БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС И СРЕДСТВО ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЕ СОБОЙ БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС
PROTEIN-PEPTIDE COMPLEX AND DRUG PREPARATION AGENT, WHICH IS PROTEIN-PEPTIDE COMPLEX

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и конкретно - к биологически активному белково-пептидному комплексу (далее - БПК), образованному взаимодействием белка и пептида, выделенных из ткани пигментного эпителия (далее - ПЭ) глаза позвоночного животного, который может быть использован в качестве субстанции лекарственного препарата для профилактики и лечения ретинальных заболеваний глаза у человека и сельскохозяйственных животных.
Несмотря на успехи современной офтальмологии в лечении распространенных глазных заболеваний, их частота в настоящее время продолжает возрастать. Это связано с широким применением теле- и компьютерной техники, которое приводит к значительному увеличению нагрузок на зрительный аппарат, особенно на сетчатку и ретинальный ПЭ - основные ткани глаза, участвующие в формировании зрительного сигнала. В настоящее время в практике офтальмологии препараты, способствующие восстановлению ПЭ, при нарушении его морфофункционального состояния, отсутствуют. Поэтому, целью настоящего изобретения явилось биологически активной субстанции - БПК, обладающего тканеспецифическим, но не видоспецифическим протекторным действием на сетчатку и ПЭ глаза позвоночных животных.
6
Известно изобретение по патенту РФ №2073518 - средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза МКИ А61К 35/44, A61F 9/00, приоритет от 17.06.93. В данном изобретении описано средство, представляющее собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, выделенных из сетчатки млекопитающих экстракцией 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и осаждением белков надосадочной жидкости ацетоном. Средство способствовало восстановлению функции сетчатой оболочки глаза. Недостатками данного изобретения является использование смеси пептидов с различными молекулярными массами, отсутствие идентификации среди них биологически активных пептидов, проявляющих регенетивную активность.
Известен способ [RU патент РФ №2373904 (2009)] лечения различных патологий заднего отрезка глаза пептидными биорегуляторами ретиналамином и кортексином, которые представляют собой полипептидные фракции сетчатки глаз скота. Недостаток изобретения - внутримышечное применение растворов биорегуляторов в высокой концентрации: 0,1% раствора ретиналамина и 0,2% раствора кортексина. Возможность развития аллергических реакций при применении ретиналамина и возрастные ограничения до 18 лет. При применении также кортексина возможна индивидуальная гиперчувствительность к компонентам препарата.
Известен тетрапептид, стимулирующий функцию сетчатой оболочки глаза, фармакологическое средство на его основе и способ его применения [RU патент РФ №2161982 (2001)]. Недостаток данного изобретения - инъекции в область глаза, что может вызывать травматические повреждения, также препарат используется в виде раствора высокой концентрации, за счет чего возможны побочные реакции со стороны организма, в том числе развитие аллергических реакций.
Известен также способ получения биологически активного комплекса и биологически активного белково-пептидного комплекса (патент RU2428196), обладающего нейрорегенеративным и нейропротективным действием и стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях центральной и периферической нервной системы и способу его получения. Данный способ позволяет получить смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов копытных животных. Недостатками данного изобретения являются незавершенная очистка конечной субстанции, представляющей собой белково-пептидный комплекс, а также использование эмбрионального материала, который может содержать другие биологически активные вещества, способные вызывать побочные неблагоприятные реакции в тканях взрослого организма. Также к недостаткам данного изобретения относится получение только из мозга эмбрионов копытных животных белково-пептидного комплекса, который не оказывает влияние на состояние тканей глаза, в том числе, пигментного эпителия.
-10
-12
Из RU 2311915, 10.12.2007 известен способ получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки и ПЭ глаза, а также сосудистой оболочки глаза, в результате которого из пигментного эпителия сетчатки позвоночных животных выделяют фракцию, содержащую регуляторные пептиды с молекулярной массой менее 8 Да, которая проявляет активность в дозах, соответствующих концентрациям 10 - 10 мг/мл (в физиологическом водно-солевом растворе). Изобретение обеспечивает получение препарата, содержащего регуляторные пептиды с небольшой молекулярной массой, которые в низких дозах оказывают протекторное действие на состояние тканей заднего отдела сетчатки глаза. Однако, использование полученного пептид-содержащего препарата не является достаточно эффективным средством для лечения глазных заболеваний, связанных с нарушением функции сетчатки и ПЭ.
-17
Из статьи В.П. Ямсковой и др. «Структурно-функциональные особенности нового биорегулятора, выделенного из ткани пигментного эпителия глаза быка» («Биохимия», 2009, том 74, вып. 9, с. 1195-1203) известен биорегулятор, действующий в сверхмалых дозах 10 мг белка. Функциональной основой данного биорегулятора являются регуляторный пептид с молекулярной массой 4372 Да и смесь белков с молекулярными массами 14980-66283 Да), которая модулирует активность регуляторного пептида. Отмечено, что регуляторный пептид отвечает за проявление биорегулятором мембранотропной активности, а белок-содержащая фракция - за его биологическое действие в сверхмалых дозах.
Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в создании БПК путем взаимодействия высокоочищенных препаратов регуляторного пептида и белка, выделенных из неповрежденных, содержащих наибольшее количество физиологически активных белков и пептидов областей ретинального ПЭ глаза позвоночных животных, который может быть использован в качестве субстанции нового лекарственного средства для лечения глазных ретинальных заболеваний.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение биологически активного комплекса путем взаимодействия пептида и белка, выделенных из ткани ПЭ глаза позвоночных животных, оказывающего протекторное действие на состояние тканей заднего сектора глаза - ПЭ, нейральной сетчатки; склеры, хороида, которое выражается в сохранении статуса адгезии, полиферациии и дифференцировки пигментных клеток, а также в поддержании жизнеспособности биполярных клеток и Мюллеровской глии в сетчатке.
Поставленная техническая задача и технический результат достигаются группой изобретений, в которую входит белково-пептидный комплекс, полученный взаимодействием эквимолекулярных количеств выделенных из ткани ПЭ (пигментного эпителия) глаза позвоночных животных смеси регуляторных пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да или регуляторного пептида с молекулярной массой 4372 Да и белка - сывороточного альбумина с молекулярными массами 66362-66898 Да.
-3
-19
Поставленная техническая задача и технический результат достигаются также фармакологической композицией для профилактики и лечения ретинальных заболеваний глаза человека и сельскохозяйственных животных, включающей белково-пептидный комплекс, охарактеризованный в предыдущем абзаце, и фармацевтически приемлемый носитель и проявляющий биологическую активность в дозах, соответствующих 10 - 10 мг белка/мл.
