ДИАГНОСТИКУМ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИРАБИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК И ПРЕПАРАТА ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА IN VITRO МЕТОДОМ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА
DIAGNOSTICUM AND TEST-SYSTEM FOR DETERMINING ACTIVITY OF ANTI-RABIES SERUMS AND PREPARATON OF HETEROLOGICAL ANTI-RABIES IMMUNOGLOBULIN IN VITRO BY DOT-IMMUNOANALYSIS METHOD

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору для определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулинов методом дот-иммуноанализа, и может быть использовано при производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина.
Антирабический иммуноглобулин в сочетании с антирабической вакциной применяют для экстренной профилактики заболевания людей гидрофобией при тяжелых укусах бешеными или подозрительными на бешенство животными. Бешенство, в связи с абсолютной летальностью и необходимостью проведения курса лечебно-профилактических прививок по жизненным показаниям, остается серьезной проблемой для органов и учреждений здравоохранения. Ежегодно в различные лечебные учреждения Российской Федерации за антирабической помощью обращаются около полумиллиона человек, примерно половина из них получают направление на специфическое антирабическое лечение (Онищенко Г.Г., Верещагин А.И., 2007).
50
50
50
В настоящее время при производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина уровень активности антирабических сывороток и готового препарата определяют in vivo в реакции нейтрализации (РН) вируса бешенства на белых мышах по Р. Atanasiu («Методы лабораторных исследований по бешенству», ВОЗ, 1975). Данный метод основан на нейтрализации постоянной дозы предварительно протитрованного инфицирующего вируса бешенства рядом последовательных разведений исследуемой сыворотки или иммуноглобулина. Метод складывается из следующих этапов: приготовление и титрование инфицирующего вируса; нейтрализация вируса сывороткой или иммуноглобулином (разведение сыворотки или иммуноглобулина и приготовление смеси сыворотка или иммуноглобулин - вирус; инокуляция мышам); интерпретация результатов. Для определения LD вируса мышам вводят интрацеребрально по 0,03 мл суспензии вируса; каждое разведение вводят группе из 5 животных. Регистрируют число мышей, погибших в период между 6-м и 20-м днем после заражения. Расчет LD вируса проводят по методу Reed и Muench («Методы лабораторных исследований по бешенству», ВОЗ, 1975). Для нейтрализации используют суспензию мозга, содержащую от 100 до 1000 LD/0,03 мл. Для этапа нейтрализации готовят ряд разведений испытываемой сыворотки или иммуноглобулина и по 0,5 мл каждого из этих разведений переносят в ряд пробирок. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл установленного разведения вируса. После инкубации в течение 1 ч при 37°С заражают интрацеребрально мышей, вводя им по 0,03 мл каждого разведения (по 5 мышей на каждое разведение). Регистрируют число мышей, погибших в период между 6-м и 20-м днем после заражения. Анализ результатов и расчет титра иммуноглобулина или сыворотки проводят по методу Reed и Muench.
Однако метод РН обладает рядом недостатков: трудоемок, требует большого количества животных, длительного времени наблюдения (20 дней) и предполагает использование инфекционного агента. В связи с этим актуальной представляется разработка альтернативных методов определения специфической активности антирабических гипериммунных сывороток и иммуноглобулина. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству в своих документах неоднократно подчеркивал необходимость разработки методов титрования антител in vitro (СТД ВОЗ: 523, 709, 824, 931). Это важно и на этапе иммунизации животных при производстве препарата антирабического иммуноглобулина, когда необходимо в короткие сроки принять решение о дальнейшей эксплуатации лошадей-продуцентов.
Известен метод реакции непрямой гемагглютинации с применением сухого эритроцитарного диагностикума для титрования сывороток доноров при получении антирабического иммуноглобулина из крови человека (Шафеева Р.С., Шамсувалеева А.К., 1995). Сухой эритроцитарный диагностикум получали путем сенсибилизации формалинизированных гусиных эритроцитов концентрированным очищенным культуральным вирусом Внуково-32 в присутствии 0,1% раствора хлорного хрома. К недостаткам этого метода можно отнести использование для конструирования диагностикума нестабильных биологических компонентов и трудоемкость.
