Штамм гибридных культивируемых клеток H.sapiens/Mus musculus 8D4E9-Ba-LF-продуцент человеческих моноклональных антител против летального фактора возбудителя сибирской язвы
STRAIN OF HYBRID CULTURED CELLS OF HOMO SAPIENS / MUS MUSCULUS 8D4E9-BA-LF-PRODUCER OF HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST LETHAL FACTOR OF ANTHRAX AGENT

Изобретение относится к области биотехнологии, биоинженерии, биохимии, лабораторных медицинских исследовании может быть использовано для получения моноклональных антител, способных нейтрализовать летальный токсин возбудителя сибирской язвы. Заявлен штамм тригибридной клеточной линии с авторским названием 8D4Е9-Ва-LF, продуцирующейодноименные человеческие моноклональные антитела 8D4E9-Ba-LF, специфичные к летальному фактору (ЛФ) возбудителя сибирской язвы, способные к нейтрализации летального токсина Bacillusanthracis в тесте invitro на клеточной модели. Штамм тригибридной клеточной линии 8D4E9-Ва-LF задепонирован в ГКПМ-Оболенск под авторским названием 8D4E9-Ba-LF, штамму присвоен регистрационный номер Н-79.
Сибирская язва, особо опасное инфекционное заболевание человека и сельскохозяйственных (преимущественно копытных) животных, отнесенное по российской классификации ко II группе патогенности [СП 1.3.3118-13], обусловлено попаданием в организм бактерий (или спор бактерий) вирулентных штаммов Bacillus anthracis. Патогенность сибиреязвенного микроба связывают с продукцией токсина и капсульной субстанции[Mock М., Fouet A. //Ann. Rev. Microbiol. - 2001. - Vol. 55. - №. 1. - P. 647-671.]. Токсин возбудителя сибирской язвы состоит из трех самостоятельных белков - протективного антигена (ПА), летального фактора (ЛФ) и отечного фактора (ОФ). Токсичность обусловлена бинарным взаимодействием ПА+ЛФ и ПА+ОФ[SpencerR. С. //J.Clin.Pathol. - 2003. - Vol. 56. - №. 3. - P. 182-187.].Считается, что за клеточную токсичность, ассоциированную с сибиреязвенной инфекцией, в основном ответственен летальный фактор (в сочетании с ПА), гидролизирующий внутриклеточные субстраты клеток организма хозяина [Hanna, Р. // J.Appl.Microbiol. - 1999. - Vol. 87, - №. 2. - P. 285-287.]. Летальный фактор также способен вызывать разрушение сосудов и гипоксию. Характерный плевральный выпот и некроз печени, селезенки и костной ткани также связывают с гипоксией, вызываемой летальным фактором [A.M. Firoved, G.F. Miller, M. Moayerietal. // Amer. J. Path. - 2005. - Vol. 167. - №. 5. - P. 1309-1320.].
В Российской Федерации, как и во всем мире, ежегодно регистрируются случаи заболевания сибирской язвой, выявляются неблагоприятные по сибирской язве районы и сельскохозяйственные животные пункты. В течение последних лет эпидемиологическая ситуация в отношении природно-очаговых и зооантропонозных инфекций остается напряженной: в период 2014-2016 гг. было зарегистрировано увеличение количества случаев заражения сибирской язвой среди населения РФ [О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2016 году: Государственный доклад. - М: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2017.-220 с.]
В 2015 году зарегистрировано 3 случая в Саратовской области [Сообщение Роспотребнадзора «Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-декабрь 2015 года» http://www.rospotrebnadzor.ru/activities/statistical-materials/statictic_details.php?ELEMENT_ID=5525], в июле-августе 2016 года на территории Ямальского района Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО) была отмечена эпизоотия сибирской язвы, приведшая к формированию самого крупного очага сибирской язвы за последние 30 лет - заболело 36 человек, в том числе 18 детей. На территории ЯНАО выявлено до 60 стационарно неблагополучных пунктов (СНП) общей площадью 2 млн га, на которых в период с 1848 по 1941 год зарегистрировано 68 эпизоотий. Всего на территории Российской Федерации зарегистрировано свыше 35 тысяч стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов (СНП) РФ [О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2016 году: Государственный доклад - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2017.-220 с.]. В 2018 году выявлена вспышка сибирской язвы в Республике Тыва [сообщение Роспотребнадзора от 14.09.2018 г. «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях за январь-июль 2018», http://rospotrebnadzor.ru/activities/statistical-materials/statictic_details.php?ELEMENT_ID=10635]. Также стоит иметь ввиду сложившуюся эпидемиологическую ситуацию по заболеваемости сибирской язвой в странах, граничащих с РФ. Так, в 2018 году крупная вспышка сибирской язвы произошла в Китае (106 случаев по состоянию на 16.08.2018 г.), сообщалось о случаях заболевания в Казахстане и Украине [сообщения Роспотребнадзора от 16.08.2018 г. и 05.10.2018 http://rospotrebnadzor.ru/about/info/news/news_details.php?ELEMENT_ID=10719&sphrase_id=1493172].
