ПЛАНШЕТ "ИФА-ВПГ-2-IgG" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА G К ВИРУСУ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА II ТИПА

Полезная модель относится к медицинской промышленности, в частности к биотехнологии, вирусологии иммунологии, для качественного и полуколичественного определения иммуноглобулинов класса IgG к вирусу простого герпеса II типа.
Известен набор для выявления антител класса IgG к вирусу простого герпеса 2 типа «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-2-G» по ТУ 9398-028-05941003-2006, производства НПО «Диагностические системы». Набор содержит неразборный планшет и набор реагентов во флаконах.
Недостатком является большие размеры планшета и всего набора в целом, высокая стоимость невысокая эффективность выявления вируса при его использовании для проведения теста из-за пластика и формы планшета.
Техническим результатом полезной модели является устранение недостатков аналога и создания удобного и практичного планшета для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу простого герпеса II типа быстро с большой вероятностью (99% и более) в условиях сельских или подвижных лабораторий, совершенствование приготовления тест-системы, при повышении чувствительности и специфичности.
Указанный результат достигается тем, что планшет для определения иммуноглобулинов класса IgG к вирусу простого герпеса 2 типа, выполнен из полистирола с сорбированным на поверхности лунок антигеном вируса герпеса 2 типа и реагентами, при этом планшет выполнен в виде корпуса и набора съемных полос с цилиндрическими или, выполненными в виде параллелепипеда лунками, высотой не менее 10 мм и толщиной стенки лунки не менее 1 мм, в качестве антигена, сорбированного на поверхности лунок, он содержит высокоиммуногенные белки вируса герпеса 2 типа в виде полного лизатного очищенного антигена и водного раствора солей натрия: натрия фосфорнокислого двузамещеного 12-водного, натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного, натрия хлорида, детергент в виде твин-20 или твин-80 или сорбиталь Л-20, с добавлением казеина, натрия азид, фетальной сыворотки, при этом он упакован в герметичную упаковку.
Планшет содержит не менее 10 полос с не менее 8 лунками в каждой полосе.
В упаковке дополнительно содержится реагент - жидкая сыворотка крови человека, содержащая иммуноглобулины класса G к вирусу простого герпеса 2 типа в титре 1:500, инактивированная прогреванием при 56°С в течение 2 ч,
В упаковке дополнительно содержится реагент - коньюгат, в качестве которого используется антитела моноклональные мышиные против иммуноглобулинов человека класса G, меченые пероксидазой хрена.
Герметичная упаковка выполнена в виде пленки с клейкой лентой, наконечники для пипеток и пластиковые ванночки для реагентов.
В герметичной упаковке дополнительно содержатся наконечники для пипеток и пластиковые ванночки для реагентов.
Съемные полосы могут быть снабжены фиксаторами
Данный планшет используется следующим образом. Вскрывают упаковку и достают из пакета рамку планшета с необходимым числом стрипов - количеством полос с лунками, на пипетки одевают наконечники. Неиспользованные стрипы допускается хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре от 2 до 8°С до истечения срока годности.
Планшет выполнен в виде корпуса и набора съемных полос с цилиндрическими или параллелепипедными лунками, высотой не менее 10 мм и толщиной стенки лунки не менее 1 мм, а в качестве антигена, сорбированного на поверхности лунок, он содержит высокоиммуногенные белки вируса герпеса 2 типа в виде полного лизатного очищенного антигена и водного раствора солей натрия: натрия фосфорнокислого двузамещеного 12-водного, натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного, натрия хлорида, детергент в виде твин-20 или твин-80 или сорбиталь Л-20, с добавлением казеина, натрия азид, фетальной сыворотки, при этом он упакован в герметичную упаковку. При таком исполнении не происходит влияние пластика и формы лунок планшета на результаты исследований (преломление лучей), и являются оптимальными для упрощения работы лаборанта с пипетками.
+
+
-
пор
При использовании одного стрипа в одну лунку вносят 100 мкл РРО, в три последующие лунки - по 100 мкл К, К  и К, в остальные лунки - по 100 мкл предварительно разведенных (1:100) исследуемых образцов (при использовании вспомогательного планшета для разведения исследуемых образцов в эти лунки внести вначале по 90 мкл РРО, а затем - по 10 мкл сывороток, предварительно разведенных 1:10 во вспомогательном планшете).
