СПОСОБ, СИСТЕМА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
METHOD, SYSTEM AND DEVICE FOR FLOW CYTOMETRY IMPLEMENTATION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка истребует приоритет согласно статье 35 Кодекса США § 119(е) предварительных заявок на патент США №61/443174 от 15 февраля 2011 г., 61/443178 от 15 февраля 2011 г. и 61/482504 от 4 мая 2011 г., каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится, в целом, к способам, устройству и системам для определения аналита и, в частности, для определения аналита в образце, текущем через замкнутую проточную кювету, с использованием, в некоторых случаях, контролируемого источника энергии для воздействия по меньшей мере на часть аналита в замкнутой проточной кювете после обнаружения.
Краткое описание уровня техники
Сортировка проточной цитометрией обеспечивает выбор, обогащение, деление на части или разделение популяций интересующих клеток, вирусов, телец или частиц (в дальнейшем именуемых клетками). Выбор критериев включает измеряемые свойства отдельных клеток, которые могут быть определены снаружи клетки, с или без помощи химических реагентов или комплексов или телец, которые являются или которые могут быть вызваны взаимосвязью с клеткой. Например, свойства клеток могут быть измерены или аппроксимированы определением и/или количественным анализом взаимосвязи клеток с одной или несколькими метками, такими как молекулы, комплексы или тельца, которые флуоресцируют или были модифицированы для придания флуоресценции. Такие флуоресцентные молекулы, комплексы и/или тельца могут дифференциально ассоциироваться с клетками на основе качественных или количественных свойств клеток, включая их состав относительно белков, липидов, фосфопротеинов, гликопротеинов, фосфолипидов, гликолипидов, нуклеиновых кислот (включая количество, последовательность или организационную структуру нуклеиновых кислот), углеводов, солей/ионов и любых других молекул в, на или связанных с клетками. Кроме того, такие флуоресцентные молекулы, комплексы и/или тельца могут по-разному ассоциировать с клетками на основе физических или физиологических характеристик клеток, примеры которых включают, но не ограничиваются этим, проницаемость мембраны, состав мембраны, текучесть мембран, химический или мембранный потенциал, жизнеспособность, химические градиенты, подвижность, снижение окислительного потенциала или состояния и другие параметры или свойства.
Другие измеряемые свойства клеток, меченых или немеченых, модифицированных или немодифицированных, которые могут предоставлять основу для выбора клеток, могут включать без ограничения:
- свойства света взаимодействовать с клетками, такие как флуоресценция, поглощение, отражательная способность, рассеивание, поляризация или другие свойства;
- электрические свойства клеток или эффект клеток на свое окружение, включая проводимость, индуктивность, резистентность, мембранный потенциал или напряжение или другие свойства;
- магнитные или электромагнитные свойства клеток, включая магнетизм, парамагнетизм, магнитный резонанс и/или взаимодействие клеток с электромагнитной энергией;
- внешний вид, визуализация или морфологические свойства клеток; и
- состав клеток относительно любого вещества или параметра, измеренного прямо или косвенно любым способом.
Кроме того, измерение таких качеств и количеств, прямым или косвенным способом, по отдельности или в комбинации, может отражать представляющие интерес простые или сложные свойства клеток.
Одним из примеров такого свойства является половая хромосома, включенная в диплоидный, гаплоидный или гаметный геном, которая может быть Х хромосомой, Y хромосомой, Z хромосомой, W хромосомой или отсутствием половой хромосомы (обозначается как «0»), или их комбинациями в зависимости от типа клетки и организма. Кроме того, известны другие определяющие пол системы, которые относятся к определению присутствия других хромосом или последовательностей ДНК. Во многих случаях определение содержания половых хромосом в клетках может быть проведено с использованием прямых или непрямых измерений или определений с использованием одного или нескольких способов. Такие способы включают измерение содержания ДНК клеток, определенных относительным или абсолютным способом; присутствием или отсутствием определенных последовательностей ДНК, или маркеров присутствия или отсутствия определенных последовательностей ДНК; размера клеток или участков или органелл клеток; присутствия, локализации или отсутствия белков или других маркеров, характерных для содержания половых хромосом в клетках, или комбинаций или схем экспрессии таких маркеров; или любые другие способы измерения, которые отображают композицию половых хромосом в клетке. Для идентификации клеток, интересующих в отдельном случае, ситуации, системе, заболевании, состоянии, процессе или обстоятельстве могут быть проведены множество других подобных измерений, или определены другие свойства.
Такие цитометрические измерения позволяют проводить качественные и/или количественные определения клеток, популяций клеток, органов, тканей или организмов. Такие определения могут использоваться во многих сферах, включая без ограничения диагностику, биомедицинские исследования, способы рекомбинации, эпидемиологию, медицину, сельское хозяйство, животноводство, содержание скота, зоологию, биофармацевтическую промышленность и другие области. Кроме возможности проводить такие измерения, современные способы и устройства позволяют разделять клетки на основе характеристик или параметров способом цитометрии, как это описано выше. Клетки могут быть отобраны положительно или отрицательно путем концентрации, сбора, разделения или разбивки на части интересующих клеток или путем удаления клеток, которые нежелательны или представляют интерес в композиции. Такой отбор может контролироваться на основе любого параметра, характеристики или комбинации параметров или характеристик, которые могут быть определены, как это описано выше.
Клетки, идентифицированные способами, включающими или относящимися к описанным выше, могут быть разделены, фракционированы, сконцентрированы, обеднены или собраны в любое произвольное количество групп. Один часто используемый способ разделения (отображен на ФИГ. 1А) использует электростатические силы для отклонения электрически или электростатически заряженного потока, капли или капель, содержащих клетку или клетки с требуемыми или нежелательными свойствами. Отклоненные клетки собирают или отбраковывают в соответствии с целью применения, как показано на ФИГ. 1А. Другие способы разделения включают использование жидкостных устройств, в том числе клапанов, или другие способы, которые изменяют свойства потока или направление потока газа или жидкости, чтобы отводить клетки в потоке текучей среды для чередования путей потока, каналов, пробирок или элементов для последующего сбора или утилизации, как показано на ФИГ. 1В. Другие способы включают использование способов, губительных для потока, таких как пересечение со вторым управляемым потоком, для отвода части потока, содержащей интересующую клетку или частицу, для отвода клеток в потоке жидкости для чередования путей потока, каналов, пробирок или элементов для последующего сбора или утилизации, как показано на ФИГ. 1В. Разделение потока жидкости по другим, отклоняющимся путям может быть достигнуто целым рядом способов. Например, патент США №6400453 описывает разделение текучей среды с использованием струйного реле жидкости или сжатого газа. Публикация международного патента № WO 2010/149739 описывает еще один способ разделения потока по разным направлениям с использованием лазера для нагревания потока текучей среды, что вызывает разрушение потока и изменение направления движения.
Существует ряд способов и систем для проведения проточной цитометрической сортировки клеток. Среди них есть способы и системы, разработанные для проведения проточной цитометрической сортировки сперматозоидов млекопитающих и, в частности, для сортировки сперматозоидов в популяции сперматозоидов, несущих Х хромосомы, и/или популяции сперматозоидов, несущих Y хромосомы, с целью повышения вероятности того, что оплодотворение яйцеклетки отсортированным сперматозоидом приведет к получению потомства требуемого пола. Например, хозяину молочной фермы может понадобиться сортировка спермы быка для получения эмбрионов рогатого скота, способом искусственного осеменения, оплодотворением in vitro или другими способами, с использованием композиции сперматозоидов, имеющих повышенную частоту клеток, несущих Х хромосому, для получения дополнительного потомства рогатого скота в виде женских особей.
Способы сортировки проточной цитометрией имеют целый ряд проблем, в частности, относительно сортировки сперматозоидов млекопитающих для последующего использования в получении потомства. Важным является то, что способы, используемые для мечения и/или дифференциации клеток и/или способов, используемых для сортировки клеток, не должны отрицательно влиять на жизнеспособность клеток. Часто одна или несколько целей используемых способов и/или систем (например, ускоренная сортировка, улучшенная точность и т.д.) конфликтуют с другими целями способов и/или систем. Должны быть учтены и сбалансированы различные факторы, включая температуру, изменения температуры, давление и/или изменение давления, которому подвергают клетки, жидкостные среды, которые воздействуют на клетки, химическое окружение и вещества, воздействующие на клетки, силы, применяемые к клеткам, а также продолжительность жизни клетки. Например, скорость, при которой флуоресцентная молекула (например, флуорохром) входит в клетку для связывания ДНК в ядре клетки (т.е. скорость, при которой клетки могут быть окрашены), может повыситься с повышением температуры. Таким образом, производительность системы (по меньшей мере, производительность процесса окрашивания) может повыситься с повышением температуры среды клеток. Однако повышенная температура может оказаться губительной для жизнеспособности клеток и/или продолжительности времени, в течение которого клетки остаются жизнеспособными. В отличие от этого, поддержание клеток при пониженной температуре для способствования поддержания хорошей жизнеспособности может повысить время, требуемое для окрашивания (и, вследствие этого, всего способа, включающего измерение и сортировку) клеток, таким образом, способ занимает более длительное время, чем обычно, или, таким образом, клетки нежизнеспособны по истечении времени, необходимого для завершения способа.
Другой вопрос, связанный с сортировкой клеток, относится к физическим и оптическим свойствам клеток. В частности, сплюснутые или ассиметричные иным образом клетки, такие как эритроциты млекопитающих или сперматозоиды, могут обладать анизотропным излучением энергии (например, света). Сложная геометрия внутреннего пространства клетки и/или сложная геометрия границ клетки действует для передачи, рефракции и/или отражения света способами, которые чрезвычайно высоко зависят от ориентации клетки относительно любых источников света и/или детекторов, используемых для дифференциации клеток. Например, сортировка проточной цитометрией сперматозоидов млекопитающих в популяции с повышенной частотой клеток, содержащих Х или Y хромосомы, обычно включает окрашивание клеток молекулой, которая связывается с ДНК в клетках и ярко флуоресцирует при связывании. Вариация в содержании ДНК между Х и Y хромосомами большинства видов млекопитающих (Y хромосома обычно содержит меньше ДНК, чем Х хромосома) приводит к относительно повышенной флуоресценции клеток, содержащих Х хромосомы. Однако различие в содержании ДНК в клетках, несущих Х и Y хромосомы, обычно составляет порядка нескольких процентов, и часто геометрия клетки и/или ориентация могут влиять на определение флуоресценции в процентном показателе, который превышает процентную разницу в содержании ДНК между Х и Y хромосомами. Кроме того, такой анализ требует, чтобы клетки проходили через область определения поодиночке, таким образом, детектор не интерпретирует флуоресценцию от двух клеток как флуоресценцию от одной клетки.
Системы сортировки проточной цитометрией часто используют жидкостный механизм «ядро в оболочке» для переноса клеток через участок определения. Как это показано на ФИГ. 1C, относительно медленно движущийся поток 750 водной суспензии клеток 752 вводят в относительно быстродвижущийся поток 754 проточной жидкости. Такой принцип фокусирует клетки 752 в потоке 756, обозначаемый как контурный поток. При соответствующем выборе давления, формы, размеров, ориентации и материалов границ и компонентов жидкостной системы, а также соответствующих скоростей и организации контурной суспензии и проточной жидкости, контурный поток сужается гидродинамическими силами под действием проточной жидкости, и клетки в контурном потоке распределяются продольно таким образом, что они проходят в путь токае одна за одной. Силы, которые продлевают и сужают контурный поток, имеют дополнительное преимущество ориентации клеток 752 таким образом, что продольная ось 758 клетки 752 обычно параллельна направлению потока отдельного потока 756. Однако ориентация клеток вокруг продольной оси 758 остается более или менее случайной в системах, в которых проточный и контурные потоки разработаны как общециллиндрические и симметричные относительно оси потока. Таким образом, при прохождении каждой клетки 752 через область определения свет падает на клетку, свет испускается клеткой (например, флуоресцирующий свет или рассеянный свет или пропущенный свет), и свет отражается от клетки, все еще оставаясь зависимым от ориентации клетки 752. Это особенно справедливо для многих типов сперматозоидов млекопитающих.
Существует целый ряд решений проблемы ориентации сперматозоида относительно освещения и определения клеток в системах проточной цитометрии. Например, ФИГ. 1D иллюстрирует одно решение, и такое решение использует отрезанный, скошенный наконечник 760 на пробирке 762, для введения потока образца 764 в проточную жидкость 766. Уплощенный, скошенный наконечник 760 помогает ориентировать клетки вдоль их продольных осей 758 (показано на Фигуре 1C) в проточной жидкости 766 таким образом, что плоские поверхности клеток стремятся выстроиться в неизменном направлении. Другое решение (которое может быть скомбинировано с решением скошенного наконечника) использует два детектора 768 и 770, перпендикулярных друг другу (детектор 68 под углом 0 градусов и детектор 770 под углом 90 градусов), которые используют в комбинации для оценки ориентации каждой клетки с прохождением ею области определения 772 и для измерения флуоресценции клеток, имеющих правильную ориентацию, таким образом, что возможна точная количественная оценка флуоресцентного сигнала. Решения, использующие гидродинамическую ориентацию клеток вокруг продольной оси обычно позволяют получить популяции, в которых требуемая настройка для измерения флуоресценции достигается для от приблизительно 60% до приблизительно 80% клеток в потоке образца, что снижает производительность устройства и приводит к элиминации неправильно ориентированных клеток.
Еще одно решение проблем, связанных с геометрией и ориентацией клеток использует оптическое определение вдоль одной и той же оси, что и поток «ядро в оболочке», который несет клетки. В одном таком решении используют эпи-оптические осветительные системы для освещения клетки и определения света, испускаемого клеткой. Как это показано на ФИГ. 1Е, поток образца 774 под действием проточной жидкости 776 поступает непосредственно на линзу объектива микроскопа 778, элиминируя зависимость от ориентации клетки (например, сперматозоида 780) вокруг продольной оси 782 клетки 780. Однако траектория клетки 780 относительно линзы объектива 778 требует, чтобы клетка 780 изменила траекторию непосредственно после прохождения через область определения 782 (т.е. точку фокусировки 784 линзы объектива 778). Система сопровождает изменение такой траектории использованием поперечного потока 786 жидкости. Неизвестность положения отдельных клеток может наблюдаться после анализа путем конвергенции 788 поперечного потока жидкости 786, а также контурного потока 776 и потока образца 774. Такое неизвестное положение может привести к тому, что система будет не способна проводить сортировку клетки по той причине, что расположение клетки 780 в конвергированном потоке может стать непредсказуемым непосредственно или вскоре после того, как клетка проходит через область определения 784.
Еще одно решение, представленное на ФИГ. 1F, использует один или несколько параболических или эллипсоидных отражателей 802 для освещения клеток однородным образом и/или для сбора света в радиальном направлении от клеток. Система использует форсунку 804 для испускания потока/выброса 806 жидкости, содержащей отдельные клетки 792. Поток 806 перемещается через область определения 794 и через отверстие 796 в отражателе 802. В некоторой точке после прохождения через область определения, поток 806 разбивается на капли 790, которые могут быть электрически заряжены. Впоследствии каждая из капель 790 может быть отсортирована, например, отведением заряженной капли 790 с использованием электростатически заряженных отражательных пластин 798 для отражения капель в один или несколько приемников 800. Проблематичным является то, что такая конфигурация «струя в воздух» подвергает поток 806 (и клетки 792, содержащиеся в потоке 806) к падению давления, т.к. поток 806 выходит из форсунки 804. Внезапное изменение давления (и повышенное давления в самой форсунке) может отрицательно влиять на жизнеспособность клетки 792, что может по существу повлиять на клетку 792 в приемнике 800. Таким образом, давление и скорость потока 806, выходящего из потока 804, должно оставаться ниже любого порога, который может повредить клетки 792, что снижает производительность системы. Кроме того, движение капель 790 через атмосферу может потребовать дополнительных ограничений окружающей среды, включая чистоту воздуха помещения (например, «чистая комната») и контроль температуры.
Таким образом, даже при относительно усовершенствованном состоянии проточной цитометрии в этой области существует постоянная потребность в обеспечении более эффективных, более чувствительных и более точных способов и устройств для идентификации и/или разделения клеток.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с осуществлением изобретения устройство для определения аналита в жидкостном образце включает источник света для получения электромагнитной энергии для освещения образца в зоне исследования, вогнутый собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, причем зона исследования совпадает с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента, и замкнутую проточную кювету. Замкнутая проточная кювета содержит отверстие для ввода образца, отверстие для вывода образца, путь тока между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, причем путь тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный ниже зоны исследования. Участок потока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и по меньшей мере участок потока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы с образованием непрерывного замкнутого потока без разделения или разветвления. Образец, включающий аналит или подозреваемый на содержание аналита, течет по пути тока жидкости в виде потока «ядро в оболочке» или ламинарного потока по меньшей мере через зону исследования. Образец течет в направлении от зоны исследования к верхушке собирающего элемента или от верхушки собирающего элемента по направлению к зоне исследования, и часть тока жидкости проходит через внутренний объем собирающего элемента. Аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение. Устройство также включает детектор для обнаружения определяемого сигнала.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения устройство для определения аналита в жидкостном образце включает источник света для освещения образца в зоне исследования, первый и второй вогнутые оптические элементы, каждый из которых имеет оптическую ось и точку фокусировки, конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого вогнутого оптического элемента, при этом источник света сфокусирован на конический оптический элемент. Устройство также включает вогнутый собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, при этом зона исследования совпадает с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента, и замкнутую проточную кювету. Замкнутая проточная кювета содержит отверстие для ввода образца, отверстие для вывода образца, путь тока между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, причем часть пути тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный ниже по течению от зоны исследования. Участок пути тока, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента. По меньшей мере участок пути тока жидкости, проходящего через зону исследования и сортирующий участок, ограничена стенкой проточной кюветы с образованием непрерывного замкнутого потока без разделения или разветвления. Образец, включающий аналит или подозреваемый на содержание аналита, течет по пути тока жидкости в виде потока «ядро в оболочке» или ламинарного потока по меньшей мере через зону исследования. Второй вогнутый оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию на образец в зоне исследования. Аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение. Устройство также включает детектор для обнаружения определяемого сигнала, причем определяемый сигнал собирается вогнутым собирающим элементом и отражается на детектор.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения устройство для определения аналита в жидкостном образце включает источник света для освещения образца в зоне исследования, первый и второй параболические оптические элементы, каждый из которых имеет оптическую ось и точку фокусировки, конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого параболического оптического элемента, при этом источник света сфокусирован на конический оптический элемент, и эллипсоидный собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки. Первый и второй параболические оптические элементы, конический оптический элемент и эллипсоидный собирающий элемент коаксиальны, и зона исследования совпадает с точкой фокусировки эллипсоидного собирающего элемента. Устройство дополнительно включает замкнутую проточную кювету, которая содержит отверстие для ввода образца, отверстие для вывода образца, путь тока между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, причем часть потока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный ниже по течению от зоны исследования. Участок потока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и по меньшей мере участок потока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы с образованием непрерывного замкнутого потока без разделения или разветвления. Проточная ячейка включает сферический элемент, окружающий зону исследования, причем сферический элемент имеет коэффициент преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы в зоне исследования. Образец, включающий аналит или подозреваемый на содержание аналита, протекает в пути тока жидкости в виде потока «ядро в оболочке» или ламинарного потока по меньшей мере через зону исследования. Второй параболический оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию на образец в зоне исследования. Аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение. Устройство также включает детектор для обнаружения определяемого вещества, причем определяемый сигнал собирается эллипсоидным собирающим элементом и отражается на детектор.
