УРОВНИ ГОРМОНА РОСТА НАТОЩАК В КАЧЕСТВЕ ПРОГНОСТИЧЕСКОГО МАРКЕРА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОГО РИСКА
FASTING LEVELS OF GROWTH HORMONE AS PREDICTIVE MARKER OF CARDIOVASCULAR RISK

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования сердечно-сосудистого риска или общего риска смертности у индивидуума, заключающийся в том, что:
определяют натощак уровень гормона роста (hGH) и/или его изоформ в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума; и
устанавливают корреляцию указанного уровня гормона роста (hGH) и/или его изоформ натощак с сердечно-сосудистым риском или общим риском смертности, при этом повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска.
Гормон роста (hGH) секретируется в передней доле гипофиза, и многие, но не все, его метаболические воздействия осуществляются посредством IGF-1 [1]. Помимо регулирования продольного роста кости в детском и подростковом возрасте hGH оказывает метаболические воздействия на протяжении всей жизни, например, в анаболическом состоянии, осуществляя совместно с инсулином стимуляцию IGF-1, приводящую к синтезу белка и анаболизму. В катаболическом состоянии hGH стимулирует липолиз и тем самым предупреждает расщепление белка и истощение запасов гликогена [1]. В последние десятилетия вызывает все растущий интерес роль hGH в сердечнососудистой системе взрослых, прежде всего в ситуациях, когда имеет место дефицит hGH и избыток hGH.
Известно, что страдающие гипопитуитаризмом взрослые характеризуются повышенной смертностью от сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний, и многие исследователи [2], [3], [4], но не все [5], объясняют этот факт дефицитом гормона роста (GHD). При сравнении пациентов с GHD со здоровыми индивидуумами было установлено, что для GHD-пациентов характерен обратный профиль зависимости риска сердечно-сосудистых заболеваний от повышенного уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-Х) [6], [7], индекса массы тела (ИМТ)[6] и отношения окружности талии к окружности бедер [6], [8] и пониженного уровня холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП-Х)[4]. Продемонстрировано, что для таких пациентов hGH-заместительная терапия оказывала благоприятное воздействие в отношении некоторых аспектов профиля сердечно-сосудистого риска, например, приводила к снижению уровня С-реактивного белка (CRP), телесного жира, отношения окружности талии к окружности бедер, туловищного жира и повышенного уровня ЛПВП-Х [9], [6], [10], а также пониженного уровня ЛПНП-Х и диастолического кровяного давления [11]. Даже несмотря на то, что воздействия на гомеостаз глюкозы могут быть негативными [11], [1], это позволяет выдвинуть предварительную гипотезу о том, что hGH-замещение является благоприятным, однако до настоящего времени не было проведено широких плацебо-контролируемых рандомизированных проспективных исследований для демонстрации воздействия hGH-замещения на сердечно-сосудистую заболеваемость или смертность.
С другой стороны, для пациентов с акромегалией, которые страдают от избыточной секреции гормона роста, также характерны повышенные коэффициенты смертности от сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний [12]. Установлено, что к факторам, которые вносят наиболее значительный вклад в эту смертность, относятся гипертензия, диабет, аритмии и кардиомиопатия, сопровождающаяся гипертрофией сердца [13], [14]. Продемонстрировано, что ингибирование секреции hGH у таких пациентов с помощью аналогов соматостатина оказывает благоприятные воздействия на структуру и функцию сердца [15]. Вредные воздействия избытка hGH дополнительно продемонстрированы в исследовании, проведенном Takala с соавторами в 1999 г., в котором было установлено, что введение в высоких дозах hGH критически больным пациентам в отделении интенсивной терапии приводило к удвоению коэффициентов смертности по сравнению с введением плацебо [16].
Большая часть литературы касается пациентов с избытком или дефицитом hGH. Однако в проспективном исследовании, проведенном среди французских полицейских, которое началось в конце 60-х и начале 70-х годов и включало последующий 18-летний период наблюдения, изучали измеренные натощак уровни hGH и риск преждевременной смертности. Полученные в этом исследовании результаты продемонстрировали, что повышенные уровни hGH после 2 часового перорального теста на переносимость глюкозы ассоциированы с повышенным риском преждевременной смертности от всех причин и от сердечно-сосудистых нарушений, при этом измеренные натощак уровни hGH (которые измеряют при проведении стандартного теста на hGH) не оказались значимыми для прогнозирования смертности [17]. Используя в качестве отсекающего значения уровень, равный 0,5 нг/мл, Maison с соавторами определили, что коэффициент риска увеличения сердечно-сосудистой смертности в течение 18 летнего периода составлял 1,79.
Точная интерпретация концентрации hGH в плазме сдерживается тем фактом, что высвобождение hGH в течение большей части дня происходит импульсами и в утренние часы, когда концентрация в плазме, является относительно стабильной [32], [33], [34], концентрации hGH являются низкими и иногда не поддаются обнаружению при использовании стандартных анализов hGH.
Объектом настоящего изобретения является новый ультрачувствительный анализ для измерения уровней hGH в плазме (hGH), позволяющий осуществлять точные измерения также и при низких концентрациях hGH в плазме (например, чувствительность анализа составляет 2 пг/мл). Объектом настоящего изобретения является установление корреляции развития сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности с измеренным натощак уровнем hGH в плазме индивидуума. Объектом настоящего изобретения является установление связи измеренного натощак уровня hGH в плазме индивидуума с риском развития заболевания коронарных артерий (ЗКА), «удара», смертности от всех причин (общей) и сердечно-сосудистой смертности (смертности от ССЗ).
Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования сердечно-сосудистого риска или общего риска смертности у индивидуума, заключающийся в том, что:
определяют натощак уровень гормона роста (hGH) и/или его изоформ в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума; и
устанавливают корреляцию между указанным уровнем гормона роста (hGH) и/или его изоформ натощак и сердечно-сосудистым риском или общим риском смертности, при этом повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска.
Сердечно-сосудистый риск или общий риск смертности означает риск возникновения обусловленного сердечно-сосудистыми причинами события или риск смерти от всех причин в течение определенного периода времени. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный период времени находится в пределах 20 лет или в пределах 15 лет, или в пределах 10 лет, или в пределах 5 лет, или в пределах 2,5 лет.
Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования сердечно-сосудистого риска или общего риска смертности у индивидуума в пределах 10 лет или в пределах 5 лет, или в пределах 2,5 лет, заключающийся в том, что:
определяют натощак уровень гормона роста (hGH) и/или его изоформ в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума; и
устанавливают корреляцию между указанным уровнем гормона роста (hGH) и/или его изоформ натощак и сердечно-сосудистым риском или общим риском смертности, при этом повышенный уровень является прогностическим критерием повышенного риска,
в котором сердечно-сосудистый риск определяют как нежелательное явление или общий риск смертности, и в котором риск указанного нежелательного явления или общий риск смертности прогнозируют на период времени, находящийся в пределах 10 лет или в пределах 5 лет, или в пределах 2,5 лет после взятия образца указанной общей воды организма у указанного индивидуума.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный индивидуум представляет собой здорового индивидуума к моменту проведения измерения или индивидуума, который не имеет сердечно-сосудистого заболевания к моменту проведения измерения. В одном из вариантов осуществления изобретения у указанного индивидуума никогда не было «удара» и/или инфаркта миокарда, и/или не имела место острая сердечная недостаточность к моменту проведения измерения. В одном из вариантов осуществления изобретения у указанного индивидуума никогда не было заболевания коронарных артерий (ЗКА) и/или ишемической болезни сердца, и/или не имело место чрескожное коронарное вмешательство (СКВ) или аортокоронарное шунтирование (АКШ) к моменту проведения измерения.
Общий риск смертности, представляющий собой риск смерти от всех причин, представляет собой риск смерти в течение определенного периода времени.
В конкретном варианте осуществления изобретения сердечно-сосудистый риск определяют как событие, выбранное из группы, включающей «удар», смертность от ССЗ (сердечно сосудистое заболевание) и заболевание коронарных артерий (ЗКА), где последнее включает фатальный или нефатальный инфаркт миокарда, смерть от ишемической болезни сердца, чрескожное коронарное вмешательство (СКВ) или аортокоронарное шунтирование (АКШ). В одном из вариантов осуществления изобретения смертность от ССЗ (сердечно сосудистое заболевание) представляет собой смертность от инфаркта миокарда, острой сердечной недостаточности или «удара». Это означает, что смертность от ССЗ (сердечно сосудистое заболевание) представляет собой смерть от сердечно-сосудистого заболевания. В конкретном варианте осуществления изобретения ССЗ (сердечно сосудистое заболевание) выбирают из группы, включающей инфаркт миокарда, острую сердечную недостаточность и «удар».
В конкретном варианте осуществления изобретения прогнозирование сердечно-сосудистого риска или общего риска смертности представляет собой краткосрочное прогнозирование указанного риска.
