Способ комбинированной терапии рака печени РС-1 в эксперименте
METHOD OF COMBINED LIVER CANCER PC-1 THERAPY IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано для рака печени РС-1 в эксперименте.
Онкологическая патология занимает одно из лидирующих мест по причине смертности среди населения, в связи с чем остается актуальной проблема поиска новых подходов к лечению больных с опухолевыми заболеваниями. Терапия с использованием цитостатиков является ключевым элементом консервативного лечения больных со злокачественными новообразованиями.
Особенностью химиотерапии опухолей является малый диапазон терапевтических доз, отделяющих лечебный эффект от токсического. Отсутствие выраженных качественных различий в биохимических свойствах и способности к делению между опухолевыми и нормальными клетками организма не позволяет цитостатикам оказывать селективное воздействие на опухоль. Данное обстоятельство определяет побочные действия на нормальные органы и ткани и существенно ограничивает их применение, приводя к снижению эффективности лечения или даже к его отмене. (Богуш Т.А. Современные подходы к повышению эффективности противоопухолевой терапии путем индивидуальной оптимизации лечения и избирательного снижения побочных токсических проявлений цитостатиков / Т.А. Богуш, Е.А. Богуш, А.А. Степанов // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – Т.45, № 1. – С. 32–38).
Применение разрешенных в медицинской практике противоопухолевых средств, приводит к развитию целого комплекса осложнений: вторичному иммунодефициту, снижению детоксикационной функции печени, возникновению вторичных очагов злокачественных опухолей и т.д. Особенно часто после введения цитостатиков наблюдается токсическая аплазия органов кроветворения (Дыгай А.М. Теория регуляции кроветворения в норме и при патологии / А.М. Дыгай, В.В. Жданов // Сибирский научный медицинский журнал. – 2012. – Т. 32, № 1. – С. 21–30).
Особое место в ряду препаратов, обладающих способностью не только усиливать эффект цитостатиков, но и существенно снижать их токсичность, занимают созданные на основе лекарственного растительного сырья средства, спектр фармакологической активности которых определяется входящими в их состав биологически активными веществами. От качественного и количественного состава БАВ зависит доминирование и степень выраженности того или иного фармакологического эффекта конкретного растения и обоснование его выбора при назначении в комбинации с химиотерапевтическими препаратами [Гольдберг Е.Д., 2008].
Известны способы, сочетающие цитостатик (циклофосфамид) с экстрактами рябины обыкновенной, рябины черноплодной, одуванчика лекарственного, родиолы розовой.
Комбинация экстракта рябины обыкновенной (Sorbusaucuparia L.) и циклофосфамида применялась в терапии карциномы лёгких Льюис в эксперименте. Содержащиеся в экстракте флавоноиды и фенольные соединения, в том числе антонцианы, оказывают ингибирующее влияние на развитие канцерогенеза и подавляют пролиферацию опухолевых клеток. Однако при использовании экстракта рябины в комбинации с цитостатиком не было выявлено существенных отличий в эффективности лечения по сравнению с монотерапией экстрактом рябины, следовательно, эффекта синергизма между цитостатиком и экстрактами разных видов рябин в отношении первичной опухоли в данном случае не развивалось. Необходимо отметить, что экстракты рябины обладают свойством снижать гематотоксичность только в случае монотерапии данными экстрактами, при комбинированной терапии данная тенденция отсутствовала.
Известно противометастатическое действие циклофосфамида при его совместном использовании с экстрактом плодов рябины черноплодной и с экстрактом плодов рябины обыкновенной в дозах 1 и 5 мл/кг, судя по таким показателям процесса диссеминации, как частота метастазирования, количество и площадь метастазов в легких на модели карциномы Льюиса.
