Индукция васкулогенеза в сфероидах из стромальных клеток пупочного канатика

УДК 612.646

ИНДУКЦИЯ ВАСКУЛОГЕНЕЗА В СФЕРОИДАХ ИЗ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОГО КАНАТИКА

А.А. ГОРКУН*, И.Н. САБУРИНА*, Н.В. КОШЕЛЕВА*, А.А. ПУЛИН*,

С.В. КОМИССАРОВА*, В.С. РЕПИН*, Д.В. ИВАНОВ**

В статье представлены разработанные методы получения многоклеточных функциональных модулей (сфероидов) из диссоциированных клеток разных тканей и органов человека и млекопитающих. Получены и изучены сфероиды из стромы жировой ткани мыши и человека, костного мозга и основного вещества пупочного канатика человека. Содержание значительных запасов васкулогенной стромы и незрелых эндотелиальных прогениторных клеток является хорошей моделью для изучения ангио- и васкулогенеза. На модели ишемии нижних конечностей была показана высокая жизнеспособность клеток, входящих в состав сфероидов, и их активное участие в вас-куло- и ангиогенезе в сравнении с клеточной суспензией. Авторами показана возможность индуцированного васкулогенеза в сфероидах, сформированных из диссоциированных стромальных клеток основного вещества пупочного канатика человека (СКПК).

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, стромальные клетки пупочного канатика, 3D-

культивирование, 3D-культура, сфероидогенез, васкулогенез.

Изучение 3D ангио- и васкулогенеза in vitro и in vivo привлекает всеобщее внимание по нескольким причинам: 1) взаимная ориентация эндотелиального и гладкомышечного слоя [10,16]. 2) пусковые эпигенетическое сигналы ангио- и васкуло-генеза 3) упорядоченная интеграция васкуло- и ангиогенеза на базе общих и разных клеточных предшественников.

В нашей лаборатории были разработаны методы получения многоклеточных функциональных модулей (сфероидов) из диссоциированных клеток разных тканей и органов человека и млекопитающих. Получены и изучены сфероиды из стромы жировой ткани мыши и человека [1], костного мозга и основного вещества пупочного канатика человека [4]. Данные ткани человека и млекопитающих содержат значительные запасы васкулогенной стромы и незрелых эндотелиальных прогениторных клеток [11,18,19,20] и поэтому являются хорошей моделью для изучения ангио- и васкулогенеза.

Установлено, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), выделенные из костного мозга или жировой ткани, индуцируют ангиогенез в основном за счет паракринной секреции ангиогенных факторов роста. Однако, ММСК оказывают низкий терапевтический эффект при введении их в ишемическую ткань вследствие плохого выживания клеток, подвергаясь действию гипоксии и воспалительных факторов. Кроме того, культивирование в 2D условиях и сбор клеток с помощью агрессивных протеолитических ферментов нарушают нормальную экспрессию молекул адгезии и, вероятно, препятствуют приживлению ММСК в поврежденных тканях.

В тоже время показано, что клетки в 3D сфероидах вырабатывают устойчивость к гипоксии через регуляторы апоптоза и факторы транскрипции семейства FOXO. На модели ишемии нижних конечностей была показана высокая жизнеспособность клеток, входящих в состав сфероидов, и их активное участие в васкуло- и ангиогенезе в сравнении с клеточной суспензией [7]. Кроме устойчивости к гипоксии, для всех сфероидов (из клеток костного мозга, жировой ткани и пупочной стромы) характерна «ламинация» - формирование внешнего слоя из плотно прилегающих друг к другу эпителиальных клеток. В формирующихся сфероидах наблюдается мезенхимально-эпителиальная (МЭ) конверсия клеток, характерная для раннего эмбриогенеза [3,5,9]. Последующая адгезия эпителио-мезенхимальных (ЭМ) сфероидов к матриксу сопровождается вторичной ЭМ-трансформацией клеток с последующей элиминацией эпителия. По-видимому, ЭМ- сфероиды способны участвовать в регенерации различных тканей за счет повторяющихся циклов ЭМ-МЭ конверсии. Однако способность пластичных ЭМ сфероидов к ангио- и васкулоге-незу in vitro остается плохо изученной. Ранее VEGF-индуцированный васкулогенез с образованием внешнего слоя гладкомышечных клеток наблюдали в сфероидах, полученных методом «висячей капли» из эмбриональной ткани аллантоиса мыши [1] и смешанной культуры эндотелиальных и гладкомышечных клеток вены пупочного канатика человека [14,17]. В настоящей работе мы показали возможность индуцированного

* ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН

** ООО «НИИ НМТ»

васкулогенеза в сфероидах, сформированных из диссоциированных стромальных клеток основного вещества пупочного канатика человека (СКПК).

Материалы и методы исследования. Изолированные пупочные канатики переносили в 100 мм чашки Петри в раствор Хенкса (ПанЭко, Россия) с антибиотиками (ПанЭко, Россия) и тщательно отмывали от сгустков крови с помощью шприца раствором Хенкса (ПанЭко, Россия). Эндотелиальные клетки вены выделяли и культивировали по стандартному протоколу [13]. Изолированные коллагеназой A (Roche, Швейцария) клетки в плотности не менее 10 000 кл./мл высевали в 35 мм чашки, покрытые желатиной (AppliChem, Германия), в полную ростовую среду 199 (Панэко, Россия) с добавлением L-глютамина (2 мМ, ПанЭко, Россия), пенициллина/стрептомицина (1:100, ПанЭко, Россия), HEPES (1,5:100, ПанЭко, Россия), NaHCO3 (1,8:100, Sigma, США), EGF (0,5:100, Prospec, США), FGF (0,6:1000, Prospec, США), гепарина (0,9:1000, Синтез, Россия) и 20% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США) и культивировали в стандартных условиях (5% СО2, 3l0C). Монослой эндотелиальных клеток получали на 10-14 сут. культивирования, пассировали с помощью 0,25% раствора трипсина (ПанЭко, Россия). Забор кондиционированной среды осуществляли каждые 3 сут, начиная с третьего пассажа.

После выделения эндотелиальных клеток оставшуюся ткань пупочного канатика механически измельчали и ферментативно (коллагеназы I и IV типов (ПанЭко, Россия); 5% СО2, 3l°C, 8 часов) дезагрегировали до однородной суспензии. После фильтрации клетки центрифугировали (8 мин., g=100 см2/с) и высевали в высокой плотности (100 000 кл./мл) в среду DМЕМ/F12 (1:1, ПанЭко, Россия) с добавлением глютамина (2 мМ L, ПанЭко, Россия), гентамицина (50 мкг/мл, ПанЭко, Россия), ИТС (1:100) (инсулин, трансферин, селенит, ПанЭко, Россия) и 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США). На l-10 сут культивирования проводили пассирование культуры. Для получения клоногенной культуры стромальных клеток пупочного канатика из гетерогенной первичной культуры клетки после 2-го пассажа пассировали в низкой плотности (3-4 кл./см2). Фенотип полученных клонированных клеток характеризовали с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентных моноклональных антител (Beckman Coulter, США) согласно стандартным требованиям к ММСК [14]. Далее культуру СКПК преддифференцировали а ангиогенном направлении, используя в качестве индуктора кондиционированную среду от эндотелиальных клеток, добавляя ее к полной ростовой среде в соотношении 1:1 в течение 2 пассажей. Затем клетки снимали с подложки с помощью 0,25% раствором трипсина (ПанЭко, Россия) и культивировали в системе «висячая капля» в течение 6-l дней в стандартных условиях (30 000 кл./мл, 5% СО2, 3l°C), используя смесь кондиционированной и полной ростовой среды в соотношении 1:1. Часть полученных клеточных сфероидов фиксировали 4% раствором параформальдегида (Sigma, США), для дальнейшего иммуногистохимическо-го анализа и 1,5% раствором глютарового альдегида (Sigma, США) для изготовления полутонких срезов. Для выявления вас-кулогенеза остальные сфероиды помещали на коллагеновый гель (BD Bioscieces, США) с полной ростовой средой и культивировали в течение l сут. Контролем служили сфероиды ,которые были получены при 2D и 3D культивировании в среде без добавления индукционной (кондиционированной).

