Фазовый и химический составы желчных камней в организме человека

р

УДК 547.93 Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2006, вып. 4

О. А. Голованова

ФАЗОВЫЙ И ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВЫ ЖЕЛЧНЫХ КАМНЕЙ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА

Введение. Результатом влияния широкого спектра природных и антропогенных факторов на живой организм является образование патогенных органоминеральных агрегатов, встречающихся практически во всех органах человека.

Настоящая работа посвящена камням, которые образуются как в самом желчном пузыре, так и в желчных протоках. Желчнокаменная болезнь нередко приводит к утрате трудоспособности. В России ею страдает около 18% взрослого населения, ежегодно оперируются более 60 тыс. человек. В последние годы отмечается тенденция к росту числа заболеваний у лиц молодого возраста [1]. Исследование фазового и химического составов, структуры, морфологии желчных камней, механизмов их формирования и преобразования представляет несомненный интерес при поиске новых путей лечения и профилактики желчнокаменной болезни (холелитиаза).

Абсолютное большинство желчных камней имеет сложный вещественный состав [2-10]. Основное значение имеют холестерин и желчные пигменты. Количество холестерина в камнях в среднем доходит до 70%, тогда как в желчи оно составляет едва 2% [11]. Из других компонентов встречаются карбонаты, фосфаты и пальмитат кальция, желчные кислоты и фосфолипиды.

Всего в составе желчных камней установлено более 20 химических элементов. Их содержание существенно варьирует в зависимости от региона проживания больных [10, 12].

Известно, что многие элементы играют важную роль в обмене веществ, гормональных и ферментативных процессах. В целом имеющиеся по данному вопросу сведения часто не достаточно полны. Высокое содержание холестерина затрудняет определение компонентов, находящихся в желчных камнях в незначительных количествах.

Образование желчных камней, согласно современным представлениям, является в основном результатом дестабилизации физико-химического состояния желчи. Поэтому актуальными задачами становятся биохимическое определение качественного и количественного составов желчи, в частности главных ее составляющих: холестерина, суммы желчных кислот, расчета их соотношений - индексов литогенности [13], а также выявление связей между составами желчных камней и параметрами камнеобразующе-го раствора (желчи), которые практически не исследованы. Эти данные представляют как научный, так и практический интерес. Они необходимы для понимания процессов зарождения, роста и последующего преобразования желчных камней и могут быть использованы для профилактики ранней стадии холестеринового литогенеза.

Цели настоящей работы - устранение этих пробелов, детальное изучение вещественного и элементного составов желчных камней жителей одного региона с использованием нового комплексного подхода, а также определение состава желчи как камне-образующей среды.

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служила коллекция из

75 камней, удаленных оперативным путем у пациентов хирургических отделений Областной клинической больницы и Больницы скорой медицинской помощи г. Омска. Желчь была предоставлена Западно-Сибирским Федеральным медицинским центром.

© О. А. Голованова, 2006

76

Для получения максимально полной информации о составе анализируемых образцов были экспериментально подобраны экстрагенты, позволяющие достичь растворения холестерина и его удаления. Были выбраны хлороформ, этанол, их смесь в соотношении 3:1, метил-третбутиловый эфир и ацетон. Усредненную пробу желчного камня в количестве 0,1 г вносили в 5,0 мл растворителя. Наибольший процент извлечения (около 98%) был достигнут при использовании хлороформа как растворителя. После экстракции для дальнейшего исследования брали 1,5 мг нерастворимого осадка.

