ОЛИГОНУКЛЕОТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИЕЙ
OLIGONUCLEOTIDE FOR TREATMENT OF MUSCULAR DYSTROPHY PATIENTS

Область изобретения
Изобретение относится к области генетики человека, более конкретно, к способу конструирования единичного олигонуклеотида, который предпочтительно способен индуцировать пропускание двух или более экзонов пре-мРНК. Кроме того, изобретение относится к указанному олигонуклеотиду, к фармацевтической композиции, содержащей указанный олигонуклеотид, и к применению указанного олигонуклеотида, как указано в настоящем описании.
Уровень техники, к которому относится изобретение
Олигонуклеотиды являются перспективными в медицине для лечения генетических нарушений, таких как мышечная дистрофия. Мышечная дистрофия (MD) относится к генетическим заболеваниям, которые характеризуются прогрессирующей слабостью и дегенерацией скелетных мышц. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) и мышечная дистрофия Беккера (BMD) являются наиболее распространенными детскими формами мышечной дистрофии, и они используются в настоящем описании для иллюстрации изобретения. DMD представляет собой тяжелое летальное нервно-мышечное нарушение, приводящее к потребности в инвалидной коляске в возрасте до 12 лет и пациенты DMD часто погибают в возрасте до тридцати лет вследствие дыхательной или сердечной недостаточности.
DMD вызывается мутациями в гене DMD; в основном делециями или дупликациями со сдвигом рамки считывания одного или нескольких экзонов, небольшими нуклеотидными вставками или делециями, или точечными нонсенс-мутациями, которые, как правило, приводят к отсутствию функционального дистрофина. В ходе последнего десятилетия появилась специально индуцируемая модификация сплайсинга для восстановления нарушенной рамки считывания транскрипта DMD в качестве перспективной терапии мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) (van Ommen G.J. et al., Yokota T., et al., van Deutekom et al., Goemans N.M., et al.). С использованием специфичных к последовательности антисмысловых олигонуклеотидов (AON), которые нацелены на конкретный экзон, фланкирующий или содержащий мутацию, и препятствуют его сигналам сплайсинга, может быть индуцировано пропускание этого экзона во время процессинга пре-мРНК DMD. Несмотря на получаемый в результате укороченный транскрипт, открытая рамка считывания восстанавливается, и образуется белок, который сходен с белками, встречающимися у пациентов с обычно более мягкой мышечной дистрофией Беккера. Индуцируемое AON пропускание экзонов обеспечивает специфический для мутации и, таким образом, потенциально персонализированный терапевтический подход для пациентов с DMD и определенных пациентов с тяжелой BMD. Поскольку большинство мутаций кластеризуются в области экзонов 45-55 в гене DMD, пропускание одного конкретного экзона в этой области может быть терапевтическим для субпопуляции пациентов с различными мутациями. Пропускание экзона 51 имеют наибольшие субпопуляции пациентов (приблизительно 13%), включая пациентов с делециями экзонов 45-50, 48-50, 50 или 52. В случае некоторых мутаций для восстановления открытой рамки считывания требуется пропускание более одного экзона. Например, для пациентов DMD с делецией с экзона 46 по экзон 50 в гене DMD, только пропускание обоих из экзонов 45 и 51 является корректирующим. Для лечения этих пациентов требуется введение двух олигонуклеотидов, один из которых нацелен на экзон 45, а другой из которых нацелен на экзон 51. Осуществимость пропускания двух или более последовательных экзонов с использованием комбинации AON, либо в коктейле, либо в доставляемых с помощью вирусов генных конструкциях, широко исследована (Aartsma-Rus A. et al., 2004; Béroud C., et al.; Van Vliet L., et al.; Yokota T., et al.; Goyenvalle A., et al.). Пропускание множества экзонов было бы применимым для совокупных субпопуляций пациентов, позволило бы имитировать делеции, о которых известно, что они ассоциированы с относительно мягкими фенотипами, и обеспечило бы инструмент для нацеливания на редкие мутации вне области горячей точки делеций в гене DMD. Однако недостатком разработки лекарственных средств, содержащих множество олигонуклеотидов, является то, что учреждение по контролю за оборотом лекарственных средств может рассматривать олигонуклеотиды с различными последовательностями как различные лекарственные средства, для каждого из которых требуются доказательства стабильной продукции, испытания токсичности и клинические испытания. Таким образом, существует потребность в одном молекулярном соединении, способном индуцировать пропускание по меньшей мере двух экзонов, чтобы упростить лечение совокупных подгрупп пациентов с DMD.
Описание изобретения
Изобретение относится к способу конструирования олигонуклеотида, где указанный олигонуклеотид способен связываться с областью первого экзона и с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Олигонуклеотиды, получаемые указанным способом, предпочтительно способны индуцировать пропускание указанного первого экзона и указанного второго экзона в указанной пре-мРНК. Предпочтительно, также индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами. Полученный транскрипт указанной пре-мРНК, где пропускаются указанные экзоны, находится в рамке считывания.
Олигонуклеотид
В первом аспекте изобретение относится к олигонуклеотиду, который способен связываться с областью первого экзона и с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где указанная область второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона.
Олигонуклеотид предпочтительно способен индуцировать пропускание первого и второго экзонов указанной пре-мРНК; более предпочтительно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт находится в рамке считывания.
Пропускание экзона препятствует природным процессам сплайсинга, происходящим в эукариотической клетке. У высших эукариот генетическая информация для белков в ДНК клетки кодируется в экзонах, которые отделены друг от друга последовательностями интронов. Эти интроны в некоторых случаях являются очень длинными. Аппарат транскрипции эукариот образует пре-мРНК, которая содержит как экзоны, так и интроны, в то время как аппарат сплайсинга, часто уже во время происходящей продукции пре-мРНК, образует истинную кодирующую мРНК для белка путем удаления интронов и связывания экзонов, присутствующих в пре-мРНК, в ходе процесса, называемого сплайсингом.
Олигонуклеотид по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и с областью второго экзона в той же пре-мРНК, следует рассматривать как олигонуклеотид, пригодный для связывания с областью первого экзона в пре-мРНК и пригодный для связывания с областью второго экзона в той же пре-мРНК. Такой олигонуклеотид по изобретению характеризуется его признаком связывания (т.е. способен связываться), когда его используют с или в комбинации с пре-мРНК, предпочтительно в клетке. В этом контексте выражение "способен к" может быть заменено на "может". Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что олигонуклеотид, способный связываться с областью первого экзона и способный связываться с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, определяемый нуклеотидной последовательностью, определяет указанный олигонуклеотид структурно, т.е. указанный олигонуклеотид обладает такой последовательностью, которая обратно комплементарна последовательности указанной области указанного первого экзона и также обратно комплементарна последовательности указанной области указанного второго экзона в одной и той же пре-мРНК. Степень обратной комплементарности с указанными областями указанного первого и/или указанного второго экзона, которая необходима для олигонуклеотида по изобретению, может составлять менее 100%. Может быть допустимым определенное количество несоответствий нуклеотидов или один или два пропуска, как дополнительно описано в настоящем описании. Нуклеотидную последовательность области первого экзона, которая обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного второго экзона (или нуклеотидная последовательность области второго экзона, которая обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона), с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению, можно конструировать с использованием способа по изобретению, как пояснено ниже в настоящем описании. Предпочтительная пре-мРНК представляет собой пре-мРНК дистрофина. Предпочтительные комбинации первого и второго экзонов пре-мРНК дистрофина и предпочтительные области указанных первого и второго экзонов дистрофина определены в таблице 2. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов в указанной пре-мРНК дистрофина; более предпочтительно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт дистрофина находится в рамке считывания, предпочтительно, как указано в таблице 1.
Транскрипт находится в рамке считывания, когда он имеет открытую рамку считывания, которая обеспечивает продукцию белка. Состояние нахождения мРНК в рамке считывания можно оценивать с помощью анализа последовательности и/или анализа ОТ-ПЦР, как известно специалисту в данной области. Полученный белок, который образуется в результате трансляции транскрипта в рамке считывания, можно анализировать с помощью иммунофлуоресценции и/или анализа с использованием вестерн-блоттинга с использованием антител, которые перекрестно реагируют с указанным белком, как известно специалисту в данной области. В рамках настоящего изобретения олигонуклеотид, описанный в настоящем описании, может быть назван функциональным, если полученный транскрипт в рамке считывания идентифицируется с помощью ОТ-ПЦР и/или анализа последовательности, или если белок, образовавшийся с указанного транскрипта, идентифицируется с помощью иммунофлуоресценции и/или анализа с использованием вестерн-блоттинга, в соответствующей системе in vitro или in vivo в зависимости от типа транскрипта. Если транскрипт представляет собой транскрипт дистрофина, соответствующая система может представлять собой мышечную клетку или мышечную трубочку здорового донора или пациента с DMD, как пояснено в настоящем описании ниже.
В одном варианте осуществления область второго экзона (присутствующая в той же пре-мРНК в качестве области первого экзона) обладает по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичностью с областью первого экзона, как определено выше (предпочтительные области первого и второго экзонов дистрофина указаны в таблице 2). Процент идентичности можно оценивать по всей длине указанных первого и/или второго экзонов или на протяжении области из 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, как проиллюстрировано в настоящем описании для экзонов дистрофина. Для квалифицированного специалиста очевидно, что первый и второй экзоны, как описано в настоящем описании, представляют собой два различных экзона одной единственной мРНК или два различных экзона одной и той же пре-мРНК. Первый экзон, как указано в настоящем описании, может быть расположен выше (т.е. с 5'-стороны) второго экзона в одной и той же пре-мРНК, как указано в настоящем описании, или второй экзон может быть расположен выше указанного первого экзона. Предпочтительно, указанный первый экзон расположен выше указанного второго экзона. Специалисту в данной области очевидно, что олигонуклеотид по изобретению может быть исходно сконструирован так, чтобы он был способен связываться с областью первого экзона; ввиду идентичности области указанного первого и указанного второй экзонов, указанный олигонуклеотид также вторично может быть способен связываться с указанной областью указанного второго экзона. Возможно обратное конструирование: олигонуклеотид по изобретению может быть первично сконструирован так, чтобы он был способен связываться с областью второго экзона; ввиду идентичности области указанного первого и указанного второго экзонов, указанный олигонуклеотид также может быть вторично способен связываться с указанной областью указанного первого экзона.
Процент идентичности между областью первого и областью второго экзонов можно оценивать по всей области указанного первого экзона, где область может быть более короткой, более длинной или в равной степени длинной относительно части этой области, с которой олигонуклеотид по изобретению способен связываться. Область первого экзона и область второго экзона, как используют в рамках изобретения, также могут быть идентифицированы как область(и) идентичности. Предпочтительно область первого экзона, которая определяет идентичность с областью второго экзона, является в равной степени длинной или более длинной, чем часть этой области, с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению. Должно быть понятно, что олигонуклеотид по изобретению может быть способен связываться с меньшей частью или частично перекрывающейся частью указанных областей, использованных для оценки идентичности последовательностей указанных первого и/или второго экзонов. Таким образом, должно быть понятно, что олигонуклеотид, который способен связываться с областью первого и второго экзонов, может связываться с частью указанной области указанного первого экзона и указанного второго экзона. Указанная часть может иметь такую же длину, как и указанная область указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может быть более короткой или более длинной относительно указанной области указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может находиться в указанной области указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может перекрываться с указанной областью указанного первого и/или указанного второго экзонов. Это перекрывание может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидов на 5'- и/или на 3'-стороне области указанного первого и/или второго экзона. Олигонуклеотид может быть по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидов длиннее или короче области указанного первого и/или указанного второго экзона и может находиться на 5'- или 3'-стороне указанной области первой и/или второй области.
Область, составляющая 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, используемая для вычисления процента идентичности между первым экзоном и вторым экзоном, может представлять собой непрерывный участок, или она может прерываться одним, двумя, тремя, четырьмя или более пропусками при условии, что процент идентичности на протяжении всей области составляет по меньшей мере 50%.
Процент идентичности между областью первого экзона и областью второго экзона можно оценивать с использованием любой программы, известной специалисту в данной области. Предпочтительно, указанную идентичность оценивают следующим образом: наилучшее попарное выравнивание между первым и вторым экзонами с использованием сетевого инструмента EMBOSS Matcher с использованием параметров по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за внесение пропуска: 16, штраф за продолжение пропуска: 4).
Олигонуклеотид, как используют в рамках изобретения, предпочтительно относится к олигомеру, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным области или части области первого и второго экзонов в одной и той же пре-мРНК.
Олигонуклеотид, как определено в настоящем описании (т.е. который способен связываться с областью первого экзона и с областью другого экзона (т.е. второго экзона) в одной и той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона), также предпочтительно по меньшей мере на 80% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 45% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Обратную комплементарность предпочтительно, но не обязательно, оценивают на протяжении всей длины олигонуклеотида.
Олигонуклеотид, охватываемый изобретением, может содержать по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Олигонуклеотид, охватываемый изобретением, может содержать не более 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 нуклеотидов. Длина олигонуклеотида по изобретению определяется общим количеством нуклеотидов, охватываемых указанным олигонуклеотидом, независимо от модификаций, присутствующих в указанном олигонуклеотиде. Как дополнительно рассмотрено ниже, нуклеотиды могут содержать определенные химические модификации, однако такие модифицированные нуклеотиды, тем не менее, считаются нуклеотидами в контексте настоящего изобретения. В зависимости от химии олигонуклеотида, оптимальная длина олигонуклеотида может отличаться. Например, длина 2'-O-метилфосфоротиоатного олигонуклеотида может составлять от 15 до 30. Если этот олигонуклеотид далее модифицировать, как проиллюстрировано в настоящем описании, оптимальная длина может быть укорочена до 14, 13 или даже менее.
В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет не более 30 нуклеотидов для ограничения вероятности снижения эффективности синтеза, выхода, частоты или масштабируемости, снижения биодоступности и/или клеточного захвата и транспорта, снижения безопасности и для ограничения расходов. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид состоит из 15-25 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно, олигонуклеотид, охватываемый изобретением, состоит из 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. Длина олигонуклеотида по изобретению предпочтительно является такой, что функциональность или активность олигонуклеотида определяется индукцией по меньшей мере 5% пропускания первого и второго экзонов (и любого экзона(ов) между ними), или способствованием тому, что образуется по меньшей мере 5% транскрипта в рамке считывания, когда по меньшей мере 100 нМ указанного олигонуклеотида используют для трансфицирования соответствующей клеточной культуры in vitro. Оценка присутствия указанного транскрипта уже описана в настоящем описании. Соответствующая клеточная культура представляет собой клеточную культуру, где пре-мРНК, содержащая указанный первый и указанный второй экзоны, транскрибируется и сплайсируется в мРНК-транскрипт. Если пре-мРНК представляет собой пре-мРНК дистрофина, соответствующая клеточная культура содержит (дифференцированные) мышечные клетки. В этом случае образуется по меньшей мере 20% транскрипта в рамке считывания, когда используют по меньшей мере 250 нМ указанного олигонуклеотида.
Область первого экзона может иметь длину по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Область первого экзона также может быть определена как составляющая по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% длины указанного экзона. Область первого экзона может быть названа областью идентичности.
Область второго экзона может составлять по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Область второго экзона может быть определена как составляющая по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% от длины указанного экзона. Область второго экзона может быть названа областью идентичности.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению способен связываться с областью экзона U+1 (первый экзон) из пре-мРНК, где область другого экзона D-1 (второй экзон) в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного (U+1) экзона, где указанный олигонуклеотид предназначен для пропускания указанного U+1 и указанного D-1 экзонов (и дополнительного экзона(ов), предпочтительно расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами) указанной пре-мРНК, с образованием транскрипта в рамке считывания, в котором экзоны U и D сплайсированы вместе (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 1). Олигонуклеотид по изобретению также обозначается в настоящем описании как соединение. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно представляет собой антисмысловой олигонуклеотид (т.е. AON). Олигонуклеотид предпочтительно предназначен для пропускания указанных двух экзонов (т.е. указанного первого (U+1) и указанного второго (D-1) экзонов) указанной пре-мРНК, и где образовавшийся транскрипт (в котором U прямо сплайсирован с D) находится в рамке считывания (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 1). Можно сказать, что указанный олигонуклеотид индуцирует пропускание указанных двух экзонов в одной единственной пре-мРНК. Необязательно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и образующийся транскрипт находится в рамке считывания.
Более предпочтительно, олигонуклеотид предназначен для пропускания указанных двух экзонов (т.е. указанного первого и указанного второго экзонов), и полного участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами в указанной пре-мРНК для удаления какой-либо мутации в указанном участке и для получения транскрипта, который является более коротким, но который обладает восстановленной открытой рамкой считывания, что обеспечивает продуцирование белка.
Без связи с какой-либо теорией, полагают, что вследствие по меньшей мере 50% идентичности или сходства последовательностей между указанными двумя экзонами, единственный олигонуклеотид по изобретению способен связываться и индуцировать пропускание обоих экзонов и предпочтительно всего участка экзонов между ними, чтобы получить более короткий транскрипт, который находится в рамке считывания. Таким образом, указанные два экзона могут быть соседними в пре-мРНК, или они могут быть разделены по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 экзонами. Область, охватывающая один или несколько экзонов, присутствующих между указанным первым и указанным вторым экзонами, также может быть названа участком (множества) экзонов или мультиэкзонным участком. Предпочтительно, первый экзон этого мультиэкзонного участка представляет собой первый экзон, определенный в настоящем описании выше, а последний экзон этого мультиэкзонного участка представляет собой второй экзон, определенный в настоящем описании ранее. Олигонуклеотид по изобретению также может быть определен как олигонуклеотид, который способен индуцировать пропускание указанных двух экзонов, или пропускание участка (множества) экзонов или пропускание указанного мультиэкзонного участка. В предпочтительном варианте осуществления пропускание как первого экзона, так и второго экзона индуцируют с использованием одного единственного олигонуклеотида по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления осуществляют пропускание более одного, более 2, более 3, более 4, более 5, более 6, более 7, более 8, более 9, более 10, более 11, более 12, более 13, более 14, более 15, более 16, более 17 экзонов, более 18, более 19, более 20, более 21, более 22, более 23, более 24, более 25, более 26, более 27, более 28, более 29, более 30, более 31, более 32, более 33, более 34, более 35, более 36, более 37, более 38, более 39, более 40, более 41, более 42, более 43, более 44, более 45, более 46, более 47, более 48, более 49, более 50 экзонов с использованием одного единственного олигонуклеотида, и, таким образом, это пропускание более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 экзонов проводят, не используя смесь или коктейль двух или более различных олигонуклеотидов, или не используя два или более различных олигонуклеотидов, которые могут быть связаны с помощью одного или нескольких линкера(ов), или не используя генную конструкцию, транскрибирующую два или более различных олигонуклеотидов. В одном варианте осуществления, таким образом, предусматривается, что изобретение охватывает один единственный олигонуклеотид и не содержит двух или более различных олигонуклеотидов, причем указанный единственный олигонуклеотид способен связываться с указанным первым и указанным вторым экзонами и способен индуцировать пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов в одной пре-мРНК, как проиллюстрировано в настоящем описании. В этом контексте квалифицированному специалисту будет понятно, что слово "единственный" не относится к количеству молекул, требуемому для индукции пропускания экзонов. "Единственный" относится к последовательности олигонуклеотида: изобретение охватывает одну единственную олигонуклеотидную последовательность и ее применение, и не включает две или более различных олигонуклеотидных последовательностей, причем указанная единственная олигонуклеотидная последовательность способна связываться с указанным первым и указанным вторым экзонами и способна индуцировать пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов в одной пре-мРНК, как объяснено в настоящем описании. Это изобретение представляет собой первое изобретение, позволяющее пропускание более чем одного экзона с помощью только одного единственного олигонуклеотида для лечения заболевания, вызываемого (редкой) мутацией в гене, при условии, что различные экзоны в указанном гене включают области, которые обладают по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей.
Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно используют в качестве части терапии на основе активности модулирования РНК, как определено в настоящем описании ниже. В зависимости от типа транскрипта, где присутствуют первый и второй экзоны, можно сконструировать олигонуклеотид для предупреждения, лечения или замедления данного заболевания.
Было показано, что нацеливание на два экзона в одной пре-мРНК с помощью одного олигонуклеотида, способного связываться с обоими экзонами, приводит к мРНК, лишенной экзонов-мишеней, и, кроме того, всего участка экзонов между ними. Преимуществом такого единственного олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, является то, что можно лечить дефекты, вызванные различными мутациями в этом мультиэкзонном участке. Если выбрать два или более различных олигонуклеотидов для индукции пропускания двух или более экзонов, следует, например, учитывать, что каждый олигонуклеотид может обладать его собственным профилем PK, и что, таким образом, необходимо будет найти условия, где каждый из них будет сходным образом присутствовать в одной и той же клетке. Таким образом, другим преимуществом использования только одного единственного олигонуклеотида, способного связываться с двумя различными экзонами, как определено выше, является то, что значительно упрощается изготовление, исследование токсичности, поиск дозы и клиническое испытание, поскольку это может быть сведено к простому изготовлению и исследованию одного единственного соединения.
Ниже определены дополнительные признаки олигонуклеотида по изобретению.
В контексте изобретения, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с, является обратно комплементарным и/или способен ингибировать функцию по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в по меньшей мере указанном первом экзоне и/или указанном втором экзоне и/или влияет на структуру по меньшей мере указанного первого экзона и/или указанного второго экзона:
где указанный олигонуклеотид содержит последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной участку связывания серин-аргининового (SR) белка в указанном первом и/или втором экзоне,
и/или
где указанный олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным энхансеру сплайсинга экзонов (ESE), последовательности распознавания экзонов (ERS) и/или сайленсеру сплайсинга экзонов (ESS) в указанном первом и/или втором экзоне.
Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным области первого экзона пре-мРНК и/или области второго экзона пре-мРНК, способен специфически ингибировать по меньшей мере одну регулирующую сплайсинг последовательность и/или влиять на структуру по меньшей мере указанного первого и/или второго экзона в указанной пре-мРНК. Препятствование регулирующим сплайсинг последовательностям и/или структурам имеет преимущество, состоящее в том, что такие элементы располагаются в экзоне. Путем предоставления такого олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, можно эффективно замаскировать по меньшей мере указанный первый и второй экзоны, и предпочтительно полный участок экзонов между ними, от аппарата сплайсинга. Отсутствие распознавания аппаратом сплайсинга этих экзонов, таким образом, приводит к пропусканию или исключению этих экзонов из конечной мРНК. Этот вариант осуществления сфокусирован только на кодирующих последовательностях. Полагают, что это позволяет способу быть более специфическим и, таким образом, надежным. Обратная комплементарность указанного олигонуклеотида с указанной областью указанного первого и/или второго экзона в пре-мРНК предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
Таким образом, настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду для применения в качестве лекарственного средства для предупреждения, замедления, смягчения и/или лечения заболевания у индивидуума,
где указанный олигонуклеотид способен связываться с областью первого экзона и областью второго экзона, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона,
где указанный первый и указанный второй экзоны находятся в одной и той же пре-мРНК у указанного индивидуума,
где указанное связывание приводит к пропусканию указанного первого экзона и указанного второго экзона и предпочтительно к пропусканию мультиэкзонного участка, начинающегося с указанного первого экзона и охватывающего один или несколько экзонов, находящихся между указанным первым и указанным вторым экзонами, и в лучшем случае к пропусканию всего участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами, и
где получают транскрипт в рамке считывания, позволяющий продуцирование функционального или полуфункционального белка.
Предпочтительно, как проиллюстрировано в настоящем описании, указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание всего участка экзонов между указанным первым экзоном и указанным вторым экзоном.
Более предпочтительно, как объяснено в настоящем описании, указанное связывание указанного олигонуклеотида способно препятствовать по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанных первого и второго экзонов, и/или вторичной структуре указанного первого и/или указанного второго экзонов, и/или вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК. Предпочтительные регулирующие сплайсинг последовательности представлены в настоящем описании ниже.
Таким образом, один предпочтительный вариант осуществления относится к олигонуклеотиду по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и/или с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 2), где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанного первого и указанного второго экзонов в указанной пре-мРНК; что приводит к транскрипту, который находится в рамке считывания (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице в таблице 1 или 6). Указанный олигонуклеотид обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок, и указанный олигонуклеотид дополнительно содержит:
- последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого и/или второго экзона пре-мРНК, которая гибридизуется с другой частью первого и/или второго экзона пре-мРНК (закрытая структура), и/или
- последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области указанного первого и/или второго экзона пре-мРНК, которая не гибридизуется с указанной пре-мРНК (открытая структура).
Для этого варианта осуществления приводится ссылка на патентную заявку WO 2004/083446. Молекулы РНК обладают прочными вторичными структурами, по большей части вследствие спаривания оснований обратно комплементарных или частично обратно комплементарных участков в одной и той же РНК. Уже давно полагают, что структуры в РНК играют роль в функции РНК. Без связи с теорией, полагают, что вторичная структура РНК экзона играет роль в структурировании процесса сплайсинга. В ее структуре экзон распознается в качестве части, которая должна быть включена в мРНК. В одном варианте осуществления олигонуклеотид способен препятствовать структуре по меньшей мере указанного первого экзона и, возможно, также указанного второго экзона и, возможно, также участка экзонов между ними, и, таким образом, способен препятствовать сплайсингу указанного первого, и, возможно, также указанного второго экзона, и, возможно, также участка экзонов между ними, путем маскирования указанных экзонов от аппарата сплайсинга и тем самым обеспечения пропускания указанных экзонов. Без связи с теорией, полагают, что перекрывание с открытой структурой повышает эффективность инвазии олигонуклеотида (т.е. повышает эффективность, с которой олигонуклеотид может проникать в структуру), в то время как перекрывание с закрытой структурой повышает эффективность препятствования вторичной структуре РНК экзона. Было обнаружено, что длина частичной обратной комплементарности как с закрытой, так и с открытой структурой в значительной степени не ограничена. Авторы настоящего изобретения наблюдали высокую эффективность в случае олигонуклеотида с различной длиной обратной комплементарности в любой структуре. Термин "обратная комплементарность" используют в настоящем описании для обозначения участка нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с другим участком нуклеиновых кислот в физиологических условиях. Условия гибридизации определены в настоящем описании ниже. Таким образом, не является абсолютным требованием, чтобы все основания в области обратной комплементарности были способны спариваться с основаниями на противоположной цепи. Например, при конструировании олигонуклеотида может быть желательным включение, например, одного или нескольких остатков, которые не образуют пары оснований с основаниями на обратной комплементарной цепи. Несоответствия оснований могут быть до некоторой степени допустимыми, если в условиях в клетке участок нуклеотидов все еще способен гибридизоваться с обратно комплементарной частью. В контексте настоящего изобретения присутствие несоответствия в олигонуклеотиде по изобретению является предпочтительным, поскольку в одном варианте осуществления указанный олигонуклеотид является по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% обратно комплементарным области первого экзона и/или области второго экзона. Присутствие несоответствия в указанном олигонуклеотиде является предпочтительной характеристикой изобретения, поскольку указанный олигонуклеотид способен связываться с областью указанного первого и с областью указанного второго экзона, как определено в настоящем описании выше.
Другие преимущества обеспечения присутствия несоответствия оснований в антисмысловом олигонуклеотиде по изобретению определены в настоящем описании, и они сходны с преимуществами, обеспечиваемыми присутствием инозина (гипоксантина), и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований: избегание присутствия CpG, избегание или снижение потенциальной мультимеризации или агрегации, избегание квадруплексных структур, возможность конструирования олигонуклеотида с улучшенной кинетикой связывания РНК и/или термодинамическими свойствами.
Предпочтительно, обратная комплементарность олигонуклеотида области идентичности между указанными первым и/или вторым экзонами составляет от 45% до 65%, от 50% до 75%, но более предпочтительно от 65% до 100% или от 70% до 90%, или от 75% до 85%, или от 80% до 95%. Как правило, это обеспечивает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 несоответствий в олигонуклеотиде из 20 нуклеотидов. Таким образом, в олигонуклеотиде из 40 нуклеотидов может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований. Предпочтительно, в олигонуклеотиде из 40 нуклеотидов присутствует менее 14 несоответствий оснований. Количество несоответствий оснований является таким, что олигонуклеотид по изобретению все еще способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и на область указанного второго экзона, тем самым индуцируя пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов и индуцируя продукцию транскрипта в рамке считывания, как объяснено в настоящем описании. Предпочтительно, продукции транскрипта в рамке считывания достигают по меньшей мере с 5% эффективностью при использовании по меньшей мере 100 нМ указанного олигонуклеотида для трансфекции соответствующей клеточной культуры in vitro, как объяснено в настоящем описании выше.
Следует отметить, что изобретение охватывает олигонуклеотид, который не обладает никаким несоответствием оснований с областью первого экзона и который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с соответствующей областью второго экзона, как определено в настоящем описании. Однако изобретение также охватывает олигонуклеотид, который не имеет никакого несоответствия оснований с областью второго экзона и который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с соответствующей областью первого экзона, как определено в настоящем описании. Наконец, изобретение охватывает олигонуклеотид, который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с областью первого экзона и который может иметь 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 несоответствие оснований с соответствующей областью второго экзона, как определено в настоящем описании. Вновь, в рамках настоящего изобретения следует понимать, что количество несоответствий оснований в олигонуклеотиде по изобретению является таким, чтобы этот указанный олигонуклеотид все еще был способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и область указанного второго экзона, как пояснено в настоящем описании.
Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно не пересекает пропуск в выравнивании области первого экзона и области второго экзона, как определено в настоящем описании. Выравнивание предпочтительно проводят с использованием сетевого инструмента EMBOSS Matcher, как пояснено в настоящем описании выше. Однако в конкретных случаях возможно, что олигонуклеотид по изобретению должен пересекать пропуск, как упомянуто в настоящем описании выше. Предпочтительно, указанный пропуск представляет собой только один пропуск. Указанный пропуск предпочтительно охватывает менее 3 нуклеотидов, наиболее предпочтительно только один нуклеотид. Количество и длина пропусков являются такими, что олигонуклеотид по изобретению все еще способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и область указанного второго экзона, тем самым индуцируя пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов и индуцируя продукцию транскрипта в рамке считывания, как пояснено в настоящем описании.
Структуру (т.е. открытые и закрытые структуры) наилучшим образом анализируют в контексте пре-мРНК, где находится экзон. Такую структуру можно анализировать в истинной РНК. Однако в настоящее время возможно спрогнозировать вторичную структуру молекулы РНК (с наибольшими затратами энергии) достаточно тщательно с использованием моделирующих структуру программ. Неограничивающим примером подходящей программы является интернет-сервер Mfold (Zuker, M.).
Специалист в данной области способен спрогнозировать с приемлемой воспроизводимостью вероятную структуру экзона, учитывая нуклеотидную последовательность. Наилучшее прогнозирование осуществляют, когда программе предоставляют как последовательность указанного экзона, так и последовательности фланкирующих интронов. Как правило, не является необходимым моделирование структуры всей пре-мРНК.
Отжиг олигонуклеотида по изобретению может влиять на локальное сворачивание или 3D-структуру или конформацию РНК-мишени (т.е. область, охватывающую по меньшей мере первый и/или второй экзоны). Отличающаяся конформация может приводить к нарушению структуры, распознаваемой аппаратом сплайсинга. Однако, когда в первом и/или втором экзоне-мишени присутствуют потенциальные (скрытые) акцепторные и/или донорные последовательности сплайсинга, иногда образуется новая структура, определяющая отличающийся (нео-) экзон, т.е. с отличающимся 5'-концом, отличающимся 3'-концом или обоими из них. Этот тип активности находится в объеме настоящего изобретения, поскольку экзон-мишень исключается из мРНК. Присутствие нового экзона, содержащего часть указанного первого и/или второго экзона-мишени в мРНК, не изменяет тот факт, что экзон-мишень, как таковой, исключается. Включение нового экзона можно наблюдать в качестве побочного эффекта, который происходит только изредка. Существует две возможности, когда пропускание экзона используется для восстановления (части) открытой рамки считывания транскрипта, которая разрушается в результате мутации. Одной из них является то, что новый экзон является функциональным в отношении восстановления рамки считывания, в то время как в другом случае рамка считывания не восстанавливается. При выборе олигонуклеотида для восстановления открытой рамки считывания с помощью пропускания множества экзонов, безусловно, очевидно, что в этих условиях выбирают только те олигонуклеотиды, которые действительно приводят к пропусканию экзона, которое восстанавливает открытую рамку считывания данного транскрипта, с новым экзоном или без него.
Кроме того, в другом предпочтительном варианте осуществления предусматривается олигонуклеотид по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона (предпочтительные области для экзонов дистрофина указаны в таблице 2 или таблице 6), где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов указанной пре-мРНК; что приводит к транскрипту, который находится в рамке считывания (для DMD, предпочтительно, как в таблице 1 или таблице 6). Указанный олигонуклеотид обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок, и указанный олигонуклеотид дополнительно содержит: последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с, является обратно комплементарной для и/или способна ингибировать функцию одного или нескольких участков связывания серин-аргининового (SR) белка в РНК экзона из пре-мРНК.
В патентной заявке WO 2006/112705 авторы настоящего изобретения описали наличие корреляции между эффективностью внутреннего антисмыслового олигонуклеотида (AON) экзона в отношении индукции пропускания экзонов и присутствием предполагаемого участка связывания SR в заданном участке пре-мРНК указанного AON. Таким образом, в одном варианте осуществления получают указанный олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, включая определение одного или нескольких (предполагаемых) участков связывания для белка SR в РНК указанного первого и/или указанного второго экзона и получение соответствующего олигонуклеотида, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным указанной РНК и который по меньшей мере частично перекрывает указанный (предполагаемый) участок связывания. Термин "по меньшей мере частично перекрывает" определяют в настоящем описании как включающий перекрывание только одного нуклеотида участка связывания SR, а также множества нуклеотидов одного или нескольких указанных участков связывания, а также полное перекрывание одного или нескольких указанных участков связывания. Этот вариант осуществления, предпочтительно, дополнительно включает определение во вторичной структуре первого и/или второго экзона области, которая гибридизуется с другой частью указанного первого и/или второго экзона (закрытая структура), и области, которая не гибридизуется в указанной структуре (открытая структура), а затем получение олигонуклеотида, который по меньшей мере частично перекрывает один или несколько указанных (предполагаемых) участков связывания, и который перекрывает по меньшей мере часть указанной закрытой структуры и перекрывает по меньшей мере часть указанной открытой структуры, и который связывается с, нацеливается на, гибридизуется с и/или является обратно комплементарным первому и второму экзонам. Таким образом, авторы настоящего изобретения увеличивают вероятность получения олигонуклеотида, который способен препятствовать включению указанного первого и второго экзонов, и, если это применимо, полного участка экзонов между ними, из пре-мРНК в мРНК. Без связи с какой-либо теорией, в настоящее время полагают, что применение олигонуклеотида, направленного на участок связывания белка SR, приводит (по меньшей мере частично) к нарушению связывания белка SR с указанным участком связывания, что приводит к нарушенному или ухудшенному сплайсингу.
Предпочтительно, область первого экзона и/или область второго экзона в одной и той же пре-мРНК, с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению, содержит открытую/закрытую структуру и/или участок связывания белка SR, более предпочтительно указанная открытая/закрытая структура и указанный участок связывания белка SR частично перекрываются, и еще более предпочтительно указанная открытая/закрытая структура полностью перекрывает участок связывания белка SR, или участок связывания белка SR полностью перекрывает открытую/закрытую структуру. Это обеспечивает дальнейшее нарушение включения экзона.
Помимо консенсусных последовательностей участков связывания, множество (или даже все) экзонов содержат регулирующие сплайсинг последовательности, такие как последовательности энхансера сплайсинга экзонов (ESE), чтобы облегчить распознавание истинных участков сплайсинга сплайсингосомой (Cartegni L, et al. 2002; и Cartegni L, et al., 2003). Подгруппа факторов связывания, называемых белками SR, может связываться с этими ESE и привлекать другие факторы сплайсинга, такие как U1 и U2AF, в (слабо определенные) участки сплайсинга. Участки сплайсинга четырех из наиболее распространенных белков SR (SF2/ASF, SC35, SRp40 и SRp55) проанализированы детально (Cartegni L, et al. 2002 и Cartegni L, et al., 2003). Существует корреляция между эффективностью олигонуклеотида и наличием/отсутствием участка связывания SF2/ASF, SC35, SRp40 и SRp55 в части первого экзона, с которой связывается, гибридизуется и/или на которую нацеливается указанный олигонуклеотид. В предпочтительном варианте осуществления изобретение, таким образом, относится к олигонуклеотиду, который связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или обратно комплементарен участку связывания для белка SR. Предпочтительно, указанный SR белок представляет собой SF2/ASF или SC35, SRp40 или SRp55. В одном варианте осуществления олигонуклеотид связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или является обратно комплементарным участку связывания белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 в первом экзоне и участку связывания другого белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 во втором экзоне. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или является обратно комплементарным участку связывания белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 в первом экзоне и участку связывания сходного белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 во втором экзоне.
В одном варианте осуществления у пациента обеспечивают функциональный или полуфункциональный белок с использованием олигонуклеотида, который способен связываться с, нацеливаться на регуляторную последовательность РНК, присутствующую в первом и/или втором экзоне, которая требуется для правильного сплайсинга указанного экзона(ов) в транскрипте. Для правильного сплайсинга экзонов в транскрипте требуется несколько цис-действующих последовательностей РНК. В частности, идентифицированы дополнительные элементы, такие как энхансеры сплайсинга экзонов (ESE), для регуляции специфического и эффективного сплайсинга конститутивных и альтернативных экзонов. С использованием соединения, содержащего олигонуклеотид, который связывается или способен связываться с одним из дополнительных элементов в указанном первом и/или втором экзоне(ах), их регуляторная функция нарушается так, что экзоны пропускаются. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона, где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзона в указанной пре-мРНК; где указанная область указанного первого экзона и/или указанная область указанного второго экзона содержит энхансер сплайсинга экзонов (ESE), последовательность распознавания экзонов (ERS) и/или последовательность энхансера сплайсинга (SES), и/или где указанный олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, способен ингибировать и/или является обратно комплементарным указанному энхансеру сплайсинга экзонов (ESE), последовательности распознавания экзонов (ERS) и/или последовательности энхансера сплайсинга (SES).
Ниже описаны предпочтительные химические структуры олигонуклеотида по изобретению.
Олигонуклеотид широко известен как олигомер, который имеет базовые характеристики гибридизации, сходные с природными нуклеиновыми кислотами. Гибридизация определена в разделе, посвященном определениям, в конце описания изобретения. В настоящей заявке термины "олигонуклеотид" и "олигомер" используют взаимозаменяемо. Для получения указанного олигонуклеотида по изобретению можно использовать различные типы нуклеозидов. Олигонуклеотид может содержать по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь и/или по меньшей мере одну модификацию сахара и/или по меньшей мере одну модификацию основания по сравнению с встречающимся в природе олигонуклеотидом на основе рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида.
"Модифицированная межнуклеозидная связь" указывает на присутствие модифицированной версии фосфодиэфира относительно встречающейся в природе РНК и ДНК. Примерами модификаций межнуклеозидной связи, которые совместимы с настоящим изобретением, являются фосфоротиоат (PS), хирально чистый фосфоротиоат, фосфородитиоат (PS2), фосфоноацетат (PACE), фосфоноацетамид (PACA), тиофосфоноацетат, тиофосфоноацетамид, фосфоротиоатное пролекарство, H-фосфонат, метилфосфонат, метилфосфонотиоат, метилфосфат, метилфосфоротиоат, этилфосфат, этилфосфоротиоат, боранофосфат, боранофосфоротиоат, метилборанофосфат, метилборанофосфоротиоат, метилборанофосфонат, метилборанофосфонотиоат и их производные. Другая модификация включает фосфорамидит, фосфорамидат, N3'→P5' фосфорамидат, фосфородиамидат, фосфортиоамидат, фосфоротиодиамидат, сульфамат, диметиленсульфоксид, сульфонат, метиленимино (MMI), оксалил- и тиоацетамидонуклеиновую кислоту (TANA); и их производные. В зависимости от длины, олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 модификаций основной цепи. Также изобретение охватывает внесение в указанный олигонуклеотид более одной отличающейся модификации основной цепи.
