СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫХ РОДОВ В СРОКЕ ГЕСТАЦИИ 24-34 НЕДЕЛИ
METHOD FOR PREDICTION OF PRETERM DELIVERY AT GESTATION PERIOD OF 24-34 WEEKS

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и лабораторной диагностике, оно может быть использовано в акушерской практике и предназначено для прогнозирования преждевременных родов.
Преждевременные роды являются ведущей причиной неонатальной заболеваемости и смертности и занимают одну из основных позиций в структуре причин детской смертности в возрасте до 5 лет. По данным ВОЗ частота преждевременных родов в разных странах варьирует в пределах от 5% до 18%. Показано, что 50% преждевременных родов являются спонтанными с интактными плодными оболочками, в 20% - развиваются вследствие дородового разрыва плодных оболочек, а в 30% родоразрешение происходит раньше физиологического срока по медицинским показаниям в связи с возникновением угрожающих жизни состояний со стороны матери и/или плода [Клинические рекомендации (Протокол лечения) «Преждевременные роды» Письмо Минздрава России от 17 декабря 2013 г. №15-4/10/2-9480. - М., 2013. - 20 с.].
Триггерами спонтанных преждевременных родов в 40-60% случаев выступают различные бактериальные патогены. Важно отметить, что инфекционно-воспалительные причины, как правило, являются индукторами преждевременной родовой деятельности в сроке с 22 по 34 неделю гестации [Romero, R. Preterm labor: one syndrome, many causes / R. Romero, S.K. Dey, S.J. Fisher // Science. - 2014. - №345 (6198). - P. 760-5.]. Наиболее часто осложняющие беременность инфекции этиологически преимущественно ассоциированы с грамотрицательными бактериями, в состав клеточной стенки которых входят липополисахариды (эндотоксины) - гетерополимеры, способные оказывать токсическое воздействие на органы и системы [Hurley, J.C. Endotoxemia: methods of detection and clinical correlates / J.C. Hurley // Clin. Microbiol. Rev. - 1995. - Vol. 8, №2. - P. 268-292.].
Взаимодействие бактериальных липополисахаридов с Toll-like рецепторами приводит к формированию каскадов цитокинов, которые стимулируют синтез оксида азота, способствуют продукции активных форм кислорода, индуцируют апоптозы, развитие коагуляционного каскада, повышают экспрессию матриксных металлопротеиназ, что вызывает разрушение коллагена в шейке матки и повышение сократительной активности миометрия и клинически манифестирует преждевременными родами [Goldenberg, R.L. Choriodecidual infection and preterm birth / R.L. Goldenberg, W.W. Andrews, J.C. Hauth // Nutr. Rev. - 2002. - Vol. 60, №5, Pt. 2. - P. S19-25.].
Определение инфицированности околоплодных вод у беременных с симптомами угрожающих преждевременных родов в режиме скрининга путем амниоцентеза не представляется возможным вследствие инвазивности процедуры, а попытки неоправданно длительной токолитической терапии при беременности, осложненной бактериальной инфекцией, сопряжены с повышенным риском возникновения побочных эффектов от использования токолитиков, развитием хориоамнионита и инфицирования плода.
Несмотря на то, что не удается блокировать каскад иммунопатобиохимических реакций, составляющих основу патофизиологии преждевременных родов, токолитическая терапия в отдельных случаях способствует отсрочке родов для проведения антенатальной глюкокортикостероидной терапии и перевода женщины в акушерский стационар, предназначенный для оказания помощи новорожденным с экстремально низкой и низкой массой тела. В этой связи для определения акушерской тактики существует необходимость прогнозирования наступления родов у женщин с симптомами угрожающих преждевременных родов в сроках гестации 24-34 недели, когда прогноз для здоровья и жизни неврожденного относительно неблагоприятен.
Прогнозирование преждевременных родов необходимо для определения времени проведения и объема терапевтических мероприятий. В тех клинических ситуациях, где прогнозируется наступление преждевременных родов и «счет идет на часы», необходимо немедленно начинать антенатальную терапию глюкокортикостероидами для профилактики респираторного дистресс-синдрома (РДС) плода, токолитическую терапию для обеспечения достаточного задела времени для перевода пациентки в соответствующую клинику, где есть отделения (палаты) интенсивной терапии для оказания помощи недоношенным новорожденным.
Известно, что для прогнозирования наступления преждевременных родов применяется ряд анамнестических, клинических, лабораторных и ультразвуковых критериев, среди которых в настоящее время используются следующие маркеры: укорочение длины шейки матки, установленное с помощью гинекологического исследования или УЗИ, менее 2,5 см и тесты на определение фосфорилированного протеина-1, связывающего инсулиноподобный фактор роста и фибронектина в цервико-вагинальной жидкости [Клинические рекомендации (Протокол лечения) «Преждевременные роды» Письмо Минздрава России от 17 декабря 2013 г. №15-4/10/2-9480. - М., 2013. - 20 с.].
