СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ПТИЦ
METHOD OF BIOLOGICAL QUALITY CONTROL OF LIVE CHICKEN CHOLERA VACCINE

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для контроля качества изготавливаемых серий любой живой вакцины против пастереллеза птиц.
В существующем контроле качества живой вакцины против пастереллеза птиц не обеспечиваются единство и достоверность измерения таких особо важных показателей, как безвредность и иммуногенность. Проблема заключается в несовершенстве способа применения вакцины и в необъективности способа определения специфической устойчивости вакцинированных птиц к пастереллезу, применяемых согласно известным нормативным документам. В частности, что касается способа биологического контроля качества вакцины согласно Техническим условиям (ТУ) 10.19.76-89, в последней редакции утвержденным 19.04.1989 г., взятого за прототип, и способа применения вакцины согласно Наставлению, в последней редакции утвержденному 22.07.1996 г., принятого за аналог, соответственно предназначенных для контроля и применения живых вакцин из штаммов «АВ» (Авирулентный Васюринский) и «К» (Краснодарский) Краснодарской НИВС, можно отметить существенные недостатки. Способ прививки живой вакцины в контроле не соответствует способу прививки ее на практике и абсолютно не повторяет естественный путь заражения птиц возбудителем пастереллеза. В соответствии с требованиями ТУ обе вакцины, наряду с другими показателями, проверяют на безвредность и иммуногенность на курах, прививая подкожно, тогда как по Наставлению эти вакцины применяют на водоплавающей птице путем прокола кожи иглой и введения в полость лицевого синуса. При определении специфической устойчивости вакцинированных птиц к пастереллезу способ введения контрольного штамма пастерелл (в грудную мышцу) не только не соответствует способу введения вакцины, но и абсолютно не повторяет естественный путь заражения птиц возбудителем болезни. Такое положение свидетельствует о несоответствии введения в организм живой вакцины в контроле и на практике, живой вакцины и контрольного штамма пастерелл, а также о нарушении естественного механизма взаимодействия микро- и макроорганизмов и об исключении в нем особой роли условий внешней среды. Микроб изначально лишают проявления важных атрибутов вирулентности - инфективности и инвазивности, а организм птицы - важной роли первичных естественных барьеров и защитных приспособлений (в частности - формирования и проявления местного иммунитета к пастереллезу как антиинвазивного, по А.В.Масюкову, 1965). Кроме того, недостоверность измерения иммуногенности вакцины обусловлена несовершенством стандартизации каждого применяемого в работе контрольного штамма бактерий возбудителя пастереллеза птиц. Проблема заключается в выраженной вариабельности возбудителя болезни, издавна обозначенная - «парадокс вирулентности». Микроорганизм обычно не удается пассировать через восприимчивый организм способом, близким к естественному заражению, и поэтому с целью заражения птиц в биологической пробе его вынуждены вводить во внутреннюю среду организма путем инъекции. Поскольку естественный путь заражения и влияние условий окружающей среды в пассаже исключены, свойства изолируемого микроорганизма каждый раз выражены недостаточно и по-разному. К тому же выделенный микроорганизм довольно быстро ослабляет вирулентность и одновременно изменяет другие свои свойства, тогда как природные условия быстрого восстановления его в исходное состояние неизвестны. В результате контрольные штаммы пастерелл практически получают нестандартные, применение которых в контроле качества вакцины не обеспечивает единства и достоверности измерения показателя иммуногенность.
