Временная динамика цитокинов в крови при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите у крыс

ВРЕМЕННАЯ ДИНАМИКА ЦИТОКИНОВ В КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АУТОИММУННОМ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТЕ У КРЫС

Н. В. Позднякова1, В. И. Туробов2, Е. Е. Гаранина3, О. А. Рябая1, Ю. К. Бирюкова4, Н. И. Минкевич2, Е. В. Трубникова5, А. Б. Шевелев6, Т. В. Кузнецова7, А. В. Белякова4, И. П. Удовиченко2,8 и

1 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н. Н. Блохина, Москва

2 Филиал Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Пущино

3 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

4 Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М. П. Чумакова РАН, Москва

5 Курский государственный университет, Курск

6 Институт биохимической физики имени Н. М. Эмануэля РАН, Москва

7 Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН, Москва

8 Пущинский государственный естественнонаучный институт, Пущино

Изучена динамика содержания цитокинов у крыс линии Dark Agouti с индуцированным экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ). В экспериментальную группу включили 11 животных, которым в подушечки задних лап инъецировали гомогенат спинного мозга беспородных крыс, смешанный с неполным адъювантом Фрейнда. В контрольную группу включили 7 животных, которым в подушечки задних лап вводили по 100 мкл физиологического раствора, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда. У животных ежедневно с 1 по 7 сутки отбирали по 500 мкл крови. Был выполнен мультиплексный цитокиновый тест с помощью набора реагентов Bio-Plex Pro Rat Cytokine 24-plex Assay на платформе Bio-Plex. Показано, что в контексте цитокинового профиля модель ЭАЭ у крыс отражает течение рассеянного склероза у человека в части динамики содержания системных лимфопролиферативных и гемо-поэтических факторов: IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-7. В части динамики факторов таксиса лимфоцитов, моноцитов и других клеток иммунной системы изученная модель удовлетворительно имитирует динамику содержания IL-17, RANTES (CCL-5) и MCP-1 (CCL-2), но отличается по динамике GRO/KC (CXCL1). В отношении факторов, влияющих на цитотоксические и апоптотические реакции, сходство модели с заболеванием человека было выявлено по таким ключевым факторам, как IFNy, IL-6 и IL-17, но не по TNFa.

Ключевые слова: рассеянный склероз, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, миелин, иммунизация, мультиплексный цитокиновый тест

Благодарности: авторы благодарят Бориса Шевелева за участие в иммунизации животных.

Финансирование: исследование поддержано Министерством образования и науки Российской Федерации (Соглашение о предоставлении субсидии № 14.607.21.0133 от 27.10.2015, уникальный идентификатор RFMEFI60715X0133).

[23 Для корреспонденции: Удовиченко Игорь Петрович

Пр-т Науки, д. 6, г Пущино, Московская обл., 142290; iudovichenko1@yandex.ru

Статья получена: 15.12.2017 Статья принята к печати: 20.12.2017

TEMPORAL DYNAMICS OF CYTOKINES IN THE BLOOD OF RATS WITH EXPERIMENTALLY INDUCED AUTOIMMUNE ENCEPHALOMYELITIS

Pozdniakova NV1, Turobov VI2, Garanina EE3, Ryabaya OA1, Biryukova YuK4, Minkevich NI2, Trubnikova EV5, Shevelev AB6, Kuznetsova TV7, Belyakova AV4, Udovichenko IP2>8E3

1 Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow, Russia

2 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Pushchino branch

3 Kazan Federal University, Kazan, Russia

4 Chumakov Federal Center for Research and Development of Immunobiological Products, the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

5 Kursk State University, Kursk, Russia

6 Emanuel Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

7 Vavilov Institute of General Genetics of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

8 Pushchino State Institute of Natural Sciences, Pushchino, Russia

In this work we explore the temporal dynamics of cytokines in Dark Agouti rats with experimentally induced autoimmune encephalomyelitis (EAE). The main group consisted of 11 animals who were injected with 100 pl (per leg) of spinal cord homogenate obtained from random-bred rats and combined with incomplete Freund's adjuvant to the hind footpads. The control group included 7 animals who received 100 pl of normal saline mixed with incomplete Freund's adjuvant. Blood samples (500 pl) were collected daily, starting from day 1 through day 7. We ran a Bio-Plex-based multiplex cytokine assay on the samples using the Bio-Plex Pro Rat Cytokine 24-plex Assay kit. EAE in rats was shown to simulate progression of multiple sclerosis in humans in terms of temporal dynamics of lymphoproliferative and hematopoietic factors IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, and IL-7. The studied model satisfactory imitates the dynamics of factors stimulating migration of lymphocytes, monocytes and other immune cells, including IL-17, RANTES (CCL-5) and MCP-1 (CCL-2) but excluding GRO/KC (CXCL1), which shows a different dynamics. The model also resembles patterns of human multiple sclerosis in terms of factors affecting cytotoxic and apoptotic reactions, including IFNy, IL-6 and IL-17, but excluding TNFa.

Keywords: multiple sclerosis, experimental autoimmune encephalomyelitis, myelin, immunization, multiplex cytokine assay

Acknowledgements: the authors thank Boris Shevelev for help in immunization of the animals.

