СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ ГЛАУКОМЫ
METHOD FOR DIAGNOSIS OF GLAUCOMA

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение принадлежит к области медицинской диагностики и относится, в частности, к способам диагностики глаукомы, основанным на анализе аутоиммунной реактивности. Данное изобретение включает два способа диагностики глаукомы. Как первый, так и второй способ диагностики основан на аутоиммунной реактивности в жидкостях организма пациентов, страдающих от глаукомы. Дополнительный аспект изобретения относится к терапевтическим способам, модулирующим аутоиммунную реактивность у пациентов, страдающих от глаукомы.
Первый способ диагностики глаукомы основан на анализе аутоиммунной реактивности жидкостей организма против глазных антигенов, которые, по меньшей мере, частично очищены. Второй способ диагностики глаукомы основан на анализе действия аутоантител в жидкостях организма, на экспрессии белков в выращенных in vitro ганглиозных клетках сетчатки (RGC).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Глаукома представляет собой группу глазных расстройств, характеризующихся прогрессирующей утратой ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов, и постепенной утратой поля зрения. Она представляет собой одну из ведущих причин слепоты во всем мире. Глаукома имеет распространенность среди приблизительно 1-2% всего населения Европы. До 3-4% людей в возрасте более чем 60 лет поражены заболеванием. Наиболее распространенная форма глаукомы представляет собой первичную открытоугольную глаукому (POAG) с распространенностью в диапазоне от 1,1% до 2%.
Патогенез глаукомы понятен только частично, и за заболевание отвечает не только увеличенное внутриглазное давление. Увеличенное внутриглазное давление все еще рассматривают как главный фактор риска, но другие патогенные факторы, такие как процессы апоптоза, увеличенные уровни оксида азота или вовлеченность иммунной системы, вероятно, также имеют значение.
Кроме того, увеличенное внутриглазное давление довольно распространено (10% населения в возрасте 40 лет), тем не менее, только у некоторых из этих людей с течением времени развивается глаукома. До настоящего времени отсутствуют стандартные диагностические тесты для идентификации тех лиц с увеличенным внутриглазным давлением, у которых будет развиваться глаукома. Поскольку раннее лечение глаукомы является критичным для предупреждения утраты зрения, существует потребность в улучшенных диагностических средствах, которые позволяли бы обнаруживать глаукому на ранней стадии независимо от увеличенного внутриглазного давления.
Увеличенное внутриглазное давление известно как главная причина гибели клеток сетчатки и развития глаукомы. Увеличенное давление как причина гибели клеток воспроизведено in vitro. Agar et al. (Brain Res. 2006. 1086 (1): p. 191-200) воздействовал на культуры линий ганглионарных клеток in vitro увеличенным гидростатическим давлением, что вызывало гибель клеток.
Тем не менее, также известно, что приблизительно 30% случаев глаукомы не сопровождается увеличением внутриглазного давления. По меньшей мере некоторые формы глаукомы соответствуют картине нейродегенеративных заболеваний с прогрессирующей дисфункцией аспектов нервной системы наряду с прогрессирующей атрофией пораженных структур периферической или центральной нервной системы. Таким образом, обсуждаются дополнительные причины и механизмы, помимо увеличенного внутриглазного давления, которые могут приводить к разрушению ганглиозных клеток сетчатки, такие как, например увеличенный уровень оксида азота или опосредованный Т-клетками процесс или аутоиммунные приступы.
Возможности раннего обнаружения глаукомы все еще ограничены. Измерение внутриглазного давления может помочь выявить некоторых из пациентов, но колебание уровней давления может также привести к ложно-отрицательному результату. К тому времени, когда пациенты сами отмечают утрату зрительной функции, значительный необратимый дефект ганглиозных клеток сетчатки в большинстве случаев уже успевает произойти.
Примерно 30% случаев глаукомы, которые не сопровождаются увеличенным внутриглазным давлением, называются нормотензивной глаукомой. Традиционный способ обнаружения, при котором измеряют увеличенное внутриглазное давление, не эффективен в случае этих пациентов.
Учитывая отсутствие способа диагностики нормотензивной глаукомы, а также отсутствие способа обнаружения глаукомы на ранней стадии, необходимо разработать способы для обнаружения глаукомы независимо от внутриглазного давления. То, что аутоиммунитет является важным фактором при глаукоме продемонстрировано в нескольких исследованиях, в которых выявлены сывороточные антитела против глазных антигенов. Например белки теплового шока HSP27, HSP60, α-В-кристаллин, γ-энолаза, α-фодрин, глутатион-S-трансфераза и глюкозаминогликаны обладают разными уровнями связывающей реактивности у пациентов, страдающих от глаукомы, по сравнению со здоровыми субъектами (например Joachim, S.C., et al„ Curr. Eye Res. 2007, 32(6): p. 501-9.) Интересно, что для жидкостей организма пациентов, страдающих от глаукомы, характерна не только увеличенная реактивность антител, которые могут оказывать аутоагрессивное влияние, но и сниженная аутоиммунная реактивность для некоторых антигенов. Кроме того, может быть продемонстрировано, что прямое применение антител против HSP приводит к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки в ситуации культуры клеток (Tezel G, et al. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1998; 39:2277-2287).
Ранее были раскрыты способы диагностики, основанные на паттерне специфической аутоиммунной реактивности у пациентов, страдающих от глаукомы. Например, в WO 2004/036220 раскрыты способы диагностики глаукомы путем анализа комплекса репертуара аутоантител против глазных антигенов в жидкостях организма, таких как сыворотка крови, слезы, внутриглазная жидкость или слюна. В качестве источника глазных антигенов используют неочищенные смеси антигенов сетчатки глаза, антигенов зрительного нерва и другие и измеряют сложные паттерны аутоиммунной реактивности. Разнообразные аналитические иммунологические способы, включая анализ путем вестерн-блоттинга, хемилюминисцентный анализ, ИФА (иммуноферментный анализ), радиоиммуноанализ для обнаружения и измерения паттерна аутоиммунной реактивности, а также способы цифрового обнаружения, обработки и анализа изображения использовали для формирования и сравнительного анализа паттернов аутоиммунной реактивности у тестируемых индивидов, здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы. В документе WO 2004/036220 раскрыты способы диагностики глаукомы, основанные на паттернах аутоиммунной реактивности против глазных антигенов, которые не выделены из сложных смесей, включающих большое количество глазных антигенов, большая часть которых не идентифицирована. Различие паттернов аутоиммунной реактивности в жидкостях организма тестируемых индивидов, здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, таким образом позволяет получить диагностический результат. Тем не менее, исследования в области диагностики, касающиеся других заболеваний, таких как рак, показали, что диагностика, основанная на аутоиммунной реактивности против биомаркеров неизвестной идентичности, часто не надежна. Таким образом, существует потребность в надежных способах диагностики глаукомы, которые не зависят от увеличенного внутриглазного давления.
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить альтернативные и улучшенные надежные способы диагностики для обнаружения глаукомы независимо от увеличенного внутриглазного давления путем анализа жидкостей организма. Дополнительная задача изобретения заключается в том, чтобы предложить способы диагностики для обнаружения глаукомы с избирательными степенями чувствительности и специфичности, используемыми для быстрого тестирования и для профессионального лабораторного тестирования. Дополнительные задачи изобретения включают предоставление элементов, несущих антиген, и наборов для диагностики глаукомы, а также вновь идентифицированных глазных антигенов, служащих в качестве биомаркеров для диагностики глаукомы и в качестве блокирующих агентов в терапевтическом лечении глаукомы.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один из аспектов изобретения относится к первому способу диагностики глаукомы, основанному на анализе аутоиммунной реактивности в жидкостях организма против по меньшей мере одного образца, содержащего по меньшей мере один из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов, где аутоиммунную реактивность против одного или более чем одного известного глазного антигена измеряют и преобразуют в индекс глаукомы в отношении предпочтительно взвешенного вклада их измеренной аутоиммунной реактивности в диагностический результат.
Дополнительные аспекты изобретения включают элементы, несущие антиген, несущие по меньшей мере один частично очищенный глазной антиген и способы получения этих элементов, несущих антиген, и их применения для диагностики глаукомы. Дополнительные аспекты включают наборы для диагностики глаукомы, содержащие элемент, несущий антиген, и возможно вспомогательные материалы. Дополнительные аспекты включают способы отбора жидкости организма, такой как слезы, для применения в способе диагностики глаукомы. Другие дополнительные аспекты включают глазные антигены, служащие в качестве биомаркеров для диагностики глаукомы или служащие в качестве терапевтических агентов в терапевтическом лечении глаукомы или служащие для приготовления специфических антител, связывающихся с таким глазным антигеном, для применения в диагностике или терапевтическом способе или композиции.
Первый способ диагностики глаукомы включает стадии (а) взятия по меньшей мере одного образца, содержащего по меньшей мере один по меньшей мере частично очищенный глазной антиген, (б) осуществления реакции жидкости организма по меньшей мере с одним образцом глазного антигена, (в) обнаружения и/или количественной оценки реакций между аутоантителами в жидкости организма и по меньшей мере одним образцом глазного антигена на стадии (б) для определения величины аутоиммунной реактивности, (г) сравнения измеренных значений аутоиммунной реактивности со стандартными данными, полученными для пациентов, страдающих от глаукомы, и/или здоровых индивидов для определения индекса глаукомы для по меньшей мере одного образца антигена и (д) возможно, определения диагностического результата путем оценки по меньшей мере одного индекса глаукомы.
Термин "жидкость организма индивидуумов-людей или животных" в контексте данной заявки на изобретение включает, но не ограничивается указанным, сыворотку крови, слезы, слюну, мочу, внутриглазную жидкость, стекловидное тело глаза или цереброспинальную жидкость и ее фракции, или гомогенат образцов тканей индивидуумов-людей или животных и его фракции. В предпочтительных воплощениях способа диагностики глаукомы используют сыворотку крови или слезы.
"Глазной антиген" относится к любому антигену, который обнаруживают также в глазу и, очевидно, некоторые из этих глазных антигенов, упомянутые ниже, явно обнаруживаются повсеместно. Глазные антигены, представленные в глазу, в частности включают антигены сетчатки глаза, антигены зрительного нерва, антигены головки зрительного нерва, антигены трабекулярной сети, увеальные антигены. Известно, что антигены, связанные с глаукомой, не ограничиваются белками, представленными в ганглиозных клетках сетчатки, но включают антигены, которые характерны для соседних клеток, таких как клетки глии или компоненты цитоскелета.
Кроме того, для данной заявки на изобретение, термин "глазные антигены" - включая все из конкретно обозначенных глазных антигенов, упомянутых ниже - применяется не только к физиологическим, природным формам соответствующих белков, но также к посттрансляционно модифицированным формам и к любым другим природным или искусственным производным, таким как пептиды, и формам, которые являются меченными, расщепленными, химически модифицированными иным образом, включая комбинации упомянутых модификаций.
"По меньшей мере частично очищенные глазные антигены" относятся к глазным антигенам, которые выделены из сложной смеси белков их физиологической окружающей среды путем по меньшей мере частичной очистки белков при помощи стандартных способов очистки белка. Глазные антигены доступной коммерческой чистоты также рассматривают как по меньшей мере частично очищенные глазные антигены для применения в способе диагностики глаукомы в контексте данного описания. Такая частичная очистка позволяет получить по меньшей мере 70 масс. % одного или более чем одного желаемого глазного антигена от общей массы белка, предпочтительно по меньшей мере 80 масс. %, более предпочтительно по меньшей мере 90 масс. %, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95 масс. %.
Термин глазной антиген образец относится к образцу, содержащему один или более чем один по меньшей мере частично очищенный глазной антиген. В предпочтительных воплощениях способа по изобретению образец глазного антигена содержит только один глазной антиген и индексы глаукомы определяют индивидуально для каждого из частично очищенных глазных антигенов по отдельности. В дополнительных предпочтительных воплощениях два или более чем два частично очищенных глазных антигена комбинируют с по меньшей мере одним из образцов глазного антигена. Для таких образцов глазных антигенов измеренные аутоиммунные реактивности соответствует аутоиммунной реакции против комбинации двух или более чем двух глазных антигенов, которые таким образом дают один индекс глаукомы. В противоположность антигенам, не выделенным из их физиологической окружающей среды, такой как глазные клеточные лизаты, относительные количества компонентов комбинации антигенов являются контролируемыми. Такая контролируемая комбинация антигенов также может привести к взвешиванию т.е. действию весового коэффициента, который модулирует вклад измеренной аутоиммунной реактивности некоторых глазных антигенов в диагностический результат.
В данном описании термины 'глазные антигены' или 'антигены' часто используются взаимозаменяемо и заменяют несколько более длинные выражения 'по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов' или 'образцы из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов'.
Аутоиммунная реактивность или взаимозаменяемо иммунореактивность и реактивность аутоантитела в контексте данного описания относятся к связывающей активности аутоантител, представленных в жидкостях организма в отношении по меньшей мере частично очищенного глазного антигена, который инкубируют с жидкостью организма.
Способы обнаружения и измерения аутоиммунной реактивности включают стандартные иммунологические аналитические способы, такие как анализ путем вестерн-блоттинга, хемилюминисцентный анализ, ИФА, радиоиммуноанализы, микрочипы и другие. Антигены наносят и фиксируют на элементе, несущем антиген, и затем инкубируют с жидкостью организма, содержащей обнаруживаемые антитела. Затем связанные аутоантитела идентифицируют для определения аутоиммунной реактивности. Способы идентификации включают, например предварительное мечение анализируемого образца, добавление вторичного антитела, который связывается с антигенсвязанными аутоантителами или с косвенной меткой, например мечеными козьими антителами против человеческих иммуноглобулинов и т.д. Дополнительно способы включают анализ адресуемых элементов, таких как гранулы, наночастицы, метки и т.д. Способы обнаружения также могут включать способы, которые не требуют мечения, например типа SELDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией), MALDI (масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией в присутствии матрицы) или другие способы с антителами на чипе.
Первый способ диагностики глаукомы по изобретению основан на различии средней аутоиммунной реактивности у здоровых индивидов по сравнению с пациентами, страдающими от глаукомы, против некоторых глазных антигенов. Таким образом, некоторые титры аутоантител против некоторых глазных антигенов в жидкостях организма используют в качестве диагностического свидетельства глаукомы.
Один из аспектов изобретения относится к вновь идентифицированным глазным антигенам, с которыми аутоантитела связываются дифференцированно у здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, и которые полезны с диагностической точки зрения в качестве маркеров (или биомаркеров) для обнаружения глаукомы и для терапевтического лечения.
Для того чтобы получить информацию на основании измеренных сигналов аутоиммунных реактивностей против образцов глазного антигена измеренные сигналы или значения аутоиммунной реактивности сравнивают со стандартными данными, в предпочтительных воплощениях сравнение со стадии г) осуществляют для каждого образца глазного антигена отдельно. В предпочтительных воплощениях стандартные данные включают средние значения для аутоиммунной реактивности, измеренные против каждого образца глазного антигена для здоровых контрольных индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы. В других предпочтительных воплощениях стандартные данные включает средние значения для аутоиммунной реактивности, измеренные в отношении каждого образца глазного антигена, характерные для некоторых стадий заболевания. Таким образом, диагностика различных стадий глаукомы, а также мониторинг прогресса глаукомы попадают в объем способа по изобретению. В дополнительных предпочтительных воплощениях стандартные данные по аутоиммунной реактивности включает аутоиммунную реактивность, характерную для субтипов специфических форм глаукомы.
Такие стандартные данные также могут быть получены при помощи контрольных реакций стадий (а) - (в) способа диагностики глаукомы из жидкостей организма здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, которые проводят параллельно с тестируемыми образцами, или такие стандартные данные могут иметь происхождение из сохраненных данных из контрольных реакций, проведенных в идентичных условиях в различные моменты времени.
В предпочтительных воплощениях индекс глаукомы рассчитывают для каждого образца глазного антигена на основании измеренного значения аутоиммунной реактивности путем сопоставления измеренного значения для тестируемого индивида со стандартными данными и перевода измеренного значения аутоиммунной реактивности в индекс глаукомы. В упрощенном примере индекс глаукомы определяют по аутоиммунной реактивности, измеренной для каждого индивидуального образца глазного антигена с использованием шкалы диагностики глаукомы от 0 до 100, где 0 соответствует среднему значению измеренной аутоиммунной реактивности против конкретного глазного антигена у здоровых индивидов и 100 соответствует среднему значению измеренной аутоиммунной реактивности против этого антигена у пациентов, страдающих от глаукомы.
