ПРИМЕНЕНИЯ LACTOBACILLUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, УВЕЛИЧИВАЮЩЕЙ АДСОРБЦИЮ ЖЕЛЕЗА ИЛИ ЕГО ИОНОВ, И ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АНЕМИИ И СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ АДСОРБЦИИ ЖЕЛЕЗА ИЛИ ЕГО ИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИМ
LACTOBACILLUS APPLICATIONS FOR PREPARING COMPOSITION INCREASING ADSORPTION OF IRON OR ITS IONS AND FOR PREPARING PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING ANEMIA, AND METHOD FOR IMPROVING ADSORPTION OF IRON OR ITS IONS IN MAMMAL

Описание
Настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного определенного штамма Lactobacillus plantarum для увеличения адсорбции металлов/ионов металлов млекопитающим. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного определенного штамма Lactobacillus plantarum для получения фармацевтической композиции и композиций, включающих, по меньшей мере, один определенного штамм Lactobacillus plantarum.
Дефицит железа и низкий запас железа превалирует у грудных детей, подростков и беременных женщин как на Западе, так и в развивающихся странах. Одной из причин дефицита железа является его низкая биодоступность из пищевых продуктов, которая отчасти связана с ингибирующими факторами в питании, такими как фитиновая кислота и фенольные соединения. Другие факторы увеличивают адсорбцию железа. Они включают мышечные ткани, аскорбиновую кислоту и другие определенные органические кислоты.
Фитиновая кислота обнаружена главным образом во фракции волокон зерновых, овощей и фруктов. Ингибирующее воздействие фитиновой кислоты связано с образованием нерастворимых комплексов с железом при интестинальном рН. Снижение содержания фитиновой кислоты в этих продуктах или возможность подавления комплексообразования с железом могло бы решить проблему низкой адсорбции железа из пищевых продуктов, богатых железом, относящихся с другой стороны к здоровым и питательным продуктам. Фитиновая кислота гидролизуется фитазой, находящейся в определенных растениях, микроорганизмах и тканях животных. Большинство зерновых фитаз имеет оптимальный рН в пределах от 5,0 до 5,6. Понижая рН пищевых продуктов, можно активировать эндогенные фитазы зерновых и овощей и, таким образом, снизить содержание фитиновой кислоты, как, например, в закваске для ферментации.
ЕР 1003532 описывает применение молочнокислых бактерий при получении не ферментированных энтеральных композиций для облегчения или увеличения адсорбции минеральных веществ из питания. Проведенные эксперименты поддерживают только заявленную адсорбцию на in vitro модели кальциевых ответов или переноса кальция с использованием Сасо-2 интестинальных клеток (карциногенная клеточная линия).
В соответствии с настоящим изобретением было проведено in vivo исследование адсорбции металлов/ионов металлов на человеке. Неожиданно было обнаружено, что не все молочнокислые бактерии обладают свойством адсорбции, как заявлено в ЕР 1003532. Кроме того, было обнаружено, что определенные специфические штаммы Lactobacillus plantarum проявляли неожиданно хорошую адсорбцию указанных металлов/ионов металлов в теле.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к использованию, по меньшей мере, одного штамма Lactobacillus plantarum, выбранного из группы, содержащей Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316 и их фрагментов для получения композиции, увеличивающей адсорбцию, по меньшей мере, одного вида металла/иона металла млекопитающим, предпочтительно человеком.
Применение выше описанных композиций может значительно улучшить общее состояние здоровья млекопитающих, предпочтительно человека, а именно женщин и детей, за счет увеличения адсорбции указанных металлов/ионов металлов в теле. Таким образом, тело человека может использовать большую часть металлов/ионов металлов из употребленных пищевых продуктов, что ведет к улучшению общего состояния здоровья и улучшению самочувствия индивидуумов. Кроме того, преимущество настоящего изобретения состоит в том, что индивидуумы не нуждаются в повышении потребления соответствующих металлов/ионов металлов, таких как железо, для достижения требуемой адсорбции. Это будет иметь место без введения дополнительных количеств соответствующих металлов/ионов металлов. Таким образом, можно избежать негативных эффектов, которые могут появиться при повышенном потреблении, например, Fe, что прежде являлось способом увеличения усвоения определенного металла. Примером таких негативных эффектов, которых можно избежать при использовании настоящего изобретения, является рак толстой кишки, то есть было установлено, что слишком высокое потребление железа может привести к раку толстой кишки, смотрите, например, «Iron intake and the risk of colorectal cancer», Wurzelmann JI et al.,in Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Jul; 5(7):503-7.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу увеличения адсорбции, по меньшей мере, одного вида металла/иона металла млекопитающим, предпочтительно человеком, введением композиции, включающей, по меньшей мере, один штамм Lactobacillus plantarum, выбранный из группы, содержащей Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316 и их фрагменты.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению, по меньшей мере, одного штамма Lactobacillus plantarum, выбранного из группы, содержащей Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316 и их фрагменты для получения фармацевтической композиции для лечения анемии, остеопороза или любого другого расстройства, связанного с дефицитом, по меньшей мере, одного из металлов/ионов металлов, выбранного из группы, содержащей Fe, Zn, Ca Mg и их ионы.
