СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
METHOD TO PRODUCE LYPOPOLYSACCHARIDE OF PLAGUE AGENT

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, может быть использовано для получения антигенов, диагностических и профилактических препаратов.
Для выяснения биологических функций, химической структуры и серологической активности липополисахарида (ЛПС) имеется ряд методов его выделения и очистки, однако все они не лишены недостатков. Так, органические вещества, используемые для получения липополисахаридных комплексов, влияют на их структуру, что отражается на биологической активности эндотоксина.
Известны способы получения липополисахаридов грамотрицательных бактерий экстракцией трихлоруксусной кислотой, водно-бутанольной и водно-эфирной смесью [Захарова И.М., Косенко Л.В., 1982]. Недостатком этих методов является невысокая степень очистки получаемых препаратов ЛПС от примесей бактериальных компонентов и длительность процедур выделения.
Существует другой способ выделения R-формы ЛПС с использованием метода экстракции смесью фенол-хлороформ-петролейный эфир (Galanos С.et al., 1969), при котором сухие бактериальные клетки трижды суспензируют в смеси 90%-ного фенола: хлороформа: петролейного эфира в соотношении 2:5:8, перемешивают при охлаждении в течение 15 мин и центрифугируют 15 мин при 5000 g. Супернатанты объединяют, удаляют хлороформ и петролейный эфир на роторном испарителе при 40°С. К фенолу добавляют дистиллированную воду по каплям до тех пор, пока ЛПС не выпадет в осадок. Фенол удаляют 6-кратным объемом охлажденной смеси серного эфира и ацетона.
Известен способ получения бактериальных ЛПС [патент RU 2051969] классической водно-фенольной экстракцией и очисткой ЛПС обработкой водной фазы неионным детергентом Тритон Х-114 при 0°С. Примеси нуклеиновых кислот удаляют осаждением холодным ацетоном.
Наибольшую популярность имеет водно-фенольный способ получения ЛПС [Westphal О. et al., 1952], включающий обработку микробной массы водно-фенольной смесью при 65°С в течение 45 мин. После охлаждения смесь разделяют центрифугированием. Водную фазу диализуют в течение 3-4 сут против дистиллированной воды для удаления фенола. ЛПС осаждают ультрацентрифугированием при 100000 g, 15°С в течение 3 ч. Недостатками способа являются необходимость длительного диализа и дополнительной очистки препарата, что связано с использованием дорогостоящего оборудования, потери ЛПС на этапах ультрацентрифугирования и продолжительность процедуры (5-6 сут).
Основным недостатком способов экстракции липополисахаридов с использованием фенола в разных вариантах является то, что они относятся к жестким химическим методам выделения эндотоксина и приводят к изменению исходной молекулярной организации биополимера, нарушая его нативную структуру и биологические свойства. Кроме того, фенол является летучим, агрессивным, ядовитым для человека и экологически вредным веществом.
К щадящим способам получения ЛПС относятся методы, основанные на предварительном разрушении или лизисе бактерий, с последующей депротеинизацией лизата коммерческими протеазами, а также обработкой нуклеазами [Darveau R.P., Hancock R.T.W., 1983; Hitchcock P.J., Brown T.M., 1983].
Метод выделения ЛПС по Darveau включает обработку суспензии микробных клеток панкреатическими нуклеазами ДНК-азой и РНК-азой, деструкцию обработанных клеток продавливанием их через French-press, повторную обработку клеток нуклеазами, разрушение молекулярных связей раствором, содержащим ЭДТА и SDS с последующей двукратной депротеинизацией материала бактериальной протеазой - проназой. Далее ЛПС осаждают этанолом и лиофилизируют. Значительным недостатком способа является многоэтапность и трудоемкость процедуры, а также использование дорогостоящих реактивов, что затрудняет процесс получения чистого ЛПС.
Широко известен способ выделения ЛПС [Hitchcock P.J., Brown T.M., 1983], который включает разрушение нативных бактерий путем кипячения в течение 10 мин в лизирующем буфере 1М Трис-HCl рН 6.8, содержащем 2% SDS и 4% меркаптоэтанола, и обработку протеиназой К в течение 60 мин при температуре 56-60°С. Недостатком способа является использование детергента SDS на этапе разрушения бактериальных клеток, что усложняет процедуру получения ЛПС, т.к. SDS является трудноудалимой примесью, снижающей качество получаемых препаратов.
ЛПС Yersinia pestis относится к R-хемотипу, т.к. построен по типу гликолипида, лишенного O-специфических антигенных цепей, присутствующих в ЛПС большинства грамотрицательных бактерий.
Для выделения препаратов ЛПС из возбудителя чумы в разное время были использованы процедуры по Westphal О., Galanos С.и Darveau R., однако отмеченные недостатки служат основанием для поиска новых методов выделения и очистки специфических полисахаридов.
Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу является метод выделения ЛПС [патент RU 2237719], в соответствии с которым ЛПС экстрагируют буферным раствором, содержащим ЭДТА в количестве 0.01-0.05 ммоль (на 1 г влажных клеток), 0.1 ммоль фенилметансульфонилфторида (ФМСФ) и 1% неионного детергента Тритона Х-100. Экстракт отделяют от интактных бактериальных клеток с помощью центрифугирования и добавляют к нему протеиназу К до конечной концентрации 80 мкг/мл. Полученную смесь инкубируют в течение 60 мин при температуре 56-60°С. Способ позволяет упростить процедуру выделения ЛПС, минуя стадию разрушения бактериальных клеток SDS, что обеспечивает отсутствие примесей этого соединения в образцах. В качестве объекта выделения ЛПС авторы патента использовали бактерии Escherichia coli. При попытке применить этот способ на модели возбудителя чумы полученный нами препарат ЛПС оказался неудовлетворительного качества, т.к. содержал большое количество белка и нуклеиновых кислот. Кроме того, использование ингибитора протеаз ФМСФ негативно влияло на внесенный протеолитический фермент.
Технической задачей настоящего изобретения является поиск оптимальных условий получения и технологичной схемы очистки ЛПС возбудителя чумы.
Технический результат заключается в улучшении качества препаратов ЛПС Y.pestis.
Технический результат достигается тем, что в способе получения ЛПС, включающем экстракцию ЛПС из бактериальных клеток и его очистку протеолитическим ферментом, согласно заявляемому способу на этапе экстракции предварительно проводят водно-солевую обработку клеток с последующим их лизисом буфером, содержащим 0,1 М Трис-HCI рН 8.0; 10 ммоль ЭДТА, 1% Тритон Х-100, и деструкцией ультразвуком, затем экстракт обрабатывают ферментным комплексом протеовибрином в концентрации 160 мкг/мл, инкубируют при 37°С, рН 7.8-8.0 в течение 18 ч, с последующим освобождением от нуклеиновых кислот подкислением ледяной уксусной кислотой до рН 3.2-3.4 и их осаждением при 5000 g в течение 30 мин.
Используемый в заявляемом способе лиофилизированный протеовибрин представляет собой хорошо растворимый в воде сыпучий порошок темно-коричневого цвета с содержанием белка 55±7% в зависимости от серии. Состав и характеристика ферментативной активности протеовибрина на тест-средах представлены в таблице 1. Таким образом, в протеовибрине присутствуют протеолитические ферменты, гидролизующие белки в широком диапазоне рН.
Протеовибрин получен из отхода производства оральной холерной вакцины - ультрафильтрата детоксицированной культуральной жидкости производственного штамма М-41 серовара Огава холерного вибриона при концентрировании O-анти-генсодержащего компонента вакцины на ультрафильтрационном аппарате марки УВА-ПС-20-1040 [Кузьмиченко И.А. и др., 2009] и применен как гидролизующий агент для белковых основ питательных сред [патент RU 2360962].
Способ осуществляют следующим способом.
Препараты ЛПС получают из лиофилизированных клеток Y.pestis EV НИИЭГ (Государственная коллекция патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб»), выращенных при 28°С и обеззараженных 0,5% формалином в течение 12-18 ч, по технологии, изложенной в производственном регламенте 01898109-04-04 на «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие псевдотуберкулезные».
1. Предварительно проводят водно-солевую экстракцию бактерий для удаления легкорастворимых веществ, для этого 5 г лиофилизированных клеток Y.pestis EV НИИЭГ 28°С суспензируют в 150 мл 0,9%-ного раствора NaCl, перемешивают в течение 2 ч и оставляют на ночь при 4°С.
2. После удаления водорастворимых компонентов центрифугированием при 3 тыс об/мин в течение 15 мин осадок взвешивают и суспензируют в лизирующем буфере (0,1 М Трис-HCL рН 8.0; 10 ммоль ЭДТА, 1% Тритон Х-100) из расчета 5 мл на 1 г влажных клеток. Деструкцию клеток Y.pestis проводят обработкой суспензии в ледяной бане ультразвуком в дезинтеграторе УЗДН-2Т при частоте излучения 44 кГц и максимальной мощности 5 раз по 1 мин с интервалом 1 мин.
3. Экстракт отделяют центрифугированием при 16000 об/мин в течение 50 мин (Beckman J2-21, ротор JA-20, температура 4°С), добавляют к нему протеовибрин до конечной концентрации в образце 160 мкг/мл и инкубируют при 37°С, рН 7.8-8.0 в течение 18 ч.
