Содержание микроядер в эритроцитах и тяжелых металлов в тканях озерных лягушек, обитающих в загрязненной водной среде

DOI: 10.24411/9999-010A-2019-10100

Е.Б. РОМАНОВА, Е.С. РЯБИНИНА, К.В. ШАПОВАЛОВА, А.В. БОРЯКОВ

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород, Россия

СОДЕРЖАНИЕ МИКРОЯДЕР В ЭРИТРОЦИТАХ И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ТКАНЯХ ОЗЕРНЫХ ЛЯГУШЕК, ОБИТАЮЩИХ В ЗАГРЯЗНЕННОЙ ВОДНОЙ СРЕДЕ

Водные объекты Нижегородской области характеризуется интенсивной антропогенной нагрузкой, проявляющейся, прежде всего, в увеличении степени загрязнения природных вод, в том числе, и тяжелыми металлами (Гелашвили и др., 2008). Изучение особенностей функционирования и адаптации водных организмов, обитающих в условиях постоянного загрязнения, одна из актуальных проблем экологии, поскольку информация о состоянии здоровья гидробионтов (беспозвоночных, рыб, амфибий) крайне важна для оценки экологической ситуации и устойчивости экосистем в целом. Важным подходом к изучению этой проблемы является анализ интенсивности мутагенеза и стабильности онтогенетических процессов организма в условиях возрастающего антропогенного воздействия методами биоиндикации, предоставляющими практически единственную возможность получения информации о влиянии комплекса параметров среды и их взаимодействии (Spang, 1996).

Кровеносной системе принадлежит решающая роль в специфических реакциях организма, определении его резистентности и реактивности, поэтому для оценки интегрирующего эффекта антропогенного загрязнения, часто используют цитогенетический анализ, основанный на содержании в эритроцитах микроядер (Жулева, Дубинин, 1994; Кожин и др., 1997; Ковалева, 2008; Бродский и др., 2012 и др.) и гематологический подход (Чернышова, Старостин, 1994; Вершинин, 2004; Пескова, 2004 и др.).

Цель работы: оценка доли микроядер в эритроцитах и накопление тяжелых металлов (Mn, Cu, Cr, Al, Zn, Sr) в органах озерных лягушек в условиях городской среды и природной трансформации.

Материалы и методы

Сбор озерных лягушек (Pelophylax ridibundus, Pallas, 1771) (50 особей) осуществлялся на территории трех водных объектах Нижегородской области, в течение полевого сезона 2018 года. 1-ый водоем: участок р. Кудьмы у п. Ветчак (Нижегородская обл, Кстовский р-н), (широта 56.096735, долгота 44.314317). Основными загрязнителями водоема являются предприятия города Богородск и нефтеперерабатывающий завод г. Кстово. 2-ой - оз. Силикатное (г. Н. Новгород, Сормовский р-н), (широта 56.370912, долгота 43.777608). Водоем создан искусственно на месте добычи песка для бетонных изделий ЗКПД-4. Глубина около 20 м, берег и дно песчаные, вода прозрачная. Заболоченности практически нет. 3-ий: торфокарьер Ситниковского орнитологического заказника (далее - торфокарьер) (Нижегородская обл., Борский р-н), (широта 56.439791, долгота 44.072462). Представляет собой крупную систему водоемов выработанных торфяных месторождений разного типа.

В прибрежной зоне были отобраны пробы воды, в которых, с помощью спектрофотометра Hach DR-2800, определены химические загрязнители: железо общее,

© 2019 Романова Елена Борисовна, romanova@ibbm.unn.ru; Рябинина Елена Сергеевна, Ryabinina.E.S@yandex.ru; Шаповалова Кристина Вадимовна, kristin.shapovalova@gmail.com; Боряков А.В.

