КОСМЕТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭКСТРАКТЫ NIGROSPORA SPHAERICA
COSMETIC COMPOSITION CONTAINING EXTRACTS NIGROSPORA SPHAERICA

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к композициям для местного нанесения на кожу человека, содержащим экстракты Nigrospora sphaerica и к способам применения этих композиций для обработки и кондиционирования и, конкретно, для осветления кожи.
Предыдущий уровень техники
Многих людей беспокоит некоторая степень пигментации их кожи. Например, для людей, имеющих возрастные пятна или веснушки, может быть желательно, чтобы подобные пигментированные пятна были менее заметны. Другие могут желать снизить потемнение кожи, вызванное воздействием солнечного света, или осветления природного цвета их кожи. Для удовлетворения этой необходимости было сделано множество попыток разработать продукты, которые снижают продуцирования пигмента меланоцитами. Однако обнаруженные вещества на сегодняшний день проявляют тенденцию либо к низкой эффективности, либо к нежелательным побочным эффектам, таким как, например, токсичность или раздражение кожи. Поэтому необходимо продолжать поиск новых агентов для осветления кожи, с общей улучшенной эффективностью, а также агентов, которые обеспечивают простоту переработки при их производстве.
Настоящее изобретение основано, по крайней мере частично, на открытии таких экстрактов грибов Nigrospora sphaerica, которые обладают по крайней мере сравнимой и/или очевидно лучшей активностью, направленной на осветление кожи, чем для известных агентов для осветления кожи. Ранее не были известны применения Nigrospora sphaerica в косметических целях.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение уменьшает недостатки решений из уровня техники и включает, частично, новую композицию, содержащую фармацевтически или косметически приемлемый носитель и экстракт Nigrospora sphaerica. Композиции согласно изобретению содержат от 0,000001 до 50 мас.% экстракта Nigrospora sphaerica, и предпочтительно, его экстракт в органическом растворителе. Предпочтительно количество экстракта составляет от 0,00001 до 10 мас.%, более предпочтительно от 0,001 до приблизительно 7 мас.%, и еще более предпочтительно 0,01 до приблизительно 5 мас.% для достижения оптимальной активности, направленной на осветление кожи при минимальных затратах.
Кроме того, композиции согласно изобретению включают агенты, полезные для кожи, и/или солнцезащитный агент. Агент, полезный для кожи, выбран из альфа-гидрокси кислот, бета-гидрокси кислот, полигидрокси кислот, гидрохинона, т-бутилгидрохинона, производных витамина В и/или С (т.е. ниацинамид) дикарбоновых кислот, ретиноидов, производных резорцина, бетулиновой кислоты, ванилиновой кислоты, бетулиновой кислоты, гидролактина и их смесей. Также могут быть включены органические и неорганические (т.е. микронизированные оксиды металла) солнцезащитные агенты. Органические солнцезащитные агенты могут включать бензофенон-3, бензофенон-4, бензофенон-8, метоксициннамат, этилдигидроксипрорил ПАБК, глицерил ПАБК, гомосалат, метилантранилат, октокрилен, октилдиметил ПАБК, октилметоксициннамат (PARSOL MCX), октилсалицилат, ПАБК, 2-фенилбензоимидазол-5-сульфокислоту, салицилат ТЭА, 3-(4-метилбензилиден)-камфору, бензофенон-1, бензофенон-2, бензофенон-6, бензофенон-12, 4-изопропилдибензоилметан, бутилметоксидибензоилметан (PARSOL 1789), этокрилен и их смеси.
Изобретение также включает способы улучшения состояния кожи местным нанесением на нее композиций согласно изобретению, содержащих экстракты Nigrospora sphaerica. Изобретение также включает способ осветления кожи нанесением на нее композиции, включающей от 0,000001 до 50 мас.% экстракта Nigrospora sphaerica и косметически приемлемого носителя.
