СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АМИЛОИДОЗА ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И КОМПЛЕКТ СРЕДСТВ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF AMYLOIDOSIS DIAGNOSTICS IN PATIENTS WITH ALZHEIMERTS DISEASE AND SET OF MEANS FOR ITS REALISATION

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и молекулярной биологии и предназначено для диагностики амилоидоза и связанных с ним нейродегенеративных заболеваний (НДЗ).
Термин амилоидоз относится к различным заболеваниям, общей характеристикой которых является тенденция к агрегации специфических белков (в том числе амилоидов) в виде нерастворимых фибрилл, волокон и бляшек. Отложения белков в форме амилоидных волокон и бляшек - признак заболеваний, для которых характерны дегенеративные процессы в центральной нервной системе, других органах и тканях [Stefani M., Dobson C.M. Mol. Med. 2003, 81, №11, 678-699].
Все амилоидные болезни распознаются, как правило, в старческом возрасте и относятся к возрастным нарушениям здоровья. Все НДЗ имеют ряд характерных общих черт. Отложение белков - характерное свойство более чем 20 дегенеративных расстройств, влияющих на ЦНС и ряд периферических тканей. Общеизвестными амилоидными болезнями являются такие НДЗ, как болезнь Альцгеймера (БА), болезни Паркинсона и Гентингтона, синдромы Дауна, Стиля-Ричардсона-Олжевски и Рейе, болезнь телец Леви, сосудистая деменция, деменция в отсутствии отличительной гистопатологии, болезнь Пика, прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальная дегенерация, множественная системная атрофия, миотропный латеральный склероз, эпилепсия и другие. Все они характеризуются амилоидозами - отложением амилоидных белков в тканях мозга. Поскольку эти патологии включают несколько форм фатальных системных амилоидозов и, по меньшей мере, одно расстройство, связанное с медицинским вмешательством (гемодиализом), то амидоидозы являются необычно важными в контексте установления точного диагноза.
Наиболее известной из нейродегенеративных заболеваний является болезнь Альцгеймера, которая по данным ВОЗ в Америке в 2006 году вышла на 4 место по количеству больных и по летальным исходам.
Первопричиной БА общепризнано накопление растворимых β-амилоидных белков (β-амилоид) в мозге по мере старения организма, которые при определенной концентрации включают каскад событий, приводящих к гибели нейрона [Мальцев А.В. и др. Альманах «Геронтология и гериатрия», Москва, 2003, Вып.2, с.78-83; Мальцев А.В. и др. Альманах «Геронтология и гериатрия», Москва, 2004, Вып.3, с.230-232]. В 90-93% случаев БА возникает как спорадическое заболевание и около 10% - как наследственное.
Таким образом, стоит задача как можно более ранней диагностики амилоидоза.
Известен способ диагностики амилоидоза (патент US 6365414) путем сравнения количества β-амилоидных формирований в цельной и ряде разведений спинно-мозговой жидкости (СМЖ) больного человека с количеством β-амилоидных формирований в цельной и ряде разведений спинно-мозговой жидкости здорового человека, которые определяют по реакции с цинком при добавлении пептида, включающего с 6-й по 28-ю аминокислоты амилоидного β-пептида (β-амилоида).
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому нами способу является взятый нами за прототип способ диагностики амилоидоза (патент US 6114133), включающий определение количества β-амилоида (1-42) в образце спинно-мозговой жидкости пациента и сравнение его с заранее предопределенной величиной, при этом количество β-амилоида измеряют при захватывании растворимого β-амилоида из исследуемого образца с помощью одного антитела с последующим определением захвата с помощью другого антитела с энзиматической меткой, т.е. методом ферментного иммуносорбентного анализа, например ELISA.
Недостатком указанных выше способов является необходимость использовать спинно-мозговую жидкость пациента, которую желательно брать только при наличии серьезных подозрений на нейродегенеративное заболевание или по жизненным показаниям. В то же время при попытке использования других жидкостей, например крови, сыворотки крови, или лимфы известные способы являются недостаточно чувствительными.
