СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩЕГО СУКЦИНИЛИРОВАННОГО КАЗЕИНА
METHOD OF PRODUCING IRON-CONTAINING SUCCINYLATED CASEIN

Изобретение относится к способу получения железосодержащего сукцинилированного казеина.
GB-A-2115821 раскрывает получение железосодержащих сукцинилированных протеинов. Их получение включает реакцию сухого молока, протеинов молока, протеинов яиц, протеинов из бычьей сыворотки, протеинов свиной печени или соевых протеинов с янтарным ангидридом в щелочных условиях, центрифугирование или фильтрование полученного опалесцирующего раствора и осаждение при подкислении. Осадок снова отделяют центрифугированием или фильтрованием и заново суспендируют в воде. Затем отделенный осадок снова растворяют в слабо щелочных условиях, раствор центрифугируют или фильтруют и снова подкисляют для образования осадка сукцинилированных протеинов. Для реакции с солью железа полученный осадок снова растворяют в слабо щелочных условиях. Несмотря на трудоемкие стадии очистки сукцинилированных протеинов путем их осаждения и переосаждения, описанный в GB-A-2115821 способ имеет недостаток, состоящий в том, что, в частности, образуются нерастворимые производные в форме слизи, удаление которых затруднено (ЕР-А2-0939083). В попытке преодолеть данные недостатки GB-A-2115821 Европейская заявка на патент EP-A2-0939083 описывает комплекс железа с сукпинилированным казеином, который получают из пищевого казеина и который применяют для лечения патологических состояний, связанных с железодефицитом. Железосодержащий сукцинилированный казеин получают путем сложного синтеза, включающего реакцию казеина с янтарным ангидридом с образованием сукцинилированного казеина, который затем вводят в реакцию с трихлоридом железа. После осаждения сукцинилированного казеина на первой стадии полученный сукцинилированный казеин снова растворяют с применением трудоемкой дилацерации. Дилацерация представляет собой способ, приводящий к большим затратам механической энергии, отличающийся применением насосов, который позволяет разрушить конгломераты суспендированного твердого материала, которые не удается разрушить простым механическим перемешиванием. Способы дилацерации выполняют с помощью специальных дилацерационных насосов, в которых движение пропеллера происходит совместно с движением зубчатого колеса. Водный раствор сукцинилированного казеина, полученный после дилацерации, затем вводят в реакцию с трихлоридом железа. Полученный железосодержащий сукцинилированный казеин также снова растворяют с применением трудоемкой дилацерации. Соответственно способ по ЕР-А2-0939083 нерационален, так как стадии отделения и дилацерации делают данный способ сложным, долгим, дорогим и энергозатратным. Более того, в данном способе необходимо применять относительно большие количества янтарного ангидрида для получения адекватного выхода целевого продукта. Способ по GB-A-2115821 также весьма нерационален, в частности, при выполнении в промышленных масштабах, поскольку он требует стадий осаждения, повторного растворения, переосаждения и повторного растворения сукцинилированных протеинов перед реагированием с солью железа.
ЕР-А 1-0319664 также раскрывает способ получения комплексов железа с сукцинилированными полипептидами, которые подвергались ферментативному расщеплению. В отношении получения сукцинилированных полипептидов, использованных в качестве исходного материала, упомянутый документ в свою очередь ссылается на IT 1150213, соответствующий упомянутому ранее GB-A-2115821.
WO 2006/021843, опубликованный после даты приоритета данной заявки, раскрывает способ получения железосодержащего сукцинилированного казеина. Подобно ЕР-А2-0939083 и GB-A-2115821 данный документ также описывает в примерах производство сукцинилированного казеина с помощью реакции казеина с янтарным ангидридом в щелочном растворе. Далее сукцинилированный казеин осаждают добавлением HCl. Осажденный сукцинилированный казеин затем снова полностью растворяют и фильтруют и затем вводят в реакцию с трихлоридом железа. То есть способ WO 2006/02183 также раскрывает дополнительные стадии выделения фильтрованием, промывки, влажного гранулирования, растворения, фильтрования промежуточного сукцинилированного казеина, до того, как раствор - а не суспензию - промежуточного сукцинилированного казеина вводят в реакцию с трихлоридом железа. Кроме того, WO 2006/02183 отличается наличием дополнительной стадии гранулирования осажденного промежуточного сукцинилированного казеина перед стадией повторного растворения, в которой получают раствор сукцинилированного казеина, который вводят в реакцию с трихлоридом железа.
Соответственно в предшествующем уровне техники предполагалось, что дополнительные стадии повторного растворения и переосаждения промежуточного сукцинилированного казеина необходимы для получения железосодержащего сукцинилированного казеина, а также, что в реакцию с трихлоридом железа необходимо вводить раствор, а не суспензию промежуточного сукцинилированного казеина.
При проведении патентного поиска, выполненного после даты приоритета данной заявки патентным ведомством Австрии, были выявлены следующие дополнительные документы из предшествующего уровня техники, которые, однако, оказались менее важными или неважными: AU 652021 В, ЕР 0739634 В1, ЕР 0243322 Bl, US 6994876 Bl, GB 1475577 A, US 2006/147552, WO 2006/001429 и WO 2006/001430.
