Влияние мужского фактора бесплодия на эффективность применения вспомогательных репродуктивных технологий

ВЛИЯНИЕ МУЖСКОГО ФАКТОРА БЕСПЛОДИЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

А.В. Маркин, Э.В. Вартанян

Клиника ВРТ «Дети из пробирки» Ул. Ленская д.15 корп.1, 129327, Москва, Россия

К.А. Цатурова, Н.В. Кибардина, Т.А. Аникина

Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198, Москва, Россия

В результате исследований последних лет удалось показать существенную роль мужского фактора в формировании бесплодия и эффективности применения вспомогательных репродуктивных технологий. Установлено, что нарушения репродуктивной функции мужчины нередко бывают обусловлены генетическими (наследственными) факторами, такими как структурные и количественные аномалии хромосом, а также мутации генов, контролирующих сперматогенез. Нами было выполнено исследование, целью которого явилось изучение возможных генетических причин снижения репродуктивной функции у мужчин, обратившихся в нашу клинику для выбора правильной тактики коррекции репродуктивной функции и рождения здорового ребенка. В результате кариотипирования мужчин в программе ЭКО-ИКСИ изменения кариотипа были выявлены у 167 (17,7 %) мужчин с нарушением сперматогенеза, в том числе аномалии в 26 (2,76 %), а полиморфизм в 141 (14,98 %) случаях. Диагностика по показаниям для выявления носительства муковисцидоза в нашей клинике была проведена 154 мужчинам, при этом у 19 из них были обнаружены мутации в гене CFTR, из них 6 тяжелых. Выявленные изменения кариотипа позволили вовремя скорректировать тактику ведения бесплодной пары и сократить число неудачных попыток применения ВРТ.

Работа была выполнена при участии КДЛ «ФертиЛаб» (руководитель Т.Р. Курносова).

Можно с уверенностью утверждать, что на протяжении всей истории репродуктивной медицины значение мужского фактора в бесплодии было недооценено. Только в последние годы ученные и врачи стали все больше уделять внимание состоянию репродуктивной системы мужчины. Во многом это связано с поиском причин, приводящих к неучам в реализации вспомогательных репродуктивных технологий.

Нарушения репродуктивной функции у мужчин проявляются изменением качества эякулята (олиго-, астено-, терато-, азооспермия), патологической вязкостью, наличием антиспермального иммунитета. Причины подобных нарушений разнообразны. Это могут быть и хронические воспалительные заболевания урогенитального тракта, и врожденные урологические заболевания, например крипторхизм или варикоцеле; инфекционный паротит, осложнения после грыжесечения, травмы и т.д.

В настоящее время установлено, что нарушения репродуктивной функции мужчины нередко бывают обусловлены генетическими

факторами, такими как структурные и количественные аномалии хромосом, а также мутации генов, контролирующих сперматогенез. Известно, что по сравнению с новорожденными мальчиками бесплодные мужчины имеют значительно большее количество хромосомных аномалий [3, 4, 8]. Это справедливо для пациентов с такими факторами бесплодия, как азооспермия и выраженная олигозооспермия. Недавние работы показали, что среди бесплодных мужчин, включенных в программы ЭКО или ИКСИ, процент хромосомных аномалий значительно превышает популяционный уровень [5, 6].

В клинической практике неоднократно приходится сталкиваться с ситуацией, когда коррекция качества спермы затягивается на многие месяцы и не всегда оказывается эффективной. Бывают случаи, когда недооценка степени выраженности изменений спермы приводит к неоднократным неудачным попыткам ЭКО при использовании классических вариантов этого метода лечения. И даже в случаях, когда вовремя выбран метод ИКСИ, вероятность благоприятного исхода лечения остается низкой. В связи с этим мы предполагаем, что при выраженных изменениях в спермограмме, а также при наличии специфических отклонений, для повышения эффективности ЭКО требуется проведение генетических исследований мужчины, результаты которых позволят вовремя выбрать правильную тактику ведения бесплодной пары.

Нами было выполнено исследование, целью которого явилось изучение возможных генетических причин снижения репродуктивной функции у мужчин, обратившихся в нашу клинику для выбора правильной тактики коррекции репродуктивной функции и рождения здорового ребенка.

