Способ экспресс-диагностики биозаражения базальтопластиковой арматуры криофильными микроорганизмами
METHOD FOR EXPRESS DIAGNOSTICS OF BIOCONTAMINATION OF BASALT-PLASTIC REINFORCEMENT BY CRYOPHILIC MICROORGANISMS

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа экспресс-диагностики биозаражения полимерных композиционных материалов (ПКМ), в частности базальтопластиковой арматуры (БПА) криофильными микроорганизмами.
Предложен способ экспресс-диагностики биозаражения БПА криофильными микроорганизмами, заключающийся в определении наличия или отсутствия клеток криофильных микроорганизмов, в смывной жидкости, отобранной с поверхности стержней БПА при экспонировании их в условиях экстремально низких температур окружающей среды, отличающийся тем, что в качестве объекта для экспресс-диагностики биозаражения используются стержни БПА (или их фрагменты), экспонируемые в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С); смывная жидкость, полученная с поверхности исследуемых стержней БПА с последующим окрашиванием смывной жидкости люминисцентным красителем, приготовлением микроскопического препарата и просмотром микроскопического препарата в флуоресцентном микроскопе.
Способ позволяет быстро определить наличие (или отсутствие) криофильных микроорганизмов, вызывающих контаминацию и биозаражение БПА, экспонируемой в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С).
Способ может использоваться для экспресс-диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами БПА, при экспонировании в условиях открытой экосистемы при экстремально низких температурах окружающей среды, что является актуальным при эксплуатации БПА в природно-климатических условиях Крайнего Севера
Преимуществом предлагаемого способа являются быстрота, высокая чувствительность, простота и точность исполнения.
Уровень техники.
ПКМ - композитные материалы, состоящие из полимерной матричной фазы (смол различных видов) и одного или нескольких дискретных армирующих материалов или заполнителей матриц (частицы, осажденные частицы, структурные домены основного материала, стеклянные волокна, базальтовые волокна или углеволокна).
В настоящее время более 50% общего объема регистрируемых в мире повреждений полимерных материалов связано с деятельностью микроорганизмов (1. Дергунова А.В. Биоповреждения конструкций зданий, сооружений и оценка ущерба от биоповреждений [Текст] / А.В. Дергунова, В.Т. Ерофеев, В.Ф. Смирнов // Дефекты зданий и сооружений. Усиление строительных конструкций: материалы XIV научно-метод. Конф. ВИТУ -СПб. -2010. -С. 175-179).
Опыт исследования биозаражений различных промышленных объектов и разработка методов защиты оборудования от биодеструкции и биокоррозии представлены в работах [2. Каблов Е.Н., Ерофеев В.Т., Светлов Д.А., Смирнов В.Ф., Богатов А.Д. Биоповреждения в космических аппаратах // Сб. Междунар. науч.-технич. конф. «Композиционные материалы. Теория и практика». Тула, 2015. С. 40-46; 3. Кривушина А.А., Горяшник Ю.С. Способы защиты материалов и изделий от микробиологического поражения (обзор) // Авиационные материалы и технологии. 2017. №2 (47). С.80-86. DOI: 10.18577/2071-9140-2017-0-2-80-86; 4. Лаптев А.Б., Барботько С.Л., Николаев Е.В. Основные направления исследований сохраняемости свойств материалов под воздействием климатических и эксплуатационных факторов // Авиационные материалы и технологии. 2017. №S. С. 547-561. DOI: 10.18577/2071-9140- 2017-0-S-547-561; 5. Коган A.M., Николаев Е.В., Голубев А.В., Лаптев А.Б., Мовенко Д.А. Этапы биообрастания и коррозии стали в черноморской воде // Труды ВИАМ: электрон, науч.-технич. журн. 2019. №6 (78). Ст. 09. URL: http://viam-works.ru (дата обращения: 08.07.2020). DOI: 10.18577/2307-6046-2019-0-6-84-94; 6. Лаптев А.Б., Голубев А.В., Киреев Д.М., Николаев Е.В. К вопросу биодеструкции полимерных материалов в природных средах (обзор) // Труды ВИАМ: электрон, науч.-технич. журн. 2019. - №9 (81). С. 100-107. DOI: 10.18577/2307-6046-2019-0-9-100-107; 7. Теремова М.И., Воробьева С.В., Романченко А.С. Углеводородокисляющие бактерии как потенциальные деструкторы полиэтилена высокого давления // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. 2011. Вып. 11. С. 133-138; 8. Hadad D., Geresh S., Sivan A. Biodegradation of polyethylene by the thermophilic bacterium Brevibacillus borstelensis // Journal Application Microbiology. 2005. Vol. 98. P. 1093-1100].
