Метод биопсии клеток трофобласта при множественных клетках, не участвующих в компактизации на стадии бластоцисты в программах преимплантационного генетического скрининга эмбрионов человека
METHOD FOR TROPHOBLAST CELLS BIOPSY AT MULTIPLICITY OF CELLS THAT DO NOT PARTICIPATE IN COMPACTION AT BLASTOCYST STAGE FOR HUMAN EMBRYOS PREIMPLANTATION GENETIC SCREENING PROGRAMMES

Преимплантационный генетический скрининг (ПГС) в настоящее время является современным и наиболее точным методом селекции эмбрионов in vitro с целью профилактики рождения детей с врожденными и наследственными заболеваниями. ПГС служит альтернативой пренатальной диагностике и селективному прерыванию беременности на ранних сроках у пар с высоким риском рождения детей с врожденными аномалиями (Dahdouh Е. et al., 2015). В качестве материала для генетического исследования эмбрионов могут быть использованы один или два бластомера эмбриона 3-х суток культивирования, или клетки трофобласта бластоцисты. По сравнению с биопсией бластомера биопсия трофоэктодермы снижает вероятность отбора для анализа мозаичных клеток, что повышает чувствительность и специфичность ПГС (Huang J. et al., 2015; Twisk M. et al., 2006). Однако при культивировании эмбрионов человека в программах экстракорпорального оплодотворения не все полученные бластоцисты пригодны для проведения биопсии и последующей диагностики. У некоторых пациентов при формировании компактной морулы, а впоследствии и бластоцисты, не все бластомеры формируют эмбрион. Некоторые клетки не участвуют в компактизации, но при этом остаются внутри зоны пеллюцида. Такие клетки (так называемые экстраклетки) могут мешать формированию бластоцели и последующему выходу эмбриона из прозрачной оболочки. Причины, по которым экстраклетки не участвуют в формировании бластоцисты, в настоящий момент неизвестны.
Показано, что в процессе компактизации происходят изменения вне- и внутриклеточной организации, включающие поляризацию бластомеров, формирование межклеточных контактов и взаимодействие цитоскелета соседних бластомеров (Fleming et al., 2000., 2001), изменяются мембранные транспортные системы, поверхностные гликопротеины, антигены. До начала компактизации бластомеры имеют сферическую форму и малое количество межклеточных контактов, микроворсинки равномерно распределены по поверхности клеток, а митохондрии в цитоплазме располагаются в случайном порядке. На ранних этапах компактизации клетки приобретают эпителиальную полярность, апикальные микроворсинки и сглаженные латеральные поверхности. Изменения расположения микроворсинок сопровождаются перераспределением локализации митохондрий и кортикальных элементов цитоскелета (Veeck, , 2003). Поверхностные микроворсинки наблюдают лишь в некоторых базальных участках, основная их масса расположена на апикальном полюсе клеток, который проявляет повышенную лиганд-связывающую способность. Актиновые микрофиламенты концентрируются под апикальной поверхностью, микротрубочки и митохондрии выстраиваются параллельно базолатеральным мембранам, колонки эндоцитозных пузырьков располагаются между апикальным полюсом и базально-расположенными ядрами.
По-видимому, появление экстраклеток говорит о нарушении вышеописанных процессов компактизации в отдельных бластомерах 8-клеточного эмбриона, что и приводит к их элиминации из дальнейшего развития.
Во время биопсии бластоцисты эмбриолог забирает не более 5-8 клеток трофобласта для анализа. Забор клеток трофобласта происходит после предварительного применения вспомогательного хетчинга на день 4 после оплодотворения. Согласно европейским рекомендациям, целесообразно проводить биопсию только тех клеток трофобласта, которые вышли из зоны пеллюцида, чтобы не повредить формирующийся эмбрион. Если выхода клеток трофобласта из зоны не наблюдают, рекомендовано продленное культивирование. Появление экстраклеток в бластоцисте существенно затрудняет процедуру биопсии.
Также следует помнить, что экстраклетки при биопсии трофобласта могут приводить к загрязнению биопсийного материала, и даже приводить к неправильной диагностике, так как к формирующемуся эмбриону данные клетки не относятся. В опубликованной зарубежной и отечественной литературе (в силу относительной новизны методики ПГС на клетках трофобласта) отсутствуют какие-либо указания на технику биопсии бластоцист субоптимального качества.
В настоящее время в мире отсутствуют единые требования и утвержденные протоколы проведения биопсии бластоцисты, а также единого стандарта проведения программ ПГС. Это связано с различными законодательными актами в разных странах (в том числе различия этических составляющих манипуляций с эмбрионами человека). В руководстве Европейской ассоциации репродукции человека (ESHRE) описано появление экстраклеток, но рекомендации по выполнению биопсии бластоцист субоптимального качества с экстраклетками не приводятся (ESHRE, 2010). Применение традиционной техники биопсии может приводить к коллапсированию и последующей дегенерации бластоцисты.
Целью настоящего изобретения является разработка метода биопсии бластоцисты человека в программах преимплантационного генетического скрининга при множественных экстраклетках внутри перивителлинового пространства под зоной пеллюцида.
Эта задача решается применением метода биопсии клеток трофобласта при множественных экстраклетках бластоцисты в программах преимплантационного генетического скрининга эмбрионов человека, который отличается тем, что таким бластоцистам удаляют зону пеллюцида, освобождают клетки трофобласта, проводят биопсию и не включают экстраклетки в материал, передаваемый на генетическую диагностику.
