Использование иммунофенотипирования для совершенствования диагностики и прогнозирования результатов терапии острых нелимфобластных лейкозов

Использование иммунофенотипирования для совершенствования диагностики и прогнозирования результатов терапии острых нелимфобластных лейкозов

И.Г.Маркина, Н.Н.Тупицын, Л.Ю.Андреева Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Эффективность лечения больных острыми лейкозами (ОЛ) в первую очередь зависит от своевременно и точно установленного диагноза. Основой диагностики биологически гетерогенной группы ОЛ является морфологический и цитохимический анализ бластных клеток, позволяющий выявить наиболее стойкие, гистогенетически обусловленные энзимохимические отличия родоначальных кроветворных клеток различного происхождения. На основании морфоцитохимических различий лейкозных клеток, согласно критериям РАВ-классификации, предусматривается выделение 3 вариантов острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) и 8 вариантов острого нелимфобластного лейкоза (ОН Л Л) [15]. Однако, современный уровень диагностики гемобласгозов, помимо морфологических и цитохимических исследований, предполагает использование иммунологических методов. В настоящее время им-мунофенотипирование при ОЛ стало неотъемлемым компонентом диагностического процесса. Использование широкой панели диагностических моноклональных антител (мкАТ) позволяет определять совокупность поверхностных и цитоплазматических антигенов злокачественных клеток с целью установления принад лежности этих клеток к определенной линии гемопоэза, а также выявления уровня возникновения патологического клона (т.е. стадию, на которой остановлено их нормальное развитие). При ОЛЛ иммунофенотипические особенности бластных клеток, в большей степени, чем их морфоцитохимические характеристики, коррелируют с рядом важных биологических и клинических параметров опухоли и, поэтому, имеют решающее значение при выборе программы терапии больных [28,36,42]. Иммунологический метод диагностики при ОН Л Л позволяет идентифицировать такие варианты как МО, Мб и М7 [13,29,38, 43], а также помогает проводить дифференциальную диагностику между М1 и М2, М2 и М3, М2 и М4 вариантами. Кроме того, использование иммунофенотипирования дает возможность выявлять гетерогенность в пределах морфоцитохимически однородной популяции лейкозных клеток внутри отдельных РАВ-вариантов, что, несомненно, является существенным для разработки иммуноклассификаций ОНЛЛ, ориентированных на индивидуализацию химиотерапевтических режимов для конкретных иммунологических подгрупп.

В Российском онкологическом научном центре РАМН накоплен достаточно большой опыт по диагностике и лечению ОНЛЛ. У истоков этих работ стоят школы акад. Г. И. Абелева, проф. А.Ю.Барышникова, проф. Н.Н.Тупи-цына. Исследования иммунофенотипа ОНЛЛ базируются на прочном морфо-иммуноцитохимическом фундаменте, критериях РАВ-классификации (этот раздел работ в РОНЦ возглавляет проф. М.А.Френкель). Приводимые нами в статье сведения о взаимосвязи экспрессии тех или иных антигенов с клиническими проявлениями и прогнозом получены совместно с проф. М.А.Волковой (отделение химиотерапии гемобласгозов (рук. - к.м.н. Д.Ш.Осма-нов) РОНЦ РАМН). Именно столь комплексный подход к проблеме позволил установить роль иммунофенотипирования как метода исследования и диагностики ОНЛЛ и рекомендовать широкое видение оценки мембранных маркеров в качестве основы совершенствования лечения этого заболевания. В данной публикации мы попытались представить не только алгоритм иммунодиагностики ОНЛЛ, но и дать характеристику наиболее часто используемых антигенов, а также их ассоциации с определенными биологическими свойствами опухоли и прогнозом заболевания на основании собственных наблюдений и анализа данных зарубежной литературы.

Согласно рекомендациям первой Европейской группы по иммунологической классификации лейкозов (ЕИЬ) [1] исследование бластных клеток при ОНЛЛ должно проводиться в два этапа. На первом этапе необходимо подтвердить миелоидную природу опухолевого клона клеток. Для этого используют наиболее специфичные маркеры миелоидного происхождения (анти-МПО, СО 13, СОЗЗ, ССКубб, СБ117), атакже линейно-неспецифические антигены и антигены, ассоциированные со стволовой клеткой (ТсГГ, СЭ34, НЬА-ОЯ). С целью дифференциальной диагностики с ОЛЛ в панель должны быть включены и наиболее специфичные лимфоидные маркеры, отражающие наиболее ранние стад™ В- и Т-клеточной направленности дифференцировки (СО 19, цитоплазматический С022, СБ79а, СО 10, цитоплазматический СОЗ, С02, СОТ). На втором этапе используется более широкая панель мкАТ с целью более детальной классификации вариантов ОНЛЛ.

В РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН иммунофенотипиро-вание ОЛ проводится в течение примерно 20 лет. Разуме-

ется, на протяжении этого периода панель мкАТ, используемых для иммунодиагностики ОЛ дополнялась и уточнялась с учетом диагностической и прогностической значимости маркеров. Накопленный нами опыт позволил полностью отказаться от алгоритма двух- или трехэтапного иммунофенотипирования по следующим причинам [5]:

1. При диагностике вариант ОЛ не известен и необходимо применение широкой панели мкАТ как к миелоид-ным, так и к лимфоидным антигенам.

2 В обязательном порядке в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН проводится полное цитохимическое исследование [8]. По эти причинам иммунофенотипирование при ОНЛЛ не является главным методом диагностики варианта лейкоза. Диагностическая роль иммунофенотипирования имеет решающее значение при редких вариантах ОНЛЛ -МО, М6иМ7.

