СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА, АССОЦИИРОВАННОГО С ВИРУСОМ ГЕРПЕСА ЧЕЛОВЕКА 6 ТИПА
METHOD FOR IDENTIFYING INFECTIOUS MONONUCLEOSIS ASSOCIATED WITH TYPE 6 HUMAN HERPES VIRUS

Изобретение относится к идентификации биомаркеров инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с вирусом герпеса человека 6 типа, и может быть использовано для изучения молекулярных механизмов патогенеза, а также для клинической диагностики и мониторинга заболевания.
Инфекционный мононуклеоз (ИМ) - это антропонозная вирусная инфекция с воздушно-капельным механизмом передачи возбудителя, характеризующаяся лихорадкой, интоксикацией, генерализованной лимфаденопатией, увеличением печени и селезенки [Поляков В.Е., Лялина B. Н., Воробьева М.Л. и др. Инфекционный мононуклеоз (болезнь Филатова) у детей и подростков // Эпидемиол. и инфекционные болезни. - 1998. - №6. - C. 50-55]. Вирус герпеса человека типа 6 (Humanbetaherpesvirus 6, ВГЧ6) как этиологический агент ИМ диагностируют в 6-22% случаев [Никольский М.А. Клинические варианты первичной инфекции, вызванной вирусами герпеса человека 6-го и 7-го типов у детей раннего возраста// Педиатрия. -2008. - Т. 87, №4. - С. 52-55]. При этом инфицирование ВГЧ6 происходит в раннем возрасте, и носителями вируса являются от 80 до 100% популяции [Balachandra K., Aguthaya P.I., Auwanit W. et al Prevalence of antibody to human, herpesvirus 6 in women and children // Microbiol, and Immunol. - 1989. Vol. 33. - P. 515-518; Мельниченко A.B. Разработка и получение диагностических тест-систем к вирусу герпеса человека 6 типа и их применение для изучения HHV-6 инфекции: автореф: дис. канд. мед. наук. -М, 2002. - 27 с.].
+
+
ВГЧ6 является представителем семейства Herpesviridae. Он инфицирует преимущественно CD4 Т-лимфоциты и угнетает их функцию, а также поражает клетки моноцитарно-макрофагальной системы, ограниченно реплицируется в CD8 Т-клетках, В-лимфоцитах, НК-клетках и макрофагах [Новосад Е.В. и др. Инфекционный мононуклеоз, ассоциированный с вирусом герпеса 6 типа// Детские инфекции. - 2008. -Т. 7, №1. - С. 36-38.]. Как и другие представители семейства, ВГЧ6 активно персистирует в пораженных клетках и формирует в организме латентную инфекцию. Персистенция представляет собой непрерывное цикличное размножение вирусов в инфицированных клетках, латенция - пожизненное сохранение вирусов в скрытой форме [Каражас Н.В., Малышев Н.А., Рыбалкина Т.Н. и др. Герпесвирусная инфекция: Методические рекомендации. - М., 2007.]. Все вирусы семейства Herpesviridae обладают эффективными механизмами взаимодействия с иммунной системой хозяина, позволяющими им достичь максимального распространения и сохраняться в организме в течение всей жизни. На молекулярном уровне воздействие вирусов реализуется путем модуляции экспрессии генов, участвующих в активации клеток иммунной системы, их пролиферации, дифференцировке и апоптозе. Отдельные гены, контролирующие указанные процессы, могут служить маркерами инфекции.
Задачей изобретения является набор биомаркеров, включающий те из них, которые дифференциально экспрессируются у больных ВГЧ6-ассоциированным инфекционным мононуклеозом.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в расширении возможностей изучения молекулярных механизмов патогенеза и иммуногенеза ВГЧб-ассоциированного инфекционного мононуклеоза, использовании для создания таргетных лекарственных препаратов, эффективной клинической диагностике и мониторинге заболевания.
Поставленная задача решается набором генов и транскриптов, регулирующих активацию транскрипции и подавление апоптоза иммунокомпетентных клеток, выявленных в лейкоцитах периферической крови: мРНК AVEN, транскрипт 2 CHUK, транскрипт 2 CIRBP, транскрипт 2 TRAF3 и транскрипт 10 IRAK4, изменение экспрессии которых положительно коррелирует с заболеванием.
