Проблема неоднозначностей при HLA-типировании с высоким разрешением для трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток от неродственного донора

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.361.4-013.3:617-089.843

ПРОБЛЕМА НЕОДНОЗНАЧНОСТЕЙ ПРИ HLA-ТИПИРОВАНИИ С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ОТ НЕРОДСТВЕННОГО ДОНОРА

Хамаганова Е.Г., Бидерман Б.В., Якутик И.А., Кузьминова Е.П., Юшкова А.А., Кузьмина Л.А., Паровичникова Е.Н., Судариков А.Б., Савченко В.Г.

ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва

Резюме. Проанализированы результаты HLA-типирования 70 образцов крови на уровне высокого разрешения методом гаплотип-специфического секвенирования при показаниях к трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) от неродственного донора. Установлено, что гаплотип-специфическое секвенирование дает возможность провести HLA-типирование с высоким разрешением в соответствии с современными требованиями для неродственной ТГСК, т.е. с разрешением всех неоднозначностей во 2-м и 3-м экзонах генов HLA класса I и во 2-м экзоне генов HLA класса II, которые могут сопровождаться заменой аминокислотных остатков в доменах, образующих пептидсвязывающую бороздку молекул HLA. Исключение - случаи гетерозиготности внутри одной HLA-специфичности при невозможности разделения HLA-гаплотипов у гетерозигот в начале методики. В этих случаях в дополнение к гаплотип-специфическому секвенированию следует использовать другой метод HLA-типирования, например PCR-SSP. При селекции неродственного донора необходимо учитывать, что больной и потенциальный донор могут не совпадать по аллелям гена HLA-С даже в том случае, когда они совпадают по высокому разрешению по генам HLA-A*/B*/DRB1*/DQB1*. В регистрах доноров костного мозга следует расширять когорты HLA-A*/B*/С*/DRB1*/DQB1*-типированных доноров.

Ключевые слова: HLA-типирование с высоким разрешением; секвенирование HLA-генов; неоднозначности; трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток; неродственный донор; неравновесное сцепление; HLA-гаплотип.

THE PROBLEM OF AMBIGUITIES IN HIGH RESOLUTION HLA TYPING FOR TRANSPLANTATION OF ALLOGENIC HEMOPOIETIC STEM CELLS FROM AN UNRELATED DONOR

Khamaganova E.G., Biderman B.V, Yakutik I.A., Kuzminova E.P., Yushkova A.A., Kuzmina L.A., Parovichnikova E.N.,

SudarikovA.B., Savchenko V.G.

Hematology Research Center, 125167, Moscow, Russia

Summary. High resolution HLA typing of 70 blood specimens by haplotype-specific sequencing in cases with indications for transplantation of allogenic hemopoietic stem cells (allo-THSc) from unrelated donors showed that haplotype-specific sequencing allowed high resolution HLA typing in accordance with modern requirements to unrelated THSC, that is, with resolution of all ambiguities in class I HLA gene exons 2 and 3 and class II HLA gene exon 2, which could be associated with amino acid residue replacement in the domains forming the peptide-binding sulcus in HLA molecules. Heterozygotic cases within the same HLA specificity, when HLA haplotypes in heterozygotes could not be separated at the beginning of the procedure, were the exclusions. In these cases haplotype-specific sequencing had to be supplemented by another HLA typing method, for example, PCR-SSP. Selecting an unrelated donor one should bear in mind that the patient and the potential donor might not coincide by HLA-C gene alleles even when they coincided with high resolution by HLA-A*/B*/ DRB1*/DQB1*genes. The cohorts of HLA-A*/B*/C*/DRB1*/DQB1*-typed donors in bone marrow donor registers should be extended.

Key words: high resolution HLA typing; HLA gene sequencing; ambiguities; allogenic hemopoietic stem cell transplantation; unrelated donor; unbalanced coupling; HLA haplotype.

Комплекс генов HLA (от англ. Human Leukocyte Antigens) характеризуется экстремальным полиморфизмом. По данным на апрель 2013 г. 19 генов HLA класса I и II кодируют 6617 уникальных

Для корреспонденции:

Хамаганова Екатерина Георгиевна, доктор биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ ГНЦ Минздрава России.

Адрес: 125167 Москва, Новый Зыковский пр., д. 4а.

Е-mail: ekhamag@mail.ru

Corresponding author:

Khamaganova Ekaterina, BD, PhD, D.Sc. (ekhamag@mail.ru).

