СОЕДИНЕНИЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ПСМА, И КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ
COMPOUND FOR DIAGNOSING TUMOURS EXPRESSING PSMA AND COMPOSITION BASED THEREON

Область техники
Изобретение относится к области органической и медицинской химии, онкологии, а именно к области радиоактивно меченых агентов визуализации. В изобретении описано новое соединение для диагностики опухолей, экспрессирующих ПСМА, в частности рака предстательной железы.
Уровень техники
Рак предстательной железы (РПЖ) является наиболее распространенным раковым заболеванием среди населения США и Европы. По меньшей мере 1-2 миллиона мужчин в западном полушарии страдают раком предстательной железы, и, согласно оценкам, указанное заболевание будет поражать одного из шести мужчин в возрасте от 55 до 85 лет. Смертность от указанного заболевания занимает второе место после рака легкого. В настоящее время преобладают анатомические способы клинической визуализации рака предстательной железы, такие как компьютерная хроматография (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ) и ультразвуковая визуализация. Тем не менее, в настоящее время отсутствует эффективная терапия для рецидивирующего, метастатического, андроген-независимого рака предстательной железы.
Избирательное нацеливание радиофармацевтических средств на раковые клетки для визуализации или для терапевтических целей представляет собой сложную задачу.
Из уровня техники известно соединение для образования радионуклидного комплекса, содержащего радиоактивный металл, для визуализации опухолевой ткани, экспрессирующей ПСМА, а также способ его получения и применения для визуализации (патент RU 2532912 «Технеций- и рений-бис(гетероарильные) комплексы и методы их применения для ингибирования PSMA», 20.11.2014). Известное соединение включает лиганд на основе производного мочевины, линкер и хелаторный фрагмент для связывания с радионуклидом.
Из уровня техники также известно соединение для образования комплекса с технеция-99м/рения для диагностики/лечения рака предстательной железы, а также способ его получения (патент RU 2692126 «Способ получения производного мочевины с хелатным центром, тропного к простат-специфичному мембранному антигену для связывания технеция-99м/рения для диагностики/лечения рака предстательной железы», 13.02.2018). Указанное соединение на основе производного мочевины с хелатным центром, тройного к простат-специфичному мембранному антигену для связывания технеция-99м/рения 188/186 для диагностики рака предстательной железы, включающий получение конъюгата ингибитора простат-специфичного мембранного антигена (ПСМА) с хелатирующим агентом на основе сукциимидного эфира ω-бис(пиридин-2-илметил)амино)алифатических кислот, заключающийся в том, что в качестве ингибитора ПСМА используют (3S,7S,25S,28S)-33-амино-25,28-дибензил-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,29,24,27,30-гептаазатриоктан-1,3,7-трикарбоновую кислоту, а в качестве хелатирующего агента - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноат.
Также из уровня техники соединение, включающее ПСМА-связывающий лиганд на основе производного мочевины для получения конъюгата с лекарственным и диагностическим агентом, а также способ его получения и применения (патент RU2697519 «Средство пептидной природы, включающее ПСМА-связывающий лиганд на основе производного мочевины, способ его получения и применение для получения конъюгата с лекарственным и диагностическим агентом», 15.08.2019). Известное соединение используется для образования конъюгата данного соединения с лекарственным или диагностическим агентом для диагностики или лечения заболеваний, вызванных клетками, экспрессирующими простатический специфический мембранный антиген.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к разработанному РИД является соединение, раскрытое в документе WO 2017165473, 28.09.2017 - конъюгат производного мочевины с замещенным галогенами бензилом для мечения радиоактивным изотопом формулы:
Однако, как показали проведенные эксперименты растворимость данного соединения не превышает 0,17 мг/мл. Невысокая растворимость в водных растворах приводит к необходимости при введении пациентам добавлять агенты, повышающие растворимость: ДМСО, спирты. Последние незначительно, но повышают токсичность препарата, а также усложняют процесс приготовления и введения препарата.
Таким образом, несмотря на большое разнообразие вариантов конъюгатов для доставки терапевтических и диагностических средств остается необходимость в соединениях для диагностики рака предстательной железы, обладающих высокой растворимостью, что позволит повысить эффективность использования радиофармацевтического лекарственного препарата при его меньшей токсичности, т.к. нет необходимости добавлять ДМСО или спирты для достижения необходимой для введения концентрации, что в свою очередь увеличивает удобство введения в организм.
Технической проблемой является низкая растворимость соединений, используемых для визуализации тканей, экспрессирующих ПСМА, в водных растворах.
Техническая проблема решается заявляемым соединением, обладающим растворимостью в водных растворах не менее 18,5 мг/мл.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема решается соединением для диагностики опухолей, экспрессирующих ПСМА, представляющим собой ковалентно-связанные ПСМА-связывающий лиганд на основе производного мочевины структуры DCL и модифицированный гидрофобный пептидный линкер, включающий фрагмент 6-аминогексановой кислоты, связанный с хелатором DOTA формулы (I):
Поставленная проблема также решается композицией для диагностики опухолей предстательной железы, экспрессирующих ПСМА (PSMA), включающая конъюгат формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель для парентерального введения.
