ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬДЕГИДОВ
ENZYMATIC METHOD OF OBTAINING ALDEHYDES

Объектом изобретения является способ получения альдегидов, а также продуктов их окисления и восстановления.
Ферментативные способы получения альдегидов многократно описаны в литературе.
Так, например, в международной заявке WO 2009001304 описывается способ получения альдегидов из многократно ненасыщенных жирных кислот при совместном действии 13-гидропероксид-лиаз.
Биохимические пути получения 3-метилбутаналя описываются в публикации Smit с соавт., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009, 81, 987-999.
Получение альдегидов из спиртов с помощью метанол-оксидаз и каталаз из Pichia, Hansenula, Candida или Torulopsis представлено в патенте США US 5783429.
Согласно международной заявке WO 2001031047 при использовании ксилол- или алкан-монооксигеназ могут получаться ароматические производные альдегидов.
3-Гидроксипропионовый альдегид (3-ГПА) может преобразовываться до акриловой кислоты, важного мономера для промышленного получения полимеров и синтетических материалов, а также до сложных эфиров акриловой кислоты, также имеющих важное значение. Другими значимыми продуктами, которые могут быть получены из 3-гидроксипропионового альдегида, являются 1,3-пропандиол (путем восстановления), 3-гидроксипропионовая кислота (путем окисления) и акролеин (путем дегидратации). Поскольку до сих пор не имеется коммерческих источников 3-гидроксипропионового альдегида, интенсивно исследуется получение 3-гидроксипропионового альдегида, в частности, в форме рейтерина, из глицерина. Так, уже в конце восьмидесятых годов Talarico и Dobrogosz, Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33, 674-679, описывают ферментативное получение 3-гидроксипропионового альдегида из глицерина с помощью Lactobacillus reuteri.
Аналогичный способ с использованием лимитирования кислорода описывается в патенте США US 5413960.
Патент Дании DK 180099 раскрывает способ с непрерывной подачей глицерина и использованием Lactobacillus reuteri DSM12246.
Doleyres с соавт., AppI Microbiol Biotechnol. 2005 Sep; 68 (4): 467-74 описывают способ получения 3-гидроксипропионового альдегида в L. reuten ATCC 53608 при различных условиях роста и показывают, что повторное использование биокатализатора по причине сильно убывающей активности является невозможным.
Патент Китая CN 1778935 описывает одностадийную ферментацию раствора глицерина с помощью Klebsiella pneumoniae DSM2026 в присутствии семикарбазида.
Патент США US 4962027 описывает способ получения 3-гидроксипропионового альдегида в процессе аэробной двухстадийной ферментации с помощью Klebsiella pneumoniae NRRL В-4011, причем на первой стадии сначала генерируется клеточная масса и глицерин-дегидратаза, а на второй стадии в присутствии семикарбазида глицерин превращается в 3-гидроксипропионовый альдегид.
12
Европейский патент ЕР 1669457 описывает биотехнологическое получение 3-гидроксипропионового альдегида с помощью (среди прочего) K. pneumoniae с добавлением кофермента B практически с количественным выходом посредством повышения соотношения клетка/субстрат.
Общим для всех описанных способов является то, что выходы и скорости превращения являются низкими. Кроме того, в описанных способах всегда необходимы высокие затраты на подготовку биокатализатора, который потом обладает лишь короткой продолжительностью службы, то есть, который затем может использоваться только в течение короткого времени.
Таким образом, задачей данного изобретения была разработка способа, который преодолевает описанные недостатки из уровня техники.
Неожиданным образом было обнаружено, что способы, описанные ниже, могут решить задачу, поставленную в данном изобретении.
Следовательно, объектом данного изобретения является способ получения альдегидов, включающий следующие стадии процесса: А) приведение в контакт предпочтительно водного раствора вицинального диола с гидролиазой, В) разделение альдегида, образовавшегося на стадии процесса А), и этой гидролиазы, С) по меньшей мере одно повторение стадии процесса А) и В) с участием гидролиазы, полученной со стадии процесса В), и при необходимости D) выделение образовавшегося альдегида, отличающийся тем, что этот способ проводится в присутствии соединения, образующего связь с этим альдегидом.
Другим объектом изобретения является способ получения продуктов окисления и восстановления альдегидов, полученных с помощью вышеуказанного способа.
Преимуществами способа согласно изобретению являются почти количественный выход альдегида в пересчете на использованный спирт, долгий срок службы гидролиазы, используемой в качестве биокатализатора, а также возможность ее повторного использования.
Таким образом, становится возможным непрерывный способ проведения процесса.
Другим преимуществом способа согласно изобретению является то, что отсутствует необходимость подавления побочного активного воздействия на образовавшийся альдегид гидролиазы, используемой в качестве биокатализатора, такого как, например, дальнейшее восстановление альдегида до спирта.
Еще одним преимуществом данного изобретения является то, что способ согласно изобретению позволяет работать по большей части при исключении или соответственно при уменьшении количества кислорода, благодаря чему может уменьшаться коррозия и нежелательное окисление, например продукта, становится возможным более простое аппаратурное оформление, и может экономиться энергия, а также предотвращаются другие известные проблемы газообразования в биотехнологическом реакторе, такие как, например, образование пены.
Под термином «альдегид» в контексте данного изобретения понимают также гидраты и димеры альдегида, а также смеси этих соединений, а также, например, в случае 3-гидроксипропионового альдегида - рейтерин.
Все указанные процентные величины (%), если не указано иное, представляют собой массовые проценты.
В качестве гидролиаз в способе согласно изобретению могут использоваться ферменты, которые перечислены в разделе классификации ферментов (КФ, англ. ЕС) ЕС 4.2.1.X.
12
12
В данном случае для способа согласно изобретению предпочтительны, прежде всего, такие гидролиазы, которые активны независимо от кофермента B, то есть которые проявляют активность гидролиазы также и в отсутствие кофермента B или заменяющих веществ/аналогов для этого соединения, таких как, например, корриноиды, кобаламины. Примеры представителей таких гидролиаз можно позаимствовать из международной заявки WO 200814864.
Гидролиазы, предпочтительно используемые в способе согласно изобретению, представляют собой глицерин-дегидратазы или соответственно дегидратазы диолов, а также пропандиол-дегидратазы (ЕС 4.2.1.30, ЕС 4.2.1.28).
