Использование карбоновых кислот для формирования нисходящих градиентов рнвнутри колонки, заполненной сверхсшитым полистиролом с карбоксильными группами

УДК 543.544

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ НИСХОДЯЩИХ ГРАДИЕНТОВ рН ВНУТРИ КОЛОНКИ, ЗАПОЛНЕННОЙ СВЕРХСШИТЫМ ПОЛИСТИРОЛОМ С КАРБОКСИЛЬНЫМИ ГРУППАМИ М.С. Вакштейн, А.В. Иванов, П.Н. Нестеренко, Е.М. Хасанова

Для формирования нисходящих градиентов рН внутри катионообменной колонки, заполненной сверхсшитым полистиролом с привитыми карбоксильными группами, применили технику хроматофокусирования. Колонку предварительно уравновешивали стартовым буферным раствором (10 мМ Трис-HCl). Показана возможность формирования градиентов рН с использованием однокомпонентных элюентов на основе карбоновых кислот. Добавление NaCl в стартовый раствор и элюент позволяет получить квази-линейные градиенты рН в интервале 7,5-3,5.

Большинство работ в области хроматофокусирования посвящено формированию нисходящих градиентов внутри аминофункциональных анионообмен-ных колонок, что связано с практическим применением хроматофокусирования для разделения белков и других биполярных соединений по анионообмен-ному механизму [1-3]. В одном из современных вариантов концентрирования и разделения - хромато-фокусировании переходных металлов - используют образование комплексов с аминогруппами сорбента и последующее разрушение в условиях нисходящего градиента рН [4, 5]. В литературе имеются отрывочные сведения о формировании восходящих градиентов рН внутри катионообменных карбоксильных колонок, но эти работы носят преимущественно теоретический характер [1, 6, 7]. С точки зрения применения техники хроматофокусирования для разделения ионов металлов, карбоксильные колонки представляют несомненный интерес, поскольку в этом случае комплексы на поверхности сорбента образуются в одну стадию (в отличие от образования комплексов с аминогруппами). Кроме того, карбоксильные сорбенты позволяют концентрировать и разделять не только ионы переходных металлов по механизму комплексообразования, но и ионы щелочноземельных металлов за счет кати-онного обмена. В предыдущей статье [8] мы показали возможность формирования нисходящих градиентов рН в системе низкого давления внутри препаративной колонки, заполненной карбоксильным катионообменником СМ-52 на основе микро-гранулированной целлюлозы. В качестве элюента, формирующего градиент рН, использовали макро-молекулярный Полибуфер-96, выпускаемый специ-

ально для хроматофокусирования [9]. Применение Полибуфера ограничено его высокой стоимостью и способностью к разложению под действием бактерий, а в хроматофокусировании металлов - и неоднозначностью комплексообразования с ионами металлов [5], в связи с чем целесообразно заменить Полибуфер более простыми, однокомпонентными элюентами на основе карбоновых кислот. Применение растворов карбоновых кислот в качестве элюентов для формирования нисходящих градиентов рН внутри анионообменных колонок описано в статьях [10-12].

Данная работа посвящена формированию нисходящих градиентов рН внутри катионообменной карбоксильной колонки при использовании однокомпонент-ных элюентов.

Экспериментальная часть

Реагенты. В качестве стартового буферного раствора использовали 10 мМ Трис [трис(гидроксиме-тил)аминометан], приготовленный из сухого препарата квалификации "ч.д.а" ("Serva", Германия); в качестве элюента применяли 0,05-5 мМ растворы уксусной, щавелевой, винной, лимонной и глутаминовой кислот, приготовленые из препаратов квалификации "ч.д.а." ("Реахим", Россия; "Merck", Германия). Кислотность стартового раствора регулировали добавлением конц. HCl, ионную силу - добавлением рассчитанного количества 2 М раствора NaCl. В связи с высокой гидрофобностью поверхности сорбента в подвижные фазы добавляли CH3CN (5 об.%).