Композиции согласно изобретению являются полезными для профилактики или лечения таких состояний кожи, как образование морщин, вялость и повреждение под действием света. Композиции и способы согласно изобретению обладают свойствами, способствующими эффективному осветлению кожи, могут быть легко доставлены к коже, эффективны по стоимости и доступны из природных источников.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям для местного нанесения на кожу человека, содержащим экстракты Nigrospora sphaerica, и к способам применения композиций для обработки и кондиционирования и, конкретно, для осветления кожи.
Nigrospora представляет собой нитевидный гриб семейства Dematiaceae, широко распространенный в почве, разлагающихся растениях и семенах. Колонии Nigrospora являются быстрорастущими, плотными, покрыты ворсинками, вначале белыми, затем становятся серыми с черными областями и черной тыльной стороной. Nigrospora sphaerica образует конидиоспоры, которые стремительно выбрасывают конидии. Конидии являются черными, растущими отдельно, одноклеточными, незначительно сплюснутыми в горизонтальном направлении и имеют тонкое экваториальное микробное отверстие. Nigrospora sphaerica, наиболее известные образцы рода Nigrospora, могут быть обнаружены на Гавайских островах и вблизи Тихого океана. Экстракты Nigrospora sphaerica, подходящие для использования в настоящих композициях, представляют собой экстракты органических растворителей, т.е. спиртовые экстракты (метанол) или этилацетатные экстракты.
Согласно настоящему изобретению экстракты Nigrospora sphaerica должны быть представлены в композиции в количестве от приблизительно 0,000001% до приблизительно 50 мас.% от общего веса композиции. Предпочтительно количество экстракта составляет от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10%, более предпочтительно от приблизительно 0,001% до приблизительно 7% и еще более предпочтительно от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% для достижения оптимальной активности, направленной на осветление кожи при минимальных затратах.
Используемый в описании термин “косметическая композиция” описывает композиции для местного нанесения на кожу человека.
Используемый в описании термин “включающий” означает включающий, изготовленный, составленный, состоящий из и/или состоящий главным образом из.
Термин “кожа”, используемый в описании, включает кожу лица, шеи, груди, спины, рук, подмышек, ладоней, ног и волосистой части головы.
За исключением примеров, или если не указано иное, все числа в настоящем описании, означающие количества материалов или условия взаимодействия, физические свойства материалов и/или использование, должны быть поняты как корректированные словом “приблизительно”. Все количества являются массовыми по отношению к общему весу композиции, если не указано иное.
Следует отметить, что при определении любого интервала концентраций, любой конкретной наибольшей концентрации может соответствовать любая конкретная более низкая концентрация.
Nigrospora sphaerica
Экстракты согласно настоящему изобретению извлекают из материала царства грибов: тип Ascomycota, род Nigrospora; и вида sphaerica. Nigrospora sphaerica, используемые согласно изобретению, собирали на Гавайский островах и вблизи Тихого океана. После сбора организмы выращивали в первой культуральной среде, из которой выделяли специфический штамм и извлекали для выращивания во второй культуральной среде. Затем Nigrospora sphaerica выделяли из второй культуральной среды с последующей экстракцией. В соответствии с настоящим изобретением использовали методы культивирования и экстракции, известные и в дальнейшем разрабатываемые специалистами, квалифицированными в области микробиологии. Далее в описании представлены конкретное описание культивирования, в котором выращивали микроорганизмы, и описание экстракции, которую использовали для получения экстрактов, которые подвергали скринингу. Описания культивирования и экстракции приведены далее ниже с подробным составом для приготовления среды и способами экстракции.
Основные сведения, касающиеся коллекции
Следующая таблица содержит информацию, касающуюся географического расположения коллекции, среды, используемой для выделения микроорганизмов, и морфологических характеристик микроорганизмов, растущих на агаровых плашках для выделения.
Описание и среда для культивирования культур гриба
Таблица 2
Компонент среды
Количество
Цитрат натрия
8 г
Мука из жмыха семян хлопчатника
5 г
Маннитол
5 г
Пептон
4 г
L-аргинин
1,5 г
Компоненты среды добавляли к 1 л морской воды, регулировали рН 4,0±0,2 и проводили ферментацию в стационарной жидкой среде в течение 16 дней @ 25°С.