Экспериментально установлено, что введение живой вакцины во внутреннюю среду организма птицы любым способом, в том числе и путем скарификации кожи или слизистой, является причиной более или менее выраженных осложнений и гибели птицы. Осложнений всегда больше, если первая прививка вакцины птице (вакцинация), при инъекции в организм, совпадает с резким похолоданием и колебаниями суточной температуры окружающей среды. В период бактериемии, при охлаждении конечностей птицы, с изменением местной температуры в тканях изменяется и морфогенез пастерелл. В крови бактерии без капсулы, тогда как в тканях суставов и сухожильных влагалищ ног, вследствие снижения температуры, бактерии инкапсулируются, проявляют свойство адгезивности и колонизируют, из-за чего развиваются артриты (синовиты) и тендовагиниты ног. Ввиду такого положения прививка живой вакцины путем инъекции во внутреннюю среду организма птицы практически не допустима. В отношении способа введения вакцины в полость лицевого синуса путем прокола кожи доказательства несколько иные. Эта полость, анатомически являясь придатком носовой полости, свободно сообщается с носовой и, по продолжению, с ротоглоточной полостью. Более наглядно это демонстрируется при введении в полость лицевого синуса любого жидкого красителя, который сразу же истекает через носовые отверстия, хоаны и небную щель. Очевидно, что в течение 50 лет живые вакцины из штаммов «АВ» и «К», применяемые таким очень трудоемким и из-за частичной инъекции в ткани небезопасным для организма птицы способом, по существу прививают в дозе 0,2 мл локально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей, эволюционно сложившихся местом локализации (колонизации) ослабленных пастерелл при естественном бактерионосительстве и особо уязвимым местом внедрения патогенных пастерелл. Между тем можно более просто, удобно, производительнее, с меньшими материальными затратами и, главное, безопасно, без осложнений прививать вакцину интраназально, причем не только водоплавающей, но и другой сельскохозяйственной птице разных видов и возрастов (Патент РФ №2310472 от 20.11.2007. Бюл. №32). Применять вакцину из штамма «АВ» как вспомогательную просто нет необходимости, тогда как реальные возможности и перспективы производства и использования вакцины из штамма «К» могут быть значительно шире. В этой связи изготавливаемые серии живой вакцины из штамма «К», как и любой другой живой вакцины против пастереллеза птиц, можно оценивать на безвредность и иммуногенность путем введения интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей птиц.
В предыдущих работах показана функциональная термолабильность пастерелл с объяснением изменчивости по морфологии (Патент РФ №2051970 от 10.01.1996. Бюл. №1. Ж. «Доклады Россельхозакадемии». 1996. №5. С.32-35) и вирулентности (Патент РФ №2123531 от 20.12.1998. Бюл. №35), показаны условия восстановления и биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования (Патент РФ №2286391 от 27.10.2006. Бюл. №30) и условия заражения птиц возбудителем пастереллеза в эксперименте для постановки биологической пробы близко к природному заражению (Патент РФ №2286390 от 27.10.2006. Бюл. №30). Из этих работ следует, что объективно биологически контролировать качество живой вакцины можно с позиции повторения естественного пути заражения птиц пастереллезом и с учетом функциональной термолабильности пастерелл, вакцинируя интраназально и в последующем таким же способом заражая птиц возбудителем пастереллеза при допустимой оптимальной температуре окружающей среды. Контролировать качество вакцины на иммуногенность по специфической устойчивости вакцинированных и восприимчивости не вакцинированных птиц к пастереллезу можно только при точности условий получения, сохранения и введения в организм птицы стандартизированного по морфологии, вирулентности и численности микробной клетки контрольного штамма пастерелл.
В целом анализ научно-технических данных свидетельствует, что существующий биологический контроль качества живой вакцины против пастереллеза птиц не отвечает требованиям стандартизации, так как не обеспечивает единство и достоверность измерения таких особо важных показателей, как безвредность и иммуногенность.
Задачей изобретения является совершенствование биологического контроля качества живой вакцины против пастереллеза птиц путем обеспечения единства и достоверности измерения безвредности и иммуногенности с позиции повторения естественного механизма взаимодействия микро- и макроорганизмов и особой роли в нем условий внешней среды.
Поставленная задача достигается тем, что живую вакцину вводят интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей птицы любого вида массой тела около 2 кг при температуре 20-22°С окружающей среды и оценивают безвредной, так как все однократно вакцинированные в двукратно нормативной дозе птицы клинически здоровы в течение 7 и более суток, и иммуногенной, так как в течение 7 суток с момента введения в организм птицы таким же способом смертельной дозы стандартизированного контрольного штамма пастерелл в капсульном варианте микробной клетки из 10 двукратно вакцинированных (с интервалом 7 суток, в нормативной дозе, через 10 суток после иммунизации) выживает не менее 8 (80%) специфически устойчивых и из 10 не вакцинированных (контрольных) гибнет не менее 8 (80%) восприимчивых.
Существенным отличием является то, что изготовленную серию живой вакцины оценивают на качество с позиции повторения естественного механизма взаимодействия микро- и макроорганизмов и особой роли в нем условий внешней среды. Вакцину вводят интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей птицы любого вида массой тела около 2 кг при температуре 20-22°С окружающей среды и устанавливают безвредной, так как все однократно вакцинированные в двукратно нормативной дозе птицы клинически здоровы в течение 7 и более суток, и иммуногенной, так как в течение 7 суток с момента введения в организм птицы таким же способом смертельной дозы стандартизированного контрольного штамма пастерелл в капсульном варианте микробной клетки из 10 двукратно вакцинированных (с интервалом 7 суток, в нормативной дозе, через 10 суток после иммунизации) выживает не менее 8 (80%) специфически устойчивых и из 10 не вакцинированных (контрольных) гибнет не менее 8 (80%) восприимчивых.
