Состав искусственной кишечной среды для исследования микробиоты слепой кишки курицы
COMPOSITION OF THE ARTIFICIAL INTESTINAL MEDIUM FOR THE STUDY OF THE MICROBIOTA OF THE CAECUM OF CHICKEN

Изобретение относится к питательным средам и моделированию биологических систем, а именно, к приготовлению питательных сред для моделирования состояния микробиоты в искусственных кишечных системах, в частности, исследования микробиоты слепой кишки курицы.
Известно устройство для автоматического моделирования желудочно-кишечного тракта в течение длительного времени, с изменяющимися условиями в процессе переваривания (см. CN209894792, G01N33/00, публ. 26.04.2019).
Известны искусственные модели кишечника, позволяющие воссоздавать условия для исследования процессов протекающих в кишечнике in vitro (см. CN108469395, G01N5/04, опубл.07.03.2018) описан способ моделирования переваривания риса.
Описано приспособление для моделирования пищеварения в ротовой полости (см. CN103680282, G09B25/00, опубл. 26.11.2013).
Большинство известных способов моделирования кишечника относится к моделям человека, например (см.CN210777450, G09B23/28, опубл. 16.06.2020), (см.MX2018004845 G09B23/00, 21.10. 2019).
Известны и модели пищеварительных систем животных, (см.CN105702146 G09B23/36, опубл. 22.06.2016) описывает динамическую систему имитации желудка и двенадцатиперстной кишки мыши. В патенте (CN104893957, C12M1/00, опубл. 09.09. 2015) описывается устройство для симуляции рубца жвачных.  Бионическая пищеварительная система крысы описана в патенте (см.CN204423786, G09B23/36, опубл. 24.06.2015). Известна и система симулирующая пищеварение цыпленка (см. CN 101246650A, G09B23/36, 22.08.2008).
Известно, что микроорганизмы, колонизирующие кишечник, оказывают значительное влияние на процессы пищеварения. О масштабе влияния микроорганизмов можно судить по общему количество микробных клеток в кишечнике, которое превосходит число собственных клеток человеческого тела (Sender R, Fuchs S, Milo R (2016) Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body. PLoS Biol 14(8): e1002533. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002533). Микробиота кишечника крупного рогатого скота оказывает влияние на качество продуцируемого молока (R. John Wallace1, Goor Sasson, Philip C. Garnsworthy, A heritable subset of the core rumen microbiome dictates dairy cow productivity and emissions, Science Advances  03 Jul 2019: Vol. 5, no. 7, DOI: 10.1126/sciadv.aav8391).
У курицы пищеварительная система по своей структуре и функции приспособлена к приему и перевариванию корма растительного происхождения. Большая роль в этом отводится слепым отросткам. Большинство исследований процессов, связанных с динамикой микробиоты в ЖКТ сельскохозяйственной птицы, сосредоточено на слепой кишке. У птиц слепая кишка является важным отделом, играющим особую роль не только в пищеварении, но и иммунных реакциях, поддержании гомеостаза. Микробиота слепой кишки наиболее многочисленна и разнообразна по сравнению с другими отделами пищеварительной системы. Генетическая идентификация показала гораздо более высокую распространенность филотипов с очень низким сходством последовательностей с известными культуральными изолятами. Слепые отростки являются основным местом разрушения клетчатки и образования летучих жирных кислот, здесь протекают различные процессы, оказывающие опосредованное влияние на здоровье и продуктивность животных.
Известные составы и среды, применяемые в искусственных кишечных системах, не обеспечивают необходимых условий для роста и проявления биологической активности микробиоты слепой кишки курицы, и не учитывают её влияние. Так, известна среда Viande levure glucose broth, включающая в состав Триптон 10 г/л, Дрожжевой экстракт 5 г/л, Экстракт мяса 2,4 г/л, Цистеина гидрохлорид 0,6 г/л, Декстроза 2,5 г/л, Натрия хлорид 5 г/л, и ее модификации, с варьируемым количеством исходных компонентов. (Crippen TL, Sheffield CL, Andrews K, Bongaerts R, Nisbet DJ. Bacterial Concentration and Diversity within Repetitive Aliquots Collected from Replicate Continuous-Flow Bioreactor Cultures. Open Microbiol J. 2008;2:60-65. doi:10.2174/1874285800802010060). Данная среда традиционно применяется для выращивания строгих анаэробов, она является очень питательной: в неё входит богатый витаминами и минеральными веществами дрожжевой экстракт, мясной экстракт, также богатый биологически активными веществами и минеральными компонентами, более того, в среде присутствует самый легкодоступный для всех бактерий сахар – глюкоза в высокой концентрации. На подобной среде наблюдается активный рост всех бактерий, так как она содержит очень широкий спектр питательных веществ и сложных соединений. Однако этот состав не соответствует естественному; подобные соединения, даже попав в просвет кишечника птицы, подверглись бы ферментативному расщеплению и всасыванию, моносахариды поглощаются практически полностью в кишечнике, в его тонком отделе, и не могли бы стать частью среды цекального отдела (Scanes, Colin G., ed. Sturkie's avian physiology. 6th Edition Elsevier, 2014. 1056 p.), поэтому их не может быть в составе питательной среды, имитирующей содержимое слепой кишки.
