СИСТЕМА И СПОСОБ ДИНАМИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ РЕДОКС-ПОТЕНЦИАЛА В ТЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ
SYSTEM AND METHOD FOR DYNAMIC MEASUREMENT OF REDOX POTENTIAL DURING A CHEMICAL REACTION

Область техники, к которой относится изобретения
Изобретение относится к системам и способам для измерения динамического изменения химического потенциала электронов и редокс-потенциала в жидкости во время протекания химической реакции, что дает возможность построения зависимости изменения энергии во время реакции.
Предпосылки создания изобретения
Изучение химических реакций затрагивает все современные направления науки. Исследование химических реакций и влияющих на эти реакции условий важно при разработке новых эффективных катализаторов для синтеза и обработки новых перспективных материалов, новых способах синтеза органических молекул, для повышения эффективности переработки сырья. Исследование биологических процессов и связанных с ними биохимическими реакций с фундаментальной точки зрения позволяет приоткрыть завесу того, как функционируют живые организмы, а с практической точки зрения позволяет открывать новые лекарства и совершенствовать существующие методы медицинской диагностики. Для многих индустриальных и исследовательских процессов состояние химической реакции может быть оценено по потенциалу между инертным электродом и электродом сравнения, помещенным в раствор. Такой потенциал принято называть окислительно-восстановительным потенциалом (OBP) раствора. В общем случае, измеряемый потенциал отображает изменение окислительно-восстановительного потенциала инертного электрода, а электрод сравнения предоставляет относительную стабильную точку, от которой производится измерение изменения потенциала.
Традиционные электродные системы состоят из рабочего электрода, который, как правило, исполняется из благородного металла, и электрода сравнения, который чаще всего представляет из себя систему металл/соль металл/раствор. Наиболее распространенными электродами сравнения являются хлорсеребряный, водородный и каломельный электроды. Основным недостатком данных электрохимических сенсоров являются относительно большое время установления равновесия в системе, необходимое для измерения, относительно большие объемы анализируемой жидкости, возникновение шумов в цепи электрохимической ячейки. Все это, значительно влияет на чувствительность, стоимость и точность измерений. Паразитные токи могут возникать из-за коррозии металла, замыканий в электрических схемах или воздействия окружающей среды. Таким образом, помимо необходимости использования нескольких электродов, традиционные электродные системы требуют разработки специализированных компенсационных электрических схем, и, в целом, плохо адаптируются для измерений в микрообъемах.
Кроме классических электродных систем для определения редокс-потенциала существуют также полупроводниковые и оптические сенсоры. Фоточувствительные полупроводниковые сенсоры основаны на детектировании изменения окраски красителей, меняющих цвет при их окислении. Детектирование полупроводниковыми сенсорами основано на использовании специальных молекул медиаторов. По сравнению с традиционными приборами полупроводниковые сенсоры обладают рядом отличительных преимуществ. В первую очередь, такие сенсоры могут регистрировать очень низкие сигналы за счет модуляции и снижения фонового шума. Кроме того, полупроводниковые сенсоры обладают огромным потенциалом для миниатюризации, что позволяет создавать портативные устройства на их основе.
Современные оптические и полупроводниковые сенсоры для определения редокс-потенциала основаны на использовании дополнительных реактивов, что добавляет как минимум одну дополнительную химическую реакцию в схему детектирования. Помимо добавочной стоимости, появления дополнительных шумов и увеличения погрешностей при измерениях, данные схемы сильно ограничены в скорости отклика системы на быстрые колебания потенциала в системе, что делает невозможным их использование для измерения динамического изменения потенциала во времени, вызванного, например, образованием промежуточного соединения в процессе химической реакции.
ISFET и ChemFET (US 4,020,830) структуры получили распространение как твердотельные сенсоры для определения рН-раствора и концентраций соединений. Данные сенсоры используются в промышленности для контроля технологических процессов, в пищевой промышленности и в контроле экологической обстановки. Однако, использование ISFET или ChemFET в качестве инструмента для измерения динамического изменения химического или редокс-потенциала электронов во время химических реакции в литературе на данный момент не представлено.
В свете вышеизложенного, целесообразным является создание устройства для детектирования «всплеска изменения энергии во время реакции», которое в перспективе может быть использовано для изучения кинетики и термодинамики химических реакций.  Также целесообразным представляется создание устройства, которое с одной стороны, обладало бы возможностью к миниатюризации, а с другой стороны, позволяло бы проводить прямое детектирование сверхнизких и быстрых изменений окислительно-восстановительного потенциала, протекающих в динамических неравновесных системах, например, во время химической реакции.
Суть изобретения
Техническая задача, на решение которой направлено разрабатываемое изобретение, и технический результат настоящего изобретения состоит в создании двухэлектродной системы, с помощью которой возможно детектировать промежуточные переходные состояния и осуществлять мониторинг изменения энергии во время протекания химической реакции.
Дополнительной технической задачей является создание способа, в котором бы использовалась разработанная двухэлектродная система, для изучения динамических процессов в электролите, например, для исследования протекающих химических процессов в жидкости.
Техническая задача решается следующим образом.
3
Система для динамического измерения редокс-потенциала в электролите с ограниченным объемом для изучения протекающих в нем химических реакций включает погруженные в электролит и связанные с внешней цепью как минимум один электрод сравнения и как минимум один индикаторный электрод. Электрод сравнения выполнен с возможностью свободного обмена электронами с электролитом и имеет низкое значение импеданса по отношению к импедансу индикаторного электрода, электрод сравнения подключен к источнику постоянного напряжения или общему потенциалу «земли» и на него подается смещение напряжения от внешней цепи. Индикаторный электрод имеет высокое значение импеданса по отношению к импедансу электрода сравнения, препятствующее электронному обмену с раствором электролита, индикаторный электрод подключен к внешней цепи для измерения на нем потенциала. Причем отношение импеданса измерительного электрода к импедансу электрода сравнения составляет не менее 5; расстояние между электродом сравнения и индикаторными электродами не более 1 см, объем электролита составляет не более 10 см и сосуд, ограничивающий объем электролита, обеспечивает высокое значение импеданса электролит – нулевой потенциал «земли» по отношению к импедансу индикаторного электрода, с отношением не менее 5.
Кроме того, значение импеданса электрода сравнения составляет от 5 Ом до 500 кОм.
Кроме того, значение импеданса индикаторного электрода составляет от 5 кОм.
Кроме того, значение импеданса электролит - нулевой потенциал «земли» составляет от 50 кОм.
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве индикаторного электрода используют ионно-чувствительный полевой транзистор, в котором жидкий раствор электролита – это жидкий затвор, а в качестве электрода сравнения используют металлический электрод с большой площадью, при этом площадь металлического электрода превышает более чем в 100 раз площадь затвора ионно-чувствительного полевого транзистора.
2
5
3
4
2
2
2
3
Кроме того, в качестве материала затворного диэлектрика ионно-чувствительного полевого транзистора, контактирующего с раствором электролита, используется диэлектрик, выбранный из диэлектрических материалов: TaO, SiN, ZrO, HfO, SiO, AlO, или их композиции.
