Каталитические свойства и стабильность рекомбинантной пероксидазы табака с заменой Ile37Met

УДК 577.15.1

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ТАБАКА С ЗАМЕНОЙ ILE37MET

A.А. Полозников2, Г.С. Захарова2,3, Т.А. Чубарь1,2,3, Д.М. Хушпульян1,2, И.Г. Газарян1,

B.И. Тишков1,2,3

Методом направленного мутагенеза получена мутантная пероксидаза табака (ТОР) с заменой Ile37Met. Данная мутация имитирует пероксидазу сои, в которой остаток Met37 отвечает за повышенную стабильность. Мутантная ТОР Ile37Met экспрессировалась в клетках E. coli BL21(DE3) CodonPlus в виде нерастворимых телец включения. Уровень экспрессии составил более 40% от общего белка клетки. Активный фермент получали с помощью рефолдинга по методике, разработанной для рекомбинантной пероксидазы табака дикого типа. Были исследованы субстратная специфичность, каталитическая активность и термостабильность мутантной ТОР Ile37Met. Показано, что введение данной мутации приводит не к увеличению стабильности фермента, а к снижению его каталитических свойств.

Ключевые слова: пероксидаза табака, мутагенез, рефолдинг, термостабильность.

Список использованнных в статье сокращений: ТОР - табачная пероксидаза; SBP - пероксидаза сои; ИПТГ - изопропилтиогалактозид; ДТТ - дитиотреитол; АБТС - 2,2'-азино-бис-[3-этилбензтиазолин-6-сульфонат].

Пероксидазы (КФ 1.11.1.Х) относятся к ферментам класса оксидоредуктаз. Они катализируют окисление широкого спектра субстратов под действием пероксида водорода. Исследование выделенной в нашей лаборатории пероксидазы табака (ТОР) позволило выявить ряд необычных свойств этого фермента. Наиболее существенное отличие от ранее изученных пероксидаз состояло в значительно большей каталитической активности по отношению к люминолу. Немаловажно, что высокий уровень сигнала достигался без добавления соединений-усилителей хемилюминесценции [1]. Фермент продемонстрировал также большую устойчивость к инактивации пероксидом водорода по сравнению с широко используемой на практике пероксидазой хрена [2]. Эти отличительные свойства пероксидазы табака могут послужить основой при создании биосенсоров для определения концентрации пероксида водорода, являющегося продуктом большого числа биохимических реакций, и для использования данного фермента в качестве метки. В нашей лаборатории было проведено изучение взаимосвязи между структурой и функциями пероксидазы табака.

В ходе исследования ТОР продемонстировала большую операционную стабильность, а также стабильность при хранении в растворе. Кроме того, ТОР проявила стабильность в широком диапазоне рН (например, ТОР способна катализировать реакцию окисления вератрового спирта при значениях рН < 2) [3].

Как известно, пероксидаза сои (SBP) также обладает повышенной стабильностью [4] и высокой активностью при низких значениях pH [5]. Как правило, потеря активности пероксидазами в процессе термоинактивации связана с диссоциацией гема и полипептидной цепи. Но в случае SBP была обнаружена повышенная аффинность к гему. Эксперименты по изучению структуры SBP показали (рис. 1) наличие в активном центре фермента трех остатков метиони-на - Met37, Met279 и Met282 [6]. Остаток Met37 расположен на удалении 3,9 Â от С8-винильной группы гема, поэтому между ними возможно возникновение Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий [7]. При этом у других растительных пероксидаз в положении 37 обычно располагаются аминокислотные остатки Ile, Leu и Val. Было выдвинуто предположение, что остатки Met37, Met279 и Met282 образуют кластер вокруг

Рис. 1. Сравнение трехмерных структур пероксидазы сои (PDB 1FHF; показана серым цветом) и пероксидазы табака (показана черным цветом). В скобках указаны положения аминокислотных остатков для пероксидазы сои

С8-винильной группы гема. р-Орбитали атомов серы находятся в состоянии, допускающем перенос электрона между остатком Met37 и п-катион-радикалом гема в Соединении I. Этим может объясняться высокая устойчивость SBP к потере гема, а следовательно, и большая термостабильность. Еще одним возможным объяснением высокой стабильности SBP является предположение, что окисление Met37 может предохранять каталитически важные остатки активного центра от окисления [6].

