УГЛЕРОДНЫЙ СОРБЕНТ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ, ДЕТОКСИКАЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
CARBON SORBENT WITH ANTIOXIDANT, DETOXIFYING PROPERTIES AND METHOD FOR ITS PREPARATION

Изобретение относится к области получения и применения углеродных сорбентов медицинского назначения, отличающихся комплексным характером своего действия и обладающих наряду с детоксикационными также и антиоксидантными свойствами.
2
2
Известно, что активные формы кислорода (АФК) составляют отдельную систему в организме, которая выполняет определенные физиологические функции, но при этом влияет и на многие патологические процессы. Главным системообразующим фактором является текущий уровень АФК в тканях. Система АФК самоорганизована за счет положительных и отрицательных связей: имеется множество механизмов контроля - уровня генерации АФК в митохондриях и микросомах, контроля активности оксидаз и антиоксидантных ферментов тканей, суммарного уровня антиоксидантной активности (АО) крови [Активные формы кислорода как система: значение в физиологии, патологии и естественном старенииВ. И. Донцов, В. Н. Крутько, Б. М. Мрикаев, С. В. Уханов Труды ИСА РАН 2006. Т. 19. С.50-69]. В процессе естественного старения организма и при протекании различных патологических процессов изменяются элементы и состояние системы АФК. Кроме 4-х электронного восстановления О до НО в дыхательной цепи митохондрий происходит и 1-, 2-, 3-электронное восстановление с образованием АФК по реакции:
2+
2+
–
1
-
–8
–
-
2+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Донорами электронов являются металлы с переменной валентностью (главным образом Fe, а также Cu и другие), входящие в состав ряда ферментов. 95–98 % вдыхаемого О расходуется на выработку энергии и окислительный метаболизм субстратов, 2–5% О переходит в активные формы кислорода [Кулинский В. И., 1999; Cheesman K. H., Slater T. F., 1993]. К важнейшим активным формам кислорода относятся: супероксидный радикал *O синглетный кислород О, гидроксильный *ОН и пероксидный HO* радикалы, перекись водорода НО, пероксидный ион HO, гипохлорит HOCl. Средняя концентрация их в тканях человека составляет 10 мМ. При снижении эффективности антиоксидантных систем организма АФК могут оказывать повреждающее воздействие на клетки и вызывать различные заболевания [Зайцев В. Г., 1998; Cross A. R., Jones O. T. G., 1991; Sandhu S. K., Kaur G., 2003]. В фагоцитах комплекс никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидаза (НАДФН-оксидаза) обеспечивает «окислительный взрыв» - быстрое избыточное образование супероксидного анион-радикала *O в ходе стимуляции неспецифической защиты организма для разрушения бактерий [Маянский А. Н., Маянский Д. Н., 1983; Скулачев В. П., 1996; Khodr B., Khalil Z., 2001; Orrienis S., McConcey D. J., Nicotera P., 1998]. Фагоцит выделяет в окружающую среду АФК и ряд ферментов, среди которых миелопероксидаза катализирует реакцию образования гипохлорита из аниона хлора и перекиси водорода. Кроме того, в присутствии ионов железа происходит образование *ОН радикала из перекиси водорода и гипохлорита. В присутствии металлов с переменной валентностью эти продукты запускают цепные реакции окислительной деградации биомолекул с образованием липидных радикалов, пероксидов и гидропероксидов [Кулинский В. И., 1999; Владимиров Ю. А., 2000]. АФК вызывают также окисление нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК и белков [Зенков Н. К., Меньшикова Е. Б., 1993; Bar-Or D., Sohal R. S., Swenson I., Brunk U. T., 1990; Sohal R. S., Dubey A. M., 1994]. Дисмутация О анион-радикалов под действием супероксиддисмутазы (СОД) в биологических тканях ведет к образованию перекиси водорода НО, способной легко проникать через мембраны клеток. В присутствии ионов переходных металлов (например Fe) перекись водорода может давать высоко активный гидроксильный радикал (ОН*), обладающий наибольшей цитотоксичностью среди АФК [Владимиров Ю. А., 2000]. Это определяет его преимущественно местное действие. При этом главными видами повреждений биомолекул являются: отрыв атома водорода (таким образом повреждается лецитин - компонент биологических мембран, а также сахара в составе нуклеозидов ДНК); присоединение к молекулам по двойным связям (взаимодействие с пуринами и пиримидинами ДНК и РНК, перенос электронов также является важным в повреждающем действии *ОН [Гамалей И. А., Клюбин И. В., 1996; Dizdaroglu M., 2002; Klungland A., Rosewell I., Zhang S., 2002]. Прямое повреждение ДНК, при этом, характеризуется разрывом цепи, окислением оснований, их модификацией, образованием гидропероксидов ДНК, повреждением хромосом. С белками *ОН образует гидропероксиды, что может изменить третичную структуру белков и даже вызывать их агрегацию и денатурацию. Это приводит к нарушению ферментативной и регуляторной активности многих процессов.
