СПОСОБ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОГО НАЗНАЧЕНИЯ АГЕНТОВ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ МЕТАСТАТИЧЕСКИМ РАКОМ ПОЧКИ В ПРЕДОПЕРАЦИОННОМ РЕЖИМЕ
METHOD OF PERSONIFIED PRESCRIBING OF TARGETED THERAPY AGENTS IN PATIENTS WITH METASTATIC KIDNEY CANCER IN PREOPERATIVE MODE

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для персонифицированного назначения таргетной терапии агентов у больных с метастатическим раком почки в предоперационном режиме.
Развитие светлоклеточного рака почки ассоциировано с мутационными изменениями белка фон Хиппель-Линдау [8], увеличением содержания ядерного фактора HIF-1, гиперэкспрессией эндотелиального фактора роста (VEGF), активацией тирозинкиназных путей [7, 11]. Таргетная терапия на сегодняшний день является наиболее эффективным методом лечения метастатического рака почки (мПКР) [1]. В клинической практике применяет как тирозинкиназные ингибиторы, так и ингибиторы m-TOR, в частности эверолимус («Афинитор», Novartis).
В настоящее время активно ведется поиск молекулярных маркеров, позволяющих предсказать эффективность применения таргетных препаратов у пациентов с метастатическим почечно-клеточным раком, т.к. существующие прогностические шкалы Motzer и Heng, основанные на клинико-лабораторных показателях, в большей степени рассматриваются в отношении возможного исхода заболевания [8, 10]. Имеются попытки предсказания возможной эффективности таргетной терапии, в частности при применении бевацизумаба (Авастина). К таким критериям относят такие факторы, как наличие нефрэктомии в анамнезе, повышенный уровень нейтрофилов и щелочной фосфатазы в крови [2]. Однако в данной работе не учитываются молекулярные маркеры, опосредующие развитие и прогрессирование заболевания. В отношении возможности выбора препаратов (афинитор или пазопаниба) на основании клинико-лабораторных и анамнестических данных таких сведений нет. С представленных позиций поиск новых предикторных маркеров, сопряженных с эффективностью и выбора таргетной терапии метастатического почечно-клеточного рака, является крайне актуальным.
В ранее проведенных работах было показано, что эффективность применения таргетных агентов, таких как ингибиторы тирозинкиназ, блокаторы m-TOR, ассоциирована с изменением комплекса молекулярных показателей. Объективный ответ на лечение этими препаратами больных раком почки наблюдается при высоких уровнях транскрипционных факторов NF-κВ, HIF-1, ростового фактора VEGF, а также повышенной активности протеасом в опухоли до лечения [3, 4]. Наличие сходных изменений молекулярных показателей с эффективностью применения как ингибиторов тирозинкиназ, так и блокаторов m-TOR обосновано их влиянием на общие биологические процессы онкогенеза.
Наиболее близким к заявляемому является способ, описанный Deprimo S.E. с соавторами, где определение эффективности применения ингибитора тирозинкиназ оценивается по уровню VEGF - сосудистого эндотелиального фактора роста в сыворотке [5]. Эти факторы анализировали отдельно по каждой группе препаратов, без обоснования условий для их выбора. При этом полученные данные представлены либо маркерами, оцененными в сыворотке крови, либо в виде качественных иммуногистохимических показателей, что не позволяет получить высокую точность и информативность.
Новая техническая задача - выявление новых прогностических критериев, ассоциированных с возможной эффективностью лечения таргетными агентами: ингибиторами тирозинкиназ и блокаторами m-TOR.