В результате целью данной заявки была разработка способа получения железосодержащего сукцинилированного казеина, который отличается
- прохождением реакции в одном сосуде,
- отсутствием промежуточных стадий выделения, очистки и/или дилацерации,
- меньшей продолжительностью способа,
- повышенными концентрациями, ведущими к более высоким объемным производительностям,
- меньшими количествами янтарного ангидрида,
- более высокой устойчивостью материала вследствие менее агрессивных рН.
Данная заявка относится к менее сложному и более эффективному в плане затрат времени, средств и энергии способу, который с высоким выходом приводит к целевому качеству продукта. Тем самым, полученный комплекс железа с сукцинилированным казеином должен позволить введение точных и воспроизводимых количеств железа, в основном без побочных эффектов. Авторы данного изобретения смогли показать, что железосодержащий сукцинилированный казеин можно получить с помощью гораздо более легкого способа, который позволяет избежать любых промежуточных стадий выделения и очистки, в частности стадии переосаждения или стадии дилацерации промежуточного сукцинилированного протеина.
Таким образом, данное изобретение описывает способ получения железосодержащего сукцинилированного казеина, включающий следующие стадии:
a) реакция казеина, по меньшей мере, с одним сукцинилирующим агентом, предпочтительно янтарным ангидридом, с образованием водной суспензии сукцинилированного казеина, и
b) реакция водной суспензии сукцинилированного казеина, полученной на стадии (а), по меньшей мере, с одной солью железа с образованием железосодержащего сукцинилированного казеина.
Соответственно такой способ отличается от способа, описанного в GB-A-2115821, тем, что с солью железа реагирует не раствор сукцинилированного протеина, который был получен в результате осаждения, растворения, повторного осаждения и повторного растворения, а водная суспензия, полученная реакцией казеина с янтарным ангидридом и последующим подкислением, непосредственно, то есть без делацерации и/или очистки, то есть стадии переосаждения, реагирует с солью железа.
Аналогичным образом способ данного изобретения отличается от способа, раскрытого в ЕР 0939083 А2, в частности, тем, что не раствор сукцинилированного протеина вводят в реакцию с солью железа, а суспензия, полученная кислотным осаждением на стадии (а) получения сукцинилированного протеина, непосредственно реагирует с солью железа. Таким образом, неожиданно было обнаружено, что продолжительные, энергозатратные и потому дорогие стадии дилацерации, направленные на перевод в раствор сукцинилированного протеина, полученного на стадии (а), могут быть полностью опущены без какого-либо ущерба. Водная суспензия, в отличие от водного раствора, означает, что суспензия содержит нерастворимые примеси, которые могут быть отделены фильтрованием.
Итак, в отличие от данного изобретения в обоих документах предшествующего уровня техники (ЕР-А2-0939083 и GB-A-2115821) в контакт с солью железа вводили раствор сукцинилированного протеина, а не суспензию. Кроме того, оба способа предшествующего уровня техники требуют дополнительных стадий очистки сукцинилированного протеина дилацерацией (ЕР-А2-0939083) и переосаждением (GB-A-2115821), которые не проводят в способе данного изобретения. Таким образом, способ данного изобретения предоставляет значительное преимущество по сравнению с предшествующим уровнем техники, в частности, при выполнении в промышленном масштабе.
То есть водную суспензию сукцинилированного казеина, полученную на стадии (а) при реакции сукцинилирующего агента с казеином, (непосредственно) вводят в реакцию с солью железа. В частности, никаких стадий отделения и/или выделения сукцинилированного казеина и никаких стадий очистки, подобных стадиям переосаждения или дилацерации, не выполняют между реакцией сукцинилирующего агента с казеином на стадии (а) и реакцией сукцинилированного казеина с солью железа на стадии (b).
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения стадия (а) включает любую из подстадий:
(а1) суспендирование казеина в воде, предпочтительно в повышенных концентрациях (в отличие от ЕР-А2-0939083 и GB-A-2115821),
(а2) при необходимости доведение рН водной суспензии, по меньшей мере, до 6,
(а3) добавление, по меньшей мере, одного сукцинилирующего агента, предпочтительно янтарного ангидрида, при поддержании рН, по меньшей мере, на уровне 6 посредством добавления, по меньшей мере, одного основания.
На стадии (а1), предпочтительно, весовое соотношение казеина к воде составляет в диапазоне от 1:1 до 1:100, предпочтительно от 1:2 до 1:15, более предпочтительно от 1:4 до 1:8 (масс./масс). Неожиданно было обнаружено, что в данном способе начальное количество воды можно уменьшить до минимума и, таким образом, можно значительно повысить объемную производительность способа.