2
2
2
2
В организме пероксид водорода разрушает фермент каталаза с образованием безопасных продуктов по реакции: 2НО → 2НО + О[Sedlak E., Musatov A. Inner mechanism of protection of mitochondrial electron-transfer proteins against oxidative damage. Focus on hydrogen peroxide decomposition // Biochimie. 2017. V.142. Р.152-157.]. Каталаза присутствует в разных тканях организма человека и животных. Максимальные количества ее обнаруживаются в эритроцитах, печени и почках.
Все АФК являются окислителями клеточных компонентов и в больших количествах необратимо повреждают клетки [Владимиров Ю. А., 2000]. Снижение активности НАДФ*Н-оксидазы в фагоцитах приводит к инфекции и сепсису [Bone R. S., 1992; Cohen J., 1995; Xin M. G. et al., 2003]. Кроме того, АФК способны стимулировать апоптоз - программируемую гибель клеток путем раскрытия каналов клеточной мембраны для белка, находящегося в межмембранном пространстве и запускающего этот процесс. Известно, что введение каталазы в клетку прерывает любые формы апоптоза [Лю Б. Н., 2000; Хансон К. П., 1999; Pollack M., 2001; Zhang J., 2002]. Гипоксия, типичная для процессов старения, является одной из самых частых причин гибели клеток. Установлено, что это связано с нарушением барьерных свойств биологических мембран вследствие перекисного окисления липидов. Анализ данных об участии АФК в механизмах старения позволяет ряду авторов утверждать, что повреждающее действие АФК на макромолекулы приводит к развитию ряда серьезных возрастных патологий: рак, сердечно-сосудистые заболевания, возрастная иммунодепрессия, дисфункция мозга, катаракта и др. [Кольтовер В. К., 2000; Cutler R. G., Rodrigues H., World H., 2003].
Защита организма от АФК осуществляется функционированием антиоксидантной системы (АОС). АОС включает низкомолекулярные антиоксиданты (АО) и систему ферментов. В организме среди антиоксидантных ферментов выделяют три линии защиты: 1) супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза, 2) глутатион-пероксидаза и глутатионтрансфераза 3) селеновая глутатионтрансфераза [Кулинский В. И., 1999]. В инактивации АФК в организме участвуют также многие другие молекулы и ферментные системы. Классические в настоящее время антиоксиданты - витамины А, С, Е и каротиноиды, активны почти ко всем АФК без участия ферментов [Sharma S., Sharma R., 2001]. АО перехватывают АФК и восстанавливают их [Jaruga P. et al., 2002; Laurnzi V., Melino G., Savini M., 1994]. Гидрофильные АО (восстановленный глутатион и аскорбиновая кислота, карнозин, ансерин) защищают вещества гиалоплазмы и матрикса митохондрий, а гидрофобные АО (витамины Е и А и другие каротиноиды) локализованы в мембране и там же инактивируют АФК. Глутатион, присутствуя в клетках в высоких концентрациях, является акцептором ОН* радикала и синглетного кислорода, а также кофактором глутатион-пероксидазы и глутатионредуктазы. Это главный восстановитель клетки, его концентрация (1–10 мМ) выше, чем большинства органических веществ. Он прямо восстанавливает АФК, перекисные соединения и обезвреживает вторичные метаболиты окисления. На практике применяются модифицированные препараты СОД и каталазы [Максименко А. В., 1993].
Однако способы «тушения» АФК антиоксидантами и фармакокоррекция АОС организма часто оказываются мало эффективными. Активность АОС организма очень высока и специфична. Более перспективными представляются способы повышения активности СОД, каталазы и пероксидазы - главных ферментов АОС. Кроме широко используемого подхода ограничения уровня АФК, в последнее время все шире стали применяться методы активной тренировки АО системы и АФК за счет индукции умеренной генерации АФК, что ведет к повышению мощности всей АО системы и системы контроля АФК и приводит к общей адаптации и биостимуляции. Это использование озона, нормобарической гипоксии, кислородотерапия, применение электрохимически-активированных соединений (ЭХАС), новых препаратов типа окислительно-восстановительного энерго-буфера («Галавит») и др.
Нарушения АО системы и АФК, в той или иной мере, возможно, видимо, при любых формах патологии, поэтому контроль АО активности тканей и снижение гипергенерации АФК является важной формой лечения и профилактики широкого спектра заболеваний.

Известным методом воздействия на систему АФК является иммуномодулирующее и противовоспалительное средство Галавит (Р N000088/02, 2010, ООО "СЭЛВИМ", Россия, активное вещество - аминодигидрофталазиндион натрия). Это достаточно простой по химический структуре препарат, показавший к настоящему времени свое высокое лечебное действие при самых различных патологических состояниях, запатентовано большое количество способов лечения на его основе. Механизм действия препарата связан со способностью воздействовать на функционально-метаболическую активность фагоцитарных клеток (моноцитов/макрофагов, нейтрофилов, естественных киллеров). Показано снижение синтеза ДНК, РНК и белка (в 2–5 раз) макрофагов при отсутствии влияния на дыхание макрофагов. Кроме того, Галавит нормализует антителообразование, опосредовано стимулирует выработку эндогенных интерферонов (ИФН-α, ИФН-γ), ингибирует избыточный синтез активных форм кислорода. Используется как противовоспалительное, антидиаррейное и детоксикационное средство при инфекциях ЖКТ, дыхательной системы, урогенитальных, туберкулезе и сибирской язве. Галавит стимулирует бактерицидную активность нейтрофильных гранулоцитов, усиливая фагоцитоз и повышая неспецифическую резистентность организма к инфекционным заболеваниям.