Технический результат - растворимость заявляемого соединения не менее 18,5 мг/мл, что позволит повысить эффективность использования данного соединения в составе композиций для диагностики опухолей предстательной железы (радиофармацевтического лекарственного препарата) без добавления дополнительных растворителей для достижения необходимой для введения концентрации. Последнее значительно увеличивает удобство введения в организм.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами, где:
1
На фиг. 1 представлен спектр ЯМР Н соединения (III) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
13
На фиг. 2 представлен спектр ЯМР С соединения (III) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
На фиг. 3 представлен спектр HRMS соединения (III) (ось абсцисс - моноизотопная масса, ось ординат - абсолютная интенсивность).
!
На фиг. 4 представлен спектр ЯМР Н соединения (IV) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
13
На фиг. 5 представлен спектр ЯМР С соединения (IV) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
На фиг. 6 представлен спектр HRMS соединения (IV) (ось абсцисс - моноизотопная масса, ось ординат - абсолютная интенсивность).
1
На фиг. 7 представлен спектр ЯМР Н соединения (V) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
13
На фиг. 8 представлен спектр ЯМР С соединения (V) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
На фиг. 9 представлен спектр HRMS соединения (V) (ось абсцисс - моноизотопная масса, ось ординат - абсолютная интенсивность).
1
На фиг. 10 представлен спектр ЯМР Н соединения (I) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
13
На фиг. 11 представлен спектр ЯМР С соединения (I) (ось абсцисс - химический сдвиг (м.д.), ось ординат - нормализованная интенсивность).
На фиг. 12 показана ВЭЖХ-хроматограмма соединения соединения (I).
На фиг. 13 показано исследование зависимости оптического поглощения соединения (I) от концентрации раствора.
На фиг. 14 показан калибровочная зависимость оптического поглощения соединения (I) от концентрации раствора при длине волны измерения 279 нм.
279
На фиг. 15 показано исследование поглощения испытуемого раствора соединения при длине волны измерения 279 нм, Abs=0,675.
68
На фиг. 16 представлено распределение [Ga]Ga-PSMA по организму мыши с привитым раком простаты в присутствии и отсутствии блокирующего вещества через 1 час после введения.
90
На фиг. 17 показана калибровочная зависимость эффективности детектирования излучения Y от гашения раствора.
68
На фиг. 18 представлено распределение [Y]Y-PSMA по организму мыши с привитым раком простаты через 1 и 24 часа после введения.
Осуществление изобретения
Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.
«ПСМА (PSMA)» - трансмембранный гликопротеид II типа с массой ~100 кДа, состоящий из 750 аминокислот. Данный белок состоит из короткого внутриклеточного участка (1-18 аминокислоты), трансмембранного домна (19-43 аминокислоты) и большого внеклеточного домена (44-750 аминокислоты). Данный белок обладает высокой экспрессией в тканях предстательной железы, в связи с этим является перспективной мишенью для адресной доставки.
НОВТ - гидроксибензотриазол
HBTU - 3-[Бис(диметиламино)метилиумил]-3Н-бензотриазол-1-оксид гексафторфосфат
EtOAc - этилацетат
МеОН - метанол
DCM (ДХМ) - дихлорметан
DMF (ДМФА) - диметилформамид
DIPEA - диизопропилэтиламин
DOTA (t-Bu)3 - три-третбутиловый эфир 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты
TIPS - триизопропилсилан
TFA - трифторуксусная кистота
РуВОР - бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфоний гексафторфосфат
THF (ТГФ)- тетрагидрофуран
ДЭК - диэтиловый эфир
ТСХ - тонкослойная хроматография
ДТПА - диэтилентриаминпентауксусная кислота
254
1
13
1
13
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, выпаривание растворителя осуществляли с использованием роторного испарителя, при пониженном давлении при температуре бани примерно 50°С; контроль за ходом реакции осуществляли при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ), и время реакции указано только для иллюстрации; структуру и чистоту всех выделенных соединений подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ (пластины для ТСХ с предварительно нанесенным силикагелем 60 F Merck), масс-спектрометрия или ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Выход продукта приведен только для иллюстрации. Колоночную флэш-хроматографию осуществляли, используя Merck силикагель 60 (230-400 меш ASTM). Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) положительных ионов зарегистрирован на спектрометре Jeol GCMate II при энергии ионизации 70 eV. Спектры ЯМР регистрировали на приборах Bruker Avance-400 (рабочая частота 400.1 и 100.6 МГц для Н и С, соответственно) и Agilent 400-MR (рабочая частота 400.0 и 100.6 МГц для Н и С, соответственно), используя дейтерированный хлороформ (99,8% D) или ДМСО (99,9% D) в качестве растворителя, если не указано иное, относительно тетраметилсилана (TMS) в качестве внутреннего стандарта, миллионных долях (м.д.); обычные используемые сокращения следующие: с - синглет, д - дублет, т - триплет, кв - квартет, м - мультиплет, шир. - широкий и так далее.
