FC ВАРИАНТЫ АНТИТЕЛА
ANTIBODY Fc VARIANTS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к полипептидам, включающим варианты Fc области. Более конкретно, настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим Fc-область, с модифицированной эффекторной функцией вследствие замены одной или более аминокислот в Fc области полипептида.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области вариантов антител и предлагает лолипелтиды, содержащие Fc варианты с пониженной эффекторной функцией, например, понижением ADCC и/или связывания C1q.
В частности, в изобретении предложен полипептид, содержащий Fc вариант Fc области человеческого IgG дикого типа, где указанный Fc вариант имеет аминокислотную замену в положении Pro329 и по меньшей мере еще одну аминокислотную замену, где аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с системой EU index согласно Кабат, и где указанный полипептид обладает пониженной аффинностью к FcγRIIIA и/или FcγRIIA и/или FcγRI человека по сравнению с полипептидом, содержащим Fc область IgG дикого типа, и где индуцированная указанным полипептидом ADCC снижена по меньшей мере на 20% по сравнению с ADCC, индуцированной полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа.
В определенном воплощении Pro329 Fc области человеческого полипептида дикого типа, описанной выше, замещен на глицин или аргинин или аминокислотный остаток достаточно большого размера, разрушающий «пролиновый сэндвич» на границе между Fc/Fcγ рецептором, образующийся между пролином-329 в Fc и остатками триптофана Trp 87 и Trp 110 в FcgRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 July 2000)). В следующем аспекте изобретения по меньшей мере еще одна аминокислотная замена в составе Fc варианта представляет собой S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S, а еще в одном воплощении указанная по меньшей мере еще одна аминокислотная замена представляет собой L234A и L235A в Fc области IgG1 человека или S228P и L235E в Fc области IgG4 человека.
В следующем аспекте изобретения предложенный полипептид обладает пониженной аффинностью по меньшей мере к одному из следующих рецепторов, выбранных из группы, включающей человеческие рецепторы FcγI, FcγIIA и C1q, по сравнению с полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа. Еще в одном аспекте изобретения полипептид содержит Fc область IgG1 или IgG4 человека. Еще в одном аспекте изобретения полипептид представляет собой антитело или белок, гибридизованный с Fc.
В следующем воплощении агрегация тромбоцитов, индуцированная полипептидом, содержащим Fc вариант, снижена по сравнению с арегацией тромоцитов, индуцированной полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа. В следующем воплощении полипептид согласно изобретению опосредует CDC, которая значительно слабее по сравнению с CDC, индуцируемой полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа.
В следующем воплощении изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант, согласно описанию выше, предложены для применения в качестве лекарства. В определенном воплощении полипептид представляет собой антитело к CD9, характеризующееся тем, что полипептид, содержащий Fc область дикого типа, содержит SEQ ID NO:9 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи и SEQ ID NO:8 в качестве вариабельного участка легкой цепи.
В следующем аспекте изобретения полипептиды согласно описанию выше предложены для применения в лечении заболевания, при котором желательно чтбы эффекторная функция полипептида, содержащего Fc вариант, была значительно снижена по сравнению с эффекторной функцией, индуцируемой полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа.
В следующем воплощении предложено применение полипептидов, описанных выше, для изготовления лекарства для лечения заболевания, при котором желательно, чтобы эффекторная функция полипептида, содержащего Fc вариант Fc области человеческого IgG дикого типа, была значительно снижена по сравнению с эффекторной функцией, индуцируемой полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа.
В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения индивида, имеющего заболевание, при котором желательно, чтобы эффекторная функция полипептида, содержащего Fc вариант Fc области человеческого IgG дикого типа была значительно снижена по сравнению с эффекторной функцией, индуцируемой полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа человеческого происхождения, включающий введение индивиду эффективного количества полипептида, описанного выше.
Следующий аспект изобретения представляет собой применение полипептида, содержащего Fc вариант Fc области человеческого IgG дикого типа, причем в указанном полипептиде Pro329 Fc области человеческого IgG замещен на глицин, где аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с системой EU index согласно Кабат, где указанный полипептид обладает пониженной аффинностью к FcγRIIIA и FcγRIIA человека, что приводит к ослаблению ADCC по меньшей мере на 20% по сравнению с ADCC, индуцированной полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа, и/или приводит к ослаблению ADCP.
Следующий аспект изобретения представляет собой применение полипептида, содержащего Fc вариант Fc области человеческого IgG дикого типа, причем в указанном полипептиде Pro329 в Fc области IgG человека замещен на глицин, и где Fc вариант содержит по меньшей мере еще две аминокислотные замены L234A и L235A в Fc области IgG1 человека или S228P и L235E в Fc области IgG4 человека, где аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с системой EU index согласно Кабат, где указанный полипептид обладает пониженной аффинностью к FcγRIIIA и FcγRIIA человека, что приводит к ослаблению ADCC по меньшей мере на 20% по сравнению с ADCC, индуцированной полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа, и/или приводит к ослаблению ADCP.
Другим аспектом изобретения является применение полипептида, описанного выше, при котором агрегация тромбоцитов, индуцированная описанным выше полипептидом, снижена по сравнению с агрегацией тромбоцитов, индуцированной полипептидом, содержащим Fc область дикого типа человеческого происхождения, где полипептид представляет собой антитело, активирующее тромбоциты.
В другом аспекте изобретения предложен способ лечения индивида, имеющего заболевание, при котором указанный индивид в ходе лечения получает полипептид, в указанном полипептиде Pro329 Fc области IgG человека замещен на глицин, где аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с системой EU index согласно Kabat, где указанный полипептид характеризуется значительно сниженным связыванием FcγRIIIA и/или FcγRIIA по сравнению с полипептидом, содержащим Fc область человеческого IgG дикого типа, включающий введение индивиду эффективного количества указанного полипептида.
В следующем аспекте изобретения полипептид, применяемый в указанном способе, содержит по меньшей мере еще две аминокислотные замены: L234A и L235A в Fc области IgG1 человека или S228P и L235E в Fc области IgG4 человека.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Моноклональные антитела являются перспективными в терапевтическом отношении и играют важную роль в арсенале лечебных средств, существующих на сегодняшний день. За последнее десятилетие общим направлением в фармацевтической промышленности была разработка моноклональных антител (mAb) как терапевтических агентов для лечения ряда заболеваний, таких как онкологические заболевания, астма, артрит, рассеянный склероз и т.д. Моноклональные антитела преимущественно получают в виде рекомбинантных белков в культуре генетически модифицированных клеток млекопитающих.
Fc область антитела, т.е. терминальные участки тяжелых цепей антитела, охватывающие домены СН2, СН3 и часть шарнирного участка, имеет низкую вариабельность и задействована в выполнении физиологических функций антитела. Эффекторные функции, обусловленные Fc участком антитела, варьируют в зависимости от класса и подкласса антитела и включают связывание Fc участка антитела со специфическим Fc рецептором ("FcR") на поверхности клеток, запускающее различные биологические ответы.
Как правило, эти рецепторы имеют внеклеточный домен, опосредующий связывание с Fc, трансмембранный участок и внутриклеточный домен, который может опосредовать передачу некоторых сигналов внутри клетки. Эти рецепторы экспрессируются различными клетками иммунной системы, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В клетки, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, естественные киллерные клетки (NK) и Т клетки. Образование комплекса Fc/FcγR сближает эти Эффекторные клетки с сайтами связывания антигена, что обычно приводит к распространению сигнала внутри клеток и последующему развитию важных иммунных ответов, таких как высвобождение провоспалительных медиаторов, активация В клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Способность опосредовать цитотоксические и фагоцитарные эффекторные функции представляет собой возможный механизм, благодаря которому антитела разрушают клетки-мишени. Опосредованная клетками реакция, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγR, распознают антитело, связанное с поверхностью клетки-мишени, и затем вызывают лизис клетки-мишени, обозначается антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC) (Ravetch, et al., Annu Rev Immunol 19 (2001) 275-290). Опосредованная клетками реакция, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγR, распознают антитело, связанное с поверхностью клетки-мишени, и затем вызывают фагоцитоз клетки-мишени, обозначается антитело-зависимым клеточно-опосредованным фагоцитозом (ADCP). Кроме того, перекрывающийся участок в Fc области молекулы также контролирует активацию цитотоксической функции, опосредуемой комплементом и не зависящей от клеток, известной также под названием комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC).
В случае антител, принадлежащих классу IgG, антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность и антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз обусловлены связыванием Fc области с рецепторами семейства, обозначаемого Fey рецепторами (FcγR). У человека в это семейство белков входят FcγRI (CD64); FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIA, FcγRIIB, и FcγRIIC; и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIA и FcγRIIIB (Raghavan, and Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181-220; Abes, et al., Expert Reviews VOL 5(6), (2009) 735-747). FcγR экспрессируются различными клетками иммунной системы, и образование комплекса Fc/FcγR сближает эти клетки с сайтами связывания антигена, что, как правило, запускает передачу сигнала и последующие иммунные ответы, такие как высвобождение провоспалительных медиаторов, активация В клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Кроме того, тогда как FcγRI, FcγRIIA/c и FcγRIIIA представляют собой активирующие рецепторы, имеющие внутриклеточные иммунорецепторные тирозиновые активирующие последовательности (immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM), FcγRIIB имеет ингибирующую последовательность (ITIM) и, следовательно, является ингибирующим. Кроме того, de Reys, et al., Blood, 81, (1993) 1792-1800 пришли к заключению, что активация и агрегация тромбоцитов, индуцированные моноклональными антителами, например, такими как антитело к CD9, инициируется при распознании антигена с последующим Fc-зависимым этапом, в котором задействован рецептор FcγRII (см. также Taylor, et al., Blood 96 (2000) 4254-4260). Тогда как FcγRI связывает мономерный IgG с высокой аффинностью, FcγRIII и FcγRII являются низкоаффинными рецепторами, взаимодействующими с агрегатами или комплексами IgG.
Каскад комплемента, участвующий в воспалительном ответе, представляет собой часть врожденного иммунитета и имеет решающее значение для способности индивида сопротивляться инфекции. Другим важным лигандом Fc является белок комплемента C1q. Связывание Fc и C1q опосредует процесс, называемый комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC). C1q способен связывать шесть антител, хотя для активации каскада комплемента достаточно связывания двух IgG. C1q образует комплекс с сериновыми протеазами C1r и C1s, составляя комплекс Cl системы комплемента.
Во многих обстоятельствах связывание и активация эффекторных функций, опосредованных Fc областью иммуногобулинов, имеет благоприятное значение, как например, в случае антитела к CD20, однако в некоторых случаях может быть целесообразным понижение или даже устранение эффекторной функции. Это особенно важно для антител, предназначенных доставлять лекарство (например, токсины и изотопы) к клеткам-мишеням, когда опосредуемые Fc/FcγR эффекторные функции сближают здоровые иммунные клетки с компонентом, оказывающим деструктивное воздействие, что приводит к истощению нормальной лимфоидной ткани наряду с клетками-мишенями (Hutchins, et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White, et al., Annu Rev Med 52 (2001) 125-145). В таких случаях применение антител, которые слабо мобилизуют комплемент или эффекторные клетки было бы чрезвычайно полезно (см. также Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276(9) (2001) 6591-6604; US 6,194,551; US 5,885,573 и публикация РСТ WO 04/029207).
В других случаях, например, когда целью является блокирование взаимодействия рецептора, экспрессируемого большим числом клеток, с распознаваемым им лигандом, было бы предпочтительно ослабить или устранить все эффекторные функции антитела для уменьшения нежелательной токсичности. Также, в случаях, когда используемое в терапевтических целях антитело беспорядочно связывается с рядом тканей человеческого организма, было бы целесообразно ограничить осуществление эффекторной функции более узким кругом тканей для уменьшения токсичности. Наконец, пониженная аффинность антител к рецептору FcγRII была бы благоприятной для антител, индуцирующих активацию и агрегацию тромбоцитов за счет связывания рецептора FcγRII, которая представляет собой существенный побочный эффект у таких антител.
Хотя существуют некоторые классы иммуноглобулинов человека, у которых отсутствуют определенные эффекторные функции, иммуноглобулины естественного происхождения, у которых отсутствовали бы все эффекторные функции, не известны. Альтернативный подход представляет собой модификацию или мутацию наиболее важных остатков в составе области Fc, отвечающих за эффекторную функцию. Например, см. публикации РСТ WO 2009/100309 (Medimmune), WO 2006/076594 (Xencor), WO 1999/58572 (Univ. Cambridge), US 2006/0134709 (Macrogenics), WO 2006/047350 (Xencor), WO 2006/053301 (Xencor), US 6,737,056 (Genentech), US 5,624,821 (Scotgen Pharmaceuticals) и US 2010/0166740 (Roche).
Связывание IgG с активирующими и ингибирующими Fey рецепторами или с первым компонентом комплемента (C1q) зависит от аминокислотных остатков, находящихся в шарнирном участке и СН2 домене. Две области СН2 домена имеют важнейшее значение для связывания FcγR и компонента комплемента C1q и имеют уникальные последовательности. Замена остатков IgG1 и IgG2 человека в положениях 233-236 и остатков IgG4 в положениях 327, 330 и 331 значительно понижает ADCC и CDC (Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29(8) (1999) 2613-2624; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604). Idusogie, et al., J. Immunol 166 (2000) 2571-2575) картировали сайт связывания C1q ритуксана и продемонстрировали, что замена Pro329Ala понижала способность Ритуксимаба связывать C1q и активировать комплемент. Было показано, что замена Pro329 на Ala приводит к уменьшению связывания с рецепторами FcγRI, FcγRII и FcγRIIIA (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604), однако было также показано, что при наличии этой мутации связывание с FcγRI и FcγRII было таким же, как у дикого типа, а связывание с рецептором FcγRIIIA снижалось лишь незначительно (Таблица 1 и Таблица 2 в ЕР 1068241, Genentech).
Oganesyan, et al., Acta Cristallographica D64 (2008) 700-704 продемонстрировали, что тройная мутация L234F/L235E/P331S в нижнем шарнирном участке и С2Н домене приводит к снижению связывающей активности молекул IgG1 человека с C1q, FcγRI, FcγRII и FcγRIIIA человека.
По прежнему существует неудовлетворенная потребность в антителах, опосредующих пониженную ADCC и/или ADCP и/или CDC. Таким образом, целью данного изобретения является получение таких антител. Неожиданно было обнаружено, что мутация остатка пролина Pro329 на глицин приводит к неожиданному значительному ингибированию связывания с рецепторами FcγRIIIA и FcγRIIA и значительному ингибированию ADCC и CDC. Кроме того, комбинированная мутация Pro329 и например, L234A и L235A (LALA) приводила к неожиданному значительному ингибированию связывания с C1q, FcγRI, FcγRII и FcγRIIIA. Таким образом, оказалось, что по способности разрушать «пролиновый сэндвич» на границе контакта Fc с Fcγ рецептором остаток глицина значительно превосходит другие аминокислотные замены в положении 329, например, замену на аланин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1
Аффинность связывания различных FcγR с иммуноглобулинами определяли при помощи поверхностного плазменного резонанса (Surface Plasmon Resonance, SPR) с применением биосенсора Biacore T100 (GE Healthcare) при 25°С.
а) определяли аффинность связывания FcγRI с вариантами антител GA101 (GA) (мутации IgG1-P329G, IgG4-SPLE и IgG1-LALA) и вариантами антител к P-селектину (PS) (IgG1-P329G, IgG1-LALA и IgG4-SPLE), а также с антителами дикого типа.
б) определяли аффинность связывания FcγRI с вариантами антител к CD9 (IgG1-дикого типа, IgG1-P329G, IgG1-LALA, IgG4-SPLE, IgG1-P329G/LALA, IgG4-SPLE/P329G), а также с антителами дикого типа.
в) определяли аффинность связывания FcγRIIA(R131) с вариантами антител к CD9 (IgG1-дикого дипа, IgG1-P329G, IgG1-LALA, IgG4-SPLE, IgG1-P329G/LALA, IgG4-SPLE/P329G) а также с антителами дикого типа. Показан нормализованный ответ в виде зависимости от концентрации рецептора.
г) определяли аффинность связывания FcγRIIB с вариантами антител к CD9 (обозначенные здесь: "ТА") (IgG1-дикого типа, IgG4-SPLE/P329G, IgG1-LALA, IgG1-LALA/P329G) и вариантами антител к (pSel) (IgG4-дикого типа, IgG4-SPLE), а также с антителами дикого типа.
д) определяли аффинность связывания FcγRIIIA-VISS с вариантами антител к CD9 (IgG1-дикого типа, IgG4-SPLE, IgG1-LALA, IgG4-SPLE/P329G, IgG1-P329G, IgG1-LALA/P329G), а также с антителами дикого типа. Показан нормализованный ответ в виде зависимости от концентрации рецептора.
Фигура 2
Исследовали связывание C1q с вариантами антитела к Р-селектину (PS) (IgG1 дикого типа, P329G, IgG4-SPLE) и вариантами антител к CD20 (GA) (IgG1-дикого типа, P329G и IgG4-SPLE).
Фигура 3
Способность рекрутировать эффекторные клетки иммунной системы зависит от типа Fc варианта. Fc варианты наносили на планшет для иммуноферментного анализа и добавляли эффекторные клетки человека NK92, трансфецированные FcγRIIIA человека. Индуцированную цитолитическую активность активированных NK клеток оценивали по высвобождению эстеразы.
а) варианты антител к CD20 (GA101) (исследовали антитела дикого типа, LALA, P329G, P329G/LALA).
б) исследовали варианты антител к CD20 (GA101) (с введением мутаций P329R или P329G). Все варианты были модифицированы с применением гликоинженерии для более эффективной мобилизации эффекторных клеток
Фигура 4
Как показало классическое исследование ADCC, способность рекрутировать эффекторные клетки иммунной системы зависит от типа Fc варианта. В качестве эффекторных клеток использовали линию клеток NK92 человека, трансфецированных FγcRIIIA человека, а в качестве клеток-мишеней использовали клетки Raji, положительные по CD20. Исследовали различные варианты антитела к CD20, как модифицированные с применением гликоинженерии (GA101 G(2), так и не модифицированные варианты (GA101) (с введением мутаций P329G, Р329А или LALA).
а) не модифицированные с применением гликоинженерии антитела к CD20: с введением в антитело мутаций P329G, LALA и P329G/LALA, соответственно
б) модифицированные с применением гликоинженерии антитела к CD20: с введением в антитело мутаций P329G, Р329А и LALA, соответственно.
Фигура 5
Исследование комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Исследовали эффективность различных Fc вариантов, не модифицированных и модифицированных с применением гликоинженерии, и антител к CD20 (GA101) в отношении CDC с применением клеток-мишеней SUDH-L4.
а) не модифицированные с применением гликоинженерии антитела к CD20: с введением в антитело мутаций P329G, LALA и P329G/LALA, соответственно.
б) модифицированные с применением гликоинженерии антитела к CD20: с введением в антитело мутаций P329G, Р329А и LALA, соответственно.
Фигура 6
а) Углеводный профиль Fc-ассоциированных гликанов вариантов IgG1 человека. Степень галактозилирования (в процентах) Fc-ассоциированных олигосахаридов hIgG1, имеющих мутации LALA, P329G, Р329А или P329G/LALA только незначительно отличается от таковой антитела дикого типа.
б) Относительная степень галактозилирования: четыре различных IgG с введением мутаций IgG1 P329G/LALA. Сравнивали степень галактозилирования четырех различных V-доменов при экспрессии в клетках Hek293 EBNA.
Фигура 7
Агрегация тромбоцитов в цельной крови, индуцированная антителом. Определяли агрегацию тромбоцитов, индуцированную мышиным IgG1 у двух доноров, с различным ответом в зависимости от концентрации антитела.
а) донор А, б) донор В.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
В настоящем описании и формуле изобретения нумерация остатков тяжелой цепи иммуноглобулина указана в соответствии с системой EU index согласно Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), напрямую включенной сюда путем ссылки. Система "EU index согласно Кабат" обозначает нумерацию аминокислотных остатков антитела человека EU IgG1.
D
"Аффинность" обозначает суммарную силу всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном или Fc рецептором). Если не указано иначе, термин "аффинность связывания" согласно использованию здесь обозначает собственную аффинность связывания, которая отражает взаимодействие между членами связывающей пары (например, антителом и Fc рецептором или антителом и антигеном) в соотношении 1:1. Аффинность молекулы Х к своему партнеру Y может в общем виде быть представлена константой диссоциации (K). Аффинность может быть измерена общепринятыми способами известными в данной области техники, включая описанные здесь. Определенные иллюстративные и приведенные в качестве примеров воплощения для измерения аффинности связывания описаны ниже.
Антитело, "подвергнутое аффинному созреванию", обозначает антитело с одной или несколькими модификациями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVRs) по сравнению с материнским антителом, не имеющим таких модификаций, такие модификации приводят к повышению аффинности антитела к антигену.
"Модификация аминокислот" обозначает изменение аминокислотной последовательности предопределенной последовательности аминокислот. Примеры модификаций включают замены, инсерции и/или делеции аминокислот. Предпочтительной модификацией аминокислоты в данном описании является замена. "Модификация аминокислоты в" определенном положении, например, в области Fc обозначает замену или делецию определенного остатка или инсерцию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, граничащего с определенным остатком. Под инсерцией "граничащей" с определенным остатком понимают инсерцию в пределах расстояния одного или двух остатков от него. Инсерция может быть M-концевой или C-концевой относительно определенного остатка.