Новый технический результат - повышение точности и информативности способа. Для достижения нового технического результата в способе персонифицированного назначения агентов таргетной терапии у больных с метастатическим раком почки в предоперационном режиме путем исследования биологически активных молекул в ткани опухоли, согласно изобретению определяют тотальную активность протеасом, активность кальпаинов, содержание NF-kB - ядерного фактора kB р50, HIF-1α - фактора, активируемого гипоксией, содержание сосудистого эндотелиального фактора роста, рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста, phospho-m-TOR, коэффициент MSKCC, степень градации по Фурману, критерий Т и рассчитывают Y1 и Y2: по уравнениям
Y1=-67,01+0,33⋅Х1+0,63⋅Х2+0,04⋅Х3+0,17⋅Х4+1,51⋅Х5-0,26⋅Х6+2,33⋅Х7-0.95⋅Х8+34,86⋅Х9+15,79⋅X10;
Y2=-62,28+0,40⋅Х1+0,36⋅Х2+0,07⋅Х3-0,06⋅Х4+1,53⋅Х5+0,33⋅Х6+2,47⋅Х7-0.91⋅Х8+25,56⋅Х9+18,64⋅Х10,
где
X1 - тотальная активность протеасом, УЕ/мг белка;
Х2 - активность кальпаинов, УЕ/мг белка;
Х3 - содержание VEGF, пг/мг белка;
Х4 - содержание HIF-1α, УЕ/мг белка в лунке;
Х5 - содержание NF-κВ р50, УЕ/мг белка в лунке;
Х6 - содержание NF-κВ р65, УЕ/мг белка в лунке;
Х7 - содержание phospho-m-TOR, пг/мг белка;
Х8 - содержание VEGFR2, пг/мг белка;
Х9 - содержание коэффициента MSKCC, где 1 - благоприятный прогноз заболевания, 2 - промежуточный, 3 – неблагоприятный;
Х10 - степень градации по Фурману;
и при Y1<Y2 прогнозируют эффективную таргетную терапию, после чего для выбора таргентного агента рассчитывают функции Y3 и Y4 по уравнениям
Y3=-53,02+0,19⋅X1+0,52⋅X2+0,05⋅VX3+0,22⋅X4+0,81⋅X5-0,32⋅Х6+2,44⋅Х7-0,56⋅Х8+35,92⋅Х9-0,32⋅X11;
Y4=-44,03+0,28⋅X1+0,10⋅X2+0,11⋅X3-0,10⋅Х4+0,56⋅Х5+0,35 Х6+2,87⋅Х7-0,36⋅X8+27,07⋅X9-3,29⋅X11,
где X11 - размер опухоли почки по TNM, где 1 - размер опухоли до 7 см, соответствующий критерию Т1; 2 - размер опухоли более 7 см, соответствующий критерию Т2; 3 - соответствует критерию Т3; 4 - соответствует критерию Т4;
и при Y3>Y4 назначают таргетную терапию пазопанибом, а при Y3<Y4 назначают таргетную терапию эверолимусом.
Способ осуществляют следующим образом.
Для прогнозирования исхода заболевания в опухолевой ткани, полученной при выполнении диагностической биопсии до оперативного лечения, проводят определение тотальной активности протеасом, активности кальпаинов, содержания NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - ядерный транскрипционный фактор kB) р50, HIF-1α (hypoxia inducible transcription factor), содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), VEGFR2, phospho-m-TOR. Образцы тканей до определения активности ферментов хранят при температуре -800С и размораживают не более 1 раза. Перед определением активности исследуемых ферментов замороженную опухолевую ткань гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. Гомогенат центрифугируют при 2400g и 40°С для получения осадка, который ресуспендируют в 50 мкл 50 mM Трис-HCl буфера (рН 7,5) и затем центрифугируют при 14000g и 40°С. Полученный супернатант используют для определения экспрессии транскрипционного фактора HIF-1α (hypoxia inducible transcription factor), содержания сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), его рецептора VEGFR2 и серин/треониновой протеинкиназы phospho-m-TOR. Молекулярные показатели определяют иммуноферментным методом. Определяют коэффициент MSKCC по 5 независимым параметрам: статус по шкале Карновского, уровень лактатдегидрогеназы, скорректированный кальций крови, уровень гемоглобина и отсутствие в анамнезе нефрэктомии. Коэффициент MSKCC, равный 1, оценивается как благоприятный прогноз заболевания, 2 - промежуточный, 3 - неблагоприятный. Также при стандартном гистологическом исследовании опухоли определяют степень градации по Фурману, критерий Т и рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y2, Y3, Y4 по вышеуказанным формулам, включенные в две модели. На первом этапе определяют значение уравнений Y1, Y2 для прогнозирования эффективности лечения таргетными препаратами. При Y1<Y2 прогнозируют высокую эффективность таргетной терапии, после чего приступают к следующему этапу - выбор препарата. Для этого оценивает значение функций Y3, Y4. При Y3>Y4 прогнозируют эффективную таргетную терапию ингибиторами тирозинкиназ, а при Y3<Y4 - эффективную таргетную терапию блокаторами m-TOR.
