Способ моделирования ювенильного эндометриоза с использованием ксенографтной модели
METHOD FOR MODELING JUVENILE ENDOMETRIOSIS USING A XENOGRAFT MODEL

Изобретение относится к области биотехнологии и связано с моделированием у лабораторных животных тяжелого инвалидизирующего заболевания - ювенильного эндометриоза. Данное изобретение может быть использовано для исследования эффективности лекарственных препаратов или методов лечения ювенильного эндометриоза.
Уровень техники
Эндометриоз - это воспалительное эстроген-зависимое заболевание, при котором эндометриальные строма и железы обнаруживаются вне слоя эндометрия. Данной патологией страдают примерно около 10% женщин репродуктивного возраста (Lin et al., 2018). При этом сейчас эндометриоз наиболее частая причина хронической боли в области таза у подростков, не поддающейся медикаментозному лечению (Stavroulis et al., 2006).
На данный момент эндометриоз все чаще поражает юных и молодых женщин и возрастанием частоты распространения форм с повреждением матки, мочевого пузыря, кишечника и других органов брюшной полости (Matalliotakis et al., 2017). Сообщалось, что распространенность эндометриоза у подростков с хронической тазовой болью составляет от 17 до 73% (Stavroulis et al., 2006).
Подростковый эндометриоз осложняется тем фактом, что значительно задержана диагностика заболевания по сравнению с женщинами в возрасте более 30 лет, а именно 12,1 год может составлять задержка у девушек до 19 лет, а у женщин после 30 лет - 3,3 года (Stavroulis et al., 2006). Возможной причиной такой задержки может являться то, что "золотым стандартом" в диагностике эндометриоза является лапароскопическая операция с комбинированным гистопатологическим исследованием (Yeung Jr, Gupta and Gieg, 2017). При этом в ряде случаев подросткового эндометриоза наблюдается легкая форма заболевания, при которой у значительной части юных пациенток отсутствует явная патология на момент лапароскопической операции (Stavroulis et al., 2006).
Основными симптомами эндометриоза у подростков являются хроническая тазовая боли и дисменорея, к другим, более редким симптомам, относятся нерегулярные менструации, диспареунии, кишечные спазмы, боли в мочевом пузыре, головные боли, депрессия и др. (Yeung Jr, Gupta and Gieg, 2017). Симптомы эндометриоза у подростков отличаются от симптомов у взрослых женщин: у подростков с эндометриозом наблюдается ациклическая боль, в то время как для взрослых женщин с эндометриозом характерен циклический паттерн болевых ощущений (Yeung Jr, Gupta and Gieg, 2017). Также сообщалось, что хроническая тазовая боль с началом во время менархе является фактором риска развития тяжелой формы эндометриоза в подростковом возрасте (Brosens, Gordts and Benagiano, 2013).
Отличие между подростковым эндометриозом и эндометриозом у взрослых женщин наблюдается и при проведении биопсии, а именно отличие в морфологии очагов: подростковый эндометриоз отличается высоким процентом тонких, прозрачных или красных имплантов (Brosens, Gordts and Benagiano, 2013).
Основной теорией возникновения эндометриоза вообще является теория ретроградной менструации, связанная с забрасыванием фрагментов эндометриальной ткани при менструации через маточные трубы в брюшную полость. При попадании в брюшную полость эти фрагменты могут прикрепляться к мезотелию брюшины и давать рост эндометриоидным гетеротопиям, к которым подрастают кровеносные сосуды. При эндометриозе происходит нарушение иммунной системы, это приводит к тому, что не происходит удаление имплантируемых фрагментов ткани (Chapron et al., 2019). Несмотря на то, что теория ретроградной менструации является основной теорией развития эндометриоза и у подростков, в последнее время выдвинуто предположение, о том, что неонатальное маточное кровотечение является фактором риска развития эндометриоза в подростковом периоде, так как оно может объяснить возникновение эндометриоза в пременархальный период. Исследование неонатального маточного кровотечения как причину возникновения подросткового эндометриоза является актуальным на данный момент направлением, в котором еще мало что известно (Dekker et al., 2021).
К настоящему времени существуют несколько стратегий терапии эндометриоза у подростков. При подозрении на эндометриоз или на начальных этапах заболевания терапию проводят оральными контрацептивами и анальгетиками. К сожалению, многие пациентки не реагируют на эту терапию. В связи с этим, альтернативным вариантом терапии являются терапия агонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) или лапароскопическая операция (Dessole, Melis and Angioni, 2012).
