ДИКЕТОНЫ И ГИДРОКСИКЕТОНЫ В КАЧЕСТВЕ АКТИВАТОРА СИГНАЛЬНОГО ПУТИ КАТЕНИНА
DIKETONES AND HYDROXYKETONES AS ACTIVATORS OF CATENIN SIGNALLING PATHWAY

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на Патент США №61/374687, зарегистрированной 18 августа 2010 года, и предварительной заявки на Патент США No. 61/427974, зарегистрированной 29 декабря 2010 года, содержание которых приводится в описании настоящего изобретения путем ссылки на них.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к активаторам одного или более белков в сигнальном пути Wnt, включая активаторы одного или более Wnt белков, и к композициям, включающим эти активаторы. Более конкретно, изобретение относится к применению β-дикетона, γ-дикетона или γ-гидроксикетона или их солей или аналогов при лечении остеопороза и остеоартропатии; несовершенного остеогенеза, дефектов костей, переломов костей, пародонтоза, отосклероза, заживления раны, черепно-лицевых дефектов, онколитического заболевания костей, травматических повреждений мозга, связанных с дифференцировкой и развитием центральной нервной системы, включающих болезнь Паркинсона, удары, ишемическое церебральное заболевание, эпилепсию, болезнь Альцгеймера, депрессивное состояние, биполярное расстройство, шизофрению; глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация, диабетический макулярный отек или пигментный ретинит, и заболеваний, связанных с дифференцировкой и ростом стволовых клеток, включающих выпадение волос, заболеваний, связанных с гемопоэзом, и заболеваний, связанных с регенерацией тканей.
Описание известного уровня техники
Сигнальный путь Wnt/β-катенина играет важную роль во многих биологических процессах. Он регулирует направление развития пока еще неразвитых клеток в эмбриональной форме. Сигнальный путь Wnt/β-катенина имеет важное значение для самообновления и пролиферации стволовых клеток, а также развития стволовых клеток во взрослых организмах (например, клеток кожи, костных клеток, клеток печени, и других клеток) [Science (2002), 296(5573), 1644-1646]. Сигнальный путь Wnt/β-катенина регулирует развитие, морфологию, пролиферацию, подвижность и предопределение клеток [Annual Review of Cell and Developmental Biology (2004), 20, 781-810]. Сигнальный путь Wnt/β-катенина играет центральную роль при онкогенезе, и неадекватная активация этой системы наблюдается при различных видах рака у человека ["Wnt Signaling in Human Cancer", in Signal Transduction in Cancer (pp. 169-187). (2006) Springer]. Wnt/β-катенин был первым описанным у человека белком, который взаимодействует с цитоплазматическим доменом E-кадгерина, при этом Wnt/β-катенин связывает комплекс кадгерина с актином цитоскелета [Science (1991), 254(5036), 1359-1361]. Кроме того, была обнаружена дополнительная функция Wnt/β-катенина у млекопитающих, а именно, в качестве ключевого медиатора передачи сигнала Wnt/β-катенин.
В случае присутствия Wnt лиганда, если он не ингибирован выделяемыми антагонистами, Wnt лиганд связывает комплекс Frizzled (Fzd)/рецептор белка липопротеина низкой плотности (LRP), активирующий цитоплазматический белок Dishevelled (Dsh у дрозофилы, и Dvl у позвоночных). Как активируется Dsh/Dvl полностью не ясно, но было сделано предположение, что активация может быть частично связана с фосфорилированием с помощью казеинкиназы 1 (CK1) и казеинкиназы 2 (CK2) [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (1999), 96(22), 12548-12552]. Dsh/Dvl затем ингибирует активность мультибелкового комплекса (β-катенин- аксин - ген аденоматозного полипоза толстой кишки (APC) - гликоген синтаза киназа (GSK)-3β), который целенаправленно воздействует на β-катенин путем фосфорилирования для деградации с помощью протеасомы. Предполагается, что Dsh/Dvl связывает CK1 и, в результате этого, ингибирует примирование β-катенина и косвенно предотвращает GSK-3β фосфорилирование β-катенина [Genes & Development (2002), 16(9), 1066-1076]. Было также показано, что после Wnt стимуляции, Dvl способствует вхождению GSK-3 связывающего белка (GBP) в мультибелковый комплекс. GBP может оттитровывать GSK-3β от аксина и таким способом ингибировать фосфорилирование β-катенина. И наконец, было описано секвестрация аксина в клеточной мембране с помощью LRP [Molecular cell (2001), 7(4), 801-809]. Суммарным результатом является накопление цитозольного β-катенина. Стабилизированный β-катенин затем перемещается в ядро и связывается с членами семейства ДНК связывающих белков, фактором Т-клетки (Tcf)/лимфоидным усиливающим фактором (Lef), что приводит к транскрипции Wnt целевых генов.
В отсутствии Wnt лиганда, аксин способствует вхождению CK1 в мультибелковый комплекс, вызывая примирование β-катенина и инициирование каскада фосфорилирования β-катенина, осуществляемого с помощью GSK-3β. Фосфорилированный β-катенин затем распознается как белок, содержащий повторяющийся β-трансдуцин (β-TrCP), и разлагается протеасомой, что приводит к снижению уровня цитозольного β-катенина.
Аберрантная активация пути Wnt/β-катенин приводит к различным фенотипам, включающим развитие ряда онкологических заболеваний у людей, и заболеваний, приводящих к аномальному развитию и функционированию стволовых клеток [Oncogene (2009), 28(27), 2163-2172; Cancer Cell (2008), 14(6), 471-484; American Journal of Pathology (2003), 162(5), 1495-1502]. Хроническая активация сигнального пути Wnt/β-катенина связана с развитием целого ряда злокачественных новообразований у человека, включающих синдром увеличенной костной массы, рубцевание ткани, колоректальные злокачественные опухоли, злокачественные гепатомы (HCC), карциномы яичника, матки, поджелудочной железы, и меланомы [BioEssays (1999) 21(72), 1021-1030; Cell (2000), 103(2), 311-320; Genes Dev. (2000), 14(15), 1837-1851]. Так как путь Wnt/β-катенин участвует в громадном количестве процессов роста и развития, мутация белков, вовлеченных в систему сигнальной трансдукции Wnt/β-катенин, тесно связана с различными заболеваниями человека, такими как аномалии развития, морфогенез волосяного фолликула, дифференцировка стволовых клеток, костеобразование и пролиферация клеток.
Выпадение волос
Волосы образуют под кожей похожую на мешочек структуру, называемую волосяным фолликулом. Видимая часть волос, например, которую мы видим на коже головы, фактически является волосяными стержнями, которые представляют собой ороговевшую отвержденную ткань, которая растет из волосяных фолликулов. В частности, волосяной стержень состоит в основном из кератина, который продуцируется кератиноцитами.
Нормальные волосяные фолликулы совершают цикл развития, включающий стадию роста (стадию анагена), стадию регрессии (стадию катагена) и стадию покоя (стадию телогена). Волосы кожи головы имеют относительно продолжительный цикл жизни: стадия анагена длится от 2 до 6 лет, стадия катагена имеет продолжительность от нескольких дней до нескольких недель, и стадия телогена составляет приблизительно три месяца. Более короткие волосы, находящиеся в других местах на теле человека, имеют соответственно более короткие продолжительности анагена. Морфология волос и волосяного фолликула значительно изменяется в течение жизненного цикла волос [Dermatology in General Medicine (Vol. I), McGraw-Hill, Inc., 1993, pp. 290-91; Sperling, L.C; J. Amer. Acad. Dermatology (1991), 25(1, Part 1), 1-17].
В период анагена, волосяной фолликул метаболически очень активен. Фолликул включает в своем основании дермальную папиллу, а эпидермальные матричные клетки, окружающие дермальную папиллу, образуют основание волосяного стержня, который распространяется вверх из папиллы через волосяной канал. Матричные клетки представляют собой активно растущую часть волос.
На стадии катагена, матричные клетки покидают папиллу, и происходят другие дегенеративные изменения. Например, сосуды и капилляры, снабжающие кровью и питательными веществами волосяной фолликул, ссыхаются и перестают функционировать. Столбик эпителиальных клеток выталкивает вверх ороговевший прилегающий стержень волоса, и внутри фолликула происходит гибель клеток. Волосяной стержень затем выпадает из кожи головы или другой части тела, и волосяной фолликул входит в стадию телогена, стадию покоя цикла роста волос.
Несмотря на то, что регуляция и рост волосяного фолликула хорошо не изучены, тем не менее, очевидно, что они представляют динамические процессы пролиферации, дифференцировки и клеточных взаимодействий во время морфогенеза тканей. Предполагают, что волосяные фолликулы образуются только на ранних стадиях развития, и они не замещаются. Поэтому, увеличение поврежденных или нефункционирующих волосяных фолликулов обычно связывают с выпадением волос.
При мужском или женском облысении обязательно присутствуют мужские или женские гормоны, например, андрогены, но причина этого неизвестна. Степень выпадения волос у любого мужчины сильно зависит от генов, которые он унаследовал от своего отца, матери, или их обоих. Выпадение волос начинается на висках или на макушке. Если выпадение волос у мужчин начинается в подростковом возрасте, последующее выпадение волос обычно становится довольно обширным. Облысение у мужчин происходит волнообразно. Выпадение волос может начинаться в возрасте около 20 лет, затем приостанавливаться, и опять возобновляться через несколько лет. В возрасте от 20 до 30 лет, 30% мужчин имеют проплешины. Выпадение волос продолжает увеличиваться вплоть до возраста 50-60 лет, в котором 50% мужчин являются абсолютно лысыми.
На скорость выпадения волос влияет возраст, тенденция к раннему облысению, обусловленная унаследованными генами, и излишнее количество мужского гормона дигидротестостерона (DHT) в волосяном фолликуле. DHT воздействует на рецептор гормона в волосяном фолликуле, в силу чего замедляется образование волос и растут слабые короткие волосы. Иногда продуцирование DHT даже полностью останавливает рост волос. Лысеющие мужчины имеют содержание DHT в волосяных фолликулах выше среднего значения, но содержания у них тестостерона обычно не превышает средних уровней.
Женское облысение отличается от мужского облысения, и частота его случаев увеличивается. Выпадение волос происходит в основном на макушке, но полное облысение встречается у женщин редко.
Токсическое облысение представляет собой временное явление, но оно обычно длится от трех до четырех месяцев и часто вызывается инфекционными заболеваниями. Например, токсическое облысение может возникать в результате гипотиреоза, диабета, гормональных проблем, авитаминозов, гипофункции гипофиза, паразитирующих организмов, плохого пищеварения, ранней стадии сифилиса, передозировки витамина A или ретиноида, или других цитотоксических лекарственных средств.
Гнездная алопеция представляет собой внезапное выпадение волос в четко очерченных областях. Она может поражать любую покрытую волосами область, но чаще всего она поражает волосы на голове и бороду. Выпадение волос на нескольких участках часто прекращается, и волосы восстанавливаются через несколько месяцев даже без лечения, но возможны и рецидивы. Гнездная алопеция обычно возникает у людей, у которых не наблюдается явное заболевание кожи или системное заболевание, но в редких случаях при лабораторных исследованиях могут обнаруживаться антимикросомные антитела к тиреоглобулину, желудочные париетальные клетки и адренальные клетки.
Рубцовая алопеция является результатом воспаления и распада ткани. Она может быть обусловлена повреждениями, такими как ожоги, физическая травма или распад после радиоактивного облучения. В этих случаях, можно ожидать небольшого возобновления роста волос. Другие случаи представляют собой кожные проявления красной волчанки, красный плоский лишай, хронические подкожные бактериальные или грибковые инфекции, подкожные язвы, саркоидоз, сифилис или туберкулез. Медленно растущие опухоли кожи головы являются редкой причиной выпадения волос.
Ни одно из этих состояний хорошо не изучено, но каждое состояние вызывает чувство обеспокоенности и дискомфорта, так как волосы часто считают важным фактором при социальных контактах и взаимодействиях людей.

Было предложено множество подходов при лечении выпадения волос. Двумя наиболее часто применяемыми и признанными соединениями для предотвращения выпадения волос являются миноксидил, активный ингредиент в препарате Rogaine, и ингибитор 5α-редуктазы, финастерид, активный ингредиент в препарате Propecia. Однако, косметическое лечение возрастного выпадения волос у пациентов с помощью раствора миноксидила или финастерида для местного применения приводило только к умеренному возобновлению роста волос у менее чем 40% таких пациентов. И на самом деле, менее чем десять процентов мужчин, которые применяют Rogaine, достигают удовлетворительных результатов. Поэтому, существует необходимость в более эффективных способах и в более эффективных композициях для лечения выпадения волос. Предпочтительно, чтобы новые способы и композиции требовали бы меньшего количества наносимых активных ингредиентов, обеспечивали бы более быстрое возобновление роста волос в большем количестве и с большой густотой, чем в настоящее время в наблюдаемых случаях при лечении миноксидилом или финастеридом.
Было обнаружено, что развитие и регенерация волосяного фолликула регулируется с помощью канонического сигнального пути Wnt/β-катенина [Investigative Dermatology (2008), 128(5), 1081-1087]. В эпидермисе, развитие волосяного фолликула инициируется при заполнении кожи мезенхимальными клетками. Во время этого процесса, сигналы, исходящие из дермы, индуцируют уплотнение эпителия, удлинение эпителиальных клеток и образование плакодов, содержащих Wnt-восприимчивые клетки. В результате, плакоды передают сигнал клеткам кожи к уплотнению, в силу чего формируется компонент дермальной папиллы волосяного фолликула, который также восприимчив к передаче сигналов Wnt. Из волосяного эпителия выделяется Wnt3a и оказывает аутокринное и паракринное действие, и было показано, что Wnt-3α поддерживает на стадии анагена экспрессию гена в клетках дермальной папиллы и опосредует побуждающую к росту волос активность в культуре органа. Этот Wnt-3α -опосредованный рост волос может зависеть от канонического сигнального пути Wnt/β-катенина, так как делеция гена β-катенина или Lef1 приводила к выпадению волос у мышей. Поэтому, активация β-катенина с помощью Wnt способствует ингибированию дифференцировки кератиноцитов, индуцированию образования волосяного фолликула, и поддержанию пролиферации предшественников нервных клеток.
Нейродегенеративные заболевания
Нейродегенеративные заболевания являются следствием нарушения функции нейронов или их миелиновой оболочки, которые с течением времени могут привести к дисфункции и, в результате этого, к нарушениям функций. Мозг взрослого млекопитающего имеет ограниченную способность к регенерации. Это делает опасным восстановление любых повреждений, и, следовательно, травмы ЦНС являются очень тяжелыми.
Новые нейроны образуются из нейронных стволовых клеток в двух областях центральной нервной системы взрослого млекопитающего: в субвентрикулярной зоне бокового желудочка, и в субгранулярной зоне гиппокампальной зубчатой извилины [Current Opinion in Cell Biology (2001), 13, 666-672]. Сигналы, подаваемые микросредой, способствуют регуляции поддержания, пролиферации и предопределенного нейронного коммитирования локальных стволовых клеток. Многие из этих сигналов и сигнальных путем являются неизученными.
Болезнь Альцгеймера (AD) является самой распространенной причиной деменции, которая постепенно разрушает нейроны, и которой страдают более чем 24 миллиона человек в мире. Она возникает главным образом у пожилых людей, и пациенты, страдающие AD, теряют способность к обучению, запоминанию, принятию решений, общению и выполнению повседневных функций. Этиология и развитие AD изучено плохо, но эту болезнь связывают с бета-амилоидными (Αβ) бляшками и нейрофибриллярными клубками в мозге.
Болезнь Паркинсона (PD) представляет собой дегенеративное расстройство центральной нервной системы, которым поражено более чем 6 миллионов человек в мире и которое часто нарушает двигательные навыки и речь пациентов. Симптомы болезни Паркинсона являются результатом потери секретирующих допамин клеток в области черной субстанции (дословно "черного вещества"). Эти нейроны имеют проекцию в стриатум, и их потеря приводит к нарушениям активности нейронных цепей в подкорковых узлах, которые регулируют движение.
Боковой амиотрофический склероз (ALS) является нейродегенеративным заболеванием со смертельным исходом, которое возникает вследствие гибели двигательных нейронов. Контролирование прогрессирующей потери мышц отрицательно влияет на способность пациента к независимому функционированию. ALS поражает клетки в головном мозге и спинном мозге (двигательные нейроны), которые посылают сигналы для движения мышц. В некоторых случаях, мутация в гене SOD1 дает в результате белок в дисфункциональном состоянии, белок супероксиддисмутазы (называемый SOD1), который обычно проводит "очистку" внутри клетки от токсичных частиц. При мутации SOD1, токсичные частицы накапливаются внутри двигательных нейронов, вызывая нарушение их функционирования. Но эта мутация объясняет только небольшой процент случаев ALS. Основная причина ALS, которым страдают около 350000 взрослых людей в мире, неизвестна.
Удар и травматическое повреждение мозга могут также вызывать потерю нейронов и приводить к снижению когнитивной способности. Удар может быть подразделен на два основных типа: ишемический и геморрагический. Ишемия обусловлена прекращением кровоснабжения, в то время как геморрагия обусловлена разрывом кровеносного сосуда или патологической васкулярной структурой. Удар может вызывать продолжительное неврологическое повреждение, осложнения и смерть, если его быстро не диагностируют и не начинают его лечение. Он является третьей по распространенности причиной смерти и причиной нетрудоспособности взрослого населения в США и Европе.
