СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЗУБНОЙ ПУЛЬПЫ И СПОСОБ ПЕРЕНОСА ЭКСТРАГИРОВАННОГО ЗУБА НА ХРАНЕНИЕ
METHOD FOR PULP CELL CULTURE AND METHOD FOR EXTRACTED TOOTH PLACEMENT IN STORAGE

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на японский патент №2009-289090, поданной 21 декабря 2009 года, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу транспортировки удаленного зуба для культивирования и консервации клеток пульпы зуба, и, в частности, относится к улучшению качества сохранения клеток пульпы зуба в процессе транспортировки удаленного зуба, имеющего пульпу, содержащую клетки пульпы зуба.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Использование выделенных клеток в регенеративной медицине, в области которой давно применяется переливание крови, для регенерации тканей и органов, утраченных, например, в результате повреждения, заболевания и несчастного случая, активно исследуется и развивается. Специфический процесс, используемый с недавнего времени в регенеративной медицине, представляет собой процесс, который включает забор недифференцированных клеток, т.е., стволовых клеток, их культивирование вне организма или, при возможности, их дифференцировку и последующую трансплантацию в поврежденную область для обеспечения регенерации. В качестве стволовых клеток, используемых в настоящей заявке, могут быть приведены эмбриональные стволовые клетки (ES-клетки) и соматические стволовые клетки.
Эмбриональные стволовые клетки представляют собой клетки, полученные из эмбриона, которые имеют высокий пролиферативный потенциал и обладают плюрипотентностью. Однако с точки зрения их применения в регенеративной медицине остается этическая проблема использования оплодотворенной яйцеклетки и проблема отторжения в результате трансплантации.
Соматические стволовые клетки, напротив, имеют ограниченную способность к дифференцировке по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками; но благодаря их присутствию в относительно недифференцированном состоянии в различных тканях живого организма можно выделять, культивировать и применять в терапевтических целях аутологичные клетки. Соответственно, при применении соматических стволовых клеток отсутствует этическая проблема и проблема отторжения, указанные для эмбриональных стволовых клеток. По этой причине практическое применение соматических стволовых клеток в регенеративной медицине имело большее развитие.
На сегодняшний день установлено, что соматические стволовые клетки присутствуют во многих тканях, таких как костный мозг, мышцы, нервы, печень, поджелудочная железа и тонкая кишка. Среди них в настоящее время наиболее перспективными для применения в регенеративной медицине являются мезенхимальные стволовые клетки, которые способны дифференцироваться в мезенхимальные ткани (кожу, кость, хрящ, зуб, нервы, кровеносные сосуды, миокард и т.д.), из-за их доступности. Среди тканей, содержащих мезенхимальные стволовые клетки, известны не только костный мозг, но также пульпа зуба, жировая ткань и пуповинная кровь. Однако при заборе стволовых клеток из тканей субъект иногда подвергается риску, такому как боль. Например, при заборе стволовых клеток из костного мозга требуется операция по забору костного мозга, включающая пункцию костного мозга; тогда как получение стволовых клеток из жировой ткани включает липосакцию. При заборе пуповинной крови субъект крайне редко ощущает боль; однако для проведения указанной процедуры требуется учреждение, имеющее оборудование, удовлетворяющее строгим условиям забора. Кроме того, возможность забора пуповинной крови ограничена моментом рождения.
В связи с указанными обстоятельствами было предложено использовать стволовые клетки пульпы зуба, так как указанные риски при их заборе крайне малы по сравнению с рисками для описанных выше тканей (Патентная литература 1 и 2). Более конкретно, клетки пульпы зуба, содержащие стволовые клетки пульпы зуба, легко получать, так как они могут быть выделены из удаленных зубов, таких как зуб мудрости и молочный зуб, которые рассматриваются как медицинские отходы в стандартных стоматологических медицинских учреждениях, и методы их культивирования и консервации являются общепризнанным. Также с этой точки зрения предполагается, что стволовые клетки пульпы зуба могут иметь высокую практическую применимость.
ДОКУМЕНТЫ СОГЛАСНО ПРЕДШЕСТВУЮЩЕМУ УРОВНЮ ТЕХНИКИ
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
Патентная литература 1: Японский патент №4125241
Патентная литература 2: Публикация нерассмотренной заявки на японский патент №2004-201612
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМА, РЕШАЕМАЯ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В то же время стволовые клетки, выделенные и культивируемые для применения в регенеративной медицине, в целом должны храниться в замороженном состоянии до момента их фактического применения в терапевтическом лечении. Однако хранение физическими лицами стволовых клеток в оптимальных условиях в течение длительного времени абсолютно невозможно. В настоящее время обработка для культивирования/консервации и консервация выделенных стволовых клеток в большинстве случаев проводится в учреждениях, имеющих подходящий пункт хранения клеток. Таким образом, очевидно, что стволовые клетки пульпы зуба должны храниться в живом состоянии в течение периода времени с момента удаления зуба в любом стоматологическом учреждении до момента обработки клеток для их культивирования/консервации, осуществляемой в пункте хранения клеток, к которому удаленный зуб транспортируется от указанного учреждения.
