КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ КОЖИ ОТ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ, СВЕТА И СТРЕССА
COMPOSITION FOR SKIN PROTECTION FROM EXPOSURE TO HARMFUL SUBSTANCES, LIGHT AND STRESS

Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции для защиты кожи от воздействия стресса, вызванного условиями окружающей среды, такими как вредные вещества и свет.
Уровень техники
Как правило, кожу человека разделяют на эпидермис, дерму и гиподерму; эпидермис подразделяют на роговой слой, блестящий слой (цикловидный слой), зернистый слой, шиповатый слой и базальный слой. Роговой слой, наружный слой кожи, образован мертвыми кератиноцитами. Он по существу состоит из кератиноцитов, которые, в свою очередь, состоят из белка, при этом пространство между кератиноцитами образовано липидами, такими как церамид, холестерол и свободные жирные кислоты. Эти липидные слои предотвращают испарение влаги из организма и обладают как оздоровительной функцией, защищая организм от внешних раздражителей, так и эстетической функцией, придавая коже блестящий и гладкий вид.
Кожа напрямую подвергается воздействию внешней среды и под воздействием вредных веществ, существующих во внешней среде, становится склонной к раздражению и воспалительным реакциям, таким как эритема, отек и зуд. Контактирование с вредными веществами вызывает стимуляцию и воспалительную реакцию из-за токсинов, в результате чего вещества могут вызывать пигментацию кожи, снижение эластичности кожи и способствовать повреждению кожного барьера.
Широко известно, что ультрафиолетовые лучи могут ускорить повреждение и старение кожи. В частности, когда кожа подвергается избыточному воздействию ультрафиолетовых лучей, свободные радикалы накапливаются с образованием активного кислорода. Это вызывает окислительный стресс и разрушает антиоксидантную систему, вызывая повреждение кожи.
Кроме того, синий свет, излучаемый дисплеями интеллектуальных устройств, таких как телевизор и компьютер, а также светодиодными осветительными приборами, представляет собой синий свет с длиной волны от 380 до 500 нанометров (нм), который имеет самую короткую и сильную длину волны среди видимого света. Существуют исследования, согласно которым воздействие на кожу синим светом вызывает пигментацию (Luc Duteil et al. Pigment Cell Melanoma Res 2014; 27: 822-6).
Физические стимуляции из внешней среды могут вызывать рак из-за повреждения ДНК в клетках и коже или могут вызывать повреждения центральной и периферической нервной системы, разрушение иммунной системы, нарушения репродуктивной системы, воспалительные заболевания, хроническую аллергию и тому подобное.
Таким образом, существует потребность в разработке композиции, которая является безопасной и не имеет побочных эффектов, при этом защищая кожу от внешнего воздействия, такого как вредные вещества и ультрафиолетовые лучи.
Подробное описание изобретения
Техническая задача
Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении композиции для защиты кожи от стресса, вызванного внешними воздействиями, такими как вредные вещества и свет.
Решение задачи
Для решения вышеупомянутых задач в настоящем изобретении предложена композиция для защиты кожи от воздействия вредных веществ и света, при этом указанная композиция содержит:
пептиды и аминокислоты,
в которой пептиды включают никотиноил трипептид, пентапептид, никотиноил гексапептид, sh-октапептид, тетракарбоксиметил гексаноил дипептид, гексакарбоксиметил дипептид и биотиноил гексапептид-2 амид, и
аминокислоты включают аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глицин, гистидин, гидроксипролин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серин и валин.
Согласно одному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать гиалуроновую кислоту, при этом молекулярная масса гиалуроновой кислоты может составлять от 500 кДа до 2 МДа.
Согласно одному варианту реализации вредные вещества могут включать одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из желтой пыли, мелкой пыли, сигаретного дыма, выхлопных газов транспортных средств, тяжелых металлов и загрязнителей воздуха.
Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция может ингибировать гибель клеток кожи, вызванную стрессом от воздействия вредных веществ и света.
Кроме того, указанная композиция может обладать антиоксидантной активностью.
Кроме того, указанная композиция может ингибировать образование циклобутан пиримидиновых димеров (ЦПД).
Кроме того, указанная композиция может адсорбировать или выводить вредные вещества.
Кроме того, указанную композицию можно применять для разглаживания морщин или повышения эластичности.