В соответствии с вариантом осуществления изобретения способ определения аналита в жидкостном образце с использованием устройства, включающего источник света, вогнутый собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, и зону исследования, совпадающую с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента, включает контроль потока образца в замкнутой проточной кювете для получения направления движения (1) от верхушки собирающего элемента к зоне исследования, или (2) от зоны исследования к верхушке собирающего элемента. Проточная кювета содержит отверстие для ввода образца, отверстие для вывода образца, путь тока между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, причем участок пути тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный ниже по течению от зоны исследования. Участок пути тока, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и по меньшей мере участок пути тока, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы с образованием непрерывного замкнутого потока без разделения или разветвления. Участок тока жидкости проходит через собирающий элемент, когда движение осуществляется в направлении от зоны исследования к верхушке собирающего элемента. Способ дополнительно включает освещение образца в зоне исследования, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение. Способ также включает получение определяемого сигнала вогнутым собирающим элементом, при этом собирающий элемент отражает определяемый сигнал на детектор, и обнаружение определяемого сигнала детектором.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения способ определения аналита в устройстве, включающем источник света, конический оптический элемент, первый и второй вогнутые оптические элементы, вогнутый собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, и зону исследования, совпадающую с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента, включает контроль потока образца, включающего аналит или подозреваемого на содержание аналита, в замкнутой проточной кювете. Замкнутая проточная кювета содержит отверстие для ввода образца, отверстие для вывода образца, путь тока между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, причем участок пути тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный книзу от зоны исследования. Участок пути тока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и по меньшей мере участок пути тока, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы с образованием непрерывного замкнутого потока без разделения или разветвления. Способ дополнительно включает освещение аналита в зоне исследования с использованием оптической системы. Аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение. Оптическая система включает первый и второй вогнутые оптические элементы, каждый из которых имеет оптическую ось и точку фокусировки, и конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого вогнутого оптического элемента. Конический оптический элемент отражает электромагнитную энергию от источника света на первый вогнутый оптический элемент. Первый вогнутый оптический элемент отражает электромагнитную энергию на второй вогнутый оптический элемент, и второй вогнутый оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования. Способ также включает получение определяемого сигнала вогнутым собирающим элементом, при этом вогнутый собирающий элемент отражает определяемый сигнал на детектор, и обнаружение определяемого сигнала детектором.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения способ определения аналита в устройстве, включающем источник света, конический оптический элемент, первый и второй параболические оптические элементы, эллипсоидный собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, и зону исследования в точке фокусировки эллипсоидного собирающего элемента, включает контроль потока образца, включающего аналит или подозреваемого на содержание аналита, в замкнутой проточной кювете. Замкнутая проточная кювета содержит отверстие для ввода образца, отверстие для вывода образца, путь тока между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, причем участок пути тока проходит через собирающий элемент, зону исследования и сортирующий участок, расположенный книзу от зоны исследования. Участок пути тока, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси эллиптического собирающего элемента, и по меньшей мере участок пути тока, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы с образованием непрерывного замкнутого потока без разделения или разветвления. Проточная кювета также включает сферический элемент, окружающий зону исследования, причем сферический элемент имеет коэффициент преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы. Способ дополнительно включает освещение аналита в зоне исследования с использованием оптической системы, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на свет. Оптическая система включает первый и второй параболические оптические элементы, каждый из которых имеет оптическую ось и точку фокусировки, и конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого параболического оптического элемента. Конический оптический элемент отражает электромагнитную энергию от источника света на первый параболический оптический элемент, первый параболический оптический элемент отражает электромагнитную энергию на второй параболический оптический элемент, и второй параболический оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования. Способ также включает получение определяемого сигнала эллипсоидным собирающим элементом, при этом эллипсоидный собирающий элемент отражает определяемый сигнал на детектор; и обнаружение определяемого сигнала детектором.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигуры 1A-1F являются схематической иллюстрацией используемых ранее в области техники способов сортировки образца с использованием проточной цитометрии;
Фигура 2 является схемой, иллюстрирующей способ определения аналита в соответствии с вариантами осуществления изобретения;
Фигура 3 является схематической иллюстрацией способа и устройства для определения аналита в соответствии с вариантами осуществления изобретения;
Фигуры 4А и 4В являются схематической иллюстрацией вариантов направления движения потока образца в соответствии с вариантами осуществления изобретения;
Фигура 5А является схематической иллюстрацией гидродинамического фокусирующего элемента в соответствии с вариантами осуществления изобретения;
Фигура 5В является схематической иллюстрацией поперечного сечения гидродинамического фокусирующего элемента, представленного на Фигуре 5А, выполненного через линию А-А',
Фигура 6 является схематической иллюстрацией используемого ранее в области техники гидродинамического фокусирующего элемента в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения;
Фигура 7А является схематической иллюстрацией способа образования потока по типу «ядро в оболочке» в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 7В является схематической иллюстрацией образования потока в способе, представленном на Фигуре 7А, перед участком ускорения;
Фигура 7С является схематической иллюстрацией потока по типу «ядро в оболочке», образующегося по способу, представленному на Фигуре 7А, после участка ускорения;
Фигура 8 является схематической иллюстрацией стандартного способа акустической фокусировки потока образца для выравнивания размещения аналита по центру;
Фигура 9 является схематической иллюстрацией освещения образца в зоне исследования с использованием одного источника света, освещающего под углом, перпендикулярном к оси потока;
Фигура 10 является схематической иллюстрацией освещения образца в зоне исследования с использованием множественных источников света, освещающих при различных углах в плоскости, перпендикулярной к оси потока;
Фигура 11 является схематической иллюстрацией освещения образца в зоне исследования с использованием проточной кюветы в качестве волновода для направления освещения в зону исследования;
Фигура 12 является схематической иллюстрацией освещения образца в зоне исследования с использованием немного отклоняющегося от оси освещения;
Фигура 13 является схематической иллюстрацией варианта осуществления изобретения, в котором собирающий элемент также функционирует для фокусирования электромагнитной энергии на зону исследования;
Фигура 14 является схематической иллюстрацией освещения образца в зоне исследования с использованием конического оптического элемента и вогнутого оптического элемента в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 15 является схематической иллюстрацией освещения образца в зоне исследования с использованием двух вогнутых оптических элементов и конического оптического элемента в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 16 является схематической иллюстрацией получения определяемого сигнала от аналита в зоне исследования с использованием линзы объектива в качестве собирающего элемента в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 17 является схематической иллюстрацией получения определяемого сигнала от аналита в зоне исследования с использованием линзы объектива в качестве собирающего элемента, причем линза объектива модифицирована таким образом, чтобы позволить по меньшей мере части потока образца протекать через линзу объектива в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 18 является схематической иллюстрацией параболического собирающего элемента, получающего определяемый сигнал от аналита в зоне исследования в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 19 является схематической иллюстрацией эллиптического собирающего элемента, получающего определяемый сигнал от аналита в зоне исследования в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 20А является схематической иллюстрацией получения определяемого сигнала, испускаемого через сферический профиль проточной кюветы, в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 20В является увеличенной схематической иллюстрацией Фигуры 20А, отображающей определяемый сигнал, испускаемый через сферический профиль;
Фигуры 21А-21С являются схематической иллюстрацией сбора образца у отверстия вывода проточной кюветы после обнаружения в соответствии с вариантами осуществления изобретения;
Фигура 22 является схематической иллюстрацией системы контроля устройства и способа в соответствии с вариантами осуществления изобретения;
Фигура 23 является схематической иллюстрацией примера осуществления способа определения и сортировки аналита в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 24 является схематической иллюстрацией примера осуществления системы определения аналита в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
Фигура 25 является схематической иллюстрацией примера осуществления системы определения аналита в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения; и
Фигура 26 является схематической иллюстрацией примера осуществления системы определения аналита в соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Описанные способы и устройство позволяют идентифицировать представляющие интерес аналиты путем определения присутствия или отсутствия любого числа характеристик (например, требуемого свойства) или параметров, которые могут быть определены, оценены или отражены в измерениях, совместимых со способами проточной цитометрии. Хотя представленное здесь описание относится к аналитам в целом и в некоторых случаях к клеткам в частности, следует понимать, что описанные здесь способы и устройство применимы к аналитам в целом, и что в отдельных случаях проточный цитометр описан относительно клеток или, более специфически, относительно сперматозоидов. В любом случае ссылку на «клетки» или «популяции клеток» в описании следует понимать не как ограничение, а скорее как применение описываемых принципов к специфическим обстоятельствам.
Цитометрические измерения, используемые для определения аналитов или популяций интересующих аналитов, включают в различных аспектах описанные здесь и известные в области техники, а также новейшие способы измерения, механизмы и/или устройства, которые могут быть представлены или быть применимыми для анализа проточной цитометрией. Аналиты, подвергнутые цитометрическому анализу в практическом применении описанных здесь способов и устройств, могут быть мечеными или немечеными, модифицированными иным способом или немодифицированными, с использованием методик и реагентов, известных в этой области.
В контексте данного изобретения термин «метка» относится к композиции, определяемой фотометрическими, визуализационным анализом, спектроскопическим, фотохимическим, биохимическим, иммунохимическим или химическим способами. Например, используемые метки включают флуоресцентные красители, электронплотные реагенты, ферменты, биотин-стрептавидин, диоксигенин, гаптены, протеины, для которых имеются антисыворотка или моноклональные антитела, или красители, специфические относительно нуклеиновых кислот. Таким образом, в данной заявке описаны способы и устройство, в которых состав, свойства и/или характеристики аналитов относительно любого вещества или параметра, измеренные прямо или косвенно любым способом, являются основой для идентификации аналитов и популяций аналитов для отбора или исключения.
Примеры определяемых составов, свойств и/или характеристик аналитов включают без ограничения (1) измерения свойств света, взаимодействующего с аналитами или испускаемого аналитами, таких как поглощение, рассеивание света, люминесценция, флуоресценция, фосфоресценция, поляризация или деполяризация света, или других свойств; (2) электрические свойства, включая без ограничения проводимость, емкость, потенциал, ток или сопротивление аналитов или окружающей среды; (3) свойства электромагнетизма, включая магнетизм, парамагнетизм, магнитный резонанс и/или взаимодействие аналита с или эмиссия электромагнитных сил и/или волн; и (4) визуализацию, свойства визуализации, морфологические свойства или родственные свойства, полученные в результате сбора и/или анализа изображения или подобные изображению свойства аналитов. В определенных аспектах измерение является присущим качественным или количественным свойством аналита, или в альтернативных аспектах измерение является значением, которое косвенно отражает, представляет или аппроксимирует количество или качество аналита. В еще одних аспектах измерение является присущим качественным и количественным свойствам аналита и косвенным отражением, представлением или аппроксимацией качества или количества аналита. Например, и без ограничений, определение или измерение флуоресценции, генерированной аналитом, может представлять собой присущую аналиту флуоресценцию или присутствие и/или количество флуорохрома флуоресцентной частицы, которая связывается с или иным образом ассоциирует с аналитом, что может быть прямым и/или косвенным показателем определенного свойства аналита.
В некоторых аспектах описанных способов и устройства аналиты являются клетками (например, сперматозоидами млекопитающих), и сортирующий цитометр использует способ, который приводит к физическому или пространственному разделению клеток и популяций клеток. В других аспектах описанных способов и устройства сортирующий цитометр использует способ, который физически и/или функционально модифицирует выбранные клетки в популяциях для обеспечения их функционального и/или физического разделения и/или дифференциации, в некоторых случаях для последовательного использования. В некоторых аспектах описанных способов и устройства сортирующий цитометр не основывается на непосредственном разделении клеток по размещению, расположению, резервуару или времени, но вместо этого обеспечивает клетки, которые инактивированы, ограничены в способностях, разрушены, разъединены, фрагментированы или изменены иным образом (т.е. «модифицированы») относительно некоторого требуемого свойства, что в некоторых случаях обеспечивает разделение или дифференциацию субпопуляций в композиции. Природа модификации зависит, полностью или частично, от предполагаемого применения идентифицированных клеток, и, следовательно, характеристик идентифицированных клеток, относящихся к применению. Для примера и только с целью объяснения или пояснения, злокачественная или иным образом иммортализированная или быстрорастущая клетка может считаться функционально инактивированной в контексте получения здоровых соматических клеток, если способность клетки воспроизводиться была подвергнута отрицательному воздействию или если клетка убита. В другом примере, опять только с целью объяснения или пояснения, если применение требует удаления из популяции субпопуляции клеток, например, субпопуляции, которая вырабатывает нежелательный протеин или другое вещество, сортирующий цитометр может достигнуть такого результата путем упразднения выработки вещества в таких клетках, гибели клеток и/или путем модификации клеток для обеспечения их физического удаления из популяции.
Способы и устройство, описанные в данном документе, используют в некоторых вариантах осуществления изобретения источник сортирующей энергии для модификации клеток или для индукции или инициации процесса, такого как химическая активация, который может модифицировать клетки. Модификации, индуцированные источником сортирующей энергии, включают в различных аспектах прямое воздействие на аналит. Например, если аналит является клеткой, прямой эффект на клетки может включать без ограничения (1) модификацию клеточных компонентов или химических веществ, включая белки, ДНК и вещества, участвующие в клеточном метаболизме; (2) разрушение, нагревание, кавитацию или разрывы, происходящие внутри или возле клеток; пермеабилизацию или перфорацию клеток; и (3) разрушение, фрагментацию или морфологическое изменение клеток, включая клетки, вирусы, тельца или частицы.
В других вариантах осуществления изобретения модификации могут также или альтернативно включать непрямое воздействие источника сортирующей энергии, опосредованное источником сортирующей энергии или другими факторами, включая, например, (1) химическую активацию и/или деактивацию, химическое образование перекрестных связей или химическую дериватизацию клеток или одного или нескольких клеточных компонентов, (2) активацию и/или деактивацию одного или нескольких химических агентов в или возле клетки, что вызывает связывание или ассоциацию таких агентов или их производных с клеткой или ее компонентами, или (3) индукцию измененной функциональности клетки. В определенных вариантах осуществления изобретения химический агент(ы), который(ые) реагирует(ют) при облучении с клеткой, может(могут) быть обычно представлен(ы) в клетке или в способе применения, или химический агент(ы) может(могут) быть добавлен(ы) к жидкостному образцу как часть способа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные способы и устройство включают использование фотоактивируемых соединений, которые индуцируются для связывания или ассоциации иным образом с клетками или клеточными компонентами при облучении светом соответствующей интенсивности и энергии. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоактивируемое соединение может быть индуцировано по существу образованием перекрестных связей или денатурацией одного или нескольких клеточных компонентов для влияния на клеточные процессы или метаболизм интересующих клеток. С другой стороны, фотоактивируемые соединения могут индуцировать по существу образование перекрестных связей или денатурацию одного или нескольких клеточных компонентов для гибели интересующих клеток. В другом случае, фотоактивируемое соединение может связываться или иным способом ассоциировать с выбранными клетками и изменять одно или несколько свойств интересующих клеток таким образом, чтобы придать интересующим клеткам возможность быть идентифицированными и/или обогащения и/или обеднения в последующих способах.
Представляющие интерес клетки, которые были изменены химической дериватизацией, такой как добавление химического вещества, в определенных аспектах удаляют, концентрируют или очищают в последующем этапе способами, которые используют свойства или взаимодействия такого вещества. Для примера и только с целью объяснения и пояснения, представляющие интерес клетки в одном аспекте дериватизируют добавлением вещества, которое в последующем связывается антителом, которое обеспечивает захват или ретенцию дериватизированной интересующей клетки различными способами. Предусмотрено большое количество таких веществ, и в одном аспекте такие вещества включают класс соединений, содержащих или родственных 2,4-динитрофенильной группе (ДНФ), которая в одном аспекте распознается и специфически связывается антителами, распознающими ДНФ. В соответствии с этим фотоактивируемые производные ДНФ или родственные соединения используют в одном аспекте для дериватизации интересующих клеток в применении такого типа.
С другой стороны, дериватизированные представляющие интерес клетки могут быть захвачены или удалены с использованием стратегий, которые приводят к преимущественному связыванию дериватизированных интересующих клеток с определенными субстратами. Для примера и только с целью пояснения и объяснения, представляющие интерес клетки, дериватизированные с использованием соединений, содержащих или родственных биотину, в одном аспекте захватываются или остаются на субстратах, поверхностях, веществах, среде, соединениях или частицах, которые связываются или были модифицированы для связывания биотина, например, присутствием авидина, стрептавидина, биотин-связывающих антител или других биотин-связующих молекул. В другом альтернативном аспекте фотоактивируемые производные биотина или родственные соединения используют для дериватизации интересующих клеток в подобном применении. С другой стороны, в других аспектах представляющие интерес клетки изменяют добавлением или ассоциацией химических веществ или соединений перед подверганием селекции и модификации. В таком случае, следовательно, вариант осуществления изобретения, включающий описанные здесь способы и устройство, использует изменение добавленного вещества на выбранных клетках для обеспечения дифференциации таких клеток от других клеток в популяции. Для примера и только с целью объяснения и пояснения, в одном аспекте все клетки в популяции дериватизируют добавлением фотолабильного химического соединения перед анализом, и в одном аспекте специфические клетки подвергают модификации с использованием источника энергии устройства для модификации фотолабильного химического соединения на таких клетках.
Как показано на Фигуре 2, в варианте осуществления изобретения способ 100 для определения и в некоторых случаях высокоскоростной сортировки аналита может в целом последовательно включать, например, введение образца, содержащего или подозреваемого на содержание аналита, в путь тока проточной кюветы через отверстие ввода образца (этап 110), пропускание образца через участок гидродинамической фокусировки (этап 112), освещение образца в зоне исследования, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение (этап 114), получение определяемого сигнала и обнаружение аналита или требуемой характеристики аналита (этап 116), в некоторых случаях - сортировку аналита или интересующего аналита с использованием сортирующей энергии, направленной на аналит в сортирующем участке ниже по течению от зоны исследования, при этом сортирующая энергия способна модифицировать, повредить или разрушить аналит (этап 118), в некоторых случаях - физическую сортировку образца в отверстии вывода образца или в любом другом участке ниже по течению от сортирующего участка (этап 119), и вывод образца через отверстие для вывода образца проточной кюветы (этап 120).
В то время как различные этапы способов описаны по отдельности выше и подробно ниже, следует понимать, что этапы способа могут осуществляться одновременно или по существу одновременно. Например, введение образца в жидкостный путь тока и гидродинамическая фокусировка могут происходить одновременно, например, в вариантах осуществления изобретения, в которых проточная кювета представлена капиллярной трубкой. Капиллярная трубка может почти мгновенно влиять на фокусировку образца. В другом варианте осуществления изобретения элемент для гидродинамической фокусировки может находиться на отверстии для ввода образца, таким образом, отверстие для ввода образца является участком гидродинамической фокусировки и/или включает устройство гидродинамической фокусировки, и образец становится сфокусированным после входа в жидкостный путь тока проточной кюветы. С другой стороны, элемент гидродинамической фокусировки или участок может располагаться книзу от отверстия для ввода образца, и образец может быть сфокусирован после введения в отверстие.
Другой пример этапов, которые могут происходить одновременно или по существу одновременно, включает в некоторых случаях физическую сортировку образца ниже по течению от сортирующего участка и выход образца из отверстия для вывода образца. Как подробно описано ниже, физическая сортировка может возникнуть во время выхода образца из пути прохождения образца. В других вариантах осуществления изобретения участок физической сортировки выше пути прохождения образца, но ниже по течению от сортирующего участка также может присутствовать при условии, что такая физическая сортировка происходит перед выходом образца.
Например, освещение образца, получение определяемого сигнала и определение аналита также может происходить по существу одновременно. По существу одновременно следует понимать таким образом, что этапы освещения, получения и определения проводят при скорости, при которой образец может быть освещен, генерировать определяемый сигнал, и определяемый сигнал может быть получен и передан детектору. Например, такое действие может произойти приблизительно при скорости электромагнитной энергии и, следовательно, может рассматриваться как по существу одновременное.
Способы и устройство для определения аналита в соответствии с вариантами осуществления изобретения обладают улучшенной точностью и производительностью по сравнению с обычно используемыми системами проточной цитометрии. Способы и устройство имеют целый ряд применений, включая дифференциацию клеток, например, на основе количества содержащейся в них ДНК, специфических белков или других биомолекулярных маркеров, которые они содержат, и/или специфических генетических маркеров, которые они содержат (встречающихся в природе или нет). Способы и устройство также используют в дифференциации аналита, например, клеток, путем использования флуоресцирующего антитела или генетического зонда или штамма, что приводит к определяемому отличию между клетками с или без маркера, или приводит к способности измерять разницу экспрессии или количества маркера. Способы и устройство по изобретению используют, в частности, для определения пола в сперматозоидах.
Варианты осуществления устройства по изобретению преимущественно обеспечивают систему проточной цитометрии, в которой оптическая система (т.е. собирающий элемент и в некоторых случаях оптические элементы) не образует барьер или иным образом не требует преобразования или изменения направления потока образца между зоной исследования и сортирующим участком, вокруг оптической системы, позволяя образцу течь в любом желаемом направлении.
Ссылка на Фигуру 3 в представленном ниже описании общих способов и устройства представлена только в иллюстративных целях и никоим образом не должна ограничивать способ освещения, оптическую систему, способ сортировки или любые другие элементы способов и устройства по изобретению, как это подробно описано ниже. Как показано на Фигуре 3, устройство в соответствии с вариантами осуществления данного изобретения обычно включает замкнутую проточную кювету 132, имеющую отверстие для ввода образца 134, отверстие для вывода образца 136 и путь тока 138, находящийся между отверстием для ввода образца 134 и отверстием для вывода образца 136. Проточная кювета 132 может в некоторых случаях включать отверстие для ввода проточной жидкости и контейнер для подачи проточной жидкости (не показано) для введения проточной жидкости в участок проточной кюветы для последующего образования потока по типу «ядро в оболочке». Устройство также включает источник света (не показано) для освещения зоны исследования 148 и вогнутого собирающего элемента 146 для получения определяемого сигнала, генерируемого аналитом 142 в ответ на освещение. Аналит при освещении может отражать, испускать, передавать или иным образом генерировать определяемый сигнал. Вогнутый собирающий элемент 146 имеет связанную верхушку 159, оптическую ось 161 и точку фокусировки 163. В контексте данного изобретения следует понимать, что «верхушка» включает участки или части собирающего элемента 146, соотносящиеся к верхушке, независимо от того, включает ли собирающий элемент 146 физическую верхушку, разветвлен или включает отверстие или промежуток, где могла бы располагаться верхушка в ином случае. В контексте данного изобретения «оптическая ось» означает ось собирающего элемента, проходящая через точку фокусировки, вокруг которой вогнутый собирающий элемент имеет ротационную симметрию. В контексте данного изобретения «точка фокусировки» используется в своем общепринятом в данной области значении и для дополнительной ясности означает виртуальную точку, в которой фокусируется электромагнитная энергия, получаемая собирающим элементом. Поскольку образец проходит через зону исследования, он имеет ось потока 145, совпадающую с оптической осью 161 собирающего элемента 146. Устройство также включает детектор 150 для обнаружения полученного определяемого сигнала.
Образец, содержащий аналит 142 или подозреваемый на его содержание, подается в замкнутую проточную кювету 132 через отверстие для ввода образца 134. Как показано на Фигуре 4А, в некоторых вариантах осуществления изобретения образец течет по пути тока 138 из зоны исследования 148 по направлению к верхушке 159 собирающего элемента 146. Как показано на Фигуре 4В, в других вариантах осуществления изобретения образец течет по пути тока 138 от верхушки 159 собирающего элемента 146 по направлению к зоне исследования 148. В обоих вариантах осуществления изобретения участок потока 138 проходит через внутренний объем 167 собирающего элемента 146. Фигура 3 также иллюстрирует вариант осуществления изобретения, в котором образец течет от верхушки 159 собирающего элемента 146 по направлению к зоне исследования 148.
В различных вариантах осуществления изобретения участок проточной кюветы 132 проходит через собирающий элемент 146 или участок или пространство в стенке собирающего элемента 146. Например, как показано на Фигурах 3, 4А и 4В, собирающий элемент 146 разветвлен, и участок проточной кюветы 132 проходит через отверстие в участке, соответствующем верхушке 159 собирающего элемента 146. Предусмотрено, что проточная кювета 132 может проходить через участок или отверстие вогнутого собирающего элемента, включая верхушку, отверстие, просверленное в верхушке, и/или отверстие или дыру в одной или нескольких боковых стенках.
Зона исследования 148 совпадает с точкой фокусировки 145 собирающего элемента 146. В некоторых вариантах осуществления изобретения зона исследования 148 может быть одной точкой, которая совпадает с точкой фокусировки 163 собирающего элемента 146. В других вариантах осуществления изобретения, например, как указано на Фигуре 4А, зона исследования 148 может иметь максимальную внешнюю границу, находящуюся в диапазоне от приблизительно 0 мкм до приблизительно 150 мкм кверху и/или книзу от точки фокусировки FP собирающего элемента 146. Другие подходящие границы (кверху, книзу или и кверху и книзу от точки фокусировки 163 собирающего элемента 146) включают, например, от приблизительно 0 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 70 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 60 мкм, от приблизительно 15 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 15 мкм до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 150 мкм и от приблизительно 30 до приблизительно 100 мкм. Подходящие расстояния между границами могут также включать, например, приблизительно, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 и 150 мкм.
Участок пути тока 138, проходящий через зону исследования 148, коаксиален оптической оси 161 собирающего элемента 146.
По всему тексту заявки «коаксиальный» означает выравнивание элементов относительно их соответствующей оси с допустимой погрешностью от приблизительно 0° до приблизительно 15°. Например, подходящая допустимая погрешность включает приблизительно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15°.
Образец освещают в зоне исследования 148 источником света (на Фигуре 3 не показано) или посредством фокусировки электромагнитной энергии, испускаемой источником света, на зону исследования 148, с использованием оптической системы (примеры осуществления которой подробно описаны ниже). Аналит 142 генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение. Собирающий элемент 146 получает определяемый сигнал и отражает или передает определяемый сигнал на детектор 150 для обнаружения аналита 142. Устройство и способ могут в некоторых случаях включать источник сортирующей энергии для сортировки аналита 142 в сортирующем участке 152 ниже по течению от зоны исследования 148.
