ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ В КЛЕТКЕ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR POTASSIUM CHANNEL REGULATION IN MYOCARDIAL CELL, METHOD FOR PREPARING AND USING IT

Область изобретения
[1] Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для регуляции калиевых каналов в клетке сердечной мышцы и к способу ее получения и ее применения.
Уровень техники
[2] Сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертония, ишемическая болезнь сердца, аритмия, стали серьезной угрозой для здоровья человека, заболеваемость и смертность от которых являются самыми высокими среди всех заболеваний в мире. Тяжелые аритмии, такие как желудочковая тахикардия (ventricular tachycardia, VT), фибрилляция желудочков (ventricular fibrillation, VF) и внезапная сердечная смерть (sudden cardiac death, SCD), являются основными причинами смерти, связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
[3] Нормальная насосная функция сердца зависит от ритмичного движения сердечной мышцы, которое представляет собой попеременное сокращение и расслабление. Формирование и проведение возбудимости на мембрану клетки сердечной мышцы является первопричиной ритмичного сократительного и расслабляющего движения сердца. Формирование и проведение возбудимости на мембрану клетки сердечной мышцы основано на изменении электрического потенциала на мембране клетки сердечной мышцы. Ненормальные изменения электрического потенциала мембраны приводят к изменению ритма сердца, т.е. к аритмии. Аритмия серьезно влияет на насосную функцию сердца, и ее нужно лечить как можно раньше.
[4] На основе локализации поражения аритмию можно классифицировать на синусовую аритмию, предсердную аритмию, атриовентрикулярную узловую аритмию, желудочковую аритмию и блокаду сердца. Предсердная аритмия включает преждевременные сокращения предсердий, предсердную тахикардию, трепетание предсердий, фибрилляцию предсердий. Желудочковая аритмия включает преждевременные сокращения желудочков, желудочковую тахикардию, трепетание желудочков, фибрилляцию желудочков (Ren-gao Ye, Internal medicine, People's medical publishing house, Oct. 1984, 2nd edition, p.172-212).
[5] В настоящее время на основании влияния на электрофизиологию сердечной мышцы и механизма действия антиаритмические агенты для клинического применения и находящиеся в разработке можно классифицировать на 4 группы: I - блокаторы натриевых каналов, II - блокаторы β-рецепторов, III - агенты, селективно увеличивающие длительность потенциала действия (APD, action potential duration) и эффективного рефракторного периода (ERP, effective refractory period) в клетках сердечной мышцы, и агенты, селективно блокирующие калиевые каналы в сердечной мышце, IV - блокаторы кальциевых каналов. Агенты из групп I, II и IV могут уменьшить скорость проведения и даже привести к нарушению проводимости, что может увеличить возможность активации возвратного возбуждения (по механизму «re-entry»), и таким образом могут привести к аритмии. Агенты из группы III существенно не влияют на автоматизм (Rui Li, Pharmacology (4th edition), People's medical publishing house, Nov. 1999, 14th print, p.159-171).
[6] Фармацевтическая композиция и способ ее получения были раскрыты в китайском патенте ZL02146572.X, который направлен только на исследование преждевременных сокращений желудочков сердца.
Сущность изобретения
[7] Неожиданно заявитель обнаружил фармацевтическую композицию для регуляции калиевых каналов в клетке сердечной мышцы, которая может ингибировать калиевые каналы, ингибировать входящий выпрямляющий калиевый ток и транзиторный выходящий калиевый ток в зависимости от напряжения и может замедлять выпрямляющий калиевый ток. Антиаритмический эффект достигается за счет уменьшения возбудимости клетки сердечной мышцы, ингибирования реполяризации потенциала действия (АР, action potential) в клетке сердечной мышцы и увеличения длительности потенциала действия (APD). Фармацевтическая композиция данного изобретения используется при различных предсердных, желудочковых и наджелудочковых аритмиях.
[8] Другим объектом данного изобретения является предоставление способа получения фармацевтической композиции.
[9] Другим объектом данного изобретения является предоставление применения фармацевтической композиции.
[10] Данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию для регуляции калиевых каналов в клетке сердечной мышцы, содержащую следующие компоненты по весу:
[11] Ginseng 45-180 частей, Ophiopogonis 50-200 частей, Corni 125-450 частей, Miltiorrhizae 125-450 частей, жареные семена Ziziphi spinosae 95-400 частей, Taxilli 95-400 частей, Rubra 45-200 частей, Steleophaga 35 -150 частей.
[12] Фармацевтическая композиция также содержит следующие компоненты по весу: Rhizoma Nardostachyos 45-200 частей, Rhizoma Coptidis 25-90 частей, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 35-150 частей, Os Draconis 75-300 частей.
[13] Фармацевтическая композиция предпочтительно содержит следующие компоненты по весу:
[14] Ginseng 45-90 частей, Ophiopogonis 112-135 частей, Corni 224-270 частей, Miltiorrhizae 200-225 частей, жареные семена Ziziphi spinosae 150-186 частей, Taxilli 150-186 частей, Rubra 89-100 частей, Steleophaga 35-100 частей, Rhizoma Nardostachyos 45-95 частей, Rhizoma Coptidis 45-60 частей, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 67-75 частей, Os Draconis 145-150 частей.
[15] Фармацевтическая композиция предпочтительно содержит следующие компоненты по весу: Ginseng 89 частей, Ophiopogonis 112 частей, Corni 224 части, Miltiorrhizae 224 части, жареные семена Ziziphi spinosae 186 частей, Taxilli 186 частей, Rubra 89 частей, Steleophaga 75 частей, Rhizoma Nardostachyos 89 частей, Rhizoma Coptidis 45 частей, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 67 частей, Os Draconis 149 частей.