Согласно еще одному варианту реализации пептиды могут содержать, в расчете на 100 частей по массе sh-октапептида,
от 1 до 50 массовых частей никотиноил трипептида;
от 10 до 150 массовых частей пентапептида;
от 0,05 до 10 массовых частей никотиноил гексапептида;
от 5 до 70 массовых частей тетракарбоксиметил гексаноилдипептида;
от 15 до 80 массовых частей гексакарбоксиметил дипептида; и
от 5 до 70 массовых частей биотиноил гексапептид-2 амида, и
аминокислоты могут содержать, в расчете на 100 массовых частей валина,
от 80 до 180 массовых частей аргинина;
от 10 до 60 массовых частей аспарагина;
от 20 до 80 массовых частей аспарагиновой кислоты;
от 30 до 100 массовых частей глицина;
от 50 до 150 массовых частей гистидина;
от 5 до 40 массовых частей гидроксипролина;
от 40 до 120 массовых частей изолейцина;
от 50 до 150 массовых частей лейцина;
от 5 до 40 массовых частей метионина;
от 40 до 120 массовых частей фенилаланина;
от 10 до 50 массовых частей пролина; и
от 20 до 80 массовых частей серина.
Согласно варианту одному реализации композиция может дополнительно содержать от 1 до 5 % масс. гиалуроновой кислоты в расчете на общую массу композиции.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена косметическая композиция для уменьшения потемнения кожи, морщин или повышения эластичности, вызванных воздействием вредных веществ и света, содержащая вышеописанную композицию.
Согласно одному варианту реализации косметическая композиция может содержать несшитую гиалуроновую кислоту.
Кроме того, в другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, вызванных воздействием вредных веществ и света, содержащая вышеописанную композицию. Заболевание может быть выбрано из группы, состоящей из рака, атопического дерматита, контактного дерматита, себорейного дерматита, эритемы, солнечного ожога, фоточувствительности, акне, сухости кожи, псориаза, летальности, иммунотоксичности, повреждения периферических нервов, повреждения центральных нервов, повреждения эндокринных желез, нарушения репродуктивной системы, нарушения развития у младенцев и детей младшего возраста, анемии, бронхита, эмфиземы легких, снижения функции легких, астмы, аритмии, сердечного приступа, стенокардии и инфаркта миокарда.
Согласно одному варианту реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена в виде филлера для инъекций.
Согласно еще одному варианту реализации, фармацевтическая композиция может содержать сшитую гиалуроновую кислоту.
Конкретные подробности других вариантов реализации настоящего изобретения включены в нижеследующее подробное описание изобретения.
Преимущества изобретения
Настоящее изобретение защищает кожу посредством ингибирования аномального ответа клеток на внешние стрессовые стимулы, такие как вредные вещества и свет, без какой-либо цитотоксичности, вследствие чего его можно эффективно применять в различных областях, таких как фармацевтика и косметика.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 представлена диаграмма, показывающая жизнеспособность клетки под воздействием синего света.
На Фиг. 2 представлена оптическая микрофотография наблюдаемых изменений в тканях кожи под воздействием ультрафиолетовых лучей.
На Фиг. 3 и 4 представлены диаграммы и микрофотографии, показывающие формирование циклобутан пиримидиновых димеров (ЦПД) соответственно.
На Фиг. 5 представлена диаграмма, показывающая жизнеспособность клетки под воздействием вредных веществ.
На Фиг. 6 представлена диаграмма, показывающая жизнеспособность клетки под воздействием вредных веществ и ультрафиолетового излучения.
На Фиг. 7 представлена диаграмма, показывающая способность акцептировать свободные радикалы под воздействием вредных веществ и ультрафиолетовых лучей.
На Фиг. 8 - Фиг. 10 представлены фотографии и диаграммы, подтверждающие эффект разглаживания морщин в результате инъекций композиции настоящего изобретения.
Лучшие варианты реализации изобретения
Поскольку в настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения и вариации, конкретные варианты реализации проиллюстрированы на графических материалах и будут подробно описаны в подробном описании изобретения. Однако, следует понимать, что настоящее изобретение не предполагает ограничение конкретными вариантами реализации, и включает все модификации, эквиваленты и альтернативы, подпадающие под сущность и объем настоящего изобретения. В последующем описании настоящего изобретения подробное описание известного уровня техники будет опущено, если будет установлено, что это может затруднить понимание сущности настоящего изобретения.
Если в настоящем описании изобретения не указано иное, выражение "между" применяется как выражение, включающее соответствующее числовое значение. В частности, например, выражение "от 1 до 2" подразумевает включение всех чисел между 1 и 2, так же как и 1 и 2.
Здесь и далее, композиция для защиты кожи от воздействия вредных веществ и света в соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения будет описана более подробно.
В контексте настоящего изобретения, термин «защита кожи» означает помощь в предотвращении, улучшении или лечении повреждений кожи от жестких условий, которым она может подвергаться из внешней среды. Жесткие условия включают, в частности, вредные вещества или свет.
