СПОСОБ УСКОРЕНИЯ РОСТА МЕДЛЕННОРАСТУЩИХ МИКОБАКТЕРИЙ
METHOD FOR GROWTH ACCELERATION OF SLOW-GROWING MYCOBACTERIA

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для ускорения (сокращения сроков) постановки бактериологического диагноза на туберкулез и других болезней, вызываемых медленнорастущими микроорганизмами.
Имеются способы ускорения роста и жизнедеятельности микроорганизмов под влиянием магнитных полей. Н.С.Боганец и А.Д.Панкратова изучали влияние пульсирующего магнитного поля на рост культур микобактерий. Установлено, что интенсивность роста микробов максимально увеличивалась на 25-30% при воздействии на посевы микобактерий пульсирующего магнитного поля в течение 150 минут (Влияние магнитных полей на ростовые свойства микобактерий туберкулеза бычьего вида// Актуальные проблемы бруцеллеза и туберкулеза животных: сб. науч. тр./ «ВНИИБТЖ». Омск, 2000. - С.72-74).
Недостатками данного способа являются трудоемкость выполнения, длительная экспозиция культур, необходимость обработки самой микробной культуры перед посевом, обработка культур в бульонной питательной среде с целью наращивания бактериальной массы.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению является способ культивирования медленнорастущих микобактерий, предусматривающий подготовку проб исследуемых микобактерий, электрохимическую обработку солевой композиции, соединение обработанной солевой композиции с жидкой питательной средой, посев на питательную среду, культивирование на питательной среде и оценку результатов (RU 2106879 С1, 20.03.1989).
Однако данный способ предполагает дополнительную электрохимическую обработку солевой композиции с использованием специальных приборов (электролизер с графитными электродами), что является довольно трудоемкой процедурой.
Задачей заявляемого изобретения является сокращение сроков выявления и повышения выхода медленнорастущих микобактерий туберкулеза - М. bovis и М. avium.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе ускорения роста медленнорастущих микобактерий, включающем воздействие на микобактерии и/или питательные среды электромагнитным полем, согласно изобретению на микобактерии и/или питательные среды воздействуют электромагнитным полем в течение 30 минут, причем располагают источник этих волн на расстоянии 3 см от культуры микобактерий, а в качестве источника электромагнитного поля используют корректор функционального состояния (КФС).
Способ осуществляется следующим образом.
Для получения необходимого эффекта электромагнитных волн и воздействия им на питательную среду и посевы культур М. bovis и М. avium был использован прибор КФС («Информационная медицина и современные пути комплексного восстановления здоровья нации»: сб. тр./Кабинет доктора Шамса. М., 2010. - 180 с.).
Прибор (устройство) КФС - корректор функционального состояния (авторы С.В.Кольцов, Т.А.Старикова) относится к классу синхронизируемых автогенераторов и представляет собой литую пластину (9,0×6,5×1,0 см) из искусственных материалов, внутри которой размещены два элемента из ферромагнетика, которые генерируют статическое правовращающее электромагнитное поле, радиус действия которого составляет 2,0 м (см. патент RU №2214843 С1, МПК А61N 5/00, 5/02, 2003 г.).
В настоящее время разработано более шестнадцати приборов КФС. На все приборы записана индивидуальная информация для решения определенных функциональных задач (Л.Г.Мазуркова, Ж.Г.Боргачева «КФС - медицина будущего». - Одесса, 2010).
Однако конструктивные особенности, параметры прибора и механизм действия прибора остаются прежними.
Для установления бактериологического диагноза на туберкулез осуществляли посев суспензии биопроб исследуемого материала (по общепринятой методике) на твердые питательные среды, на которых вырастают микобактерии туберкулеза (в виде колоний), если они присутствуют в исследуемом материале. Затем учитывали время появления первичного роста колоний микобактерий, интенсивность их роста и сроки окончательного формирования размеров и структуры колоний микобактерий, параметры которых позволяют поставить бактериологический диагноз.
Пример 1. Изучение изменения скорости роста медленнорастущих культур М. bovis и М. avium при воздействии электромагнитного поля на питательную среду.
Пробирки с приготовленной твердой питательной средой перед посевом культур М. bovis и М. avium подвергали воздействию электромагнитного поля с помощью устройства КФС в течение 30 мин на расстоянии 3 см. Затем на облученную питательную среду производили посев культур М. bovis и М. avium. Культуры медленнорастущих микобактерий взяты из музейной коллекции лаборатории туберкулеза ГНУ ИЭВСиДВ с типичными видовыми свойствами: М. bovis - (шт.14, ВНИИБТЖ); М. bovis (64-04, изолирован в лаборатории ИЭВСиДВ); М. avium (шт.78, НИВИ Нечерноземной зоны). Для посевов использовали 3-х недельные культуры, после культивирования на питательной среде Финн-2.
