ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ДЕФЕКТНОЙ КОММУНИКАЦИЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ЩЕЛЕВЫХ КОНТАКТОВ
TREATING DISEASES ASSOCIATED WITH DEFECTIVE COMMUNICATION BY MEANS OF GAP JUNCTION CONTACTS

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям и способам их применения, содержащим полифенолы, такие как процианидины, например, полифенолы какао, такие как процианидины какао, для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечных аритмий. Настоящее изобретение относится также к композициям и способам их применения, содержащим полифенолы, такие как процианидины, например полифенолы какао, такие как процианидины какао, для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения прогрессирования нейродегенеративных и других заболеваний, связанных с дефектной коммуникацией между клетками посредством щелевых контактов, например расстройства познавательной способности.
Предпосылки к созданию изобретения
Полифенолы какао, такие как флаванолы и родственные им олигомеры, как было показано, оказывают благоприятное действие при гипертензии, атеросклерозе и сердечно-сосудистом заболевании. Данные эффекты показаны, например, в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497, и в примерах, представленных в данной заявке. Было показано, что полифенолы какао можно использовать для лечения или профилактики состояний, о которых известно, что на них влияет введение нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, например аспирина. Однако применение полифенолов какао, а не аспирина, для лечения и профилактики имеет преимущества, поскольку полифенолы какао не имеют побочных эффектов аспирина, таких как желудочное кровотечение.
В настоящее время неожиданно было открыто новое применение полифенолов какао, таких как флаванолы и родственные им олигомеры. Композиции и продукты, описанные в настоящем документе, можно применять для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечных аритмий. Кроме того, указанные композиции и продукты можно применять для лечения, профилактики, уменьшения риска или замедления прогрессирования любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, такого как злокачественная опухоль, сердечная аритмия и нейродегенеративные и другие заболевания, связанного с дефектной коммуникацией между клетками посредством щелевых контактов.
Краткое описание существа изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, продуктам и способам для лечения, профилактики, уменьшения встречаемости или уменьшения риска сердечной аритмии у млекопитающего, страдающего сердечной аритмией или входящего в группу риска возникновения сердечной аритмии, человека или животного, являющегося объектом ветеринарной практики, такого как лошадь, кошка или собака. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам и продуктам для лечения, профилактики, уменьшения риска или замедления прогрессирования любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, такого как злокачественная опухоль, сердечная аритмия и нейродегенеративные заболевания и расстройство познавательной способности, связанного с дефектной коммуникацией между клетками посредством щелевых контактов.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, такой как пищевой продукт, пищевая добавка, дополнение к диете или лекарственное средство, включающей в себя полифенол какао. Композиция необязательно может содержать L-аргинин и/или агент, понижающий уровень холестерина.
Упакованные продукты, содержащие упомянутые выше композиции и этикетку и/или инструкции по применению, для лечения, профилактики, уменьшения риска или замедления прогрессирования сердечной аритмии, нейродегенеративных заболеваний или любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, также входят в объем настоящего изобретения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечной аритмии у млекопитающего, такого как человек или животное, являющееся объектом ветеринарной практики, путем введения композиции, содержащей полифенол какао, такой как флаванолы какао и/или родственные им олигомеры, млекопитающему, которое в этом нуждается.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики, уменьшения прогрессирования или уменьшения риска состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками у млекопитающего, такого как человек или животное, являющееся объектом ветеринарной практики, путем введения композиции, содержащей полифенол какао, такой как флаванолы какао и/или родственные им олигомеры, млекопитающему, которое в этом нуждается. Например, указанное состояние представляет собой нейродегенеративное заболевание или расстройство познавательной способности, а млекопитающее страдает нейродегенеративным заболеванием или расстройством познавательной способности или входит в группу риска по данным заболеваниям.
Краткое описание рисунков
На фиг.1A-D показан межклеточный щелевой контакт в клетках WB-F344, измеренный посредством исследования с переносом краски люцифер желтый. А: контроль (0,2% ДМСО); B: TPA 10 нМ (90 мин.); С: генистеин 40 мкМ (72 ч); D: (-)-эпикатехин 40 мкМ (72 ч).
На фиг.2A-D представлена полученная методом иммунофлуоресценции картина субклеточного распределения коннексина 43. А: контроль (0,2% ДМСО); B: TPA 10 нМ; С: ТРА 10 нМ плюс (-)-эпикатехин 40 мкМ; D: ТРА 10 нМ плюс генистеин 40 мкМ. Время инкубации для всех видов воздействия составляло 90 мин.
На фиг.3 показано влияние фитостеролов, процианидинов какао и их комбинации на всасывание эпикатехина в плазму крови.
На фиг.4 показано влияние фитостеролов, процианидинов какао и их комбинации на окислительное повреждение ДНК.
На фиг.5 показано влияние фитостеролов, процианидинов какао и их комбинации на окислительное повреждение липидов.
Подробное описание изобретения
Все патенты, патентные заявки и ссылки, процитированные в настоящем документе, включены в него в качестве ссылок. В случае несовпадений приоритет имеет настоящее описание.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей флаванол и/или родственные ему олигомеры, такие как по меньшей мере один флаванол какао и/или родственный ему процианидиновый олигомер, для введения млекопитающему, которое в этом нуждается. Композиция необязательно может содержать агент, понижающий уровень холестерина, например агент, понижающий уровень холестерина, на основе стерола и/или станола, L-аргинин, кальций, калий, магний, антиоксидант, например, витамин Е и витамин С, любой из витаминов группы В, каротиноид, гуаровую камедь или моно- или полиненасыщенную жирную кислоту (например, омега-3 жирную кислоту), витамин D3, ретиналь, ретиноиды, соевый белок и селен. Композиции могут содержать полифенолы из других источников, помимо какао, например, из кожуры арахиса, которые обладают свойствами, сходными со свойствами полифенолов какао, помимо или вместо полифенолов какао.
Используемый в настоящем документе термин «полифенол какао» (СР) относится к полифенольному веществу, такому как флаванолы и родственные им олигомеры, которые имеются в бобах какао или которые экстрагированы из бобов какао или ингредиентов какао. Термин «флаванол» включает мономеры катехин и эпикатехин. Олигомеры катехина и эпикатехина называют процианидинами. Любое упоминание в настоящем документе полифенола какао следует понимать как применимое также к флаванолам какао и процианидину, в комбинации и индивидуально.
Термин «ингредиент какао» относится к материалу, содержащему твердые вещества какао, полученному из лишенных кожуры молотых бобов какао, такому как шоколадный ликер и частично или полностью обезжиренные твердые вещества какао (например, плитка или порошок).
Фраза «агент, понижающий уровень холестерина» означает любое соединение, комбинацию соединений, экстракт или компонент растения, в натуральном виде или после обработки, которые обладают свойством понижать уровни холестерина у млекопитающего при введении в эффективном количестве. В случае, когда указанный агент, понижающий уровень холестерина, представляет собой соединение или комбинацию соединений типа стерола или станола, т.е. включает в себя производные и изомерные формы, агент, понижающий уровень холестерина, называют «агентом, понижающим уровень холестерина, на основе стерола и/или станола». В случае, когда приведенная фраза используется применительно к композиции, например, «черный шоколад, понижающий уровень холестерина», это означает, что композиция обладает свойством понижать уровень холестерина.
Полифенолы какао могут иметь природное происхождение, т.е. могут быть получены из бобов какао, или могут быть получены синтетическим путем. Специалист может выбрать натуральный или синтетический полифенол, основываясь на его доступности или стоимости. Полифенолы какао можно включать в композицию в форме ингредиента какао, содержащего полифенолы какао, например шоколадного ликера, включенного в шоколад, или можно добавлять независимо от ингредиентов какао, например, в виде экстракта, фракции экстракта, выделенного и очищенного отдельного соединения, объединенных фракций экстракта или соединения, полученного синтетическим путем.
Полифенолы какао включают в себя флаванолы какао и их олигомеры. Флаванолы включают в себя (+)-катехин, (-)-эпикатехин и соответствующие им эпимеры (например, (-)-катехин и (+)-эпикатехин) и имеют следующую структуру:
Процианидиновые олигомеры могут иметь приблизительно от 2 до 18, предпочтительно, примерно от 2 до 12, а наиболее предпочтительно, примерно от 2 до 10 мономерных единиц. Например, олигомеры могут представлять собой димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры, гептамеры, октамеры, нонамеры и декамеры. В олигомере мономеры соединяются между собой посредством интерфлавановых связей (4→6) и/или (4→8). Олигомеры, имеющие исключительно (4→8) связи, являются линейными, в то время как наличие по меньшей мере одной (4→6) связи дает разветвленный олигомер. В случае полифенолов кожуры арахиса имеются также такие связи как С2→О→С7.
n
Таким образом, в композициях и способах согласно изобретению можно использовать полимерное соединение формулы A или его фармацевтически приемлемую соль:
где
n представляет собой целое число от 2 до 18, таким образом, что имеется по меньшей мере одна концевая мономерная единица А и одна или множество дополнительных мономерных единиц;
R представляет собой 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН;
образование связей между соседними мономерами имеет место в положениях, выбранных из группы, состоящей из 4, 6 и 8;
связь дополнительной мономерной единицы в положении 4 имеет альфа- или бета-стереохимию;
X, Y и Z выбраны из группы, состоящей из мономерной единицы А или водорода, с теми условиями, что, как и в случае по меньшей мере одной концевой мономерной единицы, образование связи с ней дополнительной мономерной единицы происходит в положении 4, и, необязательно, Y = Z = водород.