Однако для возможности уверенного использования стволовых клеток пульпы зуба, которые могут быть выделены только в крайне малом количестве из удаленного зуба, не существует известного способа транспортировки стволовых клеток пульпы зуба к пункту хранения клеток при сохранении высокого пролиферативного потенциала, соответствующего потенциалу клеток в живом организме. Следовательно, существует вероятность повреждения функции стволовых клеток к моменту обработки указанных клеток для их выделения/консервации в указанном пункте. Более конкретно, в системе, описанной выше, из-за необходимости получения и транспортировки, время с момента удаления зуба до момента выделения, культивирования и применения консервирующей обработки для клеток пульпы зуба составляет примерно от 24 до 48 часов. Однако трудно сохранять интактными клетки пульпы удаленного зуба через такое длительного время после удаления. В частности, в случае постоянного зуба, даже если указанный зуб помещается в консервирующий раствор и транспортируется, указанный консервирующий раствор окружает дентин и не проникает достаточным образом в пульпу зуба, в результате чего клетки пульпы зуба могут сохраняться только в течение чрезвычайно короткого времени. Затем было предложено предварительно выделять из удаленного зуба пульпу, содержащую клетки пульпы зуба, погружать в консервирующий раствор и затем транспортировать; однако обработка пульпы зуба, которая имеется в малом количестве и которую сложно обрабатывать, с получением пульпы стандартного качества является фактически невозможной в стоматологических медицинских учреждениях, которые отличаются по техническому уровню и оборудованию.
Настоящее изобретение было создано в связи с указанными проблемами и относится к обеспечению способа транспортировки удаленного зуба для культивирования и консервации клеток пульпы зуба без нарушения функции, присущей клеткам пульпы зуба в живом организме.
ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
Заявителями настоящего изобретения было проведено тщательное исследование для достижения указанной цели. В результате было обнаружено, что удаленные зубы, содержащие пульпу, можно транспортировать при сохранении нормальной функции стволовых клеток пульпы зуба, необходимых для использования в регенеративной медицине, путем применения специфической обработки для обнажения пульпы удаленного зуба, помещения зуба в условия для консервации и его транспортировки. Настоящее изобретение было выполнено на основании указанного открытия.
Таким образом, способ транспортировки удаленного зуба для культивирования и консервации клеток пульпы зуба согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что включает:
нанесение прямолинейных рисок на поверхность удаленного зуба,
раскол удаленного зуба по риске для обнажения пульпы зуба, и
замачивание удаленного зуба в среде и транспортировку при поддержании удаленного зуба при подходящей для консервации клеток температуре.
Также, согласно способу, является предпочтительным нанесение
прямолинейной риски по продольной линии от коронки до корня удаленного зуба и от боковой поверхности к центру удаленного зуба.
Также, согласно способу, является предпочтительным нанесение прямолинейной риски по линии раскола на окклюзионной поверхности коронки удаленного зуба от верхней поверхности удаленного зуба к центру.
Также, согласно способу, время, необходимое для транспортировки, предпочтительно находится в пределах 48 часов.
Также, согласно способу, является предпочтительным, что удаленный зуб представляет собой постоянный зуб, который является непрорезавшимся зубом, лишним зубом или подлежащим удалению зубом, пульпа которого не подвергалась лечению.
Также, согласно способу, прямолинейная риска предпочтительно имеет длину от 5 до 10 мм, ширину от 0,5 до 1,5 мм и глубину от 2 до 4 мм.
Кроме того, способ транспортировки удаленного зуба для культивирования и консервации клеток пульпы зуба согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что включает:
замачивание в среде удаленного молочного зуба, при условии наличия у сменяющего его постоянного зуба по меньшей мере 2/3 сформированного корня и
транспортировку при поддержании зуба при подходящей для консервации клеток температуре.
