ОПОСРЕДОВАННАЯ НУКЛЕАЗОЙ СБОРКА ДНК

1. Способ сборки по меньшей мере двух нуклеиновых кислот, включающий:
(a) контактирование первой нуклеиновой кислоты с первым нуклеазным агентом, причем первый нуклеазный агент расщепляет первую нуклеиновую кислоту в первом целевом сайте с получением первой расщепленной нуклеиновой кислоты с перекрывающимися концевыми последовательностями между первой расщепленной нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой;
(b) контактирование первой расщепленной нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты с экзонуклеазой для экспонирования комплементарных последовательностей между первой расщепленной нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой; и
(c) сборку двух фрагментов нуклеиновых кислот, полученных на этапе (b).
2. Способ по п. 1, в котором этап (с) дополнительно включает:
(i) ренатурацию экспонированных комплементарных последовательностей;
(ii) удлинение 3'-концов ренатурированных комплементарных последовательностей; и
(iii) лигирование первой и второй нуклеиновых кислот.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором этап (а) дополнительно включает контактирование второй нуклеиновой кислоты со вторым нуклеазным агентом, причем вторая нуклеиновая кислота не содержит перекрывающейся концевой последовательности, а второй нуклеазный агент расщепляет вторую нуклеиновую кислоту во втором целевом сайте с получением второй расщепленной нуклеиновой кислоты с перекрывающимися концевыми последовательностями между первой расщепленной нуклеиновой кислотой и второй расщепленной нуклеиновой кислотой, и
при этом вторая нуклеиновая кислота из этапа (b) представляет собой вторую расщепленную нуклеиновую кислоту.
4. Способ по п. 3, в котором по меньшей мере один из первого нуклеазного агента и второго нуклеазного агента содержит белок Cas и гидовую РНК (гРНК) (комплекс гРНК-Cas), нуклеазу с «цинковыми пальцами» или эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), нацеленные на первый или второй целевой сайт.
5. Способ по п. 4, в котором по меньшей мере один из первого нуклеазного агента и второго нуклеазного агента содержит белок Cas и гидовую РНК (гРНК) (комплекс гРНК-Cas),
причем белок Cas представляет собой белок Cas9, гРНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR) (крРНК), и трансактивирующую CRISPR РНК (тракрРНК), и по меньшей мере один из первого целевого сайта и второго целевого сайта, который непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (РАМ).
6. Способ по п. 5, в котором белок Cas9 содержит домен RuvC и домен HNH, по меньшей мере один из которых не имеет эндонуклеазной активности.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором перекрывающаяся концевая последовательность имеет длину в диапазоне от 20 до 200 п. н.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором первая нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота или обе нуклеиновые кислоты получены из бактериальной искусственной хромосомы.
9. Способ по п. 8, в котором бактериальная искусственная хромосома содержит человеческую ДНК, ДНК грызунов, синтетическую ДНК, человеческую полинуклеотидную последовательность или их комбинацию.
10. Способ сборки по меньшей мере двух нуклеиновых кислот, включающий:
(а) контактирование первой нуклеиновой кислоты с первым нуклеазным агентом и вторым нуклеазным агентом с получением первой расщепленной нуклеиновой кислоты, причем первый нуклеазный агент создает одноцепочечный разрыв на первой цепи первой нуклеиновой кислоты в первом целевом сайте, а второй нуклеазный агент создает одноцепочечный разрыв на второй цепи первой нуклеиновой кислоты во втором целевом сайте с получением первой расщепленной нуклеиновой кислоты, содержащей нависающую последовательность на одном из ее 5'- или 3'-концов;
(b) ренатурацию первой расщепленной нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, комплементарную 5'- или 3'-нависающей последовательности; и
(c) лигирование первой расщепленной нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
11. Способ по п. 10, в котором этап (b) дополнительно включает удлинение 3'-конца первой цепи с использованием второй цепи в качестве шаблона и удлинение 3'-конца второй цепи с использованием первой цепи в качестве шаблона.
12. Способ по п. 10 или 11, в котором по меньшей мере один из первого нуклеазного агента и второго нуклеазного агента содержит белок Cas9 и гидовую РНК (гРНК) (комплекс гРНК-Cas), нацеленные на первый целевой сайт или второй целевой сайт.
