Влияние экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на продукцию цитокинов при развитии карциномы легких Льюис у мышей

LAPAROSCOPIC SPLENECTOMY IN BLOOD SYSTEM IMMUNE DISEASES TREATMENT

SA Usov, A.M. Tsigelnik, A.D. Mozes

The aim of this retrospective study was to compare two cohorts of patients with hematological diseases, who underwent open splenectomy (OS) and laparoscopic splenectomy (LS) in a single institution. The medical records of the 21 patients who underwent LS were reviewed and compared with a control group of 65 patients who underwent OS. Data were collected regarding operative time, blood loss, complications, mortality, hematological outcomes. No differences were observed in early and long-term hematological results of OS and LS. Compared with OS, LS required more operative time but it is superior in blood loss and complication rates.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бокарев И.Н. II Клиническая медицина. 1999. № 7. С. 56-59.

2. Тржимоловский А. В., Карагюлян СР., Данишян К.И. и др. II Эндоскопическая хирургия. 2003. № 4. С. 3-14.

3. Диагностика и лечение идиопатической тромбо-цитопенической пурпуры: рекомендации амери-

канского общества гематологов II Междунар. журн. мед. практики. 1997. № 6. С. 60-68.

4. Пугина С.А., Евдокимова Н.М., Расторгуев Г.Г. и др. II Терапевтический архив. 1999. № 8. С. 50-54.

5. Пучков К.В., Мартынов М.М., Гусман Б.Я. и др. // Эндоскопическая хирургия. 1997. № 1. С. 30—34.

6. Савченко В.Г., Ильин Т.П., Идельсон Л.И. //Терапевтический архив. 1983. № 8. С. 105-109.

7. Цветаева Н., Колодей С, Никулина О. и др. // Врач. 2003. № 2. С. 32-34.

8. Brodsky J.A., Brody F.J., Walsh R.M. et al. 11 Surg. Endosc. 2002. № 16(5). P. 851-854.

9. ChandВ., Walsh R.M., Ponsky J., Brody F. IISurg. Endosc. 2001. № 15(11). P. 1273-1276

10. Chirletti P., Cardi M., Barillari P. et al. II World J. Surg. 1992. № 16(5). P. 1001-1004.

11. Dan K., Gomi S., Kuramoto A. et al. 11 Int. J. Hema-tol. 1992. № 55 (3). P. 287-292.

12. Franciosi C, Caprotti R., Romano F. et al. // Surg. Laparosc. Endosc. Percutan. Tech. 2000. Oct. № 10(5). P. 291-295.

13. Law C, Marcaccio M., Tarn P. et al. // N. Engl. J. Med. 1997. № 21. P. 1494-1498.

14. Rosen M., Brody F, Walsh R.M. et al. // Surg. Endosc. 2000. № 16(2). P. 272-279.

УДК 615.277.3:616-006

Е.Ю. Шерстобоев, О.А. Капля, Е.П. Зуева, Т.Г. Разина, О.И. Эпштейн ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО

И ЕГО КОМБИНАЦИИ С ЦИКЛ0Ф0СФАН0М НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ ПРИ РАЗВИТИИ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС У МЫШЕЙ

НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, Томск ООО "НПФ "Материа Медика Холдинг"", Москва

Изучали влияние экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на выработку ключевых цитокинов клетками-эффекторами системы естественной цитотоксичности при развитии карциномы легких Льюис у мышей линии Рі(СВАхС57В1/6). Было показано, что при изучаемой экспериментальной модели злокачественного роста применение экстракта шлемника байкальского (ЭШБ), а также его комбинации с циклофосфаном усиливало продукцию перитонеальными макрофагами мышей ИЛ-ір и ФНО-а лишь в терминальную стадию опухолевого процесса. Введение ЭШБ и сочетанное применение его с циклофос-фаном корректировало на некоторые сроки развития опухоли нарушенный баланс цитоки-нов, продуцируемых Т-хелперами I типа (ИФН-у и ИЛ-2), однако при этом происходило усиление выработки ИЛ-4 и ИЛ-10, уровень которых и без того был высоким у животных-опухо-леносителей._________________________________________________________________________