Проточная кювета 132 является замкнутой проточной кюветой, имеющей отверстие для ввода образца 134, отверстие для вывода образца 136 и путь тока 138 между отверстием для ввода образца 134 и отверстием для вывода образца 136. Проточная кювета может иметь любую форму поперечного сечения, включая, но не ограничиваясь, круглую, эллиптическую, прямоугольную, квадратную или любую другую многоугольную. В различных вариантах осуществления изобретения проточная кювета является цилиндрической, имеющей круглую форму поперечного сечения. В любых вариантах осуществления изобретения, описанных в данном документе, проточная кювета 132 может в некоторых случаях включать сферическую складку 154 (как показано на Фигуре 3), окружающую зону исследования 148. Сферическая складка 154 может быть образована из материала, имеющего коэффициент преломления в пределах подходящей допустимой погрешности коэффициента преломления стенки проточной кюветы 132 в зоне исследования. Как подробно обсуждается ниже, сферическая складка может уменьшать или элиминировать рефракционное искажение определяемого сигнала, происходящее из-за контакта стенки проточной кюветы с воздухом. Допустимая погрешность может находиться в диапазоне, например, от 0 до 0,1.
В контексте данного изобретения «замкнутая проточная кювета» обозначает проточную кювету 132, в которой по меньшей мере участок пути тока 138, проходящий через зону исследования 148 и сортирующий участок 152, является замкнутым путем тока. В контексте данного изобретения «замкнутый путь тока» означает путь тока, имеющий один путь движения, ограниченный стенкой проточной кюветы и не имеющий разделения или разветвления. В контексте данного изобретения «разделение» и «разветвление» означает любое разделение пути движения на два или более отдельных путей. Замкнутая проточная кювета 132 в соответствии с изобретением включает путь тока 138 между зоной исследования 148 и сортирующим участком 152, который полностью ограничен и не разделен. Таким образом, в проточной кювете 132 в соответствии с изобретением сортировка в сортирующем участке 152 происходит под воздействием сортирующей энергии, сфокусированной в сортирующем участке 152, а не физической сортировки образца на разделенные пути потока. Замкнутая проточная кювета преимущественно исключает нежелательное воздействие преломления на электромагнитную энергию, вызванное взаимодействием между каплями в образце и воздухом в обычных, незамкнутых проточных кюветах. Как более подробно обсуждается ниже, варианты осуществления изобретения могут, однако, дополнительно включать участок физической сортировки ниже по течению от сортирующего участка 152, например, у отверстия для вывода образца 136, для физической сортировки образца после применения сортирующей энергии и/или для разделения текущей жидкости на отдельные компоненты, например, но не ограничиваясь этим, для отделения некоторой части проточной жидкости от содержащего образец аналита.
Этапы способа в соответствии с изобретением и устройство для осуществления способа будут более подробно описаны ниже. Любая комбинация элементов гидродинамической фокусировки, способов освещения, оптических систем и способов сортировки, описанных по отдельности ниже, может быть использована в способах и устройстве в соответствии с вариантами осуществления изобретения.
Поток жидкости и гидродинамическая фокусировка
Проточную жидкость и раствор аналита вводят в жидкостный путь тока 138. Например, элемент гидродинамической фокусировки может образовывать в проточной кювете поток аналита по типу «ядро в оболочке» в проточной жидкости или ламинарный поток. Поток по типу «ядро в оболочке» или ламинарный поток может быть в значительной степени стабильным перед пропусканием через зону исследования 148. Скорость потока по типу «ядро в оболочке» может составлять приблизительно от 1 до 60 м/с. Аналиты 142 в потоке по типу «ядро в оболочке» могут быть пространственно разделены так, что приблизительно от 10000 до 300000 клеток в секунду проходят через зону исследования 148. Разделение между аналитами 142 может быть скорректировано, например, коррекцией относительных вязкостей и/или скоростей ядра и оболочки потока, что, в свою очередь, может сопровождаться системой контроля потока, настраивающей соответствующие сигналы для насосов, присоединенных к соответствующим резервуарам подачи проточной жидкости и раствора аналита.
Некоторые системы жидкостных потоков, такие как, без ограничения, поток по типу «ядро в оболочке», обладают свойством ориентировать несимметричные клетки, частицы или аналиты таким образом, что длинные оси клеток, частиц или аналита располагаются коаксиально направлению жидкостного потока. Этот факт хорошо изучен специалистами в данной области, как в случае с некоторыми сперматозоидами, включая большое число разновидностей сперматозоидов млекопитающих, и было показано, что определенные сперматозоиды могут выравниваться в потоке по типу «ядро в оболочке» таким образом, что длинная ось клеток в основном коаксиальна потоку. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения поток по типу «ядро в оболочке» или другие варианты потока могут обеспечивать продольное расположение частиц (например, сперматозоидов млекопитающих), которые несутся в потоке.
Продольное выравнивание частиц в потоке имеет практическое преимущество, например и без ограничения, для анализа содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) сперматозоида. Сперматозоиды несут ДНК, и прямые или косвенные измерения относительного количества ДНК в сперматозоидах могут быть проведены в проточном цитометре с использованием флуоресцентных красителей, таких как 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорида или бисбензимида (Hoechst 33312), которыми такие клетки могут быть обработаны для получения измерений флуоресценции, которые коррелируют с количеством ДНК отдельной клетки. Принимая во внимание, что сперматозоиды у некоторых видов, включая, но не ограничиваясь, многие виды млекопитающих, могут содержать Х или Y хромосому, которая определяет женский или мужской (соответственно) пол потомства при связывании сперматозоида с ооцитом, и принимая во внимание, что Х и Y хромосомы могут иметь различный размер, и, кроме того, принимая во внимание, что другие хромосомы и ДНК в сперматозоидах могут быть относительно инвариантны в общем количестве, флуоресценция соответствующим способом окрашенных флуоресцентно сперматозоидов может использоваться для определения содержания Х или Y хромосомы. Однако сперматозоиды могут быть нецилиндрично симметричны относительно основной продольной оси. Это справедливо, например и без ограничения, для сперматозоидов человека и рогатого скота. Такие клетки имеют уплощенный протопласт, также известный как головка, и специалист в данной области должен хорошо понимать, что такие ассиметричные тельца излучают флуоресценцию анизотропно, таким образом, флуоресценция в одном направлении может значительно отличаться от флуоресценции в другом направлении относительно продольной оси сперматозоида. По этой причине сложно точно измерить флуоресценцию сперматозоидов из направлений вокруг продольной оси сперматозоидов без первичного определения угла вращения относительно детектора. Способы ориентации и/или определения ориентации сперматозоидов в потоке известны специалистам в данной области и позволили достигнуть требуемой точности для распознавания сперматозоидов, несущих Х и Y хромосому, например, Johnson, патент США №5135759, описание которого включено сюда в полном объеме посредством ссылки. Однако флуоресценция сперматозоидов в направлении продольной оси относительно инвариантна как функция вращения клеток вокруг продольной оси. Meistrich and Göhde, et al. (1978: Resolution of X and Y spermatids by pulse cytophotometry. Nature 274(5673): 821-823) и другие показали, что распознавание сперматозоидов, несущих Х и Y хромосому, практически достижимо, когда сперматозоиды ориентированы продольно в потоке жидкости, например, в потоке по типу «ядро в оболочке», и когда оптические элементы для определения флуоресценции ориентированы коаксиально потоку.
Было преимущественно определено, что давление, оказываемое на клетку во время гидродинамической фокусировки, может быть измерено в соответствии с максимальной скоростью диссипации локальной энергии, и такое измерение обеспечивает лучший прогноз показателя смертности клеток в образце по причине гидродинамической фокусировки в сравнении с прогнозами на основе напряжения сдвига. Скорость диссипации энергии (EDR) может быть рассчитана с использованием следующей формулы:
T
ε=μ(∇U+∇U):∇U
T
T
где ε является EDR, μ является вязкостью, (∇U+∇U) является тензором напряжения, ∇U является градиентом вязкости тензора и ∇U является преобразованием ∇U. EDR применимо для сил сдвига и сил растяжения, действующих на клетку в суспензии.
В некоторых вариантах осуществления изобретения элемент гидродинамической фокусировки может быть включен в участок проточной кюветы 132 для образования потока по типу «ядро в оболочке». Элемент гидродинамической фокусировки может преимущественно обеспечивать одно или несколько следующих преимуществ: создание ламинарного потока частиц аналита в потоке по типу «ядро в оболочке», исключение или сведение к минимуму рециркуляции в участке введения 155 ядра потока в поток оболочки, достижения коэффициента разбавления ядра относительно оболочки менее чем 20:1, поддержание стабильного ядра потока более чем 0,200 мм и вплоть до нескольких сантиметров, сведение к минимуму напряжения сдвига, которое испытывают частицы аналита, сведение к минимуму максимальной диссипации локальной энергии, испытываемой частицами аналита, и/или создание отдельного потока аналитов при скорости более чем 10000 частиц в секунду и до 300000 частиц в секунду. Другие известные преимущества гидродинамической фокусировки также предусмотрены изобретением.
Элемент гидродинамической фокусировки может быть расположен в любом подходящем месте пути тока 138 при условии установления стабильного ламинарного потока или потока по типу «ядро в оболочке» перед тем, как образец проходит через зону исследования 148.
Фигура 5А иллюстрирует вариант осуществления изобретения с элементом гидродинамической фокусировки 157, который может использоваться в способах и устройстве по данному изобретению. Фигура 5В является изображением поперечного сечения элемента гидродинамической фокусировки 157, представленного на Фигуре 5А, через линию А-А', показанной на Фигуре 5А. Как показано на Фигурах 5А и 5В, типичный элемент гидродинамической фокусировки 157 имеет внешний путь тока 156 и внутренний путь тока 158, расположенный внутри внешнего пути тока 156. Как внутренний путь тока 158, так и внешний путь тока 156 могут иметь соответствующую ось потока 160, 162, и оси потока 160, 162 могут быть коаксиальны. Внешний путь тока может определять поток, например, для проточной жидкости 164, и внутренний путь тока может определять поток, например, для образца 141, содержащего аналит 142 или подозреваемого на содержание аналита 142.
Внешний путь тока 156 может иметь максимальный радиус 166, например, в диапазоне от приблизительно 0,4 мм до приблизительно 20 мм, от приблизительно 0,6 мм до приблизительно 15 мм, от приблизительно 0,8 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 10 мм до приблизительно 20 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 20 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 18 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 16 мм, от приблизительно 6 мм до приблизительно 14 мм, от приблизительно 8 мм до приблизительно 12 мм, от приблизительно 0,4 мм до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,6 мм до приблизительно 0,7 мм, от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 0,7 мм, от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 1 мм и от приблизительно 0,4 мм до приблизительно 0,8 мм. Другие подходящие максимальные радиусы 166 составляют, например, приблизительно 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 мм. В некоторых вариантах осуществления изобретения максимальный радиус 166 равен приблизительно 0,628 мм.
Внутренний путь тока 158 может иметь максимальный радиус 168, например, в диапазоне от приблизительно 20 мкм до приблизительно 1000 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 35 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 35 мкм до приблизительно 45 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно 45 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 100 мкм. Другие подходящие радиусы 168 составляют, например, приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 и 1000 мкм. В некоторых вариантах осуществления изобретения максимальный радиус 168 внутреннего пути тока составляет приблизительно 38 мкм.
Элемент гидродинамической фокусировки 157 может включать стенку 170, окружающую внутренний путь тока 158. Стенка 170 может иметь внешний диаметр 172, например, в диапазоне от приблизительно 50 мкм до приблизительно 300 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 150 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 50 мкм до приблизительно 250 мкм, и от приблизительно 100 мкм до приблизительно 300 мкм. Другие подходящие диаметры 172 составляют, например, приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 и 300 мкм. В некоторых вариантах осуществления изобретения внешний диаметр 172 составляет приблизительно 191 мкм.
Внешняя поверхность 174 стенки 170, окружающей внутренний путь тока 158, может сужаться к концу 176, расположенному перед точкой соприкосновения 178 внутреннего и внешнего путей тока 158, 156. Например, расстояние 180 от начала 181 сужения 182 к соприкосновению 178 путей тока 156, 158 может быть в диапазоне от приблизительно 200 мкм до приблизительно 1000 мкм, от приблизительно 500 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 560 мкм, от приблизительно 550 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 700 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 1 мм, от приблизительно 200 мкм до приблизительно 700 мкм или от приблизительно 300 мкм до приблизительно 600 мкм. Другие подходящие расстояния 180 составляют, например, приблизительно 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 и 1000 мкм. В некоторых вариантах осуществления изобретения расстояние 180 составляет приблизительно 555 мкм.
Угол 184 между коаксиальными осями тока 160, 162 и суженной внешней поверхностью 182 стенки 170, окружающей внутренний путь тока 158, может составлять от приблизительно 0,1° до приблизительно 15°; с другой стороны, от приблизительно 0,1° до приблизительно 10°; с другой стороны, от приблизительно 5° до приблизительно 10°; с другой стороны, от приблизительно 5° до приблизительно 10°; с другой стороны, от приблизительно 8° до приблизительно 12°; с другой стороны, от приблизительно 5° до приблизительно 15°; с другой стороны, от приблизительно 9° до приблизительно 11°; с другой стороны, от приблизительно 9,5° до приблизительно 10,5°. Другие подходящие углы 184 составляют, например, приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5 и 15°. В некоторых вариантах осуществления изобретения угол 184 равен приблизительно 10°.
Внешняя поверхность 186 внешнего пути тока 156 может быть сужена от первой точки 188 до второй точки 190. Вторая точка 190 может быть точкой, соответствующей образованию стабильного потока по типу «ядро в оболочке» 192, в то время как первая точка 188 может, в некоторых вариантах осуществления изобретения, быть копланарной началу сужения 182 внешней поверхности 174 стенки 170, окружающей внутренний путь тока 158, или плоскость перпендикулярна внутреннему и внешнему путям тока 158, 156. Расстояние 194 вдоль оси 160, 162 пути тока 138 от первой точки 188 до второй точки 190 может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 0,8 мм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 0,8 мм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 0,56 мм до приблизительно 1,1 мм, от приблизительно 0,56 мм до приблизительно 1,2 мм. Другие подходящие расстояния 194 составляют, например, приблизительно 0,5, 0,52, 0,54, 0,56, 0,58, 0,6, 0,62, 0,64, 0,66, 0,68, 0,7, 0,72, 0,74, 0,76, 0,78, 0,8, 0,82, 0,84, 0,88, 0,9, 0,92, 0,94, 0,96, 0,98, 1, 1,02, 1,04, 1,06, 1,08, 1,1, 1,12, 1,14, 1,16, 1,18 и 1,2. В некоторых вариантах осуществления изобретения расстояние 194 составляет приблизительно 1,062 мм.
Угол 196 между коаксиальными осями потока 160, 162 и суженной внешней поверхностью 186 внешнего пути тока 156 может находиться в диапазоне от приблизительно 15° до приблизительно 45°, от приблизительно 15° до приблизительно 35°, от приблизительно 25° до приблизительно 45°, от приблизительно 25° до приблизительно 35°, от приблизительно 27° до приблизительно 33° или от приблизительно 29° до приблизительно 31°. Другие подходящие углы 196 составляют, например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 и 45°. В некоторых вариантах осуществления изобретения угол 196 равен приблизительно 30°.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Проточная жидкость 164, текущая через внешний путь тока 156, может течь со скоростью от приблизительно 20 мм в секунду до приблизительно 600 мм в секунду; или от приблизительно 20 мм в секунду до приблизительно 400 мм в секунду, или от приблизительно 20 мм в секунду до приблизительно 200 мм в секунду; или от приблизительно 20 мм в секунду до приблизительно 100 мм в секунду; или от приблизительно 20 мм в секунду до приблизительно 85 мм в секунду; или от приблизительно 25 мм в секунду до приблизительно 85 мм в секунду; или от приблизительно 35 мм в секунду до приблизительно 85 мм в секунду; или от приблизительно 40 мм в секунду до приблизительно 85 мм в секунду; или от приблизительно 50 мм в секунду до приблизительно 85 мм в секунду; или от приблизительно 75 мм в секунду до приблизительно 85 мм в секунду; или от приблизительно 80 мм в секунду до приблизительно 81 мм в секунду, или от приблизительно 500 мм в секунду до приблизительно 600 мм в секунду, или от приблизительно 100 мм в секунду до приблизительно 600 мм в секунду, или от приблизительно 200 мм в секунду до приблизительно 400 мм в секунду, или от приблизительно 300 мм в секунду до приблизительно 500 мм в секунду, или от приблизительно 400 мм в секунду до приблизительно 500 мм в секунду, или от приблизительно 300 мм в секунду до приблизительно 400 мм в секунду; и в частности 80,3 мм в секунду. Например, подходящие скорости составляют приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580 и 600 мм в секунду.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Ядро потока (т.е. образец 141) может течь через внутренний путь тока 158 со скоростью от приблизительно 0,1 мм в секунду до приблизительно 30 мм в секунду, от приблизительно 10 мм в секунду до приблизительно 30 мм в секунду, от приблизительно 15 мм в секунду до приблизительно 20 мм в секунду, от приблизительно 1 мм в секунду до приблизительно 30 мм в секунду, от приблизительно 2 мм в секунду до приблизительно 20 мм в секунду, от приблизительно 4 мм в секунду до приблизительно 18 мм в секунду, от приблизительно 6 мм в секунду до приблизительно 16 мм в секунду, от приблизительно 8 мм в секунду до приблизительно 10 мм в секунду, от приблизительно 20 мм в секунду до приблизительно 30 мм в секунду, от приблизительно 0,1 мм в секунду до приблизительно 10 мм в секунду; или от приблизительно 2 мм в секунду до приблизительно 10 мм в секунду; или от приблизительно 3 мм в секунду до приблизительно 10 мм в секунду; или от приблизительно 3 мм в секунду до приблизительно 8 мм в секунду; или от приблизительно 3 мм в секунду до приблизительно 6 мм в секунду; или от приблизительно 3,5 мм в секунду до приблизительно 4,5 мм в секунду; и в частности приблизительно 4 мм или приблизительно 3,93 мм в секунду. Другие подходящие скорости составляют, например, приблизительно, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и 30 мм в секунду.
В различных вариантах осуществления изобретения элемент гидродинамической фокусировки 157 может приводить к стабильному потоку по типу «ядро в оболочке» 192, имеющему диаметр ядра в диапазоне от приблизительно 10 мкм до приблизительно 50 мкм; или от приблизительно 10 мкм до приблизительно 40 мкм; или от приблизительно 10 мкм до приблизительно 30 мкм; или от приблизительно 10 мкм до приблизительно 20 мкм; или от приблизительно 20 мкм до приблизительно 30 мкм; или от приблизительно 20 мкм до приблизительно 40 мкм; или от приблизительно 20 мкм до приблизительно 50 мкм; или от приблизительно 30 мкм до приблизительно 40 мкм; или от приблизительно 30 мкм до приблизительно 50 мкм; или от приблизительно 25 мкм до приблизительно 35 мкм; и в частности приблизительно 30 мкм. В различных вариантах осуществления изобретения элемент гидродинамической фокусировки 157 может приводить к стабильному потоку по типу «ядро в оболочке» 192, имеющему диаметр ядра в диапазоне от приблизительно 1 мкм до приблизительно 10 мкм; или от приблизительно 2 мкм до приблизительно 9 мкм; или от приблизительно 3 мкм до приблизительно 10 мкм; или от приблизительно 5 мкм до приблизительно 10 мкм; или от приблизительно 5 мкм до приблизительно 7 мкм; или от приблизительно 5 мкм до приблизительно 15 мкм; и в частности приблизительно 6 мкм.
В других вариантах осуществления изобретения поток по типу «ядро в оболочке» может быть установлен, например, как это описано в патенте США №5007732, содержание которого включено сюда посредством ссылки. Как показано на Фигуре 6, поток по типу «ядро в оболочке» может быть установлен, например, с использованием элемента гидродинамической фокусировки 198, имеющего пробирку для образца, через которую образец 142, содержащий аналит или подозреваемый на содержание аналита, течет, располагаясь в центре потока проточной жидкости 200. Элемент гидродинамической фокусировки 198 включает капиллярный путь тока 202, имеющий одну боковую стенку 202А с гладкой поверхностью и внешнюю боковую стенку 202В с шероховатой поверхностью. Ламинарный поток образуется в капилляре и, благодаря расположению потоков образца и проточной жидкости, образует поток по типу «ядро в оболочке». В некоторых вариантах осуществления изобретения элемент гидродинамической фокусировки 198, представленный на Фигуре 6, может быть модифицирован для введения только раствора образца без введения проточной жидкости 200 для индукции ламинарного потока в капиллярном участке без необходимости образования потока по типу «ядро в оболочке».
Как показано на Фигуре 7А, поток по типу «ядро в оболочке» может быть образован, например, введением проточной жидкости 200 и образца 141, содержащего аналит 142, в плоскость, перпендикулярную оптической оси собирающего элемента (не показано), и направлением потока через участок ускорения 204 для получения потока по типу «ядро в оболочке» Образец 141 направляют для поступления в центр проточной жидкости 200 через отверстие или камеру, расположенные в потоке проточной жидкости. Оба потока поступают в участок ускорения 204 и образуют поток по типу «ядро в оболочке». Как показано на Фигуре 7В, поток проточной жидкости 200 может иметь вихревой поток над участком ускорения 204, что может привести к образованию ядра из образца 141. Как показано на Фигуре 7С, поток стабилизируется после участка ускорения 204 с образованием стабильного потока по типу «ядро в оболочке».
В других вариантах осуществления изобретения ламинарный поток может быть получен путем создания по меньшей мере части проточной кюветы из капиллярной трубки, и прохождения потока образца через капиллярную трубку, что приводит к упорядочиванию аналита.
Как описано в патенте США 7340957 и публикациях патентов США №2010/0009333 и 2009/0162887, содержание каждого из которых включено сюда в полном объеме посредством ссылки, проточная кювета и/или любой из описанных выше элементов гидродинамической фокусировки может использоваться с устройствами акустической фокусировки для дополнительного улучшения потока образца. Например, как показано на Фигуре 8, аналиты 142 образца могут быть расположены центрально в потоке образца с использованием акустической фокусировки. Образец течет через проточную кювету мимо преобразователя 206, который излучает механические волны, индуцирующие устойчивую волну в растворе образца. Аналиты привлекаются в центр потока образца как более стабильного участка в стоячей волне. Акустическая фокусировка может использоваться с любым из указанных выше способов гидродинамической фокусировки для дополнительной подготовки потока образца к освещению и обнаружению.