Кроме того, диэлектрик ионно-чувствительного полевого транзистора может быть дополнительно покрыт слоем металла благородного металла: Ag, Au, Pd, Pt, Ru,Rh, Ir, Os или композиции или сплава на их основе.
Кроме того, ионно-чувствительный полевой транзистор во время измерений может находиться как в допороговом, так и в инверсном режиме.
Кроме того, предлагаемая система дополнительно включает средство получения данных с целью изучения и исследования химических процессов, исходя из изменения редокс-потенциала электронов во времени в растворе электролита.
Кроме того, средство получения данных с целью изучения и исследования химических процессов выполнено с возможностью построения зависимости изменения энергии во время химической реакции.
Кроме того, средство получения данных с целью изучения и исследования химических процессов выполнено с возможностью визуализации и изучения переходных состояний во время химической реакции из зависимости изменения энергии во время химической реакций.
Кроме того, средство получения данных с целью изучения и исследования химических процессов выполнено с возможностью получения термодинамических и кинетических констант и величин химической реакции из зависимости изменения энергии во время химической реакций.
Техническая задача также решается путем создания способа изучения и исследования химических процессов в жидком растворе электролита во время протекающей химической реакции, который включает следующие этапы:
(a) обеспечение описанной выше системой,
(b) подключение электрода сравнения на постоянный потенциал через источник напряжения или общий потенциал «земли»,
(с) определение изменения редокс-потенциала электронов в жидком растворе, включающее в себя:
(i) определение изменения электрического потенциала во времени на индикаторном электроде с использованием внешней цепи,
(ii) получение, исходя из изменений, измеренных на этапе (i) изменения редокс-потенциала во времени в электролите,
(d) получение данных с целью изучения и исследования химических процессов, исходя из изменения редокс-потенциала во времени.
Краткое описание чертежей
Прилагаемые чертежи, которые включены в состав настоящего описания и являются его частью, иллюстрируют варианты осуществления изобретения и совместно с вышеприведенным общим описанием изобретения и нижеприведенным подробным описанием вариантов осуществления служат для пояснения принципов настоящего изобретения. На чертежах одинаковые позиции применяются для обозначения одинаковых деталей или элементов конструкции.
На фиг. 1 изображена измерительная система для измерения динамического изменения химического потенциала электронов в электролите и ее эквивалентная электрическая схема.
На фиг. 2 изображена энергетическая диаграмма в системе электрод-раствор - диэлектрик- полупроводник, которая является частным случаем двухэлектродной системы при смещении электрод-полупроводник в состоянии стационарного равновесия. Для упрощения металл электрода и контакт к полупроводнику выполнены из одного материала.
На фиг. 3 представлено схематическое изображение ISFET структуры, которая функционально совмещает измерительный электрод и преобразователь «электродное напряжение – ток стока»
На фиг. 4 изображено изменение химического потенциала электронов (редокс-потенциала) в ходе химической реакции и его детектирование ISFET транзистором.
E.coli
На фиг. 5 схематически изображена структура ISFET, реализованная на КНИ подложке с иммобилизованной на поверхности затворного диэлектрика нитроредуктазой из .
На фиг.6 изображены вольт - амперные характеристики структуры ISFET, реализованной на КНИ подложке.
E.coli,
E.coli
E.coli
2
4
-7
-8
-8
-6
На фиг. 7 представлена временная зависимость изменения химического потенциала электронов, вызванного каталитической активностью фермента нитроредуктазы из  при разной последовательности добавления ТНТ и фермента в 50 мМ NaHPO, pH 7,1: А) 5мМ НАДФН, 5⋅0M ТНТ, 1⋅10M нитроредуктазы из , Б) 5мМ НАДФН, 1⋅10M нитроредуктазы из , 1⋅10M ТНТ.
E.coli
На фиг. 8 изображено типичное динамическое изменение редокс-потенциала в жидком затворе, вызванное реакцией нитроредуктазы из с детектированием двух промежуточных соединений [Е-P1]* и [E-P2]*.
На фиг. 9 изображена полупроводниковая структура на объемном кремнии, использованная для детектирования промежуточного аниона в процессе биокатализа карнитин ацетил - трансферазы из сердца голубя и представлено схематическое изображение промежуточного комплекса в каталитическом центре фермента.
На фиг. 10 изображена типичная вольт-амперная характеристика полупроводниковой структуры, использованной при детектировании промежуточного комплекса в каталитическом центре карнитин ацетил-трансферазы из сердца голубя.
На фиг. 11 изображена временная зависимость изменения химического потенциала электронов (редокс-профиль) в затворе для разных концентраций L-карнитина при фиксированной концентрации коэнзима А (0,18 мкМ) во время биокатализа с участием карнитин ацетил-трансферазы из сердца голубя
На фиг. 12 представлена КНИ структура с плавающим танталовым затвором, использованная для определения констант Михаэлиса в реакциях пероксидазы хрена с субстратами АБТС и ТМБ.
На фиг. 13 изображена вольт – амперная характеристика ISFET структуры с плавающим танталовым затвором, реализованной на КНИ подложке.
-11
На фиг. 14А представлен отклик полупроводниковой структуры на реакцию пероксидазы хрена (10M) с разными концентрациями ТМБ при инициации реакции внесением 500 мкM пероксида водорода.
На фиг.14B представлен расчет кинетической константы для реакции с ТМБ.
S. cerevisiae
На фиг. 15 изображено динамическое изменение редокс-профиля во время биокатализа с участием фермента енолазы из пекарных дрожжей  в двух повторах (1 и 2) и контролем при отсутствии фермента (3).
S. cerevisiae
На фиг. 16 изображено динамическое изменение редокс профиля во время биокатализа с участием фермента триозофасфат изомеразы из пекарных дрожжей  при разных концентрациях субстрата GAP.
На фиг. 17 изображено динамическое изменение редокс-профиля в затворе полупроводниковой структуры, описанной в примере 3, во время реакции лигирования ДНК, катализируемой ДНК-лигазой Т4 (ЕС. 6.5.1.1). Реакция активировалась добавлением АТФ, профиль (1) соответствует реакции в присутствии фермента лигаза Т4, профиль (2) соответствует реакции без фермента
На фиг. 18 изображено динамическое изменение редокс-профиля в затворе полупроводниковой структуры, описанной в примере 3 во время реакции сольволиза бензоилхлорида разной концентрации в растворе, содержащего 20% воды и 80% ацетона
-4
На фиг. 19 изображено динамическое изменение редокс-профиля в затворе полупроводниковой структуры, описанной в примере 3, во время реакции сольволиза бензоилхлорида с фиксированной концентрацией 3*10M при увеличении соотношения воды в смеси вода-ацетон
На фиг. 20 изображен вариант полупроводниковой структуры, затворный диэлектрик которой покрыт золотом.