Кроме того, авторами комбинированной терапии экстрактом рябины и цитостатиком была использована концентрация цитостатика 125 мг/мл, которую они вводили внутрибрюшинно однократно, что не фиксируется ни в одних рекомендациях по его применению. Максимальная рекомендованная концентрация циклофосфана при монотерации опухолевых процессов составляет 40-50 мг/мл, при одномоментном введении, 1 раз на весь курс лечения, что говорит о неадаптированности способа комбинированной терапии на доклиническом этапе в отношении крыс и невозможности в дальнейшем сопоставлении данных результатов, в условиях клинических исследований, на человеке, так как дозировка превышает максимальную в 2,5 раза (Ульрих А.В. Изучение влияния экстракта рябины черноплодной на развитие карциномы легких Льюис и эффективность лечения циклофосфаном / материалы 15 научной студенческой конференции биологического института. – 2016. – С. 15; Ульрих А.В. Экстракт рябины обыкновенной (Sorbusaucuparia) в комплексной терапии экспериментальных опухолей / Перспективы развития фундаментальных наук. – 2016. – Т. 4. – С. 132–134; Исайкина Н.В., Калинкина Г.И., Разина Т.Г., Зуева Е.П., Рыбалкина О.Ю., Ульрих А.В., Фёдорова Е.П., Шилова А.Б. Плоды рябины обыкновенной (SorbusAucuparia L.) как источник средства для повышения эффективности химиотерапии опухолей/Химия растительного сырья. – 2017. - №4 – С. 165-173).
Также имеются экспериментальные данные о возможности ингибирования метастазирования исключительно в условиях удаления первичного опухолевого узла и повышения эффективности комбинированного действия цитостатика и экстракта одуванчика лекарственного. В эксперименте комбинированной терапии экстрактом одуванчика лекарственного и цитостатика мышам с солидными опухолями вводили 125 мг/кг циклофосфана однократно внутрибрюшинно. Максимальная рекомендованная концентрация циклофосфана при монотерапии опухолевых процессов составляет 40-50 мг/мл, что говорит о неадаптированности способа комбинированной терапии на доклиническом этапе в отношении крыс и невозможности в дальнейшем сопоставлении данных результатов в условиях клинических исследований на человеке, так как дозировка превышает максимальную в 2,5 раза. В результате исследования на модели карциномы легких Льюиса оказалась выраженной противометастатическая активность экстракта одуванчика лекарственного в дозе 100 мг/кг и циклофосфана, под влиянием которых отмечено снижение частоты метастазирования, числа и площади метастазов. Нет достоверных данных, подтверждающих успешность комбинированной терапии экстрактом одуванчика лекарственного и цитостатиком при наличии первичной опухоли. (Повышение эффективности хирургического и химиотерапевтического методов лечения перевиваемых опухолей экстрактом одуванчика лекарственного/ Е. Н. Амосова, Е. П. Зуева, Т. Г. Разина. - С.36-39, Тихоокеанский медицинский журнал. №3., 2014).
В качестве известного средства с подобными свойствами можно привести пример жидкого спиртового экстракта родиолы (Extrectum Rhodiolae fluidum) на 40% этиловом спирте в соотношении 1:1 из корневищ с корнями родиолы розовой. У экстракта родиолы обнаружены свойства: снижать частоту метастазирования экспериментальных опухолей, предупреждать развитие метастазов на фоне удаления опухолевого узла, уменьшать интенсивность процесса диссеминации на фоне введения цитостатика. Препарат обладает тонизирующим воздействием центральную нервную систему, при его использовании возможно развитие повышенной возбудимости у пациентов, бессонницы, лабильности артериального давления и головной боли. Иногда наблюдается развитие аллергических реакций. Недостатком жидкого экстракта родиолы является ограничение при назначении больным с выраженной артериальной гипертензией, лихорадкой, сахарным диабетом, заболеваниями сердечно-сосудистой системы, а также пациентам с повышенной чувствительностью к компонентам, входящим в состав препарата. (Пат. 2023446 Российская Федерация, МПК А61К 35/78. Антиметастатическое средство [Текст] / Яременко К.В., Дементьева Л.А., Саратиков А.С.; заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН (RU), - №4082815/14; заявл. 13.05.1993; опубл. 30.11.1994.Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1984. - т. 1, с. 140).
