СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТЫ ФЕНИЛАЛАНИН В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ПЬЕЗОСЕНСОРОМ, МОДИФИЦИРОВАННЫМ ПОЛИМЕРОМ С МОЛЕКУЛЯРНЫМ ОТПЕЧАТКОМ
METHOD OF DETECTING AMINO ACID PHENYLALANINE IN AQUEOUS SOLUTIONS USING PIEZOELECTRIC SENSOR MODIFIED WITH MOLECULAR IMPRINTED POLYMER

Изобретение относится к химии и может использоваться в клинической и лабораторной диагностике физиологически активных веществ, материалов, контроле качества продукции химической и пищевой промышленности.
Наиболее близким к заявляемому устройству является пьезосенсор с серебряными электродами на основе молекулярных отпечатков, используемый как иммуносенсор для проточно-инжекционного определения высоко- и низкомолекулярных органических соединений [Калмыкова Е.Н., Ермолаева Т.Н., Еремин С.А. Разработка проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений. Вестник МГУ Химия.- 2006 №20]. Установка для проточно-инжекционного анализа состоит из перистальтического насоса "Gilson", дозатора, проточной ячейки детектирования объемом 15-20 мкл, включающей серийно выпускаемые отечественные пьезокварцевые сенсоры AT-среза с серебряными электродами диаметром 8 мм и собственной частотой колебаний 8-10 МГц, на поверхности которых иммобилизуют иммунореагенты. Сенсоры контактируют одной стороной с анализируемой жидкой фазой. Силиконовые трубки диаметром 0,16 мм соединяют микроячейку с перистальтическим насосом и дозатором. Скорость потока жидкости составляет 30 мкл/мин. В качестве раствора-носителя используют 5-50 мМ фосфатный буфер (рН 6,8; 7,0; 7,2). Изменение частоты колебаний сенсора с интервалом в 1 минуту регистрируют частотомером.
Недостатками являются сложность аппаратурного оформления, наличие множества химических реагентов, низкая селективность, низкие показатели кислото- и термостойкости.
Целью изобретения является упрощение аппаратурного оформления, сокращение количества используемых химических реагентов, повышение селективности, увеличение показателей кислото- и термостойкости.
Указанная цель достигается тем, что в устройстве поверхность пьезосенсора модифицируют полимером с молекулярным отпечатком:
коллоксилин + фенилаланин, или полиамидокислота + фенилаланин.
Способ осуществляется следующим образом.
Подготовка пьезосенсора к работе. При выполнении эксперимента применяли резонаторы AT-среза с номинальной резонансной частотой 2,5 МГц.
Модификация сенсоров. В качестве модификаторов поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров используют полимер на основе коллоксилина с молекулярным отпечатком аминокислоты фенилаланин, или полиамидокислоты с молекулярным отпечатком аминокислоты фенилаланин.
Пример 1.
Получение коллоксилина с молекулярным отпечатком фенилаланина (молекулярно-импринтированного полимера на основе коллоксилина).
Получают коллоксилин согласно методике, описанной в [Е.В.Кузнецов, И.П.Прохорова, Д.А.Файзуллина. Альбом технологических схем производства полимеров и пластических масс на их основе. Издание второе, переработанное и дополненное. - М: Химия, 1976 г.].
Вводят молекулы шаблона фенилаланина. Для получения 0,5 г полимера с молекулярными отпечатками 0,045 г (точную навеску) фенилаланина растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, получают раствор А. Готовят смесь этанола и диэтилового эфира в соотношении 1:3 - это раствор В. В раствор В добавляют 0,3 мл раствора А, получают раствор С, при этом раствор С остается прозрачным. Коллоксилин добавляют к раствору С, перемешивают стеклянной палочкой. Образуется вязкий раствор - коллодий. Наносят полимер на пьезосенсор. Электроды пьезосенсоров модифицируют нанесением хроматографическим микрошприцем полимера с молекулярными отпечатками фенилаланина в таком количестве, чтобы после удаления растворителей масса пленки составляла 1,0-2,0 мкг. Затем сенсор помещают на 24 часа в дистиллированную воду для удаления молекулы-шаблона фенилаланина из полимера. После чего сенсор помещают в ячейку детектирования на 3-7 мин для стабилизации нулевого сигнала.
