Состав и антиоксидантные свойства ферментативного гидролизата мышечной ткани трепанга

УДК 573.6+664.951.7: 639.4

Состав и антиоксидантные свойства

ферментативного гидролизата мышечной ткани трепанга

Н. Н. Ковалев, д-р биол. наук, профессор, Ю. М. Позднякова, канд. техн. наук, А. Д. Перцева,

Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет

Ч. Тун, канд. техн. наук, профессор

Даляньский океанологический университет, г. Далянь, Китай

В последние годы все большее внимание уделяется разработке технологий получения биологически активных пищевых добавок. В их основу положена концепция так называемого позитивного питания, согласно которой предпочтение отдается функциональным или физиологически активным продуктам, содержащим ингредиенты, повышающие сопро-

тивляемость организма многим заболеваниям, способствующие улучшению физиологических процессов в организме человека, позволяющие долгое время сохранять активный образ жизни. В работах многих исследователей описаны способы выделения и исследования свойств вышеперечисленных соединений, а также перспективы использования голотурий для производства продуктов лечебного и профилактического назначения [1-5].

Ткани трепанга содержат богатый набор биологически активных веществ (БАВ), таких как сапонины, каротиноиды, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, коллаген и др. Перечисленные БАВ проявляют широкий спектр биологической активности [6-10].

Основным компонентом мускульного мешка трепанга является колла-

ген. Молекулярная масса коллагена, определенная методом седимен-тационного анализа, оценивается в 375 кДа, а молекулярный вес его мономера, по оценкам при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, составляет приблизительно 350 кДа [11].

Отмечено, что скармливание мышам в течение 30 дней мускульной ткани трепанга увеличивает время их плавания и синтез гликогена в печени мышей. При этом значительно снижалась выработка молочной кислоты. Исходя из описанных данных можно заключить, что трепанг проявляет заметное адаптогенное действие при месячном курсе приема в качестве пищевого продукта [12]. Согласно работе Ванг с соавторами [13] гидролизат желатина из мускульного мешка трепанга ^ИсИор^ ]ароп1сиБ) с молекулярной массой 0,7-1,7 кДа дозозависимо проявлял антиокси-дантную активность в отношении супероксид- и гидроксильных радикалов. Также обнаружено, что потребление сушеного трепанга является эффективным средством подавления симптомов артралгии [14, 15].

Таким образом, трепанг является перспективным объектом для создания биологически активных пищевых добавок и функциональных продуктов питания широкого спектра действия.

Ферментативные гидролизаты трепанга могут применяться как самостоятельные БАДы к пище, так и как компоненты рецептур пищевых продуктов лечебно-профилактического назначения для массового потребления в регионах с неблагополучными экологическими условиями.

Ранее нами были определены рациональные условия проведения ферментативного гидролиза мускульного мешка трепанга [16].

В качестве цели исследования было принято определение химического состава и антиокислительной активности ферментолизата из трепанга, полученного по разработанному нами способу.

Объектом исследования служил дальневосточный трепанг, вылов-

Таблица 2

Содержание углеводов и гексозаминов в ферментолизате тканей трепанга

и его фракциях

Таблица 1

Состав белков и гликозидов ферментолизата мышечной ткани трепанга

и его фракций

Белок, % Глико-зиды, мг /г

Образец Водорастворимый Солераство-римый Коллаген Пептиды, % от водорастворимого белка

Ферменто-лизат 32,1+1,2 31,9+0,9 29,4+1,3 75,7+3,02 2,0+0,1

Фракции:

>300 кДа 30,2+1,2 27,1+1,0 16,0+0,6 24,2+1,04 Н. о.*

100-300 кДа 38,4+1,3 36,6+1,6 7,9+0,3 74,2+2,8 2,0

< 100 кДа 38,3+1,4 35,1+1,4 5,5+0,2 80,1+3,4 1,6

* Н. о - не определяли.

