Экспериментальное обоснование иммуноориентированных технологий для коррекции восстановительных процессов

ІІ8

проводилась инфузия дофамина. Данный эксперимент показал, что дофаминэргические структуры в этой ситуации не были задействованы.

Лазерное облучение в условиях критической гипотермии не влияло на процессы депонирования гликогена и энергетический обмен, что было показано при морфометрическом исследовании содержания зерен гликогена в проводящей системе и сократительном миокарде сердец всех животных.

Заключение

Таким образом, можно предполагать, что лазерное излучение ближнего инфракрасного диапазона угнетает мускариновые рецепторы путем воздействия на ионные токи сопряженных с ними кальциевых каналов и способствует частичному восстановлению проводимости в атриовентрикулярном узле при экспериментальной атриовентрикулярной блокаде, вызванной действием низких температур на организм.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алюхин Ю. С. Механика и энергетика сердца при прогрессирующей гипотермии II Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - І992. № 78(12). - С. 132-134.

2. Гацура В. В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ.

- М.: Медицина, І974. - С. 24-48.

3. Детвейлер Д.К., США. Использование электрокардиографии в токсикологическом исследовании коротконогих гончих II Сравнительная электрокардиология. Материалы международного симпозиума. - Л.: Наука, І98І. - С. І99-204.

4. Дудкевич И.Г., Марченко А.В. Квантовая терапия II Альтернативная медицина I Под ред. Н.А. Белякова. - Архангельск: Сев.-Зап. кн. изд-во, І994. - С. 266-298.

5. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы физиологически активных веществ. - М.: Медицина, І987. - С. І38-23І.

6. Jalife J. Neural control of sinoatrial pacemaker activity I Jalife J, Michaels DC. II In: Levy MN, Schwartz PJ, eds. Vagal Control of The Heart: Experimental Basis And Clinical Implications. Armonk: Futura; І994; Р. І73-205.

7. Rasmussen H. Calcium ion a synergic and mercurial but minatory messenger. ICalcium biol. syst. Proc. 67-th Annu. Meet. Fed. Amer. Soc. Environ. Biol.- N. Y.- London.- 1985.- Р.І3-22.

8. Tilley L.P. Essentials of canine and feline electrocardiographe: interpretation and Treatment.- Philadelphia: Lea & Febiger.- І985 - Р.23-48.

9. Zivin A. Cardiac pacemakers I Zivin A, Bardy G.H. II Foundations of Cardiac Arrhythmias. Eds. P.M.Spooner, M.R.Rosen. N.Y., 2001.- Р.57І-598.

УДК 616-003.9

© В.В. Базарный, О.Ю. Береснева, И.Е. Валамина, А.И. Исайкин, Н.С. Киселев, Н.Б. Крохина, Т.М. Мельникова, Д.С. Самойлов, О.Н. Селянина, Е.А. Тихонина, П.И. Щеколдин, 2009

В.В. Базарный, О.Ю. Береснева, И.Е. Валамина, А.И. Исайкин, Н.С. Киселев, Н.Б. Крохина, Т.М. Мельникова, Д.С. Самойлов, О.Н. Селянина, Е.А. Тихонина, П.И. Щеколдин ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИММУНООРИЕНТИРОВАННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

Уральская государственная медицинская академия,

Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург

В работе на экспериментальных моделях изучалось влияние иммуномодуляторов и физических факторов на репара-тивные процессы. Показано стимулирующее влияние иммуномодулятора рибомунила, ультразвука и магнитолазерного воздействия на заживление кожной раны и регенерацию кости. Г-КСФ стимулировал остеокластическую резорбцию и активировал восстановительные процессы в миокарде после острой ишемии.

