СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГРИБОВ АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ И ИНДЕКСОВ МИКОРИЗАЦИИ
METHOD OF RAPID DETERMINING OF SYMBIOTIC EFFECTIVENESS OF MUSHROOMS OF ARBUSCULAR MYCORHIZA AND INDEXES OF MYCORHISATION

Область техники
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, более конкретно к микологии и физиологии растений, а именно к определению параметров симбиотического взаимодействия, в том числе индексов микоризации и симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, образующих неспецифический симбиоз с большинством наземных растений. Предложены способы экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и индексов микоризации, характеризующих развитие симбиотических структур грибов арбускулярной микоризы.
Уровень техники
Арбускулярная микориза представляет собой наиболее распространенный растительно-грибной симбиоз, формируемый большинством наземных растений с грибами отдела Glomeromycota. Обеспечение симбиоза растений с грибами арбускулярной микоризы является важной задачей для современного сельского хозяйства, поскольку такой симбиоз повышает адаптивные способности растений к условиям окружающей среды и решает проблемы их слабого роста за счет:
1) способности грибов усиливать поступление элементов питания в растения, особенно фосфатов;
2) способности грибов инактивировать тяжелые металлы в почве;
3) способности грибов повышать устойчивость растений к болезням, устраняя патогенные организмы путем синтеза антибиотиков, конкуренции за субстрат, либо за счет индукции иммунных реакций у растений;
4) способности грибов изменять гормональный статус растения-хозяина, ускоряя его развитие.
В связи с этим необходимо проводить определение параметров симбиотического взаимодействия, в том числе симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и индексов микоризации, характеризующих развитие симбиотических структур, формируемых грибами. Известен способ определения симбиотической эффективности и активности у сои посредством анализа симбиотической азотфиксации в полевых условиях (заявка на патент 2009129168; Российская Федерация). Данный способ включает: (1) применение в качестве тест-растения специально отселектированного мутанта сои СР-1, не фиксирующего азота воздуха; (2) посев сои в полевых нестерильных условиях; (3) определение показателей продуктивности растений, таких как прирост биомассы и содержание общего азота в растительных образцах. Описанный способ позволяет определить симбиотическую эффективность и активность бобово-ризобиального симбиоза. Однако данный способ имеет существенный недостаток: грибы арбускулярной микоризы обеспечивают растение доступным для питания фосфором, а в данном способе использован мутант по способности к азотфиксации. В связи с этим он не может быть применен для оценки симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, поскольку получение достоверных отличий при быстром экспресс-определении эффективности симбиоза требует определенных условий среды, а именно низкого содержания доступного для питания растений фосфора в почве, а не лимитированных условий азотного питания.
Также известен способ определения симбиотической эффективности между бобовым растением и клубеньковыми бактериями (заявка на патент JP 2004261078 «Method for controlling symbiotic efficiency between leguminous plant and root nodule bacterium and symbiotic mutant of leguminous plant»; Япония). Основная особенность этого способа заключается в том, что для тест-анализа используется симбиотический мутант бобового растения, имеющий сниженную в сравнении с растениями дикого типа симбиотическую эффективность с клубеньковыми бактериями. Мутант бобового растения получен путем мутагенеза этилметансульфонатом. Недостатком такого способа является то, что описанный способ не может быть применен для определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, поскольку отбор, использованный в данном способе, проводился в условиях низкого содержания азота, а не фосфора. Между тем фосфор - это основной элемент, лимитирующий рост микотрофных (имеющих симбиотрофное питание за счет формирования арбускулярной микоризы) растений в условиях без инокуляции грибом арбускулярной микоризы.
Известен мутант и способ получения этого мутанта бобового растения, имеющего повышенную способность к симбиотической фиксации азота бобовым растением в симбиозе с ризобиями (заявка JP2007306852 «Mutant of leguminous plant having enhanced symbiotic nitrogen fixation ability of leguminous plant and Rhizobium, its seed and method for producing the same»; Япония; заявка опубликована 29.11.2007). Способ направлен на получение семян в результате мутагенеза бобового растения на среде, содержащей абсцизовую кислоту в концентрации, не позволяющей прорастать семенам дикого типа, но позволяющей отселектировать мутант бобового растения, имеющий повышенную симбиотическую азотфиксацию с ризобиями. Полученные этим способом мутанты подходят для оценки симбиотической эффективности бобово-ризобиального симбиоза. Недостатком такого способа является то, что эти мутанты не могут быть использованы для оценки симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, т.к. не являются быстроотзывчивыми на инокуляцию грибами арбускулярной микоризы и не являются высокомикотрофными (зависимыми от наличия грибов арбускулярной микоризы) в условиях низкого уровня фосфора в субстрате для выращивания растений, что необходимо для проведения быстрого экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы.
Известен способ создания высокопродуктивных форм гороха с высокими симбиотическими свойствами (заявка на изобретение RU 2007121278; Российская Федерация), включающий: (1) скрещивание коммерческих сортов гороха с мутантными формами гороха; (2) выделение в гибридах F2 форм с мутантным фенотипом; (3) рекуррентный отбор растений по показателям продуктивности. Способ отличается от известных тем, что в качестве мутантных форм гороха используют суперклубеньковые мутанты гороха. Таким образом, данное изобретение представляет собой совокупность способов повышения симбиотической эффективности бобово-ризобиального симбиоза с применением такого явления, как «суперклубенькообразование». Это позволяет использовать суперклубеньковые мутанты гороха для быстрой экспресс-оценки симбиотической эффективности бобово-ризобиального симбиоза. Недостатком такого способа является то, что растения, полученные описанным способом, не могут быть использованы для оценки симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы вследствие того, что не являются высокомикотрофными на инокуляцию различными штаммами грибов арбускулярной микоризы, например облигатно-микотрофными в условиях низкого уровня фосфора в субстрате для выращивания растений.
Таким образом, анализ известного уровня техники свидетельствует о том, что в настоящее время существуют способы определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, но отсутствуют способы ее экспресс-определения вследствие отсутствия подходящих для этого анализа тест-растений, обладающих высокой микотрофностью, т.е. зависимостью от формирования и развития симбиоза с грибами арбускулярной микоризы. С другой стороны, помимо симбиотической эффективности необходимо также определять различные индексы микоризации. Определение индексов микоризации необходимо для контроля развития грибов в растении - активности их роста в корнях растений. Более высокие индексы микоризации у анализируемого штамма в сравнении с местными грибами, заселяющими опытные поля или сельскохозяйственные угодья, свидетельствует в пользу более высокой конкурентоспособности селектированного штамма. Высокие показатели симбиотической эффективности и индексы микоризации обеспечат стабильно высокие прибавки урожая сельскохозяйственных культур в полевых условиях при применении инокулята грибов арбускулярной микоризы с выявленными симбиотическими характеристиками.
