Экспериментальное изучение неспецифической сенсибилизации макроорганизма к туберкулину бактериями из родов Nokardia и Rhodococcus

УДК 616:579.61

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ МАКРООРГАНИЗМА К ТУБЕРКУЛИНУ БАКТЕРИЯМИ ИЗ РОДОВ NOKARDIA И RHODOCOCCUS

© 2G1G Нуратинов Р.А.

Прикаспийский Зональный научно-исследовательский

ветеринарный институт

Установлено, что в ответ на воздействие любого из использованных антигенов, Т- и В-системы иммунитета отвечают синтезом антител, способных вступать в реакцию с неспецифическим антигеном (микобактериальные антигены, туберкулин). В некоторых случаях определена статистически достоверная корреляция динамики бласттрансформации и специфического лизиса лимфоцитов в сравнении с контролем у животных, зараженных нокардиями иродококками при использовании в качестве специфического антигена ППД-туберкулина для млекопитающих. В сыворотках крови кроликов, зараженных нокардиями и родококками, выявлены комплементсвязывающие и гемагглютинирующие антитела к микобактериальным антигенам. У них же обнаружены кожные реакции к ППД-туберкулину для млекопитающих.

The author of the article revealed that as a response for the impact of any used antigen, T-and B-immunity system meet the synthesis of antibodies capable to react with non-specific antigen (mycobacterial antigens, tuberculin). In some cases he identified a statistically significant correlation dynamics blastgransformation and specific lysis of lymphocytes compared to control animals, infected with nocardiae and rodokokki when used PPD-tuberculin as a specific antigen for mammals. In the sera of rabbits infected with nocardiae and rodokokki revealed complement-adhesive and haemagglutinating antibodies to mycobacterial antigens. They also demonstrated skin reactions to PPD-tuberculin for mammals.

Ключевые слова: сенсибилизация, парааллергия, антиген, иммунитет, микобактерии, нокардии, родококки.

КвумогЛ*: sensitilization, рагааПвг^, antigen, тшппНу, тусоЪаШвпа, посат&ав, тодококЫ.

Специфическая реакция сенсибилизированного микобактериями макроорганизма к туберкулину лежит в основе аллергической диагностики туберкулеза у людей и животных. Данный метод, в частности, внутрикожная проба, является наиболее информативным в системе ранней диагностики туберкулеза. Однако специфичность внутрикожной пробы оказалась относительной, поскольку реакция на туберкулин проявляется при сенсибилизации макроорганизма не только микобактериями бычьего и человеческого видов, но и другими видами атипичных микобактерий (М. chelonei, М. faтcinogenes, М. \accae, М. kansasii, М. intтacellulaтe, М. scтofulaceum, М. smegmatis, М. М. paтatuЪeтculosis). Кроме того, значительная подверженность кожи воздействию различных факторов внешней среды (диссоциация кожи) еще больше усугубляет положение частым проявлением неспецифических реакций. Поэтому за последние 50 лет результаты внутрикожной пробы принимаются как ориентировочные при первичной постановке диагноза [1].

Явление парааллергии имеет глобальный характер и устойчивую тенденцию к распространению и в ветеринарной практике, о чем свидетельствуют данные литературы [6]. Исследования, проведенные в республиках Северного Кавказа и в Калмыкии, показали, что в среднем 2,4% животных благополучных по туберкулезу хозяйств реагируют на туберкулин [4]. Проблема приобрела особую значимость в связи с тем, что огромное количество животных, более 70% которых составляют коровы, оказываются безвинными жертвами, и цена наносимого ущерба становится колоссальной с точки зрения экономики.

Известно, что сенсибилизировать макроорганизм к туберкулину способны многие атипичные микобактерии, имеющие близкородственную антигенную структуру с патогенными видами. Однако также известно, что близкую антигенную структуру с микобактериями имеют еще другие группы микроорганизмов, но почти ничего неизвестно об их способности аллергизировать макроорганизм к туберкулину. В связи с этим была предпринята попытка изучения способности некоторых близкородственных микобактериям микроорганизмов сенсибилизировать организм опытных животных к туберкулину. Поводом послужили известные литературные данные о том, что нокардии, родококки имеют близкую антигенную структуру с микобактериями [4]. Они широко распространены во внешней среде и являются возбудителями нокардиоза, актиномицетомы, септического артрита, остеомиелита, пневмонии, родококкоза, мастита и эндометрита у человека и животных.

