Способ определения энергии индивидуальных магнитных частиц, приобретаемой ими в низкочастотном переменном магнитном поле
METHOD FOR DETERMINING THE ENERGY OF INDIVIDUAL MAGNETIC PARTICLES ACQUIRED BY THEM IN A LOW-FREQUENCY ALTERNATING MAGNETIC FIELD

Изобретение относится к биофизике и касается способа определения энергии индивидуальных магнитных наночастиц, приобретаемой ими в низкочастотном переменном магнитном поле, знание величин которых может быть использовано, например, в биомедицине, в частности, для точного моделирования экспериментов, основанных на магнитомеханических явлениях, таких как активация мембранных рецепторов, адресная доставка лекарств и их контролируемое высвобождение, инактивация биологически-активных молекул и т.д.
Способ определения энергии индивидуальных магнитных частиц, приобретаемой ими в низкочастотном переменном магнитном поле, в патентной и научно-технической литературе не описан. Использование прямых физических методов определения вышеуказанных энергий для этих целей не подходит ввиду высокой агрегирующей способности магнитных наночастиц и их относительно малых размеров. Следует отметить, что неоднократно предпринимались попытки теоретических расчетов перевода энергии низкочастотного переменного магнитного поля в энергию магнитной наночастицы, приобретаемую ей в таком поле [Yu.I. Golovin, N.L. Klyachko, D.Yu. Golovin, M.V. Efremova, A.A. Samodurov, M. Sokolski-Papkov, A.V. Kabanov. A new approach to the control of biochemical reactions in a magnetic nanosuspension using a low-frequency magnetic field, Tech. Phys. Lett. 39 (2013) 240-243; Y.I. Golovin, S.L. Gribanovskii, D.Y. Golovin, N. Klyachko, A. Kabanov, Single-domain magnetic nanoparticles in an alternating magnetic field as mediators of local deformation of the surrounding macromolecules, Phys. Solid State 56 (2014)1342-1351]. Однако, полученные в различных работах значения могут отличаться на порядки.
Из технических решений, близких к предлагаемому способу, можно упомянуть так называемый магнитный пинцет, включающий определение межмолекулярных энергий, в том числе у нуклеотидов, путем прикрепления макромолекул к магнитной частице и последующего манипулировании такой частицей при помощи магнитов, причем, положение магнитных частиц в пространстве оценивается с помощью видеомикроскопии [Jan Lipfert, Xiaomin Нао, Nynke Н. Dekker. Quantitative Modeling and Optimization of Magnetic Tweezers, Biophys J. 2009, 96(12), 5040-5049].
Указанное техническое решение содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как обработка различных зон на поверхности подложки или всей поверхности одной из сторон подложки водосодержащим раствором макромолекул, в том числе одноцепочечных нуклеотидов, содержащих на конце цепи якорную группу, с образованием ковалентной связи между якорной группой и поверхностью подложки, а также закрепление на подложке магнитной частицы.
Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа определения энергии индивидуальных магнитных наночастиц, приобретаемой ими в низкочастотном переменном магнитном поле.
Технический результат изобретения состоит в реализации возможности экспериментального определения энергии индивидуальных магнитных наночастиц, приобретаемой ими в низкочастотном переменном магнитном поле.
Предварительно были проведены эксперименты с различными подложками, нуклеотидами и магнитными частицами, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда способ определения энергии индивидуальных магнитных частиц, приобретаемой ими в низкочастотном переменном магнитном поле, включает обработку различных зон на поверхности одной подложки или всей поверхности одной из сторон подложки водосодержащим раствором одноцепочечного нуклеотида, содержащего на конце цепи якорную группу, с образованием ковалентной связи между якорной группой и поверхностью подложки, причем, каждая часть зон или вся другая подложка содержат нуклеотид только со своим фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, обработкой подложки органическим соединением, способным образовывать ковалентную связь с поверхностью подложки в местах, где не была образована ковалентная связь между подложкой и нуклеотидом, с последующими промывкой подложки(ек) водосодержащим раствором и сушкой подложки(ек), обработкой подложки(ек) водосодержащим раствором другого одноцепочечного нуклеотида, комплементарного ранее использованным нуклеотидам, с известной энергией связи между различными по длине комплементарными участками, содержащего ковалентно-связанную магнитную наночастицу и ковалентно-связанный флуоресцентный краситель и имеющего фиксированное количество нуклеотидных звеньев в цепи, которое не меньше, чем количество нуклеотидных звеньев в цепи у самого длинного из ранее использованных нуклеотидов, повторной промывкой подложки(ек) водосодержащим раствором и повторной ее(их) сушкой, измерением интенсивности флуоресценции иммобилизованного красителя на сухой(их) подложке(ах), обработкой подложки(ек), помещенной(ых) в водосодержащий раствор, низкочастотным переменным магнитным полем при произвольно выбранных значениях только одного варьируемого параметра, включающего продолжительность воздействия магнитного поля или амплитуду магнитного поля и неизменных значениях двух других параметров, выбранных из группы, включающей продолжительность воздействия магнитного поля, амплитуду магнитного поля и частоту магнитного поля, третьей промывкой подложки(ек) водосодержащим раствором, третьей сушкой подложки(ек), повторным измерением интенсивности флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке(ах), сравнением интенсивности флуоресценции красителя на подложке(ах) до и после обработки подложки(ек) магнитным полем и ее(их) промывки, определением доли удаленного с поверхности подложки(ек) нуклеотида, содержащего ковалентно-связанные с ним краситель и магнитную наночастицу, и на ее основе принятием решения о том, произошло ли при используемой в эксперименте величине варьируемого параметра разрушение комплементарных связей между различными нуклеотидами, построением калибровочной кривой зависимости величины этой энергии, приходящейся на моль комплементарной связи, от экспериментально определяемой величины варьируемого параметра, и определением с ее помощью энергии, приобретенной магнитными частицами, при произвольной величине варьируемого параметра и пересчетом полученного результата на энергию, приобретаемую индивидуальной магнитной частицей.
Предлагаемый способ является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.
В предлагаемом техническом решении могут быть использованы различные плоские жесткие и гибкие подложки, например, такие как стеклянные, кварцевые, золотая и т.д. Такие плоские подложки коммерчески доступны и выпускаются компанией Arrayit [http://shop.arrayit.com/]. Поверхность используемых подложек может дополнительно содержать якорные группы одного типа, например, такие как амино-, эпокси-, гидрокси- и т.д., или не содержать якорных групп. При использовании подложек, изготовленных из серебра или золота, создание дополнительных якорных групп на их поверхности не требуется. Например, для золотой подложки якорные группы на ее поверхности не нужны, поскольку при использовании нуклеотида с якорной меркапто-группой между нуклеотидом и поверхностью подложки, не содержащей дополнительных якорных групп, итак, образуется прочная ковалентная химическая связь. Следует отметить, что химическое строение якорных групп на поверхности подложки и химическое строение якорной группы на одном из концов нуклеотида, должно давать возможность образовывать между ними ковалентную связь. Если ковалентная связь не образуется, то способ становится неработоспособным. Способ также будет неработоспособным, если ковалентная связь будет образовываться с каждым из концов нуклеотида и подложкой.
В предлагаемом способе водосодержащим раствором одноцепочечного нуклеотида с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи можно обрабатывать или различные зоны, расположенные на одной из сторон подложки, например, расположенные в одном ряду лунки, или всю поверхность одной из сторон подложки. При обработке всей поверхности подложки необходимо использовать несколько одинаковых подложек, каждая из которых будет обработана раствором нуклеотида с другим фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи.
Для получения более достоверных результатов измерения целесообразно использовать несколько зон на одной подложке или несколько одинаковых подложек, которые затем будут обработаны одним и тем же раствором нуклеотида с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи с последующим усреднением полученных результатов измерений и их использовании при расчетах.
Другая часть зон или другие подложки в предлагаемом способе должны быть обработаны раствором другого одноцепочечного нуклеотида с другим фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи. В предлагаемом способе количество зон на одной подложке или количество подложек, каждая из которых обработана своим нуклеотидом, может варьироваться в зависимости от строения нуклеотида и количества нуклеотидных звеньев в его цепи. При этом для построения калибровочной кривой целесообразно использовать не менее трех различных нуклеотидов с увеличивающимся количеством нуклеотидных звеньев в цепи.
Обработка противоположной стороны подложки, а также ее торцевых поверхностей нецелесообразна ввиду нерационального расхода реагентов и создания покрытия на тех частях подложки, которые не будут задействованы при исследовании подложки конфокальным сканером.
В предлагаемом способе каждая часть зон или вся подложка должна содержать ковалентно-связанный (иммобилизованный) нуклеотид только с определенным количеством нуклеотидных звеньев в цепи. При невыполнении этого требования способ становится неработоспособным.
В качестве основы одноцепочечных нуклеотидов с различным количеством нуклеотидных звеньев в цепи могут быть использованы, например, такие коммерчески доступные нуклеотиды, производимые компанией "ДНК-синтез" (http://www.oligos.ru/), имеющие, например, последовательность звеньев tgttccgataca (SEQ ID NO.1), cacaattgat gttccgataca (SEQ ID NO.2), cgcgatgcacaattgatgttccgataca (SEQ ID NO.3) и т.д., где буква а обозначает аденин, t - тимин, g - гуанин и с - цитозин, которые являются нуклеотидными звеньями. При этом число нуклеотидных звеньев в цепи может варьироваться, например, от 1 до 60 звеньев.
Используемые нуклеотиды должны содержать на одном конце цепи якорную группу, обеспечивающую образование ковалентной связи с поверхностью подложки. В качестве якорных групп на одном конце нуклеотида могут быть использованы, например, такие группы, как амино-, меркапто-, эпокси- и т.д. Двухцепочечные нуклеотиды в предлагаемом способе не могут быть использованы. При использовании подложек, изготовленных из серебра или золота, закрепляемый нуклеотид должен содержать концевую якорную тиольную группу.
Необходимо отметить, что ковалентная связь между одним концом нуклеотида, содержащим якорную группу, и поверхностью подложки должна образовываться в результате обработки одной из сторон подложки водосодержащими растворами одноцепочечных нуклеотидов с различным количеством нуклеотидных звеньев в цепи. При этом использование водосодержащих растворов обусловлено хорошей растворимостью в них нуклеотидов. В качестве водосодержащих растворов может быть использована как дистиллированная вода, так и различные растворы солей или буферные растворы.
При обработке подложки растворами нуклеотидов концентрация таких растворов может быть различной и составлять, например, от 1 до 50 мкмоль/л (мкМ). При этом продолжительность такой обработки может быть различна и составлять, например, от 1 до 24 ч. Температура обработки подложки также может быть различна.
Нуклеотиды, содержащие якорную группу на одном конце цепи, также производятся компанией "ДНК-синтез" и являются коммерчески доступными (http://www.oligos.ru/).
После обработки подложки водосодержащими растворами одноцепочечных нуклеотидов подложку необходимо промыть водосодержащим раствором, свободным от ранее использованных нуклеотидов, например, дистиллированной водой либо одним из буферных растворов, для удаления не вступивших в реакцию иммобилизации одноцепоченых нуклеотидов. При этом продолжительность промывки может быть различной и составлять, например, от 1 до 5 мин.
После промывки подложки водосодержащим раствором, свободным от ранее использованных нуклеотидов, подложку необходимо обработать органическим соединением, способным образовывать ковалентную связь с поверхностью подложки в местах, где не была образована ковалентная связь между подложкой и нуклеотидом с целью блокировки не вступивших в реакцию якорных групп на поверхности подложки.