HLA-протеинов [1]. Наиболее распространенными на сегодняшний день являются три метода ДНК-типирования, основанные на полимеразной цепной реакции (PCR - polymerase chain reaction). Это PCR-SSP - ПЦР с сиквенс-специфическими праймерами (sequence specific primers), PCR-SSOP- ПЦР + пробы с сиквенс-специфическими олигонуклеотидными зондами (sequence specific oligonucleotide probes) и PCR-SBT - ПЦР + секвенирование (sequence based typing). Недостатки PCR-SSP - низкая производительность, PCR-SSOP - необходимость применения дорогостоящего оборудования и значительное количество неоднозначных результатов. К недостат-

4

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

кам PCR-SBT относят его высокую себестоимость и относительную трудоемкость, однако PCR-SBT позволяет напрямую определить первичную нуклеотидную последовательность того или иного гена HLA [2]. Секвенирование дает возможность выявить новый аллель, к которому еще не подобраны олигонуклеотидные зонды и/или праймеры. PCR-SBT особенно важен при подборе пар донор-реципиент при трансплантации неродственных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), так как от HLA-идентичности больного и донора во многом зависит исход трансплантации [3, 4]. Результаты аллогенной ТГСК (алло-ТГСК) за последние годы значительно улучшились, и проведение алло-ТГСК показано многим больным острыми лейкозами и другими клональными заболеваниями системы крови [5, 6]. Сек-венирование определяет аллельные варианты генов главного комплекса гистосовместимости (у человека HLA) путем прямого сравнения первичных последовательностей нуклеотидов в цепочке ДНК анализируемого образца с консенсусной последовательностью нуклеотидов в соответствующем гене HLA в базе данных. Однако, как и все другие методы ДНК-типирования, PCR-SBT имеет свои ограничения. Основной проблемой при PCR-SBT является правильное разрешение так называемых неоднозначностей (ambiguities) [7, 8]. Неоднозначности, возникающие при PCR-SBT, в основном бывают двух типов. Неоднозначности первого типа возникают вследствие диплоидного набора генов HLA (у каждого человека имеются две копии каждого гена HLA, 2n), когда неясно, к какому именно из двух HLA-гаплотипов относится данный нуклеотид. Этой проблемы можно избежать при гаплотип-специфическом (аллельспецифическом) PCR-SBT, при котором в начале методики происходит разделение HLA-гаплотипов. Если используется вариант так называемого локусспецифического секвенирования (без расщепления HLA-гаплотипов), часто неясно, к какому из двух аллелей (гаплотипов) относится данный нуклеотид. Доля неоднозначностей, получаемых при локусспецифическом SBT, составляет 41% для аллелей локуса HLA-A, 24% для аллелей локуса HLA-В [7]. Для разрешения неоднозначностей 1-го типа применяют так называемые HARPs (heterozygous ambiguity resolution primers - праймеры, разрешающие неоднозначности, возникшие вследствие гетерозиготности) или GSSP (group-specific sequence primers - группоспецифические сиквенспраймеры) - праймеры для разрешения гетерозиготных неоднозначностей. Дополнительно ставится ПЦР, при которой амплифи-цируется только тот один аллель, который комплементарен данному HARP (GSSP), далее проводится секвенирование амплифицированного аллеля. Для разрешения всех неоднозначностей, которые могут возникнуть вследствие гетерозиготности генов HLA при локус-специфическом SBT, необходима библиотека HARPs (GSPP), что значительно увеличивает стоимость HLA-типирования при локус-специфич-ном PCR-SBT.

Неоднозначности 2-го типа возникают, когда полиморфизм аллелей лежит вне анализируемого

региона. Например, аллель гена HLA-A*01:04N (N -нулевой, т.е. неэкспрессирующийся) входит в группу (стринг) аллелей HLA-A*01:01:01G (в нее входят все аллели с нуклеотидной последовательностью 2-го и 3-го экзонов гена HLA-А*, которая идентична последовательности аллеля HLA-A*01:01:01:01). HLA-A*01:04N отличается от HLA-A*01:01:01:01 инсерцией C в позиции 628 4-го экзона [7]. Исключение нулевых аллелей является необходимым по стандартам European Federation for Immunogenetics (EFI) [9]. Детекция нулевых аллелей имеет значение, поскольку отсутствие экспрессии HLA-гена чревато развитием аллореактивности. Замены, приводящие к появлению нулевых аллелей, обычно лежат вне регионов, кодирующих пептидсвязывающую бороздку молекул HLA.

Еще одним видом неоднозначности может быть присутствие нового аллеля, для которого нет последовательности в базе данных аллелей HLA (IMGT/HLA).