[16] Фармацевтическая композиция предпочтительно содержит следующие компоненты по весу:
[17] Ginseng 45 частей, Ophiopogonis 112 частей, Corni 224 части, Miltiorrhizae 225 части, жареные семена Ziziphi spinosae 186 частей, Taxilli 186 частей, Rubra 89 частей, Rhizoma Nardostachyos 45 частей, Steleophaga 35 частей, Rhizoma Coptidis 45 частей, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 67 частей, Os Draconis 149 частей.
[18] Лекарственными формами фармацевтической композиции являются капсулы, таблетки, лекарственные гранулы, порошки или растворы для перорального приема.
[19] Данное изобретение также предлагает применение фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения наджелудочковой аритмии, желудочковой тахикардии, трепетания желудочков, фибрилляции желудочков, преждевременных сокращений предсердий, предсердной тахикардии, трепетания предсердий или фибрилляции предсердий.
[20] Данное изобретение также предлагает способ получения фармацевтической композиции, включающий следующие этапы:
а) добавление соответствующего количества 70% этанола к 45-180 частям (по весу) Ginseng, трехкратное выполнение противоточной экстракции, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, концентрирование, сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок;
б) добавление соответствующего количества 70% этанола к 125-450 частям (по весу) Corni и 125-450 частям (по весу) Miltiorrhizae, трехкратное выполнение противоточной экстракции, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, концентрирование в конкрет (экстрактовое эфирное масло);
в) измельчение 35-150 частей (по весу) Steleophaga в мелкодисперсный порошок, его сушка для дальнейшего применения;
г) добавление соответствующего количества воды к 50-200 частям (по весу) Ophiopogonis, 95-400 частям (по весу) жареного семени Ziziphi spinosae, 95-400 частям (по весу) Taxilli, 45-200 частям (по весу) Rubra, двукратное кипячение, объединение полученных растворов экстрактов, концентрирование его в конкрет;
д) объединение конкретов из этапов б) и г), добавление по очереди фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа в) и фармацевтического порошка из этапа а), смешивание порошков и подготовка гомогенизированного порошка к процессу получения фармацевтической композиции.
[21] Сырье в этапе б) также содержит 45-200 частей (по весу) Rhizoma Nardostachyos, 35-150 частей (по весу) Fructus Schisandrae Sphenanthenae, 25-90 частей (по весу) Rhizoma Coptidis. Сырье в этапе г) также содержит 75-300 частей (по весу) Os draconis.
[22] Способ получения фармацевтической композиции предпочтительно включает следующие компоненты по весу: Ginseng 89 частей, Ophiopogonis 112 частей, Corni 224 частей, Miltiorrhizae 224 частей, жареные семена Ziziphi spinosae 186 частей, Taxilli 186 частей, Rubra 89 частей, Steleophaga 75 частей, Rhizoma Nardostachyos 89 частей, Rhizoma Coptidis 45 частей, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 67 частей, Os draconis. 149 частей.
[23] В заявке данного изобретения лекарственная форма фармацевтической композиции выбрана среди: капсул, таблеток, лекарственных гранул, порошков или пероральных растворов. Для того чтобы получить указанную выше лекарственную форму, при получении такой лекарственной формы может быть добавлен фармацевтически приемлемый адъювант, такой как наполнитель, разрыхлитель, смазочный агент, суспендирующий агент, вяжущий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и т.п. Наполнители включают крахмал, прежелатинизированный крахмал, лактозу, маннит, хитин, микрокристаллическую целлюлозу, сахарозу и т.д. Разрыхлители включают крахмал, прежелатинизированный крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, карбоксиметилкрахмал натрия, поперечно сшитый поливинилпирролидон, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, поперечно сшитую карбоксиметилцеллюлозу натрия и т.п. Смазочные агенты включают стеарат магния, додецилсульфат натрия, тальк, кремний и т.п. Суспендирующие агенты включают поливинилпирролидон, микрокристаллическую целлюлозу, сахарозу, агар, гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д. Вяжущие агенты включают крахмальную массу, поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д. Подсластители включают сахаринат натрия, аспартам, сахарозу, цикламат натрия, глицирретиновую кислоту и т.д. Ароматизаторы включают подсластители и различные виды ароматов. Консерванты включают нипагины, бензойную кислоту, бензоат натрия, сорбиновую кислоту и ее соль, бромид бензалкония, ацетат хлоргексидина, эвкалиптовое масло и т.п.
[24] Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может ингибировать в клетке сердечной мышцы входящий выпрямляющий калиевый ток и транзиторный выходящий калиевый ток в зависимости от напряжения и может замедлять выпрямляющий калиевый ток. Указанная фармацевтическая композиция уменьшает возбудимость клеток сердечной мышцы и ингибирует реполяризацию потенциала действия (АР) в клетке сердечной мышцы путем регуляции калиевых каналов мембраны клетки сердечной мышцы. Она увеличивает длительность потенциала действия клетки сердечной мышцы путем регуляции калиевых каналов мембраны клетки сердечной мышцы.
[25] Данное изобретение также предлагает применение фармацевтической композиции для получения антиаритмических лекарственных препаратов.
[26] Аритмия включает наджелудочковую аритмию, желудочковую тахикардию, трепетание желудочков, фибрилляцию желудочков, преждевременные сокращения предсердий, предсердную тахикардию, трепетание предсердий или фибрилляцию предсердий.