Например, вредные вещества могут содержать одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из желтой пыли, мелкой пыли, сигаретного дыма, выхлопных газов транспортных средств, тяжелых металлов и загрязнителей воздуха.
Кроме того, термин «свет» в контексте настоящего изобретения означает ультрафиолетовый свет, голубой свет или их комбинацию, если не указано иное.
Загрязнители воздуха могут включать вещества и соединения, указанные в статье 4 Закона о сохранении чистого воздуха (в редакции 2019 г.). В частности, загрязнители воздуха могут включать одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из кадмия и его соединений, цианистого водорода, свинца и его соединений, полихлорированных бифенилов, хрома и его соединений, мышьяка и его соединений, ртути и ее соединений, пропиленоксида, хлора и его соединений, соединений фтора, асбеста, никеля и его соединений, винилхлорида, диоксина, фенола и его соединений, бериллия и его соединений, бензола, четыреххлористого углерода, метилдисульфида, анилина, хлороформа, формальдегида, ацетальдегида, бензидина, 1, 3-бутадиена, полициклических ароматических углеводородов, этиленоксида, дихлорметана, стирола, тетрахлорэтилена, 1,2-дихлорэтана, этилбензола, трихлорэтилена, акрилонитрила и гидразина.
Настоящее изобретение предлагает композицию для защиты кожи от стресса, вызванного воздействием вредных веществ и света, содержащую пептиды.
В частности, настоящее изобретение включает никотиноил трипептид, пентапептид-37, никотиноил гексапептид, sh-октапептид, тетракароксиметил гексаноил дипептид, гексакарбоксиметил дипептид и биотиноил гексапептид-2 амид.
Никотиноил гексапептид представляет собой продукт, полученный в результате взаимодействия витамина В3 и гексапептида, который активизирует кожу и способствует снижению гиперчувствительности кожи.
Пентапептид способствует отбеливанию и увлажнению кожи.
Никотиноил гексапептид является продуктом, полученным в результате взаимодействия витамина В3 и гексапептида, который снижает функцию PAR2 (рецептора передачи сигнала), вызывающего экзогенное старение, а также способствует предотвращению окисления и защитите кожы.
Sh-октапептид является одноцепочечным рекомбинантным пептидом человека, содержащим 8 аминокислот, состоящих из глицина, гистидина, лейцина, лизина, фенилаланина и тирозина, и предотвращает окислительные повреждения кожи.
Тетракарбоксиметил гексаноил дипептид и гексакарбоксиметил дипептид применяют в качестве кондиционирующего агента для кожи.
Биотиноил гексапептид-2 амид представляет собой продукт реакции гексапептида-2 и биотина, в котором карбоксильный конец (С-конец) пептида представляет собой амид. Он применяется в качестве кондиционирующего агента для кожи.
Согласно варианту реализации, пептиды могут содержать, в расчете на 100 массовых частей sh-октапептида,
от 1 до 50 массовых частей, например, от 5 до 30 массовых частей, например, от 10 до 30 массовых частей никотиноил трипептида;
от 10 до 150 массовых частей, например, от 30 до 100 массовых частей, например, от 50 до 70 массовых частей пентапептида;
от 0,05 до 10 массовых частей, например, от 0,1 до 5 массовых частей, например, от 0,5 до 4 массовых частей никотиноил гексапептида;
от 5 до 70 массовых частей, например, от 10 до 50 массовых частей, например, от 20 до 40 массовых частей тетракарбоксиметил гексаноил дипептида;
от 15 до 80 массовых частей, например, от 30 до 60 массовых частей, например, от 40 до 50 массовых частей гексакарбоксиметил дипептида; и
от 5 до 70 массовых частей, например, от 10 до 50 массовых частей, например, от 20 до 40 массовых частей биотиноил гексапептид-2 амида.
Согласно одному варианту реализации, настоящее изобретение может дополнительно включать аминокислоты, в частности, аминокислоты могут дополнительно включать одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глицина, гистидина, гидроксипролина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, пролина, серина и валина, например.
