Моделирование динамических режимов биореакторов с учетом изменяющихся скоростей реакций

Абрамов О.В., Киласкин В.Е. , Торгашов А.Ю. МОДЕЛИРОВАНИЕ ДИНАМИЧЕСКИХ РЕЖИМОВ БИОРЕАКТОРОВ С УЧЕТОМ ИЗМЕНЯЮЩИХСЯ СКОРОСТЕЙ РЕАКЦИЙ

1. Введение

Особенность промышленной биотехнологии заключается в использовании биологических процессов и систем для получения разнообразной продукции. В качестве биологических систем могут использоваться бактерии, дрожжи, другие одноклеточные организмы, клетки растений и животных (клеточные культуры), а также отдельные ферменты и ферментные системы. Процессы ферментативного преобразования субстрата в продукт получили название «ферментация». В случае использования живых клеток также происходит преобразование субстратов с помощью собственных ферментов клетки. Такие процессы многие авторы [1,14-16] также называют ферментацией. Однако, в данном случае помимо реакций с субстратом и выделения продуктов жизнедеятельности в культуральную среду идет активное размножение самих микроорганизмов (или клеток культуры). Таким образом, имеет место одновременное протекание двух разных процессов, чего не наблюдается при использовании отдельных ферментов. Говоря строго, системы уравнений, описывающие состояние этих двух типов систем будут различны. С другой стороны, в литературе часто встречается термин «культивация». Как правило, его используют применительно только к процессам выращивания микроорганизмов.

Удобно разграничивать понятия «ферментация» и «культивация». Поэтому, далее под термином «ферментация» будут подразумеваться процессы преобразования субстратов в продукты при участии ферментов или биомассы. Термин «культивация» будет означать процесс преобразования субстратов в биомассу. Такое разделение особенно эффективно при рассмотрении математических моделей биотехнологических процессов. Очевидно, что процессы с участием микроорганизмов, применяемые для получения продуктов, выделяемых клетками в культуральную среду, являются совмещенными процессами ферментации и культивации.

Под биореактором понимается технологических аппарат, в котором протекают одновременно ферментация и культивация. Частным случаем биореактора считается ферментер, в котором реализуется лишь протекание процесса ферментации.

Биотехнологические процессы могут быть разделены по способу проведения на непрерывные, периодические и периодические с добавлением субстрата. В случае периодического процесса культуральную среду и микроорганизмы (или ферменты) помещают в биореактор и выдерживают в определенном режиме (перемешивание, температура, аэрация) без добавления свежей культуральной среды. В случае периодического процесса с добавлением субстрата, к культуре непрерывно или периодически подается свежая культуральная среда. При этом никакого отвода среды с клетками не производится, в результате чего суммарный объем системы растет. В случае непрерывного процесса свежая культуральная среда поступает в реактор непрерывно, и параллельно отводится такой же объем клеточной суспензии.

Все перечисленные варианты проведения процесса имеют достоинства и недостатки, и следовательно, - ограничения в применении. С точки зрения управления и оптимизации, наиболее простыми являются периодические процессы, так как в этом случае по ходу процесса возможно регулировать только интенсивность перемешивания и аэрации, а так же поддерживать оптимальную температуру и pH. Эффективность такого процесса определяется главным образом оптимальным соотношением изначально загружаемых компонентов. Для периодических процессов с добавлением субстрата и для непрерывных процессов в качестве управляющих воздействий могут выступать скорость разбавления, концентрация подаваемых субстратов, концентрация кислорода, количество биомассы.

Цель настоящей работы состоит в построении динамической модели биореактора с учетом непостоянства скоростей реакций, что позволит осуществить более точное прогнозирование и контроль качества продуктов.

2. Математическое описание процессов ферментации. Модель кинетики Михаэлиса-Ментена.