с
9
Авторами Зозуля Ю. В., Рожковым О. А. и др. разработана кормовая комплексная биологически активная добавка для животных и птиц [патент 2708161, 2019]. В состав добавки включены порошок цеолита, пробиотик, состоящий из биомассы молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus или или Bifidobacterium longum или Streptococcus termophilus и др.  титром не менее 10 КОЕ/мл, пресноводную микроводоросль хлореллу, глюкозу кормовую и отруби злаковые.
0
Известны нанокомпозиты селена на основе природных гепатотропных галактозосодержащих полисахаридных матриц [патент РФ 2557992]. Они представляют собой водорастворимые порошки оранжево-красного цвета, содержащие наночастицы нуль-валентного селена (Se) с размером частиц 1-100 нм с количественным содержанием 0.5 - 60 мас.% и обладающие антиоксидантной активностью. Нанокомпозиты селена обеспечивают направленную доставку препарата к клеткам печени, а также повышение усвояемости препарата и снижение токсического действия селена.
Известна биологически активная добавка (БАД), обладающая антиоксидантными свойствами [патент РФ 2652179]. БАД к пище представляет собой порошок, полученный из вторичных ресурсов переработки тыквы путем их обработки в электромагнитном поле сверхвысокой частоты с частотой 2450 МГц, сушки, охлаждения и измельчения. В качестве вторичных ресурсов переработки тыквы берут вторичные ресурсы, образующиеся в процессе протирки тыквы при производстве пюре. При этом обработку в электромагнитном поле сверхвысокой частоты проводят при темпе нагрева до температуры 55-60°С, равном 1,0-1,3°С/с.
Все эти воздействия относятся к методам активной тренировки АО системы и АФК за счет индукции умеренной генерации АФК, что ведет к повышению действия всей АО системы и системы контроля АФК, и приводит к общей адаптации и биостимуляции.
На сегодняшний день зарегистрированных и запатентованных сорбентов комплексного действия с детоксикационными и антиоксидантными свойствами не известно.
В связи с этим большой интерес представляет создание сорбентов медицинского назначения с антиоксидантными свойствами, так как они способны не только адсорбировать и выводить из организма избыточные количества токсических веществ благодаря своим адсорбционным свойствам и пористой структуре, но и способны ускорять разложение пероксида водорода и повышать активность ферментной защиты организма за счет биоспецифических свойств нанесенных модификаторов [Алыкова Т.В., Алыков Н.Н., Алыков Н.М. и др. Энтеросорбент с жесткофиксированными ферментами-антиоксидантами // Экология и промышленность России. 2015. Т.19. №6. С.55-57; В. И. Донцов, В. Н. Крутько, Б. М. Мрикаев, С. В. Уханов Активные формы кислорода как система Труды ИСА РАН 2006. Т. 19 С. 50-69].
//
Известно, что углеродные материалы являются катализаторами разложения пероксида водорода. Способность активированных углей, ксерогелей углерода, углеродных нанотрубок, оксида графена, графита катализировать реакцию разложения пероксида водорода описана в работе Ribeiro R.S., Silva A.M.T., Figueiredo J. L. et al. The influence of structure and surface chemistry of carbon materials on the decomposition of hydrogenperoxide // Carbon. 2013. (62). Р.97-108. Показано, что классические активированные угли, обработанные концентрированной серной кислотой, проявляют наибольшую активность в данной реакции. Химическое модифицирование поверхности углеродных материалов различными веществами способствует увеличению поверхностных функциональных групп, которые регулируют образование и токсичность активных форм кислорода и хлора [Qiu Y., Wang Z., Owens C.E. et al. Antioxidant chemistry of graphene-based materials and its role in oxidation protection technology // Nanoscale. 2014. (6). Р. 11744-11755]. Углеродные наноматериалы могут поглощать и нейтрализовать активные формы кислорода и хлора в результате реакций с поверхностными функциональными группами, гетероатомами, а также переходными металлами [Ruiz V., Yate L., García I. et al.Tuning the antioxidant activity of graphene quantum dots: Protective nanomaterials against dye decoloration Carbon. 2017. (116). Р. 366-374].
Углеродные сорбенты обладают развитой пористой структурой и являются эффективными материалами, применяемыми в медицине для детоксикации организма [Рачковская Л.Н. Углеродминеральные сорбенты для медицины. - Новосибирск, 1996. - 234с.; Дорожкин В. И. Фармакокоррекция иммунотоксического действия пестицидов: монография М. : НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА, 2018. 200 с.].
