ВЕКТОР ПАРАПОКСВИРУСА, СОДЕРЖАЩИЙ АНТИГЕН ВИРУСА БЕШЕНСТВА
PARAPOXVIRUS VECTOR CONTAINING RABIES VIRUS ANTIGEN

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение касается рекомбинантных парапоксвирусов, содержащих гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства (RV), и их применения в иммуногенных композициях и вакцинах. Оно также касается способов вакцинации, лечения или профилактики заболеваний, вызванных вирусом бешенства. Оно также касается применения рекомбинантных парапоксвирусов для диагностики.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вирусы семейства Poxviridae представляют собой овальные, довольно крупные вирусы из двухцепочечных ДНК. Род Parapoxvirus (PPV) относится к этим вирусам. Они имеют длину около 220-300 нм и ширину 140-170 нм. Они имеют уникальную спиральную оболочку, отличающую их от других поксвирусов.
PPV разделяются на три разных вида. Однако до сих пор остается невыясненным, являются ли эти вирусы самостоятельными видами в пределах рода парапоксвирусов или же они принадлежат к одному виду. Первый вид, Parapoxvirus ovis, считается прототипом рода. Он также называется вирусом контагиозной эктимы или вирусом контагиозного пустулезного дерматита. Второй, Parapoxvirus bovis 1, также называется вирусом папулезного стоматита крупного рогатого скота. Третий, Parapoxvirus bovis 2, также называется udderpoxvirus, вирусом паравакцины, вирусом ложной коровьей оспы или вирусом узелков доильщиц.
Виды парапоксвируса являются эндемическими для жвачных. PPV были обнаружены у оленя благородного, северного оленя, красной белки и обыкновенного тюленя. Инфицирование PPV может вызывать местные заболевания как у животных, так и у человека. Природно-очаговыми хозяевами видов PPV являются овцы, козы и крупный рогатый скот. Они могут инфицировать человека через прямой контакт с инфицированными животными, реакцию с локализованными эпидермальными поражениями, которые заживают без рубцевания. Для борьбы с заболеваниями могут применяться профилактические меры, такие как вакцинация.
Векторы для экспрессии инородной генетической информации на основе вирусов птичьей оспы, оспы енотовых, оспы овец и коз, оспы свиней или коровьей оспы описывались ранее (см. документы US 5,942,235 и US 7,094,412). Парапоксвирусы представляют собой другие варианты, которые могут применяться в векторных вакцинах. Однако с учетом морфологических, структурных и генетических отличий между отдельными родами поксвирусов способы, применяемые для этих поксвирусов, не могут применяться для парапоксвируса. Примером таких отличий может быть то, что в ORFV отсутствует ген тимидинкиназы (ТК), применяемый для селекции рекомбинантов в различных ортопоксвирусах. Также некоторые поксвирусы способны агглютинировать эритроциты посредством поверхностного белка, гемагглютинина, а парапоксвирусы такой способностью не обладают.
PPV могут иметь иммуномоделирующее действие, поскольку они стимулируют генерализованные (неспецифические) иммунные реакции у позвоночных. Они успешно применяются в ветеринарной медицине для повышения общей устойчивости у животных. Они могут комбинироваться с гомологичным и/или гетерологичным антигеном для обеспечения вакцин, обладающих патоген-специфическим эффектом, который длится от нескольких месяцев до нескольких лет, а также быстрым не специфическим к патогену эффектом.
Parapoxvirus ovis ранее применялся в качестве вектора, как описывается в Патенте США 6,365,393 и публикации Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145. Он обеспечивает значительные преимущества при применении в качестве вектора, включая очень узкий тропизм, отсутствие системной инфекции, краткосрочный специфический к вектору иммунитет (допускающий повторную иммунизацию), раннюю вакцинацию (индукция иммунитета может начаться в присутствии материнских антител) и благоприятные иммуномодулирующие свойства. Настоящее изобретение касается применения парапоксвируса в качестве вектора для гетерологичной ДНК, взятой из вируса бешенства.

Штамм Parapoxvirus ovis D1701 является сильно аттенуированным штаммом, который может распространяться в культуре клеток с титрами, сравнимыми с титрами вируса дикого типа. Он обладает отличными иммуностимулирующими свойствами как в хозяевах, поддерживающих репликацию инфекционного векторного вируса (например, овцах и козах), так и в хозяевах, не поддерживающих такую репликацию (например, собаках, свиньях, лошадях, мышах и крысах). Zylexis, ранее известный как Baypamune, который представляет собой препарат химически инактивированного Parapoxvirus ovis, производного от штамма D1701, применяют для профилактики, метафилактики и терапевтического лечения инфекционных заболеваний и для предотвращения вызванных стрессом заболеваний животных.
Вирус бешенства (RV), Нейротрофический лиссавирус, относится к семейству Rhabdoviridae. Он представляет собой нейротрофический вирус, вызывающий летальные заболевания у людей и других млекопитающих. Бешенство чаще всего передается через укусы бешеных животных с заражением через слюну животных. Подавляющее большинство случаев бешенства, о которых ежегодно сообщается в Центр по профилактике и контролю заболеваемости США (CDC), отмечается у диких животных, таких как еноты, скунсы, летучие мыши и лисы. Бешенство до сих пор остается очень распространенным заболеванием, в особенности в развивающихся странах. От бешенства ежегодно умирает приблизительно 50000 человек. Наиболее высокий риск инфекции для человека представляют бешеные собаки.
Вирус бешенства представляет собой содержащий одноцепочечную отрицательно-полярную нить РНК вирус, кодирующий 5 белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (Р), матриксный белок (М), гликопротеин (G) и полимераза (L). Зрелый пулевидный вирус со средней длиной приблизительно 180 нм и средней шириной приблизительно 75 нм имеет рибонуклеопротеиновое ядро, белковую оболочку и липидный конверт. Гликопротеиновые выступы, имеющие приблизительно 5-10 нм в длину и приблизительно 3 нм в диаметре, покрывают внешнюю поверхность вируса. Они образуют приблизительно 400 гримерных плотно расположенных отростков.
RV обладает высокой аффинностью к нервной ткани. Причина этого неизвестна. Однако она может состоять в том, что G-белок вируса бешенства может связываться в ацетилхолиновый рецептор (рецептор нейротрансмиттера). После присоединения RV к клетке-хозяину через вирусный G-белок вирус поглощается клеткой путем заглатывания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в целом касается рекомбинантных парапоксвирусов, в частности Parapoxvirus ovis (PPVO). Рекомбинантный парапоксвирус применяется для опосредования быстрого природного иммунного ответа, а также длительного специфического к инородному гену иммунитета против вируса бешенства. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V.
В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства или его фрагменты. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В еще одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Настоящее изобретение охватывает способы получения рекомбинантного парапоксвируса, включающего вставку гетерологичной ДНК в геном парапоксвируса. В одном варианте осуществления способ включает применение Parapoxvirus ovis. В одном варианте осуществления способ включает применение штамма Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления способ включает применение штамма Parapoxvirus ovis D1701-V. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК, применяемая согласно способу, включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК, применяемая согласно способу, включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления способа гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления способ включает получение Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Настоящее изобретение охватывает иммуногенную композицию, включающую рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способы получения иммуногенной композиции, включающие комбинирование рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение также охватывает вакцину, включающую рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способ получения вакцины, включающий комбинирование рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает Parapoxvirus ovis, в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701, а в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты, а в других вариантах осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701. В других из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Настоящее изобретение охватывает способ стимулирования у животного иммунного ответа против вируса бешенства, включающий введение вышеупомянутому животному иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способ вакцинации животного от вируса бешенства, включающий введение вышеупомянутому животному терапевтически эффективного количества композиции вакцины, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, при изготовлении медикамента для стимулирования иммунного ответа против вирус бешенства у животного. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, при изготовлении медикамента для вакцинации животного против вируса бешенства. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает Parapoxvirus ovis, в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701, а в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты, а в других вариантах осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В других из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG. В некоторых из этих вариантов осуществления стимулируется специфический защитный иммунный ответ против G-белка. В других подобных вариантах осуществления иммунный ответ состоит в вырабатывании сывороточных антител против G-белка. В других подобных вариантах осуществления такое вырабатывание в результате обеспечивает титры антител свыше 0,5 международных единиц на мл.
Настоящее изобретение обеспечивает способ определения происхождения парапоксвируса, присутствующего у животного. Описанные авторами парапоксвирусы могут отличаться от штаммов дикого типа как по геномному составу, так и по экспрессируемым белкам. Такое отличие позволяет проводить различия между вакцинированными и инфицированными животными. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, как указывается авторами в анализе дифференциации инфицированных и вакцинированных животных (DIVA). В одном варианте осуществления в DIVA-анализе применяют рекомбинантный Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Эти и другие варианты осуществления описываются и охватываются представленным ниже подробным описанием.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Для лучшего понимания настоящего изобретения представлены прилагаемые фигуры, среди которых:
Фигура 1: Построение плазмиды pdV-RabG. G-ген вируса бешенства вставляют как фрагмент ВатHI-EcoRI в сайт множественного клонирования (обведенные основания) pdV-Recl, в результате чего получают плазмиду pdV-RabG (размером 7,7 т.п.н.). Показываются позиции праймеров ORF32N (SEQ ID NO:1) и ORF31N (SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:3 показывается на Фигуре.