В частности, аминокислоты могут включать, в расчете на 100 массовых частей валина,
от 80 до 180 массовых частей, например, от 50 до 250 массовых частей, например, от 70 до 150 массовых частей, например, от 90 до 130 массовых частей аргинина;
от 10 до 60 массовых частей, например, от 20 до 50 массовых частей, например, от 25 до 40 массовых частей аспарагина;
от 20 до 80 массовых частей, например, от 30 до 70 массовых частей, например, от 35 до 50 массовых частей аспарагиновой кислоты;
от 30 до 100 массовых частей, например, от 40 до 80 массовых частей, например, от 40 до 60 массовых частей глицина;
от 50 до 150 массовых частей, например, от 60 до 120 массовых частей, например, от 70 до 100 массовых частей гистидина;
от 5 до 40 массовых частей, например, от 10 до 30 массовых частей, например, от 10 до 20 массовых частей гидроксипролина;
от 40 до 120 массовых частей, например, от 50 до 100 массовых частей, например, от 60 до 80 массовых частей изолейцина;
от 50 до 150 массовых частей, например, от 60 до 120 массовых частей, например, от 70 до 100 массовых частей лейцина;
от 5 до 40 массовых частей, например, от 10 до 30 массовых частей, например, от 10 до 20 массовых частей метионина;
от 40 до 120 массовых частей, например, от 50 до 100 массовых частей, например, от 60 до 80 массовых частей фенилаланина;
от 10 до 50 массовых частей, например, от 20 до 40 массовых частей, например, от 20 до 30 массовых частей пролина; и
от 20 до 80 массовых частей, например, от 30 до 60 массовых частей, например, от 35 до 50 массовых частей серина.
Композиция согласно настоящему изобретению может защищать клетки кожи посредством адсорбции или выделения вредных веществ.
Кроме того, она может ингибировать повреждения кожи, вызванные ультрафиолетовыми лучами. В коже могут возникать вызванные ультрафиолетовым излучением повреждения ДНК, которые приводят к образованию циклобутан пиримидиновых димеров (ЦПД). В ЦПД двойные связи в гексагональных циклических структурах соседних пиримидиновых оснований трансформируются под воздействием ультрафиолетового света коротковолнового диапазона (длина волны около 254 нм) с образованием новой тетрагональной связи, которая вызывает аномальное связывание, вызывающее структурные нарушения в ДНК. Композиция согласно настоящему изобретению может ингибировать образование ЦПД, таким образом ингибируя апоптоз клеток кожи, вызванного воздействием ультрафиолетовых лучей.
Кроме того, можно увеличить антиоксидантную активность, предотвратить и облегчить повреждение клеток кожи, вызванное стрессом воздействия вредных веществ и света, и тем самым уменьшать потемнение кожи, разглаживать морщины или улучшать эластичности кожи.
Согласно одному варианту реализации композицию согласно настоящему изобретению можно получать в любой лекарственной форме, подходящей для применения в дерматологии, такой как традиционная косметическая композиция, фармацевтическая композиция для наружного применения и подобные. Композиция, подходящая для применения в дерматологии, относится к композиции, которая может обладать относительно нетоксичным и безвредным эффективным действием для субъекта и может содержать препарат для наружного применения, который может быть нанесен на кожу, при этом композиция не ухудшает активность и свойства активного ингредиента, не вызывая побочных эффектов, обусловленных композицией, и не снижает эффективность активного ингредиента и не вызывает серьезного раздражения у субъекта.
Кроме того, композиция для наружного применения для кожи согласно настоящему изобретению может быть получена в виде любой лекарственной формы, принятой в данной области техники, примером которой является раствор, суспензия, жидкость, эмульсия, паста, гель, масса, крем, лосьон, пудра, мыло, очищающее средство, содержащее поверхностно-активное вещество, масло, тональная крем-пудра, эмульсионная основа, восковая основа, спрей и косметика для волос, но не ограничивается ими.
В частности, косметическая композиция может быть получена в виде лосьона для кожи, смягчающего средства для кожи, тоника для кожи, средства для сужения пор, лосьона, молочка для тела, увлажняющего лосьона, питательного лосьона, массажного крема, питательного крема, увлажняющего крема, крема для рук, крема-основы, эссенции, питательной эссенции, маски, мыла, шампуня для волос, шампуня для ног, очищающей пены, очищающего лосьона, очищающего крема, лосьона для тела и очищающего средства для тела и др., и, например, может быть получена в виде косметического филлера.
Косметический филлер можно применять в способе нанесения на поверхность кожи. Он может включать отдушку, ксантановую камедь, воск, твердое масло, жидкое масло, поверхностно-активное вещество, увлажняющее средство, спирт, и он может быть включен без особых ограничений, поскольку он является компонентом широко применяемой композиции. Кроме того, если композиция косметического филлера содержит гиалуроновую кислоту, гиалуроновая кислота может иметь несшитую структуру.