Полифенол какао можно получать экстрагированием из бобов какао, из лишенных кожуры молотых бобов какао или ингредиентов какао, таких как шоколадный ликер, частично обезжиренные твердые вещества какао и/или полностью обезжиренные твердые вещества какао. Предпочтительно, экстракт изготавливают из полностью или частично обезжиренного порошка какао. Можно использовать бобы любого из видов Theobroma, Herrania или их межвидовых или внутривидовых гибридов. Экстракт можно изготавливать из ферментированных, недоферментированных или неферментированных бобов; при этом ферментированные бобы содержат наименьшее количество полифенолов какао, а неферментированные - наибольшее. Выбор бобов можно осуществлять по коэффициенту ферментирования бобов, например, экстракт можно изготавливать из бобов, имеющих коэффициент ферментирования около 275 или менее. Оптимизацию уровня полифенолов в ингредиенте какао и его экстракте посредством манипулирования степенью ферментирования можно осуществлять, как описано в международной заявке № PCT/US97/15893, опубликованной как WO98/09533, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса.
Полифенолы какао можно экстрагировать из ингредиентов какао, которые были обработаны традиционными способами обработки какао (описанными, например, в Industrial Chocolate Manufacture and Use, ed. Beckett, S.T., Blackie Acad. & Professional, New York, 1997, в главах 1, 5 и 6), или улучшенным способом обработки, описанным в патенте США № 6015913, выданном Kealey et al., который сохраняет полифенолы (путем предотвращения их разрушения) с ингредиентах какао, в отличие от традиционных способов. В улучшенном способе обработки какао отсутствует традиционный этап обжарки. Таким образом, можно использовать ингредиенты какао, получаемые (а) нагреванием бобов какао в течение периода времени и при температуре, достаточной для удаления кожуры какао, без обжарки лишенных кожуры молотых бобов какао; (b) отвеиванием лишенных кожуры молотых бобов какао от кожуры какао; (с) прессованием на шнековом прессе лишенных кожуры молотых бобов какао и (d) извлечением масла какао и частично обезжиренных твердых веществ какао, которые содержат сохраненные уровни полифенолов какао. Способ сохраняет гораздо более высокий уровень высших процианидиновых олигомеров по сравнению с традиционными способами обработки. Твердые вещества какао, полученные данным способом, могут содержать более 20000 мкг общего количества флаванола и/или процианидинов на грамм нежирных твердых веществ; предпочтительно, более 25000 мкг/г, более предпочтительно, более 28000 мкг/г и, наиболее предпочтительно, более 30000 мкг/г. Для целей настоящего изобретения общие количества флаванола и/или процианидинов определяют, как описано в примере 2.
Полифенолы какао можно экстрагировать из источников, указанных выше, с помощью растворителей, в которых растворяются полифенолы. Подходящие растворители включают в себя воду или органический растворитель, такой как метанол, этанол, ацетон, изопропиловый спирт и этилацетат. Можно использовать также смеси растворителей. В случае, когда в качестве растворителя используют воду, ее можно слегка подкислять, например, уксусной кислотой. Примерами некоторых растворителей являются смеси воды и органического растворителя, например, водный метанол, этанол или ацетон. Водные органические растворители могут содержать, например, приблизительно от 50% до 95% органического растворителя. Так, можно использовать приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% и приблизительно 90% органического растворителя в воде. Растворитель может также содержать малое количество кислоты, такой как уксусная кислота, например, в количестве приблизительно от 0,5% до 1,0%. Состав экстрактов, т.е. представительство (т.е. профиль олигомеров) и количество процианидиновых олигомеров, будет зависеть от выбора растворителей. Например, водный экстракт содержит главным образом мономеры, этилацетатный экстракт содержит мономеры и низшие олигомеры, главным образом димеры и тримеры, а водный метаноловый, этаноловый или ацетоновый экстракт содержит мономеры и ряд высших олигомеров. Один из растворителей для экстрагирования мономера, а также высших процианидиновых олигомеров представляет собой приблизительно 70% ацетон. Однако любой экстракт, содержащий полифенолы, является пригодным для настоящего изобретения. Способы экстрагирования полифенолов какао известны специалистам и описаны, например, в патенте США № 5554645, выданном Romanczyk et al., и в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497. Так, в одном варианте осуществления изобретения экстракт какао получают путем измельчения бобов какао до порошка какао, обезжириванием порошка, экстрагированием полифенолов какао и очистки экстракта. Порошок какао можно получать лиофильной сушкой бобов и мякоти какао, удалением мякоти и шелухи из лиофилизированных бобов какао и размалыванием лишенных шелухи бобов.
Экстракт полифенолов какао можно очищать, например, удаляя кофеин и/или теобромин и дополнительно очищая гельпроникающей хроматографией и/или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Гельпроникающую хроматографию (например, на Sephadex LH-20) можно использовать для обогащения экстракта высшими процианидиновыми олигомерами. Например, можно не собирать элюат, содержащий мономеры и низшие олигомеры, до тех пор, пока целевой олигомер (олигомеры) не начнет элюироваться с колонки. Пример подобного экстракта известен специалистам и описан в примере 5 международной заявки № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса. Используя препаративную ВЭЖХ, например, ВЭЖХ с нормальной фазой, экстракт можно фракционировать, например, на мономерную и олигомерную фракции, содержащие по меньшей мере 50 мас.% мономера или специфического олигомера (олигомеров). В случае, когда конкретная фракция содержит мономеры или любой из низших олигомеров (например, фракцию димеров, тримеров или тетрамеров), фракция содержит приблизительно от 90 до 95 мас.% фракции конкретного олигомера. Желаемые фракции можно объединить после разделения, чтобы получить комбинацию олигомеров выбора, например олигомеров 3-10 или 5-10. Специалист может манипулировать условиями хроматографии для достижения желаемого профиля процианидинов с точки зрения руководства данного описания, общих знаний в данной области и, например, идей патента США № 5554645, выданном Romanczyk et al., и международной заявки № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497.
Мономерная фракция обычно содержит смесь мономеров эпикатехина и катехина, а олигомерная фракция обычно содержит смесь димеров (во фракции димеров), тримеров (во фракции тримеров), тетрамеров (во фракции тетрамеров) и т.п. Смеси мономеров и олигомеров встречаются в выделенных фракциях, поскольку какао содержит более одного типа каждого из изомеров, димеров и т.п. Олигомерная вариабельность наблюдается как результат наличия двух мономеров, эпикатехина и катехина, которые являются строительными блоками процианидинов, а также химической связью, соединяющей мономеры в олигомере. Так, димеры какао представляют собой, главным образом, В2 и В5, каждый из которых содержит два мономера эпикатехина. Отдельные мономеры и олигомеры можно получить с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, например, с использованием колонки С18.
Полифенол какао можно использовать в композициях согласно изобретению в форме экстракта какао, например экстракта, полученного с использованием растворителя, фракции какао, выделенных соединений, или в форме ингредиента какао или шоколада, содержащих эффективное количество флаванолов и/или процианидинов какао. Ингредиенты какао можно изготавливать с помощью традиционных технологий переработки какао, но предпочтительно с помощью способа, описанного в патенте США № 6015913, выданном Kealey et al. Альтернативно, для повышения уровня полифенолов какао можно использовать шоколадный ликер и твердые вещества какао, изготовленные из бобов какао, имеющих коэффициент ферментирования около 275 или менее. Указанные ингредиенты имеют содержание полифенолов какао, превышающее то, которое может быть получено с использованием традиционных способов обработки какао (например, с обжаркой) и полностью ферментированных бобов. Шоколад можно изготавливать с помощью обычных технологий из ингредиентов, описанных выше, или с помощью улучшенного процесса для сохранения полифенолов какао во время изготовления шоколада, как описано в международной заявке № PCT/US99/05414, опубликованной как WO99/45788, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса. Шоколад, изготовленный с помощью по меньшей мере одного из следующих нетрадиционных процессов, называется в настоящем документе «шоколад, имеющий сохраненное количество полифенолов какао»: (i) изготовление ингредиентов какао из недоферментированных или неферментированных бобов какао; (ii) сохранение полифенолов какао во время процесса изготовления ингредиентов какао и (iii) сохранение полифенолов какао во время процесса изготовления шоколада.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции содержат по меньшей мере один олигомер, такой, например, как димер. Указанные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один мономер или комбинацию мономеров, например катехина и эпикатехина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения изготавливают и используют также композиции, содержащие комбинацию мономеров, катехина и эпикатехина, например, в форме мономерной фракции, выделенной из какао.
Синтетические процианидины также можно использовать и изготавливать с помощью способов, известных специалистам, и как описано в международной заявке № PCT/US98/21392, опубликованной как WO99/19319, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса. Также могут быть пригодны производные полифенолов какао. Указанные производные включают в себя галлатированные мономеры и олигомеры, гликозилированные мономеры и олигомеры и их смеси, метаболиты процианидиновых мономеров и олигомеров, такие как сульфатированные, глюкуронидированные и метилированные формы, и продукты ферментативного расщепления процианидинов, произведенные в результате метаболизма микрофлоры толстого кишечника или метаболизма организма млекопитающего. Производные могут происходить из натуральных источников или могут быть изготовлены синтетическим путем.
