Биологические свойства гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

1 ’2011

Биологические свойства гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

С.А. Румянцев, Е.Ю. Осипова, С.Е. Ипатов, Т.В. Шаманская, О.А. Майорова, А.Г. Румянцев

ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, Москва

Контакты: Сергей Александрович Румянцев s.roumiantsev@niidg.ru

Обзор литературы посвящен анализу эволюции изучения пуповинной крови как источника гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации. Поэтапно описано развитие технологий определения и выделения стволовых клеток, оценки их способности к пролиферации и дифференцировке и функциональных характеристик с помощью методов культивирования in vitro и с помощью выращивания in vivo на животных моделях. Описаны различия стволовых клеток пуповинной крови в сравнении с другими тканевыми источниками. Показана роль микроокружения для самообновления и дифференцировки стволовых клеток. Исследованы возможности моделирования биологических свойств стволовых клеток на примере использования векторной конструкции на основе вируса иммунодефицита человека 1 типа, содержащей гены Notch, для регулирования пролиферации CD133+ и CD34+ гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека.

Ключевые слова: гемопоэтические стволовые клетки, пуповинная кровь, CD133+ клетки, CD34+ клетки

Biological properties of cord blood hematopoietic stem cells

S.A. Rumiantsev, E.Yu. Osipova, S.E. Ipatov, T.V. Shamanskaya, O.A. Mayorova, A.G. Rumyantsev Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow

This article provides an overview of research evolution of umbilical cord blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation. Phased developments of the technology of stem cells detection and selection, their proliferation, differentiation and function assessment using cultivation in vitro and in vivo in animal model was described. Differences of cord blood stem cells in comparison with those from other sources were described. The role of microenvironment for stem cells self-renewal and differentiation is shown. The possibility of stem cells biological properties modeling on example of using a vector based on HIV type 1 containing Notch genes, to regulate CD133+ and CD34+ cord blood stem cells proliferation is shown.

Key words: hematopoietic stem cells, cord blood, CD133+ cells, CD34+ cells

Первая трансплантация клеток пуповинной крови была проведена в октябре 1988 г. Реципиент — 6-летний мальчик, которому ввели пуповинную кровь его сестры [1], — лечился по поводу гематологических проявлений анемии Фанкони, выжил и хорошо себя чувствовал более 16 лет после трансплантации. Эта операция, так же как и последующие трансплантации пуповинной крови по поводу анемии Фанкони [2—4], ювенильного хронического миелолейкоза [5] и других злокачественных и незлокачественных заболеваний [6] проводились клетками от Н^-совместимого донора-сиблинга. До настоящего времени было проведено более 8000 родственных и неродственных трансплантаций, при которых использовалась полностью (шесть шестых) или частично (пять шестых, четыре шестых и три шестых) Н^-совместимая пуповинная кровь [1—6]. Клинические результаты обнацеживают, и нет сомнений, что пуповинная кровь содержит долго жи-

вущие, способные восстанавливать популяцию костного мозга, стволовые клетки. Они могут быть использованы для лечения ряда злокачественных и незлокачественных заболеваний.

Однако существует ряд проблем, которые необходимо преодолеть для частого использования трансплантаций пуповинной крови у взрослых и детей с большей массой тела. Большинство процедур трансплантаций пуповинной крови проведено у детей, и, хотя описано успешное приживление у взрослых и детей с большой массой тела, количество клеток, собранных при одной процедуре сбора пуповинной крови, рассматривается недостаточным для большинства взрослых.

Усилия исследователей были направлены на компенсацию лимитирующего количества собранных клеток пуповинной крови. Среди них попытки ex vivo экспансии гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из пуповинной крови. Клинические экс-

перименты в направлении ex vivo экспансии стволовых клеток не внушают оптимизма, что связано с решением вопроса, можно ли подвергнуть экспансии или даже поддерживать жизнедеятельность клеток, обладающих долговременной способностью восстанавливать популяцию клеток костного мозга, при условиях культивирования, которые, как известно, необходимы для экспансии более зрелых пролиферирующих клеток в пределах категории стволовых клеток. Для продвижения вперед исследований по ex vivo экспансии, без сомнения, необходимо лучшее понимание ростовых характеристик стволовых клеток и того, что регулирует их пролиферацию, самообновление и выживаемость.

Продукция клеток крови представляет собой иерархию стволовых и коммитированных клеток-предшественников, продуцируемую конвейерным способом [7]. Самые ранние, наиболее незрелые клетки имеют наибольший потенциал самообновления и долговременную способность к восстановлению популяции костного мозга. В популяции стволовых клеток существуют и другие клетки, но они имеют меньшую способность к самообновлению или существуют среди компартмента впоследствии развивающихся клеток-предшественников. Эти клетки обладают кратковременной способностью к восстановлению популяции костного мозга. В костном мозге взрослых стволовые клетки и клетки-предшественники присутствуют в концентрации менее чем 1/1000 — 1/10 000, но, вероятно, в пуповинной крови их концентрация несколько больше [8]. В настоящее время имеется 2 пути для характеристики ГСК и клеток-предшественников. Один путь — с помощью фенотипических маркеров, которые распознают компоненты поверхности клеток, например, антигены кластеров дифферен-цировки (cluster of differentiation antigens — CD). Однако фенотип не всегда повторяет функцию клеток, особенно после их культивирования ex vivo. Другим путем является характеристика этих клеток через функциональную активность — способность стволовых и клеток-предшественников формировать потомство.

Фенотип, оцененный с помощью поверхностных

клеточных маркеров

Наиболее используемым фенотипическим маркером для человеческих стволовых и клеток-предшественников является CD34 — гликофосфо-протеин [9, 10], однако о его функции известно очень немного. Хотя CD34 и используется в качестве важного клинического маркера ГСК, он также найден на клетках, которые не являются стволовыми или клетками-предшественниками (например, эндотелиальные клетки) [11]. Само по себе наличие CD34 не отличает стволовые клетки от клеток-предшественников, или даже подтипы клеток в пределах категории ство-

ловых или клеток-предшественников, хотя распределение плотности CD34 антигенов на поверхности клеток иногда используется в этом отношении. Клетки, экспрессирующие наибольшую плотность CD34 антигена (CD34+++), соответствуют популяции клеток, высоко обогащенной самыми ранними клетками [10]. Для оценки степени зрелости клетки используются и другие поверхностные клеточные маркеры, включая CD38 [12], Thyl [13], c-kit [14] и Flt3/Flk-2 [15, 16], а также суправитальная окраска родамином-123 [17, 18]. Комбинированное использование этих маркеров является наиболее информативным для определения подтипов стволовых и клеток-предшественников. Так, CD34+-клетки, являющиеся также CD38-, Thy1low, c-kit+, Flt3+ и/или родамин-123101'', рассматриваются как наиболее ранние клетки в процессе развития. Популяция CD34+CD38+-клеток содержит более зрелые клетки-предшественники, чем те, которые найдены в CD34+CD38--популяции. Фенотипическое считывание клеточных типов является более быстрым, чем функциональные исследования, например, измерение пролиферативной способности. Кроме того, фенотипирование служит важным инструментом для физической сепарации и очистки популяций и субпопуляций этих клеток, однако фенотипирование имеет свойственные ему ограничения. Фенотип не обеспечивает достоверной информации относительно способности клеток к самообновлению, пролиферации или дифференци-ровке, если фенотипический анализ не проводится в комбинации с функциональным исследованием клеток в пределах типируемой популяции, кроме того, фенотипы не всегда устойчиво экспрессируются. Отмечено, что ГСК и клетки-предшественники могут также быть найдены в популяции CD34--клеток [1921]. Ситуация относительно CD34+ против CD34- характеристик стволовых и клеток-предшественников осложняется индуцируемостью и вариабельностью CD34-антигенов на клетках [22]. Кроме того, после проведения экспансии ex vivo многие предшественники не экспрессируют CD34-антигены [23]. Фенотипические маркеры полезны, пока исследователи учитывают ограничения в их использовании. Стволовые и клетки-предшественники в свежевыделенной пуповинной крови экспрессируют, вероятно, главным образом те же фенотипические маркеры, как и эти клетки в костном мозге взрослых, исключая экспрессию HLA-DR-антигенов, которая, вероятно, отсутствует или экспрессируется на очень низком уровне на примитивных клетках костного мозга, но высоко экспрессируется на примитивных клетках пуповинной крови [17, 24].

Молекулярное фенотипирование стволовых и клеток-предшественников находится в процессе разработки [25—28] и может, в конечном итоге, позволить более точную характеристику, чем поверхностное фенотипирование.

