СПОСОБЫ EX VIVO ЭКСПАНСИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

ex vivo
1. Способэкспансии естественных клеток-киллеров (NK), включающий:
(a) получение исходной популяции мононуклеарных клеток (MNC) из пуповинной крови;
(b) стимуляцию MNC в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC) и IL-2; и
(c) повторную стимуляцию клеток с использованием APC с получением размноженных NK-клеток, при этом способ осуществляют в биореакторе, и он соответствует правилам производства и контроля качества лекарственных средств (GMP).
2. Способ по п. 1, при этом способ дополнительно включает истощение клеток, положительных в отношении CD3.
3. Способ по п. 2, где истощение осуществляют между стадиями (b) и (c).
4. Способ по п. 3, где клетки удаляют из биореактора.
5. Способ по п. 1, где получение исходной популяции MNC из пуповинной крови включает размораживание пуповинной крови в присутствии декстрана, человеческого сывороточного альбумина (HSA), ДНКазы и/или хлорида магния.
6. Способ по п. 1, где получение исходной популяции MNC из пуповинной крови включает размораживание пуповинной крови в присутствии декстрана и ДНКазы.
7. Способ по п. 5, где пуповинную кровь промывают в присутствии 10% декстрана.
8. Способ по п. 5 или 7, где пуповинную кровь суспендируют в присутствии хлорида магния.
9. Способ по п. 8, где хлорид магния присутствует при концентрации 200 мМ.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где получение включает осуществление центрифугирования в градиенте плотности фиколла с получением мононуклеарных клеток (MNC).
11. Способ по любому из пп. 1-10, при этом способ не включает удаление или добавление каких-либо компонентов среды на стадии (b).
12. Способ по любому из пп. 1-11, где биореактор представляет собой газопроницаемый биореактор.
13. Способ по п. 12, где газопроницаемый биореактор представляет собой G-Rex100M.
14. Способ по п. 13, где стимуляцию на стадии (b) осуществляют в 3-5 л среды.
15. Способ по любому из пп. 1-13, где APC подвергают гамма-облучению.
16. Способ по п. 15, где APC сконструированы для экспрессии мембраносвязанного IL-21 (mbIL-21).
17. Способ по любому из пп. 1-16, где APC сконструированы для экспрессии IL-21, IL-15, IL-7, IL-18 и/или IL-2.
18. Способ по любому из пп. 1-16, где MNC и APC культивируют при соотношении 1:2.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где IL-2 присутствует при концентрации 50-200 МЕ/мл.
20. Способ по п. 19, где IL-2 присутствует при концентрации 100 МЕ/мл.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где IL-2 пополняют через каждые 2-3 дня.
22. Способ по любому из пп. 1-20, где стадию (b) осуществляют в течение 6-8 дней.
23. Способ по п. 22, где стадию (b) осуществляют в течение 7 дней.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где стадия (b) не включает расщепление клеток.
25. Способ по п. 24, где к клеткам два раза добавляют IL-2.
26. Способ по любому из пп. 1-25, при этом способ включает использование 3, 4, 5 или 6 биореакторов.
27. Способ по п. 26, при этом способ включает использование меньше чем 10 биореакторов.
28. Способ по любому из пп. 1-27, где NK-клетки размножаются по меньшей мере 500-кратно, 800-кратно, 1000-кратно, 3000-кратно или 5000-кратно.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где культивирование NK-клеток в биореакторе дает более чем 1000-кратное количество NK-клеток по сравнению с статической жидкой культурой.
30. Способ по любому из пп. 1-29, при этом способ не включает совместимость по человеческому лейкоцитарному антигену (HLA).
31. Способ по п. 30, где исходную популяцию NK-клеток не получают от идентичного по гаплотипу донора.
32. Способ по любому из пп. 1-31, при этом способ осуществляют за меньше чем 15 дней.
33. Способ по п. 32, при этом способ осуществляют за 14 дней.
34. Способ по любому из пп. 1-33, где размноженные NK-клетки обладают повышенной противоопухолевой активностью по сравнению с NK-клетками, размноженными из периферической крови.
35. Способ по п. 34, где размноженные NK-клетки имеют более высокую экспрессию генов клеточного цикла, клеточного деления, и/или репликации ДНК по сравнению с NK-клетками, размноженными из периферической крови.
36. Способ по любому из пп. 1-34, где размноженные NK-клетки имеют более высокий пролиферативный потенциал по сравнению с NK-клетками, размноженными из периферической крови.
37. Способ любого по п. 1-36, где размноженные NK-клетки не демонстрируют истощения.
38. Способ по п. 37, где истощение определяют путем измерения экспрессии перфорина, гранзима, CD57, KLRG1 и PD1.
