Получение культуры клеток Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген силикатеина морской роговой губки Latrunculia oparinae

Биология

Вестник ДВО РАН. 2015. № 5

УДК 577.2

Д.Г. КАМЕНЕВ, Ю Н. ШКРЫЛЬ, Г.Н. ВЕРЕМЕЙЧИК, В.П. БУЛГАКОВ

Получение культуры клеток Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген силикатеина морской роговой губки Latrunculia oparinae

Получены генетические конструкции, содержащие ген силикатеина, трансгенные культуры клеток N. tabacum, экспрессирующие силикатеин LoSilAl, который выделен и очищен в нативных условиях методом аффинной хроматографии. Это первая опубликованная работа о выделении силикатеина из эукариотической экспрессионной системы. Полученные генетические конструкции могут быть использованы для экспрессии LoSilAl в других подобных системах, а трансгенные культуры клеток — в качестве прототипа источника ре-комбинантного силикатеина.

Ключевые слова: силикатеин, Latrunculia oparinae, губки, биосилификация.

Obtaining Nicotiana tabacum cell cultures expressing silicatein gene of marine horny sponge Latrunculia oparinae. D.G. KAMENEV, Y.N. SHKRYL, G.N. VEREMEICHIK, V.P. BULGAKOV (Institute of Biology and Soil Science, FEB RAS, Vladivostok).

Genetic constructions were obtained with silicatein gene and transgenic N. tabacum cell culture, expressing LoSilAl silicatein that was extracted and purified via affinity chromatography under native conditions. This is the first published report about silicatein extraction from eukaryotic expression system. Obtained genetic constructions might be used for LoSilAl expression in different systems. Obtained genetic structures may be used for LoSilAl expression in other similar systems, and transgenic cell culture may be used as a prototype of recombinant silicatein source.

Key words: silicatein, Latrunculia oparinae, sponges, biosilification.

Изучение процессов биосилификации - одно из перспективных и актуальных направлений в нанобиотехнологии. Поиск биомиметического пути для синтеза упорядоченных наноструктур на основе кремния представляет важный этап для создания новых материалов в области оптики и электроники [9]. Одним из наиболее перспективных направлений в данной области является изучение силикатеинов - белков, способных по-лимеризовать кремний [7]. Впервые ген силикатеина клонирован из морской губки Tethya aurantia [10]. Показано, что силикатеин ответствен за формирование спикул - опорных структур морских губок [3, 7], а сами спикулы с точки зрения оптики представляют собой фотонные кристаллы со свойствами, превосходящими таковые у современных кварцевых световодов [1, 6]. Известно, что по аминокислотной последовательности силикатеины очень близки к белкам семейства протеаз - катепсинам. Особенностью силикатеинов является присутствие аминокислоты серин в каталитическом домене (цистеин у катепси-нов) и наличие серин-богатого участка. Установлено, что рекомбинантные силикатеины, слитые с гистидиновым тэгом [12] или мембранным белком бактерий [5], сохраняют свои

*КАМЕНЕВ Дмитрий Геннадьевич - младший научный сотрудник, ШКРЫЛЬ Юрий Николаевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, ВЕРЕМЕЙЧИК Галина Николаевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, БУЛГАКОВ Виктор Павлович - член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией (Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: dkamenev89@gmail.com

свойства к поликонденсации предшественников. Позднее было установлено, что силика-теин способен конденсировать молекулы предшественника - тетраэтоксисилана (TEOS) с образованием кремниевых наноструктур в обычных условиях [4] и что силикатеины разных видов губок способны к поликонденсации не только кремния, но и оксидов металлов - TiO2 и ZrO2 [11]. Большая часть работ в этой области выполнена на представителях класса Demospongiae [7, 12].