1 ’2011

1 ’2011

Оценка пролиферации, дифференцировки и функции клеток с помощью методов культивирования in vitro

Имеется несколько путей для функциональной оценки ГСК. Для коммитированных клеток-предшественников и более зрелых подтипов стволовых клеток (тех, которые, вероятно, не имеют долговременной способности к восстановлению популяции in vivo) используют методы роста клеток в полутвердой питательной среде, типа агара, агарозы или метилцеллюлозы, или в суспензионной среде [29, 30]. Полутвердые питательные среды позволяют получить характерные колонии. Эти колонии происходят из отдельных клеток, которые являются стволовыми клетками с ограниченной способностью к самообновлению или клетками-предшественниками [10,

31, 32]. Стволовая клетка/клетка-предшественница, дающая начало колонии, может быть распознана по дифференцированному потомству в колонии. Анализ колоний позволяет идентифицировать клетки, называемые стволовыми клетками, колониеформирующие клетки с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-CFC), мультипотентные колониеформирующие единицы (CFU-GEMM) и более линейно ограниченные предшественники типа CFU-GM (способность к гранулоцитарной и макрофагальной дифференцировке), CFU-G (способность к грану-лоцитарной дифференцировке), CFU-M (способность к макрофагальной дифференцировке), CFU-Mega (способность к мегакариоцитарной диффе-ренцировке) и BFU-E (бурст-формирующая единица — эритроидная, способная к эритроидной дифференцировке). Способность пересаживать отдельные колонии с одной чашки на другую с развитием вторичных колоний предоставляет оценку способности к самообновлению первоначальной клетки, которая дала начало первичной колонии, особенно когда и первичная и вторичная колонии являются муль-тилинейными. Репопуляция стволово-клеточных и HPP-CFC колоний помещает эти клетки в категорию стволовых клеток. Хотя CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, CFU-Mega и BFU-E рассматриваются как клетки-предшественники без способности к самообновлению, имеются признаки, что некоторые подтипы CFU-GEMM могут быть отнесены скорее к более поздней, более зрелой категории стволовых клеток, чем к категории ранних клеток-предшественников [31, 32].

Пуповинная кровь содержит более высокую концентрацию стволовых клеток, чем костный мозг взрослых [8, 32]. Подсчет концентрации основывался на количестве образованных колоний относительно количества посаженных клеток. Фактически это была оценка количества CFU-GEMM, BFU-E и CFU-GM предшественников, которая привела к возникновению предположения, что пуповинная кровь может служить источником пересаживаемых клеток, и что она может использоваться с этой целью

у взрослых, так же как у детей [8]. Кроме того, пролиферативная способность [8, 10, 32, 33] и способность к восстановлению гемопоэза [10, 31, 32] этих типов клеток в пуповинной крови, вероятно, выше, чем в костном мозге.

Анализы с долговременными культурами клеток в суспензионной среде, в которых рост клеток поддерживается компонентами стромальных клеток и/или цитокинами, также демонстрируют ростовые характеристики клеток пуповинной крови [23,

32, 35, 36]. Клетки, инициирующие долговременные культуры (LT-CIC), которые могут быть распознаны с помощью долговременных клеточных культур, растущих с поддержкой стромальных клеток или комбинации экзогенно добавляемых цитокинов, идентифицируют клеточную популяцию более раннюю и более примитивную, чем таковая HPP-CFC, CFU-GEMM, BFU-E, CFU-GM, CFU-G, CFU-M и CFU-Mega [7, 30]. Однако доказательства того, что LT-CIC являются эквивалентными наиболее ранним ГСК, не убедительны. Углубленный анализ LT-CIC показал, что CD34+CD38--клетки пуповинной крови имеют более высокую клоногенную эффективность, быстрее пролиферируют в ответ на стимуляцию цитокинами и генерируют почти в 7 раз больше потомков, чем их костномозговые партнеры [12].

Функция, оцененная с помощью выращивания клеток in vivo на животных моделях

Стволовые клетки, обладающие способностью долговременного восстановления популяции костного мозга, были определены и с помощью исследований, использующих животные модели in vivo. В этих моделях оценивается долговременная способность восстановления популяции донорскими клетками, введенными мышам, облученным летально при некомпетентном микроокружении, или с добавлением клеток от сингенных мышей [7, 32]. Имеется возможность использования in vivo моделей, использующих в качестве реципиентов для приживления человеческих клеток мышей с различными формами тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИН, англ. SCID), при исследовании человеческих стволовых клеток [32, 37—39]. В этих моделях пуповинная кровь, вероятно, имеет более высокую способность к приживлению, чем клетки костного мозга взрослого. Эти человеческие SCID-восстанавливающие клетки (SRC) найдены только во фракции клеток, экспрессирующих высокий уровень CD34-антигена и не имеющих CD38-антигена на своей клеточной поверхности [37]. Концентрация SRC в пуповинной крови при определении с помощью анализа с ограниченным разведением составляет 1 на 9,3 х 105 клеток, что значительно выше, чем концентрация (1 SRC на 3 х 106 клеток) в костном мозге взрослого или 1 на 6 х 106 мобилизованных ростовым фактором клеток периферической крови от

здорового донора [39]. Тот факт, что имеется только около 1 SRC на 600 CD34+CD38--K4eTOK [37], еще более подчеркивает необходимость добавления к фенотипическому анализу функциональной оценки с количественной целью. SCID-восстанавливающие клетки найдены среди CD34+CD38--популяции клеток, но только небольшая часть CD34+CD38--клеток имеет функциональные характеристики SRC. Сравнение стволовых клеток, ответственных за восстановление популяции у NOD-SCID мышей, с таковыми при аутологичной трансплантации у облученных павианов, свидетельствует о том, что у NOD-SCID мышей за восстановление популяции ответственны другие ГСК и клетки-предшественники по сравнению с нечеловекообразными приматами [40]. Однако различия могут быть связаны с разным типом трансплантации (ксеногенная против аутологичной). Жизненно важную роль в способности к приживлению стволовых клеток играет хоуминг-эффект, и возможно, количество человеческих SRC, определенное с помощью NOD-SCID мышей, было недооценено. При использовании внутрибедренных инъекций стволовых клеток у мышей было продемонстрировано увеличение количества стволовых клеток при инфузии различных типов клеток [41], что, очевидно, раскрыло уникальный компартмент человеческих стволовых клеток пуповинной крови с кратковременной способностью восстанавливать популяцию клеток костного мозга у мышей [42].

Стволовые клетки пуповинной крови в сравнении с другими тканевыми источниками

Все используемые исследования свидетельствуют о повышенной концентрации ранних незрелых ГСК в пуповинной крови по сравнению с костным мозгом взрослых. Однако пока нет никаких доказательств наличия истинных уникальных особенностей стволовых/клеток-предшественников пуповинной крови по сравнению с такими же клетками костного мозга. Незрелость клеток пуповинной крови со стволово-клеточным фенотипом документирована с помощью генетических исследований с использованием определения длины те-ломеры [43]. Исследования с мышиными клетками, наилучшим образом приживляющимися у мышей, наилучшим образом удовлетворяют гипотезе о том, что отдельные стволовые клетки из костного мозга взрослого, крови плода на поздних стадиях развития или крови новорожденного — все продуцируют сходные фракции лимфоидных и эритро-идных клеток [44]. Эти результаты свидетельствуют скорее о более высокой концентрации более незрелых клеток, чем о наличии популяции клеток, уникальных для пуповинной крови.

Хотя примитивные клетки пуповинной крови в категории стволовых/клеток-предшественников имеют большую способность к пролиферации [8,

10], анализ кинетики клеточного цикла продемонстрировал, что при выделении из пуповинной крови сразу после рождения ребенка эти клетки находятся в очень медленном или неделящемся состоянии [34, 45]. Это показано с помощью методики нейтрализации меченного тритием тимидина в сочетании с анализом колоний, а также путем проточной цитометрии клеток с определенным фенотипом. Это резко контрастирует с относительно высоким пролиферативным показателем этих клеток в костном мозге. Клетки пуповинной крови вначале находятся в медленном или нециклическом состоянии, но они быстро отвечают на стимуляцию ростовыми факторами своей пролиферацией [8, 10, 34, 45]. Именно этот быстрый ответ на стимуляцию прямо ассоциирован с увеличенной экспансией этих клеток ex vivo.

Микроокружение и факторы самообновления

Пролиферация, самообновление, продолжительность жизни и дифференцировка ГСК и клеток-предшественников, вероятно, регулируются их микроокружением. В костном мозге взрослых микроокружение составлено из гемопоэтических и неге-мопоэтических стромальных клеток. В проведенных исследованиях по определению регуляторных компонентов в пределах интактной структуры микроокружения было выявлено, что остеобласты являются регуляторным компонентом ниши ГСК in vivo и влияют на функцию этих незрелых ГСК через активацию Notch [46] и через костный морфогенетический протеин [47]. Клетки и ростовые факторы, вовлеченные в развитие костей, были предварительно связаны с регуляцией гемопоэтических клеток-предшественников [48, 49].