В предпочтительных воплощениях способа по изобретению для расчета преобразования значения измеренной аутоиммунной реактивности в соответствующий индекс глаукомы в соответствии со стадией (г) используют алгоритмы с использованием стандартных методов многопараметрических статистических способов, иерархические алгоритмы или искусственные нейронные сети. Аналогично, в некоторых предпочтительных воплощениях на стадии (д) используют алгоритмы для анализа определенных индексов глаукомы для каждого из образцов глазных антигенов для определения диагностического результата, и в дополнительных предпочтительных воплощениях алгоритмы используют для обеих стадий. В других дополнительных вариантах по меньшей мере один индекс глаукомы со стадии (г) представляет собой последнюю стадию первого способа диагностики глаукомы. В соответствии с этих вариантами стадия (д) не входит в первый способ диагностики глаукомы, но осуществляется практикующим врачом, который выводит диагностический результат на основании индексов глаукомы.
Основное преимущество способа диагностики глаукомы по изобретению заключается в том, что диагностический результат основывается на анализе индексов глаукомы из частично очищенных антигенов известной идентичности.
В предпочтительных воплощениях весовой коэффициент присваивается по меньшей мере одному из образцов глазных антигенов. Такие весовые коэффициенты модулируют вклад аутоиммунной реактивности против конкретного образца глазного антигена для достижения диагностического результата. В предпочтительных воплощениях весовой коэффициент вводят путем вычислений на стадии (в) или (г), или (д) первого способа диагностики, тем не менее, в некоторые предпочтительных воплощениях весовой коэффициент вводят на стадиях (а) или (б) и в других дополнительных воплощениях весовые коэффициенты вводят в более чем одной стадии (а) - (д). Весовые коэффициенты оказывают действие на модулирование диагностического результата независимо от стадии, на которой они введены. Взвешенный индекс глаукомы получаеют в результате введения весового коэффициента на любой одной или более чем одной стадии (а) - (д).
В соответствии с предпочтительными воплощениями, в которых диагностический результат основан на взвешенном индексе глаукомы, специфический весовой коэффициент вводят на расчетной стадии, когда сигналы, испускаемые аутоантителами, связывающимися с индивидуальными антигенами, обнаруживают и измеряют при помощи средства обнаружения сигнала, такого как оптический ридер.
В соответствии с дополнительными предпочтительными воплощениями весовой коэффициент вводят путем дифференцированного определения веса для количества индивидуальных антигенов, подвергающихся реакции с аутоиммунными антителами, и/или путем определения веса одной или более чем одной из аналитических стадий для обнаружения и измерения аутоиммунной реактивности в отношении индивидуальных антигенов. Примеры таких воплощений включают обнаружение аутоиммунной реактивности с гранулами, сконструированными таким образом, чтобы быть специфическими в отношении различных антигенов, причем определение веса может быть осуществлено с помощью дифференцированной интенсивности мечения антигенспецифических гранул или дифференцированно градуированной чувствительности детектирующего средства.
Вес индексов глаукомы определяют, например, таким образом, что индексы глаукомы для образцов глазных антигенов с высокой диагностической релевантностью в большей степени вносят вклад в диагностический результат. В упрощенном примере образец X глазного антигена, который вызывает аутоиммунные реактивности, различающиеся большой значимой величиной между пациентами, страдающими от глаукомы, и здоровыми индивидами, и имеет стандартные данные средних значений с низкими стандартными отклонениями, в общем обладают более высокой диагностической релевантностью по сравнению с образцом Y глазного антигена, который вызывает аутоиммунные реактивности, отличающиеся только слегка между пациентами, страдающими от глаукомы, и здоровыми индивидами, и обладает средними стандартными значениями с высоким стандартным отклонением. Соответственно и конкретно, в тесте на глаукому, который разработан для максимизации специфичности, индексы глаукомы для образца антигена X могут быть иметь больший вес, чем индексы глаукомы для образца антигена Y при модулировании их соответствующего вклада в диагностический результат.
Дополнительное преимущество первого способа диагностики заключается в том, что известные частично очищенные глазные антигены, которые содержатся в образцах глазных антигенов, взятых на стадии а), и/или любой назначенный весовой коэффициент, выбирают в зависимости от цели конкретного диагностического теста для глаукомы. Например в скрининговом тесте, разработанном для диагностики глаукомы на ранней стадии заболевания, может быть желательно максимизировать чувствительность. Для такого применения диагностического теста некоторых количество ложно-положительных результатов рассматривают как приемлемые, но ложно-отрицательные результаты должны быть исключены.
Дополнительное преимущество предпочтительных воплощений первого способа диагностики заключается в том, что из сведений о физиологической роли антигенов, которое приводит к высокой оценке глаукомы у конкретного пациента, может быть извлечена дополнительная диагностическая информация, что обогащает диагностический результат.
По мере того, как становится известным, как прогресс заболевания коррелирует с аутоиммунной реактивностью против глазных антигенов, такие антигены, характерные для специфической стадии, конкретно ранней стадии, могут быть использованы в качестве биомаркеров для мониторинга прогресса заболевания, включая мониторинг эффективности медицинского лечения для замедления или остановки прогресса заболевания. Клинически, весьма важно идентифицировать среди индивидов с увеличенным внутриглазным давлением тех, у которых развивается глаукома, для начала лечения до необратимой гибели ганглиозных клеток сетчатки.
В предпочтительных воплощениях стадии (а) способа диагностики глаукомы по меньшей мере 2 частично очищенных глазных антигена, или по меньшей мере 3 или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 2 и меньше чем 5 или 10 антигенов из Группы 1, состоящей из следующих 46 глазных антигенов, включены в один или более чем один образец из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов: актина, альбумина, альфа-1-антитрипсина, аннексина II, аннексина V, бета-2-адренергического рецептора, нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), кальретикулина, кардиолипина, альфа-А-кристаллина, альфа-В-кристаллина, бета-L-кристаллина, бета-S-кристаллина, гамма-кристаллина, ДНК топоизомеразы 1, фибронектина, α-фодрина (=спектрина), глиофибриллярного кислого белка (GFAP), глутатион-S-трансферазы, белка теплового шока HSP10 (=шаперонина), HSP27, HSP60, HSP70, инсулина, jo-1, лизоцима, белка, связывающего миелин (МВР), миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (MOG), миоглобина, нейронспецифической энолазы (NSE), нейротрофина 3, пероксиддисмутазы, 3-фосфосерина, преальбумина, ингибитора протеинкиназы С, протеинкиназы С, супероксиддисмутазы, альфа-синуклеина, гамма-синуклеина, тиреоглобулина, трансферрина, транстиретина, ингибитора топоизомеразы, убиквитина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), виментина.
Антигены следующей подгруппы вышеупомянутых антигенов, названной Группа 2, впервые идентифицированы в качестве диагностических маркеров для глаукомы. В дополнительных предпочтительных воплощениях стадии (а) способа диагностики глаукомы по меньшей мере 1 частично очищенный глазной антиген, или по меньшей мере 2 или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 2 и меньше чем 5 или 10, или 20 антигенов следующей Группы 2 включены в один или более чем один образец из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов: альбумина, аннексина II, нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), кальретикулина, кардиолипина, бета-S-кристаллина, гамма-кристаллина, ДНК топоизомеразы 1, фибронектина, инсулина, jo-1, лизоцима, миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (MOG), миоглобина, нейротрофина 3, пероксиддисмутазы, 3-фосфосерина, преальбумина, ингибитора протеинкиназы С, протеинкиназы С, супероксиддисмутазы, альфа-синуклеина, гамма-синуклеина, тиреоглобулина, трансферрина, транстиретина, ингибитора топоизомеразы, убиквитина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
8 отношении некоторых из антигенов вышеупомянутой Группы 1 ранее было известно, что реактивность аутоантител против них отличаются у пациентов, страдающих от глаукомы, и здоровых индивидов. Это было подтверждено (см.примеры и графические материалы), и их реактивность в качестве аутоантител обладает диагностической релевантностью также при глаукоме. Эти глазные антигены из Группы 3 представляют собой: актин, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок (GFAP), глутатион-S-трансфераза, HSP27, HSP60, HSP70, белок, связывающий миелин (МВР), нейронспецифическая энолаза (NSE), виментин.
Антигены в Группе 1 классифицируются на три подгруппы А, В и С. При помощи способов, описанных в примерах и графических материалах, в которых измеряют аутоиммунную реактивность против различных глазных антигенов у здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, оценивают диагностическую релевантность антигенов. Антигены в группе С или предпочтительно антигены в группе В, или более предпочтительно антигены в группе А, входят в по меньшей мере один образец глазных антигенов, используемых для первого способа диагностики глаукомы.
24 частично очищенных глазных антигена из следующей группы идентифицированы как высокорелевантные диагностические маркеры для глаукомы, и классифицируются как антигены Группы А: актин, альфа-1-антитрипсин, аннексии V, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, бета-L-кристаллин, бета-S-кристаллин, гамма-кристаллин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок (GFAP), глутатион-S-Трансфераза, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, белок, связывающий миелин (МВР), нейронспецифическая энолаза (NSE), ингибитор протеинкиназы С, супероксиддисмутаза, трансферрин, транстиретин, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), виментин. В предпочтительных воплощениях по меньшей мере один образец глазных антигенов, которые берут на стадии а), содержит по меньшей мере 2 антигена, выбранные из Группы А глазных антигенов.
9 частично очищенных глазных антигенов из следующей группы идентифицированы как высокорелевантные диагностические маркеры для глаукомы и классифицируются как антигены Группы В: аннексии II, бета-2-адренергический рецептор, кальретикулин, белок теплового шока HSP10 (=шаперонин), инсулин, пероксиддисмутаза, протеинкиназа С, альфа синуклеин, гамма-синуклеин. В дополнительных предпочтительных воплощениях по меньшей мере один образец глазных антигенов, которые берут на стадии а), содержит по меньшей мере 2 антигена, выбранные из Группы А и/или из Группы В глазных антигенов:
Также 14 частично очищенных глазных антигенов из следующей Группы С идентифицированы как релевантные диагностические маркеры для глаукомы: альбумин, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кардиолипин, ДНК топоизомераза 1, фибронектин, лизоцим, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (MOG), миоглобин, нейротрофин 3, 3-фосфосерин, тиреоглобулин, ингибитор топоизомеразы.
В дополнительных предпочтительных воплощениях по меньшей мере один образец из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов содержит по меньшей мере 1 антиген, или предпочтительно по меньшей мере 2 или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 1 и меньшей чем 5 или 10 антигенов или предпочтительно по меньшей мере 2 и меньше чем 20 или все из антигенов, которые относятся к Группе 2 или как Группе 2, так и Группе А, классифицированной как Группа 2-А, или которые относятся к Группе 2 и также к Группе А или к Группе В, классифицированной как Группа 2-АВ.
Еще один аспект изобретения относится к элементу, несушему антиген, несущему, несущий по меньшей мере один образец, содержащий по меньшей мере один по меньшей мере частично очищенный глазной антиген.
Предпочтительные воплощения элемента, несущего антиген, включают микроматричные чипы, тестовые полоски с латеральным потоком и микрожидскостные чипы. В некоторые предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, содержит заранее определенную зону антигена, которая представляет собой площадь поверхности на полоске или слайде, или планшете и т.п, или заранее определенную поверхность в устройстве на которое образцы глазного антигена нанесены в виде пятен или микропятен. В других предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, дополнительно содержит приемную зону для жидкости организма. В дополнительных предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, содержит гранулы или другой субстрат, который покрыт образцами глазных антигенов. В дополнительных предпочтительных воплощениях элемент, несущий антиген, несет взвешенные количества образцов глазных антигенов, и в других дополнительных воплощениях элемент, несущий антиген, содержит глазные антигены, выбранные из Группы 1 или Группы 2, или Группы А или Группы А и В или Группы 2-А. Понятно, что в объем изобретения также входит использование комбинации вышеупомянутых признаков для элемента, несущего антиген, по изобретению.
В предпочтительном воплощении первого способа диагностики глаукомы элемент, несущий по меньшей мере один образец из числа образцов глазных антигенов, представляет собой чип с микроматрицей антигенов. По меньшей мере один образец глазных антигенов нанесен в виде пятен на матрицу или микроматрицу антигенов в двумерной или трехмерной матрице пятен на элементе, несущем антиген, который, например представляет предметное стекло, планшет или чип, или нитроцеллюлозный слайд, или гидрогелевый слайд и т.п. Белковые матрицы готовят путем нанесения по меньшей мере 2, предпочтительно 3-5, или 3-9 или 3-12 образцов по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов, где применимо, из конкретной группы антигенов, описанных выше, на несущий элемент, такой как покрытый нитроцеллюлозой слайд. Матрицы инкубируют с подходящим образом разбавленными образцами жидкости организма, такими как сыворотка крови, слезы или внутриглазная жидкость. Аутоиммунную реактивность обнаруживают, например путем визуализации реакции аутоантитело-антиген на матрицах в соответствии с общепринятыми способами, известными в области техники, такими как, например обработка флуоресцентно меченым антителом против IgG, с последующим сканированием флуоресценции. Сигналы, испущенные вторичными антителами, оцифровывают; интенсивность пятен измеряют и, возможно, сравнивают с результатами для жидкостей организма контрольных индивидов с использованием многопараметрических статистических способов. Альтернативные способы обнаружения реактивности аутоантитела включают визуализацию при помощи антитела против человеческого IgG, связанного с ферментативными реакциями, с компонентом, добавленным или представленным на элементе, несущем антиген, что приводит к появлению окрашивания или к изменению окрашивания. Такое изменение цвета в некоторых применениях может быть визуализировано непосредственно или при помощи детектирующего средства, такого как оптический ридер. В других дополнительных предпочтительных воплощениях аутоиммунные реактивности измеряют при помощи конкурентного анализа, который представляет собой еще один принятый способ иммуноанализа: например имеющиеся в продаже моноклональные флуоресцентные антитела, специфические в отношении некоторых глазных антигенов, конкурируют с аутоантителами, которые присутствуют в жидкости организма со стадии б) за взаимодействие с по меньшей мере частично очищенными глазными антигенами, взятыми на стадии а). Сильная аутоиммунная реактивность жидкости организма против конкретного глазного антигена при таком анализе приводит в результате к получению слабого сигнала, поскольку немеченые аутоантитела в жидкости организма затрудняют связывание с антигенами имеющихся в продаже флуоресцентно меченых антител. Очевидно, что изобретение не ограничено примерами стандартных иммунологических анализов, известных в области техники, которые упомянуты здесь как простые примеры, но распространяется на любой стандартный иммунологический анализ, известный в области техники как применимый для определения аутоиммунной реактивности в жидкостях организма против по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов.
В некоторых предпочтительных применениях весовой коэффициент, назначаемый индивидуальным антигенам для модуляции их вклада в диагностический результат, вводят, например путем нанесения пятен, содержащих различные количества антигена, на микроматрицу, или дифференцированного определения веса сигналов, испускаемых антителами, связанных с индивидуальными антигенами. В дополнительных предпочтительных воплощениях количества антигена, нанесенного в виде пятен на микроматрицу, варьируют, модулируя ожидаемую интенсивность сигнала аутоиммунной реактивности так, чтобы она находилась в пределах линейного диапазона обнаружения сигнала детектирующим средством.
Как дополнительно представлено в примере 7, тест на глаукому с выбором только пяти по меньшей мере частично очищенных антигенов приводит в результате к дифференцированию между пациентами, страдающими от глаукомы, и здоровыми индивидами со специфичностью и чувствительностью, составляющей приблизительно 90%. Таким образом, в дополнительных предпочтительных воплощениях множество образцов глазных антигенов ограничено небольшим количеством, таким как 10 или 8, или 6, или 5 или меньше чем 5, для обеспечения теста, который является простым для анализа, и который подходит при низкой стоимости для массового скрининга большого количества индивидов.
В дополнительном предпочтительном воплощении первого диагностического способа глаукомы элемент, несущий по меньшей мере один из образцов глазного антигена представляет собой тестовую полоску с латеральным потоком. В предпочтительных вариантах этих воплощений элемент, несущий антиген, содержит заранее определенную зону, несущую антиген, и заранее определенную приемную зону для жидкости организма. В дополнительных предпочтительных вариантах полоска с латеральным потоком возможно содержит несколько зон, которые включают субзоны. Выбор из по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов применим к зоне антигена. Индивидуальные образцы глазных антигенов могут в соответствии с некоторыми вариантами способа быть применены к различным субзонам или смешаны в одной зоне или нескольких субзонах. На последующей стадии образец жидкости организма, который возможно подходящим образом предварительно обработан и/или разбавлен, наносят на приемную зону тестовой полоски. Подходящие реагенты для визуализации аутоантител, которые связаны с антигенами, могут быть включены в зону антигена или приемную зону, или обе зоны. Альтернативно, тестовая полоска со связанными аутоантителами может после стадии связывания быть инкубирована с реагентами для визуализации. Стадии обнаружения, такие как визуализация, осуществляют с использованием или без использования аналитических средств, таких как устройство для визуализации планшетов, с получением оцифрованного результата. В предпочтительных применениях весовой коэффициент, присвоенный индивидуальным антигенам в отношении их вклада в диагностический результат, вводят, например путем нанесения различных количеств антигена на антигенную зону тестовой полоски или дифференцированного добавления химических реагентов, или дифференцированного определения веса сигналов, испускаемых антителами, связанными с индивидуальными антигенами. Очевидно, некоторые из особенностей и комбинаций со свойствами, которые описаны выше для воплощений способа с использованием микрочипов, также равно применимы к предпочтительным воплощениям тестовых полосок с латеральным потоком.
