Способ отбора линий яровой мягкой пшеницы с повышенным содержанием антоцианов в зерне
METHOD FOR SELECTION OF SPRING SOFT WHEAT LINES WITH AN INCREASED CONTENT OF ANTHOCYANINS IN GRAIN

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в генетике и селекции зерновых культур.
Пигменты антоцианы выполняют защитные функции у растений, противодействуя различным факторам биотического и абиотического стресса; у людей при употреблении в составе растительной пищи они способствуют предупреждению и снижению риска развития хронических заболеваний (1). Основными источниками антоцианов являются ягоды и фрукты. В последнее время в качестве источников антоцианов стали рассматривать злаковые культуры, зерно которых также может накапливать эти соединения.
У важнейшей продовольственной культуры - пшеницы мягкой – зерно может иметь фиолетовую окраску, обусловленную биосинтезом антоциановых соединений в перикарпе зерна под контролем комплементарно взаимодействующих генов Рр (Рр-1 и Рр3), которые были картированы в хромосомах 7 гомеологической группы и в хромосоме 2А, соответственно (2). В настоящее время получение сортов пшеницы с повышенным содержанием антоцианов в зерне является актуальной задачей, отражающей общемировую тенденцию на создание функциональных продуктов питания (3).
Классический селекционный подход, основанный на скрещивании доноров с рекуррентными сортами/линиями с последующим отбором растений с окрашенным зерном и с комплексом других хозяйственно ценных признаков, таких как устойчивость, урожайность, качество зерна, является длительным и трудозатратным процессом. Поскольку окраска перикарпа зерна обусловлена генотипом материнского растения, оценить фенотип полученного после скрещивания генотипа возможно только после выращивания такого растения до стадии созревания зерна, когда происходит образование антоциановых пигментов, что представляет собой отдельную сложность при селекции на окраску зерна (4). Создание, например, коммерческого сорта с фиолетовым зерном CDC Primpurple в университете Саскачевана в Канаде, заняло четырнадцать лет (5).
Применение молекулярных маркеров позволяет сократить время и снизить трудозатраты по отбору линий яровой мягкой пшеницы, накапливающих антоциановые соединения в зерне.
Молекулярные или ДНК-маркеры, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР-маркеры), стали широко востребованными в генетических исследованиях и селекции пшеницы для решения практических задач. Применение молекулярных маркеров в практической селекции обозначается термином МОС (маркер-опосредованная селекция). Основной принцип МОС заключается в идентификации тесного сцепления между маркером и геном, контролирующим признак, и использовании ассоциаций маркер-признак для отбора растений с желаемым признаком с помощью маркера. В сочетании с методами классической селекции, МОС существенно сокращает время, необходимое для создания новых генотипов, а также трудозатраты, связанные с фенотипической оценкой гибридных растений.
P
PF
1
2
2
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ отбора линий яровой мягкой пшеницы с различными комбинациями доминантных и рецессивных аллелей генов Рр3 и Pp-D1, обуславливающих отличия в окраске зерна, заключающийся в том, что линию яровой мягкой пшеницы i:S29PpD1Pp3 или i:S29PpD1Pp3 с фиолетовой окраской зерна, полученную на основе сорта «Саратовская 29», но содержащую фрагменты хромосом 2А и 7D, унаследованные от сортов Purple или Purple Feed, соответственно, и несущие доминантные аллели генов Рр3 и Pp-D1, скрещивают с исходным сортом «Саратовская 29», растения поколения F самоопыляются до поколения F, из поколения F с помощью ПЦР-маркеров, сцепленных с генами Рр3 и Pp-D1, отбирают растения, содержащие в гомозиготном состоянии маркеры либо линии-донора, либо сорта «Саратовской 29». Описанный способ позволил отобрать за три вегетационных сезона линии с различными комбинациями доминантный и рецессивных аллелей генов Pp-D1 и Рр3 в гомозиготном состоянии (6).
Недостатками данного способа являются ограниченные функциональные возможности, связанные с отсутствием возможности получать линии яровой мягкой пшеницы на основе любого сорта или перспективной селекционной линии, которые будут одновременно накапливать в зерне антоцианы фиолетового цвета и иметь другие хозяйственно-ценные признаки, характерные для сорта или линии.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего быстро и более точно отбирать растения яровой мягкой пшеницы, содержащие доминантные аллели генов Рр в гомозиготном состоянии, и сохранить комплекс хозяйственно-ценных признаков, характерных для рекуррентного сорта.