Фундаментальным представлений о механизмах ферментативных реакции является представление о

фермент-субстратном комплексе, образующемся на пути трансформации субстрата в продукт под действием фермента. Считается, что механизмы ферментативных реакций выглядят следующим образом: субстрат образует комплекс с активным центром фермента, в комплексе происходят фермент-субстратные изменения, образуются продукты реакции, которые уходят из активного центра, освобождая его для взаимодействия с новой молекулой субстрата. В простейшем случае механизм реакции можно представить следующим образом:

Е+3<=>ЕБ->Е+Р,

где Е-фермент, S-субстрат, Р-продукт, ES-фермент-субстратный комплекс. Данному механизму соответствует классическое кинетическое уравнение Михаэлиса-Ментен:

V = ГтаХЗ/К + Б) ,

где V - скорость образования продукта Р, Vтах - максимальная скорость образования продукта Р, Б -концентрация субстрата, Кт - константа Михаэлиса. Функция у(Б) имеет гиперболический характер. Данное уравнение выполняется для других механизмов, более сложных, чем механизм Михаэлиса-Ментена [1]. Однако существует множество механизмов, для которых уравнение Михаэлиса-Ментена не выполняется. Эти механизмы связаны с взаимодействием фермента с продуктами реакции, а также с ингибированием или активацией реакции избытком субстрата.

При ингибировании реакции избытком субстрата процесс ферментации в большинстве случаев может быть описан следующей кинетической схемой:

Е+3<=>ЕБ->Е+Р,

Предполагается, что к фермент-субстратному комплексу ES присоединяется вторая молекула субстрата, в результате чего образуется неактивный комплекс ES2. Данная схема аналогична схеме бесконкурентного ингибирования [1] и дает следующее уравнение скорости:

V = УтаХЗ/К + Б + ^/КЛ ,

Поскольку это уравнение содержит член, включающий Б2, оно отличается от уравнения Михаэлиса -Ментен. Вклад члена становится заметным только при высоких концентрациях субстрата, поэтому,

если Б достаточно мала, скорости реакции приближаются к значениям, удовлетворяющим уравнению Михаэлиса - Ментен, однако при больших значениях Б величина V стремится не к утах, а к нулю. Функция у(Б) в этом случае имеет максимум при Б = (КпК±)1/2 , причем это максимальное значение не равно

Ингибирование продуктом реакции может идти по различным механизмам (конкурентный, неконкурентный, бесконкурентный, смешанный), причем каждый механизм включает ряд частных случаев. Кинетические уравнения и аналитические зависимости большинства из них представлены в литературе [1-10].

3. Математическое описание совмещенных процессов культивации и ферментации. Модель кинетики Моно.

Зависимость скорости роста клеточной культуры от концентрации лимитирующего субстрата можно представить в следующем виде [1]: dX/dt = цХ , где Х - биомасса, ц - удельная скорость роста.

Для функции ц предложено множество аналитических выражений, полученных теоретически или экспериментально. Наиболее простой вид функции ц сходен с уравнением Михаэлиса-Ментена. В соответствии с этим выражением, удельная скорость ц зависит от концентрации лимитирующего субстрата (обычно -источника углерода или азота) S, максимальной удельной скорости роста цтax и субстратспецифичной константы KS:

ц = "fimaxS/Ks + S ,

Последнее уравнение получило название уравнения Моно. По аналогии с ферментативной кинетикой такое поведение системы можно описать следующей формальной схемой:

S+N<===>SN---------> P

Уравнение Моно описывает процессы неосложненного роста культуры, находящейся в экспоненциальной фазе, при условии, что культуральная среда содержит большой избыток всех субстратов кроме одного - лимитирующего, обозначенного как S. Очевидно, что при увеличении концентрации субстрата, удельная скорость роста также возрастает и стремится к цтах при S ^ ~. Уравнение не учитывает ряд эффектов, которые обычно имеют место на практике. Одним из таких эффектов является ингибирование избытком субстрата.

