СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПСИХОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И НЕЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
METHOD FOR DETECTING PSYCHOTROPIC ACTIVITY OF DRUG AND DRUG-FREE SUBSTANCES

Изобретение относится к области экспериментальной фармакологии и медицины и может быть использовано для выявления психотропных свойств изучаемых лекарственных и нелекарственных веществ.
Существующие методы оценки поведенческих реакций лабораторных животных для целей фармакологического скрининга (Крушинский Л.В. Биологические основы рассудочной деятельности: Эволюционные и физиолого-генетические аспекты поведения./Л.В.Крушинский. - М., 1977.; Тихончук В.С, Антипов В.В., Давыдов Б.И., Ушаков И.Б. // Изв. АН СССР, сер. биол. - 1982. - №2. - С.284-287) имеют ряд ограничений, которые связаны с высокими затратами времени на проведение эксперимента, большой вариабельностью получаемых результатов во времени для различных особей животных и невысокой вероятностью их проявления среди популяции животных.
Для оценки противоишемической активности лекарственных веществ в отношении гипоксии мозга известен метод проведения билатеральной окклюзии артерий - лигирование общих сонных артерий под наркозом (Мирзоян Р.С. Методические указания по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени. / Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ./ Под общей редакцией Р.У.Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.). Метод приемлем для исследования влияния веществ на мозговое кровообращение и не предназначен для оценки других проявлений психотропной активности изучаемых веществ.
Для изучения влияния различных факторов (в т.ч. лекарственных веществ) на неврологический статус животных проводят оценку по суммарной 12-балльной системе. Каждую реакцию оценивают, исходя из возможного максимального количества баллов, равного 2-м - нормальные (2 балла), сниженные (1 балл) или отсутствующие (0 баллов) рефлексы. Оценивают следующие рефлексы - реакция отдергивания хвоста и лапы, реакция вздрагивания на звуковой раздражитель, хватания передними лапами, переворачивания, роговичный рефлекс (Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения./Я.Буреш, О.Бурешова, Д.П.Хьюстон./Пер. с англ. Е.Н.Живописцевой. - М., Высшая школа, 1991. - 399 с.).
Известен метод и способ определения психотропных свойств лекарственных веществ на животных, заключающийся в том, что после введения изучаемого вещества осуществляют подвешивание животного за хвост в специальном устройстве, оснащенном датчиком, чувствительным к вертикальному смещению тела животного, являющемуся проявлением беспокойства и ажитации (FR2577791 (A1). Method and device for evaluating the psychotropic effects of medicinal substances on animals /Stem Lucien/ A01K 29/00; A61B 5/11; (IPC1-7): A61B 10/00; A61B 5/16; A61K 49/00; G01N 33/15).
Показатели локомоторной активности региструют с помощью актометров или актографов. Например, при использовании прибора «Ugo Basile» (Италия) крысу помещают в камеру размером 37×27×27 см с прозрачным верхом и полом из 30 стальных перекладин, расположенных на равном расстоянии и изолированных друг от друга. Регистрацию результатов проводят с помощью прилагаемого принтера. Двигательную активность регистрируют в течение 5 мин и оценивают в условных единицах. Приборы актографы позволяют оценить влияние преимущественно на двигательную активность животных, кроме того серьезным недостатком является высокая стоимость данных приборов.
Для оценки свободного поведения крыс известно использование теста «открытое поле». Для этого животных помещают на определенное фиксированное время, например 3 мин, на хорошо освещенное «поле» - в квадратный манеж различных размеров. Стандартная модель поля для крыс представляет собой квадратный манеж из фанеры размером 80×80 см, ножки у основания длиной 15,0 см. Поверхность манежа разделена на 16 окрашенных и неокрашенных квадратов со стороной 20 см, чередующихся в шахматном порядке. В центре каждого квадрата располагается отверстие размером 3,8 см - «норка». Известны также различные модификации манежей по размерам и форме. Горизонтальную активность - показатель локомоции - учитывают по количеству переходов животных по квадратам. Вертикальную активность (или «стойки») определяют как число подъемов на задние лапы при полном отрыве обеих передних конечностей от дна - является критерием ориентировочной реакции. Учитываемое количество фекальных болюсов отражает вегетативные последствия эмоциональной реакции страха, вызванного помещением животного в незнакомую обстановку. Норковый рефлекс определяют по количеству заглядываний в «норки» - характеризует спонтанную исследовательскую деятельность. Количество актов груминга, т.е. самовылизывания и почесывания характеризует эмоциональный статус. Фиксируемое время наблюдения (стандартное рекомендуемое время - 3-10 минут, при необходимости может быть увеличено или уменьшено), учитывают при помощи секундомера (Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма /В.А.Волчегорский [и др.]. - Челябинск: ЧГПУ, 2000. - 167 с.). Методика позволяет оценить влияние на двигательную активность и общий эмоциональный статус животного.