Предварительно для дозирования протеовибрина определяют его протеолитическую активность параллельно с коммерческой протеиназой К (Proteinase К, «Sigma», США) методом титрования на плотной тест-среде с 10% обезжиренным молоком рН 7.2 [Кузьмиченко И.А. и др., 2002]. В соответствии с полученными данными при выделении ЛПС учитывают дозу имеющейся серии протеовибрина, эквивалентную по активности дозе коммерческой протеиназы К. Анализ трех серий протеовибрина показал, что его активность в 2 раза ниже, чем у протеиназы К.
4. Очистку ЛПС от нуклеиновых кислот проводят путем подкисления (под контролем рН метра) неочищенного образца ледяной уксусной кислотой до рН 3.2-3.4 и осаждения нуклеиновых кислот при 5000 g в течение 30 мин. ЛПС выделяют путем добавления центрифугата по каплям к 8 объемам охлажденного (до 0°С) 96%-ного этилового спирта и отделяют центрифугированием. От низкомолекулярных примесей ЛПС освобождают с помощью диализа против дистиллированной воды, затем препараты лиофилизируют.
1
2
w
В результате нами были получены и охарактеризованы препараты ЛПС возбудителя чумы (по 3 серии каждого), выделенные патентуемым способом с использованием ферментного комплекса протеовибрина (ЛПС) и методом экстракции ЛПС [патент RU 2237719], послужившим прототипом (ЛПС). Для сравнения был взят препарат ЛПС возбудителя чумы, полученный классической водно-фенольной экстракцией по Westphal (ЛПС).
Все серии препаратов ЛПС, выделенные разными способами, представляют собой хлопья белого цвета, хорошо растворимые в воде и 0,9%-ном растворе NaCl.
Определение химического состава проводят общепринятыми методами: суммарные углеводы по Дюбуа с тимолом и серной кислотой, белки по Лоури, нуклеиновые кислоты - по Спирину.
1
2
2
1
W
W
Проведенный сравнительный химический анализ препаратов, выделенных патентуемым способом (ЛПС), методом-прототипом (ЛПС) и классической водно-фенольной экстракцией (ЛПС), показал сходные характеристики по проценту выхода образцов от сухого веса клеток (3,9±0,2%), однако по другим параметрам имелось значительное различие (Табл.2). Так, образец ЛПС содержал повышенное количество белка 8,4±0,2 и нуклеиновых кислот 3,2±0,1. Препараты ЛПС и ЛПС по данным показателям имели близкие цифры.
Электрофорез в SDS-ПААГ проводят по методу Laemmli в трис-глициновом буфере рН 8,3 на приборе «Mini protean II» фирмы «Bio Rad» (США), используя 4%-ный концентрирующий и 13%-ный разделяющий гели. Нагрузка на гелевую дорожку составляет 10-20 мкг препарата. Для характеристики препаратов в отношении белковых примесей гели обрабатывают Кумасси голубым, для выявления полисахаридов - азотнокислым серебром.
1
2
2
W
Электрофоретическое исследование в SDS-ПААГ показало, что препараты ЛПС, ЛПС и ЛПC представлены типичной R-формой, имеют ряд идентичных полос, однако в препарате ЛПС отмечается дополнительная полоса, соответствующая маркеру с молекулярной массой 66,2 кДа, которая окрашивалась на белок Кумасси голубым (Фиг.1).
Обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ ВЭЖХ) проводят при комнатной температуре с использованием градиентной системы Breeze на колонке Symmetry 300TM С 18 (5 мкм; 4,6×150 мм; «Waters», США). Для получения хроматографических данных при 254 нм используют УФ-детектор, скорость элюции - 1 мл/мин.
1
2
2
W
Сравнительный анализ хроматограмм образцов ЛПС, ЛПС и ЛПС методом ОФ ВЭЖХ с УФ-детекцией при длине волны 254 нм (Фиг.2) показал, что профили элюции исследованных антигенов схожи. Отмечается один основной пик высокой амплитуды на 1,2-1,5 мин, который был собран и исследован электрофоретически. Было показано, что во всех случаях в этом пике содержится полисахарид. В препарате ЛПС отмечается два дополнительных пика малой амплитуды на 1,2 и 2,0 мин.
Иммунохимическую активность полученных препаратов изучают в реакции иммунодиффузии в геле по Оухтерлони (РИД) и твердофазным иммуноферментным анализом (ТИФА). Для постановки РИД используют поликлональные чумные агглютинирующие лошадиные сыворотки (РосНИПЧИ «Микроб») и экспериментальные серии моноклональных IgG к ЛПС Y.pestis EV 28°С, выделенные из асцитической жидкости линейных мышей BALB/c, которые далее метят пероксидазой хрена и используют в ТИФА с антимышиным конъюгатом. Специфичность препаратов ЛПС чумного микроба определяют с экспериментальными мышиными сыворотками, полученными к гетерологичным штаммам: Yersinia pseudotuberculosis Ia; Francisela tularensis holarctica; E.coli 5198/99; Salmonella typhimurium 20.
