СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА БОБОВНИКА АНАГИРОВИДНОГО
METHOD OF PRODUCING PLANTING MATERIAL OF BOBOVNIK ANAGYROID

Изобретение относится к области биотехнологии и репродуктивной биологии растений, а именно для массового получения посадочного материала, и может быть использовано в биотехнологии, декоративном озеленении, интродукции, а также в целях сохранения генетических ресурсов и биологического разнообразия видов. Способ предназначен для регенерации растений семейства Бобовых, семенное размножение которых затруднено вследствие явления твердосемянности (состояния физического покоя).
Известен способ регенерации растений для получения посадочного материала бобовника с помощью культуры in vitro (Timofeeva SN, Elkonin LA, Tyrnov VS Micropropagation of Laburnum anagyroides Medic. through axillary shoot regeneration // In Vitro Cell.Dev.Biol.—Plant, 2014, v.50 , pp. 561–567), заключающийся в активации роста и развития побегов из уже существующих меристем вегетативных почек, включающий в себя несколько последовательных этапов.  Для инициации культуры in vitro поверхностно простерилизованные изолированные почки помещали на питательную среду, содержащую минеральные соли и витамины по прописи среды Мурасиге и Скуга (MS), сахарозу (20 г/л) и агар (7 г/л); с добавлением фитогармона 6-БАП (2.2 μМ). Через 2 недели культивирования активно растущие экспланты переносили на среду для пролиферации, отличающуюся от исходной среды сниженной до Ѕ концентрации минеральных солей по MS. Через 6-8 недель культивирования на этой среде из каждой почки развивался пучок из нескольких побегов длиной 3-7 мм. Побеги длиной ≥ 5 мм отделяли от пучка и субкультивировали на свежеприготовленной среде до получения нового пучка побегов. Такой цикл микроразмножения повторяли несколько раз с регулярными пересадками через каждые 6-8 недель. После получения достаточного количества экспериментального материала отбирали побеги длиной  ≥ 10 мм, состоящие из 3-4 междоузлий, переносили на среду для укоренения, отличающуюся от среды для пролиферации сниженной концентрацией минеральных солей (¼ MS) и сахарозы (10 г/л). Для стимуляции ризогенеза в среду добавляли ауксин НУК (2.7 μМ). Полученные корнесобственные растения высаживали в стаканчики с почвенным субстратом и помещали в теплицу. Через 1-2 месяца, после адаптации к нестерильным условиям, растения высаживали в полевые условия.
Однако недостатком данного способа является то, что на успешность получения культур in vitro влияет сезон эксплантирования. Кроме того, хотя частота инициации достигала 70-75%, в процессе дальнейшего культивирования не все инициированные экспланты продуцировали интенсивно растущие культуры с высоким регенерационным потенциалом. Ограничивает применение данного способа также длительность процесса получения стабильно пролиферирующих культур (около 6 месяцев) и невысокий коэффициент размножения (каждый эксплант продуцировал не более 1-2 побегов длиной ≥ 10 мм, пригодных для последующего укоренения). Кроме того, при длительном культивировании скорость размножения уменьшалась, появлялись морфологически измененные побеги, усиливался каллусогенез.
2
4
Известен также способ получения сеянцев Бобовника ангировидного путем обработки семян концентрированной серной кислотой HSO в течение 0,5-1 часов.
Однако работы с серной кислотой требует осторожности, так как она небезопасна для исполнителя работ.