В конкретном варианте осуществления изобретения это означает прогнозирование того, что у индивидуума будет иметь место событие, ассоциированное с сердечно-сосудистым риском, или наступит смерть от всех причин (общая смертность) в течение короткого периода времени, где указанный короткий период времени находится в пределах 10 лет, более конкретно в пределах 5 лет, более конкретно в пределах 2,5 лет.
При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что краткосрочный прогноз сердечно-сосудистого риска или общего риска смертности можно устанавливать на основе определения натощак уровня гормона роста (hGH) и/или его изоформ в общей воде организма. Понятие «краткосрочный» означает период времени в пределах 10 лет или в пределах 5 лет, или в пределах 2,5 лет после взятия образца указанной общей воды организма у указанного индивидуума.
В более конкретном варианте осуществления изобретения прогнозирование смертности от ССЗ представляет собой краткосрочное прогнозирование. В более конкретном варианте осуществления изобретения это означает прогнозирование риска смерти индивидуума от инфаркта миокарда, острой сердечной недостаточности или «удара» в течение короткого периода времени, где указанный короткий период времени находится в пределах 10 лет, более конкретно в пределах 5 лет, более конкретно в пределах 2,5 лет.
В более конкретном варианте осуществления изобретения прогнозирование смертности от ССЗ представляет собой краткосрочное прогнозирование для индивидуума мужского пола. В более конкретном варианте осуществления изобретения это означает прогнозирование риска смерти для индивидуума мужского пола от инфаркта миокарда, острой сердечной недостаточности или «удара» в течение короткого периода времени, где указанный короткий период времени находится в пределах 10 лет, более конкретно в пределах 5 лет, более конкретно в пределах 2,5 лет.
Изоформы гормона роста (hGH) можно выбирать из группы, включающей изоформу 1 hGH (22 кДа), изоформу 2 hGH, изоформу 3 hGH и изоформу hGH 4.
Последовательности изоформ:
SEQ ID NO: 1: Изоформа 1 hGH (22 кДа)
SEQ ID NO: 2: Изоформа 2 hGH
SEQ ID NO: 3: Изоформа 3 hGH
SEQ ID NO: 4: Изоформа 4 hGH
Уровни гормона роста (hGH) натощак означают уровни гормона роста (hGH), измеренные в крови, сыворотке или плазме голодных индивидуумов (т.е. образцы берут через 12 ч после последнего приема пищи). Голодный индивидуум означает индивидуума, который не принимал пищу в течение 12 ч до взятия образца.
В контексте настоящего описания понятие «индивидуум» относится к живому человеку или организму кроме человека. В контексте настоящего описания индивидуум предпочтительно представляет собой человека. Индивидуум может быть здоровым или больным, если не указано иное. Понятие «повышенный уровень» означает уровень, превышающий определенный пороговый уровень.
Общую воду организма можно выбирать из группы, включающей кровь, плазму, сыворотку, слюну, мочу и спинномозговую жидкость. В конкретном варианте осуществления изобретения указанную общую воду организма выбирают из группы, включающей кровь, плазму и сыворотку.
Чувствительность анализа можно оценивать по «аналитической» чувствительности анализа, которая представляет собой концентрацию hGH (результат, полученный с использованием стандартной кривой), соответствующую медианному уровню сигнала, полученного, например, по 20 измерениям для образца с истощенным hGH, +2 стандартных отклонения (SD).
Альтернативно этому чувствительность анализа можно оценивать по «функциональной» чувствительности анализа, которая в большей степени отражает предел обнаружения в клинической практике. Функциональную чувствительность анализа оценивают путем определения коэффициента вариации для серии анализов (CV) плазмы (образцов, взятых у пациента) при использовании серии индивидуальных образцов с различными концентрациями hGH. Функциональная чувствительность анализа представляет собой наименьшую концентрацию hGH, для которой коэффициент вариации CV для серии анализов составляет менее 20%.
Чувствительности анализа могут зависеть от применяемого метода калибровки и применяемого анализа hGH. Различные анализы hGH могут позволять определять различные наборы изоформ hGH, что приводит к получению различных количественных результатов, это означает, что необходимо использовать различные пороговые значения и чувствительность в зависимости от применяемого анализа и метода калибровки.
Для преодоления указанной возможной неоднородности различных анализов hGH используемые в анализе калибровки можно корректировать на основе корреляции уровней hGH в плазме отдельных индивидуумов. Если наклон корреляционной кривой отличен от 1, то уровни hGH (калибровка) можно корректировать с использованием коэффициента различия, что приводит к сопоставимой калибровке, сопоставимому анализу чувствительности и сопоставимым пороговым значениям.
Указанную выше коррекцию можно осуществлять для того, чтобы сравнивать результаты, полученные с помощью различных анализов.
Анализ, описанный в примере 1, предназначен преимущественно для распознавания изоформы 1 hGH и его калибровку осуществляют с использованием рекомбинантного человеческого гормона роста (код NIBSС 98/574, Национальный институт биологических стандартов и контроля, Херфордшир, Великобритания).
В конкретном способе, предлагаемом в изобретении, указанный уровень гормона роста (hGH) и/или его изоформы в общей воде организма натощак определяют с помощью ультрачувствительного анализа, который характеризуется аналитической чувствительностью анализа (которую определяют как концентрацию hGH соответствующую медианному уровню сигнала, полученному, например, по 20 измерениям для образца с истощенным hGH, +2 стандартных отклонения (SD)), составляющей менее 100 пг/мл, предпочтительно менее 50 пг/мл, предпочтительно менее 30 пг/мл, предпочтительно менее 20 пг/мл, предпочтительно менее 10 пг/мл, предпочтительно менее 5 пг/мл, предпочтительно составляющей 2 пг/мл. Результаты измерений hGH выражают в нг/мл (1 нг/мл = 2,6 МЕД/л).
Альтернативно этому ультрачувствительный анализ может сарактеризоваться функциональной чувствительностью анализа (см. выше), доставляющей менее 400 пг/мл, предпочтительно менее 200 пг/мл, предпочтительно менее 120 пг/мл, предпочтительно менее 80 пг/мл, предпочтительно менее 40 пг/мл, предпочтительно менее 20 пг/мл, предпочтительно 10 пг/мл, наиболее предпочтительно менее 8,5 пг/мл. Результаты измерений hGH выражают в нг/мл.
Для иммунизации и для калибровки при создании изобретения применяли рекомбинантный человеческий гормон роста (код NIBSC 98/574, Национальный институт биологических стандартов и контроля, Херфордшир, Великобритания)
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный анализ проводят согласно процедуре, описанной в примере 1.
Указанный анализ может быть избирательным в отношении одной конкретной изоформы hGH или он может обладать специфичностью и позволять определять более одного или все секретируемые изомеры hGH, выбранные из группы, включающей изоформу 1, изоформу 2, изоформу 3 и изоформу 4 hGH (см. SEQ ID NO: 1-4) в указанной общей воде организма.
В одном из вариантов способа, предлагаемого в изобретении, указанный способ осуществляют более одного раза для мониторинга сердечно-сосудистого риска для индивидуума или для мониторинга процесса лечения.
В одном из вариантов способа, предлагаемого в изобретении, указанный мониторинг осуществляют для оценки ответа указанного индивидуума на предпринимаемые профилактические и/или терапевтические меры.
В одном из вариантов способа, предлагаемого в изобретении, указанный мониторинг осуществляют для стратификации указанных индивидуумов на группы риска и/или для переклассификации указанных индивидуумов дополнительно с классификацией на основе классических маркеров риска.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный индивидуум представляет собой мужчину, и пороговое значение находится в пределах от более чем 400 пг/мл, предпочтительно 340 пг/мл, до 100 пг/мл, предпочтительно 60 пг/мл, при этом уровень гормона роста (hGH) и/или его изоформ натощак, превышающий пороговое значение, составляющее более 400 пг/мл, предпочтительно 340 пг/мл, является прогностическим критерием высокого риска, а уровень натощак, находящийся ниже порогового значения, составляющего 100 пг/мл, предпочтительно 60 пг/мл, является прогностическим критерием низкого риска.
В другом варианте осуществления изобретения указанный индивидуум представляет собой женщину и пороговое значение находится в пределах от 3150 пг/мл предпочтительно до 400 пг/мл, при этом уровень гормона роста (hGH) и/или его изоформ натощак, превышающий пороговое значение, составляющее 3150 пг/мл, является прогностическим критерием высокого риска, а уровень натощак, находящийся ниже порогового значения, составляющего предпочтительно 400 пг/мл, является прогностическим критерием низкого риска.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный сердечнососудистый риск выбирают из инфаркта миокарда, острой сердечной недостаточности и «удара».
В другом варианте осуществления изобретения дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, где указанный клинический параметр выбирают из группы, включающей: возраст, наличие сахарного диабета, курение в настоящий период времени.
