Сравнительный анализ mlva25- и MLVA7-типирования по способности определять очаговую принадлежность штаммов Yersinia pestis на примере изолятов из центральнокавказского высокогорного очага чумы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

genome and their application for high resolution genotyping. BMC Microbiol. 2007; 7: 23.

6. Duangsonk K., Gal D., Mayo M., Hart C.A., Currie B.J., Winstanley C. Use of a variable amplicon typing scheme reveals considerable variation in the accessory genomes of isolates of Burkholderia pseudomallei. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (4): 1323-34.

7. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M. et al. Different region analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. PLoS One. 2008; 3 (5): e2166.

8. Савченко С.С., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Зинченко О.В., Бондарева О.С. и др. Генотипирование штаммов B. mallei с использованием метода вариабельных ампликонов (VAT). В кн.: Материалы III Научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотреб-надзора. Оболенск; 2011; 131-4.

9. Schutzer S.E., Schlater L.R., Ronning C.M., DeShazer D., Luft B.J., Dunn J.J. et al. Characterization of clinically-attenuated Burkholderia mallei by whole genome sequencing: candidate strain for exclusion from Select Agent lists. PLoS One. 2008; 3 (4): e2058.

10. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005; 44 (1): 91-7.

Поступила 26.08.14

REFERENCES

1. Godoy D., Randle G., Simpson A.J., Aanensen D.M., Pitt T.L., Kinoshita R. et al. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (5): 2068-79.

2. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S., Tettelin H., Nelson K.E., Feldblyum T. et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101 (39): 14 246-51.

3. Bondareva O.S., Savchenko S.S., Tkachenko G.A., Abueva A.I., Muratova Yu.O., Antonov V.A. Modern approaches to the genotyping of especially dangerous infections. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2014; 1: 34-44.

4. Antonov V.A., Tkachenko G.A., Altukhova V.V., Savchenko S.S., Zinchenko O.V., Viktorov D.V. et al. Molecular identification and typing of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei: when is enough enough? Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102 (Suppl. 1): S134-9.

5. U'Ren J.M., Schupp J.M., Pearson T., Hornstra H., Friedman C.L., Smith K.L. et al. Tandem repeat regions within the Burkholderia pseudomallei genome and their application for high resolution genotyping. BMC Microbiol. 2007; 7: 23.

6. Duangsonk K., Gal D., Mayo M., Hart C.A., Currie B.J., Winstanley C. Use of a variable amplicon typing scheme reveals considerable variation in the accessory genomes of isolates of Burkholderia pseudomallei. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (4): 1323-34.

7. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M. et al. Different region

analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. PLoS One. 2008; 3 (5): e2166.

8. Savchenko S.S., Antonov V.A., Tkachenko G.A., Alekseeva V.V., Zinchenko O.V., Bondareva O.S. B. mallei strains genotyping using the variable amplicons typing

9. Schutzer S.E., Schlater L.R., Ronning C.M., DeShazer D., Luft B.J., Dunn J.J. et al. Characterization of clinically-attenuated Burkholderia mallei by whole genome sequencing: candidate strain for exclusion from Select Agent lists. PLoS One. 2008; 3 (4): e2058.

10. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005; 44 (1): 91-7.

Received 26.08.14

GENOTYPING OF THE BURKHOLDERIA MALLEI STRAINS BASED ON DIFFERENT REGION ANALYSIS

Bondareva O. S, Savchenko S. S, Tkachenko G. A., Ledeneva M. L, Lemasova L. V., Antonov V. A.

