СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК
DNA SEPARATION PROCESS

Изобретение относится к молекулярной биологии и может найти применение при получении ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) из парафиновых блоков.
ДНК несет генетическую информацию о человеке и может использоваться для медико-биологических исследований, а также для установления родства, идентификации личности и других целей. Немаловажным значением ДНК является возможность изучения патогенеза заболеваний с использованием ДНК из гистологического материала лиц, длительно лечившихся по поводу этих заболеваний. Такой материал можно получить в патоморфологической лаборатории, где он хранится достаточно длительное время. Однако в процессе морфологического исследования материал проходит несколько этапов пробоподготовки, включая фиксацию в формалине и закрепление в парафине. Это приводит к разрывам в молекуле ДНК и, как следствие, к ее фрагментации. Кроме того, целостность ДНК нарушается и в ходе забора тканей (при помощи вапоризатора или электроножа), что значительно снижает количество ДНК, пригодной для полноценного использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В настоящее время предложено множество различных методов экстракции ДНК из парафиновых блоков от простейших (двухэтапных) до сложных (многоэтапных) и дорогих (коммерческие наборы). Все эти методы основаны на двух последовательных стадиях: депарафинизации и последующей очистки ДНК. Депарафинизация выполняется путем нагревания препарата из парафинового блока с последующим механическим удалением парафина или растворением его специальными реагентами. На втором этапе производится очистка ДНК от белков, жиров, углеводов и неорганических примесей.
По данным литературы наилучшие результаты, полученные таким методом, составляют 61,3% ДНК, пригодной для использования в реакции ПЦР. Это свидетельствует о том, что почти половина ДНК выпадает из исследования. В связи с тем, что в процессе пробоподготовки часть каждого препарата выделенной ДНК используется для измерения концентрации для оптимизации ПЦР, а также для ПЦР контролей - положительного, с геном актина человека, и отрицательного (в отсутствие праймеров) - для контроля неспецифической амплификации, выделенной из парафинового блока за одну экстракцию, ДНК может быть недостаточно для проведения всего комплекса запланированных с нею исследований. Тем более, что в ряде случаев возникает необходимость постановки подтверждающей ПЦР. В связи с этим приходится неоднократно повторять процедуру экстракции ДНК, однако при каждой следующей экстракции выход ДНК вновь будет не более 61%. В то же время следует отметить, что крайне важным фактором ПЦР-диагностики является проведение комплекса реакций ПЦР на основе ДНК, выделенной в процессе одной экстракции, т.к. количество и качество ДНК в процессе разных экстракций может существенно варьировать, а различные срезы одного и того же парафинового блока могут содержать различающийся гистологический материал. Таким образом, для повышения достоверности получаемых результатов с использованием ДНК необходима постановка всего комплекса диагностических реакций в едином эксперименте.
Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим материалом, описанный в работе NJ Coombs, AC Gough and JN Primrose Optimisation of DNA and RNA extraction from archival formalin-fixed tissue» (Nucleic Acids Research, Vol 27, Issue 16 e12-е12, Copyright © 1999 by Oxford University Press), взятый нами в качестве прототипа.
Этот способ заключается в том, что к срезу из парафинового блока с гистологическим материалом толщиной 20 мкм добавляют 100 мкл 0,5% водного раствора детергента Твин 20, нагревают полученную смесь при 90°С, добавляют к ней 50 мкг протеиназы К при температуре 55°С и выдерживают смесь при этой температуре в течение трех часов с дальнейшим нагреванием ее до 99°С, затем добавляют реагенты: 100 мкл 5% водного раствора Челекс 100 и водные растворы Трис и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и центрифугируют при 10500 об/мин в течение 15 мин, охлаждают, удаляют застывший слой парафина, остаток нагревают с хлороформом при температуре 45°С, затем центрифугируют при 10500 об/мин в течение 15 мин и супернатант используют для ПЦР.
Этот способ обеспечивает получение ДНК, пригодной для ПЦР, с выходом 61,3% (это означает, что из 163 срезов, взятых для выделения ДНК, лишь из 100 получена ДНК, пригодная для ПЦР). Таким образом, как и другие известные способы выделения ДНК из парафиновых блоков, способ-прототип обеспечивает получение ДНК с недостаточно высоким выходом. Кроме того, в конечном продукте содержатся следы побочных веществ, ингибирующих ПЦР.