Знание механизмов биозаражения ПКМ микроорганизмами является очень важным фактором для профилактики биоповреждений материалов и готовых изделий в процессе эксплуатации и хранении.
Наиболее часто биозаражение полимерных композитов начинается с образования биопленок или своеобразных конгломератов, состоящих из осевших с воздуха и (или) попавших из почвы и воды микроскопических грибов с включениями между ними бактерий, которые погружены в выделяемое ими внеклеточное полимерное вещество (внеклеточный матрикс).
После прикрепления (адгезии) бактерий и микроскопических грибов на поверхность ПКМ, при благоприятных условиях (влажность, рН, наличие кислорода воздуха, температурный и др. факторы), развивается микробный процесс с последующим выделением микроорганизмами продуктов метаболизма (органических кислот, воды и др.), разрушающих материал (9. Травинская Т.В. Получение и свойства биоразлагаемых материалов на основе иономерного полиуретана и полисахарида / Т.В. Травинская, Е.А. Мищук, Л.Н. Перепелицина, Ю.В. Снвельев // Полимерный журнал. - 2010. - Т. 32, №1. - С. 66-747; 10. Ерофеевская Л.А., Неустроева Н.И., Кычкин А.К., Кычкин А.А. Исследование влияния микроорганизмов на структуру и свойства полимерных композиционных материалов в условиях холодного климата // Научные разработки: Евразийский регион: материалы международной научной конференции теоретических и прикладных разработок (Москва, 15.11.2018 г.) / отв. Ред. Д.Р. Хисматуллин. - Москва: Изд-во Инфинити, 2018. - С. 84-86).
Являясь агентами биологических повреждений, микроорганизмы вызывают необратимые изменения в структурных и функциональных свойствах материалов, что влияет на снижение процессов эксплуатации изделий, такое воздействие принято называть биоповреждением (11. Пехташева Е.Л. Биоповреждения и защита непродовольственных товаров: Учеб. Для студ. Высш. Учеб. Заведении / Под ред. А.Н. Неверова. - М.: Мастерство, 2002. - С. 3).
Наиболее часто биозаражение и биоповреждения ПКМ вызывают плесневые грибы родов: Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis, Trichoderma (12. Сухревич В.И. Защита от биоповреждений, вызываемых грибами [Текст] / В.И. Сухаревич, И.Л. Кузикова, Н.Г. Медведева // СПб: ЭЛБИ-СПБ. - 2009. -207 с.; 13. Erofeevskya L.A, Aleksandrov A.R., Kychkin А.K. Prospects for the Use of Spore-forming Bacteria to Combat the Destruction of Polymeric Composite Materials // International science and technology conference "FarEastCon-2019" IOP Conf. Series: Materials Science and Engineering753 (2020) 052010 IOP Publishing - 2020 - P. 1-5.doi:10.1088/1757-899X/753/5/052010; 14. Ерофеевская Л.А., Кычкин A.K., Кычкин A.A. Прогнозирование биодеградации полимерных композиционных материалов в климатических условиях Якутии // Журнал «Инновации и инвестиции», №6, 2019. - С. 202-207; 15. Кычкин А.А., Ерофеевская Л.А., Кычкин А.К. Исследование выделенных микроорганизмов на полимерных композиционных материалах в условиях холодного климата // Естественные и технические науки. 2019. №5 (131). - Изд-во: Спутник+, 2019. - С. 24-31).
Из бактериальной группы, вызывающей биозаражения и биоповреждения ПКМ выделены различные виды спорообразующих бактерий рода Bacillus (16. Kychkin А.А., Lebedev М.Р., Erofeevskaya L.A., Neustroeva N.I./ Study of microorganisms on polymer composite materials in frigid climate conditions Atlantis Highlights in Material Sciences and Technology (AHMST), volume 1, p. 219-223, doi.org/10.2991/isees-19.2019.43; 17. Ерофеевская Л.А. Результаты исследований полимерных композиционных материалов на биозараженность / Л.А. Ерофеевская // Инновационные подходы в современной науке: сб. ст. по материалам XLVIII Международной научно-практической конференции «Инновационные подходы в современной науке». - №12(48). - М., Изд. «Интернаука», 2019. - С. 15-22).
Не смотря на то, что состав микроорганизмов, способных вызывать биозаражения ПКМ не так разнообразен, как, например, у объектов природного органического происхождения, опасность контаминации их микрофлорой очевидна, а поиск способов диагностики и профилактики биозаражений полимерных композитов актуален и востребован.
