Особенности активности над- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в клетках легочной ткани у больных раком легкого в зависимости от полиморфизма гена GSTM1

Оригинальные исследования

© ЛАПЕШИН П,В„ САВЧЕНКО А. А.. ДЫХНО Ю.А., МОСКОВСКИХ М.Н., МАРКОВА Е.В. -

ОСОБЕННОСТИ АКТИВНОСТИ НАД- И НАДФ-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ В КЛЕТКАХ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА С8ТМ1

П.В. Лапешии, А. А. Савченко, Ю.А. Дыхно, М.И. Московских, Е.В. Маркова.

Резюме. С целью изучения особенностей активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в клетках здоровой и опухолевой ткани у больных раком легкого в зависимости от полиморфизма гена 63ТМ1 обследовано 30 больных мужского пола с раком легкого. Активность дегидрогеназ определяли биолюминеецентным методом. Анализ генетического полиморфизма 63ТМ1 гена проводили методом ПЦР. Установлено, что метаболизм здоровой ткани легкого при генотипе 63ТМ1 0/0 характеризуется повышенным уровнем ряда пластических процессов с синтезом НАДФН и высокой активность глутатионредуктазы (ГР), а также снижением активности анаэробных реакций при повышении интенсивности субстратного потока по циклу трикарбоно-вых кислот В опухолевой ткани при генотипе 63ТМ1 0/0 при сниженной активности ГР выявляется повышение интенсивности анаэробных процессов

Ключевые слова: рак легкого, опухолевая ткань легкого, метаболизм, активность дегидрогеназ, глутатионредуктаза, полиморфизм гена

В настоящее время рак легкого занимает ведущее место в структуре онкологической заболеваемости. [4]. Рост заболеваемости раком легкого связывают не только с улучшением диагностики и общим старением населения, но и с повышением степени загрязнения окружающей среды и генетическими факторами [5,9]. Среди генетических факторов наибольшее значение имеют нротоонко-гены, а также гены '"предрасположенности" [8].

Многими исследованиями показано, что полиморфизм гена С5ТМ1 (глутатион-Б-трансферазы М1) - фермента биотрансформации ксенобиотиков служит фактором риска развития рака легкого [2,11.15,16]. Такие данные получены в том числе и для жителей г. Красноярска [6]. При так называемом "нулевом генотипе" 05ТМ1 (05ТМ1 0/0) снижается эффективность глутатион-зависимой системы биотрансформации, что повышает патогенность влияния вредных факторов окружающей среды (в том числе и курения) на легочную ткань и, соответственно, повышает вероятность развития рака легкого [1].

Значительный интерес представляет фенотипическое проявление полиморфизма гена 05ТМ1 на уровне клеточного метаболизма в здоровой и опухолевой тканях. Связано это с тем. что система катаболизма ксенобиотиков с одной стороны использует субстратные и энергетические ресурсы клетки, с другой стороны, осуществляя биотрансформацию ксенобиотиков, защищает метаболическую систему от воздействия патогенных факторов [10,11,12]. В связи с этим, целью исследования явилось изучение активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в клетках здоровой и опухолевой ткани у больных раком легкого в зависимости от полиморфизма гена ОБТМ!.

В качестве показателей внутриклеточного метаболизма выбраны НАД(Ф)-зависимые дегидрогеназы в связи с тем, что, во-первых, основными переносчиками электронов в клетках являются пиридиновые нуклеотиды, а отсюда - активное участие оксидоредуктаз в биоэнергетических процессах; во-вторых, НАД(Ф)-зависимые дегидрогеназы, участвуя в направленной координации сопряженных метаболических потоков, в значительной степени обуславливают адаптивные изменения клеточного обмена веществ [3,13.14].

Материалы и методы

На базе торакального отделения Красноярского краевого онкологического центра обследовано 30 больных мужского пола с раком легкого. Ткань легкого забиралась во время операции. Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в опухолевой и здоровой ткани легкого проводили биолюминеецентным методом [7]. Данным методом определялась активность следующих ферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидро-геназы (ЛДГ и Обр.ЛДГ), НАД- и НАДН-зависи-мой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и Обр. МДГ). НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматде-гидрогеназы (НАДФГДГ и Обр.НАДФГДГ), НАДи НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НА-ДГДГ и Обр.НАДГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦ-ДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин [3]) на мг белка ткани.

