Биофармацевтический анализ ферментативной активности метаболических систем организма

М. И. Евгеньев, С. Ю. Гармонов, Н С. Шитова,

В. И. Погорельцев

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СИСТЕМ ОРГАНИЗМА

Проведено фенотипирование активности N-ацетилтрансферазы путем оценки фармакокинетических параметров экскреции изониазида с мочой пациентов. При этом установлено достоверное повышение активности сывороточной холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с другими типами ацетилирования. Разработаны методики определения фенотипа окисления по количеству выведенного антипирина слюной испытуемых.

В настоящее время весьма актуальным и перспективным является разработка и модернизация аналитических методов для изучения влияния ксенобиотиков различной природы как на организм человека в целом, так и на отдельные ферментные системы [1,2].

Роль аналитических технологий чрезвычайно важна для определения всевозможных генных нарушений. Из них конкретные генные мутации предпочтительнее определять с помощью цитогенетических и молекулярно-генетических методов, продукты гена и генетически детерминированные процессы метаболизма посредством фармацевтической и аналитической химии.

Развитие представлений о молекулярных механизмах различной чувствительности человека к средовым факторам в сочетании с наследственным полиморфизмом предрасположенности позволяют считать роль генетически детерминированных ферментных систем организма судьбоносной для отдельных индивидов. Это обусловлено тем, что исследования генетического полиморфизма биохимических процессов чрезвычайно важны в осуществлении ранней диагностики и профилактики заболеваний, оценке риска токсичности, канцерогенеза и индивидуальной химической чувствительности [1 - 6]. Такие исследования с использованием биомаркеров генетической чувствительности различных ферментативных систем организма позволяют также осуществлять идентификацию индивидуального риска в превентивной медицине [4].

Наиболее распространенным путем метаболических превращений в организме человека различных по структуре веществ являются окислительные превращения. Они осуществляются группой ферментов системы цитохрома Р450 (CYP450). Для фенотипирова-ния процессов окисления наиболее широко используют антипириновый тест [7]. Для этого проводится определение периода полувыведения антипирина (феназона или 2-фенил-2,3-диметилпиразолона-5). Средние значения периода полувыведения в фенотипических группах здоровых людей с различными скоростями окислительного метаболизма препарата колеблются от 5 до 22 часов. Группы людей по разному периоду полувыведения антипирина подразделяются на «быстрых», «средних» и «медленных» окислителей [8]. Метаболизм антипирина осуществляется гидроксилированием, окислением метильной группы и N-диметилированием.

Обращает на себя внимание и одна из универсальных ферментных систем организма человека - система ацетилирования, которая играет важную роль в биотрансформации лекарственных веществ (ЛВ) [У, 1UJ. Процесс ацетилирования заключается в присоедине-

нии ацетильной группы к молекуле субстрата и катализируется ферментом N-ацетилтрансферазой (NAT) при участии кофермента А [8]. Показана генетическая детерминация этого процесса [4]. Вариации в NAT-локусе отвечают за классический полиморфизм ацетилирования, подразделяющий индивидуумов на «быстрых», «средних» и «медленных» ацетиляторов. Генетический полиморфизм NAT оказывает токсикологическое и фармакологическое влияние на метаболизм ксенобиотиков. Также показано влияние различных патологических факторов на активность NAT, фенотипирование которой в ряде случаев может использоваться в качестве прогностического критерия риска возникновения канцерогенеза и мутагенеза [4].

С точки зрения обеспечения медицинской защиты организма важно также фенотипирование активности холинэстеразы (ХЭ), так как многие фосфорорганические токсиканты ингибируют активность фермента. Большее практическое значение имеют методы оценки сывороточной ХЭ, поскольку показана диагностическая зависимость ее активности от заболеваний печени, инфаркта миокарда и других заболеваний [11 - 13]. Причем угнетение активности ХЭ выявляется значительно раньше других симптомов интоксикации и служит основой для своевременной диагностики и лечения отравлений, а также определения индивидуальной химической чувствительности персонала при работе с экотоксикантами.