В конкретных вариантах способов, предлагаемых в настоящем изобретении, дополнительно определяют по меньшей мере один дополнительный биомаркер в общей воде организма указанного индивидуума и устанавливают корреляцию с указанным сердечно-сосудистым риском, где указанный дополнительный биомаркер выбирают из группы, включающей: пронейротензин 1-117 (PNT 1-117), С-реактивный белок (CRP), про-мозговой натрийуретический пептид 1-108 (про-BNP) 1-108, Pro-BNP, BNP, про-предсердный натрийуретический пептид 1-98 (про-ANP-N-концевой фрагмент), про-ANP, адреномедуллин, проадреномедуллин (про-ADM) 24-71, про-ADM 127-164, про-предсердный натрийуретический пептид (про-ANP) и его фрагменты, состоящие по меньшей мере из пяти аминокислот, ST-2, GDF15, галектин-3, копептин.
Объектом настоящего изобретения является способ, в котором уровень гормона роста (hGH) и/или его изоформ натощак определяют с использованием молекулы, связывающейся с гормоном роста (hGH) и/или его изоформами. Дополнительные указанные выше биомаркеры можно определять с использованием молекулы, связывающейся с указанными биомаркерами или их фрагментами, перечисленными выше.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанную связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, связывающийся с гормоном роста (hGH) и/или его изоформами.
Согласно изобретению диагностическую связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитела, например, IgG, канонический полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере вариабельный (Fv) домен тяжелой и/или легкой цепи, такие, например, как химически сшитые антитела (антигенсвязывающие фрагменты), включая (но не ограничиваясь только ими) Fab-фрагменты, включая миниантитела в виде Fab, антитело в виде одноцепочечного Fab, одновалентное антитело в виде Fab с эпитопными метками, например, Fab-V5S×2; двухвалентный Fab (мини-антитело), димеризованный с помощью СН3-домена; двухвалентный Fab или многовалентный Fab, например, образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации dHLX-доменов, например, Fab-dHLX-FS×2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные многовалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические димерные антитела (диабоди), BITE (биспецифический активатор Т-клеток), трифункциональные антитела, многовалентные антитела, например, класса, отличного от G-класса; однодоменные антитела, например, наноантитела, выведенные из верблюжьих или рыбьих иммуноглобулинов.
В конкретном варианте осуществления изобретения уровень указанного выше биомаркера или его фрагментов измеряют с помощью анализа с использованием связывающих молекул, выбранных из группы, включающей аптамеры, не-Ig-каркасы, которые связываются с hGH или его фрагментами, что будет более подробно описано ниже.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
Связывающая молекула, которую можно применять для определения уровня любого из указанных выше биомаркеров или их фрагментов, характеризуется константой аффиности к связывающей области любого из указанных выше биомаркеров, составляющей по меньшей мере 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительно константа аффинности превышает 10 М, наиболее предпочтительно превышает 10 M. Специалисту в данной области известно, что для компенсации пониженной аффинности можно рассматривать применение соединений в более высокой дозе, и этот подход не выходит за рамки объема изобретения. Аффинность связывания можно определять с помощью метода Biacore, доступного в виде сервисного анализа, например, на сайте фирмы Biaffin, Кассель, Германия (http://www.biaffin.com/de/).
Константы аффинности
Для оценки аффинности антител определяли кинетические характеристики связывания hGH с иммобилизованным антителом с помощью поверхностного плазмонного резонанса без применения метки с использованием системы Biacore 2000 (фирма GE Healthcare Europe GmbH, Фрейбург, Германия). Обратимую иммобилизацию антител осуществляли с использованием антитела к мышиной Fc-области, ковалентно сшитого с высокой плотностью с поверхностью сенсора СМ5, согласно инструкциям производителя (набор для захвата мышиного антитела; фирма GE Healthcare) [59].
Помимо антител в данной области хорошо известны другие биополимерные каркасы, образующие комплекс с молекулой-мишенью, и их применяют для создания высокоспецифичных в отношении мишени биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. He-Ig-каркасы могут представлять собой белковые каркасы и их можно применять в качестве имитаторов антитела, поскольку они обладают способностью связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig-каркасы можно выбирать из группы, включающей не-Ig-каркасы на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описанные в ЕР 1266025; каркасы на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например, описанные в WO 2011/073214), трансферриновые каркасы (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы на основе белка А (например, описанные в ЕР 2231860), каркасы на основе анкиринового повтора (например, описанные в WO 2010/060748), каркасы на основе микропротеинов, предпочтительно микропротеинов, образующих цистеиновый узел (например, описанные в ЕР 2314308), каркасы на основе SH3-домена киназы Fyn (например, описанные в WO 2011/023685), каркасы на основе А-домена EGFR (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Кунитца (например, описанные в ЕР 194867).
Объектом настоящего изобретения является также способ прогнозирования сердечно-сосудистого риска, риска смертности от сердечно-сосудистых событий или общего риска смертности у индивидуума согласно одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, в котором применяют уровень гормона роста (hGH) или его изоформ в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, либо индивидуально, либо в сочетании с другими пригодными для прогнозирования лабораторными или клиническими параметрами, который можно выбирать из следующих альтернатив:
- сравнение медианы уровня hGH или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и предварительно определенного уровня в совокупности образцов, взятых из популяции «здоровых» или «по-видимому, здоровых» индивидуумов,
- сравнение квантиля уровня hGH или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и предварительно определенного уровня в совокупности образцов, взятых из популяции «здоровых» или «по-видимому, здоровых» индивидуумов,
- расчет на основе анализа пропорциональных рисков Кокса или расчетов коэффициентов риска, таких как NRI (чистый коэффициент переклассификации, Net Reclassification Index) или IDI (интегральный индекс дискриминации, Integrated Discrimination Index).
В конкретных вариантах способов, предлагаемых в настоящем изобретении, указанный индивидуум представляет собой женщину, и помимо hGH и его изомеров определяют один дополнительный биомаркер в общей воде организма указанной женщины, и устанавливают корреляцию с указанным сердечнососудистым риском, где указанный дополнительный биомаркер представляет собой пронейротензин (PNT) и его фрагменты, состоящие по меньшей мере из пяти аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения анализ может представлять собой так называемый РОС-тест (анализ по месту лечения, point-of-care), представляющий собой технологию тестирования, позволяющую осуществлять тест в течение менее чем 1 ч в непосредственной близости от пациента без необходимости использования полностью автоматической системы анализа. Одним из примеров такой технологии является технология иммунохроматографического теста.
В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ, который осуществляют с применением любой технологии обнаружения, включая (но не ограничиваясь только ими) использование ферментной метки, хемилюминисцентной метки, электрохемилюминисцентной метки, предпочтительно полностью автоматический анализ. В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-анализ с использованием ферментной метки. Примерами автоматических или полностью автоматических анализов являются анализы, которые можно применять с использованием одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, Biomerieux Vidas, Alere Triage.
Известен целый ряд иммуноанализов, и их можно применять при осуществлении анализов и способов, предлагаемых в настоящем изобретении, они включают: радиоиммуноанализы («РИА»), гомогенные ферментативно усиленные иммуноанализы («EMIT»), твердофазный иммуноферментный анализ («ELISA»), иммуноанализ на основе реактивации апофермента («ARIS»), иммуноанализы с использованием тест-полосок (dipstick) и иммунохроматографические анализы.
В одном из вариантов осуществления изобретения осуществляют мечение по меньшей мере одной из указанных двух связующих молекул с целью обнаружения.
Предпочтительные методы обнаружения включают иммуноанализы в различных форматах, такие, например, как радиоиммуноанализ («РИА»), хемилюминисцентный и флуоресцентный иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы («ELISA»), анализы с использованием массивов гранул на основе люминекса, анализы с использованием белковых микромассивов и быстрые форматы тестирования, такие, например, как тесты с использованием иммунохроматографических полосок.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминисцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку, представляющую собой радиоактивный йод.
Анализы могут представлять собой гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные и неконкурентные анализы. В одном из вариантов осуществления изобретения анализ проводят в формате сэндвич-анализа, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, в котором подлежащая обнаружению и/или количественной оценке молекула связывается с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, гранулой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипа или полоски, а второе антитело представляет собой антитело, которое метят, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособным или обладающим каталитической активностью фрагментом. Затем с помощью пригодного метода измеряют количество меченого антитела, связанного с аналитом. Обычные композиции и процедуры, применяемые в таких «сэндвич-анализах», хорошо разработаны и известны специалисту в данной области (23).
В другом варианте осуществления изобретения в анализе используют две захватывающие молекулы, предпочтительно антитела, которые обе присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, где первый служащий для мечения компонент присоединен к первой захватывающей молекуле, при этом указанный первый служащий для мечения компонент представляет собой часть системы мечения на основе гашения или амплификации флуоресценции или хемилюминисценции, а второй служащий для мечения компонент указанной маркерной системы присоединен ко второй захватывающей молекуле, благодаря чему при связывании обеих захватывающих молекул с аналитом генерируется измеряемый сигнал, который позволяет обнаруживать образовавшиеся сэндвич-комлексы в растворе, содержащем образец.
