Способ оценки процесса апоптоза в ткани головного мозга лабораторных животных
METHOD OF ESTIMATION OF THE APOPTOSIS PROCESS IN THE FABRIC OF THE BRAIN OF LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, общей токсикологии и нанотоксикологии и касается критериев диагностики токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана.
Использование наночастиц серебра в промышленности и медицине приобретает все большее значение и широкий размах. Так, например, на настоящий момент наночастицы серебра используются при изготовлении упаковочного материала [1], в стоматологии [2, 3]. Установлена высокая стабильность наночастиц серебра в окружающей среде, определены их антибактериальная и цитотоксическая активность, а также способность сохранять токсические свойства на протяжении длительного времени [4]. Выяснено, что механизм развития токсичности связан с окислительным стрессом, нарушением функций митохондрий и увеличением проницаемости мембраны [3].
В настоящее время, в связи с необходимостью снижения токсического эффекта, активно идет разработка и испытание различных природных и синтетических полимерных матриц - носителей наночастиц [4]. В наших исследованиях использовался арабиногалактан (АГ), полученный из лиственницы сибирской [5, 6]. Возможность широкого использования подобных нанобиокомпозитов требует расширенного изучения биологического ответа организма на воздействие наночастиц серебра, инкапсулировнных в данные полимерные матрицы.
В подобных исследованиях оценивается в основном биологическое действие наночастиц серебра на органы фильтрации (печень, почки), в то время как воздействие нанокомпозита на головной мозг практически не исследуется.
Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего судить о наличии в тканях процесса апоптоза клеток головного мозга экспериментальных животных при воздействии нанобиокомпозитов, содержащих наносеребро, расширение арсенала методов оценки патологических нарушений у экспериментальных животных.
Поставленная задача решается путем проведения иммуногистохимического анализа экспрессии проапоптотического белка caspase 3 и антиапоптотического белка bcl-2 в ткани головного мозга белых крыс при воздействия наночастиц серебра, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана (нAgAГ), с последующей морфометрической обработкой и интерпретации полученного результата.
Уровень экспрессии белков является показателем функционального состояния ткани головного мозга при воздействии наночастиц серебра, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана. Данный способ позволяет уточнить причину развития патологического процесса в ткани головного мозга, а также дает более полное представление о течении патологического процесса в клетке и ткани в целом.
2
Способ осуществляется следующим образом: животные разделяются на две группы: опытную и контрольную. Животных опытной группы подвергают пероральному воздействию нAgAГ в дозировке 100 мг на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды в течение 9 дней. Животным контрольной группы на протяжении 9 дней внутрижелудочно вводят 0,5 мл дистиллированной воды. Сразу после окончания воздействия животные декапитируются. Готовят срезы тканей коры головного мозга животных из всех групп, иммуногистохимически окрашивают их на антитела к белку caspase-3 и bcl-2, при помощи обзорной микроскопии подсчитывают общее количество клеток в 0,2 мм, определяют по отдельности количество патологически измененных нейронов с экспрессией белков caspase 3 и bcl-2, количество нормальных нейронов с экспрессией этих белков. Вычисляют изменение количества патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3 и bcl-2 в препаратах опытной группы относительно аналогичных показателей в препаратах контрольной группы; изменение нормальных нейронов с экспрессией белков caspase 3 и bcl-2 в препаратах опытной группы по сравнению с аналогичными характеристиками в препаратах контрольной группы. При увеличении числа патологически измененных нейронов с экспрессией белка caspase 3 в среднем в 1,6 раза в опытной группе в сравнении с контрольной группой, увеличении числа нормальных нейронов с экспрессией белка caspase 3 в среднем в 2,5 раза в опытной группе в сравнении с контрольной группой и увеличении патологически измененных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 2,4 раза в опытной группе, увеличении числа нормальных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 1,5 раза в опытной группе в сравнении с контрольной группой делают заключение о возникновении и развитии патологического процесса с преобладанием повреждений нейронов по типу апоптоза в ткани головного мозга сразу после окончания воздействия нанокомпозита серебра.
Таким образом, совместное использование показателей экспрессии вышеназванных белков позволяет более точно представить и охарактеризовать картину возникновения и развития процесса апоптоза в ткани.
В данном способе предлагаются качественные и количественные критерии морфометрических изменений в нейронах головного мозга, с помощью которых диагностируют поражение ткани головного мозга при воздействии нAgAГ, и дается их сравнительная характеристика.
Заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как оно может использоваться в экспериментальной медицине (токсикологии, фармакологии, патологической физиологии, патологической анатомии) для верификации моделирования патологических состояний центральной нервной системы животных. Технология оценки безопасности нанопрепаратов, основанная на морфологическом анализе структурных изменений внутренних органов и тканей организма и молекулярной диагностике экспрессии внутриклеточных белков, позволит не допускать к производству и применению лекарственные формы и диагностические препараты, способные вызывать неблагоприятные последствия воздействия.