На фиг. 21 показано динамическое изменение редокс - профиля в системе:
-8
-5
-5
2
2
(1) во время реакции 1*10М пероксидазы хрена с 5*10М ТМБ при введении в систему 2*10М HO, регистрируемое полупроводниковой структурой, затвор диэлектрика которой покрыт золотом
-8
-5
-5
2
2
(2) во время реакции 1*10М пероксидазы хрена с 5*10М ТМБ при введении в систему 2*10М HO, регистрируемое в аналогичной ячейке двумя платиновыми электродами, размещенными на расстоянии меньше 2 мм друг от друга.
Термины и определения
Определения некоторых терминов, используемых в данном описании, приведены ниже. Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
В настоящем описании и в формуле изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя», «имеющий», «снабженный», «содержащий» и другие их грамматические формы не предназначены для истолкования в исключительном смысле, а, напротив, используются в неисключительном смысле (т.е. в смысле «имеющий в своем составе»). В качестве исчерпывающего перечня следует рассматривать только выражения типа «состоящий из».
В настоящей заявке термины «редокс-потенциал», «химический потенциал электронов» являются общепринятыми. В жидкости понятие «редокс-потенциал» эквивалентно более общему термодинамическому понятию - «химический потенциал электронов», который определяется соотношением редокс-пар в системе. Поскольку «редокс-потенциал» принято выражать в единицах напряжения электрического поля в Вольтах, а «химический потенциал электронов» в единицах энергии, то коэффициент пропорциональности между ними равен элементарному электрическому заряду, умноженному на число электронов, принимающих участие в процессах переноса заряда на одну редокс-пару. Удобно представлять «химический потенциал электронов» в несистемных единицах (эВ), в этом случае численные значения «редокс-потенциала» и «химического потенциала электронов» совпадают с точностью до знака. Изменение «химического потенциала электронов» во времени, эквивалентно термину используемому термину «энергетический профиль реакции» или «редок-профиль» и отображает динамическое изменение редок-потенциала в системе.
В настоящей заявке термин «импеданс» подразумевает общепринятое понятие комплексного электрического сопротивление цепи или элемента цепи, зависящее от частоты подаваемого сигнала, при этом под величиной импеданса подразумевается модуль комплексного значения импеданса, а отношение импедансов – отношение модулей комплексных значений импедансов во всем частотном диапазоне.
В настоящей заявке термины «ионоселективный полевой транзистор» (ISFET в английском варианте), «ISFET структуры» и ISFET микроструктуры являются синонимами. В таких транзисторах металлический затвор транзистора заменен жидкостью, контакт к которой осуществляется при помощи электрода сравнения, а граница раздела фаз «жидкость-диэлектрик» является химически чувствительным слоем. Взаимодействие определяемого компонента с химически чувствительным слоем вызывает изменение электрического поля в области затвора и, следовательно, порогового потенциала и тока в транзисторе, что и обусловливает аналитический сигнал.
В общем случае в данной заявке «сенсором» или «сенсорным устройством» или «устройством для обнаружения и распознавания аналитов» называют устройство, преобразующее информацию о наличии специфического химического соединения (аналита) в удобный для преобразования (детектируемый) сигнал. «Биосенсоры» – это вид сенсоров, в которых система распознавания имеет биохимическую природу и основана на реакции с участием биомолекул либо надмолекулярных биологических структур.
Термины «микросистема», «интегральная схема», «интегральная микросхема», «чип», «электронный чип» являются синонимами и представляют микроэлектронное устройство  -  электронная схема произвольной сложности (кристалл), изготовленная на полупроводниковой подложке (пластине или плёнке) и помещённая в неразборный корпус или без такового, в случае вхождения в состав микросборки. Часто под интегральной схемой (далее - ИС) понимают собственно кристалл или плёнку с электронной схемой, а под микросистемой (далее - МС) — ИС, заключённую в корпус.
Под термином «КНИ подложка» (Silicon on insulator, SOI в английском варианте) понимают трехслойную подложку структуры кремний-диэлектрик-кремний. Технология изготовления полупроводниковых приборов, основанная на использовании КНИ-подложек вместо подложек из объемного кремния, позволяет добиться улучшения некоторых рабочих характеристик полупроводниковых приборов, снижения токов утечки и уменьшение шумов
Электродом в электрохимии называют такую систему, в которой токопроводящее вещество помещено в раствор или расплав электролита.
В качестве токопроводящего материала может быть использован твердый металл (в виде кусочка, пластины, проволоки, порошка, монокристалла), жидкий металл (ртуть, расплавы металлов, амальгамы — сплавы ртути), неметаллические материалы (уголь, графит и др.) и различные соединения (оксиды, карбиды и др.). Носителями заряда в электродах являются электроны, а в электролите — ионы.
Электролит содержит заряженные частицы: катионы и анионы; чаще всего электролитом является водный раствор соли, но расплавы солей — это тоже электролиты.
Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» и т.д. используются просто как условные маркеры, не накладывая каких-либо численных или иных ограничений на перечисляемые объекты.
Термин «соединенный» означает функционально соединенный, при этом может быть использовано любое количество или комбинация промежуточных элементов между соединяемыми компонентами (включая отсутствие промежуточных элементов).
Подробное описание изобретения
Настоящая заявка направлена на создание двухэлектродной системы для измерения динамического изменения и редокс-потенциала жидкости во время протекающей химической реакции и способа использования такой системы для изучения и исследования химических процессов в жидком растворе электролита во время протекающей химической реакции.
3
Заявляемая система изображена на фиг. 1. В электролит с ограниченным объемом не более 10 см для изучения протекающих в нем химических реакций погружены на расстоянии друг от друга не более 1 см электрод сравнения и индикаторный электрод, соединенные с внешней цепью.
Объем выбран исходя из условия, когда динамическое изменение редокс-потенциала в системе будет вносить значимый вклад в изменение равновесия. При этом в большем объеме на большем расстоянии между электродами вклад динамического изменения редокса-потенциала в изменение редокс-потенциала в системе падает до такой степени, что этот эффект становится не виден и наблюдается сигнал, измеряемый по конечной точке редокс-потенциала. Более того, с практической точки зрения важно, что для рассматриваемых измерений требуются относительно большие концентрации реактивов. Для практического использования, например, при изучении ферментов, необходимые концентрации в указанном объеме достигаются путем добавления значительного количества реактивов. Кроме того, в больших объемах значительный вклад начинает вносить диффузия, из-за которой ухудшается временное разрешение измеряемого сигнала. С практической точки зрения стоит отметить, что использовать объемы больше, чем заявленный объем для описываемых измерений, становится коммерчески нецелесообразным из-за большого расхода реактивов.
Электрод сравнения подключен к источнику постоянного напряжения или общему потенциалу «земли». На электрод сравнения подается смещение напряжения от внешней цепи E ref, а индикаторный электрод подключен к внешней цепи для измерения на нем потенциала E ind.
Электрод сравнения выполнен c возможностью свободного обмена электронами с электролитом (обратимый по электронам) и имеет низкое значение импеданса по отношению к импедансу индикаторного электрода. Например, значение импеданса электрода сравнения могут варьироваться в диапазоне от 5 Ом до 500 кОм. При этом важно отметить, что импеданс этого электрода непосредственно определяет быстродействия всей системы и ее временного отклика на процессы, происходящие в электролите.