Дополнительные предпочтительные воплощения тестовых полосок с латеральным потоком разработаны для непосредственного контакта пациента с приемной зоной тестовой полоски для сбора жидкости организма, такой как слезы. Аналогичные приемные зоны для сбора жидкостей организма также составляют часть других воплощений элемента, несущего антиген, таких как микрожидкостные чипы или колонки с гранулами, несущими антиген, содержащими приемную зону из абсорбирующего материала.
В области техники известно, что отсутствие аутоиммунной реактивности или уменьшенная аутоиммунная реактивность в отношении некоторых антигенов также является показателем глаукомы. Таким образом, некоторые предпочтительные воплощения разработаны таким образом, что отсутствие или уменьшение связывания аутоиммунных антител с выбранными антигенами вносит вклад в диагностический результат или составляет основу диагностического результата. Например, в некоторых воплощениях тестовых полосок с латеральным потоком на одну или более чем одну субзону антигена наносят антигены, к которым никакая аутоиммунореактивность не является показателем заболевания, в то время как на другие субзоны наносят антигены, которые вызывают меньшую реактивность аутоантител у пациентов, страдающих от глаукомы, чем у здоровых индивидов, и/или антигены, которые вызывают более высокую реактивность аутоантител у пациентов, страдающих от глаукомы, чем у здоровых индивидов, и/или антигены, к которым никакая аутоиммунореактивность не является показателем отсутствия глаукомы и благоприятные вариации вышеприведенных комбинаций.
В дополнительном предпочтительном воплощении первого способа диагностики глаукомы элемент, несущий антиген, для по меньшей мере одного образца антигенов представляет собой микрожидкостный чип или устройство типа "лаборатория-на-чипе", где индивидуальные антигены предпочтительно расположены на отдельных микроканалах. Жидкость организма наносят на микрожидкостный чип или наносят на зону чипа, принимающую жидкость организма. Затем жидкость организма перемещают в микроканальную систему микрожидкостного чипа, например при помощи устройства для контроля давления. В предпочтительных воплощениях аутоиммунную реактивность обнаруживают с помощью вторичных флуоресцентно меченых антител с использованием стандартных оптических ридеров или стандартных компьютеров, оборудованных камерой, и затем количественно оценивают и преобразуют в индекс глаукомы, как описано здесь. Очевидно, в объем изобретения входят комбинации признаков, указанных для других элементов, несущих антигены, таких как микроматричные чипы и тестовые полоски с латеральным потоком, с признаками микрожидкостных чипов для получения дополнительных воплощений элементов, несущих антиген, для способов и устройств, описанных в данной заявке на изобретение. Они включают микрожидкостные чипы с субзонами для антигенов с более высокой аутоиммунной реактивностью и другими субзонами для антигенов с меньшей аутоиммунной реактивностью у пациентов, страдающих от глаукомы по сравнению со здоровыми индивидами.
Дополнительные аспекты изобретения относятся к тестовым наборам для первого способа диагностики глаукомы и компонентам тестовых наборов, содержащих элемент, несущий по меньшей мере один из образцов глазных антигенов, и, возможно, вспомогательный материал. В частности, предложен набор для диагностики глаукомы для способа диагностики по изобретению и/или содержащий элемент по изобретению, несущий антиген. В некоторых воплощениях в соответствии с этим аспектом такой набор содержит элементы, несущие антиген, несущие различные вариации по меньшей мере одного из образцов глазных антигенов в зависимости от задачи диагностического теста. В некоторых предпочтительных воплощениях набора элемент, несущий антиген, содержит глазные антигены, выбранные из Группы 1 или Группы 2, или Группы А, или Группы А и В, или Группы 2-А, где в некоторых из этих предпочтительных воплощений определяют вес количества антигенов, нанесенных на элемент, несущий антиген. В некоторых предпочтительных воплощениях набора элемент, несущий антиген, представляет собой микроматричный слайд, тестовую полоску с латеральным потоком или микрожидкостный чип или их часть. В дополнительных воплощениях такие тестовые наборы включают вспомогательные материалы, такие как аналитические средства и/или программное обеспечение, например устройство для считывания с планшетов и/или программное обеспечение для устройства для считывания с планшетов с получением оцифрованного результата теста, где это программное обеспечение используют для одной или более чем одной из стадий количественной оценки аутоиммунной реактивности, расчета оценки глаукомы или диагностического результата. В дополнительных предпочтительных воплощениях включен вспомогательный материал для отбора образца жидкости организма. Такой вспомогательный материал представляет собой, например, фильтровальную бумагу для приема слез. Дополнительные предпочтительные воплощения включают реагенты и/или реакционные контейнеры для обнаружения и измерения аутоиммунной реактивности после инкубации элемента, несущего антиген, с жидкостями организма или реагентами для обработки образца жидкости организма перед инкубацией с элементом, несущим антиген, или для элюирования жидкости организма из материала абсорбента, в который собирали эту жидкость. Может быть создана любая комбинация вышеописанных признаков в контексте способов диагностики глаукомы для получения дополнительных предпочтительных воплощений наборов для осуществления способа диагностики глаукомы.
В дополнительных предпочтительных воплощениях первого способа диагностики глаукомы образец жидкости организма сначала сушат и затем повторно солюбилизируют или элюируют перед реакцией с по меньшей мере одним из образцов глазных антигенов. Образец жидкости организма собирают также в профессиональных или домашних условиях. В некоторых вариантах жидкость собирают на кусок из абсорбирующего материала, такой как бумажная полоска, или непосредственно на приемную зону элемента, несущего антиген, или любой собирающий контейнер для жидкости организма. Образец жидкости организма оставляют высушиваться и хранят, например, при комнатной температуре. Опыт демонстрирует, что после хранения в течение до одной недели или дольше, в частности, при сниженной температуре или при замораживании, аутоантитела, представленные в образце высушенной жидкости организма, могут быть растворены и элюированы из абсорбирующего материала, например при помощи буфера или физиологического раствора. Таким образом, преимущество этого воплощения заключается в том, что образец жидкости организма может быть получен, например пациентом самостоятельно у себя дома и отправлен по почте в лабораторию для анализа. В дополнительных предпочтительных воплощениях первого способа диагностики глаукомы жидкость организма, которую сушат и растворяют перед анализом, представляет собой слезы или сыворотку крови.
В предпочтительных воплощениях первого способа диагностики глаукомы, при которых измеряют аутоиммунную реактивность в слезах, слезы собирают при помощи любого стандартного способа, например, при помощи пипеток или полоски фильтровальной бумаги, такого как бумажная полоска Schirmer, или другого подходящего абсорбирующего материала. Возможно, слезы сушат и хранят, например при комнатной температуре в течение до одной недели или дольше при 0-5°С или дольше при замораживании.
Затем, аутоантитела элюируют из высушенной или все еще влажной бумажной полоски с помощью буфера, например физиологического раствора, забуференного фосфатом. В дополнительных предпочтительных воплощениях слезы непосредственно собирают на тестовую полоску с латеральным потоком, например путем нанесения на приемную зону тестовой полоски слез из глаза. Очевидно, что одно из преимуществ воплощений с использованием слезной жидкости вместо, например сыворотки крови, заключается в том, что образцы слез могут быть получены неинвазивным способом. Особенное преимущество заключается в доступности для использования там, где нет соответственно обученного медицинского персонала, например, в офисах некоторых офтальмологов и специалистов по подбору очков, а также для самотестирования.
Дополнительный аспект первого способа диагностики глаукомы относится к его применению в качестве быстрого теста для раннего обнаружения глаукомы до утраты зрения в стандартном скрининге. Предпочтительные воплощения представляют собой, например диагностические тесты с низкой стоимостью, разработанные так, чтобы быть весьма чувствительными, таким образом, что при стандартном скрининге вероятность ложно-отрицательных результатов минимизирована. Соответственно, последующие более тщательно организованные тесты основаны, например, на большем количестве глазных антигенов и разработаны для идентификации ложно-положительных результатов у индивидов с положительными результатами теста в быстром тесте. Например для такого быстрого тестирования могут быть использованы тестовая полоска с латеральным потоком, микрожидкостный чип или простой микроматричный чип, как описано в различных воплощениях выше.
Дополнительный аспект применения первого способа для диагностики глаукомы связан с его применением для мониторинга прогресса заболевания и для мониторинга эффекта медицинского лечения. В предпочтительных воплощениях этих аспектов выбор антигенов и/или весового коэффициента, присваиваемого им, разработан для контроля аутоиммунной реактивности против антигенов, характерных для конкретной стадии глаукомы.
Дополнительный аспект изобретения относится к способу контакта пациента с приемной зоной элемента, несущего антиген, для сбора жидкости организма пациента, например слез из глаза пациента. В предпочтительных воплощениях пациент контактирует с приемной зоной элемента, несущего антиген, содержащей абсорбирующий материал, где сама приемная зона не содержит антигена, но жидкость организма течет в направлении зоны, несущей антиген. Например, до человеческого глаза дотрагиваются тестовой полоской с приемной зоной, содержащей абсорбирующую бумагу, такой как тестовая полоска Schirmers, для сбора слез. Затем, слезная жидкость диффундирует в зону, содержащую антиген, и таким образом переходит на стадию (б) способа диагностики глаукомы.
Дополнительный аспект изобретения относится к любому из глазных антигенов или любой комбинации одного или более чем одного из следующей Группы 2 глазных антигенов для применения в способах диагностики глаукомы, или на элементах, несущих антиген, для применения в способах диагностики глаукомы: альбумин, аннексии II, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кальретикулин, кардиолипин, бета-S-кристаллин, гамма-кристаллин, ДНК топоизомераза 1, фибронектин, инсулин, jo-1, лизоцим, миелинолигодендроцитарный гликопротеин (MOG), миоглобин, нейротрофин 3, пероксиддисмутаза, 3-фосфосерин, преальбумин, ингибитор протеинкиназы С, протеинкиназа С, супероксиддисмутаза, альфа-синуклеин, гамма-синуклеин, тиреоглобулин, трансферрин, транстиретин, ингибитор топоизомеразы, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).
Еще один аспект изобретения относится любому из глазных антигенов или любой комбинации одного или более чем одного из следующей Группы 2 глазных антигенов или производных глазных антигенов, таких как фрагменты или модифицированные глазные антигены или лиганды, такие как антитела, которые являются специфичными к любому из глазных антигенов в Группе 2, для применения в способах терапевтического лечения глаукомы, или для применения в композициях для применения в медицинском лечении и, конкретно, для применения в композициях для применения в лечении глаукомы.
В предпочтительных воплощениях использования глазных антигенов для фармацевтических композиций для лечения глаукомы их используют в качестве блокирующих агентов, связывающихся к аутоантителами, уровни которых увеличены у пациентов, страдающих от глаукомы. В частности, обнаружено, что значительная доля увеличенной аутоиммунной реактивности у пациентов, страдающих от глаукомы, направлена против белков цитоскелета, например актина и актинсвязывающих белков, таких как аннексии V, альфа фодрин, белок, связывающий миелин, HSP 27. Известно, что аутоантитела против структур цитоскелета, таких как f-актиновая сеть, задействованная ганглиозными клетками сетчатки, разрушают актиновую сеть и вызывают клеточный апоптоз. Таким образом, в соответствии с этим аспектом изобретения предложена фармацевтическая композиция для предупреждения клеточной смерти ганглиозных клеток сетчатки. Композиция, содержащая по меньшей мере один из глазных антигенов Группы 2 останавливает прогресс глаукомы посредством глазных антигенов, которые связываются с аутоантителами и блокируют их разрушительный эффект в отношении ганглиозных клеток сетчатки у пациентов, страдающих от глаукомы.
В то время как первый способ диагностики глаукомы, не зависящий от увеличенного внутриглазного давления, основан на биомаркерном профиле идентифицированных глазных антигенов, второй такой способ диагностики, не зависящий от увеличенного внутриглазного давления, основан на действии жидкостей организма на клеточную культуру в анализе in vitro.
Во втором способе диагностики глаукомы осуществляют стадии (а) взятия культуры клеток in vitro; (б) инкубации жидкости организма тестируемых индивидов с культурой клеток in vitro; (в) анализа экспрессии белков при помощи культуры клеток in vitro и/или анализа жизнеспособности клеток после обработки в соответствии со стадией (б); и (г) сравнения результатов анализа на стадии (в) со стандартными данными для определения диагностического результата.
Для стадии (а) берут культуру первичных или иммортализованных клеток in vitro, предпочтительно человеческих или животного происхождения, более предпочтительно клеток млекопитающих, таких как клетки имеющийся в продаже иммортализованной клеточной линии. Предпочтительно берут нейрональные клетки и наиболее предпочтительно ганглиозные клетки сетчатки или клетки-предшественники ганглиозных клеток сетчатки.
Можно дифференцировать паттерн экспрессии белков, экспрессию специфических биомаркерных белков и жизнеспособность ганглиозных клеток сетчатки, контактирующих с жидкостями организма здоровых индивидов и пациентов, страдающих от различных форм глаукомы или глазной гипертензии. Таким образом, конкретное преимущество различных предпочтительных воплощений способа диагностики глаукомы заключается в том, что они позволяют дифференцировать пациентов с различными формами глаукомы и, более того, позволяют выделить среди пациентов с глазной гипертензией, тех, кто имеет глаукому или увеличенный риск развития глаукомы. Таким образом, способ, который не зависит от мониторинга глазной гипертензии, обеспечивает возможную раннюю диагностику нормотензивной глаукомы и, кроме того, позволяет различать среди индивидов, пораженных глазной гипертензией, тах которые имеют глаукому, и тех, которые не имеют ее.
В дополнительных предпочтительных вариантах жидкости организма или образцы или ее фракции для обработки на стадии (б) консервируют, например путем замораживания и/или сушки или добавления консерванта, такого как консерванты, содержащиеся в обычно используемых пробирках для сбора сыворотки крови. После хранения в течение различных периодов времени правильно растворенный образец жидкости организма используют для обработки на стадии (б) второго способа диагностики.
В дополнительных предпочтительных воплощениях второго способа диагностики жидкость организма физически или химически предварительно обрабатывают для стабилизации или увеличения их эффекта на стадии (б) диагностического теста. Например, жидкость организма может быть частично очищена для удаления из жидкости организма веществ, которые потенциально влияют на рост клеток и экспрессию белков в клетках культуры клеток in vitro, взятой на стадии (а) таким образом, который не связан с глаукомой, или для того, чтобы продемонстрировать специфические реакции клеток, взятых на стадии (а) в отношении субфракций жидкости организма.
В дополнительных предпочтительных вариантах таких воплощений предварительная обработка или фракционирование позволяет получить фракцию жидкости организма, которая содержит или обогащена определенным набором антител, таких как антитела или аутоантитела, которые, как известно, являются специфическими в отношении антигенов, ассоциирующихся с глаукомой или некоторыми формами глаукомы. В дополнительных предпочтительных вариантах по меньшей мере одно антитело удалено из жидкости организма. В некоторых из этих вариантов удаление выбранных антител из жидкости организма перед его применением на стадии (б) служит для удаления одного или более чем одного из антител, которые ингибируют рост клеток или влияние экспрессии белков в клетках таким образом, который не связан с глаукомой и мог бы скрыть диагностический результат. В дополнительных воплощениях такое удаление служит для устранения аутоантител, которые, как известно, являются специфическими для некоторых форм глаукомы. В дополнительных предпочтительных воплощениях клетки инкубируют с извлеченными антителами для того, чтобы вызвать реакции клеток, типичных для используемого типа сыворотки крови.
Инкубацию на стадии (б) осуществляют в соответствии со стандартными способами инкубации, известными в области техники. В различных вариантах предпочтительных воплощений стадии (б) варьируют время инкубации, температуру инкубации и уровень приложенного гидростатического давления.
На стадии (в) анализируют действие жидкости организма во время инкубации на стадии (б) на клетки, предложенные на стадии (а). В первой группе предпочтительных воплощений на стадии (в) анализируют паттерны экспрессии белков, во второй группе предпочтительных воплощений на стадии (в) анализируют экспрессию специфических белков, таких как биомаркеры или антигены, в третьей группе предпочтительных воплощений анализируют жизнеспособность клеток и в других дополнительных предпочтительных воплощениях на стадии (в) осуществляют анализ при помощи более чем одного из вышеприведенных способов. Во все этих воплощениях результаты анализа со стадии (в) используют на стадии (г) для определения диагностического результата.