Описание экстракции
Ко всему культуральному бульону добавляли приблизительно равный объем зерен ионита НР-20 (марка DIAION, Mitsubishi, Japan), встряхивали в течение 2 часов, фильтровали, промывали дважды равным объемом воды, сушили под вакуумом в течение 45 минут и экстрагировали осадок равным объемом MeOH (метанол). Другие подходящие органические растворители включают, но не ограничиваются, этанол, ацетон, этилацетат, хлороформ и т.д. В заключение экстракт фильтруют и растворитель удаляют.
Идентификация микроорганизмов
Подлинность микроорганизмов Nigrospora sphaerica подтверждали с использованием следующей процедуры. Подробные результаты, включая профили жирных кислот и библиотеку совпадений, предоставляли Microbial ID Inc., Newark, Delaware.
Дополнительные агенты, полезные для кожи
Подходящие дополнительные агенты, полезные для кожи, включают замедляющие старение, уменьшающие морщины, придающие коже белый цвет, противовоспалительные и агенты для уменьшения салоотделения. Примеры таковых включают альфа-гидрокси кислоты, бета-гидрокси кислоты, полигидрокси кислоты, гидрохинон, т-бутил гидрохинон; производные витамина В и/или С (т.е. ниацинамид) дикарбоновые кислоты, ретиноиды, бетулиновую кислоту, ванилиновую кислоту, аллантоин, экстракт плаценты, гидролактин и производные резорцина.
Косметически приемлемые носители
Косметически приемлемый наполнитель может действовать как разбавитель, диспергирующее вещество или носитель для ингредиентов, полезных для кожи, в композиции, а также может облегчать их распределения при нанесении композиции на кожу.
Носитель может быть водным, безводным или представлять собой эмульсию. Предпочтительно композиции являются водными или представляют собой эмульсию, конкретно эмульсии вода-в-масле или масло-в-воде, предпочтительны эмульсии масло-в-воде. При наличии воды ее количества могут варьировать от 5 до 99%, предпочтительно от 20 до 7%, оптимально от 40 до 70 мас.%.
1
3
Кроме воды в качестве носителей композиций согласно настоящему изобретению также могут служить относительно летучие растворители. Наиболее предпочтительными являются одофункциональные С-С спирты. Таковые включают этиловый спирт, метиловый спирт и изопропиловый спирт. Количество однофункционального спирта может варьировать от 1 до 70%, предпочтительно от 10 до 50%, оптимально от 15 до 40 мас.%.
Смягчающие материалы также могут выполнять функцию косметически приемлемых носителей. Таковые могут находиться в форме силиконовых масел и синтетических эфиров. Количества смягчающих веществ могут варьировать приблизительно от 0,1 до 50%, предпочтительно от 1 до 20 мас.%.
Силиконовые масла могут быть разделены на летучие и нелетучие. Термин “летучий”, используемый в описании, относится к таким материалам, которые обладают измеряемым давлением пара при температуре окружающей среды. Летучие силиконовые масла предпочтительно выбраны из циклических или линейных полидиметилсилоксанов, содержащих от 3 до 9, предпочтительно от 4 до 5, атомов кремния. Летучие силиконовые материалы линейного строения в основном обладают вязкостями менее приблизительно 5 сантистокс при 25°С, в то время как материалы циклического строения обычно обладают вязкостями менее приблизительно 10 сантистокс. Нелетучие силиконовые масла, полезные в качестве смягчающих материалов, включают полиалкилсилоксаны, полиалкиларилсилоксаны и сополимеры полиэтилсилоксана.
В основном нелетучие полиалкилсилоксаны, полезные в описании, включают, например, полидиметилсилоксаны с вязкостями от приблизительно 5 до приблизительно 25 миллион сантистокс при 25°С. Среди предпочтительных нелетучих смягчающих веществ, полезных в настоящей композиции, присутствуют полидиметилсилоксаны, имеющие вязкости от приблизительно 10 до приблизительно 400 сантистокс при 25°С.
