Апробация пренатального неинвазивного выявления резус-фактора плода по крови резус-отрицательной матери методом ПЦР в режиме реального времени в злитт ГБУ Ро «СПК»

АПРОБАЦИЯ ПРЕНАТАЛЬНОГО НЕИНВАЗИВНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА

ПО КРОВИ РЕЗУС-ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ МАТЕРИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ В ЗЛИТТ ГБУ РО «СПК»

С. И. Палухин, И. В. Ищенкова, Э. Е. Кудинова, О. А. Савченко, Т. И. Труфанова, К. А. Сухорукова, Г. М. Перцева, А. А. Борщева

Аннотация. В статье представлены результаты по освоению неинвазивного пренатального метода определения резус-фактора плода по крови серологически резус-отрицательных беременных женщин. Выделение внеклеточной фетальной ДНК и постановку ПЦР проводили в режиме реального времени. Ген RHD плода определялся в 24 образцах

фетальной ДНК, выделенной из плазмы венозной крови. Полученные результаты показали эффективность и воспроизводимость метода.

Ключевые слова: резус-конфликт, резус-фактор плода, ГБН, фетальная ДНК, пренатальная диагностика.

TESTING OF PRENATAL NON-INVASIVE DETECTION OF THE RH FACTOR OF THE FETUS BY BLOOD OF THE RH-NEGATIVE MOTHER BY REAL-TIME PCR IN ZLITT SBE RR «BTC»

S. I. Palukhin, I. V. Ishchenkova, E. E. Kudinova, O. A. Savchenko, T. I. Trufanova, K. A. Sukhorukova, G. M. Pertseva, A. A. Borshcheva

Annotation. The article presents the results of the development of a non-invasive prenatal method for determining the Rh-factor of the fetus by blood of serologically Rh-negative pregnant women.

Extracellular fetal DNA was isolated and performed PCR in real-time. The fetal RHD gene was determined in 24 samples of fetal DNA isolated from venous blood plasma. The results having obtained showed the effectiveness and reproducibility of the method.

Keywords: Rhesus conflict, Rhesus factor of the fetus, HDN, fetal DNA, prenatal diagnosis.

Иммунологический конфликт по системе резус по-прежнему остается актуальной темой, поскольку в структуре перинатальной патологии и смертности гемолитическая болезнь новорожденного (ГБН) стабильно занимает 5-е место [4].

Гемолитическая болезнь плода и новорожденных (ГБП и Н) часто является причиной тяжелых нарушений эмбриогенеза и постнатального развития, и нередко — причиной гибели новорожденного [3, 7]. Перинатальная смертность в России остается высокой и составляет 15— 16% [3, 5, 9]. Среди иммунологических осложнений беременности ведущее место занимает ГБП и Н, вызванная антигенами системы резус. До 95% клинически значимых случаев гемолитической болезни связано с D-резус антигеном, обладающим высокими иммуногенными свойствами. В европейской популяции носителями антигена D являются 85% населения. Около 15% лиц, у которых на эритроцитах отсутствует антиген D, относятся к резус-отрицательным [1, 2, 8, 5].

Несмотря на многочисленные исследования по данной проблеме, многие аспекты остаются в центре внимания акушеров, неонатологов, иммунологов [1, 3, 6, 7, 9, 10, 13]. Предлагались различные методы диагностики и лечения иммунологического конфликта по резус-фактору. Однако нет достоверных критериев, которые бы позволили во время беременности неинвазивно диагностировать резус-конфликт между матерью и плодом. Мы не берем во внимание диагностику резус-фактора плода при помощи кордоцентеза. Это метод инвазивный,

его осложнением часто является отслойка плаценты, кровотечение, гибель плода. Поэтому основные задачи современной медицины направлены не только на снижение перинатальной смертности, но и на лечение ГБП и Н. Разработаны новые методы, позволяющие проводить неинвазивную диагностику ГБП.

Молекулярно-генетические технологии позволили разработать методы проведения неинвазивного определения резус-фактора плода с чувствительностью и специфичностью 98—100% [3]. Пренатальное неинва-зивное определение резус-принадлежности крови плода имеет первостепенное значение и важно для всех беременных серологически резус-отрицательных женщин. В течение беременности практически всем женщинам с резус-отрицательной принадлежностью проводят контроль наличия и титра анти-ЯИО-антител, а при необходимости возможно проводить определение антител к другим антигенам системы резус, используя геле-вые технологии.