В предпочтительных воплощениях, относящихся к первой группе предпочтительных воплощений стадии (в), осуществляют анализ экспрессии белков с полноразмерными белками, такими как интактные белки, а также, например с расщепленными или фракционированными белками, полученными из культуры клеток in vitro. Например, полный диапазон белков в и на клетках, а также внеклеточных белков, в некоторых вариантах, включает белки, которые клетки высвобождают в среду. В предпочтительных воплощениях на стадии (в) белки, подвергнутые анализу экспрессии, получают из культуры клеток in vitro путем лизиса клеток и выделяют, например, путем осаждения, и возможно предварительно обрабатывают, например, путем расщепления белков, фракционирования белков и/или стадий разделения и/или очистки и анализа при помощи стандартных способов анализа белков, известных в области техники. Примеры применимых способов, известных в области техники, включают, без ограничения, осаждение ацетоном, расщепление трипсином, гель-электрофорез, HPLC (high-performance liquid chromatography) высокоэффективная жидкостная хроматография) и т.д.
В дополнительных предпочтительных воплощениях, относящихся к первой группе предпочтительных воплощений, на стадии (в) осуществляют анализ экспрессии белков при помощи стандартного фингерпринтинга белков, известного в области техники, такого как масс-спектрометрия, включая MALDI-TOF (времяпролетная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы), масс-спектрометрия с ловушкорй типа орбитрэп, LC-MS (жидкостная хроматография-масс-спектрометрия), HPLC-MS (жидкостная хроматография высокого давления-масс-спектрометрия) и SELDI-TOF-MS (времяпролетная масс-спектрометрия с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией).
В дополнительных предпочтительных воплощениях, относящихся к первой группы предпочтительных воплощений, на стадии (в) анализ данных об экспрессии юбелков, таких как паттерны экспрессии белков или фингерпринты, осуществляют при помощи систем анализа цифрового изображения или другого устройства для оцифровки, как известно в области техники. В предпочтительных воплощениях оцифрованные данные затем обрабатывают при помощи многопараметрических статистических способов, например дискриминантного анализа, древа классификации/регресса и/или искусственных нейронных сетей.
Во второй группе предпочтительных воплощений стадии (в) анализируют экспрессию специфических белков. В предпочтительных вариантах этих воплощений анализ экспрессии белков на стадии (в) включает анализ, направленный на по меньшей мере один специфический белок или биомаркер. В предпочтительных вариантах таких воплощений биомаркер представляет собой белок, который известен как ассоциированный с глаукомой или аутоиммунным заболеванием, или нейродегенеративным заболеванием или апоптозом. В предпочтительных воплощениях анализ биомаркера основан на иммуноанализе, например иммуноанализе на основе хемилюминесценции или флуоресценции, а также ИФА (иммуноферментный анализ), Elispot (иммуноферментный анализ пятен) или анализа белковых матриц, в которых используется по меньшей мере один зонд антитела, предпочтительно специфического в отношении биомаркеров, которые известны, как ассоциированные с глаукомой или аутоиммунным заболеванием или нейродегенеративным заболеванием, или апоптозом. В предпочтительных воплощениях антитела представляют собой моноклональные антитела.
В предпочтительных воплощениях анализа экспрессии белков с использованием иммуноанализа антитела, которые используются на стадии (в) второго способа диагностики в качестве специфических антител против одного или более чем одного из 46 антигенов из Группы 1, раскрыты в первом изобретении согласно данной заявке. Для всех этих антигенов известно, что уровень их экспрессии увеличивается или уменьшается у пациентов, страдающих от глаукомы, по сравнению со здоровыми индивидами: актин, альбумин, альфа-1-антитрипсин, аннексии II, аннексии V, бета-2-адренергический рецептор, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кальретикулин, кардиолипин, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, бета-L-кристаллин, бета-S-кристаллин, гамма-кристаллин, ДНК топоизомераза 1, фибронектин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок (GFAP), глутатион-8-Трансфераза, белок теплового шока HSP10 (=шаперонин), HSP27, HSP60, HSP70, инсулин, jo-1, лизоцим, белок, связывающий миелин МВР, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин MOG, миоглобин,
нейронспецифическая энолаза (NSE), нейротрофин 3, пероксиддисмутаза, 3-фосфосерин, преальбумин, ингибитор протеинкиназы С, протеинкиназа С, супероксиддисмутаза, альфа-синуклеин, гамма-синуклеин, тиреоглобулин, трансферрин, транстиретин, ингибитор топоизомеразы, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), виментин.
В дополнительных предпочтительных воплощениях анализа экспрессии белков, включающих иммуноанализ, антитела, используемые на стадии (в) второго способа диагностики глаукомы, представляют собой специфические антитела против одного или более чем одного из антигенов Группы 2, раскрытой в первом изобретении согласно данной заявке, которые представляют собой: альбумин, аннексии II, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), кальретикулин, кардиолипин, бета-Б-кристаллин, гамма-кристаллин, ДНК топоизомераза 1, фибронектин, инсулин, jo-1, лизоцим, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин MOG, миоглобин, нейротрофин 3, пероксиддисмутаза, 3-фосфосерин, преальбумин, ингибитор протеинкиназы С, протеинкиназа С, супероксиддисмутаза, альфа-синуклеин, гамма-синуклеин, тиреоглобулин, трансферрин, транстиретин, ингибитор топоизомеразы, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).
В дополнительных предпочтительных воплощениях анализа экспрессии белков, включающих иммуноанализ, антитела, используемые на стадии (в) второго способа диагностики глаукомы, представляют собой специфические антитела против одного или более чем одного из 24 антигенов Группы А, раскрытой в первом изобретении согласно данной заявке, которые представляют собой: актин, альфа-1-антитрипсин, аннексии V, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, бета-L-кристаллин, бета-S-кристаллин, гамма-кристаллин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок (GFAP), глутатион-в-трансфераза, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, белок, связывающий миелин (МВР), нейронспецифическая энолаза (NSE), ингибитор протеинкиназы С, супероксиддисмутаза, трансферрин, транстиретин, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), виментин.
В дополнительных предпочтительных воплощениях анализа экспрессии белков, включающих иммуноанализ, антитела, используемые на стадии (в) второго способа диагностики глаукомы, представляют собой специфические антитела против одного или более чем одного из 33 антигенов Группы А или В, раскрытых в первом изобретении согласно данной заявке, которые представляют собой: актин, альфа-1-антитрипсин, аннексии V, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, бета-L-кристаллин, бета-S-кристаллин, гамма-кристаллин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок (GFAJP), глутатион-Б-трансфераза, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, белок, связывающий миелин (МВР), нейронспецифическая энолаза (NSE), ингибитор протеинкиназы С, супероксиддисмутаза, трансферрин, транстиретин, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), виментин, аннексии II, бета-2-адренергический рецептор, кальретикулин, белок теплового шока HSP10 (=шаперонин), инсулин, пероксиддисмутаза, протеинкиназа С, альфа-синуклеин, гамма-синуклеин.
В дополнительных предпочтительных воплощениях анализа экспрессии белков, включающих иммуноанализ, на стадии (в) клетки подвергают лизису и например полный спектр белков или конкретные фракции белков анализируют путем вестерн-блоттинга или ИФА или ELISPOT или микроматриц.
В предпочтительных вариантах воплощений, содержащих микроматрицы, антитела, которые могут представлять собой моноклональные антитела, или другие захватывающие агенты для выбранных биомаркеров, располагаются на несущем элементе, таком как поверхность чипа, включающая без ограничений предметное стекло или силиконовую или нитроцеллюлозную поверхность, и затем чип инкубируют с клеточными лизатами или белковыми препаратами, полученными из клеток после обработки в соответствии со стадией (б). В других предпочтительных вариантах элемент, несущий захватывающие агенты, представляет собой микрожидкостный чип или тестовую полоску.
В дополнительных предпочтительных воплощениях анализ экспрессии белков на стадии (в) осуществляют in situ в культуре клеток in vitro. Анализ экспрессии белков in situ включает без ограничения мечение или способы без метки, а также колориметрические способы, такие как флуоресцентная или хемилюминесцентная маркировка внутри- или внеклеточных белков, применение Elispot (иммуноферментный метод пятен), измерение изменений абсорбции путем мечения белков в или на клетках, а также белков в среде и т.д. Анализ экспрессии белков in situ предпочтительно осуществляют на клетках в сосуде с культурой клеток после удаления жидкости организма на стадии (б).
В третьей группе предпочтительных воплощений на стадии (в) анализируют жизнеспособность клеток. Анализ жизнеспособности клеток включает, не ограничиваясь указанным, подсчет клеток, например путем проточной цитометрии, и/или анализ паттернов клеточного роста, и/или мониторинг жизнеспособности и/или апоптоза, и/или мониторинг некроза. Предпочтительные способы включают, не ограничиваясь указанным, мечение клеток аннексином V и пропидий-йодидом для обнаружения некроза и апоптоза, а также тест с водорастворимым тетразолием или окрашивание аламаровым синим для обнаружения жизнеспособности клеток. В предпочтительных воплощениях результаты различных способов анализа жизнеспособности сравнивают со стандартными данными и комбинируют для определения диагностического результата в соответствии со стадией (г). В дополнительных предпочтительных воплощениях также результаты первой и/или второй группы предпочтительных воплощений стадии (в), включающих анализ экспрессии белков, комбинируют с результатами третьей группы воплощений стадии (в), включающих анализ жизнеспособности клеток.
На стадии (г) результаты анализа экспрессии белков клетками и/или анализа жизнеспособности клеток, полученные на стадии (в), сравнивают со стандартными данными для определения диагностического результата. В предпочтительных воплощениях стадии (г) сравнение экспрессии белков тестируемыми клетками со стандартными данными посредством вычислений осуществляют с помощью способов обработки данных, известных в области техники.
В некоторые предпочтительных воплощениях стандартные данные, используемые на стадии (г), были получены в результате контрольных анализов стадий (а) - (в) способа диагностики глаукомы, которые проводили параллельно. Контрольные анализы включают один или более чем один из следующих образцов, не ограничиваясь указанным: клетки, обработанные жидкостями организма пациентов, страдающих от глаукомы, включая жидкость организма пациентов, страдающих от специфических известных форм глаукомы, таких как NTG (нормотензивная глаукома) или POAG (первичная открытоугольная глаукома), или пациентов, страдающих от глаукомы на специфической стадии заболевания, такой как ранняя стадия заболевания, и клетки, обработанные жидкостями организма здоровых индивидов. В других предпочтительных воплощениях такие стандартные данные могут происходить из сохраненных данных контрольных исследований, проведенных в различные моменты времени.
В первой группе предпочтительных воплощений стадии (в) различия между диагностическими результатами, определенными на стадии (г), между здоровыми индивидами и пациентами, страдающими от глаукомы, определяют путем анализа экспрессии белков, учитывая сложные белковые профили для белков, которые экспрессируют анализируемые клетки тестируемого индивида.
Во второй группе предпочтительных воплощений стадии (в), различия между диагностическим результатом, определенным на стадии (г), у здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, определяют путем анализа экспрессии белков, учитывающего выбранные биомаркеры среди белков, экспрессируемых клетками после обработки жидкостью организма в соответствии со стадией (б).
В третьей группе предпочтительных воплощений стадии (в) различия между диагностическим результатом, определенным на стадии (г), у здоровых индивидов и пациентов, страдающих от глаукомы, определяют с учетом жизнеспособности клеток после обработки жидкостью организма в соответствии со стадией (б).
В дополнительных предпочтительных воплощениях способа по изобретению расчетная стадия обработки объединяет обработку данных результатов анализа экспрессии белков и/или анализа жизнеспособности клеток на стадии (в) и сравнение результатов анализа экспрессии белков со стандартными данными на стадии (г).
В некоторые предпочтительных воплощениях стадии (г) осуществляют вычислительное сравнение результатов анализа экспрессии белков и/или анализа жизнеспособности клеток со стадии (в), который основан на способах обработки данных, известных в области техники. Паттерны самого высокого сходства между результатами со стадии (в) для клеток, обработанных жидкостью организма тестируемого индивида на стадии (б), и стандартными данными, соответствующими результатам со стадии (в) для клеток, обработанных на стадии (б) жидкостями организма контрольной группы, такой как различные клинические группы пациентов или здоровых индивидов. В предпочтительных воплощениях стандартные данные получены в результате контрольных исследований, проведенных параллельно, в других вариантами стандартные данные, получают в результате контрольных анализов, проведенных в отличающиеся моменты времени.
В предпочтительных вариантах сравнения с помощью способа обработки данных на стадии (г) используют искусственные нейронные сети, которые обучаются различать разные клинические группы в результате опыта, а не программирования. Примеры техник, использующих искусственные нервные сети, применимых для стадии (г), включают многослойную сеть с прямой связью (multiple layer feed forward network, MLFN), искусственные нейронные сети с процедурами самораспространения, а также другие виды обучающих алгоритмов, техники сокращающей эвристики и генетические алгоритмы.
Способ согласно изобретению не только включает методики обработки данных, как продемонстрировано здесь для стадии (г), но также аналогичные технологии, например применение других способов сопоставления паттернов, других статистических методик классификации или других способов для сравнения результатов экспрессии белков со стандартными данными - для сравнения комплексных профилей экспрессии белков или профилей белковых фракций, а также для сравнения экспрессии ограниченного количества биомаркеров или антигенов или сравнения анализа жизнеспособности клеток.
Диагностический результат, полученный при помощи первого и второго способа диагностики глаукомы, в некоторых воплощениях представляет собой диагностический результат, понятный для пациента, или в других воплощениях диагностический результат включает одно или более чем одно диагностическое значение, интерпретируемое практикующим врачом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1: Повторы пятен антител против человеческих IgG/A/M, полученные путем контактной печати (А) и пьезонанесения пятен (В).
Фиг. 2А: Стандартные ошибки (CV), перечисленные для глазных антигенов на исследуемых микроматрицах.
Фиг. 2В: Стандартные отклонения (SD), перечисленные для различных антигенов на исследуемых микроматрицах.
Фиг. 3: Сравнение данных, полученных в результате различных подходов к обработке данных для четырех различных антигенов. Перечислены, необработанные данные (А), данные AUC (area under curve, площадь под кривой) (В) и данные Z-оценки (С) и данные, преобразованные с использованием IgG-нормализации (D).
Фиг. 4: Профили усредненных антигенных интенсивностей для 20 антигенов, инкубированных с сывороткой крови (А) и внутриглазной жидкостью (В) контрольных индивидов (CTRL) и пациентов, страдающих от первичной открытоугольной глаукомы (POAG).
Фиг. 5: Коробчатая диаграмма для антител против человеческого IgG/A/M для здоровых контрольных индивидов (CTRL) и пациентов, страдающих от глаукомы (POAG).
Фиг. 6: Рабочая характеристическая кривая (receiver operation characteristic curve, ROC) для обнаружения глаукомы с помощью реактивности антитела к сыворотке крови (6А) и к внутриглазной жидкости (6В).
Фиг. 7: Внутрииндивидуальное сравнение значений
иммунореактивности для сыворотки крови и внутриглазной жидкости для контрольной группы (7А) и образцов POAG (7В)
Фиг. 8: Анализ биологических функций при помощи аннотаций GO (генная онтология, gene ontology) выявил несколько сверхпредставленных условий путем расчета при помощи гипергеометрической модели для глазных антигенов, что продемонстрировало значимые различия между исследуемыми группами в образцах сыворотки крови.
Фиг. 9: Типичный паттерн антител для пациента, страдающего от глаукомы.
Фиг. 10: Понедельная воспроизводимость данных для микроматриц
На Фиг. 11 приведен простой обзор условий для предпочтительного воплощения второго способа диагностики глаукомы, который использовали в примерах 1-3: нейроганглиозные клетки сетчатки высевали в экспериментальные планшеты и добавляли культуральную среду, содержащую 10% сыворотку крови здоровых индивидов или пациентов, страдающих от POAG (первичная открытоугольная глаукома), NTG (нормотензивная глаукома) или ОНТ (глазная гипертензия). Клетки инкубировали при 37°С в течение 48 часов либо при нормальном давлении, либо при увеличенном давлении 15000 Паскаль. Клетки подвергали лизису, и белки отделяли путем осаждения из ацетона. Белковые профили определяли при помощи SELDI-TOF масс-спектрометрии (MS) и затем анализировали статистически.
На Фиг. 12А показана фракция измеренных белковых профилей. В общем белковом профиле насчитывалось приблизительно 400 различных белковых кластеров. Для проиллюстрированной фракции на оси X представлена молекулярная масса в Дальтонах и на оси Y представлена интенсивность уровня экспрессии белка в клетках. Очень сложный общий белковый профиль, измеренный при помощи SELDI-TOF масс-спектрометрии, белковые кластеры расположены от 3078 Дальтон (Да) до 183222 Да. Проиллюстрированная здесь фракция составляет от 4943 Да до 21934 Да и дает представление о сложности белков в клетках.
