СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА
METHOD OF PREDICTING ACUTE PANCREATITIS

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано в качестве одного из диагностических критериев в оценке степени тяжести и прогноза больных с острым панкреатитом. Потребность в прогнозировании развития острого панкреатита и поиск прогностических маркеров тяжести течения заболевания на разных стадиях патологического процесса являются актуальной и пока еще полностью нерешенной задачей.
Известен способ прогнозирования острого панкреатита, в котором показано, что при остром панкреатите выраженность воспалительного процесса в поджелудочной железе и мембранодеструктивных явлений в клеточных структурах органа, оцененных по составу фосфолипидного бислоя мембран, коррелируют с изменениями липидного метаболизма в плазме и форменных элементах крови. Наиболее демонстративные изменения липидного обмена в плазме и форменных элементах крови при остром панкреатите проявляются в виде значительного увеличения относительного уровня лизоформ фосфолипидов и свободных жирных кислот (СЖК). Установлено, что при прогрессировании острого экспериментального панкреатита и трансформации отечной формы панкреатита в панкреонекроз изменения указанных фракций липидного состава в плазме и форменных элементах крови резко возрастают (Келейников С.Б. Патофизиологическое обоснование новых прогностических критериев острого панкреатита. Автореф. дис. … докт. мед. наук. - М., 2009. - 37 с.). На основании полученных данных в качестве диагностического теста, оценивающего характер, глубину и направленность патологического процесса в поджелудочной железе при остром панкреатите, определяется уровень лизофосфолипидов (ЛФЛ) и свободных жирных кислот в плазме и форменных элементах крови (эритроцитах и тромбоцитах).
Несмотря на высокую прогностическую значимость выявленных прогностических критериев острого панкреатита, недостатками методики С.Б. Келейникова является то, что предложено использовать определение только относительного уровня одной из фракций липидного спектра в плазме крови или эритроцитах. При таком подходе высока вероятность ложноположительного или ложноотрицательного результата вследствие того, что особенностью липидного обмена является его достаточно высокая лабильность. Возможны изменения относительного уровня одной из фракций при сохранении относительного уровня или незначительном его отклонении со стороны других фракций. Кроме того, недостатками метода является отсутствие комплексной оценки структурно-функционального состояния липидного бислоя мембран форменных элементов крови, поскольку способ предполагает количественную оценку отдельных фракций, что не может считаться критерием дестабилизации липидного обмена клеточной биомембраны в целом.
Технический результат заключается в повышении точности прогнозирования течения острого панкреатита на основе оценки изменений фракций липидного состава биомембран эритроцитов, обладающих хаотропным действием.
Сущность изобретения заключается в том, в способе прогнозирования острого панкреатита, включающем оценку липидного состава эритроцитов по уровню лизофосфолипидов, свободных жирных кислот и суммарных фосфолипидов, в качестве прогностического критерия определяют индекс хаотропности липидного состава эритроцитов по формуле:
,
где ИХ - индекс хаотропности, ед.,
ЛФЛ - содержание лизофосфолипидов от общего содержания липидов, %,
СЖК - свободные жирные кислоты от общего содержания липидов, %,
СФЛ - суммарные фосфолипиды от общего содержания липидов, %.
Значения индекса хаотропности менее 1,7 соответствуют норме, от 1,8 до 2,5 показывают развитие острого отечного панкреатита с абортивным течением, от 2,6 до 4,4 - острого деструктивного панкреатита с абортивным течением, от 4,6 и более - острого деструктивного панкреатита с прогрессирующим течением.
Способ осуществляется следующим образом.
Острый панкреатит моделируют по способу В.М. Буянова (Буянов В.М. и др. Моделирование острого панкреатита // Клин. хирургия. - 1989. - №11. - С.24-26). Животным вводят желчь в паренхиму поджелудочной железы по 0,5 мл в 5 точках с целью моделирования отечной формы острого панкреатита, в 8 точек - для воспроизведения деструктивной формы заболевания, в 12 точек - с целью моделирования панкреонекроза с прогрессирующим течением и высокой вероятностью летального исхода. В контрольные сроки (1-е, 3-и, 5-е, 7-е сутки) животным производят релапаротомию, оценивают течение воспалительного процесса в поджелудочной железе, осуществляют забор крови. Для получения нормальных значений исследуемых показателей их оценивают у 10 здоровых животных.