Funding: this work was supported by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (Grant agreement 14.607.21.0133 dated October 27, 2015, ID RFMEFI60715X0133).

gg Correspondence should be addressed: Igor Udovichenko

Pr-t Nauki, d. 6, Puschino, Moscow oblast, Russia, 142290; iudovichenko1@yandex.ru

Received: 15.12.2017 Accepted: 20.12.2017

Рассеянный склероз (РС) представляет собой тяжелое ней-родегенеративное заболевание аутоиммунной природы. Актуальность борьбы с ним обусловлена высокой частотой встречаемости, а также тяжестью течения, приводящей к частичной или полной потере подвижности. Большинство пациентов с РС полностью утрачивают подвижность через 25 лет после появления первых симптомов заболевания. Более половины пациентов с РС через 15 лет после начала болезни могут передвигаться только на костылях. До настоящего времени для лечения этой болезни не предложено эффективного этиотропного средства.

Заболевание возникает, как правило, у достаточно молодых людей: у 70-80 % пациентов первые симптомы РС проявляются в возрасте от 20 до 40 лет [1]. Диагностика РС основана на клиническом осмотре невропатологом, магнитно-резонансном исследовании (МРТ) центральной нервной системы, гистологическом анализе материалов биопсии и аутопсии [2]. Болезнь имеет множество различающихся клинических проявлений, затрагивающих функции спинного и головного мозга, черепных нервов, мозжечка, когнитивные функции. При этом не выработано метода клинической диагностики, позволяющего однозначно оценивать тяжесть заболевания. Результаты МРТ, электроэнцефалографии и биохимического анализа пунктатов спинномозговой жидкости, хотя и являются ценными сведениями о состоянии больного, не всегда могут быть интерпретированы однозначно. Многие частные проявления РС могут быть вызваны не связанными с ним причинами: инфекционными заболеваниями, сосудистыми патологиями, аутоиммунными заболеваниями различной природы [3].

Выделяют четыре формы РС: возвратно-ремиттирую-щую (приступообразную), RRMS — 80-85 % случаев; первичную прогрессирующую, PPMS — 10-15 % случаев; возвратно-прогрессирующую, PRMS — 5 % случаев; вторично-прогрессирующую, SPMS [4, 5]. Около половины пациентов с RRMS приобретают симптомы SPMS через 10 лет после начала заболевания. Свыше 90 % пациентов с RRMS в конечном итоге приобретают симптоматику SPMS [6].

Основным патогностическим признаком РС является демиелинизация оболочек нейронов ЦНС, вызываемая скоплениями на их поверхности Т- и В-лимфоцитов. Для РС также характерно накопление олигоклональных антител в спинномозговой жидкости. Однако ответа на вопрос, где и как происходит первоначальный запуск клональной экспансии лимфоцитов, специфичных к основному белку миелина MBP, протекает ли этот процесс непосредственно в ЦНС при участии миелиновых оболочек или за пределами ЦНС с последующим накоплением в ней аутореактив-ных клеточных компонентов, нет [7].

Разработка средств лечения РС требует использования животных моделей, максимально точно воспроизводящих течение заболевания у человека. В качестве такой модели часто используют экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) у мышей и крыс. Заболевание вызывают введением суспензии миелина или МВР в неполном адъюванте Фрейнда в подушечки лап [8]. В результате паралич задних конечностей инициируется через 1 мес. после иммунизации и длится в течение 4-6 мес. [9]. У крыс линии Dark Agouti (DA) ЭАЭ характеризуется существенно более быстрой динамикой. Паралич конечностей проявляется на 10-11 сутки и заканчивается на 14 сутки. Наиболее значимым отличием ЭАЭ у мышей от РС у человека является полное клиническое излечение иммунизи-

рованных животных, недостижимое на сегодня для пациентов с РС.

В работе [10] приведены данные исследования цитоки-нового профиля у 19 пациентов с РС, в том числе у 16 — с возвратно-ремиттирующей формой, у 1 — c первично-прогрессирующей и у 2 — с вторично-прогрессирующей формой, в зависимости от длительности заболевания: группа 1 — 4,2 ± 0,8 мес. и группа 2 — 76,6 ± 14,3 мес. с момента постановки первичного диагноза. В работе было показано, что на ранней стадии РС в сравнении с поздней стадией и данными для контрольной группы (люди без РС) в структуре цитокинов преобладают интерферон гамма (IFNy) и антивоспалительный лимфокин IL-10. На поздней стадии снижается содержание IL-1RA, IL-8, IL-12(p70), CCL-3, CCL-7, CCL-11, CXCL-10, FGF, IFNa, а значительная представленность характерна для IL-1a, IL-1b, IL-2RA, IL-3, IL-4, IL-7, IL-12(p40), IL-18, CCL-5 (RANTES), CCL-27, HGF, MIF, M-CSF и TRAIL. Особое внимание авторы обратили на повышение содержания в крови больных РС IL-17, известного в качестве ключевого фактора развития псориати-ческих повреждений кожи [11], а также IL-22 — у пациентов с RRMS. При анализе динамики цитокинов в спинномозговой жидкости пациентов авторы [10] пришли к выводу о ключевой роли накопления в ней IFNy и MIF (ключевоого фактора дегенарации суставной сумки при артрозе), а также факторов миграции лимфоцитов, индуцируемых ими: CCL-5 (RANTES), CCL-2 и CCL-27. Для спинномозговой жидкости, но не крови пациентов с РС оказалось характерным накопление проапоптотических факторов TNF-a и TRAIL.

