Кремнеземная матрица для синтеза и иммобилизации биологически активных веществ

3!

Теория и практика Биомединженерии

УДК 54.057

В. Н. Постнов, Е. Б. Наумышева

Кремнеземная матрица для синтеза и иммобилизации биологически активных веществ

Ключевые слова: поверхность, химически модифицированный кремнезем, химическая сборка. Keywords: surface, chemically modified silica, chemical assembly.

Разработана методика синтеза неорганической матрицы с привитыми якорными группами, предназначенными для получения на их поверхности биологически активных веществ (в том числе кардиопротекторных пептидов). Основываясь на методе химической сборки, проведена последовательная обработка поверхности кремнезема 2-фенилэтилтрихлорсиланом, хлорме-тилметиловым эфиром и п-гидроксибензиловым спиртом. Полученная матрица испытана при синтезе модельного дипептида глицилглицина.

Введение

Матрицы на основе химически модифицированных кремнеземов (ХМК) применяются наряду с традиционно используемыми функционализиро-ванными полимерами для синтеза биологически активных соединений, их иммобилизации, а в случае лекарственных препаратов — для доставки к очагу заболевания. ХМК выгодно отличаются от полимерных носителей своими физико-механическими свойствами, размерной стабильностью, химической устойчивостью к действию большинства растворителей, что в совокупности позволяет использовать широкий спектр синтетических подходов, включая метод химической сборки, основанный на многостадийном синтезе с участием органических групп, привитых к поверхности кремнезема.

Цель исследования — разработка методик синтеза кремнеземных матриц с использованием метода химической сборки, предназначенных для синтеза и иммобилизации биологически активных веществ (в том числе пептидов).

Модифицирование поверхности кремнезема фенилэтилсилильными группами

Перед проведением хемосорбции модификатора поверхность кремнезема была предельно гидрокси-

лирована путем кислотной обработки концентрированной соляной кислотой, разбавленной 1 : 3 дистиллированной водой. Затем образец был высушен и выдержан в течение 2 ч при 200 °С для удаления с поверхности физически адсорбированной воды.

Хемосорбцию 2-фенилэтилтрихлорсилана из 10 % бензольного раствора проводили при температуре 80 °С в соответствии со схемой:

Для достижения предельного заполнения поверхности модификатором 2-фенилэтилтрихлор-силан необходимо вводить в реакцию с некоторым избытком. В качестве катализатора реакции использовали триэтиламин, механизм действия которого заключается в образовании водородной связи с водородом силанольной группы на поверхности силохрома. Вследствие такого взаимодействия отщепление водорода при его замещении на 2-фе-нилэтилтрихлорсилан происходит существенно легче.

В соответствии с методикой был взят раствор 10 мл 2-фенилэтилтрихлорсилана в 90 мл бензола, добавлено 5 мл триэтиламина. В смесь поместили 20 г силохрома С-120, затем нагревали до 80 °С в течение 3 ч.

Полученный образец отфильтровали на стеклянном фильтре и высушили.

Состав продуктов модифицирования силикагеля КСК-2 и силохрома С-120 представлен в табл. 1.

Как видно из таблицы, модифицированный силикагель имеет значительно большее содержание привитых групп, что можно объяснить более высокой поверхностью по сравнению с сило-хромом.

Таблица 1 Состав образцов после хемосорбции 2-фенилэтилтрихлорсилана

Образец Содержание привитых групп, ммоль/г

Силохром С-120 — ВЦСИ2)2С6И5 0,36 ± 0,03

Силикагель КСК-2 — 8ЦСИ2)2С6И5 0,79 ± 0,05

Таблица 2 Состав образцов после хлорметилирования

Образец Содержание привитых групп, ммоль/г

Силохром С-120 — 81(СИ2)2С6И4СИ2С1 0,32 ± 0,03

Силикагель КСК-2 — 81(СИ2)2С6И4СИ2С1 0,72 ± 0,05

Не вступившие в реакцию хлорсилильные группы были гидроксилированы путем обработки горячей водой после смачивания этиловым спиртом.

