Корреляция цитотоксичности штаммов возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) для клеток Tetrahymena pyriformis с их вирулентностью

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Инфекция и иммунитет

перенесших абдоминальные операции, особенно повторные, у лиц с предрасполагающей патологией (сахарный диабет, ВИЧ, хронический гепатит В, онкологические заболевания), у пациентов, имеющих в анамнезе длительную антибиотикотерапию или терапию глюкокортикостероидами. Показано, что некоторые виды Candida могут вызывать диарею новорожденных и антибиотикоассоциированную диарею у взрослых. Однако факт выявления Candida в фекалиях пациента зачастую является лишь свидетельством кандидоносительства, но не кандидо-за. Наиболее популярная трактовка находок Candida в фекалиях — дисбиоз кишечника с избыточным ростом Candida spp. При этом, как правило, не приводится видовая характеристика изолятов, что может повлечь за собой неудачные попытки элиминации не С. albicans. Нами обследовано 630 пациентов с диарейным синдромом и явлениями дисбиоза. У 99 пациентов выявлены грибы рода Candida. Видовое разнообразие изучали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Полученные штаммы Candida spp. распределились по видам следующим образом: С. albicans — 66 изолятов (65% от числа изоля-тов Candida), С. lusitaniae — 9 (9%), С. krusei — 7 (7%), С. parapsilosis — 4 (4%), С. guilliermondii — 3 (3%), С. lambica — 2 (2%), С. tropicalis — 2 (2%), С. glabrata — 2 (2%), С. kefyr — 2 (2%), С. inconspicua — 2 (2%), С. dubliniensis — 1 (1%), С. intermedia — 1 (1%). Данные находки не позволяют дифференцировать кандио-носительство от кандидоза, однако установление вида Candida spp. с помощью масс-спектрометрии в ходе исследования на дисбиоз кишечника может послужить отправной точкой для дальнейшего обследования таких пациентов с целью своевременной терапии.

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА У ДЕТЕЙ С ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

Н.В. Корнева, А.А. Старшинова, Ю.Э. Овчинникова, О.А. Якунова, И.Ф. Довгалюк

ФГБУ Санкт-Петербургский НИИфтизиопульмонологии МЗ РФ

Введение. Широко применяемый в мире иммунологический тест для определения активности туберкулезной инфекции — QuantiFERON-TB Gold (КФ) — основан на количественном определении in vitro интерферона гамма (IFNy) методом иммуно-ферментного анализа в ответ на стимуляцию лимфоцитов антигенами ESAT-6, CFP-10 и TB7.7, специфичными для M. tuberculosis.

Цель: выявление особенностей иммунного ответа у детей с различными результатами КФ теста.

Материалы и методы. Группа включения: дети 3—14 лет, обследованные в отделении детской фтизиатрии в 2011—2013 гг. Всем был выполнен КФ, на основании результатов которого пациенты разделены на 2 группы: I группа (85) — с отрицательным результатом, II группа (155) — с положительным. Диагностический комплекс: клинические, иммунологические, бактериологические и лучевые методы (мультисрезовая компьютерная томография). Иммунологические методы: ДИАСКИНТЕСТ (ДСТ), оценка субпопуляционного состава лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD95+, HLAII), продукции индуцированных цитокинов (IL-2, IL-4, IFNy, TNFa), фагоцитарной активности нейтрофилов (фагоцитарный индекс

(ФИ), фагоцитарное число Райта (ФЧ) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). Обработка материала проводилась с использованием программ Microsoft Office Word Excel 2010 и GraphPad Prism 6. Применялся критерий хи-квадрат (%2). Количественные данные представлены в виде M±SD. Различия считались значимыми при р < 0,05.