Технический результат заключается в повышении точности отбора растений яровой мягкой пшеницы с повышенным содержанием антоцианов в зерне и расширении функциональных возможностей известного способа.
Поставленная задача решается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
P
PF
1
2
2
2
1
1
1
2
1
2
1
3
1
3
1
3
1
4
1
4
Коммерческий сорт яровой мягкой пшеницы скрещивают с донором доминантных аллелей генов Рр - линией i:S29PpD1Pp3 или i:S29PpD1Pp3. Полученные растения поколения F самоопыляют до поколения F. Из поколения F отбирают растения с темно-красной окраской колеоптилей, которая также обусловлена антоцианами и является морфологическим маркером доминантного аллеля Pp-D1. ДНК отобранных растений с темно-красными колеоптилями проверяют с помощью пары ПЦР-маркеров, один из которых выбран из группы, состоящей из маркеров: Xgwm0294, Xgwm0312, Xgwm0328, Xgwm0445, сцепленных с геном Рр3, локализованным на хромосоме 2А, а другой - выбран из группы маркеров: Xgwm0044, Xgwm0111, Xgwm0437, сцепленных с геном Pp-D1, локализованным на хромосоме 7D, для отбора растений с доминантными аллелями этих генов в гомозиготном состоянии. Отобранные растения поколения F с генотипом PpD1PpD1Pp3Pp3 подвергают возвратному скрещиванию с рекуррентным сортом/линией, растения BCFсамоопыляют для получения семян BCF. Среди растений поколения BCF отбирают растения с темно-красной окраской колеоптиле, которые выращивают для получения семян BCF. Семена BCF собирают с индивидуальных растений и те из них, которые имеют фиолетовую окраску, обусловленную гомозиготным и гетерозиготным состоянием аллелей генов Рр, высевают в поле и оценивают их устойчивость к грибным инфекциям. Устойчивые растения из семей BCF, в которых нет расщепления по окраске зерна, отбирают индивидуально для получения семян поколения BCF. Растения поколения BCF оценивают в полевых условиях в селекционных питомниках на устойчивость к грибным инфекциям, характеризуют их урожайность и другие хозяйственно-ценные признаки.
В таблице 1 представлены перспективные ПЦР-маркеры для отбора растений с доминантными аллелями генов Рр3 и Pp-D1 в гомозиготном состоянии. При тестировании ДНК гибридных растений использование по одному ПЦР-маркеру из представленных маркеров, локализованных на хромосомах 2А и 7D, полиморфных между родительскими формами, позволяет определить происхождение аллелей этих маркеров и сцепленных с ними генов Рр, либо от линии-донора, либо от рекуррентного сорта (гомозиготные формы), либо от обоих родителей (гетерозиготные формы).
На фиг. 1 представлена схема отбора растений яровой мягкой пшеницы с повышенным содержанием антоцианов в зерне.
Основными определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:
- в качестве рекуррентного сорта используют любой коммерческий сорт яровой мягкой пшеницы, адаптированный к условиям выращивания в конкретном регионе, что позволяет расширить функциональные возможности заявляемого способа;
2
2
- отбор растений второго поколения F проводят сначала по окраске колеоптиле, затем с помощью ПЦР-маркеров, сцепленных с генами Рр3 и Pp-D1, что позволяет с высокой точностью и минимальными затратами отобрать 2,25% растений поколения F, содержащих в гомозиготном состоянии доминантные аллели Рр3 и Pp-D1;
2
- отобранные растения F с генотипом Pp-D1Pp-D1Pp3Pp3 подвергают однократному возвратному скрещиванию с рекуррентным сортом/линией в ту же вегетацию, когда был сделан их отбор, что позволяет сохранить у гибридов 75% генетического материала рекуррентного сорта и дает возможность отобрать на провокационных фонах растения, устойчивость которых обусловлена генами рекуррентного сорт/линии, а также сохранить комплекс хозяйственно-ценных признаков, характерных для рекуррентного сорта;
1
3
- растения, начиная с поколения BCF, тестируют в полевых условиях, что позволяет одновременно отобрать растения со стабильным генотипом по окраске зерна и с устойчивостью к грибным инфекциям.