В настоящее время разработано достаточно различных методов испытаний разнообразных промышленных и строительных материалов на биостойкость, это ASTM G21, ASTM G22, ASTM D2574, ASTM D3946, ASTM С 1338, BS EN ISO 846:1997, HS Z 2911:2010 и др. (18. Кривушина, А.А. Микромицеты в авиационном топливе: Автореф. Дис.… к.б.н. / А.А. Кривушина.- М.: МГУим. М.В. Ломоносова, 2012. - 26 с.; 19. Кряжев Д.В. Анализ методов оценки биостойкости промышленных материалов (критерии, подходы) / Д.В. Кряжев, В.Ф. Смирнов, О.Н. Смирнова и др. // Вестник Нижегородского ун-та им. Н.И. Лобачевского. - 2013. - №2 (1). - С. 118-124).
Наряду с международными стандартами существуют национальные стандарты отдельных стран, а также отраслевые стандарты (20. Варченко Е.А. Особенности оценки биоповреждений и биокоррозии материалов в природных средах // Научный журнал КубГАУ: политематический сетевой электронный научный журнал Кубан. Гос.Аграр. Ун-та. - 2014. - №104.) (таблица 1).
Наиболее значимый и существенный недостаток всех ГОСТов по биостойкости это длительность проведения испытаний (21. Rodraguez-Rodraguez, С.Е. Fungal contamination of stored automobile-fuels in a tropical environment / C.E. Rodraguez-Rodraguez, E. Rodraguez, R. Blanco et al. // Journal of Environmental Sciences. - 2010. - V. 22. - №10. - P. 1595-1601.).
В известных ГОСТах, по методам испытаний на биостойкость разных видов материалов, существенно различаются условия проведения испытаний (время экспозиции материала, зараженного суспензией спор грибов, колеблется от 28 до 90 суток, различаются также режимы температуры и влажности), что затрудняет сопоставление результатов испытаний (22. Passman, F.J. Microbial contamination and its control in fuels and fuel systems since 1980 (review) / F.J. Passman // International Biodeterioration & Biodegradation. - 2013. - V. 81. - P. 88-104.).
Поэтому важнейшей задачей в области испытаний на стойкость материалов к биоповреждению и биозаражению является проблема разработки экспресс-методов, для которых характерны быстрота, высокая чувствительность и точность (23. Konwar Uday. Vegetable oil based highly branched polyester/clay silver nanocomposites as antimicrobial surface coating materials / Konwar Uday, Korak Niranjan, Mandal Manabendra // International Journal. - 2010. -V. 68. - №4. - P. 265-273).
Основными современными методами экспресс-диагностики возбудителей являются молекулярные методы детекции, которые требуют высокотехнологичного оборудования, комплекса помещений и высококвалифицированного персонала (24. Соколов Д.М., Соколов М.С. Экспресс-методы диагностики // Молочная промышленность, №1. - 2015. // https: // mibio.ru / contents.php?id=2944, дата обращения 05.07.2020 г. ).
В настоящее время на рынке предлагаются различные мобильные и передвижные микробиологические лаборатории, «оборудованные по последнему слову науки и техники».
Так, известна передвижная микробиологическая лаборатория экспресс-диагностики, созданная на базе автомобиля повышенной проходимости, оснащенная^специальным сверхточным оборудованием для диагностики особо опасных и других очаговых инфекций (25. Патент RU №165046 Микробиологическая лаборатория экспресс-диагностики. U1. МПК В60Р 3/00. Заявка 2015151262/11, заявлено 30.11.2015. Опубликовано 27.09.2016. Авторы: Кутырев В.В., Шарова И.Н., Глазков А.Н., Морозов К.М., Карнаухов И.Г., Щербокова С.А. Патентообладатели: Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека («РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора (RU).
Недостатком известного решения является дороговизна исполнения лаборатории и оборудования для экспресс-диагностики.
В настоящее время для диагностики различных инфекций используются методы, основанные на проведении иммунологических исследований, либо ПЦР-диагностики (полимеразной цепной реакции). Использование данных методов позволяет существенно сократить продолжительность анализа.
Однако в ПЦР-диагностике имеются свои недостатки, в частности, вероятная ложно положительная реакция, связанная с наличием в продукте инактивированных микроорганизмов или их фрагментов, а также необходимость покупки дорогостоящего оборудования для проведения исследований (26. Нежвинская О., Дудчик Н. Продукт. BY №6(170), июнь 2016 // https://produkt.by/storv/ekspress-metody-vyyavlrniva-paogennyh-mykroorganismov-v-produktah-pityania, дата обращения 03.07.2020 г.).
