Изучение полиморфизма гена PRKAG3 свиней белорусской мясной и крупной белой пород

быть в 1,5 - 2 раза дешевле тракторных. Наиболее востребованы для выполнения этих работ лошади белорусской упряжной породы, что и обуславливает целесообразность их дальнейшего использования.

Установлено, что на перспективу необходимо сохранить имеющийся основной тип породы и вести работу по созданию нового тяжелоупряжного типа. Будет осуществляться как чистопородное разведение по линиям лошадей сформированного генеалогического комплекса, так и вводное скрещивание не достигших типового стандарта маток с производителями литовской, русской тяжеловозной, латвийской упряжной пород. Приведены параметры лошадей нового типа, основные приемы работы по его созданию.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гладенко, В. К. Белорусская лошадь / В.К. Гладенко. Минск: Ураджай, 1976. 105с.

2. Белорусская упряжная лошадь и ее становление / М.А. Горбуков [и др.] // Коневодство и конный спорт. 2008. № 1. С.10-13.

3. Зоотехнические правила по определению продуктивности и племенной ценности животных: утв. Постановлением Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь № 81 от 30.11.2006 г. Минск, 2006. 54 с.

4. Калашников, В.В. Стратегия и тактика развития коневодства в Российской Федерации / В. В. Калашников // Коневодство и конный спорт. 2009. № 2. С. 2-5.

5. Красота, В.Ф. Разведение сельскохозяйственных животных / В. Ф. Красота, В.Т. Лобанов. М.: Колос, 1976. 416 с.

6. Рокицкий, П.Ф. Биологическая статистика / П.Ф. Рокицкий. Минск: Вышэйш. шк., 1973. 224 с.

7. Левин, В. М. Использование живого тягла в колхозах БССР / В.М. Левин. Минск: Гос. изд. БССР, 1957. 232 с.

8. Балтакменс, Р.А. Латвийская порода лошадей / Р.А. Балтакменс. Рига: Зи-натне, 1988. 220 с.

УДК 636.4.082.2

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА PRKAG3 СВИНЕЙ БЕЛОРУССКОЙ МЯСНОЙ И КРУПНОЙ БЕЛОЙ ПОРОД

Н.В. ЖУРИНА, М.А. КОВАЛЬЧУК, А.И ГАНДЖА, И.С. ПЕТРУШКО РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству» г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160

Введение. Интенсивная селекция на создание мясных генотипов в свиноводстве привела, наряду с положительным эффектом увеличения содержания мяса в туше, к отрицательным последствиям - снижению качества мяса и появлению пороков PSE и DFD.

G. Monin, P. Sellier [1], J. Naveau [2] были первыми, кто предположил существование главного гена (RN - rendement Napole), влияющего на технологические качества свинины. Данное предположение в дальнейшем было подтверждено Le Roy и др. [3]. Рядом исследований установлено, что доминантный аллель гена RN (RN-) связан с повышенным содержанием гликогена в мышцах, который после убоя животных

превращается в лактат, что приводит к снижению уровня рН и проявлению порока мяса PSE [4,5].

В 2000 году было установлено, что аллелю RN соответствует му-тантный аллель гена PRKAG3 (protein kinase AMP-activated у3 subunit) [6], который находится на 15-й хромосоме свиней [7] и кодирует регу-ляторную субъединицу у-АМФ-активируемой протеинкиназы (АМФК). АМФк - это фермент из семейства киназ, который модифицирует другие белки путем присоединения фосфатных групп к ним (фосфорилирование) и контролирует энергетический баланс клетки. Он активируется при значительном потреблении энергии клеткой (например, при физической нагрузке) и нарастании внутриклеточного уровня АМФ. В результате активации АМФК клетка переходит в энергосберегающее состояние. АМФК представляет собой гетеротример, который включает 3 субъединицы: альфа, бета и гамма [8]. Точковая мутация в гене PRKAG3 вызывает замену аргинина глутамином в позиции 200 (R200Q).

Мутантный аллель RN был идентифицирован у свиней породы гемпшир либо у животных с некоторой долей кровности данной породы во Франции [9], Мексике [10], Швеции с частотой встречаемости 0,50-0,72 [9,11], США - 0,63 [12].

