Последовательность нуклеотидов, кодирующая β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans, и генетические конструкции, её содержащие
NUCLEOTIDE SEQUENCE ENCODING β-N-ACETYLHEXOZAAMINIDASE AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS AND GENETIC STRUCTURES CONTAINING IT

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к ферментам, разрушающим биопленку.
Сообщества микроорганизмов, образующих суперструктуры на поверхности раздела фаз и заключенных в синтезируемый матрикс, называют биопленками. В отличие от планктонной формы микроорганизмы в биопленках имеют измененный фенотип. Биопленки могут образовываться на различных органах и тканях в организме человека и животных, а также на корнях и других частях растений. Бактерии, живущие внутри биопленок, проявляют значительно более высокую устойчивость к антибиотикам и другим лекарственным препаратам, что крайне затрудняет борьбу с инфекциями, вызванными различными патогенными бактериями. Среди всех инфекционных поражений около 65-80% вызываются бактериями, формирующими биопленки [Хмель И.А. Биопленки бактерий и связанные с ними трудности медицинской практики. URL: https://img.ras.ru/files/center/biofilms.doc, дата посещения 09.08.2021]. Так например, биопленки, формируемые микроорганизмами Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli обычно вызывают внутрисосудистую катетер-ассоциированную инфекцию, а биопленки Staphylococcus aureus связаны с инфекцией, развивающейся на металлических имплантатах [Е. Barth, Q.M. Myrvik, W.Wagner, A.G. Gristina, In vitro and in vivo comparative colonization of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis on orthopaedic implant materials, Biomaterials 10 (5) (1989) 325-328; J. Dankert, A.H. Hogt, J. Feijen, Biomedical polymers: bacterial adhesion, colonization, and infection, Crit. Rev. Biocompat. 2 (1986) 219-301]. В пищевой промышленности образование биопленок на продуктах повышает риск заражения патогенными микроорганизмами пищи и возникновения в результате этого значимых инфекций у людей. Матрикс микробных биопленок представляет собой сложную гетерогенную структуру, в которую входят белки, нуклеиновые кислоты, липиды, фосфолипиды и другие вещества. Основными компонентами матрикса являются экзогенные полисахариды, синтезируемые микроорганизмами [Karatan, Е. and Watnick, P. Signals, regulatory net works, and materials, that build and break bacterial bio films, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2009, vol. 73, pp. 310-347]. Экзополисахариды (ЭПС) обеспечивают структурную стабильность биопленки, адгезию и агрегацию микроорганизмов, физическую и химическую защиту бактерий от действия противомикробных препаратов и эффекторов иммунной системы макроорганизма. Ферментативная деградация матрикса рассматривается как многообещающий метод разрушения биопленок [Kaplan, J.B. Therapeutic potential of biofilm dispersing enzymes, Appl. Microb. Cell Physiol., 2009, vol. 32, pp. 545-554] для борьбы с микробным заражением и загрязнением. Многообещающими являются биологические методы деструкции биопленок с использованием ферментов, таких как протеазы, дезоксирибонуклеаза и гликозидазы, для гидролиза ЭПС, поскольку без ЭПС клетки бактерий легко доступны для антимикробных агентов.
β-N-ацетилгексозаминидаза, обнаруженная у грамотрицательной факультативно аэробной бактерии из ротовой полости человека Aggregatibacter actinomycetemcomitans, в 2003 году была названа дисперсии Б (DispersinB, DspB) [Kaplan JB, Ragunath С, Ramasubbu N, Fine DH. (2003). Detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans Biofilm Cells by an Endogenous β-Hexosaminidase Activity. J Bacteriol 185: 4693-4698]. Этот фермент специфически гидролизует (β-1,6)-гликозидные связи поли-N-ацетилглюкозамина (PNAG) - полисахарида матрикса биопленки, который обеспечивает межклеточную адгезию и прикрепление к абиотическим поверхностям клеток. Дефицит железа вызывает Fur-опосредованную активацию dspB, позволяя A. actinomycetemcomitans ускользать из окружающей среды с дефицитом железа [Stacy A, Abraham N, Jorth Р, Whiteley М. (2016). Microbial Community Composition Impacts Pathogen Iron Availability during Polymicrobial Infection. PLoS Pathog 12:e1006084]. Гены, гомологичные dspB A. actinomycetemcomitans, присутствуют в геноме нескольких других бактерий, но нет доказательств того, что кодируемые белки являются функциональными ферментами DspB. Однако очищенный фермент DspB способен диспергировать не только предварительно сформированные биопленки А. actinomycetemcomitans, но также и те, которые образованы различными бактериями, продуцирующими PNAG. Хотя в геноме видов Staphylococcus нет гомолога dspB, DspB способствует диспергированию биопленок у штаммов, которые используют PNAG в качестве доминирующего компонента их матрикса [Kaplan JB, Ragunath С, Velliyagounder K, Fine DH, Ramasubbu N. (2004). Enzymatic Detachment of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Antimicrob Agents Chemother 48: 2633-2636; Chaignon P, Sadovskaya I, Ragunah C, Ramasubbu N, Kaplan JB, Jabbouri S. (2007). Susceptibility of staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition. Appl Microbiol Biotechnol 75: 125-132; Izano EA, Amarante MA, Kher WB, Kaplan JB. (2008). Differential Roles of Poly-NAcetylglucosamine Surface Polysaccharide and Extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Biofilms. Appl Environ Microbiol 74: 470-176]. Каплан предположил, что DspB можно использовать в качестве агента для удаления биопленки S. epidermidis с медицинских устройств [Kaplan JB. (2009). Therapeutic potential of biofilm-dispersing enzymes. Int J Artif Organs 32: 545-554]. Комбинация DspB с антисептиками дает синергетическую анти-биопленочную активность широкого спектра действия и антимикробную активность против S. aureus, S. epidermidis и Е. coli in vitro и in vivo [Darouiche RO, Mansouri MD, Gawande PV, Madhyastha S. (2009). Antimicrobial and antibiofilm efficacy of triclosan and DispersinB combination. J Antimicrob Chemother 64: 88-93].