На Фиг. 12В показаны несколько единичных измерений, выявляющих трудности идентификации различий при помощи только визуального анализа профилей. Профили для образца получены на клетках, обработанных сывороткой крови здоровых индивидов или POAG при повышенном давлении или без такового. На оси X представлена молекулярная масса белков в Дальтонах, на оси Y представлена интенсивность измеренных белков в клетках. Поскольку профили демонстрируют несколько сотен белков, не было возможности проанализировать различия между экспериментальными группами только путем их визуального осмотра.
На Фиг. 13: показано несколько графиков изменчивости расчетных биомаркеров с молекулярными массами 9192, 12390 и 12314 Дальтон. На оси X показаны различные обрабатываемые группы клеток. На оси Y представлена интенсивность белка, измеренная при помощи SELDI-TOF масс-спектрометрии. Каждый треугольник на графике означает один образец конкретной группы. Графики изменчивости показывают, что экспрессия этих 3 биомаркерных белков изменена (увеличена или уменьшена) в клетках, инкубированных с сывороткой крови POAG, по сравнению с клетками, инкубированными с сывороткой крови здоровых индивидов.
Фиг. 14: График демонстрирует дисперсионный анализ. Фиг. 14А демонстрирует влияние различных обработок клеток - с сывороткой крови здоровых индивидов или пациентов POAG при давлении окружающей среды или увеличенном давлении - на белковые профили клеток. Очевидно, что тип сыворотки крови оказывает очень большой влияние на белковый профиль, составляющее 59,1%, к которому могут быть добавлены еще 14% при сочетании с увеличенным давлением (комбинация 1+2). Само давление оказывает на белковые профили клеток действие, составляющее 11,6%. График на Фиг. 14В демонстрирует влияние различий в обработке на выбранный специфический биомаркер:9192. Действие весьма похоже.
Фиг. 15А: представлены результаты дисперсионного анализа (ANOVA, analysis of variance), оценивающий влияние присутствия антител в сыворотке крови POAG на белковые профили, как 50,5%. Тип сыворотки крови, означающий сыворотку крови POAG или сыворотку крови здоровых контролей, оказывает дополнительное влияние, составляющее 13,4%.
Фиг. 15В: Расстояния Махаланобиса демонстрируют сравнение общих белковых профилей клеток, инкубированных с сывороткой крови POAG с антителами или без антител, с клетками, инкубированным с контрольной сывороткой крови, где увеличение расстояния от нулевой точки указывает на увеличение различия в белковом профиле клеток, инкубированных с сывороткой крови пациентов POAG, по сравнению с белковым профилем клеток, инкубированных с сывороткой крови здоровый индивидов. Белковые профили клеток, инкубированных с сывороткой крови POAG, значительно больше отличаются от белковых профилей, инкубированных с контрольной сывороткой крови, что демонстрирует расстояние Махаланобиса, составляющее приблизительно 55, по сравнению с белковыми профилями клеток, инкубированных с сывороткой крови POAG, из которой удалены антитела (POAG - антитела), о чем свидетельствует расстояние Махаланобиса, составляющее приблизительно 20.
На Фиг. 16А показана фракция измеренных белковых профилей клеток, инкубированных с сывороткой крови здоровых индивидов, страдающих от POAG или NTG, в присутствие или отсутствии давление. На оси X представлена молекулярная масса белков в Дальтонах, а на оси Y представлена измеренная интенсивность белка в клетках. Очевидно, что клетки реагируют по-разному с сывороткой крови NTG и с сывороткой крови POAG.
На Фиг. 16В показан биомаркер 9207 Дальтон. На оси X представлена экспериментальная группа, на оси Y представлены измеренные интенсивности белка в образце. Группа глаукомы включает все клетки, инкубированные с сывороткой крови лиц, страдающих от глаукомы, то есть, с сывороткой крови POAG или NTG. Очевидно, что биомаркер в 9207 Дальтон подвергается повышающей регуляции в клетках, инкубированных с сывороткой крови лиц, страдающих от глаукомы.
На Фиг. 17 показана рабочая характеристическая кривая (ROC), рассчитанная на основе измеренных белковых профилей клеток, инкубированных с сывороткой крови лиц, страдающих от глаукомы, а именно сывороткой крови POAG или NTG. Она демонстрирует различие в сыворотке крови лиц, страдающих от глаукомы, и сыворотке крови лиц без глаукомы с чувствительностью 88% и специфичностью 90%. Область под кривой, представляющая собой параметр точности теста, представляет собой r: 0,92.
На Фиг. 18 показана жизнеспособность клеток RGC5 после инкубации с различными концентрациями антитела 14-3-3 и стресса, вызванного 1,5 мкМ стауроспорином (sta). На оси X представлена экспериментальная группа, на оси Y представлена жизнеспособность клеток в процентах. Контрольные клетки (темно-серый столбец) инкубировали без участия клеточного стресса или антител. Клетки, инкубированные с стауроспорином, демонстрируют утрату жизнеспособности на 16,1%. Клетки, инкубируемые со стауроспорином и предварительно инкубированные с антителом 14-3-3, демонстрируют увеличение жизнеспособности по сравнению с клетками, инкубированными со стауроспорином до 11,6%. (концентрация антитела 0,5 мкг/мл), в диапазоне от значимого (р<0,05) до весьма значимого (р<0,01).
2
2
2
2
2
2
2
2
На Фиг. 19 показана жизнеспособность клеток RGC5 после инкубации с различными концентрациями антитела против γ-синуклеина и стресса, вызванного 50 мкМ НО (1 ч). На оси X показана экспериментальная группа, ось Y демонстрирует жизнеспособность клеток в процентах. Контрольные клетки инкубировали без участия клеточного стресса или антител. Клетки, инкубированные с НО, демонстрируют утрату жизнеспособности на 17,9%. Клетки, инкубированные с НО и предварительно инкубированные с антителом против γ-синуклеина, демонстрировали увеличение жизнеспособности по сравнению с клетками, инкубированными с НО, до 15,3%. (концентрация антитела 0,05 (мкг/мл), в диапазоне от значимого (р<0,05) до весьма значимого (Р<0,01).
2
2
2
2
2
2
2
2
На Фиг. 20 показана жизнеспособность клеток RGC5 после инкубации с различными концентрациями антитела против GFAP и стресса с 50 мкМ HO (1 ч). Ось X демонстрирует экспериментальную группу, ось Y демонстрирует жизнеспособность клеток в процентах. Контроль клетки инкубировали без клеточного стресса или антител. Клетки, инкубированные с HO, демонстрировали утрату жизнеспособности на 7,4%. Клетки, инкубированные с HO и предварительно инкубированные с антителом против GFAP, демонстрировали значимое (р<0,05) увеличение жизнеспособности по сравнению к клетками, инкубированными с НО, до 9,8% (концентрация антитела 0,5 мкг/мл).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Примеры и подробное описание, касающееся первого способа диагностики глаукомы:
Пример 1: Антигенные микроматрицы, демонстрирующие сравнение аутоиммунореактивности в сыворотке крови и внутриглазной жидкости, с характерными различиями у пациентов, страдающих от глаукомы, и здоровых индивидов:
Образцы сыворотки крови и внутриглазной жидкости пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (POAG; n=13) и здоровых контрольных индивидов (CTRL; n=13) использовали для анализа антитела. Белковые матрицы готовили путем нанесения в виде пятен 40-100 различных очищенных антигенов (известных в качестве биомаркеров) на покрытые нитроцеллюлозой слайды. Матрицы инкубировали с образцами сыворотки крови (1:250) и внутриглазной жидкостью (1:20), соответственно. Для визуализации реакций антитело-антиген матрицы обрабатывали флуоресцентно меченым антителом против человеческого IgG с последующим сканированием путем флуоресценции. Сигналы, испущенные с вторичных антител, оцифровывали, и интенсивности пятен сравнивали с использованием многопараметрических статистических способов.
Результаты: внутрииндивидуальное сравнение выявило соответствия, а также различия, между паттернами антител образцов сыворотки крови и внутриглазной жидкости. Как во внутриглазной жидкости, так и сыворотке крови пациентов, страдающих от POAG, продемонстрировано более чем двухкратное увеличение реактивности в отношении α-1-антитрипсина и аннексина V по сравнению со здоровыми субъектами (Р≤0,001). Наоборот, β-L-кристаллин демонстрировал значимое увеличение средней (ME) реактивности во внутриглазной жидкости (POAG: МЕ=5049; SD=1638; CTRL: МЕ=2119; SD=673; Р≤0,01) и уменьшенную реактивность в сыворотке крови (Р≤0,01) пациентов POAG. Для семи антигенов ни один из включенных в исследование субъектов не демонстрировал иммунореактивность во внутриглазной жидкости. С использованием панели биомаркеров из десяти антител/антигенов из каждой жидкости организма, соответственно, авторы изобретения способны к различению между POAG и CTRL со специфичностью и чувствительностью приблизительно. 90% (кривая ROC; сыворотка крови: r=0,91; внутриглазная жидкость: r=0,93) при использовании специального алгоритма. Эти результаты подтверждают наличие повышающей регуляции и понижающей регуляции реактивностей антитела в сыворотке крови и внутриглазной жидкости пациентов, страдающих от глаукомы. Кроме того, увеличение реактивности во внутриглазной жидкости по сравнению с сывороткой крови свидетельствует о местной продукции антитела в глазу.
Пример 2: Приготовление образцов сыворотки крови и внутриглазной жидкости
Приготовление образцов осуществляли в соответствии с Хельсинкской Декларацией по биомедицинским исследованиям, вовлекающим субъектов-людей. Кровь и внутриглазную жидкость собирали у всех добровольцев после получения их информированного согласия. Образцы крови центрифугировали при 1000 g и образцы сыворотки крови хранили при -80°С для последующего анализа. Образцы внутриглазной жидкости хранили при -80°С непосредственно после отбора образца. Все участники были субъектами полной офтальмологической проверки, включающую аппланационную тонометрию по Гольдману, тонометрию, оптическую когерентную томографию (ОСТ) и Гейдельбергскую томографию сетчатки (HRT) в Отделе офтальмологии (Университет Майнца, Германия), и их классифицировали в соответствии с принципами Европейского Общества Глаукомы. 31 пациент, перенесший операцию по удалению катаракты, со средним возрастом 73 года (SD±10), и 37 пациентов, страдающих от первичной открытоугольной глаукомы, (POAG; средний возраст: 67, SD±10), включены в данное исследование. Пациенты, имеющие катаракту, без клинических признаков первичной или вторичной глаукомы или других заболеваний глаз, отличных от катаракты, служили в качестве контрольной группы (CTRL) в соответствии с другими исследованиями. 42 POAG-пациента имели IOP>21 мм рт. ст. без медикаментозного лечения (определенное при помощи аппланационной тонометрии по Гольдману), типичные дефекты поля зрения (определенные при помощи периметрии, OCTOPUS 101 Perimeter; Haag-Streit, Wedel, Германия) и вздутие зрительного нерва. Пациенты с аутоиммунными заболеваниями или страдающие от неврологических заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, были исключены из этого исследования.
Пример 3: Подготовка микроматриц
Авторы изобретения использовали высокоочищенные белки, приобретенные в Sigma-Aldrich (Германия) и BioMol (Гамбург, Германия), в качестве антигенов. Антигены разбавляли до 1 мкг/мкл буфером PBS (физиологический раствор, забуференный фосфатом, Phosphate Buffered Saline), содержащим 1,5% трегалозы, для оптимальных условий нанесения отпечатков. Нанесение пятен антигенов осуществляли при помощи неконтактной технологии нанесения отпечатков (sciFLEXARRAYER S3, Scienion, Berlin, Германия), основанной на пьезонанесении, и обычно используемого контактного способа печати иглами (OmniGrid100, Digilab Genomic Solutions, Ann Arbor, США). Результаты оценивали путем сравнения морфологии пятен и вариабельности между пятнами. Для того чтобы отпечатать полный набор исследуемых микроматриц использовали способ пьезонанесения пятен. Каждый антиген наносили в виде пятен в 3 параллелях на нитроцеллюлозные слайды (Oncyte, нитроцеллюлозные 16 мультиплощадочные слайды, Grace Bio-Labs, Bend, США). В качестве положительного и отрицательного контролей авторы изобретения использовали мышиные антитела против человеческого IgG/A/M (10 мкг/мкл) и буфер для нанесения пятен. Процесс нанесения пятен проводили при комнатной температуре (КТ) и влажности 30%. 1 нл каждого разведения антигена было наносили на нитроцеллюлозу поверхность путем нанесения пятен четыре раза по 250 пл на точно ту же самую позицию. Точность объема нанесения пятен и правильное расположение капель контролировали до и после процесса нанесения пятен каждого антигена с использованием sciDrop-VOLUME и программного обеспечения для автоматического обнаружения пятен (Scienion, Berlin, Германия).
Стадии инкубации и промывания проводили при 4°С на орбитальном шейкере (Titramax 100, Heidolph, Schwabach, Германия). Слайды покрывали при помощи рамочных гибридизационных камер 16-pad FAST (Whatmann, Maidstone, Великобритания) и блокировали PBS, содержащим 4%-ый BSA, в течение одного часа. Затем слайды трижды промывали PBS, содержащим 0,5% Tween (PBS-T). Образцы сывороток крови пациентов разбавляли 1:250 в PBS с внутриглазной жидкостью в отношении 1:10 в PBS. 120 мкл этих разведений произвольным образом инкубировали на приготовленных слайдах с антигенами в течение ночи. После нескольких стадий отмывания PBS-T слайды инкубировали с флуоресцентным Су-5, меченными вторичным антителом (1:500, разбавленным в PBS-T, козьи антитела против человеческого IgG, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, США) в течение одного часа в темноте. За двумя стадиями отмывания PBS-T следовали две окончательные стадии отмывания водой качества, пригодного для HPLC. Все микроматрицы сушили на воздухе перед сканированием с использованием сканера для микроматриц (Сканер для матриц Affymetrix 428 ТМ, High Wycombe, Великобритания). Полученные 16-битные изображения слайдов в формате TIFF (Формат файла с прикрепленной информацией) анализировали с использованием программного обеспечения Spotfinder 3.1.1 (ТМ4, Dana-Faber Cancer Institute, Boston, США). Вычитание фона осуществляли в соответствии с формулой: интенсивность пятна = средняя интенсивность SP - ((сумфон - суммаксбфон) / (количество пикселей SP - количество стоппикселейбфон)), где SP представляет любое пятно, фон - соответствующий фон и максбфон - максимальные пять процентов фоновых пикселей. Коэффициент вариации (CV) вычисляли следующим образом: CV=SDSP3/средн SPX… SPn, где SDSP3 представляет стандартную ошибку для трех повторов пятен одного антигена одного образца, и среднее SPX… SPn - среднее для всех интенсивностей пятен.
Пример 4: Статистический анализ данных
Для того, чтобы обеспечить смещенное сравнение результатов, вызванное отклонениями при нормализации и обработке данных, авторы изобретения сначала противопоставили два различных вида преобразования данных - область под кривой (AUC) и Z-оценка - с необработанными данными. Для анализа исследуемых данных авторы изобретения применили преобразование с Z-оценкой в соответствии с формулой: Z-оценка = (интенсивность SP - средняя интенсивность SP1… SPX)/SDSPX…SPn, где SP представляет какую-либо интенсивность пятна и SP1…SPX общую интенсивность всех 46 пятен. Обнаружение потенциальных биомаркеров и оценку значимых изменений в реактивности антитела осуществляли при помощи различных статистических способов. Для межгруппового сравнения авторы изобретения использовали односторонний ANOVA и многопараметрический дискриминационный анализ (например расстояния Махаланобиса, канонические корни) для обоих образцов материала по отдельности. На второй стадии искусственные нейронные сети (ANN) строили для определения мощности классификации паттернов аутоантител для специфического набора антигенов. Таким образом, наборы данных произвольным образом разделяли на две части с выровненными количествами пациентов на группу. Одну половину использовали для обучения ANN, и вторую половина для того, чтобы тестировать обученную ANN в отношении ее мощности в вопросе классификации. Таким образом, никакие из образцов, включенных в набор обучающих данных, не использовали в целях классификации. Результаты визуализировали путем построения рабочей характеристической кривой (кривая ROC). Подробное описание способов, применяемых для статистического анализа, можно найти в предыдущей публикации группы авторов изобретения. Для внутрииндивидуального сравнения и для иллюстрации доли уровня антител во внутриглазной жидкости к уровням в соответствующих образцах сыворотки крови, авторы изобретения рассчитывали процентное различие между ними на основе значений для сыворотки крови для каждого отдельного пациента с последующим расчетом среднего значения для всех субъектов в различных группах пациентов. Различие между образцами сыворотки крови и внутриглазной жидкости, большее чем 100%, рассматривали как значимое. Дополнительно, авторы изобретения сопоставляли измеренные данные со всеми собранными клиническими записями. Статистические анализы проводили с использованием Statistica 8.0 (Statsoft, Tulsa, AZ, США).