Для контроля использовали посев на аналогичную среду без предварительного воздействия электромагнитным полем.
В начале исследований установили оптимальные сроки экспозиции питательных сред на приборе КФС, которые вызывали структурирование компонентов питательной среды в диапазонах, обеспечивающих максимально возможное ускорение роста микобактерий. Рост колоний микобактерий учитывали через 2-3 дня. Интенсивность роста культур оценивали в крестах, при этом один крест (+) соответствовал появлению первичного роста культур, оценка роста колоний в четыре креста соответствовала стандартному состоянию окончательного роста культуры.
В таблице 1 приведены данные о влиянии облучения питательных сред на скорость роста на них медленнорастущих культур микобактерий туберкулеза.
Таблица 1
Культуры МБТ
Скорость роста культур МБТ<sup>*</sup>, сутки
облученная среда
контроль
15 мин
30 мин
45 мин
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
Среда Финн II
М. avium (шт.78)
6
12
6
10
6
12
6
12
М. bovis (шт.14)
10
19
8
17
10
22
14
23
M. bovis (64-04)
9
26
8
24
9
30
9
33
Среда ИЭВСиДВ
М. avium (шт.78)
6
15
6
10
8
15
7
11
М. bovis (шт.14)
10
20
8
15
10
20
11
19
M.bovis (64-04)
9
25
8
18
10
26
9
24
Примечание: МБТ<sup>*</sup> - микобактерии туберкулеза; П<sup>**</sup> - первичный рост культур; И<sup>***</sup> - интенсивный рост культур
Из таблицы 1 видно, что применение прибора КФС и получаемое при его использовании электромагнитное поле для облучения плотных питательных сред «Финн-2», при экспозиции 30 минут вызывает максимальное ускорение роста культур по сравнению с другими экспозициями (15, 20, 40, 45 и 60 мин). Так облучение питательной среды в течение 30 минут вызывает ускорение роста культуры М. bovis (шт.14) на 6 суток (26,1%) по сравнению с контрольными посевами этой культуры. При экспозиции 15 мин скорость роста увеличилась на 4-о суток (17,4%) и 45 мин - на 1 сутки.
Результаты показывают, что экспозиция электромагнитным полем в течение 15 минут на питательные среды оказалась недостаточно оптимальной для ускорения роста микобактерий, а экспозиция в течение 45 минут может оказывать угнетающее воздействие на рост культур.
Культура М. bovis (64-04) выросла на 9-е сутки (27,3%) быстрее, чем в контроле при экспозиции питательной среды в 30 мин. При экспозициях 15 мин скорость роста увеличилась на 7 суток (21,2%), при экспозициях 45 мин скорость роста изменилась еще меньше - на 3-е суток (9,1%).
Культура М. avium (шт.78) увеличила скорость роста на 2-е суток (16,7%) при экспозиции питательной среды на приборе 30 мин, при других экспозициях скорость роста не изменилась.
Облучение питательной среды ИЭВСиДВ в течение 30 минут вызывало ускорение роста культуры М. bovis (шт.14) на 4-о суток (21,1%) по сравнению с контрольными посевами этой культуры. При экспозиции 15 и 45 минут скорость роста не увеличилась.
Культура М. bovis (64-04) выросла на 6 суток (25,0%) быстрее, чем в контроле при экспозиции питательной среды в 30 мин. При экспозициях 15 и 45 мин скорость роста снизилась на 1 и 2 суток.
Культура М. avium (шт.78) увеличила скорость роста на 1 сутки (9,1%) при экспозиции питательной среды на приборе 30 мин, при других экспозициях скорость роста снизилась на 4-о суток.
Таким образом, облучение электромагнитным полем твердых питательных сред с помощью прибора КФС позволяет ускорить на них рост медленнорастущих микобактерий туберкулеза М. bovis до 27%, а М. avium на 16% по сравнению с контролем, при оптимальной экспозиции 30 минут.
Пример 2. Влияние облучения прибором КФС на скорость роста медленнорастущих микобактерий туберкулеза
В дальнейших исследованиях определяли влияние воздействия прибора КФС на скорость роста медленнорастущих микобактерий путем экспозиции этих культур, хранящихся в пробирках с плотными питательными средами, с последующим посевом их на питательную среду без предварительного воздействия на нее электромагнитным полем (таблица 2).