Известна методика, предполагающая использование приподнятого крестообразного лабиринта. Наиболее его распространенным вариантом является установка состоящая из 4-х крестообразно расходящихся от центральной площадки рукавов (два открытых и два закрытых). Животное помещают на центральную площадку головой к открытому рукаву, за определенный период времени (от 5 мин и с интервалами повторно) регистрируют время пребывания в открытых и закрытых рукавах, центральной площадке, количество заходов в открытые и закрытые рукова, латентный период первого захода в открытый рукав. Регистрируется также количество мочеиспусканий и фекальных болюсов, количество вертикальных стоек. Эмоциональную активность оценивают по количеству фекальных болюсов и мочеиспусканий. Двигательную активность оценивают по общему количеству заходов в открытые и закрытые рукава и вертикальным стойкам. Модель предназначена для оценки анксиолитической активности изучаемых веществ, вещества с анксиолитическим эффектом увеличивают число заходов в светлые рукава и время нахождения в них без общего увеличения числа заходов (Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ./Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ./Под общей ред. Р.У.Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.).
Предложен ротометр для лабораторных животных (Заявка на изобретение RU 92000559, МПК А61В 5/00), который согласно описанию может быть использован при исследовании препаратов на психотропную активность. Согласно описанию для повышения производительности и качества исследований, а также расширения функциональных возможностей ротометра, в ротометр для лабораторных животных введены третья оптронная пара и узел регистрации, выполненный в виде электронного блока.
Для выявления свойств препаратов с предполагаемым психотропным действием известен способ (Пат. RU 2328038, МПК G09B 23/28), заключающийся в формировании у инбредных мышей психоэмоционального расстройства в условиях социального конфликта. Для выявления лечебных свойств препарата у животных формируют психоэмоциональное расстройство в условиях хронического социального конфликта в течение 20-30 дней, затем помещении животных в комфортные условия проживания и ежедневном назначении исследуемого препарата в течение не менее 2-х недель. Для выявления протекторных свойств препарата у животных в течение 5-7 дней формируют контрастные типы социального поведения и на их фоне ежедневно вводят исследуемый препарат в течение 2-х недель.
Предложен способ (Заявка на изобретение RU 2001103771, А61В 5/11) выявления психотропных свойств веществ, включающий в себя помещение животных, находящихся под воздействием исследуемого вещества, в камеру, количественную оценку интегративных показателей поискового поведения у подопытных животных, отличается тем, что оценку проводят при различных мотивациях. В качестве экспериментальной установки используется проблемная камера. Устройство для выявления психотропных свойств у фармакологических препаратов, включающее проблемную камеру, регистратор, отличающеся тем, что на электродный пол установлен съемный настил, поилки и кормушки ставятся за пределами камеры.
Известен способ моделирования деперсонализационного расстройства, который согласно описанию может быть использован при проверке новых психотропных средств (Пат. RU 2311691, МПК G09B 23/28). Способ заключается в том, что у грызунов определяют болевые пороги (БП) чувствительности и переносимости (БПЧ и БПП). Затем за 20-30 минут перед стрессорным воздействием проводят инъекцию нейротропного средства. Через 15-25 минут непосредственно перед стрессорным воздействием повторно замеряют БПЧ и БПП и подвергают грызунов неизбегаемому стрессорному воздействию в течение 4-6 минут. При этом регистрируют суммарную продолжительность иммобилизации. Через 2-10 минут после окончания стрессорного воздействия повторно определяют БПЧ и БПП. По характеру сочетания продолжительности иммобилизации и изменений БПЧ и БПП судят о чувствительности грызунов к стрессу и выраженности деперсонализации. По изменению БП между первым и вторым их измерениями судят о влиянии препарата на болевое восприятие, а между вторым и третьим измерениями БП - о выраженности аналгезии, вызванной стрессом. Согласно описанию способ позволяет изучать механизмы формирования деперсонализационного расстройства и разрабатывать методы его терапии.
Предложен способ оценки степени угнетения нервной системы при алкогольной интоксикации в эксперименте (Заявка на изобретение RU 2009123622, МПК А61В 10/00) путем изучения клинической картины отравления у животных, отличающийся тем, что определяют по формуле индекс тяжести угнетения нервной системы. Предложенный индекс тяжести угнетения нервной системы определяют согласно описанию в баллах на основании клинической оценки показателей: поведения животных, глоточного рефлекса, тактильно-болевой чувствительности, рефлекса сгибания задних конечностей, зрачкового рефлекса, корнеального рефлекса. Для интерпретации значений используют предложенные согласно описанию диапазоны полученных баллов.
