Микрофлюидное устройство для формирования монодисперсной макроэмульсии вакуумным методом

Полезная модель относится к устройствам подготовки образцов для исследования, манипулирования материалами при автоматическом анализе в жидком или текучем состоянии. Полезная модель позволяет формировать монодисперсные эмульсии разного состава, в том числе с биологическими объектами. Каждая отдельная эмульсия представляет собой изолированный микрореактор для проведения химических или биохимических реакций. Полезная модель позволяет упростить, а также ускорить процесс формирования эмульсии и может найти применение при проведении биологических и медицинских анализов, синтезе гидрогелевых микрочастиц, скриннинге лекарственных препаратов.
В настоящее время методы капельной микрофлюидики успешно используются для молекулярной диагностики путем проведения высокочувствительных анализов в цифровой капельной полимеразной цепной реакции (цкПЦР) [1], изотермической амплификации (LAMP) [2], для секвенирования РНК отдельных клеток [3,4], а также для детектирования и скриннинга активности ферментов [5]. Кроме того, методы капельной микрофлюидики находят широкое применение в химическом синтезе [6], особенно для синтеза микро и наночастиц со специфическими характеристиками [7,8]. Основными преимуществами капельной микрофлюидики являются возможность формирования большого числа изолированных микрореакторов пико- и нанолитрового объема, идеальных для анализа отдельных клеток или молекул, что в совокупности предоставляет уникальную возможность контроля за условиями протекания реакций, при высокой производительности и скорости анализа или синтеза.
Формирование монодисперсных макроэмульсий осуществляется в микрофлюидных чипах в области контакта дисперсной водной фазы и непрерывной масляной фазы за счет возникновения неустойчивости на границе раздела или за счет механического актуатора (клапана) (Patent US 8697008B2, US 8746285B2). Также известно, что с помощью таких устройств можно осуществлять упаковку отдельных клеток в капли «вода-масло» (Patent US 7759111 В2), осуществлять синтез полимерных микрочастиц (Patent US 2007/0054119 А1), проводить генетические анализы отдельных молекул или клеток (Patent US 8454906 B2).
В качестве аналогов разработанной полезной модели могут быть приняты: микрофлюидный генератор макроэмульсий (Patent US 8697008 B2) и микрофлюидная система, осуществляющая ввод жидкостей в чип и контролирующая процесс формирования эмульсий (Patent US 9636682 B2). Микрофлюидный генератор макроэмульсий с фокусировкой потока представляет собой микрофлюидный чип, в котором поток дисперсной фазы в месте соприкосновения с потоком непрерывной фазы гидродинамически фокусируется и за счет возникновения неустойчивости распадается на отдельные капли эмульсии. Диаметр капель при этом определяется соотношением между расходами дисперсной и непрерывной фаз во входных каналах. Такой микрофлюидный генератор позволяет формировать монодисперсную макроэмульсию с высокой производительностью, но требует сложной системы ввода жидкостей, поддерживающей их постоянные расходы. Кроме того, поскольку глубина каналов в таком генераторе постоянна, поэтому при полимеризации эмульсии и ее превращении в суспензию гидрогелевых микрочастиц наблюдается закупоривание выходного канала из-за трения микрочастиц о его стенки.
Система для генерации эмульсии, описанная в патенте US 9636682 B2 и принимаемая в данной полезной модели в качестве прототипа, состоит из кассеты (картриджа), в котором сформированы микрофлюидные генераторы эмульсии, аналогичные описанным выше (Patent US 8697008 B2), и инструмента, обеспечивающего управляемое течение жидкостей в картридже за счет создания контролируемого уровня разрежения в выходном резервуаре. Система позволяет одновременно формировать до восьми образцов макроэмульсий заданного диаметра за счет системы насосов, сенсоров и клапанов. К недостаткам прототипа относятся ее большие габариты и сложность устройства, необходимость использования только специальных картриджей и расходных материалов, отсутствие возможности воздействия на формируемую эмульсию электромагнитным, тепловым или иным излучением и контроля процесса формирования методами оптической микроскопии и спектроскопии.
Задачей данной полезной модели является упрощение конструкции устройства и расширение возможностей по формированию монодисперсных макроэмульсий, а также технологии упаковки в нее биологических объектов (клеток, вирусов, нуклеиновых кислот, белков) при проведении биологических и медицинских исследований. Техническим результатом, позволяющим выполнить поставленную задачу, является движение несмешиваемых жидкостей в микрофлюидном устройстве и формирование эмульсии в месте их контакта из-за возникновения нестабильности за счет разности давлений между входными и выходным резервуарами. В качестве одной жидкости (непрерывная фаза) может выступать минеральное, силиконовое, фторуглеродное и др. масло. В качестве второй жидкости (дисперсная фаза) могут использоваться водные растворы биологических веществ, таких как нуклеиновые кислоты и белки; суспензии клеток и вирусов. В результате работы устройства формируется монодисперсная макроэмульсия, содержащая биологические объекты, присутствовавшие в водной дисперсной фазе. Технический результат достигается за счет создания вакуумного разряжения в выходном резервуаре устройства, состоящего из микрофлюидного чипа и оправы, фиксирующей положение микрофлюидного чипа и обеспечивающей подключение к его выходному резервуару вакуумного насоса. Выходной канал микрофлюидного чипа имеет переменную ширину, а конструкция оправы позволяет осуществлять воздействие на формируемую эмульсию электромагнитным, тепловым или иным излучением и контролировать процесс формирования методами оптической микроскопии и спектроскопии, что расширяет возможности по формированию эмульсий с помощью полезной модели.
