Способ получения препарата для лечения эндометрита у коров
METHOD OF PRODUCTION OF A PREPARATION FOR TREATMENT OF BOVINE ENDOMETRITIS

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения эндометрита у коров.
Эндометрит у коров - это заболевание послеродового периода, вызванное контаминацией родополовых путей самки условно-патогенной микрофлорой.
Для лечения эндометритов широко применяются этиотропные средства на основе антибиотиков, сульфаниламидов, производных нитрофуранов, которые, обладают антибактериальным действием. В ветеринарной гинекологии для внутриматочного применения применяют следующие лекарственные формы: твердые в виде таблеток, суппозиториев и палочек и жидкие в виде растворов и суспензий [Полянцев Н.И. Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных / Н.И. Полянцев, В.В. Подберезный. - Ростов-на-Дону: «Феникс», 2001. - С. 338-339].
Недостатками твердых лекарственных форм являются: узкий спектр антимикробного действия, длительность применения, высокая стоимость и невозможность их введения на протяжении всего курса лечения животного с эндометритом вследствие сужения цервикального канала, соединяющего влагалище с полостью матки.
Известен способ получения препарата Карбахтиол для стимуляции родовой деятельности, профилактики и лечения задержания последа и послеродовых эндометритов у коров, который получают следующим образом: в 700 мл дистиллированной воды растворяют глюкозу, фенол и карбахолин. После полного растворения этих компонентов в раствор вводят ихтиол, заливают водой до объема 1000 мл и тщательно перемешивают, фильтруют через 3 слоя марли или полотенчатую ткань. Карбахтиол расфасовывают по 100, 200, 500 мл в хорошо промытые флаконы, которые плотно закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. Флаконы с препаратом стерилизуют двукратным прогреванием в водяной бане в течение 1 часа через 48 час до 80 градусов С (Патент РФ 2251424, кл. A61K, А61Р, 2005).
Недостатком полученного известным способом препарата является наличие у него только миотонического действия по типу неспецифической терапии на гладкую мускулатуру матки, и отсутствия при этом антибактериального действия.
Известен способ получения препарата для лечения послеродовых эндометритов у коров в виде суппозиториев, содержащих корень солодки и лозеваль, а также вспомогательное вещество - воду, корень солодки измельчают, расчетные количества солодки и лозеваля и воды тщательно смешивают до однородного состояния. Суппозитории формуют известными методами с таким расчетом, чтобы масса одного суппозитория составляла 9-10 г, подсушивают на открытом воздухе. Каждый суппозиторий содержит, г: Корень солодки 5,9-6,1; Лозеваль 2,9-3,0; Вода 1,0-1 (Патент РФ 2251418, кл. A61K, А61Р, 2005).
Недостатком полученного известным способом препарата является форма выпуска в виде суппозиториев, которые невозможно применять через неделю после отела вследствие сужения цервикального канала.
Известен способ получения препарата для лечения эндометритов у коров в форме суппозиториев  - "Глицеррицид", содержащий тилан (тилозин), фуразолидон, корень солодки, экстракт пижмы и глицерин. Активнодействующие вещества измельчают, расчетные количества взвешивают, смешивают, добавляют расчетное количество глицерина, тщательно перемешивают массу до однородного состояния. Суппозитории формуют известными методами с расчетом, чтобы масса одного суппозитория составляла 9-10 г, и подсушивают на открытом воздухе до постоянной массы. Каждый суппозиторий содержит, г: тилан - 0,5 - 0,8; норсульфазол - 0,5 - 0,8; фуразолидон - 0,5 - 0,8; корень солодки - 4,0 - 4,5; экстракт пижмы - 1,0 - 1,5; глицерин - 3,5 - 4,0 (Патент РФ 2170086. кл. A61K, А61Р, 2001).