"Замена аминокислоты" обозначает замещение по меньшей мере одного существующего аминокислотного остатка в предопределенной аминокислотной последовательности другим отличающимся "замещающим" аминокислотным остатком. Замещающий остаток или остатки могут быть "аминокислотными остатками естественного происхождения" (т.е. закодированные в генетическом коде) и выбранные из группы, состоящей из: аланина (Ala); аргинина (Arg); аспарагина (Asn); аспарагиновой кислоты (Asp); цистеина (Cys); глутамина (Gln); глутаминовой кислоты (Glu); глицина (Gly); гистидина (His); изолейцина (Ile); лейцина (Leu); лизина (Lys); метионина (Met); фенилаланина (Phe); пролина (Pro); серина (Ser); треонина (Thr); триптофана (Trp); тирозина (Tyr) и валина (Val). Предпочтительно, замещающий остаток не является цистеином. В данном документе определение аминокислотной замены также включает замены одним или более аминокислотными остатками, не имеющими естественного происхождения. "Аминокислотный остаток, не имеющий естественного происхождения» обозначает остаток, отличный от перечисленных выше аминокислотных остатков, имеющих естественное происхождение, который способен ковалентно связываться с граничащим аминокислотным остатком (остатками) в полипептидной цепи. Примеры аминокислотных остатков, не имеющих естественного происхождения, включают норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аминокислотные остатки, аналогичные описанным Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336. Для получения аминокислотных остатков, не имеющих естественного происхождения, можно применять способы, описанные Noren, et al., Science 244 (1989) 182 и Ellman, et al., см. выше. Вкратце, эти способы включают химическую активацию суппрессорных тРНК аминокислотным остатком, не имеющим естественного происхождения, с последующей транскрипцией и трансляцией тРНК in vitro.
"Инсерция аминокислоты" обозначает включение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в предопределенную аминокислотную последовательность. Тогда как инсерция обычно заключается в инсерции одного или двух аминокислотных остатков, настоящее описание предусматривает более крупные "инсерции пептидов", например, инсерции приблизительно от трех до пяти или даже приблизительно до десяти аминокислотных остатков. Вставленный(е) остаток (остатки) могут иметь естественное происхождение или не иметь естественного происхождения, как описано выше.
"Делеция аминокислоты" обозначает удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка из предопределенной аминокислотной последовательности.
Термин "антитело" здесь используется в широком смысле и включает антитела с различной структурой, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антиген-связывающую активность, но не ограничивается ими.
Термин "вариант антитела" в данном документе обозначает вариант антитела дикого типа, характеризуемый тем, что изменение аминокислотной последовательности по сравнению с антителом дикого типа происходит у варианта антитела, например, при мутациях определенных аминокислотных остатков антитела дикого типа.
Термин "эффекторная(ые) функция(и) антитела" или "эффекторная функция" в данном документе обозначает функцию, которую опосредует эффекторный Fc домен (домены) IgG, (например, Fc область иммуноглобулина). Такая функция может осуществляться, например, при связывании эффекторного(ых) Fc домена(ов) с Fc рецептором на поверхности клетки иммунной системы, обладающей фагоцитарной или литической активностью, или при связывании эффекторного(ых) домена(ов) Fc с компонентами системы комплемента. Типичными эффекторными функциями являются ADCC, ADCP и CDC.
2
"Фрагмент антитела" обозначает молекулу, отличную от интактного антитела, содержащую часть интактного антитела, связывающего антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.
"Антитело, связывающееся с тем же эпитопом", что и референсное антитело, обозначает антитело, блокирующее связывание референсного антитела с его антигеном в тестах конкурентного связывания на 50% или более, и наоборот, референсное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в тестах конкурентного связывания на 50% или более. Примеры тестов конкурентного связывания приводятся ниже.
"Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" обозначают опосредованную клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcR (например, естественные киллерные клетки (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают антитело, связанное с клеткой-мишенью, и затем вызывают лизис клетки-мишени. Основные клетки, опосредующие ADCC, МК-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках представлена в обобщенном виде в Таблице 3 на стр.464 в публикации Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492.
Термины "антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз" и "ADCP" обозначают процесс, при котором покрытые антителами клетки частично или полностью подвергаются интернализации фагоцитирующими клетками иммунной системы (например, макрофагами, нейтрофилами и дендритными клетками), которые связываются с Fc областью иммуноглобулина.
Термин "связывающий домен" обозначает область полипептида, которая связывается с другой молекулой. В случае FcR, связывающий домен может включать часть его полипептидной цепи (например, его а цепь), которая отвечает за связывание с Fc областью. Одним из соответствующих связывающихся доменов является внеклеточный домен α-цепи FcR.
Термин "связывание" с Fc рецептором, используемый в данном документе, означает связывание антитела с Fc рецептором, например, определяемое в исследовании с помощью биосенсора BIAcore(R) (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden).
В исследовании с помощью биосенсора BIAcore(R) Fc рецептор связывается с поверхностью, а связывание варианта, например, варианта антитела, в котором были произведены мутации, определяется с помощью поверхностного плазменного резонанса (SPR). Аффинность связывания описывается показателями ka (константа скорости ассоциации антитела с образованием комплекса антитело/Fc рецептор), kd (константа диссоциации) и KD (kd/ka). В альтернативном случае сигнал, наблюдаемый на сенсограмме SPR при связывании, можно напрямую сравнить с сигналом референтного соединения, учитывая высоту резонансного сигнала и характеристики диссоциации.
"C1q" представляет собой полипептид, содержащий сайт связывания для Fc области иммуноглобулина. Вместе с двумя сериновыми протеазами C1r и C1s, C1q образует комплекс С1, первый компонент пути комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). C1q человека можно приобрести, например, в компании Quidel, San Diego, Calif.
"CH2 домен" Fc области IgG человека (также обозначаемый доменом "Cγ2") как правило находится приблизительно между аминокислотами 231 и 340. CH2 домен является уникальным, поскольку он не образует тесной пары с другим доменом. Точнее, между двумя СН2 доменами интактной нативной молекулы IgG располагаются две N-присоединенных разветвленных углеводных цепочки. Было предположено, что углевод может служить заменой составлению пары домен-домен и способствовать стабилизации СН2 домена (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985)161-206).
"СН3 домен" содержит ряд остатков, располагающихся на C-конце относительно СН2 домена в Fc области (т.е. приблизительно между 341 и 447 аминокислотными остатками IgG).
Термины «онкологический» и «раковый» обозначают или описывают физиологическое состояние млекопитающих, которое, как правило, характеризуется неконтролируемой пролиферацией клеток. Примеры онкологических заболеваний включают карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз, но не ограничиваются ими. Более конкретные примеры таких онкологических заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные формы злокачественных опухолей головы и шеи.
В данном документе выражения "клетка," "клеточная линия" и "клеточная культура" используются взаимозаменяемо и все эти обозначения включают потомков клетки. Таким образом, слова "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают заявленные первичные клетки и полученную из них культуру, независимо от количества пассажей. Считается, что все потомки не обязательно содержат идентичную ДНК, из-за возникновения спланированных или спонтанных мутаций. Сюда также включаются мутантные потомки, имеющие такие же функции или биологическую активность при скрининге, как и исходные трансформированные клетки. В зависимости от контекста понятно, в каких случаях имеются в виду иные обозначения.
Термин "химерное" антитело обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретных источников или биологических видов, тогда как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или биологического вида.
1
2
3
4
1
2
"Класс" антитела обозначает тип константного домена или константного участка его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
Термин "цитотоксический агент" здесь используется для обозначения вещества, ингибирующего или предотвращающего функционирование клетки и/или вызывающего гибель или разрушение клетки. Цитотоксические агенты включают радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные препараты (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, ингибирующие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или энзиматически активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая фрагменты и/или их варианты; и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже, но не ограничиваются ими.
Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность" или CDC обозначает механизм индукции клеточной гибели, при котором эффекторный Fc домен (домены) антитела, связанного с мишенью, запускает серию ферментативных реакций, завершающихся образованием отверстий в мембране клетки-мишени. Как правило, комплексы антиген-антитело, такие как находящиеся на поверхности покрытых антителами клеток-мишеней, связывают и активируют C1q компонент комплемента, что в свою очередь активирует каскад комплемента, приводящий к гибели клетки-мишени. Активация комплемента может также приводить к фиксации компонентов комплемента на поверхности клеток-мишеней, что усиливает ADCC за счет связывания рецепторов комплемента (например, CR3) на поверхности лейкоцитов.
"Нарушение" представляет собой любое состояние, на которое может благоприятно повлиять лечение полипептидом, таким как антителом, содержащим Fc вариант. Сюда относятся хронические и острые нарушения или заболевания, включающие такие патологические состояния, которые предрасполагают к развитию у млекопитающего указанного нарушения. В одном воплощении нарушением является онкологическое заболевание.
"Эффекторные функции" относятся к формам биологической активности, связанным с Fc фрагментом антитела, различающимся у антител различных изотипов. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз (ADCP); снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, рецепторов В-клеток) и активацию В-клеток.
"Пониженная эффекторная функция" в данном описании обозначает снижение определенной эффекторной функции, например, ADCC или CDC, по меньшей мере на 20% по сравнению с контролем (например, полипептидом с Fc областью дикого типа), а "существенно пониженная эффекторная функция" в данном документе обозначает снижение определенной эффекторной функции, например, ADCC или CDC, по меньшей мере на 50% по сравнению с контролем.
"Эффективное количество" агента, например, фармацевтического препарата, обозначает количество, эффективное для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата при необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени.
Термин "Fc фрагмент" здесь используется для обозначения C-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащего по меньшей мере часть константного участка. Термин включает нативную последовательность Fc фрагментов и вариантов Fc фрагментов. В одном воплощении Fc фрагмент тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. При этом, C-концевой лизин (Lys447) Fc фрагмента может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков в Fc фрагменте или в константном участке производится в соответствии с системой нумерации EU, также носящей название «EU index», согласно описанию в Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
"Вариант Fc области" содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от "нативной" последовательности или последовательности "дикого типа" Fc области вследствие наличия по меньшей мере одной "аминокислотной модификации" согласно данному описанию. Предпочтительно, вариант Fc области имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc области или по сравнению с Fc областью родительского полипептида, например, приблизительно от одной до приблизительно десяти аминокислотных замен и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислтных замен в нативной последовательности Fc области или в Fc области родительского полипептида. Вариант Fc области в данном документе предпочтительно имеет приблизительно 80% гомологии с нативной последовательностью Fc области и/или с Fc областью родительского полипептида и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% гомологии, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% гомологии.
Термин "Fc-вариант" в данном документе обозначает полипептид, имеющий модификацию в составе Fc домена. Fc варианты по настоящему изобретению описываются в соответствии с существующими в их составе аминокислотными модификациями. Так, например, P329G представляет собой Fc вариант с заменой пролина на глицин в положении 329 по сравнению с Fc родительского полипептида, в котором нумерация соответствует системе EU index. Наименование аминокислоты дикого типа может быть не указано, в этом случае вышеупомянутый вариант обозначается P329G. Положение всех аминокислот, встречающихся в настоящем изобретении, соответстует нумерации по системе EU index. Система EU index или EU index согласно Кабат или нумерация EU обозначает нумерацию антитела EU (публикация Edelman, et al., Proc Natl Acad Sci USA 63 (1969) 78-85, включенная сюда во всей полноте путем ссылки). Модификации могут представлять собой вставку, делецию или замену. Замены могут включать аминокислоты естественного происхождения, а также аминокислоты, не имеющие естественного происхождения. Варианты могут содержать аминокислоты, не имеющие естественного происхождения. Примеры включают патенты США 6,586,207; WO 98/48032; WO 03/073238; US 2004/0214988 A1; WO 05/35727 A2; WO 05/74524 A2; Chin, J.W., et al., Journal of the American Chemical Society 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W., and Schultz, P.O., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; and, Wang, L, and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10, все из которых включены во всей полноте путем ссылки.
Термин "полипептид, содержащий Fc область" обозначает полипептид, такой как антитело или иммуноадгезин (см. определения ниже), который содержит Fc область.
Термины "Fc рецептор" или "FcR" используются для описания рецептора, связывающегося с Fc областью антитела. Предпочтительный FcR представляет собой FcR человека, имеющий нативную последовательность. Кроме того, предпочтительный FcR связывается с антителом IgG (рецептор гамма) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы этих рецепторов, образованные в результате альтернативного сплайсинга. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), имеющие схожие аминокислотные последовательности, различающиеся преимущественно в области цитоплазматических доменов. Активирующий рецептор FcγRIIA в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторную тирозиновую активирующую последовательность (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторную тирозиновую ингибирующую последовательность (ITIM) (см. обзор Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234). Обзор по FcR представлен Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; and de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-41. Термин "FcR" в данном документе охватывает и другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем. Термин также включает неонатальный рецептор FcRn, отвечающий за транспорт материнских IgG к плоду (Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587 and Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).
"Лиганд Fc IgG" в данном документе обозначает молекулу любого организма, предпочтительно полипептид, которая связывается с Fc областью IgG антитела с образованием комплекса Fc/лиганд Fc. Лиганды Fc включают FcγRs, FcγRs, FcγRs, FcRn, C1q, C3, маннан-связывающий лектин, маннозный рецептор, белок А стафилококка, белок G стафилококка и FcγR вирусов, но не ограничиваются ими. Лиганды Fc также включают гомологи Fc рецептора (FcRH), которые представляют собой семейство Fc рецепторов, гомологичных FcγR (Davis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136, включенный во всей полноте путем ссылки). Лиганды Fc могут включать еще неоткрытые молекулы, связывающие Fc. Конкретными примерами лигандов Fc IgG являются рецепторы FcRn и Fc гамма. Под "лигандом Fc" в данном документе понимают молекулу любого организма, предпочтительно полипептид, которая связывается с Fc областью антитела с формированием комплекса Fc/лиганд Fc.
Под "Fc гамма рецептором", "FcγR" или "Fc гамма R" в данном документе понимают любого представителя семейства белков, связывающих Fc область IgG антитела и кодируемых геном FcγR. У человека это семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIA, FcγRIB и FcγRIC; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIA (включая аллотипы Н131 и R131), FcγRIIB (включая FcγRIIB-1 и FcγRIIB-2) и FcγRIIc; а также FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIA (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIB-NAI и FcγRIIB-NA2) (Jefferis, et al., Immunol Lett 82 (2002) 57-65, включенные во всей полноте путем ссылки), а также любые неизвестные FcγR человека или изоформы или аллотипы FcγR, но не ограничивается ими. FcγR может принадлежать любому организму, включая человека, мышь, крысу, кролика и обезьяну, не ограничиваясь ими. Мышиные FcγR включают, но не ограничиваются FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD16-2), а также любые неизвестные FcγR мыши или изоформы или аллотипы FcγR.
"FcRn" или "неонатальный Fc рецептор" в данном документе обозначает белок, связывающий Fc область IgG антитела и кодируемый по меньшей мере частично геном FcRn. FcRn может принадлежать любому организму, включая человека, мышь, крысу, кролика и обезьяну, не ограничиваясь ими. Как известно из уровня техники, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто обозначаемые как тяжелая цепь и легкая цепь. Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, а тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если не указано иначе, FcRn или белок FcRn обозначает комплекс тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином.
Под "полипептидом дикого типа, или родительским полипептидом" в данном документе понимают немодифицированный полипептид, который затем подвергается модификации с образованием варианта. Полипептид дикого типа может представлять собой полипептид естественного происхождения или вариант или модифицированную версию полипептида естественного происхождения. Полипептид дикого типа может обозначать сам полипептид, композиции, содержащие родительский полипептид, или его аминокислотную последовательность. Соответственно, под "иммуноглобулином дикого типа" в данном документе понимают немодифицированный полипептид иммуноглобулина, который подвергают модификации с образованием варианта, а под "антителом дикого типа" в данном документе понимают немодифицированное антитело, которое подвергают модификации с образованием варианта антитела. Следует отметить, что "антитело дикого типа" включает известные коммерческие полученные рекомбинантным способом антитела, как изложено ниже.
Термин "кристаллизуемый фрагмент (Fc) полипептида" представляет собой часть молекулы антитела, которая взаимодействует с эффекторными молекулами и клетками. Он включает C-концевые части тяжелых цепей иммуноглобулина.
Термин "Каркасные участки" или "FR" обозначает остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из 4 FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL), как правило, появляются в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "полное антитело" здесь используются взаимозаменяемо и обозначают антитело, имеющее структуру в значительной степени схожую со структурой нативного антитела, или имеющее тяжелые цепи, содержащие Fc фрагмент, как описано здесь.
"Функциональная Fc область" обладает "эффекторной функцией" Fc области с нативной последовательностью. Примеры "эффекторных функций" включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fc рецепторов; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Для таких эффекторных функций, как правило, требуется объединение Fc области со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), для их оценки можно применять различные исследования, например, как описано в данном документе.
"Шарнирный участок" как правило определяется как участок между Glu216 и Pro230 IgG1 человека (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206). Шарнирные участки других изотипов IgG можно выровнять с последовательностью IgG1, поместив в одинаковые позиции первый и последний остатки цистеина, образующие S-S связи между тяжелыми цепями.
"Нижний шарнирный участок" Fc области обычно определяется как ряд аминокислотных остатков, находящихся непосредственно за шарнирным участком ближе к C-концу, т.е. как остатки с 233 по 239 в Fc области.
"Гомология" определяется как процентное содержание идентичных аминокислотных остатков вариантов последовательности, при выравнивании последовательностей и при необходимости, введении пробелов (гэпов) для достижения максимального процентного показателя гомологии. Способы и компьютерные программы, позволяющие осуществить выравнивание, хорошо известны в области техники. Одной из таких компьютерных программ является "Align 2", разработанная компанией Genentech, Inc., и зарегистрированная с пользовательской документацией в бюро по охране авторских прав США в Вашингтоне 10 декабря 1991 г.
Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используются взаимозаменяемо и обозначают клетки, в которые была внедрена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", включающие первично трансформированные клетки и их потомков, независимо от числа пассажей. Потомство может быть не полностью идентично родительской клетке по содержащейся нуклеиновой кислоте, но может содержать мутации. Сюда также включаются мутантные потомки, имеющие такие же функции или биологическую активность при скрининге или отборе, как и исходные трансформированные клетки.
"Человеческое антитело" представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого в организме или в клетках человека или полученное из источника, не относящегося к человеку, но задействующего репертуар антител человека или иные последовательности, кодирующие антитела человека. Данное определение антитела человека, в частности, исключает гуманизированные антитела, содержащие антиген-связывающие остатки, не являющиеся человеческими.
"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcR и осуществляют Эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют эффекторную функцию ADCC. Примеры человеческих лейкоцитов, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), естественные киллерные клетки (NK), моноциты, цитотоксические Т клетки и нейтрофилы; предпочтительными являются РВМС и NK клетки. Эффекторные клетки можно выделить из их естественного источника, например, из крови или РВМС, согласно данному описанию.
"Гуманизированное" антитело обозначает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки гипервариабельных участков, не являющихся человеческими и аминокислотные остатки каркасных участков человека. В определенных воплощениях гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные участки (например, CDR) соответствуют участкам антитела, не являющимся человеческими, и все или по существу все каркасные участки соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из антитела человека. "Гуманизированная форма" антитела, например, антитела не являющегося человеческим, обозначает антитело, прошедшее гуманизацию.
Термин "гипервариабельный участок" или "HVR", используемый здесь, обозначает каждый из участков вариабельного домена антитела, имеющих гипервариабельную последовательность и/или формирующих петли определенной структуры ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные состоящие из четырех цепей антитела имеют 6 HVR; три в VH (Н1, Н2, Н3), и три в VL (L1, L2, L3). Как правило, HVR содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или "участков, определяющих комплементарность" (CDR), последние характеризуются наибольшей вариабельностью последовательности и/или задействованы в распознавании антигена. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли находятся между аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) находятся между аминокислотными остатками 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 31-35B в Н1, 50-65 в Н2 и 95-102 в Н3 (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Как правило, CDR содержат аминокислотные остатки, образующие гипервариабельные петли, за исключением CDR1 в составе VH. CDR также включают "остатки, определяющие специфичность" или "SDR," которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR находятся в составе участков CDR, обозначаемых «укороченными CDR», или a-CDR (от англ. abbreviated-CDRs). Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Н1, a-CDR-H2 и а-CDR-H3) образованы аминокислотными остатками в положениях 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35B в Н1, 50-58 в Н2 и 95-102 в Н3 (см. Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иначе, гипервариабельные остатки и иные остатки вариабельного домена (например, остатки каркасного участка) здесь пронумерованы в соответствии с Kabat et al., см. выше.
"Иммунный комплекс" обозначает относительно стабильную структуру, которая формируется, когда по меньшей мере одна молекула-мишень и по меньшей мере один гетерологичный полипептид, содержащий Fc область, связываются друг с другом, образуя высокомолекулярный комплекс. Примерами иммунных комплексов являются агрегаты антиген - антитело и агрегаты молекула-мишень - иммуноадгезин. Если не указано иначе, термин "иммунный комплекс" в данном документе обозначает комплекс ex vivo (т.е. находящийся в состоянии или окружении, отличающемся от того, в котором он обнаруживается в природе). При этом, иммунный комплекс можно вводить млекопитающему, например, для оценки клиренса иммунного комплекса у млекопитающего.