Кроме того, было показано [Clark CM. et.al., Arch Neurol, 2003, 60(12), р.1696-1702; Burkhard PR. et.al., Clin Chem Lab Med., 2004, 42(4), p.396-407], что количество β-амилоида в СМЖ в контрольных группах здоровых пациентов колеблется в широких пределах, что снижает достоверность вышеуказанных способов, т.к. для этих способов требуется сравнение со здоровым организмом.
Техническая задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в повышении чувствительности и диагностической специфичности способа, что позволит расширить арсенал биологических жидкостей, которые могут быть использованы для диагностики амилоидоза.
Поставленная задача решена тем, что в известном способе диагностики амилоидоза, включающем определение количества мономерного β-амилоида в образце жидкой биологической среды, согласно изобретению предварительно указанный образец делят на две аликвоты - опытную и контрольную, в опытной аликвоте проводят процедуру диссоциации олигомерных образований указанного β-амилоида до мономеров, и при наличии разницы количества мономеров указанного β-амилоида в опытной и контрольной аликвотах делают вывод о наличии амилоидоза.
В качестве β-амилоида преимущественно определяют β-амилоид Аβ (1-42).
Определение количества мономеров β-амилоида проводят, например, методом ферментного иммуносорбентного анализа, например ELISA, или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), или с помощью электрофореза.
В качестве жидкой биологической среды берут жидкую фазу крови, или лимфы, или спинно-мозговой жидкости и для сохранения в них олигомеров закисляют.
Образец биологической жидкости перед разделением его на аликвоты, или собственно аликвоты перед проведением процедуры диссоциации олигомерных образований указанного β-амилоида до мономеров целесообразно концентрировать, например, метанолом или Сефадексом, например G-10, или G-15, или с помощью диализа, или на хроматографической колонке.
Процедуру диссоциации олигомерных образований β-амилоида до мономеров проводят воздействием химического средства, которое нарушает водородные и гидрофобные взаимодействия между мономерами пептидов в олигомерах.
В качестве химического средства, обеспечивающего разрушение водородных связей между мономерами и гидрофобных взаимодействий между мономерами, используют, например, мочевину, которую добавляют в опытную аликвоту до концентрации, например, 2,0-5,0 М с последующей инкубацией при температуре, например, 15-45°С, в течение 5-45 минут, при этом в контрольную аликвоту добавляют равный объем нейтральной среды, например физраствора, и инкубируют ее при тех же условиях, что и опытную.
В качестве указанного химического средства можно также использовать реагенты, защелачивающие среду в опытной аликвоте до рН 7,6-9,2, с последующей инкубацией этой аликвоты при температуре, например, 15-40°С, в течение от 0,5 час до 25 часов, при этом в контрольную аликвоту добавляют равный объем нейтральной среды, например физраствора, и инкубируют ее при тех же условиях, что и опытную.
В качестве реагента, защелачивающего среду, берут щелочь или основной буферный раствор.
В качестве жидкой биологической среды берут сыворотку крови, образец которой концентрируют, делят на две равные аликвоты - опытную и контрольную, в опытной аликвоте проводят диссоциацию олигомерных образований β-амилоида до мономеров добавлением мочевины до концентрации 2,0-5,0 М с последующей инкубацией при температуре 15-45°С в течение 5-45 минут, при этом в контрольную аликвоту добавляют равный объем физраствора и инкубируют ее при тех же условиях, что и опытную.
Поставленная задача решена также тем, что предложен комплекс средств для проведения диагностики амилоидоза, включающий средство для количественного определения β-амилоида, который согласно изобретению дополнительно содержит средство для обеспечения диссоциации олигомерных образований β-амилоида до мономеров.
При этом средство для обеспечения диссоциации олигомерных образований β-амилоида до мономеров представляет собой реагент, который нарушает водородные и гидрофобные взаимодействия между мономерами пептидов в олигомерах, например мочевину или щелочь, или основной буферный раствор, а средство для количественного определения β-амилоида представляет собой комплект для осуществления электрофореза, или комплект для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии, или комплект для проведения иммуноферментного анализа.
Комплекс может дополнительно содержать средство для концентрации биологической жидкости, например метанол, или Сефадекс, например G-10, или G-15, или устройство для проведения диализа.