Ключевые слова: иммуномодуляторы, репарация, ультразвук, магнитолазер

V.V. Bazamy, O.Y. Beresneva, I.E. Valamina, A.I. Isaikin, N.S. Kiselyev, N.B. Krokhina,

T.M. Melnikova, D.S Samoilov, O.N. Selyanina, E.A. Tikhonina, P.I. Shtekoldin EXPERIMENTAL GROUNDS OF THE IMMUNOTROPIC TECHNOLOGY FOR CORRECTION OF REHABILITATION PROCESSES

The effects of immunomodulators and physical therapy on repair processes in rats were studied. Stimulating effects of ribomu-nil injection, ultrasound and magnetolaser therapy on the skin wound and bone healing have been found. The G-CSF has been shown to be an inhibitor of bone formation and stimulator of myocardial repair process after acute ischemia.

Key words: immunomodulators, repair processes, ultrasound, magnetolaser

Изучение структурных основ и регуляторных механизмов регенерации тканей [8,12] обеспечивает теоретическое обоснование для разработки новых технологий стимуляции репаратив-ных процессов. В частности, установленная у лимфоцитов морфогенетическая функция [1] позволила предложить ряд способов иммуностимуляции регенерации [4]. Результаты некоторых продолжающихся исследований в этом направлении представлены в данной работе.

Материалы и методы

В качестве экспериментальных моделей индуцированной регенерации тканей использованы кожная рана и хирургический перелом большеберцовой кости, методические особенности которых описаны нами ранее [2, 3]. В одном из экспериментов был воспроизведен инфаркт миокарда путем внутримиокардиальной инъекции адреналина.

Исследование проведено на 94 беспородных крысах-самцах в возрасте 3 - 4 месяца, массой 120 - 150 г. с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Животных выводили их эксперимента методом декапитации в условиях эфирного наркоза на седьмые и пятнадцатые сутки после воздействия.

В качестве иммунотропных воздействий были использованы стандартные иммуномодуляторы - рибомунил (внутрибрюшинно и внутри-кожно в дозе 0,001 мг) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ, нейпоген) в дозе 2 ЕД/кг. Препараты вводили трижды ежедневно после нанесения травмы.

Кроме того, применяли физические факторы, которые, как известно, оказывают неспецифические иммуностимулирующие эффекты - магнитолазерное воздействие (МЛВ) и ультразвук (УЗ) [5, 9]. Для этого использованы аппарат «УЗТ-

1.01ф» (режим генерации УЗ - непрерывный, способ озвучивания - контактный, методика лабильная, интенсивность 0,4 - 0,7 вт/см2, площадь эффективного воздействия - 1 см2, время процедуры

- 15 мин) и АМЛТ-1 (плотность мощности лазерного излучения - 4 мВт/кв.см., индукция переменного магнитного поля - 40 мТл, общая продолжительность процедуры - 8 мин). На курс - 7 процедур. В контрольных группах животных такие воздействия не проводились.

Течение восстановительных процессов контролировали на основании морфологической картины регенерата. Проводка материала, приготовление гистологических срезов и окраска осуществлялись по обычной методике (гематоксилином и эозином, пикофуксином по Ван Гизону) с использованием гистохимических методик (окраска по Хейлу, ШИК-реакция). Для объективизации количественных различий в зоне регенерата определяли объемную долю клеток на единицу площади ткани методом компьютерной морфометрии с использованием видеокомпьютерного комплекса 81АМ8-610 (регистрационное свидетельство № 940176-25.04.94).

Для оценки системной реакции организма выполняли общеклинический анализ крови (анализатор Л^1а 60) и определение концентрации острофазовых белков (СРВ, церулоплазмин, фибриноген, альбумин) унифицированными тестами [7]. Концентрацию биохимических маркеров повреждения миокарда - КФК-МВ, АСТ, ЛДГ - определяли кинетическими методами (01утрш АИ640).

Статистическая обработка результатов выполнена на основании принципов вариационной статистики с использованием пакета программ 81аИ811еа [6].

Результаты и обсуждение

В ходе регенерации кожной раны и кости выявлена стереотипная динамика лабораторных показателей. На 1 - 5-е сутки после операции картина крови и концентрация острофазовых белков соответствуют известной картине острого воспаления. К 7 - 10-м суткам наблюдалось повышение количества моноцитов и лимфоцитов в крови и костном мозге. Ранее нами была доказана патогенетическая связь между этими изменениями и активностью репаративного процесса [2, 3].