Цель настоящего исследования - анализ результатов HLA-типирования на уровне высокого разрешения методом гаплотип-специфического PCR-SBT при показаниях к алло-ТГСК от неродственного донора и возможности разрешения выявленных неоднозначностей.

Материалы и методы

В 2012-2013 гг. по показаниям к проведению алло-ТГСК методом PCR-SBT HLA-генотипированы 58 больных различными заболеваниями системы крови, у которых не было HLA-идентичного сиблинга, а также ближайшие кровные родственники 3 больных (n = 5) и 7 потенциальных неродственных доноров гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), образец крови которых поступил в Гематологический научный центр (ГНЦ, Москва) для подтверждающего HLA-типирования.

Геномную ДНК получали из периферической крови (антикоагулянт - ЭДТА) с использованием наборов для выделения ДНК ("Invitrogen", США) в соответствии с рекомендациями производителя. HLA-типирование проводили с помощью реагентов Protrans S4 (ФРГ) для локусов HLA-A/B/C/DRB1 и Protrans S3 для HLA-DQB1 в соответствии с рекомендациями производителя. Капиллярный электрофорез осуществляли на 4-капиллярном генетическом анализаторе 3130 ("Applied Biosystems", США). Анализ полученных сик-венсов проводился с помощью программного обеспечения JSI Sequence Pilot (ФРГ).

16 больных и 2 их родственника были дополнительно типированы по некоторым HLA-локусам методом PCR-SSP с использованием наборов для типирова-ния с высоким разрешением ("Invitrogen", США) или "Olerup" (Швеция). В исследование также включены данные по результатам типирования методом PCR-SSP низкого разрешения на наборах "Invitrogen" (США) гена HLA-В у 62 больных острыми лейкозами, полученные в 2012-2013 гг.

Статистическую обработку данных проводили методами описательной статистики [10]. Степень выраженности неравновесного сцепления между аллелями HLA-B*44 и HLA-C рассчитывали с помощью показателя Д (величина

5

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

неравновесного сцепления или гаметная ассоциация), вычисляемого по формуле:

Д = Vd/ N - V(b + d)(c + d)/N2 , где

b, c - число индивидов с одним из рассматриваемых генов; d - число индивидумов без обоих генов; a - число носителей обоих генов; число обследованных в выборке

N = a + b + c + d [11].

Результаты и обсуждение

Высокий полиморфизм HLA-молекул в основном обусловлен их пептидсвязывающей функцией и, следовательно, в первую очередь характерен для 2-го и 3-го экзонов генов HLA класса I (A/B/C) и 2-го экзона генов HLA класса II (DRB1, DQB1) [12]. Обязательным требованием EFI на сегодняшний день для неродственной ТГСК является разрешение всех неоднозначностей во 2-м и 3-м экзонах генов HLA класса I и во 2-м экзоне генов HLA класса II, которые ведут к замене аминокислотных остатков в доменах, образующих пептидсвязывающую бороздку молекул HLA, а также исключение нулевых аллелей [9]. В номенклатуре HLA, введенной с апреля 2010 г. для обозначения аллелей HLA класса I, имеющих идентичные 2-й и 3-й экзоны, и аллелей HLA класса II с идентичным 2-м экзоном, использовано понятие G-группы (стринга) [13]. Все аллели, входящие в определенную группу, обозначаются по трем первым полям (6 цифр) меньшего по значению аллеля в группе, за которыми следует буква G.

Принципиальное отличие гаплотип-специфи-ческого PCR-SBT ("Protons S4", ФРГ) в том, что в начале методики происходит разделение генов HLA (2n) на два отдельных гаплотипа (n), а после расщепления HLA-гаплотипов - их секвенирование. Это обычно позволяет избежать неоднозначностей 1-го типа (вследствие гетерозиготности генов HLA), поскольку примерно 90% людей гетерозиготны по каждому HLA-гену [2]. В случае гомозиготности по HLA-гену возможность разделения HLA-генов на га-плотипы отсутствует. В таких ситуациях проводится локус-специфическое секвенирование, обычно позволяющее получить однозначные результаты. В нашем опыте из 70 проведенных HLA-типирований с помощью гаплотип-специфического секвенирования в 2 случаях оказалось невозможным получить однозначные результаты на уровне высокого разрешения.