Сопоставительный анализ свойств перечисленных микроорганизмов показал близость не только антигенной структуры, но и ряда признаков ультраструктуры их клеток (наличие микрокапсул, множественное септирование клеток, деление клеток и т.д.). Разграничить роды микроорганизмов, синтезирующих миколовые кислоты, по морфологокультуральным признакам и кислотоустойчивости порой очень сложно. Так, родококков легко можно идентифицировать как М. &рр. (11); М. foтtuitum - возбудитель остеомиелита был переопределен как N. asteтoides, поскольку они сходны по морфологическим, культуральным свойствам и кислотоустойчивости.

Установлено близкое сходство биохимических и серологических свойств этих

микроорганизмов [12]. Многие штаммы нокардий и родококков имеют до 3-х преципитиногенов, общих с микобактериями [14], а коэффициент БАВ (0,72) M. phlei и родококков настолько высок, что их можно характеризовать как отдаленно родственные виды одного рода [13].

Наличие общего группоспецифического антигена у представителей родов Mycobacterium и Nocardia дает возможность объединить их в одну серологически гомогенную группу. Характерной особенностью этой группы бактерий считают уникальный химический состав и структуру молекулярных компонентов их клеточных стенок, представленных пептидогликаном, цепями жирных кислот и нейтральным полисахаридом - арабиногалактаном, являющимся группоспецифическим антигеном [2]. Боковые цепи арабиногалактана являются главными антигенными детерминантами полисахарида. Препараты полисахарида стенок микобактерий реагируют не только с сывороткой против клеточных стенок БЦЖ, но и стенок N.asteroides (15), что свидетельствует о существовании арабиногалактана в качестве общего антигенома не только микобактерий, но и нокардий.

Близкий химический состав клеток определяет и схожесть биологических свойств данных микроорганизмов. Нуклеотидный состав ДНК варьирует в пределах 62-74% гуанин-цитозина (ГЦ) [3, 7]. Липидный состав представлен пептидогликолипидами (воск Д), гликолипидами (моно-, димиколаты трегалозы и т.д.), сульфолипидами (туберкулостеариновая кислота), которые создают чрезвычайную гидрофобность клеточной стенке (содержат мезо-ДАПК, арабинозу и галактозу [9], корд-фактор, мико- и нокобактины). Считают, что патогенные свойства микобактерий, нокардий и родококков определяются корд-фактором, мико- и нокобактинами [8].

Таким образом, анализ данных литературы показывает, что нокардии и родококкоки имеют с микобактериями близкородственные морфологические, культуральные, биохимические, генетические, хемотаксономические и иммунологические свойства, по которым не всегда проводится идентификация в обычных лабораторных условиях и их легко переопределить и дать неправильное заключение.

Теоретически предполагалось, что, имея общие группоспецифические антигены с микобактериями, эти микроорганизмы, вероятно, способны сенсибилизировать макроорганизм к туберкулину. Определение такой взаимосвязи явилось целью настоящей работы.

Материалы и методы

В опыт взяли 56 кроликов. Для исключения спонтанного туберкулеза перед заражением всех животных исследовали аллергической туберкулиновой пробой на ушах.

Исходные данные определения иммунного состояния организма кроликов получили исследованием проб крови в реакции розеткообразования (РОК), в реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ), в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), в реакции специфического лизиса лимфоцитов (РСЛЛ). В качестве специфического мутагена в РТМЛ, РБТЛ и РОК использовали ППД-туберкулин для млекопитающих, а неспецифического - фитогемагглютинин (ФГА).

Пробы сывороток крови исследовали в реакции связывания комплемента с комплексным туберкулезным антигеном (КТА) УНИИЭВ и с фенольным антигеном Сиб. НИВИ. Эти исследования провели в 3-кратной повторности (через каждые 30 дней) после заражения кроликов в течение срока наблюдения (90 дней). Для заражения кроликов использовали:М. БЦЖ, М. avium, М. scrofulaceum; музейные культуры R. bronchialis - ИВМ

Ас 377; N. asteтoides (ВКМ Ас 1077); полевые изоляты N. asteтoides, N. tтansvalensis, N. Ътasiliensis, Я. eтythтopolis, Я Ътonchialis.

Каждой культурой заражали по 4 кролика введением подкожно в области брюшка 10 мг влажной культуры во взвеси в физиологическом растворе. В контрольной группе находилось 16 кроликов. В конце срока наблюдения произвели тотальное обескровливание кроликов, вскрытие, патологоанатомический осмотр внутренних органов, а также взятие проб для бактериологического исследования.

Результаты исследования

Изучение в динамике относительного содержания Т- и В-розеткообразую-щих клеток показало, что в ответ на воздействие любого из использованных антигенов организм зараженных кроликов отвечает повышением продукции данных клеток по сравнению с исходными и в контрольной группе показателями (табл. 1).

Исключение в этом отношении составляли показатели в группе зараженных микобактериями: где первоначально обнаружено снижение количества Т-клеток и повышение продукции В-лимфоцитов. В остальных группах установили незначительное, динамичное увеличение Т- и В-лимфоцитов через 60 дней и выравнивание показателей с исходными и контрольными через 90 дней после заражения.

В РБТЛ у 75,0% животных, зараженных микобактериями, было обнаружено повышение бластообразования в сравнении с контролем. Результаты реакции в группах, зараженных нокардиями и родококками, колебались в незначительных пределах (от 1,75 до 5,91%), тогда как в группах, зараженных микобактериями, процент образования бластов достигал 17,4 (Р<0,05). Положительные результаты РБТЛ на туберкулин со статистически достоверной корреляцией выраженности показателей в сравнении с контролем (Р<0,05) обнаружены у кроликов, зараженных полевыми изолятами N. asteтoides и Я ЬттМа^. Такая корреляция сохранялась до 60 дней в группах, зараженных музейной культурой N. asteтoidеs и полевым изолятом, тогда как в группах, зараженных микобактериями, оставалась до конца наблюдений. В то же время у животных, давших даже отрицательный результат на туберкулин, отмечалась резко положительная реакция на ФГА (до 80%), что указывает на высокую неспецифическую реактивность лимфоцитов у подопытных животных.

Таблица 1

Содержание Т- и В-лимфоцитов в периферической крови кроликов через 30, 60 и 90 дней после заражения

Срок исследования (в сутках) Вид культуры, использованной для зараж

М. БЦЖ М. ауїшіі (м) М. всгоМасешш (м) Я. eqшi (м) БгопсИі-А1ів (м) Я. Біоіісііаіів (п. и.) К.егк (п

Исходные: Т-л В-л 28,0±4,5 42,5±5,9 25,6±3,2 52,3±4,3 30,0±4,5 55,4±5,0 26,2±4,5 49,1±4,7 20,3±3,1 59,1±4,1 24,3±2,8 54,5±3,9 20,0±2,1 51,3±3,4 22.4 44.5

Через 30 суток после заражения Т-л В-л 17,8±3,4 89,3±3,2 16,6±2,4 90,8±5,5 23,8±4,6 72,9±4,8 27,2±2,5 38,6±3,2 27,6±3,1 63,1±5,5 24,4±2,9 56,6±5,3 27,3±З,0 60,0±5,0 24,3 58,6

Через 60 суток после заражения Т-л В-л 27,6±2,6 95,6±6,2 82 33 н- н-05 22,4±1,8 49,6±4,8 29,1±2,9 45,6±4,1 27,5±2,9 56,2±4,7 29,7±2,8 60,2±5,9 52 54 н- н-42 25,1 59,0

Через 90 суток после заражения Т-л В-л 27,2±2,5 78,5±7,0 29,0±1,2 69,0±3,4 25,2±0,9 55,6±2,3 26,7±3,1 49,6±5,0 52 н- н-97 27,7±3,0 58,4±5,4 26,5±2,9 56,7±4,9 23.5 49.6

Примечание: м - музейный штамм; пи - полевой изолят

as

іс!

23

50

25

53

25

6<

24

51

Через 30 дней после заражения наблюдали повышение коэффициента лизиса лейкоцитов в РСЛЛ у животных всех групп в сравнении с таковым в контроле. У животных, зараженных нокардиями и родококками, данный показатель колебался в

пределах 8,0±0,94-12,3±1,56, у зараженных микобактериями - 11,4±1,9-15,4±1,2; у животных контрольной группы - 6,4±0,25. К 60 дню после заражения наблюдалось некоторое снижение коэффициента лизиса в группах, зараженных нокардиями и родококками (6,38±0,3-8,02±0,59), однако к 90 дню процент лизиса колебался в пределах 9,4±1,7-12,5±2,5. Наиболее высокий процент лизиса был отмечен у животных, зараженных М. БЦЖ - 11,4±2,0-20,5±3,1).

Показатели РТМЛ колебались в значительных пределах как по вертикали (в различных группах), так и по горизонтали (в различные сроки исследования одних и тех же групп). Если принять во внимание, что у здоровых животных процент миграции колеблется в пределах 50-100 (по данной методике), то торможение миграции наблюдалось у животных всех групп, кроме контрольных, но в разные сроки после заражения. Строгой динамики или корреляции торможения миграции по сравнению с контролем, кроме как у животных, зараженных микобактериями, не обнаружено.

В качестве оценки состояния гуморального иммунитета были использованы РСК с антигеном (АГ) УНИИЭВ и антигеном Сиб. НИВИ, РНГА с полисахаридными эритроцитарными диагностикумами, полученными лабораторным путем. Следует отметить, что наиболее высокие титры антител (АТ) в этих реакциях были обнаружены у кроликов, зараженных микобактериями (от 1/10 до 1/60 в РСК и от 1/16 до 1/256 в РНГА). Что касается других групп животных, то невысокие титры комплементсвязывающих антител (1/10-1/40) обнаруживали в пробах сыворотки крови практически у всех животных в РСК с антигеном УНИИЭВ и в несколько меньшем количестве - в титрах, не превышающих 1\20 в РСК с антигеном Сиб. НИВИ.

Как показывают результаты этих исследований, в сыворотках крови кроликов, зараженных нокардиями, родококками и выделенными нами культурами, обнаруживаются как комплементсвязывающие, так и гемагглютинирующие антитела к гетерологическому заражению антигеном. Сенсибилизирующие к туберкулину свойства использованных для заражения культур изучали на тех же кроликах постановкой туберкулиновой пробы на ушах. Результаты этих исследований приведены в таблице 2.

Таблица 2

Динамика проявления аллергических реакций на туберкулин у экспериментально зараженных микобактериями нокардиями и родококками кроликов

Вид культуры заражения Интенсивность реакций на туберкулин (мм) через...

30 дней 60 дней 90 дней

М. БЦЖ 170J±H4 193^7^5 215

М. avium 114^9^7 345"0

М. scrofulaceum 157^5^4 65"0

R. equi (м) 150^9^

R. bronchialis (м) 96^15^

R. bronchialis

R. erythropolis

N. asteroids

N. asteroids (п.и.) 152^13^ 89^23^

N. transvalensis 93"4±9"6

Контроль - - -

Примечание: интенсивность реакций менее 50 мм в таблице указана знаком «-», (м) -музейный штамм, (п.и.) - полевой изолят

Реакции на туберкулин характеризовались гиперемией и припухлостью участка кожи ушной раковины в месте введения туберкулина. При оценке реакции в учет брали животных с интенсивностью 50 и более мм2. Как показывают результаты этих исследований, у кроликов, зараженных микобактериями, реакции сохранялись до конца срока наблюдения. В остальных группах кролики реагировали при первом исследовании, и только отдельные животные при исследовании через 60 дней после заражения. Через 90 дней на туберкулин реагировал только один кролик, зараженный К ЬгопсЫаНв (п.и). Кролики контрольной группы и зараженные К егуЛгороНБ не реагировали на туберкулин.

Таким образом, в опыте на экспериментально зараженных кроликах было установлено, что нокардии и родококки способны сенсибилизировать макроорганизм к туберкулину. Реакции на туберкулин обнаруживали у животных, зараженных как музейными штаммами культур, так и полевыми изолятами.