Анализируя эти данные, можно сделать вывод о том, что для РС характерно длительное системное повышение активности факторов гемопоэза, особенно направленных на гранулоцитарный компонент, длительное поддержание TM-ответа, избыток факторов миграции лимфоцитов и моноцитов при отсутствии выраженной провоспалитель-ной реакции в виде факторов, стимулирующих продукцию и таксис нейтрофилов. Результаты исследования [10] важны для понимания динамики содержания различных цитокинов в крови и спинномозговой жидкости пациентов с РС, но в силу ограничений статистических методов значимость выявленных закономерностей остается под вопросом.

С учетом изложенного в рамках работы мы решали две задачи:

1) исследовать краткосрочную динамику цитокинов в модели ЭАЭ у крыс, для которой характерна высокая скорость патологического процесса;

2) сопоставить данные о содержании цитокинов при РС у человека и ЭАЭ у крыс с целью оценить пригодность этой модели для тестирования кандидатных средств для терапии РС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Индукция ЭАЭ у крыс

Эксперименты на лабораторных животных были проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755) и с соблюдением принципов, изложенных в Хельсинкской декларации (2013).

Гомогенат спинного мозга беспородных крыс готовили по методике [12]. Далее использовали крыс линии Dark

Agouti массой 220-250 г. В экспериментальную группу включили 11 животных, которым в день 0 вводили в подушечки каждой из двух задних лап заранее приготовленный гомогенат спинного мозга, смешанный с неполным адъювантом Фрейнда в пропорции 1 : 1, общим объемом 100 мкл в каждую лапу. Животным контрольной группы (n = 7) вводили 100 мкл физиологического раствора, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда также в пропорции 1 : 1. С 1 по 7 сутки (за исключением 6-х суток) эксперимента у крыс ежедневно отбирали по 500 мкл крови из хвостовой вены. Из отобранной крови немедленно готовили сыворотку по следующей методике: кровь помещали в вакуумные пробирки Vacuette Z serum sepclot activator (для сыворотки) и центрифугировали в течение 15-20 мин при 2500 об./мин и температуре +4 °С. Сыворотку (около 100 мкл) переносили в микроцентрифужные пробирки и замораживали при -20 °С. Крыс ежедневно взвешивали и фиксировали в баллах индекс тяжести клинических проявлений ЭАЭ по следующей шкале: 0 — нет симптомов, 1 — снижение тонуса хвоста, 2 — нарушение установочного рефлекса, 3 — частичный паралич, 4 — полный паралич, 5 — животные погибли или умирают. В сомнительных случаях индекс фиксировали с занижением. Явные признаки ЭАЭ у животных контрольной группы фиксировали с 8 по 14 день с начала эксперимента. Пик заболевания длился 2-3 дня и приходился на 11-14 сутки с начала эксперимента.

Мультиплексный цитокиновый тест

Анализ выполнялся на платформе Bio-Plex (Bio-Rad, США) с помощью набора реагентов Bio-Plex Pro Rat Cytokine 24-plex Assay (Bio-Rad), работа которого основана на использовании магнитных частиц с нанесенными моно-клональными антителами к цитокинам крысы, согласно инструкции производителя и в соответствии с ранее опубликованным протоколом [13]. Для анализа использовали аликвоты сыворотки объемом 50 мкл. Среднюю интенсивность флуоресценции каждого образца определяли на приборе Luminex 200 analyzer (Luminex Corporation, США). Для сбора данных использовали программное обеспечение MasterPlex CT и MasterPlex QT analysis software (Hitachi Solutions America, США). Для каждого аналита строили калибровочный график с использованием 7 концентраций, выражая ее в пг/мл сыворотки.

Статистическая обработка данных

Для экспериментальной и контрольной групп для каждого цитокина на каждые сутки эксперимента вычисляли медианное значение содержания для группы и два квартальных значения. После этого проводили сопоставление достоверности различий между группами с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, используя пакет программ Statistica 8.0 для Windows. При p-value > 0,05 различия были недостоверны; также использовали три порога достоверности: первый — < 0,05; второй — < 0,01; третий — < 0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящее время сведений о краткосрочной динамике цитокинов в крови человека и лабораторных животных все еще недостаточно, т. к. мультиплексные тесты дороги, а ежедневный отбор крови у больных и животных сопря-

жен с техническими и этическими трудностями. Анализ динамики содержания цитокинов в контрольной группе показал, что введение неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап само по себе является фактором, вызывающим значительные волнообразные колебания уровня цитокинов в крови, хотя и не приводит к развитию ЭАЭ. Это обстоятельство снижает достоверность оценки влияния гомогената спинного мозга на развитие экспериментального заболевания и требует использования статистических методов анализа динамики содержания цитокинов.

У всех животных экспериментальной группы наблюдали паралич задних конечностей. Восходящая фаза заболевания пришлась на 11-13 сутки, нисходящая — на 12-17 сутки. К 18 суткам симптомы паралича у всех животных полностью исчезали. Таким образом, отбор крови, который производили в 1-7 сутки, осуществляли на стадии, когда внешние проявления ЭАЭ отсутствовали.