В другом варианте осуществления изобретения указанная система мечения содержит криптаты редкоземельного металла или хелаты редкоземельного металла в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминисцентным красителем, прежде всего красителем цианинового типа.
В контексте настоящего изобретения анализ на основе флуоресценции включает применение красителей, которые можно выбирать, например, из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Су7, ксантен 6-карбокси-2',4',7',4',7'-гексахлорфлуоресцеин (HEX), ТЕТ, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметодифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, этидийбромид, акридиниевые красители, карбазольные красители, феноксазиновыс красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.
В контексте настоящего изобретения анализ на основе хемилюминисценции включают применение красителей на основе физических принципов, описанных для хемилюминисцентных материалов, которые изложены в (24). Предпочтительными хемилюминисцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.
8
-1
Как указано в настоящем описании, «анализ» или «диагностический анализ» может представлять собой анализ любого типа, который можно применять в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании подлежащего обнаружению аналита с одним или несколькими захватывающими зондами, обладающими определенной аффинностью. С точки зрения взаимодействия между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами константа аффинности предпочтительно должна превышать 10 М.
В контексте настоящего изобретения «связывающие молекулы» представляют собой молекулы, которые можно применять для связывания с молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами, т.е. аналитами (т.е. в контексте настоящего изобретения с РСТ и его фрагментами), присутствующими в образце. Таким образом, связывающие молекулы должны иметь адекватную форму, как с пространственной точки зрения, так и с позиций характеристик поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, для того, чтобы специфически связываться с молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. При этом связывание может опосредоваться, например, ионными, ван-дер-Ваальсовыми, pi-pi, sigma-pi, гидрофобными взаимодействиями или водородными связями, или комбинацией двух или большего количества указанных выше взаимодействий между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения связывающие молекулы можно выбирать, например, из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу ПНК, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно связывающие молекулы представляют собой антитела, включая их фрагменты, обладающие достаточной аффинностью в отношении мишени или представляющей интерес молекулы, и включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, выведенных из вариабельной цепи, которые имеют длину по меньшей мере 12 аминокислот.
В качестве хемилюминисцентной метки можно применять метку, представляющую собой сложный эфир акридиния, стероидные метки, включая изолюминольные метки и т.п.
Ферментные метки могут представлять собой лактатдегидрогеназу (LDH), креатинкиназу (CP), щелочную фосфатазу, аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), кислую фосфатазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и т.п.
В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одна из указанных двух связывающих молекул связывается с твердой фазой, такой как магнитные частицы и по ли стироловые поверхности.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению уровня гормона роста (hGH) и/или его изоформ в образце такой анализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно полностью автоматический анализ. Он может представлять собой полностью автоматический или выполняемый вручную ELISA. Он может представлять собой так называемый РОС-тест (анализ по месту лечения). Примерами автоматических или полностью автоматических анализов являются анализы, которые можно применять с использованием одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, Biomerieux Vidas, Alere Triage. Примеры форматов тестов представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению уровня гормона роста (hGH) и/или его изоформ в образце по меньшей мере одну из указанных двух связывающих молекул метят для целей обнаружения. Примеры меток представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце по меньшей мере одну из указанных двух связывающих молекул связывают с твердой фазой. Примеры твердых фаз представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению уровня гормона роста (hGH) и/или его изоформ в образце указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминисцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку, представляющую собой радиоактивный йод.
Другим объектом настоящего изобретение является набор, содержащий систему анализа, предлагаемого в настоящем изобретении, где компоненты указанной системы анализа могут содержаться в одном или нескольких контейнерах.
Согласно настоящему изобретению указанный индивидуум может иметь сопутствующее заболевание, которое может представлять собой заболевание или событие, выбранное из группы, включающей атеросклероз, высокое кровяное давление, сердечную недостаточность, инфаркт миокарда.
-8
В предпочтительном варианте осуществления изобретения уровень указанного гормона роста (hGH) и/или его изоформ натощак измеряют с помощью иммуноанализа. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения в указанном иммуноанализе применяют по меньшей мере одно антитело, предпочтительно два антитела, обладающие аффинностью связывания 10 М или менее.
-8
Объектом настоящего изобретения является также ультрачувствительный (us-hGH) анализ, в котором применяют по меньшей мере одну моноспецифическую связывающую молекулу, предпочтительно две моноспецифические связывающие молекулы, обладающие аффинностью связывания с hGH и/или его изоформами 10 М или менее, и где ультрачувствительный анализ характеризуется аналитической чувствительностью анализа, составляющей менее 100 пг/мл, предпочтительно менее 50 пг/мл, предпочтительно менее 30 пг/мл, предпочтительно менее 20 пг/мл, предпочтительно менее 10 пг/мл, предпочтительно менее 5 пг/мл, предпочтительно равной 2 пг/мл.
В одном конкретном варианте ультрачувствительного hGH-анализа указанная моноспецифическая связывающая молекула представляет собой моноклональное антитело.
Ультрачувствительный hGH-анализ, предлагаемый в настоящем изобретении, применяют в способе, предлагаемом в настоящем изобретении.
Примеры
Пример 1, us-hGH-анализ
Химические вещества
Если не указано иное, то все химические вещества получали со степенью чистоты ч.д.а. от фирмы Merck (Дармштадт, Германия).
Антиген
Для иммунизации и калибровки при создании изобретения применяли рекомбинантный человеческий гормон роста (код NIBSC 98/574, Национальный институт биологических стандартов и контроля, Херфордшир, Великобритания).
Создание антител
Мышиные моноклональные антитела к hGH создавали на фирме UNICUS (Карлсбург, Германия).
Антитела создавали согласно следующему методу:
Мышей линии BALB/c иммунизировали путем введения 100 мкг hGH (эмульгированный в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) в дни 0 и 14 и 50 мкг (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда) в дни 21 и 28. За три дня до осуществления эксперимента по слиянию животному вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкг физиологического раствора, путем одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Осуществляли слияние спленоцитов иммуннизированной мыши с клетками миеломы линии SP2/0 с использованием 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде ГАТ (питательная среда RPMI 1640, дополненная 20% сыворотки плода коровы и ГАТ-добавкой (гипоксантин, аминоптерин, тимидин)). Через две недели среду ГАТ заменяли средой ГТ и после осуществления трех пересевов возвращали в стандартную среду для клеточных культур.
Через три недели после осуществления слияния проводили первичный скрининг супернатантов клеточных культур в отношении антигенспецифических антител IgG-типа. Позитивные по данным теста микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования осуществляли клонирование и повторное клонирование отобранных культур с применением метода серийных разведений и определяли изотипы [60], [61].
Получение моноклональных антител
Для дальнейших исследований отбирали 5 антител.
Антитела получали согласно стандартным методам получения антител (Marx и др., Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 1997, с. 121) и очищали с помощью хроматографии на белке А. Чистота антител составляла >95% по данным электрофоретического анализа на геле в присутствии ДСН.
Мечение антител и их применение для сенсибилизации
Все антитела метили с использованием сложного эфира акридиния согласно следующей процедуре:
Несущее метку соединение (трейсер): 100 мкг (100 мкл) антитела (1 мг/мл в ЗФР, рН 7,4), смешивали с 10 мкл сложного NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, фирма In Vent GmbH, Германия) (ЕР 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое антитело очищали с помощью ЖХВР-гель-фильтрации на Bio-Sil SEC 400-5 (фирма Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное меченое антитело разводили в 300 ммолей/л фосфата калия, 100 ммолей/л NaCl, 10 ммолей/л Na-ЭДТК, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0. Конечная концентрация меченого соединения соответствовала примерно 800000 относительных световых единиц (RLU) (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминисценцию сложного эфира акридиния измеряли с помощью устройства AutoLumat LB 953 (фирма Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Антитело на твердой фазе (применяемое для сенсибилизации антитело):
Твердая фаза: Полистироловые пробирки (фирма Greiner Bio-One International AG, Австрия) сенсибилизировали (в течение 18 ч при комнатной температуре) антителом (1,5 мкг антитела на 0,3 мл буфера, содержащего 100 ммолей/л NaCl, 50 ммолей/л Трис/HCl, рН 7,8). После блокирования с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина, пробирки промывали ЗФР, рН 7,4 и сушили в вакууме.
Иммуноанализ hGH:
С помощью пипетки вносили по 50 мкл образца (или калибратора) в сенсибилизированные пробирки, после добавления меченого антитела (200 мкл) пробирки инкубировали в течение 2 ч при 18-25°С. Несвязанную метку удаляли путем 5-кратной промывки (используя каждый раз по 1 мл) промывочным раствором (20 ммолей/л ЗФР, рН 7,4, 0,1% Тритон Х-100). Связанное с пробиркой меченое антитело оценивали с использованием люминометра 953. Применяли hGH в фиксированной концентрации 1 нг/мл. Величины отношения сигнала (RLU при 1 нг/мл hGH) к шуму (RLU без us-hGH) для различных комбинаций антител представлены в таблице 1. Все антитела были способны образовывать сэндвич-комплекс с любым другим антителом. Для осуществления us-hGH-иммуноанализа применяли пару антител, обеспечивающую наиболее высокое отношение сигнала к шуму (наиболее высокую чувствительность): антитело к hGH G12 применяли в качестве сенсибилизирующего пробирку антитела, а антитело к hGH Н4 применяли в качестве меченого антитела.