Аминокислотная последовательность DspB расшифрована [GeneBank: AAP31025.1], также известна из уровня техники последовательность гена, кодирующего DspB [патент US7294497B2].
Для производства рекомбинантных ферментов наиболее удобной, изученной и экономически оправданной является бактериальная система на основе штаммов Escherichia coli.
Из патента на изобретение US 7294497 известны аминокислотная последовательность DspB [GeneBank ААР31025.1] и природная последовательность гена, кодирующего дисперсии Б.
Из патента на изобретение US 7989604 известна последовательность нуклеотидов, кодирующая дисперсии Б для экспрессии в Е. coli. Экспрессированный в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) белок характеризуется молекулярной массой 41 кДа. Выход дисперсина Б составил 30 мг белка на литр культуры. Дисперсии Б показал специфичность для гликозидной связи 1→4 β-замещенного N-ацетилглюкозамина. Гликозилгидролазная активность дисперсина Б была оптимальной при рН 5,0, 30°С. Однако сложные рекомбинантные белки, синтезируемые в гетерогенном организме, зачастую формируют не корректную третичную структуру, что снижает их эффективность в дальнейшем или требует дополнительной процедуры фолдинга.
Известно, что для создания штамма, продуцирующего белок интереса наиболее эффективно, применяется биоинформационный метод так называемой кодонной оптимизации, позволяющий добиться высокого выхода чужеродного белка.
Использование кодонной оптимизации для синтеза дисперсина Б в клетках Е. coli известны из уровня техники [Bales Р. (2014) Exopolysaccharide analysis and eps depolymerases as possible biofilm control strategies. Master of Science Thesis at https://drum.lib.umd.edu/handle/1903/15745, дата обращения 27 июля 2021 г.], однако не раскрыта конкретная последовательность нуклеотидов, кодирующая белок интереса.
В целом генетический код консервативен среди организмов. Однако предпочтение кодонов варьируется между организмами: в разных организмах выбор частых и редких синонимичных кодонов различен. В то же время этот выбор более или менее постоянен в разных генах одного генома. Согласно современным данным, использование пар кодонов, которые наиболее распространены для определенного организма, может увеличить скорость синтеза белка на соответствующей мРНК и, как следствие, увеличить уровень синтеза целевого белка [Coleman, J.R., et al., Virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias. Science, 2008. 320(5884): p. 1784-7]. Оптимизация последовательностей ДНК для экспрессии белка в определенном организме выполняется с использованием специализированных программ. Основная идея оптимизации заключается в том, что для кодирования определенной аминокислоты используется кодон, наиболее встречаемый в белок-кодирующих последовательностях данного организма, например, такой механизм заложен в программу OPTIMIZER [, P., et al., OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res, 2007. 35(Web Server issue): p.W126-31]. Для того, чтобы оценить, насколько часто в определенной последовательности используются наиболее распространенные кодоны применяется CAI (Codon Adaptation Index) [Sharp, P.M. and W.H. Li, The codon Adaptation Index-a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic acids research, 1987. 15(3): p.1281-1295]. В широком диапазоне видов и геномов встречаемость пар кодонов смещена, относительно предсказанных значений встречаемости [Boycheva, S., G. Chkodrov, and I. Ivanov, Codon pairs in the genome of Escherichia coli. Bioinformatics, 2003. 19(8): p.987-98]. Поэтому, в ходе оптимизации кроме встречаемости кодонов следует учитывать также и реальную встречаемость пар кодонов. Для этого используется СРВ (Codon Pair Bias), показатель, измеряющий для последовательности частоту встречаемости пар кодонов [, A., et al., Codon optimization: a mathematical programing approach. Bioinformatics, 2020. 36(13): p.4012-4020].
Для оптимизации последовательности ДНК, кодирующей дисперсии В, использовалась программа MaxCPBstCAI [, A., et al., Codon optimization: a mathematical programing approach. Bioinformatics, 2020. 36(13): p.4012-4020]. Данная программа представляет собой Python скрипт, который с помощью библиотеки gurobipy строит математическую модель и находит решение средствами программы для оптимизации Gurobi [Gurobi Optimization, L., Gurobi Optimizer Reference Manual. 2020]. В данной программе модель оптимизируется таким образом, чтобы максимизировать СРВ при CAI, не опускающемся ниже определенного значения.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, являлось получение последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу, для цитоплазматической экспрессии в клетках Е. coli с высокой продуктивностью, то есть с выходом β-N-ацетилгексозаминидазы на уровне не менее 50% от общего количества клеточного белка по данным денситометрии. Еще одной технической задачей было получение рекомбинантного белка, синтезируемого в клетках штамма-продуцента таким образом, чтобы в растворимой форме было не менее 60% белка. Также технической задачей было получение генетической конструкции на основе клеток Escherichia coli, продуцирующей β-N-ацетилгексозаминидазу.