Информативность отобранных критериев подтверждена наличием связи активности внутриклеточных протеиназ - протеасом и кальпаинов, содержания транскрипционных, ростовых факторов и phospho-m-TOR с эффективностью терапией ингибиторами тирозинкиназ - Вотриентом и блокатором m-TOR - эверолимусом у больных метастатическим раком почки. В исследование было включено 40 больных со светлоклеточным раком почки, проходившим лечение на базе отделения общей онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2011 по 2016 г. Комплексное лечение больных предполагало проведение 2-х месячного курса предоперационной таргетной терапии тирозинкиназным ингибитором - препаратом пазопаниб в дозе 800 мг 1 раз (17 больных) и эверолимусом в дозе 10 мг (23 пациента) ежедневно в сутки с последующим выполнением хирургического этапа в объеме нефрэктомии/резекции почки. Среднее время между окончанием приема пазопаниба и хирургическим лечением составило 6 дней (от 4 до 9 дней). Непосредственная эффективность таргетной терапии оценивалась на основании результатов клинического обследования, данных СКТ/МРТ по шкале RECIST.
Объективный ответ на лечение Вотриентом составил 88.4%: у 7 (26,9%) пациентов зафиксирована частичная регрессия первичной опухоли и метастазов, у 16 (61,5%) - отмечалась стабилизация процесса, а у 3 (11,5%) - прогрессирование. В группе больных, получавших афинитор, объективный ответ, был несколько ниже и достигал значения 69%: у 3 (21,4%) пациентов зафиксирована частичная регрессия первичной опухоли и метастазов, у 8 (42,8%) - отмечалась стабилизация процесса, а у 3 (21,4%) - прогрессирование.
Объективный ответ на лечение ингибитором тирозинкиназ у больных раком почки наблюдался при высоких уровнях транскрипционных факторов NF-κВ, HIF-1, ростового фактора VEGF, а также повышенной активностью протеасом в опухоли до лечения. Эффективность применения данного препарата ассоциирована со значимым снижением изучаемых показателей после таргетной терапии. В свою очередь, объективный ответ на лечение ингибитором m-TOR у больных раком почки отмечается при высоких уровнях транскрипционных факторов NF-κВ, HIF-1, ростового фактора VEGF, его рецептора VEGFR2, а также повышенной активностью протеасом в опухоли до лечения.
Оценку качества полученных функций проводили на 12 пациентах, не включенных в основную выборку. Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели по оценке предполагаемой эффективности таргетной терапии составила соответственно 97,5% и 91,7%, диагностическая точность - 92,8%. Применение модели по выбору вида таргетной терапии имеет чувствительность, равную 77,4%, специфичность - 96,4% и диагностическую точность - 90,1%.
Таблица 1. Показатели, включенные в дискриминантную модель прогнозирования эффективности таргетной терапии у больных диссеминированным раком почки в предоперационном режиме.
Таблица 2. Показатели, включенные в дискриминантную модель прогнозирования эффективности таргетной терапии в зависимости от выбора таргетного препарата у больных диссеминированным раком почки.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что высокая эффективность при лечении ингибитором тирозинкиназ - пазопанибом и блокатором m-TOR - эверолимусом у больных раком почки ассоциируется с исходно высокими уровнями транскрипционных факторов NF-κВ, HIF-1, ростового фактора VEGF Полученные данные позволяют использовать их в качестве маркеров, сопряженных с эффективностью таргетной терапии и возможностью выбора того или иного таргетного агента, что позволяет их использовать при их выборе.
Клинические примеры
2
2
1
1
Пример 1. Больной А, 71 год, обратился в Томский НИИ онкологии, где по результатам комплексного обследования был диагностирован светлоклеточный почечноклеточный рак, стадия GTNM. Прогноз заболевания по критериям MSKCC был оценен как промежуточный. Исследование опухолевой ткани, полученной при выполнении диагностической биопсии, показало, что уровень HIF-1α составлял 12 УЕ/ мг белка в лунке, содержание VEGF и VEGFR2 - 85,14 и 15 пг/ мг белка. Экспрессия phospho-m-TOR была равна 30,82 пг/ мг белка. Активность протеасом - 88,1 УЕ/ мг белка в лунке, кальпаинов - 65,1. Концентрация NFkb50 - 23 УЕ/ мг белка в лунке, а NFkb65 - 33.7.