Любое расстройство или заболевание, связанное с дефицитом одного из вышеописанных металлов/ионов металлов, вылечено или предотвращено применением фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей, по меньшей мере, один штамм Lactobacillus plantarum, выбранный из группы, содержащей Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316 и их фрагменты в комбинации, по меньшей мере, с одним металлом/ионом металла, выбранным из группы, содержащей Fe, Zn, Ca Mg и их ионы.
В одном варианте изобретения, по меньшей мере, один из указанных металлов/ионов металлов выбран из группы, содержащей Fe, Zn, Ca Mg и их ионы. Кроме того, возможно, что, по меньшей мере, один из указанных металлов/ионов металлов связан с другим элементом или образует комплекс с другим элементом. Таким образом, можно увеличить адсорбцию любого из вышеописанных металлов/ионов металлов, присутствующих в форме, отличной от указанных металлов/ионов металлов.
В другом варианте изобретения, по меньшей мере, один указанный штамм жизнеспособен, инактивирован или подавлен, или убит, при условии, что он увеличивает требуемым образом адсорбцию металлов/ионов металлов. Кроме того, по меньшей мере, один из указанных штаммов генетически модифицирован.
В другом варианте изобретения указанная композиция включает материал-носитель. Указанный материал-носитель выбран из группы, включающей овсяную кашу, пищевые продукты молочнокислого брожения, устойчивый крахмал, инулин, фруктаны и сахарные спирты, пищевые волокна, углеводы, белки, гликозилированные белки и липиды. Кроме того, материал-носитель может представлять собой комбинацию из вышеуказанных носителей, например смесь из липида, углевода и белка. Указанный материал-носитель ферментирован одним или более штаммом, выбранным из группы, содержащей Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.
В другом варианте изобретения указанная композиция выбрана из группы, включающей пищевой продукт, пищевую добавку, питательный продукт, функциональный продукт и лекарственный пищевой продукт. Указанный пищевой продукт выбран из группы, включающей напитки, йогурты, соки, мороженое, хлеб, печенье, зерновые продукты, питательные батончики, намазываемые продукты. Указанные композиции могут быть ферментированы или не ферментированы, предпочтительными являются ферментированные композиции.
В другом варианте изобретения указанная композиция включает, по меньшей мере, один из металлов/ионов металлов, выбранный из группы, содержащей Fe, Zn, Ca Mg и их ионы. Вводя в композицию металлы/ионы металлов, можно достичь более высокой адсорбции, чем наблюдаемая при более высокой концентрации.
6
14
8
12
9
11
В другом варианте изобретения, по меньшей мере, один из указанных штаммов присутствует в композиции в количестве от около 1×10 до около 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно от 1×10до 1×10 и более предпочтительно от 1×10 до 1×10.
В другом варианте изобретения указанная фармацевтическая композиция представляет собой жидкую композицию или твердую композицию. Твердая композиция выбрана из группы, включающей таблетки, сосательные таблетки, леденцы, жевательные таблетки, жевательные резинки, капсулы, пакетики, порошки, гранулы; гранулы, покрытые оболочкой, и таблетки, покрытые оболочкой; таблетки и капсулы, покрытые оболочкой, растворяющейся в кишечнике; плавящиеся полоски и пленки. Указанная жидкая композиция выбрана из группы, включающей пероральные растворы, суспензии, эмульсии и сиропы.
В другом варианте изобретения указанная фармацевтическая композиция включает, по меньшей мере, один металл/ион металла, выбранный из группы, содержащей Fe, Zn, Ca Mg и их ионы. По меньшей мере, один из указанных металлов/ионов металлов, кроме того, связан с другим элементом или образует комплекс с другим элементом при условии получения требуемой адсорбции.