Сущность изобретения основана на следующем.
Известно [Мальцев А.В. и др. Альманах «Геронтология и гериатрия», Москва, 2003, Вып.2, с.78-83; Мальцев А.В. и др. Альманах «Геронтология и гериатрия», Москва, 2004, Вып.3, с.96-101], что в нормально функционирующем нейроне в результате протеолитического процессинга предшественника амилоидного белка (АРР) секретазами α-, β- и γ-типов образуется ряд непатогенных пептидов, в том числе и β-амилоида. Основная доля АРР расщепляется β-секретазой, которая является для него неспецифическим ферментом и может связываться с другими субстратами в клетке. Остальная часть молекул АРР подвергается воздействию β-секретазы с образованием β-амилоида в низких концентрациях, при которых они приобретают водорастворимую конформацию. Колебательные изменения α- и β-процессинга сохраняют в определенных рамках «нормальную» концентрацию АРР, и функционирование нейрона не нарушается.
В нормальном нейроне при действии γ-секретазы образуются наночастицы β-амилоида, которые в результате фолдинга обратимо переходят в структуру интермедиата, затем в полностью развернутые белковые молекулы, из которых образуются наночастицы нормально функционирующих β-амилоидов. Вероятно, такая обратимая конформационная перестройка наночастиц необходима для перехода образованных наночастиц β-амилоида из постреакционной конформации в водорастворимую для выполнения своих функций и выхода из нейрона.
Однако при хроническом дефиците α-секретазы происходит нарастание доли β-процессинга и увеличение концентрации β-амилоидов, которые стимулируют синтез АРР.
В настоящее время общепринято представление, согласно которому накопление β-амилоидных продуктов процессинга АРР является ключевым патогенетическим фактором [Мальцев А.В. и др. Нейрохимия, 2005, 22, №2, с.97-101]. При определенных концентрациях амилоидные пептиды (β-амилоиды) обладают способностью к самопроизвольному образованию олигомеров, фибрилл и агрегации в нерастворимые конгломераты с высокой нейротоксичностью.
В результате отсутствия в нейроне контроля возрастающего синтеза АРР и увеличения концентрации β-амилоида до критического уровня из наночастиц интермедиата (промежуточная конформация частично расплетенных постреакционных β-амилоидов) вначале образуются молекулярные β-листы, а затем олигомерные β-структуры, растворимые в водных растворах [Мальцев А.В. и др. Биофизика, 2005, Т.50, №3, с.470-474]. В дальнейшем предфибриллярные олигомеры в результате конформационных перестроек образуют фибриллы различной сложности. Нейротоксичность ранних олигомерных структур β-амилоида обусловлена их способностью взаимодействовать с внутриклеточными мембранами и с ионами двухвалентных металлов с образованием активных амилоидных радикалов.
Таким образом в нейронах с нарушенными функциями происходит усиление синтеза АРР и переключение процессинга его с неамилоидогенного на амилоидогенный путь - активацией синтеза АРР и β-секретазы с образованием наночастиц Аβ (1-40) и Аβ (1-42). Последующие этапы характеризуются изменением ряда параметров гомеостаза в нейроне, приводящим к окислительному стрессу, и создаются благоприятные условия для конформационно-молекулярных перестроек (модификации) патогенных нейропептидов. На ключевом этапе амилоидоза из модифицированных наночастиц амилоидов образуются олигомерные структуры, а на конечном этапе - в результате межмолекулярных взаимодействий олигомеров создаются фибриллы различной сложности, которые накапливаются и, в конечном счете, остаются на месте погибших нейронов.
Экспериментальным путем нами были подобраны описанные в настоящей заявке условия, позволяющие проводить в опытной аликвоте образца биологической жидкости диссоциацию олигомерных образований (структур) β-амилоида до мономеров. При этом в качестве контроля выступает этот же образец биологической жидкости, а именно его вторая, контрольная аликвота.
В этом случае при установлении примерно равного количества β-амилоида в опытной и контрольной аликвотах делают вывод об отсутствии амилоидоза. В том случае, когда в опытной аликвоте определяется большее количество β-амилоида, чем в контрольной, делают вывод о наличии амилоидоза и степени его выраженности.
