Способ хранения изолированных жизнеспособных эмбриональных клеток головного мозга
METHOD FOR STORING ISOLATED VIABLE EMBRYONIC BRAIN CELLS

Изобретение относится к области медицины и экспериментальной биологии и может быть использовано для решения актуальной задачи возможности обеспечения жизнеспособности в течение длительного времени хранения вне организма изолированных клеток головного мозга животного in vitro с сохранением их функциональных свойств и возможностью их дальнейшего культивирования на пригодных для этого подложках.
В настоящее время в научных целях широко проводятся опыты на животных в различных биомедицинских исследованиях, в области биологии развития, трансплантации, генетики, при тестировании различных препаратов, в том числе лекарственных, для выявления полезных и токсикологических свойств и др. Институт исследований лабораторных животных Национальной академии наук США утверждает, что опыты на животных не могут быть заменены даже сложными компьютерными моделями, которые не способны смоделировать чрезвычайно сложные взаимодействия молекул, клеток, органов и тканей, организма и окружающей среды («Science, medicine, and animals», Institute for Laboratory Animal Research, Published by the National research Council of the National Academies, 2004; page 2). Несмотря на исключительную важность использования животных моделей для широкого спектра экспериментов, количество используемых в эксперименте животных должно быть одобрено этическими рекомендациями. Доминирующей точкой зрения сегодня является необходимость опытов ради прогресса в науке при условии, что страдания животных были бы минимизированы (как и вообще количество лабораторных животных) (Bernard Е. Rollin. The Regulation of Animal Research and the Emergence of Animal Ethics: A Conceptual History, Theoretical Medicine and Bioethics, Volume 27, Number 4, 2006, pp. 285-304 DOI 10.1007/s11017-006-9007-8). Одной из главных целей при проведении эксперимента является достижение баланса между этической и научно обоснованной практикой. Ученым и учреждениям рекомендуется тщательно и взвешенно обдумывать решение об использовании животных, принимая во внимание вклад, который такое использование внесет в новые знания, этические проблемы и возможное наличие альтернатив использованию животных. Существует так называемый «принцип трех R» (replacement, reduction, refinement - замещение, сокращение, усовершенствование), который требует снижение количества животных, используемых в экспериментах, а также усовершенствование методов исследований, позволяющих минимизировать боль и страдания лабораторных животных, а также улучшить условия их содержания (Flecknell P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX. 2002; 19(2):73-8. PubMed PMID: 12098013; MacArthur Clark J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. Br J Nutr. 2018 Aug; 120(s1):S1-S7. doi: 10.1017/S0007114517002227. Epub 2017 Oct 30. Review. PubMed PMID: 29081302).
Кроме того, задача длительного сохранения клеток вне организма стоит уже довольно давно, особенно она актуальна в области трансплантации, где важным моментом является разделение во времени забор донорской ткани и самой операции по трансплантации. Испытания по трансплантации тканей могут быть облегчены эффективным методом хранения тканей и органов. Ранее методы замораживания были успешно применены к нервной ткани плода крысы и человека из различных областей мозга (стриатум, мозжечок, кора, гиппокамп), что позволяет извлекать жизнеспособную ткань при размораживании через месяцы или годы, однако выживаемость криоконсервированных нейронов не высока, поэтому требуется дальнейшее улучшение методов для достижения более высоких показателей выживаемости клеток.
На сегодняшний день известны способы хранения изолированных жизнеспособных эмбриональных клеток головного мозга, в частности путем холодного хранения при температуре +4°С эмбриональной ткани мозга в гибернационной среде (Nikkhah G, Eberhard J, Olsson M,  Preservation of fetal ventral mesencephalic cells by cool storage: in-vitro viability and TH-positive neuron survival after microtransplantation to the striatum. Brain Res. 1995 Jul 31; 687(1-2):22-34. PubMed PMID: 7583311). Данный способ дает лучшие показатели жизнеспособности клеток in vitro по сравнению со стандартными средами культивирования клеток. При этом общий выход выживших тирозингидроксилазы-позитивных нейронов не изменялся по сравнению со свежевыделенными нейронами в течение 5 дней хранения в холоде.