Технический результат достигался созданием последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans (GeneBank AAP31025.1, UniProt Q840G9).
Последовательность нуклеотидов, выбранная из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, была введена в плазмидный экспрессионный вектор рЕТ28а для создания штамма - продуцента β-N-ацетилгексозаминидазы.
R
R
q
S
S
Полученный плазмидный экспрессионный вектор был введен в клетки Е. coli штамма Escherichia coli BL21(DE3) генотип: MiniF lysY (Cam) / fhuA2 lacZ::T7 gene 1 [lon] ompT ahpC gal λatt::pcDsbC (Spec, lacI) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10-Tet)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10-Tet) endA1 Δgor Δ(mcrC-mrr)114::IS10. В результате был получен штамм - продуцент β-N-ацетилгексозаминидазы, который характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих канамицин в концентрации 30 мкг/мл, например, на среде LB. На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Интервал для культивирования - 28-30°С, оптимум роста при 30°C.
Условия хранения штамма:
- замороженным при минус 80°С (до 12 месяцев) в 25%-ном растворе глицерина в питательной среде LB (Бакто-триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, рН 6.8),
Полученные штаммы Е. coli BL21bAcNhis (содержит SEQ ID NO:3) и BL21bAcChis (содержит SEQ ID NO:4) хранятся в коллекции микроорганизмов ООО «Иннова плюс».
Культивирование Escherichia coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis в питательной среде LB с селективным антибиотиком (канамицин, 30 мкг/мл) и последующая индукция 1 мМ ИПТГ позволяют получать рекомбинантную β-N-ацетилгексозаминидазу, слитую с 6xHis-тэгом с целью облегчения очистки и сайтом расщепления TEV протеазой. Взятый за основу для трансформации штамм Е. coli экспрессирует DsbC периплазматическую изомеразу дисульфидной связи. Предполагается, что эта гидрофобная область в этом белке опосредует шаперонные свойства DsbC, ее сверхэкспрессия значительно увеличивает количество правильно свернутого белка in vivo как в периплазме, так и в цитоплазме [Kurokawa Y, Yanagi Н, Yura Т: Overproduction of bacterial protein disulfide isomerase (DsbC) and its modulator (DsbD) markedly enhances periplasmic production of human nerve growth factor in Escherichia coli. J Biol Chem 2001, 276:14393-14399, Jurado P, Ritz D, Beckwith J, de Lorenzo V, Fernandez LA: Production of functional single-chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol 2002, 320:1-10].
Последовательности нуклеотидов по настоящему изобретению были получены известными из уровня техники методами биоинформатики с использованием программного обеспечения Signa1IP v.5.0 и MaxCPBstCAI. Молекулы ДНК с разработанными оптимизированными последовательностями, кодирующие β-N-ацетилгексозаминидазу с сайтами рестрикции и с N- и С-концевым His-тагом, были синтезированы известными из уровня техники способами химико-ферментативного синтеза [Young L, Dong Q. Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res. 2004;32(7):e59. Published 2004 Apr 15. doi:10.1093/nar/gnh058].
Для получения штамма-продуцента была создана векторная конструкция на основе коммерчески доступного плазмидного вектора рЕТ28а (Novagen, Merck). Его схема представлена на Фит.1. Экспрессионные плазмиды серии рЕТ широко используются для получения рекомбинантных белков в Escherichia coli. Штудиер и его коллеги описали первую экспрессионную плазмиду рЕТ более тридцати лет назад [William Studier, F., et al.,Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, in Methods in Enzymology. 1990, Academic Press, p.60-89 и Rosenberg, A.H., et al., Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 1987. 56(1): p.125-135]. Они интегрировали сильный промотор ϕ10 для РНК-полимеразы Т7 (промотор Т7) и терминатор транскрипции Тϕ (терминатор Т7) в каркас плазмиды pBR322 и установили номенклатуру рЕТ (плазмида для экспрессии с помощью РНК-полимеразы Т7). Впоследствии Novagen и Invitrogen расширили серию до 103 уникальных плазмид экспрессии. Эти плазмиды экспрессии поддерживают высокие уровни транскрипции в штаммах Escherichia coli, которые содержат лизогенизированный фрагмент фага DE3, кодирующий РНК-полимеразу Т7 [Rosano, G.L. and Е.А. Ceccarelli, Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol, 2014. 5: p. 172]. Вектор pET28a (Фиг. 1) является одним из самых популярных векторов рЕТ-системы - высокоэффективной системы с отрицательным контролем экспрессии для производства рекомбинантных белков под регуляцией Т7 промотора. Плазмида также содержит ген аминофосфотрансферазы, фосфорилирующей молекулу канамицина, тем самым обеспечивая устойчивость к этому антибиотику, что позволяет проводить селекцию клеток, трансформация которых интересующей конструкцией прошла успешно.
Штаммы - продуценты β-N-ацетилгексозаминидазы Aggregatibacter actinomycetemcomitans получали на основе коммерчески доступного штамма Escherichia coli BL21(DE3). Клетки Е. coli трансформировали плазмидными экспрессионными векторами по настоящему изобретению pET28a-dsp-NHis и pET28a-dsp-CHis с использованием известных из уровня техники методик.
