Разработка методики подтверждения подлинности фармацевтической субстанции "бусерелина ацетат" методом ЯМР спектроскопии без использования фармакопейного стандартного образца

Разработка методики подтверждения подлинности фармацевтической субстанции «бусерелина ацетат» методом ЯМР спектроскопии без использования фармакопейного стандартного образца

Н. Е. КУЗЬМИНА, С. В. МОИСЕЕВ*, В. И. КРЫЛОВ, В. А. ЯШКИР, В. А. МЕРКУЛОВ

Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России, Москва

Development of a Procedure for the Identification of Pharmaceutical Substance «Buserelin Acetate» by NMR Spectroscopy without Using Pharmacopoeia Reference Standard

N. E. KUZMINA, S. V. MOISEEV*, V. I. KRYLOV, V. A. YASHKIR, V. A. MERKULOV

Scientific centre for expert evaluation of medical products of the Ministry of Health of Russian Federation, Moscow

На основе комплексного анализа спектральных данных ЯМР ('Н, 13C, 'H-'H gCOSY, 1H-13C gHSQC, 1H-13C gHMBC) проведена идентификация образца бусерелина ацетата без использования фармакопейного стандартного образца. Определены параметры ЯМР эксперимента, позволяющие получить спектры, в которых соотношение сигнал/шум (S/N) выше 50:1 (Н и 10:1 (13С). Показана нецелесообразность использования сигнала ацетат-аниона для калибровки шкалы химических сдвигов спектров водного раствора бусерелина ацетата. Сделано предположение о влиянии скорости прототропной таутомерии на исчезновение в спектре 13С сигналов углеродных атомов в положениях 4 и 5 имидазольного цикла в L-гистидино-вом фрагменте бусерелина ацетата.

Ключевые слова: бусерелина ацетат, подлинность, метод ЯМР, стандартный образец.

The identification of the buserelin acetate sample was carried out without using the pharmacopeia reference standard. The identification was based on the spectral NMR data OH, 13C, 1H-1H gCOSY, 1H-13C gHSQC, 1H-13C gHMBC) complex analysis. NMR experiment parameters were determined for the obtaining of spectra with S/N ratio above 50: 1 (H and 10:1 (13C). The inexpediency of using the acetate anion signal for calibration of the scale of chemical shifts in the spectra of an aqueous solution of busere-lin acetate is shown. The assumption about the effect of the speed of prototropic tautomerism on the disappearance of signals of carbon atoms in positions 4 and 5 of the imidazole ring in the L-histidine fragment of buserelin acetate was made.

Keywords: buserelin acetate, identification, NMR spectroscopy, reference standard.

Введение

Бусерелина ацетат (5-оксо-Ь-пролил-Ь-гис-тидил-Ь-триптофил-Ь-серил-Ь-тирозил-О-трет-бутил-Б-серил-Ь-лейцил-Ь-аргинил-Ь-пролил-N-этиламид ацетат) представляет собой синтетический олигопептид — аналог природного гона-дотропин-рилизинг гормона. Он применяется в медицине при лечении эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия, раковых образований молочных желез, гормонозависимых раковых образований предстательной железы, миомы матки, бесплодия [1—3].

Важным этапом контроля качества фармацевтической субстанции «бусерелина ацетат» (БА) является подтверждение его подлинности. На

© Коллектив авторов, 2017

* Адрес для корреспонденции: 127051 Москва, Петровский бульвар 8, стр. 2. НЦЭСМП

практике эта процедура осуществляется, как правило, путём сравнения УФ-спектра и (или) хро-матограммы испытуемого образца субстанции с УФ-спектром и (или) хроматограммой фармакопейного стандартного образца (ФСО) [4]. Следует отметить, что в настоящее время отечественные стандартные образцы (СО) не производятся, а вместо них применяют зарубежные (Европейская, Британская фармакопеи и Фармакопея США). Основное ограничение в использовании зарубежных ФСО связано с их большой стоимостью и длительными сроками поставки производителем. Поэтому при их отсутствии допускается проводить рутинные анализы по подтверждению подлинности действующего вещества, используя рабочие СО, идентичность которых доказывают несколькими альтернативными методами.