2
4
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ регенерации древесного растения из сем. Бобовые  Albizia odoratissima в культуре in vitro (Rajeswari V., Paliwal K. In vitro adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from seedling explants of Albizia odoratissima L.f. (Benth.)// In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 2008, v.44, pp. 78-83), в соответствии с которым семена альбиции предварительно выдерживали 15 мин в 1N HSO, после чего поверхностно стерилизовали и помещали на среду для проращивания, содержавшую Ѕ минеральных солей по MS, сахарозу (30 г/л) и агар (8 г/л), без добавления фитогормонов. Из развившихся сеянцев выделяли эпикотили, которые культивировали на среде MS с добавлением БАП (5-10 μМ) для индукции органогенного каллуса и последующего развития побегов. Полученные побеги индивидуально переносили на среду MS с добавлением НУК (25 μМ), где их выдерживали 24 часа для стимуляции ризогенеза. После этого побеги культивировали на среде того же состава, но без НУК. Полученные корнесобственные растения были акклиматизированы в стерильном вермикулите, после чего высажены в почву.
2
4
Недостатками данного способа являются многоэтапность получения корнесобственных растений, что требует большого количества реактивов и увеличивает продолжительность процесса получения растений-регенерантов. В указанном способе присутствует этап каллусообразования, который повышает вероятность самоклональной изменчивости в полученном потомстве.  Кроме того, работа с 1N HSO требует осторожности, так как она небезопасна для исполнителя работ.
Задача настоящего изобретения является разработка способа получения корнесобственных растений (саженцев/посадочного материала) Бобовника анагировидного.
Технический результат заключается в упрощении, сокращении трудоемкости и длительности процесса получения посадочного материала.
°
Поставленная задача достигается тем, что в способе регенерации растений  семейства Бобовых в культуре in vitro, включающем предварительную обработку сухих семян, поверхностную стерилизацию  и культивирование на питательной среде для проращивания, согласно решению, в качестве растения выбирают  Бобовник анагировидный, предварительную обработку осуществляют горячей водой при температуре от 90-100C, культивирование осуществляют в течение 3-4 недель, после чего развившиеся проростки высаживают в стаканчики с почвенным субстратом и помещают в микропарник для адаптации к нестерильным условиям.
Питательная среда может содержать минеральные соли и витамины по MS, 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара, и дополнительно  2.2 μМ БАП. В качестве питательной среды может быть выбрана  среда WPM с добавлением 2.2 μМ БАП.
2
4
В микропарнике постепенно снижают влажность, после появления новых листочков (через 4-6 недель) сеянцы пригодны для пересадки и выращивания в полевых условиях. Новизна предлагаемого решения заключается в том, что семена обрабатывают горячей водой, а не HSO для получения проростков, исключается многоэтапность, присущая прототипу, длительность получения сеянцев снижается до 7-10 недель.
Предлагаемое изобретение поясняется чертежами: на Фиг.1 – представлены проростки Бобовника, развившиеся при культивировании в условиях in vitro; на Фиг.2 – адаптированные к нестерильным условиям сеянцы бобовника,
где: 1 – проростки Бобовника, развившиеся через 3 недели культивирования на среде MS с добавлением 2.2 µМ БАП (слева – предобработка сухих семян кипятком, справа – контроль, без предобработки);
2 – адаптированные к нестерильным условиям сеянцы Бобовника,
слева – через 2 недели после высадки в почву, справа – через 2 месяца после высадки в почву и выращивания в теплице.
Способ получения сеянцев (посадочного материала) бобовника анагировидного заключается в следующем:
Сухие семена бобовника помещают в мерный стакан (200 мл), заливают кипящей водой (100 мл) и оставляют на 20-30 мин до остывания воды. После этого семена раскладывают в марлевые мешочки  по 30 штук, помещают в 1% раствор СМС (синтетическое моющее средство, например «Биолан»), где выдерживают 15 мин при постоянном помешивании, после чего промывают от следов СМС проточной водой (15-20 мин). Поверхностную стерилизацию проводят по общепринятой методике: мешочки с растительным материалом погружают на 1 мин в 70%-ный спирт, затем помещают на 15 мин в 0.1%-ный раствор сулемы, после чего трижды промывают стерильной автоклавированной водой. В стерильных условиях ламинара простерилизованные семена помещают на поверхность питательной среды для проращивания, содержавшей минеральные соли и витамины по MS, сахарозу (20 г/л) и агар (7 г/л), с добавлением БАП (2.2 µМ) и выращивают на свету (фотопериод 16 час / 8 час). Через 3-4 недели культивирования, после появления первого настоящего листа, развившиеся проростки высаживают в стаканчики с почвенным субстратом и помещают в микропарник для адаптации к нестерильным условиям. Через 4-6 недель сеянцы пригодны для пересадки в грунт и выращивания в полевых условиях.