Salmonella typhimurium
Salmonella  typhimurium
Статья (Crippen TL, Sheffield CL, Andrews K, Bongaerts R, Nisbet DJ. Bacterial Concentration and Diversity within Repetitive Aliquots Collected from Replicate Continuous-Flow Bioreactor Cultures. Open Microbiol J. 2008;2:60-65. doi:10.2174/1874285800802010060) ссылается на статью (Nisbet  DJ,  Corrier  DE,  Scanlan  CM,  Hollister  AG,  Beier  RC,  De-Loach  JR.  Effect  of  a  defined  continuous  flow  derived  bacterial  culture and dietary lactose on  colonization in broiler chickens. Avian Dis 1993; 37: 1017-25.), авторы которой, в свою очередь, ссылаются на другую свою статью (Nisbet, D. J. , D . E . Corrier, an d J . R . DeLoach, Effect  mixed  cecal  microflora  maintained  in  continuous  culture,  an dietary  lactose  on   colonization  in  broiler  chicks. Avian  Dis. 1993; 37:528-535.), где впервые используют Viande Levure glucose media, не приводя никаких обоснований выбору этой среды для моделирования условий цекального отдела кишечника курицы.
Предлагаемое изобретение описывает среду, способную поддерживать рост микробиоты в системах моделирования слепой кишки курицы.
Задачей изобретения является создание питательной среды, позволяющей в системах искусственного кишечника курицы моделировать микробиотическую компоненту пищеварения.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что состав искусственной кишечной среды для исследования микробиоты слепой кишки курицы в качестве основы содержит изолированный соевый белок, крахмал, масло подсолнечное нерафинированное и стимулирующие добавки: сульфат магния, хлорид натрия, гидроортофосфат калия,  сульфат марганца, сульфат железа(II), Tween 80,  г/л:
Изолированный соевый белок - 10–20 г.
Крахмал - 0.5– 2.5 г.
Масло подсолнечное нерафинированное - 10–30 мл.
4
Сульфат магния (MgSO) - 0.25 – 1.5 г.
Хлорид натрия (NaCl)  - 3 – 6 г.
2
4
Гидроортофосфат калия (KHPO) - 0.25 – 1.5 г.
4
Сульфат марганца (MnSO) - 0.05 – 0.06 г.
4
Сульфат железа (II) (FeSO)- 0.05– 0.06 г.
Tween 80 – 0.5-1.5 мл.
Дистиллированная вода до 1 л.
Технический результат заключается в создании питательной среды, позволяющей в системах искусственного кишечника курицы моделировать микробиотическую компоненту пищеварения.
Характеристика компонентов
Изолированный соевый белок с массовой долей белка 85+7 % (на абсолютно сухое вещество), пищевого качества.
Крахмал – пищевого качества.
Масло подсолнечное нерафинированное – пищевого качества.
4
Сульфат магния - реактив (сернокислый магний безводный), представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде; качества «химически чистый» (Purissimum). Формула MgSO.
Хлорид натрия - реактив (хлористый натрий), представляет собой бесцветные кристаллы или кристаллический порошок; легко растворим в воде; качества «химически чистый» (Purissimum). Формула  NaCl.
2
4
Гидроортофосфат калия - реактив (калий гидроортофосфат безводный, калий фосфорнокислый двузамещенный) представляет собой порошок; растворим в воде; качества «химически чистый» (Purissimum). Формула  KHPO.
4
Сульфат марганца - реактив (сернокислый марганец) - кристаллический порошок, хорошо растворяется в воде и не растворяется в спирте, качества «химически чистый» (Purissimum). Формула MnSO.
4
Сульфат железа (II) - реактив (железо(II) сернокислое) - безводное вещество бесцветное, непрозрачное, очень гигроскопичное, качества «химически чистый» (Purissimum). Формула FeSO.