Сокращения: Sm=SmaI, H3=HindIII, EcoV=EcoRV, P=PstI, В=BamHI, К=KpnI, E=EcoRI, S=SalI. F9L и ORF3 указывают на присутствие генов PPVO F9L (ORF 131) и ORF3 (ORF 133). Pvegf указывает на присутствие промотора vegF-E, применяемого для контроля экспрессии вставленного G-гена. (P) и (H3) показывают разрушенные сайты рестрикции PstI и HindIII основной цепи вектора плазмиды pSPT-18, соответственно, показаны промоторы Т7 и SP6 pSPT-18. Фигура показана не в масштабе.
7
6
5
4
Фигура 2: Нейтрализующий вирус ответ на сывороточное антитело (SNT) после иммунизации различными дозами D1701-V-RabG. Группы мышей C57/BL6 (для каждого дня n=6 или 7) иммунизировали единичной дозой D1701-V-RabG с применением 10 FU (колониеобразующих единиц) (А), 10 PFU (В), 10 PFU (С) и 10 PFU (D). Отдельные образцы сыворотки брали ежедневно в течение 14 дней после иммунизации (с d1 no d14).
7
4
5
50
Фигура 3: Эксперимент с провокацией иммунизированных мышей. Мышам C57/BL6 вводили единичную дозу D1701-V-RabG, как указано (от 10 до 10 PFU), и внутричерепным путем вводили провоцирующую инфекцию через 2 недели с применением как минимум 3400 LD (4,8×10PFU) RV вирулентного штамма С VS. (А) показывает кривые выживаемости отдельных животных в каждой группе, а (В) показывает те же результаты в процентах выживших особей.
Фигура 4. SEQ ID NO:4 - Последовательность кодирующей области полной длины G-гена вируса бешенства (1575 нуклеотидов) плюс 7 нуклеотидов на 5'-конце и 6 нуклеотидов на 3'-конце в качестве линкерных последовательностей для рестрикционного анализа (BamHI и EcoRI).
Фигура 5. Роль Т-клеток для защитного иммунитета. CD4-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD4 клеткам. CD8-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD8-T-клеткам. CD4/8-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD4/CD8-T-клеткам. Imm С является контрольной группой, вакцинированной D1701-V-RabG, которая не получала антисыворотки. Non-Imm С является контрольной группой, которая не была вакцинирована D1701-V-RabG и не получала антисыворотки. "Дни п. провок." означает количество дней после провокации штаммом бешенства CVS.
Фигура 6. Защита, наблюдаемая при последующей вакцинации. Non-Imm является контрольной группой, которая не была вакцинирована D1701-V-RabG. D1701-V-RabG является группой, которая была вакцинирована D1701-V-RabG. CVS является вирулентным штаммом вируса бешенства. "Дни п. провок." означает количество дней после провокации штаммом RV CVS.
Фигура 7. Защита, наблюдаемая в различных режимах последующей вакцинации. Серые квадраты означают дни, в которые мышей вакцинировали D1701-V-RabG.
Фигура 8. Ответ на сывороточное антитело (определяемый как нейтрализующие антитела сыворотки, SNT) через 6 дней и 13 дней после иммунизации. Мышей иммунизировали D1701-V-RabG интравагинально (i.vag.), путем скарификации, внутрибрюшинно (i.p.), внутрикожно (i.d.), интраназально (i.n.), подкожно (s.c.), внутримышечно (i.m.) или внутривенно (i.v.).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если нет иного определения, научные и технические термины, применяемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, общепринятые среди специалистов в данной области. Кроме того, если контекстом не предусматривается иного, термины в единственном числе в равной мере предполагают множественное число и наоборот.
Представленные ниже определения могут применяться к терминам, употребляемым в описании вариантов осуществления изобретения. Они заменяют любые противоречивые определения, содержащиеся в каждом отдельном источнике, включенном авторами путем ссылки.
"Около" или "приблизительно", применяемый в связи с измеримой числовой переменной, относится к указанному значению переменной и всем значениям переменной, которые пребывают в пределах экспериментальной погрешности указанного значения (например, в пределах 95%-ного доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов от указанного значения в зависимости от большей величины, если "около" не употребляется применительно к интервалам времени в неделях, когда "около 3 недель" означает от 17 до 25 дней, а "от приблизительно 2 до приблизительно 4 недель" означает от 10 до 40 дней.
"Адъювант" в контексте данного описания означает любое вещество, которое служит в качестве неспецифического стимулятора иммунного ответа. Дальнейшее описание адъювантов представлено ниже.
Термин "животное" в контексте данного описания означает любое животное, восприимчивое к инфицированию бешенством, включая млекопитающих, как домашних, так и диких.
"Антитело" в контексте данного описания представляет собой любой полипептид, включающий антиген-связывающий сайт, независимо от источника, способа получения или других характеристик. Оно означает молекулу иммуноглобулина или ее фрагмент, которые специфично связываются с антигеном в результате иммунного ответа на этот антиген. Иммуноглобулины являются сывороточными белками, состоящими из "легких" и "тяжелых" полипептидных цепей, имеющих "постоянные" и "вариабельные" области, и разделяются на классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) в зависимости от состава постоянных областей. Антитело, являющееся "специфическим" к данному антигену, означает, что вариабельные области антитела распознают и связываются исключительно со специфическим антигеном. Антитела могут быть поликлональной смесью или моноклональными. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, взятыми из природных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. "Антитело" может быть преобразовано в антиген-связывающий белок, включающий, помимо прочих, фрагменты антител.
Термин "антиген" или "иммуноген" в контексте данного описания означает молекулу, содержащую один или несколько эпитопов (линейных, конформационных или и тех, и других), которые после воздействия на субъект вызывают иммунный ответ, который является специфическим к антигену. Термин "антиген" может означать ослабленные, инактивированные или модифицированные живые бактерии, вирусы, грибки, паразиты или другие микробы. Термин "антиген" в контексте данного описания также может означать субъединичный антиген, отделенный и обособленный от целого организма, с которым антиген связан в природе. Термин "антиген" также означает антитела, такие как антиидиотипичные антитела или их фрагменты, и синтетические пептиды-мимотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин "антиген" также может означать олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту in vivo, например, при ДНК-иммунизации.
"Буфер" означает химическую систему, препятствующую изменениям концентрации другого химического вещества, например, системы доноров и акцепторов протонов служат в качестве буферов, препятствующих заметным изменениям концентрации ионов водорода (рН). Другим примером буфера может быть раствор, содержащий смесь слабой кислоты и ее соли (сопряженное основание) или слабого основания и его соли (сопряженная кислота).
Термин "линия клеток" или "клетка-хозяин" в контексте данного описания означает прокариотическую или эукариотическую клетку, в которой может реплицироваться или поддерживаться вирус.
"Клеточный иммунный ответ" или "клеточно-опосредованный иммунный ответ" представляет собой иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами или другими лейкоцитами, или и теми, и другими, и включает выработку цитокинов, хемокинов и подобных молекул, вырабатываемых активированными Т-клетками, лейкоцитами или и теми, и другими.
"Консервативное замещение" имеет определение в данной области, известно специалистам в данной области и распознается для классификации остатков согласно их соответствующим физическим свойствам.
Термин "культура" в контексте данного описания означает популяцию клеток или микроорганизмов, выращиваемых в отсутствие других видов или типов.
Термин "DIVA" в контексте данного описания означает дифференциацию инфицированных и вакцинированных животных.
"Доза" означает вакцину или иммуногенную композицию, которая вводится субъекту. "Первая доза" или "первичная вакцина" означает дозу такой композиции, которую вводят в начале отсчета времени (День 0). "Вторая доза", или "третья доза", или "годовая доза" означает количество такой композиции, которое вводят после первой дозы, и эта композиция может быть той же вакциной или иммуногенной композицией, что и в первой дозе, или отличной от нее.
"Эпитоп" является специфическим сайтом антигена, который связывается с Т-клеточным рецептором или специфическим антителом и, как правило, включает от приблизительно 3 аминокислотных остатков до приблизительно 20 аминокислотных остатков.
"Формообразующее" означает любой компонент вакцины или иммуногенной композиции, который не является антигеном.
"Фрагмент" означает укороченную часть белка или гена. "Функциональный фрагмент" и "биологически активный фрагмент" означает фрагмент, сохраняющий биологические свойства белка или гена полной длины. "Иммуногенно активный фрагмент" означает фрагмент, вызывающий иммунный ответ.
Термин "G-белок" в контексте данного описания означает часть гликопротеиновых выступов, покрывающих внешнюю поверхность вируса бешенства.
Термин "гетерологичный" в контексте данного описания означает взятый из другого вида или штамма.
Термин "гомологичный" в контексте данного описания означает взятый из того же вида или штамма.
"Гомология" или "процент гомологии" означает процент нуклеотидных или аминокислотных остатков в приемлемой последовательности, которые идентичны остаткам в сравнительных последовательностях после выравнивания последовательностей и вставки пробелов, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, а также с учетом любых консервативных замещений в рамках идентичности последовательностей.
"Гуморальный иммунный ответ" означает иммунный ответ, который как минимум частично опосредован антителами.
"Идентичность" или "процент идентичности" означает процент нуклеотидов или аминокислот в приемлемой последовательности, которые идентичны остаткам в сравнительной последовательности после выравнивания обеих последовательностей и вставки пробелов, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких бы то ни было консервативных замещений в рамках идентичности последовательностей.
"Иммунный ответ" у субъекта означает выработку гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. Иммуногенный ответ может быть достаточным для диагностических целей или других испытаний или может быть достаточным для предотвращения признаков или симптомов болезни, включая ее опасное для здоровья воздействие или осложнения, вызываемые инфекцией болезнетворного агента. Иммунные ответы обычно определяют с применением стандартных иммуноанализов и анализов с подавлением активности, которые известны специалистам в данной области.