Ключевые слова: цитокины, экстракт шлемника байкальского, карцинома легких Льюис, система естественной цитотоксичности

Интерес к изучению роли цитокинов при опухолевых заболеваниях неуклонно растет. На сегодняшний день характеристика клеточного противоопухолевого иммунитета все больше ассоциируется не с уровнем (содержанием) клеток-эффекторов, а с их функциональной активностью — продукцией цитокинов [5]. В ряде исследований показано, что при развитии в организме неопластического процесса наблюдается дисбаланс основных звеньев цитокиновои сети организма

[7—9]. Одним из современных подходов к повышению эффективности лечения злокачественных новообразований является комбинированное использование классических методов лечения с препаратами растительного происхождения, обладающих способностью не только усиливать эффективность цитостатической терапии, но и существенно снижать токсичность последней [1, 4, 6]. Особенно важным свойством фитопрепаратов является их способность влиять на продукцию

интерферона-у (ИФН-у), фактора некроза опухоли (ФНО), интерлейкина-1 (ИЛ-1), ИЛ-2, колониестимулирующих факторов [2, 4]; при этом наблюдается нормализация нарушенного баланса субпопуляций Т-лимфоцитов при развитии в организме опухоли [2]. Одним из таких препаратов является жидкий экстракт шлемника байкальского (ЭШБ) [4]. Однако механизмы влияния ЭШБ на противоопухолевую резистентность организма мало изучены. В связи с этим целью работы явилось исследование влияния жидкого экстракта шлемника байкальского и его комбинации с циклофосфаном на выработку ключевых цитокинов перитонеальными макрофагами и Т-лимфоцитами селезенки мышей при развитии карциномы легких Льюис.

Методика. Исследования были проведены на 146 мышах-самцах линии Р!(СВАХС57В1/6) в возрасте 2-2,5 месяцев, массой 18—20 г, полученных из лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Мышей умерщвляли под эфирным наркозом. В качестве экспериментальной модели злокачественного роста была использована карцинома легких Льюис, которую перевивали в мышцу з6адней лапы взвесью клеток в количестве 5—6Х106 на мышь. Группе животных (п=35) вводили циклофосфан (производство Саранского комбината "Биохимик") однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг на 12-ые сут после трансплантации опухоли. Корректором изменений со стороны иммунной системы служил жидкий экстракт шлемника байкальского (ГНЦЛС, Харьков). Препарат вводили животным (п=35) через зонд в желудок курсом начиная с 6 сут после трансплантации опухоли и далее — в течение 12 дней, в дозе 1 мл/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды. Также исследовали мышей (п=35) с курсовым введением ЭШБ и однократным применением циклофосфана. Контрольную группу (п=35) составляли животные с перевитой опухолью, получавшие дистиллированную воду в той же дозе и режиме. В качестве фона использовали интактных мышей (п=6) соответствующего пола и возраста.

Проводилось изучение уровней цитокинов ФНО-а, ИЛ-ір в супернатантах перитонеальных макрофагов экспериментальных животных, а также ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10 в культуральных жидкостях лимфоцитов. Клетки перитонеального экссудата мышей выделяли путем промывания брюшной полости мышей 5 мл среды 199 ("ГНЦ ВБ Вектор", Новосибирск), содержащей 10 ЕД гепарина, 40 мкг/мл гентамицина и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) ("ВіоСІоҐ', Германия) [3]. Затем отмытые и осажденные центрифугированием клетки ресуспенди-ровали в полной культуральной среде с 5% ЭТС и

вносили их в количестве 1х107 в пластиковые 90 мм чашки Петри. После инкубации в течение 1 ч при 37°С и 5% СО2 среду с неприлипшими клетками удаляли из чашек, а прилипшие клетки соскабливали с поверхности чашек силиконовым скребком. Количество жизнеспособных макрофагов опытный: и контрольной групп доводили до концентрации 2х10б клеток/мл и инкубировали в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 ("ГНЦ ВБ Вектор", Новосибирск); 10% ЭТС ("BioClot", Г ермания), предварительно инактивированной теплом (56°С, 30 мин); 2 мМ L-глютамина ("Sigma", США); 10 мМ HEPES ("Flow", Великобритания); 40 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ); 25 мкМ 2-меркап-тоэтанола ("Sigma", США) в течение суток при 37°С, 5% СОг и 100% влажности воздуха при добавлении липополисахарида Escherichia coli Serotype 055:В5 ("Sigma", США) 10 мкг/мл.