Tween 80 — полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат — неионное поверхностно-активное вещество, представитель группы полисорбатов. Маслянистая жидкость, по основной технологической функции эмульгатор и диспергирующий агент. Качество по ГОСТ 32770–2014.
2
Дистиллированная вода по ГОСТ 6709-72. Формула НО.
Способ изготовления питательной основы предлагаемой среды для поддержания микробиоты в искусственных моделях кишечника заключается в следующем: необходимое количество подсолнечного масла переливают в лабораторный стакан подходящего объема (так, чтобы масло занимало в нем примерно 1/10 объема), добавляют Tween 80 и нагревают до 80°С. Так же необходимо нагреть достаточный для приготовления среды объем воды. После нагревания масло с Tween 80 тщательно взбивают до получения однородной эмульсии. После чего следует небольшими объемами вливать воду, не прекращая взбивать получающийся раствор. Когда лабораторный стакан наполнится, перелить его содержимое в колбу, внести остальные элементы среды, долить оставшееся количество воды, перемешать до гомогенного состояния.
Автоклавировать среду при температуре 121°С в течение 20 минут.
Получившуюся среду допустимо хранить в холодильнике в течение нескольких дней. При расслоении среду необходимо гомогенизировать на вортексе с соответствующей платформой для лабораторных колб. При необходимости довести рН среды до 7-7.5, применяя 0.1Н HCl или 0.1H NaOH
Пример 1
4
2
4
4
4
По указанной методике готовили среду, содержащую  на 1 л: изолированный соевый белок - 20 г, крахмал водорастворимый – 0.5 г, масло подсолнечное нерафинированное -  30 мл, Tween 80 – 1.5 мл, MgSO – 0.25 г, NaCl - 6 г, KHPO – 0.25 г, MnSO – 0.05 г, FeSO – 0.05 г, дистиллированная вода - до 1 л.
2
2
2
В колбу, содержащую 100 мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Количество микроорганизмов, выросших на искусственной кишечной среде, представлено в таблице №1.
Таблица №1, КОЕ/мл
Штаммы
Нативное содержимое кишечника
Количество в искусственной среде
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
2.0±0.5·10<sup>8</sup>
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>7</sup>
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
3.8±0.4·10<sup>7</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
1.4±0.7·10<sup>9</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter</i> и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
1,4±0,3·10<sup>8</sup>
Пример 2
4
2
4
4
4
По указанной методике готовили среду, содержащую  на 1 л: изолированный соевый белок - 20 г, крахмал водорастворимый – 0.5 г, масло подсолнечное нерафинированное -  30 мл, Tween 80 – 1.5 мл, MgSO – 0.5 г, NaCl - 5 г, KHPO – 0.5 г, MnSO – 0.06 г, FeSO – 0.05 г, дистиллированная вода - до 1 л.
2
2
2
В колбу, содержащую 100 мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Количество микроорганизмов, выросших  на искусственной кишечной среде,  представлено в таблице №2.
Таблица №2, КОЕ/мл
Штаммы
Нативное содержимое кишечника
Количество в искусственной среде
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
2.2±0.6·10<sup>8</sup>
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>7</sup>
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
4.0±0.9·10<sup>7</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
1.5±0.6·10<sup>9</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter</i> и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
0.8±0.3·10<sup>8</sup>
Пример 3
4
2
4
4
4
По указанной методике готовили среду, содержащую  на 1 л: изолированный соевый белок - 20 г, крахмал водорастворимый – 0.5 г, масло подсолнечное нерафинированное -  30 мл, Tween 80 – 1.5 мл, MgSO – 1.5 г, NaCl - 3 г, KHPO – 1.5 г, MnSO – 0.05 г, FeSO – 0.06 г, дистиллированная вода - до 1 л.
2
2
2
В колбу, содержащую 100мл среды, вносили 200мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Количество микроорганизмов, выросших  на искусственной кишечной среде, представлено в таблице №3.
Таблица №3, КОЕ/мл
Штаммы
Нативное содержимое кишечника
Количество в искусственной среде
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
1.9±0.5·10<sup>8</sup>
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>7</sup>
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
4.4±0.8·10<sup>7</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
2.3±0.4·10<sup>9</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter </i>и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
1.1±0.4·10<sup>8</sup>
Пример 4
4
2
4
4
4
По указанной методике готовили среду, содержащую  на 1 л: изолированный соевый белок - 20 г, крахмал водорастворимый – 0.5г, масло подсолнечное нерафинированное -  30 мл, Tween 80 – 1.5 мл, MgSO - 0,5 г, NaCl - 5г, KHPO – 0.5 г, MnSO – 0.06г, FeSO – 0.05 г, дистиллированная вода - до 1 л.