Кроме того, обнаружение антигенов или ДНК микроорганизмов в исследуемом материале не дает информации об их жизнеспособности и, такие исследования не подходят для образцов с низкими уровнями контаминации (27. Соколов Д.М., Соколов М.С. Экспресс-методы диагностики // Молочная промышленность, №1. - 2015. // https://mibio.ru/contents.php?id=2944, дата обращения 05.07.2020 г.).
Известен способ экспресс-диагностики вирусов, основанный на использовании флуоресцирующего конъюгата иммуноглобулина, что позволяет упростить диагностику вирусов (28. Патент RU №2429484 Способ экспресс-диагностики ротовирусной инфекции в материалах из верхних дыхательных путей, иммуноглобулин флеоресцирующий сухой для его осуществления. С2, МПК G01N 33/533, С07К 16/06. Заявка 2009116698, заявлено 30.04.2009 г. Опубликовано 20.09.2011 г. Авторы: Дондурей Е.А., Осидак Л.В., Потапенко Л.Б., Голованова А.К., Милькинт К.К., Суховецкая В.Ф., Сироткин А.К. Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (RU)).
Недостаток известного способа в том, что он не приемлем для экспресс-диагностики биозаражения ПКМ, поскольку обеспечивает доступность диагностики только вирусов и только в биологических материалах, отобранных от людей.
Известен метод экспресс-диагностики бактериальной инвазии, основанный на спектрофотометрическом изучении материала (29. Журавлев А.С., Аврунин О.Г., Калашник Ю.М. Экспресс-диагностика характера бактериальной инвазии при хронических риносинуситах, https://pandia.ru/text/80/533/72273.php, дата обращения 04.07.2020 г.).
Недостатком известного метода является то, что для его исполнения необходимо наличие дорогостоящего оборудования.
Известен способ экспресс-диагностики штамма COVID-19 (30. Методические рекомендации MP №3.1.0169-20 «Лабораторная диагностика COVID-19», утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, утв. 30 марта 2020 г.).
Однако известные рекомендации предназначены только для выявления штамма вируса COVID-19 из биологического материала от людей и не предполагают применение перечисленных в MP исследований для экспресс-диагностики биозаражения ПКМ микроорганизмами.
Известны способы индикации патогенных биологических агентов, в том числе не установленного систематического положения (31. Методические рекомендации MP №3.1.0129-18 «Порядок организации и проведения индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения», утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, утв. 31 мая 2018 г.).
Известные рекомендации также предназначены только для диагностики материала от людей и не предполагают применение перечисленных в MP исследований для экспресс-диагностики биозаражения ПКМ микроорганизмами.
Известен способ диагностики многослойных конструкций из композитных материалов, направленный на решение задачи повышения достоверности диагностики технического состояния реальных сложных многослойных пространственных конструкций из композиционных материалов (32. Патент RU №2633288 Способ диагностики надежности и предельного ресурса эксплуатации многослойных конструкций из композитных материалов. С1, МПК G01N 25/72. Заявка 2016126818, заявлено 07.04.2016 г. Опубликовано 11.10.2017 г. Авторы: Будадин О.Н., Кульков А.А., Казельская C.O., Каледин В.О. Патентообладатель: Акционерное общество Центральный научно-исследовательский институт специального машиностроения (RU)).
Недостатком известного способа является то, что он не применим для диагностики биозаражения ПКМ, в частности, стержней БПА, криофильными микроорганизмами.
Известен способ, позволяющий быстро и эффективно идентифицировать общее количество жизнеспособных микроколоний микроорганизмов, основанный на идентификации по светопоглощению или флуоресцентными методами (33. Патент RU №2505607 Способ быстрого выращивания, детекции и идентификации или подсчета микроколоний микроорганизмов ранней стадии. С2, МПК C12Q 1/04, C12Q 1/06, C12Q 1/08. Заявка 2009138925, заявлено 24.03.2008 г. Опубликовано 27.01.2014 г. Номер публикации патента: 3. Авторы: Газенко СВ. (US). Патентообладатели: Нанолоджикс, ИНК (US)).
Недостаток известного решения заключается в сложности исполнения способа.
Известен способ для детекции микроорганизмов, обеспечивающий селективную детекцию жизнеспособных клеток микроорганизмов, содержащихся в продуктах питания, биологических образцах, промышленной и водопроводной водах (34. Патент RU №2527897 Способ и набор для детекции микроорганизмов. МПК C12N 15/09, C12Q 1/04, C12Q 1/25, C12Q 1/68. Заявка 2012106617, заявлено 23.07.2010 г. Опубликовано 10.09.2014 г. Номер публикации патента: 26. Авторы: Соедзима Такаси (JP), Шлитт-Диттрих (JP). Патентообладатели: Моринага Милк Индастри КО., ЛТД (JP)).