Индикаторный электрод имеет высокое значение импеданса по отношению к импедансу электрода сравнения, препятствующее электронному обмену с раствором электролита. Например, значение импеданса индикаторного электрода может варьироваться в диапазоне от 5 кОм до неограниченного значения.
Причем электроды выбираются таким образом, чтобы отношение импеданса измерительного электрода к импедансу электрода сравнения составляет не менее 5.
Сосуд, ограничивающий объем электролита обеспечивает высокое значение импеданса электролит – нулевой потенциал «земли» по отношению к импедансу индикаторного электрода, с отношением не менее 5. Значение импеданса электролит- нулевой потенциал «земли» составляет от 50 кОм. При этом объем электролита, форма сосуда и расстояния между электродами непосредственно влияют на все указанные импедансы, поэтому выбираются и учитываются в общем соотношении импедансов. Например, при увеличении расстояния между электродами их импедансы увеличиваются по причине увеличения составляющей, связанной с диффузионным переносом участвующих в процессе ионов, кроме того отношение импедансов может быть изменено путем регулирования уровня погружения одного электрода в электролит относительно другого.
В такой системе при динамических изменениях в электролите, связанных с изменением свободной энергии электронов будет возникать электродвижущая сила (ЭДС), приводящая к неравновесному электронному обмену электролит-электроды, который будет продолжаться пока не будет компенсирован изменением электрического потенциала в электролите. Время запаздывания потенциала от изменения энергии электронов будет определяться скоростью обмена электронами электролита с электродами и внешней средой или импедансами измерительного электрода и электрода сравнения, а также импедансом электролит – общий потенциал «земли».
Если динамический процесс в электролите описывается некими характеристическими временами, и эти времена намного меньше времени запаздывания потенциала, то изменение потенциала отражает изменения энергии электронов в исследуемой системе. При указанных отношениях импедансов индикаторного электрода и электрода сравнения в системе измерительный электрод и внешняя среда будут оказывать минимальное влияние на этот потенциал, и его можно считывать измерительным электродом.
Поскольку измеряемый потенциал по определению является редокс-потенциалом, то фактически при динамических процессах в электролите в такой системе на измерительном электроде будет наблюдаться изменение редокс-потенциала электролита.
Описываемый эффект может быть использован для изучения динамических процессов в электролите, например, для исследования протекающих химических процессов в жидкости. При этом, чем меньше импеданс электрода сравнения, тем меньше времена релаксации редокс-потенциала, тем лучшего разрешения по времени можно достичь при наблюдении динамического процесса. В примерах показано, как этот эффект может быть использован для исследования ферментативных реакций или для изучения изменения механизма нуклеофильного замещения.
12
2
Частным случаем двухэлектродной системы является система, в которой ISFET- микроструктура выполняет роль измерительного электрода и металлический электрод из металла платиновой группы достаточно большой площади, который выполняет роль электрода сравнения. Изменение потенциала на измерительном электроде, которой является поверхность ISFET-структуры, может определяться по изменению тока стока транзистора. Площадь такого измерительного электрода, изготовленного методами интегральных технологий может быть меньше квадратного микрометра, и соответственно иметь очень малую входную емкость (высокое реактивное сопротивление), при этом затворный диэлектрик обеспечивает электрическую изоляцию и имеет очень высокое входное сопротивление (более 10 Ом при размерах затвора 100х100 мкм). Поэтому ISFET структура идеально подходит в качестве измерительного микроэлектрода для рассматриваемой системы.
2
2
В конкретном варианте исполнения площадь затвора ISFET-микроструктуры, изготовленной методами микрообработок, имела очень малую площадь (100*100 мкм), а электрод сравнения в виде платиновой иглы, имел площадь более чем в тысячи раз превышающую площадь затвора ISFET-микроструктуры, имел малое электрическое сопротивление интерфейса и большую электрическую емкость двойного диффузионного слоя, что обеспечивало малое реактивное сопротивление. Расстояние между электродами составляло несколько миллиметров, что исключало влияние импеданса, связанного с диффузионным механизмами переносом при измерении исследуемых химических систем. Ограничивающий сосуд, сформированный на поверхности полупроводниковой ИС в виде колодца из полимера был изолирован от нее слоем диэлектрика SiO толщиной около 1 мкм, лежащем на кремнии с низкой концентрацией носителей, что обеспечивало высокий импеданс электролит-подложка. Такая система позволила измерять динамическое изменение редокс-потенциала реакции с характерным временем от нескольких секунд. Временное разрешение при этом ограничивалось возможностями измерительного оборудования.
Для обоснования заявленного функционирования двухэлектродной системы рассмотрим энергетическую диаграмму в системе «электрод-раствор – диэлектрик - полупроводник» при подаче смещении электрод-полупроводник в стационарном состоянии в состоянии (Фиг.2).
Электрод (1) и контакт (2) к полупроводнику (3) выполнены из одного материала (имеют одинаковый уровень Ферми). В электролит (4) погружен электрод сравнения (1) из инертного металла. Электрод (1) обменивается с электролитом (4) электронами, при этом обмен носит обратимый характер. Электрод (1) через источник напряжения (5) соединен с полупроводником (3), который также погружен в электролит (4), но изолирован от него тонким слоем диэлектрика (6). Считаем, что диэлектрик (6) идеальный, обладает бесконечным сопротивлением, и электрический ток через границу «электролит-полупроводник» (фарадеевский ток) отсутствует. Полупроводник (3) через контакт (2) подключен на опорный потенциал (7).
U
В стационарном состоянии при заданном напряжении на источнике , выполняются следующие равенства электрохимических потенциалов:
.
.      (1)
Где - электрохимический потенциал электронов в растворе,  – электрохимический потенциал электронов (уровень Ферми) в электроде сравнения,  – электрохимический потенциал электронов (уровень Ферми) в металле контакта и  – уровень Ферми в полупроводнике.
анг. site-binding model
Равновесие достигается за счет обмена электронами и перераспределения электрического заряда в системе. Если между электролитом (4) и электродом сравнения (1) происходит обмен электронами непосредственно через границу раздела, то обмен электронами между полупроводником (2) и электродом сравнения (1) происходит через внешнюю электрическую цепь (через источник напряжения, имеющий малое внутреннее сопротивление). Обменный заряд сосредотачивается на границе разделов фаз, и поэтому называемый интерфейсным зарядом (в случае полупроводника это инверсный заряд обеднения или аккумуляции, в электролите – это заряд диффузионного слоя) изменяет внутренний электростатический потенциал каждой фазы системы. Помимо интерфейсного заряда, внутренний потенциал зависит также от поверхностного потенциала, связанного с электрическим дипольным моментом на поверхности фаз. Этот дипольный момент образуется по причине простирания электронной волновой функции за пределы фазы в случае металла или полупроводника, или из-за дипольной ориентации молекул воды на поверхности в случае раствора (1.Trasatti S. The absolute electrode potential: an explanatory note (Recommendations 1986) //Pure and Applied Chemistry. – 1986. – Т. 58. – №. 7. – С. 955-966. 2.Forstmann F. The Fermi level in electrolytes—about electrochemical potentials at electrolyte‐electrode interfaces //AIP Conference Proceedings. – AIP, 2008. – Т. 979. – №. 1. – С. 181-194.). На границе «изолирующий диэлектрик – раствор» может присутствовать также абсорбированный заряд, связанный с химическим взаимодействием поверхностей диэлектрика, как с молекулами растворителя, так и растворенных веществ. Например, в случае границы «оксид-раствор» этот заряд объясняется через модель узлов связывания (), предполагающей взаимодействие на поверхности потенциал образующих ионов с оксидными поверхностными группами (D. E. Yates, S. Livine and T. W. Healy, Site-binding model of the electrial double layer at the oxide/water interface, J. Chem. Sot., Farnduy Trans. I, 70 (1974) 1807- 1818).
