Способ прогнозирования неразвивающейся беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями эмбриона
METHOD FOR PREDICTING NON-DEVELOPING PREGNANCY ASSOCIATED WITH CHROMOSOMAL ABNORMALITIES OF THE EMBRYO

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается способа прогнозирования неразвивающейся беременности, ассоциированной с наличием хромосомных аномалий у эмбриона.
От 10 до 20% клинически диагностируемых беременностей прерывается самопроизвольно, и невынашиванием беременности, в том числе неразвивающейся (НБ) представляет самое частое осложнение беременности. Этот вопрос давно уже вышел за рамки медицинских проблем. Есть все основания сегодня считать проблему невынашивания беременности серьезной социально-демографической проблемой.
Несмотря на большое число исследований, вопрос об этиологии, патогенезе и прогнозировании невынашивания беременности находится в стадии научного поиска [1, 20]. На протяжении последних 40-50 лет основной причиной невынашивания беременности ранних сроков считают хромосомные аберрации (ХА), которые регистрируются у 50-70% аборту сов ранних стадий развития [1, 5]. При этом традиционно геномные мутации преимущественно связывают со спорадическим невынашиванием беременности [1, 13]. Однако в последние годы начали появляться сообщения о том, что при сравнительном анализе хромосомного набора у эмбриона или плода при спорадическом и привычном невынашивании беременности, достоверной разницы по частоте встречаемости хромосомной патологии не получено. Ряд авторов утверждает, что это самая частая причина невынашивания беременности в первом триместре, независимо от акушерского анамнеза пациентки [4, 15, 22]. Некоторые исследователи выдвигают гипотезу, что по каким-то причинам у части пациенток с собственным нормальным кариотипом имеется больший риск нерасхождения хромосом в процессе мейоза или митоза, чем у других женщин того же возраста и сходными клиническими характеристиками. Причем в данной ситуации при каждом случае неразвивающейся беременности в продуктах зачатия могут быть обнаружены совершенно разные хромосомные перестройки [3, 14].
Недостаточная изученность причин формирования геномных мутаций (хромосомных аберраций) у эмбриона затрудняет возможность целенаправленного прогнозирования невынашивания беременности у здоровых женщин. Известно, что риск ХА у эмбриона возрастает с возрастом матери [20]. Grande и др. (2012) показали, что женский возраст (старше 35 лет) был единственным статистически значимым предиктором риска хромосомных аномалий при спорадической потере беременности и привычном невынашивании беременности [16]. Однако и среди молодых женщин с нормальным кариотипом частота неразвивающейся беременности достаточно высока, и ХА эмбриона при этом выявляются более чем в половине случаев [4, 5].
В последние годы в генезе невынашивания беременности отмечено возрастание роли «мужского» фактора. Например, Ruixue et al. (2013) провели исследование спермограмм мужчин из пар с неразвивающейся беременностью в анамнезе и здоровых мужчин и выявили, что в первой группе показатели были значительно хуже: сниженная жизнеспособность, патологическая морфология и подвижность сперматозоидов [21]. Несколько групп исследователей независимо друг от друга сделали вывод, что в парах с НБ качество спермы, профессиональные вредности и образ жизни супруга (курение, употребление алкоголя и легких наркотических препаратов) обязательно следует учитывать [12, 18, 19].
Ряд авторов говорят о возможной генетической предрасположенности к невынашиванию беременности у женщины. Например, в научной литературе отмечено, что полиморфизмы в гене MTHFR (метилентетрагидрофолат редуктазы) ассоциированы с геномными мутациями у плода и эмбриона, и, следовательно, с неразвивающейся беременностью [17].
Безусловно, важную роль в развитии невынашивания беременности играют и хронические инфекции, особенно инфекции мочеполовой системы. Токсические продукты, вырабатываемые микроорганизмами могут приводить не только к нарушению состояния эндометрия и развитию хронического эндометрита, но и к повреждению эмбриона [9].