Композиция необязательно может включать в себя агент, понижающий уровень холестерина. Можно использовать любой агент, понижающий уровень холестерина, независимо от механизма его действия. Подходящие агенты могут действовать путем уменьшения всасывания холестерина с желчью млекопитающего или путем уменьшения синтеза холестерина. Примерами подходящих агентов являются фитостеролы, фитостанолы и их производные и изомеры, соевый белок, растворимые волокна, например, бета-глюкан, например, из овса и psyllium, орехи, масло из рисовых отрубей, каждый из которых является особенно пригодным для использования в пищевых продуктах, в добавочных диетических композициях и пищевых добавках. Можно использовать также известные лекарственные средства, понижающие уровень холестерина; они являются менее предпочтительными для использования в пищевых продуктах и композициях пищевых добавок, но могут быть использованы в лекарственных средствах. Для специалиста будет очевидно, что выбор агента, понижающего уровень холестерина, зависит от планируемого носителя для доставки (например, в пищевом продукте, в дополнении к диете, в лекарственном средстве) и способа введения. Так, агент, который уменьшает всасывание холестерина с желчью, не будет предпочтительным для внутривенного введения. Подобно этому, если носителем для доставки является продукт питания, агент, понижающий уровень холестерина, который имеет сильный лекарственный вкус или запах, может быть нежелательным.
Фитостеролы представляют собой стеролы растительного происхождения, которые не растворяются в воде и имеют молекулярную массу и структуру, аналогичную холестерину. Фитостеролы уменьшают всасывание холестерина с желчью (как эндогенного холестерина, так и холестерина, поступающего с пищей), а также уровни холестерина в сыворотке крови (общего и ЛНП), но сами не всасываются. Идентифицировано более сорока растительных стеролов, однако в наибольших количествах в растениях содержатся бета-ситостерол, кампестерол и стигмастерол. Другими примерами полезных стеролов являются брассикастерол, десмостерол, халиностерол, пориферастерол и клионастерол. Можно использовать отдельные стеролы или смеси стеролов, выделенные из источников природного происхождения или полученные синтетическим путем, а также их изомеры и производные. Особенно полезными являются насыщенные производные стеролов, известные как станолы, в которых все углерод-углеродные связи в кольцах являются насыщенными. Подходящие станолы имеют 28 или 29 атомов углерода и включают бета-ситостанол, клионастанол, 22,23-дигидробрассикастанол и кампестанол. Фитостеролы могут иметь форму твердого вещества (например, порошок, гранулы) или жидкости (например, масла).
Стеролы и станолы обнаружены в нескольких растительных материалах, как описано, например, в международной заявке № РСТ/ЕР96/02344. Примерами источников стеролов/станолов являются сосновая кора, соевое масло, талловое масло, экстракт побегов бамбука (описанный в международной заявке № PCT/US98/12556, опубликованной как WO98/57545), кожура и масло какао и масло из рисовых отрубей. Талловое масло, побочный продукт целлюлозно-бумажной промышленности, является хорошим источником станола, т.е. бета-станола.
Растительный стерол можно получать из натуральных источников, таких как растительные масла, отстой растительных масел, дистилляты растительных масел и другие источники из растительных масел, такие как талловое масло, с помощью относительно простых и недорогих способов. Например, получение препарата стеролов из отстоя растительных масел с использованием растворителей, таких как метанол, описано в патенте США № 4420427, выданном Hamunen. Станолы обнаруживают в природе в малых количествах, но их легко получить из стеролов путем гидрогенизации стеролов любым из нескольких способов, известных специалистам. В случае, когда исходный стероловый материал получен из растительного материала, он содержит смесь нескольких различных стеролов; таким образом, после гидрогенизации полученный станол также будет представлять собой смесь различных станолов. Смеси являются пригодными для применения согласно изобретению. Однако также можно гидрогенизировать чистые препараты конкретных стеролов, чтобы получить чистые станолы, которые также можно использовать.
Theobroma cacao
Масло какао, экстрагированное из кожуры какао, представляет собой хороший источник фитостеролов. Фитостеролы какао представляют собой смесь свободных и связанных стеролов; причем свободные стеролы составляют приблизительно до 90% имеющихся фитостеролов. Фитостеролы включают в себя кампестерол, β-ситостерол и стигмастерол, циклоартеноил, 24-метиленциклоартеноил, а также малые количества других фитостеролов. Связанные фитостеролы включают в себя эфиры фитостеролов с жирными кислотами или ферулатные производные фитостеролов. Масло какао также содержит токолы, которые включают в себя токоферолы (которые обладают антиоксидантными свойствами) и токотриенолы (которые могут обладать свойством понижать уровни холестерина). Масло какао получают способом, включающим в себя следующие стадии: (i) размалывание кожуры какао; (ii) экстрагирование размолотой кожуры какао растворителем для фитостеролов; (iii) удаление растворителя и (iv) получения масла какао. Кожура какао, побочный продукт обжарки бобов какао, может быть получен из высушенных ферментированных бобов какао, измельченных бобов какао, обжаренных бобов какао и, предпочтительно, из высушенных неферментированных бобов, которые содержат наибольшее общее количество стеролов. Предпочтительные бобы какао получают из . Предпочтительными растворителями являются петролейный эфир, гексан, пентан и этиловый эфир. Растворитель можно удалять путем вакуумной перегонки. В одном варианте осуществления лиофилизированную кожуру измельчают до тонкого порошка на мельнице Tekmar (Cincinatti, OH), и размолотую массу экстрагируют в течение ночи подвергнутым повторной перегонке петролейным эфиром (т.кип. 38-39,6°С) на аппарате Soxtec (Fisher Scientific, Springfield, NJ). На следующее утро растворитель тщательно удаляют медленным выпариванием под потоком азота, и полученный экстракт хранят при -40°С. Фитостеролы затем можно очищать с помощью препаративной ВЭЖХ или колоночной хроматографии.
2
22
Можно использовать также эстерифицированные формы стеролов и станолов. Эстерификация делает стеролы/станолы более растворимыми в жирах и маслах, что может, в некоторых случаях, способствовать включению в пищевые продукты и другие средства доставки в организм. Например, стеролы можно эстерифицировать сложными эфирами жирных кислот. Примеры указанных эстерифицированных стеролов включают в себя ацетат ситостерола, олеат ситостерола и олеат стигмастерола. Сложные эфиры станолов можно получать способами, известными специалистам, и, например, как описано в патенте США № 6031118, выданном van Amerongen et al., в патенте США № 5892068, выданном Higgins, в патенте США № 5502045, выданном Miettenen et al., и в международной заявке № PCT/CA99/00655 (опубликованной как WO00/04887). В одном варианте осуществления пригодные сложные эфиры станолов получают эстерификацией по меньшей мере одного стерола сложным эфиром жирных кислот С-С, как описано в патенте США № 5958913, выданном Miettenen et al. Для повышения растворимости стеролов/станолов после введения млекопитающему можно использовать другие способы, известные специалистам. Один подобный способ описан в патенте США № 5932562, выданном Ostlund, в котором стерол/станол смешивают с лецитином, чтобы получить растворимый в воде порошок.
Стеролы/станолы можно добавлять в композицию в форме порошка путем смешивания с остальными ингредиентами. В случае пищевой композиции стеролы/станолы, а также другие агенты, понижающие уровень холестерина, удобно добавлять на стадии смешивания. Во время изготовления шоколада, понижающего уровень холестерина, например, стеролы/станолы можно добавлять в сухую смесь, содержащую сахар, в плавящееся масло, в молотые бобы какао перед размалыванием или в расплавленный шоколад, что менее предпочтительно. Для облегчения смешивания стеролы/станолы можно сначала растворить в солюбилизирующем агенте, таком как жир, растительное масло, моноглицериды, диглицериды, триглицериды, токоферолы и их смеси. Эффективными носителями для изготовления суспензий и эмульсий стеролов/станолов в воде являются вода, спирт, полиол, другие пищевые соединения, например, шоколадный ликер, в котором стеролы/станолы по меньшей мере частично растворимы, и их смеси.
Соевый белок можно добавлять в композицию в любой известной форме, например, она может представлять собой изолят соевого белка, концентрат соевого белка, текстурированный соевый белок или соевую муку, хлопья и муку грубого помола. Цельное зерно или его фрагмент также можно использовать, как описано, например, в примере 5. Различные формы соевого белка хорошо известны специалистам и имеются в продаже. Его свойства и способы получения описаны, например, в Soy Protein and Human Nutrition, Wilcke et al., eds., Acad. Press, NY, 1979. Соевый белок можно использовать в комбинации с любым агентом, понижающим уровень холестерина, на основе стерола и/или станола.
Растворимые растительные волокна, например, бета-глюкан, способны уменьшать содержание холестерина в плазме крови. Волокна для применения согласно изобретению можно получать из любого источника бета-глюкана, предпочтительно, из зерен овса и овсяных отрубей. Волокна можно изготавливать и добавлять в композиции в соответствии со способами, известными специалистам. Они особенно подходят для композиций, доставляемых перорально, таких как пищевые продукты и дополнение к диете. Бета-глюкан и другие растворимые растительные волокна можно использовать в комбинации с любым агентом, понижающим уровень холестерина, на основе стерола и/или станола.