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Volgograd, Russia

Development of the genotyping methods of glanders agent is urgent due to its high pathogenicity, lack of effective preventive measures and threat of the use of Burkholderia mallei as a biological weapon. In this work we proposed a scheme for the typing of the B. mallei strains based on different region analysis (DFR). The choice of variable loci differentially presented in various strains of glanders agents was performed by analyzing annotated whole-genome sequences of the B. mallei strains. Primers and fluorescence probes were designed for 9 selected loci. The amplification conditions for different regions were optimized in two variants: with electrophoretic detection and hybridization-fluorescence detection in the strip format. The possibility of applying the DFR analysis to genetic characterization of strains was assessed in 14 B. mallei strains. The genetic profiles of the studied B. mallei strains revealed that the developed DFR-typing scheme was characterized by high discrimination power (Hunter-Gaston index value was 0.92), reproducibility, rapidity, easy interpretation, and applicability for epidemiological surveillance of glanders. Key words: glanders, Burkholderia mallei, genotyping, different region analysis, DFR

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-33-37

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.579

Евсеева В.В.1, Платонов М.Е.1, Говорунов И.Г.1, Ефременко Д.В.2, Кузнецова И.В.2, Дентовская СВ.1, Куличенко А.Н.2, Анисимов А.П.1

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИз MLVA25- И МЬУА7-ТИПИРОВАНИЯ ПО СПОСОБНОСТИ

определять очаговую принадлежность штаммов yersinia pestis на примере изолятов из центрально-кавказского высокогорного очага чумы

1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, Оболенск; 2ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 355035,

Ставрополь

Проведен сравнительный анализ МЕУА25- и МЦУА7-типирования по способности определять очаговую принадлежность штаммов У. pestis на примере изолятов Ыг. medievalis из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. Для этого определили МЦУА25-генотипы 82 изолятов с указанной территории и ввели эти данные в базу, включавшую информацию о 949 штаммах чумного микроба из других природных очагов России, ближнего и дальнего зарубежья. Для построения дендрограмм применяли метод UPGMA с категорическим коэффициентом, используя данные обо всех 25 имеющихся в ней локусах УПГГО или только о семи из них, рекомендованных специалистами Российского научно-

исследовательского противочумного института «Микроб» для дифференциации штаммов Y. pestis по очаговой принадлежности. Полученные результаты свидетельствуют о большей вероятности диагностических ошибок при использовании для определения внутривидовой принадлежности метода МЦУА7-типирования и указывают на целесообразность подразделения Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы на два мезоочага. Ключевые слова: ЫЬУА25-типирование; MLVA7-типирование; VNTR; Yersinia pestis; филогеография.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-37-40

В разное время для молекулярного типирования возбудителя чумы, Y. pestis, использовали плазмидный скрининг, определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов - RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism), риботипирование, IS-типирование и методы ПЦР-фингерпринта: случайно праймированную ПЦР - AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR), случайно амплифицированные полиморфные ДНК - RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA), амплификацию повторяющихся экстрагенных палиндромов - REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic) и повторяющихся межгенных консенсусных последовательностей энтеробактерий ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequences) [1-6]. Общими недостатками этих методов являются: низкая межлабораторная воспроизводимость, необходимость в большом количестве материала для исследования, сложность использования полученных результатов для создания совместимых межлабораторных баз данных.

Доступность полной нуклеотидной последовательности геномов микроорганизмов [7] послужила толчком для развития современных молекулярно-генетических методов. В настоящее время для генотипирования Y. pestis широко используют многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов - MLVA (Multiple Lo-

Основные характеристики 25 VNTR-локусов

Локус" Количество аллелей Вариабельность размера аллелей в тандемных повторах Индекс полиморфизма8

