СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ
METHOD OF PRODUCING BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVE

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано при производстве биологически активных добавок пищевого, кормового и медицинского назначения.
Известны способы автолиза дрожжевой биомассы с получением автолизированных клеток дрожжей, белково-аминокислотных добавок, биологически активных добавок на основе деструкции внутриклеточных полимеров под действием эндоферментов дрожжевой клетки /1, 2/.
Недостатком данных способов является невысокая степень гидролиза белка протоплазмы дрожжевых клеток, полисахаридов клеточных стенок, низкий выход биологически активных веществ, необходимость дополнительного использования активаторов автолиза, а также длительный процесс гидролиза в результате невысокой активности внутриклеточных ферментов дрожжей. При этом результат автолиза и состав автолизатов полностью зависит от физиологического состояния клетки, от активности внутриклеточных ферментов, что обуславливает нестабильность качественных показателей получаемых препаратов.
Известен способ получения ферментолизата дрожжевой биомассы, предусматривающий обработку биомассы клеток дрожжей гидролитическими ферментами, продуцируемыми микромицетом Aspergillus oryzae F-683 /3/.
Однако биологическая активность ферментолизата дрожжей, получаемого данным способом, не достаточно высокая, так как в качестве источника ферментов используется микромицет Aspergillus oryzae F-683, синтезирующий гидролитические ферменты с низким уровнем активности /4/.
Известен способ получения ферментолизата биомассы гриба Aspergillus oryzae для получения биологически активных веществ /5/.
Однако в известном способе не описаны условия обработки мицелиальной биомассы гидролитическими ферментами, температура и продолжительность гидролиза, не указаны дозировки ферментов, входящих в комплекс, что не позволяет воспроизвести этот известный способ в части осуществления процесса ферментолиза или автолиза мицелиальной биомассы для получения биологически активной добавки. Кроме того, в работе используется штамм Aspergillus oryzae POM-156 (ВКПМ F-931) - продуцент экзопротеаз, синтезирующий сопутствующие ферменты: α-амилазу, ксиланазу, не участвующие в конверсии полимеров микробной биомассы /6, 7/.
Из известных способов наиболее близким аналогом предлагаемого способа является способ получения биологически активной добавки, предусматривающий обработку биомассы клеток дрожжей комплексом экзогенных гидролитических ферментов /8/.
При этом в известном способе в качестве субстрата используется дрожжевая биомасса, обработанная комплексом β-глюканаз, маннаназы, хитиназы, а также культуральной жидкостью мицелиального гриба Aspergillus oryzae ВКПМ F-931 - продуцента экзопротеаз, β-глюканазы, α-амилазы, ксиланазы /6/ и практически не используются нуклеазы, необходимые для гидролиза нуклеиновых кислот. Недостатком этого способа является высокий расход ферментов из-за низкой активности внутриклеточных (эндогенных) ферментов дрожжей и отсутствия ферментов нуклеазного действия, катализирующих гидролиз нуклеиновых кислот, наличия в культуральной жидкости мицелиального гриба ферментов α-амилазы и киланазы, не нужных для гидролиза полимеров грибной биомассы ввиду отсутствия в ней крахмала и ксиланов, а также ограниченный состав дрожжевой биомассы, в т.ч. низкое содержание хитино-глюканового комплекса, что не обеспечивает создание биологически активной добавки с широким спектром функциональных свойств.
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение эффективности процесса гидролиза полимеров микробной биомассы, сокращение продолжительности процесса, исключение или существенное снижение расхода экзогенных ферментов в результате действия внутриклеточных ферментов используемого гриба Aspergillus oryzae 12-84 (RCAM 01134), а также повышение качества и биологической ценности целевого продукта за счет обогащения гидролизата мицелиальной биомассы низкомолекулярными биологически активными продуктами глубокого ферментативного гидролиза внутриклеточных полимеров микромицета.
Указанный технический результат достигается за счет того, что в заявляемом способе используется высокопродуктивный штамм Aspergillus oryzae RCAM 01134 - продуцент комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, β-глюканазы, маннаназы, хитиназы, уровень активности которых превышает активность штамма Aspergillus oryzae F-931, используемого в известном способе: по нуклеазам - в 24,0 раза, по хитиназе - в 3,0 раза, по β-глюканазе - в 1,7 раза, по маннаназе - в 1,4 (табл. 1), что позволяет повысить интенсивность и глубину гидролиза полимеров мицелиальной биомассы.
3
Кроме того, используемая в заявляемом способе грибная биомасса содержит более высокое количество полисахаридов (38,6%), хитина (18,5%), а также незаменимых аминокислот в составе белка - триптофана (20,7%) и метионина (9,6%), что в 1,5; 10,3; 15,9 и 3,6 раза соответственно превосходит аналогичные показатели дрожжевой биомассы и в 1,2; 1,5; 1,2 и 1,3 показатели грибной биомассы, используемых в известном способе (табл. 2). Повышенное содержание хитина в биомассе сказывается на функциональных свойствах получаемых по заявленному способу биопрепаратов: на увеличении их сорбционной способности и антимикробной активности. Наличие высокого количества триптофана в ферментолизатах грибной биомассы позволяет использовать их для создания натуральных антидепрессантов, способствующих стабилизации настроения, снятию усталости, беспокойства и напряжения, нормализации сна. Триптофан, являясь предшественником ниацина (витамина B), способствует сдерживанию первичного образования компонентов жира, что снижает риск ожирения, а также способствует стимуляции синтеза гормона роста. Присутствие в грибной биомассе большого количества метионина придает ферментолизатам антиоксидантные и антитоксические свойства, способствует образованию иммунных клеток и улучшению функционирования нервной системы организма. Кроме того, предлагаемый способ позволяет использовать биомассу микромицета как отход ферментного производства, что обеспечит снижение финансовых затрат на производство биологически активной добавки за счет низкой стоимости субстрата, будет способствовать ресурсосбережению, снижению техногенного воздействия ферментных производств в результате переработки отходов.
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения биологически активной добавки заключается в осуществлении двухстадийной обработки мицелиальной биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01134 при естественном значении рН внутриклеточными (эндогенными) ферментами, катализирующими гидролиз глюканов, маннанов и хитина клеточных стенок, а также высокомолекулярных внутриклеточных белковых веществ и нуклеиновых кислот. При этом на 1-й стадии температура гидролиза поддерживается на уровне 48-50°С в течение 1 ч 45 мин - 2 ч 15 мин для осуществления деструкции полисахаридов клеточных стенок. На 2-ой стадии температуру снижают до 38-40°С во избежание инактивации эндогенных ферментов и процесс продолжают в течение 2 ч 45 мин - 3 ч 15 мин для гидролиза внутриклеточных полимеров.
В заявляемом способе исключается дополнительное введение экзогенных ферментов маннано-, хитинолитического и нуклеазного действия, так как используемый гриб Aspergillus oryzae RCAM 01134 обладает указанными активностями.
Для повышения эффективности гидролиза полисахаридов клеточных стенок под действием собственных эндо-ферментов дополнительно вводится  источник экзогенной β-глюканазы (50 ед. β-ГкС/г сухих веществ биомассы), например, ферментный препарат целловиридин, в дозировке существенно ниже, чем используется в известном способе.
Для повышения глубины деструкции внутриклеточных полимеров после 2-ой стадии гидролиза температуру снижают до 30-32°С и продолжают процесс при этой температуре в течение 5-6 ч.
Способом согласно изобретению рекомендуется проведение при определенных режимных параметрах 2-стадийной ферментативной обработки биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01134 внутриклеточными ферментами протеолитического, β-глюканазного, маннанолитического, хитинолитического и нуклеазного действия и экзогенными ферментами β-глюканазного действия, что позволяет повысить качество и биологическую ценность гидролизатов за счет более глубокого ферментативного гидролиза основных субклеточных полимеров мицелиальной биомассы и повышения выхода биологически активных легко усвояемых продуктов гидролиза с высоким содержанием свободных аминокислот, редуцирующих углеводов, низкомолекулярных пептидов и нуклеотидов в результате действия собственных ферментативных систем, что позволяет расширить спектр функциональных свойств биологически активных добавок, получаемых по заявляемому способу.
Для сравнения качества биологически активной добавки, получаемой в результате реализации способа согласно изобретению, с качеством продукта, получаемого в результате осуществления процесса по наиболее близкому аналогу, приводим таблицы 3 и 4.
Получаемый по заявленному способу препарат содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза полимеров грибной биомассы: биологически активные пептиды, незаменимые и заменимые аминокислоты, биологически активные продукты гидролиза полисахаридов клеточных стенок и нуклеиновых кислот. Препарат рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.
Медико-биологические исследования биологически активной добавки (БАД), получаемой по заявленному способу, показали, что испытанная добавка обладает антиоксидантными, антиканцерогенными свойствами. Клинические исследования эффективности ферментолизатов дрожжевой биомассы в процессе реабилитации больных с черепно-мозговой травмой (ЧМТ) показали, что испытанные препараты влияли на коррекцию здоровья, улучшая функциональное состояние организма у больных, перенесших ЧМТ.
Кроме того, БАД, получаемая по заявленному способу, обладает антимикробной способностью, антитоксическими свойствами, способствует  улучшению функций нервной системы, а также стимулирует синтез ростовых факторов. Медико-биологические исследования показали перспективность использования ферментолизатов мицелиальной биомассы как функциональных добавок для активации молекулярных шаперонов при диабете 1 типа (инсулинозависимом). Выявленные эффекты указывают на возможность создания на основе ферментолизата грибной биомассы эффективных функциональных продуктов питания.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
2
4
3
-3
3
3
3
Пример 1. Для получения биомассы гриба проводят культивирование штамма микромицета Aspergillus oryzae RCAM 01134 при температуре 32°С в течение 42 час в ферментере, снабженном барботером для аэрирования и перемешивающим устройством, на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КНРО - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммом RCAM 01134, составил: по протеазе - 30,2 ед. ПС/см, по β-глюканазе - 6,06, по нуклеазам - 4,6·10 ед. НС/см, по хитиназе - 0,20 ед. ХС/см, по маннаназе - 0,80 ед. МС/см. По окончании ферментации культуральную жидкость центрифугируют для отделения биомассы. Фугат используют для получения ферментного препарата, а биомассу с влажностью 88-90% - для дальнейшего ферментативного гидролиза с целью получения БАД.
Ферментативный гидролиз полученной биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01134 осуществляют в реакторе с перемешивающим устройством и рубашкой для поддержания необходимой температуры.
На первой стадии биомассу гриба нагревают до температуры 48°С и проводят гидролиз полимеров мицелиальных клеток под действием собственных ферментов при естественном значении рН в течение 2 ч 15 мин и постоянном перемешивании. При этом на 1-й стадии в результате ферментативного гидролиза высокомолекулярных белковых и полисахаридных полимеров клеточных стенок под действием  внутриклеточных ферментов происходит образование пептидов, олигосахаридов и аминосахаров, а также освободившихся β-глюкана, маннана и хитина. Деструкция полимеров клеточных стенок обеспечивает повышение степени доступности внутриклеточных белковых веществ протоплазмы и нуклеиновых кислот для дальнейшего действия ферментов на 2-й стадии гидролиза. Частично разрушенную мицелиальную биомассу, полученную на 1-й стадии гидролиза, охлаждают до температуры 38°С для исключения термоинактивации ферментов и процесс продолжают в течение 3 ч 15 мин при постоянном перемешивании. На 2-й стадии процесса в массу вносят ферментный препарат целловиридин как дополнительный источник β-глюканазы из расчета 50 ед. β-ГкС на 1 г сухих веществ биомассы. Об окончании второй стадии ферментолиза судят по нарастанию концентрации растворимых редуцирующих углеводов, содержанию свободных аминокислот, низкомолекулярных пептидов и нуклеотидов, образующихся в результате гидролиза полисахаридов клеточных стенок гриба (хитина, глюканов и маннанов), белковых веществ протоплазмы и нуклеиновых кислот. Для обеспечения более высокой степени деструкции внутриклеточных полимеров температуру полученной массы снижают до 30°С и выдерживают в течение 6 час. При этом гидролиз клеточных полимеров катализируют те ферменты, которые присутствуют в биомассе гриба (внутриклеточные) и целловиридин - источник β-глюканазы, который был введен в процесс на второй стадии обработки мицелиальных клеток. Полученный ферментолизат нагревают до температуры 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 15 мин для инактивации всех ферментов, затем его сушат и получают ферментолизат с влажностью 3,5% на а.с.в. Препарат содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза клеточных полимеров микромицета: биологически активные пептиды с молекулярной массой от 500 до 700 Да - 13,1%, до 500 Да - 84,3%, незаменимые и заменимые свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды до 300 Да - 73,5% от  исходного количества белка, а также биологически активные продукты гидролиза полимеров клеточных стенок (β-глюкана, маннанов, хитина) - 32,1% РВ (редуцирующих веществ), и низкомолекулярные нуклеотиды - 69,2% от исходного содержания нуклеиновых кислот. Ферментолизат мицелиальной биомассы рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.