Разработка новых методов прогнозирования невынашивания беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона, является своевременной и актуальной. При этом необходимо учитывать клинико-анамнестические параметры как самой женщины, так и ее партнера. На наш взгляд именно подобные математические модели, учитывающие множественные как материнские, так и отцовские факторы риска, могут быть эффективными для прогнозирования неразвивающейся беременности. Мы считаем важным прогнозировать не просто потерю беременности, а именно неразвивающуюся беременность, связанную с ХА у эмбриона, поскольку если у пациентки высок риск геномных мутаций у эмбриона, то при наличии угрозы выкидыша в первом триместре сохраняющая терапия не показана. Если же риск потери беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона, низкий, и тем не менее возникает угрожающий выкидыш при беременности, проведение сохраняющей терапии оправдано, так как высоковероятен нормальный хромосомный набор у эмбриона. Уровень техники
Аналогами прогнозирования аномалий родовой деятельности явились:
1. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности (пат. РФ №2689165, 2019). В 6-10 недель беременности в эпителиальных клетках цервикального канала определяется экспрессия TLR2, TLR10 и IDO методом ПЦР, а также оценивается возраст менархе.
Недостатки метода: риск неразвивающейся беременности оценивается уже при наступившей беременности, а не при преконцепционной подготовке.
В формулу изобретения включены параметры, для которых F-критерий <3,84, а р>0,05, то есть не доказано наличие дискриминирующих особенностей этих переменных.
2. Способ ранней диагностики риска потери плода в семейной паре при наличии урогенитальной инфекции у мужчин (пат. РФ №2660557, 2018). На этапе прегравидарной подготовки определяется ряд показателей в сыворотке крови и в эякуляте у мужчины из семейной пары, планирующей беременность.
Недостатки метода: учитываются только показатели здоровья мужчины, изолированно от клинико-анамнестических и лабораторных параметров самой женщины, планирующей беременность, акцент сделан преимущественно на показателях активности урогенитальной инфекции, которая является лишь одним из возможных факторов риска неразвивающейся беременности.
3. Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации (пат. РФ №2627472, 2017). В сыворотке крови беременных в сроке 6-11 недель гестации определяют уровень цитокина IL-288.
Недостатки метода: прогноз невынашивания беременности основывается только на 1 показателе, оценка риска проводится уже в период беременности. Такой подход позволяет установить риск именно инфекционного генеза потери беременности, но в целом для оценки риска невынашивания беременности, в генезе которого играет роль множество факторов, такой способ будет иметь низкую эффективность.
4. Способ прогнозирования невынашивания первой половины беременности (пат. РФ №2566728, 2015). Пациенткам проводят генотипирование: анализ полиморфизма rs-4680 гена СОМТ.
Недостатки метода: способ прогнозирования основан лишь на частоте встречаемости генотипов гена СОМТ в основной и контрольной группе, не учитывается влияние других возможных факторов риска, что снижает чувствительность и специфичность способа.
5. Способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре беременности (пат. РФ №2341800, 2008). В первом триместре беременности в сыворотке крови определяют уровень субстанции Р и фактор некроза опухоли а, значение которых подставляют в формулу и рассчитывают прогностический коэффициент.
Недостатки метода: способ используется уже при наступившей беременности, а не при планировании беременности, для расчета прогностического индекса используются показатели, не использующиеся в рутинной клинической практике. Не указана эффективность способа.
Прототипом предлагаемого метода является описанный в литературе способ прогнозирования неразвивающейся беременности, при котором оцениваются такие показатели как иммуноглобулины М и G к цитомегаловирусу, морфологический элемент «токсические бляшки» в сыворотке крови, уровень малонового диальдегида в менструальных выделениях, показатель уровня карбонильных групп белков в менструальных выделениях (пат. РФ №2560694, 2015).
Недостатки метода: способ оценивает риск неразвивающейся беременности в целом, не дифференцируя неразвивающуюся беременность, связанную с ХА у эмбриона и неразвивающуюся беременность, при которой кариотип эмбриона в норме. При этом методы лечения и профилактики данной патологии должны быть совершенно различны в зависимости от того, нормальный хромосомный набор у эмбриона, либо присутствуют ХА, несовместимые с живорождением. Кроме того, в предложенной формуле используются показатели только состояния здоровья женщины, не учитывается мужской фактор невынашивания беременности. Поставленная задача - разработка способа прогнозирования неразвивающейся беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона.
Технический результат - повышение эффективности оценки риска неразвивающейся беременности за счет учета данных анамнестических, молекулярно-генетических и лабораторных исследований как женщины, планирующей беременность, так и мужчины - ее партнера при расчете прогностического индекса.
Сущность изобретения.