По меньшей мере, один из указанных штаммов фармацевтической композиции жизнеспособен, инактивирован или подавлен, или убит. По меньшей мере, один из указанных штаммов генетически модифицирован. Кроме того, возможно комбинирование вышеуказанных используемых штаммов, то есть, например, один штамм жизнеспособный, а другой инактивированный.
6
14
8
12
9
11
По меньшей мере, один из указанных штаммов фармацевтической композиции присутствует в количестве от около 1×10 до около 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно от 1×10до 1×10 и более предпочтительно от 1×10 до 1×10.
В другом варианте изобретения композиция включает, по меньшей мере, один штамм Lactobacillus plantarum, выбранный из группы, содержащей Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316 и их фрагменты в комбинации, по меньшей мере, с одним металлом/ионом металла, выбранным из группы, содержащей Fe, Zn, Ca Mg и их ионы, причем указанный, по меньшей мере, один металл/ион металла связан с другим элементом или образует комплекс с другим элементом. Указанный, по меньшей мере, один штамм жизнеспособен, или инактивирован или подавлен, или убит. Указанный, по меньшей мере, один штамм является генетически модифицированным. Композицию по изобретению можно вводить людям для улучшения общего состояния здоровья. В частности, композиции могут вводиться для поддержания общего состояния здоровья женщин детородного возраста или другим индивидуумам с низким уровнем содержания железа. Указанные индивидуумы не страдают анемией, но общее состояние их здоровья улучшено.
В другом варианте изобретения указанная композиция включает материал-носитель, причем указанный материал-носитель выбран из группы, включающей овсяную кашу, пищевые продукты молочнокислого брожения, устойчивый крахмал, пищевые волокна, инулины, фруктаны и сахарные спирты, углеводы, белки, гликозилированные белки и липиды. Кроме того, указанный материал-носитель ферментирован одним или более штаммом, выбранным из группы, содержащей Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316.
6
14
8
12
9
11
В одном варианте изобретения указанная композиция выбрана из группы, включающей пищевой продукт, пищевую добавку, питательный продукт, функциональный продукт и лекарственный пищевой продукт. Указанный пищевой продукт выбран из группы, включающей напитки, йогурты, соки, мороженое, хлеб, печенье, зерновые продукты, питательные батончики, и намазываемые продукты. По меньшей мере, один из указанных штаммов присутствует в композиции в количестве от около 1×10 до около 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно от 1×10до 1×10 и более предпочтительно от 1×10 до 1×10.
Используемый здесь в описании термин «фрагмент» штамма относится к фрагменту бактериальной клетки, такому как фрагмент ДНК, клеточная стенка, клеточная мембрана или любому другому фрагменту бактериальной клетки, обладающему активностью, требуемой для повышения адсорбции металлов/ионов металлов, как описано здесь. В настоящем контексте фрагмент штамма также может представлять собой гомогенат или часть гомогената.
+2
+3
+2
+2
+2
Используемый здесь в описании термин «металлы/ионы металлов» относится к чистому металлу или иону металла, соответственно, такому как Fe, Zn, Ca и Mg и Fe, Fe, Zn, Ca и Mg. Описанная здесь адсорбция естественно будет иметь место, даже если указные металлы/ионы металлов находятся в другой форме, такой как комплекс, или связаны с другими элементами.
Используемый здесь в описании термин «образует комплекс с другим элементом» или «связанный с другим элементом» относится к любой существующей форме металлов/ионов металлов, в которой они сохраняют способность адсорбироваться.
Экспериментальная часть
Эксперимент 1
В настоящем исследовании проведено изучение воздействия L. plantarum 299v и продуктов его ферментации, молочной кислоты и уксусной кислоты на адсорбцию негемового железа из продукта с низкой биодоступностью железа с использованием перекрестного исследования. В тест на специфическое воздействие L. plantarum 299v и органических кислот были включены четыре различные жидкие овсяные каши: А ферментированная овсяная каша с активным L. plantarum 299v, пастеризованная ферментированная овсяная каша с продуктами ферментации, но с инактивированными бактериями, не ферментированная овсяная каша с не регулированным рН и не ферментированная овсяная каша с введенными органическими кислотами.
