СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ, РОЖДЕННЫХ ОТ МАТЕРЕЙ С ТАБАКОКУРЕНИЕМ
METHOD FOR CENTRAL NERVOUS SYSTEM HYPOXIC DAMAGE DIAGNOSIS FOR CHILDREN BORN TO SMOKING MOTHERS

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству-гинекологии и лабораторным методам исследования, может быть использовано для диагностики гипоксического поражения центральной нервной системы у детей, рожденных от матерей с табакокурением.
Никотин и компоненты табачного дыма, поступая в организм, воздействуют не только на слизистую бронхов и легкие. Органы дыхания беременной являются входными воротами для проникновения токсических веществ в кровоток матери с последующей их миграцией, воздействием на все органы и ткани. Неблагоприятному влиянию подвержены нервная (центральная, периферическая), сердечно-сосудистая и эндокринная системы, надпочечники, почки, печень и половые железы. Учитывая универсальность сосудистой реакции на токсины компонентов табачного дыма, можно предположить и наличие токсического воздействия на сосуды плаценты. Описанные в литературе изменения в плаценте курящих женщин в виде ангиопатии спиральных артерий, повышенной вязкости крови, редукции кровотока в умбиликальных артериях, повышенной частоты инфарктов и отслойки плаценты - один из ярких примеров системной сосудистой токсичности табака [Никифоровский Н.К. Курение как фактор риска возникновения фетоплацентарной недостаточности // АГ-инфо. - №1. - 2009. - С. 41-44].
Снопковым В.Н. было выявлено прогностическое значение курения матери во время беременности в развитии преэклампсии, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты в родах, невынашивания беременности, перинатального поражения нервной системы и синдрома задержки развития плода, что позволило выделить курение как фактор неблагоприятного прогноза для развития плода и показателей здоровья новорожденного ребенка [Снопков В.Н. Прогноз развития нарушения периода ранней неонатальной адаптации у детей от матерей с табакозависимостью // Научные ведомости. Серия Медицина. Фармация. - 2013. - №11. - Выпуск 22/1].
Гипоксическое поражение центральной нервной системы занимает одно из ведущих мест в структуре причин высокой летальности и инвалидизации новорожденных детей. Так, удельный вес гипоксического поражения центральной нервной системы варьирует от 20 до 50% в структуре причин перинатальной смертности, достигая 60-70% в структуре причин детской инвалидности [Барашнев Ю.И. Гипоксическая энцефалопатия: гипотезы патогенеза церебральных расстройств и поиск методов лекарственной терапии // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - №1. - 2002 - С. 6-9].
Поэтому крайне важно найти способы диагностики гипоксического поражения центральной нервной системы у детей, рожденных от матерей с табакокурением, которые позволили бы улучшить течение периода адаптации.
Применение во время беременности ультразвукового исследования, допплерометрии и кардиотокографии позволяет лишь предположить наличие у беременной гипоксического состояния плода.
Известен способ прогнозирования состояния новорожденных, основанный на оценке данных анамнеза и клинического осмотра [Патент RU 2247990 C1, МПК G01N 33/53. Способ прогнозирования нарушения адаптаций у детей в раннем неонатальном периоде].
Однако данные способы прогноза имеют определенный субъективизм, а их точность не превышает 82-89%. Кроме этого, как указывают сами авторы, результат прогнозирования некоторого числа наблюдений (до 8-10%) может носить неопределенный характер [Патент RU 2247990 C1, МПК G01N 33/53. Способ прогнозирования нарушения адаптаций у детей в раннем неонатальном периоде].
Исследование непосредственно биологических жидкостей (околоплодные воды, пуповинная кровь) от патологически измененного органа значительно повышает точность диагностики гипоксического состояния плода и гипоксического поражения центральной нервной системы у детей в неонатальном периоде, что позволит своевременно назначить дальнейшее обследование и адекватное лечение.
Так, например, было проведено исследование, направленное на прогнозирование состояния новорожденного, основанное на определении общего количества иммуноглобулинов класса M(IgM), A(IgA), G(IgG) к T. gondii и St. aureus в пуповинной крови [Яцык Г.В., Хан Э.Р., Сенцова Т.Б. Характеристика гуморального иммунитета у здоровых новорожденных детей // Педиатрия. - 1996. - №1. - С. 6-8].
Существенным недостатком указанного способа является его низкая точность, так как уровень иммуноглобулинов к антигенам T. gondii и St. aureus не в полной мере отражает состояние иммунитета ребенка [Патент RU 2247990 C1 от 16.06.2003. Способ прогнозирования нарушения адаптаций у детей в раннем неонатальном периоде].
Существует способ прогнозирования нарушений гемоликвородинамики у новорожденных в раннем периоде адаптации, основанный на определении концентрации фактора некроза опухолей альфа (ФНО) в пуповинной крови [Таболин В.А., Ковальчук Л.В., Володин Н.Н., Павлюк А.С. Определение концентраций интерлейкина-1- и фактора некроза опухолей - в сыворотке пуповинной крови // Педиатрия. - 1993. - №5. - С. 17-21].
