ОПТИМИЗАЦИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ GL-2045, МУЛЬТИМЕРИЗУЮЩЕГОСЯ СТРАДОМЕРА

1. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, в которой фракция гомодимера указанной композиции GL-2045 составляет менее 20% от всей композиции.
2. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, в которой фракция мультимеров высшего порядка указанной композиции GL-2045 составляет по меньшей мере приблизительно 30% от всей композиции.
3. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, по п. 1 или 2, в которой димер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 7% до приблизительно 12% от всей композиции.
4. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, по п. 1 или 2, в которой тример гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 11% от всей композиции.
5. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, по п. 1 или 2, в которой тетрамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 15% от всей композиции.
6. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, по п. 1 или 2, в которой пентамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 10% от всей композиции.
7. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, по п. 1 или 2, в которой гексамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 14% от всей композиции.
8. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, по п. 1 или 2, в которой фракции от димера гомодимера до 6-членных мультимеров составляют в общей сложности приблизительно 40-60% от всей композиции.
9. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, в которой:
a) гомодимерная фракция составляет менее приблизительно 20% от всей композиции;
b) фракции мультимеров высшего порядка составляют по меньшей мере приблизительно 30% от всей композиции;
c) димер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 7% до приблизительно 11% от всей композиции;
d) тример гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 11% от всей композиции;
е) тетрамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 15% от всей композиции;
f) пентамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 10% от всей композиции;
g) гексамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 14% от всей фракции;
h) фракция от димера гомодимера до гексамера гомодимера составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60% от всей композиции;
i) фракции от тримера гомодимера до гексамера гомодимера составляют от приблизительно 32% до приблизительно 50% от всей композиции;
j) фракции от тетрамера гомодимера до гексамера гомодимера составляют от приблизительно 26% до приблизительно 39%;
k) фракции от пентамера гомодимера до гексамера гомодимера составляют от приблизительно 18% до приблизительно 23% от всей композиции; или
l) присутствует любая комбинация (a)-(k).
10. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, в которой:
a) гомодимерная фракция составляет менее приблизительно 20% от всей композиции;
b) фракции мультимеров высшего порядка составляют по меньшей мере приблизительно 30% от всей композиции;
c) димер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 7% до приблизительно 11% от всей композиции;
d) тример гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 11% от всей композиции;
e) тетрамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 15% от всей композиции;
f) пентамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 6% до приблизительно 10% от всей композиции; и
g) гексамер гомодимерной фракции составляет от приблизительно 10% до приблизительно 14% от всей фракции.
11. Композиция GL-2045, полученная рекомбинантным способом, в которой:
a) гомодимерная фракция составляет менее приблизительно 20% от всей композиции;
b) фракции мультимеров высшего порядка составляют по меньшей мере приблизительно 30% от всей композиции;
h) фракция от димера гомодимера до гексамера гомодимера составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60% от всей композиции;
i) фракции от тримера гомодимера до гексамера гомодимера составляют от приблизительно 32% до приблизительно 50% от всей композиции;
j) фракции от тетрамера гомодимера до гексамера гомодимера составляют от приблизительно 26% до приблизительно 39% от всей композиции; и
k) фракция от пентамера гомодимера до гексамера гомодимера составляет от приблизительно 18% до приблизительно 23% от всей композиции.
12. Способ лечения или предотвращения воспалительного, аутоиммунного или инфекционного заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, с применением полученного рекомбинантным способом очищенного GL-2045 по любому из пп. 1-11.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанное заболевание или нарушение выбрано из идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, хронической воспалительной полинейропатии, мультифокальной моторной нейропатии, миастении гравис, трансплантации органов и ревматоидного артрита.
14. Способ по любому из пп. 11 или 12, отличающийся тем, что указанный GL-2045 вводят внутривенно, подкожно, перорально, внутрибрюшинно, сублингвально, буккально, трансдермально, с помощью субдермального имплантата или внутримышечно.