YP00120ms01_18bp_228bp_8U 7 0, 6-11 55,5

YP01290ms04_17bp_230bp_8U 9 0, 3-10 76,0

YP01935ms05_17bp_291bp_11U 6 0, 5, 9-12 61,9

YP02769ms06_60bp_606bp_8U 16 0-14, 16 78,4

YP02916ms07_10bp_184bp_9U 8 0, 3, 6-11 58,5

YP03057ms09_18bp_682bp_33U 17 0, 5-7, 9-12, 17, 18, 22-25, 33, 34, 36 72,2

YP00559ms15_15bp_237bp_10U 2 9, 10 25,0

YPO 1814ms20_15bp_253bp_9U 4 0, 5, 8-10 54,0

YPO1895ms21_18bp_278bp_9U 7 0, 6, 8-12 17,4

YP04042ms35_15bp_204bp_8U 5 0, 7-10 52,6

YPO4425ms38_16bp_233bp_8U 5 5-9 62,3

YP00581ms40_17bp_214bp_7U 5 0, 7, 9-11 51,9

YP00718ms41_17bp_217bp_7U 4 0, 5-7 57,0

YPO 1018ms44_17bp_233bp_7U 4 0, 7-9 24,3

YP01108ms45_12bp_161bp_7U 5 0, 5-8 48,4

YPO1335ms46_7bp_112bp_5U 28 0, 3-27, 29, 30 88,1

YP02058ms51_21bp_207bp_2U 3 0-2 18,5

YPO2612ms54_22bp_281bp_7U 8 0, 3-9 38,8

YP03060ms56_16bp_220bp_7U 8 0, 5-11 73,2

YP04280ms62_9bp_124bp_7U 24 0, 4-26 92,0

YPO 1118ms69_16bp_179bp_6U 5 0, 5-8 59,6

YPO 1580ms70_9bp_146bp_6U 12 0, 3-13 81,1

YPO 1925ms71_14bp_171bp_6U 7 4-9 59,9

YPO3236ms73_18bp_225bp_6U 5 0, 3-6 53,7

YPO3245ms74_15bp_195bp_6U 8 0, 3, 5-10 55,0

Примечание. а - идентификационное имя локуса включает полное описание аллели с количеством тандемных повторов в штамме К. реяйя С092

индексы полиморфизма определяли как описано ранее [9].

cus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) [1, 8-11], DFR-типирование - анализ отличающихся участков ДНК (Different Region) [12, 13], CRISPR-типирование (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - кластеризованные короткие палиндромные повторы, разделенные спейсерами) [8, 14], SNP-типирование -анализ полиморфизма единичных нуклеотидов (Single-Nucleotide Polymorphism), полногеномный сиквенс [15]. Данные методы лишены перечисленных выше недостатков, но отличаются друг от друга по скорости получения результата, своей разрешающей способности и возможности интерпретации полученных данных [16]. Кроме того, необходимо учитывать стоимость требуемого для анализа оборудования и реактивов, а также квалификацию персонала [17]. Таким образом, в каждом конкретном случае при выборе наиболее подходящей технологии установления подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности исследуемого изолята Y. pestis необходимо определиться с оптимальным сочетанием указанных факторов. Особенно важно это при выборе объемов исследований, проводимых в лабораториях регионального и федерального уровней. В последнее время все чаще применяют метод MLVA с использованием 42 [10], 25 [1, 9, 11] или всего 7 [2, 11] VNTR-локусов. Применение вариантов метода с меньшей разрешающей способностью существенно снижает эффективность его использования для молекулярно-эпидемиологических расследований, но в несколько раз сокращает стоимость исследований.

В настоящей публикации описан сравнительный анализ MLVA25- и MLVA7-типирования по способности определять очаговую принадлежность штаммов Y. pestis на примере изолятов из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В работе использовали 82 штамма Y. pestis subsp. pestis bv. mediaevalis. Бактерии выращивали, а затем выделяли геномную ДНК как описано ранее [9].

Молекулярное титрование. Последовательности праймеров, условия проведения ПЦР, учет результатов МиУЛ25-типирования [9, 11] и CRISPR-типирования [5] детально описаны ранее. Основные характеристики 25 VNTR локусов [9, 11], включая обновленные индексы полиморфизма для каждого из локусов, представлены в таблице.

Для вариантов метода с использованием 7 и 25 локусов VNTR-индексы разнообразия Симпсона [18] были практически одинаковы и составили 0,995 и 0,996 соответственно.