Фиксированные в параформальдегиде (Sigma, США) сфероиды замораживали в среде (Leica, Германия) для криотомиро-вания и производили серию срезов толщиной 10 мкм. Срезы помещали на полилизиновые предметные стекла, трижды промывали фосфатно-солевым раствором (рН=7,4, ПанЭко, Россия) и затем проводили иммуноцитохимический анализ на экспрессию следующих маркеров: нестин (Chemicon, Франция), виментин (Sigma, США), CD105 (Abcam, Великобритания), цитокератин 19 (Abcam, Великобритания), коллаген IV (Abcam, Великобритания) и ламинин (Abcam, Великобритания), а также CD31 (Thermo Scientific, США). Окрашивание срезов производили в условиях влажной камеры при комнатной температуре по протоколам, предлагаемыми производителями.

Сфероиды, фиксированные в глютаровом альдегиде, дофик-сировали OsO4 (1% водный раствор, 1-2 часа) (Sigma, США), обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в эпоксидную смолу аралдит (Sigma, США). Полутонкие срезы получали на ультратоме и окрашивали по специальной методике [2].

Результаты и их обсуждение. Первичная клеточная куль-

тура СКПК человека представляла гетерогенную популяцию, состоящую их фибробластоподобных клеток, эндотелиальных и гладкомышечных клеток. После клонирования на 15-16 сут культивирования на чашке формировались плотные колонии из активно пролиферирующих клеток по 8-10 колоний на чашке. Способность клеток к колониеобразованию является одним из критериев мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Иммунофенотипирование отобранной клоногенной клеточной популяции выявило экспрессию CD105+ (99,8%), CD90+ (99,3%), CD29+ (100%) - маркеров, характерных для ММСК, и низкую экспрессию CD14 - 0,l%, CD45 - 1,9%, CD34 - 6,1% - маркеров клеток гемопоэтического ряда.

Через 6-і сут 3D-культивирования диссоциированных СКПК в среде без индукции васкулогенеза в каждой капле формировались плотные сфероиды диаметром 100-150 мкм (рис.1А). Внешний слой сфероидов состоял из нескольких слоев эпителио-подобных клеток, а внутренний слой из отростчатых клеток и элементов экстрацеллюлярного матрикса (рис. 1Б).

Таблица

Иммунофенотипический профиль 2D и 3D культур СКПК

Рис. 1. Сфероиды из диссоциированных стромальных клеток основного вещества пупочного канатика: А - фазово-контрастная световая микроскопия; Б - полутонкий срез (универсальная окраска [15]).

Формирование эпителиоподобного слоя в 3D-сфероидах было подтверждено результатами иммуноцитохимических реакций: экспрессией цитокератина 19, а также компонентов внеклеточного матрикса, характерных для базальных мембран - лами-нина и коллагена IV типа преимущественно в клетках, расположенных в поверхностных слоях сфероидов (рис. 2А, 2Б). Одновременно с этим клетки сфероидов экспрессировали нестин, CD105 и виментин (рис. 2В, 2Г).

Рис. 2. Иммуноцитохимическое окрашивание препаратов сфероидов из диссоциированных СКПК в среде без индукции васкулогенеза, l сут 3D культивирования: А - экспрессия цитокератина 19; Б - экспрессия ламинина; В - экспрессия нестина; Г - экспрессия виментина. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия. А, Б - докраска ядер Hoechst 33258.