Активность альфа-амилазы определяют методом ферментативного гидролиза крахмала, регистрируя данные на фотоэлектроколориметре при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр).
Липиды из эритроцитов крови экстрагируют хлороформметаноловой смесью, фракционируют методом тонкослойной хроматографии. Полярные фосфолипиды разделяют на пластинах фирмы «Merk» на стеклянной основе, нейтральные липиды - на силикагелевых пластинах для обращенно-фазной тонкослойной хроматографии. Для удаления связанной воды и повышения разделительной способности силикагеля до начала фракционирования хроматографические пластины нагревают при температуре 120°С в течение 30-60 минут. Разделение липидов проводится в прямоугольных хроматографических камерах, которые выстилаются изнутри фильтровальной бумагой для лучшего насыщения внутреннего объема камеры парами растворителей.
Полученные образцы суммарных препаратов липидов растворяют в хлороформ-метанольной смеси (2:1 по объему) и наносят с помощью микрошприца фирмы «Hamilton» на расстоянии 1,5 см от краев пластины. При препаративном фракционировании раствор 2 мг липидов наносят в виде прямоугольной полосы, при аналитическом разделении нагрузка липидов на одну точку составляет 100-200 мкг.
Разделение фосфолипидов проводится одномерно в системе растворителей хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота - вода, взятых в соотношении 60:50:1:4 по объему.
Для фракционирования нейтральных липидов хроматографические силикагелевые пластины элюируют в системе растворителей гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота, взятых в соотношении 90:10:1 по объему. Для обнаружения липидов на хроматограммах используют 10% раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле. Пластины опрыскивают указанным раствором и нагревают при температуре 90°С в течение 10 минут, при этом происходит окрашивание липидных пятен в темно-синий цвет на желто-зеленом фоне.
Идентификация липидов на хроматограммах проводится с использованием специфических реагентов и свидетелей, дающих цветные реакции. Для выявления фосфолипидов применяют универсальный реагент, приготовляемый из исходного реагента, который получают путем добавления к 10 г натрия молибденовокислого в 60 мл 4 н. HCl солянокислого гидразина в 14 мл 4 н. HCl с последующим нагреванием полученной смеси в течение 20 минут на водяной бане. После этого смесь охлаждают, приливают 14 мл концентрированной серной кислоты и доводят общий объем до 100 мл дистиллированной водой. Хроматографические пластины опрыскивают универсальным реагентом, содержащим один объем исходного реагента и семь объемов 7 н. серной кислоты. При этом фосфолипиды окрашиваются в сине-голубой цвет.
Количественное определение липидов (лизофосфолипидов, свободных жирных кислот, суммарных фосфолипидов и др.) проводят непосредственно на хроматограммах денситометрическим методом после их проявления 5% фосфорнованилиновой кислотой в этаноле. Молекулярный анализ проводят на денситометре Model GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst, PS Sowtware). Содержание лизофосфолипидов, свободных жирных кислот и суммарных фосфолипидов определяют по хроматограммам в процентах от общего содержания липидов, принятого за 100%.
Используя полученные данные, определяют индекс хаотропности (ИХ) по относительному содержанию лизофосфолипидов (ЛФЛ), свободных жирных кислот (СЖК) и суммарных фосфолипидов (СФЛ) по формуле:
,
где ЛФЛ - содержание лизофосфолипидов от общего содержания липидов, %,
СЖК - содержание свободных жирных кислот от общего содержания липидов, %,
СФЛ - содержание суммарных фосфолипидов от общего содержания липидов, %.
Пример расчета. Общее содержание липидов - 100%, содержание лизофосфолипидов - 7,4%, содержание свободных жирных кислот - 8,5%, содержание суммарных фосфолипидов - 27,1%.
Значения индекса хаотропности менее 1,7 соответствуют норме, от 1,8 до 2,5 - характерны для острого отечного панкреатита с абортивным течением; от 2,6 до 4,4 - для острого деструктивного панкреатита с абортивным течением; от 4,6 и более - для острого деструктивного панкреатита с прогрессирующим течением.