В группу исследования были включены 941 мужчина с нарушением сперматогенеза (олиго-, астено-, терато-, азооспермия) из числа супружеских пар, проходивших лечение в клинике с 2005 г. по настоящее время. Данной группе пациентов было произведено кариотипирование при помощи GTG-окраски культуры лимфоцитов периферической крови согласно стандартным методикам. При наличии показаний отдельным пациентам из этой группы было проведено молекулярно-генетическое обследование для выявления мутаций гена CTFR, полиморфизма гена AR и микроделеций AZF-региона Y-хромосомы. Данные анализы проводились при помощи анализатора Abbott Prizm и праймеров производства Abbott Laboratories методом ПЦР с использованием ДНК, выделенной из клеток периферической крови.

В результате кариотипирования мужчин в программе ЭКО-ИКСИ изменения кариотипа были выявлены у 167 (17,7 %) мужчин с нарушением сперматогенеза, в том числе аномалии в 26 (2,76 %), а полиморфизм - в 141 (14,98 %) случаях (табл. 1). Полученные данные подтверждают прямую связь между нарушениями кариотипа и мужским бесплодием, а также гипотезу о том, что вероятность хромосомных аномалий обратно пропорциональна концентрации сперматозоидов в сперме [7] и, как следствие, основным

показанием для кариотипирования бесплодных мужчин служат отклонения в параметрах спермограммы.

Как видно из таблицы, после оценки кариотипа мужчины может быть четко сформирована клиническая тактика ведения бесплодной пары. Из представленных данных видно, что в некоторых случаях субфертильные показатели спермы не пригодны для проведения ЭКО и ИКСИ без применения ПГД или использования донорской спермы. Очевидно, что без проведения кариотипирования найти причину неудачных попыток ЭКО у таких пар невозможно. Таким образом, своевременное генетическое исследование может сократить число неудачных попыток и вовремя скорректировать лечебную тактику.

Таблица 1

Различные варианты изменений кариотипа у мужчин и соответствующая им клиническая картина

Виды n Основные показатели спермограмм Клиническая тактика

нарушений концентрация, Млн/мл подвижность,% нормальных форм, % метод

0 0 0 Дон.

Численные 9 56 12 15 Дон.\ПГД

нарушения 0,5 0 1 Дон.

0 0 0 Дон.\ПГД

0,5 8 2 Дон.

78 32 2 ПГД

Транслокации 12 51 49 7 Дон.

27 27 19 ПГД

62 52 21 Дон.

Инверсии 5 0 5 0 9 0 4 Дон. Дон.\ПГД

Полиморфные 141 - - - П ГД\ко нсул ьтаци я

варианты генетика

Примечание: *Дон. - донорство; ПГД - преимплантационная генетическая диагностика

Особый интерес представляет группа «полиморфизмов». К полиморфным вариантам кариотипа относятся изменения в строении хромосом, увеличения или уменьшения их размеров за счет участков гетерохроматина в аутосомах или половых хромосомах, изменения спутниковых нитей ДНК и т.д., что может приводить к нарушению процесса расхождения хромосом и, как следствие, к несбалансированным нарушениям кариотипа у ребенка. Полиморфизмы относят к вариантам нормы. Изучение природы и биологической значимости полиморфизма гетерохроматиновых районов хромосом до сегодняшнего времени остается одной из наиболее сложных проблем в клинической цитогенетике. Известно, что в нормальной популяции подобные изменения хромосом наблюдаются с частотой до 4-6%.

Рядом авторов обнаружено, что носители вариантов хромосом 1 и 9 чаще встречаются среди пациентов с врожденными пороками развития. В настоящее время единого взгляда на роль вариантов околоцентромерного гетерохроматина в возникновении той или иной патологии нет.

Как правило, изменения в спермограмме пациентов носили субфертильный характер (табл. 2). Коррекция сперматогенеза проводилась в том числе и в нашей клинике, однако улучшение параметров было незначительным или носило временный характер. Тактика ведения пациентов с выявленными изменениями в кариотипе в нашей клинике выбирается индивидуально. В наиболее тяжелых случаях ставится вопрос о применении донорских программ, преимплантационной генетической диагностике при условии возможности диагностирования данного нарушения, а также последующей пренатальной диагностике плода.