Обычно при перемешивании казеина с водой устанавливается рН около 5. Соответственно данный способ обычно включает доведение рН водной суспензии казеина в воде, по меньшей мере, до 6, предпочтительно, по меньшей мере, до 7 (стадия (а2)), что обычно достигается добавлением одного или более оснований, которые включают, но не ограничиваются этими: соли щелочных или щелочноземельных металлов, подобные гидроксидам, оксидам и/или карбонатам. Предпочтительными являются гидроксиды щелочных металлов, подобные гидроксидам натрия или калия, в частности гидроксид натрия. Еще более предпочтительно доводить рН на стадии (а2), по меньшей мере, до 7,5, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, до около 8. После получения водной суспензии казеина с целевым рН на стадии (а3) добавляют сукцинилирующий агент, предпочтительно янтарный ангидрид, при поддержании рН равным, по меньшей мере, 7 посредством добавления, по меньшей мере, одного основания. Основание предпочтительно является тем же самым, которое применялось на стадии (а2). Янтарный ангидрид обычно добавляют в виде порошка. Янтарный ангидрид можно добавлять к казеину непрерывно или с перерывами, например, в виде одной или нескольких разнесенных во времени порций. «Разнесенные во времени» означает, что период времени между двумя добавлениями составляет предпочтительно, по меньшей мере, 30 сек, более предпочтительно, по меньшей мере, 60 сек, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 300 сек. Неожиданно было установлено, что в способе изобретения можно уменьшить количество необходимого янтарного ангидрида. Так, на стадии (а) способа согласно изобретению весовое соотношение казеина к янтарному ангидриду предпочтительно составляет, по меньшей мере, 3,5:1, более предпочтительно, по меньшей мере, 4:1, более предпочтительно, по меньшей мере, 5:1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения весовое соотношение казеина к янтарному ангидриду предпочтительно составляет не более 12:1, предпочтительно не более 10:1, еще более предпочтительно не более около 8:1. Поскольку обычно стремятся сукцинилировать практически все доступные аминные остатки в казеине (то есть, степень замещения более 90%; исходя из определения с использованием нингидринового метода (Yemm, Cocking; Succinylation reaction. Analyst 80, 209)), что соответствует содержанию янтарной кислоты около 7,5% (масс./масс.) при определении методом газовой хроматографии (Cremonesi, Р, & Caramazza, I. (1993), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 31:40-51), то минимальное весовое соотношение ангидрида янтарной кислоты к казеину составляет около 1:12.
2
Согласно данному изобретению предпочтительно использовать пищевой казеин, то есть казеин, используемый для пищевых целей. Под термином «пищевой казеин» имеют в виду казеин, полученный из молока со строго контролируемых племенных хозяйств. Данные продукты имеют уровень микробиологической чистоты менее 10 КОЕ/г для бактерий и менее 10 КОЕ/г для плесневых грибков. Использование пищевого казеина дает особо чистые продукты по сравнению со сходными комплексами, полученными из обычных молочных протеинов.
Более того, предпочтительно, янтарный ангидрид добавляют к казеину в течение, по меньшей мере, 10 минут, более предпочтительно, по меньшей мере, 15 минут, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 минут.
Время реакции после добавления янтарного ангидрида обычно меньше 60 минут, предпочтительно меньше 45 минут, более предпочтительно меньше 30 минут.
Реакцию на стадии (а) обычно проводят при температуре от около 10 до 40°С, предпочтительно примерно при комнатной температуре (от 15 до 25°С).
После реакции янтарного ангидрида с казеином полученный сукцинилированный казеин обычно осаждают подкислением до рН от 2 до 7, предпочтительно от 2,5 до 6,5, более предпочтительно от 3,0 до 4,5 посредством добавления к реакционному раствору подходящей кислоты (стадия (а4)). Конкретными примерами применимых кислот являются водные растворы соляной кислоты и серной кислоты, при этом соляная кислота является наиболее предпочтительной кислотой.
Таким образом, на стадии (а) обычно получают кислую суспензию сукцинилированного казеина, имеющую рН предпочтительно ниже 7, более предпочтительно ниже 6.
В способе изобретения рассмотренную выше нормально кислую водную суспензию сукцинилированного казеина, полученную на стадии (а), обычно используют без дополнительных стадий выделения, очистки и дилацерации в следующей стадии (b) в реакции с солью железа. В частности, осажденный сукцинилированный казеин, полученный на стадии (а), не переводят снова в раствор, в частности посредством трудоемких способов дилацерации, перед реакцией с солью железа.
Таким образом, на стадии (b) кислая водная суспензия сукцинилированного казеина, полученного на стадии (а), имеющая рН предпочтительно ниже 7, более предпочтительно ниже 6, непосредственно вводится в реакцию, по меньшей мере, с одной солью железа, то есть, в частности, без дополнительных стадий выделения, очистки и/или дилацерации. В отличие от описанного в способах ЕР 0939083 А2 и GB-A-2115821 соль железа добавляют к щелочному раствору сложным образом очищенного сукцинилированного казеина, что с большой вероятностью приводит к образованию значительных количеств нерастворимых гидроксидов железа, выпадающих в осадок при щелочном рН, которые нужно снова отделять, что вызывает потерю железа в данном способе.