Лобно-височная деменция (FTD) составляет 18% деменций у людей моложе 65 лет. Сама по себе она часто проявляется в виде нарушения поведения и может прогрессировать с причинением ущерба способности пациента к самостоятельному мышлению и функционированию. В последних исследованиях были вскрыты генетические факторы, которые способствуют возникновению этой деменции, однако еще не существует лечения, которое бы блокировало нарушение функционирования мозга, вызываемое этой деменцией.
Система сигнальной трансдукции Wnt/β-катенин играет исключительно важную роль в дифференцировке и развитии нервных клеток для центральной нервной системы, что предполагает взаимосвязь между Wnt/β-катенин белками и числом случаев различных заболеваний центральной нервной системы, включающих нейродегенеративные заболевания [Nature (2005), 437(7063), 1370-1375]. В частности, было также обнаружено, что передача сигнала Wnt/β-катенин связана с заболеваниями, возникающими в результате аномалии нервных клеток, такими как повреждение мозга, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (болезнь Лу Герига), удар, эпилепсия, болезнь Альцгеймера (AD), депрессивное состояние, биполярное расстройство и шизофрения.
Болезнь Альцгеймера является самым распространенным возрастным нейродегенеративным расстройством. В действительности, была обнаружена взаимосвязь между нейротоксичностью, индуцируемой амилоид-β-пептидом (Αβ), и снижением цитоплазматических уровней β-катенина. По-видимому, Αβ связывает внеклеточный богатый цистеином домен рецептора Frizzled (Fz), тем самым ингибируя передачу сигнала Wnt/β-катенин. Перекрестная связь с другими сигнальными каскадами, которые регулируют передачу сигнала Wnt/β-катенин, включающими активацию M1 мускаринового рецептора и PKC, использование бифункциональных соединений ибупрофен-ChE, PPAR α, γ агонистов, никотина и некоторых антиоксидантов, обеспечивает в результате нейропротективное действие в отношении Αβ. Эти исследования указывают, что устойчивая потеря Wnt сигнальной функции может приводить к Αβ-зависимой нейродегенерации, наблюдаемой в мозге пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Следовательно, в качестве терапевтической цели при лечении AD могла бы быть предложена активация сигнального пути Wnt/β-катенина.
Глазные заболевания
Возрастная макулярная дегенерация (AMD) представляет собой болезненное состояние, которое обычно поражает пожилых людей и приводит к потере зрения в центре поля зрения (макулы) в результате повреждения сетчатки глаза. Она может протекать в "сухой" и "влажной" формах. AMD является основной причиной нарушения зрения у пожилых людей (старше 50 лет). Внутренний слой глаза представляет собой сетчатку, которая содержит нервы, обеспечивающие поле зрения, а за сетчаткой находится сосудистая оболочка глаза, которая содержит кровеносную сеть для снабжения кровью макулы (центральной части сетчатки). При сухой (неэкссудативной) форме, продукты распада клеток, называемые друзами, накапливаются между сетчаткой и сосудистой оболочкой, и сетчатка может начать отслаиваться. При влажной (экссудативной) форме, которая является более тяжелой, кровеносные сосуды разрастаются из сосудистой оболочки позади сетчатки, и сетчатка также может начать отслаиваться. AMD может быть подвергнута лечению с помощью лазерной коагуляции и с помощью лекарственных средств, которое приостанавливает рост кровеносных сосудов, а иногда направляет развитие процесса в обратном направлении.
Диабетическая ретинопатия представляет собой ретинопатию (повреждение сетчатки), вызываемую осложнениями при диабете, которая может, в конечном счете, приводить к слепоте. Она представляет собой офтальмологическое проявление системного заболевания, которое поражает до 80% всех пациентов, которые страдают диабетом в течение 10 лет или более. Так как в ходе пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR) образуются новые кровеносные сосуды позади глаза, они могут кровоточить (геморрагия) и в результате приводить к получению размытого изображения. У некоторых людей развивается состояние, называемое макулярным отеком. Оно возникает, когда из поврежденных кровеносных сосудов просачивается жидкость и липиды и попадают на макулу, часть сетчатки, которая позволяет нам видеть мелкие детали. По мере развития заболевания, тяжелая непролиферативная диабетическая ретинопатия вступает в позднюю, или пролиферативную, стадию. Недостаток кислорода в сетчатке вызывает рост новых хрупких кровеносных сосудов около сетчатки и в прозрачном гелеобразном стекловидном теле глаза, которое заполняет внутреннюю часть глаза. Без своевременного лечения, эти новые кровеносные сосуды могут кровоточить, приводить к затуманенному зрению и разрушить сетчатку.
Пигментный ретинит (RP) представляет собой группу генетических глазных заболеваний. В процессе развития симптомов RP, ночная слепота обычно предшествует туннельному зрению в течение нескольких лет или даже десятилетий. Многие люди, страдающие RP, не становятся официально слепыми до 40 или 50 лет и сохраняют некоторое зрение в течение всей жизни [American Journal of Ophthalmology (2003), 136(4), 678-68]. Другие становятся полностью слепыми в результате RP, в некоторых случаях уже в детстве. Развитие RP в каждом случае происходит различно. RP представляет собой тип прогрессирующей ретинальной дистрофии, группы наследственных расстройств, при которых аномалии зрительных рецепторов (палочек и колбочек) или ретинального пигментного эпителия (RPE) сетчатки приводят к прогрессирующей потере зрения. Страдающие этим заболеванием пациенты сначала испытывают нарушенную адаптацию к темноте или никталопию (ночную слепоту), затем уменьшение периферического поля зрения (известное как туннельное зрение) и, иногда, потерю центрального зрения на последней стадии заболевания.
Глия Мюллера, или клетки Мюллера, являются глиальными клетками, обнаруживаемыми в сетчатке позвоночных, которые обычно выполняют функции любых нормальных глиальных клеток. Однако было обнаружено, после повреждения сетчатки глия Мюллера подвергается дедифференцировки в мультипотентные клетки-предшественники. На этой стадии, клетка-предшественник может делиться и дифференцироваться в ряд клеток ретинального типа, включая зрительные рецепторы, которые могли быть повреждены в результате травмы. Кроме того, в недавно опубликованном исследовании было показано, что клетки Мюллера действуют в глазу млекопитающего как собиратели света, аналогично волоконнооптической пластинке, направляющие свет на клетки палочек и колбочек.
Мультипотентные ретинальные клетки-предшественники должны решать две фундаментальных проблемы. Во-первых, они должны сначала увеличить свое число, но затем ограничить свою пролиферацию, так чтобы продуцировалось надлежащее число дифференцированных клеток при приемлемом времени развития. Во-вторых, различающиеся процессы деления и дифференцировки должны быть скоординированы, так чтобы дифференцировка могла начинаться только тогда, когда клетки закончили деление [Current Opinion in Genetics & Development (1997), 7(5), 651-658; Nature Reviews Neuroscience (2001), (2), 109-118]. Wnt промотирует пролиферацию клеток во многих тканях [Cell and Tissue Research (2008), 331(1), 193-210], в частности, в развивающейся сетчатке [Stem Cells (2008), 26(5), 2063-2074; Development (2003), 130(3), 587-598; Development (2005), 132(12), 2759-2770; Development (2005), 132(13), 3027-3043]. Семейство SoxB1 генов (Sox1-3) может быть ключевыми эффекторами передачи сигналов Wnt/β-катенин в развивающейся нервной системе [Development (2006), 133(22), 4451-4461; Neuron (2005), 46(1), 23-36]. В процессе нейрогенеза, Sox2 противодействует генам предшественников нейронов и может поддерживать клетки-предшественники [Nature Neuroscience (2003), (6), 1162 - 1168; Neuron (2003), 39(5), 749-765]. В сетчатке глаза лягушки, передача сигнала Wnt/β-катенин через Fz5 является необходимой для экспрессии Sox2, который требуется для экспрессии гена предшественника нейрона и для перехода от клеток-предшественников в нейроны [Neuron (2005), 46(1), 23-36]. Было обнаружено, что эти факторы являются базовыми компонентами консервативного иерархического каскада, и предполагается, что они образуют мощную направленную сеть, которая способствует переходу клеток из пролиферативного, недифференцированного состояния в непролиферативное, дифференцированное нейронное или глиальное состояние [Development (2009), 136(19), 3289-3299].
Регенерация ЦНС млекопитающего весьма ограничена. В отличие от модели на цыплятах, современные модели подтверждают, что ретинальные нейроны никогда не регенерируются. Было показано, что в сетчатке взрослого млекопитающего после острого нейротоксичного повреждения in vivo глия Мюллера дедифференцирует и продуцирует ретинальные клетки, включая зрительные рецепторы. Однако число вновь генерированных ретинальных нейронов является очень ограниченным. Было показано, что передача сигнала Wnt/β-катенин промотирует пролиферацию образующихся из глиа Мюллера ретинальных клеток-предшественников и нейронную регенерацию после повреждения или во время дегенерации. Лечение с помощью Wnt3a увеличивает пролиферацию дедифференцированных глия Мюллера более чем в 20 раз в сетчатке с поврежденным зрительным рецептором. Было также показано, что при дегенерации сетчатки, Wnt3a повышал пролиферацию клеток, и лечение с помощью RA или VPA промотировало дифференцировку этих клеток в клетки родопсин-положительного зрительного рецептора [Journal of Neuroscience (2007), 27(15), 4210-4219].
Поэтому, предполагается, что модулирование пути Wnt/β-катенин является одной возможной терапевтической стратегией для интенсификации замены потерянных нейронов путем генерирования клеток, образующихся из эндогенных нейронных клеток-предшественников.
Костеобразование
Было показано, что каноническая передача сигнала Wnt/β-катенин повышает костеобразование, и компоненты сигнального пути Wnt рассматриваются в качестве мишеней для воздействия лекарственных средств при остеопорозе и других метаболических заболеваний костей [Bone (2009), 44(6), 1063-1068]. В настоящее время, случаи заболевания костей увеличиваются вследствие социально-экологических и генетических факторов, в частности, вследствие увеличения численности пожилых людей. Обычно, заболевания костей возникает и развивается без специальных симптомов, но с возрастом состояние быстро ухудшается. Не смотря на то, что к настоящему времени разработано много лекарственных средств для лечения заболеваний костей, большинство из них нацелено главным образом на облегчение боли или на замедление снижения плотности костей. Они не эффективны в качестве исцеляющих лекарственных препаратов, целью которых является повышение плотности костей пациентов, которые страдают от остеопороза. Некоторые другие лекарственные средства обычно используют в форме инъекций и, как сообщают, они проявляют побочные эффекты при их длительном введении.
Передача сигнала через путь Wnt/β-катенин может увеличивать массу костей в результате действия ряда механизмов, включающих обновление стволовых клеток, стимулирование репликации преостеобластов, индуцирование остеобластогенеза, и ингибирование апоптоза остеобластов и остеоцитов. Один молекулярный механизм представляет собой стимуляцию сигнального пути Wnt путем Wnt-3α взаимодействия его рецепторов LRP5 и Fzd [Journal of Medicinal Chemistry (2009), 52(22), 6962-6965]. Костеобразующие остеобласты экспрессируют на поверхности мембраны белки LRP5 и Fzd, которые служат в качестве корецепторов для растворимого пептидного агониста Wnt-3α. После стимуляции с помощью Wnt-3α, внутренние концентрации свободного β-катенина возрастают, и он проникает в ядро и стимулирует фактор Т-клетки (TCF). Далее следуют транскрипционные события, что приводит в результате к продуцированию дополнительных анаболических генных продуктов. Дополнительный растворимый внеклеточный белок, Dkk-1, противодействует этому процессу путем одновременного связывания рецепторов клеточной поверхности Kr2 и LRP5, эффективно ингибируя связывание Wnt-3α с LRP5. Кроме того, происходит эндоцитоз комплекса Kr2/LRP5/Dkk-1 с удалением LRP5 клеточной мембраны, тем самым сводя к нулю его функцию. Мутация с потерей функции выделяемых Wnt антагонистов, таких как Dkk-1, SOST/склеростин и выделяемый белок (sFRP)-1, относящийся к белку Frizzled, приводит к повышенному костеобразованию, обусловленному изменениями ряда параметров остеобластов, таких как пролиферация, дифференцировка, рекрутинг/срок жизни и функционирование [Journal of Bone and Mineral Research (2009), 21(6), 934-945], в то время как делеция активируемого β-катенином транскрипционного фактора TCF-1 вызывает остеопению, которая возникает в результате снижения экспрессии остеопротегерина под воздействием остеобластов [Developmental Cell (2005), 8(5), 751-764].
Желудочно-кишечные заболевания
Эпителиальная ткань кишечника взрослого человека характеризуется непрерывной заменой эпителиальных клеток в результате стандартного цикла деления клетки, дифференцировки, миграции и эксфолиации, происходящего в течение 5-7 дней транзитного времени для крипта/ворсинка. Предполагаемые факторы роста, регулирующие внутри ниши пролиферацию кишечных стволовых клеток взрослого человека, еще не выявлены, хотя при исследованиях изучалась внутриклеточная активность передачи сигнала β-катенин/Lef/Tcf внутри пролиферативного компатмента крипты.
Ряд патологических состояний характеризуются поражением клеток кишечника. Воспалительное заболевание кишечника (IBD) может возникать в любом одном из двух или в обоих тонком и толстом кишечнике. Болезнь Крона и язвенный колит являются наиболее изученными формами IBD, и эти оба заболевания относятся к категории "идиопатического" воспалительного заболевания кишечника, так как этиология их неизвестна. "Активное" IBD характеризуется острым воспалением. "Хроническое" IBD характеризуется архитектурными изменениями в результате деформации и рубцевания крипты. Криптогенные абсцессы могут возникать при многих формах IBD.
Язвенный колит (UC) поражает толстую кишку в форме диффузной вирусной диареи с дистальным преобладанием. Фактически, всегда поражается прямая кишка, и могут быть вовлечены в процесс дополнительные части толстой кишки, непрерывно распространяясь поблизости от прямой кишки. Этиология возникновения UC неизвестна. Пациенты, длительно страдающие UC, относятся к группе повышенного риска развития рака толстой кишки.
Пациенты, страдающие UC, относятся также к группе риска развития заболеваний печени, включая склерозирующий холангит и злокачественную опухоль желчного протока.
Болезнь Крона может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта, но наиболее часто она поражает дистальную тонкую кишку и толстую кишку. Воспаление обычно является трансмуральным и может вызывать все что угодно, от небольшой язвы и лимфоидного фолликула (афтоидной язвы) до глубоких язвенных трещин, трансмуральных рубцов и хронического воспаления. В одной трети случаев присутствует гранулема, и в паракишечных местах, таких как лимфатические узлы, печень и суставы, может также присутствовать гранулема. Трансмуральное воспаление приводит к развитию свищей между петлями кишечника и другими структурами. Обычно воспаление является сегментарным, включающим разделяющие области в пораженном кишечнике. Этиология неизвестна, хотя и были предложены инфекционный и иммунологический механизмы.
Глютен, обычный пищевой белок, присутствующий в пшенице, ячмене и ржи, вызывает у восприимчивых к нему людей заболевание, называемое глютеновой болезнью. Прием внутрь таких белков восприимчивыми к ним людьми вызывает уплощение эпителиальной выстилки тонкого кишечника, в нормальном состоянии похожей на пышный ковер.
Другие клинические симптомы глютеновой болезни включают утомляемость, хроническую диарею, нарушение всасывания питательных веществ, потерю в весе, вздутие живота, анемию, а также существенно повышенный риск развития остеопороза и злокачественных опухолей кишечника, таких как лимфома и карцинома. Глютеновую болезнь обычно считают аутоиммунным заболеванием, и антитела, обнаруживаемые в сыворотке крови пациентов, поддерживают теорию, согласно которой это заболевание является иммунологическим.
2
2
Трансгенные мыши с нокаутом Tcf локуса проявляют потерю стволовых клеток пролиферативных компартментов в тонком кишечнике на последней стадии эмбриогенеза [Oncogene (2006) 25(57), 7512-7521]. Однако нокаут вызывает летальный исход, и поэтому исследование не проводилось на взрослых мышах. У химерных трансгенных мышей, в случае которых можно проводить исследование на взрослых особях, экспрессия конститутивно активного NH-усеченного β-катенина стимулировала пролиферацию в криптах тонкого кишечника, хотя слияния либо NH-усеченного β-катенина, либо Lef-1/-катенин, также индуцировали повышенный апоптоз крипты [The Journal of Cell Biology (1998), 141(3), 765-777; The Journal of Biological Chemistry (2002), 277(18), 15843-15850]. Так как разнообразные факторы регулируют β-катенин/Lef/Tcf-зависимую транскрипцию, включая non-Frizzled GPCR и PTEN/PI-3-киназу, причина дефекта кишечных стволовых клеток остается неизученной. Гены, экспрессируемые в желудочно-кишечном тракте, которые контролируются с помощью Wnt/β-катенина, включают CD44 и EphB2.