Выделение силикатеина из спикул губок - весьма трудоемкий процесс, а для искусственного синтеза упорядоченных полимерных кремниевых соединений требуются экстремальные значения pH и температуры. Биотехнологический путь получения кремний-полимеризующих белков лишен этих недостатков. Ранее рекомбинантный силикатеин был получен путем экспрессии участка кДНК, соответствующего зрелому белку силикатеина, в клетках Escherichia coli. Он обладал способностью к полимеризации кремния in vitro, хотя его активность была ниже по сравнению с белком, выделенным из спикул [11]. Не исключено, что белок, экспрессированный в эукариотической системе, будет проявлять большую активность. Способность культур клеток растений к экспрессии рекомби-нантных белков с посттрансляционными модификациями подтверждена экспериментами по синтезу гемоглобина и секреторного иммуноглобулина (IgA) человека и интерлейки-на 2 и 4 [8]. Культуры клеток растений имеют преимущество и перед культурами клеток млекопитающих и насекомых. Культивирование растительных клеток не требует сложных условий, необходимых для выращивания клеток животных [11].

Цель данной работы - получение культуры клеток Nicotiana tabacum, экспрессиру-ющей силикатеин морской роговой губки Latrunculia oparinae. Наиболее интересным и перспективным для данной работы, на наш взгляд, является силикатеин LoSilAl морской губки L. oparinae, поскольку ген экспрессируется на высоком уровне и является типичным силикатеином [10] (рис. 1).

Lubomirskia baicalemis silicalein-a (CAI43319 Telhya aurantium silicatem-a (AAC23951 Suberites domuncula silicatem-a (CAI46305 Latrunculia oparinae silicatein-Al (ACG63793 Auiosaccus sp. AuSil-Hexa (GQ387054) QYAKSIDVRTKGAVTSV8YO--GQCGXSYAF.ä^TGALE&JiSiLli;i['KiiVTL5ECilIIDC5VFYGNHGCSGGBT AYPETVBBRTKGAVTGIK.iQ--GPCGASYAFSAHGALEGIKALATGia;TYiisECilIIOCSyPYGNHGC:-:GGNH DYPEAVDBRTKGAVTi.VKDQ— GDCGASYAFSAHGALEGANALAI-MJ.'AVSLSEQNIIDCSIPYGNHGCHGGNI SYPESVB«RTKGAVTSVKDO--SOCGASYAFSAII.ULEGANALATt'T|,VIlLSEONLII>CSVPYGNHGC:-:GGNH SgPDsjMTiGKGSMIMO^GOeDSCYtrSAVGALEiaTWKGYBslsioM'llDCSaPYGMYGCSGgm

♦ «CT ♦ ♦

t*

Lubomirskia baicalemis silicalein-a (CAI43319) Telhya aurantium silicalein-a (AAC23951) Suberites domuncula silicalein-a (CAI46305; Latrunculia oparinae silicatein-.41 (ACG63793 Auiosaccus sp. AuSil-Hexa (GQ387054) YTATKYVlr.NGGlDTESSYSrKC.KQSSCOm^TSGiSATGWSIGYGSESDLl.AAVATVGPVAVAVB.UJTNI.F YVAFLYWAKEGVDIiGGSYPFRGKQSSCTYCiQYPGiSpSGSBdfe YI'AFI.WIATJEGVI^QDSAYpfo'GKQSSCIJYN^YKGTSHSGHVSIKSGSESDL .'AAV T.'VGP^Sj/AiDGANsilF ^VAFKWIATIEGVDT^SYPgYGkQSSCVYTJEKYA^K^SGIIVpfisCGSESDLLGAVAiiVGPVAVAlDGSSIiiF M^H^JMI'GXSKQSSYTYHGBOI'SCSYS^YPGSSCeGbi'jKSGbisS^LAAVreHGPIAVAVBiPSNAF

♦ 1

*

Lubomirskia baicalensis silicalein-a (CAI43319; Telhya aurantium silicalein-a (AAC23951 Suberites domuncula silicalein-a (CAI46305] Latrunculia oparinae silicatein-Al (ACGi3793 Auiosaccus sp. AuSil-Hexa (GQ387054) RFY^iSGVFDSSSCSSTKLNHAHLVTGYGSYMGKDYllLVKHSIjSKHIIGDSGYILMVRNKYHOCGIASDALYPlI RFYYSGVYDSSRCSSSSLNHAMVXTGYGISNI^QEYULA^SHGZ^GELGYVKMARNKYNOCGIASDASYPT RFYVSGWYDSSRCSSS.iLHHAMWTGYGSYNGKKYVLAKNSeGTNieGKSGYVHHARilKYtlCCGIATDASYPT RFYSSGVYDSSRCSSSKbNHAIWTGYGSYSGKKYHLVKNSiGKN^GMYGYIHKARGKYKQCGIASDASYPT KYYSSGVFDSSRCT3T!l)t|AHsfeLTGYGAYCGiciYWLLKNS^GSCSGi!SGYIHHTRfIGYtIQCGIATDASYPT L L L L

