Уровень экспрессии молекул адгезии на лимфоцитах в зависимости от размеров их цитоплазмы

ИММУНОЛОГИЯ

ware for multiple sequence alignment. Comput. Appl. Biosci. 1992; 8 (2): 189-91.

14. Higgins C.S., Murtough S.M., Williamson E. Resistance to antibiotics and biocides among non-fermenting bacteria. Clin. Microbiol. Infect. 2001; 7 (6): 308-15.

15. Ismaeel N.A. Susceptibilities of 97 strains of Xanthomonas malto-philia to antibiotics and the effect of beta-lactamase inhibitors. Microbios. 1997; 91 (367): 97-103.

16. Kataoka D., Fujiwara H., Kawakami T. The indirect pathogenicity of Stenotrophomonas maltophilia. Int. J. Antimicrob. Agents. 2003; 22 (6): 601-6.

17. Kim J., Smathers S.A., Prasad P., Leckerman K.H., Coffin S., Zaoutis T. Epidemiological features of clostridium difficile-associated disease among inpatients at children's hospitals in the United States, 2001-2006. Pediatrics. 2008; 122 (6): 1266-70.

18. Ley B.E., Linton C.J., Bennett D.M., Jalal H., Foot A.B., Millar M.R. Detection of bacteraemia in patients with fever and neutropenia using 16S rRNA gene amplification by polymerase chain reaction. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998; 17 (4): 247-53.

19. Maha I.Z., Tawfik R.E., Muhammed I.Z., Seham M.S., Maggie R.M., Wafaa M.B. Value of 16S rRNA Gene Amplification for Early Detection of Bacteremi a In Immunocompromised Patients. The Journal of American Science. 2014; 10 (1): 165-72.

20. Schaumann R., Stein K., Eckhardt C., Ackermann G., Rodloff A.C. Infections caused by Stenotrophomonas maltophilia - a prospective. Infection. 2001; 29 (4): 205-8.

21. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G. Nei: MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28 (10): 2731-9.

22. Wilkinson F.H., Kerr K.G. Bottled water as a source of multi-resistant Stenotrophomonas and Pseudomonas species for neutropenic patients. Eur. J. Cancer Care (Engl.). 1998; 7 (1): 12-4.

23. Zbinden A., Bottger E.C., Bosshard P.P., Zbinden R. Evaluation of the colorimetric vITEK 2 card for identification of Gram-negative nonfermentative rods: comparison to 16S rRNA gene sequencing. J. Clin. Microbiol. 2007; 45 (7): 2270-3.

Поступила 17.10.16 Принята к печати 29.11.16

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2017 УДК 612.112.94.083

Шерстенникова А.К.1, Кашутин СЛ.1, Николаев в.И.2, Хлопина И.А.1

УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ АДГЕЗИИ НА ЛИМФОЦИТАХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЗМЕРОВ ИХ ЦИТОПЛАЗМЫ

1ГБОУ вПО «Северный государственный медицинский университет», 163000, Архангельск;

2ГБОУ вПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», 195067,

Санкт-Петербург, Российская Федерация

Как известно, лимфоциты являются истинными иммуноцитами, специализированными на распознавании антигена (Аг) в организме. Их поведение в крови регулируется несколькими классами белков адгезии, в том числе селектинами, инте-гринами, иммуноглобулинами. Сведений об уровне экспрессии молекул адгезии на лимфоцитах в зависимости от размеров их цитоплазмы у практически здоровых лиц нет. Цель исследования: определение уровня экспрессии молекул адгезии лимфоцитов в зависимости от размеров их цитоплазмы. В венозной крови на проточном цитометре определяли уровень экспрессии молекул адгезии у 50 человек (22 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 20 до 60 лет, не имеющих хронической патологии в анамнезе. При изучении лимфоцитограммы дифференцировали лимфоциты по величине клетки с учетом размеров цитоплазмы: малые лимфоциты - до 8 мкм, средние - от 8 до 12 мкм, большие - больше 12 мкм. У мужчин наблюдали тенденцию к снижению концентрации лимфоцитов с экспрессированной молекулой L-селектина. Выявлено отсутствие гендерных различий в уровне лимфоцитов с рецептором LFA-1, а также лимфоцитов с молекулой ICAM-1. У мужчин концентрация лимфоцитов с рецептором LFA-3 была выше, чем у женщин, но только в виде тенденции. Отмечался более низкий уровень экспрессии молекулы PECAM-1 у мужчин. Корреляционный анализ между уровнем экспрессии молекул адгезии и концентрацией лимфоцитов, различающихся по размеру цитоплазмы, показал, что при увеличении размеров цитоплазмы лимфоцитов увеличивается количество статистически достоверных корреляций. Большая часть лимфоцитов (67,97%) экспрессировала молекулу LFA-1. Шеддинг молекул L-селектина среди лимфоцитов протекает значительно активнее, чем у моноцитов. При этом к миграции более предрасположены среднеплазменные лимфоциты и большие гранулярные лимфоциты, идентифицированные как естественные киллеры. Однако лимфоциты вступающие в состояние лимфопролиферации, обладают меньшей способностью к адгезии.