К неинвазивным информативным методам относится доплерометрическое определение максимальной систолической скорости кровотока в средней мозговой артерии плода (МСС СМА), кардиотокография (КТГ), УЗИ, которые позволяют оценить состояние плода в норме и при патологии.

Дородовая неинвазивная диагностика гена /ЗИй плода по периферической крови беременной резус-отрицательной женщины стала возможной вследствие открытия в ней внеклеточной фетальной ДНК (вкфДНК). Основным

«Ж! " ПЦР-ДИАГНОСТИКА • ГИНЕКОЛОГИЯ

источником вкфДНК являются продукты распада и утилизации клеток плода и апоптоза клеток плаценты [8, 12]. ВкфДНК составляет 3—10% от всей циркулирующей в крови беременной внеклеточной ДНК при выделении из плазмы. Чаще всего для пренатального определения резус-фактора плода используют метод ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), который позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять единичные молекулы вкфДНК, полученной из крови матери. Фетальная ДНК находится в кровотоке матери уже с первого месяца беременности, количество ее возрастает с течением беременности [8]. Определение резус-фактора плода методом ПЦР-РВ заключается в выявлении гена RHD, кодирующего D-антиген, на ранних сроках беременности (8—10 недель).

Цель исследования: апробировать и, при необходимости, использовать в работе ЗЛИТТ ГБУ РО «СПК» не-инвазивный пренатальный метод выявления гена RHD в крови матери методом ПЦР в режиме реального времени (Резус-плода).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

В ЗЛИТТ проводили определение резус-фактора плода по крови матери у 24 серологически резус-отрицательных беременных женщин. У всех беременных получено согласие на пренатальное определение резус-фактора плода. Определение гена RHD по крови матери в ЗЛИТТ проводится с февраля 2019 года.

Сроки беременности составляли от 11 до 30 недель: 4 женщины — I триместр; 14 женщин — II триместр; 6 женщин — III триместр. Первая беременность была у 19 женщин, трое имели вторую беременность, двое — третью беременность.

В течение беременности у женщин проводили контроль наличия антител к RHD-антигену. У 20 женщин антирезусные антитела не обнаружены, у 4-х были обнаружены антитела, у 3-х из них титр антител нарастал (у одной — до 1:128, у двух — до 1:256).

Материалом для исследования служила венозная кровь беременной женщины. Взятие крови проводили в вакуумные пробирки типа Vacutte с ЭДТА (4,5 мл). В течение 1,5—2 часов, согласно инструкции, после центрифугирования, автоматическим дозатором отбирали только верхнюю часть плазмы.

Выделение вкфДНК из плазмы проводили комплектом реагентов Проба-НК-фет (ООО «ДНК-технология ТС»).

Одновременно с выделением ДНК через все этапы про-боподготовки приводился отрицательный контрольный образец из комплекта реагентов для выделения ДНК.

Постановка каждого образца ДНК проводилась с использованием реагентов резус-фактора плода на детектирующем амплификаторе «ДТ-лайт» по протоколу производителя. С помощью программного обеспечения учет и интерпретация результатов реакции ПЦР-РВ всегда проводится автоматически. По методике анализируются результаты исследования для каждого образца вкфДНК по 2 экзонам (7 и 10). Анализ образца ДНК проводится в двух пробирках, отрицательного контроля — в трех, положительного контроля — в одной. В итоге программа определяет генотип исследуемого образца вкфДНК с выдачей результатов.

Возможны следующие варианты результатов определения резус-плода:

• ген RHD плода выявлен — резус-фактор плода

генотипически положительный;

• ген RHD плода не выявлен — резус-фактор плода генотипически отрицательный;

• у матери обнаружен ген RHD — выявить ген плода данным методом невозможно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

В результате исследования крови 24 серологически резус-отрицательных беременных женщин был определен резус-фактор плода (в I и II триместрах — у 18, в III триместре — у 6).

У 20 беременных женщин (83,3%) ген RHD плода выявлен — резус-фактор плода генотипически положительный.

У 3 (12,5%) ген RHD плода не выявлен, у плода установлен отрицательный резус-фактор.

У 1 (4,2%) матери (серологически отрицательной) обнаружен ген RHD, выявить ген плода данным методом невозможно. То есть она генотипически является резус-положительной и относится к 1% лиц, у которых нет экспрессии гена RHD на поверхности эритроцитов, и поэтому она серологически определяется как резус-отрицательная.