В одной из работ проводилось изучение состояния девочек-подростков с хронической тазовой болью, не поддающейся лечению. Девочкам была проведена лапароскопическая операция, в результате которой выявили, что у подростков имеют быть легкие, средние и тяжелые формы эндометриоза. При легких и средних формах у пациенток была дисменорея и диспареуния, а при тяжелых формах заболевания наблюдалось также поражение мочеполовых органов и органов ЖКТ. Все юные пациентки подверглись лапароскопическому иссечению поражений без осложнений. В результате, лапароскопическая операция оказалась эффективным способом лечения эндометриоза у всех исследуемых девочек-подростков, они отметили улучшение состояния и исчезновение симптомов, при этом терапия гормональными препаратами у этой группы пациенток оказалась полностью неэффективной (Stavroulis et al., 2006).
При этом терапия эндометриоза у подростков только хирургической операцией не считается высоко эффективной, так как показано, что молодой возраст является фактором риска рецидива эндометриоза после консервативной лапароскопической операции. В связи с этим, после хирургической операции рекомендуется прием препаратов для предотвращения возникновения рецидивов (Dessole, Melis and Angioni, 2012).
В частности, в одном из исследований было сообщено о случаях рецидива после эксцизионной операции у подростков. Частота таких рецидивов оказалась 55,6% в течение 1,7 года после операции. Подтверждением рецидива являлось обнаружение с помощью ультразвукового исследования (УЗИ) или симптомов, аналогичных предшествующему случаю заболевания, новых образований в тазовой области. При этом было показано отсутствие рецидивов при послеоперационной терапии агонистом гонадотропин-рилизинг-гормона. Таким образом агонист ГнРГ оказался эффективным средством, предотвращающем случаи рецидива эндометриоза после лапароскопической операции (Yang et al., 2012).
Таким образом, на сегодняшний день подростковый эндометриоз следует рассматривать как особую форму данной патологии с ее собственными факторами риска, патофизиологией и с особенностями выраженной клинической картины и прогрессивным течением (Brosens, Gordts and Benagiano, 2013).
Несмотря на имеющееся уже большинство успешных лапароскопических операций по иссечению очагов эндометриоза, такая хирургическая операция может быть слишком обширной для данной возрастной категории, особенно опасна операция при тяжелой форме эндометриоза в связи с риском повреждения других органов тазовой и брюшной полости (Stavroulis et al., 2006).
В связи с этим требуется разработка новых малоинвазивных терапевтических методов ювенильного эндометриоза. Изучение механизмов и способов лечения данного заболевания требует разработки адекватной и воспроизводимой модели.
Исследование механизмов адгезии, инвазии эндометриальной ткани, ангиогенез в очагах, а также разработку новых терапевтических методов лучше проводить на животных моделях эндометриоза (Grüimmer, 2006). Мышь является привлекательным животным для моделирования эндометриоза благодаря своим небольшим размерам и низкой стоимости, что позволяет создать удачную тест-систему для проверки новых потенциальных методов лечения эндометриоза (Greaves et al., 2014). На данный момент существует большое разнообразие in vivo моделей эндометриоза, полученных на мышах. Эти модели подразделяются на гомологичные и гетерологичные.
Для гомологичных моделей характерна трансплантация эндометрия таким же или сингенным иммунокомпетентным животным. В связи с тем, что у мышей нет менструации, а как следствие, нет и ретроградной менструации, эндометриоз у них можно индуцировать трансплантацией ткани эндометрия на эктопические участки животного. Причем трансплантируют чаще всего эндометрий вместе со слоем миометрия, в связи с тем, что эти слои сложно разделить у мелких грызунов. Миометрий может повлиять на рост поражений, что не коррелируется с развитием заболевания у человека (Grümmer, 2006). При этом формирующиеся у мыши поражения эндометриоза по морфологии и гистологии сходны с очагами эндометриоза, выявляемые у женщин. С помощью гистологического анализа показано, что поражения у мышей, также, как и пациенток, содержат эндометриальные железы и строму. Через три дня после индукции морфология очагов геморрагическая, а после двух-четырех недель - очаги эндометриоза имеют морфологию кист, заполненных жидкостью и окруженные спайками (Pelch, Sharpe-timms and Nagel, 2012).
Более приближенной к человеческой физиологии, а именно имитации ретроградной менструации при создании мышиной модели, является методика, при которой проводят искусственную децидуализацию эндометрия, рассечение рога матки, соскабливание эндометрия со слоя миометрия, суспендирование ткани эндометрия и инъецирование суспензией реципиентных животных. В результате такого варианта модели в мышах формируются поражения, также морфологически и гистологически сходны с поражениями у женщин (Greaves et al., 2014).
Несмотря на ограничения гомологичных моделей на мышах, связанных с различной физиологий репродуктивной системы мышей и человека, достоинство этих моделей является то, что можно продолжительно исследовать развитие поражений эндометриоза, так как трансплантированный эндометрий не вызывает отторжения. В связи с этим такие модели являются отличными тест-системами для продолжительного исследования действия иммуномодулирующих и противовоспалительных препаратов на эндометриоз (Grümmer, 2006).
