Способ подготовки образцов костной ткани человека для исследования методом растровой электронной микроскопии
METHOD OF PREPARING HUMAN BONE TISSUE SAMPLES FOR SCANNING BY ELECTRON MICROSCOPY

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для изучения пространственной структуры поствитальной или пострезекционной костной ткани человека методом растровой электронной микроскопии.
Известен способ подготовки регенератов кости для исследования методом растровой микроскопии [1]. Способ включает фиксацию в 2 % растворе параформальдегида, глутарового альдегида и 0,1 % пикриновой кислоты на фосфатном буфере (рН 7,4) при температуре +4ºС в течение 48 часов, промывку, обезвоживание и заливку в аралдит по следующей схеме: 100 % ацетон + смесь аралдитов в соотношениях 3: 1, 1: 1 и 1: 3 по 12 часов в каждой смеси; смесь аралдитов без ацетона - 24 часа. Аралдитовый блок обрезали, обнажали исследуемую поверхность регенерата, которую затем полировали мелкоабразивными материалами (водостойкой абразивной бумагой Р 200, Р 400, Р 1000). Подготовленный таким образом блок (шлиф) напыляли тонким слоем серебра в ионном вакуумном напылителе IB-6 производства Японии.
Данный процесс пробоподготовки представляется достаточно длительным, занимает несколько суток, требует предварительной фиксации биологического материала, использования сложной заливочной среды. Получившийся аралдитовый блок необходимо разрезать, что требует дополнительного оборудования.
Группой исследователей под руководством Р.А. Мухамадиярова разработан способ подготовки образцов биологических тканей, в том числе содержащих различные имплантанты [2]. Способ включает фиксацию образцов в 4% растворе параформальдегида. Часть образцов, содержащих никелид титана, после фиксации раствором параформальдегида дополнительно фиксировали 2% водным раствором оксида осмия четырехвалентного в течение 12 часов. Обезвоживание образцов проводили путем последовательного помещения в растворы этилового спирта возрастающей концентрации. Обезвоженные образцы помещали в ацетон: 2 раза по 60 минут. Затем образцы выдерживали в смеси ацетона и смолы в соотношении 1:1 в течение 12 часов, после чего погружали в заливочную смолу и выдерживали в системе вакуумной импрегнации CitoVac (Struers, Дания) 12 часов. Пропитанные смолой образцы помещали в специальные формы (Fixi-Form, Struers) диаметром 25 мм для шлифовально-полировального станка TegraPol-11 (Struers, Дания), заливали свежей порцией смолы и оставляли в термостате при 37°С. Через12 часов проводили полимеризацию смолы в термостате при температуре 60°С в течение 24 час. Полученные образцы шлифовали до участка, исследование которого было необходимо произвести и полировали поверхность с использованием шлифовально-полировального станка TegraPol-11 (Struers, Дания). Шлифовку осуществляли, используя абразивные диски MDRondo (Struers) с различным размером абразивных зерен в следующем порядке: 800, 1000 и 1200 грита. Для полировки последовательно использовали диски, покрытые сукном (Struers), с различной упругостью в комбинации с суспензиями, содержащими монокристаллические алмазы (DP-SprayM, Struers). Далее шлифовали обратную сторону блоков таким образом, чтобы их плоские поверхности были параллельны. Шлифовку обратной стороны выполняли до образца, а также удаляли его неинформативные участки, чтобы добиться минимальной толщины блоков. Перед исследованием в электронном микроскопе все образцы контрастировали 2% водным раствором уранилацетата и цитрата свинца по Рейнольдсу. Затем образец промывали под струей дистиллированной воды, протирали мягкой тканью и высушивали на воздухе.