Для повышения эффективности биоспецифического действия сорбентов проводят их модифицирование биологически активными веществами.
Известно, что гликолевая кислота (ГК) способна вступать в реакцию поликонденсации с образованием олигомера, обладающего противовоспалительными и антибактериальными свойствами [Schwarz, K., Epple, M. А detailed characterization of polyglycolide prepared by solid-state polycondensation reaction / K. Schwarz, M. Epple // Macromol.Chem.Phys. - 1999. - 200. - P.2221-2229 ; Comparative analysis of transcriptional and physiological responses of Bacillus cereus to organic and inorganic acid shocks / Maarten Mols [et al.] // International Journal of Food Microbiology. 2010. V.137. P.13-21; Kornhauser, Andrija Applications of hydroxy acids: classification, mechanisms, and photoactivity / Andrija Kornhauser, Sergio G Coelho, Vincent J Hearing // Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 2010. №3. С.135–142; Stevanovic´, Magdalena Multifunctional PLGA particles containing poly(L-glutamic acid)-capped silver nanoparticles and ascorbic acid with simultaneous antioxidative and prolonged antimicrobial activity / Magdalena Stevanovic´, Ines Bracko, Marina Milenkovic // Acta Biomaterialia. 2014. Vol. 10. Р. 151–162]. Кроме того, она характеризуется отсутствием токсичности, биосовместимостью и находит широкое применение в медицине.
2
3
Наиболее близким к предлагаемому сорбенту является углеродный сорбент с антибактериальными и антимикотическими свойствами в виде гранул округлой формы, который содержит полимер гликолевой кислоты в виде полигликолида в количестве не менее 5 мас. %, характеризуется удельной адсорбционной поверхностью не более 250 м/г и общим объемом пор не более 0,65 см/г [патент РФ 2541103, прототип]. Способ получения углеродного сорбента с антибактериальными и антимикотическими свойствами включает пропитку гранул углеродного гемосорбента 10-50 мас. % водным раствором ГК в течение 7-9 часов при комнатной температуре, соотношение гемосорбент: водный раствор модификатора ГК составляет 1:1 по массе. Затем проводится сушка в течение часа при 100-110°C. Поликонденсация ГК на углеродном гемосорбенте протекает в 2 стадии: при температуре 185-205°C в течение 1 часа, при температуре 215-235°С - не менее 5 часов, на песчаной бане.
Техническим результатом заявляемой группы изобретений является получение предложенным способом углеродного сорбента с антиоксидантными и улучшенными детоксикационными свойствами.
Предлагаемый способ получения углеродного сорбента с антиоксидантными и детоксикационными свойствами включает пропитку гранул углеродного сорбента 25-50 мас. % водным раствором ГК (гликолевой кислоты) при соотношении сорбент: водный раствор модификатора 1:2 по массе в течение 3-24 часов. Поликонденсация гидроксикислоты проводится на ротационном испарителе с химической вакуумной системой при температуре 195±2°С в течение 4 ч. и установленном вакууме 17±1 мм.рт.ст, при этом необходимо снижать скорость вращения колбы с 260 до 50 об/мин каждый час на 70 об/мин.
3
Предлагаемый модифицированный углеродный сорбент представляет собой гранулы округлой формы, содержит полимер гликолевой кислоты в виде полигликолида в количестве не менее 12 мас. % до 21 мас.%, и характеризуется удельной адсорбционной поверхностью от 37 м²/г не более 100 м²/г и общим объемом пор не более 0,206 см/г.
2
В качестве исходного материала использован гранулированный углеродный мезопористый сорбент с развитой удельной адсорбционной поверхностью 300-400 м/г, суммарным объемом пор не менее 0,40см3/г, содержанием минеральных примесей не более 0,15 мас. %.
Выбор условий пропитки (продолжительности, концентрации модификатора) проводили по анализу результатов исследований свойств образцов, которые были получены при варьировании данных параметров.
Продолжительность пропитки зависит напрямую от времени установления равновесия в системе «сорбент-модификатор». При проведении пропитки сорбента раствором модификатора менее 3х часов наносится такое количество, которое недостаточно для начала реакции полимеризации. Эти данные подтверждаются результатами ЯМР-спектроскопии. Проводить пропитку более суток является нерациональным, так как в системе «сорбент-раствор модификатора» наступает за это равновесие и при увеличении времени количество нанесенного модификатора не изменяется.
2
Установлено, что при нанесении на углеродный сорбент модификатора менее 10 мас. %, получаемые образцы не проявляют выраженных антиоксидантных свойств. Повышение концентрации раствора модификатора более 50 мас. % будет приводить к практически полному закрытию пор сорбента модификатором (удельная площадь поверхности сорбента составит менее 10 м/г). Результаты исследований электронно-микроскопических снимков образца углеродного сорбента, модифицированного 80 мас. % раствором молочной кислоты, показали, что использовании высоких концентраций происходит к склеиванию гранул между собой, что является нежелательным фактором (фиг. 1). Таким образом, предлагаемый интервал концентраций модификатора является оптимальным.