Сначала получают три-третбутиловое производное ПСМА-связывающего лиганда формулы (II):
Соединение формулы (III) может быть получено известным из уровня техники способом (Ryan P. Murelli, Andrew X. Zhang, Julien Michel, William L. Jorgensen, David A. Spiege. Chemical Control Over Immune Recognition: A Class of Antibody-Recruiting Molecules (ARMs) that Target Prostate Cancer. J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131, 17090-17092). Затем полученное три-третбутиловое производное ПСМА-связывающего лиганда алкилируют с получением соединения формулы (III). Реакцию алкилирования проводят путем восстановительного аминирования с м-хлорбензальдегидом (Jan Tykvart,  i Schimer, Jitka  Petr Pachl, Lenka  Pavel Majer, Jan Konvalinka, Pavel  Rational design of urea-based glutamate carboxypeptidase II (GCPII) inhibitors as versatile tools for specific drug targeting and delivery. Bioorg Med Chem. 2014, 22(15):4099-108.)
Получение соединения формулы (IV) проводят путем ацилирования производными 5-азидогексановой кислоты с получением азидного производного алкилированного производного ПСМА-лиганда (IV) с последующей реакцией восстановления азида до аминогруппы, при этом реакцию восстановления азида до аминогруппы проводят в присутствии трифенилфосфина и воды в растворе ТГФ или в растворе метанола с использованием водорода в присутствии палладия на углероде в качестве катализатора.
Реакцию ацилирования проводят в среде полярного апротонного растворителя растворяют исходный амин (IV), 6-азидогексановую кислоту и ненуклеофильное основание, взятые из расчета, что на 1 мольный эквивалент амина берут по меньшей мере 1 мольный эквивалент 6-азидогексановой кислоты и основания, а также не менее 100 мольных эквивалента полярного апротонного растворителя, к полученной смеси при перемешивании добавляют по меньшей мере 1 мольный эквивалент РуВОР, полученную смесь перемешивают при комнатной температуре. Контроль за реакцией осуществляют с помощью метода тонкослойной хроматографии с элюентом этилацетат : петролейный эфир=1:1 (III). Исчезновение пятна, соответствующего исходному амину, является свидетельством окончания реакции. Далее из полученную реакционной смеси удаляется растворитель при пониженном давлении, и целевой полупродукт выделяется с помощью колоночной хроматографии (Puriflach SILICA-HP 120G, 50 мкм, градиент от 100% петролейного эфира до 100% EtOAc в течение 30 мин, скорость потока=50 мл/мин). Верхняя граница используемых реагентов не ограничивается, т.к. избыток какого-либо реагента не уменьшает выходов реакций, однако при большом избытке может понадобиться дополнительная очистка продуктов реакций.
f
Далее проводят реакцию восстановления азидо-группы до амино-группы в среде ТГФ/вода с содержанием воды по меньшей мере 10 об. %, в которой растворяют полученное азидо-производное и трифенилфосфин, взятые из расчета, что на 1 мольный эквивалент азидо-производного берут по меньшей мере 1,5 мольных эквивалента трифенилфосфина, а также не менее 50 мольных эквивалентов смеси растворителей (ТГФ/вода 10/1) из расчета на воду. Реакционную смесь нагревают при температуре не менее 45°С. Контроль за проведением реакции осуществляют с помощью ТСХ с элюентом этилацетат : гексан=1:1. Исчезновение пятна, соответствующего исходному азиду (R=0.5) свидетельствует о полном протекании реакции. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (триэтиламин : хлористый метилен: метанол; от 1%:98%:1% до 1%:89%:10%).
Предпочтительно в качестве полярного апротонного растворителя использовать ДМФА или ДМСО.
Полученный амин вводят в реакцию с три-трет-бутиловым эфиром хелатора DOTA в присутствии реагентов HBTU, HOBt и DIPEA в качестве ненуклеофильного основания. На первом этапе реакции проводят активацию кислоты (эфир DOTA) с помощью HOBt, HBTU, DIPEA с целью получения активированного бензотриазолового эфира. Активацию проводят в течение 1 часа. Далее добавляют амин (соединение IV) и перемешивают реакционную смесь в течение 16 часов. После окончания реакции удаляют растворитель и выделяют целевое соединение с помощью колоночной хроматографии (ацетонитрил : вода, от 10%:90% до 100%:0%).
2
На последнем этапе синтеза проводят удаления трет-бутильных защитных групп с помощью раствора трифторуксусной кислоты в воде с добавлением триизопропилсилана. Используют смесь из 95% TFA, 2,5% TIPS, 2,5%НО. Смесь перемешивают 6 часов. После удаляют растворитель и высаживают целевой продукт с помощью диэтилового эфира. Продукт не требует дополнительных методов очистки.
Заявляемые соединения (конъюгаты) можно применять отдельно или в комбинации с другими соединениями, подходящими для диагностики и визуализации заболеваний, вызванных клетками, экспрессирующими ПСМА.
Соединения по настоящему изобретению можно использовать для диагностики практически всех солидных опухолей, экспрессирующих PSMA, включая опухоль легкого, почечно-клеточную, глиобластому, поджелудочной железы, мочевого пузыря, саркому, меланому, молочной железы, толстой кишки, зародышевых клеток, феохромоцитому, пищевода и желудка. Также, в соответствии с настоящим изобретением можно визуализировать некоторые доброкачественные поражения и ткани, включая эндометрии, и хроническую пептическую язву пищевода (синдром Баррета).