Полученный ферментолизат характеризуется высоким содержанием аминокислот в свободной форме, активных низкомолекулярных пептидов и легко усваиваемых биологически активных продуктов гидролиза β-глюкана, маннанов, хитина и нуклеиновых кислот.
Пример 2. Целевой продукт получают по методике примера 1 с соблюдением перечисленных далее режимных параметров. На первой стадии гидролиз мицелиальной биомассы под действием внутриклеточных ферментов проводят при температуре 50°С в течение 1 ч 45 мин. Гидролиз на второй стадии осуществляют, вводя в биомассу источник β-глюканазы - целловиридин из расчета 50 ед. β-ГкС на 1 г сухих веществ биомассы, при температуре 40°С в течение 2 ч 45 мин. Затем температуру полученной массы снижают до 32°С и выдерживают в течение 5 часов. Препарат содержит биологически активные продукты глубокого ферментативного гидролиза клеточных полимеров микромицета: биологически активные пептиды с молекулярной массой от 500 до 700 Да - 13,0%, до 500 Да - 84,0%, незаменимые и заменимые свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды до 300 Да - 73,2% от исходного количества белка, а также биологически активные продукты гидролиза полимеров клеточных стенок (β-глюкана, маннанов, хитина) - 32,2% РВ (редуцирующих веществ), и низкомолекулярные нуклеотиды - 68,9% от исходного содержания нуклеиновых кислот. Ферментолизат мицелиальной биомассы рекомендуется к использованию как биологически активная добавка.
Полученный ферментолизат характеризуется высоким содержанием аминокислот в свободной форме, активных низкомолекулярных пептидов и  легко усваиваемых биологически активных продуктов гидролиза β-глюкана, маннанов, хитина и нуклеиновых кислот.
Таким образом, заявляемый способ согласно изобретению позволяет повысить качество получаемой биологически активной добавки за счет использования биомассы мицелиального гриба Aspergillus oryzae RCAM 01134 - продуцента комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, β-глюканазы, маннаназы, хитиназы, что обеспечивает повышение глубины гидролиза полимеров клетки и получение биологически активной добавки с широким спектром функциональных свойств.
Литература
1. Патент РФ №2065275, кл. A23J 1/18, опубл. 20.08.1996.
2. Патент РФ №2084171, кл. A23J 1/18. опубл. 20.07.1997.
3. Патент РФ №2104300, кл. C12N 1/06, A23L 1/28, опубл. 10.02.1998 г.
4. Патент РФ №2070921, кл. C12N 1/14, опубл. 1996 г.
5. Римарева Л.В. Использование биомассы гриба Aspergillus oryzae в качестве источника биологически активных веществ / Л.В. Римарева, Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, К.В. Рачков, И.М. Абрамова // Хранение и переработка сельхоз сырья. - 2012. - №9. - С. 46-49.
6. Патент РФ 2315096, кл. C12N 1/30, опубл. 2008 г.
7. Серба Е.М. Синтез и секреция гидролаз микромицетом Aspergillus oryzae - продуцентом ферментов, необходимых для биокатализа полимеров зернового сырья / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Л.В. Римарева // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2011. - №2. - С. 18-20.
8. Патент РФ 2355190, кл. A23L 1/30, опубл. 2009 г.