Для определения фазового состава применяли дополняющие друг друга методы порошковой рентгенографии (ДРОН-ЗМ, СиКа) и ИК-спектроскопии. Для установления элементного состава желчные камни были подвергнуты анализу на станции энергодисперсионного рентгенофлуоресцентного элементного анализа ВЭПП-3 Центра синхротронного излучения Института ядерной физики СО РАН (аналитик Н. В. Максимова). Эмиссионные спектры изучаемых проб возбуждались пучком поляризованного монохроматизированного излучения энергией 25 кэВ. Образцы готовили прессованием порошка в таблетки весом 30 мг и диаметром 5 мм с поверхностной плотностью 0,15 г/см2. Для количественного определения элементов методом внешнего стандарта использовали два уровня энергии возбуждения: 22 кэВ (Ti, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Си, Zn, Ga, As, Se, Br, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Pb, Th, U) и 42 кэВ (Cd, In, Sn, Sb, Те, I, Cs, Ba, La и Се). Пределы обнаружения элементов при загрузке спектрометрического тракта с частотой 10 кГц и временем измерения 1000 с варьировали в пределах (0,1-2,0)  10-4% (погрешность определений - 2-5 отн.%).

Элементный состав желчи устанавливали методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (АЭС-ИСП). Измерения проводили на ИПС-спектрометре OPTIMA 2000 DV. При количественном расчете использовали метод градуировочного графика. Пределы обнаружения элементов соответствовали (0,1-5) -10~4 мг/кг, относительная погрешность определения всех элементов - 1-3%.

Желчь, перенасыщенная холестерином, склонна к кристаллизации, поэтому ее называют литогенной. Один из способов нахождения индекса литогенности основан на расчете соотношения желчных кислот и холестерина, который называется холато-холестериновым коэффициентом. Данный показатель определяют как частное от деления количества холестерина, находящегося в желчи, на количество холестерина, которое может быть растворено в ней при данном соотношении желчных кислот и холестерина. Если индекс литогенности меньше единицы, такая желчь называется ненасыщенной, если больше - перенасыщенной. Концентрации желчных кислот и холестерина в желчи получали с помощью спектрофотометрического метода [13], основанного на способности предварительно охлажденного 0,1%-ного раствора хлорного железа в смеси равных объемов ледяной уксусной и концентрированной серной кислот реагировать с холестерином и желчными кислотами. Анализы проводили на однолучевом спектрофотометре СФ-46 со встроенной микропроцессорной системой. За норму брали следующие средние величины, согласующиеся с приводимыми в литературе данными [14, 15]: холестерин - 2,54 ммоль/л, желчные кислоты - 61,75 ммоль/л, холато-холестериновый коэффициент - 26,5.

Результаты исследования желчных камней и их обсуждение. Морфология и фазовый состав. Морфология исследованных желчных камней достаточно разнообразна (рис. 1). Присутствуют камни овальные (как правило, единичные рис. 1, а), имеющие форму «тутовых ягод» с зернистым строением внешнего слоя (рис.1, б), граненые (фасеточные рис. 1 в, г), всегда множественные, агрегативные, возникающие при срастании нескольких первичных камней с последующим обрастанием общими слоями, а также «черные образцы», напоминающие по структуре и размерам силикатный песок (рис. 1, г).

В целом цвет камней варьирует от светлых оттенков до темно-коричневых и даже черных. Чаще всего масса камней колеблется от 0,5-0,8 до 1,5 г и реже от 3-4 до 8 г, но может быть и гораздо больше, например, размеры камня 3,5 хЗ,6 х 6,8 см, вес - 36 г.

Рис. 1. Морфология желчных камней.

а - овальные; б - в форме «тутовых ягод»; в, г - граненые (фасеточные).

Рентгенофазовый анализ (РФА) желчных камней выявил наличие холестерина в качестве основного компонента в 90% образцов. После экстракционного удаления холестерина по методике, описанной выше, был определен дополнительно широкий спектр веществ, входящих в состав желчных камней. В исследуемых камнях методом РФА удалось обнаружить различные модификации карбоната кальция: в семи случаях -ватерит, в пяти - арагонит или ватерит и кальцит. Методом ИК-спектроскопии дополнительно в желчных камнях были найдены билирубин (пигмент) в большинстве образцов (примерно 65%) и натриевая соль желчной кислоты (единично). Кроме того, в образовавшихся после эктракции нерастворимых осадках были выявлены карбонаты кальция (арагонит, кальцит): арагонит вместе с пигментом, кальцит с холестерином. В двух случаях анализ спектров позволил также установить наличие слоистого алюмосиликата - минерала вермикулита.