Анализ генетического полиморфизма 05ТМ1 гена проводили методом мультиплексной ПЦР. Для этого ДНК выделяли из цельной крови. В качестве контроля реакции использовали амнлифи-

кадию СУР1А1 гена [6]. Результат выявляли элек-трофоретически в 3%-иом агарозном геле с добавлением бромистого этидия и визуализировали на трансиллюминаторе. Гетерозиготное и гомозиготное но нормальному аллелю состояние гена (ОБТМН) определялось присутствием на элек-трофореграммах фрагмента амплификации размером 271 н.11. (рис.1). Его отсутствие указывало на гомозиготное состояние но делении данного участка гена (ОБТМ! 0/0).

2 3 4 5 6 7

Рис. 1. Идентификация генотииов гена 05ТМ1 мегодом ПЦР-анализа в 3% агарозном геле (1 - огрицатель-ный контроль; 2, 5, 6 - генотип 05ТМ1 (+/+, +/0):

3, 4, 7 - генотии ОБТМ! (0/0).

Примечание: А - 271 н.н. (фрагмент 05ТМ1); Б н п. (фрагмент СУР1А1).

18'

Для всех нолученных данных определяли среднее арифметическое значение (М) и ошибку средней арифметической (т). Сравнение величин уровней активности дегидрогеназ здоровой ткани и опухолевой ткани легкого осуществляли но критерию Вилкоксона. Проверку гипотезы о статистической достоверности величин исследуемых показателей несвязанных выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Исследование силы взаимосвязей между исследуемыми параметрами осуществляли с помощью корреляционного анализа.

Результаты и обсуждение

При исследовании особенностей уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в здоровой и опухолевой ткани легкого у больных раком легкого с различным генотином в отношении гена С5ТМ1 обнаружено, что в клетках здоровой ткани при "нулевом генотине" статистически достоверно повышены уровни Г6ФДГ, НАД-ФМДГ и ГР (рис.2). Кроме того, в клетках здоровой ткани при С5ТМ1 0/0 значительно снижены уровни активности Обр.ЛДГ (при ОБТМН -11,34+2,19 мкЕ/мг белка; при С5ТМ1 0/0 -

0,01 ±0,001 мкЕ/мг белка; Р<0,01) и Обр.МДГ (при ОБТМН - 106,18+21,71 мкЕ/мг белка; при С5ТМ1 0/0 - 19,64+4,41 мкЕ/мг белка; Р<0,05), но при повышении активности МДГ (при 05ТМ1 + -

49,61+12,36 мкЕ/мг белка; при С5ТМ1 0/0 -

1363,99+205,54 мкЕ/мг белка; Р<0,01) и НА-ДИЦДГ (при ОБТМН - 6,18+2,11 мкЕ/мг белка; при С5ТМ1 0/0 - 36,93+12,07 мкЕ/мг белка;

Р<0,05).

В клетках опухолевой ткани у больных раком легкого с генотином С5ТМ1 0/0 но сравнению с показателями больных с генотином ОБТМН зна-

чительно снижена активность ГР (рис.2), но повышены уровни Обр.ЛДГ (при 05ТМ1 + -

0,01+0,001 мкЕ/мг белка; при С5ТМ1 0/0 - 42,51+ ±10,48 мкЕ/мг белка; Р<0,001) и Обр.МДГ (при ОБТМН - 2,36±0,41 мкЕ/мг белка; при С5ТМ1 0/0 - 130,63+25,69 мкЕ/мг белка; Р<0,05),

120

100

80

60

40

20

О

Р.<0,01

р.< ш—  1

Р,<0,05 Р2<0,05

1 ' 1

1 1 1

250

3 4

Р,<0,001

100

50

Р,<0,001

г-Н Р2<0,001

Р,<0,01

ч—

Рис.2, Акгивносгь Г6ФДГ, НАДФМДГ и ГР в клегках здоровой и опухолевой ткани легкого у больных раком легкою с генотипами С8ТМ1+ и С8ТМ1 0/0.