Число анализов без повторной модификации электрода пьезосенсора 10-15 измерений; время анализа, включая стадию регенерации сенсора, не более 15 мин. Данные анализа представлены в таблице 1.
Пример 2.
Получение полимера с молекулярным отпечатком фенилаланина на основе полиамидокислоты (молекулярно-импринтированного полимера на основе полиамидокислоты).
В бюкс помещают фенилаланин в количестве 0.045 г (точная навеска) и растворяют в водно-этанольно-бутанольном растворе (12:5:4). Затем в бюкс добавляют полиамидокислоту. Полученную смесь наносят на пьезосенсор с помощью хроматографического микрошприца. Для удаления молекулы-шаблона из полимера пьезосенсор помещают на 24 часа в дистиллированную воду. Затем сенсор помещают в ячейку детектирования на 3-7 мин для стабилизации нулевого сигнала.
Число анализов без повторной модификации электрода пьезосенсора 20-30 измерений; время анализа, включая стадию регенерации сенсора, не более 15 мин. Данные анализа представлены в таблице 1.
Снижение рабочей частоты колебаний пьезокварцевых сенсоров на объемно-акустических волнах рассчитывают по уравнению Зауэрбрея [Sauerbrey G.G. Messung von plattenschwingungen sehr kleiner amplitude durch lichtstrom-modulation // Z.Phys. - 1964. - Bd. 178. - S. 457-471]:
0
где m - масса модификатора, г; f - резонансная частота пьезосенсора, МГц;
2
Δf - изменение частоты резонатора, Гц; А - площадь поверхности модификатора, см.
c
Для пьезокварцевых резонаторов с номинальной частотой колебаний 2,5 МГц отклик после модификации составил f≈2-6 кГц.
-2
-3
-4
-5
-6
a
Детектирование осуществляют после отбора проб автоматической микропипеткой водного раствора аминокислоты фенилаланин концентраций 1·10 M, 1·10 M, 1·10 M, 1·10 M, 1·10 M в ячейку детектирования и регистрируют аналитический сигнал частотомером в виде резонансной частоты сенсора. Вычисляют относительный сдвиг частоты Δf по уравнению:
a
0
1
Δf=f-f,
0
1
где f и f - частоты колебаний сенсора до и после анализа, Гц.
Таблица 1
Примеры осуществления способа с помощью пьезосенсора, модифицированного полимером с молекулярным отпечатком или коллоксилин + фенилаланин, или полиамидокислота + фенилаланин
Модификаторы электродов сенсоров
Соотношение растворителя, об. ч.
Концентрация, M
Δf, МГц
1
2
3
4
Пример 1
Полимер на основе коллоксилина с молекулярными отпечатками аминокислоты, например фенилаланина
1:3
1·10<sup>-2</sup>
235897
1·10<sup>-3</sup>
196800
1·10<sup>-4</sup>
131049
1·10<sup>-5</sup>
65616
1·10<sup>-6</sup>
35763
Пример 2
Полимер на основе полиамидокислоты с молекулярными отпечатками аминокислоты, например фенилаланина
12:5:4
1·10<sup>-2</sup>
235760
1·10<sup>-3</sup>
196640
1·10<sup>-4</sup>
130957
1·10<sup>-5</sup>
65425
1·10<sup>-6</sup>
35528
Использование предложенного способа позволяет упростить аппаратурное оформление, сократить количество используемых химических реагентов, повысить селективность, увеличить показатели кислото- и термостойкости для полиамидокислоты.