Лимфоциты выщеляли из взвеси селезеночных клеток мышей на градиенте фиколла-пака (плотность 1,077) [3]. Лимфоциты дважды отмытали средой 199 с 5% ЭТС. Количество жизнеспособных лимфоцитов опытных и ко6нтрольной групп доводили до концентрации 2х10 клеток/мл и инкубировали в полной культуральной среде в течение суток при 37°С, 5% С02 и 100% влажности воздуха при добавлении конканавалина А (Кон A) (ICN, США) 5 мкг/мл. По окончании инкубации в обоих случаях собирали кондиционные среды и хранили не более месяца при — 50°С.

Уровни цитокинов ФНО-а, ИЛ-ip, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10 тестировали на 13, 15, 17, 19 и 22-ые сут после трансплантации опухоли имму-ноферментным методом с использованием наборов фирмы "Amersham Pharmacia Biotech" (Великобритания) согласно методическим указаниям, прилагаемым к наборам, и анализатора иммуно-ферментныж реакций "Униплан" АИФР-01, производства ЗАО "Пикон" (Москва).

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ "Statistica for Windows" (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стыо-дента.

Результаты. Динамика продукции ИЛ-ip перитонеальными макрофагами мышей с карциномой легких Льюис при однократном введении циклофосфана носила волнообразный характер: значительное снижение (по сравнению с контролем) количества ИЛ-ip в исследуемых супернатантах на 13, 15, 19-ые сут сменялось статистически достоверным увеличением продукции цито-кина макрофагами на 17, 22-ые сут после трансплантации опухоли. Следует отметить, что минимальный уровень выработки ИЛ-1р в данной экспериментальной группе был зарегистрирован на 15-ые сут, а максимальный — на 22-ые сут исследования. При курсовом введении ЭШБ мышам наблюдались подобные изменения: снижение уровня продукции ИЛ-ip макрофагами по срав-

l29

нению с контрольной группой на 15-ые суг и повышение на 17, 22-ые сут опухолевого процесса. Сочетанное применение циклофосфана и ЭШБ приводило на 13 и 15-ые сут исследования к достоверному снижению продукции ИЛ-1р перитонеальными макрофагами (в 4,33 раза и в 11,06 раза соответственно) по сравнению с животными, не получавшими терапевтического воздействия. Затем наблюдалось постепенное увеличение выработки ИЛ-1р макрофагами мышей-опухо-леносителей на фоне комбинированного применения циклофосфана и экстракта шлемника байкальского. С 17-х по 22-ые сут опыта уровень продукции ИЛ-1р перитонеальными макрофагами данной экспериментальной группы был достоверно выше не только контрольных значений, но и показателей продукции исследуемого цито-кина в группах животных с изолированным введением циклофосфана либо растительного препарата (рис. 1, А).

Уровень продукции ФНО-а перитонеальными макрофагами в группе мышей с опухолью, перенесших цитостатическое воздействие, был достоверно ниже контрольных значений на 13 и 17-ые сут эксперимента; при этом повышение исследуемого показателя было зарегистрировано на более поздние сроки исследования (19 и 22-ые сут). Применение ЭШБ достоверно повышало продукцию ФНО-а перитонеальными макрофагами по сравнению с контролем лишь на 19-ые сут опыта. Комбинированное введение препаратов приводило к значительному возрастанию количества ФНО-а в супернатантах перитонеальных макрофагов животных с опухолью на 15-ые сут, и особенно на 22-ые сут, наблюдения и к снижению — на 17-ые сут эксперимента как по сравнению с контролем, так и группой с изолированным введением цитостатика (рис. 1, Б).

Однократное введение циклофосфана и курсовое применение ЭШБ не приводило к статистически значимым изменениям в динамике продукции ИФН-у лимфоцитами селезенки по сравнению с контрольными значениями в течение всего периода наблюдения (кроме 17-х сут исследования, когда введение цитостатика достоверно снижало уровень исследуемого цитокина). Вместе с тем, совместное применение ЭШБ и цитостатика повышало продукцию ИФН-у лимфоцитами мышей с опухолью на 17 и 22-ые сут исследования по сравнению с контролем, а на 17-ые сут — и с группой животных, получавшей цикло-фосфан (рис. 2, А).

