Молекулярно-генетическая характеристика микрофлоры полости рта при пародонтите

Вестник Челябинского государственного университета. 2013. № 7 (298).

Биология. Вып. 2. С. 70-71.

Э. Р. Тамарова, Н. Р. Масагутова

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА ПРИ ПАРОДОНТИТЕ

Изучен видовой состав основных пародонтоттогенных бактерий (P. gingivalis, T. denticola, S. oralis,

S. sanguis, S. mutans, S. salivarius, S. sobrinus, S. macacae) с использованием метода полимеразной цепной реакции. Показано, что проведение молекулярно-генетических исследований у больных пародонтитом позволяет обосновать этиологический диагноз заболевания, назначить адекватную антибактериальную терапию.

Ключевые слова: пародонтопатогенная микрофлора, полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Введение. Современный уровень научных знаний об этиопатогенезе пародонтита определяет пародонтальную микрофлору в качестве доминирующего фактора. Среди них наиболее часто встречаются Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius и Streptococcus macacae, которые считаются «маркерными» микроорганизмами пародонтита. Особенности их метаболизма и патогенность могут оказывать влияние на течение воспалительного процесса [1; 2].

В последние годы в клиническую диагностику микрофлоры полости рта внедрён ряд высокоспецифичных и высокочувствительных методов, среди которых наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако в отечественной научной литературе исследования, в которых этот метод применялся для диагностики микрофлоры при пародонтите, немногочисленны [3-5].

Цель. Детекция патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, ассоциированных с пародонтитом, методом ПЦР

Материал и методы. Обследованы 60 пациентов (26 мужчин и 34 женщины) в возрасте от 18 до 72 лет с пародонтитом средней степени тяжести, не имевшие тяжёлой фоновой патологии внутренних органов и систем, которая могла бы оказать заметное влияние на течение патологического процесса в пародонте. Из них 41 (68,3 %) человек обратился за помощью впервые, а остальные 19 (31,7 %) человек ранее лечились, за помощью обращались 1 раз в год.

Исследовались материалы кармана, которые отбирали из наиболее глубоких участков с помощью стерильных бумажных эндодонтиче-ских штифтов (размер № 25) и затем помещали в пробирку с физиологическим раствором.

Одновременно в другую пробирку собирали слюну. Полученные образцы транспортировали в лабораторию в охлаждённом состоянии.

ДНК основных представителей пародонто-патогенной микрофлоры выявляли методом ПЦР. ДНК выделяли с использованием реагента «Челикс» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) согласно прилагаемой инструкции. Амплификацию ДНК пародонтопатогенных микробов (P. gingivalis, T. denticola, S. oralis, S. sanguis, S. mutans, S. salivarius, S. sobrinus, S. macacae) проводили в термоциклере Терцик МС-2 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с использованием реагентов ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия) согласно инструкции производителя. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 2,0 %-ном горизонтальном агарозном геле, окрашивали бромидом этидия и визуализировали при освещении ультрафиолетом в фотодокументацион-ной системе.

Результаты и обсуждение. Для достижения поставленной цели был произведён подбор оли-гонуклеотидных праймеров к специфическим консервативным последовательностям ДНК основных бактерий, ассоциированных с пародонтитом,— генам 16S рРНК, а также генам анти-биотикоустойчивости, депонированных в международном банке нуклеотидных последовательностей GenBank. Сравнительный множественный анализ найденных последовательностей проводили с помощью программы MegAlign. При подборе праймеров использовали программу PrimerSelect из пакета программ Lasergene (DNAStar, США).

В содержимом пародонтального кармана при пародонтите обнаружены все исследованные микроорганизмы. Наиболее распространены были бактерии Streptococcus mutans, которые были выявлены у 48 (80,0 %) из 60 обследованных больных. Следует отметить высокую представлен-

ность Streptococcus sanguis и Streptococcus oralis, частота которых превысила 50 %: 53,3 и 51,7 % соответственно. Остальные микроорганизмы встречались заметно реже. Так, Porphyromonas gingivalis наблюдалась в 21 (35,0 %) случае, Treponema denticola — в 15 (25,0 %) случаях, Streptococcus sobrinus - в 13 (21,7 %) случаях, а частота Streptococcus salivarius и Streptococcus macacae была равна 15,0 % (9 больных).