Ингибирование избытком субстрата так же, как и в случае ферментативной реакции может быть описано следующей кинетической схемой [1]: ks k

S+N<===>SN --------> P

При этом предполагается, что субстрат взаимодействует с клеткой с образованием промежуточной формы SN, которая может или делиться, или обратимо ингибироваться избытком субстрата. В этом случае удельная скорость роста клеточной популяции описывается выражением, называемым уравнением Холдейна:

Ц=ЦmaxS/(Ks+S+S2/Ki) ,

где Ks - константа сродства к субстрату, К± - константа ингибироваться избытком субстрата. Зависимость удельной скорости роста клеточной популяции от концентрации субстрата для режима ингибирования его избытком является экстремальной характеристикой. Данная функция имеет максимум при S = (KsKi)1/2. При малых концентрациях субстрата, в условиях S2 / Ki << S и S << Ki удельная скорость роста увеличивается с возрастанием концентрации субстрата:

ц = Vmaxß/Ks.

При больших концентрациях субстрата, когда S >> Ki и S >> KS скорость роста уменьшается при увеличении концентрации субстрата и в пределе стремиться к нулю:

ц = VmaxKi/S.

Таким образом, для культур, скорость роста которых описывается вышеприведенным уравнением существует такое значение концентрации субстрата, при котором скорость роста популяции максимальна.

Другим часто встречающимся эффектом, приводящим к отклонению кинетики роста клеточных популяций от экспоненциальной кривой, связан с ингибированием их роста продуктами жизнедеятельности. Для описания таких систем предложен ряд уравнений. Например, Н.Д. Иерусалимским рекомендовано уравнение вида:

ц=цтах (S/Ks+S)(Kp/Kp+P) ,

где KP - константа Иерусалимского, численно равная концентрации продукта, при которой удельная скорость роста равна половине скорости роста в среде без вредного продукта; Р - концентрация продукта. Из уравнения видно, что увеличение концентрации метаболита Р уменьшает удельную скорость роста, причем полное ингибирование роста будет при Р ^

В случае, если полное ингибирование роста наблюдается при достаточно низком значении Р, имеет место следующая зависимость: ц=ц^з^ (S/Ks+S)(l-P/P^a^)m,

где Pmax - концентрация метаболита, при которой рост популяции прекращается, m - эмпирическая константа.

4. Математическое описание непрерывного процесса культивации и ферментации

Культивирование клеток в проточных биореакторах - один из наиболее перспективных и развитых способов их выращивания. Преимущества этого способа культивирования состоят в стандартности условий проведения процесса, высокой производительности, возможностях тонкого управления кинетикой роста популяции. Кинетические закономерности роста и эволюции клеточных популяций в открытых системах достаточно просты и наиболее изучены.

Наиболее простым случаем является ситуация, когда подается единственный лимитирующий субстрат

Sin ( либо культуральная среда содержит большой избыток всех необходимых субстратов кроме одного -лимитирующего) и продуцируется один продукт P. В реакторе поддерживается постоянный объем среды

V, поэтому объемные скорости F подачи и отвода среды должны быть одинаковыми. Предполагается, что режим перемешивания в реакторе организован таким образом, что обеспечивает постоянные по всему объему концентрации субстрата S, продукта Р и клеток Х, то есть близок к режиму идеального смешения.

Динамика изменений в системе концентраций клеток Х определяется скоростью роста культуры ц и скоростью вывода ее из реактора: dX/dt = цХ - F/V*X.

Параметр F/V называется скоростью разбавления D. С учетом данной замены последнее уравнение запишется следующим образом: dX/dt = цХ - DX

Аналогичном образом описывается динамика изменений концентрации продукта: dP/dt = vX - DX

где v - удельная скорость биосинтеза, которая в простейшем случае может быть определена как: v = vmaxS/Ks + S ,

Ks в данном случае - субстратспецифичная константа.

