ПЕПТИД-АНТАГОНИСТ АКТИВНОСТИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-15
INTERLEUKIN-15 ANTAGONIST PEPTIDE

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной фармакологии и, в частности, к пептиду, представляющему собой производное интерлейкина-15 (IL-15), которое препятствует связыванию цитокина с субъединицей alfa рецептора (IL-15Rα) и вследствие этого является полезным для лечения заболеваний, связанных с аномальной экспрессией IL-15 и/или IL-15Rα в течение заболевания.
Предшествующий уровень техники
Цитокин, известный как IL-15, представляет собой гликопротеин с массой 14-15 кДа, который был идентифицирован одновременно для двух групп в качестве фактора, активирующего T-клетки (Grabstein, K.H. et al., Science, 1994, 264, 965-968; Burton, J.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4935-4939). Информационная рибонуклеиновая кислота (иРНК) IL-15 присутствует в широкой гамме клеток и тканей, однако белок редко встречается в супернатанте культур клеток, экспрессирующих транскрипт, так как существует сильный посттранкрипционный контроль его экспрессии на уровне трансдукции и внутриклеточного трафика (Bamford R.N. et al., J. Immunol. 1998, 160: 4418-4426; Kurys G. et al., J. Biol. Chem. 2000, 275: 30653-30659). Кроме того, описано, что IL-15 может существовать в активной в форме в качестве белка мембраны (Musso et al., Blood, 1999, 93: 3531-3539), и совсем недавно отмечено, что он может функционировать в качестве лиганда или в качестве рецептора. IL-15, экспрессируемый в качестве белка, присущего мембранам, действует в качестве рецептора и при связывании с растворимой субъединицей alfa рецептора индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8, активацию киназ, называемых MAPK и FAK, и стимулирует миграцию в клетках карциномы простаты (PC-3), экспрессирующих IL-15 в клеточной мембране (Budalgian et al., J. Biol. Chem. 2004, 40: 42192-42201).
транс
-11
Биологические эффекты IL-15 в качестве лиганда опосредованы через связывание IL-15 с рецептором в клеточной мембране, состоящим из трех субъединиц, называемых α, β и γ. Три субъединицы могут коэкспрессироваться в одной и той же клетке, или может происходить так, что IL-15, связанный с субъединицей alfa, присутствует в клетках, которые экспрессируют только субъединицы β и γ, и индуцирует в данной клетке сигнализацию, известную как феномен -сигнализации (Burkett et al., J. Exp. Med. 2004, 200: 825-834). Субъединица β рецептора взаимодействует также с IL-2, представляющим собой цитокин, относительно которого IL-15 проявляет большую структурную гомологичность, а субъединица γ взаимодействует также с другими цитокинами, такими как IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-21. IL-15Rα специфична к IL-15, с которым связывается с очень высоким сродством (Kd=10), и может находиться в виде рецептора мембраны или в растворимой форме (Budagian V. et al., J. Biol. Chem. 2004, 24: 40368-75; Mortier et al., J. of Immunology, 2004, 173: 1681-1688).
Замечены высокие уровни экспрессии IL-15, связанные с патогенезом аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как болезнь Крона (Kirman I., Am. J. Gastroenterol. 1996, 91: 1789-1794), псориаз (Rückert R., J. Immunol. 2000, 165: 2240-2250), лейкемии (Yamada Y., Leukemia and Limphoma, 1999, 35: 37-45) и ревматоидный артрит (AR) (McInnes I.B., Immunology Today, 1998, 19: 75-79).