Субъекты и методы
Субъекты
2
В течение 2-4 недель перед исследованием проводили отбор из 70 женщин добровольцев, для исследования были отобраны 24 женщины, исходя из относительно низкого уровня содержания железа, но не страдающих анемией, то есть концентрация ферретина в сыворотке крови ≤ 40 μг/л и концентрация гемоглобина ≥ 110 г/л. 24 женщины-добровольца были здоровыми молодыми женщинами со средним возрастом (± стандартное отклонение) 25±4 года, со средним весом 62±7 кг и средним индексом массы тела 21,3±1,9 кг/м. Все субъекты не курили, не были беременны или не кормили грудью, или не принимали витамины или минеральные добавки в течение ≥ 2 месяцев перед исследованием или во время проведения исследования. Восемнадцать субъектов принимали оральные контрацептивы, но девять из них регулярно принимали какие-либо другие медикаменты. Сдача крови не проводилась за ≥ 2 месяца перед исследованием или во время исследования. Каждый из участников получил устную и письменную информацию об исследовании перед подписанием соглашения. Исследование было одобрено Муниципальным комитетом по этике Копенгагена (Copenhagen) и Фридрихберга (Frederiksberg) Denmark (заявка № KF 01-219/03) и Национальным Институтом радиационной гигиены, Denmark.
План эксперимента
Исследование представляет собой полностью рандомизированное, двойное слепое перекрестное исследование, в котором каждый субъект участвовал в тестировании 4 продуктов: (А) ферментированная овсяная каша, (В) пастеризованная ферментированная овсяная каша, (С ) не ферментированная овсяная каша (рН регулировали молочной кислотой) и (D) не ферментированная овсяная каша с введенными органическими кислотами (молочная кислота и уксусная кислота).
55
59
Адсорбцию железа из 4 тестируемых блюд определяли с использованием метода двойной смены этикеток (dual label extrinsic tag method). Применяя этот способ, измеряли адсорбцию железа из 4-х тестируемых продуктов измерением адсорбции железа из 2-х тестируемых продуктов синхронно в каждый из 2-х периодов. Два различных тестируемых продукта в каждый период времени случайным методом помечали Fe, Fe соответственно и подавали дважды в течение 4 последующих утренних приемов пищи для минимизации потенциального воздействия ежедневного варьирования, например, в порядке АВВА. Все 12 порядков подачи блюд субъектам осуществляли случайным образом, таким образом, все тестируемые блюда, тестировались одинаковое количество раз, как первое блюдо, подаваемое в период исследования. Важно было оценить возможность перекрестного воздействия ферментированной овсяной каши с живыми колонизирующими бактериями за период исследования.
Активность обоих изотопов измеряли в образцах крови через 18 дней после приема продукта, затем проводили второй период исследования с оставшимися продуктами. Остаточная изотопическая активность первого периода вычиталась из уровней изотопической активности образцов крови второго периода.
Композиции тестируемых продуктов и процедура подачи продуктов
9
Овсяную кашу получали смешиванием овсяной муки с водой, затем обрабатывали ферментами и пастеризовали (с получением проб АВ). Овсяную кашу А ферментировали L. plantarum 299v (DSM 9843, количество жизнеспособных клеток 1,1×10 КОЕ/г) [20]. Овсяная каша В представляла собой пастеризованную овсяную кашу А (количество жизнеспособных клеток <10 КОЕ/г), овсяная каша С представляла собой неферментированную базовую овсяную кашу, подкисленную L-молочной кислотой до рН, эквивалентного рН овсяных каш А, В и D, и овсяная каша D представляла собой не ферментированную базовую овсяную кашу с введенными органическими кислотами DL-молочной кислотой и уксусной кислотой до количеств, эквивалентных тем, которые ожидали получить в ферментированной овсяной каше А. 100 г каждого тестируемого продукта подавали со 140 г цельно зерновой булочки (60,0 г пшеничной муки, 20,0 г муки из цельных зерен пшеницы, 2,0 г соли, 2,0 г дрожжей, 16,0 г рапсового масла, 40,0 г особо чистой воды) с 10 г масла и стаканом особо чистой воды (200 мл). Овсяные каши получали из одной партии и хранили в холодных условиях (4°С) до подачи. Цельнозерновые булочки были получены из одной партии, хранились замороженными и разогревались перед подачей в духовке при температуре 200°С в течение 10 минут.
