Способ повышения содержания линалилацетата в эфирном масле лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.)
METHOD OF INCREASING CONTENT OF LINALYL ACETATE IN ETHEREAL OIL OF NARROW-LEAVED LAVENDER (LAVANDULA ANGUSTIFOLIA MILL_)

Изобретение относится к области биохимии эфиромасличных растений и может быть использовано в сельском хозяйстве при выращивании лаванды с целью получения в дальнейшем из нее эфирного масла.
Сегодня достаточно большое количество исследований направленно на улучшение существующих приемов возделывания эфиромасличных растений с целью повышения их общей продуктивности, а также на управление их метаболическими путями с целью получения эфирного масла с более высоким содержанием отдельных ценных компонентов.
Существует сравнительно небольшое число подходов, позволяющих добиться требуемых результатов. К ним относятся селекция [Lenaerts, В., Collard, В. С. Y., & Demont, М. (2019). Review: Improving global food security through accelerated plant breeding. Plant Science, 110207.; Zimny, Т., Sowa, S., Tyczewska, A., & Twardowski, T. (2019).], методы генетической модификации [Certain new plant breeding techniques and their marketability in the context of EU GMO legislation - recent developments. New Biotechnology], а также редактирование генома [Butt, H., Eid, A., Momin, A.A., Bazin, J., Crespi, M., Arold, S.Т., & Mahfouz, M. M. (2019). CRISPR directed evolution of the spliceosome for resistance to splicing inhibitors. Genome Biology, 20(1)]. Нужно отметить, что на данный момент основным инструментом для изменения содержания отдельных ценных вторичных метаболитов и продуктивности растений лаванды узколистной является селекция, однако требуются годы для выведения нового сорта с требуемыми свойствами. Более современные подходы - генетическая модификация и редактирование генома - крайне дороги и, как и в случае селекции, занимают несколько лет [Ю.М. Сиволап. Молекулярные маркеры и селекция. Цитология и генетика, 2013, Т. 47, №3. ISSN 0564-3783].
На сегодняшний день препараты на основе коротких немодифицированных антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов не используются в сфере регулирования метаболизма растений. В то же время, обладая высокой избирательностью и отсутствием заметного негативного влияния на окружающую среду, они имеют большой потенциал стать эффективным средством избирательного регулирования вторичного метаболизма растений, в том числе эфиромасличных.
Способ повышения содержания линалилацетата в эфирном масле растений лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.) включает использование препаратов на основе ДНК, избирательно действующих на экспрессию гена линалоолсинтазы. При этом обработку растений проводят при помощи генератора холодного тумана (размер капли - 30 мкм) водными растворами антисмысловых ДНК-фрагментов гена линалоолсинтазы лаванды узколистной в концентрации 0,15 г/литр с нормой расхода 100 мл раствора на куст растения в фазе полного цветения диаметром 1 м за 4-5 дней до момента уборки соцветий.
Авторами заявленного технического решения впервые выявлен тот факт, что обработка растений лаванды узколистной антисмысловыми ДНК-фрагментами к гену линалоолсинтазы приводит к достоверному увеличению содержания линалилацетата и, как следствие, происходит уменьшение содержания линалоола в эфирном масле по сравнению с контролем. Влияние данных ДНК-фрагментов на растения лаванды узколистной выявлено впервые.
Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что антисмысловые ДНК-фрагменты гена линалоолсинтазы лаванды узколистной блокируют синтез фермента линалоолсинтазы, отвечающего за биосинтез линалоола из геранилдифосфата, тем самым блокируя синтез линалоола, что приводит к изменению траектории каскада вторичного метаболизма и превращению накопившегося линалоола в линалилацетат. Тонкие детали механизма действия данных ДНК-препаратов на сегодняшний день изучаются. Очевидно, что данные ДНК-фрагменты работают по общему механизму действия немодифицированных антисмысловых олигонуклеотидов, снижая экспрессию целевого гена линалоолсинтазы.
Пример конкретного осуществления способа.
Для эксперимента были отобраны растения лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.) в фазе полного цветения. В среднем, для каждого варианта эксперимента были использованы по 4 куста лаванды в четырехкратной повторности. Последовательность примененных антисмысловых фрагментов гена линалоолсинтазы была следующей: 5'-GCAACAATCC-3' (Lavan-blue-10), 5'-CCATCTCGAAC-3' (Lavan-white-11) и 5'-CATTCCCGAAAC-3' (Lavan-green-12). В качестве контрольных антисмысловых олигонуклеотидов использовались ДНК-фрагменты С-10 с последовательностью 5'-СССССССССС-3', С-11 с последовательностью 5'-ССССССССССС-3', и С-12 с последовательностью 5'-СССССССССССС-3'. В ходе эксперимента на каждый куст лаванды диаметром 1 м было затрачено по 100 мл ДНК-препарата с концентрацией 0,15 г/литр. Олигонуклеотиды были синтезированы на автоматическом синтезаторе ДНК/РНК ASM-10 (Биоссет, Россия) стандартным фосфорамидитным методом. Эфирное масло лаванды узколистной получали по методу Гинзберга с дальнейшим пересчетом на абсолютно-сухую массу. Навески сырья соцветий лаванды массой 100 грамм, убранные на 4 день после проведения обработки ДНК-препаратом, помещали в аппарат Гинзберга и добавляли 300 мл воды. Смесь доводили до кипения и отгонку эфирного масла проводили в течение 1 часа. Полученное эфирное масло анализировали на газовом хроматографе Кристалл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором при следующих технических условиях: газ-носитель - гелий; колонка CR-5ms размером 30 м×0,25 мм; толщина слоя неподвижной фазы - 0,25 мкм.; температура детектора - 250°С; температура испарителя - 250°С; расход газа-носителя -0,8 мл/мин. Программирование температуры: начальная температура колонки 75°С с выдержкой в 1 мин; скорость нагрева 4°С/мин; конечная температура колонки 180°С без выдержки; длительность анализа - 27,3 мин; деление потока 1:20. Расчет хроматограмм проводили по методу нормализации, для идентификации основных компонентов эфирного масла линалоола и линалилацетата использовали чистые вещества. Эффект действия препарата был пролонгированным и наблюдался с 4 по 8 день, то есть в течение 5 дней после обработки, а затем действие прекращалось и состав масла возвращался в исходное состояние.