Кроме того, в другом варианте реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, вызванных вредными веществами и светом. В частности, заболевания могут быть выбраны из группы, состоящей из рака, атопического дерматита, контактного дерматита, себорейного дерматита, эритемы, солнечного ожога, фоточувствительности, акне, сухости кожи, псориаза, летальности, иммунотоксичности, повреждения периферических нервов, повреждения центральных нервов, повреждения эндокринных желез, нарушений репродуктивной системы, нарушений развития у младенцев и детей младшего возраста, анемии, бронхита, эмфиземы легких, снижении функции легких, астмы, аритмии, сердечного приступа, стенокардии и инфаркта миокарда.
Согласно одному варианту реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель включает связующие вещества, глиданты (вещества, способствующие скольжению), разрыхлители, вспомогательные вещества, смазки, растворители, диспергирующие агенты, стабилизаторы, суспендирующие агенты, красители, отдушки, буферы, консерванты, смягчающий агент, обезболивающие средства, изотонические агенты или их комбинации. Лекарственная форма фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может быть получена различными способами посредством смешивания с фармацевтически приемлемым носителем, примеры которого описаны выше. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть получена в виде вспомогательных материалов медицинского назначения, раствора, суспензии, мази, таблетки, капсулы и т.д., однако настоящее изобретение ими не ограничивается.
Вспомогательные материалы медицинского назначения могут включать медицинские филлеры, раневые повязки, костные трансплантаты, вспомогательные материалы для мягких тканей, стоматологические материалы и т.д., которые можно применять для создания искусственных тканей, искусственных органов, каркасов для клеточных культур, агентов доставки лекарственных средств, биосенсоров для трансплантации и т.д.
Согласно одному варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению может быть получена в виде филлера для инъекций, которые могут содержать один или несколько носителей, выбранных из группы, состоящей из альгиновой кислоты, карбоксиметилцеллюлозы, хитозана, декстрана, коллагена, желатина, пектина, агара, амилозы, циклодекстрина и эластина. Кроме того, если инъекционная композиция для филлера содержит гиалуроновую кислоту, гиалуроновая кислота может иметь сшитую структуру.
Кроме того, например, биоразлагаемый полимерный каркас может включать гиалуроновую кислоту, полигликолевую кислоту (PGA), полилактид (PLA), сополимер полилактида и гликолевой кислоты (PLGA), поликапролактон (PCL), полиаминокислоту, полиангидрид, полиортоэфир или их сополимер.
Согласно другому варианту реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит гиалуроновую кислоту. Гиалуроновая кислота может включать ее соль или сшитую гиалуроновую кислоту, например, гиалуронат натрия. Кроме того, например, молекулярная масса гиалуроновой кислоты может составлять от 500 КДа до 2 МДа, например, от 1 до 2 МДа, например, от 1 до 1,5 МДа. Содержание гиалуроновой кислоты в настоящем изобретении может составлять от 1 до 5% масс., например, от 1 до 3% масс. в расчете на общую массу композиции.
Согласно еще одному варианту реализации биоразлагаемый полимерный каркас может иметь поры, образованные в нем, при этом поры образованы солями, шипучими солями, углеводами, углеводородными восками и подобными.
Кроме того, филлер для инъекций согласно настоящему изобретению может включать местное обезболивающее средство, антигистаминный препарат, витамины и тому подобное.
Местное обезболивающее средство может включать, например, лидокаин, этидокаин, бупивакаин, тетракаин, мепивакаин, прокаин, прилокаин, ропивакаин и т.д., и конкретно не ограничены в случаях, когда указанное средство является местным обезболивающим средством для инъекций.
Антигистаминный препарат может включать, например, пиприлгидринат (Plokon), хлорфенамин, дифенилпиралин, дифенгидрамин, цетиризин, и т.д., и конкретно не ограничены в случаях, когда указанное средство является антигистаминным препаратом для инъекций.
Здесь и далее варианты реализации настоящего изобретения будут описаны подробно, чтобы специалисты в данной области могли легко осуществить настоящее изобретение. Однако настоящее изобретение может быть осуществлено в различных формах и не ограничивается описанными здесь вариантами реализации.
Примеры
Композиция для защиты кожи была получена из композиции, приведенной в Таблице 1.