Также, согласно способу, время, требуемое для транспортировки, предпочтительно находится в пределах 48 часов.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению, удаленный зуб, имеющий пульпу, содержащую стволовые клетки пульпы зуба, может сохраняться без нарушения функции, присущей клеткам в живом организме, в течение от 24 до 48 часов, необходимых для транспортировки к пункту хранения клеток и т.д. Благодаря этому стволовые клетки пульпы зуба могут подвергаться обработке для культивирования/консервации при сохранении их в состоянии, близком к состоянию in-vivo, даже после удаления зуба. Таким образом, стволовые клетки пульпы зуба, выделенные в крайне малом количестве из удаленного зуба, могут эффективно использоваться в регенеративной медицине.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 показаны кривые пролиферации клеток пульпы молочного зуба (А) и постоянного зуба (В) согласно способу настоящего изобретения.
На Фигуре 2 показаны фотографии клеток пульпы молочного зуба (А), окрашенных на ALP, и клеток пульпы постоянного зуба (В), окрашенных на ALP, в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.
На Фигуре 3 показаны фотографии клеток пульпы молочного зуба (А), окрашенных SA-β-gal, и клеток пульпы постоянного зуба (В), окрашенных SA-β-gal.
На Фигуре 4 показана фотография хромосом клетки пульпы зуба, культивируемой в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.
На Фигуре 5 показана фотография хромосом клетки пульпы зуба, культивируемой в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.
ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В случае модели, в которой, например, клетки пульпы, которые присутствуют в пульпе, полученной из зубов, удаленных в частных стоматологических медицинских учреждениях, и содержащей стволовые клетки пульпы зуба, подвергаются обработке для культивирования/консервации в пункте хранения клеток и применяются в регенеративной медицине по мере необходимости, согласно настоящему изобретению предложен способ транспортировки, обеспечивающий сохранение количества жизнеспособных клеток в пульпе зуба и сохранение их функции в течение периода транспортировки от стоматологических медицинских учреждений к пункту хранения клеток. Поскольку в любом случае культивируется и консервируется малое количество клеток пульпы зуба, настоящее изобретение может с легкостью осуществляться в любом стоматологическом медицинском учреждении, независимо от имеющегося технического уровня и оборудования, и может приводить к стабильному эффекту сохранения клеток.
Необходимо отметить, что способ согласно настоящему изобретению очевидно может применяться для транспортировки клеток по пути, отличному от пути от стоматологического медицинского учреждения до пункта хранения клеток.
Далее следует описание предпочтительного варианта реализации способа согласно настоящему изобретению.
Удаленный зуб, используемый согласно настоящему изобретению, может представлять собой молочный зуб или постоянный зуб, при условии что указанный зуб содержит пульпу. Обычно используются зубы, удаленные в стоматологических медицинских учреждениях в ходе стоматологических процедур. Кроме того, может использоваться зуб, выпавший естественным путем, при условии что состояние указанного зуба соответствует описанным далее условиям и может быть сразу подвержен обработке, описанной далее для удаленного зуба.
Примеры удаленных зубов, подходящих, в частности, для использования стволовых клеток пульпы зуба, включают зубы, соответствующие следующим условиям.
В качестве молочного зуба может использоваться как не подвергавшийся лечению зуб, так и восстановленный зуб; однако зуб, пульпа которого подвергалась лечению с помощью пульпотомии, экстрипации пульпы и т.д., не является предпочтительным.
Более того, в случае шатающегося молочного зуба, подходящим является зуб, не имеющий кариеса, при условии наличия у сменяющего его постоянного зуба по меньшей мере 2/3 сформированного корня. Зуб, имеющий кариес и прикорневой периодонтит (Per) и т.д., не является предпочтительным из-за невозможности забора нормальной пульпы зуба.
Более того, в случае шатающегося молочного зуба, также является предпочтительным зуб, не имеющий кариеса, при условии наличия у сменяющего его постоянного зуба по меньшей мере 2/3 сформированного корня. Однако зуб может подходить для применения, даже если указанный зуб имеет кариес, при условии что стадия развития кариеса соответствует стадии С1 (кариес эмали) или С2 (кариес дентина), и при условии подтвержденного наличия по меньшей мере 2/3 сформированного корня у сменяющего его постоянного зуба. Напротив, зуб, имеющий воспаление пульпы, вызванное кариесом дентина, не является предпочтительным.
В качестве постоянного зуба предпочтительным является зуб, который может быть удален как непрорезавшийся зуб, представляющий собой так называемый зуб мудрости, лишний зуб или подлежащий удалению зуб; однако, как и в случае молочного зуба, зуб, пульпа которого подвергалась лечению и пульпа которого подвержена заболеванию, не является предпочтительным.