Результаты эксперимента представлены в таблицах.
Антисмысловой фрагмент Lavan-green-12 проявил достоверное влияние на процентный состав компонентов эфирного масла - линалоола и линалилацетата. Достоверные различия (р<0,05) были обнаружены между группами контроля и Lavan-green-12 на четвертый день после обработки. Концентрация линалоола и линалилацетата в контроле составила 43,52±0,50% и 21,91±0,73% соответственно, а при обработке антисмысловым фрагментом Lavan-green-12 - 38,65±0,78% и 30,48±1,89% соответственно. После обработки антисмысловым фрагментом Lavan-green-12 линалоол уменьшился в среднем на 4,87±0,28%, а линалилацетат увеличился на 8,57±1,16% по сравнению с контролем (Таблица 1). Кроме этого, в контрольной группе выход эфирного масла составил 1,71±0,07%, а после обработки антисмысловым фрагментом Lavan-green-12 - 1,90±0,04% (Таблица 2). Таким образом, выход эфирного масла после обработки антисмысловым фрагментом Lavan-green-12 увеличился в среднем на 0,19±0,03% по сравнению с контролем. Следовательно, обработка антисмысловым фрагментом Lavan-green-12 не только поменяла процентное содержание компонентов эфирного масла, но и увеличила его выход. Контрольный (случайный) фрагмент С-12 не обнаружил достоверного влияния на процентный состав компонентов эфирного масла и его общий выход (Таблицы 3, 4).
Антисмысловой фрагмент Lavan-white-11 проявил достоверное влияние на процентный состав компонентов эфирного масла - линалоола и линалилацетата. Достоверные различия (р<0,05) были обнаружены между группами контроля и Lavan-white-11 на четвертый день после обработки. Концентрация линалоола и линалилацетата в контроле составила 43,52±0,50% и 21,91±0,73% соответственно, а при обработке антисмысловым фрагментом Lavan-white-11 - 37,39±0,99% и 30,55±2,18% соответственно. После обработки антисмысловым фрагментом Lavan-white-11 линалоол уменьшился в среднем на 6,13±0,49%, а линалилацетат увеличился на 8,64±1,45% по сравнению с контролем (Таблица 5). Кроме этого, в контрольной группе выход эфирного масла составил 1,71±0,07%, а после обработки антисмысловым фрагментом Lavan-white-11 - 1,93±0,06% (Таблица 6). Таким образом, выход эфирного масла после обработки антисмысловым фрагментом Lavan-11 увеличился в среднем на 0,22±0,02% по сравнению с контролем. Следовательно, обработка антисмысловым фрагментом Lavan-white-11 не только поменяла процентное содержание компонентов эфирного масла, но и увеличила его выход. Контрольный (случайный) фрагмент С-11 не обнаружил достоверного влияния на процентный состав компонентов эфирного масла и его общий выход (Таблицы 7, 8).
Антисмысловой фрагмент Lavan-blue-10 проявил достоверное влияние на процентный состав компонентов эфирного масла - линалоола и линалилацетата. Достоверные различия (р<0,05) были обнаружены между группами контроля и Lavan-blue-10 на четвертый день после обработки. Концентрация линалоола и линалилацетата в контроле составила 43,52±0,50% и 21,91±0,73% соответственно, а при обработке антисмысловым фрагментом Lavan-blue-10 - 36,34±0,85% и 32,16±2,29% соответственно. После обработки антисмысловым фрагментом Lavan-blue-10 линалоол уменьшился в среднем на 7,18±0,35%, а линалилацетат увеличился на 10,25±1,56% по сравнению с контролем (Таблица 9). Кроме этого, в контрольной группе выход эфирного масла составил 1,71±0,07%, а после обработки антисмысловым фрагментом Lavan-blue-10 -1,98±0,01% (Таблица 10). Таким образом, выход эфирного масла после обработки антисмысловым фрагментом Lavan-blue-10 увеличился в среднем на 0,27±0,02% по сравнению с контролем. Следовательно, обработка антисмысловым фрагментом Lavan-blue-10 не только поменяла процентное содержание компонентов эфирного масла, но и увеличила его выход. Контрольный (случайный) фрагмент С-10 не обнаружил достоверного влияния на процентный состав компонентов эфирного масла и его общий выход (Таблицы 11, 12).
Полученные результаты показывают перспективность применения препаратов на основе антисмысловых ДНК-фрагментов, избирательно действующих на экспрессию гена линалоолсинтазы, например, антисмысловых ДНК-фрагментов Lavan-blue-10, Lavan-white-11 и Lavan-green-12, в практике сельского хозяйства с целью повышения содержания линалилацетата в эфирном масле лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.) и выхода эфирного масла.