ПРЕПАРАТ ТРАМЕТИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТЕЛЯТ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
PREPARATION TRAMETIN FOR TREATING GASTROINTESTINAL DISEASES IN CALVES AND METHOD FOR USING IT

Изобретение относится к ветеринарии, а именно, к препаратам и способам лечения желудочно-кишечных болезней телят.
Известно использование в медицине и ветеринарии препаратов, обладающих антимикробным и иммуностимулирующим действием и получаемых на основе грибов-ксилотрофов рода Trametes - (Чхенкели, В.А., Балтухаева Т.А., Власов Б.Я., Горяева Н.А., Калинович А.Е., Кухаренко Н.С., Мартынова А.Ю. Антиоксидантные свойства препаратов последнего поколения - продуктов биотехнологии: обнаруженные эффекты, механизмы действия // Вестник Иркутской государственной сельскохозяйственной академии. 2012. №49. С.81-91).
Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ лечения желудочно-кишечных болезней телят с использованием препарата, представляющего собой стерильную культуральную жидкость, полученную путем культивирования гриба Trametes pubescens (штамм 0663) на стандартных твердой и жидкой питательных средах с дополнительно включенной в них микрокристаллической целлюлозой. Препарат добавляют в молоко для выпаивания в дозе 1,5-2,5 мл на 1 кг живой массы животного 1 раз в сутки в течение 4-5 дней (патент RU 2429871, A61K 36/07).
Недостатком прототипа является низкая иммуностимулирующая активность препарата, а также недостаточно длительный срок хранения препарата и неудобства, связанные с его транспортировкой на дальние расстояния.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала средств и способов лечения желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных.
Задача решается тем, что препарат траметин для лечения желудочно-кишечных болезней телят, включающий стерильную культуральную жидкость, полученную путем культивирования гриба Trametes pubescens (штамм 0663) на стандартных твердой и жидкой питательных средах, согласно изобретению стерильная культуральная жидкость получена путем культивирования гриба Trametes pubescens (штамм 0663) на стандартных твердой и жидкой питательных среде с дополнительно включенными в них натрием селенистокислым и цинком сернокислым с последующей лиофилизацией.
Сущность изобретения заключается также в том, что в препарат траметин для лечения желудочно-кишечных болезней телят, согласно изобретению натрий селенистокислый добавляют в количестве 3,0 мг/л в виде раствора, цинк сернокислый добавляют в количестве 1,0 г/л.
Задача решается также тем, что в способе лечения желудочно-кишечных болезней телят, включающем внесение препарата в молоко для выпаивания, согласно изобретению вносят препарат в дозе 180-300 мг на 1 кг живой массы животного 1 раз в сутки в течение 4-5 дней.
Получение препарата для лечения желудочно-кишечных болезней телят.
Начальным этапом получения препарата является поддержание продуцента, т.е. культуры гриба Trametes pubescens (штамма 0663), на твердой питательной среде - на сусло-агаре. Посевной материал выращивают на стандартной твердой питательной среде Сабуро, в которую предварительно добавляют микрокристаллическую целлюлозу, активирующую природную метаболическую активность продуцента. Далее выращивают посевной материал на жидкой питательной среде. Для посевного материала и ферментации используется среда следующего состава (г/л):
Калий фосфорнокислый однозамещенный
1,88
Калий хлористокислый
0,94
Магний сернистокислый
0,94
Сахароза
40,0
Целлюлоза микрокристаллическая
12,5
Пептон ферментативный
12,5
Натрий селенистокислый
0,003
Цинк сернокислый
1,0
pH 6,0±0,2.
Селен вносили в питательную среду для культивирования гриба-продуцента в виде селенита натрия в количестве 3,0 мг на 1 л среды в виде водного раствора натрия селенистокислого (1 мл 0,3%-го раствора на 1 л среды).
Цинк вносили в виде цинка сернокислого в количестве 1,0 г на 1 л питательной среды.
Оптимальные концентрации натрия селенистокислого и цинка сернокислого в питательной среде при культивировании гриба Т. pubescens определи по продолжительности ферментации и выходу биомассы гриба (табл.1).
Таблица 1
Содержание солей в питательной среде, г/л
Выход биомассы, г/л а.с.б.
