СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К ХАНТАВИРУСУ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКЕ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ТЯЖЕЛЫХ ФОРМ ЗАБОЛЕВАНИЯ
METHOD FOR DETECTING HANTAAN VIRUS ANTIBODIES IN HANTAAN HEMORRHAGIC FEVER, AND PREDICTING SEVERE DISEASE

Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии.
Значительный прогресс в лабораторной диагностике ГЛПС наметился после внедрения различных вариантов иммуноферментного анализа с определением антител класса G и М. Эти методы позволяют определить общее количество антител без определения специфических антител к определенным компонентам хантавируса.
В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется диагностикум производства ИПиВЭ (г.Москва), позволяющий обнаружить антитела класса G к вирусу ГЛПС уже на первой неделе с начала заболевания в реакции непрямой иммунофлуоресценции (1). Однако в данном случае для подтверждения диагноза необходимо протестировать вторую сыворотку, отобранную через 5-7 дней после первой.
Прототипом нашего изобретения является иммуноблот анализ, используемый для выявления антител к различным компонентам вирусов, свободно циркулирующих в сыворотке крови, с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных мембран (НЦМ) (2).
Недостатком этого метода при диагностике геморрагической лихорадки является недостаточная специфичность.
Задачей изобретения является повышение эффективности обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявление предикторов тяжелого течения заболевания.
Поставленная задача достигается тем, что способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.
Способ осуществляется следующим образом.
Антигенный препарат хантавируса подвергают очистке и концентрированию при помощи изопикнического ультрацентрифугирования в 30% растворе калия бромида при 24000 об/мин в течение 20 часов при 20°С. После окончания центрифугирования содержимое отсасывают со дна пробирки при помощи перистальтического насоса через увикорд. Материал, содержащий максимальное поглощение при длине волны 280 нм, объединяют и проводят электрофоретическую разгонку в 5% растворе агарозы, содержащей 0,1% додецилсулфата натрия. Вырезают фрагменты агарозы, содержащие антиген, элюируют забуференным физраствором. Элюированный антиген подвергают диск-электрофорезу по Laemmli (3) для определения полипептидного состава антигенных препаратов хантавируса.
Электрофорез проводят при комнатной температуре при силе тока 7 мА/пластинка до внедрения белков в концентрирующий гель. Основной режим фракционирования - 30 мА/пластинка. Продолжительность электрофореза составляет 4-6 часов в зависимости от концентрации полиакриламидного геля (ПААГ).
Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ проводят, как после переноса белков на мембранные фильтры, так и непосредственно после электрофореза.
Белки после фракционирования фиксируют в водном растворе, содержащем 40% спирта (этанола или изопропанола-2) и 7% уксусной кислоты в течение суток. Фиксированный гель дважды промывают по 30 минут в дистиллированной воде при постоянном покачивании и проводят окрашивание 0,04% кумаси G-250 в 3,5% растворе хлорной кислоты в течение полутора часов. Затем гель погружают в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления от избытка красителя до полного обесцвечивания фона.
2
3
4
Также проводят дополнительное окрашивание с помощью азотнокислого серебра для выявления полисахаридов и повышения чувствительности окрашивания белковых зон с целью снижения фонового окрашивания и придания полученным дискретам черного цвета. Для этого гель выдерживают 3-е суток в дистиллированной воде при комнатной температуре с ежедневной сменой, далее воду сливают, гель перемешивают в растворе формалина (0,15 мкл на 350 мл HO), выдерживают 30 минут при 37°С, дважды промывают дистиллированной водой по 20 минут, погружают в свежеприготовленный окрашивающий раствор на 15 минут (4 мл 20% водного раствора AgNO), титруют раствором, содержащим 7,5 мл 0,36% NaOH и 3 мл 10% NHOH до полного исчезновения бурого осадка, объем раствора доводят до 100 мл дистиллированной водой, гель дважды промывают дистиллированной водой по 10 минут (350 мл на гель), погружают в проявляющий раствор, содержащий 2,5 мл 1% лимонной кислоты и 1 мл 37% раствора формалина. После появления черного окрашивания гель промывают два раза 5% раствором тиосульфата натрия. Окрашенный гель протоколируют при помощи оптического сканирования.
Для выявления антител класса IgG в сыворотке крови и в циркулирующих иммунных комплексах больных к хантавирусу инактивированный, лиофильно высушенный антигенный препарат хантавируса растворяют в лизирующей смеси, содержащей 1% додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола. Антигенный препарат кипятят 3 минуты в водяной бане и разгоняют в 12,5% полиакриламидном геле по Laemmli (3). По окончанию электрофореза гель выдерживают 30 минут в буфере для переноса (0,025М трис, 0,191М глицин, 20% метанол), собирают полусухой сендвич (semi-dry).
По окончанию электрофореза разделенный антигенный препарат переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (нм) в течение 45 минут при силе тока 100 мА. После окончания переноса антигена мембрану промывают последовательно дистиллированной водой, фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБТ), блок раствором, ФСБТ и высушивают. Далее мембрана нарезается на стрипы шириной 2-3 мм, которые помещают в специальные лоты-ванночки. В лоты вносят 2 мл ФСБТ, выдерживают 5 минут и вносят сыворотку в разведении 1:50 - 1:100. Инкубируют на шейкере 2 часа при комнатной температуре, затем промывают ФСБТ 4 раза по 1 минуте. Далее вносят конъюгат против антител класса IgG человека, меченный щелочной фосфатазой, инкубируют 1 час на шейкере. Затем промывают 4 раза ФСБТ по 1 минуте, вносят субстратный раствор, содержащий бром-хлор-индол-фосфат нитросиний тетрозоль (BCIP-NBT) и инкубируют 30 минут. Далее промывают дистиллированной водой 3 раза, высушивают, окрашенные стрипы приклеивают на бумагу, сканируют и денситометрируют. Учет результатов иммуноблотинга проводят при помощи оптического сканирования в отраженном свете на сканере SHARP JX-330 «Pharmacia Biotech» (Швеция).