При этом можно вначале промывать подложку водосодержащим раствором, свободным от ранее использованных нуклеотидов, затем органическим соединением, так и осуществлять вышеуказанные операции в обратной последовательности. В обоих случаях после проведения вышеуказанных операций подложку необходимо высушить до постоянной массы. При этом конкретные условия сушки могут быть различны. Если вышеуказанные операции не проводить, то способ становится неработоспособным.
В качестве органического соединения, способного образовывать ковалентную связь с поверхностью подложки в местах, где не была образована ковалентная связь между подложкой и нуклеотидами, могут быть использованы различные органические соединения, например, такие как первичные и вторичные амины, одно- и многоатомные спирты, оксираны и т.д. Конкретное строение органического соединения зависит от строения якорных групп на поверхности подложки. При использовании подложек, изготовленных из серебра или золота, целесообразно использовать органические соединения, содержащие тиольную группу. Однако и в этом случае после закрепления нуклеотида на золотой или серебряной подложке также рекомендуется провести обработку подложки органическим соединением (отличным от нуклеотида), также содержащим тиольную группу, для исключения возможности неспецифического связывания комплементарного нуклеотида.
В предлагаемом способе продолжительность обработки подложки органическим соединением, способным образовывать ковалентную связь с поверхностью подложки в местах, где не была образована ковалентная связь между подложкой и нуклеотидом, а также условия обработки, такие как концентрация органического соединения и температура обработки, могут варьироваться в зависимости от строения органического соединения. При этом можно использовать не только раствор органического соединения, но и вышеуказанное жидкое органическое соединение в отсутствии растворителя.
Образование ковалентной связи между якорной группой нуклеотида и поверхностью подложки было доказано дополнительной обработкой ранее модифицированной нуклеотидами подложки другим нуклеотидом, комплементарным ранее использованным нуклеотидам и содержащим на конце флуоресцентный краситель, с последующей обработкой подложки одним из водосодержащих растворов, сушкой подложки и измерением интенсивности флуоресценции красителя на поверхности подложки. Эксперименты показали, что интенсивность флуоресценции красителя на вышеуказанных подложках превышает фоновые значения флуоресценции, из чего можно сделать вывод о том, что краситель оказался иммобилизован на поверхности подложки. Если бы образование ковалентной связи между якорной группой нуклеотида и поверхностью подложки не происходило, то комплементарный другой нуклеотид с флуоресцентным красителем не закреплялся бы на поверхности подложки и интенсивность флуоресценции красителя не превышала бы фоновые значения флуоресценции.
В предлагаемом способе после первоначальной сушки подложки(ек) ее(их) обрабатывают водосодержащим раствором другого одноцепочечного нуклеотида, имеющего фиксированное количество нуклеотидных звеньев в цепи (монодисперсный нуклеотид), которое не меньше, чем количество нуклеотидных звеньев в цепи у самого длинного из ранее использованных нуклеотидов.
При этом в качестве водосодержащего раствора можно использовать, например, дистиллированную воду или один из буферных растворов. Концентрация нуклеотида с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, может быть различной и составлять, например, от 1 до 50 мкмоль/л. При этом конкретные условия обработки подложки раствором такого нуклеотида, а именно, продолжительность и температура обработки, также могут быть различными. Однако, следует отметить, что такую обработку для ускорения процесса целесообразно проводить при нагревании.
В предлагаемом способе другой одноцепочечный нуклеотид, с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, должен быть комплементарен ранее использованным нуклеотидам. Кроме этого, из научно-технической литературы должна быть известна энергия связывания комплементарных участков такого нуклеотида с комплементарными участками других нуклеотидов, ранее закрепленных на подложке. Величина такой энергии может быть рассчитана с использованием специальной компьютерной программы [http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html], позволяющей определить энергию взаимодействия для любых конкретных комплементарных нуклеотидов. Если у используемого нуклеотида количество нуклеотидных звеньев в цепи будет меньше количества нуклеотидных звеньев в цепи хотя бы у самого длинного из ранее использованных нуклеотидов, иммобилизованных на подложке, то предлагаемый способ становится неработоспособным. Если количество нуклеотидных звеньев в цепи у используемого нуклеотида не будет фиксированным, то есть, если используемый нуклеотид будет полидисперсным, то предлагаемый способ также окажется неработоспособным.
Данный нуклеотид должен быть комплементарен (взаимосоответствующим) ранее использованным нуклеотидам и содержать ковалентно-связанную магнитную частицу и ковалентно-связанный флуоресцентный краситель. Если хотя бы одно из этих требований не будет выполнено, то предлагаемый способ также становится неработоспособным.
При этом стоит отметить, что в предлагаемом способе максимальное количество нуклеотидных звеньев в цепи у ранее закрепленных на подложке нуклеотидов и, как следствие, в цепи нуклеотида, с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев, ограничено числом, при котором суммарная энергия связей между комплементарными участками таких нуклеотидов, не превышает энергию ковалентной связи между нуклеотидом, с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, и закрепленными на нем магнитной частицей и красителем. При этом конкретное максимальное число нуклеотидных звеньев в цепи может варьироваться в зависимости от типа ковалентной связи между нуклеотидом и закрепляемой на нем магнитной частицей, а также от химического строения нуклеотидов. При несоблюдении данного условия предлагаемый способ становится неработоспособным.
В предлагаемом способе другой используемый нуклеотид также должен содержать якорные группы для дальнейшего закрепления на нем магнитной частицы и флуоресцентного красителя.
При этом флуоресцентный краситель может быть, как непосредственно связан с нуклеотидом, так и быть ковалентно-связанным с магнитной частицей. Если магнитная частица и краситель не будут химически закреплены на нуклеотиде, то есть будут находиться в свободном состоянии, то предлагаемый способ становится неработоспособным. Следует отметить, что в пределах одного эксперимента необходимо использовать одинаковые магнитные частицы и один и тот же флуоресцентный краситель.
2
3
2
В качестве магнитной частицы в предлагаемом техническом решении могут быть использованы только индивидуальные (единичные) магнитные частицы, но не агрегат магнитных частиц. При этом под магнитной наночастицей понимается частица с размерами, находящимися в диапазоне 1-100 нм (Тодуа П.А. Метрология в нанотехнологии // Российские нанотехнологии. 2007. Т. 2, №1-2. С. 61-69). Форма магнитной частицы может быть различна. В качестве таких магнитных частиц могут быть использованы, например, магнетит (БезОд), маггемит (FeO), феррит кобальта (CoFe(>4) и т.д. Синтез магнитных частиц описан в научно-технической литературе. Например, сферические частицы магнетита с размером 8-25 нм могут быть получены путем термического разложения олеата железа (III) в 1-октадецене или эйкозане с добавлением олеиновой кислоты [Erik Wetterskog, Michael Agthe, Arnaud Mayence, Jekabs Grins, Dong Wang, Subhasis Rana, Anwar Ahniyaz, German Salazar-Alvarez and Lennart Bergstrom. Precise control over shape and size of iron oxide nanocrystals suitable for assembly into ordered particle arrays. Science and Technology of Advanced Materials, 2014, 15, 055010]. Кубические частицы магнетита с размером 10-20 нм также могут быть получены, например, путем термического разложения олеата железа (III) с добавлением олеиновой кислоты и олеата натрия в 1-октадецене [Nikitin Aleksey, Fedorova Mariia, Naumenko Victor, Shchetinin Igor, Abakumov Maksim, Erofeev Alexander, Gorelkin Petr, Meshkov Georgy, Beloglazkina Elena, Ivanenkov Yan, Klyachko Natalya, Golovin Yuriy, Savchenko Alexander, Majouga, Alexander. Synthesis, characterization and MRI application of magnetite water-soluble cubic nanoparticles, JMMM, 2017, 441, 6-13].
Частицы маггемита с размером 10-110 нм могут быть получены, например, гидротермальным синтезом (в автоклаве) с использованием хлорида железа (II), хлорида железа (III), нитрата железа (III) и гидроксида тетраметиламмония [Olivier Horner et al. Sophie Neveu, Sophie de Montredon, Jean-Michel Siaugue, Valerie Cabuil. Hydrothermal synthesis of large maghemite nanoparticles: influence of the pH on the particle size. Journal of Nanoparticle Research, 2009, 11, 1247-1250].
Частицы феррита кобальта различной формы (сферы, кубы, октаподы) с размером 4-30 нм могут быть получены, например, термическим разложением ацетилацетоната кобальта (II) и ацетилацетоната железа (III) в 1-октадецене с добавлением олеиновой кислоты и олеиламина [Le Т. Lu, Ngo Т. Dung, Le D. Tung, Cao T. Thanh, Ong K. Quy, Nguyen V. Chuc, Shinya Maenosono and Nguyen Т.K. Thanh. Synthesis of magnetic cobalt ferrite nanoparticles with controlled morphology, monodispersity and composition: the influence of solvent, surfactant, reductant and synthetic conditions. Nanoscale, 2015, 7, 19596-19610].
В предлагаемом способе форму магнитных частиц определяют при помощи просвечивающей электронной микроскопии, а размер частиц вычисляют по полученной с помощью микроскопии микрофотографии и последующей ее обработки с использованием компьютерной программы ImageJ. Химическую природу магнитных частиц определяют с помощью рентгенофазового анализа.
Создание якорных групп на поверхности магнитной частицы позволяет одновременно решить две проблемы: с одной стороны, предотвратить агрегацию магнитных частиц друг с другом, а с другой - закрепить индивидуальную магнитную частицу на нуклеотиде.
Создание якорных групп на поверхности магнитной частицы описано в научно-технической литературе. Например, якорная карбоксильная группа на поверхности частиц магнетита может быть получена путем взаимодействия таких частиц с 3,4-дигидроксифенилуксусной кислотой [Kim D.H, Tamada Y, Ono T, Bader SD, Rozhkova EA, Novosad V. The effect of ligands on FePt-Fe304 core-shell magnetic nanoparticles. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2014, 14(3), 2648-2652]. Якорная аминогруппа на поверхности частиц магнетита может быть получена путем взаимодействия таких частиц с 3-аминопропилтриэтоксисиланом [Mishra, Abhijeet & Sardar, Meryam. (2015). Isolation of Genomic DNA by Silane-Modified Iron Oxide Nanoparticles]. Якорная тиольная группа на поверхности частиц магнетита может быть получена путем взаимодействия частиц с (3-меркаптопропил)-триметоксисиланом в толуоле [Long Giang Bach, Jong Tae Kim, Md. Rafiqul Islam, Sungyong Seo, Kwon Taek Lim. Encapsulation of Fe3O4 magnetic nanoparticles with poly(methyl methacrylate) via surface functionalized thiol-lactam initiated radical polymerization. Applied Surface Science, 2012, 258, 2959-2966].
Нуклеотид, содержащий ковалентно-связанную магнитную частицу, может быть получен путем взаимодействия нуклеотида и магнитной частицы, содержащей якорную группу, способную образовывать ковалентную связь только с одним из концов используемого нуклеотида. Вышеуказанный прием был описан, например, в [Kerstin Wagner, Armin Kautz, Michael  Manuela Schwalbe, Katharina Pachmann, Joachim H. Clement and Matthias Schnabelrauch. Synthesis of oligonucleotide-functionalized magnetic nanoparticles and study on their in vitro cell uptake. Applied organometallic chemistry, 2004; 18, 514-519]. Для этого, к коллоидному раствору магнитных частиц оксида железа, содержащих якорную карбоксильную группу, в фосфатном буфере добавляли раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в фосфатном буфере и инкубировали полученную смесь в течение 30 мин, после чего к нему добавляли нуклеотид, содержащий якорную амино-группу, что приводило к образованию ковалентной связи между одним концом такого нуклеотида и магнитной частицей.
