СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ФИЦИНА, ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИСАХАРИДОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВИНИЛОВЫМИ МОНОМЕРАМИ
METHOD FOR OBTAINING AN IMMOBILIZED ENZYME PRODUCT BASED ON FICIN, HYALURONIC ACID AND POLYSACCHARIDES MODIFIED WITH VINYL MONOMERS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу стабилизации фицина растворами гиалуроновой кислоты и графт-сополимерами с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА). Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии.
Фицин (КФ 3.4.22.3) - протеолитический фермент, присутствующий в латексе фиговых деревьев, содержит остаток цистеина в активном центре. Фицин входит в состав группы препаратов, предназначенных для ферментативной обработки тканевых продуктов с получением бесклеточной тканевой матрицы, применяемых в хирургии и трансплантологии [Патент RU 2639477 С2, МПК A61L 27/24, опубл. 21.12.2017, Бюл. №36]. Известна пероральная композиция для предотвращения и уменьшения адгезии бактерий к поверхностям ротовой полости, включающая фицин [Патент RU 2007126845 А, МПК A61K 8/66, дата публ. заявки 27.01.2009, Бюл. №3]. Фицин используется для изготовления средств для лечения и/или профилактики глазных болезней, связанных с неоангиогенезом: макулярной дегенерации, связанной с возрастом (AMD), хориоидальной реваскуляризации, болезни Хиппеля-Линдау, реваскуляризации радужной оболочки, ишемической пролиферативной ретинопатии, реваскуляризации роговой оболочки, и пролиферативной ретинопатии серповидных клеток [Патент RU 2472523 С2, МПК A61K 38/48, А61Р 27/02, опубл. 20.01.2013 Бюл. №2].
Гиалуроновая кислота - природный полисахарид животного происхождения, широко распространен в природе, содержится в основном веществе многих видов соединительной и нервной ткани (в коже, связках, пуповине, сердечных клапанах, стекловидном теле глаза, роговице и др.) и биологических жидкостях (слюне, синовиальной и суставной жидкости). В соединительной ткани дермы гиалуроновая кислота расположена между волокнами коллагена и эластина. Гиалуроновая кислота используется при создании косметических средств ухода за кожей (увлажняющих кремов, масок-салфеток, солнцезащитных гелей, декоративной косметики), терапевтических препаратов для коррекции возрастных изменений кожи и реабилитации после проведения пилингов и пластических операций.
Имеются сведения о комплексном косметическом средстве, содержащем гиалуроновую кислоту. Описанное изобретение обеспечивает омолаживающее, противовоспалительное действие и лифтинг-эффект, кроме того, обладает мощным местным иммуностимулирующим действием, длительным сроком хранения и повышенной биологической активностью [Патент RU 2514003 С1, МПК A61K 8/02, A61K 8/73, A61K 8/19, A61K 8/64, A61K 8/92, В82В 1/00, A61Q 19/00, опубл. 27.04.2014, Бюл. №12]. Гиалуроновая кислота входит в состав пилингового косметического средства, за счет гидратации она усиливает степень отшелушивания, а пилинговый препарат за счет удаления поверхностного эпителия способствует более глубокому проникновению гиалуроновой кислоты в глубокие слои кожи, и соответственно, усилению эффекта гидратации [Патент RU 2524666 С1, МПК A61K 8/18. A61K 8/73, A61K 8/72, A61Q 19/08, A61Q 19/10, опубл. 27.07.2014, Бюл. №21]. Описана композиция внутреннего применения для коррекции гормонального старения кожи, содержащая гиалуроновую кислоту. Эффект композиции заключается в коррекции гормонального старения кожи, увеличения плотности и тургора кожи за счет стимулирования выработки коллагено-эластиновых волокон и обеспечения антиоксидантной защиты [Патент RU 2527344 С2, МПК А61К 36/8945, А61Р 17/00, опубл. 27.08.2014 Бюл. №24]. Деструктурированная гиалуроновая кислота амфифильной формы включена в состав комплексного косметического средства, обеспечивающего повышение проникающей способности активных компонентов и усиление косметических эффектов применения, а именно улучшение показателей влагометрии, эластометрии, профилометрии, а также состояния волос и ногтей [Патент RU 2618428 С1, МПК A61K 8/04, A61K 8/73, A61K 8/63, A61K 8/23, A61K 8/27, A61K 8/25, A61K 8/19, A61Q 19/08, A61Q 5/12, опубл. 03.05.2017 Бюл. №13].