Способ основан на сборе анамнеза и выявлении факторов риска при преконцепционной подготовке, молекулярно-генетическом исследовании (анализ полиморфизма гена MTHFR С677Т у пациентки, планирующей беременность) и анализе спермограммы партнера с последующим подсчетом прогностического индекса. В предлагаемом способе прогнозирования неразвивающейся беременности впервые в акушерстве использованы данные как женщины, так и мужчины, планирующих деторождение, впервые рассчитывается риск неразвивающейся беременности именно ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона (которые являются самой частой причиной неразвивающейся беременности в 1 триместре), и которые ранее в большинстве исследований трактовались как «случайные». Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ осуществляется следующим образом:
При преконцепционной подготовке проводится сбор анамнеза, для расчета прогностического индекса необходимы следующие анамнестические данные: возраст пациентки и ее партнера, наличие у пациентки хронических заболеваний мочеполовой системы (МПС), злоупотребление алкоголем партнером.
Далее пациентке проводится анализ полиморфизма С677Т гена MTHFR. Материалом для исследования служит венозная и периферическая кровь, полученная из локтевой вены и пальца пациентки стандартизированным способом, в количестве 5 мл. Полученный материал подвергается ПЦР-амплификации в режиме реального времени с использованием реагентов и протоколов фирмы НПО «ДНК-Технология» (РФ) на приборе ДТ-96 той же фирмы.
Ген MTHFR кодирует фермент - Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR), который является основным ферментом фолатного цикла. Снижение активности этого фермента из-за носительства полиморфного варианта гена MTHFR может приводить к нарушению пути реметилирования гомоцистеина (перехода гомоцистеина в метионин) и к гипергомоцистеинемии. Также нарушение фолатного метаболизма приводит к нарушению процессов метилирования ДНК, что повышает риск нерасхождения хромосом в мейозе. На Фиг. 1 представлено распределение генотипов гена MTHFR С677Т в исследуемых группах.
Генотипы СТ и ТТ в группе пациенток с неразвивающейся беременностью, при которой были выявлены ХА у эмбриона, встречались чаще, чем среди пациенток с благоприятным исходом беременности. Генотип СС, напротив, чаще встречался у пациенток, не имеющих проблем с вынашиванием беременности (различия статистически значимы).
Для подготовки к сбору эякулята для анализа спермограммы рекомендовалось половое воздержание в течение 2-5 дней. Сбор эякулята пациент осуществлял после мочеиспускания путем мастурбации в стерильный контейнер, избегая касания стенок и крышки контейнера руками.
Исследование проводили в соответствии с Руководством ВОЗ по исследованию эякулята. После разжижения проводили подсчет количества сперматозоидов, их концентрацию и подвижность с помощью спермоанализатора Biola SCA, морфологию сперматозоидов и количество лейкоцитов (сегментоядерных нейтрофилов) определяли при 100х увеличении микроскопа в окрашенных препаратах. Образцы с концентрацией сперматозоидов более 14 млн/мл, прогрессивной подвижностью (а+b) более 32% и/или общей подвижностью (a+b+с) более 40%, количеством лейкоцитов менее 1 млн/мл, соответствовали критериям нормозооспермии. Согласно рекомендациям ВОЗ (2010) за астенозооспермию принималось количество сперматозоидов с прогрессивным движением (PR) менее 32%, за тератозооспермию - количество сперматозоидов с нормальной морфологией менее 4%, за олигоспермию - концентрацию сперматозоидов менее 14 млн/мл.
Дискриминантные переменные для оценки риска неразвивающейся беременности вследствие ХА у эмбриона представлены в таблице 1.
Использовался пошаговый дискриминантный анализ, основанный на минимизации коэффициента Уилкса (к) после включения в уравнение регрессии каждого нового предиктора. В уравнение регрессии включались предикторы для которых значение F (F-статистика) было>3,84. Переменные, для которых р было>0,05 были исключены из анализа.
Результаты пошагового включения переменных в разделяющие функции представлены в таблице 2.
Сущность способа заключается в определении прогностического индекса Y по формуле:
1
2
3
4
5
6
Y=0,08Х+0,02Х+0,4Х+Х+1,3Х-0,7Х-4,6,
1
где X - возраст пациентки, лет;
2
Х - возраст партнера, лет;
3
Х - наличие у пациентки хронических заболеваний мочеполовой системы (имеются - 1, отсутствуют - 0);
4
Х - генотип MTHFR С677Т(СС-0, СТ- 1, ТТ- 1);
5
Х - злоупотребление алкоголем партнером (да - 1, нет - 0);
6
Х - тератозооспермия у партнера (по результатам анализа спермограммы спермотозоидов с нормальной морфологией >4% - 0, <4%- 1);
4,6 - константа (const). И если Y>0, то прогнозируют высокий риск неразвивающейся беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона, при Y<0 - низкий риск неразвивающейся беременности, связанной с геномными мутациями у эмбриона.