При исследовании влияния циклофосфана на продукцию ИЛ-2 лимфоцитами мышей с карциномой легких Льюис достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались только на 17-ые сут опыта (содержание данного цитокина в изучаемых супернатантах было ниже, чем в контрольной группе). Введение ЭШБ стимулировало продукцию ИЛ-2 в терминальную стадию опухолевого процесса (19-ые сут). Комбинированное применение циклофосфана и экстракта шлемника байкальского оказывало неоднознач-

£ % и

£ Ші Б

1Э 15 1Т 1В И «У*

Сроки ИКСЛбДОМИН*

Рис. 1. Динамика продукции ИЛ-ір (А) и ФНО-а (Б) перитонеальными макрофагами мышей с карциномой легких Льюис (1) на фоне введения циклофосфана (2), экстракта шлемника байкальского (3) и их сочетанного применения (4).

Заштрихованным символом обозначены достоверные различия по сравнению с контролем

ЧЧЮИЇ А

и*.

И 4.--------------------------—----------*------------------,--------------

и ч 17 щ а V

Сроки ИССЛвДОШМКЯ

Рис. 2. Динамика продукции ИФН-у (А) и ИЛ-2 (Б) лимфоцитами мышей с карциномой легких Льюис (1) на фоне введения циклофосфана (2), экстракта шлемника байкальского (3) и их сочетанного применения (4).

Заштрихованным символом обозначены достоверные различия по сравнению с контролем

ное влияние на продукцию ИЛ-2 лимфоцитами мышей-опухоленосителей. Так, статистически значимое повышение исследуемого показателя (по сравнению с контролем) на 13 и 15-ые сут наблюдения сменилось снижением последнего на 19-ые сут опыта. Следует отметить, что на всем протяжении эксперимента во всех экспериментальных группах мышей уровень продукции ИЛ-2 был ниже, чем у интактных животных (рис. 2, Б).

Циклофосфан, введенный на 12-ые сут после трансплантации карциномы легких Льюис, достоверно снижал уровень продукции ИЛ-4 лимфоцитами на 15-ые сут; при этом на более поздние сроки исследования (17, 19 и 22-ые сут) наблюдалось стимулирующее влияние цитостатика на продукцию изучаемого цитокина лимфоцитами. Динамика продукции ИЛ-4 при курсовом введении ЭШБ не имела достоверных различий с контролем, за исключением выраженного снижения количества цитокина в супернатантах лимфоцитов на 15-ые сут опыта. Сочетанное применение ЭШБ с однократным введением химиотерапевтического препарата стимулировало выработку цитокина лимфоцитами на 13, 17, 22-ые сут наблюдения, при этом на 15-ые сут исследования наблюдалось снижение содержания ИЛ-4 в культуральных супернатантах по сравнению с контролем (рис. 3, А).

Как показали наши исследования, однократное введение циклофосфана мышам на фоне опухолевого роста приводило к статистически достоверному снижению уровня продукции ИЛ-10 лимфоцитами на 17-ые сут эксперимента

% к фону А

Рис. 3. Динамика продукции ИЛ-4 (А) и ИЛ-10 (Б) лимфоцитами мышей с карциномой легких Льюис (1) на фоне введения циклофосфана (2), экстракта шлемника байкальского (3) и их сочетанного применения (4).

Заштрихованным символом обозначены достоверные различия по сравнению с контролем

и к повышению - на 19-ые сут по сравнению с контрольной группой животных. Следует отметить, что на 19 и 22-ые сут опыта исследуемый показатель был значительно выше и фоновых значений. Курсовое введение ЭШБ оказывало стимулирующее влияние на продукцию ИЛ-10 лимфоидными клетками на протяжении всего эксперимента, за исключением 15-х сут исследования, когда данный показатель был достоверно ниже как фона, так и контроля. Комбинация двух препаратов вызывала увеличение уровня секреции ИЛ-10 на 13, 17-ые (максимальное значение) и 22-ые сут после трансплантации опухоли по сравнению с группой нелеченых, а также получавших циклофосфан животных (рис. 3, Б).