K1
K1
[27] Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может ингибировать I мембраны клетки сердечной мышцы и может уменьшать плотность тока I.
to
[28] Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может ингибировать транзиторный выходящий калиевый ток (I) мембраны клетки сердечной мышцы, что может ускорить инактивацию тока.
K1
K1
[29] Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может ингибировать входящий компонент входящего выпрямляющего калиевого тока I (ток I), не влияя на обратный потенциал и выпрямляющие свойства канала, и немного увеличивает выходящий компонент тока, что важно для стабилизации клеточной мембраны и ликвидации ранней постдеполяризации.
[30] Количество фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением (по общему весу активных компонентов в сырье) составляет 3-28 г/сут. Оно может вводиться один раз в день, предпочтительно разделяется на 2-4 дозы.
Описание графических материалов
[31] Фиг.1 показывает систему перфузии сердца ex vivo (систему перфузии Лангендорфа).
K1
K1
[32] Фиг.2 показывает влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на ток I. А. Контроль. В. Лекарственный препарат с концентрацией 0,5% может ингибировать I. С. Влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на взаимосвязь плотности тока и напряжения.
to
to
to
to
[33] Фиг.3 показывает характеристики тока I и влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на ток. А. Выходящий ток, регистрируемый на одиночной мышечной клетке желудочка крысы, Vh=-90 мВ, на которую вначале давали предварительный стимул (-40 мВ 20 мс), затем проводили деполяризацию до +60 мВ с шагом 10 мВ, а время зажима составляло 400 мс; стимулированный выходящий ток состоит из двух компонентов: транзиторный ток и ток удержания. В. Лекарственный препарат может ингибировать I, когда его концентрация составляет 0,5%. С. Кривая взаимосвязи тока I и напряжения. •: общий пиковый ток, : ток удержания, : транзиторный ток (=•-). D. График взаимосвязи плотности тока и напряжения для пика транзиторного тока. •: до обработки лекарственным препаратом, : после обработки лекарственным препаратом; лекарственный препарат ингибирует I, что проявляется в уменьшении плотности тока.
to
to
[34] Фиг.4 показывает влияние фармацевтической композиции в соответствии с изобретением на зависимую от времени инактивацию I. А. до обработки лекарственным препаратом; В. Концентрация лекарственного препарата составляет 0,5%; неактивный компонент тока I выровнен с помощью единого степенного уравнения.
to
to
[35] Фиг.5 показывает влияние фармацевтической композиции в соответствии с изобретением на стационарную инактивацию I. А. До обработки лекарственным препаратом. В. Концентрация лекарственного препарата составляет 0,5%. С. Зависимость различных компонентов инактивации выходящего тока от напряжения. •: пиковый ток, : ток удержания, : транзиторный ток (=•-). D. Кривая стационарной инактивации транзиторного выходящего тока I до и после обработки лекарственным препаратом, •: до обработки лекарственным препаратом, : после обработки лекарственным препаратом; сплошные линии на графике показывают выравнивание с помощью уравнения Больцмана.
to
to
[36] Фиг.6 показывает влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на восстановление тока I после инактивации. A. Контроль. В. Концентрация лекарственного препарата составляет 0,5%. С.График зависимости восстановления после инактивации I от времени. •: до обработки лекарственным препаратом, : после обработки лекарственным препаратом; сплошные линии на графике показывают выравнивание с помощью единого степенного уравнения.
K
H
K
T
[37] Фиг.7 показывает зависимое от напряжения ингибирующее влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на медленный компонент выпрямляющего калиевого тока (I). A. V=-40 мВ, ступенчатая деполяризация до 60 мВ продолжительностью 5 с, зависимая от напряжения и времени активация выходящего тока I получена на одиночной мышечной клетке желудочка морской свинки. В. Концентрация лекарственного препарата составляет 0,5%, изменения тока длительностью 5 с при V=50 мВ до и после обработки лекарственным препаратом. С. I-V График взаимосвязи (плотность пикового следового тока (под различным испытательным напряжением) в зависимости от напряжения) до и после обработки лекарственным препаратом.
K
H
T
K
[38] Фиг.8 показывает ингибирующее влияние фармацевтической композиции в соответствии с изобретением на ток I, который активируется зависимым от времени образом. A. V=-40 мВ, V=50 мВ с продолжительностью от 500 мс до 5 с, увеличивающейся с интервалами в 500 мс. В. Ток I и следовый ток с тем же испытательным напряжением и временем после обработки лекарственным препаратом (концентрация лекарственного препарата: 0,5%). С. График зависимой от времени активации (пиковый следовый ток по отношению ко времени активации в различные моменты активации) до и после обработки лекарственным препаратом.
Подробное описание предпочтительных воплощений
[39] Следующие примеры иллюстрируют получение фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением. Эти примеры не ограничивают сферу данного изобретения ни в каком случае.
Пример 1
[40] Фармацевтическую композицию получают в виде капсулы, чтобы облегчить применение в качестве регулятора калиевого канала такой фармацевтической композиции, включающей:
Ginseng 89 г, Ophiopogonis 112 г, Corni 224 г, Miltiorrhizae 224 г, жареные семена Ziziphi spinosae 186 г, Taxilli 186 г, Rubra 89 г, Steleophaga 75 г.