"Иммуноконъюгат" представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичной(ыми) молекулой(ами), включая, но не ограничиваясь цитотоксическим агентом.
"Индивид" или "субъект" является млекопитающим. Млекопитающие включают одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и не относящихся к человеку приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В определенных воплощениях индивидом или субъектом является человек.
"Выделенное" антитело обозначает антитело, изолированное от компонентов его естественного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до степени чистоты более чем 95% или 99%, при исследовании, например, с помощью электрофоретических (например, электрофорезом в полиакриламидном геле, изоэлектрическим фокусированием (IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографических (например, ионообменной или обратнофазной ВЭЖХ) методов. Для обзора способов оценки чистоты антител см., например Flatman, et al., J. Chromatogr. В 848 (2007) 79-87.
"Выделенный" полипептид представляет собой полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или изолирован от компонентов его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой вещества, которые могут мешать диагностическому или терапевтическому примерению полипептида и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные компоненты. В предпочтительных воплощениях полипептид будет очищен (1) до более чем 95% по весу полипептида, в соответствии с определением по методу Лоури, и наиболее предпочтительно, до более чем 99% по весу, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при помощи секвенатора с вращающимся цилиндром, или (3) до гомогенности по данным денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с окрашиванием с помощью Кумасси синего или, предпочтительно, окрашивания серебром. К выделенным полипептидам относят полипептиды in situ в рекомбинатных клетках, поскольку отсутствует по меньшей мере один компонент естественного окружения полипептида. Однако, как правило, для получения выделенного полипептида применяют по меньшей мере один этап очистки.
"Выделенная" нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, изолированную от компонентов ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, как правило содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты находится внехромосомно или в участке хромосомы, отличном от естественного положения на хромосоме.
"Выделенная нуклеиновая кислта, кодирующая антитело" обозначает одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или в разных векторах, при этом такая(ие) молекула(ы) нуклеиновой кислоты находи(я)тся в одном или нескольких местоположениях в клетке-хозяине.
Термин "метка" в данном документе обозначает детектируемый компонент или композицию, которая конъюгирована с полипептидом напрямую или опосредовано. Метка может быть детектируемой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, могут катализировать химическое изменение субстрата, представленного детектируемым соединением или композицией.
Термин "домен, связывающий лиганд" в данном документе обозначает любой нативный рецептор клеточной поверхности или любую его часть или производное, сохраняющие по меньшей мере качественную способность связывать лиганд соответствующего нативного рецептора. В определенном воплощении рецептор происходит из полипептида клеточной поверхности, имеющего внеклеточный домен, гомологичный представителю суперсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, не являющиеся представителями суперсемейства иммуноглобулинов, которые также охватываются этим определением, представляют собой рецепторы цитокинов, и в частности, рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью (тирозинкиназные рецепторы), представители суперсемейств рецепторов гематопоэтина и фактора роста нервной ткани, а также молекулы клеточной адгезии, например, селектины (Е-, L- и Р-).
Термин "моноклональное антитело" здесь используется для обозначения антитела, полученного из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связывают один эпитоп, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, возникающие естественным путем или в ходе получения препарата моноклонального антитела, при этом подобные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, обычно содержащим различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Таким образом, определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела определенным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть произведены с помощью различных технологий, включая гибридомную технологию, технологию рекомбинантной ДНК, технологию фагового дисплея и технологии с использованием трансгенных животных, имеющих все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть, но не ограничиваясь ими; данные способы и другие приведенные в качестве примера способы производства моноклональных антител описаны в данном документе.
"Голое антитело" обозначает антитело, не конъюгированное с гетерологичным компонентом (например, цитотоксическим компонентом) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом препарате.
"Нативные антитела" обозначают молекулы иммуноглобулинов, возникающие естественным образом и имеющие различные структуры. Например, нативные антитела класса IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами весом приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидной связью. В направлении от N- к С-концу каждой тяжелой цепи расположен вариабельный участок (VH), также обозначаемый вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогично, в направлении от N- к С-концу каждой легкой цепи расположен вариабельный участок (VL), также обозначаемый вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым расположен константный легкий домен (CL). Легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного и вариабельного домена.
"Нативная последовательность Fc области" содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc области, встречающейся в природе. Нативная последовательность Fc области иммуногобулина человека включает нативную последовательность Fc области IgG1 человека (аллотипы не-А и А); нативную последовательность Fc области IgG2 человека; нативную последовательность Fc области IgG3 человека и нативную последовательность Fc области IgG4 человека, а также их естественным образом возникающие варианты.
Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она имеет функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК пре-последовательности или лидерной последовательности секретируемого пептида функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он располагается таким образом, что способствует трансляции. Как правило, "функционально связан" означает, что последовательности связанных ДНК являются смежными, а в случае лидерной последовательности секретируемого полипептида, смежными и в фазе считывания. Однако, энхансеры не обязательно должны мыть смежными. Связывание осуществляется при помощи лигирования по подходящим сайтам рестрикции. Если таких сайтов не существует, применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры, в соответствии со стандартными методами.
Термин "листовка-вкладыш" используется для обозначения инструкций, обычно вкладываемых в коммерческую упаковку терапевтических продуктов, содержащих информацию о показаниях к применению, способах применения, дозировках, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.
Под "положением" в данном документе понимают местонахождение в последовательности белка. Положения могут быть пронумерованы в порядке их следования или в соответствии с установленным форматом, например, системой EU index, принятой для нумерации антител.
Термины "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и обозначают полимер, который состоит из аминокислотных остатков, включая аминокислотные остатки, имеющие или не имеющие естественное происхождение, и не имеет ограничения минимального размера.
Таким образом, это определение включает пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и т.п. Определение охватывает как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Термины также включают пост-трансляционные модификации полипептидов, включая, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование и фосфорилирование.
Кроме того, "полипептид" в данном документе также обозначает модифицированный белок, такой как с наличием делеций, вставок или замен одного или нескольких аминокислотных остатков нативной последовательности, при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Например, для удаления одиночного реакционноспособного цистеина или для удаления дисульфидной связи можно осуществить замену на остаток серина или для удаления сайта расщепления можно осуществить консервативную аминокислотную замену. Такие модификации могут производиться преднамеренно, как в случае сайт-специфического мутагенеза, или происходить спонтанно, как в случае мутаций в хозяевах, продуцирующих белки, или вследствие ошибок при амплификации в ходе полимеразной цепной реакции (PCR).
Термин "полипептид дикого типа" и "Fc область дикого типа (человеческого происхождения)" в данном документе обозначают полипептид и Fc область, сооветственно, содержащие аминокислотную последовательность, которая не имеет одной или более модификаций Fc области, описанных здесь, поскольку они не производились, и, например, служит, контролем. Полипептид дикого типа может содержать нативную последовательность Fc области или Fc область с предсуществующими модификациями аминокислотной последовательности (такими как вставки, делеции и/или замены).
Термин "фармацевтический препарат" относится к препарату, который находится в такой форме, что обеспечивает эффективную биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента и не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными в отношении субъекта, которому препарат будет вводиться.
"Фармацевтически приемлемый носитель" обозначает ингредиент в составе фармацевтического препарата отличный от активного ингредиента, являющийся нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.
Полипептид с "измененной" аффинностью связывания FcR или активностью ADCC представляет собой полипептид, имеющий либо усиленную или ослабленную способность связывать FcR и/или активность ADCC по сравнению с родительским полипептидом или с полипептидом, содержащим Fc область с нативной последовательностью. Вариант полипептида, который "демонстрирует повышенное связывание" с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более высокой аффинностью, чем родительский полипептид. Вариант полипептида, который "демонстрирует пониженное связывание" с FcR, связывает по меньшей мере один FcR с более низкой аффинностью, чем родительский полипептид. Такие варианты, демонстрирующие пониженное связывание с FcR, могут проявлять слабое связывание или не проявлять детектируемого связывания с FcR, например, 0-20% от уровня связывания FcR с Fc областью IgG, имеющей нативную последовательность, например, согласно определению в приводимых здесь Примерах.
Полипептид, имеющий "пониженную аффинность" связывания с FcR по сравнению с родительским полипептидом, представляет собой полипептид, который связывается с любым из одного или нескольких описанных выше FcR с существенно меньшей аффинностью по сравнению с родительским полипептидом, когда количество варианта полипептида и родительского полипептида при исследовании связывания по существу является одинаковым. Например, вариант полипептида с пониженной аффинностью связывания FcR может демонстрировать аффинность связывания с FcR, сниженную приблизительно в 1,15-100 раз, например, приблизительно в 1,2-50 раз по сравнению с родительским полипептидом, при определении аффинности связывания с FcR, например, в соответствии с описанием в приводимых здесь Примерах.
Полипептид, содержащий Fc вариант, который "опосредует антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека менее эффективно" по сравнению с родительским полипептидом или полипептидом дикого типа, представляет собой полипептид, который значительно менее эффективно опосредует ADCC in vitro или in vivo, когда количество варианта полипептида и родительского полипептида при исследовании связывания по существу является одинаковым. Как правило, такие варианты можно идентифицировать при исследовании ADCC in vitro, как в данном описании, однако предусматриваются и другие тесты или способы определения активности ADCC, например, на моделях на животных. Предпочтительный вариант менее эффективно опосредует ADCC приблизительно в 1,5-100 раз, например, приблизительно в 2-5 раз по сравнению с родительским, например, при исследовании in vitro, описанном в данном документе.
"Рецептор" представляет собой полипептид, способный связываться по меньшей мере с одним лигандом. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор клеточной поверхности, имеющий внеклеточный лиганд-связывающий домен и, возможно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и/или связанный с мембраной). Рецептор, который исследуют в описываемом здесь анализе, может представлять собой интактный рецептор или его фрагмент или производное (например, гибридизованный белок, содержащий связывающий домен рецептора, гибридизованного с одним или более гетерологичными полипептидами). Кроме того, рецептор, у которого исследуют его связывающие характеристики, может присутствовать в клетке или быть выделенным и может использоваться для покрытия планшета для проведения исследования или какой-либо другой твердой поверхности.
Термин "рецептор-связывающий домен" используется для обозначения любого нативного лиганда рецептора, включая молекулы клеточной адгезии, или любой участок или производное такого нативного лиганда, сохраняющие по меньшей мере качественную способность соответствующего нативного лиганда связывать рецептор. Это определение, среди прочих, в частности включает связывающие последовательности лигандов вышеупомянутых рецепторов.
Используемые здесь термины "лечение" (и его грамматические производные, такие как "лечить" или "проводить лечение") обозначают клиническое вмешательство в попытке изменить естественный ход заболевания индивида, которому проводится лечение, и могут осуществляться как для профилактики, так и при наличии патологического состояния. Желательные эффекты лечения включают предупреждение возникновения или повторного проявления заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению применяют, чтобы отсрочить развитие заболевания или чтобы замедлить прогрессирование заболевания.
Под "вариантным белком" или "вариантом белка" или "вариантом" в данном документе понимают белок, который отличается от родительского белка по причине наличия по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Вариант белка может обозначать сам белок, композицию, содержащую белок или его аминокислотную последовательность. Предпочтительно, вариант белка имеет по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с родительским белком, например, приблизительно от одной до приблизительно семидесяти аминокислотных модификаций, и предпочтительно приблизительно от одной до приблизительно пяти аминокислотных модификаций по сравнению с родительским белком. Последовательность варианта белка в данном документе предпочтительно будет иметь по меньшей мере приблизительно 80% гомологии с последовательностью родительского белка, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% гомологии, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95% гомологии. Вариант белка может обозначать сам белок, композицию, содержащую вариант белка, или последовательность ДНК, кодирующую его. Соответственно, под "вариантом антитела" или "вариантным антителом" в данном документе понимают антитело, которое отличается от родительского антитела по причине наличия по меньшей мере одной аминокислотной модификации, "вариант IgG" или "вариантный IgG" в данном документе означает антитело, которое отличается от родительского IgG по причине наличия по меньшей мере одной аминокислотной модификации, а "вариант иммуноглобулина" или "вариантный иммуноглобулин" в данном описании означает иммуноглобулин, последовательность которого отличается от последовательности родительского имуноглобулина по причине наличия по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
Термин "вариабельный участок" или "вариабельный домен" обозначает домен легкой или тяжелой цепи антитела, задействованный в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела, как правило, имеют одинаковую структуру, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt, et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co. (2007) page 91). Единственного VH или VL домена может быть достаточно для обеспечения антиген-связывающей специфичности. Более того, антитела, связывающие конкретный антиген, могут быть выделены при помощи VH или VL домена антитела, связывающего этот же антиген, при скрининге библиотеки на комплементарные VL или VH домены, соответственно. См., например, Portolano, et al., J. Irnmunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628.
Термин "вектор", используемый здесь, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной передавать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Термин включает вектор как само-реплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, инкорпорированный в состав генома клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они операбельно связаны. Такие векторы здесь обозначаются "экспрессирующие векторы".
Настоящее описание относится к полипептидам, которые включают модификации аминокислот, изменяющие связывание с Fc рецепторами, в частности, с Fcγ рецепторами.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способу получения полипептида, содержащего Fc вариант. "Родительский", "исходный", "инвариантный" полипептид или полипептид дикого типа получают с применением известных в области техники способов получения полипептидов или антител, содержащих Fc область. В предпочтительном воплощении изобретения родительский полипептид представляет собой антитело, а примеры способов получения антител описаны более подробно в следующих разделах. Однако, родительский полипептид может быть любым другим полипептидом, содержащим Fc область, например, иммуноадгезином. Способы получения иммуноадгезинов более подробно приводятся ниже.
В альтернативном воплощении вариант Fc области (Fc вариант) может быть получен согласно описанным здесь способам и такой Fc вариант может быть гибридизован с предпочтительным гетерологичным полипептидом, таким как вариабельный домен антитела или связывающий домен рецептора или лиганда.
Полипептид дикого типа содержит Fc область. Как правило, Fc область полипептида дикого типа содержит Fc область, имеющую нативную последовательность или последовательность дикого типа, и предпочтительно, Fc область имеющую нативную последовательность человеческого происхождения (Fc область, имеющую человеческое происхождение). Однако, Fc область полипептида дикого типа может иметь одну или более предсуществующих изменений или модификаций аминокислотной последовательности по сравнению с нативной последовательностью Fc области. Например, способность Fc области связывать C1q или Fcγ может быть изменена ранее (другие типы модификаций Fc области описаны более подробно ниже). В следующем воплощении Fc область родительского полипептида является "концептуальной" и, хотя она не существует физически, специалист, создающий антитело, может выбрать подходящую аминокислотную последовательность варианта Fc области и получить полипептид, содержащий эту последовательность или ДНК, кодирующую необходимую аминокислотную последовательность варианта Fc области.
В предпочтительном воплощении изобретения предоставляется нуклеиновая кислота, кодирующая Fc область полипептида дикого типа, и последовательность этой нуклеиновой кислоты подвергается изменению для получения варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант Fc области.
ДНК, кодирующую вариант аминокислотной последовательности исходного полипептида, получают при помощи различных способов, известных в области техники. Эти способы включают сайт-специфический (или олигонуклеотид-направленный) мутагенез, мутагенез при помощи ПЦР и кассетный мутагенез ранее полученной ДНК, кодирующей полипептид, но не ограничиваются ими.
Сайт-специфический мутагенез представляет собой предпочтительный способ получения вариантов с заменами. Эта методика хорошо известна в области техники (см., например, Carter, et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 4431-4443 and Kunkel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488). Вкратце, при осуществлении сайтспецифического мутагенеза ДНК, для модификации исходной ДНК вначале осуществляют гибридизацию олигонуклеотида, кодирующего необходимую мутацию, с одной цепью исходной ДНК. После гибридизации производится синтез всей второй цепи с помощью ДНК-полимеразы с использованием гибридизованного олигонуклеотида в качестве праймера и с использованием одноцепочечной исходной ДНК в качестве матрицы. Таким образом, олигонуклеотид, кодирующий необходимую мутацию, включается в состав получаемой двуцепочечной ДНК.
Мутагенез при помощи ПЦР также подходит для получения вариантов аминокислотной последовательности исходного полипептида. См. Higuchi, in PCR Protocols, Academic Press (1990) pp.177-183; and Vallette, et al., Nuc. Acids Res. 17 (1989) 723-733. Вкратце, при использовании небольших количеств матричной ДНК в качестве исходного материала в ПЦР, праймеры, незначительно различающиеся по последовательности с соответствующим участком матричной ДНК, можно использовать для получения относительно большого количества определенных фрагментов ДНК, которые отличаются от матричной последовательности только в тех положениях, в которых праймеры отличаются от матрицы.
Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на методике, описанной Wells, et al., Gene 34 (1985) 315-323.
Одно воплощение изобретения включает полипептиды, содержащие Fc область антитела, имеющие вставку, замену или делецию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в Fc области, приводящие к понижению или потере аффинности по меньшей мере к одному Fc рецептору. Fc область взаимодействует с рядом рецепторов или лигандов, включающих Fc рецепторы (например, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA), белок комплемента C1q и другие молекулы, такие как белки А и G, но не ограничивающихся ими. Такие взаимодействия необходимы для различных эффекторных функций и последующих сигнальных событий, включая антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP) и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), но не ограничиваясь ими. Соответственно, в некоторых воплощениях аффинность вариантов по изобретению к Fc рецептору, отвечающему за эффекторную функцию, понижена или устранена по сравнению с полипептидом, имеющим такую же аминокислотную последовательность, как и полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, но не имеющим вставок, замен или делеций по меньшей мере одного аминокислотного остатка в Fc области (в данном документе обозначаемым также "полипептидом дикого типа"). В некоторых воплощениях полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, обладает по меньшей мере одним или более из следующих свойств: снижение или устранение эффекторной функции (ADCC и/или CDC и/или ADCP), снижение или устранение связывания с Fc рецепторами, снижение или устранение связывания с C1q или снижение или устранение токсичности. Более конкретно, в воплощениях по изобретению предложены антитела к CD20 (то же, что и GA101, или GA), к CD9 (то же, что и ТА) и к селектину (pSel), обладающие пониженной аффинностью к Fc рецепторам (например, FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA) и/или белку комплемента C1q.
В одном воплощении антитела по изобретению содежат Fc область, содержащую по меньшей мере одну вставку, замену или делецию аминокислотного остатка в положении Р329, где нумерация константного участка соответствует нумерации по системе EU index, согласно Kabat, et al., NIH Publication 91 (1991) 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA.
В определенном воплощении полипептиды по изобретению содержат Fc вариант человеческого Fc полипептида дикого типа, содержащий аминокислотную замену в положении Pro329, где нумерация остатков Fc области IgG соответствует системе EU index согласно Кабат. В другом воплощении указанный вариант содержит по меньшей мере еще одну аминокислотную замену.
В следующем воплощении полипептид, содержащий Fc вариант человеческого Fc полипептида дикого типа, имеет замену, делецию или вставку аминокислоты, которая разрушает «пролиновый сэндвич» в области и/или границе контакта Fc полипептида с Fc гамма рецептором или нарушает его функционирование.
В другом воплощении Pro329 замещен на аминокислоту, имеющую либо меньший, либо больший размер по сравнению с пролином. В еще одном воплощении замещающей аминокислотой является Gly, Ala или Arg. В следующем аспекте изобретения Pro329 Fc полипептида замещен на глицин.
В еще одном воплощении указанный полипептид, содержащий Fc вариант, имеет по меньшей мере еще одну аминокислотную замену, вставку или делецию. В еще одном воплощении указанные варианты обладают пониженной аффинностью к Fc рецептору человека (FcγR) и/или комплементу человека по сравнению с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа.
В следующем воплощении указанный полипептид, содержащий Fc вариант, обладает пониженной аффинностью к Fc рецептору человека (FcγR) и/или комплементу человека по сравнению с полипептидом, содержащим Fc область человеческого происхождения дикого типа. В следующем воплощении снижена аффинность по меньшей мере к одному из FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA, в еще одном воплощении снижена аффинность к FcγRI и FcγRIIIA, и еще в одном воплощении снижена аффинность, и еще в одном воплощении снижена аффинность к FcγRI, FcγRII и FcγRIIIA, еще в одном аспекте изобретения снижена аффинность к рецептору FcγRI, рецептору FcγRIIIA и C1q, и еще в одном аспекте изобретения снижена аффинность к рецепторам FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA и C1q.
В следующем воплощении снижена ADCC, индуцированная указанным полипептидом, содержащим Fc вариант, а в предпочтительном воплощении ADCC снижена по меньшей мере на 20% от ADCC, индуцированной полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа. В следующем аспекте изобретения понижены или устранены ADCC и CDC, индуцированные полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа, а еще в одном аспекте полипептид, содержащий Fc вариант, описанный выше, опосредует пониженную ADCC, CDC и ADCP по сравнению с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа.
В одном воплощении по меньшей мере еще одна аминокислотная замена в полипептиде, содержащем Fc вариант, выбрана из группы: S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S.
В определенном аспекте изобретения к полипептиду, содержащему Fc вариант, относится антитело. В еще одном аспекте изобретения полипептид, содержащий Fc вариант, содержит Fc область IgG1 или IgG4 человека. В еще одном аспекте изобретения вариантами являются антитела IgG1 или IgG4.
В другом воплощении изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант Pro329, также имеют вставку, замену или делецию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в Fc области, связанную с повышенной стабильностью антитела. В следующем аспекте изобретения аффинность полипептида, содержащего Fc вариант, описанный выше, к рецептору Fen изменена только незначительно, например не более чем на 10-20% по сравнению с аффинностью полипептида, содержащего Fc полипептид дикого типа.