К л ю ч е в ы е с л о в а: лимфоциты; молекулы адгезии; размер цитоплазмы лимфоцитов.

Для цитирования: Шерстенникова А.К., Кашутин С.Л., Николаев В.И., Хлопина И.А. Уровень экспрессии молекул адгезии на лимфоцитах в зависимости от размеров их цитоплазмы. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (3): 170-172. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-3-170-172

Sherstennikova A.K.1, Kashutin S.L.1, Nikolaev V.I.2, Khlopina I.A.1

THE LEVEL OF EXPRESSION OF MOLECULES OF ADHESION ON LYMPHOCYTES DEPENDING ON AMOUNT OF THEIR CYTOPLASM

1The Northern state medical university, 163000 Arkhangelsk, Russia

2The I.I. Mechnikov north-Western state medical university, 195067 st. Petersburg, Russia

The lymphocytes are true immunocytes .specialized in discerning antigen in organism. Their behavior in blood is regulated by .several classes of adhesion proteins, including selectin, integrin, immunoglobulin. In healthy humans there is no data concerning level of expression of adhesion molecules on lymphocytes depending on size of their cytoplasm. The study was carried out

Для корреспонденции: Шерстенникова Александра Константиновна, канд. мед. наук, доц. каф. нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Северный медицинский университет», e-mail: a.sherstennikova@yandex.ru

Russian clinical laboratory diagnostics. 2017; 62

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-3-170-172

immunology

to determine level of expression of adhesion molecules of lymphocytes depending on .size of their cytoplasm. The flow cytometer was applied to determine in venous blood level of expression of adhesion molecules in 50 individuals (22 males and 28 females) aged from 20 to 60 years and having no chronic pathology in anamnesis. The analysis of lymphocytogram permitted to differentiate lymphocytes according volume of cell considering size of cytoplasm: small lymphocytes- up to 8 mkm; medium - from 8 to 12 mkm; large - more than 12 mkm. In males a tendency was established concerning decreasing of concentration of lymphocytes with expressed molecule of L-selectin. The absence was detected concerning gender differences in level of lymphocytes with receptor LFA-1 and also lymphocytes with molecule ICAM-1. In males concentration of lymphocytes with receptor LFA-3 was higher than in females but only as a tendency. The lower level of expression of molecule PECAM-1 in males was observed. The correlation analysis between level of expresion of adhesion molecules and concentration of lymphocytes differing in size of cytoplasm, demonstrated that at increasing of size of cytoplasm of lymphocytes increases number of statistically reliable correlations. The shedding of molecules of L-selectin in lymphocytes proceeds significantly more active than in monocytes. At that, medium plasma lymphocytes and large granular lymphocytes identified as natural killers are more predisposed to migration. However, lymphocytes entering condition of lympho-proliferation have less ability to adhesion.

Keywords: lymphocytes; adhesion molecules; size of cytoplasm.

For citation: Sherstennikova A.K., Kashutin S.L., Nikolaev V.I., Khlopina I.A. The level of expression of molecules of adhesion on lymphocytes depending on amount of their cytoplasm. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (3): 170-172. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-3-170-172 For correspondence: SherstennikovaA.K., candidate of medical sciences, associate professor of the chair of normal physiology. e-mail: a.sherstennikova@yandex.ru

Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support.