Известен способ хранения изолированных жизнеспособных эмбриональных клеток головного мозга путем холодного хранения на выживаемость внутрижелудочковых эмбриональных вентральных мезенцефальных трансплантатов крыс (15 гестационный день). Мезенцефальную ткань плода подвергают охлаждению в свободном от кальция и магния буфере (CMF: 0,15 М NaCl, 0,008 М Na2HPO4, 0,0027 М KCl, 0,0015 М KHPO4, 0,026 М NaHCO3, с 0,1% глюкозой, 100 мкг/мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона) при температуре +4°С в течение 5-32 часов (Yoshimoto Y, Date I, Sakai K, Furuta T, Asari S, Ohmoto T. [Cool storage of fetal rat brain for neural transplantation]. No To Shinkei. 1992 Jun; 44(6):553-7. Japanese. PubMed PMID: 1389562). Данный способ обеспечивает сохранение эмбриональной мезенцефальной ткани, которая находилась в охлажденном состоянии в течение 16 ч.
Известна работа, в которой подсаживают вентральную мезенцефалическую ткань плода крысы к истощенному дофамином стриатуму крыс либо непосредственно, либо после предварительного охлаждения трансплантата в среде "гибернации" при температуре +4°С (Sauer Н, Brundin P. Effects of cool storage on survival and function of intrastriatal ventral mesencephalic grafts. Restor Neurol Neurosci. 1991 Jan 1; 2(3):123-35. doi: 10.3233/RNN-1991-2302. PubMed PMID: 21551593). Трансплантация тканей крыс приводила к улучшениям поведения животных в случае, если трансплантируемая ткань находилась в среде «гибернации» в течение 2-5 дней. Количество иммунореактивных нейронов в этих «гибернированных» трансплантатах существенно не отличалось от такового в сопоставимых трансплантатах свежей ткани. Если же трансплантат хранился более 5 дней, то выявлялось отсутствие функциональных эффектов и снижение выживаемости трансплантата до 10-20% от контрольных значений.
2
4
2
Наиболее близким техническим решением к заявленному изобретению является способ хранения изолированных жизнеспособных эмбриональных клеток головного мозга путем иссечения эмбриональной базальной ткани переднего мозга, богатую холинергическими нейронами, которую затем либо диссоциируют в клеточную суспензию и вводят в холинергически денервированный гиппокамп взрослых крыс, либо хранят при температуре +4°С в среде хранения, следующего состава (в мМ): 20 молочная кислота, 5 KHPO, 25 KOH, 0,5 MgCl, 30 NaCl, 5 глюкоза, 0,1 сорбит и 10% диметилсульфоксид. Через пять дней сохраненную ткань также диссоциируют в клеточную суспензию и вводят в денервированный гиппокамп другой группы животных (Gage, F.H., Brunkin, P., lsacson, О. and Bj6rklund, A., Rat fetal brain tissue grafts survive and innervate host brain following five-day pregraft tissue storage, Neurosci. Lett., 60 (1985) 133-137). Все трансплантаты как в недавно диссоциированной, так и в "сохраненной" группе выжили. Клетки, которые подверглись холодному хранению в так называемой "гибернационной" среде, могут безопасно использоваться в течение от 2 до 5 дней без морфологических или функциональных потерь.
Таким образом, результаты данных работ показывают, что эмбриональные клетки головного мозга после выделения и хранения становятся довольны уязвимыми к различным факторам.
Технический результат заключается в расширении технических средств для длительного хранения изолированных жизнеспособных эмбриональных клеток головного мозга с сохранением их морфологических и функциональных свойств и обеспечением сокращения количества используемых для экспериментов лабораторных животных.
Технический результат достигается тем, что хранение изолированных жизнеспособных эмбриональных клеток головного мозга проводят путем их выделения и помещения в среду хранения, при этом выделенные клетки из головного мозга переносят в среду хранения следующего состава:
0,25 мл глутамина (200 мМ, GlutaMAX, Gibco, UK),
2 мл добавки В27 supplement (50х, Gibco, UK),
97,75 мл нейробазальной среды (Neurobasal@-A medium CTS, Gibco by life technology, USA), после чего клетки помещают в холодильную камеру при температуре 4°С и хранят до 7 дней без потери количества и функциональных свойств клеток и далее до 10 и более дней с постепенным снижением данных показателей.
Способ осуществляют следующим образом.