Регенеративная медицина
Вследствие значительных успехов, которые были достигнуты в области медицины за последние годы, в результате применения методов трансплантации тканей и органов от живых доноров постоянно увеличиваются возможности для спасения жизней. Однако, имеются ограничения на лечение с помощью трансплантатов от живых доноров, обусловленные такими факторами, как нехватка доноров трансплантатов и возможность отторжения. Если бы была возможна регенерация ткани или органа, которые были потеряны вследствие хирургического лечения или непредвиденного несчастного случая, то было бы возможно значительно повысить качество жизни пациентов. Кроме того, регенеративная медицина также позволяет решать проблемы, с которыми сталкиваются живые доноры трансплантатов. С этой точки зрения, на регенеративную медицину возлагаются большие надежды.
Технологии, в которых регенеративная медицина уже достигла успеха, в основном относятся к относительно простой, с точки зрения морфологии или функции, ткани наподобие искусственной кожи, искусственной кости и искусственных зубов. Реконструируемую искусственную кожу и искусственную кость встраивают в клетки, способные обеспечить подачу сигналов, требуемых для создания ткани. Однако существуют ограничения, накладываемые методами регенеративной медицины, на репертуар дифференцировки искусственной кожи и искусственной кости. Например, несмотря на то, что аллогенные кератиноциты или фибробласты кожи и другие подобные клетки, дифференцируемые в структуры в форме эпидермиса, вводят путем окружения ими органов с образованием, в конечном счете, рогового слоя или базального слоя, обладающего барьерными свойствами, тем не менее, было сообщено, что не происходит образование вторичных производных, таких как волосяные фолликулы, сальные железы или потовые железы.
Ткань организма в нормальном состоянии содержит как клетки, которые способны к самовоспроизводству и обладают свойствами стволовых клеток для поддержания тканевого гомеостаза путем посылки сигналов дифференцированным клеткам или доставки дифференцированных клеток, так и клетки, имеющие свойства соматических клеток, которые уже были дифференцированы, которые получают различные сигналы или команды от таких клеток, и способные функционировать в результате взаимодействия между обоими этими типами клеток. Например, в случае позвоночных животных, взаимодействие между мезенхимальными клетками и эпителиальными клетками является очень важным для образования почти всех тканей и органов. В случае волосяных фолликулов, мезенхимальные клетки в форме клеток волосяных сосочков обеспечивают свойства, аналогичные свойствам стволовых клеток, в то время как эпителиальные клетки в форме кератиноцитов эквивалентны клеткам, имеющим свойства соматических клеток с точки зрения их способности дифференцировать в волосяные стержни (то есть в волосы сами по себе).
Трудность, с которой сталкиваются при формировании органов с помощью регенеративной медицины, заключается в достижении состояния сосуществования между клетками, имеющими свойства, аналогичные свойствам стволовых клеток, поддерживаемыми в недифференцированном состоянии, и клетками, которые уже продифференцированы, такими как в реальной ткани организма. В известном уровне техники, даже если эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки были способны к сокультивированию, они либо и те и другие заканчивали дифференцировку, либо и те и другие поддерживали недифференцированное состояние, в силу этого делая невозможным репродукцию сосуществующих недифференцированных клеток и дифференцированных клеток с целью имитации реальной ткани организма.
Направление мультипотентных клеток в различные линии дифференцировки и контролирование их распространение остаются фундаментальными задачами биологии развития и биологии стволовых клеток. Члены сигнального пути Wnt контролируют многие кардинальные эмбриональные события, включая самообновление или распространение клеток-предшественников.
В опубликованных исследованиях делается предположение, что канонические Wnt сигналы играют различные роли в процессе отдельных периодов развития, сначала положительно регулируя коммитирование мезодермы, и затем, по-видимому, играя негативную роль в начальном индуцировании кардиальных клеток-предшественников [Genes & Development (2001), 15(3), 316-327; Ibid., 304-315; Proc Natl Acad Sci U S A. (2006), 103(52), 19812-19817; Development (Cambridge, UK) (2006), 133(19), 3787-3796]. Описанные в изобретении исследования потери и приобретения функции канонической передачи сигнала Wnt при пространственно-временном ограничении предоставляют убедительное доказательство, что для распространения и развития прекардиальной мезодермы и кардиальной мезодермы у мыши требуется клеточная автономная передача сигнала Wnt/β-катенин. Следовательно, могут существовать узкие периоды развития, во время которых каноническая передача сигнала Wnt последовательно ингибирует, а затем промотирует кардиальное развитие. Таким образом, было показано, что для регуляции распространения и дифференцировки клеток-предшественников можно использовать манипуляции с канонической передачей сигнала Wnt.
Однако в отличие от клеток-предшественников, стволовые клетки являются значительно менее специфическими. Самое важное различие между стволовыми клетками и клетками-предшественниками заключается в том, что стволовые клетки могут реплицироваться неограниченно, в то время как клетки-предшественники могут делиться только ограниченное количество раз. Термин взрослая стволовая клетка, называемая также соматической и зрелой половой клеткой, относится к любой клетке, которая обнаруживается в развитом организме и которая обладает двумя свойствами: способностью делиться и создавать другую клетку, такую же, как она сама, а также делиться и создавать клетку, более дифференцированную, чем она сама. Они могут обнаруживаться у детей, также как и у взрослых [Nature (2002), 418(6893), 41-49]. Все соматические клетки конкретного человека, в принципе, являются генетически идентичными, они проявляют ряд тканеспецифичных характеристик в процессе дифференцировки посредством эпигенетических и регуляторных альтераций. Полипотентные соматические стволовые клетки являются редкими, и обычно они составляют небольшое количество, но их можно обнаружить в ряде тканей, включая кровь из пуповины. Большое количество исследований соматических стволовых клеток было посвящено выяснению их способности неограниченно делиться или самообновляться и их возможности к дифференцировки. У мышей, полипотентные стволовые клетки образуются непосредственно из культур взрослых фибробластов. К сожалению, многие мыши долго не живут с органами из стволовых клеток.
Соматические клетки могут быть перепрограммированы для индуцирования полипотентных стволовых клеток (iPSC) путем ретровирусной трансдукции четырех транскрипционных факторов [Cell (2008), 132(4), 567-582]. Хотя и считается, что перепрограммированные полипотентные клетки являются очень перспективными для регенеративной медицины [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2008), 105(15), 5856-5861], геномные интеграции ретровирусов, особенно, c-Myc, повышает риск образования опухолей [Nature (2007), 448(7151), 313-317]. Воспроизведение iPSC для использования в клинической ситуации может быть полезным с точки зрения выявления альтернативы, в конечном счете, большей безопасности, инициирования стимула, и более предпочтительным по сравнению с генетической модификацией. Это могло бы представлять собой процесс переходного лечения с определенными факторами, низкотоксичными химическими веществами или синтетическими малыми молекулами. Так как сигнальный путь Wnt, в конечном счете, ведет к главной цепи полипотентности, было показано, что стимуляция пути с использованием растворимого Wnt-3α промотирует образование iPSC в отсутствии c-Myc ретровируса. Эти данные говорят о том, что для перепрограммирования дифференцированных клеток в полипотентное состояние пути сигнальной трансдукции и транскрипционные факторы могут действовать координировано [Cell Stem Cell (2008), 3(2), 132-135; Cell Stem Cell (2008), 3(5), 465-466].
Как уже обсуждалось выше, можно ожидать, что активаторы сигнального пути Wnt/β-катенина являются лекарственными средствами, которые следует применять при лечении расстройств, связанных с пролиферацией клеток, заболеваний костей, глазных заболеваний, болезни Альцгеймера и даже при регенерации тканей. Поэтому, было бы полезно иметь новые активаторы сигнального пути Wnt/β-катенина в качестве потенциальных лекарственных средств для схем лечения расстройств, связанных с сигнальным путем Wnt/β-катенина. Настоящее изобретение направлено на решение этих и других важных задач.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу повышения регенерации клеток или ткани у позвоночного животного. Изобретение относится к способам повышения необходимой активности эмбриональных и/или взрослых стволовых клеток, клеток-предшественников, мезенхимальных клеток-предшественников/стволовых клеток и/или дифференцированных клеток in vivo у позвоночного животного. Кроме того, изобретение относится к способу повышения регенерации клеток или ткани у позвоночного животного путем введения соединения согласно формулам I, II или III, позвоночному животному, если это ему необходимо, и увеличения in vivo популяции стволовых клеток, клеток-предшественников и/или дифференцированных клеток у позвоночного животного по сравнению с популяцией стволовых клеток, клеток-предшественников и/или дифференцированных клеток у позвоночного животного до проведения лечения, для повышения регенерации клеток или ткани у позвоночного животного. Увеличение популяции стволовых клеток, клеток-предшественников и/или дифференцированных клеток у позвоночного животного может являться результатом пролиферации клеток, хоуминга клеток, пониженного апоптоза, самообновления или повышенной выживаемости клеток.
В одном варианте осуществления, регенерация клеток или ткани может происходить в тканях, включающих, но этим не ограничивая, кость, хондроциты/хрящ, мышцы, скелетные мышцы, сердечные мышцы, клетки поджелудочной железы, эндотелиальные клетки, васкулярные эндотелиальные клетки, липоциты, печень, кожу, соединительную ткань, гемопоэтические стволовые клетки, неонатальные клетки, клетки крови из пуповины, эмбриональные клетки печени, взрослые клетки, клетки костного мозга, клетки периферической крови, эритроидные клетки, гранулоцитарные клетки, макрофагоцитарные клетки, гранулоцитарные-макрофагоцитарные клетки, B клетки, T клетки, мультипотентные колонии смешанного типа, эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные клетки-предшественники/стволовые клетки, мезодермальные клетки-предшественники/стволовые клетки, нейронные клетки-предшественники/стволовые клетки или нейроны. Позвоночным животным может являться млекопитающее, птица, пресмыкающее, земноводное, плавниковое или хрящевое.
В одном варианте осуществления, настоящим изобретением является композиция для предотвращения или снижения выпадения волос и/или для стимуляции или увеличения роста волос или возобновления роста волос, где композиция включает соединение согласно формулам I, II или III.
Один вариант осуществления настоящего изобретения предлагает фармацевтическую композицию для лечения нейродегенеративного заболевания.
В других вариантах осуществления, неврологическое нарушение представляет собой болезнь Альцгеймера, шизофрению или шизоаффективное расстройство, биполярное расстройство или униполярное расстройство, депрессивное состояние, наркотическую зависимость и токсикоманию, нейродегенеративное заболевание, аутизм или расстройство аутистического спектра, или расстройство в результате повреждения нейронов, такого как травмы спинного мозга и травмы головного мозга. Нейродегенеративным заболеванием может являться, например, боковой амиотрофический склероз (болезнь Лу Герига) или болезнь Паркинсона. В некоторых вариантах осуществления, изобретение предлагает способы лечения повреждение мозга в результате травмы или удара.
В других вариантах осуществления, неврологическое нарушение представляет собой глазное заболевание, такое как возрастная макулярная дегенерация, диабетический макулярный отек или пигментный ретинит.
В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу (i) снижения потери массы костей или плотности костей, (ii) увеличению массы костей или плотности костей, (iii) поддержания массы костей или плотности костей, и/или (iv) снижения потерь кальция в костях, включающему: введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III. Используемые в описании настоящего изобретения термины "масса костей" и "плотность костей" применяются взаимозаменяемо.
В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу регуляции активности остеобластов или активности остеокластов, включающему применение соединения согласно формулам I, II или III. Активность остеобластов может регулироваться путем регуляции пролиферация или функции остеобластов. Функция остеобластов и/или остеокластов может регулироваться непосредственно или косвенно.
В одном варианте осуществления, способом является лечение состояния кости или дефекта кости.
В другом варианте осуществления, подвергаемым лечению состоянием кости является хрупкость, остеопорозный перелом, дефект кости, детское идиопатическое разрежение кости, разрежение альвеолярной кости, разрежение кости нижней челюсти, перелом кости, остеотомия, разрежение кости, связанное с периодонтитом или врастанием протеза.
В еще одном варианте осуществления, подвергаемым лечению состоянием кости является болезнь Педжета.
В другом варианте осуществления, подвергаемым лечению состоянием кости является онколитическое заболевание костей.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу ускорения излечения переломов костей, дефектов костей, черепно-лицевых дефектов, отосклероза или несовершенного остеогенеза, включающему: введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу реконструкции костной ткани, включающему применение соединения согласно формулам I, II или III. В одном варианте осуществления, клетки, используемые для реконструкции костной ткани, обрабатывают с помощью соединения согласно формулам I, II или III.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к применению соединения согласно формулам I, II или III в качестве лекарственного средства для (i) снижения потери массы костей или плотности костей, (ii) увеличению массы костей или плотности костей, (iii) поддержания массы костей или плотности костей, и/или (iv) снижения потерь кальция в костях у субъекта, если это ему необходимо. В другом варианте осуществления, изобретение относится к применению соединения согласно формулам I, II или III в качестве лекарственного средства для излечения переломов костей или исправления дефектов костей у млекопитающего.
В одном варианте осуществления, подвергаемым лечению состоянием кости является остеопороз. В одном варианте осуществления, подвергаемый лечению остеопороз выбирают из группы, состоящей из: индуцированного глюкокортикоидами остеопороза, индуцированного гипертиреоидизмом остеопороза, индуцированного иммобилизацией остеопороза, индуцированного гепарином остеопороза и индуцированного иммунодепрессантом остеопороза.
В одном варианте осуществления, соединение согласно формулам I, II или III вводят совместно со средством, которое увеличивает костную массу или предотвращает потерю костной массы. В одном варианте осуществления, средством, которое увеличивает костную массу, является фактор роста, минерал, витамин, гормон, простагландин, ингибитор 15-липоксигеназы, костный морфогенетический белок или другой член суперсемейства TGF-бета, который повышает костеобразование, ACE ингибитор, белок семейства Hedgehog, дексаметазон, кальцитонин, или их активный фрагмент. В одном варианте осуществления, средством, которое предотвращает потерю костной массы, являются прогестин, эстроген, комбинации эстроген/прогестин, эстрон, эстриол, 17α- или 17β-этинилэстриол, SB242784, полифосфонаты, бифосфонаты или их активный фрагмент.
В одном варианте осуществления изобретения, соединение согласно формулам I, II или III, вводят для усиления пролиферации эпителия кишечника, для лечения, или в качестве терапевтического вспомогательного средства при лечении, заболеваний, которые нарушают эпителий кишечника, включающих воспалительные заболевания кишечника и глютеновую болезнь.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу реконструкции ткани органа, включающему применение соединения согласно формулам I, II или III. В одном варианте осуществления, клетки, используемые для реконструкции ткани органа, обрабатывают с помощью соединения согласно формулам I, II или III.
Некоторые раскрытые в изобретения варианты осуществления включают активатор сигнального пути Wnt/β-катенина, содержащий в основе β-дикетон, γ-дикетон или γ-гидроксикетон. Другие раскрытые в изобретения варианты осуществления включают фармацевтические композиции и способы лечения, в которых применяются эти композиции.
Один раскрытый в изобретении вариант осуществления активатора сигнального пути Wnt/β-катенина включает соединение, имеющее структуру формулы I:
,
1
R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу;
2
R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу; и
3
4
5
6
1-9
1-9
1-9
R, R, R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, -Cалкила, -Cалкиларила и -Cалкилгетероарила.
Другой раскрытый в изобретении вариант осуществления активатора сигнального пути Wnt/β-катенина включает соединение, имеющее структуру формулы II:
,
1
R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу;
2
R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу; и
3
4
1-9
1-9
1-9
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, -Cалкила, -Cалкиларила и -Cалкилгетероарила.
Еще один раскрытый в изобретении вариант осуществления активатора сигнального пути Wnt/β-катенина включает соединение, имеющее структуру формулы III:
,
1
R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу;
2
R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу; и
3
4
1-9
1-9
1-9
R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, -Cалкила, -Cалкиларила и -Cалкилгетероарила.
Некоторые варианты осуществления включают стереоизомеры и фармацевтически приемлемые соли соединения формул I, II или III.
Некоторые варианты осуществления включают пролекарства соединения формул I, II и III.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают фармацевтические композиции, включающие соединение формул I, II или III и фармацевтически приемлемый носитель.
Другие раскрытые в изобретении варианты осуществления включают фармацевтическую композицию, включающую соединение согласно любой из выше приведенных формул и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают способы получения соединений формул I, II или III.
Следует иметь в виду, что и приведенное выше общее описание, и следующее далее подробное описание представляют собой только примеры и объяснения, а не являются ограничениями изобретения, объем которого определяется пунктами формулы изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было обнаружено, что β-дикетоны, γ-дикетоны и γ-гидроксикетоны способны активировать сигнальный путь Wnt/β-катенина. Было обнаружено, что сигнальный путь Wnt/β-катенина играет очень важную роль в дифференцировке и развитии нейронов для центральной нервной системы, костеобразовании, развитии и регенерации волосяного фолликула, и стимуляции роста, поддержания и дифференцировки стволовых клеток.