Результаты исследований свидетельствуют об отрицательном влиянии доминантного аллеля RN-ra качество мяса свиней. Мясо, полученное от животных-носителей данного аллеля, характеризуется пониженной влагоудерживающей способностью [13], бледным цветом [12,14], низкими вкусовыми качествами [1,4,12,13,15,16]. Согласно данным K.D. Miller [12], D.S. Sutton [16], K.Lundstrom [4], P. LeRoy [13], уровень рН мяса, полученного от животных генотипов RN- RN- и RN-rn+ на 0,12-0,22 ниже, чем у свиней генотипа rn+rn+. S.J. Moeller и др. [14], K.D. Miller [17] отмечают более низкий уровень содержания внутримышечного жира в длиннейшей мышце спины животных, в генотипе которых присутствует аллель RN-.

Наряду с отрицательным эффектом аллеля RN- на качество мяса отмечается положительное влияние данного аллеля на показатели откормочной и мясной продуктивности свиней. Животные-носители доминантного аллеля, как правило, отличаются более высокой скоростью роста [13,18], выходом мяса [13,18,19], тонким шпиком [13,19]. В ряде исследований отмечается тенденция положительного влияния аллеля RN- на показатель площади «мышечного глазка» [13,14,18]. Положительная ассоциация доминантного аллеля RN- с показателями продуктивности свиней объясняет высокий уровень частоты встречаемости данного аллеля у свиней мясной породы гемпшир. По данным L. An-dersson [20], концентрация аллеля RN- находилась на уровне 70% у животных данной породы до момента реализации селекционных программ по снижению частоты мутации. Очевидно, данная мутация возникла у свиней породы гемпшир и была поддержана селекцией на повышение показателей мясной продуктивности.

В 2001 году D. Ciobanu et al. [7] сообщили еще об одной точковой мутации в гене PRKAG3, которая была идентифицирована в 199 кодо-не. Данная мутация вызывает замену валина изолейцином (V199I) в

аминокислотной последовательности АМФК. Фенотипический эффект мутантного аллеля PRKAG3I противоположен эффекту аллеля PRKAG3q, он детерминирует снижение содержания гликогена, лактата и повышение рН мяса и ассоциирован с более высокими показателями качества мяса. Наличие двух мутаций с ярко выраженными фенотипи-ческими эффектами свидетельствует о важной функциональной роли данного участка молекулы [20].

Цель работы - изучить полиморфизм гена PRKAG3 свиней белорусской мясной и крупной белой пород для разработки в последующем молекулярно-генетических маркеров, позволяющих повысить технологические качества свинины.

Материал и методика исследований. Исследования проводились в РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству». Объектами исследований были свиноматки, хряки-производители и ремонтные хрячки белорусской мясной и крупной белой пород, разводимые в РСУП СГЦ «Заднепровский» Витебской области, в также откормочный молодняк белорусской мясной породы из РСУП «СГЦ «Заднепровский», ЗАО «Клевица» и РУП «Заречье» Минской области.

Ядерную ДНК выделяли из биопроб ткани перхлоратным методом [21].

Для проведения ПЦР использовали реакционную смесь конечным объемом 25 мкл, включающую 5-25 нг ДНК, праймеры - по 15 пМ каждого, по 200 мкМ каждого из дНТФ, 1х буфер (10 мМ трис рН 8,6, 50 мМ KCl, 0,1 % tween-20), 1,5 мМ MgCl2 и 1,3 ед. акт. Taq-полимеразы.

Для рестрикции амплифицированного фрагмента гена PRKAG3 ис-

пользовали эндонуклеазы V199I) (рис. 1).

BsrBI (замена R200Q) и BsaHI (замена

А

1 2 3 4 5 6 7 8 М

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 1. Электрофореграммы фрагментов рестрикции ДНК свиней с генотипами: (А) PRKAG3VV (дорожки 1, 2, 5 и 6), PRKAG3VI (дорожки 3, 4 и 7) и PRKAG3II (дорожка 8); (Б) PRKAG3RR; М - маркерная ДНК pBR322/ BsuRI.

Б

Продукты ПЦР и рестрикции разделяли электрофоретически в ага-розном геле, окрашенном бромистым этидием. Фракции нуклеиновых кислот в гелях выявляли на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 260 нм при помощи компьютерной видеосистемы и программы «УТТгап». Длину фрагментов рестрикции определяли относительно маркерной ДНК плазмиды рБЯЗ22, расщепленной рестриктазой ВБиЯ!

Биометрическую обработку данных проводили по общепринятым методикам [22].