Антибиотикотерапия сибирской язвы достаточно эффективна в случае ее применения на ранних стадиях заболевания, однако неспособна предотвратить проявление токсических эффектов при развитом заболевании, поскольку токсины, продуцируемые В. anthracis, начинают циркулировать в крови, начиная с первых часов заболевания [Thullier P. et al. Mapping the epitopes of a neutralizing antibody fragment directed against the lethal factor of Bacillus anthracis and cross-reacting with the homologous edema factor. - 2013.]. Также эффективность применения антибиотиков зависит от резистентности штамма и оптимального выбора протокола терапии.
Вспышка сибирской язвы на территории РФ в 2016 году показала наличие нерешенных вопросов, связанных с диагностикой, лечением и эпидемиологическим надзором за природными очагами сибирской язвы. В частности, одной из проблем является приостановление производства иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного и отсутствие разработок сибиреязвенного антитоксина на территории РФ [Шестакова И.В. // Журнал инфектологии. - 2016. - Т. 8. - №3. - С. 5-27.].
Известно множество разработок, связанных с конструированием антител или фрагментов антител, проявляющих способность к связыванию одного или нескольких основных факторов патогенности В. anthracis, в том числе токсинов возбудителя [Irenge L. М., Gala J. L. // App.Microbiol. Biotechnol. - 2012. - Vol.93. - №. 4. - P. 1411-1422.]. Основное применение антитела нашли в приложениях для детекции возбудителя и его факторов патогенности.
Иммунобиологические (антительные) препараты возможно применять в терапии сибиреязвенной инфекции в комбинации с антибиотикотерапией для купирования развития токсических эффектов. В РФ разрешено к использованию применение иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного (пр-ва33 ЦНИИИ Министерства обороны РФ). Между тем, использование данного препарата связано с опасностью возникновения анафилактического шока как реакции на введение гетерогенных белков, поэтомуперед началом терапии требуется обязательное проведение пробы на чувствительность. Иные препараты для иммунотерапии сибирской язвы в настоящее время отсутствуют.
Избежать анафилактических реакций можно, применив для лечения гомологичные, то есть человеческие иммуноглобулины. Известна наиболее близкая к предлагаемому изобретению разработка, которая описывает производство моноклональных человеческих антител в гибридных клетках, полученных электрослиянием с лимфоцитарной фракцией крови иммунизированных людей. Полученные антитела проявляют способность к нейтрализации ПА и ЛФна клеточной модели, а также проявляют протективные свойства при введении их мышам до инфицирования спорами В. anthracis [AlbrechtM. T.,LiH.,WilliamsonE. D. Etal. // Infect. Immun. - 2007. - Vol.75. - №. 11. - P. 5425-5433.].
Техническим результатом предлагаемого изобретения является перевиваемая линия тригибридных клеток 8D4E9-Ba-LF, производящая одноименные человеческие моноклональные антитела (чМКАт8D4E9-Ba-LF), способные к нейтрализации летального фактора возбудителя сибирской язвы на клеточной модели invitro и при пассивной иммунизации мышей.
Технический результат достигается тем, что предложен штамм гибридных культивируемых клеток H.sapiens/Mus musculus 8D4E9-BA-LF - продуцент человеческих моноклональных антител против летального фактора возбудителя сибирской язвы.
Штамм гибридных культивируемых клеток H.sapiens/Mus musculus 8D4E9-Ba-LF - продуцент человеческих моноклональных антител против летального фактора возбудителя сибирской язвы депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер Н-79.
Характеристика штамма тригибридной клеточной линии 8D4E9-Ba-LF.
Видовая принадлежность: тригибридома мышь-человек-человек. Материал, используемый для получения гибридомы: плазмобластная фракция из цельной венозной крови донора, иммунизированного против возбудителя сибирской язвывакциной сибиреязвенной живой сухой для подкожного и скарификационного применения СТИ-1 (Минобороны РФ, Россия). Партнер для гибридизации - клетки гетерогибридомы K6H6/В5 (АТСС CRL-1823™), полученной слиянием клетки мышиной миеломы P3/NSI/1-Ag4-1 с малигнизированной клеткой человека, больного нодулярной лимфомой.
Система селекции гибридных клеток - HAT. Кратность клонирования - однократно.
Морфологическая характеристика. Культура тригибридных клеток 8D4E9-Ba-LF представлена слабо прикрепленными к подложке округлыми клетками размером с исходную гетерогибридому K6H6/В5. Характер роста на питательных средах: рост суспензионный, культивирование стационарное и динамическое в шейкере-инкубаторе с орбитальным движением платформы.
2
Культуральные свойства. Культивирование в питательной среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10% бычьей фетальной сыворотки (ФБС), при температуре 37°С, 5% СО и влажности 80%. Кратность рассева 1:2-1:3, время субкультивирования 3-4 сут., посевная доза 50-100 тыс. кл./мл. Культивирование штамма производится при температуре 37°С в атмосфере 5% углекислого газа.
Продуктивность гибридной клеточной линии invitro. Титр иммуноглобулинов в культуральной жидкости после культивации в инкубаторе в колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks, анализированный в твердофазном ИФА - не менее 1:512 тыс. Концентрация иммуноглобулинов составляет в среднем 0,2-0,4 мг/мл.