"Иммуногенный" или "иммуногенность" в контексте данного описания означает способность вызывать иммунный ответ, специфически направленный против антигена.
Термины "иммуногенная композиция", или "иммунологически эффективное количество", или "количество, эффективное для выработки иммунного ответа", в контексте данного описания означают композицию или антиген, которые могут быть распознаны иммунной системой, в результате чего вырабатывается специфический иммунный ответ (то есть обладающее иммуногенной активностью), при введении животному отдельно или с фармацевтически приемлемым носителем.
"Выделенный" в контексте данного описания означает удаление из природной среды, отдельно или в гетерологичной клетке-хозяине, хромосомы или вектора (например, плазмиды, фага и т.п.). "Выделенные бактерии", "выделенные анаэробные бактерии", "выделенный бактериальный штамм", "выделенный вирус", "выделенный вирусный штамм" и т.п. означают композицию, в которой бактерии или вирус являются по сути свободными от других микроорганизмов, например, в культуре, отдельно от природной среды. Термин "выделенный", применяемый для описания любого конкретно определенного вещества, такого как полинуклеотид или полипептид, касается вещества, отделенного от природной клеточной среды, в которой обычно пребывает вещество, такое как полипептид или нуклеиновая кислота. Таким образом, в контексте данного описания, лишь в качестве примера, в рекомбинантной линии клеток, построенной с применением полинуклеотида согласно изобретению, используется "выделенная" нуклеиновая кислота. В альтернативном варианте, если конкретный белок или специфический иммуногенный фрагмент заявляется или применяется в качестве вакцины или другой композиции, он считается выделенным, поскольку он был распознан, отделен и в определенной мере очищен по сравнению с состоянием, в котором он может существовать в природе. Если белок или его специфический иммуногенный фрагмент производится в рекомбинантной бактерии или эукариотическом векторе экспрессии, который вырабатывает антиген, он считается существующим как выделенный белок или нуклеиновая кислота. Например, в рекомбинантной линии клеток, построенной с применением полинуклеотида, используется "выделенная" нуклеиновая кислота.
"Лекарственное средство" означает любой агент, который может применяться для профилактики, лечения или ослабления болезни, или для профилактики какого-либо физиологического состояния или явления.
Термин "множественность заражения" (MOI) означает пропорцию количества организмов на клетку, которая точно указывает, сколько инокулята должно использоваться при данной инфекции.
Термины "парапоксвирус", "парапоксвирусные штаммы" в контексте данного описания означают вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae и роду Parapoxvirus.
Термины "'Parapoxvirus ovis" и "Parapoxvirus ORFV" в контексте данного описания означают вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae, роду Parapoxvirus и виду Parapoxvirus ovis. Эти вирусы также называются вирусом контагиозной эктимы или вирусом контагиозного пустулезного дерматита. Они имеют уникальную спиральную оболочку, отличающую их от других поксвирусов.
Термин "штамм D1701 Parapoxvirus ovis" означает вирус, описанный в Патенте США 6,365,393, включенном в данное описание путем ссылки. "Штамм D1701 Parapoxvirus ovis-V" означает штамм Parapoxvirus ovis D1701, адаптированный к линии клеток обезьян Vero.
"Парентеральное введение" означает введение вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через путь или маршрут, не затрагивающий пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное, внутримышечное, чрескожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутриглазное и внутривенное введение.
Термин "патоген" или "патогенный микроорганизм" в контексте данного описания означает микроорганизм, например вирус бешенства, который способен вызывать болезнь, заболевание или аномальное состояние животного-хозяина.
"Фармацевтически приемлемый" означает вещества, которые по результатам тщательной медицинской клинической оценки считаются приемлемыми для применения в контакте с тканями субъектов без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соответствующими разумному соотношению между выгодой и риском и эффективными при предполагаемом применении.
Термин "поксвирус" в контексте данного описания означает вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae. Эти вирусы представляют собой овальные, довольно крупные вирусы из двухцепочечных ДНК.
Термин "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" в контексте данного описания означает молекулу органического полимера, состоящую из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепочку. ДНК (дезоксирибоонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) являются примерами полинуклеотидов с четкой биологической функцией.
Термины "предотвращать", "предотвращение" или "профилактика" и т.п. в контексте данного описания означают ингибирование репликации микроорганизма, ингибирование передачи микроорганизма или ингибирование внедрения микроорганизма в организм-хозяин. Эти и другие подобные термины в контексте данного описания также могут означать ингибирование или блокирование одного или нескольких признаков или симптомов инфекции. Лечение считается терапевтическим, если обеспечивается снижение нагрузки со стороны микроорганизма.
"Защита" и подобные термины в контексте данного описания в отношении вакцины или другой композиции означают, что вакцина или композиция предотвращает или уменьшает симптомы болезни, вызываемые организмом, из которого взят антиген, применяемый в вакцине или композиции. Термин "защита" и подобные термины также означают, что вакцина или композиция могут применяться для терапевтического лечения болезни или одного или нескольких симптомов болезни, уже существующей у субъекта.
Термин "вирус бешенства" означает нейротрофический лиссавирус, относящийся к семейству Rhabdoviridae. Он представляет собой вирус, состоящий из одноцепочечной отрицательно-полярной нити РНК, имеющий гликопротеиновые выступы на его внешней поверхности.
"Рекомбинантный PPV" означает PPV, имеющий инсерции и/или делеции в геноме. Инсерции и делеции осуществляют, применяя способы молекулярной биологии.
К "видовым гомологам" относятся гены, присутствующие в двух или более видах, имеющих существенную гомологию полинуклеотидной последовательности, и обладают одинаковыми или подобными биологическими функциями и/или свойствами. Предпочтительно полинуклеотидные последовательности, представляющие видовые гомологи, гибридизируются в умеренно жестких условиях, как описывается авторами на примере, и обладают одинаковыми или подобными биологической активностью и/или свойствами. В другом аспекте полинуклеотиды, представляющие видовые гомологи, имеют более чем приблизительно 60% гомологии последовательности, более чем приблизительно 70% гомологии последовательности, более чем приблизительно 80% гомологии последовательности, более чем приблизительно 90% гомологии последовательности, более чем приблизительно 95% гомологии последовательности, более чем приблизительно 96% гомологии последовательности, более чем приблизительно 97% гомологии последовательности, более чем приблизительно 98% гомологии последовательности или более чем приблизительно 99% гомологии последовательности.
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Термины "специфическое связывание", "специфически связывается" и т.п. определяются как две или более молекул, образующих комплекс, измеримый в физиологических или аналитических условиях и являющийся селективным. Антитело или другой ингибитор считается "специфически связывающимся" с белком, если в надлежащим образом выбранных условиях такое связывание существенно не ингибируется, в то время как неспецифическое связывание ингибируется. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и является селективным для соединения или белка. Неспецифическое связывание обычно обладает низкой аффинностью. Например, связывание в IgG антителах в целом характеризуется аффинностью как минимум приблизительно 10 М или выше, например как минимум приблизительно 10 М или выше, или как минимум приблизительно 10 М или выше, или как минимум приблизительно 10 или выше, или как минимум приблизительно 10 М или выше, или как минимум приблизительно 10 М или выше. Термин также применим, например, в случаях, когда антигенсвязывающий домен является специфическим для конкретного эпитопа, который не содержится многими антигенами, и в этом случае антитело, содержащее антигенсвязывающий домен, как правило, не связывается с другими антигенами.
"Специфический иммуногенный фрагмент" в контексте данного описания означает часть последовательности, которая распознается антителом или Т-клеткой, которые являются специфическими для этой последовательности.
"Субъект" означает любое животное, восприимчивое к инфицированию бешенством, включая млекопитающих, таких как домашние, так и дикие.
"По сути идентичный" в контексте данного описания означает степень идентичности последовательностей как минимум приблизительно 90%, как минимум приблизительно 95%, как минимум приблизительно 96%, как минимум приблизительно 97%, как минимум приблизительно 98% или как минимум приблизительно 99%.
"Терапевтически эффективное количество" в контексте данного описания означает количество антигена или вакцины или композиции, которая вызывает иммунный ответ у субъекта (например, собаки), получившего антиген или вакцину или композицию, достаточную для профилактики или ослабления признаков или симптомов болезни, включая ее опасное для здоровья воздействие или осложнения, вызванные инфекцией патогена, такого как вирус, бактерия, паразит или грибок. Может быть вызван гуморальный иммунитет или клеточно-опосредованный иммунитет или как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунитет. Иммуногенный ответ животного на антиген, вакцину или композицию может определяться косвенным образом, через измерение титров антител, анализы пролиферации лимфоцитов или непосредственно путем наблюдения за признаками и симптомами после провокации штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспечиваемый вакциной или композицией, может определяться путем измерения снижения количества провоцирующего организма и/или снижения клинических признаков, таких как смертность, болезненность, температура и общее физическое состояние, состояние здоровья и работоспособность субъекта. Терапевтически эффективное количество вакцины или композиции может быть разным в зависимости от конкретного применяемого иммуногена или состояния субъекта и может определяться специалистом в данной области.