AVEN (apoptosis and caspase activation inhibitor) - белок, который ингибирует апоптоз, оказывая влияние на активность каспаз. AVEN ингибирует самосборку адаптера Apaf-1 и таким образом уменьшает Apaf-1 -опосредованную активацию инициаторной каспазы-9 [Chau B.N., Cheng E.H.Y., Kerr D.A., Hardwick J.M. AVEN, a novel inhibitor of caspase activation, binds Bcl-xL and Apaf-1 // Mol. Cell.- 2000. Vol. 631. - P. 40]. Кроме того, экспрессия гена AVEN отдельно или в комбинации с Bcl-xL увеличивает выживаемость клеток линии СНО после воздействия апоптотических стимулов [Figueroa B.Jr., Chen S., Oyler G.A. et al. AVEN and Bcl-xL enhance protection against apoptosis for mammalian cells exposed to various culture insults // Biotechnol. Bioeng. - 2004. Vol.85. - P. 589-600].
CHUK (conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase) - белок, являющийся компонентом NF-kB-ингибиторного комплекса. Белок участвует в активации NF-kB и усилении экспрессии NF-kB-регулируемых генов, которые вовлечены во множество важных клеточных процессов, включая иммунную реакцию, воспаление, смерть и пролиферацию клетки [Solt М.А., May MJ. The IkappaB kinase complex: master regulator of NF-kappa В signaling // Immunol. Res. - 2008. Vol. 42. №1-3. - P. 3-18].
CIRBP (cold-inducible RNA-binding protein) - белок, играющий важную роль в регуляции стрессового ответа клеток, выполняет проапоптотическую функцию [Liao Y., Feng J., Zhang Y. et al. The mechanism of CIRP in inhibition of keratinocytes growth arrest and apoptosis following low dose UVB radiation // Mol. Carcinog. - 2017. Vol. 56. №4. - P. 1554-1569].
TRAF3 (TNF receptor-associated factor) - белок, который участвует в модуляции активации фактора транскрипции NF-kB и преобразовании сигнала CD40, играющего важную роль в активации иммунного ответа. Установлено, что белок является компонентом сигнального комплекса LTbetaR, вызывающего как активацию NF-kB, так и апоптоз клеток, инициируемую лигированием LTbeta [Galibert L., Tometsko M.E., Anderson D.M. et al. The involvement of multiple tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated factors in the signaling mechanisms of receptor activator of NF-kappaB, a member of the TNFR superfamily // The Journal of Biological Chemistry. - 1998. Vol. 273. №51. - P. 34120-34127.; Michel M., Wilhelmi I., Schultz A.-S. et al. Activation-induced tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 (Traf3) alternative splicing controls the noncanonical nuclear factor кВ pathway and chemokine expression in human T cells // J. Biol. Chem. - 2014. Vol. 289. №19. -P. 13651-13660].
IRAK4 (interleukin-1 receptor-associated kinase 4) - цитозольная киназа, участвующая в передаче сигнала от Т-клеточного рецептора и некоторых Toll-подобных рецепторов (TLRs). Взаимодействие адапторов TLRs и киназ IRAK 1-4 приводит к активации NF-kB и МАР-киназ, основных регуляторов транскрипции костимуляторных цитокинов, обеспечивающих врожденный иммунный ответ [Medzhitov R., Preston Н.Р., Janeway С.А. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity // Nature. - 1997. Vol. 388. №6640. - P. 394-397].
Преобладающее большинство кандидатных маркеров являются сплайсированными вариантами мРНК генов. Часть транскриптов представляет собой единственный известный, либо «основной» вариант мРНК одного гена (мРНК AVEN). Как правило, функция белков, кодируемых этими транскриптами, рассматривается как свойство самого гена. Другие транскрипты кодируют структурно-функциональные формы белка, отличные от «основного» варианта, но проявляющие схожие свойства (траснкрипт 2 CHUK и транскрипт 10 IRAK4). Третью группу формируют транскрипты, продукты трансляции которых имеют функцию, отличающуюся от таковой у «основной» формы или прямо противоположную ей (транскрипт 2 ингибитора NF-kB-киназ TRAF3 индуцирует экспрессию NF-kB в активированных Т-клетках [Michel М., Wilhelmi I., Schultz A.-S. et al. activation-induced tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 (Traf3) alternative splicing controls the noncanonical nuclear factor κВ pathway and chemokine expression in human T cells // J. Biol Chem. - 2014. Vol. 289. №19. -P. 13651-13660]).