Таким образом, между контактирующими фазами возникает интерфейсная разность потенциалов, равная разности внутренних потенциалов фаз.
В приведенной равновесной энергетической диаграмме на фиг.2 потенциалы, связанные с диполями не показаны. Эти потенциалы не зависят от изменения интерфейсной разности потенциалов (Sato N. Electrochemistry at metal and semiconductor electrodes. – Elsevier, 1998), которые здесь описываются, поэтому для упрощения восприятия эти потенциалы опущены. Адсорбционные заряды на поверхностях твердых фаз, а также заряды поверхностных состояний на интерфейсах твердых фаз также приняты нулевыми.
Выражения для электрохимического потенциала в электроде сравнения (1), электролите (4), полупроводнике (3) и контакте (2) соответственно запишутся:
(2)
(3)
(4)
(5)
e
где - уровень Ферми в металле при нулевом потенциалe, где - уровень Ферми в полупроводнике при нулевом потенциале, -  электрохимический и химический потенциалы электронов в растворе,  - потенциал в объеме раствора,  - потенциал в полупроводнике,  - элементарный заряд.
1
5
Из () - () следует:
.     (6)
.      (7)
V
G
И падение потенциала между жидкостью и полупроводником  будет равно:
.     (8)
U
Это электрическое напряжение непосредственно определяет поверхностную проводимость полупроводника (3). При этом из последнего выражения следует, что при изменении напряжения :
.        (9)
U
Если же по каким-либо причинам в растворе происходит изменение химического потенциала электронов, то при фиксированном напряжении :
.       (10)
Таким образом, изменение химического потенциала электронов в электролите (4) в рассматриваемой системе эквивалентно изменению потенциала на источнике напряжения (5), умноженному на элементарный заряд.
анг. site-binding model
e
V
V
ad
ad
G
ad
G
7
В реальной системе граница диэлектрик (6) – электролит (4) может нести дополнительный «адсорбционный» заряд за счет взаимодействия электролита с поверхностью диэлектрика. Например, в случае с оксидами, этот поверхностный адсорбционный заряд объясняется через модель узлов связывания (). В этой моделе рассматривается взаимодействие образующихся ионов с оксидными поверхностными группами (R. van Hal, J. Eijkel, P. Bergveld, A general model to describe the electrostatic potential at electrolyte oxide interfaces, Advances in Colloid and Interface Science 69 (1996) 31 – 62). Пусть этому адсорбционному электрическому заряду соответствует потенциал ψ. Формально его можно определить через работу ∙ψ, которую нужно совершить для его преодоления единичным зарядом. В общем случае этот потенциал зависит от падения потенциала раствор-полупроводник . Поскольку потенциал на полупроводнике поддерживается постоянным, то ψ есть функция от . Тогда  в () изменится на величину :
.    (11)
V
G
Изменение  при изменении U при постоянном химическом потенциале  будет равно
.    (12)
U
Изменение Vg при постоянном  и изменении химического потенциала
.    (13)
Из (12) и (13) следует, что в рассматриваемой системе изменение химического потенциала электронов в электролите (4) или адсорбции на поверхности диэлектрика (6) частиц из раствора эквивалентно, с точностью до элементарного заряда изменению потенциала на источнике напряжения (7).
англ. – ISFET
Пусть теперь поверхность полупроводника в рассматриваемой системе является каналом, расположенного между стоком (8) и истоком (9) полевого транзистора. Такая структура получила название литературе ионно-чувствительный полевой транзистор () является подвидом обычного МОП-транзистора, у которого вместо металлического затвора используется раствор электролита (фиг.2).
V
I
V
U
DS
DS
G
Зададим постоянное напряжение  (10) между стоком (8) – истоком. Тогда ток стока транзистора  будет определяться напряжением  между жидкостью и подложкой полупроводника (8). При постоянном химическом потенциале электронов в электролите это напряжение однозначно определяется напряжением . При его изменении будет однозначно изменяться ток стока:
,     (14)
U
Если же в системе изменяется химический потенциал электронов в электролите, то при постоянном напряжении , изменение тока стока будет однозначно определяться изменением химического потенциала :
,     (15)
f
где функция  – проходная вольт - амперная характеристика полевого транзистора.
Определив зависимость  при неизменном  и поместив структуру в среду с относительно медленно изменяющимся химическим потенциалом электронов, можно отслеживать это изменение:
,     (16)
где - функция, обратная функции (15).
Таким образом, ISFET структура может использоваться в качестве сенсора изменения химического потенциала электронов в растворе, который является ее затвором.
Поскольку химический потенциал электронов в растворе эквивалентен окислительно-восстановительному (редокс) потенциалу, измеренному относительно абсолютной электрохимической шкалы, энергетического уровня свободного электрона в вакууме (Khan S. U. M., Kainthla R. C., Bockris J. O. M. The redox potential and the Fermi level in solution //Journal of Physical Chemistry. – 1987. – Т. 91. – №. 23. – С. 5974-5977.):
,
,     (17)
(где  - потенциал относительно абсолютной энергии электрона в вакууме, - потенциал относительно водородного электрода), то рассматриваемая структура может быть использована в качестве сенсора изменения редокс - потенциала во время протекания физико-химических явлений в затворе.
В состоянии равновесия с электродом сравнения электрохимический потенциал электронов равен уровню Ферми электронов в электроде сравнения. Это означает, что окислительно-восстановительные реакции, в ходе которых происходит электронный обмен в растворе и с электродом сравнения находятся в состоянии термодинамического равновесия.