3
Недостатком данного способа является длительность и техническая сложность способа, необходимость фиксировать образцы, использование токсичных соединений, таких как оксид осмия четырехвалентного, уранилацетат, цитрат свинца, а также применение сложного и дорогостоящего оборудования. В Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова также разработан метод подготовки образцов костной ткани к исследованию в растровом электронном микроскопе [3]. Образцы биологических тканей размером до 1 см, выделенные из костных регенератов, фиксировали 1–3 суток в смеси 2 % растворов формальдегида и глутарового альдегида (рН 7,4) с добавлением 0,1 % пикриновой кислоты. После фиксации их последовательно отмывали в фосфатном буфере, проточной и дистиллированной воде в течение 2 часов на каждом из этапов. Затем образцы оставляли на ночь в 70 % этиловом спирте и далее дегидратировали по 2 часа в 80, 90, 96 и 100 % этиловом спирте. Далее этиловый спирт замещали этоксиэтаном, поместив образцы в смесь равных объемов растворителей (на ночь) и в этоксиэтан (на 2 часа). После этого образцы последовательно пропитывали в трех сменах смеси камфен/этоксиэтан, взятых в соотношении: 1/1, 2/1, 3/1, по 2 часа в каждой, и далее помещали на 12 часов в две смены химически чистого камфена при t = 51 °C. По окончании пропитывания образцы оставляли при комнатной температуре в особо чистых условиях до полной сублимации камфена.
Приведенные выше способы являются трудоемкими за счет многоэтапности пробоподготовки, большого количества смен рабочей среды, требуют значительных затрат материалов, притом, что такие реактивы, как этоксиэтан, соединения осмия, являются опасными, а камфен – труднодоступным.
Для подготовки биологического материала разработан способ, основанный на применении хлоридов редкоземельных элементов [4]. При осуществлении данного способа каждый образец промывали в 0,9% NaCl, затем размещали в емкость с водным изотоническим раствором одного из хлоридов редкоземельных элементов (Nd, Pr или La) или их смеси для насыщения образца контрастирующим веществом и экспонировали от 20 мин до 6 ч. Для удаления излишков раствора образцы промывались дистиллированной водой.
Фактором, ограничивающим применение этого способа для изучения структуры скелетных тканей, является тропность редкоземельных элементов к фосфатам с образованием нерастворимых соединений, что может ограничить визуализацию структурных компонентов исследуемого материала. Существенным недостатком является токсичность хлоридов редкоземельных элементов и их высокая стоимость.
Задачей изобретения является получение достоверных данных о структуре поствитальной или пострезекционной костной ткани человека путем исследования в растровом электронном микроскопе при минимальных материальных, трудовых и временных затратах.
Для этого предложен способ подготовки образцов поствитальной или пострезекционной костной ткани человека для исследования методом растровой электронной микроскопии, в котором образцы вырезают абразивным кругом из костной заготовки, охлажденной жидким азотом, на 5 мин помещают в ультразвуковой диспергатор с ацетоном, далее погружают в заливочную эпоксидную смолу, сушат в вакууматоре в течение 24 часов при 60°C, после высушивания шлифуют шлифовальной бумагой вначале с дисперсностью 800, затем с дисперсностью 1200, далее полируют на сукне с алмазной пастой с зернистостью порошка в пасте 6 мкм и на заключительном этапе подготовки  напыляют наночастицами углерода.
Абразивный круг, при помощи которого вырезают образцы, выполняет первичную шлифовку исследуемой поверхности. Костную заготовку охлаждают жидким азотом для предотвращения термической деструкции костной структуры и для снижения вязкости обрабатываемого материала. Помещение образцов в ультразвуковой диспергатор с ацетоном на 5 минут производят для обезжиривания и удаления мелкодисперсной пыли. Погружение в заливочную смолу и высушивание в вакууматоре в течение 24 часов при 60 °C производят с целью уменьшения времени полимеризации смолы и удаления пузырьков воздуха из образца. В качестве заливочной смолы предложена эпоксидная, характеризующаяся относительной простотой работы с ней, дешевизной и прозрачностью (не искажается изображение). Шлифовка в 2 стадии с использованием шлифовальной бумаги с дисперсностью 800 мкм, затем с дисперсностью 1200 мкм  с финальной полировкой с использованием алмазной пасты с зернистостью порошка в пасте 6 мкм  позволяет получить идеально гладкую поверхность образца, так как основным фактором, определяющим контрастность изображения является угол падения электронного пучка на поверхность образца, напрямую зависящий от степени неровности исследуемой поверхности. Полировка позволяет увеличить контрастность изображения, не прибегая к импрегнации ткани тяжелыми металлами. Во избежание накопления заряда на поверхности исследуемой ткани, на заключительном этапе подготовки образцы напыляют наночастицами углерода, так как исследуемая ткань, которая в условиях высокого вакуума становится изолятором, может повреждаться пучком высокоэнергетических электронов.