Контаминация штамма гибридных клеток. Проведеноисследование методом RT-PCR на выявление микоплазмы - не обнаружено; бактериологический посев на выявление бактерий, грибов - не обнаружены; проверка на вирусы - не проводилась.
Способ, условия и состав сред для криоконсервации:
A) среда для криоконсервации - 90% фетальной сыворотки, 10% диметилсульфоксида;
8
Б) режим замораживания - пластиковыефлаконы (виалы) с культурой клеток, по 2×10 кл./мл защитной среды в каждом флаконе, замораживают в заданном режиме:
1) со скоростью 1°С/мин до -70°С.
2) через сутки виалы перемещают в хранилище с жидким азотом.
B) режим размораживания - выполняют на водяной бане при 37°С в течение 2-3 минут. Виалы асептически вскрывают, содержимое переносят в центрифужную пробирку с 7-8 мл бессывороточной среды, центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин, супернатант отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде культивирования и переносят в лунки 12-луночного планшета или культуральный флакон с суточным фидерным слоем клеток.
Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.
Характеристика полезного продукта. Полученный штамм тригибридных клеток 8D4E9-Ba-LF производит высокоспецифичные человеческие моноклональные антитела подкласса IgGl к белку летальному фактору Bacillusanthracis, проявляющие активность в непрямом твердофазном ИФА не менее 1:512 тыс. Моноклональные антитела из культуральной жидкости выделяют путем аффинной хроматографии на колонке с ProteinG сефарозой, с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 10/300 GL. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают методом электрофореза в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяют методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм, а также с использованием инфракрасного спектрометра DirectDetect (Merck, Германия).
Изобретение осуществляют следующим образом:
Из образцов сыворотки крови (отобранных не позднее 2 месяцев после вакцинации) людей-доноров, иммунизированных против возбудителя сибирской язвы живой аттенуированной вакциной СТИ-1, содержащей споры Bacillusanthracis, методом аффинной хроматографии на сорбенте с белком G выделяют фракцию IgG, которую затем тестируют в иммуноферментном анализе (ИФА) в отношении специфичности определения ЛФB.anthracis.
Выделенные фракции иммуноглобулинов класса G(IgG) тестируют также invitro в тесте на нейтрализацию летального токсина, составленного из рекомбинантных белков протективного антигена и летального фактора В. anthracis, с использованием в качестве тестового объекта макрофагальной мышиной линии клеток J774. Образец крови, фракция иммуноглобулинов которого показала наилучшие результаты в тесте на нейтрализацию летального токсина, используют для дальнейшей работы по гибридизации фракции плазмобластов с миеломной линией клеток.
Для дальнейшей работы вновь проводят забор крови у ревакцинированного донора, чей образец сыворотки показал наилучшие результаты тестов. Забор крови проводят на 7-8 день после ревакцинации. Выделяют фракцию лимфоцитовпериферической крови, затем проводят выделение В-лимфоцитов методом негативного розеттинга.
+
lo
hi
hi
Фракцию плазмобластов в составе В-лимфоцитарной массы метят антителами, конъюгированными с флуорофорами, специфичными к мембранным антигенам плазмобластов, что позволяет выделить популяцию плазмобластов с использованием клеточного сортера FACSAriaIII (BD, США). Методом многократного гейтирования выделяют фракцию плазмобластов с фенотипом CD19CD20CD27CD38. Далее по заданному гейту осуществляют сортинг данной субпопуляции в пробирки со средой, содержащей 20% сыворотку.
В качестве партнера для гибридизации используют линейную гибридную культуру клеток гетерогибридомы K6H6/В5 (АТСС CRL-1823™). Плазмобластные клетки и клетки гетерогибридомы смешивают в соотношении 1:1, отмывают чистой культуральной средой RPMI-1640, затем буфером для электрослияния, в котором впоследствии ресуспендируют клетки. Электрослияние проводят в мультипораторе ЕСМ2001 (ВТХ, США) с использованиеммикрослайда для слияния Model 453 (ВТХ, Harvard Bioscience, США) в режиме, включающем три стадии: выравнивание, импульс, пост-выравнивание.
По окончании процедуры слияния суспензию клеток в слайде выдерживают 30 минут при комнатной температуре, переносят в питательную среду Hybri-Care (АТСС 46-Х™) с 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия), однократным раствором гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT) (Gibco21060-017, Thermo Fisher, США) и вносят по 100 мкл полученной суспензии в лунки 96-луночных культуральных планшетов. Инкубируют клетки с заменой селективной культуральной среды раз в трое суток до появления видимого роста гибридных клеток в лунках, а затем и монослоя.
Культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдается рост гибридных клеток, тестируют в ИФА в отношении специфического взаимодействия с ЛФB. anthracis. Клетки из лунок, показавших наилучшую активность в отношении антигена, подвергают клонированию. Единичные клоны тригибридом наращивают в увеличивающихся объемах среды в культуральных флаконах, перманентно тестируя культуральую жидкость на наличие антител, специфически взаимодействующих с ЛФ в ИФА.
Полученные клоны тригибридом наращивают с масштабированием: в культуральных флаконах Corning Т-25 и Т-75, затем в качалочных колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks (Thomson, США), после чего выделяют из культуральной жидкости фракцию IgG, применяя аффинную хроматографию на сорбенте с белком G.