На стадии (b) способа согласно данному изобретению выпавший в осадок сукцинилированный казеин непосредственно реагирует, по меньшей мере, с одним источником железа, предпочтительно, по меньшей мере, с одной солью железа, которая выбрана из группы, состоящей из трихлорида железа и других солей, содержащих железо(III), таких как сульфат, аспартат, фумарат, цитрат, глюконат, глицинат, лактат и оксалат. Наиболее предпочтительным является хлорид железа(III) (трихлорид железа).
Обычно, на стадии (b) способа согласно данному изобретению соль железа используют в виде водного раствора.
Если в качестве источника железа на стадии (b) используют трихлорид железа, реакцию сукцинилированного казеина с трихлоридом железа предпочтительно проводят с раствором трихлорида железа с содержанием железа от 0,5 до 20% (масс./масс.), более предпочтительно от 1 до 15% (масс./масс.). Повышенные концентрации трихлорида железа предпочтительны, потому что они приводят к более короткому времени добавления и более высокой объемной производительности. Время добавления раствора трихлорида железа к суспензии сукцинилированного казеина предпочтительно составляет от 1 до 40 мин, более предпочтительно от 2 до 20 мин, наиболее предпочтительно от 3 до 15 мин.
Во время добавления источника железа на стадии (b) способа согласно данному изобретению рН предпочтительно поддерживают на уровне от 2 до 6, более предпочтительно от 2,5 до 5,0 и еще более предпочтительно от 3 до 4 посредством добавления к реакционной среде достаточного количества основания для стимулирования образования комплекса железа. Что касается подходящих оснований, это относится к упомянутым выше основаниям, при этом предпочтительны водные растворы NaOH. Избегают повышенного рН, чтобы предотвратить образование гидроксидов железа.
После добавления источника железа к суспензии сукцинилированного казеина полученную смесь предпочтительно перемешивают при температуре, близкой к комнатной (от 15 до 25°С).
После этого предпочтительно на стадии (с) образовавшийся железосодержащий сукцинилированный казеин, полученный в водной суспензии, растворяют добавлением, по меньшей мере, одного основания с образованием водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин. На стадии (с) рН реакционной смеси обычно доводят до, по меньшей мере, 7,0, предпочтительно от 7 до 11, более предпочтительно от 7,5 до 9,5 посредством добавления подходящего основания. Что касается подходящих оснований, это относится к упомянутым выше основаниям, при этом предпочтительны водные растворы NaOH.
В то же время суспензию предпочтительно перемешивают при комнатной температуре или слегка нагревают до температур предпочтительно не выше 50°С, более предпочтительно не выше 45°С, наиболее предпочтительно не выше 40°С, предпочтительно в течение от около 10 до 120 мин, более предпочтительно от 20 до 100 мин, наиболее предпочтительно от 30 до 80 мин.
Оставшиеся нерастворимые частицы обычно отделяют, предпочтительно фильтрованием, от водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, для получения нормально щелочного водного раствора железосодержащего сукцинилированного казеина (стадия (d)).
В отличие от ЕР 0939083 А2, в способе согласно данному изобретению также не является необходимым подвергать суспензию железосодержащего сукцинилированного казеина длительным и дорогим процедурам выделения и/или дилацерации для получения щелочного раствора продукта. Так, в предпочтительном варианте осуществления способа согласно данному изобретению опускается также стадия выделения и/или дилацерации для получения щелочного раствора железосодержащего сукцинилированного казеина.
Предпочтительно на следующей стадии (е) железосодержащий сукцинилированный казеин осаждают из указанного водного раствора добавлением, по меньшей мере, одной кислоты и извлечением полученного железосодержащего сукцинилированного казеина. Осаждение железосодержащего сукцинилированного казеина на стадии (е) предпочтительно проводят при рН от 2 до 6, более предпочтительно от 3 до 5. В отличие от ЕР 0939083 А2 и GB 2115821, интервал рН можно повысить до 3 и даже больше 3, поскольку это приводит к менее агрессивной суспензии продукта, что делает возможным применение аппаратов из нержавеющей стали. Более высокие рН неблагоприятны, поскольку растворимость железосодержащего сукцинилированного казеина при более высоких рН может приводить к снижению выхода.
Указанной кислотой, применяемой для осаждения железосодержащего сукцинилированного казеина на стадии (е), предпочтительно является разбавленная соляная кислота в концентрации от около 15 до 25 масс.%. В качестве альтернативы может быть применена серная, уксусная, малоновая, яблочная, лимонная, винная и молочная кислота.
Согласно данному изобретению сырой продукт, содержащий железосодержащий сукцинилированный казеин, обычно извлекают фильтрованием или центрифугированием, промывкой (например, водой) и сушкой, например, на роторном испарителе или вакуумной сушке. В частности, сушку проводят при пониженном давлении и температурах выше комнатной, например от 50 до 100°С, предпочтительно от 60 до 90°С, более предпочтительно от 70 до 80°С, в течение нескольких часов, например от 2 до 50 часов, предпочтительно от 10 до 40 часов, предпочтительно при пониженном давлении, например от 10 до 200 мбар, предпочтительно от 20 до 150 мбар. Остаточное содержание влаги обычно составляет примерно менее 10 масс.%.