Результаты исследований и их обсуждение. В результате проведенных исследований были установлены генотипы по гену РЯКЛвЗ свиней различных половозрастных групп белорусской мясной и крупной белой пород, разводимых в РСУП СГЦ «Заднепровский» (табл. 1), а также откормочного молодняка белорусской мясной породы из ЗАО «Клевица», РУП «Заречье» и РСУП СГЦ «Заднепровский» (табл. 2).

При изучении 200 кодона гена РЯКЛвЗ (замена Я200Р) мутантный аллель РЯКЛвЗ0, детерминирующий развитие порока мяса Р8Б, не был идентифицирован, изучаемые животные были гомозиготны по аллелю дикого типа (РЯКЛвЗ^). Это соответствует результатам исследований зарубежных ученых, согласно которым данный аллель распространен в основном у свиней породы гемпшир либо у животных с некоторой долей кровности данной породы [9-12]. Полученные данные позволяют сделать предварительные обнадеживающие выводы об отсутствии у свиней белорусской мясной и крупной белой пород, разводимых в Беларуси, мутации РЯКЛвЗ0, отрицательно влияющей на качество мяса. Однако результаты исследований необходимо подтвердить на более обширном поголовье животных.

ДНК-тестирование свиней по 199 кодону гена РЯКЛвЗ (замена У1991) позволило идентифицировать аллель дикого типа (РЯКЛОЗУ) мутантный аллель (РЯКЛвЗ1) и три генотипа: РЯКЛвЗУУ, РЯКЛвЗ, РЯКЛвЗ11 (табл. 1).

Таблица 1. Генетическая структура популяций свиней белорусской мясной и крупной белой пород по гену РККАОЗ

Порода Половозрастная группа п Частота встречаемости

генотипов аллелей

УУ VI II У I

БМ С 116 0,578 ± 0,046 0,388 ± 0,045 0,034 ± 0,016 0,77 ± 0,0З 0,23 ± 0,0З

БМ Х П 54 0,426 ± 0,067 0,481 ± 0,068 0,093 ± 0,0З9 0,67 ± 0,04* 0,33 ± 0,04*

БМ Р Х 49 0,286 ± 0,065*** 0,612 ± 0,069 ** 0,102 ± 0,04З 0,59 ± 0,05** 0,41 ± 0,05**

В среднем по породе 219 0,475 ± 0,0З4 0,461 ± 0,0З4 0,064 ± 0,016 0,71 ± 0,02 0,29 ± 0,02

КБ С 69 0,609 ± 0,059 0,391 ± 0,059 - 0,80 ± 0,0З 0,20 ± 0,0З

КБ Х П 4З 0,535 ± 0,076 0,465 ± 0,076 - 0,77 ± 0,04 0,23 ± 0,04

КБ Р Х 6 0,ЗЗЗ ± 0,192 0,667 ± 0,192 - 0,67 ± 0,1З 0,33 ± 0,1З

В среднем по породе 118 0,568 ± 0,045 0,432 ± - 0,78 ± 0,22 ±

Примечание: С - свиноматки, ХП - хряки-производители, РХ - ремонтные хрячки. При сравнении показателей частот встречаемости с таковыми в группе свиноматок разница достоверна при: *Р<0,05; **Р<0,01; ***P<0,001.

Установлены отличия по уровню встречаемости предпочтительного аллеля PRKAG3I и генотипа PRKAG3 в зависимости от половозрастной группы свиней. Наибольшим значением концентрации аллеля PRKAG3 характеризовались группы хряков-производителей и ремонтных хрячков белорусской мясной породы (0,33 и 0,41 соответственно), которые превосходили по данному показателю группу свиноматок на 0,10 (P<0,05) и 0,18 (P<0,0l) соответственно. Частота встречаемости генотипа PRKAG3II изменялась от 0,034 в группе свиноматок до 0,102 в группе хрячков. Сходная тенденция выявлена и в популяции свиней крупной белой породы. Концентрация аллеля PRKAG3I в группе хряков-производителей и ремонтных хрячков была на 0,03 и 0,13 выше, чем в группе свиноматок. Это связано с различными направлениями селекции хряков и свиноматок. В то время как хряки-производители селекционируются на повышение мясных качеств, с которыми ассоциирован аллель PRKAG3I, при отборе свиноматок, прежде всего, учитываются показатели репродуктивных признаков.