Выделенные IgG(чМКАт) тестируют на предмет специфической активности в отношении рекомбинантного белка ЛФ возбудителя сибирской язвы, определяют параметры аффинности.
Проверяют отобранные клоны антител в in vitro тесте по нейтрализации летального токсина В. anthracis с применением модели на линии клеток J774. Отбирают клоны антител, наиболее эффективно блокирующие токсическую активность летального токсина В. Anthracis в модельном тесте.
Клоны антител, показавшие лучшие результаты в клеточном модельном тесте, проверяют на способность к нейтрализации токсина in vivo - проводят пассивную иммунизацию мышей с последующим введением мышам летального токсина В. Anthracis в дозе 4 LD50.
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:
Фиг. 1. Результаты электрофореза в 10%-ом ПААГ в денатурирующих условиях образца IgG, выделенных из сыворотки крови иммунизированного против возбудителя сибирской язвы донора.
Дорожка 1. Mapкep мoлeкyляpныx мacc PageRuler™ Prestained Protein Ladder SM0671 (Fermentas, США).
Дорожка 2. Образец IgG сыворотки крови. Окраска геля кумасси R-250.
Фиг. 2. Результаты тестирования в ИФА специфической активности образцов IgG, выделенных из сывороток крови доноров, иммунизированных против возбудителя сибирской язвы,в отношении летального фактораB. anthracis в ИФА.
Жирным шрифтом выделены предельные концентрации антител, определяющиеся в ИФА. Цветом выделены результаты образцов, показавших наилучший результат и выбранные для дальнейшей работы.
Фиг. 3. Схема внесения компонентов для тестирования нейтрализующей активности IgG в тесте invitro на клеточной модели в отношении летального токсина В. Anthracis и результаты измерения оптической плотности для образца IgG №4 после проведения модельного клеточного теста на нейтрализацию токсического действия летального токсина В. anthracis.
Фиг. 4. Результаты вестерн-блот анализа человеческих моноклональных антител 8D4E9-Ba-LF в отношении рекомбинантного белка летального фактора В. anthracis.
Дорожка 1. Маркер молекулярных масс PageRuler™ Prestained Protein Ladder SM0671 (Fermentas, США). Дорожка 2. ЛФ, детектированный моноклональными антителами 8D4E9-Ba-LF.
Фиг. 5. Результаты измерения оптической плотности для чМКАт 8D4E9-Ba-LF после проведения модельного клеточного теста на нейтрализацию токсического действия летального токсина В. anthracis.
Фиг. 6. Результаты эксперимента по нейтрализации летального токсина invivo при заражении лабораторных животных споровой культурой В. anthracisc использованием чМКАт 8D4E9-Ba-LF.
Примеры получения и использования чМКАт8D4E9-Ba-LF, синтезируемых штаммом тригибридной клеточной линии 8D4E9-Ba-LF.
Пример 1. Выделение фракции иммуноглобулинов класса G из сыворотки людей-доноров, иммунизированных против возбудителя сибирской язвы.
От 10 людей - доноров, иммунизированных против возбудителя сибирской язвы живой аттенуированной вакциной СТИ-1, содержащей споры Bacillus anthracis, методом венозной пункции получают образцы крови. Образцы объемом 20 мл собирают в центрифужные пробирки и отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования тромба. Центрифугируют пробирки при 1200gв течение 10 минут, после чего отбирают сыворотку крови в чистые пробирки. При необходимости повторяют центрифугирование.
Белки сыворотки крови осаждают добавлением равного объема насыщенного раствора сульфата аммония. Выдерживают при температуре 4-8°С в течение 1 часа, затем центрифугируют при 1000g в течение 15 минут. Супернатант удаляют, осадок растворяют в буфере нанесения состава 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, рН 7,6.
Колонку, упакованную сорбентом ProteinGSepliarose 4 FastFlow (GEHealthcare, Великобритания) уравновешивают буфером нанесения, промывают элюирующим буфером (50 мМ Трис-НСд, 100 мМ NaCl, 50 мМ глицина, рН 2,4) и вновь уравновешивают буфером нанесения. Наносят образец на колонку со скоростью 1 мл/мин при постоянном охлаждении колонки и образца. Отмывают колонку буфером нанесения до достижения состояния равновесия. Элюируют белок, нанося буфер для элюции на скорости 1 мл/мин. Собирают очищенный образец IgG в пробирку и немедленно доводят рНраствора до 7,4-7,6 добавлением 1М раствора Трис, рН 11,0.
2
4
2
4
3
Выделенные иммуноглобулины переводят в фосфатно-солевой буфер (ФСБ; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ NaHPO, 1,8 мМ KHPO, рН 7,4) методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 (GEHealthcare, Великобритания). Хранят раствор иммуноглобулинов в ФСБ с добавлением 0,1% NaNпри температуре 4-8°С.
Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях по методу Лэммли (Фиг. 1).
Пример 2. Тестирование специфической активности IgGв отношении летального фактора В. anthracis в ИФА.
На поверхности лунок поликарбонатного планшета иммобилизуют рекомбинантный белокЛФ В. anthracis. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора белкав концентрации 0,05 мг/мл, инкубируют в течение 2,5 часов при температуре 37°С и перемешивании на орбитальном шейкере на скорости 300 об/мин. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета ФСБ с добавлением 0,05% Твин-20 (ФСБ-Тв). Свободные валентности пластика блокируют обезжиренным (содержание жира не более 0,5%) молоком, внося его в объеме 250 мкл в лунку. Блокировку проводят в течение 40 мин при температуре 37°С и перемешивании, после чего трехкратно отмывают с использованием ФСБ-Тв.
Фракции IgG в ФСБ с начальной концентрацией 10 мкг/лунку титруют двукратным шагом по вертикали до конечной концентрации 0,07 мкг/лунку (по 100 мкл/лунку в ФСБ). В лунки А1 и В1 вносят чистый ФСБ, лунки считают отрицательным контролем. В лунках C1 и D1 располагают положительный контроль, который представляет собой коммерчески доступные моноклональные мышиные антитела к летальному фактору возбудителя сибирской язвы (Abcam, США) в концентрации 1 мкг/лунку.
Планшет инкубируют в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°С, затем четырехкратно промывают ФСБ-Тв. В лунки планшета добавляют по 100 мкл конъюгата антител с пероксидазой хрена (Sigma, США) в разведении 1:5000 в ФСБ: в лунки, инкубированные с мышиными антителами, вносят конъюгат кроличьих антител против IgG мыши, в лунки, инкубированные с человеческими антителами, вносят конъюгат козьих антител против IgG человека. После часовой инкубации и четырехкратной отмывки планшета во все лунки вносят по 50 мкл субстратной смеси (готовый раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, Amresco). Планшет помещают на 3-5 минут в темное место, затем останавливают реакцию 4N серной кислотой (50 мкл/лунку).
Учет результатов проводят с помощью планшетного спектрофотометра xMark(Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Положительным считают результат, превышающий показатели оптической плотности отрицательного контроля не менее, чем в 2 раза.
Из 10 образцов для дальнейшей работы по результатам ИФА с фракциями IgG отбирали 4 образца, продемонстрировавшие наивысший титр антител к токсину. Результаты представлены на Фиг. 2.
Пример 3. Проведение модельного теста in vitro на нейтрализацию летального токсина возбудителя сибирской язвы иммуноглобулинами класса G, выделенными из образцов сывороток людей, иммунизированных противB. anthracis.
4
2
2
Клетки макрофагальной линии J774 разносят в лунки 96-луночного планшета в количестве 5,0×10 кл./лунку в общем объеме 80 мкл культуральной среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Выдерживают клетки в течение 2 часов в СО-инкубаторе при температуре 37°С и содержании СОне менее 5% для прикрепления клеток ко дну лунки планшета.
Количество лунок рассчитывают, исходя из того, что на тестирование одной пробы требуется 30 лунок:
1) Летальный токсин (рекомбинатный протективный антиген (рПА) в концентрации 10 нг/мл + рекомбинантный летальный фактор (рЛФ) в концентрации 2 нг/мл) с добавлением IgG в концентрации 0,1 мг/мл;
2) IgG в концентрации 0,1 мг/мл (контроль пирогенности антител);
3) Летальный токсин с добавлением IgG в концентрации 0,01 мг/мл;
4) IgG в концентрации 0,01 мг/мл (контроль пирогенности антител);
5) Летальный токсин с добавлением IgG в концентрации 0,001 мг/мл;
6) IgG в концентрации 0,001 мг/мл (контроль пирогенности антител);
7) Летальный токсин (контроль токсичности, Ктокс);
8) Лунки с добавлением мертиолята натрия (положительный контроль сравнения, К+);
9) Лунки без добавления токсина или антител (отрицательный контроль сравнения, К1-);
10) Пустые лунки без клеток со средой культивирования (отрицательный контроль фонового сигнала от материала планшета, К2-).
Все исследуемые точки дублируются - исследования проводят не менее чем в трех повторностях (Фиг. 3).
Компоненты летального токсина - рПА и рЛФ, - предварительно подготавливают, переводя белки в рабочий буфер диализом против буфера для тестирования токсической активности: 50 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, рН 7,6.
Итоговую концентрацию антител и токсина определяют на инфракрасном спектрометре DirectDetect (Merck, Германия).
Во всех лунках планшета с культурой клеток J774 культуральную среду DMEM-ФБС заменяют на свежую DMEM в объеме 60 мкл. В лунки планшета, содержащие культуру клеток линии J774, добавляют образцы по схеме, указанной на Фиг. 3. Объем добавляемого раствора токсина составляет 20 мкл в буфере для тестирования токсической активности, объем раствора антител с заданной концентрацией - также 20 мкл в буфере для тестирования. При отсутствии в точке нанесения одного из компонентов, доводят общий объем раствора в лунке до 100 мкл чистым буфером для тестирования токсической активности. В качестве положительного контроля сравнения задействуют лунки планшета с клетками, из которых отбирают 50 мкл среды для культивирования DMEM и добавляют по 50 мкл 10%-ого раствора мертиолята натрия.
Общий заполненный объем во всех тестируемых лунках составляет 100 мкл.
2
2
Инкубируют планшет в течение 4 часов в СО-инкубаторе при температуре 37°С и содержании СОне менее 5%.