И в частности, указанный белково-пептидный комплекс получен взаимодействием эквимолекулярных количеств выделенных из ткани пигментного эпителия (ПЭ) глаза позвоночных животных регуляторного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент фосфодиэстразы циклического гуаназин монофосфата с молекулярной массой 4372Да, и бычьего сывороточного альбумина gi|367460260 с молекулярной массой 66367Да.
-3
-19
Полученный комплекс оказывает выраженное протекторное действие в дозах, соответствующих 10 - 10 мг белка/мл на состояние тканей заднего сектора глаза - ПЭ, нейральной сетчатки, склеры, хороида.
-3
2
В общем виде способ выделения и очистки БПК по изобретению заключается в том, что из свежеэнуклеированных глаз быка или другого позвоночного животного выделяют макулярную область ретинального ПЭ, промывают ее в физиологическом растворе, выдерживают ткань ПЭ в водно-солевом растворе, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, осаждают белки в 100%-ном растворе сульфата аммония, центрифугированием собирают фракцию, флотирующую при 100000 g - 105000 g, диализуют до полного удаления ионов аммония, разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией в градиенте ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте при рН 2,2-3,0, температуре 22-25°С в течение 30-60 минут, собирают фракции гидрофильных пептидов и белка - представителя семейства альбуминов сыворотки крови, из которых удаляют ацетонитрил и смешивают в присутствии 10 М CaCl в эквимолекулярных количествах.
-3
-19
Изобретение обеспечивает получение высокоочищенного БПК, обладающего активностью в дозах, соответствующих 10 - 10 мг белка/мл.
Другим объектом заявленного изобретения является фармакологическая композиция для приготовления лекарственного препарата для профилактики и лечения ретинальных заболеваний глаза человека и сельскохозяйственных животных, включающая белково-пептидный комплекс и фармацевтически приемлемый носитель.
Данный белково-пептидный комплекс (далее - БПК) оказывает протекторное действие на состояние тканей заднего сектора глаза - ПЭ, нейральной сетчатки, склеры, хороида, выражающегося в сохранении статуса адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток ПЭ, а также в поддержании жизнеспособности биполярных клеток и Мюллеровской глии в сетчатке.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, в которых описан способ получения белково-пептидного комплекса (пример 1) и определение специфической активности (примеры 2-13), а также фиг. 1-6.
Фиг. 1. Гистологический срез заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl при органотипическом культивировании тканей нейральной сетчатки, пигментного эпителия, хороида, склеры in vitro на 3-й сутки (контрольная серия).
А-об. 10 × ок. 10;
Б-об. 10 × ок. 20.
При данном типе культивирования происходит постепенная деградация всех тканей глаза: происходит нарушение адгезии между сетчаткой и ПЭ, в сетчатке наблюдается значительное количество апоптотирующих клеток, а также изменение состояния клеток пигментного эпителия, статуса их дифференцировки, которое оценивают по смещению пигмента на апикальную сторону клеток монослоя, нарушению адгезии между ними и гибелью самих клеток. В склере наблюдаются полости, которые возникли в результате деградации коллагеновых волокон.
Фиг. 2. Выявление специфических белков и состояние клеток на гистологических срезах заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl при органотипическом культивировании тканей нейральной сетчатки, ПЭ, хороида, склеры in vitro на 3-й сутки (контрольная серия).
А - иммуногистохимическая окраска на белок фоторецепторов сетчатки рековерин об. × 20 ок. × 10;
Б - иммуногистохимическая окраска на белок клеток Мюллеровской глии в сетчатке GFAP об. × 10 ок. × 10;
В - гистохимическая окраска на фермент сетчатки ацетилхолинэстеразу об. × 20 ок. × 10;
Г - нормальные и апоптотические ядра биполярных клеток в сетчатке об. × 100, ок. × 10.
-7
Фиг. 3. Гистологический срез заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl при органотипическом культивировании тканей нейральной сетчатки, ПЭ, хороида, склеры in vitro на 3-й сутки в присутствии выделенного из тканевого экстракта пигментного эпителия глаза быка полипептида с молекулярной массой 4372 Да, представляющего собой N-концевой фрагмент фосфодиэстразы циклического гуанозинмонофосфата (концентрация 10 мг белка/мл).
А-об. 10 × ок. 10;
Б-об. 10 × ок. 20.
-7
Фиг. 4. Гистологический срез заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl при органотипическом культивировании тканей нейральной сетчатки, ПЭ, хороида, склеры in vitro на 3-й сутки в присутствии выделенного из тканевого экстракта ПЭ глаза быка сывороточного альбумина (gi|367460260) с молекулярной массой 66367 Да, (концентрация 10 мг белка/мл). Полное отсутствие протекторного действия данной фракции. Состояние всех тканей глаза заднего отдела глаза не отличается от такового в контрольной серии.
А-об. 10 × ок. 10;
Б-об. 10 × ок. 20.
-17
Фиг. 5. Гистологический срез заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl при органотипическом культивировании тканей нейральной сетчатки, ПЭ, хороида, склеры in vitro на 3-й сутки в присутствии восстановленного белково-пептидного комплекса (концентрация 10 мг белка/мл). В данном случае есть наблюдается наибольшая сохранность тканей заднего отдела глаза. Между отростками фоторецепторов, монослоем ПЭ и сосудистой оболочкой отмечены плотные адгезивные взаимодействия. В отличие от других опытных серий в сетчатке наблюдали незначительное количество апоптотирующих клеток. Происходит стабилизация статуса дифференцировки клеток пигментного эпителия, что выражается в равномерном распределении пигмента в данных клетках и в поддержании целостной структуры монослоя. Состояние ткани склеры приближено к состоянию интактной ткани: наблюдается сохранение компактной структуры коллагеновых волокон.
А-об. 10 × ок. 10;
Б-об. 10 × ок. 20.
-7
Фиг. 6. Гистологический срез заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl при органотипическом культивировании тканей нейральной сетчатки, ПЭ, хороида, склеры in vitro на 3-й сутки в присутствии восстановленного белково-пептидного комплекса (концентрация 10 мг белка/мл).
А-об. 10 × ок. 10;
Б-об. 10 × ок. 20.
Протекторное действие восстановленного белково-пептидного комплекса в указанной концентрации выражается в поддержании адгезии между сетчаткой, ПЭ и сосудистой оболочкой на протяженном участке заднего отдела глаза с незначительными нарушениями в некоторых областях. Большая часть клеток сетчатки, как и в контроле, находится в апоптотическом состоянии. Следует отметить, что в монослое клеток ПЭ поддерживались адгезивные взаимодействия. Пигментные гранулы были распределены равномерно в цитоплазме клеток, что свидетельствует о стабильном состоянии дифференцировки данных клеток в указанных условиях по сравнению с контролем. Состояние склеральной оболочки не отличалось от такового в контрольной серии.