При этом, химическое строение якорной группы, способной осуществлять ковалентную связь между магнитной частицей и одним из концов нуклеотида, может быть различно.
В предлагаемом способе используемый нуклеотид с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, содержащий ковалентно-связанную магнитную частицу, обязательно должен также содержать ковалентно-связанный с ним флуоресцентный краситель, в качестве которого может быть использован, например, цианин-3, цианин-5, цианин-5.5 и т.д. Нуклеотид, содержащий ковалентно-связанный с ним флуоресцентный краситель, также является коммерчески доступным и производится компанией "ДНК-синтез" (http://wvvw.oligos.ru/).
Следует отметить, что для ускорения процесса повторную обработку подложек нуклеотидом, с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, целесообразно проводить при нагревании. Конкретные значения температуры и продолжительности нагрева зависят от химического строения использованных как одноцепочечных нуклеотидов с различным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, так и нуклеотида с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, содержащего иммобилизованную магнитную частицу и иммобилизованный флуоресцентный краситель.
После обработки подложки водосодержащим раствором нуклеотида с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, подложку вначале повторно промывают водосодержащим раствором для удаления не вступивших в реакцию реагентов, а затем повторно сушат. При этом, конкретные условия повторной промывки и повторной сушки могут быть различны. Если данные операции не проводить, то способ становится неработоспособным.
В предлагаемом способе после повторной сушки подложку помещают в конфокальный сканер, модель которого может быть различна. При этом, конфокальный сканер должен давать возможность фиксировать флуоресценцию ранее использованного красителя и получать флуоресцентную картину подложки, включающую флуоресцентные пятна, представляющие собой места закрепления нуклеотида, содержащего краситель, на подложке за счет образования комплементарных связей между нуклеотидами разных типов (иммобилизованного нуклеотида на подложке за счет образования ковалентной связи и комплементарного ему нуклеотида, связанного с флуоресцентным красителем).
Следует отметить, что измерение интенсивности флуоресценции красителя можно проводить только на сухой подложке для предотвращения нежелательного воздействия паров растворителя на используемый прибор.
После этого, с помощью специальной программы вычисляют суммарную интенсивность флуоресценции каждого светового пятна и при проведении последующих расчетов принимают ее за 100%.
Затем подложку извлекают из конфокального сканера и помещают в емкость с водосодержащим раствором, в качестве которого может быть использована, например, дистиллированная вода или один из буферных растворов. При этом подложка может быть помещена в любую емкость (плашку), позволяющую полностью покрывать жидкостью всю подложку. Затем, емкость с подложкой подвергают воздействию низкочастотного переменного магнитного поля с частотой менее 100 килогерц (кГц) [International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection. Guidelines for limiting exposure to time-varying electric and magnetic fields (1 Hz to 100 kHz). Health Phys. 2011, 100 (1), 112]. При этом, варьируют продолжительности воздействия магнитного поля или амплитуду магнитного поля при неизменных значениях двух других параметров, выбранных из группы, включающей продолжительность воздействия магнитного поля, амплитуду магнитного поля и частоту магнитного поля.
В предлагаемом способе используют только переменное низкочастотное магнитное поле ввиду того, что использование высокочастотного поля приводит к сильному разогреву подложки, которое может привести к получению недостоверных результатов. Использование постоянного магнитного поля не приводит к колебаниям магнитной частицы, закрепленной на нуклеотиде и, как следствие, не вызывает разрушения комплементарных связей между нуклеотидами.
Использование жидкости перед воздействием магнитного поля дает возможность удалять часть нуклеотидов с закрепленными магнитной частицей и флуоресцентным красителем от поверхности подложки. При использовании сухой подложки способ становится неработоспособным.
При этом, продолжительность воздействия магнитного поля и величина его амплитуды в различных экспериментах могут быть различными.
В предлагаемом способе вектор магнитного поля может быть направлен как параллельно плоскости подложки, так и быть перпендикулярным ей.
После обработки подложки низкочастотным магнитным полем, осуществляют третью промывку влажной подложки водосодержащим раствором для удаления оторвавшихся от нее нуклеотидов, содержащих как единичную магнитную частицу, так и флуоресцентный краситель. Это происходит за счет разрыва комплементарных связей в результате передачи энергии, полученной магнитной частицей под воздействием магнитного поля на связанный с ней нуклеотид, приводящей к разрыву комплементарных связей между различными нуклеотидами. При осуществлении третьей промывки может быть использован водосодержащий раствор, например, дистиллированная вода или один из буферов. При этом конкретные условия третьей промывки могут варьироваться в зависимости от конкретного строения используемых нуклеотидов.
В предлагаемом способе после третьей промывки осуществляют третью сушки подложки, условия проведения которой также могут быть различны.
Затем, высушенную подложку повторно помещают в конфокальный сканер, получают ее флуоресцентную картину и с помощью специальной программы повторно вычисляют суммарную интенсивность флуоресценции каждого светового пятна, которую затем сравнивают с ранее полученной интенсивностью флуоресценции, принятой за 100%, тем самым определяя долю молекул нуклеотида, содержащего ковалентно-связанный с ним конкретный флуоресцентный краситель, оторвавшихся от подложки.
Ввиду того, что у используемого модифицированного нуклеотида на одну закрепленную молекулу красителя приходится только одна магнитная частица, доля оторвавшегося от подложки красителя будет точно соответствовать доле оторвавшегося от подложки, модифицированного нуклеотида.
Если доля молекул красителя, оторвавшихся от подложки, достоверно не отличается от 0%, это означает, что разрушение комплементарных связей между нуклеотидом и его комплементарным партнером не произошло и необходимо в следующем эксперименте увеличить величину варьируемого параметра.
Если доля молекул красителя, оторвавшихся от подложки, достоверно больше 0%, это означает, что магнитная частица приобрела необходимую энергию для разрушения комплементарных связей.
Необходимо отметить, что под воздействием магнитного поля вначале разрываются комплементарные связи между самым коротким и более длинным нуклеотидом, поскольку для этого требуется наименьшее количество энергии, приобретенной магнитной частицей, после чего, идет разрыв между более длинным нуклеотидом и его комплементарным партнером, требующий затраты большей энергии.
В предлагаемом техническом решении нуклеотид, связанный с флуоресцентным красителем, содержит только одну ковалентно-связанную с ним магнитную частицу. В связи с этим, разрушение комплементарных связей между различными нуклеотидами и, как следствие, отрыв красителя, закрепленного на нуклеотиде, от поверхности подложки, происходит только тогда, когда магнитная частица приобретает достаточную для этого энергию магнитного поля и передает ее на связанный с ней нуклеотид. Благодаря этому, можно говорить о том, что при отрыве красителя, связанного с нуклеотидом, от поверхности подложки, индивидуальная магнитная частица приобретает энергию большую или равную энергии связи между комплементарными участками конкретных нуклеотидов.
При этом, варьируют продолжительности воздействия магнитного поля или амплитуду магнитного поля при неизменных значениях двух других параметров, выбранных из группы, включающей продолжительность воздействия магнитного поля, амплитуду магнитного поля и частоту магнитного поля.
В предлагаемом способе все расчеты проводят при конкретной величине продолжительности воздействия магнитного поля или амплитуды магнитного поля при неизменных значениях двух других параметров, выбранных из группы, включающей продолжительность воздействия магнитного поля, амплитуду магнитного поля и частоту магнитного поля.
Например, варьируют продолжительность воздействия магнитного поля при постоянных значения амплитуды магнитного поля и его частоты. Затем, величину варьируемого параметра меняют и проводят аналогичные расчеты. При этом для получения калибровочной кривой целесообразно проводить не менее трех серий экспериментов. Естественно, точность определения вышеуказанной энергии будет возрастать с увеличением числа экспериментальных точек на калибровочной кривой. При этом калибровочная кривая должна содержать не менее трех экспериментальных точек, поскольку калибровочная кривая не всегда может иметь линейный характер.
Для повышения точности определения вышеуказанных энергий целесообразно проводить следующую последовательность (алгоритм) экспериментов. На первом этапе используют подложку с ковалентно-связанным с ней самым коротким нуклеотидом и выбирают произвольную достаточно небольшую величину варьируемого параметра. Если, оказывается, что флуоресценция красителя после третьей промывки водосодержащим раствором не отличается от фонового значения, то это свидетельствует о том, что флуоресцентный краситель удален с подложки полностью и значит индивидуальная магнитная частица под действия магнитного поля приобрела энергию, большую или равную энергии комплементарного взаимодействия используемого короткого нуклеотида с более длинным комплементарным нуклеотидом. При получении такого результата целесообразно снизить величину варьируемого параметра и вновь произвести вышеописанные измерения. Если, при более низких значениях одного из параметров интенсивность флуоресценции красителя не изменилась, то магнитная частица не приобрела необходимую энергию для разрыва комплементарных связей. Проведя серию подобных экспериментов, можно с высокой вероятностью получить первую достоверную точку на требуемой калибровочной кривой. Затем, с поверхностью подложки ковалентно связывают более длинный нуклеотид и для него проводят аналогичную последовательность операций, в результате чего, получают вторую достоверную точку на требуемой калибровочной кривой. Для еще более длинных нуклеотидов проводят аналогичные эксперименты.
В предлагаемом способе после этого принимают решение, произошло ли при используемой в эксперименте величине варьируемого параметра разрушение комплементарных связей между различными нуклеотидами. Если доля удаленного нуклеотида превышает известную из литературных данных погрешность измерений интенсивности флуоресценции 1-2% (http://vvww.biosystems.com.ar/archivos/folletos/108/Brochure_-_ultimo.pdf), то разрушение комплементарных связей между различными нуклеотидами произошло и, следовательно, под воздействием магнитного поля закрепленная на нуклеотиде магнитная частица уже приобрела необходимую для этого энергию.
0
A
0
A
23
-1
Затем на основе полученных данных строят калибровочную кривую зависимости этой энергии, приходящейся на моль комплементарных связей, от экспериментально определенной величины варьируемого параметра. С помощью полученной кривой можно достоверно определить суммарную энергию, приобретенную магнитными частицами при произвольной величине варьируемого параметра и затем пересчитать полученный результат на энергию, приобретаемую индивидуальной магнитной частицей, по следующей формуле: Е=E/N, где Е - энергия, приходящаяся на моль комплементарных связей различных нуклеотидов в ккал/моль, a N=6,02⋅10 моль - число Авогадро.
Предлагаемый способ иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
В примере используют коммерчески доступные подложки из стекла, одна сторона которых содержит якорные эпоксидные группы, и кубические частицы магнетита с размером 10 нм, которые получают методом термического разложения олеата железа (III) в 1-октадецене. Для этого, 4 ммоль олеата железа (III), 1,3 ммоль олеиновой кислоты, 1,7 ммоль олеата натрия и 33 мл 1-октадецена смешивают в трехгорлой колбе, снабженной обратным холодильником, термометром и подводом инертного газа. Полученную реакционную смесь нагревают в атмосфере аргона до 317°С со скоростью 4°С/мин при непрерывном перемешивании со скоростью 500 об/мин с использованием лабораторной плитки, имеющей функцию магнитного перемешивания, и выдерживают при данной температуре в течение 30 мин. После этого полученную смесь охлаждают до комнатной температуры путем удаления источника нагрева, магнитные частицы отделяют от раствора путем магнитной декантации и суспендируют в 10 мл хлороформа.
Форму магнитных частиц определяют просвечивающей электронной микроскопией, а средний размер частиц определяют с использованием специальной компьютерной программы ImageJ. Полученные в данных условиях частицы являются магнетитом, что подтверждается ренгенофазовым анализом.