Отличительные признаки данного изобретения в сравнении с прототипом:
- изменение условий пропитки углеродного сорбента водным раствором ГК: пропитка гранул углеродного сорбента 25-50 мас. % водным раствором ГК при соотношении сорбент: водный раствор модификатора 1:2 по массе в течение 3-24 ч;
- сокращение продолжительности проведения и количества стадий процесса модифицирования: поликонденсация ГК на углеродном сорбенте проводится с использованием ротационного испарителя RV 05 basic 1-В (IKA, Германия) с химической вакуумной системой MZ 2C (Vacuubrand, Германия) при температуре 195±2°С в течение 4 ч. и установленном вакууме 17±1 мм.рт.ст, при этом необходимо снижать скорость вращения колбы с 260 до 50 об/мин каждый час на 70 об/мин.
Применение роторного испарителя для поликонденсации ГК на поверхности углеродного сорбента позволяет интенсифицировать процессы массо- и теплообмена в реакционной среде. Возможность проведения одновременно процесса концентрирования раствора модификатора (отгонка воды) с поликонденсацией способствует сокращению продолжительности синтеза. Вращение реакционной колбы оказывает влияние на процесс олигомеризации гидроксикислоты и способствует увеличению выхода продукта. Регулирование скорости перемешивания реакционной массы (постепенное уменьшение скорости вращения до минимальной по мере увеличения вязкости реакционной массы) также позволяет сократить время процесса и расход реактивов [Похарукова Ю.Е., Новиков В.Т., Глотова В.Н. Поликонденсация молочной кислоты до олигомера в растворе // Вестник Кузбасского государственного технического университета. - 2017. - № 1. - С. 134-138].
Результаты, иллюстрирующие изменения параметров пористой структуры и химического состава образцов углеродного сорбента, полученных по прототипу и с помощью роторной установки, в соответствии с примерами настоящего изобретения, приведены в таблице 1.
Свойства модифицированных сорбентов изучены комплексом физико-химических методов по стандартным и разработанным для данных материалов методикам.
Для изучения детоксикационных свойств определяли величину удельной адсорбционной площади поверхности и суммарного объема пор методом низкотемпературной адсорбции азота на анализаторе Gemini 2380 («Micromeritics», США) по данным изотерм адсорбции-десорбции азота (Т = 77,4 К) в области относительных равновесных давлений паров азота Р/Ро= 0,05-0,3. Расчет величины удельной площади поверхности проводили по уравнению БЭТ. По данным изотерм адсорбции-десорбции в области Р/Ро=10-4÷1 определяли значение суммарного объема пор. Относительная погрешность определения удельной площади поверхности на данном анализаторе составляет 4%.
Термический анализ исследуемых образцов (термогравиметрия (ТГ) – деривативная термогравиметрия (ДТГ) – дифференциальный термический анализ (ДТА)) проводили на приборе DTG-60H («Shimadzu», Япония) для определения количества нанесенных на сорбент модификаторов. Точность определения температуры и изменения веса составляли - 1°С и 0,1% соответственно. Съемки осуществляли в атмосфере воздуха, в интервале температур от комнатной до 600°С. Масса навески образца составляла 10 мг, скорость подъема температуры - 10°С/минуту. Количество нанесенной на поверхность исходного сорбента полимера гликолевой кислоты в виде полигликолида определяли по наличию экзотермического пика на кривой дифференциального термического анализа в диапазоне температур 300-400°С и соответствующей потере массы образца на кривой термогравиметрического анализа (мас. %).
В качестве примера показана типичная термограмма модифицированного сорбента, полученного по примеру 2 (фиг.2.). Для данного образца количество нанесенного полигликолида составило 13,0 мас. % (экзотермический пик с максимумом при 280°С). По литературным данным присутствие данного пика на термограмме характеризует разложение нанесенного модификатора - полигликолида [Schwarz, K., Epple, M. А detailed characterization of polyglycolide prepared by solid-state polycondensation reaction / K. Schwarz, M. Epple // Macromol.Chem.Phys. - 1999. - 200. - P.2221-2229].
Результаты физико-химического анализа образцов, модифицированных полигликолидом на роторной установке, подтверждают изменение удельной площади поверхности и суммарного объема пор, а также наличие модификатора на поверхности углеродного сорбента (табл.1, фиг.2).
2
2
2
2
.
Для изучения антиоксидантных свойств сорбентов проведены исследования в модельных условиях (табл. 2). В качестве модельной системы выбрана реакция разложения пероксида водорода с образованием кислорода и воды: 2НО → 2НО + О. Исследовали влияние сорбентов на скорость и количество разлагаемого пероксида водорода в данной реакции в модельных условиях
2
2
конеч
конеч
Изучение скорости реакции разложения пероксида водорода без сорбентов и в их присутствии проводили газометрическим методом. Газометрический метод позволяет за счет измерения объема кислорода, выделяющегося в реакции в присутствии углеродного материала, вычислить по полученным данным константы скорости реакции. Скорость разложения пероксида водорода на углеродных материалах соответствует реакции первого порядка [Khalil L.B., Girgis В.S., Tawfik T.A. M. Decomposition of HO on activated carbon obtained from olive stones // Chemical Technology and Biotechnology. 2001. (76). Р.1132-1140]. Скорость реакции определяли графическим способом: строили зависимость в координатах, соответствующих реакции первого порядка: ln(V-V) от t (V- объем кислорода, выделяющийся при полном разложении пероксида водорода, мл; V - объем кислорода, выделяющийся в ходе протекания реакции, мл; t - время, мин.), по тангенсу угла наклона графика находили константу скорости.