Полученный железосодержащий комплекс с сукцинилированным казеином обычно имеет содержание железа приблизительно от 4 до 6, предпочтительно около 5 масс.% из расчета на железо(III).
В предпочтительном варианте осуществления вместо сушки полученного железосодержащего сукцинилированного казеина можно также перерабатывать влажный материал непосредственно в фармацевтический препарат для перорального применения, предпочтительно в жидкий фармацевтический препарат.
Способ согласно данному изобретению предпочтительно проводят в одном сосуде, и предпочтительно он включает следующие стадии:
a) реакция казеина предпочтительно при более высоких концентрациях, то есть при весовых соотношениях казеина к воде от 1:2 до 1:15, более предпочтительно от 1:4 до 1:8, с янтарным ангидридом с образованием водной суспензии сукцинилированного казеина,
b) реакция указанной водной суспензии сукцинилированного казеина, полученного на стадии (а), непосредственно, то есть без промежуточных стадий выделения, очистки и/или дилацерации, по меньшей мере, с одной солью железа с образованием железосодержащего сукцинилированного казеина, который предпочтительно большей частью свободен от нерастворимых гидроксидов железа,
(c) растворение указанного железосодержащего сукцинилированного казеина посредством добавления, по меньшей мере, одного основания, предпочтительно без промежуточных стадий выделения, очистки и/или дилацерации, с образованием водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин,
(d) отделение нерастворимых частиц от указанной водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, для образования водного раствора железосодержащего сукцинилированного казеина (данное отделение, в частности посредством фильтрования, проводится главным образом из-за фармацевтических требований),
(e) осаждение железосодержащего сукцинилированного казеина из указанного водного раствора предпочтительно при повышенных рН, приводящих к менее агрессивным суспензиям продукта, посредством добавления, по меньшей мере, одной кислоты и извлечение полученного железосодержащего сукцинилированного казеина,
(f) сушка указанного полученного железосодержащего сукцинилированного казеина или дальнейшая переработка полученного влажного железосодержащего сукцинилированного казеина непосредственно в фармацевтический препарат, предпочтительно в жидкий фармацевтический препарат.
В предпочтительном варианте осуществления способ согласно изобретению состоит по существу из стадий от (а) до (f).
Способ согласно изобретению может быть выполнен с перерывами (то есть, партиями) и/или частично непрерывно.
Одним из дополнительных преимуществ способа согласно данному изобретению является то, что, с точки зрения достигнутого по сравнению с предшествующим уровнем техники огромного упрощения, его можно выполнять непрерывно, по меньшей мере, частично.
В предпочтительном варианте осуществления, в частности, обработку после упомянутой выше стадии (с), то есть после растворения железосодержащего сукцинилированного казеина посредством добавления, по меньшей мере, одного основания, проводят непрерывно. Более конкретно, после стадии (с) водную композицию, содержащую растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, непрерывно сливают из реактора и предпочтительно разбавляют водой, предпочтительно в статическом трубчатом смесителе.
Между прочим, оптимальные условия разбавления водой зависят от температуры водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, полученный на стадии (с). В случае когда водная композиция, полученная на стадии (с), имеет температуру выше 35°С или выше 40°С, например 50°С, используемая для разбавления вода предпочтительно имеет температуру, близкую к температуре водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, полученный на стадии (с). В частности, температура используемой для разбавления воды предпочтительно находится в диапазоне ±5°С от температуры водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, полученный на стадии (с). Объемное соотношение - водная композиция, содержащая растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, полученный на стадии (с)/используемая для разбавления вода - предпочтительно находится в диапазоне от около 1:1 до 1:10, более предпочтительно от 1:2 до 1:6 и наиболее предпочтительно 1:4.
В случае когда водная композиция, полученная на стадии (с), имеет температуру ниже 35°С, например 30°С, и используемая для разбавления вода имеет, в частности, температуру в диапазоне 25±5°С, объемное соотношение - водная композиция, содержащая растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, полученный на стадии (c)/используемая для разбавления вода - предпочтительно находится в диапазоне от около 1:2 до 1:10, более предпочтительно от 1:4 до 1:8 и наиболее предпочтительно 1:6.
После разбавления водой водной композиции, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, полученный на стадии (с), образующуюся разбавленную водную композицию предпочтительно фильтруют для удаления всех нерастворимых частиц (относится к стадии (d)).
После этого предпочтительно отфильтрованную и разбавленную водную композицию, содержащую растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, вводят в контакт с жидкой кислой средой, предпочтительно в дополнительном статическом трубчатом смесителе для осаждения железосодержащего сукцинилированного казеина (относится к стадии (е)). Указанную кислую среду, которая предпочтительно представляет собой разбавленную водную HCl (от 15 до 25 масс.%), вводят в контакт с разбавленной водной композицией, содержащей растворенный железосодержащий сукцинилированный казеин, в таком соотношении, что рН доводится до предпочтительно от 2 до 6, более предпочтительно от 2,5 до 5, более предпочтительно от 3 до 4.