Освещение
Образец может быть освещен любым источником электромагнитной энергии и любым типом электромагнитной энергии, достаточным для излучения определяемого сигнала аналитом при освещении или его получения иным способом. Например, электромагнитная энергия от источника света (или сфокусированная от него оптической системой) может поступать на аналит случайным образом и может вызвать отражение света или передачу света через один или более элементов в аналите или на поверхности аналита. С другой стороны или кроме того, электромагнитная энергия может поступать на аналит случайным образом или на элемент в аналите и может быть поглощена или поглощаться одним или несколькими элементами в аналите или на поверхности аналита и может вызвать излучение определяемого сигнала, такого как свет или другая электромагнитная энергия, одним или несколькими элементами. В некоторых вариантах осуществления изобретения элемент в или на поверхности элемента может быть маркером (встречающимся в природе или другим), добавленным к аналиту, например, клетке. Например, маркер может излучать флуоресцентный сигнал в ответ на освещение. В варианте осуществления изобретения маркер является флуоресцентным красителем, таким как 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид или бисбензимид (Hoechst 33312).
В контексте данного изобретения «освещение» означает освещение, возбуждение или другую энергетическую стимуляцию аналита или элемента или маркера для генерации определяемого ответа. Например, электромагнитная энергия может быть светом в видимом спектре, светом в инфракрасном спектре и/или светом в ультрафиолетовом спектре. В любом из описанных вариантов осуществления изобретения также могут использоваться другие типы и длины волн подходящей электромагнитной энергии.
Источник света может быть любым подходящим источником электромагнитной энергии. Например, источник света может быть лазером или источником некогерентного света, такого как ртутная лампа, вольфрамовая лампа, металлогалогеновая лампа, ксеноновая лампа или излучающий свет диод. В некоторых вариантах осуществления изобретения электромагнитная энергия может быть поляризована по кругу, например, с использованием четвертьволновой пластинки. Поляризация по кругу может преимущественно снижать поляризационную зависимость определяемого сигнала. В некоторых вариантах осуществления изобретения детектор или одно или несколько плоских зеркал, присоединенных к детекторному элементу (как это детально описано ниже), могут включать поляризационные элементы, которые могут снижать зависимость определяемого или измеряемого сигнала от поляризации источника света.
В некоторых вариантах осуществления изобретения источник света 151 прямо освещает образец в зоне исследования 148. Например, один или несколько источников света могут освещать образец под любым требуемым углом относительно оси потока в зоне исследования. Например, источник света может освещать образец в плоскости, перпендикулярной оси тока в зоне исследования. Также могут подходить другие углы освещения. Например, в различных вариантах осуществления изобретения источник света может освещать образец коаксиально оси потока в зоне исследования.
Зона исследования может быть освещена из одного или нескольких направлений в точках, под углами, телесными углами или участками произвольной формы. Плоские оптические элементы, такие как плоские зеркала, могут использоваться в любом из способов освещения и конфигурациях, описанных подробно ниже, для отведения пути электромагнитной энергии к требуемому участку устройства, например, другому оптическому элементу или зоне исследования, для обеспечения универсальности оптической системы устройства. Например, такие плоские оптические элементы могут использоваться для присоединения собирающего элемента, детектора, оптических элементов (если присутствуют) и сортирующей энергии (если присутствует) иным способом, кроме коаксиального. В некоторых вариантах осуществления изобретения такое перенаправление электромагнитной энергии может обеспечить более компактное размещение одного или нескольких собирающих элементов, детектора, оптических элементов (если присутствуют) и сортирующей энергии (если присутствует).
В некоторых вариантах осуществления изобретения зону исследования освещают с ротационной симметрией. В контексте данного изобретения «ротационная симметрия» означает освещение зоны исследования, которая ротационно симметрична любой из заданных осей. В других вариантах осуществления изобретения зона исследования освещается асимметрично. В контексте данного изобретения «асимметричный» означает освещение зоны исследования, которая ротационно симметрична оптической оси собирающего элемента. Освещение считается ротационно симметричным или асимметричным, несмотря на прерывания или препятствия для пути электромагнитной энергии, вызванных, например, элементом устройства, до тех пор, пока освещение будет ротационно симметричным или асимметричным, но по причине прерывания или препятствия. Например, источники когерентного света, падающего на зону исследования из любого выбранного направления, могут быть выбраны как имеющие угол падения, равный приблизительно 54,7°, друг от друга или от оси собирающего элемента, причем в данной области техники известно, что угол 54,7° является преимущественным при некоторых обстоятельствах для уменьшения трудностей измерения, связанных с поляризацией (Asbury et al. Cytometry 40: 88-101 (2000)). Такое освещение является ротационно симметричным.
В других вариантах осуществления изобретения зону исследования освещают из одного направления или из множественных направлений, которые не определяются ротационной симметрией. Только в целях примера и без ограничений, такая несимметричная схема освещения может включать использование нескольких лазерных лучей, сходящихся в точке исследования из плоскости, перпендикулярной оси потока в зоне исследования, таким образом, что углы падения из источников света неравномерно расположены и не определяются ротационной симметрией.
В различных вариантах осуществления изобретения один или несколько источников света могут использоваться для непосредственного освещения образца в зоне исследования при различных углах, распределенных вокруг оси потока в зоне исследования. В таких вариантах осуществления изобретения свет от источника света может быть напрямую сфокусирован на зону исследования под требуемым углом освещения, или один или несколько плоских оптических элементов могут использоваться для направления электромагнитной энергии в зону исследования под требуемым углом.
Фигура 9 иллюстрирует вариант осуществления изобретения, в котором освещение аналита 142 в зоне исследования 148 происходит под углом, перпендикулярном оси потока в зоне исследования 148, который также перпендикулярен оптической оси собирающего элемента (коаксиален оси тока вблизи от зоны исследования 148). Для варианта осуществления изобретения, отображенного на Фигуре 9, источник света 151 освещает зону исследования 148 прямым образом. Фигура 9 иллюстрирует проточную кювету 132 в зоне исследования, при этом оптическая ось собирающего элемента расширяется за пределы собственной оси. Также предусмотрено, что один или несколько оптических элементов может находиться между источником света 151 и зоной исследования 148 для направления освещения под углом, перпендикулярном оси потока вблизи от зоны исследования 148. Например, плоское зеркало под углом 45° может направлять электромагнитную энергию под углом 90° от ее пути при испускании источником света 151. Могут использоваться другие углы и несколько зеркал, чтобы отклонять электромагнитную энергию от источника света 151 и обеспечивать более удобное и/или компактное размещение источника света 151.
Фигура 10 иллюстрирует пример освещения (лучами электромагнитной энергии 149) аналита 142 в зоне исследования 148 в плоскости, перпендикулярной оптической оси собирающего элемента (и, вследствие этого, оси потока вблизи от зоны исследования 148), с использованием нескольких источников света 151а, 151b, 151с. Фигура 10 иллюстрирует проточную кювету 132 в зоне исследования, при этом оптическая ось собирающего элемента расширяется за пределы собственной оси. Один или несколько источников света могут освещать образец из одного или нескольких направлений, из углов дуги, превышающих 0°, но менее 360°, в плоскости, по сути перпендикулярной оси потока в зоне исследования. Например, осесимметричное освещение образца в зоне исследования 148 может быть достигнуто с использованием нескольких источников света при углах, распределенных вокруг оси потока в зоне исследования. Например, и без ограничения, три источника света могут располагаться под углом 90° (перпендикулярно) к оси потока в зоне исследования 148, 100°, 140° и 120° градусов друг от друга. В контексте данного изобретения такое освещение рассматривается осесимметричным, поскольку существует ротационная симметрия света вокруг оптической оси собирающего элемента. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут использоваться четыре источника света для направленного освещения зоны исследования из направлений под углом 90°. Может использоваться любое подходящее количество источников света.
В других вариантах осуществления изобретения один или несколько источников света могут освещать образец из одного или нескольких направлений, из углов дуги, превышающих 0°, но менее 360°, в плоскости под любым углом относительно оси потока в зоне исследования 148. Например, зона исследования 148 может быть освещена под углом к оси потока (коаксиально оптической оси собирающего элемента).
Например, могут использоваться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более источников света. Варианты осуществления изобретения с использованием нескольких источников света могут обеспечивать получение сигнала высокой силы и умеренной специфичности при одновременном минимальном влиянии на получение испускаемой, переданной или отраженной электромагнитной энергии собирающим элементом. В собирающем элементе для обеспечения освещения в разных направлениях из нескольких источников света могут использоваться одно или несколько отверстий, промежутков или дыр.
Как показано на Фигуре 11, в некоторых вариантах осуществления изобретения проточная кювета 132 может использоваться в качестве волновода для освещения, по меньшей мере, части проточной кюветы 132, например, части, проходящей через зону исследования 148. Источник света 151 (на Фигуре 11 не показан) сфокусирован, или электромагнитная энергия от источника света 151 направлена с использованием одного или нескольких оптических элементов для фокусировки, на отверстие или полупрозрачную часть проточной кюветы 132. Например, дуговая лампа может использоваться в качестве источника света 151. Проточная кювета 132 передает электромагнитную энергию 149 через проточную кювету 132 в зону исследования 148, что позволяет осветить аналит 142 в зоне исследования 148. Проточная кювета по типу капиллярной трубки особенно полезна в таких вариантах осуществления изобретения. Освещение через капиллярную трубку преимущественно нечувствительно к смещениям, его относительно легко собрать, и оно обеспечивает однородное освещение аналита в зоне исследования 148, поскольку существует незначительное изменение интенсивности в волноводе.
Фигура 12 иллюстрирует вариант осуществления изобретения, в котором электромагнитная энергия 149 освещает образец, немного отклоняясь от оси относительно оси потока образца поблизости от зоны исследования 148, которая коаксиальна оптической оси собирающего элемента 146.
В других вариантах осуществления изобретения один или несколько оптических элементов освещения и/или собирающий элемент 146 может использоваться для направления и фокусировки электромагнитной энергии от источника света 151 в зоне исследования 148. Как показано на Фигуре 13, вогнутый собирающий элемент 146 в некоторых случаях может служить в качестве оптического элемента для освещения и собирающего элемента. В таких вариантах осуществления изобретения собирающий элемент 146 получает электромагнитную энергию 149 от источника света 151 или от другого оптического элемента и фокусирует электромагнитную энергию 149 на зону исследования 148. В различных вариантах осуществления изобретения вогнутый собирающий элемент 146 может быть только оптическим элементом, фокусирующим электромагнитную энергию от источника света 151. В других вариантах осуществления изобретения собирающий элемент 146 может быть частью оптической системы и может служить в качестве финального оптического элемента для фокусировки электромагнитной энергии 149 на зону исследования 148.
Как показано на Фигуре 14, в различных вариантах осуществления изобретения источник света 151 может быть сфокусирован на конический оптический элемент 208, который переносит свет на вогнутый оптический элемент 210 или на вогнутый оптический элемент 146, служащий в качестве оптического элемента. Вогнутый оптический элемент 210 фокусирует кольцо, конус или другую произвольную форму электромагнитной энергии вокруг зоны исследования 148. В некоторых случаях электромагнитная энергия фокусируется ротационно симметрично относительно зоны исследования 148. В других случаях электромагнитная энергия фокусируется осесимметрично относительно зоны исследования 148. Такая оптическая система может дополнительно включать плоский оптический элемент (не показано) для дополнительной фокусировки электромагнитной энергии от вогнутого оптического элемента 210, при необходимости или желании.
Вогнутый оптический элемент 210 может в некоторых вариантах осуществления изобретения быть кольцеобразным оптическим элементом, имеющим общую вогнутую форму. Другие подходящие формы, такие как параболоиды, элементы конической формы, гиперболоиды, эллипсоиды и сфероиды, могут использоваться в качестве вогнутого оптического элемента в этой или любой другой описанной ниже оптической системе. Другие формы, включая без ограничения некоторые поверхности общей математической формы уравнений второго порядка в трех измерениях или относящиеся к ней, например, f(x, y, z)=ах2+bу2+cz2+2fyz+2gxz+2hxy+2px+2qy+2rz+d=0, могут также использоваться в качестве вогнутого оптического элемента. Если не указано иное, термины «вогнутый оптический элемент», «первый вогнутый оптический элемент» и «второй вогнутый оптический элемент» следует понимать в тексте данной заявки как означающие в целом все потенциальные варианты осуществления изобретения для вогнутого оптического элемента. Следует понимать, что вогнутый оптический элемент может рассматриваться, например, в целом как имеющий эллипсоидную или иную форму, независимо от разрывов или дыр в стенке оптических элементов. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения вогнутый оптический элемент может включать отверстие на верхушке и/или боковой стенке оптического элемента. Например, кольцеобразный оптический элемент может в целом рассматриваться как эллипсоидный, параболоидный, гиперболоидный или сфероидный на основе общей формы кольца при предоставлении отсутствующих стенок. В некоторых вариантах осуществления изобретения вогнутый оптический элемент является зеркалом для отражения электромагнитного облучения в требуемом направлении.
В представленных выше или любом из представленном ниже вариантах осуществления изобретения, использующих конический оптический элемент 208, конический оптический элемент 208 может иметь любую подходящую форму основания и может быть прямым конусом или наклонным конусом. Схема конического оптического элемента 208 относительно вогнутого оптического элемента 210 зависит от формы вогнутого оптического элемента 210 и формы (прямой или наклонной) конического оптического элемента 208. Схема конического оптического элемента 208 и вогнутого оптического элемента 210 для получения передачи плоскости, кольца или любой произвольной формы света может быть получена размещением конического оптического элемента 208 относительно точки во внутреннем объеме вогнутого оптического элемента 210, как это известно в области техники. Конический оптический элемент 208 может располагаться вдоль оптической оси вогнутого оптического элемента 210. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения конический оптический элемент 208 совпадает с точкой фокусировки вогнутого оптического элемента 210. В других вариантах осуществления изобретения конический оптический элемент 208 может располагаться относительно точки фокусировки вогнутого оптического элемента 210 по направлению к или от верхушки вогнутого оптического элемента 210. В некоторых вариантах осуществления изобретения плоские зеркала могут использоваться для отклонения света от конического оптического элемента 208 к вогнутому оптическому элементу 210 таким образом, что конический оптический элемент 208 не должен быть коаксиален вогнутому оптическому элементу 210. Источник света может быть коаксиален коническому оптическому элементу 208. В вариантах осуществления изобретения, в которых вогнутый оптический элемент 210, конический оптический элемент 208 и источник света 151 коаксиальны, вогнутый оптический элемент 210 может включать разрыв или отверстие на верхушке для обеспечения беспрепятственного прохода электромагнитной энергии от источника света 151 к коническому оптическому элементу 208. С другой стороны, источник света 151 может быть неправильно расположен относительно оптической оси конического оптического элемента 208, и один или несколько плоских оптических элементов могут использоваться для отражения электромагнитной энергии на конический оптический элемент 208. В таких вариантах осуществления изобретения вогнутый оптический элемент 210 также может включать разрыв или отверстие на верхушке для обеспечения беспрепятственного прохождения электромагнитной энергии.
Фигура 15 иллюстрирует вариант осуществления изобретения, использующий несколько вогнутых оптических элементов для освещения образца. Как показано на Фигуре 15, оптическая система может быть такой, как это описано выше на Фигуре 14, но может дополнительно включать второй вогнутый оптический элемент 212. Электромагнитная энергия 149, переданная или отраженная от первого вогнутого оптического элемента 210, направляется ко второму вогнутому оптическому элементу 212, а не фокусируется непосредственно на зоне исследования 148. Например, конический оптический элемент 208 может располагаться относительно первого вогнутого оптического элемента 210 таким образом, что вогнутый оптический элемент 210 передает или отражает кольцо электромагнитной энергии 149 на второй оптический элемент 212. Второй вогнутый оптический элемент 212 затем фокусирует кольцо электромагнитной энергии 149 в виде конуса на зоне исследования 148. Второй вогнутый оптический элемент 212 фокусирует электромагнитную энергию 149 вокруг зоны исследования. В некоторых случаях электромагнитная энергия фокусируется ротационно симметрично, в еще одних случаях электромагнитная энергия ротационно симметрична относительно оптической оси собирающего элемента (т.е. осесимметрична, при этом релевантной осью является оптическая ось собирающего элемента). В некоторых вариантах осуществления изобретения, как это показано на Фигуре 15, первый и второй оптические элементы 210, 212 и конический элемент 208 коаксиальны друг другу и вогнутому собирающему элементу 146. В других вариантах осуществления изобретения один или несколько оптических элементов могут неправильно располагаться относительно одного или нескольких оптических элементов и/или собирающего элемента 146, и плоские оптические элементы могут использоваться для направления электромагнитной энергии 149 к требуемому участку или оптическому элементу.
В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй вогнутые оптические элементы 210, 212 являются параболоидами, а собирающий элемент 146 является эллипсоидом. В таких вариантах осуществления изобретения первый параболический оптический элемент 210 получает электромагнитную энергию 149 от конического оптического элемента 208 и отражает или передает электромагнитную энергию 149 в виде кольца на второй параболический оптический элемент 212. Второй вогнутый параболический оптический элемент 212 фокусирует полученную электромагнитную энергию 149 на зону исследования 148.
Первый и второй вогнутые оптические элементы 210, 212 могут иметь любую подходящую форму. Например, один или оба первый и второй вогнутые оптические элементы 210, 212 могут быть эллипсоидными, параболоидными, гиперболоидными или сфероидными до тех пор, пока элементы располагаются таким образом, что второй вогнутый оптический элемент 212 получает электромагнитную энергию 149 от первого вогнутого оптического элемента 210 и фокусирует электромагнитную энергию 149 на зоне исследования 148 или собирающем элементе 146. Как это указано выше, собирающий элемент 146 также может служить, в некоторых вариантах осуществления изобретения, в качестве оптического элемента для фокусировки электромагнитной энергии 149 на зоне исследования 148. В вариантах осуществления изобретения, использующих первый и второй вогнутые оптические элементы 210, 212, также предусмотрено, что электромагнитная энергия 149 передается или отражается от второго вогнутого оптического элемента 212 на вогнутый собирающий элемент 146, который затем фокусирует электромагнитную энергию 149 на зоне исследования 148. Вогнутый собирающий элемент 146 будет также служить для получения и сбора определяемого сигнала, если аналит освещают в зоне исследования 148.
В варианте осуществления изобретения, отображенном на Фигуре 15, проточную кювету 132 помещают в оптическую систему между первым вогнутым оптическим элементом 210 и вогнутым собирающим элементом 146, и затем через отверстие на верхушке собирающего элемента 146. Однако также предусмотрены другие схемы расположения проточной кюветы. Например, проточная кювета 132 может быть помещена во внутренний объем собирающего элемента 146 через боковую стенку или разрыв (не показано) в участке боковой стенки собирающего элемента 146 и затем, в свою очередь, в зону исследования 148, таким образом, участок проточной кюветы 132, проходящий через зону исследования 148, коаксиален оптической оси собирающего элемента 146. Может использоваться любое другое расположение проточной кюветы 132 относительно собирающего элемента 146 и оптических элементов, при условии, что ось потока вблизи зоны исследования 148 коаксиальна оптической оси собирающего элемента 146, и стабильный ламинарный поток или поток по типу «ядро в оболочке» установлен выше по течению от зоны исследования 148.
В различных вариантах осуществления изобретения линза объектива может использоваться в качестве оптического элемента для фокусировки электромагнитного освещения от источника света 151 на зону исследования 148. Линза объектива может быть коаксиальна пути тока 138 проточной кюветы 132 вблизи от зоны исследования 148. В некоторых вариантах осуществления изобретения поток образца может быть направлен в направлении от линзы объектива. Фигура 16 иллюстрирует пример осуществления изобретения, в котором линза объектива 217 используется в качестве собирающего элемента, и образец течет от линзы объектива 217. В варианте осуществления изобретения, представленном на Фигуре 16, гидродинамическая фокусировка достигается с помощью планарных источников образца. Однако могут использоваться и другие способы гидродинамической фокусировки и устройство, как это описано выше. В примере, отображенном на Фигуре 16, проточная жидкость 200 и раствор образца 141 текут через участок ускорения 204, чтобы образовать стабильный поток по типу «ядро в оболочке» выше по течению от зоны исследования 148. Как показано на Фигуре 17, линза объектива 317 может быть модифицирована с обеспечением прохождения устройства гидродинамической фокусировки и/или потока образца через линзу объектива 317. В варианте осуществления изобретения, отображенном на Фигуре 17, путь тока для введения образца 141 проходит через модифицированную линзу объектива 317.
Электромагнитная энергия от источника света (не показано) фокусируется линзой объектива 217 или 317 или другим оптическим элементом, на зоне исследования 148. Линза объектива 217 или 317 также действует в качестве собирающего элемента, при этом точка фокусировки совпадает с зоной исследования 148 и взаимодействует с одним или несколькими дополнительными оптическими элементами для направления энергии, испускаемой от аналита, в зоне исследования 148 на детектор. Такая схема преимущественно позволяет использовать линзу объектива 217 или 317 без необходимости отвода потока от линзы объектива. Это может преимущественно обеспечивать расположение сортирующего участка 152 еще ниже по течению от зоны исследования 148 в сравнении с обычными системами, в которых поток должен отводиться от линзы объектива 217 или 317.
Следует учитывать, что варианты осуществления изобретения, представленные в любой из описанных выше оптических схемах, могут включать дополнительные компоненты. Во многих вариантах осуществления изобретения детекторы, источники сортирующей энергии и плоские зеркала для отвода электромагнитной энергии могут быть не показаны, но следует понимать, что они включены в соответствующую схему. Дополнительные компоненты также могут включать: оптические компоненты, такие как компоненты, функционирующие для модуляции и/или ослабления оптического или другого электромагнитного сигнала, для проведения измерений на основе определяемого электромагнитного (например, оптического) сигнала, для характеристики сигнала и/или интенсивности сигнала; и жидкостные компоненты, такие как компоненты, функционирующие для обеспечения потока проточной жидкости или аналита, для измерения скорости потока или объема потока, или для коррекции скорости или объема потока.
Сбор и определение
Собирающий элемент 146 получает энергию (определяемый сигнал), испускаемый или передаваемый и/или исходящий от аналита 142, от элемента в или на поверхности аналита 142, или от маркера в или на поверхности аналита 142. Любое количество вогнутых структур с отражающей поверхностью может использоваться в качестве собирающего элемента 146 для сбора и/или фокусировки определяемого сигнала, полученного от аналита 142 в зоне исследования 148, на детектор 150, включая параболоидные структуры, эллипсоидные структуры и/или другие формы, включая, но не ограничиваясь этим, некоторые поверхности общей математической формы уравнений второго порядка в трех измерениях и/или относящиеся к ней, например, f(x, y, z)=ах2+by2+cz2+2fyz+2gxz+2hxy+2px+2qy+2rz+d=0. Если не указано иное, термин «собирающий элемент» следует понимать в контексте данной заявки как означающий в целом собирающий элемент 146 во всех потенциальных вариантах осуществления изобретения. Если предусмотрена специфическая форма собирающего элемента 146 (например, эллипсоидная, параболоидная и т.д.), фразе «собирающий элемент» будет предшествовать соответствующий описательный термин, такой как «параболоидный» или «эллипсоидный». Следует понимать, что вогнутый собирающий элемент 146 может рассматриваться, например, в целом как имеющий эллипсоидную или иную форму, независимо от разрывов или дыр в стенке собирающего элемента 146. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения собирающий элемент 146 может включать отверстие на верхушке и/или в боковой стенке собирающего элемента 146. Например, кольцеобразный собирающий элемент может в целом рассматриваться как эллипсоидный, параболоидный, гиперболоидный или сфероидный на основе общей формы кольца при предоставлении отсутствующих участков.