Данные РФА и ИК-спектроскопии «черных камней» показали, что они содержат билирубин и пальмитат кальция, пики холестерина практически не наблюдаются. При этом оказалось, что в исследуемой коллекции есть чисто пигментный камень, а это встречается достаточно редко.

Таким образом, в результате проведенного комплексного исследования было установлено, что холестерин присутствует в 92% исследованных камней, холестерин с добавками билирубиновой компоненты - в 6%; холестерин с добавками различных моди-

фикаций карбонатов кальция (арагонита, ватерита, кальцита) - в 16%, с преобладанием ватерита - в 9%.

Характерной особенностью желчных камней является значительно более высокое, по сравнению с почечными камнями, содержание органического вещества, что сказывается на особенностях их строения. Моноядерный холестериновый камень (зеленоватого цвета) имеет радиально-слоистую структуру. Его ядро представляет собой веероподоб-ный агрегат. Образование некоторых желчных камней, вероятно, напоминает формирование сферолитов из истинных растворов. Особенно это относится к холестериновым камням с радиальной, крупнокристаллической, веероподобной структурой.

Характеристиками различных слоев анализируемого камня (корки, подкорки и центра) методом ИК-спектроскопии представлены в табл. 1. Оказалось, что фазовый состав коркового и подкоркового слоев практически идентичен. До обработки хлороформом в них фиксируются билирубин и холестерин, после проведения экстракции -холестерин наряду с билирубином, выявляются ватерит и пальмитат кальция. В белом кристаллическом центре камня до проведения обработки хлороформом обнаружены холестерин, билирубин и пальмитат кальция. После обработки фазовый состав не меняется. Можно предположить, что установленное распределение фаз в исследуемом образце связано £ физико-химическими свойствами раствора, в котором он образовал-

Таблица 1. Результаты ИК-спектроскопии различных слоев желчного камня

Камень

до растворения после экстракции

Часть камня О бнару женное вещество Часть камня Обнаруженное вещество

Корка Билирубин, холестерин Корка Билирубин, ватерит, пальмитат кальция

Подкорка Билирубин, холестерин Подкорка Билирубин, ватерит

Центр Холестерин, билирубин, пальмитат кальция Центр Состав не изменился

Элементный состав. С помощью рентгенофлуоресцентного анализа в составе желчных камней было идентифицировано более 36 элементов, доля которых колеблется в диапазоне от Ю-5 до 2 масс.%. Элементы, содержание которых составляет более 10~4масс.%, убывают в следующем порядке: Са, К, Мп, Ре, Си, РЬ, Т1, 7>п, V, В1, Сг, Б^ (табл. 2). Количество кальция составляет 95 масс. %, калия, находящегося на втором месте, - не более 3 масс.%, а на долю хрома, находящегося на третьем месте, - всего 0,02 масс.%. Сравнение полученных результатов (табл. 2) с литературными [5] говорит о том, что в желчных камнях кальций всегда является доминирующим элементом. Можно предположить, что именно кальций, образуя устойчивые комплексные соединения с холестерином, может способствовать нарушению метастабильного состояния желчи. Различное содержание и распределение микроэлементов в желчных камнях зависит от условий проживания и питания пациентов.