В одном воплощении вставка, замена или делеция аминокислотного остатка находится в положении 228 и/или 235 Fc области полипептида, содержащего Fc вариант, где нумерация константного участка соответствует системе EU index согласно Kabat, et al.
В определенном воплощении серин в положении 228 и/или лейцин в положении 235 указанного полипептида, содержащего Fc вариант, замещен на другую аминокислоту.
В определенном воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, содержат Fc область, содержащую аминокислотную замену в положении 228, где остаток серина замещен на пролин.
В определенном воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, содержат Fc область, содержащую аминокислотную замену в положении 235, где остаток лейцина замещен на глутаминовую кислоту.
В определенном воплощении полипептид, содержащий Fc вариант, имеет тройную мутацию: аминокислотную замену в положении Р329, S228P и мутацию L235E (P329/SPLE).
Еще в одном определенном воплощении полипептид, содержащий Fc вариант, содержит участок IgG4 человека.
В одном воплощении вставка, замена или делеция аминокислотного остатка находится в положении 234 и/или 235 Fc области, где нумерация константного участка соответствует системе EU index согласно Kabat et al.
В определенном воплощении лейцин в положении 234 и/или лейцин в положении 235 полипептида, содержащего Fc вариант, замещен на другую аминокислоту.
В определенном воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, содержат Fc область, содержащую аминокислотную замену в положении 234, где остаток лейцина замещен на аланин.
В определенном воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, содержат Fc область, содержащую аминокислотную замену в положении 235, где остаток лейцина замещен на серин.
В определенном воплощении полипептид, содержащий Fc вариант Fc полипептида человеческого происхождения дикого типа, содержит тройную мутацию: аминокислотную замену в положении Pro329, L234A и мутацию L235A (Р329/LALA).
В следующем определенном воплощении вышеупомянутые полипептиды содержат участок IgG1 человека.
Хотя предпочтительным является изменение связывания с FcγR, в данном документе также предусматриваются варианты Fc области с измененной аффинностью связывания неонатального рецептора (FcRn). Предполагается, что варианты Fc области с повышенной аффинностью к FcRn будут иметь увеличенное время полужизни в сыворотке, и такие молекулы найдут применение в способах лечения млекопитающих, в которых требуется длительное время полужизни введенного полипептида, например, для лечения хронического заболевания или нарушения. Напротив, предполагается, что варианты Fc области с пониженной аффинностью связывания FcRn будут обладать укороченным временем полужизни, и такие молекулы можно, например, вводить млекопитающему, когда более предпочтительным будет укороченное время существования в циркуляции, например, для диагностической визуализации in vivo или в случае, когда полипептиды проявляют токсическое побочное действие при длительной циркуляции в кровотоке, и т.д. Предполагается, что варианты Fc области с пониженной аффинностью связывания FcRn будут с меньшей вероятностью проходить через плаценту, и таким образом, могут применяться при лечении заболеваний или нарушений у беременных женщин.
Варианты Fc области с измененной аффинностью связывания FcRn включают варианты, имеющие аминокислотные модификации Fc области в любом одном или более из следующих положений: 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 или 447. Те из них, которые обладают пониженным связыванием с FcRn, как правило содержат аминокислотные модификации Fc области в любом одном или более из следующих положений: 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 или 447; а те, которые обладают повышенным связыванием с FcRn, как правило, содержат аминокислотные модификации Fc области в любом одном или более из следующих положений: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434.
В другом воплощении антитела по изобретению могут принадлежать любому классу (например, IgG, IgM и IgE, но не ограничиваться ими). В конкретных воплощениях антитела по изобретению являются представителями антител класса IgG. В определенном воплощении антитела по изобретению относятся к подклассам IgG1, IgG2 или IgG4. В другом определенном воплощении антитела по изобретению относятся к подклассу IgG1 и содержат следующие аминокислотные замены в Fc области: P329G и/или L234A и L235A. В альтернативных воплощениях антитела по изобретению относятся к подклассу IgG4. В определенном воплощении антитела по изобретению относятся к подклассу IgG4 и содержат следующие аминокислотные замены в Fc области: P329G и/или S228P и L235E. В определенных воплощениях модифицированные антитела по данному изобретению можно получить путем комбинации вариабельного домена или его фрагмента с Fc доменом, имеющим одну или более аминокислотных замен, описанных в данном документе. В других воплощениях модифицированные антитела по изобретению можно получить путем модификации антитела, содержащего Fc домен, при помощи введения одной или более аминокислотных замен в Fc домен.
Пониженное связывание с Fc лигандами
D
off
on
D
off
on
D
th
Специалистам в данной области понятно, что антитела по изобретению могут иметь измененную (по сравнению с немодифицированным антителом) способность связывать FcγR и/или C1q (примеры связывающих характеристик включают специфичность связывания, равновесную константу диссоциации (K), скорости ассоциации и дисоциации (k и k, соответственно), авидность и/или аффинность связывания, но не ограничиваются ими), и что некоторые изменения являются более или менее желательными. Из уровня техники известно, что равновесная константа диссоциации (K) определяется как k/k. Специалист в данной области может определить, какие кинетические параметры являются наиболее важными для применения заданного антитела. Например, модификация, снижающая связывание с одним или более положительными регуляторами (например, FcγRIIIA) и/или повышенное связывание с ингибирующим Fc рецептором (например, FcγRIIB) будет целесообразной для снижения ADCC активности. Соответственно, соотношение аффинностей связывания (например, равновесная константа диссоциации (K)) может указывать, понижена или усилена ADCC активность антитела по изобретению. Кроме того, для снижения или устранения CDC активности подходящими являются модификации, снижающие связывание с C1q. Для изучения взаимодействия Fc-FcγR можно определить аффинность и связывающие свойства Fc области по отношению к ее лиганду с применением различных способов исследования in vitro (биохимических или иммунологических методов исследования), известных в данной области техники, т.е., специфического связывания Fc области с FcγR, включая равновесные методы (например, иммуноферментный анализ (ИФА) или радиоиммунологический анализ (РИА)) или кинетические методы (например, BIACORE), а также другие способы, такие как непрямые методы исследования связывания, исследования конкурентного ингибирования, метод резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), электрофорез в геле и хроматография (например, гель-фильтрация), но не ограничиваясь ими. В этих и других способах можно осуществлять мечение одного или нескольких исследуемых компонентов и/или использовать различные способы детекции, включающие хромогенные, флуоресцентные, люминесцентные или изотопные метки, но не ограничивающиеся ими. Подробное описание аффинности и кинетики связывания приведено Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4 Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).
В одном аспекте изобретения полипептид, содержащий Fc вариант Fc области человеческого происхождения дикого типа, причем указанный вариант содержит аминокислотную замену в положении Pro329 и по меньшей мере еще одну аминокислотную замену, проявляет пониженную аффинность к Fc рецептору человека (FcγR) и/или к комплементу человека по сравнению с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа. В другом аспекте полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, обладает аффинностью к Fc рецептору, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз ниже, чем у Fc полипептида дикого типа.
В одном аспекте полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, проявляет пониженную аффинность к одному или более Fc рецепторам, включая, но не ограничиваясь FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIA, FcγRII и FcγRIII (CD16, включая изоформы FcγRIIIA), по сравнению с немодифицироанным антителом.
В одном аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляют пониженную аффинность связывания FcγRI (CD64), FcγRIIA и FcγRIIIA по сравнению с немодифицированным антителом.
В одном аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляют пониженную аффинность связывания FcγRIIA и FcγRIIIA по сравнению с немодифицированным антителом.
В одном аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляют пониженную аффинность связывания FcγRI (CD64) и FcγRIIIA по сравнению с немодифицированным антителом.
В одном аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляющие пониженную аффинность связывания Fc рецепторов, также проявляют пониженную аффинность к C1q.
В некоторых аспектах изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, не проявляют одновременного усиления связывания с рецептором FcγRIIB по сравнению с полипептидом дикого типа. В некоторых аспектах изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант, обладают пониженной аффинностью к человеческому рецептору FcγIIIA и по меньшей мере еще к одному рецептору из группы, включающей человеческие рецепторы FcγIIA, FcγIIIB и C1q, по сравнению с полипептидом, содержащим полипептид Fc дикого типа. В следующих аспектах изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант, имеют пониженную аффинность к человеческому рецептору FcγIIIA и по меньшей мере к двум другим рецепторам группы, включающей человеческие рецепторы FcγIIA, FcγIIIB и C1q, по сравнению с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа. В следующем аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант, обладают пониженной аффинностью к FcγRIA, FcγIIIA, FcγIIA, FcγIIIB и C1q человека по сравнению с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа. Еще в одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант, обладают пониженной аффинностью к человеческим рецепторам FcγRIA, FcγIIIA, FcγIIA, FcγIIIB и C1q по сравнению с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа.
В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают пониженной аффинностью к FcγRI или FcγRIIA по сравнению с немодифицированным антителом. В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант, проявляют аффинность к FcγRI или FcγRIIA, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз ниже, чем у полипептида дикого типа. В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают пониженной аффинностью к FcγRI или FcγRIIA, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 5% ниже, чем у полипептида дикого типа.
В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают пониженной аффинностью к FcγRIIIA no сравнению с немодифицированным антителом. В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к FcγRIIIA, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз ниже, чем у полипептида дикого типа.
В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к FcγRIIIA, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 5% ниже, чем у полипептида дикого типа.
Известно, что аллельный вариант F1-58V FcγRIIIA имеет измененные связывающие характеристики по отношению к антителам. В одном воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, связываются с рецепторами FcγRIIIA пониженной аффинностью с по сравнению с полипептидом дикого типа. В одном аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к FcγRIIIA (FI 58V), которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз ниже, чем у полипептида дикого типа.
В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают пониженной аффинностью к C1q по сравнению с немодифицировнным антителом. В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к C1q, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз ниже, чем у полипептида дикого типа.
В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к C1q, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 5% ниже, чем у полипептида дикого типа.
В одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к человеческим рецепторам FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIA (FI 58V) или C1q, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 5% ниже, чем у полипептида дикого типа.
В другом аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к рецепторам FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIA (FI 58V) и/или C1q, соответственно, которая находится в диапазоне между приблизительно 10 нМ и 100 нМ, 10 нМ и 1 мкМ, 100 нМ и приблизительно 100 мкМ, или приблизительно 100 нМ и приблизительно 10 мкМ, или приблизительно 100 нМ и приблизительно 1 мкМ, или приблизительно 1 нМ и приблизительно 100 мкМ, или приблизительно 10 нМ и приблизительно 100 мкМ, или приблизительно 1 мкМ и приблизительно 100 мкМ, или приблизительно 10 мкМ и приблизительно 100 мкМ. В некоторых воплощениях полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к рецепторам FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIA (FI-58V) или C1q, которая выше 100 нМ, 500 нМ, 1 мкМ, выше 5 мкМ, выше 10 мкМ, выше 25 мкМ, выше 50 мкМ, или выше 100 мкМ.
В другом аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают повышенной аффинностью к FcγRIIB по сравнению с полипептидом дикого типа. В другом аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к FcγRIIB, которая не изменена или повышена по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз по сравнению с таковой немодифицированного антитела. В другом аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, обладают аффинностью к рецептору FcγRIIB, которая повышена по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% по сравнению с полипептидом дикого типа.
В другом аспекте изобретения варианты по изобретению обладают аффинностью к рецепторам FcγRI, FcγRIIA FcγRIIIA или FcγRIIIA (FI 58V) или C1q, которая меньше 100 мкМ, меньше 50 мкМ, меньше 10 мкМ, меньше 5 мкМ, меньше 2,5 мкМ, меньше 1 мкМ или меньше 100 нМ, или меньше 10 нМ.
Пониженная эффекторная функция
В некоторых аспектах изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант согласно изобретению, проявляют измененную эффекторную функцию при сравнении с полипептидами, содержащими Fc полипептид дикого типа.
В другом аспекте изобретения это изменение представляет собой изменение ADCC и/или ADCP и/или CDC. В следующем аспекте изобретения изменение представляет собой понижающую регуляцию или снижение эффекта. В другом аспекте изобретения такое изменение представляет собой изменение ADCC, а еще в одном аспекте изобретения такое изменение представляет собой понижающую регуляцию ADCC. В еще одном аспекте изобретения такое изменение представляет собой понижающую регуляцию ADCC и CDC, а в другом воплощении оно представляет собой только понижающую регуляцию ADCC, в другом воплощении оно представляет собой понижающую регуляцию ADCC и CDC и/или ADCP. В еще одном аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант согласно изобретению, оказывают понижающую регуляцию или снижают ADCC/CDC и ADCP.
В следующем аспекте изобретения снижение или понижающая регуляция ADCC или CDC или ADCP, индуцируемой полипептидом, содержащим Fc вариант, представляет собой снижение до 0, 2,5, 5, 10, 20, 50 или 75% от значений, наблюдаемых при индукции ADCC или CDC или ADCP, соответственно, под действием полипептида, содержащего Fc область дикого типа.
В следующих аспектах изобретения изменение ADCC, индуцированной полипептидами, содержащими Fc вариант согласно изобретению, представляет собой снижение активности, при этом значение ЕС50 указанного Fc варианта увеличено приблизительно в >10 раз по сравнению с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа.
В другом аспекте вариант согласно изобретению по существу не опосредует ADCC и/или CDC и/или ADCP в присутствии эффекторных клеток человека в отличие от полипептида, содержащего Fc полипептид дикого типа.
В другом аспекте изобретения полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляют пониженную, например, пониженную по меньшей мере на 20% или существенно пониженную, например, пониженную по меньшей мере на 50%, эффекторную функцию, которая может представлять собой снижение ADCC (понижающую регуляцию), CDC и/или ADCP.
Пониженная ADCC активность
Для подтверждения снижения/устранения CDC и/или ADCC активностей можно проводить исследование цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, исследование связывания Fc рецептора (FcR) можно проводить для подтверждения того, что антитело не связывается с FcγR (следовательно, по всей вероятности не обладает ADCC активностью), но сохраняет способность связывать FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, RII и RIII. Данные, касающиеся экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, кратко изложены в Таблице 3 на стр.464 в публикации Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. He являющиеся исчерпывающими примеры исследований in vitro, позволяющих оценить ADCC активность молекулы, представляющей интерес, описаны в патенте США 5,500,362 (см., например, Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063) и Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502; US 5,821,337 (см. Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). В альтернативном случае можно использовать нерадиоактивные методы исследования (см, например, нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности для проточной цитометрии ACTI™ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности CytoTox 96 (Promega, Madison, WI). Подходящие эффекторные клетки для таких исследований включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные киллерные клетки (NK). В альтернативном случае или дополнительно ADCC активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, в модели на животных, такой как описанная Clynes, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Исследования связывания C1q можно также проводить для подтверждения того, что антитело не способно связывать C1q и, следовательно, не обладает CDC активностью. См., например, определение связывания C1q и C3c методом ИФА в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно выполнять исследование CDC (см., например, Gazzano-Santoro, et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; and Cragg, M.S., and Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743). Связывание FcRn и исследование клиренса/времени полужизни in vivo можно также выполнять при помощи способов, известных в области техники (см., например, Petkova, S.B., etal., Int'l. Immunol. 18(12) (2006) 1759-1769).
Предполагается, что полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, можно охарактеризовать в функциональных исследованиях in vitro, позволяющих оценить одну или несколько эффекторных функций клеток, опосредуемых FcγR. В некоторых воплощениях антитела по изобретению проявляют одинаковые связывающие характеристики и опосредуют эффекторные функции клеток как в моделях in vivo (такие как описанные и представленные в данном документе), так и в исследованиях in vitro. Однако, настоящее изобретение не исключает варианты по изобретению, которые не обладают желаемым фенотипом в исследованиях in vitro, но обладают желаемым фенотипом in vivo. В одном воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляют пониженную ADCC активность по сравнению с немодифицированными Fc полипептидами дикого типа. В другом аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляют ADCC активность, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 100 раз ниже, чем у немодифицированного антитела. В другом воплощении антитела по изобретению проявляют ADCC активность, которая снижена по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 100% по сравнению с немодифицированным антителом. В следующем аспекте изобретения снижение или понижающая регуляция ADCC, индуцированной полипептидом, содержащим Fc вариант, представляют собой снижение до 0, 2,5, 5, 10, 20, 50 или 75% от значения, наблюдавшегося при индукции ADCC или CDC или ADCP, соответственно, полипептидом, содержащим Fc область дикого типа. В некоторых воплощениях полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, не проявляет детектируемой ADCC активности. В определенных воплощениях снижение и/или устранение ADCC активности может быть отнесено за счет пониженной аффинности полипептидов, содержащих Fc вариант по изобретению, к лигандам Fc и/или Fc рецепторам. В определенном воплощении изобретения понижающая регуляция ADCC представляет собой такое снижение активности, что значение ЕС50 указанного полипептида, содержащего Fc вариант, увеличено приблизительно в 10 раз или более по сравнению с Fc полипептидом дикого типа.
В другом аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант согласно изобретению, демонстрируют измененную ADCC и/или CDC и/или ADCP. В определенном аспекте варианты согласно изобретению демонстрируют пониженную CDC и ADCC и/или ADCP активность.
Пониженная CDC активность
Путь активации комплемента инициируется при связывании первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой, например антителом, находящимся в комплексе с распознаваемым им антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить исследование CDC, например, как описано Gazzano-Santoro, et al, J. Immunol. Methods 202 (1996) 163.
50
Связывающие характеристики различных вариантов C1q можно исследовать при помощи иммуноферментного анализа типа «сэндвич». Концентрация антитела, при которой наблюдается ответ, составляющий половину от максимального, соответствует значению EC. Этот показатель представляют в сравнении с референтным стандартом, исследуемым на том же планшете, вместе с коэффициентом вариации для образца и стандарта.
В одном воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант согласно изобретению, проявляют пониженную аффинность к C1q по сравнению с полипептидом дикого типа. В другом воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант согласно изобретению, проявляют аффинность к C1q, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 7 раз или по меньшей мере в 10 раз или по меньшей мере в 20 раз или по меньшей мере в 30 раз или по меньшей мере в 40 раз или по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 60 раз или по меньшей мере в 70 раз или по меньшей мере в 80 раз или по меньшей мере в 90 раз или по меньшей мере в 100 раз или по меньшей мере в 200 раз ниже, чем у полипептида дикого типа.
В другом воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант согласно изобретению, проявляют аффинность к C1q, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 5% ниже, чем уполипептида дикого типа. В другом воплощении варианты согласно изобретению проявляют аффинность к C1q, которая находится в диапазоне приблизительно от 100 нМ до приблизительно 100 мкМ, или приблизительно от 100 нМ до приблизительно 10 мкМ, или приблизительно от 100 нМ до приблизительно 1 мкМ, или приблизительно от 1 нМ до приблизительно 100 мкМ, или приблизительно от 10 нМ до приблизительно 100 мкМ, или приблизительно от 1 мкМ до приблизительно 100 мкМ, или приблизительно от 10 мкМ до приблизительно 100 мкМ. В некоторых воплощениях полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, проявляет аффинность к C1q, которая превышает 1 мкМ, превышает 5 мкМ, превышает 10 мкМ, превышает 25 мкМ, превышает 50 мкМ или превышает 100 мкМ.
В одном воплощении полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, проявляет пониженную CDC активность по сравнению с Fc полипептидом дикого типа. В другом воплощении полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, проявляет CDC активность, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 100 раз ниже, чем у полипептида дикого типа. В другом воплощении полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, проявляет CDC активность, которая по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 100%, или по меньшей мере на 200%, или по меньшей мере на 300%, или по меньшей мере на 400%, или по меньшей мере на 500% ниже, чем у полипептида дикого типа. В некоторых аспектах полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, не проявляет детектируемой CDC активности. В определенных воплощениях снижение и/или устранение CDC активности может быть отнесено за счет пониженной аффинности полипептидов, содержащих Fc вариант, клигандам Fc и/или Fc рецепторам.
Пониженная антитело-зависимая токсичность
Известно, что биологическая терапия может порождать различные токсические эффекты, что обусловлено комплексным характером процессов, связанных с распознаванием нежелательных клеток и/или мишеней и атакующим воздействием на них иммунной системы. Если распознавание и/или определение объектов для направленной атаки не происходит там, где требуется лечение, могут развиться такие нежелательные последствия, как токсичность. Например, окрашивание антителами тканей, не являющихся мишенями, может указывать на возможные последствия, связанные с токсичностью.
В одном аспекте полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, окрашивает ткани, не являющиеся мишенями, слабее по сравнению с полипептидом дикого типа. В другом аспекте полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, окрашивает ткани, не являющиеся мишенями, по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз слабее, чем Fc полипептид дикого типа. В другом воплощении варианты по изобретению окрашивают ткани, не являющиеся мишенями, слабее по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 100%, или по меньшей мере на 200%, или по меньшей мере на 300%, или по меньшей мере на 400%, или по меньшей мере на 500% по сравнению с Fc полипептидом дикого типа.
В одном воплощении полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, проявляет пониженную антитело-зависимую токсичность по сравнению с полипептидом дикого типа. В другом воплощении полипептид, содержащий Fc вариант по изобретению, проявляет токсичность, которая по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз меньше, чем у полипептида дикого типа. В другом аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, проявляют токсичность, которая снижена по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 100%, или по меньшей мере на 200%, или по меньшей мере на 300%, или по меньшей мере на 400%, или по меньшей мере на 500% по сравнению с полипептидом дикого типа.