В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта условий прививки живой вакцины птице и определенного стандарта условий подготовки и применения контрольного штамма пастерелл.
Сведения и примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения
100
50
В исследованиях применяли живую вакцину из ослабленного штамма пастерелл «К» Краснодарской НИВС (сухую), изготовленную ФГУП «Ставропольская биофабрика», предназначенную по существующему Наставлению против пастереллеза водоплавающих птиц, и типичный возбудитель пастереллеза птиц Pasteurella multocida A:1 серовара, наиболее распространенный и повсеместно вызывающий заболевание (по нашим данным в 89% случаев эпизоотии). В частности, применяли вирулентный контрольный штамм пастерелл ВГНКИ №712, который восстанавливали в пассаже через высоко восприимчивый организм и биологически изолировали для сохранения к моменту использования с оценкой по показателям морфологии и вирулентности. Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму. Микроорганизм культивировали на плотной питательной среде (питательный агар, ТУ 9398-020-78095326-2006) и в жидкой питательной среде (питательный бульон, ТУ 9398-021-78095326-2006). Вирулентность оценивали по абсолютной летальной дозе (ЛД), а при возможности и по 50%-летальной дозе (ЛД, по Риду и Менчу или по Керберу). В целях контроля качества серий живой вакцины на безвредность и иммуногенность использовали кур и уток массой тела около 2 кг. Безвредность вакцины для птицы оценивали по результатам клинических наблюдений. Иммуногенность вакцины оценивали по результатам специфической устойчивости вакцинированных и восприимчивости не вакцинированных птиц к пастереллезу в остром опыте и выражали через коэффициент иммунологической эффективности (КИЭ, %).
Пример 1.
3
3
В разные годы соответственно контролировали изготовленные серии живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл «К» на безвредность для организма птицы. С этой целью работу вели при температуре 20-22°С окружающей среды. Лиофильно высушенную вакцину, в установленном количестве отобранных для анализа ампул, растворяли в физиологическом растворе по общепринятой методике из расчета содержания ее 2 нормативных доз (1 млрд жизнеспособных пастерелл вакцины из штамма «К») в объеме 1 см. Безвредность живой вакцины для организма птицы оценивали соответственно на 10 клинически здоровых курах или утках массой тела около 2 кг. В каждом случае голову птицы удерживали клювом вверх под углом примерно 45° и посредством пипетки или шприца (без иглы!) поочередно через каждое носовое отверстие наносили вакцину в объеме по 0,5 см на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. За вакцинированной птицей вели клинические наблюдения. Живая вакцина в дозе двукратно больше нормативной дозы не вызывала гибель птиц в течение 7 и более суток наблюдения. В течение этого срока все привитые живой вакциной птицы не только выживали, но и постоянно были клинически здоровыми. В разное время изготовленные пять серий живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл «К» соответственно все прошли биологический контроль качества на безвредность: две - на курах и три - на утках. Сделан вывод, что объективно контролировать качество живой вакцины на безвредность достаточно и на трех птицах любого вида массой тела около 2 кг, если птиц вакцинировать интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды.
Пример 2.
В разные годы соответственно контролировали изготовленные серии живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл на иммуногенность. С этой целью каждый раз последовательно выполняли иммунизацию птиц живой вакциной, подготовку контрольного штамма пастерелл и оценку иммуногенности живой вакцины.
3
3
3
2.1. Иммунизация птиц живой вакциной. Работу вели при температуре 20-22°С окружающей среды. Лиофильно высушенную вакцину из штамма «К» растворяли в физиологическом растворе по общепринятой методике из расчета содержания ее нормативной дозы (0,5 млрд жизнеспособных пастерелл) в объеме 0,5 см. С позиции повторения естественного пути внедрения пастерелл в организм птицы вакцину прививали на слизистую носовой и ротоглоточной полостей, соблюдая принцип интраназального введения согласно примеру 1. Вакцину вводили соответственно 10 клинически здоровым курам или уткам массой тела около 2 кг двукратно с интервалом 7 суток в нормативной дозе (0,5 млрд жизнеспособных пастерелл) в объеме 0,5 см - по 0,25 см в каждое носовое отверстие. Десять вакцинированных птиц и десять аналогичных не вакцинированных (контрольные) содержали по группам строго изолировано. За птицей вели клинические наблюдения 10 суток. В каждом случае все птицы по группам постоянно были клинически здоровыми. В течение этого срока готовили к последующей работе контрольный штамм бактерий Pasteurella multocida ВГНКИ №712.
