Острые цереброваскулярные катастрофы у больных артериальной гипертензией: молекулярно-генетические аспекты

ОСТРЫЕ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫЕ КАТАСТРОФЫ У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

М.А. Карпенко, Е.Г. Шацкая, В.Н. Солнцев, М.А. Богданова, В.И. Ларионова

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург,

Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург, Санкт-Петербургский государственный университет,

Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия

Острые цереброваскулярные катастрофы у больных артериальной гипертензией: молекулярно-генетические аспекты

М.А. Карпенко, Е.Г Шацкая, В.Н. Солнцев, М.А. Богданова, В.И. Ларионова

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия.

Цель. Изучить ассоциации между полиморфизмом генов ангиотензинпревращающего фермента (ACE), рецептора ангиотензина II 1 типа (ATR-|), аполипопротеина СШ (APO CIII), апопротеина Е (APO E), метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), фибриногена (Fb), эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) и развитием инсульта при артериальной гипертонии (АГ).

Материал и методы. Проведено молекулярно-генетическое тестирование с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) у 41 больного АГ, впервые перенесшего острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК).

Результаты. Развитие инсульта ассоциировано с А1166С полиморфизмом гена ATRV G-455A полиморфизмом гена Fb и С677Т полиморфизмом гена MTHFR. При этом маркерами повышенного риска выступаютС-аллель гена ATR-|, -455Ааллель и АА-генотип гена Fb, 677Таллель гена MTHFR, а протективную роль в отношении развития ОНМК у больных АГ играют А-аллель и АА-генотип гена ATR-|, G-445 аллель гена Fb, аллель С677 и генотип СС гена MTHFR.

Заключение. Установлена связь полиморфизма генов ряда молекул с острым нарушением мозгового кровообращения при АГ Ключевые слова: артериальная гипертония, инсульт, гены, полиморфизм РФК 2008;1:33-38

Acute cerebrovascular events in patients with arterial hypertension: molecular genetic aspects

M.A. Karpenko, E.G. Shatskaya, V.N. Solntsev, M.A. Bogdanov, V.I. Larionova

Military-medical Academy named after S.M. Kirov, St.-Petersburg. Federal Center of Heart, Blood and Endocrinology named after V.A. Almazov, St.-Petersburg. St.-Petersburg State University, St.-Petersburg State Pediatric Medical Academy

Aim. To study association between stroke and gene polymorphism of angeotensin converting enzyme (ACE), angeotensin II type 1 receptor (ATR-|), apolipoprotein СШ (APO CIII), apoproteine Е (APO E), methylentetrahydrofolate reductase (MTHFR),fibrinogen (Fb), endothelial NO-synthase (NOS3) in arterial hypertension (HT).

Material and methods. Molecular genetic analysis by polymerase chain reaction was done in 41 patients with HT, who experienced first episode of acute disturbances of cerebral blood circulation (ADCBC).

Results. Stroke rate in patients with HT is associated with A1166C of ATR, gene polymorphism, G-455A of Fb gene polymorphism and C677T of MTHFR gene polymorphism. The high risk markers are C-allele of ATR, gene, -455А allele and AA genotype of Fb gene, 677T allele of MTHFR. The A-al-lele and genotype AA of ATR-; gene, G-445 allele of Fb gene, С677-allele and CC genotype of MTHFR gene play protective role against ADCBC in HT. Conclusion. It is established an association between gene polymorphism of some molecules and ADCBC in HT Key words: arterial hypertension, stroke, gene, polymorphism.

Rational Pharmacother. Card. 2008;1:33-38

Острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) - одна из ведущих причин смертности и ин-валидизации взрослого населения наиболее трудоспособного возраста в развитых странах мира. Социальные затраты, связанные с расходами на лечение больных мозговым инсультом в стационарах и амбулаторных условиях, являются одной из причин истощения ресурсов здравоохранения каждой страны [1].

Многочисленные эпидемиологические исследования подтверждают закономерную связь артериальной гипертонии (АГ) с возникновением инсульта. Принимая во внимание широкую распространенность АГ, которая приобрела характер пандемии, и высокую часто-

ту сосудистых катастроф, ученые-медики разработали федеральную целевую программу «Профилактика и лечение артериальной гипертонии в Российской Федерации (2002-2008 гг.)», одна из основных задач которой - снижение смертности от инсульта.