Однако чувствительность метода измерения длины шейки матки крайне низкая (25-30% для гинекологического исследования и 35-40% для УЗИ), что не позволяет использовать данный тест в качестве скрининга. Указанные лабораторные тесты обладают высокой прогностической ценностью отрицательного результата, но низкой прогностической ценностью положительного результата, требуют влагалищного исследования, не могут применяться при повреждении плодных оболочек и при загрязнении образцов кровью, являются неспецифичными.
Известен способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах путем иммунологического исследования периферической крови беременной с 34 недель гестации, отличающийся тем, что до начала сохраняющей терапии определяют содержание TGFP, и при его значении, равном или менее 2000 пг/мл, прогнозируют преждевременные роды (RU 2437097, C1). Однако данный способ позволяет прогнозировать исход беременности только после 34 недели гестации.
Описан способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах, включающий исследование периферической крови беременной с 28 недель гестации, в котором до и после проведения курса сохраняющей терапии определяют количественный показатель нитрат-ионов, и при его увеличении на 10% и более, относительно первоначального значения, прогнозируют исход беременности в виде преждевременных родов (RU 2272574, С2). Метод не позволяет оценивать риск преждевременных родов до 28 недели и требует повторного забора материала в динамике при проведении токолитической терапии.
Известны способы прогнозирования исхода беременности при угрозе невынашивания поздних сроков путем определения в 22-33 недели беременности относительного содержания CD62L+ нейтрофилов в периферической крови и при его значении равном или более 65%, прогнозируют преждевременные роды (RU 2475752, С1) и способ прогнозирования исхода беременности при угрожающих преждевременных родах, осуществляемый путем исследования пробы периферической крови, в которой определяют относительное содержание СД16+ и СД3+ клеток и при их соотношении, меньшем или равном 0,11, прогнозируют наступление преждевременных родов при угрожающих преждевременных родах (RU 2132069, С1). Недостатком способов является их трудоемкость.
Известен способ диагностики угрозы невынашивания плода путем определения уровня содержания периферических TY - лимфоцитов до и после инкубации с АМГФ и при снижении экспрессии FcYR на поверхности TY - лимфоцитов на 12 и более процентов по отношению к исходному уровню диагностируют угрозу вынашиванию плода (RU 2077727, С1). Данные способ также отличает трудоемкость, что ограничивает его применение в рутинной практике.
Известен способ прогнозирования преждевременных родов, включающий выделение ДНК и генотипирование образцов периферической крови, при котором предварительно из анамнеза выясняют возраст пациентки, наличие вредных привычек, беременностей, закончившихся абортами, выкидышами, преждевременными родами, определяют генотипы гена интерлейкина IL1b Т>С31 и гена интерлейкина TNFa - G>A308, рассчитывают прогностический коэффициент (RU 2626510, С1). Для реализации способа необходим учет многих клинико-анамнестических и лабораторных параметров, что повышает вероятность ошибки при расчете, требует больших временных затрат в ургентной акушерской ситуации, что затрудняет его использование в качестве скринингового теста.
Имеются способы прогнозирования преждевременных родов, учитывающие, что в качестве триггера их развития ведущим является инфекционный фактор.
Описан способ прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза путем определения экспрессии гена Toll-подобного рецептора-2 (TLR-2) в слизистой цервикального канала (RU 2334233, С1), однако данный способ не имеет точных пороговых значений. Кроме того, имеется большой разброс абсолютных значений показателей экспрессии TLR-2. Чувствительность метода невысока и составляет 70%. Недостатком является его трудоемкость.
3
3
Известен способ прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза, включающий исследование эпителия эндоцервикса с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в реальном времени, при котором в клетках эпителия, начиная с 28 недель беременности, определяют уровень экспрессии гена противомикробного пептида β дефензина 1 и при его значении ниже 25,0×10 копий кДНК, относительно 10 копий кДНК β-актина, прогнозируют преждевременные роды (RU 2408014, С2) (прототип). Способ является трудоемким и сложно воспроизводимым.
Техническая проблема состоит в разработке неинвазивного информативного лабораторного способа прогнозирования преждевременных родов для определения оптимальной тактики ведения беременных с симптомами угрожающих преждевременных родов в сроке от 24 до 34 недель беременности вне зависимости от нарушения целостности плодных оболочек.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого способа, заключается в снижении перинатальной смертности за счет повышения точности прогнозирования преждевременных родов, его упрощения и доступности, обеспечения тем самым возможности своевременного выбора соответствующей тактики ведения беременности, включая своевременную профилактику РДС новорожденного, а также в расширении арсенала способов прогнозирования преждевременных родов в сроки от 24 до 34 недель беременности.