3. В зі іачитсльной части случаев ОНЛЛ решающую роль играют не маркеры линейной принадлежности, а стадиеспецифичные и линейно не ресгриктированные антигены.

4. Двух-и трехэтапная постановка реакции технически не удобна для лаборантов, так как им приходится неоднократно обрабатывать один и тот же материал (клетки больного), что требует большего времени и не является оправданным.

Используемая в РОНЦ РАМН панель для диагностики ОНЛЛ приведена в табл. 1 [5].

Представленный перечень не является исчерпывающим, он может быть дополнен другими антигенами. Чем шире набор диагностических мкАТ, тем большая вероятность выявления аномалий опухолевого фенотипа, что может быть использовано в дальнейшем для контроля минимальной резидуальной болезни. Использование широкой панели мкАТ дает возможность установить линейную коммитацию бластов и позволяет более точно охарактеризовать лейкозный клон клеток миелоидного происхождения для выявления определенных закономерностей между различными морфоцитохимическими вариантами ОНЛЛ и уровнями экспрессии ряда антигенов.

Миелоидная направленность бласгных клеток при ОЛ может быть определена по экспрессии двух общемиело-идных антигенов - СО 13 и СОЗЗ. (В последние годы широкое распространение получили исследование СО\у65 и иммунологическое исследование миелопероксидазы, но мы не имеем соответствующего опыта работы с этими маркерами). Оба этих маркера (С013 и СОЗЗ) в нормальной дифференцировке появляются на С034+ клетках после линейно не ограниченных антигенов С038 и НЬА-ОЯ и в дальнейшем присутствуют на всех стадиях дифференци-ровки миелоидных клеток.

Антиген СОЗЗ представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 67кД, кодируемый геном, локализованным в длинном плече 19хромосомы. Имеет лектино-

Таблица 1. Иммунофенотипические маркеры, используемые при диагностике ОНЛЛ.

Антиген Клеточная специфичность

Миеломоноцитарные антигены CDllb CD 13 CD 14 CD15 CD33 Гранулоциты, моноциты, ЕК-клетки Гранулоциты, моноциты со стадии КОЕ-ГМ Моноциты, макрофаги, гранулоциты (слабо) Гранулоциты, моноциты Миелоидные клетки-предшественники, моноциты

Эритроидные антигены НАЕ-3 (гликофорин А) НАЕ-9 (антиген эритробластов) Эритроциты, эритроидные предшественники Ядросодержащие эритроидные клетки

Мегакариоцитарные антигены CD41, CD42, CD61 Тромбоциты, мегакариоциты

Антигены различных линий CD34 CD38 HLA-DR CD10 Стволовые клетки Гемопоэтические клетки-предшественники, активированные В- и Т-клетки, моноциты Гемопоэтические клетки-предшественники, активированные Т-клетки, В-клетки, моноциты/макрофаги В- и Т-клетки предшественники, гранулоциты

В-клеточные антигены CD 19 CD22 CD37 В-клеточные предшественники и В-клетки В-клетки Зрелые В-клетки, низкие уровни экспрессии на некоторых Т-клетках и миелоидных клетках

Т-клеточные антигены CDla CD3 CD2 CD4 CD5 CD7 Кортикальные тимоциты Зрелые Т-клетки Тимоциты, Т-лимфоциты, ЕК-клетки Т-хелперы, моноциты, макрофаги, гранулоциты Тимоциты, зрелые Т-клетки Т-клеточные предшественники и Т-клетки, ЕК-клетки, незрелые клетки миелоидного ряда

вую активность. Антиген экспрессируется на мультипо-тенгных клегках-предшесгвенниках гранулоцигарно-моно-цитарной, эритроидной и мегакариоцитарной линий (КОЕ-ГЭММ), а также на клетках-предшественниках, ком-митированных в грануломоноцитарном (КОЕ-ГМ) и эрит-роидном (БОЕ-Э) направлении (рис. 1). Экспрессия СОЗЗ выявляется в подавляющем большинстве случаев при М1

- М5 ОНЛЛ, реже - при МО, Мб и М7. СОЗЗ-позитивный иммунофенотип коррелирует с 1:( 15; 17) и 1(8;21) [ 11 ], молодым возрастом больных [3,33], отсутствием тромбоци-топении в дебюте заболевания [41] и весьма высокой чувствительностью к проводимой терапии [24].

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 1. Экспрессия антигена СОЗЗ в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток. Здесь и на последующих рисунках обозначения: о - отсутствие антигена на клетках; о _ экспрессия антигена на части клеток; ф - наличие антигена на клетках.

Антиген СЭ13 является гликопротеином с молекулярной массой 150 кД, который в нормальной клеточной диф-ференцировке экспрессируется на поверхности комми-тированных гранулоцитарно-моноцитарных предшественников и на клетках гранулоцитарного и моноцитарного направления всех стадий дифференцировки (рис. 2). Молекула СО 13 идентична аминопептидазе 14, которая известна как мембранная металлопротеаза, участвующая в метаболизме биологически активных пептидов клетками различных типов, включая макрофаги и гранулоциты. Экспрессия антигена С013 наблюдается приблизительно у 60% больных ОНЛЛ. Реакция на СО 13 положительна для 93-100% случаев М1 - М4, несколько реже она встречается при МО и М5 вариантах (67-86%) и не обнаруживается в большинстве случаев Мб и М7 ОНЛЛ. Отсутствие экспрессии СО 13 на поверхности бластных клеток коррелирует с вариантом М2, ассоциированным с г(8;21) [14] и с М5а, ассоциированным с 1(9; 11) [22]. Особенностями СО 13-позитивного иммунофенотипа, по нашим данным, также являются исходный гиперлейкоцитоз (58,8 +/- 3,07 против 23,5 +/- 6,29 тыс./мкл; р = 0,048), гиперклеточность костного мозга (201,4 +/- 57,9 против 106,2 +/-14,43 тыс./ мкл; р = 0,03), низкая общая выживаемость (медиана 5 мес. против 13 мес.; р = 0,06).

