/2 (обозначены на оси X как от 1 до 6 соответственно). Реактивность сыворотки представлена как O.D., показанная образцом в ELISA. Точки представляют среднюю реактивность образцов из 3 сывороток (из 3 мышей при условии). Разброс фактора представляет 95%-ный доверительный интервал. Как можно видеть из Фиг.1, после единичной инъекции титр специфического антитела на 28 день существенно отличается между мышами иммунизированными с и без иммуномодулятора. Таким образом, титр специфического IgG1 в сыворотках мышей, иммунизированных в присутствии B211, был приблизительно в 16 раз выше, а титр IgG2a и IgG2b в 4 раза выше, чем в мышах контроля, иммунизированных одним антигеном. Для В134 разница составила приблизительно в 2 раза больше для каждого проанализированного изотипа.
Пример 2. Влияние В134 на экспрессию гена в спленоцитах мыши, определенное с помощью ПЦР матрицы.
Инбредным SPF Balb/c мышам (женские особи, 12 недельного возраста) были введены или антиген, или пептид, или комбинация их обоих. Для инъекций 25 мг пептида было растворено в 250 мл стерильного PBS. Инъекции были выполнены подкожно, в области шеи, с иглой инсулина. Контрольным мышам был введен только PBS.
Для инъекции антигена: 250 мл суспензии стерильного бараньевого эритроцита (SRBC из Quad Five inc., Cat# 643-100) было введено внутрибрюшинно через бок. Суспензия была приготовлена как 2 мл первоначальной суспензии, отмытой 2 раза (1500 оборотов в минуту, 5 мин) с PBS и повторно суспендированной в 2 мл. 10 мл 50%-ной суспензии было растворено в 250 мл PBS и введено.
www.superarray.com
48 ч спустя мыши были забиты, их селезенка выделена и помещена в RNALater (Ambion Inc, Cat# 7021) сразу после выделения. Образцы в RNALater немедленно были заморожены при -70°C и выдержаны при этой температуре до выделения РНК. Выделение РНК и анализ ПЦР матрицы было выполнено как обслуживание с помощью SuperArray Inc согласно их установленному протоколу ().
РЕЗУЛЬТАТЫ. Было найдено, что изменения в экспрессии мРНК, основанные на данных ПЦР, являются статистически значимыми, если различие с контрольным уровнем экспрессии было выше 3-кратного (или увеличения или уменьшения). Из анализа экспрессии для 84 генов, уровень 75-85% генов во всех образцах не был статистически отличным от контрольного образца (селезенка мыши, введенная с PBS вместо и антигена и иммуномодулятора (не показано). Ясно, что статистически значимое различие было замечено для ряда цитокиновых и хемокиновых генов и соответствующих рецепторов IL-4, IL-11, Spp1, IL-10RA и в меньшей степени IL-1f6, IL-13, IL-17b, IL-20, IL-6 и IL-1R1).
Таблица 1Известные пептиды
Пептид
Название
Ссылка
Мер
Происхождение
Эффекты
Возможные цели
EW
Timogen
2
Природное выделение из тимуса
Стимуляция иммунного ответа
Не известно, Т-клетки, выработка Il-2
IEW
Neogen
3
Синтетическое посредством удлинения EW
Стимуляция иммунного ответа, восстановление иммунной системы
Предшественники Т-клеток, предшественники других клеток?
KEVVEEAEN
Ciardelli et al., 1982
9
20-28 тимозина альфа 1
Идентично Тимозину а1
ac-SDKP
Grillion et al., 1990
4
N-конец тимозина бета 4
Активация пролиферации Т-клеток
RKDVY
Thimopeptin
Goldstein et al., 1979; Nash et al., 1981
5
32-36 тимопоэтина
Подобно целому тимопоэтину
Вызывает дифференциацию Т-клеток в бестимусных мышах, активация клеток-киллеров
RKEVY
Splenopentin
Audhya et al., 1984
5
32-36 бычьего тимопоэтина 3, выделенного из селезенки
Не активирует дифференциацию Т-клеток, но активирует дифференциацию В-клеток
В-клетки
RKDV
Denes et al., 1986
4
Фрагиент тимопоэтина
Подобно тимопоэтину, увеличивает IgM создание клеток, отторжение аллотрансплантанта
RKD
Denes et al., 1986
3
Из того же источника
То же
R-a-DKVYR
Timohexin
Колониеформирующие клетки в костном мозге, выработка Il-2
KKEVY
Biswas et al.,1997
5
Синтетические аналоги SP
Стимулирует выработку IL-2 и экспрессию CD2R
D-KKEVY
Biswas et al.,1997
5
Из того же источника
То же
KSQE
Abiko, Sekino, 1982
4
Фрагмент тимулина
LVVYPW
Миелопептиды
Petrov et al., 1984-1997
6
Выделение пептидов, вырабатываемых клетками костного мозга
Усиление Т-клеточного ответа на митоген
LGFPT
Миелопептиды
Michailova et al., 1995
6
Выделение пептидов, вырабатываемых клетками костного мозга
MLTAEEKR
Миелопептиды
8
Выделение пептидов, вырабатываемых клетками костного мозга
TAEEK
Миелопептиды
Michaltsov et al., 1997
5
Выделение пептидов, вырабатываемых клетками костного мозга
Стимуляция кроветворения
VGGEAL
Миелопептиды
6
Выделение пептидов, вырабатываемых клетками костного мозга
Goralatid
Masse et al., 1998; Gaudron 1999
4
?
