ОЧИСТКА ЭПИДАУНОРУБИЦИНА
REMOVAL OF IMPURITIES FROM EPIDAUNUBRUBICIN

Настоящее изобретение относится к способу очистки эпидаунорубицина, в частности, к разделению эпидаунорубицина и эпифеудомицина, который образуется в качестве побочного продукта в биотехнологическом производстве эпидаунорубицина.
Streptomyces peucetius
Эпидаунорубицин является 4'-эпимером даунорубицина, который входит в группу гликозидов и представляет собой антибиотик группы антрациклинов. Эпидаунорубицин в основном используется как прекурсор к эпирубицину, который используется в качестве цитостатика при химиотерапии рака молочной железы, неходжкинской лимфомы, саркомы, карциномы желудка и других солидных видах рака. Эпидаунорубицин может быть получен синтетическим, полусинтетическим и биотехнологическим путем. В биотехнологическом производстве используются различные штаммы культуры . Эпидаунорубицин может быть представлен следующей общей формулой (I):
При микробиологическом синтезе эпидаунорубицина возникает проблема образования, помимо целевого продукта, в частности, эпифеудомицина в качестве побочного продукта, который, за счет структурной схожести, очень трудно отделить от эпидаунорубицина. Наличие побочного продукта негативно влияет на выход и степень чистоты эпирубицина, который формируется из эпидаунорубицина в последующей стадии процесса. Как правило, разделение и очистка эпидаунорубицина из ферментационной среды осуществляется путем жидкостной экстракции, хроматографии и кристаллизации.
Однако, в связи с наличием эпифеудомицина, для этого требуется сложный процесс, и это приводит к относительно высоким потерям эпидаунорубицина.
Патентный документ с номером ЕР 1 990 405 А1 описывает различные штаммы микроорганизмов, которые подходят для биотехнологического производства эпидаунорубицина. Отделение эпидаунорубицина из ферментационной среды осуществляется посредством экстракции хлороформом при щелочном значении рН. Полученная сырьевая смесь затем очищается хроматографически с хлороформом в качестве подвижной фазы. На последней стадии эпидаунорубицин кристаллизуется путем добавления бутанола и доведением значения рН до кислотного.
Патентный документ с номером ЕР 2 301 943 В1 описывает кристаллизацию гидрохлорида эпидаунорубицина из смеси спирт/хлороформ, в которую спирт вводят при температуре 60°С.
Патентный документ с номером ЕР 0 030 295 В1 раскрывает технологию синтетического производства эпидаунорубицина.
Патентный документ с номером WO 2010/028667 описывает экстракцию 13-DHED, эпидаунорубицина и эпифеудомицина из ферментационной среды с помощью адсорбирующей смолы.
3
Патентный документ с номером ЕР 2 042 608 В1 описывает экстракцию агликонов из ферментационной среды, содержащей 13-DHED, эпидаунорубицин и феудомицин. Гликозиды извлекаются из водной фазы с помощью хлороформа при слабощелочном значении рН. Значение рН поддерживается стабильным с помощью насыщенного раствора NaHCO.
Стандартные методы для очистки эпидаунорубицина из ферментационной среды связаны с высокими техническими и финансовыми затратами. Разделение эпидаунорубицина и эпифеудомицина, в частности, особенно затруднительно из-за структурного подобия двух соединений, так что приемлемая степень чистоты эпидаунорубицина может быть достигнута только в сочетании со значительной потерей его выхода. Из-за сложного отделения эпифеудомицина, данная примесь также может быть найдена в продуктах, полученных из эпидаунорубицина, что является особенно разрушительным для преобразования эпирубицина. С другой стороны, высокая степень чистоты и высокий выход продукта имеют особенно важное значение для последующего преобразования эпидаунорубицина в эпирубицин.
Следовательно, существует необходимость в процессе, который обеспечивает эффективное разделение побочного продукта эпифеудомицина от желаемого продукта эпидаунорубицина без существенного снижения выхода эпидаунорубицина из-за разделения и стадий очистки.
