NF-kB-, но не mapk-сигнальный путь определяет синергический ответ макрофагов на одновременную активацию двух типов рецепторов TLR4 + NOD2 или TLR9 + NOD2

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 612.017.1.112.95.084

Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И.

NF-KB-, НО НЕ МАРК-СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ ОПРЕДЕЛЯЕТ СИНЕРГИЧЕСКИЙ ОТВЕТ МАКРОФАГОВ НА ОДНОВРЕМЕННУЮ АКТИВАЦИЮ ДВУХ ТИПОВ РЕЦЕПТОРОВ TLR4 + NOD2 ИЛИ TLR9 + NOD2

ГНЦ «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, Москва, Россия

Клетки человека и животных имеют рецепторы для большинства классов веществ, входящих в состав бактерий, вирусов, грибов и других патогенов. Их объединяют общим понятием — клеточные рецепторы, распознающие молекулярные образы патогенов, или pattern recognition receptors (PRR). При вторжении инфекции на клетках хозяина срабатывает не один, а сразу несколько типов PRR. Известно, что при срабатывании двух или более типов рецепторов ответ клетки синергически усиливается по сравнению с ответом, индуцированным через один тип рецепторов. В настоящей работе исследована роль внутриклеточных сигнальных путей в обеспечении синергического ответа макрофагов на активацию парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. В частности, мы исследовали два сигнальных пути, которые приводят к активации протеинкиназы MAPK или транскрипционного фактора NF-kB. Мы установили, что воздействие на костномозговые макрофаги парными сочетаниями агонистов TLR4 + TLR9, TLR9 + NOD2 или TLR4 + NOD2 позволяет синергически увеличить продукцию мРНК гена TNFa, одного из ключевых цито-кинов, характерных для ответа макрофагов на инфекцию. Экспрессия гена TNFa в макрофагах находится под контролем транскрипционных факторов NF-kB и AP-1, которые активируются при срабатывании MyD88 ^ NF-kB и MAPK сигнальных путей соответственно. Исследование действия агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 и их парных сочетаний на активность NF-kB- и MAPK-сигнальных путей показало, что сочетание TLR9 + NOD2 пролонгирует, а сочетание TLR4 + NOD2 ускоряет накопление транскрипционно-активного NF-kB в макрофагах, не влияя при этом на уровень активности MAPK-сигнального пути. Следовательно, синергическая продукция цитокина TNFa при действии на макрофаги парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 происходит под влиянием NF-kB, но не MAPK-сигнального пути.

Ключевые слова: макрофаги; рецепторы, узнающие молекулярные образы патогенов; внутриклеточная сигнализация; NF-kB; MAP-киназа; Erk, цитокины. Для цитирования. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. NF-KB-, но не MAPK-сигнальный путь определяет синергический ответ макрофагов на одновременную активацию двух типов рецепторов TLR4 + NOD2 или TLR9 + NOD2. Иммунология. 2017; 38(2): 76-82. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-2-76-82

Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I.

NF-KB-, BUT NOT MAPK-SIGNALING PATHWAY DETERMINES SYNERGISTIC RESPONSE OF MACROPHAGES TO THE SIMULTANEOUS ACTIVATION OF TWO TYPES RECEPTORS TLR4 + NOD2 OR TLR9 + NOD2

National Research Center — Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115478, Moscow, Russia There are several types of receptors in human and animal cells, which can bind different classes of molecules belonging to pathogens (bacteria, viruses, fungi, etc.). Such receptors are called pattern recognition receptors (PRR). During infection host cells use all types of PRR to recognize pathogenic agents. It is known that cell response induced by one type of PRR differs from the response induced by two or more types of receptors. In the present work we investigated the role of key intracellular signaling pathways that determine synergistic response of macrophages to the paired combinations of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists. In particular, we examined two signaling pathways that lead to activation of MAPK protein kinase or transcription factor NF-kB. We found that the combinations of TLR4 + TLR9 or TLR9 + NOD2 or TLR4 + NOD2 agonists lead to 2-3-fold increase in the production of mRNA transcribed from the TNFa gene, one of the key cytokines mediating macrophage response to infection.

Expression of TNFa gene in macrophages is under the control of NF-kB and AP-1 transcription factors, which are activated by trigging MyD88-> NF-kB and MAPK signaling pathways, respectively. Our study of TLR4, NOD2, TLR9 agonists and their paired combinations on NF-kB- and MAPK—signaling pathways showed that TLR9 + NOD2 combination prolongs, and TLR4 + NOD2 one enhances accumulation of transcriptionally active NF-kB in primary macrophages. The same combinations of PRR-agonists do not affect the activity of MAPK-signaling pathway in these cells. Therefore, the synergistic TNFa cytokine production in macrophages activated by paired combinations of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists is determined by NF-kB-, but not MAPK-signaling pathway.

