Определение токоферолов в маслах и маслосодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

B. А. Кищенко,

соискатель И. В. Левчук,

соискатель

НУПТ (Национальный университет пищевых технологий), г. Киев, Украина

C. Г. Ефименко,

кандидат биологических наук ГНУ ВНИИ масличных культур

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКОФЕРОЛОВ В МАСЛАХ И МАСЛОСОДЕРЖАЩИХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

УДК 547.915:634.0892.6:543.544

Жиры, масла, масложировая продукция широко используются в питании человека. Это высококалорийные продукты, которые имеют большое физиологическое значение. Они используются для приготовления кулинарных блюд, изготовления консервов, в пищевой промышленности и непосредственно в пищу.

К факторам, которые обусловливают сферу использования растительных масел, относятся качество сырья и технология их производства. Среди показателей качества масла важная роль отводится содержанию жирорастворимых витаминов. Известные химические и физико-химические методы определения витаминов базируются на их индивидуальных свойствах. Определение витаминосодержащих продуктов традиционными методами связано с большими трудностями, анализ продолжительный во времени и требует использования нескольких индивидуальных методик.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в последние годы заняла надлежащее место в аналитических лабораториях как удобный метод количественного анализа. Использование этого метода для одновременного качественного и количественного определения жирорастворимых витаминов при их совместном присутствии дает возможность сократить трудоемкость анализа по сравнению с традиционными химическими и физико-химическими методами.

Цель и задачи исследований. В настоящее время наиболее распространенными видами пищевых масел на территории Восточной Европы являются подсолнечное, рапсовое, кукурузное, оливковое, соевое и др. Известно, что показатели качества масел тесно связаны со степенью их очистки. Применяемые способы промышленной переработки предопределяют следующие варианты растительных масел: нерафинированные, гидратированные, рафинированные и дезодорированные.

Хорошо знакомые нам рафинированные масла прозрачны, лишены осадка, слабо окрашены, а в случае применения дезодорации не имеют вкуса и запаха. Напротив, нерафинированные масла имеют интенсивную окраску, ярко выраженные вкус и запах, в них наблюдаются мутность и наличие осадка,

что обусловлено присутствием сопутствующих веществ. В составе сопутствующих веществ основную часть составляют жирорастворимые витамины, такие, как стеролы, каротиноиды, токоферолы и др.

Витамины играют важную роль в жизнедеятельности человека. Большинство витаминов в составе ферментных систем выступают в роли катализаторов в реакциях преобразования белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот. В частности, они принимают участие в реакциях окисления и восстановления, трансметилирования, изомеризации, карбоксилирования, декарбоксилирования, переноса ацильных и одноуглеродных групп [1]. При участии витаминов обеспечиваются все физиологические функции органов, тканей и желез внутренней секреции, а также биохимические процессы, которые лежат в их основе. Дефицит жирорастворимых витаминов в рационе является причиной нарушения синтеза ферментов в организме, что приводит к нарушению обмена веществ и снижению сопротивляемости организма к различным заболеваниям, особенно инфекционным [2].

Учитывая важное значение жирорастворимых витаминов для организма человека, вопрос контроля их содержания в продуктах питания является актуальным. Универсальным методом определения витаминов является метод ВЭЖХ, который имеет ряд преимуществ перед традиционными химическими и физико-химическими методами [3]. Чтобы количественно оценить содержание жирорастворимых витаминов традиционными методами, необходимо разделение веществ с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), а затем элюирование с пластинки индивидуальных компонентов, получение их триме-тилсилильных производных с последующим анализом методом газовой хроматографией [4].

Цель нашей работы - разработка методики определения жирорастворимых витаминов в маслах и маслосодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенно-фазной колонке.

Для достижения этой цели были поставленны следующие задачи:

- разработать методику качественного и количес-

твенного определения жирорастворимых витаминов в маслах, зерне, масложиросодержащих продуктах с помощью ВЭЖХ;

- определить содержание токоферолов в растительных маслах;

- изучить влияние технологических процессов на содержание жирорастворимых витаминов в маслах;

- на основе анализа полученных данных обосновать контроль качества масел на основании определения содержания жирорастворимых витаминов в продуктах питания.

Материалы и методы. Объектом исследований были семена масличных культур, масла, спреды и майонезы. Для извлечения масла из семян масличных культур использовали смесь растворителей: гек-сан : хлороформ (9:1). В дальшейшем работали только с жировой частью.