В первом случае больной К. являлся гомозиготой по специфичности HLA-A*02, но, как оказалась впоследствии, был гетерозиготен по аллелям этой специфичности. Проведенное секвенирование и анализ полученного сиквенса дали ответ на уровне низкого разрешения (соответствует серологически выявляемым специфичностям) и показали, что больной - носитель HLA-A*02. Однако программное обеспечение (JSI) не смогло однозначно трактовать результаты сиквенса на уровне высокого разрешения и предложило три разных варианта:

1) A*02:01:01G, *02:05:01; 2) A*02:02, *02:06:01; 3) A*02:14, *02:22:01. Исходя из частот аллелей гена А*02, можно было предположить, что у больного оказался первый вариант, однако это предположение

требовало строгих доказательств. Данная ситуация могла быть решена двумя путями. Первый - использовать другую методику, второй - определить варианты гена HLA-A*02 у больного посредством сегрегации гаплотипов при HLA-типировании родителей. Были использованы оба подхода. Проведено HLA-типирование обоих родителей, которое показало, что от отца больной наследует аллель из группы HLA-A*02:01:01G, от матери - аллель HLA-A*02:05:01. Повторное типирование больного методом PCR-SSP c праймерами Invitrogen (США) для высокого разрешения гена HLA-A*02 дало следующий результат: у больного К. один аллель из группы HLA-A*02 -*02:01:01:01-03/01:02-15/01:17-19/01:21/88N/ 94N-97, 02:101:01/07/09/11/13N/14/16/18-21/23/25N/

32-34/38-41/45/47/50/51/53/57; второй аллель -HLA-A*02:05:01. Сравнение полученных результатов с данными, полученными при секвенировании HLA^*02, позволило также заключить, что больной - носитель аллелей HLA-А*02:01:01G и HLA-А*02:05:01.

Второй случай, связанный с невозможностью разрешения неоднозначностей при использовании данного метода, относился к аллелям специфичности HLA^*07. У больного И. при секвенировании гена HLA-С было получено 2 варианта ответов: 1) С*07:01:0Ю, *07:02:01G; 2) C*07:19, *07:27:01. Было проведено дополнительное типирование методом PCR-SSP c праймерами "Olerup" (Швеция) для высокого разрешения, полученный результат - у больного два аллеля одной специфичности HLA-Cw7 - С*07:01:01:01 и С*07:02:01:01.

Таким образом, неразрешимые с помощью PCR-SBT Protrans S4 неоднозначности первого типа наблюдались нами в двух случаях носитель-ства двух разных аллелей (разных G-групп) одной HLA-специфичности, когда на первом этапе было невозможно разделить HLA-гаплотипы. Эти случаи требовали применения дополнительных исследований другим методом (PCR-SSP). В обоих случаях комплексное использование разных подходов позволило установить оба аллеля на уровне высокого разрешения.

Неоднозначности 2-го типа связаны с полимор-физмом/мутациями вне 2-го и 3-го экзонов для генов HLA класса I и вне 2-го экзона для генов HLA класса II. Они могут иметь клиническое значение, если влияют на экспрессию гена HLA, т.е. приводят к появлению нулевого (неэкспрессирующегося) аллеля. Большинство неоднозначностей 2-го типа может быть разрешено дополнительным ДНК-типированием региона, в котором располагается данная мутация, для генов HLA класса I это чаще всего 4-й экзон. Нулевые аллели можно также выявить, если дополнительно провести серологическое определение антигенов HLA, например, в стандартном тесте комплемент-зависимой микролимфоцитотоксичности (для этого в ГНЦ используется дополнительное типирование с помощью панели сывороток, позволяющей выявлять экспрессию антигенов локусов HLA-А/В/С).

Некоторые из аллелей, входящих в одни и те же G-группы, но имеющие отличия вне 2-го и 3-го эк-

6

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

Таблица 1

Результаты HLA-типирования с высоким разрешением донора ххх для больного П

HLA-гены Больной Донор

HLA-A *02:01:01G, *24:02: 01G *02:01:01G, *24:02:01G

HLA-B *13:02:01G *44:02:01G

HLA-C *06:02:01G, *07:04:01G *05:01:01G, *06:02:01G

HLA-DRB1 *01:01:01G, *07:01:01G *01:01:01G, *07:01:01G

HLA-DQB1 *02:01:01G, *05:01:01G *02:01:01G, *05:01:01G

Примечание. Жирным шрифтом выделены варианты HLA-генов, по которым имелись расхождения между больным и донором.