Все окислительно - восстановительные процессы в растворе, можно записать в виде обобщенного уравнения реакции:
.   (18)
i
где , являются соответственно акцепторами (окислителями) и донорами (восстановителями), образующих i-ю редокс пару, m- количество таких редокс пар, . Для каждой редокс пары характерен электронный обмен, в котором участвуют n электронов:
.      (19)
19
Равновесный электрохимический потенциал электронов можно определить, из этого условия равенства электрохимических потенциалов правой и левой части (), в условии равновесия:
.     (20)
Из последнего выражения следует, что
.     (21)
21
i
для всех . Проведя суммирование () по , можно также выразить электрохимический потенциал, через все электрохимические потенциалы редокс системы (18):
,     (22)
где
,
Используя общую зависимость электрохимического потенциала от концентрации (), и то, что в состоянии равновесия электрический потенциал в жидкости постоянен, можно получить для химического потенциала электронов зависимость от концентрации компонентов редокс-системы:
,     (23)
и
,    (24)
23
V
i
Можно, показать, что выражение () в форме редокс - потенциала системы через стандартные электродные потенциалы  всех редокс пар системы имеет вид:
.      (25)
i
j
j
l
k
Пусть в рассматриваемой редокс-системе инициализируется химическая реакция фиг.4, например, при внесении в систему катализатора, в которой задействованы компоненты редокс-системы (18), которые в общем случае могут быть как окислителями, так и восстановителями, как справа, так и слева. На фиг.4 эта реакция изображена вертикально. Без ограничения общности, пусть все стехиометрические коэффициенты реакции равны. Выделим и прономеруем (независимо от индекса сопряжения редокс пары ) индексом реактанты этой реакции (=1…), индексом  – продукты реакции (k=1…p). Тогда такую реакцию можно записать в общем виде:
.    (26)
23
При протекании такой реакции (реакция сверху вниз на рисунке) редокс-система будет смещаться из состояния равновесия, поскольку будут изменяться концентрации компонентов редокс-пар. Это будет приводить к изменению химического потенциала (). Пусть химическая реакция протекает намного медленнее, чем электронный обмен электролита с электродом сравнения, тогда каждому ее состоянию (химической переменной ξ), будет соответствовать квазиравновесная редокс-система и соответствующий ей химический потенциал электронов. Изменение химического потенциала электронов можно фиксировать транзистором и, таким образом, получать «редокс-профили» реакции.
Скорость электронного обмена электролита с электродом сравнения в общем случае характеризуется импедансом электрода сравнения, чем он ниже, тем быстрее наступает квазиравновесие, тем более быстрые динамические процессы можно измерять.
С другой стороны, измерительный электрод и внешняя среда должны не влиять на установление этого квазиравновесия. Для выполнения этого условия их импеданс должен быть намного больше импеданса измерительного электрода.
Определение и запись «редокс-профилей» могут быть использованы во многих областях, где имеется потребность в изучении динамических процессов. Использование данного изобретения не ограничивается рассматриваемыми примерами, которые приведены исключительно для пояснения принципа и природы работы изобретения.
Изобретение может быть реализовано на основе двух металлических электродов или полевых структур разных конфигураций и типов и его возможность использования не зависит от дизайна и конструкции ISFET.
Устройство может быть использовано для исследования активности ферментативных реакций, например, определения первичной активности и субстратной специфичности фермента, его каталитической активности, скоростей реакции ферментативной реакции, так как любая ферментативная реакция связана с обменом фермента с молекулами воды, меняя таким образом химический потенциал электронов в затворе-электролите. В этом случае скорости реакции (а значит, концентрации фермента и субстратов) определяет ток в канале транзистора. Следовательно, изобретение может быть использовано для определения концентраций компонентов системы за считанные секунды.
В случае микрообъемов для химических реакций отсутствуют диффузионные ограничения и реакции протекают быстро, следовательно, способность системы быстро реагировать на протекающие в ней изменения становится значительным преимуществом. Кроме того, так как в процессе биокатализа образуются различные промежуточные стадии, быстрое детектирование в изменении редокс-потенциала электронов может позволять детектировать эти состояния и давать информацию об их количестве и распределении в процессе реакции, что открывает новые возможности изучения механизмов реакции, что является важным аспектом при разработке лекарственных препаратов и в фундаментальных исследованиях катализа. Кроме того, из-за быстрого отклика в системе, изобретение может использоваться в системах для изучения быстрой предстационарной кинетики реакций.
Перспективным является использование изобретения для определения взаимодействия различных активных веществ, таких как потенциальные лекарственные препараты, ингибиторы, гормоны, стероиды и другие соединения влияющие, на каталитическую активность различных биологических и биомиметических молекул – белков, рецепторов, рибозимов, нуклеиновых кислот. Кроме того, по изменению редокс потенциала можно судить об активности процессов, протекающих в клетках (например, открытии калиевых каналов), что может быть использовано при исследовании токсичности тех или иных разрабатываемых препаратов, механизмов активации и ингибирования химических сигнальных схем в клетках.
К основным конкурентным преимуществам изобретения в этом случае будет использование прямого детектирования, что делает возможность измерения любой протекающей в среде электролита реакции. Такое детектирование избавляет от необходимости использования в процессе реакций конъюгатов молекул с оптическими или редокс-метками, исключая использование дополнительных реактивов. Более того, современные технологии микрообработок позволяют создавать массивы элементов на основе изобретенного датчика, что делает возможность проводить массовый скрининг всех описанных выше процессов.
Описываемые измерения могут проводиться в разных водных буферных растворах в зависимости от химической реакции. В качестве растворов могут быть использованы популярные в биохимии растворы – фосфатный, ацетатный, боратный, на основе TRIS или HEPES в различном диапазоне рН или ионной силы. Кроме водных растворов, например, для исследования процессов катализа органических реакций могут быть использованы другие органические полярные растворители, такие как спирты или ацетонитрил или же смеси органических растворителей с водой. Изменения редокс потенциала могут так же проводиться в специальных клеточных средах, в биологических жидкостях: в крови, в лимфе, слюне, мокроте или моче.
Здесь так же стоит отметить, что изобретение может быть использовано для изучения любых реакций, компоненты которых растворимы в водном растворе. Более того, при соответствующей адаптации все выше сказанное может быть перенесено на системы с гомогенным и гетерогенным катализом, в которых в качестве затвора транзистора используется электролит или расплав электролита. Устройство может быть использовано в качестве детектора окислительно-восстановительных реакциях в различных аналитических системах для определения веществ, например, в хроматографии.
Временные зависимости изменения редокс-потенциала будут отличаться от реакции к реакции, таким образом, изобретение может быть использовано для идентификации конкретной реакции. В случае одной ферментативной реакции временные зависимости могут быть использованы для идентификации субстратов, если временная зависимость редокс потенциала для разных субстратов различается.
Изобретение может быть использовано для установления образования метало-органических комплексов или же детектирования промежуточных соединений в органической химии с целью установления типа или механизма протекающей реакции. Установление механизмов реакций в свою очередь открывает новые возможности в разработке новых эффективных катализаторов и как следствие к созданию новых методов и подходов к получению как новых соединений, так и, в целом, материалов с новыми свойствами.
Еще одним видом использования изобретения является возможность изучение термодинамических величин протекающих реакций. Так для окислительно-восстановительных реакций известно соотношение, связывающее электродный потенциал (редокс-потенциал) и энергию Гиббса реакции:
,      (27)
поэтому редокс-профиль реакции отражает изменение энергии Гиббса системы – энергетический профиль реакции.
Для подтверждения теоретических предположений дальше приведены примеры для различных типов ISFET структур, спроектированных для определения изменения редок-потенциала электронов в жидком затворе во время различных химических реакций.