Задача настоящего исследования состояла в повышении выхода качественной ДНК за счет оптимизации режимов ее выделения и дополнительной очистки.
Эта задача решена тем, что в известном способе выделения ДНК, включающем получение 20 мкм среза из парафинового блока с гистологическим материалом, добавление к нему 100 мкл 0.5% водного раствора Твина 20, нагревание полученной смеси при 90 С°, добавление к ней 50 мкг протеиназы К при температуре 55 С° и выдерживание смеси при этой температуре в течение 3-х часов с последующим нагреванием ее до 99 С°, добавление 100 мкл водного раствора Челекс 100 и водных растворов Трис и ЭДТА, центрифугирование и охлаждение смеси, удаление застывшего слоя, нагревание остатка с хлороформом при температуре 45 С° и центрифугирование, согласно изобретению, срез толщиной 20 мкм смешивают с 100 мкл 0,5% водного раствора Твин 20, полученную смесь нагревают при 90°С в течение 15 мин, затем добавляют 50 мкг протеиназы К при температуре 55°С и выдерживают в течение 3 часов при этой температуре, после этого добавляют реагенты: 100 мкл 5% водного раствора Челекс 100 и по 5 мкл водных растворов 0.5М Трис с РН 8,0 и 1М ЭДТА с РН 8,0 и нагревают до 100°С в течение 15 мин, полученный раствор центрифугируют в течение 15 мин, затем охлаждают при температуре -1°С в течение 5 мин, удаляют застывший слой парафина, остаток нагревают с хлороформом при температуре 45°С, затем центрифугируют в течение 15 мин, к 200 мкл супернатанта добавляют 5 мкл 5М водного раствора хлористого натрия и 500 мкл абсолютного этилового спирта, после чего смесь центрифугируют в течение 30 мин при температуре +4°С, верхний слой удаляют, к осадку добавляют 100 мкл 80% этилового спирта и вновь центрифугируют в течение 10 мин при температуре +4°С, верхний слой удаляют, нижний высушивают при температуре 65°С в течение 10 мин, затем растворяют его в 30 мкл бидистиллированной воды, и этот раствор, содержащий ДНК, используется для полимеразной цепной реакции.
Нагревание смеси с водным раствором Твин 20 в течение 14-15 мин, как нами показано, позволяет полностью расплавить и отделить парафин и за счет этого увеличить количество и качество ДНК. Этот температурный интервал найден нами опытным путем, причем дальнейшее увеличение времени нагревания не дает положительного результата, а сокращение его приводит к снижению выхода ДНК.
Нагревание смеси с протеиназой К в течение 14-15 мин после экспозиции при 55°С и добавления Челекс 100, Трис и ЭДТА при температуре 100°С также найдено нами опытным путем. Это, на наш взгляд, приводит к полноценной денатурации протеиназы К и связыванию оставшегося биологического материала (денатурированная протеиназа К, побочные продукты) с добавленными реагентами, повышая тем самым качество ДНК за счет удаления посторонних веществ, ингибирующих ПЦР. Дальнейшее увеличение временного режима и повышение температуры не давало положительного результата.
Что касается используемых водных растворов Трис и ЭДТА, то их количества, концентрации и РН выбраны нами из большого числа разных вариантов экстракций ДНК в процессе неоднократного повторения процедуры ее выделения. Эти условия позволили нам получать ДНК, пригодную для ПЦР, практически из каждого среза парафинового блока.
Время и температура охлаждения смеси после добавления к ней названных реагентов (5 мин при температуре -1 - -2°С), найденные также опытным путем, позволяют избежать полного замораживания смеси и дают возможность полностью удалить парафин от используемого нами остатка.
Дальнейшая очистка ДНК основана на нашем опыте работы с биологическими материалами и, наряду с оптимизацией режимов выделения ее, привела к значительному повышению выхода (в 1.5-2 раза), а за счет удаления посторонних веществ, ингибирующих ПЦР, позволила добиться высокого качества ДНК, пригодной для ПЦР из всех (100%) срезов, чего не может обеспечить ни один из существующих в настоящее время способов.