На модели кожной раны тестировали рибо-мунил и ультразвук. На 7-е сутки после нанесения раны у контрольных животных раневой дефект был выполнен грануляционной тканью (ГТ) с большим количеством капилляров, полной эпите-лизации не отмечалось. С краев дефекта эпидермис утолщен за счет пролиферации клеток базального слоя и частично наползал на зону повреждения. Клеточный состав представлен гистиоцитами, лимфоцитами, в небольшом количестве сохраняются нейтрофилы. В большом количестве представлены молодые фибробласты, появлялась нежная сеть коллагеновых волокон. В основном веществе ГТ преобладают кислые гликозаминоглика-ны. целом можно заключить, что к 7-10-м суткам на фоне стихающей воспалительной реакции выражены признаки регенерации соединительной ткани.

При введении рибомунила не было установлено принципиальных различий в динамике регенерации кожной раны, хотя при внутрикожных инъекциях препарата клеточная пролиферативная реакция была несколько более выраженной, отмечено и несколько более активное новообразование сосудов.

Под влиянием УЗ раневой дефект также был выполнен созревающей ГТ. Она содержала хорошо сформированные капилляры, разнонаправленные коллагеновые волокна, пролиферирующие клетки, среди которых преобладали фибробласты. На большем протяжении новообразованная ткань была покрыта эпителием в виде однослойного пласта клеток. Выявленные морфологические особенности указывали на стимулирующее регенерацию кожи действие УЗ. Эти результаты были подтверждены методом компьютерной морфометрии.

Дальнейшее наблюдение показало, что кожный струп у животных после интрадермаль-ных инъекций рибомунила или воздействия УЗ

отходил на сутки раньше, чем в контрольной группе.

Таблица

_______Морфометрический анализ зоны регенерата_____

Группы животных Объемная доля клеток, %

Кожная рана

Контроль 15.8±0.4

Рибомунил в/ брюшинно 16.2±0.2

Рибомунил в/кожно 20.3±0.4 *

Ультразвук 16.9±0.8 *

Перелом кости

Контроль 14,0±0,5

МЛВ 17,9±1,5 *

Г-КСФ 12,3±1,0

* р< 0.05 в сравнении с контролем.

На модели регенерации костной ткани тестировали МЛВ и Г-КСФ. Формирование регенерата в зоне дефекта большеберцовой кости в контрольной группе животных соответствовало известной морфологической картине. В частности, ранний пост-травматический период характеризовался воспалительной реакцией в области костных отломков с наличием большого количества ней-трофилов в воспалительном инфильтрате. С 7-х суток интенсивность воспалительной реакции снижалась. В зоне перелома формировалась волокнистая соединительная ткань, в которой определялись пролиферирующие фибробласты и единичные макрофаги. Кнаружи от волокнистых структур наблюдались фокусы хондробластов. К 10-м суткам в зоне регенерата была выражена пролиферация фибробластов, хондробластов и остеобластов. Ремоделяция кости происходила как за счет периостального, так и эндостального окостенения. В волокнистых структурах зоны перелома нарастало количество макрофагов. Полной репарации костных фрагментов не наблюдалось ни в одном случае. Позднее (20-е сутки) отмечалась полная консолидация, замещение дефекта регенератом, исчезали признаки воспалительной реакции, уменьшалось количество макрофагов, сохранялось большое количество фибробластов, остеобластов, появлялись очаги эндохондрального окостенения.

На 10-е сутки после операции в группе крыс, получавших МЛВ, репарация костных отломков также была неполной, ремоделяция костной ткани наблюдалась со стороны периоста. В клеточном инфильтрате встречались лимфоциты и макрофаги, а у половины животных преобладали клетки фибробластического или остеобластиче-ского дифферонов с более выраженной, чем в контроле, пролиферацией остеобластов и слабо выраженной пролиферативной реакцией хондробла-стов. Окостенение - перихондральное и эндохонд-ральное. В целом у животных после МЛВ на 10-е сутки после перелома отмечались менее выраженные нарушения кровообращения, снижение активность воспалительной реакции. По сравнению с контрольной группой наблюдались более выраженная пролиферация остеобластов и уменьшение числа остеокластов.