Предлагаемый способ позволяет использовать для анализа кровь, лимфу и сыворотку крови пациентов, при этом анализ полученных результатов не требует для сравнения результатов от здоровой группы пациентов (группа сравнения).
Предлагаемый способ прост и экономически доступен при использовании предлагаемого комплекса средств для его осуществления, который, в свою очередь, может выполняться с использованием отечественных реактивов и оборудования.
Предложенное изобретение иллюстрируется чертежом, на котором показаны результаты типичного эксперимента определения β-амилоида Аβ (1-42) при разной степени разбавления опытной аликвоты, полученной из крови крыс линии Вистар, у которых имитировали болезнь Альцгеймера.
На кривой 1 представлены количества Аβ (1-42) в разбавленных опытных аликвотах до проведения процедуры диссоциации олигомеров β-амилоида.
На кривой 2 представлены количества Аβ (1-42) в соответствующих разбавленных образцах опытной аликвоты после проведения процедуры диссоциации олигомеров β-амилоида до мономеров (инкубация при температуре 37°С и рН среды 8,0).
На кривой 3 (пунктирная линия) представлены количества Аβ (1-42) в разбавленных образцах опытной аликвоты после инкубации ее при температуре 0°С и рН среды 8,0.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
При подборе оптимальных условий осуществления предлагаемого способа на примере различных β-амилоидов [Аβ (1-42), Аβ (1-40), Аβ (25-35)] было установлено, что наиболее информативным является определение β-амилоида Аβ (1-42).
С использованием предложенного способа было проведено три серии исследований с тремя повторностями в каждом.
Для выполнения предлагаемого способа использовали предлагаемый комплекс средств для проведения диагностики амилоидоза, содержащий средство для обеспечения диссоциации олигомерных образований β-амилоида до мономеров в виде цитратного буфера [Калинин Ф.Л. и др. Справочник по биохимии, «Наукова Думка», Киев, 1971] и 0,1% раствора щелочи NaOH, средство для количественного определения β-амилоида в виде комплекта для проведения иммуноферментного анализа (ELISA) [Crowther J.R. ELISA. Theory and Practice. Humana Press, Totowa, 1995, 223 p.] и средство для концентрации биологической жидкости в виде Сефадекса G-10.
В исследованиях использовали крыс (самцов) линии Вистар возрастом 3-4 месяца. Опытная и контрольная группы состояли из 11 животных каждая. Опытным крысам в желудочки мозга вводили по 20 нмоль коммерческого препарата β-амилоида Аβ (1-42) для имитации болезни Альцгеймера [Мальцев А.В. и др. Альманах «Геронтология и гериатрия», Москва, 2006, Вып.5, с.70-74].
Через 15 дней у животных опытной и контрольной групп отбирали по 9 мл крови в пробирки с 0,5 мл известного цитратного буфера рН 6,0 [Калинин Ф.Л. и др. Справочник по биохимии, «Наукова Думка», Киев, 1971] для сохранения амилоидных олигомеров и на холоду получали сыворотку. Кровь у подопытных животных брали стандартным способом при соблюдении современных требований [Балаховский С.Д., Балаховский И.С. Методы химического анализа крови, Москва, Медгиз, 1953. С.143].
Полученные образцы сыворотки концентрировали сефадексом G-10 в 10 раз и делили на 2 аликвоты - опытную и контрольную. В опытной аликвоте проводили защелачивание среды с помощью цитратного буфера рН 6,0 и 0,1% раствора щелочи NaOH, доводя рН до 8,0.
Для диссоциации амилоидных олигомеров на отдельные мономерные молекулы β-амилоида Аβ (1-42) опытные аликвоты инкубировали при 37°С в течение 6 часов в термостате. В контрольные аликвоты добавляли соответствующее количество физраствора и инкубировали в тех же условиях, что и опытные. После инкубации опытные и контрольные аликвоты помещали на 2 минуты в сухой лед, а затем хранили при 0°С.