Сорбент. Катионообменник на основе сверхсши-того полистирола MN с карбоксильными группами (Purolite, Великобритания), диаметр частиц 5 мкм,

рН-интервал гидролитической стабильности 1-14, ионообменная емкость по Н + 0,90-1,15 ммоль/г сухого сорбента, плотность упаковки 0,18 г/мл.

Аппаратура. Хроматографическая система включала насос высокого давления "Бвсктап-114 М" (США), пластмассовую хроматографическую колонку (50^4,6 мм), заполненную катионообменным сорбентом, проточную ячейку для измерения рН, цифровой рН-метр НМ208 (ТОА-Еlectronics, Япония) с комбинированным электродом 08-5211С и перистальтический насос "МыШрегрех 2115" (ЬКБ-Бготта, Швеция) для удаления эффлюента из ячейки. Сигнал рН-метра контролировали с помощью самописца "ЬКБ" (Швеция).

Методика эксперимента. Хроматографическую колонку уравновешивали стартовым буферным раствором до рН 7,5, что соответствует начальной точке градиента, затем пропускали буферный элю-ент, непрерывно контролируя рН эффлюента. Объемная скорость расхода подвижных фаз составила 0,9 мл/мин.

Обсуждение результатов

Сорбент. Принципиальная возможность создания нисходящего градиента рН в препаративной катионо-обменной карбоксильной колонке была продемонстрирована в хроматографической системе низкого давления [8]. Использованный на этом этапе работы сорбент СМ-52 на основе микрогранулированной целлюлозы неприменим в хроматографических системах с высоким давлением вследствие низкой механической устойчивости частиц и значительной набухае-мости в растворителях. В связи с переходом к системе высокого давления мы решили использовать сорбент МК на основе сверхсшитого полистирола (ССПС) с привитыми карбоксильными группами. Сорбенты на основе ССПС, благодаря жесткости матрицы, обладают повышенной механической устойчивостью, что позволяет проводить разделение при более высоком давлении. За счет высокой регулярности частиц такие сорбенты сохраняют геометрические параметры структуры в водных и органических подвижных фазах, так как чем в меньшей степени сорбент набухает в процессе разделения, тем большей эффективности разделения можно достигнуть. Сорбенты на основе ССПС обладают стабильными свойствами в интервале рН от 1 до 14, что обусловливает их расширяющееся применение в адсорбционной и ионной хроматографии [13]. Тем не менее литературные данные по использованию таких сорбентов для градиентного рН элюирования отсутствуют, ранее ионообменные сорбенты на основе ССПС использовали в хроматографии только в изократическом режиме элюирования [14]. К недостаткам

сорбента можно отнести частичную гидрофобность поверхности, для преодоления которой требуется добавление органического модификатора (например, ацетонитрила) в стартовый раствор и элюент.

Выбор компонентов элюента. В качестве элюен-тов, формирующих градиент рН внутри колонки, были выбраны растворы карбоновых кислот с увеличивающимся числом карбоксильных групп - уксусной (рКа 4,76), щавелевой (рКа 1,25 и 4,27), винной (рКа 2,98 и 4,34) и лимонной (рКа 3,10, 4,76 и 6,40). Концентрации кислот варьировали в интервале от 0,2 (в отдельных случаях от 0,05) до 5 мМ. Для всех изученных кислот профиль нисходящего градиента рН можно разделить на несколько характерных участков: начальный участок с постоянным значением рН (соответствующим рН стартового раствора), участок с увеличением рН выше рН стартового раствора и участок с практически линейным снижением рН до значения элюента (рис. 1, а).