Результаты. Результаты ДСТ и КФ были сопоставимы: отрицательные результаты ДСТ достоверно преобладали в I группе (76,8% (I) против 3,1% (II), р < 0,001), положительные — во II (96,9% (II) против 23,2%

(I), р < 0,001). Специфические изменения во внутри-грудных лимфатических узлах (ВГЛУ) по данным МСКТ достоверно чаще выявлялись во II группе (83,3% (II) против 40,2% (I), р = 0,001). Уровни цитокинов TNFa (686,71+70,75 (I) против 962,37+91,88 (II), р = 0,05), IL-2 (173,58+24,23 (I) против 280,45+26,61

(II), р = 0,05) и IFNy (18 749,94+1566,68 (I) против 20 729,58+1396,93 (II), р = 0,05) были достоверно выше во II группе. Также во II группе отмечено достоверное повышение CD3+ (р = 0,04), CD4+ (р = 0,04) и CD95+ (р = 0,04), в I — достоверно повышены CD25+ (р = 0,03). Повышение ФЧ выявлено во II группе (42,3% (I) против 65% (II) (р < 0,01), ИЗФ выше в I группе (1,05+0,07 (I) против 0,94+0,06 (II).

Выводы. Положительные результаты КФ и ДСТ сопоставимы и ассоциированы со специфическими изменениями во ВГЛУ, активацией нейтрофилов, ростом уровня цитокинов TNFa, IL-2, IFNy и субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+ и CD95+.

КОРРЕЛЯЦИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА (BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI) ДЛЯ КЛЕТОК TETRAHYMENA PYRIFORMIS С ИХ ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ

Е.В. Король, Р.О. Абдрахманова, С.Н. Тихонов, Е.В. Шубникова

ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Инфузории вида T pyriformis известны как модель для изучения вирулентности различных видов бактерий. Показано, что вирулентные микроорганизмы могут эффективно размножаться в клетках тетра-химен и вызывать их инцистирование, являющееся результатом цитотоксического действия бактерий на клетки инфузорий.

Цель настоящей работы состояла в сравнении цитотоксичности штаммов B. pseudomallei для клеток тетрахимен и установлении ее корреляции с показателями вирулентности для экспериментальных животных.

Использовали штаммы (B. pseudomallei 107, 99, 56770, С-141, 110), отличающиеся по вирулентности для моделей золотистых хомячков и белых мышей. Аксеническая культура Т. pyriformis получена из Института цитологии РАМН (Санкт-Петербург). Тетрахимены выращивали в L-бульоне «ХайМеди» при температуре 25°С. Изменения морфологии клеток наблюдали при световой и электронной микроскопии (увеличение 10x90 и х5000 соответственно). Культуры простейших и микроорганизмов соединяли в количественном соотношении 1:100 в L-бульоне и инкубировали при температуре 28 °С в течение 72 ч в климатической камере «Sanyo». Количество трофо-зоитов и цист подсчитывали в камере Горяева после обеззараживания сокультур 10% формалином.

2014, Т. 4, № 1

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Показано, что наиболее выраженным цитотокси-ческим действием обладает штамм B. pseudomallei 110, вызывающий полное инцистирование клеток тетра-химен через 72 ч. Динамика образования цист в со-культурах с другими штаммами соотносилась с их вирулентностью (в наименьшей степени она была выражена при взаимодействии с B. pseudomallei 107, авирулентным для экспериментальных животных).

Штамм B. pseudomallei 110 далее был трехкратно пассирован на золотистых хомячках. Культуры пассированного штамма вызывали гибель экспериментальных животных при введении единичных клеток. При этом уже после однократного пассажа их цито-токсичность для тетрахимен также значительно возрастала по сравнению с исходной, приводя к 100% инцистировнию клеток в течение 24—48 ч совместного инкубирования.

Таким образом, T pyriformis может рассматриваться в качестве эукариотической модели для оценки вирулентности штаммов возбудителя мелиоидоза по степени их цитотоксического действия на клетки простейших.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ИММУНОБЛОТТИНГЕ

И.И. Корсакова1,2, Н.П. Храпова12, Т.В. Замарина12, Е.В. Пименова1, Н.С. Макаров2

1ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 2ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет МЗ РФ

Эпитопная направленность — важная характеристика моноклональных антител (МКА), отражающая их индивидуальные свойства. Ее изучение важно для последующего использования МКА как основы диагностических тестов и для выбора метода очистки антигенов. Эпитоп является очень небольшим участком, встречающимся в составе антигенного комплекса с различной частотой. После электрофореза в денатурирующих условиях эти участки можно выявить в составе отдельных антигенных фракций.

