Актуальные вопросы эпидемиологии и лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного L-формой возбудителя

Актуальные вопросы эпидемиологии и лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного L-формой возбудителя*

Л.М. Михайлов1, А.И. Калиновский1, С.В. Балахонов1, Н.Л. Баранникова1,

Н.М. Андреевская1, В.А. Михайлова1, М.Ю. Шестопалов1, О.Г. Татарникова1,

В.И. Кузнецов1, В.А. Борисов2, В.Г. Ощепков3, Л.Н. Гордиенко3, Е.В. Куликова3

1 ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора

2 Иркутская областная клиническая инфекционная больница

3 ГНУ «Всероссийский НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук», г. Омск

Резюме

Предложены усовершенствованные методы лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме, с использованием специальных питательных сред, диагностических сывороток к бруцеллам в L-форме, L-корпускулярных и растворимых антигенов атипичных бру-целл, а также ПЦР.

Приведены результаты лабораторных исследований, свидетельствующие о возможности получения дополнительной информации при постановке диагноза в неманифестных очагах бруцеллеза, обусловленных возбудителем инфекции в L-форме, для более объективной оценки уровня инфици-рованности декретированных групп населения и активного выявления больных бруцеллезом людей при диспансеризации, а также сельскохозяйственных животных - основного источника инфекции.

Ключевые слова: бруцеллез, L-форма, лабораторная диагностика

Actual Issues of Epidemiology and Laboratory Diagnosis of Brucellosis Caused by L-forms of the Parasite

L.M. Mikhailov1, A.I. Kalinovski1, S.V. Balahonov1, N.L. Barannikova1, N.M. Andreevskaya1, V.A. Mikhailova1, M.Yu. Shestopalov1,

O.G. Tatarnikova1, V.I. Kuznecov1, V.A. Borisov2, V.G. Oschepkov3,

L.N. Gordienko3, E.V. Kulikova3

1 Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East

2 Regional Clinical Hospital of Infectious Diseases of Irkutsk

3 State Scientific Institution All-Russian Scientific Research Institute of Brucellosis and Tuberculosis Animals, Siberian Branch of Russian Academy of Agricultural Sciences

Abstraet

Proposed improved methods of laboratory diagnosis of brucellosis caused by the agent in the L-form with the use of special culture media, diagnostic sera to Brucella in the L-form, L-corpuscular and soluble antigens of atypical Brucella, PCR. Results of laboratory studies, indicating the possibility of obtaining additional information when making a diagnosis in nonclinical foci of brucellosis caused by infectious agents in the L-form for a more objective assessment of the level of infection risk groups and active identification of patients with brucellosis in people with clinical examinations, as well as livestock -the main source of infection.

Key words: brucellosis, L-form, laboratory diagnosis

Введение

Современные представления о L-трансформации многих видов бактерий как одной из фаз развития микробной популяции [6, 7, 17, 19] правомерны и для возбудителя бруцеллеза [8], что может иметь важное значение в патогенезе этой инфекции и формировании скрытых очагов бруцеллеза в связи с невозможностью лабораторной диагностики стандартными методами. Комитет экспертов

ФАО (Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН)/ВОЗ по бруцеллезу на одном из последних заседаний отметил значительную опасность этой инфекции для населения многих стран и обратил особое внимание на возможность пер-систенции бруцелл с образованием диссоциированных атипичных R- и L-форм возбудителя [24]. Бруцеллы в L-форме могут быть одной из причин рецидивирующего хронического течения заболева-

* Докладывалось на Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней» (к 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о природной очаговости болезней), ноябрь 2009 г., Омск.

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

ния, создавая труднопрогнозируемые эпидемиологические ситуации вследствие формирования неманифестных очагов бруцеллеза с длительной персистенцией возбудителя в L-форме у сельскохозяйственных животных [22]. Атипичный бруцеллез, обусловленный L-формой бруцелл, сложно диагностировать общепринятыми лабораторными методами, особенно бактериологическим - основным применяемым и при эпидемиологической диагностике.