Также изобретение охватывает олигонуклеотид, который содержит межнуклеозидную связь, которая может отличаться с точки зрения атомов нуклеозидов, которые связаны друг с другом, по сравнению со встречающейся в природе межнуклеозидной связью. В этом отношении, олигонуклеотид по изобретению может содержать по меньшей мере одну межнуклеозидную связь, сконструированную как мономеры, связанные 3'-3', 5'-5', 2'-3', 2'-5', 2'-2'. Нумерация положений может отличаться для других химических структур, однако идея сохраняется в объеме изобретения.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является полностью модифицированным посредством фосфоротиоата.
"Модификация сахара" указывает на присутствие модифицированной версии рибозильной части относительно рибозильной части во встречающихся в природе РНК и ДНК (т.е. фуранозильная часть), такой как бициклические сахара, тетрагидропираны, структуры морфолино, 2'-модифицированные сахара, 3'-модифицированные сахара, 4'-модифицированные сахара, 5'-модифицированные сахара и 4'-замещенные сахара. Примеры подходящих модификаций сахаров включают, но не ограничиваются ими, 2'-O-модифицированные нуклеотидные остатки РНК, такие как 2'-O-алкил или 2'-O-(замещенный)алкил, например 2'-O-метил, 2'-O-(2-цианоэтил), 2'-O-(2-метокси)этил (2'-MOE), 2'-O-(2-тиометил)этил, 2'-O-бутирил, 2'-O-пропаргил, 2'-O-аллил, 2'-O-(2-амино)пропил, 2'-O-(2-(диметиламино)пропил), 2'-O-(3-амино)пропил, 2'-O-(3-(диметиламино)пропил), 2'-O-(2-амино)этил, 2'-O-(3-гуанидино)пропил (как описано в патентной заявке WO 2013/061295, University of the Witwatersrand, включенной в настоящее описание в качестве ссылки), 2'-O-(2-(диметиламино)этил); 2'-O-(галогеналкокси)метил (Arai K. et al.), например, 2'-O-(2-хлорэтокси)метил (MCEM), 2'-O-(2,2-дихлорэтокси)метил (DCEM); 2'-O-алкоксикарбонил, например, 2'-O-[2-(метоксикарбонил)этил] (MOCE), 2'-O-[2-(N-метилкарбамоил)этил] (MCE), 2'-O-[2-(N,N-диметилкарбамоил)этил] (DMCE); 2'-O-[метиламинокарбонил]метил; 2'-азидо; 2'-амино и 2'-замещенный амино; 2'-галоген, например, 2'-F, FANA (2'-F арабинозилнуклеиновая кислота); карбо- и аза- модификации сахаров; 3'-O-алкил, например, 3'-O-метил, 3'-O-бутирил, 3'-O-пропаргил; 2',3'-дидезокси; и их производные.
NC
Другая модификация сахара включает "мостиковые" или "бициклические" (BNA) модифицированные части сахаров нуклеиновой кислоты, такие, как встречаются, например, в закрытой нуклеиновой кислоте (LNA), ксило-LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, cEt (2'-O,4'-C связанный этил) LNA, cMOEt (2'-O,4'-C связанный метоксиэтил) LNA, связанной этиленовым мостиком нуклеиновой кислоте (ENA), BNA[N-Me] (как описано в Chem. Commun. 2007, 3765-3767 Kazuyuki Miyashita et al., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), CRN, как описано в патентной заявке WO 2013/036868 (Marina Biotech, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме); разомкнутой нуклеиновой кислоте (UNA) или других ациклических нуклеозидах, таких как описаны в патентной заявке США US 2013/0130378 (Alnylam Pharmaceuticals), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; 5'-метил-замещенных BNA (как описано в патентной заявке США 13/530218, которая включена в качестве ссылки в полном объеме); циклогексенилнуклеиновой кислоте (CeNA), алтриолнуклеиновой кислоте (ANA), гекситолнуклеиновой кислоте (HNA), фторированной HNA (F-HNA), пиранозил-РНК (p-РНК), 3'-дезоксипиранозил-ДНК (p-ДНК); или других модифицированных частях сахаров, таких как морфолино (PMO), катионный морфолино (PMOPlus), PMO-X; трициклоДНК; трицикло-PS-ДНК; и их производные. Производные BNA описаны, например, в WO 2011/097641, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Примеры PMO-X описаны в WO 2011150408, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В зависимости от длины, олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 модификаций сахаров. Также изобретение охватывает внесение более одной отличающейся модификации сахаров в указанный олигонуклеотид.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию сахара, выбранную из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, 2'-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2'-дезоксинуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры). Было показано, что олигонуклеотиды, содержащие 2'-фтор (2-'F) нуклеотид, способны привлекать связывающий энхансер интерлейкина фактор 2 и 3 (ILF2/3) и тем самым способны индуцировать пропускание экзонов в пре-мРНК-мишени (Rigo F, et al., WO 2011/097614).
В другом варианте осуществления олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, содержит или состоит из LNA или ее производного. Более предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению модифицирован по его всей длине модификацией сахара, выбранной из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, морфолино, мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA) или смешанного BNA/ДНК-мера. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является полностью 2'-O-метил-модифицированным.
В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию сахара и по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. Такие модификации включают пептидно-нуклеиновую кислоту (PNA), модифицированную борным кластером PNA, окси-пептидно-нуклеиновую кислоту на основе пирролидина (POPNA), нуклеиновую кислоту на основе гликоля или глицерина (GNA), нуклеиновую кислоту на основе треозы (TNA), ациклическую нуклеиновую кислоту на основе треонинола (aTNA), олигонуклеотиды на основе морфолино (PMO, PPMO, PMO-X), катионные олигомеры на основе морфолино (PMOPlus, PMO-X), олигонуклеотиды с объединенными основаниями и остовами (ONIB), пирролидин-амидные олигонуклеотиды (POM); и их производные. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит остов пептидно-нуклеиновой кислоты и/или остов морфолинофосфородиамидата или их производное. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированным, т.е. содержит по меньшей мере одну 2'-O-метилфосфоротиоатную модификацию, предпочтительно олигонуклеотид по изобретению является полностью 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированным. Предпочтительно, 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированный олигонуклеотид или полностью 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированный олигонуклеотид представляет собой РНК-олигонуклеотид.
Термин "модификация основания" или "модифицированное основание", как определено в настоящем описании, относится к модификации встречающегося в природе основания в РНК и/или ДНК (т.е. пиримидинового или пуринового основания) или к синтезированным de novo основаниям. Такое синтезированное de novo основание может рассматриваться как "модифицированное" по сравнению с существующим основанием.
В дополнение к модификациям, описанным выше, олигонуклеотид по изобретению может содержать дополнительные модификации, такие как различные типы нуклеотидных остатков нуклеиновой кислоты или нуклеотидов, как описано ниже. Для получения олигонуклеотида по изобретению можно использовать различные типы нуклеотидных остатков нуклеиновой кислоты. Указанный олигонуклеотид может иметь по меньшей мере одну модификацию основной цепи и/или сахара и/или по меньшей мере одну модификацию основания по сравнению с олигонуклеотидом на основе РНК или ДНК.
Олигонуклеотид может содержать природные основания пурины (аденин, гуанин) или пиримидины (цитозин, тимин, урацил) и/или модифицированные основания, как определено ниже. В контексте изобретения урацил может быть заменен тимином.
Модификация оснований включает модифицированную версию природных пуриновых и пиримидиновых оснований (например, аденин, урацил, гуанин, цитозин и тимин), таких как гипоксантин, оротовая кислота, агматидин, лизидин, псевдоурацил, псевдотимин, N1-метилпсевдоурацил, 2-тиопиримидин (например, 2-тиоурацил, 2-тиотимин), 2,6-диаминопурин, G-зажим и его производные, 5-замещенный пиримидин (например, 5-галогенурацил, 5-метилурацил, 5-метилцитозин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 5-аминометилурацил, 5-гидроксиметилурацил, 5-аминометилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, Super T), 5-октилпиримидин, 5-тиофенпиримидин, 5-октин-1-илпиримидин, 5-этинилпиримидин, 5-(пиридиламид), 5-изобутил, 5-фенил, как описано в патентной заявке US 2013/0131141 (RXi), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 7-аза-2,6-диаминопурин, 8-аза-7-деазагуанин, 8-аза-7-деазааденин, 8-аза-7-деаза-2,6-диаминопурин, Super G, Super A и N4-этилцитозин, или их производные; N2-циклопентилгуанин (cPent-G), N2-циклопентил-2-аминопурин (cPent-AP) и N2-пропил-2-аминопурин (Pr-AP), или их производные; и вырожденные или универсальные основания, такие как 2,6-дифтортолуол, или отсутствующие основания, такие как абазические участки (например, 1-дезоксирибоза, 1,2-дидезоксирибоза, 1-дезокси-2-O-метилрибоза; или производные пирролидина, в которых кислород кольца заменен азотом (азарибоза)). Примеры производных Super A, Super G и Super T могут быть найдены в патенте США 6683173 (Epoch Biosciences), который включен в настоящее описание в качестве ссылки. Было показано, что cPent-G, cPent-AP и Pr-AP снижает иммуностимулирующие эффекты при включении в миРНК (siRNA) (Peacock H. et al.), и сходные признаки были показаны для псевдоурацила и N1-метилпсевдоурацила (патентная заявка США 2013/0123481, modeRNA Therapeutics, включенная в настоящее описание качестве ссылки в полном объеме).
"Тимин" и "5-метилурацил" могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Аналогично, "2,6-диаминопурин" идентичен "2-аминоаденину", и эти термины могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо.
В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один 5-метилцитозин и/или по меньшей мере один 5-метилурацил и/или по меньшей мере одно 2,6-диаминопуриновое основание, что следует понимать как то, что по меньшей мере одно из цитозиновых нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 5 кольца пиримидина метильной группой (т.е. 5-метилцитозином), и/или что по меньшей мере одно из урацильных нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 5 кольца пиримидина метильной группой (т.е. 5-метилурацил), и/или что по меньшей мере одно из адениновых нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 2 аминогруппой (т.е. 2,6-диаминопурин), соответственно. В контексте изобретения выражение "замена протона метильной группой в положении 5 кольца пиримидина" может быть заменено выражением "замена пиримидина 5-метилпиримидином", причем пиримидин обозначает только урацил, только цитозин или оба из них. Аналогично, в контексте изобретения выражение "замена протона аминогруппой в положении 2 аденина" может быть заменено выражением "замена аденина 2,6-диаминопурином". Если указанный олигонуклеотид содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более остатков цитозина, урацила и/или аденина, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более остатков цитозина, урацила и/или аденина, соответственно, могут быть модифицированы таким путем. В предпочтительном варианте осуществления все остатки цитозина, все остатки урацила и/или все остатки аденина модифицированы таким путем или заменены 5-метилцитозином, 5-метилурацилом и/или 2,6-диаминопурином, соответственно.
Было обнаружено, что присутствие 5-метилцитозина, 5-метилурацила и/или 2,6-диаминопурина в олигонуклеотиде по изобретению имеет положительный эффект по меньшей мере на один из параметров или улучшение по меньшей мере одного из параметров указанного олигонуклеотида. В этом контексте параметры могут включать: аффинность и/или кинетику связывания, активность сайленсинга, биостабильность, (внутритканевое) распределение, клеточный захват и/или транспорт, и/или иммуногенность указанного олигонуклеотида, как объяснено ниже.
Поскольку известно, что несколько модификаций, упомянутых выше, увеличивает величину Tm и, таким образом, усиливает связывание определенного нуклеотида с его аналогом на его мРНК-мишени, эти модификации могут быть исследованы в отношении усиления связывания олигонуклеотида по изобретению как с областью первого экзона, так и с областью второго экзона, в контексте изобретения. Поскольку последовательности олигонуклеотида по изобретению могут не быть на 100% обратно комплементарными данной области первого экзона и/или второго экзона, увеличивающие Tm модификации, такие как мостиковый нуклеотид или BNA (такой как LNA) или модификация основания, выбранная из 5-метилпиримидинов и/или 2,6-диаминопурина, предпочтительно могут быть осуществлены в нуклеотидном положении, которое обратно комплементарно указанной первой и/или указанной второй области указанных экзонов.
Аффинность связывания и/или кинетика связывания или гибридизации зависят от термодинамических свойств AON. Они по меньшей мере частично определяются температурой плавления указанного олигонуклеотида (Tm; вычисляемая, например, с помощью калькулятора свойств олигонуклеотидов (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html или http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа) и/или свободной энергией комплекса олигонуклеотида и экзона-мишени (с использованием RNA structure версии 4.5 или РНК mfold версии 3.5). Если Tm увеличивается, активность пропускания экзона, как правило, возрастает, однако ожидается, что, когда Tm является слишком высокой, AON станет менее специфичным к последовательности. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности олигонуклеотида. Таким образом, трудно привести предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров.
Активность олигонуклеотида по изобретению предпочтительно определяют следующим образом:
- смягчение одного или нескольких симптома(ов) заболевания, ассоциированного с мутацией, присутствующей в первом и/или во втором экзоне, и/или с мутацией, присутствующей в участке, начинающемся в указанном первом экзоне и оканчивающемся в указанном втором экзоне, предпочтительно смягчение одного или нескольких симптома(ов) DMD или BMD; и/или
- смягчение одной или нескольких характеристик клетки от пациента, предпочтительно мышечной клетки от пациента; и/или
- обеспечение у указанного индивидуума функционального или полуфункционального белка, предпочтительно функционального или полуфункционального белка дистрофина; и/или
- по меньшей мере частичное снижение продукции аберрантного белка у указанного индивидуума, предпочтительно по меньшей мере частичное снижение продукции аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума. Каждый из этих признаков и анализов для их оценки определен в настоящем описании ниже.
Ожидается, что предпочтительный олигонуклеотид по изобретению, содержащий 5-метилцитозин и/или 5-метилурацил и/или 2,6-диаминопуриновое основание, будет проявлять увеличенную активность по сравнению с соответствующей активностью олигонуклеотида без какого-либо 5-метилцитозина, без какого-либо 5-метилурацила и без какого-либо 2,6-диаминопуринового основания. Это различие в активности может составлять по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. Биораспределение и биостабильность предпочтительно по меньшей мере частично определяются валидированным анализом лигирования при гибридизации, взятого из Yu et al., 2002. В одном варианте осуществления образцы плазмы или образцы гомогенизированной ткани инкубируют с конкретным улавливающим олигонуклеотидным зондом. После разделения, DIG-меченный олигонуклеотид лигируют с комплексом и проводят детекцию с использованием связанной с антителом против DIG пероксидазой. Некомпартментный анализ фармакокинетики проводят с использованием пакета программ WINNONLIN (модель 200, версия 5.2, Pharsight, Mountainview, CA). Проводят мониторинг уровней AON (мкг) на мл плазмы или мг ткани с течением времени для оценки площади под кривой (AUC), максимальной концентрации (Cmax), времени до достижения максимальной концентрации (Tmax), терминального времени полужизни и латентного периода всасывания (tlag). Такой предпочтительный анализ описан в экспериментальной части.
Олигонуклеотид может стимулировать врожденный иммунный ответ путем активации Toll-подобных рецепторов (TLR), включая TLR9 и TLR7 (Krieg A.M., et al., 1995). Активация TLR9, как правило, происходит вследствие присутствия неметилированных последовательностей CG, присутствующих в олигодезоксинуклеотидах (ODN), посредством имитации бактериальной ДНК, которая активирует врожденную иммунную систему посредством опосредуемого TLR9 высвобождения цитокинов. Однако 2'-O-метил-модификация может значительно снижать такой возможный эффект. Описано, что TLR7 распознает урациловые повторы в РНК (Diebold S.S., et al., 2006).
Активация TLR9 и TLR7 приводит к набору скоординированных иммунных ответов, которые включают врожденный иммунитет (макрофаги, дендритные клетки (DC) и NK-клетки) (Krieg A.M., et al., 1995; Krieg A.M., et al. 2000). В этот процесс вовлечено несколько хемокинов и цитокинов, таких как IP-10, TNFα, IL-6, MCP-1 и IFNα (Wagner H., et al., 1999; Popovic P.J., et al., 2006). Воспалительные цитокины привлекают дополнительные защитные клетки из крови, такие как T- и B-клетки. Уровни этих цитокинов можно исследовать с помощью исследования in vitro. В кратком изложении, цельную кровь человека инкубируют с возрастающими концентрациями олигонуклеотидов, после чего уровни цитокинов определяют с помощью стандартных коммерчески доступных наборов для ELISA. Снижение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению снижению концентрации по меньшей мере одного из цитокинов, упомянутых выше, при сравнении с концентрацией соответствующего цитокина в анализе в клетке, обработанной олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере один 5-метилцитозин и/или 5-метилурацил и/или 2,6-диаминопурин, по сравнению с клеткой, обработанной соответствующим олигонуклеотидом, не имеющим 5-метилцитозинов, 5-метилурацилов или 2,6-диаминопуринов.
Таким образом, предпочтительный олигонуклеотид по изобретению имеет улучшенный параметр, такой как приемлемая или сниженная иммуногенность и/или лучшее биораспределение и/или приемлемая или улучшенная кинетика связывания РНК и/или термодинамические свойства по сравнению с соответствующим олигонуклеотидом без 5-метилцитозина, без 5-метилурацила и без 2,6-диаминопурина. Каждый из этих параметров можно оценивать с использованием анализов, известных специалисту в данной области.
Предпочтительный олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из молекулы РНК или модифицированной молекулы РНК. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид является одноцепочечным. Однако квалифицированному специалисту будет понятно, что одноцепочечный олигонуклеотид может образовывать внутреннюю двухцепочечную структуру. Однако этот олигонуклеотид, тем не менее, называют одноцепочечным олигонуклеотидом в контексте настоящего изобретения. Одноцепочечный олигонуклеотид имеет несколько преимуществ по сравнению с двухцепочечным олигонуклеотидом миРНК: (i) ожидается, что его синтез будет более простым, чем синтез двух комплементарных цепей миРНК; (ii) существует более широкий диапазон химических модификаций, возможных для повышения захвата в клетки, более высокой (физиологической) стабильности и снижения потенциальных общих неблагоприятных эффектов; (iii) миРНК имеют более высокий потенциал для неспецифических эффектов (включая гены вне мишени) и улучшенную фармакологию (например, возможен меньший контроль эффективности и селективности схемы лечения или дозы); и (iv) миРНК с меньшей вероятностью будут действовать в ядре и не могут быть направлены против интронов.
В другом варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит абазический участок или абазический мономер. В контексте изобретения такой мономер может называться абазическим участком или абазическим мономером. Абазический мономер представляет собой нуклеотидный остаток или структурный элемент, который лишен нуклеинового основания, по сравнению с соответствующим нуклеотидным остатком, содержащим нуклеиновое основание. В рамках изобретения абазический мономер, таким образом, представляет собой часть структурного элемента олигонуклеотида, но лишенную нуклеинового основания. Такой абазический мономер может присутствовать, или может быть связан, или может быть присоединен, или может быть конъюгирован со свободным концом олигонуклеотида.
В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит 1-10 или более абазических мономеров. Таким образом, в олигонуклеотиде по изобретению может находиться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более абазических мономеров.
Абазический мономер может представлять собой любой тип, известный и понятный квалифицированному специалисту, неограничивающие примеры которых представлены ниже:
1
2
1
2
1
2
В рамках настоящего изобретения, R и R независимо представляют собой H, олигонуклеотид или другой абазический участок(ки) при условии, что не оба из R и R представляют собой H и R и R не оба являются олигонуклеотидами. Абазический мономер(ы) может быть связан с любым или с обоими концами олигонуклеотида, как указано выше. Следует отметить, что олигонуклеотид, связанный с одним или двумя абазическим участком(ами) или абазическим мономером(ами), может содержать менее 10 нуклеотидов. В этом отношении олигонуклеотид по изобретению может содержать по меньшей мере 10 нуклеотидов, необязательно включающих один или несколько абазических участков или абазических мономеров на одном или обоих концах. Другие примеры абазических участков, которые охватываются изобретением, описаны в патентной заявке США 2013/013378 (Alnylam Pharmaceuticals), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В зависимости от длины олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 модификаций оснований. Также изобретение охватывает внесение более одной определенной модификации оснований в указанный олигонуклеотид.
Таким образом, в одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит:
(a) по меньшей мере одну модификацию основания, выбранную из 2-тиоурацила, 2-тиотимина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, тимина, 2,6-диаминопурина; и/или
(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, выбранную из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, 2'-O-дезокси (ДНК), 2'-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2'-дезокси-модифицированные нуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры); и/или
(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, выбранную из фосфоротиоата или фосфородиамидата.
В другом варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит:
(a) по меньшей мере одну модификацию оснований, выбранную из 5-метилпиримидина и 2,6-диаминопурина; и/или
(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, которая представляет собой 2'-O-метил; и/или
(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, которая представляет собой фосфоротиоат.
В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию по сравнению со встречающимся в природе олигонуклеотидом на основе рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида, более предпочтительно
(a) по меньшей мере одну модификацию основания, предпочтительно выбранную из 2-тиоурацила, 2-тиотимина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, тимина, 2,6-диаминопурина, более предпочтительно, выбранную из 5-метилпиримидина и 2,6-диаминопурина; и/или
(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, предпочтительно выбранную из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, 2'-O-дезокси (ДНК), 2'-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2'-дезокси-модифицированные нуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры), более предпочтительно модификация сахара представляет собой 2'-O-метил; и/или
(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, предпочтительно выбранную из фосфоротиоата или фосфородиамидата, более предпочтительно модификация основной цепи представляет собой фосфоротиоат.
Таким образом, олигонуклеотид согласно этому варианту осуществления изобретения содержит модификацию основания (a) и отсутствие модификации сахара (b) и отсутствие модификации основной цепи (c). Другой предпочтительный олигонуклеотид согласно этому аспекту изобретения включает модификацию сахара (b) и отсутствие модификации основания (a) и отсутствие модификации основной цепи (c). Другой предпочтительный олигонуклеотид согласно этому аспекту изобретения содержит модификацию основной цепи (c) и отсутствие модификации основания (a) и отсутствие модификации сахара (b). Также предполагается, что настоящее изобретение охватывает олигонуклеотиды, не имеющие ни одной из упомянутых выше модификаций, а также олигонуклеотиды, содержащие две, т.е. (a) и (b), (a) и (c) и/или (b) и (c), или все три из модификаций (a), (b) и (c), как определено выше.
В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению модифицирован по всей его длине одной или несколькими одинаковыми модификациями, выбранными из (a) одной из модификаций оснований; и/или (b) одной из модификаций сахара; и/или (c) одной из модификаций основной цепи.
С появлением технологии имитации нуклеиновых кислот стало возможным получать молекулы, которые обладают сходными, предпочтительно одинаковыми по типу характеристиками гибридизации, но не обязательно сходными количественными характеристиками, с самой нуклеиновой кислотой. Такие функциональные эквиваленты, безусловно, также являются пригодными для применения в рамках изобретения.
В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит инозин, гипоксантин, универсальное основание, вырожденное основание и/или нуклеозид или нуклеотид, содержащие основание, способное образовывать качающуюся пару оснований или ее функциональный эквивалент. Применение инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является высоко перспективным, как пояснено ниже. Инозин, например, является известным модифицированным основанием, которое может образовывать пару с тремя основаниями: урацил, аденин и цитозин. Инозин представляет собой нуклеозид, который образуется, когда гипоксантин связан с кольцом рибозы (также известным как рибофураноза) через β [бета]-N9-гликозидную связь. Инозин (I) обычно встречается в тРНК, и он необходим для надлежащей трансляции генетического кода в качающихся парах оснований. Качающаяся пара оснований может существовать между G и U, или между I с одной стороны и U, A или C с другой стороны. Это является фундаментальным при образовании вторичной структуры РНК. Ее термодинамическая стабильность сравнима с термодинамической стабильностью пары оснований Уотсона-Крика. Генетический код исправляет несоответствия в количестве аминокислот (20) для триплетных кодонов (64), с использованием модифицированных пар оснований в первом основании антикодона.
Первое преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет конструировать олигонуклеотид, который способен связываться с областью первого экзона из пре-мРНК и способен связываться с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область из указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Иными словами, присутствие инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет связывание указанного олигонуклеотида с областью первого экзона и с областью второго экзона указанной пре-мРНК.
Второе преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет конструировать олигонуклеотид, который охватывает однонуклеотидный полиморфизм (SNP), без опасения, что полиморфизм нарушит эффективность отжига олигонуклеотида. Таким образом, в рамках изобретения использование такого основания позволяет конструирование олигонуклеотида, который можно использовать для индивидуума, имеющего SNP в участке пре-мРНК, на который нацелен олигонуклеотид по изобретению.
+
+
Третье преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, представляет собой случай, когда указанный олигонуклеотид в норме содержит CpG, если он сконструирован как являющийся комплементарным части первого экзона пре-мРНК, как определено в настоящем описании. Присутствие CpG в олигонуклеотиде обычно ассоциировано с увеличенной иммуногенностью указанного олигонуклеотида (Dorn A. and Kippenberger S.). Эта увеличенная иммуногенность является нежелательной, поскольку она может индуцировать разрушение мышечных волокон. Ожидается, что замена гуанина инозином в одном, двух или более CpG в указанном олигонуклеотиде обеспечит олигонуклеотид со сниженным и/или приемлемым уровнем иммуногенности. Иммуногенность можно оценивать в модели на животных путем оценки присутствия клеток CD4 и/или CD8 и/или инфильтрации воспалительных мононуклеоцитов в биоптате мышц указанного животного. Иммуногенность также можно оценивать в крови животного или человека, подвергаемого лечению олигонуклеотидом по изобретению, путем обнаружения присутствия нейтрализующего антитела и/или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа, известного квалифицированному специалисту. Увеличение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению увеличению по меньшей мере одного из этих типов клеток по сравнению с количеством каждого типа клеток в соответствующем биоптате мышц животного до обработки или лечения соответствующим олигонуклеотидом, имеющим по меньшей мере один инозин (гипоксантин) и/или универсальное основание и/или вырожденное основание и/или нуклеотид, содержащий основание, способное образовывать качающуюся пару оснований. Альтернативно, увеличение иммуногенности можно оценивать путем обнаружения присутствия или увеличения количества нейтрализующего антитела или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа. Снижение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению снижению по меньшей мере одного из этих типов клеток по сравнению с количеством соответствующего типа клеток в соответствующем биоптате мышц животного до лечения или после лечения соответствующим олигонуклеотидом, не имеющим инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований. Альтернативно, снижение иммуногенности можно оценивать по отсутствию или снижению количества указанного соединения и/или нейтрализующих антител с использованием стандартного иммуноанализа.
Четвертым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является избегание или снижение потенциальной мультимеризации или агрегации олигонуклеотидов. Например, известно, что олигонуклеотид, содержащий мотив G-квартет, имеет тенденцию к образованию квадруплекса, мультимера или агрегата, образованного хугстиновским спариванием оснований четырех одноцепочечных олигонуклеотидов (Cheng A.J. и Van Dyke M.W.), что, безусловно, нежелательно: ожидается, что в результате этого эффективность олигонуклеотида снизится. Мультимеризацию или агрегацию предпочтительно оценивают стандартными способами полиакриламидного неденатурирующего гель-электрофореза, известными квалифицированному специалисту. В предпочтительном варианте осуществления менее 20% или 15%, 10%, 7%, 5% или менее от общего количества олигонуклеотида по изобретению обладает способностью к мультимеризации или агрегации, оцениваемой с использованием анализа, упомянутого выше.
Пятым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, таким образом, также является избегание квадруплексных структур, которая ассоциирована с антитромботической активностью (Macaya R.F., et al.), а также со связыванием с и ингибированием фагоцитарного рецептора макрофагов (Suzuki K., et al.).
Шестым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является возможность конструирования олигонуклеотида с улучшенной кинетикой связывания РНК и/или термодинамическими свойствами. Кинетика связывания РНК и/или термодинамические свойства по меньшей мере частично определяются температурой плавления олигонуклеотида (Tm; вычисляемая с помощью калькулятора свойств олигонуклеотидов (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа) и/или свободной энергией комплекса AON и экзона-мишени (с использованием RNA structure версии 4.5). Если Tm является чрезмерно высокой, ожидается, что олигонуклеотид будет менее специфичным. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности олигонуклеотида. Таким образом, трудно привести предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров. Приемлемая Tm может находиться в диапазоне от 35 до 85°C, и приемлемая свободная энергия может находиться в диапазоне от 15 до 45 ккал/моль.
В зависимости от длины, олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 остатков инозина (гипоксантина) и/или универсальных оснований и/или вырожденных оснований и/или нуклеотидов, содержащих основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, или их функциональные эквиваленты.
Предпочтительно, указанный олигонуклеотид по изобретению содержит РНК, поскольку дуплексы РНК/РНК являются высокостабильными. Является предпочтительным, чтобы РНК-олигонуклеотид содержал модификацию, обеспечивающую РНК с дополнительным свойством, например, устойчивостью к эндонуклеазам, экзонуклеазам и РНК-азе H, дополнительной прочностью гибридизации, увеличенной стабильностью (например, в жидкостях организма), увеличенной или сниженной пластичностью, сниженной токсичностью, увеличенным внутриклеточным транспортом, тканевой специфичностью и т.д. Предпочтительные модификации описаны выше.
Таким образом, один вариант осуществления относится к олигонуклеотиду, который содержит по меньшей мере одну модификацию. Предпочтительный модифицированный олигонуклеотид является полностью 2'-O-метил-модифицированным. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию 2'-O-метил-фосфоротиоатным олигорибонуклеотидом и модификацию мостиковой нуклеиновой кислотой (BNA, как проиллюстрировано выше). В другом варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию 2'-O-метоксиэтилфосфоротиоатом и мостиковую нуклеиновую кислоту (BNA, как проиллюстрировано выше). В другом варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию мостиковой нуклеиновой кислотой (BNA, как проиллюстрировано выше) и модификацию олигодезоксирибонуклеотидом. Эта конкретная комбинация обладает лучшей специфичностью последовательности по сравнению с эквивалентом, состоящим только из мостиковой нуклеиновой кислоты, и обладает увеличенной эффективностью по сравнению с олигонуклеотидом, состоящим из модификации 2'-O-метилфосфоротиоатным олиго(дезокси)рибонуклеотидом.
2+
Соединение, как описано в рамках изобретения, предпочтительно может обладать ионогенными группами. Ионогенные группы могут представлять собой основания или кислоты, и они могут быть заряженными или нейтральными. Ионогенные группы могут присутствовать в качестве пары ионов с соответствующим противоионом, который имеет противоположный заряд(ы). Примерами катионных противоионов являются натрий, калий, цезий, Tris, литий, кальций, магний, триалкиламмоний, триэтиламмоний и тетраалкиламмоний. Примерами анионных противоионов являются хлорид, бромид, йодид, лактат, мезилат, ацетат, трифторацетат, дихлорацетат и цитрат. Примеры противоионов описаны [например, Kumar L, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме]. Примеры применения двух- или трехвалентных противоионов, особенно Ca, описаны в качестве дополнительных положительных характеристик к определенным олигонуклеотидам в патентной заявке США 2012046348 (Replicor), которая включена в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительные двухвалентные или трехвалентные противоионы выбирают из следующего перечня или группы: кальций, магний, кобальт, железо, марганец, барий, никель, медь и цинк. Предпочтительным двухвалентным противоионом является кальций. Таким образом, настоящее изобретение охватывает приготовление, получение и применение композиции, содержащей олигонуклеотид по изобретению и любой другой противоион, определенный выше, предпочтительно кальций.
Такой способ получения указанной композиции, содержащей указанный олигонуклеотид и указанный противоион, предпочтительно кальций, может быть следующим: олигонуклеотид по изобретению можно растворять в фармацевтически приемлемом водном эксципиенте, и постепенно к растворенному олигонуклеотиду можно добавлять раствор, содержащий указанный противоион, чтобы хелатный комплекс олигонуклеотида оставался растворимым.
2+
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению приводят в контакт с композицией, содержащей такой противоион, предпочтительно Ca, для формирования хелатного комплекса олигонуклеотида, содержащего два или более идентичных олигонуклеотидов, связанных таким противоионом, как определено в настоящем описании. Композиция, содержащая хелатный комплекс олигонуклеотида, содержащий два или более идентичных олигонуклеотида, связанных противоионом, предпочтительно кальцием, таким образом, охватывается настоящим изобретением.
Способ конструирования олигонуклеотида
Таким образом, в следующем аспекте изобретения предусматривается способ конструирования олигонуклеотида, где указанный способ приводит к олигонуклеотиду, как определено выше.
Этот способ включает следующие стадии:
(a) идентификация комбинации в рамке считывания первого и второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с областью указанного первого экзона;
(b) конструирование олигонуклеотида, который способен связываться с указанной областью указанного первого экзона и указанной областью указанного второго экзона; и
(c) где указанное связывание приводит к пропусканию указанного первого экзона и указанного второго экзона, предпочтительно к пропусканию мультиэкзонного участка, начинающегося указанным первым экзоном и охватывающего один или несколько экзонов, присутствующих между указанным первым и указанным вторым экзонами, и, в лучшем случае, к пропусканию всего участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами.
На стадии b) такого способа указанный олигонуклеотид предпочтительно конструируют так, чтобы его связывание препятствовало по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанного первого и/или второго экзонов в указанной пре-мРНК.
Альтернативно или в комбинации с препятствованием регулирующей сплайсинг последовательности, связывание указанного олигонуклеотида предпочтительно препятствует вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК.
Олигонуклеотид, получаемый этим способом, способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов в указанной пре-мРНК. Предпочтительно индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно располагается между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный мРНК-транскрипт находится в рамке считывания. Олигонуклеотид предпочтительно способен индуцировать пропускание всего участка экзонов между указанным первым экзоном и указанным вторым экзоном. В одном варианте осуществления указанные области указанного первого экзона и указанного второго экзона содержат регулирующий сплайсинг элемент, так что связывание указанного олигонуклеотида способно препятствовать по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанных первого и второго экзонов. Также предусматривается, что связывание указанного олигонуклеотида препятствует вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК. Предпочтительная регулирующая сплайсинг последовательность содержит участок связывания серин-аргининового (SR) белка, энхансер сплайсинга экзонов (ESE), последовательность распознавания экзонов (ERS) и/или сайленсер сплайсинга экзонов (ESS).
Каждый признак этого способа уже определен в настоящем описании или известен квалифицированному специалисту.
Предпочтительные олигонуклеотиды
Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению предназначен для применения в качестве лекарственного средства, более предпочтительно, указанное соединение предназначено для применения в модулирующих РНК терапевтических средствах. Более предпочтительно, указанное модулирование РНК приводит к коррекции нарушенной транскрипционной рамки считывания и/или к восстановлению экспрессии желаемого или ожидаемого белка. Таким образом, способ по изобретению и олигонуклеотид по изобретению можно в принципе применять к любому заболеванию, связанному с присутствием нарушающей рамку считывания мутации, что приводит к аберрантному транскрипту и/или к отсутствию кодируемого белка и/или к присутствию аберрантного белка. В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению и олигонуклеотид по изобретению применяют к ассоциированным с заболеванием генам, содержащим повторяющиеся последовательности и, таким образом, области с относительно высокой идентичностью последовательности (т.е. по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% идентичностью последовательности между областью второго экзона и областью первого экзона, как определено в настоящем описании). Неограничивающими примерами являются гены со спектрин-подобными повторами (поскольку ген DMD вовлечен в мышечную дистрофию Дюшенна, как описано в настоящем описании), Kelch-подобными повторами (как например, ген KLHL3, вовлеченный в семейную гиперкалиемическую гипертензию (Louis-Dit-Picard H et al.), ген KLHL6, вовлеченный в хронический лимфоцитарный лейкоз (Puente XS et al.), ген KLHL7, вовлеченный в пигментный ретинит (Friedman JS et al.), гены KLHL7/12, вовлеченные в синдром Шегрена (Uchida K et al.), ген KLHL9, вовлеченный в дистальную миопатию(Cirak S et al.), ген KLHL16 или GAN, вовлеченный в гигантскую аксональную невропатию (Bomont P et al.), гены KLHL19 или KEAP1, вовлеченные в несколько злокачественных опухолей (Dhanoa BS et al.), ген KLHL20, вовлеченный в промиелоцитарный лейкоз(Dhanoa BS et al.), или гены KLHL37 или ENC1, вовлеченные в опухоли головного мозга (Dhanoa BS et al.), FGF-подобными повторами, EGF-подобными повторами (как, например, ген NOTCH3, вовлеченный в CADASIL (Chabriat H et al.), гены SCUBE, вовлеченные в злокачественную опухоль или метаболическое заболевание костей, ген нейрексина-1 (NRXN1), вовлеченный в нейропсихиатрические нарушения и идиопатическую генерализованную эпилепсию (Moller RS et al.), ген Del-1, ген тенасцин-C (TNC), вовлеченный в атеросклероз и болезнь коронарных артерий (Mollie A et al.), ген THBS3 или ген фибриллина (FBN1), вовлеченный в синдром Марфана (Rantamaki T et al.), анкирин-подобными повторами (как, например, ген ANKRD1, вовлеченный в кардиомиопатию с дилятацией (Dubosq-Bidot L et al.), ген ANKRD2, ген ANKRD11, вовлеченные в синдром KBG (Sirmaci A et al.), ген ANKRD26, вовлеченный в тромбоцитопению (Noris P et al.) или диабет (Raciti GA et al.), ген ANKRD55, вовлеченный в рассеянный склероз (Alloza I et al.), или ген TRPV4, вовлеченный в дистальную спинальную мышечную атрофию (Fiorillo C et al.), HEAT-подобными повторами (как, например, ген, вовлеченный в болезнь Хантингтона), аннексин-подобными повторами, лейцин-богатыми повторами (как, например, гены NLRP2 и NLRP7, вовлеченные в идиопатическое привычное невынашивание беременности (Huang JY et al.)), ген LRRK2, вовлеченный в болезнь Паркинсона (Abeliovich A et al.), ген NLRP3, вовлеченный в болезнь Альцгеймера или менингит(Heneka MT et al.), ген NALP3, вовлеченный в почечную недостаточность (Knauf F et al.), или ген LRIG2, вовлеченный в урофациальный синдром (Stuart HM et al.), или доменами ингибитора сериновой протеазы (как, например, ген SPINK5, вовлеченный в синдром Незертона (Hovnanian A et al.), как описано в Andrade M.A. et al.
В контексте изобретения предпочтительной пре-мРНК или транскриптом является пре-мРНК или транскрипт дистрофина. Эта предпочтительная пре-мРНК или транскрипт предпочтительно являются человеческими. Заболевание, связанное с присутствием мутации, присутствующей в пре-мРНК дистрофина, представляет собой DMD или BMD, в зависимости от мутации. Предпочтительные комбинации и области первого и второго экзонов из пре-мРНК дистрофина, подлежащие применению в контексте изобретения, представлены в таблице 2.
В предпочтительном варианте осуществления соединение по изобретению используют для индукции пропускания экзона в клетке, в органе, в ткани и/или у пациента, предпочтительно у пациента с BMD или DMD или в клетке, органе, ткани, происходящих из указанного пациента. Пропускание экзона приводит к зрелой мРНК, которая не содержит пропущенного экзона, и, таким образом, когда указанный экзон кодирует аминокислоты, оно может приводить к экспрессии измененного, внутренне укороченного, но от частично до в большой степени функционального продукта дистрофина. Технология пропускания экзонов в настоящее время направлена на применение AON или транскрибирующих AON генных конструкций. Способы пропускания экзонов в настоящее время используют для борьбы с генетическими мышечными дистрофиями. Недавно авторами настоящего изобретения и другими исследователями были сообщены перспективные результаты в отношении терапии на основе индуцируемого AON пропускания экзонов, нацеленной на восстановление рамки считывания пре-мРНК дистрофина из мыши mdx и от пациентов с DMD (Heemskerk H., et al., Cirak S., et al., Goemans et al.). Путем направленного пропускания конкретного экзона тяжелый фенотип DMD (отсутствие функционального дистрофина) преобразуется в более мягкий фенотип BMD (экспрессия функционального или полуфункционального дистрофина). Пропускание экзона предпочтительно индуцируется связыванием AON, нацеленных на внутреннюю последовательность экзона.