Совместно с Федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования Омским государственным медицинским университетом Минздрава России проведены исследования по оценке антиоксидантных свойств образца углеродного сорбента, модифицированного на роторной установке: определена активность фермента (глутатионредуктазы) антиоксидантной системы в плазме больных после обработки сорбентом (в гемолизатах эритроцитов). Определение активности глутатионредуктазы проводили по методу Carlberg I., основанном на измерении скорости окисления никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН), которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм. В кювету с расстоянием между рабочими гранями 1 см последовательно вносили 2,7 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,0), 0,1 мл 0,1 мМ раствора НАДФН, 0,1 мл гомогената. Реакцию запускали добавлением в реакционную пробу 0,1 мл 0,5 мМ раствора окисленного глутатиона. Смесь перемешивали. Измерение оптической плотности регистрировали через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме окисленного глутатиона и раствора НАДФН. Активность фермента выражали в мкмоль/мин на г белка.
Для иллюстрации изобретения приведены следующие примеры:
Пример 1 (по прототипу).
3
Навеску углеродного сорбента массой 5,0 г помещают в фарфоровый тигель, заливают 10 мас. % водным раствором ГК в соотношении сорбент: водный раствор модификатора ГК 1:1 на 8 часов. После пропитки раствор удаляют и сорбент сушат в термошкафу при температуре 100-110°С в течение 1 часа. Далее проводится термообработка на песчаной бане при температуре 190-200°С в течение 1 часа и при температуре 220-230°С в течение 5 часов. На тигель устанавливают стеклянные воронки, меняют при запотевании. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 233 м²/г, общим объемом пор 0,475 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств.
2
2
конеч
конеч
Изучают антиоксидантные свойства углеродного сорбента, модифицированного данным способом. Исследование скорости реакции разложения пероксида водорода без сорбентов и в их присутствии осуществляют газометрическим методом. Собирают газометрическую установку [Khalil L.B., Girgis В.S., Tawfik T.A. M. Decomposition of HO on activated carbon obtained from olive stones // Chemical Technology and Biotechnology. 2001. (76). Р.1132-1140]. Навеску сорбента массой 0,5000 ± 0,0002 г помещают в реакционный сосуд, соединенный с бюреткой, предназначенной для измерения объема выделяющегося кислорода. В реакционный сосуд приливают 30 мл 3%-го раствора пероксида водорода и включают секундомер. Фиксируют изменение объема кислорода по шкале бюретки через каждые 30 секунд в течение 1 ч. В течение всего эксперимента производят перемешивание системы при помощи магнитной мешалки. По полученным данным строят зависимости в координатах: ln(V-V) от t (V- объем кислорода, выделяющийся при полном разложении пероксида водорода, мл; V - объем кислорода, выделяющийся в ходе протекания реакции, мл; t - время, мин.), по тангенсу угла наклона графика находят константу скорости реакции (k).
2
2
-5
-1
Согласно результатам проведенных исследований сорбент, модифицированный данным способом, не проявляет антиоксидантные свойства. Константа скорости реакции разложения пероксида водорода в присутствии данного образца сопоставима с исходным значением: k 3% раствора НО до и после контакта с сорбентом составила 6,5⋅10мин.
В результате оценки антиоксидантных свойств данного образца в медицинских стендовых испытаниях не выявлено влияния на рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой.
Основные характеристики данного образца приведены в табл.1, табл. 2.
Пример 2
3
Навеску углеродного сорбента массой 5,0 г пропитывают 25 мас. % водным раствором гликолевой кислоты при соотношении сорбент: водный раствор модификатора ГК 1:2 по массе в течение 24 часов. Далее проводят поликонденсацию на роторной установке при температуре 195±2°С в течение 4 часов с постепенным снижением скорости вращения колбы с 260 до 50 б/мин каждый час на 70 об/мин и установленном вакууме 17±1 мм.рт.ст. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 55 м²/г, общим объемом пор 0,112 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств.
2
2
2
2
-5
-1
-4
-1
Изучают влияние сорбента, модифицированного данным способом, на скорость реакции разложения пероксида водорода по примеру 1. Согласно результатам проведенных исследований данный образец проявляет антиоксидантные свойства. Полученный сорбент на порядок ускоряет процесс разложения пероксида водорода (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, синтезированного по примеру 2, составила 1,5⋅10мин).
В результате оценки антиоксидантных свойств образца углеродного сорбента, модифицированного по примеру 2, было установлено, что рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, повышено на 60,6 %.