Предлагаемый способ позволяет снизить перинатальную смертность при развитии угрожающих преждевременных родов за счет оптимизации акушерской тактики путем неинвазивного объективного выявления предикторов наступления преждевременных родов.
Учитывая роль бактериальных липополисахаридов в патогенезе преждевременных родов, мы предположили, что лабораторный маркер эндотоксинемии, характеризующий степень «эндотоксиновой нагрузки» на организм беременной, может положительно коррелировать с выраженностью системных провоспалительных сдвигов, сопровождающих развитие родовой деятельности, и определять эффективность токолитической терапии для подавления формирующихся липополисахарид-ассоциированных цитокиновых каскадов.
В качестве оптимального биологического материала, взятие которого не представляет трудностей и исключает попадание в образец мешающих факторов (например, околоплодных вод), использовали плазму крови беременной.
Развитие угрожающих преждевременных родов, по нашим данным, характеризуется нарастанием плазменной концентрации бактериальных липополисахаридов. Однако в случае наступления родов происходит драматическое увеличение показателя системной эндотоксинемии.
Нами определен достоверный прогностический лабораторный маркер наступления родов при наличии у беременной симптомов угрожающих преждевременных родов, указывающий на необходимость немедленного проведения антенатальной глюкокортикостериодной терапии для профилактики РДС плода и предсказывающий отсутствие эффекта от токолитической терапии.
Как показали наши исследования, высокие показатели чувствительности (97%), специфичности (95%), отрицательной прогностической ценности (95%) и положительной прогностической ценности (97%) предлагаемого лабораторного показателя позволяют рассматривать его в качестве достоверного прогностического критерия, определяющего вероятность наступления родов при наличии у беременной симптомов угрожающих преждевременных родов.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Для прогнозирования наступления преждевременных родов в сроке гестации 24-34 недели выполняют следующее. В плазме крови беременной в сроке гестации 24-34 недели с клинической картиной угрожающих преждевременных родов определяют концентрацию бактериальных липополисахаридов. При величине данного показателя свыше 8,36 EU/мл прогнозируют преждевременные роды.
Способ осуществляется следующим образом.
У беременной в сроке гестации от 24 до 34 недели с клинической картиной угрожающих преждевременных родов определяют содержание бактериальных липополисахаридов в плазме крови.
Определение бактериальных липополисахаридов в плазме крови проводят следующим образом.
Установление концентрации бактериальных липополисахаридов в плазме проводят с помощью ЛАЛ-реактива Limulus Hbt LAL (Голландия) хромогенным методом по конечной точке. Предел чувствительности метода составляет 0,01 EU/мл. В качестве биологического материала используют 2 мл плазмы крови из вены натощак. Для устранения влияния факторов интерференции проводят разведение образцов плазмы крови 1:200 водой для ЛАЛ-теста и предварительное инкубирование в водяной бане при 75°С в течение 5 минут. Проверку на наличие мешающих факторов (ингибирование/усиление реакции) проводят путем добавления липополисахаридов к образцу или разведения образца раствором липополисахаридов с известной концентрацией.
Биологический принцип метода основан на том, что липополисахариды приводят к активации профермента, содержащегося в лизате амебоцитов Limulus. Активный свертывающий фермент разрезает коагулоген, что приводит к помутнению реакционной смеси. В присутствии хромогенного субстрата (S-2423) свертывающий фермент отрезает от субстрата хромофор, р-нитроанилин (pNA). Высвобожденный pNA придает раствору желтое окрашивание, реакция останавливается добавлением уксусной кислоты и измеряется с помощью спектрофотометра.
Определение концентрации липополисахаридов с помощью хромогенного анализа по конечной точке основано на том, что интенсивность окрашивания реакционной смеси прямо пропорциональна их содержанию в образце.
На первом этапе в лунки с образцами (50 мкл) вносят по 50 мкл растворенного ЛАЛ-реактива, в лунки с контролями образцов вместо ЛАЛ-реактива вносят по 50 мкл воды, свободной от липополисахарида. Проводят инкубацию 30 минут при комнатной температуре, после чего останавливают реакцию добавлением (50 мкл) разведенного стоп-раствора, содержащего 50% уксусную кислоту. Исследование проводят на спектрофотометре при длине волны 405 нм. Концентрацию липополисахаридов в образцах определяют по калибровочной кривой на основе стандартных концентраций липополисахаридов: 10; 3.30; 1.10; 0.40; 0.12; 0.04; 0.01; 0,0 EU/мл. Плазменная концентрация липополисахаридов в системном кровотоке здорового человека составляет 0-1 EU/мл. По международной классификации концентрацию липополисахаридов (эндотоксинов) обозначают в EU/мл (endotoxin units - международная единица активности).
