Современные методы культивирования клеток рыб

УДК 591.8.085.23:597.5

Современные методы культивирования клеток рыб

Е.А. Завьялова, Т.Д. Пичугина, ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко

Ключевые слова: культура клеток, рыбы

Сокращения: ККР - культура клеток рыб

Введение

Культивирование тканей и клеток in vitro позволяет моделировать процессы, происходящие в организме при взаимодействии с различными патогенными факторами, получать вирусные антигены для производства вакцин и диагнос-тикумов, тестировать токсические свойства лекарственных препаратов и решать многие другие важные задачи.

Впервые опыты rio культивированию тканей рыб провела L. Grutsner в 1956 г. С целью диагностики оспы карпов она готовила эксплантаты из ткани аквариумных рыбок — гуппи (Lebistes reticulatus) и макропода (Macropodus opercularis). В 1957 г. К. Вольф и К.Т. Данбар разработали методику приготовления эксплантатов тканей радужной форели, кумжи и палии: маленькие кусочки ткани заключали в сгусток плазмы на покровном стекле, накрытым предметным стеклом с лункой и залитым парафином. Для поддержания жизнедеятельности тканей без пересева в течение длительного времени применяли разные модификации двойных покровных стекол, а также специальные фазовые и перфорированные стеклянные или металлические пластинки, дающие возможность проводить исследования с помощью фазовоконтраст-ной или интерферентной микроскопии. В настоящее время методику культуры фиксированных кусочков ткани практически не применяют.

В лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ с 1969 г. проводили исследования по изучению возможности выращивания эксплантатов тканей недифферецированных гонад, почек, сердца, селезенки, плавательного пузыря, жабр и плавников форели и карпа. В качестве опорной субстанции применяли плазму крови курицы и радужной форели. Свертывание плазмы происходило при добавлении к ней куриного эмбрионального экстракта и ночечно-селезеночного экстракта форели. Сравнивали пригодность питательных сред, растворов и сыворотки, предназначенных для культивирования клеток теплокровных животных и апробированных в работе с ККР [4].

Первично трипсинизированные ККР появились позднее. В ходе многочисленных опытов установили, что для успешного выращивания ККР необходима температура, оптимальная для рыб-доноров.

Первую ПЛК рыб получили из гонад неполовозрелой радужной форели (RTG -2) в 1960 г. [7]. Через несколько лет в США появились новые ПЛК рыб - FHM, BF-2, CAR, ВВ, GF-1, СЫН, CHSE-214 (рис. 1 и 2), ЕРС [5].

В начале 80-х годов XX в. ПЛК рыб стали пользоваться в лабораториях Великобритании, Германии, Югославии, Японии, Тайваня. Первые отечественные ПЛК рыб получили в ВНИИПРХ из гонад карпа (ICO) в 1986 г. и из его хвостового плавника (CTF) в 1993 г. Широкое применение в исследовательской практике нашли линии фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток рыб. Некоторые ПЛК рыб выращены из новообразований: саркомы, лимфосаркомы, гепато-мы и оспенной эпителиомы.

Рис. 1. 4-суточная ПЛК сердца кеты СНН-1, х100

Рис. 2. 4-суточная ПЛК эмбриона чавычи CHSE-214, х100

Многообразие ПЛК, а также усовершенствование методик, материалов и оборудования способствовали развитию вирусологических исследований. Стандартность свойств 11ЛК обеспечивает высокую воспроизводимость результатов, что делает их столь же привлекательными и необходимыми в работе, как чистые линии лабораторных животных. ПЛК, приобретя способность к бесконечному росту, представляют собой аналог одноклеточных организмов, но в отличие от них культивируемые in vitro клетки многоклеточных животных сохраняют большую зависимость от факторов среды. Анализ литературы свидетельствует о том, что ПЛК стали применять в лабораторной работе значительно чаще первичных культур клеток. Сейчас в мире существует более 300 ПЛК рыб."

Недостатком ПЛК является их возможная контаминация латентными вирусами и микоплазмами, которые влияют на свойства клеток и могут изменять характер нх взаимоотношений с патологическими агентами [1]. Поэтому большое значение имеет проверка ПЛК на контаминацию посторонними микроорганизмами.

Приготовление первичных ККР

Первичные ККР готовят теми же методами и с использованием растворов и сред, которые применяют при культивировании клеток теплокровных животных. Однако ряд факторов, в частности выбор доноров п температурный режим культивирования ККР, имеют свои особенности. Температура инкубации ККР зависит от их происхождения. Для роста клеток холодноводных рыб требуется от 15 до 21°С, а для клеток тепловодных рыб — от 22 до 30°С.

