Фотосенсибилизатор и способ его получения
PHOTOSENSITISER AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к разработке новых противораковых препаратов.
В настоящее время производные природных хлорофиллов и их металлокомплексы с интенсивным поглощением в красной и ближней ИК-области спектра широко используются в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для диагностики и лечения злокачественных новообразований в фотодинамической терапии (ФДТ) рака, поскольку позволяют работать в «окне прозрачности ткани» в диапазоне 660 – 800 нм. Свет с подобной длиной волны проникает в ткань на глубину до 20 мм, что открывает дополнительные возможности для лечения глубокозалегающих и пигментированных опухолей [Kwiatkowski S, Knap B, Przystupski D, Saczko J, Kędzierska E, Knap-Czop K, etal. Photodynamic therapy–mechanisms, photosensitizers and combinations. Biomedicine&Pharmacotherapy 2018; 106: 1098-1107. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.07.049].
a
Выбор природных пигментов, таких, как хлорины или бактериохлорины, для создания новых ФС обусловлен рядом факторов. К ним относятся их доступность, интенсивное поглощение в длинноволновой области спектра, возможность химической модификации боковых заместителей, структурная близость к эндогенным порфиринам, что предполагает низкий уровень токсичности подобных соединений и быстрое выведение из организма [Zhang XH, Zhang LJ, Sun JJ, Yan YJ, Zhang LX, Chen N, et al. Photodynamic efficiency of a chlorophyll  derivative in vitro and in vivo. Biomedicine&Pharmacotherapy. 2016; 81:265-272. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2016.04.007].
a
Однако хлорины и бактериохлорины имеют ограниченное применение в качестве ФС из-за высокой гидрофобности, сравнительно низкой стабильности и умеренной селективности накопления в раковых клетках. Это диктует необходимость создания новых более стабильных производных хлоринов и бактериохлоринов с повышенной тропностью к опухолям [Grin MA, Mironov AF. Chemical transformations of bacteriochlorophyll  and their medical applications. Bulletin of the Academy of Sciences. Chemicalseries 2016; 2: 333-349. https://doi.org/10.1007/s11172-016-1307-1].
6
Из уровня техники известен фотосенсибилизатор «Пурпурин-18», представляющий из себя хлориновый макроцикл с присоединенным шестичленным ангидридным циклом [патент РФ № 2054944]. К недостаткам вышеназванного фотосенсибилизатора следует отнести нестабильность ангидридного цикла, устойчивого лишь в нейтральной и кислой средах, а в присутствии оснований склонного к быстрому раскрытию с образованием хлорина р, поглощающего при 670 нм и имеющего низкую эффективность при проведении ФДТ [Drogat N, Barrière M, Granet R, Sol V, Krausz, P. High yield preparation of purpurin-18 from Spirulina maxima. Dyes and pigments 2011; 88(1): 125-127. https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2010.05.006].
a
b
Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является пурпуринимид. Были предложены разнообразные методы замены атома кислорода в экзоцикле пурпурина 18 на азот, включая реакции с аммиаком, алкиламинами, гидразингидратом и гидроксиламином с последующей модификацией экзоциклических амино- и гидроксильной групп. Однако соединения, полученные указанными способами, не обладают высокой фотоиндуцированной активностью [Wang J.J., Yin Y.F., Yang Z. Synthesis of purpurin-18 imide derivatives from chlorophyll  and  by modifications and functionalizations along their peripheries. Journal of the Iranian Chemical Society 2013; 10(3): 583-591].
Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является создание стабильного фотосенсибилизатора, обладающего высокой эффективностью при проведении противоопухолевой ФДТ.
Технический результат заявленного изобретения обеспечивает фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии со структурной формулой (1):
(1),
1
3
2
5
3
3
2
3
где в качестве R может выступать водород (H), натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа(CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать сера (S) или селен (Se), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) или палладий (Pd).
2
Эффективность заявленного фотосенсибилизатора обусловлена введением нового биогенного атома серы (S) или селена (Se) в шестичленный экзоцикл, аннелированный с основным хлориновым макроциклом (R).
Введение экзоциклических атомов серы или селена в структуру фотосенсибилизаторов хлоринового ряда было реализовано впервые. Это позволило изменить химические и фотофизические свойства пигментов. Предположительно увеличение фотоиндуцированной активности в результате такой модификации может быть связано с прооксидантным действием на опухолевые клетки. Серосодержащие и селеносодержащие соединения могут ингибировать глутатион-зависимые ферменты, что приводит к ослаблению антиоксидантной системы опухолевых клеток и повышению их уязвимости к окислительному стрессу.
