о
Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека при температуре минус 80С
METHOD FOR HUMAN NUCLEATED BLOOD CELLS CRYOPRESERVATION AT TEMPERATURE OF MINUS 80°C

Изобретение относится к области криобиологии и медицине, а именно, к технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток крови (ЯКК) человека с криопротектором диметилсульфоксид (ДМСО) и может быть использовано при ауто- и аллотрансплантации. Сущность способа: в условиях гипотермии +4°С криопротектор ДМСО смешивают с 6% декстраном (полиглюкин) до получения 10% концентрации, добавляют к концентрату ЯКК в равных объемах, фасуют в пластиковую тару, помещают в программный замораживатель, охлаждают на первом этапе от стартовой температуры +22°С со скоростью 1,2-2,0°С/мин до точки эвтектики -4,1°С, выполняют холодовую остановку в течение 5 мин, на втором этапе образец охлаждают со скоростью 10°С в 1 минуту от -4,1°С до температуры -80°С, после чего переносят в биохранилище, сохраняют в замороженном виде до 2 лет, оттаивают в водяной ванне при +37°÷+39°С при интенсивном покачивании в течение 35-50 с и незамедлительно используют по целевому назначению. Технический результат: способ позволяет максимально сохранить жизнеспособность криоконсервированных ядросодержащих клеток крови человека и может успешно применяться в программах комплексной терапии многих тяжелых заболеваний, включая онкогематологические.
В настоящее время оптимизация криоконсервирования ЯКК путем модификации рецептур криоконсервантов не обеспечивает достаточного увеличения морфологической и функциональной сохранности размороженных биологических объектов. Повысить количественную и качественную сохранность ЯКК позволяют не только криопротекторы, но и усовершенствование программ криоконсервирования биоматериала [Костяев А.А. Низкотемпературное консервирование гемопоэтических стволовых клеток при -80°С в режиме быстрого двухступенчатого замораживания (экспериментальное исследование). Автореф… дисс. докт. мед. наук.- СПб, 2003. - 35 с., Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - 80 с. (Коми научный центр УрО РАН), Полежаева Т.В. Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов. Автореф… дисс. докт. биол. наук.- СПб. - 2013. - 38 с.].
К перспективам усовершенствования программ замораживания (ПЗ) донорских ЯКК следует отнести введение дополнительных этапов ПЗ с определенными для каждого из них скоростями охлаждения клеточных суспензий и варьирование темпами замораживания биологических образцов на каждом из этапов с помощью программного замораживателя клеточных суспензий.
А
В технологии консервирования ЯКК человека известны способы их криоконсервирования, например, см. патент РФ на изобретение №2195111, МПК A01N 1/02, дата публикации патента 27.12.2002. Способ криоконсервирования клеточных суспензий. В нем использован экспоненциальный двухступенчатый режим замораживания, повышающий сохранность и устойчивость суспензий донорских ядросодержащих клеток крови: на первом этапе суспензию ядросодержащих клеток на холоде смешивают 1:1 с 10% раствором ДМСО, расфасовывают в эластичную полимерную упаковку до заполнения на 10-33%, помещают в морозильную камеру с раствором этилового спирта 38-40 об. % и температурой холодовой адаптации (Т) от -22° до -25°С, выдерживают в хладагенте 22-24 мин, после чего на втором этапе упаковку с ЯКК помещают в морозильник и замораживают до -80°С на срок до 2,5 лет.
Исследованиями термограмм установлено, что в течение 2-4 мин первого этапа происходит охлаждение суспензии ЯКК до -2°÷-9°С, которые реагируют выбросом тепла на 4-5 мин. В последующие 22-24 мин низкотемпературного консервирования клеток идут процессы кристаллизации биообъекта, его переохлаждения, холодовой термодинамической стабилизации и на втором этапе - замораживания суспензии ЯКК.
Недостатком такого решения способа криоконсервирования ЯКК являются: способ не отработан для промышленного производства, обладает низким уровнем технологичности, использование этилового спирта оказывает высокое токсическое воздействие на организм персонала, является профессиональной и бытовой вредностью, в программе низкотемпературного консервирования биообъекта не предусмотрен обход точки кристаллизации клеточной суспензии, что приводит к снижению сохранности криоконсервированных ЯКК.