Агрегация тромбоцитов
В одном аспекте изобретения полипептид дикого типа индуцирует активацию и/или агрегацию тромбоцитов, а его варианты, т.е. полипептиды, содержащие Fc варианты, демонстрируют сниженную способность вызывать активацию и/или агрегацию тромбоцитов или даже ее отсутствие. В другом аспекте изобретения полипептиды дикого типа представляют собой антитела, направленно воздействующие на тромбоцитарный белок. В другом аспекте антитело представляет собой антитело к CD9. Еще в одном воплощении это антитело к CD9 имеет мутацию в положении P329G и/или в положении L234A/L235A или S228P/L235E (P329G/LALA, P329G/SPLE). В следующем конкретном воплощении антитело антитело описывается последовательностью SEQ ID NOs:8-14.
Известно, что биологическая терапия может сопровождаться таким побочным эффектом, как агрегация тромбоцитов. Для оценки агрегации тромбоцитов могут применяться исследования in vitro и in vivo. Считается, что исследования in vitro отражают ситуацию in vivo.
В одном аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, вызывают пониженную агрегацию тромбоцитов в исследовании in vitro при сравнении с полипептидом дикого типа. В другом аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, вызывают пониженную агрегацию тромбоцитов в исследовании in vitro, которая снижена по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз по сравнению с агрегацией, индуцируемой полипептидом дикого типа. В другом воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, вызывают пониженную агрегацию тромбоцитов в исследовании in vitro, которая снижена по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 100%, или по меньшей мере на 200%, или по меньшей мере на 300%, или по меньшей мере на 400%, или по меньшей мере на 500% при сравнении с полипептидом дикого типа.
В другом аспекте полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, вызывают пониженную агрегацию тромбоцитов in vivo при сравнении с полипептидом дикого типа. В другом аспекте варианты по изобретению вызывают пониженную агрегацию тромбоцитов в исследовании in vivo, которая по меньшей мере в 2 раза, или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз ниже, чем в случае Fc полипептида дикого типа. В другом воплощении полипептиды, содержащие Fc вариант по изобретению, вызывают сниженную агрегацию тромбоцитов в исследовании in vivo, которая снижена по меньшей мере на 10%, или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 100%, или по меньшей мере на 200%, или по меньшей мере на 300%, или по меньшей мере на 400%, или по меньшей мере на 500% при сравнении с полипептидом дикого типа.
Антитела, подвергаемые интернализации
Варианты по изобретению могут связываться с антигенами клеточной поверхности, которые могут опосредовать интернализацию антител, осуществляя их перенос внутрь клетки. Оказавшись внутри клетки, варианты могут высвобождаться в цитоплазму, направляться в определенные компартменты или возвращаться на поверхность клетки. В некоторых воплощениях варианты по изобретению связываются с антигеном клеточной поверхности, которые опосредуют интернализацию. В других воплощениях антитела по изобретению могут направляться в определенные органеллы или компартменты клетки. В других воплощениях варианты по изобретению после интернализации могут возвращаться на поверхность или на периферию клетки.
В определенном воплощении антитело по изобретению является специфичным к p-селектину, CD9, CD19, CD81, CCR5 или CXCR5, IL17a или II-33.
Получение антител
В предпочтительном воплощении изобретения полипептид, содержащий Fc область, модифицированный согласно данному описанию, представляет собой антитело. Ниже следует описание способов получения антител.
Селекция и получение антигенов
Когда полипептид представляет собой антитело, он направлен против антигена, представляющего интерес. Предпочтительно, антиген представляет собой полипептид, имеющий важное биологическое значение, а введение антитела млекопитающему, страдающему от заболевания или нарушения, может обеспечивать терапевтический эффект у этого млекопитающего. Однако, также рассматриваются антитела, направленные против антигенов, не являющихся полипептидами (таких как гликолипидные антигены, ассоциированные с опухолью, см. патент США 5,091,178).
Когда антиген является полипептидом, он может представлять собой трансмембранную молекулу (например, рецептор) или лиганд, такой как фактор роста. Примеры антигенов включают такие молекулы, как ренин, гормон роста, включая человеческий гормон роста и бычий гормон роста; фактор, высвобождающий гормон роста, паратиреоидный гормон, тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор (TF) и фактор Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как протеин С; атриальный натрийуретический пептид; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа, или урокиназный активатор плазминогена или тканевой активатор плазминогена человека (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; факторы некроза опухоли альфа и бета; энкефалиназа; RANTES (хемокин, экспрессируемый и секретируемый Т-клетками при активации); воспалительный белок макрофагов человека (MIP-1-alpha); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-рилизинг ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; цитотоксический ассоциированный с Т-лимфоцитами антиген (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как мозговой нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервной ткани, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF and bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; белки CD, такие как CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, бета и гамма; колониестимулирующие факторы (КСФ), например, М-КСФ, ГМ-КСФ и Г-КСФ; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксид дисмутаза; поверхностные мембранные белки; комплемент-зависимый стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, компоненты оболочки ВИЧ; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрессины; регулятоные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухоле-ассоциированный антиген, такой как рецепторы HER2, HER3 или HER4; а также фрагменты любых перечисленных выше полипептидов.
Предпочтительные молекулярные мишени для антител, рассматриваемых в данном изобретении, включают белки CD, такие как CD4, CD8, CD19, CD20 и CD34; представителей семейства рецепторов ErbB, таких как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Мас1, р150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, интегрин α4/β7 и интегрин αv/β3, включая их α или β субъединицы (например, антитела к CD11a, CD18 или CD11b); факторы роста, такие как VEGF; тканевой фактор (TF); альфа-интерферон (α-IFN); интерлейкин, такой как IL-8; IgE; антигены групп крови; рецептор flk2/flt3; ОВ-рецептор (от англ. obesity); рецептор mpl; CTLA-4; протеин С и т.д.
Растворимые антигены и их фрагменты возможно конъюгированные с другими молекулами, можно применять в качестве иммуногенов для получения антител. В случае трансмембранных белков, таких как рецепторы, в качестве иммуногена можно использовать их фрагменты (например, внеклеточный домен рецептора). В альтернативном случае в качестве иммуногена можно использовать клетки, экспрессирующие трансмембранный белок. Такие клетки могут быть получены из естественных источников (например, линии опухолевых клеток) или могут быть клетками, которые трансформированы при помощи рекомбинантных методов, приводящих к экспрессии трансмембранных молекул. Специалистам в данной области будут очевидны другие антигены и их формы, подходящие для получения антител.
Поликлональные антитела
2
1
Поликлональные антитела преимущественно получают при многократных подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) иммунизациях животных соответствующим антигеном и адъювантом. Может быть целесообразным конъюгирование соответствующего антигена с белком, являющимся иммуногеном для животных, подлежащих иммунизации, например, гемоцианином моллюска, сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина соевых бобов при помощи бифункционального или дериватизирующего агента, например, малеимидобензоил-сульфосукцинимидного эфира (конъюгирование по цистеиновым остаткам), N-гидроксисукцинимида (по остаткам лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl или карбодиимида, где R и Rявляются различными алкильными группами.
Животных иммунизируют антигеном, иммуногенными конъюгатами или производными путем комбинирования, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъекций раствора подкожно в нескольких местах. Через один месяц животные получают повторную инъекцию например в виде 1/10 от исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда при помощи подкожных инъекций в различных местах. Спустя 7-14 дней у животных берут кровь и определяют титр антител в сыворотке. Животные получают повторные иммунизации до тех пор, пока титр не достигнет плато. Предпочтительно, животное получает повторную инъекцию конъюгатом того же самого антигена, но конъюгированным с другим белком и/или с другим реагентом, образующим поперечные связи. Конъюгаты также могут быть получены в культуре рекомбинантных клеток в виде гибридизованных белков. Кроме того, иммунный ответ может быть усилен с применением агрегирующих агентов, таких как соли алюминия.
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела могут быть получены при помощи технологии гибридом, впервые описанной Kohler, et al., Nature, 256 (1975) 495 или могут быть сконструированы при помощи технологи рекомбинантной ДНК (U.S. Pat. No. 4,816,567).
Согласно технологии гибридом, мышь или другое подходящее животное, такое как хомяка или макаку, иммунизируют, как описано выше, для получения лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, использованным для иммунизации. В альтернативном случае лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты сплавляют с клетками миеломы при помощи подходящих сплавляющих агентов, таких как полиэтиленгликоль, с образованием клеток-гибридом (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp.59-103).
Полученные таким образом клетки-гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих пролиферацию или выживаемость несплавленных, родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не имеют фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазы (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом как правило содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые предотвращают рост клеток, не имеющих HGPRT.
Предпочтительными клетками миеломы являются такие клетки, которые эффективно сплавляются, являются чувствительными к среде, такой как среда HAT, а отобранные антитело-продуцирующие клетки сохраняют стабильно высокий уровень продукции антитела. Помимо прочего, предпочтительные линии клеток миеломы мыши, такие как полученные из мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, которые можно приобрести в центре по распространению клеток института Салка (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA), и клеток SP-2 и X63-Ag8-653, которые можно приобрести в Американской коллекции типовых культур, Rockville, Md. USA. Также было описано применение клеточных линий миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек для получения человеческих моноклональных антител (Kozbor, J., Immunol. 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) pp.51-63).
В культуральной среде, в которой растут клетки гибридомы, исследуют продукцию моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяется при помощи иммунопреципитации или исследования связывания in vitro, такого как радиоиммунологический анализ (РИА) или иммуноферментный анализ (ИФА).
После определения того, что клетки гибридомы продуцируют антитела с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны можно субклонировать при помощи предельного разведения и выращивать с использованием стандартных способов (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp.59-103). Среда для культивирования, подходящая для этих целей, включает, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы можно выращивать in vivo в асцитных опухолях животных.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно выделять из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки при помощи обычных способов, используемых для очистки иммуноглобулинов, таких как, например, с применением протеин А-сефарозы, хроматографии на гидроксиапатите, электрофореза в геле, диализа или аффинной хроматографии.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно выделять и секвенировать с помощью стандартных способов (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК можно поместить в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфецируют клетки-хозяева, такие как клетки Е.coli, клетки обезьяны COS, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без этого не продуцируют белок иммуноглобулина, для осуществления синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная продукция антител более подробно описана ниже.
В следующем воплощении антитела или фрагменты антител по изобретению можно выделить из библиотек фагового дисплея, описанных McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554. Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628 и Marks, et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597 описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с применением фаговых библиотек. В следующих публикациях описано получение человеческих антител, обладающих высокой аффинностью (нМ диапазон) при помощи рекомбинации цепей (Marks, et al., Bio/Technology 10 (1992) 779-783), а также сочетанной инфекции и рекомбинации in vivo в качестве стратегий конструирования фаговых библиотек большого размера (Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res. 21 (1993) 2265-2266). Таким образом, эти методики являются эффективной альтернативой традиционному способу получения моноклональных антител с применением гибридом.
ДНК можно также модифицировать, например, путем замены кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепей гомологичных мышиных последовательностей (патенты США 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855) или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности полипептида, не являющегося иммуноглобулином.
Как правило, такие полипептиды, не являющиеся иммуноглобулинами, замещаются константными доменами антитела или замещаются вариабельными доменами одного антиген-связывающего сайта антитела для создания химерного бивалентного антитела, содержащего один антиген-связывающий сайт, специфичный к антигену и другой антиген-связывающий сайт, специфичный к другому антигену.
Аффинность антител
D
-8
-8
-13
-9
-13
В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело имеет константу диссоциации (K) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М).
125
125

В одном воплощении Kd определяют при исследовании связывания радиоактивно меченого антигена или Fc рецептора (РИА), в котором используют Fab версию антитела, представляющего интерес, и его антиген, согласно следующему ниже описанию. Аффинность связывания раствора Fab с антигеном оценивают после установлении равновесия между Fab и (I)-меченым антигеном в минимальной концентрации в присутствии серии последовательных разведений немеченого антигена, с последующей иммобилизацией связанного антигена на планшете, покрытом антителом к Fab (см., например, Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Для оптимизации условий эксперимента многолуночные планшеты MICROTITER (Thermo Scientific) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл антитела, захватывающего Fab (Cappel Labs), в 50 мМ растворе карбоната натрия (рН 9,6) и затем блокируют 2% (вес/об) раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере в течение 2-5 часов при комнатной температуре (приблизительно 23°С). В неадсорбирующих планшетах (Nunc #269620) смешивают 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена с последовательными разведениями Fab, представляющего интерес (например, аналогично исследованию антитела к VEGF, Fab-12, Presta, et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). Представляющий интерес Fab затем инкубируют в течение ночи, однако инкубация может продолжаться в течение большего периода времени (например, приблизительно 65 часов), чтобы обеспечить достижение равновесия. Затем смесь переносят в планшет для иммобилизации при инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют, а планшет восьмикратно отмывают 0,1% раствором полисорбата 20 (TWEEN-20) в PBS. После высыхания планшетов добавляют по 150 мкл/лунку сцинтиллянта (MICROSCINT-20 ™; Packard) и считывают сигнал в планшетах при помощи гамма счетчика TOPCOUNT ™ (Packard) в течение десяти минут.Концентрации каждого Fab, обеспечивающие связывание на уровне 20% или менее от максимального, используют в тестах конкурентного связывания.

6
-1
-1
on
off
off
on
Согласно другому воплощению Kd определяют при помощи исследования поверхностного плазменного резонанса с использованием BIACORE-2000 или BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с иммобилизацией антигена или Fc рецептора на чипах СМ5 до уровня сигнала ~10 единиц ответа (RU). Вкратце, карбоксиметилированный декстран на поверхности чипа биосенсора (СМ5, BIACORE, Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), согласно инструкциям производителя. Затем антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/мин для достижения уровня связывания белка приблизительно 10 единиц RU. После инжектирования антигена инжектируют 1 М этаноламина для блокирования непрореагировших групп. Для измерения кинетики инжектируют серию двукратных разведении Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% раствором сурфактанта полисорбата 20 (TWEEN-20™) (PBST) при 25°С при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k) и скорости дисоциации (k) рассчитывают с применением простой модели связывания 1:1, предложенной Ленгмюром, при одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации (BIACORE Evaluation Software version 3.2). Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение k/k. См., например, Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881. Если при исследовании методом поверхностного плазменного резонанса, описанным выше, скорость ассоциации превышает 10 М с, скорость ассоциации можно определить при помощи метода гашения флуоресценции, позволяющего измерить увеличение или уменьшение интенсивности флуоресценции распознающего антиген антитела (в форме Fab) с концентрацией 20 нМ в PBS, рН 7,2, при 25°С в присутствии увеличивающихся концентраций антигена (длина волны возбуждения = 295 нм; длина волны эмиссии = 340 нм, полоса пропускания 16 нм), с использованием спектрометра, такого как спектрофотометр с функцией остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометра серии 8000 SLM-AMINCO ™ (ThermoSpectronic) с функцией перемешивания в кювете.
2
2
В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело предствляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), Fv, и scFv фрагменты, а также другие фрагменты, описанные ниже, но не ограничиваются ими. Обзор некоторых фрагментов антител представлен в публикации Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Обзор scFv фрагментов представлен, например, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патенты США US 5,571,894 и US 5,587,458. В патенте США 5,869,046 обсуждаются Fab и F(ab') фрагменты, содержащие аминокислотные остатки эпитопа связывания «рецептора спасения» и имеющие повышенное время полужизни in vivo.
Диатела являются фрагментами антител с двумя антиген-связывающими сайтами, которые могут быть бивалентными или биспецифичными. См., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; и Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Триатела и тетратела также описаны Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134.
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых воплощениях однодоменные антитела представляют собой однодоменные антитела человека (Domantis, Inc., Waltham, MA; see, e.g., U.S. Patent No. US 6,248,516 B1).
Фрагменты антител могут быть получены при помощи различных методик, включая протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию в рекомбинантных клетках-хозяевах (например, Е.coli или фагах), согласно описанию здесь, но не ограничиваясь ими.
Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США US 4,816,567 и Morrison, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело содержит вариабельный участок, не являющийся человеческим (например, вариабельный участок полученный у мыши, крысы, хомяка, кролика или не являющегося человеком примата, например, обезьяны) и константный участок человека. В следующем примере химерное антитело представляет собой антитело "с переключенным классом", у которого класс или подкласс были изменены по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают также их антиген-связывающие фрагменты.
В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, не являющееся человеческим, подвергают гуманизации, чтобы снизить иммуногенность для человека, при этом сохраняя специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых гипервариабельные участки, например, CDR, (или их части) получены из антитела, не являющегося человеческим, а каркасные участки FR (или их части) получены на основе последовательностей антитела человека. Возможно гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константного участка человека. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим (например, антитела из которого получены аминокислотные остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.
Гуманизированные антитела и способы их получения представлены, например, в обзоре Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, и более подробно описаны, например Riechmann, et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; в патентах США 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, и 7,087,409; Kashmiri, et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описание трансплантации SDR (a-CDR); Padlan, Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описание "изменения поверхности"); Dall'Acqua, et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описание "рекомбинации FR") и Osbourn, et al., Methods 36 (2005)61-68 и Klimka, et al., Br. J. Cancer, 83 (2000) 252-260 (описание "направленного отбора" для рекомбинации FR).
Каркасные участки человека, которые могут быть использованы для гуманизации, включают: каркасные участки, выбранные при помощи метода "максимального соответствия" (см., например, Sims, et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296); каркасные участки, полученные из консенсусных последовательностей человеческих антител с вариабельными участками легкой или тяжелой цепей определенной подгруппы (см., например, Carter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285 и Presta, et al., J. Immunol., 151 (1993) 2623); зрелые каркасные участки человека (с соматическими мутациями) или каркасные участки зародышевой линии (неперестроенные) (см., например, Almagro, and Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633), а также каркасные участки, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Васа, et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 и Rosok, et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618), но не ограничиваются ими
Человеческие антитела
В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены при помощи различных способов, известных в данной области техники. Человеческие антитела описаны van Dijk, and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-74 and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.
Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному для получения интактных человеческих антител или интактных антител с вариабельными участками человека в ответ на введение антигена. Такие животные обычно имеют все локусы иммуноглобулинов человека или их часть, заменяющие локусы эндогенных иммуноглобулинов, которые находятся вне хромосом или интегрированы случайным образом в хромосомы животных. У таких трансгенных мышей локусы эндогенных иммуноглобулинов обычно бывают инактивированы. Обзор способов получения человеческих антител в трансгенных животных представлен Lonberg, Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. См. также, например, патенты США 6,075,181 и 6,150,584 описывающие технологию XENOMOUSE™; патент США 5,770,429 описывающий технологию HUMAB; патент США 7,041,870 описывающий технологию K-М MOUSE и заявку на патент США US 2007/0061900, описывающий технологию VELOCIMOUSE). Вариабельные участки человека в интактных антителах, полученных в таких животных, могут быть далее модифицированы, например, путем комбинации с различными константными участками человека.
Антитела человека могут также быть получены при помощи гибридомной технологии. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек были описаны (см., например, Kozbor, J. Immunol., 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63 и Boerner, et al., J. Immunol., 147 (1991) 86.) Человеческие антитела, полученные с применением технологии B-клеточной гибридомы человека также описаны Li, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562. Дополнительные способы включают те, что описаны, например, в патенте США 7,189,826 (описание получения моноклональных антител человека класса IgM из гибридомных клеточных линий) и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4) (2006) 265-268 (описание гибридом человек-человек). Технология человеческих гибридом (технология триом) также описана Vollmers, and Brandlein, Histology and Histopathology 20(3) (2005) 927-937 и Vollmers, and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3) (2005) 185-91.
Человеческие антитела могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельного домена Fv клонов, выбранных из библиотек фагового дисплея, созданных на основе генов человека. Такие последовательности вариабельных доменов затем могут быть объединены с необходимым константным доменом человека. Технологии для отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
Антитела, полученные из библиотек
Антитела по изобретению могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек на антитела с желаемой активностью или активностями. Например, в данной области техники известно большое количество способов создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие желаемыми характеристиками связывания. Такие способы рассматриваются, например, в обзоре Hoogenboom, H.R., et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) и также описываются, например McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu, et al., J. Mol. Biol. 338(2) (2004) 299-310; Lee, et al., J. Mol. Biol. 340(5) (2004) 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34) (2004) 12467-12472 и Lee, et al., J. Immunol. Methods 284(1-2) (2004) 119-132.
В некоторых способах фагового дисплея спектры генов VH и VL клонируют отдельно при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируют случайным образом в библиотеках фагового дисплея, и затем проводят их скрининг на связывание фаговой частицы с антигеном, согласно описанию Winter, et al., Ann. Rev. Immunol., 12 (1994) 433-455. Как правило, фаги экспонируют фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, либо в виде Fab фрагментов. Библиотеки на основе генов, полученных у иммунизированных доноров, позволяют получить высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости создания гибридом. В альтернативном случае, для получения единого источника антител к широкому спектру «чужих» и «своих» антигенов можно клонировать первичный репертуар генов (например, человеческих), согласно описанию Griffiths, et al., EMBO J, 12 (1993) 725-734. Наконец, «наивные», или первичные библиотеки также могут быть синтезированы путем клонирования неперестроенных сегментов, включающих V-гены стволовых клеток, и использования праймеров ПЦР, содержащих случайные последовательности, которые кодируют высоковариабельные участки CDR3 и обеспечивают перестройку in vitro, согласно описанию Hoogenboom, and Winter, J. Mol. Biol., 227 (1992) 381-388. Публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например, патент США 5,750,373 и публикации 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, здесь считаются человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.
Мультиспецифичные антитела
В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело представляет собой мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, имеющие связывающие валентности по меньшей мере для двух различных сайтов. В некоторых воплощениях одна из связывающих валентностей предназначена для специфического антигена, а другая - для любого другого антигена. В некоторых воплощениях биспецифичные антитела могут связывать два различных эпитопа антигена. Биспецифичные антитела также могут применяться для локализации цитотоксических агентов на клетках, экспрессирующих антиген, с которым связывается антитело. Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.
Способы получения мультиспецифичных антител включают рекомбинантную ко-экспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулинов, имеющих разную специфичность (см. Milstein, and Cuello, Nature 305 (1983) 537, WO 93/08829, and Traunecker, et al., EMBO J. 10 (1991) 3655), и инженерию "knob-in-hole" (см., например, патент США 5,731,168). Мультиспецифичные антитела также могут быть получены за счет наведения электростатических зарядов для получения молекул антител с гетеродимерными Fc-фрагментами (WO 2009/089004 А1); сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США 4,676,980, и Brennan, et al., Science, 229 (1985) 81); использования «лейциновых застежек» для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny, et al., J. Immunol., 148(5) (1992) 1547-1553); с помощью технологии "диател" для получения фрагментов биспецифичных антител (см., например, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993) 6444-6448); использования одноцепочечных Fv (sFv) димеров (см., например, Gruber, et al., J. Immunol., 152 (1994) 5368); и получения триспецифичных антител, например, согласно описанию Tutt, et al., J. Immunol. 147 (1991) 60.
Рекомбинантные антитела с тремя или более функциональными сайтами связывания антигенов, включая антитела типа "Octopus antibodies," также включены в данное описание (см., например, US 2006/0025576 А1).
Антитело или фрагмент здесь также включают "FAb двойного действия" или "DAF" (от англ. "Dual Acting FAb"), содержащие антиген-связывающий сайт, связывающий специфический антиген, а также другой отличный антиген (см., например, US 2008/0069820).
Варианты антител с измененной аффинностью связывания антигена
В некоторых воплощениях может требоваться повышение аффинности связывания с антигеном и/или других биологических свойств антитела. Аминокислотные последовательности вариантов антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем белкового синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в составе аминокислотной последовательности антитела. Для получения конечной конструкции можно осуществлять любые комбинации делеции, инсерции и замен, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, связыванием антигена.
Варианты с заменами, инсерциями и делениями
В некоторых воплощениях предложены полипептиды, содержащие Fc варианты, имеющие дополнительно одну или более аминокислотных замен в участках, отличных от Fc области. Сайты, представляющие интерес для проведения замещающего мутагенеза, включают HVR и FR. Консервативные замены представлены в Таблице 1 под заголовком "консервативные замены". Более значительные замены представлены в Таблице 1 под заголовком "примеры замен", и подробнее описаны ниже, со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно вводить в антитело, представляющее интерес, и проводить скрининг полученных продуктов на предмет желаемой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена или понижения иммуногенности.
Таблица 1
Исходная аминокислота
Примеры замен
Консервативные замены
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp, Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gln (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Asp
Gly (G)
Ala
Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine
Leu
Leu (L)
Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Val; Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine
Leu
Аминокислотные остатки можно сгруппировать в соответствии общими свойствами боковых цепей:
(1) гидрофобные: Ile, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены влекут за собой замещение представителя одного из этих классов на представителя другого класса.
Один вид замещения включает замещение одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) вариант(ы), отбираемые для дальнейшего изучения, имеют изменения (например, улучшение) определенных биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или в значительной степени сохраняют определенные биологические свойства родительского антитела. Примером варианта замещения является антитело, подвергнутое аффинному созреванию, которое может быть легко получено, например, при помощи технологии аффинного созревания с использованием фагового дисплея, подробно описанной здесь. Вкратце, один или более остатков HVR подвергают мутации и проводят скрининг вариантов антитела, экспрессируемых фагом, по определенной биологической активности (например, аффинности связывания).
Изменения (например, замены) могут осуществляться внутри HVR, например, для увеличения аффинности антитела. Такие изменения можно проводить в "горячих точках" HVR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые в процессе соматического созревания с высокой частотой подвергаются мутациям (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), и/или SDR (a-CDR), а у полученных вариантов VH или VL изучать аффинность связывания. Осуществление аффинного созревания путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, Hoogenboom, et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых воплощениях для осуществления аффинного созревания повышают изменчивость вариабельных генов, выбранных для осуществления аффинного созревания, при помощи любого из существующих разнообразных методов (например, ПЦР пониженной точности, рекомбинации цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). После этого создается вторичная библиотека. Затем проводят скрининг библиотеки для выявления любых вариантов антител с необходимой аффинностью. Другой способ повышения изменчивости включает методы, нацеленные на изменение HVR, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков одновременно). HVR остатки, задействованные в связывании антигена, могут быть специально идентифицированы, например, при помощи аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, изменениям часто подвергаются CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых воплощениях замены, инсерции или делеции могут возникать в составе одного или нескольких HVR, при условии, что такие изменения существенным образом не снижают способность антитела связывать антиген. Например, могут быть выполнены консервативные замены в HVR (например, консервативные замены, описанные здесь), которые существенным образом не снижают аффинность связывания. Такие замены могут располагаться за пределами "горячих точек" HVR или SDR. В некоторых воплощениях, каждый HVR либо остается без изменений, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен в составе вариантов последовательностей VH и VL, приведенных выше.
Полезный способ определения остатков или участков антитела, которые могут быть мишенями направленного мутагенеза, называется "аланин-сканирующий мутагенез", описанный Cunningham, and Wells, Science 244 (1989) 1081-1085. В этом методе выявляют аминокислотный остаток или группу таргетных остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и замещают нейтральными или отрицательно заряженными аминокислотами (например, аланином или полиаланином), чтобы выяснить, изменится ли взаимодействие антитела с антигеном. Дальнейшие замены могут затрагивать аминокислоты в позициях, которые оказываются функционально чувствительными к первоначальным заменам. Дополнительно или альтернативно, может оказаться полезным провести анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для выявления точек контакта между антителом и антигеном. Такие остатки, задействованные в контактах, а также соседние с ними остатки могут быть выбраны в качестве кандидатов для замещения. Можно проводить скрининг вариантов с целью выявления у них наличия желаемых свойств.
Инсерции в аминокислотных последовательностях включают сшивки в амино- и/или карбокси-терминальных участках, составляющие по длине от одного остатка до полипептидов, состоящих из сотни остатков или более, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры инсерции в терминальных участках включают антитело с N-концевым остатком метионила. Другие варианты молекулы антитела с инсерциями включают сшивание N- или С-конца антитела с ферментом (например, ADEPT) или полипептидом, приводящее к повышению времени полужизни антитела в сыворотке.
Варианты гликозилирования
В некоторых воплощениях предложенное антитело модифицировано для повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования антитела может легко достигаться за счет изменения аминокислотной последовательности таким образом, что создаются или удаляются один или несколько сайтов гликозилирования.
В случае когда антитело содержит Fc область, присоединенные к ней углеводы могут быть изменены. Нативные антитела, продуцируемые в клетках млекопитающих, обычно содержат разветвленные двухантенные олигосахариды, которые как правило присоединены посредством N-гликозидной связи к Asn297 СН2 домена Fc области. См., например, Wright, et al., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Олигосахариды могут включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» двухантенной олигосахаридной структуры. В некоторых воплощениях для создания вариантов антитела с некоторыми улучшенными свойствами могут производиться модификации олигосахаридов в составе антитела по изобретению.
Также предложены полипептиды, содержащие Fc варианты, с сиалированными олигосахаридами, например, имеющие различную степень сиалирования олигосахаридного ядра Fc, присоединенного к Fc области антитела. Такие полипептиды могут обладать повышенной степенью сиалирования и/или пониженной функцией ADCC. Примеры таких вариантов антител описаны, например, Kaneko, et al., Science 313 (2006) 670-673.
Модифицированные цистеином варианты антител
В некоторых воплощениях может быть целесообразным создание модифицированных цистеином антител, например, "thioMAbs," в которых один или более остатков антитела замещены на цистеиновые остатки. В конкретных воплощениях замещенные остатки располагаются в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков на цистеин реакционно-способные тиоловые группы размещаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгирования антитела с другими компонентами, например, компонентами лекарств или фрагментами линкер-лекарство, для создания иммуноконъюгата, согласно описанию ниже. В некоторых воплощениях один или несколько из следующих остатков могут быть заменены на цистеин: V205 (нумерация по Кабат) легкой цепи; А118 (нумерация EU) тяжелой цепи; и S400 (нумерация EU) Fc фрагмента тяжелой цепи. Модифицированные цистеином антитела могут быть получены, как описано, например, в патенте США 7,521,541.
Производные антител
В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело может быть также модифицировано с целью введения дополнительных небелковых компонентов, известных в данной области техники и легко доступных. Компоненты, подходящие для получения производных антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Не являющиеся исчерпывающими примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры) и декстран или поли(п-винил пирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида и этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве благодаря своей стабильности в воде. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и в случае присоединения более одного полимера, их молекулы могут быть идентичными или различаться. Как правило, число и/или тип полимеров, применяемых для получения производных, может определяться исходя из того, какие конкретные свойства или функции антитела, нуждаются в улучшении и того, будет ли производное антитела применяться в терапии при определенных условиях, и т.д., но не ограничиваться данными соображениями.
В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковые компоненты, которые могут быть избирательно нагреты под воздействием радиации. В одном воплощении, небелковый компонент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Радиационное воздействие может иметь любую длину волны, включая, но не ограничиваясь длинами волн, не повреждающими обычные клетки, но нагревающими небелковый компонент до температуры, которая вызывает гибель клеток, расположенных вблизи небелкового компонента антитела.
Рекомбинантные способы и композиции
Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, описанных в патенте США 4,816,567. В одном воплощении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вариант антитела, описанный здесь. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В следующем воплощении предложены один или более векторов (например, экспрессирующие векторы), содержащие такую нуклеиновую кислоту. В следующем воплощении предложены клетки-хозяева, содержащие такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких воплощений клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, Y0, NS0, Sp20 cell). В одном воплощении предложен способ получения антитела, где способ включает культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, согласно описанию выше, при условиях, подходящих для экспрессии антитела, и возможно, выделение антитела из клеток-хозяев (или среды культивирования клеток-хозяев).
Для получения варианта антитела рекомбинантным способом нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, согласно описанию выше, выделяют и вставляют в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетках-хозяевах. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована при помощи стандартных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела.
Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают клетки прокариот или эукариот, описанные здесь. Например, антитела могут производиться в бактериях, в частности, когда гликозилирование и эффекторные функции Fc не являются необходимыми. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, патенты США 5,648,237, 5,789,199 и 5,840,523. (см. также Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), описывающие экспрессию фрагментов антител в Е.coli.). После экспрессии антитело может быть выделено из бактериальной массы в виде растворимой фракции и затем очищено.
Кроме прокариот в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, подходят микроорганизмы-эукариоты, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, у которых пути гликозилирования были "гуманизированы" для обеспечения продукции антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gemgross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, and Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированных антител также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Также были найдены многочисленные штаммы бакуловирусов, которые могут использоваться совместно с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В качестве хозяев также могут использоваться культуры клеток растений. См., например, патенты США 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 и 6,417,429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).
В качестве хозяев также могут использоваться клетки позвоночных. Например, могут применяться клеточные линии млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами клеточных линий млекопитающих, используемых в качестве хозяев, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированных SV40 (COS-7); линия эмбриональных клеток почки человека (293 или клетки почки (BHK); мышиные клетки сертоли (клетки ТМ4 согласно описанию, например Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы буффало (BRL 3А); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Нер G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, согласно описанию, например Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; клетки MRC 5; и клетки FS4. Другие клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев, включают клетки яичников китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR" CHO (Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216); и линии клеток миеломы, такие как YO, NSO и Sp2/0. Обзор некоторых клеточных линий млекопитающих, подходящих в качестве хозяев для получения антител, представлен, например Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 255-268 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ).
Тесты
Для антител, предложенных здесь, можно проводить идентификацию, скрининг или исследование характеристик физических/химических свойств и/или биологической активности при помощи различных тестов, известных в области техники.
Тесты связывания и другие тесты
В одном аспекте определяют антиген-связывающую активность антитела по изобретению, например, такими известными способами как иммуноферментный анализ, вестерн-блоттинг и т.д
В приведенном в качестве примера тесте конкурентного связывания иммобилизованный антиген инкубируют с раствором, содержащим первое меченое антитело, связывающееся с антигеном (например) и второе немеченое антитело, у которого определяют способность конкурировать с первым антителом за связывание с антигеном. Второе антитело может находиться в супернатанте гибридом. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют с раствором, содержащим первое меченое антитело, но не содержащим второго немеченого антитела. После инкубации в условиях, позволяющих связаться первому антителу с антигеном, избыток несвязанного антитела удаляют, и определяют количество метки, связавшейся с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, связавшейся с иммобилизованным антигеном, существенно снижается в исследуемом образце по отношению к контрольному образцу, это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с антигеном. См. Harlow, and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Иммуноконъюгаты
В изобретении также предложены имммуноконъюгаты, содержащие антитело, конъюгированные с одним или несколькими цитотоксическими агентами, например, химиотерапевтическими агентами или лекарственными препаратами, подавляющими рост агентами, токсинами (например, белковыми токсинами, энзиматически активными токсинами бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагментами) или радиоактивными изотопами.
В одном воплощении иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитела с лекарственным препаратом (ADC), в составе которого антитело конъюгировано с одним или несколькими лекарственными препаратами, включая майтансиноид (см. патенты США 5,208,020, 5,416,064 а также Европейский патент ЕР 0425235 В1); ауристатин, например, лекарственные фрагменты DE и DF монометилауристатина (ММАЕ и MMAF) (см. патенты США 5,635,483 и 5,780,588 и 7,498,298); доластатин, калихеамицин или их производные (см. патенты США 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 и 5,877,296; Hinman, et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; и Lode, et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); антрациклин, например, дауномицин или доксорубицин (см. Kratz, et al., Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16 (2006) 358-362; Torgov, et al., Bioconj. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; и патент США 6,630,579); метотрексат; виндезин; таксан, например, доцетаксел, паклитаксел, larotaxel, tesetaxel, ортатаксел; трихотецен; и СС1065, но не ограничиваясь ими.
В другом воплощении иммуноконъюгат содержит антитело по настоящему описанию, конъюгированное с энзиматически активным токсином или его фрагментом, включая А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и РАР-S), ингибитор Momordica charantia, курицин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены, но не ограничиваясь ими.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
В другом воплощении иммуноконъюгат содержит антитело по данному описанию, конъюгированное с радиоактивным изотопом и формирующее «радиоконъюгат». Для получения радиоактивных конъюгатов существует большое разнообразие радиоактивных изотопов. Примеры их включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Если для детекции применяется радиоконъюгат, он может содержать радиоактивный изотоп для проведения сцинтиграфического исследования, например, tc99m или I123, или спиновую метку для проведения исследования методом ядерного магнитного резонанса (NMR) (также известного под названием магнитного резонансного исследования, MRI), например, иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Конъюгаты антитела с цитотоксическим агентом могут быть получены с применением различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональных производных имидоэфиров (таких как диметил адипимидат HCI), активных эфиров (таких как дисукцинимидил суберат), альдегидов (таких как глутаральдегид), бис-азидо соединений (таких как бис (р-азидобензоил) гександиамин), производных бисдиазония (таких как бис-(р-диазониумбензоил)-этилендиамин), диизоцианатов (таких как толуэн 2,6-диизоцианат) и бис-активных фтористых соединений (таких как 1,5-дифлуоро-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина может быть получен согласно описанию Vitetta, et al., Science 238 (1987) 1098. Меченая углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен триаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгирования меченого радиоактивным изотопом нуклеотида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может быть "расщепляемым линкером", способствующим высвобождению цитотоксического лекарственного препарата в клетках. Например, могут использоваться кислотный лабильный линкер, пептидазный лабильный линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari, et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; патент США 5,208,020).
Иммуноконъюгаты или ADC в данном документе рассматриваются явным образом, но не ограничиваются такими конъюгатами, которые получены с помощью образующих поперечные связи реагентов, включающих, но не ограничивающихся BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)-бензоат), доступных из коммерческих источников (например Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).
Способы и композиции для диагностики и детекции
В некоторых воплощениях любое из предложенных здесь вариантов антител может применяться для детекции наличия в биологическом образце антигена, связывающегося с этим антителом. Термин "детекция", используемый здесь, включает количественное или качественное определение. В некоторых воплощениях биологический образец включает клетки или ткани.
В одном воплощении предложен вариант антитела для применения в способах диагностики или детекции. В следующем аспекте предложен способ детекции наличия в биологическом образце антигена, с которым связывается указанное антитело. В некоторых воплощениях способ включает инкубацию биологического образца с антителом, согласно описанию здесь, в условиях, обеспечивающих связывание антитела с антигеном, и определение формирования комплекса между антителом антигеном. Такой способ может представлять собой способ для применения in vitro или in vivo. В одном воплощении вариант антитела применяют для отбора субъектов, подходящих для лечения с применением антитела, например, когда антиген, с которым связывается указанное антитело, является биомаркером для отбора пациентов.
Примеры нарушений, которые можно диагностировать с применением антитела по изобретению, включают онкологические заболевания, сердечнососудистые заболевания, нейрональные нарушения и диабет.
32
14
125
3
131
В некоторых воплощениях предложены меченые варианты антитела. Метки включают детектируемые напрямую метки или компоненты (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также компоненты, например, ферменты или лиганды, детектируемые опосредованно, например, при помощи ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия, но не ограничиваются ими. Примеры меток включают радиоизотопы P, C, I, H и I, флуорофоры, например, редкоземельные хелаты или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (патент США 4,737,456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, (3-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказу и ксантин-оксидазу, связанные с ферментом, использующим пероксид водорода для окисления хромогена, таким как пероксидаза хрена, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы, и им подобные, но не ограничиваются ими.
Фармацевтические препараты

Фармацевтические препараты варианта антитела согласно данному описанию изготавливают путем смешивания такого антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими возможными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированного препарата или водного раствора. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают: буферы, например, фосфатный, цитратный и содержащие другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензил аммоний хлорид; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкил парабены, такие как метил или пропил парабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; протеины, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахарозу, маннитол, трегалозу или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG), но не ограничиваются ими. Примеры фармацевтически приемлемых носителей здесь также включают диспергирующие агенты, такие как активные в нейтральных условиях растворимые гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX, Baxter International, Inc.). Примеры некоторых sHASEGPs и способов их применения, включая rHuPH20, описаны в публикациях 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP дополнительно комбинирован с одним или более гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Примеры лиофилизированных препаратов антител описаны в патенте США 6,267,958. Водные препараты антител включают описанные в патенте США 6,171,586 и WO 2006/044908, последние включают гистидин-ацетатный буфер.
Препараты здесь могут также содержать более одного активного ингредиента, которые предпочтительно имеют комплементарную активность и не оказывают друг на друга отрицательного влияния, что бывает необходимо при конкретных показаниях к терапии. Такие активные ингредиенты соответственно находятся в комбинации в количествах, эффективных для намеченного использования.
Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, с помощью технологии коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, в микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы поли-(метилметацилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Могут быть изготовлены препараты с пролонгированным высвобождением. Примеры подходящих препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, в которых матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, в виде пленок или микрокапсул.
Препараты, применяющиеся для введения in vivo, как правило, стерильны. Стерильность может быть достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Терапевтические способы и композиции
Любой из предложенных здесь полипептидов может применяться в терапевтических способах.
В определенном аспекте изобретения полипептид согласно изобретению применяют для лечения заболевания. В более определенном аспекте заболевание является таковым, что является желательным значительное, по меньшей мере на 50%, снижение эффекторной функции варианта, при сравнении с полипептидом, содержащим Fc полипептид дикого типа.
В определенном аспекте полипептид согласно изобретению применяют в производстве лекарства для лечения заболевания, когда целесообразно, чтобы эффекторная функция полипептида была значительно снижена по сравнению с Fc полипептидом дикого типа. В следующем определенном аспекте полипептид согласно изобретению применяют для изготовления лекарства для лечения заболевания, при котором целесообразным является снижение эффекторной функции полипептида по сравнению с Fc полипептидом дикого типа по меньшей мере на 20%.
Следующий аспект представляет собой способ лечения индивида, имеющего заболевание, при котором целесообразным является значительное снижение эффекторной функции варианта по сравнению с Fc полипептидом дикого типа, включающий введение индивиду эффективного количества полипептида согласно изобретению.
Значительное снижение эффекторной функции представляет собой снижение эффекторной функции по меньшей мере на 50% от эффекторной функции, индуцируемой полипептидом дикого типа.