2
2
2
В колбу, содержащую 100 мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Количество микроорганизмов, выросших на искусственной кишечной среде, представлено в таблице №4.
Таблица №4, КОЕ/мл
Штаммы
Нативное содержимое кишечника
Количество в искусственной среде
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
1.6±0.4·10<sup>8</sup>
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>8</sup>
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
9.7±0.4·10<sup>6</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
3.3±0.6·10<sup>7</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter</i> и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
1.8±0.5·10<sup>6</sup>
Пример 5
4
2
4
4
4
По указанной методике готовили среду, содержащую  на 1 л: изолированный соевый белок - 10 г, крахмал водорастворимый – 0.5 г, масло подсолнечное нерафинированное -  30 мл, Tween 80 – 1.5 мл, MgSO – 0.5 г, NaCl - 5 г, KHPO – 0.5 г, MnSO – 0.05 г, FeSO – 0.06 г, дистиллированная вода - до 1 л.
2
2
2
В колбу, содержащую 100 мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Количество микроорганизмов, выросших на искусственной кишечной среде, представлено в таблице №5.
Таблица №5, КОЕ/мл
Штаммы
Нативное содержимое кишечника
Количество в искусственной среде
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
0.6±0.3·10<sup>8</sup>
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>8</sup>
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
8.2±0.5·10<sup>6</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
2.2±0,3·10<sup>7</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter</i> и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
3.0±0.2·10<sup>6</sup>
Пример 6
4
2
4
4
4
По указанной методике готовили среду, содержащую  на 1 л: изолированный соевый белок - 20 г, крахмал водорастворимый – 2.5 г, масло подсолнечное нерафинированное -  30 мл, Tween 80 – 1.5 мл, MgSO – 0.5 г, NaCl - 5 г, KHPO – 0.5 г, MnSO – 0.05 г, FeSO – 0.05 г, дистиллированная вода - до 1 л.
2
2
2
В колбу, содержащую 100 мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Количество микроорганизмов, выросших на искусственной кишечной среде, представлено в таблице №6.
Таблица №6,  КОЕ/мл
Штаммы
Нативное содержимое кишечника
Количество в искусственной среде
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
1.6±0.6·10<sup>8</sup>
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>8</sup>
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
9.2±0.5·10<sup>6</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
2.8±0.9·10<sup>7</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter</i> и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
1.1±0.2·10<sup>6</sup>
Пример 7
4
2
4
4
4
По указанной методике готовили среду, содержащую  на 1 л: изолированный соевый белок - 20 г, крахмал водорастворимый – 0.5 г, масло подсолнечное нерафинированное -  10 мл, Tween 80 – 0.5 мл, MgSO - 0,5 г, NaCl - 5 г, KHPO - 0,5 г, MnSO – 0.05 г, FeSO – 0.05 г, дистиллированная вода - до 1 л.
2
2
2
В колбу, содержащую 100мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Количество микроорганизмов, выросших на искусственной кишечной среде, представлено в таблице №7.
Таблица №7, КОЕ/мл
Штаммы
Нативное содержимое кишечника
Количество в искусственной среде
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
0.8±0.4·10<sup>8</sup>
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>8</sup>
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
11.5±0.7·10<sup>6</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
2.4±0.2·10<sup>7</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter</i> и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
2.1±0.3·10<sup>6</sup>
В указанных диапазонах концентраций компонентов среды наблюдается устойчивый рост микроорганизмов, колонизирующих кишечник кур. Развитие микроорганизмов на среде очень близко к нативному содержимому слепой кишки. Таким образом, состав среды, действительно, близок по составу к содержимому слепой кишки, и полученные с использованием такой среды результаты можно экстраполировать на живых птиц. Разработанная среда подходит для имитации процессов, происходящих в слепой кишке птицы, с высокой степенью последующей экстраполяции на живой организм. В таблице №8 приведены результаты испытаний.