Комплексное изучение проблем АГ, в том числе молекулярно-генетической детерминированности ее сосудистых осложнений, позволит создать генетический профиль, определяющий степень цереброваскулярного риска болезни для каждого пациента, верифицировать новые критерии повышенного риска сердечно-сосудистых осложнений (ССО), оптимизировать профилактику ОНМК, снизить инвалидизацию и леталь-

ность при данной патологии.

В качестве генетических факторов, обусловливающих развитие и течение АГ, как правило, выступают аллельные варианты «кандидатных» генов нескольких групп: генов, кодирующих факторы ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), ферменты или транспортные белки, принимающие участие в метаболизме липидов, факторы гемостаза и функцию эндотелия. Все эти гены могут ассоциироваться с развитием острых цереброваскулярных катастроф у больных, страдающих АГ [2].

Цель исследования - изучение взаимосвязи I/D полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), А1166С полиморфизма гена рецептора ангиотензина II 1 -го типа (ATR-|), SstI полиморфизма гена аполипопротеина CIII (APOCIII), структурного полиморфизма гена апопротеина Е (APO E), С677Т полиморфизма гена фермента метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), G-455A полиморфизма гена фибриногена (Fb) и 4a/4b полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) с риском развития инсульта у больных АГ

Материал и методы

В исследование включено 88 больных, страдающих АГ I-III степени, из которых 41 человек (средний возраст 57,9 лет) впервые перенесли ОНМК и 47 больных (средний возраст 63,4 года) не имели ОНМК в анамнезе. По анамнестической длительности АГ группы не отличались.

ДНК из лимфоцитов венозной крови обследуемых выделяли стандартными методами. Амплификация полиморфного участка изучаемых генов проводилась с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на автоматическом термоциклере MJ Research (MJ Research Inc.) и Biometra (Biometra, Germany) с использованием термостабильной рекомбинантной Taq полимеразы от НПО «Сибэнзим» (Новосибирск). В каждом конкретном случае амплификация анализируе-

мых участков изучаемых генов проводилась при различных условиях.

Исследование на I/D полиморфизм гена ACE и А1166С полиморфизм гена ATR-| проведено у больных АГ обеих групп. Сравнение распределения полиморфных маркеров генов APO CIII и APO E, генов MTHFR и Fb, гена NOS3 было проведено между больными АГ, перенесшими инсульт, и группами здоровых детей и подростков (школьники Северо-Западного региона РФ). Правомерность такого сравнения распределения обоснована тем, что распределение генотипов и аллелей изучаемых генов в группе сравнения приближается к популяционной [3,4].

Сравнение распределений генотипов и аллелей кандидатных генов изучаемой группы с группами сравнения проводилось методом х2 с последующим сопоставлением анализируемых частот с помощью критерия сравнения долей.

Результаты

Частота встречаемости генотипов и аллелей I/D полиморфизма гена ACE в группах больных АГ, перенесших ОНМК и больных АГ, не имевших ОНМК в анамнезе, значимо не различалась (р=0,24; табл. 1).

При сравнении характера распределения генотипов А1166С полиморфизма гена ATR-| у больных АГ с и без ОНМК значимых различий также не выявлено (р=0,14). При этом, в группе больных АГ, перенесших инсульт, носители 1166С аллеля встречались значимо чаще (р=0,04), чем в группе больных АГ без инсульта.

При изучении структурного полиморфизма генов липидного метаболизма значимых отличий в характере распределения генотипов и аллелей гена APO E в группах сравнения не выявлено (р=0,39 и 0,2, соответственно) , однако отмечено, что у больных АГ, перенесших ОНМК, носительство аллеля Е2 встречалось несколько реже, чем в группе школьников (3,8% против 10,8%, р=0,05; табл. 2).

При сравнении распределения генотипов и аллелей

Таблица 1. Распределение генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов РААС у больных АГ с ОНМК и без ОНМК в анамнезе

Генотипы и аллели полиморфных маркеров генов РААС Больные АГ с ОНМК (n=40) Больные АГ без ОНМК (п=47) Р

II 12(30,0%) 13 (27,7%) 0,81

I/D ID 18(45,0%) 25 (53,2%) 5 ,4 0,

АСЕ DD 10(25,0%) 9(19,1%) 0,51

I 52,5% 54,3% 0,81

D 47,5% 45,7% 0,81

AA 24(60,0%) 36 (76,6%) 0,10

А1166С AC 12 (30,0%) 10(21,3%) 5 ,3 0,

ATR1 CC 4(10,0%) 1 (2,1%) 0,12

A 75,0% 87,2% 0,04

C 25,0% 12,8% 0,04

Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов липидного метаболизма у больных АГ, перенесших ОНМК

