ПРИМЕНЕНИЕ БИЯДЕРНОГО СЕРА-НИТРОЗИЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗА АНИОННОГО ТИПА В КАЧЕСТВЕ ВАЗОДИЛАТАТОРНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА
APPLICATION OF BINUCLEAR SULPHUR-NITROSYL COMPLEX OF ANION TYPE IRON AS VASODEPRESSOR MEDICATION

Изобретение относится к биядерным сера-нитрозильным комплексам железа анионного типа - новым донорам NO с вазодилататорными свойствами, и может быть использовано в качестве гипотензивных препаратов для терапии сердечно-сосудистых заболеваний.
NO, как известно уже более 20 лет, вовлечен в различные физиологические и патофизиологические процессы в организмах млекопитающих [1) J.A.McCleverty, Chem. Rev., 2004, 104, 403; 2) Р.С.Ford, L.E.Laverman, Coord. Chem. Rev., 2005, 249, 391; 3) N.M. Crawford, J. of Experimental Botany, 2006, 57, 471; 4) R.Butler and I.L.Megson, Chem. Rev., 2002, 102, 1155; 5) L.J.Ignarro (Ed.), Nitric Oxide: Biology and Pathobiology, Academic Press, San Diego, 2000; 6) D.A.Wink, Y.Vodovotz, J.Laval, F.Laval, M.W.Dewhirst, J.B. Mitchell, Carcinogenesis, 1998, 19, 711; 7) A.Butler, R.Nicholoson (Eds.), Life, Death and Nitric Oxide, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003; 8) P.C.Ford, J. Bourassa, S.Kudo and K.Miranda, Coord. Chem. Rev., 1998, 171, 185]. Полученные данные о многоликой биологической активности этого радикала-медиатора и его реакциях с биологическими субстратами в клетках используются при разработке эффективных лекарственных препаратов - доноров NO. Для изменения внутритканевого уровня NO применяют соединения, либо генерирующие этот радикал, либо эффективно его связывающие.
2
2
2
3
2
4
2
Исследованиями последних лет в области молекулярной кардиологии установлена центральная роль оксида азота (NO) в регуляции сосудистого тонуса и метаболизма миокарда [Jones S.P., Bolli R. The ubiquitous role of nitric oxide in cardioprotection. J Mol Cell Cardiol 2006; 40(1): 16-23]. Выяснено, что недостаток образования NO приводит к развитию эндотелиальной дисфункции, что, в свою очередь, вызывает повышение тонуса коронарных сосудов, а также увеличивает агрегационную и адгезивную способность тромбоцитов. При ишемическом и реперфузионном повреждении сердца это способствует развитию синдрома «no reflow», приводящему к прогрессивному ухудшению кровотока и в конечном итоге гибели кардиомиоцитов [Jugdutt B.I. Nitric oxide and cardioprotection during ischemia-reperfusion. Heart Fail Rev 2002; 7(4): 391-405]. Наиболее распространенными лекарственными средствами при нарушениях сердечно-сосудистой системы являются органические нитраты и нитропруссид [В.Г.Граник, Н.Б.Григорьев. Экзогенные доноры оксида азота (химический аспект) // Известия Академии наук. Серия химическая, 2002, №8, стр.1268-1313]. Однако эти препараты обладают рядом недостатков и побочных действий: i) нитратная толерантность и цианидное отравление, ii) необходимость дополнительной активации (термо-, фото- или ферментативной), что ограничивает возможность их использования в клинике. В связи с этим актуальной задачей является разработка новых перспективных доноров NO, к числу которых относятся биядерные нитрозильные комплексы железа с серосодержащими лигандами, которые были впервые выделены в кристаллической форме в ИПХФ РАН в 2004-2008 гг. [Н.А.Санина, С.М.Алдошин. "Функциональные модели нитрозильных [Fe-S] протеинов", Изв. АН. Сер. хим. 2004 (11) 2326-2345; Н.А.Санина, С.М.Алдошин, Т.Н.Руднева, Н.И.Головина, Г.В.Шилов, Ю.М.Шульга, В.М.Мартыненко, Н.С.