Расширение возможностей лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме, позволит получать дополнительную информацию при постановке диагноза у больных и выявлять возможность существования неманифестных очагов бруцеллеза. Изучение эпизоотолого-эпидемиологических проявлений этого зооноза с более объективной оценкой уровня инфицирован-ности людей и животных, определение границ очага инфекции, проведение диспансеризации декретированных групп населения, лечебных, противоэпидемических и профилактических мероприятий остаются актуальными до настоящего времени.

Цель работы - совершенствование методов лабораторной диагностики атипичного бруцеллеза у больных людей и животных для выявления скрытых очагов инфекции, обусловленных возбудителем в L-форме.

Материалы и методы

В экспериментальной работе использованы штаммы бруцелл коровьего вида в S- и L-формах из коллекции музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (НИПЧИ), корпускулярные и растворимые антигены, приготовленные из этих штаммов, а также корпускулярные антигены из бруцелл в L-форме и штаммы бруцелл, выделенные от северных оленей во Всероссийском НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук (ВНИИБТЖ). Эксперименты проводились на подопытных животных из питомника НИПЧИ.

С диагностической целью исследованы сыворотки крови больных людей из Иркутской областной клинической инфекционной больницы и собранные с отдельных территорий Иркутской области, Республики Бурятия и Монголии с различной эпидемиологической ситуацией по бруцеллезу. При определении сроков первоначального появления антител к бруцеллам в L-форме анализированы истории болезни пациентов Иркутской областной клинической инфекционной больницы. ПЦР выполняли, как описано нами ранее, а также в соответствии с тест-системой для выявления ДНК Brucella sрр. методом полимеразной цепной реакции ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» согласно инструкции изготовителя [15]. Для приготовления питательных сред использовали печень крупного рогатого скота

и рыбный гидролизат из байкальской сороги с добавками. Ингибитором роста бруцелл в S-форме служили бициллин-3 и налидиксовая кислота. Серологические реакции: Хедльсона (РХ), Райта (РА), Кумбса (РК), пассивной гемагглютинации (РПГА), кольцепреципитации (РКП) и иммунофлюоресценции (РИФ) - проводили в соответствии с Методическими указаниями [18].

Все манипуляции с патогенными микроорганизмами осуществляли с соблюдением мер безопасности [5]. Интенсивность роста бруцелл на питательных средах оценивали в крестах: сплошной рост - четыре креста, более 30 КОЕ - три, от 10 до 30 КОЕ - два, до 10 КОЕ - один крест.

Для экспериментальных целей при изучении свойств L-форм бруцелл ранее использовались разные питательные среды и культуры тканей [1 - 4, 13, 20, 23, 25, 26]. В настоящее время для выделения бруцелл в L-форме рекомендуются питательные среды на основе печеночного настоя или смеси мясной воды и пептона Мартена [18]. Эти среды не являются коммерческими, их приготовление требует выполнения сложных технологических операций в достаточно оборудованных производственных условиях. Кроме того, по нашим данным, на этих средах в отдельных случаях регистрируется рост колоний в типичной S-форме возбудителя, что свидетельствует о недостаточном ингибировании бруцелл в S-форме, значительно снижая эффективность бактериологического метода диагностики атипичного бруцеллеза и выявления скрытых очагов инфекции.

Разработанные в НИПЧИ питательные среды для выделения и накопления бруцелл в L-форме [10] могут производиться в нативном и, что очень важно, в сухом виде, значительно расширяя возможности их использования. Нами приготовлено и испытано более десяти вариантов сред на основе печеночного настоя и триптического гидролизата рыбы (среда М). Из них две плотные и одна полужидкая отобраны для дальнейшей работы, которые содержат агар-агар, стимуляторы роста, осмотические стабилизаторы, источники энергии, витамины, ингибиторы роста бруцелл в S-форме. При испытании этих сред рост бруцелл в L-форме составил 30 - 33% КОЕ с полным подавлением роста бруцелл в S-форме, что свидетельствует об их высокой чувствительности и элективности.