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 2. Экспрессия антигена С013 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Помимо общемиелоидных маркеров, позволяющих подтвердить миелоидную природу лейкоза в 98% случаев

[17], изучаются линейно не рестриктированные антигены лимфоцитов, экспрессия которых в большинстве случаев ОНЛЛ коррелирует с незрелостью клоногенных элементов. В нормальном костном мозге процент клеток, коэкс-прессирующих маркеры различных гемопоэтических линий, невелик, однако этот феномен достаточно часто встречается при гемобластозах. Экспрессия маркеров различных линий кроветворения выявляется в среднем у 35-48% больных ОНЛЛ [12,30,37,48]. В таких случаях вариант заболевания трактуется по-разному в зависимости от того, какие именно «лимфоидные« антигены выявляются на бластных клетках ОНЛЛ. Общим термином, который применим во всей этой группе лейкозов, является термин «острые смешанно-линейные (mixed-lmeage) лейкозы (ОСЛЛ)». Наиболее частой разновидностью ОСЛЛ являются линейно-разномаркерные лейкозы, происходящие из клеток-предшественников, коэкспрессирующих в норме маркеры различных линий [6].

Один из наиболее часто встречающихся лимфоидных маркеров при ОНЛЛ антиген С07 - гликопротеин с молекулярной массой 40 кД, который, кроме клеток Т-ряда, обнаруживается на примитивных гемопоэтических клетках, способных к миелоидной дифференцировке (рис. 3). С07 играет роль в передаче внутриклеточного сигнала для последующего развития, активации и дифференцировки Т-клеток. Связывание мембранных С07 с помощью мкАТ вызывает секрецию цитокинов и изменяет клеточную адгезию. По нашим данным С07 экспрессируется на поверхностной мембране бластных клеток в 28% случаев ОНЛЛ и ассоциируется с МО, М1, М4, М5а и Мб морфоцитохимическими вариантами. Имеются убедительные данные об ассоциации экспрессии антигена С07 с наиболее важными факторами неблагоприятного прогноза - фенотипом множественной лекарственной устойчивости, наличием РЬ-хромосомы, аномалиями 5 и/или 7 хромосомы, а также со сложными нарушениями кариотшТа [48]. Некоторыми авторами также отмечается, что клиническими особенностями С07-позитивных ОНЛЛ являются вовле-

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 3. Экспрессия антигена С07 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

чение в опухолевой процесс центральной нервной системы, высокий лейкоцитоз в дебюте заболевания, гепато-спленомегалия [25]. По данным РОНЦ РАМН отсутствие на бластных клетках антигена С07 коррелирует с более длительной безрецидивной выживаемостью (медиана 15,5 мес. против 5 мес.; р = 0,01), рис. 4. Низкая эффективность стандартной противоопухолевой терапии, по мнению рада зарубежных исследований и нашим данным [2,3,5,30,32, 45], диктует необходимость исходной интенсификации терапии для больных ОНЛЛ с наличием в иммунофенотипе С07-позитивных бластов.

Месяцы

Рис. 4. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена С07 на поверхности бластных клеток при использовании цитозар-антрациклиновых программ.

Антиген С04 представляет собой мембранный гликопротеин с молекулярной массой 55кД и является рецептором антигена гистосовмесгимости II класса, а также принимает участие во внутритимической дифференцировке Т-клеток. Помимо экспрессии на Т-клетках, он может присутствовать на мембране гемопоэтических клеток-пред-шественников, находящихся на очень ранних стадиях развития (КОЕ-ГМ, БОЕ-Э, КОЕ-Мег), а также на поверхност-

ных мембранах моноцитов и макрофагов (рис. 5). Процент выявления С04 при ОНЛЛ, по данным разных авторов, колеблется от 13% до 48%. Этот антиген наиболее характерен для МО (57%), М4 (64%) и М5 (83%) вариантов ОНЛЛ [30]. В большинстве случаев данный иммунофенотип обнаруживается у пациентов с наличием аберрации 1Ц23 и коррелирует с низкой выживаемостью [37].

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 5. Экспрессия антигена С04 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Антиген С02 является гликопротеином с молекулярной массой 50кД, относящимся к суперсемейству иммуноглобулинов. Этот многофункциональный маркер участвует в активации Т-клеток, продукции цитокинов, индукции апоптоза и в регуляции цитолиза, опосредованного Т-лимфоцитами. С02 экспрессируется на ранних стадиях внутритимической дифференцировки Т-клеток и на последующих этапах их развития, а также обнаруживается на ЕК-клетках (рис. 6). По данным разных авторов частота экспрессии этого антигена колеблется от 11% до 21% случаев ОНЛЛ. Наличие С02 наиболее часто наблюдается на поверхности бластных клеток при вариантах М3 (осо-

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 6. Экспрессия антигена С02 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

бенно при МЗу) и М4эоз. Коэкспрессия антигенов С02 и СО 19 является одной из наиболее частых при ОНЛЛ, причем при М3 такая комбинация маркеров отмечается в 2, а при М4эоз - в 8 раз чаще по сравнению с другими вариантами ОНЛЛ [12]. По данным этих же авторов, больные с иммунофенотипом [С02+; СО 19+] имеют достоверно более высокую частоту достижения ремиссии и более длительную 2-х летнюю выживаемость по сравнению с [С02; С019]-негативными пациентами.