Для получения якорных карбоксильных групп на поверхности синтезированных магнитных частиц 100 мг поли(этиленгликоль)2-аминоэтилового эфира уксусной кислоты (М=1100 г/моль), 4 мг 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, 4 мг N-гидроксисукцинимида, 6 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 20 мг карбоната калия помещают в одногорлую колбу объемом 25 мл и растворяют в смеси 2 мл N,N-диметилформамида и 2 мл хлороформа, после чего перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем к полученному раствору добавляют 10 мл дистиллированной воды и 5 мл коллоидного раствора (суспензии) ранее полученных частиц магнетита в хлороформе с концентрацией 1 мг/мл. Далее хлороформ удаляют из смеси при помощи вакуумного роторного испарителя при температуре 40°С и давлении 100 милибар (мбар). Оставшийся полученный водный коллоидный раствор частиц магнетита центрифугируют в течение 20 мин при 6000 об/мин в центрифужных фильтрах с размером пор 30 килодальтон (кДа). Оставшийся на фильтре сконцентрированный коллоидный раствор магнитных частиц суспендируют в 10 мл дистиллированной воды.
В примере также используют три различных коммерчески доступных одноцепочечных нуклеотида I, II и III, которые представлены в Таблице 1. При этом каждый из нуклеотидов I, II и III содержит на 3'-конце якорную аминогруппу в составе аденина для последующего ковалентного связывания с поверхностью подложки.
В качестве нуклеотида, с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, используют коммерчески доступный одноцепочечный нуклеотид IV (Таблица 1), содержащий на 5'-конце ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-5 (цианин-5-тимин), а на 3'-конце - якорную аминогруппу в составе гуанина для ковалентного связывания с магнитной частицей. При этом нуклеотид IV комплементарен каждому из нуклеотидов I, II и III.
Далее с помощью специальной компьютерной программы [http://biotools.nubic.northwestem.edu/OligoCalc.html] определяют, что энергия связи между комплементарными участками для следующих пар: нуклеотид IV/нуклеотид I, нуклеотид IV/нуклеотид II и нуклеотид IV/нуклеотид III составляет соответственно 9,1 ккал/моль, 31,0 ккал/моль и 90,9 ккал/моль.
Для ковалентного связывания нуклеотида IV с синтезированными магнитными частицами, имеющими якорную карбоксильную группу, 1 мл коллоидного раствора таких частиц в дистиллированной воде с концентрацией по железу 50 мкг/мл смешивают с 0,014 мл водного раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с концентрацией 10 мг/мл и с 0,008 мл водного раствора N-гидроксисукцинимида с концентрацией 10 мг/мл, после чего полученный раствор инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Далее к полученному раствору добавляют 0,001 мл свежеприготовленного раствора нуклеотида IV в дистиллированной воде с концентрацией 224 мкМ и полученный коллоидный раствор перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего несвязанный нуклеотид IV отделяют от модифицированных нуклеотидом магнитных частиц путем однократного пропускания реакционной смеси через гель-хроматографическую колонку PD-10.
Для закрепления нуклеотидов I, II и III на поверхности подложки ее обрабатывают индивидуальными водными растворами каждого нуклеотида с концентрацией 50 мкМ, путем нанесения механическим дозатором по 0,001 мл каждого из растворов на одну из сторон подложки таким образом, чтобы получить при этом три ряда, в каждом из которых находится по три лунки. При этом каждые три лунки в пределах одного ряда содержат нуклеотид только одного типа.
Вышеуказанные растворы нуклеотидов I, II и III на поверхности подложек инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее, подложки помещают в стеклянный стакан объемом 100 мл, содержащий 80 мл натрий-фосфатного буфера с концентрацией 137 ммоль/л (мМ), и промывают в течение 5 мин путем непрерывного перемешивания буфера со скоростью 200 об/мин с использованием магнитной мешалки. По описанной выше схеме получают серию подложек с закрепленными нуклеотидами I, II и III.
После это для блокировки непрореагировавших с нуклеотидами якорных групп на поверхности подложек их обрабатывают органическим соединением (этаноламином), способным образовывать ковалентную связь с поверхностью подложек в местах, где не была образована ковалентная связь между поверхностью подложек и нуклеотидом. Для этого 1 мл раствора этаноламина (98% по массе) с помощью дозатора равномерно распределяют по той же поверхности каждой из подложек и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого подложки промывают 137 мМ раствором натрий-фосфатного буфера в течение 5 мин и оставляют сушиться при комнатной температуре до тех пор, пока их масса не перестает изменяться.
Далее, всю поверхность каждой из подложек, на которой ранее были закреплены нуклеотиды I, II и III, обрабатывают 0,050 мл водного раствора комплементарного им модифицированного нуклеотида IV, содержащего ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-5 и ковалентно-связанную только одну магнитную частицу. При этом используют коллоидный раствор нуклеотида с концентрацией 8 мкМ в коммерчески доступном солевом буфере Arrayit (http://shop.arrayit.com/). После обработки подложек раствором модифицированного нуклеотида IV их переносят в герметичные камеры, которые затем помещают на 3 ч в водяную баню с температурой 62°С. По истечении данного времени, подложки извлекают из камер и повторно промывают 80 мл раствора натрий-фосфатного буфера с концентрацией 137 мМ в течение 5 мин для удаления не вступивших в реакцию молекул модифицированного нуклеотида IV. После этого подложки повторно сушат при комнатной температуре до постоянной массы, после чего помещают в конфокальный сканер модели InnoScan 900 (Arrayit) и сканируют при длине волны лазера 635 нм, получая их флуоресцентную картину. Далее измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя в каждой лунке на поверхности каждой из подложек и с помощью специальной компьютерной программы ImageJ для каждой подложки и каждого типа нуклеотида вычисляют усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя.
Каждое из этих усредненных значений для каждого типа нуклеотида на поверхности каждой подложки принимают за 100%.
Для первой подложки получают значения 124, 85 и 225 относительных единиц (отн. ед.) интенсивности флуоресценции ранее модифицированных нуклеотидом IV нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. Затем первую подложку помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, которую затем помещают в генератор низкочастотного переменного магнитного поля модели TOR 03/15 (ООО «Наноматериалы») и обрабатывают в течение 15 мин магнитным полем при неизменных частоте магнитного поля 180 Гц и амплитуде 100 милитесла (мТл). При этом налагаемый вектор магнитного поля направлен параллельно поверхности подложки, на которой закреплены нуклеотиды.
После этого подложку извлекают из генератора магнитного поля, в течение 5 мин третий раз промывают натрий-фосфатным буфером с концентрацией 137 мМ для удаления оторвавшихся от подложек модифицированного нуклеотида IV, сушат при комнатной температуре до постоянной массы, повторно помещают в конфокальный сканер и повторно сканируют при той же длине волны лазера 635 нм, после чего для каждой лунки повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке.
1i
0i
0i
1i
Затем вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают усредненные значения 84, 85 и 225 отн. ед. интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. После этого проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют процентную долю удаленного красителя  ранее закрепленного на нуклеотиде IV, с поверхности подложки, которую рассчитывают по следующей формуле: =(1 - (I/I)⋅100%, где индекс i=I, II, III указывает тип нуклеотида, ковалентно-связанного с подложкой; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке до ее обработки магнитным полем; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке после ее обработки магнитным полем и последующей промывки. Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ранее ковалентно-связанного с нуклеотидом IV, для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III составляет 32% 0% и 0%, соответственно. Таким образом, после 15 мин воздействия магнитного поля, с постоянными амплитудой и частотой, разрушаются комплементарные связи только у пары нуклеотид IV/нуклеотид I, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретает энергию магнитного поля, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида I, которая, как было отмечено выше, составляет 9,1 ккал/моль.
Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида I может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны, соответственно, 112, 54 и 89 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, и обрабатывают в течение 5 мин магнитным полем с теми же характеристиками, после чего проделывают описанную выше последовательность действий. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны 112, 54 и 89 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют параметр . В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем с вышеуказанными характеристиками, процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ранее ковалентно-связанного с нуклеотидом IV, составляет 0%, 0% и 0% для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. На основании полученных результатов делают вывод о том, что после 5 мин воздействия магнитного поля, комплементарные связи между нуклеотидами еще не разрушаются. Это свидетельствует о том, что за это время магнитная частица еще не приобрела энергию магнитного поля, достаточную для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотидов.
Далее берут новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны, соответственно, 87, 96 и 74 отн. ед., аналогичную ранее использованной и не подвергнутую воздействию магнитного поля, и продолжительность обработки подложки магнитным полем увеличивают до 10 мин, после чего с подложкой проделывают все вышеописанные операции. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, составляют 82, 96 и 74 отн. ед. интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. Последующее сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем позволяет определить, что значение параметра  составляет 6%, 0% и 0% для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно.
Таким образом, 10 мин воздействия магнитного поля достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид IV/нуклеотид I, что свидетельствует о том, что за это время частица уже приобретает энергию, не менее энергии связи между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида I. В результате, получают первую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Для получения второй экспериментальной точки новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны, соответственно, 45, 86 и 72 отн. ед. обрабатывают в течение 60 мин магнитным полем с теми же амплитудой и частотой, после чего ее промывают натрий-фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 635 нм. Далее в каждой из лунок повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 17, 65 и 72 отн. ед. интенсивности флуоресценции в случае нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III соответственно. После этого повторно проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют параметр . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом IV, с поверхности подложки составляет 62%, 24% и 0% для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. В результате получают, что после 60 мин воздействия магнитного поля, также разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид IV/нуклеотид II, что свидетельствует о том, что за это время частица уже приобрела необходимую для этого энергию, равную энергии связи между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида II, которая составляет 31,0 ккал/моль.
Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида II может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны, соответственно, 74, 58 и 75 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, и вновь обрабатывают в течение 30 мин магнитным полем, после чего проделывают описанную выше последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны 0, 58 и 75 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем в течение 30 мин, процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом IV, с поверхности подложки составляет 100, 0 и 0% для модифицированных нуклеотидом IV нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что после 30 мин воздействия магнитного поля, комплементарные связи между нуклеотидом IV и нуклеотидом II не разрушаются. Это свидетельствует о том, что за 30 мин частица еще не приобрела необходимую для этого энергию. Далее используют новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны, соответственно, 114, 78 и 61 отн. ед. и продолжительность обработки подложки магнитным полем увеличивают до 40 мин, после чего с подложкой проделывают все вышеописанные операции. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, составляют 0, 72 и 61 отн. ед. интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. Последующее сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем позволяет определить, что значение параметра  составляет 100%, 8% и 0% для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно.
Таким образом, 40 мин воздействия магнитного поля достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид IV/нуклеотид II, что свидетельствует о том, что за это время частица уже приобрела энергию, не менее энергии связи между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида II, которая, как было отмечено выше, составляет 31,0 ккал/моль. В результате, получают вторую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
На последнем этапе новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны, соответственно, 231, 98 и 114 отн. ед. в течение 180 мин обрабатывают магнитным полем, после чего ее промывают натрий- фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 635 нм. Далее повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке в каждой из лунок. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 0, 18 и 67 отн. ед. для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно.
После этого проводят повторно сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют значение параметра . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом IV, составляет 100%, 82% и 41% для модифицированных нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. Таким образом, после 180 мин воздействия магнитного поля, разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид IV/нуклеотид III, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретает энергию не менее энергии связи между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида III, которая составляет 90,9 ккал/моль.
Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида III может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля. Учитывая также из предыдущих экспериментов, что 60 мин обработки подложки магнитным полем недостаточно для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида III, новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны, соответственно, 115, 147 и 123 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера и обрабатывают в течение 120 мин магнитным полем, после чего проделывают описанную выше последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III равны 0, 0 и 108 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что после 120 мин обработки подложки магнитным полем, процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом IV, составляет 100%, 100% и 12% для модифицированных нуклеотида I, нуклеотида II и нуклеотида III, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что 120 мин воздействия магнитного поля достаточно для разрушения комплементарных связей между нуклеотидом IV и нуклеотидом III. Это свидетельствует о том, что в этих условиях магнитная частица приобретает энергию, достаточную для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида IV и нуклеотида III. В результате, получают третью достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Далее на основании полученных данных с помощью компьютерной программы строят показанную на Фиг. 1 калибровочную кривую зависимости приведенной на оси у суммарной энергии связи между комплементарными участками различных нуклеотидов в ккал/моль от приведенной на оси х продолжительности воздействия такого поля в мин при неизменных значениях частоты магнитного поля и его амплитуды. Затем с помощью компьютерной программы устанавливают, что полученная калибровочная кривая описывается зависимостью у=0,7517⋅х+0,802.
0
A
23
-23
По полученному уравнению калибровочной кривой можно вычислить, что, при произвольно выбранной величине продолжительности обработки подложки магнитным полем, например, при 140 мин, энергия, приходящаяся на моль комплементарных связей различных нуклеотидов, равна у=0,7517⋅140+0,802=106 ккал/моль. Таким образом, энергия индивидуальной магнитной частицы, приобретаемая ей в таком поле, равна Е=E/N=106/6,02⋅10=17,6⋅10 ккал.
Пример 2.
В примере используют коммерчески доступные подложки из стекла, одна сторона которых содержит якорные аминогруппы, и сферические магнитные частицы маггемита с размером 55 нм, которые получают методом термического разложения ацетилацетоната железа (III) в дибензиловом эфире. Для этого, 2 ммоль ацетилацетоната железа (III), 4 ммоль олеиновой кислоты, и 40 мл дибензилового эфира смешивают в двугорлой колбе, снабженной обратным холодильником и термометром. Полученную реакционную смесь нагревают до 296°С со скоростью 2°С/мин при непрерывном перемешивании со скоростью 500 об/мин с использованием лабораторной плитки, имеющей функцию магнитного перемешивания, и выдерживают при данной температуре в течение 5 ч. После этого полученную смесь охлаждают до комнатной температуры путем удаления источника нагрева, магнитные частицы отделяют от раствора путем магнитной декантации и суспендируют в 20 мл гексана.
Форму магнитных частиц определяют просвечивающей электронной микроскопией, а средний размер частиц определяют с использованием компьютерной программы ImageJ. Полученные частицы являются маггемитом, что подтверждается ренгенофазовым анализом.
Для получения якорных аминогрупп на поверхности синтезированных магнитных частиц 24 мг гидроксида натрия и 41 мг 4-нитродофамина растворяют в 10 мл метанола, после чего к полученному раствору добавляют 10 мл ранее полученного коллоидного раствора частиц в гексане с концентрацией 1 мг/мл. Полученную реакционную смесь выдерживают на водяной бане при температуре 50°С в течение 4 ч при постоянном перемешивании с использованием магнитной мешалки. По окончании реакции модифицированные магнитные частицы отделяют от раствора центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об/мин. Образовавшийся после центрифугирования осадок магнитных частиц ресуспендируют в 40 мл деионизированной воды и повторно центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин в центрифужных фильтрах с размером пор 30 кДа до получения 2 мл коллоидного раствора магнитных частиц. Далее полученный коллоидный раствор магнитных частиц вновь разбавляют деионизированной водой до 40 мл и проводят третье центрифугирование. После этого оставшийся на фильтре сконцентрированный раствор частиц маггемита суспендируют в 10 мл деионизированной воды.
В примере также используют три различных коммерчески доступных одноцепочечных нуклеотида V, VI и VII, которые представлены в Таблице 2. При этом каждый из нуклеотидов V, VI и VII содержит на 3'-конце якорную эпоксидную группу для последующего ковалентного связывания с поверхностью подложки.
В качестве нуклеотида, с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, используют коммерчески доступный одноцепочечный нуклеотид VIII (Таблица 2), содержащий на 5'-конце ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-3 (цианин-3-тимин), а на 3'-конце - якорную карбоксильную группу (карбокси-гуанин) для последующего ковалентного связывания с магнитной частицей. При этом нуклеотид VIII комплементарен каждому из нуклеотидов V, VI и VII.
Далее с помощью компьютерной программы [http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html] определяют, что энергия связи между комплементарными участками для следующих пар: нуклеотид VIII /нуклеотид V, нуклеотид VIII /нуклеотид VI и нуклеотид VIII /нуклеотид VII, составляет, соответственно, 19,7 ккал/моль, 24,6 ккал/моль и 46,5 ккал/моль.
Для ковалентного связывания нуклеотида VIII с синтезированными магнитными частицами маггемита, имеющими якорную аминогруппу, 1 мл коллоидного раствора таких частиц в дистиллированной воде с концентрацией по железу 100 мкг/мл смешивают с 0,028 мл водного раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с концентрацией 10 мг/мл и с 0,016 мл водного раствора N-гидроксисукцинимида с концентрацией 10 мг/мл, после чего полученный раствор инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее к полученному раствору добавляют 0,002 мл свежеприготовленного раствора нуклеотида VIII в 137 мМ натрий-фосфатном буфере и полученный коллоидный раствор перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего несвязанный нуклеотид VIII отделяют от магнитных частиц путем однократного пропускания реакционной смеси через гель-хроматографическую колонку PD-10.
Для закрепления нуклеотидов V, VI и VII на поверхности серии подложек их обрабатывают индивидуальными растворами каждого нуклеотида с концентрацией 100 мкМ каждый в 137 мМ натрий-фосфатном буфере, путем нанесения механическим дозатором 0,001 мл вышеуказанных растворов нуклеотидов V, VI и VII на одну из сторон каждой подложки таким образом, чтобы получить при этом три ряда, в каждом из которых находится по три лунки. При этом каждые три лунки в пределах одного ряда содержат нуклеотид только одного типа. По описанной выше схеме получают серию подложек с закрепленными нуклеотидами V, VI и VII.
Нанесенные на поверхность подложки растворы нуклеотидов V, VI и VII инкубируют на поверхности подложек в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее подложки помещают в стеклянный стакан объемом 100 мл, содержащий 80 мл дистиллированной воды, и промывают в течение 10 мин путем непрерывного перемешивания воды со скоростью 300 об/мин с использованием магнитной мешалки.
После это для блокировки непрореагировавших с нуклеотидами якорных групп на поверхности подложек их обрабатывают органическим соединением (эпихлогидрином), способным образовывать ковалентную связь с поверхностью подложек в местах, где не была образована ковалентная связь между поверхностью подложек и нуклеотидом. Для этого 1 мл раствора эпихлогидрина (99% по массе) равномерно распределяют механическим дозатором по всей поверхности одной из сторон каждой из подложек и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого подложки промают 137 мМ раствором натрий-фосфатного буфера в течение 5 мин и оставляют сушиться при комнатной температуре до тех пор, пока их масса не перестает изменяться.
Далее, всю поверхность каждой подложки, на которой закреплены нуклеотиды V, VI и VII, обрабатывают 0,050 мл водного раствора комплементарного им модифицированного нуклеотида VIII, содержащего ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-3 и ковалентно-связанную частицу маггемита. При этом используют раствор нуклеотида с концентрацией 10 мкМ в 137 мМ натрий-фосфатном буфере. Обработку проводят путем равномерного распределения раствора модифицированного нуклеотида VIII по всей поверхности каждой из подложек и последующего их помещения в герметичные камеры. Далее заполненные камеры помещают на 5 ч в водяную баню с температурой 50°С. По истечении данного времени подложки извлекают из камер и повторно промывают в течение 10 мин 100 мл раствора натрий-фосфатного буфера с концентрацией 137 мМ для удаления не вступившего в реакцию модифицированного нуклеотида VIII. После этого подложки повторно сушат при комнатной температуре до постоянной массы, затем помещают в конфокальный сканер модели InnoScan 710 (Arrayit) и сканируют при длине волны лазера 532 нм, получая их флуоресцентную картину. Далее измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя в каждой лунке на поверхности каждой из подложек и с помощью компьютерной программы ImageJ для каждой подложки и каждого типа нуклеотида вычисляют усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя по трем полученным значениям.
Каждое из этих усредненных значений интенсивности флуоресценции красителя для каждого типа нуклеотида на поверхности каждой подложки принимают за 100%.
Затем первую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для ранее модифицированных нуклеотидом VIII нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны, соответственно, 124, 117 и 209 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, которую затем помещают в генератор низкочастотного переменного магнитного поля модели TOR 03/15 и обрабатывают в течение 10 мин магнитным полем при неизменных частоте магнитного поля 180 Гц и амплитуде 100 мТл. При этом, вектор магнитного поля направлен перпендикулярно плоскости подложки, на которой закреплены нуклеотиды.
После этого подложку извлекают из генератора магнитного поля, третий раз промывают в течение 20 мин натрий-фосфатным буфером с концентрацией 137 мМ для удаления оторвавшего от подложки модифицированного нуклеотида VIII, сушат при комнатной температуре до постоянной массы, повторно помещают в конфокальный сканер и повторно сканируют при длине волны лазера 532 нм, после чего для каждой лунки повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке.
1i
0i
0i
1i
Затем вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают усредненные значения 101, 117 и 209 отн. ед. интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно. После этого проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют значение параметра , который рассчитывают по формуле: =(1 - (I/I)⋅100%, где индекс i=V, VI, VII казывает тип нуклеотида, ковалентно-связанного с подложкой; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке до ее обработки магнитным полем; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке после ее обработки магнитным полем и последующей промывки. Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом VIII, с поверхности подложки составляет 19%, 0% и 0% для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VII и нуклеотида VIII, соответственно. Таким образом, после 20 мин воздействия магнитного поля, с постоянными амплитудой и частотой, разрушаются комплементарные связи только у пары нуклеотид VIII/нуклеотид V, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретает энергию, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида V, которая, как было отмечено выше, составляет 19,7 ккал/моль.
Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида V может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны, соответственно, 235, 145 и 174 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, и обрабатывают в течение 10 мин магнитным полем, после чего проделывают аналогичную описанную выше последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны 235, 145 и 174 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем, процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом VIII, составляет 0%, 0% и 0% для каждого нуклеотида. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что после 10 мин воздействия магнитного поля, комплементарные связи между нуклеотидами не разрушаются.
Далее берут новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны, соответственно, 85, 102 и 107 отн. ед., и продолжительность обработки подложки магнитным полем увеличивают до 15 мин, после чего с подложкой проделывают все вышеописанные действия. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, составляют 77, 102 и 107 отн. ед. интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно. Последующее сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем позволяет определить значения параметра , равного 9%, 0% и 0% для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно.
