Способ лечения нейропатической боли
METHOD FOR TREATMENT OF NEUROPATHIC PAIN

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для снижения болевой чувствительности организма в условиях хронической нейропатической боли при применении N-докозагексаеноил-этаноламина (этаноламид докозагексаеновой кислоты, ЭА-ДГК).
Нейропатическая боль - это патологическое состояние, вызванное травмой или заболеванием соматосенсорной нервной системы. Такое повреждение нервной ткани может быть как центральным, так и периферическим, создавая условия для развития различных болевых синдромов (Schomberg D.; Ahmed M.; Miranpuri G.; Olson J.; Resnick, D.K. «Neuropathic pain: Role of inflammation, immune response, and ion channel activity in central injury mechanisms». Ann. Neurosci. 2012, 19, 125–132). Периферическая нейропатическая боль - широко распространенное и сложное патологическое состояние, которое может иметь различную этиологию, включая травму нерва во время операции или компрессионные невропатии, такие как туннельный синдром, компрессия нерва, травма нерва и различные плексопатии (Colloca L.; Ludman T.; Bouhassira, D. et al. «Neuropathic pain». Nat. Rev. Dis. Prim. 2017, 3, 17). На распространенность синдрома нейропатической боли в популяции влияют различные факторы, включая старение, диабет и рост числа онкологический заболеваний, а также побочные эффекты химиотерапии, которые влияют на все сенсорные волокна. Данная патологическая боль значительно снижает качество жизни и дорого обходится обществу. Существующие варианты фармакотерапии, такие как нестероидные противовоспалительные препараты, антидепрессанты, противосудорожные препараты и опиаты, преимущественно снимают болевые симптомы только за счет неспецифического снижения возбудимости нейронов (Bannister K.; Sachau J.; Baron R.; Dickenson A.H. «Neuropathic pain. Mechanism-based therapeutics». Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2020, 60, 257–274). Эти общие методы лечения не направлены на устранение основных причин боли и лишь в редких случаях приводят к полному облегчению симптомов. Неэффективность доступных методов лечения в основном связана с ограниченным пониманием процессов, лежащих в основе этого типа боли. Нейропатическая боль проявляется комбинацией различных сенсорных симптомов (аллодиния, гипер- и гипоалгезия, гипер- и гипестезия), а также когнитивных и аффективных расстройств, включая потерю памяти, тревогу, депрессию и ангедонию. Эти симптомы предполагают участие в патологическом процессе различных отделов мозга, включая гиппокамп (Mutso A.A.; Radzicki D.; Baliki M.N. et al. «Abnormalities in hippocampal functioning with persistent pain». J. Neurosci. 2012, 32, 5747–5756; Liu M.G.; Chen J. «Roles of the hippocampal formation in pain information processing». Neurosci. Bull. 2009, 25, 237–266). Многочисленные исследования показывают, что хроническая периферическая боль может вызывать глубокие изменения пластичности гиппокампа, включая нарушение нейрогенеза (Dellarole A.; Morton P.; Brambilla R. et al. «Neuropathic pain-induced depressive-like behavior and hippocampal neurogenesis and plasticity are dependent on TNFR1 signaling». Brain Behav. Immun. 2014, 41, 65–81) и синаптической пластичности. Продолжительная невропатическая боль может повлиять на эмоционально управляемое обучение и связанную с ним синаптическую реорганизацию, что способствует хронизации болевого синдрома. Неотъемлемой частью патогенеза и движущей силой такой реорганизации является реакция нейровоспаления, сопровождающаяся активацией микроглии и высвобождением провоспалительных факторов. Глиальные клетки, активируемые при нейропатической боли, характеризуются пролиферацией, гипертрофией и повышенной продукцией провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1β, интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли-α (Del Rey A.; Yau H.J.; Randolf A. et al. «Chronic neuropathic pain-like behavior correlates with IL-1β expression and disrupts cytokine interactions in the hippocampus». Pain 2011, 152, 2827–2835; Fiore N.T.; Austin P.J. «Glial-cytokine-neuronal adaptations in the ventral hippocampus of rats with affective behavioral changes following peripheral nerve injury». Neuroscience 2018, 390, 119–140; Fiore N.T.; Austin P.J. «Peripheral nerve injury triggers neuroinflammation in the medial prefrontal cortex and ventral hippocampus in a subgroup of rats with coincident affective behavioral changes». Neuroscience 2019, 416, 147–167).
В настоящее время существует значительный арсенал анальгетиков для лечения нейропатической боли, однако они обладают рядом недостатков, связанных с низкой эффективностью, высоким риском развития побочных эффектов, неселективностью в отношении патофизиологии болевого процесса, что требует формирования сложных многокомпонентных динамических схем для обеспечения выздоровления пациента. В этой связи, разработка новых эффективных и безопасных фармакологических средств, обладающих анальгетической и нейропротекторной активностью, для лечения нейропатической боли  является одной из приоритетных задач современной медицины и нейрофармакологии.
Известен способ снижения нейропатической боли с помощью использования ботулотоксина типа А (US № 20080138364 А1, МПК A61K38/00, A61K38/16, A61K38/48, A61K39/08, опубл. 12.01.2008), который назначали в следующих дозах:
- животным – 7-30 единиц Botox / кг, оценивали физиологическую реакцию через 5-ть дней после травмы%;
- людям – 10-300 единиц Botox однократно, в среднем 50-300 единиц, как внутримышечно, так и подкожно, при артрите онкологии, боли в брюшине, воспалении легких и др. Вызывает недоумение, что в каждом примере лечат одного конкретного человека, а применяемая доза «плавающая», что вызывает большие сомнения по поводу всего лечения.
Известный способ имеет следующие недостатки:
1. бутулиновый токсин – чрезвычайно опасное вещество, нужно соблюдать меры предосторожности для того, чтобы он не был введен в кровеносный сосуд;
2. эксперименты, выполненные на мышах, ограничились только физиологическим тестированием животных, причем проведен только визуальный анализ параметров развития острой болевой реакции, инструментальные тесты не применялись; дальнейший анализ состояния непосредственно систем болевого анализатора (спинномозговые ганглии, задние рога спинного мозга) не проводился;
3. эксперименты на людях проведены без описания каких-либо статистически значимых различий;
4. применение ботулотоксина имеет ограничения - нарушение свертываемости крови, терапия антикоагулянтами или прием других лекарственных средств в антикоагулянтных дозах, выраженная мышечная слабость или атрофия мышц-мишеней, наличие неврологических заболеваний, повышенная температура; острые инфекционные или неинфекционные заболевания и др.;
5. ботулинический токсин типа А следует с осторожностью вводить в места, находящиеся в непосредственной близости от сонных артерий, верхушек легких и пищевода;
6. применение ботулинического токсина типа А может спровоцировать нарушения глотания, речи и дыхания, что потребует незамедлительных оперативных мер;
7. для пациентов в возрасте до 18 лет исследования по воздействию ботулотоксина вообще не проводились;
8. любая терапия, содержащая ботулинический токсин, должна применяться под специальным контролем и только в том случае, когда ожидаемая польза от лечения превосходит риск;
9. облегчение от боли, по заключению авторов, составляет от 2-х до 6-ти месяцев, при этом никакими данными не подкреплено.