Помимо белок-кодирующих транскриптов, в набор маркеров включен некодирующий транскрипт 2 регулятора клеточного цикла и индуктора апоптоза CIRBP. Функциональное значение нетранслирующих белок транскриптов заключается в изменении соотношения кодирующих и некодирующих транскриптов, что влияет на уровень экспрессии белкового продукта целевого гена [Filatova E.N., utkin O.V. The role of noncoding mRNA isoforms in the regulation of gene expression//Russian Journal of Genetics.- 2018. 54(8): 879-887.; Filatova E.N., Utkin O.V. The role of noncoding mRNA isoforms in the regulation of gene expression// Russian Journal of Genetics.- 2018. 54(8).-P. 879-887].
Осуществление изобретения.
В изобретении представлен набор биомаркеров ВГЧ6-ассоциированного инфекционного мононуклеоза, включающий гены и транскрипты, регулирующие активацию, пролиферацию и апоптоз иммунокомпетентных клеток, выявленные в лейкоцитах периферической крови.
Сущность способа поясняется примером.
Пример. Выбор биомаркеров проводили на основе анализа транскриптома лейкоцитов периферической крови детей и подростков в возрасте 7-18 лет с подтвержденным диагнозом «ВГЧ6-ассоциированный инфекционный мононуклеоз» с помощью сплайсинг-ориентированных биочипов. В качестве группы сравнения выступали практически здоровые доноры сопоставимого пола и возраста без клинических и лабораторных признаков заболевания.
Материалом для исследования послужили образцы периферической крови, из которых была выделена лейкоцитарная фракция. Далее из лейкоцитов был получен пул тотальной РНК, которую подвергали реакции обратной транскрипции с получением кДНК. кДНК гибридизовали на ДНК-биочип собственного дизайна для получения амперометрического сигнала, который принимали за уровень экспрессии гена или транскрипта.
Селекцию дискриминирующих зондов, являющихся функциональной основой биочипа, производили с использованием алгоритма "Splice variants microarray design pipeline" [Солнцев Л.А., Старикова В.Д., Сахарнов Н.А. и др. Стратегия подбора зондов для изучения совокупности мРНК участников рецептор-опосредованного сигналинга апоптоза // Молекулярная биология. -2015. - Т. 49, №3. - С. 515-524]. Всего было выбрано 1115 зондов: 403- для оценки экспрессии генов, 712- для детекции уровней представленности индивидуальных транскриптов. Полный перечень генов и их транскриптов представлен в таблице 1. Синтез зондов на биочип осуществлялся in situ с помощью оборудования В3 Synthesizer и соответствующего комплекта реагентов в соответствии с рекомендациями производителя (CustomArray Inc., USA).
Обработку результатов гибридизации проводили с применением бинарной классификации и Т-теста с поправкой на ожидаемую долю ложных отклонений. В качестве маркеров ВГЧ6-ассоциированного инфекционного мононуклеоза рассматривали гены и транскрипты, которые обладали высокой важностью для классификации, а также характеризовались высоким, статистически значимым (q<0,05), изменением экспрессии при патологии по сравнению с нормой. Пороговое значение важности и изменения уровня экспрессии устанавливали эмпирически исходя из распределения данных. Для обоих показателей пороговое значение составило 75-ый процентиль.
Согласно описанной процедуре у пациентов с ВГЧ6-ИМ были определены молекулярные маркеры: мРНК AVEN, транскрипт 2 CHUK, транскрипт 2 CIRBP, транскрипт 2 TRAF3 и транскрипт 10 IRAKI мРНК AVEN, транскрипт 2 CHUK, транскрипт 2 CIRBP, транскрипт 2 TRAF3 и транскрипт 10 IRAK4 (таблица 2).
Как видно из таблицы 2, для ВГЧ6-ассоциированного инфекционного мононуклеоза характерна модуляция различных молекулярных механизмов активации транскрипции и подавления апоптоза в клетках, в частности повышение экспрессии активаторов NF-kB транскрипта 2 TRAF3 и транскрипта 2 CHUK, повышение экспрессии мРНК ингибитора митохондриального пути апоптоза AVEN. Повышение экспрессии некодирующего транкрипта 2 проапоптотического фактора CIRBP свидетельствует о снижении апоптотической активности в клетках. Обращает на себя внимание снижение экспрессии важного медиатора врожденного иммунного ответа транскрипта 10 IRAK4.
Таким образом, экспериментальные данные показывают, что заявлен набор биомаркеров, являющихся важными участниками патогенеза ВГЧ6-ИМ и отражающих специфические черты его молекулярных механизмов, а также иммунного ответа на инфекцию.