Культивирование СКПК в кондиционированной эндотелиальными клетками среде приводило к изменениям как в 2Dкультуре, так и в 3D культуре СКПК. Сравнительный имму-нофенотипический анализ 2D и 3D культур СКПК выявил увеличение количества CD34+-клеток при неизменном количестве клеток, экспрессирующих СD105+, CD90+, CD29+ клеток (табл.).

2D культура СКПК, 3D контрольная культура 3D культура СКПК

Положительная экспрессия

CD105

CD90

CD29

Иммуноцитохимическое окрашивани сфероидов СКПК, сформированных в кондиционированной эндотелиальными клетками среде выявило экспрессия СЭ31 - маркера

эндотелиальной молекулы адгезии тромбоцитов. СЭ31+ клетки, в основном,были сосредоточены на поверхности сформированных сфероидов и небольшое количество наблюдалось во внутренних слоях (рис. 3А).

Рис. 3. Сфероиды из диссоциированных СКПК после индукции васкулогенеза в кондиционированной эндотелиальными клетками среде, l сут 3D культивирования: А - экспрессия CD31, иммуноцитохимическое окрашивание, докраска ядер Hoechst 33258; Б - фазово-контрастная микроскопия, гистологическое окрашивание гематоксилин-эозином.

При гистологическом анализе 3D-культур СКПК во внутренней зоне сфероидов, полученных при культивировании в кондиционированной эндотелиальными клетками среде, были обнаружены сформированные микрополости (microlumen) (рис. 3Б).

После помещения индуцированных сфероидов в коллагеновый гель, на 2 сут наблюдали активное выселение клеток из сфероидов с формированием тубулоподобных структур, количество и длина которых при дальнейшем 3D культивировании увеличивалось. Также наблюдался рост в длину и разветвление сформированных тубулоподобных структур (рис. 4А, 4Б) Формирования подобных структур в сфероидах без индукции васкулогенеза не наблюдалось. (рис. 4В).

Рис. 4. А, Б - сфероиды СКПК в коллагеновом геле после индукции васку-логенеза, образование тубулоподобных структур 2 сут, 5 сут 3D культивирования; В - сфероиды СКПК в коллагеновом геле без индукции васкуло-генеза, l сут 3D культивирования. Фазово-контрастная световая микроскопия

Кроме того, при вторичной адгезии к пластику культуральных чашек Петри сфероидов после индукции васкулогенеза морфология выселяющихся клеток отличалась от морфологии клеток, выселяющихся из сфероидов без индукции. В индуцированных сфероидах клетки формировали длинные цитоплазматические выросты (рис. 5А). В контрольной группе клетки плотно прилегали друг к другу и имели эпителиоподобный фенотип (рис. 5Б).

Рис. 5. Адгезия сфероидов СКПК: А - выселение клеток из сфероида после индукции васкулогенеза; Б - выселение эпителиоподобных клеток из сфероида без индукции васкулогенеза. Фазово-контрастная световая микроскопия

Заключение. Известно, что организация дифференцирующихся эндотелиальных клеток в разветвленную систему сосудов, которая со временем превращается во взрослую сердечнососудистую систему, является конечным результатом серий взаимодействий между клетками и их микроокружением. Это включает, в частности, развитие и экспрессию специфичных молекул, обеспечивающих межклеточную адгезию и адгезию клетка-матрикс. Для понимания молекулярной основы развития сердечно-сосудистой системы в целом, необходимо определение молекул адгезии, вовлеченных в данный процесс. Одним из первых таких специфичных белков был определен Platelet endothelial cell adhesión molecule-1 (PECAM-1, CD31). У разных групп животных - амфибий, птиц, млекопитающих - данный белок выявляется уже на ранних стадиях эмбриогенеза в презумптивных клетках эндотелия [15], сохраняя, в дальнейшем, свою экспрессию на всех клетках эндотелия как in vivo, так и in vitro, что позволяет использовать его как специфичный маркер эндотелия. Также экспрессия CD31 была показана для неэндотелиальных клеток, выделенных из костного мозга человека и мыши и вовлеченных в процесс васкулогенеза [12]. Другим известным маркером является молекула адгезии CD34, экспрессия которой была установлена для клеток-предшественников эндотелия. Показано также, что именно CD34+/CD90+ клетки наиболее активно участвуют в формировании сфероидов, способных в дальнейшем к образованию сосудов в метилцеллюлозе [8]. В кровотоке ишемизированных животных CD31+ клетки были наделены максимальной проангио- и васкулогенной активностью и участвовали в репарации периферических повреждений сосудистой стенки [6].