15. Способ получения GL-2045, включающий:
(a) культивирование клеток яичника китайского хомяка (СНО), которые были стабильно трансфицированы вектором экспрессии, кодирующим GL-2045, при 37°C±1°C до тех пор, пока клетки СНО не достигнут плотности клеток от приблизительно 5 до приблизительно 30 миллионов клеток/мл;
(b) изменение температуры выращивания с 37ºC±1ºC до 32,5ºC±1ºC; и
(c) сбор GL-2045 из культуральных сред.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанные клетки выращивают до плотности от приблизительно 10 до приблизительно 25 миллионов клеток/мл перед изменением температуры выращивания.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанные клетки выращивают до плотности от приблизительно 10 до приблизительно 15 миллионов клеток/мл перед изменением температуры выращивания.
18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанные клетки выращивают до плотности от приблизительно 15 до приблизительно 20 миллионов клеток/мл перед изменением температуры выращивания.
19. Способ по любому из пп. 15-18, отличающийся тем, что указанное культивирование проводят в основных культуральных средах ActiCHO P.
20. Способ по любому из пп. 15-19, отличающийся тем, что во время культивирования указанных клеток СНО вносят ActiCHO Feed A и ActiCHO Feed B.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанные клетки СНО обеспечивают добавкой к питательной среде через день.
22. Способ по любому из пп. 15-21, отличающийся тем, что указанный вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, содержит лидерный пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1.
23. Способ по любому из пп. 15-22, отличающийся тем, что указанный вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, дополнительно содержит последовательность распознавания транспозазы piggyBac и трансфицируется с вектором, кодирующим транспозазу piggyBac.
24. Способ по любому из пп. 15-23, отличающийся тем, что указанный вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, приводит менее чем к 20 геномным вставкам.
25. Полученный рекомбинантным способом GL-2045, изготовленный способом по любому из пп. 15-24.
26. Вектор экспрессии, кодирующий GL-2045, содержащий кассету экспрессии GL-2045, причем указанная кассета экспрессии GL-2045 фланкирована минимальными инвертированными повторяющимися элементами piggyBac.
27. Способ получения GL-2045, включающий:
(a) трансфекцию клеток яичника китайского хомяка (СНО) вектором экспрессии по п. 26;
(b) культивирование указанных клеток СНО согласно стадии (a) в биореакторе со средами ActiCHO P при температуре выращивания 37°C±1°C;
(c) ежедневную подачу Acti CHO Feed A и Acti CHO Feed B к культурам согласно стадии (b) при температуре выращивания 37°C±1ºC до тех пор, пока культуры не достигнут плотности клеток от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 15 миллионов клеток/мл;
(d) изменение температуры выращивания с 37°C±1°C до 32,5ºC±1°C; и
(e) сбор GL-2045 из культуральных сред, причем указанные способы приводят к жизнеспособности клеток >80% на 21 день и к конечному титру белка >9000 мг/мл, из которых >70% GL-2045 присутствует в виде мультимера, при этом >30% мультимеров представляют собой мультимеры GL-2045 более высокого порядка.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанная жизнеспособность клеток превышает 95% на 18 день культивирования.
29. Способ по любому из пп. 27 или 28, отличающийся тем, что указанное процентное содержание мультимеров превышает 80%.
30. Способ очистки GL-2045, полученного с помощью способов по любому из предыдущих пунктов, включающий:
(a) очистку GL-2045 из культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии; и
(b) заключительную очистку GL-2045 с помощью одной или более из катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия.
31. Способ по п. 30, отличающейся тем, что для проведения аффинной хроматографии применяют колонку с белком A.
32. Способ по любому из пп. 30 или 31, отличающийся тем, что указанная колонка с белком A представляет собой устойчивую к NaOH колонку.
33. Способ по любому из пп. 30-32, отличающийся тем, что указанная колонка с белком A содержит смолу MabSelect SuRue.
34. Способ по любому из пп. 30-33, отличающийся тем, что указанная очистка с помощью аффинной хроматографии включает применение одного из трех различных промывочных буферов для оптимизации условий очистки.