Однако несмотря на многообразие способов в литературе отсутствует способ применения  комбинации экстрактов с цитостатиом для терапии рака печени рс-1 в эксперименте.
Наиболее близким аналогом является способ терапии рака печени цитостатиком (циклофосфамидом), что указано в показаниях к его примеению.. Однако данный способ обладает следующими недостатками: отсутствие селективного воздействия на опухоль с преобладанием системного эффекта на организм в целом, что приводит к развитию вторичного иммунодефицита, снижению детоксикационной функции печени.
Задачей данного изобретения является создание эффективного способа применения комбинации цитостатика (циклофосфамида) и экстракта аврана лекарственного, повышающего эффективность противоопухолевой терапии и снижающего прямое негативное влияние цитостатика на организм в целом.
Преимуществом предлагаемого способа комбинированной терапии рака печени в эксперименте является то, что предложенное сочетание циклофосфамида и экстракта аврана лекарственного потенцирует противоопухолевые эффекты данных веществ в 2,6 раза по сравнению с отдельным применением циклофосфамида, а также благоприятно воздействует на организм лабораторных животных с опухолью, способствует набору массы тела, препятствует развитию кахексии как за счет снижения экстрактом аврана токсичности используемого в комбинации циклофосфамида, так и уменьшения экстрактом токсичного эффекта распада и некроза опухоли.
Предложенный способ состоит в комбинированном воздействии на опухоль цитостатика и аврана лекарственного.
Используемый в комбинации экстракт представляет собой упаренный экстракт листьев и цветков аврана лекарственного, полученный путем измельчения травы аврана лекарственного, экстракции спиртом 96%, выпаривания экстракта, добавления хлороформа, удаления хлороформа. Отметим, что экстракцию спиртом проводят на водяной бане до кипения и кипятят в течение 14-15 минут. Выпаренный экстракт разводят сначала дистиллированной водой температурой 40-50°С, затем добавляют хлороформ в пропорции 4/5 части воды и 1/5 часть хлороформа, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, далее отделяют водную фракцию и высушивают ее. Средство, полученное данным способом из сырья аврана лекарственного, имеет следующий химический состав:4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он: 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-α-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро-d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин.
Параметры подлинности и качества средства.
Материалом служило сырьё аврана лекарственного, собранное в Воскресенском районе Саратовской области в окрестностях с. Чардым в июле 2016 г. Высушенные листья аврана лекарственного предварительно измельчали.
Полученный патентованным способом (Патент РФ 2482863), упаренный экстракт цветков и листьев аврана прозрачный, имеет ненасыщенный коричневый цвет, при проведении качественных реакций на флавоноиды дает положительный результат, при проведении качественных реакций на алкалоиды дает отрицательный результат, нетоксичен, что обусловлено химическим составом и подтверждено ранее в серии экспериментов на крысах [Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., 2013, 2014].
В эксперименте, проводимом в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под ред. А.Н. Миронова. — М.: ГрифиК, 2012. — 944 с.], использовано 16 самцов белых лабораторных крыс массой 200±50 гр., которым подкожно, в область лопатки, имплантировали по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса рака печени.
Внутрибрюшинный способ введения веществ (экстракта аврана, циклофосфамида и физиологического раствора) был выбран, исходя из лучшей биодоступности необходимой концентрации препаратов (70-90%). Вводили, начиная с 5 суток после трансплантации опухоли, ежедневно, в течение трёх недель.
Способ введения веществ основан на предотвращении химического взаимодействия растворов цитостатика и экстракта аврана в брюшной полости, поэтому вещества вводились с интервалом 30 минут, так как данный промежуток времени необходим для всасывания циклофосфамида введенного внутрибрюшинно. Для появления в крови его активных метаболитов в результате прохождения через печень необходимо 2-3 часа. Введённый через 30 минут экстракт аврана лекарственного соответствует времени формирования   активных метаболитов циклофосфамида, в связи с чем происходит комбинация эффекта данных веществ.