100
100
2.2. Подготовка контрольного штамма пастерелл. Подготовка контрольного штамма пастерелл последовательно включала клонирование микроорганизма после хранения, восстановление и биологическую изоляцию микроорганизма при внутримышечном заражении голубя, а затем восстановление и биологическую изоляцию микроорганизма при интраназальном заражении голубя соответственно с оценкой по показателям морфологии и вирулентности. Микроорганизм восстанавливали по установленному стандарту условий, каждый раз сохраняя в собственной капсуле в анабиозе, без доступа атмосферного воздуха и питательного субстрата, при постоянной оптимальной температуре окружающей среды к моменту использования. В целях биологического контроля качества живой вакцины на иммуногенность предварительно подтитровывали ЛД микроорганизма на птице аналогичной контрольной (не вакцинированной). В работе применяли 10-часовую бульонную культуру капсулированных бактерий первой генерации после организма птицы с известным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной. ЛД микроорганизма определяли при интраназальном заражении птицы на слизистую носовой и ротоглоточной полостей, соблюдая принцип введения согласно примеру 1.
2.2.1. Клонирование микроорганизма после хранения. Контрольный штамм пастерелл дробно высевали на плотную питательную среду и культивировали при 37°С 18-20 ч. Не менее 10 характерно растущих колоний пастерелл в S-форме, а при отсутствии таких - в М-форме, отвивали бактериологической петлей и соответственно засевали в жидкую питательную среду. Посевы культивировали при 37°С 10-12 ч. Выросшие культуры бактерий визуально оценивали на типичность роста для пастерелл и с 37°С переносили в 20°С на 1 ч для инкапсуляции микробной клетки. Одну из приготовленных культур бактерий с типичным ростом для пастерелл применяли для пассажа через восприимчивый организм.
-1
3
-2
-3
-2
-3
-2
-3
2.2.2. Восстановление и биологическая изоляция микроорганизма при внутримышечном заражении голубя. Работу вели при температуре 20-22°С окружающей среды с целью частичного восстановления, биологической изоляции и оценки микроорганизма. Микроорганизм восстанавливали в пассаже на голубе массой тела около 350 г. Учитывая, что у голубя инфекционный процесс при пастереллезе непродолжительный, птицу заражали за 9-10 ч до начала рабочего дня. Культуру клонированного микроорганизма, п.2.2.1, в произвольно взятой дозе (0,1-0,3 мл) вводили голубю внутримышечно. При септицемии, лучше в период терминальных состояний зараженного, перед тем как быть с момента смерти снижению температуры тела, готовили из крови вены крыла препараты для световой микроскопии в качестве контрольных. Препараты готовили с окраской по методам Гинса, Романовского-Гимза, Грама. Затем отмечали точное время гибели птицы и через 3 часа после смерти вскрывали полностью остывший труп, брали пробу крови из сердца и также готовили препараты для световой микроскопии. Одновременно бактерии изолировали от окружающего питательного субстрата и атмосферного воздуха в условия анабиоза. Для этого 0,2 мл (4 капли) той же пробы крови вносили в 1,8 мл физиологического раствора, встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость считали изолятом пастерелл из крови в разведении 10. Чтобы более полно уйти от питательного субстрата, брали 0,5 мл этой надосадочной жидкости и на физиологическом растворе в рабочем объеме 5 см готовили последующие разведения 10 и 10 изолированных пастерелл. Пастереллы в разведениях 10 и 10 высевали по 0,5 мл в жидкую и на плотную питательные среду для оценки культуральных свойств по общепринятым методам. Одновременно пастереллы в разведениях 10 и 10 изолировали по 0,5-1,0 мл в приготовленные из пастеровских пипеток ампулы. С этой целью пастеровские пипетки, предварительно оплавленные по форме ампул с истонченными промежутками или концами в виде капилляров, заполняли по объему, насасывая резиновой грушей, герметично запаивали концы над пламенем огня, дополнительно парафинируя конец последней пайки, и сохраняли в горизонтальном положении не более 20 суток для последующего применения.