Анализ данных (табл. 1 и 2), показал, что в первые сутки эксперимента содержание 13 из 24 анализируемых цитокинов — 11_-1а, 11_-2, 11_-4, 11_-5, 11_-6, 11_-7, 11_-12(р70), 11_-17, 11_-18, С-СБР, !РЫ-у, ЯАМТЕБ (СС1_-5) и МСР-1 (СС1_-2) — в экспериментальной группе было существенно выше, чем в контрольной, (например, до 220 % — для !1_-4) по второму и третьему порогам достоверности (рис. 1). Во вторые сутки ни по одному цитокину достоверных различий не наблюдали. На третьи сутки были выявлены различия для

Таблица 1. Оценка достоверности различий между экспериментальной и контрольной группами животных с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с поправкой Йейста на непрерывность. Результат проверки гипотезы об отсутствии значимых различий между выборками выражен виде критерия Фишера

Цитокин Сутки эксперимента

1 2 3 4 5 7

IL-1a 3 - - - 2 2

IL-1b - - 1 - 2 -

IL-2 2 - - - - 1

IL-4 3 - - - - 2

IL-5 2 - - - - 2

IL-6 3 - - - - 1

IL-7 2 - - - - 2

IL-10 - - - - - 2

IL-12 2 - - - - -

IL-13 - - - - 2 -

IL-17 3 - - - - 2

IL-18 3 - - - - 2

Эритропоэтин EPO - - - - 1 2

G-CSF 3 - - - - -

GM-CSF - - - - - 3

GRO/KC - - - - - -

ifn-y 2 - - - - 1

M-CSF - - - - - -

MIP-3a - - - - - -

RANTES 2 - - - - 2

TNFa - - - - - -

VEGF - - 1 - - -

Лептин - - - - - -

MCP-1 2 - - - - 2

Таблица 2. Описательная статистика изменения содержания цитокинов в экспериментальной и контрольной группах крыс с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом

Цитокин Сутки эксперимента

Параметр 1 2 3 4 5 7

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

IL-1a Среднее 195 387 182 206 268 181 193 144 319 138 203 359

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 87 92 65 61 148 122 113 76 279 75 84 134

025 132 304 133 170 160 68 98 83 182 90 139 218

Медиана 188 347 175 204 218 200 195 155 184 121 184 411

075 288 487 226 264 396 237 274 210 396 187 269 462

IL-1b Среднее 433 401 412 274 1033 493 469 265 819 250 319 571

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 386 382 244 184 427 362 432 157 861 164 180 288

025 251 236 211 148 701 134 119 101 279 151 180 300

Медиана 315 270 399 222 967 441 412 310 607 214 204 536

075 411 367 550 370 1 477 782 553 409 730 307 504 821

IL-2 Среднее 356 607 366 436 367 500 472 414 579 373 744 1092

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 103 138 127 207 209 303 292 180 286 215 245 348

025 278 579 285 319 186 311 213 260 396 205 543 776

Медиана 374 597 345 331 332 432 308 362 557 284 657 1145

075 443 626 463 629 523 608 762 647 668 509 914 1368

IL-4 Среднее 11 36 9 19 9 24 14 18 19 16 41 90

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 6 16 4 19 8 23 12 16 13 15 27 40

025 6 27 5 5 4 4 4 5 9 4 17 57

Медиана 11 30 8 8 6 17 8 12 15 14 33 76

075 17 38 12 37 10 32 29 34 33 23 64 128

IL-5 Среднее 77 128 59 69 56 88 69 74 91 68 136 193

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 25 27 33 51 47 59 62 45 43 49 46 34

025 55 110 26 22 23 26 22 20 43 22 106 174

Медиана 78 123 63 54 30 83 23 67 88 83 130 193

075 97 147 78 121 113 133 144 106 118 106 176 212

IL-6 Среднее 232 503 351 273 468 1595 515 540 600 316 668 1145

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 79 204 226 255 404 3960 572 743 284 269 292 496

025 172 379 169 63 170 96 76 85 414 46 456 640

Медиана 224 444 340 182 349 428 190 240 584 261 521 1240

075 287 463 540 470 758 635 1 132 559 713 556 877 1624

IL-7 Среднее 103 254 68 123 70 178 111 114 125 106 228 612

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 50 96 62 128 83 169 129 115 77 98 146 236

025 58 181 14 16 12 13 11 16 50 10 119 428

Медиана 102 226 63 72 23 144 20 64 109 108 161 724

075 145 350 90 246 159 281 239 224 209 165 391 787

IL-10 Среднее 149 240 105 180 121 215 163 157 208 132 403 634

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 70 80 53 131 93 200 129 99 70 106 160 226

025 91 208 61 57 56 63 56 58 144 44 254 420

Медиана 142 220 101 183 67 149 88 116 214 116 413 557

075 217 280 129 284 237 277 294 272 287 208 550 821

Продолжение табл. 2

11.-12 Среднее 46 125 35 56 43 81 58 54 68 47 155 288

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 29 62 35 61 56 102 68 61 50 59 98 143

025 16 88 5 6 5 6 6 6 15 4 81 173

Медиана 49 99 32 23 10 53 12 29 59 26 125 277

075 74 133 46 123 98 118 135 70 104 81 212 425

11.-13 Среднее 31 32 15 16 20 22 22 13 19 13 33 61

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 28 31 8 15 8 20 26 11 6 8 21 37