В этой связи в способе согласно изобретению используются, в частности, дегидратазы глицерина, которые могут быть выделены из микроорганизмов, выбираемых из группы родов: Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Enterobacter, Caloramator, Salmonella и Listeria, особенно предпочтительно дегидратазы глицерина выбираются из группы видов Klebsiella pneumoniae, Citrobacter pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus leichmannii, Citrobacter intermedium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Enterobacter agglomerans, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium kluyveh, Caloramator viterbensis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgardii, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes и Listeria innocua.
Используемые дегидратазы глицерина предпочтительно кодируются генами, выбираемыми из группы, состоящей из генов pduC, pduD, pduE, pddA, pddB, pddC, dhaB, dhaC, dhaE и gIdABC из Lactobacillus reuteri ATCC55730. Кроме того, предпочтительным является использование варианта дегидратазы глицерина SHGDH22, описанного в международной заявке WO-A-2004/056963, которая имеет предложенный в международной заявке WO 2004056963 номер последовательности 322 (SEQ.-ID-Nr.322). Нуклеотидные последовательности этого и других подходящих генов для дегидратазы глицерина можно узнать, например, из «Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes» (база данных KEGG), базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации Национальной Медицинской Библиотеки США (National Center for Biotechnology Information (NCBI) National Library of Medicine (Bethesda, MD, США)) или из базы данных по нуклеотидным последовательностям Европейской молекулярно-биологической лаборатории (European Molecular Biologies Laboratories).
Что касается дегидратаз диолов, то может быть предпочтительным использовать в способе, прежде всего, дегидратазы диолов, которые могут быть выделены из микроорганизмов, выбираемых из группы родов Klebsiella, Propionibacterium, Clostridium, Lactobacillus, Salmonella, Citrobacter, Flavobacterium, Acetobacterium, Brucella и Fusobactehum, особенно предпочтительно могут быть выделены из микроорганизмов, выбираемых из группы видов Klebsiella pneumoniae, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium glycolicum, Lactobacillus brews, Salmonella typhimuhum, Citrobacter freundii, Lactobacillus buchneri, Brucella melitensis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes и Listeria innocua.
Что касается дегидратаз пропандиола, то может быть предпочтительным использовать в способе, прежде всего, дегидратазы пропандиола, которые могут быть выделены из микроорганизмов, выбираемых из группы родов Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Lactobacillus, Propionibacterium и Salmonella, особенно предпочтительно могут быть выделены из микроорганизмов, выбираемых из группы видов Citrobacter freundii, Clostridium glycolicum, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus collinoides, Propionibacterium freudenreichii и Salmonella typhimurium.
12
В случае когда гидролиаза, используемая в способе согласно изобретению, является ферментом, зависимым от витамина B, может быть предпочтительным проводить стадию процесса А) в присутствии фермента или ферментного комплекса, обладающего активностью глицерин-дегидратазы-реактивазы или соответственно диол-дегидратазы-реактивазы, поскольку при некоторых обстоятельствах гидролиаза может инактивироваться путем связывания этим витамином. Подобная реактиваза описана, например, в публикации Mori с соавт., J.Biol. Chem. 272: 32034 (1997). Предпочтительно используются реактивазы, которые могут выделяться из организма, из которого может быть выделена соответствующая гидролиаза. Подходящие диол-дегидратазы-реактивазы известны из Klebsiella oxytoca (номера в международном Банке генов GenBank Nos: AAC15871, AF017781; GenBank Nos: AAC15872, AF017781), Salmonella typhimurium (GenBank Nos: AAB84105, AF026270; GenBank Nos: AAD39008, AF026270) и Lactobacillus collinoides (GenBank Nos: CAD01092, AJ297723; GenBank Nos: CAD01093, AJ297723), подходящие глицерин-дегидратазы-реактивазы из Klebsiella pneumoniae (смотрите международную заявку WO 2008137403).
Гидролиазы, используемые в способе согласно изобретению, могут использоваться во всех известных специалисту формах доступности. Так, используемые гидролиазы могут применяться в виде изолированного фермента, например, из рекомбинантной экспрессирующей системы, или в качестве компонента ферментного комплекса. Предпочтительно используются гидролиазы в форме цельноклеточного реактора, то есть эти гидролиазы находятся в биологической клетке, предпочтительно в клетке, которая экспрессирует эту гидролиазу.
Клетки, имеющие гидролиазу, могут экспрессировать эту гидролиазу уже в качестве клеток дикого типа или могут быть генетически модифицированного типа так, чтобы они обладали активностью гидролиазы только в результате генно-инженерного изменения.
В качестве клеток дикого типа, содержащих гидролиазу, в способе согласно изобретению могут использоваться клетки, которые описаны выше как микроорганизмы, из которых эти гидролиазы могут быть выделены.
Клетки, измененные генной инженерией, которые содержат подходящие гидролиазы и могут использоваться в способе согласно изобретению, описаны, например, в международной заявке WO 2008148640, которая является в данном описании ссылкой.
1
1
+
+
+
Кроме того, может быть преимуществом, понизить склонность клеток к восстановительному образованию побочных продуктов из альдегидов, в частности, тенденцию к восстановлению образующихся альдегидов до соответствующих спиртов, с помощью соответствующей генно-инженерной модификации этих клеток. Например, в случае, если альдегид, который следует получить по способу согласно изобретению, представляет собой 3-гидроксипропионовый альдегид, используются клетки с пониженной по сравнению с их диким типом активностью фермента E, который может восстанавливать 3-гидроксипропионовый альдегид до 1,3-пропандиола. Фермент E (1,3-пропандиол-дегидрогеназа, редуктаза 3-гидроксипро-пионового альдегида, 1,3-пропандиол:НАД-оксидоредуктаза или пропан-1,3-диол:НАД-1-оксидоредуктаза; ЕС 1.1.1.202) катализирует следующую реакцию: 3-гидроксипропионовый альдегид + НАД(Ф)·Н → 1,3-пропандиол + НАД(Ф). Такие ферменты представляют собой, например, белки с регистрационными номерами в международном Банке генов GenBank АР007281.1, EDX43365.1, BAG24545.1, ABQ82306.1, ABO43839.1, EEI08979.1, EEI66346.1, EEI73647.1, EEJ92522.1, EEI09194.1, EEI73500.1, ABQ83973.1 или BAG26138.1.