[41] Способ получения:
а) трехкратная противоточная (с дефлегмацией) экстракция из Ginseng с помощью 70% этанола, 3 ч при первой экстракции, 2 ч при второй и третьей экстракции, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование, сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок для дальнейшего применения;
б) трехкратная противоточная экстракция из Corni и Miltiorrhizae с помощью 70% этанола, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
в) измельчение Steleophaga в мелкодисперсный порошок, сушка для дальнейшего применения;
г) добавление воды к Ophiopogonis, жареным семенам Ziziphi spinosae, Taxilli, Rubra, двукратное кипячение, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
д) объединение конкретов из этапов б) и г), добавление к ним фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа в), сушка, измельчение в мелкодисперсный порошок, а затем добавление фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа а), смешивание и добавление адъюванта для получения 1000 капсул.
[42] Показания: наджелудочковая аритмия, желудочковая тахикардия, трепетание предсердий.
[43] Дозировка и количество: перорально, 2-4 капсулы за раз, 3 раза в сутки.
Пример 2
[44] Ginseng 45 г, Ophiopogonis 50 г, Corni 125 г, Miltiorrhizae 125 г, жареные семена Ziziphi spinosae 95 г, Taxilli 95 г, Rubra 89 г, Steleophaga 35 г, Rhizoma Nardostachyos 45r, Rhizoma Coptidis 25r, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 35r, Os draconis 75 г.
[45] Способ получения:
а) трехкратная противоточная экстракция из Ginseng с помощью соответствующего количества 70% этанола, 3 ч при первой экстракции, 2 ч при второй и третьей экстракции, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование, сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок для дальнейшего применения;
б) трехкратная противоточная экстракция из Corni, Miltiorrhizae, Fructus Schisandrae Sphenanthenae, Rhizoma Nardostachyos и Rhizoma Coptidis с помощью соответствующего количества 70% этанола, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
в) измельчение Steleophaga в мелкодисперсный порошок, сушка для дальнейшего применения;
г) добавление соответствующего количества воды к Ophiopogonis, жареным семенам Ziziphi spinosae, Taxilli, Rubra, двукратное кипячение, объединение полученных растворов экстрактов, концентрирование его в конкрет для дальнейшего применения;
д) объединение конкретов из этапов б) и г), к которым добавляют фармацевтический мелкодисперсный порошок из этапа в), его сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок, затем добавление фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа а), смешивание и формирование лекарственных гранул стандартным способом.
Пример 3
[46] Ginseng 180 г, Ophiopogonis 200 г, Corni 450 г, Miltiorrhizae 450 г, жареные семена Ziziphi spinosae 400 г, Taxilli 400 г, Rubra 200 г, Steleophaga 150 г, Rhizoma Nardostachyos 200 г, Rhizoma Coptidis 90 г, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 150 г, Os draconis 300 г.
[47] Способ получения:
а) трехкратная противоточная экстракция из Ginseng с помощью соответствующего количества 70% этанола, 3 ч при первой экстракции, 2 ч при второй и третьей экстракции, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование, сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок для дальнейшего применения;
б) трехкратная противоточная экстракция из Corni, Miltiorrhizae, Fructus Schisandrae Sphenanthenae, Rhizoma Nardostachyos и Rhizoma Coptidis с помощью соответствующего количества 70% этанола, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
в) измельчение Steleophaga в мелкодисперсный порошок, сушка порошка для дальнейшего применения;
г) добавление соответствующего количества воды к Ophiopogonis, жареным семенам Ziziphi spinosae, Taxilli, Rubra, двукратное кипячение, объединение полученных растворов экстрактов, его концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
д) объединение конкретов из этапов б) и г), добавление к ним фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа в), сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок, затем добавление фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа а), смешивание и формирование таблеток стандартным способом.
Пример 4
[48] Ginseng 60 г, Ophiopogonis 135 г, Corni 270 г, Miltiorrhizae 200 г, жареные семена Ziziphi spinosae 150 г, Taxilli 150 г, Rubra 100 г, Steleophaga 100 г, Rhizoma Nardostachyos 95 г, Rhizoma Coptidis 55 г, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 75 г, Os draconis 145 г.
[49] Способ получения:
а) трехкратная противоточная экстракция из Ginseng с помощью соответствующего количества 70% этанола, 3 ч при первой экстракции, 2 ч при второй и третьей экстракции, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование, сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок для дальнейшего применения;
б) трехкратная противоточная экстракция из Corni, Miltiorrhizae, Fructus Schisandrae Sphenanthenae, Rhizoma Nardostachyos и Rhizoma Coptidis с помощью соответствующего количества 70% этанола, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
в) измельчение Steleophaga в мелкодисперсный порошок, сушка порошка для дальнейшего применения;
г) добавление соответствующего количества воды к Ophiopogonis, жареным семенам Ziziphi spinosae, Taxilli, Rubra, двукратное кипячение, объединение полученных растворов экстрактов, концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
д) объединение конкретов из этапов б) и г), добавление фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа в) и этапа а), смешивание и формирование стандартным способом раствора для перорального применения.
Пример 5
[50] Рецепт:
Ginseng 89 г, Ophiopogonis 112 г, Corni 224 г, Miltiorrhizae 224 г, жареные семена Ziziphi spinosae 186 г, Taxilli 186 г, Rubra 89 г, Steleophaga 75 г, Rhizoma Nardostachyos 89 г, Rhizoma Coptidis 45 г, Fructus Schisandrae Sphenanthenae 67 г, Os draconis 149 г.