Животные с перевитым раком печени методом случайной выборки были разделены на четыре группы по 4 крысы.
• В первую экспериментальную группу вошли животные, получающие циклофосфамид в дозе 5 мг/кг и водный раствор экстракта аврана в дозе 110 мг/кг;
• во вторую группу вошли животные, получающие циклофосфамид в дозе 5 мг/кг;
• в третьей группе животные получали экстракт аврана в дозе 110 мг/кг;
• в четвёртой группе – группе сравнения, животным вводился раствор NaCl 0,09%в объеме 1 мл.
3
контр
опыт
контр
контр
опыт
Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=АхВхС/1000 (мм), где А– ширина, В – толщина, С – высота опухоли в мм. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждый день от начала эксперимента. Высчитывали индекс торможения роста опухоли – показатель эффективности противоопухолевого препарата, вычисляемый по формуле: ИТРО=[(M –M)/M]*100%, где M– средняя масса опухоли в группе контроль, а M– масса опухоли опытной группы  (Вычисляется масса опухоли, полученная на конец эксперимента).
Также каждый день животное взвешивали для оценки динамики массы тела. Для анализа результатов высчитывали истинную массу животного. Дельта массы тела животных определялась путем вычитания массы животного до начала эксперимента от истинной массы животного в день эксперимента. По окончанию опыта крыс выводили из эксперимента. Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащих Хельсинской декларации.
Для гистологического исследования образцы опухоли и внутренних органов фиксировали в 10%-м растворе забуференного нейтрального формалина, подвергали стандартной спиртовой проводке (изопропиловый спирт), после чего доводили до парафиновых блоков. Для обзорного описания изменений в опухоли и органов срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах. Использовали моноклональные антитела к маркёру апоптоза Bax (ab692), аутофагии LС3b (ab48394). BAX– ускоряет запрограммированную гибель клеток, способствует активации Каспазы 3 и таким образом индуцирует апоптоз, экспрессируется в цитоплазме клеток и мембране митохондрий.LC3B– белок участвующий в формировании аутофагосомальных вакуолей, имеющих значение в развитии резистентности опухолевых клеток к проводимой терапии. Характерно цитоплазматическое окрашивание, возможно окрашивание отдельных мембран, мембран аутофагосом.
Данные были подвергнуты статистической обработке при помощи программного обеспечения Statistica 17.0. Нормальность распределения показателей в группах была проверена при помощи критерия Шапиро-Уилка. Так как распределение данных не соответствовало нормальному значимость различий определяли при помощи критерия Манна-Уитни (Z-критерий) с вычислением медианы, 25 и 75 перцентиля, максимума и минимума. При данном методе отличия медиан определяется при Z≥1,96 с вероятностью в 95%.
Результаты.
При внутрибрюшинном введении циклофосфамида и экстракта аврана крысам 1-й группы, отмечали значимое замедление темпов роста перевиваемого рака печени по сравнению с 4-йгруппой животных (с опухолью, но без воздействия) на конец эксперимента (p=0,039). Как представлено на Фигуре 1, на момент окончания эксперимента объем опухоли в первой экспериментальной группе (3,00±1,26 см3) был на 61,8 % меньше, чем в группе сравнения (7,87±3,62 см3). Индекс торможения опухоли по массе в среднем составил 61,88%. В группе, которой вводился только экстракт аврана индекс составил 49,5%, в группе с введением циклофосфамида – 54,2%. (Фиг. 1)
При макроскопическом изучении опухоли в группе животных с комбинированной терапией отмечали некротизированные участки и кровоизлияния, что наблюдалось и в группе с монотерапией экстрактом аврана. Данный факт является показателем эффективности исследуемых веществ, поскольку одним из возможных путей регресса опухоли является постепенное развитие в опухолевых клетках некробиотических и дистрофических процессов.
В результате исследования патоморфологической картины в группе сравнения рак печени был представлен клетками с выраженным ядерным полиморфизмом, отражающим разные этапы клеточного деления. В строме опухоли, ее капсуле и вокруг нее располагалось много новообразованных кровеносных сосудов капиллярного типа.