Для оценки эффективности разработанного правила прогноза проведена его проверка на экзаменационной выборке, подобранной методом «скользящего» подбора. В результате проведенного анализа установлено, что чувствительность решающего правила составила 67,74%, специфичность 74,6%, эффективность 71,17%. Матрица классификации дискриминантного анализа представлена в таблице 3.
Ниже приведены примеры практического использования заявляемого способа.
Пример 1. Пациентка М., 26 лет.обратилась с целью преконцепционной подготовки. У сестры пациентки - привычное невынашивание беременности. Соматический анамнез спокоен. Супругу пациентки 45 лет, алкоголем не злоупотребляет. Пациентке проведен анализ полиморфизма С677Т гена MTHFR, выявлен генотип СС. Супругу пациентки проведен анализ спермограммы: концентрация сперматозоидов сперматозоидов 45 млн/мл, общее количество - 112,5 млн, прогрессивно подвижных - 25%, количество сперматозоидов с нормальной морфологией - 11%, заключение: астенозооспермия.
Проведен расчет прогностического индекса Y для оценки риска неразвивающейся беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона. Индекс Y=-1,62, низкий риск неразвивающейся беременности, ассоциированной с ХА у эмбриона.
Рекомендована стандартная преконцепционная подготовка, прием фолиевой кислоты обоим супругам 400 мкг/сут. Через 3 месяца наступила беременность, которая завершилась срочными родами в 39-40 недель рождением живой доношенной девочки.
Пример 2. Пациентка О., 35 лет. обратилась с целью преконцепционной подготовки. Наследственность не отягощена, соматический анамнез не отягощен. Супругу пациентки 40 лет, алкоголем не злоупотребляет. Пациентке проведен анализ полиморфизма С677Т гена MTHFR, выявлен генотип ТТ. Супругу пациентки проведен анализ спермограммы: концентрация сперматозоидов 75 млн/мл, общее количество - 225 млн, прогрессивно подвижных - 34%, количество сперматозоидов с нормальной морфологией - 3%, заключение: тератозооспермия. При расчете прогностический индекс Y=0,7 - высокий риск неразвивающейся беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона.
Супругу пациентки была рекомендована консультация андролога с целью проведения лечения и коррекции показателей спермограммы. Однако, через месяц у пациентки наступила спонтанная беременность. Учитывая высокий риск неразвивающейся беременности, пациентке было рекомендовано проведение УЗИ в 7 недель беременности. При УЗИ был выявлен увеличенный желточный мешок, копчико-теменной размер эмбриона - 10 мм, сердцебиение отсутствовало. Диагностирована неразвивающаяся беременность. После вакуум-аспирации было проведено кариотипирование абортивного материала, у эмбриона выявлен аномальный хромосомный набор: кариотип 47,ХХ,+16 (трисомия 16 хромосомы).
Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования дает возможность своевременного выявления пациенток группы риска неразвивающейся беременности, ассоциированной с хромосомными аномалиями у эмбриона еще до беременности. В случае если у пациентки уже случилась неразвивающаяся беременность, и не было проведено кариотипирование эмбриона, также возможен расчет прогностического Y.
Если Y>0, вероятно, неразвивающаяся беременность произошла по причине наличия ХА у эмбриона. Если Y<0, вероятно, неразвивающаяся беременность ассоциирована с другими причинами - требуется подробное обследование пациентки. Данный способ может использоваться и при вспомогательных репродуктивных технологиях - в случае, если у пациентки выявлен высокий риск неразвивающейся беременности, ассоциированной с ХА у эмбриона, следует предложить пациентке предимплантационное генетическое тестирование эмбриона с целью выбора эуплоидного эмбриона.
Использованная литература:
1. Выкидыш в ранние сроки беременности: диагностика и тактика ведения. Клинические рекомендации. Москва. 2016.
2. Ганковская Л.В., Свитич О.А., Доброхотова Ю.Э., Бахарева И.В., Ритчер О.В., Малушенко С.В. Способ прогнозирования невынашивания беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации. Патент RU 2627472 С1, опубл. 08.08.2017.