Изменение концентрации исходного субстрата описывается дифференциальным уравнением: dS/dt = DSin - DS - Yx цХ - Yp vX,

где Yx - коэффициент выхода биомассы, Yp - коэффициент выхода продукта. Первое слагаемое в этом уравнении характеризует скорость ввода субстрата, второе - вывод из системы непрореагировавшего субстрата, третье - расход субстрата в результате его потребления для роста культуры, четвертое -

расход субстрата для биосинтеза продукта. Коэффициенты выхода показывают, сколько субстрата затрачивается на производство единицы биомассы или продукта:

Yx = - dS/dX ; Yp = - dS/dP;

В литературе [2-7] встречается другое определение коэффициентов выхода:

Y'x = - dx/dS ; Y'p = - dP/dS,

соответственно, и другой вид уравнений, включающих их. Вид зависимостей для v и ц может быть различным. Например, в статье [8] приводятся следующие зависимости:

Ц = Uax

v = VmaxS/KS2 + S.

5. Математическое описание периодического процесса культивации и ферментации

Культивирование клеток в реакторах периодического типа - наиболее распространенный на сегодняшний день способ их выращивания. Преимущества этого способа культивирования состоят, главным образом, в относительной простоте реализации по сравнению с непрерывным. Причем таким способом можно выращивать любые клетки, включая рекомбинантные микроорганизмы с введенными в них плазмидами. Кинетические закономерности роста и эволюции клеточных популяций в таких системах достаточно просты и хорошо изучены.

Как и в случае непрерывного процесса, рассмотрим кинетику односубстратной системы в режиме идеального перемешивания с получением единственного продукта P.

Динамика изменения в системе концентраций клеток Х определяется только скоростью роста культуры ц:

dX/dt = цХ.

Аналогичном образом описывается динамика изменений концентрации продукта: dP/dt = vX. где v - удельная скорость биосинтеза.

Изменение концентрации исходного субстрата будет описываться дифференциальным уравнением: dS/dt=-YxpX-YpvX.

Характер зависимостей ц и v может быть различным для каждого конкретного технологического процесса. В статье [4] приводится пример кинетики реального технологического процесса с использованием гриба Cyathus striatus, выращиваемого в аэробных условиях: dPS/dt = - qX dX/dt = цХ dP/dt = vX

dS/dt = qX - Yx цХ - Yp vX

где q - удельная скорость расщепления полисахарида PS, который в данном случае является пре-субстратом. Функции q, ц и v имеют вид: q = qm*xPS/(KS0 + PS) ,

ц = K*x(S/(KSl + S))(pO2 / (KpO2 + pO2 )) ,

v = vmnx(S/(KS2 + S))(Ki / (Ki + pO2 )) ,

где qmax - максимальная удельная скорость расщепления полисахарида, Kso, Ksi, Ks2 - соответствующие субстратспецифические константы, pO2 - отрицательный десятичный логарифм концентрации растворенного кислорода, KpO2 - кислородспецифическая константа, K± - константа ингибирования.

В случае периодического процесса с добавлением субстрата объем системы изменяется, поэтому в систему дифференциальных уравнений добавляется еще одно: dV/dt = F,

где F - объемный поток свежей культуральной среды. При динамическом изменении объема изменяются и уравнения динамики всех компонентов внутри биореактора. В результате, периодический процесс с добавлением субстрата может быть описан следующей системой: dX/dt = цХ - F/V*X dP/dt = vX - DP

dS/dt = F/V (Sin - S) - Yx vX - Yp vX dV/dt = F

Очевидно, что первые три уравнения совпадают с соответствующими уравнениями для непрерывного процесса.

В работе [6] приводится пример кинетики реального технологического процесса с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращиваемых в аэробных условиях для производства этанола: dX/dt = vX - F/V*X dP/dt = vX - DP dS/dt = F/V (Sin - S) - qsX dV/dt = F

dDOT/d.t = ki(100 - DOT) - 14000XqO

где DOT - процент насыщения культуральной среды кислородом, kj_ - коэффициент массопередачи по

жидкой фазе для кислорода, qO - удельная скорость потребления кислорода, qS - удельная скорость потребления субстрата.

