Биназа индуцирует провоспалительный иммунный ответ макрофагов

Оригинальные исследования

209

БИНАЗА ИНДУЦИРУЕТ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ МАКРОФАГОВ

А.П. Ложкин, П.В. Зеленихин, А.В. Макеева, Е.А. Соколова, О.Н. Ильинская Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Binase induces pro-inflammatory immune response of macrophages

A.P. Lozhkin, P.V. Zelenikhin, A.V. Makeeva, E.A. Sokolova, O.N. Ilinskaya Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia

Биофармацевтические агенты, особенно белковой природы, могут обладать широким спектром иммунологических эффектов. Цитотоксические рибонуклеазы, к которым относится и биназа — РНКаза Bacillus pumilus — обладают весомым потенциалом для использования в качестве средств терапии злокачественных новообразований. Однако без всестороннего анализа реакций иммунной системы на препарат его практическое использование затруднено.

С помощью проточной цитометрии оценивали качественные и количественные изменения в синтезе периферическими макрофагами мыши цитокинов IL-6, IL-10, МСР-1 и TNF-a под действием биназы и РНКазы А.

Установлено, что в исследованных концентрациях (100 и 300 мкг/мл) биназа, в отличие от РНКазы А, способна активировать провоспалительный ответ макрофагов, индуцируя повышение в среде культивирования уровня цитокинов IL-6, МСР-1 и TNF-a. Обработка РНКазами не приводила к усилению синтеза антивоспалительного цитокина IL-10.

Полученные данные позволяют предположить, что способность биназы активировать провоспалительный ответ макрофагов усилит ее противоопухолевое действие при применении in vivo.

Ключевые слова: макрофаги, IL-6, IL-10, МСР-1, TNF-a, биназа, РНКаза А.

Иммунные реакции, возникающие в организме в ответ на действие лекарственных средств, способны внести значительный вклад в конечный результат терапии. С особенным вниманием следует относиться к биофармацевтическим агентам, которые в последние годы стали широко применяться для терапии рака, вирусных инфекций, аутоиммунных заболеваний. Использование подобных препаратов часто ассоциировано с различного рода реакциями со стороны иммунной системы, которые могут как улучшить результаты лечения, так и привести к развитию нежелательных осложнений [1]. Средства противоопухолевой терапии разносторонне модулируют работу иммунной системы. Описано как иммуносупрессивное действие хемотерапевтиков, например, циклофосфамида [2], метотрексата [3], гливека

[4], так и иммуностимулирующее, характерное для доксорубицина [5], гемцитабина [6], 5-фторурацила

[7]. Рибонуклеазы, обладающие противоопухолевой активностью, — такие как РНКаза ооцитов лягушки Ranapipiens (онконаза), рибонуклеаза семенников быка (BS-РНКаза), РНКаза Bacillus pumilus (биназа), — и представляющие собой возможную альтернативу классическим химиотерапевтическим средствам [8], также способны индуцировать иммунные реакции

[9]. В то же время отмечается, что специфический иммунный ответ на введение онконазы и BS-РНКазы в организм невысок [9] и, в случае BS-РНКазы, может быть значительно снижен с помощью химической модификации [10]. Биназа представляет собой белок с низкой молекулярной массой, что затрудняет образование специфических антител. Кроме того,

е-mail: pasha_mic@mail.ru

Biopharmaceutical agents, especially proteins, may possess a broad spectrum of immunological effects. Cytotoxic ribonucleases, such as binase — RNase of Bacillus pumilus, have a significant potential as anticancer therapeutical agents. However without comprehensive analysis of immune system reactions on the proteins, the practical utility of them is complicated.

Using the flow cytometry we estimated qualitative and quantitative changes in IL-6, IL-10, МСР-1 and TNF-acytokines synthesis by peripheral macrophages of mice under the influence of binase and RNAse A.

We established that binase in concentration 100 and 300 /ug/ml, in contrast to RNase A, is able to activate pro-inflammatory response of macrophages, inducing increase of IL-6, МСР-1 andTNF-a cytokines level in cultural media. Treatment with RNases does not enhance the antiinflammatory cytokime IL-10 synthesis.

Obtained data lead as to the assumption, that binase capability to activate pro-inflammatory response of macrophages will intensify its antitumor effects in vivo.

Key words: macrophages, IL-6, IL-10, MCP-1, TNF-a, binase, RNase A.

показано, что эта РНКаза не способна индуцировать поликлональный Т-клеточный ответ [11], что также свидетельствует о ее низкой иммуногенности. Тем не менее, для характеристики комплексного действия перспективного противоопухолевого белкового агента на организм необходима оценка реакций иммунной системы на его введение. В связи с вышесказанным, целью данной работы явилась характеристика способности биназы активировать периферические макрофаги и анализ изменений в спектре синтезируемых данными клетками цитокинов.