Хлорметилирование привитых фенилэтил-силильных групп

Хлорметилирование привитых к поверхности кремнезема фенилэтилсилильных групп осуществлялось путем взаимодействия данного вещества с хлорметилметиловым эфиром в присутствии катализатора БпС^ (реакция 2), которое является одним из вариантов реакции Блана [2—3].

В термостатируемую ячейку при температуре 57 °С помещали реактор — сосуд, оснащенный обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой. В реактор загружали смесь из 11,45 г носителя, содержащего иммобилизованный 2-фенилэтил-хлорсилан, и 32 мл хлорметилметилового эфира, а также 2,2 мл катализатора БпС^ согласно методике [4]. Продолжительность синтеза 3 ч. В соответствии с рекомендациями методики хлормети-лирования ароматических соединений эфир взят с большим избытком для максимально полного прохождения реакции.

Схема реакции:

он

После проведения реакции носитель отмывали в экстракционном аппарате Сокслета хлористым метиленом, который предварительно был очищен и высушен перегонкой над оксидом фосфора (V). О завершении отмывки свидетельствовало изменение цвета матрицы от темно-бурого до светло-бежевого.

При использовании в качестве кремнеземного носителя для матрицы силикагеля КСК-2 возникли определенные трудности на стадии отмывки после проведения хлорметилирования. Насыщенный темно-коричневый цвет матрицы в конце реакции свидетельствовал о содержании большого количества связанного олова на поверхности, в том чис-

ле в порах носителя. Это объясняется тем, что поверхность КСК-2 существенно более развита, чем у силохрома. Катализатором же при реакции хлор-метилирования являлся хлорид олова (IV), а олово имеет способность связываться с поверхностью кремнеземов, образуя конструкции —О—Бп. Подобное соединение, однако, довольно легко может быть разрушено действием на него сухого хлоро-водорода.

Отмывку проводили перегнанным над щелочью диоксаном на экстракционном аппарате Сокслета в течение 4 ч. При этом сверху через обратный холодильник внутрь аппарата был подан высушенный хлороводород.

Состав продуктов модифицирования представлен в табл. 2.

Иммобилизация п-гидроксибензилового спирта

При разработке методики присоединения к полученной матрице п-гидроксибензилового спирта (реакция 3) за основу был взят метод Ванга [5], используемый для модифицирования полимерных носителей.

В реакционный сосуд положили 30 мг хлорме-тилированного кремнезема, полученного на предыдущей стадии, затем добавили 4,4 мг п-гидро-ксибензилового спирта, 1,8 мг катализатора МаОСИз и небольшое количество растворителя — диметил-ацетамида (1—2 мл). Сосуд с реакционной смесью поместили в термостатируемую ячейку.

Схема реакции:

Согласно работе [6] глубина прохождения данной реакции сильно зависит от температурных условий и времени ее проведения. Для получения наибольшего выхода перед основным синтезом была поставлена серия экспериментов с микроколичествами реагентов. Продолжительность реакции 6

биотехносфера

| № 5(35)/2014

Таблица 3 Состав образцов, модифицированных п-гидроксибензиловым спиртом

Образец Содержание привитых групп, ммоль/г

Силохром С-120 -81(СН2)2С6Н4СН20С6Н4СН20Н 0,09 ± 0,03

Силикагель КСК-2 — 81(СН2)2С6Н4СН20С6Н4СН20Н 0,41 ± 0,05

и 8 ч. Температуру изменяли от 40 до 80 °С через интервал в 10 °С. Согласно статистике наибольший выход соответствует условиям проведения реакции — 6 ч при 60 °С.