Недостаток известного решения также заключается в сложности исполнения способа.
Известны способы дифференцировки микроорганизмов с использованием красителей на растительной основе, например: с применением спиртового экстракта черноплодной рябины (35. Ишунина Т.А., Шевченко А.В., Калуцкий П.В., Медведева О.А. Методика окрашивания и дифференцировки микроорганизмов с использованием красителя на растительной основе // Биомедицина. - №4. - 2018. - С. 72-78); с применением винограда и черной смородины (36. Ишунина Т.А. Гистологические красители на основе экстрактов ягод винограда и черной смородины // Морфологические ведомости. - №4. - 2015. -. 65-68); с применением экстрактов бузины черной, бархацев распростертых и донника лекарственного (37. Ишунина Т.А., Боева С.Г. Разработка технологии приготовления и применения гистологические красители на основе экстрактов бузины черной, бархацев распростертых и донника лекарственного // Химия растительного сырья. - №2. - 2017. - С. 163-169); с применением экстрактов цветков георганы, розы и пиона (38. Ишунина Т.А., Моспанова А.А., Архипова А.Г. Применение экстрактов цветков георганы, розы и пиона для гистологического окрашивания // Химия растительного сырья. - №3. - 2017. - С. 221-226).
Недостатком способов является предварительное культивирование микроорганизмов на специальных диагностических средах, на что требуется дополнительное время и сложность изготовления самих красителей на основе свежих ягод и цветков, которые необходимо либо специально выращивать, либо производить закупки и каким-то способом их хранить до использования, что усложняет сам способ и увеличивает время проведения процедуры.
Таким образом, несмотря на достаточное количество известных стандартов для борьбы с биоповреждениями, а так же существующих методик и рекомендаций для диагностики микроорганизмов и биозаражений материалов, в уровне техники до сих пор отсутствуют разработки по экспресс-диагностике биозаражения ПКМ, в частности БПА, криофильными микроорганизмами, что является актуальным и востребованным при эксплуатации БПА в условиях Крайнего Севера.
Криофильные микроорганизмы - микроскопические грибы, бактерии, дрожжи, актинобактерии и водоросли, способные расти при пониженных температурах (от плюс 5 до минус 6°С). Микроорганизмы, для которых верхний предел температуры роста выше плюс 20°С называют факультативными криофилами; растущие при температурах ниже плюс 20°С (оптимум ниже плюс 15°С) и до отрицательных значений температуры являются облигатными (строгими) криофилами.
Многоэтапность классического микробиологического метода исследований занимает много времени и материальных затрат, что экономически не эффективно и обуславливает необходимость в разработке способа экспресс-диагностики биозаражения БПА криофильными микроорганизмами, что позволит не только экономично расходовать материальные запасы и сократить время на проведение исследований, а также значительно сократить время на выявление и устранение причин биозаражений и биоповреждений БПА при их эксплуатации в природно-климатических условиях Крайнего Севера.
Прототипом заявляемого изобретения является применение перхлората пиримидо [1,2-а] бензимидазолия в качестве флуоресцентного красителя для растительных тканей и микроорганизмов, заключающийся в окрашивании микроскопических препаратов красителем на основе перхлоратов пиримидо 1,2-а бензимидазолия после чего микробные клетки дают флуоресценцию и с легкостью диагносцируются (40. Авторское свидетельство SU №1051091 Перхлораты пиримидо [1,2-а] бензимидазолия в качестве флуоресцентных красителей растительных тканей и микроорганизмов. А1. МПК C07D 487/04, А61К 31/505, А61К 31/519, COIN 33/52. Заявка 3462494, заявлено 01.07.1982 г. Опубликовано 30.10.1983 г. Авторы: Дмитриева Н.А., Благородов С.Г., Чернавская Л.Н., Звездина Э.А., Жданова М.П. Правообладатель: Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.А. Суслова и Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и гигиены).
Недостатком способа является то, что известное решение не позволяет диагносцировать поврежденные и неживые микробные клетки, а также то, что для микроскопирования используются микробные клетки полученные из колоний, предварительно культивированных микроорганизмов на специальных диагностических средах, что увеличивает время проведения процедуры, кроме того в известном решении отсутствует информация о возможности диагностики микробных клеток, находящихся в смывной жидкости, полученной методом смыва с поверхностей полимерных композитов до их выделения методом культивирования на питательных средах, кроме того, способ не применим для диагностики контаминации и биозаражения криофильными микроорганизмами БПА.
