Способ получения иммобилизованных бислойных везикул
METHOD FOR PRODUCTION OF IMMOBILZED BILAYER VESICLES

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, биоаналитики и касается способа получения иммобилизованных бислойных везикул.
Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки твердой поверхности слюды водной суспензией специально приготовленных агрегатов бислойных липидных везикул, приводящей к формированию на поверхности липидного полислоя с включенными в него везикулами (О. Teschke, E.F. de Souza, Liposome structure imaging by atomic force microscopy: verification of improved liposome stability during adsorption of multiple aggregated vesicles, Langmuir, 2002, v. 18, p. 6513).
Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем последовательной обработки стеклянной подложки бычьим сывороточным альбумином, олеил-О-полиэтиленгликолем и водной суспензией отрицательно заряженных везикул (US Patent №7501280, класс 435/325).
Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки носителя, содержащего ковалентно связанный полимер и поверхностный отрицательный заряд, суспензией катионных бислойных везикул в водосодержащей среде. При этом в данном способе в качестве носителя используют модифицированную стеклянную пластинку с отрицательным зарядом на поверхности, создаваемым ковалентно связанными (привитыми) анионными цепями полимера - полиакриловой кислоты, а в качестве иммоблилизуемых катионных везикул используют везикулы, полученные в водосодержащей среде (водном буферном растворе) из смеси катионного диметилдицетиламмоний бромида и электронейтрального диолеоилфосфатидилхолина (патент России, RU 2409668 С1, МПК C12N 11/00, 2009, см. пример 2) - прототип.
Недостатком известного способа является его относительная сложность, связанная с проведением многостадийной синтетической процедуры модификации поверхности носителя и очистки модифицированной поверхности носителя от не вступившего в реакцию полимеризации исходного мономера и не закрепленного на поверхности полимера и/или олигомера.
Задачей изобретения является разработка способа получения иммобилизованных бислойных везикул, лишенного вышеуказанного недостатка, и расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы в качестве способа получения иммобилизованных бислойных везикул. Технический результат изобретения заключается в упрощении известного способа получения иммобилизованных бислойных везикул.
Предварительно были проведены эксперименты с различными носителями и различными бислойными везикулами, которые показали, что вышеуказанный технический результат достигается только в том случае, если в известном способе получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки носителя, содержащего ковалентно связанный полимер и поверхностный отрицательный заряд, суспензией катионных бислойных везикул в водосодержащей среде в качестве носителя используют мицеллярные частицы, полученные путем агрегации в водосодержащей среде блок-сополимера (блок-СПЛ), состоящего из полилактида (ПЛА) и полиоксиэтилена (ПОЭ), а в качестве везикул используют везикулы, состоящие по крайней мере из одного катионного липида или смеси по крайней мере одного катионного липида и по крайней мере одного электронейтрального липида, причем на одну частицу носителя должно приходиться не менее двух везикул.
Предлагаемый способ позволяет сохранять целостность иммобилизованных на поверхности бислойных везикул. При этом химическая природа противоионов у носителя и у иммобилизуемых везикул принципиального значения не имеет.
В предлагаемом техническом решении в качестве носителя используют мицеллярные частицы, полученные путем самопроизвольной или принудительной агрегацией в водосодержащей среде блок-СПЛ, состоящего из ПЛА и ПОЭ. Экспериментально было установлено, что поверхность такого носителя имеет отрицательный заряд, который может быть обусловлен различными причинами, например остатками ионогенного инициатора полимеризации, используемого при получении блок-СПЛ. Обращенная наружу часть таких мицеллярных частиц содержит ковалентно связанный ПЭО.
При получении носителя молекулярные массы используемого блок-СПЛ принципиального значения не имеют и могут варьироваться в широких пределах, например, от 3 до 30 килодальтон (кДа). При этом мольное содержание отдельных вышеуказанных полимеров в блок-СПЛ и геометрические размеры носителя также могут варьироваться в широких пределах. Используемая при получении носителя концентрация блок-СПЛ может варьироваться в широких пределах. Получать носитель с унифицированным размером можно путем пропускания суспензии блок-СПЛ через экструдер, снабженный мембранами с порами различного размера или с помощью ультразвуковой гомогенизации. При этом частота ультразвука и продолжительность воздействия ультразвука на объект могут быть различны в зависимости от конкретной решаемой задачи.
Используемые в данном изобретении блок-СПЛ описаны в научно-технической литературе и являются коммерчески доступными соединениями (см., например, каталог реагентов фирмы Sigma-Aldrich).
Следует отметить, что в предложенном способе носитель обязательно должен иметь ковалентно связанный полимер (ПОЭ) и поверхностный отрицательный заряд. Если носитель не будет содержать ковалентно связанного полимера или будет иметь положительный поверхностный заряд, то предложенный способ утрачивает работоспособность.