collagen induced artritis
McInnes и соавт. в случае AR нашли аномальность экспрессии IL-15, высокие концентрации в синовиальной жидкости и экспрессию цитокина в клетках синовиальной мембраны. Они предположили, что IL-15 предшествует фактору опухолевого некроза α (TNFα) в каскаде цитокинов, предложив механизм, зависящий от клеточного контакта, по которому T-клетки, активированные IL-15, индуцируют синтез TNFα макрофагами. Кроме того, предложено, что IL-15 действует как важный фактор в миграции T-клеток к синовиальной жидкости (McInnes et al., Nat. Med. 1997, 3: 189-195). Ziolkowska и соавт. сообщили, что IL-15 индуцирует экспрессию IL-17 в суставе больных AR, при этом известно, что данный цитокин стимулирует высвобождение синовиоцитами медиаторов воспаления, таких как IL-6, IL-8, фактор стимуляции колоний гранулоцитов-макрофагов, и простагландина E2, предполагая важную роль IL-15 в патогенезе AR (Ziolkowska et al., J. Immunology 2000, 164: 2832-2838). Недавно было доказано, что IL-15 обостряет артрит, индуцированный коллагеном (по-английски , сокращенно CIA) у мыши, трансгенно инфицированной данным цитокином (Yoshihara et al., Eur. J. Immunol. 2007, 37: 2744-2752). Все упомянутые факты приводят к мысли, что действие антагониста IL-15 имеет терапевтический потенциал при лечении AR и других аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
Ранее описано, что остаток аспарагиновой кислоты в положении 56 молекулы IL-15 играет важную роль в связывании с субъединицей β рецептора, а остаток глутамина в положении 156 играет важную роль в связывании с субъединицей γ рецептора. Мутеины (измененные белки) этих аминокислот ведут себя как соединения-антагонисты IL-15, которые связываются с субъединицей α рецептора и препятствуют трансдукции сигнала через субъединицы β и γ. Антитела, которые распознают данные аминокислоты, также действуют как антагонисты IL-15 (патенты US 6177079, US 6168783, US 6013480, US 6001973, US 9706931, международная заявка WO 9741232).
Использование антагонистов цитокина было эффективным в моделях на животных в случае псориаза (Villadsen L.S. et al., J. Clin. Invest. 2003, 112: 1571-1580) и в случае AR (Ferrari-Lacraz S. et al., J. Immunol. 2004, 173: 5818-5826).
Ruchatz и соавт. воспроизвели растворимый фрагмент IL-15Rα мыши и показали, что введение данного фрагмента ингибирует артрит, индуцированный коллагеном у мышей DBA/1 (Ruchatz H., J. Immunology, 1998, 160: 5654-5660). Позже, было обнаружено, что IL-15Rα может действовать как мощный агонист биологической функции IL-15 (Mortier E., J. Biol. Chem. 2006, 281: 1612-1619; Rubinstein M.P., PNAS, 2006, 103: 9166-9171).
peripheral blood mononuclear cells
Genmab подал заявку на антитела человека, специфичные к IL-15 (WO 03017935), в которой описаны четыре антитела. Два из них, обозначаемые 146B7 и 146H5 и связывающиеся с IL-15 в области, взаимодействующей с субъединицей γ рецептора, ингибируют клеточную пролиферацию, индуцированную IL-15, клеточной линии CTLL-2 и в одноядерных клетках периферической крови (по-английски , сокращенно PBMC), а антитела, обозначаемые 404A8 и 404E4, пролиферацию не ингибируют. Из этих антител антитело 146B7 под наименованием AMG714 находится в стадии II клинических испытаний по лечению AR, проводимых компанией Amgen.
Bernard и соавт. в 2004 году идентифицировали две последовательности связи IL-15 с субъединицей α рецептора. Эти последовательности находятся между аминокислотами (aa) от 44 до 52 и от 64 до 68 зрелого белка и описывают мутеины, которые могут действовать как агонисты или антагонисты IL-15 (Bernard J. et al., J. Biol. Chem. 2004, 279: 24313-24322).
Santos и соавт. описали пептид-антагонист IL-15 (WO 2006/029578). Применение пептида малого размера (10 aa) в качестве антагониста IL-15 обладает преимуществом, заключающимся в селективном блокировании связывания IL-15 с субъединицей α рецептора и в посредничестве или препятствовании действию IL-15, обусловленному взаимодействием с упомянутой субъединицей рецептора.
Однако идентификация пептидных последовательностей антагонистов IL-15, обладающих растворимостью и биологической активностью, большей, чем упомянутый белок, представляет собой единственный значимый факт.