АнтигенС019 является мембранным гликопротеином с молекулярной массой 95 кД, который экспрессируется в костном мозге самыми ранними предшественниками В-клеток и на всех последующих стадиях созревания В-лимфоцитов (рис. 7). СО 19 участвует в регуляции развития, активации и дифференцировки В-лимфоцитов. В нашем наблюдении частота экспрессии СО 19 при ОНЛЛ составила 15,5%. Наиболее часто он был выявлен при М1, М2 и М4 вариантах в 15%, 23% и 13% случаях соответственно. При варианте М2 экспрессия антигена СО 19 с высокой степенью вероятности (90%) коррелирует с транслокацией 1(8;21)[31]. По нашим данным прогностическая роль СО 19 реализуется в условиях лечения лейкозов по цитозар-идарубициновой программаме, которая в настоящее время является базисной в отделении химиотерапии гемобластозов РОНЦ РАМН [4].

Костный мозг

Периферическая кровь

Костный мозг

Рис. 8. Экспрессия антигена СОЮ в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

верно большая общая выживаемость больных (медиана 21 мес. против 6 мес.; р = 0,049), рис. 9.

Периферическая кровь ж

Месяцы

Рис. 7. Экспрессия антигена С019 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Антиген СОЮ - одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 100 кД, принадлежащий к семейству мембраноассоциированных пептидаз. Он участвует в росте и формировании В-клеток, гидролизе пептидов, влияющих на пролиферацию. Этот маркер выявляется на ранних лимфоидных родоначальных клетках костного мозга и эмбриональной печени, а среди нелимфоидных гемопоэтических клеток - на зрелых нейтрофилах (рис. 8). В нашем наблюдении [3,7] экспрессия антигена СОЮ на лейкеми-ческих бласгах больных с ОНЛЛ отмечалась в 11 (8%) из 137 исследованных случаев, а именно в 13% - при М1, в 8% - при М2 и в 7% - при М3 и при М4 вариантах. Особенностью СО 10-позитивных ОНЛЛ лейкозов явилась высокая частота полных ремиссий (91%) и за счет этого досго-

Рис. 9. Общая выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена СОЮ на поверхности бластных клеток при использовании цитозар-антрацикпиновых программ.

Современный уровень диагностики ОНЛЛ предполагает также использование линейно не ограниченных антигенов, которые помогают установить стадию зрелости бластных клеток, что, в ряде случаев, коррелируют с эффективностью лечения.

Сгволовоклеточный антиген CD34 представляет собой гликозилированный трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой около 110 кД, который экспрессируется только на незрелых клетках-предшественниках ге-мопоэза (рис. 10). Ген CD34 локализован в длинном плече

1 хромосомы. В нормальном костном мозге до 1,5% мо-нонуклеарных клеток являются С034-позитивными, из них только 5% находится в митотическом цикле, а остальные 95% пребывают в фазе покоя (G0). Популяция CD34+ клеток включает в себя все определяемые in vitro гемопоэ-тические колониеобразующие клеточные линии, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом и способны полностью восстанавливать гемопоэз. При ОНЛЛ

Костный мозг

Периферическая кровь Костный мозг

Периферическая кровь Эрнтооцит

КОЕ-ГЭМ1

Т-клетка

О

Рис. 10. Экспрессия антигена С034 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

экспрессия СЭ34 наблюдается в среднем в 40% случаев. С наибольшей частотой экспрессия данного антигена обнаруживается при низкодифференцированных вариантах (МО, М1 и М5а) и при М4 и в основном отсутствует при М3 и М5б ОНЛЛ. При М2 ОНЛЛ С034-позитивные блас-ты наблюдаются примерно у 30% больных, особенно в случаях, ассоциированных с транслокацией I (8;21). Опухолевый клон клеток ОНЛЛ, экспрессирующий стволовоклеточный маркер, характеризуется низким уровнем Ю 67 - маркера активного синтеза ДНК [34]. Это свидетельствует о том, что большинство опухолевых клеток находится в фазах 00/01 клеточного цикла и, следовательно, являются слабо уязвимой мишенью для химиопрепаратов, действующих на делящиеся клетки. Это подтверждается и клиническими результатами. По данным большинства исследований [3,10,23,26,27,43], С034-позитивные ОНЛЛ характеризуются более высокой злокачественностью и резистентностью к химиотерапии. Имеются данные об ассоциации антигена С034 с высоким уровнем Ьс1-2

[18] и геном множественной лекарственной устойчивости [35]. Высокие уровни экспрессии С034 наблюдаются у больных пожилого возраста [34], а также при вторичных ОНЛЛ и ОНЛЛ, развившихся на основе миелодиспласти-ческого синдрома [26].