Генотипы и аллели полиморфных маркеров генов липидного метаболизма Больные АГ с ОНМК (п=40) Школьники СЗР (п=403) Р

Е3Е3 30 (75%) 243 (60,3%) 0,07

Е2Е3 3(7,5%) 67(16,6%) 0,13

АРОЕ Е2Е2 0(0%) 3 (0,7%) 0,59

Е3Е4 6(15,0%) 70(17,4%) 0,71

Е4Е4 1 (2,5%) 6(1,5%) 0,63

Е2Е4 0 (0%) 14(3,5%) 0,23

Е2 3,75% 10,75% 0,05

Е3 86,25% 77,3% 0,07

Е4 10,0% 12,0% 0,62

S1S1 30(80%) 322 (79,9%) 0,99

SstI S1S2 10 (20%) 77(19,1%) 0,89

АРО СШ S2S2 0 (0%) 4 (0,9%) 0,53

S1 90% 89,6% 0,88

S2 10% 10,5% 0,88

Здесь и в табл. 3,4 СЗР - Северо-Западный регион

Таблица 3. Распределение генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов системы гемостаза у больных АГ, перенесших ОНМК

Генотипы и аллели полиморфных маркеров генов гемостаза Больные АГ с ОНМК (п=41) Школьники СЗР (п=139) Р

СС 17(41,5%) 78 (56,1 %) 0,10

С-445А СА 19 (46,3%) 57(41,0%) 0,57

гена РЬ АА 5 (12,2%) 4 (2,9%) 0,02

С 64,7% 76,6% 3 ,0 0,

А 35,3% 23,4% 0,03

СС 16(39,0%) 172 (57,3%) 0,03

СТ 19 (46,3%) 105 (35,0%) 0,16

С677Т ТТ 6(14,6%) 23 (7,7%) 0,13

гена МТНРР С 62,2% 74,8% 2 ,0 0,

Т 37,8% 25,2% 0,02

Таблица 4. Распределение генотипов и аллелей 4a/4b полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) у больных АГ, перенесших ОНМК

Генотипы и аллели полиморфных маркеров гена еNOS3 Больные АГ с ОНМК (п=37) Школьники СЗР (п=143) Р

4Ь4Ь 22 (59,5%) 90 (62,9%) 0,70

ecNOS4a/4b 4Ь4а 15(40,5%) 45 (31,5%) 0, 3 О

гена NOS3 4а4а 0 (0,0%) ) % ,6 5 8 0,14

4Ь 79,7% 78,7% 0,85

4а 20,3% 21,4% 5 ,8 0,

SstI полиморфизма гена АРО СШ у больных АГ, перенесших ОНМК и контрольной группой значимых отличий также не было выявлено (р=0,81).

При изучении структурного полиморфизма генов системы гемостаза у больных АГ, перенесших инсульт, было установлено, что распределение генотипов и аллелей С-455А полиморфизма гена Fb в этой группе значимо отличается от такового в группе здоровых детей и подростков (р=0,03).

При сопоставлении частот встречаемости аллелей

и генотипов гена Fb у больных АГ, перенесших ОНМК, и у группы школьников также выявлены значимые различия (табл. 3). Так, у больных АГ, перенесших инсультзначимочаще встречались генотип АА (1 2,2% против 2,9%, р=0,02) и (С-455А аллель (35,3% против 23,4%, р=0,03), а G-445 аллель - реже (64,7% против 76,6%).

При изучении характера распределения генотипов и аллелей С677Т полиморфизма гена MTHFR у перенесших ОНМК (см. табл. 3), показано значимое уве-

личение частоты встречаемости 677Т аллеля (37,8% против 25,2%, р=0,02) и уменьшение частот встречаемости С677 аллеля (62,2% против 74,8%) и генотипа СС (39,0% против 57,3%, р=0,03).

При изучении 4a/4b полиморфизма гена еNOS3 (табл. 4) у больных АГ, перенесших инсульт, и в группе здоровых детей и подростков в характере распределения генотипов и аллелей значимых различий не выявлено (р=0,71).

Обсуждение

Известна ключевая роль ангиотензинпревращающе-го фермента (АПФ) и ангиотензина II, основных компонентов РААС, в поддержании равновесия между факторами вазоконстрикции и вазодилятации, а также их вклад в атерогенез итромбообразование. Ген АСЕ, кодирующий выработку АПФ и ген рецептора 1-го типа ангиотензина II (ATR-|), через который последний опосредует свой эффект, являются наиболее изученными «кандидатными» генами.