llSO.......lfiO.......170.......ISO.......190.......200.......210.......220

| L_S«r_} BCT "CT ♦

Рис. 1. Выровненные аминокислотные последовательности силикатеинов и катепсинов губок с силикатеином

L. ораппае

На основе полученной последовательности Ьв&1Л1 разработаны праймеры для слияния участка кДНК Ьв8ИЛ1, соответствующего зрелому белку, с последовательностью, кодирующей гистидиновый тэг для аффинной очистки продукта экспрессии. Праймеры, использованные в работе, несут сайты рестрикции SacI, ВатШ, EcoRI, Ара1:

253D-SacI-6H 5'-TACACGAGCTCAATGCATCACCATCACCATCACTCCTATCCTGAGTCCGTG

253Я-ВатШ 5'-AGCAGGGATCCCCTAAAGAGTAGGGTAGGAGG

253D-SacI 5'-GCTGAGAGCTCAATGTCCTATCCTGAGTCCGTG

253R-BamHI-6H

253SilD-EcoRI

253SilR-ApaI

5' 5' 5'

-TATAAGGATCCTCTAATGGTGATGGTGATGGTGAAGAGTAGGGTAGGAGG -GAT GAA TTC ATG TCC TAT CCT GAG TCC GTG -GTT GAG GGC CCA AGA GTA GGGT AGG AGG

При помощи ПЦР с использованием соответствующих праймеров и амплифицированной кДНК L. oparinae получен участок гена LoSilAl длиной 490 п.н. Ампликоны были очищены и подвергнуты рестрикции ферментами EcoRI, ApaI, SacI и BamHI согласно протоколу фирмы-производителя (СибЭнзим, Россия). Фрагменты LoSilAl клонировали стандартным способом [2] в соответствующие рестрикционные сайты кассетного вектора pSAT6-MCS под контроль растительных промотора и терминатора гена 35S рРНК вируса мозаики цветной капусты (35S CaMV). Полученные конструкции вводили в Т-ДНК бинарного вектора pPZP-RCS2. Для селекции трансгенных клеток растений Т-ДНК pPZP-RCS2 содержала ген устойчивости к канамицину - Npt II (неомицин-фосфотрансфе-раза) под контролем промотора и терминатора генов опи-нового синтеза (pNos и Nos 3').

Рекомбинантный вектор pPZP-RCS2 был перенесен в клетки Agrobacterium tumefaciens EHA 105 при помощи электропорации.

В результате получены три варианта генетических конструкций, содержащих рекомбинантный силикатеин: вариант S1 для экспрессии гена силикатеина LoSilAl в чистом виде и два варианта для экспрессии LoSilAl, слитого с гистидиновым тэгом для аффинного выделения белка -S2 и S3 с шестью а.о. гистидина на N- и C-концах, соответственно (рис. 2).

Методом агробактериальной трансформации нами получены четыре трансгенные культуры клеток N. tabacum, экспрессирующие различные варианты рекомбинантного силикатеина LoSilAl: Nt-S1, Nt-S2 и Nt-S3, а также культура Nt-pPZP, использованная в качестве контроля. Селекцию проводили на средах, содержащих канамицин (1000 мг/л). Контрольной культурой служили нетрансформиро-ванные каллусы табака. С помощью автоматизированной системы аффинной очистки Profinia (BioRad, США) и хроматографических колонок с никелевой агарозой (Ni-NTA Bio-Rad, США) выделен рекомбинантный силикатеин из культур клеток в нативных условиях (рис. 3).

Масса выделенного белка, равная 24,92 кДа, а также отсутствие подобных белков в контрольной пробе свидетельствуют о том, что полученные нами культуры клеток N. tabacum экс-прессируют ген силикатеина LoSilAl.