Таблица 1
Вещество
Композиция
%
мг/кг
Пептиды
Никотиноил трипептид-1
0,00012
1,2
Пентапептид-37
0,00040
4,0
Никотиноил гексапептид-44
0,00001
,0,1
sh-октапептид-4
0,00060
6,0
Тетракарбоксиметил гексаноил дипептид-12
0,00020
2,0
Гексакарбоксиметилдипептид-12
0,00029
2,9
Биотиноил гексапептид-2 амид
0,00020
2,0
Аминокислоты
Аргинин
0,00062
6,2
Аспарагин
0,00016
1,6
Аспарагиновая кислота
0,00020
2,0
Глицин
0,00028
2,8
Гистидин
0,00040
4,0
Гидроксипролин
0,00008
0,8
Изолейцин
0,00036
3,6
Лейцин
0,00040
4,0
Метионин
0,00008
0,8
Фенилаланин
0,00034
3,4
Пролин
0,00012
1,2
Серин
0,00022
2,2
Валин
0,00050
5,0
Гиалуроновая кислота в виде гиалуроната натрия
1,50000
15000
Вода
до 100
Пример 1: защита клеток от воздействия голубого света
Для подтверждения цитопротекторного эффекта композиции согласно настоящему изобретению против воздействия синего света MTS исследование ((3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразол), анализ жизнеспособности клеток, проводили с применением фибробластов человека (NHDFs).
2
2
Клетки фибробластов человека (Normal Human foreskin-derived Dermal Fibroblasts, NHDFs; ATCC, CRL-2522) в концентрации 3×104 клеток/лунку помещали в 24-луночный планшет и культивировали в модифицированном растворе среды Дульбекко (DMEM), содержащим 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 ед/мл раствора пенициллина/стрептомицина при содержании CO 5% и температуре 37°C в течение 24 часов. Композицию из примера готовили с концентрацией от 0 до 1,0%, и культивируемые клетки обрабатывали композицией в течение 24 часов, а затем подвергали облучению синим светом (453 нм, 40 Дж/см) в течение 6 часов, чтобы измерить жизнеспособность клеток. Для измерения после удаления культурной среды клетки обрабатывали раствором MTS (0,33 мг/мл MTS) в течение от 1 до 4 часов, абсорбцию измеряли при длине волны 490 нм с применением спектрофотометра (Epoch 2, BioTek).
Результаты количественного определения MTS, защитного эффекта фибропластов человека под воздействием синего света представлены на Фиг. 1. В результате, с точки зрения жизнеспособности клеток под воздействием облучения синим светом, группа, обработанная композицией согласно настоящему изобретению, продемонстрировала на 1 до 11% более высокую жизнеспособность клеток по сравнению с группой, облученной синим светом и не обработанной композицией.
Пример 2: предотвращение повреждения кожи, вызванного ультрафиолетовыми лучами (ex vivo)
Для подтверждения профилактического эффекта композиции из примера (продукт S) при повреждении кожи, образцы биопсии кожи, обработанные композицией примера, облучали ультрафиолетом (УФ-А/УФ-Б) для измерения образования эксплантов кожи (H/E Staining) и количества циклобутан пиримидиновых димеров (CPDs). Ультрафиолетовое облучение вызывает повреждение ДНК, которое обусловлено образованием ЦПД.
2
Модель ex vivo с применением полнослойных тканей кожи человека получила одобрение этической комиссии с информированным согласием. Отобранные ткани кожи культивировали в течение 24 часов при следующих условиях: содержании CO 5% и температуре 37°C, после чего проводили измерения.
Эксплантаты ткани кожи культивировали в 12-луночном планшете в течение 24 часов, затем готовили образец (композиция из примера) с концентрацией 30% и культивированные клетки обрабатывали образцом в течение 24 часов и облучали ультрафиолетовыми лучами (УФ-А/УФ-Б) в течение 5 часов. Форму тканей кожи (срез толщиной 6 мкм) наблюдали с применением оптического микроскопа (DM2000, объектив 20X) путем окрашивания гематоксилином/эозином (H/E окрашивание) (Фиг. 2).
Затем образец ткани обрабатывали при тех же условиях определения ЦПД, что и в описанном выше примере, а затем облучали ультрафиолетовыми лучами (УФ-А/УФ-Б) в течение определенного промежутка времени (30 мин, 1 ч 30 мин, 5 ч).
Для измерения представленности ЦПД применяли иммуногистохимическое исследование (IHC) с залитым парафином срезом ткани (Фиг. 3), образцы тканей изучали с применением оптического микроскопа (Фиг. 4). Доза УФ излучения А составляла 50 Дж/см2, доза УФ излучения В составляла 500 мДж/см2.
На Фиг. 2 толщина эпидермального слоя и плотность дермального слоя оценивали как показатель фотостарения при воздействии УФ-лучей. В результате наблюдения за тканями кожи подтвердили, что в группе, подвергавшейся УФ-облучению и не обработанной композицией из примера, эпидермальный слой был утолщен, и плотность дермального слоя была снижена. В то же время было установлено, что в группе, обработанной композицией из примера (продукт S), эпидермальный слой имел малую толщину, и плотность дермального слоя была увеличена.