Пример практической реализации способа получения сеянцев Бобовника анагировидного.
Для осуществления предлагаемого способа в качестве донорного растения использовали экземпляр Laburnum anagyroides, выращиваемый в полевых условиях дендрария Ботсада СГУ (г. Саратов). В работе использовали семена, собранные в сентябре 2010 и 2011 гг.
2
4
Преодоление физического покоя семян при проращивании. Семена бобовника на последних фазах созревания и во время хранения постепенно теряют как собственную влагу, так и способность поглощать водяные пары из воздуха. В результате формируется полная водонепроницаемость семенной кожуры, так называемая «твердосемянность» (или состояние физического покоя), значительно осложняющая прорастание семян. Из литературы известны различные методы преодоления физического покоя семян: скарификация, намачивание семян в кипятке, обработка концентрированной HSOили промораживание. Современные методы стимуляции прорастания покоящихся семян  - обработка семян физиологически активными веществами или проращивание на питательных средах в стерильных условиях (Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян// Ленинград: изд-во «НАУКА», 1985 – 245 с.).
Были исследованы три варианта температурной предобработки семян:
°
• Промораживание, когда сухие семена помещали в морозильную камеру при температуре -18С на 1 месяц, после чего их вводили в стерильную культуру;
• Обработка горящей водой, преимущественно кипятком; введение в стерильную культуру.
• Промороженные семена обрабатывали горячей водой и введение в стерильную культуру. Полученные экспериментальные результаты отражены в Таблице 1.
После выявления факторов, влияющих на преодоление «твердосемянности» были сравнительно изучены условия проращивания семян in vivo (почвенный субстрат) и in vitro (среда MS + 0.5 мг/л 6-БАП). Полученные экспериментальные результаты отражены в Таблице 2.
Таблица 1. Влияние температурной предобработки семян на их приживаемость в стерильной культуре (%) через 4 недели первичного культивирования на средах различного состава
Примечание: изучено 3 повторности по 15-20 штук;* р ≤ 0.05; ns – нет достоверной разницы; варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, различаются незначимо по критерию Дункана.
Таблица 2. Влияние предобработки и условий проращивания семян на число проростков Бобовника анагировидного (%) через 1 месяц выращивания
Примечание: изучено 3 повторности по 10-15 штук; * р ≤ 0.05; варианты, сопровождаемые одинаковыми латинскими буквами, различаются незначимо по критерию Дункана.
°
°
Статистически достоверно было выявлено, что наиболее эффективной предобработкой семян была обработка горячей водой 80.8. Таким образом, согласно предлагаемому способу обработку сухих семян горячей водой необходимо проводить именно кипятком (90-100С) с последующей выдержкой их до остывания воды до комнатной температуры (20-30 мин). При кратковременном ошпаривании семян в кипятке (2-3 мин) частота прорастания семян была меньшей по сравнению с выдерживанием семян в горячей воде до остывания. Если уменьшали время выдержки семян в остывающей воде, число проросших семян также уменьшалось. Если замачивание кипятком сопровождалось последующей выдержкой 20-30 мин при постоянной высокой температуре (50-60С) наблюдали значительное ухудшение качества проростков.
В этой связи при использовании данного способа процесс тепловой обработки необходимо проводить в указанном температурном и временном диапазоне.
Упрощение способа достигается за счет исключения этапов мультипликации и укоренения микропобегов.