СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИРИЦИТРИНА ИЗ КОРЫ ОРЕХА ЧЕРНОГО, ОБЛАДАЮЩЕГО НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCING MYRICITRIN FROM THE BARK OF EASTERN BLACK WALNUT, EXHIBITING NEUROTROPIC ACTIVITY

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к производству лекарственных средств в виде субстанций и индивидуальных биологически активных соединений и касается способа получения мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозид мирицетина) из коры ореха черного (Juglans nigra L.), обладающего нейротропной активностью и используемого для лечения тревожных состояний.
В настоящее время в мировой и отечественной практике широко применяют плоды и листья ореха черного и ореха грецкого, однако перспективным видом лекарственного растительного сырья является кора ореха черного ввиду достаточно богатого химического состава (1).
Известен способ выделения мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозида мирицетина) в виде суммарного экстракта из листьев и побегов багрянника китайского (Cercis chinensis Bunge) (2). Согласно данной методики проводят: измельчение пробы сырья (1 кг) листьев и побегов багрянника китайского, 2-стадийное экстрагирование при комнатной температуре 60% этиловым спиртом, получение водной суспензии с последующей трехкратной экстракцией гексаном, этилацетатом и бутанолом, насыщенным водой. Далее для последующего выделения с бутанольной фракцией выполняли YMC-гель колоночную хроматографию (размер колонки: 5 × 30 см, движущаяся фаза: метанол: вода (0:1→1:0), препаративную ВЭЖХ [движущаяся фаза: метанол: вода (3:7), скорость тока: 61 мл / мин, УФ: 254 нм], в результате чего было получено соединение (9 мг), имеющее относительное время удерживания 26 минут. Данное соединение является 3-О-α-L-рамнопиранозидом мирицетина (2).
Данный метод выделяется в качестве аналога. Недостатками данного аналога являются низкий выход целевого вещества - мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозида мирицетина) (0,009%), многостадийность хроматографической очистки с использование различных сорбентов и элюента, представляющего собой смесь сложных систем растворителей.
Также существует способ получения растительной субстанции, содержащей мирицитрин из корней кермека Гмелина (Limonium gmelinii Mill.) в качестве средства, обладающего нейропротективной активностью. Сухой экстракт выделяют из корней растения вида L. gmelinii их экстракцией 50%-ным раствором этилового спирта при комнатной температуре (22-25°С), при соотношении сырье-экстрагент, равном 1:6, и временем двукратной экстракции, каждая из которых проводится в течение 24 часов. Экстракты концентрируют в вакууме досуха при 40-60°С (3).
Указанный метод также выделяется в качестве аналога. Недостатками представленного аналога являются отсутствие указаний на выход целевого соединения, а также выделение мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозида мирицетина) в виде растительной субстанции, являющейся суммарным экстрактом.
2
1
13
Кроме того, известен способ получения мирицитрина из травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.) в виде суммы флавоноидов. 5,0 кг сырья трехкратно экстрагировали 90% этиловым спиртом при кипячении с обратным холодильником в течение 3 часов. После упаривания этилового спирта под вакуумом, концентрированный экстракт суспендировали в воде и затем подвергали колоночной хроматографии на полиамиде со смесями НО - этиловый спирт в качестве элюентов с получением четырех фракций. Сумму флавоноидов из травы горца птичьего получали во фракции, элюированной 60%-ным этиловым спиртом (фракция II). Стандарт мирицитрина были выделен из фракции II полупрепаративной жидкостной хроматографией, структура была идентифицирована на основе спектральных данных (Н-ЯМР, С-ЯМР и масс-спектр) и сравнением с литературными значениями. Анализ показал, что чистота соединения составляет>98%. Выход в данном методе неизвестен (4).
Вышеуказанный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками указанного прототипа являются отсутствие указаний на выход целевого соединения, выделение мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозида мирицетина) в виде суммы флавоноидов, а также многостадийность хроматографических операций.
Таким образом, целью изобретения является создание способа получения мирицитрина из коры ореха черного, обладающего нейротропной активностью.