Термины "лечить" или "лечение" и т.п. в контексте данного описания означают уменьшение или устранение инфицирования микроорганизмом. Эти и подобные термины также могут означать снижение репликации микроорганизма, снижение переноса микроорганизма или снижение способности микроорганизма к внедрению в организм-хозяин. Эти и подобные термины в контексте данного описания также могут означать снижение, ослабление или устранение одного или нескольких признаков или симптомов инфицирования микроорганизмом или ускорение выздоровления от инфицирования микроорганизмом.
Термины "вакцинировать", "вакцинация" и т.п. в контексте данного описания означают введение животному вакцины или иммуногенной композиции.
Термины "вакцина" и "вакцинная композиция" в контексте данного описания означают композицию, которая предотвращает или снижает инфекцию, или предотвращает или снижает один или несколько признаков или симптомов инфекции. Защитный эффект вакцинной композиции против патогена обычно достигается путем стимулирования у субъекта иммунного ответа. В общих чертах, устраненные или сниженные показатели инфекции, ослабление признаков или симптомов или ускоренное удаление микроорганизма из организма инфицированного субъекта свидетельствуют о защитном эффекте вакцинной композиции. Вакцинные композиции согласно настоящему изобретению обеспечивают защитный эффект против инфекций, вызванных вирусом бешенства.
Термин "вариант" в контексте данного описания означает разновидность данной последовательности белка и/или гена, причем эта разновидность последовательности по сути является такой же, как и данная последовательность, кроме мутационных отличий. Вышеупомянутые отличия могут быть природными или вызванными синтетическим или генетическим путем.
"Вектор" или "векторный вирус" означает PPV, подходящий для инсерции гетерологичной ДНК, которая может переносить вставленную ДНК в клетки или организмы, и которая в соответствующих случаях обеспечивает экспрессию гетерологичной ДНК.
Термин "приемлемый в ветеринарии носитель" в контексте данного описания означает вещества, которые по результатам тщательной медицинской клинической оценки считаются приемлемыми для применения в контакте с тканями животных без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соответствующими разумному соотношению между выгодой и риском и эффективными при предполагаемом применении.
Представленное ниже описание поможет специалистам в данной области в практическом осуществлении настоящего изобретения. Однако при этом данное описание не следует рассматривать как ограничивающее объем настоящего изобретения, поскольку специалистами в данной области могут осуществляться модификации и изменения в обсуждаемых вариантах осуществления без отклонения от сущности и объема представленного изобретения.
ВИРУСЫ, ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ВАКЦИНЫ
Настоящее изобретение охватывает применение парапоксвирусов для получения рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства.
В одном варианте осуществления применяется Parapoxvirus ovis (PPVO) для получения рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В другом варианте осуществления применяется штамм Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления применяется штамм Parapoxvirus ovis D1701-V.
Генетическая последовательность, вставленная в парапоксвирус, включает гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. Структура этого гена также описывается, например, в публикации Anilionis et al., Nature 294, 275-278 (1981). Вставка имеет размер 1588 нуклеотидов. Полная последовательность вставки (SEQ ID NO:4) показана на Фигуре 4. Она содержит полноразмерную кодирующую область G-гена вируса бешенства (1575 нуклеотидов) плюс 7 нуклеотидов на 5'-конце и 6 нуклеотидов на 3'-конце в качестве линкерных последовательностей для рестрикционного анализа (BamHI и EcoRI).
Сведения о последовательности полинуклеотида позволяют легко получить любой возможный фрагмент этого полинуклеотида. Таким образом, изобретение обеспечивает фрагменты G-белка. В одном варианте осуществления обеспечиваются функциональные фрагменты. В другом варианте осуществления обеспечиваются биологически активные фрагменты. Фрагменты могут быть очищены традиционными способами, например путем фильтрации или хроматографии. Фрагменты могут быть получены путем рекомбинации с применением способов, известных специалистам в данной области.
При получении рекомбинантного парапоксвируса гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. Способы, применяемые для вставки гетерологичной ДНК в парапоксвирус, являются стандартными и известными специалистам в данной области. Они описываются в Патенте США 6,365,393.
В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, представляет собой D1701-VrV RabG (K-UC1002), хранящийся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Manassas, VA, 20108, США, под патентным депозитным номером АТСС РТА-11662, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Последовательностью плазмиды pdV-RabG (7692 нуклеотидов) является SEQ ID NO:5, которая представлена в списке последовательностей.
Изобретение также охватывает полинуклеотидные последовательности, имеющие как минимум приблизительно 99%, как минимум приблизительно 98%,как минимум приблизительно 97%, как минимум приблизительно 96%, как минимум приблизительно 95%, как минимум приблизительно 93%, как минимум приблизительно 90%, как минимум приблизительно 85%, как минимум приблизительно 80%, как минимум приблизительно 75%, как минимум приблизительно 70%, как минимум приблизительно 65%, как минимум приблизительно 60%, как минимум приблизительно 55% и как минимум приблизительно 50% идентичности и/или гомологии с описанными авторами последовательностями.
Изобретение также охватывает полинуклеотидные последовательности, гибридизирующиеся в условиях от умеренной до высокой жесткости с некодирующей цепью или комплементом любой из описанных авторами последовательностей SEQ ID NO, и их видовые гомологи. Примерами условий высокой жесткости являются окончательное промывание в буфере, включающем 0,2×SSC/0,1% SDS, при температуре от 65°С до 75°С, а к условиям умеренной жесткости относится окончательное промывание в буфере, включающем 2×SSC/0,1% SDS, при температуре от 35°С до 45°С. Специалистам в данной области известно, что условия равноценной жесткости могут быть достигнуты путем изменения температуры и концентрации буфера или соли, как описывается в публикации Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons (1994), pp.6.0.3 to 6.4.10.
Рекомбинантный PPV может распространяться в клетках, линиях клеток и клетках-хозяевах. Вышеупомянутые клетки, линии клеток или клетки-хозяева, помимо прочих, могут быть, например, клетки млекопитающих и отличных от млекопитающих животных. Клетки, линии клеток и клетки-хозяева, в которых может распространяться PPV, являются хорошо известными и легко доступными специалистам в данной области. В одном варианте осуществления применяют клетки Vero. В других вариантах осуществления применяют клетки почек крупного рогатого скота или семенников барана.
Рекомбинантный PPV также может быть ослаблен или инактивирован перед применением в иммуногенной композиции или вакцине. Способы ослабления и инактивации хорошо известны специалистам в данной области. К способам ослабления, помимо прочих, относятся серийный пассаж в клеточной культуре на соответствующей линии клеток, ультрафиолетовое облучение и химический мутагенез. К способам инактивации, помимо прочих, относятся обработка формалином, бета-пропиолактоном (BPL) или бинарным этиленимином (BEI) или другие способы, известные специалистам в данной области.
Инактивация формалином может осуществляться путем смешивания вирусной суспензии с 37% формальдегидом до конечной концентрации формальдегида 0,05%. Вирусно-формальдегидную смесь смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 24 часов при комнатной температуре. Смесь инактивированного вируса затем испытывают на наличие остаточного живого вируса путем анализа роста на соответствующей линии клеток.
Инактивация путем BEI может осуществляться путем смешивания вирусной суспензии согласно настоящему изобретению с 0,1 М BEI (2-бромо-этиламин в 0,175 N NaOH) до конечной концентрации BEI 1 мМ. Смесь вируса-BEI смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 48 часов при комнатной температуре с последующим добавлением 1,0 М тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,1 мМ. Смешивание продолжают в течение дополнительных двух часов. Смесь инактивированного вируса испытывают на наличие остаточного живого вируса путем анализа роста на соответствующей линии клеток.
Рекомбинантный PPV может применяться в иммуногенных композициях и вакцинах.
Иммуногенные композиции и вакцины необязательно могут включать один или несколько приемлемых в ветеринарии носителей, включая жидкие, полутвердые или твердые растворители, которые служат в качестве фармацевтических связующих, формообразующих или сред. В контексте данного описания "приемлемый в ветеринарии носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизаторы, растворители, консерванты, бактерицидные и противогрибковые средства, изотонические агенты, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. К растворителям относятся вода, солевой раствор, декстроза, этанол, глицерин и т.п. К изотоническим агентам относятся хлорид натрия, декстроза, маннит, сорбит и лактоза, помимо прочих, известных специалистам в данной области. К стабилизаторам, помимо прочих, известных специалистам в данной области, относится альбумин. К консервантам, помимо прочих, известных специалистам в данной области, относится мертиолат.

К адъювантам, помимо прочих, относятся адъювантная система RIBI (Ribi Inc.), квасцы, гель гидроокиси алюминия, эмульсии "масло в воде", эмульсии "вода в масле", например полные и неполные адъюванты Фрейнда, блок-сополимеры (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN, сапонин, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) или другие сапониновые фракции, монофосфорил-липид А, адъювант Avridine липидамин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или полученный иным образом), холерный токсин или мурамилдипептид, помимо многих других, известных специалистам в данной области. Количество и концентрация адъювантов и добавок, применяемых в контексте настоящего изобретения, может легко определяться специалистами в данной области. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает иммуногенные композиции и вакцины, включающие от приблизительно 50 мкг до приблизительно 2000 мкг адъюванта. В другом варианте осуществления адъювант включен в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 1500 мкг, или от приблизительно 250 мкг до приблизительно 1000 мкг, или от приблизительно 350 мкг до приблизительно 750 мкг. В другом варианте осуществления адъювант включен в количестве приблизительно 500 мкг/2 мл дозу иммуногенной композиции или вакцины.