В образцах слюны больных пародонтитом сохранялась подобная тенденция по содержанию микроорганизмов. Как и в содержимом пародон-тального кармана, максимальная представленность обнаружена для Streptococcus mutans (51 человек, 85,0 %). Доля больных с Streptococcus sanguis и Streptococcus oralis составила 39 (65,0 %) человек и 37 (61,7 %) человек соответственно. Обращает на себя внимание статистически недостоверное увеличение частоты встречаемости в слюне бактерий Streptococcus salivarius и Streptococcus sobrinus по сравнению с материалом пародонтального кармана зубов — соответственно 28 (46,7 %) и 25 (41,7 %).

У пациентов с пародонтитом средней степени тяжести в исследованных биотопах полости рта наблюдались сочетания нескольких видов бактерий. Наиболее часто встречающийся состав сообщества включал S. mutans, S. sanguis, S. oralis — у 10 (16,7 %) человек. Второе место (9 человек, 15,0 %) разделили два сообщества, в состав которых входили: 1) P. gingivalis, T. denticola, S. mutans, S. sanguis, S .oralis и 2) P. gingivalis, S. mutans, S. sanguis, S. oralis, S. sobrinus. Сочетание бактерий T. denticola, S. mutans, S. sanguis, S. oralis, S. sobrinus установлено у 7 (11,7 %) пациентов, тогда как частота других сообществ микроорганизмов не превышала 5 %.

При анализе антибиотикоустойчивости бактерий, ассоциированных с пародонтитом, получены следующие результаты. Среди больных (21 человек), у которых был выявлен P. gingivalis, устойчивость к бацитрацину была обнаружена в 3 (14,3 %) случаях, к нитромидазолу — в 12 (57,1 %) случаях, к ванкомицину — в 11 (52,4 %) случаях. У 51 больного с S. mutans данный микроорганизм оказался устойчив к линкомицину

в 6 (11,8 %) случаях, к Р-лактамным антибиотикам — в 7 (13,7 %) случаях. Устойчивость S. sanguis к блеомицину установлена у 10 из 39 больных (25,6 %), S. salivarius к линкомицину — у 7 из 39 (17,9 %) больных, к ванкомицину — у 8 (28,6 %) больных. Устойчивость S. oralis к тетрациклину наблюдалась в 12 (32,4 %) из 37 случаев выявления данного микроорганизма при пародонтите.

Выводы и заключение. Таким образом, исследование ДНК микроорганизмов, колонизирующих экосистему при пародонтите (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus macacae, Streptococcus sobrinus), выделенной из образцов клинического материала, показало, что подобранные нами праймеры высокоспецифичны и чувствительны, что является важным фактором при лабораторной диагностике пародонтита. Проведение молекулярно-генетических исследований у больных пародонтитом позволяет обосновать этиологический диагноз заболевания, назначить адекватную антибактериальную терапию, направленную на освобождение пациента от возбудителей.

Список литературы

1. Грудянов, А. И. Профилактика воспалительных заболеваний пародонта / А. И. Грудянов, В. В. Овчинникова. М. : МИА, 2007. 80 с.

2. Николаева, Е. Н. Применение новой тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, в пародонтологии / Е. Н. Николаева, В. Н. Царёв, С. Н. Щербо [и др.] // Клинич. стоматология. 2004. Т. 63, № 4. С. 63-67.

3. Царёв, В. Н. Антимикробная терапия в стоматологии / В. Н. Царёв, Р. В. Ушаков М. : Мед. информ. агентство, 2004. 143 с.

4. Albander, J. M. Serum Ig G level to P. Gingivalis in healthy and early-onset periodontitis individuals / J. M. Albander, E. De Nardin // J. Dent. Res. 1999. Vol. 78. P. 250-255.

5. Haffajee, A. D. Microbiological etiological agents of destructive periodontal diseases / A. D. Haffajee, S. S. Socransky // Periodontology. 2000. 1994. Vol. 5, № 1. P. 78-111.