На Фиг. 3 представленность ЦПД показало среднее снижение на величину, составляющую от 3 до 7% в группе, подвергшейся УФ-облучению и обработанной композицией из примера, по сравнению с группой, подвергшейся УФ-облучению и не обработанной композицией из примера.
В процессе наблюдения за формированием ЦПД в тканях кожи на Фиг. 4, формирование ЦПД очевидно наблюдали в группе, подвергшейся УФ-облучению и не обработанной композицией из примера. В то же время в группе, подвергшейся УФ-облучению и обработанной композицией из примера, наблюдали снижение тенденции к формированию ЦПД по сравнению с группой, облученной УФ-лучами и не обработанной композицией из примера.
Пример 3: защита клеток от воздействия загрязнителей воздуха (in vivo)
Для подтверждения цитопротекторного эффекта композиции согласно настоящему изобретению против загрязнителей воздуха, фибробласты человека (NHDFs) обрабатывали городской пылью в качестве загрязнителя воздуха и композицией из примера. Оценку жизнеспособности клеток проводили посредством определения MTS ((3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразол).
В качестве городской пыли применяли (SRM1649b, US National Institute of Standards and Technology (NIST)) атмосферные частицы, отобранные в г. Вашингтоне в период с 1976 по 1977 г.г. Городская пыль содержит множество соединений, таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), нитрозамещенные полициклические ароматические углеводороды, конгенеры полихлорированных бифенилов (ПХБ), хлорированные пестициды, декабромдифениловый эфир (дека-БДЭ), конгенеры дибензо-п-диоксинов и дибензофуранов. Размер частиц составлял примерно 10 мкм.
4
2
Клетки фибробластов человека (нормальные дермальные фибробласты, полученные из крайней плоти человека, NHDFs; ATCC, CRL-2522) помещали в 24-луночный планшет с концентрацией 3×10 клеток/лунку и культивировали в DMEM, содержащий 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 Ед/мл раствора пенициллина/стрептомицина при содержании CO 5% и температуре 37°C в течение 24 часов. Композицию из примера готовили с концентрацией от 0 до 10%, и культивированные клетки обрабатывали композицией в течение 6 часов. Затем клетки обрабатывали городской пылью с концентрацией 200 мкг/мл в течение 18 часов для измерения жизнеспособности клеток. Для измерения, после удаления культурной среды, клетки обрабатывали раствором MTS (0,33 мг/мл MTS) в течение периода от 1 до 4 часов, и абсорбцию измеряли при длине волны 490 нм с применением спектрофотометра (Epoch 2, BioTek).
Результаты количественного определения MTS, защитного эффекта фибропластов человека от воздействия городской пыли, представлены на Фиг. 5. В результате, с точки зрения жизнеспособности клеток при воздействии городской пыли, группа, обработанная композицией согласно настоящему изобретению, продемонстрировала более высокую жизнеспособность клеток на величину от 8 до 13% по сравнению с группой, не обработанной композицией от воздействия городской пыли.
Таким образом, было подтверждено, что настоящее изобретение оказывает противозагрязняющее действие на кожу при воздействии загрязнителей воздуха.
Пример 4: защита клеток от загрязнителей воздуха и УФ-излучения (in vivo)
Для подтверждения цитопротекторного эффекта композиции согласно настоящему изобретению против воздействия загрязнителей воздуха и ультрафиолетового излучения, фибробласты человека (NHDFs) обрабатывали городской пылью в качестве загрязнителя воздуха и облучали УФ-лучами (УФ-А) для оценки цитопротекторного эффекта пептидной композиции. Оценку жизнеспособности клеток проводили посредством определения MTS ((3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразол).
4
2
Клетки фибробластов человека (нормальные дермальные фибробласты, полученные из крайней плоти человека, NHDFs; ATCC, CRL-2522) помещали в 24-луночный планшет с концентрацией 3×10 клеток/лунку и культивировали в DMEM, содержащий 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 Ед/мл раствора пенициллина/стрептомицина при содержании CO 5% и температуре 37°C в течение 24 часов. Образец (композицию из примера) готовили с концентрацией 1%, и культивированные клетки обрабатывали композицией в течение 24 часов и затем обрабатывали городской пылью с концентрацией 80 мкг/мл в течение 24 часов и облучали УФ-лучами (УФ-А) в дозе 10 Дж/см2, чтобы измерить жизнеспособности клеток. Для измерения, после удаления культурной среды, клетки обрабатывали раствором MTS (0,33 мг/мл MTS) в течение периода от 1 до 4 часов, и абсорбцию измеряли при длине волны 490 нм с применением спектрофотометра (Epoch 2, BioTek).