Композиция согласно изобретению может также содержать L-аргинин, который может содержаться в композиции согласно изобретению в различных формах, например, в форме очищенного соединения, экстракта из содержащего L-аргинин растения или в форме ингредиента семян/орехов, например, ореховой муки или цельного семени/ореха. Можно использовать любой источник L-аригинина, синтетический или натуральный. Предпочтительными источниками L-аргинина являются соевые бобы и ядра орехов, такие как арахис, грецкие орехи, миндаль и фундук. Можно использовать обезжиренные и частично обезжиренные ядра орехов. Последние могут быть размолоты и могут называться ореховой мукой.
Композиция может также содержать кальций, калий, магний, антиоксидант, такой как витамин Е и витамин С, любой из витаминов группы В, каротиноид, гуаровую камедь или моно- или полиненасыщенную жирную кислоту (например, омега-3 жирную кислоту), которые можно получать в соответствии со способами, известными специалистам. Моно- или полиненасыщенные жирные кислоты можно использовать в форме оливкового масла, рыбьего жира или ореха. Примерами орехов, подходящих для данного использования, являются арахис, миндаль и грецкие орехи.
Композиция согласно изобретению является пригодной в качестве продукта питания, пищевой добавки, дополнения к диете или лекарственного средства. Композиции могут содержать носитель, разбавитель или наполнитель. В зависимости от планируемого использования, носитель, разбавитель или наполнитель можно выбирать таким образом, что он будет подходящим для использования человеком или животным, для пищевого продукта, добавки, дополнения или фармацевтического использования.
Используемый в настоящем документе термин «пища» относится к материалу, состоящему главным образом из белка, углевода и/или жира, который используется организмом для поддержания роста, восстановительных процессов и процессов жизнедеятельности, а также в качестве источника энергии. Пищевые продукты могут также содержать дополнительные вещества, такие как минералы, витамины и приправы. См. словарь Merriam-Webster Collegiate Dictionary, 10-е издание, 1993 г. Термин «пища» включает в себя напиток, адаптированный для потребления человеком или животным. Используемый в настоящем документе термин «пищевая добавка» определен FDA в 21 C.F.R. 170.3(e)(1) и включает в себя прямые и непрямые добавки. Используемый в настоящем документе термин «лекарственное средство» представляет собой медицинское лекарственное средство. См. словарь Merriam-Webster Collegiate Dictionary, 10-е издание, 1993 г. Лекарственное средство также может называться медикаментом. Используемый в настоящем документе термин «дополнение к диете» представляет собой продукт (не являющийся табаком), который предназначен для дополнения рациона и несет или содержит один или более следующих ингредиентов диеты: витамин, минерал, траву или другой растительный материал, аминокислоту, питательное вещество для использования человеком с целью дополнения рациона путем увеличения общего ежедневного приема, или концентрат, метаболит, составную часть, экстракт или комбинацию указанных ингредиентов.
Любая обычная пища, включая любой напиток, которая была улучшена присутствием полифенола какао или его производного, например, метилированных соединений или продуктов метаболического распада, и, необязательно, в комбинации с агентом, понижающим уровень холестерина, L-аргинином, кальцием, калием, магнием, антиоксидантом, таким как витамин Е и витамин С, любым из витаминов группы В, каротиноидом, гуаровой камедью и/или моно- или полиненасыщенной жирной кислотой (например, омега-3), находится в пределах объема настоящего изобретения.
Улучшение достигается (i) добавлением полифенола какао или его производного к пище, которая не содержит полифенол какао, или (ii) в случае, когда пища традиционно может содержать полифенолы какао, такая, например, как шоколад, повышением уровня полифенола по сравнению с тем уровнем, который имеется в пище, приготовленной традиционным способом. Повышение может достигаться добавлением дополнительного количества полифенолов какао, например, в форме экстракта, фракции или выделенного из них и очищенного соединения; добавлением полифенола какао в комбинации с другим ингредиентом, содержащим полифенол (например, кожуры орехов); манипулированием обработкой ингредиентов какао и отбором бобов какао, как описано выше, для сохранения полифенола какао в ингредиенте какао, используемом для производства пищевого продукта; или манипуляциями в процессе изготовления шоколада, как описано выше. Таким образом, пищевые продукты (включая напитки) содержат «повышенный уровень полифенолов» (включая процианидины какао) по сравнению со схожими обычными пищевыми продуктами (включая напитки). Пример шоколада, имеющего повышенный уровень полифенола, наблюдается, когда производитель шоколада добавляет экстракт какао, содержащий полифенолы какао, к своему ранее продававшемуся продукту. Пищевые продукты также могут называться «пищевыми продуктами с высоким содержанием полифенола какао», т.е. они содержат более высокие уровни полифенола, чем их традиционные двойники.
Пищевые продукты, содержащие полифенолы какао и, необязательно, по меньшей мере один агент, понижающий уровень холестерина (например, агент, понижающий уровень холестерина, на основе стерола и/или станола), L-аргинин, кальций, калий, магний, антиоксидант, такой как витамин Е и витамин С, любой из витаминов группы В, каротиноид, гуаровую камедь или моно- или полиненасыщенную жирную кислоту (например, омега-3), можно адаптировать для использования в медицине или ветеринарии, и включают корма для домашних животных. Пищевой продукт может не являться кондитерским изделием, однако, предпочтительным понижающим уровень холестерина пищевым продуктом является кондитерское изделие, такое как шоколад, отвечающий стандарту идентичности (SOI), или шоколад, не отвечающий SOI, такой как молочный, сладкий и полусладкий шоколад, включая черный шоколад, шоколад с низким содержанием жира и конфеты, которые могут иметь шоколадное покрытие. Другие примеры включают выпечку (например, шоколадные пирожные с орехами, печеные закуски, печенье, бисквит), приправы, плитку granola, ирис, заменители пищи, пастообразные продукты, сиропы, порошкообразные смеси для изготовления напитков, напитки со вкусом и запахом какао или шоколада, пудинги, рисовые лепешки, рисовую смесь, острые соусы и т.п. Если желательно, пищевые продукты могут иметь вкус и запах шоколада или какао. Пищевые продукты, которые содержат L-аригинин, помимо полифенола какао и агента, понижающего уровень холестерина, предпочтительно представляют собой шоколад и кондитерские плитки, такие как плитки granola, содержащие орехи, например, арахис, грецкие орехи, миндаль и фундук. Следует отметить, что добавление орехов с кожурой к пищевым продуктам, описанным в настоящем документе, также может увеличивать общее содержание полифенолов, поскольку, например, кожура арахиса содержит приблизительно 17% флаванолов и процианидинов, а кожура миндаля содержит приблизительно 30% флаванолов и процианидинов. В одном варианте осуществления настоящего изобретения кожуру орехов добавляют в нугу шоколадной конфеты, содержащей агент, понижающий уровень холестерина.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нешоколадный пищевой продукт содержит по меньшей мере приблизительно от 5 микрограммов/г до 10 мг/г и, например, по меньшей мере 5 микрограммов/г пищевого продукта, предпочтительно, по меньшей мере 10 микрограммов/г, более предпочтительно, по меньшей мере 100 микрограммов/г флаванолов какао и/или процианидиновых олигомеров. Если желательно, нешоколадные пищевые продукты могут содержать гораздо более высокие уровни процианидинов какао, чем те, которые имеются в шоколадных пищевых продуктах, описанных ниже.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения шоколадные кондитерские изделия содержат эффективное количество флаванола и/или процианидина какао для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечной аритмии или, в целом, любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, такого, например, как нейродегенеративное заболевание. Шоколадное кондитерское изделие может представлять собой молочный или черный шоколад. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения шоколад включает по меньшей мере 3600 микрограммов, предпочтительно по меньшей мере 4000 микрограммов, предпочтительно по меньшей мере 4500 микрограммов, более предпочтительно по меньшей мере 5000 микрограммов, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5500 микрограммов флаванолов и/или процианидинов какао на каждый грамм шоколада, на основе общего количества нежирных твердых веществ какао в продукте. В другие вариантах осуществления настоящего изобретения шоколад включает в себя по меньшей мере 6000 микрограммов, предпочтительно по меньшей мере 6500 микрограммов, более предпочтительно по меньшей мере 7000 микрограммов, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 8000 микрограммов процианидинов какао на грамм, и еще более предпочтительно 10000 микрограммов/г, на основе общего количества нежирных твердых веществ какао в продукте.
Кондитерское изделие из молочного шоколада может содержать по меньшей мере 1000 микрограммов, предпочтительно по меньшей мере 1250 микрограммов, более предпочтительно по меньшей мере 1500 микрограммов, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 2000 микрограммов флаванолов и/или процианидинов какао на каждый грамм молочного шоколада, на основе общего количества нежирных твердых веществ какао в продукте из молочного шоколада. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молочный шоколад содержит по меньшей мере 2500 микрограммов, предпочтительно по меньшей мере 3000 микрограммов, более предпочтительно по меньшей мере 4000 микрограммов, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5000 микрограммов флаванолов и/или процианидинов какао на грамм молочного шоколада, на основе общего количества нежирных твердых веществ какао в продукте из молочного шоколада.
Количество L-аргинина в пищевых продуктах может варьироваться. Обычно какао содержит от 1 до 1,1 грамма L-аргинина на 100 граммов частично обезжиренных твердых веществ какао. Оно может варьировать от 0,8 до 1,5 на 100 граммов какао. Шоколадные пищевые продукты согласно изобретению содержат L-аргинин в количестве, превышающем то количество, которое имеется в натуральных ингредиентах какао. Зная количество ингредиентов какао и L-аргинина, использованное в пищевом продукте, специалист может легко определить общее количество L-аргинина в конечном продукте. Пищевой продукт обычно будет содержать по меньшей мере 5 микрограммов/г, предпочтительно по меньшей мере 30 микрограммов/г или по меньшей мере 60 микрограммов/г, еще более предпочтительно по меньшей мере 200 микрограммов/г пищевого продукта.
