Исследование изменения агрегации эритроцитов при инкубации с замещенными 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онами

УДК 612.1

Е. В. Узикова, М. Ю. Милорадов, В. Н. Левин, С. В. Булаева, А. В. Муравьёв, Ж. В. Чиркова

Исследование изменения агрегации эритроцитов при инкубации с замещенными 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онами

Исследования выполнены при поддержке РФФИ грант №09-04-00436-а.

В статье приводятся результаты исследования влияния синтезированных в Ярославском государственном техническом университете 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онов [5] на процесс объединения в агрегаты эритроцитов крови человека. Выявлено, что данные соединения способствуют значительному снижению агрегации эритроцитов по сравнению с контрольным образцом (суспензией эритроцитов в физиологическом растворе).

Ключевые слова: 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-оны, агрегация эритроцитов, биологически активные составы, протеинфосфатазы.

E. V. Uzikova, M. Ju. Miloradov, V. N. Levin, S. V. Bulaeva, A. V. Muravyov, Zh. V. Chirkova

Research of Change of Red Blood Cell Aggregation during Incubation with 4-hydroxy-6,7-dicyano-

benzoxazine-3-ones

The present study was designed to investigate the effect of 4-hydroxy-6,7-dicyano-benzoxazine-3-ones on the RBCs aggregation. It has been found that these compounds can significantly decrease the red blood cell aggregation.

Keywords: 4-hydroxy-6,7-dicyano-benzoxazine-3-ones, RBC aggregation, biologically active compounds, protein phosphatase.

Введение

Производные 1,4-бензоксазин-З-онов являются важными гетероциклическими системами. Входят в состав как природных, так и синтетических соединений. Они часто используются как основа для синтеза биологически активных составов в широких пределах от гербицидов, фунгицидов и пестицидов до терапевтически активных лекарственных средств [8, 10, 12].

В настоящее время в медицине применяются препараты, в состав которых входят бензоксази-новые фрагменты, например: Азасетрон, Бизок-сатин. На основе 1,4-бензоксазин-З-онов разрабатывается новый класс потенциальных анти-тромбических составов, замедляющих образование тромбина, а также влияющих на активность фибриногена, и реологические свойства крови [13]. Производные 4-гидрокси-1,4-бензоксазин-3-она интенсивно исследуются, и за последние 50 лет опубликовано уже более 500 работ, касающихся различных аспектов химии и биологии этого класса соединений. Наиболее важными из производных 1,4-бензоксазин-З-онов являются К-гидроксипроизводные.

Путем скрининга было установлено, что полученные соединения способны ингибировать активность фосфатаз. Протеинфосфатазы - большая группа малоизученных ферментов, осуществляющих процесс дефосфорилирования субстратов и разносторонне влияющих на функциональную активность других ферментных систем и функцию клеток, в частности, эритроцитов. В связи с этим целью данной работы являлось исследование влияния замещенных 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онов на процесс объединения в агрегаты эритроцитов крови человека.

Материалы и методы исследования

Цельную кровь (в объеме 20 мл) получали ве-нопункцией у здоровых лиц 20-25 лет (п=32), в донорском пункте. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (5 МЕ/мл). Все измерения и манипуляции с кровью проводились в течение 4 часов после ее забора.

Для регистрации агрегации эритроцитов кровь отделяли от плазмы центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Концентрированную суспензию эритроцитов (Нс1; = 95 %) отмывали три раза в изотоническом растворе

© Узикова Е. В., Милорадов М. Ю., Левин В. Н., Булаева С. В., Муравьёв А. В., Чиркова Ж. В., 2011

№С1 (Не* = 40 %). Затем разделяли их на несколько аликвот и суспендировали при 37оС в различных инкубационных средах при гематок-рите, равном 40 %, в течение 15 минут. После этого исследуемые эритроциты ресуспендирова-ли в аутологичной плазме (доводя до гематокри-та 0,5 %). Измерения агрегации проводили при комнатной температуре (21±1 оС).

Эритроциты инкубировали с веществами, представленными в таблице 1. В качестве растворителя использовали димексид.

Степень агрегации эритроцитов определяли с помощью метода оптической микроскопии с последующей видеорегистрацией и компьютерным

анализом изображения [2]. При регистрации рассчитывали показатель агрегации (ПА), как отношение числа агрегатов к количеству эритроцитов; среднее число клеток, приходящееся на один агрегат (ЧА) и интегральный индекс агрегации (ИИА), равный произведению ПА на ЧА, который характеризует процент проагрегировавших клеток.