Таким образом, 15 мин воздействия магнитного поля достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид VIII/нуклеотид V, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобрела энергию, достаточную для разрушения связи между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида V, которая, как было отмечено выше, составляет 19,7 ккал/моль. В результате, получают первую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Для получения второй достоверной экспериментальной точки на калибровочной кривой новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны, соответственно, 152, 147 и 86 отн. ед. обрабатывают в течение 40 мин магнитным полем с теми же амплитудой и частотой, после чего ее промывают натрий-фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 532 нм. Далее повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке, в каждой из лунок. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 102, 125 и 86 отн. ед. интенсивности флуоресценции в случае модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VIII, соответственно. После этого повторно проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют значение параметра . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом VIII, с поверхности подложки составляет 33%, 15% и 0% для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно. В результате получают, что после 40 мин воздействия магнитного поля, также разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид VIII/нуклеотид VI, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобрела энергию, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида VI, которая составляет 24,6 ккал/моль.
Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида VI может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны, соответственно, 114, 98 и 75 отн. ед. помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, и обрабатывают в течение 30 мин магнитным полем, после чего проделывают описанную выше аналогичную последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны 75, 92 и 75 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем, процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом VIII, с поверхности подложки составляет 34%, 6% и 0% для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно.
Таким образом, 30 мин воздействия магнитного поля, достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид VIII/нуклеотид VI, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретала энергию, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида VI, которая, как было отмечено выше, составляет 24,6 ккал/моль. В результате, получают вторую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
На последнем этапе новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны, соответственно, 201, 154 и 168 отн. ед. в течение 80 мин обрабатывают магнитным полем, после чего ее промывают натрий- фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 532 нм. Далее повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке, в каждой из лунок. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 97, 112 и 144 отн. ед. для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно. После этого проводят повторно сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют значение параметра . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом VIII, составляет 52%, 27% и 14% для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно. Таким образом, после 80 мин воздействия магнитного поля разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид VIII/нуклеотид VII, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобрела энергию, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида VII, которая составляет 46,5 ккал/моль. Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида VII может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля с теми же характеристиками. Учитывая также из предыдущих экспериментов, 40 мин обработки подложки магнитным полем было недостаточно для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида VII, новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны, соответственно, 101, 107 и 145 отн. ед. помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера и обрабатывают в течение 60 мин магнитным полем, после чего проделывают описанную выше аналогичную последовательность операций.
В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII равны 22, 81 и 132 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра п. В результате получают, что после 60 мин обработки подложки магнитным полем процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом VIII, составляет 78%, 24% и 9% для модифицированных нуклеотида V, нуклеотида VI и нуклеотида VII, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что 60 мин воздействия магнитного поля, достаточно для разрушения комплементарных связей между нуклеотидом VIII и нуклеотидом VII. Это свидетельствует о том, что за 60 мин магнитная частица приобрела энергию, достаточную для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида VIII и нуклеотида VII и равную 46,5 ккал/моль. В результате, получают третью достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Далее на основании полученных данных с помощью компьютерной программы строят показанную на Фиг. 2 калибровочную кривую зависимости приведенной на оси у суммарной энергии связи между комплементарными участками различных нуклеотидов в ккал/моль от приведенной на оси х продолжительности воздействия такого поля в мин при неизменных значениях частоты магнитного поля и его амплитуды. Затем с помощью компьютерной программы устанавливают, что полученная калибровочная кривая описывается зависимостью у=0,7314⋅х+3,5.
0
A
23
-23
По полученному уравнению калибровочной кривой можно вычислить, что, при произвольно выбранной величине продолжительности обработки подложки магнитным полем, например, при 100 мин, энергия, приходящаяся на моль комплементарных связей различных нуклеотидов, равна у=0,7314⋅100+3,5=76,6 ккал/моль. Таким образом, энергия индивидуальной магнитной частицы, приобретаемая ей в таком поле, равна Е=E/N=76,6/6,02⋅10=12,7⋅10 ккал.
Пример 3.
В примере используют коммерчески доступные подложки из золота, и октаэдрические магнитные частицы феррита кобальта с размером 100 нм, которые получают методом термического разложения смеси ацетилацетоната железа (III) и ацетилацетоната кобальта (II) в дифениловом эфире. Для этого, 6 ммоль ацетилацетоната железа (III), 3 ммоль ацетилацетоната кобальта (II), 2 ммоль олеиновой кислоты, 6 ммоль олеиламина и 30 мл дифенилового эфира смешивают в трехгорлой колбе объемом 250 мл, снабженной обратным холодильником, термометром и подводом инертного газа. Полученную реакционную смесь нагревают в атмосфере аргона до 257°С со скоростью 2°С/мин при непрерывном перемешивании со скоростью 500 об/мин с использованием лабораторной плитки, имеющей функцию магнитного перемешивания, и выдерживают при данной температуре в течение 8 ч. После этого полученный коллоидный раствор охлаждают до комнатной температуры путем удаления источника нагрева, магнитные частицы отделяют от раствора путем магнитной декантации и суспендируют в 20 мл хлороформа.
Форму магнитных частиц определяют просвечивающей электронной микроскопией, а средний размер частиц определяют с использованием компьютерной программы ImageJ. Полученные частицы являются ферритом кобальта, что подтверждается ренгенофазовым анализом.
Для получения якорных эпоксидных групп на поверхности синтезированных магнитных частиц 120 мг А,Ω-бис(эпокси)производного полиэтиленгликоля (М=1000 г/моль), 4 мг 4-нитродофамина и 10 мг карбоната калия помещают в одногорлую колбу объемом 25 мл и растворяют в 2 мл хлороформа, после чего перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем, в полученную смесь добавляют 10 мл дистиллированной воды и 10 мл коллоидного раствора ранее полученных частиц феррита кобальта в хлороформе с концентрацией 1 мг/мл. Далее хлороформ удаляют из смеси при помощи вакуумного роторного испарителя при температуре 50°С и давлении 100 милибар (мбар). Оставшийся в колбе водный коллоидный раствор частиц центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин в центрифужных фильтрах с размером пор 30 кДа. Оставшийся на фильтре сконцентрированный коллоидный раствор частиц феррита кобальта суспендируют в 20 мл дистиллированной воды.
В примере также используют три различных коммерчески доступных одноцепочечных нуклеотида IX, X и XI, которые представлены в Таблице 3. При этом каждый из нуклеотидов IX, X и XI содержит на 3'-конце якорную тиольную группу (меркапто-аденин) для последующего ковалентного связывания с поверхностью подложки.
В качестве нуклеотида, с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи, используют коммерчески доступный одноцепочечный нуклеотид XII (Таблица 3), содержащий на 5'-конце ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-5.5 (цианин-5.5 - тимин), а на 3'-конце - якорную аминогруппу для ковалентного связывания с магнитной частицей. При этом нуклеотид XII комплементарен каждому из нуклеотидов IX, X и XI.
Далее с помощью компьютерной программы [http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html] определяют, что энергия связи между комплементарными участками для следующих пар: нуклеотид XII/нуклеотид IX, нуклеотид XII/нуклеотид X и нуклеотид XII/нуклеотид XI, составляет соответственно 6,4 ккал/моль, 12,3 ккал/моль и 14,7 ккал/моль.
Для ковалентного связывания нуклеотида XII с синтезированными магнитными частицами, имеющими якорную эпоксидную группу, 1 мл коллоидного раствора таких частиц в дистиллированной воде с концентрацией по железу 100 мкг/мл смешивают с 0,002 мл свежеприготовленного раствора нуклеотида XII в дистиллированной воде с концентрацией 100 мкМ и полученный коллоидный раствор перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего несвязанный нуклеотид XII отделяют от магнитных частиц путем однократного пропускания реакционной смеси через гель-хроматографическую колонку PD-10.
Для закрепления нуклеотидов IX, X и XI на поверхности подложки ее обрабатывают индивидуальными водными растворами каждого нуклеотида с концентрацией 100 мкМ каждый, путем нанесения механическим дозатором 0,001 мл вышеуказанных растворов нуклеотидов IX, X и XI на одну из сторон подложки таким образом, чтобы получить при этом три ряда, в каждом из которых находится по три лунки. При этом каждые три лунки в пределах одного ряда содержат нуклеотид только одного типа. По описанной выше схеме получают серию подложек с закрепленными нуклеотидами IX, X и XI.
Вышеуказанные растворы нуклеотидов IX, X и XI инкубируют на поверхности подложек в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее, подложки помещают в стеклянный стакан объемом 100 мл, содержащий 70 мл натрий-фосфатного буфера с концентрацией 137 мМ, и промывают в течение 10 мин путем непрерывного перемешивания буфера со скоростью 500 об/мин с использованием магнитной мешалки.
После это дополнительно блокируют поверхность каждой золотой подложки, на которой не проводилось закрепление нуклеотидов IX, X и XI. Для этого поверхности подложек обрабатывают органическим соединением (2-меркаптоэтанолом), способным образовывать ковалентную связь с поверхностью золотых подложек в местах, где не была образована ковалентная связь между поверхностью подложек и нуклеотидами. Для этого 1 мл раствора 2-меркаптоэтанола (50% по массе) равномерно распределяют механическим дозатором по всей поверхности каждой из подложек и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого подложки промывают 137 мМ раствором натрий-фосфатного буфера в течение 5 мин и оставляют сушиться при комнатной температуре до тех пор, пока их масса не перестает изменяться.
Далее, всю поверхность каждой из подложек, на которой закреплены нуклеотиды IX, X и XI, обрабатывают 0,040 мл водного раствора комплементарного им модифицированного нуклеотида XII, содержащего ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-5.5 и ковалентно-связанную магнитную частицу феррита кобальта. При этом используют раствор нуклеотида с концентрацией 6 мкМ в коммерчески доступном солевом буфере Arrayit. Обработку проводят путем равномерного распределения раствора модифицированного нуклеотида XII по всей поверхности каждой подложки и последующего их помещения в герметичные камеры. Далее заполненные камеры помещают на 2 ч в водяную баню с температурой 40°С. По истечении данного времени подложки извлекают из камер и повторно промывают в течение 10 мин 80 мл раствора натрий-фосфатного буфера с концентрацией 137 мМ для удаления не вступившего в реакцию модифицированного нуклеотида XII. После этого подложки повторно сушат при комнатной температуре до постоянной массы, после чего помещают в конфокальный сканер модели InnoScan 710 IR (Arrayit) и сканируют при длине волны лазера 670 нм, получая их флуоресцентную картину. Далее измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя в каждой из лунок на поверхности каждой подложки и с помощью компьютерной программы ImageJ для каждой подложки и каждого типа нуклеотида по трем полученным значениям вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя.
Каждое из этих усредненных значений интенсивности флуоресценции красителя для каждого типа нуклеотида на поверхности каждой подложки принимают за 100%.
Затем первую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидом XII нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 78, 96 и 103 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 15 мл натрий-фосфатного буфера, которую затем помещают в генератор низкочастотного переменного магнитного поля модели TOR 03/15 и обрабатывают при значении амплитуды магнитного поля равной 40 мТл при неизменных частоте магнитного поля 180 Гц и продолжительности обработки 30 мин. При этом, вектор магнитного поля направлен параллельно плоскости подложки, на которой закреплены нуклеотиды.
После этого подложку извлекают из генератора магнитного поля, третий раз промывают в течение 10 мин натрий-фосфатным буфером с концентрацией 137 мМ для удаления оторвавшегося с поверхности подложки модифицированного нуклеотида XII, сушат при комнатной температуре до постоянной массы, повторно помещают в конфокальный сканер и повторно сканируют при той же длине волны 670 нм, после чего для каждой лунки повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке.