ПСМА (PSMA) часто экспрессируется в эндотелиальных клетках капиллярных сосудов в околоопухолевой и внутриопухолевой областях различных злокачественных опухолей, таким образом, соединения по настоящему изобретению и способы диагностики с использованием таких соединений являются подходящими для лечения таких злокачественных опухолей.
Изобретение относится к применению заявляемого соединения для введения субъекту, нуждающемуся в диагностической визуализации. Субъектом для диагностики предпочтительно является млекопитающее, предпочтительно человек.
Для получения изображения клеток/тканей, экспрессирующих ПСМА, т.е. опухолевых клеток или тканей, меченных заявляемым соединением, используют детектор излучения, например, детектора γ-излучения. Для улучшения визуализации предпочтительно использовать методики построения томографического изображения, такие как однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) или позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). Выбор и использование таких детекторов излучения находится в пределах квалификации среднего специалиста в данной области техники.
Следует понимать, что заявляемые соединения могут быть использованы в комбинации с любыми другими способами диагностики рака, включая способы с применением других уже разработанных диагностических и/или терапевтических средств и используя рентгеновскую компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), оптическая визуализация и ультразвук.
111
67
68
90
109
203
105
177
213
44
47
153
161
225
Терапевтически эффективное количество соединения или композиции согласно изобретению выбирают в количестве, достаточном для получения желаемого радиотерапевтического эффекта. При определении дозы для диагностической визуализации во внимание необходимо принимать удельную активность используемого радионуклидного металла. Предпочтительно в качестве металлов использовать трехзарядные катионы металлов, выбранные из In, Ga, Ga, Y, Pb, Pb, Rh, Lu, Bi, Sc, Sc, Sm, Tb и Ac.
Как правило, стандартная доза для введения обладает радиоактивностью приблизительно от 0,01 мКи до приблизительно 300 мКи, предпочтительно от 10 мКи до приблизительно 200 мКи. Для раствора для инъекций предпочтительная стандартная доза составляет приблизительно от 0,01 мл до приблизительно 10 мл. После, например, внутривенного введения, визуализация органа или опухоли in vivo может происходить в пределах от нескольких минут до нескольких часов, после того как меченный радиоактивным изотопом реагент был введен субъекту. Обычно, достаточное количество вводимой дозы будет накапливаться в целевой ткани, которая будет отображаться в течение приблизительно 1-4 часов. Для обнаружения опухолевых клеток или тканей in vitro количество соединения и/или композиции может варьироваться от приблизительно 1 нг/л до приблизительно 1000 мкг/л. Предпочтительнее количество составляет от приблизительно 1 мкг/л до приблизительно 100 мкг/л.
Соединение и/или композиции могут вводиться парентерально, внутримышечно, внутрибрюшинно или любым другим способом, обеспечивающим возможность доставки соединения и/или композиции к клеткам/тканям, экспрессирующим ПСМА. Например, соединение и/или композиции можно вводить субъекту в виде болюса или медленного вливания путем внутривенного впрыскивания. Для этих целей предпочтительно использовать стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки заявляемых соединений и/или композиций. Заявляемые соединения и/или композиции предпочтительно являются стерильными. Стерилизацию можно осуществлять любым известным из уровня техники способом.
Парентеральное введение означает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, как правило, путем инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и интрастернальную инъекции и инфузии.
Дозу соединений в соответствии с настоящим изобретением определяет лечащий врач на основании специфических параметров пациента, таких как возраст, масса тела, пол, тяжесть заболевания и т.п.Доза составляет предпочтительно от 0,00001 до 100 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,001 до 50 мг/кг массы тела, и наиболее предпочтительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела.
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксическому материалу, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевтической композиции. "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к биосовместимому раствору, который в достаточной степени имеет такие характеристики, как стерильность, p[Eta], изотоничность, стабильность и подобные, и может включать любые растворители, разбавители, включая стерильный физиологический раствор, раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, содержащий лактат раствор Рингера для инъекций и другие водные буферные растворы, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и подобные. Фармацевтически приемлемый носитель также может содержать стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты или другие добавки, которые хорошо известны специалистам в данной области, или другой наполнитель, известный из уровня техники.
Концентрация агента для визуализации или терапевтического агента в указанном радиологическом носителе должна быть достаточной для обеспечения удовлетворительной визуализации. Например, при применении водного раствора доза составляет приблизительно от 1,0 до 100 милликюри. Однако фактическая вводимая пациенту доза для целей визуализации определяется лечащим врачом. Указанный агент для визуализации или терапевтический агент должен вводиться таким образом, чтобы оставаться в организме пациента в течение приблизительно от 1 часа до 10 дней, хотя приемлемыми являются и более длительные, и более короткие периоды времени. Таким образом, могут подготавливаться удобные для применения ампулы, содержащие от 1 до 10 мл водного раствора.