По этим данным для клетки, содержащей соответствующую гидролиазу, которая используется в способе согласно изобретению, могут идентифицироваться соответствующие оксидоредуктазы и понижаться их активность в сравнении с их диким типом.
Под используемой формулировкой «пониженная активность фермента» предпочтительно понимают активность, пониженную на коэффициент по меньшей мере 0,5, особенно предпочтительно по меньшей мере 0,1, более этого предпочтительней по меньшей мере 0,01, помимо этого еще более предпочтительней по меньшей мере 0,001 и в высшей степени предпочтительно по меньшей мере 0,0001. Понижение активности определенного фермента может осуществляться, например, при помощи целевой или ненаправленной мутации, путем добавления конкурентных или неконкурентных ингибиторов или с помощью других, известных специалисту операций для подавления синтеза определенного фермента.
1
Для снижения активности фермента E путем целенаправленной мутации рассматривают, например, направленное выключение гена (англ. knockout), при котором, например, удаляются промотор активных последовательностей целевого гена, активные (необходимые для каталитической функции фермента) области целевого гена или весь целевой ген, замещаются чужеродной ДНК или прерываются чужеродной ДНК. Кроме того, специалисту известны различные техники подавления экспрессии (сайленсинга) генов, которые при помощи антисмысловых нуклеиновых кислот или малых интерферирующих РНК (миРНК, англ. siRNA) специфически понижают или вовсе полностью предотвращают транскрипцию или соответственно трансляцию отдельного гена. Это подавление в зависимости от выбранной системы может осуществляться транзиторно, быть индуцируемым или конституитивным.
1
Также специалисту известны методы, с помощью которых можно целенаправленно задавать отдельные точечные мутации в целевых генах. Кроме того, специалисту известны методы, с помощью которых можно ненаправленно задавать мутации в целевых генах, чтобы после этого селекционировать клетки, которые обладают пониженной активностью фермента Е. Так, подобные мутации могут вызываться, например, благодаря природной частоте появления дефектов при репликации генетического материала или из-за подверженности клеток физическим или химическим патогенным факторам, таким как, например, УФ-облучение, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, этилметансульфонат, нитрозокислоты, гидроксиламин или 4-нитрохинолин-1-оксид.
Клетки, содержащие гидролиазу, используемую в способе согласно изобретению, могут быть живыми или мертвыми, причем предпочтительными являются живые клетки.
Может быть предпочтительным, если используемые в качестве гидролиазы живые клетки, содержащие гидролиазу, во время проведения процесса содержатся в подходящей среде, которая снабжает их веществами, необходимыми для роста. Правда, оказалось, что в отношении содержания кислорода может быть предпочтительным, ограничивать его количество. Следовательно, является предпочтительным, что используемые в качестве гидролиазы живые клетки, содержащие гидролиазу, на стадии процесса А) используются при микроанаэробных или анаэробных условиях. Микроанаэробные или анаэробные условия являющиеся предпочтительными, отличаются тем, что среда, заключающая используемые в качестве гидролиазы живые клетки, содержащие гидролиазу, имеет содержание растворенного кислорода менее 1 мг/л, предпочтительно менее 0,5 мг/л, прежде всего, менее 0,1 мг/л, в пересчете на всю эту среду. Эти условия могут достигаться, например, благодаря тому, что среду, заключающую эти клетки, дополнительно не обрабатывают воздухом или кислородом, то есть не пропускают их через нее, а при необходимости резервуар, содержащий реакционную массу, насколько возможно дополнительно герметично закрывают.
Для того чтобы разделение альдегида и гидролиазы, которое следует произвести на стадии процесса В), можно было провести упрощенно, является предпочтительным, если эта гидролиаза иммобилизована на носителе. В случае, если гидролиаза используется в виде свободного, выделенного фермента, в распоряжении у специалиста имеются многие методы иммобилизации фермента, такие как, например, связывание с эпоксид-активированными материалами носителей и описанные в литературе способы, такие как, например, Mateo с соавт. Advances in the design of new epoxy Supports for enzyme immobilization-stabilization, Biochem Soc Trans. 2007 Dec; 35 (Pt 6): 1593-601 и Balcao с соавт., Bioreactors with immobilized lipases: state of the art, Enzyme Microb Technol. 1996 May 1; 18 (6): 392-416.
В случае, если в качестве гидролиазы используются клетки, обладающие активностью гидролиазы, для иммобилизации клеток могут применяться известные специалисту способы, такие как, например, методы с использованием альгината кальция. В частности, в этой связи особенно подходящим является описанный в немецкой заявке на патент DE 102007031689 метод, основанный на силоксанах, а также иммобилизация клеток с помощью коммерчески доступного полимера Lentikat-Liquid.
В способе согласно изобретению на стадии процесса А) могут использоваться замещенные и незамещенные вицинальные диолы;
предпочтительно заместители выбираются из группы, включающей карбоксильные, амино-, сложноэфирные, изоцианатные и гидроксильные группы, причем особенно предпочтительной является OH-группа.
В способе согласно изобретению предпочтительно используются вицинальные диолы с длиной углеродной цепи от 2 до 20, прежде всего, от 2 до 12 и наиболее предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода. К предпочтительным вицинальным диолам, используемым в способе согласно изобретению, причисляют, в частности, сахара и сахарные спирты с числом атомов углерода от 3 до 6, такие как, например, сорбитол; особенно предпочтительными в этой связи являются 1,2-пропандиол, этиленгликоль и глицерин.
Прежде всего, в способе согласно изобретению в качестве вицинального диола используется глицерин, так что получаемый альдегид представляет собой 3-гидроксипропионовый альдегид. Помимо глицерина, используется, в частности, также 1,2-пропандиол, причем в качестве альдегида получается пропаналь. Этот альдегид может превращаться в н-пропанол и пропионовую кислоту путем легко следующего затем диспропорционирования.
Вицинальный диол на стадии процесса А) используется в интервале концентраций от 0,01% масс. до 50% масс., предпочтительно от 0,2% масс. до 20% масс., в пересчете на всю реакционную смесь.