Оценка микроорганизма по морфологии микробной клетки. В препаратах, приготовленных из крови сердца трупа птицы, выявляли по методу Гинса разные по величине капсулированные бактерии, по методу Романовского-Гимза - разные по величине парно расположенные бактерии или же так называемые «биполярные палочки» («биполяры»), по методу Грама - отрицательно окрашенные бактерии. В контрольных препаратах, приготовленных из крови вены при септицемии в период терминальных состояний, при тех же методах окраски обнаруживали разные по величине бескапсульные и изредка слабо капсулированные кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии.
Изолированные в физиологическом растворе пастереллы из крови сердца трупа птицы при необходимости выявляли микроскопией препаратов, приготовленных с окраской по тем же методам. Пастереллы, вследствие нарушения в жидкой фазе парного («биполярного») расположения, опознавали в виде разных по величине бескапсульных и слабо капсулированных, грамотрицательных коккобактерий.
Микроскопией препаратов, приготовленных из 9- и 20-часовых бульонных культур пастерелл перед снятием с культивирования при 37°С, обнаруживали изредка слабо капсулированные и в основном без капсулы кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии. В препаратах, приготовленных из этих же культур пастерелл через 1 час после изменения температуры культивирования с 37 на 20°С, выявляли в основном слабо капсулированные кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии.
-2
3
-4
-5
-6
Оценка микроорганизма по морфологии роста культуры. В жидкой питательной среде, в посевах пастерелл, изолированных из крови сердца на физиологическом растворе в разведениях 10 и выше в рабочем объеме 5 см, отмечали весьма нежный, особо отличающийся бирюзовым оттенком рост культуры бактерий при 37°С. По росту 9-часовой культуры пастерелл отмечали предельный титр изолированных пастерелл на физиологическом растворе обычно в разведениях 10, 10 или 10 и соответственно в результате перерасчета условно полагали как минимум 20 тыс., 200 тыс. и 2 млн микробных клеток в 1 мл крови сердца трупа на момент изоляции пастерелл.
На плотной питательной среде в посевах тех же изолированных из крови сердца пастерелл отмечали весьма нежный, чуть с голубизной в косо проходящем свете сплошной рост культуры бактерий и нежные, прозрачные, круглые, с ровными краями, размером 0,5-1,5 мм отдельно растущие колонии бактерий S-формы.
100
100
-1
-2
-3
Оценка микроорганизма по вирулентности. При необходимости вирулентность микроорганизма оценивали на курах или утках в зависимости от пути (способа) заражения с определением ЛД. В биологической пробе, приближенной к естественному заражению - интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей - ЛД внутримышечно пассированного микроорганизма для таких птиц определяли 0,5 мл бульонной культуры в разведении 10, 10 или 10, что соответствовало около 50,5 млн и 500 тыс. микробных клеток.
3
-2
3
2.2.3. Восстановление и биологическая изоляция микроорганизма при интраназальном заражении голубя. Работу вели при температуре 20-22°С окружающей среды с целью полного восстановления, биологической изоляции и оценки микроорганизма. Микроорганизм, изолированный согласно п.2.2.2, не ранее чем через 72 часа изоляции повторно восстанавливали в пассаже на голубе массой тела около 350 г. Учитывая, что у голубя инфекционный процесс при пастереллезе непродолжительный, птицу заражали за 9-10 ч до начала рабочего дня. Для этого микробную клетку, осевшую по внутренней поверхности запаянной пастеровской пипетки (ампулы), переводили во взвесь путем вращения ампулы между ладонями рук. Затем удостоверялись в герметичности укупорки ампулы, обломив конец ее первой пайки, опустив при этом другой (парафинированный) конец в стерильную пробирку Флоринского. Если содержимое ампулы не истекало, то изолированные пастереллы считали хранившимися без доступа атмосферного воздуха (в условиях анаэробиоза). Перевернув ампулу, направив ее вскрытый конец в эту же пробирку, содержимое извлекали, оно истекало, если нарушали целостность запаянного противоположного (парафинированного) конца, обломив его. Затем изолированные пастереллы в объеме 0,5 см разведений 10 высевали в 4,5 мл жидкой питательной среды, культивировали при 37°С 9 ч. Выращенную 9-часовую культуру бактерий первой генерации после организма птицы, отличающуюся особо нежным бирюзовым оттенком, переносили с 37 в 20°С на 1 ч для инкапсуляции микробной клетки. Культуру капсулированных бактерий в произвольно взятой дозе (0,1-0,3 мл) вводили голубю интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. Всю последующую работу выполняли согласно описанию п.2.2.2. Восстановленный микроорганизм, изолированный от питательного субстрата и атмосферного воздуха на физиологическом растворе в собственной капсуле, запаянный в приготовленную из пастеровской пипетки ампулу, через 2-3 суток хранения при постоянной оптимальной температуре окружающей среды (20°С) считали стандартизированным и в течение 3 суток применяли в целях работы, контролируя титр микробной клетки. Для этого готовили ряд 10-кратных разведений изолированных пастерелл на физиологическом растворе в рабочем объеме 5 см и параллельно высевали в жидкую питательную среду. Из полученного ряда 10-часовых (9 ч при 37 и 1 ч при 20°С) бульонных культур капсулированных бактерий первой генерации после организма птицы брали для работы конкретную культуру с известным титром микробной клетки в посеве в качестве стандартизированной.