Образцы Углеводы, % Гексозамины, %

Ферментолизат трепанга 6,1 + 0,19 7,9+0,30

Фракции гидролизата трепанга > 300 кДа 17,9 + 4,34 4,7+0,20

100-300 кДа 4,9 + 0,02 2,0+0,10

< 100 кДа 3,6 + 0,16 1,1+0,05

ленный в бухте Северная (залив Славянский) Японского моря в октябре 2014 г. Для проведения ферменто-лиза использовали мышечную ткань трепанга.

Ферментативный гидролиз мышечной ткани трепанга проводили под действием протамекса при следующих параметрах среды: рН 8,0, время - 3 ч, температура - 40...42 °С, концентрация ферментного препарата - 2,5 ПЕ/г.

Для определения фракционного состава белковых и углеводных компонентов в ферментолизате мышечной ткани трепанга было проведено фракционирование методом ультрафильтрации. Водный раствор сублимированного гидролизата (0,1 г/мл) был последовательно разделен на волоконных ультрафильтрационных колонках с размером пор 100 и 300 кДа. В результате разделения получены три фракции: высокомолекулярная (свыше 300 кДа), среднемо-лекулярная (100-300 кДа) и низкомолекулярная (менее 100 кДа).

Содержание водо- и солераство-римого белка определяли по методу Лоури [17].

Общее количество пептидов находили по методу определения растворимого белка после осаждения 20% ТХУ [18].

Содержание коллагена определяли по методу Замараевой [19].

Содержание гексозаминов определяли спектрофотометрически согласно Фармокопейной статье № 42-1286-99 [20].

Содержание гликозидов определяли спектрофотометрически [21].

Антиоксидантные свойства фер-ментолизатов оценивали по их спо-

Таблица 3 Антиоксидантная активность ферментолизата тканей трепанга и его фракций

Образцы Значение, мМоль / г сух. веса

Общий 26,986

>300 кДа 20,820

100-300 кДа 22,660

<100 кДа 25,490

собности ингибировать восстановление радикал-катиона ABTS+ (2, 2'-азинобис или 3-этилбен-зотиазолин 6-сульфонат) [22].

Ранее проведенные исследования показали, что общее содержание белка в мышечной ткани трепанга составляет около 4%, при этом на долю коллагена приходится 2-3% [23].

В ферментолизате мышечной ткани трепанга, полученном с использованием ферментного препарата про-тамекс, и его фракциях, разделенных методом ультрафильтрации, был определен состав белков и гликози-дов (табл. 1).

Содержание водо- и солераство-римых белков и коллагена в общем ферментолизате было практически одинаковым. Распределение соле- и водорастворимых белков по фракциям также не выявило значительных различий. Это свидетельствует о высокой степени гидролиза исходной ткани, при котором все белки мышечной ткани переходят в водорастворимую форму с равномерным молекулярно-массовым распределением.

Иной характер распределения по молекулярным фракциям отмечается для коллагена: наибольшее его содержание обнаружено в высокопо-

лимерной фракции (свыше 300 кДа), меньшее - в средней и низкомолекулярной фракциях. Полученные данные свидетельствуют о степени деградации коллагенового матрикса и степени его перехода в растворимое состояние. Известно, что в структуру нативных коллагеновых фибрилл входят две ковалентно связанные сульфатированные содержащие гли-козаминогликан молекулы протео-гликанов. Редукция дисульфидных связей не сопровождается повышением растворимости фибрилл коллагена. Обработка тканей ферментами протеолитического типа действия способствует отделению связанных фибриллами гликозаминогликанов и, как следствие, повышению растворимости коллагена [24].

Обратная по сравнению с коллагеном зависимость распределения по фракциям отмечена для пептидов. Экспериментально установлено, что большее количество пептидов (80% общего количества водорастворимых белков) обнаружено в низкомолекулярной фракции ферментолизата. Во фракции от 100 до 300 кДа пептидов несколько меньше, в высокомолекулярной фракции обнаружено всего 24% пептидов.

Аналогичный характер распределения по фракциям характерен для углеводов и гексозаминов (табл. 2).