В предлагаемом способе при получении иммобилизуемых катионных везикул можно использовать любой катионный липид, например, димиристоилтриметилпропиламмоний хлорид (590), диметилдиоктадециламмоний бромид (630), димиристоилдиметиламмонийпропан (540) и т.д. или его смесь с любым электронейтральным липидом, например, таким как диолеоилфосфохолин (786), яичный лейцитин (700), димиристоилфосфохолин (677) и т.д. При этом мольное содержание электронейтрального липида в вышеназванной смеси, концентрация каждого из липидов и всей смеси липидов в водосодержащей среде может варьироваться в широких пределах, например, от 10 до 50%. Концентрация смеси липидов в водосодержащей среде также может варьироваться в широких пределах.
Такие липиды описаны в научно-технической литературе и являются коммерчески доступными соединениями (см. каталог реактивов фирмы Avanti Polar Lipids).
При получении везикул в качестве водосодержащей среды можно использовать различные буферные растворы или воду. При этом pH среды может варьироваться в широких пределах в зависимости от решаемой задачи.
Следует отметить, что в данном техническом решении в качестве иммобилизуемых везикул необходимо использовать только катионные бислойные везикулы. Если использовать везикулы, состоящие только из электронейтрального липида или анионные везикулы, то предлагаемый способ утрачивает работоспособность.
Обработку используемого носителя суспензией бислойных везикул необходимо проводить в водосодержащем растворе. При этом на одну частицу носителя должно приходиться не менее двух везикул. Если соотношение носитель / везикула будет 1:1, то в данном случае будет образовываться липосома, модифицированная блок-СПЛ.
Иммобилизация везикул на поверхности носителя может сопровождаться образованием коагулирующего осадка, который может быть вновь переведен в коллоидную дисперсию путем добавления новой порции суспензии модифицированного носителя или бислойных везикул.
Получать носитель, иммобилизуемые везикулы и осуществлять их иммобилизацию на носителе можно в широком интервале температур, однако из соображения удобства эти операции целесообразно проводить при температуре, близкой к комнатной.
Иммобилизованные на поверхности везикулы могут быть использованы в качестве контейнеров для инкапсулирования и контролируемого высвобождения различных веществ, например лекарств, пищевых добавок, катализаторов химических реакций и т.д. Поскольку ПЛА ([М. Itavaara, S. Karjomaa, J.F. Selin, Biodegradation of polylactide in aerobic and anaerobic thermophilic conditions, Chemosphere, 2002, v. 46, p. 879]) и иммобилизуемые бислойные везикулы ([M. Foradada, M.D. Pujol, J. Bermudez, J. Estelrich, Chemical degradation of liposomes by serum components detected by NMR, Chem Phys Lipids. 2000, v. 104, p. 133]) являются биодеградируемыми, способность к биодеградации сохраняется и у всей конструкции, включающей полилактидный носитель и иммобилизованные на нем везикулы.
Строение и состав конечных продуктов, получаемых с помощью предлагаемого способа, могут быть оценены и доказаны различными физико-химическими методами: лазерным электрофорезом, динамическим светорассеянием, флуоресценцией, электронной микроскопией, эллипсометрией, атомно-силовой микроскопией и т.д. Например, целостность иммобилизованных везикул доказывают, используя везикулы, внутренний водный объем которых заполнен 1 М водным раствором водорастворимой соли (например, хлорида натрия). Разрушение везикул неизбежно сопровождается возрастанием электропроводности суспензии, что регистрируется кондуктометрически. Неразрушенные везикулы не вносят вклад в электропроводность суспензии. Эксперименты показывают, что электропроводность суспензии иммобилизованных везикул, полученных с помощью предлагаемого нами способа, остается неизменной, что свидетельствует о сохранении целостности иммобилизованных везикул.
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1
Опыт проводят при комнатной температуре.
-4
Носитель, содержащий ковалентно связанный полимер и поверхностный отрицательный заряд, получают по следующей методике. 10 мг блок-СПЛ, содержащего 55 мольных процентов ПЛА и 45 мольных процентов ПОЭ, с молекулярной массой 12.5 килодальтон растворяют в 3 мл тетрагидрофурана (ТГФ). К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют воду до содержания воды 20 об.%. Полученую водно-органическую смесь диализуют относительно воды для удаления ТГФ. Получают 6 мл суспензии мицеллярных частиц в воде с концентрацией 1.66 мг/мл (1.4×10 М).