Настоящее изобретение относится к способу повышения регенерации клеток или ткани у позвоночного животного. Изобретение относится к способам повышения необходимой активности эмбриональных и/или взрослых стволовых клеток, клеток-предшественников, мезенхимальных клеток-предшественников/стволовых клеток и/или дифференцированных клеток in vivo у позвоночного животного. Кроме того, изобретение относится к способам повышения регенерации клеток или ткани у позвоночного животного путем введения соединения согласно формулам I, II или III, позвоночному животному, если это ему необходимо, и увеличения in vivo популяции стволовых клеток, клеток-предшественников и/или дифференцированных клеток у позвоночного животного по сравнению с популяцией стволовых клеток, клеток-предшественников и/или дифференцированных клеток у позвоночного животного до проведения лечения, для повышения регенерации клеток или ткани у позвоночного животного. Предлагается способ увеличение популяции стволовых клеток или клеток-предшественников для исправления или замены поврежденной ткани у позвоночного животного, где регенерация клеток или ткани происходит в кости, хондроцитах/хряще, мышцах, скелетных мышцах, сердечных мышцах, клетках поджелудочной железы, эндотелиальных клетках, васкулярных эндотелиальных клетках, липоцитах, печени, коже, соединительной ткани, гемопоэтических стволовых клетках, неонатальных клетках, клетках крови из пуповины, эмбриональных клетках печени, взрослых клетках, клетках костного мозга, клетках периферической крови, эритроидных клетках, гранулоцитарных клетках, макрофагоцитарных клетках, гранулоцитарных-макрофагоцитарных клетках, B клетках, T клетках, мультипотентных колониях смешанного типа, эмбриональных стволовых клетках, мезенхимальных клетках-предшественниках/стволовых клетках, мезодермальных клетках-предшественниках/стволовых клетках, нейронных клетках-предшественниках/стволовых клетках или нейронах.
Рост волос
Композиции, включающие соединения согласно формулам I, II или III, могут применяться для промотирования роста волос.
Термин "промотирование роста волос" относится к поддержанию, индуцированию, стимулированию, ускорению или восстановлению роста волос.
Способ настоящего изобретения применяют при лечении алопеции у млекопитающих, и сам по себе способ может применяться для промотирования, увеличения или облегчения роста волос. Субъектами лечения могут являться особи мужского пола или женского пола. Термин алопеция относится как к полному отсутствию волос на коже, на которой они обычно растут, так и к потере или уменьшению количества волос. Различают множество типов и причин алопеции у людей, включая мужское облысение, индуцированное химиотерапией выпадение волос, врожденную алопецию и гнездную алопецию. Термин лечение алопеции относится как к лечению кожи с полным отсутствием роста волос, так и к лечению кожи, имеющей уменьшенный или очаговый рост волос. Успешное лечение приводит к увеличению числа волос.
Субъекты, подвергаемые лечению согласно изобретению, включают мужских особей, а также других особей млекопитающих, таких как собаки, кошки, мыши, крысы, козы, ламы, норки, тюлени, бобры, горностаи и овцы. Они могут быть подвергнуты лечению непосредственно по поводу выпадение волос или просто для увеличения производства шерсти или шкур.
"Лечение алопеции" относится к (i) предотвращению алопеции у животного, которое может быть предрасположено к алопеции, (ii) приостановке, замедлению или снижению алопеции, (iii) промотированию роста волос и/или (iv) пролонгированию фазы анагена цикла развития волос.
Способ промотирования роста волос в соответствии с настоящим изобретением заключается в нанесении эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III, или ее фармакологически приемлемой соли на кожу млекопитающих и, в частности, на кожу головы человека.
Неврологическое нарушение
Соединения согласно настоящему изобретению могут модулировать дифференцировку нейронных стволовых клеток и промотировать дифференцировку этих предшественников нейронов в функциональные нейроны и глиальные клетки.
Композиции, включающие соединения согласно формулам I, II или III, могут применяться для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Неограничивающими примерами нейродегенеративных заболеваний являются болезнь Альцгеймера, шизофрения или шизоаффективное расстройство, биполярное расстройство или униполярное расстройство, депрессивное состояние, наркотическая зависимость и токсикомания, нейродегенеративное заболевание, аутизм или расстройство аутистического спектра, или расстройство в результате повреждения нейронов, такого как травмы спинного мозга и травмы головного мозга. Нейродегенеративным заболеванием может, например, являться боковой амиотрофический склероз (болезнь Лу Герига) или болезнь Паркинсона.
Другими неограничивающими примерами нейродегенеративных заболеваний являются глазные заболевания, такие как возрастная макулярная дегенерация, диабетический макулярный отек или пигментный ретинит.
Изобретение также предлагает способ лечения повреждения мозга в результате травмы или удара.
Другим аспектом изобретения является способ усиления пролиферации и дифференцировки предшественников нейронов путем контактирования предшественников нейронов с соединением согласно формулам I, II или III в эффективном количестве для усиления пролиферации и дифференцировки предшественников нейронов.
В одном аспекте, изобретение предлагает способ усиления генерации нервов путем контактирования нерва с соединением согласно формулам I, II или III в эффективном количестве для усиления генерации нерва.
В другом аспекте, настоящее изобретение предлагает способ лечения нейродегенеративного заболевания у пациента, требующего лечения, который включает введение эффективного количества соединения указанных выше формул I, II или III, или его фармацевтически приемлемой соли.
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть введены сами по себе или совместно введены с соединениями, действующими по другому механизму, например, нейропротективными средствами. В одном варианте осуществления, соединения совместно вводят с ингибитором ацетилхолинэстеразы (например, арисептом) при болезни Альцгеймера или с L-дигидроксифенил-аланином (L-DOPA) при болезни Парксинсона.
Костеобразование
Композиции, включающие соединения формул I, II или III могут применяться для лечения, предотвращения и облегчения заболеваний костей. Настоящее изобретение предлагает способ для (i) уменьшения потери костной массы, (ii) увеличения костной массы, (iii) поддержания костной массы и/или (iv) уменьшения потери кальция в костях, включающий: введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III. Способ может применяться для лечения, предотвращения или отсрочки заболевания костей. Кроме того, изобретение предлагает способ промотирования излечения переломов костей или дефектов костей, включающий: введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III. Любой из упомянутых выше способов может включать совместное введение средства, которое увеличивает костную массу или предотвращает потерю костной массы.
Изобретение также предлагает применение соединения согласно формулам I, II или III в качестве лекарственного средства для лечения, предотвращения или отсрочки заболевания костей.
Используемый в описании изобретения термин "заболевание костей" включает любое состояние, при котором желательно увеличить костную массу или плотность костей и/или предотвратить потерю костной массы или плотности костей. Заболевание костей включает любое состояние, при котором увеличивается число остеокластов, повышается активность остеокластов, увеличивается резорбция кости, увеличивается фиброз костного мозга или изменяется содержание кальция в костях.
Неограничивающие примеры заболеваний костей включают метаболические заболевания костей, такие как нефрогенная остеодистрофия, первичные формы остеопороза (например, постклимактерический и старческий остеопороз), и вторичные формы остеопороза, которые развиваются в результате лежащего в их основе болезненного состояния. Например, остеопороз может развиваться у пациентов, которые страдают эндокринными расстройствами, такими как гиперпаратиреоидизм, гипо- и гипертиреоидизм, гипогонадизм, гиперкальцемия, обусловленная злокачественной опухолью, опухоли гипофиза, диабет типа I или болезнь Аддисона. Неоплазии, такие как множественная миелома и карциноматоз, также приводят к развитию остеопороза. Кроме того, к развитию остеопороза могут приводить желудочно-кишечные проблемы, такие как недостаточность питания, нарушение всасывания, печеночная недостаточность, и недостаток витамина C или D, и длительное введение лекарственных средств, таких как антикоагулянты, химиотерапевтические средства, кортикостероиды, противосудорожные средства и алкоголь.
Неограничивающие примеры болезней костей также включают остеонекроз, остеоартрит, ревматоидный артрит, болезнь Педжета, несовершенный остеогенез, хронический гиперпаратиреоидизм, гипертиреоидизм, болезнь Горхема-Стаута, синдром Мак-Кьюна- Олбрайта и потеря кости альвеолярного отростка.
Термин "заболевание костей" включает, без ограничения, все состояния, приводящие к потере костной массы, включая, онкологические заболевания и опухоли (такие как остеосаркома и множественная миелома), почечную недостаточность (включая острую почечную недостаточность, хроническую почечную недостаточность, дистрофию костей почки и реперфузионное повреждение почки), заболевания почек, преждевременную овуляцию и другие состояния.
Эндокринные расстройства, недостаток витаминов и вирусные инфекции также могут приводить к развитию заболеваний костей, которые можно лечить с помощью способов изобретения. Примером заболевания костей, вызываемого нарушением питания, является остеомаляция, алиментарная дистрофия, вызываемая недостатком витамина D и кальция. Ее называют "рахитом" у детей, и "остеомаляцией" у взрослых. Она характеризуется размягчением костей (обусловленным нарушенной минерализацией при избыточном накоплении остеоидной ткани), болью, хрупкостью, атрофией мышц и слабостью, отсутствием аппетита и общей потерей веса. Она может быть результатом недостаточности питания, неоднократных беременностей и лактации (истощения или исчерпывания запасов витамина D и кальция), и резистентности к витамину D.
Заболевания костей включают состояния, являющиеся результатом лечения субъекта с помощью лекарственных средств, например, остеопению, возникающую в результате лечения с помощью циклоспорина A или FK506.
Заболевания костей также включают переломы костей, травмы костей, состояния, которые возникают после хирургического вмешательства в связи с травмой костей, после хирургического вмешательства в связи с протезированием сустава, после хирургического вмешательства в связи с пластикой костей, после стоматологической операции, после химиотерапии костей, после стоматологической операции и лучевой терапии костей. Переломы включают все типы микроскопических и макроскопических переломов. Примеры переломов включают отрывной перелом, осколочный перелом, поперечный перелом, косой перелом, спиральный перелом, двойной перелом, перелом со смещением, вколоченный перелом, перелом по типу зеленой ветки, компрессионный веретенообразный перелом, усталостный перелом, внутрисуставный перелом (со смещением эпифиза), закрытый перелом (неосложненный перелом), открытый перелом (осложненный перелом) и рентгенологически невыявленный перелом.
Другие неограничивающие примеры заболеваний костей включают деформацию костей, деформацию позвоночника, отсоединение протеза, остеодисплазию, сколиоз, пародонтоз и периодонтальные дефекты, восстановление зуба и фиброзный остит.
Изобретение также предлагает способ лечения субъекта с помощью терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III в том случае, когда субъект нуждается в восстановлении кости после хирургического вмешательства, таком как челюстно-лицевое восстановление после удаления опухоли, хирургическая реконструкция кости после травматического повреждения, устранение наследственных или других физических нарушений и промотирование заживление кости при пластической хирургии.
Изобретение также предлагает способ лечения субъекта с помощью терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III в том случае, когда субъект нуждается в восстановлении кости после установки имплантата (включая замену суставов и зубные имплантаты), протеза или костного трансплантата.
Изобретение также предлагает способ лечения субъекта с помощью терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III в том случае, когда: a) для субъекта необходима повышенная плотность костей или заживление кости; b) субъект подвергался или подвергается в данный момент кортикостероидной терапии, диализу, химиотерапии в связи с постклимактерической потерей костной массы, лучевой терапии в связи с онкологическим заболеванием или гормонозаместитительной терапией; c) субъект иммобилизован или вынужден длительно соблюдать постельный режим в связи с повреждением кости; d) субъект страдает от алкоголизма, диабета, гиперпролактинемии, нервно-психической анорексии, первичной или вторичной аменореи, или подвергнут овариоэктомии; e) субъект страдает от почечной недостаточности; f) субъекту 50 или более; или g) субъектом является женщина.
Изобретение также предлагает способ лечения субъекта с помощью терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III в том случае, когда субъект страдает от заболевания, выбранного из обызвествления артерии, анкилозирующего спондилита, окостенения задней продольной связки, оссифицирующего миозита, диффузного идиопатического скелетного гиперостоза, обызвествленного тендинита, заболевания ротаторной манжеты плеча, костных шпор, дегенерации хряща или связок, обусловленного отложением кристаллического гидроксиапатита, и хондрокальциноза.
Под термином "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" соединения согласно формулам I, II или III подразумевают количество, достаточное для достижения требуемого физиологического эффекта, например, активации остеобластов, увеличения числа остеобластов, повышения костеобразования, уменьшения числа остеобластов или дезактивации остеобластов. Эффективное количество активатора сигнального пути Wnt/β-катенина определяется в каждом случае лечащим врачом на основе факторов, которые обычно принимает во внимание любой специалист в области медицины при определении соответствующих доз, включая возраст, пол и вес субъекта, которого подвергают лечению, состояние, подвергаемое лечению, и тяжесть заболевания, которое подвергают лечению.
Изобретение также предлагает способ лечения субъекта с помощью терапевтически эффективного количества соединения согласно формулам I, II или III совместно со средством, которое увеличивает костную массу или предотвращает потерю костной массы. В одном варианте осуществления, средство, которое увеличивает костную массу, представляет собой фактор роста, минерал, витамин, гормон, простагландин, ингибитор 15-липоксигеназы, костный морфогенетический белок или другой член суперсемейства TGF-бета, который повышает костеобразование, ACE ингибитор, белок семейства Hedgehog, дексаметазон, кальцитонин, или его активный фрагмент. В одном варианте осуществления, средство, которое предотвращает потерю костной массы, представляет собой прогестин, эстроген, комбинации эстроген/прогестин, эстрон, эстриол, 17α- или 17β-этинилэстриол, SB242784, полифосфонаты, бифосфонаты или их активный фрагмент.
Желудочно-кишечные заболевания
Соединения согласно формулам I, II или III также применяют для лечения желудочно-кишечного воспаления. Используемый в описании изобретения термин "желудочно-кишечное воспаление" относится к воспалению слизистого слоя желудочно-кишечного тракта, и он охватывает острые и хронические воспалительные состояния. Острое воспаление обычно характеризуется быстрым возникновением и инфильтрацией или притоком нейтрофилов.
"Хроническое желудочно-кишечное воспаление" относится к воспалению слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, которое характеризуется относительно более долгим периодом возникновения, является длительным (например, от нескольких дней, недель, месяцев или лет и вплоть до периода всей жизни субъекта), и связано с инфильтрацией или притоком мононуклеарных клеток, и, кроме того, может характеризоваться периодами спонтанной ремиссии и спонтанного проявления. Поэтому, предполагается, что субъекты с хроническим желудочно-кишечным воспалением могут требовать длительного периода контроля, наблюдения или лечения. "Хронические желудочно-кишечные воспалительные состояния" (также называемые "хроническими желудочно-кишечными воспалительными заболеваниями") с таким хроническим воспалением включают, но этим не обязательно ограничивая, воспалительное заболевание кишечника (IBD), колит, вызванный неблагоприятным воздействие окружающей среды (например, желудочно-кишечное воспаление (например, колит), вызванное или связанное с (например, побочным действием) терапевтической схемой лечения, например, применением химиотерапии, лучевой терапии и других подобных методов), колит при состояниях, таких как хронический гранулематоз, глютеновая болезнь, целиакия-спру (наследственная болезнь, при которой воспаляется выстилка кишечника в ответ на попадание внутрь организма белка, называемого глютеном), пищевые аллергии, гастрит, инфекционный гастрит или энтероколит (например, хронический активный гастрит, вызываемый бактериями хеликобактер пилори) и другие формы желудочно-кишечного воспаления, вызываемого возбудителем инфекции, и другие подобные состояния.
Используемый в описании изобретения термин "воспалительное заболевание кишечника" или "IBD" относится к любому из ряда заболеваний, характеризующихся воспалением всего кишечника или его части. Примеры воспалительного заболевания кишечника включает, но этим не ограничивая, болезнь Крона и язвенный колит. Упоминание воспалительного заболевания кишечника в описании изобретения приводится только в качестве примера желудочно-кишечных воспалительных состояний, и его не следует считать ограничением.
Соединения согласно формулам I, II или III могут быть введены субъекту до начала проявления более тяжелых симптомов (например, до начала вспышки острого воспаления), или после начала проявления острых или хронических симптомов (например, после вспышки острого воспаления). По существу, средства могут быть введены в любое время, и могут быть введены с любым интервалом. В одном варианте осуществления, соединения согласно формулам I, II или III вводят через приблизительно 8 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 2 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 8 дней, приблизительно 16 дней, приблизительно 30 дней или 1 месяц, приблизительно 2 месяца, приблизительно 4 месяца, приблизительно 8 месяцев, или приблизительно 1 год после начала проявления симптомов, связанных с желудочно-кишечным воспалением, и/или после диагностирования у субъекта желудочно-кишечного воспаления.
При введении многократных доз, последующие дозы вводят в течение приблизительно 16 недель, приблизительно 12 недель, приблизительно 8 недель, приблизительно 6 недель, приблизительно 4 недель, приблизительно 2 недель, приблизительно 1 недели, приблизительно 5 дней, приблизительно 72 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 4 часов или приблизительно 2 часов или менее после предыдущей дозы. В одном варианте осуществления, ISS вводят с интервалами в пределах, по меньшей мере, от каждых двух недель до каждых четырех недель (например, с месячными интервалами) для поддержания максимального требуемого терапевтического эффекта (например, для обеспечения устойчивого облегчения связанных с BD симптомов).
Регенеративная медицина
Согласно настоящему изобретению, могут быть предложены соматические клетки, которые способны служить в качестве примитивной похожей на орган структуры, состоящей из множества типов соматических клеток.