Ованесян. "Синтез, структура и твердофазные превращения нитрозильного комплекса железа Na[Fe(SO)(NO)]·4HO", Координационная Химия, 2005, 31, 301-306]. Синтезированные в ИПХФ РАН нитрозильные [2Fe-2S] комплексы являются аналогами активных центров не гемовых нитрозильных [2Fe-2S] белков и представляют собой гибридные молекулы, содержащие в своем составе одновременно два фармакозначимых фрагмента: серосодержащие лиганды природного происхождения (пеницилламин, структурные аналогии природных сульфонатов и др.) и NO группы. Так, установлено, что вазодилатация коронарных сосудов под действием растворов моноядерных динитрозильных комплексов железа с цистеином и восстановленным глутатионом (ДНКЖ) сопровождается снижением длительности нарушений ритма во время окклюзии коронарной артерии и достоверным уменьшением повреждения клеточных мембран в зоне риска при последующей реперфузии. Эти эффекты обусловлены антиоксидантным свойствами ДНКЖ и сочетаются с лучшим восстановлением аэробного обмена в ишемизированных кардиомиоцитах. Как правило, ДНКЖ получают в виде малостабильных водных растворов или в форме лиофильно высушенных композитов этих растворов с водорастворимыми полимерами [Ванин А.Ф., Лозинский В.И., Капелько В.И. Полимерная композиция для получения стабилизированной формы динитрозильного комплекса железа и способ получения указанной формы комплекса, Патент RU 2291880 C1], что ограничивает их широкое использование в прикладных целях, связанное с неконтролируемостью исходного состава.
В ИПХФ РАН биядерные сера-нитрозильные комплексы железа выделены в кристаллической форме, и надежно установлено, что в протонных средах (вода, физиологические растворы) генерируют NO самопроизвольно без дополнительной активации и образуют в растворах динитрозильные моноядерные интермедиаты (ДНКЖ). Определены количественные показатели NO-донирования синтезированных соединений в зависимости от концентрации используемого донора, температуры, рН среды в аэробных и анаэробных условиях электрохимическим методом с помощью сенсорных электродов amiNO-700. Взятые вместе, эти результаты указывают на возможность создания новых оригинальных антигипертензивных и противоишемических лекарственных средств на основе биядерных нитрозильных комплексов железа.
2
2
2
3
2
4
2
Задача настоящего изобретения состоит в расширении арсенала кардиотропных лекарственных средств и создании кардиотропных лекарственных средств с улучшенным спектром активности на основе нетоксичного водорастворимого донора NO: комплекса Na[Fe(SO)(NO)]·4HO (далее по тексту препарата ТНКЖ).
2
2
2
3
2
4
2
Поставленная задача решается применением анионых биядерных нитрозильных комплексов железа комплекса Na[Fe(SO)(NO)]·4HO в качестве оригинальных антигипертензивных и противоишемических лекарственных средств.
Сущность изобретения заключается в следующем. Авторы изобретения исследовали действие препарата ТНКЖ на аортальное давление изолированного сердца крысы в сравнении с клиническим препаратом Нитропруссидом натрия.
В опытах на изолированных сердцах крыс Wistar (средний вес тела и сердца соответственно 340 г и 1.7 г) исследовали действие ТНКЖ на аортальное давление (АД) в условиях ретроградной перфузии стандартным, насыщенным карбогеном раствором Кребса (РК) при t=37°C и постоянном коронарном потоке.
После наркоза уретаном (1,25 мг/г веса тела, в/б) и торакотомии изолированные сердца помещали в охлажденный раствор Кребса на 30-40 сек до полной остановки сокращений. В течение 10-20 мин сердца перфузировали антеградно (при постоянном давлении наполнения левого предсердия 15 мм рт.ст. и АД 60 мм рт.ст.) и определяли величину спонтанного коронарного потока (КП). После этого переходили на перфузию с постоянной объемной скоростью, равной спонтанному КП (в среднем 17 мл/мин). Регистрировали АД, стабилизация которого на 60-65 мм рт.ст. происходила через 5-10 мин, что служило исходным фоном для введения исследуемых донаторов NO.