Время ферментации, сут
натрий селенистокислый
цинк сернокислый
-
-
8,90
7
0,001
0,5
9,12
7
0,002
0,75
9,51
6
0,003
1,0
10,52
5
0,004
1,25
10,13
5
0,005
1,5
9,72
5
0,01
1,75
6,25
5
0,015
2,00
3,74
5
Примечание: а.с.б. - абсолютно сухая биомасса.
Данные таблицы 1 показывают, что внесение цинка сернокислого в концентрации 1,0 г/л и натрия селенистокислого в концентрации 0,003 г/л в питательную среду сокращает время ферментации с 7 до 5 сут, а выход биомассы при этом увеличивается с 8,90 до 10,52 г/л, т.е. на 18,3%.
Посевной материал выращивается в колбах Эрленмейера в шейкере-инкубаторе при 220 об/мин при температуре 28-30°C в течение 4 суток. Посевной материал вносится в ферментационную среду в количестве 5-10% по объему.
Ферментация осуществляется в течение 4-5 суток при 220 об/мин и температуре 28-30°C.
Затем культуральную жидкость отделяют от биомассы культурального мицелия центрифугированием в течение 10 мин при 6000 об/мин, автоклавируют при 0,8 атм в течение 30 мин.
Лиофилизацию биологического препарата проводят с использованием лабораторной лиофильной сушилки LZ-9СР (Чехия). Процесс проводили в 2 этапа.
1. Замораживание. Препарат разливают по 2 мл в пенициллиновые флаконы, которые устанавливали в дюралюминиевую кассету. Далее кассету устанавливали на предварительно охлажденную до -40°C полку. Замораживание проводили в течение 3 ч. Температура полки к концу 1-го часа от начала замораживания составляла -60°C, температура субстанции составляла -55°C.
2. Высушивание. Вакуумирование начинают при следующих параметрах: температуре полки -65°C, температуре субстанции -55°C, температуре десублиматора -80°C. В течение первых 2-х часов от начала высушивания температуру полки повышали до 0°C, каждый последующий час температуру полки повышали на 5°C. По достижении температуры полки до +25°C сушку проводили при заданной температуре до 20-го часа от начала высушивания. Досушивание вели при температуре полки +30°C. При заданных значениях подогрева температура препарата прошла 0°C между 16-м и 17-м часом от начала высушивания. Общая продолжительность высушивания составляла 25 ч. Температура препарата изменяется от -55°C до +28°C. Температура десублиматора составляет 83±3°C, вакуум 13 Па - 6 Па (0,1 мм рт.ст. - 0,05 мм рт.ст.).
Для определения антимикробной активности исходного препарата (прототипа) и заявляемого препарата траметин использовали референтные штаммы микроорганизмов (Escherihia coli ATCC-5264; E. coli ATCC-35218; Е. coli ATCC-1176; Enterococcus faecalis), полученные из ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасовича, патогенные штаммы микроорганизмов, выделенные из патологического материала и идентифицированные в ФГБУ Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория (Е. coli-ТИ от теленка; Е. coli-O4; Е. coli-139-1; Salmonella enteritidis, S. ngor - от птиц). Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Тест-культуры
Диаметр зон подавления роста тест-культуры (в мм)
Исходный препарат (прототип)
Заявляемый препарат
Е. coli-ТИ
26,5±0,5
28,0±0,3
Е. coli-O4
10,5±0,3
12,0±0,5
S. enteritidis
28,0±0,5
27,5±0,6
S. ngor
32,5±0,2
25,5±0,7
E. coli-139-1
34,0±0,4
30,0±0,5
E. coli- ATCC 526-4
12,0±0,3
21,0±0,4
E. coli ATCC 35218
16,0±0,6
20,0±0,3
E. coli ATCC 1176
15,0±0,3
16,0±0,4
Enterococcus faecalis
20,0±0,2
17,0±0,5
Установлено, что все препараты обладают антимикробной активностью в различной степени. Показано, что активность лиофилизированной формы модифицированного препарата в отношении бактерий родов Escherichia и Salmonella сохраняется на уровне активности исходного препарата (прототипа) и его лиофилизированной формы.
Таким образом, лиофилизация препарата не снижает его биологической активности, увеличивает сроки хранения препарата и возможности его транспортировки на дальние расстояния.