На данный момент у 15 резус-отрицательных женщин беременность завершилась родами. Один новорожденный родился с резус-отрицательной принадлежностью крови, у 14 женщин новорожденные имели резус-положительный фактор крови, что подтвердило правильность результатов пренатального неинвазивного метода определения резус-фактора плода по крови матери.

С целью оценки качества нашей работы по апробации метода нами продолжается контроль за оставшейся группой беременных женщин, которым по крови пренатально определен резус-фактор плода, для сравнения результатов с резус-принадлежностью рожденных детей.

В случае пренатального определения резус-фактора плода на ранних сроках к ведению беременности и проведению перинатальной профилактики резус-сенсибилизации необходимо подходить дифференцированно. Вероятно, категорию серологически резус-отрицательных женщин, плод у которых является резус-отрицательным, оценивать как не относящуюся к группе риска, и исключить перинатальную профилактику в 28 недель. Женщины серологически резус-отрицательные, у которых плод генотипически является резус-положительным, на протяжении всей беременности должны находиться под наблюдением, так как они относятся к группе риска по возникновению резус-конфликта, и должны выполняться все рекомендации по профилактике ГБП и Н и процедуры по оказанию медицинской помощи.

В заключение можно отметить, что нами, согласно инструкции, апробирован и отработан метод выделения фетальной ДНК из крови матери, основанный на высвобождении нуклеиновых кислот, с последующим осаждением и очисткой.

Была проведена постановка ПЦР-РВ, анализ был выполнен для всех 24 образцов фетальной ДНК. При освоении метода выделения фетальной ДНК мы брали венозную кровь у женщин на разных сроках беременности с целью убедиться, что количество выделенной ДНК достаточно для постановки ПЦР-РВ.

Наш небольшой опыт работы данным методом показал, что пренатальную диагностику желательно проводить на сроках беременности не менее 13 недель, чтобы

получить нужное количество вкфДНК и упростить задачу определения резус-принадлежности плода. Это согласуется с литературными данными [3, 8].

ВЫВОДЫ

• Апробация неинвазивного пренатального метода определения резус-фактора плода по крови серологически резус-отрицательной матери показала его эффективность, воспроизводимость и возможность при необходимости использовать

его в практике ЗЛИТТ ГБУ РО «СПК», имеющей специальное оборудование и условия для его проведения.

• Целесообразно расширить применение метода неинвазивной пренатальной диагностики определения резус-плода в клинической практике для улучшения проведения профилактики резус-сенсибилизации, своевременного прогноза развития резус-конфликта и снижения перинатальной смертности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Тетруашвили Н. К., Милушева А. К., Агаджанова А. А. Проведение профилактики резус-иммунизации у женщин после хирургической коррекции истмико-цервикальной недостаточности // Медицинский совет. — 2018. — №7. — С. 84—86.

2. Минеева Н. В. Группы крови человека / Основы иммуногематологии. — СПб., 2004. — 185 с.

3. Савельева Г. М., Адамян Л. В., Курцер М. А., Сичинава Л. Г., Панина О. Б., Коноплянников А. Г., Тетруашвили Н. К., Михайлов А. В., Филиппов О. С. Резус-сенсибилизация. Гемолитическая болезнь плода: Клинические рекомендации (Протокол). — Письмо МЗ РФ от 18.05.2017 №15—4/10/2—3300.

4. Исханов М. А., Шарипова М. Г., Манабаева Г. К. Профилактика и неинвазивная диагностика гемолитической болезни плода // Universum: медицина и фармакология (электронный научный журнал). — 2019. — №4 (59). — URL: http://7universum.com/ru/med/archive/ item/7477.

5. Борзенкова Е. А., Коханова Д. А., Жиляева Д. В., Ромахова А. Д. Анализ эффективности переливания крови плоду при гемолитической болезни плода // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины. Материалы 76-й международной научно-практической конференции молодых ученых и студентов / Под ред. ЗДН РФ, акад. РАН В. И. Петрова.

6. Белуга М. В. Резус-конфликт: прошлое и настоящее в решении проблемы // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. — 2012. — №1. — С. 24—27.

7. Ворвуль А. О., Гонюкова О. В., Пономарева Н. А. Оценка эффективности профилактики иммунологического конфликта по системе резус / Неделя науки — 2018: Материалы международного форума, посвященного 80-летнему юбилею СтавГМУ. — Ставрополь: СтавГМУ, 2018. — С. 11—13.