В опытах с ТНКЖ использовали следующие исходные концентрации: 0.01 (n=6), 0.10 (n=6), 1.00 (n=8), 5.00 (n=14) и 10.0 (n=6) мкМ. Как и в контрольных опытах с НП, 1 мл раствора ТНКЖ вводили в аортальную канюлю в течение 2 сек. С учетом КП соответствующие средние действующие концентрации ТНКЖ были: 0.006, 0.059, 0.587, 3.403 и 5.919 мкМ. В качестве препарата сравнения использовали нитропруссид натрия (НП). 1 мл раствора НП вводили в аортальную канюлю в течение 2 с. Исходные концентрации НП были: 0.5 (n=11), 1.0 (n=8), 2.5 (n=10) и 5.0 (n=10) мкМ. Соответствующие действующие концентрации с учетом КП составляли 0.31, 0.61, 1.50 и 3.03 мкМ. В 12 контрольных опытах в аорту вводили РК без НП. Действие РК и НП на АД наблюдали в течение 15 мин, ТНКЖ и ПА - 30 мин после введения веществ. Контрольное введение в аорту 1 мл РК в течение 2'' сопровождалось характерными изменениями АД, представленными на фиг.1 (влияние введения 1 мл раствора Кребса (РК) на изменения аортального давления). В начале периода наблюдения (через 15'' после введения РК) АД возрастало в среднем на 29%, а в течение последующих 15'' падало в среднем на 13% от исходного. В дальнейшем АД сравнительно быстро восстанавливалось, и через 5-10 мин различия с исходным значением были недостоверны. Очевидно, что причиной изменений АД в контрольных опытах являлась кратковременная гиперволюмическая нагрузка коронарных сосудов, т.н. «гидродинамический удар», имевший место во всех группах опытов.
Действие нитропруссида.
Результаты, представленные в табл.1 и фиг.2 (изменения АД под действием введения 1 мл 0.5, 1.0, 2.5 и 5.0 мкМ нитропруссида), показали, что введение растворов НП с действующими концентрациями 0.31, 0.61 и 1.5 мкМ вызывает изменения АД, подобные контрольным: как и в контрольных опытах, наибольшему падению АД (наблюдавшемуся через 30'' после введения НП) предшествовало кратковременное увеличение и затем постепенное восстановление АД. В целом, динамика АД мало отличалась от контрольной, за исключением выраженности «гидродинамического удара», который был достоверно меньше, по сравнению с контрольным. При увеличении действующей концентрации НП до 3.03 мкМ начальный подъем АД был еще меньше, а восстановление АД замедлялось, так что к 15' все еще ниже исходного значения. Именно поэтому действующая концентрация НП 3.03 мкМ использовалась в качестве контрольной для сравнения с другими веществами.
Действие ТНКЖ.
В табл.2 представлены результаты введения растворов ТНКЖ с действующей концентрацией в диапазоне от 6 нМ до 6 мкМ. Показано, что достоверные различия с минимальной исходной концентрацией 0.01 мкМ появляются при использовании 1 мкМ раствора ТНКЖ, и в дальнейшем, по мере увеличения концентрации ТНКЖ до 10 мкМ, различия становятся более выраженными. На фиг.3 (влияние введения 1 мл 1.0, 5.0 и 10.0 мкМ ТНКЖ на АД) представлена динамика восстановления АД в течение 30' после введения в аорту 1 мл раствора ТНКЖ с исходными концентрациями 1, 5 и 10 мкМ (действующие концентрации 0.587, 3.403 и 5.919 мкМ соответственно). Показано, что по мере нарастания концентрации вещества, уменьшается выраженность первоначального подъема АД, увеличивается степень падения АД на 30'' в среднем от 27% до 35% от исходного, возрастает дефицит восстановления АД к 30' от 0 до 13%.
Сопоставление эффективности НП и ТНКЖ.
В табл.3 представлены результаты, полученные при действии на АД одинаковых (или приблизительно равных) действующих концентраций веществ: НП (3.03 мкМ) и ТНКЖ (3.40 мкМ). Показано, что при использовании равных действующих концентраций наиболее эффективным дилататором является ТНКЖ: максимальная степень падения АД через 30'' после введения составляла 30% от исходного (vs 19% у НП), а дефицит восстановления АД к 15' составлял 10% (у НП - 6%).