Тестируемые продукты подавали утром через 12часов после последнего приема пищи. Ночью разрешалось максимально принимать 0,5 л воды. В течение 12 часов перед приемом тестируемых продуктов запрещалась умеренная или чрезмерная физическая активность или прием какого-либо алкоголя или медикаментов. После приема тестируемых продуктов субъектам не разрешалось есть или пить в течение 2-х часов и принимать алкоголь в течение 24 часов. Субъекты заполняли анкету по каждому тестируемому продукту для того, чтобы убедиться, что они соблюдали все процедуры, и их проинструктировали, что нужно есть и пить поочередно и ополаскивать стакан, содержащий овсяную кашу, водой для гарантии полного приема дозы изотопов. Штатный сотрудник следил за тем, чтобы порция была съедена полностью. Во время экспериментального периода субъекты заполняли детальные анкеты с указанием своих ежедневных пищевых привычек.
Изотопы и процедура нанесения меток
55
59
55
59
55
59
3
3
3
3
3
3
Все продукты случайным образом были помечены введением 1 мл изотопного раствора [FeCl (NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA) или FeCl (Amersham Biosciences Corp., Pisctaway, NJ) в 0,1 моль/л HCl] непосредственно в овсяную кашу за 18 часов перед подачей для изотопного обмена. В первый период каждая доза содержала 37 кБк FeCl или FeCl и во второй период 74 кБк FeCl или FeCl.
Пищевой анализ
3-6
1
4 овсяные каши и хлеб сушили сублимационной сушкой, гомогенизировали и анализировали в дублирующем исследовании на общее железо, кальций, цинк и фитиновую кислоту. Калорийность высчитывали с использованием национальной базы данных по пищевым продуктам и композициям (Danish Tables of Food Composition, DANKOST 2000, version 1.20, Herlev, Denmark). Общее железо, кальций и цинк определяли с помощью атомно-адсорбционной спектрофотометрии (Spectra-АА 200, Varian, Mulgrave, Australia) после мокрого озоления в системе экстракции MES 1000 (CEM Corp., Matthews, NC) растворителями 65% (масса/объем) особо чистой азотной кислотой (Merck KgaA, Darmstadt, Germany). Был использован стандартный справочный материал по типичным продуктам питания 1548 а (National Institute of Standards and Technology (Национальный Институт Стандартов и Технологий), Gaithersburg, MD) в качестве стандарта по содержанию железа (среднее ± стандартное отклонение: 35,3±3,77 μг/г), кальция (1,96±0,11 мг/г) и цинка (24,6±1,79 μг/г), и результаты анализов составили 33,38 μг/г, 2,00 мг/г и 23,25 μг/г соответственно. Фитиновую кислоту, как отдельный инозитол три- до гексафосфатов (IP) определяли высокоэффективной ионной хроматографией. Концентрацию органических кислот в овсяной каше определяли капиллярной газовой хроматографией.
Определение статуса железа
1
rd
Ограничения в потреблении продуктов питания и напитков и физической активности перед взятием образцов крови были такими же, как описанные для тестируемых продуктов. Образцы крови брали из локтевой вены после того, как субъекты в течение 10 минут оставались в положении лежа на спине. Анализы на гемоглобин проводили на венозной крови (3,5 мл), собранной в пробирки, содержащие растворенный EDTA (вакуумный контейнер (Vacutainer System), Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) с использованием автоматического гематологического анализатора Sysmex KX-21 (Sysmex America Inc., Mundelein, IL) и подходящих контролей (Eight check-3WP, 22490822, Sysmex America Inc.). Среднестатистическая погрешность метода и коэффициент вариации для серии опытов составили 0,5% (n=12) и 0,6% (n=27) соответственно. Анализы на сывороточный ферритин и α-антихимотрипсин (АСТ) проводили на венозной крови (5,0 мл), собранной в обычные пробирки (вакуумный контейнер (Vacutainer System), Becton Dickinson). Сывороточный ферритин определяли на анализаторе Immulite 1000 (Diaqgnostic Products Corporation, Los Angeles, CA) хемилюминесцентным количественным иммуноанализом, и также анализировали подходящие стандартные сыворотки (3 International standard for ferritin (80/578), WHO, NIBSC, South Mimms, United Kingdom). Среднестатистическая погрешность метода и коэффициент вариации для серии опытов составили 2,7% (n=15) и 5% (n=15) соответственно. АСТ определяли на анализаторе Cobas Mira (Roche Diagnostic Systems, F. Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Switzerland) с использованием иммунонефелометрического анализа и также анализировали подходящие стандартные сыворотки (European Commission certified reference material 470, no. 11924, IRMM, Geel, Belgium). Среднестатистическая погрешность метода и коэффициент вариации для серии опытов составили 1,4% (n=12) и 3,2% (n=14) соответственно.