Иммуногенные композиции и вакцины также могут включать антибиотики. К таким антибиотикам, помимо прочих, относятся антибиотики из классов аминогликозидов, карбапенемы, цефалоспорины, гликопептиды, макролиды, пенициллины, полипептиды, хинолоны, сульфонамиды и тетрациклины. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает иммуногенные композиции и вакцины, включающие от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл антибиотика. В другом варианте осуществления иммуногенные композиции и вакцины включают от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 55 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 15 мкг/мл до приблизительно 45 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 40 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 25 мкг/мл до приблизительно 35 мкг/мл антибиотика. В еще одном варианте осуществления иммуногенные композиции и вакцины включают менее чем приблизительно 30 мкг/мл антибиотика.
Помимо рекомбинантного PPV, иммуногенные композиции и вакцины могут включать другие антигены. Антигены могут быть в форме инактивированной полной или частичной композиции микроорганизма или в форме антигенных молекул, полученных при помощи технологий генной инженерии или химического синтеза. К другим антигенам, подходящим для применения в соответствии с настоящим изобретением, помимо прочих, относятся взятые из патогенных бактерий или патогенных вирусов.
В отношении собак рекомбинантные иммуногенные композиции и вакцины от бешенства также необязательно могут содержать смесь с одним или несколькими дополнительными собачьими антигенами, такими как, например, Ehrlichia cams, собачий парвовирус (CPV), собачья чума, вирус собачьего парагриппа (CPI), собачий аденовирус II типа (CAV-2), собачий аденовирус (CDV), собачий коронавирус (CCV), Leptospira icterohemorrhagiae (LI), Leptospira canicola (LC), Leptospira grippotyphosa (LG), Leptospira pomona (LP), Borrelia burgdorferi и т.п. Одна комбинация антигенов включает изоляты собачьего парвовируса, собачьей чумы, собачьего аденовируса и собачьего парагриппа, с коронавирусом и Leptospira (включая возникающие серовары Leptospira grippotyphosa и Leptospira pomona) или без них.
В отношении кошек рекомбинантные иммуногенные композиции и вакцины от бешенства также необязательно могут содержать смесь с одним или несколькими дополнительными кошачьими антигенами, такими как, например, кошачий калицивирус (FCV), Chlamydophila felis (С. felis, также известный как Chlamydia psittaci (FCP)), вирус лейкоза кошачьих (FeLV), вирус панлейкопении кошачьих (FPV), вирус ринотрахеита кошачьих (FVR), вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), вирус инфекционного перитонита кошачьих (FIPV), Bartonella henselae (например, лихорадка кошачьих царапин) и т.п.
В отношении лошадей рекомбинантные иммуногенные композиции и вакцины от бешенства также необязательно могут содержать смесь с одним или несколькими дополнительными конскими антигенами, такими как, например, вирус конского гриппа, вирус конского герпеса 1 и 4, конский артеривирус, вирус Западного Нила, конский ротавирус, Streptococcus equi, столбнячный токсоид и т.п.
Описанные авторами иммуногенные композиции и вакцины вводят животным для стимулирования эффективного иммунного ответа против RV. Соответственно, описываются способы стимулирования эффективного иммунного ответа против RV, включающие введение животному терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В результате способ обеспечивает выработку сывороточных антител против G-белка.
Описанные авторами иммуногенные композиции и вакцины вводят животным для вакцинации против бешенства. Иммуногенные композиции и вакцины вводят животным для профилактики или лечения бешенства. Соответственно, авторами описываются способы вакцинации животных против бешенства и профилактики или лечения бешенства, включающие введение животному терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства.
ФОРМЫ, ДОЗЫ И ПУТИ ВВЕДЕНИЯ
Иммуногенные композиции и вакцины могут приготавливаться в различных формах в зависимости от пути введения. Например, иммуногенные композиции и вакцины могут приготавливаться в форме стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для инъекций, или в лиофилизированных формах с применением способов сушки замораживанием. Лиофилизированные иммуногенные композиции и вакцины, как правило, хранят при температуре приблизительно 4°С и восстанавливают влагосодержание в стабилизирующем растворе, например солевом растворе или HEPES. В альтернативном варианте иммуногенные композиции и вакцины могут сохраняться путем сушки замораживанием. Иммуногенные композиции и вакцины также могут приготавливаться в форме суспензий или эмульсий.
2
12
3
11
4
10
5
9
6
8
Иммуногенные композиции и вакцины включают терапевтически эффективное количество вышеописанного рекомбинантного PPV. Очищенные вирусы могут применяться непосредственно в иммуногенной композиции или вакцине или могут быть дополнительно ослаблены или инактивированы. Как правило, иммуногенная композиция или вакцина содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 PFU или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 PFU, или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 PFU, или от приблизительно 1×10 и приблизительно 1×10 PFU, или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 PFU. Точное количество вируса в иммуногенной композиции или вакцине, эффективное для обеспечения защитного эффекта, может определяться специалистами в данной области.
Иммуногенные композиции и вакцины в целом включают приемлемый в ветеринарии носитель в объеме от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 5 мл. В другом варианте осуществления объем носителя составляет от приблизительно 1 мл до приблизительно 4 мл или от приблизительно 2 мл до приблизительно 3 мл. В другом варианте осуществления объем носителя составляет приблизительно 1 мл, или приблизительно 2 мл, или приблизительно 3 мл, или приблизительно 5 мл. Приемлемыми в ветеринарии носителями, подходящими для применения в иммуногенных композициях и вакцинах, могут быть любые из описанных авторами.
Специалисты в данной области смогут легко определить, требует ли вирус ослабления или инактивации перед введением. В другом варианте осуществления рекомбинантный PPV может вводиться непосредственно животному без дополнительного ослабления. Количество вируса, которое является терапевтически эффективным, может быть разным в зависимости от разных факторов, включая состояние животного и степень инфицирования, и может определяться специалистами в данной области.
В соответствии со способами согласно настоящему изобретению животному может вводиться единичная доза или, в альтернативном варианте, могут осуществляться две или большее количество прививок с интервалами от приблизительно двух до приблизительно десяти недель. Могут требоваться режимы ревакцинации и режим дозирования может регулироваться для обеспечения оптимальной иммунизации. Специалисты в данной области смогут легко определить оптимальный режим введения.
Иммуногенные композиции и вакцины могут вводиться непосредственно в кровоток, в мышцы или во внутренний орган. К приемлемым способам парентерального введения относятся внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутриуретральное, интрастернальное, интракраниальное, внутримышечное и подкожное. Подходящими устройствами для парентерального введения являются иглы (включая микроиглы) инжекторы, безыгольные инжекторы и средства инфузии.
Парентеральные композиции, как правило, представляют собой водные растворы, содержащие формообразующие, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно с уровнем рН от приблизительно 3 до приблизительно 9, или от приблизительно 4 до приблизительно 8, или от приблизительно 5 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 6 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 7 до приблизительно 7,5), однако для некоторых случаев применения более приемлемым является рецептирование в форме стерильного неводного раствора или в высушенной форме для применения в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода.
Приготовление парентеральных композиций в стерильных условиях, например, путем лиофилизации может легко выполняться с применением стандартных фармацевтических технологий, хорошо известных специалистам в данной области.
Описанные авторами рекомбинантные парапоксвирусы и иммуногенные композиции и вакцины могут применяться при изготовлении медикамента для вакцинации животного против бешенства.
Настоящее изобретение обеспечивает способы определения происхождения парапоксвируса, присутствующего у животного.
Вакцинация, при которой применяют вакцину DIVA, которая позволяет дифференцировать инфицированных и вакцинированных животных, обеспечивает средство определения происхождения парапоксвируса, присутствующего у животного. Эта дифференциация может осуществляться любым из разных диагностических способов, включая, помимо прочих, ELISA, вестерн-блоттинг и ПЦР. Эти и другие способы легко определяются и известны специалистам в данной области.
Описанные авторами парапоксвирусы могут отличаться от штаммов дикого типа как по их геномному составу, так и по экспрессируемым белкам. Такое отличие позволяет различать вакцинированных и инфицированных животных. Например, можно выяснить, присутствует ли у животного, определенного как позитивное на парапоксвирус в лабораторных испытаниях, штамм парапоксвируса дикого типа или рекомбинантно образованный парапоксвирус, ранее полученный путем вакцинации.
Для определения могут применяться различные анализы. Например, вирус может быть выделен из организма животного, определенного как позитивное на парапоксвирус, и могут применяться анализы на основе нуклеиновых кислот для обнаружения присутствия генома парапоксвируса, что свидетельствует о предварительной вакцинации. Анализы на основе нуклеиновых кислот включают саузерн- или нозерн-блоттинг, ПЦР и секвенирование. В альтернативном варианте могут применяться анализы на белковой основе. В анализах на белковой основе клетки или ткани, в которых предполагается наличие инфекции, могут быть выделены из организма животного, позитивного на парапоксвирус согласно тесту. Из таких клеток или тканей могут быть приготовлены клеточные экстракты, которые могут подвергаться, например, вестерн-блоттингу с применением соответствующих антител против вирусных белков, способных четко определять присутствие рекомбинантно образованного парапоксвируса, предварительно инокулированного, или парапоксвируса дикого типа.
Степень и характер иммунного ответа, вызванного у животного, определяют различными способами. Например, могут быть взяты образцы сыворотки привитых животных и подвергнуты испытанию на присутствие или отсутствие антител, специфических к парапоксвирусу, например, в традиционном ELISA-анализе. Обнаружение отвечающих цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTL) в лимфоидных тканях может быть достигнуто путем анализов, например, с пролиферацией Т-клеток в качестве свидетельства стимулирования клеточного иммунного ответа. Соответствующие способы надлежащим образом описываются в источниках существующего уровня техники, например в публикации Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994).
