Осмотическая резистентность эритроцитов в условиях различной напряженности геомагнитного поля и при действии дигоксина в условиях in vitro

№ 3 - 2010 г. 14.00.00 медицинские науки

УДК 616.155.191-085.22:614.87]-092.9

ОСМОТИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНОЙ НАПРЯЖЕННОСТИ ГЕОМАГНИТНОГО ПОЛЯ И ПРИ ДЕЙСТВИИ ДИГОКСИНА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

В.Ю. Куликов, Е.А., Козяева, Ю.С. Тимофеева, Т.А. Емельяненко

ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава»

Обнаружено линейное увеличение осмотической устойчивости эритроцитов, коррелирующее со степенью ослабления геомагнитного поля, в то время как при воздействии дигоксина (ингибитора Na+/K+ АТФазы) осмотическая резистентность эритроцитов достоверно снижалась. При одновременном воздействии на эритроциты ослабленного геомагнитного поля, получаемого в специальной гипомагнитной камере при увеличении коэффициента экранирования, дигоксин компенсирует возрастающую в этих условиях резистентность эритроцитов. Делается вывод о том, что активность Na+, K+ АТФазы является точкой приложения факторов гелиогеофизической природы, которые за счет этого механизма активно участвуют в регуляции энергетического метаболизма клеток и регуляции водно-солевого обмена организма в целом.

Ключевые слова: осмотическая устойчивость эритроцитов, гипомагнитная камера, дигоксин, Na+ZK+АТФаза

Куликов Вячеслав Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой нормальной физиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», рабочий телефон: (383) 225-07-37

Козяева Елена Алексеевна - ассистент, завуч кафедры нормальной физиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», рабочий телефон: (383) 225-07-37

Тимофеева Юлия Сергеевна - студентка лечебного факультета ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», е-mail: patty@ngs.ru

Емельяненко Татьяна Александровна - студентка лечебного факультета студентка лечебного факультета ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», контактный телефон: (383) 225-07-37

Введение. В последние десятилетия увеличивается количество биотропных факторов различного происхождения, воздействия которых угрожают сохранению постоянства внутренней среды организма и вызывают напряжение регуляторных и гомеостатических систем [2]. В механизмах такого биотропного действия гелиогеофизических факторов существенная роль принадлежит нарушениям энергетики клетки и связанного с этим изменениям водно-электролитного баланса, заряда мембраны, активности мембранолокализованных рецепторов, состояния внеклеточных редокс-систем и активности тромбоцитарных и плазменных факторов гемостаза [3]. Одним из уникальных методических подходов, позволяющих выявить молекулярные механизмы биотропных эффектов гелиогеофизических факторов на организм, является их изучение в условиях экранированного пространства, т. е. в условиях гипомагнитной камеры. В качестве удобного объекта для такого рода исследований целесообразно использовать эритроцит, поскольку изменение его устойчивости под влиянием внешних воздействий представляется весьма важным для адаптации организма к экстремальным средовым факторам и при различных патологических процессах [4].

«Ахиллесовой пятой» клетки (не только эритроцита) является проницаемость мембраны для малых молекул, в первую очередь катионов. Изменение пассивной проницаемости мембраны так же сильно влияет на величину объема, как и изменение осмолярности [6]. Одним из ключевых ферментов, участвующих в регуляции энергетики клетки, формировании осмолярных градиентов и физико-химических свойств клеточных мембран в целом является №+/К+-АТФаза - фермент из группы транспортных аденозинтрифосфатаз, находящийся в клеточной мембране и переносящей одновалентные катионы через мембрану [5].

До недавних пор практически все работы, посвященные изучению №+-£+-АТФазы, начинались с утверждения о том, что в клетке этот белок нужен для создания ионной асимметрии и электрической разности потенциалов на мембране клетки. Однако очень быстро после открытия этого фермента стало ясно, что он есть в любых животных клетках. Есть он и в клетках, которые не имеют практически никакой электрической активности и у которых трансмембранная разность потенциалов ничтожно мала [1]. Для существования большой трансмембранной разности потенциалов наличие №+/К+-АТФазы и ионных градиентов является условием необходимым, но недостаточным., поскольку для обеспечение электровозбудимости нужны еще специальные ионные каналы [1].

