СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТИВНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИГЕНОВ ФЛОЭМНО-ОГРАНИЧЕННЫХ ВИРУСОВ
METHOD OF PRODUCING PREPARATIVE QUANTITIES OF PHLOEM-RESTRICTED VIRAL ANTIGENS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и фундаментальной вирусологии.
Объект заявки представляет собой способ получения препаративных количеств вирусных частиц, имитирующих вирионы вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК, Potato leafroll virus - PLRV) для получения антисыворотки к ВСЛК. ВСЛК вызывает снижение урожайности картофеля от 20 до 70%. Клубни, собранные от больных растений, более мелкие и имеют внутренние некрозы, то есть теряют товарный вид и плохо хранятся. Вторичная инфекция, которая происходит при выращивании картофеля из зараженных клубней, приводит к еще большим потерям.
Уровень техники
Вирус передается зеленой тлей Myzus persicae или прививками от зараженного растения, является флоэмно-ограниченным, в связи с чем крайне плохо накапливается в растении и представляет серьезную проблему для выделения в лабораторных условиях. Его выход составляет всего 0.4-1 мг на 1 кг зараженного материала.
Наиболее известный аналог, представляющий эффективный способ выделения ВСЛК - работа, опубликованная в 1979 г.: Y.Takanami, S.Kubo "Enzyme-assisted purification of two phloem-limited plant viruses: tobacco necrotic dwarf and potato leafroll (PLRV)" J.Gen.Virol. (1979), 44, 153-159. Этот способ позволяет выделять до 1,3 мг вируса из 1 кг зараженных листьев картофеля.
Дальнейшие попытки получения препаративных количеств ВСЛК в основном сводились к его пост-экстракционной очистке. Например, в работе A. Poison Purification of Potato Leaf Roll Virus // Preparative Biochemistry, 1993. - V.23, N 1-2. P.267-271 приводятся данные по эффективной очистке ВСЛК, который был выделен из зараженных растений. Эффективность метода заключается в получении препарата вируса со степенью очистки более 20%. При этом общее количество ВСЛК остается на уровне 1,3 мг вируса на 1 кг зараженного растительного материала.
Вирусологами обсуждается другой путь для решения проблемы получения препаративных количеств частиц труднодоступных вирусов. Это создание химер - генноинженерных конструктов, которые содержат РНК (кодирующую последовательность) одного вируса, а в качестве эпитопа (поверхностный белок) - капсид вируса, к которому требуется получать антиген.
На эту тему существует несколько технологических решений. Как правило, все они характеризуют отдельные стороны получения химерных белковых конструктов либо отдельные направления дальнейшего использования таких частиц.
Например, Европейским патентом ЕР 1758925 "RECOMBINANT ICOSAHEDRAL VIRUS LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PSEUDOMONADS" защищено право на использование технологии получения рекомбинантных частиц икосаэдрических вирусов в результате клеточной экспрессии капсидных белков таких вирусов в псевдомонадах в условиях in vivo.
Известна технология получения РНК вируса скручивания листьев картофеля, которые кодируют его капсидный белок (Европейский патент ЕР 0370710А2 "DNA SEQUENCE ENCODING THE COAT PROTEIN GENE OF POTATO LEAFROLL VIRUS"). В данном случае количественный выход вирусных частиц, которые могут имитировать вирус PLRV для лабораторных целей остается гипотетическим.
Всего на тему получения химерных вирусных частиц, в том числе для разработки иммунохимических технологий диагностики ВСЛК, было обнаружено 9 патентов и 11 печатных работ. Существующие аналоги заявляемого способа получения препаративных количеств антигенов флоэмно-ограниченных вирусов не позволяют получать ВСЛК более 1,3 мг вируса на 1 кг зараженного растительного материала.
В то же время массовую диагностику зараженности сельскохозяйственных растений традиционно проводят методами иммунохимической или иммуноферментной молекулярной диагностики.
Раскрытие изобретения
Поскольку для получения антисыворотки необходимы миллиграммовые количества высокоочищенного вирусного препарата, в данном изобретении решалась задача разработки способов получения вирусных частиц, состоящих из белка оболочки ВСЛК в достаточных количествах для иммунизации лабораторных животных.
Для решения заявленной задачи были использованы генноинженерные подходы, выстроенные в логическую цепочку.
Была разработана оригинальная генноинженерная конструкция.