Так, наибольшее количество углеводов и гексозаминов обнаружено в высокомолекулярной фракции -соответственно 17,9 и 4,7%. При этом общее содержание углеводов в высокомолекулярной фракции почти в 3 раза выше, чем в общем гидроли-зате, что может быть связано с концентрированием этих компонентов в процессе ультрафильтрации.

В среднемолекулярной и низкомолекулярной фракциях содержание углеводов в 3,5-5,0 раза, а гексоз-аминов в 2,3-4,3 раза меньше, чем в высокомолекулярной фракции ферментолизата трепанга. Это может

быть связано с особенностями строения соединительной ткани трепанга, представляющей собой волокнисто-подобную матрицу конгломерата гетерополисахаридов, связанных с белком, в которых глюкозоами-ногликаны играют роль цементирующего материала, расположенного между слоями минерализованных волокон коллагена [25-27]. При ферментативной деструкции такого комплекса большая часть гексозаминов, по-видимому, остается связанной с высокополимерными компонентами белка. Благодаря высокому содержанию гексозаминов в общем гидролизате его можно рекомендовать в качестве БАДа - источника глюкозамина [27].

Содержание гликозидов в общем ферментолизате составляет 2 мг/г. Определение гликозидов во фракциях ферментолизата не выявило зависимости распределения от молекулярной массы компонентов.

В полученных гидролизатах была проведена оценка их антиоксидант-ных свойств в тесте по их способности ингибировать восстановление радикал-катиона ABTS+.

Исследование образцов фермен-толизата трепанга показало, что наибольшей антиоксидантной активностью обладает низкомолекулярная фракция - 25,5 мМоль/г, что сравнимо с активностью общего гидро-лизата. Несколько меньшей антиоксидантной активностью характеризуются высоко- и среднемолекулярная фракции (табл. 3).

Полученные нами данные согласуются с данными Saito с соавторами (29), показавшими, что пептиды с молекулярной массой 1-3 кДа проявляли больший антиоксидантный эффект в DPPH-тесте, даже выше, чем положительный контроль, витамин Е. Следует отметить, что и сам коллаген, выделенный из трепанга с использованием пепсина, проявлял более высокую антирадикальную активность, чем витамины С и Е [28].

Таким образом, ферментолиз мышечной ткани трепанга позволяет получить продукт, содержащий водорастворимую форму коллагена и других белков, углеводы, гексо-замины и гликозиды в концентрациях, позволяющих использовать ферментолизат при изготовлении функциональных пищевых продуктов и как БАД общеукрепляющего действия, а также для восстановления соединительной и хрящевой тканей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Акулин, В. Н. Эффективность биологически активных добавок из голотурий и совершенствование технологий их получения/ В. Н. Акулин [и др.] // Известия ТИНРО-Центра. - 2012. -Т. 170. - С. 291-297.

2. Способ переработки дальневосточной кукумарии Cucumaria japonica и биологически активный продукт, получаемый этим способом. Патент РФ № 2426453./ Стоник В. А., Агафонова И. Г., Аминин Д. Л., Антонов А. С., Иващенко В. Ф., Макарьева Т. Н., Ре-бачук Н.М. Заявл. 12.11.2009; опубл. 20.08.2011.

3. Средство, стимулирующее клеточный иммунитет млекопитающих. Патент РФ № 2415863/Аминин Д. Л., Сильчен-ко А. С.., Авилов С. А., Калинин В. И., Стоник В. А. Заявл. 12.10.2009; опубл. 10.04.2011.

4. Иммуномодулирующее средство «Кумазид» и фармацевтическая композиция на его основе. Патент РФ № 2271820/Стоник В. А., Аминин Д. Л., Богуславский В. М., Авилов С. А., Агафонова И. Г., Сильченко А. С., Поно-маренко Л. П., Прокофьева Н. Г., Чайкина Е. Л. Заявл. 02.07.2004; опубл. 20.03.2006.