8. Трубникова Л. И., Тороповский А. Н., Жмырко Е. В., Никитин А. Г., Бурганова Р. Ф., Лысова О. В. Опыт внедрения в клиническую практику методики неинвазивного пренатального исследования пола и резус-фактора плода на раннем сроке по крови беременной женщины // Ульяновский медико-биологический журнал. — 2015. — №2. — С. 70—77.

9. Румянцев А. Г., Масчан А. А. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению гемолитической болезни новорожденных. — М., 2014. — С. 1—14.

10. Ожерельева М. А., Кравченко Е. Н., Куклина Л. В. Резус-сенсибилизация, гемолитическая болезнь плода и новорожденного. Современные тенденции и перспективы // Акушерство и гинекология. — 2015. — №12. — С. 16—20.

11. Савельева Г. М., Курцер М. А., Сичинава Л. Г., Коноплянников А. Г., Сонголова Е. М., Латышкевич О. А. 50 лет иммунопрофилактике резус-иммунизации: на страже перинатальной заболеваемости и младенческой смертности // Акушерство и гинекология. — http:// dx.doc.org/10.18565/aiq.2018.12. — С. 177—183.

12. Малышева О. В., Баранов В. С. Неинвазивная пренатальная диагностика. Проблемы, подходы и перспективы // Журнал акушерства и женских болезней. — 2012. — Т. LXI. — Вып. 3. — С. 83—93.

13. Перцева Г. М., Борщева А. А., Ищенкова И. В., Гулько Т. М. Иммунологический конфликт по резус-фактору во время беременности. Прошлое и настоящее // Главный врач Юга России. — 2016. — №3 (50). — С. 15—17.

АВТОРСКАЯ СПРАВКА

Государственное бюджетное учреждение Ростовской области «Станция переливания крови» (ГБУ РО «СПК»), e-mail: asublood@yandex.ru.

Палухин Сергей Иванович — кандидат медицинских наук, главный врач ГБУ РО «СПК».

Ищенкова Ирина Владимировна — заместитель главного врача по медицинской части ГБУ РО «СПК».

Кудинова Эльвира Евгеньевна — заведующая зональной лабораторией иммунологического типирования тканей, врач клинической

лабораторной диагностики ГБУ РО «СПК».

Савченко Ольга Алексеевна — врач-лаборант зональной лаборатории иммунологического типирования тканей ГБУ РО «СПК».

Труфанова Татьяна Ивановна — биолог зональной лаборатории иммунологического типирования тканей ГБУ РО «СПК».

Сухорукова Кристина Александровна — врач клинической лабораторной диагностики зональной лаборатории иммунологического

типирования тканей ГБУ РО «СПК». Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ростовский государственный медицинский университет» МЗ РФ (ФГБОУ ВО РостГМУ).

Перцева Галина Маргосовна — кандидат медицинских наук, ассистент кафедры акушерства и гинекологии №1 ФГБОУ ВО РостГМУ,

e-mail: galina.pertsewa2016@yandex.ru.

Борщева Алла Александровна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии №1 ФГБОУ ВО РостГМУ.

КОМПЬЮТЕРНЫЙ ПЛАНТОГРАФИЧЕСКИИ КОМПЛЕКС «КПГ-01»

Комплекс предназначен для проведения полного анато-мо-функционального обследования стопы с автоматической выдачей заключения и рекомендаций по лечению при выявлении патологии.

В состав комплекса входят оптический сканер с подставкой, компьютер, программное обеспечение и принтер. Программой выдается развернутая выписка по всем анализируемым параметрам с изображением стоп и рисунками по ЛФК. Все исследования сохраняются в базе данных.

Возможно использование комплекса, как в стационарных, так и в полевых условиях: в государственных и муниципальных медучреждениях, в частных клиниках и ортопедических кабинетах, в военных комиссариатах, в санаториях, в реабилитационных

центрах, в спортивных учреждениях. Комплекс хорошо себя зарекомендовал в лечебных учреждениях Воронежа, Москвы, Екатеринбурга, Омска, Новосибирска, Минска и др.

КПГ-01 отмечен дипломом победителя на конкурсе инновационных бизнес-проектов «БИТ-ЮГ 2012» (г Астрахань), а также дипломом 1 степени на конкурсе инновационных проектов социально-экономического развития г Волгограда «Лучшие проекты — жителям Волгограда». Он имеет весь необходимый перечень официальных документов.

ООО «Ортопед» 400011, г. Волгоград, ул. Электролесовская, 70Б генеральный директор — д.м.н., профессор А. И. Перепелкин тел. 8-902-311—2860, e-mail: similipol@mail.ru, www.ortoped.org.ru