В случае, когда в пищевом продукте используется агент, понижающий уровень холестерина, его количество будет зависеть от типа использующегося агента и может определяться специалистом на основании данного описания, особенно на основании суточных доз, указанных ниже, и известного уровня знаний в данной области. Пищевая композиция, например, может содержать приблизительно от 0,5 до 10 г на 45 г порции, предпочтительно примерно от 1,5 до 5 г на 45 г порции, наиболее предпочтительно от 2 до 4,5 г на 45 г порции, стеролов/станолов. Что касается соевого белка и растворимого волокна из овса, FDA указывает минимальные количества для пищевых продуктов, которые способны принести пользу здоровью. Согласно FDA, порция пищевого продукта, содержащего бета-глюкан, должна содержать по меньшей мере 0,75 г, а порция пищевого продукта, содержащего соевый белок, должна содержать по меньшей мере 6,25 г соевого белка. Указанные величины можно также использовать как руководство по определению количества указанных агентов, понижающих уровень холестерина, в пище.
Эффективное суточное количество флаванолов и/или процианидинов какао может быть обеспечено в одной порции. Так, кондитерское изделие (например, шоколад) может содержать по меньшей мере приблизительно 100 мг на порцию (например, 150-200, 200-400 мг на порцию) процианидинов какао. В случае, когда в композицию включен агент, понижающий уровень холестерина, можно добавить по меньшей мере 1,5 (например, 1,5-4,5 г) на порцию стерола/станола.
Лекарственные средства, содержащие флаванолы и/или процианидины какао, необязательно в комбинации с агентом, понижающим уровень холестерина, и/или L-аргинином, можно вводить различными путями, такими как пероральный, сублингвальный, трансбуккальный, назальный, ректальный, внутривенный, парентеральный и местный. Специалист будет способен определить подходящий агент, понижающий уровень холестерина, в зависимости от способа введения. Таким образом, лекарственные формы, адаптированные для каждого типа введения, входят в объем настоящего изобретения и включают в себя твердые, жидкие и полутвердые лекарственные формы, такие как таблетки, капсулы, желатиновые капсулы, порошки или гранулы в массе и в дозированном виде, эмульсии, суспензии, пасты, кремы, гели, пенки иди желе. Лекарственные формы с замедленным высвобождением также входят в объем настоящего изобретения и могут быть изготовлены, как описано в патентах США № 5024843, 5091190, 5082668, 4612008 и 4327725, включенных в настоящий документ в качестве ссылок в тех их частях, которые касаются рассматриваемого вопроса. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители или наполнители хорошо известны специалистам и могут быть легко определены специалистом. Таблетка, например, может включать эффективное количество композиции, содержащей полифенол какао, и, необязательно, носитель, такой как сорбит, лактоза, целлюлоза или двухкальциевый фосфат.
Дополнение к диете, содержащее флаванол и/или процианидин какао, и, необязательно, по меньшей мере один агент, понижающий уровень холестерина, и/или L-аргинин, может быть изготовлено способами, известными специалистам, и может включать в себя, например, питательное вещество, двухкальциевый фосфат, стеарат магния, нитрат кальция, витамины и минералы.
Также в объем настоящего изобретения входит упаковка, включающая в себя композицию согласно изобретению (например, пищевой продукт, дополнение к диете, лекарственное средство) и этикетку, указывающую наличие или повышенное содержание флаванола и/или процианидина какао и/или его производного, или инструкцию по применению композиции для лечения, профилактики, уменьшения встречаемости или уменьшения риска сердечной аритмии или любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, такого как нейродегенеративное заболевание. Необязательно, этикетка может указывать содержание агента, понижающего уровень холестерина, и/или L-аргинина, благоприятные свойства комбинации полифенола (полифенолов), агента (агентов), понижающего уровень холестерина и, необязательно L-аргинина. Упаковка может содержать композицию и инструкцию по применению для лечения, профилактики, уменьшения риска, замедления прогрессирования или уменьшения встречаемости сердечной аритмии или любого состояния, связанного с патологией/дефектом щелевого контакта между клетками, такого как нейродегенеративное заболевание или злокачественная опухоль.
Используемый в настоящем документе термин «лечение» означает улучшение существующего медицинского состояния, например, сердечной аритмии, или связанных с ним симптомов. Термин «профилактика» означает уменьшение риска, связанного с развитием заболевания, включая уменьшение вероятности появления заболевания. Предотвращение или профилактику можно осуществлять у индивидуума, известного по риску развития заболевания, или в популяции в целом для поддержания хорошего состояния здоровья, например, для уменьшения риска аритмии. Указанные способы можно использовать у людей или животных, являющихся объектами ветеринарной практики, таких как собака, кошка и лошадь.
Способы включают в себя введение млекопитающему, предпочтительно человеку или животному, являющемуся объектом ветеринарной практики, в течение эффективного периода времени (например, для индуцирования синтеза коннексина de novo) количества композиции, включающей в себя флаванол и/или родственный ему олигомер, такой как флаванол какао и/или родственный ему олигомер, необязательно, в комбинации с агентом, понижающим уровень холестерина, L-аргинином, антиоксидантом (например, витамином Е, витамином С); флаванол и/или родственный ему олигомер присутствует в количестве, эффективном для лечения, профилактики или уменьшения встречаемости сердечной аритмии или любого состояния, связанного с патологией/дефектами щелевого контакта между клетками, например, нейродегенеративных заболеваний (таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера). Помимо этого, лечение расстройств познавательной способности, которые связаны с коннексином, например, коннексином 40 и/или 43, также входит в объем настоящего изобретения. Так, можно лечить или улучшать функции, связанные с коннексином. Примерами расстройств познавательной способности, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, являются краткосрочная память и депрессия. Можно использовать также другие полифенолы, такие как полифенолы, выделенные из кожуры арахиса.
Таким образом, следующее применение входит в объем настоящего изобретения. Применение флаванола какао и/или его олигомера для изготовления лекарственного средства, пищевого продукта, нутрицевтика или дополнения к диете для применения для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения прогрессирования заболевания, связанного с дефектной коммуникацией между клетками посредством щелевых контактов, у человека или животного, являющегося объектом ветеринарной практики.
Следующие применения представляют собой некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Применение флаванола какао и/или его олигомера для изготовления лекарственного средства, пищевого продукта, нутрицевтика или дополнения к диете для применения для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечных аритмий у человека или животного, являющегося объектом ветеринарной практики. Применение флаванола какао и/или его олигомера для изготовления лекарственного средства, пищевого продукта, нутрицевтика или дополнения к диете для применения для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения прогрессирования расстройства познавательной способности у человека или животного, являющегося объектом ветеринарной практики.
n
В композициях и применениях согласно изобретению можно использовать полимерное соединение формулы A или его фармацевтически приемлемую соль:
где n представляет собой целое число от 2 до 18, таким образом, что имеется по меньшей мере одна концевая мономерная единица А и одна или множество дополнительных мономерных единиц;
R представляет собой 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН;
образование связей между соседними мономерами имеет место в положениях, выбранных из группы, состоящей из 4, 6 и 8;
связь дополнительной мономерной единицы в положении 4 имеет альфа- или бета-стереохимию;
X, Y и Z выбраны из группы, состоящей из мономерной единицы А или водорода, с теми условиями, что, как и в случае по меньшей мере одной концевой мономерной единицы, образование связи с ней дополнительной мономерной единицы происходит в положении 4, и, необязательно, Y = Z = водород.
Эффективное количество может определить специалист, руководствуясь указаниями, представленными в настоящем документе. Например, эффективное количество может быть таким, чтобы можно было достигать физиологически адекватной концентрации в организме млекопитающего. Указанная физиологически адекватная концентрация может составлять по меньшей мере 20 наномоль (нМ), предпочтительно по меньшей мере примерно 100 нМ и более предпочтительно по меньшей мере примерно 500 нМ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения достигается концентрация в крови млекопитающего по меньшей мере приблизительно один микромоль.
Способы могут дополнительно включать в себя определение эффективности лечения, например, путем изучения сердечных сокращений, такого как использование электрокардиограммы (ЭКГ), амбулаторных мониторов, холтеровских мониторов, транстелефонных мониторов (необязательно, с циклом памяти), теста на стресс, эхокардиограммы, катетеризации сердца, электрофизиологического исследования и ортостатической пробы.
Композицию можно вводить здоровому млекопитающему в профилактических целях или млекопитающему, которое нуждается в лечении или имеет по меньшей мере один из факторов риска, связанных с сердечной аритмией. Любой индивид, имеющий по меньшей мере один из факторов риска, связанных с сердечной аритмией, является субъектом для введения композиций, описанных в настоящем документе. Индивиды, имеющие в семейном анамнезе сердечную аритмию, гипертензию, ишемическую болезнь сердца, сердечный приступ, нарушения функции щитовидной железы, а также курящие, принимающие алкоголь, кофеин или незаконные вещества (например, кокаин), или индивиды, восстанавливающиеся после операции на сердце, являются чувствительными индивидами, которые нуждаются в лечении, описанном в настоящем документе. Другие популяции млекопитающих, у которых есть склонность к проявлению сосудистых проблем, будут определяться специалистами.