+
+
-
пор
При использовании двух и более стрипов в одну лунку внести 100 мкл раствора для разведения образцов (РРО), в следующие лунки вносят по 100 мкл положительного контроля (К), контрольного образца (К ) и отрицательного контроля (К) (по две лунки на каждый контрольный образец). В остальные лунки вносят по 100 мкл разведенных (1:100) исследуемых сывороток (при использовании вспомогательного планшета для разведения исследуемых образцов в эти лунки внести вначале по 90 мкл РРО, а затем - по 10 мкл сывороток, предварительно разведенных 1:10 во вспомогательном планшете)
Отрезают пленку требуемого размера и закрывают лунки планшета, плотно прижав пленку.
Инкубируют планшет с необходимым количеством полос с лунками 30 минут при температуре от 21 до 25°С в защищенном от света месте.
С помощью промывателя удаляют образцы из лунок, 4 раза промывают планшет ФСБ-Т, внося в лунки 350-370 мкл раствора. По окончании промывки удаляют влагу из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку.
При ручной отмывке заполненные ФСБ-Т лунки выдерживают не менее 30 с.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата, заклеивают пленкой, инкубируют 30 минут при температуре от 21 до 25°С в защищенном от света месте.
С помощью промывателя удаляют содержимое лунок, 4 раза промывают планшет.
В лунки вносится по 100 мкл раствора индикаторного и помешают планшет в защищенное от света место и инкубируют 10-15 минут при температуре от 21 до 25°С.
В лунки (в той же последовательности, с которой вносился раствор индикаторный) вносят по 100 мкл солей натрия, перемешивают содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступают к учету результатов.
Результаты регистрируют спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн - 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм, а выведение спектрофотометра на нулевой уровень ("бланк") осуществляют по лунке А1.
При наличии в исследуемом образце иммуноглобулинов класса G к вирусу простого герпеса I, II типа (ВПГ-1, ВПГ-2) они во время первой инкубации связываются с антигеном, сорбированным на поверхности лунок полистиролового планшета. Этот комплекс во время второй инкубации связывается с конъюгатом - антителами против IgG человека, меченными пероксидазой хрена. Далее, после добавления индикаторного раствора (хромоген - тетраметилбензидин) в результате ферментативной реакции реакционная смесь в лунках планшета окрашивается пропорционально концентрации антител класса G к ВПГ-1, ВПГ-2. Реакция останавливается добавлением стоп-реагента. Интенсивность окрашивания (оптическая плотность) регистрируется с помощью спектрофотометра.
Результаты оценивают если: среднее значение ОПК+ - не менее 0,60; среднее значение ОПК+пор - не менее 0,20; отношение среднего значения ОПК+ к среднему значению ОПК+пор - не менее 1,5; среднее значение ОПК- - не более 0,10. В противном случае исследование необходимо повторить.
Результаты считать положительными, если ОПобразца больше 1,1×ОПК+пор; отрицательными, если ОПобразца меньше 0,9×ОПК+пор; сомнительными, если ОПобразца = (1+0,1)×ОПК+пор. При получении сомнительных результатов сыворотки рекомендуется исследовать повторно в двух лунках планшета. Если результаты опять попадут в пределы сомнительных, следует провести тестирование сывороток, отобранных через 2-4 недели. Если и в данном случае результаты попадут в пределы сомнительных, образцы сывороток считать отрицательными.
Для определения титра антител класса G к ВПГ-2 на стандартном бланке строится калибровочный график. Для этого по оси абцисс (логарифмическая шкала) откладываются значения титров К+ (1:500) и К+пор (1:100), а по оси ординат (пропорциональная шкала) -соответствующие им средние значения ОП, полученные в ИФА. Полученные точки соединяются прямой линией. Титр антител в исследуемом образце определяется по калибровочному графику как абсцисса точки, ордината которой равна полученному в ИФА значению ОП.
Если ОП образца превышает ОПК+, для более точного определения титра рекомендуется при повторном анализе развести данный образец дополнительно в 4 раза (конечное разведение 1:400). Повторить анализ и полученное по графику значение титра увеличить в 4 раза.
Преимуществами разработанного планшета является высокая чувствительность и специфичность, готовность к работе в любых лабораториях. Отсутствие необходимости уничтожения неиспользованных стрипов планшета, благодаря наличию упаковочного и дополнительного стерильного материала (наконечников, ванночек, пленки и клейкой ленты). Все реагенты готовы к использованию и не требуют предварительных разведений. Планшет может быть использован для полуколичественного определения анти-HSV2 с целью изучения иммунного статуса населения.