Для определения индексов микоризации проводят пробоподготовку образцов корней. Известны различные способы мацерации и окрашивания микоризованных корней для определения индексов микоризации, т.е. степени развития симбиотических структур арбускулярной микоризы (арбускул, везикул и внутрикорневого мицелия). В статье Дж. С. Додд с соавт. (Dodd J.С., Boddington C.L., Rodriguez A., Gonzalez-Chavez С., Mansur I. Mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) from different genera: form, function and detection. // Plant and Soil. 2000. V. 226. P. 131-151) авторы приводят ряд наиболее используемых способов окрашивания, включающих применение красителя трипанового синего (Phillips J.M., Hayman D.S. Improved procedure for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbuscular fungi for rapid assessment of infection. // Trans. Brit. Mycol. Soc. 1970. V. 55. P. 158-161), хлоразола черного E (Brundrett M.C., Piche Y., Peterson R.L. A new method for observing the morphology of vesicular-arbuscular mycorrhizae. // Can. J. Bot. 1984. V. 62. P. 2128-2134), кислого фуксина (Kormanik P.P., McGraw A.C. Quantification of vesiculararbuscular mycorrhizae in plant roots. / In Methods and Principles of Mycorrhizal Research. Ed. N.C.Schenck. St. Paul, MN, USA. American Phytopathological Society. 1982. P. 37-45) и с применением чернильно-уксусного окрашивания (Vierheilig Н., Coughlan А.Р., Wyss U., Piche Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. // Appl. Env. Microbiol. 1998. V. 64. P. 5004-5007). Согласно данным Е.Б.Ютобо среди описанных способов окрашивания четкую картину микоризации корней растений дает способ с применением красителя трипанового синего (Utobo Е.В., Ogbodo E.N., Nwogbaga A.C. Techniques for extraction and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi. // Libyan Agriculture Research Center Journal Internation. 2011. Vol.2 (2). P. 68-78). Недостатком таких способов является то, что описанные способы позволяют провести окрашивание, контрастирование грибов арбускулярной микоризы в корнях растений, но не включают процедур анализа развития симбиотических структур грибов арбускулярной микоризы.
Известен способ определения степени микоризной инфекции по следующим индексам микоризации: встречаемость микоризной инфекции (F), интенсивность микоризной инфекции в расчете на всю корневую систему и в микоризованных фрагментах корней (М и m, соответственно), обилие арбускул в расчете на всю корневую систему и в микоризованных фрагментах корней (А и а, соответственно), обилие везикул во всей корневой системе и в микоризованных фрагментах корней (В и b, соответственно) (Trouvelot A., Kough J.L., Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de mycorhization VA d'un systeme radiculaire. Recherche de methodes ayant une signification fonctionnelle. / In: Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae. Eds. Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Paris: INRA-Press. 1986. P. 217-221). Способ является общепринятым и часто используется в совокупности со способом окрашивания трипановым синим. Недостатком такого способа является отсутствие единого показателя, характеризующего симбиотическую фазу развития арбускулярной микоризы по развитию всех ключевых симбиотических структур: внутрикорневого мицелия, арбускул и везикул.
Известен способ, разработанный российским коллективом (Калько Г.В., Воробьев Н.И., Лагутина Т.М. Векторная математическая модель развития популяции гриба Fusarium oxysporium в торфогрунте. // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40, вып.4. С.319-329), включающий разработку модели развития грибов Fusarium oxysporium -факультативных паразитов, вызывающих фузариозное увядание растений. Модель включает расчет фазы развития грибов-паразитов. Недостатком такого способа является то, что описанный способ не был использован для оценки развития грибов-симбионтов, в том числе грибов арбускулярной микоризы.
Известен способ описания пораженности растений серой гнилью, как функции плотности пропагул патогена Botrytis cinerea, с применением регрессионной модели, предложенный П. Дж. Жанг с соавт. (Zhang P.G., Sutton J.С., Hopkin А.А. Inoculum concentration and time of application of Gliocladium roseum in relation to biocontrol of Botrytis cinerea in black spruce seedlings. // Can. J. Forest Res. 1996. V. 26, N 3. P. 360-367), а также способ анализа пораженности гвоздики фузариозом с применением простой линейной регрессионной модели, разработанный Л.М. Ортега с соавт. (Ortega L.M., Gomez S., Arbelaez G. Assessment of Streptomyces griseoviridis (Mycostop) as a biocontrol agent of Fusarium oxysporum f. sp.dianthi in two standard carnation cultivars under commercial conditions. // Agronomia-Colombiana. 1994. V. 11, N 1. P. 1-12). С помощью этих способов их авторам удается успешно описывать развитие патогенных микроорганизмов.
Недостатком такого способа является то, что не выявлено ни одного исследования развития арбускулярной микоризы, включающего оценку симбиотической фазы развития арбускулярной микоризы, в котором были бы применены описанные математические модели.
Таким образом, при анализе известного уровня техники не обнаружено индексов микоризации, в полной мере характеризующих симбиотическую фазу развития грибов арбускулярной микоризы.
Задачами настоящего изобретения является быстрое экспресс-определение симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и экспресс-определение развития арбускулярной микоризы по существующим индексам микоризации и по разработанному автором новому индексу - фазе развития арбускулярной микоризы. Экспресс-тест симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы важно проводить на растениях, которые наиболее быстро и сильно откликаются на инокуляцию грибами арбускулярной микоризы, собственно с целью применения этой экспресс-оценки для промышленно получаемых биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы. Затруднение в том, что на вегетационные и полевые тесты уходит много временных, трудовых и материальных ресурсов, поэтому автором настоящего изобретения были подобраны условия для экспресс-оценки, а также тест-растения, обладающие не только быстрым откликом, но и являющиеся облигатно-микотрофными, т.е. существенно зависимыми от формирования и развития арбускулярной микоризы. Применение таких растений позволило получать достоверные различия в симбиотической эффективности между различными штаммами грибов арбускулярной микоризы в кратчайшие сроки, что обеспечило высокую чувствительность анализа и возможность проведения экспресс-определения индексов микоризации.
Недостатки известных способов определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и индексов микоризации в настоящем изобретении устранены путем применения в качестве тест-растения облигатно-микотрофного растения. В одном из вариантов реализации первого способа в качестве такого тест-растения используется селектированная автором настоящего изобретения линия Мl-1 люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L.), быстроотзывчивая на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы. За счет применения данной линии обеспечивается более точная экспресс-оценка симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, а также экспресс-оценка развития симбиотических структур по индексам микоризации в кратчайшие сроки, что формирует основной технический результат разработанного автором изобретения для тестирования качества биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы.
Также при оценке развития симбиотических структур грибов арбускулярной микоризы предложено применять новый показатель, разработанный автором настоящего изобретения, - фазу развития арбускулярной микоризы, что позволит более точно охарактеризовать скорость развития гриба арбускулярной микоризы. Кроме того, более высокая скорость роста гриба в сравнении с другими грибами арбускулярной микоризы косвенно свидетельствует о том, что такой гриб будет более конкурентоспособным в полевых условиях.
Таким образом, в задачи настоящего изобретения входит:
1) обеспечение экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы;
2) обеспечение экспресс-определения развития симбиотических структур грибов арбускулярной микоризы в корнях растений на основе индексов микоризации;
3) обеспечение совокупного экспресс-определения параметров симбиотического взаимодействия грибов арбускулярной микоризы и растения - симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и индексов микоризации.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложено экспресс-определение параметров симбиоза - арбускулярной микоризы, позволяющее в кратчайшие сроки провести анализ симбиотической эффективности и индексов микоризации, что существенно снижает его себестоимость, что повышает эффективность производства качественных биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы.
В настоящем изобретении предложен способ экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, включающий:
а) применение в качестве тест-растения облигатно-микотрофного растения в условиях низкого содержания доступного фосфора;
б) проведение стерильного относительно иных грибов арбускулярной микоризы вегетационного теста на симбиотическую эффективность анализируемого гриба арбускулярной микоризы;
в) определение показателей продуктивности растений;
г) вычисление симбиотической эффективности на основании данных по продуктивности растений с инокуляцией и без инокуляции грибом арбускулярной микоризы.
В одном из вариантов реализации способа (обозначаемого далее как «первый способ») в качестве облигатно-микотрофного растения используют облигатно-микотрофные линии люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L.).
В одном из вариантов реализации первого способа указанная люцерна хмелевидная представляет собой селектированную линию Мl-1, быстроотзывчивую на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы в условиях низкого уровня фосфора, доступного для питания растений в субстрате.
В одном из вариантов реализации первого способа на стадии (в) проводят определение содержания общего фосфора в растительных образцах.
В одном из вариантов реализации первого способа на стадии (в) проводят определение показателей продуктивности растений и содержания общего фосфора в растительных образцах.