Известен способ лечения нейропатической боли имидазотриазинонами (WO 2013/156231 Al, МПК А61К 31/00, А61К 31/53, А61Р 25/04, опубл. 24.10.2013), который рекомендовали в следующих дозах:
- примерно 0,01 мг-10 г на человека в сутки, предпочтительно 0,5-5 г (максимально до 10 г), может быть назначен орально, назально, подкожно, внутримышечно, в виде суппозиториев и пр.; ежедневная доза для введения людям для предотвращения невропатической боли может находиться в диапазоне примерно 0,01-50 мг/кг или для среднего по весу человека (70 кг) 3,5 г, и по длительности реабилитации от 1 недели до 1 года; это очень значительная нагрузка на организм и применение таких синтетических препаратов должно быть исчерпывающе обоснованным.
К недостаткам способа следует отнести:
1. имидазотриазиноны - класс полностью синтетических соединений, своей структурой близки к гербицидам;
2. основа их действия – ингибирование фосфодиэстеразы-9, что приводит к модуляции (нарастанию) уровня цикличного аденозинмонофосфата и повышению синаптической пластичности и синаптических процессов; однако для исследования имидазотриазинонов для терапии нейропатической боли была выбрана крайне противоречивая модель;
3. модель травматического повреждения спинного мозга (spinal cord injury, SCI) обычно используют для тестирования препаратов, действие которых направленно на восстановление ткани травмированного спинного мозга и проводящих путей, при этом физиологические тесты направлены на оценку восстановления чувствительности и двигательной активности животных с повреждением спинного мозга;
4. судя по дизайну исследования и применению широкого спектра физиологического тестирования нейропатической боли путем оценки чувствительности задних конечностей животных, авторам патента следовало бы использовать модель периферической нейропатической боли, которая формируется путем лигирования седалищного нерва задней лапы крысы или повреждением корешков спинного мозга, что помогло бы установить анальгетическую активность исследуемых препаратов;
5. в данном же случае кажется более вероятным тот факт, что у животных без введения имидазотриазинонов просто происходит более раннее восстановление функций задних конечностей, с более быстрым восстановлением чувствительности;
6. можно также предположить, что данная модель могла быть использована, если бы контузионная травма была легкой степени тяжести, но в патенте указано, что восстановление вегетативных функций животных наблюдалось лишь через неделю после операции, а это указывает на контузию тяжелой степени, и в данном случае речь идет о восстановлении чувствительности задних конечностей, а не о терапии нейропатической боли.
Известен патент способ, предлагающий использование этаноламида пальмитиновой кислоты в качестве средства снижения нейропатической боли. При этом лечение боли проводили дозами от 1,2 г до 2,4 г в сутки на пациента в течение 1 месяца, оценку эффекта проводили по шкале боли Numeric Rating Scale (NRS), она снижалась с 10 (максимум) до 3-х, однако для усиления авторы использовали группу витаминов В, причем их содержание в комплексных препаратах было до 300% от рекомендуемой нормы, поэтому сложно вычленить истинное действие заявляемого вещества – этаноламида пальмитиновой кислоты (WO 2016/146453 Al «Composition for use in the treatment of neuropathic pain», МПК A61K 31/164, A61K 31/197, A61K 31/455, A61K 31/51, A61K 31/525, A61K 31/714, A61P 25/00, опубл. 22.09.2016).
Недостатками данного способа являются:
1. эксперименты проведены на крайне скромной выборке людей, без описания каких-либо статистически значимых различий;
2. полностью отсутствуют данные о хотя-бы предполагаемых механизмах действия PEA и различных композиций на его основе;
3. исследователи ограничились лишь физиологическим тестированием людей, которое обладает некоторой степенью субъективности;
4. не было проведено никаких функциональных тестов или биохимических анализов крови людей, принимавших участие в эксперименте;
5. в целом, исследование анальгетического действия этаноламида пальмитиновой кислоты достаточно широко освещено в литературе в последние 10-15 лет.
Известен способ для лечения нейропатической боли, использующего композиция, в котором в качестве активного фармацевтического начала, как и в предыдущем способе предлагается использование этаноламида пальмитиновой кислоты. Прием животными этаноламида пальмитиновой кислоты составлял 5 мг/кг, орально со связующими добавками, обладающими и собственной активностью, а главный контроль показателей оценивали на 8-е сутки (US 20150265568 A1», МПК A6IK 3I/221, A61K 3I/I64, опубл. 24.09.2015).
Способ имеет следующие недостатки:
1. исследователи ограничились только физиологическим тестированием животных, причем с очень скромным объёмом экспериментальных подходов, использовался только тест на развитие тактильной аллодинии, тогда как огромный спектр дополнительных проявлений нейропатической боли не освещался (механическая аллодиния, термическая аллодиния, гипералгезия, нарушение когнитивных функций);
2. в связи с использованием лишь тестирования тактильной аллодинии животных, исследователи не в состоянии установить хотя бы некоторые механизмы действия исследуемых композиций на основе этаноламида пальмитиновой кислоты;
3. срок проведения эксперимента крайне скромный (8 дней), тогда как основное проявление нейропатической боли приходится на 14 день после операции, а признаки тактильной аллодинии сохраняются вплоть до 2-3 месяцев;
4. эксперименты представлены без описания каких-либо статистически значимых различий между экспериментальными группами.
Наиболее близким к заявляемому решению является способ лечения нейропатической боли путем введения докозагексаеновой кислоты, являющейся природной морской кислотой, получаемой из морских организмов. Докозагексаеновую кислоту в виде эмульсии вводят млекопитающим подкожно в дозе 4,5 мг/кг ежедневно в течение 2 недель после операции (Manzhulo et al. «Neuron-astrocyte interactions in spinal cord dorsal horn in neuropathic pain development and docosahexaenoic acid therapy» // Journal of Neuroimmunology. 2016. Vol. 298, P. 90–97).
Данный способ имеет следующие недостатки:
1. это была одна из первых работ авторов по подтвержденному действию докозагексаеновой кислоты при нейропатической боли, однако при всех обнадеживающих результатах средство не обладало еще той эффективностью, что присуще многим официальным лекарственным препаратам;
2. авторы сами считают, что их исследование промежуточное и, в дальнейшем, должно быть обосновано многими дополнительными факторами;
3. также была выбрана модель, не раскрывающая в полном объеме возможные направления применения препарата.
Техническая проблема, решаемая изобретением – разработка нового эффективного, способа лечения нейропатической боли и ее эмоциональных эффектов на основе нового природного морского компонента, этаноламида докозагексаеновой кислоты, обладающего высокой биологической активностью, за счет нейропротективного действия ЭА-ДГК.
Заявленная техническая проблема решается тем, что в известном способе лечения нейропатической боли, включающим введение фармацевтически эффективного количества природного компонента, полученного из морских организмов, согласно изобретению, в качестве природного компонента, полученного из морских организмов, берут этаноламид докозагексаеновой кислоты.
Использование этаноламида докозагексаеновой кислоты для лечения нейропатической боли, который ранее в этих целях не применялся, позволил получить абсолютно неожиданный эффект по устранению нейропатической боли. Кроме того, ЭА-ДГК подавляет нейровоспаление, усиливает нейрогенез, восстанавливает нарушение двигательной активности, рабочей и долговременной памяти и проявляет другие положительные эффекты.
Экспериментально установлено, что фармацевтически эффективной дозой ЭА-ДГК, позволяющей устранить воздействие нейропатической боли, является доза в количестве 4 мг/кг ежедневно в течение не менее 5-ти недель.
Целесообразно ЭА-ДГК вводить подкожно в виде водо-жировой эмульсии. Это позволяет достичь заявляемого технического результата.
