БИОЧИП ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ МОЛЕКУЛ КЛЕТОК

Полезная модель относится к области медицины и может быть использована для диагностических и исследовательских целей в гематологии, онкологии и других отраслях медицины, а также в ветеринарии и биологии.
Известен биочип для определения поверхностных антигенов клеток (см. Belov L., Huang P., Barber N., Mulligan S.P., Christopherson R.I. Identification of repertoires of surface antigens on leukemias using an antibody microarray // Proteomics. - 2003. - Vol.3. - P.2147-2154.), представляющий собой нитроцеллюлозную пленку на которой в строго определенных участках (пятнах) иммобилизованы антитела, специфичные к различным поверхностным антигенам клеток. Причем в каждом пятне антитела имеют специфичность к одному антигену. Пятна биочипа отделены друг от друга фоновыми участками, в которых иммобилизованные антитела отсутствуют.
Недостатком данного биочипа является невозможность контроля качества отмывки от не связавшихся с антителами клеток с использованием микроскопии в проходящем свете. Это может искажать результаты анализа и быть причиной ошибок.
Известен биочип, позволяющий определять поверхностные антигены клеток (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека «Биологические мембраны». - 2008. - том 25 - №4 - С.267-276.). Биочип, представляет собой твердую прозрачную подложку, на которой в строго определенных участках (пятнах) иммобилизованы антитела, специфичные к поверхностным клеток. Пятна биочипа отделены друг от друга фоновыми участками, в которых иммобилизация антител не проводилась.
Недостатком биочипа является сложность контроля адекватности условий отмывки и выбор таких условий, при которых слабо связанные с антителами клетки еще остаются в области пятен биочипа, а клетки из фоновых участков полностью устраняются.
Задачей заявленной полезной модели является повышение точности анализа и исключение возможных ошибок за счет повышения надежности контроля качества отмывки биочипа.
Поставленная задача решается за счет того, биочип для определения поверхностных молекул клеток, содержащий подложку с иммобилизованными в заданных участках антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток, имеет, по меньшей мере, один контрольный участок, обеспечивающий прочность связывания клеток, заведомо, меньшую, чем прочность их специфического связывания в области любого из участков с иммобилизованными антителами, но заведомо большую, чем прочность неспецифического связывания клеток с подложкой.
Биочип имеет, по меньшей мере, один контрольный участок, не содержащий иммобилизованных антител и предназначенный для контроля качества отмывки биочипа от не связавшихся с антителами клеток.
На подложке нанесена разметка и(или) имеется один или несколько участков, указывающих на порядок считывания результата.
На подложке имеется один или несколько участков, в которых иммобилизованы молекулы, способные связываться с поверхностными молекулами клеток, но не являющиеся антителами.
Биочип имеет один или несколько участков контроля специфичности связывания клеток.
Подложка биочипа является прозрачной.
Преимуществом полезной модели является повышение точности контроля качества, отмывки биочипа от клеток, не связавшихся с антителами. При этом исключается риск отрыва клеток, специфически связавшихся с антителами в области пятен биочипа. Процесс контроля качества отмывки биочипа становится более простым.
Заявленная полезная модель поясняется чертежом, на котором изображено:
фиг.1 биочип (вид сверху)
фиг.2 Разрез А-А на фиг.1 (проходящий через участок с иммобилизованными антителами и фоновый участок» демонстрирующий молекулярную структуру поверхности).