Пример 1. Выделение из ткани пигментного эпителия глаза быка Bos taurus белково-пептидного комплекса, определение его состава и структуры
-1
-3
-3
-3
2
3
4
Из свежеэнуклеированных глаз быка микрохирургически выделяют макулярную зону ПЭ сетчатки при 20°С, промывают и экстрагируют в водно-солевом физиологическом растворе: 1,5×10 М NaCl, 1,0×10 М CaCl, 5×10 М KCI, 1×10 М HEPES, 4-8°С, 3-4 ч. После центрифугирования при 3000 g в течение 30 мин к полученному тканевому экстракту при постоянном перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до получения насыщенного раствора (780 г/л), оставляют образовавшуюся суспензию белков при 4-8°С на 120 часов, затем центрифугируют при 105000 g 60 мин. Получают супернатант, осадок и флотирующую фракцию, которые далее диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:100) при 4-8°С до полного удаления ионов аммония. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С, далее разделяют с методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 0,1%-ный р-р HPO; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 5-10 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:10 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000-6000 Да. Проводят электрофорез ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0 в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Из геля выделяют Кумасси-окрашиваемую полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 66367 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих (под номером gi|367460260 в базе данных SwissProt). Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность этого белка (DTHKSEIAHRFKDLGE-), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы альбумина сыворотки крови быка.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 представляет собой БПК, состоящий из белка gi|367460260 - представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка с молекулярной массой 66367 Да, значением pl в области рН 3,90-4,00 и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да.
Пример 2. Образование белко-пептидного комплекса путем взаимодействия пептида с молекулярной массой 4372 Да и альбумина (qi|367460260) с молекулярной массой 66367Да, выделенных из ткани пигментного эпителия глаза быка В. taurus
-1
-3
-3
-3
2
Из свежеэнуклеированных глаз быка микрохирургически выделяют макулярную зону пигментного эпителия сетчатки при 20°С, промывают и экстрагируют в водно-солевом физиологическом растворе: 1,5×10 М NaCl, 1,0×10 M CaCl, 5×10 М KCI, 1×10 М HEPES, 4-8°С, 3-4 ч. После центрифугирования при 3000 g в течение 30 мин к полученному тканевому экстракту при постоянном перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до получения насыщенного раствора (780 г/л), оставляют образовавшуюся суспензию белков при 4-8°С на 120 часов, затем центрифугируют при 105000 g 60 мин. Получают супернатант, осадок и флотирующую фракцию, которые далее диализуют против воды при 4-8°С до полного удаления ионов аммония.
8
Обессоленную флотирующую фракцию разделяют далее обращенно-фазовой ВЭЖХ на гидрофобной колонке Биохиммак С (Россия) (4,6×250 мм) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 (США). Элюцию осуществляют в градиенте концентраций ацетонитрила (5-80%) в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты (рН 2,2) со скоростью 0,5 мл/мин в течение 30 мин при 25°С. Детекцию проводят при 214 нм и 280 нм. Получают ряд фракций с временем удерживания 3-5 мин и 14-17 мин. ВЭЖХ-фракции с временем удерживания 3-5 мин анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Выделяют фракцию, которая характеризуется масс-спектрометрическим сигналом, соответствующим молекулярной массе 4372 Да. Проводят триптический анализ белка в растворе с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза и показывают, что полипептид с молекулярной массой 4372 Да имеет следующую аминокислотную последовательность:
Ac-MNLEPPKAEIRSATRVMGGPVTPRKGPPKFKQRQTRQF.
Анализ данной последовательности показывает, что это N-концевой фрагмент фосфодиэстеразы циклического ГМФ из сетчатки глаза крупного рогатого скота [Ovchinnikov Yu.A., Lipkin V.M., Kumarev V.P., Gubanov V.V., Khramtsov N.V., Akhmedov N.B., Zagranichny V.E., Muradov K.G. FEBS Letters, 1986, 204, 288-292.].
ВЭЖХ-фракцию с временем удерживания 14-17 мин исследуют в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выделяют фракцию, которая характеризуется Кумасси-окрашиваемой полосой, соответствующей молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический анализ белка данной фракции с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза проводят масс-спектрометрически на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты Полученные результаты показывают, что данная фракция представляет собой бычий сывороточный альбумин (под номером gi|367460260 в базе данных SwissProt) с молекулярной массой 66367 Да. Методом Эдмана устанавливают частичную N-концевую аминокислотную последовательность этого белка (DTHKSEIAHRFKDLGE-), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы альбумина сыворотки крови быка. Из раствора ВЭЖХ-фракций пептида и альбумина удаляют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту и растворяют в физиологическом водно-солевом растворе.
Пример 3. Получение белково-пептидного комплекса взаимодействием выделенных из пигментного эпителия глаза быка пептида с молекулярной массой 4372 Да и альбумина сыворотки крови (qi|367460260) с молекулярной массой 66898 Да его растворов в различных концентрациях
-3
2
ВЭЖХ-фракцию (время удерживания 3-5 мин), содержащую N-концевой фрагмент фосфодиэстеразы циклического ГМФ с концентрацией белка 90 мкг/мл, и ВЭЖХ-фракцию (время удерживания 14-17 мин), содержащую бычий сывороточный альбумин gi|367460260 с концентрацией белка 200 мкг/мл, смешивают в соотношении 1:10 в присутствии 10 М CaCl. Получают таким образом БПК, который используют в качестве биологически активной субстанции, проявляющей морфофункциональную активность в отношение пигментного эпителия и сетчатки глаза.
Пример 4. Выделение белково-пептидного комплекса из ткани пигментного эпителия глаза мыши, определение его состава и структуры
Эксперимент проводят на мышах C57BI/6 обоего пола, весом 18-22 г.
-1
-3
-3
-3
2
3
4
Из свежеэнуклеированных глаз мышей микрохирургически выделяют ПЭ, промывают ткань в водно-солевом физиологическом растворе (1,5×10 М NaCl; 1,0×10 М CaCl; 5×10 М KCI; 1×10 М HEPES) и далее экстрагируют в свежем растворе при 4-5°С в течение 5 ч. Полученный тканевой экстракт центрифугируют (3000 g, 30 мин), постепенно при перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора (780 г/л), добавляют азид натрия (10 мкг/л) и оставляют суспензию белков на 72 часа при 4-5°С. Центрифугированием (10000 g, 4-5°С, 30 мин) собирают фракцию супернатанта, диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:100). Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С, далее разделяют с методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 0,1%-ный р-р HPO; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 5 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:10 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000-6000 Да, а также белок с молекулярной массой 66472 Да. Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 66472 Да представляет собой белок семейства альбуминов мыши (под номером qi|163310765 в базе данных SwissProt). Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 представляет собой БПК, состоящий из альбумина сыворотки крови мыши со значением pi в области рН 4,0-4,1 и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да.