Описание изобретения
50
Это изобретение предназначено для решения ранее упомянутой проблемы получения пептида, более растворимого и более активного, чем пептид, описанный в WO 2006/029578, за счет уменьшения ингибирующей концентрации 50 или концентрации, вызывающей 50%-е ингибирование (IC) со 130 до 8 мкМ продукта замещения вторичного Lys аминокислотой Thr и получения димерной формы. Упомянутая последовательность (SEQ ID No. 12), синтезированная в виде линейного пептида, содержащего 10 аминокислот, взаимодействует с субъединицей α рецептора и проявляет антагонистическую способность по отношению к IL-15.
Оптимизация состояла в осуществлении точечного замещения аминокислот упомянутого пептида с целью идентификации аминокислот, являющихся существенными для его антагонистической активности по отношению к IL-15. При замещении, предусматривавшем изменение заряда, в частном случае вторичного лизина упомянутого пептида треонином с нейтральным зарядом или глутаминовой кислотой, несущей отрицательный заряд, получено увеличение антагонистической активности пептид более чем в 10 раз. Кроме того, было найдено, что димерная форма данного пептида, образованная двумя молекулами пептида при посредстве свободного цистеина, является в 7 раз более активной, чем мономерная форма.
В результате было обнаружено, что, в отношении специфичности, ранее упомянутое замещение позволяет получить пептид, являющийся в 10 раз более активным в испытании на зависящую от IL-15 пролиферацию клеточной линии CTLL-2. Этот пептид сохраняет способность связывания с субъединицей α рецептора относительно IL-15.
Образующийся пептид, составляющий сущность настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID No. 12 в перечне последовательностей. Это увеличение активности пептида как результат упомянутого замещения Lys аминокислотой Thr оказалось неожиданным. На основании доступной информации специалисты в данной области техники не могли ожидать, что указанное изменение первичной структуры пептида породит настолько заметное увеличение биологической активности пептида, такое как показанное в примерах осуществления настоящего изобретения.
Полученный при посредстве свободного Cys химическим синтезом димер пептида, соответствующий последовательности SEQ ID No. 12 в перечне последовательностей, является в 7 раз более активным, чем мономерная форма, и в 15 раз более активным, чем первоначальный пептид, описанный в WO 2006/029578.
Пептид с аминокислотной последовательностью, зарегистрированной как SEQ ID No. 12, присоединяемый к растворимой цепи alfa соответственно описанному в настоящем изобретении, может ингибировать эффект обратной сигнализации посредством IL-15 мембраны, описанный Budalgian и соавт. в 2004 году (Budalgian et al., J. Biol. Chem. 2004, 40: 42192-42201).
В настоящем изобретении предусмотрено применение упомянутого пептида при лечении AR индивидуально или в комбинации с любым другим приемлемым соединением, таким как, например, стероидные противовоспалительные лекарственные средства (такие как кортикостероиды) и лекарственные средства, изменяющие течение заболевания (например, метотрексат).
Объектом настоящего изобретения является также наружное применение этого пептида при лечении заболеваний, проявляющихся на коже, и в очагах поражения которых обнаруживается экспрессия IL-15 в течение заболевания, таких как псориаз и кожная лимфома Т-клеток.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид применяют для ингибирования связывания растворимой субъединицы α рецептора с IL-15, экспрессируемым в мембране опухолевой клетки, и ингибирования ее миграции.
in vitro
Пептид, являющийся объектом настоящего изобретения, может иметь линейную структуру или может быть димеризован и отличается в основном своей антагонистической способностью по отношению к IL-15. С другой стороны, доказан эффект , вызываемый пептидом по настоящему изобретению в испытании на пролиферацию клеток линии CTLL-2 мыши и линии KiT225 человека лимфоцитарной лейкемии.
High Performance Liquid Chromatography
Для идентификации пептида, описанного в настоящем изобретении, осуществляли аланиновое картирование пептида, описанного в WO 2006/029578. Каждый измененный пептид синтезировали химическим путем способом синтеза в твердой фазе. Затем очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (по-английски , сокращенно HPLC (ВЭЖХ)) и анализировали масс-спектрометрически, получая во всех случаях чистоту более 95%. Каждый пептид оценивали относительно его эффективности ингибировать биологическую активность IL-15.