Животным, являющимся объектами ветеринарной практики, таким как собаки, кошки или лошади, можно вводить описанные выше композиции для лечения, профилактики или уменьшения встречаемости сердечной аритмии.
Эффективное количество для лечения, профилактики, уменьшения риска и/или уменьшения встречаемости сердечной аритмии может определить специалист, руководствуясь указаниями, представленными в настоящем документе и общими знаниями в данной области. Флаванолы какао и/или родственные им олигомеры можно вводить в дозе примерно от 50 мг в день до 1000 мг в день, предпочтительно примерно от 100-150 мг в день до 900 мг в день и наиболее предпочтительно примерно от 300 мг в день до 500 мг в день. Однако учитывая, что флаванолы какао не являются токсичными, можно использовать количества, превышающие указанные выше.
Для того, чтобы получить дополнительно эффект понижения уровня холестерина, используя стеролы/станолы, следует вводить их больше, чем обычно имеется в среднем рационе индивида, не являющегося вегетарианцем. Человек, имеющий обычный для Северной Америки рацион, потребляет примерно 200-400 мг в день. Таким образом, в случае, когда для понижения уровней холестерина используется фитостерол, такой как ситостерол, следует вводить примерно по меньшей мере 1 г в день, предпочтительно по меньшей мере примерно 3 г в день. Предпочтительно используют дозу по меньшей мере примерно от 1 г в день, предпочтительно по меньшей мере примерно от 4,5 г в день до 20 г в день. Однако количество будет варьировать в зависимости от способности фитостерола понижать уровни холестерина, таким образом, что если используется более эффективный ситостанол, эффективное количество будет составлять всего приблизительно от одного до трех г в день. Количества можно определять с использованием аналитической процедуры, описанной у Roger et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 70(30) 1993 и в Carpenter et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 71(8) 1994. Соевый белок можно вводить, например, в дозе по меньшей мере приблизительно 25 г в день. Дополнительные указания можно найти в Recommended Daily Allowances, 9-е изд., National Res. Council/ National Acad. Sci., Washington, D.C. Растворимое волокно можно вводить, например, в дозе по меньшей мере приблизительно 3 г в день.
L-аргинин, если он используется в композициях и лечении, можно вводить в дозе примерно от 2 г в день до 50 г в день, предпочтительно примерно от 3 г в день до 10 г в день и наиболее предпочтительно примерно от 6 г в день до 8 г в день. В данном случае также, учитывая, что L-аргинин встречается в пищевых продуктах в естественных условиях, можно использовать количества, превышающие указанные выше. Полифенолы обычно можно вводить в количествах, известных специалистам. При определении эффективного количества также можно учитывать повышенное всасывание в присутствии стеролов/станолов.
Лечение/профилактическое лечение можно продолжать как схему, т.е. в течение эффективного периода времени, например, ежедневно, ежемесячно, два раза в месяц, два раза в год, ежегодно или, в соответствии с некоторыми другими схемами, в течение другого периода времени, определяемого практикующим врачом как необходимое. Введение может продолжаться по меньшей мере в течение периода времени, которое требуется для индуцирования синтеза коннексина. Предпочтительно композицию вводят ежедневно, наиболее предпочтительно два или три раза в день, например утром и вечером, для поддержания уровней эффективных соединений в организме млекопитающего. Для получения наиболее благоприятных результатов композицию можно вводить в течение по меньшей мере приблизительно от 30 до 60 дней. Указанные схемы можно периодически повторять.
Изобретение далее описано в следующих неограничивающих примерах.
Примеры
Пример 1: Влияние флаванола/процианидина какао на коммуникацию клеток посредством щелевых контактов
Культура клеток
2
Эпителиальные клетки печени крысы WB-F344 (любезно предоставленные д-ром Trosko, East Lansing, MI) выращивали на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), снабженной 10% сывороткой плода коровы (FCS), 2 мМ L-глутамином и пенициллином/стрептомицином, на 35 мм пластиковых чашках. Клетки инкубировали при 37°С в увлаженной атмосфере с содержанием 5% СО. Образовавшие сплошной слой клетки инкубировали в DMEM (без FCS) в течение 24 ч, чтобы понизить исходный уровень межклеточного соединения. (-)-эпикатехин, генистеин (Sigma) или ТРА растворяли в ДМСО и добавляли к среде; контроли получали только ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в среде составляла 0,2%. Димер эпикатехина получали, как описано в статье Adamson et al. (“HPLC Method for the Quantification of Procyanidins in Cocoa and Chocolate Samples and Correlation to Total Antioxidant Capacity” J. Ag. Food Chem., Vol. 7:10, 4184-4188), включенной в настоящий документ в качестве ссылки в той ее части, которая касается рассматриваемого вопроса.
Исследование коммуникации посредством щелевых контактов
На клетки воздействовали (-)-эпикатехином (от 4 до 40 мкМ) и генистеином (40 мкМ) в течение 24 и 72 ч и определяли GJIC. Для экспериментов с ТРА инкубация составляла 90 мин для ТРА (1, 5, 10 нМ), ТРА (1, 5, 10 нМ) плюс эпикатехин (40 мкМ) и ТРА (1, 5, 10 нМ) плюс генистеин (40 мкМ); в качестве контроля использовали DMSO (0,2%). GJIC измеряли с помощью микроинъекции флуоресцентной краски люцифер желтый СН (10% в 0,33 М LiCl) в выбранные клетки посредством микроманипулятора и системы микроинжектора (Eppendorf). Спустя одну минуту после инъекции подсчитывали количество флуоресцентных клеток вокруг единственной клетки, которая была нагружена краской. В каждой чашке инъецировали по десять отдельных клеток, и подсчитывали среднее количество флуоресцирующих соседних клеток. Снимки делали с помощью аксиовертированного флуоресцентного микроскопа Цейсса, соединенного с камерой CCD (ORCA II, Hamamatsu).
Анализ методом вестерн-блоттинга:
2
4
2
4
Для получения клеточного лизата эпителиальные клетки печени крысы WB-F344 промывали PBS (2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KHPO, 137 мМ NaCl, 10 мМ NaHPO; рН 7,4) и обрабатывали два раза лизирующим буфером SDS-PAGE (125 мМ Tris, 4% SDS, 20% глицерин, 100 мМ дитиотреитол, 0,2% бромфеноловый синий; рН 6,8). После ультразвуковой обработки лизаты нагревали в течение 5 мин при 95°С и подвергали электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле (10% (масс./об.) акриламид). Гели подвергали блоттингу с использованием мембран из поливинилидендифторида (PVDF). Иммунологический анализ выполняли с использованием поликлонального кроличьего анти-Сх43 антитела (Zymed) в качестве первичного антитела и козий антикроличий IgG (Dianova) в качестве вторичного антитела.
Иммунохимия
Для иммунохимического анализа клетки WB-F344 выращивали на полной среде с FCS на покровных стеклах в 35 мм пластиковых чашках, пока не достигалось их 90% сливной рост. Клетки инкубировали 90 мин с 1, 5 или 10 нМ ТРА, 40 мкМ (-)-эпикатехина или 49 мкМ генистеина или комбинацией 40 мкМ (-)-эпикатехина и (1, 5, 10 нМ) ТРА или 40 мкМ генистеина и (1, 5, 10 нМ) ТРА; в качестве контроля использовали ДМСО (0,2%). После обработки клетки промывали PBS и фиксировали метанолом в течение 10 мин при -20°С. После промывания PBS неспецифичные сайты связывания блокировали 3% нормальной козьей сывороткой (NGS) в PBS, содержавшем 0,3% (об./об.) Triton-X-100 в течение 45 мин при комнатной температуре. Клетки инкубировали с поликлональным анти-Сх 43 антителом (Zymed); разбавляли 1:1500 в PBS с 1% (об./об.) NGS в течение ночи при 4°С. Клетки промывали PBS и инкубировали с козьим антикроличьим IgG (H+L) вторичным антителом, сопряженным с Alexa 546 (Molecular Probes; разбавлено до 1:800 в PBS) в течение 45 мин при 37°С. После промывания и заливки делали снимки с помощью аксиовертированного флуоресцентного микроскопа Цейсса, соединенного с камерой CCD (ORCA II, Hamamatsu).
Результаты
Генистеин влияет на GJIC (межклеточные коммуникации посредством щелевых контактов) в культуре клеток при уровнях свыше 10 мкМ [Zhang YW, Morita I, Nishida M, Murota SI. Involvement of tyrosine kinase in the hypoxia/reoxygenation-induced gap junctional intercellular communication abnormality in cultured human umbilical vein endothelial cells. J. Cell Physiol. 1999; 180:305-13].
В настоящем исследовании воздействие на эпителиальные клетки печени крысы WB-F344 генистеином или (-)-эпикатехином (40 мкМ) приводило к стимуляции GJIC, которая зависела от времени инкубации. После 24 ч воздействия стимуляция GJIC генистеином и (-)-эпикатехином соответственно в 2,1 и 1,5 раза превышала контрольную. После инкубирования в течение 72 ч возрастание было в 2,9 раза больше контрольного для генистеина и в 2,1 раза - для (-)-эпикатехина. На контроли воздействовали только ДМСО (0,2%); исходная коммуникация составляла 13,4±1,0 клеток при 24 ч и 12,1±1,3 клеток при 72 ч. На фиг.1 показаны типичные примеры измерения коммуникации при анализе переноса краски; контроль (фиг.1А), ингибирование с использованием ТРА (10 нМ) через 90 мин (фиг.1В), стимуляция генистеином (фиг.1С) или (-)-эпикатехином (фиг.1D) при 40 мкМ через 72 часа воздействия.