Примечание: 1 - Акгивносгь ферментов в клегках здоровой ткани при генотипе ОБТМН; 2 - Акгив-ность ферментов в клетках здоровой ткани при генотипе С5ТМ1 0/0; 3 - Акгивносгь ферментов в клегках опухолевой ткани при генотипе ОБТМН; 4 - Акгивносгь ферментов в клетках опухолевой ткани при генотипе С5ТМ1 0/0.

При сравнительном исследовании уровней активности оксидоредуктаз в здоровой и опухолевой ткани легкого в зависимости от С5ТМ1-генотииа установлено, что у больных с генотином 05ТМ1+ в клетках опухолевой ткани но сравнению с клетками здоровой ткани увеличена активность НАДФМДГ и ГР (рис.2), но снижены уровни Обр.ЛДГ (Р<0,01) и Обр.МДГ (Р<0,01), В то же время у больных с генотином ОБПШ 0/0 в клетках опухолевой ткани но сравнению с клетками здоровой ткани снижена активность Г6ФДГ, НАДФМДГ, ГР (рис.2) и МДГ (Р<0,01), но при повышении уровней Обр. ЛДГ (Р<0,01) и Обр. МДГ (Р<0,05).

Исследуемые ферменты находятся на разных метаболических путях и преимущественно характеризуют пластические и энергетические реакции. Так, повышение активности Г6ФДГ в здоровой ткани легкого у больных с генотипом ОБТМ1 0/0, которая является ключевым и инициализирующим ферментом нентозофосфатного цикла, определяющего реакции макромолекулярного синтеза нуклеозидов и нуклеотидов [3,13], соответственно, может привести к активации ряда пластических процессов. Кроме того, известно, что НАД-ФН, образованный в окислительно-восстановительных реакциях нентозофосфатного цикла, может быть использован ГР в реакциях восстановления глутатиона [3], При этом, установлено, что в здоровой ткани легкого у больных данной группы активность ГР также повышена, НАДФМДГ, уровень активности которого повышен в здоровой ткани больных раком с генотипом 05ТМ1 0/0, является ключевым ферментом липидного анаболизма, причем синтезированный НАДФН также используется в реакциях катаболизма ксенобиотиков, По-видимому, что подобное состояние ферментов пластического обмена, синтезирующих НАДФН, является компенсаторной реакцией, связанной с недостаточностью глутатион-Б-трансфе-разы М1,

Характеризуя энергетические процессы здоровой ткани легкого у больных с генотипом 05ТМ1 0/0, необходимо отметить снижение активности НАДН-зависимых реакций ЛДГ и МДГ, Основной синтез НАДН в цитоплазматическом комиартмен-те осуществляется в реакциях гликолиза. Ингибирование анаэробной реакции ЛДГ и НАДН-зависимой реакции МДГ отражает сниженную интенсивность анаэробного гликолиза, В то же время, в 'здоровой ткани легкого у больных с генотипом 05ТМ1 0/0 повышены уровни активности

МДГ и НАДИЦДГ, что позволяет предположить повышенный субстратный ноток но циклу три-карбоновых кислот, который является основным метаболическим циклом в митохондриальном комиартменте для реакций аэробного дыхания.

В то же время, в опухолевой ткани уровни активности исследуемых ферментов также значительно различаются в зависимости от полиморфизма гена ОБТМГ Так, в опухолевой ткани у больных с генотипом 05ТМ1 0/0 выявляется снижение ГР но сравнению с выявленным уровнем у больных с генотипом 05ТМ1+, что отражает ингибирование глутатион-зависимой антиоксидант-ной системы. Можно предположить, что при недостаточности глутатион-Б-трансферазы М1 в случае развития опухолевого процесса происходит нолный сбой системы обмена глутатиона. Кроме того, повышение активности анаэробной реакции ЛДГ и НАДН-зависимой реакции МДГ характеризует повышенный уровень анаэробных процессов в опухолевой ткани у больных с генотином С5ТМ1 0/0,