Все больше доказательств существования в пост-натальном периоде гемангиобласта, который дает начало и крови, и кровеносным сосудам, хотя они еще не окончательные [50—52]. Информация относительно регуляции роста подразумеваемого взрослого гемангиобласта должна также пролить свет на рост и дифференцировку ГСК.

Цитокины, хемокины и их рецепторы, действующие в одиночестве или в комбинации, осуществляют регуляцию пролиферации миелоидных клеток-предшественников [53, 54]; они осуществляют контроль клеточного цикла и, по существу, контрольных точек клеточного цикла [55]. Цитокины и внутриклеточные сигнальные молекулы, вовлеченные в пролиферацию и/или самообновление ГСК, включают следующие лиганды и их рецепторы: фактор стволовых клеток/steel-фактор/c-M [56], Flt3 лиганд [56], Notch лиганды/Notch [57—63] и Wnt3a/Frizzled [64, 65]. Задействованные внутриклеточные молекулы включают: p21cip1/waf1 [66], Hox B4/PBX1 [67-69], Bmi-1 [70] и мембранный белок mKirre, происходящий из стромальных клеток [71]. Представляет инте-

1 ’2011

1 ’2011

рес, что Nanog [72, 74], Stat3 [75, 76] и Hex [77] участвовали в росте и дифференцировке эмбриональных стволовых клеток. Возможно, что внутриклеточные молекулы, вовлеченные в регуляцию эмбриональных стволовых клеток и гемопоэтических клеток-предшественников, могут также играть роль в пролиферации и/или самообновлении ГСК. Так, Stat3 связан с регуляцией гемопоэза [78], а фосфори-лирование серина в Stat3 связано с пролиферацией клеток-предшественников в ответ на комбинированную стимуляцию steel-фактором и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) или интерлейкином-3 (IL-3) [79]. Экспрессия Hex ассоциирована с усилением пролиферации миелоидных клеток-предшественников [80], Stat5 является важным для Flt3 лиганда при синергичной стимуляции миелоидных предшественников [81]. Внутриклеточная сигнальная молекула SHIP вовлечена в регуляцию гемопоэтических клеток-предшественников [82] и ГСК [83].

Другие цитокины, которые могут влиять на пролиферацию стволовых клеток и/или самообновление — это тромбопоэтин, онкостатин М и IL-20. Тромбопоэтин является рано действующим цитокином [84], который вовлечен в развитие гемангиобластов [85] и служит одним из ингредиентов, наряду со steel-фактором и Flt3 лигандом, используемым исследователями для экспансии ГСК и клеток-предшественников ex vivo [86]. Онкостатин М — это цитокин, вырабатываемый Т-хелперами 1, который регулирует гомеостаз клеток-предшественников [87]. IL-20 — новый член семейства интерлейкинов [88, 89] — является кандидатом в группу стволово-клеточных эффекторных молекул, имеющим избирательную активность в отношении CFU-GEMM среди других миелоидных клеток-предшественников [90]. IL-20 способен увеличивать количество CFU-GEMM в костном мозге человека и мыши и в пуповинной крови человека в присутствии steel-фактора и эритропоэтина in vitro, тогда как не оказывает влияния на эритроидные, гранулоцитарно-макрофагальные или мегакариоци-тарные предшественники. IL-20 трансгенные мыши имеют увеличенное количество CFU-GEMM, находящихся в клеточном цикле, но не других миелоид-ных предшественников, а введение IL-20 нормальным мышам значительно увеличивает только количество CFU-GEMM и их клеточный цикл [90]. Это первый описанный цитокин с такой специфичностью. Так как CFU-GEMM могут быть накоплены in vitro при условии добавления адекватных цитоки-нов (steel-фактор ± плазма пуповинной крови) [31, 32], возможно, что IL-20 может также вызывать увеличение пролиферации и/или самообновления стволовых клеток. IL-20 связывается с рецепторами IL-20 (R) типа I и II [91]. IL-20R тип I состоит из субъединиц IL-20Ra и IL-20RP, тогда как IL-20R тип II со-

стоит из IL-20Rp субъединицы и одной субъединицы 1Ь-22^ Хотя и ^-19, и ^-24 связываются с мышиной Ва!3 клеточной линией, созданной с экспрессией типа I или типа II IL-20R, и стимулируют пролиферацию адекватных рецептор-содержащих клеток, они не показывают влияния на мышиные или человеческие миелоидные клетки-предшественники [90]. Все еще не до конца известно, какой рецептор использует ^-20 и каков его механизм действия. И ^-20Ш, и ^-20КЛ проводят внутриклеточные сигналы через БШЗ [92]. Б1а13 играет существенную роль в поддержании врожденного иммунитета [78] и является сигнальным путем, вовлеченным в сигналы самообновления, индуцируемые LIF в эмбриональных стволовых клетках [75], и наряду с JAK2-путем поддерживает самообновление в эмбриональной линии стволовых клеток сперматого-нии дрозофилы [76]. При поддержке второго сигнала от 81ее1-факгор/с-М или БКЗ лиганд/БНЗ, Б1а13 поддерживает самообновление первичных мульти-потентных гемопоэтических клеток [92].

Самообновление требует деления клеток без потери «стволовости» и плюрипотентности, по крайней мере, у одной из дочерних клеток (ассиметрич-ное деление клеток) [93]. Процесс, путем которого исходные клеточные детерминанты разделяются при делении клеток [94—96], зависит от поляризации и сегрегации поперек митотического веретена. Контрольные точки клеточного цикла необходимы для поддержания прогрессии событий деления клеток [97]. Были описаны некоторые из этих контрольных точек [98]. Контрольная точка сборки митотического веретена (МБАС) определяет, что клеточный цикл не будет развиваться от метафазы к анафазе, пока все парные сестринские хроматиды не выстроятся должным образом поперек метафазной пластинки. МБАС, вероятно, является критической для адекватной регуляции самообновления и дифференциров-ки, и в процесс могут быть вовлечены митотические белки контрольной точки.

Ингибитор циклин-зависимой киназы р21°’р1/таП вовлечен в синергичную стимуляцию stee1-фактором пролиферации клеток-предшественников [99, 100] и в функционирование стволовых клеток [66]. Так как р21с‘р1/аП связан с адекватным функционированием МБАС [101], МБАС может быть вовлечена в пролиферацию и/или самообновление стволовых клеток. Кроме того, так как р21с1р1/таП связан с ци-токиновой синергией, а цитокиновая синергия, вероятно, влияет на функцию стволовых клеток [102], цитокины могут действовать на стволовые клетки через р21о1р1/таП и МБАС.

Вдобавок к их влиянию на рост, цитокины вовлечены в выживаемость/антиапоптоз ГСК и клеток-предшественников. Одной такой молекулой является СХС-хемокин, фактор стромально-клеточного происхождения-1 (БDF-1)/CXCL12, который сигна-

лизирует и индуцирует активность через рецептор — CXCR4 [103, 104]. Возникло предположение, что даже манипуляции с одним генетическим элементом могут влиять на самообновление и дифференциро-вочный потенциал незрелых гемопоэтических клеток [105]. Если будет доказано использование любого из вышеуказанных цитокинов и/или внутриклеточных сигнальных молекул при ex vivo экспансии ГСК, то это может позволить более широкое применение трансплантаций пуповинной крови.

Первый банк пуповинной крови был организован в 1993 г. П. Рубинштейном в Нью-Йорке [8]. Однако одной из проблем при создании банков пуповинной крови служит неизвестный отрезок времени, в течение которого образцы пуповинной крови могут поддерживаться в криоконсервированном состоянии. Теоретически, с момента заморозки стволовые клетки и клетки-предшественники (при наличии постоянного источника жидкого азота) должны быть способны поддерживаться длительный период времени, по крайней мере, в течение нормального периода жизни индивидуума. Самое длительное время хранения пуповинной крови, которая впоследствии использовалась для клинической трансплантации, вероятно, находится в диапазоне от 5 до 8 лет. Три группы исследователей описали восстановление предшественников из пуповинной крови, хранившейся замороженной 12—15 лет [32, 106, 107]. В наиболее крупном исследовании [32] было продемонстрировано, что после 15 лет хранения размороженные ядросодержащие клетки, гранулоцитарно-макрофагальные (CFU-GM), эритроидные (BFU-E) и мультипотентные (CFU-GEMM) предшественники имели среднее воспроизводство (± 1 СО) в 83 ± 12, 95 ± 16, 84 ± 25 и 85 ± 25 клеток соответственно. Отсутствие повреждения функциональных возможностей этих размороженных клеток-предшественников было выявлено экстенсивной пролиферативной способностью CFU-GM, BFU-E и CFU-GEMM, которые генерировали колонии, содержащие до 22 500, 182 500 и 292 500 клеток соответственно, после стимуляции в полутвердой целлюлозной питательной среде с эритропоэтином, ГМ-КСФ, ИЛ-3 и steel-фактором. CFU-GEMM-колонии могли быть пересажены на вторичные чашки с образованием в результате CFU-GEMM-колоний таких же по размеру, как и сформированные на первичных культуральных чашках, а CD34+CD38_-клетки пуповинной крови, выделенные из размороженных после 15-летнего хранения клеток, демонстрировали более чем в 250 раз большую ex vivo экспансию клеток-предшественников. Кроме того, CD34+-клетки, выделенные из этих разморозок, были способны приживляться у NOD-SCID мышей с частотой, эквивалентной таковой у свежевыделенных CD34+-клеток пуповинной крови. Таким образом, клетки пуповинной крови могут храниться замороженными, по

крайней мере, 15 лет с вероятностью того, что они будут способны приживляться у человеческих реципиентов.