Технический результат достигается тем, что извлечение получают из коры ореха черного с помощью 70% этилового спирта в соотношении «сырье-экстрагент» 1:5 с применением метода дробной мацерации, целевое вещество элюируют смесью хлороформ-этиловый спирт 96% в соотношении 60:40; дальнейшую очистку целевого вещества осуществляют перекристаллизацией из водного спирта с выходом мирицитрина 1,7% и степенью чистоты 99,5%, обладающего нейротропной активностью.
Способ реализуется следующим образом.
Измельченное воздушно-сухое сырье коры ореха черного (100,0 г) экстрагируют 70% этиловым спиртом в соотношении 1:5 до полного истощения сырья методом дробной мацерации. Полученное объединенное водно-спиртовое извлечение упаривают на роторной вакуумной установке до густого экстракта, который затем смешивают с 70 г силикагеля L 40/100, высушивают и вносят на колонку (8 × 10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку промывают хороформом (0,5 л) и смесью хлороформ - этиловый спирт 96% в соотношении 60:40 (6,5 л). Целевое вещество элюируют смесью хлороформ - этиловый спирт в соотношении 60:40 (1 л). Контроль за разделением веществ осуществляют методом тонкослойной хроматографии в системе растворителей: хлороформ - этиловый спирт 96% - вода (26:16:3). Элюаты, содержащие мирицитрин объединяют и упаривают до 5 мл, получая осадок. Полученный осадок после отделения от маточного раствора представляет собой готовый продукт (мирицитрин) с выходом 1,7%, имеющий степень чистоты 99,5%.
Предлагаемый способ поясняется следующим примером.
Пример 1.
Измельченное воздушно-сухое сырье коры ореха черного (100,0 г) экстрагируют 70% этиловым спиртом в соотношении 1:5 до полного истощения сырья методом дробной мацерации. Полученное объединенное водно-спиртовое извлечение упаривают на роторной вакуумной установке до густого экстракта, который затем смешивают с 70 г силикагеля L 40/100, высушивают и вносят на колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку промывают хороформом (0,5 л) и смесью хлороформ - этиловый спирт 96% в соотношении 60:40 (6,5 л). Целевое вещество элюируют смесью хлороформ - этиловый спирт 96% в соотношении 60:40 (1 л). Контроль за разделением веществ осуществляют хроматографированием на пластинках "Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ-254" в системе растворителей: хлороформ - этиловый спирт 96% - вода (26:16:3). Элюаты, содержащие мирицитрин объединяют и упаривают до 5 мл, получая осадок. Образовавшийся осадок (мирицитрин) отделяют от маточного раствора. Получают 1,7 г целевого вещества с выходом 1,7% от массы воздушно-сухого сырья и степенью чистоты 99,5%.
Химическая структура мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозида мирицетина) представлена в Приложении 1 на фигуре 1.
21
20
12
max
Et0H
Спектральные и физико-химические свойства 3-О-α-L-рамнопиранозида мирицетина. Светло-желтый кристаллический порошок состава СНО с т.пл. 194-197 С; УФ- спектр: λ - 212, 260, 358; + NaOAc 268, 366; + NaOAc + Н3ВО3 260, 382; +AlCl3 278, 416; +AlCl3 + HCl 270, 406.
1
6
3
H-ЯМР-спектр (300 МГц, DMSO-d, δ, м.д., J/Гц): 12.68 (1Н, с, 5-ОН-группа), 9.23 (2Н, уш. с, 7-ОН-группа и 4'-ОН-группа), 6.88 (2Н, с, Н-2' и Н-6'), 6.36 (1H, д, 2.5 Гц, Н-8), 6.19 (1H, д, 2.5 Гц, Н-6), 5.20 (1H, д, 1.5 Гц, Н-1'' рамнозы), 3.1-5.0 (м, 4Н рамнозы), 0.84 (3H, д, 6 Гц, СН рамнозы).
13
6
С
3
С-ЯМР спектр (126,76 МГц, ДМСО-d, δ, м.д.): С-4 (177.85), С-7 (164.24), С-5 (161.37), С-4' (157.57), С-9 (156.49), С-2 и С-3 (145.83), С-3' и), С-5' (145.83), С-1' (119.70, C-2' и С-6' (108.00), С-10 (104.12), С-1'' рамнозы (102.00), С-8 (98.41), С-6 (94.30), С-2'(П6.21), С-3''(71.03), С-5'' (70.62), С-4'' (70.47), С-2'' (70.08), С-6'' (СН) (17.57).
+
+
+
Масс-спектр (HR-ESI-MS, 180°С, m/z): m/z 465.1016 [М+Н], m/z 487.0830 [M+Na], m/z 503.0560 [М+K].
3-О-α-L-рамнопиранозид мирицетина, полученный разработанным способом, исследовали на наличие нейтротропной активности.
Исследования нейтротропной активности проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 200-220 г. Животные содержались в условиях вивария на обычном рационе при свободном доступе к воде. Крысы были разделены на 2 группы: контрольную и опытную. Каждая группа состояла из десяти животных. Исследуемый препарат (полученный мирицитрин) вводили внутрижелудочно через зонд в дозе 5 мг/кг. Контролем служила вода очищенная. Препарат вводили однократно на фоне аналогичной водной нагрузки, через 1 час после введения препарата проводили эксперимент (3). Исследование нейтротропной активности проводили с использованием теста Порсолта (4). При этом в течение пяти минут фиксировали индивидуальное время активных попыток животных выбраться из воды. Полученные данные обрабатывали статистически по критерию Манна-Уитни. Результаты исследования влияния на двигательную активность крыс в методике теста Просолта представлены в таблице 1 Приложения 2.
Исходя из полученных результатов можно сделать вывод, что 3-О-α-L-рамнопиранозид мирицетина в дозе 5 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении способствовал понижению двигательной активности животных в опытной группе на 46% по отношению к водному контролю.
Таким образом, предлагаемый способ получения мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозид мирицетина) из коры ореха черного методом колоночной хроматографии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный способ позволяет получать высокий выход вещества мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозид мирицетина) - 1,7% вместо 0,009% у аналога (2), то есть в 140 раз выше по сравнению с аналогом. В аналоге (3) и прототипе (4) отсутствуют указания на выход указанного соединения.
2. В представленном прототипе (4) полученная растительная субстанция представляет собой сумму веществ. В данном источнике не указаны способы разделения и отдельного получения мирицитрина (3-О-α-L-рамнопиранозида мирицетина) высокой степени чистоты.
3. Разработанный способ менее трудоемок, поскольку включает однократную хроматографическую очистку: на силикагеле с использование элюента, представляющего собой смесь двух растворителей (хлороформ и этиловый спирт), вместо трехкратной хроматографической очистки в прототипе с использованием различных методов (колоночная хроматография и полупрепаративная жидкостная хроматография), сорбентов и элюента, представляющего собой смесь сложных систем растворителей (4).
4. Целевой продукт мирицитрин (3-О-α-L-рамнопиранозид мирицетина), полученный разработанным способом, обладает нейтротропной активностью.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
1. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармац. вузов - Изд. 4-е, перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России. 2019. - 1278 с.
2. Na Min Kyun, Yoo Jae-Kuk, Lee Chan Bog, Kim Jin Pyo, Lim Gon Hyeok, Min Dong I. Extract of Cercis chinensis having anti-oxidant activity and anti-aging activity, and cosmetical composition containing the extract for anti-oxidation, skin-aging protection and wrinkle improvement. Patent №US 20080187610, A61K 36/48; application 15.02.2008; publication 07.08.2008. 30 p.
3. Nurkenov T.T., Askarova S.N., Zhussupova G.E., Olzhayev F.S., Tsoy A.K., Umbayev B.A., Shalakhmetova T.M. Plant substance extracted from Siberian statice roots and having neuroprotective activity. Patent №WO/2020/197370, A61K 36/185; application 02.03.2020; publication 01.10.2020. 21 p.
4. Xu F., Guan H., Li G. et al. LC Method for analysis of three flavonols in rat plasma and urine after oral administration of Polygonum aviculare extract. Chroma, 2009; 69: 1251. https://doi.org/10.1365/s10337-009-1088-x.
5. Зайцева E.H., Зайцев A.P., Дубищев A.B. Устройство для введения водной нагрузки лабораторным животным. Патент на ПМ 115651 Рос. Федерация. №2011138631/13; заявл. 20.09.11; опубл. 10.05.12, Бюл. №13. 2 с. Хабриев Р.У.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.