Даже если зуб поцарапан и частично утрачен в ходе процедуры удаления зуба, указанный зуб может легко применяться, при условии что указанные повреждения ограничены зубной эмалью и дентином и не влияют на процесс обработки удаленного зуба, которая описана далее.
Далее следует более конкретное описание обработки удаленного зуба.
При необходимости поверхность удаленного зуба очищается и стерилизуется и на его поверхность наносится прямолинейная риска. Так как риска используется в качестве направляющей для раскола зуба в следующем этапе, указанная риска должна наноситься в таком положении и направлении, чтобы пульпа, находящаяся в центре зуба, обнажалась в результате раскола зуба по риске.
При условии обнажения пульпы в результате раскола зуба, риска может наноситься в любом положении и направлении; однако примеры включают следующий вариант реализации изобретения.
(Пример 1)
Вдоль продольной линии от коронки к корню удаленного зуба наносится риска от боковой поверхности к центру удаленного зуба. Положение продольной линии на боковой поверхности удаленного зуба не ограничено особым образом, при условии что риска вдоль продольной линии вырезается в направлении центра удаленного зуба.
(Пример 2)
Риска наносится от верхней поверхности к центру удаленного зуба вдоль линии раскола на окклюзионной поверхности коронки удаленного зуба. При этом линия раскола, служащая в качестве риски, предпочтительно проходит через область центра окклюзионной поверхности; однако, при условии что риска наносится в направлении центра удаленного зуба, линия разлома может вырезаться в любом положении.
Желательно наносится максимально длинная и глубокая по возможности риска. Длина и ширина риски могут быть такими, что при использовании указанной риски в качестве направляющей можно расколоть зуб. Предпочтительно соответствующим образом подбираются длина и ширина, находящиеся в диапазоне от 5 до 10 мм и от 0,5 до 1,5 мм, соответственно, в зависимости от размера удаленного зуба и места, на которое наносится риска. Кроме того, риска наносится на глубину, приблизительно соответствующую расстоянию от зубной эмали до дентина, предпочтительно глубина в направлении к центру зуба составляет от 2 до 4 мм. Если риска слишком глубокая, клетки пульпы зуба могут разрушаться. Следует соблюдать осторожность.
Необходимо отметить, что риска может наноситься, например, с помощью алмазного резца с использованием воды.
В соответствии со способом согласно настоящему изобретению, после нанесения риски на удаленный зуб, как описано выше, указанный зуб раскалывается по указанной риске. При условии что риска наносится соответствующим образом по направлению к центру зуба, в котором находится пульпа, удаленный зуб может быть расколот на две половинки по указанной риске. Более конкретно, путем предварительного нанесения соответствующей риски на этапе, указанном выше, твердый зуб может быть с легкостью расколот независимо от имеющегося технического уровня и оборудования.
Способы раскола удаленного зуба не ограничены особым образом; однако обычно зуб раскалывают на две части путем помещения в риску зубного элеватора и т.д. и разъема по линии риски. При невозможности осуществления указанного способа в риску можно помещать долото с квадратным сечением и т.д. и ударять с помощью деревянного молотка и т.д. для раскола зуба на две части.
Когда удаленный зуб раскалывается соответствующим образом по предварительно нанесенной риске, обнажается пульпа, находящаяся в центральной части зуба. При этом предпочтительно не прикасаться инструментом и т.д. к указанной пульпе зуба, обнаженной таким образом.
Более того, количество расколов зуба не ограничено; однако предполагается, что раскол на две части является достаточным для обнажения пульпы зуба. Однако если пульпа зуба не обнажается достаточным образом в результате одного раскола, процесс повторяется, при необходимости, от этапа формирования риски.
Расколотый удаленный зуб замачивается в среде или консервирующем растворе для клеток и поддерживается при подходящей для консервации клеток температуре. При транспортировке удаленного зуба в указанном состоянии клетки пульпы зуба, находящиеся в пульпе удаленного зуба и содержащие стволовые клетки пульпы зуба, могут практически полностью сохранять функции (физиологические активности), исходно присущие клеткам пульпы зуба, и поддерживать количество жизнеспособных клеток в течение периода в пределах 48 часов. Низкая температура, подходящая для консервации клеток, относится к температуре, при которой клетки могут храниться в живом состоянии при подавлении метаболической активности. Температура в целом составляет от 4 до 8°С и предпочтительно составляет 4°С.
Используемая среда или консервирующий раствор могут представлять собой среду или консервирующий раствор, которые в целом используются для культивирования и консервации клеток. Использование среды α-МЕМ (20% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), 100 мкМ L (+)-аскорбиновая кислота, пенициллин (50 ед/мл)/стрептомицин (50 мкг/мл)) является особо предпочтительным.