Received 01.04.2016 Accepted 15.06.2016

Регуляция миграции и расселения иммунокомпетентных клеток в периферических органах, процесса специфического хоминга в лимфоидные органы, участие в клеточном взаимодействии при развитии иммунного ответа - все это относится к функциям молекул адгезии [8].

Как известно, реализация процессов миграции связана с Ь-селектинами, интегринами и молекулами суперсемейства иммуноглобулинов. На первом этапе - непрочной адгезии - в процесс адгезии вступают селектины, в том числе Ь-селектины, экспрессируемые на лимфоцитах, но это не обеспечивает миграцию клеток через эндотелий [9]. Преодоление эндотелиального барьера осуществляется после наступления прочной адгезии при участии двух других групп адге-зинов: интегринов и членов суперсемейства иммуноглобулинов [10]. На лимфоцитах экспрессируются такие важные для преодоления эндотелиального барьера интегрины, как ЬРА-1 и ЬРА-3, взаимодействующие с членами суперсемейства иммуноглобулинов, представленными на эндотелиальных клетках: 1САМ-1, 1САМ-2 и VCАM-1 [1]. За фазой прочной адгезии следует этап собственно миграции лимфоцитов через эндотелий, связанной с экспрессией молекул РЕСАМ [10].

Если миграция лимфоцитов в очаг воспаления достаточно хорошо исследована, то данные об их миграции в ткани в условиях отсутствия антигенной нагрузки, роли которой могут выступать инфекция, химическое или радиационное повреждение, стандартная иммунная нагрузка, единичны и разрозненны [1, 2, 5, 6]. Отсутствуют количественные данные об уровне экспрессии молекул адгезии на лимфоцитах, в том числе в зависимости от размеров их цитоплазмы, поскольку этот критерий может указывать на уровень синтетической активности лимфоцитов и активность бласттрансформации [2]. Кроме того, представляет интерес изучение соотношения уровня экспрессии молекул Ь-селектина и уровня экспрессии молекул фазы прочной адгезии - ЬРА-1, ЬРА-3 и 1САМ-1.

Таким образом, физиологическое осмысление процессов миграции лимфоцитов, а также условий, при которых она может активизироваться или замедляться, является особенно важной для интерпретации резервов стабильности и сохранения гомеостаза.

Материал и методы. Проведено обследование 50 лиц (22 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 20 до 60 лет, не имеющих хронической патологии в анамнезе. Венозную кровь для

исследования брали утром натощак. На проточном цитоме-тре FC-500 фирмы Beckman Coulter определяли экспрессию лимфоцитами молекул L-селектина (CD62L), LFA-1 (CD11a), ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), PECAM-1 (CD31).

На мазке крови, зафиксированном смесью Никифорова и окрашенном по Романовскому-Гимзе, определяли удельный вес лимфоцитов среди других лейкоцитов - эозинофилов, ба-зофилов, нейтрофилов, моноцитов.

При изучении лимфоцитограммы дифференцировали лимфоциты по величине клетки с учетом размеров цитоплазмы: малые лимфоциты - до 8 мкм, средние - от 8 до 12 мкм, большие - больше 12 мкм [6]. Отдельно выделяли популяцию больших гранулярных лимфоцитов, которые являются морфологическими аналогами естественных киллеров [5].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью SPSS 13.0 for Windows. Распределение параметров было ненормальным, в связи с чем описание выборок проводили с помощью подсчета медианы (Md) и межквартильного интервала Q25Q75. Вероятность различий оценивали по непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова.