Полученные данные свидетельствуют о межпородных различиях в генетической структуре по гену PRKAG3. Порода мясного направления продуктивности - белорусская мясная - характеризовалась более высокой частотой встречаемости аллеля PRKAG3i (0,29), уровень которой соответствует, согласно данным российских исследователей [23], концентрации этого аллеля у свиней мясных пород: ландрас (0,23), йоркшир (0,30), дюрок (0,44). Кроме того, генотип PRKAG3 в популяции свиней крупной белой породы не идентифицирован, в то время как в популяции животных белорусской мясной породы он в среднем встречался с частотой 0,064. В группе свиноматок, хряков-производителей и ремонтных хрячков белорусской мясной породы концентрация аллеля PRKAG3I была соответственно на 0,03, 0,1 и 0,08 выше, чем в соответствующих половозрастных группах свиней крупной белой породы.

ДНК-тестирование откормочного молодняка белорусской мясной породы показало, что концентрация аллелей PRKAG3 и PRKAG3 в различных группах животных существенно не различалась и находилась на уровне 0,69-0,74 и 0,26-0,31 соответственно. Частота встречаемости генотипа PRKAG3n изменялась от 0 в РСУП СГЦ «Заднеп-ровский» до 0,088 в ЗАО «Клевица». Отсутствие животных с предпочтительным генотипом PRKAG3n в группе из РСУП СГЦ «Заднепровский», по-видимому, связано с малочисленной выборкой (n = 10) (табл. 2).

Таблица 2. Частота встречаемости генотипов и аллелей гена РККА03 в различных группах откормочного молодняка белорусской мясной породы

Частота встречаемости

Хозяйство n генотипов аллелей

VV VI II V I

РСУП «СГЦ Заднепровский» 10 0,400 ± 0,15 0,600 ± 0,15 - 0,70± 0,10 0,30± 0,10

ЗАО «Клевица» 34 0,471 ± 0,441 ± 0,088± 0,69± 0,31±

0,09 0,09 0,05 0,06 0,06

РУП «Заречье» 45 0,555 ± 0,07 0,378 ± 0,07 0,067± 0,04 0,74± 0,05 0,26± 0,05

В среднем 89 0,506 ± 0,05 0,427 ± 0,05 0,067± 0,03 0,72± 0,03 0,28± 0,03

Заключение. 1. При изучении 200 кодона гена РЯКЛвЭ у исследуемых животных мутантный аллель РЯКЛвЗ0 не выявлен.

2. При изучении полиморфизма гена РЯКЛвЭ по точковой мутации в 199 кодоне идентифицированы аллели РЯКЛвЗУ, РЯКЛвЗг и три генотипа: РЯКЛвЗУУ, РЯКЛвЗ^, РЯКЛОЗп

3. Наибольшим значением концентрации аллеля PRKЛG3I и генотипа РЯКЛОЗп характеризовались группы хряков-производителей и ремонтных хрячков в сравнении со свиноматками.

4. Концентрация аллеля PRKAG3I и генотипа PRKЛG3II в популяции животных белорусской мясной породы составила 0,29 и 0,064 соответственно. В популяции свиней крупной белой породы генотип PRKЛG3II не идентифицирован, а частота встречаемости аллеля PRKAG3I находилась на уровне 0,22.

5. Частота встречаемости аллеля PRKAG3I в различных группах откормочного молодняка белорусской мясной породы существенно не различалась и составила в среднем 0,28.

Результаты работы послужат базой для проведения дальнейших исследований, направленных на разработку ДНК-маркеров мясной продуктивности свиней.

ЛИТЕРАТУРА

1. Monin, G. Pork of low technological quality with a normal rate of muscle pH fall in the immediate postmortem period: The case of the Hampshire breed / G. Monin, P. Sellier // Meat Sci. 1985. № 13. P. 49-63.

2. Naveau, J. Contribution à l'étude du determinisme genetique de la qualité de la viande porcine. Heritabilité du rendement technologique Napole / J. Naveau // J. Rech. Porcine en France, 1986. № 18. P. 265-276.

3. Evidence for a new major gene influencing meat quality in pigs / P. LeRoy [et al.] // Genet. Res. 1990. №2 55. P. 33-40.

4. Lundstrom, K.A. Effect of the RN gene on technological and sensory meat quality in crossbred pigs with Hampshire as terminal sire / K. Lundstrom, A. Anderson, A. Hansson // Meat Sci, 1996. № 42. P. 145-153.

5. The effect of the Halothane and Rendement Napole genes on carcass and meat quality characteristics of pigs / D. N. Hamilton [et al.] // J. of Anim. Sci. 2000. № 78. P. 2862-2867.

6. A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen in pig skeletal muscle / D. Milan [et al.] // Science. 2000. № 288. P. 1248-1251.

