Анализ разнообразия генов цитруллинуреидазы у бактерий рода Francisella

13. Nakamura Т., Muramatsu Т., Ono Y. Matsushita M., Yoshimura K., Kanba S. et al. Serotonin transporter gene regulatory region polymorphism and anxiety-related traits in the Japanese. Am. J. Med. Genet. 1997; 4: 544-5.

14. Yoshida K.1, Naito S., Takahashi H., Sato K., Ito K., Kamata M. et al. Monoamine oxidase: A gene polymorphism, tryptophan hydroxylase gene polymorphism and antidepressant response to fluvoxam-ine in Japanese patients with major depressive disorder. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 2002; 26: 1279-83.

15. Sabol S.Z., Hu S., Hamer D. A functional polymorphism in monoamine oxidase A gene promoper. Human Genetics. 1998; 103: 273-9.

16. Costa P. Т., & McCrae R. R. The NEO-PI/NEO-FFI manual supplement. Odessa, FL: Psychological Assessment Resources; 1989.

17. Sokal R.R., Rohlf F.J. Biometry: the principles and practice of statistics in biological research. 3rd edn. New York: Freeman; 1994.

18. Butovskaya M.L., Veselovskaya E.V., Godina E.Z., Tret'jak A.V., Silaeva L.V. Morpho-functional and personal characteristics of male athlete as a model of adaptive systems in paleore-constructions. Vestnik Moskovskogo universiteta. Serija XXIII. Antropologija. 2011; (2): 4-17. (Russian) (Бутовская М.Л., Ве-селовская Е.В., Година Е.З., Третьяк А.В., Силаева Л.В. Мор-фофункциональные и личностные характеристики мужчин спортсменов как модель адаптивных комплексов в палеоре-конструкциях. Вестник Московского университета. Серия XXIII. Антропология. 2011; (2): 4-17).

19. Butovskaya M.L., Veselovskaya E.V., Prosikova E.A., Kondrat'eva A.V. Morpho-psychological complexes as an indicator of success in sports: women. Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya XXIII. Antropologiya. 2012; 2: 29-41. (Russian) (Бутовская М.Л., Веселовская Е.В., Просикова Е.А., Кондратьева А.В. Морфо-психологические комплексы как индикатор успешности в спорте: женщины. Вестник Московского университета. Серия XXIII. Антропология. 2012; 2: 29-41).

20. Butovskaya M.L., Veselovskaya E.V., Prudnikova A. S. Models of bio-social adaptation and their implementation in terms of industrial society. Arkheologiya, etnografiya i antropologiya Evrazii. 2010; 4: 143-54. (Russian) (Бутовская М.Л., Веселовская Е.В., Прудникова А. С. Модели биосоциальной адаптации человека и их реализация в условиях индустриального общества. Археология, этнография и антропология Евразии. 2010; 4: 143-54).

21. Strobel A.1, Gutknecht L., Rothe C., Reif A., Mössner R., Zeng Y. et al. Allelic variation in 5-HT1A receptor expression is associated with anxiety- and depression-related personality traits. Journal of Neural Transmission. 2003; 110: 1445-53.

22. Tochigi M., Umekage T., Kato C., Marui T., Otowa T., Hibino H. et al.

Serotonin 2A receptor gene polymorphism and personality traits: no evidence for significant association. Psychiatric Genetics. 2005; 15: 67-9. 23. Vedjakov A. M., Tonevickij A.G. Analysis of a number of important genetic polymorphisms in athletes. Fiziologija cheloveka. 2006; 32: 92-7. (Russian) (Ведяков, А.М., Тоневицкий А.Г. Анализ ряда значимых генетических полиморфизмов у спортсменов. Физиология человека. 2006; 32: 92-7).

Поступила 30.12.14 Received 30.12.14

ASSOCIATION BETWEEN FOUR SEROTONIC GENES POLYMORPHISM (5HTTL, 5HT1A, 5HT2A, AND MAOA) AND PERSONALITY TRAITS IN WRESTLERS AND CONTROL GROUP

Butovskaya P. R.1, Lazebnij O. E.2, Fekhretdionva D. I.6, Vasil'ev V. A.3, Prosikova E. A.4, Lysenko V. V.5, Udina I. G.1, Butovskaya M. L.4

1 Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 2 Koltsov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 3 Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 4 Miklukho-Maklai Institute of Ethnology and Anthropology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 5 Kuban State University of Physical Culture, Sports and Tourism, Krasnodar, Russia; 6 Moscow State Pedagogical University, Moscow, Russia

This study presents the data on the polymorphisms of the serotonin system genes (5-HTTL, 5-HT1A, 5-HT2A, and MAOA) in male and female wrestlers and in the control group. The population genetics analysis of the 5HTTL gene showed the highest frequency of the SS genotype 5-HTTLPR in sportsmen (p = 0.04), as well as the trend toward higher frequency of united genotypes of the locus of 5-HTTLPR VNTR and SNP rs25531 - SASA (p = 0.06) in comparison with the control group. As for the polymorphisms for other genes 5-HT1A (rs6295), 5-HT2A (rs6311), and MAOA (VNTR), we found no significant differences between the groups tested. Using the NEO PI-R questionnaire we analyzed the possible correlations between the genotypes and the psychological traits in our samples. It was demonstrated that the athletic success in elite sportsmen was associated with lower openness to experience and higher conscientiousness. The interaction effect of the gender and 5-HT2A on the self-rating for openness to experience, interaction effect of the level of the sport success and 5-HT2A, and the interaction effect of the gender and 5-HT1A genotype on self-reported conscientiousness were observed as a trend.

Key words: 5HTT; 5HT1A; 5HT2A;MAOA; wrestling;personality traits.

© коллектив авторов, 2015 УДК 579.841.95:579.25].083.1

Тимофеев В.С., Бахтеева И.В., Павлов В.М., Мокриевич А.Н.