Заключение. Таким образом, на основании проведенных исследований было установлено, что курсовое введение мышам с карциномой легких Льюис ЭШБ вызывало повышение продукции ИЛ-ip и ФНО-а перитонеальными макрофагами лишь в терминальную стадию опухолевого процесса. Сочетанное применение ЭШБ и циклофосфана приводило к более выраженному усилению выработки ИЛ-ip и ФНО-а перитонеальными макрофагами по сравнению с изолированным введением растительного препарата, но также лишь на поздние сроки злокачественного роста.

При развитии карциномы легких Льюис наблюдалось нарушение баланса цитокинов, продуцируемых Т-хелперами (Th), в сторону Th2. Выработка ИЛ-4 по мере роста опухоли усиливалась, а продукция ИФН-у и ИЛ-2 была снижена. Повышение продукции ИЛ-10 лимфоцитами наблюдалось на поздние сроки опухолевого процесса. Применение ЭШБ корректировало на некоторые сроки нарушенный баланс цитокинов, продуцируемых Т-хелперами мышей с опухолью. Так, выработка ИЛ-2 усиливалась (19-ые сут), а продукция ИЛ-4 снижалась (15-ые сут) по сравнению с контрольной группой животных. Вместе с тем, введение ЭШБ оказывало стимулирующее влияние на продукцию ИЛ-10 лимфоидными клетками на протяжении практически всего периода наблюдения. Сочетанное применение цик-лофосфана и ЭШБ приводило к повышению продукции ИФН-у, играющему важную роль в противоопухолевой резистентности организма, и ИЛ-2. Однако при этом происходило и усиление выработки ИЛ-4 и ИЛ-10, уровень которых и без того был высоким у животных-опухоленосите-лей.

INFLUENCE OF SCUTELLARIA BAICALENSIS EXTRACT AND ITS COMBINATION WITH CYCLOPHOSPHAMIDE ON PRODUCTION OF CYTOKINES UNDER DEVELOPMENT LUNG CARCINOMA LEWIS IN MICE

E.Yu. Sherstoboev, O.A. Kaplya, E.P. Zueva,

T.G. Razina, O.I. Epstein

It has been studied the influence of Scutellaria baica-lensis extract and its combination with cyclophosphamide on production of key cytokines by cell-eifectors of the

natural cytotoxicity system under development lung carcinoma Lewis in mice of the line Fi(CBAxC57Bl/6). It has been shown, that the application of Scutellaria baica-lensis extract and also its combination with cyclophosphamide under studied experimental model of the malignant growth increased production of interleukin-1 (IL-1 p) and tumor necrosis factor-a (TNF-a) by peritoneal macrophages in mice only in a terminal stage of tumor process. Introduction of Scutellaria baicalensis extract and its combined application with cyclophosphamide corrected the violated balance of cytokines, produced by T-helpers 1 type on some terms of tumor development, however by that increased production of IL-4 and IL-10, which level and without that was high in animals with tumor.

ЛИТЕРАТУРА

1. Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Крылова С.Г. И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Прил. 2. С. 24—35.

2. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. II Вопросы онкологии. 2003. Т. 49. № 2. С. 145-151.

3. Гольдберг Е.Д. Методы культуры ткани в гематологии I Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.П. Шахов. Томск, 1992.

4. Гольдберг Е.Д. Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных новообразований 1Е.Д. Гольдберг, Е.П. Зуева. Томск, 2000.

5. Потапнев МП. II Цитокины и воспаление. 2002. Т. 1. № 2. С. 81.

6. Чердынцева Н.В., Литвяков Н.Л., Кокарев О.В. и др. II Сибирский онкологический журнал. 2002. № 1. С. 56-61.

7. Maeda Н, Shiraishi А. II Immunology. 1996. Vol. 156. P. 73-78.

8. Handel-Fernandez M.E., Cheng X., Herbert L.M., LopezD.M. IIImmunology. 1997. Vol. 158. P. 280286.

9. Kobayashi M., Kobayashi H. Richard B. et al. // Immunology. 1998. Vol. 160. P. 5869-5873.