В одном из вариантов реализации первого способа вычисление симбиотической эффективности осуществляют по формуле:
<mrow><mrow><mo>[</mo><mrow><mi>Э</mi><mi>ф</mi><mi>ф</mi><mi>е</mi><mi>к</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>в</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>ь</mi></mrow><mo>]</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>[</mo><mrow><msub><mi>X</mi><mrow><mi>M</mi><mo>+</mo></mrow></msub></mrow><mo>]</mo></mrow><mo>−</mo><mrow><mo>[</mo><mrow><msub><mi>X</mi><mrow><mi>M</mi><mo>−</mo></mrow></msub></mrow><mo>]</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>[</mo><mrow><msub><mi>X</mi><mi>M</mi></msub><msub><mrow /><mo>−</mo></msub></mrow><mo>]</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mi>%</mi></mrow>
М
М
+
-
где Х+, Х- - показатели продуктивности растений, инокулированных (М) и неинокулированных (М) грибом арбускулярной микоризы, соответственно.
В настоящем изобретении предложен способ экспресс-определения индексов микоризации, включающий:
а) применение в качестве тест-растения облигатно-микотрофного растения;
б) проведение стерильного относительно иных грибов арбускулярной микоризы вегетационного теста на определение показателей микоризации анализируемого гриба арбускулярной микоризы;
в) пробоподготовку микоризованных корней растений;
г) определение индексов микоризации.
В одном из вариантов данного способа (обозначаемого далее как «второй способ») в качестве облигатно-микотрофного растения используют также облигатно-микотрофные линии люцерны хмелевидной (Medicago lupulina).
В одном из вариантов реализации второго способа указанная люцерна хмелевидная представляет собой селектированную линию Мl-1, быстроотзывчивую на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы в условиях низкого уровня фосфора, доступного для питания растений в субстрате.
В одном из вариантов реализации второго способа на стадии (в) оценка индексов микоризации включает оценку одного или более параметров, выбранных из группы, включающей:
- встречаемость микоризной инфекции (F, %);
- интенсивность микоризной инфекции в расчете на всю корневую систему (М, %);
- интенсивность микоризной инфекции в микоризованных фрагментах корней (m, %);
- обилие арбускул в расчете на всю корневую систему (А, %);
а
- обилие арбускул в микоризованных фрагментах корней (, %);
- обилие везикул во всей корневой системе (В, %);
- обилие везикул в микоризованных фрагментах корней (b, %);
- фазу развития арбускулярной микоризы (φ°):
,
где а, b, с, d и е - число полей зрения микроскопа с 0, I, II, III, IV фазой развития арбускулярной микоризы в корне, соответственно: нулевая фаза развития арбускулярной микоризы - в поле зрения микроскопа микориза не попала, первая - в поле зрения мицелий гриба, II - мицелий гриба и арбускулы, III - мицелий гриба, арбускулы и везикулы, IV - мицелий гриба и везикулы.
2
5
В одном из вариантов реализации второго способа на стадии (в) оценка индексов микоризации включает оценку фазы развития арубскулярной микоризы совместно с оценкой амплитуды симбиотического взаимодействия - I (мг PO/сут):
,
+АМ
+AM
-AM
-AM
2
1
+
-
где амплитуда симбиотического взаимодействия рассчитана как характеристика степени взаимодействия «гриб-растение» по интенсивности симбиотрофного притока фосфора в растение; Х2, Х1 и Х2, X1 - содержание фосфора в листовых пластинах микоризных растений (М) и растений без микоризы (М) в разные сроки от посадки - t и t, соответственно.
Также в настоящем изобретении предложен способ совокупного экспресс-определения параметров симбиотического взаимодействия грибов арбускулярной микоризы и растения - симбиотической эффективности и индексов микоризации, объединяющий результаты совместного определения согласно первому и второму способу.
Краткое описание чертежей
На ФИГУРЕ 1 изображена быстроотзывчивая на инокуляцию грибом арбскулярной микоризы линия М1-1 люцерны хмелевидной с инокуляцией (справа) и без инокуляции (слева) грибом арбускулярной микоризы Glomus sp. (шт. №8) на 70-е сут от посадки.
+
-
+
+
4
На ФИГУРЕ 2 изображена векторная математическая модель развития микоризного симбиоза Glomus sp. с Medicago lupulina L. На ФИГУРЕ 2.а - вариант МР - растения с микоризой на почве с низким уровнем доступного для питания растений фосфора в субстрате; на ФИГУРЕ 2.b - вариант МР - растения с микоризой на почве со средним уровнем доступного для питания растений фосфора в субстрате); Ф I, II, III, IV - фазы развития арбускулярной микоризы: Ф I - “развитие внутрикорневого мицелия”; Ф II - “развитие внутрикорневого мицелия и арбускул”; Ф III - “развитие внутрикорневого мицелия, арбускул и везикул”; Ф IV - “развитие внутрикорневого мицелия и везикул”. В математической модели развития микоризы фаза развития арбускулярной микоризы определяется фактическим углом наклона вектора в конкретный момент времени, а интенсивность потока фосфора - I характеризуется длиной вектора. Для удобства отображения на графике I преобразована в величину ln([I]·10).
+
-
M
M
На ФИГУРЕ 3 представлена диаграмма сухой биомассы растений люцерны хмелевидной на 90-е сут от посева. На диаграмме: M и М - растения, инокулированные/неинокулированные грибом арбускулярной микоризы; эффективность гриба арбускулярной микоризы показана над вариантами с инокуляцией грибом арбускулярной микоризы (%); X+, X- - показатели продуктивности растений, инокулированных и неинокулированных грибом арбускулярной микоризы, соответственно.
-
+
На ФИГУРЕ 4 представлена диаграмма площади листовых пластинок линии М1-1 люцерны хмелевидной. На диаграмме: M - растения, не инокулированные грибом арбускулярной микоризы; М - растения, инокулированные грибом арбускулярной микоризы.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение решает задачу обеспечения экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и экспресс-определения развития симбиотических структур грибов арбускулярной микоризы в корнях растений на основе индексов микоризации. Такая экспресс-оценка возможна с применением растений, обладающих высоким и быстрым откликом на микоризацию, т.е. быстро формирующих симбиоз и имеющих существенную зависимость от формирования симбиоза с грибами арбускулярной микоризы, а значит, обеспечивающих существенную разницу в симбиотической эффективности разных штаммов грибов арбускулярной микоризы. Это позволяет в кратчайшие сроки провести анализ, что существенно снижает его себестоимость при оценке эффективности биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы, применяемых в сельском хозяйстве для усиления роста растений, их фосфорного питания, адаптации к тяжелым металлам, корневым патогенам и другим неблагоприятным факторам среды биотической и абиотической природы.
Неожиданно автором настоящего изобретения было обнаружено, что значительную разницу в симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы (уже на 10-30-е сут от посадки в зависимости от анализируемого показателя продуктивности) обеспечивает применение растений облигатно-микотрофных в условиях низкого уровня доступного для питания фосфора в субстрате (ФИГУРЫ 1, 3-4, Примеры 1, 3-4). Например, таким растением оказалась быстроотзывчивая на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы линия М1-1 люцерны хмелевидной (Medicago lupulina) (ФИГУРА 1). Растения этой линии показали нормальный рост в условиях микоризации и рост с признаками карликовости в условиях без инокуляции грибом арбускулярной микоризы, где они характеризовались мелким размером листовых пластин, укороченным стеблем и междоузлиями, отсутствием кущения. Результатом такой зависимости от формирования и развития микоризного симбиоза является существенная прибавка урожая при микоризации, равная 100-2500% и более в зависимости от условий и фазы развития растения на момент учета симбиотической эффективности.
Растение линии М1-1 люцерны хмелевидной было получено следующим образом.