Среди смягчающих веществ в форме эфиров присутствуют:
(1) алкениловые или ариловые эфиры жирных кислот, имеющие от 10 до 20 атомов углерода. Их примеры включают изоарахидил неопентаноат, изононил изононоат, олеил миристат, олеил стеарат и олеил олеат.
(2) Эфиры алкоксикислоты, такие как эфиры жирных кислот и этоксилированных жирных спиртов.
(3) Эфиры многоатомных спиртов. Моно- и диэфиры этиленгликоля и жирных кислот, моно- и диэфиры диэтиленгликоля и жирных кислот, моно- и диэфиры полиэтиленгликоля и жирных кислот (200-6000), моно- и диэфиры пропиленгликоля и жирных кислот, моноолеат пропиленгликоля 2000, моностеарат пропиленгликоля 2000, моностеарат этоксилированного пропиленгликоля, моно- и диэфиры глицерина и жирных кислот, полиэфиры полиглицеринового спирта и жирных кислот, моностеарат этоксилированного глицерина, моностеарат 1,3-бутиленгликоля, дистеарат 1,3-бутиленгликоля, эфир полиоксиэтиленполиола и жирной кислоты, эфиры сорбитана и жирных кислот и эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот представляют собой удовлетворительные эфиры многоатомных спиртов.
(4) Эфиры твердых углеводородов такие, как пчелиный воск, спермацет, миристилмиристат, стеарилстеарат, бехенат арахидил.
(5) Эфиры стерола, примерами которых являются эфиры холестерина и жирных кислот.
Жирные кислоты, имеющие от 10 до 30 атомов углерода, также могут быть включены в качестве косметически приемлемых носителей в композиции согласно изобретению. Примерами этой категории являются пеларгоновая, лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая, изостеариновая, гидроксистеариновая, олеиновая, линолеиновая, рициноленовая, арахиновая, бегеновая и эруковая кислоты.
Увлажняющие вещества типа многоатомных спиртов также могут быть использованы в качестве косметически приемлемых носителей в композициях согласно изобретению. Вспомогательные увлажняющие вещества при увеличении эффективности смягчающего средства снижают образование роговых чешуек, стимулируют удаление образовавшегося рогового слоя и улучшают кожу наощупь. Многоатомные спирты для местного применения включают глицерин, полиалкиленгликоли и более предпочтительные алкиленполиолы и их производные, включая пропиленгликоль, дипропиленгликоль, полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль и их производные, сорбитол, гидроксипропилсорбитол, гексиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, 1,2,6-гексантриол, этоксилированный глицерин, пропоксилированный глицерин и их смеси. Самые лучшие результаты для увлажняющего вещества были получены предпочтительно для пропиленгликоля или гиалуроната натрия. Количество увлажняющего вещества может варьировать от приблизительно 0,5 до 30%, предпочтительно от 1 и 15 мас.% от общего веса композиции.
Загустители также могут быть использованы как часть косметически приемлемого носителя композиций согласно настоящему изобретению. Обычные загустители включают сшитые акрилаты (напр. Carbopol 982), гидрофобно-модифицированные акрилаты (напр. Carbopol 1382), полимер на основе таурата, производные целлюлозы и природных смол. Среди полезных производных целлюлозы присутствуют натрий карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилцеллюлоза и гидроксиметилцеллюлоза. Природные смолы, подходящие для настоящего изобретения, включают гуар, ксантан, склероций, каррагенан, пектин и комбинации этих смол. Количества загустителя могут варьировать от 0,0001 до 5%, обычно от 0,001 до 1%, оптимально от 0,01 до 0,5 мас.%.
Совместно вода, растворители, силиконы, эфиры, жирные кислоты, увлажняющие вещества и/или загустители составляют косметически приемлемый носитель в количествах от 1 до 99,9%, предпочтительно от 80 до 99 мас.%.
Масло или масляный материал может присутствовать вместе с эмульгатором для обеспечения либо эмульсии вода-в-масле, либо масло-в-воде в зависимости от величины значения гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) используемого эмульгатора.
