Изучение гидролиза коллагенсодержащего сырья протеолитическими ферментами

УДК 664

Э. Ш. Юнусов, В. Я. Пономарев, С. А. Морозова, Г. О. Ежкова

ИЗУЧЕНИЕ ГИДРОЛИЗА КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ

Ключевые слова: биотехнологическая модификация, ферментные препараты, микробные протеазы.

Изучено действие протеолитических ферментных препаратов различного происхождения на белковые субстраты, полученные из коллагенсодержащего сырья. Оценена степень эффективности воздействия протеаз на коллаген, оценено накопление продуктов ферментативного гидролиза, установлена степень гидролиза под действием различных препаратов. На основании проведенных исследований сделан вывод о перспективах применения протеолитических ферментов для целенаправленного воздействия на белки соединительной ткани.

Keywords: emulsified meat products, biotechnological modification, enzyme preparations.

The effect of proteolytic enzyme preparations at the various protein substrates origin derived from collagen raw material. Assess the degree of effectiveness of the impact of proteases on collagen accumulation estimated enzymatic hydrolysis products, the degree of hydrolysis is set under the influence of various drugs. On the basis of the research concluded that the prospects for the use ofproteolytic enzymes to deliberate action on the connective tissue proteins.

Введение

Коллаген - это уникальный по своей природе белок, обнаруживаемый во всех тканях в многообразных формах и разновидностях. Большое количество коллагена содержится в соединительной ткани.

Соединительная ткань - одна из основных тканей, распределенных по всему телу, и входящая в состав связок, сухожилий, хрящей, мочеточников, является фиксатором кровеносных сосудов и входит в состав межклеточного вещества в печени и мышцах, составляя его основу. Одна из основных функций заключается в том, что она принимает участие в образовании органов и исправлении их повреждений. Соединительная ткань является важнейшим компонентом мяса и мясопродуктов, что объясняется ее массовым выходом, который составляет 16% мясной туши. Таким образом, главным и основным источником коллагена является коллагенсодержа-щее сырье, получаемое и используемое в мясной промышленности [1].

Использование данного сырья без предварительной обработки в пищевой промышленности сопряжено с рядом трудностей, связанных с его низкой пищевой и биологической ценностью. В настоящий момент основной путь использования коллагенсо-держащего сырья при производстве пищевых продуктов - это его термическая обработка, в процессе которой образуются продукты гидролиза коллагена. Данный способ обработки сырья широко применяется при выработке целого ряда продуктов, таких как студни и зельцы [2].

Тем не менее, поиск путей решения проблемы более полного и рационального использования кол-лагенсодержащего сырья представляет значительный научно-практический интерес [3].

Практически любой существующий способ переработки сырья, богатого соединительной тканью, предусматривает расщепление макромолекул белка до входящих в него мономеров. Получаемые при этом белковые гидролизаты содержат ценные в биологическом плане соединения, такие как полипептиды и свободные аминокислоты.

Следует отметить, что потенциальное использование таких продуктов не ограничивается пищевой промышленностью, имеются литературные сведения о том, что продукты переработки коллагена успешно применяются в медицине при лечении ран и ожогов, а также в косметологии в качестве компонентов кремов [4].

Среди существующих способов получения белковых гидролизатов наиболее перспективным считается ферментативный гидролиз. Его особенностью, в отличии от химических способов, является проведение гидролиза при температуре 35-50 °С и атмосферном давлении. При этом не происходит разрушение аминокислот и их рацемизация.

Протеолитические ферменты являются ферментами микробного происхождения и составляют примерно половину производства всех ферментных препаратов на мировом рынке. С годами получают новые виды, и их число постоянно увеличивается, пополняется. Однако именно в нашей стране существует проблема по производству ферментных препаратов, применяющихся именно в мясной промышленности для обработки мясного сырья.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили модельные белковые субстраты, полученные из коллагенсодер-жащего сырья мясной промышленности - жилы говяжьи обработанные в замороженном состоянии [5]. Использовались белковые субстраты из коллагенсо-держащего сырья, а также модельные субстраты для специфического воздействия ферментных препаратов на белковые комплексы.