Таким образом, метаболические процессы в здоровой и опухолевой ткани легкого у больных раком легкого значительно различаются в зависимости от генотипа ОБТМГ Причем, для ряда метаболических процессов в здоровой и опухолевой ткани выявляются противоположные изменения. Так, метаболизм здоровой ткани легкого при генотипе 05ТМ1 0/0 характеризуется повышенным уровнем ряда пластических процессов с синтезом НАДФН и высокой активность ГР, Со стороны энергетических процессов обнаружено выраженное снижение активности анаэробных реакций, при повышении интенсивности субстратного потока но циклу трикарбоновых кислот, В опухолевой ткани при генотипе С5ТМ1 0/0 при сниженной активности ГР выявляется повышение интенсивности анаэробных процессов. Выявленные особенности ткани легкого как опухолевой, так еще и не подвергшейся морфологическим изменениям позволили выделить те метаболические процессы, которые качественно изменяют их интенсивность при перерождении ткани, С одной стороны полученные данные, характеризуют патогенез опухолевого процесса, с другой, делает данные ферментативных реакций перспективными в качестве цели воздействия при разработке новых

медикоментозных средств,

NAD- AND NADP-DEPENDENT DEHYDROGENASES ACTIVITY IN TUMOR CELLS AND HEALTHY LUNG TISSUE ACCORDING TO GSTM1 GENE POLYMORPHISM

P.V. Lapeshin, A, A, Savchenko, Yu.A. Dvchno, M.N. Moskovskih, E.V. Markova

30 male patients with lung cancer were examined to study the NAD- and NADP-depcndent dehydrogenises activity in tumor and healthy lung tissue according to GSTM1 gene polymorphism. Dehydrogenases activity was tested by bioluminescent method. Genetic polymorphism analysis ofGSTMl gene was determined by polymerase chain reaction. It was revealed, that in patients with GSTM1 0/0 genotype metabolism in healthy lung tissue is characterized with elevated level of plastic processes with NADF synthesis and high Glutathione reductase activity. Activity of anaerobic reactions was decreased, tricarboxylic acids cycle was activated. In tumor lung tissue genotype GSTM1 0/0 is characterized with depressed Glutathione reductaze activity and activated anaerobic processes.

Литература

1, Баранов B.C., Баранова E.B., Иващенко Т.Э., Асеев М,В, Геном человека и гены '"предрасположенности", Введение в нредикгивную медицину,-СПб,: "Интермедика", 2000, - 271 с.

2, БелогубоваЕ.В., Того А.В., Кондратьева Т,В и др, // Воир. онкологии, -2000, -Т.46, №5, -С.549-554,

3, Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

4, Двойрин В.В., Трапезников Н.Н. // Вестн, ОНЦ РАМН. - 1996, - №2, - С.3-12.

5. Перельман М, //Врач, -2001, -№9. -С.11-16.

6. Румянцева О.А,, Маркова Е.В., Титова Н.М., Jla-нешин ПВ. Полиморфизм генов глутатион-S-трансферазы класса Ml и цитохрома Р-450А1 здоровых жителей города Красноярска и больных раком легкого // Деионир. в ВИНИТИ, 03.10.2003, Ш761-В2003, - 44 с.

7. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. // Лаб. дело. - 1989. -№11.-0.23-25.