В немалой степени решение поставленной задачи обеспечивает способ получения указанного выше фотосенсибилизатора, включающий в себя следующие стадии:
-реакцию соединения со структурной формулой (2)
(2),
1
3
2
5
3
3
3
где в качестве R может выступать водород (H), натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа (CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) и палладий (Pd),
1
3
2
5
3
3
2
3
с веществом, выбранным из сульфида натрия, сульфида калия, селенида натрия и селенида калия, например, в молярном соотношении ((1,5-10):1), с получением смеси целевого продукта со структурной формулой (1), где в качестве R может выступать натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа(CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать сера (S) или селен (Se), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) или палладий (Pd),
и побочного продукта со структурной формулой (3)
(3),
1
3
2
5
3
3
3
где в качестве R может выступать натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа (CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) и палладий (Pd).
- выделение соединения со структурной формулой (1) из смеси с получением фотосенсибилизатора по п.1.
1
3
2
5
3
3
2
3
Указанный выше способ может дополнительно включать стадию воздействия на смесь целевого продукта со структурной формулой (1) и побочного продукта со структурной формулой (3) водным раствором неорганической кислоты, например, в молярном соотношении (1:(1-10)), с получением смеси целевого продукта со структурной формулой (1), где в качестве R может выступать водород (H), метильная группа (СH), этильная группа(CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать сера (S) или селен (Se), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) или палладий (Pd),
и побочного продукта со структурной формулой (4).
(4),
1
3
2
5
3
3
3
где в качестве R может выступать водород (H), метильная группа (СH), этильная группа (CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) и палладий (Pd).
Данная стадия позволяет упростить процесс выделения заявленного фотосенсибилизатора.
Выделение заявленного фотосенсибилизатора может осуществляться, например, посредством методов хроматографии, перекристаллизации или экстракции.
Также заявленный фотосенсибилизатор может быть получен другим способом, включающим в себя:
- реакцию соединения со структурной формулой (2)
(2),
1
3
2
5
3
3
3
где в качестве R может выступать водород (H), натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа (CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) и палладий (Pd),
и неорганической щелочи, например, в молярном соотношении (1:(0,1-10)), с получением соединения с формулой (3)
(3),
1
3
2
5
3
3
3
где в качестве R может выступать натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа (CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) и палладий (Pd);
- добавление к соединению со структурной формулой (3) соединения, выбранного из оксалилхлорида, хлорида фосфора (III), хлорида фосфора (V) или тионлхлорида, например, в молярном соотношении (1:(1-10)), с получением соединения со структурной формулой (5);
(5)
1
3
2
5
3
3
3
где в качестве R может выступать натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа (CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) и палладий (Pd).
- реакцию соединения со структурной формулой (5) с веществом, выбранным из гидросульфидогидридоалюминатом (III) лития или гидроселенидогидридоалюминатом (III) лития, например, в молярном соотношении (1:(1-10)), с получением заявленного фотосенсибилизатора.
1
3
2
5
3
3
2
3
Указанный выше способ может дополнительно включать стадию воздействия на вещество со структурной формулой (3) водным раствором неорганической кислоты (соляной, серной и проч.), например, в молярном соотношении (1:(1-10)), с получением вещества со структурной формулой (3), где в качестве R может выступать водород (H), метильная группа (СH), этильная группа(CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве Rможет выступать сера (S) или селен (Se), в качестве Rможет выступать водород (2H), медь (Cu), цинк (Zn) или палладий (Pd).
Выделение заявленного фотосенсибилизатора может осуществляться, например, посредством метода хроматографии, перекристаллизации или экстракции.
В качестве неорганической щелочи может быть использован, например, гидроксид натрия или гидроксид калия.
Оба предложенных способа могут дополнительно включать стадию получения металлокомплекса заявленного фотосенсибилизатора с соединением, выбранным из ацетата меди, галогенида меди, ацетата цинка, галогенида цинка, ацетата палладия, галогенида палладия с получением соединения со структурной формулой (6).
(6),
1
3
2
5
3
3
2
3
где в качестве R может выступать водород (H), натрий (Na), калий (К), метильная группа (СH), этильная группа (CH), изопропильная группа (CHCHCH), в качестве R может выступать сера (S) или селен (Se), в качестве Rможет выступать медь (Cu), цинк (Zn) и палладий (Pd).
6
6
Авторами были разработаны две стратегии синтеза. Первая включает замещение атома кислорода в пурпурине 18 на атом серы или селена с использованием сульфида или селенида натрия, соответственно. Данный подход позволяет ввести интересующий гетероатом в состав молекулы и получить целевой продукт в одну стадию, при этом в качестве побочного продукта образуется хлорин р. Второй подход к введению гетороатомов в экзоцикл Е хлоринов включает получение монометилового эфира хлорина p путем раскрытия ангидридного цикла в нем спиртовым раствором гидроксида калия, превращение полученной дикарбоновой кислоты в 13,15-дихлорангидрид под действием оксалилхлорида и образование циклического халькогеноангидрида в присутствии смеси элементарного халькогена с алюмогидридом лития.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
2
Пример 1. Получение заявленного фотосенсибилизаторас использованием сульфида натрия (NaS).