Рекомбинантный Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG может применяться в DIVA-анализе. В одном варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения N-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных. В другом варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения Р-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных. В еще одном варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения L-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных. В еще одном варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения М-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных.
Настоящее изобретение дополнительно описывается на следующих иллюстративных неограничительных примерах.
ПРИМЕРЫ
Генерировали рекомбинантный Parapoxvirus ovis, включающий ген, кодирующий G-белок RV. Определяли экспрессию G-белка, указывающую на иммуностимулирующие и защитные свойства рекомбинантного вируса против RV.
Пример 1
Генерация G-белка бешенства, экспрессирующего рекомбинантный вирус D1701-V-RabG
Получали рекомбинантно генерированный Parapoxvirus ovis, содержащий ген, который кодирует G-белок RV. Определяли экспрессию G-белка, указывающую на иммуностимулирующие и защитные свойства рекомбинантного вируса против RV.
Построение трансферной плазмиды
Для генерации рекомбинантного Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG использовали векторную систему Parapoxvirus ovis (PPVO) (Патент США 6,365,393; Rziha et al., 2000, J. BiotechnoL, 83, 137-145; Fischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323; Henkel et al., 2005, J. Virol. 79, 314-325). Ген G-белка вируса бешенства химически синтезировали (Blue Heron Biotech; США) и обеспечивали в pUC плазмиде. Полный G-ген выделяли как фрагмент ДИК BamHI - EcoRI размером в 1582 п.н. при помощи электрофореза в агарозном геле (0,8% (масса/объем)) и очищали при помощи комплекта для гель-экстракции Qiaex II (Qiagen; Германия). Плазмиду pdV-Rec1 (Fischer et al., 2003) подвергали двойному дигерированию с применением BamHI и EcoRI и использовали для лигирования (комплект для быстрого лигирования, Promega; Германия). После трансформации Е. coli DH5αF' (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; Германия) отбирали инсерционно-положительные колонии путем рестрикционного дигерирования EcoRI - ВатHI плазмидной ДНК. В результате обеспечивалась трансферная плазмида pdV-RabG (Фиг.1), которую получали при помощи комплекта Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen; Германия) и использовали для секвенирования ДНК. Для этого использовали праймер ORF32N (SEQ ID NO:1; 5'-GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3'), расположенный перед сайтом инсерции, и праймер ORF3 IN (SEQ ID NO:2; 5'-ССАТССССТТАССАССССАСАСССАСССТССС-3'), расположенный после сайта инсерции в pdV-Rec1, а также внутренние G-ген-специфические праймеры RabG-F (SEQ ID NO:6; 5'-GGAGTCTCTCGTTATCATATCTC-3') и RabG-R (SEQ ID NO:7; 5'-CTAAACAAGGTGCTCAATTTCGT-3') соответственно. Это позволило определить полную последовательность вставленного G-гена (SEQ ID NO:4).
Отбор рекомбинантов путем окрашивания Bluo-gal
6
5
Клетки Vero (10 клеток) инфицировали 0,1 MOI (множественность заражения) lacZ-экспрессирующего вируса D1701-VrV и через 2 часа трансфицировали с применением 2 мкг плазмидной ДНК pdV-RabG путем нуклеофекции в соответствии с рекомендациями производителя (Атаха Nucleofector, Lonza; Германия). Лизаты вируса собирали через 3-4 дня и использовали для титрования на клетках Vero в 6-луночных планшетах (Fisher Scientific; Германия). Когда колонии становились видимыми, наносили содержащий агарозу Bluo-Gal, как описано (Fischer et al., 2003). Вирусные колонии белого цвета собирали и элюаты отдельных бляшек (суточные при 4°С в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS)) использовали для одновременного инфицирования клеток Vero (1×10клеток) в отдельных лунках 48-луночного планшета.
Отбор рекомбинантов при помощи ПЦР бляшек.
Выделение ДНК из каждого изолята вирусных бляшек выполняли согласно модификации способа из публикации Pasamontes et al. (J. Virol. Methods 35: 137-141; 1991). Лизат вируса (0,2 мл) трижды замораживали (-70°С) и размораживали (37°С) и трижды обрабатывали ультразвуком на льду 3 в течение 20-30 сек (звуковая баня). После экстракции фенолом и хлороформом добавляли 10 мкг тРНК дрожжей или 3 мкл GlycoBlue (Ambion; Германия) перед осаждением этанолом. Осадок ДНК дважды промывали 70% (объем/объем) этанолом и растворяли после высушивания в 14 мкл воды высокой степени очистки.
Для RabG-специфической ПЦР 4 мкл ДНК смешивали на льду с 1 мкл праймерной смеси, состоящей из праймеров 4,0 пмоль RabG-F (SEQ ID NO:6) и 4,0 пмоль RabG-R (SEQ ID NO:7) и 5 мкл ReddyMix 2X PCR (Abgene, Thermo Fisher Scientific; Германия). ПЦР выполняли в Trio Thermoblock (Biometra; Германия) путем инкубации в течение 2 мин при 98°С с последующими 40 циклами в течение 1 мин при 96°С, 30 сек при 60°С, 30 сек при 72°С и конечным продленным этапом в течение 2 мин при 72°С. Продукты ПЦР отделяли путем горизонтального гель-электрофореза в 1% ((масса/объем)) агароза-этидийбромидных (0,3 мкг на мл) гелях. Лизаты вируса из изолятов бляшек, обнаруживающие G-ген-специфический ПЦР-фрагмент размером в 433 п.н., растворяли и подвергали дальнейшей очистке в колониях как минимум трижды с нанесением Bluo-Gal-агарозы, как описано выше. И наконец, ДНК изолятов рекомбинантного вируса в колониях, положительных на G-ген, испытывали в LacZ ген-специфической ПЦР с применением 4 мкл ДНК, 3,95 пмоль праймера lacZ-F (SEQ ID NO:8; 5'-CGATACTGTCGTCGTCCCCTCAA-3') и 4,13 пмоль праймера lacZ-R (SEQ ID NO:9; 5'-CAACTCGCCGCACATCTGAACT-3'). После добавления 5 мкл AccuPrime SuperMix II (Invitrogen, Fisher Scientific; Германия) выполняли ПЦР путем нагревания в течение 2 мин при 98°С с последующими 40 циклами в течение 1 мин при 96°С, 30 сек при 62°С и 90 сек при 68°С с конечным продленным этапом в течение 2 мин при 68°С. Отделение продуктов ПЦР выполняли, как описано выше. Отсутствие LacZ ген-специфического фрагмента размером в 508 п.н. продемонстрировало, что соответствующие изоляты колоний рекомбинантного вируса не содержали экспрессирующего lacZ родительского вируса D1701-VrV после трех циклов очищения колоний. После приготовления высоких титров популяций вирусов D1701-V-RabG вирусную ДНК получали, как описано ниже, и применяли для испытания RabG-ПЦР и LacZ-ПЦР.
Иммуногистохимическое окрашивание колоний рекомбинантных вирусов (IPMA)
Успешную экспрессию вставленного инородного гена сначала анализировали при помощи IPMA, включая Иммуногистохимическое окрашивание колоний рекомбинантных вирусов, титрованных на клетках Vero в 24-луночных планшетах. После появления колоний вирусов среду отсасывали из каждой лунки и клетки высушивали, оставляя планшет открытым приблизительно на 10 мин в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. После этого клетки фиксировали ледяным абсолютным метанолом при -20°С в течение 15-20 мин. После двукратного промывания ледяной 1% (объем/объем) эмбриональной телячьей сывороткой (FCS) в PBS клетки блокировали при помощи PBS, содержащего 10% (объем/объем) FCS, в течение 90 мин при комнатной температуре (RT). После инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре со специфическим к G-белку мышиным моноклональным антителом G559 разбавляли в пропорции 1:200 в 1% FCS в PBS (FLI-Tuebingen; Германия). После трехкратного промывания PBS-T (PBS, содержащим 0,05% (объем/объем) Tween-20) добавляли связанное с пероксидазой вторичное антитело против мыши (Jackson-ImmunoRes., DIANOVA; Германия), разбавленное в соотношении 1:2000, и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. После тщательного промывания PBS-T и PBS добавляли субстрат (вектор Nova Red, Axxora; Германия) согласно рекомендациям производителя, пока не становилось видимым красно-коричневое позитивное окрашивание. В качестве негативного контроля включали неинфицированные клетки и клетки, инфицированные D-1701-VrV или D-1701-V. Колонии вирусов и инфицированные клетки оказались высокопозитивными на G-белок вируса бешенства.
Пример 2
Характеризация D1701-V-RabG
Приготовление популяций вирусов
Для получения высокотитрованных популяций рекомбинантных вирусов 10-20 колб с культурой Т 15 0 (Greiner; Германия) одновременно инфицировали MOI 0,5. Через 3 дня наблюдался приблизительно 80% цитопатогенный эффект (СРЕ) и клетки и супернатант со всех колб собирали для центрифугирования (2 ч при 13000 об/мин, 4°С). Супернатант осторожно удаляли и колонию вирусов растворяли в течение суток при 4°С в 1-2 мл PBS. Суспензию вирусов полностью диспергировали путем обработки ультразвуком (ультразвуковым разрушителем клеток, Branson; Германия) на льду с применением 3 импульсов (100 Вт) по 10 сек (10 сек перерыв между импульсами) с последующим центрифугированием (500-700×g, 10 мин, 4°С) для удаления клеточного дебриса. Супернатант хранили на льду, а колонию клеток ресуспендировали в 1,0 мл PBS и обрабатывали ультразвуком на льду (2 раза по 20 сек с 10-секундным перерывом, затем один раз в течение 30 сек). После медленного центрифугирования Супернатант комбинировали с первым супернатантом, разделяли на аликвотные части, титровали и хранили при -70°С.