2
4
2
2
2
4
Для определения количества мономерного β-амилоида Аβ (1-42) [Мальцев А.В. и др. Альманах «Геронтология и гериатрия». Москва. 2004. Вып.3. С.230-232] в опытной и контрольной аликвотах использовали известный метод проведения иммуноферментного анализа ELISA [Crowther J.R. ELISA. Theory and Practice. Humana Press, Totowa, 1995, 223 p.], который заключается в том, что анализируемые образцы экспериментальных и контрольных аликвот разбавляли в фосфатном буферном растворе (ФБР), содержащем 138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl и 10 мМ NaHPO, pH 7,4, до конечной концентрации белка 0,32 мг/мл. В каждую лунку микротитровальной плашки добавляли 50 мкл образца соответствующей аликвоты, многократно разбавляли ФБР и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После этого плашку промывали в промывочном растворе - ФБР, содержащем 0,05% Твин 20, и затем покрывали 0,2 мл блокирующего раствора - ФБР, содержащего 1%-ную сыворотку крови эмбриона теленка, при 37°С. Через 60 мин блокирующий раствор удаляли и после промывания добавляли в каждую плашку 50 мкл антитела против β-амилоида Аβ (1-42) (1:1000) и инкубировали 1 час при 37°С. После промывания плашки в лунки добавляли 50 мкл конъюгированного с пероксидазой антитела против IgG (1:250) и инкубировали 1 час при 37°С. Добавляли 100 мкл развивающего цвет реагента (4 мг о-фенилендиамин (о=ФДА), разбавленного в 10 мл цитратного буфера pH 5,0, в который добавлены 38 мкл 1,3 М НО). Через 10 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М НSO и измеряли светопоглощение при 492 нм. При этом ставили положительный контроль с заведомо внесенным в пробирку амилоидом Аβ (1-42) известной концентрации, а также отрицательный контроль, не содержащий амилоида.
На чертеже представлены результаты типичного эксперимента диссоциации Аβ (1-42) при разных разбавлениях опытной аликвоты до начала инкубации (кривая 1), после инкубации при температуре 37 С и pH среды 8,0 (кривая 2) и после инкубации при температуре 0°С и pH среды 8,0 (кривая 3).
Результаты исследований, проведенные на крысах Вистар, представлены также в таблице 1. Статистический анализ проводили с помощью компьютерной программы.
Таблица 1Исследование определения мономеров β-амилоидов Аβ (1-42) в пробах крови животных
Подопытные животные (крысы)
Пол животных и возраст (месяцы)
Количество животных
Содержание Аβ (1-42) в крови после диссоциации олигомеров
Содержание Аβ (1-42) в крови без диссоциации
Контроль здоровые
Самцы 3-4
11
18±7
13±9
Оперированные (болезнь Альцгеймера)
Самцы 3-4
8
154±96
Не выявлено
Экспериментальные данные, отраженные в табл.1 и на чертеже констатируют диссоциацию олигомеров Аβ (1-42) до мономеров в образцах крови. Это подтверждает, что предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью (определяет только мономеры β-амилоидов Аβ (1-42).
Пример 2.
Нами было установлено, что определение β-амилоида Аβ (1-42) в образцах крови можно осуществлять также с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Этот метод оказался более простым в исполнении и менее затратным, чем метод ELISA, а также показал хорошие результаты при использовании отечественного прибора Милихром А-02.
При анализе когнитивных нарушений в начальной стадии БА и других формах поражения вещества головного мозга (цереброваскулярная болезнь, НДЗ) возникают трудности в постановке правильного диагноза. Дифференциальная диагностика когнитивных нарушений разного генеза и разной степени выраженности основывается на психоневрологической симптоматике, состоящей из различных тестов и критериев. Наряду с этим применяются дополнительные методы нейровизуализации (магнитно-резонансная томография, компьютерная томография, позитронно-эмиссионная томография) и электрофизиологические (электроэнцефалография) методы.
Для выполнения предлагаемого способа по примеру 2 использовали предлагаемый комплекс средств для проведения диагностики амилоидоза, содержащий средство для обеспечения диссоциации олигомерных образований β-амилоида до мономеров в виде мочевины, средство для количественного определения β-амилоида в виде комплекта для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и средство для концентрации биологической жидкости в виде Сефадекса G-15.