Заявленный фотосенсибилизаторполучали по следующей схеме. Пурпурин 18 (88.5 ммоль, 50 мг) растворяли в 1.5 мл тетрагидрофурана, добавляли 0.5 мл водного раствора 0.9 М сульфида натрия. Реакцию проводили при перемешивании в инертной атмосфере в течение 60 минут. Продукт выделяли экстракцией смесью растворителей: 4%-ный водный раствор соляной кислоты/хлороформ (250/25, v/v). Экстракт очищали с помощью препаративной ТСХ в системе хлористый метилен-метанол (10/1, v/v). Выход целевого соединения составил 15 мг (30%). Полученный продукт был охарактеризован методами спектрофотометрии, масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии. Результаты исследования приведены ниже.
3
max
-1
-1
UV/VIS (CHCl), λ, нм (ε, Mсм): 412 (116500), 481 (11500), 550 (4500), 698 (25000).
m/z
33
32
4
4
+
Масс-спектр (MALDI-TOF): для CHNOS рассчитано [M+H]: 580,21; найдено: 580,8.
1
1
2
2
1
1
2
2
3
3
2
2
3
2
3
3
2
3
3
H ЯМР (300 МГц, CDСl): δ 9.59 (1H, с, 5H), 9.37 (1H, с, 10H), 8.59 (1H, с, 20H), 7.90 (1H, дд, J=17,8 Гц, 3-CH), 6.32 (1H, дд, J=18 Гц, 3-CH), 6.22 (1H, дд, J=11.5 Гц, 3-CH), 5.21 (1H, м, 17H), 4.40 (1H, к, J=7.2 Гц, 18H), 3.79 (3H, с, 12-CH), 3.63 (2H, м, 8-CH), 3.36 и 3.17 (3H, с, 2-CHи 7-CH), 2.73, 2.48, 2.44, 1.98 (1H, м, 17-CH and 17-H), 1.76 (3H, д, J=7.3 Гц, 18-CH), 1.67 (3H, т, J=7.6 Гц, 8-CH), 0.24 (1H, с, NH), -0.06 (1H, с, NH).
Пример 2. Получение заявленного фотосенсибилизатора с использованием элементарной серы и алюмогидрида лития.
6
2
2
2
2
3
6
2
2
3
6
6
6
2
2
3
о
3
3
3
3
3
Циклический тиоангидрид хлорина рс использованием элементарной серы и алюмогидрида лития может быть получен, например, следующим образом. К раствору 100 мг пурпурина 18 (177 мкмоль) в 3 мл CHClдобавляли 3 мл насыщенного раствора диазометана в диэтиловом эфире и реакционную смесь выдерживали при 0С в течение 30 минут. Раствор концентрировали в вакууме и проводили очистку с помощью колоночной хроматографии (CHCl/CHOH, 80/1, v/v). Выход 17-метилового эфира пурпурина 18 составил 96 мг (96%). 50 мг последнего растворяли в 5 мл ацетона и добавляли 2 мл 1 M раствора гидроксида натрия. Реакцию проводили при перемешивании 15 мин. Полученный 17-метиловый эфир хлорина p экстрагировали смесью растворителей: 4%-ный водный раствор соляной кислоты/хлороформ (250/25, v/v). Раствор концентрировали в вакууме и проводили очистку методом колоночной хроматографии (CHCl/CHOH, 20/1, v/v).  Выход 17-метилового эфира хлорина p составил 43.7 мг (87.4%). К раствору 17-метилового эфира хлорина p (67 мкмоль) в диэтиловом эфире прибавляли оксалилхлорид (134 мкмоль, 17 мг), 5 мкл триэтиламина и реакцию выдерживали в инертной атмосфере в течение 30 минут, затем добавляли предварительно приготовленный реагент LiAlHSH. Последний получали при добавлении к раствору серы (2,2 мг) в 250 мкл тетрагидрафурана алюмогидрида лития (2,6 мг). Полученный раствор выдерживали в инертной атмосфере 24 часа, а продукт - 17-метиловый эфир тиоангидрида хлорина p- выделяли экстракцией хлороформом (15 мл) и многократной промывкой экстракта водой (150 мл). Раствор концентрировали в вакууме и проводили очистку с помощью препаративной ТСХ (CHCl/CHOH, 60/1, v/v). Выход целевого соединения составил 11.3 мг (28.3%).
