ПРОСТОЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ СИАЛИЛЛАКТОЗЫ
SIMPLE METHOD OF SIALILLACTOSE PURIFICATION

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу очистки сиалиллактозы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к простому и экономичному способу отделения сиалиллактозы от других углеводов, таких как лактоза и моносахариды, а также больших по размеру олигосахаридов, таких как дисиалиллактоза, которые могут присутствовать в качестве загрязняющих углеводов в ферментационном бульоне, если указанную сиалиллактозу получают посредством микробной ферментации.
Предшествующий уровень техники
Человеческое грудное молоко считается наилучшим питанием для развития младенца. Оно состоит из жиров, белков, витаминов, минеральных веществ, микроэлементов и сложных олигосахаридов. Помимо лактозы человеческое грудное молоко, а также молоко других млекопитающих, содержит разные структурно различные олигосахариды, которые также известны, как олигосахариды грудного молока (ОГМ) (Usashima Т. et al., (2011) Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York ISBN 978-1-61122-831-1).
Среди ОГМ сиалированные ОГМ (СОГМ), как наблюдалось, поддерживают устойчивость к энтеропатогенным бактериям и вирусам. Что интересно, недавние исследования кроме того продемонстрировали защитное действие длинноцепочечных СОГМ в отношении некротического энтероколита, который является одним из наиболее распространенных и смертельных заболеваний у недоношенных новорожденных. Кроме того, полагают, что СОГМ поддерживают развитие головного мозга младенца и его когнитивные способности. Кроме того, показано, что сиалированные олигосахариды нейтрализуют энтеротоксины разных патогенных микробов, включая Escherichia coli, Vibrio choierae и Salmonella. Кроме того, обнаружено, что сиалированные олигосахариды препятствуют колонизации кишечника Helicobacter pylori и, вследствие этого, предотвращают или ингибируют язвы желудка и двенадцатиперстной кишки.
Среди сиалированных олигосахаридов 3'-сиалиллактоза и 6'-сиалиллактоза являются наиболее распространенными членами в человеческом грудном молоке.
Поскольку сиалированные олигосахариды имеют сложную структуру, их химический или (химико-)ферментативный синтез является проблематичным и ассоциирован с серьезными трудностями, например, контролем стереохимии, образованием специфичных связей, доступностью сырья и т.д. И, как следствие, имеющиеся в продаже сиалированные олигосахариды являются очень дорогими за счет их низкого количества в природных источниках.
Таким образом, были сделаны попытки в конструировании обмена веществ микроорганизмов для продукции сиалированных олигосахаридов, поскольку данный подход является наиболее перспективным путем для получения ОГМ в промышленном масштабе. Для получения СОГМ посредством микробной ферментации микроорганизм обычно культивируют в присутствии экзогенной сиаловой кислоты.
В международных публикациях WO 2007/101862 А1 и WO 2014/153252 А1 раскрыты способы и композиции для конструирования бактерий, продуцирующих сиалированные олигосахариды. Однако, ферментативная продукция 6'-сиалиллактозы, как известно, ассоциирована с биосинтезом других углеводов, таких как дисиалиллактоза (Drouillard, S. et al. (2010) Efficient synthesis of 6'-sialyllactose, 6,6'-disialyllactose, and 6'-KDO-lactose by metabolically engineered E.coli expressing a multifunctional sialyltransferase from the Photobacterium sp.JT-ISH-224. Carbohydrate Research 345: 1394-1399), которая образуется из 6'-сиалиллактозы за счет активности сиалилтрансферазы, экспрессируемой в генетически сконструированных бактериях. Кроме того, автоклавирование (тепловая обработка) углеводов (например, лактозы) приводит к образованию нежелательных побочных продуктов, таких как продукты альдольной реакции или реакции Майяра, или реакциям перегруппировки (например, превращение лактозы в лактулозу). Наличие таких загрязняющих веществ в конечном продукте, в частности в больших количествах, является нежелательным или даже неприемлемым.
