Изучение пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии индолил-3-уксусной кислоты

Изучение пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты в присутствии индолил-3-уксусной кислоты

Рогожин В.В. fvrogozhin@mail.ru), Рогожина Т.В.

Якутская государственная сельскохозяйственная академия

Пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7) катализирует реакции окисления неорганических и органических соединений перекисью водорода [1]. Субстраты пероксидазы можно условно разделить на две группы - быстро и медленно окисляемые. Последние из них являются соединениями, относящиеся к донорам электронов. Среди этой группы следует выделить вещества, обладающие высокой функциональной активностью в растениях (НАДН, индолил-3-уксусная кислота (ИУК), аскорбиновая кислота (АК)). Пероксидаза катализирует окисление индолил-3-уксусной кислоты как в присутствии, так и в отсутствие перекиси водорода [2-4]. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола [5,6]. Предложено, что пероксидаза способна одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК. Высказывается предположение, что на поверхности белка существует центр специфического связывания ауксина, отличающийся от активного центра, расщепляющего перекись водорода или органическую гидроперекись [6]. С помощью компьютерных методов показано, что пероксидазы растений и ауксин-связывающие белки содержат участки сходной структуры. При этом эти участки формируют основную часть дистального домена пероксидаз растений, и один из них непосредственно соответствует последовательности, координирующей гем с дистальной стороны активного центра [6]. По данным антигенного картирования пероксидазы хрена установлено, что в состав активного центра фермента входят несколько функционально важных аминокислотных остатков: Arg 38, Phe 142 и 143, которые формируют канал

доступа ароматических субстратов к активному центру пероксидазы хрена [7]. Установлен молекулярный механизм расщепления перекиси водорода в активном центре пероксидаз растений [8-9]. Показано, что в катализе фермента участвуют железо (III) протопорфирина IX и два дистальных аминокислотных остатков - His 42 и Arg 38. Однако до сих пор существуют сложности в предсказании субстратной специфичности пероксидазы хрена, недостаточно изучены механизмы пероксидазного окисления быстро и медленно окисляемых органических субстратов фермента. Поэтому целью данной работы было изучить участие индолил-3-уксусной кислоты в механизме пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, а также, по возможности, раскрыть закономерности этого каталитического процесса.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали пероксидазу хрена производства (<<Reanal>>, Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ=1.0. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при 403 нм (s=100 мМ-1 см-1 [10]) и по пиридингемохромогену [11]. Использовали аскорбиновую кислоту и индолил-3-уксусную кислоту фирмы (<<Serva>>, Германия). Концентрацию перекиси водорода (<<Реахим>>, Россия) определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент поглощения при 230 нм - 72,7 М-1 см-1 [12].

Реакцию окисления аскорбиновой кислоты (3,65-91,2 мкМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 23о в среде 0,1 М натрий-ацетатного (рН 4,5-6,0) или 0,1 М натрий-фосфатного (рН 6,0-7,5) буферов объемом 2,5 мл при концентрациях пероксидазы хрена 99-142 нМ. Окисление аскорбиновой кислоты регистрировали по уменьшению поглощения при 265 нм (s=7,0 мМ-1см-1 [13]). Ингибирование пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты индолил-3-уксусной кислотой изучали путем добавления в кювету вместе с

субстратами (при насыщающей концентрации одного из субстратов) пероксидазы ингибитора. Кинетические кривые снимали на двухлучевом спектрофотометре БМБ 100 Б фирмы (<<Varian>>, США). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль аскорбиновой кислоты за 1 мин.

Кажущиеся константы скорости окисления субстратов пероксидазы определяли из данных по стационарной кинетике [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты изучено в работе [15]. Показано, что окисление АК зависит от числа молекул субстрата, взаимодействующих с окисленными формами пероксидазы. Если с ферментом связываются более одной молекулы субстрата, то последующее каталитическое превращение АК ускоряется. Аналогичное предположение образования тройного промежуточного комплекса Е2 с двумя молекулами донора водорода было высказано для объяснения кинетических закономерностей пероксидазного окисления люминола и пирогаллола в стационарных условиях [16, 17]

Для объяснения механизма действия пероксидазы в реакциях окисления АК предложена схема 1 [15]: Е + Н2О2 -* Е1

Е1 + АН2 Е1-АН2 -> Е2-АН' -> Е + А

П АН2

Е2-2АН2-> Е + 2А

Схема 1

Е, Е1, Е2 - нативный фермент и его окисленные формы; АН2 - аскорбиновая кислота; Е1-АН2, Е2-АН', Е2-2АН2 - комплексы одной и двух молекул аскорбиновой кислоты с промежуточными соединениями Е1 и Е2.

