МУТАНТНЫЙ ШТАММ BURKHOLDERIA CEPACIA KM196, ДЕФЕКТНЫЙ ПО ПРОДУКЦИИ ПОРИНА OpcP1, ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ У ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ
MUTANT BURKHOLDERIA CEPSCIA KM196 STRAIN DEFECT IN OpcPL PORINE PRODUCTION FOR STUDYING OF MOLECULAR MECHANISMS OF MULTIPLE RESISTANCE TO ANTIBIOTICS IN PATHOGENIC BURCHOLDERIA

Изобретение относится к микробиологии и генетике и касается получения штамма, обладающего повышенной чувствительностью к антибиотикам различных классов, несущего индуцированную N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (НГ) мутацию в последовательности гена opcP1, ответственного за экспрессию перового белка с молекулярной массой 36 kDa. Штамм предназначен для изучения молекулярно-генетических основ множественной лекарственной резистентности у B.cepacia и филогенетически родственных видов буркхольдерий. Мутант депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») под номером КМ196. Особенностями штамма является опосредованный действием химического мутагена (НГ) дефект в продукции порина OpcPl, сочетающийся с фенотипом множественной чувствительности к антибиотикам (пефлоксацину, офлоксацину, цефтазидиму, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу).
B.cepacia, как и другие патогенные представители рода Burkholderia, характеризуется высокой природной резистентностью к антибиотикам, в формировании которой участвуют различные молекулярные механизмы [6, 10, 11, 15]. Принципиальное значение для развития множественной резистентности у B.cepacia имеют изменения в проницаемости клеточной оболочки, связанные с функцией ЛПС [9] и белков наружных мембран [5]. Отмечена роль порообразующих белков наружной мембраны в резистентности B.cepacia к бета-лактамам [5], аминогликозидам и полимиксину [14], салицилатам [6]. Клонированы и секвенированы последовательности гена, ответственного за липопротеин наружной мембраны мутанта B.cepacia с множественной резистентностью к хлорамфениколу, триметориму и цефтазидиму [7]. Показано функционирование этого порина в составе выявленной у B.cepacia системы лекарственного эффлюкса.
r
r
Необходимыми элементами модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих устойчивость к тем или иным антимикробным соединениям, являются маркированные штаммы с измененной чувствительностью к антибиотикам [1, 2, 8, 12]. Для изучения молекулярных механизмов устойчивости к антибиотикам фторхинолонового (пефлоксацин, офлоксацин) и цефалоспоринового (цефтазидим) ряда у различных видов буркхольдерий (B.pseudomallei, В.mallei, B.cepacia) проведено получение штаммов с повышенной резистентностью к препаратам, характеризующихся дополнительной множественной резистентностью широкого спектра, включающего аминогликозиды, тетрациклины, хлорамфениколы [3, 4]. При анализе белковых спектров этих штаммов [4, 17] установлено варьирование продукции белков наружных мембран с различной молекулярной массой, в том числе полифункциональных поринов мембранной транспортной системы клеток с M 36 кДа (B.cepacia) и M 39 кДа (B.pseudomallei). Роль этих поринов, имеющих сходные структурно-функциональные характеристики [16], в формировании резистентности множественного типа у патогенных буркхольдерий не изучена.
Прототипом сконструированного штамма B.cepacia KM196 являлся полученный методом направленной селекции мутант B.cepacia SMR2 с повышенным уровнем резистентности к антибиотикам фторхинолонового (МПК пефлоксацина более >200 мкг/мл) и цефалоспоринового (МПК цефтазидима >250 мкг/мл) ряда, характеризующийся измененной экспрессией ряда мембранных протеинов.
Целью изобретения является получение мутанта с повышенной чувствительностью к антибиотикам множественного типа, позволяющего оценивать роль поринов, входящих в состав мажорных белков наружной мембраны B.cepacia, являющихся частью многофункциональной системы транспорта через мембрану различных соединений, стабильно сохраняющего свои свойства при хранении, культивировании на питательных средах, пассировании через организм лабораторных животных.