Пример 5. Выделение белков-пептидного комплекса из ткани пигментного эпителия глаза кур
Эксперимент проводят на цыплятах породы Леггорн обоего пола, весом 400-500 г.
-1
-3
-3
-3
2
3
4
Из свежеэнуклеированных глаз цыплят микрохирургически выделяют ткань пигментного эпителия, промывают в водно-солевом физиологическом растворе (1,5×10 М NaCl; 1,0×10 М CaCl; 5×10 М KCI; 1×10 М HEPES) и далее экстрагируют в свежем растворе при 4-5°С в течение 5 ч. Полученный тканевой экстракт центрифугируют (3000 g, 30 мин), постепенно при перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора (780 г/л), добавляют азид натрия (10 мкг/л) и оставляют суспензию белков на 72 часа при 4-5°С. Центрифугированием (10000 g, 4-5°С, 30 мин) собирают фракцию супернатанта, диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:100). Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С, далее разделяют с методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 0,1%-ный р-р HPO; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 5 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:10 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 800-5000 Да, а также белок с молекулярной массой 67155 Да Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 68000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок представляет собой белок семейства альбуминов кур (под номером gi|766944282 в базе данных SwissProt). Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 представляет собой БПК, состоящий из альбумина сыворотки крови кур со значением pi в области рН 3,9-4,0 и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 800-5000 Да.
Пример 6. Получение растворов БПК в различных концентрациях его растворов в различных концентрациях
-3
2
В качестве исходного раствора БПК, обнаруженного в ткани пигментного эпителия глаза быка используют два препарата: БПК1 - ИЭФ-фракция, собранная в области рН<3,0, (Пример 1) с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл и БПК2, образованный взаимодействием эквимолекулярных количеств регуляторного пептида с молекулярной массой 4372 Да и белка (gi|367460260) с мол. массой 66367 Да, в присутствии ионов 10 М CaCl (Пример2), в виде раствора с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл.
Во флакон, содержащий 0,1 мл раствора БПК добавляют 0,9 мл дистиллированной воды и интенсивно встряхивают 15 раз. Отбирают 0,1 мл образовавшегося раствора во флакон н добавляют 0,9 мл дистиллированной воды, встряхивают 15 раз. Данную процедуру повторяют, получая таким образом растворы БПК.
-3
-3
-7
-17
-19
2
Аналогично получают растворы БПК с 10-кратным последовательным разбавлением от 1 до 20 степени в физиологическом растворе состава 0,15 М NaCl; 10 М CaCl. В экспериментах по изучению специфической активности на модели культивирования тканей глаза в составе заднего сектора глаза исследовали растворы с концентрациями, соответствующими 10; 10 - 10; 10 мг белка/мл.
Пример 7. Влияние растворов белково-пептидного комплекса, обнаруженного в пигментном эпителии глаза быка, в различных концентрациях, а также отдельных его компонентов - регуляторного пептида и белка-модулятора, на состояние тканей глаза заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl. при органотипическом культивировании in vitro
Действие БПК, обнаруженного в ткани пигментного эпителия глаза быка в различных дозах, а также отдельных его компонентов, на состояние сетчатки, ПЭ, склеры, изучали на модели органотипического культивирования заднего сектора глаза тритона in vitro, поскольку активность БПК характеризуется наличием тканевой, но не видовой специфичности.
Исследование проводили на взрослых половозрелых особях тритона Pleurodeles waltl, содержащихся в аквариальной Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Микрохирургическим путем выделяют глаза у предварительно наркотизированных в 0,1%-ном растворе MS-222, и культивируют в среде, содержащей 350 мл среды 199, 150 мл бидистилированной воды, 0,15 мл 1М Hepes и 1 мл 4%-ного раствора сульфата гентамицина. Перед культивированием проводят холодную стерилизацию среды через мембранные фильтры GV с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США). Ткани глаза тритона изолируют с помощью бинокуляра. Сначала освобождают глаз от кожных покровов и жира, затем разрезают по окружности проксимальнее лимба. Отбрасывают ростовую область сетчатки вместе с радужкой, роговицей и хрусталиком. Для последующего культивирования используют задние секторы глаз, в состав каждого из которого входит сетчатка, ПЭ, сосудистая оболочка и склера. Полученные задние отделы глаз помещают в пенициллиновые флаконы, заполненные бессывороточной средой, на целлюлозные фильтры типа А/Е («Gelman», США), отмытые в 70%-ном этаноле и ополоснутые в культуральной среде. Во флаконы опытной серии перед началом культивирования добавляют белково-пептидный комплекс, очищенный после обращенно-фазовой ВЭЖХ в различных концентрациях. В контрольной серии в культуральную среду добавляют соответствующее количество физиологического раствора. Все флаконы закрывают стерильными крышками, пленкой Parafilm М, алюминиевой фольгой и культивируют без смены культуральной среды в термостате в темноте при 20-22°С в течение 72 часов.
Культуры заднего сектора глаза погружают в 4%-ный раствор формалина, приготовленный на фосфатном буфере (0,1 М PBS, рН 7.4) и фиксируют в течение 6 ч. Помимо формалиновой используют фиксацию переохлажденным в жидком азоте 96%-ным этанолом. После фиксации материал отмывают в 0,1 М PBS 2 раза по 24 ч при 4°С, дегидратируют и заливают в парафин. Для исследования методом непрямого иммуноокрашивания (Энгельгардт, 1968) готовят срезы толщиной 6-7 мкм. Перед инкубацией с антителами срезы освобождают от парафина, дегидратируют и отмывают в холодном 0,1 М PBS буфере в течение 30 мин. Для изучения фоторецепторов используют рекомбинантные поликлональные моноспецифические антитела против фоторецепторного белка рековерина в разведении 1:20 (конечная концентрация 0,011 мг/мл) в PBS, содержащем тритон Х-100 (0.3%) и бычий сывороточный альбумин (0.5%). Для исследования глиальных клеток сетчатки применяют коммерческие поликлональные антитела против кислого глиального фибриллярного белка (GFAP, «Sigma», США) в разведении 1:50.
После инкубации с первыми антителами срезы отмывают трижды по 5 мин в 0,1 М PBS буфере, а затем обрабатывают вторыми, конъюгированными с пероксидазой (lgG, полная молекула, «Sigma», США), антикроличьими (для рековерина и GFAP) антителами в разведении 1:50. В реакциях окрашивания антителами используют срезы культивированных фрагментов, а также срезы нормальных глаз тритона. Кроме этого, для контроля используют срезы, окрашенные только вторыми антителами. Изучение иммунореакции и приготовление изображений проводят с помощью микроскопа «Olympus» (VANOX, АНВТ3, Япония), цифровой камеры «Olympus» (U-PMTVC, Япония) и компьютерной приставки, оснащенной программами (ViewfinderLite, StudioLite).