Для экспрессии белка оболочки ВСЛК используется кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV, родственный ВТМ), который принадлежит к тобамовирусам и способен накапливаться в количестве до 7 г на 1 кг зараженного материала. В кДНК ВПЖТ, которая находится под контролем растительного промотора, на конце имеется терминатор транскрипции.
1. Учитывая вышеизложенное, была произведена замена гена белка оболочки ВПЖТ на ген мажорного белка оболочки ВСЛК.
2. Полученная конструкция была перенесена в агробактериальный вектор (плазмиду) pCambia 1300. Такой плазмидой была трансформирована агробактерия штамма GV3101, способная эффективно встраивать кДНК химерного вируса в хромосому растительной клетки.
3. Новая рекомбинантная ДНК несла антиген ВСЛК (капсидный белок) и была способна встраиваться в геном растения-хозяина и системно размножаться в нем.
4. После транскрипции РНК химерного вируса начала транскрибироваться с помощью тобамовирусной полимеразы, и химерный вирус получил распространение по всем тканям растения, не ограничиваясь флоэмой. За накоплением вируса в зараженном растении мы следили методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, методом иммунной электронной микроскопии, иммуноферментного анализа, просвечивающей электронной микроскопии и УФ-спектроскопии.
Основным результатом работы является то, что технология получения препаративных количеств целевых антигенов флоэмно-ограниченного вируса ВСЛК стала многократно проще и эффективней: нет зависимости от природного переносчика ВСЛК - персиковой тли; выделение химерных вирусных частиц из всего листа растения проще, чем выделение ВСЛК, который нужно экстрагировать из жестких проводящих пучков. Количественным эффектом нашей технологии можно считать то, что выделение 2-4 мг вирусной химеры проводили всего лишь из 11 г, а не килограмма зараженных листьев картофеля. Полученные таким способом препаративные количества вируса получаются химически более чистыми, а их выделение становится менее трудоемким.
Важно, что накопившийся в растении капсидный белок ВСЛК упаковывает РНК вируса ВПЖТ в икосаэдрический вирион. По своим спектрофотометрическим и электронно-микроскопическим характеристикам химерный вирус подобен ВСЛК, стереометрия его антигенных детерминант должна быть близка таковой дикого вируса, поскольку она определяется общим механизмом сборки вирусных частиц, что является необходимым условием для использования такой частицы в качестве антигена для иммунизации лабораторных животных.
Полученный препарат химеры ВСЛК используется для производства антисыворотки, использующейся для диагностического определения растений инфицированных ВСЛК. Двух кроликов иммунизовали трижды препаратами ВСЛК с полным (1 раз) и неполным (1 раз) адъювантами кролика, вводя под кожу по 300-500 мкг препарата ВСЛК. Анализ антисывороток непрямым иммуноферментным анализом (фиг.1) показал, что достоверные отличия иммунологической реакции начинаются после разведения ее в 100-30000 раз.
Наблюдаемый неспецифический фон при малых разведениях антисыворотки мы объясняем примесью антител на хозяйские антигены. Эту проблему обычно снимают истощением антисыворотки соком растения-хозяина. Несмотря на то, что мы этого не делали, результаты ИФА однозначно говорят о высоком титре целевых антител в антисыворотке.
Фрагмент длиной 627 нуклеотидов (3572-4199), содержащий ген белка оболочки PLRV, был амплифицирован с матрицы pBNUPHO, содержащей инфекционную копию канадского штамма PLRV GenBank: D 13954.1, с помощью праймеров:
3572
4199
5' TTCTCGAGATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAACGTCAACGG-3' PLRV-CPΔ4-p 5' -TTGGTACCCTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCA-3' PLRV-CP-m
Дополнительно был инактивирован транспортный ген PLRV р4, который находится полностью внутри гена белка оболочки р3 экспрессируется с той же субгеномной РНК, но находится в другой рамке. Для этого в праймер PLRV-CPA4-p были внесены замены Т на С (подчеркнуты), которые элиминировали два стартовых ATG кодона в р4, но не изменяли аминокислотный состав р3. (N Asp aat-aac)
Полученный PCR фрагмент был порезан по сайтам XhoI-Acc65I и заклонирован в плазмиду pCambia-4351 по сайтам рестрикции XhoI-BsrGI, полученную конструкцию назвали pCambia-4351-PLRV-CP (фиг.2).