Keywords: macrophages, pattern recognition receptors, intracellular signaling, NF-kB, MAP-kinase, Erk, cytokines. For citation: Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. NF-kB-, but not MAPK-signaling pathway determines synergistic response of macrophages to the simultaneous activation of two types receptors TLR4 + NOD2 or TLR9 + NOD2. Immunologiya. 2017; 38

Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, д-р мед. наук, проф., руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com

ORIGINAL ARTICLE

For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head, Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The work was performed with financial support from grant RSF15-15-00102

Received 30.09.16 Accepted 03.11.16

введение

Рецепторы, узнающие молекулярные образы патогенов (pattern recognition receptors, PRR) объединяют семейства рецепторов на внешней и эндосомальной мембранах клетки, а также в цитозоле. В частности, Toll-подобные рецепторы (TLR) представлены на мембранах, а NOD- и RIG-подобные рецепторы — в цитозоле [1—3]. TLR — наиболее изученная группа PRR, к настоящему времени известно 10 различных TLR у человека. TLR1, 2, 4 и 5 встроены во внешнюю клеточную мембрану и участвуют в распознавании таких бактериальных компонентов, как липопротеин, липопептид, пептидогликан (TLR1, 2 и 6), липополисахарид (TLR4) и флагеллин (TLR5). Консенсусные структуры чужеродных нуклеиновых кислот dsRNA, ssRNA и CpG-DNA распознаются, соответственно, TLR3, TLR7/8 и TLR9, представленными в мембране внутриклеточных органелл эндосом и фагосом. Внутриклеточные рецепторы NOD1 и NOD2 распознают компоненты пептидо-гликана клеточной стенки бактерий — диаминопимелиновую кислоту и мурамилдипептид соответственно. RIG-I-подобные рецепторы RlG-I, MDA5 и LGP2 взаимодействуют с молекулами двуцепочечной вирусной РНК и служат сенсорами вирусной инфекции. Такая трехуровневая локализация PRR на внешней мембране, эндосоме и в цитозоле, обеспечивает эффективность детекции возбудителей инфекции.

В ответ на связывание соответствующих агонистов с PRR в клетках индуцируются сигнальные каскады. TLR-опосредованные сигнальные пути начинаются взаимодействием TIR-домена TLR-рецепторов со своими адаптерными молекулами. В зависимости от задействованных адаптерных молекул (MyD88 или TRIF) TLR-сигнальные пути подразделяют на MyD88- и TRIF-зависимые. MyD88^ra активируют все TLR, кроме TLR3. TLR3 использует в качестве адаптера TRIF, а TLR4 — оба адаптера (MyD88 и TRIF). MyD88-сигнальный путь начинается со взаимодействия MyD88 с протеинкиназами IRAK-4, IRAK-1, IRAK-2, которые, активируясь, фосфорилируют цитозольный адаптерный белок TRAF-6. Последний в свою очередь убиквитинилирует киназу TAK1, что приводит к фосфорилированию IKKaPy-комплекса и разрушению IkBa, ингибитора транскрипционного фактора NF-kB. NF-kB транслоцируется в ядро, где активирует подконтрольные ему гены. Кроме того, TAK1 передает сигнал на митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK) — p38, Erk1/2 и JNK, участвующие в активации транскрипционных факторов AP-1 и Elk-1. В случае TRIF-зависимого пути в результате связывания адаптерных молекул TRIF (TLR3, TLR4) и TRIP (TLR4) происходит активация IKK-подобной киназы TBK-1, TBK-1 фосфорилирует транскрипционные факторы семейства IRF, регулирующие транскрипцию генов интерферонов 1-го типа. NLR (NOD1 и NOD2), подобно TLR, через протеинкиназу TAK1 индуцируют NF-kB- и MAPK-сигнальные пути. RLR, наряду с TLR3, 7, 8 и 9, стимулируют транскрипционные факторы семейства IRF. Транскрипционные факторы, активированные через PRR-сигнальные пути, индуцируют экспрессию генов, кодирующих провоспалительные цитокины и противомикробные субстанции. Набор транскрипционных факторов, активируемых патогенами, определяет спектр функциональных белков клетки, производящихся в ответ на инфекцию.

При встрече клетки с возбудителем инфекции происходит одновременная активация самых разных клеточных PRR. Эксперименты по одновременной активации клеток сочетанием

двух PRR-агонистов демонстрируют индукцию усиленных защитных реакций врожденного иммунитета по сравнению с действием одиночных агонистов [4—8]. Ранее мы исследовали синергический ответ дендритных клеток и макрофагов на активацию агонистами TLR4, TLR9 и NOD2, а также их парными сочетаниями TLR4 + TLR9, TLR9 + NOD2 или TLR4 + NOD2 [9]. Активация клеток парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 приводит к синергической продукции интерфе-ронов 1-го типа, цитокинов TNFa, IL-6 и активных форм азота, обладающих противомикробной и противоопухолевой активностью. Усиленная продукция интерферонов, провоспалительных цитокинов и противомикробных субстанций играет критическую роль в надежной защите организма от инфекций [10—12], поэтому понимание механизмов синергического действия агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 может привести к разработке новых эффективных способов активации иммунной защиты.

В настоящей работе на примере активации макрофагов парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 мы исследовали возможные механизмы внутриклеточной сигнализации, от которых зависит синергический ответ клеток. Мы установили, что синергическая продукция цитокина TNFa при действии на макрофаги парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 опосредована активацией NF-kB-, но не MAPK-сигнального пути. В частности, сочетание TLR9 + NOD2 пролонгирует, а сочетание TLR4 + NOD2 ускоряет накопление в макрофагах транскрипционно-активного NF-kB, не влияя при этом на уровень активности MAPK-киназы Erk1/2.