Указанную среду или консервирующий раствор помещают, например, в культуральную пробирку с присоединенной крышкой. В указанную пробирку погружают расколотый удаленный зуб, содержащий обнаженную пульпу, завинчивают крышку и затем указанную пробирку предпочтительно транспортируют при поддержании подходящей для консервации клеток температуры (например, 4°С).
Необходимо отметить, что когда удаленный зуб представляет собой молочный зуб, корневая часть которого рассосалась, среда и консервирующий раствор с легкостью проникают в пульпу зуба. Таким образом, в случае молочного зуба, этап нанесения риски на зуб и этап раскола зуба могут быть пропущены. Удаленный молочный зуб может транспортироваться только при помещении его в клеточную среду или консервирующий раствор, как описано выше, при поддержании низкой температуры. Также в указанном случае клетки пульпы зуба могут сохраняться почти в неизменном состоянии в течение от 24 до 48 часов.
Очевидно, что способ нанесения риски и раскола зуба, описанный для постоянного зуба, может применяться для молочного зуба.
Клетки пульпы зуба (пульпа), содержащей стволовые клетки пульпы удаленного зуба, которые транспортируются в соответствии со способом, описанным выше, предпочтительно выделяются из удаленного зуба при подходящих условиях в пункте хранения клеток и подвергаются обработке для культивирования/консервации, проводимой в соответствии с известным способом обработки клеток, и консервируются на длительное время. Консервированные клетки пульпы зуба могут отбираться по мере необходимости и использоваться в регенеративной медицине и т.д. Альтернативно, консервированные клетки пульпы зуба могут подвергаться превращению в ИПК (индуцированные плюрипотентные клетки) и использоваться для терапевтического лечения и научного исследования.
ПРИМЕРЫ
Далее следует описание примеров настоящего изобретения; однако настоящее изобретение не ограничивается указанными примерами.
Сначала предложено описание примера транспортировки (консервации) удаленного зуба (молочного зуба/постоянного зуба) с помощью способа согласно настоящему изобретению.
<Пример транспортировки (консервации)>
Молочный зуб
Шатающийся молочный зуб, не имеющий кариеса, при условии наличия у сменяющего его постоянного зуба по меньшей мере 2/3 сформированного корня, или не шатающийся молочный зуб, имеющий зубной кариес, ограниченный кариесом эмали или кариесом дентина, при условии наличия у сменяющего его постоянного зуба по меньшей мере 2/3 сформированного корня, удаляли в ходе стоматологической процедуры, помещали в стерильную пробирку, наполненную средой α-МЕМ, охлаждали при низкой температуре (4°С) и хранили в течение 24 часов, включая время транспортировки.
Постоянный зуб
Непрорезавшийся зуб, лишний зуб или подлежащий удалению зуб, который не имеет зубного кариеса и пульпа которого не подвергалась лечению, удаляли в ходе стоматологической процедуры. После удаления зуба наносили риску в средней части боковой поверхности зуба от вершины коронки к окончанию корня алмазным резцом. Глубина указанной риски соответствовала расстоянию до дентина.
После этого зубной элеватор перемещали вдоль риски для продольного раскола зуба на две части для обнажения пульпы зуба. Расколотый зуб помещали в стерильную пробирку, заполненную средой α-МЕМ, охлаждали при низкой температуре (4°С) и хранили в течение 24 часов, включая время транспортировки.
После завершения процесса, описанного в примере транспортировки (консервации), клетки пульпы зуба молочного зуба и постоянного зуба культивировали и консервировали в ходе следующей процедуры и исследовали на предмет сохранения функции.
<Способ культивирования>
1. Забор пульпы зуба
После завершения процесса, описанного в примере транспортировки (консервации), удаленный зуб (24 часа после удаления зуба) помещали в стерильную чашку Петри и фотографировали. После этого пульпу зуба отбирали с использованием пинцета и сверла. Зуб, из которого была отобрана пульпа, фотографировали и фиксировали формалином.
Пульпу зуба восстанавливали и центрифугировали при 100×g и 4°С в течение 20 секунд. После этого супернатант удаляли и добавляли 10 мл ФСБ для промывки. Полученный раствор снова центрифугировали. Описанный этап промывки повторяли три раза.
Супернатант удаляли и добавляли 2 мл среды для ферментативного расщепления. Обработку осуществляли при 37°С в течение 1 часа (перемешивали раз в 30 минут). Полученный раствор центрифугировали при 2000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут.