Для исследований использовали жидкостной хроматограф производства фирмы Hewlett-Packard 1100 с флуоресцентным и диодно-матричным детекторами, обращенно-фазную колонку Hypersil MOS с диаметром 2,1 мм, длиной 200 мм. Условия хромато-графирования: мобильная фаза ацетонитрил : вода (70:80), скорость потока 0,4 мл/мин, температура термостата 40 °С.

Флуоресцентный детектор - длина волны возбуждения 295 нм, поглощение 330 нм. Стандарты витаминов - чистые вещества основных форм токоферолов (а, ß, у и 5) производства фирмы Supelco. Реактивы - производства фирм Aldrich, Fluka и др.

Рабочий диапазон массовой доли витамина Е, которую можно определять с помощью данного метода составляет 1-500 мг/кг.

Результаты исследований. Растительные масла одного товарного наименования, но выделенные из семян растений, выращенных в разных регионах, отличаются по физико-химическим показателям. Одним из важных показателей, характеризующим качество масла, является содержание жирорастворимых витаминов. Поэтому наши исследования были направлены на разработку методики определения жирорастворимых витаминов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для этого выполнялась следующая последовательность действий: щелочной гидролиз пробы, экстракция диэтиловым эфиром не-омыленного остатка, концентрирование путем выпаривание пробы до сухого остатка, растворение в метиловом спирте и введение экстракта в жидкостной хроматограф для разделения пиков витаминов и их количественного определения.

Совместное содержание жирорастворимых витаминов в растительных маслах определяли по разработанной нами методике, которая приведена ниже.

К навеске образца массой 5 г добавляли 15 см3 метилового спирта, 10 см3 водного 10 % раствора аскорбиновой кислоты, 4 см3 водного раствора гидроокиси калия, помещали в круглодонную колбу, соединенную с обратным водяным холодильником, и выдерживали на водяной бане при температуре 8590 °С на протяжении 30 мин, периодически переме-

шивая и избегая интенсивного кипения и прямого попадания солнечного света.

В омыленную пробу после охлаждения добавляли 50 см3 дистиллированной воды и помещали в делительную воронку. Трижды экстрагировали неомы-ленные вещества в том числе и витамины диэтиловым эфиром порциями по 30-50 см3.

Объединенные эфирные экстракты промывали дистиллированной водой порциями по 100 см3 до отсутствия щелочной реакции промывных вод (проба по лакмусовой бумаге, рН 6,5-7,0).

Раствор фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в колбу для отгона. Сульфат натрия промывали трижды диэтиловым эфиром порциями по 10 см3, которые собирали в ту же колбу, и прибавляли антиоксидант (10 % раствор аскорбиновой кислоты). Эфир отгоняли в вакууме или в токе азота на водяной бане при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток немедленно растворяли в метиловом спирте и количественно переносили в мерную колбу объемом 10 см3. Доводили объем раствора метанолом до метки, закрывали и перемешивали. Полученный экстракт использовали для хроматографического определения витаминов.

Одновременно проводили идентичный анализ контрольного раствора, который содержал а-то ко -ферол в концентрациях, близких к ожидаемой в пробе, и так называемую „холостую" пробу. Для приготовления контрольного раствора отбирали необходимый объем стандартных исходных растворов а-токоферола, прибавляли 15 см3 метилового спирта, 10 см3 водного 10 % раствора аскорбиновой кислоты, 4 см3 водного 50 % раствора гидроокиси калия, помещали в круглодонную колбу и проводили щелочной гидролиз.

„Холостую" пробу готовили аналогичным образом, заменив навеску 5 см3 дистиллированной воды, пробу проводили ее через весь ход анализа. На хро-матограмме „холостой" пробы пиков, которые совпадают по времени удерживания с пиками витаминов, не должно быть.

Подготовку хроматографической системы к работе проводили соответственно инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа НР 1100. Градуировочные растворы витаминов готовили из исходного раствора в метаноле и анализировали при тех же самых условиях, что и образцы. Регистрировали не меньше 5 хроматограмм каждого раствора. Из полученных значений площадей хроматографиче-ских пиков находили среднее арифметическое (использовали значения, расхождение между которыми не превышало 10 %). По полученным данным строили градуировочную зависимость площади пика от концентрации компонента. Градуировочные характеристики должны быть линейными (линейный динамический диапазон - это диапазон концентраций масс, внутри которого наблюдается линейная зависимость сигнала детектора от концентрации или массы вещества).