зонов у HLA-генов класса I, являются широко распространенными и находятся в неравновесном сцеплении с разными аллелями других HLA-генов. Так, в октябре 2013 г. в ГНЦ по показанию к проведению алло-ТГСК был HLA-типирован больной П. с диагнозом хронический миелолейкоз, резистентност-ный к терапии ингибиторами тирозинкиназ. Брат пациента оказался только HLA-гаплоидентичен с больным, поэтому больному проведен поиск неродственного донора. Совпадающий с больным по генам HLA-A/HLA-B/HLA-DRB1 донор был найден в регистре Российского научно-производственного центра "Росплазма" ФМБА России, и образец его крови поступил в ГНЦ (Москва) для подтверждающего HLA-типирования. Результаты HLA-типирования больного П. и потенциального донора представлены в табл. 1 Хотя пациент и донор совпали по высокому разрешению на уровне G-группы по генам HLA-A, HlA-B, HLA-DRB1, HLA-DQB1, они имели несовпа-

Таблица 2

Совместное выявление аллелей геновHLA-B*44 и HLA-C* у больных острыми лейкозами

Больной Аллели гена HLA-B Аллели гена HLA-C

Ш. *44:02:01:01, *07 *05, *07

П. *44:27, *13 *06, *07

Б. *44:02:01:01, *08 *05, *07

Н. *44:03, *35 *04, *12

С. *44:02:01:01, *35 *04, *16

М. *44:02:01:01, *15 *05, *07

Р. *44:02:01:01, *27 *05, *02

T. *44:27, *13 *06, *07

В. *44:02:01:01, *14 *05, *08

А. *44:02:01:01, *35 *05, *04

Г. *44:02:01:01, *38 *05, *12

П. *44:02:01:01, *40 *05, *02

В. *44:02:01:01, *58 *05, *03

А. *44:27, *57 *06, *07

С. *44:27, *15 *04, *07

Таблица 3

Неравновесное сцепление между аллелямиHLA-B*44:02:01G и HLA-С* у больных - носителейHLA-B*44

HLA-гаплотип А

B*44:02:01:01-C*05 212 75

B*44:27-C*07 105 22

B*44:02:01:01- C*07 -163 -45

B*44:27-C*05 -177 -8

дение по гену HLA-С (на уровне антигена - группы аллелей).

Известно, что аллели генов HLA-С и HLA-В находятся в неравновесном сцеплении (LD - linkage disequilibrium). Результаты HLA-типирования больного П. и донора из регистра "Росплазмы" позволили предположить, что аллели HLA-В - В*44:02:01:01 и В*44:27 находятся в неравновесном сцеплении с разными аллелями HLA-С. HLA-B44 - один из самых распространенных антигенов локуса HLA-В у европеоидов [14], это дало возможность провести исследование по сцеплению аллелей HLA-B44* со специфичностями HLA-С. Из 62 больных различными острыми лейкозами, HLA-типированных (с низким или высоким разрешением) с января 2012 г. по октябрь 2013 г. по показаниям к проведению алло-ТГСК (родственной и неродственной), HLA-B*44 выявлен у 16 (25,8%). Из них у 15 больных сохранился образец ДНК, который был дополнительно ти-пирован с высоким разрешением методом PCR-SSP с использованием набора Invitrogen (США). Данные представлены в табл. 2.

Проведено исследование неравновесного сцепления между аллелями HLA-B*44 и HLA-С*. Показатель А - величина неравновесного сцепления между генами; А = 0 указывает на отсутствие неравновесного сцепления между генами (табл. 3). Выявлено, что аллель HLA-B*44:02:01:01 находится в сильном неравновесном сцеплении с HLA-C*05; А=212, а аллель B*44:27 - с C*07; А = 105. И наоборот, вероятность нахождения HLA-B*44:02:01:01 в одном гаплотипе с HLA-C*07 очень низка, на что указывает их отрицательное сцепление - А = -163, так же как и вероятность нахождения HLA-B*44:27 в одном гаплотипе с HLA-C*05, А = -177. Отсюда следует, что вероятны два гаплотипа HLA-B*44:02:01G/HlA-C*'. первый -HLA-B*44:02:01:01/ C*05, второй - HLA-B*44:27 -C*07. При вычислении показателя А между аллелями HLA-B и HLA-C в группе всех больных острыми лейкозами (n = 62), а не только больных - носителей гена HLA-B*44 сильное неравновесное сцепление сохраняется между HLA-B*44:02:01:01 и HLA-C*05 (А = 75) и менее выраженное - между B*44:27 и C*07 (А = 22). Это можно объяснить тем, что HLA-C*05 обычно встречается в гаплотипе HLA-B*44:02:01:01/ C*05, а HLA-C*07 входит в состав многих HLA-B/ HLA-C-гаплотипов.

Следовательно, разные аллели из группы B*44:02:01G входят в разные HLA-B/HLA-C-гапло-типы. Поскольку совпадение больного и потенциального донора по гену HLA-С также учитывается при подборе неродственного донора [3, 4, 15], нали-

7

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

чие нескольких возможных гаплотипов необходимо принимать во внимание, если донор не типирован по гену HLA-С, даже в том случае, когда имеется типи-рование гена HLA-В с высоким разрешением.

