Модуляция опухолетоксического действия свободных радикалов оксидом азота.

МОДУЛЯЦИЯ ОПУХОЛЕТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ ОКСИДОМ АЗОТА

Г.В. Загребельная, И.В. Кондакова

НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Свободнорадикальные реакции занимают важное место в механизме противоопухолевой активности антрациклиновых антибиотиков [1] и лучевой терапии [14, 15]. В результате свободнорадикальных реакций образуются активированные кислородные метаболиты, которые в высоких концентрациях могут вызывать повреждения нуклеиновых кислот, белков, углеводов, инициацию перекисного окисления липидов, инактивацию ферментов [3]. Итак, образование свободных радикалов ведет к нарушению различных клеточных функций, следствием чего являются ингибирование пролиферации и индукция апоптоза [4, 6, 9].

Развитие резистентности опухолевых клеток к свободнорадикальному повреждению связано с увеличением антирадикальных процессов в них [13], активации адаптивных реакций клеток на повреждение и отбор наиболее автономных, злокачественных клонов [2], что представляет одну из актуальных проблем в современной онкотерапии. В последние годы большое внимание уделяется оксиду азота (NO) как возможному модулятору опухолетоксических воздействий [3]. Однако литературные данные о механизме сочетанного воздействия свободных радикалов и оксида азота противоречивы. NO способен как потенцировать свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их [3], проявляя, таким образом, антиокси-дантные свойства [10, 11]. Такая неоднозначность, полученная при оценке взаимодействия NO со свободными радикалами, не позволяет правильно интерпретировать его эффект на клеточном уровне и затрудняет рекомендации его в плане перспективного использования для терапии опухолей.

Целью работы было исследование способности NO-генерирующих соединений модулировать опухолетоксическое действие свободнорадикальных агентов.

Методика исследования

Эксперименты проводились на половозрелых мышах линии ОБЛ/2 массой 15—20 г разводки

питомника Научно-исследовательской лаборатории экспериментального биомоделирования ТНЦ СО РАМН. В работе использовали штаммы асцитной мастоцитомы Р-815, перевиваемой внутрибрюшинно. Асцитную жидкость с опухолевыми клетками брали на седьмые сутки после трансплантации опухоли и трижды отмывали средой RPMI-1640. Жизнеспособность клеток определяли с использованием трипанового синего. Свободнорадикальное воздействие вызывали гидропероксидом третичного бутила

(АБАП), который при термическом разложении (t = 37oC) образует пероксирадикалы [11]. Источниками NO были нитропруссид натрия (SNP) и нитрит натрия (NaNO2) («Sigma»), который в ходе циклических реакций превращается в оксид азота [3]. Для эндогенной генерации NO в опухолевых клетках применяли L-аргинин (отечественного производства марки х.ч.). Активность NO-синтазы ингибировали с помощью метилового эфира нитроаргинина («Sigma»).

Пролиферативную активность опухолевых клеток определяли по включению меченного радионуклидами предшественника синтеза нуклеиновых кислот [3Н]-тимидина («Изотоп») в ДНК. Опухолевые клетки доводили средой RPMI-1640 до конечной концентрации 1млн/мл. Клетки культивировали в присутствии различных концентраций NO-генерирующих соединений и свободнорадикальных агентов в 96-луночных круглодонных планшетах в объёме 200 мкл среды культивирования. Во все лунки добавляли [3Н]-тимидин по 0,1 мкС на лунку. Планшеты инкубировали 18 ч в атмосфере 5% СО2 при 37оС. После инкубации клетки переносили с помощью 12-канального сборщика клеток “Flow” на стекловолоконные фильтры, промывая ячейки планшеты физиологическим раствором, этиловым спиртом (96%) и трихлоруксусной кислотой (30%). В высушенных фильтрах измеряли радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счётчике Mark-III (Tracor Analytic) в сцинтилля-

торе Lumax (Lumac Systems inc.). Изменение скорости синтеза ДНК выражали в процентах по отношению к контролю.

Полученные данные обрабатывали статистически с использованием непараметрического критерия Вилкоксона — Манна—Уитни.

Результаты

Соединения, используемые нами для индукции свободнорадикального окисления, существенно отличаются друг от друга по структуре, однако они оба могут служить источниками перок-сирадикалов. Показано, что распад трет-бутилгидропероксида (ГПТБ) происходит при его взаимодействии с внутриклеточными ионами переменной валентности, главным образом железа и меди, с образованием пероксидных радикалов [1]. Термолизис АБАП также приводит к их накоплению [11].