Пример 1
Образцы ISFET структур были изготовлены на КНИ SIMOX пластинах (исходные параметры: рабочий слой кремния – 192 нм, толщина скрытого слоя кремния - 380 нм, тип легирования p-типа, проводимость 12-20 Ом*см по разработанному технологическому маршруту с использованием КМОП технологии производства ИС по 1,2 мкм топологическим нормам (Фиг.5). Наклон допороговой характеристики (S) экспериментальных образцов составил ~ 90 мВ/декаду тока. Пороговое напряжение было определено методом касательных и составило 0,75 В (Фиг.6). Напряжение фиксировали на электроде сравнения так, чтобы структура оставалась в допороговом режиме. Дальше снимали зависимость тока стока от времени. Во время записи сигнала инициировали реакцию путем добавления в систему реакционных компонентов.
E.сoli
Для исследования динамического изменения редок-потенциала в системе во время протекающей каталитической реакции анализировались временные изменения поверхностного потенциала после добавления субстрата в модельную гомогенную систему, содержащую буферный раствор, НАДФН и нитроредуктазу из . В качестве основного модельного субстрата использовался тринитротолуол, так как именно для этого субстрата существуют данные, экспериментально подтверждающие качественный состав промежуточных продуктов катализа (фиг.7). Исследуемая реакция представлена на фиг.8 Процесс переноса двух электронов в ходе реакции восстановления с участием нитроредуктазы происходит через две стадии по механизму двухсубстратного замещения (би-би-пинг-понг). Механизм пинг-понга подразумевает, что на первой стадии происходит связывание фермента с субстратом-донором группы. Донорная группа переносится на фермент, переводя его в активное состояние. При этом субстрат-донор уже без донорной группы высвобождается в виде первого продукта реакции. На второй стадии катализа активированный таким образом фермент взаимодействует со вторым субстратом, перенося донорную группу на него.
-7
орто
Динамическое изменение редокс потенциала во времени позволяет говорить о том, что в ходе реакции происходит образование двух промежуточных комплексов фермент-продукт. Промежуточные комплексы образуются в районе 800 сек представленного графика (фиг.8) (~ через 120 сек от инициации реакции) и в районе 1250 сек (~ 770 сек от инициации реакции) для начальной концентрации субстрата 10М. Согласно литературным данным, можно предположить, что в процессе изменения редокс потенциала в растворе отображается две последовательные реакции восстановления. Первый горб соответствует реакции восстановления ТНТ до 4-нитрозо-2,6-динитротолуола и его изомера, а второй связан с восстановлением нитрозо-соединения до 4-гидроксиламин-2,6-динитротолуола и его  изомера.
E.Coli
Таким образом, в данной примере показано, что отслеживание динамического изменения редокс потенциала позволяет детектировать возникновение промежуточных соединений в процессе биокатализа с участием нитроредуктазы из .
Пример 2
Образцы полупроводниковых структур n-типа с плавающим танталовым затвором были изготовлены по стандартной КМОП-технологии с использованием кремниевых пластин p-типа с сопротивлением 12–22 Ом*см и интегрированы с МОП структурами обработки сигнала. Структуры сенсора были сформированы после формирования МОП транзисторов перед стадией стандартной металлизации. Для этого на подзатворный диэлектрик из оксида кремния был сформирован слой в 50 нм из тантала. После операции формирования металлизации и пассивации поверхности поверхность тантала окислялась в деионизованной воде. Итоговая структура представлена на (фиг.9). Наклон допороговой характеристики (S) экспериментальных образцов составил ~ 82 мВ/декаду тока (фиг.10).
Данные структуры были использованы для детектирования аниона, образующегося в каталитическом центре фермента карнитин ацетил-трансферазы. Для этого на поверхности кристалла с сенсорами формировали открытую микроячейку, в которую вносили буферный раствор. В качестве электрода сравнения использовался платиновый электрод, на который подавали зафиксированное напряжения так, чтобы структура находилась в допороговом режиме. Снимали временные зависимости тока стока во время инициации ферментативной реакции в микроячейке на поверхности кристалла. Карнитин ацетил-трансфераза (ЕС.2.3.1.7) фермент, катализирующий обратимый перенос ацетильной группы между коэнзимом А и L-карнитином. Реакция проходит по механизму без упорядоченного присоединения двух субстратов в каталитическом центре с образованием промежуточного аниона (фиг.9). Варьируя концентрацией одного из субстратов при постоянной концентрации второго, можно подобрать условия, в которых происходит детектирование этого аниона (фиг.11).
Пример 3
Полностью обедненные полевые наноструктуры были изготовлены по стандартной КНИ КМОП технологии с проектными нормами 1.2 мкм. Для изготовления использовались SIMOX пластины p-типа сопротивлением 12-20 Ом*см с рабочим слоем кремния 0,18 мкм и слоем диэлектрика 0,38 мкм. Плавающий затвор был изготовлен из пентоксида тантала. Изготовленная структура представлена на (фиг. 12). Для измерений использовались структуры с длиной канала 100мкм и шириной 6 мкм. В качестве электрода сравнения использовалась платиновый электрод. Наклон допороговой характеристики (S) экспериментальных образцов составил ~ 68 мВ/декаду тока (фиг. 13).
-11
2
2
2
2
Данные структуры были использованы для определения кинетических параметров реакции пероксидазы хрена с двумя субстратами: 3,3',5,5'–тетраметилбензидином (TMB) и 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты) диаммониевая соль (АБТС). Для этого на поверхности кристалла с полевыми структурами формировали микроячейку в виде колодца. В эту ячейку добавляли 27 мкл буферного раствора, 1,5 мкл ТМБ или АБТС в разных концентрациях и пероксидазу хрена до конечной концентрации ее в ячейке 1*10М. При фиксированном напряжении на электроде сравнения, так чтобы структура во время измерений оставалась в допороговом режиме, производилась запись зависимости тока стока во времени при добавлении в ячейку 1,2 мкл HO. Значения тока переводили в поверхностный потенциал. Для определения констант Михаэлиса сравнивали относительное изменение потенциала на 300 с для TMB и 700 s для ABTS после добавления HO с данными полученными при добавлении пероксида в смесь, не содержащую соответствующие субстраты. С увеличением концентраций субстрата, увеличивается скорость реакции, и соответственно разница с контролем становится больше. На основе формируемого транзистором сигнала расчетные значения константы Михаэлиса составили (294 ± 87) мкМ для TMB и (317 ± 49) мкМ для ABTS (фиг.14A, фиг.14В). Данные хорошо согласуются со спектрофотометрическими данными (222 ± 40) мкМ для TMB и (491 ± 57) мкМ для ABTS. Данный пример показывает, что при помощи предложенного изобретения можно определять кинетические параметры реакции, при этом для определения констант Михаэлиса с помощью полупроводниковых структур потребовалось на один порядок меньше пероксидазы хрена.
Пример 4
S. cerevisiae
S. cerevisiae
).