-2
Иммобилизуемые бислойные везикулы получают следующим образом. 2 мл 0,1 вес.%-ного раствора катионного липида димиристоилтриметилпропиламмоний хлорида в растворителе - метаноле помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют метанол на роторном испарителе в вакууме. После удаления метанола на стенках колбы образуется тонкая пленка липида, которую диспергируют в 2 мл 10 М боратного буфера с рН 9,2. Получают опалесцирующий раствор липида в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 22 килогерц (кГц) в течение 400 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают суспензию катионных бислойных везикул в водосодержащем растворе с концентрацией 1 мг/мл.
Иммобилизованные бислойные везикулы получают путем смешения 0.6 мл суспензии ранее полученных бислойных везикул с 0.2 мл суспензии ранее полученного носителя. Получают продукт, в котором на одну частицу носителя приходится 5 иммобилизованных везикул, отделяют центрифугированием. Отсутствие не вступивших в иммобилизацию везикул в надосадочной жидкости доказывают динамическим светорассеянием - количество частиц, регистрируемых прибором, равно нулю.
-5
Целостность иммобилизованных везикул доказывают путем проведения аналогичного опыта, в котором на стадии приготовления везикул в реационную систему вводят флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин (КФ) в концентрации 10 М. О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,05 абсолютных единиц соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 3 дня и 7 дней идентичны, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 2
Опыт проводят при 15°С.
-4
Носитель, содержащий ковалентно связанный полимер и поверхностный отрицательный заряд, получают следующим образом. 8 мг блок-СПЛ, содержащего 70 мольных % ПЛА и 30 мольных % ПОЭ, с молекулярной массой 3 кДа растворяют в 2 мл метанола. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют воду до содержания воды 30 об.%. Полученную водно-органическую смесь диализуют относительно воды для удаления метанола. Получают 5 мл суспензии анионных мицеллярных частиц в водосодержащей среде с концентрацией 1 мг/мл (0,85×10 М), которые используют в качестве анионного носителя, содржащего ковалентно связанный полимер.
-2
0,4 мл 0.15%-ного раствора катионного липида диолеилоксипропилтриметил хлорида в растворителе ТГФ помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют ТГФ на роторном испарителе в вакууме. После удаления растворителя на стенках колбы образуется тонкая пленка липида, которую диспергируют в 3 мл 10 М ТРИС буферного раствора с рН 7. Затем на полученный опалесцирующий раствор воздействуют ультразвуком частоты 25 кГц в течение 350 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают суспензию катионных везикул в водосодержащей среде с концентрацией 0,2 мг/мл.
Иммобилизацию бислойных везикул проводят путем смешения 0,05 мл суспензии полученного анионного носителя с 1 мл суспензии катионных бислойных липидных везикул. Получают продукт, в котором на одну частицу носителя приходится 15 иммобилизованных везикул, отделяют методом хроматографии.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния, равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,03 абсолютных единиц соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 5 дней совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 3
Опыт проводят при 25°С аналогично примеру 1, однако используют блок-СПЛ с молекулярной массой 30 кДа, содержащий 30 мольных % ПЛА и 70 мольных % ПОЭ и в качестве катионного липида используют диметилдиоктадециламмоний бромид (630).
0,9 мл 0.2%-ного катионного липида в хлороформе помещают в круглодонную стеклянную колбу, затем удаляют растворитель на роторном испарителе в вакууме. Образовавшуюся на стенках колбы пленку липида диспергируют в 3 мл раствора NaCl с концентрацией 0,15 М. Получают опалесцирующий раствор липида, на который воздействуют ультразвуком частотой 30 кГц в течение 300 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают суспензию катионных везикул в водно-солевой среде с концентрацией везикул 0,6 мг/мл.
Иммобилизацию везикул на носителе проводят путем смешения 0,1 мл суспензии носителя с 0,5 мл суспензии полученных везикул. Продукт, в котором на одну частицу носителя приходится 12 иммобилизованных везикул, отделяют центрифугированием.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния, равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,06 абсолютных единиц соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 4 дня совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 4
Опыт проводят при комнатной температуре.
Носитель получают аналогично примеру 1.
Иммобилизуемые катионные везикулы получают аналогично примеру 1, однако, используют смесь 1,168 мл 0,1 вес.%-ного раствора катионного липида димиристоилтриметилпропиламмоний хлорида в хлороформе и 0,832 мл 0,1 вес.%-ного раствора электронейтрального липида дилауроилфосфатидилхолина в хлороформе. При этом мольное содержание электронейтрального липида составляет 41,6% от общего содержания липидов в смеси.
Иммобилизацию везикул проводят путем смешения 0,6 мл суспензии используемого носителя с 1 мл суспензии бислойных катионных везикул. Продукт, в котором на одну частицу носителя приходится 6 иммобилизованных везикул, отделяют центрифугированием.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,04 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 6 дней совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 5
Опыт проводят при 15°С.