Моделирование биологических свойств CD133+ и CD34+ ГСК пуповинной крови человека

Возможность воздействовать на механизмы, регулирующие развитие стволовых клеток, открывает широчайшие перспективы применения этих клеток в разных областях медицины.

Изучение возможности моделирования влияния различных генетических агентов и прочих внешних факторов на биологические свойства стволовых клеток представляется актуальной задачей, так как в этом случае можно получить возможность влиять на степень и направленность их дифференцировки [108-110].

Трудности изучения биологических свойств стволовых клеток связаны в первую очередь с тем, что они в большей своей массе находятся вне клеточного цикла, и в таком состоянии недоступны для большинства вирусных векторов.

Таким образом, появилась задача создания нового поколения векторов, способных проникать в не-делящиеся клетки. Выходом из этого положения стала генерация новой конструкции на базе вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1). Было замечено, что вирус обладает способностью инфицировать практически все типы клеток, в том числе и находящиеся в покое.

К настоящему времени в распоряжении ученых появились мощные инструменты, способные коренным образом влиять на биологию клетки. К их числу следует, прежде всего, отнести векторы так называемой «третьей генерации» [111-114], способные переносить и встраивать чужеродную ДНК в геном исследуемых клеток, влияя, таким образом, на их функции.

Векторы, переносчики ДНК, полученные от лен-тивирусов, таких как вирус иммунодефицита человека 1-го типа, применяются при лечении некоторых заболеваний человека (болезнь Альцгеймера) благодаря их способности внедряться практически во все типы клеток независимо от их пролиферативного статуса, как ex vivo, так и in vivo [112-121].

Векторы на базе ВИЧ 1 — это не способные реплицироваться, гибридные вирусные элементы, состоящие из базовых протеинов лентивируса и имеющие оболочку другого вирусного агента, чаще всего вируса везикулярного стоматита человека (VSV) или MLV — его амфотропной оболочки [114, 118]. Применение VSV дает более устойчивый и высокий вирусный титр, что выражается в высокой стабильности вирусных частиц по сравнению с оболочками, взятыми от других вирусов.

Лентивирусы имеют сложную организацию генома. Наряду с основными структурными генами

1 ’2011

1 ’2011

(gag, pol, env), которые присущи всем ретровирусам, лентивирусы содержат 2 главных регуляторных гена (tat и rev) и несколько дополнительных генов, принимающих участие в модулировании вирусной генной экспрессии, сборке вирусных элементов, а также структурных и функциональных взаимодействиях в пораженных клетках. Репликация лентивирусов осуществляется частично путем работы cis-акгивных последовательностей ДНК, которые не кодируют протеины вируса. Большинство cis-активных последовательностей крайне необходимы для функционирования вируса, и они обычно всегда включаются в создаваемый вектор. Также существуют еще и trans-активные последовательности ДНК, которые кодируют 3 группы протеинов: структурные, регуляторные и вспомогательные [111, 115, 116, 122, 123].

Улучшение качества биологической безопасности получаемых векторов было достигнуто в результате полного удаления «ненужных» генов — Vif, Vpr, Vpu и Nef из основной конструкции при одновременном сохранении исходного титра получаемого вектора. Это привело к созданию так называемой «второй генерации» векторных систем, без снижения уровня их эффективности [115]. В настоящее время ученые имеют в своем распоряжении третье поколение векторов [111], в которых полностью отсутствуют главные регуляторные гены вируса tat и rev, что также сделано для достижения наиболее высокого уровня биологической защищенности при работе с вирусом с сохранением высокого уровня активности получаемого вектора. Эта кассета содержит гены gag и pol [124—126], а также участок, кодирующий протеин, продукт гена rev [127], встраиваемый отдельной, не наслаивающейся конструкцией [111]. Высокоактивные промоторы, расположенные перед сайтом старта транскрипции вектора, способны полностью заменить функцию гена tat [128]. Это нововведение дало возможность не только существенно повысить титр производимых векторов (около 107 TU/ml — на клетках HeLa), но и достичь еще более высокой степени биологической защиты, поскольку теперь любой способный к репликации рекомбинантный вирус, который только может быть произведен в процессе приготовления векторов, будет нуждаться во всех факторах, необходимых для достижения вирулентности и репликации ВИЧ-1 in vivo. Поэтому возможно утверждать, что работа с векторами на базе ВИЧ-1 стала практически абсолютно безопасной [115, 116]. К тому же существенный прогресс был достигнут в результате получения векторов, способных после переноса трансгена в клетку-мишень подвергаться самостоятельной инактивации (self inactivating vectors — SIN) [118, 120, 123, 129].

К другим особенностям можно отнести изменения с целью улучшения доставки трансгенов к клетке-мишени и последующей экспрессии. Одна из таких модификаций включает в себя внедрение

посттранскрипционного регуляторного элемента [130], который был выделен из генома вируса гепатита североамериканского лесного сурка (Woodchuck posttranscriptional regulatory element — WPRE), в 3’конец переносимого вектора. WPRE действует на уровне посттранскрипции путем стимулирования нуклеарного экспорта транскриптов и/или увеличения реакций полиаденилирования самих транскриптов, тем самым увеличивая количество общей мРНК в клетках. Способность векторов инфицировать не-делящиеся и терминально дифференцированные клетки, включая нейроны, фоторецепторные клетки сетчатки, некоторые виды эпителиальных клеток, а также плюрипотентные стволовые клетки крови, делает возможным создание методов, позволяющих применить генную терапию в лечении ряда заболеваний [113].

Этот вектор имеет сайт клонирования (MCS), который позволяет удобно встроить интересующий исследователя ген в его последовательность ДНК, а затем перемещать в другие конструкции, «разрезая» интересующий участок вектора уже с соответствующими промоторами и дополнительными генами устойчивости к ампициллину (bla), а также ori. Этот вектор был выбран экспериментальным путем (изначально использовались другие векторы в качестве промежуточных), что сильно сказалось на конечном результате — при использовании других типов векторных систем переносимые гены не работали. Возможность эффективного переноса трансгена к клетке-мишени открыла новые возможности в области анализа влияния разных генов на функции ГСК.

В нашем случае исследовательский интерес представляет семейство генов Notch, которое известно своим активным участием в регуляции диффе-ренцировки и развития ГСК. Notch был идентифицирован впервые в 1919 г., как ген, который обуславливает развитие насечек на краях крыльев мух. Как было выяснено позднее, гены семейства Notch играют ключевую роль в эмбриональном развитии дрозофилы и C. elegans. У мух ген необходим для нормального нейрогенеза, миогенеза, формации крыльев, развития тканей глаза, оогенеза и других тканей [131, 132].

Усиленное изучение работы генов этого семейства у дрозофилы показали, что ген Notch кодирует высоко законсервированный трансмембранный рецептор, который экспрессируется как на эмбриональных клетках, так и на клетках взрослой особи [133, 134]. Механизмы передачи сигнала каскадом Notch в животном мире универсальны, ему присущи все характерные свойства сигнальных систем. Белок Notch, который служит рецептором для Notch-сигнального пути, выделен как у беспозвоночных, так и у позвоночных: дрозофилы, нематоды, лягушки, рыб, грызунов, человека. Путь Notch через ла-

теральное ингибирование или индукцию участвует фактически во всех клеточных контактах у животных и наиболее изучен у Drosophila melanogaster [132].

Рецепторы Notch вовлечены в большое количество взаимодействий [135—137], определяющих в конечном итоге судьбу той или иной клетки или клеточной популяции в целом, что не может, естественно, не затронуть общее развитие и функцию многих органов, включая гематопоэз и иммунную систему [138].

