Подавление активности гидролитических ферментов личинок колорадского жука ингибиторами из растительных тканей

Шпирная И.А., Умаров И.А., Шевченко Н.Д., Ибрагимов Р.И.

ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЛИЧИНОК КОЛОРАДСКОГО ЖУКА ИНГИБИТОРАМИ ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет», г.Уфа

Г идролитическим ферментам и их ингибиторам принадлежит важная роль во взаимоотношениях фитофагов и растений. Уровень активности, молекулярной гетерогенности гидролитических ферментов гетеротрофных организмов и их ингибиторов в тканях растений может рассматриваться как результат сопряженной эволюции растений и организмов-фитофагов [1; 2]. В процессе коэволюции с растениями, насекомые-фитофаги сформировали набор пищеварительных гидролаз, обеспечивающих усвоение питательных веществ из определенных видов растений, их отдельных органов, тканей [3].

Можно предположить, что поддержание свойств, обеспечивающих устойчивость растений, происходило за счет усложнения или повышения активности комплекса ингибиторов, подавляющих активность гидролитических ферментов. Значительные генетически обусловленные различия в содержании

ингибиторов ферментов указывают на

целесообразность поиска связей этого показателя с устойчивостью растений к патогенным

микроорганизмам и вредным насекомым -фитофагам.

Яркий пример специализации и адаптивности ферментативной системы к пищевым субстратам проявляется у колорадского жука. Как известно, растениями картофеля питаются и взрослые насекомые (имаго), и личинки, но наибольший вред картофельным посадкам наносят личинки. Установлено, что личинки колорадского жука за 2 недели уничтожают до 45 % листовой поверхности растений [4].

В настоящей работе была исследованы протеиназы и амилазы личинок колорадского жука и их ингибиторы из тканей картофеля.

Наши эксперименты показали, что

протеолитические ферменты личинок обладают широкой субстратной специфичностью. Они проявляют активность по отношению к синтетическому субстрату БАПНА и белковым субстратам различного происхождения - казеину, гемоглобину, желатине, яичному белку. Особенно активно эти ферменты действовали на желатин, гемоглобин, яичный белок. Активность протеиназ личинок по отношению к этим субстратам определяется на уровне, сопоставимом с активностью высокоочищенных коммерческих препаратов протеиназ. Расчеты показывают, что 1 г тканей личинок содержат активность, эквивалентную 2,3 и 2,7 мг коммерческих препаратов трипсина и проназы, соответственно.

Растения картофеля характеризуются высоким содержанием в тканях ингибиторов протеолитических ферментов. Большая часть экспериментальных работ посвящено изучению белков, подавляющих активность трипсина и химотрипсина [5]. Мы измерили уровень активности белков, подавляющих действие протеиназ личинок колорадского жука, а также протеиназ актиномицетов (проназы Е) в различных органах картофеля. Наибольшая активность этих белков определяется в стеблях картофеля. Так, показатель удельной активности ингибиторов протеиназы личинок колорадского жука в стеблях картофеля изученных сортов изменяется от 2,4 до 4,3 мИЕ/мг белка. Белки картофеля в различной степени подавляют активность проназы Е и протеиназ колорадского жука (рис.1). В целом, уровень активности ингибиторов проназы Е в клубнях, проростках, листьях картофеля значительно выше, чем уровень ингибиторов протеиназ личинок насекомых. Стебли картофеля, напротив, характеризуются относительно более высокой активностью ингибиторов протеиназ личинок, чем ингибиторов проназы Е. Видно также, что высокая активность ингибиторов проназы Е характерна для этиолированных проростков и клубней картофеля. В стеблях и листьях активность этих ингибиторов наоборот, низкая, а активность ингибиторов протеиназ личинок относительно высокая.

мИЕ/мг бёлка

6 1

_________________клубни______________ростки_____________листья_______________стебли_______

РйсЛГ'Активность ингибиторов проназы Е и прбтёиназы личинок колорадского жука из вегетативных органов картофеля (средние арифметические данные по пяти исследованным сортам).