Из рисунка 1 видно, что ИУК ингибирует пероксидазу в реакциях окисления аскорбиновой кислоты. Поэтому нами был исследован характер ингибирования пероксидазы ИУК при связывании одной молекулы АК в активном центре фермента. Показано, что зависимости обратных начальных скоростей (у0) пероксидазного окисления АК имеют вид семейства прямых, пересекающихся на оси ординат, что соответствует конкурентному типу ингибирования (рис. 2,а). Данный тип ингибирования указывает на то, что ингибитор и субстрат могут связываться в одном и том же месте активного центра фермента. При этом между субстратом и ингибитором наблюдается конкуренция за центр связывания. При связывании ауксина в активном центре фермента процесс пероксидазного окисления АК замедляется. Аналогичные зависимости были получены и при других значениях рН (4,57,0).

Пероксидазное окисление АК, при связывании двух и более молекул субстрата, сопровождалось неконкурентным характером ингибирования пероксидазы индолил-3-уксусной кислотой. При этом типе ингибирования точка пересечения прямых лежит на оси абсцисс (рис. 2,б), т.е. ингибитор связывается вдали от участка связывания второй молекулы АК, однако его связывание на поверхности белка нарушает нормальное взаимодействие субстрата с активным центром фермента [18].

Связывание ИУК с пероксидазой в реакциях конкурентного ингибирования достаточно прочное и составляет 5,4-20,5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания аскорбиновой кислоты и о-дианизидина, для которых константы Михаэлиса при рН 4,5-7,0 равны 6,1-

К =

£

0,8 -

0,6 -

0,4 - у' ^—*

0,2 -

0 -1-1-1-1- —1-1

2

1

-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

1МХ, мкМ-1

Рис. 1. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты от ее концентрации в отсутствие (1) и в присутствии (2) индолил-3-уксусной кислоты. Концентрации: пероксидаза -142 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий- фосфатный буфер, рН 6,5.

0,3 -0,2

0,1 0 0,1 1/АК, мкМ-1

0,2

4 3

0,3

X

а

£

0,02

0,24

0,16

0,08

-0-

б

X

« *

0 0,02 1/АК, мкМ-1

х

4

х 3 * 2

1

0,04

Рис. 2. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при рН 5,0 (а) и 7,0 (б) от ее концентрации при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-5, 3-10, 4-15. Концентрации: а) пероксидаза - 99 нМ, аскорбиновая кислота -3,65-9,12 мкМ; б) пероксидаза - 142 нМ, аскорбиновая кислота - 22,8-91,2 мкМ.

2

1

11,5 и 5,5-20 мкМ соответственно [15, 19]. В реакциях неконкурентного ингибирования ИУК связывается с пероксидазой в 3,2-10,2 раза лучше, чем связывание второй молекулы АК. При этом величины констант ингибирования в реакциях неконкурентного ингибирования при рН 4,5-7,0 для ИУК равны 27,3-34,6 мкМ. Таким образом, связывание ингибитора практически не зависит от рН. Тогда как значения величин K^ для АК изменяются в пределах от 88 до 353 мкМ [15].

В активном центре пероксидазы имеется несколько функциональных групп, принимающих участие в ферментативном катализе. Однако природа этих групп пока не установлена [20]. Предполагается, что в области связывания ароматических субстратов могут располагаться аминокислотные остатки: Arg 38, Phe 142 и 143 [7]. При этом место связывания ИУК может находиться в структуре субдомена ауксин-связывающего участка вблизи Trp 117, который может принимать участие в связывании ИУК пероксидазами растений [6].

Исследование зависимостей lgkcat/Km от рН для пероксидазного окисления одной молекулы аскорбиновой кислоты и двух молекул АК не позволяет определить природу функциональных групп активного центра, принимающих в катализе АК (рис. 3). Аналогичная закономерность отмечается и на кривых lgKi от рН для констант конкурентного и неконкурентного ингибирования (рис. 4). Причем величины констант конкурентного ингибирования практически не зависели от рН (рис. 4, кривая 2). тогда как значения констант неконкурентного ингибирования понижались в диапазоне рН 5-6, с возрастанием в кислой и нейтральной областях рН (рис. 4, кривая 1).

Таким образом, используя ИУК можно предположить место локализации участка связывания молекул АК в активном центре пероксидазы. По-видимому, таким участком является дистальная область

Рис. 3. рН-Зависимости ^(км/Кт) для реакций пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при связывании с ферментом одной молекулы субстрата (1) и двух молекул АК (2).

-4

* -5

2

5 6

рН

Рис. 4. Зависимости констант конкурентного (1) и неконкурентного (2) ингибирования пероксидазы индолил-3-уксусной кислотой в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты от рН.

активного центра пероксидазы. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления АК, когда в активном центре фермента связывается по крайней мере одна молекула субстрата.

Для объяснения конкурентного характера ингибирования пероксидазы ИУК можно предложить схему 2:

Е1 + АН2 с-эР1-ан2 -> Е2-АН' —> Е + А

А

I ^ ^ Кц [Е1-1]

Схема 2

I - индолил-3-уксусная кислота, Е1-1 - комплекс окисленной формы пероксидазы с ИУК.