Возвращаясь к Фигуре 3 только в целях примера, можно видеть, что собирающий элемент 146 в целом вогнутый, имеющий внутренний объем 167. Собирающий элемент 146 также имеет оптическую ось 161 и точку фокусировки 163. Собирающий элемент 146 дополнительно включает верхушку 159. В некоторых вариантах осуществления изобретения собирающий элемент 146 может иметь кольцо или иным образом неполную внешнюю стенку (например, образующую в целом параболоид, эллипсоид или сферу). В контексте данного изобретения «верхушку» следует понимать как участок, включающий участки собирающего элемента 146, соответствующие верхушке независимо от того, включает ли собирающий элемент 146 стенку или отверстие на верхушке. Например, как это показано на Фигуре 3, собирающий элемент 146, имеющий разветвленную форму, считается как имеющий верхушку 159, где бы располагалась физическая верхушка при отсутствии разветвления.
Оптическая ось 161 собирающего элемента 146 коаксиальна части пути тока 138, проходящей через зону исследования 148. Кроме того, точка фокусировки FA собирающего элемента 146 совпадает с зоной исследования 148.
В некоторых вариантах осуществления изобретения собирающий элемент 146 коаксиален одному или нескольким вогнутым оптическим элементам, таким как вогнутые оптические элементы 210, 212. В других вариантах осуществления изобретения один или несколько вогнутых оптических элементов 210, 212 оптической системы могут располагаться в несоответствии к оси относительно оптической оси 161 собирающего элемента 146, и одно или несколько зеркал могут использоваться для направления отражаемой или передаваемой электромагнитной энергии 149 к интересующему участку, например, сфокусированные на зоне исследования 148.
В некоторых вариантах осуществления изобретения собирающий элемент 146 может быть коаксиален детектору 150. В других вариантах осуществления изобретения оптические элементы могут использоваться для направления полученного определяемого сигнала от собирающего элемента 146 на детектор 150. Например, одно или несколько зеркал могут отражать, перенаправлять и/или фокусировать полученный определяемый сигнал к детектору 150 или на него.
Как показано на Фигуре 18, использование параболоидного собирающего элемента 346, например, преимущественно позволяет получить определяемый сигнал осесимметрично от аналита 142 с очень высокой числовой апертурой. Кроме того, параболоидный собирающий элемент 346 обладает высокой избирательностью, будучи чувствительным к исследуемому аналиту и нечувствительным к другим аналитам и иным источникам шума за пределами точки фокусировки параболоидного собирающего элемента 346.
Как опять показано на Фигуре 18, в некоторых вариантах осуществления изобретения параболоидный собирающий элемент 346 может быть объемом, имеющим внутреннюю параболическую отражающую поверхность 348, соответствующую поверхности усеченного кругового параболоида и, в частности, соответствуя поверхности кругового параболоида, усеченного первой и/или второй плоскостями 350, 352, перпендикулярными оси 354 параболоида. В некоторых вариантах осуществления изобретения электромагнитная энергия от источника света 151 может поступать в объем параболоидного собирающего элемента 346, проходя через первую плоскость 350 перед воздействием на аналит в зоне исследования 148 (т.е. в точке фокусировки 358 параболоидного собирающего элемента 346), но не попадает случайным образом на отражательную поверхность 348 параболоидного собирающего элемента 346 перед воздействием на аналит в зоне исследования 148. В других и/или дополнительных вариантах осуществления изобретения определяемый сигнал 153, полученный параболоидным собирающим элементом 346, выходит из параболоидного собирающего элемента 346, проходя через первую плоскость 350. В варианте осуществления изобретения, отображенном на Фигуре 18, определяемый сигнал 153 проходит через параксиальную линзу 251 и крошечное отверстие 216 перед попаданием на детектор 150. Параксиальная линза 251 и крошечное отверстие 216 являются необязательными и могут быть включены при использовании любого типа собирающего элемента для дальнейшей фокусировки определяемого сигнала 153 перед обнаружением. Один или несколько таких фокусирующих элементов могут быть особенно желательными при использовании параболического собирающего элемента 346, потому что получаемый определяемый сигнал в целом отражается в виде параллельного луча от параболического собирающего элемента.
Вариант осуществления изобретения, отображенный на Фигуре 18, иллюстрирует параболоидный собирающий элемент 346, наполненный средой для снижения эффектов дифракции на определяемый сигнал 153. Среда обведена рамкой 147. Наполнение собирающего элемента 146 средой подробно обсуждается ниже. Было выяснено, что наполненный параболический собирающий элемент 346 обладает эффективностью сбора приблизительно 68% в точке фокусировки 358 и в то же самое время обладает эффективностью сбора только приблизительно 0,4% на расстоянии 100 мкм выше от точки фокусировки 358. Таким образом, параболический собирающий элемент 346 демонстрирует высокую специфичность, а также высокую эффективность сбора. Неправильное расположение оси потока в зоне исследования 148 относительно оптической оси собирающего элемента 346 также может снизить эффективность сбора собирающего элемента 346. Такая схема, не будучи идеальной, может подходить для различных вариантов осуществления изобретения. Было замечено, что неправильное расположение оси потока в зоне исследования 148 на расстоянии 50 мкм относительно оптической оси приводило к эффективности сбора параболического собирающего элемента 346 34% и повышало эффективность сбора выше по течению от зоны/точки исследования 148.
Как показано на Фигуре 19, в некоторых вариантах осуществления изобретения эллипсоидный собирающий элемент 446 используют для получения света от точки исследования 148. Эллипсоидный собирающий элемент 446 может иметь любую форму внешней поверхности и определяется как отдельная, внутренняя, находящаяся на оси эллипсоидная отражающая поверхность, соответствующая поверхности усеченного эллипсоида, которая может быть образована вращением эллипса вокруг его большой оси. Эллипсоид может быть усечен в первой точке плоскостью 450, определенной малой осью эллипсоида, или, с другой стороны, определенной плоскостью, перпендикулярной большой оси и расположенной между центром эллипсоида и первой точкой фокусировки в объеме, определенном эллипсоидным собирающий элементом 446. В еще одном альтернативном случае эллипсоид может быть усечен в первой точке плоскостью, проходящей через большую ось эллипсоида и образующей острый угол с плоскостью, определенной малой осью эллипсоида. В некоторых вариантах осуществления изобретения эллипсоид может быть дополнительно усечен во второй точке 452 между первой точкой фокусировки 454 и границей эллипсоида, определяющей эллипсоидный собирающий элемент 446.
Подобно параболоидному собирающему элементу 346, эллипсоидный собирающий элемент 446 получает определяемый сигнал 153 осесимметрично от аналита 142 с очень высокой числовой апертурой и обладает высокой избирательностью. Кроме того, эллипсоидный собирающий элемент 446, как это описано выше, преимущественно отражает электромагнитную энергию от первой точки фокусировки 454 по направлению ко второй точке фокусировки 456, которая может соответствовать расположению крошечного отверстия 216, фильтрующего нежелательную электромагнитную энергию (например, отраженную электромагнитную энергию света) от попадания на детектор 150 без необходимости присутствия дополнительных линзы и зеркала между первой точкой фокусировки 454 и отверстием 254. В некоторых вариантах осуществления изобретения проточная кювета 132, которая может быть пробиркой, содержащей поток по типу «ядро в оболочке», такой как образующийся гидродинамическим фокусирующим элементом, описанным выше, может проходить через поверхность эллипсоидного собирающего элемента 446 и в частности может проходить через эллипсоидный собирающий элемент 446 вдоль его большой оси между первой точкой фокусировки 454 и границей эллипсоида, определяемой эллипсоидным собирающим элементом 446.
Как и в варианте осуществления изобретения, представленном на Фигуре 18, эллипсоидный собирающий элемент 446 изображен наполненным средой (представлено прямоугольником 147) для сведения к минимуму рефракционных эффектов от взаимодействия стенки проточной кюветы с воздухом. Было замечено, что наполненный эллиптический собирающий элемент 446 обладает эффективностью сбора приблизительно 68% в точке фокусировки 454 (совпадающей с зоной исследования 148) и в то же самое время обладает эффективностью сбора только приблизительно 0,003% на расстоянии 100 мкм выше по течению от точки фокусировки 454. Таким образом, эллиптический собирающий элемент 346 демонстрирует высокую специфичность, а также высокую эффективность сбора.
Для снижения или исключения эффектов интерференции на определяемый сигнал, возникающий от стенок проточной кюветы, внутренний объем собирающего элемента 146 (например, параболоидного и эллипсоидного собирающих элементов 346 и 446, соответственно) может быть наполнен средой, имеющей коэффициент преломления в подходящем диапазоне допустимой погрешности коэффициента преломления стенки проточной кюветы 132 в зоне исследования 148, таким образом, дифракция энергии определяемого сигнала 153 в результате изменения коэффициента преломления по пути прохождения энергии сводится к минимуму или устраняется. Допустимая погрешность может находиться в диапазоне, например, от 0 до 0,1. Подходящие среды включают, например, материалы, хорошо известные в области техники как «жидкости с соответствующим коэффициентом преломления» или «масла с соответствующим коэффициентом преломления». Наполненный собирающий элемент 146 может использоваться в комбинации с любым из способов гидродинамической фокусировки, устройствами и оптическими схемами, описанными выше. Кроме того, собирающий элемент 146 может быть наполнен твердым полимером с соответствующим коэффициентом преломления проточной кюветы, таким образом, дифракция энергии определяемого сигнала в результате изменения коэффициента преломления по пути прохождения энергии сводится к минимуму или устраняется. Кроме того, проточная кювета может быть произведена частично из твердого материала, например, в виде канала, проходящего через твердый материал, и собирающий элемент может быть сконструирован как целостная часть участка поверхности твердого материала, например, в виде вогнутого (относительно зоны исследования) оптического элемента, находящегося на внешней поверхности твердого материала.
В других вариантах осуществления изобретения проточная кювета 132 включает целостную сферическую складку 154 в зоне исследования 148. Сферическая складка 154 также снижает или устраняет интерференцию в определяемом сигнале в результате передачи света через стенку проточной кюветы 132. Определяемый сигнал 153, испускаемый из, передаваемый через или отраженный аналитом, обычно падает на сферическую складку 154 под углом, перпендикулярном поверхности сферической складки 154, что сводит к минимуму или устраняет эффекты преломления, т.к. свет проходит через границу материал-воздух (поверхность сферической складки-воздух).
Сферическая складка 154 может быть образована из того же самого материала, что и проточная кювета 132, или, в альтернативном варианте осуществления изобретения, может быть образована из материала, имеющего коэффициент преломления в пределах подходящей допустимой погрешности коэффициента преломления стенки проточной кюветы 132 в зоне исследования 148, таким образом, дифракция энергии определяемого сигнала 153 в результате изменения коэффициента преломления вдоль пути прохождения энергии снижена или устранена. Допустимая погрешность может находиться в диапазоне, например, от 0 до 0,1. Кривизна сферической складки может находиться в пределах допустимой погрешности от приблизительно 0% до приблизительно 5%, от приблизительно 1% до приблизительно 5%, от приблизительно 2% до приблизительно 4%, и от приблизительно 1% до приблизительно 3%. Другие подходящие значения допустимой погрешности составляют, например, приблизительно 1, 2, 3, 4 и 5%. Кроме того, центрирование сферической складки вокруг точки фокусировки собирающего элемента 146 может находиться в пределах допустимой погрешности от приблизительно 0 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 4 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 3 мм, и от приблизительно 1 мм до приблизительно 3 мм. Другие походящие значения допустимой погрешности составляют, например, приблизительно 0, 1, 2, 3, 4 и 5 мм.
Сферическая складка 154 преимущественно приводит к эффективности сбора приблизительно 75% в точке фокусировки собирающего элемента 146 и высокой избирательности для получения эффективности сбора приблизительно 0,00002% на расстоянии 50 мкм выше или ниже по течению от точки фокусировки. В таких вариантах осуществления изобретения зона исследования 148 преимущественно является очень малой и обеспечивает сбор в одной точке.
Фигура 20А иллюстрирует сферическую складку 154 и испускание определяемого сигнала 153 из сферической складки 154 на собирающий элемент 146, а также передачу определяемого сигнала 153 на детектор 150 или плоский оптический элемент или крошечное отверстие 216, размещенное перед детектором 150. Фигура 20В является увеличенным схематическим изображением излучения определяемого сигнала 153 через сферическую складку 154, демонстрируя, что стенка складки не нарушает определяемый сигнал 153.
В других вариантах осуществления изобретения эффекты преломления при взаимодействии стенки проточной кюветы и воздуха могут быть ослаблены утончением стенки проточной кюветы в зоне исследования 148. Например, стенка проточной кюветы в зоне исследования 148 может иметь толщину от приблизительно 20 мкм до приблизительно 2000 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 1500 мкм, от приблизительно 60 мкм до приблизительно 1000 мкм, от приблизительно 80 мкм до приблизительно 800 мкм, от приблизительно 100 мкм до приблизительно 600 мкм, от приблизительно 200 мкм до приблизительно 400 мкм, от приблизительно 1000 мкм до приблизительно 2000 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 80 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 400 мкм до приблизительно 1000 мкм или от приблизительно 1500 мкм до приблизительно 2000 мкм. Например, подходящая толщина стенки может быть приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 и 2000 мкм. Эффективность сбора для вариантов осуществления изобретения, имеющих толщину стенок проточной кюветы в зоне исследования 148 без иных устраняющих элементов (таких как наполненный коллектор или сферическая складка 154), может демонстрировать эффективность сбора до приблизительно 50% в точке фокусировки собирающего элемента 146 и приблизительно 3% на расстоянии приблизительно 100 мкм выше по течению от точки фокусировки собирающего элемента 146.
Как показано на Фигуре 26, собирающий элемент может являться, например, линзой объектива 517, при этом точка фокусировки линзы объектива совпадает с зоной исследования 148. Определяемый сигнал собирается линзой объектива и передается в виде кольца на другую линзу 517 или другой фокусирующий элемент, который фокусирует определяемый сигнал 153 на детектор 150. Как описано выше относительно Фигур 16 и 17, в некоторых вариантах осуществления изобретения линза объектива также может использоваться для освещения образца. В других вариантах осуществления изобретения линза объектива может использоваться для сбора, и освещение может быть достигнуто с использованием любого из описанных выше способов, включая, например, освещение от источника света, перпендикулярного зоне исследования 148, как показано на Фигуре 26.
В различных вариантах осуществления изобретения устройство может дополнительно включать крошечное отверстие 216 или плоский оптический элемент, например, дихроическое зеркало, присоединенное к детектору 150, для фокусировки полученного определяемого сигнала 153 перед обнаружением детектором 150.
Сортировка
В некоторых аспектах описанных способов и устройства сортирующий цитометр использует способ, который физически и/или функционально модифицирует выбранные клетки в популяциях для обеспечения их дифференциации. То есть, вместо того, чтобы полагаться на непосредственное разделение клеток по размещению, расположению, резервуару или времени, описанные варианты осуществления изобретения вместо этого обеспечивают клетки, которые инактивированы, ограничены в способностях, разрушены, разъединены, фрагментированы или изменены иным образом (т.е. «модифицированы») относительно некоторого требуемого свойства, что в некоторых случаях обеспечивает разделение или дифференциацию субпопуляций в композиции. Природа модификации зависит, полностью или частично, от предполагаемого применения идентифицированных клеток, и, следовательно, характеристик идентифицированных клеток, относящихся к применению. Для примера и с целью объяснения или только пояснения, злокачественная или иным образом иммортализированная или быстрорастущая клетка может считаться функционально инактивированной в контексте получения здоровых соматических клеток, если способность клетки воспроизводиться была подвергнута отрицательному воздействию или если клетка убита. В другом примере, опять-таки только с целью объяснения или пояснения, если применение требует удаления из популяции субпопуляции клеток, которая вырабатывает нежелательный протеин или другое вещество, сортирующий цитометр может достигнуть такого результата путем упразднения выработки вещества в таких клетках, гибели клеток и/или путем модификации клеток для обеспечения их физического удаления из популяции.
Способы и устройство, описанные в данном документе, используют, в некоторых вариантах осуществления изобретения, источник энергии для модификации клеток или для индукции или инициации процесса, такого как химическая активация, который может модифицировать клетки. Модификации, индуцированные источником энергии, включают, в некоторых аспектах, прямой эффект на клетки, включая, но не ограничиваясь, модификацию клеточных компонентов или химических веществ, включая белки, ДНК и вещества, участвующие в клеточном метаболизме; разрушение, нагревание, кавитацию или разрывы, происходящие внутри или возле клеток; пермеабилизацию или перфорацию клеток; и разрушение, фрагментацию или морфологическое изменение клеток, включая клетки, вирусы, тельца или частицы. В других вариантах осуществления изобретения модификации могут также или в иных случаях включать непрямое воздействие источника сортирующей энергии, опосредованное источником сортирующей энергии или другими факторами, включая химическую активацию и/или деактивацию, химическое образование перекрестных связей или химическую дериватизацию клеток или одного или нескольких клеточных компонентов, активацию и/или деактивацию одного или нескольких химических агентов в или возле клетки, что вызывает связывание или ассоциацию таких агентов или их производных с клеткой или ее компонентами, или индукцию измененной функциональности клеток. В определенных вариантах осуществления изобретения химические агенты, которые реагируют при облучении с клетками, присутствуют в клетках или способе естественным образом, или их добавляют как часть способа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные способы и устройство включают использование фотоактивируемых соединений, которые индуцируются для связывания или ассоциации с клетками или клеточными компонентами при облучении светом соответствующей интенсивности и энергии. Такие соединения в определенных аспектах индуцируют по существу образование перекрестных связей или денатурацию одного или нескольких клеточных компонентов для влияния на клеточные процессы или метаболизм интересующих клеток. С другой стороны, такие соединения в определенных аспектах могут индуцировать по существу образование перекрестных связей или денатурацию одного или нескольких клеточных компонентов для гибели интересующих клеток. В другом случае, фотоактивируемые соединения, используемые в описанных способах и устройстве, связываются с выбранными клетками и изменяют одно или несколько свойств интересующих клеток таким образом, чтобы придать интересующим клетками возможность быть идентифицированными и/или обогащения и/или обеднения в последующих способах. Представляющие интерес клетки, которые были изменены химической дериватизацией, такой как добавление химического вещества, в определенных аспектах удаляют, концентрируют или очищают в последующем этапе способами, которые используют свойства или взаимодействия такого вещества. Например, и в целях только объяснения и пояснения, представляющие интерес клетки в одном аспекте дериватизируют добавлением вещества, которое в последующем связывается антителом, которое обеспечивает захват или ретенцию дериватизированной интересующей клетки различными способами. Предусмотрено большое количество таких веществ, и, в одном аспекте, такие вещества включают класс соединений, содержащих или родственных 2,4-динитрофенильной группе (ДНФ), которая в одном аспекте распознается и специфически связывается антителами, распознающими ДНФ. В соответствии с этим, фотоактивируемые производные ДНФ или родственные соединения используют в одном аспекте для дериватизации интересующих клеток в применении такого типа. С другой стороны, дериватизированные представляющие интерес клетки могут быть захвачены или удалены с использованием стратегий, которые приводят к преимущественному связыванию дериватизированных интересующих клеток с определенными субстратами. Например, и в целях только пояснения и объяснения, представляющие интерес клетки, дериватизированные с использованием соединений, содержащих или родственных биотину, в одном аспекте захватываются или остаются на субстратах, поверхностях, веществах, среде, соединениях или частицах, которые связываются или были модифицированы для связывания биотина, например, присутствием авидина, стрептавидина, биотин-связывающих антител или других биотин-связующих молекул. В другом альтернативном аспекте фотоактивируемые производные биотина или родственные соединения используют для дериватизации интересующих клеток в подобном применении. С другой стороны, в других аспектах представляющие интерес клетки изменяют добавлением или ассоциацией химических веществ или соединений перед подверганием селекции и модификации. В таком случае, следовательно, вариант осуществления изобретения, включающий описанные здесь способы и устройство, использует изменение добавленного вещества на выбранных клетках для обеспечения дифференциации таких клеток от других клеток в популяции. Например, и в целях только объяснения и пояснения, в одном аспекте все клетки в популяции дериватизируют добавлением фотолабильного химического соединения перед анализом, и в одном аспекте специфические клетки подвергают модификации с использованием источника энергии устройства для модификации фотолабильного химического соединения на таких клетках.
После освещения, аналит, если присутствует, течет от зоны исследования 148 к сортирующему участку 152. По причине прогнозируемого и стабильного потока по типу «ядро в оболочке» или ламинарного потока, возможно узнать для каждого аналита его положение для некоторого расстояния, которое проходит аналит после выхода из зоны исследования 148 и перемещения по направлению к сортирующему участку 152. В некоторых вариантах осуществления изобретения источник сортирующей энергии 350 (отображен на Фигуре 22) может быть проконтролирован для облучения аналита или части аналита в образце в сортирующем участке для придания неактивности, модификации или разрушения аналита.
В других вариантах осуществления изобретения образец может включать первый и второй аналиты, которые могут быть дифференцированно определены с использованием описанных здесь способов и устройства. Сортировка первого и второго аналитов может быть достигнута, например, облучением первого или второго аналита после обнаружения. Например, детектор 150 может быть настроен для обнаружения и определения того, является ли определяемый сигнал 153 исходящим от первого или второго аналита. После определения отдельного аналита, например, второго аналита, для сортировки, источник сортирующей энергии 350 может быть использован для облучения второго аналита для придания неактивности, модификации или разрушения второго аналита.
В некоторых вариантах осуществления изобретения источник сортирующей энергии 350 может быть присоединен для облучения образца перпендикулярно пути тока 138 в сортирующем участке 152. В других вариантах осуществления изобретения источник сортирующей энергии 350 может быть присоединен для облучения образца под косым углом относительно сортирующей энергии.
В некоторых вариантах осуществления изобретения источник сортирующей энергии 350 является лазером, испускающим электромагнитную энергию, например, ультрафиолетовый свет, видимый свет и инфракрасный свет.
Например, источник сортирующей энергии 350 может быть УФ лазером. УФ волны с длиной менее чем приблизительно 350 нм могут поглощаться нуклеиновыми кислотами, белками и/или красителями, используемыми для поглощения света, и могут переносить энергию к участку аналита (например, клетке), что приводит к модификации, повреждению или гибели клетки,
Источник сортирующей энергии 350 может быть, например, лазером видимых/инфракрасных лучей. Видимые/инфракрасные волны с длиной приблизительно 775 нм и выше могут поглощаться клеточными компонентами и/или красителями, используемыми для поглощения света и/или воды, и могут переносить энергию к участку аналита (например, клетке), что приводит к модификации, повреждению или гибели клетки.