Соматические клетки, упоминаемые в настоящем изобретении, относятся к клеткам, которые достигли дифференцировки в клетки, составляющие различные органы тела, и относятся к клеткам, которые представляют собой противоположность недифференцированным стволовым клеткам. Настоящее изобретение характеризуется использованием двух или более типов соматических клеток, и, предпочтительно, чтобы применялись их различные комбинации, такие как комбинация линии эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток, комбинация эндотелиальных клеток и мезенхимальных клеток, или комбинация эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток.
Как заявлено в настоящем изобретении, не существует конкретных ограничений для органов, которые могут быть образованы соматическими клетками, и примеры этих органов включают различные органы, такие как волосяной фолликул, легкое, почки, печень, поджелудочная железа, селезенка, сердце, желчный пузырь, тонкий кишечник, толстая кишка, толстый кишечник, сустав, кость, зуб, кровеносный сосуд, лимфатический проток, роговица, хрящ, орган обоняния или орган слуха.
Как заявлено в настоящем изобретении, в соответствии с ее целями могут быть использованы без ограничения различные млекопитающие в качестве источника клеток, примеры которых включают шимпанзе, других приматов, домашних животных, таких как собаки и кошки, сельскохозяйственных животных, таких как коровы, свиньи, лошади, овцы или козы, лабораторных животных, таких как кролики, крысы, мыши или морские свинки, и, более предпочтительно, "голые" мыши, мыши SCID или "голые" крысы. Кроме того, хотя их комбинации могут быть гомогенными комбинациями или гетерогенными комбинациями, гомогенные комбинации являются предпочтительными.
Настоящее изобретение характеризуется добавлением активатора сигнального пути Wnt/β-катенина согласно формулам I, II или III к смеси описанных выше типов дифференцированных соматических клеток и затем их культивирования. Передача сигнала Wnt относится к серии эффектов, которые наглядно демонстрируют функцию транскрипционных факторов путем промотирования миграции β-катенина в ядро. Эти сигналы возникать в результате клеточного взаимодействия, которое включает, например, серию процессов, в которых белок, называемый как Wnt3A, секретируемый из конкретных клеток, затем воздействует на другие клетки, вызывая ядерную миграцию внутриклеточного β-катенина, который воздействует как транскрипционный фактор. Эта серия процессов приводит к начальному формированию органа на примере эпителиального-мезенхимального взаимодействия. Известно, что сигнальный путь Wnt/β-катенина контролирует пролиферацию и дифференцировку клеток, формирование органа и различные функции клеток, такие как миграции в процессе начального развития. Несмотря на то, что передачу сигнала Wnt используют при культивировании ES клеток с целью ингибирования дифференцировки, обусловленного их функцией поддержания недифференцированного состояния, тем не менее, их применение и эффекты в процессе культивирования соматических клеток полностью не изучены.
Другой характеристикой настоящего изобретения является культивирование смеси типов дифференцированных соматических клеток, к которым было добавлено соединение согласно формулам I, II или III, без контакта с чашкой для культивирования. Культивирование без контакта с чашкой относится к методу культивирования клеток на границе раздела, имеющей сферическую поверхность, для того чтобы предотвратить прилипание клеток к чашке. Примером культивирование без контакта с чашкой является метод висячей капли. Метод висячей капли реализуется путем прилипания капли культуральной среды, содержащей культивируемые клетки, на внутренней поверхности верхней крышки чашки для культивирования, тщательного закрытия крышки, так чтобы культуральная среда не могла падать или сползать вниз, и культивирования клеток в культуральной среде, подвергаемых культивированию в форме перевернутой капли, обусловленной поверхностным натяжением. В результате культивирования таким методом, могут быть минимизированы негативные воздействия на клетки, присущие при контакте с плоской поверхностью, как в случае культивирования в чашке Петри. Другие примеры методов культивирования без контакта с чашкой включают метод формирования, использующий для культивирования полусферическую чашку, поверхность которой была заранее обработана для предотвращения прилипания клеток (например, "Spheroid" фирмы Sumitomo Bakelite) (называемый методом сферического формирования), и суспензионный метод, в котором клетки агрегируют в суспендированном состоянии путем культивирования в среде нитроцеллюлозы.
В некоторых вариантах осуществления, предлагаются фармацевтические композиции, которые являются эффективными при лечении заболевания животного, например, млекопитающего, вызванного патологической активацией или мутациями сигнального пути Wnt. Композиция включает фармацевтически приемлемый носитель и раскрываемый в изобретении активатор сигнального пути Wnt.
Определения
Если не определено иначе, то все технические и научные термины, используемые в описании изобретения, имеют значения, которые являются традиционными для любого обычного специалиста в области, к которой относится настоящее изобретение. Содержание всех патентов, патентных заявок, опубликованных патентных заявок, и других публикаций приводится в описании настоящего изобретения путем ссылки на них. В случае, когда существует множество определений для приводимого в описании изобретения термина, определения, приводимые в этом разделе описания, имеют преимущественную силу, если не заявлено иначе.
В этом описании и пунктах формулы изобретения, следующие термины имеют приведенные значения. Используемый в описании изобретения термин "алкил" обозначает разветвленную или линейную цепочечную химическую группу, содержащую только углерод и водород, такую как метил, изопропил, изобутил, вторбутил и пентил. Алкильные группы могут быть или незамещенными, или замещенными с помощью одного или более заместителей, например, галогена, алкокси, ацилокси, амино, амидо, циано, нитро, гидроксила, меркапто, карбокси, карбонила, бензилокси, арила, гетероарила или другой функциональности, которая может быть соответствующим образом блокирована, в случае необходимости, для целей изобретения, с помощью защитной группы. Алкильные группы могут быть насыщенными или ненасыщенными (например, содержащими -C=C- или -C≡C- фрагменты) в одном или нескольких положениях. Обычно, алкильные группы будут включать от 1 до 9 углеродных атомов, предпочтительно, от 1 до 6, и более предпочтительно, от 1 до 4 углеродных атомов.
Используемый в описании изобретения термин "карбоциклил" обозначает циклическую кольцевую систему, содержащую только углеродные атомы в скелете кольцевой системы, такую как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогексенил. Карбоциклилы могут включать несколько конденсированных колец. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщенности, при условии, что, по меньшей мере, одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим. Карбоциклильные группы могут быть или незамещенными, или замещенными с помощью одного или более заместителей, например, галогена, алкокси, ацилокси, амино, амидо, циано, нитро, гидроксила, меркапто, карбокси, карбонила, бензилокси, арила, гетероарила или другой функциональности, которая может быть соответствующим образом блокирована, в случае необходимости, для целей изобретения, с помощью защитной группы. Обычно, карбоциклильные группы будут включать от 3 до 10 углеродных атомов, предпочтительно, от 3 до 6.
Используемый в описании изобретения термин "низший алкил" обозначает подсовокупность алкилов, и, следовательно, представляет собой углеводородный заместитель, который является линейным или разветвленным. Предпочтительные низшие алкилы имеют от 1 до 4 углеродов, и могут быть разветвленными или линейными. Примеры низшего алкила включают бутил, пропил, изопропил, этил и метил. Аналогично, радикалы, в отношении которых используют выражение "низший", относятся к радикалам, предпочтительно, имеющим от 1 до 4 углеродов в алкильной части радикала.
Используемый в описании изобретения термин "амидо" обозначает H-CON- или алкил-CON-, карбоциклил-CON-, арил-CON-, гетероарил-CON- или гетероциклил-CON, где алкил, карбоциклил, арил или гетероциклил определены в описании изобретения.
Используемый в описании изобретения термин "арил" обозначает ароматический радикал, имеющий единственное кольцо (например, фенил), или множество конденсированных колец (например, нафтил или антрил), содержащий только одни углеродные атомы в скелете кольца. Арильные группы могут быть или незамещенными, или замещенными с помощью одного или более заместителей, например, амино, циано, гидроксила, низшего алкила, галогеналкила, алкокси, нитро, галогена, меркапто и других заместителей. Предпочтительным карбоциклическим арилом является фенил.
Используемый в описании изобретения термин "гетероарил" обозначает ароматический радикал, имеющий один или более гетероатомов (например, N, O, или S) в скелете кольца, и он может включать единственное кольцо (например, пиридин) или множество конденсированных колец (например, хинолин). Гетероарильные группы могут быть или незамещенными, или замещенными с помощью одного или более заместителей, например, амино, циано, гидроксила, низшего алкила, галогеналкила, алкокси, нитро, галогена, меркапто и других заместителей. Примеры гетероарила включают тиенил, пирридил, фурил, оксазолил, оксадиазолил, пироллил, имидазолил, триазолил, тиодиазолил, пиразолил, изоксазолил, тиадиазолил, пиранил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, триазинил, тиазолил и другие.
В этих определениях однозначно предполагается, что замещение на арильных и гетероарильных кольцах входит в объем конкретных вариантов осуществления. В случае замещения, радикал называют замещенным арилом или замещенным гетероарилом. Предпочтительно, чтобы на арильном кольце присутствовало от одного до трех заместителей, и, более предпочтительно, один или два заместителя. Хотя могут применяться многие заместители, но предпочтительные заместители включают те заместители, которые обычно присутствуют в арильных соединениях, такие как алкил, циклоалкил, гидрокси, алкокси, циано, галоген, галогеналкил, меркапто и другие подобные заместители.
Используемый в описании изобретения термин "амид" включает как RNR'CO- (в случае R=алкил, алкаминокарбонил-), так и RCONR'- (в случае R=алкил, алкилкарбониламино-).
Используемый в описании изобретения термин "эфир" включает как ROCO- (в случае R=алкил, алкоксикарбонил-), так и RCOO- (в случае R=алкил, алкилкарбонилокси-).
Используемый в описании изобретения термин "ацил" обозначает H-CO- или алкил-CO-, карбоциклил-CO-, арил-CO-, гетероарил-CO- или гетероциклил-CO-, где алкил, карбоциклил, арил или гетероциклил определены в описании изобретения. Предпочтительные ацилы содержат низший алкил. Примеры алкилацильных групп включают формил, ацетил, пропаноил, 2-метилпропаноил, третбутилацетил, бутаноил и пальмитоил.
Используемый в описании изобретения термин "галоген или галогенид" обозначает радикал атома хлора, брома, фтора или йода. Хлор, бром или фтор являются предпочтительными галогенидами. Термин "гало" взаимозаменяем с терминами "галоген" или "галогенид".
Используемый в описании изобретения термин "галогеналкил" обозначает углеводородный заместитель, который является линейным оили разветвленным или циклическим алкилом, алкенилом или алкинилом, замещенным с помощью атомов хлора, брома, фтора или йода. Наиболее предпочтительными из них являются фторалкилы, в которых один или более атомов водорода были замещены на фтор. Предпочтительные галогеналкилы имеют от 1 до 3 углеродов в цепи, более предпочтительные галогеналкилы имеют от 1 до 2 углеродов, и самые предпочтительные имеют 1 углерод в цепи. Для специалиста в этой области является очевидным, что используемый в описании изобретения термин "галогеналкилен" обозначает дирадикальный вариант галогеналкила, такие дирадикалы могут действовать в качестве спейсеров между радикалами, другими атомами, или между основным кольцом и другими функциональными группами.
Используемый в описании изобретения термин "гетроциклил" обозначает циклическую кольцевую систему, включающую, по меньшей мере, один гетероатом в скелете кольцевой системы. Гетероциклилы могут включать множество конденсированных колец. Гетероциклилы могут иметь любую степень насыщенности, при условии, что, по меньшей мере, одно кольцо в кольцевой системе, не является ароматическим. Гетероциклилы могут быть незамещенными или замещенными с помощью одного или более заместителей, например, галогена, алкокси, ацилокси, амино, амидо, циано, нитро, гидроксила, меркапто, карбокси, карбонила, бензилокси, арила, гетероарила и других заместителей, и присоединяются к другим группам посредством любой доступной валентной связи, предпочтительно, через доступный углерод или азот. Более предпочтительными гетероциклами являются 5-7 членные гетероциклы. В шестичленных моноциклических гетероциклах, гетероатомы выбирают в количестве от одного до трех из атомов O, N или S, и когда гетероциклом является пятичленный гетероцикл, предпочтительно, чтобы он имел один или два гетероатома, выбранных из атомов O, N, или S.
Используемый в описании изобретения термин "замещенный амино" обозначает аминный радикал, который замещен с помощью одного или двух алкилов, циклоалкилов, арилов, гетероарилов или гетероциклилов, где алкил, арил, гетероарил или гетероциклил определены выше.
Используемый в описании изобретения термин "замещенный тиол" обозначает RS- группу, где R представляет собой алкил, арил, гетероарил или гетероциклил, где алкил, циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклил определены выше.
2
2
2
2
2
Используемый в описании изобретения термин "сульфонил" обозначает алкил-SO, арил-SO, гетероарил-SO, карбоциклил-SO или гетероциклил-SO, где алкил, карбоциклил, арил, гетероарил или гетероциклил определены выше.
2
2
2
2
2
Используемый в описании изобретения термин "сульфамидо" обозначает алкил-N-S(O)N-, арил-NS(O)N-, гетероарил-NS(O)N-, карбоциклил-NS(O)N- или гетероциклил-NS(O)N-, где алкил, карбоциклил, арил, гетероарил или гетероциклил определены в описании изобретения.
2
2
2
2
2
Используемый в описании изобретения термин "сульфонамидо" обозначает алкил-S(O)N-, арил-S(O)N-, гетероарил-S(O)N-, карбоциклил-S(O)N- или гетероциклил-S(O)N-, где алкил, карбоциклил, арил, гетероарил или гетероциклил определены в описании изобретения.
Используемый в описании изобретения термин "уреидо" обозначает алкил-NCON-, арил-NCON-, гетероарил-NCON-, карбоциклил-NCON- или гетероциклил-NCON-, где алкил, карбоциклил, арил, гетероарил или гетероциклил определены в описании изобретения.
Когда в описании изобретения указывается, что две группы "соединяют" или "связывают" с образованием "кольца", это означает, что между двумя группами образуется связь и может происходить замена атома водорода в одной или обеих группах с образованием связи, в результате чего образуется карбоциклильное, гетероциклильное, арильное или гетероарильное кольцо. Для специалиста в этой области является очевидным, что такие кольца могут быть образованы и легко образуются с помощью хорошо известных химических реакций, и специалист в этой области хорошо осведомлен о таких кольцах и методах их синтеза. Предпочтительными являются кольца, имеющие 3-7 членов, более предпочтительно, 5 или 6 членов. Используемый в описании изобретения термин "кольцо" или "кольца", когда речь идет об их образовании в результате комбинации двух радикалов, обозначает гетероциклические, карбоциклические, арильные или гетероарильные кольца.
Для специалиста в этой области является очевидным, что некоторые описанные в изобретении структуры могут находиться в резонансных формах или в виде таутомеров соединений, которые могут быть представлены фактически другими химическими структурами, даже с кинетической точки зрения, и специалист четко представляет себе, что такие структуры являются только очень малой частью примеров таких соединений. Несмотря на то, что такие резонансные формы или таутомеры не приведены в описании изобретения, тем не менее, однозначно предполагается, что такие соединения входят в объем настоящего изобретения.
Предлагаемые изобретением соединения могут включать различные стереохимические формы. Соединения также включают диастереомеры, а также оптические изомеры, например, смеси энантиомеров, включая рацемические смеси, а также индивидуальные энантиомеры и диастереомеры, которые возникают вследствие наличия структурной асимметрии в некоторых соединениях. Разделение индивидуальных изомеров или селективный синтез индивидуальных изомеров осуществляется с помощью различных методов, которые хорошо известны специалистам в области органического синтеза. Если не заявлено иначе, то в случае, когда раскрываемое соединение называют или изображают с помощью структуры без указания его стереохимии и это соединение имеет один или более хиральных центров, предполагается, что это название или эта структура представляют все возможные стереоизомеры соединения.
Термин "введение" относится к способу введения дозы соединения или фармацевтической композиции позвоночному или беспозвоночному животному, включая млекопитающего, птицу, рыбу или земноводное, где способ представляет собой, например, интрареспираторное, местное, пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, внутримышечное, буккальное, ректальное сублингвальное введение. Выбор предпочтительного способа введения может зависеть от различных факторов, например, компонентов фармацевтической композиции, места заболевания, вида заболевания и тяжести заболевания.
Используемый в описании изобретения термин "диагностирование" относится к соединению, методу, системе или устройству, с помощью которых выявляют и дают оценку состояния здоровья или болезненного состояния. Диагностирование может применяться при проведении известных в медицине стандартных анализов.
Используемый в описании изобретения термин "млекопитающее" применяется в его обычном биологическом смысле. Следовательно, он конкретно включает людей, крупный рогатый скот, лошадей, обезьян, собак и кошек, но кроме этого включает и многие другие виды.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" или "фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество" включает все без исключения растворители, диспергирующую среду, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и другие подобные вещества. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно. За исключением случаев, когда какая-либо традиционная среда или средство не совместимы с активным ингредиентом, их применение предусмотрено в терапевтических композициях. В композиции могут быть также введены дополнительные активные ингредиенты. Кроме того, могут быть включены различные вспомогательные вещества, которые обычно используются в фармацевтике. Эти и другие такие соединения описаны в литературе, например, в справочнике Merck Index, Merck & Company, Rahway, NJ. Соображения по поводу включения различных компонентов в фармацевтические композиции приводятся, например, в монографии Gilman et al. (Eds.) (2006); Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., The McGraw-Hill Companies.
Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений предпочтительных вариантов осуществления, и которые не являются неприемлемыми с биологической точки зрения или по другим причинам. Во многих случаях, соединения предпочтительных вариантов осуществления способны образовывать соли присоединения кислот и/или оснований в силу присутствия аминогрупп и/или карбоксильных групп или аналогичных им групп. Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть образованы с неорганическими кислотами и органическими кислотами. Неорганические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и другие подобные кислоты. Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, салициловую кислоту и другие подобные кислоты. Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы с неорганическими и органическими основаниями. Неорганические основания, из которых могут быть образованы соли, включают, например, основания натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца, алюминия и другие подобные; особенно предпочтительными являются соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Органические основания, из которых могут быть образованы соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая природные замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и другие подобные органические основания, особенно, такие как изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин и этаноламин. Многие такие соли известны в фармацевтике и описаны в патентном документе World Patent Publication 87/05297, Johnston et al., опубликованном 11 сентября 1987 года (содержание которого приводится в описании настоящего изобретения путем ссылки на него).
Термин "сольват" относится к соединению, образованного в результате взаимодействия растворителя и ингибитора сигнального пути Wnt, метаболита или его соли. Подходящими сольватами являются фармацевтически приемлемые сольваты, включая гидраты.
Используемый в описании изобретения термин "субъект" обозначает человека или не относящегося к человеку млекопитающее, например, собаку, кошку, мыш, крысу, корову, овцу, свинью, козу, не относящегося к человеку примата или птицу, например, цыпленка, а также любого другого позвоночного или беспозвоночного животного.
Под "терапевтически эффективным количеством" или "фармацевтически эффективным количеством" обычно подразумевают количество, которое достаточно для достижения требуемого эффекта и которое может изменяться в зависимости от природы и тяжести болезненного состояния и активности соединения. Очевидно, что для профилактики могут быть использованы концентрации, которые отличаются от концентраций для лечения активного заболевания. Кроме того, это количество может зависеть от роста, массы, пола, возраста пациента и анамнеза заболевания.
Терапевтический эффект заключается в ослаблении, до известной степени, одного или более симптомов заболевания, и включает излечивание заболевания. "Излечивание" означает ликвидацию симптомов активного заболевания. Однако некоторые длительные или необратимые эффекты заболевания могут проявляться даже после окончательного излечения (такие как обширное повреждение ткани).
Используемые в описании изобретения термины "лечить" или лечение относятся к введению фармацевтической композиции в терапевтических целях. Термин "терапевтическое лечение" относится к проведению лечения пациента, который уже страдает от заболевания, в результате чего достигается терапевтически положительный эффект, такой как облегчение существующих симптомов, предотвращение появления дополнительных симптомов, облегчение или предотвращение лежащих в основе симптомов метаболических нарушений, отсрочка или предотвращение дальнейшего развития расстройства и/или снижение тяжести симптомов, развитие которых предполагается в данной момент или в будущем.
Следует иметь в виду, что выражение "высвобождение лекарственного средства" относится ко всем без исключения механизмам, например, диффузии, миграции, проникновению и/или десорбции, с помощью которых лекарственное средство (лекарственные средства), введенное в материал, высвобождающий лекарственное средство, выводится из него в течение времени в окружающую ткань организма.
Следует иметь в виду, что выражение "материал, высвобождающий лекарственное средство" обозначает любой природный, синтетический или полусинтетический материал, который способен приобретать и сохранять требуемую форму или конфигурацию и в который может быть введено одно или более лекарственных средств, и из которого введенное лекарственное средство (лекарственные средства) может высвобождаться в течение времени.
Следует иметь в виду, что выражение "высвобождаемое лекарственное средство" обозначает любое лекарственное средство или комбинацию лекарственных средств, имеющее способность высвобождаться в течение времени из материала, высвобождающего лекарственное средство, в который оно было введено, в окружающие области организма.
Следующие сокращения имеют указанные значения:
Αβ = бета-амилоид
ACE = ангиотензин I-конвертирующий фермент
AD = болезнь Альцгеймера
ALS = боковой амиотрофический склероз
AMD = возрастная макулярная дегенерация
APC = аденоматозный полипоз толстой кишки
β-TrCP = белок, содержащий повторные участки β-трансдуцина
CD44 = гликопротеин клеточной поверхности
C1,2 = казеинкиназа 1 и 2
DHT = дигидротестостерон
Dkk = белок dickkopf (антагонист Wnt)
DME = диабетический макулярный отек
Dsh/Dvl = белок dishevelled
EphB2 = эфриновый рецептор 2 типа-B
ES клетки = эмбриональные стволовые клетки
FTD = лобно-височная деменция
Fzd = белок frizzled
GBP = GSK-3 связывающий белок
GI = желудочно-кишечный
GPCR = рецептор, сопряженный с G белком
GSK-3 = гликоген-синтаза-киназа-3
HCC = злокачественная гепатома
IBD = воспалительное заболевание кишечника
Kr2 = крингл-домен 2
L-DOPA = L-3,4-дигидроксифенилаланин
Lef = лимфоидный стимулирующий фактор
LRP = белок, связанный с рецептором липопротеина низкой плотности
MMTV = вирус опухоли молочной железы мышей
PD = болезнь Паркинсона
PKC = белок киназы C
PI-3 = фосфатидилинозит-3 киназа
PPAR = рецепторы активатора пролиферации пероксисом
PTEN = фосфатаза и гомолог тензина
RP = пигментный ретинит
SCID = тяжелый комбинированный иммунодефицит
SOD1 = белок супероксиддисмутазы
SOST = склеростин
sFRP = белок, связанный с секретируемым белком Frizzled
TCF = фактор Т-клетки
TGF = трансформирующий фактор роста
UC = язвенный колит
Wg = бескрылый
Wnt = член бескрылого типа семейства места интеграции MMTV
Соединения
Описанные в изобретении соединения и композиции способны активировать сигнальный путь Wnt/β-катенина. Было обнаружено, что сигнальный путь Wnt/β-катенина играет очень важную роль в дифференцировке и развитии нейронов для центральной нервной системы, костеобразования, развитии и регенерации волосяного фолликула, и стимуляции роста, поддержания и дифференцировки стволовых клеток. Поэтому, предполагается, что такие соединения и композиции могут применяться для лечения расстройств клеточной пролиферации, заболеваний костей, болезни Альцгеймера и даже для регенерации тканей.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения, их соли, фармацевтически приемлемые соли или пролекарства формулы (I):
.
1
В некоторых вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу.
2
В некоторых вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу.
3
4
5
6
1-9
1-9
1-9
В некоторых вариантах осуществления, R, R, R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, -Cалкила, -Cалкиларила и -Cалкилгетероарила.
1
В более конкретных вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из
2
В других конкретных вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила,
и .
3
4
5
6
В других конкретных вариантах осуществления, R, R, R и R представляют собой H.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения, их соли, фармацевтически приемлемые соли или пролекарство формулы (II):
.
1
В некоторых вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу.
2
В некоторых вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу.
3
4
1-9
1-9
1-9
В некоторых вариантах осуществления, R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, -Cалкила, -Cалкиларила и -Cалкилгетероарила.
1
В более конкретных вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из
2
В других конкретных вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила,
и .
3
4
В других конкретных вариантах осуществления, R и R представляют собой H.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения, их соли, фармацевтически приемлемые соли или пролекарство формулы (III):
1
В некоторых вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу.
2
В некоторых вариантах осуществления, R выбирают из группы, состоящей из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного карбоциклила и замещенного или незамещенного гетероциклила, при условии, что углеродный атом присоединен к карбонилу.
3
4
1-9
1-9
1-9
В некоторых вариантах осуществления, R и R независимо выбирают из группы, состоящей из H, -Cалкила, -Cалкиларила и -Cалкилгетероарила.
Иллюстративные примеры соединений формул I, II и III приведены в таблице 1.
Получение соединений
Используемые для получения соединения изобретения исходные материалы являются известными реагентами, их получают известными методами или приобретают у фирм-производителей. Для специалиста в этой области является очевидным, что методы получения предшественников и функциональных групп заявляемых изобретением соединений в целом описаны в литературе. Для специалиста вполне достаточно приведенной литературы и этого описания изобретения, для того чтобы синтезировать любое из соединений.
th
th
n
Нельзя не отметить, что специалист в области органической химии может легко осуществить соответствующие синтезы без дополнительной инструкции, то есть, для специалиста проведение этих реакций является обычной профессиональной деятельностью. Они включают восстановление карбонильных соединений до их соответствующих спиртов, реакции окисления, ацилирования, ароматического замещения, как электрофильного, так и нуклеофильного, образования простых эфиров, образования сложного эфира и омыления и другие подобные реакции. Эти химические превращения обсуждаются в хорошо известных учебниках и монографиях, таких как March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure 6 Ed., John Wiley & Sons (2007), Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 5 Ed., Springer (2007), Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Transformations, 2 Ed., John Wiley & Sons (1999) (содержание которых приводится в описании настоящего изобретения путем ссылки на них) и другой подобной литературе.
Для специалиста является очевидным, что определенные реакции лучше всего проводить, когда другая функциональность в молекуле экранирована или защищена, тем самым, исключая протекания любых побочных реакций и/или повышая выход реакции. Часто специалист использует защитные группы для достижения таких повышенных выходов или для исключения протекания нежелательных реакций. Эти реакции описаны в литературе и хорошо известны специалистам в этой области. Примеры многих таких превращений можно найти, например, в T. Greene and P. Wuts Protecting Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., John Wiley & Sons (2007), содержание которой приводится в описании настоящего изобретения путем ссылки на нее.
Следующие далее примеры схем синтеза приводятся в качестве руководства для читателя и представляют предпочтительные методы получения соединений, приводимых в качестве примеров. Эти методы не являются ограничениями для изобретения, и очевидно, что для получения этих соединений могут быть использованы и другие схемы синтеза. Такие методы в частности включают твердофазные синтезы, включая подходы комбинаторной химии. Для специалиста в области органического синтеза не составит проблем получить эти соединения с помощью тех методов, которые приведены в литературе и в настоящем изобретении. Нумерация соединений, используемая в схемах синтеза, изображенных ниже, предназначена только для этих конкретных схем, и ее не следует считать или путать с аналогичной нумерацией в других разделах описания заявки.
Для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения далее приводятся следующие примеры. Разумеется, примеры не следует рассматривать в качестве конкретных ограничений изобретения. Для любого специалиста в этой области являются очевидным, что могут быть предложены варианты изменений этих примеров в объеме пунктов формулы изобретения, и эти варианты входят в объем описанного изобретения и заявляемых пунктов формулы изобретения. Очевидно, что специалист в этой области с помощью описания настоящего изобретения и на основе своих профессиональных знаний способен осуществить и применить изобретение без проведения дополнительных обстоятельных исследований.
Используемые в описании изобретения торговые наименования веществ и устройств являются только примерами и представляют собой иллюстративные материалы, применяемые на момент создания изобретения. Для специалиста является очевидным, что можно ожидать изменений в товарах, технологиях и в других подобных атрибутах. Следовательно, примеры и используемые в них торговые наименования веществ и устройств не являются ограничивающими, и их не следует считать ограничением, так как они являются просто иллюстрацией того, как и что может выбрать специалист для осуществления одного или более вариантов осуществления изобретения.
1
1
СпектрыH ядерного магнитного резонанса (ЯМР) регистрировали в указанных растворителях на спектрометре Bruker NMR (Avance TM DRX300, 300 МГц для H). Положение пиков выражается в частях на миллион (ppm) относительно тетраметилсилана. Мультиплетность пиков обозначается следующим образом: s синглет; d дуплет; t триплет; m мультиплет.
Следующие сокращения имеют указанные значения:
3
Bi(OTf) = трифлат висмута(III)
Солевой раствор = насыщенный водный раствор хлорида натрия
3
CDCl = дейтерированный хлороформ
6
DMSO-d = дейтерированный диметилсульфоксид
ESIMS = распылительная электронная масс-спектрометрия
EtOAc = этилацетат
HCl = хлористоводородная кислота
4
MgSO = сульфат магния
NaH = гидрид натрия
ЯМР = ядерный магнитный резонанс
Ph = фенил
2
3
KCO = карбонат калия
rt = комнатная температура
TFA = трифторуксусная кислота
THF = тетрагидрофуран
TLC = тонкослойная хроматография
Следующие далее примеры схем синтеза приводятся в качестве руководства для читателя, и в совокупности представляют метод получения соединений, приводимых в качестве примеров. Кроме того, на основе следующих далее схем реакций и примеров, обычный специалист в области органического синтеза может предложить другие методы получения соединений изобретения. Если не указано иначе, то все переменные определены выше.
Общие методики
Соединения формулы I настоящего изобретения могут быть получены, как показано на схеме 1.
Схема 1
На схеме 1 приведен метод получения незамещенных производных 1,4-дикетонов (VII) с помощью модифицированной реакции Стеттера основания Манниха, в качестве предшественника винилкетона, с альдегидом. Сначала получают основание Манниха взаимодействием метилкетона (IV) с параформальдегидом и гидрохлоридом диметиламина с образованием 3-диметиламинопропан-1-она (V). Затем основание Манниха (V) подвергали реакции с различными альдегидами (VI) при стандартных условиях реакции Стеттера, используя соль триазолия в качестве катализатора, с получением незамещенных производных 1,4-дикетона (VII).
Соединения формулы I настоящего изобретения, в которых альфа и/или бета положения являются замещенными, могут быть получены, как показано на схеме 2.
Схема 2
На схеме 2 приведен метод получения незамещенных производных 1,4-дикетонов (IX) с помощью метода Кельина и Кулинковича [Synthesis (1996), (3), 330-2], который основан на применении магнийсодержащих реагентов в кросс-альдольной конденсации метилкетонов с α-бромкетонами. Метилкетон (IV) реагирует с замещенным α-бромкетоном (VIII) в присутствии бромида диэтиламидомагния и кислоты, и затем проводят обработку триэтиламином с получением требуемых замещенных производных 1,4-дикетона (IX).
Соединения формулы II настоящего изобретения могут быть получены, как показано на схеме 3.
Схема 3
На схеме 3 приведен метод получения производных β-дикетона (VII) путем перекрестной конденсации Кляйзена. Метилкетон (IV) подвергают конденсации с эфиром (X) в присутствии гидрида натрия с получением производных β-дикетона (XI). Полученное производное может быть дополнительно замещено с помощью алкилбромидов и основания или с помощью алкиловых спиртов в присутствии катализатора кислоты Льюиса с получением производных β-дикетона (XII).
Соединения формулы III настоящего изобретения могут быть получены, как показано на схеме 4.
Схема 4
2
2
2
1
2
1
1
На схеме 4 приведен метод получения производных γ-гидроксикетона (XIII), описанный в публикации Xue, et al., [Journal of Organic Chemistry (2006), 71(1), 215-218]. Смесь соединений цинка, образующаяся из 4,0 эквивалентов EtZn, 2,0 эквивалентов TFA и 4,0 эквивалентов CHI, эффективно превращает β-дикетоны в γ-гидроксикетоны. R группы, содержащие электронодонорные заместители, стремятся вставить циклопропан рядом с R (XIII), тогда как R группы, содержащие электроноакцепторные заместители, стремятся вставить циклопропан рядом с R (XIV).
Иллюстративные примеры получения соединения
Пример 1.
Получение соединения (1) приведено ниже на схеме 5.
Схема 5
Реагенты и условия: a) этанол, HCHO, HCl, кипячение с обратным холодильником в течение ночи; b) диоксан, PhCHO, 3-этил-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилтиазолия бромид, 95°C, в течение ночи.
Стадия a
1
3
Раствор 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)этанона (XV) (11 ммоль), гидрохлорид диметиламина (14 ммоль), параформальдегида (16 ммоль) и 12н HCl (2 капли) в этаноле (5 мл) кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Раствор охлаждали до комнатной температуры, и этанол испаряли под вакуумом. Остаток обрабатывали этилацетатом, слегка нагревали и диспергировали с помощью ультразвука в тонкодисперсные частицы. Твердые вещества отфильтровывали и сушили при комнатной температуре с получением 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-3-(диметиламино)пропан-1-она (XVI) в виде белого твердого вещества (82% выход), H ЯМР (CDCl, 400 МГц):  ч/млн 2,77 (с, 6H), 3,41 (м, 2H), 3,56 (м, 2H), 4,25 (м, 4H), 6,85 (м, 1H), 7,45 (м, 2H).
Стадия b
2
2
4
6
18
16
4
1
Триэтиламин (3,61 ммоль) и бензальдегид (4,3 ммоль) в сухом диоксане (10 мл) добавляли к раствору 1-(2,3-дигидробензо-[b][1,4]диоксин-6-ил)-3-(диметиламино)пропан-1-она (XVI) (5,4 ммоль) и 3-этил-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилтиазолия бромида (0,43 ммоль) в диоксане, нагретом при 95°C в атмосфере азота. Раствор затем нагревали в течение ночи при 95°C. Раствор охлаждали, и избыточный растворитель испаряли под вакуумом. Остаток распределяли между CHCl и водой. Органическую фазу сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, элюируя с помощью градиента этилацетата в гексане, с получением 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-фенилбутан-1,4-диона 1 в виде белого твердого вещества (12% выход). H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,33-3,37 (м, 4H), 4,29 (м, 2H), 4,34 (м, 2H), 6,98 (м, 1H), 7,48 (м, 1H), 7,55 (м, 3H), 7,64 (м, 1H), 8,00-8,02 (м, 2H); ESIMS обнаружено CHO m/z 297 (M+H).