У ТОР в положении 37 вместо метионина находится остаток изолейцина. Мы решили провести направленный мутагенез ТОР и изучить, как повлияет замена Ile37Met на стабильность и активность пероксидазы табака. Полученная мутантная форма ТОР Ile37Met была экспрессирована в клетках E. coli, выделена и охарактеризована.

Методы исследования

Мутагенез

Направленный мутагенез осуществляли с помощью набора «Quik-Change» фирмы «Stratagene» (США). В качестве основы использовали плазмиду pTOP2, полученную клонированием кДНК ТОР в плазмиду pET40b [8]. После проведения реакции мутагенеза реакционная смесь была использована для трансформации клеток E. coli TG1. Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой 2 YT (16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л хлорида натрия, рН 7,0), содержащую канами-цин в концентрации 40 мкг/мл, а затем чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день

с чашки брали 4 колонии, ресуспендировали каждую в 4 мл среды 2YT c канамицином (40 мкг/мл) и культви-ровали в течение ночи при 30°С. Полученную биомассу клеток использовали для выделения плазмид. Выделение плазмид проводили с использованием набора для выделения плазмид «Nucleospin Plasmid» фирмы «Machery-Nagel» (Германия). Секвенирование полученных плазмид проводили на автоматическом секве-наторе ДНК «ABI PRISM 3100-Avant». Для экспрессии мутантной ТОР и фермента дикого типа проводили соответствующими плазмидами трансформацию клеток E. coli BL21(DE3)Codon Plus.

Экспрессия

Единичную колонию трансформированных клеток E. coli BL21(DE3) Codon Plus культивировали в

3 мл среды 2YT в присутствии 40 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола в течение ночи при 31°С и 180 об/мин. Затем из этой пробирки отбирали 1 мл культуральной жидкости и помещали в 200 мл той же среды, находящейся в качалочной колбе объемом 1 л. Культивирование проводили при 31°С и 100 об/мин. В начале логарифмической фазы роста клеток проводили индукцию экспрессии добавлением в среду ИПТГ до конечной концентрации 0,2 мМ. Далее температуру снижали до 27°С и культивировали клетки в течение 6

4 (до концентрации клеток 5-7 г/л). Биомассу собирали центрифугированием при 5000 g.

Выделение пероксидазы табака

Осадок клеток ресуспендировали в 2 М растворе NaCl, содержащем 10 мМ ДТТ, и разрушали ультразвуком 3 мин при 22 кГц с последующим 7-минутным охлаждением на льду (процедуру повторяли трое-крат-но). Затем полученный раствор инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Далее проводили центрифугирование (13500 g, 20 мин). Супернатант удаляли, а осадок дважды промывали 50 мМ Трис-HCl (рН 8,5) и солюбилизировали в 6 М растворе мочевины, содержащей 1 мМ ДТТ.

Рефолдинг

Солюбилизированный апобелок (95% чистоты) приливали по каплям к среде для рефолдинга и инкубировали при 4°С. Состав среды для рефолдинга был оптимизирован нами ранее для TOP дикого типа и включал мочевину (1,8 М), окисленный глутатион (0,5 мМ), ДТТ (0,1 мМ), Са02 (1 мМ), гемин (5 мкМ), глицерин (5%) в 50 мМ буфере Трис-НО (рН 9,5). Во время инкубации измеряли каталитическую активность по АБТС. После прекращения роста активности

раствор фермента концентрировали на ячейке Ашюоп через мембрану УМ-10.