35. Способ по любому из пп. 30-34, отличающийся тем, что указанная очистка с помощью аффинной хроматографии включает элюирование GL-2045 из колонки для аффинной хроматографии.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что элюирование GL-2045 включает элюирование с градиентом рН.
37. Способ по п. 35, отличающийся тем, что элюирование GL-2045 включает элюирование без градиента рН.
38. Способ по любому из пп. 30-35, отличающийся тем, что указанную колонку для аффинной хроматографии регенерируют для удаления связанного GL-2045.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанную колонку для аффинной хроматографии регенерируют чаще, чем предложено производителем.
40. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанную колонку для аффинной хроматографии регенерируют перед каждым циклом очистки.
41. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанную колонку для аффинной хроматографии регенерируют 0,5 М NaOH-буфером.
42. Способ по любому из пп. 30-41, отличающийся тем, что заключительная очистка GL-2045 включает анионообменную хроматографию в проточном режиме.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что анионообменная хроматография в проточном режиме включает применение колонки Q Sepharose Fast Flow.
44. Способ по любому из пп. 30-43, отличающийся тем, что заключительная очистка GL-2045 включает катионообменную хроматографию.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что катионообменная хроматография включает применение колонки POROS XS.
46. Способ по любому из пп. 44 или 45, отличающийся тем, что катионообменная хроматография включает применение элюирующего буфера с ацетатом натрия.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что указанный элюирующий буфер дополнительно содержит 36,5-38,5% 1 М NaCl-буфера.
48. Способ по любому из пп. 30-41, отличающийся тем, что заключительная очистка GL-2045 включает хроматографию гидрофобного взаимодействия.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что хроматография гидрофобного взаимодействия включает применение смолы бутил-FF.
50. Способ по п. 48, отличающийся тем, что хроматография гидрофобного взаимодействия включает применение смолы фенил-HP.
51. Способ по п. 49 или 50, отличающийся тем, что указанная колонка позволяет выделять гомодимер GL-2045.
52. Способ по п. 48, отличающийся тем, что хроматография гидрофобного взаимодействия включает применение смолы октил-FF.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанная колонка приводит к удалению неупорядоченных агрегатов GL-2045.
54. Способ очистки GL-2045, включающий:
(a) очистку GL-2045 от культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии с белком A, причем в колонке с белком A применяют устойчивую к щелочи среду, такую как среда MabSelect SuRe, при этом очистку выполняют с по меньшей мере двумя циклами промывки и при этом процедуры очистки на месте (CIP) выполняют после каждого цикла очистки с этапом регенерации высокой концентрацией NaOH, например, 0,5 М NaOH-буфером.
55. Способ заключительной очистки GL-2045, включающий:
(a) заключительную очистку GL-2045 с помощью катионообменной хроматографии, причем катионообменная колонка содержит смолу с высокой емкостью и высоким разрешением, такую как POROS XS, и при этом элюирующий буфер представляет собой буфер на основе ацетата натрия, содержащий 36,5-38,5% 1 М NaCl-буфера;
(b) заключительную очистку GL-2045 с помощью анионообменной хроматографии, причем анионообменная колонка содержит сильную анионообменную среду, которая обладает высокой химической стабильностью, позволяет осуществлять протоколы очистки на месте и обеззараживания, например, среду Q Sepharose Fast Flow; и
(c) заключительную очистку GL-2045 с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия, причем среда для гидрофобного взаимодействия представляет собой смолу бутил-FF, фенил-HP или октил-FF и выбрана так, чтобы обеспечивать выделение или удаление конкретной фракции GL-2045 в дополнение к заключительной очистке.
56. Способ по любому из пп. 54 или 55, отличающийся тем, что указанный конечный титр белка GL-2045 составляет >4 г/л.
57. Способ по любому из пп. 54-56, отличающийся тем, что указанная готовая белковая композиция GL-2045 содержит >70% мультимеров.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что указанные мультимеры представляют собой мультимеры более высокого порядка.
59. Полученный рекомбинантным способом очищенный GL-2045, изготовленный с помощью способа по п. 27.