Набор олигонуклеотидных праймеров для выявления вариантных штаммов Burkholderia thailandensis, содержащих кластер генов биосинтеза капсульного полисахарида, высоко гомологичный Burkholderia pseudomallei
SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR DETECTING VARIANT STRAINS BURKHOLDERIA THAILANDENSIS, CONTAINING CLUSTER OF CAPSULAR POLYSACCHARIDE BIOSYNTHESIS GENES, HIGHLY HOMOLOGOUS BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров для проведения экспресс-оценки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) наличия у штаммов Burkholderia thailandensis кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида, высоко гомологичного ортологичному кластеру генов Burkholderia pseudomallei (Bp-like CPS).
Изобретение может быть использовано в генетике и медицине для выявления вариантных (BTCV) штаммов В. thailandensis при расширенном молекулярно-генетическом исследовании данных микроорганизмов и экспресс-оценке их возможной степени патогенности.
В. thailandensis - аэробная подвижная грамотрицательная неферментирующая палочка, впервые выделенная в Юго-Восточной Азии. Бактерия входит в состав комплекса «Burkholderia pseudomallei», однако, в отличие от возбудителей мелиоидоза и сапа - В. pseudomallei и В. mallei, соответственно, является слабовирулентным микроорганизмом.
Известно, что одним из основных факторов вирулентности В. pseudomallei является кластер генов (BPSL2787-2810) биосинтеза капсульного полисахарида (CPS), который у большинства штаммов В. thailandensis заменен на кластер генов биосинтеза экзополисахаридов (EPS) (ВТН_I1324-1343). Однако в последнее десятилетие было обнаружено существование почвенных вариантных штаммов В. thailandensis, обозначенных BTCV, у которых вместо кластера EPS присутствует область, обладающая высокой гомологией с кластером генов CPS В. pseudomallei, получившая название Bp-like CPS. Кроме того, обнаружено, что BTCV штаммы В. thailandensis могут являться причиной тяжелых инфекций, включая сепсис и летальный исход [Glass et al., 2006; Chang et al., 2017; Gee et al., 2018]. Регулярные сообщения об инфекциях различной степени тяжести, обусловленных В. thailandensis, определяют актуальность разработки набора праймеров, позволяющего провести экспресс-оценку методом ПЦР потенциала вирулентности штаммов В. thailandensis, определяющего прогноз течения инфекции.
ПЦР является прямым методом выявления ДНК и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Полимеразную цепную реакцию можно использовать для выявления специфических генетических последовательностей, например, кластера генов биосинтеза Bp-like CPS.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для искомой генетической мишени и имеющие решающее значение в образовании продуктов амплификации. Кроме того, выбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации.
Наиболее близким аналогом можно считать выявление BTCV штаммов В. thailandensis методом aCGH - сравнительной гибридизации массивов геномных ДНК В. pseudomallei и В. thailandensis (array-based comparative genomic hybridization), с подтверждением результата в ПЦР с праймерами для детекции отдельных генов wcb-оперона В. pseudomallei (последовательности праймеров авторы не приводят) и иммунофлуоресцентным анализом бактериальной культуры с использованием моноклональных антител к капсульному полисахариду возбудителя мелиоидоза [Sim, В. М. Q. Genomic acquisition of a capsular polysaccharide virulence cluster by non-pathogenic Burkholderia isolates/ В. M. Q. Sim, N. Chantratita, W. F. Ooi, T. Nandi et al. // Genome biology. - 2010. - Vol. 11, №. 8. - P. R89]. Кроме того, в опубликованных работах авторы использовали косвенное подтверждение наличия у штаммов В. thailandensis кластера генов биосинтеза Bp-like CPS методом мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) [Gee, J. Е. Burkholderia thailandensis isolated from infected wound, Arkansas, USA/ J. E. Gee, M. G. Elrod, C. A. Gulvik, D. T. Haselow et al. // Emerging infectious diseases. - 2018. - Vol. 24, №. 11. - P. 2091] и сочетания положительных тестов на утилизацию арабинозы и латекс-агглютинации с использованием моноклональных антител к капсульному полисахариду возбудителя мелиоидоза [Hantrakun, V. Presence of В. thailandensis and В. thailandensis expressing В. pseudomallei-like capsular polysaccharide in Thailand, and their associations with serological response to B. pseudomallei / V. Hantrakun, J. Thaipadungpanit, P. Rongkard, P. Srilohasin et al. // PLoS neglected tropical diseases. - 2018. - Vol. 12, №. 1. - P. е0006193]. Все приведенные выше методы являются длительными и трудоемкими, а во втором и третьем случаях - косвенными. До настоящего времени набора олигонуклеотидных праймеров для прямой детекции методом ПЦР последовательностей генов Bp-like CPS кластера В. thailandensis предложено не было.
Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров для проведения экспресс-оценки методом полимеразной цепной реакции наличия в геноме штаммов В. thailandensis полного или частично редуцированного Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида.
Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для амплификации методом полимеразной цепной реакции гомологов генов wcbO, wcbJ, wcbI, wcbH, wcbF и wcbD В. pseudomallei, входящих в состав Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis.