Апробация сконструированных питательных сред проведена при экспериментальном бруцеллезе у 60 морских свинок, зараженных бруцелла-ми S-, L- и смесью S-, L-форм при использовании трех доз заражения: 1 х 109, 2 х 1010 и 4 х 1010 м.к. Хлороформированных животных вскрывали на 1-е, 2-е, 7-е, 14-е и 30-е сутки. Бруцеллы в L-форме изолированы в первые две недели после заражения, рост на испытуемых средах появился на 5 - 13-е сутки инкубации посевов при 37 °С. При заражении S- или совокупно S- и L-формами бруцеллы в S-форме выделены через 30 суток при дозе зара-

жения 1 х 109 м.к. только на контрольном коммерческом эритрит-агаре.

Результаты и обсуждение

Интенсивность и скорость роста бруцелл на разработанных сухих питательных средах для их выделения в L-форме проводили в ВНИИБТЖ с использованием 24 экспериментальных L-трансформантов и 89 штаммов в S- и L-формах, изолированных от северных оленей - основного источника инфекции в очагах бруцеллеза на Крайнем Севере. Все экспериментальные L-трансформанты выросли че-

рез 24 часа на обеих плотных питательных средах с разной интенсивностью, более выраженной на среде М. На печеночной среде более интенсивный рост L-трансформантов наблюдался через 72 часа инкубации (рис. 1).

Культуры бруцелл от северных оленей в L-форме интенсивнее росли также на среде М (рис. 2).

С использованием разработанных сред получено бактериологическое подтверждение хронического рецидивирующего бруцеллеза у двух больных людей с выделением гемокультур бруцелл в L-форме, идентифицированных в ПЦР. Изоляты

Рисунок 1.

Ростовые свойства сконструированных питательных сред для выделения бруцелл в L-форме с использованием 24 экспериментальных L-трансформантов бруцелл

Рисунок 2.

Ростовые свойства сконструированных питательных сред для выделения бруцелл в L-форме с использованием 89 штаммов, выделенных от северных оленей

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

по культурально-морфологическим, тинкториаль-ным свойствам, результатам фазово-контрастного микроскопирования и серологического исследования с экспериментальными бруцеллезными L-сыворотками, а также по отсутствию реверсии в S-форму отнесены к бруцеллам в стабильной L-форме. Индекс инфицированности находился в пределах 2 - 18, что свидетельствует об ослабленной вирулентности бруцелл и, вероятно, определяет их длительную персистенцию (в комплексе с другими факторами) в организме больных, являющуюся одной из причин хронического течения бруцеллеза.

На предлагаемых нами питательных средах рост бруцелл в L-форме обычно появлялся на 3 - 14-е сутки при 37 °С, возможно замедление роста до 18 - 20 суток, что влияло на учет результатов.

Вероятность выделения бруцелл в L-форме значительно увеличивается в периоды обострения болезни. Кровь засевали на плотные и полужидкие питательные среды для выделения и накопления бруцелл в L-форме и заражали биопробных животных. Результативность выделения гемокультур бруцелл в L-форме невысока. Нами показано, что наиболее эффективными сроками для выделения L-форм бруцелл от биопробных животных являются 7 - 14-е сутки после заражения. На плотных питательных средах бруцеллы в L-форме формируют мелкие колонии - диаметром 0,5 - 2 мм и крупные - до 5 мм - круглые, янтарно-желтого цвета в проходящем свете и серо-голубоватого - в падающем, возможно формирование более темного центра («яичница»). Первые генерации возбудителя могут давать скудный рост в виде нежного налета беловато-сероватого в падающем и янтарно-желтого цвета - в проходящем свете. Колонии часто врастают в агаровую пластинку, имеют крошковатую или тянущуюся консистенцию, плохо снимаются петлей. Добавление в сухую основу питательной среды на основе печеночного настоя кристаллического фиолетового придает колониям синеватый цвет. На полужидкой питательной среде бруцеллы в L-форме формируют в толще среды колонии в виде беловатых крупинок, со временем увеличивающиеся в размере.