Под влиянием Г-КСФ выраженность воспалительной реакции в области костных отломков на 10-е сутки после травмы оставалась достаточно заметной, чего не было в контрольной группе. В

воспалительном инфильтрате выявлялось большое количество нейтрофилов и макрофагов. Посттрав-матический регенерат характеризовался наличием всех видов клеточных дифферонов, при этом более выражена пролиферация хондробластов и фиброб-ластов, а периостальный остеогенез осуществлялся лишь перихондральным способом с умеренной пролиферацией остеобластов и увеличением количества остеокластов. Важно отметить, что под влиянием Г-КСФ в зоне регенерата в сравнении с контролем повышалась доля наименее дифференцированной ткани - волокнистой. Это также свидетельствует о замедлении образования и созревания костной ткани. Данное заключение подтверждается и морфометрическими данными. Так, содержание клеток остеобластического дифферона снижалось под влиянием препарата на 17% (р <

0,05), хотя общая клеточность зоны регенерата снижалась менее выраженно (см. таблицу).

Таким образом, под влиянием МЛВ активировалась пролиферация остеобластов, а после введения Г-КСФ - остеокластов, что вызывало разнонаправленные изменения ремоделирования костной ткани.

Использование моделей кожной раны и перелома трубчатой кости позволяет изучать регенерацию тканей с высоким пролиферативным потенциалом. Для изучения возможностей иммунокоррекции репарации тканей с преимущественно внутриклеточной регенерацией мы изучили влияние Г-КСФ на ремоделирование миокарда в условиях его острой ишемии.

У животных контрольной группы наблюдались стандартные морфологические изменения реактивного характера с выраженными очаговыми дистрофическими и некротическими поражениями. Они сопровождались соответствующими изменениями ЭКГ и повышением уровня сывороточных маркеров повреждения миокарда. После введения Г-КСФ в миокарде были отмечены снижение выраженности дистрофических и некротических нарушений, активация микроциркулятор-ного русла.

Таким образом, иммуномодуляторы - ри-бомунил и Г-КСФ - оказывают разнонаправленное влияние на регенерацию тканей. Причем, репара-тивное действие рибомунила более выражено при локальном (интрадермальном) введении. Ингибирующий остеорепарацию эффект Г-КСФ связан с активацией гранулоцитопоэза, поддержанием «высокого» уровня воспалительной реакции и стимуляцией остеокластической резорбции. Вместе с тем данный препарат обладает выраженной способностью стимулировать восстановительные процессы в миокарде.

Физические факторы - МЛВ и УЗ - оказывают неспецифическое действие (противовоспалительное, метаболическое, ангиопротекторное), а также и иммуностимулирующее. Это обеспечивает оптимизацию процессов регенерации в тканях. Не вызывает сомнения, что указанные эффекты реализуются с участием цитокинов [10, 11].

Полученные данные являются патогенети- ности у пациентов с пониженной плотностью ко-

ческим обоснованием для широкого внедрения стной ткани. В то же время данный препарат об-

локальной иммуностимуляции репаративных про- ладает кардиопротективными и ангиогенезстиму-

цессов. Введение Г-КСФ требует особой осторож- лирующими свойствами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бабаева А.Г. Зотиков Е.А. Иммунология процессов адаптивного роста, пролиферации и их нарушений.- М.:Наука, 1987.- 207 с.

2. Базарный В.В., Валамина И.Е.,Селянина О.Н., Тихонина Е.А., Береснева О.Ю.,Клейн А.В., Исайкин А.И. //Бюлл.эксп.биол.мед.-2007.-Т.143, № 6.- С.660-662.

3. Базарный В.В., Крохина Н.Б., Исайкин А.И., Тихонина Е.А. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на репаративный остеогенез//Патол. физиология и эксперимент. терапия.- 2008.-№ 3.-С.26-27.