Недостатком полученного известным способом препарата является невозможность введения суппозиториев на протяжении всего курса лечения животного с эндометритом вследствие сужения цервикального канала, соединяющего влагалище с полостью матки, а также применение одновременно трех антимикробных компонентов, что может привести к выработке множественной резистентности микроорганизмов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятое авторами за прототип является техническое решение, в котором получают средство для лечения и профилактики эндометрита у животных, обладающее противовоспалительным и антибактериальным действием и состоящее из метронидазола 4,0; ципрофлоксацина 2,0 и доксициклина 1,0; тавегила 2,5; новокаина 5,0; дистиллированной воды - остальное. Новокаин в количестве 5,0 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, затем берут по 250 мл раствора новокаина и растворяют в нем ниже следующие препараты: метронидазол в количестве 4,0 г, предварительно растертый в ступке, растворяют в 250 мл раствора новокаина; ципрофлоксацин в количестве 2,0 г, предварительно растертый в ступке, растворяют в 250 мл раствора новокаина; доксициклин в количестве 1,0 г, предварительно растертый в ступке, растворяют в 250 мл раствора новокаина; тавегил в количестве 2,5 г, предварительно растертый в ступке, растворяют в 250 мл раствора новокаина, затем все компоненты соединяют и получают 1 литр средства для лечения и профилактики эндометрита у животных (Патент РФ 2537146, кл. A61K, А61Р, 2014).
Недостатком полученного известным способом препарата является применение нескольких антимикробных компонентов, что может привести к выработке множественной резистентности микроорганизмов.
Техническим результатом является получение препарата для лечения эндометрита у коров, обладающего противовоспалительным, антибактериальным и регенеративным действиями и имеющим удобную форму применения.
Технический результат достигается тем, что в способе получения препарата для лечения эндометритов у коров, включающем растворение в дистиллированной воде ципрофлоксацина, согласно изобретению используют отвар корня солодки, приготовленный на дистиллированной воде, который процеживают, охлаждают и при температуре не более 30°С и в нем растворяют ципрофлоксацин и фенол при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Ципрофлоксацин
0,2-0,3
корень солодки
1-2
фенол
0,1
дистиллированная вода
остальное
Сущность изобретения поясняется чертежом, на фиг. 1 представлен график зависимости антимикробной активности препарата к некоторым представителям микрофлоры, вызывающей эндометрит; на фиг. 2 – фото, на котором изображена рана после первых суток использования средства; на фиг. 3 - фото - та же рана, после трое суток лечения.
Новизна заявленного технического решения заключается в том, что способ получения препарата позволяет повысить процент выздоровления животных с острыми послеродовыми эндометритами, так как препарат обладает способностью стимулировать процесс регенерации тканей и высокой антимикробной активностью.
Корень солодки содержит набор биологически активных веществ: глицирризин, глюкозу, белковые, дубильные, эмульгирующие вещества. Корень солодки обладает смягчительным, обволакивающим и регенерирующим действием.
Ципрофлоксацин - синтетический антибактериальный препарат широкого спектра действия из группы фторхинолонов. Ципрофлоксацин нарушает синтез ДНК, рост и деление бактерий; вызывает выраженные морфологические изменения (в т.ч. клеточной стенки и мембран) и быструю гибель бактериальной клетки. Низкая токсичность для клеток макроорганизма объясняется отсутствием в них ДНК-гиразы. На фоне применения ципрофлоксацина не происходит параллельной выработки устойчивости к другим антибактериальным ЛС, не принадлежащим к группе ингибиторов ДНК-гиразы, что делает его высокоэффективным по отношению к бактериям, устойчивым, например к аминогликозидам, пенициллинам, цефалоспоринам, тетрациклинам.
Фенол - химическое вещество органического происхождения, принадлежит к группе ароматических углеводородов и в количестве 0,5-0,1% от объема препарата фенол используют для его консервирования.