Супернатант удаляли и добавляли 5 мл среды α-МЕМ. Полученный раствор центрифугировали при 2000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут. После этого супернатант удаляли и добавляли 5 мл среды α-МЕМ. Подсчитывали количество клеток и полученные клетки пульпы зуба рассевали на флакон Т-25.
Необходимо отметить, что среда для ферментативного расщепления представляла собой смешанный раствор 7,5 мл среды α-МЕМ (смешанный раствор α-МЕМ: 395 мл, ЭБС: 100 мл, 200 мМ аскорбиновой кислоты: 250 мкл, пенициллин/стрептомицин: 5 мл), 2,5 мл диспазы II (2,4 ед/мл, производство F. Hoffmann-La Roche Ltd.) и 30 мг коллагеназы (производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
2. Культивирование клеток пульпы зуба
После завершения описанного этапа среду заменяли на свежую среду каждые два дня. При достижении клетками субконфлюентного состояния проводили очередную процедуру пересева.
Кроме того, клетки фотографировали через один день после рассева и до момента их пересева.
3. Пересев
Культивируемые клетки промывали два раза ФСБ (-) и затем добавляли 1 мл раствора 0,05% трипсин/ЭДТА. Клетки снова промывали и инкубировали при 37°С в течение 5 минут.
После этого клетки суспендировали путем добавления 5 мл свежей среды α-МЕМ и центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут. Супернатант удаляли и клетки суспендировали в свежей среде, рассевали на чашку диаметром 10 см и культивировали (2-ой пассаж).
Необходимо отметить, что клетки после 2-го пассажа культивировали в течение 3 дней, или более. 10 мл полученной в результате среды отбирали и хранили при -20°C. Указанную среду использовали в качестве образца для определения вирусов.
Процесс, описанный выше, повторяли и получали подобным образом клетки на 3-м -10-м пассаже.
4. Приготовление исходного раствора
Исходный раствор каждой генерации клеток после пересевов получали следующим образом.
6
После процедуры пересева подсчитывали количество клеток и центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут. После этого удаляли супернатант, добавляли такое количество среды Cell Banker II, чтобы количество клеток составляло 1×10 клеток на мл, или более, на ампулу, и клетки суспендировали. Полученную суспензию аликвотировали по 1 мл на ампулу и ампулы помещали в сосуд для заморозки биологического материала и оставляли при -80°С в течение 2 дней и затем переносили в жидкий азот.
Клетки пульпы зуба на 3-м, 7-м, 10-м пассаже, культивируемые с помощью указанного выше способа, анализировали с помощью следующего способа.
<Получение кривой пролиферации>
Клетки, культивируемые на чашке, промывали дважды ФСБ (-). Затем добавляли 1 мл раствора 0,05% трипсин/10 мМ ЭДТА для промывки клеток. После этого клетки инкубировали при 37°С в течение 5 минут. После подтверждения удаления клеток с чашки добавляли среду для суспендирования клеток. Суспензию клеток центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут. После удаления супернатанта снова добавляли среду для суспендирования клеток. Суспензию центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут.
После этого клетки суспендировали в свежей среде и подсчитывали количество клеток.
5
5,4×10 клеток суспендировали В 9,5 мл среды и рассевали в 12 лунок 24-луночного планшета в плотности 500 мкл/лунку. После этого в каждую лунку добавляли по 500 мкл среды с получением конечного объема 1 мл/лунку.
2
Указанные клетки культивировали при 37°С в инкубаторе (5% CO) и подсчитывали количество клеток одновременно в 2 лунках каждые 24 часа. Для получения кривой пролиферации, показанной на Фигуре 1, подсчет проводили до тех пор, пока кривая клеточной пролиферации не выходила на плато.
На Фигуре 1 показаны кривые пролиферации клеток пульпы молочного зуба (А) и постоянного зуба (В). Как молочный зуб, так и постоянный зуб, получали в соответствии с Примером транспортировки (консервации). Клетки пульпы зуба культивировали в соответствии со способом культивирования.
Как показано на Фигуре 1, клетки пульпы как постоянного, так и молочного зуба, используемых в настоящей заявке, имели практически одинаковый пролиферативный потенциал до 10 пассажа. Не наблюдалось нарушений по сравнению с кривой пролиферации обычных клеток пульпы зуба (культивируемых сразу после удаления зуба).
Необходимо отметить, что такому же анализу подвергали клетки удаленного зуба, который просто погружали в консервирующий раствор после его удаления вместо использования способа транспортировки согласно настоящему изобретению, которые культивировали, как описано выше, в пределах 24 часов. В результате, в случае постоянного зуба, наблюдали значительное снижение пролиферативного потенциала. Наблюдалось снижение в значительной степени по мере повышения количества генераций после пересевов.