Апробация способа проведена на экспериментальном материале (три группы, 60 собак). В исследуемых группах оценивалась макроскопическая картина поджелудочной железы, свидетельствующая об адекватности модели острого панкреатита. Развитие воспалительного процесса в поджелудочной железе отмечалось уже на следующие сутки, что подтверждалось также повышением уровня α-амилазы в плазме крови. При отечной форме острого панкреатита (первая группа) наблюдалось повышение α-амилазы на 80,34-188,87% (р<0,05) в течение пяти суток. Лишь на конечном этапе динамического наблюдения (7-е сутки) показатель активности α-амилазы достигал исходных значений. У животных с деструктивной формой острого панкреатита с абортивным течением (вторая группа) активность α-амилазы плазмы крови была повышена на всех этапах эксперимента на 63,81-260,46% (р<0,05). При остром панкреатите деструктивной формы с прогрессирующим течением активность α-амилазы плазмы крови была наиболее максимальной в течение всего периода наблюдения и превышала исходные данные на 279,84 -439,04% (р<0,05).
Следует отметить, что модель острого панкреатита по В.М. Буянову с соавт. была адекватной для решения цели и поставленных задач.
У животных, которым желчь вводили в пяти точках (первая модель), развивался острый панкреатит со всеми морфологическими проявлениями интерстициальной (отечной) формы. Отметим, что в этой экспериментальной группе у некоторых животных происходила трансформация отечной формы острого панкреатита в деструктивную, что приводило к гибели двух животных (одна собака погибла на четвертые, вторая - на шестые сутки). На аутопсии было зарегистрировано тотальное поражение поджелудочной железы с явлениями разлитого перитонита. Такое прогрессирующее течение патологического процесса, по-видимому, связано с индивидуальными особенностями и реактивностью организма погибших животных.
При данной форме острого панкреатита наибольшие морфологические проявления патологии выявлены через трое суток, когда паренхима поджелудочной железы была отечна и гиперемирована. Отмечалась гиперемия окружающих тканей. На фоне отека и гиперемии в поджелудочной железе определялись небольшие участки кровоизлияний и некроза тканей, особенно в зоне инъекций желчи (рис.1 - Макроскопическая картина поджелудочной железы. Трое суток после операции).
В брюшной полости наблюдалось незначительное количество желтоватого цвета экссудата. Петли тонкой кишки и париетальная брюшина были отечны, гиперемированы. Петли тощей кишки были вздуты, их серозная оболочка синюшно-бледного цвета, сосуды расширены. Брыжейка кишечника была отечна, с инъецированными сосудами. В брюшной полости обнаруживался той или иной степени выраженности спаечный процесс.
К пятым суткам исследования патологический процесс со стороны органа поражения, прилежащих к нему органов и брюшной полости в целом значительно уменьшался, что свидетельствовало о благоприятном течении острого панкреатита (купирование патологического процесса). В участках инъекций желчи к этому сроку отмечены кровоизлияния поджелудочной железы без существенных воспалительных явлений.
Отметим, что через семь суток после моделирования острого панкреатита со стороны поджелудочной железы, а также прилежащих к ней органов видимые морфологические изменения были слабо выражены. В ряде случаев в брюшной полости отмечен лишь незначительный спаечный процесс. Фактически к этому сроку можно было документировать о полном купировании воспалительного процесса в поджелудочной железе. В ряде случаев в поджелудочной железе даже в местах инъекций желчи четких видимых морфологических изменений не отмечено.
Выявленная такого рода динамика морфологических изменений со стороны поджелудочной железы соответствовала и клиническим проявлениям заболевания. К седьмым суткам, а в ряде случаев - к пятым, поведение животных не отличалось от здоровых. Они охотно передвигались по вольеру, пили воду, принимали пищу.
У животных, которым при моделировании острого панкреатита желчь в паренхиму поджелудочной железы вводили в восьми точках (вторая группа), развивалась деструктивная форма острого панкреатита с преимущественным очаговым поражением органа. При этом на третьи сутки исследования погибли две собаки, на четвертые сутки - три собаки. На аутопсии погибших животных выявлено тотальное поражение поджелудочной железы с расплавлением тканевых структур. В брюшной полости имелся мутный экссудат в большом количестве.