Пример 5: Анализ генной онтологии (GO)
Для того чтобы глубже понять биологические процессы антигенов, демонстрирующих значимые различия между разными группами пациентов, авторы изобретения использовали Cytoscape 2.6.2 в комбинации с Bingo 2.3 Plugin 50. Для назначения аннотаций согласно Генной онтологии (Gene Ontology, GO) для каждого антигена использовали полную базу данных аннотаций GO и для организма/аннотации выбирали Homo sapiens. Гипергеометрическая модель и коррекция темпа открытий Benjamini and Hochberg (Р≤0,05) обеспечивали значимость избыточно представленных белковых функций.
Пример 6: Схема примера способа определения индексов глаукомы
На первой стадии для определения индексов глаукомы рассчитывают процентное различие между нормализованными значениями интенсивности реактивностей аутоантитела для тестируемых образцов и референсного образца. Эти процентные различия используют в качестве вводных данных для анализа с помощью нейронной сети для определения индекса глаукомы. В зависимости от требуемой чувствительности и специфичности способа диагностики глаукомы образцы сыворотки крови со стадии (б) инкубировали в качестве примера с одним из трех вариантов образцов: (1) или (2), или (3), которые брали в соответствии со стадией (а) первого способа диагностики:
Образец (1) содержит все 46 по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов Группы 1, образец (2) и образец (3) содержат, соответственно, 12 и 5 по меньшей мере частично очищенных глазных антигенов.
Как ожидается, чем больше количество глазных антигенов составляет образец в соответствии со стадией (а), тем лучше чувствительность и специфичность первого способа диагностики. В образце (3), хотя он содержит только 5 глазных антигенов, все же достигается чувствительность и специфичность приблизительно 90%.
Кроме того, индивидуальным антигенам, содержащимся в образцах 1, 2 и 3, присваивали различные весовые коэффициенты для расчета индекса глаукомы, таким образом, что антигены с высоким весовым коэффициентом (например антигены в Группе А) обладают более сильным воздействием на индекс глаукомы.
Индексы глаукомы, отличающиеся от определенного референсного значения - например, превышающие определенное пороговое значение -позволяют идентифицировать те тестируемые образцы, в которых жидкость организма собирали у пациентов, страдающих от глаукомы.
Нормализованные значения интенсивности по реактивностям аутоантител
Вычисление процента различия значений интенсивности относительно референсных значений при помощи формулы:
Оценка индекса глаукомы Оценка индекса глаукомы с использованием алгоритма нейронной сети с расчетными процентными различиями при вводе данных:
1) Оценка индекса, основанная на всех тестируемых антигенах
Чувствительность: 96%
Специфичность: 97%
2) Оценка индекса, основанная на подмножестве 12 тестируемых
антигенов, включающих:
MBP, GST, HSP27, ингибитор протеинкиназы С, GFAP, jo-1, убиквитин,
актин, бета-Б-кристаллин, HSP70, супероксиддисмутаза, транстиретин
Чувствительность: 92%
Специфичность: 94%
3) Оценка индекса, основанная на подмножестве 5 тестируемых
антигенов, включающих:
HSP70, актин, бета-Б-кристаллин, HSP27, GFAP
Чувствительность: 91%
Специфичность: 88%
В соответствии с их влиянием на диагностику глаукомы и с учетом данных статистического анализа, такого как тест апостериори или дискриминационный анализ, антигены разделяют на три различные группы с различными весами для вычисления индекса глаукомы. Антигены, демонстрирующие очень сильное межгрупповое различие, относятся к группе А, антигены с сильным различием относятся к группе В, и антигены с отчетливым межгрупповым различием относятся к группе С:
Группа А (с очень высокой степенью релевантности):
актин, альфа-1-антитрипсин, аннексии V, альфа-А-кристаллин, альфа-В-кристаллин, бета-L-кристаллин, бета-S-кристаллин, гамма-кристаллин, α-фодрин (=спектрин), глиофибриллярный кислый белок GFAP, глутатион-S-трансфераза, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, белок, связывающий миелин МВР, нейронспецифическая энолаза NSE, ингибитор протеинкиназы С, супероксиддисмутаза, трансферрин, транстиретин, убиквитин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), виментин
Группа В (высокая степень релевантности):
аннексии II, бета-2-адренергический рецептор, кальретикулин, белок теплового шока HSP10, инсулин, пероксиддисмутаза, протеинкиназа С, альфа-синуклеин, гамма-синуклеин
Группа С (релевантные антигены):
альбумин, нейротрофический фактор головного мозга BDNF, кардиолипин, ДНК топоизомераза 1, фибронектин, лизоцим, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин MOG, миоглобин, нейротрофин 3, 3-фосфосерин, тиреоглобулин, ингибитор топоизомеразы
Антигены, демонстрирующие очень высокую релевантность в отношении диагностики глаукомы, обладают большим весом, чем антигены группы В или С, приводя в результате к более высокому влиянию на индекс глаукомы.
Антигены с высокой релевантностью обладают большим весом, чем антигены группы С, давая среднее влияние на индекс глаукомы. Релевантные антигены оказывают наименьшее влияние на оцененный индекс глаукомы.
Субъектов, превышающих определенный порог, диагностируют как пациентов, страдающих от глаукомы
Фиг.1: Представлены три повтора пятен антител против человеческих IgG/A/M, полученные путем контактного нанесения отпечатков (А) и пьезонанесения пятен (В). Числа отражают соответствующие средние интенсивности пикселей на пятно. А: средняя интенсивность для всех пятен составляет 7173,32+/-1473,27 единиц. Коэффициент вариации (CV) составляет 0,21. В: средняя интенсивность 11716+/-374,78 единиц. CV составляет 0,03.
Два различных способа нанесения пятен сравнивали для обнаружения наилучшего подхода для специфического воспроизводимого нанесения пятен белков с различными физическими характеристиками. Обычно используемый способ описания вариации интенсивностей пятен в повторах пятен представляет собой определение коэффициента вариации 45. Используя контактную технологию печати, основанную на иглах, авторам изобретения удалось достичь среднего CV, составляющего 0,32, для трех технических повторов пятен для всех антигенов. Морфология и интенсивность пятен варьирует среди повторов пятен, как показано на фиг. 1А. Напротив, микроматрицы, нанесенные при помощи бесконтактного пьезонанесения пятен демонстрировали более чем в 10 раз меньшую вариабельность между пятнами (средний CV=0,029) и намного большее постоянство морфологии пятен (фиг. 1В). Эти результаты согласуются с данными, полученными с помощью sciDROP-VOLUME и программного обеспечения для обнаружения автоматического нанесения пятен. Обнаруживаемая при помощи программного обеспечения вариация объема пятна составляет всего 0,8% (эквивалентно 2 пл 250 пл пятна) для всех антигенов. По этому, для того, чтобы отпечатать весь набор исследуемых микроматричных слайдов для обеспечения нанесения точно равных объемов растворов антигена выбрали бесконтактную технологию печати. Аналогично оценке CV для валидации технологий нанесения пятен авторы изобретения вычислили средний коэффициент вариации для технических повторов пятен исследуемых микроматриц. Эти микроматрицы демонстрировали средний CV 0,031 при стандартной ошибке 0,061 (в отношении распределения CV для единичных антигенов см. Фиг. 2А), тогда как медиана стандартного отклонения для измеренных интенсивностей повторов пятен для всех образцов варьирует от 44 до 480 в зависимости от антигена и его усредненных интенсивностей пятен (см. Фиг. 2В).
Фиг. 2А и Фиг. 2В: На Фиг. 2А показаны коэффициенты вариации (CV) необработанных данных, перечисленных для каждого антигена в исследуемой микроматрице. На оси x представлены различные антигены, на оси у представлены значения CV. Медиана CV по всем антигенам составляет 0,031+/-0,061. На Фиг. 2В представлены стандартные ошибки (SD) для необработанных данных, перечисленные для различных антигенов на исследуемых микроматрицах. На оси x представлены различные антигены, а ось у значения для стандартной ошибки (SD).
Для определения профиля антитела для исследуемых пациентов и тестируемых индивидов сравнение различных алгоритмов для нормализации данных выявило, что преобразование Z-оценки в наибольшей степени применимо к данному подходу вследствие низкого отклонения между исследуемыми группами (Фиг. 3) и возможности сравнивать измерения количественным образом для различных экспериментов и тестов на глаукому.
Фиг. 3: Сравнение данных, полученных в различных способах обработки данных для четырех различных антигенов. Перечислены: необработанные данные (А), данные AUC (В) и данные Z-оценки (С) и данные, преобразованные с использованием IgG-нормализации (D).
Авторы изобретения смогли обнаружить сложные паттерны реактивности антитела у всех исследуемых пациентов и множественные различия между пациентами, страдающими от глаукомы, и контрольными субъектами, в сыворотке крови, а также во внутриглазной жидкости (Фиг. 4А и В). Авторы изобретения не обнаружили корреляции между уровнем IgG/A/M и возрастом или полом пациентов, также авторы изобретения не обнаружили значимых различий в уровнях IgG/A/M для исследуемых групп ни в сыворотке крови (Р≥0,9, Фиг. 5А), ни во внутриглазной жидкости (Р≥0,6, Фиг. 5В).
Фиг. 4: Профили усредненных интенсивностей антител для сыворотки крови (А) и внутриглазной жидкости (В). Представлены усредненные значения интенсивности для контрольных субъектов (CTRL) и пациентов, страдающих от первичной открытоугольной глаукомы (POAG), для 20 антигенов. Линейный паттерн представляет группы пациентов (красный цвет = POAG, синий = CTRL), на оси X представлено подмножество из 20 антител, которые демонстрировали самые сильные различия между группами, и на оси Y представлено значение вычисленных Z-оценок.
Фиг. 5: Представлены определенные значения антител против человеческих IgG/A/M в виде коробчатой диаграммы. На оси X представлены различные группы (контрольная группа (CON); группа, пациентов страдающих от глаукомы (POAG)), и на оси Y представлены измеренные и нормализованные интенсивности (Z-оценка). Не смогли обнаружить никакого значимого различия между обеими группами (Р≥0,05) в сыворотке крови (5А) или во внутриглазной жидкости (5В).
В образцах сыворотки крови пациентов POAG продемонстрированы несколько увеличенные иммунореактивности по сравнению с субъектами CTRL, но также выявлено некоторое уменьшение реактивности (Фиг. 4А). Как продемонстрировано, HSP27, HSP70, основной белок миелина (МВР) или аннексии V демонстрировали увеличенные реактивности антител у пациентов POAG по сравнению с контрольной группой. Для других антигенов, таких как глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) или убиквитин, пациенты POAG демонстрировали меньшую реактивность антител по сравнению со здоровыми субъектами. Редко встречающиеся или очень небольшие, вплоть до не обнаруживаемых, интенсивности обнаружены для миоглобина, миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (MOG) и ДНК топоизомеразы 1. Односторонний анализ ANOVA и многопараметрический дискриминационный анализ не только выявил значимое различие между реактивностями целых антител в сыворотке крови пациентов POAG и здоровых контрольных индивидов (Р≤0,002), но также статистически значимое различие для несколько единичных антигенов. Например пациенты POAG демонстрировали значимое увеличение реактивности против МВР (Р≤0,0028), HSP27 (Р≤0,019), HSP70 (Р≤0,0033) или α-фодрина (Р≤0,0027) (таблица 3.). Значимое уменьшение реактивности антител обнаружено для GFAP (Р≤0,001), убиквитина (Р≤0,0038) и β-L-кристаллина (Р≤0,03).
В контексте потенциального использования реактивностей аутоантител в качестве диагностического инструмента для глаукомы авторы изобретения тестировали их классификационную мощность с помощью искусственных нейронных сетей (ANN). Обучение сети осуществляли с использованием подмножества пациентов (CTRL N=18, POAG N=17) и данных девяти наиболее значимых реактивностей сывороточное антитело-антиген (14-3-3, Альфа-1-антитрипсин, бета-L-кристаллин, GFAP, HSP 27, HSP 70, МВР, альфа-фодрин, убиквитин). Затем обучаемую сеть применяли к неизвестным образцам сыворотки крови. Персонализованные выходные значения ANN для каждого пациента, демонстрирующие классификацию групп при помощи ANN, использовали в качестве комбинированной оценки антител (CTRL≥0,5, POAG≤0,5). Оценки антител, рассчитанные для наборов данных после обучения сетей для образцов сыворотки крови, выявили сильную положительную корреляцию с оценками, вычисленным для образцов внутриглазной жидкости одних и тех же пациентов (R≤0,74, Р≤0,001, Фиг 6А). Кроме того, для предполагаемых образцов (CTRL N=13, POAG N=20; данные тестов), не включенных в учебный набор данных, авторы изобретения обнаружили корреляцию между индексами антител для сыворотки крови и внутриглазной жидкости (R≤0,72, Р≤0,001, Фиг. 6В). С использованием расчетных индексов для антител для классификации пациентов только один субъект (CTRL) был неправильно классифицирован как субъект POAG по индексу антител для сыворотки крови и внутриглазной жидкости (Фиг. 6В). Сильная положительная корреляция для рассчитанных инлдексов для обоих типов образцов подчеркивает минимальные различия между иммунореактивностями в сыворотке крови и внутриглазной жидкости, обнаруженные путем внутрииндивидуального сравнения. Чувствительность и специфичность отличия субъектов с предполагаемой глаукомой и контрольных субъектов, составляла 93% (Фиг. 6С; AUC r=0,93).
Фиг. 6: А, В: Диаграммы рассеяния для реактивностей антител в сыворотке крови и внутриглазной жидкости. Ось X демонстрирует значения для индекса антител в сыворотке крови, ось Y - значения для образцов внутриглазной жидкости. Каждая точка представляет одного пациента (синие точки = POAG, красные точки = CTRL). А: Диаграммы рассеяния для образцов, включенных в набор учебных данных (R=0,74), В: Диаграммы рассеяния для всех исследуемых образцов (R=0,72). С: рабочая характеристическая кривая для предполагаемых образцов сыворотки крови (Ось X: 1-специфичность, Ось Y: чувствительность, r=0,93).
Проверка образцов внутриглазной жидкости аналогичным образом демонстрирует несколько различий между исследуемыми группами, (Фиг. 4В). Однако в отличие от образцов сыворотки крови имели место только несколько случаев уменьшения реактивности. Большая часть антигенов, таких как МВР, HSP70, аннексии V или глутатион-S-трансфераза показали увеличение реактивности в случае группы POAG, и некоторые из них находятся в соответствии с образцами сыворотки крови. Для других, таких как цепь-В инсулина или MOG, реактивности антител могут быть изредка обнаружены во внутриглазной жидкости и частично они представляют собой те же самые антигены, которые изредка демонстрировали реактивность в сыворотке крови (например MOG или ДНК топоизомераза 1, таблица 3.) Кроме того, статистический анализ дополнительно подтверждает наличие общих черт между обоими типами образцов. Полученные таким образом данные продемонстрировали, например Р≤0,022 для МВР и Р≤0,03 для аннексина V во внутриглазной жидкости - оба антигена демонстрировали значимо увеличенные значения в сыворотке крови также пациентов POAG. Соответствуя меньшему количеству статистических одномерных значимых различий у субъектов POAG и CTRL, установленная классификационная мощность образцов внутриглазной жидкости была меньшей (кривая ROC; AUC r=0,7), по сравнению с таковой образцов сыворотки крови.
Фиг. 7: Внутрииндивидуальное сравнение иммунореактивностей сыворотки крови и внутриглазной жидкости. Антигены перечислены на оси X. На оси Y представлены измеренные значения Z-оценки. Столбики выше нулевой линии представляют более высокие иммунореактивности во внутриглазной жидкости, столбики ниже нулевой линии представляют более высокие интенсивности в сыворотка крови. Представлены результаты для контрольной группы (7А) и образцов POAG (7В). В общем, может быть обнаружено, что только некоторые антигены демонстрируют различия в иммунореактивности больше чем 100% (=2-кратное увеличение).
Внутрииндивидуальное сравнение иммунореактивностей образцов сыворотки крови с иммунореактивностями соответствующих образцов внутриглазной жидкости выявили лишь немногие значимые различия. В отношении CTRL субъектов (Фиг. 7) могут быть обнаружены значимо более высокие уровни реактивностей антител сыворотки крови (например МВР, HSP60, GFAP) по сравнению с соответствующими образцами внутриглазной жидкости, а также значимо более высокие иммунореактивности внутриглазной жидкости (например α-1-антитрипсина). Но в целом, для более чем 80% из проверенных антигенов выявили почти аналогичные иммунореактивности в сыворотке крови и внутриглазной жидкости контрольных субъектов. Для пациентов POAG также выявили некоторые значимые различия между образцами сыворотки крови и внутриглазной жидкости (фиг. 7В). Например, альбумин и α-1-антитрипсин демонстрировали более высокие иммунореактивности в образцах сыворотки крови, и в последнем случае это противоречит контрольным образцам, для которых продемонстрирована более высокая иммунореактивность для α-1-антитрипсина во внутриглазной жидкости. Образцы внутриглазной жидкости от группы пациентов, страдающих от глаукомы, продемонстрировали несколько более высокие реактивности антител по сравнению с соответствующими образцами сыворотки крови (например фибронектин, транстиретин). Но так же как с контрольной группой, лишь небольшое количество значимых различий между иммунореактивностями сыворотки крови и внутриглазной жидкости проявлялось в группе пациентов, страдающих от глаукомы, и более чем 80% из проверенных антигенов выявили почти совпадлающие паттерны антител.