Результаты количественного определения MTS, защитного эффекта фибропластов человека против воздействия городской пыли (ГП) и облучения УФ-лучами (УФ-А) представлены на Фиг. 6. В результате, группа, обработанная композицией согласно настоящему изобретению, продемонстрировала на 16% и более повышенную жизнеспособность клеток по сравнению с группой, не обработанной композицией для защиты от воздействия городской пыли и УФ-излучения (УФ-А).
Таким образом, было подтверждено, что настоящее изобретение оказывает цитопротекторное действие на кожу при одновременном воздействии загрязнителей воздуха и УФ-облучения.
Пример 5: клеточный окислительный стресс, вызванный воздействием загрязнителей воздуха и УФ-лучей
Для подтверждения защитного эффекта композиции согласно настоящему изобретению в отношении клеточного окислительного стресса, измеряли образование свободных радикалов (реактивные формы кислорода (РФК)).
2
2
2
Количественное определение HDCFDA (2',7'-дихлор-дигидро-флуоресцеин диацетат) применяли для определения формирования внутриклеточных свободных радикалов (РФК). Количественное определение HDCFDA (2',7'-дихлор-дигидро-флуоресцеин диацетат (DCFDA)) основано на принципе превращения HDCFDA в его флуоресцирующий продукт DCF (2',7'-дихлор-дигидро-флуоресцеин).
4
2
Клетки фибробластов человека (нормальные дермальные фибробласты, полученные из крайней плоти человека, NHDFs; ATCC, CRL-2522) помещали в 24-луночный планшет с концентрацией 3×10 клеток/лунку и культивировали в DMEM, содержащий 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 Ед/мл раствора пенициллина/стрептомицина при содержании CO 5% и температуре 37°C в течение 24 часов. Образец (композицию из примера) готовили с концентрацией 1%, культивированные клетки обрабатывали композицией в течение 24 часов и затем добавляли DCFDA (Fisher Scientific, D399) с концентрацией 10 мкмоль/л. Затем клетки культивировали в течение 30 минут.
2
DCFDA применяли разбавленным в буферном солевом растворе Хэнкса (HBSS). После удаления раствора DCFDA клетки промывали раствором HBSS 2 раза, обрабатывали городской пылью с концентрацией 80 мкг/мл в течение 24 часов и облучали УФ-лучами (УФ-А) в дозе 10 Дж/см. Интенсивность внутриклеточной флуоресценции измеряли с применением флуориметра (Victor3,1420 Multilabel counter, Perkin Elmer) при возбуждении на длине волны 485 нм и эмиссии на длине волны 520 нм. Результаты представлены на Фиг. 7. Было подтверждено, что способность к поглощению свободных радикалов улучшили примерно на 73% и более в группе, обработанной образцом, по сравнению с группой, не обработанной образцом.
Пример 6: эффект разглаживания морщин
Для подтверждения эффекта разглаживания морщин композиции согласно настоящему изобретению применяли инъекцию, содержащую композицию из примера, как показано в Табл. 1.
Исследования проводили на здоровых женщинах в возрасте от 35 до 55 лет. Композицию для инъекции в объеме 2 мл вводили в кожу трехкратно с двухнедельным интервалом с целью подтверждения эффекта разглаживания морщин. Состояние морщин оценивали с помощью фотографии и 3D-анализа.
Результаты приведены на Фиг. 8 - Фиг. 10, показывающих сравнение фотографий до и после инъекционных введений в области, подверженные морщинам.
На Фиг. 8 - 10 показано, что после трехкратного введения композиции согласно настоящему изобретению с двухнедельным интервалом было подтверждено, что скорость разглаживания морщин увеличивается от 10 до 20%.
На основании приведенных выше результатов было подтверждено, что настоящее изобретение не обладает токсичным действием на клетки кожи и способно защищать клетки кожи от воздействия вредных веществ и света из внешней среды.
Приведенные выше описания носят лишь иллюстративный характер технического замысла настоящего изобретения, и специалисты в той области техники, к которой относится настоящее изобретение, могут вносить различные модификации и вариации, не отступая от сущности настоящего изобретения. Кроме того, варианты реализации, раскрытые в настоящем изобретении, предназначены не для ограничения технического замысла настоящего изобретения, а для пояснения технического замысла, и объем технического замысла настоящего изобретения не ограничен этими вариантами реализации. Объем охраны настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, и все технические замыслы в пределах эквивалентного объема следует понимать как входящие в объем настоящего изобретения.