m/z
34
34
4
4
+
+
Масс-спектр (MALDI-TOF):  рассчитано для CHNOS [M+H]: 594,23; найдено: [M+H] 595.96;
1
1
2
2
1
1
2
2
3
3
2
2
3
2
3
3
2
2
3
3
H ЯМР (300 МГц, CDСl): δ 9.58 (1H, с, 5H), 9.37 (1H, с, 10H), 8.59 (1H, с, 20H), 7.90 (1H, дд, J=17,5 Гц, 3-CH), 6.31 (1H, дд, J=18 Гц, 3-CH), 6.21 (1H, дд, J=11.5 Гц, 3-CH), 5.21 (1H, м, 17H), 4.39 (1H, к, J=6 Гц, 18H), 3.78 (3H, с, 12-CH), 3.64 (2H, м, 8-CH), 3.36 и 3.17 (3H, с, 2-CHи 7-CH), 2.76, 2.49, 2.46, 2.02 (1H, м, 17-CH и 17-СH), 1.76 (3H, д, J=7.3 Гц, 18-CH), 1.67 (3H, т, J=7.6 Гц, 8-CH), 0.23 (1H, с, NH), -0.07 (1H, с, NH).
34
34
4
4
Элементный анализ для CHNS. Рассчитано для CHNOS (%): С, 68.67; H, 5.76; N, 9.42; O, 10.76; S 5,39. Найдено (%): С, 68.64; H, 5.78; N, 9.43; S 5.37.
Пример 3. Получение Cu-комплекса заявленного фотосенсибилизатора.
2
2
3
2
2
2
2
3
Заявленный фыотосенсибилизатор(25 мг, 33.6 мкмоль) растворяли в 4 мл CHCl. К полученному раствору добавляли ацетат меди (6 мг, 33.6 мкмоль), суспензированный в 2 мл CHOH. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 10 минут, после чего к ней добавляли CHCl(25мл). Органический слой отделяли, промывали водой (3х100 мл), высушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении.  Продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии в системе: CHCl/CHOH (30/1, v/v). Выход целевого соединения составил 21мг (85%).
m/z
34
32
4
4
+
+
Масс-спектр (MALDI-TOF):  рассчитано для CHCuNOS [M+H]: 655,14; найдено: [M+H]655,47.
6
Пример 4. Сравнительное исследование фотоиндуцированной активности метилового эфира циклического тиоангидрида хлорина рна культуре клеток саркомы мыши S37.
3
2
2
Исследование проводили на культуре клеток саркомы мыши S37. Для экспериментов клетки рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 7×10 клеток на лунку. Воздействие на клетки проводили в экспоненциальной фазе роста. Раствор заявленного фотосенсибилизатораи препаратов сравнения в полной культуральной среде вносили в лунки через 24 часа после посева клеток в конечной концентрации от 20 нМ до 19 мкМ, в триплетах. Длительность инкубации клеток с ФС перед облучением составляла 0.5, 2 и 4 часа. Световое воздействие проводили галогеновой лампой через широкополосные фильтры в дозе 10 Дж/см в двух модификациях: в присутствии красителя в среде инкубации и при замене перед облучением содержимого лунок на среду, не содержащую ФС. После завершения светового воздействия планшеты с клетками помещали в СО-инкубатор на сутки.
2
Для оценки цитотоксичности клетки инкубировали с ФС сутки в затемненных условиях в СО-инкубаторе. Контролем служили клетки, не подвергавшиеся воздействию.
Выживаемость клеток оценивали с использованием колориметрического МТТ-теста.
50
Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста клеток в культуре более чем на 50% (ИК). Это значение было рассчитано как среднее трех независимых экспериментов.
6
Исследование на стабильность проводили в растворе PBS с фотосенсибилизаторами циклического тиоангидрида хлорина ри препаратов сравнения с конечной концентрацией 20 нМ. Длительность инкубации с ФС составляла 24 часа. Оценку стабильности исследовали спектрофотометрически по изменению или сохранению максимума поглощения в длинноволновой области спектра. Результаты исследования представлены в таблице 1 (см. в графической части).
Методами МТТ и микроскопии установлено, что без светового воздействия исследуемые образцыне оказывают цитотоксического действия на клетки саркомы мыши в течение 24 часов инкубации.
6
Стоит отметить смещение пика поглощения пурпурина 18 в сторону видимой области (от 700 нм до 666 нм) при инкубации в клеточной среде в течение 24 часов. Данный эффект является показателем раскрытия ангидридного цикла пурпурина 18 с образованием хлорина p. Этим, в свою очередь, обусловлено снижение эффективности пурпурина 18 при проведении противоопухолевой ФДТ.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности и стабильности заявленного фотосенсибилизатора при проведении противоопухолевой ФДТ.