Реконструирование соматического окружения овариальных фолликулов в системе in vitro

Реконструирование соматического окружения овариальных фолликулов в системе in vitro

Ключевые слова: овариальная ткань, рост фолликулов, культивирование

Храмова Ю.В.1, Никишин Д.А.12, Багаева Т.С.1, Филатов М.А.1, Семенова М.Л.1

1 МГУ им. М.В.Ломоносова

119991, Российская Федерация, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12

2 ИБР им. Н.К.Кольцова РАН

119334, Российская Федерация, г. Москва, ул. Вавилова, 26

Keywords:

cultivation,

human ovarian tissue,

growth of ovarian follicles

Reconstruction of the somatic cellular environment of ovarian follicles in vitro

Khramova Y.V.1, Nikishin D.A.12, Bagaeva T.S.1, Filatov M.A.1, Semenova M.L.1

1 Lomonosov Moscow State University

1-12, Leninskie Gory, Moscow, Russian Federation, 119991

2 IDB RAS

26, Vavilova str., Moscow, Russian Federation, 119334 E-mail: yul.khramova@gmail.com

Культивирование овариальных фолликулов в системах in vitro является одним из перспективных способов сохранения фертильности женщин репродуктивного возраста, страдающих различными заболеваниями, в том числе онкологическими. В настоящее время овариальные фолликулы культивируют как в 2D условиях — на поверхности культуральных планшетов, так и в 3D системах — инкапсулирование в гидрогели, культивирование на неадгезивных поверхностях. Помимо способа культивирования важную роль также играет состав среды. Однако единого протокола культивирования овариальных фолликулов, позволяющего получить компетентные к оплодотворению ооциты в системе in vitro, на данный момент не существует. Учитывая, что большая часть факторов роста, оказывающих влияние на рост и созревание ооцита, выделяется соматическими клетками в составе яичника, целью нашей работы стала разработка системы реконструирования соматического окружения овариальных фолликулов млекопитающих в системе in vitro. Для реконструкции соматического окружения овариальных фолликулов, выделенных из яичников неполовозрелых мышей, мы использовали смешанную культуру клеток стромы яичника мыши, а также мезенхимные стволовые клетки, выделенные из костного мозга мыши (МСК КМ). Клетки выделяли по стандартному протоколу, культивировали в 60 мм чашках Петри в полных ростовых средах. Клетки 3-4 пассажа использовали для реконструкции соматического окружения фолликулов. Капли среды с клетками наносили на поверхность крышек чашек Петри

(3000 кл/30 мкл), затем в них помещали по одному фолликулу, крышку переворачивали для получения «висячей капли». Донце чашки было заполнено средой для создания влажной камеры. Сокультивирование проводили в течение 7 суток, после чего образцы исследовали методами световой и электронной микроскопии, методом количественного ПЦР-анализа. В результате проведенных экспериментов было показано, что клетки стромы формируют с фолликулом единую систему, в которой имеют место элементы самоорганизации — кубические клетки занимают более внутреннее положение, уплощенные клетки располагаются снаружи агрегата. При сокультивировании происходило увеличение размера как фолликула, так и ооцита. МСК КМ также формировали с фолликулом единую структуру, но за более длительное время. МСК изменяли свою форму с округлой на элипсоидную, на их поверхности образовывались отростки, соединяющие МСК с клетками фолликула. Методом количественного ПЦР-анализа было показано, что МСК КМ меняли свой фенотип с CD34-, CD45-, CD73+, CD90+, CD105+ на CD34+, CD45-, CD73-, CD90+, CD105+ и приобретали маркеры стероидогенных клеток теки (LHR, Cyp17a1). Также наблюдали увеличение размера и фолликула, и ооцита. Таким образом, мы показали, что реконструирование соматического окружения фолликулов можно проводить при помощи клеток различного происхождения. Разработанная нами система позволяет не только культивировать фолликулы, но и изучать динамику клеточных процессов, происходящих при фолликулогенезе.

\~48

Международная научно-практическая конференция «РЕПРОДУКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ОНКОЛОГИИ» 22-23 мая 2015. Обнинск, Калужская область, Россия