СПОСОБ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК LAK
METHOD FOR PROLIFERATION OF LAK CELLS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Это изобретение относится к способу пролиферации клеток LAK, к препарату клеток, содержащему пролифелирующие клетки, LAK, к способу лечения заболеваний (таких как рак, иммунологические заболевания и инфекционные заболевания), не относящихся к человеку животных с использованием препарата клеток и к набору для культивирования клеток для применения для пролиферации клеток LAK.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В данной области является общеизвестным то, что способ лечения, такой как хирургическая терапия посредством удаления очага поражения, химиотерапия посредством введения противораковых средств и радиотерапия посредством применения радиации к очагу поражения, можно использовать в качестве средства для лечения рака и/или опухолей.
Однако эти виды терапии обладают некоторыми недостатками для пациентов, такими как значительная физическая нагрузка и неблагоприятные эффекты, связанные с химическими средствами или ионизирующей радиацией. Таким образом, с 1980 г. в качестве четвертого вида терапии исследовали терапию с использованием активированных аутологичных лимфоцитов, такую как терапию LAK (лимфокин-активированными киллерами) и терапию CTL (цитотоксическими T-лимфоцитами), и стали использовать для лечения раковых заболеваний человека (см. Непатентный документ 1).
В данной области термин «терапия LAK» относится к способу лечения рака у пациента с использованием иммунитета, вызванного аутологичными лимфоцитами пациента, которые подвергают пролиферации и активации ex vivo. В частности «терапия LAK» представляет собой способ лечения рака посредством следующих стадий: (1) отбора крови у пациента, страдающего раком, и выделения фракции, содержащей лимфоциты; (2) пролиферации и активации лимфоцитов посредством культивирования выделенной таким образом фракции в культуральной среде, дополненной интерлейкином-2 и антителом против CD3, приблизительно в течение двух недель; (3) промывания полученной таким образом суспензии клеток, содержащей некоторое число лимфоцитов, удаления интерлейкина-2, антитела против CD3 и культуральной среды от клеток, и суспендирования полученных таким образом лимфоцитов в подходящем растворе (таком как физиологический солевой раствор для инфузии, содержащий альбумин), с получением препарата клеток, и (4) введения препарата клеток, с возвращением активированных лимфоцитов обратно в организм пациента. Терапия CTL также представляет собой способ с использованием цитотоксических T-лимфоцитов вместо клеток LAK, после пролиферации и активации цитотоксических T-лимфоцитов.
Терапию с использованием активированных аутологичных лимфоцитов улучшали по различным пунктам, как и другую терапию. Например, посредством культивирования суспензии клеток, содержащих аутологичные лимфоциты, в культуральной среде, дополненной митогенами T-клеток (такими как конканавалин A) и цитокином (таким как интерлейкин 7), вместо антитела против CD3, в данной области разработан способ эффективного лечения рака посредством специфической пролиферации/активации T-клеток γδ-типа (непосредственно вовлеченных в опосредованный клетками иммунитет) вместо активации всех лимфоцитов (см. Патентные документы 1 и 2).
В данной области терапию с использованием активированных аутологичных лимфоцитов (такую как терапия LAK или терапия CTL) пытались применять к заболеваниям, отличным от рака (таким как иммунологические заболевания или инфекционные заболевания), как описано в Патентных документах 1 и 2.
Однако существуют некоторые проблемы, которые необходимо разрешить. Во-первых, поскольку белок CD3, применяемый в качестве иммуногена, чтобы вызвать образование антитела против CD3, отличается у различных видов, из которых он происходит (таких как собака, кошка, домашние животные и человек), антитела против CD3 необходимо получать для каждого вида, подлежащего лечению. Кроме того, антитела против CD3, особенно антитело против CD3 для человека, в настоящее время применяемые в данной области, являются очень дорогими. Таким образом, считают, что терапию с использованием активированных аутологичных лимфоцитов (такую как терапия LAK или терапия CTL) с экономической точки зрения сложно применять для не относящихся к человеку животных.
Также рассматривают как проблему и то, что поскольку для T-клеток γδ-типа не показали антигенной специфичности или MHC-рестрикции даже в результате пролиферации T-клеток γδ-типа T-клетки γδ-типа не настолько применимы для терапии с использованием активированных аутологичных лимфоцитов (такой как терапия LAK или терапия CTL).
Патентный документ 1: Japanese Patent Domestic Announcement No.2002-528115 (JP-2002-528115-W)
Патентный документ 2: Japanese Patent Domestic Announcement No.2003-529363 (JP-2003-529363-W)
Непатентный документ 1: [найден 27 июня 2006 г.], в Интернет <URL: http://www.j-immunother.com/treatment/02Treatment.html>
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, КОТОРЫЕ НЕОБХОДИМО РАЗРЕШИТЬ ПОСРЕДСТВОМ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящей заявки является предоставление способа лечения, эффективного для различных видов рака, вызванных иммунодефицитом заболеваний и инфекций, и связанного с ним способа пролиферации/активации клеток, которые можно осуществлять при настолько низкой стоимости, что эти способы можно применять к не относящимся к человеку животным.
СРЕДСТВА ДЛЯ РАЗРЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
Основным признаком настоящего изобретения является дополнение растительным лектином (таким как конканавалин A) и фактором роста, обладающим интерлейкин-2-подобной активностью, культуральной среды при культивировании клеток, полученных из исходного образца.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
[ФИГ.1] Фиг.1 представляет собой график, показывающий эффект различий в концентрации конканавалина A в культуральной среде на пролиферацию T-клеток αβ-типа.
[ФИГ.2] Фиг.2 представляет собой график, показывающий эффект присутствия или отсутствия конканавалина A в культуральной среде на экспрессию рецептора интерлейкина-2 на поверхности периферических лимфоцитов собаки.
[ФИГ.3] Фиг.3 представляет собой график, показывающий влияние различий в концентрации сыворотки в культуральной среде на пролиферацию T-клеток αβ-типа.
[ФИГ.4] Фиг.4 представляет собой график, показывающий влияние различий в концентрации интерлейкина-2 в культуральной среде на пролиферацию T-клеток αβ-типа.
[ФИГ.5] Фиг.5 представляет собой график, показывающий результат культивирования T-клеток αβ-типа, полученных от различных собак, в присутствии аутологичной сыворотки каждой собаки.
[ФИГ.6] Фиг.6 представляет собой график, показывающий результат культивирования T-клеток αβ-типа, полученных от различных собак, в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки.
[ФИГ.7] Фиг.7 представляет собой график, показывающий результат культивирования T-клеток αβ-типа, полученных от различных кошек, в присутствии аутологичной сыворотки каждой кошки или эмбриональной бычьей сыворотки.
[ФИГ.8] На Фиг.8 показаны гистограммы проточной цитометрии при измерении до и после пролиферации клеток.
[ФИГ.9] Фиг.9 представляет собой график, показывающий результат цитотоксичности периферических лимфоцитов собаки, культивируемых в культуральной среде, дополненной конканавалином A и интерлейкином-2, против клеток меланомы человека.
[ФИГ.10] Фиг.10 представляет собой фотографию после электрофореза, показывающую влияние культивирования периферических лимфоцитов собаки в культуральной среде, дополненной конканавалином A и интерлейкином-2, на активность транскрипции мРНК гранзима B.
[ФИГ.11] Фиг.11 представляет собой график, показывающий цитотоксичность периферических лимфоцитов против клеток меланомы человека, где периферические лимфоциты получены на последовательных стадиях культивирования периферических лимфоцитов собаки в культуральной среде, дополненной конканавалином A и интерлейкином-2, переноса культивированных периферических лимфоцитов собаки собаке, из которой происходят лимфоциты, и получения периферических лимфоцитов от собаки, подвергшейся переносу.