анализ разнообразия генов цитруллинуреидазы у бактерий

рода francisella

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279, Оболенск, Московская область,

Российская Федерация

В данной работе представлены результаты анализа in silico генетического разнообразия гена цитруллинуреидазы (ctu) у двух видов бактерий рода Francisella: tularensis (ssp. tularen-sis, holarctica, mediasiatica, novicida) и philomiragia. Штаммы среднеазиатского подвида, обладающие цитруллинуреидазной активностью, отличаются в гене ctu от ssp. tularensis Schu тремя нуклеотидными заменами, приведшими к появлению двух несущественных аминокислотных замен в кодируемом им белке. У проанализированных штаммов F. tularensis ssp. holarctica ген ctu кодирует неактивный фермент, вероятно, из-за замены аминокислот: 151 Gly ^ Asp, 183 Pro ^ Leu, 222 Asp ^ Asn. За

Для корреспонденции: Мокриевич Александр Николаевич; e-mail: mokrievich@obolensk.org.

исключением бактерий японского биовара, во всех штаммах голарктического подвида в последовательности гена ctu находятся также два стоп-кодона.

У бактерий подвида novicida ген ctu обнаружен только у штамма 3523, в других штаммах присутствует ген FTN_0827, кодирующий C-N-гидролазу, которая, возможно, обладает цитруллинуреидазной активностью.

Ключевые слова: FranciselШ; цитруллинуреидаза; С-N-гидролаза; ферментативная активность.

Введение

Бактерия Francisella tularensis - возбудитель туляремии - является внутриклеточным паразитом. Заражение людей происходит различными путями: через укусы ин-

Таблица 1

Штаммы F. tularensis, использованные в работе

№ Название штамма Каталожный номер Подвид Дата выделения Место выделения

1 9 В-4671 holarctica 1948 г. Московская обл.

2 503 В-4676 " 1949 г. " "

З 21/400 В-4677 " 1949 г. " "

4 Jasoe В-4680 holarctica bv.japonica 1974 Япония

5 Miura В-4681 holarctica bv.japonica 1975 "

б C-4 В-6091 holarctica 1975 Грузия

l C-7 В-6092 H 1948 Ставропольский край

B C-12 В-6093 H 1973 " "

9 345 В-6096 H 1983 Мурманская обл.

10 C-22 В-6099 H 1987 Азербайджан

11 C-24 В-6100 H 1981 Грузия

12 C-26 В-6101 H 1986 Калмыкия

13 I-388 В-7047 H 2011 Новосибирская обл.

14 I-387 В-7046 H 2010 " "

15 I-382 В-6890 H 1991 Бурятия

1б А-1045 B-7178 H 2011 Алтайский край

1l Schu В-4679 tularensis 1941 США

фицированных клещей, мух и комаров, прямым контактом с больными животными, с приемом внутрь контами-нированной воды и пищи, аэрогенным путем.

Бактерии Е tularensis и Е philomiragia относятся к роду Francisella. Согласно современной классификации, в пределах вида Е. tularensis выделяют 4 подвида: Шагеп-

Таблица 2

Список проанализированных штаммов рода FranciseUa из базы данных NCBI

№ Название штамма Систематическое положение NCBI Reference Sequence

1 FSC198 Francisella tularensis subsp. tularensis NC_008245.1

2 SCHU S4 Francisella tularensis subsp. tularensis NC_006570.2

З WY96-3418 Francisella tularensis subsp. tularensis NC_009257.1

4 FSC147 Francisella tularensis subsp. mediasiatica NC_010677.1

5 LVS Francisella tularensis subsp. holarctica NC_007880.1

б FSC200 Francisella tularensis subsp. holarctica NC_019551.1

l OSU18 Francisella tularensis subsp. holarctica NC_008369.1

B 3523 Francisella tularensis subsp. novicida NC_017449.1

9 Fx1 Francisella tularensis subsp. novicida NC_017450.1

10 U112 Francisella tularensis subsp. novicida NC_008601.1

11 ATCC 25017 Francisella philomiragia subsp. philomiragia NC_010336.1

12 Toba 04 Francisella noatunensis subsp. orientalis. NC_017909.1

sis, holarctica, mediasiatica и novicida [1]. Вирулентность разных подвидов F. tularensis для человека существенно различается [2], поэтому подвидовая дифференциация культур возбудителя туляремии является важным этапом, так как позволяет прогнозировать эпидемическую опасность выделенной культуры. Одним из биохимических признаков F. tularensis, используемым для подви-довой дифференциации, является активность фермента цитруллинуреидазы [3].

Цитруллинуреидазная активность обнаружена у природных штаммов туляремийного микроба подвида tularensis [4, 5], а также у бактерий ssp. mediasiatica [6, 7] и штаммов F. tularensis ssp. novicida [8, 9]. У штаммов ssp. holarctica цитруллинуреидазная активность отсутствует [6, 7]. Вскоре после обнаружения цитруллинуреидазы у F. tularensis было высказано предположение о том, что

Таблица 3 Праймеры, использованные в данной работе

Название праймера Последовательность 5'-, 3'

CTUF1 TGGAGGAGGAATTCACTGTATTACTATG

CTUR1 GGTGAGATTATGCAGGTTAGAACTC

CTUF2 GTAAAATTATTCAAGCAGCTAAAAATGGTGC

CTUR2 CTTGCATCACTCTTTGCCAATGA

CTUR3 ATCGAACCATCCGCATCAATC

CTUF4 GATTGATGCGGATGGTTCGAT

CTUR4 CTATTTGATGCTAATACGGGCAACA

CTUF5 GATCATTGGCAAAGAGTGATGCA

CTUR6 GATTCATCAATGGTTTTAGCTAAATCAA

CTURl GTATCCCAAACCTTAAAACCAGCA

CTUFB TGCTGGTTTTAAGGTTTGGGATAC

CTURB CAGCAATTTTATCACCAGTATGATCAG

Таблица 4

Наличие стоп-кодонов в гене ctu и активность цитруллинуреи-дазы в разных штаммах голарктического подвида F. tularensis

№ Название штамма Подвид Стоп-кодон 1 160С^Т Стоп-кодон 2 422G^A Цитруллинуреидазная активность

1 9 holarctica + + -

2 503 holarctica + + -

3 21/400 holarctica + + -

4 Jasoe holarctica _ _ _

Miura

bv.japonica

holarctica bv.japonica

6 C-4 holarctica + +

7 C-7 holarctica + +

8 C-12 holarctica + +

9 345 holarctica + +

10 C-22 holarctica + +

11 C-24 holarctica + +

12 C-26 holarctica + +

13 I-388 holarctica + +

14 I-387 holarctica + +

15 I-382 holarctica + +

16 1045 holarctica + +

этот фермент является фактором патогенности туляре-мийного микроба [10].