Оценка микроорганизма по морфологии микробной клетки. В препаратах, приготовленных из крови сердца трупа птицы, выявляли по методу Гинса одинаковые выражено капсулированные бактерии, по методу Романовского-Гимза - одинаковые, парно расположенные бактерии или же равномерно сформированные так называемые «биполярные палочки» («биполяры»), по методу Грама - отрицательно окрашенные бактерии. В контрольных препаратах, приготовленных из крови вены при септицемии в период терминальных состояний, то есть перед тем как быть снижению температуры тела с момента смерти зараженного, обнаруживали бескапсульные, очень маленькие по величине, коккоподобные, грамотрицательные бактерии.
Изолированные в физиологическом растворе пастереллы из крови сердца трупа птицы при необходимости выявляли микроскопией препаратов, приготовленных с окраской по тем же методам. Пастереллы, вследствие нарушения в жидкой фазе парного («биполярного») расположения, опознавали только в виде одинаковых по величине, капсулированных, грамотрицательных коккобактерий.
Микроскопией препаратов, приготовленных из 9- и 20-часовых бульонных культур пастерелл перед снятием с культивирования при 37°С, обнаруживали изредка слабо капсулированные и в основном без капсулы кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии. В препаратах, приготовленных из этих же культур пастерелл через 1 час после изменения температуры культивирования с 37 на 20°С, выявляли одинаковые, в основном выражено капсулированные кокко- и диплококкоподобные, грамотрицательные бактерии.
-2
3
-7
-8
3
-2
3
Оценка микроорганизма по морфологии роста культуры. В жидкой питательной среде, в посевах пастерелл, изолированных из крови сердца на физиологическом растворе в разведениях 10 и выше в рабочем объеме 5 см, отмечали весьма нежный, особо отличающийся бирюзовым оттенком рост культуры бактерий при 37°С. По росту 9-часовой культуры пастерелл отмечали предельный титр изолированных пастерелл на физиологическом растворе обычно по разведению 10 (изредка 10) и соответственно в результате перерасчета условно полагали как минимум 20 (изредка 200) млн. микробных клеток в 1 мл крови сердца трупа на момент изоляции пастерелл. В результате посева изолированных пастерелл в объеме 0,5 см разведения 10 в 4,5 мл жидкой питательной среды и культивирования (9 ч при 37 и 1 ч при 20°С) в 1 мл устанавливали около 1 млрд жизнеспособных микробных клеток, что обычно являлось предельным накоплением микроорганизма в данной среде в рабочем объеме 5 см. Следует отметить, что в бульонной культуре пастерелл, представляющей собой первую генерацию микробных клеток после организма птицы, под вазелиновым маслом столбиком примерно в 1 см при температуре 15-25°С никогда при длительном хранении не формировался хорошо известный слизистый осадок. После постепенного просветления среды с выпадением пастерелл в осадок в виде пуговки до 3 мм на дне пробирки любое встряхивание с переводом бактерий во взвесь или же резкое колебание температуры на 5 и более °С окружающей среды влекло их последующую генерацию в среде как факультативных анаэробов и ослабление исходных свойств. С последующим пересевом, культивированием при 37°С и затем хранением полученной бульонной культуры пастерелл при 20°С окружающей среды отмечали изменение исходных культуральных свойств - оседание микробных клеток с формированием слизистого осадка, хорошо известного тем, что при встряхивании поднимается в виде «косички» как важный признак при идентификации этих бактерий.