KCl
Растения выращивали и отбирали на специально подобранном субстрате с низким содержанием доступного для питания растений фосфора. Характеристика субстрата: содержание органического вещества - 3%, общего азота - 78,0 мг N, доступного фосфора - 1,7 мг Р/100 г, доступного калия - 2,9 мг К/100 г (вытяжка 0,2 н. HCl по Кирсанову), pH=6,2. Проводили селекцию на снижение коэффициента вариации (CV) по показателям продуктивности растений с микоризой и без микоризы (CV<20%), а также на увеличение семенной продуктивности (>400 шт.) и более раннюю микоризацию корневой системы (с образованием арбускул к 10 сут от посадки).
Вегетационный тест на симбиотическую эффективность взаимодействия люцерны с грибом арбускулярной микоризы проводили в ряду 5 поколений растения с участием одного и того же штамма гриба и в стерильных условиях относительно иных грибов арбускулярной микоризы.
Растения выращивали при искусственном освещении (освещенность 3000 люкс, режим смены дня и ночи: 18 и 6 часов при температуре воздуха +25°C и +21°C, соответственно), полив проводили по весу - 0,6 полной влагоемкости. Проверена стабильность наследования симбиотических признаков линии до 5 поколения включительно.
Новая полученная линия М1-1 люцерны хмелевидной имеет, в частности, следующие характеристики:
1) обладает низкими CV (<20%) по показателям продуктивности и достоверным (Р<0,05) отсутствием полиморфизма по симбиотической эффективности с грибами арбускулярной микоризы, определяемым как отсутствие достоверных (Р<0,05) различий между CV по продуктивности микоризованных растений и растений без микоризы;
2) обладает высокой семенной продуктивностью - более примерно 400 семян с растения на 3 мес. от посадки на хорошо окультуренной почве;
3) имеет стабильное наследование ценных признаков, описанных выше.
Показано, что данная линия удовлетворяет критериям экспресс-определения параметров симбиотического взаимодействия.
Следует отметить, что растение линии М1-1 люцерны хмелевидной также может быть получено любым другим подходящим способом.
В настоящем изобретении предложен способ экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы, включающий в одном из вариантов: (а) применение в качестве тест-растения облигатно-микотрофного растения в условиях низкого содержания доступного фосфора; (б) проведение стерильного относительно иных грибов арбускулярной микоризы вегетационного теста на симбиотическую эффективность анализируемого гриба арбускулярной микоризы; (в) определение показателей продуктивности растений; (г) вычисление симбиотической эффективности на основании данных по продуктивности растений с инокуляцией и без инокуляции грибом арбускулярной микоризы.
Под термином “арбускулярная микориза” понимается наиболее распространенный растительно-грибной симбиоз, формируемый грибами отдела Glomeromycota с большинством наземных растений (около 90% видов), исключая некоторые виды из семейств: крестоцветные, маревые, осоковые, ситниковые, гвоздичные и гречишные. Развитие арбускулярной микоризы и коэволюция растений и грибов арбускулярной микоризы в течение полумиллиарда лет обеспечили формирование всего современного облика биосферы. Применение биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы обеспечивает высокие достоверные прибавки урожая сельскохозяйственных культур (15-60%) и ведение рационального природопользования в крупных городах с нарушенными экосистемами посредством инокуляции растений грибным препаратом. Обработка растений инокулятом на основе грибов арбускулярной микоризы позволяет решить проблемы слабого роста растений путем их адаптации: (1) за счет способности грибов усиливать поступление элементов питания в растения, особенно фосфатов; (2) за счет способности грибов инактивировать тяжелые металлы в почве; (3) за счет способности грибов повышать устойчивость растений к болезням, устраняя патогенные организмы путем синтеза антибиотиков, конкуренции за субстрат, либо за счет индукции иммунных реакций у растений; (4) способности грибов изменять гормональный статус растений, ускоряя их развитие. Контроль параметров симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и степени развития их симбиотических структур является неотъемлемой частью организации эффективного крупномасштабного производства биопрепаратов на их основе.
Под параметрами симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы понимаются показатели, основанные на учете “биологического эффекта”, т.е. действия микросимбионта на жизнеспособность (относительную приспособленность) растения- хозяина (Одум Ю. Основы экологии (Пер. с англ. под ред. Н.П. Наумова) - М.: Мир. 1975. - 502 с.). Вычисление симбиотической эффективности на основании данных по продуктивности растений может быть осуществлено любым способом, известным специалисту в данной области. В одном из вариантов предпочтительно осуществлять вычисления по формуле:
,
M
M
+
-
где X+, X- - показатели продуктивности растений, инокулированных (М) и неинокулированных (М) грибом арбускулярной микоризы, соответственно.
Согласно ранее разработанным способам эффективность действия грибов арбускулярной микоризы принято рассчитывать, как прибавку урожая - показателей продуктивности, выраженную в процентах и обусловленную инокуляцией растений грибами. В качестве показателей продуктивности в анализе применяются: сухая биомасса, накопление фосфора, белка, высота растения, кустистость, число листьев, площадь листовой поверхности и др. (Martensson A., Rydberg I. Variability among pea varieties for infection with arbuscular mycorrhizal fungi. // Swedish J. Agric. Res. 1994. V.24. P.13-19; Kahiluoto H. How to measure the effectiveness of mycorrhiza. // Lantbr. Akad. Tidskr. 1998. V.137, N 7. P.119-120; Якоби Л.М., Кукалев A.C., Ушаков K.B., Цыганов В.Е., Проворов Н.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями // Сельскохозяйственная биология. 2000. N 3. С.94-102).
Под термином “облигатно-микотрофное растение” понимается растение, не способное к нормальному росту при наличии лимитирующих факторов среды, например низкого содержания доступного для питания растений фосфора в субстрате для выращивания. Такие растения обладают высокой продуктивностью при образовании микоризного симбиоза и слабым ростом при его отсутствии. Генетическая облигатность растений от формирования микоризного симбиоза (в случае, когда растения без гриба совсем не растут, как, например, происходит в случае отсутствия орхидной микоризы у орхидеи) не представляет интереса для исследователя, т.к. симбиотическую эффективность не посчитать вследствие отсутствия роста растений без микоризации. Но весьма важным условием представляется наличие экологической облигатности, при которой с изменением внешних условий среды растения способны опять нормально развиваться. Например, при добавлении фосфорного удобрения в почву с низким содержанием фосфора, доступного для питания растений, можно наблюдать восстановление нормального роста и развития у облигатно-микотрофных растений при отсутствии симбиоза с грибами арбускулярной микоризы.
Подобные растения (экологически облигатно-микотрофные в условиях низкого уровня доступного фосфора в субстрате) не использовались ранее для оценки симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы. Таким образом, настоящее изобретение является новым. Применение подобных растений для экспресс-определения параметров симбиотического взаимодействия грибов арбускулярной микоризы и растения - симбиотической эффективности и индексов микоризации - позволило достичь неожиданного неочевидного результата - достоверных и высоких различий показателей симбиотической эффективности и индексов микоризации для различных штаммов грибов арбускулярной микоризы при проведении их экспресс-определения в течение уже первых 10-30 сут от начала экспериментов (в зависимости от анализируемого показателя продуктивности (ФИГУРА 4, в Примерах 2-3 дана сравнительная характеристика облигатно-микотрофного и слабомикотрофного растения). Таким образом, данное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень».
На втором этапе разработанного способа проводится стерильный относительно иных грибов арбускулярной микоризы вегетационный тест на симбиотическую эффективность анализируемого гриба арбускулярной микоризы. С этой целью проводится предварительная стерилизация фитобокса ультрафиолетом, используется фитобокс с неактивной вентиляцией, при инокуляции используются стерилизованные инструменты. Спорокарпы грибов арбускулярной микоризы, взятые для инокуляции, стерилизуются в растворе 100% белизны (действующее начало - гипохлорит натрия) в течение 30 с. Полив тестовых растений проводится стерильной водой.