Световая и фазово-контрастная микроскопия нативных препаратов бруцелл в L-форме характеризуется их выраженным полиморфизмом. Сфе-ропласты могут окрашиваться по Козловскому в красный, темно-бордовый, по Граму - в фиолетовый, сиреневый или красный цвет. Исследователи выделяют от 7 до 15 различных фенотипов L-форм бруцелл [14, 21]. По нашим данным, их морфология разнообразна: на начальных этапах L-трансформации наблюдается слипание клеток с образованием конгломератов, появление увеличенных изогнутых палочек, клеток раздутых и неправильной формы, а также сферических, в которых более плотные участки выглядят в виде полу-

колец или колец с просветлением в центре. Клетки часто располагаются цепочками. На поздних этапах в поле зрения много клеток увеличенных, палочковидных и овоидных, в виде темных полуколец или запятых, колец и овалов, нитевидных форм. Спор и капсул не образуется, что отмечено нами ранее [9].

Из 114 культур бруцелл, выделенных от северных оленей, в РА с поливалентной бруцеллезной S-сывороткой прореагировало 27% культур, с сыворотками против разных штаммов бруцелл в L-форме положительные реакции зарегистрированы в 17 - 91,2% случаев.

Культуры бруцелл в L-форме в пластинчатой и объемной РА со специфической L-сывороткой формируют мелкозернистый, крупнозернистый или тяжистый агглютинат, с S-антисывороткой - результат отрицательный, в отдельных случаях - слабоположительный. Особенностью агглютината L-форм в отличие от S-форм бруцелл является то, что он легко разбивается при встряхивании. L-культуры, выделенные от людей, агглютинируются только L-бруцеллезной антисывороткой. С родоспецифическими праймерами в ПЦР бруцеллы в L-форме формировали специфический амплификон, выявляемый при гель-электрофорезе.

Результаты ПЦР-тестирования экспериментальных L-трансформантов штаммов от северных оленей, а также изолированных от больных людей были неоднозначны, что определяет необходимость более глубокого изучения свойств бруцелл в L-форме, длительно персистирующих в организме животных и человека. Использование РИФ возможно для индикации бруцелл в L-форме, при этом специфическое свечение с L-антисывороткой оценивается в три-четыре креста с отсутствием или слабым свечением с S-антисывороткой. Получен положительный опыт конструирования бруцеллезного эритроцитар-ного антигенного диагностикума, выявляющего гемагглютинины к L-формам бруцелл в гиперим-мунных сыворотках до разведения 1:12 800, в сыворотках крови больных людей до 1:1600, в РКП с использованием водорастворимого препарата из бруцелл в L-форме обнаруживали пре-ципитирующие антитела в 4,7% случаев.

С целью получения ревертантов в S-форме проведены пассажи бруцелл в L-форме на плотных питательных средах без трансформирующих агентов и через организм морских свинок. При этом пассирование бруцелл в стабильной L-форме не дало положительных результатов, но зарегистрирована реверсия L-форм на начальных стадиях трансформации, отмеченная ранее [11].

Сравнительное изучение результативности отдельных серологических реакций (рис. 3) показало, что из 108 больных людей с установленным диагнозом «бруцеллез» положительный результат с S-антигеном отмечен в 100% случаев, из них в РХ -у 92 (85,2%) больных, в РА - у 21 (19,4%), в РПГА -у 72 (66,7%), в РК - у 74 (68,5%). С L-антигеном

Рисунок 3.

Результаты серологических реакций на бруцеллез у больных людей с использованием S- и L-диагностикумов

100

00

_0

К

О

0

1

00

80

60

«о 40 .Ú

со

£ 20

< О. X О. РПГА Р Кумбса 2 X Р Р Кумбса

Результативность тестов Результативность

тестов с L-диагностикумом

0

выявлено 47 (43,5%) инфицированных: в РХ - 4 (3,7%), в РА - 10 (9,3%), в РК - 45 (41,7%).

В 40 сыворотках людей с подозрением на бруцеллез позитивных результатов с S-антигеном не обнаружено, в то же время с L-антигеном выявлено четверо больных с положительными реакциями на бруцеллез, вызванный атипичным возбудителем. Это подтверждает целесообразность его применения для диагностики бруцеллеза, обусловленного L-формами возбудителя.

Оценка уровня инфицированности декретированной группы населения на территории с неясной эпизоотолого-эпидемиологической обстановкой по бруцеллезу свидетельствует о том, что из 205 обследованных у 37 (18,1%) человек зарегистрированы положительные результаты с S-диагностикумом.