Одним из наиболее эффективных методов идентификации структуры СО является метод

Таблица 1. Влияние параметров ЯМР — эксперимента на величину S/N

С, мг/мл D1, c N S/N Длительность эксперимента С, мг/мл D1, c N S/N Длительность эксперимента

н

1 1 256 53,3 16 мин 5 1 16 56 1 мин

1 5 128 53,8 16 мин 29 с 5 5 4 58 31 сек

2,5 5 64 60,4 8 мин 14 с 10 1 1 50 4 с

13С

5 1 10000 5,8 5 ч 37 мин 20 1 1500 8,1 47 мин

10 1 4500 9,6 2 ч 19 мин 20 1 2000 10,4 1 ч 2 мин

10 1 5000 10,0 2 ч 35 мин 20 2 1000 7,7 48 мин

10 2 5000 11 4 ч 20 2 1500 11,2 1 ч 11 мин

ЯМР спектроскопии [5, 6]. Он позволяет фиксировать наличие в молекулярной системе определённых структурных фрагментов и последовательность их соединения друг с другом [7].

Цель данного исследования — разработка методики подтверждения подлинности БА методами и 13С ЯМР спектроскопии для её дальнейшего использования в контроле качества субстанций и при создании рабочих стандартных образцов БА.

Материал и методы

В качестве объекта исследования использовали образец лекарственной субстанции БА производства ЗАО «Ф-Синтез», Россия (серия 02042017). Варьируемые навески анализируемого образца растворяли в 0,5 мл дейтерированного растворителя (D2O или ДМСО-ё6) производства Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Для калибровки шкалы химических сдвигов (б) в водный раствор испытуемого образца добавляли 10 мкл аналитического стандарта 1,4-диоксана производства Fluka. Регистрацию спектров >Н, 13C, 'H-'H gCOSY, >H-13C gHSQC, 'H-13C gHMBC проводили при температуре 25°С на ЯМР спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 (США) с 5-мм мульти-ядерным датчиком, оснащённым градиентной катушкой.

Результаты исследования

Основная задача, решаемая при разработке методики подтверждения подлинности соединения методом ЯМР спектроскопии, заключается в структурной интерпретации спектральных данных, то есть в соотнесении каждого сигнала в спектрах ЯМР с конкретным структурным фрагментом соединения. Поэтому при разработке такого типа методик на начальном этапе исследований подбирают условия эксперимента, обеспечивающие появление достаточно интенсивных сигналов (удовлетворительное значение отношения сигнал/шум S/N).

Европейская фармакопея при проверке идентичности олигопептидов методом 1Н ЯМР рекомендует руководствоваться минимальной величиной S/N = 50 [8]. При переходе к менее чувствительному методу 13С ЯМР мы ориентировались на требования к пределу количественного обнаружения вещества (S/N = 10) [9].

На величину S/N влияет целый ряд параметров ЯМР-эксперимента, наиболее значимыми

12 -

z 10

и я 2 3

I 6

о

Е 4 -о

«3 2

О

О 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Количество накоплений ССИ

Рис. 1. Графическая зависимость величины S/N от числа накоплений ССИ в спектре 13С БА (D2O, c=10 мг/мл, D1=1 c).

являются концентрация исследуемого образца (с), время релаксации и число накоплений (n) сигнала спада свободной индукции (ССИ). Оптимальные значения этих параметров устанавливали, используя растворы БА в D2O. Соотношение S/N измеряли на сигналах с наименьшей интенсивностью. В спектрах это мультиплетные сигналы пирролидинового фрагмента L-Pro, в спектрах 13С — сигналы карбонильных групп и четвертичных атомов углерода L-His и L-Trp. Концентрацию подбирали таким образом, чтобы спектры

1Н и 13С, снятые с одного раствора образца, удовлетворяли требованиям к величине S/N. Результаты подбора оптимальных параметров эксперимента представлены в табл. 1.

Как следует из табл. 1, качественный протонный спектр (S/N>50) можно получить при концентрации с = 1 мг/мл (7,7х10-4 ммоль/мл). Для регистрации спектра 13С с S/N>10 необходимо увеличивать концентрацию БА или значительно увеличивать число накоплений ССИ. Ранее мы показали, что графическая зависимость величины S/N от n имеет форму, близкую к параболической [10]. Экспериментальные данные, представленные на рис. 1, хорошо согласуются с этим выводом и показывают нецелесообразность увеличения соотношения S/N за счёт большого накопления ССИ.