Пептид, являющийся объектом настоящего изобретения, ингибирует экспрессию IL-8, индуцируемую IL-15Rα. Тот же самый пептид ингибирует экспрессию IL-6 и высвобождение TNF-alfa (TNFα), индуцируемые IL-15Rα.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид получали генетической манипуляцией или химическим синтезом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид получали в виде димера, образованного двумя молекулами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12. В особом варианте осуществления димер получали, исходя из двух молекул пептида, димеризуемого при посредстве свободного цистеина.
Объектом настоящего изобретения является также дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая пептид с последовательностью SEQ ID No. 12, причем ее продукт экспрессии способен связываться с субъединицей alfa клеточного рецептора интерлейкина-15 или с ее растворимой фракцией и ингибирует биологическую активность интерлейкина-15. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор, содержащий упомянутую последовательность ДНК, может быть использован как альтернатива для экспрессии пептидной последовательности.
Полученные результаты предполагают применение заявленного пептида по настоящему изобретению в качестве терапевтического средства при лечении заболеваний, связанных со сверхэкспрессией IL-15 соответственно упомянутому ранее и в случае которых оправдано использование антагонистов IL-15. Таким образом, объектом настоящего изобретения является также терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, отличающаяся тем, что она включает в себя пептид, содержащий аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтическая фармацевтическая композиция содержит димеризованный пептид. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит мономерный или димерный конъюгированный пептид, или пептид, смешанный с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. В другом варианте осуществления терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, содержит цепь нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид (SEQ ID No. 12).
Объектом настоящего изобретения является также применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона, псориаза и для лечения рака предстательной железы.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Действие пептида в различных концентрациях на пролиферацию клеток линии CTLL-2, индуцированную IL-15. Клетки CTLL-2 инкубированы с 300 пг/мл IL-15 в комбинации с серийными разведениями пептидов. Пролиферация определена при использовании митохондриального окрашивания посредством 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-бромуродифенилтетразолия (MTT). Фиг.1A: Оценка пептидов SEQ ID No. 4 и SEQ ID No. 5. Фиг.1B: Оценка пептидов SEQ ID No. 2 и SEQ ID No. 3. Фиг.1C: Оценка пептидов SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 и SEQ ID No. 9.
Фиг.2. График, отображающий связывание IL-15Rα человека с пептидами. Способом ELISA оценена способность пептидов замещать IL-15 в связи с IL-15Rα.
Фиг.3. Действие пептида в различных концентрациях на пролиферацию клеток линии KiT225, индуцированную IL-15. Клетки KiT225 инкубированы с 300 пг/мл IL-15 в комбинации с серийными разведениями пептидов. Пролиферация определена при использовании митохондриального окрашивания посредством MTT.
Фиг.4. Действие пептида на пролиферацию клеток линии CTLL-2, индуцированную IL-15 с различными концентрациями при фиксированной концентрации пептида. Использованные концентрации IL-15: 75 пг/мл (1), 150 пг/мл (2), 300 пг/мл (3).
Фиг.5. График, отображающий ингибирующее действие пептида на индукцию иРНК посредством IL-8 (фиг.5A) и IL-6 (фиг.5B) в клетках клеточной линии PC-3 при инкубации с IL-15Rα.
Фиг.6. Ингибирование высвобождения TNF-alfa, индуцированного посредством IL-15, при инкубации клеток синовиальной жидкости с пептидом. Клетки синовиальной жидкости больных AR инкубированы с IL-15 (100 нг/мл) в комбинации с пептидом с концентрацией 65 мкМ в течение 48 ч. Количество TNF-alfa определено способом ELISA. Показаны данные анализов излияния синовиальной жидкости вследствие травмы.
Подробное описание вариантов осуществления/Примеры осуществления
Настоящее изобретение пояснено приведенными далее примерами осуществления.
Пример 1. Оптимизация пептида IL-15, связывающегося с IL-15Rα и ингибирующего биологическую функцию IL-15
Планирование эксперимента
Исходя из пептида, заявленного в WO 2006/029578, составляют серию пептидов, в которых каждая аминокислота замещена аланином (Ala). В другой группе пептидов осуществляют замены цистеина (Cys) на Ser и Lys на Thr или Glu.