Таким образом, благодаря настоящему изобретению возможна транспортировка удаленного зуба при сохранении пролиферативного потенциала клеток пульпы зуба, содержащей стволовые клетки.
<Окрашивание на щелочную фосфатазу (ALP)>
Клетки, культивируемые на чашке, промывали дважды ФСБ (-) и затем добавляли 1 мл раствора 0,05% трипсин/10 мМ ЭДТА для промывки. После этого клетки инкубировали при 37°С в течение 5 минут. После подтверждения удаления клеток с чашек к клеткам добавляли среду для суспендирования. Суспензию клеток центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут. После удаления супернатанта снова добавляли среду для суспендирования клеток. Суспензию центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут.
5
После этого подсчитывали количество клеток, клетки рассевали на 6-луночный планшет в плотности 1×10 клеток на лунку и культивировали в течение ночи.
После культивирования клетки промывали один раз ФСБ, фиксировали 2 мл 4% параформальдегида (ПФА) в течение 3 минут и промывали два раза ФСБ. После этого добавляли 1 мл буфера для выявления (смесь 1 М трис-HCl (рН 9,5): 50 мл, 3 М NaCl: 16,67 мл, 1 М MgCl: 25 мл, В, W: 408,33 мл) и оставляли на 2 минуты.
Буфер для выявления удаляли и добавляли 500 мкл красящего раствора (красящий раствор: 5 мл, нитросиний тетразолий (НСТ): 16,5 мкл, 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (БХИФ): 16 мкл). Клетки закрывали от света и оставляли на 2 часа, затем клетки в лунках промывали дистиллированной водой в течение 5 минут.
В каждую лунку добавляли по 700 мкл 4% ПФА/ФСБ. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого удаляли 4% ПФА/ФСБ и клетки промывали три раза ФСБ (-).
Затем в каждую лунку добавляли по три капли среды для заключения IMMU-MOUNT и покрывали покровным стеклом. Планшет хранили при комнатной температуре.
На Фигуре 2 показаны фотографии клеток пульпы молочного зуба (А), окрашенных на ALP, и клеток пульпы постоянного зуба (В), окрашенных на ALP. Как молочный, так и постоянный зуб, были получены в соответствии с Примером транспортировки (консервации). Клетки пульпы зуба культивировали согласно способу культивирования.
Щелочную фосфатазу (ALP) использовали в качестве маркера остеобластов, при этом клетки, формирующие кость (ALP-положительные клетки), как известно, окрашиваются в темно-красный цвет.
Как показано на Фигуре 2, среди клеток пульпы как постоянного, так и молочного зуба, используемых в настоящей заявке, наблюдали ALP-положительные клетки. Наблюдали, что количество ALP-положительных клеток снижалось по мере повышения количества генераций после пересевов; однако общее число клеток само по себе повышалось при пересеве. Полученные данные дают основание полагать, что указанные клетки пульпы зуба могут достаточно эффективно применяться при ортопедических нарушениях (например, для восстановления сломанной кости). Более того, результаты были эквивалентны результатам отдельно проведенного культивирования обычных клеток пульпы зуба (культивируемых сразу после удаления зуба).
Необходимо отметить, что такому же анализу подвергали клетки удаленного зуба, который просто погружали в консервирующий раствор после его удаления вместо использования способа транспортировки согласно настоящему изобретению, которые культивировали, как описано выше, в пределах 24 часов. В результате, в случае постоянного зуба, наблюдалось крайне малое количество ALP-положительных клеток и общее количество клеток по сравнению клетками, представленными на Фигуре 2(B).
Таким образом, благодаря настоящему изобретению возможна транспортировка удаленного зуба при сохранении остеогенного регенераторного потенциала клеток пульпы зуба, содержащих стволовые клетки.
<Оценка старения клеток (окраска SA-β-gal)>
Клетки, культивируемые на чашке, промывали дважды ФСБ (-) и затем добавляли 1 мл раствора 0,05% 10 мМ трипсин/ЭДТА для промывки. После этого клетки инкубировали при 37°С в течение 5 минут. После подтверждения удаления клеток с чашки добавляли среду для суспендирования клеток. Суспензию клеток центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут. После удаления супернатанта снова добавляли среду для суспендирования клеток. Полученную суспензию центрифугировали при 1000 об./мин. (4°С) в течение 5 минут.
5
2
После этого клетки суспендировали в свежей среде и подсчитывали количество клеток. Клетки рассевали в 6-луночные планшеты в плотности 1×10клеток на лунку и инкубировали при 37°С и 5%CO в течение 24 часов.