После осаждения водную суспензию, содержащую железосодержащий сукцинилированный казеин, обычно выделяют фильтрованием или центрифугированием и промывают (например, водой). В лабораторном масштабе эти стадии проводят с перерывами, в промышленном масштабе выделение и промывку можно осуществлять непрерывно с применением декантирующего или центрифугирующего аппарата, соответственно. Сушку, например, проводят на роторном испарителе или вакуумной сушке, как описано выше (стадия (f)). Данную стадию предпочтительно выполняют с перерывами в лабораторном и промышленном масштабе.
Преимущества непрерывной обработки:
- возможны большие размеры партии (синтез в реакторе определенного объема, обработка вне реактора),
- процедура обработки независима от размеров партии,
- улучшенная консистенция осажденного продукта (менее липкий).
Предпочтительно согласно данному изобретению упомянутые выше стадии от (а) до (с) проводят с перерывами (то есть, партиями), а упомянутые выше стадии от (d) до (f) проводят непрерывно. Согласно данному изобретению также можно объединить несколько реакторов периодического действия, в которых с перерывами осуществляются стадии от (а) до (с), с одной линией непрерывной обработки (стадии от (d) до (f)) и эксплуатировать реакторы периодического действия в чередующемся режиме, так чтобы непрерывная обработка могла осуществляться практически без остановок.
Способ, описанный в соответствии с данным изобретением, делает возможным получение железосодержащего сукцинилированного казеина, свободного от осадков или от соединений железа, нерастворимых или плохо растворимых в воде. В частности, было обнаружено, что продукт полностью растворим при нейтральных/щелочных рН, то есть при типичных для кишечного тракта значениях, таким образом гарантируя биодоступность железа для всасывания в кишечнике.
Комплексы железа с сукцинилированным казеином согласно данному изобретению имеют постоянный состав, демонстрируют прекрасную фармакологическую активность, связанную с их способностью выступать в роли переносчиков железа, и соответственно имеют очень низкий процент побочных эффектов. Терапевтическое применение данного продукта не вызывает вредных последствий, присущих известным соединениям на основе железа, в частности поражений желудка. Кроме того, продукт согласно данному изобретению можно включать в состав фармацевтических препаратов, в частности, пригодных для перорального применения.
Соответственно способ согласно данному изобретению предпочтительно включает также стадию производства фармацевтического препарата из железосодержащего сукцинилированного казеина, полученного в описанном выше способе, при этом лекарственная форма обычно предназначена для перорального применения.
Такой способ обычно включает смешивание железосодержащего сукцинилированного казеина, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем или носителем. Примерами наполнителей, разбавителей или носителей, пригодных для перорального применения, являются, например, микрокристаллическая целлюлоза, фосфат кальция, кизельгур, сахар, такой как лактоза, декстроза или маннитол, тальк, стеариновая кислота, крахмал, бикарбонат натрия и/или желатин. Композиции могут также содержать подходящие консервирующие, стабилизирующие и увлажняющие вещества, солюбилизаторы, подсластители, красители и отдушки.
Подходящие лекарственные формы для перорального применения включают, например, таблетки, таблетки в оболочке, капсулы, драже, эликсиры, таблетки для рассасывания, пилюли, порошки, растворы, суспензии, сиропы, питье в пузырьках, соки. Фармацевтические композиции могут, при желании, быть приготовлены в форме с замедленным высвобождением.
Суточная дозировка зависит, разумеется, от отдельного субъекта, подвергающегося лечению, и от состояния и заболевания, на которое направлено лечение. Средняя суточная дозировка составляет, например, между 10 и 500 мг железа в день. Например, пациенты, с железодефицитом, принимают 2-3 раза в день около 100 мг железа, а беременные женщины принимают 1-2 раза в день 60 мг железа.
Способ согласно данному изобретению предпочтительно включает также использование полученного железосодержащего сукцинилированного казеина для производства лекарственного препарата, который предназначен предпочтительно для лечения пациентов, страдающих от любых симптомов железодефицита.
Такие симптомы включают, например, утомление, слабость, низкую концентрацию, сниженную активность, трудности с нахождением правильных слов, забывчивость, ненормальную бледность или ухудшение цвета кожи, раздражительность, учащенный пульс (тахикардия), воспаленный или опухший язык, увеличенную селезенку, желание поедать специфические вещества (пикацизм), головные боли, отсутствие аппетита, повышенную подверженность инфекциям, депрессивную дисфорию.
Данное изобретение включает также применение полученного железосодержащего сукцинилированного казеина для производства лекарственного препарата для лечения железодефицитной анемии, в частности железодефицитной анемии при беременности, латентной железодефицитной анемии у детей и подростков, железодефицитной анемии, вызванной нарушениями в желудочно-кишечном тракте, железодефицитной анемии вследствие потери крови, например, при кровотечении в желудочно-кишечном тракте (например, вследствие язв, карцином, геморроидальных узлов, воспалительных расстройств, приема ацетилсалициловой кислоты), при менструальном кровотечении или травме, железодефицитной анемии вследствие спру, железодефицитной анемии вследствие бедной железом диеты, связанного с железодефицитной анемией иммунодефицита, связанной с железодефицитной анемией недостаточности функции головного мозга или синдрома усталых ног (RLS).