Источник сортирующей энергии 350 может быть, например, лазером видимых лучей. Видимые волн с длиной от 350 нм до приблизительно 775 нм могут поглощаться цитохромами и/или красителями, используемыми для поглощения света и/или воды, и могут переносить энергию к участку аналита (например, клетке), что приводит к модификации, повреждению или гибели клетки.
В вариантах осуществления изобретения, в которых аналитом является клетка, и сортировка достигается гибелью клетки, сортирующая энергия может быть выбрана для нагрева внутренней температуры клетки до приблизительно 70°С. Такое нагревание может быть достигнуто, например, мгновенной мощностью приблизительно 50 Вт. Источники, способные привести к гибели клетки, включают, например, лазерную диодную матрицу, маломощную циклическую пульсацию и модулированный продолжительный или квази-продолжительный источник энергии соответствующей длины волны или мощности.
Любой из таких или других известных источников сортирующей энергии 350 могут использоваться для гибели, модификации или повреждения аналита в сортирующем участке 152. Источник сортирующей энергии 350 может повреждать клетку целым рядом способов, включая, например, разрушение мембран или других клеточных органелл или компонентов, денатурацию биомолекул в клетках и образование перекрестных связей или смещение биомолекул. Разрушение мембран или других клеточных органелл или компонентов может быть достигнуто кавитацией водой в клетке и повреждением проксимальных клеточных компонентов или индуцированной энергией диссоциацией воды или биомолекул в клетке. Денатурация биомолекул и образование перекрестных связей или смещение биомолекул приводит к связанным изменениям в или потери функции биомолекул и/или клеток.
После обнаружения аналита или нежелательного аналита источник сортирующей энергии 350 может быть задействован, или его производительность модулирована или перенаправлена для связывания аналита. Сортировка с использованием источника сортирующей энергии 350 достигается путем модификации, потери функционирования или разрушения аналита. Источник сортирующей энергии 350 может повредить, модифицировать или придать нефункциональность аналиту в образце целым рядом способов, включая, например, активацию кавитации жидкости образца в участке аналита (в сортирующем участке), активацию нагревания жидкости образца в участке аналита (в сортирующем участке), активацию разрушения молекул и/или образования перекрестных связей в аналите, а также активацию химической модификации аналита прямым образом или путем индуцирования химических реагентов в жидкости образца для связывания аналита.
В некоторых вариантах осуществления изобретения источник сортирующей энергии 350 может быть источником тепла, таким как нагревательный элемент, микроволны или электрический разряд. Образец сортируют в сортирующем участке 152 нагреванием жидкости в участке аналита в сортирующем участке 152 для повреждения, модификации или разрушения аналита.
В некоторых вариантах осуществления изобретения сортировка может быть достигнута электропорацией или посредством сил, действующих на образец в сортирующем участке. Сила может быть, например, ультразвуком.
Сбор образца после определения и сортировки
После того как образец прошел через зону исследования 148 для освещения и определения и, в некоторых случаях, через сортирующий участок 152 для сортировки, образец протекает к выходному отверстию 136 проточной кюветы 132 и может быть собран в открытый или закрытый контейнер у выпускного отверстия проточной кюветы. Фигура 21А иллюстрирует и приводит пример сбора в открытый контейнер 218.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выпускное отверстие 136 проточной кюветы 132 может иметь увеличенный диаметр для обеспечения сбора образца 141 с пониженным давлением и/или вязкостью. Фигура 21В иллюстрирует пример сбора через участок 220 проточной кюветы 132, имеющей увеличенный диаметр, что приводит к образованию участка с пониженным давлением и/или вязкостью. Образец 141 может быть собран в открытый или закрытый контейнер (открытый контейнер 218 представлен на Фигуре 21В) у выпускного отверстия 136. Другие способы также могут использоваться для замедления скорости выходящего тока для сведения к минимуму повреждения аналита.
В еще других вариантах осуществления изобретения физическая сортировка у выпускного отверстия 136 книзу от сортирующего участка 152 может быть проведена путем разделения пути тока 138 у выпускного отверстия на две или более частей потока. Фигура 21С иллюстрирует, например, вариант осуществления изобретения, в котором путь тока 138 разделен на три пути тока 138а, 138b, 138с у выпускного отверстия 136 на конце проточной кюветы 132 книзу от сортирующего участка 152. Аналиты 142 в контурном потоке жидкости могут быть направлены к центру пути тока 138b, в то время как проточная жидкость может быть отведена во внешние пути тока 138а и 138с. Отдельные контейнеры 140а, 140b, 140с могут использоваться для сбора из путей тока 138а, 138b, 138с. Контейнеры могут быть открытыми или закрытыми. Проточная кювета 132 может в некоторых случаях включать компонент (не указано) для обеспечения положения частиц относительно разделенных путей тока. Необязательный компонент может включать, например, оптический прибор для определения частиц аналита, попадающих в центральный путь тока 138b. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная скорость потока у выходного отверстия или участка физического разделения может использоваться для отведения аналита и/или интересующего аналита и/или модифицированного аналита в один из путей тока, например, как это описано в патенте США №7355696, содержание которого включено сюда в полном объеме посредством ссылки.
В тексте данной заявки под проточной кюветой 132 понимают замкнутый путь тока при условии, что путь тока 138 является единым, неделимым и ограниченным путем тока в участке, проходящем через зону исследования 148 и через сортирующий участок 152. Разделение пути тока 138 книзу от сортирующего участка 152 не влияет на характеристику проточной кюветы 132 как замкнутой.
Система управления
Обращаясь к Фигуре 22, система проточной цитометрии также может включать компьютерную систему управления 400. Компьютерная система управления может включать одно или несколько компьютерных устройств 402, таких как рабочие станции, портативные компьютеры, планшетные компьютеры, нетбуки, персональные цифровые устройства и т.п. Как это в целом известно, каждое компьютерное устройство 402 включает или имеет доступ к одному или нескольким микропроцессорным устройствам 404, одному или нескольким энергозависимым запоминающим устройствам (например, RAM) 406, и одному или нескольким устройствам постоянной памяти (например, жестким дискам, устройствам оптической памяти и т.д.) 408. Микропроцессорное устройство 404 может хранить инструкции и данные по энергозависимому запоминающему устройству 406 во время выполнения операции и, подобным образом, может хранить инструкции и/или данные по устройству постоянной памяти 408. Например, как это общеизвестно, инструкции по одному или нескольким протоколам программ могут храниться в устройстве постоянной памяти 408 для извлечения с помощью микропроцессорного устройства 404. Микропроцессорное устройство 404 может, при выполнении протокола, извлекать из устройства постоянной памяти 408 и хранить копию протокола в энергозависимом запоминающем устройстве 406. Во время выполнения протокола, микропроцессорное устройство 404 может дополнительно хранить данные в одном или обоих энергозависимом запоминающем устройстве и устройстве постоянной памяти 406 и 408, соответственно. Кроме того, микропроцессорное устройство 404 может получать, обрабатывать и/или хранить в устройствах памяти 406, 408 данные от одного или нескольких устройств, являющихся внешними для компьютера 402, как это описано ниже. Одно или несколько устройств ввода/вывода (I/O) 410 могут облегчать коммуникацию между микропроцессором 404 и внешними устройствами и, кроме того, между микропроцессором 404 и устройствами памяти 406, 408. Кроме того, устройство I/O 410 может сообщаться с устройством отображения 412, которое может быть внутренним или внешним для компьютерного устройства 402 и может использоваться для отображения интерфейса пользователя для обеспечения оператору управления цитометрической системой. Одно или несколько устройств ввода 414 (например, мышь, сенсорный экран, клавиатура и т.д.) могут позволить пользователю вводить данные или команды в цитометрическую систему.
Устройство I/O 410 может облегчить коммуникацию между микропроцессором 404 и аппаратным обеспечением для цитометрии, таким как источник сортирующей энергии, детектор 150, источник света 151 и жидкостная система. Относительно жидкостной системы, в частности, устройство I/O 410 может облегчить коммуникацию между микропроцессором 404 и подсистемой контроля потока 416, функционирующей для контроля тока проточной жидкости и жидкости образца от источников проточной жидкости и жидкости образца, соответственно, а также контейнера для сбора. Например, подсистема контроля потока 416 может контролировать насос 310А в гидравлическом сообщении с источником проточной жидкости 310, может контролировать насос 312А в гидравлическом сообщении с источником жидкости образца 312, и/или может контролировать насос 314А в гидравлическом сообщении с контейнером для сбора 314. Кроме того, подсистема контроля потока 416 может включать или сообщаться с сенсорами, функционирующими для определения объема или скорости потока проточной жидкости, жидкости образца, жидкости, попадающей в контейнер для сбора 140, и/или потока по типу «ядро в оболочке», образованного в системе проточной цитометрии. Наконец, устройство I/O 410 может облегчать сообщение между микропроцессором 404 и одним или несколькими компонентами 420 оптической подсистемы. Компоненты 420 могут включать один или несколько перемещаемых оптических элементов (например, зеркал или линз) и/или один или несколько электрохромных устройств, которые могут использоваться для избирательного направления, перенаправления и/или блокировки энергии от источника сортирующей энергии и/или источника энергии света 418. Кроме того, компоненты 420 могут включать один или несколько перемещаемых оптических элементов, функционирующих для калибровки или облегчения калибровки: (1) положения оптического элемента; (2) направления энергии света, сортирующей энергии и/или определенной энергии; и/или (3) интенсивности энергии света, сортирующей энергии и/или определенной энергии.
Как это будет очевидно, компьютер 402 может хранить и выполнять различные считываемые компьютером инструкции для внедрения одного или нескольких протоколов, которые могут включать контрольные протоколы, протоколы анализа, протоколы сортировки и т.д., и, в частности, для контроля относительного потока проточной жидкости и жидкости образца, для получения и анализа данных, выходящих от детектора 150, для контроля источника света, для контроля источника сортирующей энергии, для контроля конфигурации оптического элемента, для анализа одного или нескольких свойств потока жидкости и т.д. В то время как протоколы описаны как хранящиеся в устройствах памяти и выполняемые микропроцессорным устройством, протоколы также могут быть аппаратными модулями. Аппаратный модуль является материальной единицей, способной выполнять определенные операции и которая может быть конфигурирована или собрана определенным образом. В типичных вариантах осуществления изобретения одна или несколько компьютерных систем (например, автономная, клиентская или серверная компьютерная система) или один или несколько аппаратных модулей компьютерной системы (например, процессор или группа процессоров) могут быть настроены компьютерным обеспечением (например, приложением или частью приложения) в качестве аппаратного модуля, который функционирует для выполнения определенных операций, как это описано выше.
В различных вариантах осуществления изобретения аппаратный модуль может быть внедрен механически или электронно. Например, аппаратный модуль может включать специальную электронную или логическую схему, которая постоянно настроена (например, в виде специализированного процессора, такого как программируемая пользователем логическая матрица (FPGA) или специализированная интегральная микросхема (ASIC)) для выполнения определенных операций. Аппаратный модуль может также включать программируемую логическую или электронную схему (например, которая входит в состав общего процессора или другого программируемого процессора), которая временно настроена программным обеспечением для проведения определенных операций. Будет очевидно, что решение внедрить аппаратный модуль механическим способом в специализированной и постоянно настроенной электрической схеме или во временно настроенной электрической схеме (например, настроенной программным обеспечением) может основываться на стоимости и времени.
Иллюстративный способ сортировки сперматозоидов
ФИГ. 23 иллюстрирует иллюстративный вариант осуществления способов, описанных в тексте данной заявки, и, в частности, способа 430 выбора требуемой субпопуляции клеток из образца клеток (например, выбор клеток, несущих Х или Y хромосому, из образца, содержащего смесь клеток, несущих Х и Y хромосомы). В некоторых вариантах осуществления изобретения способ 430 или его части хранят в одной из памятей 406, 408 в виде набора считываемых компьютером инструкций, составляя контрольный протокол для одного или нескольких используемых устройств. Процессор 404 может считывать инструкции из памяти 406, 408 и выполнять инструкции для выполнения способа 430. В другом варианте осуществления изобретения способ 430 включает несколько протоколов. Протоколы могут индивидуально контролировать одно или несколько устройств, могут анализировать данные, собранные одним или несколькими устройствами, и/или могут выполнять одно или несколько определений на основе анализированных данных и т.д. Как это в целом известно, техник или устройство может помечать (например, с использованием красителя Хехста) образец для анализа (например, сбора сперматозоидов) (блок 432). Мечение клеток может сопровождаться сортировкой проточным цитометром или происходить в отдельном процессе или процедуре вне сортирующего проточного цитометра. Кроме того, отдельная метка, используемая для клеток, может зависеть от цитометрического применения. В некоторых вариантах осуществления изобретения параметры процесса мечения могут быть определены процессором 404 и/или процесс мечения или его этап можно контролировать процессором 404. Клетки могут быть помечены, например, таким образом, что клетки и/или компоненты мечения генерируют определяемый сигнал в ответ на свет.
В любом случае, после мечения клеток устройство по данному изобретения и, в частности, сортирующий проточный цитометр, может создавать поток проточной жидкости в пути тока 138 (блок 434). Посредством отдельного ввода, сортирующий проточный цитометр может вводить образец (т.е. меченые клетки в подходящей жидкости) в путь тока 138 (блок 436), преимущественно в месте или возле центра тока проточной жидкости. Также преимущественно, что образец поступает в ток проточной жидкости медленно относительно потока проточной жидкости, таким образом, клетки в образце (например, сперматозоиды) выравниваются с длинной осью параллельно току проточной жидкости и, таким образом, клетки перемещаются по общей единой схеме. Подсистема контроля потока 416 может контролировать ток проточной жидкости и жидкости образца от источников проточной жидкости и жидкости образца в соответствии с протоколом, выполняемым процессором 404, для оптимизации относительных потоков проточной жидкости и жидкости образца. Подсистема контроля потока 416 может включать различные сенсоры и/или детекторы, обеспечивающие показатели для выполнения протокола процессором 404, для облегчения оптимизации относительных потоков.
С перемещением клеток вдоль пути тока 138 источник энергии света 151, такой как УФ лазер, освещает образец (блок 438) в зоне исследования 148. Источник энергии света может продолжительно освещать зону исследования 148, или выполнение протокола процессором 404 может контролировать источник энергии света 151 для освещения зоны исследования 148 избирательно (например, только когда образец присутствует в зоне исследования 148). Клетки и/или компонент или метка, связанные с клетками, генерируют определяемый сигнал в ответ на освещение.
Вогнутый собирающий элемент 146 функционирует для фокусировки энергии, испускаемой, передаваемой или отражаемой от каждой клетки (например, флуоресцирующего света, испускаемого меткой в ответ на свет) (блок 440). Таким образом, комбинированный ток проточной жидкости и образца в пути тока 138 движется в целом вдоль оптической оси вогнутого собирающего элемента 146, чья оптическая ось в целом коаксиальна току, и, номинально, каждая клетка в образце проходит через точку фокусировки (совпадает с интересуемым участком 148) вогнутого собирающего элемента 146. Детектор 150 получает сфокусированную энергию от вогнутого собирающего элемента 146 (блок 442) и отсылает сигнал об определенной энергии на процессор 404. В некоторых вариантах осуществления изобретения детектор 150 может определять индивидуально сфокусированную энергию от более чем 40000 клеток в секунду, может определять индивидуально сфокусированную энергию от более чем 75000 клеток в секунду, может определять индивидуально сфокусированную энергию от более чем 100000 клеток в секунду, может определять индивидуально сфокусированную энергию от более чем 200000 клеток в секунду, или может определять индивидуально сфокусированную энергию от более чем 300000 клеток в секунду.
Процессор 404 получает сигнал, представляющий определенную энергию, и анализирует данные (блок 444) для определения (в блоке 446), представляют ли данные клетку из требуемой субпопуляции или клетку, не включенную в требуемую субпопуляцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения процессор 404 также может определить, представляют ли данные неопределенную клетку, которая не может быть определена как присутствующая в требуемой субпопуляции и не может быть определена как отсутствующая в требуемой субпопуляции. В последнем случае процессор 404 может воздействовать на клетку, как если бы детектор 150 определил, что клетка отсутствует в требуемой субпопуляции. Если процессор 404 определяет, что клетка не находится в требуемой субпопуляции или является неопределенной, процессор 404 может посылать сигнал к источнику сортирующей энергии 350, такому как инфракрасный лазер, для облучения клетки (например, для изменения клетки, разрушения клетки, придания клетке нежизнеспособности и т.д.) (блок 448) в подходящий момент времени, как только клетка пройдет от зоны исследования 148 к сортирующему участку 152; источник сортирующей энергии сфокусирован на сортирующем участке 152. С другой стороны, если процессор 404 определяет, что клетка находится в требуемой субпопуляции, процессор 404 может посылать сигнал на источник сортирующей энергии 350 (или воздержатся от посылания сигнала), таким образом, источник сортирующей энергии 350 не облучает клетку (блок 450), когда клетка проходит через сортирующий участок 152. Источник сортирующей энергии может быть настроен таким образом, что он поставляет энергию образцу или не поставляет энергию образцу в периоды времени, когда ожидается присутствие желательных или нежелательных клеток в сортирующем участке 152. Другими словами, источник сортирующей энергии 350 может поставлять энергию или не поставлять энергию образцу по умолчанию, и может получать сигналы от процессора 404 для изменения своего состояния поставки или отсутствия поставки энергии в соответствующее время, определяемое процессором 404. Конечно, следует понимать, что вместо или в дополнение к контролю сигнала источника сортирующей энергии 350, модуляция и/или ослабление сортирующей энергии, поставляемой источником сортирующей энергии 350, может сопровождаться контролем оптической системой 420, которая может включать ослабители, перемещаемые оптические элементы и т.п.
Устройство может собирать клетки для использования и/или дальнейшей обработки (например, разделения клеток) по окончании способа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут включать вариант осуществления изобретения, отображенный на ФИГ. 15, процессор 404 отсылает сигнал источнику сортирующей энергии 350 и/или оптической системе 420 оставить клетки, определенные как присутствующие в требуемой субпопуляции, неизмененными (т.е. не облучать), и полученный сбор обработанных клеток включает соотношение клеток в требуемой субпопуляции клеток к общему числу неизмененных клеток более чем или равное 60%. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения, которые могут включать вариант осуществления изобретения, отображенный на ФИГ. 15, процессор 404 отсылает сигнал источнику сортирующей энергии 350 и/или оптической системе 420 оставить клетки, определенные как присутствующие в требуемой субпопуляции, неизмененными (т.е. не облучать), и полученный сбор обработанных клеток включает соотношение измененных клеток в требуемой субпопуляции клеток к общему числу клеток в требуемой субпопуляции менее чем или равное 50%.
Конечно, описанный выше способ отражает один или несколько вариантов осуществления изобретения с описанными здесь способами, но также может включать один или несколько этапов или протоколов, как это описано в тексте данной заявки относительно различных вариантов осуществления изобретения. Кроме того, некоторые варианты осуществления изобретения могут не включать один или несколько этапов или протоколов, описанных с ссылкой на способ 430. Например, и без ограничения, в некоторых вариантах осуществления изобретения клетка или компонент клетки могут испускать определяемый сигнал присущим им образом, например, фосфоресценцией или хемилюминесценцией, что исключает необходимость в мечении образца меткой для получения определяемого ответа. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения (как это описано выше) способ может включать блоки 448 и 450 в обратном порядке, что позволит определенным клеткам, не находящимся в требуемой субпопуляции, проходить без облучения контролируемым источником энергии, при этом контролируемый источник энергии облучает клетки, определенные как находящиеся в требуемой субпопуляции.
Первый иллюстративный вариант осуществления системы
Фигура 24 отображает первый иллюстративный вариант осуществления системы 470 для проведения проточной цитометрии. Компьютер 402, как это описано выше, контролирует систему 470. Компьютер 402 получает сенсорные сигналы и другую информацию от подсистемы контроля потока 416 и отсылает контрольные сигналы обратно подсистеме контроля потока 416. Подсистема контроля потока 416 функционирует в соответствии с сигналами, полученными от компьютера 402, для контроля насоса 310А, прокачивающего проточную жидкость от источника проточной жидкости 310, и для контроля насоса 312А, прокачивающего жидкостный образец от источника жидкостного образца 312. В результате создается поток вдоль пути тока жидкости 138. Путь тока 138 включает элемент гидродинамической фокусировки 157, который функционирует для создания потока по типу «ядро в оболочке». Протокол, выполняемый процессором 404 компьютера 402, приводит к тому, что компьютер 402 отсылает сигнал подсистеме контроля потока 416, таким образом, подсистема контроля потока 416 поддерживает и/или настраивает потоки проточной жидкости и жидкости образца для поддерживания стабильного потока и для оптимизации расположения частиц аналита в потоке по типу «ядро в оболочке».
Компьютер 402 также коммуникационно сообщается с источником энергии света 151, обеспечивая один или несколько контрольных сигналов для избирательной подачи питания на источник энергии света 151 и/или определения установки мощности источника энергии света 151. Энергия света 149 проецируется от источника энергии света 151 через отверстие в первом параболическом оптическом элементе 210. Энергия света 149 падает случайным образом на конический оптический элемент 210, который перенаправляет энергию света 149 по направлению к поверхности первого параболического оптического элемента 210. Первый параболический оптический элемент 210 отражает энергию света 149 в виде кольца на второй параболический оптический элемент 212. Как только кольцо энергии света 149 падает случайным образом на второй параболический оптический элемент 212, энергия света 149 отражается (имея в целом коническую форму) по направлению к точке фокусировки второго параболического оптического элемента 212, чья точка фокусировки совпадает с зоной исследования 148 в пути тока 138. Сферическая складка 154, являясь неотъемлемым элементом проточной кюветы в зоне исследования 148, обеспечивает сфокусированность энергии света 149 при случайном падении на аналит.
С падением энергии света 149 случайным образом на аналит, аналит испускает определяемый сигнал 153 в форме флуоресценции. Сферическая складка 154, являясь неотъемлемым элементом проточной кюветы в зоне исследования 148, сводит к минимуму преломление определяемого сигнала 153 при его покидании проточной кюветы. Определяемый сигнал 153 падает случайным образом на эллипсоидный собирающий элемент 146, который имеет первую точку фокусировки, совпадающую с зоной исследования 148 в пути тока 138. Эллипсоидный собирающий элемент 146 отражает определяемый сигнал 153 по направлению ко второй точке фокусировки эллипсоидного собирающего элемента 146, чья вторая точка фокусировки соответствует расположению крошечного отверстия 216. Определяемый сигнал 153 проходит через крошечное отверстие и падает случайным образом на детектор 150.
Детектор 150, соединенный с компьютером 402, отсылает компьютеру 402 сигнал, соответствующий определяемому сигналу 153. Компьютер 402 выполняет протокол для получения сигнала от детектора 150 и для определения от детектора, находится ли аналит, который испустил определяемый сигнал 153, в требуемой субпопуляции или он не находится в требуемой субпопуляции.