Таблица 1

Активность ингибиторов протеиназ (проназы Е, протеиназ личинок колорадского жука) в органах растений

- представителей различных таксонов

Ш ингибиторы проназы ЕЗ ингибиторы протеиназы ЛКЖ

Вид растения Орган растения Ингибиторы

проназы Е протеиназы ЛКЖ

ИЕ/г массы ИЕ/мг белка ИЕ/г массы ИЕ/мг белка

Семейство Пасленовые

Томат (Solanum lycopersicum) лист 1,2*0,09 4,6*0,36 0,54*0,03 2,1*0,17

плод 0 0 0,73* 8,1*

Баклажан (Solanum melongena лист 1,4*0,12 6,1 ±0,45 0,22*0,011 0,96*0,05

Физалис (Physalis sp.) лист 0,36*0,01 1,6*0,09 0 0

Картофель (Solanum tuberosum) лист 0,74*0,05 2,8±0,18 0,3*0,019 1,12*0,07

проросток клубня 0,8*0,03 7,3*0,51 0,3*0,015 2,9*0,22

стебель 0,74*0,03 2,8±0.12 0,45*0,03 3,5*0,24

клубень 1,08±0,09 4,7*0,41 0,27*0,02 1,2*0,09

цветок 0,8*0,03 4,7*0,39 0,28*0,02 1,65*0,06

Другие семейства

Одуванчик (Taraxacum sp.) лист 1,5*0,21 8,8*0,35 0,36*0,02 2,1*0,14

Тополь (Populus nigra L.) лист 0 0 0,31*0,018 6,2*0,34

Люцерна (Medicago sativa) лист 0 0 0,24*0,01 0,92*0,03

Морковь (Daucus carota) лист 0,85*0,06 4,0*0,28 0,73* 4,6*

корнеплод 0 0 0,73* 4,5*

STI (ком. препарат) - 3,3* 3,3* 0,73* 0,73*

Примечание: активность протеиназы ЛКЖ - 0,12 Е/мл: активность проназы Е — 0,56 Е/мл

*-полное подавление активности протеиназы.

Эти факты позволяют предположить, что в процессе роста и развития растений, имеет место последовательный синтез различных ингибиторов, отличающихся по специфичности действия, мишенью которых являются ферменты представителей разных групп организмов-фитофагов. Как известно, клубни и молодые проростки более подвержены действию гидролаз микроорганизмов (грибов, бактерий), для вегетирующих растений картофеля главную опасность

представляют насекомые, в первую очередь, колорадские жуки. Соответственно, клубни и проростки, обладают высокой активностью ингибиторов ферментов микроорганизмов, а листья и стебли взрослых растений - высокой активностью ингибиторов протеиназ насекомых.

Интересно отметить, что белки из тканей различных видов растений способны подавлять протеиназы личинок колорадского жука и проназы Е

Уровень активности ингибиторов этих протеиназ у изученных видов подвержен значительным колебаниям. При этом, активность ингибиторов в тканях разных органов одних и тех же растений, также существенно различается. Так, в листьях томатов активность ингибиторов проназы высокая, а в плодах такая активность совсем не обнаруживается. Ингибиторы проназы Е отсутствуют также в корнеплодах моркови, в листьях тополя и люцерны. При анализе данных таблицы прослеживается определенная закономерность: между активностью ингибиторов проназы Е и активностью ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука в растительных объектах обратно пропорциональная связь. Так, растения семейства пасленовых, неустойчивые к колорадскому жуку, обладают высоким содержанием белков -ингибиторов проназы Е, и напротив, сниженной, по сравнению с растениями из других семейств, уровнем активности ингибиторов протеиназ личинок жука. Белки из плодов томата и корнеплодов моркови хорошо подавляют активность протеиназ насекомых, но уровень антипроназной активности в них равна нулю. Можно предположить, низкая активность или отсутствие ингибиторов ферментов микроорганизмов в тканях, является одним из факторов низкой устойчивости растительных объектов к грибным и бактериальным поражениям

Литература

1.Harborne J.B. Biochemical aspects of plants and animal devolution // New Phytologist. -1979.-V.83. № 2. P. 601-602.

2.Конарев Ал.В. Системы ингибиторов гидролаз у злаков - организация, функции и эволюционная изменчивость // Автореф. дисс. докт. биол. наук. - М.: 1992.- 38 с.

3.Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Эндогенные ингибиторы протеаз как фактор устойчивости растений // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С.119-123

4.Теняев А.В. Вредоносность колорадского жука на территории Рязанской области // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку. - М.: Наука. 2000. 224 с. Серия «Генетическая инженерия и экология». Том 1. - С. 10-11.

5.Ryan C. A. Protease inhibitors in plants: Genes for improving defenses against insects and pathogens // Ann. Rev. Phytopathol.-1990.- № 28. Р. 425-449.