Рис. 2. Спектры 1Н растворов бусерелина ацетата в D2O

Как видно из табл. 1, увеличение времени релаксации, существенно повышая время проведения эксперимента, также не ведёт к значительному росту Б/Ы. Для получения спектра 13С, удовлетворяющего требованию Б/Ы>10, необходимо использовать концентрации растворов БА не менее 10 мг/мл. Увеличение концентрации до 20 мг/мл (Б1=1 с; «=2000) сокращает время эксперимента до 1 ч. Дальнейшие исследования мы проводили, используя параметры с=20 мг/мл, Б!=1, п=1(1Н) и 2000 (13С).

На следующем этапе разработки методики подбирали внутренний эталон для калибровки шкалы д. При растворении в ДМСО-ё6 целесообразно использовать в этом качестве сигнал дейте-рированного растворителя (д=2,50 (1Н) и 39,52 м.д. (13С) [10]). Для водных растворов олигопепти-дов в качестве эталона в спектрах ЯМР 1Н применяют, как правило, 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия или З-(триметилсилил) пропи-онат натрия [8]. В кислой среде эти соединения переходят в соответствующие кислоты, плохо растворимые в Б20. В связи с этим европейская фармакопея рекомендует использовать в качестве эталона для калибровки шкалы д присутствующий в образцах олигопептидов ацетат-анион, приравнивая его химический сдвиг в спектре исследуемого образца к химическому сдвигу в спектре стандартного образца, снятому в аналогичных условиях [8]. На наш взгляд, в отсутствие стандартного образца использование ацетат-аниона для калибровки шкалы д не совсем корректно, так как величина его химического сдвига в ассоциате олигопептид — уксусная кислота сильно зависит от степени диссоциации кислого протона, кото-

рая, в свою очередь, определяется эффективностью невалентных взаимодействий между компонентами ассоциата. Например, в соответствии с нашими экспериментальными данными (растворы олигопептидов в ДМСО-ё6, калибровка под остаточный недейтерированный растворитель) д метильной группы ацетат-аниона в БА и десмо-прессина ацетате составляют 1,83 и 1,71 м.д. (1Н); 22,40 и 24,76 (13С), соответственно. В фармакопейном анализе для калибровки спектров водных растворов часто используют 1,4-диоксан, поэтому данное соединение было выбрано нами в качестве эталонного (д=3,75 (1Н), 67,19 м.д. (13С) [11]).

1Н и 13С спектры БА в Б20 и ДМСО-ё6 представлены на рис. 2 и 3, соответственно. Структурную интерпретацию спектральных данных осуществляли по следующему алгоритму:

♦ соотнесение сигналов спектров 1Н и 13С с конкретными углеводородными фрагментами (метильными, метиленовыми, метиновыми группами) на основе данных 1Н-13С gHSQC эксперимента;

♦ определение соседних водородсодержа-щих фрагментов, связанных ковалентной связью, и составление из них последовательности в цикле или алифатической цепочке на основе данных 1Н-1Н gC0SY;

♦ объединение в конкретную аминокислоту углеводородных фрагментов (алифатических и ароматических) и амидных групп на основе данных 1Н-13С gHMBC эксперимента;

♦ Установление аминокислотной последовательности на основе данных 1Н-13С gHMBC эксперимента по наличию кросс-пиков между сигналами а-СН и С=О групп соседних аминокислот.

Рис. 3. Спектры 13С растворов бусерелина ацетата в D2O

Проведённая структурная интерпретация представлена в табл. 2, нумерация атомов — на рис. 4. Следует отметить, что в спектрах 'Н наблюдается частичное или полное перекрывание ряда сигналов. Например, в спектре раствора в ДМСО-ё6 перекрываются сигналы амидных протонов Ь-А^, Ь-Тгр и Ь-Ьеи (6=8,14-8,11 м.д.); протонов а-СН групп Ь-8ег, Ь-Ьеи, 0ЧБи-8ег (¿=4,34-4,32 м.д.); Ь-№8 и Ь-А^ (6=4,45-4,43

м.д.); протонов в-СН2 групп 5-оксо-Ь-Рго, L-Aгg, Ь-Рго (6=1,75-1,72 м.д.) и т.д. Спектр 'Н в Б2О не содержит сигналы амидных и гидроксильных протонов. В нём перекрываются сигналы ароматических протонов Ь-Ш8 и Ь-Тгр (6=7,13-7,12 м.д.); протонов а-СН групп Ь-Туг и Ь-Ьеи (6=4,38-4,37 м.д.), 5-оксо-Ь-Рго и Ь-Рго ((6=4,22-4,19 м.д.); протонов в-СН2 групп 5-ок-со-Ь-Рго, Ь-А^, L-Aгg (6=1,64-1,66 м.д.) и т.д. В

Таблица 2. Спектральные характеристики БА в D2O

№ атома Б20+10 мкл 1,4-диоксана ДМСО^б

Н, 6, м.д.; Л, Гц 13С, 6, м.д. Н, 6, м.д.; Л, Гц 13С 6, м.д.