Рыб-доноров для приготовления ККР отбирают в благополучных по инфекционным болезням рыбоводческих хозяйствах. Рыбу обездвиживают и обескровливают, для чего оставляют ее на некоторое время в посуде с небольшим количеством воды. На левой стороне тела и на брюшке удаляют чешую, обрезают плавники, затем рыбу обмывают водой и обтирают сухой тканью, после чего кожу протирают ватным тампоном, смоченным спиртом. Подготовленную таким образом рыбу помещают в чистую кювету и вносят в бокс, перед вскрытием ее кожу вновь протирают спиртом.

Скальпелем прокалывают брюшную стенку выше и спереди анального отверстия. Затем ножницами разрезают дугой по направлению вверх и вперед до жаберной крышки и вдоль нее вниз (рис. 3). Образовавшийся лоскут брюшной стенки отрезают. Пинцетами стерильно извлекают внутрен-

Рис. 3. Карп, вскрытый для извлечения внутренних органов

ние органы. Объединяют органы от 4...5 рыб одного вида, возраста и веса.

Больше всего клеток можно получить из почек, селезенки и гонад рыб, хуже диспергируются жабры и сердце. Остальные ткани практически непригодны, т.к. дают очень малый выход клеток.

Модификации метода получения и поддержания субкультур рыб

Почки и гонады рыб помещают в сосуды со средой Игла MEM с пенициллином, канамицином и стрептомицином (по 500 ЕД/мл каждого). Ткани измельчают ножницами и отмывают от эритроцитов 5...6 раз раствором Хенкса, заливают 0,25%-м раствором трипсина и экстрагируют на магнитной мешалке в течение 40 мин до полной дезагрегации. Затем суспензию центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют средой Игла MEM с двойным набором аминокислот. Добавляют к суспензии 10% сыворотки плодов коров и определяют концентрацию клеток в камере Горяева. Предварительно 1 мл клеточной суспензии смешивают с равным объемом 0,5%-го раствора трипанблау. Посевная концентрация должна составлять около 500 тыс. клеток в 1 мл среды (рис. 4).

Рис. 4. Первичная культура клеток гонад карася (7-сут). Окраска по Романовскому-Гимза, х200

№1

Сердце и селезенку карповых рыб трипсинизируют смесью 0,02%-х растворов версена и трипсина (2 : 5). Органы помещают в сосуд со средой Игла MEM и антибиотиками (пенициллином, канамицином и гентамицином по 500 ЕД/мл). Измельчают, отмывают от эритроцитов раствором Хенкса, заливают смесью версена и трипсина и экстрагируют на магнитной мешалке 40 мин. Надосадок сливают, а осадок заливают свежей порцией рабочего раствора и экстрагируют 30...40 мин. Эту процедуру повторяют несколько раз до полного истощения ткани. Полученную суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в питательной среде и определяют концентрацию клеток. Посевная концентрация должна быть около 600 тыс. клеток в 1 мл среды.

При получении монослойных культур сердца и селезенки лососевых рыб не следует применять раствор трипсина, который сильно травмирует клетки, отчего они теряют адгезивную способность. Вместо него используют раствор версена или коллагеназы, что обеспечивает более щадящий режим по сравнению с традиционной трипсинизацией [2].

Для диспергирования эмбриональных тканей и внутренних органов аквариумных рыб гуппи мы пользуемся средой Игла MEM с двойным набором аминокислот, L-глютамином и 10% сыворотки плодов коров. Ткани гуппи очень нежные и легко дезагрегируются за 30 мин на магнитной мешалке без дополнительной ферментации [4, 5].

После 72 ч инкубирования при оптимальной температуре во всех флаконах с ККР осторожно меняют ростовую среду. Наблюдения ведут иод микроскопом (окуляр 10, объектив 10). Клетки быстро прикрепляются к поверхности стекла, на 3...4 день образуются неплотные островки и зоны роста, которые соединяются между собой и в течение недели образуют сплошной монослой, состоящий из удлиненных фиброблас-топодобных клеток, которые обладают высокой потенцией роста in vitro (рис. 5).