[ФИГ.12] На фиг.12 показаны фотографии, показывающие изменение пораженного участка у собаки, страдающей от рака, которую подвергали лечению способом согласно изобретению. Фиг.12(a) представляет собой фотографию пораженного участка перед лечением, а ФИГ. 12(b) представляет собой фотографию пораженного участка после лечения.
[ФИГ.13] На фиг.13 показаны фотографии, показывающие изменения пораженного участка у собаки, страдающей демодикозом собак (демодекозным акариазом), которую подвергали лечению способом согласно изобретению. Фиг.13(a) представляет собой фотографию пораженного участка перед лечением, а фиг.13(b) представляет собой фотографию пораженного участка после лечения.
[ФИГ.14] На фиг.14 показаны фотографии, показывающие изменения других пораженных участков у той же самой собаки, что и на фиг.13. Фиг.14(a) представляет собой фотографию пораженного участка перед лечением, а фиг.13(b) представляет собой фотографию пораженного участка после лечения.
ОБОЗНАЧЕНИЯ
1: опухоль
2 и 3: пораженные участки
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ пролиферации клеток LAK
Способ пролиферации клеток LAK согласно изобретению включает в себя следующие стадии: (1) стадию сбора посредством забора исходного образца, содержащего T-клетки αβ-типа, от животного; и (2) стадию пролиферации/активации посредством культивирования клеток полученного таким образом исходного образца в культуральной среде, дополненной по меньшей мере растительным лектином и фактором роста, обладающим интерлейкин-2-подобной активностью, и пролиферации и активации клеток. Соответствующие стадии согласно изобретению подробно проиллюстрированы ниже.
(1) Стадия сбора
Целью этой стадии является отбор у животного исходного образца, содержащего T-клетки αβ-типа.
(a) Животное
Термин «животное» относится к животному-млекопитающему, включая собаку, кошку, домашних животных, таких как корова и лошадь, и к человеку, а термин «не относящееся к человеку животное» относится к животному-млекопитающему, отличному от человека.
(b) Исходный образец
Жидкость или ткань организма, содержащие T-клетки αβ-типа или их клетки-предшественники, можно использовать в качестве «исходного образца» для пролиферации. Конкретно пример исходного образца включает в себя периферическую кровь, пуповинную кровь, костный мозг, лимфатическую ткань, эпителий, тимус, печень, селезенку, раковую ткань, инфицированную ткань, ткань лимфатических узлов, эмбриональную ткань или их фракции. В частности фракции периферической крови предпочтительно используют в качестве исходного образца, принимая во внимание высокую плотность T-клеток αβ-типа и простоту их получения.
(c) Сбор
4
Можно использовать любые известные способы для сбора исходного образца. В частности, например, в случае, когда исходный образец представляет собой жидкость организма, исходный образец можно собирать наслаиванием жидкости организма, собранной у субъекта с использованием шприца для инъекций, поверх раствора, обладающего подходящей определенной удельной плотностью, и сортировкой подходящих фракций способом центрифугирования в градиенте плотности. Следует заметить, что в случае, когда исходный образец обогащен красными клетками крови, обладающими удельной плотностью, сходной с плотностью T-клеток αβ-типа, в частности, в случае, когда периферическую кровь используют в качестве исходного образца, концентрацию T-клеток αβ-типа в образце можно дополнительно увеличить предварительным разрушением красных клеток крови с использованием буферного раствора, такого как буферный раствор NHCl. Кроме того, в случае, когда периферическую кровь используют в качестве исходного образца, гепарин, лимонную кислоту и т.п. можно добавлять к исходному образцу для предупреждения свертывания.
Кроме того, в случае, когда ткань используют в качестве исходного образца, исходный образец можно собирать посредством следующих стадий: трипсинизации фрагмента ткани, вырезанного у субъекта посредством хирургической операции, для расщепления молекул межклеточной адгезии, диспергирования полученных таким образом клеток в культуральной среде, с получением суспензии клеток, наслаивания суспензии клеток поверх раствора, обладающего подходящей удельной плотностью, и сортировки подходящих фракций способом центрифугирования в градиенте плотности.
(d) Другое
Можно осуществлять эффективную пролиферацию большинства T-клеток αβ-типа известным способом сбора исходного образца, предварительно обогащая T-клетками αβ-типа путем центрифугирования. Примеры известных способов включают в себя способ обогащения только T-клетками αβ-типа путем пропускания суспензии клеток через колонку аффинной хроматографии с иммобилизованным антителом или способ исключения из суспензии только T-клетки γδ-типа.
(2) Стадия пролиферации/активации
Стадия «пролиферации/активации» представляет собой стадию пролиферации/активации клеток в собранном таким образом исходном образце в культуральной среде, дополненной по меньшей мере растительным лектином и фактором роста, обладающим интерлейкин-2-подобной активностью.
В контексте настоящего изобретения термин «пролиферация» означает культивирование клеток in vitro. Далее, термин «культивирование» означает, что клетки помещают в культуральную среду, дополненную источниками питательных веществ и т.п., которые необходимы для выживания клеток и предоставляют клеткам возможность размножаться. Далее, термин «активация» означает регуляцию функции клеток, так что функции клеток активируют путем стимуляции клеток; более конкретно термин «активация» означает индукцию или улучшение противоопухолевой активности клеток, активности клеток против иммунологического заболевания или активности клеток против инфекционных заболеваний.
(a) Растительный лектин
Термин «растительный лектин» означает глико-связывающий белок, полученный из организма растения; в частности «растительный лектин» включает в себя в качестве неограничивающих примеров конканавалин A, фитогемагглютинин, митоген лаконоса и т.п. Учитывая стоимость и доступность лектина, в качестве растительного лектина предпочтительно используют конканавалин A. Далее, концентрация конканавалина A в культуральной среде предпочтительно лежит в диапазоне от 1 до 15 мкг/мл, более предпочтительно в диапазоне от 5 до 10 мкг/мл.
(b) Фактор роста, обладающий интерлейкин-2-подобной активностью
Выражение «фактор роста, обладающий интерлейкин-2-подобной активностью» означает любые соединения, обладающие способностью, сходной со способностью интерлейкина-2, вызывать пролиферацию T-клеток αβ-типа. В частности «фактор роста, обладающий интерлейкин-2-подобной активностью», включает в себя в качестве неограничивающих примеров собственно интерлейкин-2 и функциональный эквивалент, такой как модифицированный интерлейкин-2 с заменой (заменами) аминокислот, частично расщепленный интерлейкин-2, миметик интерлейкина-2 и т.п. Кроме того, пока соединение удовлетворяет описанным выше условиям, нет необходимости ограничивать источник факторов роста, таких как интерлейкин-2 и т.п. Например, согласно изобретению можно использовать фактор роста, полученный из организма человека, собаки, кошки, домашнего животного и т.п. Из них интерлейкин-2 предпочтительно используют в качестве фактора роста из-за его доступности. Концентрация фактора роста, обладающего интерлейкин-2-подобной активностью, предпочтительно лежит в диапазоне от 1 to 1000 Ед./мл, более предпочтительно лежит в диапазоне от 500 до 750 Ед./мл.