Известна установка «Экстраполяционное избавление», предназначеная согласно описанию [Интернет-сайт ООО «НПК Открытая Наука», http://www.openscience.ru/index.php?page=ts&item=004], для изучения когнитивных функций грызунов в условиях острого стресса и позволяет оценить: индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути избавления из острой стресс-ситуации); становление когнитивных функций в онтогенезе; влияние фармакологически-активных веществ. Согласно описанию, установка предназначена для тестирования крыс и представляет собой внутренний цилиндр, выполненый из прозрачного акрилового пластика, внешнюю емкость из белого полипропилена, стальные крепления удерживают цилиндр в центре емкости. Для тестирования животных необходимо наличие воды (22°С) во внешней емкости, цилиндр должен быть погружен в воду на 2,5 см). В том числе, согласно описанию, установка пригодна для скрининга анксиолитиков, психостимуляторов, нейролептиков, атипичных транквилизаторов, антидепрессантов, нейропротекторов.
Наиболее близким к настоящему изобретению является известный тест «принудительное плавание». Принцип теста сводится к оценке продолжительности жизни животных в условиях физической нагрузки (плавание) при относительно низкой температуре воды (на 17-20°С ниже средней температуры тела). Тест осуществляется как на мышах, так и на крысах. Животных вынуждают плавать при низкой температуре воды в течение 30 минут. Регистрируют время плавания до наступления летального исхода и оценивают смертность (в процентах от общего числа мышей) за период наблюдения. Для постановки теста на мышах используют стеклянные хроматографические камеры размером 29×19×40,5 см или пластиковые ведра сходных размеров. При проведении теста принудительного плавания на мышах высота водного столба должна быть не менее 20 см. Для проведения теста «принудительного плавания» на крысах используется резервуар большей емкости, например, согласно описанию, металлический бак круглого сечения, диаметром 63 см, высотой 72 см. Водный столб не менее 50 см, высота части бака, которая не занята водой не менее 22 см. Температура воды для «принудительного плавания» крыс колеблется в диапазоне 17-18°С. В остальном тест проводится аналогично вышеописанной методике для мышей. При соблюдении описанных условий, по данным авторов, летальность крыс составляет 93,87% за 30-минутный период наблюдения, средняя латентность гибели животных равняется 18,88±2,2 минутам (Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма /В.А.Волчегорский [и др.]. - Челябинск: ЧГПУ, 2000. - 167 с.). Указанные параметры теста следует расценить как недостатки, так как, во-первых, согласно описанию, модель предусматривает высокий процент гибели животных, что не вполне отвечает современным принципам гуманного обращения с животными, и, кроме того, повышает расход животных на проведение эксперимента, соответственно повышая затраты; во-вторых, указанный период наблюдения является достаточно длительным, что увеличивает затраты времени на проведение эксперимента. Согласно описанию, тест принудительное плавание предназначен для интегральной оценки механизмов резистентной (т.е. стрессорной) стратегии адаптации, то есть не предназначен непосредственно для выявления психотропной активности изучаемых веществ.
Задачей настоящего изобретения является создание способа, пригодного для скрининга и изучения фармакологической активности веществ, обладающих потенциальными психотропными свойствами.
Технический результат заключается в быстроте, простоте и низкозатратности способа.
Технический результат достигается тем, что способ выявления психотропной активности лекарственных и нелекарственных веществ состоит в моделировании эмоционально-физической стрессовой ситуации, достигаемой помещением животных в стеклянный цилиндр, заполненный холодной водой, первом предъявлении средств спасения в виде рейки, лестници или веревки, установленных в цилиндре, втором предъявлении средства спасения через заданный промежуток времени, регистрации времени от момента погружения в воду до момента выбора средства спасения (время нахождения решения задачи ВНР) и времени от момента выбора средства спасения до попадания на выходную площадку, расположенную над цилиндром с водой (время выполнения решения задачи ВВР), подсчете количества животных, успешно выполнивших задачу и вычислении вероятности решения задачи (ВРЗ) по формуле
где n - количество животных в группе, успешно выполнивших задачу, N - общее количество животных в группе, подвергнутых эксперименту, вычислении индекса психоэмоционального воздействия (ИПД) по формуле
o1
о2
o1
о2
к1
к2
к1
к2