Определение адсорбции негемного железа
55
59
55
59
Активность Fe и Fe определяли в образцах крови (60мл), собранных в пробирке, содержащей в качестве антикоагулянта гепарин (вакуумный контейнер (Vacutainer System), Becton Dickinson). Одновременное определение Fe и Fe проводили методом сухого озоления с последующей рекристаллизацией и растворением перед подсчетом на жидкостном сцинтилляционном счетчике Tricarb 2100TR (Packard Incstruments, Meriden, CT) с автоматическим гашением и корректировкой способом, описанным выше.
Статистический анализ
i
i
i
i
i
i
i
Данные адсорбции негемного железа были логарифмированы перед проведением статистического анализа и результаты были антилогарифмированы. Все данные, использованные для статистического анализа, нормально распределились с вариантами однородности по остаточному распределению. Абсорцию негемного железа из различных продуктов сравнивали, используя линейную смешанную модель с log (адсорбции негемного железа) в качестве зависимой переменной; продукт, альтернатный продукт и ферритин в качестве независимых заданных переменных; и субъекта, и субъекта х период взаимодействия, как случайные воздействия: log (адсорбции негемного железа) = μ(продукт) + α(альтернатный продукт) + b х ферритин + А(субъект) + В(субъект х период взаимодействия) + ε
Данные получены в виде оценочных показателей по методу наименьших квадратов, и отличия между оценочными показателями получены по методу сводного индекса (CIs) 95%. Статистический анализ был проведен с использованием SAS пакета программ для обработки статистических данных, версия 8.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC) и значения имели значительные отличия для Р<0,05.
Результаты
Композиции тестируемых продуктов
Композиции тестируемых продуктов и содержание органических кислот в овсяных кашах приведены в Таблице 1.
Таблица1Композиции тестируемых продуктов, включая цельнозерновые булочки с маслом, и рН и концентрации органических кислот в овсяных кашах
Ферментированная овсяная каша А
Пастеризованнаяферментированная овсяная каша В
Базовая овсяная каша С (рН регулирован)
Овсяная каша с органическими кислотами D
Энергия (МДж)
2,5
2,5
2,5
2,5
Негемное железо (мг)
2,8
2,8
2,5
2,8
Фитат<sup>1</sup> (мг)(μмоль)
403645
393635
388621
344551
Кальций (мг)
39,6
42,2
39,5
41,1
Цинк (мг)
2,2
2,2
2,1
2,2
Молочная кислота (μмоль/г)
110
89
61
43
Уксусная кислота(μмоль/г)
4,0
3,7
1,1
3,7
Янтарная кислота (μмоль/г)
0,3
0,3
0
0
рН
3,9
4,1
4,2
4,0
<sup>1</sup> Представляет отдельный инозитол тетра- до гексафосфатов
Статус железа и адсорбция негемного железа
Концентрации гемоглобина у субъектов находились в пределах 111-137 г/л и концентрации сывороточного ферритина находились в пределах 12-40 μг/л. Концентрация сывороточного ферритина служит показателем воспаления, в фазе обострения белок АСТ был определен в сыворотке, как маркер острофазового ответа. Концентрации находились в пределах 0,20-0,37 г/л, указывая на отсутствие острофазового ответа (АСТ <0,6 г/л) и, таким образом, достоверное измерение статуса железа у субъектов.
Адсорбция негемного железа из 4 тестируемых продуктов, вычисленная с использованием линейной смешанной модели, приведена ниже в Таблице 2.
Таблица 2Адсорбция негемного железа из 4 различных овсяных каш
Ферментированная овсяная каша
Пастеризованнаяферментированная овсяная каша
Овсяная каша с органическими кислотами
Базовая овсяная каша
Негемное железо, адсорбированное в крови (%)<sup>1</sup>
1,1 (0,8, 1,5)<sup>*</sup>
0,6 (0,4, 0,7)
0,5 (0,4, 0,7)
0,5 (0,4, 0,7)
Тестируемый продукт:контрольный продукт<sup>2</sup>
2,2 (1,7, 2,9)<sup>*</sup>
1.1 (0,8, 1,4)
1,0 (0,8, 1,3)
-
<sup>1</sup> означает оценочные показатели, полученные методом наименьших квадратов, смешанной линейной модели с 95% CI в круглых скобках, n=24
<sup>2</sup> означает отличия в оценочных показателях смешанной линейной модели с 95% CI в круглых скобках, n=24
<sup>*</sup>Оценки в каждом ряду значительно отличаются от всех других оценок (Р<0,0001)
Результаты демонстрируют высокозначимые величины тестируемой ферментированной овсяной каши при сравнении как абсолютного, так и относительного показателей адсорбции негемного железа по сравнению с неферментированной овсяной кашей с регулированным рН (Р<0,0001), в котором во внимание принимали единичные отклонения.