(c) Пролиферация и активация
(c1) Культуральная среда
Любую известную культуральную среду (без какого-либо ограничения), такую как коммерчески доступная культуральная среда (такая как в качестве неограничивающих примеров культуральная среда RPMI-1640, доступная из Nissui Pharmaceutical Co, Ltd.), можно использовать в качестве культуральной среды согласно изобретению при условии, что культуральная среда дополнена растительным лектином и фактором роста, обладающим интерлейкин-2-подобной активностью. В данной области можно использовать бессывороточную культуральную среду. Однако чтобы стимулировать пролиферацию клеток в качестве культуральной среды, предпочтительно используют культуральную среду, содержащую сыворотку. Любую коммерчески доступную сыворотку, такую как эмбриональная бычья сыворотка, можно использовать в качестве сыворотки. Можно использовать также сыворотку, которая аллогенно получена из видов животных, у которых отбирали исходный образец или их аутологичную сыворотку. В случае, когда сыворотку добавляют к культуральной среде, добавленное количество предпочтительно лежит в диапазоне от 1 до 20 мас.% от количества культуральной среды, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 5 мас.% от количества культуральной среды.
(c2) Способ культивирования
2
Культивирование клеток можно проводить с использованием обычного способа культивирования для культивирования клеток животных, т.е. помещения сосуда для культивирования, содержащего культуральную среду, в CO-инкубатор. Любые известные сосуды для культивирования, включая в качестве примеров планшет для культивирования клеток, чашку для культивирования клеток, флакон для культивирования клеток, роллерный флакон, проницаемый для газа пакет для культивирования и т.д., можно использовать в качестве сосуда для культивирования.
2
2
2
Концентрация CO в CO-инкубаторе предпочтительно лежит в диапазоне 1-10%, более предпочтительно в диапазоне 3-7%. Температура в CO-инкубаторе предпочтительно лежит в диапазоне 30-40°C, более предпочтительно в диапазоне 35-38°C.
Нет необходимости ограничивать период культивирования, сходный с периодом в случае обычной культуры клеток животных. Для пролиферации и активации клеток период культивирования предпочтительно лежит в диапазоне приблизительно от 2 до 20 суток, более предпочтительно в диапазоне приблизительно от 7 до 14 суток. Во время периода культивирования можно проводить микроскопическое обследование состояния клеток для подсчета числа клеток, чтобы добавлять свежую культуральную среду или ее конкретные составляющие в культуральную среду в зависимости от состояния культивируемых клеток, и в некоторых случаях заменять культуральную среду или пассировать пролиферирующие клетки в свежую культуральную среду, содержащуюся в другом сосуде для культивирования.
2. Суспензия клеток и препарат клеток
Суспензию клеток, где T-клетки αβ-типа в исходном образце подвергали пролиферации или активации (обогащению) с использованием способа пролиферации клеток LAK, описанного в разделе 1 выше, можно использовать для различных типов экспериментов в качестве суспензии клеток. После удаления из суспензии клеток, содержащихся там в культуральной среды, растительного лектина и фактора роста, обладающего интерлейкин-2-подобной активностью, (стадия удаления), собранные клетки ресуспендируют в подходящем растворе при подходящей плотности клеток (стадия получения), с получением препарата клеток. Стадия удаления и стадия получения более подробно описаны ниже.
Полученный таким образом препарат клеток содержит клетки, которые подвергали пролиферации способом пролиферации клеток LAK согласно изобретению. Пока препарат клеток можно использовать для лечения заболевания, нет необходимости ограничивать форму, исходный образец, виды животных, от которых отбирали исходный образец, тип раствора для применения для ресуспендирования и т.п.
(3) Стадия удаления
После завершения стадии пролиферации/активации для предотвращения нежелательной иммунной реакции, потенциально вызываемой культуральной средой или растительным лектином, можно использовать любые известные способы для удаления культуральной среды или растительного лектина посредством сбора только клеток, содержащихся в культуральной среде, и отмывки культуральной среды, удерживаемой на поверхности клеток.
В частности способ удаления культуральной среды или растительного лектина включает в себя способ, включающий в себя стадии центрифугирования сосуда для культивирования для осаждения клеток, удаления культуральной среды путем декантации и ресуспендирования клеток в забуферивающем растворе или способ с использованием колонок для центрифугирования. Способ удаления культуральной среды или растительного лектина также включает в себя способ с использованием магнитных бусин, на которых иммобилизовано антитело против T-клеток αβ-типа, или способ аффинной хроматографии, способ выделения только этих клеток с использованием сочетания флуоресцентного антитела против T-клеток αβ-типа и способа проточной цитометрии.
(4) Стадия получения
После удаления культуральной среды любые известные способы, такие как способ, включающий в себя добавление подходящего раствора в культуральный флакон, содержащий клетки, и суспендирование клеток путем перешивания со встряхиванием, можно использовать для суспендирования собранных клеток в подходящем растворе при подходящей плотности клеток.
5
7
6
6
Любые известные растворы можно использовать в качестве раствора для суспендирования клеток при условии, что растворы можно использовать для поддержания свойств клеток LAK, и они не вызывают какой-либо неблагоприятной иммунной реакции, такой как иммунологическое отторжение у не относящегося к человеку животного, которому вводят препарат клеток, содержащий этот раствор. В частности раствор может включать в себя в качестве примеров обычный раствор для инфузии (такой как раствор для инфузии, содержащий альбумин, витамин, глюкозу и т.п.) или культуральную среду, содержащую аутологичную сыворотку. Плотность клеток в растворе меняется в зависимости от исходного образца, вида животных, из которых собраны клетки, типа раствора для использования для ресуспендирования. Согласно изобретению клетки при плотности в диапазоне 1×10 - 1×10 клеток/мл, более предпочтительно при плотности в диапазоне 1×10 - 6×10 клеток/мл, предпочтительно используют для получения препарата клеток.
3. Способ лечения
Настоящее изобретение относится к способу лечения не относящегося к человеку животного, страдающего от рака или опухолей, заболеваний, вызванных иммунодефицитом или инфекционных заболеваний, посредством введения эффективного количества препарата клеток, в частности эффективного количества препарата клеток, происходящих из исходного образца не относящегося к человеку животного, у которого собран исходный образец (т.е. стадии введения). Эффективное количество означает общее количество препарата клеток, необходимого для желаемого исхода (такого как полное излечение от заболевания), и его можно определить, например, на основании числа клеток, подлежащих введению в однократной дозе, числа доз в сутки или суток дозирования на один месяц.
(5) Стадия введения
(a) Подробное описание введения
Введение клеток можно осуществлять любыми известными способами при условии, что известным способом можно доставлять препарат клеток внутрь организма не относящегося к человеку животного, в частности в кровеносный сосуд посредством инфузии или инъекции. Согласно изобретению инфузию предпочтительно используют для доставки большого числа клеток LAK в организм не относящегося к человеку животного.
6
7
6
7
Применяемая доза для инфузии меняется в зависимости от видов рассматриваемых животных, типа заболеваний, подлежащих лечению и т.п. Согласно изобретению клетки предпочтительно вводят в дозе 1×10 - 5×10 клеток на 1 кг массы тела, более предпочтительно в дозе 5×10 - 1×10 клеток на 1 кг массы тела. Частота введения клеток также меняется в зависимости от видов рассматриваемых животных, типа заболеваний, подлежащих лечению. Согласно изобретению введение клеток предпочтительно осуществляют с частотой один раз/10 суток - один раз/14 суток или дважды/месяц - три раза/месяц, более предпочтительно с частотой один раз/7 суток - один раз/8 суток или четыре раза/месяц - пять раз /месяц.
(b) Заболевания, подлежащие лечению
Рак или опухоли, подлежащие лечению данным способом, могут включать в себя, в качестве неограничивающих примеров, такие рак или опухоли, например рак легких, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак тела матки, рак мочевого пузыря, лейкоз, остеогенная саркома, церебральная опухоль и т.п.
Вызванные иммунодефицитом заболевания, подлежащие лечению этим способом, могут включать в себя, в качестве неограничивающих примеров, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, синдром Шегрена, миастению, злокачественную анемию, хронический тиреоидит (болезнь Хашимото), СПИД и т.п.