Следовательно, главная биологическая роль асимметричного распределения катионов между внутри- и внеклеточным пространством заключается в обеспечении осморегуляции, в то время как объединенная работа осморегулирующих систем, приводящая к возникновению ионных градиентов, в процессе эволюции используется клеткой и для решения других задач, таких как электровозбудимость, способность реагировать на повреждения [1]. Не вызывает сомнения и тот факт, что в процессе эволюционного развития живые организмы должны были выработать, так же как в отношении других факторов внешней среды, приспособительные механизмы к постоянному воздействию естественно-природных электромагнитных полей [7]. Этот процесс взаимодействия живого вещества планеты Земля с факторами геофизической и

космопланетарной природы следует рассматривать как необходимый и важный этап в развитии человечества в целом. Важнейшая функция живого вещества - «космическая», по выражению В. И. Вернадского (1967), состоит в улавливании солнечной и последующем накоплении биохимической энергии, в создании в биосфере термодинамического поля с высоким информационным потенциалом. Роль геомагнитного поля в жизни и эволюции биосферы сформулирована и в теории «электромагнитной природы жизни» [8], который в качестве отправной точки теории использован постулат о способности живых систем «воспринимать, хранить и преобразовывать все типы электромагнитного излучения» [8].

Таким образом, №+/£+-АТФазу можно рассматривать как универсальный и ключевой фермент сформировавшейся на определенных этапах эволюции в тесном взаимодействии не только с природно-климатическими, но и гелиогеофизическими средовыми факторами.

Цель работы: изучить влияние ингибитора Na+-K+-АТФазы (дигоксина) и гипомагнитной камеры с различными коэффициентами экранирования на осмотическую резистентность эритроцитов донора в условиях in vitro.

Задачи

1. Оценить влияние ослабленного геомагнитного поля на осмотическую резистентность эритроцитов в гипомагнитной камере с различными коэффициентами экранирования.

2. Исследовать влияние ингибитора Na+/K+ -АТФазы (дигоксин) на осмотическую резистентность эритроцитов.

3. Изучить особенности осмотического гемолиза эритроцитов при одновременном воздействии на них дигоксина и ослабленного геомагнитного поля.

Материалы и методы. Гипомагнитная камера - устройство, характеризующееся мощной защитой от электромагнитных излучений. Эффект камеры заключается в изменении ряда физиологических параметров. Ослабленное геомагнитное поле получали в ферромагнитной камере (экране), разработанной канд. технич. наук Ю. А. Зайцевым (авторское свидетельство на изобретение № 991517 «Ферромагнитный экран»). Ферромагнитный экран представляет собой камеру оригинальной конструкции, состоящую из двух секций, каждая из которых набрана из пермаллоевых пластин толщиной 1,5 мм, между которыми проложены аналогичной толщины медные пластины. Внутренний объем первой секции - 60 х 60 х 230 мм, второй секции - 130 х 130 х 430 мм. Каждая секция имеет специальные крышки той же конструкции. Первая секция вставляется во вторую. Ферромагнитные экраны описанной конструкции в комплексе позволяют экранировать геомагнитное поле до 105 раз.

Дигоксин - лекарственный препарат группы сердечных гликозидов, ингибирующий работу №+/К+-АТФазы.

Материалом исследования служила кровь здорового донора, взятая из локтевой вены и стабилизированная раствором 3,8 % цитрата натрия в соотношении 9:1. Кровь центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин, а затем разделяли на плазму и клеточный (эритроцитарный) осадок. Оставшуюся эритроцитарную массу отмывали путем добавления 2 мл 0,9 % раствора NaCl с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин и удалением надосадочной жидкости.

В эксперименте было задействовано 6 групп пробирок с 20 мкл выделенных эритроцитов в каждой: 2 контрольных и 4 опытных. В каждую пробирку вносили по 2 мл

0,45 % раствора №С1. Затем в группы контроль № 2, опыты № 2 и 4 дополнительно вносили по 20 мкл 0,025 % раствора дигоксина. Контрольные группы пробирок находились в деревянной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Опытные группы (№ 1 и 2) были помещены в условия гипомагнитной камеры с коэффициентом экранирования 10-2, при комнатной температуре на 1 час. Опытные группы (№ 3 и 4) были помещены в условия гипомагнитной камеры с коэффициентом экранирования 10-5, при комнатной температуре на 1 час. Далее контрольные и опытные образцы центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин. Из каждой пробирки сливали надосадочную жидкость, вносили в супернатант 5 мл трансформирующего раствора и определяли содержание гемоглобина на гемоглобинометре «МиниГем-540». Полный (100 %) гемолиз определяли путем внесения к 20 мкл эритроцитарной взвеси 2 мл дистиллированной воды.

