СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С
METHOD OF DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF HEPATIC FIBROSIS IN CASE OF CHRONIC VIRAL HEPATITIS C

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням и гепатологии, и может быть использовано для проведения неинвазивной диагностики выраженности фиброза печени.
Известны морфологические методы определения выраженности фиброза печени, оцениваемые полуколичественно по R.G.Knodell (1981), K.G.Ishak (1994), K.P.Batts (1995), и наиболее используемая шкала оценки гистологических изменений печени METAVIR (1996), предусматривающая оценку четырех стадий фиброза [Серов В.В. Сравнительная морфологическая характеристика хронических вирусных гепатитов В и С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1999. - №1. - С.36-40].
Недостатком морфологического метода является его инвазивность, травматичность для пациента, большая вероятность таких осложнений, как кровотечение, билиарный перитонит и невозможность получения воспроизводимого результата при повторных исследованиях. Летальность, связанная с проведением биопсии, в среднем составляет 0,01%. В ряде случаев указанную манипуляцию невозможно выполнить из-за наличия противопоказаний.
Существуют способы диагностики фиброза печени путем подсчета количества баллов по классификационной счетной шкале М. Bonacini с использованием 3 параметров: количества тромбоцитов, протромбинового времени и соотношения активности АлАТ/АсАТ. У пациентов с количеством баллов 7 и более диагностируют фиброз 3-4 балла, т.е. портопортальный и портоцентральный фиброз печени или предполагают цирроз печени [Ющук Н.Д., Знойко О.О., Сафиуллина Н.Х., Келли Е.И. Пункционная биопсия печени и возможности неинвазивного мониторинга фиброза при хроническом вирусном гепатите С // Клин. перспективы гастроэнтерол., гепатол. - 2002. - №1. - С.9-16].
К недостаткам способа следует отнести низкую чувствительность этого теста, которая не превышает 50%.
Изобретение направлено на решение задачи: разработка неинвазивного способа диагностики фиброза печени, обладающего высокой точностью.
Поставленная задача достигается тем, что способ дифференциальной диагностики фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С осуществляют путем забора у пациента венозной крови и определения концентрации в сыворотке крови трансформирующего фактора роста-1β(TGF-1β) методом твердофазного иммуноферментного анализа, и при значении концентрации TGF-1β более 400 пг/мл диагностируют слабый или умеренно выраженный фиброз печени, а при значении TGF-1β менее 400 пг/мл - тяжелый фиброз или цирроз печени.
Изобретение иллюстрируется приложенными диаграммами:
на фиг.1 показан средний уровень TGF-1β в крови больных ХВГС и здоровых лиц;
на фиг.2 - средний уровень TGF-1β в сыворотке крови больных ХВГС в зависимости от стадии фиброза.
Характеристики метода согласно предложенному способу:
1. Чувствительность = 75%.
2. Специфичность = 92,3%.
3. Точность = 84%.
4. Ожидаемая ценность = 92,3%.
Преимущество метода - инвазивность, определение выраженности фиброза ткани печени с точностью 84% без проведения пункционной биопсии печени.
Известно, что фиброгенез - это универсальный процесс, основу которого составляет избыточное накопление протеинов внеклеточного матрикса и тканевых коллагеназ, основным источником которых являются звездчатые клетки печени. Звездчатые клетки (липоциты, клетки Ито) в нормальной ткани печени находятся в покоящемся состоянии и, накапливая ретиноиды, производят протеины внеклеточного матрикса. Исследованиями последних лет установлено, что активация звездчатых клеток медиаторами клеточного воспаления, к которым помимо активных форм кислорода, секретируемых поврежденными гепатоцитами, исследователи относят и некоторые факторы роста, являются основным патогенетическим звеном фиброгенеза. Звездчатые клетки при этом перемещаются в зону центральной вены и превращаются в активированный фенотип (становятся похожими на миофибробласты), активно пролиферируют и теряют запасы ретиноидов.
По данным некоторых исследователей, среди ростовых факторов с профиброгенным действием важное значение имеет трансформирующий фактор роста-1β (TGF-1β). В ранее проведенном исследовании C.Hora, et al. (2006) (Connective tissue growth factor (CTGF) the missing link between steatosis, insulin resistance and fibrosis in patients with chronic hepatitis С / C. Hora, F. Negro, L. Rubbia et al. // J. Hepatology. - 2006. - Vol.11(2). - P.535) показали, что TGF-1β наряду с фактором хемотаксиса моноцитов-1 кодирует синтез белков, участвующих в иммунном воспалении, ведет к изменению характера иммунного ответа на вирусную инфекцию. С биологическим действием TGF-1β связывают трансформацию звездчатых клеток в миофибробласты и опосредованную этим механизмом стимуляцию синтеза белков внеклеточного матрикса. В немногочисленных исследованиях, представленных в современной литературе имеются сведения, свидетельствующие о повышении содержания TGF-1β при хроническом вирусном гепатите С (ХВГС), участие фактора в процессе фиброгенеза печени. Однако следует признать, что однозначно ясного представления о механизмах участия TGF-1β в патоморфогенезе ХВГС, как и данных о его содержании в сыворотке крови больных при различных стадиях фиброза при ХВГС на настоящем этапе изучения патогенеза этого заболевания не имеется.