Номенклатура природных очагов чумы. Природные очаги чумы бывшего Советского Союза обозначены цифрами [19, 20]; природные очаги Китая - латинскими буквами от A до O [21]. Географическое положение и описание этих природных очагов представлено в предыдущих публикациях [19-21].

Анализ результатов. Полученные результаты вносили в базу данных программы Bionumerics 5.1, включавшую информацию о 949 штаммах чумного микроба из других природных очагов России, ближнего и дальнего зарубежья. Для построения дендрограмм применяли метод UPGMA с категорическим коэффициентом.

Результаты и обсуждение Исследованные нами с помощью MLVA25-типирования 82 штамма Y. pestis bv. medievalis, выделенные в Центрально-Кавказском высокогорном очаге чумы, формировали два клональных кластера (cc01/A и cc01/B; рис. 1 ^м. 2-ю полосу

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

обложки) [1]), четко проявляющих свою автономность в составе группы кластеров штаммов данного биовара на дендрограмме, включающей данные о МЬУА25-типах 1031 изолятов, относящихся к различным внутривидовым группам чумного микроба (данные не приводятся).

Как видно из представленных на рис. 1 и 2 (см. 2-ю и 3-ю пол. обложки) данных MLVA25- и MLVA7-генотипирования, методика с использованием большего числа маркеров обладает более высокой разрешающей способностью (52 и 45 генотипов соответственно). Кроме того, MLVA7-типирование делило 82 исследованных штамма на 5 автономных кластеров в составе гетерогенной группы, включающей представителей не только bv. medievalis, но и bvv. antique, altaica, talassica и xilin-golensis. Анализ базы данных М1УА25-генотипов 1031 штамма чумного микроба из природных очагов России, ближнего и дальнего зарубежья (данные не приводятся) показал, что использование 25 локусов позволяет четко кластеризовать в составе двух автономных клональных кластеров штаммы из Центрально-Кавказского высокогорного (01) очага вместе с незначительным числом штаммов того же биовара из близрасположенных природных очагов (cc01/A - изоляты из очагов 01 и 02, 03, 07, 09, 10, 11; cc01/B - 01 и 43) сусликового (01, 02, 03) и песчаночьего (07, 09, 10, 11, 43) типа (см. рис. 1 на 2-й полосе обложки). Делать заключение о возможном заносе единичных штаммов с генотипами, характерными для 01 очага, в соседние очаги или о циркуляции в этой группе очагов генетически близких штаммов можно будет после молекулярного типирования представительного набора штаммов из этих близлежащих, но относящихся к различным ландшафтно-экологическим типам очагов [22]. При использовании для типирования лишь 7 маркеров, предлагаемых для установления «подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности исследуемого изолята» [2], в кластеры штаммов из данного очага попадает целый ряд изолятов (см. рис. 2 на 3-й пол. обложки), включая штаммы других биоваров, как из соседних, так даже из китайских очагов, удаленных от Кавказа на расстояние более 5000 км. Обмен штаммами между столь отдаленно расположенными очагами маловероятен.

Каждый из двух клональных кластеров штаммов из Центрально-Кавказского высокогорного очага, выявленных с помощью MLVA25-типирования включает по два-три подкластера. В кластер cc01/A в основном входят независимые от пролина (Pro+) штаммы с «универсальной» вирулентностью [19], выделенные на территории Кабардино-Балкарии, и два ауксотрофных по проли-ну штамма из Карачаево-Черкесии. Во втором кластере преобладали Pro- изоляты. В этот кластер входили штаммы, выделенные как в Карачаево-Черкесии, так и в Кабардино-Балкарии или на не указанной в паспортах территории. Отсутствие полной корреляции между принадлежностью к определенному генетическому кластеру и зависимостью или независимостью от пролина можно объяснить высокой вероятностью мутаций по данному признаку, обусловленной экологическими особенностями Центрально-Кавказского высокогорного очага. Еще одним объяснением присутствия Pro- штаммов в обоих кластерах может быть передача криптической 4 МДа плазмиды, чье присутствие в геноме коррелирует с данным признаком [19]. Однако данное предположение требует экспериментального подтверждения.

