Оценка долгосрочной стабильности антибиотиков тетрациклиновой группы хромато-масс-спектрометрическим методом

Ветеринарный врач. 2023. № 5. С. 15 - 20 The Veterinarian. 2023; (5): 15 - 20

Научная статья

УДК 543.544.53+636.2.034

DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_5_15

Оценка долгосрочной стабильности антибиотиков тетрациклиновой группы хромато-масс-

спектрометрическим методом

Айсылу Завдатовна Мухарлямова, Данил Наильевич Мингалеев, Александр Маратович Сайфутдинов, Оксана Викторовна Шлямина

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр

токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия

Автор, ответственный за переписку: Айсылу Завдатовна Мухарлямова, muharlyamova82@mail.ru

Аннотация. В настоящее время в животноводстве применяется большое разнообразие ветеринарных препаратов, в том числе и антибиотиков. В целях безопасности пищевых продуктов и предотвращения устойчивости к антибиотикам допускается использование только зарегистрированных препаратов. Для определения их остаточного количества в продуктах животноводства необходимы чувствительные количественные аналитические методы. Стабильность антимикробных препаратов является одной из основных характеристик, в частности при определении их остаточных количеств. Известно, что недостаточная стабильность анализируемого вещества или компонентов матрицы в образце во время хранения или анализа может привести к существенным отклонениям в результатах анализа. Мониторинг стабильности результатов анализируемых веществ в растворе и биологических образцах является частью обычной системы аккредитации лабораторий. Проведена оценка стабильности антибиотиков в образцах пищевых продуктов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографиеи с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС), которая позволяет с большой вероятностью выявлять целевые аналиты в сложных матрицах. Протестирована стабильность антибиотиков, принадлежащих к классу тетрациклинов (тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин, доксициклин). Образцы подвергали исследованию в день внесения добавки, через один и три месяца. По истечении выбранного времени хранения проводили ВЭЖХ-МС/МС анализ. Установили, что в мышечной ткани, хранящейся при температуре минус 20 °C, не наблюдалось серьезного разложения тестируемых антибиотиков в указанный период хранения. Данный факт свидетельствует о стабильности анализируемых антимикробных средств.

Ключевые слова: антибиотики, тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин, доксициклин, мясо, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия

Аssessment of long-term stability of tetracycline group antibiotics by chromatography-mass

spectrometric method

Aisylu Z. Mukharlyamova, Danil N. Mingaleev, Aleksandr M. Saifutdinov, Oksana V. Shlyamina

Federal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for toxicological, radiation, and biological safety», Kazan, Russia

Corresponding author: Aisylu Zavdatovna Mukharlyamova muharlyamova82@mail.ru

Abstract. Currently, there is a wide variety of veterinary drugs in animal husbandry, including antibiotics. For food safety purposes and to prevent antibiotic resistance, only registered antibiotics are allowed. Sensitive quantitative analytical methods are needed to analyze their residual amounts in animal products. The stability of antimicrobials is one of the main characteristics, in particular when determining their residual amounts. It is known that insufficient stability of the analyte or matrix components in the sample during storage or analysis can lead to significant deviations in the analysis results. Monitoring the stability of the results of the analyzed substances in solution and biological samples is part of the usual laboratory accreditation system. The stability of antibiotics in food samples was evaluated using high-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS), which makes it possible to identify target

analytes in complex matrices with high probability. The stability of antibiotics belonging to the tetracycline class (tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, doxycycline) was tested. The samples were examined on the day of addition, after one and three months. After the selected storage time, HPLC-MS/MS analysis was performed. It was found that no serious decomposition of the tested antibiotics was observed in the muscle tissue stored at a temperature of minus 20 °C during the specified storage period. This fact indicates the stability of the analyzed antimicrobial agents.

Keywords: antibiotics, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, doxycycline, meat, highperformance liquid chromatography, mass spectrometry

Введение. В настоящее время в животноводстве, в условиях интенсивного выращивания животных и домашней птицы, применяют большое количество антибиотиков различных классов, среди которых тетрациклины являются наиболее широко используемыми во всем мире [1, 2, 3]. Для мониторинга их остаточных количеств в пищевых продуктах и продовольственном сырье применяют чувствительные количественные аналитические методы [4, 5].

Вне зависимости от выбранного аналитического метода, стабильность определяемых антибиотиков (как в стандартных растворах, применяемых для калибровок, так и материале исследуемых образцов) также важна для получения достоверных результатов и безопасности пищевой продукции.