Возможность неинвазивной оценки процессов фиброгенеза при ХВГС и факторов, влияющих на них, представляется весьма ценной для клинической практики, дает возможность выбрать тактику наблюдения больных и наиболее точно определить объем терапевтических мероприятий.
Показатели содержания TGF-1β в сыворотке крови больных ХВГС
Было изучено содержание TGF-1R в крови 35 обследованных нами больных ХВГС, из них 25 больным произведена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании гепатобиоптатов был выявлен фиброз ткани печени различной стадии (F1-F4 по шкале METAVIR, 1996 г.). Так, расширение портальных трактов за счет фиброза без образования септ (F1) было выявлено у 3 (12%), портальный фиброз с редкими септами (F2) выявлен у 10 (40%), многочисленные септы без формирования цирроза (F3) у 10 (40%), цирроз печени (F4) у 2 (8%) обследованных больных ХВГС.
Выбор нами именно этого фактора роста был связан с широким спектром его биологического действия. Так, TGF-1β является важным просклерогенным медиатором фиброгенеза, играя исключительную роль в образовании миофибробластов.
Проведенное исследование по содержанию TGF-1β позволили выявить его повышенную концентрацию в сыворотках крови у всех больных ХВГС по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы.
При исследовании содержания TGF-1β в сыворотках крови больных ХВГС было обнаружено значительное его повышение. Средний уровень концентрации TGF-1β составил 485±28,2 пг/мл, что достоверно превышало показатель его среднего содержания по сравнению с группой здоровых лиц 77,41±5,1 пг/мл (Р<0,001) (см. фиг.1).
При изучении содержания TGF-1β в зависимости от клинико-биохимических данных и некоторых эпидемиологических факторов было установлено, что наличие клинических либо отсутствие проявлений заболевания, отягощенного преморбидного фона хронической соматической патологией и наркологического анамнеза не оказывало существенного влияния на содержание TGF-1β в крови (Р>0,05). Эти данные позволяют судить о том, что изменение сывороточного содержания TGF-1β1β у обследованных больных было обусловлено хроническим течением HCV-инфекции.
Был проведен сравнительный анализ содержания TGF-1β в сыворотках крови больных ХВГС в зависимости от степени фиброза (см. фиг.2).
Показатели среднего содержания TGF-1(3 в сыворотке крови у больных ХВГС с различной степенью выраженности фиброза ткани печени представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Концентрация TGF-1β в сыворотках крови больных ХВГС в зависимости от степени фиброза печени
Фактор роста
Стадия фиброза по METAVIR(1996)
Фиброз отсутствует (F0) n=0
Слабый фиброз (F1) n=3
Умеренный фиброз (F2) n=10
Тяжелый фиброз (F3) n=10
Цирроз печени (F4) n=2
TGF-1β (пг/мл)
-
403,1±12,42
648,4±39,47
344±34,54
303,8±52,9
При изучении взаимосвязи содержания в сыворотке крови TGF-1β с выраженностью фиброза печени было установлено, что повышение уровня TGF-1β отмечалось в группах больных со слабо- и умеренно выраженным фиброзом ткани печени (F1 и F2).