В ходе синтеза наблюдались проблемы, связанные с затруднением транспорта растворенного п-гидроксибензилового спирта и катализатора ко всей поверхности кремнеземной матрицы. Очевидно, что в ходе процесса необходимо постоянное перемешивание реакционной смеси. Однако использование механических мешалок затруднено плотностью слоя матрицы в реакторе. Использование же сосуда большого объема требует больших количеств растворителя, что снижает концентрацию в растворе реагентов и негативно сказывается на выходе.

С учетом этих нюансов был изготовлен специальный реактор, предусматривающий мягкое перемешивание реакционной смеси путем барботирова-ния через нее слабого тока инертного газа. Состав продуктов модифицирования представлен в табл. 3.

Как видно из таблицы, содержание якорных групп на силикагеле КСК-2 значительно выше, чем на силохроме С-120, что соответствует существенно большей удельной поверхности силикагеля (312 м2/г) по сравнению с силохромом (116 м2/г). Наличие привитых п-гидроксибензильных групп доказано ИК-Фурье-спектроскопией. Инфракрасный спектр снимали на приборе Регкт-Е1тег 1760х с разрешением 4 см-1 с использованием 20 сканирований. Образец для снятия спектра готовили с КВг. Было установлено, что в спектре присутствует характеристическая полоса 1308 см-1, соответствующая колебанию С—О—Н-связи, которая указывает на наличие синтезированных якорных групп.

Присоединение Fmoc-аминокислот и синтез глицилглицина

Для разработки методики иммобилизации на поверхности неорганических матриц аминокислот и синтеза пептидной последовательности была использована стратегия твердофазного синтеза Мер-рифильда. Синтез включает следующие стадии:

1) присоединение 1-й защищенной с Оконца аминокислоты к поверхности матрицы;

2) деблокирование аминокислоты;

3) присоединение 2-й защищенной аминокислоты;

4) снятие дипептида с поверхности и промывка.

Присоединение глицина

Выбор глицина в качестве аминокислоты для иммобилизации на твердом носителе был сделан нами неслучайно.

Во-первых, это простейшая из алифатических аминокислот, имеющая легко прогнозируемый химизм взаимодействия с функциональными группами матрицы и другими объектами синтеза.

Во-вторых, глицин обладает хорошо изученной биологической активностью и является нейроме-диаторной аминокислотой. Рецепторы к глицину имеются во многих участках головного мозга и спинного мозга. Они, воздействуя на нейроны, уменьшают выделение из них «возбуждающих» аминокислот, таких как глутаминовая кислота, и повышают выделение у-аминомасляной кислоты. Фармакологический препарат на основе глицина оказывает седативное и мягкое антидепрессивное действие, уменьшает чувство тревоги, страха, психоэмоционального напряжения. Иммобилизация глицина на поверхности неорганических носителей, по-видимому, является одним из путей создания лекарственных препаратов пролонгированного действия.

Для иммобилизации использовали М-защищен-ный глицин. Возможность закрепления защищенных аминокислот исследовали, используя метод активированных эфиров. Реакция проводилась в присутствии катализатора 4-диметиламинопиридина.

Для этого 10 мг пентахлорфенилового эфира глицина с Етое-защитой на аминогруппе и 0,5 мг катализатора растворили в ДМФА. Для достижения максимальной концентрации реагентов в растворе количество растворителя было минимальным.

В реактор загрузили 30 мг матрицы, содержащей 4-(гидроксиметил)-феноксиметильные группы и добавили приготовленный раствор аминокислоты и катализатора. Продолжительность синтеза 8 ч. Перемешивание осуществлялось с использованием шейкера.