Наши данные для I/D полиморфизма гена ACE соответствуют результатам некоторых исследований, также не обнаружившим связь между I/D полиморфизмом и инсультом [5,6]. Однако имеются и противоположные результаты, свидетельствующие об ассоциации I/D полиморфизма гена ACE с развитием ОНМК и ИМ, где отмечена протективная роль аллеля I и генотипа II [7-9].

Нами показано, что у больных АГ, перенесших ОНМК, аллель А1166 гена ATR-| встречалась значимо (р=0,04) реже, тогда как аллель 1166С - чаще (р=0,04). В исследовании, проведенном среди популяции больных с метаболическим вариантом АГ, перенесших инсульт, связь между структурным полиморфизмом гена ATR-i и риском развития ОНМК не выявлена [9]. Тем не менее, в этом же исследовании была обнаружена ассоциация A1166C полиморфизма гена ATR-с развитием ИМ, при этом А аллель и генотип АА снижали риск ИМ, а С аллель и генотип СС, напротив, повышали. Существуют исследования, подтверждающие влияние полиморфизма гена ATR- на риск развития ИМ [9 - 11] и лакунарных инсультов [12]. В ряде других работ [4,13] ассоциации структурного полиморфизма гена ATR1 с развитием ИМ установлено не было. Результаты нашего исследования позволяют предполагать протективную роль А аллеля и предрасполагающее действие С аллеля гена ATR1 в отношении развития ОНМК у больных АГ

Главными кандидатными генами в изучении предрасположенности к атеросклерозу являются гены липидного метаболизма (АРО СШ, APO Е). Известно, что ген АРО СШ кодирует выработку аполипопротеина СШ (апоСШ), активно участвующего в регуляции катаболизма липопротеинов, богатых триглицеридами (ТГ). Установлена положительная корреляция между уров-

нем аро СШ и уровнями ТГ и общего холестерина. Хорошо изученным является SstI полиморфизм АРО СШ, связанный с заменой цитозина на гуанин в 3238 нуклеотиде в 3'нетранслируемой области, вследствие которой образуются два аллеля, обозначаемые ка^1 и S2. Ряд исследований свидетельствует об ассоциации S2 аллеля гена АРО СШ с гипертриглицеридемией и риском развития ИМ [14, 15]. Вместе с тем существуют исследования, не обнаружившие ассоциации этого полиморфизма с уровнем ТГ [16].

Ген АРО Е кодирует выработку апопротеина Е (АроЕ), при участии которого осуществляются процессы метаболизма и транспорта липидов в плазме крови и внутри клетки, процессы регуляции клеточного метаболизма и иммунного ответа. Генетический полиморфизм гена АРО Е обусловлен замещениями аминокислот ци-стеина и аргинина в положениях 112 и 156 полипеп-тидной цепи белка; известны три аллеля (Е2, Е3, Е4) и шесть генотипов (Е2/2, Е2/3, Е3/3, Е3/4, Е4/4) гена АРО Е [17]. Повышенная (в 4 раза) встречаемость генотипов Е2/3 и Е2/2 среди долгожителей позволила считать аллель Е2 «геном долгожительства» [18]. В то же время показана ассоциация Е4 аллели гена АРО Е с ИБС [19].

Наше исследование не выявило значимых различий в распределении генотипов и аллелей генов липидного метаболизма (АРО СШ, АРО Е) у больных АГ, перенесших ОНМК, и группой здоровых детей и подростков, что, возможно, свидетельствует об отсутствии связи между полиморфизмом генов липидного метаболизма и развитием ОНМК у больных АГ Требуется дальнейшее изучения их влияния на развитие сердечно-сосудистой патологии.

Исключительно важную роль в поддержании нормального гемостаза имеет эндотелий сосудов. Одним из факторов, приводящих к его повреждению и, соответственно, к повышенному тромбообразованию, является увеличение концентрации гомоцистеина. Развитие гипергомоцистинемии связано с наличием термолабильного варианта фермента метилентетраги-дрофолатредуктазы (МТГФР), который образуется вследствие замены цитозина (С) на тимин (Т) в 677 позиции гена, определяющего структуру МТГФР! Существует строгая зависимость между генотипом, активностью МТГФР и ее термочувствительностью [20]. У носителей двух копий Т аллели гена MTHFR уровень гомоцистеина повышен в наибольшей степени [21].

