МАКЕТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ МИКРОСЕНСОРНОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ НЕРВНЫХ КЛЕТОК

Полезная модель относится к лабораторному оборудованию для проведения исследований в области медицины и физиологии.
Развитие и совершенствование подходов к диагностике и лечению заболеваний нервной системы определяется перспективными методами исследования электрической и биохимической активности мозга. Сегодня, для эффективного поиска новых подходов к лечению заболеваний нервной системы, кроме таких традиционных методов, как, например, электроэнцефалография (ЭЭГ) необходимы методы, позволяющие максимально детально и полно исследовать нормальную и патологическую функциональную активность нейронов на микроуровне. В последние годы для решения этой задачи широко используются монослойные культуры нейронов in vitro.
В нейрональных культурах диссоциированные клетки, выращиваемые на плоской подложке, способны выпускать отростки, формировать синапсы и создавать нервные сети. Монослойные нейрональные культуры in vitro все чаще рассматриваются как инструмент для исследования функционального ответа нервных сетей на аппликацию активных веществ, позволяющий закрыть разрыв между высокопроизводительными подходами геномики и протеомики с одной стороны и животными моделями с другой.
Нейрональные культуры достаточно компактны, и как следствие, полностью доступны для детальных исследований всем арсеналом методов современной клеточной биологии. При этом они достаточно сложны, что обеспечивает их высокую физиологическую адекватность как модели нервной ткани. Подбор условий культивирования позволяет сохранить тканеспецифичность и поддержать гистотипический состав рецепторов родительской ткани. Это дает возможность исследовать in vitro вещества, действующие на возбуждающие, тормозные и модуляторные рецепторные системы в физиологически релевантных моделях. Современные подходы к исследованию культур нейронов in vitro делятся на две группы. К первой группе относятся многочисленные методы флуоресцентной микроскопии, а ко второй - методы многоканальной регистрации на планарных мультиэлектродных матрицах. Обе группы методов обычно используются по отдельности, хотя их комбинация позволяет получить качественно новую информацию о соотношении электрической активности нейронов с внутриклеточными процессами.
В последние время предприняты попытки создания систем, объединяющих оптическую флуоресцентную и электрическую мультиэлектродную регистрацию. Так, Ito D. et al (Immunostaining for Identification of Neuronal-Impulse Pathway on Multielectrode Arrays // MEA Meeting 2008, c.53) использовал флуоресцентную иммуногистохимию с клеточными маркерами нейронов, что позволило идентифицировать пути передачи импульсов в сети нервных клеток, культивируемых на мультиэлектродной матрице. Комбинация электрофизиологической записи с высоким разрешением и иммунофлуоресцентной детекции дифференциированных нервных клеток с помощью антител к NeuN и МАР2 позволила Flavell, S.W. et al (Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 2008. V.31. P.563-90) выделить микро-сети нейронов с синхронной активностью.
,
Однако, в указанных системах использована иммунофлуоресцентная детекция морфологического фенотипа клеток, культивируемых на мультиэлектродных матрицах, а не их функционального состояния или геномной активности. Вместе с тем, именно механизмы геномной активации нейронов при тех или иных физиологических или химических воздействиях составляют основу нейрональной пластичности, как одного их ведущих признаков функционирования нервной системы в норме и патологии. Анализ этих клеточных механизмов требует выявления процессов индуцированной внешними воздействиями экспрессии генов. В частности, показано, что молекулярным маркером, позволяющим выделить нейроны, участвующие в обучении, является активация экспрессии гена c-fosкодирующего индуцируемый транскрипционный фактов (см., например, Анохин К.В. Молекулярные сценарии консолидации долговременной памяти //Журн. высш. нервн. деят. им. И.П.Павлова 1997. Т. 47. С.262-286; Okuno Н., Regulation and function of immediate-early genes in the brain: Beyond neuronal activity markers. // Neurosci.Res. 2011, doi: 10.1016/j.neures.2010.12.007 и др.).
Таким образом, задачей, решаемой в рамках настоящей заявки, является создание таких гибридных физиологических микросенсорных систем на основе нервных клеток, культивируемых на мультиэлектродных матрицах, которые способны детектировать сигналы как клеточной, так и внутриклеточной активности, при этом результат, достигаемый при решении такой задачи, состоит в расширении возможностей исследования пластичности мозга, диагностики и лечения заболеваний нервной системы, в частности, в повышении эффективности исследований физиологической активности нервных клеток в мискросенсорных системах, разработке новых тест систем для клеточной диагностики заболеваний нервной системы, разработке новых технологий скрининга кандидатных соединений для лечения заболеваний нервной системы.
Для достижения поставленного результата предлагается микросенсорная система, служащая для регистрации активности нейрональных культур, содержащая микроскоп с помещенной в него матрицей с культурой нервных клеток, блок регистрации генерируемой нервными клетками электрической активности и генератор стимулирующих импульсов, при этом микроскоп выполнен с возможностью фотографической цифровой регистрации флуоресцентного свечения нервных клеток, а матрица с культурой нервных клеток связана с упомянутыми блоком регистрации и генератором стимулирующих импульсов.
Ниже представлен вариант конкретного воплощения заявленной системы.
В общем виде, предлагаемая система обеспечивает одновременную регистрацию электрической активности и экспрессии генов в нейрональной культуре. С учетом поставленных задача, основными компонентами системы являются собственно нейрональная культура, микроскоп, обеспечивающий имиджинг флуоресцентных молекулярных маркеров с клеточным разрешением и установка для многоканальной регистрации электрической активности, генерируемой нервными клетками, и стимуляции нейронов in vitro (согласно формуле полезной модели - блок регистрации и стимуляции генерируемой нервными клетками электрической активности).
В качестве установки может быть использована, например, установка производства компании Multichannel Systems (Германия). Установка управляется посредством рабочей станции при помощи пакета программного обеспечения, обеспечивающего регистрацию электрической активности клеток, выбор электродов и управление стимуляцией, генерацию и загрузку паттернов стимуляции, а также управление термостатом, в который помещена культура клеток. При регистрации электрической активности возможен вывод изображения расположения клеток относительно электродов поверх фотоизображения матрицы с той культурой, с которой производится эксперимент.
В качестве микроскопа может быть использован стереомикроскоп по схеме Аббе, предназначенный для визуального наблюдения увеличенного трехмерного изображения объекта и цифровой регистрации данного изображения. Система анализа и обработки изображения микроскопа содержит цветную цифровую видео камеру высокого разрешения с охлаждением Пелтье, с возможностью получения изображений непосредственно с цифровой камеры, установленной на микроскопе и сохранение их в распространенных форматах.
Обобщенный пример использования микросенсорной системы может выглядеть следующим образом. Нервные клетки извлекаются из мозга новорожденного трансгенного животного и высаживаются на мультиэлектродную матрицу. После 3-х недель в инкубаторе, необходимых для созревания нейрональной культуры, мультиэлектродная матрица, с высаженными клетками, помещается в установку. Посредством стимулятора нейроны в культуре стимулируются по заданному протоколу с одновременной регистрацией электрической активности при помощи блока регистрации и флуоресценции при помощи микроскопа. Затем в культуру добавляется исследуемое нейроактивное вещество и описанная выше процедура стимуляции и регистрации повторяется. Сравнение электрического и геномного откликов на стимуляцию до и после воздействия на культуру нейроактивным веществом позволяет сделать выводы о его эффективности.