Известно о применении теста ингибиции фокусов флюоресценции для определения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови крупного рогатого скота, лошадей и собак, иммунизированных инактивированной культуральной антирабической вакциной (Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Жестерев В.И. и др., 1998). Предлагаемый метод дает 100% корреляцию с РН. Недостатками метода являются его трудоемкость, дороговизна, потребность в квалифицированных специалистах и специальном оборудовании для работы с перевиваемой культурой клеток почек сайги, использование токсичных реагентов для фиксации клеток, необходимость получения ФИТЦ-конъюгатов.
Известно о применении иммуноферментного метода (ИФА) для обнаружения антител к вирусу бешенства в крови лисиц с использованием антивидовых реагентов (Кузьмин И.В., Хисматуллина Н.А., Колесникова Е.М., 2001). Для конструирования диагностикума применяли пероксидазный конъюгат кроличьего иммуноглобулина. По данным авторов, не выявлено корреляции ИФА и реакции нейтрализации в 100% случаев, и в целом данный метод рекомендован как качественный для скрининговой оценки иммунного статуса популяций лисиц в природных очагах бешенства при проведении эпизоотологических и эпидемиологических обследований и на территориях проведения оральной вакцинации животных.
Известно о применении реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции связывания комплемента (РСК), ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотках крупного рогатого скота, кроликов и лис (Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В. и др., 1991). Недостатками РСК и РДП является их недостаточная чувствительность по сравнению с ИФА.
Известно о применении ИФА для определения антител к гликопротеиду вируса бешенства в сыворотках вакцинированных людей с применением диагностикума Platelia (r) rabies kit - Sanofi Pasteur Diagnostics, Франция (Сельникова О.П., Моисеева А.В., Антонова Л.А., Маричев И.Л., 2005).
Недостатками метода ИФА являются многостадийность, необходимость получения антивидовых реагентов для изготовления конъюгата, использование токсичных субстратов. Высокую точность измерений обеспечивают только специальные анализаторы. Кроме того, свойства микротитровальных планшетов, используемых для анализа, изменяются от партии к партии, от планшета к планшету и даже от лунки к лунке (так называемый краевой эффект).
В модифицированном варианте для адсорбции различных антител вместо внутренних поверхностей лунок микротитровальных планшетов используют нитроцеллюлозные фильтры. Такую модификацию называют дот-ИФА (точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В дот-ИФА минимальные объемы растворов антител наносят на нитроцеллюлозную или подобную подложку в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Преципитирующие хромогенные субстраты, обычно применяемые в иммуноблоттинге, на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют легко различимые цветные пятна, в результате чего отпадает необходимость в дорогих фотометрах. Белый цвет подложки вокруг пятен помогает контролировать реакции неспецифического связывания. Фильтры с результатами анализа можно хранить в темноте в течение многих лет без потери окраски. Кроме того, преимуществами анализов типа дот-ИФА являются простота и экономичность в отношении расхода реагентов. Однако при применении метода дот-ИФА также необходимы ферментные конъюгаты и субстрат для проявления.
Настоящее изобретение предлагает выявление уровня содержания специфических антител в сыворотках продуцентов и в готовом препарате антирабического иммуноглобулина методом дот-иммуноанализа без использования ферментных конъюгатов.
Применение данного метода на этапе иммунизации животных позволит в более короткие сроки, по сравнению с реакцией нейтрализации in vivo, определять величину титров специфических антител в гипериммунных сыворотках, что необходимо для принятия решения о дальнейшей эксплуатации лошадей после циклов иммунизации. До настоящего времени метод дот-иммуноанализа не находил широкого применения в производстве антирабического иммуноглобулина в связи с отсутствием соответствующих коммерческих диагностикумов для исследования сывороток животных.
Известен диагностикум, состоящий из золя серебра и белковополисахаридного антигена бруцелл, полученный по способу, описанному в патенте №2202798, при котором золь серебра добавляют к белковополисахаридному антигену бруцелл, с последующей стабилизацией фосфатным буфером, содержащим сывороточный альбумин, телячью фетальную сыворотку и азид натрия. Диагностикум предназначен для выявления бруцеллезных антител методом дот-иммуноанализа в сыворотках крови.