1i
0i
0i
1i
Затем вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают усредненные значения 53, 96 и 103 отн. ед. интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. После этого проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют значение параметра , который рассчитывают по формуле: =(1 - (I/I))⋅100%, где i=IX, X и XI - тип нуклеотида, ковалентно-связанного с подложкой; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке до ее обработки магнитным полем; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке после ее обработки магнитным полем и последующей промывки. Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XII, составляет 32%, 0% и 0% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. Таким образом, при амплитуде магнитного поля 40 мТл, разрушаются комплементарные связи только у пары нуклеотид ХП/нуклеотид IX, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобрела энергию, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида IX, которая, как было отмечено выше, составляет 6,4 ккал/моль.
Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида IX может произойти и при более низких значениях амплитуды магнитного поля. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 115, 147 и 101 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, и обрабатывают магнитным полем при амплитуде 20 мТл, после чего проделывают описанную выше последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны 115, 147 и 101 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем, процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XII, с поверхности подложки составляет 0, 0 и 0% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что при амплитуде магнитного поля равной 20 мТл, комплементарные связи между различными нуклеотидами не разрушаются. Это свидетельствует о том, что в данных условиях магнитная частица еще не приобрела энергию, необходимую для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотидов.
Далее берут новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 94, 257 и 182 отн. ед., амплитуду магнитного поля увеличивают до 30 мТл, после чего с подложкой проделывают все вышеописанные действия. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, составляют 90, 257 и 182 отн. ед. интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. Последующее сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем позволяет определить, что значение параметра  составляет 5%, 0% и 0% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно.
Таким образом, амплитуды магнитного поля, равной 30 мТл, достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид ХП/нуклеотид IX, что свидетельствует о том, что при такой амплитуде частица феррита кобальта приобрела энергию, достаточную для разрыва вязи между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида IX, которая, как было отмечено выше, составляет 6,4 ккал/моль. В результате, получают первую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Для получения второй достоверной экспериментальной точки новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 94, 257 и 182 отн. ед., обрабатывают магнитным полем с амплитудой равной 100 мТл при тех же постоянных значениях частоты магнитного поля и продолжительности обработки, после чего ее промывают натрий-фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 670 нм. Далее в каждой из лунок повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 43, 188 и 182 отн. ед. интенсивности флуоресценции в случае модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. После этого повторно проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют параметр . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XII, составляет 54%, 27% и 0% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. В результате получают, что при амплитуде магнитного поля 100 мТл, также разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид XII/нуклеотид X, что свидетельствует о том, что в этих условиях частицы приобрела энергию, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида X, которая составляет 12,3 ккал/моль.
Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида X может произойти и при более низких значениях амплитуды магнитного поля, но не ниже 40 мТл. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 139, 158 и 147 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, и обрабатывают магнитным полем с амплитудой 50 мТл, после чего проделывают описанную выше последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны 0, 158 и 147 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XII, составляет 100%, 0% и 0% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что после обработки подложки магнитным полем с амплитудой 50 мТл, комплементарные связи между нуклеотидом XII и нуклеотидом X не разрушаются. Это свидетельствует о том, что при такой амплитуде поля магнитная частица еще не приобрела энергию, достаточную для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида X.
Далее берут новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 132, 96 и 91 отн. ед., и амплитуду магнитного поля увеличивают до 80 мТл, после чего с подложкой проделывают все вышеописанные операции. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, составляют 0, 88 и 72 отн. ед. интенсивности флуоресценции для нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. Последующее сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем позволяет определить, что значение параметра  составляет 100%, 8% и 0% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно.
Таким образом, магнитного поля с амплитудой 80 мТл достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид XII/нуклеотид X, что свидетельствует о том, что магнитная частица приобрела энергию, достаточную для разрушения связи между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида X, которая, как было отмечено выше, составляет 12,3 ккал/моль. В результате, получают вторую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
На последнем этапе новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 141, 162 и 197 отн. ед., обрабатывают магнитным полем с амплитудой 120 мТл, после чего ее промывают натрий- фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 670 нм. Далее для каждой из лунок измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 0, 34 и 124 отн. ед. для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно.
После этого проводят повторно сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют значение параметра . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XII, составляет 100%, 79% и 37% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. Таким образом, под воздействием магнитного поля с амплитудой 120 мТл разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид ХП/нуклеотид XI, что свидетельствует о том, что магнитная частица приобрела энергию, необходимую для разрушения связи между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида XI, которая составляет 14,7 ккал/моль.
Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида XI может произойти и при более низких значениях амплитуды магнитного поля. Учитывая, что амплитуды магнитного поля 80 мТл недостаточно для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида XI, новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны, соответственно, 76, 87 и 96 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера и обрабатывают при амплитуде магнитного поля равной 100 мТл, после чего проделывают описанную выше последовательность операций.
В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI равны 0, 0 и 88 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что при амплитуде магнитного поля равной 100 мТл процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XII, составляет 100%, 100% и 8% для модифицированных нуклеотида IX, нуклеотида X и нуклеотида XI, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что амплитуды магнитного поля 100 мТл достаточно для разрушения комплементарных связей между нуклеотидом XII и нуклеотидом XI. Это свидетельствует о том, что при такой амплитуде частица приобрела энергию, необходимую для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида XII и нуклеотида XI. В результате, получают третью достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Далее на основании полученных данных с помощью компьютерной программы строят показанную на Фиг. 3 калибровочную кривую зависимости приведенной на оси у суммарной энергии связи между комплементарными участками различных нуклеотидов в ккал/моль от приведенного на оси х значения амплитуды магнитного поля в мТл при неизменных значениях частоты магнитного поля и продолжительности обработки. Затем с помощью компьютерной программы устанавливают, что полученная калибровочная кривая описывается зависимостью у=0,1422⋅х+0,8829.
0
A
23
-23
По полученному уравнению калибровочной кривой можно вычислить, что, при произвольно выбранной величине амплитуды магнитного поля, например, при 140 мТл, энергия, приходящаяся на моль комплементарных связей различных нуклеотидов, равна у=0,1422⋅140+0,8829=20,8 ккал/моль. Таким образом, энергия индивидуальной магнитной частицы, приобретаемая ей в таком поле, равна Е=E/N=20,8/6,02⋅10=3,46⋅10 ккал.
Пример 4.
Пример 4 проводят аналогично примеру 1, и используют аналогичные подложки и аналогичные магнитные частицы магнетита, однако, нуклеотид с фиксированным количеством нуклеотидных звеньев в цепи (нуклеотид XVI), не содержит на 5'-конце ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-5, а на 3'-конце содержит якорную аминогруппу в составе гуанина (Таблица 4).
Вместо этого, флуоресцентный краситель цианин-5 ковалентно закрепляется на магнитной частице, имеющей якорные карбоксильные группы. Для этого к 1 мл коллоидного раствора магнитных частиц с концентрацией 1 мг/мл в дистиллированной воде добавляют 0,014 мл водного раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с концентрацией 10 мг/мл и с 0,008 мл водного раствора N-гидроксисукцинимида с концентрацией 10 мг/мл, после чего полученный коллоидный раствор инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее к полученному коллоидному раствору добавляют 0,010 мл раствора флуоресцентного красителя цианин-5 с концентрацией 1 мг/мл в диметилсульфоксиде и перемешивают реакционную смесь в течение 24 ч при комнатной температуре. По окончании реакции несвязанные молекулы красителя отделяют от магнитных частиц путем однократного пропускания реакционной смеси через гель-хроматографическую колонку PD-10. В результате получают магнитные частицы, у которых часть якорных карбоксильных групп ковалентно-связанна с молекулами флуоресцентного красителя.
В примере 4, как и в примере 1, используют три различных коммерчески доступных одноцепочечных нуклеотида XIII, XIV и XV, которые представлены в Таблице 4. При этом каждый из нуклеотидов XIII, XIV и XV содержит на 3'-конце якорную аминогруппу в составе аденина для последующего ковалентного связывания с поверхностью подложки.
Далее с помощью компьютерной программы [http://biotools.nubic.northwestem.edu/OligoCalc.html] определяют, что энергия связи между комплементарными участками для следующих пар: нуклеотид XVI/нуклеотид XIII, нуклеотид XVI/нуклеотид XIV и нуклеотид XVI /нуклеотид XV, составляет соответственно 9,1 ккал/моль, 31,0 ккал/моль и 90,9 ккал/моль.
Для ковалентного связывания нуклеотида XVI с синтезированными магнитными частицами, имеющими якорную карбоксильную группу, 1 мл коллоидного раствора таких частиц в дистиллированной воде с концентрацией по железу 50 мкг/мл смешивают с 0,014 мл водного раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида с
концентрацией 10 мг/мл и с 0,008 мл водного раствора N-гидроксисукцинимида с концентрацией 10 мг/мл, после чего полученный раствор инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Далее к полученному коллоидному раствору добавляют 0,001 мл свежеприготовленного раствора нуклеотида XVI в дистиллированной воде с концентрацией 224 мкМ и полученный коллоидный раствор перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего несвязанный нуклеотид XVI отделяют от магнитных частиц путем однократного пропускания реакционной смеси через гель-хроматографическую колонку PD-10.
Для закрепления нуклеотидов XIII, XIV и XV на поверхности подложки ее обрабатывают индивидуальными водными растворами каждого нуклеотида с концентрацией 50 мкМ, путем нанесения механическим дозатором по 0,001 мл каждого из вышеуказанных растворов на одну из сторон подложки таким образом, чтобы получить при этом три ряда, в каждом из которых находится по три лунки. При этом каждые три лунки в пределах одного ряда содержат нуклеотид только одного типа.
Вышеуказанные растворы нуклеотидов XIII, XIV и XV инкубируют на поверхности подложек в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее, подложки помещают в стеклянный стакан объемом 100 мл, содержащий 80 мл натрий-фосфатного буфера с концентрацией 137 ммоль/л (мМ), и промывают в течение 5 мин путем непрерывного перемешивания буфера со скоростью 200 об/мин с использованием магнитной мешалки. По описанной выше схеме получают серию подложек с закрепленными нуклеотидами XIII, XIV и XV.
После это для блокировки непрореагировавших с нуклеотидами якорных групп на поверхности подложек их обрабатывают органическим соединением (этаноламином), способным образовывать ковалентную связь с поверхностью подложек в местах, где не была образована ковалентная связь между поверхностью подложек и нуклеотидом. Для этого 1 мл раствора этаноламина (98% по массе) с помощью дозатора равномерно распределяют по той же поверхности каждой из подложек и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого подложки промывают 137 Мм натрий-фосфатным буфером в течение 5 мин и оставляют сушиться при комнатной температуре до тех пор, пока их масса не перестает изменяться.
Далее, всю поверхность каждой из подложек, на которой ранее были закреплены нуклеотиды XIII, XIV и XV, обрабатывают 0,050 мл водного раствора комплементарного им модифицированного нуклеотида XVI, содержащего ковалентно-связанный флуоресцентный краситель цианин-5 и ковалентно-связанную только одну магнитную частицу. При этом используют раствор нуклеотида с концентрацией 8 мкМ в коммерчески доступном солевом буфере Arrayit Chttp://shop.arrayit.com/). После обработки подложек раствором нуклеотида XVI их переносят в герметичные камеры, которые затем помещают на 3 ч в водяную баню с температурой 62°С. По истечении данного времени, подложки извлекают из камер и в течение 5 мин повторно промывают 80 мл раствора натрий-фосфатного буфера с концентрацией 137 мМ для удаления не вступивших в реакцию молекул модифицированного нуклеотида XVI. После этого подложки повторно сушат при комнатной температуре до постоянной массы, после чего помещают в конфокальный сканер модели InnoScan 900 (Arrayit) и сканируют при длине волны лазера 635 нм, получая их флуоресцентную картину. Далее измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя в каждой лунке на поверхности каждой из подложек и с помощью компьютерной программы ImageJ для каждой подложки и каждого типа нуклеотида вычисляют усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя.