025 18 16 9 6 13 9 7 6 15 6 19 29

Медиана 21 20 14 9 20 13 13 9 18 11 23 44

075 28 37 22 20 23 28 26 15 22 17 58 95

11.-17 Среднее 24 55 17 25 19 36 26 27 36 25 67 119

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 12 20 15 28 24 36 32 23 22 24 38 43

025 12 43 3 3 3 3 3 4 16 3 38 84

Медиана 24 49 16 15 4 34 5 21 35 28 62 108

075 37 56 24 44 50 52 52 42 58 45 102 168

11-18 Среднее 1110 2360 909 1480 976 2004 1351 1829 1628 1562 2476 4182

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 340 822 345 828 600 1513 895 1390 455 1557 774 1495

025 846 1671 623 707 591 582 615 779 1494 426 1663 3219

Медиана 1009 2167 877 1444 609 1677 1064 1157 1616 1152 2334 3808

075 1462 2766 1094 2243 1701 3435 2055 2367 1831 2632 3217 4100

Эритропоэ-тин ЕРО Среднее 202 263 186 242 197 310 238 246 281 175 342 745

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 68 60 77 141 62 240 71 95 86 91 117 345

025 154 235 127 110 158 127 173 153 209 107 249 504

Медиана 175 258 179 219 202 272 209 223 247 166 360 585

075 235 287 225 346 241 352 300 346 373 197 415 1060

О-СБР Среднее 3 6 3 4 3 6 4 4 5 4 9 15

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 1 3 1 3 2 6 3 2 1 2 6 9

025 3 4 2 2 2 2 2 2 3 2 4 8

Медиана 3 6 3 3 2 4 2 3 4 3 6 12

075 4 7 3 6 5 8 6 5 6 5 14 24

ЭМ-СБР Среднее 5 7 5 5 6 9 8 5 6 4 8 2

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 3 3 3 3 4 10 6 2 4 2 2 1

025 2 6 3 2 3 4 4 3 2 2 7 1

Медиана 5 7 6 5 6 9 9 5 5 5 8 2

075 6 10 8 8 9 10 10 7 11 5 10 3

ЭТО/КС Среднее 161 237 156 165 217 153 201 90 153 116 163 178

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 93 104 79 65 134 97 115 31 128 43 62 57

025 72 124 101 135 75 64 84 62 82 74 103 153

Медиана 142 267 140 157 239 133 198 96 90 119 155 170

075 270 331 191 189 341 272 299 116 324 145 184 222

1РЫу Среднее 36 79 30 42 32 63 61 45 53 40 107 215

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 14 46 13 40 23 77 62 41 19 35 45 122

025 27 52 20 14 17 14 17 15 36 12 65 87

Медиана 30 64 27 20 20 43 24 28 52 27 98 206

075 46 74 41 60 56 64 95 66 76 69 148 290

Продолжение табл. 2

M-CSF Среднее 132 174 92 89 91 121 100 79 93 104 113 164

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 42 44 46 38 70 83 116 49 54 60 55 74

Q25 99 143 64 55 32 53 32 33 39 41 52 110

Медиана 124 159 80 88 71 106 40 69 69 105 141 149

Q75 175 205 122 111 174 183 164 121 147 164 165 234

MIP-3a Среднее 70 88 55 49 45 88 69 64 76 45 88 128

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 19 38 44 40 44 95 80 59 45 40 36 44

Q25 52 47 19 13 12 21 14 13 25 11 65 107

Медиана 76 94 41 31 21 53 19 51 91 34 83 139

Q75 86 122 85 83 99 134 161 83 122 90 102 171

RANTES Среднее 685 1070 342 470 295 696 364 505 574 456 757 1311

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 230 247 277 422 306 541 403 381 208 389 147 388

Q25 545 966 80 73 108 60 37 51 437 39 726 814

Медиана 665 1052 334 387 139 679 57 545 634 660 758 1495

Q75 805 1129 558 855 481 1212 821 777 687 735 846 1580

TNFa Среднее 58 39 25 30 29 33 30 28 33 27 54 82

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 26 10 15 18 18 19 20 14 11 19 26 42

Q25 42 29 17 16 16 16 17 16 21 14 32 51

Медиана 57 39 19 21 19 27 23 25 36 24 57 72

Q75 72 49 26 47 46 44 49 34 39 29 82 106

VEGF Среднее 130 87 88 55 128 73 107 46 133 65 92 110

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 110 90 57 79 73 80 78 24 149 49 44 50

Q25 41 52 42 20 53 37 54 32 33 29 57 57

Медиана 119 60 88 35 129 44 78 36 97 46 84 100

Q75 132 74 128 44 178 84 185 58 136 89 146 139

Лептин Среднее 158 217 59 131 121 264 129 90 231 213 239 460

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 161 240 77 184 163 255 202 167 219 199 237 358

Q25 10 1 20 11 11 16 3 4 12 17 0 20

Медиана 150 137 24 27 21 312 21 20 246 286 324 620

Q75 301 437 83 273 304 482 375 30 447 419 404 745

MCP-1 Среднее 1979 2662 2277 2317 2428 3097 2071 2468 2117 2254 1910 3300

N 6 10 8 12 6 11 7 11 7 11 7 11

Ст. откл. 413 365 949 754 576 1120 830 1141 830 623 557 879

Q25 1592 2353 1606 1729 2130 2126 1501 1575 1651 1889 1340 2986

Медиана 2102 2606 2155 2063 2428 3108 1849 2192 2012 2448 1946 3411

Q75 2317 2864 2909 3047 2904 3762 2369 3021 2189 2750 2405 3846

IL-1b и VEGF (< 0,05), но на четвертые сутки вновь ни для одного цитокина достоверных различий не было. На пятые сутки эксперимента в экспериментальной группе достоверно снизилось содержание IL-1a, IL-1b, IL-13 и эритро-поэтина (рис. 2).