10
20
2
10
8
20
В косметической композиции согласно настоящему изобретению также могут присутствовать поверхностно-активные вещества. Общая концентрация поверхностно-активного вещества может варьировать от 0,1 до 40%, предпочтительно от 1 до 20%, оптимально от 1 до 5 мас.% от общего веса композиции. Поверхностно-активное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из анионных, неионогенных, катионных и амфотерных действующих веществ. Конкретно предпочтительные неионогенные поверхностно-активные вещества представляют собой таковые, содержащие С-С жирные спирты или гидрофобные кислоты, конденсированные с от 2 до 100°моль этиленоксида или пропиленоксида на моль гидрофобной кислоты; С-С алкил фенолы, конденсированные с от 2 до 20 моль алкиленоксида; моно- и диэфиры жирных кислот и этиленгликоля; моноглицерид жирных кислот, сорбитан, моно- и дикарбоновые С-С жирные кислоты; блочные сополимеры (этиленоксид/пропиленоксид) и полиоксиэтиленсорбитан, а также их комбинации. Алкилполигликозиды и амиды жирных кислот и сахаридов (например, метилглюконамиды) также представляют собой подходящие неоиногенные поверхностно-активные вещества.
8
20
8
20
Предпочтительные анионные поверхностно-активные вещества включают омыляющее вещество, алкиловые эфиры серной и сульфоновой кислот, алкилсульфаты и сульфонаты, алкилбензилсульфонаты, алкил и диалкилсульфосукцинаты, С-С изетионаты, ацилглутаматы, С-С алкиловые эфиры фосфорной кислоты и их комбинации.
Необязательные компоненты
В косметические композиции согласно изобретению при желании могут быть добавлены пластификаторы, каламин, антиоксиданты, хелатирующие агенты, а также солнцезащитные агенты.
Другие дополнительные малозначительные компоненты также могут быть включены в косметические композиции. Эти ингредиенты могут включать красящие вещества, пигменты, замутнители и отдушки. Количества этих других дополнительных малозначительных компонент может варьировать приблизительно от 0,001% до 20 мас.% от общего веса композиции.
При использовании в качестве солнцезащитного агента могут быть использованы оксиды металлов отдельно или в смеси и/или в сочетании с органическими солнцезащитными агентами. Примеры органических солнцезащитных агентов включают, но не ограничиваются таковыми, приведенными в таблице ниже.
Количество органических солнцезащитных агентов в косметической композиции предпочтительно находится в интервале от приблизительно 0,1 мас.% до приблизительно 10 мас.%, более предпочтительно от 1 до приблизительно 5 мас.%. Предпочтительные органические солнцезащитные агенты представляют собой PARSOL MCX и Parsol 1789 благодаря их эффективности и коммерческой доступности.
Таблица 3
Название, присвоенное АПКТДВ
Товарный знак
Производитель
Бензофенон-3
UVINUL M-40
BASF Cemical Co.
Бензофенон-4
UVINUL MS-40
BASF Cemical Co.
Бензофенон-8
SPECRA-SORB UV-24
American Cyanamide
Метоксициннамат
BERNEL HYDRO
Bernel Chemical
Этилдигилроксипропил-ПАБК
AMERSCREENP
Amerchol Corp.
Глицерил-ПАБК
NIPA G.M.P.A.
Nipa Labs.
Гомосалат
KEMESTER HMS
Hunko Chemical
Метилантранилат
SUNAROME UVA
Felton Worldwide
Октокрилен
UVINUL N-539
BASF Cemical Co.
Октилдиметил ПАБК
AMERSCOL
Amerchol Corp.
Октилметоксициннамат
PARSOL MCX
Bernel Chemical
Октилсалицилат
SUNAROME WMO
Felton Worldwide
ПАБК
PABA
National Starch
2-Фенилбензимидазол-5-сульфоновая кислота
EUSOLEX 232
EM Industries
Салицилат ТЭА
SUNAROME W
Felton Worldwide
3-(4-метилбензилиден)-камфора
EUSOLEX 6300
EM Industries
Бензофенон-1
UVINUL 400
BASF Cemical Co.
Бензофенон-2
UVINUL D-50
BASF Cemical Co.
Бензофенон-6
UVINUL D-49
BASF Cemical Co.
