ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА CLL-1
TREATING CANCER USING A CHIMERIC ANTIGENIC CLL-1 RECEPTOR

Родственные заявки
Настоящая заявка притязает на приоритет РСТ заявки № РСТ/CN2014/082602, поданной 21 июля 2014, и РСТ заявки № РСТ/CN2014/090500, поданной 6 ноября 2014. Эти заявки полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Список последовательностей
Настоящая заявка содержит список последовательностей, который представлен в электронном виде в формате ASCII и таким образом полностью включен в настоящее описание. Копия указанного ASCII, созданная 15 июля 2015, называется N26077044WO3_SL.txt и имеет размер 339932 байта.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится вообще к применению иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток), сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) для лечения заболеваний, связанных с экспрессией лектиноподобного С-типа рецептора 1 (CLL-1).
Предпосылки создания изобретения
+
-
Лектиноподобный С-типа рецептор 1 (CLL-1) также известен как MICL, CLEC12A, CLEC-1, лектин 1, ассоциированный с дендритными клетками, и DCAL-2. CLL-1 является гликопротеиновым рецептором и членом большого семейства лектиноподобных рецепторов С-типа, вовлеченных в иммунную регуляцию. CLL-1 экспрессируется на гемопоэтических клетках, главным образом, на клетках врожденного иммунитета, включая моноциты, DC, pDC и гранулоциты (Cancer Res., 2004; J. Immunol., 2009), и миелоидных клетках-предшественниках (Blood, 2007). CLL-1 также обнаружен на бластах острого миелоидного лейкоза (AML) и лейкозных стволовых клетках (например, CD34/CD38) (Zhao et al., Haematologica, 2010, 95(1): 71-78). Экспрессия CLL-1 также может соотноситься с другими миелоидными лейкозами, такими как острый миеломоноцитарный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, острый промиеломоноцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз (CML) и миелодиспластический синдром (MDS).
Сущность изобретения
В первом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), причем CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном воплощении CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, и внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен).
В воплощениях CAR включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющий комплементарность участок 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющий комплементарность участок 3 тяжелой цепи (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2. В воплощениях человеческий CLL-1-связывающий домен также включает определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (LC CDR3). В воплощениях человеческий CLL-1-связывающий домен включает определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает человеческий CLL-1-связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен, и где указанный CLL-1-связывающий домен включает один или больше участков из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2, и один или больше участков из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В одном воплощении кодированный человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше (например, все три) участков из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше (например, все три) участков из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (HC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, включающего один или больше (например, все три) LC CDR и один или больше (например, все три) НC CDR.
В одном воплощении кодированный человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2), и/или вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2). В одном воплощении кодированный человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности из таблицы 2. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленной в таблице 2, или последовательности с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблицы 2; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной в таблице 2, или последовательности с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблицы 2.
В других воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает один, два или все LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2, и один, два или все НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В одном воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:39-51, 65-77, 195, 78-90 или 196. В воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен (например, scFv) включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39-51, 65-77, 195, 78-90 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39-51, 65-77, 195, 78-90 или 196. В другом воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен включает вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 65-77 или 195, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В другом воплощении кодированный CLL-1-связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 66-74 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 52-64, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный гуманизированный анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly4-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv может находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В одном воплощении кодированный CAR включает трансмембранный домен, который включает трансмембранный домен белка, выбранного из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном воплощении кодированный трансмембранный домен включает последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении кодированный трансмембранный домен включает аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая трансмембранный домен, включает последовательность SEQ ID NO: 17 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирным участком, например, шарнирным участком, описанным в настоящем описании. В одном воплощении кодированный шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая шарнирный участок, включает последовательность SEQ ID NO: 13 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен включает первичный сигнальный домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен и первичный сигнальный домен.
В одном воплощении кодированный костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен, полученный из белка, выбранного из группы, включающей молекулу ГКГС (МНС) класса I, белки рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, молекулы, передающие сигнал активации лимфоцитов (белки SLAM), рецепторы, активирующие NK-клетки, BTLA, лиганд Тоll рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83. В воплощениях кодированный костимулирующий домен включает 4-1BB, CD27, CD28 или ICOS.