Следует также отметить, что по данным MLVA25-типирования штаммы из 01 очага, входящие в кластер cc01/A филогенетически ближе штаммам bv. medievalis из китайских очагов Y, I, J и K [9, 13, 14] (см. рис. 1), чем штаммам bv. medievalis из одного с ними очага, но вхо-

дящим в кластер cc01/B. Это может свидетельствовать о двукратном независимом заносе на данную территорию возбудителя чумы, оба клона которого сформировали относительно самостоятельные и стабильные паразито-ценозы. Автономность паразитоценозов со штаммами кластеров cc01/A и cc01/B можно объяснить высокой степенью расчлененности рельефа в границах 01 очага чумы, открытого в 1971 г. (основной носитель - Citellus musicus) [19].

Таким образом, на примере Центрально-Кавказского высокогорного очага показана большая достоверность MLVA25-типирования, позволяющего минимизировать диагностические ошибки при определении биоварной и очаговой принадлежности изолятов Y. pestis. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о целесообразности выделения в составе Центрально-Кавказского высокогорного очага двух автономных мезоочагов.

Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011-2015 гг.).

Сведения об авторах: Евсеева В.В. - научн. сотр., ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, e-mail: veramikrob@yandex.ru;

Платонов М.Е. - ст. научн. сотр., ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, e-mail: platonov@obolensk.org;

Говорунов И.Г. - зав. отделом информационных технологий, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, e-mail: govorunov@obolensk.org;

Дентовская Светлана Владимировна - зав. лаб. микробиологии чумы, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, e-mail: dentovskaya@obolensk.org;

Анисимов Андрей Павлович - зам. дир. по науч. работе, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора; автор, ответственный за контакты с редакцией и читателями. e-mail - anisimov@obolensk.org, a-p-anisimov@yandex.ru

Ефременко Д.В. - зав. лаб. индикации ООИ ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора, e-mail: labindic@mail.ru;

Кузнецова И.В. - научный сотрудник ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора, e-mail: labindic@mail.ru;

Куличенко А.Н. (Kulichenko A.N.) - дир. ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора, e-mail: snipchi@mail.stv.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Евченко Ю.М., Ефременко Д.В., Кузнецова И.В., Мезенцев В.М., Бе-лявцева Л.И., Платонов М.Е. и др. Изучение генетического разнообразия штаммов Y. pestis из Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 4: 51-5.

2. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М. и др. Отандартный алгоритм молекулярного типирования штаммов Yersinia pestis. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012; 3: 25-35.

3. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типи-рование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003; 1: 6-14.

4. Попов Ю.А., Ерошенко Г. А., Булгакова Е.Г, Смирнова Н.И. Разработка комплексного алгоритма генотипирования и методов оценки генетического разнообразия природных штаммов чумы и холеры. Проблемы особо опасных инфекций. 2009; 2: 5-10.

5. Трухачев А.Л., Лебедева С.А. Способы диагностики и дифференциации возбудителя чумы: внутривидовая дифференциация Yersinia pestis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2006; 1: 3-6.

6. Lindler L.E. Typing methods for the plague pathogen, Yersinia pestis. J. AOAC Int. 2009; 92 (4): 1174-83.

7. Parkhill J., Wren B.W., Thomson N.R., Titball R.W., Holden M.T., Prentice M.B. et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature. 2001; 413 (6855): 523-7.

8. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Светоч Т.Э., Ефременко Д.В., Кузнецова И.В., Дентовская С.В. и др. Филогеография полевочьих штаммов Yersinia pestis из природных очагов Кавказа и Закавказья. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 3: 18-21.

9. Li Y., Cui Y., Hauck Y., Platonov M.E., Dai E., Song Y. et al. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by MLVA: insights into the worldwide expansion of Central Asia plague foci. PLoS ONE. 2009; 4 (5): e6000.