Калибровка:
2
4
При проведении анализа калибровку осуществляли с использованием разведений рекомбинантного hGH (фирма WHO International Standard, код NIBSC 98/574), разведенного в растворе, содержащем 20 мМ KРО, 6 мМ ЭДТК, 0,5% БСА, 50 мкМ амастин, 100 мкМ леупептин, рН 8,0 (фиг. 1).
Спецификации анализа
Аналитическая чувствительность анализа (оцениваемая по среднему количеству относительных световых единиц для 20 определений для образца, не содержащего hGH, плюс 2SD) составляла 2 пг/мл hGH, а функциональная чувствительность анализа (см. выше) составляла 8,5 пг/мл. Уровень выделения составлял >85% при диапазоне разведений для измерений 5-10000 пг/мл hGH. Коэффициент корреляции для N=997 образцов между результатами us-hGH-анализа и hGH-анализа, специфического в отношении рекомбинантного hGH (22 кДа), составлял r=0,98, а для анализа, позволяющего распознавать преимущественно изоформы hGH, продуцируемые гипофизом, было установлено, что r=0,95 [20]. Полученные данные свидетельствуют о том, что согласно настоящему изобретению можно количественно оценивать все изоформы hGH.
Пример 2. Исследование популяции
Индивидуумы и методы
Изучаемая популяция
Выполненное в университете г. Мальме исследование по изучению диеты и рака (MDC) представляет собой проспективное эпидемиологическое исследование популяции индивидуумов, в котором группу 28449 индивидуумов обследовали в период между 1991 г. и 1996 г. [18]. Из этой группы отбирали случайным образом подгруппу (n=6103), обследованную в период между ноябрем 1991 г. и февралем 1994 г., которую включали в сердечно-сосудистую группу MDC (MDC-CC), при этом основная цель заключалась в изучении эпидемиологии заболевания сонной артерии [19]. После исключения индивидуумов, для которых отсутствовали данные измерений в плазме натощак и, следовательно, отсутствовали данные о наличии сахарного диабета или уровнях ЛПВП-Х, ЛПНП-Х или hGH натощак, было оставлено 4453 индивидуума, которые составляли основную исследуемую группу.
Все участники дали письменное согласие, и исследование было разрешено комитетом по этике университета Лунда, Лунд, Швеция.
Клинические исследования и анализы
У участников изучали историю болезни, их подвергали физикальному обследованию и лабораторным анализам. Кровяное давление измеряли с помощью ртутного сфингоманометра после нахождения в состоянии покоя в течение 10 мин в положении лежа на спине. Окружность талии измеряли на уровне пупка. Курение в настоящее время определяли как любое курение в течение последнего года и его контролировали на основе опросника, заполняемого самим участником. Тот же самый опросник наряду с дневником использовали для регистрации применения гипотензивного лекарственного средства на исходном уровне. Наличие сахарного диабета определяли на основе сообщения самого участника об установленном лечащим врачом диагнозе, применения противодиабетического лекарственного средства или по уровню глюкозы в цельной крови натощак, превышающему 6,0 ммоля/л (109 мг/дл).
Все образцы плазмы и цельной крови брали после голодания в течение ночи, образцы брали в промежуток времени между 7.30 am и 9.00 am после нахождения в покое в течение 15 мин в положении лежа на спине. Уровни ЛПВП-Х и общего холестерина измеряли согласно стандартным процедурам отделения клинической химии госпиталя университета Мальме. Уровни ЛПНП-X рассчитывали согласно формуле Фридвальда.
Уровни hGH измеряли в помещенных на хранение образцах плазмы, взятых натощак, которые замораживали до -80°С сразу после исходного MDC-CC-обследования. Измерение осуществляли с помощью ультрачувствительного хемилюминисцентного иммуноанализа (см. пример 1, us-hGH-анализ). Предел обнаружения составлял 2 пг/мл, функциональная чувствительность анализа составляла 8,5 пг/мл. Результаты измерений hGH выражали в нг/мл (1 нг/мл = 2,6 МЕД/л).
Распределение уровней hGH у мужчин и женщин
Наименьшие обнаруженные концентрации hGH составляли 0,02 нг/мл у мужчин и 0,01 нг/мл у женщин, это свидетельствовало о пригодности применяемого us-hGH-теста (аналитическая чувствительность: 0,002 нг/мл (2 пг/мл), функциональная чувствительность 0,0085 нг/мл (8,5 пг/мл)) для обнаружения hGH натощак у всех индивидуумов. Предельные значения для ССЗ-смертности у мужчин могли быть установлены на уровне выше 0,34 нг/мл для индивидуумов с высоким риском и ниже 0,06 нг/мл для индивидуумов с низким риском.
Клинические конечные точки
При создании изобретения изучали 4 основных исхода: заболевание коронарных артерий (ЗКА), «удар», сердечно-сосудистая смертность и общая смертность. Сведения о конечных точках получали с использованием персонального идентификационного номера каждого шведского гражданина из Шведского национального регистра выписки из госпиталей (SHDR), Шведского регистра причин смерти (SCDR), Регистра сердечных приступов университета Мальме и Шведской Web-системы улучшения и развития основанного на доказательной базе ухода при сердечном заболевании, оцениваемого в соответствии с рекомендованными терапиями (Web-system for Enhancement and Development of Evidence-based care in Heart disease Evaluated According to Recommended Therapies (SWEDEHEART)). Ранее было валидировано применение указанных регистров для классификации исходов и было продемонстрировано, что чувствительность в отношении выявления таких событий, как инфаркт миокарда, превышает 90% [21], [22], [23]. ЗКА определяли как фатальный или нефатальный инфаркт миокарда, смерть от ишемической болезни сердца, чрескожного коронарного вмешательства (СКВ) или аортокоронарного шунтирования (АКШ), в зависимости от того, что имело место первым, на основе Международной классификацией болезней (International Classification of Diseases), 9-е и 10-е пересмотренные издания (ICD-9 и ICD-10), коды 410 и I21 соответственно в SHDR или SCDR, коды 412 и 414 (ICD-9) или I22, I23 и I25 (ICD-10) в SCDR. «Удар» определяли как фатальный или нефатальный «удар» на основе кодов 430, 431, 434 и 436 (ICD-9) или I60, I61, I63 и I64 (ICD-10). Сердечно-сосудистую смертность определяли на основе кодов 390-459 (ICD-9) или кодов I00-I99 (ICD-10) в SCDR. Последующий период наблюдения для выявления исходов был продлен до 30 июня 2009 г.
Статистический анализ
Уровни hGH натощак характеризовались отклоненным направо распределением и перед осуществлением всех анализов их преобразовывали в натуральные логарифмы. Для определения того, имеет ли место какая-либо корреляция hGH с традиционными факторами сердечно-сосудистого риска [24], проводили перекрестные анализы на исходном уровне с применением линейных регрессионных моделей с использованием hGH в качестве зависимой переменной и возраста, пола, курения в настоящее время, применения гипотензивного лекарственного средства, наличия сахарного диабета и стандартизованных значений для систолического кровяного давления, ИМТ, ЛПВП-Х и ЛПНП-Х в качестве независимых переменных, которые вводили либо по отдельности (без корректировки), либо одновременно (многофакторная корректировка).
Применяли многопараметрические модели пропорционального риска Кокса для исследования ассоциации между hGH и случаями возникновения сердечнососудистых событий и смертностью. При анализе ЗКА и «удара» при создании изобретения исключали индивидуумов, в истории болезни которых имелась ЗКА (n=94) или «удар» (n=35) до момента определения исходного уровня для соответствующего анализа. Во всех моделях учитывали возраст, пол, систолическое кровяное давление, применение гипотензивного лекарственного средства, курение в настоящее время, наличие сахарного диабета, ИМТ и уровни ЛПВП-Х и ЛПНП-Х. Было подтверждено, что предположение о пропорциональности рисков удовлетворялось при использовании остатков Шенфельда (т.е. тест на ненулевой наклон для обобщенной линейной регрессии стандартизованных остатков Шенфельда в указанный момент времени. Отношения рисков (HR) для hGH выражали в виде соответствующей величины на единицу (1) приращения SD натурального логарифма hGH. Для того, чтобы установить, имеются ли какие-либо значимые тендерные различия, осуществляли тест по оценке влияния пола.
Для получения кривых Каплана-Мейера группу разделяли на гендеро-специфические квартили.
В таблице 3 представлены отсекающие концентрации различных квартилей для мужчин и женщин. Отсекающие концентрации можно адаптировать в случае применения hGH-анализов, которые позволяют распознавать различные наборы одной или нескольких изоформ hGH.