где BHP - время нахождения решения задачи при первом предъявлении средства спасения в опытной группе; ВНР - время нахождения решения задачи при последующем после первого через заданный промежуток времени (повторном) предъявлении средства спасения в опытной группе; BP3 -вероятность решения задачи в процентах (см. выше) при первом предъявлении средства спасения в опытной группе; ВРЗ - вероятность решения задачи в процентах (см. выше) при повторном предъявлении средства спасения в опытной группе; ВНР - время нахождения решения задачи при первом предъявлении средства спасения в контрольной группе; ВНР - время нахождения решения задачи при повторном предъявлении средства спасения в контрольной группе; ВРЗ - вероятность решения задачи в процентах при первом предъявлении средства спасения в контрольной группе; ВРЗ - вероятность решения задачи в процентах при повторном предъявлении средства спасения в контрольной группе,
и индекса моторно-двигательного воздействия (ИДД) по формуле
о1
о2
о1
о2
к1
к2
к1
к2
где ВВР - время выполнения решения задачи при первом предъявлении средства спасения в опытной группе; ВВР - время выполнения решения задачи при последующем после первого через заданный промежуток времени (повторном) предъявлении средства спасения в опытной группе; ВРЗ - вероятность решения задачи в процентах (см. выше) при первом предъявлении средства спасения в опытной группе; ВРЗ - вероятность решения задачи в процентах (см. выше) при повторном предъявлении средства спасения в опытной группе; ВВР - время выполнения решения задачи при первом предъявлении средства спасения в контрольной группе; ВВР - время выполнения решения задачи при повторном предъявлении средства спасения в контрольной группе; ВРЗ - вероятность решения задачи в процентах при первом предъявлении средства спасения в контрольной группе; ВРЗ - вероятность решения задачи в процентах при повторном предъявлении средства спасения в контрольной группе,
причем, если ИПД<1,0, то изучаемое вещество характеризуется наличием психостимулирующего эффекта и свидетельствует о вероятности наличия общестимулирующей, тонизирующей, адаптогенной, ноотропной активности изучаемого вещества, ИПД>1,0 - характеризует наличие психоседативного эффекта и свидетельствует о вероятности наличия седативной, нейролептической, транквилизирующей, депримирующей активности изучаемого вещества, если ИДД<1,0, то изучаемое вещество характеризуется способностью повышать двигательную активность и свидетельствует о вероятности наличия общестимулирующего, актопротекторного эффектов изучаемого вещества, ИДД>1,0 -характеризует способность изучаемого вещества снижать двигательную активность и свидетельствует о вероятности наличия психоседативного, миорелаксирующего, атаксического эффектов изучаемого вещества.
Моделирование эмоционально-физической стрессовой ситуации можно осуществить на установке, предложенной коллективом авторов (Ю.Н.Чернов, М.В.Васин, С.Н.Комарова. Экспериментальная модель эвристических решений в опытах на крысах для фармакологического скрининга. Фармакология и токсикология. 1989, т.52, №4, с.96-99) с модификациями.
На фиг.1 представлена схема устройства; на фиг.2 - Таблица 1 -сохранение памяти о найденном решении задачи в условиях необходимости смены стереотипа (Примечание: * - р<0,05 достоверность различий по сравнению с исходными данными по группе; условные обозначения: ВРЗ, % - вероятность решения задачи в процентах; средства спасения: 1 - рейка, лестница, 2 - веревка; 1+1 - рейка, лестница при первом и втором предъявлении - без смены способа спасения, 1+2 - рейка, лестница при первом предъявлении и веревка при втором предъявлении - смена способа спасения; 2+2 - веревка при первом и втором предъявлении - без смены способа спасения); на фиг.3  - Таблица 2 - влияние тренировки на скорость решения задачи в условиях необходимости смены стереотипа (Примечание: использованы условные обозначения: средства спасения: 1 - рейка, лестница, 2 - веревка; ВНР - время нахождения решения задачи, ВВР - время выполнения решения задачи, ВРЗ, % - вероятность решения задачи в процентах); на фиг.4 Таблица 3 - оценка психотропной активности известных веществ при помощи экспериментального моделирования задачи поиска эвристических решений (Примечание: * - р<0,05 к группе контроля, ** - р<0,05 к исходному фону).
Устройство для выявления психотропной активности веществ при помощи построения эвристической модели процесса поиска животным решения задачи по спасению состоит из стеклянного цилиндра 1, заполненного водой 2, выходной площадки 3, навеса 4, рейки или лестницы 5, крестовины для фиксации веревки 6, веревки 7, лотка 8 со стенками 12, помещенного в лоток хладоэлемента 9, верхней камеры для цилиндра 10, нижней камеры для хладоэлемента 11, нижнего дна лотка 13, верхнего дна лотка 14.
Стеклянный цилиндр 1 имеет диаметр 24,0 см и высоту 42,0 см, наполняется холодной (10-12°С) отстоянной водопроводной водой. Охлаждение воды осуществляют любым известным способом, например путем охлаждения отстоянной водопроводной водой комнатной температуры в холодильной камере бытового холодильника. Перед помещением каждого животного в цилиндр температура воды контролируется при помощи электронного термометра.