Схема присоединения аминокислоты:

Матрицу после присоединения глицина промыли на стеклянном пористом фильтре с использова-

Таблица 4 Состав образцов после присоединения глицина

Образец Содержание привитых групп, ммоль/г

Силохром С-120 - 81(СИ2)2С6И4СИ2ОС6И4СИ2—О—а1у 0,029 ± ± 0,0025

Силикагель КСК-2 — 81(СИ2)2С6И4СИ2ОС6И4СИ2ОИ—О—а1у 0,072 ± ± 0,006

Таблица 5  Элементный анализ глицилглицина | C4H8N2Oз

Элемент Теоретическое содержание, % Экспериментальное содержание, %

N 21,22 20,70

С 36,36 36,28

И 6,06 6,15

О 36,36 36,87

нием небольших количеств ДМФА, а затем — этилового спирта. Для деблокирования матрицу с иммобилизованной аминокислотой залили 50%-ным раствором морфолина в ДМФА. Через час носитель промыли ДМФА, а затем спиртом до нейтральной реакции и высушили.

Провели анализ на наличие концевых аминогрупп с использованием красителя кислотного ярко-оранжевого Ж, а также нингидриновый тест [7]. Оба анализа показали наличие аминогрупп на поверхности носителя.

Содержание глицина, определенное с помощью красителя кислотного ярко-оранжевого Ж, приведено в табл. 4. Как видно из представленных данных, содержание глицина на силикагеле КСК-2 существенно выше, чем на силохроме С-120. В связи с этим пептидный синтез был проведен с помощью кремнеземной матрицы, полученной на основе си-ликагеля КСК-2.

Синтез глицилглицина

Следующая стадия синтеза — получение на поверхности кремнеземной матрицы модельного ди-пептида — глицилглицина.

Сорбцию второй аминокислоты проводили на матрице, содержащей деблокированный эфир глицина.

В реактор поместили 1 г носителя, содержащего иммобилизованный деблокированный эфир глицина, добавили 2 мл раствора пентахлорфенило-вого Етое-глицина в ДМФА, содержащего 100 мг защищенной аминокислоты. Продолжительность синтеза 8 ч. Перемешивание осуществлялось при помощи шейкера.

Затем проводили промывку и деблокирование. Полученный дипептид удалили с поверхности путем обработки носителя 99% -ной трифторуксусной кислотой в течение 2 ч.

Чистота пептида проверена методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) со свидетелем. В качестве свидетелей служили глицин и глицилглицин. Для проявления хроматограммы использовали раствор нингидрина в ацетоне.

Результат ТСХ показал, что продукт является гомогенным, на хроматограмме полученного про-

дукта наблюдалось одно пятно, положение которого соответствовало положению пятна свидетеля — глицилглицина. Величина составила 0,219. Температура плавления полученного дипептида соответствует литературным данным и составляет 261 °С.

Экспериментальные данные, полученные с помощью элементного анализа (табл. 5), были близки к теоретическим значениям, что подтверждает количественный состав элементов в глицилглицине.

Таким образом, была продемонстрирована возможность использования неорганических матриц на основе кремнезема, содержащих 4-(гидроксиметил)-феноксиметильные группы, для пептидного синтеза и отделения пептидов под действием мягких кислотных реагентов. Помимо этого, использование в качестве матрицы наноразмерного кремнезема позволяет получать лекарственные препараты для адресной доставки кардиопротекторов в зону повреждения миокарда [8].

Выводы

Разработана методика синтеза кремнеземных матриц с привитыми п-гидроксибензильными группами и установлена возможность их применения для иммобилизации глицина и синтеза модельного дипептида глицилглицина. Очевидно, что данная методика может быть использована для синтеза нанодисперсных кремнеземных носителей лекарственных препаратов, обеспечивающих их отделение в мягких условиях.

Работа выполнена на базе оборудования Ресурсного центра Санкт-Петербургского государственного университета «Инновационные технологии композитных наноматериа-лов».

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-15-00473).

Литература

1. Постнов В. Н. Матричный синтез на кремнеземе и его использование для получения сорбентов и катализаторов. СПб.: Изд-во СПбГУ, 2003. С. 207-251.

2. Вацуро К. В., Мищенко Г. Л. Именные реакции в органической химии. М.: Химия, 1976. 528 с.