Наиболее близким техническим решением является набор для многопрофильного анализа сыворотки крови методом дот-иммуноанализа. Набор включает в себя плотные подложки в виде отдельных стрипов, на которые дискретно нанесены антигены и человеческие иммуноглобулины. Набор содержит растворы для отмывок, разведения образцов и конъюгата, систему проявления и конъюгат, представляющий собой золь золота или серебра, связанный с антителами к иммуноглобулинам человека или стафилококковым белкам А или G (Патент РФ №2298795, 10.05.2007). Набор предназначен для одновременного выявления антител различной специфичности к возбудителям нескольких инфекционных заболеваний и используется в клинической практике.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, показал, что сведений о диагностикумах, предназначенных для выявления антирабических антител в сыворотках продуцентов методом дот-иммуноанализа, не обнаружено.
Технической задачей настоящего изобретения является получение диагностикума для оценки уровня активности антирабических сывороток продуцентов и готового препарата in vitro методом дот-иммуноанализа, обеспечивающего получение достоверных результатов в короткие сроки, простого в исполнении и не требующего специального оборудования для учета результатов анализа.
Технический результат заключается в расширении возможности определения специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина.
Технический результат достигается тем, что в диагностикуме, содержащем маркер, сорбционно связанный с иммунореагентом и стабилизированный буферной смесью, в качестве маркера используют наночастицы коллоидного золота размером 15-17 нм, в качестве иммунореагента - инактивированный фиксированный вирус бешенства производственного штамма «Москва-3253» из кроличьей вируссодержащей мозговой суспензии, применяемой в производстве антирабического иммуноглобулина при получении рабического антигена для иммунизации продуцентов, а в качестве стабилизатора - 0,5% раствор полиэтиленгликоля-20М (ПЭГ-20М).
Как вариант возможно использование в качестве иммунореагента гликопротеида, выделенного из вируса бешенства. Гликопротеид - поверхностный белок, ответственный за индукцию синтеза и выработку вируснейтрализующих антител. Гликопротеид выделяют, обрабатывая очищенный вирус неионным детергентом тритоном Х-100 (Кузнецова С.В. с соавт., 1981).
Диагностикум для определения специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина методом дот-иммуноанализа представляет собой гидрозоль золота с размером частиц 15-17 нм, сорбционно связанный с антигеном - инактивированным фиксированным вирусом бешенства производственного штамма «Москва-3253» из кроличьей вируссодержащей мозговой суспензии или гликопротеидом вируса бешенства в соотношении по объему маркера к иммунореагенту от 10:1 до 320:1 и стабилизированный 0,5% раствором полиэтиленгликоля-20М.
Способ приготовления диагностикума включает следующие этапы.
1. Приготовление маркера.
При выборе маркера предпочтительным является применение коллоидных металлов, преимущество которых заключается в полной безопасности для исследователей при использовании их в работе по сравнению с радиоизотопными и ферментными метками. В качестве маркера используют коллоидный раствор золота, обеспечивающий прочное адсорбционное взаимодействие с высокомолекулярными субстанциями. Стабилизация частиц золота макромолекулами осуществляется благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям. Свойства коллоидного раствора золота позволяют получить четкие результаты специфических реакций за счет его интенсивной окраски и визуализировать результаты анализа непосредственно после взаимодействия исследуемого образца с диагностикумом, следовательно, не требуется дополнительная стадия субстратного проявления, как в ИФА. Преимущества применения коллоидного золота в качестве метки описаны рядом авторов (Богатырев В.А. с соавт., 1991; Хлебцов Н.Г. с соавт., 1995; Загоскина Т.Ю. с соавт., 1998, 1999; Краснов Я.М., 2003).
4
Приготовление коллоидного раствора золота с диаметром частиц 15-17 нм осуществляют по методу Г.Френса (Frens G. Controlled nucleation for the particle size in monodisperse gold suspension // Nature Phys. Sci, 1973), в соответствии с которым в колбу Эрленмейера с обратным холодильником наливают 241,4 мл деионизованной воды, доводят ее до кипения на магнитной мешалке с электроподогревом. Затем последовательно добавляют 2,5 мл 1% золотохлористоводородной кислоты (HAuCl) и, увеличивая обороты мешалки, 7,8 мл 1% раствора цитрата натрия, после чего продолжают кипятить раствор в течение 20 минут, до появления красного цвета. Метод позволяет получать достаточно стабильные и гомодисперсные золи золота необходимого диаметра частиц.