Оба флавоноида не оказывали значимого влияния на GJIC после 90 мин инкубирования. По мере возрастания уровней (-)-эпикатехина в культуре клеток (от 4 до 40 мкМ), количество сообщающихся клеток увеличивалось (таблица 1). В клетках, обработанных самой низкой концентрацией (4 мкМ), коммуникация все еще в 1,6 раза превышала контроль с растворителем. Димерная форма эпикатехина, испытанная на уровне 20 мкМ, стимулировала GJIC приблизительно в такой же степени, как и мономер на уровне 40 мкМ.
Таблица 1: Влияние (-)-эпикатехина и генистеина на GJIC клеток печени крысы WB-F344
Клетки подвергали воздействию различных концентраций (-)-эпикатехина (4-40 мкМ). Генистеин изучали в концентрации 40 мкМ. Коммуникацию определяли через 72 ч инкубирования. Значение GJIC представлено как количество сообщающихся клеток, определенное анализом переноса краски, и как % от контроля. На контроли воздействовали ДМСО (0,2%); исходная коммуникация составляла 12,1±1,3 клеток и принималась за 100%. Данные представлены как среднее ±СО по 3 независимым экспериментам.
Соединение
Количество сообщающихся клеток
% от контроля
Контроль
(0,2% ДМСО)
12,1±1,3
100±11
(-)-эпикатехин
4 мкМ10 мкМ40 мкМ
18,1±2,2*20,1±6,8*24,2±3,1*
156±18*173±56*209±26*
Димер эпикатехина
20 мкМ
23,4±3,1*
202±26*
Генистеин
40 мкМ
35,4±2,4*
293±20*
*: достоверно отличается от контроля (p<0,001)
ТРА влияет на GJIC посредством модификации белка Сх43. Поскольку Сх43 представляет собой главный белок щелевого контакта между клетками WB344, заявители изучили влияние ТРА на GJIC в присутствии (-)-эпикатехина и генистеина (таблица 2). Когда клетки подвергали воздействию ТРА в отдельности в течение 90 мин, межклеточная коммуникация полностью разрушалась при уровнях 5 и 10 нМ (фиг.1В); GJIC уменьшалась приблизительно на 40%, когда использовали 1 нМ ТРА. При использовании 0,1 нМ ТРА эффекта не наблюдалось. Во всех экспериментах жизнеспособность клеток не подверглась изменениям. Инкубирование клеток с ТРА в течение 72 ч не оказывало действия на GJIC; количество сообщающихся клеток было сравнимо с контролем, т.е. через 90 мин наблюдалось полное восстановление потерь.
Таблица 2: Ингибирующее влияние ТРА на GJIC; противодействие (-)-эпикатехином и генистеином
Клетки подвергали воздействию различных уровней ТРА и комбинаций различных количеств ТРА с 40 мкМ (-)-эпикатехином или 40 мкМ генистеином. GJIC представлена как % от контроля. На контроли воздействовали ДМСО (0,2%); исходная коммуникация составляла 18,6±2,9 клеток и принималась за 100%. Данные представлены как среднее ±СО по 3 независимым экспериментам.
ТРА (нМ)
ТРА (% от контроля)
ТРА плюс(-)-эпикатехин 40 мкМ(% от контроля)
ТРА плюсгенистеин 40 мкМ(% от контроля)
0,1
94±14
95±14
н.и.
1
55±19
95±19*
90±23*
5
0
61±15*
83±18*
10
0
50±16*
72±17*
*: достоверно отличается от обработки ТРА (p<0,001) среднее значение ±СО (n=3)н.и. = не измерено
Полной потере GJIC благодаря ТРА через 90 мин (5 и 10 нМ) частично противодействовало совместное инкубирование ТРА с 40 мкМ (-)-эпикатехином или генистеином. Генистеин был незначительно эффективнее (-)-эпикатехина. Оба соединения восстанавливали GJIC до исходных уровней при использовании с 1 нМ ТРА.
Параллельно изучали распределение белка Сх43 внутри клеток с помощью окрашивания с использованием иммунной метки (фиг.2). Типичный контроль показан на фиг.2А. Клетки образуют сплошной слой, а коннексиновые белки локализованы на плазматической мембране. Небольшой белковый сигнал также выявляется в цитоплазме. После обработки ТРА в течение 90 мин (10 нМ) сигнал связанного с мембраной Сх43 резко уменьшился (фиг.2В); участки аккумулированного белка Сх43 более не выявляются. Когда в культуре клеток присутствовал (-)-эпикатехин (фиг.2С) или генистеин (фиг.2D), эффект ТРА был ослаблен. Белок Сх43 выявлялся в мембране в виде кластерных структур, сравнимых с контролем (фиг.2А). Сходные противодействующие эффекты (-)-эпикатехина и генистеина были установлены при использовании ТРА в концентрации 1 и 5 нМ.
Пример 2: Определение флаванолов/процианидинов
Количество процианидинов определяли следующим образом: сложный стандарт изготавливали с использованием коммерчески доступного (-)-эпикатехина и димеров через декамеры, полученные в чистом состоянии, способами, описанными у Hammerstone, J.F. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (10) 490-496; Lazarus, S.A. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (9); 3693-3701 и Adamson, G.E. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (10) 4184-4188. Стандартные маточные растворы с использованием указанных соединений анализировали способом ВЭЖХ с нормальной фазой, описанным в цитировавшемся ранее источнике Adamson, с выявлением флуоресценции на волнах возбуждения и эмиссии соответственно 276 нм и 316 нм. Пики группировали и их площади суммировали, чтобы учесть вклад всех изомеров любого одного класса олигомеров, и строили калибровочные кривые с использованием квадратного соответствия. Мономеры и олигомеры меньшей величины имели почти линейные графики, что согласуется с предварительным использованием линейной регрессии для построения калибровочных кривых на основе мономера и на основе димера.
Указанные калибровочные кривые затем использовали для расчета уровней процианидинов в образцах, изготовленных следующим образом: сначала образец какао или шоколада (приблизительно 8 граммов) обезжиривали с использованием трех экстракций гексаном (по 45 мл каждая). Затем один грамм обезжиренного материала экстрагировали 5 мл смеси ацетон/вода/уксусная кислота (70:29,5:0,5 об./об.). Затем определяли количество процианидинов в обезжиренном материале путем сравнения данных ВЭЖХ образцов с калибровочными кривыми, полученными, как описано выше (где использовались очищенные олигомеры). Процентную долю жира в образцах (величиной в один грамм для шоколада и в половину грамма для ликеров) определяли с помощью стандартной методики Association of Official Analytical Chemists (официальная методика АОАС 920.177). Затем рассчитывали общее количество процианидинов в оригинальном образце (с жиром). Калибровку осуществляли перед каждым анализом образца, чтобы нивелировать различия между колонками.
Пример 3: Эффект употребления внутрь процианидинов какао, фитостеролов и их комбинации
Результаты данного эксперимента показывают влияние употребления в пищу комбинации неэстерифицированных фитостеролов и фитостанолов, полученных из таллового масла («фитостерол») и порошка какао (CPd), содержащего приблизительно 70 мг/г процианидинов какао, (1) на показатели окислительного стресса и повреждения и (2) на уровни холестерина, а также синергический эффект комбинированного введения фитостеролов и процианидинов какао.
Корм из очищенной яичной скорлупы с добавлением фитостеролов (2 мас.%) и/или CPd (0, 0,5, 1, 2 мас.%) использовали для кормления самцов крыс в течение 2 недель. Крысы были разделены на восемь групп (по три крысы в группе) и получали 20-25 г в день контрольного корма и экспериментальных рационов, согласно следующему описанию:
Рацион +2% фитостерола (440 мг в день)
Рацион - фитостерол
Группа 1
0% CPd (0,0 мг/день)
Группа 5
0% CPd (0,0 мг/день)
Группа 2
0,5% CPd (110 мг/день)
Группа 6
0,5% CPd (110 мг/день)
Группа 3
1% CPd (220 мг/день)
Группа 7
1% CPd (220 мг/день)
Группа 4
2% CPd (440 мг/день)
Группа 8
2% CPd (440 мг/день)
Воду животные получали без ограничений, а потребление определяли путем взвешивания остатков корма и рассыпанного корма, собранного под кормушками. Потребление корма определяли ежедневно, а массу тела животных - через день.
Определяли параметры окислительного повреждения/стресса, уровни холестерина и всасывания эпикатехина в плазму крови.
TBARS плазмы измеряли с использованием модификации способа, описанного Yagi (Biochem. Med. 15:212-6, 1976). Сто мкл цельной крови добавляли к одному мл физиологического раствора и центрифугировали при 1700 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость собирали и замораживали при -70°С до проведения анализа. Липиды выделяли путем осаждения с использованием системы фосфовольфрамовая кислота/серная кислота. Липидная фракция затем взаимодействовала с тиобарбитуровой кислотой, а полученные аддукты определяли флуорометрически, с использованием 1,1',3,3'-тетраэтоксипропана в качестве стандарта. Результаты выражали в наномолях MDA на миллилитр плазмы и как функцию от концентрации полиненасыщенных жирных кислот в плазме.