Цитруллинуреидаза (CTU), кодируемая у штамма F. tularensis ssp. tularensis Schu S4 геном ctu размером 861 нуклеотид (FTT0435) [11], принадлежит к семейству C-N-гидролаз и разлагает цитруллин на орнитин, двуокись углерода и аммиак [4]. Цитруллин является одним из ключевых метаболитов аргинин-цитруллинового цикла в макрофагах, участвуя в регуляции синтеза оксида азота индуцибельной NO-синтазой (iNOS) в процессе окислительного взрыва в макрофагах [12, 13]. Бактериальная цитруллинуреидаза в макрофаге подавляет аргинин-цитруллиновый цикл, разрушая цитрул-лин [12]. Продукт деградации цитруллина - аммиак -защелачивает эндосому и тем самым задерживает созревание фагосом, способствуя выживанию F. tularensis в макрофагах [14]. У мутантов F. tularensis ssp. tularensis Schu S4 с делетированным геном цитруллинуреидазы снижается уровень выживания и внутриклеточного размножения в мышиных макрофагах [11]. В экспериментах in vivo утрата гена ctu в геноме Schu S4 приводила также к снижению обсемененности паренхиматозных органов зараженых мышей, уменьшению выраженности гистопато-генных изменений в легких и увеличению среднего времени гибели мышей, однако показатель LD50 при этом не менялся. Таким образом, ци-труллинуреидаза является фактором патогенности F. tularensis, который, вероятно, влияет на тяжесть инфекционного процесса.

Сведений о наличии гена ctu или его аналогов у других представителей рода Francisella в доступной литературе мы не обнаружили.

В настоящем сообщении приведены данные анализа in silico нуклеотидных последовательностей гена ctu и первичной структуры кодируемого ими белка, а также генов, кодирующих C-N-гидролазы, к которым отно-стится цитруллинуреидаза, у различных представителей рода Francisella.

Материалы и методы

Штаммы микроорганизмов. Штаммы F. tularensis, использованные в работе, представлены в табл. 1.

Среды и условия культивирования. Штаммы F. tularensis культивировали при температуре 37 0С на плотной питательной среде «FT-агар» (ФБУН ГНЦ ПМБ) с добавлением полимиксина B до концентрации 100 мкг/мл. Стандартную суспензию клеток F. tularensis (11010 м.к./мл) готовили с использованием стандарта мутности (ОСО 42-28-85-2012 ФГБУ НЦЭСМП).

Цитруллинуреидазную активность определяли по методу [7]: к 1 мл суспензии бактерий (1-1010 м.к./мл) в фосфатном буфере рН 6.5, добавляли 1 мл 0,7% раствора цитруллина и инкубировали при температуре 30оС в течение 20 ч. После этого из пробы отбирали 0,01 мл и добавляли к 0,49 мл дистиллированной воды. Разбавленную суспензию смешивали с 1 мл свежего нингидринового реактива (625 мг нингидрина растворяют в 10 мл 6 М раствора орто-фосфорной кислоты и 15 мл ледяной уксусной кислоты при нагревании в течение нескольких минут) и 1,5 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь прогревали 1 ч в кипящей водяной бане. Появление розовой окраски свидетельствовало о наличии цитруллинуреидазной активности в анализируемом образце. В качестве положительного контроля использовали бактерии F. tularensis штамм Schu.

Анализ in silico. Множественное выравнивание нуклеотид-ных и аминокислотных последовательностей, дизайн праймеров и трансляция in silico проводили с помощью пакета программ Vector NTI 10.0.1. («Invitrogen Corporation»). Поиск аналогов целевых генов и полипептидов проводили с использованием алгоритма BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Для построения филогенетических деревьев применяли программы MEGA 6.0 (http://www.megasoftware.net). Помимо нуклеотидных последовательностей генов, секвенированных в данной работе, были использованы аннотированные последовательности геномов микроорганизмов, представленные на портале NCBI http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ (табл. 2).

Секвенирование ДНК и синтез праймеров. Секвенирование проводили в компании «Синтол» (http://www.syntol.ru/). Для проведения секвенса фрагменты ДНК с геном ctu амплифицировали в ПЦР на термоциклере Mastercyclergradient («Eppendorf»,

ATG6C6AATATAAAAGTTGCAGTTGTCCAATTATCTTTTAATGATAATGAA6CT6AAAATTTA6CAAAACT66A GAGTAAAATTATTCAAGCAGCTAAAAATGGTGCAAAAATAATTCTTACCCCAGAGTTACCAAGTTATCTATATT TTTGCAAAAAACAAAATTCTAAATATTTTGATTTAGCTAAAACCATTGATGAATCACCAATAGTAAAATTATATA AACTCTTAGCACATAAATATAATATTGTTTTGCCTGCTAGTTTTTTTGAGAGAGATGGAAATGCTTGTTATAACT

CGATAGCAATGATTGATGCGGATGGTTCGATAATGGGTATATATCGTAAAGCCCATATTCCAGACGGTATTGG TTACCAAGAGAAATATTATTTCTCACCTGGAAGTGTTGGTTTTAAGGTTTGGGATACTAAATATGCTAAAGTTG GAGTTGATATTTGCTGGGATCAATGGTTTCCAGAAGCTGCTAGAGTAATGGCTTTAAAAGGTGCTGAAATTTTA TTATATCCAACAGCAATAGGGAGCGAACTACACTTACCAGATTACGATTCAAAAGATCATTGGCAAAGAGTGA TGCAAGGGCATGCTGCGGTAAATATGTTGCCCGTATTAGCATCAAATAGATATGCAACTGAGGCAAATGATAA TATCACAGCAACTTATTATGGCAGCTCATTCATAACTGATCATACTGGTGATAAAATTGCTGAGGCTGACAGAA GCGATGACGATATACTTTATGCAACATTTGATTTTGCTGAACTACAGCAGCAAAGGTTTTATTGGGGATTATTT AGGGATCGTCGCCCTGAGCTTTATGATGAAATTGTTAGAAAGTATTAA

Рис. 1. Нуклеотидная последовательность гена ctu F. tularensis ssp. holarctica bv.

japonica Miura.