Статистическую обработку полученных цифровых материалов и все виды анализа результатов проводили на РС IBM, используя табличный редактор Microsoft Excel и программу "Statistica" (версия 6.0).

Некоторые сведения о веществах, применяемых в эксперименте

Таблица 1

№ п/п Формула Название Концентрация, M

Препарат 1 ÎH3 Oh (2Е)-2-[циано(метилфенил)-метилен]-4-гидрокси-3-оксо-3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-6,7-дикарбонитрил 0,1 цмоль

Препарат 2 a 2b 2c N^ ° ifTNY° ГП1 N^ ° J II N (2Е)-2-[циано(фенил)-метилен]-4-гидрокси-3-оксо-3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-6,7-дикарбонитрил 100цмоль 0,1 цмоль 0,1 цмоль

Препарат 3 OH 1 N<v 1 1 N (2Е)-2-[циано(метоксифенил)-метилен]-4-гидрокси-3-оксо-3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-6,7-дикарбонитрил 0,1 цмоль

Результаты и обсуждение

По полученным данным с помощью статистических методов обработки было установлено влияние препарата в среднем на процесс агрега-

ции. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2

Исследование изменения агрегации эритроцитов при инкубации с замещенными 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онами

Таблица 2

Показатели агрегации эритроцитов при введении раствора препарата по сравнению с контролем

Препараты Показатели ПА, отн. ед. ЧА, отн. ед. ИИА, отн. ед.

Контроль для 1 0,054±0,015 4,875±0,244 0,275±0,082

Препарат 1 0,040±0,006 4,736±0,184 0,194±0,036

Контроль для 2 0,066±0,014 4,762±0,209 0,329±0,08

Препарат 2a 0,040±0,008* 4,526±0,162 0,191±0,042

Препарат 2Ь 0,026±0,004** 4,342±0,179 0,112±0,017**

Препарат 2c 0,033±0,005** 4,706±0,219 0,159±0,029**

Контроль для 3 0,066±0,012 4,704±0,202 0,315±0,062

Препарат 3 0,045±0,009 4,271±0,311 0,272±0,070

* - различия достоверны при р<0,05. ** - различия достоверны при р<0,01.

В ходе исследований было установлено, что присутствие в исследуемых образцах замещенных 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онов способствовало значительному снижению агрегации по сравнению с контролем (суспензией эритроцитов в физиологическом растворе).

При инкубации эритроцитов с соединениями 1 и 3 наблюдалась тенденция к снижению агрегации на 26 % и 32 % соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Изменение агрегации эритроцитов под влияние инкубации с соединениями 1 и 3

При исследовании соединения 2 (а-с) получено достоверное снижение агрегации эритроцитов, которое составило от 39 до 61 % (рис. 2).

Наибольшее снижение агрегации наблюдалось при концентрации 0,1 цмоль.

Рис. 2. Изменение агрегации (в % к контролю) эритроцитов под влиянием инкубации с (2Е)-2-[циано(фенил)метилен]-4-гидрокси-3-оксо-3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-6,7-дикарбонитрилом

Снижение агрегации было статистически достоверным (табл. 2) по двум основным критериям: по показателю агрегации (ПА) и интегральному индексу агрегации (ИИА). Эти изменения следует расценивать как позитивные сдвиги реологической картины крови: ее текучести и транспортного потенциала.

Исходя из химической структуры данных соединений, можно предположить, что снижение агрегации обусловлено ингибированием фосфа-таз, что соответственно приводит к активации протеинкиназ [9].

Известно несколько типов протеинкиназ, активируемых различными эффекторами. Например, протеинкиназа А, стимулируемая при помощи цАМФ [4, 6, 7], и протеинкиназа С, которая, являясь подмембранным белком, осуществляет фосфорили-рование по остаткам серина и треонина [3, 14]. В эритроцитах представлены также и тирозиновые протеинкиназы, осуществляющие фосфорилирова-ние белков, в частности, белка полосы 3 по тирози-новым остаткам, которые можно активировать ги-

пертоническим раствором или повышением внутриклеточного Са2+ [11, 14].