Способ приготовления средства для лечения эндометрита у коров, заключается в следующем: готовят отвар из корня солодки: к 5 л дистиллированной воды добавляют 50 г корня солодки и кипятят 10 мин, затем процеживают и охлаждают до 30°С и добавляют 10 г ципрофлоксацина при постоянном перемешивании. Охлаждение отвара корня солодки обусловлено тем, что при температуре ниже 30°С происходит не полное растворение ципрофлоксацина, что влияет на эффективность действия препарата, а при более высокой температуре, наоборот эффективность ципрофлоксацина снижается из-за потери его свойств. При этом препарат изменяет цвет (кофе с молоком). Затем добавляют 5 г фенола для консервирования лекарственного средства. Содержание фенола в готовом препарате составляет 0,1%.
Рабочее название используемого препарата на основе отвара корня солодки с ципрофлоксацином для лечения эндометрита у коров - Фитафлокс (далее препарат Фитафлокс).
Полученный препарат Фитафлокс применяют внутриматочно в дозе 100 мл с помощью шприца Жане через день до выздоровления, но не более 7 введений с интервалом не более 48 часов.
Оценку острой токсичности проводили способом перорального введения препарата Фитафлокс подопытным животным (крысам) путем однократного внутрижелудочного введения с помощью шприца и зонда. Концентрация действующих веществ в 1 мл соответствовала прописи. Крысам первой группы препарат Фитафлокс вводили внутрижелудочно в дозе 8 мл. Крысы второй группы служили контролем, животным этой группы вводили 0,9% раствор натрия хлорида, в объеме тестируемого препарата вводимого животным.
Для определения субхронической токсичности были подобраны животные по принципу парных аналогов, которые содержались в идентичных условиях кормления и содержания. В опыте участвовало 20 половозрелых беспородных белых крыс массой 150-180 г. Крысам первой группы (n=10) испытуемый препарат Фитафлокс давался в свободном доступе вместо воды в течение 14 дней. Вторая группа животных (n=10) служила контролем. За животными вели пристальное наблюдение, учитывая их поведение, общее состояние и аппетит.
В результате определения острой токсичности токсических явлений и гибели у лабораторных животных за весь период наблюдения не отмечали.
При изучении субхронической токсичности также не наблюдалось каких-либо изменений в поведении, общем состоянии и аппетите. Животные вели себя так же, как и животные из второй контрольной группы. На протяжении всего срока эксперимента гибели животных не наблюдалось.
Изучение параметров массы тела и внутренних органов крыс при изучении субхронической токсичности показало, что многократное применение препарата per os отрицательно не влияло на показатели клинического гомеостаза организма крыс. На протяжении опыта при применении препарата в течение 14 дней и после 10-дневного восстановительного периода во всех подопытных группах не было отмечено гибели животных.
Статистического достоверного различия в привесах крыс опытной и контрольной группы не наблюдается.
Результаты изменений коэффициента массы внутренних органов крыс представлены в таблице 1.
Как следует из данных, представленных в таблице 1, введение per os тестируемого препарата в течение 14 дней белым крысам в изученных дозах не оказывает статистически достоверного влияния на показатели относительной массы внутренних органов на протяжении всего опыта.
При патологоанатомическом изучении внутренних органов крыс опытной группы каких-либо изменений в их структуре не наблюдалось.
Слизистая оболочка рта, носа и глаз блестящая, бледно-розового цвета. Кожа ушных раковин бледно-розового цвета. Кожные покровы эластичные, бледно-розовые. Подкожная клетчатка хорошо развита, бледно-розового цвета. Скелетные мышцы кровенаполнены, розового цвета, умеренной влажности, хорошо развиты. При вскрытии грудной и брюшной полостей расположение внутренних органов было анатомически правильным. Серозные оболочки полостей имели ярко-розовый цвет, гладкую и блестящую поверхность. Слизистая гортани бледно-розовая, складчатая, блестящая. Слизистая пищевода гладкая, блестящая, бледно-розовая. Слизистая оболочка желудка и кишечника серо-розового цвета без изъявлений и кровоизлияний. Печень не увеличена, блестящая. Капсула почки легко снималась, мозговое и корковое вещество хорошо различимо на разрезе.
Подчелюстные лимфоузлы бледно-розового цвета, гладкие, блестящие, упругой консистенции. Кольца трахеи белого цвета.