В результате были получены штаммы Е. coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis, экспрессирующие β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans, в которых уровень экспрессии β-N-ацетилгексозаминидазы составляет 50% от общего клеточного белка. При этом штамм BL21bAcNhis содержит 63,8% β-N-ацетилгексозаминидазы в растворимой форме, а штамм BL21bAcChis - 90,6%. Ферментативная активность полученного белка примерно в 7 раз превышает активность, необходимую для разрушения биопленок.
Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 демонстрируется схема структуры вектора рЕТ28а. MCS - сайт множественного клонирования, где KanR - ген устойчивости к канамицину, lacI - ген, кодирующий lac-репрессор, pBR322 ori - последовательность сайта начала репликации из плазмиды pBR322.
На Фиг. 2 представлены данные предсказания отсутствия сигнальных пептидов SignalP 5.0.
На Фиг. 3 демонстрируется аминокислотная последовательность белка β-N-ацетилгексозаминидазы с 6xHis на N-конце (SEQ ID NO: 1). Желтым отмечен 6xHis, серым - линкер, зеленым - сайт расщепления TEV протеазой.
На Фиг. 4 демонстрируется аминокислотная последовательность белка β-N-ацетилгексозаминидазы с 6xHis на С-конце (SEQ ID NO:2). Желтым отмечен 6xHis, серым - линкер, зеленым - сайт расщепления TEV протеазой.
На Фиг. 5 демонстрируется оптимизированная нуклеотидная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на N-конце последовательности (SEQ ID NO:3). Желтым отмечены сайт рестрикции NcoI - XhoI, красным - два стоп кодона.
На Фиг. 6 демонстрируется оптимизированная нуклеотидная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на С-конце последовательности (SEQ ID NO:4). Желтым отмечены сайт рестрикции NcoI - XhoI, красным - два стоп кодона.
На Фиг. 7 демонстрируется электрофореграмма целевого белка β-N-ацетилгексозаминидазы, полученная с помощью вертикального диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. М - Маркер Bio-Rad Precision Plus Protein Dual Color Standards, #1610374, 1-3 - клетки штамма BL21bAcChis, 1 - общий лизат, 2 - растворимая фракция, 3 -нерастворимая фракция; 4-6 - клетки штамма BL21bAcChis, 4 - общий лизат, 5 - растворимая фракция, 6 - нерастворимая фракция. Стрелкой отмечен целевой белковый продукт.
Сущность и промышленная применимость изобретения поясняются следующими примерами:
Пример 1. Получение последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу.
Пример 1.1. Получение кодонно оптимизированной последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу (биоинформатические методы)
В качестве исходной аминокислотной последовательности белка β-N-ацетилгексозаминидазы из Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Dispersin В, DspB) использовали последовательность из базы данных UniProt с идентификационным номером Q840G9.
Анализ последовательности с помощью программы SignalIP v.5.0 [Almagro Armenteros, J.J., Tsirigos, K.D., , С.K. et al. SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks. Nat Biotechnol 37, 420-423 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0036-z] показал, что в ней отсутствуют сигнальные последовательности, подлежащие удалению при дизайне нуклеотидной последовательности (Фиг. 2).
β-N-ацетилгексозаминидаза состоит из 361 аминокислоты, молекулярная масса составляет 40,963 кДа и pI 5,7.
Для облегчения условий очистки β-N-ацетилгексозаминидазы к аминокислотной последовательности был добавлен афинный таг - 6xHis, а за ним последовательность линкера SSGGS и сайт расщепления TEV-протеазой ENLYFQ. Выбор конца, на котором добавляется His-метка, зависит от характеристик белка. Некоторые концы скрыты внутри ядра белка, а другие важны для функциональной активности или структуры белка. В этой связи были сконструированы аминокислотные последовательности с N - и С - концевым His-тагом, представленные на Фиг. 3 (SEQ ID NO:1) и Фиг. 4 (SEQ ID NO:2) соответственно. Молекулярная масса dspB-His равна 43,2 кДа, изоэлектрическая точка - 5,93.
Аминокислотная последовательность была преобразована в нуклеотидную последовательность с учетом кодонового предпочтения Е. coli с помощью программы MaxCPBstCAI [, A., et al., Codon optimization: a mathematical programing approach. Bioinformatics, 2020. 36(13): p.4012-4020].
Дополнительно на 5'- и 3'-концы оптимизированной последовательности были добавлены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции - NcoI и XhoI соответственно. На 3'-конец также добавлены два стоп-кодона для увеличения вероятности терминации трансляции. Полученные последовательности представлены на Фиг. 5 (SEQ ID NO:3) и Фиг. 6 (SEQ ID NO:4).
Пример 1.2. Синтез кодонно оптимизированной последовательности нуклеотидов, кодирующей β-N-ацетилгексозаминидазу
Разработанные оптимизированные последовательности нуклеотидов с N- и С-концевым His-тагом, кодирующие β-N-ацетилгексозаминидазу с сайтами рестрикции, были получены известными из уровня техники способами химико-ферментативного синтеза [Young L, Dong Q. Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res. 2004;32(7):e59. Published 2004 Apr 15. doi:10.1093/nar/gnh058].