На стадии процесса В) альдегид, образовавшийся на стадии процесса А), и гидролиаза разделяются.
При этом отделение гидролиазы, в частности, иммобилизованной на носителе, осуществляется с помощью способов разделения, известных специалисту, таких как, например, центрифугирование. Допустимо, в случае, если на стадии процесса А) в качестве гидролиазы используются клетки, содержащие гидролиазу, отделение этих клеток от альдегида, например, с помощью подходящего фильтра, к примеру, с помощью фильтра с молекулярной массой отсекаемой фракции в интервале от 20 до 200 кДа. Допустимо также использование центрифуги, подходящего седиментационного оборудования или комбинации этих установок, причем особенно предпочтительно сначала по меньшей часть клеток отделить осаждением, а затем подавать альдегид, частично очищенный от этих клеток, на ультрафильтрацию или центрифугирующую установку.
Отделенные таким образом клетки, если они были получены на нескольких проведенных друг за другом ступенях разделения, при необходимости объединяются и могут снова непосредственно подаваться на стадию процесса А). Однако может оказаться предпочтительным, перед повторным проведением стадии процесса А) клетки, содержащие гидролиазу, еще промывать, причем эта промывка предпочтительно осуществляется уже с помощью той же среды, которая используется на стадии процесса А).
Особенно предпочтительно эта промывка осуществляется с помощью среды, используемой на стадии процесса А), с дополнительным добавлением глюкозы; тем самым в процессе непосредственно самой биотрансформации благоприятным образом может подавляться образование побочных продуктов - производных альдегида.
Для промывки клеток они могут, например, быть повторно суспендированы в подходящем объеме среды, использованной на стадии процесса А), а затем отделены от этой среды с помощью описанных выше способов разделения, в частности, с помощью фильтрации, осаждения или центрифугирования, или с помощью комбинации этих операций. Аналогичные процессы промывки также могут быть применены для гидролиазы, иммобилизованной на носителе.
Так же разделение альдегида и гидролиазы, которое необходимо произвести на стадии процесса В), может быть облегчено тем, что соединение, образующее связь с альдегидом, является иммобилизованным на носителе. В качестве примеров в данном случае рассматривают ионообменные смолы, насыщенные гидросульфитом, такие как Amberlite CG400 или Amberlite IRA400 (фирмы Rohm and Haas).
Существенным для изобретения является то, что стадии процесса А) и В) с отделенной гидролиазой повторяются по меньшей мере один раз, чтобы снова использовать биокатализатор для получения альдегида вместе со свежей порцией вицинального диола.
В предпочтительном, альтернативном варианте исполнения способа согласно изобретению стадии процесса А), В) и С) проводятся в непрерывном режиме.
Это может быть реализовано различными путями.
Гидролиаза присутствует в иммобилизованном виде как неподвижная фаза, а среда, содержащая вицинальный полиол и соединение, образующее связь с альдегидом, омывает иммобилизованную гидролиазу и в соответствии со стадией процесса А) вводится с ней в контакт. Образовавшийся альдегид в виде подвижной фазы отделяется от стационарной фазы, что соответствует разделению альдегида и гидролиазы на стадии процесса В). Вицинальный диол, непрерывно подающийся в виде свежей порции на гидролиазу, соответствует повторению стадии процесса А) и В) с гидролиазой, полученной на стадии процесса В).
Альтернативно в качестве иммобилизованного как неподвижная фаза может присутствовать соединение, образующее связь с альдегидом. Вицинальный полиол и гидролиаза содержатся в одной среде и, следовательно, вводятся в контакт в соответствии со стадией процесса А) и омывают иммобилизованное соединение, образующее связь с альдегидом, причем образовавшийся альдегид остается на неподвижной фазе. Гидролиаза покидает неподвижную фазу, что соответствует разделению альдегида и гидролиазы на стадии процесса В), и, например, по принципу петлевого реактора снова подается на неподвижную фазу вместе со свежим вицинальным диолом.
Другим вариантом осуществления способа согласно изобретению, который проводится в непрерывном режиме, является процесс, оформленный так, что как соединение, образующее связь с альдегидом, так и гидролиаза, присутствуют иммобилизованными в виде неподвижной фазы. Среда, содержащая вицинальный полиол, омывает эту неподвижную фазу и таким образом приводится в контакт с гидролиазой в соответствии со стадией процесса А). Образовавшийся альдегид связывается на неподвижной фазе соединением, образующим связь с этим альдегидом, и, следовательно, является отделенным от гидролиазы в соответствии со стадией процесса В). Непрерывно подаваемая на неподвижную фазу свежая порция вицинального диола соответствует повторению стадий процесса А и В) с гидролиазой, полученной со стадии процесса В).
Чтобы решить поставленную задачу, в процессе осуществления способа согласно изобретению должно присутствовать соединение, образующее связь с альдегидом.
Связь, образовавшаяся с альдегидом, может представлять собой любую известную форму химической связи, такую как, например, ковалентная или ионная связь, но также и так называемые слабые связывания, такие как водородные мостиковые связи или связи, вызванные электростатическими взаимодействиями.
Предпочтительно соединение, образующее связь с альдегидом, образует с этим альдегидом ковалентную связь.
Соединение, образующее связь с альдегидом, может быть полифункциональным, это значит, что в расчете на одну молекулу этого соединения может образовываться более одной связи с альдегидом.
Подходящими соединениями, образующими связь с альдегидами, являются, например, гидразиды, амины, гидразины, соединения мочевины, гидроксиламины, спирты, меркаптаны, гидросульфиты, сульфиты, метабисульфиты и пиросульфиты, причем в способе согласно изобретению предпочтительно используются семикарбазид [регистрационный номер CAS 57-56-7], карбогидразид [рег. номер CAS 497-18-7] и сульфит натрия [рег. номер CAS 7757-83-7].
Эти соединения могут использоваться в свободном виде в растворе, но также и иммобилизованными на носителях, предпочтительными в этом контексте являются не иммобилизованные, растворенные соединения, поскольку они более эффективно и быстро могут вступать в связывание с альдегидом, а следовательно, могут предотвращать нежелательные побочные реакции.
