Экспрессия и очистка рекомбинантного раково-тестикулярного антигена GAGE1

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

111

(так называемые интраэпителиальные неоплазии вульвы) и раком вульвы. Из них у 13 (30,9 %) пациенток был диагностирован крауроз вульвы, у 8 (19,1 %) — интраэпителиальные неоплазии вульвы I—III степени, у 21 (50 %) — плоскоклеточный рак. Все пациентки были разделены на 2 группы: в 1-й (n = 29) препарат на основе хлорина е6 (фотолон) вводили внутривенно капельно в дозе 1 мг/кг массы тела; во 2-й (n = 13) препарат на основе 5-аминоле-вулиновой кислоты (аласенс) наносили аппликационно в виде 20 % мази. Длительность лечения составляла 20—40 мин. Плотность энергии — 100—350 Дж/см.

Результаты. Лечебный эффект после ФДТ при патологии вульвы оценивался визуально, субъективно (отсутствие жалоб на зуд) и по данным цитологического или морфологического исследования через 3—6 мес после ФДТ Положительный лечебный эффект был достигнут у всех пациенток через 3 мес. Полная клиническая ремиссия через 1 год после проведения сеанса ФДТ была достигнута у 40 (95,2 %) больных. У 2 (4,7 %) пациенток было проведено повторное лечение в связи с рецидивом заболевания. У 1 пациентки с диагнозом дисплазии вульвы III степени через 1 год по данным гистологического исследования диагностирована дисплазия вульвы II степени, и у 1 больной с дистрофическим заболеванием вульвы (крауроз) через 6 мес зарегистрированы клинические проявления болезни (зуд) и гиперкератоз плоского эпителия по данным гистологического исследования. Побочные проявления заключались в болевом синдроме после проведения ФДТ, который купировался приемом нестероидных противовоспалительных средств.

Заключение. Таким образом, полученные результаты ФДТ с использованием препаратов фотолон и аласенс при лечении пациенток с дистрофическим изменениями, ин-траэпителиальными неоплазиями и раком вульвы показали высокую лечебную эффективность с минимальным количеством побочных эффектов и отсутствием осложнений после проведенного лечения. Метод ФДТ позволил выполнить органосохраняющее лечение у больных с заболеваниями вульвы без ухудшения качества их жизни.

А.А. Фильченков1, М.П. Завелевич1,

С.Л. Рыбалко2, Д. Б. Федорченко2, Д.Ю. Блохин3

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ВИРУСАМ РАЗНЫХ

ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП КЛЕТОК JURKAT/A4

С ФЕНОТИПОМ МНОЖЕСТВЕННОЙ

ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

ИЭПОР им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, Украина;

2НИИэпидемиологии и инфекционных заболеваний АМН

Украины, Киев, Украина;

3ФГБУ«РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

Введение. В лейкозных клетках с фенотипом множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) апоптотиче-ский ответ при действии химиотерапевтических препаратов существенно снижен. Использование моделей лейкозных клеток со стабильным фенотипом МЛУ позволяет анализировать механизмы, препятствующие запуску в них программы апоптоза. Вместе с тем апоптоз, как известно, является одним из механизмов цитопатогенного действия многих вирусов. Определение чувствительности к вирусам

клеток с фенотипом МЛУ позволяет расширить наши представления о роли различных компонентов системы апоп-тоза как в реализации МЛУ, так и в развитии цитопатоген-ного эффекта при действии вирусов.

Цель исследования — сравнить чувствительность клеток линии Jurkat и ее клональной сублинии Jurkat/A4 с фенотипом МЛУ к вирусу простого герпеса (ВПГ), вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирусу диареи крупного рогатого скота (BVDV).

Материалы и методы. Линии клеток Jurkat, Vero, МТ-4 и MDBK получены из банка клеточных линий ИЭПОР НАНУ. Клональная сублиния Jurkat/A4, полученная селекцией при действии на клетки Jurkat агонистических анти-CD95-антител, была предоставлена авторами. В работе использованы штамм ВН ВПГ 2-го типа и ВИЧ-1, продуцируемый клетками культуры МТ4/ВШ (НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского), BVDV (Институт ветеринарной медицины УААН). Вирусами заражали культуры Jurkat и Jurkat/A4, после чего определяли титр вирусов по цито-патогенному действию на чувствительных линиях клеток Vero (для ВПГ через 72 ч) и MDBK (для BVDV через 24 ч). О репродукции ВИЧ судили по уровню р24 в культураль-ной жидкости, после чего определяли инфекционный титр ВИЧ на чувствительных клетках МТ-4 на 5-е сутки. Содержание гиподиплоидных клеток и клеток с активной формой каспазы-3 определяли с помощью цитофлуориметра FACSCalibur (Becton Dickinson, США) и набора Caspase-3, Active Form, mAb Apoptosis Kit: FITC (BD Bioscience Phar-mingen, США).