У человека известно 4 гена из этого семейства, каждый из которых имеет свой собственный рецептор. Семейство рецепторов Notch локализовано на хромосомах 9q34, 1p13-p11, 19p13.2-p13.1 и 6p21.3. Эти рецепторы представляются как довольно гомологичные структуры, что справедливо и для других организмов, включая человека. Все 4 рецептора экспрессируются на клетках кроветворной системы [137, 139]. Notch 1 — преимущественно на тимоцитах, а также макрофагах и стволовых клетках. Notch 2-рецепторы находят на тимоцитах и В-клетках. Notch 3 экспрессируется на всех типах клеток. Экспрессия Notch 4 доминирует у эндотелиальных клеток, а также макрофагов. Экстрацеллюлярный домен Notch 1—2 состоит из 36 epidermal growth factor (EGF)-похожих повторов и 3 Lin-12/Notch-повторов. Notch 3—4 имеют 34 и 29 EGF-похожих повторов соответственно. Интрацеллюлярный домен рецепторов состоит из RAM-домена, шести ANK-повторов, двух последовательностей ядерной локализации (NLS) и пролин-глутамат-серин-треонин-обогащенного домена (PEST). Notch 4 имеет более короткий домен из-за отсутствия второй NLS [139].

Как видно, функции этих рецепторов несколько перекрывают друг друга и, кроме того, они могут использовать одни и те же лиганды. Лигандами для Notch являются трансмембранные протеины, которые экспрессируются на соседствующих клетках. Пока их известно всего 3 — это Delta, Jagged 1 и Jagged 2. Они расположены на хромосомах 6q27, 20p12-p11 и 14q32. На гемопоэтических клетках Jagged 2 экспрессируется у тимоцитов, Delta, по данным многих исследователей, обнаруживает себя практически на всех клетках кроветворной системы, а также клетках стромы. Jagged 1, наоборот, скорее всего имеет ограниченную экспрессию на клетках нескольких типов, таких как клетки стромы, мегакари-оциты и стволовые клетки [137]. Подлинно известно, что все 3 лиганда взаимодействуют как минимум с рецепторами генов Notch 1 и Notch 2. Также известно, что лиганд Jagged 1 взаимодействует с Notch 3 у мышей. Активация сигнального пути для Notch посредством его лигандов не вызывает сомнений: в экспериментах с мышами, у которых отсутствовал лиганд Jagged 1, наблюдалась эмбриональная смерть, как результат дефектов сосудистого морфогенеза. Дефицит Jagged 2 обуславливал перинаталь-

ную смертность, как результат дефектов краниофациального морфогенеза. Delta-дефицитные мыши также демонстрировали эмбриональную смертность. Взаимодействие рецептора с лигандом индуцирует дополнительные каскадные протеолитические реакции, заканчивающиеся перемещением интрацеллю-лярного домена (активированной формы интрацел-люлярной части рецептора Notch-ICN) к ядру. Там ICN взаимодействует с факторами транскрипции, такими как CBF1/RBPJk, активируя тем самым CBF-1-регулируемые гены, как например Hairy и HES 1. Эти гены в свою очередь регулируют экспрессию тканеспецифичных факторов транскрипции, которые влияют на линейную дифференцировку клеток (применительно к гематопоэзу) и некоторые другие события [137]. Во время этого процесса ICN может контактировать с дополнительными регуляторами сигнальной системы, включающими в себя так называемые позитивные регуляторы Deltex и Mastermind, или с негативным регулятором Numb. Точные молекулярные механизмы этих взаимодействий пока не известны. Кроме того, остаются до конца не изученными условия, при которых происходит переключение от угнетения к активации самих генов Notch, индуцируемое присутствием ICN [140]. Активно исследуемый в последние годы ген Presenilin также причисляют к участникам Notch-пути [141]. Список генов, имеющих отношение к Notch-пути, все время расширяется [142, 143]. Однако сеть взаимоотношений очень сложна, и решение вопроса о принадлежности генов к Notch-пути или иной цепи передачи информации — задача не из легких. Так, только часть авторов на основании данных о генетическом взаимодействии Notch и Delta и сходстве мутантных фенотипов относят к Notch-сигнальному пути ген deltex [136].

Четко известно, что Notch 1 принимает участие в развитии и созревании Т-клеток [139]. Также он влияет на развитие CD8+- и CD4+-клеток. Кроме того, ICN способствует приобретению фенотипа CD44+CD25+ клетками TCR а/p при переходе их к клеткам CD44"CD25". Под его регулированием происходит CD4+ Т-клеточный иммунный ответ.

На В-клеточной линии чаще экспрессируется Notch 2, который функционирует по-разному на разных стадиях развития этих клеток [139]. Как уже было отмечено, Notch угнетает функцию продукта гена Е2А, протеина Е47. Е2А экспрессируется на всем протяжении В-клеточного развития и является очень важным фактором транскрипции на ранних стадиях дифференцировки. Потеря функции Е2А блокирует В-клеточное развитие на про В-клеточной стадии [139].

Действие генов Notch на клетки миелоидной линии, по мыслям ученых, сводится к тому, что во многих случаях они ингибируют или, по крайней мере, отсрочивают их дифференцировку [137].

1 ’2011

1 ’2011

Кроме того (и это справедливо для всех типов ге-мопоэтических клеток), на разных стадиях развития различные сигналы, продуцируемые цитокина-ми, вносят свою лепту в регуляцию дифференциров-ки. Скорее всего, сигналы генов Notch кооперируют и/или модифицируют эффекты разных цитокинов, что в свою очередь приводит к изменениям направления развития.

При определении колониеобразующей активности CD133+-клеток пуповинной крови оказалось, что гены Notch 1 и 2 оказывают супрессивное действие независимо от линейной принадлежности колоний, что, как правило, заканчивается их гибелью. YFP-позитивные колонии с момента их формирования до 3—4 дней выглядели вполне жизнеспособными, но затем наблюдалось достаточно резкое угасание их роста и отсутствие формирования новых колоний. Затем в течение 3—4 дней наблюдался распад и гибель колонии в целом. Колонии негативного контроля, напротив, сохраняли способность к росту еще достаточно продолжительное время — около 7—10 дней. Ген Notch 2 оказывал большее супрессивное воздействие, чем ген Notch 1. Наибольший супрессивный эффект генов Notch отмечался в популяции клеток, дающих рост смешанных колоний, т. е. наиболее ранних предшественников гемопоэ-

за (при сравнении групп Notch 1 против негативного контроля и Notch 2 против негативного контроля) по сравнению с линейно-специфичными клетками-предшественниками [144].

Такая же тенденция наблюдалась при определении уровня спонтанного апоптоза CD133+-клеток. Клетки, инфицированные геном Notch 1, имели уровень спонтанного апоптоза 15,78 ± 3,27 %, а Notch 2 — 29,31 ± 5,64 % . В контрольной популяции этот показатель не превышал 2 % [145].

Таким образом, перспектива создания эффективного механизма для переноса генов в неделящие-ся клетки, а также создание и отработка моделей для изучения влияния различных факторов на биологические свойства ГСК с целью возможности модификации их дальнейшей пролиферации и дифференци-ровки представляется актуальной задачей.

В конечном итоге большое значение имело бы точное понимание, какие клетки необходимы и в каком количестве для гарантии того, что образец пуповинной крови имеет адекватное количество долго- и кратковременно приживляющихся стволовых и клеток-предшественников. Накопление знаний относительно биологии ГСК и клеток-предшественников, без сомнения, расширит полноценность пуповинной крови для трансплантации.

Литература

1. Gluckman E., Broxmeyer H.E.,

Auerbach A.D. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi anemia by means of umbilical-cord blood from

an HLA-identical sibling. N Engi J Med 1989;321:1174-8.

2. Broxmeyer H.E., Kurtzberg J.,

Gluckman E. et al. Umbilical cord blood hematopoietic stem and repopulating cells in human clinical transplantation. Blood Cells 1991;17:313-29.

3. Broxmeyer H.E., Gluckman E.,

Auerbach A. et al. Human umbilical cord blood: A clinically useful source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. Int J Cell Cloning 1990:8:76-91.

4. Kohli-Kumar M., Shahidi N.T.,

Broxmeyer H.E. et al. Haematopoietic stem/ progenitor cell transplant in Fanconi anemia using HLA-matched sibling umbilical cord blood cells. Br J Haematol 1993;85:419-22.

5. Wagner J.E, Broxmeyer H.E., Byrd R.L. et al. Transplantation of umbilical cord blood after myeloblative therapy: Analysis of engraftment. Blood 1992;79:1874-81.

