СПОСОБ ОЧИСТКИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО ВИРУСА ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА ИЗ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

1. Способ очистки вируса везикулярного стоматита (BBC) из жидкости клеточной культуры, полученной из культуры клеток млекопитающего, зараженных ВВС, который включает:
(a) осветление жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования с получением BBC в надосадочной жидкости;
(b) фильтрование надосадочной жидкости, полученной на стадии (а), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, и получение ВВС в отфильтрованном растворе;
(c) загрузку содержащего BBC отфильтрованного раствора, полученного на стадии (b), на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором, элюирование ВВС из анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором и сбор элюированных фракций, содержащих BBC;
(d) очистку BBC, выделенного на стадии (с), проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет от 300 кДа до 1000 кДа, и получение ВВС в концентрате; и
(e) фильтрование содержащего ВВС концентрата, полученного на стадии (d), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получение ВВС в отфильтрованном растворе.
2. Способ по п.1, согласно которому ВВС, полученный на стадии (е), по меньшей мере на от 90,0 до примерно 99,0% очищен от загрязняющих его белков клеточной культуры и нуклеиновых кислот.
3. Способ по п.1, согласно которому клетки млекопитающего выбирают из группы, включающей эмбриональные клетки почки человека (НЕК), клетки НЕК 293, клетки яичников Китайского хомячка (СНО), клетки почки новорожденных хомячков (BHK), клетки почки Африканской зеленой мартышки (AGMK) и клетки Vero AGMK.
4. Способ по п.1, согласно которому скорость низкоскоростного центрифугирования составляет от 4000×g до 8000×g.
5. Способ по п.1, согласно которому первый буферный солевой раствор или второй буферный солевой раствор, используемый на стадии (с), независимо имеет одну или несколько характеристик, выбранных из группы, состоящей из следующего:
(a) содержит соль, независимо вбранную из NaCl или KCl;
(b) содержит соль, ионная сила которой составляет от 100 до 400 мМ;
(c) содержит буфер, pKa которого составляет от 6,0 до 8,5;
(d) имеет значение pH от 6,5 до 8,0;
(e) содержит буфер, выбираемый из группы, состоящей из фосфатного буфера, буфера, включающего N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES) или трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS); и
(f) содержит сахарозу в концентрации от 1,5 до 5%.
6. Способ по п.5, согласно которому соль во втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl и согласно которому ВВС элюируют из мембранного адсорбера добавление второго pH-буферного солевого раствора в течение одной операции, и согласно которому концентрация NaCl при элюировании, проводимом в течение одной операции, составляет от 500 до 750 мМ.
7. Способ по п.6, согласно которому скорость элюирования вторым буферным солевым раствором составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/мин) до 30 ОК/мин.
8. Способ по п.5, согласно которому соль во втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl и согласно которому ионную силу NaCl во втором буферном солевом растворе линейно увеличивают от 1 до 750 мМ при скорости элюирования, составляющей от 10 до 30 ОК/мин.
9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому мембрана ПФ имеет одну или несколько характеристик, выбираемых из группы, состоящей из:
(a) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 300 кДа;
(b) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 750 кДа; и
(c) мембранный модуль изготовленный из полого волокна.
10. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому ПФ включает концентрированно ВВС, полученного на стадии (с), проводимое по меньшей мере 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере однократной или по меньшей мере пятикратной замены буфера.
11. Способ по п.10, согласно которому буфер, применяемый при буферном обмене, имеет одну или несколько характеристик, выбранных из группы, состоящей из следующего:
(a) представляет собой фосфатный буфер;
(b) представляет собой буфер, содержащий HEPES;
(c) представляет собой буфер, содержащий TRIS;
(d) концентрация буфера составляет от 5 до 15 мМ, а рН составляет 7,2 до 7,5; и
(e) буфер также содержит от 100 до 200 мМ NaCl и от 3,5 до 4,5% сахарозы.
12. Способ по любому из пп.1-8, 11, согласно которому операции очистки (a)-(e) проводят при значении или значениях температуры, составляющем или находящемся в диапазоне от 15 до 25°С.
13. Способ по любому из пп.1-8, 11, согласно которому осветление культуральной жидкости клеточной культуры, проводимое на стадии (а), осуществляют при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, и при этом из операции (а) исключают проведение низкоскоростного центрифугирования.
14. Способ по любому из пп.1-8, 11, согласно которому очищенный ВВС получают в форме фармацевтической композиции.
15. Вирус везикулярного стоматита, очищенный в соответствии со способом по любому из предшествующих пунктов.
16. Вирус везикулярного стоматита по п.15, который имеет одну или несколько характеристик, выбранных из группы, состоящей из следующего:
(a) серотип, выбранный из группы, состоящей из серотипа BBC Indiana, серотипа ВВС New Jersey, серотипа ВВС San Juan, серотипа ВВС Isfahan, серотипа ВВС Glasgow или серотипа ВВС Chandipura;
(b) геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну или по меньшей мере две мутации, которые ослабляют патогенное действие ВВС;
(c) геномную последовательность п.(b), в которой ослабляющие мутации ВВС выбирают из группы, состоящей из чувствительной к температуре (ts) мутации, точечной мутации, мутации перетасовки генов, мутации G-ствола, нецитопатической мутации М-гена, мутации двусмысленной РНК, мутации, укорачивающей G-ген, инсерционной мутации G-гена и мутации, приводящей к делеции гена; и
(d) причем геномная последовательность ВВС содержит последовательность открытой рамки считывания чужеродной РНК, выбранную из группы, состоящей из: гена вируса ВИЧ, выбранного из группы, состоящей из последовательностей генов gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev или vpu, гена вируса HTLV, гена вируса SIV, гена вируса RSV, гена вируса PIV, гена вируса HSV, гена вируса CMV, гена вируса Эпштейна-Барра, гена вируса Варицелла-Зостер, гена вируса эпидемического паротита, гена вируса кори, гена вируса гриппа, гена полиовируса, гена риновируса, гена вируса гепатита А, гена вируса гепатита В, гена вируса гепатита С, гена вируса Norwalk, гена тогавируса, гена альфавируса, гена вируса краснухи, гена вируса бешенства, гена вируса Марбург, гена вируса Эбола, гена вируса папилломы, гена вируса полиомы, гена метапневмовируса, гена коронавируса, гена Vibrio cholerae, гена Streptococcus pneumoniae, гена Streptococcus pyogenes, гена Helicobacter pylori, гена Streptococcus agalactiae, гена Neisseria meningitidis, гена Neisseria gonorrheae, гена Corynebacteria diphtheriae, гена Clostridium tetani, гена Bordetella pertussis, гена Haemophilus, гена Chlamydia, гена Escherichia соli, гена, кодирующего цитокин (например, интерлейкин), гена, кодирующего антигенную детерминанту Т-клетки-хелпера (хелперную детерминанту), гена, кодирующего антигенную детерминанту CTL, гена, кодирующего адъювант, и гена, кодирующего кофактор.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая вирус везикулярного стоматита по п.15 или 16, в фармацевтически приемлемом носителе.
18. Иммуногенная композиция, содержащая вирус везикулярного стоматита по п.15 или 16, в фармацевтически приемлемом носителе.