1
2
1
2
W
W
Анализ иммунохимической активности показал, что препараты ЛПС ЛПC в реакции иммунодиффузии с поликлональными чумными агглютинирующими лошадиными сыворотками и моноклональными IgG к ЛПС Y.pestis EV 28°С давали одну четкую линию преципитации в концентрации 1 мг/мл, что говорит об их серологической гомогенности. Образцы ЛПС в РИД давали более слабую размытую линию преципитации, частично совмещаемую с линиями двух других образцов. Сравнительное тестирование препаратов ЛПС ЛПС и ЛПC в ТИФА показало, что их иммунологическая активность составляет 0,32±0,03; 0,96±0,02 и 0,26±0,05 мкг/мл соответственно. Специфичность препаратов липополисахарида подтверждена отрицательной реакцией с гетерологичными мышиными сыворотками.
Таким образом, реализация настоящего изобретения позволит внедрить новый способ, в котором определены оптимальные условия получения и технологичная схема очистки липополисахарида Y.pestis с использованием щадящей обработки неочищенного материала ферментным комплексом протеовибрином, обладающим высокой протеолитической активностью, позволяющие улучшить качество препаратов ЛПС возбудителя чумы по сравнению с методом-прототипом и получать ЛПС, практически не отличающийся по физико-химической характеристике, гомогенности, иммунологической активности и специфичности от ЛПС, полученного классической водно-фенольной экстракцией по Westphal.
Заявляемый способ дает возможность исключить применение ядовитых и трудноудаляемых реактивов, дорогостоящего оборудования, длительного диализа, что позволит упростить и удешевить методику, сократить сроки выделения ЛПС. Получение необходимого количества протеовибрина обеспечено выпуском холерной вакцины, при востребованности препарата он может быть предоставлен авторами по запросу.
Способ получения липополисахарида возбудителя чумы
Табл.1.
Фермент
Тест-среда, рН
Ферментативная активность в усл. ед. на мг белка
Нейтральная протеаза
с молоком, рН 7.2
16000±4000
Щелочная протеаза
с молоком, рН 8.5
20000±2000
Кислая протеаза
с молоком, рН 5.6
8000±400
Фосфолипаза А2
с желтком, рН 7.5
12500±2000
Фосфолипаза С
с желтком, рН 7.5
770±10
Табл.2.
Метод выделения антигена
Химический состав, %
Белок
Углеводы
Нуклеиновые кислоты
ЛПС<sub>1</sub>
ЛПС<sup>w</sup>
1,2±0,4
38,9±0,2
0,3±0,1
ЛПС<sub>2</sub>
8,4±0,2
34,5±0,5
3,2±0,1
ЛИТЕРАТУРА
1. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. - Киев: Наукова думка, 1982. - 192 с.
2. Westphal О., Luderitz О., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol / Wasser // Z.Naturforsch. Teil B. - 1952. - Vol.7. - P.148-155.
3. Galanos C., Luderitz O., Westphal O.A. New method for the extraction of R lipopolysaccharide // Eur. J.Biochem. - 1969. - V.9. - P.245-249.
4. Марков Е.Ю., Николаев В.Б. Способ получения бактериальных липополисахаридов // Патент RU 2051969, опубл. 10.01.1996 г.
5. Darveau R.P., Hancock R.T.W. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella thyphimurium strains // J.Bacteriol. - 1983. - Vol.155, №2. - P.831-838.
6. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silverstained polyacrylamide gels // J.Bacteriol. - 1983. - V.154. - P.269-277.
7. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Способ получения липополисахаридов // Патент RU 2237719, опубл. 10.10.2004 г.
8. Махнева З.К., Вишнивецкая Т.А., Прохоренко И.Р. Влияние метода выделения на выход и состав липополисахаридов из фотосинтезирующих бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т.32. - №4. - С.444-447.
9. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н., Плотников О.П., Грачева И.В., Виноградова Н.А., Солодовников Н.С., Червякова Н.С., Нижегородцев С.А., Антонычева М.В. Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов рода Yersinia и Vibrio // Патент RU 2360962, опубл. 10.07.2009 г.
10. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н., Нижегородцев С.А. Получение и свойства протеовибрина - ферментного комплекса из отхода производства вакцины холерной химической таблетированной // Первый Моск. междунар. Конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Матер, конгресса. - ч.1. - М.: ЗАО "Экспо-биохим. технологии" РХТУ им. Д.И.Менделеева. - 2009. - С.158.
11. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Киреев М.Н., Белякова Н.И., Клокова О.Д. Тест-среды для определения активности твиназы, протеазы и фосфолипазы в холерной химической вакцине и ее компонентах // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2002. - Вып.1 (83). - С.148-153.