На плотной питательной среде в посевах тех же изолированных из крови сердца пастерелл отмечали весьма нежный, чуть с голубизной в косо проходящем свете сплошной рост культуры бактерий и нежные, прозрачные, круглые, с ровными краями, размером 0,5-1,5 мм отдельно растущие колонии бактерий S-формы.
-7
-2
-2
-3
-4
100
50
100
50
Оценка микроорганизма по вирулентности. Количество пастерелл в крови сердца трупа птицы считали косвенным показателем вирулентности изолированного контрольного штамма пастерелл ВГНКИ №712. Если при культивировании в жидкой питательной среде 10-кратных разведений изолированных пастерелл устанавливали характерный рост в разведении 10, что в перерасчете на исходную концентрацию в 1 мл крови есть как минимум около 20 млн микробных клеток, штамм бактерий условно считали восстановленным. В биологической пробе вирулентность микроорганизма оценивали на курах или утках в зависимости от пути (способа) заражения с определением ЛД и, при возможности, ЛД. С целью точного определения вирулентности микроорганизма применяли из ряда полученных 10-часовых бульонных культур капсулированных пастерелл (9 ч при 37°С и 1 ч при 20°С) конкретно обозначенную культуру бактерий. Эту культуру бактерий определяли по титру в посеве изолированной микробной клетки из организма птицы, например, 0,5 мл разведения 10 (100 тыс. м.к.), посеянных в 4,5 мл жидкой питательной среды, и применяли в качестве стандартной. В данном случае в биологической пробе, приближенной к естественному заражению птиц, - интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей - ЛД интраназально пассированного микроорганизма для кур или уток устанавливали 0,5 мл бульонной культуры в разведении 10, что соответствовало около 5 млн микробных клеток. При этом ЛД микроорганизма устанавливали 0,5 мл бульонной культуры в разведении 10 или изредка - 10, что соответствовало около 500 и 50 тыс. микробных клеток.
3
3
2.3. Оценка иммуногенности живой вакцины. Иммуногенность живой вакцины оценивали по специфической устойчивости вакцинированных птиц в сравнении с восприимчивостью не вакцинированных (контрольных) к пастереллезу в биологической пробе при температуре 20-22°С окружающей среды. С этой целью 10 вакцинированных птиц через 10 суток после последней прививки вакцины и 10 невакцинированных (контрольные) одновременно заражали культурой восстановленного контрольного штамма пастерелл ВГНКИ №712 в абсолютной летальной дозе в объеме 0,5 см интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей - по 0,25 смв оба носовых отверстия, соблюдая принцип введения согласно примеру 1. Зараженную птицу содержали по группам изолировано и вели наблюдение. При этом учитывали клинические признаки заболевания птиц, ежесуточно регистрировали количество павших птиц в группе вакцинированных и в группе невакцинированных (контрольных) соответственно. Гибель птиц от пастереллеза подтверждали по результатам патологоанатомических и бактериологических исследований. Живую вакцину изготовленной серии оценивали иммуногенной, если в течение 7 суток с момента введения смертельной дозы культуры стандартизированного контрольного штамма пастерелл в капсульном варианте микробной клетки выживало не менее 8 (80%) специфически устойчивых вакцинированных и при этом гибло не менее 8 (80%) восприимчивых невакцинированных (контрольных) птиц. В разное время изготовленные пять серий живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл «К» соответственно все прошли биологический контроль качества на иммуногенность: две - на курах и три - на утках. Сделан вывод: объективно контролировать качество живой вакцины на иммуногенность можно на птице любого вида массой тела около 2 кг, если птиц вакцинировать и затем заражать интраназально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды.
Вышеизложенные результаты исследований в приведенных примерах, подтверждающих возможность осуществления изобретения, многократно воспроизведены при проверке качества изготовленных серий живой вакцины против пастереллеза птиц. Предлагаемый способ биологического контроля качества любой живой вакцины из ослабленного штамма пастерелл по точности места вакцинации и заражения птиц - локально на слизистую носовой и ротоглоточной полостей - соответствует эволюционно сложившемуся месту локализации (колонизации) ослабленных пастерелл при естественном бактерионосительстве и особо уязвимому месту внедрения патогенных пастерелл. В силу функциональной термолабильности пастерелл определяющим отличительным признаком технического решения одновременно являются как путь (место) введения соответственно живой вакцины и вирулентного контрольного штамма пастерелл, так и допустимая оптимальная температура окружающей среды, в основном - вдыхаемого воздуха и употребляемой питьевой воды птицей.