С038 представляет собой интегральный мембранный одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 46 кД, около 20% которой приходится на долю углеводного компонента. Этот антиген обладает активностью (АЕ)Р)-рибозилциклазы, которая принимает участие в поступлении аденозин 5'-дифосфат-рибозы в клетку и регуляции ее количества, а также ЫАГ)+-гликогидразы. Кроме того, антиген СЭ38 участвует во внутриклеточном обмене кальция. В нормальном костном мозге экспрессия С038 отмечается на 99% С034+ мононуклеарах. Линейная коммита-ция клеток-предшественников различных ростков гемопо-эза ассоциируется со снижением уровня экспрессии С034 и повышением уровня С038. Экспрессия антигена С038 при нормальной клеточной дифференцировке показана на рис. 11. При ОНЛЛ он выявляется в среднем в 61,5% случаев, наиболее часто при вариантах М0-М2, реже - при

Рис. 11. Экспрессия антигена С038 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

М3- М5. Прогностическое значение антигена СЭ38 особенно важно в условиях современных программ химиотерапии ОНЛЛ. По данным ЮНЦ РАМН препаратом выбора в лечении ОНЛЛ по цитозар-антрациклиновым программам должен являться идарубицин. Этот антрацикли-новый антибиотик полностью нивелирует негативное влияние всех клинико-гематологических и морфоцитохимических факторов на прогноз [3]. При этом прогностическое значение иммунологических маркеров бластных клеток резко возрастает. При использовании идарубицина, по сравнению с другими антрациклинами, пациенты с экспрессией СБ38 имели более высокую частоту полной ремиссии (68,2% против 33,3% соответственно), а также безрецидивную (медиана 14 мес. против 5 мес.; р = 0,013) и общую выживаемость (медиана 12 мес. против 1 мес.; р = 0,019), рис. 12.

НЬА-ХЖ антиген, так же как и антиген С038, экспрессируется на гемопоэтических клетках-предшественниках гемопоэза, он обнаруживается и на некоторых последующих стадиях созревания клеток гранулоцитарного, моно-цитарного, мегакариоцитарного и эритровдного направления (рис. 13). Присутствие НЬА-ОЯ антигена характерно для 69% больных ОНЛЛ. НЬА-ВЯ-позитивные бласгы регистрируются в подавляющем большинстве случаев МО,

0 10 20 30 40 50 60 70

Месяцы

Месяцы

Рис. 12. Общая (вверху) и безрецидивная (внизу) выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена С038 на поверхности бластных клеток при использовании идарубицин-цитарабиновой программе терапии.

М1, М5, Мб и М7 ОНЛЛ и у 60-70% пациентов с вариантами М2 и М4. Дифференциально-диагностическое значение имеет отсутствие НЬА-ОЯ антигена при остром про-миелоцитарном лейкозе, что, наряду с морфоцитохимической характеристикой, может учитываться для идентификации группы наиболее дифференцированных грану-лоцитарных лейкозов. Имеются данные о корреляциях между экспрессией данного маркера с экстрамедулляр-ными проявлениями заболевания [21] и с меньшей чувствительностью к противоопухолевой терапии как у детей с ОНЛЛ[7], так и у взрослых [2,16].

Костный мозг

Эритробддст

О

:пск

КОЕ-1

Ретикулоцит

о

Мспийрнобласт Мегїшї^иоцит

" Миелобласт Проыонопит Миелоцит

~ -О----------------О—

-о-

нтроц

-О

КОЕ-М Монобласт Промиелоцит Про-В Пре-прс-В Пре-В

^х-прс-В

лек

>o-i—о—о---------------------а ,

Про-Т {Субкортикальный Кортикальный Медуллярный

! ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ

I

! Тимус

Маркер миелоидных клеток СО 15 является углеводным антигеном лакто-М-фукопентозы III и участвует в клеточной адгезии. Он появляется на стадии бипотентного предшественника и экспрессируется на большинстве незрелых и дифференцированных клеток, включая промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы и эозинофилы, моноциты, тучные клетки, макрофаги и клетки Лангерганса (рис. 14). На поверхности лейкемических клеток ОНЛЛ СО 15 обнаруживается в 37% случаев. По нашим наблюдениям, наиболее часто экспрессия антигена СО 15 обнаруживается при М2, М3 и М4 и М5б ОНЛЛ, несколько реже - М1 и Мб. Характерной особенностью МО и М7 ОНЛЛ является практически полное отсутствие этого антигена на поверхностных мембранах бластных клеток, поэтому СО 15 можно использовать для дифференциальной диагностики М1 и МО вариантов ОНЛЛ. У больных со специфической транслокацией К8;21) присутствие данного маркера наблюдается практически в 100% случаев [44]. Ряд исследователей указывает на высокую эффективность стандартной цито-зарантрациклиновой терапии для больных, имеющих в иммунофенотипе СО! 5-позитивные бласгные клетки [20,44].

Костный мозг

КОЕ-ГЭМ1

БОЕ-Э

Эритробласт

О

Нериферическая кровь

Эритроцит

Периферическая кровь Эри

Ретикулоцит

о

^ -О-

Мегакариобласт Мегакариоцит

КОЕ-Г Миелоблает Промоношгг Миелоцит ‘ #----------------•----------•—

О

КОЕ-М Монобласт Промислоцит

NK-клетки

-о

•-В Пре-пре-В Пре-В ! В-клетка

о--------------------о—і—о

ри^оц

Тромбоцит

О

Гранулоцит —#

ОЦИТ

Тромбоцит

О

Гранулоцит

—О

^оцит

NJt-клетки

-О

В-клетка

Про-Т

О

-о

| Субкортикальный Кортикальный Медуллярный

! ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ ТИМОЦИТ !

! Тимус |

Т-клетка

-О

Т-клетка

-О

Рис. 13. Экспрессия антигена ША-ОК в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Панель мкАТ для иммунодиагностики ОНЛЛ включает линейно-специфичные маркеры, характерные для эрит-роидной и мегакариоцитарной направленности, а также стадиеспецифичные маркеры, которые появляются на более поздних стадиях дифференцировки гранулоцитар-ных или моноцитарных клеток.