Среду удаляли и клетки промывали ФСБ (-). В каждую лунку добавляли по 700 мкл 4% ПФА/ФСБ и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого удаляли 4% ПФА/ФСБ и клетки промывали три раза ФСБ (-).
В каждую лунку добавляли по 700 мкл раствора связанной со старением β-галактозидазы (SA-β-gal) и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. Окрашенные клетки анализировали с помощью микроскопа и фотографировали.
Раствор SA-β-gal удаляли и клетки промывали дважды ФСБ (-), затем в каждую лунку добавляли по 700 мкл 4% ПФА/ФСБ и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого удаляли 4% ПФА/ФСБ и клетки промывали три раза ФСБ (-).
Затем в каждую лунку добавляли по три капли IMMU-MOUNT. Покрывали покровным стеклом и планшет хранили при комнатной температуре.
На Фигуре 3 представлена фотография клеток пульпы молочного зуба (А), окрашенных SA-β-gal, и клеток пульпы постоянного зуба (В), окрашенных SA-β-gal. Как молочный, так и постоянный зуб, получали в соответствии с Примером транспортировки (консервации). Клетки пульпы зуба культивировали в соответствии со способом культивирования.
SA-β-gal используется в качестве маркера старения клеток, и старые клетки, не способные больше проходить клеточное деление, как известно, окрашиваются в синий цвет (SA-β-gal-положительные клетки).
Как показано на Фигуре 3, SA-β-gal-положительные клетки не наблюдали в клетках пульпы как постоянного, так и молочного зуба, используемых в настоящей заявке. Результаты были одинаковыми даже при увеличении количества генераций после пересевов. Полученные результаты дают основание полагать, что указанные клетки пульпы зуба могут стабильно пересеваться с меньшим изменением пролиферативного потенциала и, таким образом, применяться с достаточной эффективностью. Более того, результаты были эквивалентны результатам отдельно проведенного культивирования обычных клеток пульпы зуба (культивируемых сразу после удаления зуба).
Необходимо отметить, что такому же анализу подвергали клетки удаленного зуба, который просто погружали в консервирующий раствор после его удаления вместо использования способа транспортировки согласно настоящему изобретению, которые культивировали, как описано выше, в пределах 24 часов. В результате, в случае постоянного зуба, наблюдали SA-β-gal - положительные клетки.
Таким образом, благодаря настоящему изобретению возможна транспортировка удаленного зуба при сохранении высокого пролиферативного потенциала клеток пульпы зуба, содержащих стволовые клетки.
<Хромосомный анализ>
Образцы клеток пульпы зуба человека, которая была выделена, соответственно, из постоянного зуба женщины и молочного зуба мужчины, полученных согласно Примеру транспортировки (консервации), культивировали в соответствии со способом культивирования и анализировали число хромосом. Из каждого образца отбирали пятьдесят культивируемых клеток и анализировали число хромосом. Результаты показаны в Таблице 1 и Таблице 2. Более конкретно, использовали следующий далее способ анализа.
Из клеток пульпы зуба, прошедших 10 пассажей, готовили препарат хромосом и окрашивали красителем Гимза для определения числа хромосом. После этого проводили дифференциальное окрашивание препарата в соответствии с окраской красителем Хинакрин-Хехст. Для анализа кариотипа хромосомы классифицировали на основе стандартного кариотипа.
Таблица 1
Число хромосом
≤
44
45
46
47
48
≤
Общее
Количество клеток
0
4
45
0
1
50
Таблица 2
Число хромосом
≤
44
45
46
47
48
≤
Общее
Количество клеток
2
3
45
0
0
50
На Фигуре 4 показан типичный пример (число хромосом: 46) из Таблицы 1, и на Фигуре 5 показан типичный пример (число хромосом: 46) из Таблицы 2.
Десять клеток из Таблицы 1, имеющих 46 хромосом, анализировали с помощью метода Q-дифференциального окрашивания. В результате было обнаружено, что все хромосомы принадлежали к типу XX, как показано на Фигуре 4. Кроме того, клетки из Таблицы 2, имеющие число 46 хромосом, анализировали таким же образом. В результате было обнаружено, что все хромосомы принадлежали к типу XY, как показано на Фигуре 5.
Как показано в Таблицах 1, 2 и на Фигурах 4, 5, анализированные клетки пульпы зуба человека имели нормальное число хромосом, составляющее 46 почти во всех указанных клетках.
Таким образом, очевидно, что способ транспортировки согласно настоящему изобретению не приводит к изменению числа хромосом клеток пульпы зуба.