Таким образом, до настоящего времени не известно ни одной экспресс-диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами ПКМ, в частности БПА, экспонируемых в условиях открытой экосистемы при экстремально низких температурах окружающей среды (от 0 до минус 42°С).
Задачей изобретения является расширение номенклатуры имеющихся способов экспресс-диагностики биозаражения материалов, в частности БПА, криофильными микроорганизмами, с использованием метода окраски микробных клеток, вызывающих биозаражение различных материалов и разработка нового способа экспресс-диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами БПА, экспонируемой в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С).
Поставленная задача решается тем, что предлагается способ экспресс-диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами БПА, экспонируемой в условиях открытой экосистемы при экстремально низких температурах окружающей среды, заключающийся в определении наличия или отсутствия микроорганизмов, вызывающих контаминацию и биозаражение БПА в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С), отличающийся от прототипа тем, что в качестве красителя для диагностики биозаражения БПА криофильными микроорганизмами применяется люминисцентный краситель L-7012 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, производства Molecular Probes (США); в качестве объекта для экспресс-диагностики биозаражения используются стержни БПА, экспонируемые в условиях открытой экосистемы, при экстремально низких температурах окружающей среды (от 0 до минус 42°С) и смывная жидкость, полученная с поверхностей исследуемых стержней БПА, экспонируемых в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С), с последующим окрашиванием ее люминисцентным красителем L-7012, приготовлением микроскопического препарата и микроскопированием полученного препарата.
Известно, что люминисцентная микроскопия применяется в диагностике туберкулеза, при нативном исследовании биологического материала от больных туберкулезом людей [41. Приказ Минздрава РФ от 21 марта 2003 г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» (с изменениями и дополнениями). Приложение №10. Инструкция по унифицированным методам микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий в клинико-диагностических лабораториях учебно-профилактических учреждений].
Однако не известно о каких-либо публикациях, освещающих применение люминисцентной микроскопии в качестве экспресс-диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами БПА, при экспонировании ее в условиях экстремально-низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С).
Предлагаемый способ позволяет быстро определить наличие (или отсутствие) криофильных микроорганизмов, вызывающих биозаражение БПА при экспонировании ее в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С).
Предлагаемое решение может применяться для экспресс-диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами БПА, экспонируемой в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С), что является перспективным для принятия мер по ранней профилактике биоповреждений при эксплуатации БПА в природно-климатических условиях Крайнего Севера.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Диагностика биозаражения криофильными микроорганизмами базальтопластиковой арматуры, экспонируемой в условиях открытой экосистемы при экстремально низких температурах.
Для диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами использовали метод смыва с опытных образцов БПА, экспонируемых в условиях открытой экосистемы на полигоне климатических испытаний Якутского научного центра (г.Якутск, ул. Автодорожная, 20) в течение 1 года (2018-2019 гг.).
Опытные образцы БПА изготовлены ООО «ТБМ» на технической линии «Струна» согласно ТУ (42. ТУ 2296-001-86166796-2013 «Арматура неметаллическая композитная из базальтопластика»).
Отбор смывов с образцов БПА производили 6 декабря 2019 г., в соответствии с методическими указаниями (43. МУК 4.2.2942-11 Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях, Москва, 2011) стерильными ватными тампонами, вмонтированными в биологические пробирки.
Температура воздуха, зафиксированная на отметке 0°С на территории полигона климатических испытаний в городе Якутске, где экспонировались опытные образцы БПА, в 2019 году пришлась на 9 октября, постепенно снижаясь температура воздуха достигла своего минимума к 28 декабря - минус 46°С. Средняя температура воздуха на территории полигона климатических испытаний в городе Якутске с 1 по 6 декабря 2019 г. составила днем - минус 33,8°С, ночью - минус 42,1°С; в день отбора проб (06.12.2019 г., в 08:30) - 40°С.
Таким образом, в период с 9 октября по 6 декабря 2019 г., образцы БПА экспонировались в условиях экстремально низких температур окружающей среды (от 0 до минус 42°С).
Для осуществления способа предварительно готовили забуференную пептонную воду следующего состава (грамм/литр): протеозопептон - 10,00; натрия хлорид - 5,00; натрия гидрофосфат - 3,50; калия дигидрофосфат - 1,50.
Ингридиенты, входящие в вышеописанный состав размешивали в 1 литре дистиллированной воды, после чего устанавливали рН до 7,2±0,2 усл.ед. и разливали в стерильные стеклянные флаконы по 50 мл.
Флаконы с забуференной пептонной водой стерилизовали при 1,1 атм (121°С) в течение 15 минут.
После стерилизации флаконы с забуференной пептонной водой охлаждали при комнатной температуре.