Кроме того, применение генетически сконструированных бактерий для продукции олигосахаридов приводит к загрязнению ферментационного бульона рекомбинантным материалом, таким как молекулы нуклеиновых кислот или полипептиды, происходящие из данного микроорганизма. Однако, загрязнение продукта для потребления человеком рекомбинантной ДНК или белками на сегодняшний день является неприемлемым как со стороны регулирующих органов, так и потребителей. Таким образом, любые нуклеиновые кислоты и белки, происходящие из рекомбинантного микроорганизма, должны быть удалены из желательных олигосахаридов грудного молока. Пределы обнаружения для рекомбинантных молекул ДНК на сегодняшний день являются очень низкими, что требует схем тщательной очистки. В случае выявления ДНК на основе кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция), в образце может быть выявлено даже вплоть до одиночной молекулы ДНК.
Способы очистки отдельных олигосахаридов от ферментационного бульона «современного уровня техники» являются технически сложными и часто неэкономичными, в частности, когда указанный олигосахарид предназначен для применений в пище. Для очистки дисахарида лактоза или сахароза от сложных смесей, таких как молочная сыворотка или патока, были разработаны промышленные способы, которые включают множественные стадии кристаллизации. Однако, указанные способы дорабатываются и приводят лишь к низким выходам. Также, данные способы не применимы для предоставления олигосахарида, полученного посредством микробной ферментации, подходящего для применения в пищевой промышленности, по существу ферментационный бульон - в отличие от молочной сыворотки и патоки - еще не является пищевым продуктом.
Однако, способы фильтрации, подобно ультрафильтрации, микрофильтрации и нанофильтрации, технически легко осуществить, если все параметры способа известны и оптимизированы. Диафильтрация является еще одним подходящим способом, который включает добавление к раствору свежей воды для удаления мембранопроницаемых компонентов. Ультрафильтрацию и микрофильтрацию обычно используют для отделения от ферментационного бульона или водного раствора гораздо более крупных молекул, подобно белкам или клеткам. Кроме того, удаление воды, минеральных веществ и очень маленьких молекул посредством нанофильтрации хорошо известно и используется в молочной промышленности для концентрирования и деминерализации молочной сыворотки. В большинстве случаев материалы мембраны для нано- и ультрафильтрации основаны на материалах, подобно пиперазину, полиамиду, полиэфирсульфону, полиэтиленгликолю и керамике. Мембраны могут быть собраны, например, в виде половолоконных модулей, спиральнонавитых модулей и мембран с плоским слоем, и данная сборка может приводить к разным выполнениям разделения. В общем, нанофильтрационные мембраны имеют порог отсечения по молекулярной массе в интервале 150-300 Дальтон. Мембраны с порогом отсечения по молекулярной массе в интервале 400-600 Дальтон являются очень редкими, особенно для крупномасштабного промышленного производства. Это делает разделение олигосахаридов еще сложнее, поскольку необходимы другие методики разделения, такие как хроматография, или партиями или в непрерывном режиме.
Тогда как эксклюзионная хроматография представляет собой удобный лабораторный метод, только хроматография с псевдодвижущимся слоем представляет подходящий способ очистки 6-SL (от англ. sialyllactose) в масштабах, сопоставимых с производством продуктов питания. Однако, все другие опубликованные способы страдают недостатком, заключающимся в том, что загрязняющие углеводы не могут быть эффективно удалены из желательного продукта.
Таким образом, цель настоящего изобретения заключалась в предложении простого и экономически выгодного способа очистки сиалиллактозы от продуктов микробной ферментации, где нуклеиновые кислоты и полипептиды, происходящие из рекомбинантного микроорганизма, могут быть отделены от желательного олигосахарида, а также других указанных углеводов.
Краткое изложение сущности изобретения
Предложен способ очистки сиалиллактозы, который является простым, экономически эффективным и масштабируемым. Способ очистки сиалиллактозы может быть осуществлен без применения органического растворителя для кристаллизации указанной сиалиллактозы. Кроме того, способ очистки сиалиллактозы можно осуществить без стадии прерываемой хроматографии.