Для исследований было выбрано четыре вида ферментных препаратов. Перечень используемых препаратов представлен в таблице 1. Дозировка ферментных препаратов составила 0,1 % масс.

Анализ воздействия выбранных ферментных препаратов на белковые фракции субстрата вели на спектрофотометре, регистрируя спектры поглощения хромофоров в диапазоне длин волн 200-800 нм согласно методике [6].

Таблица 1 - Перечень используемых ферментных препаратов

Образец Наименование ферментных препаратов

1 Коллагеназа

2 Мегатерин Г10Х

3 Протосубтилин Г10х

4 Протеиназа Bac. pumilus

Результаты исследований и обсуждение

Для оценки эффективности воздействия ферментного препарата на коллаген, который является основным белком соединительной ткани, нами были получены коллагеновые массы в соответствии с методикой [5]. Опыты вели согласно методике, инкубируя полученный коллаген и ферментные препараты в течение 12 часов при температуре 36 °С.

При обработке коллагена ферментными препаратами в водной вытяжке фиксировалось накопление продуктов гидролиза в диапазоне длин волн 200-300 нм, 380-400 нм. Данные длины волн характерны для высокомолекулярных продуктов гидролиза коллагена, а также ряда аминокислот.

В данном диапазоне волн наблюдался пик с максимумом, отмеченным для ферментных препаратов Протосубтилин Г10х и Мегатерин Г10х. Можно предположить, что наблюдаемая картина обусловлена гидролизом балластных компонентов, входящих в состав коллагеновой массы, что и объясняет более эффективное воздействие Протосубтилина Г10х и Мегатерина Г10х по сравнению с коллагеназой.

На рисунке 1 показана спектрометрия низкомолекулярных продуктов гидролиза коллагена в процессе ферментативной обработки. Опыты вели с внесением трихлоруксусной кислоты после инкубирования субстрата с исследуемыми ферментными препаратами. Как видно из полученных результатов, наиболее интенсивное накопление продуктов гидролиза отмечено при обработке коллагена ферментными препаратами Мегатерин Г10Х и Коллагеназа. Установлено накопление продуктов гидролиза в диапазоне длин волн 250-300 нм, что соответствует коэффициентам поглощения аминокислот.

Рис. 1 - Спектрометрия низкомолекулярных продуктов гидролиза коллагена, обработанного ферментными препаратами различного происхождения

На следующем этапе работы для уточнения характеристик гидролиза и выяснения степени гидролиза коллагена были проведены исследования по установлению интенсивности протекающих процессов под действием протеолитических ферментных препаратов.

Результаты представлены на рисунках 2-3. Коллаген инкубировали с ферментными препаратами в течении 24 часов при 36 °С и определяли продукты гидролиза на спектрофотометре. Оценку вели биу-ретовым методом, который позволяет оценить как количество белка, так и количество высокомолекулярных продуктов гидролиза. Наибольшее количество высокомолекулярных продуктов гидролиза было отмечено при обработке ферментным препаратом Мегатерин Г10Х.

При этом следует отметить, что при оценке белка по методу Бредфорда наблюдалось значительное снижение количества белка. Результаты представлены на рисунке 2.

Рис. 2 - Содержание белка в продуктах гидролиза коллагена в процессе ферментативной обработки

Наиболее интенсивно гидролиз протекал под действием ферментных препаратов Мегатерин Г10Х и Коллагеназа. Согласно полученным данным степень гидролиза составила 60-66%.

При инкубировании коллагена происходит экстрагирование в водную фракцию фибриллярных белков и высокомолекулярных пептидов, которые являются составной частью соединительной ткани. В процессе ферментативного гидролиза наблюдается гидролиз белков и пептидов с образованием низкомолекулярных продуктов гидролиза, регистрируемых при длине волны 540 нм биуретовым методом.

Оценивая накопление продуктов гидролиза, следует отметить, что при использовании Коллагеназы наблюдалось наибольшее количество низкомолекулярных продуктов, что подтверждается данными на рис. 3.