2. Фильтрация раствора иммунореагента.
Фильтрацию раствора, содержащего инактивированный фиксированный вирус бешенства производственного штамма «Москва-3253» из кроличьей вируссодержащей мозговой суспензии или гликопротеид вируса бешенства, используемого в качестве иммунореагента, осуществляют через нитроцеллюлозные фильтры «Millipore» (США) с размером пор 0,22 мкм.
3. Определение «золотого числа».
«Золотое число» определяют по известной методике Жигмонди Р. (Коллоидная химия. - Харьков, Киев: Изд-во НК Снаба УССР, 1933).
2
3
Значение рН исходного коллоидного раствора золя с наночастицами золота диаметром 15-17 нм составляет 5,8-6,0. Для оптимальных условий стабилизации увеличивают рН коллоидного раствора золота поташом (0,2М КСО) до рН 7,0. Для определения «золотого числа» в иммунологических планшетах делают ряд двойных разведений антигена (по 20 мкл) на деионизованной воде. В каждую лунку добавляют 200 мкл золя коллоидного раствора золота, имеющего оптимальное значение рН 7,0. Через 5 минут в каждую лунку добавляют 20 мкл раствора 10% NaCl. Последняя лунка в ряду разведений конъюгата, не изменившая своего цвета после добавления солевого раствора, содержит минимальное количество антигена, необходимое для защиты коллоидного раствора золота от его солевой агрегации - «золотое число».
4. Связывание частиц маркера с иммунореагентом.
Для связывания частиц маркера с иммунореагентом в раствор коллоидного золота с оптимальным значением рН 7,0 добавляют при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке необходимое количество антигена в соотношении по объему маркера к иммунореагенту от 10:1 до 320:1 в соответствии с выявленным «золотым числом».
5. Стабилизация полученного конъюгата.
С целью блокировки свободных сайтов поверхности наночастиц золота и вторичной стабилизации конъюгата к нему добавляют 0,5% раствор высокомолекулярного полимера ПЭГ-20М до конечной концентрации 0,02% и перемешивают на мешалке в течение 15 минут. Затем полученный диагностикум выдерживают при температуре +3-5°С не менее 1 часа. По истечении данного времени диагностикум готов к применению.
Специфичность полученного диагностикума подтверждена постановкой дот-иммуноанализа с набором антивирусных и антибактериальных сывороток (таблица 2).
Технический результат достигается также использованием заявляемой тест-системы для оценки уровня активности антирабических сывороток продуцентов и готового препарата in vitro методом дот-иммуноанализа. В состав тест-системы входят:
1. Полоски нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) с размером пор 0,45 мкм с очерченными квадратами для нанесения исследуемых образцов. Ширина мембраны позволяет наносить исследуемые образцы в три ряда, а длина - наносить десять последовательных двойных разведений каждого образца. На верхний и нижний ряды каждой мембраны нанесены аликвотами по 2 мкл положительный и отрицательный контрольные образцы из ряда двойных разведений, начиная с 1:20. В качестве положительного контрольного образца использован отраслевой стандартный образец специфической активности антирабического иммуноглобулина, в качестве отрицательного - нормальная лошадиная сыворотка.
2. Диагностикум, представляющий собой гидрозоль золота размером 15-17 нм, сорбционно связанный с инактивированным фиксированным вирусом бешенства производственного штамма «Москва-3253» из кроличьей вируссодержащей мозговой суспензии или гликопротеидом вируса бешенства.
3. Физический проявитель для усиления цветового сигнала иммунологической реакции, содержащий растворимую соль - нитрат серебра и восстанавливающие агенты. Компоненты проявителя представлены в виде сухих навесок для последующего их растворения. Проявитель готовят непосредственно перед использованием. Для приготовления трехкомпонентного проявителя, состоящего из 0,2% раствора нитрата серебра (0,025 г на 250 мкл деионизованной воды), 0,2% раствора метола (0,1 г на 25 мл деионизованной воды), 0,5% раствора лимонной кислоты (0,625 г на 25 мл деионизованной воды), соединяют растворенные навески в следующих соотношениях: 600 мкл деионизованной воды, 400 мкл раствора лимонной кислоты, 1000 мкл раствора метола и 40 мкл раствора нитрата серебра.