5о
Заявляемый препарат (траметин) представляет собой лиофилизированную стерильную культуральную жидкость, получаемую путем глубинного культивирования Trametes pubescens (штамма 0663). Траметин представляет собой белый порошок с желтоватым оттенком. Препарат малотоксичен при введении в желудок и область брюшины лабораторным животным - белым мышам и крысам. ЛД составляет 8200 мг/кг. Местно-раздражающее и аллергическое действие препарата выражено слабо. Содержание в нем солей тяжелых металлов находится на уровне следовых количеств. Остаточных количеств ядохимикатов, микотоксинов и нитрозоаминов не содержится.
Содержание цинка и селена в исходном препарате (прототипе) и в заявляемом препарате, а также некоторых токсичных элементов представлено в таблице 3.
Таблица 3
Микроэлемент
Содержание, мг/кг
прототип
заявляемый препарат (траметин)
Цинк
2,55±0,36
237,5±3,2
Селен
0,14±0,05
0,75±0,08
Медь
0,15±0,07
0,23±0,03
Свинец
0,109±0,002
0,068±0,004
Ртуть
0,0007±0,00005
0,0004±0,00007
Кадмий
0,007±0,0003
0,004±0,0002
Мышьяк
0,0001±0,00004
0,001±0,0003
Расчеты, проведенные в соответствии с принятыми нормами микроэлементов для молодняка крупного рогатого скота при выращивании и откорме (Макарцев Н.Г. Кормление сельскохозяйственных животных. - Калуга: ГУП «Облиздат», 1999. 646 с.), свидетельствуют о том, что при использовании заявляемого препарата телята получают суточную норму микроэлементов - цинка и селена.
Примеры применения препарата.
Пример 1. За оптимальный способ введения препарата был принят только пероральный, так как внутримышечный и подкожный способы являются неприемлемыми вследствие сильной реактогенности препарата, раздражительности, болезненной реакции на месте введения.
Для определения лечебных доз препарата при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят с симптомокомплексом диареи, преимущественно токсической диспепсии и колибактериоза, было подобрано 64 теленка 1-10-дневного возраста черно-пестрой породы, которых распределили в 8 групп по 8 голов (табл.4).
Таблица 4
Группы животных
Доза препарата
Продолжительность лечения, дней
Лечебная эффективность, %
Сохранность, %
1 опыт (траметин)
100 мг/кг веса
6-7
84,7
93,4
2 опыт
180 мг/кг веса
4-5
88,20
100,0
3 опыт
240 мг/кг веса
4-5
88,2
100,0
4 опыт
300 мг/кг веса
4-5
88,2
100,0
5 опыт
360 мг/кг веса
4-5
88,2
100,0
6 опыт
480 мг/кг веса
4-5
88,2
100,0
7 Контроль с исходным препаратом - прототипом
2,5 мл/кг веса
6-7
87,4
100,0
8 контроль (без лечения)
-
-
-
56,8
Первые 7 групп - опытные и 7, 8-я группа - контрольные. Телятам 6 опытных групп препарат давали один раз в сутки в следующих дозах: 0,8, 100, 180, 240, 300, 360, 480 мг на 1 кг живой массы животных до выздоровления. Препарат вносили в молоко перед выпойкой. Телята 7 группы получали исходный препарат (прототип) в дозе 2,5 мл на 1 кг живой массы, который вносили в молоко перед выпойкой. За телятами вели клиническое наблюдение в течение 10 дней, определяли биохимические, морфологические показатели крови, подсчитывали лейкоцитарную формулу, учитывали продолжительность болезни и сохранность.
При бактериологическом исследовании патологического материала была выделена кишечная палочка (непатогенная для мышей при их экспериментальном заражении) и другая условно-патогенная микрофлора (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis и др.). При вскрытии было установлено, что слизистые оболочки анемично-цианотичны, кровоизлияния отсутствовали, селезенка и лимфатические узлы бледного цвета и не увеличены.
При лечении телят препаратом в дозах 180-480 мг на 1 кг живой массы выздоровление телят наступает через 4-5 суток, при этом эффективность лечения составляет в среднем 88,2%. При уменьшении дозы препарата его лечебная эффективность снижается до 84,7%, продолжительность лечения увеличивается до 6-7 суток. В таблицах 5, 6, 7 и 8 приведены результаты биохимических, морфологических, иммунологических исследований крови телят всех групп, а также лейкограммы.