Зачастую образцы поступают в испытательную лабораторию спустя определенное время после отбора пробы, при этом необходимые условия транспортировки и хранения могут не соблюдаться. Это может привести к получению недостоверных результатов, которые могут кардинально отличаться от результатов первоначальных исследований, если таковые были проведены.

На стабильность анализируемых соединений оказывают влияние следующие параметры: температура, время, влажность, состав матрицы, воздействие света. Например, биологические образцы необходимо транспортировать достаточно оперативно замороженными на сухом льду. Большое значение имеет то как быстро и в каких условиях происходит подготовка проб перед анализом. Важно также время хранения размороженной пробы непосредственно перед анализом в лаборатории; наличие стадий повторного замораживание/размораживание образца; длительность хранения замороженного образца после отбора пробы и до проведения испытаний и т. д. [6, 7].

Введение в ветеринарную практику новых ветеринарных препаратов, всевозможные комбинации применяемых лекарственных средств, различные виды животноводческой продукции - все это приводит к необходимости проверки применяемых методов исследования на стабильность результатов в исследуемой матрице. Так как стабильность антимикробных препаратов может зависеть от типа ткани, органа и вида животных, она должна быть установлена для каждой отдельной новой матрицы.

Таким образом, оценка стабильности анализируемых веществ в замороженной матрице необходима для получения надежных результатов анализа определенной системы.

На сегодняшний день в литературе недостаточно информации о стабильности остатков антимикробных средств в пищевых продуктах при длительном хранении в замороженном виде.

Целью исследования явилось изучение стабильности четырех основных антибиотиков тетрациклинового (ТЦ) ряда в сохраненном в условиях глубокой заморозки образце мышечной ткани цыплят-бройлеров.

Материалы и методы. Объектом исследования явились антибиотики ТЦ группы. Пробоподготовку образцов и хромато-масс-спектрометрические исследования проводили по ГОСТ 31694-2012 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» [8]. Эксперимент проведен с использованием мяса цыплят-бройлеров, в которых при предварительном исследовании остаточных количеств антибиотиков ТЦ группы не было выявлено.

Реагенты. Использовали аналитические стандарты демеклоциклина (91,0 %), тетрациклина (96,7 %), окситетрациклина (96,1 %), хлортетрациклина (93,3 %) и доксициклина (> 98,0 %) производства «Sigma-Aldrich» (США), метиловый спирт марки «для хроматографии» «Merck» (Германия), лимонную кислоту, муравьиную кислоту, ортофосфорную кислоту марки «х.ч.», двузамещенный фосфат натрия марки «ч.д.а.», деоионизированную воду. Для каждого анализируемого антибиотика готовили исходный раствор в метиловом спирте, который впоследствии разбавляли до серии рабочих стандартов.

Стабильность антибиотиков в растворе метанола. Из каждого исходного раствора был приготовлен смешанный стандартный раствор концентрацией 10 мкг/г, который был разлит в различные стеклянные емкости и оставлен на хранение при 4 °С и минус 20 °С. Через 1, 2 недели, 1, 2 и 3 месяца образцы при необходимости размораживали, доводили до комнатной температуры и проводили исследование.

Стабильность антибиотиков в матрице мяса птицы. Оценку стабильности проводили путем приготовления гомогената «чистой» ткани, смешивая его с анализируемыми веществами и последующим проведением соответствующего эксперимента по стабильности. Для этого гомогенизированную мышечную ткань птицы разделяли на шесть отдельных аликвот, массой 1,0 г, чтобы избежать повторного замораживания/оттаивания. К образцам добавляли по 50 мкл каждого антибиотика из соответствующих стандартных растворов концентрацией 10 мкг/см3. Образцы пробы с добавкой для изучения долгосрочной стабильности хранили при минус 20 °С. Период проведения эксперимента составил 3 месяца. Через 0, 1 и 3 месяца аликвоту каждого образца (с параллельной пробой) размораживали до комнатной температуры для проведения исследований.

Для количественного определения анализируемых соединений и для получения достоверных результатов градуировку хроматографа проводили с применением матрицы «чистой» пробы. Градуировку осуществляли по четырем уровням концентраций в диапазоне от 5 до 1000 нг/см3. Для обеспечения стабильности исходных растворов антибиотиков хранение осуществляли при минус 20 °С. Из-за того, что стабильность антибиотиков в биологической матрице при повторных циклах замораживания/размораживания снижается, а также на стабильность могут оказывать влияние коэкстрактивные соединения биоматрицы, матричные градуировочные растворы готовили в день проведения хроматографических исследований.