Для поддержания постоянной желаемой температуры воды стекляный цилиндр помещают в лоток 8 с камерой для расположенного в нем хладоэлемента 9. Лоток выполнен из листов пенополистирола со стенками 12 толщиной 2,0 см. Лоток состоит из нижней камеры 11 для хладоэлемента и верхней камеры 10 для цилиндра с водой, размеры лотка - высота 15,0 см от дна, наружный размер нижнего дна 29,0×29,0 см. Камера для хладоэлемента имеет два дна - верхнее дно 13 и нижнее дно 14. В закрытом виде камера для хладоэлемента виде представляет собой паралелепипед с размерами нижнего дна 29,0×29,0 см, верхнего дна 25,0×25,0 см и высотой 7,5 см, лист верхнего дна имеет сквозную прорезь посередине с размерами 1,5×2,0×2,0 см для удобства извлечения листа верхнего дна. Верхняя камера для цилиндра имеет наружные стенки высотой 7,5 см от верхнего дна, дном камеры для цилиндра является лист верхнего дна камеры для хладоэлемента с размерами 25,0×25,0 см. Лоток устанавливают на горизонтальную поверхность, снимают лист верхнего дна с камеры путем захватывания пальцем через прорезь, в камеру на нижнее дно помещают хладоэлемент, помещают лист верхнего дна обратно, далее на верхнее дно сверху устанавливают цилиндр и заполняют его водой. Используют хладоэлемент любой известной марки, выпускаемый промышленным путем, например хладоэлемент многоразовый МХД-1 размерами 165×95×33 мм. Перед использованием хладоэлемент замораживают в морозильной камере бытового холодильника при температуре минус 18,0°С±2,0°С на 15-24 часа, затем выдерживают при комнатной температуре (+20,0±2,0°С) 1 час и затем закладывают в лоток под верхнее дно камеры для хладоэлемента.
Вода наливается в цилиндр до уровня 15,0 см от дна. Такой уровень воды исключает возможность контакта конечностей животного с дном цилиндра и избегания таким образом стрессовой ситуации по необходимости плавания в холодной воде.
В цилиндр опускается предлагаемое средство спасения - рейка 5, лестница или веревка 7. Рейка и лестница выполнены из дерева, веревка хлопчатобумажная. Одним концом лестница или рейка упираются в дно цилиндра под углом 60°, а противоположным фиксируются на его краю к выходной площадке. Выходная площадка 3 прикрыта смонтированным на ней навесом 4, что имитирует «нору». Веревка 7 одним концом привязывается к центру крестовины 6 из реек, помещенной сверху на цилиндр, другой конец веревки свободно свисает над поверхностью воды, заполняющей цилиндр.
Подопытное животное помещают в цилиндр с холодной водой и осуществляют наблюдение, регистрируя время решения и выполнения задачи покинуть цилиндр.
Время наблюдения составляет 2 минуты. Если по прошествии 2-х минут животное не выполнило задачу по спасению (т.е. не выбрало средство спасения и продолжает плавать либо начинает тонуть), животное извлекают из цилиндра и учитывают данный результат как не выполнение задачи. Количество таких животных, не выполнивших задачу, вычитают из общего количества животных в группе, получая количество животных, успешно выполнивших задачу.
Для изучения способности к смене стереотипа способа решения задачи животных тренируют покидать цилиндр с холодной водой с помощью одного из средств спасения ежедневно в течение 3 сут. На 4-й день животным предоставляют возможность решить задачу с помощью ранее не встречавшегося предмета. Сохранение памяти о решенной задаче оценивают по скорости ее решения при повторном ее предъявлении через 15 мин, 2, 4, 6 ч, 1 и 7 суток после первого эксперимента.
Критерии оценки:
- время нахождения решения задачи (сек) - далее условно обозначено аббревиатурой ВНР, время от момента погружения в воду до момента выбора средства спасения (веревка, лестница или рейка). Время измеряют при помощи секундомера. Характеризует эмоциональный статус и функции высшей нервной деятельности испытуемого животного.
- время выполнения решения задачи (сек - далее условно обозначено аббревиатурой ВВР, время от момента выбора средства спасения до попадания на выходную площадку, расположенную над цилиндром с водой. Время измеряют при помощи секундомера. Характеризует преимущественно двигательный статус, в том числе мышечный тонус.
- вероятность решения задачи (%) - далее условно обозначено аббревиатурой ВРЗ, количество животных, успешно выполнивших задачу в процентах от общего количества животных в группе, вычисляют по формуле
где ВР3 - вероятность решения задачи в процентах, n - количество животных в группе, успешно выполнивших задачу, N - общее количество животных в группе, подвергнутых эксперименту.
Для обработки данных и их интерпретации вычисляют индексы: Индекс психоэмоционального воздействия (ИПД) и Индекс моторно-двигательного воздействия (ИДД) по формулам (2) и (3):
Индекс психоэмоционального воздействия характеризует влияние изучаемого вещества на общий психоэмоциональный статус и оценивается по способности изменять время, затрачиваемое животным на процесс поиска эвристического решения задачи по спасению в динамике при первом и последующем предъявлении способов решения задачи.
Критерии оценки величин Индекса психоэмоционального воздействия: ИПД<1,0 - характеризует психостимулирующий эффект изучаемого вещества; свидетельствует о вероятности наличия общестимулирующей, тонизирующей, адаптогенной, ноотропной активности изучаемого вещества. ИПД>1,0 - характеризует психоседативный эффект изучаемого вещества; свидетельствует о вероятности наличия седативной, нейролептической, транквилизирующей, депримирующей активности изучаемого вещества.
Индекс моторно-двигательного воздействия характеризует влияние изучаемого вещества на двигательный статус и оценивается по способности изменять время, затрачиваемое животным на выполнение решения задачи по спасению в динамике при первом и последующем предъявлении способов решения задачи.
Критерии оценки величин Индекса моторно-двигательного воздействия: ИДД<1,0 - характеризует способность изучаемого вещества повышать двигательную активность; свидетельствует о вероятности наличия общестимулирующего, актопротекторного эффектов изучаемого вещества. ИДД>1,0 - характеризует способность снижать двигательную активность изучаемого вещества; свидетельствует о вероятности наличия психоседативного, миорелаксирующего, атаксического эффектов изучаемого вещества.
Пример 1
Изначально проведена апробация пригодности предлагаемого способа путем изучения поведенческих реакций здоровых животных при эвристическом поиске решения задачи избегания экстремальной ситуации. В данной серии опытов никакие вещества животным не вводили и оценивали их поведенческие реакции в предлагаемой модельной ситуации.
Опыты проведены на 141 белых аутбредных крысах самцах массой 220-260 г. Животные были разделены на группы в зависимости от целей экспериментов с соблюдением принципа парных аналогов. Достоверность различий между полученными цифровыми значениями по экспериментальным группам проводили по методу Фишера (Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. /Е.В.Гублер. - Л., 1978).
Установлено, что в группе здоровых интактных крыс (контрольная группа) среднее время для решения задачи по избеганию стрессовой ситуации плавания в холодной воде при помощью рейки или лестницы существенно не различалось и составило для 40 животных в среднем 90,7 с (78,2÷103,2). Время решения задачи при помощи веревки составило 155,2 с (131,1÷179,3).
Вероятность выполнения задачи соответствовала 97,3% при предъявлении рейки или лестницы и 87,0% - веревки. При повторном тестировании через 15 мин, вновь попадая в сходную ситуацию, животные выполняли ту же задачу в 3-5 раз быстрее (табл.1).
Установлено, что память о найденном способе избегания экстремальной ситуации сохранялась в течение 7 сут. Причем память о единственно возможном решении данной задачи носила обобщенный характер с фиксацией конечной цели поведенческой реакции. Замена предмета спасения (рейки на веревку), ведущая к смене определенного стереотипа действий, практически не повлияла на результат выполнения задачи (см. табл.1).
Ежедневная в течение 3 дней тренировка может сократить время, за которое крыса покидает емкость с холодной водой с помощью предлагаемых средств спасения, практически до нескольких секунд (табл.2). Смена рейки или лестницы на веревку в этой ситуации не оказывала существенного влияния на скорость выполнения поведенческой реакции.
Сокращение времени первого решения задачи было достигнуто за счет предварительной экспозиции животного в холодной воде в течение 15 мин, без средств спасения, что усиливало мотивацию более быстрого поиска оптимального выхода из неблагоприятной стрессовой ситуации.
Предложенный более сложный способ избегания экстремальной ситуации с помощью веревки отодвигает во времени решение задачи по сравнению со случаем более простого пути достижения цели (табл.2), так как выполнение упражнения на веревке требует от животного значительно больше времени, чем на рейке или лестнице. При ежедневной тренировке время на принятие решения сокращается, но различие между ситуациями с более и менее сложными способами достижения цели сохраняется (см. табл.2). Данный пример свидетельствует о способности животных прогнозировать сложность и конечный итог деятельности до начала осуществления поведенческого акта. К эвристическому решению животное приходит, перебирая наиболее легкие возможные пути достижения цели с дальнейшим формированием более сложной цепи действий до начала осуществления поведенческой реакции.
Таким образом, предлагаемый способ пригоден не только для изучения влияния различных факторов (в т.ч. лекарственных и нелекарственных веществ) на скорость решения относительно несложной для грызунов задачи, что позволяет определить воздействие различных факторов на двигательную функцию и общий психический статус, но так же способ пригоден для оценки влияния на высшую нервную деятельность и способность к формированию цельного поведенческого акта с фиксацией конечной цели действий, что обеспечивает возможность выявления влияния на когнитивные процессы.
Пример 2
Исследования проведены на 258 белых крысах самцах со средней массой тела 210-230 г. Известные лекарственные вещества, проявляющие психотропную активность (хлорпромазин, натрия оксибутират, морфин, феназепам, пирацетам, фенамин, кофеин, стрихнин) вводили животным внутрибрюшинно. С учетом известных данных о фармакокинетике тестируемых веществ, фенамин, кофеин, хлорпромазин, пирацетам, натрия оксибутират, морфин вводили за 30 мин. до помещения животного в цилиндр с водой; стрихнин - за 15 мин, феназепам за 60 мин. Исследовано влияние известных по литературным данных доз перечисленных тестируемых веществ, проявляющих психотропную активность, испытанные дозы указаны далее в таблице (см. табл.3). Все исследования проводились в параллельных группах, из которых одна обязательно являлась группой биологического контроля - здоровые животные, без введения каких либо лекарственных веществ. Достоверность различий между экспериментальными группами определяли по методу Фишера [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов./Е.В.Гублер. - Л., 1978].