В конце срока наблюдения произвели декапитацию всех кроликов и патологоанатомический осмотр внутренних органов. При этом у всех кроликов (за

исключением зараженных R. erythropolis, N. transvalensis и контрольных) вместо инокуляции культур обнаружили плотные узелочки с гнойным содержимым различной величины: с семя фасоли и до грецкого ореха. Наблюдалась гиперплазия паховых лимфоузлов. У кроликов, зараженных N.asteroidеs, поверхность легких была усеяна мелкими (с просяное зерно) узелочками, кишечник местами воспален.

Следует отметить, что у всех кроликов с обнаруженными патологоанатомическими изменениями при жизни были зарегистрированы реакции на туберкулин. При бактериологическом исследовании биоматериалов, взятых от убитых кроликов, удалось выделить исходные культуры.

Заключение

Анализируя результаты исследований, следует отметить, что, подобно известным утверждениям о проявлении парааллергических реакций на РРД-туберкулин для млекопитающих у инфицированных атипичными видами микобактерий животных, были обнаружены аналогичные реакции у кроликов, зараженных нокардиями и родококками. Поэтому для правильной постановки диагноза и определения истинной природы туберкулиновых реакций, при бактериологических исследованиях следует дифференцировать выделенные культуры хотя бы до рода.

Примечания

1. Авербах М. М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза. М. : Медицина, 1976. 312

с. 2. Варбанец Л. Д. Структура и биологическая роль полисахаридов Mycobacterium,

Corynebacterium, Nocardia // Микробиологический журнал. 1988. Т. 50. № 5. С. 98. 3. Нестеренко О. А., Леванова Г. Ф., Панченко Л. П. Нуклеотидный состав и гомология ДНК видов рода родококков // Микробиологический журнал. 1982. Т. 44. № 4. С. 11-13. 4. Нестеренко О. А., Квасников Е. И., Ногина Т. М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев : Наукова думка, 1985. 334 с. 5. Нуратинов Р. А. Туберкулез крупного рогатого скота в республиках Северного Кавказа и Калмыкии (эпизоотология, проблемы дифференциальной диагностики и меры борьбы). Автореф. дис. ... д-ра вет. наук. М., 1998. 360 с. 6. Ткаченко А. А. Парааллергические реакции на туберкулин // Ветеринария. 1985. №

4. С. 29. 7. Baess J., Mansa B. Determinasion of genom size and base ratio on deoxyribonucleic asid from Mycobacteria // Acta patol et microbiol. scand B. 1978. V. 86. № 5. P. 309-312. 8. Beatman B. L., Bourgeois A. L., Moring S. E. Cell wall modification resulting from in vitro induction of L-phase variants of Nocardia asteroides // J. Bacteriol, 1981. 148. № 2. P. 600-609. 9. Collins M. D., Jones D. Distribution of isoprenoid guinone structural types in bacteria and their taxonomic implications // Microbiol. Rev. 1981. V. 45. № 2. P. 316-354. 1o. Cummins C. S., Harris H. The chemical composition of the cell wall in some grampositive bacteria and its possible value as a taxonomic character // L. Gen. Microbiol. 1956. V. 14. № 3. P. 583-600. 11. Dogen de Long L. E. Uber protaminofage bacterien // L. Bacteriol. Parasitenk, Infektionskrankt und . Hyg. Abt. 1927. V. 71. № 8/14. P. 193-232. 12. Harrington B. I. F. numerical taxonomical study of some corynebacteria and related organisms // L. Gen. Microbiol. 1966. V. 45. № 1. P. 31. 13. Stackebrandt E., Seiler H., Schleifer K. N. Union of the genera Cellulomonas bergey et al and Oerskova Prauser et al in a redefined genus cellulomonas // G. Bacteriol. Parasitenk. Infectionckrankh und Hyg. 1982. V. 3. № 3. P. 401-409. 14. Ling A., Ridell M. Serological relationships between Nocardia, Mycobacterium and the "Rodococcus" taxon // Jn: The biology of the nocardiae. London etc: Acad, press. 1976. P. 220235. 15. Misaki A., Seto N., Asuma J. Structure and immunological properties of D-arabino - D-

••• Известия ДГПУ, №1, 2010 galactans isolated from cell walls of Mycobacterium species // J. Biochem. 1974. V. 76. P. 15-27.

Статья поступила в редакцию 23.02.2010 г.

••• Известия ДГПУ" №°1 2010

••• Известия ДГПУ" №°1 2010

••• Известия ДГПУ" №°1 2010