Ниже изобретение иллюстрируется при помощи мутантной пре-мРНК дистрофина, где присутствуют первый и второй экзоны. Как определено в настоящем описании, пре-мРНК дистрофина предпочтительно означает пре-мРНК гена DMD, кодирующего белок дистрофина. Мутантная пре-мРНК дистрофина соответствует пре-мРНК пациента с BMD или DMD с мутацией по сравнению с пре-мРНК DMD дикого типа у здорового индивидуума, что приводит к (сниженным уровням) аберрантному белку (BMD), или к отсутствию функционального дистрофина (DMD). Пре-мРНК дистрофина также называют пре-мРНК DMD. Ген дистрофина также может быть называться геном DMD. Дистрофин и DMD могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.
Пациент предпочтительно означает пациента, имеющего DMD или BMD, как определено в настоящем описании ниже, или пациента, предрасположенного к развитию DMD или BMD вследствие его (или ее) генетического фона. В случае пациента с DMD, используемое соединение предпочтительно корректирует мутацию, присутствующую в гене DMD указанного пациента и, таким образом, предпочтительно образует белок дистрофина, сходный с белком дистрофина пациента с BMD: указанный белок предпочтительно представляет собой функциональный или полуфункциональный дистрофин, как определено в настоящем описании ниже. В случае пациента с BMD, антисмысловой олигонуклеотид по изобретению предпочтительно модифицирует мутацию, присутствующую в гене BMD указанного пациента и предпочтительно образует дистрофин, который является более функциональным, чем дистрофин, который исходно присутствует у указанного пациента с BMD.
Как определено в настоящем описании, функциональный дистрофин предпочтительно представляет собой дистрофин дикого типа, соответствующий белку, имеющему аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO: 1. Функциональный дистрофин предпочтительно представляет собой дистрофин, который имеет действующий связывающий домен в его N-концевой части (первые 240 аминокислот на N-конце), цистеин-богатый домен (аминокислоты с 3361 по 3685) и C-концевой домен (последние 325 аминокислот на C-конца), причем каждый из этих доменов присутствует в дистрофине дикого типа, как известно квалифицированному специалисту. Аминокислоты, указанные в настоящем описании, соответствуют аминокислотам дистрофина дикого типа, указанным в SEQ ID NO: 1. Иными словами, функциональный или полуфункциональный дистрофин представляет собой дистрофин, который проявляет по меньшей мере в некоторой степени активность дистрофина дикого типа. "По меньшей мере в некоторой степени" предпочтительно означает по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% соответствующей активности функционального дистрофина дикого типа. В этом контексте активность функционального дистрофина предпочтительно представляет собой связывание с актином и взаимодействие с ассоциированным с дистрофином гликопротеиновым комплексом (DGC) или (DAGC)(Ehmsen J et al.). Связывание дистрофина с актином и с комплексом DGC можно визуализировать либо посредством ко-иммунопреципитации с использованием экстрактов тотального белка, либо посредством иммунофлуоресцентного анализа поперечных срезов из биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофичной, как известно квалифицированному специалисту.
Индивидуумы, страдающие DMD, как правило, имеют мутацию в гене, кодирующем дистрофин, которая препятствует синтезу полного белка, например, преждевременный стоп-кодон препятствует синтезу C-конца. При BMD ген дистрофина также содержит мутацию, однако эта мутация не нарушает открытую рамку считывания и синтезируется C-конец. В результате образуется (полу)функциональный или функциональный белок дистрофин, который обладает сходным типом активности с белком дикого типа, хотя и не обязательно сходным уровнем активности. Геном индивидуума с BMD, как правило, кодирует белок дистрофин, содержащий N-концевую часть (первые 240 аминокислот на N-конце), цистеин-богатый домен (аминокислоты с 3361 по 3685) и C-концевой домен (последние 325 аминокислот на C-конце), однако в большинстве случаев его центральный домен в форме стержня может быть короче, чем у дистрофина дикого типа (Monaco A.P., et al.).
Пропускание экзонов для лечения DMD, как правило, относится к обходу преждевременного стоп-кодона в пре-мРНК путем пропускания экзона, фланкирующего или содержащего мутацию. Это позволяет коррекцию открытой рамки считывания и синтез внутренне укороченного белка дистрофина, но включающего C-конец. В предпочтительном варианте осуществления у индивидуума, имеющего DMD и подвергаемого лечению олигонуклеотидом по изобретению, синтезируется дистрофин, который проявляет, по меньшей мере в некоторой степени, сходную активность с дистрофином дикого типа. Более предпочтительно, если указанный индивидуум является пациентом с DMD или предположительно является пациентом с DMD, (полу)функциональный дистрофин представляет собой дистрофин индивидуума, имеющего BMD: как правило, указанный дистрофин способен взаимодействовать как с актином, так и с DGC или DAGC (Ehmsen J., et al., Monaco A.P., et al.).
Центральный стержневой домен дистрофина дикого типа содержит 24 спектрин-подобных повтора (Ehmsen J., et al.). Во многих случаях центральный стержневой домен в BMD-подобных белках является более коротким, чем в дистрофине дикого типа (Monaco A.P., et al.). Например, центральный стержневой домен дистрофина, как предусматривается в настоящем описании, может содержать от 5 до 23, от 10 до 22 или от 12 до 18 спектрин-подобных повторов при условии, что он может связываться с актином и с DGC.
Смягчение одного или нескольких симптомов DMD или BMD у индивидуума с использованием соединения по изобретению можно оценивать с помощью любого из следующих анализов: продление времени до прекращения хождения, увеличение мышечной силы, повышение способности поднимать тяжести, улучшение времени вставания с пола, улучшение времени ходьбы на девять метров, улучшение времени подъема на четыре ступеньки, улучшение степени функции ног, улучшение легочной функции, улучшение сердечной функции, улучшение качества жизни. Каждый из этих анализов известен квалифицированному специалисту. В качестве примера, в публикации Manzur et al. (Manzur A.Y. et al.) приводится обширное пояснение каждого из этих анализов. Для каждого из этих анализов, когда выявляют поддающееся обнаружению улучшение или продление параметра, измеряемого в анализе, это предпочтительно означает, что один или несколько симптомов DMD или BMD смягчились у индивидуума с использованием соединения по изобретению. Поддающееся обнаружению улучшение или продление предпочтительно представляет собой статистически значимое улучшение или продление, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Альтернативно, смягчение одного или нескольких симптомов DMD или BMD можно оценивать посредством измерения улучшения функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон. В предпочтительном способе один или несколько симптомов пациента с DMD или BMD смягчается и/или одна или несколько характеристик одной или нескольких мышечных клеток от пациента с DMD или BMD улучшается. Такие симптомы или характеристики можно оценивать на клеточном, тканевом уровне или у самого пациента.
Смягчение одной или нескольких характеристик мышечной клетки от пациента с DMD или BMD можно оценивать с помощью любого из следующих анализов на миогенной клетке или мышечной клетке от этого пациента: сниженный захват кальция мышечными клетками, сниженный синтез коллагена, измененная морфология, измененный биосинтез липидов, сниженный окислительный стресс и/или улучшенная функция, целостность и/или выживаемость мышечных волокон. Эти параметры обычно оценивают с использованием иммунофлуоресцентных и/или гистохимических анализов поперечных срезов биоптатов мышц.
Улучшение функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон можно оценивать с использованием по меньшей мере одного из следующих анализов: поддающееся обнаружению снижение уровня креатинкиназы в крови, поддающееся обнаружению снижение некроза мышечных волокон в поперечном срезе биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофической, и/или поддающееся обнаружению повышение гомогенности диаметра мышечных волокон в поперечном срезе биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофической. Каждый из этих анализов известен квалифицированному специалисту.
Креатинкиназу можно выявлять в крови, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Поддающееся обнаружению снижение креатинкиназы может означать снижение на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с концентрацией креатинкиназы у того же пациента с DMD или BMD до лечения.
Поддающееся обнаружению снижение некроза мышечных волокон предпочтительно оценивают в биоптате мышц, более предпочтительно, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.), с использованием поперечных срезов биоптатов. Поддающееся обнаружению снижение некроза может представлять собой снижение, составляющее 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более от площади, где идентифицирован некроз с использованием поперечных срезов биоптатов. Снижение измеряют путем сравнения с некрозом, как оценивают у того же пациента с DMD или BMD до лечения.
Поддающееся обнаружению повышение гомогенности диаметра мышечных волокон предпочтительно оценивают в поперечном срезе биоптата, более предпочтительно, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Увеличение измеряют путем сравнения с гомогенностью диаметра мышечного волокна у того же пациента с DMD или BMD до лечения.
Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению обеспечивает у указанного индивидуума (более высокие уровни) функциональный и/или (полу)функциональный белок дистрофин (как для DMD, так и для BMD) и/или способен, по меньшей мере частично, снижать продукцию аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума. В этом контексте, функциональный и/или полуфункциональный дистрофин может означать, что может образовываться несколько форм функционального и/или полуфункционального дистрофина. Этого можно ожидать, когда область с по меньшей мере 50% идентичностью между первым и вторым экзонами перекрывается с одной или несколькими другими областями с по меньшей мере 50% идентичностью между другими первым и вторым экзонами, и где указанный олигонуклеотид способен связываться с указанной перекрывающейся частью, так что несколько различных участков экзонов пропускается и продуцируется несколько различных транскриптов в рамке считывания. Эта ситуация иллюстрируется в примере 4, где один единственный олигонуклеотид по изобретению (PS816; SEQ ID NO: 1679) способен индуцировать продукцию нескольких транскриптов в рамке считывания, все из которых имеют общий экзон 10 в качестве первого экзона, и где второй экзон может представлять собой экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48 или 55.
Более высокие уровни относятся к увеличению уровня функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина по сравнению с соответствующим уровнем функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина у пациента до начала лечения олигонуклеотидом по изобретению. Уровень указанного функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина предпочтительно оценивают с использованием иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок).
Снижение продукции аберрантной мРНК дистрофина или аберрантного белка дистрофина предпочтительно означает, что 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или менее от первоначального количества аберрантной мРНК дистрофина или аберрантного белка дистрофина все еще поддается обнаружению с помощью ОТ-ПЦР (мРНК) или иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок). Аберрантную мРНК или белок дистрофина также обозначают в настоящем описании как менее функциональную (по сравнению с функциональным белком дистрофина дикого типа, как определено в настоящем описании ранее) или нефункциональную мРНК или белок дистрофина. Нефункциональный белок дистрофина предпочтительно представляет собой белок дистрофина, который не способен связывать актин и/или представителей белкового комплекса DGC. Нефункциональный белок дистрофина или мРНК дистрофина, как правило, не обладает или не кодирует белок дистрофина с интактным C-концом белка. В предпочтительном варианте осуществления используют способ пропускания экзонов (также называемый модулированием РНК или переключением сплайсинга).
Увеличение продукции функциональной и/или полуфункциональной мРНК и/или белка дистрофина предпочтительно означает, что такая функциональная и/или полуфункциональная мРНК и/или белок дистрофина поддаются обнаружению или увеличены по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с выявляемым количеством указанной мРНК и/или белка в начале лечения. Указанное выявление можно осуществлять с использованием ОТ-ПЦР (мРНК) или иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок).
В другом варианте осуществления соединение по изобретению обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок дистрофина. Этот функциональный или полуфункциональный белок или мРНК дистрофина можно выявлять в качестве аберрантного белка или мРНК дистрофина, как пояснено в настоящем описании выше.
Посредством направленного совместного пропускания указанных двух экзонов (указанный первый и указанный второй экзоны) можно индуцировать пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт дистрофина находится в рамке считывания (предпочтительно, как в таблице 1 или 6), фенотип DMD или тяжелой BMD преобразуется в более мягкий фенотип BMD или даже бессимптомный фенотип. Совместное пропускание указанных двух экзонов предпочтительно индуцируется связыванием олигонуклеотида с областью первого экзона в пре-мРНК дистрофина и связыванием олигонуклеотида с областью второго экзона в пре-мРНК дистрофина, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Предпочтительно, указанный первый и указанный второй экзоны дистрофина и области идентичности в них представлены в таблице 2 или 6. Указанный олигонуклеотид предпочтительно не обладает перекрыванием с последовательностями не экзонов. Указанный олигонуклеотид предпочтительно не перекрывается с участками сплайсинга, по меньшей мере не в той степени, в какой они присутствуют в интроне. Указанный олигонуклеотид, направленный на внутреннюю последовательность экзона, предпочтительно не содержит последовательность, обратно комплементарную соседнему интрону. Способ пропускания экзонов предпочтительно используют так, что отсутствие указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), более предпочтительно расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами, из мРНК, продуцированной с пре-мРНК DMD, образует кодирующую область для (более высокой) экспрессии более (полу)функционального - хотя и более короткого - белка дистрофина. В этом контексте (как правило, у пациента с BMD), ингибирование включения указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), расположенных между указанным первым и указанным вторым экзонами, предпочтительно означает, что:
- уровень исходной аберрантной (менее функциональной) мРНК дистрофина снижен по меньшей мере на 5% при оценке способом ОТ-ПЦР, или уровень соответствующего аберрантного белка дистрофина снижается по меньшей мере на 2% при оценке с помощью иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга с использованием антител против дистрофина; и/или
- транскрипт в рамке считывания, кодирующий полуфункциональный или функциональный белок дистрофин, поддается обнаружению или его уровень возрастает по меньшей мере на 5% при оценке способом ОТ-ПЦР (уровень мРНК) или по меньшей мере на 2% при оценке с помощью иммунофлуоресцентного анализа или вестерн-блоттинга с использованием антител против дистрофина (белковый уровень).
Снижение аберрантного менее функционального или нефункционального белка дистрофина предпочтительно составляет по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, и предпочтительно оно происходит одновременно или параллельно выявлению или увеличенной продукции более функционального или полуфункционального транскрипта или белка дистрофина. В этом контексте (как правило, у пациента с DMD), ингибирование включения указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами, предпочтительно означает, что у указанного индивидуума обеспечивается (более высокий уровень) более функциональный или (полу)функциональный белок или мРНК дистрофина.
После того, как у пациента с DMD обеспечивают (более высокие уровни) (более) функциональный или полуфункциональный белок дистрофина, причина DMD, по меньшей мере частично, смягчается. Таким образом, можно ожидать, что симптомы DMD в достаточной степени снижаются. Кроме того, настоящее изобретение относится к пониманию того, что пропускание всего участка из по меньшей мере двух экзонов дистрофина в пре-мРНК, содержащей указанные экзоны, индуцируется или усиливается при использовании единственного олигонуклеотида, направленного на (или способного связываться с, или гибридизоваться с, или являющегося обратно комплементарным или способного нацеливаться на) оба из внешних экзона указанного участка. В настоящей заявке, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению, таким образом, по меньшей мере на 80% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 45% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона, как определено в настоящем описании, где указанные первый и второй экзоны соответствуют наружным экзонам участка экзонов, подлежащего пропусканию. Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, 90% 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Увеличенная частота пропускания также увеличивает уровень более (полу)функционального белка дистрофина, продуцированного в мышечной клетки индивидуума с DMD или BMD.
Олигонуклеотид в соответствии с настоящим изобретением, который предпочтительно используют, предпочтительно является обратно комплементарным или способен связываться, или гибридизоваться, или нацеливаться на область первого экзона дистрофина, причем указанная область имеет по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, предпочтительно является обратно комплементарной или способна связываться, или гибридизоваться, или нацеливаться на область второго экзона дистрофина, причем указанная область имеет по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, где указанная область указанного второго экзона в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона.
В контексте изобретения олигонуклеотид может содержать или состоять из функционального эквивалента олигонуклеотида. Функциональный эквивалент олигонуклеотида предпочтительно означает олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, где один или несколько нуклеотидов заменены, и где активность указанного функционального эквивалента сохраняется по меньшей мере в некоторой степени. Предпочтительно, активность указанного соединения, содержащего функциональный эквивалент олигонуклеотида, представляет собой обеспечение функционального или полуфункционального белка дистрофина. Указанную активность указанного соединения, содержащего функциональный эквивалент олигонуклеотида, таким образом, предпочтительно оценивают путем количественного определения функционального или полуфункционального белка дистрофина. Функциональный или полуфункциональный дистрофин предпочтительно определяют в рамках настоящего изобретения как представляющий собой дистрофин, способный связываться с актином и представителями комплекса белков DGC и поддерживать структуру и гибкость мембран мышечных волокон. Оценка указанной активности соединения, содержащего функциональный олигонуклеотид или эквивалент, предпочтительно включает ОТ-ПЦР (для обнаружения пропускания экзона на уровне РНК) и/или иммунофлуоресценцию или анализ с использованием вестерн-блоттинга (для обнаружения экспрессии и локализации белка). Указанная активность предпочтительно сохраняется, по меньшей мере в некоторой степени, когда она соответствует по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% или более соответствующей активности указанного соединения, содержащего олигонуклеотид, из которого происходит функциональный эквивалент. На протяжении настоящей заявки, когда используют слово "олигонуклеотид", оно может быть заменено его функциональным эквивалентом, как определено в настоящем описании.
Таким образом, применение олигонуклеотида или его функционального эквивалента, содержащего или состоящего из последовательности:
которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона дистрофина,
которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области второго экзона дистрофина,
и
где указанная область второго экзона в пре-мРНК дистрофина обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона, проявляет терапевтические результаты в отношении DMD посредством:
- смягчения одного или нескольких симптомов DMD или BMD; и/или
- смягчения одной или нескольких характеристик мышечной клетки от пациента; и/или
- обеспечения у указанного индивидуума функционального или полуфункционального белка дистрофина; и/или
- по меньшей мере частичного снижения продукции аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума.
Каждый из этих признаков уже определен в настоящем описании.
Предпочтительно, олигонуклеотид содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона DMD или дистрофина, где область второго экзона DMD или дистрофина в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Указанные первый и второй экзоны предпочтительно выбирают из группы экзонов, включающей экзоны с 8 по 60, где участок экзонов, начинающийся с первого экзона и содержащий второй экзон в качестве последнего экзона, участок экзонов, начинающийся первым экзоном и содержащий второй экзон в качестве последнего экзона, когда он пропускается, обеспечивает транскрипт в рамке считывания. Предпочтительные комбинации экзонов в рамке считывания в мРНК дистрофина приведены в таблице 1, 2 или 6.
Без связи с какой-либо теорией, идентичность первого и второго экзонов дистрофина можно определять с помощью одного или нескольких из следующих аспектов. В одном варианте осуществления один или несколько интронов, присутствующих между первым экзоном и вторым экзоном, не являются чрезмерно большими. В этом контексте, чрезмерно большой интрон в гене дистрофина может составлять 70, 80, 90, 100, 200 т.п.н. или более; например, интрон 1 (~83 т.п.н.), интрон 2 (~170 т.п.н.), интрон 7 (~110 т.п.н.), интрон 43 (~70 т.п.н.), интрон 44 (~248 т.п.н.), интрон 55 (~119 т.п.н.) или интрон 60 (~96 т.п.н.). Кроме того, в следующем варианте осуществления может предусматриваться пример уже пациента с BMD, у которого экспрессируется укороченный белок дистрофин, где этот первый, этот второй экзон и участок экзонов от указанного первого экзона до указанного второго экзона удалены. Другим критерием может быть относительно большая применимость пропущенных экзонов для объединенных субпопуляций пациентов с DMD (и/или BMD) с конкретными соответствующими мутациями.
В предпочтительном варианте осуществления пропускается участок экзонов DMD в рамке считывания (более предпочтительно, полностью пропускается в одном транскрипте), где наружные экзоны определяются первым и вторым экзонами следующим образом:
- первый экзон представляет собой экзон 8, и второй экзон представляет собой экзон 19 (применимо для ~7% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 9, и второй экзон представляет собой экзон 22 (применимо для ~11% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 9, и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~14% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 18 (применимо для ~5% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 10 и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~13% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 42 (применимо для ~16% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 47 (применимо для ~29% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 57 (применимо для ~72% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~72% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 11, и второй экзон представляет собой экзон 23 (применимо для ~8% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 13 и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~10% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 23, и второй экзон представляет собой экзон 42 (применимо для ~7% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 34 и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~42% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 40, и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~38% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 44, и второй экзон представляет собой экзон 56 (применимо для ~40% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 51 (применимо для ~17% пациентов с DMD)
- первый экзон представляет собой экзон 45 и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~28% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 55 (применимо для ~33% пациентов с DMD),
- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~37% пациентов с DMD), или
- первый экзон представляет собой экзон 56, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~2% пациентов с DMD).
Таким образом, в одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению индуцирует пропускание следующих экзонов дистрофина: экзоны с 8 по 19, экзоны с 9 по 22, экзоны с 9 по 30, экзоны с 10 по 18, экзоны с 10 по 30, экзоны с 10 по 42, экзоны с 10 по 47, экзоны с 10 по 57, экзоны с 10 по 60, экзоны с 11 по 23, экзоны с 13 по 30, экзоны с 23 по 42, экзоны с 34 по 53, экзоны с 40 по 53, экзоны с 44 по 56, экзоны с 45 по 51, экзоны с 45 по 53, экзоны с 45 по 55, экзоны с 45 по 60 или экзоны с 56 по 60.
Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона пре-мРНК дистрофина, так что обратно комплементарная часть составляет по меньшей мере 30% длины указанного олигонуклеотида по изобретению, более предпочтительно по меньшей мере 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% или еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, или еще более предпочтительно 98% и наиболее предпочтительно вплоть до 100%. В этом контексте первый экзон предпочтительно представляет собой экзон 8, 9, 10, 11, 13, 23, 34, 40, 44, 45 или 56 пре-мРНК дистрофина, как определено в настоящем описании. Указанный олигонуклеотид может содержать дополнительные фланкирующие последовательности. В более предпочтительном варианте осуществления длина указанной обратно комплементарной части указанного олигонуклеотида составляет по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Можно использовать несколько типов фланкирующих последовательностей. Предпочтительно, фланкирующие последовательности используют для модификации связывания белка с указанным олигонуклеотидом или для модификации термодинамического свойства указанного олигонуклеотида, более предпочтительно для модификации аффинности связывания РНК-мишени. В другом предпочтительном варианте осуществления дополнительные фланкирующие последовательности являются обратно комплементарными последовательностям пре-мРНК дистрофина, которые не присутствуют в указанном экзоне.
В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и является обратно комплементарной по меньшей мере области первого и области второго экзона дистрофина, присутствующей в пре-мРНК дистрофина, где указанные первый и второй экзоны выбраны из группы экзонов 8 (SEQ ID NO: 2), 9 (SEQ ID NO: 3), 10 (SEQ ID NO: 4), 11 (SEQ ID NO: 1761), 13 (SEQ ID NO: 1762),18 (SEQ ID NO: 5), 19 (SEQ ID NO: 6), 22 (SEQ ID NO: 7), 23 (SEQ ID NO: 8), 30 (SEQ ID NO: 9), 34 (SEQ ID NO: 1763), 40 (SEQ ID NO: 1764), 42 (SEQ ID NO: 11), 44 (SEQ ID NO: 1765), 45 (SEQ ID NO: 12), 47 (SEQ ID NO: 10), 51 (SEQ ID NO: 1760), 53 (SEQ ID NO: 13), 55 (SEQ ID NO: 14), 56 (SEQ ID NO: 15), 57 (SEQ ID NO: 1744) или 60 (SEQ ID NO: 16) и указанные области имеют по меньшей мере 10 нуклеотидов. Однако указанные области также могут иметь по меньшей мере 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Для предпочтительных экзонов, указанных выше, квалифицированный специалист способен идентифицировать область первого экзона и область второго экзона с использованием способов, известных в данной области. Более предпочтительно используют сетевой инструмент EMBOSS Matcher, как пояснено выше. Еще более предпочтительно, предпочтительные области идентичности первого и второго экзонов дистрофина, с которыми олигонуклеотид по изобретению предпочтительно связывается и/или для которых он является, по меньшей мере частично, обратно комплементарным, представлены в таблице 2. Обратная комплементарность в этом контексте предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. Предпочтительная олигонуклеотидная последовательность, подлежащая применению в рамках изобретения, способна связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на и/или является обратно комплементарной области идентичности между указанными первым и вторым экзонами, предпочтительно из таблицы 2, и имеет длину по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов, более предпочтительно менее 40 нуклеотидов или более предпочтительно менее 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно менее 25 нуклеотидов и наиболее предпочтительно от 20 до 25 нуклеотидов. Обратная комплементарность в этом контексте предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
В одном варианте осуществления предпочтительный олигонуклеотид является таким, что первый и второй экзоны дистрофина являются такими, как указано в таблице 1, 2 или 6, и указанный олигонуклеотид способен связываться с соответствующими областями первого и второго экзонов, как указано в таблице 2 или 6 и как определяется SEQ ID NO: 17-1670, 1742, 1743 или 1766-1777.
Предпочтительные олигонуклеотиды описаны в таблице 3 и содержат или состоят из SEQ ID NO: 1671-1741. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1778-1891, как описано в таблице 6. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат SEQ ID NO: 1671-1741 или 1778-1891 и имеют на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов больше или на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов меньше, чем их точный SEQ ID NO, как указано в таблице 3 или 6. Эти дополнительные нуклеотиды могут присутствовать на 5'- или 3'-стороне данного SEQ ID NO. Эти отсутствующие нуклеотиды могут представлять собой нуклеотиды, присутствующие на 5'- или 3'-стороне данного SEQ ID NO. Каждый из этих олигонуклеотидов может иметь любую химическую структуру, как определено в настоящем описании ранее или их комбинации. В каждом из олигонуклеотидов, указанных в настоящем описании с помощью SEQ ID NO, U может быть заменен на T.
Более предпочтительные олигонуклеотиды приведены ниже.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 8 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 19, предпочтительная область экзона 8 содержит или состоит из SEQ ID NO: 17, и предпочтительная область экзона 19 содержит или состоит из SEQ ID NO: 18. Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1722 или 1723 или содержит SEQ ID NO: 1722 или 1723, и имеет длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 13, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 101, и предпочтительная область экзона 13 содержит или состоит из SEQ ID NO: 102.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 14, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 103, и предпочтительная область экзона 14 содержит или состоит из SEQ ID NO: 104.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 15, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 105, и предпочтительная область экзона 15 содержит или состоит из SEQ ID NO: 106.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 109, и предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 110. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1778, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1815-1819 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1820, 1824 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1822 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1887 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1888 или 1889 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1827 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1828 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1766, и другая предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1767. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835 и имеющую длину 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1768, и другая предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1769. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 20, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 111, и предпочтительная область экзона 20 содержит или состоит из SEQ ID NO: 112.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 27, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 121, и предпочтительная область экзона 27 содержит или состоит из SEQ ID NO: 122.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 127, и предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 128. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1784, 1836 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1786, 1838 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1785, 1837 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1772, и другая предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1773. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1688, 1689, 1839, 1840, 1841, 1842, 1843 или 1844 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1849, 1850 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1787, 1851 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 31, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 129, и предпочтительная область экзона 31 содержит или состоит из SEQ ID NO: 130.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 32, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 131, и предпочтительная область экзона 32 содержит или состоит из SEQ ID NO: 132.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 35, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 137, и предпочтительная область экзона 35 содержит или состоит из SEQ ID NO: 138.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 42, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 151, и предпочтительная область экзона 42 содержит или состоит из SEQ ID NO: 152.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 44, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 153, и предпочтительная область экзона 44 содержит или состоит из SEQ ID NO: 154.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 47, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 157, и предпочтительная область экзона 47 содержит или состоит из SEQ ID NO: 158.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 48, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 159, и предпочтительная область экзона 48 содержит или состоит из SEQ ID NO: 160.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 167, и предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 168.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 57, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 169, и предпочтительная область экзона 57 содержит или состоит из SEQ ID NO: 170.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 173, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 174.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1673 или содержит SEQ ID NO: 1673 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1675 или содержит SEQ ID NO: 1675 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1677 или содержит SEQ ID NO: 1677 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1679 или содержит SEQ ID NO: 1679 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 1679 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Необязательно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 из U в SEQ ID NO: 1679 заменены на T. В предпочтительном варианте осуществления все U в SEQ ID NO: 1679 заменен/заменены на T. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1679, содержит любую из химических структур, определенных в настоящем описании выше: модификацию основания и/или модификацию сахара и/или модификацию основной цепи.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1681 или содержит SEQ ID NO: 1681 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1684 или содержит SEQ ID NO: 1684 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1685 или содержит SEQ ID NO: 1685 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1686 или содержит SEQ ID NO: 1686 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1688 или содержит SEQ ID NO: 1688 и имеет длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 1688 и имеет длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Необязательно, 1, 2, 3, 4, 5, 6 из U в SEQ ID NO: 1688 заменен/заменены на T. В предпочтительном варианте осуществления все U в SEQ ID NO: 1688 заменены на T. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1688, содержит любую из химических структур, определенных в настоящем описании выше: модификацию основания и/или модификацию сахара и/или модификацию основной цепи.
Для каждого из олигонуклеотидов, соответствующих SEQ ID NO: 1673, 1675, 1677, 1679, 1681, 1684, 1685, 1686 и 1688, первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10. Однако второй экзон дистрофина представляет собой экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48, 55, 57 или 60. Это означает, что при использовании любого из этих олигонуклеотидов может произойти образование нескольких транскриптов в рамке считывания, каждый из которых приводит к продукции укороченного, но (полу)функционального белка дистрофина.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 11 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 23, предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 191, и предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 192. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 13 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, предпочтительная область экзона 13 содержит или состоит из SEQ ID NO: 285, и предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 286. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1857, 1872 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 23 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 42, предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 776, и предпочтительная область экзона 42 содержит или состоит из SEQ ID NO: 777. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1698-1703.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 34 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 34 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1294, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1295. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 и имеющую длину 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 40 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 40 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1477, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1478. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1804, 1880 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1805, 1881 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 44 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 56, предпочтительная область экзона 44 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1577, и предпочтительная область экзона 56 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1558. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 51, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1567, и предпочтительная область экзона 51 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1568. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1730-1731.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1569, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1570. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1732-1737.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1571, и предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1572. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1704-1719, 1788, 1852, 1789, 1853.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1706 или содержит SEQ ID NO: 1706 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1706 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1706.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1707 или содержит SEQ ID NO: 1707 и имеет длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1707 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1706.
Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1713 или содержит SEQ ID NO: 1713 и имеет длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1713 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1710.
Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, другая предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1774, и другая предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1775. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1577, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1578. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1738-1741.
Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 56 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 56 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1742, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1743. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1720-1721.
Более предпочтительный олигонуклеотид содержит:
(a) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или
(b) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или
(c) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или
(d) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или
(e) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1684-1686 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или
(f) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1688 или 1689 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или
(g) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1704-1706 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,
(h) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1707-1709 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или
(i) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1710, 1713-1717 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Еще более предпочтительные олигонуклеотиды содержат:
(a) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1778, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(b) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1688, 1689 или 1839-1844 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(c) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(d) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(e) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(f) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1684-1686 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(g) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1704-1706 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(h) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1707-1709 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(i) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1710, 1713-1717 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(j) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1815-1819 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(k) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1820, 1824, и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(l) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(m) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(n) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1822 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(o) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(p) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835 и имеющую длину 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(q) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1887 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(r) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1888 или 1889 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(s) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1827 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(t) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1828 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(u) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1784, 1836 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(v) или последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1786, 1838 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(w) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(x) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1785, 1837 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(y) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(z) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1849, 1850 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(a1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1787, 1851 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(b1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(c1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(d1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(e1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(f1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(g1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(h1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(i1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(j1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1857, 1872 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(k1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 и имеющую длину 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(l1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(m1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1804, 1880 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(n1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1805, 1881 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или
(o1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
Олигонуклеотид по изобретению, который содержит или состоит из последовательности, определяемой номером SEQ ID, также охватывает олигонуклеотид, содержащий последовательность оснований, определяемую этим SEQ ID. Олигонуклеотиды, имеющие модифицированную основную цепь (т.е. модифицированные части сахаров и/или модифицированные межнуклеозидные связи), относительно олигонуклеотидов, определяемых SEQ ID, также охватываются изобретением. Каждое основание U в SEQ ID NO олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, может быть модифицировано или заменено на T.
Композиция
В следующем аспекте предусматривается композиция, содержащая олигонуклеотид, как описано в предыдущем разделе под названием "Олигонуклеотид". Эта композиция предпочтительно содержит или состоит из олигонуклеотида, как описано выше. Предпочтительная композиция содержит один единственный олигонуклеотид, как определено выше. Таким образом, понятно, что пропускания по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзона достигают с использованием одного единственного олигонуклеотида, а не с использованием коктейля различных олигонуклеотидов.
2+
В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция предназначена для применения в качестве лекарственного средства. Таким образом, указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция обычно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент. В предпочтительном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит соединение, как определено в настоящем описании, и необязательно дополнительно содержит фармацевтически приемлемый состав, наполнитель, консервант, солюбилизатор, носитель, разбавитель, эксципиент, соль, адъювант и/или растворитель. Такой фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, консервант, солюбилизатор, разбавитель, соль, адъювант, растворитель и/или эксципиент может быть найден, например, в Remington. Соединение, как описано в рамках изобретения, обладает по меньшей мере одной ионогенной группой. Ионогенная группа может представлять собой основание или кислоту, и она может быть заряженной или нейтральной. Ионогенная группа может присутствовать в качестве пары ионов с соответствующим противоионом, который имеет противоположный заряд(ы). Примерами катионных противоионов являются натрий, калий, цезий, Tris, литий, кальций, магний, триалкиламмоний, триэтиламмоний и тетраалкиламмоний. Примерами анионных противоионов являются хлорид, бромид, йодид, лактат, мезилат, ацетат, трифторацетат, дихлорацетат и цитрат. Примеры противоионов описаны (Kumar L., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению приводят в контакт с композицией, содержащей такие ионогенные группы, предпочтительно Ca, с получением хелатного комплекса олигонуклеотида, содержащего два или более идентичных олигонуклеотидов, связанных таким мультивалентным катионом, как уже определено в настоящем описании.
Фармацевтическую композицию, кроме того, можно составлять, чтобы дополнительно способствовать повышению стабильности, растворимости, всасывания, биодоступности, фармакокинетики и клеточного захвата указанного соединения, в частности, составов, содержащих эксципиенты или конъюгаты, способные образовывать комплексы, наночастицы, микрочастицы, нанотрубки, наногели, гидрогели, полоксамеры или плюроники, полимерсомы, коллоиды, микропузырьки, везикулы, мицеллы, липоплексы и/или липосомы. Примеры наночастиц включают полимерные наночастицы, золотые наночастицы, магнитные наночастицы, частицы на основе диоксида кремния, липидные наночастицы, наночастицы на основе сахаров, белковые наночастицы и пептидные наночастицы.
Предпочтительная композиция содержит по меньшей мере один эксципиент, который может далее способствовать усилению нацеливания и/или доставки указанной композиции и/или указанного олигонуклеотида к и/или в мышцу и/или клетку. Клетка может представлять собой мышечную клетку.
Другая предпочтительная композиция может содержать по меньшей мере один эксципиент, классифицируемый как второй тип эксципиента. Второй тип эксципиента может включать или содержать конъюгатную группу, как описано в настоящем описании, для усиления нацеливания и/или доставки композиции и/или олигонуклеотида по изобретению к ткани и/или клетке и/или в ткань и/или клетку, например, такую как мышечная ткань или клетка. Оба типа эксципиентов можно комбинировать в одну единственную композицию, как определено в настоящем описании. Предпочтительные конъюгатные группы описаны в части, посвященной определениям.
Квалифицированный специалист может выбирать, комбинировать и/или адаптировать один или несколько из описанных выше или других альтернативных эксципиентов и систем для доставки для составления и доставки соединения для применения в рамках настоящего изобретения.
Такую фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить в эффективной концентрации в установленные моменты времени животному, предпочтительно млекопитающему. Более предпочтительным млекопитающим является человек. Соединение или композиция, как определено в настоящем описании, могут быть пригодны для прямого введения в клетку, ткань и/или орган in vivo у индивидуумов, предпочтительно указанные индивидуумы страдают или имеют риск развития BMD или DMD, и их можно вводить прямо in vivo, ex vivo или in vitro. Введение можно осуществлять системным и/или парентеральным путями, например, внутривенным, подкожным, внутрижелудочковым, интратекальным, внутримышечным, интраназальным, энтеральным, интравитреальным, внутрицеребральным, эпидуральным или пероральным путем.
Предпочтительно, такая фармацевтическая композиция по изобретению может быть инкапсулирована в форме эмульсии, суспензии, пилюли, таблетки, капсулы или мягкой желатиновой капсулы для пероральной доставки, или она может быть в форме аэрозоля или сухого порошка для доставки в дыхательные пути и легкие.
В одном варианте осуществления соединение по изобретению можно использовать вместе с другим соединением, уже известным тем, что его используют для лечения указанного заболевания. Такие другие соединения можно использовать для замедления прогрессирования заболевания, для снижения аномального поведения или движений, для снижения воспаления мышечной ткани, для улучшения функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон и/или для улучшения, увеличения или восстановления сердечной функции. Примерами являются, но не ограничиваясь ими, стероид, предпочтительно (глюко)кортикостероид, ингибитор ACE (предпочтительно периндоприл), блокатор рецептора ангиотензина II типа 1 (предпочтительно лозартан), ингибитор фактора некроза опухоли-альфа (TNFα), ингибитор TGFβ (предпочтительно декорин), рекомбинантный бигликан человека, источник mIGF-1, ингибитор миостатина, манноза-6-фосфат, антиоксидант, ингибитор ионных каналов, ингибитор протеаз, ингибитор фосфодиэстеразы (предпочтительно ингибитор PDE5, такой как силденафил или тадалафил), L-аргинин, блокаторы дофамина, амантадин, тетрабеназин и/или кофермент Q10. Это комбинированное применение может представлять собой последовательное применение: каждый компонент вводят в отдельной композиции. Альтернативно, каждое соединение можно использовать вместе в одной композиции.
Применение
В следующем аспекте предусматривается применение композиции или соединения, как описано в настоящем описании, в качестве лекарственного средства или части терапии, или применения, в которых соединение проявляет его активность внутриклеточно.
В предпочтительном варианте осуществления соединение или композиция по изобретению предназначены для применения в качестве лекарственного средства, где лекарственное средство предназначено для профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания, как определено в настоящем описании, предпочтительно DMD или BMD.
Способ профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания
В следующем аспекте предусматривается способ профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания, как определено в настоящем описании, предпочтительно DMD или BMD. Указанное заболевание можно предупреждать, лечить, замедлять или смягчать у индивидуума, в клетке, ткани или органе указанного индивидуума. Способ включает введение олигонуклеотида или композиции по изобретению указанному индивидууму или субъекту, нуждающемуся в этом.
Способ по изобретению, где олигонуклеотид или композиция, как определено в настоящем описании, могут быть пригодными для введения в клетку, ткань и/или орган in vivo индивидуумам, предпочтительно индивидуумам, страдающим BMD или DMD или имеющим риск развития такого заболевания, можно проводить in vivo, ex vivo или in vitro. Индивидуум или субъект, нуждающиеся в этом, предпочтительно представляют собой млекопитающее, более предпочтительно человека.
В одном варианте осуществления в способе по изобретению концентрация олигонуклеотида или композиции находится в диапазоне от 0,01 нМ до 1 мкМ. Более предпочтительно, используемая концентрация составляет от 0,02 до 400 нМ, или от 0,05 до 400 нМ, или от 0,1 до 400 нМ, еще более предпочтительно от 0,1 до 200 нМ.
Диапазоны доз олигонуклеотида или композиции по изобретению предпочтительно выбирают, исходя из исследований с возрастающей дозой в клинических испытаниях (применение in vivo), для которых существуют строгие требования протокола. Олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, можно использовать в дозе, которая находится в диапазоне от 0,01 до 200 мг/кг, или от 0,05 до 100 мг/кг, или от 0,1 до 50 мг/кг, или от 0,1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг.