КНИ структуры с чувствительной поверхностью из пентоксида тантала были использованы на предмет определения возможности детектирования редокс-профиля реакции во время ферментативного катализа енолазы из пекарных дрожжей  (ЕС 4.2.1.11), триозофасфатизомеразы пекарных дрожжей  (ЕС.5.3.1.1) и ДНК-лигазы Т4 (ЕС. 6.5.1.1
2
2
Для исследования возможности детектирования промежуточных соединений в реакции, катализируемой енолазой (фосфопируватгидратазой) использовали КНИ структуры с чувствительной поверхностью из оксида тантала, описанные в примере 3. Реакцию активировали добавлением 1,2 мкл фермента с активностью 14.4Ед/мл в 35 мкл буферного раствора (Tris/HCl: 5 мM NaCl, 2 мM Tris-HCl [pH 7.6], 1 мM KCl, 1 мM MgCl, 0,5 мM CaCl, суммарная молярность – 9,5 мM) содержащего 1.4мкл смеси субстратов из коммерческого кита для измерения активности фермента. На фиг.15 представлено динамическое изменение редокс-потенциала электронов в затворе во время реакции. Можно отметить, что после инициации реакции в данных условиях по профилям можно предположить образование промежуточного продукта приблизительно на 230с (при резком обвале поверхностного потенциала) для первого профиля и аналогичный провал в профиле на 290с для другого эксперимента.
Триозофосфатизомераза (D-глицер- альдегид-3-фосфат кетол-изомераза, КФ 5.3.1.1) - фермент гликолиза, катализирующий взаимопревращение диоксиацетонфосфата и D-глицеральдегид-3-фосфата. Возможность получения редокс-профиля реакции исследовали на структурах, описанных в примере 3. В 21мкл буферного раствора для триозофосфатизомеразы (15 мM Tris/HCl, pH 7.2, содержащий 0.02% бычьего сывороточного альбумина) вносилось по 2 мкл GAP (глицероальдегид-3-фосфата) разной концентрации. Затем для запуска реакции в смесь добавлялось 1.5мкл фермента с измеренной активностью 0.4 Ед/мл. Формирующийся профиль в зависимости от концентрации субстрата GAP представлен на фиг. 16.
(
Для измерения редокс-профиля во время реакции лигирования ДНК с участием ДНК-лигазы Т4 использовались структуры аналогичные структурам из примера 3, с шириной и длиной канала 100мкм. К синтезированным олигонуклеотидам (рабочие названия последовательностей temp1, penta1, com) с концентрацией 1мкМ находящимся в 33 мкл буферного раствора 8,5 мМ Tris/HCl, 2,5 мМ MgCl2, 1,25 мМ ТСЕР) в колодце добавляли 2,15 мкл АТФ (с нач концентрацией 10 мМ). При наличии в колодце ДНК-лигазы Т4 происходил рост сигнала, в тоже время без фермента, после дабавления АТФ происходило понижение сигнала с возратом к базовой линии после 1000 секунд (фиг.17).
Таким образом, данный пример показывает, что реакций ферментов из групп лиаз, изомераз и лигаз могут быть детектированы, а их механизмы катализа могут быть потенциально изучены при помощи предложенного изобретения.
Пример 5
1
2
2
1
Для демонстрации возможности исследования механизмов органических реакций было проведено изучение изменения профиля реакции сольволиза бензоилхлорида при изменении соотношения содержания ацетона в воде. Из литературы известно, что реакция сольволиза бензоилхлорида протекает по механизму нуклеофильного замещения. В зависимости от условий реакция может протекать по двум механизмам: SN и SN. Для Sn1 механизма предполагается образование промежуточного карбокатиона с последующей нуклеофильной атакой, т.е. реакция происходит в две стадии с образованием промежуточного соединения. Механизм SN подразумевает протекание реакции в одну стадию без образования промежуточного продукта. В ряде случаев вероятность протекания реакции по механизму SN тем больше, чем выше полярность (и протонность) растворителя. Так как в реальности в процессе реакции всегда происходит конкуренция двух механизмов, меняя полярность растворителя, теоретически можно наблюдать переход одного механизма реакции (меняется энергетический профиль реакции).
2
1
Для демонстрации возможности использования изобретения для исследования механизмов органической реакции проводили эксперименты с использованием структур, описанных в примере 3, по следующей схеме: к смеси ацетон-вода объемом 32 мкл добавляли 1мкл бензоилхлорида в разной концентрации. Зависимость изменения динамического редокс профиля от концентрации бензоилхлорида представлена на фиг.17. Согласно фиг.18 можно предположить, что в растворителе состава 20% воды на 80% ацетона реализуется механизм SN (без образования промежуточного соединения). Для увеличения скорости реакции SN в дальнейшем меняли полярность растворителя в растворе вода-ацетон путем увеличения процентного соотношения воды.
1
1
Экспериментальные данные показывают, что с увеличением процентного содержания воды в растворе ацетон-вода начинает прописываться промежуточное соединение, которое указывает, что с увеличением полярности растворителя в реакции нуклеофильного замещения начинает преобладать механизм мономолекулярного замещения SN (фиг.19). Смена растворителя приводит к улучшению сольватации хлорид-иона, и как к следствию увеличению скорости образования карбкатиона (Sn-механизм).
Следовательно, данный пример показывает, что использование изобретения не ограничивается возможностью визуализации энергетических состояний во время биохимических ферментативных реакций, и может быть использовано для исследований каталитических процессов широкого спектра химических реакций.
Пример 6
Полностью обедненные полевые наноструктуры были изготовлены по стандартной КНИ КМОП технологии с проектными нормами 1.2 мкм. Для изготовления использовались SIMOX пластины p-типа сопротивлением 12-20 Ом*см с рабочим слоем кремния 0,18 мкм и слоем диэлектрика 0,38 мкм. Дополнительно на поверхность затворного диэлектрика был нанесен адгезивный слой на основе Ti, поверх которого осаждено 50 нм золота. Изготовленная структура представлена на фиг. 20. Для измерений использовались структуры с длиной канала 100 мкм и шириной 6 мкм. В качестве электрода сравнения использовался платиновый электрод.
-5
-5
2
2
Данные структуры были использованы для визуализации изменения химического потенциала электронов в процессе реакции пероксидазы хрена: 3,3',5,5'–тетраметилбензидином (TMB). Для этого на поверхности кристалла с полевыми структурами формировали микроячейку в виде колодца. В эту ячейку добавляли 35 мкл буферного раствора, содержащего 5*10М ТМБ. При фиксированном напряжении на электроде сравнения, так чтобы структура во время измерений оставалась в допороговом режиме, производилась запись зависимости тока стока во времени при добавлении в ячейку HO до конечной концентрации 2*10M. На фиг. 21 показано, что изменение поверхностного потенциала (1) позволяет детектировать образование промежуточного комплекса. Дополнительно, в ячейке такого же объема были проведены измерения динамического изменения редок-потенцила с использованием двух платиновых иголок в качестве электрода сравнения и индикаторного электрода, помещенных на расстояние ближе 2мм. Полученная временная зависимость представлена на фиг. 21, (зависимость (2)). Данные результаты демонстрируют, что обе двухэлектродные конструкции могут быть использованы для визуализации динамического изменения редокс потенциала, одна структура с большей разницей в отношении импедансов дает больший отлик на динамическое изменение.