Данные таблиц 5, 6, 7, 8 свидетельствуют о том, что оптимальными лечебными дозами препарата следует считать дозы 180-300 мг на 1 кг живой массы животного.
При анализе биохимических показателей телят (табл.6), получавших препарат, установлено, что уровень общего количества белка возрастал незначительно (на 3,1-8,1%), других существенных различий не отмечалось. Количество эритроцитов у телят в 1-6 группах возрастало на 13,1-18,1, гемоглобина - на 14,0-19,5% (табл.5). Содержание лейкоцитов во всех опытных группах, по сравнению с контрольной группой, практически не изменялось (табл.6). Фагоцитарная активность повышалась на 5,5-10,8%, фагоцитарный индекс - на 40,8-45,8%, фагоцитарное число - на 23,8-37,0% (табл.8). Более высокие дозы (>300 мг на 1 кг живой массы) и менее низкие (<180 мг на 1 кг живой массы) были недостаточно эффективными. Применение препарата до клинического выздоровления приводит не только к сокращению сроков заболевания, исключению рецидивов, а также дальнейшему интенсивному росту и развитию телят.
Пример 2. Для определения лечебных доз препарата при колибактериозе телят было подобрано 64 теленка 10-15-дневного возраста черно-пестрой породы, которых распределили в 8 групп по 8 голов (табл.9).
9
26
Первые 6 групп - опытные и 7, 8 группы контрольные. Телятам опытных групп препарат давали в следующих дозах: 100, 180, 240, 300, 360, 480 мг на 1 кг живой массы животных до выздоровления. За телятами вели клиническое наблюдение в течение 10 дней, определяли биохимические, морфологические показатели крови, подсчитывали лейкоцитарную формулу, учитывали продолжительность болезни и сохранность. У больных телят наблюдали угнетение, снижение аппетита, усиленную перистальтику кишечника, жидкий, бежевого цвета кал, частота дефекаций составляла до 7 раз в сутки, наблюдали также вялость, шаткость походки, одышку. Температура тела составляла 39,0-40,1°C, частота дыхания составляла 28-32. При бактериологическом исследовании фекалий были выделены бактерии Е. coli сероваров O и O, патогенные для белых мышей.
При лечении телят препаратом в дозах 180-300 мг на 1 кг живой массы выздоровление телят наступает через 4-5 суток, при этом эффективность лечения составляет не менее 88,7%. При уменьшении дозы препарата его лечебная эффективность снижается до 80,4%, продолжительность лечения увеличивается до 6-7 суток. Данные наблюдений приведены в таблицах 10, 11, 12, 13. Данные таблиц 10, 11, 12, 13 свидетельствуют о том, что оптимальными лечебными дозами препарата следует считать дозы 180-300 мг на 1 кг живой массы животного.
При анализе биохимических показателей телят (табл.11), получавших препарат, установлено, что уровень общего количества белка возрастал на 13,9-21,0%, других существенных различий не отмечалось. Количество эритроцитов у телят во 2-4-х группах возрастало на 16,0-23,0%, гемоглобина - на 22,9-34,0% (табл.10). Содержание лейкоцитов во всех опытных группах, по сравнению с контрольной группой, снижалось на 6,6-7,2%, в основном, за счет палочкоядерных нейтрофилов и эозинофилов (табл.11). Фагоцитарная активность повышалась на 2,7-11,6%, фагоцитарный индекс - на 44,2-60,2%, фагоцитарное число - на 16,4-39,7% (табл.13). Более высокие дозы (>300 мг на 1 кг живой массы) и менее низкие (<180 мг на 1 кг живой массы) оказались недостаточно эффективными.
Пример 3. Для определения лечебных доз препарата при сальмонеллезе телят было подобрано 64 теленка 80-90-дневного возраста черно-пестрой породы, которых распределили в 8 групп по 8 голов (табл.14).