Увеличение количества клеток, экспрессирующих CD34 -маркер предшественников эндотелиальных клеток, и выявление экспрессии CD31 - раннего маркера васкулогенеза [12,20] позволяет говорить об успешной индукции раннего васкулогенеза в сфероидах из СКПК. Формирование полостей в центральной области сфероидов и капилляроподобных структур в коллагеновом геле наглядно демонстрируют способность клеток индуцированной 3D-культуры к образованию сосудов de novo.

Литература

1. Горкун, А.А.. Получение сфероидов из стромальных клеток подкожной жировой ткани мыши в условиях 3D культивирования / А.А.Горкун, И.М.Зурина, Н.В.Кошелева, И.Н. Сабурина // Мат. III конф.«Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты»; 6-8 июня 2011г.; Москва. Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: Тезисы докладов.- М., 2011: ИБР РАН. С. 32-33.

2. Дубровин, И.П. Универсальный способ окрашивания воспалительных очагов и неповреждённых участков мозга в вибра-томных и полутонких срезах / И.П.Дубровин, С.В.Комиссарова, С.А. Турыгина // Вестник РГМУ.- 2012.- №3.-C.35-38

3. Репин, В.С. Обратимые эпителио-мезенхимальные трансформации клеток в эмбриогенезе и постнатальном обновлении ткани/ В.С. Репин, И.Н. Сабурина //Клеточная трансплантология и тканевая инженерии.- 2006.- №3.- C.64-72.

4. Сабурина, И.Н. Сопоставление поведения стромальных клеток пупочного канатика и мультипотентных стромальных клеток взрослого костного мозга в 2-D и 3-D культуре: моделирование стромальной регенерации / А.А. Сабурина, А.А. Горкун, Н.В. Кошелева, М.Л. Семенова, А.А. Пулин, В.С. Репин //Вестник новых медицинских технологий.- 2009.- Т. 16.- №4.- C.9-11.

5. Сабурина, И.Н. 3D-культивирование: от отдельных клеток к регенерационной ткани (к вопросу о феномене эпителио-мезенхимальной пластичности) / В.С. Сабурина, В.С. Репин //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2009.-№2.- C.75-86.

6. Baudin B., Bruneel A., Bosselut N., Vaubourdolle M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.// Nat Protoc. 2007.Vol.2.№3.P.481^85.

7. Bhang S., Cho S., La W., Lee T., Yang H., Sun A., Baek S., Rhie J., Kim B. Angiogenesis in ischemic tissue produced by spheroid grafting of human adipose-derived stromal cells. //Biomaterials, 2011. Vol.32.№11.P. 2734-2747.

8. De Francesco F., Tirino V., Desiderio V., Ferraro G., DAnd-rea F., Giuliano M., Libondi G., Pirozzi G., De Rosa A., Papaccio G. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries//J.PLoSOne,

2009.Vol.4.№8.P.1-13.

9. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper—Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.//Cytotherapy, 2006.Vol.8.№4.P.315-317.