В табл.3 представлены данные по влиянию тестируемых известных веществ, проявляющих психотропную активность, на способность животных к нахождению и выполнению решения задачи по избеганию стрессовой ситуации.
Установлено, что при применении хлорпромазина в дозе 5 мг/кг, морфина в дозах 5-10 мг/кг и натрия оксибутирата в дозе 250 мг/кг наблюдалось значительное снижение количества животных, успешно решивших задачу при первом предъявлении (вероятность решения задачи - 55,5%, 60,0% и 80,0% соответственно указанным группам) при 100% решения задачи в течение 2 мин в группе биологического контроля (здоровые животные, без введения каких либо лекарственных веществ). При этом, если в группе контрольных животных при повторном тестировании (через 15 мин после решения задачи при первом ее предъявлении) время на выполнение и решение задачи сокращалось в 2-3 раза, то среди животных, получавших хлорпромазин и морфин, время для решения задания сохранялось практически на исходном уровне, что свидетельствует о способности хлорпромазина и морфина препятствовать формированию краткосрочной памяти о правильно найденном решении задачи. Отмеченный эффект в наибольшей степени был выражен при введении морфина в дозах 5,0-10,0 мг/кг. Уменьшение дозы морфина до 1,0 и 2,5 мг/кг не снимало неблагоприятного депримирующего действия препарата, так для дозы 2,5 мг/кг выявлено значительное увеличиение времени нахождения и выполнения решения задачи при первом и последующем тестировании, соответственно расчетные величины Индекса психомоторного воздействия составили 1,949 и Индекса моторно-двигательного воздействия 3,369. Для натрия оксибутирата в дозе 250 мг/кг расчетные величины Индекса психомоторного воздействия составили 2,253 и Индекса моторно-двигательного воздействия 2,276. В случае сокращения дозы натрия оксибутирата (до 100 мг/кг) у животных прежде всего восстанавливалась способность обучаться быстро покидать цилиндр при стрессорной ситуации, хотя время на принятие решения при первом предъявлении в этих условиях было существенно (в 2 раза) больше, чем у контрольных крыс (см. табл.3). Хлорпромазин в дозе 5,0 мг/кг так же вызывал увеличение времени нахождения и времени выполнения решения задачи, соответственно Индекс психомоторного воздействия составил 4,04 и Индекс моторно-двигательного воздействия 11,84, что характеризует наиболее выраженное угнетающее влияние аминазана среди вышеуказанных препаратов (см. табл.3).
При применении феназепама в дозах 0,5-1 мг/кг отмечалась та же направленность изменений поведенческих реакции с увеличением времени нахождения и выполнения задачи, задержкой способности решить задачу при первом и повторном предъявлении, снижением количества животных, успешно выполнивших задачу, что соответственно выражалось в увеличении значений Индекса психомоторного воздействия (составил 1,609) и Индекса моторно-двигательного воздействия (1,608) (см. табл.3).
Таким образом, хлорпромазин, морфин, натрия оксибутират и феназепам вызывали снижение психомоторной и двигательной активности, при этом резко сокращали способность крыс формировать поведенческую реакцию избегания стрессовой ситуации. Действие препаратов сокращало также общее число животных, способных к решению данной задачи.
Установленный комплекс изменений подтверждает пригодность использования предлагаемого способа оценки психотропной активности веществ, так как известно, что хлорпромазин, морфин, натрия оксибутират и феназепам обладают выраженным психоседативным (психоингибирующим, депримирующим) действием и при этом также вызывают угнетение двигательной составляющей поведенческих реакций, оказывая центральный миорелаксирующий эффект [Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. - Т.1. - 14-е изд. перераб., испр. и доп. - М.: Изд-во «Новая волна»: Издатель С.Б.Дивов, 2002. - 540 с.].
Фенамин в дозе 5 мг/кг вызывал повышенную, однако нецеленаправленную двигательную активность крыс и при этом устранял практически у всех животных попытки покинуть емкость с холодной водой с помощью предлагаемого средства спасения - количество животных выполнивших задачу при первом предъявлении не превышало 10,0%, при повторном - ни одно из животных опытной группы не оказалось способным выполнить задачу (вероятность решения задачи 0,0%, расчет индексов нецелесообразен). При дозах фенамина 1-2,5 мг/кг все животные решали задачу при первом ее предъявлении (вероятность решения задачи 100,0%), однако отмечено удлинение времени как на принятие решения, так и на выполнение упражнения, что особенно обращает внимание - при повторном, через 15 мин, предъявлении той же задачи, кроме того, выявлено снижение количества животных успешно выполнивших задачу при повторном решении до 80,0%, что свидетельствует о снижении способности к формированию краткосрочной памяти. Соответственно, указанные изменения выражались в значительном увеличении значений Индекса психомоторного воздействия (составил 4,62) и Индекса моторно-двигательного воздействия (4,73) (см. табл.3). Установленные факты подтверждают пригодность предлагаемого способа оценки психотропной активности, так как известно, что фенамин оказывает стимулирующее действие на ЦНС и повышает способность к выполнению физической работы в сочетании с эффектом субъективного уменьшения ощущения усталости и устранения чувства страха [Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. - Т.1. - 14-е изд. перераб., испр. и доп. - М.: Изд-во «Новая волна»: Издатель С.Б.Дивов, 2002. - 540 с.], что приводит к нарушению способности к осуществлению целенаправленной деятельности.