6. Wagner J.E., Kernan N.A., Steinbuch M. et al. Allogeneic sibling umbilical cord blood transplantation in forty-four children with malignant and non-malignant disease. Lancet 1995,346:214-9.

7. Broxmeyer H.E. Role of cytokines in he-matopoiesis. In: Oppenheim J.J., Rossio J.L., Gearing A.J.H., eds. Clinical aspects of

cytokines: Role in pathogenesis, diagnosis and therapy. New York: Oxford University Press, 1993:201-6.

8. Broxmeyer H.E., Hangoc G., Cooper S.

et al. Growth characteristics and expansion of human umbilical cord blood and estimation of its potential for transplantation of adults. Proc Nati Acad Sci USA 1992;89:4109-13.

9. Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I.,

May W.S. CD34: Structure, biology and clinical utility. Blood 1996;87:1-13.

10. Lu L., Xiao M., Shen R.N. et al. Enrichment, characterization and responsiveness of single primitive CD34+++ human umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells with high proliferative and replating potential. Blood 1993;81:41-8.

11. Broxmeyer H.E., Cooper S., Li Z.H. et al. Myeloid progenitor cell regulatory effects of vascular endothelial cell growth factor, a ligand for the tyrosine kinase receptor Flk-1. Int J Hematol 1995;62:203-15.

12. Hao Q.L., Shah A.J., Thiemann F.T. et al. A functional comparison of CD34+ CD38 cells in cord blood and bone marrow. Blood 1995;86:3745-53.

13. Mayani H., Lansdorp P.M. Thy-1 expression is linked to functional properties of primitive hematopoietic progenitor cells from human umbilical cord blood. Blood 1994;83:2410-7.

14. Laver J.H., Abboud M.R., Kawashima I. et al. Characterization of c-kit expression by

primitive hematopoietic progenitors in umbilical cord blood. Exp Hematol 1993;23:1515-9.

15. Rappold I., Ziegler B.L., Kohler I. et al. Functional and phenotypic characterization of cord blood and bone marrow subsets expressing Flt3 (CD 135) receptor tyrosine kinase. Blood 1997;90:111-25.

16. Broxmeyer H.E., Lu L., Cooper S. et al. Flt-3-ligand stimulates/co-stimulates the growth of myeloid stem/progenitor cells. Exp Hematol 1995;23:1121-9.

17. Traycoff C.M., Abboud M.R., Laver J. et al. Evaluation of the in vitro behavior of phenotypically defined populations of umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol 1994;22:215-22.

18. Cicuttini F.M., Welch K.L, Boyd A.W. The effect of cytokines on CD34+ Rh-123 high and low progenitor cells from human umbilical cord blood. Exp Hematol 1994;22:1244-51.

19. Osawa M., Hanada K., Hamada H., Nakauchi H. Long-term lymphohematopoi-etic re-constitution by a single CD34-low/ negative hematopoietic stem cell. Science 1996;273:242-5.

20. Bhatia M., Bonnet D., Murdoch B. et al.

A newly discovered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulating activity. Nat Med 1998;4:1038-45.

21. Zanjani E.D., Almeida-Porada G., Livington A.G. et al. Human bone marrow CD34 cells engraft in vivo and undergo multilineage expression including giving rise to

CD34+ cells. Exp Hematol 1998,26:353-60.

22. Sato T., Laver J.H., Ogawa M. Reversible expression of CD34 by murine hemato-poietic stem cells. Blood 1999:94:2548-54.

23. Ruggieri L., Heimfeld S., Broxmeyer H.E. Cytokine-dependent ex vivo expansion of early subsets of CD34+ cord blood myeloid progenitors is enhanced by cord blood plasma, but expansion of the more mature subsets of progenitors is favored. Blood Cells 1994;120:436-54.

24. Traycoff C.M., Abboud M.R., Laver J. et al. Human umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells: Are they the same as their adult bone marrow counterparts? Blood Cells 1994;20:382-91.

25. Hao Q.L., Zhu J., Price M.A. et al. Identification of a novel, human multilymphoid progenitor in cord blood. Blood 2001;97:3683-90.

26. Phillips R.L., Ernst R.E., Brunk B. et al. The genetic program of hematopoietic stem cells. Science 2000;288:1635-40.

27. Ramalho-Santos M., Yoon S.,

Matsuzaki Y. et al. Sternness: Transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells. Science 2002;298:597-600.

28. Ivanova N.B., Dimos J.T., Schaniel C.

et al. A stem cell molecular signature. Science 2002;298:601-4.

29. Cooper S., Broxmeyer H.E. Clonogenic methods in vitro for the enumeration of granulocyte-macrophage progenitor cells (CFU-GM) in human bone marrow and mouse bone marrow and spleen. J Tissue Culture Methods 1991;3:77-82.

30. Cooper S., Broxmeyer H.E. Measurement of interleukin-3 and other hematopoietic growth factors, such as GM-CSF, G-CSF, M-CSF, erythropoietin and the potent co-stimulating cytokines steel factor and Flt-3 ligand. In: Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H. et al. (eds). Current protocols in immunology. Vol 1, Suppe 18. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1996:6.4.1-6.4.20.

31. Carow C.E., Hangoc G., Broxmeyer H.E. Human multipotential progenitor cells (CFU-GEMM) have extensive replating capacity for secondary CFU-GEMM: An effect enhanced by cord blood plasma. Blood 1993;81:942-9.

32. Broxmeyer H.E., Srour E.F., Hangoc G. et al. High efficiency recovery of hemato-poi-etic progenitor cells with extensive proliferative and ex vivo expansion activity and of hematopoietic stem cells with NOD/SCID mouse repopulation ability from human cord blood stored frozen for 15 years. Proc Nail Acad Sci USA 2002;00:645-50.

33. Xiao M., Broxmeyer H.E., Horie M. et al. Extensive proliferative capacity of single isolated CD34+++ human cord blood cells in suspension culture. Blood Cells 1994;20;455—67.

34. Moore M.A.S., Hopkins I. Ex vivo expansions of cord blood derived stem cells and progenitors. Blood Cells 1994:20:468-81.

35. Piacibello W., Sanavio F., Garretto L. et al. Extensive amplification and self-renewal of human primitive hematopoietic stem cells from cord blood. Blood 1997;89:2644-53.

36. Lu L., Ge Y., Li Z.H. et al. CD34+++ stem/ progenitor cells purified from cryopreserved normal cord blood can be transduced with

high efficiency by a retroviral vector and expanded ex vivo with stable integration and expression of Fanconi anemia complementation C gene. Cell Transplant 1995;4:493-503.

37. Bhatia M., Wang J.C.Y., Kapp U. et al. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Nati Acad Sci USA 1997;94:5320-5.

38. Hogan C.J., Shpall E.J., McNulty O.

et al. Engraftment and development of human CD34(+)-enriched cells from umbilical cord blood in NOD/LtSz-scid/scid mice. Blood 1997;90:85-96.

39. Wang J.C.Y., Doedens M., Dick J.E. Primitive human hematopoietic cells are enriched in cord blood compared with adult bone marrow or mobilized peripheral blood as measured by the quantitative in vivo SCID-repopulating cell assay. Blood 1997;89:3919-24.

40. Horn P.A., Thomasson B.M., Wood B.L. et al. Distinct hematopoietic stem/progenitor cell populations are responsible for repopulating NOD/SCID mice compared with nonhuman primates. Blood 2003;102:4329-35.

41. Yahata T., Ando K., Sato T. et al. A highly sensitive strategy for SCID-repopulating cell assay by direct injection of primitive human hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood 2003;101:2905-13.

42. Mazurier F., Doedens M., Gan O.I. et al. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med 2003;9:959-63.

43. Vaziri H., Dragowska W., Allsopp R.C. et al. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: Loss of telomeric DNA with age. Proc Nati Acad Sci USA 1994;91:9857-60.

44. Harrison D.E., Astle C.M. Short- and long-term multilineage repopulating hematopoietic stem cells in late fetal and newborn mice: Models for human umbilical cord blood. Blood 1997;90:174-81.

45. Movassagh M., Caillot L., Baillou C. et al. Optimization of the cycling of clonogenic and primitive cord blood progenitors by various growth factors. Stem Cells 1997;15:214-22.

46. Calvi L.M., Adams G.B.,

Weibrecht K.W. et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 2003;425:841-6.

47. Zhang J., Niu C., Ye L. et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 2003;425:836-41.

48. Bellido T., Jilka R.L., Boyce B.F. et al. Regulation of interleukin-6, osteoclasto-genesis, and bone mass by androgens: The role of the androgen receptor. J Clin Invest 1995;95:2886-95.