Диапазоны концентрации или дозы олигонуклеотида или композиции, приведенные выше, являются предпочтительными концентрациями или дозами для применений in vitro или ex vivo. Квалифицированному специалисту будет понятно, что в зависимости от типа используемого олигонуклеотида, клетки-мишени, подлежащей лечению, гена-мишени и его уровней экспрессии, используемой среды и условий трансфекции и инкубации, концентрация или доза указанного используемого олигонуклеотида может далее варьировать и может требовать дальнейшей оптимизации.
Определения
"Идентичность последовательностей", как известно в данной области, представляет собой взаимосвязь между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты (полинуклеотид или нуклеотид), как определяют путем сравнения последовательностей. В данной области процент "идентичности" или "сходства" указывает на степень родственности последовательностей нуклеиновой кислоты при определении по соответствию цепей таких последовательностей. "Идентичность" может быть заменена в настоящем описании "сходством". Предпочтительно, процент идентичности определяют путем сравнения всей SEQ ID NO, как определено в настоящем описании. Однако также можно использовать часть последовательности. Часть последовательности в этом контексте может означать по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% данной последовательности или SEQ ID NO.
"Идентичность" и "сходство" можно без труда вычислить известными способами, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).
Предпочтительные способы определения идентичности разработаны так, чтобы обеспечить наибольшее соответствие между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности и сходства закодированы в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают, например, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BestFit и FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Семейство программ BLAST 2.0, которое можно использовать для поиска сходства в базах данных, включает, например, BLASTN для нуклеотидных последовательностей запроса против нуклеотидных последовательностей из баз данных. Семейство программ BLAST 2.0 является общедоступным от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Также для определения идентичности можно использовать хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана.
Предпочтительные параметры для сравнения нуклеиновых кислот включают следующие параметры: алгоритм: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); матрица сравнений: совпадение = +10, несовпадение = 0; штраф за пропуск: 50; штраф за продолжение пропуска: 3. Доступен в качестве программы Gap от Genetics Computer Group, расположенной в Madison, Wis. Выше приведены параметры по умолчанию для сравнений нуклеиновых кислот.
Другим предпочтительным способом определения сходства и идентичности последовательностей является способ с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453, Kruskal, J.B. (1983), обзор сравнения последовательностей: D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).
Другим предпочтительным способом определения сходства и идентичности последовательностей является способ с использованием EMBOSS Matcher и алгоритма Waterman-Eggert (локальное выравнивание двух последовательностей; [Schoniger и Waterman, Bulletin of Mathematical Biology 1992, Vol. 54 (4), pp. 521-536; Vingron and Waterman, J. Mol. Biol. 1994; 235(1), p1-12]). Можно использовать следующие web-сайты: http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html или http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/matcher. Определения параметров, используемых в этом алгоритме, находится на следующем web-сайте: http://emboss.sourceforge.net/docs/themes/AlignFormats.html#id. Предпочтительно используют параметры по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за пропуск: 16, штраф за продолжение пропуска: 4). Emboss Matcher обеспечивает наилучшее локальное выравнивание между двумя последовательностями, однако также предоставляются альтернативные выравнивания. В таблице 2 представлено наилучшее локальное выравнивание между двумя различными экзонами, предпочтительно экзонами дистрофина, которые предпочтительно используют для конструирования олигонуклеотидов. Однако также можно идентифицировать альтернативные выравнивания и, таким образом, альтернативные области идентичности между двумя экзонами, и их можно использовать для конструирования олигонуклеотидов, что также является частью настоящего изобретения.
На протяжении заявки слова "связывается", "нацеливается", "гибридизуется" могут использоваться взаимозаменяемо, когда их используют в контексте олигонуклеотида, который обратно комплементарен области пре-мРНК, как определено в настоящем описании. Аналогично, выражения "способен связываться", "способен нацеливаться" и "способен гибридизоваться" могут использоваться взаимозаменяемо для указания на то, что олигонуклеотид имеет определенную последовательность, которая позволяет связывание, нацеливание или гибридизацию с последовательностью-мишенью. Когда последовательность-мишень определена в настоящем описании или известна в данной области, квалифицированный специалист способен сконструировать все возможные структуры указанного олигонуклеотида с использованием принципа обратной комплементарности. В этом отношении будет понятно, что допустимо ограниченное количество несоответствий или пропусков в последовательности между олигонуклеотидом по изобретению и последовательностями-мишенями в первом и/или втором экзонах при условии, что связывание не изменяется, как рассмотрено выше. Таким образом, олигонуклеотид, который способен связываться с определенной последовательностью-мишенью, может считаться олигонуклеотидом, который обратно комплементарен последовательности-мишени. В контексте изобретения "гибридизуется" или "способен гибридизоваться" используют для физиологических условий в клетке, предпочтительно в клетке человека, если нет иных указаний.
Как используют в рамках изобретения, "гибридизация" относится к спариванию комплементарных олигомерных соединений (например, антисмысловое соединение и его нуклеиновая кислота-мишень). Не ограничиваясь конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм образования пар вовлекает образование водородных связей, которое может представлять собой образование водородных связей по типу Уотсона-Крика, Хугстина или обратному хугстиновскому типу между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (нуклеиновые основания). Например, природное основание аденин представляет собой нуклеиновое основание, комплементарное природному нуклеиновому основанию тимину, 5-метилурацилу и урацилу, которые образуют пару путем образования водородных связей. Природное основание гуанин представляет собой нуклеиновое основание, комплементарное природным основаниям цитозину и 5-метилцитозину. Гибридизация может происходить в различных условиях.
Аналогично, "обратную комплементарность" используют для указания на две нуклеотидных последовательности, которые способны гибридизоваться друг с другом, в то время как одна из последовательностей ориентирована от 3' к 5', а другая ориентирована в обратном направлении, т.е. от 5' к 3'. Таким образом, нуклеозид A на первой нуклеотидной последовательности способен образовывать пару с нуклеозидом A* на второй нуклеотидной последовательности через их соответствующие нуклеиновые основания, и нуклеозид B, расположенный в 5'-положении от упомянутого выше нуклеозида A в первой нуклеотидной последовательности, способен образовывать пару с нуклеозидом B*, который расположен в 3'-положении от упомянутого выше нуклеозида A* во второй нуклеотидной последовательности. В контексте настоящего изобретения первая нуклеотидная последовательность, как правило, представляет собой олигонуклеотид по изобретению, и вторая нуклеотидная последовательность представляет собой часть экзона из пре-мРНК, предпочтительно пре-мРНК дистрофина. Олигонуклеотид предпочтительно называют обратно комплементарным области экзона (первого и/или второго экзона), когда указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого и/или второго экзона. Предпочтительно, обратная комплементарность составляет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
В контексте изобретения эксципиенты включают полимеры (например, полиэтиленимин (PEI), полипропиленимин (PPI), производные декстрана, бутилцианоакрилат (PBCA), гексилцианоакрилат (PHCA), сополимер молочной и гликолевой кислоты (PLGA), полиамины (например, спермин, спермидин, путресцин, кадаверин), хитозан, поли(амидоамины) (PAMAM), поли(сложный эфир-амин), поливиниловый эфир, поливинилпирролидон (PVP), полиэтиленгликоль (PEG) циклодекстрины, гиалуроновую кислоту, коломиновую кислоту и их производные), дендримеры (например, поли(амидоамин)), липиды {например, 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний пропан (DODAP), диолеоилдиметиламмоний хлорид (DODAC), производные фосфатидилхолина [например, 1,2- дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC)], производные лизо-фосфатидилхолина [например, 1-стеароил-2-лизо-sn-глицеро-3-фосфохолин (S-LysoPC)], сфингомиелин, 2-{3-[бис-(3-аминопропил)амино]пропиламино}-N-дитетрацедилкарбамоилметилацетамид (RPR209120), производные фосфоглицерина [например, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин, натриевая соль (DPPG-Na), производные фосфатицидной кислоты [1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатицидная кислота, натриевая соль (DSPA), производные фосфатидилэтаноламина [например, диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE), 2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPhyPE)], N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний (DOTAP), N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний (DOTMA), 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламид (DOSPER), (1,2-димиристоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмоний (DMRIE), (N1-холестерилоксикарбонил-3,7-диазанонан-1,9-диамин (CDAN), диметилдиоктадециламмоний бромид (DDAB), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицерол-3-фосфохолин (POPC), (b-L-аргинил-2,3-L-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламид тригидрохлорид (AtuFECT01), производные N,N-диметил-3-аминопропана [например, 1,2-дистеароилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DSDMA), 1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DoDMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-3-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA), производные фосфатидилсерина [1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин, натриевая соль (DOPS)], холестерин}, белки (например, альбумин, желатины, ателлоколлаген) и пептиды (например, протамин, PepFects, NickFects, полиаргинин, полилизин, CADY, MPG).
В контексте изобретения конъюгатные группы выбирают из группы, состоящей из нацеливающих частей, повышающих стабильность частей, усиливающих захват частей, усиливающих растворимость частей, улучшающих фармакокинетику частей, улучшающих фармакодинамику частей, повышающих активность частей, репортерных молекул и лекарственных средств, где эти части могут представлять собой пептиды, белки, углеводы, полимеры, производные этиленгликоля, витамины, липиды, полифторалкильные части, стероиды, холестерин, флуоресцентные части и радиоактивно меченые части. Конъюгатные группы необязательно могут быть защищенными и они могут быть связаны с олигонуклеотидом по изобретению прямо или через двухвалентный или поливалентных линкер.
2
13
14
15
18
18
32
35
57
99m
123
125
131
153
Конъюгатные группы включают части, которые усиливают нацеливание, захват, растворимость, активность, фармакодинамику, фармакокинетику или которые снижают токсичность. Примеры таких групп включают пептиды (например, глутатион, полиаргинин, пептиды RXR (см., например, Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 525), полиорнитин, TAT, TP10, pAntp, полилизин, NLS, пенетратин, MSP, ASSLNIA, MPG, CADY, Pep-1, Pip, SAP, SAP(E), транспортан, буфорин II, полимиксин B, гистатин, CPP5, NickFects, PepFects), vivo-porter, белки (например, антитела, авидин, Ig, трансферрин, альбумин), углеводы (например, глюкоза, галактоза, манноза, мальтоза, мальтотриоза, рибоза, трегалоза, глюкозамин, N-ацетилглюкозамин, лактоза, сахароза, фукоза, арабиноза, талоза, сиаловая кислота, гиалуроновая кислота, нейрамидиновая кислота, рамноза, квиновоза, галактозамин, N-ацетилгалактозамин, ксилоза, ликсоза, фруктоза, манноза-6-фосфат, 2-дезоксирибоза, глюкал, целлулобиоза, хитобиоза, хитотриоза), полимеры (например, полиэтиленгликоль, полиэтиленимин, полимолочная кислота, поли(амидоамин)), производные этиленгликоля (например, триэтиленгликоль, тетраэтиленгликоль), водорастворимые витамины (например, витамин B, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C), жирорастворимые витамины (например, витамин A, D, D2, D3, E, K1, K2, K3), липиды (например, пальмитил, миристил, олеил, стеарил, батил, глицерофосфолипид, глицеролипид, сфинголипид, церамид, цереброзид, сфингозин, стерин, пренол, эруцил, арахидонил, линолеил, линоленил, арахидил, бутирил, сапеинил, элаидил, лаурил, бегенил, нонил, децил, ундецил, октил, гептил, гексил, пентил, DOPE, DOTAP, терпенил, дитерпеноид, тритерпеноид), полифторалкильные части (например, перфтор[1H,1H,2H,2H]-алкил), одобренные лекарственные средства с ММ<1500 Да, которые обладают аффинностью к конкретным белкам (например, NSAID, такие как ибупрофен (больше описано в патенте США 6656730, включенном в настоящее описание в качестве ссылки), антидепрессанты, противовирусные средства, антибиотики, алкилирующие средства, амебицидные средства, аналгетики, андрогены, ингибиторы ACE, снижающие аппатит средства, антациды, противогельминтные средства, антиангиогенные средства, антиадренергетики, антиангинальные средства, антихолинергетики, антикоагулянты, противосудорожные препараты, противодиабетические средства, противодиарейные средства, антидиуретики, антидоты, противогрибковые средства, противорвотные средства, средства против головокружения, противоподагрические средства, антигонадотропные средства, антигистамины, антигиперлипидемические средства, антигипертензивные средства, противомалярийные средства, средства против мигрени, средства против злокачественной опухоли, антипсихотические средства, противоревматические средства, антитиреоидные средства, антитоксины, противокашлевые средства, анксиолитические средства, контрацептивы, стимуляторы ЦНС, хелаторы, сердечно-сосудистые средства, противозастойные средства, дерматологические средства, диуретики, отхаркивающие средства, диагностические средства, желудочно-кишечные средства, анестетики, глюкокортикоиды, антиаритмические средства, иммуностимулирующие средства, иммунодепрессивные средства, слабительные средства, лепростатические средства, метаболические средства, средства, действующие на органы дыхательной системы, муколитики, мышечные релаксанты, нутрицевтические средства, сосудорасширяющие средства, тромболитические средства, утеротонические средства, сосудосуживающие средства), природные соединения с ММ<2000 Да (например, антибиотики, эйкозаноиды, алкалоиды, флавоноиды, терпеноиды, кофакторы ферментов, поликетиды), стероиды (например, преднизон, преднизолон, дексаметазон, ланостерин, холевая кислота, эстран, андростан, прегнан, холан, холестан, эргостерин, холестерин, кортизол, кортизон, дефлазакорт), пентациклические тритерпеноиды (например, 18β-глицирретиновая кислота, урсоловая кислота, амирин, карбеноксолон, эноксолон, ацетоксолон, бетулиновая кислота, азиатиковая кислота, эритродиол, олеанолевая кислота), полиамины (например, спермин, спермидин, путресцин, кадаверин), флуоресцентные части (например, FAM, карбоксифлуоресцеин, FITC, TAMRA, JOE, HEX, TET, родамин, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, CW800, BODIPY, AlexaFluors, Dabcyl, DNP), репортерные молекулы (например, акридины, биотины, дигоксигенин, (радио)изотопно меченые части (например, с H, C, C, N, O, F, P, S, Co, Tc, I, I, I, Gd)) и их комбинации. Такие конъюгатные группы могут быть присоединены прямо к соединениям по изобретению или через линкер. Этот линкер может быть двухвалентным (обеспечивающим конъюгат 1:1) или поливалентным, обеспечивающим олигомер с более чем одной конъюгатной группой. Методики связывания такой конъюгатной группы, либо прямо, либо через линкер, с олигомером по изобретению известны в данной области. Также в контексте изобретения находится применение наночастиц, с которыми ковалентно связаны олигонуклеотиды по изобретению, таким образом, такие конструкции называют сферическими нуклеиновыми кислотами (SNA), например, как описано в J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12192 (Hurst et al., включенная в настоящее описание в качестве ссылки).
В настоящем документе и в его формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения используют в неограничивающем значении для обозначения того, что объекты после этого слова включены, однако объекты, конкретно не упомянутые, не исключены. Кроме того, глагол "состоять из" может быть заменен на "по существу состоять из", что означает, что олигонуклеотид или композиция, как определено в настоящем описании, могут содержать дополнительный компонент(ы) помимо компонентов, конкретно указанных, причем указанный дополнительный компонент(ы) не изменяет уникальной характеристики изобретения. Кроме того, указание на элемент в единственном числе не исключает возможности того, что присутствует более одного элемента, если контекст явно не требует, чтобы существовал один и только один из элементов. Таким образом, форма единственного числа обычно означает "по меньшей мере один".
Слова "приблизительно" или "примерно", когда их используют применительно к числовой величине (приблизительно 10), предпочтительно означают, что величина может представлять собой данную величину, равную 10, или отличается менее чем на 1% от этой величины.
Каждый вариант осуществления, как указано в настоящем описании, может быть комбинирован с другим, если нет иных указаний. Все патентные и литературные ссылки в настоящем описании включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Следующие примеры представлены только для иллюстративных целей, и они не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения никоим образом.
Примеры
Таблицы 1-3
Таблица 1Перечень возможных комбинаций экзонов в транскрипте гена DMD, для которых экзон U (вышележащий) имеет непрерывную открытую рамку считывания с экзоном D (нижележащий), если экзоны с U+1 (первый экзон) по D-1 (второй экзон), и любые экзоны между ними, удалены из транскрипта.
Первый экзон ("U")
Второй экзон ("D")
1
8,20,22,51,53,59,62,64,65,67,76,79
2
5,6,9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
3
6,9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
4
9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
5
9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
6
12,18,44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78
7
20,22,51,53,59,62,64,65,67,76,79
8
11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
9
13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
10
13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
11
18,44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78
12
15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
13
16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
14
17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
15
19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
16
19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
17
44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78
18
21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
19
22,51,53,59,62,64,65,67,76,79
20
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
21
51,53,59,62,64,65,67,76,79
22
25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
23
26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
24
27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
25
28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
26
29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
27
30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
28
31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
29
32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
30
33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
31
34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
32
35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
33
36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
34
37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
35
38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
36
39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
37
40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
38
41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
39
42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
40
43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
41
45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
42
45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
43
46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78
44
47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
45
55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78
46
49,50,52,54,56,58,60,61,68,70
47
50,52,54,56,58,60,61,68,70
48
52,54,56,58,60,61,68,70
49
52,54,56,58,60,61,68,70
50
53,59,62,64,65,67,76
51
54,56,58,60,61,68,70
52
59,62,64,65,67,76
53
56,58,60,61,68,70
54
57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78
55
58,60,61,68,70
56
63,66,69,71,72,73,74,75,77,78
57
60,61,68,70
58
62,64,65,67,76,79
59
68,70
60
68,70
61
64,65,67,76,79
62
66,69,71,72,73,74,75,77,78
63
67,76,79
64
67,76,79
65
69,71,72,73,74,75,77,78
66
76,79
67
70
68
71,72,73,74,75,77,78
70
73,74,75,77,78
71
74,75,77,78
72
75,77,78
73
77,78
74
77,78
Таблица 2Перечень областей экзонов: участки последовательности с (частично) высокой идентичностью или сходством последовательности (по меньшей мере 50%) между двумя различными экзонами дистрофина, идентифицированные в качестве наилучшего попарного выравнивания с помощью EMBOSS Matcher с использованием параметров по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за пропуск: 16, штраф за продолжение пропуска: 4) (http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_matcher/nucleotide.html). Пропускание этих экзонов, и предпочтительно любых экзонов между ними, может привести к транскрипту DMD в рамке считывания (как в таблице 1)
Экзоны-мишени
Выравнивание EMBOSS
SEQ ID NO
819
AGAUAAGAAGUCCA||.|.||||||.||AGCUGAGAAGUUCA
1718
821
ACCUAUCCAGAUAAG-AAGUCCAUCUUAAUGUACA||..|||....|||| |||||..|..|.||||.||ACAAAUCAUUUUAAGCAAGUCUUUUCUGAUGUGCA
1920
850
UUUGCCUCAACAAGUGAG--CAUUGAAGCC|||.|.||||.|..||||  ||..|.||||UUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCC
2122
852
GAAGCCAUCCAGGAAGUGGAA|.|.|.||.|||||..|||||GCAACAAUGCAGGAUUUGGAA
2324
858
CAAGUGAGCAUUGAA||||.|.|.||||||CAAGAGGGAAUUGAA
2526
910
CUAGCACAGGGAUA|.||||||.|||.|CAAGCACAAGGAGA
2728
912
GUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAAC|.|.|.|||.||.|...|.|.||.|||||GACUGGCUAACAAAAACAGAAGAAAGAAC
2930
913
UCUAGCACAGGGAUAUGAGAG|||||.|||.|.|.|.|..||UCUAGAACAAGAACAAGUCAG
3132
914
ACACAGGCUGCUUAUGUCACCACCUCUGAC|.|||..||.||.|..|..|.||.|||.||AGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCUUAC
3334
915
UCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAA|.|||..||.||.|.|.|||.||UUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAA
3536
916
UAUGCCUACACACAGGCUGCUUAUGUCACCAC|||.|...||.|||.|.| |||.|.|||.|||UAUUCACUCAAACAAGAU-CUUCUUUCAACAC
3738
918
GAUAUGAGAGAACUUC|||||.|..|||||||GAUAUAACUGAACUUC
3940
920
CACCACCUCUGACCCUACA||||.|.||.||.||.|||CACCCCAUCAGAGCCAACA
4142
922
CUUA-UGUCACCACCUCUGA|||| |||||||..||.|||CUUAGUGUCACCGACUAUGA
4344
923
UAUGUCACCACCUCUG|||.|||.||||.|||UAUCUCAGCACCACUG
4546
925
CAGGGAUAUG-AGAGAACUUCUUCCC|||.|||||. |||.|| |||..|||CAGUGAUAUUCAGACAA-UUCAGCCC
4748
926
UAAGCCUCGAUUCAAGAGCUAU||||||||.|.. ||||.||||UAAGCCUCCAGA-AAGAUCUAU
4950
927
ACCACCUCUGACCCUACAC||.|||..||.|.||.|||ACUACCAGUGGCUCUGCAC
5152
928
GGAUAUGAGAGAACUUCU|||..||||..||..|||GGAGCUGAGGAAAUCUCU
5354
929
AGGGAUAUGAGAGAACUUCUUCCCCU|||.|..|||||.|..|..|||.|.|AGGAACUUGAGACAUUUAAUUCUCGU
5556
930
CAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUUCCCCUAAGCCUCGAUUC|||||| ||.||||....|||.|.|.|.| |.|.|.|||.||..||.||CAGUCU-GCCCAGGAGACUGAAAAAUCCU-UACACUUAAUCCAGGAGUC
5758
931
GGUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUUC|.|||||.|||.|    ||.||||...|||.|..||GAUCAGUUUAGAA----GAAAUGAAGAAACAUAAUC
5960
932
UUCUUCCCCUAAGCCUCGAUUCAAGAGCUAUGCCUACA||.||||...||.|..|.|.|...||||...|.|||||UUAUUCCAGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACA
6162
933
CCCUAAGC-CUCGAUUCAAGAG|||.|||. ||.|||..|||||CCCAAAGAACUUGAUGAAAGAG
6364
934
GGGAUAUGAGAGAACUUCUUCCCCUAAGCCUCGAUUCAAGAGCUAUGCCUACACACA--GGCUG|.||.|||...|||.||.| |||.||||...|||....|.|...|||.||..|||.|  |||||GAGAAAUGCUUGAAAUUGU-CCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUG
6566
935
AGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUU||..||.|||||.|.||.|||||..|||AGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUU
6768
936
UCAGUCUAGCACAG----GGAU--AUGAGAGAA||||.||..||||.    ||||  ||.||||||UCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAA
6970
938
CAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUU||||.||.|.||  |||||...|.||.|.|||CAGUUUAACUCA--GAUAUACAAAAAUUGCUU
7172
940
CAGGCUGCUUAUGUC|||||||.|.||.||CAGGCUGAUGAUCUC
7374
941
CCACCUCUGACCC|||.|||.||.||CCAACUCAGAUCC
7576
942
GAUAUGAGAGAACUUCU||..||..|.|||||||GAAGUGGAACAACUUCU
7778
944
GGGAUAUGAGAGAACU|.|||.|||.|||.||GCGAUUUGACAGAUCU
7980
946
GUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUU|||||..|..||.||.|||.|.|..|||.||.||GUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUU
8182
947
UCCCCUAAGCCUCGA||||.||||||..||UCCCAUAAGCCCAGA
8384
948
GAUUCAAGAGCUAUGCCU-ACACACAGG|.|||.||||||.|.||| |.|.|||.|GUUUCCAGAGCUUUACCUGAGAAACAAG
8586
949
GGUCAGUCUAG-CACAGGGAUAUGAGAGAACUUCU|.|||..|||. ||...||||.||..|||..||.|GUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUU
8788
951
CACGGUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUU|.|.|.|||..|...||.|||.|..||.|||||||CUCUGGCAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACUU
8990
953
CUACACACAGGCUG|.|||||..|||||CAACACAAUGGCUG
9192
957
GUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCU|||| ||||.....|.||...||||||||GUCU-GCACCUUUCUCUGCAGGAACUUCU
9394
959
CAGGCUGCUUAUGUCACCAC|||||||...|.||||..||CAGGCUGAGGAGGUCAAUAC
9596
960
CACCUCUGACCCUACA||.||||.|||.||.|CAGCUCUCACCGUAUA
9798
1012
UGAUGUGGAAGUGGUGAAAGACCAGUUUCAUACUCAUGAG||||.|.||||...|.|||..|||..|.||....|||.||UGAUCUUGAAGACCUAAAACGCCAAGUACAACAACAUAAG
99100
1013
UCAAACAGCUUUAGAAGAAGUA||||..||.|.|||||.|||.|UCAAGAAGAUCUAGAACAAGAA
101102
1014
CAAACAGCUUUAGAAGAAGU-AUUAUCG-UGGCUUCUUU||||||.||.||||.|.|.. |..|.|| |||.||||||CAAACAUCUGUAGAUGGACAGAAGACCGCUGGGUUCUUU
103104
1015
ACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUCGUGGCUUC|.||.|..|.|.|||.|.|||||..|.||||AAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUC
105106
1016
AGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGU|.|.||.|..||.|.|..|..|||| ||..||||.||||ACUCAAACAAGAUCUUCUUUCAACA-CUGAAGAAUAAGU
107108
1018
AUUUGGAAGCUC-CUGAAGACAAGUCAUUUGGCAG|||||.||.||. |.||||..|.|..|.||..|||AUUUGCAAUCUUUCGGAAGGAAGGCAACUUCUCAG
109110
1020
AUCAAACA-GCUUUAGAAGAAGU|||||||| ||.|.||||.||.|AUCAAACAAGCCUCAGAACAACU
111112
1022
GACACAUUGCAAGCA|||||.||||.|.||GACACUUUGCCACCA
113114
1023
UGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGU||||.|.|.||.|.|   .||||||.|||..||.||||||.|UGAAAUUAGCCGGAA---AUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAU
115116
1025
AAACCUG-GACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUC|.||.|| |||.|...|||||.|.|||.|.|...|||...|||AGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUC
117118
1026
CUGCUGAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAU||.|.||.||...|..|.|||||...|.||||||CUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAU
119120
1027
ACAGCUUUAGAAGAAG|.||||..||||||.|AGAGCUAAAGAAGAGG
121122
1028
AAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUU--UAGAAGAAGUAUUAUCGUGGCUUCUUUCUGCUGAGGACACAUUGCAAGC|.||.||||  |..|.||||||..|.  ||.|.||||||..||.....|||....|..||||  |.|||||.|..||AUACUUGGA--GAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGA--AAACAUUCCUGGC
123124
1029
CUAAUGA-UGUGGAAGUGGUGAAA|||||.| ||.||||.|.|.||.|CUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACA
125126
1030
GACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAG|||||| ||.|||||||.|.||        |.||.||..||..|||||.....|||||...||...||||GACAAG-CAGUUGGCAGCUUAU--------AUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUCAAAUGCCUCAGGAAG
127128
1031
GACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAG-UGAAGUAA||||||||||.    ||.|||.|...|.|||. |||||.||GACAAGUCAUG----AGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAA
129130
1032
ACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAGU-GAAGUAAA--CCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAA---GAAGUAUUAUCGU|||||..|.|..|..|.|..|.||||.||.|. ||.|.|..  ||||.|..|..|.||||.||   |.|.||| ||||||.||..||ACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAG-UGUGGAACAGGAAGUAGUACAGU
131132
1033
UGAUGUGGAAGUGGUGA--AAGAC|||.||||||.||||||  |||||UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGAC
133134
1034
CUAAUGAUGUGGAAGUGGUGAA-AGACCAG|||..|||.|||||.||...|| |||.|||CUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAG
135136
1035
AAACAGCUUUAG--AAGAAGUA||||||.|||.|  ||||||.|AAACAGUUUUGGGCAAGAAGGA
137138
1036
AAGCACAAGGAGAGAUUUCUAAUGA-UGUGGA||.||||.|||.|..|||.....|| ||||||AAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUGUGGA
139140
1037
GAAGUAAACCUGGA|||.|||..|||||GAAUUAAGACUGGA
141142
1038
UGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGU|||||.||  .||||.|..|.|.|..|||.|.||.||.||.|UGAAGGAA--UUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUU
143144
1039
AUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCU||||.||.|.||.|.||..|||.|AUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUU
145146
1040
UGAGGACACAUUGCAAGCACAAGG----AGAGAUUUCUAAUGAUGUGGAAGUGGUGAAAGA|||||.|.||..|.|...|.||||    |||.||||||.||.| ||||.|...||..||||UGAGGUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCA-GUGGUAUCAGUACAAGA
147148
1041
GCUGAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAUU-UCUAAUGAUGUGG|||||...||....|.|.|||....|||.|.|| |||.|.||||.||GCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUGAGGGCUUGUCUGAGGAUGGGG
149150
1042
CUGAAGACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUU-AGAAGAAGUAUUAUC-GUGG-----CUUCUUUCUGCUGAGGACACAU-UGC-//|||||||||.| |.|||||.|.||..|| |||.....|..|.|.|  .|.|||.|..||||..||..|.| |.|||...|||||.| ||||     |||||...||||...|||...| |||CUGAAGACAUG-CCUUUGGAAAUUUCUU-AUGUGCCUUCUACUUA--UUUGACUGAAAUCACUCAUGUCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUCCUGACCUCUGUGCU//
//AAGCACAAGGAGAGAUUUCU  |||..|...|| ||||.|||//AAGGACUUUGA-AGAUCUCU
151152
1044
CGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUC-GUGGCUUCUUUCUGCUGAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAUUUCUAAUGAUGUGGAAGUGGUGAAAGACCAGU||||.|||....|.|.|| ||||..|.|.||| ||||||.......|||||  |||..||...|| |.|...|.|.|||.||.|..||..||||...|..|||.||.|..CGUUUUCAUUAUGAUAUA-AAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGA--ACAGUUUCUCAG-AAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAU
153154
1046
AAGUAAACCUGGACCGU-UAUCAAACAGCUUUAGAAGAA---GUAUUAUCGUGG|||.|.|.||.|.|.|. |.|||||.||.||||.|.|||   ||.||||.||.|AAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUUUUAUGGUUG
155156
1047
AAGCUCCUGAAGACAAGUC||||||..|.||||||.||AAGCUCAAGCAGACAAAUC
157158
1048
UGGAAGCUCCUGAAGACAAGUCAUUUGGCAGUU|.|||||||.  ||.|.|||.|.||.|||||.|UUGAAGCUCA--AAUAAAAGACCUUGGGCAGCU
159160
1049
GAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUC||.|.||||.||....|..|...|.|.|||.|.|.|.|.|||||..|.||.||GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUUGUC
161162
1051
UUCAUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGA-AGAAGUAUUAUCG--UGGCUUCUUUCUGCU-GAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAU|||.||||||..|.|.|.|......|||| |.|.|.||||.|.|..||.|| ||||.|  ||.||  |||||| |.|||||| ||..|.....|..||.||||..|.|.|||UUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGG-CAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACU--UACCGACUGGCUU-UCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAU
163164
1053
GAGAGAUUUCU-AAUGAUGUGGAAGUGGUGAAAGACCAGUUUCAUA||.|||.|||. |||.|...|||.|..||..||||.||..||||.|GAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGA
165166
1055
CAGCUUUAGAAGAA|.|||||.||||||CUGCUUUGGAAGAA
167168
1057
CAUUUGGAAGCUCCUGAAGACAAGU|||||||||||...|...|||.|||CAUUUGGAAGCCAGUUCUGACCAGU
169170
1059
CUUUCUGCUGAGGACACA||..||.|||||||.|.|CUGCCUCCUGAGGAGAGA
171172
1060
CAUUUGGAAGCUCCUGAAG||..||||||||.|||.||CAGAUGGAAGCUUCUGCAG
173174
1112
AUCAGAAGAUGAA------GAA--ACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAGCAUGGAAAAACAAA|||||||..||||      |||  ||||....||||.|.||||.|||....|.|.....|.|..||.|..|||||..|| |.||....|.|||.|.|.||AUCAGAAACUGAAAGAGUUGAAUGACUGGCUAACAAAAACAGAAGAAAGAACAAGGAAAAUGGAGGAAGAGCCUCUUGG-ACCUGAUCUUGAAGACCUAA
175176
1113
AGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUU-CAAGAUGG|||||||..||||   .|||.|||||....|.|.|||...||.|.|. ||.|.|||AGAAGAUCUAGAA---CAAGAACAAGUCAGGGUCAAUUCUCUCACUCACAUGGUGG
177178
1114
GAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGA||||...||||....|||.|.|..||||.||GAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGACAGAAGA
179180
1115
UAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAG-CAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAGCAUGGAAAAAC|.||||||.|.|||||..|.|. |.||||||. ||.|..|.|..|.|    |.|||||...||||.  .|...||.|.||.|.|.||||||UUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGU-GAACAAGAUUCACACAACUGGCUU----UAAAGAUCAAAAUGA--AAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAAC
181182
1116
AAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGA-UGAAUCUCCUAAAUUCAAGAU||||||..|.|.|.||.|.|||.| ||.||...||.||. ||||||AAGAAAAAGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAAA-CAAGAU
183184
1118
AGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAA|||.||.||.|||||.....||||||AGGCAACUUCUCAGACUUAAAAGAAA
185186
1120
CGGGUUGGUAAUAUUCUACAA-UUGGGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAA-AUUAUCAGAAGA|.|||.|.|...|||||.|.| |||..||||.||....||  |||.||... |.||||||||.|CCGGUGGAUCGAAUUCUGCCAGUUGCUAAGUGAGAGACUU--AACUGGCUGGAGUAUCAGAACA
187188
1122
CCAUCAGGGCCGGGUU||||||||.|..||.|CCAUCAGGACAUGGGU
189190
1123
CUGAUUGGAACAGGAAAAUU--AUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCU||||....|.|.|||||..|  |||||||..||||||||.|||.|.||....|.|||.|. ||||||CUGAAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGC-UCUCCU
191192
1124
GAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUC|||..|||||.|.   ||.||.|||||.||||.|GAUUCAGAAAUUC---UAAAAAAGCAGCUGAAAC
193194
1125
GUUGGUAAUAUUCU-ACAAUUGGGA--AGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACA||..||.||||||. ||||||..|.  |||......|.||..| |.|||..|...||||||||.|||||  |||||.|.|GUCAGUGAUAUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCA-AUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAA--UGAAGCAGA
195196
1126
CAGGAAAAU-UAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAA|||.||.|| ||||||| ||||.|..|| ||.|..|||..|||.||.|||CAGAAAGAUCUAUCAGA-GAUGCACGAA-UGGAUGACACAAGCUGAAGAA
197198
1127
AAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAU||||.||.|......||..|.|||.|.|..||||.|||||.|.|AAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACU
199200
1128
GAAGAUGAAGAAA---CUGAAGUACAAGA|.||.|||.||||   ||||.||.|.|||GGAGCUGAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAGA
201202
1129
GCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCA--GAUGAAUCUCCUAAAUUCAA||..|||||.||||  |...||.||||.|..|.||..|..||.|..|.| |.||  ||.|||..|...|.|||.||GCAUAUUGGCACAG--ACCCUAACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGCUA-AUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAA
203204
1131
AAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUA-CAAGAGCAGAUGAA||.||||||.||..||..|....|||||...| ||||||| |||||.| ||..|.|||..|||AAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUA-GAAGAAA-UGAAGAAACAUAAUCAGGGGAA
205206
1132
AUUGGGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAA|||||.||..|||. |..|||||||||||AUUGGAAACAAAGA-GUGUGGAACAGGAA
207208
1133
AAAAUUAUCAG--AAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAA||||.|.|.||  ||| |||||  .|||||||..||..|..|||.||AAAAGUCUGAGUGAAG-UGAAG--UCUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAA
209210
1134
UGGAACAGGAAAAUU-AUCAGAAGAUGAAGAAA|||||..|..|||.. |||||.||.|||||.||UGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAA
211212
1135
AGAUGAAGAAACUGAAG||||..||||||.||||AGAUUGAGAAACAGAAG
213214
1136
AUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUG|||||| ||..|||||||...||.| ||.||.|||.|AUCAGA-GAAAAAGAAACCCCAGCA-AAAAGAAGACG
215216
1137
AUGGAUUUGACAGCC||.|||||| |||||AUCGAUUUG-CAGCC
217218
1138
AAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCU||||||....|||......||..|||||.|.||..||..|.|||||||AAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCU
219220
1139
AGAAGAUGA-AGAAACUGAAG-UACAAGAGCAGAUG||||...|| ||.||.|.||| ||.||.|||||.||AGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUG
221222
1140
AGUACAAGAG-CAGA-UGA--AUCUCCUAAAUU|||||||||| |||. |||  |||||||.||.|AGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAU
223224
1141
GAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAU||||.|.|||.|.|..||.||||   ||||.|  ||||.||.|||||GAAAUUGAUCGGGAAUUGCAGAA---GAAGAA--AGAGGAGCUGAAU
225226
1142
UAUCAGAAGAUGAAGAA|||.|||||..|||.||UAUUAGAAGUGGAACAA
227228
1144
ACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAGCAUGGAAAA-ACAAA|||..|||.||..|.|.||..|.|   ||||....|||.|||.||..|.|..|.||||..||| |||||ACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGA---AAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAA
229230
1146
GAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAA||||.||||.||.|.||.. |.||..||.|||||GAAGAACAAAAGAAUAUCU-UGUCAGAAUUUCAA
231232
1147
CAGAAGAUGAAGA--AACUGAAGUACAAG----AGCAGAUGAAUCUCC|||||||..||||  ||||..|..|.|||    ||||||..|||||||CAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCC
233234
1148
AACUGAAGUACAAG-AGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGA|.||||...||||| ||.|..||||.|||  ||||..||||ACCUGAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUC--AAAUAAAAGA
235236
1149
GGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAG|.|||.|.||.|..|....|||.|.||.||.|.||.||..|||||GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAG
237238
1151
AUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCC|.|||.||.|.|..|.|||..|.|.||||||AGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCC
239240
1153
GAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCA||||....||||||...|..|.|  ||||||||||||.||GAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGA--UGAAGUACAAGAACA
241242
1155
AGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUC|||.||....|..|.||||.||||||.||||||.|AGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAAC
243244
1157
GGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAU--GAAGAA-ACUGAAGUACA||.||..|.|| ||||||   ||..|.||..|||.||.|  ||||.| |..||.|||||GGCAGGCACCU-AUUGGA---GGCGACUUUCCAGCAGUUCAGAAGCAGAACGAUGUACA
245246
1159
UCAGGGCCGGGUUGGUAAUAUUCUACAAUUGGGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUU- AUCAGAAGAUGAAGAAACU----GAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAU-//|||...|.|.||.||.||.|||..||..    |.|.|..|||||.|||.|.||.|||||. ||.|||...|..|.|.|||    |||.|.||||||...|.|.||...||..|.UCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCU----GCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUGG ACC//
//UCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAG  |||||.||.|.....||.|||..|.|.||//UCAAGCUGCGCCAAGCUGAGGUGAUCAAG
247248
1160
CCUAAAUUCAAGAUGGGA|||.||..|.||||||.|CCUGAACACCAGAUGGAA
249250
1217
ACAUAGAGUUUUAAUGGA|||.|.|..|.|||||||ACAGACAACUGUAAUGGA
251252
1243
GCUAACAAAAAC-AGAAGAAAGAACAAGG|.||||||||.. |.|||.|...||||||GUUAACAAAAUGUACAAGGACCGACAAGG
253254
1245
CAAAAACAGAAGAAAGAA-----CAAGGAAAAUGGAGGAAG||||||||||.|..||.|     ||.|.|||||.| |||||CAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAAUUG-GGAAG
255256
1254
UUACAUAGAGUUUUAAUGGAUCUCC-AGAAUCA|.|||.|||.|.|.||||..|||.. ||||.||UAACAGAGAAUAUCAAUGCCUCUUGGAGAAGCA
257258
1256
GAUCUCCA----GAAUCAGAAACUGAAAGAGUUGA--AUGACUGGCUA-ACAAAAACAGAAGAAAGAAC||.|||||    |||...|||.||.|.|.||.||.  ||.||...||. |..|||||||...|||.|.|GACCUCCAAGGUGAAAUUGAAGCUCACACAGAUGUUUAUCACAACCUGGAUGAAAACAGCCAAAAAAUC
259260
1315
UCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAA||||.||||||  |||||. ||||.|||UCACACAACUG--GCUUUA-AAGAUCAA
261262
1316
AAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAG|||..||||||||| |||||.|||AAGCGGAUCUAGAA-AAGAAAAAG
263264
1318
AAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCU--GCUUUGGAAGAACAACUUAA|||||...|||....|.||||||.||  |..||..|||||.||.|.||AAUCUUUCGGAAGGAAGGCAACUUCUCAGACUUAAAAGAAAAAGUCAA
265266
1320
AUCUAGUGGAGAUCACG-CAACUGCUGCU|.|.|.|||||...|.| |||||.|||||AACAAUUGGAGCAGAUGACAACUACUGCU
267268
1322
AGUCAGGGUCAAUUCUCUC||||||...|.|..|||||AGUCAGAAACCAAACUCUC
269270
1323
GCUUCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAG-GGUCAAUUCUCUCAC||||.|..|||.|||... |||||.|||...|| ||.|.||.||.||.|GCUUUACAAAGUUCUCUG-CAAGAGCAACAAAGUGGCCUAUACUAUCUC
271272
1324
ACAUGG-UGGUGGUAGUUGAUG|.|||| |||..|.||||||||AAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUG
273274
1325
AGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGU|||||||..||||..|.....||.|||.||AGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGAGCCAGAGU
275276
1326
CUUCAAGAAGAUCUA||.||..||||||||CUCCAGAAAGAUCUA
277278
1327
UCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGUCAAUUCUCUCACUCA|.|||||||.....|||||.||.|||..|..||.||....||.|||.|UAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGA
279280
1328
CAUGGUGGUGGUAGUUGAUG--AAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUG-GAAGAACAACUUAA||||.|||....||||..||  |..||.|..||.|.||..|||.||  |||... ||||.|.||.||||CAUGUUGGCAUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAACAAGUG--GCUAAAUGAAGUAGAAUUUAA
281282
1329
CAUGGUGGUGGUAGUUGAUGA|||||..|.|.||.|..||||CAUGGAUGAGCUAAUCAAUGA
283284
1330
UCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUC-ACGCAACU|||.|.|||.|..|.|||.||.|.|| |.|..||...||.|. |||||.||UCAUUGACAAGCAGUUGGCAGCUUAU-AUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCU
285286
1331
AGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGG||||||..| |||.||..|.|| ||||||AGAAGAAAU-GAAGAAACAUAA-UCAGGG
287288
1332
GAUGAAUCUAGUGGA---GAUCACGCAACUGC-UGCUUUGGAA|||||.|.|||..||   ||..|.|||..||| |||.||||||GAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAA
289290
1334
GCAACUGCUGCUUUGGAA|||.||.|.|.|.|||||GCAGCUACAGAUAUGGAA
291292
1335
UCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGUCAAUUCUCUCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAACUUA||||.||||..|.||..||.|..|.||.....|.||...|.||||..|..|.|..|.||.. ||||..|...|..|||..|..|.|.|...|.||.  |||||||..||||.|UCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCC-UUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGG--UGGAAGAUAAACUCA
293294
1336
UUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUG-GAAGAACAACUUAAG|.||||||||.    ||||..|.|.|||..|.||.... |||||....||||||UGGAUGAAUCA----GAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAAG
295296
1337
GAAUCUAGUGGAGAUCACGCAAC||.||||...|.||.||.|||.|GACUCUACACGUGACCAAGCAGC
297298
1338
AUCUAGAACAAGAACAAGUCA||||..||.|.|||.|..|||AUCUGAAAGAGGAAGACUUCA
299300
1339
GAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGC---AACUGCUGCUUUGGAAGA-ACAACUUAA||..||.|.||.|||.||.|.|.   |||.||.|||.|...||| |.|||.|||GAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUGUUACAGACAAAACAUAA
301302
1340
AGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGUC---AAUUCUCUCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGA-GAUCACGC-AACUGCU||.|||..||.|||||.||   |||.||   ||.|.||||| |||    |||||...|||..|.||..|..|..|| ||||.|.. ||.||||AGGUCUCAAAGAAGAAAAA---AGGCUCUAGAAAUUUCUCA-UCA----GUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCU
303304
1341
AGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAG|||||||...||.||..|.|.|||..|.|||AGUGGAGCCAACUCAGAUCCAGCUCAGCAAG
305306
1342
UGAUGAAUCUAG--UGGAGAUCACGCAACUGCUGC-UUUGGAA|||.|||.|.|.  |||.|||.||..||....||| |||||||UGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUGAAGACAUGCCUUUGGAA
307308
1344
AGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCA----CGCAACUGCUGCUUUGGAAGA-ACAACUU||.|..|.|||| |||||..|.||    |..|||.|.|.||..|.|||| ||||.||AGAUAUUUAAUC-AGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUU
309310
1346
CUUCAAGAAGAUCUAGAACAAG||..|||||.|.||.||.||||CUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAG
311312
1347
GUGCUUCAAGAAGAUCU--AGAACAAGAACAAGU|||||.|.|.|||..|.  |||.|||||..||.|GUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACU
313314
1348
AGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGG||.|.||.|.|..||.||||||||.|||AGAGCAGUUAAAUCAUCUGCUGCUGUGG
315316
1349
UAGAACAAGAACAAGUCAG|.|.|||||.|.||..|||UUGUACAAGGAAAAACCAG
317318
1351
GGUCAAUUCUCUCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAA|.||||.|.....|.|||||..| ||||.|.||.|.|||. ||.|.|||.||||...|..||.|..|...|.||||GAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAG-GGUGAUGGUGGGUGAC-CUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAA
319320
1353
GAUCUAGAACAAGAACA|||..||.|||||||||GAUGAAGUACAAGAACA
321322
1355
GCUGCUUUGGAAGAA|||||||||||||||GCUGCUUUGGAAGAA
323323
1357
UUCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAA|||.||.||.|| ||||..|||||.|UUCCAGCAGUUC-AGAAGCAGAACGA
324325
1359
GGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAACUUAAG||.||||.|...|.||...||.|..||||.||.||..||GGCGAUCUCCUCAUUGACUCUCUCCAAGAUCACCUCGAG
326327
1360
GCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAACUUAAG|.||.|||..||.||.||||. |||.|.||GAAAUUGCGCCUCUGAAAGAG-AACGUGAG
328329
1415
ACGUCUUACUGAAGAACA|.|.|||.|.|||.||.|AUGGCUUUCAGAAAAAGA
330331
1416
AUCGAUGGGCAAAC|||.||||||||||AUCCAUGGGCAAAC
332333
1418
UUCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGAA|.||.||.|.||||  ||||.|.||||.|UCCUGAAUUUGCAA--UCUUUCGGAAGGA
334335
1420
CAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGA||.|||.|||| |..|.|||||.|CAGAUGACAAC-UACUGCUGAAAA
336337
1422
UAUUGGGAGAUCGAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGG|||..|||||.| |||.|... ||||.|.|.||||UAUCAGGAGACC-AUGAGUGC-CAUCAGGACAUGG
338339
1423
UUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAAC||||||| |..||  |||..||..|||||UUUACAA-AGUUC--UCUGCAAGAGCAAC
340341
1424
AAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGAA||||.||...|..|..|.|...|.||.||.||||||.|AAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGGA
342343
1425
UGUAGAUGGACAGAAGA||.||.|||.|||||||UGAAGGUGGGCAGAAGA
344345
1427
AAAUGGCAACGUCUUACUGA|||..|.|||..||||||||AAAGUGAAACUCCUUACUGA
346347
1428
GCAAACAUCUG--UAGAUGGA|||||||..||  ||.|||.|GCAAACAAGUGGCUAAAUGAA
348349
1429
AUCGAUGGGCAAA||.||||.||.||AUGGAUGAGCUAA
350351
1430
CAGAAGACCGCUGGGUUCUUUUACAAG|||.||.||......|||.||.|||||CAGGAGUCCCUCACAUUCAUUGACAAG
352353
1431
UUUUACAAGACAU|||.|||||.|||UUUGACAAGUCAU
354355
1432
UGUAGAUGGACAGAAGA|.||||||.|..|||||UUUAGAUGAAGUGAAGA
356357
1433
AACGUCUUACUGAAG||.||||.|.|||||AAAGUCUGAGUGAAG
358359
1434
AAAUGGCAACGUCUU-ACUGAA|||||  ||.||||| ||.|||AAAUG--AAUGUCUUGACAGAA
360361
1435
CAGAAGACCGCUGGGUUCUUUU|||||||..|.|....||||||CAGAAGAGUGGUUAAAUCUUUU
362363
1436
CAAAUGGCAACGUCUUAC||.||||.|||.|.|.||CACAUGGAAACUUUUGAC
364365
1437
AUCGAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGACAGAAGACCG||||||..|||..|||.|. |.|..||...|||||.|AUCGAUUUGCAGCCAUUUC-ACACAGAAUUAAGACUG
366367
1438
UCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGA|||.|||..|.||....|.|.|.||||UCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGA
368369
1439
GAAGACCGCUGGGUUCUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCUUAC||||||.....||.|..|.||.|||| ||..||...||..||..||..|||||GAAGACAAUGAGGGUACUGUAAAAGA-AUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUAC
370371
1440
ACGUCUUACUGAAGAACA|.||||.|..||||||.|AGGUCUCAAAGAAGAAAA
372373
1441
GGGAGAUCGAUGGGCAAA||||.||.|| |.|||||GGGAAAUUGA-GAGCAAA
374375
1442
AAGACAU-CCUUCUCAAAU||||||| ||||...||||AAGACAUGCCUUUGGAAAU
376377
1444
AAAUGGCAACGUCUUACUGAAGA|||||||..|||.||..|.|.||AAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGA
378379
1446
UAGAUGGACAGAAGA||||.|.|||.||||UAGAAGAACAAAAGA
380381
1447
UUCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGAAC||||||||.....|..|...||||.||.||UUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGAC
382383
1448
AUUGGGAGAUCGAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGAC|.|.|||.||..||...|||.||.....|||.||||AGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGAAGGAC
384385
1449
AUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGACAGA|.|||||. |||.||||.|.|||.|.|AAGGGCAG-CAUUUGUACAAGGAAAAA
386387
1451
UGGACAGAAG--ACCG-CUGGGUUCUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCA|||||||||.  |||| ||||.||..|.|.|..||.....||.|.||||..||UGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACA
388389
1453
UGGGUUCUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGG---CAACGUCUUACUGAA||||.|....|||||||...|||||..||..||   ||||...|.|.||||UGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAA
390391
1455
CAAAUGGCAACGUCUUACUGAA|||.||.|||.|||.|||.|.|CAACUGCCAAUGUCCUACAGGA
392393
1457
CUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCU|.|||..|||.||....|..|.|.|||.|.|||||CAUUUGGAAGCCAGUUCUGACCAGUGGAAGCGUCU
394395
1459
GAUGGGCAAACAUCUGUAGAUG||..||||.|.|....||||||GACUGGCAGAGAAAAAUAGAUG
396397
1460
CUGUAGAUGGACAGAAGACC-GCUGGGUUCUUUUACA||.|.||.|..|.|||.||| |.|||...|||.|.||CUCUGGAAGACCUGAACACCAGAUGGAAGCUUCUGCA
398399
1516
AGAAAAAGAAGAUGCAGUG---AACAAGAUUCACACAA||||||||.| ||.||..|   |||...||||||.|||AGAAAAAGCA-AUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAA
400401
1518
CACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAA||||.||||.||....|.|||.|| |...||||....||||.|.||CACAGCUGGAUUACUCGCUCAGAA-GCUGUGUUGCAGAGUCCUGAA
402403
1520
AAAGAAGAU-GCAGUGAACAAGAUUCACA-CAACUG||.|.|||| |||...||||||..|||.| ||||||AAUGCAGAUAGCAUCAAACAAGCCUCAGAACAACUG
404405
1523
AACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAU||.|.||...|||.|||||...|||.|AAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUU
406407
1524
UUCAGAAAAAGAAGAUG---CAGUGAACA|||..||||||.||.||   |||||.|.|UUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGUGCAGA
408409
1525
UUUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACA-AGAUUCACACAACUGGCUUUAAAGAUCAA-AAUGAA|||||||...||...||||||.||...||.. ||||..|.| ||..|||...||...|.....|||||.|| ||||||UUUUAGUCAGUGAUAUUCAGACAAUUCAGCC-CAGUCUAAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAA
410411
1526
AUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAG|||..||.||||||  |.||.||.||.||..|||AUGAAUUACAGAAA--GCAGUUGAAGAGAUGAAG
412413
1527
AGAAAAAGAAGAUGCAGUGAA|.|||||||||....||||||ACAAAAAGAAGCGAAAGUGAA
414415
1528
CACACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAACU||.||||.|||||..|...|..|.|||..||..|||..|...||..|||.|.|CAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUU
416417
1529
AGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACA|||.|||......||..||||||.||.|AGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUA
418419
1530
UUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCA||.||||.||.|..||.||||...|.|.|..|||UUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUCAAAUGCCUCA
420421
1531
AAAAUGAAAUGUUAU----CAAGUCUUCAAA|||||..|||.|.||    ||||||.|.|.|AAAAUCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGA
422423
1532
GCCUUUUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUG|||..|||.|.|||..|..|.||..|||..||||||GCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUG
424425
1533
UUCAGAAAAAGAAGAUGCA|.|||||||||.|||.|.|UACAGAAAAAGCAGACGGA
426427
1534
CAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUGGCUUUAAAGAU-CAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAACUGGC||||||.| |||...||||.....|.||.|....||.||.|....||||| |.|||.||||||.    |.|||||.|.|.|.||||CAGAAAGA-AAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGA----AUGUCUUGACAGAAUGGC
428429
1535
UUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACA||.|||||.|||||.||||....|..||..|||||.|UUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGA
430431
1536
UGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGA||.|||..|...||||||||||....|||..|| ||||UGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAA-AAGA
432433
1537
UUUAAAGAUCAAAAUGAA|||||||....||.||||UUUAAAGGCAGAACUGAA
434435
1538
UGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUG-AACA-AGAUUCACACAACUGGCUUUAA|.|||..||||  |||..|...|..|||||. |||. ||||..|||.||.|.||||.||UCCAUUCCUUU--GAAGGAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAA
436437
1539
UCAGAAAAAGA-AGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAG|.|||.||||. |||.|.|.|.||.|    |.|.|||.|.|...|||.||| |||||...||||.|.|||||UGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGA----UAAAACAGCAGCUGUUACAGA-CAAAACAUAAUGCUCUCAAG
438439
1540
AAAGAAGAUGCAGUGAACAAGA---UUCACACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAACUGG||||||||...|..|..|.|||   |||.||..|.|||..|.  ||..|||.|.|.|...|.||.|..||.|.|||..||.|AAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUC--AGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUG
440441
1541
UUUCAGAAAAAGAAGAUGCAG-UGAA||.|||||.|||||...|.|| ||||UUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAA
442443
1542
GGCUUUAAAGAUC|.||||.||||||GACUUUGAAGAUC
444445
1544
UUUUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUG-GCUUUA--AAGAU-CAAAAUG-AAAUGUUAUC|.||||.|...|||||..|||||...|||.|.....|.|..||||..||.|...||| |..||.  ||.|| |.||||. |||||.||||UAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUC
446447
1546
AAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAA||||.|||||..|.||.||.|||....||||||.|AAGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCAAAGA
448449
1547
AAGAUCAAAAUGAAA-UGUUAUCAAGUCUUCAAA|||||.||..||||| |....|||||....||||AAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAA
450451
1548
GCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAA||||..|||....||||| |||||.||GCUUGAAGACCUUGAAGA-GCAGUUAA
452453
1549
GAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUGGCUUU||||..|||...|||||.  ||||.|  |.|||||.||.|.|GAAACUGAAAUAGCAGUU--CAAGCU--AAACAACCGGAUGU
454455
1551
UGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUU-AUCAAG||.|.||.|.|||...||.||.|||.| ||||||UGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAG
456457
1553
UUCAGAAAAAGAAG-AUGCAGUG-AACAAGAUUCACACAACUGGCUUUAA-AGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAA-ACUGGC|||||||..||..| |||.|||. ||.||.|....||.|||.||....|| ||.|.|  |||||||||||  |||..|||||.| |.||||UUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGA--AUGAAAUGUUA--AAGGAUUCAACACAAUGGC
458459
1555
UUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAA|||..|||.||||||.|||||...|||UUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAA
460461
1557
UUCAGAAAAAGAA-GAUGCA|||||||..|||| ||||.|UUCAGAAGCAGAACGAUGUA
462463
1559
UGGCUUUCAGAAAAAGA-AGAUG||.||..||||.|||.| |||||UGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUG
464465
1560
UCAGAAAAAGAAGAUG||.||||.||||..||UCUGAAAGAGAACGUG
466467
1618
AAAAGAAAAAG-CAAU||||||||||| ||||AAAAGAAAAAGUCAAU
468469
1620
UAAGUCAGUGACCCAGAAGACGGAAGCAUGGCUGGAUAACUUUGCCCGGUGUUGGGAUAAUUUAGUCCAAAAACUUGAAAAGAGUACAGC|||||.||.|||..|...|.|.|.||.||  |.|.|.|||.|   |.....||...|||||....|.|||.||.|.||..|||..|||.|UAAGUGAGAGACUUAACUGGCUGGAGUAU--CAGAACAACAU---CAUCGCUUUCUAUAAUCAGCUACAACAAUUGGAGCAGAUGACAAC
470471
1622
AAGUCAGUGACCCAGAAGACGGAAGCAUGG||.|.||||.|.|.||..|.|.||.|||||AACUUAGUGUCACCGACUAUGAAAUCAUGG
472473
1623
AAAAGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAAACAAGAUC||||||.|  .|.|.||||| ||.||..||||..|.||..||AAAAGCUA--GAGGAGCAAA-UGAAUAAACUCCGAAAAAUUC
474475
1624
ACCCAGAAGACGGAAGCAUGGCUGGA||||.|||||.  |.|.|||||||.|ACCCUGAAGAA--AUGGAUGGCUGAA
476477
1625
AAGACGGAAGCAUGGCUGGAUAACUUUGCCCGGUGUUGGGAUAAUUUAGUCCAAAAACUUGAAA||||..||||||..||..||.   |||||...|.|....||.|....|.||.||.|||||.|.|AAGAAUGAAGCAGAGCCAGAG---UUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACA
478479
1626
GGGCAAACUGUAUUCACUCAAACAAGAUCU|.|.||||||||..| |||.|..|||||||GAGAAAACUGUAAGC-CUCCAGAAAGAUCU
480481
1627
UUAAAAGCGGAUCUAGAAA||||||..|||.||.||||UUAAAAAAGGAACUUGAAA
482483
1628
GAAAAAGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUU||.|||||||.|.|..|||.||.||.|.|GAGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGU
484485
1629
CAGAAGACGGAAGCAUGGCUG||||.|.||||..|||||.||CAGAUGGCGGAGUCAUGGAUG
486487
1630
CCCAGAAGACGGAAGCAU|||||.||||.|||..||CCCAGGAGACUGAAAAAU
488489
1631
AGAAAAGAAAAAGCA-AUCCAUGGGCA|||||.|||.||.|| |..||.|||.|AGAAAUGAAGAAACAUAAUCAGGGGAA
490491
1632
UUAGUCCAAAAAC|||.||||.||||UUAUUCCAGAAAC
492493
1633
CCAAA-AACUUGA--AAAGAGUA-CAGC||||| |||||||  |||||||| ||||CCAAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACAGC
494495
1634
CGGAUCUAGAAAAGAAAAAGCAAUC|.|||.|.|||..||.||||..|||CAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUC
496497
1636
GGAUCUAGAAAAGAAAAAGCAAUCC||||..|..|.||||||||.||.||GGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCC
498499
1637
AAAAGCGGA-UCUAGAAAAGAAAAAGCA--AUCCAUG--GGCAAACUG|||.|.||| ||||.|...||..|||||  |..|.||  |||||||.|AAAGGUGGACUCUACACGUGACCAAGCAGCAAACUUGAUGGCAAACCG
500501
1638
AUUCACUCAAACAAGAUCUUCUUUCAACACUGAAGAAU--AAGUCAG|.|||...|.||||.|..|.|||..|.|||||.||..|  ||.||||ACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAG
502503
1639
AACUGUAUUCACUCAAACAAGAU-CUUCUUUCAACACUGAAGAAUAAGUCAGUGA||..|.|||....||||.|.||. |..|||.|||||..|||..|.|..|.||.||AAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGA
504505
1640
AAAAGCGGAUCUAGAAA||||..||.||||||||AAAAAAGGCUCUAGAAA
506507
1641
CAGAAGACGGAAGCAUGGCUGGAU|||||||.|.|||....||||.||CAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAU
508509
1642
ACUGUAUUCACUCA||||.|.|||||||ACUGAAAUCACUCA
510511
1644
ACUGAAGAAUAAGUCAGUGACCCAGAA-GACGGAA||.||||...||  ||||..|.||||| |||..||ACAGAAGCUGAA--CAGUUUCUCAGAAAGACACAA
512513
1646
AAAAGCGGAUCUAGAAAAGAAAAAGC|||||.|.|.|.|..|||..||||||AAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC
514515
1647
AAAAACUUGAAAAGA|.|||||||||||.|AUAAACUUGAAAAUA
516517
1648
AGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAAAC-AAGA||.||||..|.||.||..|.||..||..||||| ||||AGGAAUCAGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGA
518519
1649
UUUCAACACUGAAGAAUAAGUCAGUGACCCAG|||..|||..|||.||..||.||.|.|.||||UUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCCAG
520521
1651
GCAAACUGUAUUCACUCAAACAAGAUCUUCUUUCAACACUGAAG|.||||||...||.| |||||.|||..|.|..||..|..|||.|GGAAACUGCCAUCUC-CAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUG
522523
1653
AAAGAAAAAGCAAUCCAUGGGCAAA|.||.|.|.||||||||...|.|||ACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAA
524525
1655
GAAGAAU--AAGUCAGUGACCCAGAAGACGGAAGCAUGGC|||||.|  |||..|||.|...||..||.|.||..|||||GAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUGGC
526527
1657
UUCACUCAAACAAGAUCUUCUUU--CAACA-CUGAAGAAUAAGUCAGUGACCCAGAAGAC|||.||..|..||..|||..|.|  |.||| |||||..||.|...|.|.|.||.|.||.|UUCUCUGCAGGAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGAUGAUGAAUUAAGCCGGCAGGC
528529
1659
GCAAUCCAUGGGCAAACUGU--AUUCACUCAAAC-AAGAUCUUCUUUCAACACUGAAG|||..||.|||||.|.||..  |||.||||...| ||||||..||....|.|.|.|||GCAGCCCGUGGGCGAUCUCCUCAUUGACUCUCUCCAAGAUCACCUCGAGAAAGUCAAG
530531
1660
CAGAAGACGGAAGCAU||..|||.||||||.|CACCAGAUGGAAGCUU
532533
1718
AUCACUAACACAGACAACUGUAAUGGAAA||.|||..|.|||| |.||||..||.|.|AUUACUCGCUCAGA-AGCUGUGUUGCAGA
534535
1720
GAACUUCCACCACCACCUCCCCAAAAGA|||..||||.| |||||.|||||..|||GAAAAUCCAAC-CCACCACCCCAUCAGA
536537
1722
CCACCACUCAGCCAUCA||||||.|..||.||||CCACCAAUGCGCUAUCA
538539
1723
CACCACCUCCCCAAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAUUAG||.||||.|....||||| ||.|..||..|..|.|...|||||||||||CAGCACCACUGUGAAAGA-GAUGUCGAAGAAAGCGCCCUCUGAAAUUAG
540541
1724
UGUGGAUUCUGAAAUUAGGAAAA||.||||||.||||||...||||UGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAA
542543
1725
AAACAGU---AACUACGGUGACCACAAGGGAA|||||||   ||..|.||||..||.|||..||AAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAA
544545
1727
AAGAGGAACUUCCACCACCACCUCCCCAAAAGAAGAGGC||.||||||||..|.|.|.|.|..||.|..|..||.|||AAAAGGAACUUGAAACUCUAACCACCAACUACCAGUGGC
546547
1728
AACACAGACAACUG--UAAUGGAAACAGUAACUACGGUGACCACAAGGGAACAGAU-CCUGGUAAAGC||..||.||||.||  |||..|||..||.|..||...|.|..||.|..|||.|.|| |||||...|||AAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGC
548549
1729
UCCUGGUAAAGCAUGCUCAA-GAGGAACUU||.|||...||| |..|||| |||||||||UCAUGGAUGAGC-UAAUCAAUGAGGAACUU
550551
1730
AAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAA||.|||..|..|||..|.|...|||..||||||AACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAA
552553
1731
AGGGAACAGAUCCUGGUAAAGCAUGCU|.|.||||.|..|.||..|||.|.|||AAGAAACAUAAUCAGGGGAAGGAGGCU
554555
1732
CUGUAAUGGAAACAGUAACUACGGUGACCACAAGG-GAACAGAUCCUGGUAAAGCAU|||.|.||||||||...|.|..||. ||...|||. |.||||...|.|.||||.|||CUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGA-ACAGGAAGUAGUACAGUCACAGCUAAAUCAU
556557
1733
AGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAUUAGGAAAAG|.||.||.|.||.|...|||.|.||||||.|  |||||.|AUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGU--GGAAAUG
558559
1734
AGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAUU|.||..|.||.|.|||||||||||.||AUGCCUAGUAAUUUGGAUUCUGAAGUU
560561
1735
CACCUCCCCAAAAGAAGAG||||||||.|..|||||||CACCUCCCGAGCAGAAGAG
562563
1736
CCAAAAGAAGAGG|.|||||||||.|CAAAAAGAAGACG
564565
1737
CAGACAACUGUAAUGGAAACAGUAACUACGGUGACCAC|||..|||| |.||||.||     ||..||||||||||CAGCAAACU-UGAUGGCAA-----ACCGCGGUGACCAC
566567
1738
UGGAUUCUGAAAUU||||..||||||||UGGAGGCUGAAAUU
568569
1739
AAAGAAGAGGCAGAUUACUGUG--GAUUCUGAAAUUAGGAAAAG|||||.|||.||..||||....  ||.||..|.||.||..||||AAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAG
570571
1740
CAAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAU||..|.|||||||||..|..||... |.|||||||CAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUC-UCCUGAAAU
572573
1741
CAGAUCCUGGUAAAGCAUGCUCAAGAGGAA|||||||.|.|.| |||.||.|..|.||.|CAGAUCCAGCUCA-GCAAGCGCUGGCGGGA
574575
1742
AAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGA|||.||.||.|..|||.||||..||AAACGAUGAUGGUGAUGACUGAAGA
576577
1744
AAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAA||||..||.|||.|||.|.|||..|||AAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAA
578579
1746
GAAGAGGCAGAUUACUGUG||.||.||||||.||..||GAGGAAGCAGAUAACAUUG
580581
1747
GACCACAAGGG-AACAGAUCCUGGUAAAGCAUGCUCAAGAGGA|.|||.|||.| ||.|.|..||.| |||..|.|||||||..||GCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUG-AAAAUAAGCUCAAGCAGA
582583
1748
UACUGUGGAU-UCUGAAAUUAGGAA|.||||||.| |||...||||||||UGCUGUGGUUAUCUCCUAUUAGGAA
584585
1749
ACCA-CCACUCAGCCA|||| |||||||||||ACCAGCCACUCAGCCA
586587
1751
AAACAGUAACUACGGUGACCACAA|.||.||.|||..|||||| ||||AGACUGUUACUCUGGUGAC-ACAA
588589
1753
CCAUCACUAACACAGACAACUGU--AAUGGAA||.|||..|.|..||.||||.||  ||||.||CCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAA
590591
1755
CUCCCCAAAAGAAGAGGC||.|||..|||.|.||||CUACCCGUAAGGAAAGGC
592593
1757
AGCAUGCUCAAGAGGAACUUC|.|.|.|||...|||||||||ACCUUUCUCUGCAGGAACUUC
594595
1759
GUGACCACAAGGGAACA--GAUCCUGGUAAAGCAUGCUCAAGAGG|.|.|||.||.|..||.  |.|.||...||||||.|||.|.||||GAGCCCAGAAUGUCACUCGGCUUCUACGAAAGCAGGCUGAGGAGG
596597
1760
UUUCACAGGCUGUCACCACCACUCAGCCAUCACU-AACAC|.||||.|..|..|..||.|||||.|..|...|| |||||UCUCACCGUAUAACCUCAGCACUCUGGAAGACCUGAACAC
598599
1843
GAAGCUGUGUUGCAGAGUCCUGAAUUUGCAAU||||||.|.|..|||    ||..||||.||||GAAGCUCUCUCCCAG----CUUGAUUUCCAAU
600601
1845
GAGUCCUGAAUUUGCAAUCUUUCGGAAGGAAGGCAACU---UCUCAGACUUAAAAGAAA||..|||||||.|||..|.  .|.|.|||...||||..   |.||||||..||||.|.|GAAGCCUGAAUCUGCGGUG--GCAGGAGGUCUGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAAGA
602603
1854
UAAAAGAAAAAGUCAAU|||.|||.||..|||||UAACAGAGAAUAUCAAU
604605
1856
GAUGUUGAUAUAAC-UGAACUUCA||.|||...||||| |||||||||GACGUUUGGAUAACAUGAACUUCA
606607
1920
AGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGUGGAACAGAUGGUG|.|.||||.|.|..|||.....|..||||.||.||.|....|.||||||.|..||..||AAUGCAGAUAGCAUCAAACAAGCCUCAGAACAACUGAACAGCCGGUGGAUCGAAUUCUG
608609
1922
UCAGAAAACUGCAAGA-UGCCAGCAGAUCA||||.|.||  ||.|| |||||.|||..||UCAGGAGAC--CAUGAGUGCCAUCAGGACA
610611
1923
AGCGAGAAAAAGC--UGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCC--CUGGUGGAACA|||..||||.|.|  |.||||.||.|..|||.||...||.||..|.|||....|||...||  |||||.||.||AGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCA
612613
1924
AUCAGCU-CAGGCCCUGGUGGAACAGAUGG-UGAA||||..| ||..|||||..|.||..||||| ||||AUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAA
614615
1925
AGAGCGAGAAAAAGCUGAGA-AGUUCAGAAA--ACUGCAAGA|||||.|||....|||..|| |.||.|||.|  |||..||||AGAGCCAGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGA
616617
1926
GCCAUAGAGCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUC--AGAAAACUGCAAGAUGCCAGCA-GAUC-AGCUCAG-- GCCCUGGUGGA--ACAGAUGGUGAA||||.|.|| |||.....|..|.||.|||.  |||||||||.|||...||||.| |||| |.|..||  ||.|...||||  |||.|.|.||||GCCAGAAAG- GAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAA
618619
1928
AGCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAU|||||||.|..||....|..|||.||||AGCUGAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAGAU
620621
1929
AGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGUGGAACAGAUGGUGAA||||.|  |||.||..||.|||.||||     |||||||||.|.|AGAUUC--GCAUAUUGGCACAGACCCU-----AACAGAUGGCGGA
622623
1930
CAUAGAGCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUG-CAAGAUGCCAGCAGAUCA|||..|..||.||..||.|| |.||.|.|.|...|.| ||||.||...||||.|||CAUUCAUUGACAAGCAGUUG-GCAGCUUAUAUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUCA
624625
1931
AGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAG|.|.|.||..|||||||.|.||ACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAG
626627
1932
AGAAAACUGCAAGAUGCCAGCA|.||||.|.|||||||.|..||AAAAAAUUACAAGAUGUCUCCA
628629
1933
AGAAAAAGCUGA-GAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCU|||||||||.|| |||..||..|||... |..||||..||...|.|||||AGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAA-CUUGAUGAAAGAGUAACAGCU
630631
1934
CAUAGAGCGAGAAAAAGCUG-AGAAGUUCAGAAAACUG||.|.||..||.||.||.|| ||||.|.|...|||.||CAGAAAGAAAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUG
632633
1935
AGCUGAGAAGU-UCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGUGGAACAGAUGGUGAAUG|.||||..||| |||.|.|..|...|||.|||...|.|.|||.|..||.|..|..|||...|.|||||.|.|ACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAG
634635
1937
GCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAG|.|||..|.|.|||.|||.|...|||..||...|..||||GGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAGCCCCAAAUCUCAG
636637
1938
AGCAGAUCAGCUCAG|||||.|.|.|||||AGCAGUUUAACUCAG
638639
1939
CAUAGA-GCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGA--AAACUGCA||.||| |.||||||..|....|||.|..|||  ||||.|||CACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCA
640641
1940
CGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGU-GGAACAGAUGGUGAA|.|||||...||.|..|||... |..|.|.|||||.||..||.|||.|.|||..|...||.| |||..|.||.|..||CUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGU-AUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAA
642643
1941
CAGAUC-AGCUCAG---GCCCUGGUGGAACA|||||| |||||||   ||.||||.||.|.|CAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAA
644645
1942
GUGGAACAGAUGGUGAAUG||||||||..|..|.||||GUGGAACAACUUCUCAAUG
646647
1944
CAUAGAGCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCA||.|.||..|.|||...||||||| ||..|||.| |||.|.||.|.|CAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAA-UUGGGAACA-UGCUAAAUACAA
648649
1946
AGAAAAAGCUGAGAAGUUCA||||||...||||.|..|||AGAAAAGCUUGAGCAAGUCA
650651
1947
AGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUG--CCAGCAGAUCAGCUCAGGC|.|||..|||||.|  |||||||.  |..|.|.||.||||||.||AUAAGCCCAGAAGA--GCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGC
652653
1949
AGCAGAUCA-GCUCAGGCCCUGG---UGGAACAGAUGGUG|||||.||| |||.|....|.||   |||||.||||..||AGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUUG
654655
1953
GAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUG-CAAGAUGCCAGC|||.||||||||.||.||..|..||.| |.|||..|.|||GAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGC
656657
1955
AGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAG|||||.|.|.|.||||||.|....||..|||AGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAG
658659
1957
GCAAGAUGCCAGCAGAUCAG||.|..|.|||||||.||||GCGACUUUCCAGCAGUUCAG
660661
1959
AACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCU||||.|||||.|||| |.|||.||||  ||.|||AACUUCAAGAGGCCA-CGGAUGAGCU--GGACCU
662663
1960
AGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCU|.||..||||.|..|||.||||  ||.|.|.|.|||.|AUAACCUCAGCACUCUGGAAGA--CCUGAACACCAGAU
664665
2021
AACCCACCACCCCAUCAGAGC-CAACAGCAAUUAAAAGUCAGUUAAAAAUU||..||.|...|.|||||..| ||||..|||.|..|| |..|||||||||AAGUCAACCGGCUAUCAGGUCUUCAACCUCAAAUUGAA-CGAUUAAAAAUU
666667
2050
ACAACAAUUGGAGC||.||.||||||||ACCACUAUUGGAGC
668669
2052
CAAUUGGAGCAGAUGACAACUACUGCUGAAAACUGGUUGAAAAUCCAACCCACCACCCCAUCA-GAGCCAACAGCAAUUA||.|||||..|..|.|..||..||||..||||.|   ||||||.|.|..|||.||    |||| |||.|.|.|.||||.|CAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUU---UGAAAAACAAGACCAGCA----AUCAAGAGGCUAGAACAAUCA
670671
2058
ACUGAACAGCCGGUGGAUCGAAU||.||.|||||..||||..||.|ACAGAGCAGCCUUUGGAAGGACU
672673
2122
CAACCGGCUAUCAGG|||...|||||||||CAAUGCGCUAUCAGG
674675
2123
UCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAGA||..||||...|..|||||||||UCUCAGCACCACUGUGAAAGAGA
676677
2124
GAUUAA-AAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAG||||.| ||||||.||..|.....||||||.||GAUUCAGAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAG
678679
2125
CAUUUUAAGCAA-GUCUUUUCUGAUGUGCAGGCCAGAGAGAAAGAGCUACAGACA||.|.|||.||. |||..|...|.||.||||...|.|.||||.||...|.||.||CAGUCUAAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGAGCCA
680681
2126
AGAAAGAGCUA-CAGACA|||||||.||| ||||.|AGAAAGAUCUAUCAGAGA
682683
2127
CUGAAAGAGAAAGGACAAG|||||.|.||||.| ||||CUGAAUGGGAAAUG-CAAG
684685
2128
AUUAAAAAUUCAAAGCA|||.|||.||.|||.||AUUUAAACUUAAAACCA
686687
2129
GAUUAAAAAUUCAAAGCAUAGCCC|||...|.|||||.||.|||.|||GAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCC
688689
2130
CCUCAAAUUGAACGAUUAAAAAUUCAAAGCAUA|||||.|||.|..||..|..|.||...|||.||CCUCACAUUCAUUGACAAGCAGUUGGCAGCUUA
690691
2131
AAGUCUUUUCUGAUGUG-CAGGCCA-GAGA||.||...||||||.|| ||.|.|| ||||AAAUCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGA
692693
2132
UGAAGUC-AACCGGCUAUCAGGUCUUCAACCUCAAAUUGAACGAUUAAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGA||||||. ||..||..||.|.|.||..| |.|||.||||.|| |..||||....|..|.|.|.|||  |||||UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGA-CGUCAGAUUGUAC-AGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCC--AAAGA
694695
2133
AAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGA---GAAAGGACAAGGACCCAUGUUCCUGGAUGCAGACUUUGUGGCCUUUACAAAU|.||||.|...|.||.|.||.|.||||   ||||||| ||.||   ||||  ||.||  ||||.|...||||...||||.||AGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGA-AAUGA---AUGU--CUUGA--CAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAU
696697
2134
GUGGCCUUUACAAAUCAUUUUAAGCAAG|.||||||.| |||...||||..|||||GAGGCCUUGA-AAACAGUUUUGGGCAAG
698699
2135
UUUGUGGCCUUUACAAAUCAUUUUAAG||||..|||.||.||.|.....|||||UUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUAAG
700701
2136
CUGAAAGAGAAAG|||||||||.|||CUGAAAGAGGAAG
702703
2139
AAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAGAAAGGACA|||.|.|||.||...||.   |||||.||.||||.|AAAGAAUCACAGAUGAGA---GAAAGCGAGAGGAAA
704705
2140
AGCCCUGAAAGAGAAAGGACAA|||||.||.|. |||||||.||AGCCCAGAGAU-GAAAGGAAAA
706707
2141
AAGCAUAGCCCUGAAAGAGAAAGGACAAGGACCCAUGUUCCUGGAUGCAGACUUUG||||...|.|..||||..||.||.|.|....|.||..|||...||..|| ||||||AAGCGCUGGCGGGAAAUUGAGAGCAAAUUUGCUCAGUUUCGAAGACUCA-ACUUUG
708709
2142
AGCCCUGAAAGAGAAAGGACAAGGACCCA-UGUUCCUGGAUGCAGACUUUGUGGCCUUUACAAAUCAUUUUAAGCAAG||||||...|||....|.||||...|.|| ||.|||||....|.|...|.. ||.||||..|.|||..||||||||||AGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUCCUGACCUCUGUGCUAA-GGACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCAAG
710711
2144
ACAAGGACCCAUGUUCCUG|.||.|||.||..||||||AGAAAGACACAAAUUCCUG
712713
2146
UUACAAAUCAUUUUAA--GCAAGUCUUUUCUGAUGUGCAGGCCAGAGAGAA-AGAGCUA||.||||....|||||  |.|..|.||||.||.| ||.|||....|||.|| |..||||UUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUUUUAUGGU-UGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUA
714715
2147
AGCCCUGAAAGAGAAAG|||||.||| |||.|||AGCCCAGAA-GAGCAAG
716717
2148
UUCAACCUCAAAUUGAA||.||.|||||||..||UUGAAGCUCAAAUAAAA
718719
2149
UGGAUGCAGACUUUGU||||.| |||.|||||UGGAAG-AGAUUUUGU
720721
2151
CCAUGUUCCUGGAUG||||.|||||.||||CCAUCUUCCUUGAUG
722723
2153
AAUUGAACGAUUAAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAGAAAGGACAAG|||..||.|.|.||..||||||..||..|.| ||.|||..||.|.|.|||AAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGC-UGGAAGCUAAGGAAGAAG
724725
2155
CCCAUGUUCCUGGAUGCAGACUUUGUGGCCU---UUACAAA|||.||..||||||   |.|.|||.|.||||   |||||.|CCCCUGGACCUGGA---AAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGA
726727
2157
GAUGAAGUCAACCGGCUAUCAGGUCUU||||||.|.|.|||||...||..|.||GAUGAAUUAAGCCGGCAGGCACCUAUU
728729
2159
GGCCUUUAC-AAAUCAUUUUAAGCAAGUCUUUUCUGA|||.|.||| |||.||...|.||.|.|||..|.||||GGCUUCUACGAAAGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGA
730731
2160
CCCUGAAAGAGAAAG|.|||||||||||.|CUCUGAAAGAGAACG
732733
2250
GGGUCCAGCAGUCAGAAACCAAACUC|||...|||||.|.||  ||.|.|||GGGCAAAGCAGCCUGA--CCUAGCUC
734735
2252
CACCAAUGCGCUAUCAGGAGACCAUGAGUGCC||.||||||...||..|||....|.|.||.||CAACAAUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCC
736737
2258
CGCUAUCAGGAGACCA|.|||.||||||.|||CUCUACCAGGAGCCCA
738739
2324
AAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGG|||..||..||.|...|||||||||.||.||AAUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGG
740741
2325
GAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGA||.|..|.|..|||||.|..|||||.||.|GAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAA
742743
2326
CUGAAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAU--UGAGGGACGCUGGAAGAAG|||.||....||.||||.|||.||||||..|..|.|||..  |||...|.|||| ||||||CUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUG-AAGAAG
744745
2327
CUCAGCACCACUGUGAAAGAGAUGUCGAAGA|||.||||.|...||||.|.||..|..||||CUCUGCACUAGGCUGAAUGGGAAAUGCAAGA
746747
2328
AGAGCAACAAAGUGGC|.|||||..|||||||AAAGCAAACAAGUGGC
748749
2329
AUCAAUCAG-AAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCU||||||.|| ||.||||...|.||.|....||.||||.|.|.||AUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAAUUCUCGUUGGAGGGAACU
750751
2330
AAAUUG-AGGGACGCUGGAAGAAGCUC|.|||| ||..|.|.||||.|.|||||AUAUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUC
752753
2331
AUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGAC|||||. ||.||||||||..||..||AUCAGU-UUAGAAGAAAUGAAGAAAC
754755
2332
AGUUCUCUGCAAGAGCAACAAAGUG|.||..|||||...|.|||||||.|ACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAG
756757
2333
AAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAA|||..||.|||||| |||....||||.||||.||||AAAGCAGACGGAAA-AUCCCAAAGAACUUGAUGAAA
758759
2334
AAGAAAGCGCCCUCUGAAAUUA-GCCGGAAAUAU--CAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCU//||||||||..|...||.|...| ||..|||||..  |..|.|||.....|||.||.|||..|.|. ||..||||...||.....|..|.|.|...|.||||.||||.AAGAAAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCU-UGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAG---//
//AGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAAAAAUU  |||..||||..||||..||..||.|..||||//AGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGCCUAGUAAUU
760761
2335
CCACUGUGAAAGAGAUGUCGAA---GAAAGCGCCCUCUGAA|.|||...||||||||...|||   |||.|.||.| |||||CUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCAC-CUGAA
762763
2336
ACAAAGUGGCCUAUACUAUCUCAG-CACCACUG--UGAAAGAGAUGUCGAAGAAAGCGCCCUCUGAAAUUAGCCG|||||||||...||.|...||.|. |||...||  ||||..||| |...||||||.| ||..|..|||..||.||ACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGA-GAAAAAGAAACC-CCAGCAAAAAGAAGACG
764765
2337
AUAUCAAUCAGAAUU||.|||..|||||||AUUUCACACAGAAUU
766767
2338
UUUGAAGAAAUUG|||||||.|||||UUUGAAGGAAUUG
768769
2339
AAAGCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAAC|||||.||||||...||.||..||||AAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAAC
770771
2340