Характеризация вирусной ДНК
Клетки Vero инфицировали MOI 0,5 и собирали через 2-3 дня (приблизительно 80% СРЕ) путем трипсинизации и кратковременного медленного центрифугирования при 4°С. ДНК выделяли с применением комплекта для выделения ДНК Master Pure (Epicentre Biotechnology, Biozym Scientific; Германия) в соответствии с протоколом производителя.
32
Для проверки инсерции G-гена в надлежащем локусе 2 мкг ДНК обрабатывали рестрикционным ферментом, отделяли в 0,8% ((масса/объем)) агарозных гелях и переносили на нейлоновую мембрану (GE Healthcare; Германия) для гибридизации путем саузерн-блоттинга в соответствии со стандартными процедурами. Специфический к G-гену бешенства зонд (продукт Rabg-F/-R ПЦР) выделяли при помощи гель-электрофореза, радиоактивно метили (P-dCTP, MP Biomedicals; Германия) с использованием RediPrime (GE Healthcare; Германия). Затем ее использовали для гибридизации путем саузерн-блоттинга, которую осуществляли в условиях 50°С в 4 Х SSPE (1X=0,18 М NaCl, 10 мМ РР, 1 мМ EDTA, рН 7,4) с содержанием 0,5% ((масса/объем)) обезжиренного сухого молока, 1,0% ((масса/объем)) додецилсульфата натрия (SDS) и 0,5 мг/мл денатурированной ДНК телячьей вилочковой железы (КТ-ДНК, Sigma; Германия). После рентгеновского облучения (Kodak X-Omat; Германия) пробу удаляли с фильтра путем инкубации в 0,4 N NaOH при 45°С в течение 30-60 мин с последующей кратковременной инкубацией при 100°С в 0,1×SSC, 0,5% SDS, 0,2 М Tris-HCl (pH 7,4). Для второй гибридизации фрагмент Н HindIII D1701-V, содержащий локус vegF-E, использовали, как описано (Cottone et al., 1998. Vims Res. 56, 53-67). Результаты саузерн-блоттинга подтверждали правильность инсерции G-гена в геном D1701-VrV.
Обнаружение G-ген-специфической РНК
Клетки Vero инфицировали MOI 3-5 и полную РНК выделяли в различные моменты времени после инфицирования (p.i.) с применением комплекта для извлечения полной РНК SurePrep (Fisher Scientific; Германия). Дополнительно РНК извлекали из клеток, инфицированных в присутствии цитозина арабинозида (AraC; 0,04 мг/мл, Sigma; Германия) или циклогексимида (СНХ, 0,1 мг/мл, Serva; Германия) для испытания на раннюю экспрессию вставленного G-гена. В качестве контроля выделяли РНК из неинфицированных клеток. РНК отделяли в денатурирующем 1% агарозном геле, содержащем формальдегид, и переносили на нейлоновую мембрану, как описано (Kroczek, R.A. & Siebert, E. Anal. Biochem. 184:90-95, 1990). Радиоактивно меченный фрагмент Rabies G PCR (RabG-F/-R) использовали в качестве гибридизационного зонда в растворе UltraHyb (Ambion; Германия) при 42°С. Результаты четко продемонстрировали немедленную раннюю экспрессию G-гена бешенства благодаря регуляции под контролем раннего промотора vegF-E ORFV (Rziha et al. 1999, J. Biotechnol, 73, 235-242).
Обнаружение G-белка путем иммунофлуоресценции
5
Для иммунофлуоресценции клетки Vero (1×10 клеток/мл) инфицировали на 4-камерных предметных стеклах (BD Falcon; Германия) MOI 0,1 или 3,0. В различные моменты времени после инфицирования клетки промывали средой и фиксировали 3,7% (объем/объем) не содержащим метанол формальдегидом (Pierce, Thermo Fisher Scientific; Германия) в течение 15 мин при 37°С. После трехкратного промывания PBS клетки пермеабилизировали путем обработки 0,2% (объем/объем) Triton X-100 в течение 5 мин при 37°С. После промывания PBS клетки блокировали 5% FCS в PBS в течение 30-40 мин при 37°С. Для обнаружения G-белка клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С мышиным моноклональным антителом G559 (FLI; Tuebingen, Германия), разбавленным в соотношении 1:1000 в PBS, содержащем 1% FCS. После пятикратного промывания в PBS стекла инкубировали в темноте при 37°С в течение 30 мин с вторичным антителом против мыши Alexa-555, разбавленным в соотношении 1:1000 в PBS (Molecular Probes; Германия).
Обнаружение клеток в более позднее время после инфицирования ORFV осуществляли путем применения ORFV-специфической антисыворотки кролика PAS2274, предоставленной Dr. Rudiger Raue (Pfizer, Великобритания). Сыворотку разбавляли в соотношении 1:100 в PBS 1% FCS и вторичное антитело, Alexa-488 против кролика, использовали разведенным в соотношении 1:1000.
Окрашивание на актин выполняли с использованием Phalloidin-647 согласно инструкциям производителя (Biotium; Германия) с последующим окрашиванием ядра 0,04 мкг/мл DAPI (4',6-диамидин-2'-фенилиндолдигидрохлорид; Roche Molecular Biochemicals; Германия) в течение 20-30 мин при комнатной температуре в темноте. После тщательного промывания в PBS стекла помещали в Mowiol-DABCO и выполняли флуоресцентную визуализацию при помощи Zeiss ApoTome с использованием программы Axiovision.
Результаты четко продемонстрировали сильную экспрессию G-белка бешенства на раннем (4 ч после инфицирования), а также позднем (24 ч после инфицирования) этапе после инфицирования D1701-V-RabG. Клетки, инфицированные на позднем этапе, могут дополнительно распознаваться путем специфического окрашивания антисывороткой PAS2274. Кроме того, флуоресцентное окрашивание обеспечивало свидетельство поверхностной экспрессии G-белка. Специфичность окрашивания испытывали путем применения неинфицированных клеток.
Обнаружение G-белка при помощи вестерн-блоттинга
5
2
Клетки Vero (3×10 клеток) одновременно инфицировали MOI 1,0 и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО. В различные моменты времени после инфицирования клетки плюс супернатант собирали, центрифугировали (8900×g, 10 мин, 4°С) и осадок клеток трижды промывали 1,0 мл PBS и ресуспендировали в 0,15 мл PBS, содержащем 1% (объем/объем) Triton X-100. После 30 мин на льду лизат центрифугировали в течение 15 мин при 15000×g, 4°С и супернатант сохраняли для SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле). Для этого 3 части лизата смешивали с одной частью 4Х загрузочного белкового буфера DualColor (Fermentas; Германия), кипятили в течение 5 мин, обрабатывали ультразвуком и приблизительно 10 мкг белка выделяли при помощи SDS-PAGE с использованием 8% ((масса/объем)) геля ProSieve50 с подвижным буфером Tris-Tricine-SDS согласно рекомендациям (FMC Bioproducts, Biozym; Германия). Prestained Protein Ladder (Fermentas; Германия) использовали в качестве маркеров молекулярной массы. После электрофореза белки переносили на мембрану из PVDF согласно указаниям производителя (Pierce, Thermo Fisher Scientific; Германия). После блокирования мембраны в 3Х Rotiblock (Roth; Германия) в течение 3 часов при комнатной температуре использовали антипептидную антисыворотку кролика, специфическую к С-концу G-белка вируса бешенства (предоставленную Dr.K.-K.Conzelmann, Max-von-Pettenkofer Institute; Munich, Германия), в соотношении 1:10000, разбавленную в 1X RotiBlock. После суточной инкубации при 4°С мембрану тщательно промывали 5 раз в TBS-Т (Tris-буферный солевой раствор с 0,05% объем/объем Tween-20) и инкубировали со связанным с пероксидазой антителом против кролика (1:20000; Jackson-ImmunoRes., Dianova; Германия) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания TBS-T использовали ECL субстрат согласно рекомендациям (Immobilon Western, Millipore; Германия). Прореагировавшие белки обнаруживали путем применения рентгеновской пленки для обнаружения хемилюминесценции (CL-XPosure, Pierce, Thermo Fisher Scientific; Германия).
Экспрессию G-белка вируса бешенства ожидаемой молекулярной массы (58-60 кДа) подтверждали в разные моменты времени после инфицирования.
Пример 3
Стимулирование специфического иммунного ответа после иммунизации мышей D1701-V-RabG
Зависящая от дозы индукция сывороточных антител против G-белка
G-белок может рассматриваться как наиболее важный антиген для защитного иммунного ответа, и количество индуцированных нейтрализующих вирус сывороточных антител (SNT) может коррелировать с провоцирующей инфекцией для защиты от вируса бешенства. Согласно OIE (Всемирной ветеринарной организации) и WHO (Всемирной организации здравоохранения) присутствие титров антител от 0,5 до 1,0 МЕ/мл (международных единиц) SNT и выше считается обеспечивающим защиту. Таким образом, индукцию специфических к G-белку антител SNT определяли с 1-го по 14-й дни после первичной иммунизации мышей с использованием D 1701-V-RabG.