Носитель получают аналогично примеру 2.
Иммобилизуемые катионные везикулы получают аналогично примеру 2, однако используют смесь 0,6 мл 0,15 вес.%-ного раствора катионного липида диолеилоксипропилтриметил хлорида в ТГФ и 1,2 мл 0,15 вес.%-ного раствора электронейтрального липида яичного лецитина (700). При этом мольное содержание электронейтрального липида составляет 66,7% от общего содержания липидов.
Иммобилизацию везикул проводят путем смешения 0,05 мл суспензии анионного носителя с 0,5 мл суспензии катионных везикул. Продукт, в котором на одну частицу носителя приходится 8 иммобилизованных везикул, отделяют центрифугированием.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния, равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,05 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 5 дней совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 6
Опыт проводят при температуре 25°С.
Носитель получают аналогично примеру 3.
Иммобилизуемые катионные везикулы получают аналогично примеру 3, однако, используют смесь 1 мл 0,2 вес.%-ного раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в хлороформе и 4 мл 0,2 вес.%-ного раствора электронейтрального липида диолеоилфосфахолина (786). При этом мольное содержание электронейтрального липида составляет 80% от общего содержания липидов.
Иммобилизацию везикул проводят путем смешения 0,08 мл суспензии анионного носителя с 0,5 мл суспензии катионных везикул. Продукт, в котором на одну частицу носителя приходится 14 иммобилизованных везикул, отделяют центрифугированием.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния, равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,03 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 7 дней совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 7
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако, иммобилизуемые везикулы получают из смеси 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного липида димиристоилпропиламмоний хлорида в метаноле и 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в хлороформе.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,04 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 7 дней совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 8
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако, иммобилизуемые везикулы получают из тройной смеси 2 мл 0,1 вес.%-ного раствора катионного липида димиристоилпропиламмоний хлорида в хлороформе, 2 мл 0,1 вес.%-ного раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в хлороформе и 2 мл 0,1 вес.%-ного раствора катионного диолеилоксипропилтриметил хлорида в хлороформе.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния, равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,03 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 3 дня совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 9
Опыт проводят аналогично примеру 7, однако, иммобилизуемые везикулы получают из смеси четырех липидов, содержащей 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного липида димиристоилпропиламмоний хлорида в хлороформе, 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в хлороформе, 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного диолеилоксипропилтриметил хлорида в хлороформ, 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора электронейтрального липида дилауроилфосфатидилхолина в хлороформе, 1 мл 0,2 вес. %-ного раствора электронейтрального липида диолеоилфосфахолина.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния, равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,05 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 3 дня совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 10
Опыт проводят аналогично примеру 8, однако, иммобилизуемые везикулы получают из смеси шести липидов, содержащей 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного липида димиристоилпропиламмоний хлорида в хлороформе, 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в хлороформе и 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора катионного диолеилоксипропилтриметил хлорида в хлороформе, 2 мл 0,1 вес. %-ного раствора электронейтрального липида дилауроилфосфатидилхолина в хлороформе и 1 мл 0,2 вес %-ного раствора электронейтрального липида диолеоилфосфахолина и 1 мл 0,2 вес. %-ного раствора электронейтрального липида яичного лецитина в хлороформе.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния, равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,02 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 5 дней совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Иммобилизацию везикул на поверхности носителя и целостность иммобилизованных везикул доказывают аналогично примеру 1. Количество свободных везикул в надосадочной жидкости после отделения целевого продукта методом центрифугирования, регистрируемых методом динамического светорассеяния равно нулю. Что свидетельствует о полной иммобилизации везикул на носителе.
О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул - значение флуоресценции 0,05 абсолютные единицы соответствует значению фонового сигнала прибора в отсутствие измеряемого образца. То есть везикулы с нарушенной целостностью отсутствуют.
Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней. Изображения иммобилизованных на носителе везикул, полученные через 5 минут после выделения целевого продукта, через 5 дней совпадают, что свидетельствует о сохранении морфологии.
Пример 11
Опыт проводят аналогично примеру 5, однако, иммобилизацию везикул проводят путем смешения 0,05 мл суспензии анионного носителя с 0,125 мл суспензии катионных везикул. Продукт в котором на одну частицу носителя приходятся 2 иммобилизованные везикулы отделяют центрифугированием.
Таким образом, из приведенных примеров действительно видно, что предложенный способ упрощает известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул и расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для получения иммобилизованных бислойных везикул.
Экспериментальные исследования проведены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант №14-13-00255).