Неоднозначности, которые могут иметь клиническое значение, хотя находятся вне экзонов, кодирующих полиморфную часть пептидсвязывающей бороздки, для генов HLA класса II это неоднозначности вне 2-го экзона. G-группа HLA-DRB1*14:01:01G включает два аллеля: *14:01:01:01 и *14:54, отличающихся по одной позиции в 3-м экзоне и встречающихся у европеоидов с равной частотой. Разрешение этой неоднозначности наиболее значимо при частично совместимых ТГСК [4], так как данные аллели находятся в сцеплении с разными аллелями гена HLA-DRB3 - DRB1*14:01:01:01/DRB3*02:01 и DRB1*14:54 /DRB3*02:02 [16]. Совместимость по HLA-DRB3/4/5 учитывается при подборе не полностью совместимого донора, поскольку у больных возможно наличие антител к несовместимому аллелю, что чревато потенциальным риском отторжения трансплантата [4, 17]. Дополнительное несоответствие по HLA-DRB3 (4/5) в комбинации с мисматчем по какому-либо из генов HLA-A/B/C/DRB1 ухудшает выживаемость больных после частично совместимых ТГСК [4, 18]. Среди HLA-типированных методом PCR-SBT образцов ДНК HLA-DRB1*14:01:01G выявлен в 2 случаях. При дополнительном типиро-вании с высоким разрешением методом PCR-SSP ("Invitrogen", США) установлено, что в первом случае больной оказался носителем аллеля HLA-DRB1*14:54, во втором - больная была носительницей аллеля DRB1*14:01:01:01.

Таким образом, нам удалось разрешить все неоднозначные результаты, полученные при HLA-типировании на уровне высокого разрешения методом PCR-SBT. Неоднозначности первого типа мы наблюдали при типировании 2 из 70 образцов ДНК. У 1 больного неоднозначность была выявлена в локусе HLA-А, у другого - в локусе HLA-С. В обоих случаях гетерозиготные образцы было невозможно разделить на гаплотипы на этапе гаплотип-специфи-ческой амплификации, предшествующем секвениро-ванию, поскольку амплифицируемые группы в основном совпадают с серологическими вариантами, а пациенты были гетерозиготны внутри одного серологического варианта. Один больной был гетерозиготой по аллелям HLA-A2-А*02:01:01:01/А*02:05:01. Другой больной - гетерозиготой по аллелям HLA-C7 -С*07:01:01:01/С*07:02:01:01. У обоих больных оба варианта аллелей относились к высокочастотным, так называемым common аллелям [19, 20], и занимали первое и второе место по частоте среди аллелей внутри серологического варианта. Следовательно, при но-сительстве двух аллелей одной HLA-специфичности (антигена) для получения однозначных результатов на уровне G-группы при HLA-гаплотип-специфическом секвенировании Protrans S4 одного этого метода может быть недостаточно. Данная ситуация возможна в первую очередь при носительстве двух высокочастотных аллелей разных G-групп одного высокочастотного антигена (группы аллелей), таких как HLA-A2

или HLA-Cw7. В таких случаях лаборатория должна иметь возможность разрешить неоднозначность с помощью другого метода (например, PCR-SSP).

Неоднозначности второго типа могут быть связаны с нулевыми аллелями, также они важны тем, что аллели, имеющие отличия вне 2-го и 3-го экзонов, могут находиться в неравновесном сцеплении с разными вариантами других HLA-генов. К сожалению, в регистрах доноров костного мозга еще достаточно высоко число доноров, не типированных по гену HLA-C. В крупнейшем европейском регистре доноров костного мозга ZKRD в 2012 г. число доноров, типированных по HLA-A*/B*/DRB1* с высоким разрешением, приближалось к 2 млн, однако доноров, типированных с высоким разрешением по HLA-A*/ B*/C*/DRB1*, было примерно на 300 тыс. меньше [21], хотя современные критерии селекции неродственного донора для ТГСК требуют его совпадения с больным по генам HLA-A*/B*/C*/DRB1* на уровне высокого разрешения [3, 4, 14]. Полученные нами результаты показывают, что больной и потенциальный донор могут не совпадать по аллелям гена HLA-С даже в случае совпадения по генам HLA-A*/B*/DRB1*/ DQB1* с высоким разрешением на уровне G-группы. Именно иным вариантом гена HLA-С часто объясняется невозможность подобрать полностью совместимого неродственного донора ГСК, несмотря на совместимость по HLA-A*/B*/DRB1*/DQB*. Совпадение по гену HLA-C даже с низким разрешением (в дополнение к совпадению по HLA-A*/B*/DRB1*) является фактором, предсказывающим возможность нахождения полностью HLA-A */B*/C*/DRB1*/ DQB1*-совместимого донора [22].