При уменьшении концентрации уксусной кислоты от 5 до 0,2 мМ наблюдается увеличение подъема на начальном участке градиента на 0,75 ед. рН (таблица), при этом протяженность этого участка увеличивается более, чем в 10 раз. Стоит отметить, что отрезок градиента до появления подъема рН имеет одинаковую протяженность во всех случаях (рис. 1, а-в), что объясняется первоначальным вытеснением Трис из колонки элюентом. Затем в эффлюенте появляются ацетат-ионы, что и приводит к появлению подъема на профиле градиента. Сорбент, являясь более сильным основанием, чем элюент, забирает протоны у уксусной кислоты, причем чем ниже концентрация кислоты, тем меньшей буферной емкостью обладает раствор элюента, а следовательно, проще депротони-руется. Отсюда становится понятным увеличение подъема рН при переходе к более разбавленным кислотам в элюенте. Увеличение же протяженности участка градиента с подъемом рН связано с тем, что на дополнительное протонирование сорбента требуется все большее количество элюента при более сильном разбавлении. Кроме того, при уменьшении концентрации кислоты, например винной, от 5 до 0,2 наблюдали (рис. 1, б; таблица) увеличение протяженности, следовательно, пологости всего градиента рН. На общую протяженность и наклон градиента влияют два фактора: уменьшение концентрации кислоты в элюенте и снижение ионной силы элюента при его разбавлении. Ионную силу элюента рассчитывали с помощью программы "Acid-Base Calculator" [15].

Рассмотрим возможный механизм этого процесса. При уравновешивании колонки стартовым буферным раствором на поверхности сорбента удерживается

pH

pH

pH

Рис. 1. Влияние концентрации: а - уксусной, б - винной, в - глу-таминовой кислоты в составе элюента на профиль внутреннего нисходящего градиента рН в катионообменной системе

протонированный Трис. При пропускании элюента с меньшей ионной силой, чем в стартовом растворе, сначала происходит дополнительное протонирование карбоксильных групп сорбента, в результате из колонки выходит анион кислоты (в данном случае тартрат-ион), который, видимо, и приводит к повышению рН эффлюента. Чем больше разница в ионной силе, тем выше степень дополнительного прото-нирования сорбента, следовательно, из колонки выходит большее количество анионов кислоты. Этот процесс протекает тем дольше, чем ниже концентрация кислоты в эффлюенте, что объясняет увеличение протяженности начального участка на приведенных кривых (рис. 1, а-в).

Далее начинается постепенное вытеснение кислотой протонированного Трис. Продолжительность этого процесса напрямую связана с концентрацией кислоты. В случае разбавленных растворов (рис. 1, кривые 2, 3) градиенты получаются наиболее пологие, но зато увеличивается время достижения конечной точки градиента. Аналогичную зависимость наблюдали для щавелевой и лимонной кислот, причем наиболее сильно рассмотренные эффекты проявились при переходе к 0,05 мМ растворам (таблица).

Другим возможным способом получения линейных градиентов является использование растворов аминокислот в качестве буферных элюентов. Так, например, глутаминовая кислота имеет константы ионизации (рКа1 2,19, рКа2 4,25, р Ка(КИ2) 9,67), равномерно распределенные в интервале формирования градиента рН [16]. Для глутаминовой кислоты наблюдали те же закономерности, что и для карбоновых кислот. Градиенты рН получились более пологие за счет того, что глутаминовая кислота слабее щавелевой, а также за счет присутствия первичной аминогруппы в ее молекуле (рис. 1, в). Как видно из рисунка, уже при концентрации кислоты 0,2 мМ получается достаточно плавный градиент рН. Характерно, что для более слабой кислоты подъем на начальном участке градиента выражен сильнее.

Влияние природы кислоты при одинаковой концентрации. Если сравнивать градиенты, полученные с разными кислотами при их одинаковой концентрации (рис. 2), то следует обратить внимание на некоторые особенности профиля градиента: а) протяженность начального участка градиента рН, б) величину подъема рН на начальном участке, в) наклон градиента рН.