Изолированные жизнеспособные клетки головного мозга получают любым доступным способом, например, с помощью классической методики выделения с использованием ферментно-механической диссоциации (Лозиер Е.Р., Джанибекова А.И., Стельмашук Е.В., Граф А.В., Зоров Д.Б., Соколова Н.А., Исаев Н.К. Глюкозная депривация потенцирует токсичность уабаина и глутамата в кортикальных нейронах различных сроков культивирования. // Нейрохимия. - 2009. т. 26. №3. с. 232-236; Генрихс Е.Е. Защитное действие модуляторов эндогенной каннабиноидной системы при экспериментальной церебральной ишемии. // Дисс.канд. биол. наук. М. 2012. НЦН РАМН. 144 с). Экспериментальное животное подвергают анестезии и дислокации шейных позвонков. Для получения клеток головного мозга скальпелем отсекают оба больших полушария и очищают выделенные структуры от мозговых оболочек. Полученную ткань измельчают в камере Максимова и помещают в раствор трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА, Invitrogen), после чего инкубируют 15-20 минут при 37°С. После трипсинизации ткань переносят в PBS и дважды промывают. Далее PBS заменяют питательной средой, состоящей из минимальной среды Игла в комплексе с инактивированной эмбриональной телячьей сывороткой 10%, 2 мМ глутамина, 10 мМ буфера HEPES, рН 7,2-7,4. Производят механическую диссоциацию ткани многократным пипетированием, используя пастеровскую пипетку с оплавленным концом. Клеточную суспензию центрифугируют на 1000 оборотах 3 минуты, надосадок сливают. Затем клетки помещают в среду хранения следующего состава:
0,25 мл глутамина (200 мМ, GlutaMAX, Gibco, UK),
2 мл добавки В27 supplement (50х, Gibco, UK),
97,75 мл нейробазальной среды (Neurobasal@-A medium CTS, Gibco by life technology, USA).
После чего из расчета в среднем 5,7±0,9 млн. клеток в 1 мл среды хранения указанного состава, или с меньшей плотностью клетки помещают в холодильную камеру при температуре 4°С и хранят до 7 дней без потери количества и функциональных свойств клеток и далее до 10 и более дней с постепенным снижением данных показателей.
Примеры конкретного выполнения способа.
Разработанный нами способ был успешно применен при хранении клеток коры и гиппокампа 15-19-дневных эмбрионов крысы с последующим их культивированием для установления их жизнеспособности и функциональных свойств. Изолированные жизнеспособные клетки были получены с помощью классической методики выделения с использованием ферментно-механической диссоциации. Беременная крыса подвергалась анестезии и дислокации шейных позвонков. После чего брюшную полость обрабатывали 2% раствором йода, рассекали ножницами и извлекали эмбрионов. Из каждого эмбриона вынимали головной мозг целиком и переносили в чашку Петри, содержащую солевой раствор PBS. Для получения клеток коры и гиппокампа скальпелем отсекали оба больших полушария и очищали выделенные структуры от мозговых оболочек. Полученную ткань измельчали в камере Максимова и помещали в раствор трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА, Invitrogen), инкубировали 15-20 минут при 37°С. После трипсинизации ткань переносили в PBS и дважды промывали. Далее PBS заменяли питательной средой, состоящей из минимальной среды Игла в комплексе с инактивированной эмбриональной телячьей сывороткой 10%, 2 мМ глутамина, 10 мМ буфера HEPES, рН 7,2-7,4. Производили механическую диссоциацию ткани многократным пипетированием, используя пастеровскую пипетку с оплавленным концом. Клеточную суспензию центрифугировали на 1000 оборотах 3 минуты, надосадок сливали. Клетки же помещали в среду хранения следующего состава: 97,75 мл нейробазальная среда (Neurobasal@-A medium CTS, Gibco by life technology, USA), 0,25 мл глутамина (200 мМ, GlutaMAX, Gibco, UK), 2 мл добавка B27 supplement (50x, Gibco, USA). После чего из расчета в среднем 5,7±0,9 млн клеток в 1 мл среды хранения указанного состава или с меньшей плотностью клетки помещались в холодильную камеру при температуре 4°С.
Количество клеток в 1 мл суспензии подсчитывали на автоматическом счетчике клеток (Countess automated cell counter, Invitrogen). Считали процент жизнеспособных клеток в 1 мл заявленной среды хранения сразу после выделения материала из головного мозга, после суток нахождения в заявленной среде хранения в холодильнике при температуре 4°С, далее через 3, 7 и 10 дней заявленного холодного хранения. Результаты приведены на фиг. 1.
На фиг. 1 показано количество жизнеспособных клеток в 1 мл заявленной среды хранения после заявленного холодного хранения, по оси абсцисс - дни заявленного холодного хранения в заявленной среде хранения, 0 - подсчет количества жизнеспособных клеток сразу после выделения из головного мозга до заявленного холодного хранения в заявленной среде хранения n0-7день=12, n10день=5.