Согласно одному из вариантов реализации способа экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы в качестве облигатно-микотрофного растения используют облигатно-микотрофные линии люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L.).
Согласно одному из вариантов реализации, указанная люцерна хмелевидная представляет собой селектированную линию М1-1, быстроотзывчивую на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы в условиях низкого уровня фосфора, доступного для питания растений в субстрате. Автором настоящего изобретения были проведены исследования внутрипопуляционного полиморфизма по показателям продуктивности и микоризации различных популяций растений с целью отбора наиболее отзывчивых на инокуляцию линий, а также отбора контрастных по симбиотической эффективности генотипов. Такая линия была получена на облигатно-микотрофной люцерне, слабо развивающейся в условиях низкого уровня доступного для питания растений фосфора в почве при отсутствии гриба и имеющей нормальное развитие в этих условиях при микоризации. На быстроотзывчивой на микоризацию люцерне проведен ряд экспериментов, результатом которых стал отбор в результате мутагенеза симбиотических растительных мутантов, обладающих сниженной симбиотической эффективностью грибов арбускулярной микоризы. Это указывает на возможность отбора растений с различной эффективностью и возможность их применения наряду с исходной линией М1-1 для экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы.
Согласно одному из вариантов реализации способа экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы на стадии (в) проводят определение содержания общего фосфора в растительных образцах.
Согласно одному из вариантов реализации на стадии (в) проводят определение показателей продуктивности растений и содержания общего фосфора в растительных образцах.
Таким образом, автору настоящего изобретения удалось определить условия и получить основные объекты, необходимые для проведения экспресс-определения параметров симбиоза - симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и индексов микоризации.
В настоящем изобретении предложен способ экспресс-определения индексов микоризации, включающий в одном из вариантов: (а) применение в качестве тест-растения облигатно-микотрофного растения; (б) проведение стерильного относительно иных грибов арбускулярной микоризы вегетационного теста на определение показателей микоризации анализируемого гриба арбускулярной микоризы; (в) пробоподготовку микоризованных корней растений и (г) определение индексов микоризации.
Под индексами микоризации понимаются показатели, характеризующие степень развития симбиотических структур грибов в корнях растений, которые определяются способом световой микроскопии. Фиксация и анализ степени развития симбиотических структур путем микроскопии необходимы для оценки степени развития различных грибов арубускулярной микоризы при экспресс-тестировании грибных биопрепаратов для стимуляции роста растений. Оценка микоризной инфекции наиболее часто проводится по встречаемости микоризной инфекции (F), интенсивности микоризной инфекции в расчете на всю корневую систему и в микоризованных фрагментах корней (М и m, соответственно), обилию арбускул в расчете на всю корневую систему и в микоризованных фрагментах корней (А и а, соответственно), обилию везикул во всей корневой системе и в микоризованных фрагментах корней (В и b, соответственно) (Trouvelot A., Kough J.L., Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de mycorhization VA d'un systeme radiculaire. Recherche de methodes ayant une signification fonctionnelle. / In: Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae. Eds. Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Paris: INRA-Press. 1986. P. 217-221). Способ является общепринятым и часто используется в совокупности со способом окрашивания трипановым синим (Phillips J.M., Hayman D.S. Improved procedure for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbuscular fungi for rapid assessment of infection. // Trans. Brit. Mycol. Soc. 1970. V. 55. P. 158-161; Utobo E.B., Ogbodo E.N., Nwogbaga A.C. Techniques for extraction and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi. // Libyan Agriculture Research Center Journal Internation. 2011. Vol.2 (2). P. 68-78). Недостатком таких способов является отсутствие единого показателя, характеризующего фазу развития арбускулярной микоризы по развитию всех ключевых симбиотических структур: внутрикорневого мицелия, арбускул и везикул.
Под пробоподготовкой образцов с целью определения индексов микоризации понимают совокупность процедур мацерации образцов микоризованных корней, их окрашивания, укладку на предметные стекла и приготовление давленого препарата для дальнейшей микроскопии.
Согласно одному из вариантов реализации способа экспресс-определения индексов микоризации в качестве облигатно-микотрофного растения используют облигатно-микотрофные линии люцерны хмелевидной (Medicago lupulina).
Согласно одному из вариантов реализации способа указанная люцерна хмелевидная представляет собой селектированную линию М1-1, быстроотзывчивую на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы в условиях низкого уровня фосфора, доступного для питания растений в субстрате.
Согласно одному из вариантов реализации на стадии (в) оценка индексов микоризации грибов арбускулярной микоризы включает оценку одного или более параметров, выбранных из группы, включающей:
- встречаемость микоризной инфекции (F, %);
- интенсивность микоризной инфекции в расчете на всю корневую систему (М, %);
- интенсивность микоризной инфекции в микоризованных фрагментах корней (m, %);
- обилие арбускул в расчете на всю корневую систему (А, %);
- обилие арбускул в микоризованных фрагментах корней (а, %);
- обилие везикул во всей корневой системе (В, %);
- обилие везикул в микоризованных фрагментах корней (b, %);
- фазу развития арбускулярной микоризы (φ°):
<mrow><mrow><mo>[</mo><mrow><msup><mi>ϕ</mi><mo>∘</mo></msup></mrow><mo>]</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><msup><mn>0</mn><mo>∘</mo></msup><mo>⋅</mo><mi>a</mi><mo>+</mo><msup><mrow><mn>90</mn></mrow><mo>∘</mo></msup><mo>⋅</mo><mi>b</mi><mo>+</mo><msup><mrow><mn>180</mn></mrow><mo>∘</mo></msup><mo>⋅</mo><mi>c</mi><mo>+</mo><msup><mrow><mn>270</mn></mrow><mo>∘</mo></msup><mo>⋅</mo><mi>d</mi><mo>+</mo><msup><mrow><mn>360</mn></mrow><mo>∘</mo></msup><mo>⋅</mo><mi>e</mi></mrow><mrow><mi>a</mi><mo>+</mo><mi>b</mi><mo>+</mo><mi>c</mi><mo>+</mo><mi>d</mi><mo>+</mo><mi>e</mi></mrow></mfrac></mrow>
где а, b, с, d и е - число полей зрения микроскопа с 0, I, II, III, IV фазой развития арбускулярной микоризы в корне, соответственно: нулевая фаза развития арбускулярной микоризы - в поле зрения микроскопа микориза не попала, первая - в поле зрения мицелий гриба, II - мицелий гриба и арбускулы, III - мицелий гриба, арбускулы и везикулы, IV - мицелий гриба и везикулы.
2
5
Согласно одному из вариантов реализации на стадии (в) оценка индексов микоризации грибов арбускулярной микоризы включает оценку фазы развития арбускулярной микоризы совместно с оценкой амплитуды симбиотического взаимодействия - / (мг РО/сут):
<mrow><mrow><mo>[</mo><mi>I</mi><mo>]</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mrow><mo>[</mo><mrow><mi>X</mi><msub><mn>2</mn><mrow><mo>+</mo><mi>A</mi><mi>M</mi></mrow></msub></mrow><mo>]</mo></mrow><mo>−</mo><mrow><mo>[</mo><mrow><mi>X</mi><msub><mn>2</mn><mrow><mo>−</mo><mi>A</mi><mi>M</mi></mrow></msub></mrow><mo>]</mo></mrow></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>−</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mrow><mo>[</mo><mrow><mi>X</mi><msub><mn>1</mn><mrow><mo>+</mo><mi>A</mi><mi>M</mi></mrow></msub></mrow><mo>]</mo></mrow><mo>−</mo><mrow><mo>[</mo><mrow><mi>X</mi><msub><mn>1</mn><mrow><mo>−</mo><mi>A</mi><mi>M</mi></mrow></msub></mrow><mo>]</mo></mrow></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>[</mo><mrow><msub><mi>t</mi><mn>2</mn></msub></mrow><mo>]</mo></mrow><mo>−</mo><mrow><mo>[</mo><mrow><msub><mi>t</mi><mn>1</mn></msub></mrow><mo>]</mo></mrow></mrow></mfrac></mrow>
+АM
+АM
-AM
-AM
2
1
+
где амплитуда симбиотического взаимодействия рассчитана как характеристика степени взаимодействия «гриб-растение» по интенсивности симбиотрофного притока фосфора в растение; Х2, Х1 и X2, Х1 - содержание фосфора в листовых пластинах микоризных растений (М) и растений без микоризы (М-) в разные сроки от посадки - t и t, соответственно.