Целью данной работы является фенотипирование акгивности N-ацетилтрансферазы и ферментов системы цитохрома Р450 путем оценки фармакокинетических параметров экскреции изониазида с мочой и антипирина со слюной пациентов, соответственно, а также оценка активности сывороточной холинэстеразы в группах быстрых и меленных ацетиляторов.

Экспериментальная часть

Фенотип ацетилирования оценивали по параметрам экскреции изониазида (гидразид изо-никотиновой кислоты, ГИНК) с мочой. Реактивом для определения изониазида в моче служил коммерческий ванадат аммония. Изониазид вводился перорально в дозе 0,45 г.

Активность холинэстеразы в сыворотке крови, свободной от эритроцитов, определяли по методу Эллмана, основанном на использовании ферментативной реакций гидролиза стандарта бу-тирилтиохолина при инкубации с образцами сыворотки с последующим детектированием продуктов аналитической реакции. Достаточную избирательность и чувствительность широко используемого спектрофотометрического детектирования продуктов ферментативной реакции обеспечивает дериват изация ацетилхолина при помощи гидроксамовой реакции, продукты гидролиза тиохолинов регистрируют по восстановлению дисульфиднитробензоата до окрашенных в желтый цвет тиолов, окрашенных производных тиохолина с дитионитробензойной кислотой (реактив Эллмана) [14].

Активность окислительных ферментов определялась с помощью модернизированного нами антипиринового теста. Хорошее всасывание и равномерное распределение антипирина приводят к тому, что после введения его концентрация в плазме, слюне, плевральной, перикардиальной и спинно-мозговой жидкости почти одинакова. Основой данного фармакокинетических исследований является определение уровня антипирина в слюне, освобожденной от белков.

В проведенных исследованиях фенотип ацетилирования и активность сывороточной холинэстеразы определяли в группе здоровых курсантов военных вузов из 100 человек. Антипирино-вый тест проводился у 40 здоровых добровольцев, не получавших в течение нескольких месяцев других лекарственных средств. Возраст обследуемых колебался от 18 до 24 лет.

Спектрофотометрические измерения проведены на спектрофотометре СФ-26 и фотоэлектроколориметре КФК-2.

Методика определения активности сывороточной холинэстеразы. Кровь центрифугируют в течение 15 минут при 2000 об./мин. Далее смешивают в указанном порядке: 2,9 мл дистиллированной воды, 1 мл раствора реактива Эллмана в фосфатном буфере, 1 мл 0.11%-ного раствора ацетилтиохолинбромида и помещают смесь в термостат с температурой 37°. После 2 - минутного прогрева добавляют 0,1 мл разведенной в 10 раз сыворотки, тщательно перемешивают встряхива-

ннем и переливают смесь в термостатированную кювету. Первое измерение оптической плотности производят сразу же, второе - через 5 минут после первого. Разность величин оптической плотности (+Е) подставляют в формулу:

А = +Е----------,

ЮООХЬ/

где +Е - разность величин оптической плотности во втором и первом измерениях;

V - конечный объем реакционной смеси;

N - концентрация стандартного реактива Эллмана;

X - величина оптической плотности стандартного реактива Эллмана;

I - время реакции;

V - объем исследуемой сыворотки.

Методика определения фенотипа ацетилирования. Изониазид однократно перорально вводится пациенту в дозе 0,45 г, эквивалентной разовой дозе приема препарата. Мочу собирают каждые два часа в течение 6 часов после приема тест-маркера. В почасовых пробах мочи определяют содержание ГИНК фотоколориметрическим методом. По полученным данным строят кинетические кривые, определяют фракцию дозы ГИНК и оценивают фенотип ацетилирования пациента. Для определения концентрации ГИНК отбирают 0,3 мл мочи, добавляют 7,7 мл дистиллированной воды и 2 мл 2.2%-ного раствора ванадата аммония в 10%-ной серной кислоте. Измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при фиолетовом светофильтре. Количество выведенного ГИНК определяют по градуировочному графику.