Очистка ренатурированного фермента

Препарат фермента после концентрирования наносили порциями по 3 мл на колонку (2,6^90 см) с 8ерЬаегу1 8200, уравновешенным 50 мМ буфером Трис-НС1 (рН 8,5). Фракции, содержащие активный фермент, объединяли и концентрировали. Вторичную очистку проводили на колонке (2,6^60 см) с Тоуореаг1 Н^55, уравновешенным тем же буфером. Фракции, содержащие активный фермент, объединяли и концентрировали. Содержание белка определяли по эмпирической формуле

С (мкг/мл) = 183А230 - 75,8А260,

где А230 и А260 - поглощение при 230 и 260 нм соответственно [9]. Предварительно было подтверждено, что результаты определения концентрации белка по этой методике хорошо коррелируют с результатами определения по методу Лоури и др. [10]. Чистоту полученных препаратов контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по методу ЬаешшН [11].

Определение значения

Значение (ЯетЬе^ЕаЫ) определяли как отношение поглощения при 403 нм к поглощению при 275 нм.

Измерение каталитической активности

Каталитическую активность определяли на основании фотометрической детекции образования окрашенных продуктов реакции. Скорость реакции окисления донорных субстратов при их насыщающей концентрации измеряли при 25°С в приведенных ниже условиях.

АБТС - реакционная смесь содержала 0,36 мМ АБТС и 5 мМ Н202 в 0,1 М Ка-ацетатном (рН 4,5 или 5,0); коэффициент экстинкции продукта окисления АБТС на 405 нм был принят равным 36 800 М-1см-1 [12].

Гваякол - реакционная смесь содержала 2,25 мМ гваякола и 5 мМ Н202 в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,05% СаС12; коэффициент экс-тинкции продукта окисления на 470 нм был принят равным 5 570 М-1см-1[13].

Фенол/4-аминоантипирин - реакционная смесь содержала 10 мМ фенола, 0,1 мМ 4-аминоантипирина и 5 мМ Н202 в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7,0); коэффициент экстинкции продукта окисления на 510 нм был принят равным 6 580 М *см 1 [14].

Ферроцианид - реакционная смесь содержала 0,6 мМ ферроцианида калия и 5 мМ H2O2 в 0,1 М K-фосфатном буфере (pH 7,0); коэффициент экстинкции продукта окисления на 420 нм принят равным 1040 М-1см-1 [15].

о-Дианизидин - реакционная смесь содержала 0,15 мМ о-дианизидина и 5 мМ H2O2 в 0,1 М калий-фосфатном буфере (pH 7,0); коэффициент экстинкции продукта окисления на 460 нм был принят равным 30 000 М-1см-1 [16].

о-Фенилендиамин - реакционная смесь содержала 1 мМ субстрата и 1 мМ H2O2 в 0,1 М Na-ацетатном буфере (pH 5,0); коэффициент экстинкции продукта окисления на 445 нм был принят равным 11 000 М-1см-1 [17].

Суммарную и удельную активность выражали в E и E/мг (мкмоль окисленного в 1 мин субстрата на 1 мг белка).

Расчет каталитических констант

Константы скорости в реакции окисления АБТС, катализируемой ТОР, определяли на основании данных стационарной кинетики. Для этого варьировали концентрации обоих субстратов: в диапазоне 0,0150,15 мМ для АБТС и 0,010-0,5 мМ для H2O2. Определение точной концентрации пероксида водорода осуществляли методом спектрофотометрии, используя при этом значение коэффициента экстинкции s240 = 43,6 М-1 см-1 [18].

Термоинактивация

Изучение термостабильности ферментов проводили при 56°. Микропробирки объемом 0,5 мл с алик-вотами фермента (3,3 мкМ) объемом 30 мкл в 50 мМ Tris-HCl, буфере (pH 8,0) инкубировали в термостате (точность термостатирования ±0,1°С) и через определенные интервалы времени отбирали по одной пробирке. Для охлаждения отобранные пробирки помещали в холодную воду (4°С) и затем центрифугировали для удаления возможного осадка. Далее измеряли величину остаточной активности фермента по АБТС.

Результаты и их обсуждение Культивирование и экспрессия

Результаты секвенивания показали, что все выделенные после проведения реакции мутагенеза плаз-миды содержали только требуемую мутацию, обеспечивающую замену Ile37Met, а другие нуклеотидные замены отсутствовали. Для экспрессии мутантной TOP Ile37Met были использованы те же условия, что

и для ТОР дикого типа (см. Методы исследования), за исключением температуры культивирования (температура была понижена с 37 до 31°С до индукции ИПТГ и с 35 до 27°С после индукции ИПТГ). Фермент экспрессировался в виде нерастворимых телец включения. Уровень экспрессии составлял около 40% общего белка (50-60 мг на 1 л культуральной среды) (рис. 2). После разрушения клеток и промывки полученного осадка от растворимых белков были получены нерастворимые осадки целевых рекомбинантных пероксидаз (около 95% чистоты). Для получения активных форм ферментов была проведена процедура рефолдинга.

Рефолдинг

На рис. 3 приведен график зависимости каталитической активности в рефолдинг-среде для ТОР дикого типа и для мутанта Ile37Met от времени инкубации с момента добавления солюбилизированного апо-фер-мента в среду для рефолдинга (здесь и далее активность ТОР измерялась по отношению к АБТС).

Максимального значения активность в рефолдинг-среде достигала на четвертые сутки. После этого проводили концентрирование фермента для последующей хроматографической очистки.

Очистка ренатурированного фермента

Очистку ренатурированного фермента проводили путем гель-фильтрации (см. Методы исследования). В табл. 1 представлены данные по очистке TOP ди-

»1 100 "85

I—ТОР

Рис. 2. Экспрессия ТОР 11е37Ме1 в штамме Е.еоП БЬ21(ЭЕ3) СёР1ш через 0, 2, 4 и 6 ч после индукции ТРТО

Рис. 3. Рост активности в процессе рефолдинга: 1 - ТОР дикого типа

кого типа и мутантного фермента с заменой Ile37Met. Значение RZ очищенного фермента в обоих случаях равнялось 3, что считается признаком высокоочищен-ного фермента для классических пероксидаз. Чистота полученных ферментных препаратов подтверждена с помощью электрофореза (данные не приведены). Как видно из табл. 1, в случае мутантной ТОР Ile37Met удалось достичь большей степени очистки, однако удельная активность фермента была в 5,3 раза ниже по сравнению с ферментом дикого типа.

Каталитическая активность

Результаты определения удельной активности мутантной ТОР Ile37Met приведены в табл. 2, откуда видно, что активность по отношению к объемным ароматическим субстратам существенно снизилась, тогда как активность по отношению к субстратам меньшего размера сохранилась на уровне фермента дикого типа. По-видимому, это связано с тем, что введение мутации приводит к изменению конформации центра связывания субстратов.

Т а б л и ц а 1

Результаты очистки мутантной пероксидазы табака TOP Ile37Met и фермента дикого типа

Показатель

Общий белок, мг

Общая активность, Е

Удельная активность, Е/мг

Степень очистки, разы

RZ

Пероксидаза

TOP Ile37Met

1,50

1125

750

6,25

3,0

wt-TOP

0,75

3005

4005

3,9

3,0

Т а б л и ц а 2

Субстратная специфичность рекомбинатных пероксидазы табака дикого типа

Субстрат Удельная активность, E/мг

wt-TOP TOP Ile37Met wt-HRP

АБТС (pH 4,5) 4000 780 2000

АБТС (pH 5,0) 1200 230 2000

Ферроцианид 210 70 9

Иодид 0,5 0,5 110

Гваякол 1550 55 1750

Фенол 26 30 7,5

о-Фенилендиамин 1300 545 460

о-Дианизидин 550 50 520

TOP + H2O2 ^ Соединение I + H2O

Соединение I + AH2 ^ Соединение II + AH%

где AH2 - электрон-донорный субстрат, AH - радикальный продукт реакции.

При этом зависимость скорости реакции от концентрации субстратов выражается следующим уравнением:

Кинетические параметры реакции окисления АБТС

Реакция окисления АБТС под действием пероксида водорода, катализируемая гем-содержащими перокси-дазами, протекает по механизму типа «пинг-понг»:

где [E]0 - начальная концентрация фермента; ки соответствует мономолекулярной скорость-лимити-рующей стадии; kH O - константа скорости второго порядка по пероксиду водорода; kS - константа скорости второго порядка по субстрату-донору, в данном случае АБТС. На основании полученных экспериментальных данных были рассчитаны кинетические параметры окисления АБТС. Как видно из приведенных на рис. 4 графиков, характер протекания реакции окисление АБТС под действием TOP Ile3Met соответствует механизму «пинг-понг», как и для ТОР дикого типа.

Для определения кинетических констант вначале были построены графики зависимости скорости реакции от концентрации АБТС в двойных обратных координатах (координаты Лайнуивера-Берка) для разных фиксированных концентраций пероксида водорода (рис. 4, а). В данных координатах зависимость носит линейный характер, при этом прямые, полученные для разных концентраций Н2О2, параллельны. Из их тангенса угла наклона была определена константа скорости второго порядка по АБТС. После этого был построен вторичный график зависимости величины отсекаемого на оси ординат отрезка от обратной кон-

Рис. 4. Зависимость в двойных обратных координатах начальной скорости реакции окисления АБТС пероксидом водорода под действием мутантной формы пероксидазы табака 11е37Ме1 от: а - концентрации АБТС при различных фиксированных концентрациях Н202 (1-6 - концентрации АБТС 45, 90, 200, 250, 300 и 350 мкМ соответственно) и б - от концентрации Н202 при насыщающей концентрации АБТС

центрации пероксида водорода (рис. 4, б). Из тангенса угла наклона вторичного графика была определена константа скорости второго порядка по пероксиду водорода.

Полученные значения констант приведены в табл. 3, откуда видно, что в случае мутантной ТОР 11е37Ме1 константа скорости реакции взаимодействия с перок-сидом водорода практически не изменилась, однако наблюдается сильное падение константы взаимодействия с АБТС. Возможным объяснением может служить предположение, что в процессе катализа происходит окисление введенного остатка метионина, что в свою очередь приводит к конформационным изменениям в области активного центра, которые препятствуют корректному взаимодействию Соединения I перок-сидазы табака с АБТС.

Термостабильност ь

Термостабильность ТОР дикого типа и ее мутанта с заменой 11е37Ме1 была изучена при 56°С. Оказалось, что зависимости остаточной активности от времени для обоих ферментов описываются кинетикой реакции первого порядка. Значения констант скорости термоинактивации первого порядка для ТОР дикого типа и ее мутанта с заменой 11е37Ме1 составили (7,3±0,4)*10 и (7,7±0,3)*10 мин соответственно, т.е. скорость термоинактивации ТОР !1е37Ме! осталась приблизитель-

Т а б л и ц а 3

Кинетические параметры рекомбинантных пероксидаз табака в реакции окисления АБТС

Фермент Константа скорости

kHOx106, MV1 k абтс х106, mV

wt-TOP 3,6±0,4 8,2±0,9

Ile37Met 3,1±0,3 0,55±0,06

но на уровне пероксидазы табака дикого типа. Следовательно, введение замены Ile37Met не приводит к росту стабильности фермента.

Таким образом, в данной работе была получена мутантная пероксидаза табака с заменой Ile37Met. Изучение ее свойств показало, что введение такой замены приводит к сильному падению каталитической активности по сравнению с ферментом дикого типа. Термостабильность TOP Ile37Met по сравнению с исходным ферментом практически не изменилась. Очевидно, предположение о том, что остаток метионина в положении 37 может стабилизировать Соединение I, является неверным. Возможно, в процессе катализа происходит окисление введенного остатка метиони-на, что приводит к конформационным изменениям в активном центре фермента и падению активности по отношению к ароматическими субстратами.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 13-04-02013-а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gazarian I.G., Lagrimini L.M., George S.J., ThorneleyR.N.F. // J. Biochem. 1996. 320. Р. 369.

2. Gazaryan I.G., RubtsovaM.Yu., Kapeliuch Yu.L., Rodriguez-Lopez J.N., Lagrimini L.M., Thorneley R.N.F. // Photochem. Photobiol. 1998. 67. Р. 106.

3. Gazaryan I.G., and Lagrimini L.M. // Phytochemistry. 1996. 41. Р. 1029.

4. McEldoon J.P., and Dordick J.S. // Biotechnol. Prog. 1996. 12. Р. 555

5. McEldoon J. P., Pokora A. R., Dordick J. S. // Enzyme Microb. Technol. 1995. 17. Р. 359.

6. Henriksen A., Mirza O., Indiani C., Teilum K., Smulevich G., WelinderK.G., GajhedeM. // Protein Sci. 2001. 10. Р. 108.

7. Amisha Kamal J.K., Digambar V. Behere // Biochem. Engineer. J. 2008. 38. Р. 110

8. Хушпулян Д.М., Савицкий П.А., Рожкова А.М., Чубарь Т.А., Фечина В.А., Сахаров И.Ю., Лагримини Л.М.,

Тишков В.И., Газарян И.Г. // Биохимия. 2003. 68. С. 1480.

9. Patterson W.R., Poulos T.L. // Biochemistry. 1995. 34. Р. 4331.

10. Piontek K, Glumoff T, Winterhalter K. // FEBS Lett. 1993. 315. Р. 119.

11. Laemmli U.K. // Nature. 1970. 227 (5259). Р. 680.

12. ChildsR.E., Bardsley W.G. // Biochem. J. 1975. 145. Р. 93.

13. Hosoya T. // J. Biochem. 1960. 47. Р. 794.

14. Gallati H. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1997. 15. Р. 699.

15. Hasinoff F., Dunford H.B. // Biochemistry. 1970. 9. Р. 4930.

16. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. // Биохимия. 1977. 42. С. 1372.

17. Gallati H. and Brodbeck H. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1982. 20. Р. 221.

18. Paler-Martinez A., Panus P.C., Chumley PH., Ryan U., Hardy M.M., Freeman B.A. // Arch.Biochem.Biophys. 1994. 311. Р. 79.

Поступила в редакцию 11.11.13

CATALYTIC PROPERTIES AND STABILITY OF RECOMBINANT TOBACCO PEROXIDASEWITH AMINO ACID CHANGE ILE37MET

A.A. Poloznikov, G.S. Zakharova, T.A. Chubar, D.M. Hushpulian, I.G. Gazaryan, V.I. Tishkov

The Ile37Met substitution was generated in tobacco anionic peroxidase (TOP) by site-directed mutagenesis to mimic the soybean peroxidase (SBP), in which Met37 is responsible for the increased thermal stability. TOP Ile37Met has been expressed in E. coli BL21(DE3) CodonPlus and accumulated in inclusion bodies. The expression level of the constructed enzyme was approximately 40% of the total E. coli protein. The enzyme was reactivated into an active and soluble form via a refolding procedure that was optimized based on the earlier developed protocol for wild-type TOP. The substrate specificity, catalytic activity and thermostability of TOP Ile37Met were investigated. It was shown that the introduction of Ile37Met mutation does not increase the stability of the enzyme and on the contrary, leads to a reduction of the catalytic properties of the enzyme.

Key words: tobacco peroxidase, mutagenesis, refolding, thermostability.

Сведения об авторах: Полозников Андрей Александрович - сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук; Захарова Галина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН; мл. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ»; Чубарь Татьяна Анатольевна - ассистент кафедры химической энзимологии МГУ, науч. сотр. лаборатории молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук; Хушпульян Дмитрий Михайлович - мл. науч. сотр. кафедры радиационной химии МГУ, сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук; Газарян Ирина Георгиевна - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ, докт. хим. наук, профессор; Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН; сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», докт. хим. наук, профессор.