4. Воложин А.И, Бондаренко М.О., Фионова Э.В, Ожелевская С.А. //Патолог.физиология и экспе-рим.терапия.-2007.-№ 1.- С.27-28.

5. Гилязетдинова Ю.А. //Стоматология.-2003.- Т.82, № 2.- С.62-64.

6. Гланц С.Медико-биологическая статистика.- М.:Практика, 1998.- 459 с.

7. Клиническая лабораторная аналитика. Т.2. // Под ред. В.В.Меньшикова.- М.: Лабинформ-РАМЛД, 1999.- 352 с.

8. Саркисов Д.С. Общая патология человека: Руководство для врачей / Д.С. Саркисов, В.П.Туманов. / Под ред. А.И.Струкова.- Т.2.- М.:Медицина, 1990.- С.199 - 322.

9. Nelson F. T., Brighton C.T., Ryaby J., Simon B. J., Nielson J.H., Loric D. G.//J. Am. Acad. Orthop. Surg.-2003.- Vol. 11, No 5.-P. 344-354.

10. Takayanagi H. //Nat. Rev. Immunol. - 2007.- Vol.7, N 4.-P.292-304.

11. Werner S. Grose R.// Physiol. Rev.- 2003.- Vol. 83.-P. 835-870.

12. Yannas I.V.//Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.- 2005.- Vol.93.-P.1-38.

УДК 616.13-007 .272-085.849.19 © М.Г. Баранова, Е.С. Головнева, Г.К. Попов, 2009

М.Г. Баранова, Е.С. Головнева, Г.К. Попов ВЛИЯНИЕ ВЫСОКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ РЕЖИМАХ НА РЕАКЦИЮ ПЕРИВАСКУЛЯРНЫХ ТУЧНЫХ

КЛЕТОК

ОГУЗ ЦОСМП «Челябинский государственный институт лазерной хирургии», г. Челябинск

Изучены реакции тучных клеток брыжейки крыс с аллоксановым диабетом и хроническим гиподинамическим стрессом в ответ на высокоинтенсивное лазерное воздействие в неповреждающем терапевтическом режиме. Отмечено усиление индекса дегрануляции у облученных животных по сравнению с необлученными; в группе с аллоксановым диабетом с 41,4 до 95,1%, в группе с гиподинамией с 75,3 до 97,9%. Выявлено существенное увеличение количества тучных клеток в группах, подвергшихся лазерному воздействию, по сравнению с контрольными. Таким образом, реакция тучных клеток может являться основой стимуляции неоангиогенеза и нормализации микроциркуляции в ишемизированных тканях. Полученные данные дают возможность разработки новых методов лечения сосудистых заболеваний.

Ключевые слова: высокоинтенсивное лазерное излучение, тучные клетки, микроциркуляция.

M.G. Baranova, E.S. Golovnyeva, G.K. Popov THE INFLUENCE OF HIGH INTENSIVE THERAPEUTIC NON-INJURING LASER IRRADIATION ON REACTION OF PERIVASCULAR MAST CELLS

We have studied the reaction of mesentery mast cells of rats with alloxan diabetes and chronic hypodynamic stress on highintensive therapeutic non-injuring laser irradiation. The increasing of degranulation index was marked in irradiated animals: from 41,1% to 95,1% in alloxan group, and from 75,3% to 97,9% in hypodynamic group. The remarkable increase of mast cell number in the irradiated groups in comparison with control was also observed. So, the reaction of mast cells may form the basis of neoangi-ogenesis stimulation and normalization of microcirculation in ischemic tissues. The results obtained give the opportunity to develop new methods of vascular disease treatment.

Key words: high intensive laser radiation, mast cells, microcirculation.

В течение последних десятилетий возрастает социальное значение окклюзирующих заболеваний артерий нижних конечностей различной этиологии (атеросклеротические поражения, диабетические микро-, макроангиопатии) в связи с

угрожающим увеличением частоты заболеваемости, тяжестью осложнений, существенным изменением качества и продолжительности жизни и возрастающей смертностью [1]. Несмотря на значительные успехи реконструктивной хирургии и