Методика определения фенотипа окисления. Антипирин принимают однократно перорально в дозе 0,6 г утром натощак. Слюну собирают через каждые 3 часа в течение 12 часов. Для осаждения твердых частиц слюну центрифугируют в течение 10 минут. В пробирки вносят по 2 мл надосадочной жидкости, 2 мл дистиллированной воды, 2 мл цинкового реактива (100 г 2пЭ04 растворяют в 1 л 1,2 %-ого раствора серной кислоты), 2 мл 0,75н гидроксида калия (по каплям). Встряхивают раствор в течение 30 с. Далее производят центрифугирование в течение 15 минут. По 3 мл чистого супернатанта каждого образца переносят в пробирки и помещают в термостат на 5 мин при температуре 25°С. Затем, не извлекая пробы из термостата добавляют 0,05 мл 4н серной кислоты и 0,1мл 0,2%-ного раствора нитрита натрия. Инкубацию продолжают в течение 20 мин. Далее оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 350нм. Количество выведенного антипирина определяют по градуировочному графику.

Результаты и их обсуждение

Выявление активности М-ацетилтрансферазы осуществляют с использованием тест-маркеров процесса ацетилирования, в качестве которых можно использовать ЛВ, содержащие аминные функциональные группы, а также продукты метаболизма этих веществ и эндогенные соединения организма человека - серотонин, гистамин, холин [15]. Чаще всего фенотипирование полиморфизма ацетилирования проводится установлением фармакокинетических параметров сульфаниламидов, ГИНК в крови или при выведении с мочой пациента.

Наиболее распространенным в клинической практике методом детектирования содержания тест-маркеров ацетилирования и их метаболитов благодаря универсальности и невысокой стоимости является спектрофотометрия. Однако, в этих случаях для достижения избирательности аналитических определений ЛВ в биологических матрицах важным условием является проведение реакций дериватизации, протекающих с образованием окрашенных соединений [16]. Спектрофотомегрическое определение фенотипа ацетилирования основано на реакциях получения окрашенных диазопроизводных ЛВ, продуктов их конденсации с карбонильными соединениями [17 -20].

Для определения содержания свободного ГИНК в моче была использована реакция этого Л В с ванадатом аммония в кислой среде [19]. На основе этой реакции дериватизации были оптимизированы условия аналитических определений ГИНК в моче. Было установлено, что в водных средах взаимодействие ванадата аммония с ГИНК протекает практически при сливании растворов с образованием интенсивно окрашенных в желто-коричневый цвет производных (рис. 1). Для количественного завершения аналитической реакции кислотность смеси на уровне рН=1.8 необходимо поддерживать добавлением раствора серной кислоты. При этом хорошо воспроизводимые зависимости оптической плотности от концентрации линейны для области концентраций 510"6 - 210'5 М:

А = 0,0466СХ (мкг/мл)+0,0517 (г = 0.998).

Предел обнаружения ГИНК при указанных условиях фотоколориметрического определения достигает 0,69 мкг/мл, что ниже интервата фармакокинетических концентраций Л В.

Для определения фенотипа окисления производилась регистрация 4-нитрозоанти-пирина, образующегося при добавлении азотистокислого натрия и серной кислоты к свободному от белка супернатанту, содержащему антипирин [21].

При этом хорошо воспроизводимые зависимости оптической плотности от концентрации линейны для области концентраций 5 ТО'5 -10‘3М:

А = 0,0141 Сх (мкг/мл)+0,0188 (г = 0.998).

Предел обнаружения для спектрофотометрического обнаружения 4-нитрозоантипирина достигает 0,94 мкг/мл.

Кинетические кривые содержания ГИНК в моче приведены на рис. 2. По этим результатам рассчитаны фармакокинетические параметры (табл.1). Как видно, полученные данные позволяют оценить генетически обусловленную активность М-ацетилтрансферазы отдельных пациентов. Оказалось, что удобным параметром для этого является количество выводимого изониазида в процентах от вводимой дозы (фракция дозы). Быстрому фенотипу ацетилирования соответствует меньший процент выведения тест-маркера - изониазида и, наоборот, медленному фенотипу - более высокий процент выведения данного маркера.