Результаты. Инфекционные титры исследуемых вирусов оказались следующими: ВПГ — 4,0 lgID50 в клетках Jurkat и 5,5 lgID50 в клетках Jurkat^; BVDV - 3,0 lgID50 в клетках Jurkat и 4,0 lgID50 в клетках Jurkat/А4; ВИЧ — 3,0lgID50 в клетках Jurkat и 3,0 lgID50 в клетках Jurkaty^. Инфицирование ВПГ увеличивало содержание гиподипло-идных клеток и клеток с активной формой каспазы-3 в равной степени в линиях Jurkat и Jurkat/А4.

Заключение. Клетки Jurkat и Jurkat/A4 оказались чувствительными к инфицированию ВПГ, ВИЧ и BVDV. При этом клетки Jurkat/A4 с фенотипом МЛУ более чувствительны к инфицированию ВПГ и BVDV в сравнении с клетками исходной линии Jurkat. Индукция каспазозависимой гибели клеток Jurkat/A4 при продуктивной инфекции ВПГ свидетельствует об активации в них эффекторных механизмов апоптоза.

Ю.П. Финашутина, В.А. Мисюрин, Е.Н. Пушкова, Н.А. Лыжко, В. В. Тихонова, О.Н. Солопова, А. В. Мисюрин ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНОГО АНТИГЕНА GAGE1

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

Введение. Белки семейства GAGE насчитывают около 16 членов и относятся к раково-тестикулярным антигенам, экспрессирующимся в различных опухолях. Экспрессия белков GAGE у здоровых людей происходит только в семенниках, однако было обнаружено, что активация экспрессии группы генов GAGE может происходить при различных раковых заболеваниях, и их экспрессия коррелирует с плохим прогнозом у больных раком желудка, раком пи-

№1 I том 15 I 2016

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

112

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

щевода и нейробластомой. Пептиды этих белков распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами в комплексе с молекулой HLA. Кроме того, антитела к белкам семейства GAGE обнаруживаются в сыворотке больных мелано-мой, раком толстой кишки и Т-клеточными лимфомами. Таким образом, белки GAGE могут быть подходящими мишенями для специфической иммунотерапии. Разработка препаратов рекомбинантных белков является перспективным направлением в иммунотерапии, так как в отличии от пептидов полноразмерные белки могут стимулировать как CD4-, так и CDS-лимфоциты, и не зависят от подтипа HLA пациента.

Цель исследования — получить высокоочищенный ре-комбинантный раково-тестикулярный белок GAGE1.

Материалы и методы. Кодирующая последовательность гена была получена с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией; в качестве матрицы использовали выделенную рибонуклеиновую кислоту из линии клеток эритромиелоидного лейкоза К562. Кодирующая последовательность гена была клонирована в плаз-миду pET-30a, и белок был экспрессирован в штамме Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Нуклеотидная последовательность всех элементов плазмиды и гена GAGE1 подтвер-жена секвенированием. Рекомбинантный белок GAGE1 был очищен с помощью металл-аффинной хроматографии.

Результаты. Нами была получена плазмида для экспрессии гена GAGE1 в бактериальных клетках на основе вектора pET-ЗОа. Рекомбинантный белок GAGE1 был экс-прессирован под контролем индуцируемого промотора в суспензионной культуре клеток E. coli. Были подобраны условия для оптимальной экспрессии и очистки белка из бактериальных клеток. Выход целевого продукта составил 6 мг/л бактериальной культуры. Согласно данным электрофореза, масса полученного продукта составила примерно 24 кДа, что соотвествует массе природного белка GAGE1. Чистота рекомбинантного белка также оценивалась по электрофореграмме и составила 95 %.

Заключение. Получен бактериальный продуцент рекомбинантного человеческого антигена GAGE1. Очищенный белок GAGE1 может быть использован для широкого спектра исследований в онкологии и иммунологии, например для получения специфических антител. На основе рекомбинантного белка GAGE1 можно создавать противоопухолевые вакцины с применением адъювантов или дендритных клеток. Кроме того, с помощью этого белка можно оценивать специфический гуморальный ответ в сыворотке крови онкологических больных.