3. Карп Г.Д., ред. Привычное невынашивание беременности: причины, версии и контраверсии, лечение; пер. с англ. под ред. В. Е. Радзинского. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2017. - 592 с.: ил.
4. Кудрявцева Е.В. "Большие акушерские синдромы": патогенез, прогнозирование, тактика. Дисс...доктора медицинских наук. Москва, 2020.
5. Кудрявцева Е.В., Ковалев В.В., Канивец И.В., Коростелев С.А. Современные возможности выявления хромосомных аномалий в абортивном материале. Уральский медицинский журнал. 2016; 11: 5-8.
6. Лебедева О.П., Козаренко О.Н., Пахомов С.П., Жукова И.О., Дюмина Ю.В., Саушкина Т.И. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности. Патент RU 2689165 С1, опубл. 24.05.2019.
7. Левченко М.В., Орлов В.И. Способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре беременности. Патент RU 2341800 С1, опубл. 20.12.2008.
8. Макаров О.В., Морозова К.В., Луценко Н.Н., Сальникова Л.Е., Хаджиева М.Б. Способ прогнозирования невынашивания первой половины беременности. Патент RU 2627472 С1, опубл. 08.08.2017.
9. Манухин И.Б., Колесов А.А., Семенцова Н.А., Чабонян А.Г. Профилактика привычного невынашивания у пациенток с неразвивающейся беременностью на фоне хронического эндометрита // Акушерство и гинекология. - 2013. - №5. - С.76-80.
10. Маркелова Е.В., Чепурнова Н.С., Тулупова М.С. Способ ранней диагностики риска потери плода в семейной паре при наличии урогенитальной инфекции у мужчин. Патент RU 2660557 С1, опубл. 06.07.2018.
11. Тишкова О.Г., Дикарева Л.В., Воронина Л.П. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности. Патент RU 26560694 С1, опубл. 20.08.2015.
12. Anifandis G., Bounartzi Т., Messini СЛ., Dafopoulos К., Sotiriou S., Messinis I.E. The impact of cigarette smoking and alcohol consumption on sperm parameters and sperm DNA fragmentation (SDF) measured by Halosperm(). Arch Gynecol Obstet. 2014; 290(4): 777-82.
13. Berghella V. Early pregnancy loss: in book Obstetric Evidence Based Guidelines. 2nd ed. 2012. P. 142-149
14. Burada F., Sosoi S., Ilescu D., Ioana M., Cernea D., Tudorache S. A rare occurrence of three consecutive autosomal trisomic pregnancies in a couple without offspring. Clin Exp Obstet Gynecol. 2016; 43(2): 287-90.
15. Goldstein M., Svirsky R., Reches A., Yaron Y. Does the number of previous miscarriages influence the incidence of chromosomal aberrations in spontaneous pregnancy loss? J Matern Fetal Neonatal Med. 2017; 24: 2956-2960.
16. Grande M., Borrell A., Garcia-Posada R., Borobio V., Munoz M., Creus M. et al. The effect of maternal age on chromosomal anomaly rate and spectrum in recurrent miscarriage. Hum Reprod. 2012; 27(10): 3109-17.
17. Jackson, R. A. Synthetic combinations of missense polymorphic genetic changes underlying Down Syndrome susceptibility / R. A. Jackson, M. L. Nguyan, A. N. Barrett [et al.] // Cell Mol Life Sci. - 2016. - Vol. 73, №21. - P. 4001-17.
18. MacDonald A.A., Herbison G.P., Showell M., Farquhar СМ.. The impact of body mass index on semen parameters and reproductive hormones in human males: a systematic review with meta-analysis. Hum Reprod Update. 2010; 16(3): 293-311.
19. Pacey A.A. Environmental and lifestyle factors associated with sperm DNA damage. Hum Fertil (Camb). 2010; 13: 189-93.
20. Recurrent pregnancy loss. Guideline of the European Society of Reproducrion and Embryology (ESHRE). 2017.
21. Ruixue W., Hongli Z., Zhihong Z., Rulin D., Dongfeng G., Ruizhi L. The impact of semen quality, occupational exposure to environmental factors and lifestyle on recurrent pregnancy loss. J Assist Reprod Genet. 2013; 30(11): 1513-8.
22. Zhang L.M., Yang Y.N., Zhang R.X., Luo L., Tan J.F., Zhou L. et al. Comparison of the etiological constitution of two and three or more recurrent miscarriage. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2018; 53(12): 855-859.