Бензофенон-12
UVINUL 408
BASF Cemical Co.
4-Изопропилдибензоилметан
EUSOLEX 8020
EM Industries
Бутилметоксидибензоилметан
PARSOL 1789
Givaudan Corp.
Этокрилен
UVINUL N-35
BASF Cemical Co.
Применение композиции
Экстракты гриба и композиции согласно изобретению задуманы, главным образом, как продукты для личной гигиены для местного нанесения на кожу человека, а также для осветления кожи, для снижения степени пигментации кожи или даже тона цвета кожи.
При использовании небольшое количество композиции из подходящей емкости или инструмента для локального применения лекарственного средства, например от 1 до 5 мл, наносят на открытые области кожи, и при необходимости, затем ее распределяют по поверхности кожи и/или втирают в кожу с использованием ладони или пальца или подходящего устройства.
Форма выпуска и упаковка
Косметическая композиция согласно изобретению может быть составлена в виде лосьона, обладающего вязкостью от 4000 до 10000 мПа·с, жидкого крема, обладающего вязкостью от 10,000 до 20,000 мПа·с, или крема, обладающего вязкостью от 20,000 до 100,000 или выше. Композиция может быть упакована в подходящую емкость, соответствующую ее вязкости и предназначенную использованию потребителем. Например, лосьон или жидкий крем могут быть упакованы во флаконы, или шариковые аппликаторы, или аэрозольное устройство с пропеллентом, или емкость, оборудованную нагнетателем, подходящим для приведения в действие с помощью пальца. Если композиция представляет собой крем, ее удобно хранить в недеформируемом флаконе или легкосжимаемой емкости, такой как тюбик или банка с крышкой. Если композиция представляет собой твердый или полутвердый карандаш, то она может быть упакована в емкость, подходящую для ручного или механического вытеснения или выдавливания композиции.
Согласно изобретению соответственно также предлагается закрытая емкость, содержащая косметически приемлемую композицию, как определено в описании.
Следующие примеры являются примерами, а не ограничениями, для принципов настоящего изобретения и иллюстрируют лучший способ осуществления изобретения.
Пример 1
Данный пример иллюстрирует снижение синтеза нового меланина с использованием экстрактов Nigrospora sphaerica согласно изобретению.
Экстракты Nigrospora sphaerica, используемые для всех примеров, которые приведены ниже, были получены в соответствии со способами, представленными в описании выше.
Способ с использованием органной культуры
2
Являющуюся отходами производства образцы кожи 8-месячных свиней, имеющих пигментированную масть, брили для удаления волос и тщательно промывали для удаления грязи и снижения содержания микроорганизмов. Затем из чистых образцов кожи получали дерматомы толщиной приблизительно 1 мм (75-см и помещали в колбы для тканевых культур, содержащие среду Игла, модифицированную по Дульбекко (СИМД кат.#1188507), содержащую пенициллин (100-единиц/мл), стрептомицин (100-мкг/мл), канамицин (200-мкг/мл), глутамин (2 мМ) и фунгизон (0,5 мкг/мл). Все колбы инкубировали в течение ночи при 37°С в присутствии 5% диоксида углерода. Эта процедура обеспечила выдерживание образца кожи в течение 18 часов перед добавлением ингибиторов меланина. Были удалены области образца кожи, которые имели царапины, покраснения или неравномерную пигментацию.
14
На следующее утро из образцов кожи получали биопсии 4-мм в диаметре и перемещали их в 96-луночный планшет для тканевых культур. В каждую лунку, содержащую биопсию, добавляли 180 микролитров свежей СИМД, содержащей пенициллин (100-единиц/мл), стрептомицин (100-мкг/мл), глутамин (2 мМ), гидрокортизон (100-мкг/мл) и 0,4 мкКю/мл тиоурацил, содержащий изотоп углерода С (Moravek Biochemicals) вместе с 20 микролитрами натурального экстракта (экстракт сначала растворяли в ДМСО, т.е. диметилсульфоксиде, и разбавляли солевым раствором, забуференным фосфатом). Все планшеты снова помещали в инкубатор на три дня.