GAAAUAUCA-AUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCA-GCU-GGUUGAGCAUUGUCAAAA|||||.||. |||||...|...||.|...||||.|.||||    |.|.||||||...| ||| ||.||| |||||..||||GAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUG----AUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGA-CAUUGAAAAAA
772773
2341
AUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACG--CUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCUAGAGGAGCAA|.||..|||.|.|.|||.||||...||..||.|  |||.|.|.||..|.....|.|||||  .|.|| |||||..|.|.|.|.|..||||AAAUUGAUCGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUG--AGGGC-UUGUCUGAGGAUGGGGCCGCAA
774775
2342
ACUGUGAAAGAGAUGUC-GAAGAAAGCGCCCUCUGAAAUU||..|||..|.||||.| |||||.|. |||.|..||||||ACGAUGAUGGUGAUGACUGAAGACAU-GCCUUUGGAAAUU
776777
2344
GAAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGAC--GCUGGAAGAAGCU|||||  |.|||...|.||| |.|..||.|.||||.|||.|...|.  |||...|||||||GAAAU--GGCGGCGUUUUCA-UUAUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCU
778779
2346
GCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAAAAAUUCA||||||.||.||||.|||||...|...|.||.||||GCUAGAAGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCA
780781
2347
GGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGC||||.|.||||.||  |||..|.||||.||..||||.|GGAAUUCUCAAACA--AUUAAAUGAAACUGGAGGACCC
782783
2348
GAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCC|.|||||||||.|  |.|....|.|||..||....| ||||.|...|..|...|.||.|.||.||.|||||..|.|||.|.||.|GGAGAAAUUGAAG--CUCAAAUAAAAGACCUUGGGC-AGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUGC
784785
2349
UGUGAAAGAGAUGUCGAAGAAAGCGC||||.|||||||.|.|...||||.||UGUGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGGC
786787
2351
UUCUCUGCAAGAGCAA||||||||..||.|||UUCUCUGCUUGAUCAA
788789
2353
GAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCU--GGAAGAAGCU|||||.|.||  ||.|||..|...|||.|..|||.|||  ||||||||||GAAAUGUUAA--AGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCU
790791
2355
UUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCU-AGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAA||.|||||||.|.|..||.....|.|..||.||.||....|.||||...||..|..|.....||| |.||.|||   ||||..||||.|.||UUGGAAGAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGC---UGAAACAACUGCCAA
792793
2357
UUCUCUGCAAGAGC|||||||||.||.|UUCUCUGCAGGAAC
794795
2359
CUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAAAAAUUCA||.|.|.|.||||..|| |||..|   |||..||||.|||....|..|.|.|||||...||.||||CUGCACUCCGCUGACUG-GCAGAG---AAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCA
796797
2360
GAAGAAAGCGC-CCUCUGAAA|.|||||..|| |||||||||GGAGAAAUUGCGCCUCUGAAA
798799
2425
AUUCAGA-AAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGUG||||||| |||||    |...|||...||||||||AUUCAGACAAUUC----AGCCCAGUCUAAACAGUG
800801
2426
UGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUG||.|..||||||||.|..|||.|||.|UGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAG
802803
2427
UAAAAAAGCAGCU-GAAAC||||||||.|.|| |||||UAAAAAAGGAACUUGAAAC
804805
2428
ACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUU-UCUGAAG||.||.||.|.|||||.|.||...||||.|| |.|||.|...| |||||.|ACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGA-GCUGAGGAAAUCUCUGAGG
806807
2429
ACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGGAGGAA|||.||||| ||.|.||||..|..|.|.|  ||||...|..|.||.||||||ACAGACCCU-AACAGAUGGCGGAGUCAUG--GAUGAGCUAAUCAAUGAGGAA
808809
2430
AAAAGCAGCUGAAACAGUGCA|||||..|||..|||||.|||AAAAGUUGCUUGAACAGAGCA
810811
2431
UGGCUGAAGUUGAUGUU||.||.|..||||||||UGUCUCAGAUUGAUGUU
812813
2432
UGAAGGAGGAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGU|||||..|.|.|.||||||..|   |||..||.|.|.|.|..||.||.|..|...|||||UGAAGAUGCACUUGCCUGCAUU---GGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGU
814815
2433
ACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGGAGGAAUGG|.|.||.|.|||.|..||..|||||| ||.||    ||||||..|.|||||AACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGU-GAAGU----CUGAAGUGGAAAUGG
816817
2434
GAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAA----AGCAGCUGAAACAGUGC|||||||..||...|...|||...|||.|...|||.|    |||||.||||..|.|||GAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGC
818819
2435
AGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCU--GAAGGAGGAAUGGCCU|||||..||.|| ||.|..|||.|..|.||.  ||.|.||||..|||||AGAAACAGAAGG-UGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCU
820821
2436
AAUCACAUACAAAC||.|||||..||||AAACACAUGGAAAC
822823
2438
ACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAU------GUUUUUCUGAAGGAGGAA|||.|.|...|.||||..|.|||| |||||||.||.|.      ||...||||||.||||||ACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGA-GGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAA
824825
2439
UAAAAAAGCAGCUGAAACAG|||||.||||||||..||||UAAAACAGCAGCUGUUACAG
826827
2440
GAAAUGGAUGGCUGAAGUUGA||||||..|||.|||..||||GAAAUGCUUGGAUGACAUUGA
828829
2441
AAAAAGCAGCUGAAA-CAGUGC|||.||.|||||||. ||||||AAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGC
830831
2442
CAUACAAACCCUGAAGAAAUG--GAUGG||.||...||.||||||||.|  |||||CACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGG
832833
2444
AUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAU--GUUUUUCUGAAGGA||.|.|||.|.|...|.||..|.|||.|..|.||||.|||.  ||||.||.|||.||AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGA
834835
2446
AUGGAUGGCUGAAGUUGAU||||.|||..||||..|||AUGGUUGGAGGAAGCAGAU
836837
2447
UUUCUGAAGGAGGAAUGGCC--UGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAA--AAGCAGCUGAAACAGUGC||.|||..|||.||.|.|||  |||.|..|||.||||..|||...|.|||  ||.|.|..|.|.|.||||UUACUGGUGGAAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGC
838839
2448
GAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACA|||...||..||.|||||.|.||.||GAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCA
840841
2449
CUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGG||.||.||..|||||  ||.|...||| |||.|||.||||CUAAACAACCGGAUG--UGGAAGAGAU-UUUGUCUAAAGG
842843
2451
UGCCCUUGGGGAU-UCA--GAAAUUCUAAAAAAGCAG||.|||||.|||| |||  ||.||..|.|..||||||UGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAG
844845
2453
AAUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGA-UGUUUUUCUGAAGGA||..||| |.||..|||..||||..||| |||...|||||| ||...|..|.|||||AAGUACA-AGAACACCUUCAGAACCGGA-GGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGA
846847
2455
AGGAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGUG|||||.|||.   |||.|..||.||..|.....|||||.|||.|.|||||||.||AGGAAAGGCU---CCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUG
848849
2457
UUCUGAAG-GAGGAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAA-UUCUAAAAAAGC---AGCUGAAACA||||||.. |.||||..|.||||.|.|.....|.|||.|| ||||......||   ||||||||.|UUCUGACCAGUGGAAGCGUCUGCACCUUUCUCUGCAGGAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGA
850851
2459
UUCUAAAAAAGCAG-CUGA|||||..||||||| ||||UUCUACGAAAGCAGGCUGA
852853
2526
CUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUC-AGUGGGAUCACA|||||||.|||..|.   |||..|||.|||| ||..|.||.|||CUUGAGAGAGAUUUU---GAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACA
854855
2527
AAAGAACUUAACACUC||.||||||.|.||||AAGGAACUUGAAACUC
856857
2529
AGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGAC-AGAACUCAAA|.|.||||.|.|||.| ||.|||. |.|||.||||AAAAUUUGAUGCGACA-UUCAGAGGAUAACCCAAA
858859
2530
GCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGU||.||.||.||....|....|||.|||.|.|.|.|||||.|.|GCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAAU
860861
2531
ACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGA|.||.||| ||||.|.||..|||.|||   ||||.||.|AGUUUAGA-AGAAAUGAAGAAACAUAA---UCAGGGGAA
862863
2532
UAUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAG|||||. |.||..|||||.|.|.|.|.|||.|||.|. |||...|..|||.|||.....||||||UAUUCC-AGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUAC-AAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAG
864865
2533
UGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGAGCCAGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAA---CUCAAAGAACUUAA|||||..|....|..||||||||.||.|.    |.||||  |||....||.|....||||.|||   |.||||||||||.|UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGAC----GUCAGA--UUGUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGA
866867
2534
AAGAUAAAGAAUGAAGCAG||.|.||||||.|.|.|||AACAGAAAGAAAGCAACAG
868869
2535
AGGUGGGCAGAAGAUAAA|.||.||..|||||||||ACGUUGGUGGAAGAUAAA
870871
2536
GAAUGAAGCAGAGCCAGAG|.|||||.|||||..|.||GGAUGAAUCAGAGAAAAAG
872873
2537
CAGUGAUAUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAA||..|||.|.|||.||.|||| |.|||..|.||.|.||..||CAUCGAUUUGCAGCCAUUUCA-CACAGAAUUAAGACUGGAAA
874875
2538
CAGAGUUUGCUUCGAG-ACUUGAGACAGAACU||.|..||||||..|. |||.|||.|.|||.|CAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAU
876877
2539
AUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAAUG-AAGGUGGGCAGAAGAUA-AAGAAUGAAGCAGAG||..|||||||. ||...|.|.|||| ||..|...|| ||.|.||..|.||..|| ||.||.|||.||.||AUGAAGACAAUG-AGGGUACUGUAAA-AGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAG
878879
2540
AGACAGAA--CUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUCA|||.|.||  |||.|..||.||..|| |||||||.||||AGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCA-UCAGUGGUAUCA
880881
2541
GUGAUAUUCAGA-CAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAA|.||.|||.||| |||.|..||.||||.|..| ||..||||GGGAAAUUGAGAGCAAAUUUGCUCAGUUUCGA-AGACUCAA
882883
2542
ACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAG|||.||||..|||||....|..||.|.|.|.||.|||||ACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUGAAG
884885
2544
UCUAAACAGUGUCAAUGAA-GGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGA--GCCAGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGA|.||||.|...|.|||.|. ||....||||||.|.||.|.|....||||  |.||.|..||.||  ||||.|||.||UAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCU--GAGAAUUGGGA
886887
2546
GACAGAACU-CAAAGA-ACUUAA|.|||||.| |||||| |.||||GUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAA
888889
2547
CAGCCCAGUCU-AAACAGUGUCAAUGAAGGUGG|||...|.||| |||||.| |.||||||..|||CAGGGAAUUCUCAAACAAU-UAAAUGAAACUGG
890891
2548
CUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUCACAUG|||||.|.|.|.||..||||.|||.|....||||...||||..||CUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUG
892893
2549
CAGCCCAGUCUAAACA|||..||..|||||||CAGUUCAAGCUAAACA
894895
2551
AGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGA||.||.|..|..|.|||| |||||||||.|..||AGAUUUCAACCGGGCUUG-GACAGAACUUACCGA
896897
2553
UCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUCA|.|||||| ||.|.|.||||||||||.|UGAAAGAA-UUCAGAAUCAGUGGGAUGA
898899
2555
AGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAA-CUCAAAGAACU|.|||||..|.|..|.|||   |||||| ||.|||.||||AAAGUUUCUUGCCUGGCUU---ACAGAAGCUGAAACAACU
900901
2557
AAGAUAAAGAAUGAAGCAG|||||.|.||||.||||.|AAGAUGAUGAAUUAAGCCG
902903
2559
AGAGCC-AGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUU-AACACUCAGUGGGAUCACAUGUGCCAACA|||||| |||.|.|...|||.....|..||.||.|..|..||.|..| ||.|||.|||||||..|..||..||..||AGAGCCCAGAAUGUCACUCGGCUUCUACGAAAGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCA
904905
2627
AGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGA-UGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAUGAAG||||.||||||||...|...|.|.|||... |||..|.|||||||..| |||.|  |.|.||..|||...|.||.|.|||AGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGC-GAAAGUGAAACUCCUUACUGAGU--CUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAG
906907
2628
UGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAU|||...|||.|||.||..||||||..|.||..|..|.|.....|.||.|||.||.||UGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCUGAGGAAAU
908909
2629
CUAUCAGA-GAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGAA-GAGUAUCUUGAGAGA|||.|||| |..|.|...||||||||     |||.|..|| |||.|.|||||||.|CUAACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGA-----GCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACA
910911
2631
GAAAGCAGUU--GAAGAGAUGAAG||.|.|||||  |||||.||||||GAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAG
912913
2632
UAUGCCAGAAAGGAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCAC|||.|||||||..||.|..|...|.|..|..|..|.||.|..|||||. |......||||..|....||||||||UAUUCCAGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGA-UGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCAC
914915
2633
UAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAUGA|||||||.||....||||.|..||...|.|||.|||..|.|||UAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAAUGGUGA
916917
2634
AGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUG---AAGAA---GAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAA---UAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAA-AGCAGUUGAAGAGAUG|||.||||..|||....|..|..|||.||   |||.|   ||.|.||||||.|||.....||..   ||.|.|..|..|..|||...|.|||. |||||||||||..|||AGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUG
918919
2635
GAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUA-UCAG|||||||||||...||.|||||..||.|..|..|...|...|.|||||..| ||||GAGGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGAUAAACUCAG
920921
2636
AAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUC--CAGAAAG---AUCUAUCAGA--GAUGCACGAAUGGAUGACACA-AGCUGAAGAA|.||.|..|||.||..|.|.|||...||.|  ||.||||   |||..||||.  ||..|||...|||||||..|| ||...|||||AUGGAAACUUUUGACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAA
922923
2637
AGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAA|.|.|||..|.||.||||||.|.||..||AAAGGCAGAACUGAAUGACAUACGCCCAA
924925
2638
UCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAG|||||..|.||..|||.|.|...||.|...||.|..||...||...||.|.|    |||||.|.|||..  .||.||.||..|.||||UCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGG----UGAAUCUGAAAGA--GGAAGACUUCAAUAAAG
926927
2639
GAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAA|.|||||....|.||.|||||||..|||.||  |||||||.|GCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUG--UUACAGACA
928929
2640
GAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCU-AUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGA|||||.|..|..||.....|||.|||.|||||..||| |||||.|.|  |..|.|..|.||..||.|||||.||GAGGUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGU--AUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGA
930931
2641
GAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAUGAA|||||.|||||.......||.|||.||||GAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAA
932933
2642
UUUGGAGAAAACUGUAAGC||||.|||...||.|||||UUUGAAGAUCUCUUUAAGC
934935
2644
AGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUC--CAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAA-UGGAUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGA||.|.||..||.||.||...||.|.  ||..|.|||.||. |||.||..|...| |||.|.|||.||||||||.|   ||.|||. |||.|||AGAUCUGUUGAGAAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUAUAA-AGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACA---GUUUCUC-AGAAAGA
936937
2646
AGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUU|.||||.|||||||..||| ||||..||.|.|    |..|.|||||||AAAAGAAUAUCUUGUCAGA-AUUUCAAAGAGA----UUUAAAUGAAUU
938939
2647
AUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAG--AGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGA||.|..|.||..||..||||..|.|||||.|.  ||.|...|.|.|.|||.||||||..||AUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGA
940941
2648
UCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAA||||||  |.|.||.|.||||..||.|.|...||   ..|||||.||..|.|..|.||||.|.   |..|||||   ||||..|..||.||..|..| |.|||||||.||UCCAGA--GCUUUACCUGAGAAACAAGGAGAAAU---UGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGC---AGCUUGAA---AAAAAGCUUGAAGACCUUGA-AGAGCAGUUAAA
942943
2649
CAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUAC-AGAAAGCAG||||||.||.||..|.||.|.|| ||||||||||..||.|...|..||..||.|..|. |.|||.|||CAAGCUAAACAACCGGAUGUGGA-AGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAG
944945
2651
AUGACACAAGCUGAAGAAGAGU-AUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAA||.|||.|.|.|||.|..|.|| |.|||||| ||.||.....|.||.|...||.||..|||AUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAG-GAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAA
946947
2653
UGAA-UAUAA-AACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAA-GAGAUG|||| ||.|| |||.||....|||....||..|.|||||||| ||.|||UGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUG
948949
2655
GAAAGGAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCU-CCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAA||.|||..||.|||.|.|.|..|... |||..||||.||...| ||.....||.||...|.||.|.|..|..|||.|.|||.||||||||GAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUCAU-AGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAA
950951
2657
GAUGAAUUACAGAAAGCAG||||||||| ||...||||GAUGAAUUA-AGCCGGCAG
952953
2659
CAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUU--UUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGA||.|||||.||.|...||..||||.|.||..  |||||..|..| |||| |.|||.|..||||.|..|.|.||.||||CAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCA-CUCC-GCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGA
954955
2728
ACAAGAGGCCUUAAAAAAG--GAACUUGAAACUCUAACCAC|||||.||| |.||..|||  |||.||.||..|..||||||ACAAGUGGC-UAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCAC
956957
2729
UAAAAAAGGAACUUGAAAC|.||..||||||||||.||UCAAUGAGGAACUUGAGAC
958959
2730
AGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACA|||||||...||.|..|.|||.||AGCUCAAAUGCCUCAGGAAGCCCA
960961
2731
AAAAGAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGAGUCUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACA|||.|||  ||||...||.|.....|..|||.|||...|.||.|||.|..|||| |.|..|  |||.|||||AAAUGAA--GAAACAUAAUCAGGGGAAGGAGGCUGCCCAAAGAGUCCUGUCUCA-GAUUGA--UGUUGCACA
962963
2732
AGUGGCUCUGCACUAGGCUGAAUGGGAAAUGCAAGACUUUGGAA||||....||||||.|.|||.||.|||||.. ||||.|.|||||AGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACA-AAGAGUGUGGAA
964965
2733
UGUAAAUAGUGUCAUAG-CUCAAGCUCCACCUGUA--GCACAAGAGGCCUUAAAA----AAGGAACUUGA||.||||.|||..|.|| ||..|..||....||||  |.|.|||..|.|..||||    ||.||||||||UGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGA
966967
2734
AAGAAGCGAAAG----UGAAACUCCUUACUGAGU||||.|||||||    ||||..||.|.||.||.|AAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAU
968969
2735
ACUGAGUCUG-UAAAUAGUGUC---AUAGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACAAGAGGCCUUAAA|||.|||||. |.||||||..|   ||||||..  |.||.||.| ||||.|||||...|||||ACUCAGUCUUCUGAAUAGUAACUGGAUAGCUGU--CACCUCCCG-AGCAGAAGAGUGGUUAAA
970971
2736
AGAGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAG||||..||||||.  .||||.||||||||||AGAGAAAAAGAAA--CCCCAGCAAAAAGAAG
972973
2737
AGUGUCAUAGCUCAAGC-UCCACCUGUAGC|.|.|||.|||||||.| ||.|..||.|||AAUCUCAGAGCUCAACCAUCGAUUUGCAGC
974975
2738
GGCUGAAUGGGAAAU-GCAAGACUU||.|||||..||||. |.|||||||GGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUU
976977
2739
AAAGAAGAGGC--CCAACAA-AAAGAAGCGAAAGUGAAA|||||.|||.|  |..|||| ||||||.|..|..|||.|AAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGA
978979
2740
AAAAAAGGAACUUGAAACU-CUAACCA||||||||..||.||||.| ||.|.||AAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCA
980981
2741
UGAAUGGGAAAUGCA|||..|||||.||||UGAUCGGGAAUUGCA
982983
2742
GAAACUCCUUACUGAGUCUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACAAGAGGCCUUAAAAAAGGAAC||||.|.|||| ||.|.||...|.|..|.|.|   ||.||....|.|.|||..||||||.....|||.||..|||||GAAAUUUCUUA-UGUGCCUUCUACUUAUUUGA---CUGAAAUCACUCAUGUCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAAC
984985
2744
UCUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAGCUCCAC|.|.|||..||||.| ||.|..|||||..||UAUUUAAUCAGUGGC-UAACAGAAGCUGAAC
986987
2746
AGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAACUC|.||..|.|||||...||||.|||||||..|...|.|.||.||ACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUC
988989
2747
AGAAGCGAAAGUGAAACU|||||.|.|||..|||||AGAAGAGCAAGAUAAACU
990991
2748
AGAGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAA---GAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGAGUCUGUAAAUA||||||..|...|||...|||..|.||   |||||..||.|.|||..||||....||..||.|||.|AGAGCUUUACCUGAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAGCUUGAAAAAA
992993
2749
AGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAA|.||.||..||..|..|||...|||.||.||.|.|||.||AACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAA
994995
2751
UUAAAAAAGGAACUUGAAACUCUAACCACCAACUACCA|||..||.|.||||...|.|||.||.|...||.|.|||UUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCA
996997
2753
AGCUAAAGAAGAGGCCCAACA||||||.|||||.||..|.||AGCUAAGGAAGAAGCUGAGCA
998999
2755
ACCAACUACCAGUGGCUCUGCACUAGGCUGAAUGGGAAAUGCAAGACU|.|||||.|||.||.| ||.||..|.|||  |...|.||.|.|||.||AACAACUGCCAAUGUC-CUACAGGAUGCU--ACCCGUAAGGAAAGGCU
10001001
2757
ACCAGUGGC----UCUGCAC||||||||.    |||||||ACCAGUGGAAGCGUCUGCAC
10021003
2759
CUGCACUAGGCUGAAUGGGAAA|||||||..|||||.|||.|.|CUGCACUCCGCUGACUGGCAGA
10041005
2760
AAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGA|||.|||.||||..|.|.|.|.|||AAGAGAACGUGAGCCACGUCAAUGA
10061007
2829
AUUGUCAUACUUGGAGAAAGCA-AACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUU|||..||||.|.|.|.|.|.|. ||||..||||..|.|.|.|.|..|..|||.|....|...|||..|.|||||AUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACAUU
10081009
2830
GUUGGCAUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAA-CAAGUGGCUAA|||||||.....||||| ||.||..||.|.|.|||.. |||.||.||.|GUUGGCAGCUUAUAUUG-CAGACAAGGUGGACGCAGCUCAAAUGCCUCA
10101011
2831
AAAUGAAGUAGAAU||||||||.|..||AAAUGAAGAAACAU
10121013
2832
AGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACA||||||.||. |.|....||.||||||| |||..|..||||.....||.||.|||||AGAAAGUAAG-AUGAUUUUAGAUGAAGU-GAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACA
10141015
2833
ACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAA|.||..|.||.|.||||||..|.|.|.||.|..|||AUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAA
10161017
2834
AGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUG||||||||| ||..|||..|||||AGAAAGCAA-CAGUUGGAGAAAUG
10181019
2835
AGCAAACAAGUGGCUAAAU||||.|..|||||.|||||AGCAGAAGAGUGGUUAAAU
10201021
2836
GAGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAA||||||...||......||.|||.||||..|...||||GAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAA
10221023
2837
AGAAUUUAAACUUAAAA||||||.|.|||..|||AGAAUUAAGACUGGAAA
10241025
2838
CUAAAUGAAGUAGAAUUUAA||.||.||.|.|||.||.||CUGAAAGAGGAAGACUUCAA
10261027
2839
AAACAAGUG--GCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGA|||.||.||  ||.||..|.||...|.||..|||..|.||.|||.||AAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGA
10281029
2840
GGCUAAAUGAAGUAGAA------UUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGA--GCUGAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAG|.||.||.||||.|.||      |..|||.||...|.||.||..|.||.|.|..|.||.  |||||.||..|| ||||..||||.|GUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUC-CUGAAAUGCUUG
10301031
2841
CUGAAAACAUUCC-UGGCGGAGCUGAGGAAAUCUCUGAGG|||||..||.|.| |.|...||||||||...|.|||||||CUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUGAGGGCUUGUCUGAGG
10321033
2842
CUGAGGAAAUCUCUGAGGUGC||..||||||.|||.|.||||CUUUGGAAAUUUCUUAUGUGC
10341035
2844
GUUUGGGCAUGUUGGCAUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUG|||..|..|||..|||.|.. |.|||.|.|||  |..|||.|...||..|||||||||..||||..|||......||.|.||..||..||   |||||||GUUGAGAAAUGGCGGCGUUU-UCAUUAUGAUA--UAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAA---AUUCCUG
10361037
2846
AUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAACAAG-UGGCUA||||.||..|.|.||..||||||.|||||.|.||. |.||||AUGAAUUUGUUUUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUA
10381039
2847
AAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAA||||..|.|||.| |.|.||.||.|.|||..|||.||.||AAGCCCAGAAGAG-CAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAA
10401041
2848
AAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCU-GAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAGA||..|||.||||.||.||..|.|||.     ||||.|  |||.|.|.|||| ||..|||....|||.|..||.||AAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAU-----AAAAGA--CCUUGGGCAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGA
10421043
2849
AAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAA||.||||.|||.|.||.||..||||AACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAA
10441045
2851
CUUGGAGAAAGCAAACA-AGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACU-UAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCU-GAGGAAAUCUCUGAGGUGCU||||||.|.|.|..||. |.|||||...|....|.||  |.||..| |||||.|||.||......|..|||..||.|| |||||.|||...|||.||.|CUUGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGA--UCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAU
10461047
2853
AGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUC-CUGGCGGAGCUGAGGAAAUCUCUGAG|||.||||. |||..|.|||..|.|.||.|||.|. ||||  .||||.|||||....|||||AGUUGAAUG-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGG--AAGCUAAGGAAGAAGCUGAG
10481049
2855
AAACUUAAA-ACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCUGAGGAAAUCUCU|||||.|.| |..||||.||...||||....|||.|||...||.|.|||AAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCU
10501051
2857
GCUAAAUGAAGUAGAAUUUA|||.||.||.|..|||||.|GCUGAAAGAUGAUGAAUUAA
10521053
2859
GUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGA|.|.||||.||.||..|..||.||||GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGA
10541055
2930
CUUGAAAAUUUGAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACA||||||.|....||.|....|.|..||||.|....|||.....|.|.|.||.|.....||.||||.|||CUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAAUCCAGGAGUCCCUCACA
10561057
2931
AGUCAUG-GAUGAGCU---AAUCAAUGAGGAA||||||| |||.||.|   ||..|||||.|||AGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAA
10581059
2932
ACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACC|.|.|.|.|.|||..|.|.|...||.||||..||||. ||.|.|||AAAAUUACAAGAUGUCUCCAUGAAGUUUCGAUUAUUC-CAGAAACC
10601061
2933
AAAAUUUGAUGCGACAUUCAGAG|.||.||||||..|.|.|.|.||AGAACUUGAUGAAAGAGUAACAG
10621063
2934
CAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUGGCGGAGU|||||..|.| ||||.||.|||....|.|||.||..|||.|CAGAUAUGGA-AUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAU
10641065
2935
AACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAA||||||.||.|.|  |.|| |.|||  .||||..||||.|...|||.|.||.||AACAGAAGGUGCA--CCUG-AAGAG--UAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAA
10661067
2936
CACUUGAAAA--UUUGAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUG|||.||.|||  |||||...|| ||...||..|.|.|.||||...|||   |||...|||..|.||.||....||||CACAUGGAAACUUUUGACCAGA-AUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAU---CAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUG
10681069
2937
GCAUAUUGGCACAGACCCUAA-CAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGC|.|.|||.|.|.||.|||.|| |..|..||..|..|||.|||..||GGAAAUUAGUAGAGCCCCAAAUCUCAGAGCUCAACCAUCGAUUUGC
10701071
2938
AGGAACUUGAGACAUUUAAUUC|||||.|.|||...|||||.||AGGAAUUGGAGCAGUUUAACUC
10721073
2939
GAGUCAUGGAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACA||.|||..||||||..||.....||||||.|..|||.|GAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUA
10741075
2940
UCACUUGAAAA--UUUGAUGCGACAUUCAGA||.|.|||||.  ||.|||  ||||||.|.|UCUCCUGAAAUGCUUGGAU--GACAUUGAAA
10761077
2941
ACCCAAAUCAGAUUC|.||||.||||||.|AGCCAACUCAGAUCC
10781079
2942
CACAGACCCUAACAGAUG||||..|||||..|||.|CACAAGCCCUAUUAGAAG
10801081
2944
AUUCAGAGGAUAACCCAA----AUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGAC-CCUAACAGAUGG|.||||.||.||||..||    |.|||.|||.||.|..|.||||.|. |||.|.|..|||AAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGG
10821083
2946
GAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAA||..|||.|.|.||.||..|.||||||..|.|.||GAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUCAA
10841085
2947
ACUUGAAAAUUUGAU---GC-GACA----UUCAGAGGAUAA||||||||||..|.|   || ||||    |.|||.||||||ACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGAUAA
10861087
2948
UCACUUGAAAAUUU|||.|||.||||||UCAGUUGGAAAUUU
10881089
2949
AGCUAAUCAAUGAGGAACUUGA-GACAUUU||||||.|||.. |||..|.|| ||.||||AGCUAAACAACC-GGAUGUGGAAGAGAUUU
10901091
2951
AACUUGAGA---CAU-UUAAUUCUCGUUGGAGGGAACUAC||||.||.|   ||| ||..||...||||||||.|.||.|AACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGC
10921093
2953
UUGAGACAUUUAAUUCUCGUUGGAGGGAACUACAUGAAGA||||.|.|.||.|...||..|||...|||.||||.|||.|UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACA
10941095
2955
CUUGAAAA-UUUGAUGC--GACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCC-UAACAGAUGGC||.||||| |||..|||  |.|.|.||||.|.|.|..|||.|...|.|..|.||..||.....|||| |||...|.|||CUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGC
10961097
2957
AUUUGAUGCGACAUUC|||.||.|||||.|||AUUGGAGGCGACUUUC
10981099
2959
GAAAAUUUGAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCC----AAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUGGCGGAGUC-AUGGAUGAGCU|||||.||||..|..||.||.|..||....|.    |||..||||..|....|||  |.||||.|.|..|..|....|||.| |.|||||||||GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUG--AAAGACUCCAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCU
11001101
3031
UAAGGAGGCAAAAGUUGCUUGAACAGAGCAUCCAGUCU|||..|||..||.|..||| |..||.||..|||.||||UAAUCAGGGGAAGGAGGCU-GCCCAAAGAGUCCUGUCU
11021103
3032
ACAAGCAGUUGGCAGCUUAUAUUGCAGACAAGGUG|.|.|||.|||.|.||    ||||.|.||||.|.|AGAUGCACUUGCCUGC----AUUGGAAACAAAGAG
11041105
3033
AGGAGACUGAAAAAUCCUUACA-CUUAAUCCAGGAGUCCC-----UCACAUUCAUUGACAAGCAGUUGGCAGC||.||||.|||||..||..|.| |||.||..|.||||..|     |.|.|||...|.|.||..||.|||.|||AGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACAGCUUUGAAAUUGCAUUAUAAUGAGCUGGGAGC
11061107
3034
UUGACA-AGCAGUUGGCAGCUU---AUAUUGCA--GACAAGGUGGAC-GCAGCUCAA---AUGCCU|||||| |...|.||||||||.   ||||.|.|  |||||.|.|..| ||||.|.||   ||||||UUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGCCU
11081109
3035
GUAAGGAGGCAAAAGUUGCUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAG--ACUGAAAA|.|||.||| |.|.||||.|.|||.|.|. |..||||||.|..|..||  ||||.|.|GCAAGAAGG-AGACGUUGGUGGAAGAUAA-ACUCAGUCUUCUGAAUAGUAACUGGAUA
11101111
3036
ACAAGCAGUUGGCAGCUUAUAUUGCAGACAAGGUGGACG-CAGCUCAAA-UGCCUCA|.||.||..|||.|.|||   |||...|.||.||||||. ||.|.|||| ||..|||AGAAACACAUGGAAACUU---UUGACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCA
11121113
3037
CAAAAGUUGCUUGAAC|||||.||||||||||CAAAAAUUGCUUGAAC
11141115
3038
CAGCUUAUAUUGCAGACAA||||...|.||.|||||||CAGCAGCUGUUACAGACAA
11161117
3039
CAGCUUAUAUUGCAGACAA||||...|.||.|||||||CAGCAGCUGUUACAGACAA
11161117
3040
CAUUGACAAGCAGUUGGC-AGCUUA||||||.||..|.||.|| |||.||CAUUGAAAAAAAAUUAGCCAGCCUA
11181119
3041
GUGGACGCAGCUCAAAUGC--CUCAGGAAGCCCAG|||||..||.||||.||.|  |||||.||||.|.|GUGGAGCCAACUCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUG
11201121
3042
CCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAAUCCAGGAGUCCCUCA||..|.|||..||||...||||.|...|||..|...|.   |||||||.||.|CCUCUGUGCUAAGGACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCAAG---AGGAGUCUCUGA
11221123
3044
CUCAAAUGCCUCAGGA|.|||||.|||.||.|CACAAAUUCCUGAGAA
11241125
3046
CUUGAACAGAGCAUCCAGU||.|||.||||||.|.|.|CUGGAAAAGAGCAGCAACU
11261127
3047
UGCUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAA--UCCAGGAGUC||||||.| ||.|| |||..|..||||||.|||...|.|.|..|||..|..|||  ||.||.||.|UGCUUGUA-AGUGC-UCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGAC
11281129
3048
AUUGACAAGCAGUUGGCAGCUUAUA|||...||.|||||||.|..|||||AUUAGGAAUCAGUUGGAAAUUUAUA
11301131
3049
UGUAAGGAGGCAAAAGUUG--CUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCC|.|||.| ||||..|.|||  |..|.|.|.|.||.|||.||.|||UCUAAAG-GGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCC
11321133
3051
GCUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCC|||||.|||||.|.|.|.|.|||.|GCUUGGACAGAACUUACCGACUGGC
11341135
3053
GGAGGCAAAAGUUGCUUGAA||||||||.|||||..||||GGAGGCAACAGUUGAAUGAA
11361137
3055
GCAAAAGUUGCUUG|.|||||||.||||GGAAAAGUUUCUUG
11381139
3057
AAAAAUCCUUACA|||||||||.|.|AAAAAUCCUGAGA
11401141
3059
UGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCC|||.||..|.||||.|.|.||||UGAUCAAGGGAUCCUGGCAGCCC
11421143
3060
UGACAAGCAGUUGGCAGCUUAU|||..|.|||.|||.|||||.|UGAACACCAGAUGGAAGCUUCU
11441145
3132
ACAAGUCA-UGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACA|||||..| |.||||.|.||||||.|||.||||||..||ACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCA
11461147
3133
AAGUCAUGAGAUCAGUUU--AGAAGAAAUGAAGAAACAUAAUCAGGGGAAGGAGGCUGCCCAAAGAGU|||.|..||..||||.||  |.|..|||.|.|||...|.||||.   .||.||...||...|||||||AAGACUGGACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAUCC---CAAAGAACUUGAUGAAAGAGU
11481149
3134
GAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUU-UAGAAGAAAUG||.||||||    |.||||||||.. |.||||.||||GAAUUGACA----AAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUG
11501151
3135
AGAAGAAAUGAAGAAACAUAA|.||||.||..|||||||.||AAAAGAGAUUGAGAAACAGAA
11521153
3136
UUUAGAAGAAAUGAAGAAACAUAAUC|||.||.|||....|||||.|.||.|UUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAAC
11541155
3137
CAAUCUGAUUUGACAAGU-CAUGAGAUCAGUUUAG|||.|.|...||||.|.| ||.||.||.|||..||CAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAG
11561157
3138
UCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACAU||||.||  .||||  |||..||..||.|||||||....|.||..|.|||.||UCCAUUC--CUUUG--AAGGAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAU
11581159
3139
AUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACAUAAUCAG||||||..|....|||.|||||.||||.|.|..|.|||AUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAG
11601161
3140
UCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAU-GAAGAAACAUAAUC||.|||.||  |.||.||.||.|| |||.|||.||.|.|UCCUGAAAU--GCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUAGC
11621163
3141
AUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGA|.||||.|....||..|.|||||||.|||||AAUUGAGAGCAAAUUUGCUCAGUUUCGAAGA
11641165
3142
GAAGAAAUGAAGA|||||||.||.||GAAGAAACGAUGA
11661167
3144
AAGAAAUGAAGAAACAUAAUCAGGGG---AAGGAGGCUGCCCA|.||.||.||||.|..|||||||.||   |..||.||||..||AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACA
11681169
3146
UAGAAGAAAUGAAGAA||||||||...|||||UAGAAGAACAAAAGAA
11701171
3147
AAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACAU---AAUCAGGGGAAGGAGGC||||..|...||.||...||||||.....|.||||.|   |||.||...|||.||.|AAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGAC
11721173
3148
AAAUCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAA---UGAAGA||||..||.||.|..|.|.|...|.||.|  |||.||..||.|||   ||||||AAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGG--CAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGA
11741175
3149
GGGGAAG-GAGGCUGCCCAAAGAG|.||||| ||...||.|.||||.|GUGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGG
11761177
3151
UCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCA||||.||...|||||.||.|.||||UCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCA
11781179
3153
GGAAGGAGGCUGCCCAAAGAGU|||||||||.|.||.|.|.|||GGAAGGAGGGUCCCUAUACAGU
11801181
3155
UAGAAGAAAUGAAGAAACA||.||||..|||.||||||UAAAAGAGCUGAUGAAACA
11821183
3157
AUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAA|||.||...|.|.|...|.|||||.|||||.|AUUGGAGGCGACUUUCCAGCAGUUCAGAAGCA
11841185
3159
UAAUCAGGGGAAGGAGGCUGCCC|.||||.||||....|||.||||UGAUCAAGGGAUCCUGGCAGCCC
11861187
3160
AUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGA|.||.|.|.|||||..||||.|AGCACUCUGGAAGACCUGAACA
11881189
3233
UGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGUCACAGC||||||||||....|..||   |.|.|||..|.|||||.||.   ||...|..|.||||||..|.|||UGAAGUGAAGUCUGAAGUG---GAAAUGGUGAUAAAGACUGG---ACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGC
11901191
3234
GUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAU---UGGAAACAAAGAGUGUGGAA||||||||   ..|.|.|||.||||..|   ||||.|.|.||   |||.|.|.|....|.|||||GUAAGAUG---CGAAAGGAAAUGAAUGU---CUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAA
11921193
3235
AAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGU|||.|.|||.||.|.|||||.|.||AAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGU
11941195
3236
AUUCCAGAAAC-CAGCCAA-- UUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGA||.|||||||| ||...||  ||||||.|||..|.|..|..|.|..|..|.|....|...|.|.|...|.|..|..|||..||.||..||.|.|||||AUACCAGAAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGA
11961197
3237
UCACAGCUAAAUCAUUG|||.||||.||.|||.|UCAGAGCUCAACCAUCG
11981199
3238
GAGUGUGGAACAGGAAG||.|.||.||.||||||GAAUCUGAAAGAGGAAG
12001201
3239
GGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGUCACAGCUAAAU|||||.|||||   |..|||||.|..|..|||||.||.|.|..|||GGAAAUAAAGA---UAAAACAGCAGCUGUUACAGACAAAACAUAAU
12021203
3240
UACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUG-CAUUGGAAACAAA|||||||. |.|.|.||||    |||....|||| ||||  |||..|| |||||.|||.|||UACAAGAG-GCAGGCUGAU----GAUCUCCUGAA-AUGC--UUGGAUGACAUUGAAAAAAAA
12041205
3241
GCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUAC--AGUCACAGCUAAAUCAUUGUGUG|.||||.|.|..||||..|.|||.|.|.|.|.|||.|  ||.|| ||||.|....||||.||GAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCA-AGCUGAGGGCUUGUCUG
12061207
3242
AAGUAA-GAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAA|||.|| ||||||..| |||||. ||||||    |.|||||   |||||||AAGAAACGAUGAUGGU-GAUGAC-UGAAGA----CAUGCCU---UUGGAAA
12081209
3244
GUUUCGAUUAUUCCAGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAU GAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGC--AUUGGAAACA||||..|||||...|.|||.     |..|||.|.|||.|.|||..||||..|  ||..|.|||....|||    |||..||..|.||||.  |||||.||||GUUUUCAUUAUGAUAUAAAG-----AUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCU--GAACAGUUUCUCAGAA----AGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACA
12101211
3246
AUGAAGUUUCGAUUAUUCCAGA--AACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAA||.|..||.|.|.|||.|||..  ||||.|..||.   |||||||..|||.||||||AUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAA---GAGCAGCAACUAAAAGAAA
12121213
3247
GAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGA|||||...|..||..||||.||||.|.|GAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCA
12141215
3248
AGAAAGUAAGAUGAUUUUA-GAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGUCACAGCUAAAUCAU|||||..|.||..|.||.| |.|.||.|.|| |..|..|.|.|.||  |.||||.||||..||..||.|..|||| ||        |||.||||||||AGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAA-AGACCUUGGGCAGC--UUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAG-AG--------CAGUUAAAUCAU
12161217
3249
AGAAACCAGCCAAU|.||||||||||.|AAAAACCAGCCACU
12181219
3251
UUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGU-GAAGAU||||.||...|.||.||..|...|.|.||||..|.|.|||..| ||.|||UUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAU
12201221
3253
