Популяционный полиморфизм клубеньковых бактерий люцерны ( Sinorhizobium meliloti) по генам симбиотической эффективности и конкурентоспособности

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 3, с. 339-344

УДК 633.31:631.461.5 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.339rus

ПОПУЛЯЦИОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЫ (Sinorhizobium meliloti) ПО ГЕНАМ СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ И КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ*

О.П. ОНИЩУК, О.Н. КУРЧАК, Е.П. ЧИЖЕВСКАЯ, Н.А. ПРОВОРОВ,

Б.В. СИМАРОВ

Важнейшие признаки клубеньковых бактерий (ризобий), по которым проводится отбор хозяйственно ценных штаммов, — симбиотическая эффективность (способность повышать массу инокулированных растений-хозяев благодаря интенсивной фиксации молекулярного азота) и конкурентоспособность (способность инокулировать растения в присутствии других штаммов этого же вида ризобий). С помощью ПЦР-анализа штаммов ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) различного происхождения мы впервые показали полиморфизм природных популяций по генам Smc03879, или phbA («негативный регулятор эффективного симбиоза», кодирует синтез поли-р-гидроксибутирата), и Sma0907, или cmp-107 (участвует в конкуренции за образование клубеньков). В популяции, обитающей в бедной солончаковой почве (Уральская область, Казахстан), ген phbA выявлен у 100 % штаммов, тогда как в популяции из богатой черноземной почвы Тернопольской области Украины — лишь у 82,2 % штаммов. Еще более низкая встречаемость гена phbA (30,8 %) характерна для штаммов из клубеньков люцерны, собранных в Тернопольской области. Наблюдаемый полиморфизм может отражать низкую адаптивную значимость конверсии С-соединений в по-ли-р-гидроксибутират для штаммов ризобий из Тернопольской области по сравнению со штаммами из Уральской области. Участие гена phbA в контроле симбиотической эффективности подтверждается тем, что для гена nifH, который кодирует структуру малой субъединицы нитрогеназы, но не влияет на интенсивность ее синтеза, различий в показателях популяционного полиморфизма между штаммами двух популяций выявлено не было. Отсутствие во всех изученных популяциях полиморфизма по гену Smb21375, или eff-798, может быть связано с тем, что кодируемый им АВС-транспортер необходим для переноса в бактериальную клетку широкого спектра питательных веществ, получаемых как от растения-хозяина, так и из почвы. Высокая встречаемость эффективных симбионтов среди штаммов, лишенных гена phbA, указывает на возможность использования молекулярных зондов, содержащих этот ген, для отбора практически значимых генотипов ризобий, способных обеспечивать растения-хозяина значительными количествами фиксированного азота.

Ключевые слова: бобово-ризобиальный симбиоз, клубеньковые бактерии, азотфиксация, симбиотическая эффективность, конкурентоспособность, популяционный полиморфизм, ПЦР-анализ.

Клубеньковые бактерии (ризобии), которые формируют ^-фиксирующие симбиозы с бобовыми растениями, относятся к наиболее широко используемым в сельском хозяйстве микроорганизмами: масштабы их ежегодного выпуска в составе биопрепаратов для инокуляции бобовых культур по площадям исчисляются сотнями миллионов гектаров (1). До недавнего времени штаммы ризобий для приготовления препаратов получали методами аналитической селекции — посредством выделения из почв и клубеньков растений. С использованием транспозонового (Tn5) мутагенеза у ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) была получена коллекция мутантов по ef-генам, которые повышают симбиотическую эффективность (СЭ) бактерий — способность увеличивать продуктивность (биомассу, количество накапливаемого азота, урожай семян) у инокулируемых растений (2). Многие из этих генов, обозначенных как негативные регуляторы симбиоза, кодируют метаболизм поставляемых растениями С-сое-динений, включая их транспорт в клетку (eff-798), запасание в форме по-

* Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-01441 и Программой ЕврАзЭС, контракт № 14.М04.12.0011 (тестирование симбиотической активности), а также Российским научным фондом, грант № 14-26-00094 (молекулярное генотипирование популяций).

339

ли-р-гидроксибутирата (phbA) и расходование на синтез поверхностных полисахаридов (exoZ, rkpC, eglC). Эти гены расположены в различных частях генома S. meliloti (хромосома, мегаплазмиды), что создает предпосылки для их использования в конструировании штаммов с повышенной СЭ (3). Большой интерес для конструирования таких штаммов представляют также cmp-гены, определяющие способность ризобий конкурировать за образование клубеньков с находящимися в почве малоактивными аборигенными штаммами (4). Перспективными источниками исходного материала для этой работы служат природные популяции ризобий, изменчивые по наличию eff- и cmp-генов.

В настоящей статье впервые показан популяционный полиморфизм S. meliloti по генам, контролирующим симбиотическую эффективность и конкурентоспособность, который может быть использован для отбора хозяйственно ценных штаммов ризобий.

Методика. Штаммы клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizo-bium meliloti) выделяли по стандартной методике (5) из солончаковой почвы Уральской области (Казахстан), а также из черноземной почвы Тернопольской области (Украина) и из клубеньков произрастающей на ней люцерне разных видов (Medicago lupulina, M. sativa). Гены, контролирующие хозяйственно ценные симбиотические признаки, идентифицировали ранее на основе анализа Tn5-мутантов эффективных штаммов СХМ1-105 и СХМ1-188, обладающих повышенной симбиотической эффективностью (eff-798 и phbA) либо сниженной конкурентоспособностью (cmp-107) (2, 6, 7).

Для ПЦР-амплификации фрагментов ДНК, содержащих изучаемые гены, использовали следующие праймеры:

Smb21375 (eff-798) — 5'-GAGAACAGCCGGGAGGAAA-3' и 5'-CAGAACACAGCAGCCAAAGC-3';

phbA (eff-152) — 5'-CCTTCGGCAATACTCTCGC-3' и 5'-GTTGA-GACCCGAAGCGTTG-3';

Sma0907 (cmp-107) — 5'-CCACCCTCCAGATCCAAGGT-3' и 5'-CCTACGAGCTTTCCGGTCTC-3'.

Протокол проведения ПЦР: предварительная денатурация — 3 мин при 95 °С; 30 циклов — денатурация 30 с при 94 °С, отжиг праймеров 30 с при 54 °С, синтез ДНК 1 мин при 72 °С; финальный синтез ДНК — 5 мин при 72 °С (Термоциклер C1000TM, «Bio-Rad», США; ЦКП «Геномные технологии и клеточная биология» Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии). Полученные ПЦР-продукты разделяли в 1 % агарозном геле по стандартной методике (8). В качестве ДНК-мат-рицы в ПЦР использовали лизаты изучаемых штаммов ризобий. Для этого свежую культуру бактерий вносили в 20 мл лизирующего буфера (0,25 мМ NaOH; 0,25 % SDS), денатурировали в ПЦР-машине (95 °С, 15 мин), добавляли 180 мл бидистиллированной воды, центрифугировали 1 мин и хранили при -20 °С. Хромосомный локус IGS (участок между генами 16S- и 23S-рРНК), а также плазмидный локус, содержащий ген nifH (кодирует малую субъединицу нитрогеназы), анализировали по описанной ранее методике (9).

Симбиотическую эффективность штаммов S. meliloti изучали в стерильных микровегетационных опытах на люцерне посевной (M. sativa) сорта Вега (5).

Для статистической обработки данных использовали t-критерий Стьюдента (10).

Результаты. Для изучения популяционной изменчивости ризобий

340

люцерны (S. meliloti) по генам эффективности и конкурентоспособности в зависимости от экологических условий (тип почвы, возможность вступления в симбиоз) был проанализирован полиморфизм генов eff-798, phbA и cmp-107 у изолятов из контрастно различающихся почв: бедной, лишенной растительности солончаковой почвы Уральской области Казахстана и богатой черноземной почвы Тернопольской области Украины, на которой произрастают многочисленные популяции разных видов люцерны хмелевидной и посевной (M. lupulina и M. sativa).

1. Встречаемость генов эффективности и конкурентоспособности среди штаммов Sinorhizobium meliloti различного происхождения

Происхождение штаммов (их число) Доля штаммов, у которых выявлен ген, %*

eff798 | phbA | cmpl07

Уральская область, почва (24) 100 100a 91,7±5,6a

Тернопольская область, почва (46) 100 82,2±5,7b 84,8±5,3a

Тернопольская область, клубеньки (13) 100 30,8±12,8c 52,8±13,8b

* В каждой колонке одинаковыми буквами обозначены величины, которые достоверно не различаются

(P0 > 0,05).

Анализ полученных данных показал (табл. 1), что ген eff-798 (кодирует ABC-транспортер, обеспечивающий поступление в бактериальную клетку С-соединений) присутствует у всех штаммов S. meliloti независимо от источника выделения. Фрагмент ДНК, содержащий ген phbA (кодирует Р-кетотиолазу, участвующую в накоплении бактериями поли-р-гидрокси-бутирата), имеется у всех штаммов из почв Уральской области, однако выявляется только у 82,2 % штаммов из почв Тернопольской области. Еще более низкая встречаемость гена phbA (30,8 %) была характерна для штаммов из клубеньков люцерны, собранных в Тернопольской области.

Логично предположить, что полиморфизм ризобий по гену phbA, выявленный в популяции из Тернопольской области, отражает снижение способности бактерий накапливать углерод в форме поли-р-гидроксибу-тирата, связанное с переключением на симбиотрофное питание углеродом, в избытке поставляемым растениями. Вероятно, циркуляция бактерий между богатой углеродом черноземной почвой и растениями способствует ослаблению отбора в пользу штаммов, активно накапливающих запасные питательные вещества. В то же время отбор в пользу этого признака, определяющий однородность популяции из Уральской области по наличию гена phbA, может обеспечить ей максимальную выживаемость в бедной питательными веществами и лишенный растительности солончаковой почве. Отсутствие в изученных популяциях полиморфизма по гену eff-798, возможно, связано с тем, что кодируемый им АВС-транспортер необходим для переноса в клетку широкого спектра питательных веществ, получаемых как от растения-хозяина, так и из почвы.

Анализ СЭ S. meliloti в микровегетационных опытах показал, что все штаммы, у которых не удалось обнаружить ген phbA, эффективны (инокуляция достоверно повышала сухую массу растений люцерны сорта Вега), тогда как среди штаммов, содержащих этот ген, 29±8,1 % неэффективны. Однако для эффективных штаммов степень СЭ не зависит от присутствия гена phbA, что может быть связано с варьированием генетического фона, на котором осуществляется экспрессия этого гена.

В обеих почвенных популяциях S. meliloti был выявлен одинаково высокий полиморфизм по гену cmp-107, Tn5-мутация в котором снижает конкурентоспособность бактерий (см. табл. 1). В то же время среди изоля-тов из клубеньков, собранных в Тернопольской области, ген встречается реже, чем среди почвенных изолятов. Это позволяет предположить участие

341

гена cmp-107, кодирующего белок с неизвестными функциями, в конкуренции бактерий не только за клубеньковые, но и за почвенные экологические ниши.

При проведении контрольных опытов по анализу полиморфизма ризобий по маркерам, не связанным непосредственно с количественным проявлением активности симбиоза, оказалось (табл. 2), что, во-первых, изменчивость по локусу IGS для клубеньковых изолятов выше, чем для ризосферных, что отражает описанное ранее общее повышение популяционного полиморфизма ризобий при переходе из почвы в клубеньковую нишу (9); во-вторых, не было обнаружено различий между популяциями по локусу nifH, который кодирует малую субъединицу нитрогеназы, но не участвует в количественном определении азотфиксирующей активности клубеньков. Таким образом, различие почвенных и клубеньковых субпопуляций по наличию генов phbA и cmpl07 определяется именно их участием в контроле количественных признаков симбиоза.

2. Показатели структуры почвенной и клубеньковой субпопуляций Sinorhizo-bium meliloti по локусам igs и nifH

Локус Показатель Происхождение (число) штаммов

почва

IGS Число генотипов

Индекс Нея 0,384 0,798

Доля доминирующего генотипа, % 77±6 27 ±13*

nifH Число генотипов

Индекс Нея 0,486 0,489

Доля доминирующего генотипа, % 63±8 69±13

* Различие клубеньковой и почвенной популяций достоверно (Pq < 0,05).

Ранее у разных видов клубеньковых бактерий был описан ряд генов, контролирующих симбиотическую эффективность (11-17) и конкурентоспособность (18-22), однако исследования популяционного полиморфизма этих генов не проводились.

Итак, нами впервые показан популяционный полиморфизм клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meliloti) по генам, контролирующим хозяйственно ценные признаки — симбиотическую эффективность (phbA) и конкурентоспособность (cmp-107). Высокая изменчивость популяции из богатой питательными веществами черноземной почвы Тернопольской области по гену phbA, контролирующему образование поли-р-гидроксибутирата, может быть связана с высокой доступностью углерода, получаемого посредством гетеротрофного либо симбиотрофного питания, которая снижает интенсивность отбора в пользу штаммов, активно запасающих С-соединения. Анализ полиморфизма генов, выполняющих роль негативных регуляторов симбиотической эффективности, может быть использован при отборе штаммов, перспективных для инокуляции бобовых культур.

ЛИТЕРАТУРА

1. Тихонович И.А., Круглов Ю.В., Кожемяков А.П., Чеботарь В.К., Кандыбин Н.В., Лаптев Г.Ю. Биопрепараты в сельском хозяйстве. М., 2005.

2. Sharypova L.A., Onishchuk O.P., Chesnokova O.N., Fomina-Eshchen-ko J.G., Simarov B.V. Isolation and characterization of Rhizobium meliloti Tn5-mutants showing enhanced symbiotic effectiveness. Microbiology, 1994, 140: 463-470 (doi: 10.1099/00221287-140-3-463).

3. Проворов Н.А., Онищук О.П., Юргель С.Н., Курчак О.Н., Чижевская Е.П., Воробьев Н.И., Затовская Т.В., Сим ар о в Б.В. Конструирование высокоэффективных симбиотических бактерий: эволюционные модели и генетические подходы. Генетика, 2014, 50(11): 1273-1285 (doi: 10.7868/S0016675814110113).

342

4. Онищук О.П., Курчак О.Н., Шарыпова Л.А., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Анализ различных типов конкурентоспособности у Tn5-мутантов клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meliloti). Генетика, 2001, 37: 1507-1512.

5. Румянцева М.Л., Симаров Б.В., Онищук О.П., Андронов Е.Е., Чижевская Е.П., Белова В.С., Курчак О.Н., Мунтян А.Н., Румянцева Т.Б., Зато в с кая Т.В. Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценозах. Теоретические основы и методы. СПб, 2011.

6. Сагуленко Е.А., Шарыпова Л.А., Кроль Е.А., Симаров Б.В. Клонирование генов «эффективности» Rhizobium meliloti с использованием вектора pK18mob. Генетика, 1998, 34: 903-907.

7. Chizhevskaya E.P., Onishchuk O.P., Sharypova L.A., Simarov B.V. Isolation and characterization of a gene involved in control of nodulation competitiveness of Sinorhizobium meliloti strain CXM1-105. Proc. 11th Int. Congr. on molecular plant-microbe interactions /I.A. Tikhonovich., B.J.J. Lugtenberg, N.A. Provorov (eds.). St. Petersburg, 2004: 549-553.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.

9. Проворов Н.А., Андронов Е.Е., Онищук О.П., Курчак О.Н., Чижевская Е.П.. Генетическая структура интродуцированных и местных популяций Rhizobium leguminosarum в системах «растения-почва». Микробиология, 2012, 81: 244-253.

10. Л а кин Г.Ф.. Биометрия (4-е изд.). М., 1990.

11. Finan T.M., McWhinnie E., Driscoll B.T., Watson R.J. Complex symbiotic phenotypes result from gluconeogenic mutations in Rhizobium meliloti. Mol. Plant Microbe Interact., 1991, 4: 386-392.

12. Cevallos M.A., Encarnacion S., Leija A., Mora Y., Mora J. Genetic and physiological characterization of a Rhizobium etli mutant strain unable to synthesize poly-beta-hydroxybutyrate. J. Bacteriol., 1996, 178: 1646-1654.

13. Юр гель С.Н., Шарыпова Л.А., Симаров Б.В. Т^-мутации Rhizobium meliloti, вызывающие повышение редокс-потенциала свободноживущих клеток и эффективности их симбиоза с люцерной. Генетика, 1998, 34: 737-741.

14. Yurgel S.N., Kahn M.L. Dicarboxylate transport by rhizobia. FEMS Microbiol. Rev., 2004, 28: 489-501 (doi: 10.1016/j.femsre.2004.04.002).

15. Miller S.H., Elliot R.M., Sullivan J.T., Rons on C.W. Host-specific regulation of symbiotic nitrogen fixation in Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Microbiology, 2007, 153: 3184-3195 (doi: 10.1099/mic.0.2007/006924-0).

16. Bonaldi K., Gourion B., Fardoux J., Hannibal L., Cartieaux F., Bour-sot M., Vallenet D., Chaintreuil C., Prin Y., Nouwen N., Giraud E. Large-scale transposon mutagenesis of photosynthetic Brndyrhizobium sp. strain ORS278 reveals new genetic loci putatively important for nod-independent symbiosis with Aeschynomene in-dica. Mol. Plant Microbe Interact., 2010, 23: 760-770 (doi: 10.1094/MPMI-23-6-0760).

17. Онищук О.П., Воробьев Н.И., Проворов Н.А., Симаров Б.В. Симбиотическая активность ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) с генетическими модификациями системы транспорта дикарбоновых кислот. Экологическая генетика, 2009, 7(2): 3-10.

18. Онищук О.П., Шарыпова Л.А., Курчак О.Н., Беккер А., Симаров Б.В. Выявление генов Sinorhizobium meliloti, влияющих на синтез поверхностных полисахаридов и конкурентоспособность. Генетика, 2005, 41: 1617-1623.

19. Pobigaylo N., Szymczak S., Nattkemper T.W., Becker A. Identification of genes relevant to symbiosis and competitiveness in Sinorhizobium meliloti using signature-tagged mutants. Mol. Plant-Microbe Interact., 2008, 21: 219-231 (doi: 10.1094/MPMI-21-2-0219).

20. Williams A., Wilkinson A., Krehenbrink M., Russo D.M., Zorreguie-ta A., Downie J.A. Glucomannan-mediated attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hairs is required for competitive nodule infection. J. Bacteriol., 2008, 190: 4706-4715 (doi: 10.1128/JB.01694-07).

21. van Dillewijn P., Soto M.J., Villadas P.J., Toro N. Construction and environmental release of a Sinorhizobium meliloti strain genetically modified to be more competitive for alfalfa nodulation. Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67: 3860-3865 (doi: 10.1128/AEM.67.9.3860-3865.2001).

22. Ding H., Yip C.B., Geddes B.A., Oresnik I.J., Hynes M.F. Glycerol utilization by Rhizobium leguminosarum requires an ABC transporter and affects competition for nodulation. Microbiology, 2012, 158: 1369-1378 (doi: 10.1099/mic.0.057281-0).

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию

микробиологии, 30 марта 2015 года

196608 Россия, г. Санкт-Петербург-Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: olony@yandex.ru

343

SelSkokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 3, pp. 339-344

POPULATION POLYMORPHISM OF THE ALFALFA NODULE BACTERIA (Sinorhizobium meliloti) FOR THE GENES ENCODING FOR SYMBIOTIC EFFICIENCY AND COMPETITIVENESS

O.P. Onishchuk, O.N. Kurchak, E.P. Chizhevskaya, N.A. Provorov, B.V. Simarov

All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 3, sh. Podbel’skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail olony@yandex.ru

Supported by Russian Foundations for Fundamental Research

Received March 30, 2015 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.339eng

Abstract

The most important traits of nodule bacteria (rhizobia), which are tested for selection of commercially valuable strains are the symbiotic efficiency (ability to increase the mass of the inoculated host plants due to intensive fixation of molecular nitrogen) and competitiveness (ability to inoculate the plants in the presence of other rhizobia strains of the same species). By PCR analysis of alfalfa rhizobia (Sinorhizobium meliloti) of various origins we for the first time showed polymorphism of natural populations for genes Smc03879 or phbA (negative regulator of the effective symbiosis, encodes for synthesis of poly-p-hydroxybutyrate) and Sma0907 or cmp-107 (involved in the competition for nodultion). The population of the Uralsk region of Kazakhstan living in the impoverished saline soil, phbA gene was detected in 100 % of the strains, while population of the rich Chernozem soil of the Ternopil region of Ukraine in only 82.2 % of the strains. Even lower occurrence of phbA (30.8 %) is characteristic of the strains isolated from alfalfa nodules collected in the Ternopil region. This polymorphism may reflect a low adaptive value for conversion of C-compounds into poly-p-hydroxybutyrate for rhizobia strains from the Ternopil region in comparison with the strains of the Uralsk region. Participation of gene phbA in the control symbiotic efficiency is confirmed by the fact that the gene nifH, which encodes for the structure of the small subunit of nitrogenase, but does not affect the intensity of its synthesis, differences in polymorphism between strains of two populations were not identified. The absence of polymorphism for gene Smb21375 or eff-798 in all studied populations may be due to the fact that it encodes an ABC transporter required for the uptake by bacteria the broad range of essential nutrients obtained from both the host plant or from the soil. An increased incidence of effective symbionts among strains lacking gene phbA, indicates the prospects to use the molecular probes containing this gene for the selection of practically important rhizobia genotypes that can provide the plant host with the significant amounts of fixed nitrogen.

Keywords: legume-rhizobia symbiosis, nodule bacteria, nitrogen fixation, symbiotic efficiency, competitiveness, population polymorphism, PCR analysis.

Научные собрания

IV МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ В СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВЕ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР. ТРАДИЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ»,

посвященная 95-летию Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур

Организаторы: Российская академия наук, Федеральное агентство научных организаций, Министерство образования и науки РФ, Министерство сельского хозяйства РФ, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур»

Основные тематические направления:

❖ Теория, методы создания и идентификации исходного материала для селекции овощных культур

❖ Приоритетные направления селекции:

на стабильную продуктивность; на высокое качество продукции;

на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессорам

❖ Технологические, организационно-экономические аспекты семеноводства овощных культур

Контакты и информация: vegetables.of.russia@yandex.ru, vniissok@mail.ru, http://www.vniissok.ru

344