4. Раствор для блокировки свободных сайтов связывания НЦМ - 0,5% раствор высокомолекулярного полимера ПЭГ-20М или 1-3% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА).
5. Деионизованная вода для титрования исследуемых образцов и для отмывки НЦМ.
6. Пленка типа «Parafilm» для изготовления пакета-камеры для мембран.
Определение уровня содержания специфических антител в гипериммунных сыворотках продуцентов и/или в готовом препарате антирабического иммуноглобулина методом дот-иммуноанализа с использованием заявляемой тест-системы осуществляют следующим образом.
1. Готовят последовательные двукратные разведения исследуемых образцов в деионизованной воде 1/20, 1/40, 1/80 и т.д. по 20 мкл. Для разведения сыворотки 1/20 необходимо взять 50 мкл сыворотки и 950 мкл деионизованной воды.
2. Исследуемый образец наносят на мембрану аликвотами по 2 мкл в виде последовательного ряда точек, начиная с последнего разведения. Полоску мембраны с нанесенными образцами высушивают при комнатной температуре.
3. Заливают мембрану на 15 минут для блокировки свободных сайтов связывания 0,5% раствором ПЭГ-20М или 1-3% раствором БСА, приготовленными на деионизованной воде.
Мембрану промывают деионизованной водой трижды по 1 минуте.
4. Заблокированную мембрану помещают в пакетик из пленки типа «Parafilm», куда добавляют 400 мкл диагностикума. Мембрану выдерживают до появления красных пятен.
5. Промывают мембрану деионизованной водой трижды по 1 минуте.
6. Проводят процедуру усиления цветового сигнала в растворе физического проявителя с последующей отмывкой в деионизованной воде и высушиванием при комнатной температуре.
7. Проводят учет результатов. За титр сыворотки или иммуноглобулина принимают то наибольшее разведение, при котором визуально регистрируют четко различимое пятно.
ПРИМЕР 1. Определение специфической активности гипериммунных антирабических сывороток и иммуноглобулина in vitro с использованием диагностикума и сравнение результатов реакции нейтрализации и дот-иммуноанализа.
При определении специфической активности антирабических сывороток и иммуноглобулина методом дот-иммуноанализа с использованием диагностикума в качестве отрицательного контрольного образца была взята нормальная лошадиная сыворотка, в качестве положительного - препарат антирабического гетерологичного иммуноглобулина серии 35. Для определения титра специфических антител в гипериммунных сыворотках и готовом препарате антирабического иммуноглобулина готовят серию двукратных разведений на деионизованной воде исследуемых образцов, начиная с 1:20. Двукратные разведения наносят на нитроцеллюлозную мембрану (фирма Millipore, США; 0,45 мкм) и высушивают ее. Свободные сайты связывания блокируют 1-3% раствором бычьего сывороточного альбумина или 0,5% раствором полиэтиленгликоля 20-М. Промывают мембрану трижды по 1 минуте деионизованной водой. После процедуры отмывания полоску помещают в конверт из пленки типа «Parafilm» и инкубируют в растворе диагностикума при комнатной температуре до появления красных пятен, с последующей отмывкой в деионизованной воде. Затем проводят процедуру усиления цветового сигнала иммунологической реакции в растворе физического проявителя в течение 1-2 мин при комнатной температуре, с последующей отмывкой в деионизованной воде и высушиванием при комнатной температуре. После процедуры усиления учитывают результаты, принимая за титр сыворотки или иммуноглобулина то наибольшее разведение, при котором визуально регистрируют четко различимое пятно.
При исследовании специфической активности препарата антирабического иммуноглобулина (АИГ) положительный результат регистрировали в разведении 1:5000-1:10000, у отдельных серий - до 1:20000, активность гипериммунных антирабических лошадиных сывороток соответствует уровню 1:320-1:640, у отдельных сывороток до 1:1280.
Для выявления корреляции результатов дот-иммуноанализа и РН проведено сравнительное изучение 13 серий препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Постановку РН проводили по общепринятой методике («Методы лабораторных исследований по бешенству», ВОЗ, 1975) на белых мышах 3-4-недельного возраста.