Таблица 1
Действие нитропруссида на АД (%)
Время после введения
РК
Нитропруссид, мкМ
0,5
1,0
2,5
5,0
n=12
n=11
n=8
n=10
n=10
15''
129±5
103±1a
102±1a
100±abc
99±1d
30''
87±4
85±1
86±1
86±1
81±1d
45''
88±3
87±1
88±1
88±1
82±1d
1'
89±3
89+1
90±1
90±1
84±1d
2'
90±3
91±1
92±1
91±1
85±1d
3'
92±3
93±1
93±1
93±1
87±1d
4'
94±3
94±1
95±1
95±1
89±1d
5'
96±3
96±1
97±1
96±1
90±1d
10'
98±3
99±1
99±1
98±1
93±1d
15'
100±2
10±1
100±1
100±1
94±1d
a - P<0,05 vs 0,5
b - P<0,05 vs l,0
c - P<0,05 vs 2,5
d - P<0,05 vs all
Таблица 2
Действие ТНКЖ на АД (%)
Время после введения
ТНКЖ, мкМ
0,01
0,10
1,00
5,00
10,0
n=6
n=6
n=8
n=14
n=6
15''
104±3
102±2
103±2
99±2
89+3d
30''
73±2
74±2
73±2
70±2b
65±3abc
45''
75±2
77±2
76±2
73±2b
67±3d
1'
77±2
79±2
77±2
75±2b
69±3d
2'
79±2
82±2
81±1a
78±2b
72±2d
3'
82±2
84±1
83±1
80±1abc
74±2d
4'
83±1
87±1a
85±1ab
83±1bc
76±2d
5'
86±1
89±1a
88±la
86±1bc
78±2d
10'
89±1
92±1a
90±1a
88±1bc
80±2d
15'
92±1
93±1
92±1
90±1abc
82±2d
20'
95±1
95±1
95±1
92±1abc
83±2d
25'
98±1
97±1
97±1
94±1abc
86±1d
30'
100±1
100±1
100±1
96±1abc
87±1d
a - P<0,05 vs 0,01
b - P<0,05 vs 0,10
c - P<0,05 vs 1,00
d - P<0,05 vs all
Таблица 3
Действие ~3 мкМ НП, ПА и ТНКЖ на АД (%)
Время после введения
НП
ТНКЖ
n=8
n=14
15''
99±1
30''
81±1
70±2ab
45''
82±1
73±2ab
1'
84±1
75±2ab
2'
85±1
78±2ab
3
87±1
80±1ab
4'
89±1
83±1ab
5'
90±1
86±1ab
10'
93±1
88±1ab
15'
94±1
90±1ab
a - P<0.05 vs НП
b - P<0,05 vs ПА
Таким образом, результаты свидетельствуют о том, что ТНКЖ снижает АД при болюсном введении в аорту изолированного сердца крысы, перфузируемого при постоянном коронарном потоке. Вазодилататорная эффективность изученного донора NO при близких действующих концентрациях (около 3 мкМ) уменьшается в ряду ТНКЖ>нитропруссид.
Авторы изобретения также изучили действие препарата ТНКЖ на коронарную, сократительную и насосную функцию изолированного сердца крысы.
2
2
Действие ТНКЖ, наиболее эффективного вазодилататора, на коронарную, сократительную и насосную функцию изучали в опытах на изолированных сердцах крыс-самцов Wistar (вес тела 360 г, вес сердца 1.6 г). После наркоза уретаном (1.25 мг/г, в/б) и торакотомии изолированное сердце помещали в охлажденный раствор Кребса (РК) на 30-40 сек до полной остановки сокращений. В течение 10-15 мин сердце ретроградно перфузировали стандартным РК (37°C, pH=7.4), насыщенным карбогеном (95% O+5% CO), при постоянном перфузионном давлении (ПД) 60 мм рт.ст. После удаления крови из коронарных сосудов и полостей сердца в левое предсердие вводили канюлю и сердце перфузировали антеградно при постоянном давлении наполнения левого предсердия 15 мм рт.ст. и сопротивлении оттоку (аортальном давлении) 60 мм рт.ст.