материал и методы

РНКазы

В работе использовали гуанилспецифичную РНКазу — биназу (молекулярная масса 12,3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pI = 9,5), выделенную как гомогенный белок из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21, несущей плазмиду pGEMGX1/ent/Bi; каталитическая активность биназы по отношению к дрожжевой РНК составляет 14000000 ед/мг при pH 8,5 [12]. Также использовали панкреатическую РНКазу А быка (Вектор, Россия). Уровень каталитической активности РНКазы А был сопоставим с таковым у биназы.

Макрофаги

Мышам линии C57BL/6 в нижнюю часть брюшной полости вводили 3 мл 4% тиогликолата (Sigma, США). Через 72 ч проводили перитонеальный лаваж

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

210

Оригинальные исследования

путем введения в брюшную полость мыши 6 мл RPMI 1640. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 2000 g в течение 5 мин, надосадочную жидкость осторожно удаляли, осадок ресуспенди-ровали в RBC-буфере (BioLegend, США) для лизиса эритроцитов, инкубировали 5 мин при 4°С, центрифугировали 5 мин при 2000 g, удаляли супернатант и ресуспендировали в среде RPMI 1640 (Sigma, США) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, США).

Обработка макрофагов РНКазами

Макрофаги инкубировали 6 суток в среде RPMI 1640 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина (Sigma, США) и по 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина, 0,1% фунгизона и 50 нг/мл макрофагального колониестимулирующего фактора (Sigma, США) в концентрации 20 000 кл/мл при 37°С в атмосфере 5% СО2. Через 72 ч после начала инкубации в среду вносили бина-зу и РНКазу А в концентрациях 100 и 300 мкг/мл. По истечении еще 72 ч аспирировали среду, центрифугировали (5 мин, 2000 g) и определяли содержание цитокинов в надосадочной жидкости.

Анализ содержания цитокинов

Количество IL-6, IL-10, МСР-1, TNF-a в среде инкубирования макрофагов определяли при помощи BD Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit (BD, США) согласно инструкции производителя. Для анализа образцов применяли цитометр BD FACSСalibur (BD Bioscience, США). При анализе результатов использованы программные пакеты FlowJo 7.5 и GraphPadPrism 5.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна — Уитни (уровень статистической значимости р<0,05) для сравнения количественных показателей несвязанных групп.

Результаты

Мы показали, что биназа, в отличие от РНКазы А, способна активировать периферические макрофаги мыши, что проявляется в усилении синтеза некоторых цитокинов (рис.). Цитометрическая оценка содержания IL-6, IL-10, МСР-1, TNF-a показала, что

Количество цитокинов, синтезированных макрофагами под действием РНКазы А и биназы. К — вариант без добавления РНКаз

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

211

содержание MCP-1, TNF-a и IL-6 в среде инкубирования возрастало в вариантах с обработкой биназой (300 мкг/мл) в 4,6, 5,2 и 2,2 раза по сравнению с контрольным вариантом без добавления РНКаз, в то время как внесение РНКазы А не приводило к достоверным изменениям содержания цитокинов в среде. Более низкая концентрация биназы (100 мкг/мл) также индуцировала достоверное повышение секреции цитокинов: концентрация MCP-1, TNFa

и IL-6 превышала таковую в варианте без обработки РНКазами в 2,3, 2,5 и 1,4 раза, соответственно. Обработка макрофагов РНКазами ни в одной из исследованных концентраций не приводила к статистически достоверному повышению уровня IL-10 в среде инкубирования (см. рис.).

Таким образом, нами установлено достоверное повышение уровня в среде инкубирования цитокинов МСР-1 и TNF-a, что свидетельствует об индукции би-назой провоспалительного ответа макрофагов.

Обсуждение

МСР-1 является одним из ключевых цитокинов, регулирующих миграцию и инфильтрацию моноцитов и макрофагов, в том числе и при воспалении [13]. Индукция биназой синтеза данного цитокина макрофагами свидетельствует о возможном усилении воспалительной реакции в очаге опухолеобразования, что связано с возрастанием противоопухолевого действия РНКазы in vivo. Вместе с тем, МСР-1 является одним из индукторов опухолевого ангиогенеза, поскольку представляет собой не только аттрактант моноцитов, но и индуктор их адгезии [14], приводящей к активации клеток эндотелия, что является необходимым этапом инициации ангиогенеза [15]. Обнаруженное нами при обработке клеток биназой увеличение продукции IL-6 согласуется с повышением уровня МСР-1 в среде инкубирования, поскольку данный цитокин является одним из индукторов МСР-1 [16]. Также немаловажно, что локальное повышение уровня IL-6 способно ингибировать рост злокачественных клеток, в частности рака молочной

ЛИТЕРАТУРА:

1. Tovey M.G., Lallemand C. Immunogenicity and other problems associated with the use of biopharmaceuticals. Ther.Adv.Drug.Saf. 2011; 2: 113-28.

2. Weiner H.L., Cohen J.A. Treatment of multiple sclerosis with cyclophosphamide: critical review of clinical and immunologic effects. Mult. Scler. 2002; 8: 142-54.

3. Weinblatt M.E. Methotrexate in rheumatoid arthritis: a quarter century of development. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 2013; 124: 16-25.