Пример 2. Получение штамма - продуцента β-N-ацетилгексозаминидазы
Пример 2.1. Синтез плазмидного экспрессионного вектора.
Для получения штамма-продуцента была создана векторная конструкция на основе коммерчески доступного плазмидного вектора рЕТ28а (Novagen, Merck). Его схема представлена на Фиг. 1. Экспрессионные плазмиды серии рЕТ широко используются для получения рекомбинантных белков в Escherichia coli. Штудиер и его коллеги описали первую экспрессионную плазмиду рЕТ более тридцати лет назад [William Studier, F., et al.,Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, in Methods in Enzymology. 1990, Academic Press, p. 60-89 и Rosenberg, A.H., et al., Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 1987. 56(1): p. 125-135]. Они интегрировали сильный промотор ϕ10 для РНК-полимеразы Т7 (промотор Т7) и терминатор транскрипции Тϕ (терминатор Т7) в каркас плазмиды pBR322 и установили номенклатуру рЕТ (плазмида для экспрессии с помощью РНК-полимеразы Т7). Впоследствии Novagen и Invitrogen расширили серию до 103 уникальных плазмид экспрессии. Эти плазмиды экспрессии поддерживают высокие уровни транскрипции в штаммах Escherichia coli, которые содержат лизогенизированный фрагмент фага DE3, кодирующий РНК-полимеразу Т7 [Rosano, G.L. and Е.А. Ceccarelli, Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol, 2014. 5: p. 172]. Вектор pET28a (Ошибка! Источник ссылки не найден. Фиг. 1) является одним из самых популярных векторов рЕТ-системы - высокоэффективной системы с отрицательным контролем экспрессии для производства рекомбинантных белков под регуляцией Т7 промотора. Плазмида также содержит ген аминофосфотрансферазы, фосфорилирующей молекулу канамицина, тем самым обеспечивая устойчивость к этому антибиотику, что позволяет проводить селекцию клеток, трансформация которых интересующей конструкцией прошла успешно.
Рестрикцию амплифицированного гена с последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 и вектора рЕТ28а проводили в рекомендуемых фирмой-производителем (NEB, США) для выбранных рестриктаз (NcoI -XhoI) буферных растворах в течение 1 часа при 37°С при концентрации рестриктаз равных 5-ти единицам фермента на 1 мкг ДНК. Обработанный рестриктазами целевой ген (SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4) очищали с использованием парамагнитных частиц (Agencourt AMPure ХР, Beckman Coulter Life Sciences). Последовательности целевого гена после этого лигировали в вектор рЕТ28а с использованием лигазы Т4 (NEB, Ipswich, MA). Трансформировали лигированные плазмидные ДНК в электрокомпетентные клетки Escherichia coli DH5alpha (ElectroMAX™ DH5α-E Competent Cells, Thermo Fisher Sci.) методом электропорации с использованием электропоратора GenePulserXcell (Bio-Rad, США). Получение плазмид проводили с использованием набора ZR Plasmid Miniprep - Classic (Zymo Research, США) в соответствии с инструкцией производителя. Выделение плазмидной ДНК из культуры Escherichia coli DH5alpha проводили с использованием набора ZR Plasmid Miniprep-Classic (Zymo Research, США) в соответствии с инструкцией производителя. Плазмидную ДНК выбранных клонов секвенировали по методу Сэнгера ABI и протокола Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing protocol (Applied Biosystems, Life Technologies). В результате были получены два плазмидных экспрессионных вектора, несущих ген β-N-ацетилгексозаминидазы: pET28a-dsp-NHis (содержит SEQ ID NO:3) и pET28a-dsp-CHis (содержит SEQ ID NO:4)
Пример 2.2. Трансформация клеток Е. coli.
Для экспрессии гена β-N-ацетилгексозаминидазы использовали описанные в предыдущем примере плазмидные экспрессионные векторы pET28a-dsp-NHis и pET28a-dsp-CHis, и электрокомпетентные клетки Е. coli BL21(DE3). Трансформацию проводили с помощью аппарата GenePulserXcell (Bio-Rad, США) согласно инструкции производителя. Положительные трансформанты отбирали на агаризованной среде LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина, что гарантировало содержание плазмиды в отобранных колониях.
В результате были получены штаммы Е. coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis, содержащие последовательности SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно. Штаммы хранятся в коллекции микроорганизмов ООО «Иннова плюс».
Пример 3. Получение β-N-ацетилгексозаминидазы.
Пример 3.1. Индукция экспрессии белка β-N-ацетилгексозаминидазы и проверка его растворимости.