Синтез пептидов
Пептиды синтезировали по стратегии Fmoc/tBu в шприцах. Использовали смолу Fmoc-AM-MBHA с концентрацией 0,54 ммоль/г, осуществляя синтез при механическом перемешивании. После обработки трифторуксусной кислотой пептиды лиофилизовали и анализировали способами ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Все пептиды были получены с чистотой более 95% при соответствии полученной массы массе, ожидаемой для соответствующей аминокислотной последовательности.
Пример 2. Действие описанных пептидов на пролиферацию клеточных линий CTLL-2 и KiT225
Клетки линий CTLL-2 и KiT225 зависят от IL-15 и пролиферируют в присутствии цитокина. Соединения, которые связываются с IL-15 и препятствуют трансдукции сигнала через рецептор, ингибируют пролиферацию клеток данных линий.
3
Для оценки нейтрализующей способности пептидов по настоящему изобретению готовили серийные разведения пептидов в 96-луночных культуральных планшетах (Costar, США) в объеме 25 мкл среды RPMI (Gibco), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco). Прибавляли клетки CTLL-2 или KiT225 (предварительно промытые) в количестве 5·10 клеток на лунку и инкубировали в течение 30 мин, затем в каждую из лунок вносили достаточное количество IL-15 до концентрации 300 пг/мл.
2
50
Также оценивали антагонистическую способность пептидов, изменяя концентрацию IL-15 при фиксированной концентрации пептида 260 мкМ. Инкубацию осуществляли в течение 72 ч при 37°C в атмосфере с 5% CO. Для определения пролиферации использовали митохондриальное окрашивание посредством MTT (Cosman et al., Nature, 1984, 312: 768-771). MTT восстанавливали митохондриальной дегидрогеназой живой клетки до пурпурного формазана. Определяли IC каждого пептида при концентрации IL-15 300 пг/мл.
<b>Таблица 1</b><b>Перечень испытуемых пептидов и значения IC</b><sub>50</sub><b>, полученные в испытании на пролиферацию клеток линии CTLL-2</b>
<b>Пептид</b>
<b>IC</b><sub>50</sub><b> (мкМ)</b>
KVTAMKCFLL
130
KVTAMKCFLA
260
KVTAMKCFAL
200
KVTAMKCALL
0
KVTAMKAFLL
0
KVTAMACFLL
н/о
KVTAAKCFLL
130
KVAAMKCFLL
130
KATAMKCFLL
130
AVTAMKCFLL
н/о
KVTAMKSFLL
0
KVTAMTCFLL
24,6
KVTAMECFLL
0
KVTAMTCYLL
57,7
н/о: не определено
50
50
Данное испытание осуществляли для оценки всех пептидов, что позволило получить значения IC, приведенные в таблице 1. Значения IC показывают снижение ингибирующего действия пептида в случае пептидов с заменами Cys-Ala, Cys-Ser, Phe-Ala и Gly-Glu и улучшение данного эффекта почти на 50% в случае пептидов с заменой Leu-Ala. Была достигнута ингибирующая активность в 5 раз больше в случае пептида с заменой Lys-Thr и в 15 раз больше в случае димерной формы пептида с заменой Lys-Thr.
На фиг.1A, 1B и 1C представлено изменение оптической плотности (DO) при 576 нм, полученной для различных концентраций пептида с заменами Phe-Ala, Cys-Ala, Leu1-Ala, Leu2-Ala, Met-Ala, Thr-Ala, Val-Ala. На фиг.3 показано изменение оптической плотности в случае пептида с заменой Lys-Thr в мономерной и димерной форме, при этом видно, что ингибирующее действие зависит от концентрации пептида, а наибольшее ингибирующее действие относится к димерной форме пептида с заменой Lys-Thr.
Также оценивали антагонистическую способность пептидов, изменяя концентрацию IL-15 при фиксированной концентрации пептида. На фиг.4 видно, что антагонистическое действие пептида с заменой Lys-Thr зависит от концентрации IL-15.