Предлагаемый способ позволяет за три года отобрать перспективные для селекции линии с повышенным содержанием антоцианов в зерне, и комплексом хозяйственно-ценных признаков, которыми обладает родительский сорт, при этом минимизировать трудовые затраты, связанные с фенотипическим контролем окраски зерна в каждом гибридном поколении.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример. Отбор перспективных линий яровой мягкой пшеницы с повышенным содержанием антоцианов в зерне
В качестве рекуррентного сорта использовали сорт «Элемент 22».
PF
Сорт включен в Госреестр, разновидность - эритроспермум, среднепоздний, высокоурожайный, устойчив к полеганию, к грибным заболеваниям, является стандартом на государственных сортоучастках Омской области для испытываемых новых сортов яровой мягкой пшеницы среднепозднего типа. В качестве линии-донора использовалась линия i:S29PpD1Pp3 с интрогрессиями участков генома сорта Purple Feed (PF) в хромосомах 2А и 7D, несущие, соответственно, гены Рр3 и Pp-D1, контролирующие синтез антоцианов фиолетового цвета в перикарпе зерновки.
PF
1
2
Посев зерен линии-донора и рекуррентного сорта «Элемент 22» производился в ванну гидропонной теплицы ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, Россия) с автоматическим поливом по 5 рядков каждого образца (по 20 растений в каждом рядке) в осеннюю вегетацию 2016 года (октябрь 2016 -январь 2017). Скрещивание проводилось с помощью удаления недозревших пыльников у вышедших наполовину из трубки колосков растений рекуррентного сорта с последующей их изоляцией и опылением через 1-2 дня зрелой пыльцой от молодых пылящих колосьев растений линии-донора i:S29PpD1Pp3. Всего было получено 29 зерен поколения F, которые самоопылялись до поколения F в весеннюю вегетацию 2017 года (февраль 2017-апрель 2017).
2
2
PF
Во втором поколении F был проведен отбор гомозиготных растений с генотипом Pp-D1Pp-D1Pp3Pp3 с помощью визуальной оценки пигментации колеоптилей и ПЦР-маркеров Xgwm0294 и Xgwm0111, сцепленных с генами Рр3 и Pp-D1. На первом этапе 80 зерен второго поколения F проращивали в чашках Петри и отбирали для посева по 50 проростков с темно-красными колеоптилями. Отобранные проростки высаживали в парнике селекционно-генетического комплекса ИЦиГ СО РАН в летнюю вегетацию 2017 года (май 2017 г. - август 2017 г.). Из молодых листьев 24-х высаженных растений выделяли ДНК, которую анализировали с помощью ПЦР-маркеров Xgwm0294 и Xgwm0111, выбранных из представленного в Таблице 1 списка на основе наличия полиморфизма между рекуррентным сортом «Элемент 22» и линией-донором i:S29PpD1Pp3, для определения происхождения аллелей этих маркеров и сцепленных с ними генов Рр, либо от линии-донора, либо от рекуррентного сорта (гомозиготные формы), либо от обоих родителей (гетерозиготные формы).
PF
2
Результаты амплификации геномной ДНК линии i:S29PpD1Pp3, сорта «Элемент 22» и популяции растений поколения F, полученной в результате их скрещивания, с помощью ПЦР-маркера Xgwm0294, представлены на фиг. 2.
PF
PF
1
1
1
2
1
2
1
3
1
3
1
4
1
4
1
4
На фиг. 2 видно, что полученные ПЦР-продукты, отличаются по длине у родительских форм (i:S29PpD1Pp3, «Элемент 22»), что позволило отобрать растения 5, 6, 7, 14, 15, 17, 21, 22, 23 (отмечены на фиг. 2 стрелками), содержащие аллели маркера Xgwm0294, унаследованные от линии-донора, в гомозиготном состоянии. Те же образцы ДНК растений были также проанализированы с помощью полиморфного между линией i:S29PpD1Pp3 и сортом «Элемент 22» ПЦР-маркера Xgwm0111, сцепленного с геном Pp-D1. Результаты анализа представлены на фиг. 3. На основании этого анализа были отобраны растения 17, 21, 22, 23, содержащие доминантные аллели гена Pp-D1 в гомозиготном состоянии (отмечены стрелками на фиг. 3). Отобранные растения имели генотип Pp-D1Pp-D1Pp3Pp3, в эту же вегетацию они были скрещены с рекуррентным родительским сортом, были получены зерна BCF, из которых 40 штук от каждого из отобранных растений высевались в гидропонную теплицу в осеннюю вегетацию 2017 года (октябрь 2017 - январь 2018) для получения зерен поколения BCF. В весеннюю вегетацию 2018 года (февраль 2018 - апрель 2018) семена второго поколения беккросса BCF (всего 160 гибридных растений) высаживались в теплицу, из которых отбирались проростки с темно-красными колеоптилями, самоопылялись для получения семян BCF, которые собирали от каждого растения по отдельности. Зерна с фиолетовой окраской высевались семьями на отдельные делянки в полевом селекционном питомнике Омского ГАУ (Омск, Россия) летом 2018 года. Устойчивые растения из семей BCF, в которых не наблюдалось расщепления по окраске зерна, отбирали индивидуально для получения семян поколения BCF. Всего было отобрано 23 устойчивых растения, семена которых BCF летом 2019 высевали в поле и оценивали полученные растения на устойчивость к грибным инфекциям и по хозяйственно-ценным признакам. Среди растений BCF были отобраны 12 перспективных линий мягкой пшеницы, с повышенным содержанием антоцианов в зерне. В таблице 2 представлены характеристики отобранных линий, где R (resistant) - устойчивый; MR (moderately resistant) - умеренно устойчивый; М (heterogeneous type) - гетерогенный тип; MS (moderately susceptible) - умеренно чувствительный; S (susceptible) - чувствительный; 5, 10, 15 - процент инфицированных растений.