[51] Способ получения:
а) в соответствии с описанием выше трехкратная противоточная экстракция из Ginseng с помощью 70% этанола, 3 ч при первой экстракции, 2 ч при второй и третьей экстракции, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование, сушка и измельчение в мелкодисперсный порошок для дальнейшего применения;
б) в соответствии с описанием выше трехкратная противоточная экстракция из Fructus Schisandrae Sphenanthenae, Corni, Miltiorrhizae, Rhizoma Coptidis и Rhizoma Nardostachyos с помощью 70% этанола, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, восстановление из этанола, концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
в) в соответствии с описанием выше измельчение Steleophaga в мелкодисперсный порошок, сушка порошка для дальнейшего применения;
г) в соответствии с описанием выше добавление воды к Ophiopogonis, жареным семенам Ziziphi spinosae, Taxilli и Rubra, двукратное кипячение, объединение полученных растворов экстрактов, фильтрация, объединение этого фильтрата с ранее полученными растворами экстрактов, содержащими Fructus Schisandrae Sphenanthenae и т.д., концентрирование в конкрет для дальнейшего применения;
д) объединение конкретов из этапов б) и г), добавление фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа в), измельчение в мелкодисперсный порошок, затем добавление фармацевтического мелкодисперсного порошка из этапа а), смешивание и заполнение этим 1000 капсул.
Эксперименты
[52] Ниже приведен эксперимент по определению фармакологического действия фармацевтической композиции в соответствии сданным изобретением.
[53] Для того чтобы проиллюстрировать регулирующее действие фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на натриевые и калиевые каналы проводили следующие эксперименты на животных с использованием порошка внутри капсул из примера 2 (далее обозначаемого как «порошок для капсулы в соответствии сданным изобретением»).
1. Материалы и способы
1.1 Материалы
2
2
[54] 1) Реагенты: порошок для капсулы в соответствии с данным изобретением получен от SHIJIAZHUANG YILING PHARMACEUTICAL CO. LTD. Коллагеназа II получена от Gibico. Проназа Е получена от Merck. N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (HEPES), этиленгликоль-бис-тетрауксусная кислота (EGTA), L-глутаминовая кислота, таурин, аспартат, динатрия креатинфосфат, холин-Cl, CaCl, KАТР получены от Sigma. 4-аминопиридин (4-АР) получен от Fluka. Другие агенты являются химически чистыми и получены от Beijing Chemical Reagent Company.
[55] 2) Растворы:
2
2
4
(1) Бескальциевый раствор Кребса (ммоль/л): NaCl 136, KCl 5,4, MgCl 1,0, NaHPO 0,33, HEPES 10, глюкоза 10, рН доводили до 7,4 с помощью NaOH.
2
4
4
(2) Раствор KB (ммоль/л): KCl 40, KHPO 20, MgSO 3,0, KОН 80, L-глутаминовая кислота 50, таурин 20, HEPES 10, глюкоза 10, EGTA 0,5; рН доводили до 7,4 с помощью KОН.
2
2
4
2
2
K
K1
2
(3) Перфузат для выявления калиевого тока в целой клетке (ммоль/л): холин-Cl 136, MgCl 1,2, KCl 5,4, NaHPO 0,33, CaCl 1,8, CdCl 0,15, HEPES 10, глюкоза 10; рН доводили до 7,4 с помощью LiOH. Чтобы выявить I, для блокирования тока I добавляли 1 ммоль/л BaCl.
2
2
(4) Раствор для заполнения электрода (электролит) для выявления калиевого тока в целой клетке (ммоль/л): аспартат калия 120, KCl 20, HEPES 5, MgCl 1,0, K-АТФ 4, EGTA 10, динатрий креатинфосфат 2, рН доводили до 7,3 с помощью KОН. Используемый электролит фильтровали через мембрану для микрофильтрования с диаметром пор 0,22 мкм.
+
(5) Получение порошка для капсул в соответствии с данным изобретением: создание из порошка для капсул в соответствии с данным изобретением 5% раствора (по массе) со свободным от KCl внеклеточным перфузатом, затем доведение концентрации K до 5,4 ммоль/л, центрифугирование раствора и получение супернатанта для дальнейшего применения.
[56] 3) Животные: самцы крыс SD весом 250-300 г, полученные от Beijng WEI TONG LI HUA experimental animal technology Co. LTD.
1.2 Способы
2
2
[57] 1.2.1 Выделение одиночной клетки сердечной мышцы: Одиночную мышечную клетку желудочка получали путем быстрой ферментативной обработки. Крыс анестезировали с помощью 50 мг/кг мебумала натрия путем внутрибрюшинной инъекции и выделяли сердце путем торакотомии. Затем удаляли жир и перикард в бескальциевом растворе Tyrode при 4°С, выделяли аорту и канюлировали ее для выполнения перфузии сердца по Лангендорфу (фиг.1) со скоростью 6-8 мл/мин. Перфузию осуществляли в течение 3 мин, используя бескальциевый раствор Кребса (перфузионное давление составляло 20 см вод. ст.), чтобы очистить от крови коронарные сосуды, затем для выполнения рециркуляторной перфузии использовали ферментативный раствор с низким содержанием кальция (раствор Кребса с низким содержанием кальция, с CaCl 0,05 ммоль/л, содержащий 0,4 мг/мл коллагеназы II и 0,04 мг/мл протеазы Е). Примерно через 20 минут сердце извлекали из системы Лангендорфа, помещали в раствор KB комнатной температуры, отрезали ткани предсердий и основания сердца, ткани желудочков аккуратно разрывали с помощью офтальмологических пинцетов и медленно пипетировали с помощью пипетки с широким наконечником для отделения клеток сердечной мышцы от мышечной ткани сердца, чтобы получить одиночные мышечные клетки желудочка. Супернатант фильтровали через нейлоновый фильтр (120 отверстий/дюйм), и клетки сердечной мышцы сохраняли в пробирке, заполненной раствором KB. Температуру всей перфузионной системы поддерживали на уровне 37°С, а насыщение O всего перфузата и раствора KB на уровне 100% в течение более 30 мин. Клетки оставляли при комнатной температуре примерно на полчаса до рекальцификации до 0,25 ммоль/л, а затем хранили их при комнатной температуре для дальнейшего применения. Способ выделения клеток сердечной мышцы морской свинки по существу является таким же.