На хроматограммах проб идентифицировали ком-

поненты по совпадению времени удержания пиков с пиками витаминов на хроматограммах градуировоч-ных растворов.

Количественное определение проводили, измеряя площади пиков. За результат принимали среднее арифметическое для двух введений, если расхождение между ними не превышало 10 %.

Витамин Е чаще всего в исследуемых нами маслах присутствовал в виде а-токоферола, но в отдельных объектах растительного происхождения (семена, растительное масло из семян различных культур) встречаются и другие формы токоферолов.

Нами проведено определение жирорастворимых витаминов в семенах льна, подсолнечника, рапса и в растительных маслах, полученных в результате исследования разных технологических процессов.

Примеры хроматограмм, полученных при определении токоферолов в растительных маслах, приведены на рисунках 1-3. В результате исследования установлено, что в рафинированных, дезодорированных и гидратированных маслах находятся остатки витаминов. Нерафинированное масло включает в себя токоферолы в виде различных форм токоферолов (рис. 3). Данные о содержании токоферолов в растительных маслах приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Массовая доля токоферолов в нерафинированных (первого отжима) растительныш маслах

Вид масла Токоферол, мг/кг

а в у- 8-

Подсолнечное 94-950 0-50 0-50 0-10

Рапсовое 100-386 0-140 189-753 0-22

Льняное 5-10 - 170-575 4-8

Оливковое 63-135 7-15

Растительные масла являются естественным источником биологически активных соединений. Для определения состава жирорастворимых витаминов был использован современный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Тщательно подготовленные в соответствии с вышеизложенной методикой пробы масел рафинированных, нерафинированных, дезодорированных и гидра-тированных анализировали на жидкостном хроматографе НР 1100.

В результате проведенных нами исследованиях было установлено, что в растительных маслах, полученных с помощью разных технологических процессов, а именно рафинации, гидратации и дезодорации, жирорастворимые витамины содержатся в незначительном количестве или совсем отсутствуют (см.

FLD1 A, Ex=295, Em=330

25

20

2.5

7.5

10

12.5

15

7.5

20

г^П

Рисунок 1 - Хроматограма витамина Е в растительном масле КТИОЛ

Рисунок 2 - Хроматограмма содержимого витамина Е в масле подсолнечном рафинированном и дезодорированном

Рисунок 3 - Хроматограмма содержания витамина Е в масле подсолнечном нерафинированном

2.5_5_7.5_10_12.5_15_17.5_20_т

80

6Ё

4Б

20

рис. 2). Поэтому производители в некоторых случаях обогащают растительные масла жирорастворимыми витаминами искусственным путем.

Выводы. Метод ВЭЖХ является универсальным для качественного и количественного определения жирорастворимых витаминов при их совместном присутствии и позволяет произвести оперативный и комплексный анализ их содержания в растительных, купажных, модифицированных маслах и в липидо-содержащих пищевых продуктах и добавках.

Нами разработана методика определения жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором на колонке с обращенной фазой. Предложенный метод пригоден для количественного определения жирорастворимых витаминов в широком диапазоне.

При исследовании растительных масел, полученных путем первого холодного отжима, нами установлены их различия по составу и содержанию отдельных форм токоферолов. Большая стабильность ряда масел в отношении окисления молекулярным кислородом воздуха обусловливается содержанием в них некоторых форм токоферолов. В подсолнечном масле больше всего биологически активного а-токо-ферола по сравнению с другими растительными мас-

лами (см. табл. 1).

Состав и содержание отдельных форм токоферолов в результате технологического процесса рафинации подсолнечного масла значительно изменяется.

Для производителей и потребителей растительных масел и жиров безопасность продукции и повышение её качества является актуальной задачей. В связи с этим контроль качества масла требует дальнейшего усовершенствования. В настоящее время его качество в соответствии со стандартами определяется несколькими показателями, но эти показатели, на наш взгляд, недостаточно характеризуют пищевую и биологическую ценность растительных масел, жиров и масложировых продуктов.

Литература

1. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии,- М.: Агар, 1999. - 505 с.

2. Душейко А. А. Витамин А. Обмен и функция,-Киев: Наукова думка, 1989. - 288 с.

3. Осейко М. I. Технолопя рослинних олш - Ки-!в: Варта, 2006. - С. 190.

4. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматографiя. -М.: Мир, 1981. - Т. 2. - С. 407-413.