Протеинфосфатазы - большая группа малоизученных ферментов, осуществляющих процесс дефосфорилирования субстратов (то есть возвращение белковой молекулы в исходное состояние). Известно, что ингибирование активности тирозиновых протеинфосфатаз должно приводить к повышению активности тирозиновых протеинкиназ [9]. Большинство протеинкиназ клетки, осуществляя процесс фосфорилирования ключевых белков мембраны, сопровождающийся мгновенным изменением их конфигурации и свойств, могут участвовать в изменениях микрореологических свойств крови, и в частности, агрегации и эластичности мембраны эритроцитов

[1, 6, 7,].

Сходный эффект был обнаружен при инкубации эритроцитов с ортованадатом натрия и эри-тропоэтином, которые являются активаторами тирозиновых протеинкиназ [1].

Исследование изменения агрегации эритроцитов при инкубации с замещенными 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онами

Таким образом, синтез соединений 4-гидрокси-6,7-дициано-1,4-бензоксазин-3-онового ряда дает возможность изучать молекулярные механизмы изменения микрореологических ха-

рактеристик клеток крови, а также проводить дальнейшие доклинические исследования данных соединений.

Библиографический список

1. Маймистова, А. А. Роль внутриклеточных эф-фекторных путей эритроцитов в изменении их микрореологических свойств в норме и на фоне атеросклероза [Текст] : автореф. дисс...канд. биол. наук / А. А. Маймистова. - Ярославль, 2009. - 24 с.

2. Муравьев, А. В. Компьютерная регистрация агрегации эритроцитов при их инкубации с адреналином [Текст] / А. В. Муравьев // Мат. научно-практическая конференции «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике». - СПб., 2003. - С. 78-80

3. Andrews D.A., Lu Yang, Low P.S. Phorbol ester stimulates a protein kinase C-mediated agatoxin-TK-sensitive calcium permeability pathway in hu-man red blood cells // Blood. - 2002. - Vol. 100, N 9. - P. 33923399.

4. Boivin P., Garbarz M., Dhermy D., Galand C. In vitro phosphorylation of the red blood cell cytoskeleton complex by cyclic AMP-dependent protein kinase from erythrocyte membrane // Biochim. Biophys. Acta. - 1981. - Vol. 21. - P. 1-6.

5. Chirkova Zh. V., Filimonov S. I., Abramov. I. G. et al. Synthesis of novel substituted 4-hydroxy-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxa-zine-6,7-dicarbonitriles // Het-erocycles. - 2011. - Vol. 83, № 4. - P 755 - 763.

6. Eder P.S., Soong C.J., Tao M. Phosphorylation reduces the affinity of protein 4.1 for spectrin // Biochemistry. - 1986. - Vol. 25. - P. 1764-1770.

7. Ling E., Danilov Y.N., Cohen C.M. Modulation of red cell band 4.1 func-tion by cAMP-dependent kinase and protein kinase C phosphorylation // J. Biol. Chem. -1988. - Vol. 15. - P. 2209-2216.

8. Macas F.A., Marn D., Oliveros-Bastidas A. // Nat. Prod. Rep., 2009, 26, 478-489.

9. Manno S., Takakuwa Y., Mohandas N. Modulation of erythrocyte mem-brane mechanical function by protein 4.1 phosphorylation // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280. - P. 7581-7587.

10. Martindale The Complete Drug Reference, /Thirty-sixth edition. / Edited by Sean C Sweetman, Pharmaceutical Press, 2009.

11. Minetti G., Ciana A., Balduini C. Differential sorting of tyrosine kinases and phosphotyrosine phosphatases acting on band 3 during vesiculation of hu-man erythrocytes // Biochem. J. - 2004. - Vol. 377. - P. 489497.

12. Oeztuerk S., Ozturk A.M., Hakan G., Nurten A. // IL Farmaco, 2000, 55, 715-718.

13. Stefanic Anderluh P., Anderluh M., Ilas J. // J. Med. Chem., 2005, 48 (9), 3110-3113.

14. Zipser Y., Piade A., Barbul A., Korenstein R., Kosower N.S. Ca2+ promotes erythrocyte band 3 tyrosine phosphorylation via dissociation of phosphotyrosine phosphatase from band 3 // Biochem. J. - 2002. - Vol. 15, N 368. - P. 137-144.