[58] 1.2.2 Эксперимент по фиксации потенциала целой клетки
2
Перед экспериментом небольшой объем суспензии KB с большим количеством клеток пипетировали в перфузионной камере объемом 0,5 мл и оставляли еще на 5-10 мин. Как только клетки осаждались и прикреплялись к камере, в течение 5-10 минут выполняли поверхностное вливание (со скоростью 2 мл/мин) внеклеточной жидкости, насыщенной О на 100%. С помощью инвертированного микроскопа (Olympus IX70) выбирали несокращенные клетки с четкой границей, гладкой поверхностью и четкой исчерченностью. Эксперимент проводили при комнатной температуре (22-24°С). Ток через канал записывали при напряжении, фиксированном с помощью стандартного способа фиксации потенциала целой клетки. Усилитель для фиксации потенциала (Axopatch 700B, Axon Со, США) был связан с компьютером через A/D и D/A конвертер данных (Digidata 1322, Axon Со, США). Программное обеспечение (pClampex 10.0, Axon Со, США) контролировало запись входного сигнала и напряжение, ток входного сигнала. Кусок стеклянной трубки (из Института физики, Китайская Академия Наук) изготавливали с помощью микроэлектродного пуллера (р-97, Scutter Co., США) в 4 этапа и полировали с помощью системы микрокузницы (MF-830, Narishige Co., Япония), получая диаметр кончика 2-3 мкм. Сопротивление электролита составляло 1,5-3 МОм. После того как компенсационная жидкость была заряжена потенциалом, кончик электрода помещали на клеточную поверхность с помощью трехмерного манипулятора, образуя гигаизолятор, изолятор с сопротивлением выше 1 ГОм. Емкость быстро компенсировали и клеточную мембрану разрушали для создания режима записи целой клетки. При определении емкости проводили этап стимуляции -10 мВ и рассчитывали емкость мембраны по формуле Cm=т·Iss/ΔV). Медленную компенсацию емкости и последовательную компенсацию сопротивления доводили до 80-90% для уменьшения тока и ошибки фиксации, связанной с кратковременным зарядом и разряжением. Сигналы проходили через низкочастотный фильтр Бесселя четвертого порядка с частотой среза 1 кГц, а частота дискретизации составляла 10 кГц.
[59] Во время записи в электролит добавляли АТФ, чтобы избежать влияния затухания тока и закончить эксперимент в течение 25 мин после разрушения клеточной мембраны. На основании протокола приготовленный раствор лекарственного препарата заливали в перфузионную камеру с помощью перистальтического насоса с постоянной скоростью 2 мл/мин. Затем отработанный раствор засасывали за счет отрицательного давления с помощью устройства для всасывания. Ток записывали через 5 минут после разрыва мембраны до обработки лекарственным средством и через 5 минут после обработки лекарственным средством. Полученные данные сохраняли на жестком диске компьютера для дальнейшего измерения и анализа. В целях устранения статистической ошибки между клетками значение тока представляли как плотность тока (пА/пФ).
K1
K1
to
to
to
to
to
K
H
H
K
H
H
[60] 1.2.3 План схем стимуляции током и наблюдаемые показатели: 1) схема стимуляции для записи I: потенциал удержания (Vh) - 40 мВ, командный потенциал - 120 мВ - 0 мВ с шагом в 10 мВ, время фиксации 400 мс, частота стимуляции 0,2 Гц; наблюдаемым показателем является изменение плотности постоянного тока I (под испытательным напряжением -100 мВ) до и после обработки лекарственным средством; 2) схема стимуляции для записи взаимосвязи тока I и напряжения: потенциал удержания (Vh) -90 мВ, предварительный стимул (-40 мВ 20 мс), а затем осуществляется стимул деполяризации -40 мВ - +60 мВ с шагом в 10 мВ, время фиксации 400 мс, частота стимуляции 0,2 Гц; наблюдаемым показателем является изменение плотности пикового тока I (под испытательным напряжением 60 мВ) до и после обработки лекарственным средством; 3) схема стимуляции для записи стационарной инактивации I: потенциал удержания -90 мВ, предварительный стимул (400 мс) давали от -120 мВ до 60 мВ с шагом в 10 мВ, затем проводили фиксацию при 60 мВ в течение 300 мс для записи тока I и сравнивали ток до и после обработки лекарственным средством; 4) схема стимуляции для записи зависимого от времени восстановления после инактивации I: давали двойной импульс, потенциал удержания -90 мВ, затем давали два стимула деполяризации (до 60 мВ, длительность 200 мс) Р1 и Р2, со следующими увеличивающимися интервалами (Δt): 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 250, 300 (мс). Записывали амплитуду пикового тока I, соответствующую Р2. Строили график восстановления после стационарной инактивации как зависимость I/Imax от Δt. 5) Определяли зависимую от напряжения активацию I: V=-40 мВ, деполяризацию осуществляли постепенно от -40 мВ до +60 мВ с шагом в 10 мВ и длительностью возбуждающего сигнала 5 с, затем возвращались к V, удерживали 2,5 с для записи следового тока. 6) Зависимая от времени активация следового тока I (envelop of tail test): V=-40 мВ, деполяризацию проводили до +50 мВ, затем возвращались к V, давали 10 непрерывных импульсов с длительностью сигнала 500-5000 мс, увеличивая ее каждый раз на 500 мс.
