Обновление клеточного состава костного мозга тrр53-/-/р16lnk4a-/-/p19Arf-/гемопоэтическими клетками-предшественницами

И I II II

ш

Новости клеточных технологий

в дорсальном отделе полосатого тела. Кроме того, введенные нейроны экспрессировали также Еп1, УМАТ2 и транспортер дофамина.

При стимуляции амфетамином движения мышей контрольной группы характеризовались вращением и уклоном в сторону, соответствующую стороне среднего мозга, в которой была нарушена функция дофаминовых нейронов посредством инъекции 6-гидроксидофамина. У большинства животных, перенесших трансплантацию iPS-полученных нейронов, наблюдалось восстановление нормального характера движений.

Исследователи показали экспрессию Ю-67 - маркера пролиферации - в области введения клеток, связывая этот факт с пролиферационной активностью трансплантированной культуры, а также выявили «тератомы», источником которых, по мнению авторов, являлись немногочисленные недифференцированные 55ЕА1-положительные клетки, содержащиеся в культуре трансплантируемых нейронов.

Наиболее вероятно, что присутствие недифференцированных клеток было связано с недостаточной индукцией диф-ференцировки части iPS клеток по линии нейронов. С целью предупреждения формирования опухолей, исследователи в последующем проводили селекцию 55ЕА1-позитивных элементов из высокоспециализированной культуры с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортинга, что предотвращало образование «тератом».

Таким образом, исследователи продемонстрировали возможность применения высокоспециализированных аутогенных клеток, полученных с использованием явления репрограммирования, в целях устранения дегенеративнодистрофической патологии ЦНС. В целом, этот подход является перспективным путем решения проблемы поиска клеточного материала, предназначенного для трансплантации, при условии воспроизводимости экспериментальных результатов.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Freed C.R., Greene P.E., Breeze R.E. et al. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 710-19.

2. Lim J., Byeon Y., Ryu H. Transplantation of canine umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced spinal cord injured dogs. J. Vet. Sci. 2007; 8(3): 275-82.

3. Jawad H., Ali N.N., Lyon A.R. et al. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2007; 1(5): 327-42.

4. Wernig M., Zhao J., Pruszak J. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. PNAS 2008; 105(15): 5856-61.

5. Wernig M., Meissner A., Foreman R. et. al. In vitro reprogramming of

fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007; 448(7151): 260-2.

6. Takahashi K., Yamanaka S., Tanabe K. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 2007; 131 (5): 861-72.

7. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663-76.

8. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448(7151): 313-7.

9. Yu J., Vodyanik M.A., Thomson J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318(5858): 1917-20.

10. Hanna J., Wernig M., Markoulaki S. et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 2007; 318: 1920-23.

Подготовил И.Я. Бозо

По материалам Wernig M., Zhao J., Pruszak J. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. PNAS 2008; 105(15): 5856-61

Обновление клеточного состава костного мозга Trp53-/-/p16Ink4a-/-/p19Arf-/- гемопоэтическими клетками-предшественницами

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - резиденты костного мозга, дающие начало гемопоэтическим мультипо-тентным клеткам-предшественницам [1]. В отличие от ГСК, мультипотентные клетки-предшественницы не обладают способностью к длительному самообновлению популяции, и после определенного числа делений их пролиферация прекращается [2]. Молекулярные механизмы, отвечающие за этот процесс, ясны не до конца [3], однако известна система из четырех генов, которая регулирует самообновление ГСК и ограничивает пролиферацию их производных. Это, прежде всего, ген ВтМ [4, 5], необходимый для самообновления популяции ГСК. ВтМ является негативным регулятором двух генов-репрессоров самообновления - Тгр53 и Cdkn2a, последний из которых имеет две альтернативные рамки считывания: р161пк4а, р19АГ: и, соответственно, два белковых продукта со сходными функциями [6]. Эти гены функционируют не только в ГСК и клетках гемопоэтического ряда. Например, для нейрональных клеток-предшественниц с дефицитом экспрессии ВтМ было показано, что их активная пролиферация

и самообновление частично восстанавливаются при искусственной супрессии р161пк4а-/- и р19Аг^/- [7].

Исследователи из группы 0.0. Ака1а и соавт. предположили, что разные нарушения экспрессии указанных генов могут быть причиной возникновения онкологических заболеваний, при которых наблюдается неограниченная пролиферация клеток-предшественниц гемопоэтического ряда и их потомков. Для проверки этого предположения были проанализированы эффекты одновременной делеции локусов Тгр53, р161пк4а и р19Аг: а также делеций каждого из ло-кусов по отдельности на способность ГСК и мультипотентных гемопоэтических клеток-предшественниц к обновлению костного мозга реципиентов, подвергшихся радиоактивному излучению в летальных дозах.