Следующие примеры приведены в иллюстративных целях без ограничения изобретения.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Если не указано иное, все процентные соотношения относятся к масс./масс.
Получение железосодержащего сукцинилированного казеина
Пример 1
3
120 г казеина суспендируют в 1620 г воды при температуре 20°С. рН доводят до 8 добавлением 9,8 мл 30%-ного раствора NaOH в течение 40 мин. Добавляют 22 г янтарного ангидрида в четыре приема в течение 20 мин. В это время рН поддерживают равным 8 добавлением 35,3 мл 30%-ного раствора NaOH. Полученный раствор перемешивают в течение 30 мин, поддерживая рН равным 8. Сукцинилированный казеин осаждают посредством доведения рН до 4 с помощью 66,1 мл 20%-ного раствора HCl. В течение 10 мин добавляют 57,2 г раствора FeCl (12%-ный), поддерживая рН равным 4 посредством добавления 32,3 мл 30%-ного раствора NaOH. Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 1 часа при рН 4 и затем нагревают до 30°С в течение 20 мин. рН доводят до 6 добавлением 27,6 мл 30%-ного раствора NaOH. Добавляют 2,45 г пропил пара-гидроксибензоата и 9,14 г метил пара-гидроксибензоата, растворенные в 30 мл воды. рН доводят до 9 добавлением 19,7 мл 30%-ного раствора NaOH. Раствор перемешивают в течение 1 часа при 50°С и рН 9. После фильтрования продукт осаждают добавлением 82,2 мл 20%-ного раствора HCl до тех пор, пока не будет достигнуто рН 3,6. Продукт отфильтровывают, промывают 1 л воды и затем сушат в течение 5 часов при температуре 75°С и давлении 50 мбар на роторном испарителе. Затем сушат продукт в течение 15 часов при 75-80°С и давлении 125 мбар в вакуумной сушке. Получают 127 г железосодержащего сукцинилированного казеина.
Пример 2
3
120 г казеина суспендируют в 1622 г воды при температуре 20°С. рН доводят до 8 добавлением 9,8 мл 30%-ного раствора NaOH в течение 40 мин. Добавляют 20 г янтарного ангидрида в четыре приема в течение 20 мин. В это время рН поддерживают равным 8 добавлением 32,8 мл 30%-ного раствора NaOH. Полученный раствор перемешивают в течение 30 мин, поддерживая рН равным 8. Сукцинилированный казеин осаждают посредством доведения рН до 4 с помощью 60,5 мл 20%-ного раствора HCl. В течение 10 мин добавляют 57,2 г раствора FeCl (12%-ный), поддерживая рН равным 4 посредством добавления 32,9 мл 30%-ного раствора NaOH. Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 1 часа при рН 4 и затем нагревают до 30°С в течение 25 мин. рН доводят до 9 добавлением 45,0 мл 30%-ного раствора NaOH. Раствор перемешивают в течение 1 часа при 30°С и рН 9. После фильтрования продукт осаждают добавлением 70,5 мл 20%-ного раствора HCl до тех пор, пока не будет достигнуто рН 3,6. Продукт отфильтровывают, промывают 1 л воды и затем сушат 5 час при температуре 75°С и давлении 50 мбар на роторном испарителе. Затем сушат продукт в течение 15 часов при 75°С и давлении 125 мбар в вакуумной сушке. Получают 133 г железосодержащего сукцинилированного казеина.
Пример 3
3
120 г казеина суспендируют в 810 г воды при температуре 20°С. рН доводят до 8 добавлением 9,8 мл 30%-ного раствора NaOH в течение 40 мин. Добавляют 20 г янтарного ангидрида в четыре приема в течение 20 мин. В это время рН поддерживают равным 8 добавлением 29,4 мл 30%-ного раствора NaOH. Полученный раствор перемешивают в течение 30 мин, поддерживая рН равным 8 посредством добавления 5 мл 30%-ного раствора NaOH. Сукцинилированный казеин осаждают посредством доведения рН до 3,8 с помощью 64,0 мл 20%-ного раствора HCl. В течение 10 мин добавляют 57,2 г раствора FeCl (12%-ный), поддерживая рН равным 3,8 посредством добавления 32,2 мл 30%-ного раствора NaOH. Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 1 часа при рН 3,8 и затем нагревают вплоть до 50°С за 20 мин. рН доводят до 9 добавлением 46,8 мл 30%-ного раствора NaOH. Раствор перемешивают в течение 1 часа при 50°С и рН 9. Раствор разбавляют водой (предварительно нагретой до 50°С) в объемном соотношении 1:4 (реакционный раствор:вода) и перемешивают 5 мин при 50°С. После фильтрования продукт осаждают добавлением 74,2 мл 20%-ного раствора HCl до тех пор, пока не будет достигнуто рН 3,6. Продукт отфильтровывают, промывают 1 л воды и затем сушат в течение 24 часов при 75°С и давлении 125 мбар в вакуумной сушке. Получают 130 г железосодержащего сукцинилированного казеина.