S
S
S
S
S
S
r
Заявляемый штамм B.cepacia KM196 получен в результате двух циклов НГ мутагенеза штамма B.cepacia 25416 и последующего направленного выделения мутантных клонов на понижающихся от МПК для исходного штамма концентрациях пефлоксацина (офлоксацина) и цефтазидима. Среди мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам классов цефалоспоринов и фторхинолонов далее осуществляли отбор клонов, чувствительных к канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, недостаточных по продукции мажорных белков наружной мембраны. Предлагаемый штамм является вариантом с селектированными маркерами чувствительности PfxOfxfCzKanTetChl, дефектным по белку-порину ОрсР1 с M 36 кДа и обозначен в рабочей коллекции как B.cepacia 25416 NSP.
Основные свойства штамма.
Культурально-морфологические свойства: грамотрицательные палочки; культуры штамма растут в факультативных аэробных условиях на полноценных питательных средах (МПА, МПБ, L-arap, Nutrient agar, Nutrient broth «Difco» (США), Tryptic soy agar (broth) «Difco» (США) при оптимальной температуре 37°С, рН 6.8-7.2. На плотных питательных средах через 24 ч формируют гладкие полупрозрачные колонии, которые через 48 ч приобретают пигментацию бежевого цвета; в бульоне через 24 ч дают помутнение и образование тонкой пленки, через 48 ч - образование плотной пленки кремового цвета и рыхлого осадка на дне.
Биохимическая активность: в тесте Хью-Лейфсона - окисление глюкозы (+), мальтозы (+); оксидаза (+), аргининдигидролаза (-), лизиндекарбокси-лаза (+), орнитиндекарбоксилаза (-), желатиназа (-), L-арабиноза (+), Аrа (+).
Устойчивость к антибиотикам: штамм чувствителен к пефлоксацину (МПК<3 мкг/мл), офлоксацину (МПК<5 мкг/мл), цефтазидиму (МПК<3 мкг/мл); канамицину (МПК<20 мкг/мл), тетрациклину (МПК<30 мкг/мл); левомицетину (МПК<5 мкг/мл).
Отношение к видовым диагностическим сывороткам: диагностируется в РДД с преципитирующей сывороткой к штамму B.cepacia 25416.
r
Белковый спектр: дефектен по продукции белков наружной мембраны M 21, 27, 36, kDa;
50
8
Вирулентность: не вирулентен для белых мышей (LD>5×10 м.к.).
Питательные потребности: прототроф.
S
S
S
S
S
S
-
Генетические особенности: PfxOfxCfzKanTetChlОрсР.
Полученный с помощью описанных приемов штамм B.cepacia 25416 NSP депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») под номером КМ196.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Определение основных культурально-биохимических свойств мутанта B.cepacia KM196.
При посеве в Nutrient broth через 48 ч при 37°С культура штамма B.cepacia KM196 давала равномерное помутнение среды с образованием на поверхности пигментированной пленки и придонного осадка; на Nutrient agar через 24-48 ч вырастала в виде полупрозрачных колоний в S-форме бежевого оттенка.
Определение биохимических свойств показало наличие признаков, характерных для типового штамма B.cepacia 25416 (окисляет, но не ферментирует глюкозу на среде Хью-Лейфсона, обладает оксидазной, лизиндекарбоксилазной активностью, не имеет аргининдигидролазной, орнитиндекорбоксилазной и желатиназной активности; утилизирует из минимальной среды арабинозу, Ara+). На среде Skin milk («Difco», США) не гидролизует козеин молока, не проявляет лецитиназной и липазной активности.
7
МПК антибиотиков различных классов для культур мутантного штамма (1×10 м.к./мл) определяли на плотной питательной среде, используя общепринятый метод серийных разведений. Результаты представлены в таблице 1. Показано, что мутант B.cepacia KM196 имеет сниженную в сравнении с исходным штаммом резистентность к ряду препаратов различных классов, отличающихся по механизму действия на клетку.