В одном воплощении кодированный костимулирующий домен 4-1BB включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В другом воплощении кодированный костимулирующий домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен CD28, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 483 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В другом воплощении кодированный костимулирующий домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен CD27, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В другом воплощении кодированный костимулирующий домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484. В одном воплощении кодированный костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая костимулирующий домен ICOS, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 485 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В воплощениях кодированный первичный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В воплощениях функциональный сигнальный домен CD3-дзета включает последовательность SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (человеческий CD3-дзета дикого типа) или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен 4-1ВВ включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен 4-1ВВ, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, или нуклеотидную последовательность CD3-дзета с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD27 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен CD27, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 CD3-дзета или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD28 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен CD28, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 483 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 CD3-дзета или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен ICOS и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен ICOS, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 485 или последовательность с 95-99% идентичностью ей, и/или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21 CD3-дзета или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении изолированная молекула CAR дополнительно включает лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании. В одном воплощении лидерная последовательность включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию CAR, включающую лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, например, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, включающий LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3, описанные в настоящем описании, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью ей, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, например, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, и внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании (например, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, костимулирующий домен CD28, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482, или костимулирующий домен ICOS, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484, или костимулирующий домен CD27, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8), и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, CD3-дзета стимулирующий домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10).
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию CAR, включает последовательность человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, кодированную нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 и SEQ ID NO:64, или последовательностью с 95-99% идентичностью ей.
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает (например, состоит из) нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность CAR SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:103 или SEQ ID NO: 197; или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:103 или SEQ ID NO: 197; или аминокислотную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO:103 или SEQ ID NO: 197.
В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает (например, состоит из) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116 или SEQ ID NO:198; или нуклеотидную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116 или SEQ ID NO:198.
В одном аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-CLL-1 связывающий домен, где анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (HC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (HC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (HC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, включающего один или больше, например, все три, LC CDR и один или больше, например, все три, НC CDR.
В других воплощениях CLL-1-связывающий домен включает HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен дополнительно включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В воплощениях CLL-1 связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях CLL-1-связывающий домен включает один, два или все LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2, и один, два или все HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи домена, связывающего CLL-1, перечисленных в таблице 2.
4
В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196), и/или вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195). В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций аминокислотной последовательности (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций аминокислотной последовательности (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, соединяется с вариабельным участком тяжелой цепи, включающим аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении кодированный анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле CAR (например, полипептида), кодированной молекулой нуклеиновой кислоты. В одном воплощении изолированная молекула CAR включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 197, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле химерного антигенного рецептора (CAR) (например, полипептида), включающей анти-CLL-1-связывающий домен (например, человеческое антитело или фрагмент антитела, который специфически связывается с CLL-1), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном воплощении CAR включает антитело или фрагмент антитела, который включает анти-CLL-1-связывающий домен (например, человеческое антитело или фрагмент антитела, который специфически связывается с CLL-1, описанные в настоящем описании), трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, и внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании.
В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен включает один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) анти-CLL-1-связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) анти-CLL-1-связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1-связывающего домена, включающего один или больше (например, все три) LC CDR и один или больше (например, все три) НC CDR. В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2), и/или включает вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 2). В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности, указанной в таблице 2. В одном воплощении анти-CLL-1-связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности, представленной в таблице 2; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности, представленной в таблице 2.
В других воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен дополнительно включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В воплощениях CLL-1-связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает один, два или все из LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2, и один, два или все из HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
4
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 65-90 или SEQ ID NO: 195-196, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) любой из вышеуказанных последовательностей; или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, присоединяется к вариабельному участку тяжелой цепи, включающему аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В одном воплощении изолированная молекула CAR включает трансмембранный домен белка, выбранного из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном воплощении трансмембранный домен включает последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении трансмембранный домен включает аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности SEQ ID O: 6, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирным участком, например, шарнирным участком, описанным в настоящем описании. В одном воплощении кодированный шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2 или последовательность с 95-99% идентичностью ей.