Сиалиллактоза представляет олигосахарид грудного молока, чье включение в детскую питательную смесь и лечебный продукт питания является крайне желательным. Высокая стоимость сиалиллактозы препятствует ее широкому применению, в частности, в детской питательной смеси. В частности, очистка продуктов от продуктов микробной ферментации часто является сложной и дорогой. Также применение органических растворителей и стадий прерываемой хроматографии делает 6'-сиалиллактозу и другие нейтральные олигосахариды чрезмерно дорогими. Также применение этанола неприменимо по некоторым религиозным пищевым стандартам, например, Халяль. Таким образом, изобретение относится к простому экономически эффективному способу очистки сиалиллактозы от продуктов микробной ферментации с использованием рекомбинантного технологического вспомогательного средства, приводящему к получению продукта сиалиллактоза, подходящего для потребления человеком, в частности, подходящего для продукта для детского питания и лечебных продуктов питания.
Способ очистки основан на применении двух разных мембран для очистки/отделения сиалиллактозы от загрязняющих углеводов посредством фильтрации и включает две стадии мембранной фильтрации, где одна мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, и где другая мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон.
Подробное описание
Предложен способ очистки сиалиллактозы от других углеводов, где данный способ включает стадии подвергания водного раствора, содержащего сиалиллактозу и другие указанные углеводы, двум стадиям мембранной фильтрации с использованием разных мембран, где одна мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, и где другая мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон.
Мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, делает возможным удаление основной части углеводов, имеющих молекулярную массу, которая меньше, чем молекулярная масса сиалиллактозы. При фильтрации SL и углеводы, имеющие молекулярную массу больше, чем молекулярная масса SL, остаются в ретентате.
В дополнительном и/или альтернативном воплощении мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, имеет размер пор от 1 до 2 нм.
Подходящие мембраны, имеющие порог отсечения по молекулярной массе, которая меньше молекулярной массы SL, представляют сбой, например, TriSep XN-45 (TriSep Corporation, США), Dairy DK (Suez Water Technologies, formely GE) и Filmtech NF270 (Dow).
Мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон, обладает проницаемостью к сиалиллактозе и углеводам, имеющим молекулярную массу меньше, чем молекулярная масса SL. При фильтрации SL находится в фильтрате, тогда как углеводы, имеющие молекулярную массу больше, чем молекулярная масса SL, остаются в ретентате.
В дополнительном и/или альтернативном воплощении мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон, имеет размер пор 2,5-3 нм.
Подходящие мембраны для обладания проницаемостью в отношении 6-SL и задерживания углеводов, имеющих молекулярную массу больше, чем молекулярная масса 6-SL, в ретентате, представляют собой, например, мембрану 0,65 кДа TangenX SIUS TFF (Repligen Corporation), модули Zirkonia 3 нм (Pervatech BV) и S-CUT YSNF-YS600 (CUT/).
Способ не подразумевает применения дорогих стадий прерывающейся хроматографии и также делает ненужными стадии осаждения или кристаллизации с использованием органических растворителей. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении способ не включает одну или более стадий прерывающейся хроматографии и/или одну или более стадий осаждения и/или кристаллизации 6-SL посредством использования органического растворителя.
В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор получают в результате ферментации или ферментативного процесса для получения сиалиллактозы.
Способ, описанный в данном документе, подходит для очистки олигосахаридов грудного молока - 3'-сиалиллактозы или 6'-сиалиллактозы - от продуктов микробной ферментации или реакции биокатализа в многотонных количествах, поскольку он является экономически целесообразным и масштабируемым.
В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор получают в результате ферментации, а именно культивирования микробных клеток, которые способны продуцировать сиалиллактозу в культуральной среде (ферментационном бульоне) и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении продукции микробными клетками сиалиллактозы, посредством отделения биомассы от ферментационного бульона. Предпочтительно, отделение биомассы от ферментационного бульона включает по меньшей мере одну стадию ультрафильтрации, предпочтительно две стадии ультрафильтрации, более предпочтительно первую ультрафильтрацию с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе примерно 500 кДа, и вторую ультрафильтрацию с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе примерно 150 кДа.
+
-
В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор обрабатывают катионообменной смолой, предпочтительно в форме Н, и анионообменной смолой, предпочтительно в форме Cl. Предпочтительно, водный раствор, содержащий сиалиллактозу и другие углеводы, обрабатывают ионообменными смолами перед подверганием стадиям мембранной фильтрации для удаления других углеводов.
В дополнительном и/или альтернативном воплощении способ дополнительно включает стадию диализа, предпочтительно стадию электролиза, для удаления ионов. Предпочтительно, водный раствор, содержащий сиалиллактозу, подвергают диализу и/или электродиализу после удаления других указанных углеводов из водного раствора.
Продукт можно наиболее удобным образом поставлять в виде стерильного концентрата или в виде продукта, подвергнутого распылительной сушке.
Способ делает возможной очистку 3'-сиалиллактозы или 6'-сиалиллактозы, а именно отделение 3-SL или 6-SL от других углеводов, где чистота сиалиллактозы в водном растворе составляет 70% или меньше, 60% или меньше, 50% или меньше, 40% или меньше, 30% или меньше, 20% или меньше; 10% или меньше или 5% или меньше перед очисткой, и/или водный раствор содержит сиалиллактозу с чистотой 80% или больше, предпочтительно 85% или больше или более предпочтительно 90% или больше после очистки.
В дополнительном и/или альтернативном воплощении очистка включает следующие стадии:
i) отделение биомассы от ферментационного бульона;
ii) подвергание бесклеточного ферментационного бульона по меньшей мере одной обработке ионообменной смолой для удаления заряженного вещества, предпочтительно обработке анионообменной смолой и обработке катионообменной смолой;
iii) подвергание водного раствора, полученного на стадии ii., стадии мембранной фильтрации с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, для удаления углеводов, имеющих молекулярную массу меньше, чем молекулярная масса сиалиллактозы;
iv) подвергание ретентата, полученного на стадии iii., стадии мембранной фильтрации с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон, для удаления углеводов, имеющих молекулярную массу больше, чем молекулярная масса сиалиллактозы; и - возможно -
v) повышение концентрации сиалиллактозы, находящейся в фильтрате стадии iv.
Ввиду того, что другие способы, используемые для очистки сиалиллактозы, являются довольно сложными и, вследствие этого, дорогими, способ, ранее описанный в данном документе, основан главным образом на применении двух стадий мембранной фильтрации.
Некоторые воплощения включают одну или более дополнительных стадий, таких как стадии диализа (для удаления солей), электродиализ (для удаления заряженных молекул), обработка активированным углем (для обесцвечения раствора продукта) и/или другие процессы фильтрации (подобно удалению эндотоксинов и/или стерильной фильтрации). Хотя и необязательно, способ может включать обработку водного раствора, содержащего сиалиллактозу, органическим растворителем (таким как короткоцепочечные спирты, подобно метанолу) для осаждения загрязняющих олигосахаридов или для элюирования после адсорбции на активированном угле с помощью смесей короткоцепочечных спиртов и воды, и/или для кристаллизации сиалиллактозы.
Водный раствор, полученный посредством способа, содержит сиалиллактозу, но не содержит нуклеиновых кислот и полипептидов микробных клеток. Кроме того, указанный водный раствор едва ли содержит, если вообще содержит, моносахариды и/или дисиалиллактозу.
Настоящее изобретение будет описано в отношении конкретных воплощений, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.
Следует понимать, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличие или добавление одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.
Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно обычному специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.
Аналогично следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в приведенной далее формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.
Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в приведенной ниже формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.
Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.
В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако, понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание данного описания.
Теперь изобретение будет описано с помощью подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть скомпонованы в соответствии со знаниями специалистов в данной области, не отклоняясь от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Ферментативное получение 6'-сиалиллактозы
tet
Проводили периодическую ферментацию с подпиткой для получения 6'-сиалиллактозы с использованием штамма Е. coli, синтезирующего рекомбинантную 6'-сиалиллактозу (Е. coli BL21(DE3) ΔlacZ), экспрессирующего ген α-2,6-сиалилтрансферазы plsT6 из Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119. Для усиления биосинтеза СМР-сиаловой кислоты, гены, кодирующие глюкозамин-6-фосфатсинтазу GlmS из Е. coli, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу Slr1975 из Synechocystis sp., глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу Gna1 из Saccharomyces cerevisiae, фосфоенолпируватсинтазу PpsA из E. coli, N-ацетилнейраминатсинтазу NeuB и синтетазу СМР-сиаловой кислоты NeuA, обе последние из Campylobacter jejuni, хромосомно интегрировали в хозяина Е. coli BL21(DE3). Кроме того, ген, кодирующий лактозопермеазу LacY из Е. coli, и гены cscB (сахарозопермеаза), cscK (фруктокиназа), cscA (сахарозогидролаза) и cscR (регулятор транскрипции) из Е. coli W интегрировали в геном BL21, таким образом, чтобы транскрипция интегрированных генов инициировалась с конститутивных промоторов, или с тетрациклин-чувствительного промотора P или промотора РТ5. Функциональный gal-оперон (галактозный оперон), состоящий из генов galE (УДФ (Уридиндифосфат)-глюкозо-4-эпимераза), galT (галактозо-1-фосфат уридилилтрансфераза), galK (галактокиназа) и galM (галактозо-1-эпимераза) переносили из Е. coli K12 в геном штамма BL21. Для предотвращения деградации N-ацетилглюкозамин-6-фосфата, гены, кодирующие N-ацетилглюкозамин-6-фосфат деацетилазу (NagA), глюкозамин-6-фосфат-деаминазу (NagB) и N-ацетилглюкозамин-специфичный PTS белок МАВС (NagE), удаляли из бактериальной хромосомы. Кроме того, оперон manXYZ, кодирующий транспортер Сахаров PTS системы Е. coli для маннозы, глюкозы, глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, удаляли, а также гены папА, nanK, папЕ и папТ, кодирующие N-ацетилнейраминатлиазу, N-ацетилманнозаминкиназу, N-ацетилманнозамин-6-фосфатэпимеразу и транспортер сиаловой кислоты, соответственно. Ген, кодирующий N-ацетилгалактозамин-6-фосфатдеацетилазу (AgaA), также удаляли.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
4
2
4
2
4
4
2
4
2
2
2
2
2
2
4
2
2
4
2
2
3
4
Штамм Е. coli, продуцирующий 6'-сиалиллактозу, выращивали в среде с определенными минеральными солями, содержащей 7 г⋅л NHHPO, 7 г⋅л KHPO, 2 г⋅л KOH, 0,3 г⋅л лимонной кислоты, 5 г⋅л NHCl, 1 мл⋅л пеногасителя (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0,1 мМ CaCl, 8 мМ MgSO, микроэлементы и 2% сахарозы в качестве источника углерода. Микроэлементы состояли из 0,101 г⋅л нитрилотриуксусной кислоты, рН 6,5, 0,056 г⋅л цитрата железа(III)-аммония, 0,01 г⋅л MnCl × 4 HO, 0,002 г⋅л CoCl × 6 HO, 0,001 г⋅л CuCl × 2 HO, 0,002 г⋅л борной кислоты, 0,009 г⋅л ZnSO × 7 HO, 0,001 г⋅л NaMoO × 2 HO, 0,002 г⋅л NaSeO, 0,002 г⋅л NiSO × 6 H2O.