В состав полезной модели входит микрофлюидный чип и оправа, обеспечивающая подключение выходного резервуара чипа к вакуумному насосу для создания разряжения, в следствие которого происходит движение жидкостей по микроканалам чипа. Основной особенностью микрофлюидного чипа по сравнению с прототипом является переменная глубина и ширина выходного канала (фиг. 1). На расстоянии 0.1-1 мм от области пересечения каналов с дисперсной и непрерывной фазой происходит увеличение глубины выходного канала по крайней мере в 2 раза. Это позволяет обеспечивать полимеризацию полимерных микрочастиц непосредственно в микрочипе. Для увеличения времени движения капель по каналу где происходит полимеризация частиц, он выполнен в форме серпантина. Ввод жидкостей в микрофлюидный чип осуществляется из интегрированных входных резервуаров под действием разряжения, создаваемого в выходном резервуаре, в котором осуществляется накопление сформированной эмульсии. Такое техническое решение обеспечивает малый расход пробы, не ограничивает количество входных резервуаров тем самым позволяя упаковывать в эмульсию одновременно несколько веществ и объектов. Необходимое соотношение между расходами непрерывной и дисперсной фаз, а следовательно и диаметр формируемых капель, обеспечивается гидравлическими сопротивлениями входных каналов. При необходимости изменения диаметра капель потребуется заменить чип на чип аналогичной конструкции, но с другим соотношением между гидравлическими сопротивлениями входных каналов. Монодисперсность эмульсии обеспечивается конфигурацией области слияния потоков непрерывной и дисперсной фаз, а также наличием апертуры, определяющей диаметр формируемых капель. Регулируя степень разряжения в выходном резервуаре можно регулировать скорость генерации эмульсии.
На фигуре 1а представлен чертеж микрофлюидного чипа для формирования макроэмульсий, а на фигуре 1б чертеж области формирования капель эмульсии. Чип имеет один вход для непрерывной фазы (1), один вход для дисперсной фазы (2) и один выход для сбора макроэмульсии (7). Вход для непрерывной фазы (1) соединен двумя микроканалами (3) с областью формирования капель макроэмульсии (5). Вход для дисперсной фазы (2) соединен одним микроканалом (4) с областью формирования капель макроэмульсии (5). Входные отверстия чипа снабжены фильтрами с переменным размером пор для предотвращения засорения рабочей области чипа. В области формирования капель (5) происходит соприкосновение потоков дисперсной и непрерывной фаз, при этом за счет образования нестабильности поток дисперсной фазы разбивается на капли, транспортируемые потоком непрерывной фазы к выходному отверстию. Выходной канал (6) выполнен в виде серпантина и имеет в 2 раза большую глубину для проведения реакции полимеризации эмульсии непосредственно в чипе.
На фигуре 2 представлен эскиз устройства, обеспечивающего создание разряжения в выходной камере микрофлюидного чипа (8) путем подключения вакуумного насоса к стандартному фитингу (11) по шлангу (12). Устройство состоит из двух частей, нижней (9) и верхней (10), между которыми закрепляется с помощью винтов микрочип. В нижнюю часть устройства может быть помещен нагревательный элемент (13).
Техническая реализация оправы, обеспечивающей создание разряжения в выходной камере микрофлюидного чипа путем подключения вакуумного насоса к стандартному фитингу, представлена на эскизе, размещенном на фиг. 2. Оправа состоит из двух частей, выполненных методом микрообработки из прозрачного пластика. Нижняя часть оправы содержит прозрачный нагревательный элемент на основе стеклянной пластины с нанесенным слоем оксида индия-олова (ITO) и обеспечивает расположение чипа, фиксация которого осуществляется путем его прижатия к нижней части оправы верхней частью. В верхней части оправы сформирован микроканал, соединенный с фитингом, который обеспечивает откачивание воздуха из выходного резервуара чипа путем подключения к устройству вакуумного насоса. Герметичность соединения между верхней частью оправы и чипом обеспечивается за счет механического прижима эластичного материала чипа, эластичной или адгезивной прокладки. Конструкция оправы выполнена таким образом, что позволяет изменять положение ее верхней части относительно нижней за счет массива крепежных отверстий, делая возможным использование чипов разного размера. Основными преимуществами полезной модели над аналогом являются простота конструкции, универсальность, возможность использовать микрофлюидные чипы разных топологий, а также возможность обеспечивать воздействие на формируемую эмульсию электромагнитным, тепловым или иным излучением и контролировать процесс формирования методами оптической микроскопии и спектроскопии.
Список литературы
1 I. Hudecova Digital PCR analysis of circulating nucleic acids, Clinical Biochemistry, 2015
2 Tushar D. Rane et.al., Microfluidic Continuous Flow Digital Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) // LabChip, 2015
3 Antonia Wallrapp et al. Nature 549, 351-356 (21 September 2017)
4 AssafRotemetal. PLOS ONE, 2015. (DOI:10.1371/journal.pone.0116328)
5 L. Mazutis, J. Gilbert, W.L. Ung, D.A. Weitz, A.D. Griffiths, J.A. Heyman Single-cell analysis and sorting using droplet based microfluidics // Nature Protocols, 2013;
6 J. Ji, Y. Zhao, L. Guo, B. Liu, C. Jib, P. Yang Interfacial organic synthesis in a simple droplet-based microfluidic system //: Lab Chip, 2012, 12, 1373
7 T.S. Kaminski, P. Garstecki Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays // Chem. Soc. Rev., 2017, 46, 6210
8 A. Choi, K.D. Seo, D.W. Kim, B.C. Kim, D.S. Kim Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications // Lab Chip, 2017, 17, 591-613.