В клеточном составе костного мозга, периферической крови, печени и селезенки всех мутантов не было выявлено каких-либо отличий в сравнении с интактными животными. То есть делеции Тгр53, р161пк4а и р19Аг: не влияют на дифференцировку ГСК и не подавляют ни один из ростков

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

тттт

Новости клеточных технологий

гемопоэза. Однако при трансплантации костного мозга мутантных животных мышам-реципиентам, подвергшимся летальной дозе радиоактивного излучения, были получены весьма любопытные результаты. В сравнении с костным мозгом мышей дикого типа, трансплантация которого служила в качестве контроля, восстановление гемопоэза в случае трансплантации костного мозга Тгр53-/-/р161пк4а-/-/ р19А|:-/- животных происходило по крайней мере в 10 раз быстрее. В то же время восстановление гемопоэза при трансплантации костного мозга от животных, мутантных по одному или двум из этих локусов имела весьма незначительные отличия от контроля, но также была несколько выше.

Исследователи задались вопросом, какие именно клетки костного мозга отвечают за обновление пула кроветворных клеток. Поскольку в костном мозге мутантных (Тгр53-/-/ р161пк4а-/-/р'19Аг:-/-) животных не было отмечено резкого увеличения числа ГСК, 0.0. Ака1а и соавт. предположили, что некая популяция более дифференцированных клеток приобретает свойства стволовых. Чтобы проверить это,

летально облученным реципиентам были проведены отдельные трансплантации либо ГСК (клетки с фенотипом CD'l50+/Sca-1+/c-kit+/CD48-/Lin-), либо мультипотентных гемопоэтических предшественников (клетки с фенотипом CD'50-/Sca-'+/c-kit+/CD48-/Lin-) от мутантных по всем трем генам животных. Индикатором долговременного восстановления костного мозга служили показатели количеств лимфоцитов, гранулоцитов и моноцитов [1]. Как ГСК, так и Trp53-/-/p'6Ink4a-/-/p'9Arf-/- мультипотентные гемо-поэтические клетки-предшественницы обеспечивали длительное функционирование костного мозга облученных реципиентов, сохраняясь в их организме до '2 мес. В случае трансплантации ГСК и мультипотентных клеток-предше-ственниц дикого типа длительное восстановление функций костного мозга осуществлялась только ГСК.

Чтобы определить причину, по которой происходило увеличение времени жизни гемопоэтических клеток-предше-ственниц в случае делеции по трем локусам, было проведено три серии экспериментов in vitro, в которых были определены

Деплеция 1пк4а/А^ и Тгр53 снимает ограничения, лимитирующие самообновление у мультипотентных гемопоэтических клеток-предшественниц (МГКП), но не у миелоидных клеток-предшественниц (МКП). ВтИ эпигенетически репрессирует 1пк4а/АМ: и Тгр53, что необходимо для самообновления ГСК. Недостаточная активность ВтИ у МГКП и МКП лимитирует самообновление данных популяций клеток. V клеток с тройной мутацией деплеция локусов 1пк4а/АН: и Тгр53 снимает ограничения на самообновление у МГКП, но не у МПК, что свидетельствует о наличии дополнительных механизмов, ограничивающих самообновление МПК

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

I I I I I

Ш

Новости клеточных технологий

уровни пролиферации и клоногенный потенциал мутантных мультипотентных клеток-предшественниц в сравнении с ГСК. Уровень пролиферации мутантных клеток-предше-ственниц и ГСК несущественно отличался от уровней пролиферации клеток дикого типа, в то время как в случае тройной мутации заметно снижалось число апоптотических клеток, что было показано окрашиванием аннексином-У. Способность же формировать гемопоэтические колонии у мутантных клеток была существенно повышена в сравнении с клетками дикого типа. Было дополнительно показано, что мутантные Sca-1+/c-kit+/CD150-/CD48-/Lin- клетки способны отвечать на стимуляцию Flt-3-лигандом. Это доказывает, что в связи с мутацией они не приобретают свойств ГСК, которые не способны реагировать на Flt-3-лиганд.

Мутация Тгр53-/-/р'61пк4а-/-/р'9Аг:-/- не приводит к приобретению другими, более дифференцированными клетками способности к длительному восстановлению костного мозга. Авторы показали это, трансплантируя облученным реципиентам мутантные клетки-предшественницы ми-елоидного либо гранулоцитарно-макрофагального ряда.