-1
-1
-1
-1
-1
4
2
4
При подаче сахарозы (500 г⋅л) добавляли 8 мМ MgSO, 0,1 мМ CaCl, микроэлементы и 5 г⋅л NHCl. Для образования 6'-сиалиллактозы использовали подачу лактозы 216 г⋅л. рН культуральной среды контролировали посредством использования раствора аммония (25 об./об.%). Периодическую ферментацию с подпиткой проводили при 30°С при постоянной аэрации и перемешивании в течение 72 часов посредством применения скорости подачи сахарозы 5,5-7 мл⋅л⋅ч относительно исходного объема. Через 72 часа после начала ферментации наибольшая часть добавленной лактозы превращалась в 6'-сиалиллактозу. Для удаления остаточной лактозы в ферментационном супернатанте в ферментационный чан добавляли β-галактозидазу.
Пример 2: Получение бесклеточного ферментационного бульона
Клеточную массу (примерно 10% ферментационного бульона) отделяли от среды посредством ультрафильтрации (порог отсечения 0,05 мкм) (CUT membrane technology, Erkrath, Германия) с последующими фильтрациями с перекрестным током с использованием фильтра, имеющего MWCO (от англ. Molecular-weight cutoff - порог отсечения по молекулярной массе) 150 кДа (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Германия).
Пример 3: Обработка ионообменной смолой бесклеточного ферментационного бульона, содержащего 6'-сиалиллактозу
+
Бесклеточный ферментационный бульон, как получено в примере 2, содержал 6'-сиалиллактозу (с чистотой 9% на сухую массу) в объеме 1000 литров и пропускали через сильную катионообменную смолу (Lewatit S2568, полученная от компании Lanxess, Германия) в форме Н для удаления положительно заряженных загрязняющих веществ (размер объема слоя ионообменника составлял 200 л). Элюирование 6-SL с ионообменной смолы продолжалось с помощью деионизированной воды. Затем рН полученного раствора устанавливали на уровне 7 посредством добавления раствора гидроксида натрия. Затем раствор (без задержки) пропускали через колонку с анионообменником (объем слоя ионообменника составлял 200 л). Используемый сильный анионообменник Lewatit S6368 A (Lanxess, Германия) находился в форме хлорида (СГ). Элюирование 6-SL продолжали посредством деионизированной воды. Полученный раствор снова нейтрализовали до рН 7.
Пример 4: Первая фильтрация для удаления молекул/углеводов меньшего размера
Раствор, полученный в результате обработки ионообменной смолой, изложенной в примере 3, подвергали диафильтрации, используя нанофильтрационную мембрану TriSep XN-45 (TriSep Corporation, США) и 500 л деионизированной воды. Полученный раствор дополнительно концентрировали, используя нанофильтрационную мембрану (RE 8040-ВЕ, CSM-Saehan), где получали раствор 6'-сиалиллактозы с чистотой 31% (на сухую массу) и электропроводность 8 мСм/см.
Пример 5: Вторая фильтрация для удаления молекул/углеводов большего размера
Для отделения 6'-сиалиллактозы от полученного в результате ферментации побочного продукта - дисиалиллактозы использовали вторую мембранную обработку. Для фильтрования использовали мембрану TangenX SIUS TFF с номинальным порогом отсечения 0,65 кДа (Repligen Corporation). Раствор, содержащий 94,4% 6'-сиалиллактозы и 6,6% дисиалиллактозы (соотношение 15:1) подвергали фильтрации с перекрестным током с помощью описанной системы, и концентрацию 6'-сиалиллактозы и дисиалиллактозы определяли внутри пермеата и ретентата. Результаты показывают значимое уменьшение количества дисиалиллактозы внутри пермеата с 6,6% до 0,2% (отношение 6'-сиалиллактозы к дисиалиллактозе составляло 55:1), тогда как отношение 6'-сиалиллактозы к дисиалиллактозе внутри ретентата составляло 14:1. Данный результат показывает, что 6'-сиалиллактоза могла быть отделена от дисиалиллактозы посредством использования дополнительной стадии фильтрации. Данное наблюдение могло быть также продемонстрировано посредством использования второго вида мембраны с похожим порогом отсечения от другого поставщика. Посредством использования мембраны S-CUT YSNF-YS600-2540-M46D-ATD (CUT Membrane Technology GmbH) с номинальным порогом отсечения 600-800 Да 6'-сиалиллактозу также отделяли от дисиалиллактозы посредством фильтрации с перекрестным током.