Поскольку L. plantarum 299v может колонизировать слизистую кишечника человека в течение около 2 недель и поскольку тестируемая ферментированная овсяная каша увеличивает адсорбцию негемного железа, определенный переходящий эффект этого тестируемого продукта оказывает действие на последующие тестируемые продукты во время тестирования. Как правило, у тестируемых продуктов переходный эффект не наблюдался, но определенный переходный эффект, наблюдаемый у ферментированной овсяной каши, был статистически достоверным (Р = 0,06).
11
Показатели адсорбции различных тестируемых продуктов показали высокозначимое увеличение адсорбции негемного железа из тестируемого продукта, такого как ферментированная овсяная каша с молочной кислотой, полученной ферментированием, следует принимать во внимание, что такой эффект отсутствует у пастеризованной ферментированной овсяной каши и не ферментированной овсяной каши, используемых в качестве отличительных контролей. Поскольку содержание железа и фитата в 4 тестируемых продуктах было постоянным, этот значительный эффект был прямым следствием эффекта ферментации L. plantarum 299v. Является ли этот эффект следствием активной L. plantarum 299v или эффектом от органических кислот, полученных ферментацией, определено из сравнений показателей адсорбции ферментированной овсяной каши с показателем адсорбции продуктов с инактивированной L. plantarum 299v (пастеризованной ферментированной овсяной каши) и не ферментированной овсяной каши с введением органических кислот, поскольку молочная кислота и уксусная кислота были введены позднее в концентрациях, соответствующим нормально продуцируемым в процессе ферментации. Результаты анализов органических кислот показали, что невозможно достичь уровней, аналогичных уровням содержания органических кислот в 3 овсяных кашах на момент потребления (Таблица 2). Наименьшее отличие от ферментированной овсяной каши по содержанию органических кислот имела пастеризованная ферментированная овсяная каша, в которой концентрации молочной и уксусной кислоты составили меньше на 19% и 8% соответственно. При сравнении показателей адсорбции железа 2 этих продуктов показатель для пастеризованной ферментированной овсяной каши был на 50% меньше. Поскольку уровень содержания молочной кислоты в овсяной каше с введенными органическими кислотами был на 52% ниже, чем у пастеризованной ферментированной овсяной каши, и показатель адсорбции был ниже только на 9%, маловероятно, что увеличение адсорбции железа в ферментированной овсяной каше происходило главным образом за счет воздействия органических кислот. Кроме того, результаты настоящего исследования указывают, что активность молочнокислых бактерий L. plantarum 299v (1,1×10КОЕ) была способна увеличить адсорбцию негемного железа из продукта с низкой биодоступностью железа у молодых женщин.
Описано как происходит в норме адсорбция железа в двенадцатиперстной кишке и проксимальном отделе тонкого кишечника. Небольшое количество органических кислот из пищевых продуктов, таких как молочная кислота и уксусная кислота из пастеризованной ферментированной овсяной каши и овсяной каши с введением органических кислот, очень быстро адсорбируются в желудочно-кишечном тракте. Возможное объяснение увеличенной адсорбции негемного железа из ферментированной овсяной каши может заключаться в колонизации L. plantarum 299v слизистой большей части проксимального отдела тонкого кишечника или возможно толстой кишки, где локальное продуцирование органических кислот активными бактериями может как повышать местный рН, так и молочная кислота может образовывать растворимые комплексы с железом, как описано Derman et al. Эта гипотеза подкреплена тем фактом, что переходящий эффект ферментированной овсяной каши был статистически достоверным (Р = 0,06), указывая на воздействие L. plantarum 299v на адсорбцию негемного железа из продуктов, потребленных в последующие дни, в то время, пока бактерии все еще колонизировали кишечник.
При сравнении показателей адсорбции для тестируемых продуктов, таких как ферментированная овсяная каша, пастеризованная ферментированная овсяная каша и овсяная каша с введением органических кислот (как описано выше), ясно, что увеличение адсорбции железа из тестируемых продуктов, таких как ферментированная овсяная каша, не отнесено за счет воздействия только одних органических кислот, как предполагалось выше, но за счет воздействия L. plantarum 299v.
Эксперимент 2
Реагенты.
Все реагенты были от GTF (Göteborg, Sweden), если не указанно иное.