Таблица №8
Нативное содержимое кишечника
1
2
3
4
5
6
7
Viande Levure glucose media
Изолированный соевый белок, г
Количество аминокислот в исследуемых образцах содержимого слепой кишки2
20
20
20
20
10
20
20
Белково -пептидные компонентыи аминокислоты18
Крахмал, г
Количество сахаров в исследуемых образцах содержимого слепой кишки0,4 г/л
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
2,5
0,5
Декстроза2,5
Масло подсолнечное нерафинированное, мл
Количество жира в исследуемых образцах содержимого слепой кишки39,8
30
30
30
30
30
30
10
-
Tween 80, мл
-
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
0,5
-
MgSO<sub>4</sub>, г
-
0,25
0,5
1,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-
NaCl, г
-
6
5
3
5
5
5
5
5
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>, г
-
0,25
0,5
1,5
0,5
0,5
0,5
0,5
-
MnSO<sub>4</sub>, г
-
0,05
0,06
0,05
0,06
0,05
0,05
0,05
-
FeSO<sub>4</sub>, г
-
0,05
0,05
0,06
0,05
0,06
0,05
0,05
-
Результаты исследования
<i>Lactobacillus</i>
3,3±0,5·10<sup>8</sup>
2.0±0.5·10<sup>8</sup>
2.2±0.6·10<sup>8</sup>
1.9±0.5·10<sup>8</sup>
1.6±0.4·10<sup>8</sup>
0.6±0.3·10<sup>8</sup>
1.6±0.6·10<sup>8</sup>
0.8±0.4·10<sup>8</sup>
-
<i>Bifidobacterium</i>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>7</sup>
1·10<sup>8</sup>
1·10<sup>8</sup>
1·10<sup>8</sup>
-
<i>Enterococcus</i>
1,5±0,4·10<sup>6</sup>
3.8±0.4·10<sup>7</sup>
4.0±0.9·10<sup>7</sup>
4.4±0.8·10<sup>7</sup>
9.7±0.4·10<sup>6</sup>
8.2±0.5·10<sup>6</sup>
9.2±0.5·10<sup>6</sup>
11.5±0.7·10<sup>6</sup>
3.17·10<sup>7</sup>
<i>E.coli</i>
5,0±1,1·10<sup>7</sup>
1.4±0.7·10<sup>9</sup>
1.5±0.6·10<sup>9</sup>
2.3±0.4·10<sup>9</sup>
3.3±0.6·10<sup>7</sup>
2.2±0,3·10<sup>7</sup>
2.8±0.9·10<sup>7</sup>
2.4±0.2·10<sup>7</sup>
Общее количество 7,2·10<sup>7</sup>
<i>Citrobacter, Enterobacter</i> и др.
4,3±1,2·10<sup>6</sup>
1,4±0,3·10<sup>8</sup>
0.8±0.3·10<sup>8</sup>
1.1±0.4·10<sup>8</sup>
1.8±0.5·10<sup>6</sup>
3.0±0.2·10<sup>6</sup>
1.1±0.2·10<sup>6</sup>
2.1±0.3·10<sup>6</sup>
Список источников, цитированных в патентном описании:
1. CN108469395 (Zhejiang Gongshang University) 2018-03-07
2. CN103680282 (Nanchang University) 2013-11-26
3. CN209894792 (Hefei Polytechnic University) 2019-04-26
4. CN210777450 (桑喜成) 2020-06-16
5. MX2018004845 (Centro De Investig Y Asistencia En Tecnologia Y Diseno Del Estado De Jalisco A C) 2019-10-21
6. Crippen TL, Sheffield CL, Andrews K, Bongaerts R, Nisbet DJ. Bacterial Concentration and Diversity within Repetitive Aliquots Collected from Replicate Continuous-Flow Bioreactor Cultures. Open Microbiol J. 2008;2:60-65. doi.org/10.2174/1874285800802010060
7. CN105702146  (陈晓东) 2015-12-31
8. CN104893957 (Institute of Animal Science of CAAS, Hunan Agricultural University) 2015-09-09
9. CN204423786 (Nantong Donggainian New Material co Ltd) 2015-06-24
10. CN 101246650A (Institute of Animal Science of CAAS) 2008-02-22
11. R. John Wallace1, Goor Sasson, Philip C. Garnsworthy, A heritable subset of the core rumen microbiome dictates dairy cow productivity and emissions, Science Advances  03 Jul 2019: Vol. 5, no. 7, doi.org/10.1126/sciadv.aav8391
12. Sender R, Fuchs S, Milo R (2016) Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body. PLoS Biol 14(8): e1002533. doi.org/10.1371/journal.pbio.1002533
13. Scanes, Colin G., ed. Sturkie's avian physiology. 6th Edition Elsevier, 2014. 1056 p.