Биочип содержит подложку 1 (фиг.2), которая может состоять из одного материала, образующего один слой, либо из нескольких материалов, образующих несколько слоев. Па поверхности подложки 1 ковалентно или за счет адсорбции иммобилизованы молекулы антител 2 и молекулы вещества 3, блокирующего сайты неспецифического связывания (например, молекулы бычьего сывороточного альбумина или овальбумина) и ослабляющего прочность неспецифического связывания клеток с подложкой. Молекулы антител 2 с известной специфичностью иммобилизованы в строго определенных участках 4 (пятнах биочипа) на поверхности подложки. В разных пятнах 4 (фиг.1) биочипа находятся антитела 2 (фиг.2), имеющие специфичность к разным антигенам. При этом в каждом отдельно взятом расположены антитела специфичные к одному антигену. Часть пятен может дублироваться, кроме того, могут присутствовать одно или несколько дополнительных пятен 5 (фиг.1), необходимых, например, для отрицательного или положительного контроля или изотипического контроля. Кроме того, на подложке могут находиться реперные участки (точки) 6, указывающие на порядок считывания результата. Пятна биочипа отделены друг от друга фоновыми участками 7, на которых нет иммобилизованных антител, а вместо них иммобилизованы молекулы вещества 3 (фиг.2), блокирующего сайты неспецифического связывания. Эти молекулы, могут быть иммобилизованы на подложке биочипа его изготовлении, либо могут наноситься уже в процессе проведения анализа на этапе, предшествующем инкубации биочипа с клеточной суспензией. На подложке биочипа может быть нанесена разметка 8 (фиг.1), облегчающая нахождение нужных участков при неавтоматизированном считывании результата. На поверхности биочипа может находиться, по меньшей мере, один контрольный участок 9, не имеющий иммобилизованных антител и предназначенный для контроля качества отмывки биочипа от не связавшихся с антителами клеток. Поверхность участка 9 может быть покрыта иммобилизованными молекулами вещества, блокирующего сайты неспецифического связывания или молекулами иного вещества обеспечивающего прочность неспецифического связывания клеток, меньшую, чем прочность их специфического с иммобилизованными антителами в области 4. Участок 9 (фиг.1) имеет большие размеры по сравнению с фоновыми участками 7. Кроме того, на поверхности биочипа имеется контрольный участок 10, предназначенный для контроля достижения предельно допустимой скорости потока жидкости при отмывке биочипа. В этом участке на подложке биочипа иммобилизованы молекулы антител или иных веществ, с которыми способны связываться любые клетки, присутствующие в исследуемом образце. При этом прочность связывания клеток в области участка 10 заведомо меньше, чем прочность специфического связывания клеток в области пятен 4, но больше, чем в области фоновых участков 7 и в области контрольного участка 9. Расстояние между пятнами 4 биочипа и контрольными участками 9 и 10 составляет не менее половины диаметра пятен 4. Необходимость этого обусловлена тем, что вокруг пятен биочипа 4 (фиг.2) в фоновых участках 7 образуются области 11, в которых связывается небольшое количество молекул антител. Связывание этих молекул в сколько-нибудь значимых количествах происходит в непосредственной близости от 4, и уменьшается, по мере удаления от них. Это происходит вследствие вымывания избытка антител из области пятен биочипа и адсорбции вокруг них при контакте биочипа с жидкостью. Этот процесс может происходить перед иммобилизацией молекул вещества 3, блокирующего сайты неспецифического связывания при изготовлении биочипа или на этапе выполнения анализа. Границы контрольных участков 9 (фиг.1) и 10 могут быть отмечены линиями разметки 8 для удобства их нахождения при микроскопическом исследовании. На поверхности подложки также может находиться одно или несколько пятен 12, содержащих иммобилизованные молекулы (например, селектинов, интегринов или иных молекул адгезии) не являющихся антителами, но способных связываться с поверхностными молекулами клеток.
Анализ с помощью биочипа осуществляется следующим образом. Биочип последовательно инкубируют с необходимыми растворами, а затем осуществляют инкубацию с исследуемой клеточной суспензией. Затем отмывают биочип от не связавшихся с антителами клеток. Отмывку биочипа осуществляют при таких условиях и до тех пор, пока не будут смыты все клетки из контрольного участка 9, но не при этом не начнется отрыв клеток из контрольного участка 10, признаком которого является нарушение монослоя клеток в этом участке. Качество отмывки биочипа оценивают с помощью микроскопии. После завершения отмывки биочипа выполняют считывание результата.