В случае когда способ согласно изобретению проводится с клетками, согласно изобретению предпочтительно, если соединение, образующее связь с альдегидом, добавляется в среду, окружающую эти клетки.
Также могут использоваться смеси соединений, образующих связь с альдегидом.
Является предпочтительным, когда в способе согласно изобретению вицинальный диол и функциональные группы соединения, образующего связь с альдегидом, используются в мольном соотношении по меньшей мере 1:1, предпочтительно по меньшей мере 1:1,2, прежде всего, по меньшей мере 1:1,5.
На стадии процесса D) способа согласно изобретению образовавшиеся альдегиды могут выделяться, причем для целей выделения принимают во внимание все известные специалисту методы выделения низкомолекулярных веществ из сложных композиций. Здесь в качестве примеров следует упомянуть осаждение с помощью подходящего растворителя, экстракцию подходящим растворителем, образование комплексов, например, с помощью циклодекстринов или производных циклодекстринов, кристаллизацию, очистку или соответственно выделение с помощью хроматографических методов или переведение альдегида в легко отделяемые производные.
Частью процесса выделения на стадии процесса D) также может быть еще и отделение от альдегида соединения, образующего связь с этим альдегидом.
3
2
3
Это может достигаться при помощи методов, известных специалисту, в зависимости от присутствующей связи. Так, например, связи между альдегидом и семикарбазидом или карбогидразидом могут расщепляться с помощью кислоты; связи внутри комплекса альдегида с соединением, образующим связь с этим альдегидом, а также веществами Amberlite CG400 или Amberlite IRA400 могут разъединяться, например, с помощью увеличения концентрации соли, например, 1 M NaCl или системы из NaHCO/NaCO (0,15 М/0,075 М). Кроме того, связь между альдегидом и соединением, образующим связь с этим альдегидом, может расщепляться с помощью термической обработки.
Другой вклад в решение задач, обозначенных во вступлении, вносит также способ получения продуктов окисления или восстановления альдегида, включающий следующие стадии процесса:
I) приготовление альдегида с помощью описанного выше способа получения альдегидов из вицинальных диолов,
II) химическое или биокаталитическое превращение этого альдегида путем восстановления, окисления, диспропорционирования или дегидратации с получением при необходимости ненасыщенных промежуточных продуктов восстановления или окисления, а при необходимости
III) дополнительное химическое или биокаталитическое превращение промежуточных продуктов восстановления или окисления, полученных на стадии процесса II), путем восстановления, окисления или присоединения.
Продукты окисления или восстановления альдегида включают соединения, такие как, например, при необходимости ненасыщенные карбоновые кислоты, производные карбоновых кислот, амины, изоцианаты, ацетали, нитрилы и оксимы.
Промежуточные продукты восстановления или окисления со стадии процесса II), таким образом, уже могут представлять собой желаемые продукты восстановления или окисления альдегида.
Сначала на стадии процесса I) приготавливают альдегид с помощью описанного выше способа получения альдегидов, причем этот альдегид при необходимости может быть очищен, как описано выше в разделе, относящемся к этому способу.
Затем на стадии процесса II) этот альдегид химически или биокаталитически путем восстановления, окисления, диспропорционирования или дегидратации подвергают превращению с получением промежуточных продуктов восстановления или окисления, в частности, в случае, если альдегид, полученный на стадии процесса I), представляет собой 3-гидроксипропионовый альдегид, с получением 1,3-пропандиола (1,3-ПДО) (восстановление), акролеина (дегидратация) или 3-гидроксипропионовой кислоты (окисление). При этом подробности превращения 3-гидроксипропионового альдегида в акролеин, среди прочего, описаны авторами Hall и Stern в публикации в Journal of the Chemical Society, 1950, страницы 490-498, в то время как подробности получения 1,3-пропандиола из 3-гидроксипропионового альдегида, среди прочего, могут быть позаимствованы из патента США US 5,334,778. В свою очередь, получение 3-гидроксипропионовой кислоты из 3-гидроксипропионового альдегида описано, среди прочего, в патенте США US 6,852,517. В случае, если альдегид, полученный на стадии процесса I), представляет собой пропаналь из 1,2-пропандиола, тогда 1-пропанол и пропионовая кислота могут образовываться с помощью легко проходящего диспропорционирования пропаналя в биотрансформирующей среде (Sriramulu, D.D.; Liang, M.; Hernandez-Romero, D.; Raux-Deery, E.; Lunsdorf, H.; Parsons, J.B.; Warren, M.J. & Prentice, M.B. J. Bacteriol., 2008, 190, 4559-4567).
При необходимости промежуточные продукты восстановления или окисления, полученные на стадии процесса II), могут еще дополнительно подвергаться превращению химически или микробиологически с помощью восстановления, окисления или присоединения на дополнительной стадии процесса III). В данном случае рассматривают, прежде всего, превращение полученного на стадии процесса II) акролеина путем окисления в акриловую кислоту, которая потом при необходимости на еще одной стадии процесса IV) может по радикальному механизму подвергаться превращению с образованием полимеров на основе акриловой кислоты. В этом случае принимают во внимание, прежде всего, радикальную полимеризацию при необходимости частично нейтрализованной акриловой кислоты в присутствии подходящего сшивающего агента с образованием абсорбирующих воду полиакрилатов, которые также обозначаются как «суперабсорбенты». Химическое окисление акролеина до акриловой кислоты и последующая радикальная полимеризация полученной таким образом акриловой кислоты, среди прочего, описаны в международной заявке WO-A-2006/136336.
Кроме того, также принимают во внимание превращение полученного на стадии процесса II) акролеина путем окислительной этерификации в сложные эфиры акриловой кислоты, которые потом при необходимости на еще одной стадии процесса IV) могут по радикальному механизму подвергаться превращению с образованием полимеров на основе сложных эфиров акриловой кислоты.
Таким образом, предпочтительные продукты восстановления или окисления альдегида, которые могут быть получены способом согласно изобретению с помощью представленных выше стадий, представляют собой такие вещества, как 1,3-пропандиол, 1-пропанол, акролеин, 3-гидроксипропионовую кислоту, пропионовую кислоту, акриловую кислоту, сложные эфиры акриловой кислоты и полимеры на основе акриловой кислоты или сложных эфиров акриловой кислоты, причем альдегид, полученный на стадии процесса I), является 3-гидроксипропионовым альдегидом.
