Экспериментальное изучение формирования холерными вибрионами биопленок на абиотических поверхностях в разных условиях культивирования

март №3

31

Г-Ь

ного токсина (наиболее характерны спектральные пики: 3 868 ± 1; 5 803 ± 4; 11 603 ± 7). Аналогичные совпадения отмечались и при исследовании водопроводной воды, контаминированной холерным токсином ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Метод MALDI-TOF MS позволил определить наличие холерного токсина в водопроводной воде в концентрации 0,01 мкг/мл (в то время как индикаторный иммунохроматографический элемент (производства ФГУП «ГосНИИБП», ФМБА, Россия) для выявления холерного токсина в пробах, взятых из объектов внешней среды, дает положительную реакцию в концентрации не менее 1 мкг/мл).

Выводы. В результате проведенного исследования определен масс-спектр холерного токсина с помощью MALDI-TOF MS, выявлены специфические пики масс-спектров, определена возможность индикации холерного токсина в водопроводной воде. Использовать данный метод можно для индикации токсинов в объектах окружающей среды при наработке базы данных токсинов биологического происхождения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абдрашитова А.С. и др. Оценка диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза и холеры методом ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени» / А.С. Абдрашитова, Л.В. Саяпина, А.Н. Малахаева [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 1 (238). С. 32—34.

Водопьянов С.О. и др. Испытание метода ПЦР в работе индикационной лаборатории мобильного комплекса СПЭБ при исследовании экспериментальных проб на холеру / С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2011. № 8. С. 43—45.

Дубровский Я.А. и др. Определение токсинов пептидной природы методом MALDI-MS /Я.А. Дубровский, Е.П. Подольская //Научное приборостроение. 2010. Т. 20. № 4. С. 21—35.

Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.: «БИНОМ. Лаборатория знаний», 2003. 493 с. ОнищенкоГ.Г. и др. Биологическая безопасность / Г.Г. Они-щенко, М.А. Пальцев, В.В. Зверев [и др.]. М.: «Медицина», 2006. 304 с.

De Haan L. at al. Cholera toxin: a paradigm for multi-functional engagement of cellular mechanisms (Review). //Mol. Membr. Biol. 2004. V. 21 (2). P. 77—92.

Fagerquist C.K. at al. Top-Down Proteomic Identification of Furin-Cleaved a-Subunit of Shiga Toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 Using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. //Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010. V. 2010. 11 p. Williams J.P. at al. Gas Phase Characterization of the Noncovalent Quaternary Structure of Cholera Toxin and the Cholera Toxin B Subunit Pentamer //Biophysical Journal. 2006. V. 90. № 9. P. 3246—3254.

Контактная информация:

Германчук Валерий Геннадьевич, тел.: (8452) 51-52-11, e-mail: rusrapi@microbe.ru

Contakt information:

Germanchuk Valery, phone: (8452) 51-52-11, е-mail: rusrapi@microbe.ru

УДК: 549.843.1:579.26:57.083.13

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФОРМИРОВАНИЯ ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ БИОПЛЕНОК НА АБИОТИЧЕСКИХ ПОВЕРХНОСТЯХ В РАЗНЫХ

УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

С.В. Титова, Е.В. Кушнарева ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора,

г. Ростов-на-Дону, Россия

Определен оптимальный твердый субстрат (покровные стекла) и среды культивирования (водопроводная, речная вода, PBS, солевая среда) для моделирования нативных биопленок холерными вибрионами в лабораторных условиях. На примере двух нетоксигенных штаммов V.cholerae показано, что применение данной модели позволяет проследить стадии данного процесса — от адгезии отдельных клеток до образования стабильной многослойной структуры. Ключевые слова: штаммы холерных вибрионов, концентрация, биопленка, покровные стекла, твердый субстрат, среда культивирования.

Titova S.V, Kushnaryova E.V.  EXPERIMENTAL STUDY OF FORMATION OF BIOFILM BY VIBRIO CHOLERAE ON ABIOTIC SURFACES UNDER DIFFERENT CULTURE CONDITIONS  FSHE «Rostov-on-Don Anti-Plague Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Rostov-on-Don, Russia.