Рис. 14. Экспрессия антигена CD15 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

CD 14 - одноцепочечный мембранный гликопротеин с молекулярной массой 55 кД - представляет собой маркер специфичный для клеток моноцитарной линии поздних этапов дифференцировки (рис. 15). В ряде случаев имеет место экспрессия данного маркера при гранулоцитарных лейкозах. Являясь высокоафинным рецептором для липо-полисахаридов, мембранная форма CD 14 принимает участие в активации продукции цитокинов (туморнекроти-ческого фактора, интерлекинов 1 и 6), а также, в транспорте липидов. Ген, кодирующий CD14, локализуется на 5 хромосоме в регионе, содержащим множество генов ростовых факторов и рецепторов факторов роста. Экспрессия антигена CD 14 обнаруживается у больных ОНЛЛ в среднем в 32% случаев и коррелирует со снижением уровня гемоглобина в дебюте заболевания [41] и низкой эффективностью современной противоопухолевой терапии [19,21,25].

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 15. Экспрессия антигена С014 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Наиболее поздний миелоидный антиген С011Ь является рецептором дня СЗЫ-комплемента, фибриногена, гепарина и т.д. Он осуществляет взаимодействие кроветворных клеток с активизированным эндотелием, участвует в дегрануляции, хемотаксисе и фагоцитозе нейтрофилов. МкАТ к антигену СЭ11Ь реагируют с созревающими клетками гранулоцитарного ряда, начиная со стадии миелоб-ласта, а также с моноцитами, ЕК-клетками, субпопуляцией лимфоцитов (рис. 16). Экспрессия антигена СЭ11Ь наблюдается в среднем в 33% случаев ОНЛЛ и позволяет прогнозировать высокий риск развития рецидива [19,39].

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 16. Экспрессия антигена С011Ь в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Как видно из представленных выше данных, иммуно-фенотипирование не позволяет с такой надежностью как морфология установить тип властных клеток при М1-М5 вариантах ОНЛЛ, однако дает возможность выявить множество дополнительных субтипов в морфоцитохимически однородной популяции злокачественного клона клеток, описывая, тем самым, более детальную картину опу-

холевого субстрата заболевания. Принципиальное значение иммунологическое исследование имеет при установлении ОНЛЛ с эритроидной и мегакариоцитарной направленностью дифференцировки, которые в подавляющем большинстве случаев не могут быть определены на основании морфоцитохимических критериев. С целью распознавания этих редких вариантов ОНЛЛ используют линей-но-специфичные маркеры - гликофорин А (мкАТ НАЕ-3) для варианта Мб и С1Э41, СШ2, СОб1 для варианта М7.

Гликофорин А является специфическим антигеном клеток эритроидного ряда, который выявляется на всех морфологических стадиях, начиная с эритробласта и заканчивая зрелыми эритроцитами (рис. 17). Экспрессия других дифференцировочных маркеров (СЭ34, С038, Н1А-БЯ, СБЗЗ, СО 13, СО 15, С07), по нашим данным, может быть весьма разнообразной и не влияет на установление диагноза. Однако, высокая частота обнаружения таких антигенов, как С034, СОТ, а также линейно не ограниченных маркеров, свидетельствует, что основную массу в пуле опухолевых клеток при Мб варианте ОНЛЛ составляют ранние эритроидные предшественники (БОЕ-Э).

Костный мозг Периферическая кровь

Рис. 17. Экспрессия антигена гликофорина А в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Дополнительным маркером, свидетельствующим о признаках эритроидной дифференцировки, может служить антиген эритробластов (НАЕ-9), мкАТ к которому получены в лаборатории акад. Г.И.Абелева РОНЦ им.

Н.Н.Блохина РАМН. В дифференцировочном ряду этот антиген появляется раньше гликофорина А и отсутствует на зрелых эритроцитах. НАЕ-9 выявляется в среднем в 78% случаев Мб ОНЛЛ, однако также обнаруживается у 14% больных с другими вариантами (наиболее часто - при М2 и М4 ОНЛЛ в 16 и 21% случае соответственно). Проведены обширные исследования (более 400 больных) экспрессии эритроидных антигенов при гемобластозах, включая ОНЛЛ [47], и, тем не менее, время вопрос об их прогностической значимости во многом остается открытым. По нашим данным экспрессия бласгными клетками гликофорина А была ассоциирована с более короткой продолжительностью ПР (медиана 1,5 мес. против 16 мес.; р = 0,02).

В более ранних исследованиях нашей клиники негативное влияние на БРВ обоих эритроидных маркеров оказалось взаимодополняющим [2].

Для установления мегакариоцитарной природы властных клеток при М7 варианте ОН Л Л применяют мкАТ к маркерам СЕ)41, СЕ>42 и СОб 1. Экспрессия антигена СЭ61 (гликопротеин тромбоцитов вРШа) позволяет выявить самые ранние клетки-предшесгвенники, коммитированные в мегакариоцитарном направлении. Наиболее специфичным маркером тромбоцитов и мегакариоцитов является антиген СЕ)41 (гликопротеин тромбоцитов вР ИЫШа), появление которого предшествует процессу полиплоидиза-ции. К более поздним маркерам мегакариоцитарной диф-ференцировки относится антиген С042 (гликопротеин тромбоцитов СР1Ь), появление которого совпадает с началом процесса полиплоидизации. Экспрессия антигенов СБ61, СБ41 и С 042 при нормальной клеточной диффе-ренцировке показана на рис. 18,19и20.

ЮЕ-Э Эритробдает

О

Периферическая кровь Эритооцвт

РеТИКУЛОЦИТ

о

Мегакариобласт Мегакариоцит

КОЕ-Г Мислоблает Промопоцнт Миелоцит ;

~ —о—о—

КОЕ-М Моне гг Промиелоцит Про-В -пре-В Пре-В

Тромбоцит

ГЪапулоцит

—О

Моноцит

-О

NK-клетки

-О

В-клетка

-О

Костный мозг

! Субкортикальный Кортикальный Медуллярный тимоцит ткмоцит тимощгг !