Культура клеток Caco-2.
2
2
Клетки Сасо-2 были получены из американской коллекции типовых культур (Rockville, MD) с 17 пассажами и, как описано для экспериментов, с 20-35 пассажами. Исходные культуры выдерживали на модифицированной α поддерживающей среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 20% (объем/объем) фетальной телячьей сыворотки (FSC), 100 единиц/л пенициллина G и 100 мг/л стрептомицина при 37°С в кондиционированной атмосфере с 95% кислорода и 5% CO. Питательную среду меняли каждыe два, три дня. Клетки при ~ 80% слиянии обрабатывали с использованием трипсина в количестве 0,5 г/л с 0,5 ммоль/л EDTA в среде Дульбекко, забуференной солевым фосфатным буфером (PBS). Перед проведением эксперимента 100000 клеток в 0,5 мл DMEM высевали на 0,4 μм микропористые поликарбонатные мембранные вставки (1 см Tranwell inserts; Corning, Acton, MA). Базолатеральная камера содержала 1,5 мл DMEM. Среда с обоих сторон вставного фильтра заменялась каждые два, три дня. Все эксперименты по всасыванию и переносу железа проводили через 14-17 дней после посева.
Бактериальные культуры.
600
3
7
7
Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843), (5), Lactobacillus plantarum 299, (1), Lactobacillus plantarum HEAL 9 (DSM 15312), (2), Lactobacillus plantarum HEAL 19 ( DSM 15313), (4), Lactobacillus plantarum 299v мутанат (AMJ 1277), (3), и Lactobacillus reuteri, (6), культивировали в MRS питательной среде в ротационном шейкере (37°С, 200 оборотов в минуту). Бактерии собирали в экспоненциальной фазе роста (OD, max=1,3). Объем клеточной культуры, соответствующий определенному количеству клеток, был рассчитан по заранее заданной стандартной кривой. Вращение прекращали при 5000 об/мин в течение 2 минут (Sorvall heraeus, multifuge) и затем ресуспендировали в транспортный раствор HBSS (РАА), HEPES 2,5% (1М, РАА) и FeCl 10μм. Опыт проводили при концентрации клеток 6,7×10 клеток/мл для всех видов кроме Lactobacillus reuteri, которую вводили в концентрации 3,35 х 10 клеток/мл. Опыт повторяли дважды.
Анализ усвоения
Fe клетками и переноса через монослои
55
55
55
2
Клетки помещали в свежую DMEM за 1 день до проведения анализа на усвоение и перенос. Для исследования усвоения Fe (III) и трансэпителиального переноса клетками Сасо -2 бактериальные суспензии пометили Fe (Perkin Elmer). Суспензии в объемах 0,5 мл помещали с апикальной стороны клеток Сасо-2, во время нахождения их в базолатеральной камере с 1,5 мл HBSS/HEPES. Клетки инкубировали при 37°С в кондиционируемой атмосфере, состоящей из 95% кислорода и 5% CO. После 2 часов инкубирования клетки промывали 4 раза ледяным промывным буфером (150 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л HEPES, 1 ммоль/л EDTA, рН 7) и гомогенизировали в 0,5м NaOH. Измеряли Fe, перенесенное в базолатеральную камеру или связанное с Сасо-2 лизатами, с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика. Целостность монослоев клеток проверяли перед анализом и после анализа с использованием TEER.
3
Перенос FeCl (10 μмоль/л) в HBSS/HEPES с введением различных штаммов бактерий (смотрите описание способа).
Контроль: как описано выше, но без бактерий.
Перенос, %
Контроль
0,06
1. Lactobacillus plantarum 299
0,58
2. Lactobacillus plantarum HEAL 9
0,23
3. Lactobacillus plantarum 299v мутанат
0,32
4. Lactobacillus plantarum HEAL 19
0,69
5. Lactobacillus plantarum 299v
0,38
6. Lactobacillus reuteri
0,11
Результаты: Штаммы 1-5 оказывали влияние на транспорт Fe по сравнению с раствором чистого Fe. Наблюдалось увеличение в 3-9 раз. В образце, содержащем Lactobacillus reuteri, также наблюдалось увеличение транспорта, но не сравнимое с образцами, содержащими различные штаммы Lactobacillus рlantarum.
Таким образом, увеличенный перенос, наблюдаемый для различных штаммов Lactobacillus рlantarum, показал аналогичное увеличение адсорбции железа, что соответствует более ранним исследованиям на человеке.