Способ лечения ЭА-ДГК (N-докозагексаеноил-этаноламином) нейропатической боли осуществляли следующим образом.
Средства и методы исследования
Животные и хирургия
В работе использовали крыс-самцов линии Вистар (250±10 г, возраст 3 месяца). Крысы были получены из Национального научного центра морской биологии им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук (ННЦМБ ДВО РАН), Владивосток, Россия. Животных содержали по три-четыре в клетке с неограниченным доступом к корму и воде с 12-часовом циклом свет/темнота. Температура (23±2°C) и влажность (55±15%) были постоянными. Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике животных при Национальном научном центре морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН (№ 1/2020) в соответствии с международными нормами Европейской директивы 2010/63/EU и этические руководящие принципы для изучения экспериментальной боли у находящихся в сознании животных Международной ассоциации изучения боли. Животных анестезировали изофлураном с использованием вапорайзера для анестезии грызунов (VetFlo, Kent Scientific Corporation, США). Моделирование нейропатической боли проводили путем наложения трех лигатур (шелк, Ethicon, США) на расстоянии 1-2 мм на седалищный нерв правой задней лапы крысы (Bennett G.J.; Xie Y.K. «A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man». Pain 1988, 33, 87–107).
Получение N-докозагексаенил-этаноламина (ЭА-ДГК)
ЭА-ДГК получали из продуктов промышленной переработки дальневосточного кальмара, выловленного в Беринговом море или из жиров промысловых морских рыб (тихоокеанская сельдь, сардина иваси, скумбрия, сайра и др.). Концентрат ПНЖК получали по методике Ермоленко с соавт. (Ermolenko E.; Latyshev N.; Sultanov R.; Kasyanov S. «Technological approach of 1-O-alkyl-sn-glycerols separation from Berryteuthis magister squid liver oil». Food Sci. Technol. 2016, 53, 1722–1726; Патент РФ № 1581737 «Способ получения концентрата этиловых эфиров эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот», МПК С11С 1/00, С11В 7/00, опубл. 21.05.1993). Далее, концентрат ПНЖК превращали в этиловые эфиры, затем обрабатывали этаноламином для получения этаноламидов жирных кислот (Патент РФ № 2412157С1 «Способ получения этаноламидов полиненасыщенных жирных кислот», МПК С07С 231/02, С07С 233/20, опубл. 09.09.2009). ВЭЖХ этаноламидов ПНЖК выполняли на хроматографе Shimadzu LC-8A (Shimadzu, Япония) с детектором UV/VIS SPD-20A (205 нм). Разделение проводили на препаративной колонке с обращенной фазой Supelco Discovery HS С-18 (Bellefonte, PA); размер частиц 10 мкм, внутренний диаметр 250Ч50 мм. Использовали изократическое элюирование системой этанол/вода (70:30, об./об.). Скорость элюирования 50 мл/мин. Фракции, содержащие этаноламид ДГК, собирали, упаривали в вакууме и анализировали с помощью газовой хроматографии (ГХ) и масс-спектрометрии ГХ (ГХ-МС). ЭА-ДГК представлял собой светло-желтую масляную жидкость с невыраженным запахом при комнатной температуре. Чистота 99.4% (фиг. 1).
Для определения истинного состава триметилсилильного производного (TMS-NAE или TMS-ЭА-ЖК, триметилильных производных жирных кислот) этаноламида жирной кислоты использовали методы ГХ и ГХ-МС. Для получения TMS-производных 50 мкл N, O-бис-(триметилсилил)-трифторацетамида (BSTFA) добавляли к 1 мг этаноламидов жирных кислот с последующим нагреванием до 60°C в течение 1 часа в атмосфере аргона. Затем добавляли 1 мл гексана и вводили по 1 мкл каждой силилированной фракции в систему ГХ. Для определения состава ТМС-АЭ-ЖК использовали хроматограф Shimadzu GC-2010 с капиллярной колонкой Supelco SL-5 ms 30 мм × 0.25 мм внутренний диаметр (США) и пламенно-ионизационный детектор (Япония). Компоненты смеси разделяли при определенных условиях: (1) начальная температура 180°C; (2) скорость нагревания от 2°C / мин до 260°C; и (3) температура поддерживалась в течение 35 мин. Температура инжектора и детектора была одинаковой и составляла 260°C. Для идентификации структуры TMS-NAE использовали GC-MS. Электронные спектры ударов регистрировали на приборе Shimadzu TQ-8040 (Япония) с колонкой Supelco SL-5 ms (США) при 70 эВ. Использовали те же температурные условия, что и при газовой хроматографии
Терапия
ЭА-ДГК вводили крысам подкожно в виде водо-жировой эмульсии. Эмульсию готовили смешиванием ЭА-ДГК с водой до конечной концентрации 25 мг/мл при постоянном встряхивании с использованием встряхивающего устройства Multi-Vortex (V-32, Biosan, Латвия). Полученную эмульсию вводили крысам подкожно в таком количестве, чтобы обеспечить дозу ЭА-ДГК 4 мг/кг. Период введения составлял пять недель ежедневно со дня проведения операции.
Животные (n=60) были случайным образом разделены на четыре группы:
1 группа
«ЛО» (n=15), включала ложнооперированных животных, обработанных носителем (вода);
2 группа
«ЛО+ЭА-ДГК» (n=15), включала ложнооперированных животных, получавших ЭА-ДГК;
3 группа
«Боль» (n=15), включала животных, которым вводили носитель (вода), с повреждением седалищного нерва;
4 группа
«Боль+ЭА-ДГК» (n=15), состояла из животных с повреждением седалищного нерва, получавших ЭА-ДГК. Крыс выводили из эксперимента через 35 дней после операции в день последнего введения ЭА-ДГК или носителя.
Статистический анализ данных
Полученные данные выражены как среднее значение ± SEM. Нормальность данных оценивали с помощью теста Шапиро–Уилка. Данные, полученные с помощью поведенческих тестов, иммуногистохимии, ELISA и липидного анализа, сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующим повторным тестом множественного сравнения Тьюки. В работе использовали двухфакторный дисперсионный анализ для оценки величины каждого эффекта, а именно лечения ЭА-ДГК («лечение») и лигирования седалищного нерва («хирургия»). Различия считались статистически значимыми при p<0.05. Все статистические тесты были выполнены с использованием программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft, Талса, Оклахома-сити, США) и GraphPad prism 4 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:
на фиг. 1 – Химическая структура N-докозагексаеноил-этаноламина (ЭА-ДГК).