UGGAAACAAAG--AGU-GUGGAACAGGAAGUAGUACAGUC-ACAGCUAA|||||.|.|||  ||. |..||.||||...|||.||||.| |.|||.||UGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAA
12221223
3255
CAGAAACCA--GCCAAUUUUGAGCAGCGU-CUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGA|.|||||.|  ||||||.|....|||..| ||||..|.|||.|| |.|.|..||||.||CUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAA-AGGCUCCUAGAAGA
12241225
3257
AGCCAAUUUUGAGCAGCG|||||.||.|||.|||.|AGCCAGUUCUGACCAGUG
12261227
3259
GAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGA||..||.||||..||||||...|||..|.|.|.|.|||.|GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAA
12281229
3260
AGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAAC||..|.|.||||  ||.|..||||.|.|..|||.|..||AGGAGAAAUUGC--GCCUCUGAAAGAGAACGUGAGCCAC
12301231
3334
ACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGG|.|||.|..||.|.|| |||.|..||.|.||||||||.|AGUUGAAGGAAUGCCU-AGUAAUUUGGAUUCUGAAGUUG
12321233
3335
AAUCCCAAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACAGCUUUGAAAUUGCAUUAUAAUGAGCUGGGAG|.||..|||||..|||| ||||.||.|...||.....||..|.||.|.|  |||.|.||||ACUCAAAAAGAGAUUGA-GAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACA--GAGGUAGGAG
12341235
3338
AGCAGACGGAAAAUCCCAAAGA-----ACUUGAUGAAAGA|||||..||..||||..|||||     ||||.|..|||||AGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGA
12361237
3339
AACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGCAGA|||||..|..||||..|.|..||.|.||.......||.||||||...||||||      ||..|||.|..||||||.|||.||.|AACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAA------ACAGCAGCUGUUACAGACAAAACAUA
12381239
3340
GAAGUGAAGUCUGAA-GUGGAAAU--GGUGAUAAAGACUGGACGUCAGAUUGUA-CAGAAAAAG---CAGACGGAAAAUCCC---AAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACA||..|||.||||.|| |..||||.  ||...||.|.|.|...|.|||| |.||| |||.|.|||   |||.|.||..|||.|   |||....|.|||||.|..|.||.|GAUUUGAGGUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAG-UGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAA
12401241
3341
UCAGAUU--GUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAU||||||.  |..|||.||..||.|.|||.||||UCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAAU
12421243
3342
UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGA|||||.....|||.||.|.|.|||||.|UGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUGAA
12441245
3344
AAAGA-ACUUGAUGAAAGAGUAACAG||||| |.||.||.|..|..||||||AAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAG
12461247
3346
AACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAG||||...|.|||||..||||. ||||.|||AACUAAAAGAAAAGCUUGAGC-AAGUCAAG
12481249
3347
GGAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGAAA---GAGUAACAGCU-UUGAAAUUGC||.||.||.||||.||.|..||||||   |||.|.|.|.. |||.||.|||GGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGC
12501251
3348
AAAAUCCCAAAGAACUUGAUGA||||.|...||||.|||||.||AAAAGCUUGAAGACCUUGAAGA
12521253
3349
CUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGACGUCAGA--UUGUACA--GAAAAAGCAGAC|.||.||||||   |.|||...|.||..|.|.|||.  |||||||  ||||||.|||.|CGGAUGUGGAA---GAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCC
12541255
3351
CAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGAAAGAG-UAACAGCUUUG--AAAUUGCA||.||...||||.|||.....|||||||...||| ||.|.|||.||  |.|||.||CAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGGCAGAUUUCA
12561257
3353
AGAACUUGAUGAAAGAGU---AACAGCUUUGAAAU--UGCAUUAUAAUGAGCUGGGAGCAAAG|||||..||.|.||.|||   |..|..|.|.|||.  |.||..|.|||| |||||.|||.|||AGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUG-GCUGGAAGCUAAG
12581259
3355
AAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACA|||||.|| |||||||.|.|..||AAAGAGCU-GAUGAAACAAUGGCA
12601261
3357
GAAGUGAAGUCUGA--AGUGGAA||||..|..|||||  |||||||GAAGCCAGUUCUGACCAGUGGAA
12621263
3359
AGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAG-ACUGGACGUCAGAUUGU-ACAGAAAAAGC----AGACG---GAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGA||.||||| ||.||.||..||||...|||||...|||....| |||   |..|.||.||. |.|||||||..    ||||.   ||||..|.|.|.||||||.|.||AGGCUGAG-GAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCACU---CCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCAAGA
12641265
3360
CAAAGAACUUGAU-GAAAGAGUAACAGCUUUGAAAUU|||.||.||||.| |..||..||.||..||.|..|||CAAUGACCUUGCUCGCCAGCUUACCACUUUGGGCAUU
12661267
3435
GCUACAGAUAUGGA-AUUGACAAAGAGAUCA-GCAGUUGAAG|||||..|.|..|| |||||.|||.|||... |||..|||||GCUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAG
12681269
3436
GAAAGGAAAUGAAUGUCUUGAC-AGAAUG||||...|..|||..|.||||| ||||||GAAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUG
12701271
3437
GAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACA|||.||||||.|.|......|..|.|||...|||||GAACUGAAUGACAUACGCCCAAAGGUGGACUCUACA
12721273
3438
AGAAAUGCUUGAA--AUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUG|.||.||||||||  |.||.....|.|.||.|...|||...|||||.|... |.||.|.|.||...|  ||.|||||||AAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAA-AGAGGAAGACUUCAA--UAAAGAUAUG
12741275
3439
AAGGAAAUGAAUGUCUUG-ACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGC|||..|||||..||..|| |.|..|....|.|||...|..............||||||| |||| |||.|||..|||.||AAGACAAUGAGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGA-AUCA-CAGAUGAGAGAAAGC
12761277
3441
GAUAUGGAAUUGACAAAGAG--AUCAGCAGUUGAAGGAA-UGCCUAG|||..|||||||...||||.  |..||.||.||||.|.| |||.|||GAUCGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAG
12781279
3442
AAAUUGUCCCGUAAGAUGCGA--AAGGAAAUGAAUG|.|.|||||...||||..|||  |.||..||||.||ACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUG
12801281
3444
AGAAAUGCUUGA-AAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGA|.||||.|.||| |||||    |.||.||||.|||...||....|.||||.|ACAAAUUCCUGAGAAUUG----GGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUCUUAA
12821283
3446
AAAUGAAUGUCUUGACAGAAU|||.||||.|||||.||||||AAAAGAAUAUCUUGUCAGAAU
12841285
3447
AAAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUG-UCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGG-CUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAG||.|.|||.|..|||....||||||.||.|| ||||.||||....|||..|.|| ||....|||||.|..|.|. |..||||  |||.||.|....|.||.||||AAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAA-GAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAG--ACAAAUCUCCAGUGGAUAAAG
12861287
3448
UUGGAGAAAUGCUUGAA|||.|.|||.|||||||UUGAAAAAAAGCUUGAA
12881289
3449
CAGAUAUGGAA------UUGACAAAGAGAUCAGCAGUUG---AAGGAAUGCCUAGUAAUUUGGAUUCUGAAG|.|||.|||||      |||.|.|| ||..|||||.|||   ||||||...|.||..|.|..|....|||||CGGAUGUGGAAGAGAUUUUGUCUAA-AGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCCAGUGAAG
12901291
3451
AGGAAUGCCUAGUAAUUUGGAUUCUGAAGUUGCCUG||.||||||...|...||| ||..||.||.|.||||AGAAAUGCCAUCUUCCUUG-AUGUUGGAGGUACCUG
12921293
3453
GAAAGAA---AGCAACAGUUGGA-GAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAA--GAUGCGAAAG------GAAAUG---AAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGA|||||||   ||.|.||||.||| |||.|.|..|||....|.|.|.|.  ||.||.|.||      ||||||   ||.|..|..|||.|||||||||.|||||..||GAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGA
12941295
3455
ACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCU||||..|..||||....||..|.|||||...|.|||||.|...|.||.|||.|.||ACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCU
12961297
3457
GGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGA|||.||||.|||..|.....||.||..||.. ||.||||.||..|||.||GGCAGGCACCUAUUGGAGGCGACUUUCCAGC-AGUUCAGAAGCAGAACGA
12981299
3459
UGGAAUUGACAAAGAGAUCAG-CAGUUGAAGGAAUGCCUAGUAAUUU|||.|..||.|||.||||.|| |..|||||.||.|  |.||.||.||UGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACU--CCAGGAACUU
13001301
3460
AGUAAUUUGGAUUCUGAA||.||||..|..||||||AGAAAUUGCGCCUCUGAA
13021303
3536
GCAAGAAGGAGACGU||||.|||.||||||GCAAAAAGAAGACGU
13041305
3537
UGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGA||..||||.||.|.|| |||.|||.|.|UGACCAAGCAGCAAAC-UUGAUGGCAAA
13061307
3538
GCUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGG-UGCACCUGA--AGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUG|.||..||||||..|.||||...||.|.||| ||.|..|.|  ||.|.||.|....|..||..||.|.|||.||.|.||.|.||GAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGAUAUG
13081309
3539
GCUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGA----AGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAG|.||||..|||||| ||||....|.|||.|...||.||.|    |.||.||||||||.|...||.||GGUACUGUAAAAGA-AUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAG
13101311
3540
CUCAAA-AAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGC|||||| ||||.|....|....||||..|.|.|.|.|...||||||     |||..||||||CUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCA-----GUACAAGAGGC
13121313
3541
GAGUAUCACAGAGGUAGGA-GAGGCCUUGAAAACAGUUU-UGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGAU|.|.||..||||.|.||.| ||||...||||..||||.. |.||||||..| ||...|||...||.|||GGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUG-AGGGCUUGUCUGAGGAU
13141315
3542
GGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUG|.|.|||||.|....|||..|||||| ||||.|..||GACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCAAGA-GGAGUCUCUG
13161317
3544
AAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGU----GCACCUGAAGAGUAUCACAGA|.|||||.|||.  ||.|||..|.|    |.|.|||||.|||.||.||||AUAAAGAUAUUU--AAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGA
13181319
3546
GCUACUCAAA-AAGAGAUUGAGAAACAGAAG||.|||.||| ||.||.|||||.||...|||GCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUCAAG
13201321
3547
UGGAAGAUAAACUCAGUCUUCUGAAUAGUAACUGGAUA|.|||.||||.||||..|.....|||....|.||||||UUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGAUA
13221323
3548
UGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUA--UCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUG||||||||  ||||.|.|..|||||...|  |.|.|||..|.||..||  ||||||||.|...|||UGAGAAAC--AAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAG--CUUGAAAAAAAGCUUG
13241325
3549
AACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGAUAAACUCAGUC||.||.|||.|.|.|.|.||...|.||.||..|||..|||..|||.|AAGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCC
13261327
3551
AAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGU||||..|.|..|.|..|..|..||||..|.|||.|| |||||..|||.|AAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGA-UAUCAACGAGAU
13281329
3553
AAACAGAAGGUGCA--CCUGAAGAGUAUCACAGA|.||||.||.||||  ||..||||..||||||||AUACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACAGA
13301331
3555
AAAAGAGAUUGAGAAACA|||||||.|...||||||AAAAGAGCUGAUGAAACA
13321333
3557
UAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGA|.||||..|.|||...|.|||||..|....||||.||UUGGAGGCGACUUUCCAGCAGUUCAGAAGCAGAACGA
13341335
3559
UCAAAAA-GAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCAC-CUGAAGAGUAUCACAGAGG--UAGGAGAGGCC-UUGAAA||||.|. |||...||.|||..|||..||||| |.|..||.|..||.|||..  |||..|||.|| ||||||UCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAA
13361337
3560
UCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGA||.|..|||.||||.|...|.|||.|.|.||.|||UCGAGGAGAAAUUGCGCCUCUGAAAGAGAACGUGA
13381339
3637
ACUUUUGACCAGAAUGUGGAC----CACAUCACAAAG||.|..|.||| ||.||||||    |||.|.||.|||ACAUACGCCCA-AAGGUGGACUCUACACGUGACCAAG
13401341
3638
AGGCUGACA--CACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAG|||||||.|  ||.....||.||||||.||.|.|...|.||..||..|||.|.|.|AGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGAUAUG
13421343
3639
AUGAAUCAGAGAAAA-AGAAACCCCAGCAAAAAGAAGA|.||||||.|||..| |||||.|......|||..||||AAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGA
13441345
3640
UUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAA||||||||  ||..||||||.||UUGGAUGA--CAUUGAAAAAAAA
13461347
3641
GAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAG||||...||||.||||||....|||..||.|.||GAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAG
13481349
3642
AGAAUGUGGACCACAUCACAAAG||||...|.||.||.||.|||.|AGAAGUGGAACAACUUCUCAAUG
13501351
3644
AGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAA|||||.|.|...|.||||| |||.|||.       |||||.|.|.|.|||..||.|..||..|...||.||||.||AGUGGCUAACAGAAGCUGA-ACAGUUUC-------UCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAA
13521353
3646
AAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAAG|||...||||||..|.||||...||||.||AAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAG
13541355
3647
AAAAGAAACCCCAGCAAAAAGA||||.||.|.|.||||.|.|.|AAAAUAAGCUCAAGCAGACAAA
13561357
3648
GAAACACAUGGAAACUUUUGACCA|||.||..||||||.||.|.||||GAAUCAGUUGGAAAUUUAUAACCA
13581359
3649
AAAAAGAAACCCCAGCAA|.||.||||..|||||.|ACAAGGAAAAACCAGCCA
13601361
3651
UGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGA|.||..|.||||...||..|||||| ||.||.||UUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAU-CAAGCAGA
13621363
3653
CAGAAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUGU|||||.|..| ||.|||..||||....|||||CAGAACCGGA-GGCAACAGUUGAAUGAAAUGU
13641365
3655
CAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGA|||||..||.|.||..|..|||.||    |.|.||||.||..||.|.|..|||CAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGU----CCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGA
13661367
3657
UGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACA--CACUU-UUGGAUG||||| |.|||.|..||||..|||.|.|.|.||.|.||  |||.| |||||.|UGUGG-CUACAGCUGAAAGAUGAUGAAUUAAGCCGGCAGGCACCUAUUGGAGG
13681369
3659
ACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGG--AUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAA|.|||..||.|||...||..||..|||||  |..|||.|..||| |||.|...||..||  .||||||||||.|.|AGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUG-CACUCCGCUGACUG--GCAGAGAAAAAUAGA
13701371
3660
GAAUACCAGAAA--CACAUGGAAACUUUUG|||.|||.|||.  ||.||||||.|||.||GAAGACCUGAACACCAGAUGGAAGCUUCUG
13721373
3738
GAUUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUA||.|||.|||..|||.||.||||..||GAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUA
13741375
3739
UUAAAGGCAGAACUGAAUG|||.||.||.|||..||||UUACAGACAAAACAUAAUG
13761377
3740
AAAUUAGUAGAGCC--CCAAAUCUCAGAGCUCAA|||||||.. ||||  ||..|.|.|||||.|.||AAAUUAGCC-AGCCUACCUGAGCCCAGAGAUGAA
13781379
3741
AGUAGAGCCCCAAAUCUCAGA----GCUCAACCAUCGAUUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUU|||.|||||    |.||||||    |||||.|.|.||.|. ||.|..|.||.|.|...||||AGUGGAGCC----AACUCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUG-GCGGGAAAUUGAGAGCAAAUU
13801381
3742
AUUAGUAGAGCCCCAAAU-CUCAGAGCUC|||||.||.|...|||.| ||||..||||AUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUC
13821383
3744
AGAGCCCCAAAUCUCAGAG|.||.|.|||||..|.|||AAAGACACAAAUUCCUGAG
13841385
3746
AGAGCUCAACCAUCGAUUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUAA|||.|..||..||...||..|||. ||||||.|.|||.||||AGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGA-AUUUCAAAGAGAUUUAA
13861387
3747
CAUACGCCCAAAGGUGGACUCUACACGUGA||||.|||||.|.|.|.|...||.||.|||CAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGA
13881389
3748
UUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUAAG|||.|||...|||..|..||||..|||UUUCCAGAGCUUUACCUGAGAAACAAG
13901391
3749
GCAGCCAUUUCACACAGAA|||||..||..|||..|||GCAGCAUUUGUACAAGGAA
13921393
3753
AAAUCUCAGAGCUCAA|||||.||||...|||AAAUCACAGAAACCAA
13941395
3755
CAAGCAGCAAACUUGAUGGCAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAGC||.|..||.|.|...|.||.||..|.|...||..|||.||.|..|.||..|||||CAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGC
13961397
3757
GUUUAAAGGCAGAACUGAAUGACAUACG|||.|.|.||||||| ||...|||||.|GUUCAGAAGCAGAAC-GAUGUACAUAGG
13981399
3759
GCAAACUUGAUGGCAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAGCCCC|.|||.||||......||..||.||||......||.|||.|||..|||.|||GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCC
14001401
3760
ACGUGA-CCAAG-CAGCAAACUUGAUGGCAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAG-UAGAGCCCCA-AAUCUCAGAGCUC|||||| |||.| ||...|.||||.|.||.|     |.|.||||||...||.|.|.|| |....||..| ||.|||||..|||ACGUGAGCCACGUCAAUGACCUUGCUCGCCA-----GCUUACCACUUUGGGCAUUCAGCUCUCACCGUAUAACCUCAGCACUC
14021403
3839
UAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUU-CAGCAGGGGGUGA---AUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGAUA|.||.||.|||||.|..||..|  ||||.|  ||.|| ||.||..|..|.|   ||..||.|.||..|||... ||||||||||UGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGA--GGAGAC--AACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGA-AAUAAAGAUA
14041406
3840
AGGCU---GAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAA--AGAGGAAGACU|||||   ||||||...||...|..|.|||.|.|  |||||.||.||AGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCU
14071408
3841
AAUUGGAGCAGUUUA----ACUCAGAUAUACAAAAAUU||||.|..||||||.    |||||..|.|.||.|||||AAUUUGCUCAGUUUCGAAGACUCAACUUUGCACAAAUU
14091410
3842
UUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAA||.||||.|.||.|..||||||UUAAGCAAGAGGAGUCUCUGAA
14111412
3844
GAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCU|||...||.||||||  ||||||.|.|||.|||||.||GAAGCUGAACAGUUU--CUCAGAAAGACACAAAUUCCU
14131414
3846
AAAAUUGCUUGAA--CCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAG||.||||||.|.|  |||||.||..|||.||...|||||AACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAG
14151416
3847
AAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGG||.||||...||||  ||||||||AACAAUUAAAUGAA--ACUGGAGG
14171418
3848
UUGAAGGAAUUG--GAGCAGUUUAA||||||...|||  ||||||||.||UUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAA
14191420
3849
GAAUCUGAAAGAGGA|||.||||||.||.|GAAACUGAAAUAGCA
14211422
3851
AAAUUCAGCAGGGGGUGA|||.||| |||.||||||AAAAUCA-CAGAGGGUGA
14231424
3853
UUGAAGGAAUU--GGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGC|||||.|||||  |.|.||||...|.   ||..|||||.||...|||.|.. ||.||||||UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAU---GAAGUACAAGAACACCUUCAGA-ACCGGAGGC
14251426
3855
AUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUG---GAGGCUGAAA|.||.|.|||||...|...||..|..||||.||.||||.....||.   ||.|||||||ACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAA
14271428
3857
GAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCA|||.|||.|..|.||.|..|.||||||||.||.||.||.|GAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGAUGAUGAAUUAA
14291430
3859
AGGGGGUGAAU-CUGAAAGAGGAAGACUUCAA|||.|||.||| ||||..| ||||.|.||.||AGGAGGUCAAUACUGAGUG-GGAAAAAUUGAA
14311432
3860
UCUGAAAGAGGAAG||||||||||.|.|UCUGAAAGAGAACG
14331434
3940
GAGAGGAAAUAAAGAUAAA||||.||||..||.|||||GAGAUGAAAGGAAAAUAAA
14351436
3941
AGAGGAGACAACUUACAACAA----AG-AAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAU||.||||.|||||.|.|.|.|    || ||.|.|.|  |.|.||||..|||||.||||AGUGGAGCCAACUCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUG--GCGGGAAAUUGAGAGCAAAU
14371438
3944
AGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUGUUA-CAGA|.||.|||||||||....|.|||..|.|| ||||AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGA
14391440
3946
AACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAG|||.|..||.|.||.|.||...|..||| |||||..|||.||.|.|||AACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGA-AAAGCUUGAGCAAGUCAAG
14411442
3947
AGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAA-UCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUGUUACAGACAAAAC||||.|.|.|.|||.||||.....||||.||||....|.|.|....|||.. ||.||.|.|.....|||.|..||   |||||..|.||| |..||||....||||||||.|AGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAG---AUAAACUUGAAA-AUAAGCUCAAGCAGACAAAUC
14431444
3948
GAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAG||||||....|||.||.|.|||.|.|||.|..||GAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAG
14451446
3949
UGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCA||.||.|||.||..|..||||.|.||......|||||..||.||.||UGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCA
14471448
3951
AAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUA|.|.|||||||||.| |.||..|.|.|.|....|.|.||||AUAAAAUCACAGAGG-GUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUA
14491450
3953
AAUGAAGA--CAAUGAGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCA-AAGAGGAGACAAC-- UUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAA-UAAAGAUAAAAC--AGCAGCUGUUA|||..|||  ||.|| ||.|...|||.|||||....|.|| ||..||||.||||  ||..|..|||...|.|..|||...|.|.|..|...||||. |||.||..||.|  |||||.|.|||AAUUCAGAAUCAGUG- GGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAG CUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUA
14511452
3955
GAAGACAAUGAGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCAA||||||....||||.   ||||||||..||.||.||GAAGACUCCAAGGGA---GUAAAAGAGCUGAUGAAA
14531454
3957
GUUACAGACAAAACAUAAUG|.|||||...|||.||.|||GCUACAGCUGAAAGAUGAUG
14551456
3959
CAAAGAAUCACAGAUGAGA||.||||..|.||||||||CAGAGAAAAAUAGAUGAGA
14571458
3960
UGAGAGAAAGCGAGAG|||.|||.|.||.|||UGAAAGAGAACGUGAG
14591460
4041
AUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUAGC|.|||...||..|||.|...||.|||||.|..|||||.||AGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAAUUGAGAGCAAAUUUGC
14611462
4042
AAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAU|.|.|.|.||.|.|||||||||.||AGACAUGCCUUUGGAAAUUUCUUAU
14631464
4044
AGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGG-UAUCAGUA|.|.|.||.|.||.|.|.|||||||| ||.|||.|AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAA
14651466
4046
AUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUAGCCAG---CCUACCUGAGCCCAGAGAUGAAAGGAAAAUAAA||||..|..|...|||.|||||.||.   |.|.|.||..|.||.||   ||.||.|||.||..||.|.||...|.||.||||AUGAAUUUGUUUUAUGGUUGGAGGAA--- GCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAA
14671468
4047
AAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAA-AUUUCUCAUCAGUGG|||...|||||.|.||||.||.| |....||..||||||AAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGG
14691470
4048
AAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUA|||.|||||.| |||.|||||.|..|.|||AAAAGCUUGAA-GACCUUGAAGAGCAGUUA
14711472
4049
UUGAAAAAAAAUUAGCCAGCCUACCUGAGCCCAGAGAUG|||.|.||..|..|.||||||.  ||.|||| ||.||.|UUGUACAAGGAAAAACCAGCCA--CUCAGCC-AGUGAAG
14731474
4051
UGGAUGACAUUGA|||.||||.||||UGGGUGACCUUGA
14751476
4053
AAUUUCUCAUCAGUGGUAUCA-GUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAA||||....||||||||.||.| ||||||||. ||...|.|..|.|....|.||...|||.||||.||...|||AAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAA-CACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAA
14771478
4055
UUGAGGUCUCAAAGA-AGAAAAAAGGCUCUAGAAA|.||.|.|||.|||. ||.||||..|||...||||UAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAA
14791480
4057
AGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUC||..|.||||.|.||||||.|.|AGCCAGUUCUGACCAGUGGAAGC
14811482
4059
AAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUG ACAUUGAAAAAAAAUUAGCCAGC--//|.||||...||||...||..|...|..|.|||||.|..|.|..||...|||..|.|.|||....|.||.|....|.|||||.|......|||.|.|  ||||.ACGAAAGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUG AGACCCUUGAAAGACU--CCAGGAA//
//CUACCUGAGCCCAGAGAUGAAAGGAAAAUAAAG  ||.|..|||.|||..|||||...|.|..|.|||//CUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUGGACCUCAAG
14831484
4060
AGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCU|||||||.|.|.||.   |.|..||.||..|||.||.|...||||.||AGAAAUUGCGCCUCU---GAAAGAGAACGUGAGCCACGUCAAUGACCU
14851486
4142
AAGAAAGAGGAG---CUGAA|||.||||||||   |||||AAGCAAGAGGAGUCUCUGAA
14871488
4144
AAUUUGCUCAGUUUCG----AAGACUCAACUU||..||..|||||||.    |||||.|||.||AAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUU
14891490
4146
GAAGAAAG-AGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAG|||.|.|| ||.|.||.||.|.|..||.|..|||||GAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAG
14911492
4147
GGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUG--CAGUGCGU|||||||....||.||..||..|.|.|||.|.|  |.||||.|GGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUU
14931494
4148
AGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAA|.|||.|||||..|.||||.||ACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAA
14951496
4149
CAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAA|||.||.||||.|.|||.||...|.||.|.|CAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGA
14971498
4153
AAUUGCAG-AAG--AAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAG--CUGAGG---GCUUGUCUGA-GGAUGG-- GGCCGCAAUGGCAGUGGAGCCAACUCAGA|||.||.| |||  |||.||||  ||||||  ||||..|.||||..||  |.|||.   |||||..|.| |||.||  ||.|.|.||. ||||.||..|||..||.|AAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGA--AGCUGA-- GCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGCUUGAGUCAUGGAAGGAGGGUCCCUAUA-CAGUAGAUGCAAUCCAAA
14991500
4155
UUGCAGAAGAAGAAAGA||.||||||..||||.|UUACAGAAGCUGAAACA
15011502
4157
UCGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCA||.||..|.||...||..||||||.||  |||||..||...|.|||||UCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGAUGA--UGAAUUAAGCCGGCAGGCA
15031504
4159
CGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUGAGG|.||||.|.||..||...|..||.||||||.|......||...|.||||||||||CAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUGGACCUCAAGCUGCGCCAAGCUGAGG
15051506
4160
GAGCCAACUCA--GAUCCAGCUCAGCAAGC||||||..|||  ||.|..|||| ||.|||GAGCCACGUCAAUGACCUUGCUC-GCCAGC
15071508
4244
CUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCA|||..|||||..|||||..||||||CUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCA
15091510
4246
UGAAAUCACUCAUGUCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACU|.|.||..||..|.||.|||..|..|....|.|||.|.|.|||||UAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACU
15111512
4247
UCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAU||.||.|||||| |..|||....||..|||||...|||UCCCAUAAGCCC-AGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAU
15131514
4248
UAAGGACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCA|.|.|||.|||||||.|..||.||.||UGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCA
15151516
4249
CACACUGUCCGUGAAG|||.|.|.|.||||||CACUCAGCCAGUGAAG
15171518
4251
AGAAACGAUGAUGGUGA-UGAC--UGAAGACAU|.|.|.|.||||||||. ||||  |||.||.||ACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAU
15191520
4253
CACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGA---CUGAAGACAUGCC||||.||.|.|..|...||.||.||.|.|||..|   ||.|.||||.|||CACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCC
15211522
4255
AGAAG-UGGAACAACUUCUCAAUGCUCCU||||| ||.|||||||.| ||||| ||||AGAAGCUGAAACAACUGC-CAAUG-UCCU
15231524
4257
GAAAUUUCUUAUGUGCCUUCUACUUA|.||.||||..||||.||.|..||.|GGAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGA
15251526
4259
ACUGUCCGUGAAGAAACGAUGA||||.|.|.|||.||..|||||ACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGA
15271528
4260
AGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUCCUGACCUCUGUGCUAAGGACUUUG||||...||.|.||.|  |||||..|.||..|.|.. |||.|..||||||AGAACGUGAGCCACGU--CAAUGACCUUGCUCGCCA-GCUUACCACUUUG
15291530
4344
AAUGGGAAAAAGUUAA---CAAAAUGUA|.||||||.|.|.|||   ||||..|||AUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUA
15311532
4346
GAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGGAA|||.|.|||||||  .|.||..|.||.||.||.|.||GAAAAGAGCAGCA--ACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAA
15331534
4347
AAGAUAGUCUACAACA-AAGCUCAGG||||||..||..||.| |||||||.|AAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAG
15351536
4348
GCUCUCUCCCAGCUUGAUUUCCAAUGGGAAAAAGUUAACAAAAUGUACAAGGACCGACAA|.|.|||||.|....||.|  ||.|.|||||....||||.||....||.|.||..|||.|GUUAUCUCCUAUUAGGAAU--CAGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGAAGGACCA
15371538
4349
AAAGUUAACAAAAUGUACAAGGACCGACAAG||||...|..|..||||||||||...||.||AAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAG
15391540
4351
UUGCAAAGUGCAAC--GCCUGUGGAAAGGGUGAAGCUACAGGAAGCUCUCUCCCAGCUUGAU|.|||.|.|.||||  |.|| ||||.||.....|.|.||.||     ||.||.|.|||||||UGGCAGAUUUCAACCGGGCU-UGGACAGAACUUACCGACUGG-----CUUUCUCUGCUUGAU
15411542
4353
CAGCUUGAUUUCCAAUGGGAAAAAGUUAACAAAAUGUACAAGGA||.|||.|...||...||.||.|..|.||..||||||..|||||CACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGA
15431544
4355
UGCAACGCCUGUGGAAAGGGU|||.||.|.|..|||||||.|UGCUACCCGUAAGGAAAGGCU
15451546
4357
GGUGAAGCUACAG||||..|||||||GGUGUGGCUACAG
15471548
4359
AAUGGGAAAAAGUUAAC|.|||||||||.|.|||AGUGGGAAAAAUUGAAC
15491550
4360
CUGUGGAAAGGGUGAAG-CUACA-GGAAGCU||.|||||....||||. |.|.| |||||||CUCUGGAAGACCUGAACACCAGAUGGAAGCU
15511552
4445
UUAAUCAGUGGCUAACAGAAG--CUG--AACAGUUUCUCAGAAAGACACAA|.||||.|.|| |..|||.||  |||  |||||.|. |||||.|||.|.||UGAAUCUGCGG-UGGCAGGAGGUCUGCAAACAGCUG-UCAGACAGAAAAAA
15531554
4454
CAGUGGCUAACAGAAGCUGA|||||||..|||.|.|..||CAGUGGCAGACAAAUGUAGA
15551556
4456
AGAAAGACACAAAUUCCUGAGA|.|.||.||.|||.||||||||AAACAGCCAAAAAAUCCUGAGA
15571558
4546
GCAACUGGGGAAGAAAUAAUUCAGCAA||||||.  .||||||...||.|||||GCAACUA--AAAGAAAAGCUUGAGCAA
15591560
4547
CAGCGGCAAACUGUUGUCAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAA|.|||.||.....||.|||.|..|||.||||.||||||.|.|CUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGA
15611562
4548
UUGGGAAGCCUGAA|||||.|||.||||UUGGGCAGCUUGAA
15631564
4549
AGAUGCCAGUAUUC-UACA-GGAAAAA|.|.|.|||.|||. |||| |||||||AAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAA
15651566
4551
CAGCAAUCCUCAAAA-ACAGAUGCCA|.||.|||..||||. |.|.||||||CUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCA
15671568
4553
UCAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAA-GAAAUAAUUCAGCAAUCCUCAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAA|||||||  .|.|.|||||.|..||| |||||..|..||.|.||    ||.||| |||.|.|.|..||| |||||.||UCAGAAC--CGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUC----AACACA-AUGGCUGGAAGCUA-AGGAAGAA
15691570
4555
AAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGA|||||..|||||.|.|.||||||||AAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGA
15711572
4557
AUUGGGAAGCCUGAAUCUG--CGGUGGCAGGAGGUCUGCA|||.|||||||.|. ||||  |.||||.||  .|||||||AUUUGGAAGCCAGU-UCUGACCAGUGGAAG--CGUCUGCA
15731574
4559
CUGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAA|||||..|.||||.|.|.||||.||||CUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAA
15751576
4560
CCUCAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAG|||.||.|.||||||..||. ||||.|||CCUGAACACCAGAUGGAAGC-UUCUGCAG
15771578
4654
CACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAA||..|||..|..||||||..||.....|||.|||.||CAGAUGAUACCAGAAAAGUCCACAUGAUAACAGAGAA
15791580
4656
AACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAA||||||||..|.|.||||.|..|||AACCUGGAUGAAAACAGCCAAAAAA
15811582
4748
AGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCU|.||||.|..|...|.||||||||.|||||AAAAGACCUUGGGCAGCUUGAAAAAAAGCU
15831584
4749
AAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGA|||||..||.|..||.||||||..|..||.|....|||||AAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGA
15851586
4751
AGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGA|.||.|||..||..||.|  |||||||||AUAUCAACGAGAUGAUCA--UCAAGCAGA
15871588
4753
AACAAUUAAAUGAAA||||.||.|||||||AACAGUUGAAUGAAA
15891590
4755
UGGAAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAA||.||.||||.||||||..||.||.||UGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAA
15911592
4757
UUACUGGUGGAAGAGU-UGCCCCUG---CGCCAGGGAAUUCU|.||..|||||||.|| |||.|||.   |..||||.|.||||UGACCAGUGGAAGCGUCUGCACCUUUCUCUGCAGGAACUUCU
15931594
4759
UACUG-GUGG- AAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGCUCCCAUAAGC CCAGAAGAGCAAG-AUAAACUUGAAAAUAAGCU----//||||| |||| ||.|.|||..|||||       |.|.|.|..||....|.|..|||.|.||.||..|.  ||||.|||. ||||...||...||..||...|.| ||.|.||.||....|||||UACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGC-------ACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACC--CUUGAAAGA-CUCCAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUGGACCUCAAGCUGCGC//
//CAAGCAGA  |||||.||//CAAGCUGA
15951596
4760
UGGUGGAAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGA|.|.|||..|.||||.|||..|..||.|||.. |.|..||..|.|||||UCGAGGAGAAAUUGCGCCUCUGAAAGAGAACG-UGAGCCACGUCAAUGA
15971598
4849
GAAAUUGAAGCUCAAA-UAAAAGACC|||||.|.||.||||. ||||..|||GAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACC
15991600
4851
CUUGGGCAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGA||..|||||.||..||....|||||.|.|CUCUGGCAGAUUUCAACCGGGCUUGGACA
16011602
4853
UGAGAAACAA--GGA-GAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAGC--UUGAAAAAAAGCUUGAAG|.||||.||.  ||| |||.|..|||..||..|..|..|||...||||.|  |||||..|||..||.|||UCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAG
16031604
4855
GCAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUGCUGCUGU|.|.||.|||||....||||.....|||  |.||.||.|.||.||.||||...|||GGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUU--ACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGU
16051606
4857
UUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUGCUGCUGU|.||||.|..|...||.||||..||.|.|||||..||.|UGGAAGCCAGUUCUGACCAGUGGAAGCGUCUGCACCUUU
16071608
4859
GGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAA|||.||||||||.||..|.|.......||  |||||.  ||||||.||.| ||...|||||||GGAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACU--GGCAGA--GAAAAAUAGAU-GAGACCCUUGAA
16091610
4860
CAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAGCUUGAA|.|||||||||||...|||..| ||.|||.|.||.||..|.|.||CGAGGAGAAAUUGCGCCUCUGA-AAGAGAACGUGAGCCACGUCAA
16111612
4951
CAACCGGAUGUGGA-AGAGAUU|||||||...|||| |||..||CAACCGGGCUUGGACAGAACUU
16131614
4953
UGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUG||||.||..||..||. ||..|.|||||||.|UGAAGUACAAGAACAC-CUUCAGAACCGGAGG
16151616
4955
GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUU-UUGUCU||||||.|.|.|..|.|.|||......|..|.|||..|||||.||.|| |||.||GAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCU
16171618
4957
AGCAGUUCA--AGCUAAACAA|||||||||  |||..|||.|AGCAGUUCAGAAGCAGAACGA
16191620
4959
UCAAGCUAAAC-AACCGGAUGUGG--AAGAGAUUUUGUC|||||||...| ||.|.||.|||.  |||.|||..||.|UCAAGCUGCGCCAAGCUGAGGUGAUCAAGGGAUCCUGGC
16211622
4960
GCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGA|||.|||.||...||....||..|.||.||||||GCACUUCGAGGAGAAAUUGCGCCUCUGAAAGAGA
16231624
5051
AAGUUAGAAGAUCUGAGCUCUGAGUGGAAGGCGGUAAACCGUUU--ACUUCAA-GAGCUGAGGGCAAAGCAG||||||.||.|||..||.   |.||| |.||.||...|||.|..  |..|||| |||.|||.....||||||AAGUUAUAAAAUCACAGA---GGGUG-AUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAG
16251626
5053
UUAGAAGAUCUGAGCUCUGAGUGGAAGGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUG||..||||..|.||.. |.|||||.|.|..|||.|.......|||||..|.|.||||..|.||..|..|||..| |.|...|||.|.|.|||.||.|UUGAAAGAAUUCAGAA-UCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAU-GUUAAAGGAUUCAACACAAUGG
16271628
5055
AGGAAGUUAGAAGAUCUGA|||.|||.| ||||.||||AGGGAGUAA-AAGAGCUGA
16291630
5057
AGAUCUGAGCUCUGAGUGGAAGGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCU||.|||||.|    ||||||||....|..|||.||..||.||.||.||AGUUCUGACC----AGUGGAAGCGUCUGCACCUUUCUCUGCAGGAACU
16311632
5059
ACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCU--AGCUCC||||||||||...|.||...|||.|   |||||  ||||.|ACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUG---GACCUCAAGCUGC
16331634
5060
UGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGG||||||.||||.....||.||||||.|.||UGACCUUGCUCGCCAGCUUACCACUUUGGG
16351636
5152
AUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAAG||.|.||..|.|.||.||.|||.||..||AUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAG
16371638
5158
ACUAAGGAAACUGCCAUC|||||.|||.|||..|||ACUAAAGAACCUGUAAUC
16391640
5253
UUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACA-----AGACCAGCAAUCAAGAGGCUAGAACAAUCAUUACGGAUCGAA|||.|||||.|||..|.|..||.....||.|..||.||||     |||.|.|.|..|||.||...|....|||..|.|.||||..||UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAA
16411642
5255
UUGGAAGAA-CUCAU||||||||| |||||UUGGAAGAAACUCAU
16431644
5257
CCAGCAAUCAAGAGGCUAGAACAAU||||||.|..|||.|| |||||.||CCAGCAGUUCAGAAGC-AGAACGAU
16451646
5259
UUGAAAAACAAGACCAGCAA--UCAAGAGGCUA||||||.||.   ||||.||  |||||||||.|UUGAAAGACU---CCAGGAACUUCAAGAGGCCA
16471648
5260
UGGAAGAACUCAUUACC|||||||.||.|..|||UGGAAGACCUGAACACC
16491650
5358
CUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAG|.||||||. |||.|||..|.|.||||CAGAGCAGC-CUUUGGAAGGACUAGAG
16511652
5455
CUGAAACUUCUCCGGGAUUAUUCUGCAG-AUGAUACCAGAAAAG|||||||..||.|  .|.|.|.||.||| |||.||||.|.||.|CUGAAACAACUGC--CAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGG
16531654
5457
CAGUGGCAGACAAAUGUAGAU|||..|||||...|||||.||CAGAAGCAGAACGAUGUACAU
16551656
5459
CUCCGCC-AGUGGCAGACAAAUGUAGAUGUGGCAAAUGACUUGGCCCUGAAACUUC||||||. |.|||||||.|||..||||||.|.|...|||......||.|.||||||CUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUC
16571658
5460
UCCGCCAGUGGCAGACAAAUGUAGAUGUGGCAAAUGACUUGGCCCUGAAACUU|.||||..||..|||.||....||....|.||| ||||.|.||.|...|.|||UGCGCCUCUGAAAGAGAACGUGAGCCACGUCAA-UGACCUUGCUCGCCAGCUU
16591660
5556
GAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCU------CCUAGAAGACUCCAAGG||||||.|.|||..||...||..|...|.|||||..|.|.|..|..|||..||      |||.||||..|||.|.|GAAGCUCACACAGAUGUUUAUCACAACCUGGAUGAAAACAGCCAAAAAAUCCUGAGAUCCCUGGAAGGUUCCGAUG
16611662
5657
ACAGCCAAAAAAUCCUGAGAUCC-CUGGAAGGUUCCGAU|||||..|||.||..|||..|.. |.||.|||..||.||ACAGCUGAAAGAUGAUGAAUUAAGCCGGCAGGCACCUAU
16631664
5659
GGUGAAAUUGAAGCU-CACACAGAUGUUUAUCACA---ACCUGGAUGAAAACAGCCAAAAAAUCCUGAGAUCCCUGGAAGGUUCCGAUGA||..||||||||.|| |||.|.|.||..|..||.|   |..|.|||||.|.|....|||.|.|||.|..|...|..||.|...|.|||||GGAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGA
16651666
5859
ACAGAGCAGCCUUUGGAAGGACUAGAGAAACUCUACCAGG|.|||..||.|..|.|||.||||..||.||||..|..|||AUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCAAGAGG
16671668
5860
CUUCAAGAGGGAAUUG||||.||..|.|||||CUUCGAGGAGAAAUUG
16691670
5660
CUCCAAGGUGAAAUUGAAGCUCACACAGA|..|.|||.|||||||...|||..|.|||CUUCGAGGAGAAAUUGCGCCUCUGAAAGA
17421743
1018
CAGCUUUAGAAGAA|||..|||.|||||CAGACUUAAAAGAA
17661767
1018
AUUUCUAAUGAUGUGGAAG||||..|||..|..|||||AUUUGCAAUCUUUCGGAAG
17681769
1030
CAUUUGGAAGCUCCU---GAAGACAAG||.||||.||||..|   |.|||||||CAGUUGGCAGCUUAUAUUGCAGACAAG
17701771
1030
GGAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAG|||||.||||. ||.|||....|.|.|||.|..||GGAGACUGAAA-AAUCCUUACACUUAAUCCAGGAG
17721773
4555
AUGCAACUGGGGAAGAAA|.||..||..||||||||AGGCUGCUUUGGAAGAAA
17741775
4555
AGCCUGAAUCUGCGGUGGCAGGAGGUC|||..||..||||..|||.||.|..||AGCGAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUC
17761777
Таблица 3Перечень предпочтительных последовательностей оснований олигонуклеотидов по изобретению. Олигонуклеотиды, содержащие эти последовательности оснований, способны связываться с высоко сходными областями (участки последовательности с >50% идентичностью) в двух различных экзонах DMD (как проиллюстрировано в таблице 2), и они способны индуцировать пропускание этих двух экзонов и любых экзонов между ними с образованием транскрипта DMD в рамке считывания.