5-оксо-Ь-Пролин

1 175,14 172,18

2 4,19 дд (1=8,5; 5,3) 57,16 3,97 дд (1=4,0; 8,6) 55,47

3 1,66 м; 2,36 м 25,69 1,75; 2,15 25,15

4 2,27 м; 2,33 м 29,75 2,17 м; 2,23 м 29,04

5 182,65 177,44

2-КИ 7,75 с

Ь-Гистидин

6 171,99 170,83

7 4,64 дд (1=8,3; 6,5) 53,22 4,43 м 52,85

8 3,04дд (1=15,3; 8,3) 3,14 дд (1=15,3; 6,5) 27,28 2,79 (1=15,3; 8,3); 2,89 (1=15,3; 6,5) 29,52

9 129,79 н/н*

10 8,37 с 134,63 7,49 с 134,77

11 7,13 с 117,66 6,76 н/н

7-КИ 7,98 д

9-КИ 8,34

Продолжение табл. 2.

№ атома _Р2(>+10 мкл 1,4-диоксана_ДМСО^б

1Н, д, м.д.; . Гц 13С, д, м.д. 1Н, д, м.д.; .1, Гц 13С д, м.д.

Ь-Триптофан

12 173,85 171,51

13 4,69дд (1=7,2; 6,6) 55,11 4,57 м 53,46

14 3,19 м; 3,23 м 27,79 2,97 м; 3,18 м 27,43

15 109,26 109,92

16 127,61 127,36

17 7,57 д (1=7,9) 118,83 7,57 д (1=7,9) 118,40

18 7,12 дд (1=7,9; 7,2) 119,97 6,93 дд (1=7,9; 7,2) 118,14

19 7,23 дд (1=8,2; 7,2) 122,56 7,03 дд (1=8,2; 7,2) 120,74

20 7,48 д (1=8,2) 112,47 7,30 д (1=8,2) 111,17

21 136,77 136,00

22 7,18 с 125,04 7,12 с 123,61

13-ЫН 8,14 д

21-ЫН 10,79 с

Ь-Серин

23 171,26 169,64

24 4,33 дд (1=5,8; 5,0) 56,03 4,32 м 55,21

25 3,69 дд (1=11,7; 5,0) 3,71 дд (1=11,7; 5,8) 61,80 3,52 м; 3,57 м 61,55

24-ЫН 8,39 д

25-ОН 5,15 уш. с.

Ь-Тирозин

26 173,36 170,83

27 4,37 м 56,45 4,53 м 54,16

28 2,88 дд (1=13,6; 9,0) 2,96 дд (1=13,6; 6,9) 36,73 2,74 м; 2,87 м 36,93

29 128,17 127,41

30,34 7,07 д (1=8,5) 131,19 7,01 д (1=8,5) 130,18

31,33 6,83 д (1=8,5) 116,12 6,61 д (1=8,5) 114,78

32 155,31 155,82

27-ЫН 7,91 д

32-0Н 8,81 уш.с.

Б-Серин-О^еЛ-Би

35 172,11 169,30

36 4.30 дд (1=5,5; 4,5) 54,37 4,34 м 53,15

37 3,22 м; 3,50 м 61,56 3,28 61,70

38 75,39 72,65

39-41 1,10 с 26,99 1,07 с 27,03

36-ЫН 8,03 д

Ь-Лейцин

42 174,63 171,82

43 4,38 м 52,79 4,33 м 50,76

44 1,56 м; 1,64 м 40,48 1,40; 1,46 40,84

45 1,55 м 24,75 1,66 м 23,79

46 0,85 д (1=6,1) 21,32 0,82 д (1=6,1) 21,32

47 0,90 д (1=6,1) 22,86 0,85 д (1=6,1) 23,25

43-ЫН 8,11 д

Ь-Аргинин

48 171,85 170,68

49 4,46 дд (1=8,2; 5,7) 51,70 4,45 м 50,18

50 1,64 м; 1,77 м 28,18 1,54 м; 1,72 м 27,97

51 1,54 м 24,68 1,54 м 24,45

52 3,11 м 41,19 3,06 м 40,48

53 157,23 157,12

49-ЫН 8,13 д

53-ЫН2 7,45 уш. с.