600
600
Культивирование Е. coli BL21bAcNhis и BL21bAcChis проводили в питательной среде LB с 0,2% глюкозы и 30 мкг/мл канамицина при 30°С до индукции и при 25°C в течение 16 часов после индукции при 250 об/мин. Начальная плотность засева составляла 0,1 ед. ОП, при достижении оптической плотности 0,5-0,7 ед. ОП вносили индуктор изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации 1 мМ. После культивирования культуральную жидкость центрифугировали при 4800 g и 4°С. Осадок замораживали при минус 80°С в течение 40-60 минут. После чего клетки разрушали лизирующим буфером (20 мМ Tris-НС1, рН 8,0) в соотношении 1:10. Полученную суспензию гомогенизировали ультразвуком и получали общий лизат, отбирали пробу для вертикального диск-электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Лизат центрифугировали при 10000 g и 4°С в течение 45 минут. Из супернатанта (растворимая фракция) отбирали пробу для электрофореза. Осадок вновь обрабатывали лизирующим буфером в соотношении 1:10 и центрифугировали при 10000 g и 4°С в течение 45 минут. После центрифугирования осадок смешивали с лизирующим буфером в соотношении 1:10 (нерастворимая фракция) и отбирали пробу для электрофореза. Затем проводили вертикальный диск-электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с использованием прибора Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, США) при следующих условиях: напряжение 200 B в течение 40±5 минут. Результаты анализировали денситометрическим методом в программе TotalLab v2.01 (Фиг. 7). В результате анализа было выявлено, что уровень экспрессии β-N-ацетилгексозаминидазы составляет 50% от общего клеточного белка. В случае экспрессии гена β-N-ацетилгексозаминидазы с С-концевым His тагом в растворимой форме присутствовало 90,6% целевого белка, а при экспрессии гена β-N-ацетилгексозаминидазы с N-концевым His тагом - 63,8% целевого белка.
Пример 4. Свойства β-N-ацетилгексозаминидазы.
Активность полученного фермента была измерена с использованием раствора субстрата, содержащего 5 мМ 4-нитрофенил-N-ацетил-бета-D-галактозаминида, 50 мМ натрий фосфатного буфера с рН 6,0 и 100 мМ хлорида натрия. 10 мкл фермента добавляли к 200 мкл раствора субстрата и инкубировали 10 мин при температуре 40°С в термостатируемом шейкере для микротитровальных планшетов. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл 10 М гидроксида натрия. Результаты оценивали с использованием планшетного спектрофотометра при длине волны 405 нм. 1 единица активности фермента (U) оценивается как количество фермента, катализирующего образование 1 цмоль натрия п-нитрофенолята в течение 1 мин при описанных условиях реакции.
Активность полученного фермента составила 2,78±0,17 U/мг. Для разрушения биопленок, образуемых Staphylococcus aureus, достаточно 0,4 U/мл активности фермента.
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Последовательность нуклеотидов, кодирующая β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans, и генетические конструкции, ее содержащие» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.
--->
Перечень последовательностей нуклеотидов и аминокислот
<110> Общество с ограниченной ответственностью «Иннова плюс»
Innova plus LLC
<120> Последовательность нуклеотидов, кодирующая
β-N-ацетилгексозаминидазу Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
и генетические конструкции, её содержащие
<130>
<160> 4
<210> 1
<211> 381
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(381)
<223> Аминокислотная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы
с 6×His на N-конце
<400> 1
Met Gly His His His His His His Ser Ser Gly Gly Ser Glu Asn Leu
1               5                  10                  15
Tyr Phe Gln Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro Gln
20                  25                  30
Lys Thr Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg His
35                  40                  45
Phe Tyr Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser Leu
50                  55                  60
Ser Gly Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Ala Ile Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val Gln
85                  90                  95
Gly Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu
100                 105                 110
Ser Tyr Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly
115                 120                 125
Ile Glu Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala Ile
130                 135                 140
Phe Lys Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly Leu
145                 150                 155                 160
Lys Ser Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp Ser
165                 170                 175
Ile Thr Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe Gly
180                 185                 190
Asp Thr Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser
195                 200                 205
Val Glu Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr
210                 215                 220
Phe Leu Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu
225                 230                 235                 240
Ile Lys Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr Tyr
245                 250                 255
Trp Ser Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg
260                 265                 270
Arg Asp Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr
275                 280                 285
Val Leu Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala Ser
290                 295                 300
Pro Thr Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile Lys
305                 310                 315                 320
Asn Trp Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Val
325                 330               335
Gln Asn Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly Glu
340                 345                 350
Asp Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys Ser
355                 360                 365
Leu Leu Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu***