Для оценки возможных различных результатов, получаемых с помощью различных анализов, позволяющих распознавать различные наборы изоформ hGH, при создании изобретения сравнивали описанный в примере 1 анализ (с использованием сконструированных антител к рекомбинантному hGH (изоформа 1), с анализом, позволяющем распознавать преимущественно изоформы 2-4 (Pit-hGH-анализ, [29]. Осуществляли корреляцию результатов определения hGH, полученных для 997 здоровых индивидуумов, коэффициент корреляции составлял 0,95 (r=0,95), это свидетельствует о почти идентичных результатах, полученных с помощью анализов связывания с различными изоформами hGH.
Для оценки того, можно ли использовать hGH для переклассификации риска, применяли описанные ранее методы для расчета чистого коэффициента переклассификации (NRI) [25]. Коэффициенты многовариантного риска, полученные с использованием указанных выше параметров, применяли для оценки 10-летнего риска возникновения сердечно-сосудистого события и для классификации участников на следующие группы риска: менее 5%, от 5% до менее чем 10%, от 10% менее чем 20%, 20% или более. Затем после добавления уровней hGH участников можно было переклассифицировать на другие группы. Была проведена оценка переклассификации индивидуумов и рассчитан NRI в качестве критерия оценки успешности модели. Дискриминацию модели оценивали на основе расчета С-статистики (Harrell), которая представляет собой площадь под кривой операционных характеристик приемника (ROC), для различных моделей [25].
Все анализы за исключением NRI и С-статистики осуществляли с помощью статистической программы SPSS (версия 20.0.0, фирма SPSS inc, Чикаго, шт. Иллинойс). Анализы NRI и С-статистические анализы проводили с помощью программы Stata, версия 11 (фирма StataCorp, Колледж-Стейшн, шт. Техас). Если 2-стороннее значение Р было меньше 0,05, то результат рассматривали как статистически значимый.
Результаты
Перекрестный анализ
2
2
2
Характеристики группы на исходном уровне представлены в таблице 2. Как и ожидалось, у женщин уровни hGH, измеренные натощак, были статистически значимо больше, чем у мужчин (таблица 3). В нескорректированных регрессионных моделях все переменные за исключением возраста у женщин являлись значимыми детерминантами уровней hGH для обоих полов (таблица 4). В скорректированных моделях возраст, курение в настоящее время и ЛПВП-Х находились в значимой положительной корреляции с hGH, в то время как ЛПНП-Х и ИМТ находились в значимой отрицательной корреляции для обоих полов (таблица 4). Систолическое кровяное давление находилось в значимой отрицательной корреляции у женщин, но не у мужчин. У женщин по данным простого анализа была обнаружена выраженная отрицательная корреляция сахарного диабета с hGH, но по данным скорректированного анализа она находилась на границе значимости. В отличие от этого, корреляция между hGH и сахарным диабетом у мужчин была положительной и значимой по данным анализа с использованием обеих моделей. В моделях множественной регрессии величина R составляла 9,5% для мужчин и 11,8% для женщин. При анализе всей группы и коррекции модели для учета пола величина R составляла 39%. Добавление ассоциированных с hGH переменных, таких как окружность талии, инсулин (натуральный логарифм) и процент телесного жира, приводило к величине R, равной 10,4% для мужчин и 12,6% для женщин. Результаты, полученные с использованием всех нескорректированных регрессионных моделей, включавших указанные дополнительные переменные, свидетельствовали о наличии значимой отрицательной корреляции с уровнями hGH натощак.
Гормон роста и риск ЗКА
Из 4358 (1799 мужчин, 2559 женщин) индивидуумов, у которых в истории болезни ранее отсутствовала ЗКА, у 401 (249 мужчин, 152 женщин) произошло ЗКА - событие в течение медианного последующего периода наблюдения, составлявшего 16,1 года (IQR, 15,4-16,7). Каждое увеличение на величину SD исходного уровня hGH было ассоциировано с величиной HR, определенной с использованием многовариантной скорректированной модели, равной 1,14 (Р=0,008), для всей группы (таблица 5). Величина HR была сходной в отдельных анализах, проведенных для мужчин (HR, 1,17; р=0,01), но она незначимо повышалась для женщин. Не было обнаружено значимого влияния пола на исход ЗКА (р=0,37). Сравнение верхнего квартиля hGH с нижним ассоциировано с HR 1,33 (95% CI, 0,99-1,78; р=0,05) при анализе всей группы, 1,46 (95% CI, 1,01-2,09; р=0,04) для мужчин, а для женщин различие не было значимым (р=0,91) (таблица 6).
Гормон роста и риск «удара» (см. таблицы 5 и 6)
Из 4417 индивидуумов (1849 мужчин, 2568 женщин) в группе в истории болезни ранее отсутствовал «удар». В течение последующего периода наблюдения, медиана которого составляла 16,2 года (IQR, 15,5-16,7), у 265 индивидуумов (152 мужчин, 123 женщин) имел место «удар». Каждое увеличение на величину SD исходного уровня hGH натощак было ассоциировано с величиной HR, определенной с использованием многовариантной скорректированной модели, равной 1,19 для всей группы, при этом по данным гендеро-специфического анализа величина HR для мужчин составляла 1,18 и она оказалась незначимой для женщин. Не было обнаружено значимого влияния пола на исход (р=0,81). Сравнение верхнего квартиля hGH с нижним ассоциировано с HR 1,47 (95% CI, 1,02-2,11; р=0,04) при анализе всей группы, 1,48 (95% CI, 0,91-2,42; р=0,11) для мужчин и 1,46 (95% CI, 0,83-2,58; р=0,19) у женщин.
Гормон роста и общая смертность (см. таблицы 5 и 6)
Из 4452 индивидуумов (1872 мужчин, 2580 женщин) в группе, 698 (383 мужчин, 315 женщин) умерли в течение медианного последующего периода наблюдения, составлявшего 16,2 года (IQR, 15,6-16,7). Каждое увеличение на величину SD исходного уровня hGH натощак было ассоциировано с величиной HR, определенной с использованием многовариантной скорректированной модели, равной 1,21 для всей группы, соответствующая величина HR для мужчин была равна 1,26 и она была незначимой для женщин. Анализ влияния пола на исход выявил значимое различие (р=0,01) между полами. Сравнение верхнего квартиля hGH с нижним ассоциировано с HR 1,46 (95% CI, 1,17-1,84; р<0,001) при анализе всей группы, 2,05 (95% CI, 1,47-2,86; р<0,001) для мужчин, а для женщин различие не было значимым (р=0,96).
Гормон роста и сердечно-сосудистая смертность (таблицы 5 и 6)
Из группы 4452 индивидуумов, пригодных для анализа на исходном уровне и в течение последующего периода наблюдения, который был идентичен периоду наблюдения при анализе общей смертности, 215 (126 мужчин, 89 женщин) умерли в результате сердечно-сосудистого события, явившегося основной причиной смерти. Каждое увеличение на величину SD исходного уровня hGH натощак было ассоциировано с величиной HR, определенной с использованием многовариантной скорректированной модели, равной 1,51 для всей группы. Гендер-специфические величины HR составляли 1,41 для мужчин и 1,38 для женщин. Не было обнаружено значимого влияния пола на исход (р=0,81). Сравнение верхнего квартиля hGH с нижним ассоциировано с HR 2,68 (95% CI, 1,70-4,23; р<0,001) при анализе всей группы, 3,41 (95% CI, 1,76-6,61; р<0,001) для мужчин и 1,94 (95% CI, 0,98-3,81; р=0,06) для женщин. На фиг. 2 проиллюстрировано изменение смертности от ССЗ-событий с течением времени для мужчин.
Гормон роста является краткосрочным прогностическим критерием ССЗ-смертности
Зависимость ССЗ-смертности от времени проиллюстрирована на фиг. 2. При создании изобретения неожиданно было установлено, что прогностическое различие между индивидуумами с низким риском и высоким риском становится более выраженным при укорочении периода наблюдения (таблица 7).
Влияние hGH оказалось чрезвычайно важным для краткосрочного прогнозирования риска ССЗ-смертности у мужчин. Относительный риск событий (сравнение квартиля 4 с квартилем 1 на исходном уровне) составлял >15 для 2,5-летнего прогноза риска, 9,1 для 5-летнего прогноза риска, 7,9 для 10-летнего прогноза риска и 4,2 для 15-летнего прогноза риска ССЗ-смертности у мужчин. Эти данные свидетельствуют о большой краткосрочной прогностической мощности hGH и о пригодности серийных измерений уровней hGH.
Дискриминация и переклассификация риска
Результаты NRI-анализов оказались незначимыми для ЗКА и «удара», хотя при общем анализе ЗКА и «удара» можно наблюдать тенденцию к улучшению классификации. При анализе исходом в виде общей смертности NRI был значимым для мужчин (4,5%; р=0,005), но оказался незначимым для женщин. Улучшение было обусловлено в основном понижающей классификацией событий сомнительной важности (8,6%). При анализе сердечно-сосудистой смертности NRI составлял 11,1% (р<0,001) для всех индивидуумов и 10,2% (р=0,05) для женской группы, улучшение проявлялось прежде всего в повышающей классификации достоверных событий (14,4% событий были переклассифицированы для общей группы и 16,9% для женщин).