Визуализация может быть выполнена обычным способом, например путем введения достаточного количества композиции для визуализации для обеспечения адекватной визуализации и последующего сканирования с помощью подходящего аппарата для визуализации или сканирования, такого как томограф или гамма-камера. Способ визуализации определенной области у пациента включает следующие этапы: а) введение пациенту диагностически эффективного количества соединения в комплексе с радионуклидом; б) экспонирование области организма пациента в сканирующем устройстве; и с) получение изображения указанной области организма пациента.
Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний.
Пример 1.
Синтез соединения (III)
2
4
К раствору соединения II (1000 мг, 2,051 ммоль) в метаноле (60 мл) добавили 4-нитробензальдегид (310 мг, 2,051 ммоль) и перемешивали 16 ч. Далее порционно добавили боргидрид натрия (116 мг, 3,077 ммоль) и перемешивали 1,5 часа. Далее удалили 2/3 растворителя и добавили 10 мл 1М NaOH. Раствор экстрагировали 150 мл хлористого метилена, органическую фракцию промыли 150 мл насыщенным раствором хлорида натрия. Сушили над NaSO. Дальнейшее выделение проводили с помощью колоночной хроматографии (InterchimPuriflash 15μ 25g, От 4% метанола до 20% метанола за 20 минут, скорость потока 20 мл/мин, элюент: хлористый метилен/метанол). Было получено соединение III в виде желтого маслянистого вещества с выходом 55% (707 мг).
1
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
Спектр ЯМРH (400 МГц, CDC1, δ, м.д.): 8.16 (д, J=8.7 Гц, 2Н, Ph), 7.49 (д, J=8.6 Гц, 2Н, Ph), 5.16 (дд, J=18.3 Гц, 8 Гц, 2Н, NH), 4.30-4.34 (м, 2Н, СН), 2.59 (т, J=7 Гц, 2Н, CH(Bz)), 2.25-2.32 (м, 2Н, СН), 2.04-2.06 (м, 1Н, СН), 1.73-1.84 (м, 2Н, СН), 1.58-1.62 (м, 2Н, СН), 1.47-1.54 (м, 2Н, СН), 1.41-1.44 (м, 27Н, С(СН)), 1.33-1.38 (м, 2Н, СН). (фиг. 1)
13
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
3
3
3
2
2
Спектр ЯМР С (101 МГц, CDCl, δ, м.д.): 172.12 (СООС(СН)), 172.00 (СООС(СН)), 171.82 (СООС(СН)), 156.36 (NHC(O)NH), 147.98 (Ph), 146.53 (Ph), 128.18 (Ph), 123.15 (Ph), 81.64 (ОС(СН)), 81.31 (ОС(СН)), 80.10 (ОС(СН)), 52.98 (СН), 52.74 (СН), 52.26 (СН), 48.77 (СН), 32.71 (СН), 31.14 (СН), 29.24 (СН), 27.99 (СН), 22.41 (СН). (фиг. 2)
31
50
4
9
+
ESI-HRMS: для CHNO: m/z рассчитано для [М+Н] 623.3651, найдено: 623.3652. (фиг. 3)
Синтез соединения (IV)
2
4
Соединение III (412 мг, 0,661 ммоль) растворили ДМФА (30 мл) и добавили DIPEA (230 мкл, 1,322 ммоль) и 6-азидогексановую кислоту (156 мг, 0,992 ммоль). К полученной смеси добавили РуВОР (413 мг, 0,793 ммоль), полученную реакционную смесь перемешивали 16 часов. После окончания реакции удалили растворитель при пониженном давлении. Сухой остаток растворили в 100 мл хлористого метилена и промыли дважды 75 мл воды и 100 мл насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фракцию сушили над NaSO. Дальнейшую очистку проводили с помощью колоночной хроматографии (InterchimPuriflash 15μ 25g, скорость потока 20 мл/мин), используя следующий градиент: от 5% EtOAc до 100% за 20 минут.
2
К раствору полученного азида (400 мг, 0,525 ммоль) в смеси ТГФ/HO (5/1, 24 мл) был добавлен трифенилфосфин (275 мг, 1,05 ммоль) и перемешивали 2 часа при температуре 60°С. Далее удалили растворитель при пониженному давлении. Дальнейшую очистку проводили с помощью колоночной хроматографии с элюентом хлористый метилен (1% триэтиламин):метанол (InterchimPuriflash 15μ 25g, скорость потока 20 мл/мин), используя следующий градиент: от 0% метанола до 10% в течение 20 минут. Было получено соединение IV в виде желтого маслянистого вещества с выходом 97% (373 мг).