На завершающем этапе работы были проведены исследования по определению степени гидролиза коллагена. Оценку вели после инкубирования коллагена с ферментным препаратом в течение 18 часов. Результаты, представленные на рисунке 4, свидетельствуют о том, что применение ферментных препаратов Мегатерин Г10Х и Коллагеназа наиболее целесообразно для обработки коллагенсодержа-щего сырья. Согласно предоставленным данным степень гидролиза составила 12,5 % для Коллагена-

зы и 8,5 % для препарата Мегатерин Г10х. Для остальных ферментных препаратов степень гидролиза находилась в диапазоне 3-5 %.

Рис. 3 - Содержание низкомолекулярных продуктов гидролиза коллагена в процессе ферментативной обработки

Рис. 4 - Степень гидролиза коллагена в процессе ферментативной обработки

Резюмируя вышеизложенное можно сделать вывод, что среди рассматриваемых ферментных препаратов наибольшее предпочтение следует отдать препарату Мегатерин Г10Х, который, несмотря на то, что показал несколько худшие результаты по сравнению с Коллагеназой, обладает рядом преимуществ, таких как:

- высокий уровень протеолитической активности;

- доступность источников;

- температурный и рН оптимум действия, совпадающий с естественным рН мяса.

Таким образом, в ходе работы была теоретически дополнена и экспериментально подтверждена научная концепция использования ферментных препаратов для регулирования функционально-технологических свойств, обеспечивающих стабильность качества изделий из мясного сырья. Вышеперечисленные преимущества позволяют использовать ферментный препарат Мегатерин Г10х для обработки сырья с повышенным содержанием соединительной ткани. Исследование возможности применения данного препарата для обработки мясного сырья с повышенным содержанием соединительной ткани позволит расширить сырьевую базу для производства мясопродуктов и создать перспективу для создания эффективных биотехнологий в мясной отрасли.

Полученные данные хорошо соотносятся с исследованиями, ранее проведенными на кафедре ТММП КНИТУ, а также с литературными данными.

Литература

1. В.Я. Пономарев, Э.Ш. Юнусов, Г.О. Ежкова, О.А. Решетник, Биотехнологические основы применения препаратов микробиологического синтеза для обработки мясного сырья с пониженными функционально-технологическими свойствами. КГТУ, Казань, 2009. 192с.

2. Рогов И.А., Забашта А.Г., Казюлин Г.П.Технология мяса и мясных продуктов. Книга 1. Общая технология мяса. - Учебник — М.: КолосС, 2009. — 565 с.

3. Пономарев В.Я., Юнусов Э.Ш., Ежкова Г.О., Вестник Казанского технологического университета. 23 (Т.15), 132-134, (2012);

4. Антипова Л.В., Глотова И.А. Использование вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности. - СПБ: ГИОРД, 2006.-384 с.

5. Патент РФ 2232515. Способ изготовления сухого рыбного коллагена / Чертова Е.Н., Заметалина Л.Г.; Заявл. 20.02.2012. Опубл. 20.01.2013. Бюл. № 2.

6. Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов, Методы исследования мяса и мясных продуктов. Колос, Москва, 2001. 376 с.

© Э. Ш. Юнусов - к.б.н., доцент кафедры ТММП КНИТУ, ed.yunusov@gmail.com; В. Я. Пономарев - к.т.н., доц. той же кафедры, v.y.ponomarev@gmail.com; С. А. Морозова - магистрант той жекафедры; Г. О. Ежкова - д.б.н., проф., зав. каф. ТММП КНИТУ, egkova@kstu.ru.

© E. Sh. Yunusov, Ph.D., assistant professor. Dep. technology of meat and dairy products of KNRTU, ed.yunusov@gmail.com; V. Ya. Ponomarev, Ph.D., assistant professor. the same Department,v.y.ponomarev@gmail.com; S. A. Morozova, undergraduate the same Department; G. O. Ezhkova, Doctor of Sc., Professor Dep. technology of meat and dairy products of the Institute of Food Production and Biotechnology KNRTU, egkova@kstu.ru.

Все статьи номера поступили в редакцию журнала в период с 10.09.16. по 20.12.16.