Стимуляция кроветворения, уменьшение цитотоксических эффектов цитостатиков
EEDCK
Cuthbertson et al., 1997; Paukovits et al., 1998
5
Стимуляция кроветворения
KKGE
MPF, человеческий
Owen et al., 1997, 1998
4
Нейропептид, природный
Стимулирует рост нейронов, пролиферацию Т-клеток
KKGQ
MPF, крысиный
4
Стимулирует рост нейронов, пролиферацию Т-клеток
DYMGWMDF
Holeocystokin
Molchanova et al., 1992
8
Природный гормон
Стимулирует тимус-зависимость, но не независимый ответ
DYMG
4
Фрагмент 1
?
WMDF
4
Фрагмент 2
?
FFGLM
Siemion et al., 1990
5
С-конец вещества P
Подавляет гуморальный иммунный ответ при дозах 1-100 мкг/мышь
RPKP
4
N-конец вещества P
0,1 мкг/мл - подавляющий, 1-5 мкг/мл - стимулирующий
GPRP
Аналог N-вещества
Подавляющий
GAAVLEDSQ
Фрагмент MCF
9
N-конец MCF
Стимулирует цитотоксическую активность моноцитов
LEDSQ
Фрагмент MCF
5
То же
GAAVL
Фрагмент MCF
5
Нет активности
GAAVLENSQ
Фрагмент MCF с замещением
9
Нет активности
ITGSE
Фрагмент IL-1
Siemion et al., 1990
5
Подавление иммунного ответа, выработка IL-2 и т.д.
VQGEESNDK
Фрагмент IL-1
Bajpai et al., 1998
9
Фрагмент IL 1a, 163-171
Иммуностимулирующая активность
TKPR
Тафцин
Fridkin, Najjar, 1998
4
Продукт распада Fc
Стимулирует фагоцитную активность лейкоцитов и макрофагов, выработку IL1 мононуклеарными клетками селезенки
TEPR
Синтетический вариант Тафцина
Chipens et al., 1990
4
Уменьшение активности макрофагов, увеличение при инфекциях
KPR
Синтетический вариант Тафцина
3
Сокращенная версия Тафцина
Уменьшение активности макрофагов, увеличение при инфекциях
TKP
Вариант тафцина при распаде IgE
Auriault et al., 1985
3
Продукт распада IgE
Ингибирование активности макрофагов, по другим отчетам - стимуляция. Может быть свя зано с моделями и дозами
GQPR
Rigin
4
Фрагмент IgG CH<sub>2 </sub>
Стимулирует фагоцитную активность
RGDS
Домен фибронектина
4
Связывание домена фибронектина с клетками
Стимулирует фагоцитоз
GP
Фрагменты коллагена
Mundy et al., 1981
2
Фрагменты коллагена выделенные из мочи
Стимулирует хемотаксис периферийных моноцитов крови
GPA
Фрагменты коллагена
3
Стимулирует хемотаксис периферийных моноцитов крови
VEPIPY
Parker et al., 1984
6
54-59 казеин
Стимулирует in vitro фагоцитоз, in vivo защищает против K. pheumoniae
KE
Vilon
2
Стимулирует экспрессию Т-клеточных рецепторов
Gamma-EW
Bestim
2
Аналог Тимогена
Стимуляция предшественников Т-клетки
KNPY
Gagnon пептид
4
Стимуляция В клеток
ALTTE
Ogawa пептид
5
Стимуляция В клеток