СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ОКСИГЕНАЦИЮ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ПОВЫШЕНИИ В ЭРИТРОЦИТАХ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ МАГНИЯ
METHOD FOR ASSESSING INDUCING ACTION OF CYTOMEGALOVIRAL INFECTION ON HEMOGLOBIN OXYGENATION WITH IMPROVED ERYTHROCYTE CONTENT OF MAGNESIUM IONS

1. Цель изобретения - разработать способ, позволяющий оценить влияние обострения цитомегаловирусной инфекции на оксигенацию гемоглобина на третьем триместре гестации при повышении содержания в эритроцитах периферической крови ионов магния.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке метода, позволяющего оценить влияние цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на снижение оксигенации гемоглобина на фоне увеличения в эритроцитах ионов магния.
3. Раскрытие изобретения
2++
2++
2++
2++
2++
2++
Ионы Mg, которые содержатся в эритроцитах в пределах 1,75 ммоль/л эритроцитарной массы [4], образуют комплексы с 2,3ДФГ (дифосфоглицерофосфорной кислотой), что приводит к уменьшению концентрации свободного 2,3ДФГ, способного реагировать с гемоглобином [5, 6]. Сами по себе ионы Mg, а также комплексы с 2,3ДФГ с гемоглобином не реагируют [2]. Таким образом, на связь кислорода с деоксигемоглобином сильное влияние оказывает присутствие в эритроците анионов и катионов, к числу которых относится Mg, связь которого с 2,3ДФГ снижает его свободное содержание, подавляя тем самым оксигенацию гемоглобина. Увеличение в составе эритроцитов Mg возможно при нарушении строения его мембраны [7, 9], что и происходит при контакте ее с цитомегаловирусом. В состав оболочки цитомегаловируса входят белковые частицы gp64 [8, 10], слияние которых с белками мембраны эритроцита позволяет изменять конформацию белков мембраны и формировать в ней поры, через которые из окружающей среды могут проникать вовнутрь эритроцита различные ионы, в том числе и ионы Mg. Таким образом, в эритроците накапливается повышенное количество ионов Mg, которые образуют комплексы с 2,3ДФГ и тем самым снижают оксигенацию гемоглобина.
4. Новая техническая задача
Разработать способ, позволяющий оценить подавляющее влияние цитомегаловирусной инфекции на оксигенацию гемоглобина при увеличении ионов магния в эритроцитах, количественное содержание которых определялось в отдельно взятом эритроците гистохимическим методом.
2
5. Придавая большое значение ионам магния в тканевом метаболизме организма, авторы считают [3], что для оценки содержания магния в крови нужно определять его не в сыворотке, поскольку этот метод малоинформативен, а учитывать его содержание в эритроцитах. В данной работе мы прибегли к методу определения магния в пиксель/ммк в отдельно взятых эритроцитах по программе «Scion» (США), что позволяет в зависимости от его количества при воздействии цитомегаловирусной инфекции оценить уровень оксигенации гемоглобина в эритроцитах. Подобного рода работ в доступной литературе мы не обнаружили.
6. Осуществление изобретения
6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 20 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз обострения хронической цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к ЦМВ.
6.2. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2008 г. и правил клинической практики в Российской Федерации, утвержденных приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.3. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методика ПЦР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
6.4. Содержание магния в отдельно взятых эритроцитах определяли гистохимическим методом. Магний в щелочной среде образует комплекс бурого цвета с титановым желтым, присутствие гидроксиламина стабилизирует окраску. При анализе эритроцитов белки осаждают вольфраматом натрия.
Последовательные этапы реакции
1. 0,075%-ный раствор титанового желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл воды, хранят в холодильнике в темной склянке (реактив очень светочувствителен, годен не более 10 дней).
2
2
4
-
2. 2%-ный раствор гидрохлорида гидроксиламина: 2 г гидроксиламинагидро-сульфата (HNOH·HSO) растворяют в 100 мл воды.
3. 0,1%-ный раствор метилового красного в 95%-ном этиловом спирте (индикатор с зоной перехода рН 4,4-6,2).