Анализ контрольных препаратов во всех случаях показывает отсутствие специфического окрашивания. Описание состояния эксплантатов проводят на сериях обычных и полутонких срезов. Для приготовления серий обычных срезов эксплантаты задней стенки глаза, содержащих сетчатку, сразу после культивирования помещают в фиксатор Буэна. Парафиновые срезы толщиной 7 мкм окрашивают гематоксилин-эозином. Для приготовления полутонких срезов эксплантатов используют метод (Григорян Э.Н., Иванов И.П., Поплинская В.А Изв. РАН. Сер. биол., 1996, 3, 319). Серии полутонких срезов, делают максимально строго вдоль длинных осей наружных сегментов фоторецепторов, приклеивают на стекла, окрашивают толуидиновым синим и анализируют при увеличении 1000х микроскопа «Jenaval» (Carl Zeiss, JENA, Германия). Для морфологического исследования используют фрагменты глаз тритона, культивированные только в бессывороточной среде (контроль) и в той же среде, но с добавлением фракций, выделенных из ПЭ глаза быка.
Для определения жизнеспособности клеток культивированной сетчатки, обработанной и необработанной изучаемыми фракциями, применяют прямой подсчет жизнеспособных клеток и общего числа клеток на полутонких срезах. Используют четкие морфологические критерии: форма и плотность окрашивания тел биполярных клеток. На сериях полутонких срезов с помощью окулярной линейки выбирают равновеликие участки слоя. И определяют отношение не изменившихся, морфологически нормальных клеток к общему числу клеток и проводят статистическую обработку полученных данных по программе Origin 6.0 Professional. Также определяют число глиальных клеток Мюллера после окраски антителами против GFAP на 7 мкм срезах эксплантатов. При подсчетах используют описанный выше подход и окулярная сетка. Так как тела Мюллеровских клеток трудно различимы на срезах в 7 мкм, то считают число их окрашенных длинных волокон, хорошо заметных даже при смещении основной ориентации среза. Число этих отростков дополнительно оценивается на плоскостных срезах сетчатки. В количественных исследованиях используют задние фрагменты глаз тритонов, культивированные только в бессывороточной среде и в той же среде, но с добавлением фракций, выделенных из ПЭ глаза быка. Для гистохимического окрашивания применяют криосрезы толщиной 14 мкм. Культивированные эксплантаты сетчатки фиксируют в переохлажденном спирте. Культивирование ткани глаза тритона в бессывороточной среде приводит к постепенной деградации всех тканей глаза (фиг. 1). В сетчатке присутствует значительное количество апоптотирующих клеток, происходит нарушение адгезии между сетчаткой и ПЭ, а также наблюдается изменение состояния клеток ПЭ: статуса дифференцировки клеток ПЭ, которое оценивается по смещению пигмента на апикальную сторону клеток монослоя, нарушению адгезии между ними и гибелью самих клеток. В склере наблюдают полости, которые возникли в результате деградации коллагеновых волокон. Однако при данном типе культивирования в составе задней стенки глаза, клетки сетчатки демонстрируют как жизнеспособность, так и экспрессию специфических белков глиальных клеток и нейронов (глиального кислого фибриллярного белка), белка фоторецепторов - рековерина и фермента модулятора холинэргической трансмиссии - ацетилхолинэстеразы (Фиг. 2А-Г).
-7
-9
-11
-13
-15
-17
Культивирование заднего отдела глаза тритона в среде, содержащей фракцию пептида с мол. массой 4372 Да в дозах, соответствующих 10; 10; 10; 10; 10; 10 мг белка, не приводит к изменению состояния тканей глаза тритона по сравнению с культурой заднего сектора глаза, инкубируемой в бессывороточной среде (фиг. 3).
-7
-9
-11
-13
-15
-17
Культивирование заднего отдела глаза тритона в среде, содержащей фракцию белка с молекулярной массой 66367 Да в дозах, соответствующих 10; 10; 10; 10; 10; 10 мг белка, не приводит к изменению состояния тканей глаза тритона по сравнению с культурой заднего сектора, инкубируемой в бессывороточной среде (фиг. 4).
-3
-17
2
На модели культуры заднего отдела глаза тритона изучали комплекс, образованный взаимодействием эквимолекулярных количеств пептида с мол. массой 4372 Да и белка с молекулярной массой 66367 Да в присутствии ионов 10 М CaCl (Пример 2). Добавление в питательную среду БПК в дозе, соответствующей 10 мг белка, при органотипическом культивировании тканей заднего отдела глаза тритона in vitro способствует поддержанию в них адгезии, статуса пролиферации и дифференцировки клеток, обеспечивает наибольшую сохранность тканей глаза (Фиг. 5). Между отростками фоторецепторов, монослоем ПЭ и сосудистой оболочкой отмечают плотные адгезивные взаимодействия, наблюдают незначительное количество апоптотирующих клеток. Происходит стабилизация статуса дифференцировки клеток ПЭ, что выражается в равномерном распределении пигмента в данных клетках и в поддержании целостной структуры монослоя. Состояние ткани склеры приближено к состоянию интактной ткани: наблюдают сохранение компактной структуры коллагеновых волокон, а также жизнеспособные фибробласты.
-7
Раствор БПК добавляют в питательную среду в дозе, соответствующей 10 мг белка, при органотипическом культивировании тканей заднего сектора глаза in vitro как указано в Примере 5. Культуры фиксируют и приготавливают гистологические срезы. Раствор БПК в данной дозе оказывает влияние на состояние тканей заднего отдела глаза тритона, которое выражается в поддержании адгезивных взаимодействий между сетчаткой, ПЭ и сосудистой оболочкой на протяженном участке заднего сектора глаза с незначительными нарушениями в некоторых областях (фиг. 6). Большая часть клеток сетчатки, находится в состоянии апоптоза. В монослое клеток ПЭ поддерживаются адгезионные межклеточные взаимодействия, пигментные гранулы распределены равномерно в цитоплазме клеток, что свидетельствует о стабильном состоянии дифференцировки данных клеток в указанных условиях по сравнению с контролем. Состояние склеральной оболочки не отличается от такового в контрольной серии.
-17
Таким образом, БПК в дозе, соответствующей 10 мг белка/мл оказывает выраженное протекторное действие на ткань сетчатки и ПЭ глаза: БПК поддерживает не только состояние клеток самого ПЭ, но и влияет на состояние биполярных и Мюллеровских клеток нейральной сетчатки (клеточные источники регенерации), а также на состояние склеральной оболочки и хороида.