Добавление hGH к основной модели улучшало все С-статистические характеристики при анализе ЗКА, «удара», ССЗ-смертности и общей смертности. Для общей смертности у мужчин имело место улучшение от 70,5% до 71,4%. Наибольшее улучшение наблюдалось при анализе ССЗ-смертности, в этом случае С-статистические характеристики повышались от 78,7% до 79,8% для всей группы, от 75,7% до 77,1% для мужчин и от 80,4% до 81,2% для женщин.
Описание чертежей
На чертежах показано:
На фиг. 1 - типичная для us-hGH-анализа кривая доза/сигнал;
На фиг. 2 - результаты анализа методом Каплана-Мейера квартилей hGH (см. таблицу 3) прогноза ССЗ-смертности для мужчин. Y-ось: функции 1-выживаемость (% событий/100); Х-ось: последующий период наблюдения (в годах) от исходного уровня до эмиграции или смерти, или до последней даты периода наблюдения (2009-06-30).
Список литературы
1. Møller N., Jørgensen J.O.L., Effects of Growth Hormone on Glucose, Lipid, and Protein Metabolism in Human Subjects. Endocrine reviews; 30 (2), 2009, cc. 152-177.
2. Rosen Т., Bengtsson B.A., Premature mortality due to cardiovascular disease in hypopituitarism. Lancet; 336 (8710), 1990, cc. 285-258, Epub 1990/08/04.
3. Svensson J., Bengtsson B.A., Rosen Т., Oden A., Johannsson G., Malignant disease and cardiovascular morbidity in hypopituitary adults with or without growth hormone replacement therapy, The Journal of clinical endocrinology and metabolism; 89 (7), 2004, cc. 3306-3312, Epub 2004/07/09.
4. Bulow В., Hagmar L., Mikoczy Z., Nordstrom C.H., Erfurth E.M., Increased cerebrovascular mortality in patients with hypopituitarism, Clinical endocrinology; 46 (1), 1997, cc. 75-81, Epub 1997/01/01.
5. Tomlinson J.W., Holden N., Hills R.K., Wheatley K., Clayton R.N., Bates A.S. и др., Association between premature mortality and hypopituitarism. West Midlands Prospective Hypopituitary Study Group. Lancet, 357 (9254), 2001, cc. 425-431, Epub 2001/03/29.
6. Abs R., Feldt-Rasmussen U., Mattsson A.F., Monson J.P., Bengtsson B.A., Goth M.I. идр., Determinants of cardiovascular risk in 2589 hypopituitary GH-deficient adults - a KIMS database analysis, European journal of endocrinology/European Federation of Endocrine Societies, 155 (1), 2006, cc. 79-90. Epub 2006/06/24.
7. de Boer H., Blok G.J., Voerman H.J., Phillips M., Schouten J.A., Serum lipid levels in growth hormone-deficient men, Metabolism: clinical and experimental, 43 (2), 1994, cc. 199-203. Epub 1994/02/01.
8. Bulow В., Hagmar L., Eskilsson J., Erfurth E.M., Hypopituitary females have a high incidence of cardiovascular morbidity and an increased prevalence of cardiovascular risk factors, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 85 (2), 2000, cc. 574-584, Epub 2000/02/26.
9. Sesmilo G., Biller B.M., Llevadot J., Hayden D., Hanson G., Rifai N. и др., Effects of growth hormone administration on inflammatory and other cardiovascular risk factors markers in men with гормон роста deficiency. A randomized, controlled clinical trial, Annals of internal medicine, 133 (2), 2000, cc. 111-122, Epub 2000/07/15.
10. Beauregard C., Utz A.L., Schaub A.E., Nachtigall L., Biller B.M., Miller K.K. и др., Growth hormone decreases visceral fat and improves cardiovascular risk factors markers in women with hypopituitarism: a randomized, placebo-controlled study, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 93 (6), 2008, cc. 2063-2071, Epub 2008/04/03.
11. Maison P., Griffin S., Nicoue-Beglah M., Haddad N., Balkau В., Chanson P., Impact of growth hormone (GH) treatment on cardiovascular risk factors factors in GH-deficient adults: a Metaanalysis of Blinded, Randomized, Placebo-Controlled Trials, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 89 (5), 2004, cc. 2192-2199, Epub 2004/05/06.
12. Orme S.M., McNally R.J., Cartwright R.A., Belchetz P.E., Mortality and cancer incidence in acromegaly: a retrospective cohort study. United Kingdom Acromegaly Study Group, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 83 (8), 1998, cc. 2730-2734, Epub 1998/08/26.
13. Melmed S., Casanueva F.F., Klibanski A., Bronstein M.D., Chanson P., Lamberts S.W. и др., A consensus on the diagnosis and treatment of acromegaly complications, Pituitary, 2012, Epub 2012/08/21.
14. Colao A., Marzullo P., Di Somma C, Lombardi G., Growth hormone and the heart, Clinical endocrinology, 54(2), 2001, cc. 137-154. Epub 2001/02/24.
15. Maison P., Tropeano A.I., Macquin-Mavier I., Giustina A., Chanson P., Impact of somatostatin analogs on the heart in acromegaly: a metaanalysis, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 92 (5), 2007; cc. 1743-1747, Epub 2007/02/22.
16. Takala J., Ruokonen E., Webster N.R., Nielsen M.S., Zandstra D.F., Vundelinckx G. и др., Increased mortality associated with growth hormone treatment in critically ill adults, The New England journal of medicine, 341 (11), 1999, cc. 785-792, Epub 1999/09/09.
17. Maison P., Balkau В., Simon D., Chanson P., Rosselin G., Eschwege E., Growth hormone as a risk for premature mortality in healthy subjects: data from the Paris prospective study, BMJ (Clinical research ed), 316 (7138), 1998, cc. 1132-1133, Epub 1998/04/29.
18. Berglund G., Elmstahl S., Janzon L., Larsson S.A., The Malmo Diet and Cancer Study. Design and feasibility, Journal of internal medicine, 233 (1), 1993, cc. 45-51, Epub 1993/01/01.
19. Rosvall M., Janzon L., Berglund G., Engstrom G., Hedblad В., Incidence of stroke is related to carotid IMT even in the absence of plaque. Atherosclerosis, 179 (2), 2005, cc. 325-331, Epub 2005/03/22.
20. Bidlingmaier M., Suhr J., Ernst A., Wu Z., Keller A., Strasburger C.J. и др., High-sensitivity chemiluminescence immunoassays for detection of growth hormone doping in sports, Clinical chemistry, 55 (3), 2009, cc. 445-453, Epub 2009/01/27.
21. Jerntorp P., Berglund G., Stroke registry in Malmö, Sweden, Stroke, 23 (3), 1992, cc. 357-361.
22. Hammar N., Alfredsson L., ., Spetz C.L., Kahan Т., Ysberg A.S., A national record linkage to study acute myocardial infarction incidence and case fatality in Sweden, International Journal of Epidemiology, 30 (приложение 1), 2001, с. 30.
23. Ludvigsson J., Andersson E., Ekbom A., Feychting M., Kim J-L., Reuterwall С. и др., External review and validation of the Swedish national inpatient register, BMC Public Health, 11 (1), 2011, c. 450.
24. D'Agostino R.B., Sr., Vasan R.S., Pencina M.J., Wolf P.A., Cobain M., Massaro J.M. и др., General cardiovascular risk factors profile for use in primary care: the Framingham Heart Study, Circulation, 117 (6), 2008, cc. 743-53, Epub 2008/01/24.
25. Pencina M.J., D'Agostino R.B., Sr., D'Agostino R.B., Jr., Vasan R.S., Evaluating the added predictive ability of a new marker: from area under the ROC curve to reclassification and beyond, Statistics in medicine, 27 (2), 2008, cc. 157-172; обсуждение cc. 207-212, Epub 2007/06/15.
26. Pencina M.J., D'Agostino R.B., Overall С as a measure of discrimination in survival analysis: model specific population value and confidence interval estimation, Statistics in medicine, 23 (13), 2004, cc. 2109-2123.
27. Engstrom B.E, Karlsson F.A., Wide L., Marked gender differences in ambulatory morning growth hormone values in young adults, Clinical chemistry, 44 (6 Pt 1), 1998, cc. 1289-1295, Epub 1998/06/13.
28. Eden Engstrom В., Karlsson F.A., Naessen Т., Gillberg P., Wide L., Ambulatory morning growth hormone concentrations increase in men and decrease in women with age, Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation, 62 (1), 2002, cc. 25-31, Epub 2002/05/11.