49. Jilka R.L., Passeri G., Girasole G. et al. Estrogen loss causes an upregulation of several hematopoietic bone marrow progenitors in the mouse: A mediating role of interleukin-6. Exp Hematol 1995;25:500-6.

50. Temple S. Embryonic stem cell selfrenewal, analyzed. Cell 2003;15:247-53.

51. Kyba M., Daley G.Q. Hematopoiesis from embryonic stem cells: Lessons from and for

ontogeny. Exp Hematol 2003;31:994-1006.

52. Bailey A.S., Fleming W.H. Converging roads: Evidence for an adult hemangioblast. Exp Hematol 2003;31:987-93.

53. Broxmeyer H.E. Regulation of hematopoi-esis by chemokine family members. J Hematol 2001;74:9-17.

54. Bagby G.C. Jr, Henrich M. Growth factors, cytokines and the control of hematopoi-esis. In: Hoffman R., Shattil S., Furie B. et al. (eds). Hematology: Basic principles and practice, 3rd ed. New York: Churchill Livingstone, 1999:154-201.

55. Mantel C.R., Gelfanov V.M., Kim Y.J. et al. P21waf-1-Chk1 pathway monitors G1 phase microtubule integrity and is crucial for restriction point transition. Cell Cycle 2002;1(5):327-36.

56. Lyman S.D., Jacobsen S.E.W. C-kit ligand and Flt3 ligand: Stem/progenitor cell factors with overlapping yet distinct activities. Blood 1998;91:1101-34.

57. Li L., Milner L.A., Deng Y. et al. The human homolog of Rat Jagged 1 expressed by marrow stroma inhibits differentiation of 32D cells through interaction with notch 1. Immunity 1998;8:43-55.

58. Milner L.A., Bigas A. Notch as a mediator of cell fate determination in hema-topoiesis: Evidence and speculation. Blood 1999;93:2431-48.

59. Varnum-Finney B., Wu L., Yu M. et al. Immobilization of Notch ligand, Delta-1, is required for induction of Notch signaling.

J Cell Sci 2000:113:4313-18.

60. Karanu F.N., Murdoch B., Miyabayashi T et al. Human homologues of Delta-1 and Delta-4 function as mitogenic regulators of primitive human hematopoietic cells. Blood 2001;97:1960-7.

61. Kojika S., Griffin J.D. Notch receptors and hematopoiesis. Exp Hematol 2001;29:1041-52.

62. Maillard I., He Y., Pear W.S. From the yolk sac to the spleen: New roles for notch in regulating hematopoiesis. Immunity 2003;18:587-9.

63. Kumano K., Chiba S., Kunisata A. et al. Notch1 but not notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity 2003; 18:699-711.

64. Reya T., Duncan A.W., Allies L. et al. A role for Wnt signaling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature 2003;423:409-14.

65. Willert K., Brown J.D., Danenberg E. et al. Wnt proteins are lipid-modifled and can act as stem cell growth factors. Nature 2003;423:448-52.

66. Stier S., Cheng T., Forkert R. et al. Ex vivo targeting of p21Cip1/Waf1 permits relative expansion of human hematopoietic stem cells. Blood 2003;102:1260-6.

67. Buske C., Feuring-Buske M.,

Abramovich C. et al. Deregulated expression of HOXB4 enhances the primitive growth activity of human hematopoietic cells. Blood 2002;100:862-8.

68. Krosi J., Austin P., Beslu N. et al. In vitro expansion of hematopoietic stem cells by re-combinant TAT-HOXB4 protein. Nat Med 2003;9:1428-32.

1 ’2011

1 ’2011

69. Amsellem S., Pflumio F., Bardinet D. et al. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells by direct delivery of the HOXB4 homeoprotein. Nat Med 2003;9:1423-7.

70. Lessard J., Sauvageau G. Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukae-mic stem cells. Nature 2003;423:255-60.

71. Ueno H., Sakita-Ishikawa M.,

Morikawa Y. et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nat Immunol 2003;4:457-63.

72. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 2003;13:631-42.

73. Chambers I., Colby D., Robertson M.

et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003;13:643-55.

74. Cavaleri F., Scholer H.R. Nanog: A new recruit to the embryonic stem cell orchestra. Cell 2003;13:551-7.

75. Raz R., Lee C.K., Cannizzaro L.A. et al. Essential role of Stat3 for embryonic stem cell pluripotency. Proc Nati Acad Sci USA 1999;96:2846-51.

76. Kiger A.A., Jones D.L., Schulz C. et al. Stem cell self-renewal specified by Jak-Stat activation in response to a support cell cue. Science 2001;294:2542-5.

77. Guo Y., Chan R., Ramsey H. et al. The homeoprotein Hex is required for heman-gioblast differentiation. Blood 2003;102:2428-35.

78. Welte T., Zhang S.S.M., Wang T. et al.

Stat3 deletion during hematopoiesis causes Crohn‘s disease-like pathogenesis and lethality: A critical role of Stat3 in innate immunity. Proc Nati Acad Sci USA 2003;100:1879-84.

79. Gotoh A., Takahira H., Mantel C. et al. Steel factor induces serine phosphorylation of Stat3 in human growth factor-dependent myeloid cell lines. Blood 1996;88:138-45.

80. Mack D.L., Leibowitz D.S., Cooper S.

et al. Down-regulation of the myeloid homeo-box protein Hex is essential for normal T-cell development. Immunology 2002;107:444-51.

81. Zhang S., Fukuda S., Lee Y.H. et al. Essential role of signal transducer and activator of transcription (Stat)5a but not Stat5B for Flt3-dependent signaling. J Exp Med 2000;192:719-28.

82. Kim C.H., Hangoc G., Cooper S. et al. Altered responsiveness to chemokines due to targeted disruption of SHIP. J Clin Invest 1999;104:1751-9.

83. Helgason C.D., Antonchuk J., Bodner C., Humphries R.K. Homeostastis and regeneration of the hematopoietic stem cell pool are altered in SHIP-deficient mice. Blood 2003;102:3541-7.

84. Carver-Moore K., Broxmeyer H.E.,

Luoh S.M. et al. Low levels of erythroid and myeloid progenitors in TPO and c-mpl-deficient mice. Blood 1996:88:803-8.

85. Perlingeiro R.C.R., Kyba M., Bodie S. et al. A role for thrombopoietin in hemangioblast development. Stem Cells 2003;21:272-80.

86. Lewis I.D., Almeida-Porada G., Du J. et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after

ex vivo culture in a noncontact system. Blood 2001;97:3441-9.

87. Broxmeyer H.E., Bruns H., Zhang S. et al. Th1 cells regulate hematopoietic progenitor cell homeostasis by production of oncostatin M. Immunity 2002; 16:815-25.

88. Blumberg H., Conklin D., Xu W. et al. Interleukin 20: Discovery, receptor identification, and role in epidermal function. Cell 2001;104:9-19.

89. Rich B.E., Kupper T.S. Cytokines:

IL-20 — a new effector in skin inflammation. Curr Biol 2001;11(13):531-4.

90. Liu L., Zeng W., Ding C. et al. Selective enhancement of multipotential hematopoietic progenitors in vitro and in vivo by IL-20. Blood 2003:102:3206-9.

91. Dumoutier L., Leemans C.,

Lejeune D. et al. Cutting edge: Stat activation by I L-19, IL-20 and mda-7 through IL-20 receptor complexes of two types. J Immunol 2001;167:3545-9.

92. Zhao S., Zoller K., Masuko M. et al. Jak2, complemented by a second signal from c-kit or flt3, triggers extensive self-renewal of primary multipotential hematopoietic cells. EMBO J 2002;21:2159-67.

93. Bums C.E., Zon L.I. Portrait of a stem cell. Dev Cell 2002;3:612-3.

94. Momson S.J., Shah N.M., Anderson D.J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell 1997;88:287-98.

95. Jan Y.N., Jan L.Y. Asymmetric cell division. Nature 1998,392:775-9.

96. Brummendorf T.H., Dragowska W., Zijimans J.M. et al. Asymmetric cell divisions sustain long-term hematopoiesis from singlesorted human fetal liver cells. J Exp Med 1998;188:1117-24.

97. Hartwell L., Weinert T. Checkpoints: Controls that control the order of cell cycle events. Science 1989;246:629-34.

98. Murray A. Cell cycle checkpoints. Curr Opin Cell Biol 1994;6:872-6.

99. Mantel C., Luo Z., Canfleld J. et al. Involvement of p21cip-1 and p27kip-1 in the molecular mechanisms of steel factor induced proliferative synergy in vitro and of p21cip-1 in the maintenance of stem/progenitor cells in vivo. Blood 1996;88:3710-9.

100. Braun S.E., Mantel C., Rosenthal M. et al. A positive effect of p21cip-1/waf-1 in the colony formation from murine myeloid progenitor cells as assessed by retroviral-mediated gene transfer. Blood Cells Mol Dis 1998;24:138-48.