39. Способ по п. 38, где размноженные NK-клетки имеют высокую экспрессию перфорина и гранзима.
40. Способ по п. 38, где размноженные NK-клетки имеют низкую экспрессию или отсутствие экспрессии CD57, KLRG1 и PD1.
41. Способ по любому из пп. 1-40, где размноженные NK-клетки включают клинически релевантную дозу.
42. Способ по любому из пп. 1-41, где пуповинная кровь представляет собой замороженную пуповинную кровь.
43. Способ по п. 42, где замороженная пуповинная кровь была протестирована на инфекционное заболевание.
44. Способ по любому из пп. 1-43, где пуповинная кровь представляет собой объединенную пуповинную кровь.
45. Способ по п. 44, где пуповинная кровь является объединенной из 3, 4, 5, 6, 7 или 8 отдельных единиц пуповинной крови.
46. Способ по любому из пп. 1-45, где NK-клетки не являются аутологичными.
47. Способ по любому из пп. 1-46, где NK-клетки не являются аллогенными.
48. Способ по любому из пп. 1-47, где APC представляют собой универсальные антигенпрезентирующие клетки (uAPC).
49. Способ по п. 48, где uAPC сконструированы для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) мембраносвязанного интерлейкина-21 (mbIL-21) и (3) 41BB лиганда (41BBL).
50. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют CD48.
51. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют CS1.
52. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют CD48 и CS1.
53. Способ по п. 48, где uAPC по существу не имеют экспрессии эндогенных молекул HLA класса I, II или CD1d.
54. Способ по п. 48, где uAPC экспрессируют ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58).
55. Способ по любому из пп. 1-54, где uAPC также определены как aAPC, происходящие из лейкозных клеток.
56. Способ по п. 55, где происходящие из лейкозных клеток aAPC также определены как K562 клетки.
57. Способ по любому из пп. 1-56, дополнительно включающий криоконсервирование размноженных NK-клеток.
58. Фармацевтическая композиция, содержащая популяцию NK-клеток, полученную способом по любому из пп. 1-57, и фармацевтически приемлемый носитель.
59. Композиция, содержащая эффективное количество NK-клеток, полученных способом по любому из пп. 1-57, для применения в лечении заболевания или расстройства у субъекта.
60. Применение композиции, содержащей эффективное количество NK-клеток, полученных способом по любому из пп. 1-57, для лечения иммуноопосредованного расстройства у субъекта.
61. Способ лечения заболевания или расстройства, включающий введение субъекту эффективного количества размноженных NK-клеток по любому из пп. 1-57.
62. Способ по п. 61, дополнительно включающий введение химиотерапии.
63. Способ по п. 62, где химиотерапию вводят до введения размноженных NK-клеток.
64. Способ по п. 62 или 63, где химиотерапия является миелоаблативной.
65. Способ по п. 62 или 63, где химиотерапия не является миелоаблативной.
66. Способ по п. 62 или 63, где химиотерапия представляет собой лимфоистощающую химиотерапию.
67. Способ по п. 66, где лимфоистощающая химиотерапия представляет собой лимфоистощающую химиотерапию на основе флударабина.
68. Способ по любому из пп. 62-67, где химиотерапия представляет собой леналидомид.
69. Способ по любому из пп. 62-68, при этом способ не включает осуществления HLA-типирования.
70. Способ по любому из пп. 62-69, где заболевание или расстройство представляет собой иммуноопосредованное расстройство.
71. Способ по п. 70, где иммуноопосредованное расстройство представляет собой аутоиммунное расстройство, болезнь «трансплантат против хозяина», отторжение аллотрансплантата или воспалительное состояние.
72. Способ по любому из пп. 61-69, где заболевание или расстройство представляет собой рак.
73. Способ по п. 72, где рак представляет собой множественную миелому.
74. Способ по любому из пп. 61-73, где у субъекта не развивается болезнь «трансплантат против хозяина» или другая токсичность.
75. Способ по любому из пп. 61-74, дополнительно включающий введение эффективного количества по меньшей мере еще одного терапевтического средства.
76. Способ по п. 75, где по меньшей мере еще одно терапевтическое средство включает химиотерапию, иммунотерапию, хирургическую операцию, лучевую терапию или биотерапию.
77. Способ по п. 75, где NK-клетки и/или по меньшей мере еще одно терапевтическое средство вводят внутривенно, интраперитонеально, интратрахеально, интратуморально, внутримышечно, эндоскопически, внутриочагово, чрескожно, подкожно, регионарно или путем прямой инъекции или перфузии.
78. Способ по любому из пп. 75-77, где второе терапевтическое средство включает элотузамаб.