По окончании инкубации из каждой лунки планшета с помощью автоматической 8-канальной пипетки удаляют жидкость. Вносят во все задействованные в тесте лунки планшета по 50 мкл окрашивающего раствора (0,5%-ый раствор генцианвиолета с 25%-ым содержанием метилового спирта), инкубируют на орбитальном планшетном шейкере в течение 5-7 минут при скорости вращения платформы 300 об/мин.
Окрашивающий раствор полностью отбирают и проводят четырехкратную отмывку с применением ФСБ по 200 мкл/лунку. Вносят в каждую лунку по 250 мкл отмывающего раствора (100 мМ цитрата натрия с 50%-ым содержанием этилового спирта), инкубируют на орбитальном планшетном шейкере в течение 30 минут при скорости вращения платформы 300 об/мин.
Далее проводят измерение оптической плотности тестируемых лунок спектрофотометрическим методом на планшетном спектрофотометрех Mark (Bio-Rad, США) при длине волны 595 нм. В лунках с положительным контролем сравнения наблюдается полная гибель всех клеток, что соответствует минимальным фоновым значениям оптической плотности OD=0,2-0,4. Показатели оптической плотности лунок отрицательных контролей фонового сигнала окраски планшета находятся в пределах OD=0,1-0,2, что указывает на неспецифическую окраску пластика планшета. Отрицательный контроль сравнения с живыми клетками, а также контроли пирогенности антител имеют показатели оптической плотности не менее OD=1,0.
Результаты тестирования нейтрализующей активности одного из образцов представлены на Фиг. 3.
На основании полученных данных о специфической и нейтрализующей invitro активности для дальнейшей работы отбирали образцы двух иммунизированных доноров. Для получения лимфоцитарной фракции крови у избранных доноров отбирают свежую порцию цельной венозной крови через 7 дней после ревакцинации.
Пример. 4. Получение и подготовка плазмобластной фракции из цельной венозной крови иммунизированного против возбудителя сибирской язвы донора.
К 40 мл свежезабранной дефибринированной и обработанной антикоагулянтом венозной крови добавляют 20 мл ФСБ, перемешивают пипетированием. Медленно наслаиваюткровь поверх 40 мл Ficoll-PaquePLUS (GEHealthcare, Великобритания). Центрифугируют смесь в течение 40 минут при температуре 20°С и 400g, разгон центрифуги устанавливают на минимальные значения и отключают произвольное торможение.
Пипеткой переносят лимфоцит-содержащую фракцию (расположенную под фракцией плазмы крови мутную фракцию) в чистую центрифужную пробирку, разбавляют 10 мл ФСБ, затем трижды отмывают центрифугированием в течение 10 мин при 100g и охлаждении до 8°С, каждый раз ресуспендируя осадок в 10 мл ФСБ. Удаляют супернатант, осадок лимфоцитов суспендируют в 10 мл стерильного охлажденного ФСБ.
Для выделения В-лимфоцитов применяют набор для негативной селекции RosetteSep™ HLA В Cell Enrichment Cocktail (StemCellTech, США). Все реагенты прогревают до комнатной температуры. К суспензии лимфоцитов добавляют смесь антител RosetteSep™ HLA Cocktail до концентрации 40 мкл/мл суспензии. Инкубируют смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляют к смеси равный объем ФСБ с содержанием фетальной бычьей сыворотки 2%. Наслаивают поверх смеси среду для создания градиента плотности (density gradient medium) - 1,5 объема от изначальной суспензии лимфоцитов до разведения. Центрифугируют в течение 20 минут при ускорении 1200g и комнатной температуре без использования произвольного торможения ротора. Отбирают обогащенный слой клеток, расположенный поверх градиента плотности, созданного density gradient medium. Дважды отмывают клетки ФСБ с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки.
6
Выделенные В-лимфоциты (6×10 кл/мл) окрашивают моноклональными антителами, меченными флюорохромами (ВВ515, АРС-Н7, АРС, SF 594), к поверхностным маркерам: CD19, CD20, CD27, CD38 (все производства eBioscience, США). К 100 мкл анализируемой клеточной взвеси добавляют по 1 мкл моноклональных антител. Инкубируют в темноте 30 мин при комнатной температуре. Добавляют 1 мл ФСБ с 2% ФБС и центрифугируют при скорости 400g в течение 5 мин. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 200 мкл ФБС с 2% ФБС.
+
lo
hi
hi
С помощью системы для клеточного сортинга FACSAria III (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0) методом многократного гейтирования выделяют фракцию плазмобластов с фенотипом CD19CD20CD27CD38. Далее по заданному гейту осуществляют сортинг данной субпопуляции в пробирку с охлажденной питательной средой RPMI-1640.
7
Отделенные плазмобласты дважды промывают чистой охлажденной средой RPMI-1640 в объеме 10 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 300g и охлаждении до 8°С.Суспендируют осадок клеток в чистой RPMI-1640, проводят подсчет концентрации клеток с применением автоматического счетчика клеток ТС-20 (Bio-Rad, США), доводят концентрацию чистой культуральной средой до 1×10 кл/мл.
Пример. 5. Получение гетерогибридом, продуцирующих антитела, имеющие специфическую и нейтрализующую активность в отношении летального фактора возбудителя сибирской язвы.
В качестве партнера для гибридизации с плазмобластами используют линейную культуру гетерогибридомы K6H6/В5 (АТСС CRL-1823™), полученной слиянием клетки мышиной миеломы P3/NSI/1-Ag4-1 с малигнизированной клеткой человека, больного нодулярной лимфомой. Клетки K6H6/В5 культивируют в среде RPMI-1640 с содержанием2 мМ L-глутамина и ФБС 10%. Для слияния берут клетки, находящиеся в фазе экспоненциального роста. Для этого культивируют клетки K6H6/В5 после размораживания или пересева в новый флакон не менее 24 часов. Перед электрослиянием клеточный монослой К6Н6/В5 снимают с поверхности культурального флакона с помощью раствора 0,05% раствора трипсина с ЭДТА (Gibco, ThermoFisher).
7
Плазмобласты и клетки миеломной линии суспендируют, собирают взвесь и помещают в отдельные центрифужные пробирки. Центрифугируют клетки при комнатной температуре при 200g в течение 10 мин, а затем трижды ресуспендируют в буфере для электрослияния BTXpress Cytofusion Medium С (ВТХ, Harvard Bioscience, США) и центрифугируют. После отмывки клетки подсчитывают на автоматическом счетчике клеток ТС20™ (Bio-Rad, США), одновременно определяя жизнеспособность с помощью 0,4% раствора трипанового синего, смешивают. Для оценки процедуры электрослияния используют 600 мкл буфера для электрослияния с равным содержанием клеток линии К6Н6/В5 и В-лимфоцитов, по 1⋅10клеток. При необходимости оставляют клетки в буфере при 37°С до проведения процедуры слияния, но не более, чем на 30 мин.
2
Заранее готовят 96-луночный культуральный планшет, в 60 центральных лунок которого помещают по 100 мкл культуральной среды с фидерными макрофагальными клетками мыши, и прогревают в CO-инкубаторе при 37°С. Краевые лунки заполняют 1%-ым раствором сульфата меди для предотвращения контаминации.
Электрослияние проводят в мультипораторе ЕСМ2001 (ВТХ, США) в микрослайдеМоdеl 453 (ВТХ, HarvardBioscience, США)при условиях, описанных ниже. Пре-электропорационный диэлектрофорез клеток (линейное выстраивание клеток, плотно соприкасающихся мембранами, перпендикулярно электродам) осуществляют при среднеквадратичном значении напряжения 50 В в течение 30 с, затем подают два прямоугольных импульса напряжением 500 В продолжительностью 30 мкс каждый (электропорация), после чего проводят пост-электропорационный диэлектрофорез при среднеквадратичном значении напряжения 50 В в течение 30 секунд с последующим затуханием до нуля за 9 с. После электрослияния содержимое микрослайда оставляют на 30 мин при комнатной температуре, а затем переносят в 60 мл среды Hybri-Care (АТСС 46-Х™) с 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия), однократным раствором гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT) (Gibco21060-017, Thermo Fisher, США) и вносят по 100 мкл полученной суспензии в лунки 96-луночных культуральных планшетов.
Таким образом, в результате гибридизации получают десять 96-луночных планшетов, содержащих по 60 лунок с клетками.
Пример 6. Культивирование гибридных клеток и получение клонов гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела, специфичные к летальному факторуB. anthracis.
2
Слитые клетки, распределенные по лункам культурального планшета, культивируют в СО-инкубаторе в течение суток, после чего добавляют в каждую лунку по 100 мкл среды RPMI-1640 с добавлением 20% ФСБ, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ селективной добавки HAT(Sigma, США). Культивируют клетки с селективной средой в течение 7 дней, после чего подкармливают клетки, отбирая половину объема (100 мкл) среды и приливая по 100 мкл культуральной среды RPMI-1640, содержащей 20% ФБС, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ селективной добавки HT(Sigma, США). Через 3 дня после инкубации с добавкой НТ производят замену среды в объеме 100 мкл на RPMI-1640 с 20% ФБС и L-глутамином. Повторяют на протяжении еще 12 дней. Контролируют рост колоний клеток визуально с использованием светового микроскопа.
После образования монослоя гибридных клеток в лунках планшета при замене среды в лунках культуральную жидкость в объеме 100 мкл отбирают для анализа специфической активности антител, наработанных тригибридомами, в отношении летального фактораB. Anthracis методом ИФА. Для этого используют планшет с иммобилизованным белком рЛФ (методика подготовки планшета соответствует описанной выше, в примере 2), в который вносят культуральную жидкость по 100 мкл на лунку. В качестве отрицательного контроля используют лунку А1, в которую вносят чистый ФСБ. Разведение коммерческих антител 1:500, специфичных к ЛФ, используют как положительный контроль. Методика проведения ИФА описана в примере 2.
На основании полученных данных для дальнейшей работы выделяют те лунки планшета, культуральная жидкость из которых в ИФА показывает стабильный результат, превышающий значения отрицательного контроля не менее чем в 2 раза.
Клетки из лунок с наилучшими и стабильными показателями подвергают процедуре клонирования. Для этого клетки в лунке суспендируют, подсчитывают концентрацию клеток в суспензии на счетчике клеток ТС-20, затем делают разведениясуспензии в среде RPMI-1640 из расчета 2 кл. на лунку (в 100 мкл), 1 кл. на лунку и 0,5 кл. на лунку. Каждым вариантом разведенной суспензии заполняют 60 лунок 96-луночного планшета. Культивируют до образования визуально различимых колоний. Для тестирования в ИФА (аналогично описанному выше) отбирают культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдают единичные сформированные хорошо растущие колонии тригибридных клеток.
Колонии, показывающие хороший рост и стабильные высокие показатели в ИФА, при наработке монослоя подвергают пересеву в планшеты и флаконы увеличивающегося объема, затем нарабатывают антитела культивированием гибридных клонов в колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks(ThomsonInstrumentCompany, США).
Антитела выделяют из культуральной жидкости аналогично процессу, описанному в примере 1.
Таким образом получили 7 стабильных клонов моноклональных антител, выделенных из культуральной жидкости и исследованных на специфическую активность.
Пример 7. Тестирование специфической и нейтрализующей активности выделенных моноклональных антител, специфичных к летальному фактору возбудителя сибирской язвы.
Специфическую активность определяют в отношении летального фактора В. anthracis. Для этого используют метод вестерн-блот анализа. Рекомбинантный белок рЛФ подвергают электрофорезу в ПААГ в денатурирующих условиях, после чего осуществляют горизонтальный перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-CExtra (GEHealthcare, Великобритания) стандартным методом. Мембрану по окончании переноса погружают в обезжиренное (не более 0,5% жирности) молоко для блокировки свободных валентностей нитроцеллюлозы, инкубируют в течение часа при покачивании и температуре 37°С. Промывают мембрану ФСБ-Тв трижды, после чего погружают в раствор антител с концентрацией 10 мкг/мл в ФСБ. Инкубируют час при 37°С при покачивании, затем отмывают трижды ФСБ-Тв. Детектируют антитела на мембране козьими антителами против IgG человека, конъюгированньгми с пероксидазой хрена. Для этого конъюгат с пероксидазой хрена (Sigma, США) разводят в ФСБ 1:5000, погружают в него нитроцеллюлозную мембрану и инкубируют 40 мин при покачивании и температуре 37°С. Мембрану отмывают ФСБ-Тв не менее шести раз и проявляют 1%-ым раствором диаминобензидина в ФСБ с добавлением хлоридов никеля и кобальта, а также 33%-ой перекиси водорода в количестве 1 мкл на 1 мл красящего раствора. После развития окраски реакцию останавливают, ополаскивая мембрану водой и высушивая (Фиг. 4.).
Тестирование нейтрализующей активности антител в отношении летального токсина В. Anthracis проводят аналогично описанному в примере 3. Для тестирования используют моноклональные антитела в различных концентрациях (0,1 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,001 мг/мл).
По результатам тестирования определили наиболее эффективное для нейтрализации летального токсина invitro моноклональное антитело - 8D4E9-Ba-LF. Результаты тестирования чМКАт 8D4E9-Ва-LF представлены на Фиг. 5.
Пример 8. Тестирование чМКАт 8D4E9-Ba-LF, специфичных к ЛФ возбудителя сибирской язвы, на нейтрализацию токсина invivo.
Для проверки способности выбранной пары антител нейтрализовать летальный токсин В. anthracisinvivo проводят пассивную иммунизацию мышей линии BALB/c с последующим введение летального токсина возбудителя сибирской язвы, составленного из рПА и рЛФ.
Для постановки эксперимента используют пять групп по пять животных в каждой.
Группа I - контрольная группа, введение физиологического раствора.
Группа II - животные, которым вводят раствор чМКАт 8D4E9-Ba-LF.
Группа III - контрольная группа, введение летального токсина.
Группа IV - животные, которым после проведения пассивной иммунизации чМКАт 8D4E9-Ba-LFв количестве 100 мкг антител на животное вводят летальный токсин.
Группа V - животные, которым после проведения пассивной иммунизации чМКАт 8D4E9-Ba-LFв количестве 50 мкг антител на животное вводят летальный токсин.
Все растворы вводят в адекватном объеме 200 мкл. Антитела 8D4Е9-Ва-LF вводят в количестве 50 и 100 мкгна мышь внутрибрюшинно в физиологическом растворе. Точную концентрацию исходного раствора измеряют при помощи инфракрасного спектрометра DirectDetect (MerckMillipore, США). Животным внутривенно (в ретроорбитальный синус) вводят летальный токсин В. anthracis, составленный из рПА и рЛФ в количестве 50 мкг каждого, что составляет 4LD50, через 24 ч после проведения пассивной иммунизации. Наблюдение за состоянием всех животных проводят в течение 10 дней.
Средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе (Группа III), получавшей летальный токсин без применения пассивной иммунизации, составляет 0 сут. Пассивная иммунизация антителами 8D4E9-Ba-LF зa сутки до заражения в дозе 100 мкг/мышь позволяет увеличить выживаемость до 9,2 сут., в дозе 50 мкг/мышь - до 6,8 сут. Результаты теста нейтрализации токсина invivo с применением чМКАт представлены на Фиг. 6.