При содержании бактериальных липолисахаридов в плазме крови более 8,36 EU/мл прогнозируют преждевременные роды.
Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Клинический пример 1.
Беременная Б., 23 года, встала на учет в женскую консультацию в сроке 11 недель. Из соматических заболеваний: хронический холецистит, аппендэктомия в 19 лет. Из гинекологических заболеваний: цервико-вагинальные инфекции (кандидозный вагинит, бактериальный вагиноз). В первом триместре беременность осложнилась ОРВИ с повышением температуры до 38°С и бактериальным вагинозом.
Поступила в акушерский стационар с симптомами угрожающих преждевременных родов в гестационном сроке 33-34 недели. Жалобы на периодические тянущие ощущения в нижних отделах живота. По данным объективного осмотра живот увеличен за счет беременной матки, соответствующей сроку беременности 34 недели, матка возбудима. Положение плода продольное, предлежит головка, над входом в малый таз. Сердцебиение плода ясное, ритмичное 127-137 ударов в минуту. При влагалищном исследовании: шейка матки располагается центрально, укорочена до 1,5 см, размягчена, наружный зев приоткрыт, пропускает один палец. Околоплодные воды не изливались. По данным УЗ исследования размеры плода соответствуют 33-34 неделям беременности, шейка матки укорочена до 19 мм, раскрытие внутреннего маточного зева - 7 мм.
В момент госпитализации провели определение концентрации бактериальных липополисахаридов в плазме, которая составила 10,3 EU/мл (значение показателя выше 8,36 EU/мл является предиктором наступления преждевременных родов).
Диагноз: Беременность 33-34 недели. Головное предлежание. Угрожающие преждевременные роды. Бактериальный вагиноз.
Беременной была назначена антенатальная глюкокортикостероидная терапия для профилактики РДС плода и токолитическая терапия. Несмотря на проведение токолитической терапии, на 2 сутки наблюдения произошли роды через естественные родовые пути, родилась живая недоношенная девочка массой тела 2260 г, длиной 43 см, с оценкой по шкале Апгар 7/8 баллов. У новорожденной диагностировали недоношенность. Ребенок переведен в детское отделение, выписан вместе с матерью на 6 сутки.
Клинический пример 2
Беременная Г., 38 лет встала на учет по беременности в женскую консультацию в сроке 7 недель. Из соматических заболеваний: хронический пиелонефрит в стадии ремиссии, хронический аутоимунный тиреоидит. Из гинекологических заболеваний: эндометриоз тела матки. Данная беременность третья по счету, протекала в первом триместре с явлениями угрозы прерывания и обострения хронического пиелонефрита.
Поступила в акушерский стационар с симптомами угрожающих преждевременных родов в сроке гестации 28 недель. По данным объективного осмотра живот увеличен за счет беременной матки, соответствующей сроку беременности 27-28 недель, матка возбудима. Положение плода продольное, предлежание головное, головка расположена высоко над входом в малый таз. Сердцебиение плода ясное, ритмичное 145 ударов в минуту. При влагалищном исследовании: шейка матки укорочена до 2,0 см, размягчена, наружный зев приоткрыт, пропускает кончик пальца. Околоплодные воды не изливались. По данным УЗ исследования размеры плода соответствуют 27-28 неделям беременности, шейка матки укорочена до 23 мм, раскрытие внутреннего маточного зева - 3 мм.
У данной пациентки в момент госпитализации значение показателя бактериальных липополисахаридов составило 5,4 MU/мл (при уровне менее 8,36 EU/мл прогнозируем возможность пролонгирования беременности посредством назначения токолитической терапии).
Диагноз: Беременность 28 недель. Головное предлежание. Угрожающие преждевременные роды.
Беременной была назначена антенатальная глюкокортикостероидная терапия для профилактики РДС плода и токолитическая терапия. Через 2 недели пациентка была выписана под наблюдение врача женской консультации. На момент выписки признаки угрожающих преждевременных родов отсутствовали.
Беременность завершилась своевременными родами в 38 недель гестации. Родился живой доношенный мальчик массой 3560 г, ростом 54 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов.
Предлагаемый способ был использован у 104 беременных с угрожающими преждевременными родами в сроки 24-34 недели беременности; из них у 61 пациентки прогнозировали наступление родов, прогноз подтвердился в 97% (в 59 наблюдениях), у 43 - возможность пролонгирования беременности до физиологического срока, прогноз подтвердился в 95% (в 41 наблюдении), Перинатальная смертность отсутствовала.
Таким образом, предложенный способ удобен в применении, не травматичен и не инвазивен, обладает высокой положительной и отрицательной прогностической ценностью. Заявленное изобретение позволит прогнозировать наступление преждевременных родов и оптимизировать акушерскую тактику в зависимости от результата тестирования.