на фиг. 2 – Влияние нейропатической боли и терапии ЭА-ДГК на поведение животных. (А) Гипералгезия (время до одергивания хвоста). (Б) Двигательная активность (количество пересеченных квадратов в тесте «открытое поле»). (В) Рабочая память (частота правильного чередования рукавов в Y-лабиринте, %). (Г) Двигательная активность (количество входов в рукава Y-образного лабиринт). (Д) Тревожность (время пребывания в закрытых рукавах крестообразного лабиринта, %). (Е) Долговременная память (латентный период в тесте пассивного избегания, сек). Данные представляют собой средние значения±SEM, n=10 (количество животных в группе), *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
на фиг. 3 – Влияние нейротравмы и терапии ЭА-ДГК на активность микроглии гиппокампа. (А) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания Iba-1. Масштабная линейка: 100 мкм. (Б) Гистограмма, демонстрирующая % Iba1-позитивного окрашивания в областях гиппокампа CA1, CA3 и DG после операции и терапии ЭА-ДГК. Данные представляют собой среднее значение±SEM, n=40 (количество срезов), *p<0.05, **p<0.01. (В) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания CD86. Масштабная линейка: 100 мкм. (Г) Гистограмма, демонстрирующая % CD86-позитивного окрашивания в областях гиппокампа CA1, CA3 и DG после операции и терапии ЭДГК. Среднее значение±SEM, n=40 (количество срезов), *p<0.05, **p<0.01. (Д) Эффекты влияния нейротравмы и терапии ЭДГК на микроглиальный маркер гиппокампа и экспрессию цитокинов, измеренные с помощью ИФА; гистограммы экспрессии Iba-1, CD86, IL1β и IL6 в гиппокампе. Среднее значение±SEM, n=5 на группу (количество животных), *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
на фиг. 4 – Эффект влияния нейротравмы и терапии ЭА-ДГК на пролиферацию нейрогенез в гиппокампе. (А) Репрезентативные изображения окрашивания PCNA-позитивных клеток. Масштабная линейка: 100 мкм. (Б) Гистограмма, показывающая изменение количества PCNA+ клеток в субгранулярной зоне зубчатой извилины (DG SGZ). (В) Репрезентативные изображения окрашивания DCX-позитивных нейронов. Масштабная линейка: 100 мкм. (Г) Гистограмма, показывающая изменения количества незрелых нейронов в DG SGZ. Среднее значение ± SEM, n=20 (количество срезов в группе), *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
на фиг. 5 – Результаты липидного анализа LC-MS всего мозга крысы после нейротравмы и терапии ЭА-ДГК. (А) Уровень различных N-ацилэтаноламинов выражен в нМ/мл. (Б) Содержание в мозге основных жирных кислот и DMA (% от общего количества жирных кислот и DMA). Среднее значение ± SEM, n=5 (количество животных в группе), *p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001.
Эксперимент 1. Изучение влияния ЭА-ДГК на связанные с нейропатической болью сенсорные и поведенческие изменения.
Болевая чувствительность
. Для оценки антиноцицептивной активности ЭА-ДГК использовали тест «отдергивания хвоста» на аппарате LE5022 (Panlab, Барселона, Испания). Для этого хвост помещали на нагревательный элемент, точка нагрева которого располагалась на расстоянии 5–8 см от кончика хвоста. Точка отсечения была установлена на 20 с, после чего нагревание прекращалось, для предотвращения повреждения тканей. Регистрировали время реакции животного, выраженное отдергиванием хвоста.
В группе «Боль» через две-четыре недели после операции наблюдались процессы гипералгезии. В то же время введение ЭА-ДГК предотвратило развитие тепловой гипералгезии у животных с нейропатической болью на вторую и третью неделю после операции (фиг. 2А).
Двигательная активность.
Двигательную активность животных оценивали с помощью Y-лабиринта. Y-образный лабиринт представлял собой устройство из непрозрачного акрилового стекла с тремя равными рукавами (длина 50 см, высота 32 см и ширина 16 см). Каждую крысу помещали в центр лабиринта на 5 мин, чтобы она могла свободно перемещаться и исследовать окружающее пространство. Вход в рукав засчитывали, когда животное входило в него всеми четырьмя лапами. Для регистрации уровня двигательной активности оценивалось общее количество заходов каждой крысы в рукава лабиринта. Также для оценки общей двигательной активности использовали тестирование в открытом поле. Каждое животное помещали в центр квадратной арены из плексигласа (ширина: 50 см; высота: 40 см) на 5 мин. Арена была разделена на 25 квадратов. Поведение животного регистрировали с помощью видеокамеры, установленной над устройством, и подсчитывали количество пересеченных квадратов. Тесты проводили еженедельно на протяжении 5 недель эксперимента.
Исследование двигательной активности в Y-лабиринте выявило общее увеличение двигательной активности у животных, получающих ЭА-ДГК в сравнении с животными, получающими носитель. Разница в количестве заходов между животными группы «ЛО» и «Боль» не наблюдалась в течение всего эксперимента (фиг. 2Г). Исследование в открытом поле также показало, что лечение ЭА-ДГК значительно индуцировало усиление двигательной активности у животных, получавших терапию, по сравнению с животным в группе «Боль» и «ЛО» на всех неделях эксперимента. Более того, у животных с болью, получающих ЭА-ДГК, двигательная активность была значительно выше, чем у животных с нейропатической болью, получающих носитель (вода) (фиг. 2Б). Увеличение двигательной активности у всех животных, получавших терапию, мы связываем с обезболивающим эффектом ЭА-ДГК. Но поскольку ранее было показано, что ЭА-ДГК не оказывает прямого действия на каннабиноидные рецепторы CB1, его анальгетическая активность не может быть обусловлена их стимуляцией. Это подтверждается в нашем исследовании тем фактом, что введение ЭА-ДГК увеличивает двигательную активность, а ранее было доказано, что стимуляция рецепторов CB1 в головном мозге снижает подвижность (Cosenza M.; Gifford A.N.; Gatley S. et al. «Locomotor activity and occupancy of brain cannabinoid CB1 receptors by the antagonist/inverse agonist AM281». Synapse 2000, 38, 477–482; Bass C.E.; Griffin G.; Grier M.; Mahadevan A.; Razdan R.K.; Martin B.R. «SR-141716A-induced stimulation of locomotor activity: A structure–activity relationship study». Pharmacol. Biochem. Behav. 2002, 74, 31–40). В данном случае анальгетические и когнитивные эффекты потенциально были основаны на повышенной концентрации анандамида, который, напротив, может стимулировать рецепторы CB1, за счет чего развивается анальгетическое действие. Это согласуется с нашими результатами, согласно которым введение ЭА-ДГК приводит к увеличению концентрации анандамида в головном мозге крыс.
Рабочая память.
Оценка рабочей памяти у крыс проводилась с помощью теста спонтанного чередования в Y-лабиринте. Эксперимент проводился одновременно с изучением двигательной активности. Для оценки уровня рабочей памяти анализировалось количество «правильных» чередований рукавов (последовательный выбор каждой из трех ветвей без повторных входов). Оценивалось общее количество входов (N) и количество «правильных» троек (M). Уровень сохранности рабочей памяти рассчитывался по следующей формуле: R (%) = Mx100/(N-2).
Исследование в Y-лабиринте показало снижение рабочей памяти у животных с нейропатической болью на 2 и 3 неделях после операции. У животных, получавших синаптамид, показатели рабочей памяти существенно не отличались от группы ложнооперированных животных на тех же сроках после операции (фиг. 2В).
Тревожность.
Исследования тревожности животных проводили с использованием приподнятого крестообразного лабиринта (Panlab, Барселона, Испания). Исследование было основано на тенденции избегать открытых пространств с повышенной тревожностью. Лабиринт представлял собой устройство, состоящее из двух открытых рукавов (30×5 см, стены высотой 0.25 см) и двух закрытых рукавов (30×5 см, стены высотой 15 см), выходящих из центральной площадки (5×5 см), расположенных друг напротив друга. Животное помещали в центр лабиринта лицом к открытому рукаву и оставляли в аппарате на 5 мин, при этом его поведение регистрировали с помощью видеокамеры, расположенной над лабиринтом. Время нахождения в открытом и закрытом рукавах и в центральной зоне регистрировалось автоматически.