8
Определение вирулентности. Мутант B.cepacia KM196 не вирулентен для белых мышей. При внутрибрюшинном заражении культурой в дозе 5×10 м.к. гибель лабораторных животных не наблюдали в течение 21 сут. Заражение на фоне применения иммунодепрессантов (гидрокортизон, циклофосфамид) также не вызывало гибели белых мышей.
Пример 2. Анализ экспрессии мажорных белков клеточных мембран В. cepacia KM196.
r
Для изучение продукции белков клеточных мембран мутантного штамма использовали электрофорез в SDS-полиакриламидных гелях по Laemmli [13]. Анализ в SDS-PAGE препаратов клеточных мембран, выделенных из исследованных штаммов, показал у В. cepacia 25416 NSP наличие дефекта в продукции белков M 21, 27, 36 kDa (рисунок 1). В. cepacia 25416 NSP (KM196 - трек 7).
Пример 3. ПЦР-анализ последовательности гена орсР1 мутанта B.cepacia KM196.
Для детекции последовательности орсР1 полимеразную цепную реакцию проводили с олигонуклеотидными праймерами bpsomp39s и bpsomp39as, фланкирующими кодирующую последовательность гена omp39 В. pseudomallei, гомологичного opcP1 B.cepacia [16], таблица 2.
9
2
2
ДНК выделяли из клеток 24 ч культур исследуемого штамма на Nutrient agar. Культуру суспендировали в 0,15 М Nad до плотности 2×10м.к./мл, смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-НСl, 100 мМ КСl, 5 мМ MgCl, 0,2 мг/мл желатина, 0,9% Nonidet P-40, 0,9% Твин 20, 150 мкг/мл протеиназы К) и инкубировали при 65°С 120 мин; прогревали при 95°С 30 мин для инактивации фермента. Пробы центрифугировали при 10000 об/мин 1 мин и использовали 10 мкл супернатанта, 1×реакционный буфер (Интерлабсервис, Россия), 1,5 мМ MgCl, 0,2 мМ каждого dNTP, 15 пмоль каждого праймера, 1 ед. ДиаТак ДНК-полимеразы (Интерлабсервис, Россия). Амплификацию последовательностей пориновых генов орсР1 В.cepacia и omp39 В.pseudomallei проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) по программе: начальный прогрев 95°С 5 мин, 35 реакционных циклов (94°С 30 с, 57°С 30 с, 72°С 60 с), финальная элонгация 72°С 10 мин. Электрофоретический анализ ПЦР-ампликонов проводили в 1,5-2% агарозных гелях, окрашивая ДНК этидиум бромидом. Продукты ПЦР анализировали в 1,5% агарозном геле (рис.2).
Установлено, что у мутантного штамма В.cepacia KM196 (трек 3) не обнаружены продукты амплификации, по размеру соответствующие фрагментам ДНК, выявляемым у исходного штамма В.cepacia 25416.
S
S
S
S
S
S
r
Таким образом, мутант В.cepacia KM196 с фенотипом множественной чувствительности к антибиотикам (PfxOfxCfzKanTetChl) дефектен по гену орсР1 и не продуцирует детерминируемый им порообразующий белок ОрсР1 с M 36 kDa.
Таблица 1
Устойчивость к антибиотикам индуцированного НГ мутанта В.cepacia KM196
Штаммы В.cepacia
Фенотип
МПК, мкг/мл
Cfz
Pfx
Ofx
Tet
Kan
Chl
25416
W.t
30
10
20
200
250
50
25416 NSP (KM196)
Tet<sup>S</sup>Kan<sup>S</sup>Chl<sup>S</sup>Pfe<sup>S</sup>Cfz<sup>S</sup>
2.5
2.5
5
10
10
2
Примечания: Cfz - цефтазидим, Pfx - пефлоксацин, Chl - хлорамфеникол, Tet - тетрациклин, Kan - канамицин