Результаты и обсуждение. Проведенные исследования показали, что осмотическая устойчивость эрироцитов изменяется как в условиях экранированного пространства, так и и при действии дигоксина.

Таблица 1

Осмотическая резистентность эритроцитов в гипомагнитной камере с различными коэффициентами экранирования и при воздействии дигоксина

№ Условия эксперимента К-во дублей НЬ, г/л

1 Полный гемолиз 6 183,0 ± 5,2

2 Величина гемолиза в 0,45% растворе № ^ 6 143,2 ± 2,7

3 Величина гемолиза в 0,45% растворе № ^ + дигоксин 6 173,6 ± 2,4

4 Величина гемолиза в гипомагнитной камере с коэффициентом экранирования 10-2 6 107,8 ± 4,8

5 Величина гемолиза в гипомагнитной камере с коэффициентом экранирования 10-2 + дигоксин 6 139,8 ± 2,9

6 Величина гемолиза в гипомагнитной камере с коэффициентом экранирования 10-7 6 56,8 ± 3,0

7 Величина гемолиза в гипомагнитной камере с коэффициентом экранирования 10-7 + дигоксин 6 113,5 ± 4,0

Примечание: P1-2 < 0,05, P1-3 н.д., Р1-4, 5, 6, 7 < 0,05, P2-3, 4, 6, 7 < 0,05, P2-5 н.д., Р3-5, 7 < 0,05, P4-6 < 0,02, P5-7 < 0,05

В табл. 1 отображены полученные данные, из которых видно, что осмотическая резистентность эритроцитов изменяется как при нахождении в гипомагнитной камере, так и при действии дигоксина.

На первом этапе анализа рассмотрим влияние условий экранированного пространства на осмотическую устойчивость эритроцитов донора. Как видно из данных, представленных в табл. 1 с увеличением коэффициента экранирования достоверно увеличивается осмотическая устойчивость эритроцитов в гипоосмолярных условиях (0,45 % растров №С1). Эта закономерность хорошо прослеживается на рис. 1.

Исследования, проведенные на втором этапе работы, показали, что прибавление дигоксина к суспензии эритроцитов достоверно снижало их осмотическую устойчивости в гипоосмолярных условиях, что видно из табл. 1 и на рис. 2.

Как видно из данных, представленных на рис. 2, дигоксин достоверно увеличивает процесс гемолиза эритроцитов в гипоосмолярных условиях.

В следующей серии экспериментов мы изучали особенности осмотического гемолиза эритроцитов при одновременном воздействии на них дигоксина и ослабленного геомагнитного поля.

Наблюдая «чистые» эффекты дигоксина и гипомагнитной камеры выявляем большую разницу в значениях. Так, при воздействии дигоксина на суспензию эритроцитов вне гипомагнитной камеры величина гемолиза практически не отличалась от максимального гемолиза при помещении эритроцитов в дистиллированную воду, когда концентрация гемоглобина составила 173,67 ± 2,43 г/л, что соответствует примерно 95 % гемолиза, но эти данные достоверно отличались от величины гемолиза эритроцитов вне камеры в гипоосмолярных условиях. В этих условиях величина гемолиза равнялась 143,2 ± 2,7 г/л (табл. 1). Таким образом, получены достоверные данные о том, что дигоксин достоверно увеличивает степень гемолиза эритроцитов вне гипомагнитной камеры. Аналогичные закономерности были получены и при действии дигоксина на величину гемолиза эритроцитов, находящихся в гипомагнитной камере с различным коэффициентом экранирования. Действительно, если величина гемолиза эритроцитов в гипомагнитной камере с коэффициентом экранирования без добавления дигоксина была равно 107,8 ± 4,8 г/л, то при добавлении дигоксина она достоверно увеличивалась до 139,8 ± 2,9 г/л. Аналогичная закономерность прослеживалась при изучении эффектов дигоксина в гипомагнитной камере с максимальным коэффициентом экранирования. Величина гемолиза соответственно равнялась 56,8 ± 3,0 и 113,5 ± 4,0 г/л.