Давление в аорте и левом желудочке регистрировали при помощи тензометрических датчиков Р 50, монитора SP 1405 и регистратора SP 2010, Gould Statham. Показателем интенсивности сократительной функции СФ (ИСФ) служило произведение частоты сокращений сердца (ЧСС) на развиваемое давление, РД (разность между систолическим и минимальным диастолическим давлением, ДД). Насосную функцию характеризовал минутный объем (MO - сумма коронарного потока (КП) и аортального объема). Коронарную функцию (КФ) оценивали по коронарному сопротивлению (KC - аортальному давлению, отнесенному к КП).
-5
Стабилизация функции длилась 15-20 мин, после чего регистрировали исходные показатели и прекращали отток раствора из аорты (дистальнее аортальной камеры) на 15 мин. При этом РК продолжал поступать в ЛЖ антеградно, однако перфузат, оттекающий из ЛЖ, попадал в коронарные сосуды в полном объеме (поскольку отток на периферию был перекрыт). Раствор ТНКЖ вводили в аортальную канюлю инфузионным насосом со скоростью 1 мл/мин в течение 5 мин (с 6-й по 10-ю мин окклюзии аорты). Действующая концентрация ТНКЖ и НП составляла 3.7·10 М при среднем КП 18+2 мл/мин. Выполнено 8 опытов с ТНКЖ и НП. В контроле (n=7) вводили стандартный РК без НП и ТНКЖ. После инфузии НП или ТНКЖ сердца перфузировали РК в течение 5 мин, после чего возобновляли антеградную перфузию с обычным оттоком перфузата из аорты, длившуюся 15 мин. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием t-критерия Стьюдента.
Начало окклюзии аорты сопровождалось увеличением КП и ПД до 136% и 111% соответственно. При этом КС снижалось на 20%, ИСФ - на 18% (вследствие уменьшения РД), в то время как ЧСС оставалась стабильной, а ДД возросло на 7 мм рт.ст. (табл.4).
В процессе контрольной инфузии РК, КП и ПД уменьшались ниже исходных значений, а КС, наоборот, возрастало до 121%. Инфузия НП и ТНКЖ достоверно отличалась от контрольной, сопровождаясь увеличением КП и более низкими значениями КС, что, по-видимому, было обусловлено дилятацией коронарных сосудов. Если в контроле на фоне уменьшенного КП продолжалось снижение показателей СФ, то инфузия НП и особенно ТНКЖ обеспечивала более высокие значения показателей СФ в условиях окклюзии. При инфузии ТНКЖ показатели СФ незначительно отличались от начала окклюзии, в то время как снижение показателей в контроле и при введении НП было более выраженным (табл.4).
При отмывании (после прекращения инфузии) наблюдается быстрое выравнивание показателей коронарной и сократительной функции в контроле и опытах с НП. В то же время в опытах с ТНКЖ благоприятное действие после инфузии сохранялось, что выражалось в более высоких показателях СФ (табл.4).
В табл.5 показаны значения показателей коронарной, сократительной и насосной функции через 15 мин после прекращения окклюзии аорты. Видно, что восстановление функции в опытах с НП лучше, чем в контроле, но особенно успешно оно проходит после инфузии ТНКЖ (фиг.4).
Таблица 4
Функция при окклюзии аорты и инфузии РК, НП и ТНКЖ (в % от исходных значений)
ИСХОДНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
ОККЛЮЗИЯ АОРТЫ
Начало
Инфузия
Отмывание
5 мин
5 мин
5 мин
Перфузионное давление
РК
111±1
94±1a
92±1ab
63±6 мм рт.ст.
НП
104±2а*
93±1ab
ТНКЖ
106±2a*
95±1ab**
Коронарный поток
РК
138±2
78±4a
72±4a
18±2 мл/мин.