5. Средство, обладающее антикоагу-лянтным действием, и способ его получения. Патент РФ № 2302250/Попов А. М., Артюков А. А, Ли И. А., Глазунов В. П., Кофанова Н. Н., Козловская Э. П. -Заявл. 15.02.06; опубл. 10.07.07.

6. Долматова, Л. С. Влияние экстракта из дальневосточных видов голотурий на оксидантно-антиоксидантный баланс и апоптоз в макрофагах мышей при экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции/Л. С. Долматова, О. А. Заика, Н. Ф. Тимченко // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - № 1. -С. 53-56.

7. Md. Zainul Abedina, Alias A. Karima, Aishah A. Latiffb, Chee-Yuen Ganc, Farid Che Ghazalid, Zoha Barzideha, Sahena Ferdosha, Md. Jahurul Haque Akandaa, Wahidu Zzamana, Md. Rezaul Karime & Md. Zaidul Islam Sarkerf. Biochemical and radical-scavenging properties of sea cucumber (Stichopus vastus) collagen

hydrolysates // Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters. - 2014. -V. 28 (16). - P. 1-4.

8. Попов, А. М. Механизмы биологической активности гликозидов женьшеня: сравнение с гликозидами голотурий/А. М. Попов // Вестник ДВО РАН. -2006. - № 6. - С. 92-104.

9. Табакаева, О. В. Антирадикальная активность продуктов переработки голотурий Cucumaria japonica и их практическое применение для стабилизации ли-пидов/О. В. Табакаева, Т. К. Каленик // Тихоокеанский медицинский журнал. -2014. - № 1. - С. 52-53.

10. Долматова, Л. С. Сравнительное исследование действия дексаметазона и нового экстракта из голотурий на уровень цитокиноподобных веществ в отдельных типах иммуноцитов голотурии Eupentacta fraudatrix/Л. С. Долматова, О. А. Уланова, И. Ю. Долматов // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2014. -№ 1 (55). - С. 34-38.

11. Trotter, J. A, Lyons-Levy G., Luna D., Koob T. J., Keene D. R., Atkinson M. A. Stiparin: A glycoprotein from sea cucumber dermis that aggregates collagen fibrils // Matrix Biology. - 1996. -V. 15. Issue 2. - P. 99-110.

12. Bing, L.; Jing-feng, W.; Jia, F.; Xiao-lin, L.; Hui, L.; Qin, Z.; Chang-hu, X. Antifatigue effect of sea cucumber Stichopus japonicus in mice // Food Sci. - 2010. - V. 31. P. 244-247.

13. Wang, J.; Wang, Y.; Tang, Q.; Wang, Y.; Chang, Y.; Zhao, Q.; Xue, C. Antioxidation activities of low-molecular-weight gelatin hydrolysate isolated from the sea cucumber Stichopus japonicas. // J. Ocean Univ. China. - 2010. - V. 9. -Р. 94-98.

14. Chenghui, L.; Beiwei, Z.; Xiuping, D.; Liguo, C. Study on the separation and antioxidant activity of enzymatic hydrolysates from sea cucumber // Food Ferment. Ind. - 2007. - V. 33. -P. 50-53.

15. Kariya, Y.; Mulloy, B.; Imai, K.; Tominaga, A.; Kaneko, T.; Asari, A.; Suzuki, K.; Masuda, H.; Kyogashima, M.; Ishii, T. Isolation and partial characterization of fucan sulfates from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus and their ability to inhibit osteoclastogenesis. // Carbohydr. Res. - 2004. - V. 339. -1339-1346.

16. Позднякова, Ю. М. Обоснование технологии получения гидро-лизата из мышечной ткани трепанга/ Ю. М. Позднякова, А. Д. Перцева, Н. Н. Ковалев // Материалы III Международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы освоения биологических ресурсов Мирового океана». - C. 135-140.

17. Lowry, O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent //

J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - № 1. -P. 265-275.