При этом количество положительно реагирующих по отдельным тестам составило: в РХ - 18 (8,8%), в РА - 3 (1,5%), в РПГА - 14 (6,6%) и РК - 24 (11,7%). С L-антигеном позитивные результаты получены только в РХ дополнительно в 5 (2,4%) случаях. При исследовании 60 проб сывороток крови с территории, официально свободной от бруцеллеза, положительные реакции отмечены у 7 человек только в РХ, из них с S-антигеном - у 4 (6,6%), с L-антигеном - у 3 (5%).

У 12 больных установлен период первоначального появления L-антител в крови после официально установленного диагноза «бруцеллез», из них у 2 (16,7%) этот период длился до 10 лет, у 8 (66,6%) - 11 - 20 лет, а у 2 (16,7%) - от 21 года до 30 лет (рис. 4).

Рисунок 4.

Временные периоды первичного появления L-антител в крови больных бруцеллезом людей от момента постановки диагноза

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010

Сконструированные питательные среды для выделения и накопления бруцелл в L-форме обладают рядом преимуществ перед рекомендованными к применению ранее [18], которые заключаются в более высоких технологичности при производстве, чувствительности и элективности, возможности выпуска в сухом виде, с более длительным сроком хранения, чем нативные среды, удобством при работе, особенно в полевых условиях.

С использованием разработанных сред выделены возбудители бруцеллеза в L-форме после длительной персистенции у больных с хронической формой бруцеллеза, что отмечено нами ранее [12]. Установлено, что при выделении бру-целл в L-форме биологическим методом посевы органов биопробных животных целесообразно проводить на 7 - 14-е сутки после заражения, что согласуется с результатами других исследователей [16].

Приведенные данные о культурально-морфологических признаках, полученные при микроскопии, с выраженным полиморфизмом бруцелл, трансформированных в L-форму, согласуются с данными других авторов [14, 21].

С помощью диагностических сывороток против бруцелл в L-форме показана возможность ускоренной идентификации культур, выделенных от животных.

Результаты ПЦР-тестирования свидетельствуют о целесообразности использования этого метода для ускоренной идентификации штаммов, изолированных от больных людей, от животных и при исследовательской работе с экспериментальными L-трансформантами, что позволет рекомендовать его в комплексе стандартных идентификационных методов.

Необходимо более глубокое изучение свойств бруцелл в L-форме из-за неоднозначных результатов в ПЦР штаммов в L-форме, изолированных от разных носителей.

Сравнительная результативность комплекса серологических реакций: РХ, РА, РПГА, РК

с S- и L-корпускулярными антигенами - показала их неоднозначность при определении специфических антител против бруцелл в S- и L-формах в крови больных и при мониторинге на территориях с различной эпидемиологической обстановкой по бруцеллезу.

Впервые у 12 больных хроническим бруцеллезом установлен период первоначального появления антител к бруцеллам в L-форме, который от момента установления диагноза составил до 10 и свыше 20 лет - по 16,7%, от 11 до 20 лет - 66,6%, это свидетельствует о том, что в большинстве случаев трансформация возбудителя инфекции из типичной в L-форму происходит после 10 лет заболевания, обусловливая целесообразность использования в этот период дополнительно в комплексе лабораторных методов диагностикумов на основе L-антигенов бруцелл.

Выводы

У больных хроническим бруцеллезом людей может происходить трансформация типичных S-бруцелл в L-форму с длительной персистенцией их в организме больного.

Рекомендованные нами специальные питательные среды позволяют более эффективно выделять культуры бруцелл в L-форме от больных людей и животных.

Лабораторная диагностика бруцеллеза с помощью комплекса серологических реакций с использованием бруцеллезных L-диагностикумов дает дополнительную информацию об инфицированности декретированных групп населения на территориях с различной эпизоотолого-эпидемиологической ситуацией по бруцеллезу.

ПЦР и диагностические сыворотки против бру-целл в L-форме при ускоренной идентификации L-культур необходимы для определения окончательного диагноза, своевременного выявления неманифестных очагов бруцеллеза и проведения противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий. Ш

Литература

8.

1. Базиков И.А. Получение и характеристика L-форм бруцелл и их ревер-

тантов: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1990. - 16 с. 9.

2. Базиков И.А. Морфологическая характеристика L-форм рода Бруцел-

ла, полученных при их стабилизации // Особо опасные инфекции на Кавказе: Тез. докл. к 6-й Краевой науч. конф., посвящ. 70-летию Вели- 10.

кой Октябрьской социалистической революции. - Ставрополь, 1987.

С. 215, 216.

3. Базиков И.А., Таран И.Ф. Получение и сравнительная характеристика

L-форм бруцелл и их ревертантов / Актуальные вопросы профилак- 11

тики бруцеллеза и организация медицинской помощи больным: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - М., 1989. С. 61 - 63. 12.

4. Барабанова Е.Б. Изучение метода лазерной спектроскопии в целях использования индикации L-форм бруцелл: Автореф. дис. ... канд. вет.

наук. - Омск, 1996. - 17 с. 13.

5. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности): Санитарные правила. СП 1.3.1285-03. - М.,

2003. - 85 с. 14.

6. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Н.М. и др. Механизмы выживания бактерий. - М.: Медицина, 2005. - 367 с.

7. Елисеева И.В., Бабич Е.М., Волянский Ю.Л. и др. О роли латентных 15.

трудно культивируемых и некультивируемых персистентных бактерий

в патологии человека // Анали Мечниковського 1нституту (Харьков). 2006. № 1. С. 12 - 45.

Зыкин Л.Ф., Васильев Д.А. L-формы возбудителей зооантропоно-зов. - Ульяновск, 2000. - 68 с.

Калиновский А.И., Михайлов Л.М., Андреевская Н.М. и др. Получение и характеристика бруцелл в L-форме // Бюл. Восточно-Сибирского НЦ СО РАМН. 2004. Т 2. № 1. С. 84 - 88.

Кузнецов В.И., Татарникова О.Г., Маевский М.П. и др. Приготовление питательных основ для микробиологических целей из речной рыбы / Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока, Крайнего Севера. - Новосибирск, 2006. - 292 с.

Методы индикации и идентификации L-форм бруцелл: Методические рекомендации. - Омск, 2005. - 19 с.

Михайлов Л.М, Калиновский А.И., Балахонов С.В. Персистенция L-форм бруцелл у человека с хронической формой бруцеллеза // Микробиология. 2009. № 5 (1). С. 114, 115.

Ощепков В.Г., Копейкин И.Г., Степанов Е.М. и др. L-трансформация

B. ovis на искусственных питательных средах и в организме овец // Сб. науч. тр. ОМСХИ. - Омск, 1986. С. 21 - 28.

Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., Шварева А.Ю. и др. Морфо- и сероварианты L-форм В. abortus начального этапа трансформации и их биологические свойства // Сб. науч. трудов ВНИИБТЖ. - Омск, 2000. С. 257 - 270. Балахонов С.В., Шестопалов М.Ю., Калиновский А.И. Оптимизация детекции бруцелл с помощью полимеразной цепной реакции // Мо-лекуляр. генетика, микробиол., вирусол. 1996. № 4. С. 33 - 35.

16. Островская Н.Н., Толмачева Т.А. Вирулентность для морских свинок L-форм бруцелл вида Abortus // Микробиология. 1974. № 6.

С. 146, 147.

17. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий. - М.: Медицина. 1981. - 239 с.

18. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза: Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. - М., 2003. - 38 с.

19. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии. - М.: Медицина, 1973. - 392 с.

20. Толмачева Т.А., Кац Л.Н. Биологические свойства и ультраструктура бруцелл в процессе L-трансформации и реверсии // Микробиология. 1977. № 1. С. 90 - 93.

21. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. - Л.: Колос, 1976. - 279 с.

22. Banai M., Adams L.G., Frey M. et al. The myth of Brucella L-forms and possible involvement of Brucella penicillin binding proteins (PBPs) in pathogenicity // Vet. Microbiol. 2002. V. 90. № 1 - 4. P. 263 - 279.

23. Egwu I.N., Eveland W.C. Cytological change related to Brucella canis variants uptake in vitro // Med. Microbial. Immunol. 1979. V. 167. № 2. P. 107 - 115.

24. Joint FAO/WHO expert committee on Brucellosis sixth report World Health Organisation Technical Report Ceries. - Geneva, 1986. - 133 p.

25. Hatten B.A., Sulkin E.S. Intracellular production of Brucella L-forms. Recovex of L-forms tissue culture cells infected with Brucella // J. Bacteriol. 1966. V. 91. № 1. P. 285 - 296.

26. Nelson E.L., Pickett M.J. The covery of Brucella and their relation to Brucella phage // J. Infect. Disiase. 1951. V. 8. № 3. P 226 - 232.

Метод ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза*

Ю.К. Кулаков, М.М. Желудков (mmzhel.gamaleya@mail.ru),

Т.А. Толмачева, Л.Е. Цирельсон

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

Резюме

Цель работы заключалась в совершенствовании системы идентификации и дифференциации представителей рода Brucella и лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

ПЦР использовали для проведения родовой и видовой идентификации 131 штамма патогенных видов бруцелл разного географического происхождения, идентифицированных традиционными фенотипическими методами. Из шести синтезированных пар праймеров на специфические родовые и видовые последовательности мишеней генов белков (BruAb1_1825, BRA0378, BMEI1661, BruAb2_0168, BruAb1_0266 и

BMEII0827) только одна мишень BruAb2_0168 оказалась строго специфичной к виду B. abortus. Применение в ПЦР праймеров на остальные генные мишени позволяло идентифицировать вид у всех изолятов по наличию специфических продуктов амплификации.

Изучение диагностической эффективности ПЦР в клинических образцах 196 сывороток крови больных с подозрением на бруцеллез подтвердило возможность использования этого метода в качестве дополнительного в лабораторной диагностике бруцеллеза людей.

Ключевые слова: бруцелла, бруцеллез, полимеразная цепная реакция, диагностика

PCR in Laboratory Diagnosis of Brucellosis

Yu.K. Kulakov, M.M. Zheludkhov (mmzhel.gamaleya@mail.ru),

T.A. Tolmacheva, L.E. Cirelson

N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Academy of Medical Sciences, Moscow Abstract

The investigation was aimed at improving tools for identification and differentiation of the genus Brucella and laboratory diagnosis of brucellosis infection using PCR.

PCR was used for the genera, species identification of 131 strains of pathogenic species of Brucella of different geographical origin, identified by traditional phenotypic methods. From the six pairs of primers synthesized on the specific sequence of target genes (BruAb1_1825, BRA0378, BMEI1661, BruAb2_0168, BruAb1_0266 and BMEII0827) only one target BruAb2_0168 was strictly specific to the species B. abortus. Application of PCR-primers for the rest of the target genes allows the species identification of all isolates by the presence of specific amplification products.

Survey on the diagnostic efficiency of PCR with clinical samples of blood sera of 196 patients with suspected brucellosis confirmed the possibility of using it as a supplementary method in the laboratory diagnosis of human brucellosis.

Key words: Brucella, brucellosis, polymerase chain reaction, diagnosis

Введение

Бруцеллез - инфекционное, особо опасное зоонозное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, которое передается от животных к человеку, характеризуется тяжелым и часто хроническим течением [1, 8]. Бруцеллез представляет актуальную проблему для здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется более 500 тыс. впервые выявленных случаев этого заболевания у людей [12], для России данный показатель составляет около 500 случаев. Что

касается хронической формы бруцеллеза, то она не имеет официального учета [2].

Противоэпидемические мероприятия включают определение возбудителя инфекции и источника его распространения. Одним из наиболее информативных показателей является выделение возбудителя заболевания. При выделении культуры микроорганизмов в первую очередь необходимо их идентифицировать и дифференцировать с применением традиционных методов (длительных, трудоемких, дорогостоящих и небезопасных), основан-

* Докладывалось на Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней-(к 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о природной очаговости болезней), ноябрь 2009 г., Омск.

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (51)/2010