В Примерах, приведенных далее, данное изобретение описывается в качестве образца, без того, чтобы это изобретение, область применения которого вытекает из всего описания и пунктов Формулы изобретения, следовало ограничивать вариантами исполнения, указанными в этих Примерах.
Следующие Фигуры являются составными частями Примеров
Фиг.1: кривые изменения концентрации глицерина, 3-ГПА (3-гидроксипропионовый альдегид) и 1,3-ПДО (1,3-пропандиол) при взаимодействии глицерина с иммобилизованными клетками L reuteri в ходе протекания цикла биотрансформации.
Фиг.2: кривые изменения концентрации глицерина, 3-ГПА и 1,3-ПДО при взаимодействии глицерина с иммобилизованными клетками L. reuteri в ходе протекания 7 циклов биотрансформации и в присутствиии семикарбазида в качестве улавливающего вещества.
Фиг.3: обобщенный выход 3-ГПА при взаимодействии глицерина с иммобилизованными клетками L. reuteri в ходе протекания 7 циклов биотрансформации и в присутствиии семикарбазида в качестве улавливающего вещества.
Фиг.4: кривые изменения концентрации глицерина, 3-ГПА и 1,3-ПДО при взаимодействии глицерина с иммобилизованными клетками L. reuteri в ходе протекания 10 циклов биотрансформации и в присутствиии карбогидразида в качестве улавливающего вещества.
Фиг.5: обобщенный выход 3-ГПА при взаимодействии глицерина с иммобилизованными клетками L. reuteri в ходе протекания 10 циклов биотрансформации и в присутствиии карбогидразида в качестве улавливающего вещества.
Фиг.6: кривые изменения во времени концентрации глицерина и 1,2-пропандиола при биотрансформации глицерина или соответственно 1,2-пропандиола с помощью клеток L. reuteri.
Фиг.7: кривые изменения концентраций 3-ГПА, глицерина и 1,3-ПДО в ходе семи протекающих друг за другом биотрансформаций глицерина с помощью иммобилизованных клеток L. reuteri без добавления сульфита (Пример для сравнения).
Фиг.8: кривые изменения концентраций 3-ГПА, глицерина и 1,3-ПДО в ходе семи протекающих друг за другом биотрансформаций глицерина с помощью иммобилизованных клеток L. reuteri с добавлением гидросульфита натрия (Пример согласно изобретению).
Фиг.9: кривые изменения во времени концентраций 3-ГПА, глицерина и 1,3-ПДО при биотрансформации глицерина с помощью клеток L. reuteri дикого типа.
Фиг.10: кривые изменения во времени концентраций 3-ГПА, глицерина и 1,3-ПДО при биотрансформации глицерина с помощью генетически модифицированных клеток L. reuteri.
Примеры
Пример 1. Культивирование Lactobacillus reuteri.
Культивирование Lactobacillus reuteri осуществлялось в анаэробной среде MRS (среда для Lactobacillus согласно DeMan, Rogosa und Sharpe) с добавлением 20 мМ глицерина (MRSG20) в закрытых подходящих банках при числе оборотов 80 об/мин. Эта среда MRSG20 (Состав [данные на один литр]: 10 г пептона протеозы №3 (фирмы Roth), 8 г говяжьего экстракта (Roth), 4 г дрожжевого экстракта (фирмы VWR), 1,5 мл глицерина (Roth), 1 мл Tween 80 (Roth), 40 мл раствора солей [10 г/л гидрофосфата дикалия {Roth}, 250 г/л тригидрата ацетата натрия {Roth}, 100 г/л гидроцитрата диаммония {Roth}, 10 г/л гептагидрата сульфата магния {Roth}, 2,5 г/л тетрагидрата сульфата марганца {Roth}] после анаэробизации и автоклавирования (20 мин при 121°С) была смешана с 25 мл раствора глюкозы (4 моль/л).
Для предварительной культуры 1 (50 мл) применялась крио-культура.
Для этого L. reuteri SD2112 при -80°С помещали в среду MRS, которая дополнительно содержит 6% (масс./объемн.) порошка обезжиренного молока и 10% (объемн./объемн.) глицерина. Для получения исходной культуры простоявшая в течение ночи культура (10 мл среды MRS) смешивается с основным раствором в соотношении 1:1. Предварительная культура служила в качестве 1%-ной посевной культуры и инкубировалась при 33°С. Спустя 15 часов из этой загрузки вносили затравку 1% во вторую предварительную культуру (50 мл) и инкубировали 9 часов при 37°С. Эта культура, в свою очередь, служила в качестве 1%-ной посевной культуры для главной культуры (2 раза по 1 л). Спустя 15 часов при 33°С были получены клетки.
2
4
2
4
Для этого удаляли центрифугированием 2 литра (4000 г; 20°С; 10 мин), верхний слой отбрасывали, а оба полученных в результате гранулята повторно суспендировали при рН 7 в 1 л 0,1 М буферного раствора из фосфата калия ((КФБ) калий-фосфатный буфер; KHPO+KHPO [Roth]). Проводилось повторное центрифугирование при аналогичных условиях. Верхний слой снова отбрасывали, гранулы клеток повторно суспендировали в 0,1 М КФБ при рН 7 в соотношении 1 г к 1 мл и хранили под азотом. Эта суспензия была использована для последующей иммобилизации.
Пример 2. Иммобилизация Lactobacillus reuteri.
Для иммобилизации 20 мл описанной в Примере 1 суспензии клеток смешивали с термостатированным при ~35°С реагентом Lentikat-Liquid (фирма GeniaLab), получали полимерные частицы Lentikats с помощью устройства LentiKatPrinter (GeniaLab) и сушили до остаточной влажности 28%. После повторного набухания в устройстве LentiKat-Stabilizer (GeniaLab) эти иммобилизаты по меньшей мере в течение 2 часов при 300 об/мин в неокислительной атмосфере перемешивали для стабилизирования частичек Lentikats в LentiKat-Stabilizer. Отделенные и дважды промытые 0,1 М КФБ при рН 7 иммобилизаты регенерировались в течение 15 часов при 33°С при стоянии 3%-ными в MRSG20 в полностью заполненной склянке объемом 1 л с возможностью для газообмена. После отделения иммобилизатов от среды (в аэробных условиях) они были дважды промыты 0,1 М КФБ (рН 7).