Из этого следует, что задачей настоящего изобретения является создание способа, который обеспечивает эффективное разделение эпидаунорубицина и эпифеудомицина после микробиологического производства, в котором выход очищенного эпидаунорубицина выше, чем полученный с помощью стандартных способов, известных из предшествующего уровня техники.
Данная задача решается с помощью объекта независимого пункта формулы изобретения. Зависимые пункты формулы изобретения описывают предпочтительные варианты осуществления.
Задачей, определяющей настоящее изобретение, является способ очистки эпидаунорубицина, включающий следующие стадии:
a) получение смеси, содержащей эпидаунорубицин, эпифеудомицин и, по крайней мере, один галогеносодержащий растворитель;
b) регулирование значения рН смеси в диапазоне от 5,0 до 7,5;
c) нагревание смеси на стадии b) более чем 25°C; и
d) очистка эпидаунорубицина,
характеризующийся тем, что содержание спиртов с 1-5 атомами углерода в смеси на стадиях a) и b) не превышает 5 об.%, исходя из общего объема смеси.
Не ограничиваясь рамками теории, предполагается, что в условиях способа по настоящему изобретению, эпифеудомицин избирательно расщепляется, и в результате продукты распада легче отделить от желаемого эпидаунорубицина. Предполагается, что способ по настоящему изобретению также приводит к конверсии реакционной смеси и, соответственно, к сокращению эпифеудомицина. Результаты масс-спектрометрического анализа позволяют предполагать, что сахар расщепляется, и оставшиеся кольца ароматизируются. Кроме того, предполагается, что имеет место специфическое расщепление эпифеудомицина, поскольку никакие продукты разложения эпидаунорубицина не обнаружены. В этом отношении распад в способе по настоящему изобретению отличается от обычного кислотного гидролиза антрациклинов, который также мог бы применяться к эпидаунорубицину.
Способ по настоящему изобретению начинается с эпидаунорубицина в качестве сырья, который очищается в несколько стадий. Источник и способ производства эпидаунорубицина не ограничены никаким образом. Например, можно использовать имеющийся в продаже эпидаунорубицин, который содержит долю эпифеудомицина, что делает его непригодным для других применений.
Streptomyces sp.
S. peucetius
S. coeruloruidus
S. griseus
Streptomyces sp. C5
S. peicetius var. caesius
S. bifurcus
В предпочтительном варианте осуществления способа очистки по настоящему изобретению, смесь эпидаунорубицина на стадии a) получают с помощью биотехнологических способов, например, с помощью подходящих микроорганизмов. Предпочтительно, чтобы эпидаунорубицин присутствовал в ферментационной среде вместе с эпифеудомицином. К подходящим микроорганизмам относятся, например, бактерии группы актинобактерий, в частности, штаммы группы , например, , , , ,  и . Также могут быть использованы модифицированные штаммы или мутанты.
Предпочтительно, смесь эпидаунорубицина и эпифеудомицина на стадии a) способа по настоящему изобретению получают путем экстракции из ферментационной среды. Данная экстракция может включать в себя несколько стадий, например, экстракцию с помощью соответствующей полимерной смолы с последующей жидкостной экстракцией. Смесь a), предпочтительно, получают из концентрата от жидкостной экстракции ферментационной среды и, при необходимости, путем добавления галогенсодержащих растворителей.
В особенно предпочтительном варианте исполнения исходная смесь на стадии a) имеет щелочное значение рН, в особенности предпочтительно, значение pH в диапазоне от 8 до 10,5.
3
В смеси a) эпидаунорубицин представлен в растворенной форме в присутствии хотя бы одного галогеносодержащего растворителя. В предпочтительном варианте галогенсодержащий растворитель выбирают из группы хлорированных растворителей, в частности, хлороформ (CHCl).
Содержание спиртов с 1-5 атомами углерода в смеси на стадиях a) и b)способа по настоящему изобретению составляет не более 5 об.%, исходя из общего объема смеси.
Неожиданно было обнаружено, что более высокое содержание спиртов с 1-5 атомами углерода приводит к снижению скорости реакции, что, в свою очередь, негативно влияет на степень чистоты эпидаунорубицина.