Полученные данные свидетельствуют о том, что эффекты дигоксина на величину осмотического гемолиза эритроцитов противоположны эффекту, оказываемому гипомагнитной камерой. С учетом того, что дигоксин оказывает блокирующее влияние на активности №+/+К-АТФазы, есть основание полагать, что точкой приложения факторов гелиогеофизической природы, которые экранируются гипомагнитной камерой, также является №+/£+-АТФаза, на что в свое время указывалось в работах С. Шноля [9]. Известно, что активность №+/К+-АТФазы в клетке регулируется многими факторами. На первом месте стоят соотношение Na/K и доступность АТФ - это факторы так называемой краткосрочной регуляции активности. Содержание АТФ в клетке, как правило, мало изменяется в нормальных условиях, хотя может изменяться как при патологических состояниях, так и лекарственной терапии, в первую очередь сердечными гликозидами (дигоксин, уабаин) [10]. Гормоны также оказывают регулирующее влияние на активность этого фермента. Опосредованно повышает активность №+/К+-АТФазы инсулин. Он способствует входу калия в мышечные клетки и клетки печени, при|чем этот эффект не связан с влиянием инсулина на транспорт глюкозы. При недостаточности инсулина, напротив, калий выходит из клеток. Катехоламины влияют на распределение калия по -разному. Бета2-адреностимуляторы повышают активность №+/К+-АТФазы, стимулируют секрецию инсулина и усиливают поступление калия в клетки, а альфа-адреностимуляторы оказывают противоположное действие.

Выявленная нами закономерность влияние условий экранированного пространства на величину гемолиза эритроцитов объясняется, как нам представляется тем, что гидролизуя АТФ, чтобы обеспечить энергией активный транспорт ионов, №+/К+-АТФаза осуществляет сложную многостадийную реакцию, в которой участвуют ионы натрия, калия и магния, а также АТФ. И, поскольку фермент имеет лабильную структуру, то он легко изменяет свою конформацию в зависимости от характера окружающего его пространства, что позволяет рассматривать этот фермент как неравновесную систему,

которая чувствительна не только к гидрофильно-гидрофобному, но и полевому окружению [7].

Таким образом, выявленная нами чувствительность Na+-K+-АТФазы к гелиофизическим факторам, открывает новые перспективы в понимании фундаментальных механизмов взаимодействия организма человека с экологическими факторами полевой природы в процессах эволюции и онтогенеза, за счет наличия нового принципа регуляции водно-электролитного и энергетического балансов клетки. На основании проведенных исследования возможно также объяснить и прогнозировать индивидуальную магниточувствительность и магнитореактивность, а также разработать критерии по выявлению вариантов чувствительности человека к факторам гелиогеофизической природы с целью обоснования средств первичной и вторичной профилактики болезненных метеотропных реакций.

Выводы

1. В условиях ослабленного геомагнитного поля осмотическая резистентность эритроцитов увеличивается пропорционально коэффициенту экранирования.

2. Дигоксин, ингибируя работу №+/К+-АТФазы, снижает устойчивость эритроцитов в гипотоническом растворе.

3. Гипомагнитная камера и дигоксин, обладая противоположными эффектами, «нейтрализуют» друг друга, за счет того, что гипомагнитная камера повышает устойчивость эритроцитов в гипотоническом растворе, активируя №+/К+-АТФазу.

4. При увеличении коэффициента экранирования дигоксин компенсирует возрастающую в этих условиях резистентность эритроцитов.

Список литературы

1. Атауллаханов Ф. И. Как регулируется объем эритроцита, или что могут и чего не могут математические модели в биологии / Ф. И. Атауллаханов [и др.] // Биол. мембраны. - 2009. - Т. 26, № 3. - С. 163-179.

2. Биотропные свойства ослабленного геомагнитного поля / В. Ю. Куликов, А. Ю. Воронин, К. В. Гайдуль [и др.] ; под. ред. В. А. Шкурупия. - Новосибирск : ООО «Редакционно-издательский центр», 2005.

3. Козяева Е. А. Механизмы влияния ослабленного геомагнитного поля на систему гемостаза в условиях in vivo и in vitro / Е. А. Козяева, В. Ю. Куликов // Вопр. патогенеза типовых патологических процессов : сб. трудов науч.-практич. конф. с международным участием. - Новосибирск, 2009. - С. 206-209.

4. Борисов Ю. А. Резистентность эритроцитарных мембран: механизмы, тесты, оценка / Ю. А. Борисов, В. Н. Спиридонов, Е. Д. Суглобова // Клин. лаб. диагностика. -2007. - № 12. - С. 36-40.

5. Котык А. Мембранный транспорт / А. Котык, К. Яначек. - М. : Мир, 1980.

6. Орлов С. Н. Транспорт ионов в эритроциты человека при различных формах гемолитической анемии : корреляционный анализ / С. Н. Орлов [и др.] // Биохимия. -1993. - Т. 58, № 6. - С. 866-873.