Сердце округлой формы, упругой консистенции. Миокард на разрезе ярко-красного цвета, умеренной плотности. Перикард и эпикард гладкие, блестящие. Клапаны сердца тонкие, гладкие, блестящие.
Просвет трахеи и бронхов свободен. Легкие обычной формы с поверхностью розовато-красного цвета, гладкие, блестящие, упругой консистенции. На разрезе выражена дольчатость, легочная ткань бледно-розового цвета.
Результаты исследований биохимических показателей крови опытных крыс отражены в таблице 2
В результате исследования сенсибилизирующего и раздражающего действия были получены следующие результаты: инсоляция препарата в нижний отдел конъюнктивального мешка не вызывает покраснения конъюнктивы после введения, не отмечалось помутнения роговицы глаза, радужная оболочка была без видимых изменений, также не отмечали хематоз (отек конъюнктивы) и выделений из глаз. Во второй серии опыта определяли раздражающее действие методом накожных аппликаций.
За сутки до проведения исследований выстригали шерсть на участках площадью примерно 10×15 см по обеим сторонам спины для аппликации и наблюдения.
Наносили 0,5 мл исследуемого препарата на кожу и фиксировали повязкой. Наблюдение за реакцией кожи осуществляют при естественном или близком к естественному искусственном освещении.
При однократном воздействии регистрировали состояние каждого участка кожи, где проводили аппликации, через 1, 24, 48 и 72 ч после удаления образцов.
В ходе исследования не отмечалось у подопытных животных образование эритемы и отека кожи, в результате чего индекс первичного раздражения равен нулю.
Изучение сенсибилизирующего действия препарата методом максимального сенсибилизирующего воздействия. Исследование проводили на морских свинках. За животными вели наблюдение, отмечая наличие на коже в области аппликаций препаратом отека, эритемы и др. Нами было отмечено, что спустя 24, 48 и 72 часа после провокационной пробы и снятия повязки положительных реакций кожи (отек, эритема, пузырь) не выявлено. Таким образом, препарат Фитафлокс не обладает раздражающим и сенсибилизирующим воздействием на ткани в зоне его применения.
Также нами были проведены опыты по определению ранозаживляющего действию препарата Фитафлокс.
Суть метода заключается в определении характера и скорости заживления раны путем регистрации темпов уменьшения площади раневой поверхности во времени.
Для проведения опыта использовались лабораторные кролики.
За сутки до проведения исследований выстригали шерсть на участках площадью примерно 10×15 см. Подготовленный участок обрабатывали 70° этиловым спиртом, проводили местную анестезию 2%-ным раствором новокаина, скальпелем наносили 2-3 линейных разреза по трафарету, веретенообразной формы, 40×15 мм и глубиной 1,5-20 мм. Расстояние между разрезами было не менее 5 см. Первый разрез (левый) обрабатывали опытным препаратом, второй - контрольным.
В результате проведенного опыта было установлено, что данный препарат обладает высоким регенеративным эффектом. В среднем площадь заживления раны составляла 20,4% в сутки (рис. 2-3).
В ходе проведения эмбриотоксического действия самкам белых крыс per os вводили исследуемый препарат Фитафлокс. Так как исследуемый препарат будет применяться внутриматочно коровам только в послеродовой период не более 5-7 раз, для оценки эмбриотоксичности его вводили с 3 по 6, с 9 по 12 и с 16 по 19 дни беременности в дозе 5 мл на 1 крысу (n=10) Контрольной группе (n=10) препараты не вводили. За состоянием и поведением беременных животных вели наблюдение в течение всего опыта. На 20 день беременности по 5 самок опытных и контрольной групп подвергали эвтаназии и проводили вскрытие. Подсчитывали количество желтых тел, живых и мертвых плодов.
В результате было установлено, что беременность у всех животных проходила без патологических изменений, что отражалось в поведении, потреблении корма и воды, а также состоянии волосяного покрова и слизистых оболочек. Динамика массы тела белых крыс, которым вводили опытный препарат и животных контрольной группы, была положительной и не имела достоверно значимых отличий.