29. Pincus S.M., Gevers E.F., Robinson I.C., van den Berg G., Roelfsema F., Hartman M.L. и др., Females secrete growth hormone with more process irregularity than males in both humans and rats, The American journal of physiology, 270 (1 Pt 1), 1996, cc. 107-115, Epub 1996/01/01.
30. Hindmarsh P.C., Dennison E., Pincus S.M., Cooper C, Fall C.H., Matthews D.R. и др., A sexually dimorphic pattern of growth hormone secretion in the elderly, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 84 (8), 1999, cc. 2679-2685, Epub 1999/08/12.
31. Veldhuis J.D., Roelfsema F., Keenan D.M., Pincus S., Gender, age, body mass index, and IGF-I individually and jointly determine distinct GH dynamics: analyses in one hundred healthy adults, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 96 (1), 2011, cc. 115-121, Epub 2010/10/12.
32. Saini S., Hindmarsh P.C., Matthews D.R., Pringle P.J., Jones J., Preece M.A. и др., Reproducibility of 24-hour serum growth hormone profiles in man. Clinical endocrinology, 34 (6), 1991, cc. 455-462, Epub 1991/06/01.
33. Surya S., Symons K., Rothman E., Barkan A.L., Complex rhythmicity of growth hormone secretion in humans. Pituitary, 9 (2), 2006, cc. 121-125, Epub 2006/07/18.
34. Jaffe C.A., Ocampo-Lim В., Guo W., Krueger K., Sugahara I., DeMott-Friberg R. и др., Regulatory mechanisms of growth hormone secretion are sexually dimorphic, The Journal of clinical investigation, 102 (1), 1998, cc. 153-164, Epub 1998/07/03.
35. Faje А.Т., Barkan A.L., Basal, but not pulsatile, growth hormone secretion determines the ambient circulating levels of insulin-like growth factor-I. The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 95 (5), 2010, cc. 2486-2491, Epub 2010/03/02.
36. Ho K.Y., Weissberger A.J., Characterization of 24-hour growth hormone secretion in acromegaly: implications for diagnosis and therapy, Clinical endocrinology, 41 (1), 1994, cc. 75-83, Epub 1994/07/01.
37. van der Klaauw A.A., Pereira A.M., van Thiel S.W., Frolich M., Iranmanesh A., Veldhuis J.D. и др., Attenuated pulse size, disorderly growth hormone and prolactin secretion with preserved nyctohemeral rhythm distinguish irradiated from surgically treated acromegaly patients, Clinical endocrinology, 66 (4), 2007, cc. 489-498.
38. Roelfsema F., Biermasz N.R., Veldhuis J.D., Pulsatile, nyctohemeral and entropic characteristics of GH secretion in adult GH-deficient patients: selectively decreased pulsatile release and increased secretory disorderliness with preservation of diurnal timing and gender distinctions, Clinical endocrinology, 56 (1), 2002, cc. 79-87, Epub 2002/02/19.
39. Bartke A., Can growth hormone (GH) accelerate aging? Evidence from GH-transgenic mice, Neuroendocrinology, 78 (4), 2003, cc. 210-216, Epub 2003/10/30.
40. Coschigano K.T., Holland A.N., Riders M.E., List E.O., Flyvbjerg A., Kopchick J.J., Deletion, but not antagonism, of the mouse growth hormone receptor results in severely decreased body weights, insulin, and insulin-like growth factor I levels and increased life span, Endocrinology, 144 (9), 2003, cc. 3799-3810, Epub 2003/08/23.
41. Brown-Borg H.M., Borg K.E., Meliska C.J., Bartke A., Dwarf mice and the ageing process, Nature, 384(6604), 1996, c. 33, Epub 1996/11/07.
42. Masternak M.M., Bartke A., Growth hormone, inflammation and aging, Pathobiology of aging & age related diseases, 2, 2012, Epub 2012/09/07.
43. Guevara-Aguirre J., Balasubramanian P., Guevara-Aguirre M., Wei M., Madia F., Cheng C.W. и др., Growth hormone receptor deficiency is associated with a major reduction in pro-aging signaling, cancer, and diabetes in humans, Science translational medicine, 3 (70), 2011, 70ra13, Epub 2011/02/18.
44. Menezes Oliveira J.L., Marques-Santos C., Barreto-Filho J.A., Ximenes Filho R., de Oliveira Britto A.V., Oliveira Souza A.H. и др., Lack of evidence of premature atherosclerosis in untreated severe isolated growth hormone (GH) deficiency due to a GH-releasing hormone receptor mutation, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 91 (6), 2006, cc. 2093-2099, Epub 2006/03/09.
45. Aguiar-Oliveira M.H., Oliveira F.T., Pereira R.M., Oliveira C.R., Blackford A., Valenca E.H. и др., Longevity in untreated congenital growth hormone deficiency due to a homozygous mutation in the GHRH receptor gene. The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 95 (2), 2010, cc. 714-721, Epub 2009/12/08.
46. Besson A., Salemi S., Gallati S., Jenal A., Horn R., Mullis P.S. и др., Reduced longevity in untreated patients with isolated growth hormone deficiency, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 88 (8), 2003, cc. 3664-3667, Epub 2003/08/14.
47. Rudling M., Norstedt G., Olivecrona H., Reihner E., Gustafsson J.A., Angelin В., Importance of growth hormone for the induction of hepatic low density lipoprotein receptors, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89 (15), 1992, cc. 6983-6987, Epub 1992/08/01.
48. Rudling M., Olivecrona H., Eggertsen G., Angelin В., Regulation of rat hepatic low density lipoprotein receptors. In vivo stimulation by growth hormone is not mediated by insulin-like growth factor I, The Journal of clinical investigation, 97 (2), 1996, cc. 292-299, Epub 1996/01/15.
49. Vahl N., Klausen I., Christiansen J.S., Jorgensen J.O., Growth hormone (GH) status is an independent determinant of serum levels of cholesterol and triglycerides in healthy adults, Clinical endocrinology, 51 (3), 1999, cc. 309-316, Epub 1999/09/01.
50. Clasey J.L., Weltman A., Patrie J., Weltman J.Y., Pezzoli S., Bouchard С. и др., Abdominal visceral fat and fasting insulin are important predictors of 24-hour GH release independent of age, gender, and other physiological factors, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 86 (8), 2001, cc. 3845-3852, Epub 2001/08/15.
51. Miller K.K., Biller B.M., Lipman J.G., Bradwin G., Rifai N., Klibanski A., Truncal adiposity, relative growth hormone deficiency, and cardiovascular risk factors, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 90 (2), 2005, cc. 768-774, Epub 2004/12/02.
52. Bredella M.A., Lin E., Brick D.J., Gerweck A.V., Harrington L.M., Torriani M. и др, Effects of GH in women with abdominal adiposity: a 6-month randomized, double-blind, placebo-controlled trial, European journal of endocrinology/European Federation of Endocrine Societies, 166 (4), 2012, cc. 601-611, Epub 2012/01/26.
53. Sandberg H., Roman L., Zavodnick J., Kupers N., The effect of smoking on сыворотку somatotropin, immunoreactive insulin and blood glucose levels of young adult males, The Journal of pharmacology and experimental therapeutics, 184 (3), 1973, cc. 787-791, Epub 1973/03/01.
54. Wilkins J.N., Carlson H.E., Van Vunakis H., Hill M.A., Gritz E., Jarvik M.E., Nicotine from cigarette smoking increases circulating levels of cortisol, growth hormone, and prolactin in male chronic smokers, Psychopharmacology, 78 (4), 1982, cc. 305-308, Epub 1982/01/01.
55. Veldhuis J.D., Aging and hormones of the hypothalamo-pituitary axis: gonadotropic axis in men and somatotropic axes in men and women, Ageing research reviews, 7(3), 2008, cc. 189-208, Epub 2008/03/18.
56. Bramnert M., Segerlantz M., Laurila E., Daugaard J.R., Manhem P., Groop L., Growth hormone replacement therapy induces insulin resistance by activating the glucose-fatty acid cycle, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 88 (4), 2003, cc. 1455-1463, Epub 2003/04/08.
57. Norrelund H., Nielsen S., Christiansen J., Jorgensen J., Moller N., Modulation of basal glucose metabolism and insulin sensitivity by growth hormone and free fatty acids during short-term fasting, European Journal of Endocrinology. 150 (6), 2004, cc. 779-787.
58. Ho K.Y., Evans W.S., Blizzard R.M., Veldhuis J.D., Merriam G.R., Samojlik E. и др., Effects of sex and age on the 24-hour profile of growth hormone secretion in man: importance of endogenous estradiol concentrations, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 64 (1), 1987, cc. 51-58, Epub 1987/01/01.
59. Lorenz и др., «Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy» Antimicrob Agents Chemother., 55 (1), январь 2011 г., cc. 165-173.
60. Lane R.D., «A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas», J. Immunol. Meth. 81, 1985, cc. 223-228.
61. Ziegler В. и др., «Glutamate decarboxylase (GAD) is not delectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies», Horm. Metab. Res. 28, 1996, cc. 11-15.