7. Куликов В. Ю. Геоэкологические особенности системы гемостаза в условиях in vivo и in vitro / В. Ю. Куликов, Е. А. Козяева, С. К. Орумбаева // Экология человека. -2006. - Прил. 4/1. - С. 85-87.

8. Sedlak W. The electromagnetic nature of life / W. Sedlak // Second Internetional Congres of Psychotronic Research. - Monte Carlo, Monaco, 1975. - P. 77-83.

9. Шноль С. Э. Физико-химические факторы биологической эволюции / С. Э. Шноль. - М. : Наука, 1979. - 263 с.

10. Болдырев А. А., Твердислов В.А. Молекулярная организация и механизм функционирования Ка-насоса / А. А. Болдырев, В. А. Твердислав. - М. : ВИНИТИ, 1978.

ERYTHROCYTES OSMOSIS RESISTANCE IN VARIOUS INTENSITY GEOMAGNETIC FIELD AND IN VITRO DIGOXIN ACTION

V.Y. Kulikov, E.A. Kozyaeva, Y.S. Timofeeva, T.A. Emelyanenko

SEE HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth»

Erythrocytes osmosis stability lineal increase has been found out, correlating with geomagnetic field weakening degree; as erythrocytes osmosis resistance reduced vividly in digoxin influence (Na+/K+ ATPhase).

In simultaneous influence of weakened geomagnetic field in special hypo-magnetic chamber, during screening factor, on erythrocytes; digoxin compensates rising erythrocytes' resistance. We conclude that Na+/K+ ATPhase activity is the point of gelio-geo-physical nature factors, which animatedly regulate cells energetic metabolism and the whole water-salt exchange.

Keywords: erythrocytes osmosis stability, hypo-magnetic chamber, digoxin, Na+/K+ ATPhase

About authors:

Kulikov Viacheslav Yurjevich - doctor of medical sciences, professor, honored scientist RF, head of normal physiology department SEE HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth», office telephone: (383) 225-07-37

Kozyaeva Elena Alexeevna - assistant, normal physiology department SEE HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth»director of studies, office telephone: (383) 225-07-37

Timofeeva Yulia Sergeevna - student of medical faculty SEE HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth», e-mail: patty@ngs.ru

Emelianenko Tatiana Aleksandrovna - student of medical faculty SEE HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth», contact telephone (383) 225-07-37

List of the Literature:

1. Ataullakhanov F.I. How the erythrocyte’s volume is regulated, or what can and can't mathematical models in biology / F.I. Ataullakhanov [et al.] // Biol. membranes. - 2009. - V. 26, № 3. - P. 163-179.

2. Weakened geomagnetic field’s bio-tropic features / V.Y. Kulikov, A.Y. Voronin, K.V. Gaidul [et al.]; under the edit. of V.A. Shkurupia. - Novosibirsk: SRR «Editorial-publishers centre», 2005.

3. Kozyaeva E.A. Weakened geomagnetic field’s influence mechanisms on haemostatic system in vivo and in vitro / E.A. Kozyaeva, V.Y. Kulikov // Questions of typical pathological processes' pathogenesis: international participation scientific-practical conference’s collection of works. - Novosibirsk, 2009. - P. 206-209.

4. Borisov Y.A. Erythrocyte’s membranes resistance: mechanisms, tests, evaluation / Y.A. Borisov, V.N. Spiridonov, E.D. Suglobova //Clin. lab. diagnostics. - 2007. - № 12. - P. 36-40.

5. Kotyk A. Membranous transport / A. Kotyk, K. Yanachek. - M. Peace, 1980.

6. Orlov S.N. Ionic transport to human erythrocytes in different forms of hemolytic anemia: correlation analysis / S.N. Orlov [et al.] // Biochemistry. - 1993. - V. 58, № 6. - P. 866873.

7. Kulikov V.Y. Haemostatic system geo-ecological features in vivo and in vitro / V.Y. Kulikov, E.A. Kozyaeva, S.K. Orymbaeva // Human ecology. - 2006. - Suppl. 4/1. - P. 85-87.

8. Sedlak W. The electromagnetic nature of life / W. Sedlak // Second Internetional Congres of Psychotronic Research. - Monte Carlo, Monaco, 1975. - P. 77-83.

9. Shnol S.E. Physical-chemical factors of biological evolution / S.E. Shnol. - M.: Science, 1979. - 263 p.

10. Boldyrev A.A., Tverdislov V.A. Molecular organization and Na-pump functioning mechanism / A.A. Boldyrev, V.A. Tverdislov. - M.: VINITI, 1978.