Следовательно, предпочтительным является вариант осуществления настоящего изобретения, в котором содержание спиртов с 1-5 атомами углерода в смеси на стадиях a) и b) составляет не более 4 об.%, в особенности предпочтительно, от 0,1 до 4 об.%, в частности, от 1,0 до 3 об.%, всегда исходя из общего объема смеси. Содержание спирта в заявленном диапазоне гарантирует, что эпидаунорубицин остается полностью растворенным, и что реакция завершается в удовлетворительном временном диапазоне.
Вариант осуществления настоящего изобретения, где спирт с 1-5 атомами углерода выбирают из группы, включающей метанол, бутанол, пропанол, этанол, пропанол, пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, 2,2-диметилпропанол и изобутанол также является предпочтительным. В особенно предпочтительном варианте спиртом с 1-5 атомами углерода является метанол.
Кроме того, вариант осуществления, в котором содержание воды в смеси на стадии a) составляет не более 1 об.%, исходя из общего объема смеси, является предпочтительным.
Неожиданно было обнаружено, что эпидаунорубицин, полученный с помощью способа по настоящему изобретению, имеет особенно высокую степень чистоты, если концентрация эпидаунорубицина на стадии a) составляет не более 13 г/л.
Следовательно, вариант осуществления, в котором концентрация эпидаунорубицина на стадии a) составляет не более 13 г/л, предпочтительно, от 6 до 13 г/л, в частности, в особенности предпочтительно, от 8 до 13 г/л. Было обнаружено, что нежелательные побочные реакции и нарушения реакции могут быть предотвращены, если концентрация эпидаунорубицина на стадии a) находится в указанном диапазоне. Например, может быть уменьшена опасность выпадения в осадок эпидаунорубицина. Выпадение в осадок эпидаунорубицина приводит к нежелательной потере выхода, поскольку осажденный эпидаунорубицин удаляется в результате процесса очистки. Кроме того, было отмечено, что вместе с эпидаунорубицином должны быть отделены примеси, эпифеудомицин также выпадает в осадок, поэтому осаждение не является подходящим способом очистки.
Согласно стадии b) способа по настоящему изобретению для очистки эпидаунорубицина, значение pH смеси устанавливается в пределах от 5,0 до 7,5. Неожиданно было обнаружено, что эпидаунорубицин дезинтегрирует, если значение pH выше, чем в заявленном диапазоне. Если значение рН слишком кислотное, то есть доведено до значения ниже 5, происходит нежелательное частичное протонирование эпидаунорубицина, что приводит к выпадению в осадок эпидаунорубицина вместе с феудомицином, так что он удаляется в последующем технологическом процессе.
Предпочтительно, значение pH смеси доводят до значения в пределах от 5,0 до 7,5 при помощи кислоты, проявляющей как подходящее значения pKa, так и хорошую растворимость в галогеносодержащих растворителях, в частности в хлороформе. В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению, значение рН смеси на стадии b) регулируют с помощью одной или более кислот, предпочтительно, органической кислоты, и в особенности предпочтительно, уксусной кислоты.
В другом предпочтительном варианте осуществления по заявляемому способу количество кислоты составляет от 0,05 до 0,3 об.%, предпочтительно, от 0,1 до 0,25 об.%, исходя из общего объема смеси. После добавления кислоты можно наблюдать явное увеличение скорости реакции. С другой стороны, если содержание кислоты составляет более 0,3 об.%, исходя из общего объема смеси, могут возникать проблемы с растворимостью, которые приводят к выпадению из раствора в осадок эпидаунорубицина вместе с эпифеудомицином, так что он удаляется в последующем технологическом процессе.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления кислоту, которую используют для регулирования значения рН в смеси, предварительно растворяют в спирте с 1-5 атомами углерода, предпочтительно, метаноле. Как неожиданно было обнаружено, это может предотвратить проблемы, связанные с растворимостью эпидаунорубицина и выпадения его в осадок. Общее содержание спирта с 1-5 атомами углерода, в частности, метанола, в смеси не должно превышать заявленного значения 5 об.%, исходя из общего объема смеси.
Согласно стадии с) по заявленному способу для очистки эпидаунорубицина, после доведения уровня рН до значения заявленном диапазоне, смесь на стадии b) нагревают выше 25°C. Неожиданно было обнаружено, что очистка может быть ускорена, если смесь нагревают до температуры выше 25°C. Предпочтительно, смесь нагревают до температуры, которая соответствует точке кипения галогеносодержащих растворителей. Было показано, что особенно приемлемы температуры выше 50°C, так как при данной температуре можно наблюдать значительное увеличение скорости реакции.
Следовательно, вариант осуществления, в котором смесь на стадии c) нагревают до температуры в диапазоне от 55 до 75°C, предпочтительно, от 60 до 65°C, является предпочтительным.
В предпочтительном варианте осуществления по заявленному способу смесь перемешивают в течение определенного периода времени при температуре более 25°C, предпочтительно, при температуре более 35°C, особенно в диапазоне от 60 до 65°C. Период времени должен позволять проводить заявленный способ эффективно и своевременно, и в то же время приводить к удовлетворительной степени чистоты эпидаунорубицина.
Следовательно, вариант осуществления по заявленному способу, в котором смесь на стадии с) перемешивают в течение периода времени не более 48 часов, предпочтительно, в течение периода времени от 10 до 30 часов и, в особенности предпочтительно, от 15 до 25 часов. Было обнаружено, что продолжительность реакции более чем 48 часов невыгодна с процедурной точки зрения, в то же время было обнаружено, что по прошествии времени реакции менее 10 часов снижение содержания эпифеудомицина в смеси является недостаточным. Вариант исполнения, в котором смесь на стадии с) перемешивают до тех пор, пока общее содержание эпифеудомицина составляет менее 1 мас.%, исходя из общего веса эпидаунорубицина, является в особенности предпочтительным, поскольку время реакции не превышает 48 часов. Количество эпифеудомицина в смеси может быть определено, например, с помощью стандартных хроматографических процессов, таких как обращенно-фазовая ВЭЖХ с использованием колонок с материалом RP-18.
Как описано на стадии d) способа по настоящему изобретению, эпидаунорубицин очищают. Такую очистку желательно проводить в то время, когда общее содержание эпифеудомицина упало ниже предельного значения 1 мас.%, основываясь на весе эпидаунорубицина, определяемого с помощью аналитической хроматографии. Кроме того, желательно, чтобы очистка эпидаунорубицина на стадии d) осуществлялась путем водной экстракции.
Во время очистки эпидаунорубицина на стадии d) было установлено, что выгодно, если водную экстракцию эпидаунорубицина на стадии d) проводят в щелочной среде. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления водную экстракцию эпидаунорубицина на стадии d) по заявленному способу осуществляют при значении рН от 8 до 10, предпочтительно, от 8,5 до 9,5. Значение рН может быть, доведено, например, с помощью аммиака, в результате чего было установлено, что особенно выгодно, если аммиак содержит приблизительно от 0,5 до 1,5 мас.% NaCl, во избежание частичного перехода эпидаунорубицина из органической фазы в водную. Количество аммиака, необходимое для доведения до требуемого значения рН, может колебаться и зависит от количества добавленной кислоты. Например, необходимое количество аммиака может быть в 2,5 раза больше количества кислоты в граммах.
2
Высокая степень чистоты эпидаунорубицина имеет важное значение для последующего преобразования эпидаунорубицина в эпирубицин, так как это единственный способ повысить выход продукта. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению за стадией d) следует еще одна стадия e), которая является хроматографической очисткой эпидаунорубицина. Хроматографическую очистку желательно проводить с силикагелем (SiO) в качестве стационарной фазы, в то время как смесь метанола и хлороформа предпочтительно использовать в качестве подвижной фазы. Преимущество в том, что растворитель не может быть изменен, что, в свою очередь, способствует повышению эффективности способа в соответствии с настоящим изобретением.
Неожиданно было обнаружено, что нагрузка хроматографической колонны эпидаунорубицином, очищенным с помощью способа по настоящему изобретению, может быть увеличена по сравнению с эпидаунорубицином, очищенным с помощью обычных процессов, не приводя к ухудшению эффективности разделения. Это является еще одним преимуществом способа в соответствии с настоящим изобретением, так как более высокая нагрузка колонны в сочетании с такими же характеристиками разделения позволяет сделать технологический цикл более эффективным и экономичным. Неожиданно было обнаружено, что нагрузка хроматографической колонны эпидаунорубицином, очищенным с помощью способа по настоящему изобретению, может быть увеличена до 7 мас.% в пересчете на сухую массу матрицы колонны, в то время как максимальная нагрузка колонны в традиционных процессах составляет около 4 мас.%
В еще одном предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению эпидаунорубицин на стадии e) подвергают дальнейшей очистке, например, кристаллизации. Кристаллизация может быть выполнена, например, в виде хлористоводородной соли. В связи с этим, было установлено, что качество эпидаунорубицина, очищенного в соответствии со способом по настоящему изобретению, является настолько высоким, после всего лишь одной стадии кристаллизации нет необходимости для проведения второй стадии, как правило, проводимого в стандартных процессах разделения предшествующего уровня техники.
В особенности предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению, способ включает следующие стадии:
а) получение смеси, содержащей эпидаунорубицин, эпифеудомицин и, по крайней мере, один галогеносодержащий растворитель, предпочтительно, хлороформ, в которой содержание феудомицина превышает значение 1 мас.%, исходя из общей массы эпидаунорубицина и эпифеудомицина;
b) регулирование значения рН смеси в диапазоне от 5,0 до 7,5;
c) нагревание смеси на стадии b) до температуры в диапазоне от 55 до 75°C, предпочтительно, от 60 до 65°C;
d) очистка эпидаунорубицина, предпочтительно, путем водной экстракции;
e) хроматографическая очистка эпидаунорубицина стадии d),
в котором содержание спиртов с 1-5 атомами углерода в смеси на стадиях a) и b) составляет от 0,1 до 4 об.%, предпочтительно, от 1,0 до 3,0 об.%, исходя из общего объема смеси, и количество воды на стадии a) составляет не более 1 об.%, исходя из общего объема смеси.
В еще один предпочтительный вариант осуществления способа по настоящему изобретению входят следующие стадии:
a) получение смеси, содержащей эпидаунорубицин, эпифеудомицин и, по крайней мере, один галогеносодержащий растворитель, предпочтительно, хлороформ, в которой содержание феудомицина превышает значение 1 масс.%, исходя из общей массы эпидаунорубицина и эпифеудомицина, и концентрация эпидаунорубицина находится в диапазоне 6 до 13 г/л;
b) регулирование значения рН смеси в диапазоне от 5,0 до 7,5;
c) нагревание смеси на стадии b) до температуры в диапазоне от 55 до 75°C, предпочтительно, от 60 до 65°C;
d) очистка эпидаунорубицина, предпочтительно, путем водной экстракции, в которой значение рН экстрагируемой смеси находится в диапазоне от 8 до 10, предпочтительно, от 8,5 до 9,5;
e) хроматографическая очистка эпидаунорубицина стадии d),
в котором содержание спиртов с 1-5 атомами углерода в смеси на стадиях a) и b) составляет от 0,1 до 4 об.%, предпочтительно, от 1,0 до 3,0 об.%, исходя из общего объема смеси, и количество воды на стадии a) составляет не более 1 об.%, исходя из общего объема смеси.
В предпочтительном варианте осуществления отдельные стадии процесса от a) до е) не являются взаимозаменяемыми. В особенности предпочтительно, чтобы способ проводился в заявленном порядке.
Далее изобретение будет описано более подробно в следующих примерах; тем не менее, они не должны ограничивать концепцию изобретения каким-либо образом.
Примеры:
Пример 1
3
Концентрацию эпидаунорубицина в смеси, содержащей хлороформ (CHCl), эпидаунорубицин и эпифеудомицин, устанавливают в количественном диапазоне от 8 до 12 г/л путем дистилляции. Соответствующая исходная смесь может быть получена, например, путем разделения фазы хлороформа и ферментационной среды. 194 г уксусной кислоты (0,15 мас.%) и 2,4 кг метанола (2 мас.%) были добавлены в концентрированный раствор (128 л), где количества, приведенные в мас.%, относились к общему объему раствора, и значение рН было отрегулировано в диапазоне от 5,0 до 7,5. Полученный раствор нагревали до 60 до 65°C и перемешивали в течение 17 часов в диапазоне температур. Затем смесь охлаждали до 25°C, и содержание примеси эпифеудомицина - исходя из веса эпидаунорубицина - определяли с помощью аналитической ВЭЖХ (ВЭЖХ с использованием колонок с материалом RP-18) и интегрирования измеренных пиков. Результаты показаны в Таблице 1.
Пример 2 служит в качестве Сравнительного Примера и показывает результат стандартной очистки эпидаунорубицина, отличающийся тем, что смесь не нагревали до температуры от 60 до 65°C и не добавляли уксусную кислоту. Проценты, показанные для эпифеудомицина, основаны на количестве эпидаунорубицина.
Таблица 1:
Пример
Эпифеудомицин (%)
1
0,6
2 (Сравнительный)
3,3
Как можно заключить из Таблицы 1, более высокая степень чистоты эпидаунорубицина может быть получена с помощью способа по настоящему изобретению, который отражается в более низком содержании эпифеудомицин.
На другом стадии эпидаунорубицин, очищенный с помощью способа по настоящему изобретению, дополнительно обрабатывают путем водной экстракции при значениях рН от 8 до 9 и последующей хроматографической очисткой. Были опробованы различные нагрузки колонны. Фракции, полученные в ходе хроматографической очистки были объединены, и были определены степень чистоты эпидаунорубицина и содержание эпифеудомицина. Результаты показаны в таблице 2. Нагрузка колонны означает весовое отношение эпидаунорубицина к сухой массе матрицы колонны, умноженное на 100%.
Таблица 2:
Пример
Нагрузка (%)
Очистка (%)
Выход (%)
Содержание эпи-феудомицина (%)
3
5,1
91
87
0,3
4
5,8
86
97
0,2
5
7,2
90
97
0,2
Как можно заключить из Таблицы 2, даже при высокой нагрузке колонны, эффективность разделения не только остается неизменной, но может быть даже увеличена.
В Таблице 3 показаны результаты экспериментов, в которых изменяли количество уксусной кислоты, используемой для регулировки значения рН. Как можно заключить из Таблицы 3, содержание эпифеудомицина уменьшается с увеличением количества кислоты. В качестве растворителя использовали хлороформ. Смеси, каждая из которых содержала 1 мас.% метанола, перемешивали в течение 25 часов при температуре 60°С до того, как определяли количество эпифеудомицина. Количественное содержание эпифеудомицина в исходной смеси составляло 8,7%. Пример 6 представлен как Сравнительный пример, в котором уксусную кислоту не добавляли к смеси.
Таблица 3:
Пример
Уксусная кислота (мас.%)
Эпифеудомицин (%)
6
0
7,7
7
0,1
3,3
8
0,2
1,9
9
0,3
1,3
10
0,5
0,8
Как показано в Таблице 3, даже добавление 0,1 мас.% уксусной кислоты в смесь, содержащую хлороформ, эпидаунорубицин, эпифеудомицин и 1 мас.% метанола приводит к заметному уменьшению примеси эпифеудомицина при продолжительности реакции 25 часов при температуре 60°С. Таким образом, степень чистоты полученного эпидаунорубицина может быть увеличена без потери его выхода из-за сложных методов очистки.
Как можно заключить из приведенных выше примеров, способ по настоящему изобретению приводит не только к значительно более высокой степени чистоты эпидаунорубицина, по сравнению со стандартными способами очистки, но также обеспечивает увеличение эффективности и экономичности процесса очистки за счет более высокой нагрузки колонны, в сочетании с, по крайней мере, такой же эффективностью разделения, и сокращения необходимых стадий процесса, как например, ненужность второй стадии кристаллизации.