Материал и методы

Реактивы и антитела. В работе использованы агонисты Toll-подобных рецепторов: липополисахарид из E. coli, серо-тип 055: B5 (LPS, агонист TLR4, Sigma, L-2880), иммуномакс (IMM, агонист TLR4, Иммафарма), ODN CpG-1826 (CpG, агонист TLR4, Invitrogen), L18-MDP (MDP, агонист NOD2-рецептора, Invitrogen).

В работе использованы моноклональные антитела к следующим белкам: Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (T202/204) (Cell signaling, 4370), Phospho-NF-кВ p65 (Ser536), (Cell signaling, 3033S), ß-актин (Cell signaling, 4967S).

Животные. Мышей линии BALB/c в возрасте 8—10 нед, полученных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной диете в стандартных условиях вивария Института иммунологии ФМБА России.

Культуры клеток. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM с 25 мМ HEPES, дополненной коктейлем заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/ мл гентамицина (все реактивы фирмы «ПанЭко») при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.

Костномозговые макрофаги получали in vitro дифференци-ровкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, Sigma). Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (Sigma) в течение 7 дней, как описано в литературе [13]. К окончанию этого срока адгезионная культура клеток была на 95% представлена макрофагами. Монослой адгезионных клеток

Иммунология. 2017; 38

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-76-82 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в

работе

Ген Праймер 5'—>3' последовательность

b-actin b-actin-F AGAGGGAAATCGTGCGTGAC

b-actin-R CAATAGTGATGACCTGGCCGT

b-actin-TP FAM-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-RTQ

tnfa TNF-F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA

TNF-RV TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC

TNF-TP FAM-CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGA-RTQ

промывали (PBS, 0,5% BSA), выдерживали в растворе Версена (ПанЭко) в течение 1 ч при 37°C и смывали (PBS, 0,5% BSA) тщательным пипетированием. Полученную культуру макрофа-гальных клеток использовали в дальнейших экспериментах.

ПЦР в реальном времени. Препараты тотальной РНК и кДНК получали с использованием наборов реагентов фирмы «Синтол» (РНК-экстран, набор реагентов для проведения ОТ соответственно), следуя инструкциям производителя. Препарат кДНК использовали в качестве матрицы для проведения количественного ПЦР в реальном времени. Нуклеотидные последовательности использованных в работе праймеров (Синтол) представлены в таблице. ПЦР осуществляли с помощью амплификатора с детекцией в режиме реального времени DT-Prime фирмы «ДНК-технология», используя смесь реактивов фирмы «Синтол». Относительный уровень экспрессии анализируемых генов вычисляли методом 2ACp, где ДСр = Cp (нормировочный ген)—Cp (ген интереса), в качестве нормировочного гена использовали ген р-актина.

Внутриклеточное окрашивание белков. Клетки фиксировали (BD CytofixTM — Fixation Buffer) в течение 10 мин при 37°C, отмывали (PBS, 0,5% BSA), после чего их пермеа-билизировали (BD Phosphoflow Perm Buff III, BD Bioscience, USA) в течение 30 мин при -20°C. Далее клетки промывали (PBS, 0,5% BSA) и окрашивали первичными антителами Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (T202/204) (Cell signalling, 4370), Phospho-NF-KB p65 (Ser536), (Cell signaling, 3033S) и вторичными anti-Rabbit-AF488 (Invitrogen). Флуоресценцию в полученных пробах измеряли на проточном цитофлуори-метре BD FACSAria II.

Статистическая обработка данных. Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Статистическую значимость различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверное отличие измеренного отклика от парного воздействия агонистов PRR (прирост относительно контрольного значения) от линейного суммирования прироста от двух лигандов рассчитывали по непараметрическому критерию Вилкоксона—Манна—Уитни [14].

Результаты и обсуждение

Экспрессия гена TNFa в костномозговых макрофагах при активации парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Активация макрофагов сочетаниями агонистов TLR4 + TLR9, TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2 синергически усиливает транскрипцию гена TNFa (рис. 1), что согласуется с результатами нашей предшествующей работы [9]. Данные, представленные на рис. 1, доказывают, что парные сочетания агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 позволяют индуцировать продукцию TNFa, в 2—3 раза более интенсивную, чем при воздействии теми же агонистами по отдельности. Наибольший эффект синергизма наблюдали при сочетании агонистов TLR4 + NOD2. Совместное применение двух агонистов TLR4 + NOD2 вызывало ответную продукцию TNFa в макрофагах, в 3 раза превышающую сумму ответов на одиночные агонисты TLR4 и NOD2. Воздействие на клетки агонистами TLR4 + TLR9 индуцировало наименьшее синергическое усиление продукции мРНК TNFa, превышающее сумму двух ответов на одиночные агонисты TLR4 и TLR9 в 1,4 раза. Воздействие на клетки агонистом NOD2 практически не стимулировало экспрессию гена TNFa, однако его сочетание с агонистами TLR4 или TLR9 приводило к усиленной транскрипции мРНК цитокина TNFa. Полученные результаты свидетельствуют о синергической кооперации PRR-сигнальных путей в клетке.