Ь-Пролин-1Ч-этиламид

54 174,15 171,18

55 4,22 дд (1=8,1; 6,5) 61,42 4,20 дд (1=8,1; 6,5) 59,64

56 1,84 м; 2,18 м 30,04 1,73 м; 2,00 м 29,26

57 1,88 м; 1,98 м 25,19 1,81 м; 1,90 м 24,50

58 3,50 м; 3,65 м 48,50 3,54 м; 3,65 м 46,73

59 3,17 м 35,04 3,00 м; 3,07 м 33,20

60 1,06 т (1=7,3) 14,10 0,97 т (1=7,3) 13,10

Уксусная кислота

1а 1,94 с 23,38 1,83 с 22,40

2а 181,14 173,35

Примечание. *н/н - сигнал не наблюдается

Рис. 4. Нумерация структурных фрагментов в молекуле БА

спектрах 13С сигналы практически не перекрываются, что делает их более удобными для идентификации БА.

Характерной особенностью спектра 13С БА в ДМСО-ё6 является отсутствие сигналов С(9) и СН(11) имидазольного фрагмента L-His, в то время как в спектре водного образца все его сигналы наблюдаются. По-видимому, данное явление связано с различной скоростью прототропной таутомерии замещённого имидазола в этих растворителях. Известно, что обменные прототропные превращения в азолах, чрезвычайно быстрые во временной шкале ЯМР в обычных средах, замедляются растворителями с ярко выраженными протонодонорными или протоноакцепторными свойствами [12]. Можно предположить, что из-за замедления протонного обмена под действием ДМСО в 4-замещённом имидазоле происходит усиление неэквивалентности электронного окружения углеродных ядер в позициях 4 и 5 имидазольного цикла и, как следствие, уширение соответствующих сигналов до критического соотношения S/N (их видимое отсутствие). Повышение температуры с 25 до 50°С не приводит к появлению отсутствующих сигналов. Аналогичная картина наблюдается в спектрах 13С растворов в ЛИТЕРАТУРА

1. Mezo I., Lovac S, Palyi I., Vincze B, Kalnay A., Turi G. et al. Synthesis of Gonadotropin-Releasing Hormone III Analogs. Structure-Antitumor Activity Relationships. J Med Chem 1997; 40 (21): 3353-3358.

2. Хасханова Л.Х., Пиддубнъш М.И., Ордиянц И.М., Плаксина Н.Д., По-гасов А.Г., Золичев Т.Е. и др. Вестник РУДН, сер. Медицина. Акушерство и гинекология 2002; 1: 225-227. / Khaskhanova L.Kh, Piddubnyj M.I., Ordijanc I.M., Plaksina N.D., Pogasov A.G., Zolichev G.E. i dr. Vestnik RUDN, ser. Medicina. Akusherstvo i ginekologija 2002; 1: 225-227. [in Russian]

ДМСО-ё6 родственных олигопептидов (дезокси-бусерелина ацетата, [5-D-тирозин]-бусерелина ацетата, трипторелина ацетата).

Проведённая на основе комплексного анализа структурная интерпретация спектральных данных испытуемого образца БА однозначно доказывает его аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. Это позволит в дальнейшем использовать его в качестве рабочего СО при решении задачи подтверждения подлинности. При этом достаточно ограничиваться регистрацией исключительно одномерных спектров ('Н или 13С).

Таким образом, разработаны различные варианты методики подтверждения подлинности фармацевтической субстанции БА методом ЯМР спектроскопии без использования ФСО (на ядрах 'Н и 13С, в растворителях D2O и ДМСО-ё6). Планируемая в дальнейшем оценка специфичности каждого варианта методики путём сравнения спектральных данных бусерелина ацетата и его диастереомера ([5^-тирозил]-бусерелина) позволит выбрать наиболее селективный вариант, обеспечивающий максимальное разделение сигналов основного компонента и родственных примесей в субстанции БА.