Фиг. 8: Анализ биологических функций путем аннотаций GO выявил несколько представленных в избыточном количестве условий. Вычисление путем гипергеометрической модели для антигенов продемонстрировало значимые различия между исследуемыми группами в образцах сыворотки крови. На оси X представлены номера белков, относящиеся к различным функциональным группам.
Функциональные группы перечислены на оси Y. Синие столбики демонстрируют антигены с более высокой иммунореактивностью у субъектов POAG, красные столбики демонстрируют антигены с меньшей иммунореактивностью у пациентов, страдающих от глаукомы. Звездочки маркируют функциональные группы, которые также могут быть обнаружены во внутриглазной жидкости.
Интересно, что условия, такие как ответ на стресс, цитоскелет, везикулярный транспорт и апоптоз представлены в избыточном количестве (Фиг. 8). Условия, такие как цитоскелет или везикулярный транспорт, сильно связаны с неврологическими процессами, а другие, такие как ответ на стресс или апоптоз, должны рассматриваться в сочетании с нейродегенеративными заболеваниями.
Фиг. 9: А) Типичный паттерн аутоантител для пациента, страдающего от глаукомы. Белки слез элюировали из высушенной полоски Schirmer с использованием физиологического раствора, забуференного фосфатом, с последующей инкубацией образца на белковой микроматрице. В) рабочая характеристическая кривая (кривая ROC). Паттерны аутоантител из слез для пациентов, страдающих от глаукомы, и здоровых субъектов использовали для обучения искусственной нервной сети в отношении распознавания паттерна у пациентов, страдающих от глаукомы. На оси Y представляет чувствительность, а на оси X - 1-специфичность. При использовании этих паттернов аутоантител могут быть достигнуты специфичность и чувствительность ≥90% (область под кривой: r=0,93).
Фиг. 10: Изменчивость от недели к неделе данных для микроматрицы. Стандартную сыворотку крови инкубировали в течение семи последовательных недель с последующим вычислением коэффициента изменчивости (CV). Для нескольких различных антигенов представлены CV (черные столбики), включая стандартную ошибку.
С использованием подхода, включающего белковую микроматрицу, авторы изобретения смогли подтвердить различия в реактивностях антител в сыворотке крови и внутриглазной жидкости пациентов, страдающих от глаукомы, как известно в области техники.
Кроме того, обнаружено, что несколько новых антигенов, таких как α-1-антитрипсин или аннексии V, оказывают воздействие на глаукому. По сравнению с контрольными субъектами авторы изобретения обнаружили значимое увеличение иммунореактивности в сыворотке крови и внутриглазной жидкости у пациентов POAG, а также значимое уменьшение реактивности в сыворотке крови субъектов, страдающих от глаукомы. Для нескольких антигенов, например аннексина V, шаперонина, HSP27, HSP60, HSP70 или МВР различия такого же вида между группами пациентов могут быть обнаружены в образцах внутриглазной жидкости и сыворотки крови пациентов, страдающих от глаукомы, что предоставляет первое указание на общие черты между обоими типами образцов. В общем, различия между контрольными субъектами и пациентами, страдающими от глаукомы, по видимому меньше в образцах внутриглазной жидкости, где могут быть обнаружены только восемь одномерных значимых различий между обеими группами в противоположность одиннадцати значимым различиям в образцах сыворотки крови. Внутрииндивидуальное сравнение внутриглазной жидкости и сыворотки крови выявило, что лишь немногие антигены, например МВР, GFAP или α-1-антитрипсин, демонстрируют значимо отличающиеся иммунореактивности между обоими типами образцов контрольных субъектов. Кроме того, в образцах субъектов, страдающих от глаукомы, несколько антигенов, например альбумин или транстиретин, демонстрируют статистически значимые различия между паттернами иммунореактивности обеих жидкостей организма. По сравнению с образцами сыворотки крови транстиретин демонстрировал более высокую реактивность аутоантител во внутриглазной жидкости пациентов POAG. Этот результат является очень интересным с учетом того, что более высокие количества самого транстиретина могут быть обнаружены во внутриглазной жидкости пациентов POAG. В целом, более чем 80% реактивностей антиген-антитело выявляются, как сравнимые в обеих жидкостях, у здоровых субъектов и у пациентов POAG. Это результат указывает на то, что иммунореактивности в глазной жидкости, такой как внутриглазная жидкость, которая находится в близком контакте с сетчаткой - местом патогенеза глаукомы - не сильно отличается от системных иммунореактивностей в сыворотке крови с точки зрения антител. Таким образом, это наблюдение подчеркивает специфичность обнаруженных изменений в паттернах антител сыворотки крови пациентов, страдающих от глаукомы, и может быть важным также для других заболеваний глаз.
Подробное описание и примеры, касающиеся второго способа диагностики глаукомы:
В соответствии с предпочтительными воплощениями второго способа обнаружения глаукомы на стадии (а) берут культуру нейроретинальной линии клеток R28 или линии клеток-предшественников клеток сетчатки RGC 5 и на стадии (б) клетки обрабатывают при нормальном или увеличенном давлении 15000 Паскаль (Па) сывороткой крови контрольных индивидов и пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (POAG), нормотензивной глаукомой (NTG) и глазной гипертензией (ОНТ). Пациенты с глазной гипертензией (ОНТ) имеют внутриглазное давление, которое выше чем нормальное в отсутствие симптомов глаукомы, таких как повреждение оптического нерва или утрата поля зрения.
В примерах использовали следующие материалы и способы. Тем не менее, изобретение не ограничивается комбинациями материалов и способов, описанными ниже, и способы, описанные ниже, могут быть заменены на альтернативные способы, используемые для соответствующих задач.
2
2
Культура клеток: использовали нейроретинальную клеточную линию R28 [получена у G М. Seigel; Ross Eye Institute, University of Buffalo], Представляет собой нейроретинальную клеточную линию, полученную на шестые сутки после родов у крыс Sprague-Dawley, и иммортализованную 12S фрагментом гена Е1А. Клеточная линия демонстрирует особенности, относящиеся к клеткам-предшественникам сетчатки глаза, таким как ганглиозные клетки сетчатки, фоторецепторные клетки, клетки Мюллера, а также глиальные клетки [Seigel, G.M., A.L. Mutchler, and E.L. Imperato, Expression of glial markers in a retinal precursor cell line. Mol Vis, 1996. 2: p. 2], Культуры поддерживали в модифицированной Дулбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS; Cambrex Bioscience, Verviers, Belgien), 5 мг/мл раствора гентамицин-глутамин (Sigma-Aldrich - GmbH, Steinheim), 10% витамины MEM (100x (Invitrogen)) и 10% не незаменимые аминокислоты (100х (Invitrogen)). Клетки пересевали каждые 4-5 суток с неферментным раствором для клеточной диссоциации (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim) и выращивали в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СО, при 37°С. Клеточная линия предшественников клеток сетчатки глаза RGC 5 [полученная у N. Agarwal, UNT Health Science Center, Fort Worth] представляет собой линию клеток сетчатки, также иммортализованную 12S фрагментом гена Е1А для нейрональных клеток, а также клетками сетчатки [Krishnamoorthy, R. R., P. Agarwal, et al. (2001). "Characterization of a transformed rat retinal ganglion cell line." Brain Res Mol Brain Res 86(1-2): 1-12.; Van Bergen, N. J., J. P. Wood, et al. (2009). "Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line." Invest Ophthalmol Vis Sci 50(9): 4267-4272.]. Культуры поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ глутамина, и выращивали в увлажненной атмосфере при 37°С с 5% CO. Среду меняли через сутки и клетки пересаживали каждые 4-5 суток с нефрементным раствором для разделения клеток.
Приготовление клеточных лизатов: В некоторых экспериментах среду выливали через 48 часов и клетки, растущие на дне 5 мл экспериментального планшета дважды промывали 5 мл физиологического раствора, забуференного фосфатом (PBS; Invitrogen). 100 мкл лизирующего буфера (Мочевина 9,5М, Chaps 2%, DTT 1%) с добавленной смесью ингибитора протеиназы (Р 1860 (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim)) в пропорции 400:1 пипетировали на клетки. Затем клетки соскребали с планшета и переносили в охлажденные на льду пробирки Eppendorf. Клетки затем лизировали при помощи генератора ультразвуковых импульсов (LabsonicM (Sartorius, Gottingen)) с амплитудой 80% и частотой/цикл 0,5 для времен 3×25. После двойного отмывания клеток в 24-луночных планшетах по 150 мкл PBS, добавляли 60 мкл буфера Seldi с дополнительной смесью ингибитора протеиназы. Клетки вновь соскребали со дна лунки и лизировали, как указано выше. Клетки помещали на лед после каждого цикл лизиса при помощи генератора сверхзвуковых импульсов. Концентрацию белка в клеточных лизатах из 5 мл экспериментальных планшетов затем измеряли с использованием способа Лоури [Lowry, О.Н., et al., Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 1951. 193(1): p. 265-75].
В дополнительных экспериментах среду сливали и клетки промывали теплым не содержащим кальций PBS. Клетки затем отделяли от планшета с культурой клеток с использованием неферментного раствора для разделения клеток. Отделенные клетки центрифугировали при 300 g в течение 10 минут при 4°С. Супернатант удаляли, и клеточный осадок промывали PBS. Клетки снова центрифугировали, супернатант удаляли, и клетки замораживали при -80°С. После замораживания клеткам позволяй оттаивать, и добавляли лизирующий буфер с 0,1% додецил D-β-мальтозидом и ингибитором протеиназы. Клеточный лизис увеличивали путем переноса клеток с лизирующим буфером в охлажденную на льду ванну для ультразвуковой обработки на 1 минуту. Концентрацию белка также измеряли с использованием метода Лоури.
Приготовление тотального белка из клеточных лизатов: Для измерения белковых профилей клеток эквивалент 150 мкг белка отбирали из приготовленных выше клеточных лизатов, и белки осаждали с ацетоном путем добавления 8-кратного объема ацетона при -80°С к образцу, и инкубирования на льду в течение 30 минут. Образцы затем центрифугировали при 14000 об/мин при 4°С в течение 30 минут. Ацетон затем сливали, и PBS добавляли к белковому осадку, оставляя конечную концентрацию белков 8 мкг/мкл. Для растворения белков в PBS пробирку помещали в ледяную ультразвуковую ванну на 30 минут.2 мкл образца затем наносили в виде пятен на белковые матрицы для Seldi-Tof-MS.
Анализ пептидных фрагментов при помощи орбитрэп: Эквивалент 60 мкг белка отбирали из клеточных лизатов, приготовленных в соответствии со способом с использованием додецил-D-β-мальтозида, и отделяли при помощи гель-электрофореза с 12% Bis-Tris (Invitrogen). Полосы разделяли на 16 частей равного размера, и белки в этих частях переваривали трипсином. После расщепления белки экстрагировали из геля, и белки из каждой части дополнительно фракционировали на восемь различных фракций с использованием наконечников для пипеток С 18 ZipTip.В ZipTip загружали образцы и пептиды, затем высвобождали из наконечников с использованием градиента ацетонитрила от 10% до 50%. Фракции затем наносили на подложку для орбитрэп и покрывали синапиновой кислотой в качестве матрицы. Пептиды измеряли при помощи орбитрэп в соответствии с протоколами производителя. Информацию, например, о массе пептидов, полученную путем измерения пептидов при помощи орбитрэп, пересылали в несколько баз данных и сравнивали с известными пептидными фрагментами белков, зарегистрированными в базе данных. Получали список измеренных белков. Получали и сравнивали интенсивность измеренных белков в различных экспериментальных группах.
2
Анализ общего количества клеточных белков при помощи Seldi-Tof-масс-спектрометрии: Для анализа белковых профилей использовали времяпролетный масс-спектрометр с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией с PBS-II SELDI-TOF (имеющиеся в продаже, например у BioRad Hercules, СА, USA или Ciperhgen Biosystems Inc Fremont). Этот масс-спектрометр использует белковые мастрицы с различными химическими поверхностями. Каждый образец наносили на несколько восьмипятновых матриц с каким-либо слабым катионообменником (СМ 10) или обращенно-фазной поверхностью (Н50) [после их обработки в соответствии с протоколом производителя]. После высушивания образца 1 мкл синапиновой кислоты в качестве матрицы, представляющей собой молекулу, поглощающую энергию (20 мг синапиновой кислоты, 750 мкл CAN(ацетонитрила), 750 мкл HO-HPLC, 15 мкл TFA (трифторуксусной кислоты, trifluoroacetic acid) пипетировали на каждое пятно дважды, во всех случаях давая возможность кристаллизоваться. Образцы затем анализировали с использованием PBS-IIc ридера для белковых чипов с автозагрузчиком белковых чипов, способного анализировать 24 чипа одновременно с использованием программного обеспечения Protein Chip Software Версия 3.2. Образцы измеряли при интенсивности лазера до 200, установке дефлектора 2800 Да, чувствительности детектора 9 и диапазоне обнаружения молекулярных масс 3000-200000 Да, оптимизированном на 3000-15000 Да.
Обнаружение пиков белковых профилей, измеренных при помощи Seldi-Tof-MS: измеренные белковые профили затем направляли в программное обеспечение Ciphergen Express Data Manager Software version 3.0 значимыми/достаточно мощными, то сеть имеет возможность учиться различать экспериментальные группы и способна распределить/ассоциировать новые образцы с соответствующей группой.
2
2
2
2
4
3
4
3
2
Идентификация белков: для идентификации белковых биомаркеров, измеренных при помощи MS Seldi-Tof, использовали Maldi-Tof-Tof MS. Белки в клеточных лизатах отделяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с использованием эквивалента 200 мкг белка для каждого анализа после их приготовления путем осаждения ацетоном. Оставшийся осадок растворяли в 5 мкл 4х буфера для образцов NuPageLDS (Invitrogen), разбавленном 15 мкл Н20. После денатурации белков при 90°С в течение 5 минут их разделяли на 12% Bis-Tris геле (Invitrogen) с использованием 20х буфера для анализа SDS NuPageMES Invitrogen. После анализа гели инкубировали с фиксирующим раствором (40 мл HO, 50 мл метанола, 10 мл уксусной кислоты) в течение десяти минут, а затем с окрашивающим раствором (набор Colloidal Blue staining, Invitrogen) (55 мл HO, 20 мл метанола, 20 мл красителя А, 5 мл красителя (В) в соответствии с протоколом производителя в течение ночи. Белки в полосах геля, содержащие биомаркеры, элюировали в соответствии со следующим протоколом: 2х 1-мм части полос вырезали из геля и переносили в 100 мкл промывающего раствора (50% метанол, 40% HO, 10% уксусная кислота) и инкубировали в течение 30 минут при энергичном встряхивании, затем дегидратировали со 100% ACN в течение 20 минут. Затем 50 мкл элюирующего раствора (50% муравьиная кислота, 25% ACN, 15% изопропанол, 10% HO) добавляли к высушенным кусочкам геля и инкубировали в течение 4 часов. Образец 2 мкл измеряли при помощи Seldi-Tof MS для демонстрации элюированных белков. После демонстрации белков при помощи Seldi-MS осуществляли расщепление. Оставшуюся часть полосы нарезали на небольшие кусочки и 50 мкл ACN добавляли в течение 15 минут.После кратковременного центрифугирования и удаления ACN кусочки геля сушили с использованием сушилки speed-Vac в течение 10 минут и покрывали 50 мкл трипсинового буфера (50 мМ NHHCO, 14,8 нг/мкл трипсина) и оставляли при 37°С в течение приблизительно 12 ч. 20 мкл 25 мМ NHHCO добавляли к расщепленным белкам и затем расщепленные белки экстрагировали путем инкубации в течение 30 минут с 20 мкл экстрагирующего раствора (5% муравьиная кислота; 50% ACN; 45% HO). С использованием двухслойного способа 1 мкл расщепленных белков наносили на подложку для MALDI с использованием 2×0,5 мкл матрицы на основе коричной кислоты. Фракционированные белки измеряли при помощи Maldi-TofTof MS (Bruker Ultra Flex II) в соответствии с протоколом производителя.
