СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗ И СУБСТРАТНАЯ СМЕСЬ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗ
METHOD OF DETERMINING PEROXIDASE ACTIVITY AND SUBSTRATE MIXTURE FOR DETERMINATION OF PEROXIADSE ACTIVITY

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при создании аналитических наборов, основанных на применении реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой пероксидазами (A.Roda, M. Guardigli, Analytical chemiluminescence and bioluminescence: latest achievements and new horizons // Analyt. Bioanal. Chem. 2012. Vol.402, P.69-76; C.A.Marquette, L.J.Blum, Chemiluminescent enzyme immunoassays: a review ofbioanalytical applications // Bioanalysis. 2009, Vol.1, P.1259-1269; патент США №0192736. 2002). Определение пероксидазной активности наиболее часто используется в биохимических и иммуноферментных наборах для определения разнообразных биологически активных веществ.
Активность пероксидазы в большинстве случаев определяется с помощью колориметрического метода с использованием хромогенных субстратов. Хотя применяются различные субстраты пероксидазы, наиболее популярным из них является 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Однако в тех случаях, где требуется снижение предела обнаружения и расширение рабочего диапазона анализа, используется хемилюминесцентный метод определения активности пероксидазы.
В основе хемилюминесцентного метода определения пероксидазной активности лежит реакция окисления люминола пероксидом водорода, протекающая в щелочной среде. Известно, что пероксидаза, выделенная из корней хрена (ПХ), является малоактивным катализатором данной реакции (Thorpe G.H.G., Kricka L.J. // Meth. Enzymol. 1986. Vol.133. Part В. Р.331-353). Пероксидаза сои (ПС), хотя и является более активным катализатором по отношению к люминолу (I.S.Alpeeva, I.Yu.Sakharov // J. Agric. Food Chem. 2005. Vol.53. P.5784-5788), все же и этот фермент проявляет низкую каталитическую эффективность для его практического применения.
Ранее было установлено, что широкий круг соединений, включающий производные 6-гидроксибензотиазолов, замещенные фенолы, нафтолы и анилины, способен ускорять реакцию пероксидазного окисления люминола (G.H.G.Thorpe, L.J.Kricka, E.Gillespie, R.Moseley, R.Amess, N.Buggett, T.P.Whietehead // Anal. Biochem. 1985. Vol.145. P.96-100; T.J.N.Carter, C.J.Groucutt, R.A.W.Stott, G.H.G.Thorpe, T.P.Whitehead // Europ. patent 87959, 1982; G.H.G.Thorpe, L.J.Kricka, R.Moseley, T.P.Whietehead // Clin. Chem. 1985. Vol.31. P.1335-1341). Субстрат-усилитель и люминол при совместном окислении проявляют синергизм, который выражается в неаддитивности наблюдаемого сигнала и сигналов для индивидуального окисления субстратов. Усиление хемилюминесценции может достигать нескольких сотен раз и зависит от природы субстрата-усилителя, концентраций реагентов и условий проведения реакции (G.H.G.Thorpe, L.J.Kricka // Meth. Enzymol. 1986. Vol.133. Part В. Р.331). Наибольшим усиливающим эффектом обладает 3-(10'-фенотиазинил)пропан-1-сульфанат натрия (ФТПС), используемый совместно с 4-аминопиридинами (E.Marzocchi, S.Grilla, L.Della Ciana, L.Prodi, M.Mirasoli, A.Roda // Anal. Biochem. 2008. Vol.377. P.189-194; M.M.Vdovenko, L.Delia Ciana, I.Yu.Sakharov // Anal. Biochem. 2009. Vol.392. P.54-58; патент США №7855287, 2010; патент США №0053200, 2011).
В работах по изучению реакции усиленной хемилюминесценции (J.Lind, G.Merenyi, Т.Е.Eriksen // J. Amer. Chem. Soc. 1983. Vol.105. P.7655; S.B.Vlasenko, A.A.Arefyev, A.D.Klimov, B.B.Kirn, E.L.Gorovits, A.P.Osipov, E.M.Gavrilova, A.M.Yegorov // J. Biolum. Chemilum. 1989. Vol.4. P.164; P.M.Easton, A.C.Simmonds, A.Rakishev, A.M.Egorov, L.P.Candeas // J. Amer. Chem. Soc. 1996. Vol.118. P.6619) был постулирован следующий механизм совместного окисления люминола и усилителя. На первом этапе протекает ряд реакций ферментативного окисления усилителя в соответствии с «пинг-понг» механизмом:
2
2
E+HO⇒EI
•
EI+SH⇒EII+S
•
EII+SH⇒E+S,
•
где SH - субстрат-усилитель, S - радикальный продукт окисления субстрата-усилителя, Е, EI и EII - различные формы пероксидазы.