Каждое из этих усредненных значений интенсивности флуоресценции красителя для каждого типа нуклеотида на поверхности каждой подложки принимают за 100%.
Для первой подложки получают значения 86, 85 и 78 относительных единиц (отн. ед.) интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV соответственно. Затем первую подложку помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, которую затем помещают в генератор низкочастотного переменного магнитного поля модели TOR 03/15 и обрабатывают в течение 15 мин магнитным полем при неизменных частоте магнитного поля 180 Гц и амплитуде 100 мТл. При этом вектор магнитного поля направлен параллельно поверхности подложки, на которой закреплены нуклеотиды.
После этого подложку извлекают из генератора магнитного поля, третий раз в течение 5 мин промывают натрий-фосфатным буфером с концентрацией 137 мМ для удаления оторвавшихся от подложек модифицированного нуклеотида XVI, сушат при комнатной температуре до постоянной массы, повторно помещают в конфокальный сканер и повторно сканируют при той же длине волны лазера 635 нм, после чего для каждой лунки повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке.
1i
0i
0i
1i
-
Затем вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают усредненные значения 60, 85 и 78 отн. ед. интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. После этого проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют параметр  по формуле: =(1 - (I/I))100%, где индекс i=XIII, XIV и XV указывает тип нуклеотида, ковалентно-связанного с подложкой; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке до ее обработки магнитным полем; I - среднее значение интенсивности флуоресценции красителя для конкретного типа нуклеотида на подложке после ее обработки магнитным полем и последующей промывки. Таким образом, получают, что процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ранее ковалентно-связанного с нуклеотидом XVI, для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV составляет 30% 0% и 0%, соответственно. Таким образом, после 15 мин воздействия магнитного поля, с постоянными амплитудой и частотой, разрушаются комплементарные связи только у пары нуклеотид XVI/нуклеотид XIII, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретает энергию магнитного поля, необходимую для разрыва связи между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XIII, которая, как было отмечено выше, составляет 9,1 ккал/моль. Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XIII может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля с теми же характеристиками. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны, соответственно, 69, 78 и 152 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера, и обрабатывают в течение 5 мин магнитным полем, после чего проделывают описанную выше последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны 69, 78 и 152 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют параметр . В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем с вышеуказанными характеристиками, процентная доля с поверхности подложки удаленного красителя, ранее ковалентно-связанного с нуклеотидом XVI, составляет 0%, 0% и 0% для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. На основании полученных результатов делают вывод о том, что после 5 мин воздействия магнитного поля, комплементарные связи между нуклеотидами не разрушаются. Это свидетельствует о том, что за это время магнитная частица не приобретает энергию магнитного поля, достаточную для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотидов.
Далее берут новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны, соответственно, 77, 112 и 54 отн. ед., аналогичную ранее использованной и не подвергнутую воздействию магнитного поля, и продолжительность обработки подложки магнитным полем увеличивают до 10 мин, после чего с подложкой проделывают все вышеописанные операции. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, составляют 74, 112 и 54 отн. ед. интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. Последующее сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем позволяет определить, что значение параметра  составляет 4%, 0% и 0% для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно.
Таким образом, 10 мин воздействия магнитного поля достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид XVI/нуклеотид XIII, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретает энергию, не менее энергии связи между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XIII. В результате, получают первую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Для получения второй экспериментальной точки новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны, соответственно, 74, 87 и 53 отн. ед. обрабатывают в течение 60 мин магнитным полем с такой же амплитудой и частотой, после чего ее промывают натрий-фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 635 нм. Далее в каждой из лунок повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 31, 68 и 53 отн. ед. интенсивности флуоресценции в случае модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. После этого повторно проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют параметр . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XVI, с поверхности подложки составляет 58%, 22% и 0% для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. В результате получают, что после 60 мин воздействия магнитного поля, также разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид XVI/нуклеотид XIV, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобрела необходимую для этого энергию магнитного поля, равную энергии связи между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XIV, которая составляет 31,0 ккал/моль.
Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно прдположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XIV может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля. Для этого новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны, соответственно, 54, 87 и 71 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера и обрабатывают в течение 30 мин магнитным полем с теми же характеристиками, после чего проделывают описанную выше последовательность операций. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны 0, 87 и 71 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра п. В результате получают, что после обработки подложки магнитным полем, процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XVI, с поверхности подложки составляет 100, 0 и 0% для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что после 30 мин воздействия магнитного поля, с постоянными амплитудой и частотой, комплементарные связи между нуклеотидом XVI и нуклеотидом XIV не разрушаются. Это свидетельствует о том, что за 30 мин магнитная частица еще не приобрела необходимую для этого энергию. Далее используют новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны, соответственно, 201, 145 и 78 отн. ед. и продолжительность обработки подложки магнитным полем увеличивают до 40 мин, после чего с подложкой проделывают все вышеописанные операции. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, составляют 0, 136 и 78 отн. ед. интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. Последующее сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем позволяет определить, что значение параметра  составляет 100%, 6% и 0% для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно.
Таким образом, 40 мин воздействия магнитного поля достаточно для разрушения комплементарных связей у пары нуклеотид XVI/нуклеотид XIV, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретает энергию не менее энергии связи между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XIV, которая, как было отмечено выше, составляет 31,0 ккал/моль. В результате, получают вторую достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
На последнем этапе новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны, соответственно, 156, 102 и 145 отн. ед. в течение 180 мин обрабатывают магнитным полем, после чего ее промывают натрий-фосфатным буфером и сушат по описанной выше схеме, а затем помещают в конфокальный сканер и сканируют при длине волны лазера 635 нм. Далее повторно измеряют интенсивность флуоресценции иммобилизованного красителя, оставшегося на подложке в каждой из лунок. Затем вновь вычисляют средние значения интенсивности флуоресценции красителя в лунках, содержащих конкретные нуклеотиды, и получают значения 0, 16 и 91 отн. ед. для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно.
После этого проводят повторно сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и определяют значение параметра . Таким образом, получают, что процентная доля удаленного красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XVI, с поверхности подложки составляет 100%, 84% и 37% для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. Таким образом, после 180 мин воздействия магнитного поля, с постоянными амплитудой и частотой, разрушаются комплементарные связи у пары нуклеотид XVI/нуклеотид XV, что свидетельствует о том, что за это время магнитная частица приобретает энергию не менее энергии связи между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XV, которая составляет 90,9 ккал/моль.
Как и в предыдущем случае, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что разрушение связей между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XV может произойти и за более короткий промежуток времени воздействия магнитного поля. Учитывая также из предыдущих экспериментов, что 60 мин обработки подложки магнитным полем недостаточно для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XV, новую подложку, у которой значения интенсивности флуоресценции для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны, соответственно, 165, 112 и 94 отн. ед., помещают в плашку, содержащую 10 мл натрий-фосфатного буфера и обрабатывают в течение 120 мин магнитным полем, после чего проделывают аналогичную последовательность операций, описанную выше. В результате получают, что усредненные значения интенсивности флуоресценции красителя для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV равны 0, 0 и 86 отн. ед. интенсивности флуоресценции, соответственно. После этого вновь проводят сравнение интенсивности флуоресценции красителя на подложке до и после обработки подложки магнитным полем и вновь определяют значение параметра . В результате получают, что после 120 мин обработки подложки магнитным полем с вышеуказанными характеристиками, процентная доля удаленного с поверхности подложки красителя, ковалентно-связанного с нуклеотидом XVI, составляет 100%, 100% и 9% для модифицированных нуклеотидов XIII, XIV и XV, соответственно. Таким образом, на основании полученных результатов делают вывод о том, что 120 мин воздействия магнитного поля достаточно для разрушения комплементарных связей между нуклеотидом XVI и нуклеотидом XV. Это свидетельствует о том, что за 120 мин магнитная частица приобретает энергию, достаточную для разрушения связей между комплементарными участками нуклеотида XVI и нуклеотида XV. В результате, получают третью достоверную экспериментальную точку на калибровочной кривой.
Далее на основании полученных данных с помощью компьютерной программы строят показанную на Фиг.4 калибровочную кривую зависимости приведенной на оси у суммарной энергии связи между комплементарными участками различных нуклеотидов в ккал/моль от приведенной на оси х продолжительности воздействия такого поля в мин при неизменных значениях частоты магнитного поля и его амплитуды. Затем с помощью компьютерной программы устанавливают, что полученная калибровочная кривая описывается зависимостью у=0,7517-х+0,802.
По полученному уравнению калибровочной кривой можно вычислить, что, при произвольно выбранной величине продолжительности обработки подложки магнитным полем, например, при 180 мин, энергия, приходящаяся на моль комплементарных связей различных нуклеотидов, равна у=0,7517-180+0,802=136 ккал/моль. Таким образом, энергия индивидуальной магнитной частицы, приобретаемая ей в таком поле, равна Е=Eo/Na=136/6,02-10=22,6 -10' ккал.
Пример 5.
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако, вместо использованной ранее частоты магнитного поля 180 Гц используют магнитное поле с частотой 1000 Гц. На основании полученных данных с помощью компьютерной программы строят показанную на Фиг.5 калибровочную кривую зависимости приведенной на оси у суммарной.
энергии связи между комплементарными участками различных нуклеотидов в ккал/моль от приведенной на оси х продолжительности воздействия такого поля в мин при неизменных значениях частоты магнитного поля и его амплитуды. Затем с помощью компьютерной программы устанавливают, что полученная калибровочная кривая описывается зависимостью у=0,8021 х - 0,983.
По полученному уравнению калибровочной кривой можно вычислить, что, при произвольно выбранной величине продолжительности обработки подложки магнитным полем, например, при 20 мин, энергия, приходящаяся на моль комплементарных связей различных нуклеотидов, равна у=0,8021-20 - 0,983=15,1 ккал/моль. Таким образом, энергия индивидуальной магнитной частицы, приобретаемая ей в таком поле, равна Е=Eo/Na=15,1/6,02-10=2,5-10’ ккал.
Пример 6.
Опыт проводят аналогично примеру 3, однако, вместо использованной ранее частоты магнитного поля 180 Гц используют магнитное поля с частотой 3000 Гц. На основании полученных данных с помощью компьютерной программы строят показанную на Фиг.6 калибровочную кривую зависимости приведенной на оси у суммарной энергии связи между комплементарными участками различных нуклеотидов в ккал/моль от приведенного на оси х значения амплитуды магнитного поля в мТл при неизменных значениях частоты магнитного поля и продолжительности обработки. Затем с помощью компьютерной программы устанавливают, что полученная калибровочная кривая описывается зависимостью у=0,1066 х+3,5315.
По полученному уравнению калибровочной кривой можно вычислить, что, при произвольно выбранной величине амплитуды магнитного поля, например, при 160 мТл, энергия, приходящаяся на моль
O
A
комплементарных связей различных нуклеотидов, равна у=0,1066-160+3,5315=20,6 ккал/моль. Таким образом, энергия индивидуальной магнитной частицы, приобретаемая ей в таком поле, равна Е=E/N=20,6/6,02-1023=3,42-10'23 ккал.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ позволяет экспериментально определить энергию индивидуальных магнитных частиц, приобретаемую ими в низкочастотном переменном магнитном поле