Результаты исследований представлены в таблице 1. Титры специфических антител, выявленные в реакции нейтрализации на мышах, колебались в пределах от 1:2576 до 1:13772, титры специфических антител, определенные в дот-иммуноанализе (ДИА), - от 1:2500 до 1:20000. Показана линейная корреляция между результатами РН и дот-иммуноанализа, коэффициент корреляции r=0,9.
ПРИМЕР 2. Определение специфичности диагностикума в дот-иммуноанализе с набором антивирусных и антибактериальных сывороток.
Определение специфичности диагностикума проводили с использованием набора иммунных антивирусных и антибактериальных сывороток, включающего: сыворотку против вируса инфекционного ринотрахеита КРС, сыворотку против вируса инфекционной анемии лошадей (ИНАН), сыворотку против вируса лейкоза КРС; чумную, холерную 01, псевдотуберкулезную, бруцеллезную и хламидийную лошадиные сыворотки. В качестве отрицательного контрольного образца была взята нормальная лошадиная сыворотка, в качестве положительного - препарат антирабического гетерологичного иммуноглобулина серии 35. На мембрану наносят двукратные разведения исследуемых сывороток. Дот-иммуноанализ проводят так, как описано в примере 1. В ходе анализа выявлено, что ни с одной из иммунных сывороток, перечисленных выше, не зарегистрировано положительной реакции даже в начальных разведениях. Результаты анализа представлены в таблице 2.
Таким образом, настоящее изобретение позволяет выявлять методом дот-иммуноанализа уровень содержания специфических антител как в готовом препарате антирабического иммуноглобулина, так и в гипериммунных сыворотках продуцентов на этапе иммунизации животных (при производстве препарата). Постановка дот-иммуноанализа с заявляемым диагностикумом проста и экономична, позволяет получить результаты в течение короткого времени (время анализа обычно не превышает 4-5 часов), не требует наличия дорогостоящего оборудования и аппаратуры. При реализации изобретения отпала необходимость в использовании инфекционного агента и большого количества дорогостоящих животных, требующихся для постановки реакции нейтрализации. Кроме этого изобретение безопасно для исследователей при использовании его в работе по сравнению с радиоизотопными и ферментными маркерами. Коллоидное золото, используемое в качестве маркера, нетоксично и неаллергенно. Сконструированный диагностикум сохраняет свои основные свойства в процессе хранения (срок наблюдения - 1 год) без потери интенсивности окрашивания.
Таблица 1
Специфическая активность препарата антирабического иммуноглобулина в тестах in vivo (РЦ) и in vitro (ДИА)
№ серии АИГ
Титр специфических антител в РН
Количество LD<sub>50</sub>/0,03 мл в РН
Активность в РН, МЕ/мл
Титр специфических антител в ДИА
34
1:8000
333
320
1:5000-1:10000
35
1:8812
333
360
1:5000-1:10000
36
1:12912
333
410
1:10000-1:20000
37
1:7962
562,5
621
1:5000-1:10000
38
1:5623
576,5
634
1:5000-1:10000
39
1:2951
562,5
230
1:2500-1:5000
40
1:7130
469
358
1:5000-1:10000
41
1:8689
469
434
1:5000-1:10000
42
1:2576
576,5
291
1:2500
43
1:12302
617,8
419
1:10000
44
1:10000
617,8
341
1:10000
45
1:13772
316
556
1:10000-1:20000
46
1:10839
316
438
1:10000
Средняя геометрическая титров 1:8582
Средняя геометрическая титров 1:8558
Таблица 2
Результаты определения специфичности диагностикума для дот-иммуноанализа
Наименование сыворотки или препарата
Результат дот-иммуноанализа
Нормальная лошадиная (отрицательный контроль)
отрицательный
Иммунная сыворотка против вируса ИНАН лошадиная
отрицательный
Иммунная сыворотка против вируса инфекционного ринотрахеита КРС
отрицательный
Иммунная сыворотка против вируса лейкоза КРС
отрицательный
Иммунная хламидийная лошадиная
отрицательный
Иммунная чумная лошадиная
отрицательный
Иммунная холерная 01 лошадиная
отрицательный
Иммунная бруцеллезная лошадиная
отрицательный
Иммунная псевдотуберкулезная лошадиная
отрицательный
Антирабический гетерологичный иммуноглобулин серии №35 (положительный контроль)
1:5000-1:10000