Пример 4
Этот пример иллюстрирует предпочтительный вариант осуществления, объединяющий синтез в концентрированных условиях и частично непрерывную обработку.
3
600 г казеина суспендируют в 4050 г воды при температуре 20°С. рН доводят до 8 добавлением 46 мл 30%-ного раствора NaOH в течение 40 мин. Добавляют 100 г янтарного ангидрида в четыре приема в течение 20 мин. В это время рН поддерживают равным 8 добавлением 124 мл 30%-ного раствора NaOH. Полученный раствор перемешивают в течение 30 мин, поддерживая рН равным 8. Сукцинилированный казеин осаждают посредством доведения рН до 3,8 с помощью 280 мл 20%-ного раствора HCl. В течение 10 мин добавляют 286 г раствора FeCl (12%-ный), поддерживая рН равным 3,8 посредством добавления 170 мл 30%-ного раствора NaOH. Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 30 мин при рН 3,8 и затем нагревают вплоть до 50°С за 25 мин. рН доводят до 9 добавлением 215 мл 30%-ного раствора NaOH. Раствор перемешивают в течение 1 часа при 50°С и рН 9.
Для непрерывной обработки половину реакционного раствора разбавляют водой при 50°С в объемном соотношении 1:4 (реакционный раствор:вода) в статическом трубчатом смесителе. Жидкости переносят с помощью перистальтических насосов, получая в статическом трубчатом смесителе поток объединенных жидкостей 3,0-3,5 л/мин. Из статического трубчатого смесителя разбавленный раствор непосредственно переносят в аппарат для фильтрования и фильтруют. Отфильтрованный раствор непосредственно переносят во второй статический трубчатый смеситель и осаждают соразмерным добавлением 280 мл 20%-ного HCl, поддерживая рН потока суспензии продукта на уровне 3,2-3,8. Поток суспензии продукта направляют непосредственно в аппарат для фильтрования и фильтруют. Продукт промывают 2 л воды и затем сушат в течение 48 часов при 75°С и давлении 125 мбар в вакуумной сушке. Получают 257 г железосодержащего сукцинилированного казеина.
Пример 5
3
100 г казеина суспендируют в 500 г воды при температуре 20°С. рН доводят до 8 добавлением 8,3 мл 30%-ного раствора NaOH в течение 40 мин. Добавляют 16,7 г янтарного ангидрида в четыре приема в течение 20 мин. В это время рН поддерживают равным 8 добавлением 25,3 мл 30%-ного раствора NaOH. Полученный раствор перемешивают в течение 30 мин, поддерживая рН равным 8 посредством добавления 1,9 мл 30%-ного раствора NaOH. Сукцинилированный казеин осаждают посредством доведения рН до 3,8 с помощью 49,8 мл 20%-ного раствора HCl. В течение 10 мин добавляют 47,7 г раствора FeCl (12%-ный), поддерживая рН равным 3,8 посредством добавления 28,6 мл 30%-ного раствора NaOH. Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 30 минут при рН 3,8 и затем нагревают вплоть до 30°С за 30 мин. рН доводят до 9 добавлением 32,8 мл 30%-ного раствора NaOH. Раствор перемешивают в течение 1 часа при 30°С и рН 9. Раствор разбавляют водой (комнатной температуры) в объемном соотношении 1:6 (реакционный раствор:вода) и перемешивают в течение 5 мин. После фильтрования продукт осаждают добавлением 43,8 мл 20%-ного раствора HCl до тех пор, пока не будет достигнуто рН 3,6. Продукт отфильтровывают, промывают 0,8 л воды и затем сушат в течение 20 час при 75°С и давлении 125 мбар в вакуумной сушке. Получают 78 г железосодержащего сукцинилированного казеина.
В следующей таблице показаны результаты анализа для материалов, синтезированных в примерах 1-5. Для сравнения приведены данные анализа для продукта, описанного в ЕР 0939083.
Результаты анализа (примеры 1-5)
Данные анализа
Продукт по ЕР0939083
Пример 1*
Пример 2
Пример 3
Пример 4
Пример 5
Общее содержание железа
5,4%
5,2%
5,1%
5,4
5,1%
5,2%
Содержание хлоридов
1,6%
0,5%
0,4%
1,1%
1,0%
0,3%
Содержание протеинов
76,5%
78,7%
80,0%
79,5%
78,5%
77,5
Содержание свободной янтарной кислоты
0,9%
0,2%
0,6%
0,5
0,6%
0,3%
Общее содержание янтарной кислоты
8,0%
8,8%
8,3%
7,6
9,0%
8,0%
рН водной суспензии
2,7
3,1
3,1
3,0
3,2
3,3
* Содержание метил пара-гидроксибензоата = 1,0%, пропил пара-гидроксибензоата = 0,45%.
ИК-спектры (в KBr) материалов, полученных в примерах от 1 до 5, подтверждают структуру железосодержащего сукцинилированного казеина.