Полученный БПК может быть использован в качестве фармакологической композиции для лечения глазных заболеваний. В далее приведенных примерах 10-18 представлены результаты изучения безопасности раствора БПК, выделенного из глаза быка.
Пример 8. Оценка раздражающего действия раствора БПК на глаз кролика in vivo
2+
-3
-12
2
Изучали биологическое действие БПК, образованного взаимодействием эквимолекулярных количеств выделенных из ПЭ глаза быка регуляторного пептида с мол. массой 4372 Да и белка с мол. массой 66367 Да, в присутствии ионов Са (10 М), в виде раствора в концентрации, соответствующей 10 мг белка/мл, приготовленного на физ. р-ре состава - 0,9% NaCl и 0,01% CaCl.
Исследование проводили на половозрелых кроликах породы Шиншилла весом 2500 г. Инстилляцию р-ром БПК производили ежедневно 3 раза в день в течение 4 месяцев. Животных разделяли на 2 группы по 6 кроликов. Вторая группа контрольная. Для кормления использовали гранулированный комбинированный корм и свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное, температура воздуха 18-22°С. До начала испытаний все животные прошли двухнедельный карантин.
Проводили клинические наблюдения за глазами кроликов методом биомикроскопии. Состояние глаза оценивали по степени выраженности реакции радужки, состоянию эпителия, прозрачности влаги передней камеры, покраснению конъюнктивы, зрачковому рефлексу, сосудистой оболочке глаза.
Животных выводили из эксперимента гексеналовым наркозом. Глаза энуклеировали, фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, заливали в целлоидин, изготовляли серийные срезы толщиной 15 мкм и окрашивали их гематоксилин-эозином. Кроме того, роговицы глаз каждой серии опытов изучали под сканирующим электронным микроскопом. Для чего роговицы фиксировали 2,5%-ном растворе глютаральдегида, напыляли золотом и изучали под сканирующим электронным микроскопом.
Данные каждого наблюдения животных, которым инстиллировали раствор БПК, сравнивали с данными контрольных животных.
Прижизненные биомикроскопические исследования глаза
На протяжении всего срока наблюдения глаза испытуемых животных подвергались биомикроскопическому исследованию. Оно заключалось в осмотре глаз с помощью офтальмоскопа и щелевой лампы.
Контрольная группа.
Конъюнктива бледно-розового цвета, без отеков и выделений. Роговая оболочка прозрачна. При щелевом наблюдение с флюоресциином изъяны в эпителии не обнаруживаются. Жидкие среды глаза прозрачны. Рефлексы соответствовали физиологической норме. Сосуды глазного дна умеренного кровенаполнения, без узлов. Сетчатка прилежит по всей поверхности.
Опытная группа (БПК)
глаза оставались спокойными. Конъюнктива слабо-розовая, без выделений. Роговица прозрачна, отеков не наблюдалось. Среды глаза прозрачны. Зрачковый рефлекс в норме. Сосуды ретинальной оболочки не изменены. Состояние роговицы глаз исследовали с помощью флюоресцеина на щелевом освещение. Ни в одном случае кератопатических изменений не выявлено. При наблюдение через линзу отмечен более четко по сравнению с контролем сосудистый рисунок сетчатки глаза.
Оценка сенсибилизирующего действия БПК
2+
-3
-12
2
Изучали биологическое действие БПК, образованного взаимодействием эквимолекулярных количеств выделенных из ПЭ глаза быка регуляторного пептида с молекулярной массой 4372 Да и белка с мол. массой 66367 Да, в присутствии ионов Са (10 М), в виде раствора в концентрации, соответствующей 10 мг белка/мл, приготовленного на физиологическом растворе состава - 0,9% NaCl и 0,01% CaCl.
Исследования проводили на морских свинках, белых крысах и белых мышах. Животные получены из питомника "Крюково", согласно паспорту молодые, половозрелые. Их содержали в стандартных металлических клетках по 5 особей. Для кормления использовали гранулированный комбинированный корм и свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное, температура воздуха 18-22°С. До начала испытаний все животные прошли двухнедельный карантин.
В целях стандартизации, перед началом опыта, животных не кормили в течение суток.
Результаты эксперимента обрабатывали методами вариационной статистики по критерию t Стьюдента.
Пример 9. Оценка способности БПК. вызывать активную кожную анафилаксию у морских свинок in vivo
-7
-9
-10
-17
Исследование проводили на морских свинках в количестве по 10 голов в группе, всего 2 группы. Сенсибилизировали животных по схеме: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра в концентрациях 10, 10, 10, 10 мг/мл. На 14 день на выстриженных участках спины морским свинкам вводили внутрикожно препарат. Для контроля реактивности кожи вводили физиологический раствор тому же животному на другой выстриженный участок кожи. Контрольным животным вводили разрешающую инъекцию препарата (равную сенсибилизирующей дозе). Затем животным вводили внутривенно по 0,5 мл 1%-ного раствора синего Эванса. Через 30 минут животных выводили из эксперимента эфирным наркозом и определяли размер синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения. Положительной считается реакция при размере пятна выше 6 мм, не более 3 мм в контроле.
Результаты измерения размеров окрашенного кожного пятна приведены таблице 1.
Результаты статистически не достоверны.
Пример 10. Влияние БПК, на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей
-7
-9
-10
-17
Опыты проводили на нелинейных мышах, массой 18-20 г, по 10 животных в группе. Общее количество животных в опыте - 30. Животных однократно сенсибилизировали внутрикожно в основании хвоста эмульсией препарата в концентрации 10, 10, 10, 10 мг/мл в НАФ (1:1). Доза введения составила 60 мкл. Контрольных животных сенсибилизировали эмульсией НАФ с раствором Хенкса (1:1). Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы ввели 40 мкл раствора тест - препарата в растворе Хенкса. Через 24 часа после тестирования измеряли величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25.
Результаты измерения толщины лапы у испытуемых животных сведены в таблице 2.
При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница в толщине лапок опытных групп и контрольной (Р>0,05).
Введение р-ра БПК не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Пример 11. Влияние БПК, на реакцию дегрануляции тучных клеток у крыс in vitro
-7
-9
-10
-17
Постановку эксперимента проводили на крысах Wistar, массой 180-200 г, самках. Общее количество животных в опыте - 30. Вводили р-р БПК внутрибрюшинно в концентрациях 10, 10, 10, 10 мг/мл, контролем служила интактная группа.
Для получения взвеси тучных клеток животных декапитировали, в брюшную полость вводили буфер; после массажа передней брюшной стенки взвесь тучных клеток собирали в центрифугированием (3000 g, 30 мин) в пробирки.