Изобретение содержит существенные отличия научно-практического значения и может быть использовано в микробиологии, эпизоотологии, биотехнологии и в условиях современной биологической промышленности.
Источники информации
1. Технические условия ТУ 10.19.76-89 на вакцины против пастереллеза водоплавающих птиц из штаммов Pasteurella multocida AB и К Краснодарской НИВС, сухие. - В последней редакции утверждены 19.04.1989 г.
2. Наставление по применению вакцин против пастереллеза водоплавающих птиц из штаммов AB и К Краснодарской НИВС, сухих. - В последней редакции утверждено от 22.07.1996 г. зам. начальника Департамента ветеринарии МСХ РФ В.В.Селиверстовым.
3. Буткин Е.И. - Кн.: Пастереллез (холера) птиц. - М.: Колос, 1972. С.48, 58, 62, 63.
4. Глебова И.Я. Опыты по ослаблению вирулентности штамма птичьих пастерелл путем пассажей через организм маловосприимчивых животных в целях получения вакцинного штамма // Тр. Краснодарской НИВС. - Краснодар, 1958. Т.1. С.61-80.
5. Домарадский И.В. - Кн.: Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. - М.: Медицина, 1971. С.46.
6. Ищенко Г.Д., Дубров И.С. Аэрозольный метод иммунизации уток против пастереллеза // Ветеринария. - 1982. - №8. С.31.
7. Масюков А.В. Накожный метод вакцинации птиц против пастереллеза культурой из слабовирулентного штамма «К» (краснодарский) // Тр. Краснодарской НИВС. - Краснодар, 1958. Т.1. С.81-89.
8. Масюков А.В. Направленная изменчивость патогенных микроорганизмов с целью получения вакцинных штаммов // Тр. Краснодарской НИВС. Т.3. - Краснодарское книжное издательство, 1965. С.179-187.
9. Масюков А.В. Изучение вопросов формирования и проявления иммунитета к пастереллезу у кур и уток в результате вакцинации их живыми вакцинами из штаммов «AB» и «К» (Автореферат) // Тр. Краснодарской НИВС. Т.3. - Краснодарское книжное издательство, 1965. С.188-191.
10. Каширин В.В. Объяснение феномена биполярности бактерий Pasteurella multocida // Доклады Россельхозакадемии. - 1996. - №5. С.32-35.
11. Кожевников Е.М. Локализация Р. multocida в организме птиц - пастереллоносителей // Ветеринария. - 1971. - №2. С.106-107.
12. Кожевников Е.М. О формировании пастереллоносительства у птиц // Ветеринария. - 1973. - №8. С.45-46.
13. Патент на изобретение №2050161 «Способ вакцинации утят против пастереллеза» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 1995. - Бюл. №35.
14. Патент на изобретение №2051970 «Способ выявления бактерий Pasteurella multocida при пастереллезном процессе у птиц» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 1996. - Бюл. №1.
15. Патент на изобретение №2123531 «Способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 1998. - Бюл. №35.
16. Патент на изобретение №2286391 «Способ биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 2006. - Бюл. №30.
17. Патент на изобретение №2286390 «Способ заражения птиц возбудителем пастереллеза для постановки биологической пробы» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 2006. - Бюл. №30.
18. Патент на изобретение №2310472 «Способ профилактики пастереллеза птиц живой вакциной» / В.В.Каширин // Описание изобретения к патенту РФ. - 2007. - Бюл. №32.
19. Пустовит Г.Л. Геоклиматические факторы и пастереллез птиц // Птицеводство. - 1965. - №12. С.22-24.
20. Derieux W.T. Immune response of medicated turkeys vaccinated with live Pasteurella multocida // Amer. J. Vet. Res. 1977. Vol.38. №4. P.487-489.
21. Derieux W.T. The efficacy of CU strain of fowl cholera vaccine in chickens // Zootecn. Internat. 1980. №12. P.45-46.
22. Rhoades K.R., Rimler R.B. Pasteurella multocida Colonization and Invasion in Experimentally Exposed Turkey Poults // Avian Diseases. 1990. Vol.34. P.381-383.
23. Pasteur L. De L'attenuation du virus de cholera des poles // C.R.Acad. Sci. 1880. 91. P.637-680.
24. Singer N., Malkinson M. An avirulent live Pasteurella multocida vaccine for drinking water and aerosol administration against turkey cholera // Avian Path. 1979. Vol.8. №4. P.391-399.