6
8
8
8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8OH2'dG) определяли следующим образом. Ядерную ДНК выделяли с помощью набора Wako DNA Extractor WB (Wako Chemical USA, Inc., Richmond, VA). Ткань (100-250 мг) или клетки (10 клеток) гомогенизировали в лизисном буфере из набора и центрифугировали при 10 000 g в течение 20 секунд при 4°С. Осадок после центрифугирования обрабатывали лизисным буфером, и полученный осадок растворяли в ферментном реакционном растворе из набора. Добавляли РНКазу до конечной концентрации 20 мкг/мл, и образец инкубировали при 50°С в течение 10 минут. Добавляли раствор протеиназы из набора, и инкубирование при 50°С продолжали еще в течение часа. Образец центрифугировали при 10000 g в течение пяти минут при комнатной температуре, и надосадочную жидкость обрабатывали раствором NaI и изопропанолом из набора для выделения ДНК. Осадок собирали при 10000 g в течение 10 минут при комнатной температуре и промывали растворами А и В из набора. Конечный осадок сушили на воздухе в течение короткого периода времени и ресуспендировали в 200 мкл смеси 0,1 мМ десферил/20 мМ ацетат Na, рН 4,8. Ферментативное расщепление и анализ ДНК выполняли согласно методике Shigenaga et al. (Methods Enzymol. 234:16-33, 1994) с некоторыми модификациями. Кратко, ДНК расщепляли до нуклеотид-5'-монофосфатов путем инкубирования с нуклеазой Р1 в конечной концентрации 0,1 мг/мл в течение 15 минут при 65°С. рН корригировали с помощью 1 М Tris-HCl, рН 8,5, и использовали щелочную фосфатазу из кишечника теленка для дальнейшего ферментативного расщепления образца до нуклеотидов (один час, 37°С). рН образца корригировали с помощью 3 М буфера ацетата натрия, рН 5,1, и для предотвращения опосредованного металлом окисления добавляли 0,1 мМ ЭДТА/0,1 мМ десферил. Образец пропускали через фильтр с отсекающей величиной молекулярной массы 30 000 и помещали в инъекционный флакон для ВЭЖХ. Образцы анализировали не позднее 48 часов после изготовления, чтобы избежать артефактов. Для анализа образцы инъецировали в колонку ВЭЖХ Hewlett Packard 1100, оборудованную электрохимическим детектором (ESA, Coulochem II). Разделение производили на колонке Supelcosil LC-18-DB (150×4,6 мм, размер частиц 3 микрона) с использованием мобильной фазы 100 мМ буфера ацетата Na, рН 5.2, с 5% метанолом, изократно, при скорости потока 1,0 мг/мин. OHdG выявляли при 450 мВ с использованием электрохимического обнаружения, и 2'-дезоксигуанозин (dG) выявляли на 248 нм с использованием УФ-обнаружения. Уровни OHdG выражали относительно количества dG в образцах.
Всасывание эпикатехина измеряли, как описано у Rein et al., J. of Nutr., 2000, 130 (8S), 2109S-2114S.
Результаты
Результаты свидетельствуют о неожиданных преимуществах комбинированного введения фитостеролов и полифенолов.
Согласно фиг.3 количество всосавшегося эпикатехина возрастало дозозависимым образом. Неожиданно было установлено, что введение фитостеролов усиливает всасывание эпикатехина, таким образом, что, например, при использовании рациона CPd с 2 мас.% уровни эпикатехина в плазме увеличивались приблизительно на 30% по сравнению со сравнимым рационом без фитостеролов. Следовательно, фитостерол увеличивал биодоступность эпикатехина.
Согласно фиг.4 CPd ингибировал окислительное повреждение ДНК дозозависимым образом. Неожиданно было установлено, что при более высоких дозах CPd (2 мас.%) наблюдалось неожиданное уменьшение окислительного повреждения ДНК, что указывает на синергическое действие фитостеролов и CPd по предотвращению окислительного повреждения ДНК.
Согласно фиг.5 кормление рационом, содержащим фитостеролы, неожиданно вызвало более выраженный окислительный стресс, чем при кормлении контрольным рационом, т.е. прием фитостерола с пищей (без процианидинов какао), который рекомендовался ранее, до даты регистрации настоящей заявки, обострял окислительный стресс. Скармливание процианидинов какао вызывало реверсию или смягчало указанное негативное действие фитостеролов.
Также измеряли общее содержание холестерина в плазме - результаты представлены в таблице 3.
<b>Таблица 3</b>Общий холестерин плазмы
Количество образцов
Средняя величина
2% стерол
3
84000
2% стерол + 0,5% какао
2
84500
2% стерол + 1% какао
3
82000
2% стерол + 2% какао
3
80000
Без стеролов + без какао
3
88333
0,5% какао
3
82667
1% какао
3
87000
2% какао
3
81667
Согласно таблице 3, как ожидалось, фитостеролы уменьшали уровни холестерина. Неожиданно, однако, было установлено, что когда фитостеролы вводили вместе с CPd, уровни холестерина уменьшались еще в большей степени, дозозависимым образом. Например, средний уровень общего холестерина у трех крыс, получавших рацион, содержавший фитостерол, составлял 84 мг/дл. Дополнение данного рациона 2 мас.% CPd приводило к дополнительному снижению общего холестерина до 80 мг/дл, что указывает на синергический эффект двух соединений. Крысы, получавшие контрольный рацион, имели средний уровень холестерина 88,3 мг/дл.
Пример 4: Пищевые композиции, содержащие агенты, понижающие уровень холестерина, в комбинации с какао или шоколадом, содержащим процианидины какао
Изготавливали черный шоколад, жевательный ирис и плитки granola, содержавшие агенты, понижающие уровень холестерина.
Жевательный ирис изготавливали из ингредиентов, показанных в таблице 4, путем предварительного смешивания сахара и какао и смешивания полученной смеси с карамелью. Свободные фитостеролы (в натуральном виде или измельченные) добавляли к смеси сахара и какао.
<b>Таблица 4</b>Жевательный ирис, содержащий фитостерол
Пределы % в составе
% в составе
Фитостеролы
Процианидины какао
Карамель
55-65
63
Какао
20-30
22
Сахар
5-10
7,4
Фитостеролы
5-12
7,5
Всего в 100 г
7,5
550
Всего в 45 г порции
3,375
248
Черный шоколад, содержащий свободный стерол, изготавливали с использованием коммерчески доступного черного шоколада (Dove черного от компании Mars Inc.). Для облегчения смешивания с расплавленным шоколадом и для того, чтобы избежать неблагоприятного воздействия на текстуру шоколада, гранулированные формы растительного стерола/станола размалывали с помощью Universal Muche M20, производства IKA, в течение 30-60 секунд, перемешивали и размалывали еще в течение 30 секунд до получения частиц, сравнимых по размеру с частицами шоколада. Черный шоколад расплавляли и добавляли стерол при медленном перемешивании для равномерного распределения частиц стерола. Полученная композиция представлена в таблице 5.
<b>Таблица 5</b>Черный шоколад, содержащий фитостерол
Пределы % в составе
% в составе
Фитостеролы
Процианидины какао
Черный шоколад
88-95
92,5
Фитостеролы
5-12
7,5
Всего в 100 г
7,5
361
Всего в 45 г порции
3,375
162
Плитки granola, содержащие овсяное волокно, понижающее уровень холестерина, изготавливали из ингредиентов, перечисленных в таблицах 6 и 7. Связывающий сироп изготавливали, расплавляя пальмоядровое масло до температуры 45°С, и держали при данной температуре до использования. Кукурузный сироп, глицерин, порошок какао, желтый сахар, соль, лецитин и пропилгаллат объединяли и добавляли пальмоядровое масло. Смесь держали в тепле. Для изготовления granola воздушный овес или сою (от компании Sovex Food, Collegedale, TN) смешивали с кусочками шоколада и в смесь выливали теплый связующий сироп, изготовленный, как описано выше. Из смеси granola затем изготавливали пластины, присыпали смесью 10X сахара (62%), порошка какао (33%) и корицы (5%) и нарезали на кусочки. Порошок какао, использованный в смеси, изготавливали согласно способу, описанному в патенте США № 6015913, выданном Kealey et al.
<b>Таблица 6</b>Плитка granola с шоколадом и овсом
Пределы % в составе
% в составе
Овес
Процианидины какао
Кукурузный сироп 63 DE
20-30
24,0
Пальмоядровое масло
0,4
3,2
Глицерин
2-3
2,4
Порошок какао
1-5
1,7
Желтый гранулированный сахар
1-2
1,3
Соль
0,2-0,5
0,3
Лецитин
0,1-0,5
0,1
Пропилгаллат
0,01-0,05
0,01
Овес
20-35
30
Сахар
0-20
11
Растительное масло
0-10
6
Кусочки полусладкого шоколада
10-30
20
Всего в 100 г
30
150
Всего в 45 г порции
13,5
68
<b>Таблица 7</b>Плитка granola с шоколадом и соевым белком
Пределы % в составе
% в составе
Овес
Процианидины какао
Кукурузный сироп 63 DE
20-30
24,0
Пальмоядровое масло
0-4
3,2
Глицерин
2-3
2,4
Порошок какао
1-5
1,7
Желтый гранулированный сахар
1-2
1,3
Соль
0,2-0,5
0,3
Лецитин
0,1-0,5
0,1
Пропилгаллат
0,01-0,05
0,01
Кусочки сои
50-60
52
Кусочки полусладкого шоколада
10-30
15
Всего в 100 г
20
125
Всего в 45 г порции
9
56