Аппаратура. Хроматографирование выполняли на ВЭЖХ Agilent 1100 оснащенным тандемным квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектором высокого разрешения Bruker Impact II.

Хроматографические параметры. Скорость потока элюента - 200 мм3/мин. Подвижная фаза А - деионизованная вода, содержащая 0,5 % муравьиной кислоты; Б - метиловый спирт, содержащий 0,5 % муравьиной кислоты. Количество вводимой пробы составило 20 мм3, при скорости потока подвижной фазы 0,2 мл/мин. Температура термостата хроматографической колонки 40 °С

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft

Excel.

Результаты исследований.

Согласно применяемому методу анализа в качестве внутреннего стандарта (ВС) применяли демеклоциклин, относящийся к группе ТЦ, но не применяемый в кормовых добавках для сельскохозяйственных животных и птицы, соответственно отсутствующий в мясе. Для количественного определения антибиотиков строили график зависимости массовой доли анализируемого вещества (с) от отношения площади аналитического сигнала наиболее интенсивного фрагментного иона анализируемого вещества (S) к площади сигнала ВС (S0) (рисунок 1).

S/S,

О 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

С, нг/см3

• ТЦ хтц отц дц

Рисунок 1 - Градуировочная характеристика для антибиотиков ТЦ группы в условиях ВЭЖХ-МС/МС (ТЦ - тетрациклин, ХТЦ - хлортетрациклин, ОТЦ - окситетрациклин, ДЦ - доксициклин).

Коэффициент корреляции градуировочных графиков по каждому фрагментному иону соответствующего анализируемого антибиотика находился в диапазоне от 0,990 до 0,999, что указывает на удовлетворительную градуировочную зависимость (таблица 1). В таблице 2 приведены характеристики родительских псевдомолекулярных и дочерних фрагментных ионов анализируемых соединений при масс-спектрометрической детекции.

Таблица 1 - Градуировочные характеристики антибиотиков ТЦ группы определяемых методом ВЭЖХ-МС/МС

Определяемое соединение Концентрация МГР, нг/см3 Уравнение градуировочного графика Коэффициент корреляции, г2

Тетрациклин 5,0 у = 0,1097х - 0,5379 0,999

Окситетрациклин 50 у = 0,0923х - 0,2271 0,999

Хлортетрациклин 500 у = 0,0247х - 0,378 0,998

Доксициклин 1000 у = 0,0872х - 0,3284 0,999

Примечание: МГР - матричный градуировочный раствор

Таблица 2 - Характеристики ионов-предшественников и ионов-фрагментов в условиях Б81-ионизации и режиме регистрации положительных ионов при ВЭЖХ-МС/МС определении антибиотиков ТЦ группы

Антибиотик

Тетрациклин (С22Н24К208) 445,1605 445,1615 410,1263 427,1243 410,1245 427,1224

Окситетрациклин (С22Н24^09) 461,1586 461,1566 426,1184 444,1282 426,1197 444,1296

Хлортетрациклин (С22Н23СШ2О8) 479,1215 479,1223 444,0864 462,0975 444,0855 462,0962

Доксициклин (С22Н24^08) 445,1605 445,1611 428,1368 410,1263 428,1355 410,1247

Хроматографический анализ для оценки стабильности антибиотиков в образцах мяса проводили в течение одного дня с использованием ВЭЖХ-МС/МС в качестве метода обнаружения. Преимуществами данного метода является чувствительность и селективность. Селективность достигается благодаря возможности измерения массы молекулярных ионов аналитов и образующихся в ходе их распада соответствующих ионов-фрагментов. Аналитические сигналы коэкстрактивных веществ и помехи могут быть проигнорированы.

Стабильность антибиотиков в растворе. Результаты исследования стабильности анализируемых соединений в растворе метанола хранящихся при 4 °С и минус 20 °С представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Стабильность антибиотиков ТЦ группы в растворе метанола

Определяемое Относительный отклик, %

соединение t:H t2н "2м "3м

Хранение при 4 °С

Тетрациклин 95,8 87,2 76,4 80,3 68,2

Окситетрациклин 92,6 89,3 81,5 84,1 77,8

Хлортетрациклин 98,4 96,7 93,2 88,7 91,6

Доксициклин 97,5 101,3 98,7 94,2 92,7

Хранение при минус 20 °С

Тетрациклин 96,3 99,7 99,2 95,8 89,2

Окситетрациклин 98,1 97,4 101,4 97,2 92,8

Хлортетрациклин 100,7 98,2 97,5 99,6 97,3

Доксициклин 98,5 99,4 99,8 98,1 95,6

Примечание: Ън - через 1 неделю; 12н - через 2 недели; 11м - через 1 месяц; 12м - через 2 месяца;