Компьютер 402 дополнительно соединен с источником сортирующей энергии 350. Компьютер 402 отсылает сигнал источнику сортирующей энергии 350 для избирательной подачи питания на источник сортирующей энергии 350 во время, когда аналит, который испустил определяемый сигнал 153, будет находиться в сортирующем участке 152, при этом на пути прохождения будет действовать электромагнитное облучение 476, испускаемое источником сортирующей энергии 350. Компьютер 402 вызывает испускание источником сортирующей энергии 350 электромагнитного облучения 476, когда аналит не находится в требуемой субпопуляции, и вызывает отсутствие испускания источником сортирующей энергии 350 электромагнитного облучения 476, когда аналит находится в требуемой субпопуляции. Протокол, выполняемый компьютером 402, может определить, когда аналит будет находиться в сортирующем участке 152 в соответствии с известными параметрами потока, которые, в любом случае, также контролируются компьютером 402 посредством подсистемы контроля потока 416. Ограничитель луча 478 предотвращает случайное падение электромагнитного облучения 476 на другие части системы 470.
Контейнер для сбора 314 собирает жидкость, содержащую отсортированный образец, в конце пути тока 138.
Как показано на Фигуре 24, проточная кювета 132 остается замкнутой (т.е. поток по типу «ядро в оболочке» не подвергнут влиянию атмосферы) и непрерывной (т.е. поток по типу «ядро в оболочке» не разветвляется), по меньшей мере, перед тем, как поток проходит через зону исследования 148, до момента после его прохождения через сортирующий участок 152. Кроме того, ось тока пути тока 138, с его прохождением через зону исследования 148, коаксиальная оптической оси эллипсоидного собирающего элемента 146, коаксиальна оптической оси второго параболического оптического элемента 212 и коаксиальна оптической оси первого параболического оптического элемента 210.
Второй иллюстративный вариант осуществления системы
Фигура 25 отображает второй иллюстративный вариант осуществления системы 480 для проведения проточной цитометрии. Компьютер 402, как описано выше, контролирует систему 480. Компьютер 402 получает сенсорные сигналы и другую информацию от подсистемы контроля потока 416 и отсылает контрольные сигналы обратно подсистеме контроля потока 416. Подсистема контроля потока 416 функционирует в соответствии с сигналами, полученными от компьютера 402, для контроля насоса 310А, прокачивающего проточную жидкость от источника проточной жидкости 310, и для контроля насоса 312А, прокачивающего жидкостный образец от источника жидкостного образца 312. В результате создается поток вдоль пути тока жидкости 138. Путь тока 138 включает элемент гидродинамической фокусировки 157, который функционирует для создания потока по типу «ядро в оболочке». Протокол, выполняемый процессором 404 компьютера 402, приводит к тому, что компьютер 402 отсылает сигнал подсистеме контроля потока 416, таким образом, подсистема контроля потока 416 поддерживает и/или настраивает потоки проточной жидкости и жидкости образца для поддерживания стабильного потока и для оптимизации расположения частиц аналита в потоке по типу «ядро в оболочке».
Компьютер 402 также коммуникационно сообщается с источниками энергии света 151А и 151В, обеспечивая каждому один или несколько контрольных сигналов для избирательной подачи питания на источник энергии света 151А, 151В и/или определения установки мощности источника энергии света 151А, 151В. Энергия света 149 проецируется от каждого из источников энергии света 151А, 151В посредством соответствующего отверстия 482А, 482В на эллипсоидный собирающий элемент 146. Энергия света 149 направляется в зону исследования 148 в пути тока 138. Сферическая складка 154, являясь неотъемлемым элементом проточной кюветы в зоне исследования 148, обеспечивает отсутствие преломления энергии света 149 при случайном падении на аналит.
С падением энергии света 149 случайным образом на аналит в зоне исследования 148, аналит испускает определяемый сигнал 153 в форме флуоресценции. Сферическая складка 154, являясь неотъемлемым элементом проточной кюветы в зоне исследования 148, сводит к минимуму преломление определяемого сигнала 153 при его покидании проточной кюветы. Определяемый сигнал 153 падает случайным образом на эллипсоидный собирающий элемент 146, который имеет первую точку фокусировки, совпадающую с зоной исследования 148 в пути тока 138. Эллипсоидный собирающий элемент 146 отражает определяемый сигнал 153 по направлению ко второй точке фокусировки эллипсоидного собирающего элемента 146, чья вторая точка фокусировки соответствует расположению крошечного отверстия 216. Определяемый сигнал 153 проходит через крошечное отверстие 216 и затем падает случайным образом на детектор 150.
Детектор 150, соединенный с компьютером 402, отсылает компьютеру 402 сигнал, соответствующий определяемому сигналу 153. Компьютер 402 выполняет протокол для получения сигнала от детектора 150 и для определения от детектора, находится ли аналит, который испустил определяемый сигнал 153, в требуемой субпопуляции или он не находится в требуемой субпопуляции.
Компьютер 402 дополнительно соединен с источником сортирующей энергии 350. Компьютер 402 отсылает сигнал источнику сортирующей энергии 350 для избирательной подачи питания на источник сортирующей энергии 350 во время, когда аналит, который испустил определяемый сигнал 153, будет находиться в сортирующем участке 152, при этом на пути прохождения будет действовать электромагнитное облучение 476, испускаемое источником сортирующей энергии 350. Компьютер 402 вызывает испускание источником сортирующей энергии 350 электромагнитного облучения 476, когда аналит не находится в требуемой субпопуляции, и вызывает отсутствие испускание источником сортирующей энергии 350 электромагнитного облучения 476, когда аналит находится в требуемой субпопуляции. Протокол, выполняемый компьютером 402, может определить, когда аналит будет находиться в сортирующем участке 152 в соответствии с известными параметрами потока, которые, в любом случае, также контролируются компьютером 402 посредством подсистемы контроля потока 416. Ограничитель луча 478 предотвращает случайное падение электромагнитного облучения 476 на другие части системы 470.
Контейнер для сбора 314 собирает жидкость, содержащую отсортированный образец, в конце пути тока 138.
Как это отображено на Фигуре 25, проточная кювета 132 остается замкнутой (т.е. поток по типу «ядро в оболочке» не подвергнут влиянию атмосферы) и непрерывной (т.е. поток по типу «ядро в оболочке» не раздваивается), по меньшей мере, перед тем, как поток проходит через зону исследования 148, до момента, после его прохождения через сортирующий участок 152. Кроме того, ось тока пути тока 138 с прохождением тока через зону исследования 148 коаксиальна оптической оси эллипсоидного собирающего элемента 146.
Третий иллюстративный вариант осуществления
Фигура 26 отображает третий иллюстративный вариант осуществления системы 580 для проведения проточной цитометрии. Компьютер 502, как это описано выше, контролирует систему 580. Компьютер 502 получает сенсорные сигналы и другую информацию от подсистемы контроля потока 516 и отсылает контрольные сигналы обратно подсистеме контроля потока 516. Подсистема контроля потока 516 функционирует в соответствии с сигналами, полученными от компьютера 502, для контроля насоса 310А, прокачивающего проточную жидкость от источника проточной жидкости 310, и для контроля насоса 312А, прокачивающего жидкостный образец от источника жидкостного образца 312. Как это показано на Фигуре 26, линза объектива 517 проточного цитометра может быть модифицирована для обеспечения прохождения жидкости образца 141 через линзу 517 и откачки в проточную жидкость в качестве контурного потока. В частности, образец 141 направляют для поступления в центр проточной жидкости 200 через отверстие или камеру, расположенные в пути тока проточной жидкости. Оба потока поступают в участок ускорения 204 и образуют поток по типу «ядро в оболочке». Протокол, выполняемый процессором 504 компьютера 502, приводит к тому, что компьютер 502 отсылает сигнал подсистеме контроля потока 516, таким образом, подсистема контроля потока 516 поддерживает и/или настраивает потоки проточной жидкости и жидкости образца для поддерживания стабильного потока и для оптимизации расположения частиц аналита в потоке по типу «ядро в оболочке».
Компьютер 502 также коммуникационно сообщается с источником энергии света 151, обеспечивая один или несколько контрольных сигналов для избирательной подачи питания на источник энергии света 151 и/или определения установки мощности источника энергии света 151. Энергия света 149 направляется в зону исследования 148 в пути тока 138.
С падением энергии света 149 случайным образом на аналит в зоне исследования 148, аналит испускает определяемый сигнал 153 в форме флуоресценции. Определяемый сигнал 153 падает случайным образом на линзу объектива 517, который имеет первую точку фокусировки, совпадающую с интересуемым участком 148 в пути тока 138. Линза объектива 517 отражает определяемый сигнал 153 по направлению ко второй линзе 519, которая фокусирует определяемый сигнал 153 на детекторе, расположенном в точке фокусировки второй линзы 519.
Детектор 150, соединенный с компьютером 502, отсылает компьютеру 502 сигнал, соответствующий определяемому сигналу 153. Компьютер 502 выполняет протокол для получения сигнала от детектора 150 и для определения от детектора 150, находится ли аналит, который испустил определяемый сигнал 153, в требуемой субпопуляции или он не находится в требуемой субпопуляции.
Компьютер 502 дополнительно соединен с источником сортирующей энергии 350. Компьютер 402 отсылает сигнал источнику сортирующей энергии 350 для избирательной подачи питания на источник сортирующей энергии 350 во время, когда аналит, который испустил определяемый сигнал 153, будет находиться в сортирующем участке 152, при этом на пути прохождения будет действовать электромагнитное облучение 576, испускаемое источником сортирующей энергии 350. Компьютер 502 вызывает испускание источником сортирующей энергии 350 электромагнитного облучения 576, когда аналит не находится в требуемой субпопуляции, и вызывает отсутствие испускания источником сортирующей энергии 350 электромагнитного облучения 576, когда аналит находится в требуемой субпопуляции. Протокол, выполняемый компьютером 502, может определить, когда аналит будет находиться в сортирующем участке 152 в соответствии с известными параметрами потока, которые, в любом случае, также контролируются компьютером 502 посредством подсистемы контроля потока 516. Ограничитель луча 478 предотвращает случайное падение электромагнитного облучения 576 на другие части системы 570.
Контейнер для сбора 314 собирает жидкость, содержащую отсортированный образец, в конце пути тока 138.
Как показано на Фигуре 26, проточная кювета 132 остается замкнутой (т.е. поток по типу «ядро в оболочке» не подвергнут влиянию атмосферы) и непрерывной (т.е. поток по типу «ядро в оболочке» не раздваивается), по меньшей мере, перед тем, как поток проходит через зону исследования 148, до момента, после его прохождения через сортирующий участок 152. Кроме того, ось тока пути тока 138 с прохождением тока через зону исследования 148 коаксиальна оптической оси линзы объектива 517.
На схеме ниже указаны различные иллюстративные комбинации способа и устройства по изобретению. Эти комбинации представлены в качестве примеров и не должны ограничивать раскрытие изобретения никоим образом. В каждом иллюстративном варианте осуществления изобретения, указанном на схеме, образец протекает через зону исследования в проточной кювете, и проточная кювета является замкнутой между интересуемым участком и сортирующим участком книзу от зоны исследования, как это определено в пункте 77 выше. Зона исследования, как это определено выше, совпадает с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента или собирающего элемента в виде линзы объектива. Кроме того, как это указано выше, оптическая ось собирающего элемента коаксиальна оси тока образца вблизи от зоны исследования. В любом из типичных вариантов осуществления изобретения следует понимать, что зона исследования может быть участком, имеющим определенную площадь, или это может быть одиночной точкой, совпадающей с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента, как это детально описано выше.
На схеме А представлены способы и устройство для гидродинамической фокусировки. Следует понимать, что элемент гидродинамической фокусировки (если используется) или способ гидродинамической фокусировки может располагаться в любом участке проточной кюветы при условии, что гидродинамическая фокусировка происходит таким образом, что стабильный, ламинарный поток и/или поток по типу «ядро в оболочке» достигается перед тем, как поток образца достигнет зоны исследования, и поддерживается при прохождении через сортирующий участок. А1 представляет гидродинамическую фокусировку, достигаемую с использованием элемента гидродинамической фокусировки, представленного на Фигурах 5А и 5В и описанного в пунктах 87-97. А2 представляет гидродинамическую фокусировку, достигаемую с использованием элемента гидродинамической фокусировки, представленного на Фигуре 6 и описанного в пункте 98. A3 представляет гидродинамическую фокусировку, достигаемую с использованием способа гидродинамической фокусировки, представленного на Фигуре 7А и описанного в пункте 99. А4 представляет гидродинамическую фокусировку, достигаемую путем прохождения жидкости образца через капиллярную трубку, как это описано в пункте 100. А5 представляет использование акустической фокусировки для центрирования аналита в проточной кювете, как это указано на Фигуре 8 и описано в пункте 101. Акустическая фокусировка может использоваться в некоторых случаях как добавление к любому из описанных здесь способов гидродинамической фокусировки.
На схеме В представлены способы и схемы для освещения образца. Следует понимать, что в любом из типичных вариантов осуществления изобретения плоские зеркала могут использоваться в оптической схеме для направления электромагнитной энергии в требуемое место, таким образом, при необходимости может использоваться более удобная и/или более компактная схема оптического элемента (в сравнении с коаксиальным расположением оптических элементов), как это описано в пункте 106. В1-В4 представляет направление света от одного или нескольких источников света. Следует понимать, что направление света от источника света считается прямым, несмотря на использования плоского зеркала для перенаправления электромагнитной энергии от источника света для обеспечения более удобной и/или компактной схемы источника света в устройстве по изобретению. В1 представляет прямое освещение от одного источника света, как это описано в пункте 109. В1а представляет прямое освещение от одного источника света при угле, перпендикулярном к оси тока вблизи от зоны исследования, как это показано на Фигуре 9. B1b представляет прямое освещение от одного источника света при угле, не являющимся перпендикулярным к оси тока.
B2 представляет прямое освещение от множественных источников света, как это описано в пунктах 110-113. В2а представляет прямое освещение от множественных источников света, которые расположены в плоскости, перпендикулярной оси тока, вблизи от зоны исследования, как это показано на Фигуре 10. B2b представляет прямое освещение от множественных источников света, которые ротационно симметричны относительно оси тока (т.е. осесимметричны), как это описано в пунктах 107 и 111. В2с представляет прямое освещение от множественных источников света, которые ротационно симметричны (относительно любой оси), как это описано в пункте 107. B2d представляет прямое освещение от множественных источников света, которые расположены в разных плоскостях и/или не имеют ротационной симметрии.
B3 представляет прямое освещение от источника света с использованием проточной кюветы в качестве волновода, как это описано в пункте 114 и показано на Фигуре 11.
B4 представляет прямое освещение от источника света, который немного отклонен от оси относительно оси тока вблизи от зоны исследования, как это описано в пункте 115 и показано на Фигуре 12.
B5 представляет освещение с использованием собирающего элемента для фокусировки электромагнитной энергии от источника света на зону исследования, как это описано в пункте 116 и представлено на Фигуре 13. Как детально описано в пункте 127, собирающий элемент может иметь любую подходящую форму.
B6 представляет освещение с использованием одного вогнутого оптического элемента для фокусировки электромагнитной энергии от источника света на зону исследования, как это описано в пунктах 117-119. В6а представляет схему освещения, в которой источник света непосредственно освещает вогнутый оптический элемент, который получает электромагнитную энергию от источника света и фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования. В6b представляет схему освещения, в которой источник света непосредственно освещает конической оптический элемент, который направляет электромагнитную энергию на вогнутый оптический элемент, который фокусирует свет на зоне исследования, как это описано в пункте 117 и показано на Фигуре 14. Выбор на схеме В6 (а или b) и В5 представляет освещение, в котором вогнутый оптический элемент направляет электромагнитную энергию на вогнутый собирающий элемент, который затем фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования, как это описано в пункте 116. Как описано в пункте 118, вогнутый оптический элемент может иметь любую подходящую форму.
B7 представляет освещение с использованием двух вогнутых оптических элементов для освещения зоны исследования, как это описано ранее. В7а представляет освещение с использованием двух вогнутых оптических элементов и электромагнитной энергии от источника света, падающей случайным образом прямо на первый вогнутый оптический элемент, который направляет электромагнитную энергию в виде кольца на второй вогнутый оптический элемент, который, в свою очередь, фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования, как это описано в пункте 120. B7b представляет освещение с использованием двух вогнутых оптических элементов, при этом конический оптический элемент направляет электромагнитную энергию от источника света на первый вогнутый оптический элемент, который, в свою очередь, направляет электромагнитную энергию в виде кольца на второй вогнутый оптический элемент, который затем фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования, как описано в пунктах 120-123 и показано на Фигуре 15. Выбор на схеме В7 (а или b) и В5 представляет освещение, в котором вогнутый оптический элемент направляет электромагнитную энергию на вогнутый собирающий элемент, который затем фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования, как это описано в пункте 116. Как описано в пункте 118, вогнутые оптические элементы могут иметь любую подходящую форму. Первый и второй оптические элементы и вогнутый оптический элемент (если используется) могут быть соединены любым подходящим способом. Например, оптические элементы могут быть коаксиально соединены друг с другом. Плоские зеркала также могут использоваться для направления электромагнитной энергии к одному или нескольким оптическим элементам, собирающему элементу или интересуемому участку, если оптические элементы соединены не коаксиально.
В8 представляет освещение через линзу объектива, например, как это описано в пункте 124 и показано на Фигурах 16 и 17.
С представляет сбор определяемого сигнала от аналита при освещении аналита. С1 представляет вогнутый собирающий элемент, как описано в пунктах 127-138 и показано на Фигурах 18 и 19. Как описано в пункте 127, вогнутый собирающий элемент может иметь любую подходящую форму. С2 представляет линзу объектива, используемую в качестве коллектора, как описано в пункте 144 и показано на Фигуре 26. В каждом из вариантов осуществления изобретения коллектор собирает определяемый сигнал от аналита (при освещении аналита) и передает сигнал детектору для определения. Любой из описанных здесь вариантов осуществления изобретения может дополнительно включать плоские зеркала, крошечные отверстия или другие фокусирующие элементы для дополнительной фокусировки собранного определяемого сигнала перед попаданием на детектор.
D представляет способы сортировки аналита в сортирующем участке. Как детально описано в пунктах 146-160, сортирующая энергия может модифицировать, повреждать или иным образом разрушать аналит или субпопуляцию аналита для проведения сортировки. D1 представляет прямую сортировку аналита, при которой сортирующая энергия непосредственно облучает аналит, приводя к модификации, повреждению или разрушению аналита, как описано в пунктах 146-157. D2 представляет непрямую сортировку аналита, как описано в пунктах 158-160. D2a представляет сортировку путем направления сортирующей энергии на жидкость образца, вызывая кавитацию жидкости образца в части аналита в сортирующем участке. D2b представляет сортировку с использованием источника сортирующей энергии для нагревания жидкости образца в части аналита в сортирующем участке. D2c представляет сортировку путем индуцирования химической модификации аналита, например, связыванием химических реагентов в образце жидкости с аналитом. D2a-D2c описаны в пунктах 158-160. В то время как каждый из примеров осуществления изобретения, представленных на схеме, включает сортировку, следует понимать, что сортировка с использованием сортирующей энергии является необязательным этапом описанного способа.
Е представляет способы снижения аберраций в определяемом сигнале, испускаемом, передаваемом или отражаемом аналитом, вызванных взаимодействием воздух/жидкость образца между стенкой проточной кюветы и собирающим элементом, как описано в пунктах 138-143. Е1 представляет снижение аберраций путем наполнения собирающего элемента жидкостью, гелем или твердым веществом, имеющим коэффициент преломления, который по существу такой же, что и коэффициент преломления стенки проточной кюветы в зоне исследования, как это описано в пункте 138. Е2 представляет снижение аберраций путем интегрального образования сферической складки на проточной кювете в пределах зоны исследования, как это описано в пунктах 139-142 и показано на Фигурах 20А и 20В. Е3 представляет снижение аберраций путем придания высокой тонкости стенке проточной кюветы в зоне исследования, как описано в пункте 143. Любая одна или комбинация Е1-Е3 могут в некоторых случаях использоваться с любым из описанных здесь вариантов осуществления изобретения.
F представляет направление тока образца вблизи от зоны исследования. F1 представляет ток образца от зоны исследования по направлению к верхушке собирающего элемента, как описано в пункте 70 и показано на Фигуре 4А. F2 представляет ток образца от верхушки собирающего элемента по направлению к интересуемому участку, как описано в пункте 70 и показано на Фигуре 4В. F3 представляет ток образца от собирающего элемента по типу линзы объектива, как показано на Фигуре 7А.
G представляет сбор образца после определения и, в некоторых случаях, сортировки. G1 представляет образование воронки контурного потока из проточной жидкости при сборе образца, например, как описано в пункте 163 и показано на Фигуре 21С. G2 представляет сбор всего потока по типу «ядро в оболочке». В любом из G1 или G2 отверстие для выпуска образца может включать увеличенную площадь для снижения скорости потока образца при сборе, например, как описано в пункте 162 и показано на Фигуре 21В. Кроме того, акустическая фокусировка может использоваться в любом из G1 или G2 для удерживания аналита в центра потока образца для сбора. Сбор образца также может сопровождаться использованием открытого или закрытого контейнера в любом из G1 или G2.
В любом из указанных ниже на схеме вариантах осуществления изобретения система проточной цитометрии также может включать систему компьютерного управления, как это в общем описано в пунктах 170-173. В частности, система компьютерного управления может быть присоединена к одному или любой комбинации или всему источнику сортирующей энергии, детектору, источнику света и жидкостной системе. Относительно жидкостной системы, в частности, система компьютерного управления может контролировать подсистему контроля потока, функционирующую для контроля потока проточной жидкости и/или жидкости образца от источников проточной жидкости и жидкости образца, соответственно, и контейнер для сбора, как это описано выше. Наконец, система компьютерного управления может контролировать различные компоненты оптической подсистемы, которая может включать один или несколько перемещаемых оптических элементов (например, зеркала или линзы) и/или одно или несколько электрохромных устройств, которые могут использоваться для избирательного направления, перенаправления и/или блокировки энергии от источника сортирующей энергии и/или источника энергии света, и может включать один или несколько перемещаемых оптических элементов, функционирующих для калибровки или облегчения калибровки: (1) расположения оптического элемента; (2) направления энергии света, сортирующей энергии и/или определенной энергии; и/или (3) интенсивности энергии света, сортирующей энергии и/или определенной энергии.
Данная схема включает примеры осуществления изобретения, идентифицирующие выбор описанных выше характеристик. Варианты выбора имеют формат значений, разделенных запятыми.