Сконструированные олигонуклеотиды обладают в реакции амплификации активностью прямого и обратного праймеров и имеют следующую структуру:
SEQ ID NO: 1 ctaccagcctccgtccaaaa
SEQ ID NO: 2 tgcagctcaattccgactcc
SEQ ID NO: 3 ttctcgaaacgcgcagaact
SEQ ID NO: 4 tcggctttcctacgtgttctc
SEQ ID NO: 5 aaaccactcgaactgctcca
SEQ ID NO: 6 gtgaaaacgacggtgggaag
SEQ ID NO: 7 tttccgacgccaacttctcc
SEQ ID NO: 8 ctggacggtttcgttcacca
SEQ ID NO: 9 cgcacaagcggagtagtcaa
SEQ ID NO: 10 gtccttggacgttggacagg
SEQ ID NO: 11 tcagtgcagaggcaagaagc
SEQ ID NO: 12 ggtgcggaagccaaggtaaa
Характеристика генетических мишеней для данных пар праймеров и ожидаемые размеры амплифицируемых фрагментов ДНК приведены в Таблице 1.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Алгоритм конструирования набора праймеров.
Поиск генетических мишеней для детекции Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis был проведен на основании результатов сравнительного анализа трех первично аннотированных полных геномов (Genbank ас.СР113360.1, СР008914.2, NZ_CP013409.1) и трех шотган полногеномных сиквенсов (NZ_AECN00000000, PHRD00000000, NZ_LNNG00000000) BTCV штаммов В. thailandensis и последовательностей референтных штаммов В. pseudomallei K96243 и В. thailandensis Е264.
С использованием алгоритма BLASTN была оценена гомология ортологичных областей перечисленных геномов, кодирующих биосинтез капсульного полисахарида. В качестве потенциальной генетической мишени были использованы генетические последовательности штамма В. thailandensis 2003015869 (Genbank ас.CP013360.1), присутствующие у штаммов В. pseudomallei, BTCV В. thailandensis и отсутствующие у В. thailandensis.
С помощью программы PrimerBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) было сгенерировано 18 пар олигонуклеотидных праймеров. После оценки специфичности которых в этой же программе, окончательно было выбрано 6 пар олигонуклеотидов, комплементарных гомологам генов wcbO, wcbJ, wcbI, wcbH, wcbF и wcbD В. pseudomallei, входящих в состав Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis.
Пример 2. Экспериментальная оценка специфичности сконструированных праймеров была проведена на образцах геномной ДНК штаммов В. thailandensis Е264, В. pseudomallei ВКМ900, и BTCV В. thailandensis 2.1, для которого известно присутствие Bp-like, CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида, из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Выделение ДНК осуществляли методом мембранных технологий на основе диоксида кремния в виде колонок, используя коммерческий набор реагентов для выделения геномной ДНК «GeneJET», «Thermo Scientific» в соответствии с инструкцией к указанному набору.
Для постановки ПЦР использовались ДНК - амплификатор С1000 (Bio -Rad, США) с 96-луночным реакционным блоком. Программа амплификации для всех пар праймеров состояла из этапов начального прогрева проб 98°С 30 с, 39 реакционных циклов (денатурация 98°С 5 с, отжиг праймеров N°С 5 с, удлинение цепи 72°С 30 с) и финальной элонгации 72°С 1 мин. Температура отжига праймеров для каждой пары праймеров приведена в Таблице 2.
Объем реакционной смеси на 1 пробу составлял 15 мкл. В состав реакционной смеси входили по 1 мкМ прямого и обратного праймеров, 0.3 мкл Phire Hot start II ДНК-полимеразы (Thermo Fisher Scientific, Литва) и 7.5 мкл 2×ПЦР-master mix с дНТФ. Препараты геномной ДНК вносили в реакционную смесь в количестве ~ 1нг.
Электрофоретический анализ продуктов ПЦР проводили в 1,5% агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием. Размер ампликона оценивали, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркерных фрагментов ДНК.
Результаты тестирования в ПЦР разработанного набора праймеров показали наличие ампликонов ожидаемых размеров у штаммов буркхольдерий с известным присутствием тестируемых мишеней (В. pseudomallei ВКМ900 и BTCV В. thailandensis 2.1 - дорожки 2 и 3, соответственно) и их отсутствие у В. thailandensis Е264 (дорожки 1), у которой ортологичная область представлена отличающимся кластером генов биосинтеза экзополисахаридов (EPS) (Рисунок 1).
Полученные in silico и подтвержденные in vitro данные свидетельствуют о пригодности набора праймеров для детекции генов, входящих в состав Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида В. thailandensis и проведения экспресс-оценки методом ПЦР наличия у штаммов В. thailandensis Bp-like CPS кластера генов биосинтеза капсульного полисахарида.
SEQ ID NO:1
ctaccagcctccgtccaaaa
SEQ ID NO:2
tgcagctcaattccgactcc
SEQ ID NO:3
ttctcgaaacgcgcagaact
SEQ ID NO:4
tcggctttcctacgtgttctc
SEQ ID NO:5
aaaccactcgaactgctcca
SEQ ID NO:6
gtgaaaacgacggtgggaag
SEQ ID NO:7
tttccgacgccaacttctcc
SEQ ID NO:8
ctggacggtttcgttcacca
SEQ ID NO:9
cgcacaagcggagtagtcaa
SEQ ID NO:10
gtccttggacgttggacagg
SEQ ID NO:11
tcagtgcagaggcaagaagc
SEQ ID NO:12
ggtgcggaagccaaggtaaa