Пример 3. Количественная оценка глицерина и 1,3-пропандиола на основе метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Для количественной оценки глицерина и 1,3-пропандиола (1,3-ПДО) в каждом случае 1 мл суспензии клеток биомассы был отделен с помощью цетрифугирования (10 мин, 16,100 г, 4°С) и 40 мл верхней фракции над культурой анализировали с применением системы для ВЭЖХ фирмы Shimadzu (Shimadzu-HPLC-Systems, автоматический дозатор SIL-10AT, насос LC-10AT, дегазатор DGU-3A, детектор показателя преломления RID-10А, УФ-детектор SPD-10A, печь СТО-10А, контроллер SCA-10A-VP) с использованием разделительной колонки Aminex HPX-87H 300×7,8 мм (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen) с размером частиц 9 мкм и с применением предварительной колонки (HPX-87H, 30×4,6 мм). Соединения, подлежащие анализу, были элюированы в изократичном режиме с помощью подвижной фазы из 5 мМ серной кислоты со скоростью потока 0,6 мл/мин в течение 20 мин при 40°С. Идентификация осуществлялась путем сравнения со временем пребывания эталонных веществ (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim). Концентрация соединений в верхних фракциях над культурой была рассчитана с помощью сравнения площадей пиков с предварительно построенной с внешними стандартами калибровочной прямой.
Пример 4. Превращение глицерина в 3-ГПА с помощью иммобилизованных Lactobacillus reuteri (Пример для сравнения).
Полученные в соответствии с Примером 2, содержащие L. reuteri иммобилизаты с концентрацией 10% (20 г, соответствует концентрации 2 г сухих клеток в одном литре) были использованы в биотрансформации в стеклянном ферментере (общий объем 500 мл) с 200 мл реакционного буферного раствора. Последний состоял из ананэробизированного и предварительно термостатированного до 35°С 0,1 М КФБ (рН 7). После установления постоянного значения рН, равного 7, и постоянной температуры 35°С реакция была запущена путем добавления 8 мл 98%-ного глицерина (Roth; соответствует концентрации 500 мМ в реакционной смеси).
Отбор проб осуществлялся в течение одного часа каждые 10 минут, а затем в течение 2 часов каждые 30 минут. Концентрации глицерина и побочных продуктов определялись с помощью ВЭЖХ в соответствии с Примером 3.
Количественная оценка 3-гидроксипропионового альдегида осуществлялась при помощи колориметрического теста в соответствии с Doleyres с соавт. («Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process with Lactobacillus reuteri», Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.68, 2005, страницы 467-474).
Спустя время прохождения реакции ~100 минут как в случае свободных, так и в случае иммобилизованных клеток не смогли больше обнаружить превращения глицерина.
Кривые изменения концентрации для глицерина, 3-ГПА и 1,3-ПДО воспроизведены на Фиг.1; в процессе биотрансформации было получено 1,29 г 3-ГПА. Реакционная среда была отделена от клеток или соответственно иммобилизатов и хранилась отдельно при 4°С.
Превращение глицерина в 3-ГПА и побочные продукты в соответствии с описанными выше аналитическими измерениями протекало примерно на 25%.
При повторном применении клеток или соответственно иммобилизатов не смогли обнаружить превращения глицерина в 3-ГПА.
Пример 5. Превращение глицерина в 3-ГПА с помощью иммобилизованных Lactobacillus reuteri и в присутствии семикарбазида, согласно изобретению.
Полученные в соответствии с Примером 2, содержащие L. reuteri иммобилизаты с концентрацией 10% (20 г, соответствует концентрации 2 г сухих клеток в одном литре) были использованы в биотрансформации в стеклянном ферментере (общий объем 500 мл) с 200 мл реакционного буферного раствора. Этот раствор состоит из 0,1 М КФБ (рН 7), а также 500 мМ семикарбазида и был подвергнут анаэробизации, а также предварительно термостатирован до температуры реакции 35°С. После установления постоянного значения рН, равного 7, и постоянной температуры 35°С реакция была запущена путем добавления 8 мл 98%-ного глицерина (Roth; соответствует концентрации 500 мМ в реакционной смеси).
Отбор и анализ проб из реакционной смеси осуществлялся, как описано в Примере 4.
Спустя время прохождения реакции 150 минут реакционная среда была отделена от иммобилизата, и была добавлена новая анаэробизированная, предварительно термостатированная реакционная среда (0,1 М КФБ, рН 7, содержит 500 мМ семикарбазида). Был проведен дополнительный цикл биотрансформации, как описано выше. В общей сложности были проведены 7 следующих друг за другом циклов без промежуточного выдерживания иммобилизата. Кривые изменения концентрации для глицерина, 3-ГПА и 1,3-ПДО воспроизведены на Фиг.2;
Фиг.3 показывает обобщенный выход 3-ГПА.
Превращение глицерина в 3-ГПА с семикарбазидом в качестве улавливающего вещества в соответствии с описанными выше аналитическими измерениями протекало в первых 5 циклах только примерно на 55%, в двух последующих циклах этот выход непрерывно снижался.
Пример 6. Превращение глицерина в 3-ГПА с помощью иммобилизованных Lactobacillus reuteri и в присутствии карбогидразида, согласно изобретению.
Полученные в соответствии с Примером 2, содержащие L. reuteri иммобилизаты с концентрацией 10% (20 г, соответствует концентрации 2 г сухих клеток в одном литре) были использованы в биотрансформации в стеклянном ферментере (общий объем 500 мл) с 200 мл реакционного буферного раствора. Этот раствор состоит из 0,1 М КФБ (рН 7), а также 520 мМ карбогидразида и был подвергнут анаэробизации, а также предварительно термостатирован до температуры реакции 35°С. После установления постоянного значения рН, равного 7, и постоянной температуры 35°С реакция была запущена путем добавления 8 мл 98%-ного глицерина (Roth; соответствует концентрации 500 мМ в реакционной смеси).
Отбор и анализ проб из реакционной смеси осуществлялся, как описано в Примере 4.