5

on

2

in NH

m g

I [2

N u

I il

I s

â

С &

» 2

ТЛ "Д

г Es

У U

£ ä

о S

w й

- о 00 ю

С^ о

и I

И es

fe к

Í2 s с s

в S

* i

U

3

чЗ

к

о

5

U ft

CS

ч

s

с

Щ

í

CS Я

Ю ft

0 U

as

Й О

1 к

2 «

I ü § *

U со & в

р

и Ь о -S §13

1 %

u CS

и b §?

u

^ CS

« s

и Ä

H 2

u s

ig §

л «

4 CS

u к

H u

CS M

и ^

u ^

S3 ¡=>

О и

С О

s Ö

o fe <u

и и 1

s «

S о

U «

к P

rn ^

es J3 ft о О -s

<N cj S

P

holarctica FTNF002-00 holarctica OSU 18 holarctica LVS Mediasiatica FSC147 tularensis Schu S4 tularensis FSC 198 tularensis WY96-3418

holarctica FTNF002-00 holarctica OSU 18 holarctica LVS Mediasiatica FSC147 tularensis Schu S4 tularensis FSC 198 tularensis WY96-3418

(151) tgcam

(151) tgcam

(151) tgcam

(151) tgcam

(151) tgcam

(151) tgcam

(151) tgcam

\aata \aata \aata

\aa!

\aada \aafa

\aattctamtatt \aattctamtatt \aattctamtatt \aattctamtatt \aattctamtatt \aattctamtatt \aattctamtatt

gmgtgttggttttmgg gmgtgttggttttmgg gmgtgttggttttmgg gmgt G0TGGTTT taagg gmgt gütggttt taagg gmgt gcjtggttt taagg gmgtgqtggttttmgg

Рис. 3. Нуклеотидные замены, приведшие к инактивации гена

с1и у Е tularensis ssp. ^1агсйса. Левая колонка - штаммы Е tularensis, в скобках - номер нуклеотида, регионы с нуклео-тидными заменами обозначена: серым цветом. Триплеты со значимыми нуклеотидными заменами обозначены рамкой.

Германия) с помощью праймеров CTUF1 и CTUR1 (табл. 3). При секвенировании гена ctu F. tularensis использовали прайме-ры CTUF2, CTUR2, CTUR3, CTUF4, CTUR4, CTUF5, CTUR6, CTUR7, CTUF8, CTUR8 (см. табл. 3). При конструировании праймеров использовали данные по последовательности гена ctu F. tularensis Schu из базы данных NCBI.

Результаты и обсуждение Для сравнения нуклеотидных последовательностей гена ctu у различных штаммов вида F. tularensis был сек-венирован ген ctu F. tularensis ssp. holarctica bv. japónica Miura (рис. 1), а также были частично секвенированы 15 штаммов ssp. holarctica (табл. 4).

При анализе последовательностей гена ctu из базы данных NCBI (см. табл. 2) оказалось, что у штаммов F.

tularensis подвида tularensis, с заведомо активным геном данные последовательности идентичны. В то же время у туляремийных штаммов, относящихся к другим подвидам, были выявлены различия гена ctu по сравнению с spp. tularensis. Так, у штамма F. tularensis ssp. mediasiatica FSC147 в последовательности гена ctu имеются 3 нуклеотидные замены, у всех исследованных штаммов ssp. holarctica 9 замен, у штамма ssp. novicida 3523 — 48 замен (рис. 2).

Нуклеотидные замены в гене ctu у F.tularensis ssp. mediasiatica FSC147 привели к появлению двух аминокислотных замен в кодируемом им белке - 148 Val^-Ala и 170 Ala^-Thr, не влияющих на активность фермента.

У штаммов голарктического подвида две нуклеотидных замены: 160-го нуклеотида с С на Т и 422-го нуклеотида с G на A привели к появлению стоп-кодона ТАА вместо кодона CAA(Gln) в 54-м положении последовательности аминокислот и стоп кодона TAG вместо TGG (триптофан) в 141-м положении. Данные замены объясняют отсутствие цитруллинуреидазной активности у штаммов ssp. holarctica (рис. 3).

При анализе фрагментов генов ctu 16 штаммов F. tularensis ssp. holarctica (табл. 4) в области 160 и 422 ну-клеотидов было подтверждено наличие стоп-кодонов у всех штаммов голарктического подвида, за исключением двух штаммов, относящихся к японскому биовару.

Хотя у двух штаммов японского биовара в гене ctu отсутствуют стоп-кодоны, оба штамма не обладают ци-труллинуреидазной активностью. Эти данные по штаммам F. tularensis ssp. holarctica bv. japonica Jasoe и Miura согласуются с описанными ранее результатами [15].

Для выяснения причины отсутствия у штаммов японского биовара активности фермента нами была проанализирована нуклеотидная последовательность гена ctu штамма F. tularensis ssp. holarctica bv. japonica Miura (см. рис. 1).

Этот ген по сравнению с геном F. tularensis ssp. tularensis Schu отличается 7 нуклеотидами, приводящими к замене 7 аминокислот. При этом 6 замен являются об-