1
3
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
Спектр ЯМРH (400 МГц, CDCl, δ, м.д.): 7.05-7.16 (м, 2Н, Ph), 6.81-6.89 (м, 2Н, Ph), 5.59-5.72 (м, 1H, NH), 5.33-5.44 (м, 1H, NH), 4.44-4.57 (м, 2Н, СН), 4.25-4.36 (м, 2Н, СН), 3.27-3.39 (м, 1Н, СН), 3.79 (д, J=7.2 Гц, 3Н, ОСН), 3.12-3.17 (м, 1Н, СН), 3.11-3.12 (м, 1H, СН), 2.71-2.77 (м, 1H, СН), 2.25-2.38 (м, 6Н, CH+NH), 2.05-2.08 (м, 1H, СН), 1.80-1.87 (м, 1H, СН), 1.64-1.74 (м, 4Н, СН), 1.50-1.57 (м, 4Н, СН), 1.42-1.45 (м, 29Н, С(СН)+СН), 1.31-1.36 (м, 4Н, СН). (фиг. 4)
13
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
Спектр ЯМРС (101 МГц, CDC1, δ, м.д.): 173.02 (СООС(СН)), 172.81 (СООС(СН)), 172.07 (СООС(СН)), 171.96 (СООС(СН)), 171.92 (СООС(СН)), 171.82 (СООС(СН)), 156.74 (С(O)), 156.63 (С(О)), 146.96 (Ph), 146.66 (Ph), 145.35 (Ph), 144.37 (Ph), 128.00 (Ph), 126.54 (Ph), 123.69 (Ph), 123.28 (Ph), 81.40 (С(СН)), 81.30 (С(СН)), 81.22 (С(СН)), 81.00 (С(СН)), 80.05 (С(СН)), 79.96 (С(СН)), 52.77 (СН), 52.56 (СН), 52.46 (СН), 52.34 (СН), 50.17 (СН), 47.70 (СН), 47.22 (СН), 45.70 (СН), 45.45 (СН), 41.29 (СН), 41.20 (СН), 32.58 (СН), 32.50 (СН), 32.37 (СН), 32.26 (СН), 31.68 (СН), 31.16 (СН), 28.02 (СН), 27.93 (СН), 27.83 (СН), 27.58 (С(СН)), 27.54 (С(СН)), 27.51 (С(СН)), 26.27 (СН), 26.07 (СН), 25.95 (СН), 24.57 (СН), 24.39 (СН), 21.97 (СН), 21.88 (СН). (фиг. 5)
37
61
5
10
+
ESI-HRMS: для CHNO: m/z рассчитано для [М+Н] 736.4493, найдено: 736.4491. (фиг. 6)
Синтез соединения (V)
3
2
2
4
3
DOTA(t-Bu) (50 мг, 87,3 мкмоль), HBTU (43 мг, 113,49 мкмоль), НОВТ (15 мг, 113,49 мкмоль) и DIPEA (17 мг, 23 мкл, 130,95 мкмоль) перемешивали в DMF (3 мл) 1 час. Далее добавили соединение IV (67 мг, 91,66 мкмоль) и перемешивали 16 часов. Далее удалили растворитель, сухой остаток растворили в 50 мл DCM и промыли 2*25 мл HO и 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Органическую фракцию сушили над NaSO. Продукт выделяли с помощью метода обращенно-фазовой хроматографии (Puriflash-C18, 7 ml/min, от 10% CHCN до 100% в течение 20 минут, далее промывка метанолом). Было получено соединение V в виде желтого маслянистого вещества с выходом 28% (33 мг).
1
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Спектр ЯМР H (400 МГц, CDCl, δ, м.д.): 8.13-8.15 (м, 2Н, Ph), 7.36 (д, J=8.4 Hz, 2Н, Ph), 4.55-4.69 (м, 2Н, СН), 4.26-4.30 (м, 2Н, СН), 3.72-3.77 (м, 2Н, СН), 3.45-3.55 (м, 2Н, СН), 3.19-3.31 (м, 8Н, СН), 2.92 (м, 5Н, СН), 2.78-2.79 (м, 3Н, СН), 2.40-2.46 (м, 1H, СН), 2.22-2.34 (м, 3Н, СН), 2.02 (м, 1Н, СН), 1.80-1.85 (м, 1Н, СН), 1.67-1.70 (м, 3Н, СН), 1.51-1.58 (м, 5Н, СН), 1.40-1.43 (с, 53Н, t-Bu), 1.23-1.31 (м, 7Н, t-Bu+CH), 0.96-1.04 (м, 2Н, СН), 0.81-0.86 (м, 4Н, СН). (фиг. 7)
13
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
2
Спектр ЯМРС (100 МГц, CDCl, δ, м.д.): 172.46 (СООС(СН)), 172.39 (СООС(СН)), 172.33 (СООС(СН)), 172.12 (СООС(СН)), 169.80 (СООС(СН)), 145.89 (С(О)), 145.89 (Ph), 128.38 (Ph), 127.14 (Ph), 124.04 (Ph), 123.72 (Ph), 109.99 (Ph), 81.85 (С(СН)), 81.74 (С(СН)), 81.25 (C(CH)), 80.35 (С(СН)), 80.25 (С(СН)), 80.01 (С(СН)), 56.57 (СН), 55.73 (СН), 53.64 (СН), 52.86 (СН), 48.09 (СН), 47.78 (СН), 39.36 (СН), 32.66 (СН), 31.74 (СН), 29.64 (СН), 28.51 (СН), 28.43 (СН), 28.14 (С(СН)), 28.10 (С(СН)), 28.05 (С(СН)), 28.03 (С(СН)), 28.01 (С(СН)), 27.99 (С(СН)), 27.97 (С(СН)), 27.90 (СН), 26.72 (СН), 26.45 (СН), 24.84 (СН). (фиг. 8)
65
111
9
17
+
2+
ESI-HRMS: для CHNO: m/z рассчитано для [М+Н] 1290.8171, найдено: 1290.8167; m/z рассчитано для [М+2Н] 645.9122, найдено: 645.9145. (фиг. 9)
Синтез соединения (I)
2
Соединение V (23 мг, 17,82 мкмоль) растворили в смеси, состоящей из 95% TFA, 2,5% TIPS и 2,5% HO, объемом 2 мл. Смесь перемешивали 6 часов. Далее удалили растворитель. Продукт высадили ДЭК. Было получено соединение I в виде белого порошка с выходом 68% (17 мг).