Пример 6: Обработка на основе электродиализа
Пермеат, полученный в примере 5, подвергали электродиализу до 2 мСм/см, используя электродиализатор PC-Cell 15 (PC-Cell, Heusweiler, Германия), оснащенный мембранным пакетом PC-Cell ED 1000Н. Данный мембранный пакет был оснащен следующими мембранами: катионообменная мембрана СЕМ: PK SK и анионообменная мембрана AEM:PcAcid60 с границей разделения по размеру 60 Да. 0,025 M раствор сульфаминовой кислоты (амидосульфоновая кислота) использовали в качестве электролита в процессе электродиализа. После электродиализа получали раствор, содержащий 6'-сиалиллактозу с чистотой 83% (по сухой массе). В качестве альтернативы обработке на основе электродиализа можно было использовать способ диафильтрации.
Пример 7: Концентрирование и обработка активированным углем
Некоторое количество воды удаляли из водного раствора, используя фильтр с обратным осмосом и ротационное выпаривание при 45°С с получением 25%-ного (масс./об.) раствора 6'-сиалиллактозы. Затем полученный водный раствор обрабатывали активированным углем (Norit SA2). 125 г активированного угля использовали на 1 л 25%-ного (масс./об.) раствора 6'-сиалиллактозы.
Пример 8: Стерильная фильтрация и удаление эндотоксина
Далее, раствор, полученный в примере 7, подвергали стерильной фильтрации посредством пропускания раствора через фильтр 6 кДа (половолоконный модуль ультрафильтрации Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Германия). Стерильный раствор затем хранили при KТ до распылительной сушки.
Пример 9: Распылительная сушка 6'-сиалиллактозы
Полученную таким образом (пример 8) стерильную 6'-сиалиллактозу затем подвергали распылительной сушке, используя распылительную сушилку NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Германия). Для распылительной сушки 6'-сиалиллактозы раствор пропускали под давлением 3,5 бар (350 кПа) через сопла распылительной сушилки, установленные при 130°С, и поток регулировали для поддержания температуры нагнетания от 67°С до 69°С.Используя данные установки, мог быть получен порошок, высушенный посредством распылительной сушки, с влажностью меньше чем 9%. Содержание влаги определяли посредством титрования по Карлу Фишеру.
Пример 10: ЖХ-МС/МС анализ 6'-сиалиллактозы
2
Для количественной оценки проводили масс-спектрометрический анализ посредством MRM (от англ. multiple reaction monitoring - мониторинг множественных реакций) с использованием хромато-масс-спектрометра LC Triple-Quadrupole MS detection system. Ионы-предшественники отбирают и анализируют в квадруполе 1, фрагментация проходит в столкновительной ячейке с использованием аргона в качестве газа CID, отбор фрагментных ионов проводят в квадруполе 3. Хроматографическое разделение сахаридов проводили на колонке для ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) XBridge Amide (3,5 мкм, 2,1 × 50 мм (Waters, США) с защитным картриджем XBridge Amide (3,5 мкм, 2,1 × 10 мм) (Waters, США). Температура термостата колонки системы ВЭЖХ составляла 50°С. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила/HO с 10 мМ ацетатом аммония. Образец 1 мкл инъецировали в прибор; прогон проводили в течение 3,60 мин со скоростью потока 400 мкл/мин. 6'-Сиалиллактозу анализировали посредством MRM в режиме положительной ионизации ИЭР (ионизация электрораспылением). Масс-спектрометр работал при единичном разрешении. Сиалиллактоза образует ион m/z 656,2 [М+Na]. Ион-предшественник сиалиллактозы был дополнительно фрагментирован в столкновительной ячейке на фрагментные ионы m/z 612,15, m/z 365,15 и m/z 314,15. Энергию столкновения, Q1 и Q3 Pre Bias оптимизировали для каждого аналита отдельно. Способы количественной оценки устанавливали с использованием имеющихся в продаже стандартов (Carbosynth, Compton, UK).