Исследование уровня тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте не выявило существенных различий между группами «ЛО» и «Боль». Однако мы обнаружили в группах, получавших ЭF-ДГК, значительное снижение процента времени, проведенного в закрытых рукавах лабиринта, что указывало на анксиолитическую активность соединения. В то же время ложнооперированные животные, получавшие лечение ЭF-ДГК, предпочитали находиться в центре лабиринта, а животные из группы «Боль+ЭА-ДГК» проводили больше времени, изучая открытые рукава (фиг. 2Д).
Долгосрочная память.
Для оценки влияния хронической нейропатической боли и лечения ЭА-ДГК на долговременную память применялся тест пассивного избегания (Ishiyama T.; Tokuda K.; Ishibashi T.; Ito A.; Toma S.; Ohno Y. «Lurasidone (SM-13496), a novel atypical antipsychotic drug, reverses MK-801-induced impairment of learning and memory in the rat passive-avoidance test». Eur. J. Pharmacol. 2007, 572, 160–170). Испытательная установка состояла из светлой и темной камер, разделенных раздвижной дверцей. Во время фазы обучения крыс помещали в светлую камеру и позволяли свободно передвигаться в течение 60 с, прежде чем открыть раздвижную дверь. Когда животное входило в темную камеру, дверь закрывалась, и через 2 с производился электрический удар (0.3 мА). Второй этап тестирования проводился через 24 ч после тренировки, но без электрошока. Чтобы оценить долговременную память, мы измерили задержку до входа животных в темную камеру (step-through latency).
Поведенческое тестирование выявило гиппокамп-зависимое нарушение памяти у крыс с перевязанным седалищным нервом. Показатели долгосрочной памяти в группе «Боль» резко снижались по сравнению с группой «ЛО». Терапия ЭА-ДГК предотвращала контекстно-зависимое ухудшение долговременной памяти у крыс с нейропатической болью. В группе «Боль+ЭА-ДГК» не было значительных различий с ложнооперированными животными (фиг. 2Е).
Эксперимент 2. Иммунологическое исследование влияния ЭА-ДГК на опосредованные нейропатической болью изменения активности микроглии в гиппокампе.
Образцы для последующего гистологического анализа были собраны на 35-е сутки после операции. Животных анестезировали с помощью изофлурана с использованием вапорайзера для анестезии грызунов (VetFlo, Kent Scientific Corporation, США). Перед проведением перфузии делали разрез стенки ушка правого предсердия. В левый желудочек вводили фосфатный буфер (рН=7.2), после чего проводили перфузию забуференным 10% формалином, приготовленным на 0.1М фосфатном буфере (рН=7.2). Далее проводили фиксацию в течении 16 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатным буфером (рН=7.2) образцы ткани помещали в парафиновые блоки и получали срезы толщиной 10 мкм с использованием ротационного микротома Leica RM 2245 (Leica Biosystems, США). После депарафинирования парафиновые срезы гиппокампа инкубировали в 3% перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазной активности перед иммуногистохимическим окрашиванием. После 3 промывок в 0.1М фосфатном буфере (рН=7.2) срезы обрабатывали в течение 60 мин в 2% растворе бычьего сывороточного альбумина (sc-2323; Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, США) и 0.25% растворе Тритон Х-100 (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Для оценки активности микроглии в гиппокампе иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием кроличьих поликлональных антител против Iba-1 (1:500, ab108539) и кроличьих моноклональных антител против CD86 (1:1000, ab53004) (Abcam, Cambridge, MA, США). Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (PI-1000, антикроличий; PI-2000, антимышиный), использовали в соответствии с рекомендациями производителя (1:100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, США). После промывки 0.1М фосфатным буфером (рН 7.2) срезы обрабатывали в течение 5-10 минут хромогеном (DAB Plus; Abcam, США). Затем срезы промывали 0.1М фосфатным буфером (рН 7,2), обезвоживали и помещали в среду для заключения Dako (CS705; Dako, Carpinteria, CA, USA). Изображения были получены с использованием микроскопа Zeiss Axio Imager, оснащенного цветной видеокамерой AxioCam 503 и программным обеспечением AxioVision (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Изображения были сохранены в виде файлов TIFF с последующей обработкой и анализом с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США). Оценка Iba1- и CD86-специфической окрашенной области проводилась с использованием каждого шестого среза. Для этого изображения обрабатывались следующим образом: преобразование изображения в режим оттенков серого, вычитание фона и бинаризация. Затем рассчитывали площадь, занимаемую иммунопозитивной микроглией по Iba-1 и CD86 в областях CA1, CA3 и DG. Все измерения были выполнены оператором, который не знал идентичности срезов. Для определения концентраций белков Iba1, CD86, IL-6 и IL-1β в гиппокампе использовали иммуноферментный анализ (ИФА). Крыс анестезировали изофлураном с использованием испарителя для анестезии грызунов (VetFlo, Kent Scientific Corporation, США), и каждый гиппокамп быстро извлекали, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°C. Были использованы кит наборы ИФА для количественного определения Iba1 (NBP2-66675, NovusBio), CD86 (RAB0887-1KT, Sigma-Aldrich), IL-6 (ERA32RB, Invitrogen) и IL-1beta (BMS630, Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Для анализа использовали как правый, так и левый гиппокамп. Буфер для гомогенизации состоял из 100 мМ Трис (pH 7.4), 150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100 и 0.5% дезоксихолата натрия с коктейлем ингибиторов протеаз (cOmplete, Sigma-Aldrich). Набор BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) использовали для определения концентрации белка. Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре iMark (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм.
Изучая влияние периферической нейротравмы и терапии ЭА-ДГК на активность микроглии в гиппокампе мы обнаружили увеличение Iba-1-положительного иммунного окрашивания при нейропатической боли в зубчатой извилине гиппокампа, в зоне CA1 и области CA3. Более того, площадь Iba-1-положительного иммуноокрашивания в группе животных с нейропатической болью, получающих ЭА-ДГК существенно не отличалась от таковой в группах ложнооперированных животных, получавших ЭА-ДГК и носитель (фиг. 3А, Б). CD86-иммунопозитивное окрашивание в зубчатой извилине выявило увеличение в группе «Боль», при этом в группе «Боль+ЭА-ДГК» не наблюдалось увеличения CD86-иммунопозитивного окрашивания. Однако в области CA3 введение ЭА-ДГК не предотвращало увеличения окрашивания CD86-иммунопозитивной области микроглии. Окрашивание CD86 в группе «Боль+ЭА-ДГК» оказалось на уровне группы «Боль». В области CA1 изменений иммунореактивности CD86 не наблюдалось ни при боли, ни при терапии (фиг. В, Г). Иммуногистохимические данные об активности микроглии были подтверждены данными, полученными с помощью ИФА. Было показано, что концентрация Iba-1 в гиппокампе животных с нейропатической болью, которым вводили носитель, была значительно увеличена по сравнению с группой ложнооперированных животных. У крыс с болью, получающих ЭА-ДГК, концентрация Iba-1 была значительно ниже, чем в группе «Боль». Аналогичная ситуация наблюдалась и для накопления белка CD86. У животных с нейропатической болью, получавших носитель, количество CD86 было значительно выше, чем в группе животных с болью, получавших ЭА-ДГК. ИФА цитокинов в ткани гиппокампа показал увеличение продукции провоспалительного цитокина IL-1β в группе «Боль» по сравнению с группой «Боль+ЭА-ДГК». Кроме того, было показано увеличение концентрации IL-6 в группе «Боль» по сравнению с группой «Боль+ЭА-ДГК» (фиг. 3Д). Изучение продукции IL-10 не выявило существенных различий между группами (данные не показаны).