Это позволяет нам проводить весь комплекс реакций ПЦР с использованием ДНК, выделенной в процессе одной экстракции, что повышает достоверность получаемых результатов.
Сущность способа поясняется примером.
Пациент А. находился в клинике института на лечении в 1997 году, когда ему была выполнена трансуретральная резекция по поводу рака предстательной железы.
В связи с научными исследованиями по изучению патогенеза этого заболевания и ретроспективным анализом гистологических материалов, полученных от больных раком предстательной железы, в 2007 году мы запросили в патоморфологической лаборатории парафиновые блоки с удаленным у этого пациента биологическим материалом. Из блоков получили срезы толщиной 20 мкм. К срезу добавили 100 мкл 0,5% водного раствора Твин 20, полученную смесь нагревали при 90°С в течение 15 мин, затем добавили 50 мкг протеиназы К при температуре 55°С и выдерживали в течение 3 часов при этой температуре с ежечасным аккуратным взбалтыванием, после этого добавили реагенты: 100 мкл 5% водного раствора Челекс 100 и по 5 мкл водных растворов 0.5М Трис с РН 8,0 и 1М ЭДТА с РН 8,0 и нагрели до 100°С в течение 15 мин, полученный раствор центрифугировали при 10500 об/мин в течение 15 мин, затем охладили при температуре -1°С в течение 5 мин, удалили застывший слой парафина стерильным наконечником, остаток нагрели с хлороформом при температуре 45°С, затем центрифугировали при 10500 об/мин в течение 15 мин, 200 мкл супернатанта перенесли в стерильную пробирку, добавили к нему 5 мкл 5М водного раствора хлористого натрия и 500 мкл абсолютного этилового спирта, после чего смесь центрифугировали при 10500 об/мин в течение 30 мин при температуре +4°С, верхний слой удалили, к осадку добавили 100 мкл 80% этилового спирта и вновь центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин при температуре +4°С, верхний слой удалили, нижний высушили при температуре 65°С в течение 10 мин, затем растворили его в 30 мкл бидистиллированной воды и этот раствор, содержащий ДНК, использовали для ПЦР. Концентрация ДНК (на флюориметре) составляла 285 нг/мкл (при выделении ДНК по способу-прототипу концентрация ее составляла около 100 нг/мкл). С полученной ДНК поставили ПЦР с праймерами к генам домашнего хозяйства (гену рецептора фактора роста эндотелия и гену белка р16) с использованием положительного и отрицательного контроля. При анализе ПЦР на электрофорезе в агарозном геле обнаружены амплифицированные фрагменты соответствующих размеров (90 и 200 нуклеотидов соответственно), что характеризует высокое качество ДНК. Полученную при экстракции ДНК использовали в исследовательской работе, а именно определяли наличие цитомегаловируса в ткани предстательной железы методом гнездной ПЦР с праймерами к гликопротеину В и большому, непосредственно раннему, белку указанного вируса. Ранее нами было обнаружено, что в 60% случаев рака предстательной железы в ткани опухоли выявляется цитомегаловирус, который рассматривается как потенциальный онкомодулятор и участвует в прогрессии опухоли. Сейчас на панели гистоблоков пациентов с известной историей болезни нами ретроспективно оценивается влияние цитомегаловирусов на течение заболевания. В частности, в ткани предстательной железы, удаленной у данного больного, были найдены вышеназванные гены вируса, что подтверждало этот факт и способствовало прогрессированию у него заболевания.
Выделяемая предлагаемым способом ДНК используется нами и во многих других научных исследованиях.
Предлагаемый способ по сравнению с известными, как показывает приведенный пример, имеет существенное преимущество, обеспечивая высокий выход (в 1.5-2 раза выше, чем в прототипе) качественной ДНК, пригодной для ПЦР при получении ее из всех 100% срезов, что не может обеспечить ни один из известных способов.
Благодаря этому предлагаемый способ может быть использован при создании коммерческого набора для выделения ДНК из парафиновых блоков, а также для такой технологии молекулярной биологии, как гибридизации.
Способ разработан в лаборатории генной инженерии и отделении урологии ФГУ РНЦ РХТ.