13. Способ по п. 12, в котором белок Cas9 содержит домен RuvC и домен HNH, один из которых не имеет эндонуклеазной активности.
14. Способ по любому из пп. 10-13, в котором первый целевой сайт отделен от второго целевого сайта по меньшей мере 4 п. н.
15. Способ по любому из пп. 10-14, в котором гРНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR) (крРНК), и трансактивирующую CRISPR РНК (тракрРНК), и причем по меньшей мере один из первого целевого сайта и второго целевого сайта непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (РАМ).
16. Способ сборки двух или более нуклеиновых кислот, включающий:
(а) контактирование первой нуклеиновой кислоты с по меньшей мере одним нуклеазным агентом с получением первой расщепленной нуклеиновой кислоты;
(b) контактирование первой расщепленной нуклеиновой кислоты со второй нуклеиновой кислотой, соединительным олигонуклеотидом и экзонуклеазой,
причем соединительный олигонуклеотид содержит:
(i) первую комплементарную последовательность, которая комплементарна первой расщепленной нуклеиновой кислоте;
(ii) спейсер; и
(iii) вторую комплементарную последовательность, которая комплементарна второй нуклеиновой кислоте;
при этом экзонуклеаза экспонирует первую и вторую комплементарные последовательности; и
(c) сборку соединительного олигонуклеотида с первой расщепленной нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой.
17. Способ по п. 16, в котором сборка на этапе (с) включает:
(i) ренатурацию первой комплементарной последовательности соединительного олигонуклеотида с первой расщепленной нуклеиновой кислотой и второй комплементарной последовательности соединительного олигонуклеотида со второй нуклеиновой кислотой; и
(ii) лигирование соединительного олигонуклеотида с первой расщепленной нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой.
18. Способ по п. 16 или 17, в котором первая комплементарная последовательность и вторая комплементарная последовательность соединительного олигонуклеотида содержат от 15 до 120 комплементарных оснований.
19. Способ по любому из пп. 16-18, в котором спейсер соединительного олигонуклеотида содержит некомплементарные нуклеиновые кислоты.
20. Способ по любому из пп. 16-18, в котором сборка первой расщепленной нуклеиновой кислоты со второй нуклеиновой кислотой происходит бесшовно.
21. Способ по п. 20, в котором по меньшей мере один нуклеазный агент предназначен для отщепления фрагмента из по меньшей мере 20 п. н. от конца первой нуклеиновой кислоты, на котором будет происходить бесшовная сборка,
причем спейсер соединительного олигонуклеотида содержит последовательность, идентичную фрагменту из по меньшей мере 20 п. н., при этом между первой комплементарной последовательностью и фрагментом из по меньшей мере 20 п. н. нуклеотидные основания отсутствуют, и между второй комплементарной последовательностью и фрагментом из по меньшей мере 20 п. н. нуклеотидные основания отсутствуют,
так что сборка первой нуклеиновой кислоты с соединительным олигонуклеотидом и второй нуклеиновой кислотой восстанавливает фрагмент из по меньшей мере 20 п. н. и обеспечивает бесшовную сборку первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
22. Способ по п. 20, в котором по меньшей мере один нуклеазный агент предназначен для отщепления фрагмента из по меньшей мере 20 п. н. от конца второй нуклеиновой кислоты, на котором будет происходить бесшовная сборка,
причем спейсер соединительного олигонуклеотида содержит последовательность, идентичную фрагменту из по меньшей мере 20 п. н., при этом между первой комплементарной последовательностью и фрагментом из по меньшей мере 20 п. н. нуклеотидные основания отсутствуют, и между второй комплементарной последовательностью и фрагментом из по меньшей мере 20 п. н. нуклеотидные основания отсутствуют,
так что сборка первой нуклеиновой кислоты с соединительным олигонуклеотидом и второй нуклеиновой кислотой восстанавливает фрагмент из по меньшей мере 20 п. н. и обеспечивает бесшовную сборку первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
23. Способ по п. 21 или 22, в котором спейсер содержит от около 20 до около 120 п. н.