10. Gentile K., Fleming P.A., Mironov V., Argraves KM., Argraves W.S., Drake CJ. VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids. // Dev. Dyn., 2008. Vol.237. P.2918 -2925

11. Janovski M., Lukomska B., Domanska Janik K. Migratory capabilities of human umbilical cord neural stem cells in vitro. //Acta Neurobiol. Exp. 2011. №71.P.24-35.

12. Kim H., Cho H.J., Kim S.W., et al. CD31+cells represent highly angiogenic and vasculogenic cells in bone marrow: novel role of CD31+non-endothelial cells in neovascularization and their therapeutic effect on ischemic vascular diseas-es.//J.Cirec.Res.,2010.Vol.107.P.602-614.

13. Kim S.W., Kim H., Cho HJ.,et al. Human peripheral blood-derived CD-31+ cells have robust angiogenic and vasculogenic properties and are effective for treatment of ischemic vascular diseas-es.//J.Amer.Coll.Cardiol.,2010.Vol.56.P.593-607.

14. Korff T., Kimmina S., Martiny—Baron G., Augustin H.G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsive-ness.//J.FASEB, 2001 Vol.15.№2.P.447-457.

15. Mickanin C., Trask T., Kirschbaum N.E., Newman PJ., Albelda S.M., Buck C. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1/CD31): alternatively spliced, functionally distinct isoforms expressed during mammalian cardiovascular development. //J.Development, 1994.Vol.120.P.2539-2553.

16. Milde F., Bergdorf M., Koumoutsakis P. A hybrid model of 3D simulation of sprouting angiogenesis. // Biophys. J., 2008.Vol.95.P.3146-3160

17. Nource M.B., Halpin D.E., Scatena M.,et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human ESCs: implications for tissue engineering. //J.Arterioscler.Thromb.Vascular Bi-ol.,2010.Vol.30.№10.P.161-169.

18. Pacini S., Cornicelli V., Trombi L., Montali M, Fazzi R, Lazzarini E, Giannotti S, Petrini M. Constitutive expression of pluri-potency associated genes in mesodermal progenitor cells, .//J. Plo-sOne, 2010,Vol.5.№3.P.9861

19. Palpaut N.J., Metzger J.M. Aestatic cardiology: adipose-derived cells for myocardial repair. //Curr. Stem Res. Ther., 2010. №5. P.145-152.

20. Walls J.R, Coultas L., Rossant J., Henkelman RM. Threedimensional analysis of vascular development in the mouse embryo.//! PlosOne, 2008,Vol.3.№8.P.1-12

21. Zipori D. The stem state: mesenchymal plasticity as a paradigm. //J.Curr.Stem Cell Res. Ther., 2006.Vol.1.№1.P.95-102.

INDUCTION OF VASCULOGENESIS IN THE SPHEROID OF THE STROMAL CELLS OF UMBILICAL CORD

A.A.GORKUN, I.N. SABURINA, N.V.KOSHELEVA, A.A.PULIN, A.S.KOMISSAROVA, V.S.REPIN, D.V.IVANOV

"Institute of General Pathology and Pathophysiology,” RAMS "Research Institute of New Medical Technologies”

The article presents the developed methods for the preparation of multicellular functional modules (spheroids) from dissociated cells of various tissues and organs of humans and mammals. Spheroids were obtained and studied from the stroma of adipose tissue of mouse and human, bone marrow and the main substance of umbilical cord of human. Contents of significant reserves vasculogenic stroma and immature endothelial progenitor cells is a good model for studying angio-and vasculogenesis. In the model of lower limb ischemia has been shown high viability of cells comprising the spheroids, and their active involvement in vasculo-and angiogenesis in comparison with the cell suspension. The authors have shown the possibility of induced vasculogenesis in the spheroid formed from dissociated cells of the stromal of the main substance of human umbilical cord (SCUC).

Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, stromal cells of umbilical cord, 3D-cultivation, 3D-cultures, spheroidogenesis, vasculogenesis.