Недостатком данного способа является невозможность в целом прогнозировать течение раннего неонатального периода. Способ не учитывает резервов адаптационных возможностей иммунитета новорожденного, который может быть оценен по уровню иммуноглобулинов [Патент RU 2247990 C1, МПК G01N 33/53. Способ прогнозирования нарушения адаптаций у детей в раннем неонатальном периоде].
Существует способ прогнозирования состояния новорожденного, основанный на определении в пуповинной крови уровня фактора некроза опухолей альфа и иммуноглобулина. При оценке указанных факторов и их повышении прогнозировали нарушение адаптации у детей в раннем неонатальном периоде [Патент RU 2247990 C1 от 16.06.2003, МПК G01N 33/53. Способ прогнозирования нарушения адаптаций у детей в раннем неонатальном периоде].
Недостатками данного способа являются:
- для диагностики гипоксического поражения центральной нервной системы у детей недостаточно использовать определение уровня иммуноглобулина G2 и фактора некроза опухоли -α;
- уровень фактора некроза опухоли -α не отражает уровень провоспалительных процессов;
- повышение фактора некроза опухоли -α может быть связано с различными процессами в организме ребенка, а не только с гипоксическим поражением нервной системы;
- одновременное определение уровня фактора некроза опухоли -α и иммуноглобулина G2 не позволяет с высокой достоверностью прогнозировать степень риска возникновения гипоксического поражения центральной нервной системы.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ исследования в пуповинной крови уровня тиреотропного гормона, дигидроэпиандростерона-сульфата, эстрадиола и исследования липидного обмена у детей, рожденных от матерей с табакокурением. Было доказано, что для детей от курящих матерей характерны нарушения неонатальной адаптации. Наиболее частыми формами расстройств неонатальной адаптации являются нарушения билирубинового и липидного обменов, токсико-метаболической энцефалопатии, задержки внутриутробного развития плода [Бочкова Л.Г. Табачный синдром новорожденного // Педиатрия. Саратовский научно-медицинский журнал. - №4. - 2008. - С. 64-67].
Недостатком данного способа является невозможность подтверждения связи гипоксического поражения центральной нервной системы с уровнем тиреотропного гормона, дигидроэпиандростерона-сульфата и эстрадиола.
Предлагаемое изобретение направлено на повышение точности способа диагностики гипоксического поражения центральной нервной системы у детей, рожденных от матерей с табакокурением.
Технический результат изобретения достигается тем, что методом иммуноферментного анализа в сыворотке пуповинной крови новорожденных определяют количественное содержание гипоксией индуцированного фактора - 2α и при его концентрации 0,04 нг/мл и выше диагностируют гипоксическое поражение центральной нервной системы.
Большим достижением в биологии и физиологии последнего десятилетия явилась расшифровка молекулярного механизма поддержания гомеостаза кислорода. Основой этого механизма являются гипоксией индуцированные факторы (hypoxia inductor factors - HIF's): HIF-1 и HIF-2 [Левченко O.C., Новиков B.E. Индукторы регулярного фактора адаптации к гипоксии // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. - 2014. - №2. - С. 134-144].
Являясь ключевыми медиаторами клеточного гомеостаза кислорода, гипоксией индуцированные факторы HIF-1 и HIF-2 контролируют передачу кислорода тканям и адаптацию к кислородному истощению.
Исследования на человеке также продемонстрировали, что гипоксией индуцированный фактор играет главную роль в системном ответе на гипоксию, и его действие можно проследить в каждой реакции, в результате которой высвобождается кислород [Appelhoff R.Y., Tian Y.M., Raval R.R. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD 1, PHD 2 and PHD 3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J. Biol. Chem. 2004; 279: 38458-38465].
Семейство HIF состоит из трех стабилизирующих гипоксию факторов: HIF-1, HIF-2 и HIF-3, реагирующих на разный уровень кислорода и обладающих разной временной реакцией. Гипоксией индуцированный фактор связывается с элементами ответа на гипоксию в промоторах и тем самым регулирует более 200 генов, включая гены белков, участвующих в процессе ангиогенеза, осуществляющих вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз.
Экспрессия гипоксией индуцированного фактора - 2α определяется в эндотелиальных клетках сосудов, клетках, продуцирующих катехоламин, клетках почек и легких в период эмбриогенеза, в опухоль-ассоциированных макрофагах.
В настоящее время считается, что гипоксией индуцированный фактор - 2α более специфичен для эндотелия сосудов.
Новизна изобретения заключается в том, что впервые предлагается способ диагностики гипоксического поражения центральной нервной системы у детей, рожденных от матерей с табакокурением, методом количественного определения содержания гипоксией индуцированного фактора - 2α в пуповинной крови. Ранее указанное исследование у рожениц с табакокурением не проводились.
Способ осуществляют следующим образом.
Сразу после рождения у новорожденного собирали пуповинную кровь в количестве 1 мл и инкубировали ее в течение 2 часов при комнатной температуре, затем центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 20 минут. Далее сыворотку пуповинной крови аликвотировали и хранили при температуре -20°С. Непосредственно перед проведением анализа сыворотку крови размораживали при комнатной температуре (18-25°С) и в отделившейся сыворотке определяли уровень гипоксией индуцированного фактора - 2α с помощью иммуноферментного набора для количественного определения in vitro (Hypoxia Inducible Factor 2 Alpha (HIF2α). Кат. №SED466Hu, версия 11 от 2013 г. Cloud-Clone Corporation. Human HIF2a ELISA Kit).