К гетерологичным моделям относятся модели, которые индуцируются ксенотрансплантацией фрагментов эндометрия человека внутрибрюшинно или подкожно иммунодефицитным мышам (Grümmer, 2006). Данные модели необходимы с целью выяснения более точной этиологии заболевания, учитывая особенности эндометриальной ткани человека, и создания методов персонализированной терапии и апробации их на человеческом материале до введения их в клинику.
Ограничением данных моделей является то, что для их создания необходимы иммунодефицитные животные, так как в иммунокомпетентных будет происходить отторжение вводимого человеческого материала (Greaves et al., 2014).
В мировой науке выведено уже много линий иммунодефицитных мышей, при этом для создания ксенографтных моделей популярными являются мыши линии Balb/c Nude и мыши линии Scid. Мыши линии Nude имеют мутацию в гене Foxnl, который участвует в формировании тимуса. Эти мыши бестимусные: у них снижен Т-зависимый ответ на антиген, при этом у них высоко активированные NK-клетки. В связи с этим такая мутация позволяет этим животным не отторгать ксенотрансплантат (Belizario, 2009).
Prkdc
Другим штаммом иммунодефицитных мышей являются мыши линии Scid. Scid - это тяжелый комбинированный иммунодефицит. Эти мыши обладают мутацией в Prkdc - ДНК-зависимой протеинкиназы, которая необходима для соединения негомологичных концов двуцепочечной ДНК. В связи с этим происходит нарушение V(D)J рекомбинации (перестройки В - и Т- клеточного рецептора), а также нарушается репарация двуцепочечных разрывов ДНК. У животных, гомозиготных по аллелю scid, поражены и В, и Т лимфоциты, что также делает этих мышей привлекательным реципиентом для ксенотрансплантации человеческого материала (Belizário, 2009).
Несмотря на привлекательность идеи создания ксенографтной модели на основе иммунодефицитных животных для изучения развития тканей человека и разработки таргетной терапии, данные модели также имеют свое ограничение. Это ограничение связано временными рамками исследования. В большинстве случаев культивирование эндометрия человека в иммунодефицитных мышах, при этом ткань должна сохраниться и остаться неповрежденной, не должно превышать 4 недель (Grümmer, 2006).
Технической задачей изобретения является создание адекватной воспроизводимой модели ювенильного эндометриоза. Техническим результатом изобретения является последовательно действий приводящая к формированию ювенильного эндометриоза у лабораторных животных.
Для решения данной проблемы предложен способ моделирования ювенильного эндометриоза с использованием ксенографтной модели характеризующийся тем, что в работе используют самок мыши линии Balb/c (nu/nu) весом 18-20 г., которым пришивают к брюшине со стороны брюшной полости фрагмент очага эндометриоза размером 2x2 мм, полученный от женщин раннего репродуктивного периода, после операции животному вводят подкожно 3 раза в неделю по 100 нг 17-бета эстрадиол, разведенный в касторовом масле, культивирование очага эндометриоза in vivo продолжают в течение двух недель, после чего модель пригодна для исследования методов лечения ювенильного эндометриоза.
Изобретение осуществляется следующим образом.
Пример 1. Моделирование эндометриоза
Забор ткани проводят в стерильных условиях. Хирургические манипуляции с животными проводят в ламинарных боксах, предназначенных для работы с животными, под ламинарным потоком стерильного воздуха.
В работе используют самок мыши линии Balb/c (nu/nu) весом 18-20 г. Животные содержатся в отдельном чистом помещении в индивидуально вентилируемых клетках с регулируемым микроклиматом (влажность воздуха 50-60%, температура 23 С) (AWTech, Италия). Животные имеют свободный доступ к воде и еде. Перед использованием клетки, вода и корм стерилизуются. В ходе экспериментальных работ животные подвергаются ежедневному осмотру.
Очаги эндометриоза женщин раннего репродуктивного возраста, полученные в результате плановых хирургических операций, помещают в холодную стерильную полную питательную среду DMEM / F-12, содержащую 50000 ед. пенициллина/ 50000 ед. стрептомицина.
Из операционной очаги в течение часа доставляют в лабораторию, где будет проводиться их ксенотрансплантация в иммунодефицитных бестимусных мышей линии Balb/c Nude. Очаги перемещают со средой в стерильные чашки Петри и измельчают до фрагментов размером 2×2 мм.
Мышь анестезируют путем введения раствора золетила с концентрацией 33,3 мг/мл (Virbac, Франция) - 40 мкл раствора на 20 г массы животного. Мышь располагают на операционном столике вентральной стороной вверх. Делают продольный разрез кожи и брюшины длиной 2 см по средней линии ниже грудной клетки.