7. Evidence for New Alleles in the Protein Kinase Adenosine Monophosphate-Activated3-Subunit Gene Associated With Low Glycogen Content in Pig Skeletal Muscle and Improved Meat Quality / D. Ciobanu [et al.] // Genetics. 2001. № 159. P. 1151-1162.

8. Hanks, S. K. The Eukaryotic Protein Kinase Superfamily: Kinase (Catalytic) Domain Structure and Classification / S. Hanks K., T. Hunter // FASEB J. 1995. Vol. 9. P. 576-596.

9. Fernandez, X. major gene affecting pork quality: the RN gene / X. Fernandez, G. Monin // A Meat Focus. 1994. P. 332.

10. Microstructere of porcine meat with the Rendement Napole gene / A.D. Alarcon-Rojo [et al.] // J. An. Sci Pap. And Rep. 2007. Vol. 25. № 4. P. 259-267.

11. Technological meat quality and the frequency of the RN-gene in purebred Swedish Hampshire and Yorkshire pigs / A. C. Enfalt [et al.] // 40th IcoMST. Netherlands, 1994.

12. Miller, K. D. The detection and characterization of pigs with differing glycolytic potential levels within United States Swine populations / K. D. Miller // Ph.D. Thesis, University of Illinois, Urbana-Champaign. Illinois, 1998.

13. Effect of the RN genotype on growth and carcass traits in pigs / P. LeRoy [et al.] // 47th EAAP, Lillehammer, Norway. 1996.

14. Rendement Napole gene effects and a comparison of glycolytic potential and DNA ge-notyping for classification of Rendement Napole status in Hampshire-sired pigs / S. J. Moeller [et al.] // J. Anim. Sci. 2003. № 81. Р. 402-410.

15. Technological meat quality and the frequency of the RN-gene in purebred Swedish Hampshire and Yorkshire pigs / A. C. Enfalt [et al.] // 40th IcoMST, The Hague, Netherlands. 1994.

16. Sutton, D.S. The meat quality and processing characteristics of RN carrier and non-carrier pigs / D. S. Sutton // Ph. D. Thesis, University of Illinois, Urbana, IL. 1997.

17. Frequency of the Rendement Napole RN- allele in a population of American Hampshire pigs / K. D. Miller [et al.] // J. Anim. Sci. 2000. № 78. Р. 1811-1815.

18. Comparison of non-carrier and heterozygous and heterozygous carriers of the RN- allele for carcass composition, muscle distribution and technological meat quality in Hampshire-sired pigs / A. C. Enfalt [et al.] // Livestock Prod. Sci. 1997. № 47. Р. 221.

19. Growth performance, carcass composition, quality, and enhancement treatment of fresh pork identifed through deoxyribonucleic acid marker-assisted selection for the Rendement Napole gene / C.C. Carr [et al.] // J. An. Sci. 2006. №2 84. Р. 910-917.

20. Andersson, L. Identification and characterization of AMPK gamma3 mutations in the pig / L. Andersson // Biochem Soc Trans. 2003. Vol. 31. №2 1. Р. 232-235.

21. Методические рекомендации по применению ДНК-тестирования в животноводстве Беларуси / И. П. Шейко [и др.]. Жодино, 2006. 26 с.

22. Животовский, Л.А. Интеграция полигенных систем в популяциях / Л.А. Жи-вотовский. М., 1984.

23. Сохранение локальных пород / Н. А. Зиновьева [и др.] // Животноводство России. 2006. № 6. С. 46-47.

УДК 619:577.1:619:612.015:636.2

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ В РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНАХ ТЕЛОК ПРИ ВЛИЯНИИ ГОРМОНАЛЬНО-ВИТАМИННИХ ПРЕПАРАТОВ

Л.Н. КОВАЛИВ Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С.З.Гжицкого г. Львов, Украина, 79050

Введение. Нарушение норм сбалансированного питания животных ведет к понижению регуляторных процессов в органах и тканях, уровня функционирования желез внутренней секреции, гипофункции яичников и матки, снижает воспроизводимую способность животных, увеличивает длительность сервис-периода с явлениями гипофункции воспроизводимых органов [2,7-11].

В биотехнологическом процессе при трансплантации эмбрионов животным предложены различные методы индукции полиовуляция, которые отличаются между собой схемой введения препаратов и природой вводимых гонадотропинов [6-11]. Однако не всегда можно получить надлежащий эффект, который зависит от эндокринного и био-