FSC 198 (1

Schu (1

FSC147 (1

3523 (1

LVS (1

FSC200 (1

OSU 18 (1

Miura (1

FSC 198 (101

Schu (101

FSC147 (101

3523 (101

LVS (100

FSC200 (100

OSU 18 (100

Miura (101

FSC 198 (201

Schu (201

FSC147 (201

3523 (201

LVS (199

FSC200 (199

OSU 18 (199

Miura (201

1 100 MANIKVAWQLS FNDNEAENLAKLESKIIQAAKNGAKIILTPELPSYLYFCKKQNSKYFDLAKTIDESPIVKLYKLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS MANIKVAWQLSFHDNEAENLAKLESKIIQAAKNGAKIILTPELPSYLYFCKKQNSKYFDLAKTIDESPIVKLYKLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS MANIKVAWQLSETJDNEAENLAKLESKIIQAAKHGAKIILTPELPSYLYFCKKQNSKYFDLAKTIDESPIVKLYKLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS MANIKVAWQLS FSDNEAKNLAKLESKIIQAANDGAKIILTPELPSYLYFCKKQNSKYFDLAKTIDESPIVKLYRLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS MANIKVAWQLS FNDNEAENLAKLESKIIQAAKNGAKIILTPELPSYLYFCKK-NSKYFDLAKTIDESPIVKLYKLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS MANIKVAWQLSFNDNEAENLAKLESKIIQAAKNGAKIILTPELPSYLYFCKK-NSKYFDLAKTIDESPIVKLYKLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS MANIKVAWQLS FNDNEAENLAKLESKIIQAAKNGAKIILTPELPSYLYFCKK-NSKYFDLAKTIDESPI VKLYKLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS MANIKVAWQLS FNDNEAENLAKLESKIIQAAKNGAKIILTPELPSYLYFCKKQNSKYFDLAKTIDESPIVKLYKLLAHKYNIVLPASFFERDGNACYNS 101 200 IAMIDADGSIMG^RKAHIPDGIGYQEKYYFSPGSAGFKVWDTKYAKVGVGICWDQWFPEAARVMALKGAEILLYPTAIGSE§HLPDYDSKDHWQRVMQG IAMIDADGSIMGyYRKAHIPDGIGYQEKYYFSPGSAGFKVWDTKYAÍCVGVGICWDQWFPEAARVMALKGAEILLYPTAIGSEgHLPDYDSKDHWQRVMQG IAMIDADGSIMG^YRKAHIPDGIGYQEKYYFSPGSAGFKVWDTKYAKAGVGICWDQWFPEAARVMALKGTEILLYPTAIGSE|HLPDYDSKDHWQRVMQG IAMIDADGSIMGyYRKAHI PDGIGYQEKYYFSPGSAGFKVWDTKYAKVGVGICWDQWFPEAARVMALKGAEILLYPTAIGSEgHLPDYDSKDHWQRVMQG IAMIDADGSIMGgYRKAHIPDGIGYQEKYYFSPGSgGFKV-DTKYAKVGVGICWDQWFPEAARVMALKGAEILLYPTAIGSELHLPDYDSKDHWQRVMQG IAMIDADGSIMGYYRKAHI PDGIGYQEKYYFSPGSgGFKV-DTKYAKVGVGICWDQWFPEAARVMALKGAEILLYPTAIGSELHLPDYDSKDHWQRVMQG IAMIDADGSIMGIYRKAHIPDGIGYQEKYYFSPGSgGFKV-DTKYAKVGVGICWDQWFPEAARVMALKGAEILLYPTAIGSELHLPDYDSKDHWQRVMQG IAMIDADGSIMGgYRKAHIPDGIGYQEKYYFSPGSgGFKVWDTKYAKVGVDICWDQWFPEAARVMALKGAEILLYPTAIGSELHLPDYDSKDHWQRVMQG 201 286 HAAANMLPVLASNRYATEANDDITATYYGSSFITDHTGDKIAEADRSgDDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPELYDEIVRKY HAAANMLPVLASNRYATEANDDITATYYGSSFITDHTGDKIAEADRSgDDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPELYDEIVRKY HAAANMLPVLASNRYATEANDDITATYYGSSFITDHTGDKIAEADRS|DDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPELYDEIVRKY HAAANMLPVLASNRYAAETNDDITATYYGSSFITDHTGDKl|EANRSgDDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPEHYGEIVRKY HAAVNMLPVLASNRYATEANDNITATYYGSSFITDHTGDKIAEADRSDDDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPELYDEIVRKY EfflAgNMLPVLASNRYATEANDÍlTATYYGSSFITDHTGDKIAEADRSDDDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPELYDEIVRKY HAAVNMLPVLASNRYATEANDNITATYYGSSFITDHTGDKIAEADRSDDDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPELYDEIVRKY HAA§NMLPVLASNRYATEAND§ITATYYGSSFITDHTGDKIAEADRSDDDILYATFDFAELQQQRFYWGLFRDRRPELYDEIVRKY

Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей транслированных т silico генов цитруллинуреидазы штаммов туляремий-ного микроба разных подвидов: ssp. mediasiatica - FSC147; ssp. tularensis - FSC 198, Schu; ssp. novicida - 3523; ssp. ^1аШка - LVS, FSC200, OSUl8, Мшга. Левая колонка - штаммы Е. tularensis, в скобках - номер аминокислоты, регионы с аминокислотными заменами обозначены серым цветом.

MFKNKSLTLFCLLMSGCGCYAQTINVAAAQMLIKQQSFDEFASDIKRLAKQA

KDQGAEWFPEDNSV^mDLPWNKQSnKXSEYYSQTKSFIANLAKEYSMTVI

GGTIyVKNDNGKISNTVTIGLPDGQIIENDKIYLTPEERSIGA'NKFGKNILVLDYK

GTHAILICYTSEFPMSLELAKIKPDIWPSYTNDLYGLNRVHNAVKMLSIQNF

AYGVIVGMASGFDKQNTQGroGVSQILFTSPQNKAFALNHLSRGNFNKEDVV

VENLDITKLQQARKNYDAFPNEDIKYSQNLTIKSISI

Рис. 5. Аминокислотная последовательность C-N-гидролазы YP_898469.1. F. tularensis

ssp. novicida U112.

щими с другими штаммами голарктического подвида, представленными в базе данных NCBI: 113 Уа1^-Пе, 136 А1а^Уа1, 183 Рго^Ьеи, 147 А1а^Уа1, 222 Asp^Asn, 248 G1y^Asp, и одна замена уникальна для Е. tularensis Мшга: 151 G1y^Asp (рис. 4).

На наш взгляд, 3 из этих замен могут вызвать подавление ферментативной активности белка: в 151-м положении нейтральный глицин заменяется на положительно заряженную аспарагиновую кислоту (замена уникальна для японского биовара), в 183-м положении пролин, позволяющий образовывать изгиб полипептидной цепи, -на лейцин, и в 222-м положении отрицательно заряженная аспарагиновая кислота меняется на положительно заряженный аспарагин. По данным анализа ш si1ico, эти замены приводят к изменению заряда белка при рН 7.0 с -4,72 до -5,72. Косвенным подтверждением важности аминокислот в положении 151 и 153 является факт, что в с^-гене бактерий подвида mediasiatica эти аминокислоты совпадают с аминокислотами в цитруллинуреидазе штамма Schu. Утрата цитруллинуреидазной активности бактериями голарктического подвида, вероятно, связана с вышеупомянутыми аминокислотными заменами, а появление стоп-кодонов в гене произошло уже после отде-

г*

N-carbamoylputrescine amidase Vibrio parahaemolyticus VPTS-2010 2. N-carbamoylputrescine amidase Vibrio parahaemolyticus VPCR-2009. N-carbamoylputrescine amidase Vibrio parahaemolyticus BB220P.