марганец, медь, хром, нитрат-ионы (NO3), нитрит-ионы (NO2), свинец, кобальт, никель, цинк, сульфаты, сульфиды и водородный показатель (рН). По результатам анализа был произведен расчет удельного комбинаторного индекса загрязненности воды УКИЗВ (Гелашвили и др., 2016). Число эритроцитов (тыс/мм3), лейкоцитов (тыс/мм3) и дифференцированный подсчет видов лейкоцитов (в %): нейтрофилов, базофилов. эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов, проводили общепринятым способом (Лабораторные методы..., 1987). Подсчет микроядер (Жулева, Дубинин, 1994) осуществляли на микроскопе Meiji Techno с использованием иммерсионного объектива при общем увеличении х1500, просматривая для каждой особи по 2000 эритроцитов (40000 клеток на выборку). Дифференцировали 4 вида микроядер: 1 -оформленные; 2 -прикрепленные; 3 - палочковидные; 4 - разрыхленные. С помощью окуляр микрометра измеряли большую (2a) и малую (2b) ось каждого микроядра и рассчитывали его площадь (мкм2). Тяжелые металлы определяли атомно-эмиссионным методом, с помощью AES-ICP-спектрометра Prodigy High Dispersion ICP (Teledyne Leeman Labs, США). При подготовке проб для анализа использовали микроволновую систему пробоподготовки МС-6. Результаты содержания тяжелых металлов в тканях получали в ppm (мкг/мл), конечную концентрацию выражали в мг/кг. По полученным данным рассчитывали коэффициент биологического поглощения (КБП) (Перельман, 1982) и коэффициент накопления (Кн) тяжелых металлов тканями (Пр. Росрыболовства №695 от 04.08.2009). Статистический анализ проводили непараметрическими методами, с расчетом критериев: Краскела - Уоллиса (H); Данна (D), коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). За критический уровень значимости принимали р= 0.05.

Результаты и их обсуждение

Исследованные водоемы различались видом химических загрязнителей. По результатам гидрохимического анализа наиболее грязным водоемом, оказался участок р. Кудьмы у п. Ветчак. В пробах воды выявлено превышения ПДКрыб.хоз по содержанию тяжелых металлов: железа, марганца, меди, хрома, никеля, кобальта, цинка и свинца. Качество вод характеризовалось 5-ым классом, экстремально грязные. Воды оз. Силикатное и торфокарьера соответствовали 4 классу качества воды, грязные. Отметим, что состояние водных объектов находится в прямой зависимости от состояния площади водосбора и уровня антропогенного освоения бассейна. Эффективность применения нормативов ПДК и УКИЗВ может быть не высокой, поскольку на водные экосистемы оказывают влияние не только химические, но и другие негативные факторы (например, тепловое загрязнение, мутность воды, изменение гидрологического режима и др.). Поэтому для оценки характера и силы воздействия загрязнителей использовали зооиндикаторов (озерных лягушек), демонстрирующих реакции на весь спектр химических, физических и климатических факторов, характерных для данной экосистемы.

Общее содержание лейкоцитов у озерных лягушек оз. Силикатное находилось в границах условной нормы. При этом общая численность в крови эритроцитов была минимальной для исследованных выборок. У выборок лягушек популяции участка р. Кудьмы (9.05±0.46)% и торфокарьера (9.95±0.47)% выявлена лейкопения, свидетельствующая о нарушении нормального кроветворения и снижении иммунной защиты организма (табл. 1). Количество эритроцитов у лягушек торфокарьера было повышенным, по сравнению с другими выборками.

Значительный интерес представлял сравнительный анализ лейкограмм озерных лягушек выборок (участок р. Кудьмы и торфокарьер), для которых выявлена лейкопения. В результате анализа данных по лейкоцитарной системе крови установлены количественные изменения во всех показателях, кроме моноцитов, доля которых была одинаковой в обеих выборках (u= 0.56, р=0.57) (рис.). Пониженное содержание лимфоцитов (u= 4.74, р<0.001) в крови озерных лягушек участка р. Кудьмы

свидетельствовало об угнетение специфической реакции иммунной системы, что компенсировалось повышением неспецифической защитной системой крови (нейтрофильных гранулоцитов, и= 4.92, р<0.001). Выявленное перераспределение лейкоцитарной системы крови иллюстрировало адаптивный ответ и обеспечивало устойчивое функционирование организма в условиях постоянного загрязнения водной среды.