Соединение
Последовательность*
SEQ ID NO
Первый экзон 8 - Второй экзон 19
PS830
GUGAUGUACAUUAAGAUGGACUUC
1671
GYGZYGYZXZYYZZGZYGGZXYYX
1672
YGGZXYYXYYZYXYGGZY
1722
YXYGZZXYYXYXZGXYY
1723
Первый экзон 9 - Второй экзон 22
YXZGZGGYGGYGZXZYZZG
1724
YXZYZGYXGGYGZXZXYZZG
1725
Первый экзон 9 - Второй экзон 30
YXYXZYZYXXXYGYGXYZGZXYG
1726
GZZYXGZGGXYYZGGYGZZGZZG
1727
YYXZGYXYXXYGGGXZGZXYG
1728
GZXYXXYGGZYYZZGYGYZZGG
1729
Первый экзон 10 - Второй экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48, 55, 57 или 60
PS811
CUUCCUUCCGAAAGAUUGCAAAUUC
1673
XYYXXYYXXGZZZGZYYGXZZZYYX
1674
PS814
GACUUGUCUUCAGGAGCUUCC
1675
GZXYYGYXYYXZGGZGXYYXX
1676
PS815
CAAAUGACUUGUCUUCAGGAGCUUC
1677
XZZZYGZXYYGYXYYXZGGZGXYYX
1678
PS816
CUGCCAAAUGACUUGUCUUCAGGAG
1679
XYGXXZZZYGZXYYGYXYYXZGGZG
1680
PS1168
CUGCCDDDUGDCUUGUCUUCDGGDG
1681
PS1050
CCAAAUGACUUGUCU
1682
CCAAAYGACYYGYCY
1683
PS1059
CAAAUGACUUGUCUUCAGGAG
1684
PS1138
<u>C</u>AAAUGA<u>C</u>UUGU<u>C</u>UU<u>C</u>AGGAG
1685
PS1170
CDDDUGDCUUGUCUUCDGGDG
1686
ZYGZXYYGYXYYXZGGZGGZG
1687
PS1016
CAGUCUCCUGGGCAGACUGGAUGCUC
1688
XZGYXYXXYGGGXZGZXYGGZYGXYX
1689
ZYGZZXYGXXZZZYGZXYYGYX
1690
ZYZZGXYGXXZZXYGXYYGYX
1691
GYXXZGGYYYZXYYXZXY
1692
GYXXZXXYYGYXYGXZZY
1693
XYYXYZZZGXYGYYYGZ
1694
XYYXXYGZGGXZYYYGZ
1695
YYYGZYZZXGGYXXZGGYYYZXYYXZ
1696
ZGGXZYYYGZGXYGXGYXXZ
1697
Первый экзон 23 - Второй экзон 42
YXYYXGZXZYXYXYYYXZXZGY
1698
GXGXYYYXYYXGZXZYXYX
1699
ZZYYYXZGZGGGXGXYYYXYYX
1700
YXYYXZGYXZYXZXXZYXZYXGY
1701
GGXZYGYXYYXZGYXZYXZX
1702
ZZYYYXXZZZGGXZYGYXYYX
1703
Первый экзон 45 - Второй экзон 51
YGGXZYXYGYGYYYGZGGZYYGXYG
1730
YGGXZYYYXYZGYYYGGZGZYGGXZG
1731
Первый экзон 45 - Второй экзон 53
YYXXZXZGYYGXZYYXZZYGYYXYGZ
1732
YYXZZXYGYYGXXYXXZGYYXYGZ
1733
YYXXYGYZGZZYZXYGGXZYXYGY
1734
YYXZZXYGYYGXXYXXGGYYXYGZ
1735
XYYYZZXZYYYXZYYXZZXYGYYGX
1736
YYXYYXXYYZGXYYXXZGXXZYYGYGYY
1737
Первый экзон 45 - Второй экзон 55
UCCUGUAGAAUACUGGCAUCUGUUU
1704
YXXYGYZGZZYZXYGGXZYXYGYYY
1705
PS1185
UCCUGUDGDDUDCUGGCDUCUGUUU
1706
PS1186
UCCUGUDGDDUDCUGGCDUCUGU
1707
UCCUGUAGAAUACUGGCAUCUGU
1708
YXXYGYZGZZYZXYGGXZYXYGY
1709
PS1187
UCCUGUDGGDUDUUGGCDGUUGUUU
1710
UCCUGUAGGAUAUUGGCAGUUGUUU
1711
YXXYGYZGGZYZYYGGXZGYYGYYY
1712
PS1188
UCCUGUDGGDUDUUGGCDGUUGU
1713
UCCUGUAGGAUAUUGGCAGUUGU
1714
YXXYGYZGGZYZYYGGXZGYYGY
1715
UCCUGUAGGACAUUGGCAGUUGU
1716
YXXYGYZGGZXZYYGGXZGYYGY
1717
UCCUGUAGGACAUUGGCAGUUGUUU
1718
YXXYGYZGGZXZYYGGXZGYYGYYY
1719
Первый экзон 45 - Второй экзон 60
ZZYZXYGGXZYXYGYYGYYGZGG
1738
XYGYZGZZYZXYGGXZYXYGYY
1739
GXYYXXZYXYGGYGYYXZGG
1740
XYGXZGZZGXYYXXZYXYGGY
1741
Первый экзон 56 - Второй экзон 60
YXYGYGYGZGXYYXZZYYYXZXXYYGGZG
1720
YCYYYXZGZGGXGXZZYYYXYXXYXGZZG
1721
*D=2,6-диаминопурин; C=5-метилцитозин; X=C или 5-метилцитозин, Y=U или 5-метилурацил; Z=A или 2,6-диаминопурин
Таблица 6Перечень наиболее предпочтительных и/или дополнительных комбинаций экзонов, наиболее предпочтительных и/или дополнительных областей идентичности экзонов, и наиболее предпочтительных и/или дополнительных олигонуклеотидов с их последовательностями оснований, химическими модификациями и идентификационными номерами последовательностей, где *= LNA, C=5-метилцитозин, U=5-метилурацил, D=2,6-диаминопурин, X=C или 5-метилцитозин, Y=U или 5-метилурацил, Z=A или 2,6-диаминопурин, и < > все 2'-фторнуклеотиды (как в SEQ ID NO: 1844).
Примеры 1-5
Материалы и способы
4
Конструирование олигонуклеотидов в первую очередь было основано на обратной комплементарности с конкретными высоко сходными участками последовательности в двух различных экзонах DMD, как идентифицировано в EMBOSS Matcher и как описано в таблице 2. Следующими учитываемыми параметрами последовательности были присутствие частично открытых/закрытых структур РНК в указанных участках последовательности (как предсказано с помощью RNA structure версии 4.5 или РНК mfold версии 3.5 (Zuker, M.) и/или присутствие предполагаемых участков связывания SR-белка в указанных участках последовательности (как предсказано с помощью программного обеспечения ESE-finder (Cartegni L, et al. 2002 и Cartegni L, et al., 2003). Все AON были синтезированы в Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Netherlands) или были получены из коммерческого источника (ChemGenes, США), и они содержат 2'-O-метил-РНК и полноразмерные фосфоротиоатные (PS) основные цепи. Все олигонуклеотиды представляли собой 2'-O-метилфосфоротиоатную РНК, и их синтезировали в масштабе 10 мкмоль с использованием устройства для синтеза OP-10 (GE/ÄKTA Oligopilot), с помощью стандартных протоколов для фосфорамидитов. Олигонуклеотиды расщепляли и из них удаляли защитные группы двухстадийным способом (обработка DIEA, а затем концентрированным NHOH), очищали с помощь ВЭЖХ и растворяли в воде, и добавляли избыток NaCl для обмена ионами. После упаривания соединения перерастворяли в воде, обессоливали с помощью FPLC и лиофилизировали. Масс-спектрометрия подтвердила идентичность всех соединений, и чистота (определенная с помощью UPLC) была найдена приемлемой для всех соединений (>80%). Для экспериментов in vitro, описанных в настоящем описании, приготавливали 50 мкМ рабочие растворы AON в фосфатном буфере (pH 7,0).
Культивирование тканей, трансфекция и анализ способом ОТ-ПЦР
Дифференцированные здоровые контрольные мышечные клетки человека (мышечные трубочки) трансфицировали в 6-луночных планшетах при стандартной концентрации AON 400 нМ в соответствии со стандартными рабочими методиками, не относящимися к GLP. Для трансфекции использовали полиэтиленимин (ExGen500; Fermentas Netherlands) (2 мкл на мкг AON, в 0,15 M NaCl). Упомянутые выше методики трансфекции были адаптированы из ранее описанных материалов и способов (Aartsma-Rus A., et al., 2003). Через 24 часа после трансфекции РНК выделяли и анализировали способом ОТ-ПЦР. В кратком изложении, для получения кДНК использовали случайную смесь гексамеров (1,6 мкг/мкл; Roche Netherlands) в реакции с обратной транскриптазой (RT) на 500-1000 нг исходной РНК. Затем проводили анализ ПЦР на 3 мкл кДНК для каждого образца, и он включал первую и гнездовую ПЦР с использованием праймеров, специфичных к гену DMD (см. таблицы 4 и 5). Выделение РНК и анализ ОТ-ПЦР проводили в соответствии со стандартными рабочими методиками, не относящимися к GLP, адаптированными из ранее описанных материалов и способов(Aartsma-Rus A., et al., 2002; и Aartsma-Rus A., et al., 2003). Продукты ОТ-ПЦР анализировали гель-электрофорезом (2% агарозные гели). Полученные фрагменты ОТ-ПЦР количественно определяли с помощью анализа DNA Lab-on-a-Chip analysis (Agilent Technologies USA; DNA 7500 LabChips). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения "Agilent 2100 Bioanalyzer" и Excel 2007. Оценивали соотношение меньших продуктов транскрипции (содержащих ожидаемое пропускание множества экзонов) и общего количества продуктов транскрипции (что соответствует эффективности пропускания в процентах), и прямо сравнивали с количеством продуктов транскрипции в нетрансфицированных клетках. Фрагменты ПЦР также выделяли из агарозных гелей (набор для экстракции из геля QIAquick gel extraction kit, Qiagen Netherlands) для подтверждения последовательности (секвенирование по методу Сенгера, BaseClear, Нидерланды).
Таблица 4Наборы праймеров для ПЦР, использованные для обнаружения пропускания экзонов-мишеней
Экзоны-мишени
1-я ПЦР
2-я ПЦР
прямой
обратный
прямой
обратный
10-18
h7f
h20r
h8f
h19r
10-30
h7f
h32r
h8f
h31r
10-47
h8f
h50r
h9f
h49r
10-57
h8f
h64r
h9f
h63r2
45-55
h43f2
h57r
h44f
h56r
Таблица 5Последовательности праймеров
ID праймера
Последовательность (5'→3')
h7f
agtcagccacacaacgactg
h8f
caaggccacctaaagtgactaaa
h9f
gagctatgcctacacacagg
h43f2
cctgtggaaagggtgaagc
h44f
gcgatttgacagatctgttg
h19r
gcatcttgcagttttctgaac
h20r
actggcagaattcgatccac
h31r
tgtgcaacatcaatctgagac
h32r
tagacgctgctcaaaattgg
h49r
cactggctgagtggctgg
h50r
tcagtccaggagctaggtc
h56r
cgtctttgtaacaggactgc
h57r
tctgaactgctggaaagtcg
h63r2
gagctctgtcattttgggatg
h64r
gggccttctgcagtcttcgga
(SEQ ID NO: 1745-1759)
Результаты
Пример 1. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзонах 10 и 18 посредством AON в различных положениях
Исходя из высоко сходного участка последовательностей (63%) в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110) конструировали серию AON, распределенных по указанному участку последовательности, на 100% обратно комплементарные либо экзону 10 (PS814; SEQ ID NO: 1675, PS815; SEQ ID NO: 1677, PS816; SEQ ID NO: 1679) или либо экзону 18 (PS811; SEQ ID NO: 1673). После трансфекции в контрольных культурах мышечных трубочек здорового человека анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что все четыре AON были способны индуцировать пропускание экзонов с 10 по 18 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.1). PS811 и PS816 обладают наиболее высокими процентами обратной комплементарности с обоими экзонами (фиг. 1B), и они были наиболее эффективными с эффективностью пропускания экзонов с 10 по 18, составляющей 70% и 66%, соответственно (фиг.1C). PS814 был наименее эффективным, что может быть связано с его расположением и/или более короткой длиной (21 против 25 нуклеотидов) и, таким образом, более низкой аффинностью или стабильностью. В необработанных клетках не наблюдали пропускания экзонов с 10 по 18 (NT). Эти результаты были высоко воспроизводимыми (пропускание экзонов с 10 по 18 посредством PS816 при 20/20 различных трансфекциях) и демонстрируют, что пропускание мультиэкзонного участка с 10 по 18 экзоны является осуществимым с использованием одного AON, который способен связываться как с экзоном 10, так и с экзоном 18, в области с высоким сходством последовательности (63%), и который способен индуцировать пропускание этих экзонов и всех экзонов между ними. Хотя в этой области транскрипта могут быть получены дополнительные фрагменты с пропусканием множества экзонов, полученный транскрипт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания), был наиболее распространенным во всех экспериментах.
Пример 2. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзоне 10 и 18 посредством AON различной длины
Учитывая высоко сходные участки последовательности в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110), авторы настоящего изобретения оценивали эффект AON различной длины для идентификации наиболее эффективной минимальный длины. После трансфекции PS816 (25-мер; SEQ ID NO: 1679), PS1059 (21-мер; SEQ ID NO: 1684) или PS1050 (15-мер; SEQ ID NO: 1682) в контрольных мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированных мышечных трубочках), анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что все три AON были способны индуцировать пропускание экзонов с 10 по 18 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.2A, B). PS816 и PS1059 были наиболее эффективными (68% и 79%, соответственно). Наиболее короткий PS1050 был менее эффективным (25%). В необработанных клетках (NT) не наблюдали пропускания экзонов с 10 по 18. Эти результаты указывают на то, что пропускание мультиэкзонного участка с 10 по 18 экзоны является осуществимым с использованием AON из 15, 21 и 25 нуклеотидов. Также ожидается, что будут действовать более длинные AON. 21-мерный PS1059 был наиболее эффективным наиболее коротким кандидатом. 15-мер PS1050 был наименее эффективным, что может быть связано с его уменьшенной обратной комплементарностью экзону 18 (47%; фиг.2B) и/или уменьшенной аффинностью связывания с РНК-мишенью или стабильностью. Для повышения Tm и, таким образом, аффинности связывания и стабильности дуплекса, 15-меров в целях повышения их биоактивности могут требоваться модификации оснований. Наиболее многочисленным полученным продуктом-транскриптом в этом эксперименте вновь был продукт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания).
Пример 3. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзоне 10 и 18 посредством AON с модифицированной химической структурой оснований
Конкретные характеристики выбранной химической структуры AON, по меньшей мере частично, влияет на доставку AON к транскрипту-мишени: путь введения, биостабильность, биораспределение, внутритканевое распределение и клеточный захват и транспорт. Кроме того, считается, что дальнейшая оптимизация химической структуры олигонуклеотида повысит аффинность связывания и стабильность, повысит активность, улучшит безопасность и/или снизит затраты вследствие уменьшения длины или усовершенствования методик синтеза и/или очистки. В высоко сходном участке последовательностей в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110) авторы настоящего изобретения оценивали эффект AON на основе 2'-O-метил-РНК с различными модифицированными основаниями (такими как 5-замещенные пиримидины и 2,6-диаминопурины). После трансфекции PS816 (AON с регулярной 2'-O-метил РНК; SEQ ID NO: 1679), PS1168 (PS816, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурин; SEQ ID NO: 1681), PS1059 (AON с регулярной 2'-O-метилфосфоротиоатной РНК; SEQ ID NO: 1684), PS1138 (PS1059, но в котором все Cs заменены на 5-метилцитозин; SEQ ID NO: 1685), или PS1170 (PS1059, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурин; SEQ ID NO: 1686) (фиг.3B) в контрольных мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированные мышечные трубочки). Анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что все пять AON были способны индуцировать пропускание экзонов с 10 по 18 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.3). PS816 был наиболее эффективным (88%). Хотя модификации оснований в этих конкретных последовательностях не повышали биоактивность еще более, они могли иметь более положительный эффект на биораспределение, стабильность и/или безопасность, так что менее эффективные соединения все еще являются предпочтительными для клинической разработки. Эти результаты указывают на то, что пропускание мультиэкзонного участка с 10 по 18 экзоны является осуществимым с использованием AON с модифицированными основаниями. Наиболее многочисленным полученным транскриптом-продуктом в этом эксперименте вновь был транскрипт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания).
Пример 4. PS816 индуцирует пропускание других мультиэкзонных участков в рамке считывания
Высоко сходный участок последовательности в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110) также (частично) присутствует в экзонах 30 (SEQ ID NO: 128), 31 (SEQ ID NO: 130), 32 (SEQ ID NO: 132), 42 (SEQ ID NO: 152), 47 (SEQ ID NO: 158), 48 (SEQ ID NO: 160), 57(SEQ ID NO: 170) и 60 (SEQ ID NO: 174) (фиг.4A, B, таблица 2). Таким образом, авторы настоящего изобретения сфокусировались на выявлении пропускания мультиэкзонных участков после трансфекции 400 нМ PS816 (SEQ ID NO: 1679). Авторы настоящего изобретения использовали различные наборы праймеров (таблица 4 и 5) для этой цели. Действительно, с помощью анализа ОТ-ПЦР авторы настоящего изобретения выявили пропускание в рамке считывания экзонов с 10 по 30, экзонов с 10 по 42, экзонов с 10 по 47, экзонов с 10 по 57 и/или экзонов с 10 по 60 в множественных экспериментах (подтверждено с помощью анализа последовательности), которое не наблюдалось в необработанных клетках. В качестве примера, на фиг.4C представлено индуцированное PS816 пропускание экзонов с 10 по 18, экзонов с 10 по 30 и экзонов с 10 по 47. Несмотря на дополнительные случаи пропускания множества экзонов (как в рамке считывания, так и не в рамке считывания), полученный транскрипт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания), был наиболее воспроизводимым и оказался наиболее многочисленным во всех экспериментах. Эти результаты подтверждают, что в гене DMD может быть индуцировано пропускание множества экзонов с использованием одного AON, который способен связываться с участком последовательности, который высоко сходен между двумя различными экзонами и способен индуцировать пропускание этих экзонов и всех экзонов между ними с образованием транскрипта DMD в рамке считывания.
Пример 5. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзоне 45 и 55 с помощью AON с модифицированной химической структурой оснований
Исходя из высоко сходного (80%) участка последовательности в экзонах 45 (SEQ ID NO: 1571) и 55 (SEQ ID NO: 1572) была сконструирована серия AON, распределенных по всему указанному участку последовательности, либо на 100% обратно комплементарных экзону 45 (PS1185; SEQ ID NO: 1706, PS1186; SEQ ID NO: 1707), либо на 96% обратно комплементарных экзону 55 (с одним несоответствием оснований) (PS1188; SEQ ID NO: 1713) (фиг.5A). Во всех трех AON As были заменены на 2,6-диаминопурин. После трансфекции в контрольных культурах мышечных трубочек здорового человека анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что PS1185, PS1186 и PS1188 были способны индуцировать пропускание экзонов с 45 по 55 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.5B). В необработанных клетках (NT) не наблюдали пропускания экзонов с 45 по 55. Эти результаты демонстрируют, что пропускание другого мультиэкзонного участка с 45 по 55 экзоны является осуществимым с использованием одного AON, который способен связываться как с экзоном 45, так и с экзоном 55 в области с высоким сходством последовательности (80%), и который способен индуцировать пропускание этих экзонов и всех экзонов между ними. Полученный транскрипт, в котором экзон 44 был прямо сплайсирован с экзоном 56, находится в рамке считывания, и он был выявлен во множестве экспериментов. Что касается экспериментов с пропусканием экзонов с 10 по 18 (пример 3), авторы настоящего изобретения вновь продемонстрировали, что можно эффективно использовать AON с модифицированными основаниями. Более того, результаты, полученные с помощью PS1188, указывают на то, что AON не должен быть на 100% обратно комплементарным одному из экзонов-мишеней, но также может быть сконструирован в качестве гибридных структур, в которых отсутствует 100% обратная комплементарность с каким-либо экзоном-мишенью.
Описание чертежей
Фиг. 1. A) Локализация PS811 (SEQ ID NO: 1673), PS814 (SEQ ID NO: 1675), PS815 (SEQ ID NO: 1677) и PS816 (SEQ ID NO: 1679) в участке последовательности, который является высоко сходным (63%) в экзоне 10 и экзоне 18. B) Характеристики и эффективность AON. Указан процент обратной комплементарности (обр. компл.) каждого AON в отношении либо экзона 10, либо экзона 18. C) Анализ способом ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированных мышечных трубочках) все четыре AON были эффективными в отношении индукции пропускания мультиэкзонного участка с 10 экзона по 18 экзон. PS811 и PS816 были наиболее эффективными. В рамках слева на фигуре представлено содержание амплифицированных способом ПЦР продуктов транскриптов. (M: маркер размера ДНК; NT: не обработанные клетки).
Фиг. 2. A) Анализ ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированных мышечных трубочках) исследовали AON с различной длиной, однако с одинаковой центральной последовательностью-мишенью в участке последовательности, который является высоко сходным (63%) в экзоне 10 и экзоне 18. PS816 (SEQ ID NO: 1679), 25-мер, и PS1059 (SEQ ID NO: 1684), 21-мер, были наиболее эффективными (пропускание экзонов 10 и 18 составляет 68% и 79%, соответственно). 15-мер PS1050 (SEQ ID NO: 1682) был менее эффективным. В рамках слева на фигуре представлено содержание амплифицированных способом ПЦР продуктов-транскриптов. (M: маркер размера ДНК; NT: необработанные клетки). B) Характеристики и эффективность AON. Указан процент обратной комплементарности (обр. компл.) каждого AON в отношении либо экзона 10, либо экзона 18.
Фигура 3. A) Анализ ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированные мышечные трубочки) исследовали AON с различной химической структурой оснований: PS816 (AON с регулярной 2'-O-метилфосфоротиоатной РНК; SEQ ID NO: 1679), PS1168 (PS816, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурин; SEQ ID NO: 1681), PS1059 (AON с регулярной 2'-O-метилфосфоротиоатной РНК; SEQ ID NO: 1684), PS1138 (PS1059, но в котором все Cs заменены на 5-метилцитозины; SEQ ID NO: 1685) или PS1170 (PS1059, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурины; SEQ ID NO: 1686). Пропускание экзонов с 10 по 18 наблюдали для всех исследованных AON. PS816 был наиболее эффективным (88%). В этих конкретных последовательностях модификации оснований не повышали далее биоактивность. В рамках слева на фигуре указаны амплифицированные способом ПЦР продукты-транскрипты. (M: маркер размера ДНК; NT: не обработанные клетки). B) Характеристики и эффективность AON.
Фиг. 4. A) Высоко сходные участки последовательности в экзонах 10, 18, 30 и 47 в качестве множественных мишеней для PS816. SEQ ID NO относятся к полноразмерному выравниванию экзонов EMBOSS (как в таблице 2). Серым цветом выделена часть последовательности, которая не была включена в выравнивание EMBOSS, но которая является соседней с частью с высокой обратной комплементарностью с PS816. B) Обзор выравнивания экзонов и процентов обратной комплементарности (обр. компл.) с PS816. C) Анализ ОТ-ПЦР. С помощью PS816 может быть индуцировано пропускание мультиэкзонного участка, обозначаемое в настоящем описание как пропускание экзонов с 10 по 18, экзонов с 10 по 30 и экзонов с 10 по 47. Полученные транскрипты находятся в рамке считывания. Они не были выявлены в необработанных клетках (NT). В рамках слева и справа на фигуре представлено содержание амплифицированных способом ПЦР продуктов транскриптов. (M: маркер размера ДНК).
Фиг. 5. A) Локализация PS1185 (SEQ ID NO: 1706), PS1186 (SEQ ID NO: 1707) и PS1188 (SEQ ID NO: 1713) в участке последовательности, который является высоко сходным (80%) в экзоне 45 и экзоне 55. В таблице обобщенно представлены характеристики AON. Указан процент обратной комплементарности (обр. компл.) каждого AON в отношении либо экзона 45, либо экзона 55. B) Анализ ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированные мышечные трубочки) все три AON были эффективными в отношении индукции пропускания мультиэкзонного участка с 45 по 55 экзоны. В рамках слева на фигуре представлено содержание амплифицированных способом ПЦР продуктов транскриптов. (M: маркер размера ДНК; NT: необработанные клетки).
Список ссылок
Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson AA, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. See 1 article found using an alternative search: Neuromuscul Disord. 2002; 12:S71-7.
Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, den Dunnen JT, Baas F, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients. Hum Mol Genet. 2003; 12(8):907-14.
Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, van Ommen GJ, den Dunnen JT, van Deutekom JC. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am. J. Hum. Genet. 2004; Jan 74(1):83-92.
Alloza I et al., Genes Immun 2012; 13(3):253-257.
Abeliovich A et al., J Neurochem 2006; 99:1062-1072.
van Ommen GJ, van Deutekom J, Aartsma-Rus A. The therapeutic potential of antisense-mediated exon skipping. Curr Opin Mol Ther. 2008; 10(2):140-9.
Andrade MA, Perez-Iratxeta C, Ponting CP. Protein repeats: structures, functions, and evolution. J Struct Biol. 2001; 134(2-3):117-31.
Arai K, Uchiyama N, Wada T. Synthesis and properties of novel 2'-O-alkoxymethyl-modified nucleic acids. Bioorg Med Chem Lett. 2011; 21(21):6285-7.
Béroud C, Tuffery-Giraud S, Matsuo M, Hamroun D, Humbertclaude V, Monnier N, Moizard MP, Voelckel MA, Calemard LM, Boisseau P, Blayau M, Philippe C, Cossée M, Pagès M, Rivier F, Danos O, Garcia L, Claustres M. Multiexon skipping leading to an artificial DMD protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients with Duchenne muscular dystrophy. Hum Mutat. 2007; Feb;28(2):196-202.
Bomont P et al., Nat Genet 2000; 26(3):370-374.
Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 2002; 3(4):285-98.
Cartegni L, Wang J, Zhu Z, Zhang MQ, Krainer AR. ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res 2003; 31(13):3568-71.
Chabriat H et al., Lancet Neurol 2009; 8(7):643-653.
Cheng AJ and Van Dyke MW. Oligodeoxyribonucleotide length and sequence effects on intramolecular and intermolecular G-quartet formation. Gene. 1997; 197(l-2):253-60.
Cirak S, Arechavala-Gomeza V, Guglieri M, Feng L, Torelli S, Anthony K, Abbs S, Garralda ME, Bourke J, Wells DJ, Dickson G, Wood MJ, Wilton SD, Straub V, Kole R, Shrewsbury SB, Sewry C, Morgan JE, Bushby K, Muntoni F. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 2011; 378(9791):595-605.
Cirak S et al., Brain 2010; 133(Pt 7):2123-2135.
Diebold SS, Massacrier C, Akira S, Paturel C, Morel Y, Reis e Sousa C. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. Eur J Immunol; 2006; 36(12):3256-67.
Dhanoa BS et al., Hum Genomics 2013; 7(1):13.
Dorn A, Kippenberger S. Clinical application of CpG-, non-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Curr Opin Mol Ther. 2008; 10(1):10-20.
Dubosq-Bidot L et al., Eur Heart J 2009; 30(17):2128-2136.
Ehmsen J. et al., J. Cell Sci. 2002, 115 (Pt14):2801-2803.
Fiorillo C et al., Neurogenetics 2012; 13(3):195-203.
Friedman JS et al., Am J Hum genet 2009; 84(6):792-800.
Goemans NM, Tulinius M, van den Akker JT, Burm BE, Ekhart PF, Heuvelmans N, Holling T, Janson AA, Platenburg GJ, Sipkens JA, Sitsen JM, Aartsma-Rus A, van Ommen GJ, Buyse G, Darin N, Verschuuren JJ, Campion GV, de Kimpe SJ, van Deutekom JC. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 2011; 364(16):1513-22.
Goyenvalle A, Wright J, Babbs A, Wilkins V, Garcia L, Davies KE. Engineering Multiple U7snRNA Constructs to Induce Single and Multiexon-skipping for Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. 2012 Jun; 20(6):1212-21.
Heemskerk H, de Winter C, van Kuik P, Heuvelmans N, Sabatelli P, Rimessi P, Braghetta P, van Ommen GJ, de Kimpe S, Ferlini A, Aartsma-Rus A, van Deutekom JC. Preclinical PK and PD studies on 2'-O-methyl-phosphorothioate RNA antisense oligonucleotides in the mdx mouse model. Mol Ther. 2010; 18(6):1210-7.
Heneka MT et al., Nature2013; 493(7434):674-678.
Hodgetts S, Radley H, Davies M, Grounds MD. Reduced necrosis of dystrophic muscle by depletion of host neutrophils, or blocking TNFalpha function with Etanercept in mdx mice. Neuromuscul Disord. 2006; 16(9-10):591-602.
Hovnanian A, Cell Tissue Res 2013; 351(2):289-300.
Huang JY et al., Hum Reprod 2013; 28(4):1127-1134.
Knauf F et al., Kidney Int 2013; doi:10.1038/ki.2013.207.
Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, Koretzky GA, Klinman DM. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature. 1995; 374(6522):546-9.
Krieg, AM. The role of CpG motifs in innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 2000; 12:35-43.
Kumar L, Pharm. Technol. 2008, 3, 128.
Louis-Dit-Picard H et al., Nat Genet 2012; 44(4):456-460.
Macaya RF, Waldron JA, Beutel BA, Gao H, Joesten ME, Yang M, Patel R, Bertelsen AH, Cook AF. Structural and functional characterization of potent antithrombotic oligonucleotides possessing both quadruplex and duplex motifs. Biochemistry. 1995; 34(13):4478-92.
Manzur AY, Kuntzer T, Pike M, Swan A. Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst Rev. 2008; (1):CD003725.
Monaco A.P., et al., Genomics 1988; 2:90-95.
Peacock H, Fucini RV, Jayalath P, Ibarra-Soza JM, Haringsma HJ, Flanagan WM, Willingham A, Beal PA. Nucleobase and ribose modifications control immunostimulation by a microRNA-122-mimetic RNA. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133(24):9200-3.
Mollie A et al., Hum Genet 2011; 129(6):641-654.
Moller RS et al., Epilepsia 2013; 54(2):256-264.
Noris P et al., Blood 2011; 117(24):6673-6680.
Popovic PJ, DeMarco R, Lotze MT, Winikoff SE, Bartlett DL, Krieg AM, Guo ZS, Brown CK, Tracey KJ, Zeh HJ 3rd. High mobility group B1 protein suppresses the human plasmacytoid dendritic cell response to TLR9 agonists. J of Immunol 2006; 177:8701-8707.
Puente XS et al., Nature 2011; 475(7354):101-105.
Raciti GA et al., Diabetologia 2011; 54(11):2911-2922.
Rantamaki T et al., Am J Hum Genet 1999; 64(4):993-1001.
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
Sirmaci A et al., Am J Hum Genet 2011; 89(2):289-294.
Stuart HM et al., Am J Hum Genet 2013; 92(2):259-264.
Suzuki K, Doi T, Imanishi T, Kodama T, Tanaka T. Oligonucleotide aggregates bind to the macrophage scavenger receptor. Eur J Biochem. 1999; 260(3):855-60.
Uchida K et al., Immunology 2005; 116(1):53-63.
van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhuizen WS, Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, den Dunnen JT, Koop K, van der Kooi AJ, Goemans NM, de Kimpe SJ, Ekhart PF, Venneker EH, Platenburg GJ, Verschuuren JJ, van Ommen GJ. Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med. 2007; 357(26):2677-86.
van Vliet L, de Winter CL, van Deutekom JC, van Ommen GJ, Aartsma-Rus A. Assessment of the feasibility of exon 45-55 multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy. BMC Med Genet. 2008, Dec 1; 9:105.
Wagner, H., Bacterial CpG DNA activates immune cells to signal infectious danger Adv. Immunol. 1999; 73: 329-368.
Yokota T, Duddy W, Partridge T. Optimizing exon skipping therapies for DMD. Acta Myol. 2007; 26(3):179-84.
Yokota T, Hoffman E, Takeda S. Antisense oligo-mediated multiple exon skipping in a dog model of duchenne muscular dystrophy. Methods Mol Biol. 2011; 709:299-312.
Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003; 31(13), 3406-3415.