Затем подготавливали необходимое количество предварительно простерилизованных биологических пробирок с ватными тампонами для забора смывов с опытных образцов БПА, экспонируемых на полигоне климатических испытаний.
В подготовленные пробирки с ватными тампонами асептически разливали по 2 мл охлажденной стерильной забуференной пептонной воды.
Забуференная пептонная вода использовалась в качестве средства для повышения эффективности диагностики криофильных микроорганизмов-контаминантов ПКМ, в том числе, поврежденных микробных клеток, под воздействием неблагоприятных условий окружающей среды (резкие перепады температуры воздуха, атмосферные осадки, изменение атмосферного давления, воздействие солнечного излучения, влажности и др.).
Ранее забуференная пептонная вода была рекомендована Международным комитетом (ISO 6579:1993) для повышения высеваемости поврежденных клеток бактерий рода Salmonella из пищевых продуктов (44. International Organization for Standardization (ISO), 1993, Draft ISO/DIS, 6579).
Смоченными в забуференной пептонной воде тампонами производили отбор смывов с образцов БПА, экспонируемых в условиях открытой экосистемы, при экстремально низких температурах, предварительно сняв с них снежный покров заранее подготовленной стерильной щеточкой.
На следующем этапе проводили подготовку микроскопа и люминисцентного красителя L-7012 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, производства Molecular Probes (США) для окраски смывной жидкости и приготовления микроскопического препарата.
Для этого, компонент А (флюорохром пропидиум иодида) и компонент В (изо-тиоцинат флюоресцеина) из упаковки с красителем L-7012 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit размораживали при комнатной температуре в темных условиях, разместив их в закрытом лабораторном шкафу (45. Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecularprobes inc., Eugene, 2001. https://www.scirp.org/reference/reherencespapers.aspx?referenceid-727325).
Размороженный краситель центрифугировали в течение 1 минуты при 15000 оборотах в минуту.
Затем, из пробирки с ватным тампоном, которым производили смыв с образца БПА, асептически пастеровской пипеткой переносили в центрифужную стерильную пробирку 1 мл смывной жидкости и также центрифугировали в течение 1 мин при 15000 об/мин.
После чего к 1 мл, полученной после центрифугирования, смывной жидкости добавляли по 1,5 мкл компонента А и 1,5 мкл компонента В из упаковки с размороженным красителем L-7012 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit.
Содержимое каждой пробирки встряхивали до перемешивания красителей и смывной жидкости, пробирки снова помещали в лабораторный шкаф с закрытой дверцей и экспонировали при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин.
Не использованный краситель, согласно инструкции, снова замораживали и хранили до следующего применения при температуре минус 20°С.
После экспонирования из каждой пробирки отбирали по 5 мкл полученной окрашенной смывной жидкости и наносили ее на предметные стекла, распределяя тонким слоем в центре стекла на площади 2×1 см и немедленно просматривали в флуоресцентном микроскопе (объектив × 100, окуляр × 10, масляная иммерсия).
В полученных микроскопических препаратах хорошо были видны жизнеспособные микробные клетки криофильных микроорганизмов, светящиеся зеленым светом и желто-оранжевые клетки поврежденных и нежизнеспособных микроорганизмов.
В микроскопических препаратах, полученных из смывной жидкости, отобранной с поверхности образцов БПА, экспонируемых на полигоне климатических испытаний в условиях открытой экосистемы при экстремально низких температурах окружающей среды (от 0 до минус 42°С), доля жизнеспособных и нежизнеспособных клеток составила по 50%, это свидетельствует о высокой устойчивости, обнаруженных микробных клеток к экстремально низким температурам (от 0 до минус 42°С) (таблица 2).
Предлагаемый способ позволил сравнительно быстро (в течение 15-20 минут) диагносцировать биозаражение БПА криофильными микроорганизмами, при этом в микроскопических препаратах были выявлены как неповрежденные (живые) клетки, так и поврежденные клетки микроорганизмов, идентификация которых заключается в различной окраске микробных клеток: не поврежденные - окрашиваются в ярко зеленый цвет, а поврежденные - в желтый, оранжевый или красный цвет.
Полученные результаты предлагаемого способа экспресс-диагностики биозаражения БПА криофильными микроорганизмами подтверждены классическим микробиологическим способом.
Классический микробиологический метод диагностики биозаражения ПКМ криофильными микроорганизмами состоит из следующих этапов: подготовка объекта к отбору проб на исследование; отбор проб для исследований; посев материала прямым методом и (или) с применением метода накопительных культур; культивирование полученного материала на простых, накопительных и (или) специальных дифференциально-диагностических питательных средах при температурах, соответствующих оптимальным значениям для роста и метаболизма криофольных микроорганизмов; выделение микроорганизмов и получение чистых культур; идентификация выделенных культур.