Экспрессия генов провоспалительных цитокинов и про-тивомикробных веществ в клетке находится под контролем транскрипционных факторов, которые активируются в ходе сигнальных каскадов, индуцируемых в ответ на связывание PRR со своим агонистом [2, 3]. PRR-агонисты индуцируют в клетке 2 основных сигнальных пути — NF-kB и MAPK, они и определяют профиль противомикробного ответа клетки

а

TLR4+NOD2

б

TLR9+NOD2

в

TLR9+TLR4

К NOD2 TLR4 TLR4+NOD2

12 10 8 6 4 2 0

TLR9 NOD2 TLR9+NOD2

25 20 15 10 5 0

TLR9 TLR4 TLR9+TLR4

Рис. 1. Продукция мРНК TNFa в ответ на активацию макрофагов агонистами TLR4, TLR9 и NOD2 и их парными сочетаниями.

Костномозговые макрофаги инкубировали 3 ч в присутствии 100 нг/мл TLR4 агониста иммуномакса (TLR4), 2,5 мкг/мл агониста МОБ2-рецептора L18-MDP (NOD2), 5 мкг/мл TLR9 агониста ODN CpG 1826 (TLR9) и их попарных сочетаний (TLR4 + TLR9; TLR9 + NOD2 и TLR4 + NOD2); в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (К). Уровень экспрессии мРНК гена TNFa анализировали методом ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров, мРНК ß-актина использовали в качестве внутреннего стандарта. По оси ординат — значение активации экспрессии мРНК TNFa относительно мРНК ß-актина, нормированное на значение в контроле. Приведены средние величины и стандартные отклонения по двум культуральным и двум измерительным параллелям. Здесь и на рис. 2, 4: * — достоверное (p < 0,05) отличие измеренного отклика от парного воздействия (прирост относительно контрольного значения) от линейного суммирования прироста от двух лигандов, посчитанное по непараметрическому критерию Вилкоксона—Манна—Уитни (Wilcoxon—Mann—Whitney test, WMW) [14].

ORIGINAL ARTICLE

a

TLR4 NOD2 TLR9

К 5 15 30 60 К 5 15 30 60 К 5 15 30 60 мин

P-NF-kB — —— —— —

TLR4+NOD2 NOD2+TLR9 TLR9+TLR4

К 5 15 30 60 К 5 15 30 60 К 5 15 30 60 мин

P-NF-kB ß-actin

б

4 - 4- * 4 -

С о з- го * * с о го 3- с й 3 -ГО

са  ' ' са со. /

ш 2- m 2- СО О . ^

U- 1 I" / ^^ LL z CL 1 - —♦--ф- LL 1 1- é

0 -I 0 5 15 30 60 Время экспозиции, мин 0 - 0 5 15 30 Время экспозиции, мин 60 о -I 0 ' 5 ' 15 ' 30 ' 60 Время экспозиции, мин 1

—TLR4 —и— TLR4+NOD2 -à- NOD2 -NOD2 —TLR9+NOD2 -i- -TLR9 —TLR4 —— TLR4+TLR9 —à— TLR9

Рис. 2. Активация NF-kB в макрофагах в ответ на стимуляцию агонистами TLR4, TLR9 и NOD2 и их парными сочетаниями. а — костномозговые макрофаги инкубировали 0—60 мин в присутствии 100 нг/мл TLR4 агониста LPS (TLR4), 1 мкг/мл агониста МОБ2-рецептора L18-MDP (NOD2), 5 мкг/мл TLR9 агониста ODN CpG 1826 (TLR9) и при их сочетании (TLR4 + TLR9; TLR9 + NOD2 и TLR4 + NOD2). Активированные клетки подвергали лизису, в полученных клеточных экстрактах методом иммуноблота анализировали уровень активации транскрипционного фактора NF-kB по фосфорилированию его p65 субъединицы (P-NF-kB), белок р-актин использовали в качестве внутреннего стандарта; б — по оси ординат приведены значения интенсивности окраски пятен целевого белка (P-NF-kB) методом иммуноблота относительно белка-стандарта (р-актин). Интенсивность пятен анализировали с помощью программы ImageJ. Здесь и на рис. 3, 4: по оси абсцисс — время инкубации.

[15]. Логично предположить, что интеграция двух или более PRR-сигналов в клетках тоже происходит на уровне NF-kB- и MAPK-сигнальных путей. Это предположение подтверждает сообщение о том, что при действии на макрофаги, полученные из моноцитов человека, парными сочетаниями агони-стов TLR3, TLR4 и TLR8 уровень экспрессии цитокина IL-12 определяется соотношением транскрипционных факторов, активируемых в NF-kB- и MAPK-сигнальных путях [16]. Роль молекулярного переключателя NF-kB- и MAPK-путей отдается протеинкиназе IKKp [17]. Эта киназа, фосфори-лируя субъединицы белков IkBa и p105, может перекрестно усиливать сигналы по NF-kB- и MAPK-путям.

Синергическая активация транскрипционного фактора NF-kB при стимуляции костномозговых макрофагов парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Известно, что продукция TNFa в клетке находится под контролем NF-kB- и MAPK-сигнальных путей [18]. Промотор гена TNFa содержит несколько сайтов связывания транскрипционных факторов NF-kB и AP-1 [19, 20], ключевых транскрипционных факторов NF-kB- и MAPK-пути соответственно. Используя агонисты TLR4, TLR9, NOD2 и их парные сочетания, мы проанализировали возможные механизмы кооперации NF-kB- и MAPK-сигнальных путей, приводящие к усиленной экспрессии цитокина TNFa. Об активности двух сигнальных путей в костномозговых макрофагах судили по степени фосфорили-рования транскрипционного фактора NF-kB и центральной MAP-киназы ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase).

NF-kB — главный транскрипционный фактор, активируемый в клетках в ответ на активацию всех PRR и выполняющий ключевую роль в индукции реакций врожденного иммунитета [2, 3]. Мы исследовали активацию NF-kB в костномозговых макрофагах при воздействии на них агонистами TLR4, TLR9 и NOD2 и их парными сочетаниями. Активность

NF-kB определяли методом иммуноблотинга с антителом, специфичным к фосфорилированному остатку Ser536 субъединицы p65 (рис. 2) и методом проточной цитофлуориметрии с окрашиванием внутриклеточного фосфо-р65 (рис. 4, а).

Результаты, представленные на рис. 2, показывают, что агонист TLR4 (LPS) индуцирует быструю активацию NF-kB. Максимум активности NF-kB наблюдают уже через 5 мин после активации клеток. Значительно более медленной была активация NF-kB в ответ на агонист TLR9 (CpG). Мы наблюдали постепенное нарастание активной формы NF-kB в макрофагах в течение 60 мин после активации агонистом TLR9. Воздействие на клетки агонистом NOD2 (MDP) приводило к слабой активации NF-kB через 30—60 мин. Такое различие в динамике активации одного и того же транскрипционного фактора NF-kB под действием трех разных агонистов PRR (LPS, CpG, MDP), вероятно, объясняется разной компартментализацией активируемых рецепторов: TLR4 локализуется на внешней клеточной мембране, тогда как TLR9 (эндосома) и NOD2 (ци-тозоль) имеют внутриклеточную локализацию. Несмотря на разную кинетику, CpG и LPS одинаково эффективно активируют NF-kB, тогда как MDP значительно уступает им в этом.

При парных сочетаниях агонистов TLR4 или TLR9 c аго-нистом NOD2 накопление в клетках транскрипцино-активной формы NF-kB нарастает по сравнению с таковым в клетках, активированных теми же агонистами по отдельности. Сочетание агонистов TLR4 + NOD2 значительно пролонгирует присутствие в клетках фосфорилированной формы транскрипционного фактора, а сочетание TLR9 + NOD2 — ускоряет накопление NF-kB в активированных клетках по сравнению с одиночным действием CpG и MDP. Сочетание агонистов TLR4 + TLR9 не усиливает транскрипционную активность NF-kB относительно одиночного действия LPS или CpG. При совместном действии агонистов TLR4 + TLR9 наблюдают ди-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Рис. 3. Активация Erk1/2 в макрофагах в ответ на стимуляцию агонистами TLR4, TLR9 и NOD2 и их парными сочетаниями. а — костномозговые макрофаги инкубировали 0—60 мин в присутствии 100 нг/мл TLR4 агониста LPS (TLR4), 1 мкг/мл агониста NOD2-рецептора L18-MDP (NOD2), 5 мкг/мл TLR9 агониста ODN CpG 1826 (TLR9) и при их сочетании (TLR4 + TLR9; TLR9 + NOD2 и TLR4 + NOD2), в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (К). Активированные клетки подвергали лизису, в полученных клеточных экстрактах методом иммуноблота анализировали уровень фосфорилирования Erk1/2 (P-Erk1/2), белок р-актин использовали в качестве внутреннего стандарта; б — по оси ординат приведены значения интенсивности окраски пятен целевого белка (P-NF-kB) методом иммуноблота относительно белка-стандарта (р-актин). Интенсивность пятен анализировали с помощью программы ImageJ.

намику фосфорилирования ЫР-кВ в клетках, характерную для агониста TLR4 — мгновенное возрастание транскрипционно-активного ЫР-кВ с максимумом через 5 мин и последующим снижением активности ЫР-кВ до постоянного уровня.

10 20 30 40 50 Время экспозиции, мин

-NOD2

TLR4

10 20 30 40 50 Время экспозиции, мин

A—TLR4+NOD2

Рис. 4. Активация транскрипционного фактора ЫБ-кВ и МАРК-киназы ЕИК1/2 в макрофагах в ответ на стимуляцию агонистами !ЪК4, ЫОБ2 и их парными сочетаниями. Костномозговые макрофаги инкубировали 0—60 мин в присутствии 1000 нг/мл ТЬЯ4 агониста иммуномакса (ТЬЯ4), 2 мкг/мл агониста ЫОБ2-рецептора Ь18-МБР (ЫОБ2), и при их сочетании (ТЬЯ4 + ЫОЙ2), в качестве отрицательного контроля — клетки без активаторов (К). Клетки мгновенно фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали первичными антителами к Р-ЫБ-кВ (а) или Р-Егк1/2 (б) и вторичными флуорохром-меченными антителами. Анализ флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре ВБ FACSAria II. По оси ординат приведены средние значения и стандартные отклонения по двум культуральным параллелям, нормированные на значение в контроле без активации.

Активация NF-kB — конечный и общий результат активации всех PRR-сигналов в клетке. Сигнальные пути PRR различаются своими начальными звеньями. Агонисты TLR4 и TLR9 активируют NF-kB через адаптерную молекулу MyD88, аго-нист NOD2 сигнализирует непосредственно на молекулу TAK1 через киназу RIP2. Кина-за TAK1 — связующее звено PRR-путей, на нее распространяются сигналы от всех PRR. Активация NF-kB индуцируется в результате TAK1-опосредованного фосфорилирования IKKp в составе комплекса IKKaPy. Из наших данных (см. рис. 2) следует, что наибольший уровень активности NF-kB наблюдают при одновременном сочетании TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2, т. е. при одновременной активации сигнальных путей, действующих через разные адаптерные молекулы — MyD88 и RIP2. Сочетание агонистов, передающих сигнал через одну и ту же адаптерную молекулу MyD88 (TLR4 + TLR9), не изменяет уровня активности NF-kB в клетках.

Известно, что воздействие TLR-агонистами вызывает активацию макрофагов, которая довольно быстро сменяется состоянием рефрактерности клеток в отношении повторной стимуляции идентичным или другим агонистом TLR. Так, по-видимому, обеспечивается защита организма от избыточного выброса провоспалительных цитокинов и противомикробных веществ [21]. Одним из механизмов, определяющих

состояние рефрактерности активированных клеток, считают снижение в таких клетках активности киназы IRAK-1 [22]. Это приводит к нарушению передачи сигнала от TLR через MyD88 к киназе TAK1 и NF-kB. Вероятно, при сочетании двух MyD88-зависимых агонистов, TLR4 + TLR9, имеющих разную временную кинетику, происходит быстрая активация MyD88-пути через мембраносвязанный TLR4, после которой наступает рефрактерное состояние клеток, поэтому клетки не успевают отреагировать на второй агонист (TLR9). В результате при совместном действии на клетки агонистами TLR4 + TLR9 мы наблюдаем кинетику активации NF-kB, характерную для LPS, а не CpG. В случае же сочетания агонистов TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2 после быстрой активации TLR4, несмотря на неотвечаемость MyD88-пути, наблюдается возрастание или пролонгация активности NF-kB в клетках в результате дополнительной активации адаптерной молекулы RIP2, не использованной в TLR-сигнальном пути. Кроме того, известно, что NOD2-рецепторы в отсутствие своих агонистов способны выполнять роль ингибиторов TLR-сигнальных путей [23]. Вероятно, при использовании двойных сочетаний TLR4 + NOD2 или TLR9 + NOD2 агонист NOD2 (MDP) связывает рецепторы-ингибиторы NOD2 и снимает ингибирование TLR-путей, что приводит к возрастанию активности NF-kB в клетках.

Уровень активности NF-kB в клетках, активированных парными сочетаниями TLR4, TLR9 и NOD2-агонистов, коррелируют с экспрессией гена TNFa в этих же клетках (см. рис. 1). Наибольшее усиление продукции мРНК TNFa наблюдали при сочетании агонистов TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2. Действие на клетки агонистами TLR4 + TLR9, несмотря на отсутствие изменений в активности NF-kB, также приводило к возрастанию транскрипции мРНК гена TNFa, однако экспрессия гена TNFa активировалась под влиянием TLR4 + TLR9 слабее, чем при стимуляции клеток агонистами TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2. Оба агониста, TLR4 и TLR9, способны к активации генов интерферонов 1-го типа, задействуя в этом разные адап-терные молекулы — MyD88 и TRIF соответственно. [2, 3]. Показано, что при стимуляции клеток сочетанием агонистов TLR7, TLR3 и TLR4 интерфероны 1-го типа могут паракрин-ным и аутокринным путями активировать продукцию провос-палительных цитокинов [24]. Возможно, такой механизм участвует в усилении продукции TNFa при сочетанной активации макрофагов парой агонистов TLR9 и TLR4.

Парные сочетания агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 не влияют на активность MAPK сигнального пути. MAPK-сигнальный путь представляет собой последовательность из каскада трех киназных реакций, приводящих к активации в клетках эффекторных протеинкиназ — JNK, p38 и ERK. Эти киназы в координации с NF-kB-сигнальным путем играют ключевую роль в активации генов провоспалительных цитокинов и индукции полноценного иммунного ответа на инфекцию [2, 3].

Для изучения модуляции MAPK-пути в макрофагах в ответ на воздействие парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 мы исследовали активность ERK1/2, ключевой и наиболее хорошо изученной киназы сигнального пути MAPK (рис. 3 и 4, б). Об активности ERK1/2 судили по фосфорилированию ее субъединиц p44/p42 в положениях Thr202/Tyr204 методом иммуноблотинга (см. рис. 3) и проточной цитометрии (см. рис. 4, б). По результатам, представленным на рис. 3 и 4, видно, что при действии на клетки агонистом TLR4 мы наблюдали быструю активацию ERK1/2 уже через 5 мин после стимуляции клеток. Агонист TLR9 активировал ERK1/2 довольно медленно, максимум активности наблюдали через 30—60 мин после воздействия на клетки CpG. Агонист NOD2 (MDP) практически не влиял на фосфорилирование ERK1/2 в макрофагах.

Сочетанное и действие по отдельности пар агонистов TLR4 + NOD2 и TLR9 + NOD2 на активность ERK1/2 в макрофагах не отличались (см. рис. 3, 4, б). Воздействие на макрофаги агонистом NOD2 не только не индуцировало активацию ERK1/2, но и никак не влияло на активацию ERK1/2,

ORIGINAL ARTICLE

вызванную агонистом TLR4 или агонистом TLR9. Интересно, что при воздействии на клетки сочетанием агонистов TLR4 + TLR9 происходила усиленная активация ERK1/2 с кинетикой, характерной для активации агонистом TLR4.

Таким образом, изучение активности NF-kB- и MAPK-сигнальных путей в костномозговых макрофагах, активированных парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2, демонстрирует участие NF-KB-сигнального пути в синергической активации клеток. В частности, синергиче-ское усиление фосфорилирования субъединицы p65 NF-kB в клетках, активированных сочетанием агонистов TLR9 + NOD2 или TLR4 + NOD2, приводит к синергической продукции провоспалительного цитокина TNFa.

Заключение

Детальное понимание кооперации нескольких PRR-сигнальных путей в клетке важно в перспективе разработки новых подходов в борьбе с инфекционными и опухолевыми заболеваниями. Ранее нами обнаружена усиленная продукция TNFa, IL-12 и других цитокинов при активации дендритных клеток и макрофагов парными сочетаниями агонистов TLR9, TLR4, NOD2. В настоящей работе мы рассмотрели возможные механизмы синергической транскрипции гена TNFa. С этой целью мы исследовали эффективность активации сигнальных путей NF-kB и MAPK одиночными и парными сочетаниями исследуемых агонистов. Мы обнаружили, что воздействие на макрофаги парным сочетанием агонистов TLR4 + NOD2 значительно пролонгирует, а сочетанием TLR9 + NOD2 значительно ускоряет накопление транскрипционно-активной формы NF-kB в активированных клетках. Сочетание агонистов TLR4 + TLR9 не приводит к синергической активации NF-KB-сигнального пути. Любопытно, что при воздействии на клетки сочетанием агонистов TLR4 + TLR9 происходит усиленная активация ERK1/2. Напротив, воздействие на макрофаги агонистом NOD2 не только не индуцирует активацию ERK1/2, но и никак не влияет на вызванную агонистом TLR4 или TLR9 активацию этой киназы.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-15-00102.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

литература

9. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Ата-уллаханов Р.И. Синергическое усиление транскрипции генов интерферонов и цитокинов при активации макрофагов и дендритных клеток сочетанием двух агонистов PRR. Иммунология. 2017; 38(1): 64—71.

references

1. Janeway C.A., Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1989; 54 (1): 1—13.

2. Janeway C.A., Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 2002; 20: 197—216.

3. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity. Int. Immunol. 2005; 17(1): 1—14.

4. Wolfert M.A., Murray T.F., Boons G.J., Moore J.N. The origin of the synergistic effect of muramyl dipeptide with endotoxin and peptidoglycan. J. Biol. Chem. 2002; 277: 39179—86.

5. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35: 2459—70.

6. Tada H., Aiba S., Shibata K., Ohteki T., Takada H. Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect. andImmun. 2005; 73: 7967—76.

7. van Beelen A.J., Zelinkova Z., Taanman-Kueter E.W., Muller F.J., Hommes D.W., Zaat S.A. et al. Stimulation of the intracellular

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007; 27: 660—9.

8. Schwarz H., Posselt G., Wurm P., Ulbing M., Duschl A., Horejs-Hoeck J. TLR8 and NOD signaling synergistically induce the production of IL-1ß and IL-23 in monocyte-derived DCs and enhance the expression of the feedback inhibitor SOCS2. Immunobiology. 2013; 218(4): 533—42.

9. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Synergistic enhancement of cytokines and interferon genes transcription during activation of macrophages and dendritic cells by a combination of the two agonists PRR. Immunologiya. 2017; 38

10. Whitmore M.M., DeVeer M.J., Edling A., Oates R.K., Simons B., Lindner D. et al. Synergistic activation of innate immunity by double-stranded RNA and CpG DNA promotes enhanced antitumor activity. Cancer Res. 2004; 64(16): 5850—60.

11. Nasirudeen A.M.A., Wong H.H., Thien P., Xu S., Lam K.P., Liu D.X. RIG-I, MDA5 and TLR3 synergistically play an important role in restriction of dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 2011; 5(1): e926.

12. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D.V., Artemicheva N.M., Burdelya L.G., Shmarov M.M. et al. Combined stimulation of Tolllike receptor 5 and NOD1 strongly potentiates activity of NF-kB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. Infect. and Immun. 2013; 81(10): 3855—64.

13. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S. et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 1992; 176(6): 1693—702.

14. Mann H.B., Whitney D.R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. Ann. Mathemat. Statist. 1947; 18: 50—60.

15. Peroval M.Y., Boyd A.C., Young J.R., Smith A.L. A critical role for MAPK signalling pathways in the transcriptional regulation of toll like receptors. PloS One. 2013; 8(2): e51243.