На седьмые сутки различия между группами были выявлены по 14 цитокинам из 24 исследованных. Это были практически все те же цитокины, различия по которым наблюдали в первые сутки эксперимента, с тем отличием что были зафиксированы статистически значимые изменения по IL-10 и эритропоэтину GM-CSF и не были зафиксированы — по IL-12(p70) и G-CSF (рис. 3). Необходимо отметить, что содержание 13 из 14 цитокинов в экспери-

ментальной группе оказалось выше, чем в контрольной. Исключение составил только GM-CSF, содержание которого снизилось с 8,17 пг/мл до 2,00 пг/мл.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Резкий рост содержания различных цитокинов в первые сутки эксперимента с последующим падением во вторые сутки следует интерпретировать как острый клонально-неспецифичный ответ на появление избытка миелина вне ЦНС. Вероятно, реакция на миелин в виде одновременного выброса нескольких лимфопролиферативных факторов стимулируется гиперпродукцией IL-1b, источником

300

250 -

200

150 -

100

Контроль Ц Опыт

50

CC_QC\l^riOCOr~OC\IC0r--C001J-1J-O raLL CCCßCCLL Ст-

t щи 1 СС f

Î

Рис. 1. Изменение содержания цитокинов в сыворотке крови крыс экспериментальной группы по сравнению с крысами контрольной группы через 1 сутки после иммунизации. Содержание цитокинов в крови животных контрольной группы были приняты за 100 %. Достоверные различия показаны стрелками

120

100 -

80

60 -

40

20 -

112

43

31

64

87

75

85

53

70

64

68

96

69

81

62

2456

т г

О '

70

76

I I

т г

о ^

о ее а

76

59

80

84

п г

' от

49

Т Г

LL

а

106

92

I Контроль I Опыт

Рис. 2. Изменение содержания цитокинов в сыворотке крови крыс экспериментальной группы по сравнению с крысами контрольной группы через 5 суток после иммунизации. Содержание цитокинов в крови животных контрольной группы были приняты за 100 %. Достоверные различия показаны стрелками

которого являются макрофаги, дендритные клетки или фибробласты кожи.

Рост уровня продукции цитокинов на пятые и особенно седьмые сутки эксперимента, скорее всего, можно объяснить накоплением в организме животных клонально-спе-цифичных лимфоцитов различных типов, среди которых могут быть лимфоциты с аутологичной реактивностью в отношении миелина. Для системной клональной экспансии Т-лимфоцитов характерна именно такая длительность реакции, после чего возникают внешние проявления физиологической реакции.

Наиболее значимые в абсолютном выражении различия между экспериментальной и контрольной группами на седьмые сутки эксперимента были выявлены для IL-18 — 2475,85/4182,05 пг/мл, RANTES — 756,78/1310,78 пг/мл,

MCP-1 (CCL-2) — 1909,68/3300,50 пг/мл и IL-2 — 743,52/1091,57 пг/мл. С учетом того, что для IL-2 доказана способность индуцировать продукцию многих других ростовых и гемопоэтических факторов [14], можно предположить, что именно этот лимфокин является индуктором таких неспецифических для иммунной системы факторов, как VEGF и эритропоэтин, а также IL-13, всплеск продукции которых запаздывал по фазе относительно IL-2. С учетом длительной персистенции высоких уровней продукции IL-2, по данным [10], характерной для пациентов с РС, можно предположить главную роль этого лимфокина в характерной для РС массовой пролиферации лимфоцитов за пределами ЦНС. Повышение уровня продукции IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и IL-13, также представляющих собой лим-фопролиферативные и гепомоэтические факторы, на

0

0

300 -1

250 -

200 -

150 -

100 -

50 -

268

Контроль H Опыт

221

117 179

147

171

142

218

186 185

157

179

169

201

169

109

25

193

173

145 146

150

120

173

- - 1

î T

î î î

T =d =d =d =d =d 1 î î î

О

CL Ш

î

О го

^ Z

О У=

cc t

rn

СЛ О

<

cc î

о

Ш >

о î

Рис. 3. Изменение содержания цитокинов в сыворотке крови крыс экспериментальной группы по сравнению с крысами контрольной группы через 7 суток после иммунизации. Содержание цитокинов в крови животных контрольной группы были приняты за 100 %. Достоверные различия показаны стрелками

фоне падения уровня продукции ОМ-СЭР, можно рассматривать в качестве каскада, индуцированного при участии 11_-2.

Для ЭАЭ у крыс в отличие от РС у человека не характерна продукция проапоптотических факторов, прежде всего ТЫР-а, несмотря на подъем уровня синтеза его классических индукторов — цитокинов 11_12, 11_-18 и !РЫ-у [14]. Таким образом, рост содержания ТЫР-а при РС следует рассматривать скорее в качестве результата, а не причины поражения миелиновых оболочек. В то же время ТЫР-а может вносить существенный вклад в поражение астроци-тов и нейронов на поздних стадиях развития РС.