Таблица 1. Общее содержание лейкоцитов и эритроцитов в крови озерных лягушек

№ п/п Водоем Содержание лейкоцитов, тыс/мм3 Содержание эритроцитов, тыс/мм3

1 Участок р. Кудьма 9.05±0.46 81.2±5.09

2 Оз. Силикатное 15.3±2.62 66.8±4.93

3 Торфокарьер 9.95±0.47 116.9±3.20

Статистические показатели: критерий Краскела-Уоллиса (Н); критерий Дана (Б) Н=6.24, р=0.044 Б1_2=2.44, р=0.043; Бг-3=1.16, р=0.73; Б2-3=1.49, р=0.40 Н=34.36, р<0.001 Б!-2=1.46, р=0.43; Б1_з=4.58, р=0.00001; Б2_3=5.20, р<0.001;

1 2 3 4 5 6

Лейкоциты, %

Участок р. Кудьмы  Торфокарьер

Рис. 1. Лейкоцитарные формулы крови озерных лягушек, в %: 1- миелоциты, 2 -нейтрофилы, 3 - базофилы, 4 - эозинофилы, 5 - моноциты, 6 -лимфоциты

Таблица 2. Содержание микроядер в периферической крови озерных лягушек

Водоем Число клеток с микроядрами, шт/ 1000 клеток Содержание микроядер в выборке Х/1000 клеток

Виды микроядер

оформленные прикрепленные палоч-ковид-ные разрыхленные

1. Участок р. Кудьмы 2/0.05 332/8.51 - 18/0.46 352/9.02±0.74

2. Оз. Силикатное 2/0.1 272/15.1 - 9/0.5 283/15.7±2.19

3. Торфокарьер - 146/3.65 - 16/0.4 158/4.05±0.53

Статистические показатели: Критерий Краскела-Уоллиса (Н); критерий Дана (Б) Сравнение выборок по сумме микроядер: Н=55.37, р<0.001 Б1-2=2.52, р=0.11; Б1-3=4.18, р=0.0002;Б2-3=5.84, р<0.001

Примечание: * - в числителе: число эритроцитов с микроядрами в выборке, шт; в знаменателе: доля клеток с микроядрами на 1000 эритроцитов

Для анализа цитогенетической стабильности озерных лягушек использовали микроядерный тест. Известно, что микроядра образуются из хромосомных фрагментов или целой хромосомы, которые не входят в основное ядро при делении клетки, как следствие это приводит к фрагментации ДНК и изменению митотического аппарата (Ковалева, 2008; Бродский и др., 2012). Все исследованные популяции характеризовались высоким содержанием микроядер (табл. 2). По суммарному содержанию микроядер лягушки, обитающие на участке р. Кудьма, превосходили другие выборки. Отметим, что во всех выборках в эритроцитах наиболее часто встречались прикрепленные и отсутствовали палочковидные микроядра. Доля разрыхленных и оформленных была не большой. Средняя площадь прикрепленных микроядер составляла (1.2±0.04) мкм2.

Коэффициентом ранговой корреляции Спирмена выявлена сильная положительная корреляционная взаимосвязь между концентрацией в водном объекте свинца и цитогематологическими показателями: суммой микроядер (г=0.88, р=0.049); долей прикрепленных микроядер (г=0.89, р=0.038), содержанием лейкоцитов (г=0.87, р=0.05), что свидетельствовало о наиболее сильном влиянии этого химического элемента на иммунный статус лягушек.

Биоаккумуляцию тяжелых металлов (Мп, Си, Сг, А1, 2п, Бг) оценивали в тканях и органах озерных лягушек оз. Силикатное. Исследованные металлы накапливались во всех тканях организма, но их распределение было неравномерным, а в ряде случаев избирательным. В высоких концентрациях тяжелые металлы обнаружены в селезенке (хром: 232,33±35.33 мг/кг) и костях (цинк: 150,25±37.66 мг/кг, стронций: 170,79±50.8 мг/кг) лягушек. Ионы меди предпочтительно аккумулировались в сердечной мышце; хром, марганец, алюминий, кадмий, никель, свинец в печени озерных лягушек. В мышцах содержание тяжелых металлов было невысоким (от 6,3 до 3,8 мг/кг). Максимальный коэффициент биологического поглощения тяжелых металлов тканями (Кн>1000) лягушек, относительно содержания их в водной среде обитания, выявлен для Мп, Си, Сг, А1 и 2п. Так, по способности аккумулировать ионы марганца, исследованные ткани озерных лягушек расположились в порядке убывания в следующем ряду: селезенка, кости, кожа, половые органы, печень, сердце. В порядке убывания по накоплению ионов меди, в ряду: сердце, печень, кровь, селезенка.