Далее выделяются ЦИК из сыворотки крови, для этого используют 7%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярным весом 6000, который обеспечивает выделение двух фракций: «быстро» (18 часов-ЦИК-1) и «медленно» (72 часа-ЦИК-2) - преципитирующих ЦИК. Для этого сыворотки крови смешивают в соотношении 1:1 с 7%-ным раствором ПЭГ. Далее смесь инкубируют при +6 - +2°С в течение 18 и 72 часов. Преципитат осаждают центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и четырежды промывают десятикратным объемом 7%-ным раствором ПЭГ в 0,05М боратном буфере, рН 8,8. Далее препараты ЦИК диссоциируют температурным воздействием при +60°С в течение 3-х часов и проводят иммуноблот анализ для выявления антител класса IgG.
Нами проведены исследования динамики образования антител к хантавирусам и определение их диагностической значимости у больных ГЛПС при различных формах тяжести методом иммуноблот анализа.
Для выполнения поставленных задач было обследовано 226 больных ГЛПС. В зависимости от тяжести течения болезни все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 24 человека с легким течением болезни, вторую группу - 105 человек со среднетяжелым течением и третью группу - 97 человек с тяжелым течением.
Результаты исследований частоты выявления спектра хантавирусных антител класса IgG у больных ГЛПС методом иммуноблот анализа представлены в таблице 1.
Результаты анализа на наличие серологических маркеров хантавируса у больных различными формами тяжести ГЛПС показали, что частота выявления антител класса IgG к поверхностным белкам (молекулярной массы 58 кДа и 72 кДа) в сыворотке крови и в составе ЦИК-1 у наблюдаемых больных была 100%, носила стабильный характер и не зависела от тяжести инфекционного процесса (табл.1).
Антитела к нуклеокапсидному белку 45 кДа не были обнаружены ни в одной из тестируемых сывороток, как в свободном виде, так и в составе ЦИК-1.
Анализ выявления специфического спектра антител в составе ЦИК-2 показал, что доминирует по частоте выявление антител к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа, 72 кДа. Тем не менее, каких-либо корреляционных взаимосвязей частоты обнаружения антител и тяжести инфекционного процесса выявлено не было.
Наименьшая частота индикации антихантавирусных антител в ЦИК-2 была к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа. Максимальная частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа наблюдалась у больных тяжелой формой заболевания, которая составила 100%, начиная с лихорадочного периода.
У больных легкой формой антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа в лихорадочном периоде не определялись, в олигурическом периоде - лишь у 46,1% больных, в полиурическом - у 73,2%. У больных среднетяжелой формой заболевания частота их обнаружения была выше - 37,2%, 66,6% и 78,2% соответственно. Частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа у больных тяжелой формой заболевания была достоверно выше частоты выявления антител у больных легкой и среднетяжелой формами заболевания (р<0,01).
В результате проведенного иммуноблот анализа в циркулирующих иммунных комплексах у больных ГЛПС на ранних сроках заболевания обнаруживаются антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа только у больных тяжелой формой (100% случаев) и не обнаруживаются у больных с легким течением болезни.
Таким образом, выявление антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания позволяет диагностировать тяжелые формы болезни уже в самом начале болезни на ранних сроках.
Пример 1.
9
Больной К., 32 года. Диагноз: ГЛПС тяжелое течение. Поступил на 4-й день болезни с жалобами на лихорадку до 39 С°, головную боль, рвоту, нарушение зрения в виде «тумана» перед глазами, боли в поясничной области, снижение диуреза. В анализах крови: лейкоцитоз 15×10/л, тромбоцитопения, повышение мочевины - 25 ммоль/л, креатинин - 600 мкмоль/л.
Больному проводили исследование сыворотки на выявление антител класса IgG к хантавирусам в сыворотке крови и в составе циркулирующих иммунных комплексов.
Проводили электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса (фиг.1), определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, также антитела класса IgG определяли в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.
В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1 выявили антитела класса IgG к поверхностным белкам молекулярной массой 58кДа и 72 кДа. В составе ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к белкам массой 45 кДа, 58 кДа и 72 кДа. Выявление антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Наличие антител в составе ЦИК-2 к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания свидетельствовали о тяжелом течении болезни.
Пример 2.
9
Больная Ф. 27 лет. Поступила на 3 день болезни с жалобами на повышение температуры до 38 С°, головную боль, слабость. Уменьшение диуреза не отмечала. В анализах крови лейкоцитов - 6×10/л, тромбоцитов 190 тыс в мкл, мочевина - 6 ммоль/л, креатинин - 110 мкмоль/л.
Проведено исследование сыворотки крови на наличие антихантавирусных антител в сыворотке крови и в ЦИК методом иммуноблот анализа.
В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1, ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа и 72 кДа. Выявленние антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Отсутствие в составе ЦИК-2 антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа свидетельствовало о легком течении болезни.
Список использованной литературы
1. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики) / Р.Ш.Магазов (под ред. Акад. АН РБ Магазова Р.Ш.). - Уфа, Изд-во «Гилем», 2006. - 250 с.
2. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П.Иванов // Вопр. вирусол. - 1996. - №6. - С.236-265.
3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage / U.K. Laemmli // - Nature. London. - 1970, T4. V.227, pp.680-685.