The results of investigations made it possible to determine optimal solid substrate (cover-glasses) and culture media (tap, river water, PBS, saline medium) for modeling the formation of native biofilms by Vibrio cholerae under laboratory conditions. With the use of two atoxigenic V. cholerae strains it was demonstrated that this model allows us to follow different stages of biofilm formation — from adhesion of single cells to the development of stable multilayer structure.

Key words: Vibrio cholerae strains, concentration, biofilm, cover-glass, a solid substrate, culture medium.

На территории России из объектов окружающей среды (ООС) ежегодно выделяется значительное количество штаммов Vibrio cholerae, большей частью атоксигенных, хотя периодически имеют место и заносы эпидемически опасных штаммов [1]. Возможность сохранения и персистенции холерных вибрионов в ООС обусловлена их способностью к образованию биопленок, которая зависит как от целого ряда внешних факторов, так и от исходно-

го количества клеток в популяции. В последние годы число публикаций, касающихся биопленок холерных вибрионов постепенно увеличивается. В работах отечественных ученых нашли отражение вопросы, касающиеся изучения способности сахаров ингибировать пленкообразование, и установлена роль определенных лектиновых рецепторов в этом процессе [3]. Показана вариабельность свойств, характеризующих способность к выживанию хо-

32

ЗНиСО

март №3

лерных вибрионов в биопленочных сообществах [4, 7], исследовано влияние некоторых факторов на формирование биопленки токсигенными и атоксигенными вибрионами Эль-Тор.

Сведения о формировании биопленок холерными вибрионами на абиотических субстратах различного происхождения крайне ограничены. Спектр твердых поверхностей, к которым возможно прикрепление представителей Vibrio cholera широк, поэтому актуален ответ на вопрос, насколько важна природа субстрата для адгезии и выживания вибрионов в водной среде.

Цель исследования: сравнительное изучение особенностей формирования холерными вибрионами биопленок на различных твердых субстратах и в среде культивирования в условиях эксперимента.

Материалы и методы. Объектами исследования служили два штамма: V. cholerae El-Tor ctx Р-5392 и V. cholerae O139 ctx Р-17918, полученные из музея живых культур ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора.

Из суточных агаровых культур готовили суспензии клеток, которые вносили во флаконы с кипяченой водопроводной, речной либо морской водой, с забуференным фосфатами физиологическим раствором (PBS), с солевой средой и бульоном Мартена в конечной концентрации от 108 до 106 м.к./мл. В опытные пробы погружали твердые субстраты: керамзит, песок, покровные стекла, а в качестве контроля использовали те же суспензии без твердых субстратов.

Эксперименты проводили при комнатной температуре. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты жидкой среды (планктонные пробы) и твердых субстратов, последние отмывали в водопроводной воде или PBS и помещали в новые флаконы со стерильной водой или PBS для отслаивания биопленок. Концентрацию клеток холерных вибрионов определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве из десятикратных разведений на пластины агара Мартена, а также прямым подсчетом. Покровные стекла после отмывания и удаления оставшейся жидкости также накладывали на поверхность агара Мартена и через 15 мин переворачивали на другую сторону. Для микроскопического исследования экспериментальные покровные стекла после такой же обработки помещали на предметные стекла, наносили раствор акридинового оранжевого (АО) в разведении 20 мкг/мл (прижизненное флуорох-ромирование) [5] и накрывали покровным стеклом большего размера. Препарат раздавленной капли исследовали в люминесцентном микроскопе (МЛД—1) при увеличении 90 х 7 [8].

Результаты и обсуждение. На первом этапе исследований нам предстояло определить, какие из твердых субстратов являются наиболее оптимальными для моделирования образования биопленок в условиях эксперимента. Для этого на дно флаконов помещали песок или камни (керамзит), между камнями или в песок вставляли покровные стекла и добавляли 50 мл суспензии холерных вибрионов в водопроводной воде в концентрациях 106, 107, 108 КОЕ/мл. Исследование (высевы планктонной пробы и микроскопирование препаратов) проводили в течение трех месяцев.

В пробах с керамзитом и покровными стеклами через две недели от начала эксперимента концен- "— трация холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в пробах с начальной концентрацией 108 КОЕ/мл ^ снизилась на два порядка. Через два-три месяца концентрация холерных вибрионов в планктонных пробах, как экспериментальных, так и контрольных, ^^ была в пределах 2 х 105—4 х 106 КОЕ/мл. В течение е первых двух недель в микроскопических препаратах из проб с песком были выявлены скопления клеток холерных вибрионов зеленого и оранжевого цветов, с сохраненной подвижностью в пределах скопления, песчинки были окрашены в оранжевый цвет. В течение этого же срока наблюдения между керамзитовыми камнями визуально были заметны хлопьевидные образования. Покровные стекла, извлеченные из всех проб, были покрыты налетом и выглядели мутными. Полученные данные позволили предположить, что в описанных условиях эксперимента холерные вибрионы постепенно формировали биопленки на твердых поверхностях, однако необходимо было доказать, что наблюдаемые налеты и хлопьевидные образования действительно представляли собой зрелые биопленки. Для этого мы исследовали их методом люминесцентной микроскопии с прижизненным флуорохромированием [5].

Хлопья, отобранные в этот же период из проб с керамзитом с помощью пипеток и петель, под микроскопом выглядели как биопленки, находящиеся на третьей стадии формирования, о чем свидетельствует наличие вещества мутно-оранжевого цвета, окружающего неподвижные клетки холерных вибрионов. Некоторые клетки сохраняли подвижность в пределах скопления. В литературе данная, третья, стадия описана как слияние некоторых клеток микроорганизмов и выделение полимерных веществ (полисахаридов, липополисахаридов, гликопротеина), т. е. формирование внеклеточного матрикса.

На покровных стеклах из этих проб можно было наиболее отчетливо проследить образование биопленки. На всей площади стекла просматривались скопления из клеток холерных вибрионов, погруженных в аморфное вещество (рис. 2в). Также наблюдалась стадия сформированной биопленки, а именно: присутствие нескольких слоев, которые, наслаиваясь друг на друга, образовывали многомерную структуру. Окружающее клетки аморфное вещество, окрашенное в мутно-оранжевый и мутно-зеленый цвета, представляло, по-видимому, матрикс, состоящий из полисахаридов и белков. Между скоплениями просматривались пустые места в виде дорожек (рис. 2г). Аналогичное описание приводится в публикациях как четвертая стадия вторичных колонизаторов. Микроорганизмы прикрепляются к тем, которые уже сформировали биопленку, в этой же стадии формируются специфические структуры: полости, каналы, выросты, поры.

Таким образом, исследуемые нами субстраты способствовали формированию биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента. Однако песок в качестве субстрата давал искажение просмотра микроскопических препаратов «раздавленная капля». Биопленки, формирующиеся между камнями керамзита, хорошо визуализировались, но процесс изъятия камней из флакона с

март №3

ЗНиСО

33

ц

Ел«

ю

14 21 28

время

" У.еЬог Р-5392 вода " У.еИяг Р-5392 физ. раствор " УеИ:ог р-5392 солевая УеКог Р-5392 речная УеКог Р-5392 морская "У.еНог Р-5392 бульон Матрена

Рис. 1. Концентрация штаммов V. екокгае О1 и О139 в экспериментальных пробах с покровными стеклами

а) 1 стадия б) 2 стадия в) 3 стадия г) 4 стадия

Рис. 2. Стадии формирования на покровных стеклах биопленок холерных вибрионов на примере V. еко1егае Е1-Тог Р-5392

последующим отмыванием и отслаиванием биопленки оказался проблематичным, в том числе и с точки зрения соответствия требованиям режима биологической безопасности. Покровные стекла, расположенные между камнями керамзита, легко изымались из флаконов, потому именно они были использованы в качестве субстрата в дальнейших экспериментах.

На следующем этапе работы мы провели сравнительное изучение формирования биопленок холерными вибрионами в разных средах культивирования при концентрации холерных вибрионов 106 мк/мл. В каждый флакон помещали до 9 покровных стекол. Для исследования динамики процесса адгезии холерных вибрионов к поверхности покровных стекол, а также их размножения в планктонной пробе, через 6, 9, 24, 48 ч, затем 1 раз в неделю и 1 раз в месяц исследовали покровные стекла описанным выше способом и делали высевы по 0,1 мл на пластины с агаром Мартена.

Через 6 часов после начала исследования микроскопические препараты из всех проб содержали подвижные и неподвижные палочковидные клетки зеленого и оранжевого цветов, цепочки клеток и скопления, состоящие из 4—10 клеток. По данным литературы, эта, вторая, стадия — собственно микробная адгезия, когда микроорганизмы необратимо прикрепляются к твердой поверхности (рис. 2б). Между молекулами и структурами на поверхности микроорганизмов и твердого субстрата действуют неспецифические физико-химические силы. Количество клеток, в том числе с сохраненной подвижностью, увеличивалось только в пробах с бульоном Мартена. Дальнейшие изменения проис-

ходили в самих скоплениях клеток. Так, через 9 и 24 ч исследования в пробах с бульоном Мартена и с морской водой размер скоплений увеличивался так, что они занимали все поле зрения, происходило наслаивание клеток друг на друга. Между скоплениями находилось аморфное вещество, просматривались пустые места в виде дорожек. Описанная картина принята нами за сформированную биопленку. Через одну неделю биопленки были сформированы и во всех остальных экспериментальных пробах, они соответствовали 3—4 стадиям.

В течение второй недели во всех исследуемых пробах микроскопические препараты (биопленки) выглядели без изменений. С третьей недели экспериментов микроскопическая картина препаратов не изменялась, кроме препаратов с морской водой — в сторону уменьшения размера скоплений клеток и многослойности препаратов.

Концентрация клеток холерных вибрионов в биопленках, формирующихся на покровных стеклах, во всех экспериментальных пробах не поддавалась подсчету, так как в отпечатках покровных стекол на пластинах агара Мартена наблюдался сливной рост.

Концентрация клеток холерных вибрионов в планктонной пробе колебалась от 104 до 107 КОЕ/ мл, в зависимости от среды культивирования в течение срока исследования, соотношение КОЕ в экспериментальных и контрольных пробах было в пределах одного порядка (рис. 1). Таким образом, состав среды не оказывал существенного влияния на конечный итог — образование многомерных биопленок, различия касались только сроков, необходимых для их формирования. Быстрее всего этот процесс

34

ЗНиСО

март №3

завершался в пробах с бульоном Мартена (9 ч), тогда как в пробах с водой формирование зрелой биопленки происходило лишь спустя 48 ч.

Таким образом, в результате проведенных исследований нам удалось определить оптимальный твердый субстрат (покровные стекла) и среды культивирования (водопроводная, речная вода, PBS, солевая среда) для моделирования условий формирования биопленок холерными вибрионами в лабораторных условиях. На примере двух атоксигенных штаммов V. cholerae показано, что применение данной модели позволяет проследить все известные стадии этого процесса — от адгезии отдельных клеток до образования стабильной многослойной структуры (рис. 2).

Преимущество покровных стекол перед широко используемыми большинством исследователей полистироловыми планшетами [2, 4, 6] состоит в возможности не только констатировать факт способности того или иного штамма к формированию биопленки, но и увидеть ее структуру с помощью обычного светового (люминесцентного) микроскопа. В дальнейшем мы намерены использовать описанный подход для изучения биопленок, образуемых токсигенными штаммами холерных вибрионов, в условиях in vivo и in vitro.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ежова М.И. и др. Холерные вибрионы О1 серогруппы, выделенные из водных объектов Ростова-на-Дону в ходе мониторинга в 2008—2012 гг. / М.И. Ежова, В.Д. Кругли-ков, А.С. Водопьянов [и др.] //Проблемы особо опасных инфекций. 2013. Вып. 4. С. 56—59.

2. Ильина Т.С. и др. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. / Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург //Генетика. 2004. Т. 40. № 11. С. 1445—1456.

