Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов

1. Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных на основе определения количества Т- и В-клеток, для осуществления которого экстрагируют ДНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), после чего в два этапа проводят полимеразную цепную реакцию для целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, при этом анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, абсолютное количество целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных кривых, построенных при амплификации серии последовательных разведений стандартных образцов ДНК с известными концентрациями искомых продуктов TREC, KREC и эталонных генов GAPDH, HPRT, RPP30 или известным количеством клеток, по результатам определения TREC и KREC делают выводы о состояния иммунитета новорожденных.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что диагностику осуществляют в два этапа, на первом из которых проводят одновременную амплификацию в одной емкости участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов, тем самым выявляя среди анализируемых образцов образцы с отсутствием или низким уровнем целевых молекул TREC и KREC, а на втором этапе для выявленных образцов осуществляют подтверждение или опровержение полученного результата, проводя из одной навески экстрагированной ДНК амплификацию в двух мультиплексных постановках: в одной (целевой) емкости проводится амплификация участков молекул ДНК TREC, KREC и одного эталонного нормировочного гена, в другой (нормировочной) емкости проводится амплификация участков молекул ДНК трех эталонных генов, один из которых тот же, что в целевой емкости.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на первом этапе в качестве эталонных нормировочных генов в единой емкости используют гены GAPDH и HPRT, на втором этапе в качестве эталонных нормировочных генов в целевой емкости используют ген GAPDH, а в нормировочной емкости используют гены GAPDH, HPRT и RPP30.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для нормализации целевого продукта на эталонный ген при наличии нескольких эталонных нормировочных генов на первом этапе вводят «нормировочный коэффициент», который вычисляют как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов, а на втором этапе при анализе результатов производят корреляционный пересчет данных, полученных для мультиплексной постановки эталонных генов в нормировочной емкости, на данные, полученные для эталонного гена в целевой емкости, после чего вводят «нормировочный коэффициент», вычисляемый как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов, а затем производят расчет данных, полученных для молекул ДНК TREC, KREC.
5. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для проведения амплификации целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов GAPDH, HPRT и RPP30: TRECF1-ccatgctgacacctctggtt, TRECR1-tcgtgagaacggtgaatgaag, TREC-zond1-R6G-cacggtgatgcataggcacctgc-RTQ1, KRECF1-tcccttagtggcattatttgtatcact, KRECR1-aggagccagctcttaccctagagt, KREC-zond1-FAM-tctgcacgggcagcaggttgg-RTQ1, GAPDH-FP-atcttccaggagtgagcgag, GAPDH-RP-gactccacgacgtactcagc, GAPDH-zond-ROX-tccaaaatcaagtggggcgatg-RTQ2, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zond-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zond-FAM-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ1.