Так, у больных ХВГС со слабовыраженным фиброзом (F1) средний уровень TGF-1β в сыворотке крови составил 403,1±12,42 пг/мл, с умеренно выраженным фиброзом (F2) был еще более высоким - 648,4±39,47 пг/мл (Р<0,001). В то же время у больных ХВГС с более выраженными фибротическими изменениями - тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3 и F4) средние значения концентрации TGF-1R были достоверно более низкими, чем в группах больных с F1 и F2 и составили 344±34,54 и 303,8±52,9 пг/мл соответственно, не отличаясь между собой (Р>0,05). Установлено значимое снижение TGF-1β в крови у больных с тяжелым фиброзом (F3) в сравнении с этим показателем у больных, имеющих умеренный (F2) фиброз - 344±34,54 против 648,4±39,47 пг/мл (Р<0,001). Таким образом, можно заключить, что наибольшая степень гиперпродукции TGF-1β происходит на ранних этапах фиброгенеза. Показатели среднего содержания TGF-1β в зависимости от этапа фиброгенеза представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Концентрация TGF-1β в сыворотке крови больных ХВГС
Факторы роста
Этапы фиброгенеза у обследованных больных ХВГС (n=25)
Показатель достоверности Р
Слабый и умеренный фиброз(F1-F2) n=13
Тяжелый фиброз и цирроз печени (F3-F4) n=12
TGF-1β (пг/мл)
591,8±42,36
337,3±29,6
Р<0,001
При сравнительном анализе значений концентрации TGF-1β в сыворотке крови на раннем и позднем этапах фиброгенеза при ХВГС, напротив, были установлены значимые различия - 591,8±42,36 против 337,3±29,6 пг/мл соответственно (Р<0,001). Выявленная значимая разница и большой разрыв значений этих показателей стали основой предложенного нами неинвазивного способа разграничения умеренного и тяжелого фиброза, позволяющий дифференцировать выраженность фибротических изменений в печени при ХВГС без проведения пункционной биопсии печени.
При проведении нами исследования индивидуальные значения концентрации TGF-1β были выше 400 пг/мл у 12 (92,3%) из 13 больных ХВГС со слабо- и умеренно выраженным фиброзом (F1-F2) и лишь у 3 (25%) из 12 больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4) (Р<0,001). В то же время снижение концентрации TGF-1β ниже значения 400 пг/мл было отмечено у 9 (75%) из 12 больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4) и лишь у 1 (7,7%) из 13 пациентов с ХВГС со слабовыраженным фиброзом (F1-F2) (Р<0,001). Удельный вес обследованных больных в зависимости от концентрации TGF-1β и выраженности фиброза представлен в таблице 3.
Таблица 3.
Концентрация TGF-1β в сыворотке крови больных ХВГС
Концентрация TGF-1β
Этапы фиброгенеза у больных ХВГС
Показатель достоверности Р
Слабый и умеренный фиброз (F1-F2) n=13
Тяжелый фиброз и цирроз печени (F3-F4) n=12
Абс.
%
Абс.
%
400 пг/мл и более
12
92,3
3
25
Р<0,001
менее 400 пг/мл
1
7,7
9
75
Р<0,001
С учетом полученных нами данных возможно использовать определение в сыворотке крови уровня TGF-1β в качестве неинвазивного дифференциально-диагностического критерия для разграничения умеренного и тяжелого фиброза печени при хроническом течении HCV-инфекции.
По полученным результатам исследования были рассчитаны показатели чувствительности, специфичности, точности и ожидаемой ценности этого дифференциально-диагностического способа.
1. Чувствительность была рассчитана по формуле:
Чувствительность = ИПР/(ИПР+ЛОР)×100%
2. Специфичность была рассчитана по формуле:
Специфичность = ИОР/(ИОР+ЛПР)×100%
3. Точность была рассчитана по формуле:
Точность=(ИПР+ИОР)/(ИПР+ИОР+ЛОР+ЛПР)×100%
4. Ожидаемая ценность была рассчитана по формуле:
Ожидаемая ценность = ИОР/(ИОР+ЛПР)×100%
где
ИПР (истинные положительные результаты) - число больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4), у которых определение TGF-1β совпадало с данными гистологического исследования биоптата;
ЛОР (ложноотрицательные результаты) - число больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4), у которых определение TGF-1β не совпадало с данными гистологического исследования биоптата;
ИОР (истинные отрицательные результаты) - число больных, у которых при помощи определения концентрации TGF-1β в сыворотке крови был установлен слабый или умеренно выраженный фиброз (F1-F2);
ЛОР (ложноположительные результаты) - число больных, у которых по определению концентрации TGF-1β в сыворотке крови был ошибочно установлен слабый или умеренно выраженный фиброз;
Расчеты с учетом полученных результатов исследования:
5. Чувствительность = 9/(9+3)×100%=75%
6. Специфичность = 12/(12+1)×100%=92,3%
7. Точность = (12+9)/(9+12+1+3)×100%=84%
8. Ожидаемая ценность = 12/(12+1)×100%=92,3%
Таким образом, при определении TGF-1β в сыворотке крови пациента с хроническим течением гепатита С в концентрации менее 400 пг/мл с точностью 84% могут быть установлены стадии тяжелого фиброза и цирроза печени, а при уровне этого показателя 400 пг/мл и более - исключить их и диагностировать слабый или умеренный фиброз ткани печени.