10. Klevytska A.M., Price L.B., Schupp J.M., Worsham P.L., Wong J., Keim P. Identification and characterization of variable-number tandem repeats in the Yersinia pestis genome. J. Clin. Microbiol. 2001; 39 (9): 3179-85.

11. Pourcel C., Andre-Mazeaud F., Neubauer H., Ramisse F., Vergnaud G. Tandem repeats analysis for the high resolution phylogenetic analysis of Yersinia pestis. BMC Microbiol. 2004; 4: 22.

12. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Ефременко Д.В., Кузнецова И.В., Чиркова Е.В., Дентовская С.В. и др. DFR-типирование штаммов Yersinia pestis из природных очагов СНГ Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 108 (2): 42-5.

13. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M. et al. Different region analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. PLoS One. 2008; 3 (5): e2166.

14. Cui Y., Li Y., Gorge O., Platonov M.E., Yan Y., Guo Z. et al. Insight into microevolution of Yersinia pestis by clustered regularly interspaced short palindromic repeats. PLoS One. 2008; 3 (7): e2652.

15. Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., Eppinger M., Roumagnac P., Wagner D.M. et al. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. Genet. 2010; 42 (12): 1140-3.

16. Busch U., Nitschko H. Methods for the differentiation of microorganisms. J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1999; 722 (1-2): 263-78.

17. Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gramnegative bacterial foodborne pathogens. Infect. Genet. Evol. 2009; 9 (4): 430-40.

18. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's indexof diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26 (11): 2465-6.

19. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., ред. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004.

20. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17 (2): 434-64.

21. Zhou D., Han Y., Song Y., Huang P., Yang R. Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis. Microbes Infect. 2004; 6: 1226-34.

22. Попов Н.В., Слудский А.А., Попов Ю.А., Булгакова Е.Г., Удовиков А.И., Князева Т.В. и др. Совершенствование принципов типизации природных очагов чумы на территории России и других стран СНГ Проблемы особо опасных инфекций. 2005; 90 (2): 32-5.

REFERENCES

1. Evchenko Yu.M., Efremenko D.V., Kuznetsova I.V., Mezentsev V.M., Be-lyavtseva L.I., Platonov M.E. et al. Studies of genetic diversity of Yersinia pestis strains isolated in Central-Caucasian high-mountain natural plague focus. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; 4: 51-5.

2. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M. et al. Standard algorithm of molecular typing of Yersinia pestis strains. Zhurnal mikrobiologii, epi-demiologii i immunobiologii. 2012;

3. Kutyrev V.V., Smirnova N.I. Genodiagnosis and molecular typing of the pathogens for plague, cholera, and anthrax. Molekulyarnaya genetika, mik-robiologiya i virusologiya. 2003; 1: 6-14.

4. Popov Yu.A., Eroshenko G.A., Bulgakova E.G, Smirnova N.I. Development of complex genotyping algorithm and methods of evaluation of the genetic diversity of plague and cholera agents natural strains. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2009; 4: 5-10.

5. Trukhachev A.L., Lebedeva S.A. Methods of diagnosis and differentiation of plague pathogen: approaches to detection of atypical strains of Yersinia pestis by molecular biology. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2006; 1: 3-6.

6. Lindler L.E. Typing methods for the plague pathogen, Yersinia pestis. J. AOAC Int. 2009; 92 (4): 1174-83.

7. Parkhill J., Wren B.W., Thomson N.R., Titball R.W., Holden M.T., Prentice M.B. et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature. 2001; 413 (6855): 523-7.

8. Platonov M.E., Evseeva V.V., Svetoch T.E., Efremenko D.V., Kuznetsova I.V., Dentovskaya S.V. et al. Phylogeography of Yersinia pestis vole strains

isolated from natural foci of the Caucasus and South Caucasus. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 27 (3): 18-21. (in Russian) 9. Li Y., Cui Y., Hauck Y., Platonov M.E., Dai E., Song Y. et al. Genotyping and phylogenetic analysis of Yersinia pestis by MLVA: insights into the worldwide expansion of Central Asia plague foci. PLoS ONE. 2009; 4 (5): e6000.