В настоящем изобретении предложен способ совокупного экспресс-определения параметров симбиоза - симбиотической эффективности и индексов микоризации, объединяющий определения, проводимые по 1-му и 2-му способу.
Развитие арбускулярной микоризы, как очень лабильной надорганизменной системы, контролируется целым рядом факторов, как внешних, так и внутренних. Для того чтобы провести корректный анализ эффективности взаимодействия партнеров этого симбиоза, необходимо привести взаимодействия растений и грибов арбускулярной микоризы к некой модели, которая бы включала лишь наиболее значимые для развития арбускулярной микоризы параметры. Анализ известного уровня техники показал, что наиболее часто популяционную динамику живых организмов описывают с помощью логистических моделей, негативно-экспоненциальных, моделей гиперболического насыщения и пробит-моделей. Кроме того, например, Е.Монтесинос и А.Бонатерра для анализа влияния плотности патогена на развитие болезни использовали модели нелинейной регрессии (Montesinos Е., Bonaterra A. Dose-response models in biological control of plant pathogens: an empirical verification. // Phytopathol. 1996. V. 86, N 5. P. 464-472). П. Дж. Жанг с соавт. успешно применил регрессионную модель при описании пораженности растений серой гнилью как функции плотности пропагул патогена Botrytis cinerea (Zhang P.G., Sutton J.C., Hopkin A.A. Inoculum concentration and time of application of Gliocladium roseum in relation to biocontrol of Botrytis cinerea in black spruce seedlings. // Can. J. Forest Res. 1996. V. 26, N 3. P. 360-367). Л.M. Ортега с соавт. использовал простую линейную регрессионную модель для анализа пораженности гвоздики фузариозом (Ortega L.M., Gomez S., Arbelaez G. Assessment of Streptomyces griseoviridis (Mycostop) as a biocontrol agent of Fusarium oxysporum f. sp.dianthi in two standard carnation cultivars under commercial conditions. // Agronomia-Colombiana. 1994. V. 11, N 1. P. 1-12). Между тем анализ известного уровня техники не выявил ни одного исследования развития арбускулярной микоризы с применением векторной математической модели.
Предложенный автором настоящего изобретения новый индекс микоризации - фаза развития арбускулярной микоризы (φ°) с амплитудой симбиотического взаимодействия (I), разработанная в рамках создания векторной математической модели развития арбускулярной микоризы (ФИГУРА 2), является интегральной характеристикой взаимодействия партнеров симбиоза, обеспечивающей наглядное представление данных и возможность быстрого и точного анализа ключевых изменений в развитии симбиотической системы. Исходной информацией для построения модели послужили данные по содержанию фосфора в растении, сухой биомассе растений, фазе развития растений и арбускулярной микоризы. Исходя из модели развития симбиоза видно, что на 25-е сут арбускулярная микориза в варианте с низким содержанием доступного для питания растений фосфора в субстрате (ФИГУРА 2.а) уже перешла из 1-й фазы - "развитие внутрикорневого мицелия” в следующую фазу - "развитие внутрикорневого мицелия и арбускул". Именно к этому сроку в варианте с внесением фосфорного удобрения (ФИГУРА 2.b) наблюдалось снижение поступления фосфора в растение, что выражено в снижении амплитуды взаимодействия. Таким образом, следует говорить не об ускорении развития арбускулярной микоризы в варианте с низким содержанием фосфора в субстрате (ФИГУРА 2.а), а о торможении ее развития со стороны растения-хозяина в варианте со средним уровнем фосфора в почве (ФИГУРА 2.b).
Общая схема развития арбускулярной микоризы у растений облигатно-микотрофной линии люцерны хмелевидной выражается следующим образом: 1) 7-е сут от посева -образование апрессориев, проникновение гриба арбускулярной микоризы в корень, начало развития гиф в верхнем слое кортекса; 2) 18…25 → 25…32 сут - переход симбиоза с первой фазы "развитие внутрикорневого мицелия" во II фазу "развитие внутрикорневого мицелия и арбускул"; 3) 32 → 42 сут - переход симбиоза со II в III фазу "развитие внутрикорневого мицелия, арбускул и везикул"; 4) 42→69 сут - переход симбиоза с III в IV фазу "развитие внутрикорневого мицелия и везикул".
Пример 1
Проведено несколько серий опытов на облигатно-микотрофных растениях. В качестве примера в данном разделе приведены данные экспериментов, проведенных на люцерне хмелевидной (Medicago lupulina L.).
Исследования, проводимые автором настоящего изобретения, показали, что люцерна хмелевидная является одним из наиболее полиморфных видов по симбиотической эффективности с грибами арбускулярной микоризы, что позволяет вести селекцию линии с повышенной симбиотической эффективностью (Юрков А.П., Якоби Л.М., Дзюбенко Н.И., Шишова М.Ф., Проворов Н.А., Кожемяков А.П., Завалин А.А. Полиморфизм популяции Павловская люцерны хмелевидной по показателям продуктивности, микоризации и эффективности симбиоза с Glomus intraradices. II Сельскохозяйственная биология. 2011. №3. С.65-71). Ключевым этапом отбора и дальнейшей селекции высокосимбиотрофной линии люцерны послужили данные, полученные при анализе внутривидового полиморфизма люцерны хмелевидной по симбиотической эффективности.
Сначала получают инокулят грибов арбускулярной микоризы для обработки растений в вариантах с микоризацией, для чего подготавливают свежие микоризованные корни плектрантуса южного (Plectranthus australis R.Br.). Встречаемость микоризной инфекции - не менее 75%.
Затем берут семена 2 примитивных сортов (Мира, ВИК32) и 2 дикорастущих популяций (Юнтоловская и Павловская) люцерны хмелевидной. Перед проращиванием семена люцерны очищают от створок, стерилизуют концентрированной серной кислотой в течение 8 мин и промывают стерилизованной водой. Проращивание проводят на влажной стерилизованной фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре +27°С.
КСl
Потом проводят инокуляцию проростков люцерны (микоризованными корнями плектрантуса в вариантах с арбускулярной микоризой и немикоризованными корнями в вариантах без арбускулярной микоризы). Осуществляется посадка в сосуды емкостью 200 мл. В качестве субстрата берут смесь дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы и промытого речного песка в соотношении 2:1. Содержание фосфора доступного для питания растений в субстрате низкое, рН составляет 6,1.
Выращивание растений в вегетационных условиях проводится в отсутствии инокуляции ризобиями, что предполагает использование стерилизованного ультрафиолетом (до постановки опыта) светового бокса с неактивной вентиляцией, стерилизованного субстрата с низким содержанием доступного фосфора и свежекипяченой воды для полива. Режим смены дня и ночи: 18 и 6 часов, соответственно, при температуре +21 и +25°С, соответственно. Для освещения используют люминесцентные лампы LB-40 (Россия) и OSRAM L36/77 Fluora (Германия), световой поток - 1400 лм. Полив растений проводится один раз в сутки по весу из расчета достижения 60% от полной влагоемкости почвы. Минимальная биологическая повторность по вариантам - 35 растений.