НП
115±6a*
76±5ab
ТНКЖ
122±6a*
83±4ab*
Коронарное сопротивление
РК
80±1
121±5a
128±6a
3.58±0.04 мм рт.ст./мл
НП
91±4а*
124±6ab
ТНКЖ
87±3a*
115±5ab*
Систолическое давление
РК
92±1
72±2a
65±2ab
101±1 мм рт.ст
НП
83±3а*
70±3ab
ТНКЖ
92±3**
79±2ab**
Диастолическое давление*
РК
3±1
8±1a
11±1ab
-4±1 мм рт.ст.
НП
6±1a*
9±1ab*
ТНКЖ
2±1**
5±1ab**
Развиваемое давление
РК
85±1
62±3a
52±3ab
104±1 мм рт.ст.
НП
74±4а*
58±3ab*
ТНКЖ
87±3**
71±3ab**
Частота сокращений сердца
РК
100±1
80±2а
76±2ab
307±2 /мин
НП
91±2а *
79+2ab
ТРКЖ
98±2**
85±2ab**
Интенсивность СФ
РК
82±2
50±4а
39±3ab
33038±524 мм рт.ст./мин
НП
68±5a*
47±4ab*
ТНКЖ
85±5**
61±4ab**
* - изменения в абсолютных значениях
a - P<0,05 vs начала окклюзии
b - P<0,05 vs инфузии
* - P<0,05 vs РК
** - P<0,05 vs PK и НП
Таблица 5
Восстановление функции после окклюзии аорты (в % от исходных значений) и инфузии РК, НП и ТНКЖ
ИСХОДНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
РЕПЕРФУЗИЯ, 15 мин
РК
НП
ТНКЖ
Перфузионное давление
95±1
96±1
98±1ab
63±6 мм рт.ст.
Коронарный поток
83±4
87±5
94±4a
18±2 мл/мин
Коронарное сопротивление
115±5
111±5
104±4a
3.58±0.04 мм рт.ст./мл
Систолическое давление
79±2
84±3
93±2ab
101±1 мм рт.ст
Диастолическое давление *
5±1
3±1a
-1±1ab
-4±1 мм рт.ст.
Развиваемое давление
71±3
78±3a
90±3ab
104±1 мм рт.ст.
Частота сокращений сердца
85±2
89±2a
95±2ab
307±2/мин
Интенсивность СФ
61±4
69±4а
86±5ab
33038±524 мм рт.ст./мин
Аортальный объем
31±3
46±5а
77±4ab
27±3 мл/мин
Минутный объем
52±4
63±5a
84±4ab
45±1 мл/мин
Ударный объем
61±4
70±4а
88±3ab
144±1 мкл
* - изменения в абсолютных значениях
a - P<0,05 vs РК
b - P<0,05 vs НП
-5
Таким образом, результаты показывают, что ТНКЖ вызывает выраженную длительную дилятацию коронарных сосудов. Возможно, именно улучшение коронарной функции обеспечивает более эффективное восстановление сократительной и насосной функции изолированного сердца крысы после 15 мин окклюзии аорты по сравнению с нитропруссидом. На фиг.6 показано влияние 5-мин инфузии 3.7·10 М нитропруссида (НП) и ТНКЖ на восстановление коронарного потока (КП), сократительной функции (СФ) и показателя насосной функции минутного объема (МО) после окклюзии аорты.
2
2
2
3
2
4
2
Таким образом, результаты исследований указывают на способность препарата ТНКЖ эффективно влиять на тонус сосудов. Вазодилатационное действие донора NO отчетливо проявлялось на модели изолированного перфузируемого сердца крысы дозозависимым снижением аортального давления: на этой модели наибольшая вазодилатационная эффективность обнаружена у ТНКЖ. Настоящее изобретения расширяет арсенал кардиотропных лекарственных средств и позволяет создать кардиотропные лекарственные средства с улучшенным спектром активности на основе нетоксичного водорастворимого донора NO: Na[Fe(SO)(NO)]·4HO.
2
2
2
3
2
4
2
Предлагаемое изобретение позволяет применять анионый биядерный нитрозильный комплекс железа формулы Na[Fe(SO)(NO)]·4HO в качестве оригинального антигипертензивного и противоишемического лекарственного средства с улучшенным спектром активности.