1.3 Анализ данных и статистика
-
[61] Исходные данные о токе регистрировали и собирали с помощью Clampfit 10.0 (Axon Co, США), а собранные данные анализировали, согласовывали и графически представляли с помощью программного обеспечения для обработки данных Origin 6.0 (Software Microcal Co, США). Данные эксперимента представляли как среднее ± стандартное отклонение (x±s), с помощью парного t-критерия проводили анализ для групп до и после обработки лекарственным препаратом. Разница считалась значимой, если р<0,05.
2. Результаты
K1
2.1 Влияние фармацевтической композиции в соответствии с изобретением на I мембраны клетки сердечной мышцы крысы
2
K1
K1
K1
K1
K1
[62] Быстро активирующийся входящий ток записывали на отдельной мышечной клетке желудочка крысы без явной инактивации в течение 400 мс (потенциал удержания (Vh)-40 мВ, командный потенциал 120 мВ - 0 мВ с шагом в 10 мВ, время фиксации 400 мс, частота стимуляции 0,2 Гц) (см. фиг.2А). Такой ток можно полностью заблокировать с помощью 1 ммоль/л BaCl, что обозначает, что ток представляет собой I. Входящий компонент тока I уменьшался, когда происходила деполяризация, обратный потенциал составлял примерно -40 мВ (со свойствами внутреннего выпрямителя). Порошок для капсулы в соответствии с данным изобретением разводили внеклеточной калийсодержащей жидкостью до 0,5% раствора, который может ингибировать I (см. фиг.2В). Под напряжением -100 мВ средняя плотность пикового тока составляла -10,78±1,80 (пА/пФ) до обработки лекарственным препаратом, средняя плотность пикового тока составляла -7,18±2,05 (пА/пФ) после обработки лекарственным препаратом, средняя скорость ингибирования составляла 33,1±16,85% (n=11, р<0,05). Плотность тока при воздействии различных импульсов изображали графически как функцию соответствующего мембранного потенциала, получая график I-V. Под действием каждого командного тока лекарственный препарат может уменьшать плотность тока I, в то время как обратный потенциал и форма кривой остаются без существенных изменений (см. фиг.2С). После обработки лекарственным препаратом ток I ингибируется под действием каждого фиксированного напряжения, что проявляется подъемом кривой «плотность тока-напряжение» без существенного влияния на обратный потенциал и выпрямление.
to
2.2 Влияние фармацевтической композиции в соответствии с изобретением на I мембраны клетки сердечной мышцы крысы
to
2.2.1 Влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на кривую «ток I-напряжение (I-V)»
to
to
mainiained
to
to
to
[63] Использовали внеклеточную и внутриклеточную регистрацию калиевых каналов, потенциал удержания (Vh) составлял -90 мВ, давали первый предварительный стимул (-40 мВ 20 мс), а затем стимул деполяризации от -40 мВ до +60 мВ (с шагом в 10 мВ), время фиксации составляло 400 мс, частота стимуляции составляла 0,2 Гц. Выходящий калиевый ток, регистрируемый в мышечной клетке желудочка крысы, состоит из двух компонентов. Один компонент представляет собой транзиторный ток (I) с острой «А»-формой, который быстро активируется и инактивируется, становится активным при 0 мВ и достигает пика примерно через 10 мс, а затем быстро становится неактивным до развития стационарного состояния через 200 мс. Процессы активации и инактивации зависят от напряжения и времени. Ток можно полностью блокировать с помощью 2 мМ 4-АР, что обозначает, что ток представляет собой I. Другой компонент представляет собой поддерживаемый ток (I), который активируется при -10 мВ и увеличивается по мере увеличения напряжения в пределах от -10 до 60 мВ (см. фиг.3А, С). Плотность тока при воздействии различных импульсов изображали графически как функцию соответствующего мембранного потенциала, получая график I-V. Транзиторный ток, т.е. I, получали путем вычитания поддерживаемого тока из пикового тока. 0,5% раствор порошка для капсул в соответствии с данным изобретением может блокировать ток I (см. фиг.3В), пиковый ток уменьшался при испытательном напряжении от 0 до 60 мВ, и кривая I-V опускалась. Средняя плотность тока при 60 мВ снижалась с -19,82±7,10 (пА/пФ) до -10,02±3,93 (пА/пФ) при средней скорости ингибирования 50,60±10,77% (n=6, р<0,05) (см. фиг.3D). Неактивный компонент I выравнивали с помощью единого степенного уравнения для получения временной константы зависимой от времени инактивации (т). Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может ускорить инактивацию тока (см. фиг.4), значения т до и после обработки лекарственным препаратом составляли 29,06±4,66 и 21,44±3,12, соответственно (n=6, р<0,05).