Наши данные согласуются с литературными данными. Так, группы Nagvenkar et al.(2005), Peschka et al.(1999) и Mau et al.(1997), проведшие диагностику 88, 781 и 150 мужчин соответственно, включали в число обнаруженных аномалий полиморфные варианты кариотипа, в результате чего выявили соответственно 9 (10,2%), 123 (15,7%) и 18 (12%) измененных кариотипов. Среди исследовательских групп, ограничившихся выявлением только структурных и количественных аномалий хромосом у мужчин с бесплодием, особый интерес представляют результаты Hens et al.(1988), Gekas et. al (2001) и Meschede et al.(1998), в которых соответственно у 500, 2196 и 432 мужчин было обнаружено 4 (0,8%), 134 (6,1%) и 9 (2,1%) аномальных кариотипов.

Таблица 2

Выявленные полиморфизмы кариотипов

Полиморфизмы

концентрация, Млн/мл подвижность, % нормальных форм, %

46XYqh+ 49

46XYqh- 11

46XY,9qh+ 35

46XY,1qh+ 9

46XY,16qh+ 7

46XY,pstk 16

Прочее 14 (1,48) - - -

В настоящее время в качестве наиболее частых молекулярно-генетических нарушений сперматогенеза рассматривают микроделеции AZF-региона Y-хромосомы и мутации гена CFTR, также имеются данные о взаимосвязи нарушений сперматогенеза с полиморфизмом гена AR.

Муковисцидоз - (от латинского mucus - слизь, viscidus - вязкий) самое распространенное наследственное гомозиготное генетическое заболевание, при котором поражаются все органы, которые выделяют секреты (слизь). Из-за мутации гена секреты во всех органах вязкие, густые, поэтому их выделение затруднено. Существуют многочисленные данные о влиянии на качество эякулята мутаций в гене CFTR в гетерозиготном состоянии. Тяжелые мутации гена, такие как Del508, del21kb, N1303K, w1282x и др., приводят к полной

инактивации гена, а легкие, к которым в частности относят Я117Н, 5Т, приводят к частичному снижению его функции.

В нашей клинике диагностика по показаниям была проведена 154 мужчинам (табл. 3), при этом у 19 из них были обнаружены мутации в гене CFTR, из них 6 тяжелых. У мужчин носителей мутаций часто выявляются простатовезикулит, повышенные концентрации антиспермальных антител, пиоспермия, астенотератозооспермия.

Таблица 3

Мутации гена CFTR, выявленные в Клинике ВРТ «Дети из пробирки»

Мутации N Основные показатели спермограмм

вязкость концентрация, Млн/мл подвижность, % Норм. форм, %

«Тяжелые» Del508, del21kb, N1303K, \м1282хи др. 6 ++++ 2

«Мягкие» R117H,5T 13 +++ 54

В нашей клинике при обнаружении у мужчины мутаций в гене CFTR, обязательна диагностика его и у супруги для избежания рождения ребенка, страдающего муковисцидозом, так как при наличии у супруги даже мягкой мутации вероятность рождения здорового ребенка составляет 25%. Мы рекомендуем данный анализ для пациентов с такими отклонениями в показателях спермограммы, как стойкая олигоастенотератозооспермия, олигоспермия, хроническая пиоспермия и патологическая вязкость эякулята.

Исходя из вышеизложенного, мы считаем необходимым включение генетических методов диагностики в алгоритм обследования мужчин с тяжелыми формами нарушения сперматогенеза, а также в тех случаях, когда пара уже столкнулась с неудачными попытками ЭКО.

Таким образом, мы постарались выявить значение генетических исследований мужчин в анализе причин, приводящих к неудачным попыткам ЭКО. Своевременное выявление нарушений кариотипа позволяет определить тактику ведения пациентов как перед первой попыткой ЭКО (в случаях длительного бесплодия при отсутствии явных причин бесплодия), так и в случаях, когда имели место неудачи.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Михайленко Д.С., Бабенко О.В., Курносова Т.Р. и др. Комплексный молекулярно-генетический анализ микроделеций области AZF, мутаций гена CFTR и длины CAG-повтора гена AR у мужчин с бесплодием. // Проблемы репродукции - 2005. - Т.11. -№6. -С. 35-40.

[2] Bonduelle, M., Wilikens, A., Buysse, A. et al. Prospective follow-up study of 877 children born after intracytoplasmic sperm injection (ICSI), with ejaculated, epididymal and testicular spermatozoa and after replacement of cryopreserved embryos obtained after ICSI. // Hum. Reprod.- 1996.-Vol.11. (Suppl. 4).- P. 131-155.

[3] Bourrouillou, G., Dastugue, N. and Colombies, P. Chromosome studies in 952 males with a sperm count below 10 million/ml. / // Hum. Genet. -1985.-Vol.71.- P. 366-367

BecTHHK Py^H, cepua Medu^Ha, 2009, № 5

[4] Chandley, A.C. Infertility and chromosome abnormality.// Oxf. Rev.Reprod. Biol. -1984.-№6.- P. 1-46.

[5] J Gekas, F.Turleau, J.P.Siffroi, et al. Chromosomal factors of infertility in candidate couples for ICSI: an equal risk of constitutional aberrations in women and men. // Hum. Reprod. -2001.-Vol.16.- P.82-90

[6] D.Meschede, B.Lemcke, J.R.Exeler ,et al. Chromosome abnormalities in 447 couples undergoing intracytoplasmic sperm injection—prevalence, types, sex distribution and reproductive relevance. // Hum. Reprod. -1998.- Vol.13.- P.576-582

[7] Punam Nagvenkar, Kundan Desai, Indira Hinduja & Kusum Zaveri. Chromosomal studies in infertile men with oligozoospermia & non-obstructive azoospermia // Indian J Med Res. -2005.-№ 122.- P 34-42

[8] Pandiyan N, Jequier AM. Mitotic chromosomal anomalies among 1210 infertile men. // Hum Reprod.- 1996.-Vol. 11.-P. 2604-2608.

[9] Scholtes, M.C., Behrend.C., Dietzel-Dahmen, J. et al. Chromosomal aberrations in couples undergoing intracytoplasmic sperm injection: influence on implantation and ongoing pregnancy rates. // Fertil. Steril. -1998.- Vol. 70.- P. 933-937

[10] Simpson, J.L. Genetics in Obstetrics and Gyneacology. - W.B. Saunders, Philadelphia. -1992.- P. 133-164

[11] Van der Ven, K., Peschka, B., Montag, M. et al. Increased frequency of congenital chromosomal aberrations in female partners of couples undergoing intracytoplasmic sperm injection. // Hum. Reprod.-1998.-Vol. 13.-P.48-54.

INFLUENCE OF MALE FACTOR INFERTILITY ON ART EFFICIENCY

A.V. Markin, E.V. Vartanyan

ART Clinic "Test-tube babies" St. Lenskaya 15, bld.1, 129327, Moscow, Russia

K.A. Tsaturova, N.V. Kibardina, T.A. Anikina

Department of Obstetrics and Gynecology with the course of Perinathology of Peoples' Friendship University of Russia

Mikluho-Maklaya st., 8, Medical Faculty, 117198, Moscow, Russia

Crucial role of male factor in infertility formation and ART efficiency was shown in last years. Genetic analysis identified 26/941 (2,76%) abnormal karyotypes and 141/941 (14,98%) chromosome variants. Chromosomal abnormalities included 5 cases of sex chromosome aneuploidy, 12 cases of translocations, 5 cases of chromosome inversion and per 2 cases of mosaicism and marker chromosome were found. Among chromosome variants Yqh+ was the most frequent (49/941 or 5,2%) variant in sex chromosomes and 9qh+ was most frequent in autosomal chromosomes and observed in 35/941 (3,71%) cases. Analysis of CFTR gene mutation detected 19/154 disorders, from which 6 were severe. Detection of abnormalities allowed us to correct couples follow-up and reduce number of ART failure.