16. Mäkelä S.M., Strengell M., Pietilä T.E., Österlund P., Julkunen I. Multiple signaling pathways contribute to synergistic TLR ligand-dependent cytokine gene expression in human monocyte-derived macrophages and dendritic cells. J. Leukoc. Biol. 2009; 85(4): 664—72.

17. Salmeron A., Janzen J., Soneji Y., Bump N., Kamens J., Allen H. et al. Direct phosphorylation of NF-kappaB1 p105 by the IkappaB kinase complex on serine 927 is essential for signal-induced p105 proteolysis. J. Biol. Chem. 2001; 276: 22215—22.

18. Yao J., Mackman N., Edgington T.S., Fan S.T. Lipopolysaccharide induction of the tumor necrosis factor-a promoter in human monocytic cells regulation by Egr-1, c-Jun, and NF-кЬ transcription factors. J. Biol. Chem. 1997; 272(28): 17795—801.

19. Zhu W., Downey J.S., Gu J., Di Padova F., Gram H., Han J. Regulation of TNF expression by multiple mitogen-activated protein kinase pathways. J. Immunol. 2000; 164(12): 6349—58.

20. Falvo J.V., Uglialoro A.M., Brinkman B.M., Merika M., Parekh B.S., Tsai E.Y. et al. Stimulus-specific assembly of enhancer complexes on the tumor necrosis factor alpha gene promoter. Mol. cell. Biol. 2000; 20(6): 2239—47.

21. Medvedev A.E., Lentschat A., Wahl L.M., Golenbock D.T., Vogel S.N. Dysregulation of LPS-induced Toll-like receptor 4-MyD88 complex formation and IL-1 receptor-associated kinase 1 activation in endotoxin-tolerant cells. J. Immunol. 2002; 169: 5209—16.

22. Li L., Cousart S., Hu J., McCall C.E. Characterization of interleukin-1 receptor-associated kinase in normal and endotoxin- tolerant cells. J. Biol. Chem. 2000; 275: 23340—5.

23. Tsai W.H., Huang D.Y., Yu Y.H., Chen C.Y., Lin W.W. Dual roles of NOD2 in TLR4-mediated signal transduction and induced inflammatory gene expression in macrophages. Cell. Microbiol. 2011; 13(5): 717—30.

24. Mäkelä S.M., Österlund P., Julkunen I. TLR ligands induce synergistic interferon-ß and interferon-11 gene expression in human monocyte-derived dendritic cells. Mol. Immunol. 2011; 48(4): 505—15.

Поступила 30.09.16 Принята в печать 03.11.16

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 612.6.02.017.1:575.174.015.3

Рыбкина В.Л., Азизова Т.В., Адамова Г.В., Теплякова О.В., Румянцева А.В., Тепляков И.И.

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА АНТИГЕНОВ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ УРАЛЬСКОГО РЕГИОНАЛЬНОГО РЕГИСТРА ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ФГУП «Южно-Уральский институт биофизики» ФМБА России 456780, г Озерск, Россия

Цель исследования — оценка частот семейств аллелей системы HLA, встречающихся в Уральском региональном регистре доноров гемопоэтических стволовых клеток (УРРД ГСК) (г. Озерск Челябинской области). Основными этносами, представленными в УРРД ГСК, были русские, башкиры и татары. ДНК выделена из периферической крови детергентно-солевым методом с осаждением на мембранных колонках фирмы Protrans (Германия). HLA-типирование проведено с использованием методов сиквенс-специфических праймеров (SSP) с использованием реактивов фирмы Protrans (Германия) и сиквенс-специфических олигонуклеотидов (SSO) с использованием реактивов фирмы One Lambda (США). Для русских УРРД ГСК были характерны генетические черты кавказоидных популяций. Особенностью УРрД ГСК служит более низкая частота специфичности А*01, более высокая А*33, В*45, В*55 по сравнению с таковой у русских в Челябинской области. У татар имелись признаки кавказоидов, однако у татар УРРД ГСК частоты аллельных семейств А*01, В*44, ниже чем у русских УРРД ГСК и русских Челябинской области, что сближает их с представителями монголоидных популяций. Частота аллельного семейства А*03 статистически значимо выше, чем у татар Челябинской области. Более высокие частоты А*24, В*40 и DRB1*12, чем у русских УРРД ГСК, и ненулевые уровни А*33, В*46, В*48, В*58 и DRB1*09 роднят башкир УРРД ГСК в большей степени с монголоидными популяциями, чем с кавказоидными. У башкир УРРД ГСК отмечена статистически значимо более высокая частота аллельных семейств В*08, В*35 и DRB1*03 по сравнению с башкирами Челябинской области. Результаты исследования показали, что УРРД ГСК имеет свои особенности распределения частот семейств аллелей системы HLA и может способствовать обогащению международной сети регистров разнообразием местных генотипов.

Ключевые слова: частота семейств аллелей системы HLA; трансплантация гемопоэтических стволовых клеток; регистр доноров гемопоэтических стволовых клеток; русские; башкиры; татары.

Для корреспонденции: Рыбкина Валентина Львовна, д-р мед. наук, старший научный сотрудник клинического отдела ФГУП «Южно-Уральский институт биофизики» ФМБА России, E-mail: clinic@subi.su