C putative carbon-nitrogen hydrolase Vibrio alginolyticus NBRC 15630 ATCC 17749. I- N-carbamoylputrescine amidase Vibrio sp. JCM 18904.

— carbon-nitrogen hydrolase Vibrio fortis.

— carbon-nitrogen hydrolase Vibrio shilonii. carbon-nitrogen hydrolase Vibrio furnissii NCTC 11218. carbon-nitrogen hydrolase Vibrio sp. VCC19. N-carbamoylputrescine amidase Vibrio fluvialis. n-carbamoylputrescine amidase Sulfuricurvum kujienseDSM 16994. n-carbamoylputrescine amidase Butyrivibrio sp. CAG:318. N-carbamoylputrescine amidase Eubacterium siraeum 70/3. N-carbamoylputrescine amidase Bacillus cellulosi lytic us DSM 2522. N-carbamoylputrescine amidase Dehalobacter sp. DCA. N-carbamoylputrescine amidase Starfceya novella DSM 506. carbon-nitrogen family hydrolase Rhizobium sp. PD01-076. N-carbamoylputrescine amidase Pseudomonas caeni. hydratase Pseudomonas stutzeri DSM 10701. N-carbamoylputrescine amidase Pseudomonas thermotolerans. N-carbamoylputrescine amidase Pseudomonas pelagia._

N-carbamoylputrescine amidase F.tularensis subsp. ncwcida 3523. citrulline ureidase F. tularensis subsp. holarctica Miura citrulline ureidase F. tularensis subsp. tularensis SCHU S4 hydrolase carbon-nitrogen family F. tularensis subsp. mediasiaticaFSC147,

Рис. 6. Филогенетическое дерево, построенное на основе аминокислотной последовательности цитруллинуреидазы Е. tularensis и С-П-гидролаз гетерологичных микроорганизмов, с помощью алгоритма ЦРОМА. Рамкой выделены белки Е. tularensis. Последовательность цитруллинуреидазы штамма Мшга транслирована т si1ico на основе результатов секвенирования соответствующего гена.

ления японского биовара от общего предка [16].

В ctu-подобном гене штамма F. tularensis spp. novicida 3523 присутствуют 48 нуклеотидных замен в (в сравнении с геном ctu штамма Schu), что приводит к появлению одиннадцати аминокислотных замен: 14 Asn^-Ser, 19 Glu^-Lys, 33 Lys^Asn, 34 Asn^Asp, 75 Lys^Arg, 217 Thr^Ala, 219Ala^Thr, 242Ala^Ser, 245 Asp^Asn, 278 Leu^His, 289 Asp^Gly. Следует отметить, что замены 181 Pro^Leu и 222 Asp^-Asn, предположительно приведшие к инактивации белка у голарктического подвида, отсутствуют у штамма 3523. У других представителей подвида novicida (штаммы U112, Fx1 и Fx2 [8, 9]) ген ctu или его фрагменты не выявлены. Также его не удалось обнаружить и в аннотированных геномах других представителей рода Francisella (F. philomiragia ATCC 25015, F. philomiragia ATCC 25017, F. noatunensis Toba 04).

Наличие цитруллинуреидазной активности у подвида novicida, скорее всего, указывает на то, что ее обеспечивает фермент, отличающийся от цитруллинуреидазы, кодируемой геном ctu. Так как цитруллинуреидаза относится к группе C-N-гидролаз, нами был проведен in silico поиск генов в базе данных NCBI, кодирующих ферменты этого семейства в геномах штаммов подвида novicida. Поиск ограничивался только ферментами, отсутствующими у штаммов голарктического подвида, лишенных цитруллинуреидазной активности. Этим требованиям отвечает лишь фермент, последовательность которого для штамма F. tularensis ssp. novicida U112 депонирована в базу данных NCBI под референсным номером YP_898469.1. (рис. 5).

Гомология его аминокислотной последовательности с аналогичными белками других штаммов подвидов tularensis, mediasiatica и novicida составляет 99-96%, за исключением штамма F. tularensis ssp. novicida 3523, у которого этот показатель составляет 87%. Подобные белки присутствуют у штаммов F. philomiragia и F. noatunensis, хотя степень гомологии аминокислотной последовательности с YP_898469.1. при этом не превышает 83%, что, возможно, объясняет отсутствие цитруллинуреидазной активности у бактерии.

Таким образом, наши исследования показали, что цитруллинуре-идазная активность у подвидов tu-larensis и mediasiatica определяется геном ctu. Неактивные формы этого гена присутствуют в бактериях ssp. holarctica, выделенных в Евразии, а также в Японии (bv. japonica). В геноме бактерий ssp. novicida ctu-подобный ген обнаружен только в одном штамме F. tularensis ssp. novicida 3523 из четырех, депонированных в базу данных NCBI. В остальных штаммах присутствует ген FTN_0827, кодирующий C-N-гидролазу (YP_898469.1), относящуюся к той же группе ферментов, что и цитруллинуреидаза. Ген FTN_0827 отсутствует у бактерий

голарктического подвида. Возможность того, что ферментативная активность продукта этого гена определяет цитруллинуреидазную активность штаммов F. tularensis ssp. novicida, требует экспериментального подтверждения.

Семейство генов ctu бактерий F. tularensis представляет собой отдельную группу C-N-гидролаз и имеет низкий уровень аминокислотной гомологии с аналогичными белками гетерологичных микроорганизмов (менее 58%) (рис. 6).

Следует отметить, что у различных штаммов, даже в пределах одного подвида, кодируемый данным геном белок представлен в базе под различными названиями - в большинстве случаев C-N-гидролаза, а также цитруллин-уреидаза, бета-аланинсинтаза, бета-уреидопропионаза, N-карбамоилпутресцинамидаза.

У штаммов голарктического подвида (в том числе и японского биовара) присутствует измененный ctu-ген, отличающийся 7-9 нуклеотидными заменами от бактерий ssp. tularensis, 9-11 заменами от штаммов ssp. mediasiatica и 48 заменами от штамма F. tularensis ssp. novicida 3523.

Штаммы японского биовара, в отличие от других штаммов голарктического подвида, не содержат нуклео-тидных замен в гене ctu, приводящих к возникновению стоп-кодонов. Данный факт указывает на более позднее появление этих мутаций в процессе эволюции туляре-мийного микроба на территории Евразии.