6. Моделирование динамики биореактора в условиях изменяющихся скоростей реакций

Рассматривается следующая модель динамики биореактора:

X = rx -DX,

s = -ylrl-y1r1+D{Sin-S),

Р = r2— DP,

где ri=^X, Г2=уХ - скорости реакций роста биомассы и биосинтеза, соответственно, а ^ и v их

удельные значения (*).

Непостоянство удельных скоростей реакций вызвано изменяющейся скоростью разбавления D реагирующих веществ в биореакторе. Выполнено моделирование и исследовано поведение биореактора при условии, что D является некоторой гармонической функцией (рис.1-3), недоступной наблюдению.

Приведенные модели могут быть использованы для синтеза систем управления биотехнологическими процессами.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 06-08-96014-р_восток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: Практический курс. - М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. -

720 с.

2. Kartik B. Ariyur, Krstic M. Real-time optimization by extremum-seeking control, John Wiley

& Sons, 2003.

3. Mhamdi A., Marquardt W. Estimation of reaction rates by nonlinear system inversion // Proc. ADCHEM'2003, Hong-Kong.

4. Schneider R., Jalelr N. A., Munack A., Leigh J.R. Adaptive predictive control for the fed batch fermentation process // Proc ACC'94, 21-24 March, 1994. P. 249 - 254.

5. Renard F., Vande Wouwer A., Valentinotti S., Dumur D. Bioprocess robust control using minimal a priori knowledge // Proc. IFAC'2005 World Congress, Czech, Praha.

6. Abhishek S. Soni, Robert S. Parker. Fed-batch bioreactor control using a multi-scale model

// Proceedings of the American Control Conference Denver, Colorado June 4-6, 2003. P. 2371 -

2376.

7. Renard F., Vande Wouwer A., Valentinotti S., Dumur D. Robust control with youla parametri-

zation of yeast fed-batch cultures // Proc. ADC0NIP'2005, Korea, Seoul.

8. Farza M., Busawon K., Hammouri H. Simple nonlinear observers for on-line estimation of ki-

netic rates in bioreactors // Automatica. 1998. Vol. 34, №. 3. P. 301-318.

9. Tiberiu M. Leiba, Carmo J. Pereiraa, Villadsenb J. Bioreactors: a chemical engineering perspective // Chemical Engineering Science. 2001. Vol. 56. P. 5485-5497

10. Feng-Sheng Wang, Tzu-Liang Su, Horng-Jhy Jang. Hybrid differential evolution for problems

of kinetic parameter estimation and dynamic optimization of an ethanol fermentation process // Ind. Eng. Chem. Res. 2001. Vol. 40. P. 2876-2885.

11. Mark E. Davis, Robert J. Davis. Fundamentals of chemical reaction engineering

12. Диксон М. Уэбб Э. Ферменты : в 3 т. / перев. с англ. Л.М. Гинодман, М.И. Левянт. - М.:

Мир, 1982. - 1086 с.

13. Бекер М. Е. Введение в биотехнологию. - М: Пищевая промышленность, 1978.- 231 с.

14. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. - СПб. : Наука, 1995. - 600 с.

15. Биотехнология: принципы и применение / под ред. И. Хиггинс, Д. Бест, Дж. Джонс ; перев. с

англ. А.С. Антонов. - М.: Мир, 1988. - 480 с.

16. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / перев. с англ.

Н.В. Баскакова, О.А. Колесникова, Ю.М. Романова, [и др.]. - М.: Мир, 2002. - 592 с.

t,hr

Рис.1. Колебания биомассы X

t,hr

Рис.2. Расход субстрата S

1/6‘с!

Рис.3. Вариации продукта Р