В этой группе животных через сутки после моделирования при релапаротомии выявлено наличие в брюшной полости большого количества геморрагического экссудата с хлопьями фибрина. В брюшной полости имелся спаечный перипроцесс, в который были вовлечены главным образом поджелудочная железа, петли тонкой кишки, пряди большого сальника. Париетальная брюшина и серозная оболочка кишечника были гиперемированы, на петлях тонкой кишки имелись участки, покрытые фибрином. Отмечалось резкое увеличение желудка и петель кишечника из-за их вздутия. Особенно выраженными воспалительные явления отмечены со стороны двенадцатиперстной и тощей кишки. Одними из характерных признаков были гиперемия и заметное увеличение кровеносных сосудов. В указанный срок в самой поджелудочной железе отмечены множественные участки панкреонекроза. Их число соответствовало количеству зон поражения органа при моделировании патологии.
Через трое суток после моделирования воспалительные явления со стороны органа поражения и брюшной полости прогрессировали. На аутопсии в брюшной полости выявлялся геморрагический экссудат, выраженный спаечный перипроцесс, в центре которого чаще всего располагалась воспаленная поджелудочная железа. Желудок и петли тонкой кишки были увеличены в диаметре. Поджелудочная железа была резко увеличена, участки некроза в ней становились с большей зоной поражения тканей. Выявлялись участки расплавления омертвевших тканей железы. Близлежащие тканевые структуры органа были отечными и гиперемированными с очагами обширных кровоизлияний (рис.2 - Макроскопическая картина поджелудочной железы. Трое суток после операции).
Через пять суток развития заболевания при макроскопической оценке в брюшной полости выявлен выраженный воспалительный процесс. Отмечено наличие геморрагического экссудата, спаечного процесса. К этому сроку спайки становились грубыми и с трудом подвергались разделению. Желудок и петли тонкой кишки также были увеличены в диаметре, но без прогрессирующего увеличения. Со стороны поджелудочной железы отмечалось распространение некротического процесса фактически по всей вертикальной части паренхимы органа. Горизонтальный отдел ее был резко увеличен, с массивными явлениями кровоизлияний и гиперемии.
Через семь суток у животных этой группы происходила стабилизация патологического процесса. При релапаротомии в брюшной полости количество экссудата было незначительным, имелся спаечный процесс. В желудке и кишечнике заметных структурно-функциональных изменений не отмечено. Перистальтика кишечника была активная. В поджелудочной железе участки панкреонекроза определялись в виде серозированных структур, выполненных стеариновыми наложениями и массивными кровоизлияниями. Участков расплавления тканей, как проявления прогрессирования заболевания, не отмечалось.
В третьей группе животным моделировали острый панкреонекроз с прогрессирующим течением. С этой целью желчь в паренхиму поджелудочной железы вводили в двенадцати точках. У животных этой группы развивалась деструктивная форма острого панкреатита с тотальным поражением органа. При этом на третьи сутки исследования погибли три собаки, на четвертые-пятые сутки - пять собак.
На аутопсии погибших животных диагноз был подтвержден. Установлено тотальное некротическое поражение поджелудочной железы с расплавлением тканевых структур. В брюшной полости имелся разлитой перитонит. Мутный экссудат в большом количестве располагался во всех отделах брюшной полости. Желудок и кишечник были резко увеличены в диаметре. Их содержимым оказалась мутная жидкость и газ.
Через трое суток после моделирования отмечены выраженные воспалительные явления со стороны поджелудочной железы и органов брюшной полости (рис.3 - Макроскопическая картина поджелудочной железы. Трое суток после операции).
На аутопсии в брюшной полости выявлялся в большом количестве геморрагический экссудат, выраженный спаечный перипроцесс, в центре которого чаще всего располагалась воспаленная поджелудочная железа. Желудок и петли тонкой кишки были увеличены в диаметре. Орган поражения - поджелудочная железа - был резко увеличен, в ее вертикальной части отмечены множественные участки некроза тканей с их расплавлением. Указанный процесс распространялся и на горизонтальный отдел, тканевые структуры которого были отечными и гиперемированными с очагами обширных кровоизлияний.