Рис. 1 - Спектр поглощения производного ГИНК (С=10‘4 моль/л) с ванадатом аммония

Рис. 2 - Кривые кумулятивного выведения ГИНК с мочой: 1- сверхмедленный; 2 медленный, 3 - быстрый ацетиляторы. Стрелками обозначен доверительный ин тервал определяемых значений

Таблица 1 - Фармакокинетические параметры экскреции изониазида с мочой при нероральном приеме в дозе 0,45 г

Фенотип ацетнлиро- вания Фракция дозы,% AUC, мкг-ч/мл Ке„ч'1 Т-1/2, ч Vd, мл

Быстрый 3,1 ±0,2 21236±2250 0,561 ±0,050 1,3±0,2 41,7±4,5

Медленный 9,4±1,3 75452±1431 0,230±0,080 3,9±0,2 32,18±3,4

Сверхмедлен- ный 15,9±1,3 801256+1232 0,180±0,050 4,8±0,3 24,12±2,6

При фенотипировании активности NAT по разработанной методике было получено тримодальное распределение фармакокинетических параметров экскреции ГИНК в обследуемой выборке (табл. 2). При этом в указанных фенотипических группах была определена активность сывороточной ХЭ. Экспериментальные данные демонстрируют достоверную разницу активности холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с быстрыми и медленными, причем активность холинэстеразы у быстрых и медленных достоверно не отличается (рис.З). При статистической обработке данных по параметрическому критерию Стьюдента (tst) для N-ацетилтрансферазы нулевая гипотеза опровергается на 0,1%-ном уровне значимости (Р<0,001, tst=3.46), а для холинэстеразы нулевая гипотеза оп-

Была оценена достоверность результатов для тримодального распределения фармакокинетических параметров выведения антипирина (табл. 3). По параметрическому критерию Стьюдента нулевая гипотеза опровергалась в обоих случаях на 0,1%-ном уровне значимости (Р<0,01,131=2,66). Значит, с уверенностью можно говорить о достоверности разработанного метода и возможности с помощью него фенотипировагь инактиваторов антипирина на три группы: быструю, среднюю и медленную.

Таблица 3 - Фармакокинетические параметры экскреции антипирина слюной

Фенотип окисления Количество антипитина, выведенного за 12 часов, мкг Вероятность распределения

Быстрый 2,8±1,8 Р<0,001 Р<0,001

Средний 10,7±0,8

Медленный 24,2±3,2

Процесс ацетилирования, связанный с активностью N-ацетилтрансферазы, определяет не только метаболизм известных ксенобиотиков, но и осуществляет различные модификации в структуре гистонов [2], что может воздействовать на их способность ингибировать синтез РНК in vivo, тем самым, регулируя синтез РНК в клетке. Причем выявлено, что адреналин стимулирует ацетилирование гистонов [4]. Физиологическими регуляторами адреналина являются адренокортикотропный гормон (АКТГ) (стимулирует активность) и ацетилхолин (физиологический антагонист). Производные проопиомеланокортина (ПОМК) в процессе постгрансляционного процессинга подвергаются различным изменениям (гликозилирование, ферментативное отщепление, фосфорилирование и ацетилирование) с отщеплением молекулы АКТГ. Интересно, что индуктор клеточного метаболизма (пантотенат кальция) стимулирует ацетилирование и ингибирует ацстилэстеразу. При этом АКТГ взаимодействует с плазматическими рецепторами мембраны клетки надпочечника и активирует аденилатциклазу. Активируются протеинкиазы, контролирующие переход эфиров холестерина в холестерин. При этом наблюдается усиление гидролиза эфиров холестерина путем активации фермента холинэстеразы. Таким образом, наряду с оценкой ацетилирования и окисления при исследовании генетического полиморфизма в популяции, важным показателем может стать определение активности холинэстеразы.