Эксперимент 3. Исследование влияния ЭА-ДГК на опосредованные нейропатической болью изменения активности пролиферации и нейрогенеза в зубчатой извилине гиппокампа.
На гистологическом материале, который использовали для окрашивания микроглии проведена оценка интенсивности нейрогенеза, количество новообразованных нейронов в субгранулярной зоне (SGZ) зубчатой извилины (DG) определяли с использованием антител к даблкортину (anti-DCX) (1:500, ab18723; Abcam). Пролиферативную активность в DG SGZ определяли иммуногистохимическим окрашиванием ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) с использованием мышиных моноклональных антител против PCNA (1: 500, ab29) (Abcam). Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (PI-1000, антикроличий; PI-2000, антимышиный), использовали в соответствии с рекомендациями производителя (1: 100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, США). После промывки 0.1М фосфатным буфером (рН 7.2) срезы обрабатывали в течение 5-10 минут хромогеном (DAB Plus; Abcam, США). Затем срезы промывали 0.1М фосфатным буфером (рН 7,2), обезвоживали и помещали в среду для заключения Dako (CS705; Dako, Carpinteria, CA, USA). Изображения были получены с использованием микроскопа Zeiss Axio Imager, оснащенного цветной видеокамерой AxioCam 503 и программным обеспечением AxioVision (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Изображения были сохранены в виде файлов TIFF с последующей обработкой и анализом с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США). Каждый шестой срез использовался для количественного определения DCX и PCNA. Иммунопозитивные клетки подсчитывались только в пределах DG SGZ. В расчетах использовались только целые клетки, содержащие видимые ядра. Все измерения были выполнены оператором, который не знал идентичности срезов.
Изучение процессов пролиферации и нейрогенеза в гиппокампе проводилось путем иммуногистохимического обнаружения ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и даблкортина (маркер новообразованных нейронов). При подсчете количества PCNA- и DCX-иммунопозитивных клеток учитывались только клетки, расположенные строго в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа. Установлено, что у животных с нейропатической болью, получающих носитель, количество PCNA-иммунопозитивных нейронов было значительно снижено по сравнению с группами «ЛО» и «ЛО+ЭА-ДГК», тогда как в группе «Боль+ЭА-ДГК» среднее количество иммунопозитивных нейронов было значительно выше, чем в группе «Боль» (фиг. 4А, Б). Аналогичный результат наблюдался при анализе иммуногистохимического окрашивания даблкортина. Мы обнаружили снижение плотности даблкортин-положительных нейронов в DG SGZ у крыс с нейропатией. В группе «Боль+ЭА-ДГК» средняя плотность DCX-положительных нейронов была значительно выше, чем в группе «Боль» (фиг. 4В, Г).
Учитывая, что активация микроглии и выработка провоспалительных цитокинов отрицательно влияют на гиппокампозависимую память, наиболее вероятно, что в основе наблюдаемых эффектов лежит противовоспалительная активность ЭА-ДГК. Кроме того, выраженная противовоспалительная активность играет важную роль в поддержании нормального уровня нейрогенеза гиппокампа, нарушенного нейропатической болью. Хроническая нейропатическая боль способствует долговременной поведенческой адаптации, связанной с нейровоспалительным сигналом и нарушением нейропластичности. Недавно стало известно, что повреждение периферической нервной системы приводит к нарушению нейрональной пластичности и изменению активности микроглии и астроцитов, что, в свою очередь, приводит к дисбалансу продукции цитокинов и центральной сенсибилизации (Clark A.K.; Old E.A.; Malcangio M. «Neuropathic pain and cytokines: Current perspectives». J. Pain Res. 2013, 6, 803–814). В нашем исследовании нейровоспаление, вызванное болью, нарушило нейрогенез гиппокампа и способствовало когнитивному и аффективному дефициту. Введение ЭДГК в течение пяти недель позволило нам поддерживать нормальный уровень пролиферативной активности в DG SGZ. Мы предполагаем, что наблюдаемые фармакологические эффекты во многом обусловлены выраженной противовоспалительной активностью ЭА-ДГК. Известно, что провоспалительные цитокины ингибируют нейрогенез, а противовоспалительные, наоборот, стимулируют пролиферацию нейронов гиппокампа и обеспечивают их выживание (Goshen I.; Kreisel T.; Ben-Menachem-Zidon O. et al. «Brain interleukin-1 mediates chronic stress-induced depression in mice via adrenocortical activation and hippocampal neurogenesis suppression». Mol. Psychiatry 2008, 13, 717–728; Zunszain P.A.; Anacker C.; Cattaneo A.; Carvalho L.A., Pariante C.M. «Glucocorticoids, cytokines and brain abnormalities in depression». Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 2011, 35, 722–729; Perez-Asensio F.J.;  Planas A.M.; Pozas E. «Interleukin-10 regulates progenitor differentiation and modulates neurogenesis in adult brain». J. Cell Sci. 2013, 126, 4208–4219; Pereira L.; Font-Nieves M.; Van den Haute C.; Baekelandt V.; Planas A.M.; Pozas E. «IL-10 regulates adult neurogenesis by modulating ERK and STAT3 activity». Front. Cell. Neurosci. 2015, 9, 57). Например, снижение пролиферативной активности нейронов в гиппокампе наблюдалось у трансгенных мышей с повышенной продукцией астроцитарного IL-6 (Vallieres L.; Campbell I.L.; Gage F.H.; Sawchenko P.E. «Reduced hippocampal neurogenesis in adult transgenic mice with chronic astrocytic production of interleukin-6». J. Neurosci. 2002, 22, 486–492). И если нарушение рабочей памяти при нейропатической боли может быть следствием нейровоспаления (Chen J.; Buchanan J.B.; Sparkman N.L.; Godbout J.P.; Freund G.G.; Johnson R.W. «Neuroinflammation and disruption in working memory in aged mice after acute stimulation of the peripheral innate immune system». Brain Behav. Immun. 2008, 22, 301–311), то дефицит ассоциативного эмоционального обучения долговременной памяти, который мы идентифицировали в тесте пассивного избегания, вероятно, является результатом нарушения нейрогенеза гиппокампа. Мы делаем такой вывод на основании исследований, подтверждающих участие нарушения нейрогенеза гиппокампа в развитии гиппокампозависимых нарушений контекстного обучения (Jaako-Movits K.; Zharkovsky T.; Romantchik O. et al. «Developmental lead exposure impairs contextual fear conditioning and reduces adult hippocampal neurogenesis in the rat brain». Int. J. Dev. Neurosci. 2005, 23, 627–635; Hernandez-Rabaza V.; Llorens-Martin M.; Velázquez-Sánchez C. et al. «Inhibition of adult hippocampal neurogenesis disrupts contextual learning but spares spatial working memory, long-term conditional rule retention and spatial reversal». Neuroscience 2009, 159, 59–68; Yang M.; Kim J.S.; Song M.S. et al. «Cyclophosphamide impairs hippocampus-dependent learning and memory in adult mice: Possible involvement of hippocampal neurogenesis in chemotherapy-induced memory deficits». Neurobiol. Learn. Mem. 2010, 93, 487–494). Специфический для гиппокампа дефицит контекстуальной памяти (Mutso A.A.; Radzicki D.; Baliki M.N. et al «Abnormalities in hippocampal functioning with persistent pain». J. Neurosci. 