Наиболее близким к заявляемому по признакам является способ, описанный в статье авторов: Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Селиванов Е.А. «Наш опыт по заготовке, тестированию и хранению гемопэтических клеток пуповинной крови», журнал «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия №1[3], 2006. - С. 63-65. Клеточную взвесь смешивали с 10% ДМСО в конечной концентрации и аутологичной сывороткой, замораживали по линейной программе от +22°С до -80°С-1°С/мин. Температура начала кристаллизации отмечалась от -5,3°С до -13,2°С. Выброс латентного тепла (фаза кристаллизации) длился в течение 23''-2'40''. Витальность криоконсервированных ЯК пуповинной крови составляла 76,7±17,4%. Сохранность ЯКК - 88,7±14,1%.
Недостатками прототипа являются: высокая трудоемкость, а также проявление критической кристаллизации извне и изнутри замораживаемого биообъекта, приводящей к снижению сохранности ЯКК.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека, лишенного указанных недостатков и обеспечивающего высокую сохранность ядросодержащих клеток.
Технический результат достигается путем изменения программы замораживания суспензии ЯКК, включающей охлаждение объекта на первом этапе - от стартовой температуры +22°С до точки эвтектики -4,1°С со скоростью 1,2-2,0°С/мин, выполнение холодовой остановки на 5 мин, на втором этапе - от -4,1°С до температуры -80°С со скоростью 10°С/мин, перемещение ЯКК в электроморозильник с температурой минус 80°С и сохранение биообъекта до срока трансплантации.
Практически способ осуществляют следующим образом.
Экспериментальные исследования выполнены на базе отделения трансфузиологии и процессинга ГСК и лаборатории консервирования крови и тканей ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».
Пример выполнения
В условиях гипотермии +4°С криопротектор ДМСО смешивали с 6% декстраном (полиглюкин) до получения 10% концентрации, затем медленно (в течение 1-2 мин) добавляли в соотношении 1:1 к концентрату лейкоцитов (КЛ) объемом 17±2 мл, полученному методом цитафереза («Sorvall», США) из периферической крови доноров-добровольцев до получения 5% концентрации ДМСО, фасовали в пластиковые пробирки, герметизировали, маркировали, затем помещали в программный замораживатель KRYO (модель 360, производство фирмы «PLANER Plс», Великобритания). Замораживание осуществляли по двухэтапной программе: на первом этапе - от стартовой температуры +22°С до точки эвтектики -4,1°С со скоростью 1,2-2,0°С/мин, затем выполняли холодовую остановку в течение 5 мин, на втором этапе образец охлаждали от -4,1°С до температуры -80°С со скоростью 10°С в 1 мин, после чего переносили в биохранилище, где ЯКК сохраняли в замороженном виде до 2 лет. Размораживали биообъект в 20-литровой водяной ванне при температуре +37°÷+39°С при интенсивном покачивании в течение 35-50 с. Размороженные ЯКК незамедлительно использовали по целевому назначению.
По предложенному способу было заморожено 30 образцов КЛ. Исследованиями установлено, что сохранность лейкоцитов после замораживания-оттаивания оставалась на уровне 87,2-91,0%, а число жизнеспособных (эозинорезистентных) клеток в пределах 69,0-75,0% от исходного количества.
Технический результат: способ позволяет максимально сохранить жизнеспособность криоконсервированных ядросодержащих клеток крови человека, что гарантирует восстановление кроветворения реципиента при лечении тяжелых заболеваний крови, в том числе онкогематологических, и, в то же время, повышает технологичность этой медицинской технологии. Используемый ДМСО и полиглюкин (6% декстран) являются доступными для любого медицинского учреждения. Отказ от применения в технологии замораживания ЛК от этилового спирта является несомненным преимуществом на социальном и производственном уровне.
Таким образом, предлагаемый способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека, позволяющий максимально сохранить жизнеспособность ядросодержащих клеток, не требует этилового спирта и может применяться при многих тяжелых заболеваниях, включая онкогематологические.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека до температуры -80°С.
Использование простых приемов и доступного криогенного оборудования указывает на возможность промышленной применимости.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.