10. Klevytska A.M., Price L.B., Schupp J.M., Worsham P.L., Wong J., Keim P. Identification and characterization of variable-number tandem repeats in the Yersinia pestis genome. J. Clin. Microbiol. 2001; 39 (9): 3179-85.

11. Pourcel C., Andre-Mazeaud F., Neubauer H., Ramisse F., Vergnaud G. Tandem repeats analysis for the high resolution phylogenetic analysis of Yersinia pestis. BMC Microbiol. 2004; 4: 22.

12. Platonov M.E., Evseeva V.V., Efremenko D.V., Kuznetsova I.V., Chirkova E.V., Dentovskaya S.V. et al.. DFR-typing of Yersinia pestis strains from the CIS natural foci. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2011; 108

13. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M. et al. Different region analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. PLoS One. 2008; 3 (5): e2166.

14. Cui Y., Li Y., Gorge O., Platonov M.E., Yan Y., Guo Z. et al. Insight into microevolution of Yersinia pestis by clustered regularly interspaced short palindromic repeats. PLoS One. 2008; 3 (7): e2652.

15. Morelli G., Song Y., Mazzoni C.J., Eppinger M., Roumagnac P., Wagner D.M. et al. Yersinia pestis genome sequencing identifies patterns of global phylogenetic diversity. Nat. Genet. 2010; 42 (12): 1140-3.

16. Busch U., Nitschko H. Methods for the differentiation of microorganisms. J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1999; 722 (1-2): 263-78.

17. Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of Gramnegative bacterial foodborne pathogens. Infect. Genet. Evol. 2009; 9 (4): 430-40.

18. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's indexof diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26 (11): 2465-6.

19. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., Eds. Natural Foci of Plague in the Caucasus, Caspian Region, Central Asia, and Siberia. Moscow: Meditsina; 2004.

20. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis. Clin. Microbiol. Rev. 2004; 17 (2): 434-64.

21. Zhou D., Han Y., Song Y., Huang P., Yang R. Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis. Microbes Infect. 2004; 6: 1226-34.

22. Popov N.V., Sludskiy A.A., Popov Yu.A., Bulgakova E.G., Udovikov A.I., Knyazeva T.V. et al. Improving the Principles of Typifying the Natural Plague Foci in the Territories of Russia and Other CIS Countries. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2005; 90

COMPARATIVE ANALYSIS OF THE MLVA25-AND MLVA7-TYPING ACCORDING TO THEIR ABILITY TO ASCERTAIN FOCAL AFFILIATION OF

YERSINIA PESTIS STRAINS BY THE EXAMPLE OF ISOLATES FROM THE CENTRAL-CAUCASIAN HIGHLAND NATURAL PLAGUE FOCUS

1Evseeva V. V., 'Platonov M. E, 'Govorunov I. G, 2Efremenko D. V., 2Kuznetsova I. V., 'Dentovskaya S. V., 2Kulichenko A. N, 'Anisimov A. P.

'State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russia; 2 Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol, Russia

Comparative analysis of the MLVA25- and MLVA7-typing ability to evaluate focal belonging of Y. pestis strains by the example of bv. medievalis isolates from the Central-Caucasian highland natural plague focus was carried out. The MLVA25-types of 82 isolates from this area were determined and included into the database containing information on 949 Y. pestis strains from other natural foci of Russia and other countries. Categorical-UPGMA dendrograms were created on the bases of the data concerning all 25 VNTR loci or only seven of them, which were recommended by the experts of the Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" for differentiation of the Y. pestis strains according to their affiliation to specific foci. The obtained data indicated greater possibility of diagnostic mistakes in the case of the MLVA7-typing and supported expediency of division of the Central-Caucasian highland natural plague focus into two sub-foci.

Key words: MLVA25-typing, MLVA7- typing, VNTR, Yersinia pestis, phylogeography

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-37-40