Y1 составил - 135,1; а коэффициент Y2=199,7. Функция Y1<Y2, что свидетельствовало об ожидаемой эффективности предоперационной таргетной терапии у данного пациента. Y3 был равен 150,32, а Y4 - 138,73. Y3>Y4, что позволило прогнозировать эффективность применения ингибиторов тирозинкиназ. Лечение больного включало в себя проведение 2-х месячного курса таргетной терапии ингибитором VEGFR - пазопанибом в дозе 800 мг 1 раз в сутки, по окончании которого была оценена его эффективность по критериям RECIST. На фоне терапии отмечена частичная регрессия, как основного очага, так и метастазов. Пациенту была выполнена резекция почки с последующим назначением пазопаниба. Срок наблюдения за больным на сегодняшний момент составляет 26 месяцев, признаков прогрессии заболевания не зафиксировано.
2
1
1
1
Пример 2. Больная Д., 66 лет, обратилась Томский НИИ онкологии, где по результатам комплексного обследования был диагностирован светлоклеточный почечно-клеточный рак, стадия GTNM. Прогноз заболевания по критериям MSKCC был оценен как промежуточный. Исследование опухолевой ткани, полученной при выполнении диагностической биопсии, показало, что уровень HIF-1α составлял 3,27 УЕ/ мг белка в лунке, содержание VEGF и VEGFR2 - 6,79 и 28,27 пг/ мг белка. Экспрессия phosphor-m-TOR была равна 12,58 пг/ мг белка. Активность протеасом - 2,9 Е/ мг белка в лунке, кальпаинов - 0,8. Концентрация NFkb50 - 7,24 УЕ/ мг белка в лунке, а NFkb65 - 6,03.
Коэффициент Y1 составил - 47,57; а коэффициент Y2=43,36. При этом Y1>Y2. Полученные уровни свидетельствовали о предполагаемой низкой эффективности предоперационной таргетной терапии у данного пациента. Однако дальнейшее лечение больного проводилось без учета данных, рассчитанных с помощью дискриминантной модели. Пациенту был проведен 2-х месячный курс предоперационной таргетной терапии ингибитором m-TOR - эверолимусом в дозе 10 мг 1 раз в сутки, по окончании которого была оценена его эффективность по критериям RECIST. На фоне терапии отмечено прогрессирование заболевания с развитием полиорганной недостаточности и смертью пациента в течение 4-х месяцев.
2
1
1
Пример 3. Больная К., 51 год, обратилась в Томский НИИ онкологии, где по результатам комплексного обследования был диагностирован светлоклеточный почечно-клеточный рак, стадия GTN0M. При этом прогноз заболевания по критериям MSKCC был оценен как промежуточный. Исследование опухолевой ткани, полученной при выполнении диагностической биопсии, показало, что уровень HIF-1α составлял 7,12 УЕ/ мг белка в лунке, содержание VEGF и VEGFR2 - 52,59 и 35,24 пг/ мг белка. Экспрессия phosphor-m-TOR была равна 7,43 пг/ мг белка. Активность протеасом - 33,3 Е/ мг белка в лунке, кальпаинов - 4,1. Концентрация NFkbp50 - 20,63 УЕ/ мг белка в лунке, а NFkbp65 - 15,37.
На первом этапе были рассчитаны функции Y1 и Y2, которые составили 60,81 и 66,56  соответственно. Y1<Y2, что свидетельствовало об ожидаемой эффективности таргетной терапии и позволило перейти к следующему этапу: определению функций Y3 и Y4. Y3 составила - 15,56; а коэффициент Y4 - 14,94. Y3>Y4. Полученные данные свидетельствовали о предполагаемой высокой эффективности предоперационной таргетной терапии TKI Вотриентом у данной пациентки. Лечение больной включало в себя проведение 2-х месячного курса предоперационной таргетной терапии ингибитором VEGFR - пазопанибом в дозе 800 мг 1 раз в сутки, по окончании которого была оценена его эффективность по критериям RECIST. На фоне терапии отмечена частичная регрессия, как основного очага, так и метастазов. Пациентке после предоперационной таргетной терапии была выполнена резекция почки с последующим назначением пазопаниба. Срок наблюдения за пациенткой на сегодняшний момент составляет 27 месяцев, признаков прогрессии заболевания не зафиксировано.