101. Mantel C., Braun S.E., Reid S. et al. p21(cip-1/waf-1) deficiency causes deformed nuclear architecture, centriole overduplication, polyploidy, and relaxed microtubule damage checkpoints in human hematopoietic cells. Blood 1999;93:1390-8.

102. Mantel C., Hendrie P., Broxmeyer H.E. Steel factor regulates cell cycle asymmetry. Stem Cells 2001;19:483-91.

103. Broxmeyer H.E., Kohli L., Kirn C.H. et al. Stromal cell derived factor-1/CXCL 12 enhances survival/anti-apoptosis of hematopoietic stem and myeloid progenitor cells: Direct effects mediated through CXCR4 and Gai proteins. J Leuk Biol 2003;73:630-8.

104. Lee Y., Gotoh A., Kwon H.J. et al. Enhancement of intracellular signaling associated with hematopoietic progenitor cell survival in response to SDF-1/CXCL12 in synergy with other cytokines. Blood 2002;99:4307-17.

105. Mulloy J.C., Cammenga J., Berguido FJ. et al. Maintaining the self-renewal and differentiation potential of human CD34+ hematopoietic cells using a single genetic element. Blood 2003;102:4369-76.

106. Kobylka P., Ivanyi P., Breur-Vriesendorf B. Preservation of immunological and colony-forming capacities of long-term (15 years) cryopreserved cord blood cells. Transplantation 1998;65:1275-8.

107. Mugishima H., Harada K., Chin M. et al. Effects of long-term cryopreservation on hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood. Bone Marrow Transplant 1999;23:395-6.

108. Medcalf D. The molesular control of cell division, differentiation, commitment and maturation in hematopoietic cells. Nature 1989;399:27-30.

109. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 1993;81:2844-53.

110. Varnum-Finney B., Pulton M.E., Yu M. et al. The Notch ligand, Jagged 1, influences the development of primitive hematopoietic precursors cells, Blood 1998;91:4084.

111. Dull T., ZuJerey R., Kelly M.,

Mandel R.J., Nguyen M., Trono D. and Naldini L. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol 1998;72:8463-71.

112. Marino M.P., Luce M.J., Reiser J. Small-to large-scale production of lentivirus vectors. Methods in Molecular Biology, vol.229: Lentivirus Gene Engineering Protocols. Edited by M. Federico, Humana Press Inc., Totowa, NJ 2002:43-50.

113. Sutton R.E. Production of Lentiviral Vector Supernatants and Trasduction of Cellular Targets. Methods in Molecular Biology, vol.229: Lentivirus Gene Engineering Protocols. Edited by M. Federico, Humana Press Inc., Totowa, NJ 2002:147-58.

114. Sutton R.E., Henry T., Wu M., Rigg R., Bohnlein E. and Brown P.O. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Vectors Efficiently Transduce Human Hematopoietic Stem Cells. Journal of Virology 1998;72(7):5781-8.

115. Antonia Follenzi and Luigi Naldini Generation of HIV-1 derived lentiviral vectors. 2002 Academic press:454-6.

116. Finer M.H., Dull T.J., Quin L., Farson D. and Roberts M.R. Kat: a high efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood 1994;83:43-50.

117. Hawley R.G., Covarrubias L., Hawley T. and Mintz B. Handicapped retroviral vectors efficiently transduce foreign genes into hematopoietic stem cells. Proc Natl Acad. Sci USA 1987;84:2406-10.

118. Zufferey R., Dull T., Mandel R.J., Bukovsky A. et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of virology 1998;72(12):9873—80.

119. Yee K., Moores C., Jolly D.J., Wolff J.A., Respress J.G. and Friedmann T. Gene

expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proc Natl Acad Sci USA 1987;84:5197-5201.

120. Yu S.F., von Ruden T., Kantoff P.W., Graber C., Sciberg M., Ruther U., Anderson W. F. and Gilboa E.. Self-inactivating retroviral vectors designed for transfer of whole genes into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:3194-8.

121. Zufferey R., Nagy D., Mandel R.J., Naldini L. and Trono D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biolcchnol 1997;15:871-5.

122. Ingham P.W. Hedgehog signaling: a tale of two lipids. Science 2001;294:1879-81.

123. Hwang J.J., Li L., Anderson W.F. A conditional self-inactivating retrovirus vector that uses a tetracycline-responsive expression system. J Virol 1997;71:7128-31.

124. Cullen B.R., Lomedico P.T. and Ju G. Transcriptional interference in avian retroviruses — implications for the promoter insertion model of leukaemogenesis. Nature 1984;307:241-5.

125. Dougherty J.P., Temin H.M. A promoter-less retroviral vector indicates that there are sequences in U3 required for 3’ RNA processing. Proc Natl Acad Sci USA 1987;84:1197-201.

126. Kafri T., Blomer U., Peterson D.A.,

Gage F.H., Verma M. Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lenti viral vectors. Nat Genet 1997;17:314-7.

127. Olson P., Temin H.M., Dornburg R. Unusually high frequency of reconstitution of long terminal repeats in U3-minus retrovirus vectors by DNA recombination or gene conversion. J Virol 1992;66:1336-43.

128. Michael N.L., D’Arcy L., Ehrenberg P.K. and Redfield R.K. Naturally occuring genotypes of human immunodeficiency virus type

1 long terminal repeat display a wide range of basal and Tat-induced activities. J Virol 1994;68:3163-74.

129. Olson P., Nelson S., Dornburg R. Improved self-inactivating retroviral vector derived from spleen necrosis virus. J Virol 1994;68:7060-6.

130. Zufferey R., Nagy D., Mandel R.J., Naldini L. and Trono D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biolcchnol 1997;15:871-5.

131. Arias A.M. New alleles of Notch draw a blueprint for multifunctionality. Trends in Genet 2002;18:168-70.

132. Baonza A., Freeman M. Notch signalling and the initiation of neural development in the Drosophila eye. Development 2001;128:3889-98.

133. Barolo S., Stone T., Bang A.G.,

Posakony J.W. Default repression and Notch signaling: Hairless acts as an adaptor to recruit the corepressors Groucho and dCtBP to Suppressor of Hairless. Genes Dev 2002;15:1964-76.

134. Klein T., Seugnet L., Haenlin M.,

Arias A.M. Two different activities of Suppressor of Hairless during wing development in Drosophila. Development 2000;127:3553-66.

135. Artavanis-Tsakonas S., Matsuno K., Fortiny M.E. Notch signalling II. Science 1995;268:225-32.

136. Diederich R.J., Matsuno K., Hing H., Artavanis-Tsakonas S. Cytosolic interection between deltex and Notch ankyrin repeats implicates deltex in the signalling pathway. Development 1994;120:473-81.

137. Satoru Kojika, James D. Griffin. Notch receptors and hematopoiesis. Experimental Hematology 2001;29(Issue 9):1041 —52.

138. Wu L., Aster J., Griffin J.D. Notch receptor signal transduction. Experimental Hema-

tology 2000;28(Issue 7), Supplement 1:92.

139. Singh N., Phillips R.A., Iscove N.N. and Egan S.E. Expression of notch receptors, notch ligands, and fringe genes in hematopoiesis Experimental Hematology 2000;28(Issue 5):527-34.

140. Lawrence N., Klein Т., Brennan K.,

Arias A.M. Structural requirements for Notch signalling with Delta and Serrate during the development and patterning of the wing disc of Drosophila. Development 2000;127:3185-95.

141. Struhl G., Greenwald I. Presenilin mediated transmembrane cleavage is required for Notch signal transduction in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:229-34.

142. Cadigan K.M., Nusse R. Wnt signaling: a common theme in animal development. Genes Dev 1997;11:3286-305.

143. Doherty D., Feger G., Younger-Shepherd S., Jan L.Y., Jan Y.N. Delta is a ventral to dorsal signal complementary to Serrate, another Notch ligand, in Drosophila wing formation. Genes Dev 1996;10:421-34.

144. Ипатов С.Е., Румянцев С.А.,

Sutton R.E., Румянцев А.Г. Создание генных векторов на базе вируса иммунодефицита человека типа I для работы со стволовыми гемопоэтическими клетками человека. Вопр гематол/онкол и иммунопатол в пед 2005;4(2):92-7.

145. Ипатов С.Е., Румянцев С.А.,

Sutton R.E., Румянцев А.Г. Способность Cd133+Cd34- и CD133-Cd34+ клеток пуповинной крови человека обеспечивать донорский гемопоэз у NOD/SCID мышей. Вопр гематол/онкол и иммунопатол в пед 2005;4(2):97-102.

1 ’2011