В дальнейшем протекает ряд неферментативных реакций, основными из которых являются окисление радикалами усилителя молекул аниона люминола, образование диазохинона люминола при взаимодействии радикалов люминола с кислородом или в процессе диспропорционирования радикалов люминола, образование пероксида люминола при взаимодействии радикалов люминола с супероксидными радикалами или взаимодействии диазохинона люминола с анионом пероксида водорода и распад пероксида люминола на азот и 3-аминофталат, находящийся в электронно-возбужденном состоянии. Переход 3-аминофталата в базовое состояние сопровождается выбросом кванта света. Указанные реакции представлены ниже в виде химических уравнений:
•
-
•-
S+AH⇒SH+A
•-
•-
2
2
A+O⇒A+O
•-
•-
+
-
2
2
A+O +H⇒AOH
•-
-
2A⇒A+AH
2
2
-
-
A+HO ⇒AOH
2
2
-
AOH⇒3-AP+N+H+hν,
-
•-
-
2
где АН - анионная форма люминола в щелочной среде. А - радикальный продукт окисления люминола, А - диазохинон люминола, AOH - пероксид люминола и 3-АР - 3-аминофталат.
Хотя использование реакции усиленной хемилюминесценции позволило разработать высокочувствительный метод определения пероксидазной активности, все же в ряде случаев биоаналитическая практика требует повышения чувствительности данного метода анализа.
Задачей изобретения является разработка высокочувствительного метода определения ферментативной активности пероксидазы.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения активности пероксидаз, включающем приготовление субстратной смеси, состоящей из буферного раствора, люминола, пероксида водорода, 4-аминопиридинов и усилителя, введение в субстратную смесь пероксидаз с последующей регистрацией интенсивности образующегося свечения, согласно изобретению в качестве усилителя используют N-карбоксипроизводные фенотиазина, при этом рН буферного раствора составляет 7,9-9.0.
Поставленная задача решается также тем, что используемая в способе субстратная смесь характеризуется перечисленным выше составом в следующих конечных концентрациях компонентов:
Буферный раствор 10-125 мМ
Люминол 0.05-8 мМ
Пероксид водорода 0.05-8 мМ
4-аминопиридины 0.1-10 мМ
N-карбоксипроизводные фенотиазина 0.1-10 мМ,
при этом в качестве N-карбоксипроизводных фенотиазина используют N-карбоксифенотиазин, или N-(карбоксиметил)фенотиазин, или N-(2-карбоксиэтил)фенотиазин, или N-(3-карбоксипропил)фенотиазип, а в качестве 4-аминопиридинов используют 4-морфолинопиридин, или 4-диметиламинопиридин, или 4-пирролидинопиридин.
Таким образом, способ определения активности пероксидаз с хемилюминесцентной детекцией предусматривает проведение реакции ферментативного окисления люминола пероксидом водорода в присутствии 4-аминопиридинов, пероксидаз и усилителя, где в качестве усилителя используют N-карбоксипроизводные фенотиазина. В качестве 4-аминопиридинов предпочтительно используются 4-морфолинопиридин, 4-диметиламинопиридин и 4-пирролидинопиридин.
Применение N-карбоксипроизводных фенотиазина в качестве усилителя вместо 3-(10'-фенотиазинил)-пропап-1-сульфоната, используемого в методе-прототипе для хемилюминесцентного определения активности пероксидаз, позволило резко повысить чувствительность разрабатываемого метода анализа.
В настоящее время отсутствует теоретическая база, которая могла бы предсказать появление новых высокоэффективных усилителей пероксидаза-зависимой хемилюминесценции. В связи с чем решение поставленной задачи связано с проведением научно-исследовательской и экспериментальной работы, результатом которой стало обнаружение того, что N-карбоксипроизводные фенотиазина являются высокоэффективными усилителями. Подтверждением «неочевидности» найденного решения является также обнаружение того факта, что другие исследованные нами производные фенотиазина, а именно дипразин, хлорацизин, нонахлазин, этацизин и перфеназин, не обладали свойствами усилителя пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.