Описание плазмиды pCambia-4351
50
Инфекционная копия тобамовируса TVCV (NCBI Reference Sequence: NC_001873.1) р1С4351, содержащая репортерный ген GFP вместо белка оболочки, поставленная под контроль промотора гена актина 2 из Arabidopsis thaliana (GenBank accession no. BRU 03387), (Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 6852-6857), была переклонирована из бинарного вектора BV1 в другой бинарный вектор pCambia 1300 и названа pCambia-4351.
2
600
Затем конструкцией pCambia-4351-PLRV-CP трансформировали агробактерии штамма GV 3101, наращивали ее в среде 2YT, содержащей антибиотики (Rif 50, Gent 25 и Km 100 мкг/мл), при температуре 28°С в течение ночи. Клетки высаживали и ресуспендировали в буфере для инфильтрации (10 mM MgCL+10mM MES рН6.5) до плотности 0.2 при OD. Суспензию агробактерии впрыскивали шприцом в межклетники листьев растения Nicotiana benthamiana в присутствии агробактерии с антисайленсинговыми генами р19 (TBSW) Р1-HcPro (PVA) или без них. Вектор оказался способен системно заражать N. benthamiana и показывать высокий титр белка оболочки ВСЛК в верхних листьях растения (фиг.3: 1 - зона инфильтрации, 2 - некротизация флоэмы, 3 - накопление вируса). На фотографии можно увидеть, что в молодых листьях развиваются симптомы накопления вирусной химеры. Кроме того, в растениях некротизируются стебли листьев из-за закупорки флоэмных проводящих пучков каллозой, что свойственно настоящему ВСЛК.
В зараженных листьях первого, второго и третьего ярусов, начиная с верхушки, делали высечки одинаковой площади, растирали зеленый материал в 3 объемах 10 mM TrisHCl pH 7.5. Стрелочкой обозначена зона, соответствующая подвижности белка оболочки PLRV (фиг.4). Количество белка оболочки оценивали денситометрически относительно известного количества BSA. Получилось, что листья верхнего яруса содержат белка оболочки PLRV больше 1 mg/ml, а второго яруса уже в 4 раза меньше.
Результаты тестирования различных растительных препаратов на содержание белка оболочки PLRV в листьях твердофазным ИФА
№
Объект исследования
Концентрация PLRV мкг/г сырого веса
1
Листья картофеля
0,12-0,32
2
Накопление белка оболочки PLRV в зоне агроинфильтрации листьев N.benthamiana плазмидой pBNUP 110
0,1-0,6
3
Накопление белка оболочки PLRV в зоне агроинфильтрации листьев N.benthamiana, pCambia-4351-PLRV-CP
2,4
4
Накопление белка оболочки PLRV в самых верхних листьях N.Benthamiana при системном заражении растения pCambia-4351-PLRV-CP
100
Выделение вирусного препарата
С 30 растений собирали 10-11 г зараженных листьев и выделяли 2-4 мг химерного вируса по методу (Takanami & Kubo, 1979a).
2
4
Листья с симптомами гомогенизировали в коммерческом блендере в 0.1 М цитратном буфере, доведенном до рН 7.5 с помощью 0.5 М NaHPO с 0.1% 2 - меркаптоэтанолом и 1% Triton Х-100. Гомогенат листьев перемешивали в этом буфере 30 мин. Дебрис откручивали при 10.000 G, а супер осветляли 1/4 V хлороформа. Вирус высаживали на ультрацентрифуге при 40.000g в течение 90 мин. Осадок растворяли в 1 ml 10 mM TrisHCl pH 7.5 Количество вируса определяли спектрометрически фиг.5 (А260/А280: 1.78; А260/А240: 1.43 (Takanami & Kubo, 1979a). A(0.1%;1 cm) at 260 nm: 8.6 (Takanami & Kubo, 1979a).)
Чистоту вирусного препарата оценивали с помощью электофореза по Лемли (фиг.6).
Электронная микрофотография вирусного препарата
Вирусный препарат разводили в 100 раз, наносили на формваровую подложку и контрастировали 2% уранилацетатом. Ниже приведены электронные микрофотографии химерного вируса, снятые при разном увеличении. Видны икосаэдричекие вирионы размером 25 нм, такие же, как и у настоящего PLRV (фиг.7а и 7в).