Таким образом, гаплотип-специфическое сек-венирование методом PCR-SBT Protrans S4 дает возможность провести HLA-типирование с высоким разрешением в соответствии с современными требованиями для неродственной ТГСК, т.е. с разрешением всех неоднозначностей во 2-м и 3-м экзонах генов HLA класса I и во 2-м экзоне генов HLA класса II, которые могут приводить к замене аминокислотных остатков в доменах, образующих пептидсвязывающую бороздку молекул HLA. Исключением являются случаи гетерозиготности внутри одной HLA-специфичности при невозможности разделения HLA-гаплотипов у гетерозигот в начале методики. При гетерозиготности внутри одной HLA-специфичности для получения результатов типиро-вания с высоким разрешением следует в дополнение к гаплотип-специфическому секвенированию использовать другой метод HLA-типирования, например PCR-SSP.

Имеются два распространенных гаплотипа HLA-B*44:02:01 G/HLA-C: первый - HLA-B*44:02:01:01/ C*05, второй - HLA-B*44:27/C*07. При селекции неродственного донора необходимо учитывать, что больной и потенциальный донор могут не совпадать по аллелям гена HLA-С даже в том случае, когда они совпадают с высоким разрешением по генам HLA-A*/B*/DRB1*/DQB1*. В регистрах доноров костного мозга следует расширять когорты HLA-A*/B*/C*/ DRB1*/DQB1*-типированных доноров.

8

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]

1. Milius R.P., Mack S.J., Hollenbach J.A., Pollack J., Heuer M.L., Gragert L., et al. Genotyping List String: a grammar for describing HLA and KIR genotyping results in a text string. Tissue Antigens. 2013; 82(2): 106-2.

2. Blasczyk R. HLA diagnostic sequencing - conception, application and automation. J. Lab. Med. 2003; 27(9/10): 359-68.

3. Lee S.J., Klein J., Haagenson M., Baxter L.A., Confer D.L., Eapen M., et al. High resolution donor-recipient HLA matching contributes to the success of unrelated donor marrow transplantation. Blood. 2007; 110(13): 4576-83.

4. Spellman S.R., Eapen M., Logan B.R., Mueller C.H., Rubinstein P., Stterholm M.I., et al. A perspective on the selection of unrelated donors and cord blood units.for transplantation. Blood. 2012; 120(2): 259-65.

5. Савченко В.Г., Любимова Л.С., Паровичникова Е.Н., Менделеева Л.П., Момотюк К.С., Демидова И.А. и др. Трансплантация аллогенных и аутологичных стволовых клеток при острых лейкозах. Тер. арх. 2007; 7: 30-5.

[Savchenko V.G., Lyubimova L.S., Parovichnikova E.N., Mendeleeva L.P., Momotyuk K.S., Demidova I.A., et al. Transplantation of allogeneic and autologous stem cells in acute leukemias. Terapevticheskiy arkhiv. 2007; 7: 30-5].

6. Савченко В.Г., ред. Программное лечение заболеваний крови. М.: Практика; 2012.

[Savchenko V.G., ed. Program therapy in blood disorders

7. Adams S.D., Barracchini K.C., Chen D., Robbins FM, Wang L., Larsen P., et al. Ambiguous allele combinations in HLA Class I and Class II sequence-based typing: when precise nucleotide sequencing leads to imprecise allele identification. J. Transl. Med. 2004; 2(30): 1-6. http://www.translational-medicine.com/content/2/1/30.

8. Erlich H. HLA DNA typing: past, present, and future. Tissue Antigens. 2012; 80(1): 1-11. doi: 10.1111/j.1399-0039.2012.01881.x.

9. Standards for histocompatibility and immunogenetics testing. Version 5.7. http:// www.efiweb.org

10. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М.: Практика; 1999.

[Glantz S.A. Primer of biostatistics

11. Зарецкая Ю.М., Абрамов В.Ю. Новые антигены тканевой совместимости человека. M.: Медицина; 1986.

[Zaretskaya Yu.M., Abramov VYu. New human histocompatibility antigens

12. Хамаганова Е.Г, Зарецкая Ю.М. Ассоциации строения анти-генсвязывающего сайта молекулы HLA-DR c онкогематоло-

гическими заболеваниями. Гематология и трансфузиология. 2003; 1: 10-6.