18. Гаврилин, М. В. Выбор оптимальных условий получения гидролизатов молочнокислых бактерий термокислотным способом/М. В. Гаврилин [и др.]// Химико-фармацевтический журнал Т. 41. -№ 2. - 2007. - С. 54-56.

19. Замараева, Т. В. Современные методы в биохимии: Метод определения содержания коллагеновых белков по оксипролину/Т. В. Замараева. - М.: Медицина, 1977. - C. 262-264.

20. Ф а р м о к о п е й н а я статья 42-1785-96.

21. Аминин, Д.Л. определение сти-хопозида А из голотурии Stichopus

japonicus S./ Д. Л. Аминин [и др.] // Антибиотики. - 1981. - Т. 26. - № 8. -С. 585-588.

22 Pellegrini, N., Proteggente A., Min Yang et all. Antioxidant activity applying an improved ABTS Radical cation decolorization assay // Free Radical Biology I Medicine. - 1999. - V. 26. -№ 9/10. - P. 1231-1237.

23. Аюшин, Н. Б. Химический состав и содержание биологически активных веществ в мышечной ткани трепан-га/Н. Б. Аюшин, А. Г. Ким, Т. Н. Слуцкая // Пищевая технология. - 2014. - № 4 (340). - С. 35-37.

24. Yamada, S.; Sugahara, K. Potential therapeutic application of chondroitin

sulfate/dermatan sulfate // Curr. Drug Discov. Technol. - 2008. - V. 5. -P. 289-301.

25. Поликар, А. Молекулярная цитология мембранных систем животной клетки/А. Поликар. - М.: Мир, 1972. -158 с.

26. Лупа, Ю. Основы гистохи-мии/Ю. Лупа. - М.: Мир, 1980-343 с.

27. Приложение 11 к техническому регламенту Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021 / 2011).

28. Saito, M.; Kunisaki, N.; Urano, N. Collagen as the major edible component of sea cucumber // J. Food Sci. - 2002. -V. 67. - P. 1319-1322.

Состав и антиоксидантные свойства ферментативного гидролизата мышечной ткани трепанга

Ключевые слова

антиоксидантная активность; гликозиды; глюкозамины; коллаген; трепанг, ферментолизат

Реферат

Исследован химический состав ферментативного гидролизата мышечной ткани дальневосточного трепанга АроБ^сИориБ ]ароп1сыБ. Ферментативный гидролиз мышечной ткани трепанга проводили под действием протамекса при следующих параметрах среды: рН 8,0, время - 3 ч, температура - 40...42 ОС, концентрация ферментного препарата- 2,5 ПЕ/г сырья. Проведено фракционирование ферментолизата методом ультрафильтрации на три фракции: низкомолекулярную (менее 100 кДа), среднюю (100-300 кДа) и высокомолекулярную (свыше 300 кДа). В общем ферментолизате и его фракциях определено содержание растворимых белков. Отмечено равномерное распределение водо- и со-лерастворимых белков по фракциям. Определено содержание коллагена, углеводов и гексозаминов, составившее соответственно 29, 6,1 и 7,9%. Выявлено, что вышеперечисленных компонентов больше в высокомолекулярной фракции: коллагена - 16%, углеводов - 17,9%, гексозаминов - 4,7%. Установлено, что фермен-толиз способствует переходу в растворимое состояние коллагена, углеводов, гексозаминов. Наибольшее количество пептидов обнаружено в низкомолекулярной фракции (80% общего количества водорастворимых белков). В средней (100-300 кДа) и высокополимерной (свыше 300 кДа) фракциях содержание пептидов составило соответственно 74,2 и 24,2% общего количества растворимого белка. Содержание гликозидов в общем ферментолизате -2 мг/г ткани. Фракционирование ферментолизата и определение гликозидов во фракциях показало, что их распределение не зависит от молекулярной массы белковых компонентов. В ферменто-лизате мышечной ткани трепанга выявлена антиокислительная активность в тесте по их способности ингибировать восстановление радикал-катиона АВТ5+, которая составила 26,986 мМоль/г сухого веса. Показано, что наибольшей антиоксидантной активностью характеризуются компоненты с молекулярной массой ниже 100 кДа. По содержанию гексозаминов ферментолизат мускульного мешка трепанга соответствует рекомендуемым суточным нормам потребления НИИ питания РАМН. На основании химического состава (содержание гексозаминов и растворимой формы коллагена) и антиоксидантной активности ферментолизат можно рекомендовать для изготовления функциональных пищевых продуктов и БАД общеукрепляющего и хондропротекторного действия.