Для контроля эффективности предлагаемого способа экспресс-диагностики биозаражения был выполнен параллельный посев смывной жидкости с исследуемых образцов БПА на мясопептонный агар (МПА) и агаризированную среду Чапека-Докса, при этом микроскопический препарат и контрольный посев смывной жидкости производили из одной и той же порции материала.
Для приготовления МПА к 1 л мясопептонного бульона (МПБ) промышленного производства добавляли 20 граммов агар-агара и оставляли на несколько часов для набухания агара, затем кипятили на слабом огне до полного его растворения, после этого доводили объем жидкости до первоначального дистиллированной водой, фильтровали через марлевый фильтр, смоченный предварительно горячей водой. Устанавливали рН до 7,0±0,2усл.ед.
Готовую среду в горячем виде разливали в стеклянные колбы и стерилизовали в автоклаве при 1 атмосфере (121°С) в течение 20 минут.
После стерилизации МПА разливали в асептических условиях в чашки Петри.
После застывания и просушивания МПА в термостате при плюс 37°С, в течение 45 минут, на его поверхность производили прямой посев смывной жидкости, отобранной с исследуемых образцов БПА.
3
4
2
4
4
Для приготовления среды Чапека-Докса готовили 1 литр дистиллированной воды, из этого объема отливали 300 миллилитров воды в отдельную емкость, в которую вносили 20 граммов агар-агара для набухания. В емкость с оставшейся водой вносили (в граммах): сахарозу - 30,0; нитрат натрия (NaNO) - 2,0; сульфит магния (MgSO) - 0,5; хлорид калия (KCl) -0,5; фосфат калия двузамещенный (KНРО) - 1,0; сульфит железа (FeSO) - 0,01.
В полученный состав вносили разбухший агар-агар, хорошо размешивали.
Затем всю смесь кипятили при постоянном помешивании, чтобы не допустить пригорания агар-агара.
Устанавливали рН до 7,3±0,2 усл.ед.
Готовую среду в горячем виде разливали в стеклянные колбы и стерилизовали в автоклаве при 1 атмосфере (121°С) в течение 20 минут.
После стерилизации среду Чапека разливали в асептических условиях в чашки Петри до застывания.
После застывания и просушивания среды в термостате при плюс 37°С, в течение 45 минут, на ее поверхность производили прямой посев смывной жидкости, отобранной из исследуемых образцов БПА.
Культивирование посевов на среде Чапека и МПА проводили в стационарных условиях при температуре плюс 4±1°С.
Через 7-30 суток культивирования посевов на чашках с питательными средами отмечен полноценный рост актинобактериальных, бактериальных и грибных форм микроорганизмов, котрорые идентифицировали по морфо-культуральным, биохимическим и микроскопическим методам.
Выделенные из смывной жидкости, полученной методом смыва с поверхностей экспонируемых образцов БПА криофильные микроорганизмы распределены в следующем соотношении: грибы (преимущественно родов Aspergillus и Penicillium) - 43,5%, актинобактерии (преимущественно род Nocardia) - 39,1%, бактерии (преимущественно род Bacillus) - 17,4%, что согласуется с результатами других исследователей, в ходе которых установлено, что грибы менее чувствительны к низким температурам, чем бактерии, а актинобактерии занимают промежуточное положение между грибами и бактериями (46. Алтон Л.В. Адаптация организмов к условиям Крайнего Севера // Всесоюзное совещание: Тезисы докладов. Таллин. 1984. С. 13-14).
Таким образом, полученные результаты предлагаемого способа экспресс-диагностики биозаражения БПА криофильными микроорганизмами подтверждены классическим микробиологическим исследованием, а сам способ позволяет быстро определить наличие (или отсутствие) криофильных микроорганизмов, вызывающих биозаражение БПА, при их экспонировании в условиях открытой экосистемы при экстремально низких температурах окружающей среды (от 0 до минус 42°С).
В сравнении с классическим методом микробиологической диагностики, предложенный способ экспресс-диагностики биозаражения БПА криофильными микроорганизмами обладает значительным преимуществом, а именно значительным сокращением сроков диагностики биозаражения БПА криофильными микроорганизмами (до 15-20 минут).
Предлагаемое решение может применяться для экспресс-диагностики биозаражения криофильными микроорганизмами БПА, экспонируемыми в условиях открытой экосистемы при экстремально низких температурах окружающей среды (от 0 до минус 42°С), что является актуальным при эксплуатации БПА в природно-климатических условиях Крайнего Севера.