В настоящий момент в литературных источниках нет данных о выделении рекомбинантного силикатеина

Рис. 2. Генетические конструкции, содержащие ген силикатеина LoSailA1. Сверху вниз: А - S1, Б - S2 и S3

Рис. 3. Фотография электрофореза белка, выделенного из культуры клеток №^2, в полиакриламидном геле. Стрелкой отмечена полоса, где молекулярная масса белка соответствует силикатеину LoSilA1

LoSilAl морской роговой губки Latrunculia oparinae из эукариотической экспрессионной системы. Нами силикатеин выделен в нативных условиях с помощью автоматизированной системы аффинной очистки Profinia.

Таким образом, по результатам наших исследований можно заключить, что в клетках трансгенных культур белок силикатеин присутствует в растворимой форме. Полученные генетические конструкции возможно использовать для экспрессии LoSilAl в других экс-прессионных системах с целью поиска более эффективных продуцентов. Результаты настоящей работы могут послужить предпосылкой к началу биотехнологического получения рекомбинантного силикатеина.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кульчин Ю.Н., Букин О.А., Вознесенский С.С., Галкина А.Н., Гнеденков С.В., Дроздов А.Л., Куря-вый В.Г., Мальцева Т. Л., Нагорный И.Г., Синебрюхов С.Л.,Чередниченко А.И. Волоконные световоды на основе природных биоминералов - спикул морских губок // Квантовая электроника. 2008. Т. 38, № 1. C. 51-55

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

3. Cao X., Fu W., Yu X., Zhang W. Dynamics of spicule production in the marine sponge Hymeniacidon perlevis during in vitro cell culture and seasonal development in the field // Cell Tissue Res. 2007. Vol. 329 (3). P. 595-608.

4. Cha J., Shimizu K., Zhou Y., Christiansen S., Chmelka B., Stucky G., Morse D. Silicatein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 361-365.

5. Curnow P., Bessette P., Kisailus D., Murr M., Daugherty P., Morse D. Enzymatic synthesis of layered titanium phosphates at low temperature and neutral pH by cell-surface display of silicatein-a // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127. P. 15749-15755.

6. Kozhemyako V.B., Veremeichik G.N., Shkryl Y.N., Kovalchuk S.N., Krasokhin V.B., Rasskazov V.A., Zhuravlev Y.N., Bulgakov V.P., Kulchin Y.N. Silicatein genes in spicule-forming and nonspicule-forming Pacific Demosponges // Mar. Biotechnol. 2010. Vol. 12. P. 403-409.

7. Müller W.E., Boreiko A., Wang X., Belikov S.I., Wiens M., Grebenjuk, V.A., Schlossmacher U., Schröder H.C. Silicateins, the major bio-silica forming enzymes present in demosponges: protein analysis and phylogenetic relationship // Gene. 2007. Vol. 395. P. 62-71.

8. Plasson C., Michel R., Lienard D., Saint-Jore-Dupas C.,Sourrouille C., de March G.G., Gomord V. Production of Recombinant Proteins in Suspension-Cultured Plant Cells // Methods in Molecular Biology, Recombinant Proteins From Plants. 2009. Vol. 483. P. 145-161.

9. Schroder H., Brandt D., Schlobmacher U., Wang X., Tahir M.N., Tremel W., Belikov S., Muller W. Enzymatic production of biosilica glass using enzymes from sponges: basic aspects and application in nanobiotechnology (material sciences and medicine) // Naturwissenschaften. 2007. Bd 94. P. S. 339-359.

10. Shimizu K., Cha J., Stucky G., Morse D. Silicatein a: Cathepsin L-like protein in sponge biosilica // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 6234-6238.

11. Tahir M.N., Theato P., Muller W., Schroder H., Borejko A., Faib S., Janshoff A., Huth J., Tremel W. Formation of layered titania and zirconia catalysed by surface-bound silicatein // Chem. Commun. 2005. Iss. 44. P. 5533-5535.

12. Tahir M.N., Theato P., Muller W., Schroder H., Janshoff A., Zhang J., Huth J., Tremel W. Monitoring the formation of biosilica catalysed by histidine-tagged silicatein // Chem. Commun. 2004. Iss. 24. P. 2848-2849.