Спустя время прохождения реакции 180 минут реакционная среда была отделена от иммобилизата, и была добавлена новая анаэробизированная, предварительно термостатированная реакционная среда (0,1 М КФБ, рН 7, содержит 520 мМ карбогидразида). Был проведен дополнительный цикл биотрансформации, как описано выше. В общей сложности были проведены 10 следующих друг за другом циклов без промежуточного выдерживания иммобилизата; кривые изменения концентрации для глицерина, 3-ГПА и 1,3-ПДО воспроизведены на Фиг.4;
Фиг.5 показывает обобщенный выход 3-ГПА.
Превращение глицерина в 3-ГПА и побочные продукты с карбогидразидом в качестве улавливающего вещества в соответствии с описанными выше аналитическими измерениями протекало во всех 10 циклах примерно на 95%.
Пример 7. Превращение глицерина в 3-ГПА с помощью свободных Lactobacillus reuteri и в присутствии серусодержащих соединений, согласно изобретению.
10
Клетки, полученные в соответствии с Примером 1, были суспендированы в растворе глицерина с концентрацией 1000 ммоль/л, так что общая концентрация клеток получалась 2,2×10 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц/мл). После добавления серусодержащего соединения (сульфита натрия, гидросульфита натрия или пиросульфита натрия; соответственно с конечной концентрацией в реакционном растворе 100 ммоль/л) суспензию инкубировали в течение 120 мин, причем смесь сохраняли свободной от кислорода с помощью введения непрерывного тока азота. Перечисленные в Таблице 1, полученные по истечении 120 мин концентрации 3-ГПА и 1,3-ПДО, а также выживаемости клеток наглядно показывают повышение концентраций 3-ГПА, которые могут быть достигнуты, а также уменьшение падения выживаемости клеток в результате добавления серусодержащих соединений.
Таблица 1
Серусодержащее соединение
с (3-ГПА) [ммоль/л]
с(1,3-ПДО) [ммоль/л]
Выживаемость клеток [КОЕ/мл]
отсутствует
504
32
5,1*10<sup>4</sup>
Na<sub>2</sub>S<sub>2</sub>O<sub>5</sub>
524
31
>6,0*10<sup>9</sup>
NaHSO<sub>3</sub>
546
30
3,2*10<sup>9</sup>
Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub>
607
31
2,6*10<sup>9</sup>
Пример 8. Превращение 1,2-пропандиола или соответственно глицерина в пропаналь или 3-гидроксипропионовый альдегид с помощью иммобилизованых Lactobacillus reuteri в присутствии карбогидразида, согласно изобретению.
10
Клетки, полученные в соответствии с Примером 1, в каждом из случаев были суспендированы в растворе глицерина с концентрацией 500 ммоль/л, или соответственно в растворе 1,2-пропандиола с концентрацией 500 ммоль/л, так что общая концентрация клеток получалась 2,2×10 КОЕ/мл. После добавления в реакционный раствор карбогидразида с конечной концентрацией в реакционном растворе 100 ммоль/л суспензию инкубировали в течение 120 минут, причем смесь сохраняли свободной от кислорода с помощью введения непрерывного тока азота. Кривые изменения концентрации для глицерина и 1,2-пропандиола, представленные на Фиг.6, наглядно поясняют равнозначную трансформацию обоих субстратов.
Пример 9. Превращение глицерина в 3-ГПА с помощью иммобилизованных клеток Lactobacillus reuteri в присутствии серусодержащих соединений и при добавлении глюкозы к промывному раствору, согласно изобретению.
Полученные в соответствии с Примером 2, содержащие L. reuteri иммобилизаты с концентрацией 20% (4 мл) были использованы в биотрансформации в стеклянном ферментере с 20 мл реакционного раствора. Этот раствор содержит 80 ммоль/л глицерина, и после термостатирования до температуры 30°С был доведен до постоянной величины рН 5 (Пример для сравнения и Пример согласно изобретению).
В реакционную массу согласно изобретению к реакционному раствору дополнительно был добавлен гидросульфит натрия (соответственно конечной концентрации 50 ммоль/л). По прохождении цикла биотрансформации (30 минут) иммобилизаты отфильтровывают, регенерируют в среде MRSG20 (см. Пример 1) в течение 30 минут и снова используют в реакционном растворе, как описано. Описанным способом проводятся в общей сложности 7 превращений глицерина. В то время как без добавления гидросульфита в каждой стадии трансформации образуются 10 ммоль/л 1,3-ПДО (Фиг.7), при добавлении гидросульфита натрия может наблюдаться снижение концентрации 1,3-ПДО (Фиг.8).
Пример 10. Превращение глицерина в 3-ГПА с помощью свободных, немодифицированных или соответственно модифицированных с помощью генной инженерии Lactobacillus reuteri, согласно изобретению.
10
Клетки дикого типа или соответственно клетки, генерированные путем удаления гена оксидоредуктазы, были суспендированы в растворе глицерина с концентрацией 250 ммоль/л, так что общая концентрация клеток соответственно составила 1,2×10 КОЕ/мл. Как показывают кривые изменения концентрации в ходе 120-минутной биотрансформации, при использовании L. reuteri дикого типа 3-ГПА, образовавшийся после 20-ти минутной биотрансформации, разлагается в направлении образования 1,3-ПДО (Фиг.9), в то время как превращение 3-ГПА в 1,3-ПДО в случае применения клеток, генерированных путем удаления гена оксидоредуктазы, предотвращается (Фиг.10).
Пример 11. Получение акролеина из выгруженной реакционной ферментационной массы, содержащей 3-ГПА, согласно изобретению.
Из выгруженных реакционных ферментационных масс, полученных согласно Примерам 4-6, смогли получить акролеин с помощью кислотного гидролиза при повышенных температурах. Для этого часть выгруженной реакционной ферментационной массы разбавляли водой в соотношении 1:100, смешивали с 3 частями 37%-ной соляной кислоты и инкубировали 0,5 часа при 37°С. Образовавшийся при этом акролеин после добавления раствора DL-триптофана (фирмы Пика, 0,01 моль/л триптофана в 0,05 моль/л соляной кислоты) и повторном инкубировании при 37°С (0,5 часа) образовывал окрашенный аддукт, который колориметрически мог быть определен количественно с помощью своего поглощения при 560 нм.