У пациентов с установленным диагнозом БА брали по 30 мл крови стандартным способом при соблюдении современных требований [Балаховский С.Д., Балаховский И.С. Методы химического анализа крови. Москва, Медгиз, 1953, с.143], из которой обычным способом получали сыворотку. С целью стабилизации амилоидных олигомеров полученные образцы сыворотки доводили до рН 6,8 цитратным буфером рН 6,0, инкубировали 2 часа при 37°С, а затем концентрировали сефадексом G-15 в 10 раз.
После концентрирования жидкую фазу собирали и делили на 2 аликвоты - опытную и контрольную. Для диссоциации амилоидных олигомеров на отдельные мономерные молекулы β-амилоида Аβ (1-42) к опытной аликвоте добавляли мочевину до общей концентрации 2 М и инкубировали при 37°С в течение 20 минут в термостате.
В контрольные аликвоты добавляли соответствующее количество физраствора и инкубировали их в тех же условиях без мочевины. После инкубации опытные и контрольные аликвоты помещали на 2 минуты в сухой лед, а затем хранили при 0°С. Для определения количества мономерного препарата β-амилоида Аβ (1-42) опытные и контрольные аликвоты анализировали на высокоэффективном жидкостном хроматографе Милихром А-02.
Предварительно проводили калибровку хроматографа образцами β-амилоида Аβ (1-42) известной концентрации (положительный контроль), а также ставили отрицательный контроль (образец, не содержащий амилоида). Анализ хроматограмм показал, что в мочевине эффективно диссоциируют олигомеры β-амилоида Аβ (1-42) на мономерные молекулы β- амилоида Аβ (1-42), которые выходят в зоне калибровки коммерческого стандарта β-амилоида Аβ (1-42). При хроматографии контрольной аликвоты (образец крови, не обработанный мочевиной) в зоне стандарта (положительный контроль) пик β-амилоида Аβ (1-42) отсутствует.
В таблице 2 представлены сравнительные данные исследований, проведенных на пациентах на стадии, промежуточной между ослаблением когнитивных функций и деменцией «альцгеймеровского типа», с помощью диагностики амилоидоза предлагаемым способом и с помощью других современных методов.
Таблица 2Количество пациентов с болезнью Альцгеймера в разных возрастных группах риска, выявленных предлагаемым способом диагностики амилоидоза и другими современными методами приборной диагностики
ВозрастЧисло больных
Методы исследования
Магнитно-резонан-снаятомография
Компьютерная томография
Электроэнцефало-графия
Диагностика амилоидоза предлагаемым способом
45-65 лет (6 чел)
6
5
-
6
65-74 года (4 чел)
4
3
1
4
После 75 лет (2 чел)
2
2
1
2
Таким образом, полученные с помощью ВЭЖХ экспериментальные результаты по определению количества мономеров β-амилоида Аβ (1-42) в образцах крови пациентов целесообразно использовать для проведения диагностики амилоидоза в нейронах у пациентов с возрастными когнитивными изменениями и мягкой деменцией, переходящей в БА.
Границы между нормальным старением и патологическими изменениями когнитивных функций при НДЗ определить непросто. Ранняя диагностика амилоидоза является первостепенной проблемой. Ее широкое использование поможет изменить тактику эффективной профилактики и лечения этих заболеваний.
Предлагаемое изобретение может быть использовано при разработке диагностикумов некоторых НДЗ для практического здравоохранения, а также для исследования механизма возникновения, например нейродегенеративных заболеваний. Предложенный нами КОМПЛЕКС, позволяющий определять в крови мономерные и косвенно олигомерные амилоиды, можно эффективно использовать в фармацевтической промышленности для начального скрининга соединений, ингибирующих развитие амилоидоза нейронов, а также для поиска веществ, препятствующих возникновению и развитию амилоидозов в нейронах, и выявления клеточных факторов, контролирующих процесс амилоидогенеза, на организменном уровне, когда имеет место гематоэнцефалический барьер.