Такими заболеваниями, например, являются все заболевания, при которых клетки-мишени не должны разрушаться под влиянием, например, ADCC, ADCP или CDC. Кроме того, это справедливо и для тех антител, которые предназначены для доставки лекарства (например, токсинов и изотопов) к клетке-мишени, где при осуществлении эффекторных функций, опосредованных Fc/FcγR, происходит сближение здоровых иммунных клеток с компонентом, оказывающим деструктивное воздействие, вызывая истощение нормальной лимфоидной ткани наряду с клетками-мишенями (Hutchins, et al, PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White, et al, Annu Rev Med 52 (2001) 125-145). В таких случаях применение антител, которые бы слабо мобилизовали комплемент или эффекторные клетки, было бы чрезвычайно благоприятным (см., например, Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276(9) (2001) 6591-6604; US 6,194,551; US 5,885,573 и публикацию WO 04/029207).
В других случаях, например, когда целью является блокирование взаимодействия рецептора, экспрессируемого большим количеством клеток, с распознаваемым им лигандом, было бы предпочтительно понизить или устранить все эффекторные функции антитела для уменьшения нежелательной токсичности. Также, в случаях, когда используемое в терапевтических целях антитело беспорядочно связывается с рядом тканей человеческого организма, было бы целесообразно ограничить осуществление эффекторной функции более узким кругом тканей для уменьшения токсичности.
Кроме того, для агонистических антител было бы очень благоприятным, если бы эти антитела проявляли сниженную эффекторную функцию.
Патологические состояния, которые можно лечить с применением варианта полипептида, очень многочисленны и включают онкологические заболевания (например, когда вариант антитела связывает рецептор HER2, рецептор ангиопоэтина или фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF)); аллергические расстройства, такие как астма (с антителом к IgE) и LFA-1-опосредованные расстройства (например, когда вариант полипептида представляет собой антитело к LFA-1 или к ICAM-1), нейрологические и метаболические нарушения.
В случае, когда антитело связывается с рецептором HER2, нарушение предпочтительно представляет собой онкологическое заболевание, характеризующееся экспрессией HER2, например, доброкачественную или злокачественную опухоль, характеризующуюся сверхэкспрессией рецептора HER2. Такие онкологические заболевания включают рак молочной железы, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак мочевого пузыря, гепатому, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные формы злокачественных опухолей головы и шеи, но не ограничиваются ими.
Вариант полипептида или антитела вводят любым подходящим способом, включая парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение, а при необходимости местного иммуносуппрессивного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, можно осуществлять пульсовое введение варианта антитела, в частности, с понижением доз варианта полипептида. Предпочтительно дозирование осуществляют путем инъекций, наиболее предпочтительно, внутривенных или подкожных инъекций, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным.
Соответствующая дозировка полипептида или варианта антитела для предупреждения или лечения заболевания будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли вариант полипептида в превентивных или в терапевтических целях, от предшествующего лечения, истории болезни пациента и ответа на вариант полипептида, а также от выбора лечащего врача. Соответственно, вариант полипептида вводят пациенту единовременно или на протяжении серии процедур.
В зависимости от типа и тяжести заболевания приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) полипептида или варианта антитела может служить возможной исходной дозировкой для введения пациенту, как, например, в виде одного или нескольких отдельных введений, так и в виде длительной инфузии. Типичная суточная дозировка может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. При повторном введении на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от патологического состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не наступает желаемое подавление симптомов заболевания Однако, могут применяться и другие режимы дозирования. Успех данного лечения легко отслеживается при помощи известных методик и тестов.
В некоторых воплощениях изобретения предложены вариант антитела или полипептид для применения в способе лечения индивида, имеющего онкологическое заболевание, включающем введение индивиду эффективного количества варианта антитела. В одном из таких воплощений способ также включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, согласно описанию ниже. В других воплощениях изобретения предложен вариант антитела для применения для ингибирования ангиогенеза, ингибирования пролиферации клеток или истощения В-клеток у индивида, включая введение индивиду эффективного количества варианта антитела для ингибирования ангиогенеза, ингибирования клеточной пролиферации или истощения В-клеток согласно любому из указанных выше воплощений у "индивида", который предпочтительно является человеком.
В следующем аспекте изобретения предложено применение варианта антитела или полипептида для изготовления или получения лекарства. В одном воплощении лекарство предназначается для лечения онкологического или воспалительного заболевания. В другом воплощении лекарство предназначается для лечения онкологического заболевания, диабета, нейрональных нарушений или воспалительных заболеваний, включающего введение индивиду, имеющему онкологическое заболевание, диабет, нейрональное нарушение или воспалительное заболевание, эффективного количества лекарства. В одном из таких воплощений способ также включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, соглансо описанию ниже. В следующем воплощении лекарство предназначается для ингибирования ангиогенеза, подавления клеточной пролиферации или истощения В-клеток.
В следующем воплощении лекарство предназначается для применения в способе ингибирования ангиогенеза, ингибирования клеточной пролиферации или истощения В-клеток у индивида, включающем введение индивиду эффективного количества лекарства для ингибирования ангиогенеза, ингибирования клеточной пролиферации или истощения В-клеток. "Индивид" согласно любому из указанных выше воплощений может быть человеком.
В следующем аспекте изобретения предложен фармацевтический препарат, содержащий любой из предложенных здесь вариантов антитела, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтический препарат содержит любой из предложенных здесь вариантов антитела и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтический препарат содержит любой из предложенных здесь вариантов антитела и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, согласно описанию ниже.
Антитела по изобретению могут применяться в терапии либо по-отдельности, либо в сочетании с другими агентами. Например, антитело по изобретению можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом.
Такая комбинированная теарпия, упомянутая выше, предусматривает совместное введение (когда два или более терапевтических агента входят в состав одного и того же препарата или отдельных препаратов) и раздельное введение, когда введение антитела по изобретению можно осуществлять перед, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела по изобретению можно также применять в сочетании с лучевой терапией.
Антитело по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное и, при необходимости местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым подходящим способом, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. Здесь рассматриваются различные режимы дозирования, включающие однократное или многократное введение через различные промежутки времени, болюсное введение и пульсовое введение, но не ограничивающиеся ими.
Антитела по изобретению должны изготавливаться, дозироваться и вводиться в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые необходимо при этом учитывать, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, принимающее лечение, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, место введения агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные медицинскому персоналу. Антитело не обязательно, но возможно находится в сочетании с одним или несколькими агентами, используемыми на данный момент для предупреждения или лечения указанного нарушения. Эффективное количество этих иных агентов зависит от количества антитела, присутствующего в препарате, типа нарушения или лечения и других факторов, обсуждавшихся выше. Их, как правило, применяют в таких же дозировках и вводят такими же способами, как описанные здесь, или как в случае приблизительно от 1 до 99% описанных здесь дозировок, или в любой дозировке и любым способом, который эмпирически/клинически считаются подходящими.
Соответствующая дозировка антитела по изобретению (при использовании отдельно или в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами) для предупреждения или лечения заболевания будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело в превентивных или в терапевтических целях, от предшествующего лечения, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от выбора лечащего врача. Соответственно, антитело вводят пациенту единовременно или на протяжении серии процедур. В зависимости от типа и тяжести заболевания приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг) антитела может служить возможной исходной дозировкой для введения пациенту, как, например, в виде одного или нескольких отдельных введений, так и в виде длительной инфузии. Одна типичная суточная дозировка может варьировать приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. При повторном введении на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от патологического состояния, лечение будет продолжаться до тех пор, пока не наступит желаемое подавление симптомов заболевания. Одним из примеров дозировки антитела может быть диапазон от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту могут быть введены одна или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Эти дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получил приблизительно от двух до приблизительно двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Может производиться введение первоначальной ударной дозы, за которой следует введение одной или нескольких более низких доз. Однако, могут применяться и другие режимы дозирования. Успех данного лечения легко отслеживается при помощи известных методик и тестов.
Очевидно, что любой из вышеупомянутых препаратов или терапевтических способов может осуществляться с применением иммуноконъюгата по изобретению вместо или в дополнение к антителу согласно изобретению.
Изделия
В другом аспекте изобретения предложены изделия, содержащие материалы, полезные для лечения, предупреждении и/или диагностики нарушений, описанных выше. Изделия включают контейнер и этикетку или листовку-вкладыш на контейнере или внутри него. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты с раствором для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая самостоятельно или в комбинации с другой композицией является эффективной при лечении, предупреждении и/или диагностике патологических состояний, и может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело по изобретению. На этикетке или листовке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения предпочтительного патологического состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит антитело по изобретению и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие в данном воплощении изобретения может также содержать листовку-вкладыш, с указанием, что композиции могут применяться в лечении конкретного патологического состояния. Альтернативно или дополнительно изделие может также содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически-приемлемый буфер, например бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может также содержать другие материалы, привлекательные с коммерческой и с потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.
Очевидно, что любое из вышеупомянутых изделий может содержать иммуноконъюгат по изобретению вместо или в дополнение к варианту антитела.
Нетерапевтическое применение полипептида
Вариант антитела по изобретению можно применять в качестве агента для аффинной очистки. В этом способе вариант антитела иммобилизуют на твердой основе, такой как смола Sephadex или фильтровальная бумага с помощью известных в области техники способов. Иммобилизованный вариант полипептида приводят в контакт с образцом, содержащим антиген, подлежащий очистке, а затем основу промывают подходящим растворителем, который удаляет по существу весь материал образца, за исключением антигена, подлежащего очистке, который остается связанным с иммобилизованным вариантом антитела. В конце основу промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который отделяет антиген от варианта полипептида.
Вариант антитела можно также применять в диагностических исследованиях, например, для детекции экспрессии антигена, представляющего интерес, в определенных клетках, тканях или сыворотке.
Для диагностических целей к варианту антитела обычно прикрепляют детектируемый компонент. Существуют различные метки, которые можно разделить на следующие группы:
35
14
125
3
131
(а) радиоактивные изотопы, такие как S, С, I, H и I. Вариант полипептида можно пометить радиоактивными изотопами, например, при помощи методов, описанных Coligen, et al., Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs. (1991), а радиоактивность измерять при помощи сцинтилляционного счетчика.
(б) флуоресцентные метки, такие как редкоземельные хелаты (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрит и техасский красный. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с вариантом полипептида с помощью методов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, см. выше. Флуоресценцию можно измерять при помощи флуориметра.
(в) различные метки на основе ферментативных субстратов, обзор некоторых из них приведен в патенте США 4,275,149. Фермент как правило катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое затем можно измерить с помощью различных методов. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно измерить спектрофотометрически. В альтернативном случае, фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Методы количественного определения изменения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат переходит в электронно-возбужденное состояние в результате химической реакции и затем может испускать свет, который можно зарегистрировать (например, с помощью хемилюминометра) или передает энергию флуоресцентному акцептору. Примеры ферментативных меток включают люциферазы (например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу, патент США 4,737,456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малат-дегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы (например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу), оксидазы гетероциклических соединений (такие как уриказа и ксантин-оксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Способы конъюгирования ферментов с антителами описаны O'Sullivan, et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981).
Примеры комбинаций фермент-субстрат включают, например:
(i) пероксидазу хрена (HRPO), которая использует в качестве субстрата пероксид водорода, где пероксид водорода окисляет хромоген (например, ортофенилендиамин (OPD) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидин гидрохлорид (ТМВ));
(ii) щелочную фосфатазу (АР), использующую пара-нитрофенилсосфат в качестве хромогенного субстрата;
(iii) β-D-галактозидазу (β-D-Gal), использующую хромогенный субстрат (например, р-нитрофенил-β-D-галактозид) или флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид.
Специалистам в данной области известно множество других комбинаций фермент-субстрат. Общий обзор по ним представлен, например в патентах США 4,275,149 и 4,318,980.
В некоторых случаях метку конъюгируют с вариантом полипептида опосредованно. Специалистам в данной области известно, как добиться этого различными способами. Например, вариант полипептида может быть конъюгирован с биотином, а любая из меток, принадлежащих трем большим категориям, упомянутым выше, может быть конъюгирована с авидином, или наоборот. Биотин селективно связывается с авидином и, таким образом, метка может быть конъюгирована с вариантом полипептида таким опосредованным способом. В альтерантивном случае для достижения опосредованной конъюгации метки с вариантом полипептида вариант полипептида конъюгируют с гаптеном, имеющим небольшую молекулярную массу (например, дигоксином), а одну из меток различных типов, упомянутых выше, конъюгируют с вариантом полипептида, направленным против гаптена (например, антителом к дигоксину). Таким образом, можно осуществить опосредованное конъюгирование метки с вариантом полипептида.
В другом воплощении изобретения вариант антитела не нуждается в мечении, а его присутствие можно детектировать при помощи меченного антитела, которое связывается с вариантом полипептида.
Вариант антитела по настоящему изобретению можно использовать в любом известном способе исследования, таком как исследование конкурентного связывания, прямые и непрямые «сэндвич»-методы и исследование иммунопреципитации. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (1987) pp.147-158, CRC Press, Inc..
111
99
14
131
125
3
32
35
Вариант антитела также можно применять в диагностических исследованиях in vivo. Как правило, вариант полипептида метят радионуклидом (таким как In, Tc, С, I, I, H, P или S) таким образом, что антиген или клетки, экспрессирующие его, можно было локализовать при помощи иммуносцинтиграфии. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в некоторых деталях при помощи иллюстраций и примеров в целях исключения двусмысленного толкования, описания и примеры не должны рассматриваться как исчерпывающие.
Перечень последовательностей:
SEQ ID NO:1
Легкая каппа цепь человека
SEQ ID NO:2
Легкая лямбда цепь человека
SEQ ID NO:3
IgG1 человека (аллотип, характерный для европеоидов)
SEQ ID NO:4
IgG1 человека (аллотип, характерный для афроамериканцев)
SEQ ID NO:5
IgG1 человека с мутацией LALA (аллотип, характерный для европеоидов)
SEQ ID NO:6
IgG4 человека
SEQ ID NO:7
IgG4 человека с мутацией SPLE, который представляет собой пример человеческой последовательности легкой каппа цепи, легкой лямбда цепи, IgG1 и IgG4, который может служить основой для создания вариантов согласно изобретению
В последовательностях No 3-5, представляющих последовательности аллотипов IgG1, область Р329 согласно нумерации EU index по Кабат находится в положении 212,
тогда как в последовательностях No 6 и 7 указанная область Р329 находится в положении 209
SEQ ID NO:8
легкая каппа цепь моноклонального антитела 40A746.2.3
SEQ ID NO:9
тяжелая цепь IgG1 дикого типа моноклонального антитела 40A746.2.3
SEQ ID NO:10
тяжелая цепь IgG1 P329G моноклонального антитела 40A746.2.3
SEQ ID NO:11
тяжелая цепь IgG1 LALA/P329G моноклонального антитела 40A746.2.3
SEQ ID NO:12
тяжелая цепь IgG4 SPLE моноклонального антитела 40A746.2.3
SEQ ID NO:13
тяжелая цепь IgG4 SPLE/P329G моноклонального антитела 40A746.2.3
SEQ ID NO:14 40A746.2.3
тяжелая цепь IgG1 LALA моноклонального антитела
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следующие восемь примеров представляют собой примеры способов и композиций согласно изобретению. Очевидно, что в рамках общего описания, приведенного выше, может существовать множество других воплощений.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в некоторых деталях при помощи иллюстраций и примеров в целях исключения двусмысленного толкования, описания и примеры не должны рассматриваться как исчерпывающие. Описания всех патентов и научных публикаций, процитированные здесь, явным образом полностью включены в данный документ путем ссылок.
Пример 1
Антитела
В описанных ниже экспериментах использовали антитела против CD9 (см. SEQ IDs 8-14), Р-селектина (последовательности описаны в WO 2005/100402) и CD20 (синоним: GA101, последовательности описаны в ЕР 1692182).
Все описанные здесь варианты, например, P329G, Р329А, P329R SPLE, LALA, P329G/LALA, P329G/SPLE варианты антитела к селектину, CD9, CD20 (GA101) и модифицированного с использованием гликоинженерии антитела, связывающего CD20 (GA101) (нумерация в соответствии с номенклатурой EU) были созданы при помощи мутагенеза с использованием ПЦР. Молекулы IgG экспрессировали в системе HEK-EBNA или HEK293 (Fc варианты антитела к CD9) и очищали при помощи белка А и эксклюзионной хроматографии.
Пример 2
Определение аффиности связывания различных Fcγ рецепторов с иммуноглобулинами
Аффинность связывания различных FcγR с иммуноглобулинами определяли при помощи поверхностного плазменного резонанса (SPR) с применением биосенсора Biacore T100 (GE Healthcare) при 25°С.
a
d
D
Система BIAcore хорошо адаптирована для исследования молекулярных взаимодействий. Она позволяет непрерывно регистрировать связывание лиганд/аналит в реальном времени и, таким образом, определять константу скорости ассоциации (k), константу скорости диссоциации (k) и константу равновесия (K). Изменения показателя преломления указывают на изменение массы на поверхности, вызванное взаимодействием иммобилизованного лиганда с аналитом в инжектируемом растворе. Если молекулы связываются с иммобилизованными лигандами на поверхности, масса увеличивается, в случае диссоциации масса уменьшается.
При взаимодействии 1:1 результаты не должны различаться при инжектировании связывающейся молекулы на поверхность или при ее иммобилизации на поверхности. Поэтому использовали различные условия экспериментов (с применением Fcγ рецептора в качестве лиганда и аналита, соответственно), в зависимости от растворимости и доступности лиганда или соответствующего аналита.
В случае FcγRI на поверхности чипа СМ5 иммобилизовали захватывающее антитело, распознающее полигистидиновую последовательность (моноклональное антитело pentaHis, Qiagen Hilden, кат. номер 34660) при рН 4,5 до достижения сигнала 10000 резонансных единиц (RU) с применением набора, обеспечивающего связывание по аминогруппе, поставляемого GE Healthcare. Захват FcγRI проводили при концентрации 5 мкг/мл при скорости 5 мкл/мин в течение 60 с. Для регистрации фазы ассоциации через проточные ячейки пропускали антитела в различных концентрациях от 0 до 100 нМ при скорости потока 30 мкл/мин при 298 K в течение 120 с. Фазу диссоциации регистрировали в течение 240 с и запускали путем замены раствора образца на проточный буфер. Регенерацию поверхности проводили при помощи отмывки в течение 2 мин раствором глицина, рН 2 при скорости потока 30 мкл/мин. Во всех экспериментах использовали буфер HBS-P+, поставляемый GE Healthcare (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% (об/об) Сурфактант Р20). Найденное изменение показателя преломления корректировали путем вычитания сигнала, полученного без иммобилизации FcγRI. Также вычитали сигнал, полученный при инжектировании холостой пробы (= двойной контроль).
D
a
d
Равновесную константу диссоциации (K), рассчитываемую как k/k, определяли путем анализа кривых сенсограмм, полученных для нескольких различных концентраций, с помощью пакета программ BIAevaluation. Аппроксимацию данных выполняли с использованием подходящей модели связывания.
В случае FcγRIIA и FcγRIIIAV158 на поверхности чипа СМ5 иммобилизовали исследуемое моноклональное антитело до достижения сигнала 10000 резонансных единиц (RU) с применением набора, обеспечивающего связывание по аминогруппе, поставляемого GE (рН 4,5 при концентрации 10 мкг/мл).
Для регистрации фазы ассоциации через проточные ячейки пропускали FcγRIIA и IIIA в различных концентрациях, варьирующих от 0 до 12800 нМ, при скорости потока 5 мкл/мин при 298 K в течение 120 с.Фазу диссоциации регистрировали в течение 240 с и запускали путем замены раствора образца на проточный буфер. Регенерацию поверхности проводили при помощи отмывки в течение 0,5 мин раствором 3 мМ NaOH/1M NaCl при скорости потока 30 мкл/мин. Во всех экспериментах использовали буфер HBS-P+, поставляемый GE Healthcare (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% (об/об) сурфактант Р20).
Найденное изменение показателя преломления корректировали путем вычитания сигнала, полученного без иммобилизации антитела. Также вычитали сигнал, полученный при инжектировании холостой пробы (= двойной контроль).
D
Равновесную константу диссоциации (K) определяли путем анализа кривых сенсограмм, полученных для нескольких различных концентраций, с помощью пакета программ BIAevaluation. Аппроксимацию данных проводили с использованием подходящей модели связывания, выполняя аппроксимацию после установления состояния равновесия.
В случае FcγRIIB на поверхности чипа СМ5 иммобилизовали захватывающее антитело, распознающее полигистидиновую последовательность (моноклональное антитело pentaHis, Qiagen Hilden, кат. номер 34660) при рН 4,5 до достижения сигнала 10000 резонансных единиц (RU) с применением набора, обеспечивающего связывание по аминогруппе, поставляемого GE Healthcare. Захват FcγRIIB проводили при концентрации 5 мкг/мл при скорости 5 мкл/мин в течение 120 с. Для регистрации фазы ассоциации через проточные ячейки пропускали различные антитела в концентрации от 1340 нМ при скорости потока 5 мкл/мин при 298 K в течение 60 с.Фазу диссоциации регистрировали в течение 120 с и запускали путем замены раствора образца на проточный буфер. Регенерацию поверхности проводили при помощи отмывки в течение 0,5 мин раствором глицина, рН 2,5 при скорости потока 30 мкл/мин. Во всех экспериментах использовали буфер HBS-P+, поставляемый GE Healthcare (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% (об/об) Сурфактант Р20).
Найденное изменение показателя преломления корректировали путем вычитания сигнала, полученного без иммобилизации FcγRIIB. Также вычитали сигнал, полученный при инжектировании холостой пробы (= двойной контроль).