24. Способ по любому из пп. 16-23, в котором этап (а) дополнительно включает контактирование второй нуклеиновой кислоты со вторым нуклеазным агентом и экзонуклеазой, причем второй нуклеазный агент расщепляет вторую нуклеиновую кислоту с получением второй расщепленной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарную второй комплементарной последовательности соединительного олигонуклеотида, при этом проводят сборку первой расщепленной нуклеиновой кислоты со второй расщепленной нуклеиновой кислотой.
25. Способ по любому из пп. 16-23, в котором этап (а) дополнительно включает контактирование второй нуклеиновой кислоты с рестрикционным ферментом или мегануклеазой и экзонуклеазой, причем рестрикционный фермент или мегануклеаза расщепляет вторую нуклеиновую кислоту с получением второй расщепленной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарную второй комплементарной последовательности в соединительном олигонуклеотиде, при этом проводят сборку первой расщепленной нуклеиновой кислоты со второй расщепленной нуклеиновой кислотой.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором этап (b) дополнительно включает удлинение 3'-конца первой расщепленной нуклеиновой кислоты и/или второй расщепленной нуклеиновой кислоты.
27. Способ по любому из пп. 16-26, в котором сборку соединительного олигонуклеотида с первой нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой выполняют в одной реакции.
28. Способ по любому из пп. 16-26, в котором сборку соединительного олигонуклеотида с первой нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой выполняют последовательно.
29. Способ по любому из пп. 24-28, в котором по меньшей мере один нуклеазный агент и/или второй нуклеазный агент содержит белок Cas и гидовую РНК (гРНК) (комплекс гРНК-Cas), нуклеазу с «цинковыми пальцами» или эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), нацеленные на первый или второй целевой сайт.
30. Способ по п. 29, в котором по меньшей мере один из первого нуклеазного агента и второго нуклеазного агента содержит белок Cas и гидовую РНК (гРНК) (комплекс гРНК-Cas),
причем белок Cas представляет собой белок Cas9, гРНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR) (крРНК), и трансактивирующую CRISPR РНК (тракрРНК), и по меньшей мере один из первого целевого сайта и второго целевого сайта, который непосредственно фланкирован последовательностью мотива, прилежащего к протоспейсеру (РАМ).
31. Способ по п. 30, в котором белок Cas9 содержит домен RuvC и домен HNH, по меньшей мере один из которых не имеет эндонуклеазной активности.
32. Способ по любому из пп. 10-31, в котором первая нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота или обе нуклеиновые кислоты получены из бактериальной искусственной хромосомы.
33. Способ по любому из пп. 10-32, в котором первая нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты содержат человеческую ДНК, ДНК грызунов, синтетическую ДНК или их комбинацию.
34. Способ по любому из пп. 10-33, в котором первая нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота или обе нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере 10 т.п.н.
35. Способ по любому из пп. 16-34, в котором соединительный олигонуклеотид содержит линейный двухцепочечный фрагмент ДНК.
36. Способ по п. 35, в котором линейный двухцепочечный фрагмент ДНК не содержит кассету селекции.
37. Способ сборки двух или более нуклеиновых кислот, включающий:
(a) контактирование первой нуклеиновой кислоты с по меньшей мере одним нуклеазным агентом с получением первой расщепленной нуклеиновой кислоты;
(b) контактирование второй нуклеиновой кислоты со вторым нуклеазным агентом с получением второй расщепленной нуклеиновой кислоты;
(c) контактирование первой расщепленной нуклеиновой кислоты и второй расщепленной нуклеиновой кислоты с соединительным олигонуклеотидом и экзонуклеазой,
причем соединительный олигонуклеотид содержит:
(i) первую комплементарную последовательность, которая комплементарна первой расщепленной нуклеиновой кислоте;
(ii) спейсер; и
(iii) вторую комплементарную последовательность, которая комплементарна второй расщепленной нуклеиновой кислоте;
при этом экзонуклеаза экспонирует первую и вторую комплементарные последовательности; и
(d) сборку соединительного олигонуклеотида с первой расщепленной нуклеиновой кислотой и второй расщепленной нуклеиновой кислотой.