Таблица 2
Культуры МБТ
Скорость роста культур МБТ<sup>*</sup>, сутки
облученные культуры
контроль
15 мин
30 мин
45 мин
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
Среда Финн II
М. avium (шт.78)
4
12
4
8
4
9
4
9
М. bovis (шт.14)
9
23
8
19
11
23
11
23
M.bovis (64-04)
6
28
4
23
4
27
6
33
Среда ИЭВСиДВ
М. avium №78
7
10
6
9
8
10
7
11
М. bovis №14
10
18
8
15
8
18
11
19
M. bovis №64-04
9
24
8
21
9
24
9
24
Примечание: МБТ<sup>*</sup> - микобактерии туберкулеза; П<sup>**</sup> - первичный рост культур; И<sup>***</sup> - интенсивный рост культур
Облученные прибором культуры М. bovis (шт.14) при экспозиции 30 минут, посеянные на среду Финн-2, вырастали на 4-о суток (17,4%) быстрее, чем в контроле. При экспозициях 15 и 45 мин, они вырастали в сроки, одинаковые с контролем. Облученные в течение 30 мин посевы культуры М. bovis (64-04) вырастали на 10 суток (30,4%) раньше, а при экспозициях 15 и 45 мин - на 5 суток (15,2%) и 6 суток (18,2%) раньше контрольных посевов.
Культура М. avium (шт.78), после 30 минут экспозиции выросла на одни сутки раньше (11,1%), чем контроль. После 45-минутной экспозиции, изменений в сроках роста не было, а после 15-минутной экспозиции произошла задержка в росте на 3-е суток по сравнению с контролем.
Облученные прибором культуры М. bovis (шт.14) при экспозиции 30 минут, посеянные на среду ИЭВСиДВ, вырастали на 4-о суток (21,1%) быстрее, чем в контроле. При экспозициях 15 и 45 мин, они вырастали на одни сутки раньше контроля.
Облученные в течение 30 мин посевы культуры М. bovis (64-04) вырастали на 3-е суток (22,5%) раньше контроля, а при экспозициях 15 и 45 мин они вырастали в сроки, одинаковые с контролем.
Культура М. avium (шт.78), после 30 минут экспозиции выросла на двое суток раньше (18,2%), чем контроль, после 45 и 15-минутной экспозиций изменений в сроках роста, по сравнению с контролем, не было.
Пример 3. Изменение скорости роста облученных посевов микобактерий туберкулеза.
В дальнейших исследованиях определяли влияние на скорость роста культур воздействия прибора КФС одновременно на питательную среду и микобактерии путем экспозиции на приборе свежих посевов микобактерий в пробирках с плотными питательными средами (таблица 3).
Таблица 3
Культуры МБТ
Скорость роста культур МБТ<sup>*</sup>, сутки
облученные посевы
контроль
15 мин
30 мин
45 мин
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
П<sup>**</sup>
И<sup>***</sup>
Среда Финн II
1
2
3
4
5
6
7
8
9
М. avium (шт.78)
5
10
5
8
5
10
6
1
М. bovis (шт.14)
10
20
13
19
10
23
14
3
M. bovis (64-04)
9
28
7
26
9
28
9
33
Среда ИЭВСиДВ
M. avium (шт.78)
8
10
7
10
8
10
7
11
M. bovis (шт.14)
9
18
8
17
8
18
11
19
M. bovis (64-04)
9
24
8
20
9
24
9
24
Примечание: МБТ<sup>*</sup> - микобактерии туберкулеза; П<sup>**</sup> - первичный рост культур; И<sup>***</sup> - интенсивный рост культур
Облученные прибором посевы культуры M. bovis (шт.14) на среде Финн-2 при экспозиции 30 мин вырастали на 4-о суток быстрее (17,4%), чем в контроле. При экспозициях 15 мин они вырастали на 3-е суток раньше. Облученные в течение 30 мин посевы культуры M. bovis (64-04) вырастали на 7 суток (21,2%) раньше, а при экспозициях 15 и 45 мин - на 5 суток (15,2%) раньше контрольных посевов.
M. avium (шт.78) лучше всего росла после экспозиций посевов в течение 30 минут и вырастала на 4-о суток раньше контроля (33,3%). Посевы с экспозицией 15 и 45 минут вырастали на двое суток (16,7%) раньше контроля.
При экспозиции посевов микобактерий на среде ИЭВСиДВ в течение 30 минут культура M. bovis (шт.14) ускорила рост на двое суток (10,5%) по сравнению с контролем, культура M. bovis (64-04) - на 4-о суток (16,7%), культура M. avium (шт.78) - на 1 сутки (9,1%). Первичный рост культур появлялся раньше соответственно на 3 и 1 сутки по сравнению с контролем. Экспозиция посевов на приборе в течение 15 и 45 мин ускорила рост культуры M. bovis (шт.14) на 1 сутки (5,3%), культуры №78 - на 1 сутки (9,1%), культуры M. avium (шт.78) выросла в одинаковые сроки с контролем.
Следовательно, облучение прибором КФС посевов M. bovis (шт.14) в течение 30 минут на расстоянии 3 см от культур вызывает ускорение их роста на 10,5-21,2% по сравнению с контролем, а M. avium (шт.78) на 9,1%-33,3%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет ускорить рост медленнорастущих микобактерий туберкулеза, что дает возможность сократить сроки постановки бактериологического диагноза на туберкулез.
Предлагаемый способ апробировали в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии в течение 2006-2010 гг.