1зм - через 3 месяца

Стабильность антибиотиков сравнивали по относительному отклику, который представляет собой соотношение среднего значения площади хроматографического пика в растворе в момент исследования к среднему значению площади хроматографического пика аналита на начало опыта. Соединение считается нестабильным, если относительный отклик падает ниже 90 % [6]. Исследования показали, что для растворов тетрациклина и окситетрациклина, хранящихся при 4 °С в течение двух недель измеренная стабильность была ниже установленного критерия. Хлортетрациклин в растворе метанола показал свою нестабильность ко второму месяцу хранения при 4 °С. Показатель по стабильности раствора доксициклина, хранящегося при 4 °С хотя и был в пределах нормы, но находился на нижнем диапазоне к концу опыта.

Растворы антибиотков показали стабильность в течение всего периода исследования при хранении в условиях минус 20 °С. Следует отметить, что стабильность раствора тетрациклина была несколько ниже установленного критерия к третьему месяцу хранения.

Таким образом, полученные данные свидетельствует о необходимости еженедельного приготовления свежих растворов тетрациклина и окситетрациклина в метаноле, если их хранение осуществляется в условиях 4 °С. Если растворы хранятся при минус 20 °С, то каждые два месяца для тетрациклина и каждые три месяца для остальных исследуемых антимикробных средств.

Стабильность антибиотиков в матрице мяса птицы. Для получения более достоверных результатов добавку антибиотиков в образцы осуществляли на двух уровнях: на пределе чувствительности метода (10 нг/г) и в 50 раз более высоком. Содержание исследуемых антибиотиков в каждом экстракте мышечной ткани анализировали в двух повторностях, средние значения которых представлены в таблице 4.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что концентрация всех четырех антибиотиков в замороженном образце мышечной ткани цыплят-бройлеров во время хранения при температуре минус 20 °С в течение тестируемого периода менялась несущественно. Наименьшую стабильность через один месяц хранения, как при высоком, так и при низком уровне добавки установили в пробе, контаминированной окситетрациклином. После трех месяцев хранения наименьшая стабильность при высокой концентрации добавки получена для тетрациклина, где относительный отклик составил 90,1 %. При низком уровне - для окситетрациклина с относительным откликом 91,0 %. Относительный отклик выше 90,0 % свидетельствует об удовлетворительной стабильности анализируемых антимикробных средств.

Таблица 4 - Результаты исследования стабильности антибиотиков ТЦ группы в образцах мяса, хранящегося при минус 20 °С

Определяемое соединение Значение показателя в добавке, нг/г Значение показателя в пробе с добавкой, нг/г

10 11м 13м

Тетрациклин 500 488,5 474 450,5

10 9,6 9,4 9,2

Окситетрациклин 500 479,5 465 452,5

10 9,5 9,3 9,1

Хлортетрациклин 500 475,5 469 461,5

10 9,8 9,7 9,3

Доксициклин 500 481,5 486,5 472

10 9,3 9,2 9,4

Примечание: ^ - в день внесения добавки; 11м - через 1 месяц; 1зм - через 3 месяца

Таким образом несмотря на то, что показатели для тетрациклина и окситетрациклина к концу исследований были наименьше по сравнению с другими антибиотиками, что указывает на их подверженность к более быстрому разложению при хранении, полученные результаты ясно демонстрируют, что анализируемые антибиотики можно считать достаточно стабильными в образцах мяса при низких температурах в течение трех месяцев хранения.

Заключение. Изучена стабильность антибиотиков ТЦ группы как в растворах метанола при различных условиях хранения (4 °С и минус 20 °С), так в условиях заморозки (минус 20 °С) в образцах мяса птицы с использованием ВЭЖХ-МС/МС в качестве метода контроля. В ряду тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин и доксициклин сравнительная стабильность соединений повышается. В долгосрочной перспективе (в течение тестируемого периода) стабильность рассмотренных веществ является индивидуальным свойством.

Литература

1. Асланов Р.М., Гасанов А.С., Зухрабова З.М., Алвердиев Г.Р.О., Сардарлы В.В.Г., Сулейманова Р.А.Г. Комплексное лечение раневых инфекций у животных // Ветеринарный врач. 2023. № 1. С. 70-74.