4. 0,2N NaOH.
5. 1,5N NaOH.
2
4
6. 10%-ный раствор вольфрамовокислого натрия: 10 г вольфрамата натрия (NaWO) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.
7. 0,67N серная кислота. Методика выявления магния.
2
Субстратом служили: 500 мкл воды с добавлением 250 мкл 10%-ного вольфрамата натрия и 250 мкл 0,67N серной кислоты. В отдельной пробирке готовили инкубационный раствор, отбирая 625 мкл раствора, к нему добавляли каплю индикатора метилового красного и 0,2N NaOH до установления желтой окраски. После этого вносили 250 мкл 2%-ного гидроксиламинагидросульфата, 250 мкл 0,075%-ного титанового желтого и 500 мкл 1,5N NaOH. В отдельную пробирку вносили 250 мкл полученного раствора и 250 мкл цельной крови с коагулянтом, взятой из локтевой вены утром натощак в стандартизованные вакуумные пробирки PUTH, КЗ ЭДТА. Инкубацию проводили в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего готовили монослойный мазок на центрифуге «Diffe Spin-2». Полученные мазки высушивали и изучали с помощью цифрового микроскопа МТ (Япония), связанного с программно-аппаратным комплексом «Scion» (США). Далее в программе «PhotoShop» выделяют отдельно взятый эритроцит (фигура 1) и через программу «Scion», откалиброванную в компьютере, автоматически определяют в пикселях/ммк выделенный участок - отдельно взятый эритроцит.
6.5. Для контроля брали адекватное количество фосфатного буфера рН 7,4-7,6.
6.6. Содержание оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Меллой [1].
7. Статистическую обработку данных осуществляли по критерию Манна-Уитни, гипотезу о статистической значимости различий двух выборок - с помощью t критерия Стьюдента. Значения считали достоверными при р<0,01.
8. Полученные данные
2
2
Исследования показали, что при обострении цитомегаловирусной инфекции до титра антител IgG к ЦМВ 1:1600 на третьем триместре гестации в периферической крови увеличивается содержание ионов магния до 72,20±1,65 пикселей/ммк (фигура 2) (контроль - 8,88±0,80 пикселей/ммк) (фигура 3). В периферической крови в эритроцитах снижается оксигенация гемоглобина до 86,50±1,3%, что становится угрозой формирования у беременной анемии.
Литература
1. Покровский А.А. Справочник. Биохимические методы исследования. М.: Медицина. 1969. 337 с.
2. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция. М.: Медицина. 1976. 538 с.
3. Юлиш Е.И. Роль магния в патологии // Здоровье ребенка. - Донецк. - 2007. - Т. 5, №8. - С. 5-8.
4. Elin R.J. Magnesium metabolism in health and disease. Diseas - A - Morth. 1998. Vol. 3. P. 173.
5. Garby L., de Verdier C. Affinity of human hemoglobin A to 2,3-diphosphoglycerate. Effect of hemoglobin concentration and pH // Scand J. Clin. Labor. Invest. 1971. Vol. 27. P. 345-350.
6. Garby L. In: Synthesis, structure and function of hemoglobin. Molecular biology and clinical aspects. Ed. H. Martin L., Nowicki, J. Lehmanns Munchen, 1972. Vol. 10.
7. Levin S., Korenstein R. Membrane flucluations in erythrocytes are linked to Mg ATP-dependent dynamic assembly of the membrane skeleton // Biophys. J. 1991. 60(3). P. 733-737.
8. Li Z., Blissard G. Baculovirus GP64 disulfide bonds: the intermolecular disulfide bond of AcMNPV GP64 is not essential for membrane fusion and virion bundding // J. Virol. 2011. 8(23). P. 12492-12504.
9. Tuvia S., Levin S., Korenstein R. Oxygenation-deoxygenation cycle of erythrocytes modulates submicron cell membrane fluctuations // J. Biophys. 1992. 63(2). P. 599-602.
10. Xu R., Wilson I.A. Structural characterization of an early fusion intermediate of influenza virus hemagglutenin // J. Virol. 2011. Vol. 85. P. 5172-5182.