Из литературы известно, что попадая в организм, металлы практически не подвергаются каким-либо существенным превращениям, включаются в биохимический цикл и крайне медленно покидают его (Лобанова, 2008; Моисеенко, 2008 и др.). Находясь в тканях и органах в виде комплекса с белками, аминокислотами и другими биологически активными соединениями металлы способны вызывать нарушение функций, отравление или гибель организма. Степень токсического воздействия зависит от природы металла, концентрации и комплексообразующей способности. Представлялось интересным проследить взаимосвязь между накоплением тяжелых металлов в тканях и исследованными цитогематологическими показателями. Выявлена сильная отрицательная взаимосвязь, между долей прикрепленных микроядер (г = -0.99, р = 0.023), суммой микроядер (г = -0.99, р = 0.041) и содержанием в крови 2п. Накопление ионов меди в трубчатых костях положительно скоррелировано с долей разрыхленных микроядер (г = 0.97, р=0.03) Установлена положительная взаимосвязь между общим числом эритроцитов и содержанием: в сердечной мышце стронция (г = 0.87, р = 0.05); в печени цинка (г = 0.9, р=0.03); в костях марганца (г = 0.99, р<0.001). Отрицательная корреляционная взаимосвязь числа эритроцитов в крови выявлена с содержанием в печени А1 (г = -0.90, р=0.03), в мышцах Бг (г = -0.98, р=0.003) и Мп (г = 0.90, р=0.035).

Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, о высокой степени аккумуляции загрязнителей природного и техногенного происхождения в тканях и органах озерных лягушек; во-вторых, о способности тяжелых металлов оказывать

гемотоксическое действие, следствием чего является снижение защитных иммунных реакций; и, в-третьих, о возрастании цитогенетической нестабильности амфибий, обитающих в условиях городской среды.

Список литературы

Бродский И.Б., Брянцева С.А., Ковалева А.М., Урюпова Е.Ф., Гусев С.А.,Сергиенко В.И., Матишов Д.Г. Микроядра как маркеры хромосомных изменений клеток // Журн. фундаментальной медицины и биологии. 2012. № 1. С. 86.

Вершинин В.Л. Гемопоэз бесхвостых амфибий - специфика адаптациогенеза видов в современных экосистемах // Зоол. журн. 2004. Т. 83, № 11. С. 1367-1374.

Гелашвили Д.Б., Охапкин А.Г., Доронина А.И. Экологическое состояние водных объектов Нижнего Новгорода. Нижний Новгород, 2008. 414 с.

Гелашвили Д.Б., Безель В.С., Романова Е.Б., Безруков М.Е., Силкин А.А., Нижегородцев А.А. Принципы и методы экологической токсикологии. Нижний Новгород, 2016. 702 с.

Жулева Л.Ю., Дубинин Н.П. Использование микроядерного теста для оценки экологической обстановки в районах Астраханской области // Генетика. 1994. Т. 30, № 7. С. 999-1004.

Ковалева О.А. Цитогенетические аномалии в соматических клетках млекопитающих // Цитология и генетика. 2008. Т. 42, № 1. С. 58-72.

Кожин А.А., Алексеенко В.А., Закруткин В.Е. О возможности использования скринингового цитогенетического анализа для оценки степени загрязнения природной среды тяжелыми металлами // Материалы Международ. симпоз. «Тяжелые металлы в окружающей среде». Пущино, 1997. С. 219-226.

Лабораторные методы исследования в клинике / Под. ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. 368 с.

Лобанова Т.М. Особенности накопления тяжелых металлов промысловыми видами рыб // Вестн. КГУ им. Н.А. Некрасова. 2008. Т. 14, № 1. С. 18-21

Моисеенко Т.И. Водная токсикология: теоретические принципы и практическое предложение // Водные ресурсы. 2008. Т. 35, № 5. С. 554-565.

Перельман В.И. Краткий справочник химика / Под ред. Б.В. Некрасова. М.; Л., 1982. 384 с.

Пескова Т.Ю. Адаптационная изменчивость земноводных в антропогенно загрязненной среде: автореф. дис... докт. биол. наук. Тольятти, 2004. 36 с.

Приказ Федерального агентства по рыболовству от 4 августа 2009 г. № 695 "Об утверждении Методических указаний по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения" URL: http://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/206945 2/#ixzz5eIfsb2hM

Чернышова Э.В., Старостин В.И. Периферическая кровь лягушек рода Rana - тест-система для оценки окружающей среды // Изв. РАН. 1994. № 4. С. 656-660.

Spang W.D. Bioindikation in Rahmenraum relevanter Planungen - Grundlagen, Bedeutung, Indikatorwahl // Heidelberg. geogr. Arb. 1996. №. 100. Pp. 75-87.