Инфекционные заболевания, подлежащие лечению этим способом, могут включать в себя в качестве неограничивающих примеров вирусные инфекционные заболевания (такие как вызванные вирусом собачьей чумы, вирусом бешенства, парвовирусом, вирусом иммунодефицита кошек), бактериальные инфекционные заболевания, протозойные инфекционные заболевания (такие как филяриоз и токсоплазмоз), клещевые инфекционные заболевания (такие как демодикоз собак (демодекозный акариаз) и отодектоз) и т.п.
4. Набор для пролиферации
Каждый из компонентов, необходимых для пролиферации клеток (такой как растительный лектин, фактор роста, обладающий интерлейкин-2-подобной активностью, культуральная среда, сосуд для культивирования клеток), применяемых в способе пролиферации клеток LAK согласно изобретению, можно покупать отдельно от различных производителей. Альтернативно можно предварительно объединять эти компоненты для получения набора для пролиферации, чтобы избавить специалиста от проблем с покупкой каждого компонента отдельно и чтобы легче достигать пролиферации клеток.
Набор для пролиферации согласно изобретению включает в себя широкое множество наборов, таких как простой набор, содержащий необходимый растительный лектин и фактор роста, обладающий интерлейкин-2-подобной активностью, или набор, содержащий культуральную среду, сосуд для культивирования клеток и/или другие компоненты, такие как другие факторы роста, в дополнение к необходимому растительному лектину и фактору роста. Набор для пролиферации можно получать, не только объединяя описанные выше компоненты, но также выполняя любые дополнительные модификации.
Например, растительный лектин может быть иммобилизован на поверхности сосуда для культивирования. Иммобилизация растительного лектина может облегчить манипуляции с культурой клеток посредством исключения стадии измерения растительного лектина и может также облегчить пролиферацию клеток LAK посредством улучшения эффективности контакта между растительным лектином и клетками LAK. Иммобилизации растительного лектина можно достичь добавлением растительного лектина в сосуд для культивирования клеток и иммобилизацию растительного лектина на поверхности сосуда.
Фактор роста, обладающий интерлейкин-2-подобной активностью, растворяют в растворе, таком как вода, физиологический солевой раствор, фосфатный буферный или культуральная среда, и замораживают для хранения в небольших сосудах, где каждый содержит однократную дозу, которые можно подвергнуть оттаиванию перед использованием. При способе хранения фактора роста, описанном выше, может быть исключена стадия измерения фактора роста, обладающего интерлейкин-2-подобной активностью.
Кроме того, культуральную среду, дополненную растительным лектином и фактором роста, обладающим интерлейкин-2-подобной активностью в культуральной среде, замораживают для хранения в небольших сосудах, которые перед использованием подвергают оттаиванию. Такой способ хранения позволяет исключить почти все процедуры, относящиеся к пролиферации или активации клеток.
Ниже изобретение подробно проиллюстрировано примерами. Однако следующие примеры служат только для иллюстрации описанного здесь изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
В этом примере оптимальные условия для пролиферации клеток LAK исследовали с использованием конканавалина A в качестве растительного лектина и интерлейкина-2 человека в качестве фактора роста, обладающего интерлейкин-2-подобной активностью.
1. Оптимизация концентрации конканавалина A
(1) Сбор исходного образца
4
4
30 мл цельной крови отбирали из шейной вены бигля (в возрасте 6 лет) в шприц для инъекций (свертывание крови ингибировали гепарином). Затем собранную цельную кровь подвергали центрифугированию, один объем собранного осадка периферической крови объединяли с 10 объемами любого из растворов: (a) забуферивающим раствором NHCl (NHCl:0,83 г/100 мл дистиллированной воды), (b) раствором Трис-основания (20,6 г/1000 мл дистиллированной воды, pH 7,2) или (c) стерилизованным путем фильтрования раствором смеси растворов (a) и (b) в соотношении 9:1, и затем полученную таким образом суспензию помещали в лед на 5 минут (иногда перемешивая), и красные клетки крови, содержащиеся в цельной крови, разрушались.
По три мл раствора определенной удельной плотности (для выделения лимфоцитов собак, Lympholyte, доступный из Cedarlane) поровну наливали в две пробирки для центрифугирования, и цельную кровь после лизиса медленно наслаивали поверх раствора, не нарушая его поверхности. Пробирки для центрифугирования, содержащие клетки, подвергали центрифугированию при температуре окружающей среды при 800×g в течение 20 минут для сбора фракций, содержащих лимфоциты, с использованием шприца для инъекций или стерильной пипетки Пастера.
7
Клетки промывали путем суспендирования собранных фракций в культуральной среде, с получением суспензий клеток, центрифугирования полученных таким образом суспензий клеток при 300×g при температуре окружающей среды в течение 5 минут и затем удаления супернатанта путем декантации. После трехкратной промывки клеток их суспендировали в 5 мл культуральной среды (плотность клеток: 4,76×10 клеток/мл). Культуральную среду RPMI-1640 (доступную из Nissui Pharmaceutical Co, Ltd., далее обозначаемую просто как «культуральная среда») использовали в качестве культуральной среды.
(2) Пролиферация клеток
6
6
Суспензии клеток в пробирках для центрифугирования переносили в пробирки, в которые добавляли культуральную среду для доведения плотности клеток до 1×10 клеток/мл, затем сыворотку крови собаки после тепловой инактивации при 56°C в течение 30 минут (собранную от собаки - донора крови) до конечной концентрации 2% или 10% или эмбриональную бычью сыворотку после тепловой инактивации при 56°C в течение 30 минут (эмбриональная бычья сыворотка, доступная из JRH Biosciences), добавляли к соответствующим суспензиям клеток и, наконец, по 2 мл каждой суспензии клеток рассевали в каждую лунку двух 6-луночных планшетов (2×10 клеток/лунку). Затем конканавалин A (Конканавалин A, доступный из Elastin Products) добавляли к соответствующим суспензиям клеток в каждой лунке, в конечной концентрации 1, 5, 10 или 15 мкг/мл, с получением четырех наборов с различной конечной концентрацией конканавалина A.
2
Затем планшеты помещали в увлажненный инкубатор с 5% CO при 37°C для начала пролиферации клеток. Увеличение и уменьшение числа клеток от начала пролиферации клеток до суток 14 измеряли для расчета средних значений для каждого набора концентраций ConA. Число клеток рассчитывали по счету клеток, полученному смешиванием 20 мкл суспензии клеток и 20 мкл раствора трипанового синего и измерением счета клеток, содержащихся в 1 мкл смеси, с использованием гемоцитометров (гемоцитометры Burker-Turk, доступные из ERMA) и микроскопа.
(3) Результаты эксперимента
Измеренные изменения числа клеток показаны в таблице 1 и на фиг.1, полученной по данным таблицы 1. Как видно из таблицы 1 и фиг.1, обнаружили, что 5 мкг/мл конканавалина A является наиболее подходящей концентрацией ConA.
<u>Таблица 1</u>
1 мкг/мл
5 мкг/мл
10 мкг/мл
15 мкг/мл
Сутки 2
13
11
7,3
7,9
Сутки 4
6,9
4,6
6,1
5,9
Сутки 6
6,5
10
12
13
Сутки 8
9,8
29
22
18
Сутки 10
19
57
29
23
Сутки 12
18
53
53
46
Сутки 14
17
51
36
43
×10<sup>5</sup> клеток/лунку
2. Изменение лимфоцитов посредством конканавалина A
Эффект конканавалина A на функции лимфоцитов, конкретно эффект на экспрессию рецептора α интерлейкина-2 на поверхности лимфоцитов определяли посредством проточного цитометра.