Кофеин в дозах 5-10 мг/кг существенно сокращал время, затрачиваемое на решение задачи, но не оказывал столь выраженного влияния на скорость его выполнения, соответственно для дозы 5,0 мг/кг расчетный Индекс психомоторного воздействия составил 0,965 и Индекс моторно-двигательного воздействия 1,247 (см. табл.3). Таким образом, при помощи предлагаемого способа оценки психотропной активности подтверждены известные для кофеина психостимулирующие свойства, способность стимулировать положительные условные рефлексы и повышать двигательную активность [Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. - Т.1. - 14-е изд. перераб., испр. и доп. - М.: Изд-во «Новая волна»: Издатель С.Б.Дивов, 2002. - 540 с.].
Пирацетам в дозе 800,0 мг/кг вызывал сокращение времени нахождения решения задачи при незначительном увеличении времени выполнения решения задачи, незначительном снижении вероятности выполнения решения задачи по группе, соответственно выявлено уменьшение значений Индекса психомоторного воздействия (составил 0,955) при увеличении Индекса моторно-двигательного воздействия (0,983), указанные изменения объясняются большой дозой пирацетама, при этом известно, что в больших дозах пирацетам усиливает ГАМК-эргические тормозные процессы.
Пирацетам в дозе 400,0 мг/кг вьввал сокращение времени нахождения решения и времени выполнения решения задачи при 100,0-процентном ее выполнении при первом и последующем предъявлениях, соответственно выявлено уменьшение значений Индекса психомоторного воздействия (составил 0,955) и Индекса моторно-двигательного воздействия (0,983) (см. табл.3). Невысокая выраженность изменений объясняется однократным введением пирацетама (согласно целям опыта, как и для всех других веществ), при этом известно, что достаточная его эффективность обычно развивается через 2-3 недели ежедневного применения. Установленные изменения подтверждают пригодность предлагаемого способа оценки психотропной активности, так как известно, что пирацетам повышает интегративную и когнитивную деятельность головного мозга [Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. - Т.1. - 14-е изд. перераб., испр. и доп. - М.: Изд-во «Новая волна»: Издатель С.Б.Дивов, 2002. - 540 с.].
Стрихнин в дозах 0,1-0,2 мг/кг вызывал незначительное снижение времени нахождения и выполнения решения задачи при первом тестировании, однако сокращал процентное количество животных успешно выполнивших задачу (см. табл.3), соответственно выявлено увеличение значений Индекса психомоторного воздействия (составил 1,108) и Индекса моторно-двигательного воздействия (1,067). Установленные изменения подтверждают пригодность предлагаемого способа оценки психотропной активыности, так как известно, что стрихнин в низких дозах тонизирует скелетную мускулатуру, однако в основном облегчает проведение импульсов преимущественно в синапсах спинного мозга [Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. - Т.1. - 14-е изд. перераб., испр. и доп. - М.: Изд-во «Новая волна»: Издатель С.Б.Дивов, 2002. - 540 с.], не влияя существенно на общий психический статус.
Разработанный способ выявления психотропной активности веществ, осуществляемый в опытах на крысах при помощи построения эвристической модели процесса поиска животным решения задачи по спасению из эмоционально-физической экстремальной ситуации, позволяет проводить дифференцированую оценку влияния потенциальных психотропных веществ на высшую нервную деятельность животных по формированию цельной поведенческой реакции при решении задачи при первом и последующим ее предъявлении.
Способ пригоден для изучения влияния различных факторов (в т.ч. лекарственных и нелекарственных веществ) на скорость решения задачи по спасению из экстремальной ситуации, что позволяет определить воздействие различных факторов на двигательную функцию и общий психический статус, а также способ пригоден для оценки влияния на высшую нервную деятельность и способность к формированию цельного поведенческого акта с фиксацией конечной цели действий, что обеспечивает возможность выявления влияния на когнитивные процессы.
Предложенный способ является технически простым, низкозатратным, имеет высокий уровень воспроизводимости, позволяет за короткий промежуток времени и с высокой долей вероятности определить наличие психотропной активности изучаемого вещества и ее направленность (психоседативное или психостимулирующее действие), в связи с чем достаточно адекватен для целей фармакологического скрининга веществ, обладающих потенциальной психотропной активностью.