СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ТРИПЛ-НЕГАТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
METHOD FOR DETERMINING PROLIFERATIVE ACTIVITY OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER TUMOR CELLS

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в патологической анатомии, медицинской диагностике и для медицинских исследований, в частности для определения пролиферативной активности опухолевых клеток трипл-негативного рака молочной железы с последующим решением вопроса о назначении терапии и прогнозе пациентки.
В настоящее время трипл-негативный рак молочной железы считается гетерогенным заболеванием и делится на базальноподобный и небазальноподобный подтипы, характеризующиеся различными прогнозами и ответами на химиотерапию. Показатель пролиферативной активности, определенный экспрессией белка Ki-67 является предиктором эффективности неоадьювантной химиотерапии у больных с операбельных трипл-негативным раком. Высокий уровень пролиферативной активности, определенной индексом Ki-67 (более 10%), достоверно ассоциируется с высокой эффективностью неоадьювантной химиотерапии и достижением полной морфологической ремиссии, но низкой выживаемостью, низкий уровень пролиферативной активности (индекс Ki-67 менее 10%) имеет обартное клиническое значение (Fasching P.A., Heusinger К, Haeberle L., et al. Ki-67 can be used for further classification of triple negative breast cancer into two subtypes with different response and prognosis // Breast Cancer Research.- Vol. 11 (486). - P. 2-13. doi: 10.1186/1471-2407-11-486).
Существует способ определения пролиферативной активности клеток рака молочной железы на гистологических срезах, приготовленных путем стандартной парафиновой проводки с использованием иммуногистохимического исследования с моноклональными антителами к белку Ki-67. Фрагмент ткани трипл-негативного рака молочной железы, полученный путем биопсии или во время операции, подвергают стандартной парафиновой проводке с последующим иммуногистохимическим исследованием на парафиновых срезах пероксидазно-антипероксидазным методом с демаскировкой антигенов в РТ-модуле (DAKO) с использованием буфера для демаскировки (Tris/EDTA рН 9) (DAKO). В качестве системы визуализации используют универсальный набор с полимером EnVision Flex (DAKO). Ядра докрашивают гематоксилином Майера. Используют мышиные моноклональные антитела к фактору пролиферации - белку Ki-67 (клон MIB 1, RTU). Пролиферативную активность оценивают на основании расчета индекса пролиферативной активности в процентах на основании подсчета 400 клеток при большом увеличении микроскопа в зонах с максимальной концентрацией позитивно-окрашенных ядер (hot spot) (Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань, 2004. - 452 с). Недостатки данного способа:
1) Необходимость дорогостоящего оборудования для автоматической стандартизированной окраски и специальных реактивов.
2) Иммунореактивность Ki-67 во многом зависит от целого ряда методических параметров, таких как сроки фиксации образца ткани, условия его обработки и метод демаскировки антигена, условий выполнения метода.
3) Трудоемкость обработки результатов.
4) Результаты способа во многом субъективны и зависят от квалификации специалиста, проводящего оценку экспрессии.
3
Существуют способы определения пролиферативной активности: радиоавтография с Н-тимидином, выявление клеток, меченных BrdU; иммуногисто- и цитохимическое выявление белков, регулирующих клеточный цикл, таких как PNCA, пистоны Н3, циклин D1 (Кирш О.В., Г.В. Безнин, Д.Э. Коржевский Маркеры пролиферации, применяемые в гистологических исследованиях //Морфология. - №6, Т136. - С. 95-100). Недостатками данных методов являются дороговизна, необходимость предварительной подготовки материала, экспрессия маркеров только в определенные фазы клеточного цикла, а также токсичность первого метода.
Техническим результатом предлагаемого способа является упрощение методики и повышение объективности получаемых результатов для определения пролиферативной активности у больных с трипл-негативным раком молочной железы.
265
305
265
305
265
305
Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что неокрашенные депарафинированные гистологические срезы ткани рака молочной железы после определения его трипл-негативного статуса, приготовленные путем стандартной парафиновой проводки, подвергают флуориметрическому исследованию, поместив их на кварцевое стекло, предварительно депарафинировав в растворе гексана. После этого проводят измерение спектра возбуждения флуоресценции опухолевой ткани в диапазоне длин волн от 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм. Дополнительно проводят измерения спектра флуоресценции опухолевой ткани при длине волны возбуждения 300 нм и длин волн регистрации от 330 до 450 нм и определяют соотношение между интенсивностями кривых с максимумами в области 265 и 305 нм (I/I) и если I/I = 1,0, то пролиферативная активность трипл-негативного рака низкая, увеличение значения соотношения I/I говорит о высокой пролиферативной активности.
Способ осуществляют следующим образом.
Фрагмент ткани рака молочной железы, полученный путем биопсии или во время операции, подвергают стандартной парафиновой проводке. После подтверждения путем иммуногистохимического исследования трипл-негативного статуса рака молочной железы (отсутствие экспрессии рецепторов к эстрогену, прогестерону и рецепторов HER-2/neu) с парафинового блока готовят параллельный срез толщиной 6-7 мкм без окрашивания гематоксилином и эозином, депарафинируют его в гексане в течение 3 мин, помещают на кварцевое стекло, не окрашивая, и измеряют спектры возбуждения флуоресценции с 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм и спектры флуоресценции при длине волны возбуждения 300 нм и длин волн регистрации от 330 до 450 нм на спектрофлуориметре SOLAR СМ-2203. На графиках фигуры 1 изображены типичные спектры возбуждения флуоресценции образцов трипл-негативного рака молочной железы. Все спектры возбуждения флуоресценции имеют сложную структуру, состоящую из трех четко выраженных максимумов: первый на 260-265 нм, второй 305-310 нм и третий на 335-340 нм. Кривые 1, 2, 3, 4 представляют собой спектр возбуждения флуоресценции исследуемой ткани при индексе пролиферативной активности, равном 10%, 70%, 80% и 90% соответственно (результаты сравнивали с результатами иммуногистохимического исследования с мышиными с моноклональными антителами к белку Ki-67 (клон MIB 1, RTU) с последующим подсчетом индекса пролиферативной активности по вышеописанной методике). При самом малом индексе пролиферативной активности два пика плохо разрешены и поэтому образуют один общий пик с максимумом на 287 нм, другой пик четко выражен с максимумом на 334 нм. Остальные кривые имеют три четко выраженных хорошо разрешенных между собой максимума в области 265, 305 и 335 нм. При увеличении индекса пролиферативной активности изменяется соотношение между первыми двумя максимумами.