По концентрации марганца, железа и меди в исследуемой коллекции выделяются три группы образцов. Возможно, повышенное содержание этих элементов в желчных камнях связано с экологической обстановкой в Омском регионе. По данным Обь-Иртышского межрегионального территориального управления по гидрометеорологии

79

Таблица 2. Содержание микроэлементов в желчных камнях

Экспериментальные Литературные

Элемент данные

Число Среднее Число Среднее

проб содержание, масс.% проб содержание, масс.%

Са 12 2,0721 207 6,95

К 12 0,0735 - -

Мп 12 0,0085 207 0,076

Fe 12 0,0058 207 0,285

Си 12 0,0033 207 0,018

РЬ 12 0,0025 57 0,002

Ti 12 0,0016 207 0,011

Zn 12 0,0011 - -

V 12 0,0006 194 0,0012

Ni 12 0,0005 2 0,0012

Bi 8 0,0005 8 0,002

Сг 12 0,0005 207 0,018

Hg 4 0,0004 - -

Вг 12 0,0007 - -

Sr 12 0,0005 - -

Se 12 0,00003 -

и мониторингу окружающей среды, р. Иртыш сильно загрязнен соединениями марганца, железа и меди (превышение ПДК в 44 , 24 и 23 раз соответственно), в р. Оби концентрации марганца и меди достигают более 100 ПДК [16].

Были выделены отдельные желчные камни, резко отличающиеся по составу от средних значений элементов в выборке. Для первого образца содержание свинца превышает среднее значение в желчных камнях в 50 раз. Во втором холеолите ртути в 12 раз больше среднего. В третьем камне отмечено максимальное количество меди, оно в 290 раз больше среднего значения меди в выборке, железа - в 59 раз больше, а висмута - в 310 раз, интересно отметить, что содержание никеля минимально: в 10 раз ниже среднего. На основании полученных данных можно сделать вывод, что особенности распределения микроэлементов в отдельных образцах связаны со спецификой физиологических процессов, протекающих в организме человека.

Элементный и биохимический составы желчи. В результате исследования операционной желчи было выявлено девять элементов, содержание которых (более Ю-4 масс.%) убывает в следующем порядке: Ка, Са, Р, К, М^, Ее, Хп, Си, Мп (рис. 2). При сравнении полученных результатов с нормой [11] оказалось, что концентрации в патогенной желчи таких элементов как Р, К, Са и.М^ выше, чем в норме (в 1,5; 1,5; 2,5; 4,5 раз соответственно), а железа - в 3,5 раза меньше нормы.

Общепризнанными факторами инициализации желчнокаменной болезни являются, с одной стороны, нарушение моторной (эвакуационной) функции пузыря, а с другой -пересыщение желчи холестерином, нарушение коллоидальной устойчивости желчи и как следствие зарождение кристаллов, их рост и агрегация в виде камня. По результатам исследования шести образцов пузырной желчи, взятой от больных желчекаменной болезнью в момент операций (табл. 3), среднее значение холато-холестеринового коэффициента составляет 1,96. Оно существенно меньше критического (10-12) и свиде-

Содержание, масс.%

щ I щ 2 Элемент

Рис. 2. Соотношение элементов в нормальной (1) и патогенной (8) желчи для усредненного варианта исследованных образцов.

Таблица 3. Результаты анализа желчи

№ образца Концентрация Концентрация Холато- Среднее

желчи желчных кислот, холестерина, холестериновый значение К

ммоль/л ммоль/л коэффициент, К

1 3,26 1,56 2,08

2 5,63 2,54 2,22

3 4 7,56 6,99 7,23 2,98 1,05 2,34 1,96

5 10,65 9,23 1,15

6 62,24 21,53 2,89

Норма 61,75 2,54 26,5

тельствует о литогенности исследуемой пузырной желчи. Кроме того, важно отметить, что концентрация желчных кислот, отвечающих за устойчивость желчи к коагуляции, для 5 образцов (см. табл. 3) в несколько раз меньше нормы.

Заключение. Впервые в результате комплексного изучения желчных камней с помощью разработанного метода экстракционного отделения холестериновой составляющей получена детальная информация о составе и распределении их компонентов. Показано, что нарушение элементного равновесия в желчи может стать одним из факторов, приводящим к камнеобразованию. Экспериментально установленное соотношение индекса литогенности пузырной желчи во всех случаях меньше нормы, что свидетельствует о литогенности желчи, в которой происходило формирование патогенных образований.

Таким образом, изучение состава желчи и желчных камней очень важно как с точки зрения раскрытия механизма литогенеза, так и для выработки диагностических и прогностических критериев лечения желчнокаменной болезни.

Автор благодарит О. В. Франк-Каменецкую за полезные замечания к проделанной работе.

Summary

Golovanova 0. A. Phase and chemical composition of human call stones.

The representative collection of gallstones of Omsk region inhabitants is investigated. Using the original extract separation the phase and element composition of samples is determined. The crystalline holesterol is found by the X-ray powder diffraction method in more than 90% stones. IR-spectroscopy also shows gall pigment (bilirubin), calcium corbanates (cal-cite, aragonite and vaterite) and, frequently, calcium salts of cholic acids. The content in stones of such elements as Са, K, Mn, Fe, Cu, Pb, Ti, Zn, V, Ni, Bi, Cr, Hg is more than 10-4 wt.% (part of calcium is 95 wt.%). Nine elements (Na, Са, P, K, Mg, Fe, Zn, Cu, Mn) with content more than 10~4 wt % in bile are revealed. The average value of holato-cholesteric coefficient isl.96 that supports the letogennosty of bile.

Литература

1. Голованова О. А., Юдина JI. Н., Пятанова П. А. Экологический аспект патогенного биоминералообразования //Докл. Омск. отд. Междунар. академии наук экологии и безопасности жизнедеятельности. Омск, 2002. Т. 2, вып. 1(3). 2. Carey М. С. Pathogenesis of gallstones // Amer. J. Surg. 1993. N 4. 3. Flynn G. L., Shay Y. // J. Pharm. Sci. 1979. Vol. 68, N 9. 4. Дедерер Ю. M., Крылова H. П. Желчнокаменная болезнь. M., 1983. 5. Кораго А. А. Введение в биоминералогшю. СПб., 1992. 6. Шелектина И. И. Современные представления о генезе и принципах типирования желчных конкрементов // Журн. АМН Украхни. 1996. Т. 2, № 4. 7. Иванченкова Р. А., Свиридов А. В. Современный взгляд на патогенез желчнокаменной болезни // Клиническая медицина. 1999. № 5. 8. Thistle G. L., Garlson G. L. // Gastroenterology. 1980. Vol. 78. 9. Лонсдейл К., Съютпор Д. Кристаллографические исследования почечных и желчных камней // Кристаллография. 1971. Т. 16, вып. 6. 10. Пальчик Н. А., Стпол-повская В. Н., Мороз Т.Н. и др. Фазовый и элементный анализ желчных камней // Неорг. химия. 2003. Т. 48, JV« 12. 11. Биохимия / Под ред. Е. С. Северина. М., 2003. 12. Голованова О. А., Ачкасова Е. Ю., Россеева Л. В. Роль геохимического фона в развитии эндемических заболеваний (Омский регион) // Материалы 3-й Междунар. конференции по геологии и par циональному недропользованию «Экогеология-2003». СПб., 2003. 13. Мирошниченко В. П., Громагиевская Л. А., Касатпкина И. Г., Казачек Г. А. Определение содержания желчных кислот и холестерина в желчи // Лаб. дело. 1978. JV« 3. 14. Рубенс Ю. П., Юрика Э. В., Селезнев Ю. В. Индексы литогености желчи: методы определения, клиническая доступность, информативность // Клиническая медицина. 1992. № 7-8. 15. Юликов С. А., Шапиро С. 3. Фотометрический метод определения желчных кислот в дуоденальном содержимом // Здравоохранение. 1973. Вып. 2. 16. Куркин В. Без очищенной воды нам, товарищи, «кранты»! // Комсомольская правда (Омск). Март 2002.

Статья поступила в редакцию 15 апреля 2006 г.