Ю.М. Фоменко1, Н.А. Кабилдина1, И.М. Омарова2,

Г.Х. Тулеуова3, С.С. Жумакаева1, В. Б. Сирота1

НЕПОСРЕДСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ

АРГЛАБИНА ПРИ МЕСТНО-РАСПРОСТРАНЕННОМ

РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

1КГМУ, Караганда, Казахстан;

2КГП «Областной онкологический диспансер»,

Караганда, Казахстан;

3АО МНПХ «Фитохимия», Караганда, Казахстан

Цель исследования — повышение степени доказательности клинической эффективности препарата арглабин

путем проведения рандомизированного клинического исследования.

Материалы и методы. В исследование включены 93 пациента с местно-распространенным раком молочной железы (МРРМЖ) с гистологической и иммуногистохимиче-ской верификацией в возрасте от 30 до 75 лет. Все больные разделены на 3 группы: 2 исследуемые, 1 контрольная. В контрольной группе 36 пациентам проводили 4 курса неоадъювантной химиотерапии (ХТ) по схеме АС (доксору-бицин — 50 мг/м2, циклофосфан — 500 мг/м2) каждые 21 день, радикальную мастэктомию, 4 курса адъювантной ХТ (АС), лучевую терапию и гормональную терапию по показаниям. Исследуемая группа 1 (n = 30) получала лечение по аналогичной схеме, только режим ХТ (АС) сочетался с арглаби-ном (арглабин 370 мг/м2 в течение 7 дней). Исследуемая группа 2 (n = 27) получала лечение по аналогичной схеме, но в неоадъювантном и адъювантном режиме применяли монотерапию арглабином. Клиническую эффективность оценивали по критериям Всемирной организации здравоохранения.

Результаты. Частичный ответ опухоли у больных после ПХТ по схеме АС наблюдали в 58,3 ± 8,2 %, после АС с арглабином — в 63,3 ± 8,8 %, после монотерапии арглабином — в 25,9 ± 8,4 % случаев (p > 0,05); стабилизацию опухоли соответственно в 38,9 ± 8,1 %, 33,3 ± 8,6 %, 51,9 ± 9,6 %. Степень регрессии опухоли у больных МРРМЖ составила после ХТ по схеме АС 54,6 ± 6,9 %, после АС с арглабином — 57,1 ± 7,9 %, после монотерапии арглабином — 10,0 ± 15,1 %. Степень регрессии метастатических подмышечных лимфатических узлов у пациентов после неоадъювантной терапии по схеме АС составила 39,6 ± 7,0 %, после АС с арглабином — 63,7 ± 14,1 %, после монотерапии арглабином — 2,9 ± 20,2 %. В контрольной группе лекарственный патоморфоз опухоли III и IV степени имели 25 % больных, после неоадъювантной ХТ по схеме АС + арглабин — 33,3 %, после монотерапии арглабином — 14,8 %.

Заключение. Наблюдается общая положительная динамика регрессии опухоли и лимфатических узлов после неоадъювантной ПХТ при ее комбинации с арглабином у больных МРРМЖ.

Д. С. Хачатрян1, В.А. Мисюрин2, М.А. Барышникова1,2, В.Н. Осипов1,2, А.Н. Балаев1, А. В. Колотаев1, К. Р. Матевосян3 СИНТЕЗ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА НОВЫХ 1,2-ДИГИДРО-4-ХИНАЗОЛИНОНОВ ФГУП «ИРЕА», Москва;

2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва; 3ФГБОУ ВО «РХТУ им. Д. И. Менделеева», Москва

Введение. Интерес к синтезу и изучению свойств производных хиназолинона в последние десятилетия объясняется их разноплановой биологической активностью. В частности, ранее синтезированые Khan-0101 и Khan-0140 подтвердили такую мультиактивность. Соединения SMR000040130 инги-бировали рост клеток рака легкого, но при этом проявляли кардио- и нейротоксичность. Ряд полученных 2,3-дигидро-хиназолин-4(1Н)-онов активны в отношении опухолевых линий клеток HepG2, MCF-7; некоторые производные изоиндоло[2,1-а]-хиназолина являются ингибиторами фак-

№1 / том 15 / 2016

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