Моделирование реакции стромальных стволовых клеток и мононуклеаров крови на имплантаты как основа для прогноза клинической эффективности инженерии костной ткани

сроке клеток, экспрессирующих СК19 не обнаружено. На сроке 11,5 нед. гестации СК19 экспрессировали все клетки островков Лангерганса. С 15-й нед. гестации количество СК19+ клеток в островках уменьшалось. А в постнатальном периоде в островках присутствовали лишь единичные СК19+ клетки.

В ходе исследования мы установили, что в процессе развития поджелудочной железы количество СК19+ клеток в островках Лангерганса уменьшается. Это уменьшение мы связываем с дифференцировкой СК19+ клеток в островках. Кроме того, мы еще раз подтвердили, что клетки островков поджелудочной железы развиваются из протокового эпителия.

И.А. Хлусов1-4, Н.В. Рязанцева1-5, O.E. Чечина1 5,

Е.В. Сазонова1, А.К. Биктасова1, Н.М. Шевцова1,

М.Ю. Хлусова1, Ю.П. Шаркеев а,В.Ф. Пичугин 3,

Е.В. Легостаева а, К.В. Зайцев 4 Н.В. Литвяков 4 К.А. Нечаев 4, М.В. Дворниченко 4, Е.Н. Больбасов 4 Т.В. Саприна 1 4, Н.Ю. Захарова 4 Моделирование реакции стромальных стволовых клеток и мононуклеаров крови на имплантаты как основа для прогноза клинической эффективности инженерии костной ткани

1 Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия

2 Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск, Россия

3Н0Ц «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при ТПУ и СибГМУ, Томск, Россия 4 Томский филиал РНЦ ВТО им. акад. ГА. Илизарова Росмедтехнолотий, Томск, Россия 5Н0Ц молекулярной медицины СибГМУ Росздрава,

Томск, Россия khlusov63@mail.ru

I.A. Khlusov, N.V. Ryazantseva, O.E. Chechina, E.V. Sazonova,

AK. Biktasova, N.M. Shevtsova, M.Yu. Khlusova,

Yu.P. Sharkeev, V.F. Pichugin, E.V. Legostaeva,

K.V. Zaytsev, N.V. Litvyakov, K.A. Nechaev, M.V. Dvornichenko, E.N. Bolbasov, T.V. Saprina, N.Yu. Zaharova Modelling of stromal stem cells and blood mononuclear leukocytes reaction to implants as a base of clinical efficacy prognosis of bone tissue engineering

Цели исследования: 1) изучение in vitro секреции цитокинов, процессов апоптоза и продукции активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах, топографии и некоторых параметров искусственных микротерриторий, способствующих дифференцировке ММСК в остеогенном направлении при контакте с имплантатами с кальцийфосфатными (КФ) покрытиями; 2) оценка in vitro связи морфофункциональных и молекулярно-генетических параметров культуры мононуклеаров крови с клиническими вариантами несовершенного остеогенеза (НО), сроками реабилитационного периода (клиническим эффектом терапии), возможностью прогнозирования степени воспалительного (остеолитического) ответа.

Материал и методы. Применяли подложки из наноструктурного титана с двусторонними КФ покрытиями, на которые наносили культуру пренатальных фибро-бластоподобных клеток легкого (источник ММСК) или мононуклеаров периферической крови здоровых добровольцев или пациентов с НО, полученных центрифугированием на градиенте плотности 1,077 г/см3 Ficoll-Paque. Культивирование мононуклеаров крови больных НО осуществляли на титановых дисках с дву-

сторонними композитными КФ и полимерными (тефлоновыми) покрытиями. Концентрацию молекулярных маркеров в супернатантах определяли с помощью наборов для ИФА. Морфологию окрашенных клеток на поверхности имплантатов исследовали с помощью растровой электронной и оптической микроскопии в отраженном свете.

Результаты. Согласно секреторной активности культуры клеток (остеокальцин, щелочная фосфатаза), ММСК, напрямую взаимодействующие с КФ дисками, получают преимущество в проявлении остеобластоподобной функциональной активности, по сравнению с культурой клеток на пластике. КФ шероховатые поверхности стимулируют формирование 30-культуры фибробластоидных клеток человека. Клетки, позитивно окрашивающиеся на кислую фосфатазу, располагаются на сферолитах, клетки, воспринимающие щелочную фосфатазу (ЩФ, маркер остеобластов), заселяют углубления («ниши») искусственной поверхности. При этом «ниша» для индукции остеогенной дифференци-ровки ММСК человека является, по-видимому, структурно-функциональным понятием, выражающимся в соотношении площади окраски клеток на ЩФ к площади занимаемой ею территории.

Тестируемые материалы обладают хорошей биосовместимостью на клеточно-молекулярном уровне, поскольку не вызывают увеличения апоптоза мононуклеаров крови и концентраций внутриклеточных АФК. Секреторная активность культуры стромальных клеток не зависела от шероховатости (Ra) КФ покрытий. В то же время, выявлена тесная связь Ra с секрецией мо-нонуклеарами крови TNF— (г = -0,80; р = 0,01; п=9), П-2 (г =0,69; р = 0,04; п = 9) и IL-4 (г =0,83; р=0,006; п = 9).

В периферической крови у больных НО циркулирует значительное количество клеток, проявляющих при культивировании в остеогенной среде на пластике фибробластоидную морфологию, окраску на кислую фосфатазу, выраженную активность в отношении образования CrossLaps по мере нарастания клинической тяжести заболевания. Материал имплантата является триггером индивидуальных молекулярных процессов, связанных с соотношением остеолитических (CrossLaps) и остеобластических (остеокальцин) реакций, характерных для костного ремоделирования. При контакте in vitro мононуклеаров больных НО с композитными материалами экспрессия гена RANTES может оказаться эффективной в развитии методов прогнозирования степени воспалительного (остеолитического) ответа, тогда как экспрессия гена CCR5 — репаративного ремоделирования костной ткани в ответ на клиническое применение различных имплантатов.

Выводы. 1. Клетками, регулирующими процессы приживления/отторжения имплантатов с разной шероховатостью, являются, в первую очередь, мононуклеа-ры крови.

2. При контакте с искусственной поверхностью ММСК активно проявляют остеобластный фенотип при наличии структурно-функциональных единиц (искусственных остеогенных микротерриторий).

3. Выявленные изменения параметров культуры мононуклеарных клеток крови могут рассматриваться как вероятные маркеры и предикторы тяжести НО и сроков реабилитационного периода пациентов

Исследование выполнено при поддержке ФЦП (гос-контракт 02.512.11.2285 от 10.03.2009), грантов РФФИ № 09-04-00287а и № 09-04-99105-р^офи.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010