Аспекты
Нижеприведенные аспекты раскрытия изобретения представлены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема изобретения. Как уже было замечено ранее, любые из различных вариантов осуществления изобретения, включающие гидродинамическую фокусировку, освещение, собирающие элементы, сортировку и сбор образца, могут использоваться в любых комбинациях.
1. Устройство для определения аналита в жидкостном образце, включающее:
источник света для получения электромагнитной энергии для освещения образца в зоне исследования;
вогнутый собирающий элемент, включающий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, причем зона исследования совпадает с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента;
замкнутая проточная кювета, включающая:
отверстие для ввода образца,
отверстие для вывода образца,
путь тока, определяемый между отверстием для ввода и отверстием для вывода образца, и такой путь тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный после зоны исследования, при этом участок тока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы для образования непрерывного замкнутого пути тока жидкости, без разделения или разветвления, и
образец, включающий аналит или подозреваемый на содержание аналита и текущий в потоке жидкости, при этом:
образец протекает в виде потока «ядро в оболочке» или ламинарного потока, по меньшей мере, через зону исследования,
образец имеет направление тока, двигаясь от зоны исследования по направлению к верхушке собирающего элемента, или направление тока, двигаясь от верхушки собирающего элемента по направлению к зоне исследования, и участок тока жидкости проходит через внутренний объем собирающего элемента, и
аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение; и
детектор для обнаружения определяемого сигнала.
2. Устройство по аспекту 1, отличающееся тем, что детектор коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента.
3. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что зона исследования находится в интересуемой точке.
4. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что источник света освещает образец при угле, который по существу перпендикулярен пути тока жидкости в зоне исследования.
5. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что источник света освещает образец при угле, который по существу перпендикулярен пути тока жидкости в зоне исследования, по меньшей мере, в двух направлениях.
6. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что источник света сфокусирован коаксиально пути тока жидкости для освещения участка пути тока жидкости, проходящего через зону исследования.
7. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что источник света освещает образец из одного или нескольких направлений при углах дуги, превышающих 0 градусов и менее или равных 360 градусам, на плоскости, которая по существу перпендикулярна оси тока жидкости в зоне исследования.
8. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что источник света освещает образец из одного или нескольких направлений при углах дуги, превышающих 0 градусов и менее или равных 360 градусам, на плоскости под углом, диагональным к оси тока жидкости в зоне исследования.
9. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что источник света освещает образец из одного или нескольких направлений вдоль точек, дуг, углов, телесных углов или участков произвольной формы на поверхности виртуальной сферы, окружающей зону исследования.
10. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что источник света освещает образец по существу с ротационной симметрией относительно оси потока в зоне исследования, за исключением прерываний препятствиями по пути луча света.
11. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что оно дополнительно включает:
конический оптический элемент, при этом конический оптический элемент получает электромагнитную энергию от источника света; и
вогнутый оптический элемент, включающий точку фокусировки, совпадающую с интересуемым участком, при этом вогнутый оптический элемент отражает электромагнитную энергию от конического элемента и фокусирует электромагнитную энергию на зоне исследования для освещения образца.
12. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что оно дополнительно включает:
конический оптический элемент, при этом конический оптический элемент получает электромагнитную энергию от источника света; и
кольцеобразный оптический элемент, присоединенный относительно конического оптического элемента для сбора электромагнитной энергии от конического элемента и фокусировки электромагнитной энергии на зоне исследования для освещения образца.
13. Устройство по аспекту 11 или 12, отличающееся тем, что оно дополнительно включает один или несколько планарных оптических элементов для отклонения электромагнитной энергии от любого места между источником света и интересуемым участком.
14. Устройство по аспекту 11 или 12, отличающееся тем, что источник света и конический элемент расположены коаксиально.
15. Устройство по любому из аспектов 1-3, отличающееся тем, что оно дополнительно включает первый и второй вогнутые оптический элементы, расположенные таким образом, что первый вогнутый оптический элемент получает электромагнитную энергию от источника света и отражает кольцевой луч электромагнитной энергии на второй вогнутый оптический элемент, и второй вогнутый оптический элемент фокусирует кольцевой луч электромагнитной энергии на зоне исследования для освещения образца.
16. Устройство по аспекту 15, отличающееся тем, что первый и второй вогнутые оптические элементы каждый включают оптическую ось, и оптические оси расположены коаксиально.
17. Устройство по аспекту 16, отличающееся тем, что оптические оси первого и второго вогнутых оптических элементов расположены коаксиально оптической оси собирающего элемента, и второй вогнутый оптический элемент фокусирует кольцевой луч электромагнитной энергии на зоне исследования осесимметрично относительно зоны исследования.
18. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что участок пути тока жидкости проходит через стенку собирающего элемента.
19. Устройство для определения аналита в жидкостном образце, включающее:
источник света для освещения образца в зоне исследования;
первый и второй вогнутые оптические элементы, каждый из которых включает оптическую ось и точку фокусировки;
конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого вогнутого оптического элемента, при этом источник света сфокусирован на коническом оптическом элементе;
вогнутый собирающий элемент, включающий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, при этом зона исследования совпадает с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента;
замкнутая проточная кювета, включающая:
отверстие для ввода образца,
отверстие для вывода образца,
путь тока, определяемый между отверстием для ввода и отверстием для вывода образца, и такой путь тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный книзу от зоны исследования, при этом участок тока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы для образования непрерывного замкнутого пути тока жидкости, без разделения или разветвления; и
образец, включающий аналит или подозреваемый на содержание аналита и текущий в потоке жидкости, при этом:
образец протекает в виде потока «ядро в оболочке» или ламинарного потока, по меньшей мере, через зону исследования,
второй вогнутый оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию коаксиально относительно оптической оси собирающего элемента на образце в зоне исследования, и
аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение; и
детектор для обнаружения определяемого вещества, причем определяемый сигнал собирается вогнутым собирающим элементом и отражается на детектор.
20. Устройство по аспекту 19, отличающееся тем, что первый вогнутый оптический элемент эллипсоидный, параболический или сферический.
21. Устройство по аспекту 19 или 20, отличающееся тем, что второй вогнутый оптический элемент эллипсоидный, параболический или сферический.
22. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что собирающий элемент эллипсоидный, параболический или сферический.
23. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что проточная кювета дополнительно включает сферический элемент, окружающий зону исследования, и сферический элемент имеет коэффициент преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы.
24. Устройство для определения аналита в жидкостном образце, включающее:
источник света для освещения образца в зоне исследования;
первый и второй параболические оптические элементы, каждый из которых включает оптическую ось и точку фокусировки;
конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого параболического оптического элемента, при этом источник света сфокусирован на коническом оптическом элементе;
эллипсоидный собирающий элемент, включающий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, при этом первый и второй параболические оптические элементы, конический оптический элемент и эллипсоидный собирающий элемент расположены коаксиально, и зона исследования совпадает с точкой фокусировки эллипсоидного собирающего элемента;
замкнутая проточная кювета, включающая:
отверстие для ввода образца,
отверстие для вывода образца,
путь тока, определяемый между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, и такой путь тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный книзу от зоны исследования, при этом участок тока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы для образования непрерывного замкнутого пути тока жидкости, без разделения или разветвления,
сферический элемент, окружающий зону исследования, сферический элемент имеет коэффициент преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы в зоне исследования;
образец, включающий аналит или подозреваемый на содержание аналита и текущий в потоке жидкости, при этом:
образец протекает в виде потока «ядро в оболочке» или ламинарного потока, по меньшей мере, через зону исследования,
второй параболический оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию осесимметрически на образец в зоне исследования, и
аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение; и
детектор для определения определяемого вещества, определяемый сигнал собирается эллипсоидным собирающим элементом и отражается на детектор.
25. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что собирающий элемент наполняют средой с коэффициентом преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы в зоне исследования.
26. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что оно дополнительно включает плоское зеркало, которое фокусирует определяемый сигнал, отражаемый собирающим элементом на детектор.
27. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что оно дополнительно включает устройство с крошечным отверстием, присоединенное к детектору для фокусировки определяемого сигнала, отражаемого собирающим элементом на детектор.
28. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что образец имеет направление тока, двигаясь от верхушки собирающего элемента по направлению к зоне исследования.
29. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что образец имеет направление тока, двигаясь от зоны исследования по направлению к верхушке собирающего элемента.
30. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что проточная камера является капиллярной трубкой.
31. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что оно дополнительно включает гидродинамический фокусирующий элемент, расположенный в проточной кювете перед зоной исследования.
32. Устройство по любому из предшествующих аспектов, отличающееся тем, что аналит включает первый и второй аналиты, и устройство дополнительно включает логический протокол, работающий на процессоре, соединенном с детектором, и логический протокол служит для (1) определения на основе определяемого сигнала того, является ли аналит, от которого был получен определяемый сигнал, первым аналитом или вторым аналитом, и (2) вывода сигнала на основе определения.
33. Устройство по аспекту 32, отличающееся тем, что оно дополнительно включает контролируемый распознающий источник энергии, соединенный с логическим протоколом и служащий для избирательной сортировки в сортируемом участке первого или второго аналита в соответствии с исходящим сигналом от логического протокола.
34. Устройство по любому из аспектов 1-31, отличающееся тем, что детектор функционирует для вывода сигнала при определении определяемого сигнала, и устройство дополнительно включает контролируемый распознающий источник энергии, соединенный с детектором и служащий для сообщения энергии аналиту в сортируемом участке в соответствии с сигналом, исходящим от детектора.
35. Способ определения аналита в жидкостном образце с использованием устройства, включающего источник света, вогнутый собирательный элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, и зона исследования совпадает с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента, и такой способ включает:
контроль тока образца в замкнутой проточной кювете для создания направления тока (1) от верхушки собирающего элемента по направлению к зоне исследования, или (2) от зоны исследования по направлению к верхушке собирающего элемента, проточная кювета включает:
отверстие для ввода образца,
отверстие для вывода образца, и
путь тока, определяемый между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, и такой путь тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный книзу от зоны исследования, при этом участок тока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы для образования непрерывного замкнутого пути тока жидкости, без разделения или разветвления,
при этом участок тока жидкости проходит через собирающий элемент, и направление тока проходит от зоны исследования по направлению к верхушке собирающего элемента;
освещение образца в зоне исследования, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение;
сбор определяемого сигнала вогнутым собирающим элементом, при этом собирающий элемент отражает определяемый сигнал на детектор, и
обнаружение определяемого сигнала детектором.
36. Способ по аспекту 35, отличающийся тем, что замкнутая проточная кювета дополнительно включает сферический элемент, окружающий зону исследования, и сферический элемент имеет коэффициент преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы.
37. Способ по аспекту 35 или 36, отличающийся тем, что детектор коаксиален оптической оси собирающего элемента.
38. Способ по любому из аспектов 35-37, отличающийся тем, что участок освещения находится в точке освещения.
39. Способ по любому из аспектов 35-38, отличающийся тем, что он включает освещение образца перпендикулярно оси тока в зоне исследования.
40. Способ по любому из аспектов 35-38, отличающийся тем, что он включает освещение образца перпендикулярно оси тока в зоне исследования, по меньшей мере, в двух направлениях.
41. Способ по любому из аспектов 35-38, отличающийся тем, что освещение образца включает расположение источника света коаксиально оси тока жидкости и освещение участка пути тока жидкости, проходящей через зону исследования.
42. Способ по любому из аспектов 35-38, отличающийся тем, что освещение образца включает:
отражение электромагнитной энергии от источника света к вогнутому оптическому элементу с использованием конического оптического элемента; и
фокусировку электромагнитной энергии на зоне исследования с использованием вогнутого оптического элемента, вогнутый оптический элемент включает точку фокусировки, совпадающую с зоной исследования.
43. Способ по любому из аспектов 35-38, отличающийся тем, что освещение образца включает:
отражение электромагнитной энергии от источника света к кольцеобразному оптическому элементу с использованием конического оптического элемента, при этом конический оптический элемент расположен относительно кольцеобразного оптического элемента таким образом, что электромагнитная энергия поступает на кольцеобразный оптический элемент, и
фокусировку электромагнитной энергии на зоне исследования с использованием кольцеобразного оптического элемента.
44. Способ по аспекту 42 или 43, отличающийся тем, что он дополнительно включает отражение электромагнитной энергии от источника света на конический оптический элемент с использованием плоскостного оптического элемента.
45. Способ по аспекту 42 или 43, отличающийся тем, что источник света и конический оптический элемент расположены коаксиально.
46. Способ по любому из аспектов 35-38, отличающийся тем, что освещение образца включает отражение электромагнитной энергии от источника света в виде кольцевого луча на втором вогнутом оптическом элементе с использованием первого вогнутого оптического элемента; и
фокусировку кольцевого луча электромагнитной энергии на зоне исследования с использованием второго вогнутого оптического элемента.
47. Способ по аспекту 46, отличающийся тем, что первый и второй вогнутые оптические элементы каждый включают оптическую ось, и оптические оси расположены коаксиально.
48. Способ по аспекту 47, отличающийся тем, что оптические оси первого и второго вогнутых оптических элементов расположены коаксиально оптической оси собирающего элемента.
49. Способ по любому из аспекту 35-48, отличающийся тем, что направление тока образца проходит от верхушки собирающего элемента по направлению к интересуемому участку, и часть тока жидкости проходит через собирающий элемент.
50. Способ определения аналита в устройстве, включающем источник света, конический оптический элемент, первый и второй вогнутые оптические элементы, вогнутый собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, и зона исследования совпадает с точкой фокусировки вогнутого собирающего элемента, и такой способ включает:
контроль тока образца, включающего аналит или подозреваемого на содержание аналита, в замкнутой проточной кювете, включающей:
отверстие для ввода образца,
отверстие для вывода образца,
путь тока, определяемый между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, и такой путь тока проходит через зону исследования и сортирующий участок, расположенный книзу от зоны исследования, при этом участок тока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси вогнутого собирающего элемента, и при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы для образования непрерывного замкнутого пути тока жидкости, без разделения или разветвления;
освещение аналита в зоне исследования с использованием оптической системы, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение, и оптическая система включает:
первый и второй вогнутые оптические элементы, каждый из которых имеет оптическую ось и точку фокусировки, и
конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого вогнутого оптического элемента, при этом конический оптический элемент отражает электромагнитную энергию от источника света на первый вогнутый оптический элемент, первый вогнутый оптический элемент отражает электромагнитную энергию на второй вогнутый оптический элемент, и второй вогнутый оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию на зону исследования;
сбор определяемого сигнала вогнутым собирающим элементом, при этом вогнутый собирающий элемент отражает определяемый сигнал на детектор; и
обнаружение определяемого сигнала детектором.
51. Способ по аспекту 50, отличающийся тем, что первый вогнутый оптический элемент эллипсоидный, параболический или сферический.
52. Способ по аспекту 50 или 51, отличающийся тем, что второй вогнутый оптический элемент эллипсоидный, параболический или сферический.
53. Способ по любому из аспектов 35-52, отличающийся тем, что собирающий элемент эллипсоидный, параболический или сферический.
54. Способ определения аналита в устройстве, включающем источник света, конический оптический элемент, первый и второй параболические оптические элементы, эллипсоидный собирающий элемент, имеющий верхушку, оптическую ось и точку фокусировки, и зону исследования, определяемую в точке фокусировки эллипсоидного собирающего элемента, и такой способ включает:
контроль тока образца, включающего аналит или подозреваемого на содержание аналита, в замкнутой проточной кювете, включающей:
отверстие для ввода образца,
отверстие для вывода образца,
путь тока, определяемый между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, и такой путь тока проходит через собирающий элемент, зону исследования и сортирующий участок, расположенный книзу от зоны исследования, при этом участок тока жидкости, проходящий через зону исследования, коаксиален оптической оси эллиптического собирающего элемента, и при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости, проходящий через зону исследования и сортирующий участок, ограничен стенкой проточной кюветы для образования непрерывного замкнутого пути тока жидкости, без разделения или разветвления, и
сферический элемент, окружающий зону исследования, сферический элемент имеет коэффициент преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы;
освещение аналита в зоне исследования с использованием оптической системы, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на освещение, и оптическая система включает:
первый и второй параболические оптические элементы, каждый из которых имеет оптическую ось и точку фокусировки, и
конический оптический элемент, расположенный во внутреннем объеме первого параболического оптического элемента, при этом конический оптический элемент отражает электромагнитную энергию от источника света на первый параболический оптический элемент, первый параболический оптический элемент отражает электромагнитную энергию на второй параболический оптический элемент, и второй параболический оптический элемент фокусирует электромагнитную энергию на зону исследования;
сбор определяемого сигнала эллипсоидным собирающим элементом, при этом эллипсоидный собирающий элемент отражает определяемый сигнал на детектор; и
обнаружение определяемого сигнала детектором.
55. Способ по любому из аспектов 35-54, отличающийся тем, что собирающий элемент наполняют средой с коэффициентом преломления, который на 0,1 больше или меньше коэффициента преломления стенки проточной кюветы в зоне исследования.
56. Способ по любому из аспектов 35-55, отличающийся тем, что он дополнительно включает отражение определяемого сигнала от собирающего элемента с использованием плоского зеркала.
57. Способ по любому из аспектов 35-56, отличающийся тем, что он дополнительно включает фокусировку определяемого сигнала от собирающего элемента с использованием устройства с крошечным отверстием, присоединенного к детектору.
58. Способ по любому из аспектов 35-57, отличающийся тем, что он включает контроль тока образца для создания направления тока жидкости, движущейся от верхушки собирающего элемента по направлению к зоне исследования.
59. Способ по любому из аспектов 35-57, отличающийся тем, что он включает контроль тока образца для создания направления тока жидкости, движущейся от зоны исследования по направлению к верхушке собирающего элемента.
60. Способ по любому из аспектов 35-59, отличающийся тем, что ток жидкости коаксиален оптической оси собирающего элемента.
61. Способ по любому из аспектов 35-60, отличающийся тем, что проточная кювета является капиллярной трубкой.
62. Способ по любому из аспектов 35-61, отличающийся тем, что он дополнительно включает создание тока по типу «ядро в оболочке» в токе образца, по меньшей мере, через зону исследования.
63. Способ по любому из аспектов 35-49, отличающийся тем, что аналит включает первый и второй аналиты, и такой способ дополнительно включает:
получение данных от детектора после обнаружения определяемого сигнала;
определение на основе полученных данных присутствия в зоне исследования аналита; и
определение на основе полученных данных, является ли аналит первым или вторым аналитом.
64. Способ по аспекту 63, отличающийся тем, что он дополнительно включает контролируемый распознающий источник энергии для избирательной сортировки в сортирующем участке одного из первого или второго аналита на основе определения аналита, являющегося первым или вторым аналитом.
65. Способ по аспекту 64, отличающийся тем, что избирательная сортировка включает дериватизацию, уничтожение, повреждение, модификацию, разрушение или фрагментацию первого или второго аналита.
66. Способ по любому из аспектов 35-62, отличающийся тем, что он дополнительно включает:
получение данных от детектора после обнаружения определяемого сигнала, и
контроль распознающего источника энергии для губительного сообщения энергии аналиту в сортируемом участке на основе полученных данных.
67 Способ по аспекту 66, отличающийся тем, что сообщение энергии аналиту включает дериватизацию, уничтожение, повреждение, модификацию, разрушение или фрагментацию аналита.
68. Устройство для определения аналита, включающее:
источник света;
линзу объектива, включающую оптическую ось и точку фокусировки;
зону исследования, совпадающую с точкой фокусировки;
проточную кювету, имеющую отверстие для ввода образца, отверстие для вывода образца, и ток жидкости, определяемый между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости проходит через зону исследования и имеет ось тока, коаксиальную оптической оси оптического элемента;
образец, включающий аналит или подозреваемый на содержание аналита, текущий в пути тока жидкости, и образец имеет направление тока, двигаясь от линзы объектива в участке тока жидкости с осью тока, которая коаксиальна оптической оси линзы объектива, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на свет;
детектор для обнаружения определяемого сигнала; и
контролируемый источник энергии для сортировки образца вниз по направлению от точки фокусировки оптического элемента.
69. Способ определения аналита в устройстве, включающем источник света и линзу объектива, имеющую оптическую ось и точку фокусировки, и зону исследования, определенную в точке фокусировки линзы объектива, а также детектор, и такой способ включает:
контроль тока образца, включающий аналит в замкнутой проточной кювете, в направлении движения от линзы объектива, и проточная кювета включает:
отверстие для ввода образца,
отверстие для вывода образца,
путь тока, определяемый между отверстием для ввода образца и отверстием для вывода образца, путь тока ограничен стенкой проточной кюветы, при этом, по меньшей мере, участок тока жидкости проходит через линзу объектива и зону исследования и имеет ось тока, которая коаксиальна оптической оси линзы объектива;
освещение образца в зоне исследования, при этом аналит генерирует определяемый сигнал в ответ на свет;
сбор определяемого сигнала линзой объектива и отражение определяемого сигнала на детектор; и
обнаружение сигнала.
70. Способ по аспекту 69, отличающийся тем, что аналит включает первый и второй аналиты, и такой способ дополнительно включает:
получение данных от детектора после обнаружения определяемого сигнала;
определение на основе полученных данных присутствия в зоне исследования аналита; и
определение на основе полученных данных, является ли аналит первым или вторым аналитом.
71. Способ по аспекту 70, отличающийся тем, что он дополнительно включает контролируемый распознающий источник энергии для избирательной сортировки одного из первого или второго аналита на основе определения аналита, являющегося первым или вторым аналитом.
72. Способ по аспекту 71, отличающийся тем, что избирательная сортировка включает дериватизацию, уничтожение, повреждение, модификацию, разрушение или фрагментацию первого или второго аналита.
73. Способ или устройство по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что аналит является сперматозоидом.
74. Способ или устройство по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что аналит включает первый и второй аналиты, первый аналит является сперматозоидом, включающим Х хромосому, и второй аналит является сперматозоидом, включающим Y хромосому.
75. Способ по п. 73 или 74, отличающийся тем, что он дополнительно включает гидродинамическую фокусировку образца таким образом, что сперматозоиды ориентированы в одинаковом направлении и находятся в жидкостном образце, или устройство по п. 73 или 74, отличающееся тем, что оно дополнительно включает участок гидродинамической фокусировки для ориентации сперматозоидов в одинаковом направлении и расположения сперматозоидов в жидкостном образце.
77. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что он дополнительно включает акустическую фокусировку аналита для центрирования аналита в образце, или
устройство по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что оно дополнительно включает преобразователь, присоединенный к проточной кювете и функционирующий для излучения механической волны для акустической фокусировки аналита в образце.
3
3
78. Способ или устройство по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что образец течет через проточную кювету при скорости от приблизительно 0,1 мм в секунду до приблизительно 30 мм в секунду.
3
3
79. Способ или устройство по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что образец течет по типу «ядро в оболочке» и проточная жидкость течет при скорости от приблизительно 20 мм в секунду до приблизительно 600 мм в секунду.
80. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что он включает обнаружение определяемого сигнала от более чем 100000 аналитов в секунду при прохождении аналитов через зону исследования.