Следующие соединения получали в соответствии с методикой, описанной выше в примере 1.
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(пиридин-2-ил)бутан-1,4-дион 2.
Белое твердое вещество.
1
3
17
15
4
H ЯМР (CDCl, 400 МГц):  ч/млн 3,37 (м, 2H), 3,40 (м, 2H), 4,31 (м, 4H), 6,92 (м, 1H), 7,47 (м, 2H), 7,56 (м, 1H), 7,83 (м, 1H), 8,03 (м, 1H), 8,71 (м, 1H); ESIMS обнаружено CHNO m/z 298 (M+H).
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(тиофен-2-ил)бутан-1,4-дион 3.
Желтое твердое вещество.
1
6
16
14
4
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 4,29 (м, 2H), 4,34 (м, 2H), 6,97 (м, 1H), 7,25 (м, 1H), 7,47 (м, 1H), 7,52 (м, 1H), 8,00-8,03 (м, 2H); ESIMS обнаружено CHOS m/z 303 (M+H).
1-(пиридин-2-ил)-4-(тиофен-2-ил)бутан-1,4-дион 5.
Белое твердое вещество.
1
6
3
11
2
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,40 (м, 2H), 3,56 (м, 2H), 7,27 (дд, J=4,8, 3,8 Hz, 1H), 7,70 (м, 1H), 7,95 (д, J=7,8 Hz, 1H), 8,00-8,05 (м, 3H), 8,76 (д, J=4,3 Hz, 1H); ESIMS обнаружено C1HNOS m/z 246 (M+H).
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(4-фторфенил)бутан-1,4-дион 7.
Желтовато-белое твердое вещество.
1
3
18
15
4
H ЯМР (CDCl, 400 МГц):  ч/млн 3,40 (с, 4H), 4,30 (м, 4H), 6,92 (м, 1H), 7,16 (м, 2H), 7,57 (м, 2H), 8,04 (м, 2H); ESIMS обнаружено CHFO m/z 315(M+H)
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(4-метоксифенил)бутан-1,4-дион 10.
Белое твердое вещество (19% выход).
1
6
19
18
5
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,85 (с, 3H), 4,30 (м, 2H), 4,34 (м, 2H), 6,99 (д, J=8,3 Hz, 1H), 7,06 (д, J=8,8 Гц, 2H), 7,48 (д, J=2,0 Гц, 1H), 7,54 (дд, J=8,3, 2,0 Гц, 1H), 7,98 (д, J=8,8 Гц, 2H); ESIMS обнаружено CHO m/z 327(M+H)
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(4-((2-метоксиэтокси)метокси)фенил)бутан-1,4-дион 11.
Желтовато-белое твердое вещество.
1
6
22
24
7
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,33 (м, 4H), 3,46 (м, 2H), 3,75 (м, 2H), 4,30 (м, 2H), 4,34 (м, 2H), 5,36 (с, 2H), 6,99 (д, J=8,3 Гц, 1H), 7,14 (д, J=8,8 Гц, 2H), 7,48 (д, J=2,0 Гц, 1H), 7,55 (дд, J=8,5, 2,0 Гц, 1H), 7,98 (д, J=8,8 Гц, 2H); ESIMS обнаружено CHO m/z 401(M+H).
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(3-((2-метокси-этокси)метокси)фенил)бутан-1,4-дион 12.
1
6
22
24
7
Белое твердое вещество. H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,21 (с, 3H), 3,35 (м, 4H), 3,48 (м, 2H), 3,75 (м, 2H), 4,30 (м, 2H), 4,33 (м, 2H), 5,32 (с, 2H), 6,99 (д, J=8,3 Гц, 1H), 7,31 (дд, J=8,2, 2,0 Гц, 1H), 7,49 (м, 2H), 7,55 (дд, J=8,5, 2,0 Гц, 1H), 7,58 (м, 1H), 7,67 (д, J=7,8 Гц, 1H); ESIMS обнаружено CHO m/z 401 (M+H).
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(2-((2-метоксиэтокси)метокси)фенил)бутан-1,4-дион 13.
Вязкое масло (14% выход).
1
6
22
24
7
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,21 (с, 3H), 3,25-3,29 (м, 4H), 3,46-3,48 (м, 2H), 3,79 (м, 2H), 4,29 (м, 2H), 4,33 (м, 2H), 5,39 (с, 2H), 6,98 (д,J=8,6 Гц, 1H), 7,10 (м, 1H), 7,25 (дд, J=8,3 Гц, 1H), 7,47 (м, 1H), 7,49-7,54 (м, 2H), 7,58 (дд, J=1,1, 1,6 Гц, 1H); ESIMS обнаружено CHO m/z 401 (M+H).
1,4-бис(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бутан-1,4-дион 14.
Желтовато-белое твердое вещество.
1
3
20
18
6
H ЯМР (CDCl, 400 МГц):  ч/млн 3,35 (с, 4H), 4,30 (м, 8H), 6,92 (м, 2H), 7,57 (м, 4H); ESIMS обнаружено CHO m/z 355 (M+H).
Пример 2.
Получение соединения (4) показано ниже на схеме 6.
Схема 6
2
2
Реагенты и условия: a) CHCl, TFA, rt, в течение ночи.
Стадия a
2
2
2
2
3
18
16
5
1
Чистую TFA (0,5 мл) добавляли к раствору 1-(2,3-дигидро-бензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(4-((2-метоксиэтокси)метокси)фенил)бутан-1,4-диона 11 (0,35 ммоль) в CHCl (5 мл), перемешивая при комнатной температуре. Раствор затем перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Летучие компоненты испаряли под вакуумом. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле, элюируя с помощью 1% метанола в CHCl, с получением 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(4-гидроксифенил)бутан-1,4-диона 4 в виде желтовато-белого твердого вещества (21% выход). H ЯМР (CDCl, 400 МГц):  ч/млн 3,37 (м, 4H), 4,29 (м, 2H), 4,33 (м, 2H), 5,76 (с, 1H), 6,87 (д,J=8,8 Гц, 2H), 6,93 (м, 1H), 7,60 (м, 2H), 7,94 (д, J=8,8 Гц, 2H); ESIMS обнаружено CHO m/z 313 (M+H).
Следующие соединения получали в соответствии с методикой, описанной выше в примере 2.
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(3-гидроксифенил)бутан-1,4-дион 6.
Желтовато-белое твердое вещество (27% выход).
1
6
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,27 (м, 4H), 4,30 (м, 2H), 4,34 (м, 2H), 6,99 (д,J=8,8 Гц, 1H), 7,03 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,36 (м, 2H), 7,45 (м, 2H), 7,54 (д, J=8,8 Гц, 1H).
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4-(2-гидрокси-фенил)бутан-1,4-дион 8.
Желтовато-белое твердое вещество (62% выход).
1
6
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,43 (м, 4H), 4,00 (м, 4H), 4,34 (м, 2H), 6,96 (м, 3H), 7,48-7,56 (м, 3H), 7,97 (м, 1H).
Пример 3.
Получение соединения (9) показано ниже на схеме 7.
Схема 7
2
2
2
4
2
3
Реагенты и условия: a) i) EtNMgBr·EtO, толуол, 0°C, 3 часа ii) HS0, HO, 0°C-rt, iii) EtN, rt.
Стадия a
2
4
4
3
4
3
17
17
2
1
В сухую 3-горлую колбу, снабженную магнитной мешалкой и холодильником, загружали металлический магний (12 ммоль) и эфир (1,8 мл). Добавляли с помощью шприца чистый бромэтан (2,5 ммоль), и мгновенно начиналась реакция. К раствору медленно добавляли раствор бромэтана (10,5 ммоль) в толуоле (30 мл). После завершения добавления, раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут в атмосфере азота, затем добавляли чистый диэтиламин (24 ммоль). Раствор затем перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Раствор охлаждали до 0°C, и к раствору добавляли смесь 1-(пиридин-2-ил)этанона (XVIII) (12 ммоль) и 2-бромизобутирофенона (XVII) (13 ммоль). Раствор затем перемешивали в течение 3 часов при 0°C в атмосфере азота. К раствору добавляли водную 5% HSO (20 мл), и раствор подогревали до комнатной температуры. Органический слой отделяли, сушили над MgSO и фильтровали. Органический слой затем обрабатывали с помощью EtN (10 ммоль) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Раствор затем промывали водой, сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, элюируя с помощью градиента 1-5% EtOAc в гексане, с получением 2,2-диметил-1-фенил-4-(пиридин-2-ил)бутан-1,4-диона 9 в виде бесцветного вязкого масла (11% выход). H ЯМР (CDCl, 400 МГц):  ч/млн 1,47 (с, 6H), 3,80 (с, 2H), 7,34-7,50 (м, 4H), 7,65-7,75 (м, 2H), 7,80 (м, 1H), 7,94 (м, 1H), 8,67 (м, 1H); ESIMS обнаружено CHNO m/z 268 (M+H).
Пример 4.
Получение соединения (15) показано ниже на схеме 8
Схема 8
Реагенты и условия: a) THF, NaH, rt-кипячение с обратным холодильником в течение ночи.
Стадия a
4
3
16
13
4
1
Раствор 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)этанона (XV) (1 экв.) в THF медленно добавляли к суспензии NaH (1,5 экв.) в THF, перемешивая в атмосфере азота при комнатной температуре. Раствор затем перемешивали при комнатной температуре до момента, когда заканчивалось выделение газа. К раствору добавляли этилпиколинат (XIX) (1,1 экв.) и кипятили с обратным холодильником в течение ночи в атмосфере азота. Раствор охлаждали, выливали в ледяную воду и экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле с получением 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-3-(пиридин-2-ил)пропан-1,3-диона 15 в виде желтого твердого вещества (71% выход), H ЯМР (CDCl, 400 МГц):  ч/млн 4,13-4,43 (м, 4H), 6,94 (д, J=8,31 Гц, 1H), 7,42 (м, 1H), 7,44 (м, 1H) 7,59 (м, 2H), 7,85 (м, 1H), 8,14 (д, J=7,81, 1H), 8,65 (м, 1H); ESIMS обнаружено CHNO m/z 284 (M+H).
Следующие соединения получали в соответствии с методикой, описанной выше в примере 4.
1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-3-(тиофен-2-ил)пропан-1,3-дион 16.
Желтое твердое вещество.
1
6
15
12
4
H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 4,34 (м, 4H), 6,98 (м, 1H), 7,15 (ушир. с, 1H), 7,59 (м, 1H), 7,64 (м, 2H), 8,01 (м, 1H), 8,28 (м, 1H); ESIMS обнаружено CHOS m/z 289 (M+H).
Пример 5.
Получение соединений (17) и (18) показано ниже на схеме 9
Схема 9
2
3
Реагенты и условия: a) DMSO, бромэтан, KCO, rt, в течение ночи.
Стадия a
2
3
4
6
19
18
4
1
Бромэтан (0,87 ммоль) медленно добавляли к раствору 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-3-фенилпропан-1,3-диона (XX) (0,39 ммоль) и KCO(1,58 ммоль) в DMSO (4 мл), перемешивая при комнатной температуре в атмосфере азота. Раствор затем перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере азота. Раствор выливали в смесь воды и эфира. Эфирный слой отделяли, промывали солевым раствором, сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией с получением 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-2-этил-3-фенилпропан-1,3-диона 17 в виде бесцветного вязкого масла (35% выход). H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 0,93 (т, J=7,4 Гц, 3H), 1,93 (м, 2H), 4,28 (м, 2H), 4,33 (м, 2H), 5,60 (т, J=6,5 Гц, 1H), 6,99 (д, J=8,6 Гц, 1H), 7,51-7,55 (м, 4H), 7,66 (м, 1H), 7,98 (д, J=7,3 Гц, 2H); ESIMS обнаружено CHO m/z 311 (M+H)
21
22
4
и 1-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-2,2-диэтил-3-фенилпропан-1,3-диона 18 в виде белого твердого вещества. ESIMS обнаружено CHO m/z 339 (M+H).
Пример 6.
Получение соединения (19) показано ниже на схеме 10.
Схема 10
3
2
3
Реагенты и условия: a) CHNO, Bi(OTf), 100ºC, 2ч
Стадия a
3
2
2
3
2
6
26
20
2
1
Раствор нафталин-1-илметанола (XXII) (0,75 ммоль) в CHNO (1 мл) медленно добавляли в течение 45 минут к раствору дибензоилметана (XXI) (2,27 ммоль) и Bi(OTf) (0,008 ммоль) в CHNO, нагревая при 100°C. Раствор затем перемешивали при 100°C в течение 2 часов. Раствор охлаждали, и растворитель удаляли под вакуумом. Остаток очищали колоночной хроматографией с получением 2-(нафталин-1-илметил)-1,3-дифенилпропан-1,3-диона 19 в виде желтого твердого вещества (75% выход). H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц):  ч/млн 3,75 (д, J=7 Гц, 2H), 6,23 (т, J=7 Гц, 1H), 7,24-7,38 (м, 6H), 7,50-7,55 (м, 4H), 7,57 (м, 1H), 7,81-7,87 (м, 5H), 8,14 (м, 1H); ESIMS обнаружено CHO m/z 365 (M+H).
Введение и фармацевтические композиции
Некоторые варианты осуществления включают фармацевтические композиции, содержащие: (a) безопасное и терапевтически эффективное количество соединения согласно формулам I, II или III, или его соответствующего энантиомера, диастереомера или таутомера, или фармацевтически приемлемой соли; и (b) фармацевтически приемлемый носитель.
Введение раскрытых в изобретении соединений или их фармацевтически приемлемых солей может быть осуществлено с помощью любого из общепринятых способов введения лекарственных средств, которые применяются в аналогичных случаях, включающих, но этим не ограничивая, пероральное, подкожное, внутривенное, интраназальное, местное, трансдермальное, интраперитонеальное, внутримышечное, внутрилегочное, вагинальное, ректальное или внутриглазное введение. Пероральное и парентеральное введения являются общепринятыми при назначаемых врачом терапиях.
Соединения изобретения, предназначенные для фармацевтического применения, могут быть введены в виде кристаллических или аморфных продуктов. Фармацевтически приемлемые композиции включают твердые, полутвердые, жидкие и аэрозольные лекарственные формы, такие как, например, таблетки, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, суппозитории, аэрозоли или другие подобные формы. Они могут быть получены, например, в виде тонких слоев с помощью таких методов, как осаждение, кристаллизация, лиофилизация, сушка распылением или сушка испарением. Для этой цели может быть использована сушка путем микроволнового и радиоволнового нагрева. Соединения могут быть также введены в лекарственных формах с замедленным или контролируемым высвобождением, включающих инъекции с замедленным всасыванием, осмотические насосы, пилюли, трансдермальные (включающие электроперенос) пластыри и другие подобные формы, для пролонгированного и/или приуроченного к определенному времени импульсного введения с заданной скоростью. Предпочтительно, чтобы композиции приготавливались в дозированных лекарственных формах, удобных для однократного введения соответствующей дозы.
st
Соединения могут быть введены или в чистом виде, или, что более типично, в комбинации с традиционным фармацевтическим носителем, вспомогательным веществом или другими подобными веществами. Термин "вспомогательное вещество" используется в описании изобретения для обозначения любого ингредиента помимо соединения (соединений) изобретения. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества включают, но этим не ограничивая, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, самоэмульгирующиеся системы доставки лекарственного вещества (SEDDS), такие как d-α-токоферол - полиэтиленгликоль 1000 сукцинат, поверхностно-активные вещества, используемые в фармацевтических лекарственных формах, такие как Tweens, или другие аналогичные полимерные матрицы для доставки лекарственных средств, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, двузамещенный фосфорнокислый натрий, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воски, блок-сополимеры полиэтилена с полиоксипропиленом и ланолин. Для улучшения доставки соединений описанных в изобретении формул могут также быть с успехом использованы циклодекстрины, такие как α-, β и γ-циклодекстрин, или их химически модифицированные производные, такие как гидроксиалкилциклодекстрины, включая 2- и 3-гидроксипропил-b-циклодекстрины, или другие растворимые производные. Могут быть приготовлены лекарственные формы или композиции, содержащие описанное в изобретении соединение в интервале от 0,005% до 100% и нетоксичный носитель в количестве по балансу. Предлагаемые композиции могут содержать 0,001%-100% активного ингредиента, в одном варианте осуществления, 0,1-95%, в другом варианте осуществления, 75-85%. Существующие в настоящее время методы приготовления таких лекарственных форм являются известными или являются очевидными для специалистов в области фармацевтики; например, смотрите Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 Edition (Lippincott Williams & Wilkins. 2005).
В одном предпочтительном варианте осуществления, композиции имеют форму дозированной лекарственной формы, такой как пилюля или таблетка, и при этом композиция может содержать, наряду с активным ингредиентом, разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальций фосфат или другие подобные вещества; скользящее вещество, такое как стеарат магния или другое подобное вещество; и связующее, такое как крахмал, гуммиарабик, поливинилпирролидон, желатин, целлюлоза, производные целлюлозы или другие подобные вещества. В другой твердой лекарственной форме, в желатиновую капсулу инкапсулируют порошок, marume, раствор или суспензию (например, в пропиленкарбонате, растительных маслах или триглицеридах). Также предлагаются дозированные лекарственные формы, в которых два активных ингредиента физически разделены; например, капсулы с гранулами каждого из лекарственных средств; двухслойные таблетки; желатиновые капсулы с двумя отделениями, и другие формы.