*р<0,01 по сравнению с исходной суспензией (0 день).
За 100 процентов принимали исходное количество выделенных клеток (0 день), достоверное снижение было зафиксировано только к 10 дню заявленного холодного хранения клеток в заявленной среде хранения. В течение недели количество клеток в суспензии было сходным. Это указывает на то, что данный способ хранения обеспечивает поддержание жизнеспособности изолированных клеток в заявленной среде хранения. К 10 дню выживаемость клеток снижалась на 39±11%, т.е. значимая часть клеток еще оставалась жизнеспособной.
6
Для исследования функциональных свойств нейронов, подвергнутых заявленному холодному хранению в заявленной среде хранения, использовали мультиэлектродные матрицы, интегрируемые в систему MEA2100-System (Multi Channel Systems, Германия), с помощью которых исследовали электрофизиологические свойства клеток, их способность образовывать функционально гетерогенную нейронную сеть культивируемых клеток ЦНС и реагировать на цитотоксическое действие глутамата. Данная методика позволяет однозначно изучить степень зрелости данной диссоциированной культуры. Сразу после выделения суспензию клеток головного мозга (плотность 10×10 клеток в мл) наносили на мультиэлектродную матрицу, остальные клетки подвергали обработке заявленным способом холодного хранения в заявленной среде хранения (см. состав выше). Суспензию клеток после суток, трех суток и на седьмой день после заявленного холодного хранения в заявленной среде хранения центрифугировали на 1000 оборотах 3 минуты и высаживали на мультиэлектродные матрицы.
Прижизненное наблюдение проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии, используя инвертированный микроскоп «Olympus CKX41» (Япония). Культуры, высаженные из исходной суспензии, а также после заявленного холодного хранения (от 1 до 7-го дня включительно) в заявленной среде хранения морфологически не различались и их биоэлектрические свойства были исследованы на 9-10 день развития in vitro. На фиг. 2А и Б показано изменение биоэлектрической активности культивированных нейронов коры и гиппокампа головного мозга крыс в зависимости от сроков заявленного холодного хранения в заявленной среде хранения. А - количество потенциалов действия, Б - количество пачек. По оси абсцисс отложены дни заявленного холодного хранения в заявленной среде хранения клеточной суспензии головного мозга. *р<0,05 по сравнению с исходной суспензией (0, n=6).
Достоверного отличия ни по количеству, ни по частоте потенциалов действия получено не было (фиг. 2А). Количество пачечной активности в культурах, полученных из суспензии клеток заявленного холодного хранения в заявленной среде хранения, постепенно увеличивалось в зависимости от времени заявленного холодного хранения клеток в заявленной среде хранения и из 7-дневной суспензии количество пачек было достоверно выше, чем у культур, посаженных из свежевыделенной суспензии (0 день). Последнее является очень позитивным фактором, демонстрируя, что у культур, подвергшихся длительному хранению в разработанной среде хранения, лучше показатели по сетевой электрической активности (фиг. 2Б).
6
Для определения зрелости культур и ответа их на цитотоксическое воздействие в каждую лунку 96-луночных планшетов (Costar), покрытых субстратом, вносили 100 мкл суспензии, содержащей 2×10 клеток на мл, и на 10 день развития in vitro подвергали воздействию глутамата в концентрации 50-500 мкМ. На фиг. 3 показано воздействие глутамата (50-500 мкМ) на выживаемость культивированных нейронов коры и гиппокампа головного мозга эмбрионов крыс. МТТ-тест.
Белые столбцы - культура из свежевыделенной суспензии клеток, черные столбцы -культура клеток, подвергшихся заявленному холодному хранению в заявленной среде хранения в течение 4-7 дней.
*p=0,05, **р<0,01 по сравнению с контролем (0). #р<0,05, по сравнению с действием той же концентрации глутамата на культуру из свежевыделенной суспензии.
Было обнаружено, что клетки, которые подвергались заявленному длительному холодному хранению в заявленной среде хранения в течение 4-7 дней, также, как и свежевыделенные клетки реагировали на воздействие глутамата, то есть их зрелость к 10 дню культивирования не отличалась от таковой, если бы клетки не подвергали заявленному холодному хранению в заявленной среде хранения.
Таким образом, заявленный способ обеспечивает расширение технических средств для длительного хранения изолированных жизнеспособных эмбриональных клеток головного мозга с сохранением их морфологических и функциональных свойств и сокращением количества используемых для экспериментов лабораторных животных.