(1) Экспериментальная процедура
7
5
6
Посредством способа, сходного со способом примера 1, три серии (случая) суспензий клеток (5 мл каждая) собирали от 3 собак (в возрасте 6 лет) (плотность клеток: 2-4×10 клеток/мл). К каждой серии суспензий клеток, полученных таким образом, добавляли культуральную среду для доведения плотности клеток до 5×10 клеток/мл. По два мл каждой суспензии клеток рассевали в каждую лунку 6-луночного планшета (1×10 клеток/лунку) и затем суспензии клеток дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, сывороткой крови собаки (собранной от собаки - донора крови) до конечной концентрации 2% и эмбриональной бычьей сывороткой до конечной концентрации 10% и культивировали при 37°C в течение 5 суток (стимулированные cPBL). Суспензии клеток, дополненные сывороткой крови собаки и эмбриональной бычьей сывороткой, но не конканавалином A, использовали в качестве контроля (нестимулированные cPBL).
6
После культивирования культивированные клетки собирали центрифугированием и промывали три раза, из каждых из них 1×10 клеток переносили в пробирки, и добавляли по 10 мкл меченого FITC-антитела мыши против рецептора интерлейкина-2 человека для инкубации при 4°C в темноте в течение 30 минут. В этом примере использовали антитело мыши против рецептора интерлейкина-2 человека, закупленное в American Research Products.
После инкубации клетки промывали PBS три раза и суспендировали в PBS и затем соотношение клеток, экспрессирующих рецептор α интерлейкина-2 (IL-2Rα) на поверхности клеток, определяли с использованием проточного цитометра (FACSCalibur, доступен из BECTON DICKINSON). Результаты показаны на фиг.2. Данные, показанные на этих фигурах, выражены как среднее ± стандартная ошибка.
(2) Результаты эксперимента
Как понятно из фиг.2, обнаружили, что соотношение лимфоцитов, экспрессирующих рецептор интерлейкина-2 на их поверхности, является высоким в случае, когда клетки культивировали в культуральной среде, дополненной конканавалином A (стимулированные cPBL), по сравнению со случаем, когда клетки культивировали в отсутствие конканавалина A (нестимулированные cPBL) (статистически значимо, P<0,05). Данные показывают, что добавление конканавалина A в культуральную среду индуцирует экспрессию рецептора интерлейкина-2.
3. Оптимизация концентрации сыворотки
(1) Экспериментальная процедура
7
5
6
Посредством способа, сходного со способом из раздела 1 выше, получали 5 мл суспензии клеток (плотность клеток: 1,38×10 клеток/мл). Культуральную среду добавляли для доведения плотности клеток до 5×10 клеток/мл к суспензии клеток, которую дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, и затем по 1 мл каждой из суспензий клеток рассевали в каждую лунку 6-луночного планшета (5×10 клеток/лунку). Затем сыворотку крови собаки после тепловой инактивации при 56°C в течение 30 минут (собранную от собаки - донора крови) добавляли до конечной концентрации 2%, 5% или 10% к суспензиям клеток в каждой лунке для получения 3 наборов суспензий клеток, содержащих различные конечные концентрации сыворотки.
2
Затем планшет помещали в увлажненный инкубатор с 5% CO при 37°C для начала пролиферации клеток. Увеличение и уменьшение числа клеток от начала пролиферации клеток до суток 13 измеряли способом, сходным со способом, который использовали в разделе 1 выше.
(2) Результаты эксперимента
Измеренные изменения числа клеток показаны в таблице 2 и на фиг. 3, полученной по данным таблицы 2. Как видно из таблицы 2 и фиг.3, обнаружено, что концентрация 5% сыворотки является наиболее подходящей концентрацией сыворотки.
<u>Таблица 2</u>
2% сыворотки
5% сыворотки
10% сыворотки
Сутки 2
2,3
3,4
3,8
Сутки 5
9,3
10
7,2
Сутки 7
31
27
18
Сутки 9
22
25
16
Сутки 11
25
28
19
Сутки 13
23
20
17
×10<sup>5</sup> клеток/лунку
4. Оптимизация концентрации интерлейкина-2
(1) Экспериментальная процедура
7
5
5
Посредством способа, сходного со способом из раздела 1 выше, получали 5 мл суспензии клеток (плотность клеток: 1,68×10 клеток/мл). Культуральную среду добавляли для доведения плотности клеток до 5×10 клеток/мл к суспензии клеток, которую дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, сывороткой крови собаки (собранной от собаки - донора крови) до конечной концентрации 2% и эмбриональной бычьей сывороткой до конечной концентрации 10%, и по 1 мл каждой из суспензий клеток (5×10 клеток/мл) рассевали в каждую лунку 24-луночного планшета. Затем интерлейкин-2 добавляли до конечной концентрации 250 Ед., 500 Ед., 750 Ед., 1000 Ед. или 0 Ед./мл к суспензиям клеток в каждой лунке для получения 5 наборов суспензий клеток, содержащих различные конечные концентрации интерлейкина-2.
2
Затем планшет помещали в увлажненный инкубатор с 5% CO при 37°C для начала пролиферации клеток. Затем на сутки 5 после начала пролиферации клеток к культуре клеток добавляли интерлейкин-2 до конечной концентрации 500 Ед. и конканавалин A до конечной концентрации 5 мкг/мл. Увеличение и уменьшение числа клеток от начала пролиферации клеток до суток 12 измеряли способом, сходным со способом, который использовали в разделе 1 выше.
(2) Результаты эксперимента
Измеренные изменения числа клеток показаны в таблице 3 и на фиг.4, полученной по данным таблицы 3. Как видно из таблицы 3 и фиг.4, обнаружено, что концентрация 750 Ед./мл интерлейкина-2 является наиболее подходящей концентрацией интерлейкина-2.
<u>Таблица 3</u>
250 Ед.
500 Ед.
750 Ед.
1000 Ед.
0 Ед.
Сутки 3
3,0
2,7
2,9
2,6
3,2
Сутки 5
12
9,8
10
7,9
9,9
Сутки 8
24
28
33
27
21
Сутки 12
26
25
28
30
20
×10<sup>5</sup> клеток/лунку
Пример 2
Влияние типов сыворотки, применяемой в культуральной среде, на пролиферацию клеток LAK определяли с использованием аутологичной сыворотки, эмбриональной бычьей сыворотки или сыворотки крови кошки. В частности эффекты определяли следующими способами.
1. Использование аутологичной сыворотки
(1) Экспериментальная процедура
6
5
5
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, четыре серии суспензий клеток (1 мл каждая) собирали от 4 собак (карликовый пинчер в возрасте 2 лет; смешанная порода в возрасте 1 года; померанский шпиц в возрасте 10 лет; смешанная порода в возрасте 3 лет) (плотность клеток: 1,5×10 клеток/мл). К каждой серии суспензий клеток, полученных таким образом, добавляли культуральную среду для доведения плотности клеток до 1×10 клеток/мл и в каждую лунку 6-луночного планшета заливали по 3 мл каждой суспензии клеток (3×10 клеток/лунку), которые дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, аутологичной сывороткой до конечной концентрации 5% и интерлейкином-2 до конечной концентрации 750 Ед./мл. Число клеток рассчитывали в начале пролиферации клеток с использованием гемоцитометров, как описано в примере 1. Аутологичную сыворотку, используемую в этом примере, получали помещением периферической крови в чистое место на ночь для свертывания, центрифугированием свернувшейся крови (при температуре окружающей среды, при 1500×g в течение 10 минут) для сбора супернатанта и обработкой супернатанта при 56°C в течение 30 минут для тепловой инактивации.