Известно, что графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из N-винилимидазола или N,N-диметиламиноэтилметакрилата являются биодеградируемыми за счет наличия основной цепи из модифицированных полисахаридов [N.М. Mahmoodi, М.Н. Saffar-Dastgerdi, В. Hayati. Environmentally friendly novel covalently immobilized enzyme bionanocomposite: From synthesis to the destruction of pollutant. Composites Part B: Engineering. 2020. Vol. 184. P. 107666; K.J. Edgar, С.M. Buchanan, J.S. Debenham et al. Advances in cellulose ester performance and application. Progress in Polymer Science. 2001. Vol. 26. P. 1605-1688], а также могут выступать в качестве носителя противоопухолевого препарата «Паклитаксел» при пероральном или внутривенном введении [V.А. Kuznetsov, А.V. Sorokin, М.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949; V.A. Kuznetsov, A.V. Sorokin, M.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
На данный момент нет сведений о комплексах растительного фермента фицина с гиалуроновой кислотой и полисахаридами, модифицированными виниловыми мономерами, такими как графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА).
Известен способ получения гетерогенного препарата на основе фицина [Патент RU 2677858 С2, МПК A61K 31/74, A61K 38/46, А61Р 17/02, C12N 11/08, опубл. 22.01.2019, Бюл. №3]. Данный способ включает иммобилизацию фицина в буферном растворе на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 в соотношении 20 мл буферного раствора фицина в концентрации 1 мг/мл на 1 г волокон, при этом в качестве буферного раствора используют 0.05 М трис-HCl буфер с рН 7.0; далее проводят инкубирование в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; а затем промывают образовавшийся осадок 0.05 М трис-HCl буфером с рН 7.0 до отсутствия в промывных водах фицина.
Недостатком способа является получение ферментного препарата в твердой фазе, не позволяющей проникать молекулам фицина в глубокие слои кожи.
Запатентован способ стабилизации ферментов - пепсина, химотрипсина, трипсина, панкреатина, папаина и других протеаз, путем добавления в их растворы полисахаридов - гуаровой камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, крахмала, декстрана, пуллулана, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, каррагинана, пектина, хитозана и прочих полисахаридов, а также производных целлюлозы: карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы [JPH034791A].
В отличие от этого способа предложенное нами использование полисахаридов (карбоксиметилцеллюлозы и хитозана), модифицированных виниловыми мономерами (N-винилимидазолом или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом) обеспечивает большее количество связей между полисахаридом и ферментом в ходе иммобилизации, что увеличивает прочность образуемого комплекса и пролонгирует процесс высвобождения фермента в область поврежденных тканей.
Известно, что полимеры на основе поли-β-гликозидов (целлюлозы и ее производных, хитозана, гиалуроновой кислоты и т.д.) склонны к образованию пленок, которые могут защитить кожу от пересыхания или обеспечить дополнительную защиту на поверхности раневого повреждения. Однако способность образовывать конъюгаты у таких полимеров несколько ограничена рядом факторов: поверхностным зарядом, типом функциональной группы и т.д. Поэтому для придания ряда новых свойств целесообразно проводить химическую модификацию природных полисахаридов. Так, например, введение азольных заместителей повышает комплексообразующую способность полисахаридов и снижает поверхностный отрицательный заряд карбоксиметилцеллюлозы [V.A. Kuznetsov, А.V. Sorokin, М.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949], а введение звеньев N,N-диметиламиноэтилметакрилата не только снижает поверхностный заряд, но придает водному раствору модифицированного полисахарида стимулочувствительные свойства [V.A. Kuznetsov, А.V. Sorokin, М.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
В качестве прототипа служила топическая противомикробная дерматологическая композиция [Патент RU 2668827 С2, МПК A61K 38/08, A61K 31/728, А61Р 31/00, А61Р 17/00, A61K 31/722, опубл. 02.10.2018, Бюл. №28], предложенная в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.
В отличие от прототипа в качестве действующего вещества мы используем не противомикробный пептид, а фермент фицин, который, кроме антимикробных, обладает антиоксидантными, ранозаживляющими, антигельминтными, противовоспалительными свойствами. Ранее нами было показано, что растительная протеаза фицин эффективно разрушает структурные компоненты матрикса биопленки Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis уже при концентрации 10 мкг/мл, почти полностью разрушая пленку при концентрации 1 мг/мл, в то время как широко распространенные трипсин и химотрипсин используют в концентрациях 1-2 мг/мл. С помощью атомно-силовой микроскопии мы показали, что после обработки фицином структура биопленки становится пористой и с пониженной вязкостью. Окрашивание красителем конго красным подтвердило гидролиз белкового компонента матрикса биопленок. Кроме того, было установлено, что обработка фицином увеличивает антимикробное действие ципрофлоксацина, гентамицина и бензалкония хлорида против клеток, находящихся внутри биопленок S. aureus и S. epidermidis. Соответственно растворимый фицин является перспективным соединением для разрушения биопленок и уменьшения риска повторного инфицирования организма [D.R. Baidamshina, E.Y. Trizna, M.G. Holyavka et al., Scientific reports, 7, 46-68 (2017); doi: 10.1038/srep46068].
Кроме того, добавление нами в раствор графт-сополимеров карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) позволяет путем включения в полисахаридный гель (один из способов физической иммобилизации ферментов) дополнительно стабилизировать фицин и обеспечить ему пролонгированное действие.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе фицина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы фицина можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи; при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение фицина, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.
Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного ферментного препарата на основе фицина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающем растворение фицина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 к Да или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг фицина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию фицина, путем  добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с молекулярной массой 50-100 кДа с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Фиг. 1. Диаграмма значений каталитической активности (А) фицина в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 4°С.
Фиг. 2. Диаграмма значений каталитической активности (А) фицина в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 25°С.
Фиг. 3. Таблица 1. Вязкость препаратов, содержащих фицин, гиалуроновую кислоту и полисахариды, модифицированные виниловыми мономерами.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран фицин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве стабилизирующих агентов применяли три вида гиалуроновой кислоты (ООО «Лаборатория Гиалика») с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) и 800 (ВМГК) кДа. В качестве матрицы для иммобилизации фицина применяли графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) с молекулярной массой 50-100 кДа.
Стабилизацию фицина осуществляли путем растворения его навески массой 10 мг в 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) или 800 (ВМГК) кДа в концентрации 1.5% с последующим перемешиванием при комнатной температуре до полного растворения. Затем к полученной смеси добавляли для иммобилизации фицина графт-сополимер карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) (при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля (табл. 1).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах фицина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Измерение уровня протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине [GarciVCarreno, F.L. The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial characterization and the effect of feed on their composition //Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry - 1992. - V. 103. - P. 575-578]. К 200 мкл образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера (рН 7.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при минус 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 200 мкл трис-HCl буфера и 200 мкл образца, который вносили после инкубации смеси в течение 2 часов при 37°С. За единицу каталитической активности фицина принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность фицина рассчитывали по формуле:
ПА=D*1000/120/200/C,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность пробы при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, в мкл,
1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Были проведены исследования стабильности фицина в растворах гиалуроновой кислоты (300, 500 и 800 кДа) по сравнению с нативным энзимом. Препараты инкубировали при 4 и 25°С в течение 0, 1, 2, 3, 7, 14 и 21 суток с дальнейшим измерением протеолитической активности. Полученные результаты отражены на фиг. 1, 2.
В ходе наших экспериментов было выявлено, что гиалуроновая кислота не ингибирует фицин. На фиг. 1 представлена диаграмма зависимости каталитической активности энзима от времени его хранения при 4°С. Установлено, что нативный фицин сохраняет 65% каталитической активности интактного образца после 7 суток инкубации при 4°С. На 14 день хранения ферментативная способность энзима составляет 61% от начальной. После 21 дня инкубации фицин инактивирован на 41%. Фицин в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 к Да) на 7 день хранения теряет 13% каталитической способности. Активность продолжает снижаться после 2 и 3 недель, но составляет не менее 74% от исходной. Раствор фицина со среднемолекулярной гиалуроновой кислотой (500 кДа) на 7 и 14 сутки хранения снижает свою активность на 12 и 27% соответственно. Энзим сохраняет 60% каталитической способности после 3 недель инкубации. Фицин в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) после 7 дней хранения активен на 68% от исходного уровня. После 14 и 21 дня инкубации при 4°С фермент сохраняет соответственно 65 и 62% активности от интактного образца.
На фиг. 2 изображена диаграмма изменения каталитической активности фицина после его хранения при 25°С. Выявлено, что свободный энзим на 7 сутки инкубации при температуре 25°С сохраняет 60% активности, а на 14 и 21 сутки - 42 и 21%. Фицин в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) наиболее стабилен среди растворов фермента в гиалуроновой кислоте: после 21 дня инкубации энзим проявляет не менее 76% от начальной протеолитической способности. Раствор фицина в среднемолекулярной гиалуроновой кислоте (500 к Да) после 7 и 14 суток инкубации при температуре 25°С стабильнее раствора нативного фермента и сохраняет более 73 и 70% от исходной протеолитической способности. Раствор фицина в высокомолекулярной гиалуроновой кислоте (800 кДа) на 7 сутки проявляет 59% каталитической способности, при повышении срока хранения происходит более значительная инактивация энзима: на 14 сутки остается 48% активности, на 21 сутки - 21%.
Из вышеизложенного материала следует, что фицин в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) наиболее стабилен по сравнению с остальными растворами фермента при хранении при 4°С. Раствор фицина в низкомолекулярной гиалуроновой кислоте (300 к Да) и среднемолекулярной гиалуроновой кислоте (500 кДа) после 21 суток инкубации при температуре 25°С оказался активнее раствора нативного фермента и его раствора в высокомолекулярной гиалуроновой кислоте и сохранял более 70% от исходной протеолитической способности.
Таким образом, был разработан способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе фицина, низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) и высокомолекулярной (800 кДа) гиалуроновой кислоты с последующим добавлением графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) для иммобилизации фицина.
При этом полученный предложенным способом препарат можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фицин при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи. Внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение фицина, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.