Заявляемый способ определения активности пероксидаз включает приготовление субстратной смеси, введение в субстратную смесь пероксидаз с последующей регистрацией интенсивности образующегося свечения. При этом субстратная смесь имеет следующий состав компонентов с их конечной концентрацией:
Буферный раствор 10-125 мМ
Люминол 0.05-8 мМ
Пероксид водорода 0.05-8 мМ
4-аминопиридины 0.1-10 мМ
N-карбоксипроизводные фенотиазина 0.1-10 мМ.
Наилучший результат достигается при рН буферного раствора, выбранном из интервала значений 7,9-9,0, и при использовании в качестве N-карбоксипроизводных фенотиазина N-карбоксифенотиазина, или N-(карбоксиметил)фенотиазина, или N-(2-карбоксиэтил)фенотиазина, или N-(3-карбоксипропил)фенотиазина, а также при использовании в качестве 4-аминопиридинов - 4-морфолинопиридина или 4-диметиламинопиридина или 4-пирролидинопиридина.
В процессе реализации способа происходят следующие реакции:
а) реакция пероксидазы с пероксидом водорода с образованием Соединения I;
б) реакция Соединения I с N-карбоксипроизводными фенотиазина с образованием катион-радикала производных фенотиазина;
в) реакции катион-радикала производных фенотиазина с люминолом с образованием 3-аминофталата и формирования хемилюминесценции.
Применение N-карбоксипроизводных фенотиазина в качестве усилителей в реакции ферментативного окисления люминола пероксидом водорода позволяет проводить определение активности пероксидаз растений с высокой чувствительностью.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример №1.
В 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-(2-карбоксиэтил)фенотиазин и 4-морфолинопиридин в концентрациях 1, 3, 5.2 и 9.3 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы составила 525150 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы (чувствительность метода определения пероксидазы численно равен тангенсу калибровочной кривой в ее рабочем диапазоне).
Пример №2.
В 60 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-(2-карбоксиэтил)фенотиазин и 4-морфолинопиридин в концентрациях 0.5, 3, 4.2 и 7.5 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 573000 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы.
Пример №3.
В 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-(карбоксиметил)фенотиазин и 4-морфолинопиридин в концентрациях 1, 3, 5.2 и 9.3 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 467100 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы.
Пример №4.
В 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-карбоксифенотиазин и 4-морфолинопиридин в концентрациях 1, 3, 5.2 и 9.3 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 325050 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы.
Пример №5.
В 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-(3-карбоксипропил)фенотиазин и 4-морфолинопиридин в концентрациях 1, 3, 5.2 и 9.3 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 455300 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы.
Пример №6.
В 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-(2-карбоксиэтил)фенотиазин и 4-диметиламинопиридин в концентрациях 1, 3, 5.2 и 9.3 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 499400 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы.
Пример №7.
В 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-(2-карбоксиэтил)фенотиазин и 4-пирролидинопиридин в концентрациях 1, 3, 5.2 и 9.3 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 471800 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы.
Пример №8.
В 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, N-(2-карбоксиэтил)фенотиазин и 4-морфолинопиридин в концентрациях 1, 3, 5.2 и 9.3 мМ, соответственно. Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу сои (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 475900 у.е. интенсивности свечения /пМ пероксидазы.
Пример №9 (сравнительный).
В 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3 добавляли люминол, пероксид водорода, натриевую соль 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната и 4-морфолинопиридин в концентрациях 0.75, 0.5, 1 и 1 мМ, соответственно. Сравнительный эксперимент проводили по методике, описанной в (E.Marzocchi, S.Grilla, L.Delia Ciana, L.Prodi, M.Mirasoli, A.Roda // Anal. Biochem. 2008. Vol.377. P.189-194). Для инициации ферментативной реакции к приготовленной субстратной смеси добавляли пероксидазу хрена (в контрольном эксперименте фермент не добавляли), а затем с помощью люминометра регистрировали интенсивность образующегося свечения. Чувствительность метода определения пероксидазы в рабочем диапазоне составила 56625 у.е. интенсивности свечения/пМ пероксидазы.
Таким образом, на основании приведенных выше примеров был сделан однозначный вывод, что замена в реакционном растворе 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната на М-карбоксипроизводные фенотиазина приводит к резкому повышению чувствительности метода хемилюминесцентного определения пероксидаз.