2
2
Через три дня инкубационного периода избыток невключенной радиоактивной метки удаляли промыванием биопсий при комнатной температуре два раза 0,1 М карбонатным буфером при рН 10 в течение 30 минут и 2 часов соответственно с использованием автоматизированной машины для мойки планшетов. Затем биопсии обесцвечивали и растворяли добавлением 100 мкл 1 Н NaOH/3% HO c последующим инкубированием в течение ночи при 60°С.
Сушили один раз, в каждую лунку добавляли 50 микролитров 2 Н HCl для повторного растворения/нейтрализации образцов с последующим добавлением 220 микролитров коктейля для сцинтилляционного счета (Packard MicroScint-40). Образцы перемешивали несколько раз для обеспечения равномерного диспергирования, герметизировали и оценивали включение радиоактивной метки с использованием сцинтилляционного счетчика Packard TopCount. Снижение включения радиоактивной метки интерпретировали как снижение синтеза нового меланина.
Таблица 4
Обработка
Концентрация
% снижения включения радиоактивной метки*
Экстракт Nigrospora sphaerica
80-мкг/мл
45
8-мкг/мл
4
Койевая кислота
1,4 мг/мл(10 мМ)
56
* Статистически значимая величина р менее 0,05 с использованием критерия Стьюдента.
Пример 2
Способ для модели ткани, пораженной меланодермией
Для подтверждения результатов, полученных для органной культуры свиньи, использовали модель, эквивалентную ткани, пораженной меланодермией (MEL-300 Mat Tek, Ashland, Massachusetts), содержащую меланоциты, полученную из темной кожи индивидов. Меланодермы культивировали в соответствии с инструкциями производителя.
Среду заменяли каждые два дня в течение 14 дней и агенты для обработки, включая натуральные экстракты, добавляли к фазе среды до конечной концентрации 50 и 100 микрограмм на мл. Включали положительный контроль, т.е. койевую кислоту, которая известна как агент, осветляющий кожу. В течение каждой смены среды для порции, предназначенной для удаления, определяли уровни лактатдегидрогеназы как индикатора клеточной токсичности и стресса. Не наблюдалось поднятие уровня лактатдегидрогеназы свыше плацебо растворителей (вода или этанол).
Определение содержания меланина в каждой меланодерме проводили с использованием анализа, предоставленного производителем. Каждый меланодерм гомогенизировали в 450 микролитрах буфера (1% ДСН, 0,05 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 6,8), содержащем 20 микролитров протеиназы К (5 мг/мл) и инкубировали в течение ночи при 45°С. На следующий день 50 микролитров карбоната натрия (500 мМ) и 10 микролитров пероксида водорода (30% раствор) добавляли к каждому образцу и инкубировали при 80°С в течение 30 минут и затем охлаждали. Оптическую плотность верхней фазы определяли (405 нм) после экстрагирования образца 100 микролитрами хлороформ:метанол (2:1) и центрифугирования (10000 g) в течение 30 минут.Затем рассчитывали оптическую плотность, варьирующуюся относительно не подвергнутого обработке контроля или плацебо (вода или этанол).
Таблица 5
Результаты для модели эквивалентной ткани, пораженной меладермией
Обработка
Концентрация
% Снижения меланина
Койевая кислота
14 мкг/мл(100 мкМ)
9,5
Экстракт Nigrospora sphaerica
50 мкг/мл
60,9*
100 мкг/мл
48,9*
*Статистически значимая величина р мене 0,05 с использованием критерия Стьюдента.
Пример 3
Были получены косметические композиции в объеме изобретения.
Основной препарат, приведенный в таблице, ниже был изготовлен нагреванием ингредиентов фазы А до 70 - 80°С при перемешивании. Ингредиенты фазы В нагревали при перемешивании в отдельной емкости до 70 - 80°С. Затем, пока обе фазы находились при 70 - 80°С, фазу А добавляли к фазе В. Смесь перемешивали в течение по крайней мере 15 минут при 70 - 80°С, затем охлаждали.