370                 375                 380 381
<210> 2
<211> 380
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(380)
<223> Аминокислотная последовательность β-N-ацетилгексозаминидазы
с 6×His на С-конце
<400> 2
Met Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro Gln Lys Thr
1               5                  10                  15
Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg His Phe Tyr
20                  25                  30
Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser Leu Ser Gly
35                  40                  45
Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr Ala Ile
50                  55                  60
Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val Gln Gly Lys
65                  70                  75                  80
Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu Ser Tyr
85                  90                  95
Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly Ile Glu
100                 105                 110
Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala Ile Phe Lys
115                 120                 125
Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly Leu Lys Ser
130                 135                 140
Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp Ser Ile Thr
145                 150                 155                 160
Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe Gly Asp Thr
165                 170                 175
Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser Val Glu
180                 185                 190
Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr Phe Leu
195                 200                 205
Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu Ile Lys
210                 215                 220
Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr Tyr Trp Ser
225                 230                 235                 240
Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg Arg Asp
245                 250                 255
Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr Val Leu
260                 265                 270
Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala Ser Pro Thr
275                 280                 285
Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile Lys Asn Trp
290                 295                 300
Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Val Gln Asn
305                 310                 315                 320
Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly Glu Asp Ala
325                 330               335
Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys Ser Leu Leu
340                 345                 350
Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
355                 360                 365
Gly Ser Ser Gly Gly Ser His His His His His His***
370                 375                 380
<210> 3
<211> 1157
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(1157)
<223> Оптимизированная нуклеотидная последовательность
β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на N-конце последовательности
<400> 3
CC ATG GGG CAT CAT CAT CAT CAT CAC TCC AGC GGC GGC AGT GAA AAT 47
Met Gly His His His His His His Ser Ser Gly Gly Ser Glu Asn
1               5                  10                  15
CTC TAT TTC CAG GGC AAC TGC TGC GTG AAA GGC AAC AGC ATT TAT CCG 95
Leu Tyr Phe Gln Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro
20                  25                  30
CAA AAA ACA TCA ACA AAG CAA ACC GGG CTG ATG CTC GAT ATC GCC AGA 143
Gln Lys Thr Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg
35                  40                  45
CAT TTC TAC AGC CCG GAA GTG ATT AAA AGT TTT ATC GAC ACC ATC AGC 191
His Phe Tyr Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser
50                  55                  60
CTT TCC GGC GGT AAC TTC CTG CAT CTG CAT TTC TCT GAC CAT GAA AAC 239
Leu Ser Gly Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn
65                  70                  75
TAC GCC ATT GAA AGC CAT TTG CTC AAT CAG CGG GCA GAA AAC GCC GTT 287
Tyr Ala Ile Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val
80                  85                  90                  95
CAG GGA AAA GAC GGT ATT TAT ATC AAT CCT TAC ACC GGT AAA CCG TTC 335
Gln Gly Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe
100                 105                 110
CTC TCT TAT CGC CAG CTT GAT GAT ATC AAA GCC TAT GCC AAA GCG AAA 383
Leu Ser Tyr Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys
115                 120                 125
GGG ATT GAG CTG ATT CCT GAA CTC GAC AGC CCG AAC CAT ATG ACC GCC 431
Gly Ile Glu Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala
130                 135                 140
ATT TTC AAA CTG GTG CAA AAA GAT CGC GGC GTG AAA TAT TTG CAG GGG 479
Ile Phe Lys Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly
145                 150                 155
CTG AAA TCG CGC CAG GTT GAT GAT GAA ATT GAT ATC ACC AAC GCC GAC 527
Leu Lys Ser Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp
160                 165                 170                 175
AGC ATC ACC TTT ATG CAG TCG CTG ATG AGT GAA GTG ATT GAT ATT TTT 575
Ser Ile Thr Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe
180                 185                 190
GGC GAT ACC AGC CAG CAT TTC CAT ATT GGC GGC GAT GAG TTT GGT TAC 623
Gly Asp Thr Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr
195                 200                 205
AGC GTT GAA AGT AAT CAT GAG TTT ATC ACT TAC GCC AAT AAA CTC TCT 671
Ser Val Glu Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser
210                 215                 220
TAT TTC CTG GAA AAA AAA GGG CTG AAA ACG CGG ATG TGG AAC GAC GGT 719
Tyr Phe Leu Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly
225                 230                 235
TTG ATT AAA AAT ACC TTT GAG CAA ATC AAC CCG AAT ATT GAA ATC ACT 767
Leu Ile Lys Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr
240                 245                 250                 255