Новый технический результат, достигаемый заявленным способом, заключается в получении высокой контрастности исследуемой поверхности без использования токсичных реагентов при простоте исполнения и снижении материальных, трудовых и временных затрат.
Изобретение иллюстрируется рисунками, где на фиг. 1 представлен фрагмент поствитальной костной ткани околосуставной локализации из области головки плечевой кости; на фиг.2 – образец для исследования после обезжиривания, заливки в эпоксидную смолу и шлифовки с нанесенным токопроводящим слоем; на фиг.3 – структура образца трабекулярной кости, полученная растровой электронной микроскопией; на фиг.4 – структура образца костной балки, полученная  растровой электронной микроскопией.
3
Способ опробован в ФГБУН «Институт высокотемпературной электрохимии» УрО РАН в лаборатории медицинского материаловедения и биокерамики. Для изучения забирались фрагменты поствитальной костной ткани околосуставной локализации в области головки плечевой кости на кафедре оперативной хирургии и топографической анатомии ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» МЗ РФ. Из искомых костных фрагментов после охлаждения жидким азотом при помощи абразивного круга вырезали образцы кубической формы объемом 1 см. Образцы обезжиривались и очищались от абразива в ультразвуковом диспергаторе с ацетоном в течение 5 минут. Далее костные фрагменты погружали в заливочную эпоксидную смолу и высушивали в вакууматоре в течение 24 часов при 60 °C. Далее проводили шлифование в две стадии: (1) с использованием шлифовальной бумаги с дисперсностью 800; (2) с использованием шлифовальной бумаги с дисперсностью 1200. После этого образцы полировались на сукне с использованием алмазной пасты с зернистостью порошка 6 мкм. На заключительном этапе образцы напыляли наночастицами углерода. В структуре образца, представленной на фиг.3 видны костные трабекулы губчатой кости (показаны белыми стрелками). В структуре образца, представленной на фиг.4, видны элементы остеонной структуры, лакуны остеоцитов с перилакунарными межклеточными контактами (показаны черными стрелками). Изображения этих образцов содержат достоверные данные о гистоархитектонике и пространственной архитектуре костной ткани околосуставной локализации в субхондральной области.
Таким образом, предлагаемый способ подготовки образцов поствитальной или пострезекционной костной ткани человека для изучения в растровом электронном микроскопе позволяет достоверно оценивать особенности структуры костной ткани в различных режимах работы оборудования. Способ прост в исполнении, не требует больших материальных, трудовых и временных затрат.
Источники информации:
1.Ирьянов Ю.М. и др. Особенности подготовки образца регенерата кости для исследования при помощи сканирующей электронной микроскопии// Морфологические ведомости, 2010, № 1, c.
2.Мухамадияров Р.А. и др. Применение композиционного контраста для исследования биологических объектов методом сканирующей электронной микроскопии // Комплексные проблемы сердечнососудистых заболеваний, 2017, N 3, С.93-103.
3.Силантьева Т.А. и др. Подготовка образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе с использованием камфена// Фундаментальные исследования, 2015, № 2, с. 4919-4923.
4.Новиков И.А. и др. Суправитальное контрастирование лантаноидами для визуализации структуры биологических образцов на сканирующем электронном микроскопе// Гены и клетки, 2015, Т.10, №2, с.90-96.