Способ количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в гистологических препаратах
METHOD FOR QUANTIFYING THE LEVEL OF EXPRESSION OF PROTEIN C23/NUCLEOLIN IN HISTOLOGICAL SPECIMENS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к клеточной биологии, цитологии и гистологии, в частности к количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в гистологических препаратах.
Уровень техники
Известен способ визуальной оценки интенсивности экспрессии белка С23, который проводится визуально с учетом интенсивности окрашивания и устанавливается как низкая, умеренная и высокая. Недостаток данного способа в том, что он является полуколичественным и не позволяет отследить статистически значимые различия интенсивности окрашивания продукта иммуногистохимической реакции (Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А., Пономарева М.В., Чекини А.К., Павловская А.И., Шабанов М.А. // Пролиферативная активность, степень злокачественности и прогноз при карциноидных опухолях легких Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 2012. Т. 23. № 4 (90). С. 17-24.).
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ, в котором определяется отношение суммарной площади иммуногистохимически окрашенных гранул белка С23/нуклеолина к суммарной площади клеток. Недостатком данного способа является то, что отражающие концентрацию продукта иммуногистохимической реакции критерии интенсивности окрашивания гранул  в количественной оценке не учитываются и определяются также визуально как низкая, умеренная и высокая. (Уханова Е.М., Каршиева С.Ш., Зенит-Журавлева Е.Г., Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Лушникова А.А., Покровский В.С., Трещалина Е.М. Экспрессия маркеров пролиферации ki-67, С23/нуклеолина и В23/нуклеофозмина в ксенографтах рака легкого человека с разной скоростью роста и чувствительностью к химиотерапии у иммунодефицитных мышей // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 2013. Т. 24. № 3-4 (93). С. 23-29.).
Вышеперечисленные методы не имеют комплексного количественного подхода к оценке содержания продукта иммуногистохимической реакции в гистологическом препарате.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в гистологических препаратах, что позволит получить числовой результат, с помощью которого становится возможным определять статистическую значимость различий по данному показателю между исследуемыми биологическими объектами.
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к определению объективного параметра, в цифровом выражении отражающего количественное содержание белка С23/нуклеолина в клетках.
Технический результат изобретения достигается с помощью способа количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в гистологических препаратах, включающего фиксацию кусочков органов в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина и проведение через спирты и ксилол с последующей заливкой в гистологическую среду и фиксацией на стандартные гистологические кассеты с последующим изготовлением гистологических срезов толщиной 5-7 мкм, при этом депарафинизацию, гидратацию и демаскировку антигенов на гистологических срезах проводят высокотемпературной обработкой в течение 20 минут в 5% раствор TrilogyTM и ополаскивании в 5% буфере TBS IHC Wash Buffer+Tween 20 (TBS (Tween 20x)) с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 секунд и обработкой 3 % раствором Н2О2 в течение 10 минут, после чего срезы ополаскивают в дистиллированной воде в течение 10 секунд и помещают в 5% буфер TBS (Tween 20x) на 5 минут с нанесением гидрофобного слоя и блокировочного раствора на 10 минут, после чего со срезов удаляют излишки раствора и наносят первичные антитела к Anti-Nucleolin antibody, после чего инкубируют во влажной камере при температуре 27ºС в течение 24 часов, после этого срезы помещают в 5% буфер TBS на 5 минут, а затем наносят раствор № 1 полимерной системы детекции HiDef DetectionTM Amplifier и инкубируют в течение 60 минут во влажной камере при температуре 27ºС со смывкой в 5% буфере TBS (Tween 20x) в течении 5 минут, после чего наносят раствор № 2 полимерной системы детекции HiDef DetectionTM HRP Polymer Detector и инкубируют в течение 60 минут во влажной камере при температуре 27ºС со смывкой в 5% буфере TBS (Tween 20x) в течение 5 минут, после буфера на срезы наносят хромоген DAB Substrate Kit на 3-5 минут и промывают в 2-х сменах дистиллированной воды по 5 минут в каждой, после чего извлекают, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и ксилоле и заключают в монтирующую среду БиоМаунт, которая позволяет выполнить оцифровку при увеличении в 1000 раз с последующим измерением в каждом цифровом снимке оптической плотности и суммарной площади окрашенных гранул белка С23/нуклеолина, а также суммарной площади клеток с последующим расчетом коэффициента экспрессии белка С23/нуклеолина в поле зрения по формуле:
,
где: K ex. С23 – коэффициент экспрессии белка С23/нуклеолина в поле зрения, ∑S С23 – суммарная площадь окрашенных гранул белка С23/нуклеолина в поле зрения, ∑S Cell – суммарная площадь клеток в поле зрения, D С23 – оптическая плотность окрашенных гранул белка С23/нуклеолина в поле зрения.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг.1 окрашенные гранулы белка С23/нуклеолина в гепатоцитах нутрии в возрасте 4,5 месяца. Увеличение ×1000.