В группе с комбинированной терапией при гистологическом исследовании в ткани опухоли обнаружены обширные зоны некроза, уменьшенные в размерах клетки, появлялись «клетки-тени», что свидетельствует о выраженных атрофических и дистрофических процессах. Выявлено увеличение и утолщение соединительнотканных перегородок.
В группе с монотерапией как экстрактом аврана, так и циклофосфамидом, так же наблюдалось увеличение площади зон некроза, однако площадь их была меньше, чем в группе с комбинированной терапией.
При иммуногистохимическом окрашивании на цитоплазматический маркер активации апоптоза Bax в клетках рака печени РС-1 группы сравнения и группы с монотерапией циклофосфамидом наблюдали отрицательную реакцию. Данный эффект подтверждает тот факт, что циклофосфамид обладает цитотоксическим и вызывает некроз в клетках опухоли, не вызывая в них апоптоза. В группах с монотерапией экстрактом аврана и комбинированной терапией отмечали выраженную экспрессию данного маркёра, что доказывает апоптотическую активность экстракта аврана на клетки рака печени, а в комбинации с циклофосфамидом достигается двойной (цитотоксический и апоптотический) эффект.
При иммуногистохимическом окрашивании на маркер аутофагии LC3b в клетках рака печени РС-1 группы сравнения и группы с мототерапией циклофосфамидом наблюдалась умеренная экспрессия данного маркера, что свидетельствует о развитии устойчивости клеток к влиянию на нее цитостатика. В группе монотерапией экстрактом аврана и группе с комбинированной терапией экспрессия была отрицательная, что свидетельствует об отсутствии развития резистентности клеток и врезультате достигается более высокая эффективность терапии, что отражает в индекс торможения роста опухоли. (Фиг.5.)
На фигуре 4 представлены гистологические препараты для оценки патоморфологических изменений внутренних органов.
При оценке патоморфологических изменений в печени животных группы сравнения наблюдали выраженное полнокровие крупных кровеносных сосудов, выраженную тотальную дистрофию вплоть до некроза гепатоцитов. На фоне монотерапии циклофосфамидом отмечалось умеренное полнокровие сосудов, дистрофия гепатоцитов выражена, но в меньшей степени, чем в группе сравнения. В группе с монотерацией экстрактом аврана и в группе, получающей комбинированную терапию, не было обнаружено выраженных структурных изменений.
В группе крыс с монотерапией циклофосфамидом в селезенке отмечали обеднение лимфоидной ткани, наблюдали отсутствие ярко выраженных светлых центров и мантийной зоны. В группе, получающей комбинированную терапию  выраженных структурных изменений выявлено не было.
В почках крыс группы сравнения отмечали набухание эпителия извитых канальцев, умеренное полнокровие клубочков и отсутствие просвета между капсулой Шумлянского-Боумена и сосудистым клубочком. В группе животных, получающей комбинированную терапию выраженных структурных изменений выявлено не было (Фиг.4).
При оценке динамики дельты массы тела животных, представленной на фигуре 2, наблюдалось ее увеличение в группе крыс с комбинированной терапией, то есть комбинированное использование экстракта аврана лекарственного и циклофосфамида способствует набору истиной массы животных. При лечении животных только циклофосфамидом, развивалась кахексия, в то время как при комбинированном использовании его совместно с экстрактом аврана кахексия не развивается (Фиг.2).
Под действием экстракта повышается эффективность действия цитостатика в целевой точке (опухоли) и минимизируется токсическое влияние продуктов обмена циклофосфамида на организм в целом.
Сравнительному анализу подвергались индексы массы внутренних органов, представленные на фигуре 3, которые рассчитывались по формуле: масса органа/масса тела крысы*100%.
По результатам исследования было выявлено отсутствие значимых отличий в экспериментальных группах по сравнению с контрольной группой, что соответствует неизмененной макроскопической картине органов, косвенно отражающей их нормальную функциональную активность (Фиг. 3).