В соответствии с описанной в работе [10] закономерностью, наблюдавшиеся нами подъем и спад продукции !РЫ-у и ЯАЫТЕБ (СС1_-5) у крыс с ЭАЭ, происходившие синхронно, следует рассматривать как процессы, характерные и для РС у человека.

На ранней стадии развития ЭАЭ у крыс нами не было выявлено изменение уровня накопления в крови ОЯО/КС (СХС1_1), ответственного за инфильтрацию лимфоцитов в ЦНС, что отличает модель от течения РС у человека (по данным [10]).

Для ЭАЭ у крыс и РС у человека в равной мере характерна гиперпродукция 11_-17, которая может способствовать накоплению специфических лимфоцитов в ЦНС и активации у них цитотоксических функций.

Несмотря на выраженную гиперпродукцию 11_-1Ь, для РС у человека характерно отсутствие участия в патогенетических реакциях нейтрофилов и факторов их таксиса и активации. В случае с моделью наблюдали похожую реакцию системы нейтрофилов. Фактор пролиферации предшественников нейтрофилов М-СЭР не изменял своего содержания в процессе моделирования. То же наблюдали для М!Р-3а (СС1_20) — фактора защиты слизистых от бактериальной инфекции и лептина, отвечающего за повышение температуры при инфекции.

Гиперпродукцию !1_-4 и !1_-10 при ЭАЭ у крыс, особенно на фоне повышенного содержания !1_-5, !1_-13 и ОМ-СЭР, следует рассматривать в качестве фактора, стимулирующего пролиферацию В-лимфоцитов. Теоретически этот

набор факторов может способствовать появлению оли-гоклональных антител, однако такой факт до настоящего времени никем не был описан.

Отвечая на вопрос о локализации очага пролиферации миелин-специфичных лимфоцитов — внутри или вне ЦНС, необходимо отметить, что выбранная модель демонстрирует принципиальную возможность запуска этой реакции вне ЦНС. Однако динамика развития заболевания при ЭАЭ у крыс и РС у человека значительно различается. Нельзя исключать, что при развитии РС у человека первым событием является инфильтрация в ЦНС лимфоцитов, не прошедших клональную экспансию, которые затем подвергаются селекции в условиях избытка миелина. На аномальное поведение лимфоцитов в модели может влиять их первоначальная клонально-неспецифическая гиперпролиферация под действием системного или местного избытка лимфопролиферативных факторов и/или возникновение градиента лимфотактических факторов, исходящего из ЦНС. Альтернативой может быть инициация аномально быстрой деградации миелина в ЦНС, приводящая к массовому выходу продуктов его распада в системную циркуляцию. В этом случае модель является наиболее адекватной ранним стадиям РС у человека.

ВЫВОДЫ

Данные о динамике содержания цитокинов при ЭАЭ у крыс, полученные с помощью мультиплексного цитоки-нового теста, показали, что с точки зрения цитокинового профиля модель соответствует течению рассеянного склероза у человека в части динамики содержания системных лимфопролиферативных и гемопоэтических факторов: IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-7. В отношении факторов таксиса лимфоцитов, моноцитов и других клеток иммунной системы модель удовлетворительно имитирует поведение IL-17, RANTES (CCL-5) и MCP-1 (CCL-2), но отличается по поведению GRO/KC (CXCL1). Применительно к факторам, влияющим на цитотоксические и апоптотические реакции, модель схожа с течением РС у человека по таким ключевым факторам, как IFNy, IL-6 и IL-17, но не по TNFa.

0

Литература

1. Noonan CW, Kathman SJ, White MC. Prevalence estimates for MS in the United States and evidence of an increasing trend for women. Neurology. 2002 Jan 8; 58 (1): 136-8.

2. Lucchinetti C, Brück W, Parisi J, Scheithauer B, Rodriguez M, Lassmann H. Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of demyelination. Ann Neurol. 2000 Jun; 47 (6): 707-17.

3. McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD et al. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Ann Neurol. 2001 Jul; 50 (1): 121-7.

4. Kremenchutzky M, Cottrell D, Rice G, Hader W, Baskerville J, Koopman W et al. The natural history of multiple sclerosis: a geographically based study. 7. Progressive-relapsing and relapsing-progressive multiple sclerosis: are-evaluation. Brain. 1999 Oct; 122 (Pt 10): 1941-50.

5. Confavreux C, Vukusic S, Moreau T, Adeleine P. Relapses and progression of disability in multiple sclerosis. N Engl J Med. 2000 Nov 16; 343 (20): 1430-8. DOI: 10.1056/ NEJM200011163432001.

6. Weinshenker BG, Bass B, Rice GP, Noseworthy J, Carriere W, Baskerville J et al. The natural history of multiple sclerosis: a geographically based study. I. Clinical course and disability. Brain. 1989 Feb; 112 (Pt 1): 133-46.

7. Frischer JM, Bramow S, Dal-Bianco A, Lucchinetti CF, Rauschka H, Schmidbauer M et al. The relation between inflammation and neurodegeneration in multiple sclerosis brains. Brain. 2009 May; 132 (Pt 5): 1175-89. DOI: 10.1093/brain/ awp070.