Таблица 6
Ингредиенты
а мас.%
b мас.%
Фаза
Изостеарил пальмитат
6,00
6,00
А
С12-С15 алкил октаноат
3,00
3,00
А
Стеарат ПЭГ-100
2,00
2,00
А
Глицерил гидроксистеарат
1,50
1,50
А
Стеариловый спирт
1,50
1,50
А
Стеариновая кислота
3,00
4,00
А
ТЭА, 99%
1,20
1,20
В
Диметикон
1,00
1,00
А
Сорбитан моностеарат
1,00
1,00
А
Силикат магния алюминия
0,60
0,60
В
Ацетат витамина Е
0,10
0,10
А
Холестерин
0,50
0,50
А
Симетикон
0,01
0,01
В
Ксантановая смола
0,20
0,20
В
Гидроксиэтилцеллюлоза
0,50
0,50
В
Пропилпарабен
0,10
0,10
В
Динатриевая соль ЭДТА
0,05
0,05
В
Бутилированный гидрокситолуол
0,05
0,05
В
Экстракт Nigrospora sphaerica
0,05
2,00
В
Ниацинамид
1,00
1,00
В
Оксид металла
2,50
5,00
В
Метилпарабен
0,15
0,15
В
Вода
БАЛ*
БАЛ*
В
Общее
100,00
100,00
В
БАЛ* означает баланс.
Пример 4
Дополнительная косметическая композиция в объеме изобретения была получена следующим образом:
Нагревание фазы А до 80°С.
Нагревание фазы В до 75°С в отдельной емкости.
Добавление В к А и перемешивание с отводом тепла в течение 30 мин.
Добавление С при 50°С и перемешивание в течение 10 мин.
Таблица 7
Компонент
мас.%
Фаза
Вода, ДИ
Баланс
А
Динатривая соль ЭДТА
0,05
А
Силикат магния алюминия
0,6
А
Метилпарабен
0,15
А
Симетикон
0,01
А
Бутиленгликоль 1,3
3,0
А
Гидроксиэтилцеллюлоза
0,5
А
Глицерин фармакопеи США
2,0
А
Ксантановая смола
0,2
А
Триэтаноламин
1,2
В
Стеариновая кислота
3,0
В
Пропилпарабен НФС
0,1
В
Гидроксистеарат глицерина
1,5
В
Стеариловый спирт
1,5
В
Пальмиат изостеарила
6,0
В
Октаноат С12-С15 спиртов
3,0
В
Диметикон
1,0
В
Холестерин NF
0,5
В
Сорбитан стеарат
1,0
В
Микронизированный диоксид титана
5,0
С
Ацетат токофенила
0,1
В
Стеарат ПЭГ-100
2,0
В
Стеароил лактилат натрия
0,5
В
Гидроксикаприловая кислота
0,1
С
Экстракт Nigrospora sphaerica
10,0
С
PARSOL MCX
2,4
С
Альфа-бисаболол
0,2
С
Примеры 5-12
Согласно способу примера 3 в объеме настоящего изобретения был получен ряд дополнительных композиций, и они перечислены в таблице ниже.
Таблица 8
Ингредиенты
Фаза
Примеры (мас.%)
5Омыляющее вещество на основе кислоты
6
7
8
9
10
11
12
Стеариновая кислота
А
17,9
17,9
17,9
17,9
17,9
17,9
17,9
17,9
Стеарил сульфат натрия*
А
2,2
1
1,5
2
3
2
Myrj 59*
А
2
2
2
2
2
1
Span 60*
А
2
2
2
2
2
1
Экстракт Nigrospora sphaerica
В
0,05
0,05
2,0
2,0
3,5
3,5
5,0
10,0
Микронизированный оксид цинка
В
2,50
5,00
5,00
2,50
2,50
5,00
2,50
5,00
КОН, 22% (образует со стеариновой кислотой in situ омыляющее вещество)
А
2,20
Октилметоксициннамат
В
2,50
2,50
2,50
2,50
Вода
Бал
Бал
Бал
Бал
Бал
Бал
Бал
Бал
Бал
Глицерин
В
1
1
1
1
1
1
1
1
Эмульгатор