2
2
Набор в примерах 1-4 диагностического теста для глаукомы в соответствии с одним из предпочтительных воплощений описан в общих чертах на Фиг. 11. Пример 1 осуществляли в экспериментальных планшетах на 5 мл (nunclon Surface) в соответствии с условиями для культуры клеток, описанными выше. Примеры 2 и 3 осуществляли в 24-луночных планшетах, и условия для культуры клеток слегка адаптировали: клетки высевали на планшеты с конфлюэнтностью приблизительно 40% и обрабатывали средой DMEM, как описано выше, содержащей 10% экспериментальной сыворотки крови, а не PBS. Их затем инкубировали в увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% CO при 37°С при увеличенном давлении 15000 Паскаль (112 мм рт. ст.) или без такового в течение 48 ч. Для достижения увеличенного [гидростатического] давления авторы изобретения использовали специальным образом сконструированную стеклянную барокамеру. Ее помещали в инкубатор при 37°С и прикрепляли к устройству для поставки сжатого воздуха, содержащему 95% синтетический воздух, а также 5% CO (AirLiquide, Ludwigshafen). Клетки в примере 4 выращивали в 10 мл клеточных культуральных планшетах в соответствии с описанными выше условиями для культуры клеток.
Пример А
Пример А осуществляли в 5 мл (nunclon Surface) экспериментальных планшетах. Белковые профили клеток, инкубированных с сывороткой крови здоровых индивидов при нормальном или увеличенном давлении, сравнивали с белковыми профилями клеток, инкубированных с сывороткой крови пациентов, страдающих от POAG. Количество образцов в каждой группе составляло n=8 при использовании четырех различных образцов сыворотки крови. Пациентов классифицировали в соответствии с принципами Европейской ассоциации по глаукоме (The European Glaucoma Society. Terminology and Guidelines for Glaucoma, http://www.eugs.org. 2004).
Дискриминационный анализ продемонстрировал панель из 10 белков, которые подвергаются значимой повышающей или понижающей регуляции в клетках в зависимости от обработки клеток перед анализом белкового профиля: А: обработка сывороткой крови здоровых индивидов под давлением; В: обработка сывороткой крови здоровых индивидов без давления; С: обработка сывороткой крови пациентов POAG под давлением; D: обработка сывороткой крови пациентов POAG без давления. На Фиг. 13 представлены три примера белковых биомаркеров с молекулярными массами 9192, 12390, 12314 Да, каждый из которых демонстрирует значимые различия в некоторых группах. На Фиг. 13. показан биомаркер при 9192 Да (р=0,000058), который подвергается повышающей регуляции в клетках, обработанных сывороткой крови пациентов, страдающих от POAG, под давлением и без такового. Биомаркер в 12390 Дальтон значимо (р=0,000086) подвергается понижающей регуляции только в тех клетках, которые инкубируют с сывороткой крови POAG и с увеличенным давлением 15000 Па, как показано на Фиг. 13. Дискриминационный анализ также выявил биомаркеры, которые значимо (р=0,000000) подвергались понижающей регуляции в тех клетках, которые обрабатывали под давлением независимо от типа сыворотки крови. В качестве примера на Фиг. 13 показан биомаркер в 12314 Дальтон.
На Фиг. 14А показан вклад в различия в белковом профиле со стороны различных обработок А, В, С или D, как описано выше. Дисперсионный анализ рассчитывали с учетом общего влияния со стороны типа сыворотки крови, давления, а также комбинации типа сыворотки крови и давления на белковые профили клеток. На Фиг. 14 показано, что тип сыворотки крови оказывает наибольшее влияние на белковые профили, а именно, 59,1%. Само давление оказывает влияние 11,6% на белковые профили. Таким образом, на экспрессию белков гораздо большее влияние оказывает то, обрабатывали ли клетки сывороткой крови пациентов POAG или сывороткой крови здоровых индивидов, а не то, обрабатывали ли клетки при увеличенном давлении или при давлении окружающей среды, о чем свидетельствуют различия белковых профилей.
Большое влияние типа сыворотки крови может наблюдаться не только для общего белкового профиля, а также при расчете дисперсионного анализа в отношении выбранных биомаркеров. Например, Фиг. 14B демонстрирует анализ различий для биомаркера в 9192 Да: влияние типа сыворотки крови снова является наиболее важным, и может быть показано, что он оказывает значимое действие 55,1%.
Эти результаты примера 1 демонстрируют, что анализ белковых профилей клеток, обработанных сывороткой крови тестируемых индивидов по сравнению с клетками, обработанными сывороткой крови здоровых индивидов (СЕ; Ciphergen Biosystems). Базовое значение вычитали, и пики обнаруживали в соответствии с протоколом производителя.
По обнаруженным пикам строили перечень кластеров пиков для каждых экспериментальных условий. Списки групп экспортировали в программу для статистического анализа (Statistica, ver. 8.0; Statsoft, Tulsa, OK). Программу использовали для многопараметрического дискриминационного анализа, основанного на комбинации множества биомаркерных пиков. Это может показать, какие белковые пики значимо отличаются между индивидуальными экспериментальными группами и могут быть использованы для установления различий между группами. В первом исследовании, сравнивающем клетки, инкубированные с сывороткой POAG, с клетками, инкубированными с сывороткой крови здоровых индивидов, обнаружена биомаркерная панель из 10 белковых масс, которая демонстрировала пики, наиболее способные выявить разлоичия между разными группами.
Сравнение результатов анализа экспрессии белков в клетках, инкубированных с различными образцами сыворотки крови в присутствии или отсутствии увеличенного давления путем статистического анализа: С использованием статистики компоненту дисперсии и смешанную модель ANOVA рассчитывали для определения влияния зависимых переменных (сыворотка крови/барометрическое давление), а также независимых переменных на белковые профили клеток. Вычисление основано на канонических корнях существующей биомаркерной панели. Влияние переменных также вычисляли для каждого белкового биомаркера. Это анализ был также предпринят для расчета влияния антител сыворотки крови на белковые профили. Также вычисляли расстояния Махаланобиса для того, чтобы показать направление, в котором меняются белковые профили после удаления антитела.
С использованием расчетных биомаркеров вычисляли рабочую характеристическую кривую (ROC). Можно зарегистрировать обнаружение сыворотки крови пациентов, страдающих от глаукомы, с чувствительностью 88% и специфичностью 90%. Область под кривой r: 0,92 как показано на Фиг. 17.
В дополнение генерировали нейронную сеть. Она представляет собой статистический инструмент моделирования данных, на который подают информацию о пиках белковых профилей. Если данные являются и/или пациентов POAG, служит чувствительным тестом для диагностики заболевания POAG.
Как описано выше, в предпочтительных вариантах выбраны биомаркеры или антигены, для которых известно, что уровень их экспрессии увеличивается или уменьшается у пациентов, страдающих от глаукомы, по сравнению со здоровыми индивидами, или при других аутоиммунных или нейродегенеративных расстройствах, или во время апоптоза по сравнению с нормальным ростом клеток. Пример такого биомаркера представляет собой гистон Н4: белок с 9192 Дальтон в Примере А (Фиг. 13) был идентифицирован при помощи MALDI TOF TOF MS, как фрагмент белка гистона Н4.
В примере 1 уровень экспрессии гистона Н4 - биомаркера 9192 Дальтон -значимо увеличивался в клетках, инкубированных с сывороткой крови пациентов, страдающих от глаукомы. Этот эффект увеличивался при дополнительной инкубации при увеличенном давлении.
Гистоны Н3 и Н4 относятся к коровым гистонам, которые собираются в нуклеосомные коровые частицы хромосом в эукариотических клетках и также вовлечены в регуляцию генов. Гистоны, особенно Н3 и Н4, могут быть посттрансляционно модифицированы, например, путем ацетилирования или метилирования. Результаты медицинского исследования выявили, что изменения уровня экспрессии, модификации и расположения гистонов ассоциируются также с несколькими другими нейродегенеративными заболеваниями, например с болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона. Интересно, что гистоны не только играют роль в патологическом механизме некоторых нейродегенеративных заболеваний, но также раковые клетки, такие как клетки рака толстой кишки, изменяются за счет изменений в экспрессии и модификации гистонов. С точки зрения физиологической роли гистонов, изменения уровня экспрессии гистонов могут привести к апоптозу. Последнее согласуется с тем фактом, что глаукома сопровождается апоптозом ганглиозных клеток сетчатки. Таким образом, биомаркеры или антигены, известны как ассоциированные с глаукомой - или также в более общем аспекте, которые, известны как ассоциированные с аутоиммунным заболеванием или нейродегенеративным заболеванием или апоптозом - представляют собой кандидаты для анализа экспрессии белков, направленного на выбранные биомаркеры на стадии (с).
Еще одно интересное наблюдение заключается в том, что в течение 48 ч инкубации при увеличенном давлении до 35% клеток, которые инкубировали с сывороткой крови POAG, утрачивали свою жизнеспособность, тогда как только приблизительно 10% клеток, которые инкубировали с сывороткой крови здоровых индивидов, погибали.
Пример В
Пример В осуществляли в 24-луночных планшетах. Белковые профили клеток, инкубированных с сывороткой крови здоровых индивидов, в качестве контроля, сравнивали с белковыми профилями клеток, инкубированных с сывороткой крови пациентов, страдающих от первичной открытоугольной глаукомы (POAG), нормотензивной глаукомы (NTG) и глазной гипертензии (ОНТ).
Белковые профили вновь демонстрируют очень сложный паттерн, на Фиг. 16 показано увеличенное изображение диапазона измеренных белков. Дискриминационный анализ вновь выявил панель значимых биомаркеров. Некоторые из биомаркеров, обнаруженных в первом исследовании с сывороткой крови POAG, вновь могут быть обнаружены в этом эксперименте, демонстрирующем то же самое действие с точки зрения повышающей или понижающей регуляции, как замечено выше. Уровень одного из этих биомаркеров в 9207 Дальтон, который может рассматриваться как эквивалент биомаркера в 9192 Да, обнаруженный в первом эксперименте с использованием только сыворотки крови POAG, был увеличен в клетках, инкубированных с сывороткой крови пациентов, страдающих от глаукомы. Биомаркер может быть обнаружен на Фиг. 16b. Как показано в предыдущих примерах, биомаркер подвергается повышающей регуляции в клетках, инкубированных с сывороткой крови пациентов, страдающих от глаукомы.
Пример В позволяет получить еще один интересный результат: Клетки, обработанные образцами сыворотки крови пациентов, страдающих от ОНТ, имеют очень похожие профили экспрессии белков для полных белковых профилей, а также для выбранных биомаркеров как клеток, обработанных образцами сыворотки крови здоровых индивидов. Это результат согласуется с клиническим наблюдением, что только у приблизительно 1% людей с увеличенным внутриглазным давлением развивается глаукома, и преимущество способа по изобретению заключается в том, что этот способ может идентифицировать людей с глазной гипертензией, у которых развивается глаукома. Пример С
Пример С осуществляли в 24-луночных планшетах. Белковые профили клеток, инкубированных с сывороткой крови здоровых пациентов, в качестве контроля сравнивали с белковыми профилями клеток, инкубированных с сывороткой крови пациентов, страдающих от POAG, как содержащих антитела, так и после удаления антител из сыворотки крови. Антитела удаляли с использованием магнитных шариков с белком G (DynabeadsProtein G; Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway), которые покрывают аффинной матрицей для иммуноглобулинов. 20 мкл гранул использовали для очистки 35 мкл сыворотки крови. Для использования гранул их дважды промывали 600 мкл NaAc, рН 5, в течение 2 минут и однократно в течение 5 минут.Гранулы затем могут быть добавлены к сыворотке крови и инкубированы при 12°С на орбитальном шейкере в течение 6 часов.
Дисперсионный анализ для изменений белковых профилей в клетках, обработанных сывороткой крови пациентов POAG и сывороткой крови пациентов POAG, из которой антитела удалены, как описано выше, в сравнении с белковыми профилями из клеток, обработанных сывороткой крови здоровых индивидов, представлен на Фиг. 15. Влияние антител на белковые профили составляло 50,5%. Вычисление расстояний Махаланобиса выявило, что белковые профили этих клеток, инкубированных с сывороткой крови POAG, после удаления антитела значительно изменились в направлении профилей клеток, инкубированных с сывороткой крови здоровых индивидов: белковые профили клеток, инкубированных с сывороткой крови POAG, в большей степени отличаются от белковых профилей, инкубированных с сывороткой крови здоровых индивидов, о чем свидетельствует расстояние Махаланобиса приблизительно 55. Белковые профили клеток, инкубированных с сывороткой крови POAG, из которой удалены антитела (POAG - антитела), отличаются от белковых профилей, инкубированных с сывороткой крови здоровых субъектов, в меньшей степени, о чем свидетельствует расстояние Махаланобиса приблизительно 20.
Эти результаты согласуются с данными, полученными в первом способе диагностики глаукомы, основанном на различии в аутоиммунной реактивности в жидкостях организма, происходящих из пациентов, страдающих от глаукомы, по сравнению со здоровыми контрольными индивидами. Пример D:
Пример D осуществляли в чашках для клеточных культур объемом 10 мл с использованием клеток RGC 5, которые инкубируют с POAG или сывороткой крови здоровых индивидов в течение периода 24 часов. Белковый или пептидный паттерн определяли при помощи орбитрэп.Клеточные лизаты были также очень сложными, и в пилотном исследовании при помощи орбитрэп обнаружили свыше 150 белков. После анализа различий в интенсивности белков, измеренных при помощи орбитрэп, авторы изобретения смогли обнаружить значимые различия между экспериментальными группами. Авторам изобретения удалось обнаружить белки, которые подвергаются значимой повышающей регуляции в тех клетках, которые инкубировали с сывороткой крови здоровых индивидов, например белком теплового шока 60, филамином В или бета-актином, а также белки, которые подвергаются повышающей регуляции в клетках, инкубированных с сывороткой крови POAG, например фактором элонгации 1 альфа, субъединицей альфа В белка 1 Т-комплекса, фосфоглицераткиназой 1.
Примеры, касающееся терапевтических применений антител против глаукомы:
Пример i:
Клетки RGC5 высевали в 24-луночные планшеты в количестве 45000 клеток на лунку. Клетки затем преинкубировали с различными концентрациями антитела 14-3-3 (ингибитор протеинкиназы С) в течение 3 ч, которое, как известно, обладает диагностическим потенциалом (антитело из группы 1) в отношении глаукомы. Для того, чтобы вызвать клеточный стресс и клеточную смерть, клетки RGC5 инкубируют с 1,5 мкМ стауроспорином. Спустя 5 ч жизнеспособность клеток измеряли с использованием кристаллического фиолетового. Авторам изобретения удалось обнаружить значимое, а также высоко значимое увеличение жизнеспособности подвергнутых стрессу клеток при инкубации с различными концентрациями антитела 14-3-3. Значимое увеличение жизнеспособности (р<0,05) на 7,4% может быть обнаружено для клеток, инкубированных с 1 мкг/мл антитела 14-3-3. Высоко значимое увеличение жизнеспособности (р<0,01) на 11,6% обнаружено в клетках, инкубированных с 0,5 мкг/мл антитела 14-3-3 (Фиг. 18).
Пример ii:
2
2
Клетки RGC5 высевали в 24-луночные планшеты в количестве 45000 клеток на лунку. Клетки затем преинкубировали в течение 3 ч с различными концентрациями антитела против γ-синуклеина, которое, как известно, обладает диагностическим потенциалом (антитело Группы 1) в отношении глаукомы. Для того чтобы вызвать клеточный стресс и клеточную гибель, клетки RGC5 инкубировали с 50 мкМ НО. Через 1 ч жизнеспособность клеток измеряли с использованием кристаллического фиолетового. Авторам изобретения удалось обнаружить значимое, а также высокозначимое увеличение жизнеспособности клеток, подвергнувшихся стрессу, при инкубации с различными концентрациями антитела против у- синуклеина. Значимое увеличение жизнеспособности (р<0,05) до 15,3% может быть обнаружено для клеток, инкубированных с различными концентрациями (0,05; 0,5; 1 и 5 мкг/мл) антитела против γ-синуклеина. Высокозначимое увеличение жизнеспособности (р<0,01) на 13,2% обнаружено для клеток, инкубированных с 1 мкг/мл антитела против γ-синуклеина (Фиг. 19).
Пример iii:
2
2
Клетки RGC5 высевали в 24-луночные планшеты в количестве 45000 клеток на лунку. Клетки затем преинкубировали с различными концентрациями антитела против GFAP в течение 3 ч, которое, как известно, обладает диагностическим потенциалом (антитело Группы 1) в отношении глаукомы. Для того, чтобы вызвать клеточный стресс и клеточную смерть, клетки RGC5 инкубировали с 50 мкМ HO. Спустя 1 ч жизнеспособность клеток измеряли с использованием кристаллического фиолетового. Авторам изобретения удалось обнаружить значимое увеличение жизнеспособности подвергнутых стрессу клеток при инкубации с различными концентрациями антитела против GFAP. Значимое увеличение жизнеспособности (р<0,05) до 9,8% может быть обнаружено для клеток, инкубированных с различными концентрациями (0,1; 0,5 и 1 мкг/мл) антитела против GFAP (Фиг. 20).