[Khamaganova E.G., Zaretskaya Yu.M. Associations between antigen binding site of DR molecule and blood disorders. Hema-tologiya i transfuziologiya. 2003; 1: 10-16].

13. Marsh S.G., Albert E.D., Bodmer W.F. Bontrop R.E., Dupont B., Erlich H.A., et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2010. Tissue Antigens. 2010; 75(4): 291-455. doi: 10.1111/j.1399-0039.2010.01466.x.

14. Gonzalez-Galarza F.F., Christmas S., Middleton D., Jones A.A. Allele frequency net: a database and online repository for immune gene frequencies in worldwide populations. Nucleic Acid Res. 2011; 39 (Suppl. 1): D913-9.

15. Зарецкая Ю.М., Хамаганова Е.Г., Алещенко С.М., Мура-шева Л.А. Поиск неродственного донора Российским регистром доноров костного мозга. Тер. арх. 2002; 7: 30-5. [Zaretskaya Yu.M., Khamaganova E.G., Aleshchenko S.M., Mu-rasheva L.A. The search for an unrelated donor using Russian registry of bone marrow donors. Terapevticheskiy arkhiv. 2002; 7: 30-5].

16. Pasi A., Crocchiolo R., Bontempelli M., Carcassi C., Carel-la G., Crespiatico L., et al. The conundrum of HLA-DRB1*14:01/*14:54 and HLA-DRB3*02:01/*02:02 mismatches in unrelated hematopoietic SCT. Bone Marrow Transplant. 2011; 46 (7): 916-22.

17. Brand A., Doxiadis I.N., Roelen D.L. On the role of HLA antibodies in hematopoietic stem cell transplantation. Tissue Antigens. 2013; 81(1): 1-11. doi: 10.1111/tan.12040.

18. Fernandez-VinaM.A., Klein J.P., Haagenson M., HaagensonM., AljurfM., AskarM., et al. Multiple mismatches at the low expression HLA loci DP, DQ, and DRB3/4/5 associate with adverse outcomes in hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2013; 121(22): 4603-10. doi: 10.1182/blood-2013-02-481945.

19. Cano P., Klitz W., Mack S.J., Maiers M., Marsh S.G., Noreen H., et al. Common and well-documented HLA alleles: report of the ad-hoc committee of the American Society for Histocompatibility and Immunogenetics. Human Immunol. 2007; 68 (5): 392-417.

20. Mack S. J., Cano P., Hollenbach J. A., He J., Hurley C.K., Middleton D., et al. Common and well-documented HLA alleles: 2012 update to the CWD catalogue. Tissue Antigens. 2013; 81(4): 194-203.

21. ZKRD, Annual Report 2012. http://www.zkrd.de.

22. Gourraud P.A., Balere M.L., Faucher C., Loiseau P., Dormoy A., Marry E., Garnier F. HLA phenotypes of candidates for HSCT: comparing transplanted versus non- transplanted candidates, resulting in the predictive estimation of the probability to find a 10/10 HLA matched donor. Tissue Antigens. 2014; 83 (1): 1726. doi: 10.1111/tan.12263.

Поступила 07.02.14 Received 07.02.14

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.419-007.17-092:612.014.1]-07

СОДЕРЖАНИЕ АКТИВИРОВАННОЙ ФОРМЫ АНТИАПОПТОТИЧЕСКОГО ПРОТЕИНА AKT1 В ЛИЗАТАХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ПЕРВИЧНЫХ МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИХ СИНДРОМАХ

Климкович Н.Н. ', | Пивень НТВТ| 2, Красько О.В. 3, Козарезова Т.И. ', Тишкевич М.Н. 2

'ГУО Белорусская медицинская академия последипломного образования; 2ГНУ Институт биоорганической химии НАН Беларуси; 3ГНУ Объединенный институт проблем информатики НАН Беларуси, Минск, Республика

Беларусь

Резюме. Исследовано содержание антиапоптотического протеина Aktl в лизатах клеток костного мозга при первичных миелодиспластических синдромах и обнаружено его высокое значение при прогрессировании заболевания. Уровень Aktl в лизатах клеток костного мозга более 500 пг/мл является пороговым для биологических процессов, характеризующихся снижением апоптотической готовности и высокой клоновой пролиферативной активностью. Повышение содержания активированной формы Aktl в лизатах клеток костного мозга при первичных миелодиспластических синдромах является дополнительным фактором, отражающим степень поражения гемопоэза, и может служить прогностическим критерием. Ключевые слова: миелодиспластические синдромы; антиапоптотический протеин Aktl; костный мозг.

9