to
2.2.2 Влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на кривую стационарной инактивации I
to
to
to
1/2
1/2
to
1/2
[64] Схема стимуляции для регистрации стационарной инактивации I является следующей: потенциал удержания -90 мВ, предварительный стимул (400 мс) давали от -120 мВ до 60 мВ с шагом в 10 мВ, затем проводили фиксацию при 60 мВ в течение 300 мс для регистрации тока I и сравнивали ток до и после обработки лекарственным препаратом (фиг.5А, В). Из полученного графического изображения тока можно наблюдать, что инактивация выходящего тока может быть разделена на два компонента, инактивацию поддерживаемого тока с низким напряжением инактивации и инактивацию пикового тока с напряжением инактивации выше, чем у первого. Амплитуда I зависит от разницы между пиковым током и поддерживаемым током, измеренным в конце тестового импульса (фиг.5С). Амплитуды каждого тока стандартизировали, и каждый мембранный потенциал изображали графически как функцию соответствующего тока, получая кривую стационарной инактивации. Напряжение полуинактивации (V) и фактор наклона кривой инактивации (k) получали путем выравнивания с помощью уравнения Больцмана (I/Imax=1/{1+exp[(Vm-V)/k]}) (фиг.5D). 0,5% раствор порошка для капсул в соответствии с данным изобретением дает сдвиг влево кривой стационарной инактивации I с увеличением наклона. V до и после обработки лекарственным препаратом составляло -15,67±2,52 мВ и -26,45±3,88 мВ, соответственно значение k изменялось с 3,41±0,67 до 6,38±2,02 (n=7, р<0,05) (см. фиг.5).
to
2.2.3 Влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на кривую восстановления после инактивации I
[65] Давали двойной импульс, потенциал удержания составлял -90 мВ, затем по очереди давали два стимула деполяризации (до 60 мВ, длительность 200 мс) Р1 и Р2 со следующими увеличивающимися интервалами (Δt): 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 250, 300 (мс). Записывали амплитуду пикового тока I, соответствующую Р2. Восстановление после стационарной инактивации графически изображали как зависимость I/Imax от Δt. Кривую выравнивали с помощью единого степенного для получения временной константы кривой восстановления (т). Когда концентрация лекарственного препарата составляет 0,5%, время восстановления может увеличиться с 12,86±0,31 до 18,52±3,76 до (n=5, р<0,05) (см. фиг.6).
K
2.2 Влияние фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением на I клетки сердечной мышцы морской свинки
K
H
K
K
T
K
K
[66] Фиг.7 показывает выходящий ток I, который активируется в зависимости от напряжения и времени, записанный на мышечной клетке желудочка морской свинки (V=-40 мВ, деполяризация до 60 мВ с шагом в 10 мВ в течение 5 с). Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением ингибирует ток I в зависимости от напряжения (фиг.7С). Наблюдаемым показателем являлся записанный I при V=50 мВ, когда концентрация лекарственного препарата составляла 0,5%, плотность пикового следового тока уменьшалась до 30,77±1,11% (n=5, р<0,05). Фиг.8А, В показывают следовой ток I, активированный в течение всего времени по схеме envelope stimulus, а также ингибирующее влияние лекарственного препарата на зависимый от времени активированный I.
to
to1
to2
2
to2
to
to
to
to
to1
2+
[67] В настоящее время выяснили, что I включает два типа, I (который чувствителен к 4-аминопиридину и нечувствителен к внутриклеточному кальцию) и I (который является кальцийзависимым и может быть заблокирован кофеином и Со). В данном исследовании в пипетируемом растворе присутствует высокая концентрация агента EGTA (10 ммоль/л), образующего комплексы с кальцием, а перфузат содержит 0,15 ммоль/л блокатора кальциевых каналов CdCl. Таким образом, транзиторный выходящий выпрямляющий калиевый ток, регистрируемый в данном исследовании, не включает компонент I. В данном исследовании авторы наблюдали, что фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может существенно ингибировать I, уменьшение I может возникнуть под влиянием фазы 1 реполяризации потенциала действия, особенно у видов с более высоким I (например, у собак, крыс, людей и т.д.), удлиняя APD. Кроме того, I является основным током, ответственным за неравномерную трансмиокардиальную реполяризацию, ингибирование которой позволяет сократить неравномерную трансмиокардиальную реполяризацию и ограничить формирование проходящих через стенку микрокругов re-entry, чтобы избежать аритмии, такой как пируэтная желудочковая тахикардия и т.д. В настоящее время среди антиаритмических препаратов не существует лекарственных препаратов для клинического применения, воздействующих на I-каналы.
K
K
K
KS
KS
K
[68] В данной работе авторы наблюдали влияние лекарственного препарата на ток I в одиночной клетке сердечной мышцы морской свинки. Ток I в клетке морской свинки можно разделить на 2 типа: быстро активирующийся и медленно активирующийся; в течение 5 с после тестового импульса в качестве наблюдаемого показателя авторы записывали следовый ток, который соответствует медленно активирующемуся компоненту I. (I). На самом деле при увеличении частоты сердечных сокращений I играет важную роль в реполяризации. В данном исследовании авторы наблюдали, что когда лекарственный препарат в концентрации 0,5% может ингибировать I, это приводит к удлинению APD, и тем самым он оказывает антиаритмическое действие при тахикардии.
K1
K1
[69] Также в данном исследовании наблюдалось ингибирование препаратом входящего компонента тока I, которое не влияло на обратный потенциал и выпрямляющие свойства канала, но немного увеличивало выходящий компонент тока. Хотя нет значительной разницы между таким увеличением до и после обработки лекарственным препаратом, увеличение выходящего компонента I может способствовать реполяризации фазы 3 потенциала действия клетки, и это способствует стабилизации клеточной мембраны, устраняет раннюю постдеполяризацию и ингибирует аритмию, вызванную механизмом возбуждения.
[70] 5% раствор, приготовленный из порошка для капсулы в соответствии с данным изобретением, может ингибировать входящий выпрямляющий калиевый ток и транзиторный выходящий калиевый ток в зависимости от напряжения, а также медленный компонент выпрямляющего калиевого тока. Таким образом, он может оказывать антиаритмическое действие, уменьшая возбудимость клеток сердечной мышцы, ингибируя процесс реполяризации АР в клетке сердечной мышцы и удлиняя APD.