Тестируемый препарат Фитафлокс в терапевтической дозе не оказывает влияния на плодовитость крыс.
Количество желтых тел и мест имплантаций на одну самку в среднем по группам практически не отличается. Не установлено достоверных различий по показателям пред- и постимплантационной гибели. Однако общая эмбриональная смертность у крыс опытных групп была несколько ниже, чем в группе контроля.
Наружный осмотр плодов под микроскопом не выявил наличия каких-либо аномалий или задержки развития плодов у подопытных животных. Размер и вес крысят опытных и контрольных групп не имели достоверных различий.
Таким образом, проведенные исследования на острую токсичность показали, что препарат Фитафлокс относится к IV классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76. Препарат Фитафлокс не обладает раздражающим, сенсибилизирующим и эмбриотоксическим действием.
Для доказательства эффективности способа получения препарата для лечения эндометрита у коров были проведены опыты в УОХ «Кубань» ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».
Отработка дозы препарата Фитафлокс проводилась на коровах больных острым гнойно-катаральным эндометритом. Для этого было создано 2 группы (n=20). Коровам первой группы препарат вводили внутриматочно в дозе 50 мл. Коровам второй группы препарат применяли в дозе 100 мл. Препарат применяли через день до получения терапевтического эффекта.
В результате были получены следующие данные. В первой группе терапевтический эффект составил 40%. Количество введения препарата составило 7 введений с интервалом не более 48 часов. 60% животных в дальнейшем были переведены на другую схему лечения.
Во второй группе терапевтический эффект составил 80% и количество введений препарата Фитафлокс - 5. Анализ течения заболевания показал, что после 2-3 введения препарата увеличивалась сократительная функция матки. При этом нами было отмечено, что увеличивалась экссудация и слизь изменяла свою консистенцию. Она становилась прозрачной и более тягучей. Однако только после 4-5 введения препарата матка сокращалась до небеременного состояния. Проведенные лабораторные исследования антимикробной активности препарата Фитафлокс указывают на то, что препарат по отношению к S. aureus, St. xylosus и Ps. aeruginosa обладает МБцК (минимальная бактерицидная концентрация) 7,8 мг, а к Е. coli и P. vulgaris 15,6 и 31,2 мг соответственно. При этом МБсК (минимальная бактериостатическая концентрация) тестируемого препарата по отношению к S. aureus и Е. coli, St. xylosus составляет 31,2 мг, а к P. vulgaris - 62,5 мг.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что разработанный препарат обладает высокой антимикробной активностью и широким спектром действия, что свидетельствует о целесообразности его применения для лечения послеродовых заболеваний у коров.
По проведенным исследованиям терапевтическая эффективность заявляемого препарата Фитафлокс составляет 85%, что на 15% выше, чем при применении аналогичного препарата. В качестве препарата-аналога использовали Эндометрамаг-К (https://www.vidal.ru/veterinar/endometramag-k-28159).
Исследования проводили на коровах голштинской породы в послеродовом периоде, заболевших острым послеродовым эндометритом. Коровы были разделены на 2 группы по принципу пар-аналогов по 20 голов в каждой группе. Коровам опытной группы применяли препарат фитафлокс, коровам контрольной группы - Эндометрамаг К.
Анализ течения заболевания показал, что после 2-3 введения препарата Фитафлокс увеличивалась сократительная функция матки. При этом нами было отмечено, что увеличивалась экссудация и слизь изменяла свою консистенцию. Она становилась прозрачной и более тягучей. Однако только после 4-5 введения препарата матка сокращалась до небеременного состояния. В результате проведенного лечения было установлено, что эффективность препарата Фитафлокс составила 85% (после курса лечения при 4-5-кратном применении фитафлокса выздоровление наступило у 17 коров), при этом эффективность Эндометрамага К составила 70% (выздоровление наступило у 14 коров) при этом среднее количество введений препарата составило 6-7. Коров, у которых после 7 введений препарата не наступило выздоровление, перевели на другой курс лечения, применяемый в хозяйстве.