Пример.
Самцу крысы массой 213 г. подкожно в области лопатки имплантировали опухолевую взвесь штамма альвеолярного рака печени PC-1 по 0,5 мл 25% в растворе Хэнкса. Комбинированную терапию циклофосфамидом и экстрактом аврана лекарственного проводили ежедневно начиная с 5 суток с момента трансплантации опухоли в течение 3 недель. Раствор циклофосфамида вводился внутрибрюшинно в дозировке 5 мг/кг, затем не ранее чем через 30 минут и не позже 45 минут внутрибрюшинно вводился раствор экстракта аврана лекарственного в дозировке 110 мг/кг, полученного патентованным способом (патент РФ 2482863). Динамику роста опухоли оценивали по увеличению ее объема ежедневно на всём протяжении эксперимента. Измерения проводились электронным штангенциркулем. На 20-е сутки терапии крысу вывели из эксперимента и произвели забор образцов ткани органов, опухоли для морфологического исследования.
В структуре исследуемой опухоли отмечали атрофические и дистрофические изменения опухолевых клеток и появление четких зон некроза. Митозы в клетках опухоли не были выявлены. Отсутствие митозов и уменьшение диаметра клетки и диаметра ядра (по сравнению с литературными данными средних значений характерных для данной опухоли) указывают на низкую митотическую активность клеток опухоли.
3
3
3
3
3
3
Изменение объема опухоли крысы, получавшей экстракт аврана, через 5 суток после введения – 0,39 см, 8 суток – 0,66 см, 10 суток – 0,86 см, 12 суток –1,03 см, 14 суток – 1,38 см, 20 суток – 3,00 см. Таким образом, динамика роста опухоли при лечении комбинацией экстракта аврана и циклофосфамида свидетельствует о заметном замедлении роста опухоли, относительно группы сравнения, где объемы составляли (по сравнению с известными в литературе средними значениями объема рака печени РС-1 на определенные сутки после перевивки).
Как видно из описания и примера, способ комбинированной терапии рака печени заключается в ежедневном последовательном введении циклофосфамида внутрибрюшинно в дозировке 5 мг/кг (согласно инструкции применения) и последующем внутрибрюшинном введении не ранее, чем через 30 минут и не позже 45 минут нетоксичного экстракта травы аврана лекарственного в дозировке 110 мг/кг (Патент РФ 2482863). Предложенный способ не только эффективно задерживает темпы роста опухоли, вызывая в ней дистрофические изменения и некрозы, но и позволяет снизить токсичность циклофосфамида благодаря комбинации с авраном. Ключевой особенностью действия предложенной комбинации является антикахексическое свойство, благодаря чему не только минимизируются нежелательные побочные эффекты цитостатика, но и оказывается общее благоприятное воздействие на организм лабораторного животного с привитой опухолью, набор массы тела животными.Таким образом, противоопухолевое действие экстракта аврана лекарственного позволяет рекомендовать его комбинацию с цитостатиком для комбинированной терапии рака печени, а антикахексические свойства экстракта обуславливают его потенциальное преимущество в постоперационном периоде после удаления первичного опухолевого узла, обеспечивая лучшее течение реабилитации.
Таким образом, при комбинации экстракта аврана и циклофосфамида наблюдается значительное замедление темпов роста опухоли; выраженные признаки повреждения клеток опухоли (выявленные при гистологическом исследовании); признаки активации апоптоза (как наиболее благоприятного варианта гибели опухолевых клеток); блокируется аутофагия (как следствие не формируется резистентность опухоли к проводимой терапии). Кроме того, комбинированная терапия способствует набору массы у животных с опухолью, препятствуя развитию раковой кахексии, за счет снижения токсического влияния продуктов распада рака печени и цитостатика.
Полученные данные, позволяют сделать вывод, что при комбинации экстракта аврана лекарственного и циклофосфамида противоопухолевая терапия рака печени РС-1 значительно эффективнее по сравнению с монотерапией экстрактом аврана или циклофосфамидом.