Растения убирают на 90-е сут от посадки и фиксируют показатели продуктивности и симбиотической эффективности (ФИГУРА 3).
Как показано на ФИГУРЕ 3, наиболее отзывчивыми генотипами люцерны являются линии образца ВИК32, которые обеспечивают ~28-кратную среднюю прибавку урожая надземных частей растений.
Как показано в табл.1, у всех популяций люцерны имеет место внутрипопуляционный полиморфизм по показателям симбиотической эффективности, что фиксируется по достоверной разнице в коэффициентах вариации, асимметрии и эксцесса между показателями продуктивности растений без арбускулярной микоризы и растений с арбускулярной микоризой (контроля и опыта). Наиболее полиморфной является сортопопуляция ВИК32. Такие данные свидетельствуют в пользу того, что именно из этой популяции следует вести отбор высокомикотрофного растения для экспресс-определения растений на симбиотическую эффективность.
Таблица 1
Выявление полиморфизма по отзывчивости на инокуляцию Glomus intraradices образцов люцерны хмелевидной различного происхождения
Статистический параметр
Высота растенияM<sup>-</sup>|M<sup>+</sup>
КустистостьM<sup>-</sup>|M<sup>+</sup>
Сухая массаM<sup>-</sup>|M<sup>+</sup>
Сортопопуляция Мира
C<sub>v</sub>,%
29
61
38
21
39
39
As
2,6
1,5
-0,8
-0,3
0,0
0,9
Ex
10,3
4,4
-0,2
-0,3
-0,5
0,2
Дикорастущая популяция Павловская
C<sub>v</sub>%
43
78
61
39
53
89
As
1,3
1,7
0,5
-0,3
0,7
1,6
Ex
1,6
2,0
-0,8
-0,7
-0,3
1,4
Дикорастущая популяция Юнтоловская
C<sub>v</sub>%
39
65
53
39
58
57
As
0,4
1,4
0,4
0,2
0,4
1,4
Ex
-1,0
1,7
-1,1
-0,7
-0,9
1,8
Сортопопуляция ВИК2
С<sub>v</sub>,%
39
10
47
12
60
29
As
0,5
0,0
1,6
-0,8
1,8
0,0
Ex
0,6
-0,6
2,5
0,9
5,7
-0,6
Примечание: М<sup>-</sup> - растения, не инокулированные грибом арбускулярной микоризы;М<sup>+ </sup>- растения, инокулированные грибом арбускулярной микоризы. Значения в ячейках, выделенных серым цветом, указывают на наличие внутрипопуляционного полиморфизма люцерны хмелевидной (достоверные различия контроля и опыта)
Как видно из данного примера, все популяции люцерны хмелевидной обладали полиморфизмом по симбиотической эффективности арбускулярной микоризы. Из этого следует вывод о возможности отбора линий быстроотзывчивых на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы из популяций люцерны хмелевидной. Результатом селекции стала быстроотзывчивая на микоризацию линия Мl-1 люцерны хмелевидной, облигатно-микотрофная в условиях низкого уровня фосфора в почве (ФИГУРА 1).
Подтверждение применимости данной облигатно-микотрофной линии для экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы и индексов микоризации представлено в Примерах 3-4. Низкая чувствительность способа определения тех же показателей симбиоза на необлигатно-микотрофных линиях представлена в Примере 2.
Пример 2
Для экспресс-определения симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы проведены несколько серий опытов на горохе посевном {Pisum sativum L.). В исследование взят P. sativum L. subsp.sativum изолят ВИР №1693 (среднепоздний). Этот образец по результатам исследования активности микоризообразования 99 образцов дикорастущих популяций и примитивных сортов гороха посевного по фону инокуляции ризобиями в условиях вегетационного опыта отличался высоким приростом биомассы и накоплением фосфора в ответ на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы Glomus sp. (Якоби Л.М., Кукалев А.С., Ушаков К.В., Цыганов В.Е., Проворов Н.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями. // Сельскохозяйственная биология. 2000. N 3. С.94-102).
Сначала получают инокулят грибов арбускулярной микоризы для обработки растений аналогично процедуре Примера 1.
Затем берут семена изолята ВИР №1693 гороха посевного. Для посева отбирают крупные и одинаковые по размеру семена. Фракция семян: 0,13÷0,17), 17 г. Семена стерилизуют и проращивают аналогично процедуре Примера 1.
Потом осуществляется посадка в сосуды емкостью 1 л. В качестве субстрата берут смесь аналогичную описанной в Примере 1.
Затем проводится инокуляция растений грибами арбускулярной микоризы (9 штаммов в отдельных вариантах) путем внесения свежих мелконарезанных микоризованных корней плектрантуса в почву под проростки из расчета 100 мг на одно растение. Инокуляция растений ризобиями не проводится, а во избежание спонтанного заражения полив растений осуществляют кипяченой водой. Выращивание растений в вегетационных условиях проводится аналогично процедуре, описанной в Примере 1. Проростки высаживают в почву по 5 растений на один сосуд. Биологическая повторность по вариантам - 20 растений.
Растения убирают на 35-е сут от посадки и фиксируют показатели продуктивности и симбиотической эффективности (табл.2).
Таблица 2
Показатели продуктивности и симбиотической эффективности Pisum sativum subsp. sativum со штаммами грибов арбускулярной микоризы различного происхождения
Вариант
Высота стебля, см
Число листьев
Сырая масса надземных частей, г
Сухая биомасса надземных частей, г
Симбиотическая эффективность (%), рассчитанная по
высоте стеблей
числу листьев
сырой массе надз. частей
сухой массе надз. частей
без AM
74,0
14,8
3,38
0,598
---
---
---
---
шт.№1
74,4
14,2
3,24
0,582
0,6
-4,1
-3,9
-2,6
шт.№2
76,2
14,6
3,25
0,596
3,0
-1,4
-3.7
-0,2
шт.№3
75,5
14,8
3,30
0,617
2,0
-0.3
-2,2
3,3
шт.№4
73,7
14,6
3,37
0,619
-0,3
-1,7
-0,3
3,5
шт.№5
77,6
14,7
3,42
0,635
4.9
-0.7
1,3
6,2
шт.№6
79,3
14,7
3,57
0,646
7,2
-0,7
5.7
8,1
шт.№7
78,1
14,8
3,48
0,649
5,6
-0,3
3,1
8,6
шт.№8
77,6
14,9
3,87
0,668
4,9
0,3
14,8
11,8
шт.№9
81,5
15,1
4,06
0,699
10,1
2,0
20,2
17,0
Как показано в табл.2, на изоляте №1693-ВИР гороха посевного не выявлено достоверных (Р<0,05) прибавок от инокуляции грибами арбускулярной микоризы.
Как видно из данного примера, применение необлигатно-микотрофного растения не позволяет получать достоверные различия в действии различных грибов арбускулярной микоризы на растение-хозяина. Это означает, что такие растения не подходят в качестве тест-растений для экспресс-определения параметров симбиоза - симбиотической эффективности и индексов микоризации при отборе эффективных штаммов грибов для биопрепаратов, а также для экспресс-контроля качества биопрепаратов.
Пример 3
Сначала получают инокулят грибов арбускулярной микоризы для обработки растений аналогично процедуре Примера 1.
Затем берут семена облигатно-микотрофной линии М1-1 (ФИГУРА 1) люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L.). Проводят стерилизацию, проращивание семян и инокуляцию проростков аналогично процедуре Примера 1.
Посадка осуществляется в сосуды емкостью 200 мл. В качестве субстрата берут смесь, аналогичную смеси, описанной в Примере 1. Выращивание растений проводится в условиях, аналогичных условиям, описанным в Примере 1. Минимальная биологическая повторность по вариантам - 12 растений.