У больных АГ, перенесших ОНМК, значимо чаще встречался 677Т аллель (р=0,02), а С677 аллель и генотип СС гена MTHFR, которые, будучи ассоциированы с низким уровнем гомоцистеина [22], вероятно, обладают протективными свойствами и в отношении развития инсульта у больных АГ, встречались значимо реже.

Повышение уровня фибриногена является независимым фактором риска развития ОНМК. Уровень фибриногена в крови зависит от многих факторов: курения, характера питания, наличия или отсутствия воспалительных заболеваний и т. д. Вместе с тем уровень фибриногена может зависеть и от структурных изменений кодирующего его гена. Наиболее изученным в гене РЬ является полиморфизм, представляющий собой замену гуанина (О на аденин (А) в 455 нуклеотиде промо-торной области, обусловливающий повышенное содержание фибриногена в плазме [23]. Известна ассоциативная связь А аллеля с риском развития ИБС и ИМ [24].

В нашем исследовании обнаружена сильная ассоциация С-455А полиморфизма гена РЬ с риском развития инсульта у больных АГ; при этом маркером повышенного риска выступает аллель 455А. Так установлено, что у больных АГ, перенесших ОНМК, значимо чаще встречался нетолько 455А аллель (р=0,3), но и гомозиготный по 455А аллели генотип АА (р=0,02).

Эндотелиальная NO-синтаза продуцирует оксид азота, который регулирует сосудистый тонус и участвует в процессах тромбообразования и атерогенезе. Среди генов, кодирующих NO-синтазу, наиболее вероятным кандидатом на участие в развитии сердечно-сосудистых заболеваний является ген NOS3. В интроне 4 данного гена расположен минисателлит еNOS4а4b, насчитывающий два аллеля, которые состоят из 4 (аллель 4а) или 5 (аллель 4Ь) тандемных повторов размером 27 п. н.

[25].

Показана потенциальная роль генотипа 4а/4а как фактора риска развития атеросклероза и заболеваний, приводящих к нарушению нормальной выработки N0

[26].

Для 4а/4Ь полиморфизма гена N053 нами не выявлена ассоциация с развитием ОНМК у больных АГ Наши данные соответствуют результатам исследования в московской популяции больных АГ, также не обнаружившим связи полиморфизма гена эндотелиальной N0-синтазы с развитием ишемического атеротромбо-тического инсульта [6]. В то же время, другое исследование в московской популяции показало связь аллеля 4а и генотипов 4а/4а и 4а/4Ь гена N053 с риском развития инсульта у больных АГ и СД 2-го типа [9]. Ассоциация 4а/4Ь полиморфизма гена N053 отмечена и для риска развития лакунарных инсультов у больных АГ [1 2].

Заключение

Развитие ОНМК у больных АГ ассоциировано с А1166С полиморфизмом гена ATR1, с G-455A полиморфизмом гена Fb и с С677Т полиморфизмом гена MTHFR. При этом маркерами повышенного риска развития острых цереброваскулярных катастроф выступают 1166С аллель гена ATRl, А-455 аллель и генотип АА гена Fb, 677Т аллель гена MTHFR. Протективную значимость в отношении развития ОНМК у больных АГ имеют А1166 аллель гена ATRl, G-445 аллель гена Fb, аллель С677 и генотип СС гена MTHFR.

Литература

1. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Стаховская Л.В. Эпидемиология инсульта в России. Журн неврол психиатр им СС Корсакова 2003;(прил 8):4-9.

2. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А., и др. Полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента у больных с ишемической болезнью головного мозга. Журн неврол психиатр им СС Корсакова 2001 ;(прил 3): 21 -7.

3. Badenhop R.F., Wang X.L., Wilcken D.E. Angiotensin-converting enzyme genotype in children and coronary events in their grandparents. Circulation 1995;91 (6):1655-8.

4. Badenhop RF, Wang XL, Wilcken DE. Association between an angioten-sinogen microsatellite marker in children and coronary events in their grandparents. Circulation 1 996;93:2092-6.

5. Моляка Ю.К., Петрук С.В., Кирьянов С.А. и др. Анализ ассоциации полиморфизма генов ангиотензинпревращающего фермента при ишемическом инсульте. Журн неврол психиатр им СС Корсакова 1 998;98(6):35-7.

6. Скворцова В.И., Сломинский П.А., Кольцова Е.А., и др. Изучение роли миссенс-мутации (M235T) гена ангиотензинпревращающего фермента в развитии ишемической болезни мозга. Мол ген микробиол вирусол 2003;1:52-4.