Рис.18. Экспрессия антигенов CD61 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Т-клетка

о

Периферическая кровь

Эритроцит Тромбоцит

Гранулоцит

О

Моноцит

-О

NK-клетки

О

В-клетка

О

Рис. 20. Экспрессия антигена CD42 в ходе нормальной дифференцировки гемопоэтических клеток.

Сказанным, разумеется, не исчерпывается маркерный набор, изучаемый на мембране бластных клеток ОН Л Л. Одним из перспективных антигенов для последующих иммунодиагносгических работ в этом направлении является панмакрофагальный рецептор CD 163. Наши работы указывают на целесообразность использования мкАТ D11 к этому антигену в иммунофенотипировании лейкозов [9,46], однако, его прогностическая роль еще предстоит оценить в последующем.

По данным Reading С.L. ссоавт. одновременная экспрессия антигенов, в норме не встречающихся, определяется в 85 % случаях ОНЛЛ [40]. Основные иммунофено-типические характеристики бластных клеток различных морфоцитохимических вариантов ОНЛЛ суммированы в табл. 2.

В заключение еще раз хотелось подчеркнуть, что в связи с тенденцией к углубленному изучению биологических свойств опухолевой популяции при ОНЛЛ отнюдь не снижаются требования к морфоцитохимическому методу исследования, позволяющему детально описать субстрат заболевания. Однако актуальность иммунофеноти-пирования, позволяющего выявить характерные и атипические свойства бластных клеток, все более возрастает. Принимая во внимание собственные данные и публикации последнего времени, следует признать, что результаты терапии отдельных иммунологических вариантов ОНЛЛ являются неудовлетворительными, несмотря на существенные достижения в лечении этого заболевания в целом. Это диктует необходимость индивидуализации химиотерапевтических режимов для больных с различными иммунофенотипами бластных клеток. Помимо вышеперечисленного, детальный анализ опухолевой популяции при диагностике ОНЛЛ, выявляющий аберрантные комбинации антигенов, создает предпосылки для возможности контроля за остаточной опухолевой популяцией. Это, по-ввдимому, позволит сделать прогнозОНЛЛ более предсказуемым.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСХИЙ ЖУРНАЛ

Таблица 2. Особенности иммунофенотипа бластных клеток при различных вариантах ОНЛЛ

Экспрессируемые антигены Морфоцитохимические варианты ОНЛЛ

МО Ml М2 М3 М4 M5 M6 M7

TdT +/- +/- -/+ - -/+ -/+ - -/+

МПО + + + + + -/+ + +

CD34 + +/- +/- -/+ +/- -/+[3] +/- +/-

CD38 + + + -/+ + -/+ +/- +/-

HLA-DR + + + - + + + +

CD33 +/- + + + + + +/- +/-

CD13 +/- + + + + +/- -/+ -/+

CD15 - +/- + +/- +/- -/+ -/+ -

CD lib - -/+ +/- -/+ + + -/+ -

CD14 - - -/+ - + +/-[3] - -

НАЕ-3 - - - - - - + -

НАЕ-9 - -/+ -/+ - -/+ - + -

CD41 / CD42/CD61 - -/+ [і] -/+ [і] - - -/+ [1] - +

CD10 - * * * * - - -

Т-клеточные CD7*** CD2* CD2** CD2*** CD2*[2] CD2** CD2* CD4**

CD4*** CD4** CD7** CD4* CD5* CD7* CD5* CD3*[2] CD4** CD5*[2] CD7** CD3** CD4*** CD5*[3] CD7** CD4* CD5* CD7*** CD7**

В-клеточные - CD 19* CD19** CD 19* CD 19* - CD19* -

Примечание: *** часто, ** редко, * крайне редко

[1] только для антигена CD61

[2] для М4эоз с аномалиями хромосомы 16 - CD2***, CD3**, CD5**

[3] для М5Ь обычно CD34 (-), CD14 (+), для М5а - CD5**

Литература

I. Бене М.К., Кастолди Г., Напп В. и др. Гематол. и трансфузиол.-1996.-Т.41,N6. -С.43-45.

2 Калетин Г.И., Тупицын Н.Н., Волкова М. А. и др. В кн.: Новое в онкологии. Вып.2/Подред. И.В.Поддубнойи Н.А. Огнерубова. - Воронеж, 1997. - С. 11-14.

3. Маркина И.Г. Автореф. дисс. канд. мед. наук. - М. -2000.-30 С.

4. Маркина И.Г., Волкова М. А., Тупицын Н.Н. и др. Вестник ЮНЦ им. Н.Н.БлохинаРАМН. -2000. -N2. -С. 30-

36.

5. Тупицьш Н.Н. В кн.: Клиническая онкогематология

| /Под ред. М.А.Волковой. - Москва, 2001. - С. 124-145.

f 6. Тупицьш Н.Н. Гематол. и трансфузиол. -1990. - Т.

35, N9.-С. 18-20.

7. Тупицьш Н.Н., Попа А.В., Маркина И.Г. и др. Гематол. и трансфузиол. -1999. - Т. 44, N. 3. - С. 3-8.

8. Френкель М.А. В кн.: Клиническая онкогематология/Под ред. М.А.Волковой. - Москва, 2001. - С. 146-155.

9. Френкель М.А., Тупицьш Н.Н.,РудинскаяТ.Д. и др. Гематол. и трансфузиол. -1995.-Т. 40, N4.-С. 13-16.