Растения убирают на 30-е сут от посадки и фиксируют показатели продуктивности и симбиотической эффективности (табл.3-4).
Как показано в табл.3, такая характеристика продуктивности, как "длина корня", не имеет зависимости от инокуляции растений грибов арбускулярной микоризы и потому не имеет существенной (Р>0,05) симбиотической эффективности по этому показателю. Таким образом, данный параметр исключается из параметров оценки симбиотической эффективности грибов арбускулярной микоризы.
Несмотря на то что все анализируемые штаммы грибов арбускулярной микоризы являются эффективными и уже прошли ранее отбор, данный способ позволил выявить существенные различия (Р<0,05) в симбиотической эффективности, рассчитанной по всем остальным показателям продуктивности (сухой массе корней и надземных частей, высоте стебля). Наиболее симбиотически эффективным штаммом по сухому весу растений является штамм №2.
Таблица 3
Показатели продуктивности и симбиотической эффективности 7 различных штаммов грибов арбускулярной микоризы
Длина
Длина
Сухой вес
Сухой вес
Сухой вес
Вариант
корня
стебля
надз. ч.
корней
растения
см
Э, %
см
Э, %
мг
Э, %
мг
Э, %
мг
Э, %
без AM
10,1
---
0,4
---
8,8
---
5,8
---
14,7
---
шт.№8 (контроль)
10,8
6,6
1,5
267,9
19,7
122,8
9,3
58,7
29,0
97,3
шт.№1
13,2
30,7
1,6
309,7
17,6<sup>1</sup>
98,6
9,2
58,6
26,8
82,7
шт.№2
13,8
36,8
1,6
295,3
24,6<sup>2</sup>
177,4
12,2<sup>2</sup>
109,6
36,8<sup>2</sup>
150,5
шт.№3
12,2
20,9
1,1<sup>1</sup>
163,8
20,1
127,0
9,8
68,0
29,9
103,6
шт.№4
10,8
7,1
1,6
305,0
19,2
116,6
9,1
56,2
28,3
92,6
шт.№5
11,6
14,8
1,2<sup>1</sup>
204,9
21,3
140,3
9,7
65,9
30,9
110,7
шт.№9
12,2
20,9
1,6
302,8
22,7<sup>2</sup>
156,1
7,9<sup>!</sup>
35,2
30,6
108,1
Примечание: в таблице вариант "без AM" - без инокуляции грибом арбускулярной микоризы; "Э" - симбиотическая эффективность (прибавка показателя продуктивности, определяемая влиянием гриба на растение)
1
1,1 - значение показателя существенно (Р<0,05) ниже значения для контрольного шт.№8, а симбиотическая эффективность, рассчитанная по этому показателю (справа от данной цифры) достоверно ниже эффективности контрольного штамма гриба арбускулярной микоризы;
2
24,6 - значение показателя существенно (Р<0,05) выше значения для контрольного штамма №7, а симбиотическая эффективность, рассчитанная по этому показателю (справа от данной цифры), достоверно выше эффективности контрольного штамма гриба арбускулярной микоризы.
Как показано в табл.4, анализ микоризации лучше всего проводить по фазе развития арбускулярной микоризы, поскольку она является интегральным показателем, характеризующим развитие арбускулярной микоризы. Из представленных данных видно, что штаммы №1, №4, №5 и №9 развиваются в корнях растения-хозяина существенно (Р<0,05) слабее, чем тестовый штамм №8. С другой стороны, штамм №2 достоверно (Р<0,05) лучше развивается, чем тестовый штамм.
Таблица 4
Индикаторы микоризации 7 различных штаммов грибов арбускулярной микоризы
Вариант
F, %
М, %
m, %
А, %
а, %
B, %
b, %
Фаза развития AM - φ°
без AM
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0
шт.№8 (контроль)
48,2
11,2
19,2
2,8
20,6
1,0
7,7
174
шт.№1
45,5
13,8
22,4
1,3
8,8<sup>1</sup>
0,0<sup>1</sup>
0,0<sup>1</sup>
102<sup>1</sup>
шт.№2
57,6
19,5<sup>2</sup>
34,3<sup>2</sup>
4,0<sup>2</sup>
18,9
4,9<sup>2</sup>
22,4<sup>2</sup>
235<sup>2</sup>
шт.№3
43,7
18,2
27,2<sup>2</sup>
2,4
10,4
1,2
5,4
167
шт.№4
32,5<sup>1</sup>
7,0
17,9
1,5
14,5
0,0<sup>1</sup>
0,0<sup>1</sup>
111<sup>1</sup>
шт.№5
45,2
5,8<sup>1</sup>
9,1<sup>1</sup>
1,0<sup>1</sup>
10,5
0,1<sup>1</sup>
0,9<sup>1</sup>
120<sup>1</sup>
шт.№9
49,1
14,0
21,1
3,8
20,0
1,9
12,5
157<sup>1</sup>
Примечание: варианты: см. Примечание к Таблице 3; анализируемые параметры микоризации: F - встречаемость микоризной инфекции; М - интенсивность микоризной инфекции в расчете на всю корневую систему; m - интенсивность микоризной инфекции в микоризованных фрагментах корней; А - обилие арбускул в расчете на всю корневую систему; а - обилие арбускул в микоризованных фрагментах корней; В - обилие везикул во всей корневой системе; b - обилие везикул в микоризованных фрагментах корней; φ° - фаза развития арбускулярной микоризы
1
32,5 - значение показателя существенно (Р<0,05) ниже значения для контрольного штамма №8 гриба арбускулярной микоризы;
2
19,5 - значение показателя существенно (Р<0,05) выше значения для контрольного штамма №8 гриба арбускулярной микоризы.
Как видно из данного примера, применение облигатно-микотрофного растения позволяет получать достоверные различия в действии различных грибов арбускулярной микоризы на растение-хозяина. Это позволяет, в свою очередь, проводить отбор эффективных штаммов грибов для биопрепаратов, а также позволяет проводить точный экспресс-контроль качества биопрепаратов, включая контроль симбиотической эффективности и индексов микоризации.
Помимо того, разработанный автором настоящего изобретения новый индекс микоризации - фаза развития арбускулярной микоризы (φ°) в полной мере описывает процесс развития симбиоза и является более чувствительным, чем остальные анализируемые показатели микоризации.
Пример 4
Сначала получают инокулят грибов арбускулярной микоризы для обработки растений аналогично процедуре Примера 1.
Затем берут семена облигатно-микотрофной линии Мl-1 (ФИГУРА 1) люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L.). Стерилизацию, проращивание семян и инокуляцию проростков проводят аналогично процедуре, описанной в Примере 1.
Посадка осуществляется в сосуды емкостью 200 мл. В качестве субстрата берут смесь, аналогичную смеси, описанной в Примере 1.
Выращивание растений в вегетационных условиях аналогично процедуре, описанной в Примере 1. Минимальная биологическая повторность по вариантам - 12 растений.
Растения убирают на 10-е, 20-е, 30-е и 40-е сут от посадки и фиксируют показатели продуктивности и симбиотической эффективности (ФИГУРА 4).
Как показано на ФИГУРЕ 4, существенные (Р<0,05) различия между контролем (без инокуляции грибом арбускулярной микоризы) и опытным вариантом (с инокуляцией шт.№8 гриба арбускулярной микоризы) наблюдаются уже с 10 сут от посадки и со временем увеличиваются.
Как видно из данного примера, применение облигатно-микотрофного растения позволяет получать достоверные различия по симбиотической эффективности в кратчайшие сроки - уже на 10 сут от посадки, что подтверждает возможность экспресс-определения параметров симбиоза - арбускулярной микоризы.
Специалисту в данной области очевидно, что в переделах объема и сущности настоящего изобретения возможно различные модификации. Данные модификации также включены в настоящее изобретение.