4. Seggewiss R., Lore K., Greiner E. et al. Imatinib inhibits T-cell receptor-mediated T-cell proliferation and activation in a dose-dependent manner. Blood. 2005; 105: 2473-9.

5. Zagozdzon R., Golab J., Stoklosa T. et al.Effective chemo-immunotherapy of L1210 leukemia invivousing interleukin-12 combined with doxorubicin but not with cyclophosphamide, paclitaxel or cisplatin. Int. J. Cancer. 1998; 77: 720-7.

6. Plate J.M., Plate A.E., Shott S.et al.Effect of gemcitabine on immune cells insubjects with adenocarcinoma of the pancreas. Cancer Immunol. Immunother. 2005; 54: 915-25.

7. Tanaka F., Yamaguchi H., Ohta M. et al. Intratumoral injection of dendritic cells after treatment of anticancer drugs induces tumor-specific antitumor effect in vivo. Int. J.Cancer. 2002; 101: 265-9.

8. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents. Bioessays 2008; 30: 781-90.

9. Rutkoski T.J., Raines R.T. Evasion of ribonuclease inhibitor as a determinant of ribonuclease cytotoxicity. Curr. Pharm. Biotechnol. 2008; 9: 185-9.

10. Matousek J. Ribonucleases and their antitumor activity. Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2001; 129: 175-91.

11. Ilinskaya O.N., Zelenikhin P.V., Petrushanko I.Y. et al. Binase induces apoptosis of transformed myeloid cells and does not induce T-cell immune response. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 361: 1000-5.

железы [17]. Индукция биназой продукции фактора некроза опухолей макрофагами, выявленная в нашем исследовании, свидетельствует о способности РНКазы усиливать естественный противоопухолевый иммунитет [18].Усиление экспрессии провоспалительных цитокинов MCP-1, TNF-a и IL-6 моноцитами и макрофагами происходит при участии компонентов NF-kB пути [19]. Активация данного сигнального каскада в клетках Kasumi-1 под действием биназы уже была показана нами ранее [20]. Исходя из полученных нами данных об экспрессии цитокинов, можно заключить, что механизм действия РНКазы на клетки разных типов реализуется схожим образом.

Обработка РНКазами не повлияла на продукцию макрофагами антивоспалительного IL-10. Этот факт позволяет предположить, что при терапии новообразований с помощью биназы не будет происходить супрессии естественных киллеров (NK-клеток) [21], которые проявляют высокую цитотоксическую активность в отношении раковых клеток [22]. Более того, TNF-a, повышение уровня которого после обработки биназой зафиксировано нами в среде инкубирования макрофагов, является одним из известных активаторов NK-клеток [22].

Результаты наших экспериментальных исследований однозначно свидетельствуют, что биназа способна индуцировать провоспалительный иммунный ответ макрофагов мыши. Комплекс полученных данных позволяет предположить активацию естественного противоопухолевого иммунитета при терапии злокачественных образований РНКазой, что приведет к усилению противоопухолевой активности фермента in vivo.

Благодарности

Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и поддержана грантами РНФ 14-14-00522 и РФФИ 2-04-01226а.

12. Ilinskaya O.N., Ivanchenko O.B., Karamova N.S. et al. SOS-inducing ability of native and mutant microbial ribonucleases. Mutat. Res. 1996; 354: 203-9.

13. Deshmane S.L., Kremlev S., Amini S. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 tMCP-1): an overview. J. Interferon. CytokineRes. 2009; 29: 313-26.

14. Scholz D., Ito W., Fleming I. et al. Ultrastructure and molecular histology of rabbit hind-limb collateral artery growth tarteriogenesis). Virchows Arch. 2000; 436: 257-70.

15. Polverini P.J., Cotran P.S., Gimbrone M.A. et al. Activated macrophages induce vascular proliferation. Nature 1977; 269: 804-6.

16. Biswas P., Delfanti F., Bernasconi S. et al. Interleukin-6 induces monocyte chemotactic protein-1 in peripheral blood mononuclear cells and in the U937cell line. Blood 1998; 91: 258-65.

17. Dethlefsen C., Hojfeldt G., Hojman P. The role of intratumoral and systemic IL-6 in breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 2013; 138: 657-64.

18. van Horssen R., Ten Hagen T.L., Eggermont A.M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist 2006; 11: 397-408.

19. Kamimura D., Ishihara K., Hirano T. IL-6signal transduction and its physiological roles: the signal orchestration model. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2003; 149: 1-38.

20. Mitkevich V.A., Kretova O.V., Petrushanko I.Y. et al. Ribonuclease binase apoptotic signature in leukemic Kasumi-1 cells. Biochimie. 2013; 95: 1344-9.

21. Scott M.J., Hoth J.J., Turina M. Interleukin-10 suppresses natural killer cell but not natural killer T cell activation during bacterial infection. Cytokine 2006; 33: 79-86.

22. Wu J., Lanier L.L. Natural killer cells and cancer. Adv. Cancer Res. 2003; 90: 127-56.

Поступила: 11.08.2014

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014