Рис. 5. Первичная культура клеток гуппи. Окраска по Рома-новскому-Гимза, х200

Поддержание ПЛК рыб

Поддержание ПЛК обеспечивают периодическими пассажами. При одновременной работе с несколькими линиями принимают меры по предупреждению перекрестной контаминации. На случай загрязнения культур необходимо иметь в запасе дубликаты, которые сохраняют при комнатной температуре, в рефрижераторе, термостате, жидком азоте.

Для пересева отбирают нестарые (7...10-суточные) культуры с полностью сформированным монослоем. Их просматривают при малом увеличении светового микроскопа (окуляр 7, объектив 10). Из культуральных флаконов удаляют ростовую среду. Монослой промывают раствором Хенкса, подогретым до комнатной температуры, и заливают смесью растворов версена (0,02%) и трипсина (0,25%) в соотношении 2:1. Культуры оставляют на 5...10 мин, время от времени покачивая. Как только клетки под воздействием ферментов набухнут и небольшое их количество начнет отделяться от стекла, флаконы переворачивают и осторожно сливают диспергирующий раствор. Для инактивации ферментов добавляют немного сыворотки плодов коров. После энергичного встряхивания определяют концентрацию клеток в суспензии. Обычно коэффициент пересева составляет 1 : 3. Культуральные флаконы плотно закрывают стерильными пробками и помещают в термостаты с оптимальной для ПЛК температурой.

Клетки ПЛК прикрепляются к субстрату в течение нескольких часов, на следующий день образуют островки за счет периферического роста. Постепенно островки сливаются в сплошной монослой. Выращивание клеток продолжается в течение 4...5 дней, после чего культуру клеток можно использовать для вирусологических работ.

Заключение

В лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ для научно-исследовательской работы используют субкультуры клеток гонад карася и форели, сердца и селезенки форели, эмбрионов гуппи, а также клеточные линии СНН-1, СН5Е-214 и ЕРС. Эти культуры пригодны для диагностики экономически значимых вирусных болезней рыб: весенней виремии карпа, инфекционного некроза гемопоэтической ткани и инфекционного некроза поджелудочной железы.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Дьяконов Л.П., Ситьков В.И. (ред.). Животная клетка в культуре-М, 2000, с. 148— 159.

2. Завьялова Е.А., Пичугина Т.Д., Дьяконов Л.П., Борисова М.Н. Культура клеток гуппи и ее применение в вирусологических исследованиях//Ветеринарная патология, 2003, 1,5, 50-52.

3. Пичугина Т.Д., Мочалкин В.П., Анисимов М.К. Однослойные культуры клеток эмбрионов гуппи//Бюллетень ВИЭВ, 1976, вып. 26, с. 32.

4. Рудиков Н.И. О клеточных культурах из эмбрионов и личинок пресноводных рыб/ /Рыбоводство и болезни рыб//Научные труды. Отделение животноводства и ветеринарии ВАСХНИЛ.-М., 1969, С. 221-224.

5. Fijan N., Sulimanovic D., Bearzotti M. et al. Some properties of the epithelioma papulosum cyprini (EPC) cell line from carp Cyprinus carpió. Ann Virol (Inst. Pasteur), 1983, 134, 207-220.

6. Wergeland H.I., Jakobsen R.A. A salmonid cell line (TO) for production of infection salmon anaemia virus (ISAV). Diseases of aquatic orqanisms, 2001, 44, 183-190.

7. Wolf K.,Quimby M.C. Established eurethremic line of fish cells in vitro. Science, 1962, 135, 3508, 1065-1066.

SUMMARY

E.A. Zavjalova, T.D. Pichugina. Modern methods of culturing fish cells.

Tissues of the fishes are amenable to the techniques of modern cell culture as mammalian tissues and organs. The authors describes the methods of preparing primary & continues fish cell cultures.

Вирусы аквакультур

Ключевые слова: вакцина, инфекционные заболевания, рыба

Сокращения: Вс - вирус(ы); пз - после заражения; ПЦР - полиме-разная цепная реакция; ТЦД - тканевые цитопатические дозы; ЦПД -цитопатическое действие

Герпесвирусы

При сравнении генома европейских и японских изолятов герпесвируса угрей обнаружили консервативный участок размером 463 пар оснований, который использовали в качестве праймера при проведении ПЦР. Тест оказался чувствительнее изоляции вируса, служащей стандартным методом диагностики этой инфекции. Он позволил обнаруживать в тканях рыб около 10 копий генома герпесвируса угрей [16].