Ввиду того, что действующим веществом является отвар корня солодки на дистиллированной воде с растворенным ципрофлоксацином, то в примерах приведено разное содержание корня солодки и ципрофлоксацина.
Пример 1
Для приготовления препарата соединили компоненты в следующем процентном соотношении: сделали отвар из корня солодки: к 5 л дистиллированной воды добавили 50 г корня солодки и кипятили 10 мин, затем остудили до 30°С и добавили 10 г ципрофлоксацина при постоянном перемешивании. При этом препарат изменил цвет (кофе с молоком). Затем добавили 5 г фенола для консервирования лекарственного препарата. Содержание фенола в готовом препарате составило 0,1%.
Определили раздражающее действие полученного препарата методом накожных аппликаций (ГОСТ 31926-2013 Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности). Полученный препарат применяли при лечении эндометрита у 20 коров за 5 дней выздоровело 17 коров, эффективность терапии составила 85,0%.
Пример 2
Для приготовления препарата соединили компоненты в следующем процентном соотношении: сделали отвар из корня солодки: к 5 л дистиллированной воды добавили 70 г корня солодки и кипятили 10 мин, затем остудили до 30°С и добавили 10 г ципрофлоксацина при постоянном перемешивании. При этом препарат изменил цвет (кофе с молоком). Затем добавили 5 г фенола для консервирования лекарственного препарата. Содержание фенола в готовом препарате составило 0,1%.
Определили раздражающее действие полученного препарата методом накожных аппликаций (ГОСТ 31926-2013 Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности). Полученный препарат применяли при лечении эндометрита у 14 коров за 5 дней выздоровело 12 коров, эффективность терапии составила 85,7%.
Пример 3
Для приготовления препарата соединили компоненты в следующем процентном соотношении: сделали отвар из корня солодки: к 5 л дистиллированной воды добавили 50 г корня солодки и кипятили 10 мин, затем остудили до 30°С и добавили 20 г ципрофлоксацина при постоянном перемешивании. При этом препарат изменил цвет (кофе с молоком). Затем добавили 5 г фенола для консервирования лекарственного препарата. Содержание фенола в готовом препарате составило 0,1%.
Определили раздражающее действие полученного препарата методом накожных аппликаций (ГОСТ 31926-2013 Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности). Полученный препарат применяли при лечении эндометрита у 14 коров, за 5 дней выздоровело 12 коров, эффективность терапии составила 85,7%.
Пример 4
Для приготовления препарата соединили компоненты в следующем процентном соотношении: сделали отвар из корня солодки: к 5 л дистиллированной воды добавили 20 г корня солодки и кипятили 10 мин, затем остудили до 30°С и добавили 10 г ципрофлоксацина при постоянном перемешивании. При этом препарат изменил цвет (кофе с молоком). Затем добавили 5 г фенола для консервирования лекарственного препарата. Содержание фенола в готовом препарате составило 0,1%.
Определили раздражающее действие полученного препарата методом накожных аппликаций (ГОСТ 31926-2013 Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности). Полученный препарат применяли при лечении эндометрита у 14 коров за 5 дней выздоровело 10 коров, эффективность терапии составила 71,4%.
Пример 5
Для приготовления препарата соединили компоненты в следующем процентном соотношении: сделали отвар из корня солодки: к 5 л дистиллированной воды добавили 50 г корня солодки и кипятили 10 мин, затем остудили до 30°С и добавили 5 г ципрофлоксацина при постоянном перемешивании. При этом препарат изменил цвет (кофе с молоком). Затем добавили 5 г фенола для консервирования лекарственного препарата. Содержание фенола в готовом препарате составило 0,1%.
Определили раздражающее действие полученного препарата методом накожных аппликаций (ГОСТ 31926-2013 Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности). Полученный препарат применяли при лечении эндометрита у 14 коров за 5 дней выздоровело 7 коров, эффективность терапии составила 50%.