1
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Спектр ЯМРH (400 МГц, CDCl, δ, м.д.): 12.60 (bs, 3Н, СООН), 8.16-8.24 (m, 2Н, Ph), 7.45-7.43 (m, 2Н, Ph).6.31-6.53 (m, 2Н, NH), 4.39-4.70 (m, 3Н, CH), 4.05-4.06 (m, 6Н, CH+CH), 3.80-3.89 (m, 4Н, СН), 3.72-3.73 (m, 4Н, СН), 3.34-3.40 (т, 8Н, СН), 3.22-3.24 (m, 5Н, СН), 3.08 (m, 10Н, СН), 2.21-2.39 (т, 5Н, СН), 1.90 (m, 1H, СН), 1.62-1.70 (m, 3Н, СН), 1.45-1.53 (m, 8Н, СН), 1.22-1.37 (m, 8Н, СН). (фиг. 10)
13
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Спектр ЯМРС (100 МГц, CDCl, δ, м.д.): 174.49 (СООН), 174.19 (СООН), 173.76 (СООН), 172.34 (СООН), 171.34 (СООН), 171.87 (СООН), 162.36 (С(О)), 158.12 (С(О)), 157.80 (С(О)), 157.30 (С(О)), 146.87 (Ph), 146.52 (Ph), 128.37 (Ph), 127.56 (Ph), 123.89 (Ph), 123.55 (Ph), 118.46 (Ph), 115.49 (Ph), 54.95 (CH), 54.03 (CH), 52.63 (CH), 52.11 (CH), 51.69 (CH), 50.62 (CH), 48.38 (CH), 47.33 (CH), 35.82 (CH), 31.83 (CH), 29.92 (CH), 29.06 (CH), 28.76 (CH), 27.85 (CH), 27.54 (CH), 26.17 (CH), 24.56 (CH), 22.35 (CH), 17.88 (CH), 12.11 (CH). (фиг. 11)
По результатам LCMS 85% в положительном режиме, 100% в отрицательном режиме (фиг. 12)
Растворимость заявляемого соединения и соединения-прототипа проводили при комнатной температуре (25°С) с использованием следующего оборудования:
1. U-2900 Hitachi Double Beam Spectrophotometer. Двулучевой спектрофотометр УФ-видимого диапазона.
2. Кюветы для спектрофотометра кварцевые предназначены для проведения исследований в инфракрасном диапазоне. Для их получения применяется кварц высокого качества: KB и КУ-1. Подразделяются на два вида клееные и спекаемые.
3. Кюветы стеклянные. Им отдают предпочтение при необходимости работы со световым излучением в диапазоне 100-560 нм. Предназначены для использования в большинстве спектрофотометров от отечественных и зарубежных производителей. Изготавливаются обычно из стекла К8 так же двумя способами: спекания и склеивания.
4. Кюветы пластиковые. Представляют собой вид одноразовой лабораторных приборов и могут использоваться для растворов с оптической плотностью 320-2500 нм.
В качестве стандартного образца использовали раствор, приготовленный из 6,979 мл деионизованной воды и 0,021 мл диметилсульфоксида. Получали 7 мл раствора.
При регистрации спектров поглощения образца заявляемого соединения было установлено, что максимальное поглощение растворов достигается при длине волны 279 нм. Данное значение длинны было выбрано в качестве контрольной длинны волны измерения.
Для измерения растворимости заявляемого соединения были приготовлены его растворы с известными концентрациями (0,013, 0,032, 0,065, 0,13, 0,26 мг/мл) в воде (Фиг. 13).
С использованием полученных данных была построена калибровочная зависимость оптического поглощения от концентрации раствора конъюгата при длине волны 279 нм (Фиг. 14).
278
В результате было установлено, что зависимость оптического поглощения от концентрации может быть описана уравнением Abs=3,622×С - 0,012. С использованием данного уравнения была оценена растворимость в испытуемом образце.
Для определения растворимости была отобрана навеска 5 мг опытного образца соединения и растворена в 100 мкл деионизованной воды с использованием УЗИ-бани (ультразвуковая частота: 35 кГц; пиковая мощность ультразвука: 320 Вт; высокочастотная мощность: 80 Вт эфф.) в течение 5 минут.Полученный раствор был отфильтрован и разбавлен в 100 раз. Поглощение раствора 0,675 единиц, при контрольной длине волны измерения 279 нм (Фиг. 15). С использованием ранее построенной калибровочной зависимости, была установлена растворимость соединения по формуле:
где С - концентрация в мг/мл, Abs - поглощение при контрольной длине волны 279 нм. Таким образом, растворимость соединения составила 18,9 мг/мл или 13,49 mM.