биотехносфера

| № 5(35)/2014

42

Теория и практика Биомединженерии

3. Мищенко Г. Л., Вацуро К. В. Синтетические методы орга- 6. нической химии. М., 1982. 440 с.

4. Постнов В. Н. Синтез неорганических матриц методом молекулярного наслаивания и исследование их реакционной 7. способности в процессе сорбции аминокислот: Автореф.

дис. ... канд. хим. наук. Л., 1978. 24 с. 8.

5. Wang S. p-Alkoxybenzyl alcohol resin and p-alkoxybenzy-loxycarbonylhydrazide resin for solid phase synthesis of protected peptide fragments // J. Am. Chem. Soc. 1973. N 95 (4). P. 1328-1333.

Improved synthesis of 4-alkoxybenzyl alcohol resin / G. Lu, S. Mojsov, J. Tam and R. Merrifield // J. Org. Chem. 1981. N 46 (17). P. 3433-3436.

Химия полипептидов // Под ред. П. Катсояниса. М.: Мир, 1977. 462 с.

Passive targeting of ischemic-reperfused myocardium with adenosine-loaded silica nanoparticles / M. Galagudza, D. Korolev, V. Postnov, E. Naumisheva [et al.] // International Journal of Nanomedicine. 2012. N 7. P. 16711678.

УДК 06.54.31

К. Н. Семенов, Н. А. Чарыков, В. Н. Постнов, И. В. Мурин

Синтез и идентификация фуллеренолов, полученных из нитро- и бромпроизводных С60

Ключевые слова: фуллеренол, синтез, идентификация, растворимость. Keywords: fullerenols, synthesis, identification, solubility.

Проведен синтез водорастворимых производных — фуллеренола-Ы, полученного из нитро-производного С^о, и малорастворимого в воде фуллеренола-В, полученного из бромпроизводно-го С60. Идентификация фуллеренола-Ы и -В проведена методами электронной и инфракрасной спектроскопии, а также масс-спектрометрии. Актуальность изучения фуллеренолов связана с возможностью их применения в медицине, биологии, косметологии, пищевой промышленности и т. д.

Введение

Легкие фуллерены (С60 и Су0) применяют в самых различных областях науки и техники, а именно: материаловедении, механике, машиностроении, строительстве, электронике, оптике, медицине, фармакологии, пищевой и косметической промышленности и т. п. (см., например, обзорные работы [1, 2]). Однако их широкое применение зачастую тормозится практически полной несовместимостью легких фуллеренов с водой и водными растворами. Например, истинная растворимость фуллерена С60 в воде при 25 °С составляет 1,3х10-11г/л, а фулле-

рена С70 в тех же условиях — 1,1х10-13 г/л [2-4]. То же относится и к большинству производных легких фуллеренов (галоген- [фтор-, хлор-, бром- и иод-], оксо-, амино-, карбоксо- и т. п.) — они, как правило, весьма малорастворимы в воде и водных растворах (см., например, [3, 4]).

Между тем водорастворимые формы производных фуллеренов могут находить самое широкое применение в машиностроении (в водорастворимых охлаждающих и антифрикционных составах), строительстве (в качестве растворимых присадок к цементам и бетонам), медицине и фармакологии (вследствие хорошей совместимости с водой, физиологическими растворами, кровью, лимфой, желудочным соком и т. д.), косметологии (при использовании водных и водно-спиртовых основ), а также в других областях науки и техники.

К фуллеренолам имеет смысл относить не только гидроксилированные производные самого легкодоступного из всех фуллеренов (С60)—С60(ОН)^, но и производные всех других индивидуальных фуллеренов Сп(ОН)х (п = 60, 70, 76, 78, 84, 90...), причем, помимо собственно гидроксильных групп, в фуллеренолы могут входить некоторые иные не-гидроксильные группы, например кислородные (=О, -О) Сп(ОН)^Оу, солевого типа, например