Высокие концентрации АБАП и ГПТБ более чем 10 и 0,5 мМ соответственно угнетали скорость синтеза ДНК опухолевых клеток. Уменьшение концентрации ГПТБ и АБАП до 0,1 и 5 мM соответственно приводило к снижению их антипролиферативного эффекта с последующей стимуляцией пролиферации опухолевых клеток, достигающей максимальных значений при концентрации ГПТБ 1нМ и АБАП 0,5 мM (рис. 1).

Цитотоксический эффект доноров оксида азота был выражен слабее по сравнению с противоопухолевым действием пероксирадикалов (рис. 2). SNP снижал пролиферативную активность опухолевых клеток в концентрациях 10-3 —10-5 М, более низкие концентрации не влияли на скорость синтеза ДНК. NaNO2 оказывал цитотокси-ческое действие в концентрациях 10-3 М. Стиму-

ляция пролиферации опухолевых клеток наблюдалась при концентрации №N02 10-6—10-8 М. Слабое стимулирующее действие на пролиферацию оказывал эндогенный источник оксида азота Ь-аргинин (субстрат ЫО-синтазной реакции). Причем ингибирование ЫО-синтазной реакции метиловым эфиром нитроаргинина практически не изменяло скорости синтеза ДНК по сравнению с контрольной популяцией опухолевых клеток. Вероятно, это обусловлено наличием в клетках мастоцитомы Р-815 индуцибельной N0-синтазы, которая не проявляет своей активности до стимуляции.

Комбинация нетоксических доз продуцентов N0 и низкотоксичных доз пероксидных радикалов приводила к увеличению включения [3Н]-тимидина в ДНК по сравнению с контрольной популяцией опухолевых клеток, инкубированных только с источниками пероксидных радикалов, либо не влияла на неё (табл. 1).

Из всех изученных нами ЫО-генерирующих соединений Ь-аргинин проявлял наибольшую активность в плане подавления противоопухолевого действия пероксидных радикалов. В связи с этим можно предположить, что данный эффект обусловлен способностью пероксирадикалов опосредованно, через изменение внутриклеточного ионного гомеостаза, стимулировать активность индуцибельной ЫО-синтазы, что приводит к наработке оксида азота.

Использование цитотоксических доз ГПТБ и АБАП и доноров оксида азота в низкотоксичных концентрациях вызывало к снижение опухолеток-сичности пероксирадикалов (табл.2). Ранее установлено, что оксид азота может защищать опухолевые клетки от ГПТБ-индуцированной

Таблица 1

Сочетанное действие NO-генерирующих соединений и субтоксических доз пероксидных радикалов на включение [3Н]-тимидина в клетки мастоцитомы Р-815

Соединение Контроль SNP

Контроль 100 124,2± 20 143,8± 18 112,б± 18,7

АБАП (10 мМ) 54,9± 5,9 б8,3± 8,2 135,б± ± 1б,9* 1б8± 14,8**

АБАП (1 мМ) 107± 12,8 125,б± 1б,б* 142,б± 21,8* 180± 21,1**

ГПТБ (100 нМ) б7,8± 17,5 100,3± 12* 111,S± 10,2* 199,б± 54,2*

ГПТБ (1мкМ) 3,7± 1,б 97,2± 3,8** 107± 18,3** 249± 33**

Пр имечание. * — р<0,05; **- р<0,01 — показатели достоверности различий по сравнению с действием свободнорадикальных агентов в соответствующих концентрациях. Результаты выражены в процентах по отношению к контролю.

%

10-5 М

тМ

Рис. 1. Влияние источников пероксидных радикалов на включение [3Н]-тимидина в ДНК клеток мастоцитомы Р-815 (2) (М±т) по сравнению с контролем: а - гидропероксид третичного бутила (1); б - 2,2’азо-бис(2-

амидинопропан) (3).