TAC TGG AGT TAT GAC GGC GAT ACC CAG GAT AAA AAT GAA GCG GCA GAG 815
Tyr Trp Ser Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu
260                 265                 270
CGT CGC GAT ATG CGC GTT TCG CTG CCG GAA CTG CTG GCG AAA GGT TTT 863
Arg Arg Asp Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe
275                 280                 285
ACC GTG CTG AAC TAC AAC AGC TAT TAT CTC TAT ATC GTT CCG AAA GCC 911
Thr Val Leu Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala
290                 295                 300
TCG CCA ACC TTC AGC CAG GAT GCG GCA TTT GCC GCA AAA GAT GTT ATC 959
Ser Pro Thr Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile
305                 310                 315
AAA AAC TGG GAT CTC GGC GTC TGG GAT GGC AGA AAT ACC AAA AAC CGG 1007
Lys Asn Trp Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg
320                 325                 330                 335
GTA CAA AAT ACC CAT GAA ATC GCC GGG GCG GCG CTT TCC ATC TGG GGA 1055
Val Gln Asn Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly
340                 345                 350
GAA GAT GCG AAA GCG CTG AAA GAT GAA ACC ATT CAG AAA AAT ACC AAA 1103
Glu Asp Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys
355                 360                 365
TCG CTG CTG GAA GCG GTG ATT CAT AAA ACC AAC GGC GAT GAA TAA TGA 1151
Ser Leu Leu Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu
370                 375                 380 381
CTC GAG 1157
<210> 4
<211> 1154
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<222> (1)…(1154)
<223> Оптимизированная нуклеотидная последовательность
β-N-ацетилгексозаминидазы с His-tag на C-конце последовательности
<400> 4
CC ATG GGG AAC TGC TGC GTG AAA GGC AAC AGC ATT TAT CCG CAA AAA 47
Met Gly Asn Cys Cys Val Lys Gly Asn Ser Ile Tyr Pro Gln Lys
1               5                  10                  15
ACA TCA ACA AAG CAA ACC GGG CTG ATG CTC GAT ATC GCC AGA CAT TTC 95
Thr Ser Thr Lys Gln Thr Gly Leu Met Leu Asp Ile Ala Arg His Phe
20                  25                  30
TAC AGC CCG GAA GTG ATT AAA AGT TTT ATC GAC ACC ATC AGC CTT TCC 143
Tyr Ser Pro Glu Val Ile Lys Ser Phe Ile Asp Thr Ile Ser Leu Ser
35                  40                  45
GGC GGT AAC TTC CTG CAT CTG CAT TTC TCT GAC CAT GAA AAC TAC GCC 191
Gly Gly Asn Phe Leu His Leu His Phe Ser Asp His Glu Asn Tyr Ala
50                  55                  60
ATT GAA AGC CAT TTG CTC AAT CAG CGG GCA GAA AAC GCC GTT CAG GGA 239
Ile Glu Ser His Leu Leu Asn Gln Arg Ala Glu Asn Ala Val Gln Gly
65                  70                  75
AAA GAC GGT ATT TAT ATC AAC CCT TAC ACC GGT AAA CCG TTC CTC TCT 287
Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Phe Leu Ser
80                  85                  90                  95
TAT CGC CAG CTT GAT GAT ATC AAA GCC TAT GCC AAA GCG AAA GGG ATT 335
Tyr Arg Gln Leu Asp Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Gly Ile
100                 105                 110
GAG CTG ATT CCT GAA CTC GAC AGC CCG AAC CAT ATG ACC GCC ATT TTC 383
Glu Leu Ile Pro Glu Leu Asp Ser Pro Asn His Met Thr Ala Ile Phe
115                 120                 125
AAA CTG GTG CAA AAA GAT CGC GGC GTG AAA TAT TTG CAG GGG CTG AAA 431
Lys Leu Val Gln Lys Asp Arg Gly Val Lys Tyr Leu Gln Gly Leu Lys
130                 135                 140
TCG CGC CAG GTT GAT GAT GAA ATT GAT ATC ACC AAC GCC GAC AGC ATC 479
Ser Arg Gln Val Asp Asp Glu Ile Asp Ile Thr Asn Ala Asp Ser Ile
145                 150                 155
ACC TTT ATG CAG TCG CTG ATG AGT GAA GTG ATT GAT ATT TTT GGC GAT 527
Thr Phe Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Val Ile Asp Ile Phe Gly Asp
160                 165                 170                 175
ACC AGC CAG CAT TTC CAT ATT GGC GGC GAT GAG TTT GGT TAC AGC GTT 575
Thr Ser Gln His Phe His Ile Gly Gly Asp Glu Phe Gly Tyr Ser Val
180                 185                 190
GAA AGT AAT CAT GAG TTT ATC ACT TAC GCC AAT AAA CTC TCT TAT TTC 623
Glu Ser Asn His Glu Phe Ile Thr Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Tyr Phe
195                 200                 205
CTG GAA AAA AAA GGG CTG AAA ACG CGG ATG TGG AAC GAC GGT TTG ATT 671
Leu Glu Lys Lys Gly Leu Lys Thr Arg Met Trp Asn Asp Gly Leu Ile
210                 215                 220
AAA AAT ACC TTT GAG CAA ATC AAC CCG AAT ATT GAA ATC ACT TAC TGG 719
Lys Asn Thr Phe Glu Gln Ile Asn Pro Asn Ile Glu Ile Thr Tyr Trp
225                 230                 235
AGT TAT GAC GGC GAT ACC CAG GAT AAA AAT GAA GCG GCA GAG CGT CGC 767
Ser Tyr Asp Gly Asp Thr Gln Asp Lys Asn Glu Ala Ala Glu Arg Arg
240                 245                 250                 255
GAT ATG CGC GTT TCG CTG CCG GAA CTG CTG GCG AAA GGT TTT ACC GTG 815
Asp Met Arg Val Ser Leu Pro Glu Leu Leu Ala Lys Gly Phe Thr Val
260                 265                 270
CTG AAC TAC AAC AGC TAT TAT CTC TAT ATC GTT CCG AAA GCC TCG CCA 863
Leu Asn Tyr Asn Ser Tyr Tyr Leu Tyr Ile Val Pro Lys Ala Ser Pro
275                 280                 285
ACC TTC AGC CAG GAT GCG GCA TTT GCC GCA AAA GAT GTT ATC AAA AAC 911
Thr Phe Ser Gln Asp Ala Ala Phe Ala Ala Lys Asp Val Ile Lys Asn
290                 295                 300
TGG GAT CTC GGC GTC TGG GAT GGC AGA AAT ACC AAA AAC CGG GTA CAA 959
Trp Asp Leu Gly Val Trp Asp Gly Arg Asn Thr Lys Asn Arg Val Gln
305                 310                 315
AAT ACC CAT GAA ATC GCC GGG GCG GCG CTT TCC ATC TGG GGA GAA GAT 1007
Asn Thr His Glu Ile Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Trp Gly Glu Asp
320                 325                 330               335
GCG AAA GCG CTG AAA GAT GAA ACC ATT CAG AAA AAT ACC AAA TCG CTG 1055
Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Thr Ile Gln Lys Asn Thr Lys Ser Leu
340                 345                 350
CTG GAA GCG GTG ATT CAT AAA ACC AAC GGC GAT GAA AAT CTC TAT TTC 1103
Leu Glu Ala Val Ile His Lys Thr Asn Gly Asp Glu Asn Leu Tyr Phe
355                 360                 365
CAG GGT TCT TCC GGC GGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA TGA CTC 1151
Gln Gly Ser Ser Gly Gly Ser His His His His His His
370                 375                 380
GAG 1154
<---