5
6
2
2
Мышей C57/BL6 в возрасте 6-8 недель (n=6 или 7 на группу), выведенных в FLI (Friedrich-Loeffler-Institute, Federal Research Institute of Animal Health, Institute of Immunology; Tuebingen, Германия), внутримышечно иммунизировали 0,1 мл указанных PFU (колониеобразующих единиц) D1701-V-RabG (0,05 мл на бедро каждой задней лапы). Отдельные образцы сыворотки брали ежедневно и использовали для определения SNT при анализе быстрого ингибирования фокусов флюоресценции (RFFIT) согласно описанию (см. Публикацию OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies, которую также можно найти на следующем веб-сайте: www.oie.mt/fr/normes/mmanual/A_00044.htm; Cox, J.H. и L.G.Schneider, 1976, J. Clin. Microbiol. 3, 96-101.) То есть приготавливали последовательные 5-кратные разведения сыворотки в среде RPMI и 0,05 мл каждого разбавленного образца смешивали (в двух экземплярах) в лунках 96-луночного планшета, вместе с 0,05 мл вируса бешенства, штамм CVS 11 (партия №47, 1,7×10 PFU/мл). После 90 мин инкубации при 37°С и 5% СО в каждую лунку добавляли 0,1 мл суспензии клеток ВНК21 (1×10клеток/мл), смешивали и инкубировали в течение 24 часов при 37°С в 5% СО. После промывания лунки планшетов с культурой PBS и предварительно охлажденным 80% (объем/объем) ацетоном клетки фиксировали в свежем 80% (объем/объем) ацетоне в течение дополнительных 30 мин при 4°С. После удаления ацетона и высушивания на воздухе добавляли 0,05 мл моноклонального глобулина против кролика FITC (Centocor; США) в течение 30 мин при 37°С для окрашивания инфицированных вирусом бешенства клеток. После двукратного промывания PBS и однократного промывания водой высокой степени очистки вирусную инфекцию наблюдали при помощи флуоресцентной микроскопии. Разбавления сыворотки, которые снижали количество инфицированных клеток до 50%, считывались как позитивные. Титры сывороток выражались в МЕ/мл и сравнивались с позитивной контрольной сывороткой согласно WHO.
4
6
7
7
Фигура 2 демонстрирует развитие SNT после однократной внутримышечной иммунизации мышей указанными PFU рекомбинантного вируса D1701-V-RabG. Сыворотки испытывали в указанные дни (d) после иммунизации FFIT. Как можно увидеть на Фиг.2(D), даже низкая доза (10PFU) иммунизации к 8-му дню в результате приводила к среднему показателю SNT 5,5 МЕ/мл, который до 14-го дня после иммунизации повышался до приблизительно 13 МЕ/мл. При использовании 10 или 10PFU для иммунизации (Фиг.2А и 2В) на одну неделю позже достигали среднего показателя SNT приблизительно 10-20 МЕ/мл соответственно, который возрастал до приблизительно 50 МЕ/мл через 14 дней после примирования. При использовании 10 PFU D1701-V-RabG на 4-й день после иммунизации обнаруживали титры антител иммунной сыворотки (0,6-3,0 МЕ/мл), чего не наблюдалось при использовании более низких испытываемых доз иммунизации (Фиг.2).
6
7
6
7
Еще один эксперимент на мышах (данные не показаны) продемонстрировал, что бустер-иммунизация с применением 10 или 10 PFU рекомбинантного вируса ведет лишь к незначительному увеличению SNT через 14 дней после первичной иммунизации (с применением 10 или 10PFU).
В целом эти результаты демонстрируют успешную стимуляцию титров антител защитных SNT в течение первой недели после иммунизации мышей различными дозами D1701-V-RabG.
Пример 4
Защитный иммунный ответ у мышей, опосредованный D1701-V-RabG
5
Оценку защитной способности D1701-V-RabG выполняли путем провоцирующей инфекции разных иммунизированных мышей (C57/BL6) согласно рекомендациям OIE (см. публикацию Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies, которую также можно найти на веб-сайте www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm.). В возрасте 6-8 недель мышей (n=11 или 12 на группу) иммунизировали указанным PFU D1701-V-RabG, как описано выше. Неиммунизированные контрольные мыши (п=15) получали инъекцию PBS. Через три недели после иммунизации всем животным интракраниально вводили провоцирующую дозу вирулентного штамма вируса бешенства CVS (0,03 мл с содержанием 4,8×10 PFU). Животных наблюдали ежедневно до 21 дня после провоцирующей инфекции. Умирающих животных, страдающих от тяжелых нейрональных симптомов, подвергали эвтаназии.
7
6
5
4
Как показано на Фиг.3, одноразовая внутримышечная иммунизация с применением 10 PFU D1701-V-RabG полностью защищает мышей (11/11) от высокой дозы интракраниально введенного провоцирующего вируса. Одно иммунизированное животное из этой группы умерло на 12-й день, но не по причине провоцирующей инфекции вируса бешенства. Таким образом, это животное было исключено из анализа данных. Применение одной дозы, содержащей в 10 раз меньшее количество (10 PFU) D1701-V-RabG, все же позволяло достигать 73% защиты (8/11 выживших). Дальнейшее снижение иммунизирующей дозы снижало показатель защиты до 58% (10 PFU; 7/12) или до 27% (10 PFU; 3/11), в то время, как все контрольные иммунизированные мыши (n=15) погибли в течение 6-9 дней после провоцирующей инфекции (Фиг.3).
Пример 5
Роль Т-клеток в защитном иммунитете
7
В следующих экспериментах исследовали вклад Т-клеток (CD4-, CD8-или CD4/8-позитивные клетки) в стимулировании защитного иммунитета рекомбинантным D1701-V-RabG у мышей. Как показано на Фигуре 5А, непосредственно перед и после дня 0 иммунизации с применением 10 PFU D1701-V-RabG (то есть в дни -1, 0, +1 и +5) антисыворотки, специфические к CD4- или CD8-Т-клеткам, внутрибрюшинно вводили группам мышей (количество (n) животных показано на Фигуре) для удаления каждой популяции Т-клеток in vivo.
Затем на 15-й день все животные интрацеребрально получали провоцирующую дозу 500 LD5o вирулентного штамма RV CVS.
Как показано на Фигуре 5А, животные с удаленными CD4-позитивными Т-клетками, как правило, были не защищены, о чем можно судить по подобному ответу у неиммунизированных контрольных животных.
Как показано на Фигуре 5 В, группы животных иммунизировали в день 0 с применением D1701-V-RabG, а затем in vivo удаляли CD4- и/или CD8-T-клетки непосредственно перед и после 15-го дня подвергались провоцирующей инфекции вирулентным штаммом RV CVS, то есть на 13 (за 2 дня до провоцирующей инфекции), 15, 19 и 23-й дни. Результаты демонстрируют, что после успешного примирования иммунного ответа против вируса бешенства с применением D1701-V-RabG удаление Т-клеток через 14 дней не имело отрицательного влияния на защиту, поскольку 75-90 процентов животных, у которых in vivo были удалены популяции Т-клеток, выжили после провоцирующей прививки.
Таким образом, результаты показывают, что CD4-позитивные Т-клетки (наиболее вероятно, Т-хелперные клетки, необходимые для выработки антитела против G-белка) являются основным определителем защитного иммунитета, вызванного рекомбинантным D1701-V-RabG.
Пример 6
Постконтактная вакцинация
7
6
Эффективность рекомбинантного D1701-V-RabG для терапевтической вакцинации испытывали на мышах. Для этого группы животных внутримышечно (i.m.) вакцинировали с введением 10 PFU D1701-V-RabG в дни 0, 1 и 4. Мыши получали провоцирующую дозу 1×10 PFU вирулентного штамма RV CVS в день 0. Как показано на Фигуре 6, все мыши в иммунизированной группе, кроме одной, были защищены от бешенства.
Дополнительные эксперименты проводили на мышах для испытания различных режимов постконтактной иммунизации после вирулентного штамма RV CVS. На Фигуре 7 серые квадраты указывают дни, в которые мышей вакцинировали D1701-V-RabG. Результаты (выжившие) показаны на Фигуре.
Результаты демонстрируют эффективность D1701-V-RabG для терапевтической вакцинации мышей. Как показано на Фигуре 7, посредством двойной вакцинации, осуществленной в день провокации и на следующий день, обеспечивалась 80% защита, и как минимум 60% животных были защищены 4 ежедневными иммунизациями, начиная с 3-го дня после провоцирующей инфекции периферическим RV.
Пример 7
Иммунный ответ, вызываемый различными путями иммунизации
6
Мышей иммунизировали 1×10 PFU D1701-V-RabG следующими путями введения: интравагинально (i.vag.), путем скарификации, внутрибрюшинно (i.p.), внутрикожно (i.d.), интраназально (i.n.), подкожно (s.c.), внутримышечно (i.m.) и внутривенно (i.v.). Вызванный ответ на сывороточное антитело (определяемый как нейтрализующие антитела сыворотки или SNT) через 6 дней (серые полосы) и 13 дней (черные полосы) после иммунизации показывается на Фигуре 8. Через четырнадцать дней после иммунизации животные интрацеребрально получали инфекцию 100 LD5o вирулентного штамма RV CVS и рассчитывали процент выживших.
Результаты показывают, что самые высокие титры SNT (указываемые в ME на мл) были вызваны i.v., i.p. и i.m. вакцинацией, что также в результате обеспечивало наилучшие показатели защиты 86%, 100% и 78% соответственно.