10. Adamczyk-CiochM.B., Dmoszyncka A., Hus М. etal. Pol. Arch. Med. Wewn. -1995. - Vol. 94(1). - P. 40-46.

II. Baer M.R., Stewart C.C., Lawrence D. et al. Prog.

I Annu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol. -1994. - Vol. 13. - abstr.

I A1004.

12. BallE.D.,DavisR.B.,GriffinJ.D.etal. Blood.- 1991.-Vol.77(10).-P. 2242-2250.

13. Ball E.D., Fanger M.W. Blood. -1993. - Vol. 61 (3). - P. 456463.

14. Bene M.C., Bernier М., Casasnovas R.O. et al. Leukemia. -1998. - Vol. 2. -P. 54.

15. Bennet J.M., Catovsky D., Daniel M.T. et al. Brit.J. Haematol. -1991.-Vol. 78. -P. 325-328.

16. Bernier М., Massy М., De Leeuw N. et al. Leuk. Lymphoma. -1994. - Vol. 13(1). - P. 109.

#

17. Bloomfield C., Lawerence D., Byrd C. et al. Cancer Res. -1998. - Vol. 58 (18). - P. 4173-4179.

18. Bradbury D.A., Russel N.H. Br.J. Haematol. - 1995.-Vol.91.-P.374-379.

19. Bradstock K., Matthews J., Benson E. et al. Blood. -

1994. - Vol. 84 (4). - P. 1220-1225.

20. Campos L., Guyotat D., Archimbaud E., et al. Br. J. Haematol. -1989. - Vol. 72. -P. 161-166.

21. Casasnovas R.O., Solary E., Campos L. et al. Leuk. Lymphoma. -1994. - Vol. 13(1). -P. 109.

22. CreutzigU.,RitterY.,LudwigW.D.etal. Klin.Radiatr. -1993. -Vol. 205. -P. 272-300.

23. Cuneo A., Fagioli F., Passi I. et al. Leuk. Res. -1992. -Vol. 16 (8).-P. 789-796.

24. De Nully Broun P., Jurlander J., Pedersen-Bjergaard J. etal. Leuk.Res.-1997.- Vol.21(10).- P.985-995.

25. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. Leukemia. -

1994.-Vol. 8(3).-P. 388-394.

26. Fagioli F., Cuneo A., Carli M.G. et al. Cancer Genet. Cytogenet. - 1993. - Vol. 71 (2). - P. 119-124.

27. GuinotM.,SansG.F.,SempereA.etal. Br.J.Haematol. -1991.-Vol. 78.-P. 533-534.

28. HerlzerD.,SeipeltG. Leukemitherapie. - Bremen: Uni-Med Verlag A.G. -1998. - P. 66-80.

29. Jennings C.D., FoonfLA. Blood. -1997. - Vol. 90. - P. 2863.

30. KhalidiH.S.,MedeirosL.J.,ChangK.L. etal. Am.J. Clin. Pathol. -1998. - Vol. 109. - P. 211-220.

31. KitaK., MiwaH.,NakaseK.etal.. Blood. -1992.- Vol. 80.-P. 470-477.

32. KitaK.,MiwaH.,NakaseK.etal.. Blood.-1993.- Vol. 81(3).-P. 2399-2405.

33. Kristensen J.S., Hokland R. Leuk. Res. -1991. - Vol. 15(8).-P. 693-700.

34. Lanza F., Rigolin G.M., Moretti S. et al. Leuk. Lymphoma. -1994. - Vol. 13. -P. 81-85.

35. LeithC.P.,ChenI.M.,KopckeyK.J.etal. Blood.-

1995,-Vol.86.-P.2329-2342.

36. Luesma-Gonalons M., Pavlovsky S., Santarelli M.T. et al. Ann. Oncol. -1992. - Vol. 2. - P. 33-39.

37. Mizutani M., Miwa H., Tarahashi T. et al. Br. J. Haematol. -1997. - Vol. 66. - P. 479.

38. NooterK.,SonneveldP. Cytotehtnology.- 1993.-Vol.

12.-P. 213-230.

39. PaiettaE.,AndersenJ.,YunisJ.etal. Br. J.Haematol. -1998. - Vol. 100(2). -P. 265-272.

40. ReadingCL.,EsteyE.H.,HuhY.O.etal. Blood.-1993. -Vol. 81.-P. 3083-3090.

41. SolaryE.,CasasnovasR.O.,CamposL. etal. Leukemia. -1992.-Vol. 6(5).-P. 393-399.

42. SullivanM.P.,PullenD.J.,CristW.M. etal. Leukemia. -1990.-Vol. 4.-P. 6-11.

43. Terstappen L.W., Safford M., Konemann S. et al. Leukemia. - 1991. - Vol. 5. - P. 75-80.

44. Tien H.F., Wang C.H., Lee M.C. et al. Cancer Genet. Cytogenet. -1995. - Vol. 84(11). - P. 60-68.

45. Tupitsyn N., Volkova M., Frenkel M. et al. Leuk. Lymph. -1994. - Vol. 13.(suppl. 1). - P. 109.

46. Tupitsyn N.N., Frenkel M.A., Rudinskaja T.D. et al. Int. J. Cancer. -1996. - Vol. 68. - P. 160-163.

47. Tupitsyn N.N., Mechetner E.B., Baryshniikov A.Yu. et al. Int. J. Cancer. -1989. - Vol. 44. - P. 589-592.

48. Venditti A., Del Poeta G., Bucdsano F. et al. Leukemia.

- 1998.-Vol. 12.-P. 1056-1063.

>