3. Колякина А.В. и др. Сравнительное изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов при образовании биопленки на поверхности жидких питательных сред. / А.В. Колякина, Е.М. Курбатова, Н.Р. Телесманич [и др.] //Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. совещ. и пробл. комиссии. Ростов-на-Дону, 2008. Вып. № 21. С. 67—72.

4. Куликалова Е.С. и др. Способность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп к образованию биопленки в эксперименте / Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович, А.С. Марамович [и др.] //Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии. Ростов-на-Дону. 2009. Вып. № 22. С. 90—92.

5. Сайфитдинова А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: Учебно-методическое пособие. СПб., 110 с.

6. Смирнова Т.А. и др. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок. / Т.А. Смирнова, Л.В. Диденко, Р.Р. Азибекян [и др.] //Микробиология. 2010. Т. 79. № 4. С. 435—446.

7. Татаренко О.А. и др. Влияние некоторых факторов на формирование биопленки токсигенными и атоксиген-ными холерными вибрионами Эль-Тор. / О.А. Татаренко, Л.П. Алексеева, Н.Р. Телесманич [и др.] //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012. № 5. С. 36—40.

8. Безопасность работы с микроорганизмами I—II группы патогенности (опасности): СП 1.3.3118—13.

Контактная информация:

Титова Светлана Викторовна, тел.: 8 (863) 2 402703, e-mail: svetatitova@bk.ru

Contact information: Titova Svetlana, phone: 8 (863) 2 402703, e-mail: svetatitova@bk.ru

-

УДК 616.995.7

ФЕНОЛОГИЧЕСКИЕ НАБЛЮДЕНИЯ ЗА ПОПУЛЯЦИЕЙ ПОДВАЛЬНЫХ КОМАРОВ В ЭПИДЕМИЧЕСКИ АКТИВНОМ МИКРООЧАГЕ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА В

ГОРОДЕ САРАТОВЕ

А.М. Поршаков, С.А. Яковлев, К.С. Захаров, В.А. Сафронов, А.Н. Матросов, В.Н. Чекашов, М.М. Шилов, Т.В. Князева, А.А. Кузнецов

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»», г. Саратов, Россия

В статье представлены результаты фенологических наблюдений за популяцией подвальных комаров Culexpipiens в урбанизированных биоценозах г. Саратова. Дано описание биоценоза и факторов, способствующих развитию всех стадий комаров внутри подвальных помещений. Установлена высокая численность комаров и личинок в подвальных помещениях жильх домов, расположенных на территории выявленного очага лихорадки западного Нила (ЛЗН). Ключевые слова: кровососущие комары, синантропные популяции комаров, лихорадка Западного Нила.

A.M. Porshakov, S.A. Yakovlev, K.S. Zakharov, V.A. Safronov, A.N. Matrosov, V.N. Chekashov, M.M. Shilov, T.V. Knyazeva, A.A. Kuznetsov  PHENOLOGICAL SURVEILLANCE OVER THE POPULATION OF BASEMENT MOSQUITOES FOUND IN EPIDEMICALLY ACTIVE MICRO-FOCUS OF WEST NILE FEVER IN SARATOV  FSHE «Russian Scientific Research Anti-Plague Institute «Microbe»», Saratov, Russia.

Represented are the results of phenological surveillance over the population of basement mosquitoes Culex pipiens, carried out in urbanized biocoenoses of Saratov. Characterized are the biocoenoses themselves and the factors that contribute to the progress of all the growth-stages of mosquitoes inside the basement units. Identified has been high abundance rate of both mosquitoes and their wrigglers in basements of residential buildings situated in the territory of the allocated West Nile fever (WNF) focus. Key words: blood-sucking mosquitoes, synanthropic populations of mosquitoes, West Nile fever.

Заболевания населения лихорадкой Западного Нила (ЛЗН) на территории Саратовской области с нарастающим итогом начали регистрировать с 2010 г. Зафиксировано 11 случаев заболевания ЛЗН в 2012 г., 31- в 2013 г., более 90 % больных -

г-Ь

городские жители [2, 5]. По результатам эпидемического расследования, проведенного по каждому случаю заболевания ЛЗН, были выявлены предположительные места заражения. Большинство случаев (61 %) связаны с нападением комаров по