2. Мухарлямова А.З., Балымова М.В., Мухамметшина А.Г., Сайфутдинов А.М., Гайнуллин А.З. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы методом ВЭЖХ-МС/МС // Бутлеровские сообщения. 2022. Т. 70. № 6. С. 48-54.

3. Саматова А.А., Шлямина О.В., Мухарлямова А.З. Оценка качества мяса говядины микробиологическим и хромато-масс-спектрометрическим методами // Бутлеровские сообщения. 2023. Т. 74. № 4. С. 127-132.

4. Фицев И.М., Лихачева А.Ю., Сайфутдинов А.М., Мухарлямова А.З., Мохтарова С.Л., Насыбуллина Ж.Р. Определение диквата и параквата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в объектах экомониторинга // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. 2021. Т. 163. № 1. С. 61-71.

5. Мухарлямова А.З., Мухамметшина А.Г., Рахметова Э.Р., Мохтарова С.Л., Фицев И.М. Применение технологии QUECHERS для исследований химической безопасности кормов, продовольственного сырья, пищевых продуктов и объектов экомониторинга // Современные проблемы пищевой безопасности : материалы международной научной конференции, Санкт-Петербург, 22-23 октября 2020 года - Санкт-Петербург: Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины, 2020. С. 306-310.

6. Berendsen B.J.A., Elbers I.J.W., Stolker A.A.M. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection // Food Additives & Contaminants: Part A. 2011. Vol. 28 (12). P. 1657-1666.

7. Okerman L., Hende J., Zutter L. Stability of frozen stock solutions of beta-lactam antibiotics, cephalosporins, tetracyclines and quinolones used in antibiotic residue screening and antibiotic susceptibility testing // Anal Chim Acta. 2007. Vol. 586. P. 284-288. DOI: 10.1016/j.aca.2006.10.034

8. ГОСТ 31694-2012. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором - Введ. 2013-07-01. - М.: Стандартинформ, 2013. - 20 с.

References

1. Aslanov R.M., Gasanov A.S., Zukhrabova Z.M., Allahverdiyev G.R., Sardarly V.V., Suleymanova R.A. Comprehensive treatment wound infections in animals // Veterinarian. 2023. № 1. P. 70-74.

2. Mukharlyamova A.Z., Balymova M.V., Mukhammetshina A.G., Sayfutdinov A.M., Gaynullin A.Z. Determination of antibiotics of the tetracycline group by HPLC-MS/MS // Butlerov Communications. 2022. Vol. 70. № 6. С. 48-54.

3. Samatova A.A., Shlyamina O.V., Mukharlyamova A.Z. Evaluation of beef meat quality by microbiological and chromato-mass spectrometric methods // Butlerov Communications. 2023. Vol. 74. № 4. P. 127-132.

4. Fitsev I.M., Likhacheva A.Yu., Sayfutdinov A.M., Mukharlyamova A.Z., Mokhtarova S.L., Nasybullina Z.R. Determination of diquat and paraquat by high performance liquid chromatography in areas of environmental monitoring // Scientific notes of Kazan university. Series: Natural sciences. 2021. Vol. 163. № 1. P. 61-71.

5. Mukharlyamova A.Z., Mukhammetshina A.G., Rakhmetova E.R., Mokhtarova S.L., Fitsev I.M. Application of QUECHERS technology for research of chemical safety of feed, food raw materials, food products and ecomonitoring facilities // Modern problems of food safety : Proceedings of the International scientific Conference, St. Petersburg, October 22-23, 2020. - Saint Petersburg: Saint Petersburg State University of Veterinary Medicine, 2020. P. 306-310.

6. Berendsen B.J.A., Elbers I.J.W., Stolker A.A.M. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection // Food Additives & Contaminants: Part A. 2011. Vol. 28 (12). P. 1657-1666.

7. Okerman L., Hende J., Zutter L. Stability of frozen stock solutions of beta-lactam antibiotics, cephalosporins, tetracyclines and quinolones used in antibiotic residue screening and antibiotic susceptibility testing // Anal Chim Acta. 2007. Vol. 586. P. 284-288.

8. GOST 31694-2012. Food products, food raw materials. Method of determination of the antibiotic residues of tetracycline group by High performance Liquid Chromatography. Mass spectrometry - Vved. 2013-07-01. - M.: Standardized, 2013. - 20 p.

© Мухарлямова А.З., Мингалеев Д.Н., Сайфутдинов А.М., Шлямина О.В., 2023