Цель работы: определить эпитопную направленность ряда МКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudo-mallei в иммуноблоттинге.

Электрофорез антигенов (водно-солевых (ВСЭ) и формамидных (ФЭ) экстрактов B. pseudomallei) в ПААГ-ДСН и последующий перенос осуществляли по методике H. Towbin Клетки 12 гибридом-проду-центов МКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudomallei 100 тиражировали для получения препаративных количеств МКА. Из мышиной асцитической жидкости выделяли моноклональные иммуноглобулины, на их основе готовили иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) по методу P.K. Nakane, A. Kawaio, которые после проверки на специфичность использовали для визуализации полос на нитроцеллюлоз-ных мембранах. Рабочее разведение ИПК составило 1:20. Полученные блоттограммы анализировали с помощью компьютерной программы «TotalLab TL120».

Анализ окрашенных различными способами электрофореграмм позволил обнаружить 16—35 и 4—13 антигенных фракций в составе ВСЭ и ФЭ соответственно, а также установить гликопротеиновую природу изучаемых антигенов.

Число обнаруженных иммуноблоттингом эпи-топов, гомологичных МКА 5С2, было наибольшим. Эпитопы выявлены в составе 17 фракций антигенов с молекулярной массой (м.м.) от 37 до 18,4 kDa.

У остальных ИПК картина эпитопного профиля была разнообразной и зависела от вида антигена и штамма, из которого его получали.

Ни одно из изученных МКА не реагировало с ФЭ серии 5 B. pseudomallei 100, имеющим низкое содержание гликопротеинов.

Таким образом, иммуноблоттинг с применением препаратов ВСЭ и ФЭ штаммов B. pseudomallei позволил установить картину специфического взаимодействия экспериментальных ИПК с биополимерами различной м.м., входящими в их антигенный спектр, а также получить представление об эпитопной направленности использованных в работе МКА.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИНАМИКИ КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ К ЦИТОКИНАМ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ПРИМЕРЕ ВАКЦИННОГО ШТАММА В. ABORTUS 19 BA

М.В. Костюченко, Н.С. Саркисян, Т.В. Бердникова

ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Цитокины воздействуют на клетку, связываясь со специфическими рецепторами на цитоплазма-тической мембране, которые запускают каскадную реакцию межклеточных взаимодействий, ведущую к регуляции иммунного ответа.

Цель работы — изучить экспрессию рецепторов к цитокинам на субпопуляциях лейкоцитов в процессе формирования иммунного ответа при вакцинации белых мышей В. abortus 19 BA.

Исследовали кровь 60 белых мышей иммунизированных подкожно вакцинным штаммом B. abortus 19 BA в дозе 0,1 мл, содержащей 105 микробных клеток. Контролем служили 30 интактных животных, которым вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме. Забор крови осуществляли на 3, 5, 7, 14 и 21 сутки после иммунизации, по 6 животных опытной и контрольной группы в каждый период исследования. Методом проточной цитометрии на аппарате «FACSCalibur» с помощью моноклональных антител фирмы Invitrogen определяли рецепторы к интерлейкинам 2, 4 (IL-2, IL-4) и фактору некроза опухоли (TNF) на поверхности лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Так в процессе формирования иммунного ответа отмечалось повышение содержания моноцитов, экс-прессирующих рецепторы к IL-2, на 5 сутки 18,67± 2,25%, по сравнению с контролем 3,13+0,37%, ней-трофилов — на 5 и 14 сутки 15,81+1,19 и 12,20+0,63%, контроль — 4,01+0,22%, Количество моноцитов и нейтрофилов, экспрессирующих рецепторы к IL-4 значительно повышалось на 5 сутки и достигало значений 25,88+3,63 и 26,59+1,94% по сравнению с контролем 4,18+0,39 и 2,60+0,35%. Значение этих показателей оставалось высоким в течение всех сроков наблюдения. Повышение уровня моноцитов и нейтрофилов экспрессирующих рецепторы к TNF отмечалось на 3 сутки. Максимальных значений достигало на 7 сутки 22,39+1,87 и 17,55+1,87% по сравнению с этими показателями у интактных животных 5,03+0,45 и 2,25+0,62%. К 21 суткам ис-