Результаты выражены в процентах по отношению к контролю

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

%

М

-3

10

-4

10

-5

10

-6

10

140

120

100

80

60

40

20

0

%

Ї

тМ

10

10

1 2

Рис. 2. Влияние NO-генерирук>щих соединений (а) (1 - нитропруссид натрия, 2 - нитрит натрия) (М±т) на включение [3Н]-тимидина в ДНК клеток мастоцитомы Р-815 по сравнению с контролем (3) и различных концентраций Ь-аргинина (б) (2 - 1 мМ; 3 - 5 мМ; 5 - 10 мМ) и метилового эфира нитроаргинина (4 - 5 мМ) (М±т) на включение [3Н]-тимидина в ДНК опухолевых клеток по сравнению с контролем (1). Результаты выражены в процентах по отношению к контр

5

Т аблица 2

Влияние NO-генерирующих соединений на токсический эффект пероксидных радикалов

в клетках мастоцитомы Р-815

Соединение Контроль АБАП

Контроль 100 1б± 3,1 14,9± 2,7

SNP, 10-3 М 54,4± 11,5 14± 3,5 13± 3,3

SNP, 10-4 М 71± 12,2 117± 7,8** 29± 4,б*

SNP, 10-S М 100,5± 10,б 102± 9** 3б,4± 5,7*

NaNO2, 10-3 М 52± 7,8 б4,3± 11* 8,2± 2,1**

NaNO2,10-4 М 94± 8,9 93± 8* 13± 3,7

NaNO2,10-S М 180± 17,8 121± 14,7** 29± 4,7*

L-аргинин, S мМ 113± 1б,7 150± 17** 37,б± 7,3*

Пр имечание. * — р<0,05; ** — р<0,01 — показатели достоверности различий по сравнению с действием

свободно-радикальных агентов в соответствующих концентрациях. Результаты выражены в процентах по отношению к контролю.

цитотоксичности двумя путями: уменьшать содержание каталитических железосодержащих центров и химически модифицировать свободные радикалы [18].

Слабое потенцирование антипролифератив-ного эффекта ГПТБ проявлял ЫаЫО2 в концентрации 10-3 М. Таким образом, инкубация опухолевых клеток с ЫО-генерирующими соединениями в нетоксичных концентрациях не приводила к значительному изменению пролиферативной активности, но при использовании их в сочетании с пероксирадикалами наблюдалась стимуляция синтеза ДНК.

Таким образом, оксид азота вызывает стимуляцию пролиферативной активности клеток мышиной мастоцитомы Р-815. На основании полученных результатов можно предположить, что оксид азота — один из факторов, способствующих появлению резистентных клонов опухолевых клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Владимиров Ю.А. // Вестник Российской академии мед. наук. 1998. № 7. С.43-51.

2. Окулов В.Б., Зубова С.Г. // Адаптивные реакции клеток как основа прогрессии опухолей // Вопросы онкологии. 2000. Т. 46, № 5. С.505-512.

3. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е. и др. // Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М., 1998.

4. Filep J.G., Lapierre C., Lachance S. et al. // Biochem. J. 1997. Vol. 321. P.897-901.

5. Gansauge S., Gansauge F.,Gause H. et al. // FEBS Letters. 1997. Vol. 404. P.6-10.

6. Gansauge S., Gansauge F., Nussler A.K. et al. // FEBS Letters. 1997. Vol. 410. P.160-164.

7. Glockzin S., Knethen A., Scheffner M. et al. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P.19581-19586.

8. Gorman A., McGowan A., Cotter G. // FEBS Letters. 1997. Vol. 404. P.27-33.

9. Juckett M. B., Weber M., Balla J. // Free Rad. Biol. Med. 1996. Vol. 20. P.63-73.

10.Kanner J., Harel S., Granit R. // Lipids. 1992. Vol. 27. P. 46-49.

11.Lissi E., Pascual C., Castillo M. // Free Rad. Res. Comms. 1992. Vol. 17. P. 299-311.

12.Marklund S. L., Westman N.G. // Radiat. Res. 1984. Vol. 100. P.155-123.

13Miura T., Muraoka S., Ogiso T. // Res. Commun. Molec. Pathol. Pharmacol. 1995. Vol. 87. P. 133-143.

14.Miura Y., Anzai K., Urano S. et al. // Free Rad. Biol. Med. 1997. Vol. 23. P. 533-540.

15.Padmaja S., Huie R.E. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 195. P.539-544.

16.Radi R., Beckman J.S., Bush K.M. et al. // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P.4244-4250.

17.Nitric oxide contributes to adriamycin’s antitumor effect / D.S. Lind, M.I. Kontaridis, P.D. Edwards et al. // J. Surg. Res. 1997. Vol. 2. P. 283-287.

18.Yalowich J.C., Gorbunov N.V., Kozlov A.V. et al. // Biochemistry. 1999. Vol. 33. P. 10691-10698.