Разнонаправленность во влиянии образца, модифицированного гликолевой кислотой, проявилась, с одной стороны, в повышении активности глутатионредуктазы, что подразумевает поддержку пула восстановленного глутатиона; с другой стороны, использование восстановленного глутатиона в глутатионпероксидазной реакции снижено, что может отражать взаимодействие гликолевой кислоты с ферментом.
Основные характеристики данного образца приведены в табл.1., табл. 2.
Пример 3
3
-5
-1
-5
-1
2
2
2
2
Аналогичен примеру 2, но концентрация модификатора для пропитки 10 мас. %. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 181 м²/г, общим объемом пор 0,368 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств. Снижение концентрации раствора ГК уменьшает количество модификатора на поверхности сорбента (менее 10 мас. %). Изучение влияния сорбента на скорость реакции разложения пероксида водорода по примеру 1 показало, что полученный данным способом материал на скорость реакции не влияет (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, полученного по примеру 3, составила 5,6⋅10мин) и антиоксидантные свойства в стендовых медицинских испытаниях для него не выявлены (рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, в присутствии сорбента не изменяется). Основные характеристики данного образца приведены в табл.1., табл.2.
Пример 4
3
-5
-1
-5
-1
2
2
2
2
Аналогичен примеру 2, но концентрация модификатора и время для пропитки составили 10 мас. % и 18 часов. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 209 м²/г, общим объемом пор 0,426 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств. Снижение концентрации раствора ГК и сокращение продолжительности стадии пропитки уменьшает количество модификатора на поверхности сорбента (менее 10 мас. %), в результате антиоксидантные свойства сорбент, модифицированный данным способом, не проявляет ни в модельной реакции (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, полученного по примеру 4, составила 5,0∙ 10мин), ни в стендовых медицинских испытаниях (рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, в присутствии сорбента не изменяется). Основные характеристики данного образца приведены в табл.1., табл.2.
Пример 5
3
-5
-1
-5
-1
2
2
2
2
Аналогичен примеру 2, но концентрация модификатора и время для пропитки составили 10 мас. % и 3 часа. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 231 м²/г, общим объемом пор 0,470 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств. Снижение концентрации водного раствора ГК и сокращение продолжительности стадии пропитки уменьшает количество модификатора на поверхности сорбента (менее 10 мас. %), в результате антиоксидантные свойства сорбент, модифицированный данным способом, не проявляет (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, полученного по примеру 5, составила 5,9×10мин; рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, в присутствии сорбента не изменяется). Основные характеристики данного образца приведены в табл.1.,табл.2.
Пример 6
3
Аналогичен примеру 2, но время пропитки сорбента водным раствором ГК составляет 18 часов. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 85 м²/г, общим объемом пор 0,173 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств.
2
2
2
2
-5
-1
-4
-1
Изучают антиоксидантные свойства сорбента, модифицированного данным способом, по примеру 1. Согласно результатам проведенных исследований данный образец на порядок ускоряет процесс разложения пероксида водорода (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, синтезированного по примеру 6, составила 1,3⋅10мин).
В результате оценки антиоксидантных свойств образца углеродного сорбента, модифицированного данным способом, было установлено, что рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, повышено на 60,3 %.
Основные характеристики данного образца приведены в табл.1., табл. 2.
Пример 7
3
Аналогичен примеру 2, но время пропитки сорбента водным раствором ГК составляет 3 часа. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 100 м²/г, общим объемом пор 0,206 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств.
2
2
2
2
-5
-1
-4
-1
В результате проведения испытаний в модельных условиях установлено, что полученный сорбент на порядок ускоряет процесс разложения пероксида водорода (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, синтезированного по примеру 7, составила 1,4⋅10мин).
Оценка антиоксидантных свойств образца углеродного сорбента, модифицированного данным способом, показала, что рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, повышено на 60,8 %.
Основные характеристики данного образца приведены в табл.1., табл. 2.
Пример 8
3
Аналогичен примеру 2, но концентрация модификатора для пропитки 50 мас. %. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 37 м²/г, общим объемом пор 0,075 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств.
2
2
2
2
-5
-1
-4
-1
Согласно результатам проведенных исследований в модельных условиях данный образец на порядок ускоряет процесс разложения пероксида водорода (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, синтезированного по примеру 8, составила 1,5⋅10мин), а стендовых медицинских испытаниях установлено, что рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, повышено на 60,9 %.
Основные характеристики данного образца приведены в табл.1, табл. 2.
Пример 9
3
Аналогичен примеру 2, но концентрация модификатора и время для пропитки составили 50мас. % и 18 часов. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 71 м²/г, общим объемом пор 0,145 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств.
2
2
2
2
-5
-1
-4
-1
Полученный сорбент на порядок ускоряет процесс разложения пероксида водорода (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, синтезированного по примеру 9, составила 1,4⋅10мин) и повышает рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой на 60,4 %.
Основные характеристики данного образца приведены в табл.1, табл. 2.