Авторы

Ковалев Николай Николаевич, д-р биол. наук, профессор, Позднякова Юлия Михайловна, канд. техн. наук, Перцева Анна Дмитриевна,

Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет, 690087, г. Владивосток, ул. Луговая, д. 52Б, kovalevпп61@yaпdex.ru Тун Чанцин, канд. техн. наук, профессор Даляньский океанологический университет, 116023, Китай, г. Далянь, Хейшиждиао, 52, changqingtong@dlou.edu.ch

The Composition and Antioxidant Enzymatic Hydrolyzate of Trepang Muscle

Key words

repang; collagen; hydrolysate; aminosugars; glycosides; antioxidant activity

Abstracts

The chemical composition of Far Eastern sea trepang of Apostichopus japonicas muscle tissue enzymatic hydrolysate was investigated. Enzymatic hydrolysis of the muscle tissue of sea cucumber by protameks under the following conditions: pH 8.0, time - 3 hours 40-42 operating temperature, concentration of enzyme preparation- 2.5 PU / g of tissue. The three enzymatic hydrolysates fractionations were obtained: low molecular weight (less than l0o kDa), medium (100 to 300 kDa) and high molecular weight (over 300 kDa). The content of soluble protein in enzymatic hydrolysate and its fractions was determined. Uniform distribution of water and salt-soluble protein fractions is noted. The content of collagen, carbohydrates and hexosamine was defined. The contents of collagen, carbohydrates and hexosamine in general fermentatlisate are 29%, 6.1% and 7.9% respectively. The above components are more in the high molecular weight fraction: collagen-l6 %, carbohydrates-17.9 %, hexosamine - 4.7 %. The enzymatic hydrolysis facilitates transition collagen to solubilized state. The enzymatic hydrolysis of collagen, carbohydrates, hexosamine contributes to transition into a soluble state has been established. The greatest amount of peptides in the low molecular weight fraction was founded. Which was 80% of the total soluble proteins. In the middle (100 to 300 kDa) and high polymer (over 300 kDa) fractions peptide content was 74.2 and 24.2% of the total soluble protein, respectively. Contents of glycosides in the total enzymatic hydrolysate was 2 mg/g of tissue. Glycosides definition in the fractions has show that the distribution does not depended at the molecular weight of the protein component. In enzymatic hydrolysate of muscle cucumber antioxidant activity was detected in a test for their ability to inhibit restoration radical cation ABTS +, which was 26.986 mMoles/g dry weight. It is shown that the most active antioxidant component characterized by a molecular weight below 100 kDa. The muscular tissue enzymatic hydrolysate of trepang by daily intake of the hexosamine contents was corresponded by Research Sciences Institute of Nutrition consumption rate. The enzymatic hydrolysate on the basis of chemical composition (hexosamine content and collagen soluble form) and antioxidant activity can be recommended for the production of functional foods and dietary supplements tonic with chondroprotective effect.

Authors

Kovalev Nikolay Nikolaevich, Doctor of Biological Science, Professor, Poznyakova Yuliya Mikhaylovna, Candidate of Technical Science, Pertseva Anna Dmitrievna,

Far Eastern State Technical Fisheries University, 52B, Lugovaya St., Vladivostok, 690087, kovalevnn61@yandex.ru Tun Chantsyn, Candidate of Technical Science, Professor Dalian University of Oceanology, 52, Heysham Jiao, Dalian, China, 116023, changqingtong@dlou.edu.ch