2012, 32, 5747–5756) подтверждает участие зубчатой извилины гиппокампа в обработке и передаче болевых импульсов. По нашим данным, введение ЭА-ДГК предотвращает нарушение длительного контекстуального обучения гиппокампа и снижает активность CD86-позитивной (провоспалительной M1) микроглии в DG. Данное обстоятельство предполагает связь между активацией микроглии в DG, снижением нейрогенеза в гиппокампе и нарушением гиппокамп-зависимой памяти. В то же время через пять недель после операции мы не наблюдали увеличения активности CD86-позитивной микроглии в области гиппокампа CA1, что может объяснить восстановление пространственной рабочей памяти, поскольку функционирование этого типа памяти связано с областью CA1 (Murray A.J.; Sauer J.F.; Riedel G. et al. «Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory». Nat. Neurosci. 2011, 14, 297–299; Zhang X.H.; Liu S.S.; Yi F.; Zhuo M.; Li B.M. «Delay-dependent impairment of spatial working memory with inhibition of NR2B-containing NMDA receptors in hippocampal CA1 region of rats». Mol. Brain 2013, 6, 13). Нарушение рабочей памяти, вызванное нейропатической болью, и лежащие в основе морфологические изменения в дендритном дереве пирамидных нейронов CA1, вероятно, связаны с проекциями аксонов из III слоя медиальной энторинальной коры в область гиппокампа CA1. Входы из III слоя энторинальной коры в гиппокамп, как известно, играют важную роль в задачах пространственной рабочей памяти (Suh J.; Rivest A.J.; Nakashiba T.; Tominaga T.; Tonegawa S. «Entorhinal cortex layer III input to the hippocampus is crucial for temporal association memory». Science 2011, 334, 1415–1420; Kitamura T.; Macdonald C.J.; Tonegawa S. «Entorhinal–hippocampal neuronal circuits bridge temporally discontiguous events». Learn. Mem. 2015, 22, 438–443). Этот входной путь, а также аксоны, идущие от II слоя энторинальной коры к дендритам DG, являются основным входным путем информации о боли в гиппокамп (Liu M.G.; Chen J. «Roles of the hippocampal formation in pain information processing». Neurosci. Bull. 2009, 25, 237–266). Повышенное иммуноокрашивание Iba-1-позитивной микроглии в области CA1 может косвенно указывать на активацию противовоспалительной микроглии M2, секретирующей нейропротекторные факторы и способствующей нормальному функционированию нейронов в этой области, что приводит к восстановлению рабочей памяти у животных с перевязанным седалищным нервом. Кроме того, известно, что область CA1 гиппокампа участвует в тревожно-подобном поведении, изменяя экспрессию GluR1 в ответ на различные внешние раздражители (Xiang X.; Huang W.; Haile C.N.; Kosten T.A. «Hippocampal GluR1 associates with behavior in the elevated plus maze and shows sex differences». Behav. Brain Res. 2011, 222, 326–331). Отсутствие повышенной тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте у животных, получающих ЭА-ДГК, в наших экспериментах также подчеркивает взаимосвязь между процессами нейровоспаления в области CA1 и их функциональной активностью, указывая на анксиолитическую активность ЭА-ДГК. В то же время мы наблюдали усиление иммуноокрашивания CD86 в области гиппокампа CA3, в то время как введение ЭА-ДГК не уменьшало активность провоспалительной микроглии в данной области через пять недель после операции. Учитывая, что область СА3 наиболее восприимчива к изменениям при различных стрессовых условиях (McEwen B.S.; Nasca C.; Gray J.D. «Stress effects on neuronal structure: Hippocampus, amygdala, and prefrontal cortex». Neuropsychopharmacology 2016, 41, 3–23; Marrocco J.; Gray J.D.; Kogan J.F. et al. «Early life stress restricts translational reactivity in CA3 neurons associated with altered stress responses in adulthood». Front. Behav. Neurosci. 2019, 13, 157), активация микроглии может в этом случае быть не только следствием нейропатической боли, но также следствием хронического стресса, связанного с гипоталамо-гипофизарным синдромом, активацией оси надпочечников и развитием дезадаптивного ответа (Ulrich-Lai Y.M.; Figueiredo H.F.; Ostrander M.M. et al. «Chronic stress induces adrenal hyperplasia and hypertrophy in a subregion-specific manner». Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2006, 291, E965–E973). В этом случае введение ЭА-ДГК снижает интенсивность этих изменений и не позволяет им приводить к фатальным структурным аномалиям дендритного древа нейронов и нарушению когнитивных функций экспериментальных животных.
Эксперимент 4. Изучение влияния ЭА-ДГК на опосредованные нейропатической болью изменения липидного состава головного мозга.
0
3
2
Для анализа липидов была взята дополнительная группа из 20-ти животных. Для анализа липидов животных умерщвляли изофлураном с использованием испарителя для анестезии грызуров (VetFlo, Kent Scientific Corporation, США), и каждый мозг быстро извлекали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70C до использования. В замороженный мозг крысы добавляли внутренний стандарт ЭА-22:0 (этаноламид насыщенной жирной кислоты с 20-ю атомами) в концентрации 0.1 нМ с последующей экстракцией липидов по методу Блая и Дайера (Bligh E.G.; Dyer W.J. «A rapid method of total lipid extraction and purification». Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911–917). Конечный липидный остаток восстанавливали в 1 мл ледяного CHCl, продували аргоном и хранили при -80 °C до проведения жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Анализ этаноламидов жирных кислот (ЭА-ЖК) методом ЖХ-МС был проведен с помощью аналитической колонки Ascentis C18 (2.1 мм × 100 мм × 3 микрон, Supelco, США) и LC-MS 8060 (Shimadzu, Япония), оснащенной источником ионизации электрораспылением с подогревом при атмосферном давлении в режим положительной полярности. Смесь анализировали с помощью мониторинга множественных реакций (MRM). Параметры источника ионов задавались следующие: температура интерфейса 380°C; температура линии десольватации 250°C; расход распыляющего газа (N2) 3 л/мин; расход осушающего газа (N) 3 л/мин; расход греющего газа (сухой воздух) 17 л/мин. Энергия столкновения была оптимизирована для каждого соединения индивидуально. Молекулярный ион и фрагмент для каждого измеренного соединения были следующими: 348→62 для АЭ-АК (этаноламид арахидоновой кислоты), 372→62 для ЭА-ДГК (этаноламид докозагексаеновой кислоты), 326→62 для ЭA-ОК (этаноламид олеиновой кислоты), 300→62 для ЭА-ПК (этаноламид пальмитиновой кислоты), 328→62 для ЭА-СК (этаноламид стеаридоновой кислоты) и 384→62 для внутреннего стандарт (ЭА-22:0). Количественная оценка каждого этаноламида жирной кислоты в образце ткани была достигнута с использованием LabSolution (Shimadzu) с последующим сравнением площади пика с площадью пика внутреннего стандарта. Значения выражены в нМ ЭА-ЖК/г влажной ткани.
Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) и диметилацетали (ДМА) из липидов головного мозга крыс получали по методике Карро и Дубака (Carreau J.P.; Dubacq J.P. «Adaptation of a macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts». J. Chromatogr. А 1978, 151, 384–390). α, β-ненасыщенный эфир в молекулах плазмалогена превращался в ДМА соответствующего альдегида во время переэтерификации, относительное количество плазмалогена таким образом отражалось в соотношении между альдегидом 18:0 и стеариновой кислотой, а также в соотношении между 16:0 альдегидом и пальмитиновой кислотой (Bjorkhem I.; Sisfontes L.; Bostrom B.; Kase B.F.; Blomstrand R. «Simple diagnosis of the Zellweger syndrome by gas-liquid chromatography of dimethyl acetals». J. Lipid Res. 1986, 27, 786–791). Анализ МЭЖК и ДМА проводили с помощью газовой хроматографии на хроматографе Shimadzu GC-2010 (Shimadzu, Киото, Япония) с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой 30 м × 0.25 мм внутренний диаметр Supelcowax 10 (Беллефонте, Пенсильвания). Анализ проводился при следующих условиях: температура колонки 190°С, температура инжектора и детектора 240°C. В качестве газа-носителя использовался гелий. Пики метиловых эфиров жирных кислот идентифицировали по временам удерживания отдельных сложных эфиров жирных кислот в сравнении с аутентичными стандартами их эквивалентных чисел длины углерода. Идентификацию ДМА проводили путем сравнения времен удерживания со стандартами 16:0-DMA и 18:0-DMA (Sigma-Aldrich, США). ГХ-МС использовали для подтверждения структур МЭЖК и ДМА. Электронные спектры удара записывали на приборе Shimadzu TQ-8040 (Япония) с колонкой Supelco SL-5 ms (США) при 70 эВ при определенных условиях: (1) начальная температура 160°C; (2) скорость нагрева от 2°C/мин до 240°C; и (3) поддержании температуры в течение 35 мин.
Анализ липидов выявил повышение концентрации ЭА-ПК (этаноламид пальмитиновой кислоты) в головном мозге животных получающих ЭА-ДГК, как у ложнооперированных животных, так и у крыс с нейротравмой. Также наблюдалось увеличение концентрации ЭA-ОК (этаноламид олеиновой кислоты) в группе с терапией по сравнению с группой «ЛО». Мы обнаружили влияние травмы и лечения на концентрацию ЭА-АК (этаноламид арахидоновой кислоты) в мозге, так терапия ЭА-ДГК увеличивает его концентрацию в несколько раз в мозге у крыс. Также мы обнаружили, что сама травма также увеличивает концентрацию ЭА-АК даже без введения ЭА-ДГК. Интересно, что при введении ЭА-ДГК крысам в течение пяти недель, концентрация самого липида в головном мозге существенно не увеличивается (фиг. 5А).
Кроме того, мы определили влияние нейропатической боли и терапии ЭА-ДГК на состав жирных кислот в головном мозге крыс. В частности, было показано, что введение ЭА-ДГК предотвращает опосредованное болью снижение уровня 16:0-DМA и 18:0-DMA. ЭА-ДГК предотвращало индуцированное болью снижение содержания плазмалогенных непрямых маркеров 1,1-диметоксигексадекан (16:0-DMA)/пальмитат (C16:0) и 1,1-(18:0-DMA)/октадеканоат (C18:0) (фиг. 5Б).
Поддержание нормального уровня плазмалогенов (Pls) в головном мозге играет важную роль в снижении активности микроглии во время введения ЭА-ДГК. Известно, что плазмалогены содержат насыщенную жирную кислоту со связью сложного винилового эфира в положении sn-1, а также полиненасыщенную жирную кислоту (например, арахидоновую или докозагексаеновую кислоту) в положении sn-2, которая высвобождается Pls-селективной фосфолипазой А2 (PLA2) (Farooqui A.A. «Studies on plasmalogen-selective phospholipase A 2 in brain». Mol. Neurobiol. 2010, 41, 267–273). В нашем исследовании нейровоспаление, вызванное периферической нейротравмой, привело к снижению содержания плазмалогенов в головном мозге, на что указывают количества диметилацеталей 16:0 и 18:0. Это снижение может быть связано с развитием окислительного стресса, вызванным процессом нейровоспаления, поскольку Pls-специфическая виниловая эфирная связь в положении sn-1 может быть повреждена окислителями, включая активные формы кислорода/азота (Engelmann M.G.; Redl C.V.; Nikol S. «Recurrent perivascular inflammation induced by lipopolysaccharide (endotoxin) results in the formation of atheromatous lesions in vivo». Lab. Investig. 2004, 84, 425–432). Кроме того, Pls-селективная фосфолипаза PLA2 (активность которой значительно повышается при воспалительных состояниях) может метаболизировать плазмалогены, снижая их содержание в головном мозге (Farooqui A.A. «Studies on plasmalogen-selective phospholipase A 2 in brain». Mol. Neurobiol. 2010, 41, 267–273). Недавно стало известно, что провоспалительные стимулы, стресс и старение подавляют экспрессию синтезирующего Pls фермента, Gnpat, что приводит к снижению уровня Pls (Hossain M.S.; Abe Y.; Ali F. et al. «Reduction of ether-type glycerophospholipids, plasmalogens, by NF-κB signal leading to microglial activation». J. Neurosci. 2017, 37, 4074–4092). Мы не наблюдали снижения уровня плазмалогенов у крыс, получающих ЭА-ДГК, что, с одной стороны, может быть следствием их противовоспалительной активности. В то же время мы также наблюдали увеличение общего содержания ДГК у животных с периферической нейротравмой, получающих как носитель, так и ЭА-ДГК. Согласно результатам ANOVA, основное влияние на общее содержание ДГК в головном мозге оказало наличие/отсутствие нейротравмы. Это может означать, что высвобождение ДГК во время гидролиза ЭА-ДГК не является основным механизмом противовоспалительной активности ЭА-ДГК, что подтверждается наблюдением гораздо более низкой биологической активности ДГК по сравнению с ЭА-ДГК (Kim H.Y., Spector A.A. «N-Docosahexaenoylethanolamine: A neurotrophic and neuroprotective metabolite of docosahexaenoic acid». Mol. Asp. Med. 2018, 64, 34–44). Ранее, эксперименты in vitro показали, что активность ЭА-ДГК не блокируется циклооксигеназой и липоксигеназой, а снижается в результате воздействия амидгидролазы жирных кислот, что также подтверждает гипотезу о том, что ЭА-ДГК является основным метаболитом, определяющим нейропротекторную активность ДГК (Park T.; Chen H.; Kevala K.; Lee J.W.; Kim H.Y. «N-Docosahexaenoylethanolamine ameliorates LPS-induced neuroinflammation via cAMP/PKA-dependent signaling). J. Neuroinflamm. 2016, 13, 1–5).
Заявляемый способ лечения нейропатической боли с помощью нового природного соединения, полученного из морских организмов позволяет практически полностью устранить нейропатическую боль при приеме препарата в течение 5-ти недель. Таким образом, предлагаемое нами использование N-докозагексаеноиламина в аспекте нейропатической боли является подтвержденным фактом и может быть применено при разработке новых лечебных композиций с повышенной фармакологической активностью.
Изобретение создано с использованием материалов, представленных в статье Tyrtyshnaia A.A., Egorova E.L., Starinets A.A., Ponomarenko A.I., Ermolenko E.V., Manzhulo I.V. N-Docosahexaenoylethanolamine attenuates neuroinflammation and improves hippocampal neurogenesis in rats with sciatic nerve chronic constriction injury // Marine drugs. 2020. Vol. 18(10). P. 516. Опубликована 15.10.2020.