В цитруллинуреидазе штамма F. tularensis Miura японского биовара было выявлено 7 аминокислотных замен, 3 из которых могут влиять на заряд и конформа-цию белка и, таким образом, могут нести ответственность за редукцию цитруллинуреидазной активности F. tularensis голарктического подвида.

Сведения об авторах:

Тимофеев Виталий Сергеевич - мл. науч. сотр. лаб. микробиологии сибирской язвы отдела ООИ; e-mail: timofeev_vitalii@mail.ru;

Бахтеева Ирина Викторовна - ст. науч. сотр. лаб. микробиологии чумы отдела ООИ, канд. мед. наук; e-mail: bahtejeva@mail.ru;

Павлов Виталий Михайлович - зав. лаб. микробиологии туляремии отдела ООИ, д-р биол. наук; e-mail: vitpav@obolensk.org;

Мокриевич Александр Николаевич - зав. отделом особо опасных инфекций, канд. мед. наук; e-mail: mokrievich@obolensk.org;

142279, Московская обл., Серпуховский р-н, Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. 2005. Vol. 2. P. 199-210.

2. Champion M.D., Zeng Q., Nix E.B., Nano F.E., Keim P., Kodira C.D. et al. Comparative genomic characterization of Francisella tularensis strains belonging to low and high virulence subspecies. PLoS Pathog. 2009; 5(5): e1000459.

3. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад. РАМН В.В. Кутырева. Изд. 2-е, перераб. и доп. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.

4. Fleming D.E., Foshay L. Studies on the physiology of virulence of Pasteurella tularensis. I. Citrulline ureidase and deamidase activity. J. Bacteriol. 1955; 70(3): 345-9.

5. Fleming D.E., Foshay L. Studies on the physiology of virulence of Pasteurella tularensis. II. Serine deaminase and transaminase activity. J. Bacteriol. 1956; 71(3): 324-7.

6. Родионова И.В. Цитруллинуреидазная активность у географи-

ческих рас Francisella tularensis. Докл. Акад. наук СССР. 1968; 179(2): 457-60.

7. Родионова И.В. Дифференциация географических рас Francisella tularensis на основании активности цитруллинуреидазы. Лабор. дело. 1970; 1: 42-3.

8. Clarridge J.E., Raich Т. J, Sjösted A., Sandström G, Darouiche R.O., Shawar R.M. et al. Characterization of two unusual clinically significant Francisella strains. J. Clin Microbiol. 1996; 34(8): 1995-2000.

9. Siddaramappa S., Challacombe J.F., Petersen J.M., Pillai S., Hogg

G., Kuske C.R. Common ancestry and novel genetic traits of Francisella novicida-like isolates from North America and Australia as revealed by comparative genomic analyses. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77(15): 5110-22.

10. Marchette N.J., Nicholes P.S. Virulence and citrulline ureidase activity of Pasteurella tularensis. J. Bacteriol. 1961; 82: 26-32.

11. Mahawar M.J., Kirimanjeswara G.S., Metzger D.W., Bakshi C.S. Contribution of citrulline ureidase to Francisella tularensis strain Schu S4 pathogenesis. J. Bacteriol. 2009; 191(15): 4798-806.

12. Wu G.Y., Brosnon J.T. Macrophages can convert citrulline into argi-nine. Biochemistry. 1992; 28: 145-8.

13. Sonck, K.A., Kint G., Schoofs G., Vander W.C., Vanderleyden J., De Keersmaecker S.C. The proteome of Salmonella typhimurium grown under in vivo-mimicking conditions. Proteomics. 2009; 95: 65-79.

14. Larsson P. Oyston P.C., Chain P., Chu M.C., Duffield M., Fuxelius

H.H. et al. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. Nat. Genet. 2005; 37: 153-9.

15. Куделина Р.И.,Олсуфьев Н.Г. Дифференциация географических рас туляремийного микроба при помощи некоторых антибиотиков. ЖМЭИ. 1973; 4: 3-9.

16. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Byström M., Forsman M., Johansson A. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11): 3903-8.

Поступила 01.08.14

REFERENCES

1. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. 2005. Vol. 2. P. 199-210.

2. Champion M.D., Zeng Q., Nix E.B., Nano F.E., Keim P., Kodira C.D. et al. Comparative genomic characterization of Francisella tularensis strains belonging to low and high virulence subspecies. PLoS Pathog. 2009; 5(5): e1000459.

3. Laboratory diagnosis of dangerous infectious diseases: A Practical Guide. Ed. Acad. RAMS G.G. Onischenko, Acad. RAMS V.V. Kutyrev. Ed. 2nd, revised. and add. Moscow: ZAO «Chico»; 2013. 560 p.

4. Fleming D.E., Foshay L. Studies on the physiology of virulence of Pasteurella tularensis. I. Citrulline ureidase and deamidase activity. J. Bacteriol. 1955; 70(3): 345-9.

5. Fleming D.E., Foshay L. Studies on the physiology of virulence of Pasteurella tularensis. II. Serine deaminase and transaminase activity. J. Bacteriol. 1956; 71(3): 324-7.

6. Rodionova I.V. Citrulline ureidase activity in geographical races of Francisella tularensis. Report. Acad. Sciences of the USSR. 1968; 179(2): 457-60.

7. Rodionova I.V. Differentiation of Francisella tularensis geographical races based on activity of citrulline ureidase. Laboratory work. 1970; 1: 42-3.

8. Clarridge J.E., Raich T.J, Sjösted A., Sandström G, Darouiche R.O., Shawar R.M. et al. Characterization of two unusual clinically significant Francisella strains. J. Clin Microbiol. 1996; 34(8): 1995-2000.

9. 9Siddaramappa S., Challacombe J.F., Petersen J.M., Pillai S., Hogg

G., Kuske C.R. Common ancestry and novel genetic traits of Francisella novicida-like isolates from North America and Australia as revealed by comparative genomic analyses. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77(15): 5110-22.

10. Marchette N.J., Nicholes P.S. Virulence and citrulline ureidase activity of Pasteurella tularensis. J. Bacteriol. 1961; 82: 26-32.

