СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДРОЖЖЕЙ РОДА PICHIA НА ОСНОВЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ TAQMAN ЗОНДА
METHOD FOR IDENTIFICATION OF YEAST GENUS PICHIA BASED ON REAL TIME PCR USING A TAQMAN PROBE

Настоящее изобретение относится к микробиологии и касается способов измерения, использующих микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в пищевой промышленности при идентификации дрожжей рода Pichia в как во входящем сырье пищевого предприятия, так и на разных этапах производства, включая конечную продукцию.
Раннее обнаружение дрожжей рода Pichia является актуальной задачей в масложировой промышленности ввиду широкого распространения этой группы микроорганизмов в данных видах продуктов, что приводит к их порче. Важность раннего обнаружения Pichia sp.позволит пищевым предприятиям быстро выявлять произведенную продукцию и входящее сырье предприятия, обсемененную этим видом дрожжей и вовремя ее браковать. Предварительно нами было выявлены многочисленные случаи загрязнения дрожжами рода Pichia пищевых продуктов с высоким содержанием жиров. Размножение этой группы организмов приводит к порче произведенной продукции и ее не соответствию требованиям СанПина.
{
На данный момент идентификацию дрожжей рода Pichia в большинстве случаев проводят по морфологическим признакам, что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный микробиолог. Также, вывить данный организм можно с помощью секвенирования консервативных участков генома. Зачастую необходимо быстро выявить присутствие данной таксономической группы дрожжей ввиду их быстрого роста в продуктах с высоким содержанием жиров (например, майонез), чтобы выявить продукцию, а также входящее сырье, содержащие данную группу организмов для дальнейшей ее отбраковки.
Рядом авторов были разработаны молекулярно-генетические методы идентификации некоторых представителей рода Pichia молекулярно-генетическими методами. Был разработан молекулярно-генетический метод идентификации Pichia guilliermondii (MotaA.J. etal. Molecular identification of Pichia guilliermondii, Debary omyceshansenii and Candida palmioleophila. Genetics and Molecular Biology. 2012, 35(1): 122-125); молекулярно-генетический метод идентификации дрожжей, обсеменяющих винные продукты (Pramateftaki P.V. et al. Molecular identification of wine yeasts at species or strain level: a case study with strains from two vine-growing areas of Greece. JournalofAppliedMicrobiology. 2000, 89(2):236-248); молекулярно-генетический метод идентификации дрожжей, которые могут содержаться в крови (ChangH.C. etal. Rapid identification of yeasts in positive blood cultures by a multiplex PCR method. Journal of Clinical Microbiology.2001, 39:3466-3471); молекулярно-генетический метод идентификации дрожжей, значимых для ветеринарии (Garner C.D. et al. Molecular Identification of Veterinary Yeast Isolates by Use of Sequence-Based Analysis of the D1/D2 Region of the Large Ribosomal Subunit. Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(6):2140-2146) и др. Перечисленные молекулярно-генетические методы узкоспециальные и не имеют отношения к масложировой промышленности.
Известен способ определения наличия определенных микроорганизмов в биологическом образце (патент RU 2435865, МПК C12Q 1/68, G01N 33/569, G01N 33/543, опубл. 10.12.2011), взятый за прототип, включающий иммобилизацию биологического организма и его; ДНК с последующей идентификацией на основе ПЦР с генотипирующими праймерами. Недостатком данного способа является низкая видоспецифичность ввиду того, что одни лишь праймеры не обеспечивают высокой специфичности анализа, что может привести к ложноположительным результатам.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокоспецифичного и оперативного способа идентификации присутствия дрожжей рода Pichia.
Технический результат заключается в разработке высокочувствительного способа и сокращении времени анализа присутствия дрожжей рода Pichia с 5 суток до 1 суток (в 5 раз).
Технический результат достигается тем, что в «способе идентификации дрожжей рода Pichia в майонезах на основе ПЦР в реальном времени, включающем предварительное обогащение дрожжей, осаждение их центрифугированием, выделение ДНК с проведением ПЦР в реальном времени, согласно изобретению, для амплификации используются праймеры PichUn-f GATCTCTTGGTTCTCGCATC и PichUn-r GCGTTCAAGAACTCGATGA, а также Taqman зонд PichUn-p FAM TCACACTAGGTATCGCATTTCGCTGC BHQ1, где логарифмическое повышение уровня флюоресценции свидетельствует о наличии штама дрожжей рода Pichia.
Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участка ДНК, включающего гены 18S рРНК, 5.8S рРНК и 28S рРНК и межгенные участки ITS1 и ITS2 для значимых в пищевой промышленности дрожжей рода Pichia. Установлены консервативные участки для данной группы организмов, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации дрожжей на основе ПЦР в реальном времени с использованием Taqman зонда, который представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. При проведении ПЦР гибридизованный с ДНК зонд расщепляется ДНК-полимеразой (вследствие ее экзонуклеазной активности) и высвобождается флуоресцентная метка. Таким образом, наблюдается повышение уровня флуоресценции.
На фиг. 1 приведены кривые флуоресценции ДНК из 5 проб майонеза, полученные в ходе проведения ПЦР в реальном времени.
Способ идентификации дрожжей рода Pichia с помощью проведения ПЦР в реальном времени с использованием Taqman зонда в представленном способе реализуется следующим образом:
1. Производится сбор биологического материала (майонез, входящее сырье и др.). Для анализа используется 1 мл биологического материала.
2. Проводится предварительное 18-часовое обогащение образца в среде для культивирования дрожжей и плесени (например, бульон Сабуро). Объемное соотношение майонез/среда обогащения составляет не менее 1:10.
3. Проводится осаждение клеток дрожжей с помощью центрифугирования (например, 10000 g, 5 мин), супернатант вместе с майонезом удаляется.
4. Производится выделение ДНК из осажденных клеток, выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов («БиоСилика»,«ДНК-технологии», «Праймтех», «Zymоresearch» и др.), так и методами органической экстракции.
5. Проводят ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек, 54°С 30 сек, 72°С 30 сек.)
Используется следующиепраймеры и зонд:
Прямой GATCTCTTGGTTCTCGCATC
Зонд FAM TCACACTAGGTATCGCATTTCGCTGC BHQ1
Обратный GCGTTCAAGAACTCGATGA
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР длиной 114 п.н., который содержит нуклеотидные полиморфизмы, характерные только для дрожжей рода Pichia, с которыми взаимодействует Taqman зонд.
6. В случае, если наблюдается логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, это означает, что продукт обсеменен дрожжами Pichia sp.
Предлагаемый способ является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих амплификатор в реальном времени, центрифугу, сопутствующие реактивы и расходные материалы.
Способ поясняется примером:
После предварительного обогащения и выделения ДНК из 5 проб майонеза был проведен ПЦР в реальном времени (фиг. 1). В одной из проб (№1) наблюдался логарифмическое повышения уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, при этом в других пробах (№2-5) не наблюдалось повышение флуоресценции. Следовательно, проба майонеза №1 содержит дрожжи рода Pichia.