Порядок проведения иммуноферментного анализа выполнялся согласно прилагаемым инструкциям и состоял в следующем.
В подготовленные лунки вносили по 100 мкл каждого разведения стандарта. Далее планшеты инкубировали в течение 120 минут при температуре +37°С. Затем вносили по 100 мкл рабочего раствора детектирующего реагента А в каждую лунку. Планшет закрывали и инкубировали в течение 60 минут при температуре +37°С. Далее раствор из лунок аспирировался и в них вносили по 350 мкл готового буфера для промывок и оставляли на 1-2 минуты. Содержимое лунок удаляли путем встряхивания из перевернутого планшета. Процедуру повторяли три раза.
Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл рабочего раствора детектирующего реагента В. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при температуре +37°С. Вышеописанную процедуру промывания проводили 5 раз. Далее в лунки вносили по 90 мкл субстратного раствора тетраметилбензидина (ТМБ), закрывали новой крышкой. Инкубировали в защищенном от света месте при температуре +37°С в течение 15-25 минут (но не более 30). При добавлении раствора субстрата цвет жидкости менялся на голубой.
Далее во все лунки планшета вносили по 50 мкл стоп-раствора. При этом цвет в лунках менялся на желтый. Затем производили измерения с помощью микропланшетного ридера при длине волны 450 нм.
Предлагаемый способ был успешно апробирован в родильном отделении областного перинатального центра Александро-Мариинской областной клинической больницы (ОПЦ ГБУЗ АМОКБ) г. Астрахани в 2015 году.
Обследовано 90 новорожденных. Контрольную группу составили 30 (33,3%) новорожденных, рожденных от матерей с физиологическим течением беременности и не имевших экстрагенитальной патологии. Исследуемая группа (от матерей с табакокурением) - 30 новорожденных (33,3%) и 30 новорожденных (33,3%) от матерей с артериальной гипертензией составили группу сравнения.
В таблице №1 представлены значения гипоксией индуцированного фактора - 2α в пуповинной крови. В исследуемой группе по сравнению с группами контроля и сравнения отмечается увеличение значения гипоксией индуцированного фактора - 2α, что подтверждает факт перенесенного ребенком гипоксического поражения ЦНС.
Так, например, у новорожденных, рожденных от матерей с табакокурением, гипоксическое поражение центральной нервной системы было выявлено у 23 новорожденных (83,4%).
Ниже приводятся результаты апробации.
Пример №1.
Роженица Л., 30 лет, на 38 неделе беременности родила девочку весом 3200,0 ростом 48 см, окружностью головки 34 см. Оценка по шкале Апгар 8/8 баллов. Родильница курит с 18 лет до 10 сигарет в день. Ребенок родился в периоде физиологической адаптации.
Согласно заявленному способу методом иммуноферментного анализа было проведено определение содержания в сыворотке пуповинной крови гипоксией индуцированного фактора - 2α. Забор материала для определения гипоксией индуцированного фактора - 2α проводился согласно вышеописанной методике.
Концентрация гипоксией индуцированного фактора - 2α в пуповинной крови - 0,04 нг/мл. На третьи сутки жизни у ребенка возникла клиника гипоксического поражения центральной нервной системы, в фазе угнетения.
Заключение: гипоксическое поражение центральной нервной системы подтверждено. После проведенной коррекции ребенок вместе с матерью выписан домой на 5 сутки.
Пример №2.
Роженица Б., 25 лет, на 39 неделе беременности родила мальчика весом 2520, ростом 46 см, окружностью головки 33 см. Оценка по шкале Апгар 7/8 баллов. Родильница курит с 16 лет до 6 сигарет в день.
Ребенок родился с клиникой гипоксического поражения центральной нервной системы в фазе гипервозбудимости. Согласно заявленному способу было проведено количественное определение содержания в сыворотке пуповинной крови гипоксией индуцированного фактора - 2α методом иммуноферментного анализа. Забор материала для определения гипоксией индуцированного фактора - 2α проводился согласно вышеописанной методике.
Концентрация гипоксией индуцированного фактора - 2α в пуповинной крови - 0,05 нг/мл.
Заключение: гипоксическое поражение центральной нервной системы подтверждено. После проведенной коррекции ребенок вместе с матерью выписан домой на 6 сутки.
Предлагаемый способ диагностики гипоксического поражения центральной нервной системы у детей, рожденных от матерей с табакокурением, позволяет повысить точность диагностики гипоксического поражения нервной системы у новорожденных в короткие сроки и на малых объемах биологических жидкостей. Методика определения содержания гипоксией индуцированного фактора в крови технически проста, забор материала легко переносится роженицами.
Кроме того, предлагаемый способ способствует более ранней диагностике гипоксического поражения центральной нервной системы у детей, рожденных от матерей с табакокурением, и своевременной коррекции выявленных нарушений.