8. Mensah-Brown EP, Shahin A, Garey LJ, Lukic ML. Neuroglial response after induction of experimental allergic encephalomyelitis insusceptible and resistant rat strains. Cell Immunol. 2005 Feb; 233 (2): 140-7. DOI: 10.1016/j.cellimm.2005.04.023.

9. Contarini G, Giusti P, Skaper SD. Active Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in C57BL/6 Mice. Methods Mol Biol. 2018; 1727: 353-60. DOI: 10.1007/978-1-4939-7571-6_26.

10. Khaibullin T, Ivanova V, Martynova E, Cherepnev G, Khabirov F, Granatov E et al. Elevated Levels of Proinflammatory Cytokines in Cerebrospinal Fluid of Multiple Sclerosis Patients. Front Immunol. 2017 May 18; 8: 531. DOI: 10.3389/fimmu.2017.00531.

11. Albanesi C, Scarponi C, Cavani A, Federici M, Nasorri F, Girolomoni G. Interleukin-17 is produced by both Th1 and Th2 lymphocytes, and modulates interferon-gamma- and interleukin-4-induced activation of human keratinocytes. J Invest Dermatol. 2000; 115(1): 81-7.

12. Beeton C, Garcia A, Chandy KG. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 2007; (5): 224. DOI: 10.3791/224.

13. Повещенко А. Ф., Казаков О. В., Орлов Н. Б., Повещен-ко О. В., Ким И. И., Бондаренко Н. А. и др. Цитокины сыворотки крови как маркеры онкогенеза и эффективности терапии при экспериментальной опухоли молочной железы крыс Wistar. Фундаментальные исследования. 2015. 1 (ч. 8): 1664-70.

14. Hamblin AS. Lymphokines and interleukins. Immunology. 1988; 64 (Suppl 1): 39-41.

References

1. Noonan CW, Kathman SJ, White MC. Prevalence estimates for MS in the United States and evidence of an increasing trend for women. Neurology. 2002 Jan 8; 58 (1): 136-8.

2. Lucchinetti C, Brück W, Parisi J, Scheithauer B, Rodriguez M, Lassmann H. Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of demyelination. Ann Neurol. 2000 Jun; 47 (6): 707-17.

3. McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD et al. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Ann Neurol. 2001 Jul; 50 (1): 121-7.

4. Kremenchutzky M, Cottrell D, Rice G, Hader W, Baskerville J, Koopman W et al. The natural history of multiple sclerosis: a geographically based study. 7. Progressive-relapsing and relapsing-progressive multiple sclerosis: are-evaluation. Brain. 1999 Oct; 122 (Pt 10): 1941-50.

5. Confavreux C, Vukusic S, Moreau T, Adeleine P. Relapses and progression of disability in multiple sclerosis. N Engl J Med. 2000 Nov 16; 343 (20): 1430-8. DOI: 10.1056/ NEJM200011163432001.

6. Weinshenker BG, Bass B, Rice GP, Noseworthy J, Carriere W, Baskerville J et al. The natural history of multiple sclerosis: a geographically based study. I. Clinical course and disability. Brain. 1989 Feb; 112 (Pt 1): 133-46.

7. Frischer JM, Bramow S, Dal-Bianco A, Lucchinetti CF, Rauschka H, Schmidbauer M et al. The relation between inflammation and neurodegeneration in multiple sclerosis brains. Brain. 2009 May; 132 (Pt 5): 1175-89. DOI: 10.1093/brain/ awp070.

8. Mensah-Brown EP, Shahin A, Garey LJ, Lukic ML. Neuroglial response after induction of experimental allergic encephalomyelitis insusceptible and resistant rat strains. Cell Immunol. 2005 Feb; 233 (2): 140-7. DOI: 10.1016/j.cellimm.2005.04.023.

9. Contarini G, Giusti P, Skaper SD. Active Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in C57BL/6 Mice. Methods Mol Biol. 2018; 1727: 353-60. DOI: 10.1007/978-1-4939-7571-6_26.

10. Khaibullin T, Ivanova V, Martynova E, Cherepnev G, Khabirov F, Granatov E et al. Elevated Levels of Proinflammatory Cytokines in Cerebrospinal Fluid of Multiple Sclerosis Patients. Front Immunol. 2017 May 18; 8: 531. DOI: 10.3389/fimmu.2017.00531.

11. Albanesi C, Scarponi C, Cavani A, Federici M, Nasorri F, Girolomoni G. Interleukin-17 is produced by both Th1 and Th2 lymphocytes, and modulates interferon-gamma- and interleukin-4-induced activation of human keratinocytes. J Invest Dermatol. 2000; 115(1): 81-7.

12. Beeton C, Garcia A, Chandy KG. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 2007; (5): 224. DOI: 10.3791/224.

13. Poveschenko AF, Kazakov OV, Orlov NB, Poveschenko OV, Kim II, Bondarenko NA et al. Serum cytokines of Wistar rats — markers of carcinogenesisand effectiveness of cancer therapy. Fundamental research. 2015; 1 (Pt 8): 1664-70. Russian.

14. Hamblin AS. Lymphokines and interleukins. Immunology. 1988; 64 (Suppl 1): 39-41.