Через пять суток после введения желчи в паренхиму поджелудочной железы в брюшной полости воспалительный процесс сохранялся. Явления острого деструктивного панкреатита прогрессировали. В брюшной полости отмечалось большое количество геморрагического экссудата, вокруг поджелудочной железы имелся спаечный перипроцесс. Отмечены явления паралитической кишечной непроходимости: желудок и петли тонкой кишки были увеличены в диаметре. В самой поджелудочной железе отмечено прогрессирование воспалительно-некротического процесса с вовлечением в него и горизонтального отдела (рис.4 - Макроскопическая картина поджелудочной железы. Пять суток после операции).
Через семь суток у животных этой группы в брюшной полости отмечено сохранение выраженного воспалительного процесса. При релапаротомии определялось достаточно большое количество мутного экссудата, преимущественно геморрагического характера, спаечный процесс был достаточно массивным. Явления паралитической кишечной непроходимости сохранялись. В поджелудочной железе отмечалось тотальное поражение вертикального отдела с явлениями расплавления тканей.
Таким образом, необходимо указать, что при выбранных моделях острого панкреатита в поджелудочной железе возникали воспалительные процессы различной степени выраженности. Фактически нами воспроизведены все возможные варианты течения острого панкреатита, которые встречаются в практике, за исключением гнойных осложнений (рассмотрение последних не входило в задачи исследования).
Отметим, что при выбранных моделях острого панкреатита спектр всевозможных изменений в поджелудочной железе, начиная с абортивного течения и кончая прогрессирующим с высокой вероятностью летального исхода, возникал в течение выбранного периода - семь суток. Указанное является достаточным основанием для установления закономерности сопряженности динамики морфологических изменений в поджелудочной железе с расстройствами гомеостаза.
Исследования показали, что при различных вариантах течения острого панкреатита в эритроцитах наблюдается снижение содержания суммарных фосфолипидов и рост уровня липидов, обладающих хаотропным действием, - лизофосфолипидов и свободных жирных кислот. Индекс хаотропности более полно отражает степень патологических изменений липидного обмена и воспалительного процесса в поджелудочной железе.
При остром панкреатите отечной формы индекс хаотропности липидного состава эритроцитов повышается в 1,9-2,5 раза. Наибольшее его значение регистрируется через 3-е суток после моделирования, когда воспалительные явления со стороны поджелудочной железы были максимальной степени выраженности для этой формы острого панкреатита.
Деструктивный панкреатит с абортивным течением характеризовался повышением индекса хаотропности в 2,5-4,1 раза, что было достоверно выше, чем при отечной форме острого панкреатита. Выявлено, что при такой форме заболевания отмечено прогрессирующее увеличение индекса до 5-х суток с последующим его незначительным снижением к 7-м суткам. В данной группе экспериментов также выявлено соответствие патоморфологических изменений со стороны поджелудочной железы с уровнем индекса хаотропности.
При остром деструктивном панкреатите с прогрессирующим течением индекс хаотропности был максимального уровня и превышал условную норму в 2,9-5,6 раза. Отметим, что в данной группе наблюдалось прогрессирующее увеличение индекса хаотропности, что соответствовало динамике патологии - существенное увеличение деструктивного процесса со стороны поджелудочной железы (табл.1 - Значения индекса хаотропности биомембран эритроцитов при различных вариантах течения острого панкреатита в эксперименте (М±m)).
Многочисленными экспериментами при различных вариантах течения острого панкреатита показано, что проявлением регресса острого воспалительного процесса в поджелудочной железе следует считать снижение индекса хаотропности, а признаком прогрессирования острого панкреатита - сохранение высоких значений или рост индекса хаотропности клеточных структур эритроцитов в течение 7 суток.
Подчеркнем, что подтверждением выявленной закономерности явились результаты установленной корреляционной зависимости между альфа-амилазной активностью плазмы крови, как одного из важнейших показателей выраженности воспалительного процесса в поджелудочной железе, и индексом хаотропности мембран эритроцитов при различной тяжести острого панкреатита (табл.2 - Корреляционная зависимость между альфа-амилазной активностью плазмы крови и индексом хаотропности мембран эритроцитов при различной тяжести острого панкреатита в эксперименте).