Результаты и обсуждение. Общее содержание лимфоцитов периферической крови составило 2,56а109 кл/л (2,05; 3,2) при этом молекулу L-селектина экспрессировали 0,32а109 кл/л (0,12; 0,64) лимфоцитов, что составило 11,42% (4,5; 23,38) от общего числа лимфоцитов. У мужчин наблюдали тенденцию к снижению концентрации лимфоцитов с данной молекулой (0,25а109 кл/л (0,13; 0,47) против 0,4а109 кл/л (0,09; 0,71); Z = 0,88; p = 0,4). Молекулу LFA-1 экспрессировали 1,73а109 кл/л (1,15; 2,27) лимфоцитов, что составило 67,97% (44,71; 77,69) от общего их числа. У мужчин и женщин различия в уровне лимфоцитов с рецептором LFA-1 не регистрировались (1,71а109 кл/л (1,26; 2,37) и 1,79а109 кл/л (1,08; 2,26); Z = 0,67; p = 0,75). Среднее содержание лимфоцитов с молекулой ICAM-1 было на уровне 0,29а109 кл/л (0,1; 0,68), что составило 11,56% (4,37; 21,6) от общего числа лимфоцитов, - без существенных гендерных различий (0,24а109 кл/л (0,03; 0,79) против 0,3а109 кл/л (0,11; 0,61); Z = 0,74;p = 0,64). Уровень лимфоцитов, экспрессирующих молекулу LFA-3, был равен 0,91а109 кл/л (0,31; 2,28), что составило 33,02% (12,66; 82,6) от общего числа лимфоцитов. У мужчин концентрация лимфоцитов с рецептором LFA-3 была выше, чем у женщин, но только на уровне тенденции (1,36а109 кл/л (0,4; 2,69) про-

ИММУНОЛОГИЯ

тив 0,91а109 кл/л (0,29; 2,18); Z = 0,55; р = 0,92). Молекулу РЕСАМ-1 экспрессировали в среднем 0,41а109 кл/л (0,13; 0,75) лимфоцитов, что составило 12,56% (3,7; 28,6) от общего числа лимфоцитов с тенденцией к более низкому уровню этих клеток у мужчин (0,33а109 кл/л (0,07; 0,63) против 0,55а109 кл/л (0,19; 0,82); Z = 0,73;р = 0,64).

Малые лимфоциты в структуре лимфоцитограммы составили 26% (16; 37), среднеплазменные - 44% (36; 50), большие - 10 (5; 16,5), большие гранулярные лимфоциты - 16 (12; 23,5).

Корреляционный анализ между уровнем экспрессии молекул адгезии и концентрацией лимфоцитов, различающихся по размеру цитоплазмы, показал, что при увеличении размеров цитоплазмы лимфоцитов увеличивается количество статистически достоверных корреляций. Так, если содержание малых лимфоцитов коррелировало только с содержанием лимфоцитов с рецептором ЬРА-1 (р = 0,38; р = 0,03), концентрация среднеплазменных лимфоцитов уже была связана с концентрацией лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы ЬРА-1 (р = 0,57; р = 0,001), ЬРА-3 (р = 0,43; р = 0,016), и Ь-селектином (р = 0,35; р = 0,013). Подобную ситуацию регистрировали в случае больших гранулярных лимфоцитов, тогда как между уровнем больших лимфоцитов и лимфоцитов, экспрессирующих изучаемые молекулы адгезии, статистически значимых корреляций не было выявлено.

Итак, в условиях отсутствия антигенной стимуляции 11,42% лимфоцитов экспрессируют молекулы Ь-селектина, 67,97% - молекулы ЬРА-1, 11,56% - 1САМ-1, 33,02% - ЬРА-3, 12,56% - РЕСАМ-1. Как известно, Ь-селектин обеспечивает роллинг-эффект, и адгезия, вызванная селектинами, обратима, кратковременна и малоэффективна. Более прочную и необратимую адгезию лимфоцитов на эндотелии обусловливают Р2 интегрины, к которым относится молекула ЬРА-1 [2, 8]. В соответствии с результатами исследования большая часть лимфоцитов экспрессировала эту молекулу - 67,97%, что в 6 раз больше, чем удельная доля лимфоцитов, экспрессирую-щих молекулу Ь-селектина (11,42%). Для сравнения, соотношение уровней экспрессии молекул ЬРА-1 и Ь-селектина у нейтрофилов составило 1,5, а моноцитов 2,3 [3, 4]. Кроме того, учитывая статистически достоверные корреляции между уровнем среднеплазменных лимфоцитов, а также больших гранулярных лимфоцитов и уровнем экспрессии молекул ЬРА-1, ЬРА-3, можно полагать, что к миграции более предрасположены именно среднеплазменные лимфоциты и большие гранулярные лимфоциты, идентифицированные как естественные киллеры. Напротив, между концентрацией больших лимфоцитов статистически достоверных корреляций выявлено не было. А поскольку уровень больших лимфоцитов может указывать на активность лимфопролифе-рации в периферической крови, создается впечатление, что лимфоциты, вступающие в состояние лимфопролиферации, обладают меньшей способностью к адгезии [1].