У больных телят наблюдалось угнетение, снижение аппетита, температура в начале заболевания составляла 39,9-40,9°C, а затем у большинства снижалась до 39,1-39,5°C, фекалии выделялись с большим содержанием слизи, от бежевого до темного цвета, водянистой, кашицеобразной консистенции. При бактериологическом исследовании фекалий были выделены культуры Salmonella dublin и S. thyphymurium. Первые 6 групп - опытные и 7, 8-я группы - контрольные. Телятам опытных групп препарат давали в следующих дозах: 100, 180, 240, 300, 360, 480 мг на 1 кг живой массы животных до выздоровления. За телятами вели клиническое наблюдение в течение 10 дней, определяли биохимические, морфологические показатели крови, подсчитывали лейкоцитарную формулу, учитывали продолжительность болезни и сохранность. При лечении телят в дозах 180-300 мг на 1 кг живой массы выздоровление телят наступает через 4-5 суток, при этом эффективность лечения составляет 96,3%. При уменьшении дозы препарата его лечебная эффективность снижается до 92,4%, продолжительность лечения увеличивается до 6-7 суток. Данные наблюдений приведены в таблицах 14, 15, 16, 17, 18.
Данные таблиц свидетельствуют о том, что оптимальными лечебными дозами следует считать дозы 180-300 мг на 1 кг живой массы. При анализе биохимических показателей телят, получавших препарат, установлено, что уровень общего белка возрастал на 5,2-6,5% (табл.15). Количество эритроцитов у телят во 2-4-й группах возрастало на 16,7-19,2%, гемоглобина - на 13,6-16,6% (табл.14). Содержание лейкоцитов во всех опытных группах, по сравнению с контрольной группой, снижалось на 6,6-7,2% (табл.16), в основном, за счет палочкоядерных нейтрофилов и эозинофилов (табл.17). Фагоцитарная активность повышалась на 1,5-8,4%, фагоцитарный индекс - на 32,1-35,6%, фагоцитарное число - на 13,7-42,5% (табл.18). Более высокие дозы (>300 мг на 1 кг живой массы) и менее низкие (<180 мг на 1 кг живой массы) оказались неэффективными. Это связано с тем, что препарат в дозах менее 180 мг на 1 кг живой массы обладает более низким антимикробным действием, а в более высоких дозах - раздражающим действием на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.
Обоснованием курса лечения телят в течение четырех-пяти дней является средняя продолжительность желудочно-кишечных болезней телят, т.е. наиболее оптимальный период, когда происходит исчезновение клинических признаков и выздоровление животного.
Наиболее оптимальным вариантом лечения желудочно-кишечных болезней телят, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae - колибактериоза и сальмонеллеза телят, является внесение препарата в молоко при выпойке в дозах от 180 мг до 300 мг на 1 кг живой массы животного 1 раз в день. При внесении препарата в молоко при выпойке в дозе 180-300 мг на 1 кг живой массы телят 1 раз в сутки продолжительность лечения колибактериоза и сальмонеллеза телят составляет 4-5 суток, эффективность лечения - 96,3%.
Пример 4. Научно-производственные опыты по применению препарата с лечебной целью были проведены в трех хозяйствах Иркутской области по согласованию со Службой ветеринарии Иркутской области - на МТФ производственного отдела НИИСХ Россельхозакадемии (Иркутский район) и на МТФ СХ ОАО «Белореченское» (Усольский район), ФГУП «Элита» Россельхозакадемии (Эхирит-Булагатский район) на 329 телятах.
Препарат вводили по описанной выше методике перорально с молоком в дозах 180-300 мг на 1 кг живой массы телят, т.е. 7,2-12,0 мг/гол. при колибактериозе и по 14,4-24,0 мг/ гол. при сальмонеллезе телят, т.к. телята, больные колибактериозом, были 10-15-дневного возраста, а телята, больные сальмонеллезом, - 2,5-3-х - месячного возраста. Препарат вводили один раз в сутки в течение 4-5 дней. Терапевтическая эффективность метода подтверждена проведенными исследованиями: из 234 телят, которых лечили препаратом, выздоровело 228 голов, что составляет 97,4% от общего числа. Из общего числа контрольных животных (96 голов), которых лечили по общепринятым в хозяйствах схемам, выздоровело 74 головы или 77,1%. Таким образом, на основании проведенных опытов были получены положительные результаты, свидетельствующие о высоком терапевтическом эффекте препарата при данном способе его применения.
Использование предлагаемого препарата и способа лечения позволяет расширить арсенал комплексных препаратов, применяемых для лечения желудочно-кишечных болезней телят, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae.