СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПРОТЕАЗЫ
METHOD FOR PREPARING IMMOBILISED PROTEASE

Изобретение относится к нанотехнологиям и может быть использовано в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве.
Известны многочисленные методы иммобилизации различных ферментов, включая протеазы, путем их включения в различные биополимеры (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Экологические основы биотехнологии. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2006. - С.164-180).
Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ получения панкреатина, предусматривающий растворение карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в дистиллированной воде, подкисление раствора 3М НСl до рН 4,0, добавление при перемешивании и температуре 20°С 1-этил-3(диметиламинопропил)-карбодиимида для активации карбоксильных групп КМЦ, добавление раствора панкреатина в фосфатном буфере с рН 7,5, охлаждение смеси до 4°С, перемешивание при этой температуре в течение 18 ч, очистку диализом и лиофилизированную сушку с получением порошка (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бабурин М.И. Получение и свойства панкреатина, иммобилизованного на карбоксиметилцеллюлозе. Прикладная биохимия и микробиология, 1998, т.34, №1, с.61-65).
Основным недостатком всех этих способов является использование в качестве носителя преимущественно синтетических полимеров, которые невозможно применять в пищевой и медицинской промышленности. Размер частиц получаемых иммобилизованных ферментов сравнительно велик и обычно составляет 100-200 мкм, что не позволяет использовать их в медицинской практике.
Задача, решаемая данным изобретением, заключается в получении иммобилизованных протеаз на пищевой карбоксиметилцеллюлозе - носителе природного типа. Заявляемое техническое решение дает возможность получать частицы иммобилизованных протеаз размером в тысячи раз меньше. Химические процессы, в которых участвуют ферменты, протекают на межфазных поверхностях раствор-субстрат (протеины), при этом фермент адсорбируется на поверхности субстрата. Уменьшение размеров частиц иммобилизованного фермента (протеазы) резко увеличивает его доступность в сферу реакции, следовательно, увеличивает скорость ферментативного процесса, а часто и возможность осуществления самого процесса. Применение пищевой карбоксиметилцеллюлозы для получения иммобилизованных протеаз в заявленном техническом решении позволяет получать на их основе биодобавки, биокатализаторы для самых разнообразных целей, включая медицину, пищевую промышленность и сельское хозяйство.
Техническая сущность заявленного решения заключается в получении иммобилизованных протеаз, содержащих частицы наноразмеров, на природном носителе - карбоксиметилцеллюлозе, использование которых позволяет проводить ферментативные реакции с большими скоростями не только в растворах, но и на твердых субстратах, что является важным при их использовании в пищевой промышленности, медицине и сельском хозяйстве.
Для выполнения поставленной задачи используется способ получения иммобилизованных протеаз, заключающийся в растворении носителя в буферном растворе или в подщелоченной дистиллированной воде с добавлением порошка фермента с активностью не ниже 1000 ед./г, в качестве носителя используют пищевую карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в качестве фермента - нейтральную или щелочную протеазу из Bacillus subtilis в виде порошка или концентрированного раствора, а также панкреатин, активность которых определяется по методу Ансона (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Федотов Г.Н. Практический курс по общей химии, биотехнологии и экологическим основам производств. - МГУЛ, 2004. - С.373-374). Иммобилизацию проводят в буферных растворах или в подщелоченной дистиллированной воде с рН 7,5-9,5 в присутствии 1-1,5% раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании со скоростью 3000-5000 об/мин, в течение 60 мин, охлаждение образовавшейся эмульсии до 5-10°С, неоднократное добавление к оставшимся после отделения раствора частицам ацетатного буфера с рН 4-4,5, последующим неоднократным перемешиванием и отделением раствора, затем выпавшие частицы отделяют и высушивают.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. 10 г пищевой карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) добавляют к 50 мл фосфатного буфера, имеющего рН 7,5-8,0, реакционную смесь перемешивают до максимального растворения КМЦ, полученный раствор фильтруют и добавляют к фильтрату 1 г порошка нейтральной протеазы с активностью 1500 ед./г и 3 мл 1,5% раствора ПАВ, например твин 40. Раствор интенсивно перемешивают при помощи вибротуракса со скоростью 3500-5000 об/мин в течение одного часа, образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, после чего подкисляют ее соляной кислотой до значения рН 3,0-3,5. Эмульсию помещают на сутки в холодильник, через каждые 3-3,5 часа снова подвергают всю смесь перемешиванию при помощи вибротуракса, спустя сутки раствор вновь перемешивают. Полученные частицы отделяют от реакционной массы центрифугированием со скоростью 5000 об/мин, после чего отделившийся раствор сливают, а к оставшимся частицам добавляют по 10 мл ацетатного буфера с рН 4-4,5. Операцию повторяют 2-3 раза, каждый раз подвергая реакционную массу перемешиванию вибротураксом. После этого раствор снова центрифугируют. Оставшуюся массу переносят в колбы или пенициллиновые флаконы по 1 мл во флакон и высушивают на сублимационной сушилке.
Выход полученных частиц составляет 75-80%, активность нейтральной протеазы составляет 1100-1200 ед./г, размер полученных частиц иммобилизованного фермента равен 150-160 нм.
Пример 2. Опыт проводят аналогично примеру 1, но в качестве буфера используют боратный буфер с рН 9,5, в качестве фермента берут щелочную протеазу из Bacillus subtilis, в виде концентрированного раствора, с активностью 120-100 ед./мл. Выход частиц иммобилизованного фермента составляет 95%, активность протеаз составляет 950 ед./г, размер частиц 180-200 нм.
Пример 3. Опыт проводят аналогично примеру 1, но в качестве фермента используют панкреатин с протеазной активностью 2200 ед./г. Выход полученных частиц составляет 75%, активность протеаз 1950-2000 ед./г, размер частиц 140-150 нм.
Таким образом, изобретение позволяет получать иммобилизированные протеазы, которые могут быть с успехом использованы в пищевой, медицинской промышленности и сельском хозяйстве.