Пример 10
3
Аналогичен примеру 2, но концентрация модификатора и время для пропитки составили 50 мас.% и 3 часа. Полученный модифицированный сорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 71 м²/г, общим объемом пор 0,145 см/г, что свидетельствует о наличии его детоксикационных свойств.
2
2
2
2
-5
-1
-4
-1
Установлено, что сорбент, модифицированный данным способом, на порядок ускоряет процесс разложения пероксида водорода (k 3% раствора НО составила 6,5⋅10мин; k 3% раствора НО в присутствии образца, синтезированного по примеру 10, составила 1,3⋅10мин) и повышает рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой на 60,6 %.
Основные характеристики данного образца приведены в табл.1., табл. 2.
Таким образом, заявленный технический результат достигается за счет выбранных параметров процесса модифицирования углеродного сорбента водным раствором гликолевой кислоты: концентрация водного раствора модификатора для пропитки 25 - 50 мас. %, соотношение сорбент: водный раствор ГК 1:2 по массе; время пропитки 3 - 24 часа. Выбранные условия обеспечивают равномерное распределение модификатора на углеродной поверхности, позволяющее получить при полимеризации полигликолид в количестве, которое является эффективным для проявления антиоксидантного действия. Снижение концентрации модификатора в водном растворе для пропитки менее 25 % масс. и времени пропитки менее 3 часов уменьшает содержание полимера гликолевой кислоты в виде полигликолида (менее 10 мас. %), что не позволяет достичь выраженных антиоксидантных свойств (при сохранении детоксикационных).
Разработанный способ модифицирования углеродного сорбента позволяет получить материал комплексного действия с антиоксидантными и детоксикационными свойствами. Детоксикационные свойства сорбента обусловлены его способностью адсорбировать микробные клетки, выделяемые микроорганизмами токсины, продукты жизнедеятельности, независимо от резистентности возбудителей к антибактериальным препаратам. Помимо этого, нанесенный модификатор – полимер гликолевой кислоты проявляет антиоксидантные свойства (способствует разложению пероксида водорода и повышает рециклирование восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой), оказывая дополнительное антиоксидантное воздействие сорбента. Известно, что глутатион является акцептором ОН* радикала и синглетного кислорода. Это главный восстановитель клетки, и чем выше его концентрация, тем быстрее происходит восстановление. Он напрямую восстанавливает активные формы кислорода, перекисные соединения и обезвреживает вторичные метаболиты окисления.
Предлагаемый углеродный сорбент представляет значительный интерес для сорбционной медицины и может найти широкое применение для профилактики и лечения заболеваний, связанных с накоплением активных форм кислорода в организме человека.
Таблица 1. Условия модифицирования и физико-химические характеристики исследуемых образцов углеродного сорбента
Образец
Условия модифицирования
Физико-химические характеристики
Время пропитки, ч
Концентрация модификатора ГК для пропитки, мас.%
Соотношение сорбент:водный раствор ГК по массе
Температура, °Си время поликонденсации, ч
Удельная адсорбционная поверхность, S<sub>BET</sub>, м<sup>2</sup>/г
Суммарный объем пор, см<sup>3</sup>/г
Содержа-ние полиглико лида, %
1 стадия
2 стадия
Пример 1 (прототип)
8
10
1:1
195±5°С, 1 ч
225±5°С, 5 ч
233
0,475
5,5
Пример 2
24
25
1:2
195±2°С, 4 ч
-
55
0,112
13,0
Пример 3
24
10
1:2
195±2°С,, 4 ч
-
181
0,368
6,5
Пример 4
18
10
1:2
195±2°С, 4 ч
-
209
0,426
7,0
Пример 5
3
10
1:2
195±2°С, 4 ч
-
231
0,470
6,0
Пример 6
18
25
1:2
195±2°С, 4 ч
-
85
0,173
12,0
Пример 7
3
25
1:2
195±2°С, 4 ч
-
100
0,206
13,0
Пример 8
24
50
1:2
195±2°С, 4 ч
-
37
0,075
21,0
Пример 9
18
50
1:2
195±2°С, 4 ч
-
71
0,145
17,0
Пример 10
3
50
1:2
195±2°С, 4 ч
-
71
0,145
16,0
Таблица 2. Результаты исследования антиоксидантных свойств образцов углеродного сорбента
Образец
Константа скорости реакции разложения H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> после контакта с сорбентом,мин<sup>-1</sup>
Повышение процесса рециклирования восстановленного глутатиона, осуществляемое глутатионредуктазой, %
Пример 1 (прототип)
6,5·10<sup>-5</sup>
-
Пример 2
1,5·10<sup>-4</sup>
60,6
Пример 3
5,6·10<sup>-5</sup>
0
Пример 4
5,0·10<sup>-5</sup>
0
Пример 5
5,9·10<sup>-5</sup>
0
Пример 6
1,3·10<sup>-4</sup>
60,3
Пример 7
1,4·10<sup>-4</sup>
60,8
Пример 8
1,5·10<sup>-4</sup>
60,9
Пример 9
1,4·10<sup>-4</sup>
60,4
Пример 10
1,3·10<sup>-4</sup>
60,6