По результатам испытаний было установлено, что растворимость заявляемого соединения составляет 13,49 мМ.
4-нитро - 18,97 мг/мл (13,49 мМ)
4-бром - 0,17 мг/мл (0,120 мМ)
90
90
90
90
Y
ДТПА
Комплексообразование конъюгата с катионами радионуклидов сравнивали на примере изотопа Y, который был получен из радионуклидного генератора Sr/Y на хроматографической смоле Sr-resin (Triskem Inc). Методом тонкослойной хроматографии были разделены фракции радионуклида, связанные в комплекс с пептидом и несвязанные, в присутствии различной концентрации лиганда - конъюгата - Br- или NO2-соединений. Использованный метод [Nucl. Med. Biol., 55 (2017) 38-46] позволяет рассчитывать константы устойчивости комплексных соединений с небольшими количествами биологически активных молекул, таких как ингибиторы простат-специфического мембранного антигена. В качестве конкурирующего хелатирующего агента используется известный полиаминокарбоксилат - диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) 1og K-=21,2 [Chem. Soc. Rev., 43 (2014) 260-290]. Образование комплекса с NO2- или Br- соединениями проводили в присутствии ДТПА. Радионуклид Y, неспецифически связанный с NO2-DOTA-ПСМА, был в хелате с ДТПА.
Для расчета констант комплексообразования заявляемого соединения и соединения-прототипа готовили серию растворов по 100 мкл с одинаковым одинаковым содержанием 90Y 1 кБк и разным соотношением NO2-DOTA-PSMA/ДТПА=l-10. Для установления рН 6 использовали 0,1 М водный раствор морфолино-этансульфоновой кислоты (MES). Далее растворы выдерживали при 95°С в течение 15 минут, охлаждали и проводили тонкослойную хроматографию. Измерение радиоактивности участков пластины проводили методом жидкостно-сцинтилляционного счета.
Расчет констант комплексообразования проводили согласно уравнениям, приведенным в [Nucl Med Biol., 55 (2017) 38-46.]. Полученные значения (табл. 1) свидетельствуют о том, что использованная модификация заявляемого соединения не ухудшает комплексообразующих свойств по отношению к катионам в сравнении с Br-соединением (соединение-прототип).
3
68
90
Для определения возможности диагностики опухолей исследовали биораспределение на лабораторных мышах-самцах BALB/c nu/nu с ксенографтами опухоли рака простаты (клеточная линия LNCaP) размером около 1 см. Соединения, меченные радионуклидом, вводили через хвостовую вену 0,8-1,2 МБк [Ga]Ga-DOTA-PSMA или 50 кБк [Y]Y-DOTA-PSMA на мышь.
Для исследования in vivo меченные соединения получали следующим образом:
90
68
90
90
68
68
3
3
К 760 мкл раствора [Y]YCl 200 кБк или [Ga]GaCl 4 МБк в 0,1 М HCl, полученных из радионуклидных генераторов Sr/Y и Ge/Ga, соответственно, добавляли 20 мкл водного раствора NO2-DOTA-PSMA с концентрацией 0,5 мг/мл, 20 мкл 0,5 г/мл раствора NaOAc рН 5. Выдерживали полученный раствор при 95°С в течение 15 минут.(J. Med. Chem. 53 (2010) 5333-5341).
68
68
Постмортальное исследование органов проводили через 1 час после инъекции. Органы промывали, взвешивали и измеряли. Измерение радиоактивности проводили методом гамма-спектрометрии для Ga. Накопление в органах рассчитывали в процентах от введенной дозы на грамм органа (% в.д./г) (табл. 2). Для тестирования специфичности связывания с клетками in vivo проводили дополнительный эксперимент, в котором параллельно с [Ga]Ga-DOTA-PSMA вводили 2-(фосфонометил)-пентандиовую кислоту, 2-ФМПК, которая блокирует ПСМА-рецепторы (фиг. 16).
90
Исследование биораспределения через 1 и 24 часа проводили с меченным Y соединением. Измерение радиоактивности в органах проводили с помощью жидкостно-сцинтилляционного счета. Для этого органы после гомогенизации смешивались с жидким сцинтиллятором. Для учета оптического гашения использовали ранее построенную калибровочную кривую гашения (фиг. 17).
Результаты биораспределения меченных галлием-68 и иттрием-90 соединений показывают более высокое накопление в почках и опухоли по сравнению с остальными органами (табл. 3). В случае меченного галлием-68 соединения в присутствии блокирующего агента 2-ФМПК через 1 час наблюдается практически полное отсутствие накопления в почках и опухоли, что свидетельствует о достаточной специфичности соединения к клеткам, экспрессирующим ПСМА в условиях in vivo (фиг. 18). Далее, данные по [90Y]Y-PSMA через 1 час согласуются с результатами по [68Ga]Ga-PSMA, из чего можно сделать вывод об отсутствии влияния природы трехзарядного катиона на биораспределение соединения. Согласно биораспределению через 24 часа превалирующее накопление соединения в почках через 1 час значительно снижается и максимальное содержание соединения наблюдается в опухоли.