2
Затем 6-луночный планшет помещали в увлажненный инкубатор с 5% CO при 37°C для начала пролиферации клеток. Увеличение и уменьшение числа клеток от начала пролиферации клеток до суток 15 измеряли с использованием гемоцитометров.
(2) Результаты эксперимента
7
Измеренные изменения числа клеток показаны в таблице 4 и на фиг.5, полученной по данным таблицы 4. Как видно из таблицы 4 и фиг.5, число клеток после остановки пролиферации менялось для серий суспензий клеток и лежало в диапазоне 3,9-5,4×10 клеток/мл.
<u>Таблица 4</u>
Линия 1
Линия 2
Линия 3
Линия 4
25 февраля
30
30
30
30
3 марта
960
1050
1578
900
6 марта
3600
3300
4200
3180
9 марта
5130
4500
5220
3780
11 марта
4500
3900
5400
4000
×10<sup>4</sup> клеток/лунку
2. Использование эмбриональной бычьей сыворотки
(1) Экспериментальная процедура
6
5
5
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, четыре серии суспензий клеток (1 мл каждая) собирали от 4 собак (карликовый пинчер в возрасте 2 лет; смешанная порода в возрасте 1 года; померанский шпиц в возрасте 10 лет; смешанная порода в возрасте 3 лет) (плотность клеток: 1,5×10 клеток/мл). К каждой серии суспензий клеток, полученных таким образом, добавляли культуральную среду для доведения плотности клеток до 1×10 клеток/мл и в каждую лунку 6-луночного планшета заливали по 3 мл каждой суспензии клеток (3×10 клеток/лунку), которые дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, эмбриональной бычьей сывороткой до конечной концентрации 5% (эмбриональная бычья сыворотка, доступная из JRH Biosciences) и интерлейкином-2 до конечной концентрации 750 Ед./мл. Число клеток рассчитывали в начале пролиферации клеток с использованием гемоцитометров.
(2) Результаты эксперимента
7
Измеренные изменения числа клеток показаны в таблице 5 и на фиг.6, полученной по данным таблицы 5. Как понятно из таблицы 5 и фиг.6, число клеток после остановки пролиферации менялось для серий суспензий клеток и лежало в диапазоне 3,0-5,0×10 клеток/мл.
<u>Таблица 5</u>
Линия 1
Линия 2
Линия 3
Линия 4
25 февраля
30
30
30
30
3 марта
720
120
1116
600
6 марта
4320
2700
3780
3600
9 марта
4050
3240
4500
4050
11 марта
4200
3000
5000
3500
×10<sup>4</sup> клеток/лунку
3. Использование аутологичной сыворотки кошек
(1) Экспериментальная процедура
6
5
5
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, две серии суспензий клеток (1 мл каждая) собирали из периферической крови 2 кошек (смешанная порода в возрасте 2 лет) (плотность клеток: 1,5×10 клеток/мл). К каждой серии суспензий клеток, полученных таким образом, добавляли культуральную среду для доведения плотности клеток до 1×10 клеток/мл и в каждую лунку двух 6-луночных планшетов заливали по 3 мл каждой суспензии клеток (3×10 клеток/лунку), которые дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, сывороткой до конечной концентрации 5% и интерлейкином-2 до конечной концентрации 750 Ед./мл. В этом примере эмбриональную бычью сыворотку использовали в одних сериях, в то время как аутологичную сыворотку кошек использовали в других сериях. Число клеток рассчитывали в начале пролиферации клеток с использованием гемоцитометров. Аутологичную сыворотку кошек, используемую в этом примере, получали помещением периферической крови в чистое место на ночь для свертывания, центрифугированием свернувшейся крови (при температуре окружающей среды, при 1500×g в течение 10 минут) для сбора супернатанта.
2
Затем планшеты помещали в увлажненный инкубатор с 5% CO при 37°C для начала пролиферации клеток. Увеличение и уменьшение числа клеток от начала пролиферации клеток до суток 15 измеряли с использованием гемоцитометров.
(2) Результаты эксперимента
7
Измеренные изменения числа клеток показаны в таблице 6 и на фиг.7, полученной по данным таблицы 6. Как видно из таблицы 6 и фиг.7, в случае периферической крови кошки число клеток после остановки пролиферации меньше менялось в сериях суспензий клеток, чем в случае периферической крови собаки, и лежало в диапазоне 1,9-2,2×10 клеток/мл.
<u>Таблица 6</u>
Кошка 1, сыворотка кошки
Кошка 1, FBS
Кошка 2, сыворотка кошки
Кошка 2, FBS
29 марта
30
30
30
30
3 апреля
390
810
540
180
5 апреля
396
492
450
582
10 апреля
2220
2100
1920
2160
×10<sup>4</sup> клеток/лунку
Сравнивая результаты, полученные в разделе 1 и разделе 2, обнаружили, что не существует значительной разницы между линиями по пролиферации T-клеток αβ-типа собаки между T-клетками αβ-типа, культивированными в присутствии аутологичной сыворотки собаки, или клетками, культивированными в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки. Кроме того, по результатам, полученным в разделе 3, сравнивающим случай, когда T-клетки αβ-типа кошки культивировали в присутствии аутологичной сыворотки кошки со случаем, когда клетки культивировали в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки, обнаружили также, что не существует значительной разницы по пролиферации T-клеток αβ-типа кошки между экспериментальными группами. В результате обнаружили, что пролиферация T-клеток αβ-типа собаки или T-клеток αβ-типа кошки практически не зависит от источника сыворотки, добавляемой в культуральную среду.
Пример 3
+
+
+
+
В этом примере изменения профиля клеток до и после пролиферации определяли с использованием проточного цитометра. В частности, что касается клеток CD8 (которые представляют собой T-клетки αβ-типа и связаны с опосредованным клетками иммунитетом) и клеток CD4 (которые связаны с опосредованным антителами иммунитетом), которые все подвергали пролиферации способом для пролиферации согласно изобретению, число клеток CD8 и клеток CD4 и их соотношение определяли посредством следующей процедуры.
(1) Экспериментальная процедура
7
6
6
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, три серии (случая) суспензий клеток (5 мл каждая) собирали от 3 собак (в возрасте 6 лет) (плотность клеток: 2-4×10 клеток/мл). К каждой серии суспензий клеток, полученных таким образом, добавляли культуральную среду для доведения плотности клеток до 1×10 клеток/мл. По два мл каждой суспензии клеток рассевали в каждую лунку 6-луночного планшета (2×10 клеток/лунку), и затем суспензии клеток дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, сывороткой крови собаки (собранной от собаки - донора крови) до конечной концентрации 5%, эмбриональной бычьей сывороткой до конечной концентрации 10% и интерлейкином-2 до конечной концентрации 750 Ед./мл.
6
+
+
+
+
Суспензии клеток, содержащие 1×10 клеток каждая, переносили в пробирки и добавляли по 10 мкл каждого из меченных FITC антитела против CD8 собаки и антитела против CD4 собаки для инкубации при 4°C в темноте в течение 30 минут. После инкубации клетки промывали PBS три раза и суспендировали в PBS, и затем профиль клеток определяли с использованием проточного цитометра (FACSCalibur, доступного из BECTON DICKINSON). Антитело против CD8 собаки и антитело против CD4 собаки, закупленные в UK-Serotec, использовали в этом примере.
2
Затем планшет помещали в увлажненный инкубатор с 5% CO при 37°C для пролиферации клеток в течение 7 суток, и профиль клеток определяли с использованием описанного выше способа.
(2) Результаты эксперимента
-
-
+
+
+
+
Гистограммы с проточного цитометра после измерения до начала культивирования клеток и после культивирования клеток показаны на фиг.8, и значения соотношения между числом клеток показаны в таблице 7, на основании данных, показанных на фиг.8. В таблице 7 «DN» обозначает процентное содержание суммы клеток CD8 и CD4, «CD8 SP» обозначает процентное содержание клеток CD8, «CD4 SP» обозначает процентное содержание клеток CD4, «DP» обозначает процентное содержание клеток CD8 и CD4, соответственно.
<u>Таблица 7</u>До пролиферации
DN
CD4 SP
CD8 SP
DP
CD8 SP/CD4 SP
случай-1
45%
35%
19%
1%
0,54%
случай-2
32%
42%
20%
6%
0,48%
случай-3
36%
36%
23%
5%
0,64%
После пролиферации
DN
CD4 SP
CD8 SP
DP
CD8 SP/CD4 SP
случай-1
2%
20%
59%
19%
2,95%
случай-2
4%
24%
60%
12%
2,5%
случай-3
12%
19%
67%
2%
3,53%
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Как понятно из фиг.8 и таблицы 7, как число, так и процентное содержание клеток CD8 (CD8 SP) значимо увеличивалось во всех случаях. Кроме того, обнаружили, что число и процентное содержание клеток CD8 и CD4 (DP) также увеличивалось. В отличие от этого, хотя число клеток CD4 (CD4 SP) увеличивалось, процентное содержание клеток CD4 (CD4 SP) уменьшалось. По этому результату CD8T-клетки αβ-типа в основном являются пролифелирующими способом пролиферации согласно изобретению. Кроме того, не только клетки CD8 (CD8 SP), но также клетки CD8 и CD4 (DP) являются пролифелирующими, что позволяет предполагать пролиферацию любых не рестрицированных по MHC лимфоцитов, таких как γδT-клетки и T-клетки NK. Однако, принимая во внимание то, что образец получен из периферической крови, может существовать высокая вероятность того, что T-клетки NK являются пролифелирующими.
Пример 4
В этом примере исследовали цитотоксичность, проявляемую пролифелирующими клетками против клеток опухоли. В частности после культивирования лимфоцитов в культуральной среде, дополненной конканавалином A и интерлейкином-2, и совместного культивирования культивированных лимфоцитов и клеток меланомы человека, исследовали эффект супрессии пролиферации лимфоцитов, проявляемый клетками меланомы человека, и его механизм.
1. Цитотоксичность пролифелирующих клеток
(1) Экспериментальная процедура
7
5
6
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, три серии (случая) суспензий клеток (5 мл каждая) собирали от 3 собак (в возрасте 6 лет) (плотность клеток: 2-4×10 клеток/мл). К каждой серии суспензий клеток, полученных таким образом, добавляли культуральную среду для доведения плотности клеток до 5×10 клеток/мл. По два мл каждой суспензии клеток рассевали в каждую лунку 6-луночного планшета (1×10 клеток/лунку) и затем суспензии клеток дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл конканавалина A, сывороткой крови собаки (полученной от собаки - донора крови способом, сходным со способом из примера 2) до конечной концентрации 2%, эмбриональной бычьей сывороткой до конечной концентрации 10% и интерлейкином-2 до конечной концентрации 750 Ед./мл, и культивировали при 37°C в течение 7 суток или 11 суток.
Полученные таким образом лимфоциты в качестве эффекторных клеток и клетки меланомы человека (клетки MeWo) в качестве клеток-мишеней совместно культивировали в культуральной среде и исследовали цитотоксичность, проявляемую эффекторными клетками против клеток-мишеней. В частности цитотоксичность исследовали следующим способом.
6
5
Сначала эффекторные клетки и клетки-мишени рассевали в каждую лунку 24-луночных планшетов при соотношении E:T 33 (т.е. 4,95×10 эффекторных клеток/лунку): 1 (т.е. 1,5×10 клеток-мишеней/лунку) и культивировали при 37°C в течение 16 часов. На этой стадии культуральную среду, дополненную сывороткой крови собаки (полученной от собаки - донора крови способом, сходным со способом из примера 2) до конечной концентрации 2% и эмбриональной бычьей сывороткой до конечной концентрации 10%, использовали для совместного культивирования. Затем число жизнеспособных клеток-мишеней (клеток MeWo) подсчитывали с использованием гемоцитометров, и жизнеспособность клеток-мишеней рассчитывали на основании счета клеток. Результаты показаны на фиг.9.
Результат эксперимента, полученный при культивировании только клеток MeWo, и результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo и нестимулированных периферических лимфоцитов собаки, использовали в качестве контрольных результатов. На фиг.9: колонка 1 обозначает контрольный результат эксперимента, полученный при культивировании только клеток MeWo; колонка 2 обозначает контрольный результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo и нестимулированных периферических лимфоцитов собаки; колонка 3 обозначает результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo со стимулированными периферическими лимфоцитами собаки, которые культивировали в присутствии конканавалина A и интерлейкина-2 в течение 7 суток; и колонка 4 обозначает результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo со стимулированными периферическими лимфоцитами собаки, которые культивировали в присутствии конканавалина A и интерлейкина-2 в течение 11 суток.
Как понятно из фиг.9, сравнивающей данные, полученные без совместного культивирования (колонка 1), и данные, полученные при совместном культивировании с нестимулированными периферическими лимфоцитами собаки (колонка 2), обнаружили, что совместное культивирование со стимулированными лимфоцитами значимо уменьшало жизнеспособность клеток-мишеней (т.е. клеток MeWo), как показано в колонке 3 и колонке 4 (статистически значимо, P<0,05). Этот результат позволяет предполагать применимость использования стимулированных лимфоцитов в лечении рака.
2. Эффект гранзима B (GrB) на трансактивацию мРНК
В этом разделе определяли эффект дополнения культуральной среды конканавалином A и интерлейкином-2 на активность транскрипции мРНК GrB, показательной для цитотоксичности. В частности цитотоксичность исследовали следующим способом.
(1) Экспериментальная процедура
Сначала стимулированные периферические лимфоциты собаки, которые культивировали в присутствии конканавалина A и интерлейкина-2 в течение 7 суток, как описано в разделе 1 выше (стимулированные cPBL), использовали для выделения тотальной РНК с использованием реагента Trizol (доступного из Life Technologies).
Затем набор для ПЦР с РНК TaKaRa (доступный из TAKARA BIO) использовали для синтеза кДНК с тотальной РНК, и синтезированные кДНК использовали в качестве матриц для проведения реакции ПЦР (способ RT-ПЦР). В этом эксперименте дизайн условий реакции ПЦР, синтеза праймеров для амплификации гена GrB собаки и синтеза праймеров для амплификации гена β-актина собаки, применяемого в качестве внутреннего стандарта, соответствовал описаниям из публикации Ito H., et al. (Ito H., et al., Neuromuscul. Disord. 8, 95-110 (1998)).
Наконец, полученные таким образом продукты ПЦР подвергали электрофорезу и сравнивали с контрольным экспериментом. Результаты показаны на фиг.10. Периферические лимфоциты собаки, культивированные в культуральной среде в течение 4 суток в отсутствие конканавалина A и интерлейкина-2 (нестимулированные cPBL), использовали в качестве контроля.
(2) Результаты эксперимента
Как понятно из фиг.10, обнаружили, что уровень транскрипции GrB больше увеличивался в стимулированных лимфоцитов, которые культивировали в культуральной среде, дополненной конканавалином A и интерлейкином-2 (стимулированные cPBL), по сравнению с контрольной группой (нестимулированные cPBL). Результаты, показанные на фиг.10, позволяют предполагать, что в культуре клеток стимуляция лимфоцитов культивированием лимфоцитов в культуральной среде, дополненной конканавалином A и интерлейкином-2, увеличивает уровень транскрипции мРНК GrB и уровень экспрессии гена GrB, и улучшает цитотоксичность, проявляемую стимулированными лимфоцитами.
3. Эффект переноса лимфоцитов на цитотоксичность
Лимфоциты, стимулированные с использованием конканавалина A и интерлейкина-2, переносили обратно рассматриваемому индивидууму, от которого исходно собирали лимфоциты, и лимфоциты снова собирали от рассматриваемого индивидуума для измерения цитотоксичности лимфоцитов. Затем исследовали эффект переноса стимулированных лимфоцитов на цитотоксичность лимфоцитов рассматриваемого индивидуума, подлежащего введению.
(1) Экспериментальная процедура
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, три серии (случая) периферических лимфоцитов собаки собирали от 3 собак (в возрасте 6 лет). Периферические лимфоциты собаки стимулировали посредством культивирования в течение 7 суток, как описано в разделе 1 выше.
Клетки промывали центрифугированием стимулированных периферических лимфоцитов собаки при 300×g при температуре окружающей среды в течение 5 минут для формирования осадка, затем удалением супернатанта декантацией. После промывания клеток три раза промытые клетки суспендировали в 5 мл физиологического солевого раствора для получения препарата клеток. Препарат клеток получали суспендированием лимфоцитов в отсутствие конканавалина A и интерлейкина-2 (нестимулированные периферические лимфоциты собаки) сходным способом.
8
8
Препарат клеток переносили обратно рассматриваемому индивидууму, от которого исходно собирали лимфоциты, и лимфоциты снова собирали из периферической крови рассматриваемого индивидуума. В частности в группе 1 рассматриваемой индивидуальной собаке вводили препарат клеток (1×10 клеток/собаку) в течение 4 недель подряд, и спустя двое суток после конечного введения препарата клеток, лимфоциты собирали из периферической крови. В группе 2 рассматриваемой индивидуальной собаке вводили препарат клеток (1×10 клеток/собаку) в течение 5 недель подряд и спустя двое суток после конечного введения препарата клеток лимфоциты собирали из периферической крови.
Полученные таким образом лимфоциты в качестве эффекторных клеток и клетки меланомы человека (клетки MeWo) в качестве клеток-мишеней совместно культивировали в культуральной среде, как описано в разделе 1 выше, и исследовали цитотоксичность, проявляемую эффекторными клетками против клеток-мишеней. Результаты показаны на фиг.11.
Результат эксперимента, полученный при культивировании только клеток MeWo, и результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo и нестимулированных периферических лимфоцитов собаки, использовали в качестве контрольных результатов. На фиг.11: колонка 1 обозначает контрольный результат эксперимента, полученный при культивировании только клеток MeWo; колонка 2 обозначает контрольный результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo и нестимулированных периферических лимфоцитов собаки; колонка 3 обозначает результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo со стимулированными периферическими лимфоцитами собаки из группы 1 (которые вводили в течение 4 недель подряд); и колонка 4 обозначает результат эксперимента, полученный при совместном культивировании клеток MeWo со стимулированными периферическими лимфоцитами собаки из группы 2 (которые вводили в течение 5 недель подряд).
(2) Результаты эксперимента
Как понятно из фиг.11, сравнивающей данные, полученные без совместного культивирования (колонка 1), и данные, полученные при совместном культивировании с нестимулированными периферическими лимфоцитами собаки (колонка 2), обнаружили, что совместное культивирование со стимулированными лимфоцитами значимо уменьшало жизнеспособность клеток-мишеней (т.е. клеток MeWo), как показано в колонке 3 и колонке 4 (статистически значимо, P<0,05). Этот результат позволяет предполагать, что цитотоксичность лимфоцитов сохраняется даже после введения лимфоцитов в организм рассматриваемого индивидуума.
Пример 5
В этом примере исследовали терапевтический эффект, проявляемый пролиферирующими клетками. В частности препарат клеток, содержащий пролифелирующие T-клетки αβ-типа, которые выращивали способом пролиферации согласно изобретению вводили модельным животным, страдающим от рака или демодикоза собак (демодекозный акариаз) (кожное нарушение), для определения терапевтического эффекта.
1. Терапевтический эффект для рака
6
2
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, 1 мл суспензии клеток собирали от собаки, несущей опухоль (гистиоцитому), локализованную на шее (смешанная порода в возрасте 14 лет, масса тела 17 кг) (плотность клеток: 1,5×10 клеток/мл). Полученную таким образом суспензию клеток переносили во флакон для культивирования клеток (25 см), в который добавляли 9 мл культуральной среды (т.е. всего 10 мл). Суспензию клеток дополняли конканавалином A до конечной концентрации 5 мкг/мл, аутологичной сывороткой до конечной концентрации 5% и интерлейкином-2 до конечной концентрации 750 Ед./мл. Аутологичную сыворотку, используемую в этом примере, получали способом, сходным со способом из примера 2.
2
6
Затем флакон для культивирования помещали в увлажненный инкубатор с 37°C при 5% CO для пролиферации клеток в течение 10 суток. Клетки промывали центрифугированием суспензии клеток при 300×g при температуре окружающей среды в течение 5 минут для формирования осадка, затем удалением супернатанта декантацией культуральной среды, ресуспендированием осадка клеток в физиологическом солевом растворе, и центрифугированием снова для удаления супернатанта. После промывания клеток три раза промытые клетки суспендировали в 30 мл физиологического солевого раствора для применения в качестве раствора для инфузии (физиологический солевой раствор, доступный из Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) для получения препарата клеток, и наполняли ими пакет для трансфузии. Клетки присутствовали в препарате клеток при плотности 1,67×10 клеток/мл.
Препарат клеток вводили один раз собаке, несущей опухоль, способом инфузии. Результаты показаны на фиг.12. Фиг.12(a) представляет собой фотографию опухоли No. 1 до лечения, и фиг. 12(b) представляет собой фотографию опухоли No. 1 после лечения. По этим фотографиям обнаружили, что опухоль 1 явно уменьшилась, что показывает, что способ лечения согласно изобретению является эффективным.
2. Эффективность терапии для демодикоза собак (демодекозного акариаза)
6
Посредством способа, сходного со способом из примера 1, препарат клеток получали от собаки, страдающей от демодикоза собак (демодекозного акариаза) (французский бульдог в возрасте 2 лет, 12 кг массы тела). Клетки присутствовали в препарате клеток при плотности 1,5×10 клеток/мл. Препарат клеток вводили один раз собаке, страдающей от демодикоза собак (демодекозного акариаза), способом инфузии. Результаты показаны на фиг.13 и 14. Фиг.13 и 14 представляют собой фотографии двух отдельных участков поражения индивидуальной пораженной собаки. Фиг.13(a) и 14(a) представляют собой фотографии участков поражения 2 и 3 до лечения соответственно и фиг.13(b) и 14(b) представляют собой фотографии участков поражения 2 и 3 после лечения соответственно. На этих фотографиях показан рост шерсти в участках поражения 2 и 3 после лечения согласно изобретению. Таким образом, способ лечения согласно изобретению является эффективным.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Способом пролиферации клеток LAK согласно изобретению можно предпочтительно вызвать пролиферацию и активацию T-клеток αβ-типа, обладающих антигенной специфичностью или рестрикцией по MHC. Поскольку полученные таким образом клетки LAK содержат относительно высокое процентное содержание T-клеток αβ-типа, обладающих рестрикцией по MHC, полученные таким образом LAK можно использовать для более эффективной терапии активированными аутологичными лимфоцитами, что приводит к снижению физической нагрузки и экономической нагрузки на пациента, подлежащего лечению, страдающего различными заболеваниями (такими как рак, заболевания, вызванные иммунодефицитом, и инфекционные заболевания).