8. Bilello K.S., Murin S„ Mattay R.A. // Clin. Chest. Med. - 2002. - Vol.23, N. 1. - P. 1-25.

9. Hemminki K., Zhang H,, Czene K. //Int. J. Cancer. -2003. - Vol. 105, N.5. - P.692-700,

10. Jefieries H,, Coster J., Khalil A. et al. // ANZ J. Surg, -2003. - Vol.73, N.7.-P.517-522.

11. Kiyohara C., Wakai K,, Mikami H. et al. // Int. J. Cancer. - 2003. - Vol. 107, N.I. -P.139-144.

12. Ma J.Y., Rengasamy A., Frazer D. et al. // Environ. Health Perspect -2003. - Vol.lll, N9. - P. 1215-1221.

13. Matsubara S., Matsubara D,, lshibashi T,, Takiza-wa T. // Eur, J. Histochera. - 2003. - Vol.47, N.2. -P. 173-176.

14. McCammon M.T., Epstein C.B., Przybyla-ZawislakB, et al. // Mol. Biol. Cell. - 2003. - Vol. 14, N.3. -P.958-972.

15. Seidegard J., Pero R.W., Markowitz M.M. et al. // Carcinogenesis. - 1990. - Vol.ll. - P.33-36.

16. Strange R.S., Mathereo B,, Faulder J.C. et al. // Carce-nogenesis. - 1991. - Vol. 12. -P.25-28.

О ВИННИК Ю.С., ДУНАЕВСКАЯ С.С., ЯКИМОВ С.В., КАРАПЕТЯН Г.Э. -

ВЛИЯНИЕ АСКОРБАТ ХИТОЗАНА НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ СТАТУС БОЛЬНЫХ С ГНОЙНЫМИ РАНАМИ

Ю.С. Винник, С.С. Дунаевская, С. В. Якимов, Г.Э. Карапетян.

Резюме. Исследованы показатели активности дегидрогеназ крови больных с гнойными ранами на фоне применения аскорбат хитозана. Обнаружено, что данный метод вызывает усиление обменных процессов в клетках. Возрастает поступление на цикл Кребса субстратов с аминокислотного обмена, что приводит к повышению утилизации глюкозы в ПФП. Параллельное повышение активности ГР и Г6ФДГ в свою очередь влияет на процесс пролиферации и блает-трансформации клеток.

Ключевые слова: гнойные раны, метаболический статус, лечение аскорбат хитозана.

В настоящее время во всем мире отмечается возрастание интереса к композитным полимерам из коллагена и хитозана, которые высоко совместимы с тканями, обладают антиоксидантными свойствами.

Хитозан очень близок по структуре к мукопо-лисахаридам клеточных оболочек и внеклеточного вещества различных органов человека (гиалу-роновая кислота, хондроитин), является нетоксичным высокомолекулярным аминополисахари-дом. способным к биологической деструкции до обычных для организма веществ (^ацетилглю-козамин или глюкозамин) под действием амилазы и лизоцима. Являясь аналогом мукополисахари-дов. проявляет высокий мукоадгезивный эффект, стимулирует макрофаги, активирует образование цитокинов, подавляет фиброз, хорошо сочетается с альбумином, коллагеном, полисахаридами.

Целью данного исследования явилось изучение влияния аскорбат хитозана на метаболическую активность организма больных с гнойными ранами.

При этом в последние годы появилась тенденция к увеличению частоты затяжных форм инфекции и осложнений, что. как предполагается, связано с ростом в популяциях числа людей с им-мунодефицитными состояниями. Одним из перспективных направлений, позволяющих оценивать иммунологическую реактивность организма, является исследование метаболизма клеток цельной крови. Доказано, что у людей с иммунодефицитами снижается активность ряда окислительновосстановительных ферментов и понижается

внутриклеточная концентрация АТФ. К числу наиболее информативно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма можно отнести несколько дегидрогеназ.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ) является ключевым ферментом пентозофосфатного пути - от этого фермента зависит, подвергнется ли глюкоза гликолизу или будет утилизироваться в ПФП. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа достаточно тесно взаимосвязана с ферментами антиок-сидантной защиты: например, известно о кофак-торной взаимосвязи между Г6ФДГ и глютатион-редуктазы (ГР).

Глицерол-З-фосфатдегидрогеназа (ГЗФДГ) существует в двух формах - цитоплазматической и внутримитохондриальной, В цитоплазме осуществляет взаимосвязь между системой липидного обмена и гликолизом.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует реакцию, находящуюся на разветвление анаэробного и аэробного превращения пиру вата. В результате аэробной реакции ЛДГ нарабатывается основное количество НАДН.

Две изоцитратдегидрогеназы (НАД- и НАДФ-зависимая ИЦДГ) контролируют метаболизм соответствующего субстрата цикла трикарбоновых кислот. Активность фермента НАДИЦДГ отражает субстратный поток по циклу, обусловливающий поддержание необходимой концентрации НАДН и энергетического потенциала митохондрий.

Два фермента участвуют в реакциях метаболизма малата. НАДМДГ является одним из фер-