Пришивают к брюшине со стороны брюшной полости фрагмент очага размером 2×2 мм и зашивают животное. После операции животному вводят подкожно 17-бета эстрадиол, разведенный в касторовом масле. Эстрадиол вводят 3 раза в неделю по 100 нг.
Культивирование ткани in vivo продолжается в течение двух недель. Затем мышь эвтанизируют передозировкой наркоза, вскрывают и забирают очаг эндометриоза для дальнейшего анализа.
Пример 2. Эффективность и воспроизводимость ксенографтной модели ювенильного эндометриоза
После двухнедельного культивирование очага эндометриоза in vivo на вскрытии обнаруживался неповрежденный пришитый фрагмент очага. Успешность трансплантации подтверждалась васкуляризацией очага в 80% случаев трансплантации: при визуальном осмотре к месту фиксации очага на брюшине тянулись проросшие сосуды. Таким образом, ксенографт не отторгался, а приживался и васкуляризировался.
Для верификации состава ткани и ее сохранности после двухнедельного культивирования in vivo проводился морфометрический анализ. Обзорный гистологический анализ подтвердил, что очаг состоит из живых клеток с сохраненной структурой и хорошо окрашенными ядрами.
Внутри пришитых очагов обнаружены стромальные и эпителиальные клетки: соединительная ткань, кровеносные сосуды, железы, гладкие миоциты. Плотность сосудов внутри очага по данным морфометрического анализа составила 30%. Гладкомышечная ткань встречалась лишь в тех очагах, которые исходно были удалены лапраскопически со стенки кишки пациента и составила 40% по данным морфометрии.
Для проверки воспроизводимости нашей модели были проведены повторные ксенотрансплантации с хроническим введением эстрадиола (n=30). Были получены идентичные результаты.
Данная модель является адекватной и легко-воспроизводимой in vivo моделью ювенильного эндометриоза, аналогов которой ранее не было предложено в литературе.
Список литературы
1. Belizário, J. Е. (2009) 'Immunodeficient Mouse Models: An Overview', pp. 79-85.
2. Brosens, I., Gordts, S. and Benagiano, G. (2013) 'Endometriosis in adolescents is a hidden, progressive and severe disease that deserves attention, not just compassion', 28(8), pp.2026-2031. doi: 10.1093/humrep/det243.
3. Chapron, C. et al. (2019) 'Rethinking mechanisms, diagnosis and management of endometriosis', Nature Reviews Endocrinology. Springer US, 15(11), pp.666-682. doi: 10.1038/s41574-019-0245-z.
4. Dekker, J. et al. (2021) 'Neonatal Uterine Bleedings: An Ignored Sign but a Possible Cause of Early-Onset Endometriosis - A Systematic Review', pp.6-16. doi: 10.1159/000512663.
5. Dessole, M., Melis, G.B. and Angioni, S. (2012) 'Endometriosis in Adolescence', 2012, pp.4-7. doi: 10.1155/2012/869191.
6. Greaves, E. et al. (2014) 'A Novel Mouse Model of Endometriosis Mimics Human Phenotype and Reveals Insights into the In fl ammatory Contribution of Shed Endometrium', 184(7), pp.1-10. doi: 10.1016/j.ajpath.2014.03.011.
7. Grümmer, R. (2006) 'Animal models in endometriosis research', 12(5), pp.641-649. doi: 10.1093/humupd/dml026.
8. Lin, Y. et al. (2018) 'Chronic Niche Inflammation in Endometriosis-Associated Infertility: Current Understanding and Future Therapeutic Strategies', pp.1-33. doi: 10.3390/ijmsl9082385.
9. Matalliotakis, M. et al. (2017) 'Endometriosis in adolescents and young girls: Report a series of 85 cases', Journal of Pediatric and Adolescent Gynecology. Elsevier Inc. doi: 10.1016/j.jpag.2017.05.007.
10. Pelch, K.E., Sharpe-timms, K.L. and Nagel, S. C. (2012) 'Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue', (January), pp.1-8. doi: 10.3791/3396.
11. Stavroulis, A. I. et al. (2006) 'Laparoscopic treatment of endometriosis in teenagers', 125, pp.248-250. doi: 10.1016/j.ejogrb.2005.08.024.
12. Yang, Y. et al. (2012) 'Original Study Adolescent Endometriosis in China: A Retrospective Analysis of 63 Cases', Journal of Pediatric and Adolescent Gynecology. Elsevier Inc., 25(5), pp.295-299. doi: 10.1016/j.jpag.2012.03.002.
13. Yeung Jr, P., Gupta, S. and Gieg, S. (2017) 'Endometriosis in Adolescents: A Systematic Review', (June), doi: 10.5301/je.5000264.