На фиг.2 окрашенные гранулы белка С23/нуклеолина в кардиомиоцитах нутрии в возрасте 12 месяцев. Увеличение ×1000.
На фиг.3 окрашенные гранулы белка С23/нуклеолина в экзокринных панкеатоцитах нутрии в возрасте 2 месяца. Увеличение ×1000.
На фиг. 4 окрашенные гранулы белка С23/нуклеолина в почечных канальцах нутрии в возрасте 12 месяцев. Увеличение ×1000.
На фиг. 5 параметры экспрессии белка С23/нуклеолина, их достоверно значимые различия при р<0,05 в гепатоцитах нутрий разных половозрастных групп.
Осуществление изобретения
Способ количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в гистологических препаратах заключается в том, что кусочки органов, фиксируют в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина и проводят через спирты возрастающей концентрации (50°, 60°, 70°, 80° и 96°) и ксилол, а затем заливают в гистологическую среду «Гистомикс» с использованием гистологического процессора замкнутого типа Tissue-Tek VIP™ 5 Jr. производства Sakura (Япония) и станции парафиновой заливки Tissue-Tek TEC™ 5 производства Sakura (Япония).
После заливки кусочки органов фиксируют на стандартные гистологические кассеты, затем с помощью ротационного микротома делают гистологические срезы толщиной 5 мкм.
Для иммуногистохимической реакции используют поликлональные кроличьи антитела к Anti-Nucleolin antibody (Abcam plc, Великобритания).
Негативным контролем служили реакции с заменой первых антител раствором для разведения (SpringBioScience, США).
2
2
Депарафинизацию, гидратацию и демаскировку антигенов на гистологических срезах проводят высокотемпературной обработкой в пароварке-стимере в течение 20 минут, погружая стекла в 5% раствор TrilogyTM (CELL MARQUE, Нидерланды), после чего стекла со срезами оставляют в горячем растворе еще на 10 минут. Затем стекла со срезами ополаскивают в 5% буфере TBS IHC Wash Buffer+Tween 20 (TBS (Tween 20x)) (CELL MARQUE, Нидерланды), после чего буфер смывают путем ополаскивания стекол в дистиллированной воде в течение 10 секунд. Далее стекла обрабатывают 3 % раствором НО в течение 10 минут для блокирования эндогенной пероксидазы. Затем стекла со срезами ополаскивают в дистиллированной воде в течение 10 секунд, после чего помещают в 5% буфер TBS (Tween 20x) на 5 минут. После буфера вокруг срезов делают гидрофобный слой при помощи гидрофобного барьерного карандаша-маркера PAP-pen (SpringBioScience, США). Затем наносят на срезы блокировочный раствор Background Block TM (CELL MARQUE, Нидерланды) на 10 минут, после чего со срезов удаляют излишки раствора путем их промакивания бумажным полотенцем и наносят первичные антитела к Anti-Nucleolin antibody. Инкубацию срезов с первичными антителами проводят во влажной камере при температуре 27ºС в течение 24 часов, после чего смывают первичные антитела путем помещения стекол со срезами в 5% буфер TBS (Tween 20x) на 5 минут. Затем наносят раствор № 1 полимерной системы детекции HiDef DetectionTM Amplifier (Mouse and Rabbit) (CELL MARQUE, Нидерланды) и инкубируют в течение 60 минут во влажной камере при температуре 27ºС. Смывают раствор № 1 путем помещения стекол со срезами в 5% буфер TBS (Tween 20x) на 5 минут, после чего наносят раствор № 2 полимерной системы детекции HiDef DetectionTM HRP Polymer Detector (CELL