Разработанный метод биопсии позволяет увеличить количество бластоцист, анализируемых методом сравнительной геномной гибридизации на 24 пары хромосом, отобрать больше эуплоидных эмбрионов для переноса в полость матки в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий.
Преимущества предлагаемой техники биопсии клеток трофэктодермы бластоцисты были подтверждены на 17 бластоцистах человека. Все пациентки подписали добровольное информированное согласие. Бластоцисты субоптимального качества были биопсированы с применением полного удаления зоны пеллюцида, материал отдан на генетическую диагностику, эмбрионы криоконсервированы. После размораживания все эмбрионы были хорошего качества, продолжили процесс экспандирования.
Клинические примеры
1. Пациентка А., 39 лет, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ЭКО/ИКСИ/ПГС и переноса эмбрионов. Проведено полное клиническое обследование. В анамнезе проведение четырех программ экстракорпорального оплодотворения с отсутствием бластоцист хорошего качества на перенос. Беременности у пациентки не наступали. Гинекологический и эндокринологический статусы без особенностей. Муж, 43 года, по результатам спермограммы - астенозооспермия, вторичное бесплодие. Супруге была проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормонами, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 8 зрелых ооцитов. Оплодотворение проводили методом ПИКСИ (отбор сперматозоидов по связыванию с гиалуроновой кислотой). На 3 сутки культивирования наблюдали фрагментацию всех эмбрионов. На 5-е сутки культивирования два эмбриона - кавитирующие морулы с множеством экстраклеток. Проведение биопсии трофобласта было невозможно, так как существовал большой риск загрязнения материала экстраклетками. Было принято решение провести полное удаление зоны пеллюцида. Выполнение вспомогательного хетчинга позволило полностью освободить клетки трофобласта и эмбриобласта и корректно провести биопсию. В результате был выполнен полногеномный скрининг, отобраны эуплоидные эмбрионы и перенос генетически нормального эмбриона в полость матки. Наступила беременность. В настоящий момент прогрессирует.
2. Пациентка Б., 30 лет, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ЭКО/ИКСИ/ПГС и переноса эмбрионов. Проведено полное клиническое обследование. Гинекологический и эндокринологический статусы без особенностей. Кариотип пациентки 46, ХХ, der(14; 21) (q10; q10), робертсоновская транслокация между 14 и 21 хромосомами. Есть здоровая девочка (кариотип неизвестен). В анамнезе прерывание беременности на позднем сроке в связи с патологией плода (46, ХХ, der(14; 21) (q10; q10), +21). Беременность наступила самостоятельно. Муж, 33 года, по результатам спермограммы - астенозооспермия, вторичное бесплодие. Супруге была проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормонами, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 3 зрелых ооцита. Оплодотворение проводили методом ИКСИ. На 5-е сутки культивирования два эмбриона - кавитирующая морула (с экстраклетками с перивителлиновом пространстве) и бластоциста хорошего качества. Третий эмбрион остановился в развитии на стадии 8 бластомеров с фрагментацией.
Была выполнена биопсия трофобласта бластоцисты хорошего качества классическим методом. На кавитирующей моруле провели полное удаление зоны пеллюцида. Через 4 часа экспандированную бластоцисту пробиопсировали. В результате был выполнен полногеномный скрининг. Из двух эмбрионов 1 эуплодидый, 2 - гетероплоидный с множественной генетической патологией. Осуществлен перенос генетически нормального эмбриона в полость матки. Беременность не наступила. Супружеская пара готовится к повторной программе ЭКО/ИКСИ/ПГС.
Таким образом, разработанная техника биопсии клеток трофобласта является эффективным методом работы с бластоцистами субоптимального качества, что позволяет выполнять забор клеток трофобласта, проводить преимплантационный генетический скрининг и повысить эффективность программ лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий.
Список литературы
1. Dahdouh Е.М., Balayla J., -Velasco J.A. Impact of blastocyst biopsy and comprehensive chromosome screening technology on preimplantation genetic screening: a systematic review of randomized controlled trials // Reprod Biomed Online. - 2015. - Mar 30. - N3. - pp. 281-289.
2. Huang J., Zhao N., Wang X. et al. Chromosomal characteristics at cleavage and blastocyst stages from the same embryos // J Assist Reprod Genet. - 2015. - May 32. - N5. - pp. 781-787.
3. Twisk M., Mastenbroek S., van Wely M. et al. Preimplantation genetic screening for abnormal number of chromosomes (aneuploidies) in in vitro fertilisation or intracytoplasmic sperm injection // Cochrane Database Syst Rev. - 2006. - Jan 25. - N1: CD005291.
4. Fleming T.P., Ghassemifar M.R., Sheth B. Junctional complexes in the early mammalian embryo// Semin Reprod Med. - 2000. - N18. - pp. 185-93.
5. Fleming T.P., Sheth В., Fesenko I. Cell adhesion in the preimplantation mammalian embryo and its role in trophectoderm differentiation and blastocyst morphogenesis// Front Biosci. - 2001. - N6. - D1000-7.
6. Veeck L.L.,  N. An Atlas of Human Blastocysts. The Parthenon Publishing Group, 2003.
7. Harton G., Braude P., Lashwood A. et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for organization of a PGD centre for PGD/preimplantation genetic screening // Human Reproduction. - 2010. - vol. 00. - N0. - pp. 1-11.
8. Vajta G., Rienzi L., Bavister B.D. Zona-free embryo culture: is it a viable option to improve pregnancy rates? // Reprod Biomed Online. - 2010. - Jul 21. - N1. - pp. 17-25.