7. Демуров Л.М., Чистяков Д.А., Чугунова Л.А. и др. Исследование полиморфизма типа вставка/делеция гена ангиотензинпревращающего фермента в норме и среди больных сахарным диабетом с сосудистыми осложнениями. Мол биол 1 997;31 (1 ):59-62.

8. Котовская Ю.В., Кобалава Ж.Д., Сергеева ТС., и др. Полиморфизм генов ренин-ангиотензиновой системы и гена эндотелиальной N0-синтетазы и микрососудистые осложнения при сахарном диабете типа 2. Артериальная гипертензия 2002;8(3):86-96.

9. Araujo M.A., Goulart L.R., Cordeiro E.R., et al. Genotypic interactions of renin-angiotensin system genes in myocardial infarction. Int J Cardiol 2005; 1 03(1 ):27-32.

1 0. Berge K.E., Bakken A., Bohn M. et al. A DNA polymorphism at the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) locus and myocardial infarction. Clin Genet 1997;52:71-6.

1 1. Amant C., Hamon M., Banters G. et al. The angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism is associated with coronary artery vasoconstriction. Am J Cardiol 1 997;29:486-90.

1 2. Henskens L.H., Kroon A.A., van Boxtel M.P, et al. Associations of the angiotensin II type 1 receptor A11 66C and the endothelial NO synthase G894T gene polymorphisms with silent subcortical white matter lesions in essential hypertension. Stroke 2005;36(9):1 869-73.

1 3. Castellano M., Muiesan M.L., Beschi M. et al. Angiotensin II type 1 receptor A/C1 1 66 polymorphism. Relationships with blood pressureand cardiovascular structure. Hypertension 1 996;28:1 076-80.

1 4. Zeng Q., Dammerman M.,Takada Y et al. An apolipoprotein CIII marker associated with hypertriglyceridemia in Caucasians also confers increased risk in a west Japanese population. Hum Genet 1995;95:371-

5.

1 5. Talmud PJ., Humphries S.E. Apolipoprotein C-III gene variation and dys-lipidaemia. CurrOpin Lipidol 1 997;8(3):1 54-8.

16. Shoulders C.C., Harry PJ., Lagrost L. et al. Variation at the apo AI/CIII/AIV gene complex is associated with eleveted plasma levels of Apo CIII. Atherosclerosis 1 991;87:239-47.

1 7. Stengard J., Zerba K., Pekkanen J. et al. Apolipoprotein E polymorphism predicts death from coronary heart disease in a longitudinal study of elderly Finnish men. Circulation 1995;91:265-9.

1 8. Anstey K., Christensen H. Education, activity, health, blood pressure and apolipoprotein E as predictors of cognitive change in old age: a review. Gerontology 2000;46(3):1 63-77.

1 9. Corbo R., Scacchi R., Mureddu L. et al. Apolipoprotein B, apolipoprotein E and angiotensin-converting enzyme polymorphisms in 2 Italian populations at different risk for coronary artery disease and comparison of allele freguencies among European populations. Hum Biol 1 999;71 (6):933-45.

20. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia, atherosclerosis and thrombosis. Thromb Haemost 1 999;81:1 65-76.

21. Wotherspoon F., Laight D., Shaw K., Cummings M. Homocysteine, endothelial dysfunction and oxidative stress in type 1 diabetes mellitus. BrJ Diabetes VascDis2003;3(5):334-40.

22. Cappuccio F., Bell R., Perry I. et al. Homocysteine levels in men and women of different ethnic and cultural background living in England. Atherosclerosis 2002;1 64(1 ):95-1 02.

23. Tybjaeg-Hansen A., Agerholm-Larsen B., Humphries S.E., et al. A common mutation (G-455 A) in the -fibrinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen, but not of ischemic heart disease. A study of 9,1 27 individuals based on The Copenhagen City Heart Study. J Clin Invest 1 997;99:3034-9.

24.Kessler C., Spitzer C., Stauske D., et al. The apolipoprotein E and -fibrinogen G/A -455 gene polymorphisms are associated with ischaemic stroke involving large-vessel disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:2880-4.

25. Wang X.L.,SimA.S., Badenhop R.F. et al. A smoking-dependent risk of coronary artery disease associated with a polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase gene. Nat Med 1996;2:41-5.

26. Tsukada T, Yokoyama K., Aral T et al. Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans. Biochem Biophys Res Commun 1 998;245:1 90-3.