В другом предпочтительном варианте осуществления, описанные в изобретении композиции используют в качестве высвобождающих лекарственное средство покрытий для медицинского устройства, включающего, но этим не ограничивая, временные или постоянные имплантаты, губку, полимер или гель.
Имплантат согласно варианту осуществления изобретения представляет собой ортопедический имплантат, включающий, но этим не ограничивая, (i) тазобедренный сустав, (ii) винты, канюлированные винты, гвозди, сетки, каркасы, проволоки, стержни, гвозди для остеосинтеза, штифты, штыри, фиксаторы и пластинки, предназначенные для объединения или соединения костных фрагментов, кусочков или частей друг с другом, (iii) наружные костные фиксаторы, такие как монолатеральные, мультипланарные или гибридные фиксаторы, (iv) имплантаты, предназначенные для лечения дегенеративной неустойчивости, переломов, опухолей, и деформации позвоночника, (v) черепно- челюстно-лицевые имплантаты, предназначенные для лечения переломов, реконструкции и коррекции деформаций нижней челюсти, средней зоны лица или черепа, (vi) хирургические стенты, коллагеновые стенты, интрамедуллярные костные стенты, (vii) системы восстановления передней крестообразной связки (ACL) и задней крестообразной связки (PCL), (viii) зубные имплантаты.
В ряде случаев, соединение согласно формулам I, II или III вводят в комбинации с одним или более терапевтическими средствами, например, терапевтическими средствами, применяемыми при лечении описанных в изобретении поражений или состояний костей. Например, некоторые вторые терапевтические средства, такие как факторы роста, могут промотировать рост или инфильтрацию ткани. Примеры факторов роста для этой цели включают, без ограничения, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующие факторы роста (TGF), гормон паращитовидной железы (PTH), фактор, ингибирующий лейкоз (LIF) и инсулиноподобные факторы роста (IGF). Другие вторые терапевтические средства могут промотировать рост костей, такие как, костные морфогенетические белки (U.S. Pat. No. 4761471; PCT Pub. WO 90/11366), остеогенин (Sampath, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987), 84(20), 7109-7113), NaF (Tencer, et al., Journal of Biomedical Materials Research (1989), 23(6), 571-589). Пептидные последовательности, такие как IKVAV, могут быть добавлены для скрепления нервов и в случае неврита (Tashiro, et al, The Journal of Biological Chemistry (1989), 264(27), 16174-16182).
Жидкие фармацевтические композиции для введения могут быть приготовлены, например, путем растворения, диспергирования и других манипуляций, описанного выше активного соединения и необязательных фармацевтических вспомогательных веществ в носителе {например, воде, физиологическом растворе, водном растворе декстрозы, глицерине, гликолях, этаноле или других подобных средах) с образованием раствора или суспензии. Если желательно, то фармацевтическая композиция может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажнители, эмульгаторы, солюбилизирующие средства, буферные вещества для корректировки pH и другие подобные вещества (например, ацетат натрия, цитрат натрия, производные циклодекстрина, сорбитанмонолаурат, ацетат триэтаноламина, олеат триэтаноламина и другие подобные вещества). Инъецируемые препараты могут быть приготовлены в традиционных формах, или в виде жидких растворов или суспензий, в виде эмульсий, или в форме твердых веществ, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости непосредственно перед инъекцией. Концентрация активного соединения, содержащегося в таких парентеральных композициях, сильно зависит от конкретных свойств соединения, а также активности соединения и потребностей субъекта. Однако используемое содержание активного ингредиента в растворе составляет от 0,01% до 10%, и может быть выше в твердом веществе, которое затем разбавляют до указанных выше процентов. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает 0,2 - 2% активного вещества в растворе.
Следует отметить, что величины концентраций и доз могут также зависеть от тяжести состояния, подвергаемого лечению. Кроме того, следует иметь в виду, что конкретные режимы дозирования для любого конкретного пациента должны подбираться в течение времени в соответствии с его индивидуальной потребностью и на основании профессионального заключения медицинского специалиста, который осуществляет введение композиций или осуществляет контроль за введением композиций, и что устанавливаемые интервалы концентраций являются только примерами, и их не следует рассматривать в качестве ограничений объема или применения заявляемых композиций.
Твердые композиции могут быть предложены во множестве различных типов лекарственных форм, в зависимости от физико-химических свойств лекарственного средства, требуемой скорости растворения, вопросов стоимости и других критериев. В одном из вариантов осуществления, твердая композиция представляет собой одну монолитную форму. Это означает, что одноразовая доза лекарственного средства заключена в одну физически различимую твердую форму или изделие. Другими словами, твердая композиция составляет одно целое, в отличие от множественной стандартной лекарственной формы, в которой единицы инкогерентны.
Примеры единичных стандартных лекарственных форм, которые могут быть использованы в качестве лекарственных форм для твердых композиций, включают таблетки, такие как прессованные таблетки, пленкообразные элементы, напоминающие фольгу элементы, вафли, лиофилизированные матричные элементы и другие подобные формы. В предпочтительном варианте осуществления, твердая композиция представляет собой высокопористую лиофилизированную форму. Такие лиофилизаты, называемые иногда вафлями или лиофилизированными таблетками, применяют, в частности, тогда, когда требуется быстрый распад лекарственной формы, который также способствует быстрому растворению активного соединения.
С другой стороны, для некоторых применений, твердые композиции могут также быть приготовлены в виде множественной стандартной лекарственной формы, описанной выше. Примерами множественной стандартной лекарственной формы являются порошки, гранулы, микрочастицы, крупинки, шарики, лиофилизированные порошки и другие подобные формы. В одном варианте осуществления, твердая композиция представляет собой лиофилизированный порошок. Такая диспергированная лиофилизированная система включает множество частиц порошка, и вследствие процесса лиофилизации, используемого при приготовлении порошка, каждая частица имеет беспорядочную пористую микроструктуру, благодаря которой порошок способен очень быстро абсорбировать воду, что обеспечивает в результате быстрое растворение.
Другим типом многочастичной системы, которая также способна обеспечивать быстрое растворение лекарственного средства, является система порошков, гранул или крупинок из водорастворимых вспомогательных веществ, на которые наносят покрытие из лекарственного средства, в результате чего лекарственное средство расположено на внешней поверхности индивидуальных частиц. В этом типе системы, водорастворимое низкомолекулярное вспомогательное вещество применяют для приготовления сердцевины таких частиц с нанесенным слоем, на которые затем может быть нанесена композиция, включающая лекарственное средство и, предпочтительно, одно или более дополнительных вспомогательных веществ, таких как связующее, порообразователь, сахарид, сахарный спирт, пленкообразующий полимер, пластификатор или другие вспомогательные вещества, применяемые в фармацевтических композициях, наносимых в виде покрытий.
Кроме того, изобретение предлагает наборы. Обычно, набор включает одно или более описанных в изобретении соединений или композиций. В конкретных вариантах осуществления, набор может включать одну или более систем доставки, например, для доставки или введения предлагаемого выше соединения, и инструкции по использованию набора (например, инструкции по лечению пациента). В другом варианте осуществления, набор может включать описанное в изобретении соединение или композицию и наклейку, на которой указано, что содержимое предназначено для введения пациенту, страдающему онкологическим заболеванием. В другом варианте осуществления, набор может включать описанное в изобретении соединение или композицию и наклейку, на которой указано, что содержимое предназначено для введения пациенту, страдающему одним или более заболеваниями, такими как остеопороз и остеоартропатия; несовершенный остеогенез, дефекты костей, переломы костей, пародонтоз, отосклероз, заживление раны, черепно-лицевые дефекты, онколитическое заболевание костей, травматические повреждения мозга, относящиеся к дифференцировки и развитию центральной нервной системы, включающие болезнь Паркинсона, удары, ишемическое церебральное заболевание, эпилепсию, болезнь Альцгеймера, депрессивное состояние, биполярное расстройство, шизофрению; глазные заболевания, такие как возрастная макулярная дегенерация, диабетический макулярный отек, наследственная экссудативная витреоретинопатия или пигментный ретинит, и заболевания, относящиеся к дифференцировке и росту стволовых клеток, включающие выпадение волос, заболевания, относящиеся к гемопоэзу, заболевания, относящиеся к регенерации тканей, и другие заболевания, связанные с нарушениями развития и дифференцировки стволовых клеток пролиферации клеток.
Фактически применяемая величина дозы активных соединений настоящего изобретения зависит от конкретного соединения и от состояния, подвергаемого лечению; для специалиста в области медицины выбор соответствующей дозы не составляет никаких проблем.
Способы лечения
Предлагаемые изобретением соединения и композиции могут быть использованы в качестве активаторов одного или более членов сигнального пути Wnt, включая одного или более Wnt белков, и, следовательно, могут применяться для лечения ряда расстройств и заболеваний, при которых имеет место аберрантная передача сигналов Wnt, таких как остеопороз и остеоартропатия; несовершенный остеогенез, дефекты костей, переломы костей, пародонтоз, отосклероз, заживление раны, черепно-лицевые дефекты, онколитическое заболевание костей, травматические повреждения мозга, относящиеся к дифференцировке и развитию центральной нервной системы, включающие болезнь Паркинсона, удары, ишемическое церебральное заболевание, эпилепсию, болезнь Альцгеймера, депрессивное состояние, биполярное расстройство, шизофрению; глазные заболевания, такие как возрастная макулярная дегенерация, диабетический макулярный отек, наследственная экссудативная витреоретинопатия или пигментный ретинит, и заболевания, относящиеся к дифференцировке и росту стволовых клеток, включающие выпадение волос, заболевания, относящиеся к гемопоэзу, заболевания, относящиеся к регенерации тканей, и другие заболевания, связанные с нарушениями развития и дифференцировки стволовых клеток пролиферации клеток.
Что касается выпадения волос, то известно, что канонический сигнальный путь Wnt/β-катенина регулирует развитие и регенерацию волосяного фолликула. В эпидермисе, развитие волосяного фолликула инициируется при заполнении кожи мезенхимальными клетками. Во время этого процесса, сигналы, исходящие из дермы, индуцируют уплотнение эпителия, удлинение эпителиальных клеток и образование плакодов, содержащих Wnt-восприимчивые клетки. В результате, плакоды передают сигнал клеткам кожи к уплотнению, в результате чего формируется компонент дермальной папиллы волосяного фолликула, который также восприимчив к передаче сигналов Wnt. Из волосяного эпителия выделяется Wnt3α и оказывает аутокринное и паракринное действие, и было показано, что Wnt-3α поддерживает на стадии анагена экспрессию гена в клетках дермальной папиллы и опосредует побуждающую к росту волос активность в культуре органа. Этот Wnt-3α-опосредованный рост волос может зависеть от канонического сигнального пути Wnt/β-катенина, так как делеция гена β-катенина или Lef1 приводила к выпадению волос у мышей. Соответственно, описанные в изобретении соединения и композиции могут применяться местно для лечения выпадения волос путем модулирования сигнального пути Wnt/β-катенина.
Что касается нейродегенеративных заболеваний, то система сигнальной трансдукции Wnt/β-катенина играет очень важную роль в дифференцировке и развитии нейронов для центральной нервной системы. В частности, было обнаружено, что передача сигнала Wnt/β-катенин связана с заболеваниями, являющимися результатом аномалии нейронов.
Более конкретно, в случае болезни Альцгеймера, исследования показывают, что устойчивая потеря функции передачи сигнала Wnt может приводить к Αβ-зависимой нейродегенерации, наблюдаемой в мозге при болезни Альцгеймера. Следовательно, описанные в изобретении соединения и композиции могут применяться для реактивации потерянной функции передачи сигнала Wnt, принимающей участие при нейродегенерации.
Другие нейродегенеративные заболевания могут также подвергаться лечению с помощью описанных в изобретении соединений и композиций.
Более конкретно, нейродегенеративные заболевания, которые могут быть подвергнуты лечению с помощью описанных в изобретении соединения, композиций и способов, включают, но этим не ограничивая, следующие:
болезнь Паркинсона, шизофрению, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз (болезнь Лу Герига), первичный боковой склероз (PLS), прогрессирующую атрофию мышц (PMA), биполярное расстройство, депрессивное состояние, удар, ишемическое церебральное заболевание, эпилепсию, повреждение головного мозга и спинально-церебеллярную атаксию типа 1 (SCA1).
Что касается глазных заболеваний, то система сигнальной трансдукции Wnt/β-катенин регулирует поддержание популяции ретинальных клеток-предшественников в цилиарной маргинальной зоне (CMZ), и, следовательно, функционирует в качестве предполагаемого фактора стволовых клеток в сетчатке. В частности, было обнаружено, что пути Wnt/β-катенина опосредуют процесс восстановления сетчатки, и что применение Wnt активаторов может промотировать регенерацию нейронов сетчатки. При повреждении, Wnt могут выполнять защитную роль. Недавно было показано, что Wnt3α обеспечивает защиту зрительных рецепторов. Результаты настоящего исследования могут быть убедительно объяснены повышенной регуляцией самообновления стволовых клеток при повреждении.
Соответственно, описанные в изобретении соединения и композиции могут быть использованы для усиленного восполнения вызванной заболеванием потери нейронов, и защиты зрительных рецепторов при травме путем модулирования сигнального пути Wnt/β-катенина.
Другие глазные заболевания могут также быть подвергнуты лечению с помощью описанных в изобретении соединений и композиций.
Более конкретно, глазные заболевания, которые могут быть подвергнуты лечению с помощью описанных в изобретении соединения, композиций и способов, включают, но этим не ограничивая, следующие:
возрастную макулярную дегенерацию, диабетический макулярный отек, наследственную эксудативную витреоретинопатию и пигментный ретинит.
Что касается заболеваний, связанных с дифференцировкой и ростом стволовых клеток, то передача сигнала Wnt/β-катенин является очень важной при самообновлении стволовых клеток во многих различных тканях, включающих кожу, кишечник, мозг и кровь. Поэтому, описанные в изобретении соединения и композиции могут быть использованы для лечения расстройств и заболеваний, относящихся к нарушениям развития.
Оценка биологической активности
Биологическая активность описанных в изобретении соединений может быть исследована с помощью подходящего анализа, известного специалистам в этой области, например, приведенного в патентных документах WO 2001/053268 или WO 2005/009997. Например, активность соединения может быть исследована с помощью одного или более методов испытания, изложенных ниже.
Пример 7.
Соединения, которые усиливают Wnt активность, или активаторы, исследовали следующим образом. Генерировали линии клеток-репортеров путем стабильной трансдукции клеток линии раковых клеток (например, рака толстой кишки) с помощью лентивирусной конструкции, которая включает Wnt-восприимчивый промотор, управляющий экспрессией гена люциферазы светлячка.
Были приготовлены лентивирусные конструкции, в которых SP5 промотор, промотор, имеющий восемь TCF/LEF связывающих сайтов, полученных из SP5 промотора, связан с 3'-5' направлениями гена люциферазы светлячка. Лентивирусные конструкции могут также включать ген, устойчивый к действию гигромицина, в качестве селектируемого маркера. Конструкцию промотора SP5 использовали для трансдукции SW480 клеток, линии клеток рака толстой кишки, имеющих мутированный APC ген, который генерирует процессированный APC белок, приводя к нерегулируемому накоплению β-катенина.
50
Культивируемые SW480 клетки, несущие репортерскую конструкцию, могут быть распределены с плотностью приблизительно 10000 клеток на лунку в 384-луночных или 96-луночных планшетах. Затем в лунки могут быть добавлены испытываемые соединения изобретения при полулогарифмических разбавлениях, используя максимальную концентрацию три или десять микромолей. В ряд контрольных ячеек для каждого типа клеток добавляли только буфер и растворитель DMSO. Через двадцать четыре часа после добавления соединения, может быть проанализирована репортерная активность для люцефиразы, например, путем добавления люминесцентного реагента BrightGlo (Promega) и использования планшет-ридера Victor3 (Perkin Elmer). Считываемые данные нормализуют относительно клеток, которые были обработаны только с помощью DMSO, и любые активности выше значения активности для DMSO считаются активацией. Соединения считают активаторами, если их репортерная активность превышает в 2 раза или более активность DMSO. EC представляет собой концентрацию, при которой достигается половина максимальной активности. В таблице 2 приведена активность выбранных активаторов.
Таблица 2.
Соединение
Wnt активация, IC<sub>50</sub>
Соединение
Wnt активация, IC<sub>50</sub>
1
0,028-0,029 мкМ
10
>10 мкМ
2
0,013 мкМ
11
>10 мкМ
3
0,036-0,041 мкМ
12
>10 мкМ
4
0,61-1,0 мкМ
14
>10 мкМ
5
0,64-1,9 мкМ
15
0,68-2,1 мкМ
6
2,1 мкМ
16
2,57 мкМ
7
0,096-0,27 мкМ
17
>10 мкМ
8
0,083 мкМ
18
6,0 мкМ
9
>10 мкМ
19
2,8-5,0 мкМ
Используемый в описании изобретения термин "включающий" является синонимом выражений "имеющий в своем составе", "содержащий" или "характеризуемый", и он является включающе-отличающим или допускающим изменения термином, и он не исключает дополнительные неперечисленные элементы или стадии способа.