При связывании двух и более молекул АК с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК, что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата. Использование ИУК позволяет высказать предположение, что участки связывания молекул АК пространственно удалены, проявлением этого является неконкурентный характер ингибирования пероксидазы ИУК при окислении АК в присутствии второй молекулы субстрата. При этом связывание ИУК в активном центре пероксидазы создает препятствие для протекания реакции пероксидазного окисления АК. Однако ингибитор проявляет неконкурентный характер ингибирования при окислении двух и более молекул АК. Это, возможно, обусловлено отрицательным кооперативным влиянием различных участков активного центра пероксидазы.

На основании полученных данных неконкурентный тип ингибирования пероксидазы ИУК можно описать схемой 3:

Е2-АН' + АН2 <-^ Ег-ЛИ'-ЛИг * Е + 2А

[Е2-АН'-1] + АН2 [1-Е2-2АН2]

Схема 3

Ег-АН'-АНг, Е2-АН'-1, 1-Е2-2АН2 - комплексы одной и двух молекул АК с окисленными формами пероксидазы в отсутствие и в присутствии ИУК.

В заключении следует отметить, что выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, катализируемое пероксидазой, имеет важное биологическое значение. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина, служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. Таким образом, ИУК может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Реализация действия ауксина, возможно, проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность пероксидазы, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к

генерированию свободных радикалов, необходимых на конечных этапах эмбриогенеза для активизации механизмов прорастания.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Механизм пероксидазного окисления. Субстрат-субстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена//Известия РАН. Сер. химическая.-1996.-№ 1.-C.25-32.

2. Metodiewa D., Pieres de Melo M., Escobar J.A., Cilento G., Dunford H.B. Horseradish peroxidase-catalysed aerobic oxidation and peroxidation of indole-3-acetic acid. I. Optical spectra//Arch. Biochem. and Biophys.-1992.-V.296.-N 1.-P.27-33.

3. Park R.D., Park C.K. Oxidation of indole-3-acetic acid - amino acid conjugates by horseradish peroxidase//Plant Physiol.-1987.-V.84.-N 3.-P.826-829.

4. Pieres de Melo M., Escobar J.A., Metodiewa D., Dunford H.B., Cilento G. Horseradish peroxidase - catalyzed aerobic oxidation of indole-3-acetic acid.II.Oxygen uptake and chemiexcitation//Arch. Biochem. and Biophys.-1992.-V.296.-N 1.-P.34-39.

5. Gazarian,I.G., Lagrimini, L. M., Mellon, F. A., Naldrett, M. J., Ashby, G. A., and Thorneley, R. N. Identification of skatolyl hydroperoxide and its role in the peroxidase- catalysed oxidation of indol-3-yl acetic acid//Biochem. J.-1998, V.333.-N.1.- P.223-232.

6. Савицкий П.А., Рожкова А.М., Тишков В.И., Упоров И.В., Руденская Г.Н., Газарян И.Г. Существование центра связывания индолил-3-уксусной кислоты в пероксидазах растений. Структурное сходство пероксидаз и ауксин-связывающих белков//Биохимия.- 1998.-Т.63.-Ы 6.-C.749-754.

7. Аммосова Т.Н., Упоров И.В., Рубцова М.Ю., Игнатенко О.В., Егоров А.М., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Антигенное картирование пероксидазы хрена (изофермент С)//Биохимия.-1997.- ^62.-N 4.-C.516-524.

8. Schuller, D.J., Ban, N., van Huystee, R.B., McPherson, A., Poulos, T.I. Propretie and structure of peroxidase//Structure.-1996.-V.4.-P. 311-321.

9. Gajede, M., Henriksen, A., Schuller, D.J., Poulos, T.I., Smith, A.T. Crystal structure of Horseradish peroxidase C (HRPC): with and without the substrate benzohydroxamic acid (BHA) bound in the active site, in Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology, 1996 (IV International symposium, July 6-10, 1996, Vienna, Austria) p.O2.

10. Ogawa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme enviromental structure//Biochem. Biophys. Res. Commun.-1979.-V.90.-N2.-P.674-678.

11. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphyrins//Amsterdam.-N.Y.-London etc.: Elsevier, 1964. 236 p.

12. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome C peroxidase and horseradish peroxidase:-.Titration with reducing agents//Biocem. J.-1953.-V.54.-N2.-P.267-276.

13. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, М:Мир, 1991. 544 с.

14. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики.-М:МГУ, 1976. 320 с.

15. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы хрена//Биохимия.-1997.-Т. 62.-N 12.-C.1678-1682.

16. Dure L., Cormier M.J. The oxidasation of phenol and its reaction product by hirseradish peroxidase and hydrogen peroxide//Biochem. Biophys. Res. Commun.-

1963.-V.11.-P.489-495.

17. Dure L., Cormier M.J. Additional properties of the peroxidase//J.Biol. Chem. -

1964.-V.239.-P. 2351-2359.

18. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии.-М.:Мир, 1981.-Т.1.-С.264-265.

19. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена.//Биохимия.-1977.-Т.42.-Ш.-СЛ372-1379.

20. Андреева В.А. Фермент пероксидаза.-М.:Наука, 1988. 128 с.