MARQUE, Нидерланды) и инкубируют в течение 60 минут во влажной камере при температуре 27ºС. После инкубации раствор № 2 смывают в 5% буфере TBS (Tween 20x) в течение 5 минут. Затем после буфера на срезы наносят хромоген DAB Substrate Kit (CELL MARQUE, Нидерланды) на 3-5 минут. По достижению необходимой интенсивности окрашивания срезы промывают в 2-х сменах дистиллированной воды по 5 минут в каждой, извлекают, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и ксилоле по стандартной гистологической схеме согласно рекомендациям (Коржевский Д.Э., Гияров А.В. Основы гистологической техники. – Спб.: СпецЛит, 2010. – 95 с.) и заключают в монтирующую среду БиоМаунт (БиоВитрум, Россия).
Выполняется оцифровка изображений (фиг. 1, 2, 3, 4), случайно выбранных полей зрения при увеличении в 1000 раз с последующим измерением в каждом цифровом снимке оптической плотности и суммарной площади С23-экспессирующих структур, а также суммарной площади клеток.
Морфометрические исследования и определение оптической плотности проводятся с использованием специализированных пакетов программ (например, Видео-Тест Морфология 5.1 для Windows).
Для количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в полученном гистологическом препарате применяется расчет коэффициента экспрессии белка С23/нуклеолина в поле зрения по формуле:
,
где: K ex. С23 – коэффициент экспрессии белка С23/нуклеолина) в поле зрения, ∑S С23 – суммарная площадь окрашенных гранул белка С23/нуклеолина в поле зрения, ∑S Cell – суммарная площадь клеток в поле зрения, D С23 – оптическая плотность окрашенных гранул белка С23/нуклеолина в поле зрения.
Синтез белка и ядерно-цитоплазматический транспорт являются одними из ключевых звеньев в жизнедеятельности клетки. Основную функцию по образованию рибосомных субъединиц выполняет ядрышко, при этом одним из самых многочисленных и основных ядрышковых белков является нуклеолин (С23), который функционирует как молекулярный шаперон и помимо биогенеза рибосом участвует во многих клеточных процессах, таких как организации и стабильности хроматина, метаболизме ДНК и РНК, ангиогенезе, регуляции апоптоза, цитокинезе, клеточной пролиферации, стресс-реакции и процессинге микроРНК (Jia W., Yao Z., Zhao J., Guan Q., Gao L. New perspectives of physiological and pathological functions of nucleolin (NCL) // Life Sci. 2017; 186:1-10. doi: 10.1016/j.lfs.2017.07.025. Epub 2017 Jul 24.).
Разработанный способ количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в гистологических препаратах позволит получить числовой результат, благодаря которому становится возможным определять статистическую значимость различий по данному показателю между исследуемыми биологическими объектами (фиг. 5).
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими техническими решениями имеет следующие преимущества:
- Комплексная количественная оценка экспрессии белка С23/нуклеолина, определяющаяся на основе как морфологических характеристик, так и показателя оптической плотности продукта иммунногистохимической реакции;
- Позволяет проводить статистический анализ полученных числовых (цифровых) результатов и определять достоверно значимые различия в уровне экспрессии белка С23/нуклеолина между исследуемыми биологическими объектами.