Аргументацией возможности использования индекса хаотропности в качестве критерия прогнозирования острого панкреатита послужила высокая его информативность в диагностике данного патологического состояния. Указанные выше факты по существу являются теоретической основой и экспериментальным подтверждением высокой прогностической значимости разработанного индекса хаотропности в определении характера, глубины и направленности патологического процесса в поджелудочной железе при остром панкреатите, что является основанием для его использования в клинической практике.
Способ апробирован у 69 больных острым панкреатитом различной тяжести (три клинические группы). Пациентам первой группы с отечной формой острого панкреатита проводили интенсивную консервативную терапию. Во второй и третьей группах больным острым панкреатитом деструктивной формы с абортивным (вторая группа) и прогрессирующим течением (третья группа) выполняли различные хирургические вмешательства, а в послеоперационном периоде больные получали стандартизированную терапию. Исследования показали, что, как и в экспериментальных группах, у больных острым панкреатитом деструктивной формы с прогрессирующим течением уровень α-амилазы был наиболее высоким, как и индекс хаотропности мембран эритроцитов. Сопоставляя течение острого панкреатита, величину индекса хаотропности и активность α-амилазы, следует отметить, что у больных, имеющих более высокие значения индекса хаотропности, наблюдали формирование острого панкреатита деструктивной формы с прогрессирующим течением (табл.3 - Значения индекса хаотропности биомембран эритроцитов при различных вариантах течения острого панкреатита в клинических группах (М±m)).
Необходимо отметить, что значения индекса хаотропности, составляющие менее 1,7, соответствуют норме; от 1,8 до 2,5 - характерны для острого отечного панкреатита с абортивным течением; от 2,6 до 4,4 - для острого деструктивного панкреатита с абортивным течением; от 4,6 и более - для острого деструктивного панкреатита с прогрессирующим течением.
Корреляционная зависимость между альфа-амилазной активностью плазмы крови и индексом хаотропности мембран эритроцитов при различной тяжести острого панкреатита подтверждает, что рост индекса хаотропности является свидетельством прогрессирования острого панкреатита (табл.4 - Корреляционная зависимость между альфа-амилазной активностью плазмы крови и индексом хаотропности мембран эритроцитов при различной тяжести острого панкреатита). Таким образом, прогностическая значимость индекса хаотропности имеет не только теоретическое, но и практическое значение.
По сравнению с известным решением предлагаемый способ позволяет повысить точность прогнозирования течения острого панкреатита по индексу хаотропности липидного состава эритроцитов, который наиболее полно и адекватно отражает характер и направленность воспалительного процесса в поджелудочной железе.
Таблица 1
Группа
Норма
Этапы наблюдения
1-е сутки
3-и сутки
5-е сутки
7-е сутки
Первая. Острый отечный панкреатит с абортивным течением.
1,05±0,06
2,41±0,10*
2,64±0,11*
2,12±0,09*
1,99±0,09*
Вторая. Острый деструктивный панкреатит с абортивным течением.
2,60±0,09*
4,30±0,15*
4,29±0,17*
3,48±0,12*
Третья. Острый деструктивный панкреатит с прогрессирующим течением.
3,05±0,12*
4,37±0,16*
5,33±0,18*
5,87±0,19*
Примечание: * - достоверность изменений по отношению к норме р<0,05.
Таблица 3
Группа
Норма
Этапы наблюдения
1-е сутки
3-и сутки
5-е сутки
7-е сутки
Первая. Острый отечный панкреатит с абортивным течением.
0,94±0,05
2,32±0,09*
2,53±0,10*
2,01±0,07*
1,78±0,06*
Вторая. Острый деструктивный панкреатит с абортивным течением.
2,67±0,11*
4,46±0,17*
4,52±0,16*
3,61±0,13*
Третья. Острый деструктивный панкреатит с прогрессирующим течением.
3,20±0,15*
4,68±0,17*
5,49±0,20*
5,76±0,18*
Примечание: * - достоверность изменений по отношению к норме <0,05.