Выводы

Предложен неинвазивный метод определения активности N-ацетилтрансферазы, основанный на изучении кинетики экскреции изониазида с мочой фотоколориметрическим методом при использовании в качестве аналитического реагента ванадата аммония.

Установлено достоверное повышение активности сывороточной холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с другими типами ацетилирования.

Разработана методика фенотипирования микросомальных оксидаз с помощью оценки общего количества антипирина выведенного за 12 часов сослюной обследуемого.

При длительном совместном применении лекарственных веществ, подвергающихся ацетилированию и препаратов, инактивирующися холинэстеразой необходимо проводить оценку фенотипа ацетилирования и активности сывороточной холинэстеразы.

Литература

1. Christensen С.В. V. IITalanta. 2002. V. 56. P. 289-299.

2. FestingM.F. W. // Toxicology Letters. 2001. V. 120. P. 293-300.

3. Miller C. S. II Toxicology. 1996. V. 111. P. 69-86.

4. Nebert D. W., Roe A.L. II Sci. Total Environ. 2001 V.274. P. 93-102.

5. PfostD. R„ Boyce-Jacino M. T. Grant D. M. II Trends Biotechnol. 2000. V. 18. P. 334-338.

6. Scheepers P. T.J., Heussen G.A.H. II Trends in Analyt. Chem. 1997. V. 21. P. 613-616.

7. Аширметов A.X., Краковский M. Э. // Лаб. дело. 1990. № 1. С. 16.

8. Холодов Л.Е., Яковлев В.П. Клиническая фармакология. М.: Медицина, 1985. 465с.

9. Гладких С.П. Направленный поиск, получение и исследование новых лекарственных средств на основе концепции метало-лигандного гомеостаза: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Старая Купавна, 1991.

10. 10 Подымов В.К. Красная волчанка. Ереван, 1981.

11. Карлинский В. М, Брейдо Е. В., Фаликович М. Я., Искаков Б.С., Бейсетаев О.Б., Баранов Н.П., Бекенова Ф.К. IIКлин, медицина. 1991. Т.69. №6. С. 85-87.

12. Муратов И. Д., Вавилова Т. И., Красовская Т. В. // Вестн. хирургии им. И. И. Грекова. 1992. Т. 148. №4-6. С. 73-75.

13. Штейнлухт Т. П., Маслова М. Н. //Вестн. дерматологии и венерологии. 1988. №9. С. 28-32.

14. ХегайМ. Д., Доброхотова Е. Г. И Лаб. дело. 1990. №10. С. 26-29.

15. Соради И. Основы и педиатрические аспекты фармакогенетики. Будапешт: изд- во АН Венгрии, 1984. 421с.

16. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Гисмятов Р.Г., Шитова Н.С., Зыкова И.Е. II Вопросы биол., мед. и фармацевт, химии. 2003. №3. С. 34-39.

17. Буловская JI.H., Борисенко Г.Н., Дробаченко О.А., Курбатова Г.П., Иванова В.В. //Лаб. дело. 1990. №.10. С. 28-30.

18. ГребенникЛ.И. //Проблемы туберкулеза. 1961. № 4. С. 69-73.

19. Джорджеску П., Пэунеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. Бухарест: Медицинское издательство, 1963. 345с.

20. Методы экспериментальной химиотерапии. / Под ред. Г.Н.Першина. М.: Медицина, 1971. 426с.

21. 21 .Brodie B.,Axelroa J., Sober топ A. et al. Hi. boil. Chem. 1949. V. 179. P. 25-28.

22. 22. ПанкинГ.Ф. Биометрия. M.: Высшая школа, 1973.-343с.

© М. И Евгеньев - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. той же кафедры;

Н. С. Шитова - асп. той же кафедры, В. И. Погорельцев - канд. мед. наук, доц. кафедры факультетской терапии Казанского государственного медицинского университета.