Для анализа спектры раскладывают их на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых. На фигуре 2 приведен пример такого разложения типичного спектра. Кривая 1 представляет собой интенсивность света, после поглощения которого произойдет ионизация молекулфлуорофоров исследуемой ткани. Кривые 2 и 3 характеризуют свечение эндогенных флуорофоров исследуемой ткани. Кривая 4 характеризует рассеянный свет. Кривая 5 характеризует измеренный спектр, который разложили на составляющие. После разложения спектра на составляющие необходимо вычисляют отношение максимумов кривых 2 и 3, соответствующее определенному индексу пролиферативной активности.
265
305
265
305
265
305
265
В таблице 1 приведены соотношения между интенсивностями кривых с максимумами в области 265 и 305 нм (I/I) полученных после разложения кривых фигуры 1. Наибольшее значение отношения I/I, где I - это интенсивность флуоресценции кривой с максимумом в районе 265 нм, I - это интенсивность флуоресценции кривой с максимумом в районе 305 нм, наблюдается в образце с индексом пролиферативной активности равным 90%. С увеличением индекса пролиферативной активности вклад I увеличивается.
На графиках фигуры 3 изображены типичные спектры флуоресценции этих же образцов опухолевой ткани, что и на фигуре 1. Кривая 1 представляет собой спектр флуоресценции ткани трипл-негативного рака молочной железы при индексе пролиферативной активности 10%. Кривые 2, 3, 4 представляют собой спектр возбуждения флуоресценции исследуемой опухолевой ткани трипл-негативного рака молочной железы при индексе пролиферативной активности равном 70%, 80% и 90% соответственно. Кривая 1, как и кривые 2,3 и 4, имеет два пика. Однако второй пик очень маленький с максимумом на 428 нм. На осях координат он изображен отдельно пунктирной линией. При индексе пролиферативной активности от 70 до 90% пик с максимумом на 440 нм хорошо выражен и постепенно уменьшается. Такое различие в спектрах образцов с индексом пролиферативной активности менее и более 10%, являющийся пороговым значением при назначении неоадьювантной химиотерапии, позволяет заменить иммуногистохимию на более доступную флуориметрию.
Способ основан на выявлении биохимического атипизма, который является ранним проявлением злокачественной трансформации клеток на молекулярном уровне. Благодаря селективному свечению флуорофоров (никотинамиддинуклеотида, коллагена, эластина и витамина В6) на длине волны 410 нм и переносу энергии на них с триптофан и тирозин содержащих белов удается выявить радикальные отличия в спектрах возбуждения флуоресценции тканей с различным индексом пролиферативной активности.
Пример 1. Пациентка А., 45 лет. Выполнена правосторонняя мастэктомия по поводу неспецифиированного рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиопсией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 определило индекс пролиферативной активности равный 10%.
265
305
Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I/I составляет 1,0, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 10%.
Пример 2. Пациентка К., 54 года. Выполнена правосторонняя мастэктомия по поводу протокового рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиоспией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 выявило индекс пролиферативной активности равный 80%.
265
305
Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I/I составляет 1,22, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 80%.
Пример 3. Пациентка С, 76 лет, выполнена левосторонняя мастэктомия по поводу неспецифицированного рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиоспией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 выявило индекс пролиферативной активности равный 90%.
265
305
Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I/I составляет 1,31, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 90%.
Пример 4. Пациентка О., 62 лет, выполнена трепанобиоспия опухоли левой молочной железы. Гистологическое заключение: неспецифицированный рак молочной железы. Иммуногистохимическое исследование выявило трипл-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к белку Ki-67 выявило индекс пролиферативной активности равный 70%.
265
305
Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I/I составляет 1,15, что соответствует индексу пролиферативной активности равному 70%.
Данным способом исследовано 28 фрагментов ткани трипл-негативного рака молочной железы, в 100% случаев предложенный метод дифференцировал высокую (больше 10%) и низкую (менее 10%) пролиферативную активность в ткани трипл-негативного рака молочной железы, в 6 случаях с высокой пролиферативной активностью результаты иммуногистохимического исследования разнились на 10% с данными флуориметрического исследования, чем можно пренебречь, учитывая присутствие субъективности в анализе индекса пролиферативной активности путем определения белка Ki-67, а также отсутствия значения для назначения терапии.
Преимуществами предлагаемого способа являются дешевизна, отсутствие необходимости приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, требующих определенных температурных условий хранения, упрощение методики определения пролиферативной активности клеток трипл-негативного рака молочной железы, устранение влияния субъективности на обработку результатов, отсутствие необходимости специальной подготовки материала к исследованию и возможности искажения результатов под влиянием внешних условий, быстрота получения результата, что особенно важно для онкологических больных для скорейшего решения вопроса о назначении химиотерапии.