Препараты готовили на предметных стеклах, окрашенных 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляли 0,03 мл сыворотки опытного животного и 0,03 мл исследуемого р-ра БПК в разведении 1:100. В контроле дегрануляция не превышала 5%. Препараты накрывали покровным стеклом, края которого герметизировали парафином. Затем инкубировали 15 минут в термостате при 37°С. Препараты исследовали микроскопически при увеличении × 40, подсчитывая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные, в сумме 100. Реакцию считали положительной, если степень дегрануляции превышала 20%.
Процент дегрануляции тучных клеток в опытной группе (БПК) составляет 4%, а в контрольной группе - 3%. Результаты статистически не имели достоверных отличий (р>0,05).
Таким образом, введение р-ра БПК не вызывает дегрануляции тучных клеток: значения параметра дегрануляции не отличались от контроля и не превысили порогового значения 5%.
Пример 12. Влияние БПК. на Фагоцитарную активность макрофагов крысы in vitro
Постановку экспериментов проводили на белых крысах массой 180-200 г. Общее число животных в опыте 20, по 10 в каждой группе.
3
Метод основан на определение оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Крыс, подвергнутых воздействию исследуемого препарата, декапитировали. Асептически внутрибрюшинно вводили 5 мл среды 199, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки. После массажа брюшной полости среду отбирали шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяли в общий пул. Концентрацию живых клеток доводили до 1,5×10 клеток/мл. Суспензию клеток стерильно разливали по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки инкубировали 2 часа при 37°С. Надосадочную фракцию, содержащую не адгезировавшие к пластику клетки, сливали, а фиксированный на пластике монослой дважды промывали средой 199. В слегка подсушенные чашки наливали раствор, содержащий нейтральный красный, и выдерживали при 37°С в течение 1 часа, затем раствор сливали, клетки промывали средой 199. В каждую чашку вносили по 3 мл лизирующего раствора, которым обрабатывали тщательно клетки, совершая вращательное движение чашки. Раствор сливали в пробирки и на спектрофотометре при длине волны 540 нм измеряли оптическую плотность. Результаты исследования светопропускания лизирующего раствора сведены в таблицу 3.
7
-9
-10
-17
При введении БПК в концентрациях 10-, 10, 10, 10 мг/мл не было отмечено изменения фагоцитарной активности макрофагов по сравнению с контрольной серией. Статистически достоверных различий между показателями в опытной и контрольной группах нет (р>0,05).
Выводы
.
Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод об отсутствии аллергенных, сенсибилизирующих и иммунотоксических свойств р-ра БПК.
Раствор БПК можно рекомендовать для испытаний в клинике.
Пример 13. Исследования влияния БПК. инстиллированного в глаз кролика, на состояние тканей глаза
-7
-9
-10
-17
Раствор БПК в концентрациях 10, 10, 10, 10 мг/мл инстиллировали 6 раз в сутки в глаза кроликов (порода Шиншилла, обоего пола, 2300-2500 г) в течение 4-х месяцев. В контрольной группе (10 кроликов) аналогично инстиллировали в глаза физиологический раствор. Кроликов выводили из эксперимента эмболией, микрохирургически выделяли глаза. Гистологические срезы произведены по экваториальной части. Анализу были подвергнуты все структуры глаза.
Контрольная группа.
Роговица имеет пять слоев: плоский неороговевающий эпителий (наружный слой); Боуменову пограничную мембрану; собственное вещество, которое представлено правильно расположенными коллагеновыми пластинками и уплощенными фибробластами; заднюю пограничную мембрану (десцеметову оболочку), состоящую из коллагеновых волокон и эндотелий, имеющий один слой правильных шестигранных клеток, между которыми находятся уплощенной формы фибробласты.
Радужка представляет собой передний вырост сосудистой оболочки. Она разделяет переднюю и заднюю камеры глаза. Гистологически она представлена со стороны передней камеры однослойным плоским эпителием; передним пограничным слоем; сосудистым слоем; задним пограничным и пигментным слоями. В толще радужке прослеживаются пигментные клетки.
Хрусталик имеет вид двояковыпуклого тела. Его передняя стенка состоит из однослойного кубического эпителия, который по направлению к экватору становится выше. Эпителиальные клетки связаны щелевыми контактами. Основную часть хрусталика занимают хрусталиковые волокна. Капсулу хрусталика составляет толстая базальная мембрана.
Склера построена из плотных тяжей коллагеновых волокон, между склерой и роговицей находится сеть сообщающихся полостей для оттока внутриглазной жидкости (шлеммов канал). Со стороны задней стенки глаза можно грубо разделить три слоя: сетчатка, сосудистая оболочка и склера. Под склерой и внутренним ядерным слоем лежит слой пигментного эпителия, далее зона палочек и колбочек, прикрытых наружной пограничной мембраной. Далее располагаются слои наружный ядерный, наружный ретикулярный, внутренний ядерный, внутренний ретикулярный, ганглиозный, нервных волокон и завершается внутренней пограничной мембраной.
Место входа зрительного нерва - слепое пятно.
Опытная группа - БПК.
Гистологические исследования: роговица, строма и эндотелий без изменения. Угол передней камеры открыт. Сосудистый рисунок радужной оболочки и ее отростков не изменен, отека стромы нет. Цилиарное тело без особенностей. Структура хрусталика в норме. Четко выраженные ядерные слои сетчатки, каких-либо дистрофических и или воспалительных явлений не обнаружено. Хориоидея без особенностей.
Электронно-микроскопическое исследование.
В контрольных группах животных
в образцах роговицы вся внутренняя поверхность покрыта эндотелием. Клетки имеют правильную шестигранную форму и округлое ядро, плотно прилегают друг к другу.
В группах животных, получавших БПК,
не отмечали каких-либо дистрофических процессов. Состояния эндотелия не отличалось от контроля.
Таким образом, клинические и патоморфологические, в том числе и ультраструктурные исследования оболочек глаз, после введения БПК половозрелым животным в течение 4 месяцев, свидетельствуют об отсутствие повреждающего воздействия на ткани глаза.
Пример 14. Изучение мутагенного и канцерогенного действия р-ра БПК на соматических клетках млекопитающих in vivo
Исследование потенциальной мутагенной активности БПК было проведено на млекопитающих в условиях in vivo с помощью методов, входящих в стандартную систему испытаний в соответствии с утвержденными Фармакологическим комитетом МЗ СССР «Методическими рекомендациями по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов», 1981 год.
Эксперимент проводили на мышах линии C57BI/6J (самцы, весом 20-22 г), в каждой группе было 5 животных.
-7
-9
-10
-17
Мышам опытной группы №1 в течение пяти дней ежедневно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл препарата р-р БПК в концентрациях 10, 10, 10, 10 мг/мл;
животным контрольной группы №2 внутрибрюшинно в течение 5 дней вводили по 0,1 мл физ. р-ра;
группа №3 - интактные животные, которые не получали ни БПК, ни физ. р-р.
Через 7 дней животных всех групп выводили из эксперимента эфирным наркозом, из бедренных костей извлекали мозг и приготавливали цитогенетические препараты по общепринятой методике, включающей предварительное введение колхицина, гипотоническую обработку 0,6%-ным KCI, фиксацию в смеси метанол: уксусная кислота (1:3). Результаты обрабатывали с помощью критерия Стьюдента.
Мутагенный эффект изучали по микроядерному тесту и тесту частоты хромосомных аберраций в клетках костного мозга (таблица 4).
Выводы
. В результате проведенных исследований установлено, что при воздействии БПК доля поврежденных клеток и количество аберраций на клетку в костном мозге мышей были такими же, как у интактных и контрольных животных, получавших физиологический раствор.
Экспериментальные данные, полученные в ходе проведенной оценки генетической активности БПК свидетельствуют об отсутствии мутагенного действия исследованного раствора в соматических и генеративных клетках млекопитающих и отсутствии потенциальной канцерогенной активности исследованного препарата.
Пример 15. Изучение иммунотоксических и аллергизируюших свойств раствора БПК
-12
Исследование иммунотоксических и аллергизирующих свойств р-ра БПК было проведено на морских свинках. Раствор БПК наносили на кожу экспериментальным животным в дозе 0,1 мл в концентрации 10 мг белка/мл в течение 5 дней. Действие препарата определяли, оценивая такие параметры:
• состояние кожных покровов в области нанесения препаратов,
• реакцию специфического лизиса лейкоцитов,
• реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении,
• реакцию бласттрансформации клеток тимуса,
• реакцию бласттрансформации клеток селезенки.
Анализируя результаты проведенных экспериментов по изучению иммунотоксических и аллергенных свойств р-ра БПК можно сделать следующее заключение:
Раствор БПК:
• Не вызывает каких-либо изменений кожных покровов морских свинок.
• При накожном применении не влияет на реакцию специфического лизиса лейкоцитов.
• Не влияет на реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении (опыт 3,3±1,3%, контроль 3,4±1,7%).
• Не оказывает влияния на бласттрансформацию клеток тимуса (индекс стимуляции - опыт 138,9±6,7; контроль 141,0±5,7).
• Не влияет на бласттрансформацию клеток селезенки (индекс стимуляции - опыт 267,1±3,7, контроль 275,3±4,3).
Учитывая, что р-р БПК не обладает иммунотоксическим и аллергизирующим действиями можно в качестве близких аналогов отметить такие офтальмологические препараты, также основанные на биологически активных веществах, которые выделяют из тканей животных (сыворотка крови, глаза бычков) как Солкосерил (регистрационное удостоверение Р.П. №013887/01-2002) и Офталамин (Цитамины - биологически активные добавки к пище, Санкт-Петербург, 2004). Как было установлено, данные препараты, Солкосерил и Офталамин, которые применяются в существенно более высоких дозах, соответственно, 8,3 мг/г и 10 мг три раза в сутки, чем р-р БПК, не обладают иммунотоксической и аллергизирующей активностями.
Вывод
. Раствор БПК не проявляет иммунотоксических и аллергизирующих свойств.
Пример 16. Исследование эмбриотоксичности и тератогенности БПК
Экспериментальная оценка токсического действия БПК на эмбриональное развитие зародышей, а также выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в постнатальном периоде жизни, была проведена на крысах Wistar. Исследование препарата проводили в течение всего периода беременности - 20 дней. Животным вводили р-р БПК (0,1 мл) внутримышечно ежедневно. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств р-ра БПК проводили в два этапа: 1-ый - исследовали влияние препарата на эмбриональное развитие в пренатальном периоде, во 2-ом - обследовали потомство в постнатальном периоде. Для оценки влияния р-ра БПК на эмбриотоксичность и тератогенность определяли количество выкидышей у крыс, количество крысят в помете, количество выживших крысят, оценивали физическое и эмоциональное состояние потомства, двигательную функцию и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов. Кроме того, проводили изучение изменения половых органов у крыс после введения р-ра БПК.
Было показано, что при воздействии р-ра БПК у опытных животных не наблюдали выкидышей, потомство рождалось в срок, количество крысят в пометах не отличалось от количества крысят контрольной группы. Крысята опытной группы имели тот же вес, что и потомство контрольной группы, выживаемость крысят, испытавших влияние р-ра БПК была полной. Их двигательная и эмоциональная активности не отличались от крысят контрольной группы. У экспериментальных животных, получавших р-р БПК, не было обнаружено изменений в половых органах. Таким образом, проведенными исследованиями не установлено отсутствие каких-либо патологических нарушений в ходе эмбрионального и постэмбрионального развития потомства экспериментальных животных после приема р-ра БПК.
Вывод
. БПК, исследуемый в виде раствора не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием, не оказывает влияния на общее физическое развитие потомства, его двигательную активность и эмоциональное состояние, а также на скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов.
Заключение о безопасности БПК
Подводя итоги токсикологического изучения БПК, предназначенного в глазную практику в качестве биорегулятора метаболических процессов в тканях заднего сектора глаза, оказывающего стабилизирующее воздействие на клеточную дифференцировку в пигментном эпителии, на состояние биполярных и Мюллеровских клеток нейральной сетчатки (клеточные источники регенерации), а также на состояние склеральной оболочки и хороида глаза, следует отметить, что БПК является малотоксичным веществом при инстилляции в конъюнктивальный мешок в течение 4-х месяцев.
В связи с предполагаемым клиническим использованием р-ра БПК было проведено исследование в условиях хронического эксперимента. Исследования выполнены на кроликах породы шиншилла, которым 6 раз в день в течение 4 месяцев вводили р-р БПК. Как показали исследования, данный р-р хорошо переносится животными и не влияет на их общее состояние, на гематологические показатели и систем организма (по данным использованных биохимических тестов). По результатам исследований р-р БПК можно рекомендовать для исследования в клинике.
2+
-3
12
2
Таким образом, БПК, образованный взаимодействием эквимолекулярных количеств выделенных из ПЭ глаза быка, например, регуляторного пептида с молекулярной массой 4372 Да и сывороточного альбумина белка с мол. массой 66367 Да, в присутствии ионов Са (10 М), в виде р-ра в концентрации, соответствующей, например, 10- мг белка/мл, приготовленного на физ. р-ре состава - 0,9% NaCl и 0,01% CaCl может быть применен как биорегулятор метаболических процессов, протекающих в ПЭ, в сетчатке, склере и хороиде глаза, который оказывает стабилизирующее воздействие на клеточную пролиферацию и дифференцировку в ПЭ.