Из-за очень низкой аффинности к IgG1 дикого типа, свойственной FcγRIIB, проводили качественную оценку связывания без рассчета аффинности.
В следующих ниже таблицах представлено влияние мутаций в Fc части на связывание с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и FcγRIIIAV1-58 (А), а также влияние на ADCC (определенное в отсутствие (BLT) и в присутствии клеток-мишеней (ADCC)) и на связывание C1q (Б).
Таблица 2А
FcγRI
FcγRIIaR131
FcγRIIIAV158
FcγRIIB
WT IgG1
++ (5 нМ)
++ (2 мкМ)
+ (0,7 мкМ)
++
IgG4 SPLE
-
+/- (10 мкМ)
- (>20 мкМ)
+
IgG1 P329G
++ (6 нМ)
- (>20 мкМ)
- (>20 мкМ)
-
IgG1 Р329А гликоинж.
++ (8 нМ)
+ (4,4 мкМ)
+ (1,8 мкМ)
+
IgG1 P329G LALA
-
- (>20 мкМ)
- (>20 мкМ)
-
IgG1 P329G гликоинж.
++ (10 нМ)
- (>20 мкМ)
- (>10 мкМ)
-
*++ для гликоинж. IgG1
30 нМ
Таблица 2Б
Мутация
FcγRI
FcγRII
FcγRIII
C1q
ADCC без клеток-мишеней
ADCC с клетками-мишенями
Исследование
Biacore
Biacore
Biacore
CDC
C1q
BLT
ADCC
P329G
+
-
-
-
-
--
--
P329R
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
--
--
LALA
-
n.d.
-
-
n.d.
n.d.
--
IgG1_P329G/LALA
--
--
--
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
IgG4_SPLE
--
-
--
--
--
n.d.
n.d.
-- значительное снижение/неактивное в отличие от дикого типа,
- снижение в отличие от дикого типа,
+ сопоставимо с взаимодействием, характерным для дикого типа,
n.d. не определяли/нет результатов
Полученные результаты более подробно описаны ниже.
Аффинность к рецептору FcγRI
Мутации P329G, Р329А, SPLE и LALA были введены в Fc полипептид антител к P-селектину, CD20 и CD9, а аффинность связывания с FcγRI определяли с применением биосенсора Biacore. Тогда как антитело с мутацией P329G по-прежнему связывалось с FcγRI (Фиг.1а и 1б), введение тройной мутации P329G/LALA и P329G/SPLE, соответственно, приводило к получению антител, у которых связывание практически не определялось (Фиг.1б). Мутации LALA или SPLE снижали связывание с рецептором больше, чем P329G в отдельности, но меньше, чем в комбинации с P329G (Фиг.1а и 1б). Таким образом, комбинация P329G с какой-либо из мутаций LALA или SPLE являлась более эффективной, чем мутация P329G или двойная мутация LALA или SPLE сама по себе. Значение kd для IgG1 антитела дикого типа к CD20 составило 4,6 нМ, а для мутанта P329G того же антитела - 5,7 нМ, но для тройного мутанта P329G/LALA значение kd было невозможно определить вследствие того, что связывание антитела с рецептором FcγRI практически не определялось. Само антитело оказывало незначительный эффект на аффинность связывания, т.е. независимо от того, исследовали ли антитело к CD9 или к CD20 или к Р-селектину.
Аффинность к рецептору FcγRIIA
Мутации P329G, SPLE и LALA, соответственно, были введены в Fc полипептид антитела к CD9, а аффинность связывания с рецептором FcγRIIA-R131 определяли с применением биосенсора Biacore. Уровень связывания нормализовали таким образом, чтобы сигнал при иммобилизации моноклонального антитела составлял 100 RU. Таким образом, при стехиометрии 1:1 сигнал не должен превышать приблизительно 20 RU. На Фиг.1в показано, что связывание с рецептором FcγRIIA значительно понижается при введении в Fc вариант мутаций LALA, SPLE/P329G, P329G и LALA/P329G. В отличие от связывания с рецептором FcγRI, введение только одной мутации P329G приводило к очень выраженному блокированию связывания с указанным рецептором, более или менее подобно влиянию тройной мутации P329G/LALA (Фиг.1в).
Аффинность к рецептору FcγRIIB
Мутации SPLE, LALA, SPLE/P329G и LALA/P329G соответственно, были введены в Fc полипептид антител к CD9 и Р-селектину, а аффинность связывания с рецептором FcγRIIB определяли с применением биосенсора Biacore. На Фиг.1г показано, что связывание с рецептором FcγRIIB значительно понижается при наличии мутации LALA и тройных мутаций P329G/LALA, P329G/SPLE.
Аффинность к рецептору FcγRIIIA
Мутации P329G,LALA, SPLE, P329G/LALA и SPLE/P329G были введены в Fc полипептид антитела к CD9, а аффинность связывания с рецептором FcγRIIIA-V158 определяли с применением биосенсора Biacore. Мутация P329G и тройная мутация P329G/LALA снижали связывание с рецептором FcγRIIIA наиболее выражение, практически до недетектируемого уровня. Мутация P329G/SPLE также приводила к значительному снижению аффинности связывания, мутации SPLE и LALA, соответственно, только незначительно понижали аффинность связывания с рецептором FcγRIIIA (Фиг.1д).
Пример 3
Иммуноферментное исследование связывания C1q
50
50
Способность связывать C1q различных полипептидов, содержащих Fc варианты, исследовали при помощи иммуноферментного анализа типа «сэндвич». Каждый вариант иммобилизовали на поверхности гидрофобных 96-луночных планшетов Maxisorp в 8 концентрациях в диапазоне от 10 мкг/мл до 0 мкг/мл. Такая иммобилизация способствовала образованию комплексов антител, что было необходимым для высокоаффинного связывания молекулы C1q. После отмывания проводили инкубацию образцов, чтобы обеспечить возможное связывание C1q. После следующего отмывания использовали поликлональное кроличье антитело к hC1q, позволяющее детектировать связанные молекулы C1q. После следующего этапа отмывания добавляли конъюгированное с ферментом антитело, специфическое к Fcγ кролика. Для визуализации иммунологической реакции добавляли субстрат, который конвертировался в окрашенный продукт под действием фермента. Полученная оптическая плотность, измеряемая фотометрически, была пропорциональна количеству C1q, связанного с исследуемым антителом. Рассчитывали значения ЕС для взаимодействия между вариантом и C1q. Строили зависимость значений оптической плотности, полученных в результате цветной реакции, от концентраций антитела. Концентрация антитела, при которой наблюдался ответ, составляющий половину от максимального, соответствовала значению ЕС. Этот показатель представляли в сравнении с референтным стандартом, находящимся на том же планшете, с указанием коэффициента вариации для образца и стандарта.
Мутация P329G, введенная в антитело к Р-селектину или к CD20, значительно снижала связывание с C1q, аналогично мутации SPLE (Фиг.2). В Таблице 3 представлены значения ЕС 50, рассчитанные для связывания вариантов с C1q. C1q принадлежит к белкам, активирующим систему комплемента, и играет важную роль в активации классического пути комплемента, который приводит к образованию мембрано-атакующего комплекса. C1q также принимает участие в других иммунологических процессах, таких как усиление фагоцитоза, удаление апоптотических клеток или нейтрализация вирусов. Таким образом, можно предполагать, что мутации, у которых здесь была показана способность снижать связывание с C1q, например, P329G и SPLE, а также по всей вероятности тройные мутации, содержащие вышеупомянутые одиночные мутации, будут значительно ослаблять вышеуказанные функции C1q.
Таблица 3
Антитело
Значение ЕС50
IgG1 к Р-селектину, дикий тип
1,8
GA101 IgG1, дикий тип
2,4
IgG1 к Р-селектину, P329G
2,7
IgG4 к Р-селектину, SPLE
3,0
GA101 IgG1 P329G
5,5
GA101 IgG4 SPLE
>10
Пример 4
ADCC в отсутствие клеток-мишеней, тест с BLT
Тестируемые антитела (к CD20 (GA101) и CD9), находящиеся в фосфатно-солевом буфере, иммобилизовали в течение ночи на подходящих 96-луночных плоскодонных планшетах при 4°С. После отмывания планшетов фосфатно-солевым буфером свободные сайты связывания блокировали раствором 1% БСА в фосфатно-солевом буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. В это время собирали эффекторные клетки (линия клеток NK-92, трансфецированных с целью экспрессии низко- или высокоаффинных FcγRIII человека) и после удаления блокирующего буфера высаживали в лунки по 200000 живых клеток на лунку в объеме 100 мкл/лунку в среде AIM V. Для определения максимального высвобождения эстеразы эффекторными клетками использовали сапониновый буфер по 100 мкл/лунку (0,5% сапонин + 1% БСА в PBS). Клетки инкубировали в течение 3 ч в инкубаторе при 37°С, 5% CO2. Спустя 3 ч, смешивали по 20 мкл/лунку супернатанта и 180 мкл/лунку субстрата BLT (0,2 мМ BLT + 0,11 мМ DTNB в 0,1 М Tris-HCL, pH 8,0) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С перед считыванием данных при 405 нм с помощью планшетного ридера. Высвобождение эстеразы в процентах определяли, принимая максимальное высвобождение (клетки, обработанные сапонином) за 100%, а высвобождение нестимулированными клетками (без иммобилизации антитела) за 0%.
Антитело дикого типа к CD20 (GA101 wt (1)) демонстрировало выраженную индукцию цитолитической активности. Вариант LALA демонстрировал значительно сниженное высвобождение эстеразы, тогда как варианты P329G и P329G/LALA не демонстрировали какой-либо ADCC активности (Фиг.3а). На Фиг.3б показано, что не только замена G в положении Р329 приводит к выраженному снижению цитоплазматической активности, но и замена Р329 на R329 (антитело к CD20). Таким образом, аргинин по-видимому нарушает функционирование «пролинового сэндвича» антитела, аналогично глицину. Значительное снижение ADCC, наблюдавшееся здесь при мутации P329G, вероятнее всего было следствием значительного снижения связывания с рецепторами FcγRIIA и FcγRIIIA (см. Фиг.1в и Фиг.1д).
Пример 5
ADCC в присутствии клеток-мишеней
max
max
В качестве эффекторных клеток использовали мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), которые выделяли с помощью Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA), по существу следуя инструкциям производителя. Вкратце, у добровольцев брали венозную кровь с помощью шприцов с гепарином. Кровь разводили 1:0,75-1,3 фосфатно-солевым буфером (не содержащим Са++ или Mg++) и наслаивали на Histopaque-1077. Центрифугирование в градиенте плотности проводили при 400×g в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) без торможения. Собирали РВМС, находящиеся в интерфазе, и отмывали PBS (по 50 мл на количество клеток, полученное из двух градиентов) и осаждали центрифугированием при 300×g в течение 10 мин при комнатной температуре. После ресуспендирования осадка в PBS, подсчитывали РВМС и отмывали второй раз при центрифугировании при 200×g в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки ресуспендировали в соответствующей среде для последующих манипуляций. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней при исследовании ADCC составляло 25:1, а РВМС и NK-клеток - 10:1, соответственно. Эффекторные клетки подготавливали в среде AIM-V в соответствующей концентрации, для внесения в круглодонные 96-луночные планшеты по 50 мкл на лунку. Клетки-мишени представляли собой В-клетки лимфомы человека (например, клетки Raji), которые выращивали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки-мишени отмывали PBS, подсчитывали и ресуспендировали в среде AIM-V при концентрации 0,3 млн на мл, для добавления по 30000 клеток в 100 мкл на лунку. Антитела разводили в среде AIM-V, добавляли по 50 мкл к предварительно внесенным клеткам-мишеням и давали возможность связаться с мишенями в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого добавляли Эффекторные клетки и планшеты оставляли инкубироваться в течение 4 часов при 37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% CO2. Гибель клеток-мишеней оценивали путем измерения высвобождения лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) из поврежденных клеток при помощи набора Cytotoxicity Detection kit (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland). После 4-часовой инкубации планшеты центрифугировали при 800×g. По 100 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в новый прозрачный плоскодонный 96-луночный планшет. В лунки добавляли по 100 мкл раствора цветного реагента из набора. Определяли показатели V цветной реакции при помощи планшетного ридера при 490 нм по меньшей мере через 10 мин с приенением программы SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Спонтанное высвобождение ЛДГ определяли в лунких, содержащих только клетки-мишени и эффекторные клетки, но не содержащие антител. Максимальное высвобождение определяли в лунках, содержащих только клетки-мишени и 1% Triton X-100. Специфический антитело-опосредованный киллинг в процентах определяли по формуле: ((x-SR)/(MR-SR)*100, где x обозначает среднее значение Vmax при определенной концентрации антитела, SR обозначает среднее значение Vmax при спонтанном высвобождении, a MR обозначает среднее значение V при максимальном высвобождении.
При классическом определении ADCC способность мобилизовать эффекторные клетки иммунной системы зависит от типа Fc варианта. Здесь в качестве эффекторных клеток использовали линию клеток человека NK92, трансфецированных FcgRIIIA человека, а в качестве клеток-мишеней использовали CD20-положительные клетки Raji. Как показано на Фиг.4а, ADCC значительно понижена у Fc-вариантов GA101 (анти-CD20), у которых пролин замещен на глицин (P329G), а также в аналогичной степени у имеющих двойную мутацию P329G/LALA. Напротив, снижение ADCC было менее выраженным при наличии мутации LALA. Для того, чтобы лучше провести различие между разными вариантами, также были получены модифицированные с помощью гликоинженерии версии вариантов, проявляющие усиленную ADCC активность. Можно отметить, что, как и ожидалось, родительская молекула (GA101 (анти-CD20)) характеризуется выраженной ADCC. Версия LALA характеризуется значительным снижением ADCC активности. Мутация P329G очень существенно понижает ADCC; гораздо более выражение, чем вариант Р329А антитела GA101 (анти-CD20) (Фиг.4б).
Пример 6
Активность комплемента
Клетки-мишени подсчитывали, отмывали PBS, ресуспендировали в среде AIM-V (Invitrogen) в концентрации 1 млн/мл. Клетки высевали в плоскодонные 96-луночные планшеты в количестве 50 мкл на лунку. Антитела разводили в среде AIM-V и добавляли к клеткам по 50 мкл. Антитела оставляли при комнатной температуре в течение 10 мин для связывания с клетками. Комплемент из сыворотки крови человека (Quidel) размораживали перед экспериментом, разводили в 3 раза в среде AIM-V и добавляли в лунки по 50 мкл. Комплемент кролика (Cedarlane Laboratories) подготавливали в соответствии с интрукциями производителя, разводили в 3 раза в среде AIM-V и добавляли в лунки по 50 мкл. В качестве контроля использовали комплемент, инактивированный нагреванием в течение 30 мин при 56°С перед использованием в эксперименте. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Гибель клеток оценивали по высвобождению ЛДГ. Вкратце, планшеты центрифугировали при 300×g в течение 3 мин. По 50 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в новый 96-луночный планшет и добавляли по 50 мкл реагента из набора Cytotoxicity Kit (Roche). Кинетическое определение при помощи ридера для ИФА позволило определить значение Vmax, соответствующее концентрации ЛДГ в супернатанте. Максимальное высвобождение определяли при инкубации клеток в присутствии 1% Triton X-100.
У различных Fc вариантов исследовали способность опосредовать CDC с применением клеток-мишеней SUDH-L4. Молекула GA101, не подвергавшаяся модификации с помощью гликоинженерии, четко демонстрировала способность индуцировать CDC. Вариант LALA проявлял активность только в максимальной концентрации, тогда как варианты P329G и P329G/LALA не проявляли какой-либо CDC активности (Фиг.5а). Кроме того, вариант LALA, также как и варианты P329G и Р329А молекулы GA101, подвергшейся модификации с помощью гликоинженерии, не проявляли какой-либо CDC активности (Фиг.5б).
Пример 7
Углеводный профиль IgG1 человека
Углеводные профили IgG1 антител человека, имеющие мутации в составе Fc, введенные с целью устранения связывания с Fcγ рецепторами, анализировали при помощи масс-спектрометрии MALDI/TOF-MS в режиме положительных ионов (нейтральные олигосахариды).
Варианты IgG1 человека (h) обрабатывали сиалидазой (QA-Bio) в соответствии с инструкциями производителя для удаления концевых остатков сиаловой кислоты. Затем отщепляли нейтральные олигосахариды hIgG1 при помощи пептид-N-гликозидазы F (QA-Bio), как было описано ранее (Ferrara, С.et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861). Углеводные профили анализировали при помощи масс-спектрометрии (Autoflex, Bruker Daltonics GmbH) в режиме положительных ионов, как было описано ранее (Ferrara, С. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861).
Углеводный профиль нейтральных гликанов, ассоциированных с Fc фрагментом IgG1 человека, характеризуется наличием трех основных пиков m/z, которые можно приписать фукозилированному сложному олигосахариду, не имеющему (G0), имеющему один (G1) или два (G2) концевых остатка галактозы.
Углеводные профили hIgG1, имеющих мутации в составе Fc, введенные с целью устранения связывания с Fc рецепторами, анализировали и сравнивали с теми, которые были получены для антитела дикого типа. Варианты IgG, содержащие одну из мутаций в составе Fc (P329G, LALA, P329A, P329G/LALA), обладали углеводными профилями, схожими с антителом дикого типа, где ассоциированные с Fc гликаны представляли собой сложные фукозилированные олигосахариды (данные не приведены). Мутации в составе Fc могут влиять на степень галактозилирования и сиалирования концевых остатков, как было показано при заменах аминокислот в положениях 241, 243, 263, 265 или 301 на аланин (Lund, J. et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969).
На Фиг.6а показана относительная степень галактозилирования, выраженная в процентах, для различных Fc-вариантов hIgG1, описанных здесь. При экспрессии антител в различных хозяевах наблюдались небольшие вариации, однако существенных различий в галактозилировании концевых остатков не наблюдалось.
На Фиг.6б показаны изменения в содержании галактозы для 4 различных антител дикого типа и IgG1-P329G/LALA, у которых сравнивали степень галактозилирования четырех различных V-доменов при экспрессии в клетках Hek293 EBNA.
Пример 8
Исследование антитело-индуцированной агрегации тромбоцитов в цельной крови
Агрегацию тромбоцитов человека в цельной крови исследовали с помощью прибора Multiplate компании Dynabyte. Вначале брали 20 мл крови нормальных доноров и переносили в проирки, содержащие гирудин (Dynabyte Medical, #МР0601). Использовали миникюветы для исследования импедансным методом (Dynabead #MP0021) на приборе Multiplate. В миникюветы добавляли 175 мкл 0,9% NaCl. В миникюветы добавляли антитело до получения конечной концентрации. Затем добавляли 175 мкл крови чловека и инкубировали 3 мин при 37°С. Регистрация импеданса начиналась автоматически и продолжалась 6 мин при 37°С. Для анализа данных определяли площадь под кривой как показатель агрегации тромбоцитов.
Было показано что антитело к CD9 индуцирует активацию и агрегацию тромбоцитов (Worthington, et al., Br. J. Hematol. 74(2) (1990) 216-222). Ранее было показано, что агрегация тромбоцитов, индуцированная связыванием антител с тромбоцитами, опосредована связыванием с FcγRIIA (de Reys, et al., Blood 81 (1993) 1792-1800). Как было показано выше, мутации LALA, P329G, P329G/LALA и P329G/SPLE, введенные в антитело к CD9, значительно снижают связывание антитела к CD9 с рецептором FcγRIIA (Фиг.1в).
Активация (характеризуемая притоком Са, данные не приведены), а также агрегация тромбоцитов, индуцированная антителом к CD9, устранялась при введении тройной мутации P329G и LALA в антитело, что сопровождалось значительным снижением связывания с FcγRIIA по сравнению с антителом дикого типа (см. Фиг.7а и 7б). IgG1 мыши индуцировал агрегацию тромбоцитов при низких концентрациях антитела (0,1-1 мкг/мл). При более высоких концентрациях гиперактивация тромбоцитов приводила к ослаблению агрегационного ответа (3-30 мкг/мл). В случае chim-hu-lgG4-SPLE результаты варьировали у разных доноров. На Фиг.6а приведены данные для донора, у которого наблюдался ответ на chim-hu-IgG4-SPLE при более высоких концентрациях антитела, а на Фиг.6б приведены данные для донора, у которого не наблюдался ответ на chim-hu-IgG4-SPLE. Ни в одном из образцов крови не наблюдался агрегационный ответ на варианты антитела chim-hu-IgG1-LALA, chim-hu-IgG-WT-P329G, chim-hu-IgG1-LALA-P329G, chim-hu-IgG4-SPLE-P329G, chim-hu-IgG4-SPLE-N297Q. Контроль: спонтанная агрегация в необработанном образце крови (фон); агрегация тромбоцитов, индуцировнная АДФ и аналогом тромбина (TRAP6). Изотипический контроль: IgG1 мыши (изотипический контроль для мышиного антитела) и IgG4-SPLE человека (изотипический контроль hu-IgG4-SPLE).
Одно из возможных объяснений полученных данных состоит в том, что в основе снижения агрегации тромбоцитов, наблюдавшегося для этого типа мутантных антител, лежит сниженное связывание антитела к CD9, имеющего тройную мутацию, с рецептором FcγRIIA. По существу, предупреждение агрегации тромбоцитов, как токсического побочного эффекта при лечении антителами, может оказаться возможным при введении в Fc область антитела указанных выше мутаций, способных понижать связывание с рецептором FcγRIIA.