Клинические примеры этого дифференциально-диагностического способа, демонстрирующие возможность эффективного применения определения концентрации TGF-1β в практике для разграничения умеренного и тяжелого фиброза, цирроза печени:
Пример 1. Выписка из медицинской карты стационарного больного №1470/515. Больной С., 28 лет, госпитализирован с диагнозом: хронический вирусный гепатит С. На догоспитальном этапе при профилактическом обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени и желчевыводящих путей не изменена. Активность АлАТ и АсАТ не превышали нормальные значения (0,57 и 0,31 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1β в сыворотке крови составила 376,1 пг/мл, что не позволяло исключить тяжелое фибротическое поражение печени. Пациенту выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При световой микроскопии гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки тяжелого фиброза печени - многочисленные септы без формирования цирроза, что соответствовало стадии F3 по шкале METAVIR.
Пример 2. Выписка из медицинской карты амбулаторного больного №5109. Больная М., 41 год, наблюдается в консультативно-диагностическом кабинете инфекционного отделения Холмской ЦРБ с 2001 года, диагноз: хронический вирусный гепатит С. При случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени не изменена, калькулезный холецистит. Активность АлАТ и АсАТ не превышали нормальные значения (0,3 и 0,45 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1β в сыворотке крови составила 308,4 пг/мл, что также не позволяло исключить тяжелое фибротическое поражение печени. Пациентке выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При световой микроскопии гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки тяжелого фиброза печени - многочисленные септы без формирования цирроза, что соответствовало стадии F3 по шкале METAVIR.
Пример 3. Выписка из медицинской карты стационарного больного №1502/560. Больная Н., 56 лет, госпитализирована с диагнозом: хронический вирусный гепатит С. На догоспитальном этапе при случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР РНК HCV не обнаружена. Клинически выявлена умеренная гепатомегалия. Эхографическая картина печени и желчевыводящих путей не изменена. Активность АлАТ и АсАТ превышали нормальные значения в 1,5-2,5 раза (1,57 и 0,84 мкмоль/л·ч Е/л соответственно). Концентрация TGF-1β в сыворотке крови составила 594,9 пг/мл, что также не позволяло исключить фибротическое поражение печени. Пациентке выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При световой микроскопии гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки умеренно выраженного фиброза печени - портальный фиброз с редкими септами, что соответствовало стадии F2 по шкале METAVIR.
Пример 4. Выписка из медицинской карты стационарного больного №1564/498. Больной М., 36 лет, госпитализирован с диагнозом: хронический вирусный гепатит С. Из анамнеза: в 2004 году при случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. Динамически наблюдался в консультативно-диагностическом кабинете инфекционного отделения Холмской ЦРБ. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени и желчевыводящих путей не изменена. Активность АлАТ и АсАТ превышали нормальные значения в 1,5 раза (1,11 и 0,15 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1R в сыворотке крови составила 418,2 пг/мл. Пациенту выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании биоптата обнаружены морфологические признаки умеренно выраженного фиброза печени - портальный фиброз с редкими септами, что соответствовало стадии F2 по шкале METAVIR.
Пример 5. Выписка из медицинской карты амбулаторного больного №5109. Больная Ф., 37 лет, наблюдается в консультативно-диагностическом кабинете инфекционного отделения Холмской ЦРБ с 2005 года, диагноз: хронический вирусный гепатит С. При профилактическом обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР РНК HCV не обнаружена. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени не изменена, калькулезный холецистит. Активность АлАТ и АсАТ не превышали нормальные значения (0,11 и 0,12 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1β в сыворотке крови составила 418,8 пг/мл. Пациентке была выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки легкого фиброза печени - расширение портальных трактов за счет фиброза без образования септ, что соответствовало стадии F1 по шкале METAVIR.
Пример 6. Выписка из медицинской карты стационарного больного №1561/209. Больной К., 47 лет, диагноз: хронический вирусный гепатит С. При случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени не изменена, незначительное уплотнение паренхимы. Активность АлАТ и АсАТ имели нормальные значения (0,37 и 0,38 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1β в сыворотке крови составила 250,9 пг/мл, что указывало на тяжелое фибротическое поражение печени. Пациенту выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании биоптата обнаружены морфологические признаки цирроза печени, что соответствовало стадии F4 по шкале METAVIR.
С учетом полученных нами данных можно заключить, что возможно использование определения в сыворотке крови уровня TGF-1β в качестве дополнительного неинвазивного дифференциально-диагностического критерия для разграничения умеренного и тяжелого фиброза печени при хроническом течении HCV-инфекции. Вероятно, при хроническом течении HCV-инфекции содержание TGF-1β в концентрации ниже 400 пг/мл ассоциировано с усилением процессов фиброгенеза печени, а его содержание в сыворотке крови свыше 400 пг/мл способствует снижению интенсивности фиброгенеза печеночной ткани.