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Добродеева Л.К. Грипп и ОРЗ, иммунологическая реактивность коренного и пришлого населения Севера Европейской территории СССР: Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. Архангельск; 1989.

2. Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Рыжкова А.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки. Вестник новых медицинских технологий. 2009; 16 (2): 14-6.

3. Кашутин С.Л., Пустынная М.В., Гудков А.Б., Данилов С.И., Ключарева С.В., Пирятинская В.А. Уровень экспрессии молекул адгезии на моноцитах, в зависимости от морфологической диф-ференцировки их ядер. Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 59 (10): 21-2.

4. Кашутин С.Л., Данилов С.И., Верещагина Е.Н. Уровень экспрессии молекул адгезии на нейтрофилах, в зависимости от сегментации их ядер. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; (11): 45-8.

5. Пичугина Л.В. Изменение фенотипа лимфоцитов при неимму-нодефицитных патологиях. Лабораторная медицина. 2008; (9): 39-44.

6. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция. М.: Медицина; 1976.

7. Филиппова О.Е., Добродеева Л.К., Щеголева Л.С., Шашкова Е.Ю. Соотношение фенотипов лимфоцитов периферической крови у людей в процессе физиологической регуляции иммунного ответа. Вестник Северного (Арктического) федерального университета. Серия: Медико-биологические науки. 2014; (4): 73-80.

8. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. СПб.; 1998.

REFERENCES

1. Dobrodeeva L.K. Influenza and Respiratory Diseases, the Immunological Reactivity of the Radical and Alien Population of the North European Part of the USSR: Diss. Arkhangel'sk; 1989.

2. Dolgushin I.I., Andreeva Yu.S., Ryzhkova A.I. Neutrophil extracellular traps. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2009; 16

3. Kashutin S.L., Pustynnaya M.V., Gudkov A.B., Danilov S.I., Kly-uchareva S.V., Piryatinskaya V.A. The level of adhesion molecules expression on monocytes depending on their morphological differentiation of nuclei. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2014; 59

4. Kashutin S.L., Danilov S.I., Vereshchagina E.N. The level of adhesion molecules expression on neutrophils depending on their nuclei segmentation. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2013;

5. Pichugina L.V. Change phenotype of lymphocytes non-immunode-ficient pathologies. Laboratornaya meditsina. 2008;

6. Fedorov N.A. NormalHematopoiesis and its Regulation [Normal'noe krovetvorenie i ego regulyatsiya]. Moscow: Meditsina; 1976.

7. Filippova O.E., Dobrodeeva L.K., Shchegoleva L.S., Shashkova E.Yu. The ratio of the peripheral blood lymphocyte phenotypes in humans in the physiological regulation of the immune response. Vestnik Severnogo

8. Freydlin I.S., Totolyan A.A. Cells of the Immune System [Kletki im-munnoy sistemy]. St. Petersburg; 1998.

9. Albert-Wolf М., Meuer S.C., Wallich R. Dual function of recombinant human CD58: inhibition of T cell adhesion and activation via CD2 pathway. Int. Immunol. 1991; 3 (12): 1335-47.

10. Koopman G., Keehnen R.M., Lindhout E., Newman W., Shimizu Y., van Seventer G.A. et al. Adhesion through the LFA-1 (CDIIa/ CD18)-ICAM-1 (CD54) and the VLA-4 (CD49d)-VCAM-1 (CD 106) pathways prevents apoptosis of germinal center В cells. J. Immunol. 1994; 152 (8): 3760-7.

Поступила 01.04.16 Принята к печати 15.06.16