Пример осуществления способа
Предлагаемый способ был применен на 40 особях беспородных белых крыс-самцов в трехмесячном возрасте и массой от 240 до 280 грамм. Животным опытной группы (20 особей) внутрижелудочно через зонд на протяжении 9 дней вводили водный раствор АГ с наночастицами серебра (нAgAГ) из расчета 100 мкг серебра на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды. После окончания воздействия животные были декапитированы. Животные контрольной группы (20 особей) получали на протяжении 9 дней внутрижелудочно 0,5 мл дистиллированной воды.
После декапитации головной мозг от каждого исследуемого животного был извлечен и фиксирован в нейтральном буферном растворе формалина (10%), обезвожен этанолом восходящей концентрации (70, 80, 90, 95 и 100%) и помещен в гомогенизированную парафиновую среду для гистологических исследований HistoMix (BioVitrum, Россия). Далее, с помощью микротома НМ 400 (Microm, Германия) изготавливались срезы толщиной 4-5 мкм. Для исследования биологического ответа организма на субклеточном уровне применяли имунногистохимический метод определения активности проапоптотического белка caspase 3 и антиапоптотического белка bcl-2. Полученные на микротоме срезы были помещены на полизиновые стекла (Menzel, Германия) и окрашены на антитела к белку caspase-3 (Monosan, Нидерланды) и bcl-2 в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Дополнительно для визуализации нервных клеток проводили окраску по Нисслю. Окрашенные срезы фиксировались полистиролом и накрывались покровным стеклом. После высыхания полистирола полученные микропрепараты просматривали на светооптическом исследовательском микроскопе. Исследование полученных срезов осуществляли при помощи светооптического исследовательского микроскопа Olympus ВХ 51 (Япония) с вводом микроизображений в компьютер при помощи камеры Olympus.
2
2
Далее при помощи системы микроскопии и анализа Image Scope М были проанализированы заранее выбранные параметры полученных фотоматериалов: количество патологически измененных нейронов с экспрессией проапоптотического белка caspase 3 и количество патологически измененных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в процентах от общего количества клеток в 0.2 мм, количество нормальных нейронов с экспрессией белка caspase 3 и количество нормальных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в процентах от общего количества клеток в 0.2 мм. Изменение показателя выражалось в отношении количественного показателя образца опытной группы к значению аналогичного показателя из контрольной группы.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0» (Statsoft Inc., США). Статистическую значимость различий в независимых выборках определяли по методу Манна-Уитни. Достигнутый уровень значимости признаков - при р<0,05.
Как видно из таблицы, в опытной группе по сравнению с контролем увеличилось количество патологически измененных нейронов с экспрессией caspase 3 в среднем в 2,5 раза, количество нормальных нейронов с экспрессией белка caspase 3 в среднем в 1,6 раза, также увеличилось по сравнению с контрольной группой количество патологически измененных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 2.4 раза, а количество нормальных нейронов с экспрессией белка bcl-2 в среднем в 1,5 раза. Учитывая полученные результаты, делают заключение о возникновении и развитии патологического процесса с преобладанием повреждений нейронов по типу апоптоза в ткани головного мозга сразу после окончания воздействия нанокомпозита серебра.
Предлагаемый способ позволяет оценить функциональное состояние нейронов головного мозга при воздействие нанобиокомпозитов серебра. Данный метод используется для моделей нейроинтоксикаций у экспериментальных животных. Он расширяет арсенал методов оценки действия токсических веществ на организм лабораторных животных, повышает точность верификации токсической энцефалопатии, позволяет оценивать функциональное состояние, наряду со структурными, благодаря морфометрической характеристике нейронов головного мозга, уточняя механизм развития патологического процесса по типу апоптоза.
Литература
1. Верников В.М., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Наночастицы серебра в природе, промышленности, упаковочных материалах, предназначенных для пищевых продуктов: характеристика возможных рисков / Вопросы питания 2009, №6, стр. 13-20.
2. Садыков М.И., Нестеров A.M., Фесик Е.В. // Изготовление съемных зубных протезов из акриловой пластмассы содержащей наночастицы серебра (лабораторное исследование) / Врач-аспирант, 2011, т. 49 №6.3, стр. 451-456.
3. Sahoo S.K., Parveen S., Panda J.J. // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2007. №3. P. 20-31.
4. Prozorova G.F., Pozdnyakov A.S., Kuznetsova N.P. et al. // International Journal of Nanomedicine, 2014. №9. 1883.
5. Lewinski N., Colvin V., Drezek R. // Small-journal 2008, 4, No. 1, 26-49.
6. Ji J.H. // Inhalation Toxicology 2007. Vol. 19. Iss. 10. P. 857-71.
7. Дубровина В.И., Медведева С.А. и др. Иммуномодулирующие свойства арабиногалактана лиственницы сибирской. - М.: Фармация, 2001. С. 26-27.