3. Сафронова Е.Ю., Крашенинников A.A., Сергиенко С.А., Костин A.A. Использование современных аналогов лютеинизирующего гормона рилизинг-гормона при проведении гормональной терапии у больных раком предстательной железы. Исследования и практика в медицине2017; 4 (2): 23—28. / Safronova E.Ju, Krasheninnikov A.A., Sergienko S.A., Kostin A.A. Ispol'zovanie sovremennykh analogov ljuteinizirujushhego gormona rilizing-gormona pri provedenii gormon-al'noj terapii u bol'nykh rakom predstatel'noj zhelezy. Issledovanija i praktika v medicine2017; 4 (2): 23—28. [in Russian]

4. Monograph 01/2017:1077 Buserelin. in: European Pharmacopoeia, 9th ed. V.1. Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines & Health Care; 2016. p. 1887-1889.

5. General monograph 5.12 Reference standards. in: European Pharmacopoeia, 9th ed. V.1. Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines & Health Care; 2016. p. 733-738.

6. Кузьмина H.E., Моисеев С.В., Яшкир В.А., Осинцева E.B. Возможности использования метода ядерного магнитного резонанса при аттестации стандартных образцов. Стандартные образцы 2014; 2: 19—25. / Kuz'mina N.E., Moiseev S.V., Jashkir V.A., Osinceva E.V. Vozmozhnosti ispol'zovanija metoda jadernogo magnitnogo rezonansa pri attestacii standartnykh obrazcov. Standartnye obrazcy 2014; 2: 19— 25. [in Russian]

7. Лутцева А.И., Боковикова Т.Н., Яшкир В.А., Стронова Л.А., Кузьмина H.E., Агапкина М.В. и др. Методологические подходы к выбору методов установления подлинности лекарственных средств. Ведомости НЦ ЭСМП 2017; 7 (2): 71—76. / LutcevaA.I, Bokovikova T.N, Jashkir V.A., Stronova L.A, Kuz'mina N.E., Agapkina M.V. i dr. Metodologicheskie podkhody k vyboru metodov ustanovlenija podlin-nosti lekarstvennykh sredstv. Vedomosti NC JeSMP 2017; 7 (2): 71—76. [in Russian]

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Кузьмина Наталия Евгеньевна — д.х.н., главный эксперт лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии, ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва

Моисеев Сергей Владимирович — к.х.н, доцент, ведущий эксперт лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии, ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва

Крылов Владислав Игоревич — ведущий инженер лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотера-пии, ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва

8. General monograph 2.2.64 Peptide identification by nuclear magnetic resonace. in: European Pharmacopoeia, 9th ed. V.1. Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines & Health Care; 2016; 112.

9. 0ФС.1.1.0012.15 Валидация аналитических методик в ГФ РФ, XIII изд. Т. 1. Москва: Изд-во Министерства здравоохранения РФ; 2015; 222-234.

10. Кузьмина Н.Е., Моисеев С.В., Крылов В.И., Яшкир В.А., Меркулов В.А. Возможности метода ЯМР спектроскопии при определении микрокомпонентов смесей. Журнал аналитической химии 2014: 69 (11): 1152—1160. / Kuz'mina N.E., Moiseev S.V., Krylov V.J., Jashkir V.A., Merkulov V.A. Vozmozhnosti metoda JaMR spektroskopii pri opredelenii mikrokomponentov smesej. Zhurnal analiticheskoj khimii 2014: 69 (11): 1152—1160. [in Russian]

11. Gottlieb H.E, Kotlyar V., Nudelman A. NMR chemical shifts ofcommon laboratory solvents as trace impurities. J Org Chem 1997; 62 (21): 7512—7515.

12. Ларина Л.И. Спектроскопия ЯМР и строение замещенных азолов. Автореферат дис. док. хим. наук. Иркутск: Иркутский гос. унив. 2003. / Larina L.I. Spektroskopija JaMR i stroenie zameshhennykh azolov. Avtoreferat dis. dok. khim. nauk. Irkutsk: Irkutskij gos. univ. 2003. [in Russian]

Яшкир Вадим Анатольевич — к.х.н., доцент, начальник лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и ге-нотерапии, ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва

Меркулов Вадим Анатольевич — д.м.н., профессор, заместитель генерального директора по экспертизе лекарственных средств, ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва