Биоинформационный поиск и скрининг фагов и плазмид через спейсерные сайты CRISPR/Cas-системы штамма Yersinia pseudotuberculosis ypiii

Сибирский медицинский журнал (Иркутск), 2015, № 7

оригинальные исследования

© перетолчина н.п., джиоев ю.п., борисенко а.ю., парамонов а.и., воскресенская е.а., степаненко л.а., зелинская Н.Е.,

КОЛБАСЕЕВА о.В., ШМИДТ н.В., ЗЛоБИн В.И. - 2015 удк 576.8

биоинформационный поиск и скрининг фагов и плазмид через спейсерные сайты crispr/cas-системы штамма yersinia pseudotuberculosis ypiii

Надежда Павловна Перетолчина1, Юрий Павлович Джиоев1-2, Андрей Юрьевич Борисенко1, Алексей Игоревич Парамонов2, Екатерина Александровна Воскресенская3, Лилия Александровна Степаненко1, Надежда Евгеньевна Зелинская1, Ольга Владимировна Колбасеева1, Надежда Васильевна Шмидт1,

Владимир Игоревич Злобин1

Резюме. В работе представлены результаты поиска бактериофагов и плазмид через расшифрованные спейсерные последовательности штамма Y. pseudotuberculosis YPIII с использованием методов биоинформатики. Для поиска CRISPR/Cas-систем использовали методы программного моделирования MacSyFinder. Расшифровку и анализ CRISPR-кассет проводили с помощью пакета программ по трем поисковым алгоритмам, объединенных в суммарный блок. Скрининг бактериофагов и плазмид по спейсерным последовательностям CRISPR-кассет осуществляли с использованием программных систем поиска BLAST по фаговым и плазмидным базам данных. В результате исследования представлен программный алгоритм поиска CRISPR/Cas-систем и скрининга бактериофагов и плазмид, через спейсерные последовательности CRISPR-кассет исследуемого штамма. Было определено, что CRISPR/ Cas-система штамма Y. pseudotuberculosis YPIII относится к типу IF и имеет 2 локуса, расположенных на расстоянии друг от друга. Показано, что cas-гены находятся в непосредственной близости от первой CRISPR-кассеты. Спейсеры бактерии идентичны протоспейсерам Staphylococcus phage, Enterobacteria phage phi80 и Enterobacteria phage HK225. Обнаружено соответствие спейсерной последовательности с участком ДНК плазмиды штамма Yersinia pseudotuberculosis YP 31758.

Ключевые слова: Yersinia pseudotuberculosis, CRISPR/Cas-система, бактериофаги, плазмиды, биоинформатика, суммарный блок программных методов.

bíoínformatíc search and screening of phages and plasmíds by spacer sequence of yersinia pseudotuberculosis ypiii crispr/cas system

N.P. Peretolchina1, Yu.P. Dzhioev1,2, A.Yu. Borisenko1, A.I. Paramonov2, E.A. Voskresenskaya3, L.A. Stepanenko1, N.E. Zelinskaya1, O.V. Kolbaseeva1, N.V. Shmidt1, V.I. Zlobin1

Summary. The research presents the results of phages and plasmids search by decoded spacer sequences of str. Y. pseudotuberculosis YPIII using bioinformatic technologies. The modeling software MacSyFinder was used in order to identify CRISPR/Cas system. The interpretation and analysis of CRISPR-locuses was carried out by software package, combined into accumulated block. The phages and plasmids analysis was realized by BLASTn searching algorithm in phages and plasmids databases through spacer sequences of CRISPR/Cas system. As a result the software search algorithm of CRISPR/Cas system, phages and plasmids is presented. The CRISPR/Cas system of str. Y.pseudotuberculosis YPIII refers to the IF type and has 2 locuses in different positions. Cas-genes are situated after CRISPR-1. Bacterial spacers are identical to Staphylococcus phage, Enterobacteria phage phi80 и Enterobacteria phage HK225. The correspondence of spacer sequence with plasmid pVM82 of str. Yersinia pseudotuberculosis YP 31758 was discovered.

Key words: Yersinia pseudotuberculosis, CRISPR/Cas system, bacteriophages, plasmids, bioinformatics, total block programming methods.

В связи с возрастающей устойчивостью патогенных бактерий к большому количеству антибиотиков и химиотерапевтических препаратов поиск альтернативных методов борьбы с ними становится все более актуальным. Поэтому, в настоящее время в медицинской практике вновь возрастает интерес к применению бактериофагов для лечения инфекций бактериального происхождения. Однако внедрение принципов фаготерапии в повседневную практику требует всестороннего изучения взаимодействий между бактерией и специфическим фагом [6,8].

Длительное время считалось, что бактерии беззащитны в отношении бактериофагов. Но за последние несколько лет были открыты молекулярные механизмы защиты бактерий и архей от чужеродных генетических внутриклеточных элементов - бактериофагов и плазмид [9,15,24]. Этот процесс осуществляется через структуры

CRISPR/Cas-системы, эволюционно сформировавшейся у микроорганизмов в ходе антагонистического противостояния с фагами и плазмидами [26,27]. CRISpR/ Cas-система (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR - associated proteins, или короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами с CRISPR-ассоциированными белками) - это специфическая адаптивная защитная система прокариот от чужеродного генетического материала. CRISPR-кассеты представляют собой набор коротких палиндромных повторов длиной 21-47 пар нуклеотидов (п.н.), разделенных уникальными спейсерными сайтами. Спейсеры комплементарно соответствуют участкам генов (протоспейсерам) бактериофагов и плазмид, к которым бактерия демонстрирует устойчивость [11]. В непосредственной близости от CRlSPR-локуса находятся cas-гены, продукты которых обеспечивают функ-

ционирование CRISPR-локусов. На сегодняшний день выделяют 3 типа CRISPR/Cas-систем, различающихся по cas-генам, представленным в геноме, и по механизму действия системы [16,21,22].

Спейсерные последовательности CRISPR/Cas-системы, в том числе, несут информацию о встречах бактерии с плазмидами в ходе эволюционного процесса. Учитывая, что плазмиды ответственны за проявление бактериальной клеткой различных признаков (формирование лекарственной устойчивости, экспрессия факторов патогенности и др.), наличие спейсеров, комплементарных протоспейсерным сайтам плазмидной ДНК, может влиять на способность бактерий приобретать те или иные свойства. В частности, патогенность Yersinia pseudotuberculosis - возбудителя псевдотуберкулеза у животных и людей зависит в значительной степени от наличия плазмид, которые отвечают за синтез факторов вирулентности [2,3,4,6,20].

За последние годы с помощью метода секвенирова-ния были расшифрованы гены и геномы многих видов бактерий. Для обработки полученной информации о последовательностях ДНК широко используются методы биоинформатики. Биоинформационные технологии позволяют в расшифрованных полногеномных последовательностях обнаружить и определить структуры нуклеотидных повторов CRISPR/Cas-систем [2].

вания MacSyFinder (Macromolecular System Finder, ver. 1.0.2) [7]. Поиск точной гомологии последовательностей проводили при помощи установленных вспомогательных пакетов makeblastdb (ver.2.2.28) и HMMER (ver. 3.0), а также осуществляли выявление структурных и функциональных характеристик, обнаруженных cas-генов анализируемого генома [15]. Нами разработан общий алгоритм поиска и расшифровки CRlSPR-кассет за счет объединения в суммарный блок трех алгоритмов поиска, включающих следующие программы: PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats, CRISPI: a CRISPR Interactive database и CRISPR Finder: CRISPR finder program online [13,17,25]. Для скрининга фагов и плазмид по спейсерным сайтам было использовано онлайн-приложение «CRISPR Target: a tool to explore targets of CRISPRRNAs», фаговые базы данных и алгоритм поиска BLASTn [10,18,23].

Результаты и обсуждение

В результате анализа полногеномной последовательности Y. pseudotuberculosis YPIII была выявлена CRISPR/ Cas-система, относящаяся к типу IF. При помощи MacSyFinder были обнаружены и описаны структурно-функциональные характеристики 3 cas- и 3 csy-генов, являющихся обязательными (mandatory) (табл. 1).

Таблица 1

Структурно-функциональные характеристики cas-генов Y. pseudotuberculosis YPIII

Hits summary for detected CAS-TypelF system

Color Sequence Id Position Profile Match Gene Function status System Protein length (aa) Score hevalue Profile coverage Sequence coverage Begin match End match

ld|CP009792.1_prot_BZ22_2209_2136 2136 cas1_TypelF mandatory CAS-TypelF 326 544.7 1.3e-164 1.00 0.94 1. 318

Id CP009792.1_prot_BZ22_2210_2137 2137 cas3-cas2_TypelF mandatory CAS-TypelF 1095 1818.4 0 1.00 1.00 1 1090

ld|CP009792.1_prot_BZ22_2214_2141 2141 cas6_TypelF mandatory CAS-TypelF 184 234.7 1.6e-70 1.00 0.99 3 184

lcl|CP009792.1_prot_BZ22_2211_2138 2136 csy1_TypelF mandatory CAS-TypelF 446 531.6 22e-160 1.00 0.85 5 436

lcl|CP009792.1_prot_BZ22_2212_2139 2139 csy2_TypelF mandatory CAS-TypelF 316 417.3 7e-126 1.00 0.94 4 300

Id CP009792.1_prot_BZ22_2213_2140 2140 csy3_TypelF mandatory CAS-TypelF 334 506.8 7.3e-153 1.00 0.98 7 333

Примечания: Sequence Id: название белка в полногеномной последовательности, представленной в базах данных GenBank; Position: позиция исследуемого белка относительно других белков Y. pseudotuberculosis YPIII; Profile Match: совпадение исследуемого белка с аминокислотным профилем cas-белков; Gene Status: статус гена; mandatory - ген свидетельствует о наличии активной CRISPR/ Cas-системы; System: тип CRISPR/Cas-системы; Protein length: длина аминокислотной последовательности; Score: показатель совпадения профилей (hmmer); Profile coverage: процент перекрытия аминокислотных профилей cas-белков с исследуемой аминокислотной последовательностью; Sequence coverage: процент перекрытия исследуемой аминокислотной последовательности с аминокислотным профилем cas-белков; Begin match: начальная позиция, в которой аминокислотные профили совпадают; End match: конечная позиция, в которой аминокислотные профили совпадают.

Скрининг спейсеров с помощью биоинформационных методов дает возможность в короткие сроки определить степень устойчивости бактерий к специфичным фагам и плазмидам. Исследования в этом направлении крайне актуальны как для изучения внутривидовых и межвидовых эволюционных процессов, так и для решения практических задач терапии инфекционных заболеваний [6,8].

Целью данной работы являлись исследования по разработке биоинформационного алгоритма поиска и скрининга фагов и плазмид через спейсерные последовательности CRISPR/Cas-системы на примере штамма Y. pseudotuberculosis YPIII, представленного в международных базах данных GenBank.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использована полногеномная последовательность штамма Y. pseudotuberculosis YPIII, представленная в базах данных GenBank (NZ_CP009792). Для поиска CRISPR/Cas-систем применяли методы программного моделиро-

Штамм Y. pseudotuberculosis YPIII содержит в своем геноме 2 локуса CRISPR/Cas-системы размером 2791 (CRISPR-1) и 1828 (CRISPR-2) нуклеотидных оснований (н.о.) с уникальной последовательностью повторов в CRISPR-кассетах размером 28 н.о. (рис. 1). В результате расшифровки и анализа CRISPR-кассет было установлено, что первая кассета содержит 46 спейсеров размером 32 н.о., а вторая кассета - 30 спейсеров размером 31-33 н.о. (табл. 2). При сопоставлении полученных данных по cas-генам и CRISPR-кассетам было установлено, что cas-гены находятся после CRISPR-кассеты-! (рис. 2). Можно предположить, что активность CRISPR-кассет регулируется одним набором этих генов. Причем, ло-кус CRISPR-1, возможно, «обслуживается» в первую очередь из-за того, что возможно, она сформировалась раньше, а структура CRISPR-кассеты-2 сложилась позже. Либо cas-гены обеспечивают функционирование кассет в равной степени, но до сих пор остается открытым вопрос о выборе кассеты для встраивания новых спейсеров cas-генами. В любом случае, этот интересный факт требует дальнейшего анализа на расширенной выборке штаммов Y. pseudotuberculosis.

Рис. 1. Расположение CRISPR-кассет и чередующиеся повторы в геноме Y. pseudotuberculosis YPIII.

Расшифрованные спейсерные последовательности CRISPR-кассет в дальнейшем были использованы для

Списка спейсерных последовательностей (spacer), представленных в первой CRISPR-кассете

начало Конец последовательность размер

spacer 1 2470696 2470727 CTACTAACCCAGATTATTTAATGAATGACATA 32

spacer 2 2470756 2470787 AATTATTACTGTTGATAAACTTATCGATACTG 32

spacer 3 2470816 2470847 TACTCTGAAACTACGGAGTGCGATTATATTTC 32

spacer 4 2470876 2470907 CTACTAACCCAGATTATTTAATGAATGACATA 32

spacer 5 2470936 2470967 ACTTACATCAAAAACATTTCTAGATGCCCATG 32

spacer 6 2470996 2471028 CGGTTGGGCCATCTCGTGCACTGACCTGATAGC 33

spacer 7 2471057 2471088 TGCTGCAAACTTAGCTACTTCAGGCAAACATA 32

spacer 8 2471117 2471148 ATCCGCATGCATTCGTTGAAGCCACTCAATGC 32

spacer 9 2471177 2471208 AAGTAACGAATAGGCGCTATTCCAGCTCCCGC 32

spacer 10 2471237 2471268 TTGATATGGTCATGCGGGGTTATCACATTGGC 32

spacer 11 2471297 2471328 ATTACCGGCAGTCAATCTGCTGAGGAATAGTT 32

spacer 12 2471357 2471388 TAAAAATACTGTAGTAAACAATACTTTTAGTG 32

spacer 13 2471417 2471449 AAGTTAAACAGTATGTGGACGATGAAATAAGTA 33

spacer 14 2471478 2471509 GCCCCAAGTACCACCAATAGACTCCCAATACT 32

spacer 15 2471538 2471570 CAGTCTGGCGGCGCATTATCTGGTTTTATGTAT 33

spacer 16 2471599 2471630 CTATCAGCTTCGAATACAGAGCGCAGATAGAA 32

spacer 17 2471659 2471690 ACTCAGAAATATTTTTATTTGGCCCTATTTTT 32

spacer 18 2471719 2471750 AGAGAGTCCGCTACGGCTGGCAATGATTGTAT 32

spacer 19 2471779 2471810 TGATAATAAAACAGGTTTTTTGAGTCCATTTG 32

spacer 20 2471839 2471870 ACACGATTCAACTACAAAAATGACTCGTTTTA 32

spacer 21 2471899 2471930 GTGTAGACGCTTATGCTCAGGTTCTACTAATA 32

spacer 22 2471959 2471990 TATCTCGGCTGTGAAGAGGTCGAATACACCGA 32

spacer 23 2472019 2472050 GTTAGCGCCACCGGTCTTAATAACGCTACAAC 32

spacer 24 2472079 2472110 CCCTCTATGTTTGACTCACTACACTCTGAGGG 32

spacer 25 2472139 2472170 GTGCTAGCTAATCACGCTAGTAGTGTGCAAGG 32

spacer 26 2472199 2472231 TTCTCCGGCTCGGCGGCTAGCTGCCTGATTATT 33

spacer 27 2472260 2472291 ATGAAACATGCAATCAGCACGGCAATAGATTT 32

spacer 28 2472320 2472351 ACAGGAAAAAGATGAAACCGAGAGGCTTGAGG 32

spacer 29 2472380 2472411 TTCACACACTGCAAATGGACCTTATTTCTAAT 32

spacer 30 2472440 2472471 ACCGTGCAAGTCTGGCGGGTTGGTTTCGCCAC 32

spacer 31 2472500 2472531 GTTTTAATGTGAGAAATAGAGCGCATCCACGC 32

spacer 32 2472560 2472591 AATCTGGATAGCGCATATTTATCCTGTTTATT 32

spacer 33 2472620 2472651 ATGGTGTCATCATCAATAATAAAACCAAATGA 32

spacer 34 2472680 2472711 TTTATTAATTGAGTTTGCGCGTATACCCATTT 32

spacer 35 2472740 2472771 CATTAATAGAGGTATAAAAGGGATCATATTAT 32

spacer 36 2472800 2472831 ATAGACTCCCAATACTCACCCAACAATTTAAA 32

spacer 37 2472860 2472891 ATTATAATAATCGTGATTGTCTTTAAACGCTA 32

spacer 38 2472920 2472951 AGTGTTCTGTATTAATTTGCCTTCACATCTAA 32

spacer 39 2472980 2473011 AAGTTAAACAGTATGTGGACGATGAAATAAGT 32

spacer 40 2473040 2473071 AATTGAAATAATGGTTACTGGCAACGGGCAAG 32

spacer 41 2473100 2473131 ATTAAAGAATAAATTGTATTCTAAATAGTTGT 32

spacer 42 2473160 2473191 TACAGGAGGTGATCTAAATCTCAATCCGGTAG 32

spacer 43 2473220 2473251 ACGTAAACGAGAATATAGACACCTTCCTGATC 32

spacer 44 2473280 2473311 GCTAATCATGCTGCTAATGGTGCCGCGCGAGA 32

spacer 45 2473340 2473371 ACTAATAGTTGGCCCGCTGTAGGCTCGTCCGC 32

spacer 46 2473400 2473431 ATCCGGCAGCGCATCAAACTCAAGAACATCGC 32

скрининга фагов и плазмид, к которым бактерия может проявлять устойчивость (табл. 3). В результате биоинформационного скрининга фагов, идентичных спей-серным последовательностям CRISPR-кассет, были обнаружены соответствия протоспейсерам Staphylococcus phage StB20-like (номер доступа GenBank: KT429161), Enterobacteria phage phi80 (JX871397) и Enterobacteria phage

HK225 (JQ086371). Принимая во внимание, что бактериофаги как вирусы обладают высокой мутационной изменчивостью, CRISPR/Cas-система способна сохранять устойчивость при наличии не более 2-4 мутаций в протоспейсерной последовательности фага [20]. Для штамма Y. pseudotuberculosis YPIII было показано, что только 2 спейсера первой CRISPR-кассеты несут устойчивость к бактериофагам, представленных в базе данных.

Так, спейсер 39 был идентичен участку протоспейсера ДНК Staphylococcus phage StB20-like (KT429161), а спейсер 22 - двум бактериофагам одновременно: Enterobacteria phage phi80 (JX871397) и Enterobacteria phage HK225 (JQ086371).

Возможно, данное явление связано с тем, Таблица 2 что этот участок ДНК включен в ген, который кодирует один и тот же белок. Однако, анализ последовательностей, представленных в базах данных GenBank, показал, что последовательность исследуемого прото-спейсера встречается также в различных генах бактериофагов.

Более разнообразная картина наблюдается при поиске и анализе плазмид через выявленные спейсерные последовательности. Для первой CRISPR-кассеты обнаружены соответствия с протоспейсерами плаз-мид рода Borrelia, Pseudomonas и Clostridium. Спейсер 2 идентичен протоспейсеру линейной плазмиды Borrelia hermsii, которая отвечает за образование антигенных вариаций бактерий [5]. Также спейсер 2 идентичен участку ДНК плазмиды Pseudomonas aeruginosa. Спейсер 41 определяет устойчивость Y. pseudotuberculosis к плазмидам Borrelia crocidurae и Clostridium botulinum. Спейсеры второй CRISPR-кассеты несут устойчивость к плазмидам бактерий рода Azospirillum (спейсер 24) и Pantoea ananatis (спейсер 9). Интересно, что бактерии рода Azospirillum и Pantoea являются фитопато-генами [12,19]. Также оказалось, что спей-сер 4 соответствует участку ДНК плазмиды pVM82 штамма Yersinia pseudotuberculosis IP 31758, которая несет основные факторы па-тогенности бактерии [14]. Возможно, «иммунитет» бактерии к плазмиде своего вида позволит объяснить различия патогенных свойств у штаммов.

Таким образом, используемые в данной работе биоинформационные технологии позволяют описать CRISPR/Cas-системы бактерий, а также оценить степень их устойчивости к фагам и плазмидам. Разработанный нами суммарный поисковый алгоритм CRISPR/Cas-систем, объединяющих три программных алгоритма позволил повысить качество и мощность скрининга, что является важным инструментом отсечения ложноположительных или ложноотрицательных данных наличия искомых систем. Каждая из этих трех поисковых программ выдает специфичную ей структуру вариантов наличия или отсутствия CRISPR/Cas-систем, что искажает истинную картину. Объединив в один суммарный блок все три поисковых программных алгоритма, получаем консенсусную информацию, более близкую к истинной структуре CRISPR/Cas-систем, если они выявляются в

Рис. 2. Схематичное расположение cas-генов и CRISPR-кассет в геноме Y. pseudotuberculosis YPIII.

определенном штамме бактерии. На примере штамма Y. pseudotuberculosis YPIII нами показано, что, имея в своем геноме 2 локуса CRISPR/Cas-системы и активные cas-

Таблица 3

Список спейсеров и соответствующих им протоспейсеров фагов и плазмид в геноме Ypseudotuberculosis YPIII

Спейсер* Номер доступа Genbank Протоспейсер Баллы**

Бактериофаги

Spacer22 1 JX871397 Enterobacteria phage phi80 22

Spacer22_1 JQ086371 Enterobacteria phage HK225 22

Spacer39 1 KT429161 Staphylococcus phage StB20-like 20

Плазмиды

Spacer2 1 NC 021623 Borreliahermsii strain HS1 plasmid lp174 20

Spacer2_1 NZ CP005707 Borreliahermsii YBT 20

Spacer2_1 NZ CP004154 Borreliahermsii YOR clone 20

Spacer 2_1 NZ CP005690 Borreliahermsii MTW clone 20

Spacer 2_1 NZ CP011370 Pseudomonas aeruginosa strain S04 90 20

Spacer2 1 NG 036554 Pseudomonas aeruginosa plasmid Rms148 20

Spacer41_1 NZ CP004342 Borreliacrocidurae DOU clone 20

Spacer 41 1 NZ CP004270 Borreliacrocidurae DOU clone 20

Spacer41_1 NZ CP006901 Clostridium botulinum Prevot_594 plasmid pCBH 20

Spacer4 2 NC 009705 Yersinia pseudotuberculosis IP 31758 22

Spacer9_2 NC 016817 Pantoea ananatis LMG 5342 plasmid pPANA10 20

Spacer24_2 NC 013859 Azospirillum sp. B510 plasmid pAB510e 21

Примечания: *8раеегх_у, гдех-номерспейсера, у-номерСККРЯ-кассеты; **Степень идентичности спейсера и протоспейсера. Является результатом суммы одинаковых н.о. в последовательностях спейсера и протоспейсера за вычетом несовпадающих н.о.

гены, данный штамм высоко устойчив к чужеродным генетическим элементам. Также количество спейсеров и степень их идентичности протоспейсерам бактериофагов и плазмид свидетельствует об уровне их воздействия на штамм в ходе эволюции.

Как видим из результатов данного исследования, первичной целью которого являлась разработка биоинформационного алгоритма поиска и скрининга фагов и плазмид через спейсеры CRISPR/Cas-системы штамма Y. pseudotuberculosis YPIII, обнаружились очень интересные факты, которые, возможно, во многом специфичны для этого штамма. Наличие двух CRISPR-кассет не является особенностью данного штамма, но присутствие одного набора CRISPR-ассоциированных генов при CRISPR-кассете-!, возможно характеризует

некоторую специфичность СКВРШСаз-системы относительно СШ8РБ.-кассеты-1. Возможно, данная система функционально является ведущим запуска обоих кассет или более «древним» относительно СШ8РБ.-кассеты-2. Также показано, что из большого количества спейсеров в обоих кассетах только к 6 спейсерам выявлены протоспейсеры в фагах и плазмидах. Но наличие спейсерных последовательностей в СККРЯ-кассетах бактерии свидетельствует о встрече и с другими про-тоспейсерами фагов и плазмид, которых еще нет в базах данных. Большой набор разнообразных спейсерных последовательностей в кассетах данного штамма также может свидетельствовать как о его большой эволюционной истории, так и об адаптационном и эпидемическом потенциале бактерии. Поэтому разработка и подбор качественных программных методов и их алгоритмических конструкций позволяют выявлять специфичные особенности исследуемого штамма, которые другими методами могли быть не замечены.

Полученная информация, в перспективе позволит подбирать фаг для проведения штаммоспецифичной фаготерапии, а профили плазмид могут давать информацию о степени патогенности того или иного штамма.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Прозрачность исследования. Исследование не имело спонсорской поддержки. Исследователи несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.

Декларация о финансовых и иных взаимодействиях. Все авторы принимали участие в разработке концепции и дизайна исследования и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами. Авторы не получали гонорар за исследование.

Работа поступила в редакцию: 16.09.2015 г.

литература

1. Борисенко А.Ю., Джиоев Ю.П., Парамонов А.И. и др. Использование биоинформационных программных методов для поиска СИ8РЯ/Са8систем в геномах штаммов Staphylococcus aureus // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2015 - №2.- С.71-74.

2. Бургасова О.А., Воскресенская Е.А., Ценева Г.Я. и др. Влияние факторов патогенности Y. pseudotuberculosis на развитие поражений опорно-двигательного аппарата в виде реактивных артритов // Инфекционные болезни. - 2009. - №4.

- С.33-36.

3. Воскресенская Е.А., Ценева Г.Я., Козаренко А.А. и др. Генетические особенности Y. pseudotuberculosis и эпидемиологические черты групповых заболеваний псевдотуберкулезом в организованных коллективах // Эпидемиология и ин-фекц. болезни. - 2009. - №3. - С.31-34.

4. Демина Ю.В., Ценева Г.Я., Воскресенская Е.А. и др. Профилактика инфекционных болезней. Кишечные инфекции. Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза: Методические указания.

- М., 2009.

5. Колотова Т.Ю., Балута И.М., Воропай А.Ю. и др. Механизмы и регуляция фазовых и антигенных вариаций бактерий // Annals of Mechnikov Institute (Украина). - 2009.

- №3. - С.9-16.

6. Македонова Л.Д., Кудрякова Т. А., Качкина Г. В. и др. Бактериофаги Yersinia pseudotuberculosis: обнаружение в штаммах различных O-сероваров и их идентификация // Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - №8. - С.52-53.

7. Abby S.S., Néron B., Ménager H., et al. MacSyFinder: A Program to Mine Genomes for Molecular Systems with an Application to CRISPR-Cas Systems // PLoS ONE. - 2014. - Vol. 9. №10. - P.110-125.

8. Abedon S.T., Kuhl S.J., Blasdel B.G., et al. Phage treatment of human infections // Bacteriophage. - 2011. - Vol. 1. №2. - P.66-85.

9. Babu M., Beloglazova N., Flick R., et al. A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair // Molecular microbiology. - 2011. - Vol. 79. №2. -P.484-502.

10. Biswas A., Gagnon J.N., Brouns S.J.J., et al. CRISPRTarget: Bioinformatic prediction and analysis of crRNA targets // RNA Biology. - 2013. - Vol. 10. №5. - P.817-827.

11. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extra chromosomal origin // Microbiology. - 2005. -№151. - P.2551-2561.

13. De Maayer P., Chan W.Y., Rezzonico F., et al. Complete Genome Sequence of Clinical Isolate Pantoea ananatis LMG 5342 // Journal of Bacteriology. - 2012. - Vol. 194. №6. - P.1615-1616. 13. Edgar R.C. PILER-CR: Fast and accurate identification of

CRISPR repeats // BMC Bioinformatics. - 2007. - №8. - P. 18.

14. EppingerM., RosovitzM.J., Fricke W.F., et al. The Complete Genome Sequence of Yersinia pseudotuberculosis IP31758, the Causative Agent of Far East Scarlet-Like Fever // PLoS Genetics. -2007. - Vol. 3. №8. - P.142.

15. Gaj T., Gersbach C.A., Barbas C.F. ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering // Trends in biotechnology. - 2013. - Vol. 31. №7. - P.397-405.

16. Gasiunas G., Sinkunas T., Siksnys V. Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2014. - Vol. 71. №3. - P.449-465.

17. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPR Finder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats // Nucleic Acids Research. - 2007. - Vol. 35. - P.52-57.

18. Johnson M., Zaretskaya I., Raytselis Y., et al. NCBI BLAST: a better web interface. NCBI BLAST: a better web interface // Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol. 36. - P.5-9.

19. Kaneko T., Minamisawa K., Isawa T., et al. Complete Genomic Structure of the Cultivated Rice Endophyte Azospirillum sp. B510 // DNA Research: An International Journal for Rapid Publication of Reports on Genes and Genomes. - 2010. - Vol. 17. №1. - P.37-50.

20. Koskela K.A., Mattinen L., Kalin-Mänttäri L., et al. Generation of a CRISPR database for Yersinia pseudotuberculosis complex and role of CRISPR-based immunity in conjugation // Environ Microbiol. - 2015. - Vol. 17. №11. - P.4306-4321.

21. Makarova K.S., Grishin N.V., Shabalina S.A., et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action // Biology Direct. - 2006. - №1. - P.7.

22. Makarova K.S., Haft H.D., Barrangou R., et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems // Nature Reviews Microbiology. - 2011. - Vol. 9. №6. - P.467-477.

23. Overbeek R., Begley T., Butler R.M., et al. The Subsystems Approach to Genome Annotation and its Use in the Project to Annotate 1000 Genomes // Nucleic Acids Research.- 2005. - Vol. 33. №17. - P.5691-5702.

24. Pougach K., Semenova E., Bogdanova E., et al. Transcription, Processing, and Function of CRISPR Cassettes in Escherichia coli // Molecular microbiology. - 2010. - Vol. 77. №6. - P.1367-1379.

25. Rousseau C., Gonnet M., Le Romancer M., et al. CRISPI: a CRISPR interactive database // Bioinformatics. - 2009. - Vol. 25. №24. - P.3317-3318.

26. Sontheimer E.J., Marraffini L.A. MICROBIOLOGY: Slicer for DNA // Nature. - 2010. - Vol. 468. №7320. - P.45-46.

27. van der Oost J., Jore M.M., Westra E.R., et al. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes // Trends Biochem Sci. - 2009. - Vol. 34. №8. - P.401-407.

REFERENCES

1. Borisenko A.Y., Dzhioev Y.P., Paramonov A.I., et al. The use of bioinformatic software methods for search CRISPR / Cas systems in genomes of the strains of Staphylococcus aureus // Sibirskij Medicinskij Zurnal

2. Burgasova O.A., Voskresenskaya E.A. Tseneva G.Y., et al. Effect of pathogenicity factors on the development of Y. pseudotuberculosis lesions of the musculoskeletal system in the form of reactive arthritis // Infekcionnie Bolezni. - 2009. - №4. - P.33-36.

3. Voskresenskaya E.A., Tseneva G.Y., Kozarenko A.A., et al. Genetic features of Y. pseudotuberculosis and epidemiological features of the group pseudotuberculosis disease in organized groups // Epidemiologya i infecionnye bolezni. - 2009. - №3. -P.31-34.

4. Demina Yu.V., Tseneva G.Y., Voskresenskaya E.A., et al. Prevention of infectious diseases. Intestinal infections. Surveillance and prevention of pseudotuberculosis and intestinal yersiniosis: Guidelines. - Moscow, 2009.

5. Kolotova T.Y., Baluta I.M., Voropai A.Y., et al. Mechanisms and regulation of phase and antigenic variation of bacteria // Annals of Mechnikov Institute

6. Makedonova L.D., Kudryakova T.A., Kachkina G.V., et al. Bacteriophages Yersinia pseudotuberculosis: Detecting in various

strains of O-serovars and their identification // Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. - 2013. - №8. - P.52-53.

7. Abby S.S., Néron B., Ménager H., et al. MacSyFinder: A Program to Mine Genomes for Molecular Systems with an Application to CRISPR-Cas Systems // PLoS ONE. - 2014. - Vol. 9. №10. - P.110-125.

8. Abedon S.T., Kuhl S.J., Blasdel B.G., et al. Phage treatment of human infections // Bacteriophage. - 2011. - Vol. 1. №2. - P.66-85.

9. Babu M., Beloglazova N., Flick R., et al. A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair // Molecular microbiology. - 2011. - Vol. 79. №2. -P.484-502.

10. Biswas A., Gagnon J.N., Brouns S.J.J., et al. CRISPRTarget: Bioinformatic prediction and analysis of crRNA targets // RNA Biology. - 2013. - Vol. 10. №5. - P.817-827.

11. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extra chromosomal origin // Microbiology. - 2005. -№151. - P.2551-2561.

13. De Maayer P., Chan W.Y., Rezzonico F., et al. Complete Genome Sequence of Clinical Isolate Pantoea ananatis LMG 5342 // Journal of Bacteriology. - 2012. - Vol. 194. №6. - P.1615-1616.

13. Edgar R.C. PILER-CR: Fast and accurate identification of CRISPR repeats // BMC Bioinformatics. - 2007. - №8. - P. 18.

14. EppingerM., RosovitzM.J., Fricke W.F., etal. The Complete Genome Sequence of Yersinia pseudotuberculosis IP31758, the Causative Agent of Far East Scarlet-Like Fever // PLoS Genetics. -2007. - Vol. 3. №8. - P.142.

15. Gaj T., Gersbach C.A., Barbas C.F. ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering // Trends in biotechnology. - 2013. - Vol. 31. №7. - P.397-405.

16. Gasiunas G., Sinkunas T., Siksnys V. Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2014. - Vol. 71. №3. - P.449-465.

17. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. CRISPR Finder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats // Nucleic Acids Research. - 2007. - Vol. 35. - P.52-57.

18. Johnson M., Zaretskaya I., Raytselis Y., et al. NCBI BLAST: a better web interface. NCBI BLAST: a better web interface // Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol. 36. - P.5-9.

19. Kaneko T., Minamisawa K., Isawa T., et al. Complete Genomic Structure of the Cultivated Rice Endophyte Azospirillum sp. B510 // DNA Research: An International Journal for Rapid Publication of Reports on Genes and Genomes. - 2010. - Vol. 17. №1. - P.37-50.

20. Koskela K.A., Mattinen L., Kalin-Mänttäri L., et al. Generation of a CRISPR database for Yersinia pseudotuberculosis complex and role of CRISPR-based immunity in conjugation //

Environ Microbiol. - 2015. - Vol. 17. №11. - P.4306-4321.

21. Makarova K.S., Grishin N.V., Shabalina S.A., et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action // Biology Direct. - 2006. - №1. - P.7.

22. Makarova K.S., Haft H.D., Barrangou R., et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems // Nature Reviews Microbiology. - 2011. - Vol. 9. №6. - P.467-477.

23. Overbeek R., Begley T., Butler R.M., et al. The Subsystems Approach to Genome Annotation and its Use in the Project to Annotate 1000 Genomes // Nucleic Acids Research.- 2005. - Vol. 33. №17. - P.5691-5702.

24. Pougach K., Semenova E., Bogdanova E., et al. Transcription, Processing, and Function of CRISPR Cassettes in Escherichia coli // Molecular microbiology. - 2010. - Vol. 77. №6. - P.1367-1379.

25. Rousseau C., Gonnet M., Le Romancer M., et al. CRISPI: a CRISPR interactive database // Bioinformatics. - 2009. - Vol. 25. №24. - P.3317-3318.

26. Sontheimer E.J., Marraffini L.A. MICROBIOLOGY: Slicer for DNA // Nature. - 2010. - Vol. 468. №7320. - P.45-46.

27. van der Oost J., Jore M.M., Westra E.R., et al. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes // Trends Biochem Sci. - 2009. - Vol. 34. №8. - P.401-407.

Информация об авторах:

Перетолчина Надежда Павловна - аспирант; Джиоев Юрий Павлович - ведущий научный сотрудник, руководитель лаборатории, к.б.н.; Борисенко Андрей Юрьевич - аспирант; Парамонов Алексей Игоревич - младший научный сотрудник; Воскресенская Екатерина Александровна - старший научный сотрудник, к.б.н.; Степаненко Лилия Александровна -старший научный сотрудник, к.м.н.; Зелинская Надежда Евгеньевна -студент; Колбасеева Ольга Владимировна -старший научный сотрудник; Шмидт Надежда Васильевна -младший научный сотрудник; Злобин Владимир Игоревич - академик РАН, д.м.н., профессор, заведующий кафедрой.

Information About the Authors:

Peretolchina Nadezhda - graduate student; Dzhioev Yuri - leading researcher, PhD; Borisenko Andrei - graduate student; Paramonov Alexei - junior researcher; Voskresenskaya Ekaterina -senior researcher, PhD; StepanenkoLilya - senior researcher, PhD; Zelinskaya Nadezhda -student; Kolbaseeva Olga - senior researcher, PhD; Shmidt Nadezhda- junior researcher; Zlobin Vladimir - academician RAS, рrofessor, MD.

© ИВАНОВА Л.А., УКРАИНСКАЯ Л.А. - 2015 УДК: 616.24-099:547.292

стрессорное легкое: морфофункциональные изменения и их коррекция

Любовь Алексеевна Иванова, Людмила Анатольевна Украинская

Резюме. Проведено комплексное исследование структурных нарушений легких при остром иммобилизацион-ном стрессе. Выявлены участки легких менее резистентные к альтерирующему действию стресса. Выяснены возможности коррекции стресс-индуцированных нарушений легких путем ограничения альтерирующих эффектов стресса при введении стресс-лимитирующих препаратов.

ключевые слова: легкое, стресс, перекисное окисление липидов, коррекция, стресс-лимитирующие препараты, даларгин, а-токоферол, глицин, ГОМК, гамма-оксимасляная кислота.

stressoric lung: morphofunctional changes and correction

L.A. Ivanova, L.A. Ukrainskaja

Summary. There has been conducted a comprehensive study of structural disorders of lung in acute immobilization stress. It was found that some sections of lungs are less resistant to the alterative effects of stress. The possibilities of correction of stress-induced lung disorders by limiting the alterative effects of stress by introducing stress-limiting drugs have been cleared.

Key words: lung, stress, correction, stress-limiting drugs.

Прошло много лет с тех пор, как Г. Селье описал состояние, которое назвал стрессом. Дальнейшее его изучение показало, что он является причиной развития многих соматических заболеваний [4,7,8,11] и вызывает неспецифические изменения во внутренних органах [2,6]. Причем при чрезмерном или длительном воздействии стрессора и недостаточности адаптационных механизмов возникают нарушения на уровне функций органов,

что может трансформироваться в ведущее звено патогенеза психических и соматических заболеваний [8,11].

Согласно данным литературы, стресс может являться патогенетическим звеном развития изменений структуры и функции сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, психоневрологических расстройств, иммунодефицитных состояний организма и онкологической патологии [9,10,12].