Протяженность начального участка до появления подъема рН выше этого показателя для стартового раствора у всех кислот одинакова. Это связано с тем,

а

б

в

Влияние состава элюента на характерные участки градиента рН

Элюент (кислота, концентрация) рН элюента Ионная сила элюента Подъем, ед. рН Протяженность начального участка, мл

Уксусная, 5 мМ 3,55 <0,001 0,10 4

Уксусная, 1 мМ 3,92 ~0 0,50 17

Уксусная, 0,2мМ 4,30 ~0 0,85 60

Щавелевая, 5 мМ 2,35 0,005 0,15 2

Щавелевая, 1 мМ 3,00 0,001 0,30 10

Щавелевая, 0,2 мМ 3,63 <0,001 0,40 27

Щавелевая, 0,05 мМ 4,15 ~0 0,75 57

Винная, 5 мМ 2,73 0,002 0,10 4

Винная, 1 мМ 3,18 <0,001 0,20 7

Винная, 0,2 мМ 3,70 ~0 0,70 25

Лимонная, 5 мМ 2,80 0,002 0,10 2

Лимонная, 1 мМ 3,23 <0,001 0,30 9

Лимонная, 0,2 мМ 3,75 ~0 0,80 38

Лимонная, 0,2 мМ 3,92 0,01 (№С1) (а) 0,05 13

Лимонная, 0,2 мМ 3,97 0,1 (№С1) (б) 0,02 7

Лимонная, 0,05 мМ 4,25 ~0 1,00 65

Глутаминовая, 5 мМ 3,42 0,005 0,10 5

Глутаминовая, 1 мМ 3,70 0,001 0,35 13

Глутаминовая, 0,2 мМ 4,10 <0,001 0,70 43

Примечание. Ионная сила стартового раствора: а - 0,01 (КаС1), б - 0,1 (КаС1).

что сначала происходит вымывание стартового раствора из пор сорбента. Затем в эффлюенте появляются анионы кислоты, которые и приводят к увеличению рН. Величина и протяженность подъема на начальном участке градиента рН довольно хорошо коррели-

рует с силой кислот, используемых в качестве элюен-тов. Так, в ряду от щавелевой до уксусной кислот происходит постепенное увеличение подъема (в единицах рН), а также протяженности этого участка (рис. 2). Вероятно, это можно объяснить как увели-

РН

0 20 40 60 80 100 120 140

V, мл

Рис. 2. Нисходящие градиенты рН при использовании 1 мМ растворов кислот: 1 - щавелевой, 2 - винной, 3 - лимонной, 4 -глутаминовой, 5 - уксусной в качестве элюентов

рН

4 -1-г-1-1-1-1-1---

0 20 40 60 80 100 120 140 160

V, мл

Рис. 3. Влияние ионной силы подвижных фаз на профиль градиента: 1 - 0, 2 - 0,01, 3 - 0,1; элюент 0,2 мМ раствор лимонной кислоты

чением в этом ряду силы сопряженного основания, так и уменьшением собственного значения рН кислот при их одинаковой концентрации. Стоит отметить, что ионная сила кислот в этом ряду уменьшается, т.е. для уксусной кислоты разница в ионной силе по сравнению со стартовым раствором максимальна. Таким образом, в случае с уксусной кислотой происходит наибольшее дополнительное прото-нирование сорбента. Если учесть самое низкое собственное значение рН раствора для этой кислоты,

Работа выполнена при финансовой

то можно предсказать, что подъем рН на профиле градиента будет самым продолжительным. Эти предположения хорошо согласуются с экспериментальными данными (рис. 2).

Осталась нерассмотренной последняя из особенностей градиента рН - его наклон. Наклон будет определяться несколькими факторами. Известно, что чем сильнее кислота, тем более резкое падение рН наблюдается при титровании, причем это сохраняется и для гетерогенных систем, например сорбентов. На рис. 2 показано, что присутствие более сильных кислот в элюенте приводит к более резкому снижению рН на профиле градиента. На наклон квази-линейно-го участка градиента рН оказывает влияние также буферная емкость элюента. Если сравнить градиенты, полученные для глутаминовой и уксусной кислот (рис. 2, кривые 4, 5), видно, что, хотя уксусная кислота слабее, для нее градиент не такой пологий, как для глутаминовой. Аминокислота обладает большей буферной емкостью, чем уксусная.