Возможно, иерархическая система клеток-предше-ственниц разных уровней дифференцировки возникла в эволюции как защита от накопления пролиферирующими популяциями клеток онкогенных мутаций. Действительно, утрата генов, отвечающих за подавление самообновления популяции ГСК, приводила к восстановлению этого свойства у их потомства. Однако более дифференцированные клетки с такой же мутацией все равно имели ограниченный срок жизни, не приобретая онкогенного потенциала. Это свидетельствует о том, что существуют другие генетические пути озлокачествления как гемопоэтических, так и прочих камбиальных клеток тканей организма. Результаты этой работы весьма интересны и объясняют, по какой причине при развитии некоторых онкологических заболеваний нарушается экспрессия генов Тгр53 и Cdkn2a [8-11]. Авторы считают, что они могут быть использованы в разработке генной терапии онкозаболеваний. В то же время, требуются дальнейшие исследования в данном направлении, так как полная картина генетического контроля свойств ГСК и их потомства остается неясной.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Morrison S.J., Weissman I.L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity 1994; 1: 661-73.

2. Clarke M.F., Fuller M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell 2006; 124: 1111-5.

3. Morrison S.J. A genetic determinant that specifically regulates the frequency of hematopoietic stem cells. J. Immunol. 2002; 168: 635-42.

4. Park I., Qian D., Kiel M. et al. Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells. Nature 2003; 423: 302-5.

5. Jacobs J.J., Kieboom K., Marino S. et. al. The oncogene and Polycomb-group gene bmi-1 regulates cell proliferation and senescence through the ink4a locus. Nature 1999; 397: 164-8.

6. Molofsky A., Pardal R., Iwashita T. et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell selfrenewal from progenitor proliferation. Nature 2003; 425: 962-7.

7. Molofsky A.V., He S., Bydon M. et. al. Bmi-1 promotes neural stem cell

self-renewal and neural development but not mouse growth and survival by repressing the p16Ink4a and p19Arf senescence pathways. Genes Dev. 2005; 19: 1432-7.

8. Berggren P., Kumar R., Sakano S. et al. Detecting homozygous deletions in the CDKN2A(p16INK4a)/ARF(p14ARF) gene in urinary bladder cancer using real-time quantitative PCR. Clin. Cancer Res. 2003; 9: 235-42.

9. Esteller M., Guo M., Moreno V. et al. Hypermethylation-associated inactivation of p14ARF is independent of p16INK4a methylation and p53 mutational status. Cancer Res. 2000; 60: 129-33.

10. Weber A., Bellmann U., Bootz F. et. al. INK4a-ARF alterations and p53 mutations in primary and consecutive squamous cell carcinoma of the head and neck. Virchows Arch. 2002; 441: 133-42.

11. Burke L., Flieder D., Guinee D. et al. Prognostic implications of molecular and immunohistochemical profiles of the Rb and p53 cell cycle regulatory pathways in primary non-small cell lung carcinoma. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 232-41.

Подготовила A.C. Григорян

По материалам: Akala O.O., Park I.-K, Qian D. et al. Long-term haematopoietic reconstitution by Trp53-/-/p16Ink4a-/-/p19Art/~ multipotent progenitors. Nature 2008; 453(7192): 228-32

uPA и uPAR опосредуют тропизм стволовых клеток к злокачественным новообразованиям

Детализация механизмов, контролирующих процессы миграции клеток-предшественниц в организме, является важной теоретической предпосылкой для успешного применения клеточных технологий в медицине. Установлено, что как мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (MMCK), так и гемопоэтические стволовые клетки FCK) находятся не в стационарном, а в постоянном динамическом состоянии - мигрируют между основным депо - костным мозгом - и периферическими тканями [1, 2]. В этой связи, управление механизмами хемотаксиса стволовых клеток и клеток-предшественниц может являться эффективным подходом для оптимизации лечения пациентов с различными дегенеративно-дистрофическими заболеваниями, травматическими повреждениями и новообразованиями.

Способность стволовых клеток к направленному хемотаксису в область локализации патологического очага, такого как

воспаление или новообразование, называется патотропизмом и характерна для нейральных [3, 4] и гемопоэтических стволовых клеток [5], MMCK [6], клеток-предшественниц эндотелия [7]. Единого представления о биологической значимости этого процесса нет, однако показано участие мигрирующих недифференцированных клеток в процессах регенерации [8], ангиогенеза [7], а также в формировании стромы опухолей [9].

В настоящее время активно проводятся исследования, нацеленные на идентификацию биохимических механизмов, регулирующих хемотаксис стволовых клеток и клеток-пред-шественниц. Например, для TCK установлены оси хемотаксиса SDF-1/CXCR4, SCF/c-Kit, VEGF/VEGFR, HGF/c-Met, вовлеченные в процессы миграции к очагам воспаления. Особый интерес представляет тропность MMCK и нейральных стволовых клеток к новообразованиям. В частности, ис-

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008