Пример 3. Способ конкурентного анализа ELISA для изучения способности пептидов выступать в качестве заместителя в связи с IL-15Rα
Phosphate Buffered Saline
Пептиды были охарактеризованы в отношении связывания с IL-15Rα способом ELISA. Согласно краткому описанию методики 96-луночные планшеты покрывали раствором очищенного IL-15 в PBS и блокировали 1%-м раствором бычьего альбумина в буферном фосфатно-солевом растворе (по-английски , сокращенно PBS). Разведения каждого пептида вносили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Планшет промывали смесью PBS-Tween 20 и инкубировали с IL-15Rα-Fc в течение 1 часа при 37°C. Затем промывку повторяли и инкубировали с конъюгатом "anti-Fc-IgG человека-пероксидаза" в течение 1 часа при 37°C. Далее снова промывали и определяли степень прохождения реакции "антиген-антитело" в присутствии субстрата и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB), осуществляя измерение DO при 450 нм. Результаты показаны на фиг.2, при этом видно, что пептид с заменой Cys-Ala (SEQ ID No. 5) не замещает IL-15 в связи с IL-15Rα, а пептид с заменой Phe-Ala (SEQ ID No. 4) замещает только в 10% случаев связи.
Пример 4. Оценка действия пептида (SEQ ID No. 12) на экспрессию IL-8 и IL-6 в клетках рака предстательной железы линии PC-3
6
Оценивали действие пептида (SEQ ID No. 12) на экспрессию IL-8 и IL-6, которая опосредуется в отношении связывания IL-15Rα с IL-15, присутствующим в мембране клеток PC-3 (Budagian V. et al., J. Biol. Chem. 2004, 279: 42192-42201). Эксперимент осуществляли в 24-луночных планшетах, инкубируя 1,5·10 клеток с пептидами SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 12 с концентрацией 100 мкг/мл и IL-15Rα (1 нг/мл) и с комбинациями IL-15Rα с пептидами SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 12.
РНК выделяли способом TriReagent (Sigma) и анализировали посредством измерения DO при 260/280 нм и электрофореза в геле агарозы. Осуществляли обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, используя набор Quantitect Reverse Transcription Kit и QuantiTect SYBR Green PCR (QUIAGEN) на установке Rotor Gene 6000.
На фиг.5A и 5B видно, что пептид SEQ ID No. 12 ингибирует транскрипцию провоспалительных цитокинов IL-8 и IL-6, индуцированную IL-15Rα.
Пример 5. Ингибирование продуцирования TNF-alfa, индуцированного IL-15, димеризованным пептидом SEQ ID No. 12 в клетках синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом (AR)
После получения информированного согласия отбирали синовиальную жидкость больных AR и инкубировали с гиалуронидазой в количестве 10 мкг на мл жидкости в течение 45 мин при 37°C. После центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 мин получали клетки синовиальной жидкости.
5
В 96-луночном планшете инкубировали 2·10 клеток на лунку с 50 мкг/мл пептида, 60 нг/мл IL-15 и комбинацией пептида в количестве, превышающем количество IL-15. После инкубации в течение 48 часов отбирали супернатант и хранили при -70°C для последующей его оценки. Количество TNFα определяли способом ELISA (R&D DTA50).
На фиг.6 показано, что пептид SEQ ID No. 12 ингибирует секрецию TNFα в клетках синовиальной жидкости больного AR.
Пример 6. Модель на мышах SCID ксенотрансплантата псориаза человека
Мышам SCID (в возрасте 2-3 месяцев) трансплантировали участок кожи размером 1,5×1,5 см, полученный от больного псориазом. Через три недели после трансплантации мышей разделили на три группы, получавшие плацебо, получавшие пептид SEQ ID No. 12 с дозой 10 мг/кг массы и получавшие циклоспорин A с дозой 10 мг/кг через день в течение 2 недель. Через неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и производили биопсию диаметром 4 мм из каждого ксенотрансплантата. Биопсийный материал фиксировали в формалине, покрывали парафином и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E).
Как результат эксперимента отмечено, что на коже, полученной от больных псориазом, после лечения пептидом SEQ ID No. 12 или его димерной формой наблюдается уменьшение тяжести заболевания, значительное уменьшение плотности эпидермиса, числа воспаленных клеток и колец кератиноцитов, а также степени паракератоза в очагах псориатических поражений.