Влияние ионной силы элюента на профиль градиента рН. Когда стартовый раствор обладает более высокой ионной силой, чем элюент, то на начальном участке градиента рН значение подьема выше, чем значение рН стартового раствора. Этого эффекта можно избежать, повышая ионную силу элюента. Так, при относительно высокой ионной силе элюента и стартового раствора (рис. 3, кривая 3, таблица) удается получить достаточно плавный градиент рН без подъема на начальном участке, зато с более протяженным квази-линейным участком. Вероятно, при увеличении ионной силы в подвижных фазах карбоксильные группы катионообменника частично депро-тонируются, в результате чего не происходит повышения рН в первых порциях эффлюента. Вероятно, увеличивается также буферная емкость сорбента за счет улучшения соотношения незаряженных групп к заряженным. Как мы уже отмечали ранее [11, 12], с помощью изменения ионной силы подвижной фазы можно влиять на профиль градиента рН.

Таким образом, впервые были получены нисходящие градиенты рН на катионообменном сорбенте на основе ССПС с привитыми карбоксильными группами. Выделены общие закономерности формирования градиента рН при использовании слабых карбоновых кислот в качестве элюентов. В дальнейшем предполагается более подробно исследовать влияние ионной силы элюента на профиль нисходящего градиента рН в катионообменной системе и промоделировать это влияние.

»ддержке РФФИ (грант 02-03-33007 а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sluyterman L.A.A., Wijdenes J. // J.Chromatogr. 1978. 150. P. 31.

2. Hutchens T.W., Li C.M., Besch P.K. // J.Chromatogr. 1986. 359.

P. 169.

3. Sluyterman L.A.A., Kooistra C. // J.Chromatogr. 1989. 470. P. 317.

4. Нестеренко П.Н., Иванов А.В. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2.

Химия. 1993. 32. С. 574.

5. NesterenkoP.N., Ivanov A.V. // J. Chromatogr. 1994. 671. P. 95.

6. Hearn M.T., Lyttle D.J. // J. Chromatogr. 1981. 218. P. 483.

7. Salamoun J., Slais K. // J. Chromatogr. 1990. 522. P. 205.

8. Иванов А.В., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. // ЖФХ. 2003.

77. №1. С. 137.

9. Хроматофокусирование Полибуфером на ПБИ (russian transl.).

Stockholm-Uppsala: Pharmacia, 1981.

10. Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н., Гармаш А.В. // ЖФХ. 1999. 73. №8. С. 1476.

11. Тессман А.Б., Иванов А.В., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. // ЖФХ. 2001. 75. №2. С. 342.

12. Иванов А.В., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н. и др. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2001. 42. С. 109.

13. ПеннерН.А. Дис. ... канд. хим. наук. М., 2000.

14. Нестеренко П.Н, Кебец П.А., Волгин Ю.В. // ЖАХ. 2001. 56. №8. С. 801.

15. Тессман А.Б., Иванов А.В. // ЖАХ. 2002. 57. №1. С. 6.

16. Snow J.T. Peptides. Derivatized amino acids. N.Y., 1988.

Поступила в редакцию 28.03.03

APPLICATION OF CARBONIC ACIDS FOR THE DESCENDING pH GRADIENT FORMATION IN THE COLUMN FILLED WITH HYPER CROSS-LINKED POLYSTERENE WITH ATTACHED CARBOXILIC GROUPS

M.S. Vakstein, A.V. Ivanov, P.N. Nesterenko, E.M. Khasanova

For descending pH gradient formation in the cation-exchange column, filled with hyper cross-linked polysterene with attached carboxilic groups, the chromatofocusing technique has been applied. The column was presaturated by start buffer solution (10 mM Tris-HCl). The possibility of pH gradients formation by using of single-component elu-ents, based on carbonic acids, has been shown. The addition of NaCl to the start buffer and in the eluent allows to form quasi-linear pH gradient in range 7,5- 3,5.