Из таблицы 2 видно, что отобранные линии характеризуются повышенной урожайностью по сравнению с сортом «Элемент 22», а также являются устойчивыми к мучнистой росе, стеблевой и листовой ржавчине.
1
3
Таким образом, за два года были отобраны новые линии BCF яровой мягкой пшеницы с повышенным содержанием антоцианов в перикарпе зерновки на основе коммерческого сорта «Элемент 22». Отобранные линии несут в своем составе около 75% геномной ДНК рекуррентного сорта, что дает преимущество в дальнейшем отборе по генам устойчивости к грибным заболеваниям и другим хозяйственно-ценным признакам, которыми обладает родительский сорт. Коммерческий сорт «Элемент 22» является одним из немногих сортов с групповой устойчивостью против всех местных западносибирских популяций патогенов стеблевой и листовой ржавчины. Сорт имеет пшенично-ржаную транслокацию 1BL.1RS с геном Sr31, ко-сегрегированным с Lr26 и Yr9. Вместе с геном Sr35 (3AL) они обеспечивают высокий уровень устойчивости к расе стеблевой ржавчины Ug99 (8).
Предлагаемый способ позволяет отбирать с помощью ПЦР-маркеров перспективные линии яровой мягкой пшеницы для селекции новых сортов для функционального питания путем пирамидирования генов устойчивости к грибным патогенам, высокой продуктивности и другим хозяйственно ценным признакам, которыми обладает родительский сорт, с генами, контролирующими биосинтез антоцианов в перикарпе.
Источники информации
1. Li D., Wang P., Luo Y., Zhao M., Chen F. Health benefits of anthocyanins and molecular mechanisms: update from recent decade // Crie. Rev. Food Sci. Nutr. 2017. V. 57(8). P. 1729-1741.
2. Khlestkina E.K., Shoeva O.Y., Gordeeva E.I. Flavonoid biosynthesis genes in wheat // Russ. J. Genet. Appl. Res. 2015. V. 5. P. 268-278.
3. Loskutov I.G., Khlestkina E.K. Wheat, barley, and oat breeding for health benefit components in grain // Plants. 2021. V. 10. 86.
4. Гордеева Е.И. Генетическая регуляция фиолетовой окраски перикарпа зерна мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) / Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Новосибирск, 2014, 121 с.
5. King, С.New Possibilities with Purple Wheat. 5 May 2017. Available online: https://www.topcropmanager.com/new-possibilities-with-purple-wheat-20050/ доступ 22 января 2021).
6. Gordeeva E.I., Shoeva O.Y., Khlestkina E.K. Marker-assisted development of bread wheat near-isogenic lines carrying various combinations of purple pericarp (Pp) alleles // Euphytica. 2015. V. 203. P. 469-476.
7.  M.S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixier M.H., Leroy P., Ganal M.W. A microsatellite map of wheat // Genetics. 1998. V. 149. P. 2007-2023.
8. Shamanin V., Salina E., Wanyera R., Zelenskiy Y., Olivera P., Morgounov A. Genetic diversity of spring wheat from Kazakhstan and Russia for resistance to stem rust Ug99 // Euphytica. 2016. V. 212. №2. P. 287-296.