В 1998...2004 гг. по всему миру прокатилась волна вспышек высококонтагиозного заболевания, сопровождавшегося массовой гибелью карпов и кои. Заболевшие рыбы быстро утомлялись и начинали задыхаться на мелководье. Их кожа темнела, а жабры некротизировались. При вскрытии погибших рыб обнаруживали интерстициальный нефрит, некроз жабр и петехиальные кровоизлияния в печени. Возбудителем болезни оказался крупный (100 х 110 нм) икосаэдричес-

кий оболочечный ДНК-Вс, названный Вс нефрита-некроза жабр или Вс герпесвируса кои (см. «РВЖ. СХЖ», 2005, № 2 и «РВЖ. МДЖ», 2005, № 2). С помощью электронной микроскопии его легче всего обнаружить в селезенке [5]. Агент размножается в культурах клеток карпов и кои, вызывая в них ЦПД через 4 дня пз. [9]. Пассирование в культуре клеток ведет к утрате агентом вирулентности. В Университете Хеб-ру (Израиль) данный метод использовали при создании вакцины. Аттенуация возбудителя болезни предусматривала периодическое заражение низкопассажным Вс с последующей изоляции"! и репродукцией его в культуре клеток 115].

Герпесвирус устриц 1 — единственный представитель сем. Негре$ушс1ае, способный вызывать инфекцию у беспозвоночных. Заразившиеся им тихоокеанские устрицы (С. gigas) погибают. Криоэлектронная микроскопия очищенных капсидов Вс показала, что они имеют типичную для гер-песвирусов икосаэдрическую (Т=16) форму. Установили гомологию значительной части ДНК герпесвируса устриц 1 с геномом герпесвирусов млекопитающих, птиц, рептилий, рыб и амфибий [6]. У герпесвируса устриц 1 обнаружили 124 уникальных гена, часть из которых кодирует синтез ингибиторов апоптоза, дезоксиуридиновой триптофазы, ДНК-по-лимеразы, рибонуклеотид редуктазы, геликазы, примазы, АТФ-субъединичной терминазы и мембран-ассоциирован-ных протеинов.

Нодавирусы

Нодавирусы вызывают вспышки заболевания преимущественно у мальков и молоди морских рыб. В последнее десятилетие эти агенты стали серьезным тормозом развития рыбоводства во многих странах мира. В Канаде первая вспышка инфекции произошла в 1999 г. в одном из рыбоводческих хозяйств провинции Новая Шотландия у атлантической трески. Недавно болезнь поразила атлантическую треску, пикшу и камбалу в ряде хозяйств Ньюфаундленда и Нью-Брансуика, а также на пограничной с США территории. Сравнение штаммов нодавирусов, изолированных в разных регионах мира, позволило разделить их на 2 группы— североатлантический и европейский кластеры. Получены праймеры для обратнотранскриптазной ПЦР, позволяющие выявлять североатлантические нодавирусы в икре и разных тканях рыб [7].

У норвежской трески нодавироз протекал с симптоматикой энцефалопатии и ретинопатии. При постмортальном исследовании рыб, погибших на острой стадии инфекции, обнаружили интенсивную вакуолизацию центральной нервной системы. Анализ генома возбудителя показал, что он отличается от 4 известных кластеров нодавирусов [10].

В рыбоводческих хозяйствах Греции произошли вспышки нодавирусной инфекции среди пресноводных рыб. Источником инфекции по всей видимости оказался морской окунь, которого до этого считали резистентным к ней. У заболевших рыб развивались сколиоз и лордоз, они становились сонливыми, утрачивали баланс и координацию движений. Вторичные инфекции АеготопаБ Ьус1горЫ1а и ТпсЬосНпа ер. осложняли течение болезни, повышая инцидентность летального исхода [2]. Генетический анализ 128 штаммов Вс геморрагической септицемии морских рыб, изолированных от нескольких видов рыб в разных географических районах, показал их принадлежность к 4 разным генотипам. Генотип I включал штаммы, выделенные от радужной форели (генотип 1а) и разных видов рыб в Балтийском море (генотип 1Ь). У рыб в Балтийском море циркулирует также генотип II. К генотипам III и IV отнесли изоляты Вс, обнаруженные в Великобритании и Северной Америке соответственно [19].

Изолятами Вс геморрагической септицемии морских рыб, выделенными от рыб в Балтийском море, экспериментально заразили радужных форелей. Агент поражал в первую

НОВОСТИ

ВЕТЕРИНАРНЫХ НАУКИ И ПРАКТИКИ