11. Mahawar M.J., Kirimanjeswara G.S., Metzger D.W., Bakshi C.S. Contribution of citrulline ureidase to Francisella tularensis strain Schu S4 pathogenesis. J. Bacteriol. 2009; 191(15): 4798-806.

12. Wu G.Y., Brosnon J.T. Macrophages can convert citrulline into argi-nine. Biochemistry. 1992; 28: 145-8.

13. Sonck, K.A., Kint G., Schoofs G., Vander W.C., Vanderleyden J., De Keersmaecker S.C. The proteome of Salmonella typhimurium grown under in vivo-mimicking conditions. Proteomics. 2009; 95: 65-79.

14. Larsson P. Oyston P.C., Chain P., Chu M.C., Duffield M., Fuxelius

H.H. et al. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. Nat. Genet. 2005; 37: 153-9.

15. Kudelina R.I., Olsufiev N.G. Differentiation of geographical races of Francisella tularensis with the aid of some antibiotics. ZHMEI. 1973; 4: 3-9.

16. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Byström M., Forsman M., Johansson A. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11): 3903-8.

Received 01.08.14

CITRULLINUREIDASE GENE DIVERSITY IN THE GENUS FRANCISELLA

Timofeev V. S, Bakhteeva I. V., Pavlov V. M, Mokrievich A. N.

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russia

This work describes the results of the in silico analysis of the genetic diversity of the citrullinureidase gene (ctu) in two species

of bacteria of the genus Francisella: tularensis (ssp. tularensis, holarctica, mediasiatica, novicida) and philomiragia. The strains of the Central Asiatic subspecies possessing the citrullinureidase activity differ in the gene ctu from the ssp. tularensis Schu by three nucleotide substitutions leading to two insignificant amino acid substitutions in the encoded polypeptide. In the strain F. tularensis of the ssp. holarctica the gene ctu encodes inactive enzyme, which is probably due to amino acid substitutions: 151 Gly ^ Asp, 183 Pro ^ Leu, 222 Asp ^ Asn. Except for the Japan biovar bacteria, in all strains of the Holarctic subspecies there are two stop codons in the gene ctu.

The bacteria of the subspecies novicida contain the ctu gene only in the strain 3523, whereas the other strains contain the gene FTN_0827 encoding the C-N hydrolase, which probably provides the citrullinureidase activity.

Key words: Francisella, citrullinureidase, C-N hydrolase, enzymatic activity

© коллектив авторов, 2015 УДК 579.852.11:579.252].034.1

Микшис Н.И., Каштанова Т.Н., Кутырев В.В.

способ дифференциации штаммов BACILLUS ANTHRACIS и филогенетически родственных видов, основанный на выявлении

различий в структуре хромосомных генов биосинтеза флагеллина

и метионина

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора», 410005, г. Саратов

В процессе анализа нуклеотидных последовательностей ряда генов, ответственных за экспрессию отличительных признаков сибиреязвенного микроба - подвижности и пенициллиназной активности, выявлен хромосомный локус, перспективный для межвидовой дифференциации. Установлено, что в гене fliC, детерминирующем синтез флагеллина, присутствует протяженная область, отличающая возбудителя сибирской язвы от большинства непатогенных и условно-патогенных бацилл. Предложен оригинальный способ индикации и идентификации сибиреязвенного микроба, основанный на выявлении различий в структуре хромосомных генов fliC и hom2. С использованием двух хромосомных ДНК-мишеней тестировано 60 штаммов различных бациллярных видов - B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. megaterium, B. subtilis и др. Разработанный алгоритм позволяет выявлять патогенный микроорганизм и надежно дифференцировать его от представителей других видов рода Bacillus. Введение в условия мультиплексной ПЦР праймеров, комплементарных специфичным последовательностям плазмид pXO1 и pXO2, предоставляет дополнительную информацию о предполагаемой вирулентности изолята.

К л юче вые слова : Bacillus anthracis; подвижность; фла-геллин; хромосомные ДНК-мишени; мультиплексная ПЦР.

В Российской Федерации насчитывается несколько тысяч стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов. Несмотря на достаточно эффективные противоэпидемические и профилактические мероприятия, ежегодно регистрируются случаи инфицирования людей этим особо опасным заболеванием [1]. Возбудитель сибирской язвы - грамположительная спорообразующая бактерия, принадлежащая к роду Bacillus. В наиболее близком филогенетическом родстве с Bacillus anthracis состоят виды B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides и B. weihenstephanensis. Сходство генетических, морфологических и физиологических характеристик позволяет выделить их в особую таксономическую группу [2].

Одним из признаков, отличающих штаммы B. anthracis от представителей других видов рода Bacillus, является наличие плазмид pXO1 и pXO2. Практически все отечественные и зарубежные тест-системы, предназначенные

для молекулярной диагностики сибиреязвенного микроба, основаны на выявлении в первую очередь последовательностей плазмидных генов. Однако бактериальные плазми-ды являются менее стабильными генетическими элементами, чем хромосомная ДНК, и могут с разной частотой элиминироваться. Необходимо также учитывать, что в исключительных случаях репликоны, идентичные pXO1 и pXO2, обнаруживают и у штаммов близкородственных бациллярных видов. Как правило, их выделяют от людей или животных с симптомами заболевания, напоминающего сибирскую язву [3-5].

Достоверность индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы повышается при использовании мультиплексных ПЦР с праймерами на фрагменты плаз-мидных и хромосомных генов. Ранее ввиду высокой гомологии хромосомных ДНК возбудителя сибирской язвы и отдельных представителей близкородственных видов, межвидовую дифференциацию проводили преимущественно на основании полиморфизма единичных нуклеотидов [6-9]. В ряде случаев обнаружение штаммов B. cereus или B. thuringiensis, содержащих идентичные с B. anthracis последовательности полиморфных генов, ставило под сомнение уникальность выявленных ДНК-мишеней [10, 11].

Осуществляемые в последнее десятилетие работы по секвенированию геномов патогенных микроорганизмов расширяют потенциальные возможности их молекулярной диагностики. В частности, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей бациллярных штаммов позволил разработать специфичные мультиплексные ПЦР для обнаружения возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и пробах из окружающей среды [12, 13]. С использованием современных технологий в геноме B. anthracis удалось выявить относительно протяженные участки хромосомной ДНК, отличающие возбудителя сибирской язвы от других видов рода Bacillus. Так, в кодирующем АТФ-синтазу гене