В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен изолированной молекулы CAR включает костимулирующий домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен изолированной молекулы CAR включает первичный сигнальный домен. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен изолированной молекулы CAR включает костимулирующий домен и первичный сигнальный домен. В одном воплощении изолированная молекулы CAR дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении костимулирующий домен включает функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, включающей молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуногллобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, молекулы, передающие сигнал активации лимфоцитов (белки SLAM), рецепторы, активирующие NK клетки, BTLA, лиганд Толл рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83. В одном воплощении костимулирующий домен 4-1ВВ включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В другом воплощении костимулирующий домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482. В другом воплощении костимулирующий домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В другом воплощении костимулирующий домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484. В одном воплощении костимулирующий домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484.
В воплощениях первичный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В воплощениях функциональный сигнальный домен CD3-дзета включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (человеческий CD3-дзета дикого типа) или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 и/или последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 и/или последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD27 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 8 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен CD28 и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 482 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 482 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен ICOS и/или функциональный сигнальный домен CD3-дзета. В одном воплощении кодированный внутриклеточный сигнальный домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 484 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 484 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в той же рамке, что и отдельная пептидная цепь.
В одном воплощении изолированная молекула CAR дополнительно включает лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании. В одном воплощении лидерная последовательность включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле CAR, включающей лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, описанную в настоящем описании, например, лидерную последовательность SEQ ID NO: 1 или имеющую 95-99% идентичность ей, анти-CLL-1 связывающий домен, включающий LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 и HC CDR3, описанный выше, например, анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в таблице 2, или последовательность с 95-99% идентичностью им, шарнирный участок, например, шарнирный участок, описанный в настоящем описании, например, шарнирный участок SEQ ID NO: 2 или имеющий 95-99% идентичность ему, трансмембранный домен, например, трансмембранный домен, описанный в настоящем описании, например, трансмембранный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, или последовательность, имеющую 95-99% идентичность ей, внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, внутриклеточный сигнальный домен, включающий костимулирующий домен и/или первичный сигнальный домен). В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании, например, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7 или имеющую 95-99% идентичность ей, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, например, стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или имеющую 95-99% идентичность им. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, описанный в настоящем описании, например, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, например, стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
В одном воплощении изолированная молекула CAR включает (например, состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 или SEQ ID NO: 197, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, 10, 15, 20 или 30 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), но не более 60, 50 или 40 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 или SEQ ID NO: 197, или аминокислотную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 197.
В одном аспекте изобретение относится к анти-CLL-1 связывающему домену, включающему один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1-связывающего домена, включающего один или больше (например, все три) LC CDR и один или больше, например, все три, НC CDR.
В других воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2. В воплощениях CLL-1-связывающий домен дополнительно включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3. В воплощениях CLL-1-связывающий домен включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
В некоторых воплощениях кодированный CLL-1-связывающий домен включает один, два или все LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2, и один, два или все из НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3 любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи CLL-1-связывающего домена, представленных в таблице 2.
4
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает вариабельный участок легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196) и/или вариабельный участок тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в in SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195). В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленного в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 или 196; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленного в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 или 195. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51, или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, присоединяется к вариабельному участку тяжелой цепи, включающему аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В другом аспекте изобретение относится к вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании, например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании. В одном воплощении вектор выбирают из группы, включающей ДНК, РНК, плазмиду, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или ретровирусный вектор.
В одном воплощении вектор представляет собой лентивирусный вектор. В одном воплощении вектор дополнительно включает промотор. В одном воплощении промотор представляет собой промотор EF-1. В одном воплощении промотор EF-1 включает SEQ ID NO: 11. В другом воплощении промотор представляет собой промотор PGK, например, усеченный промотор PGK, описанный в настоящем описании.
В одном воплощении вектор представляет собой транскрибированный in vitro вектор, например, вектор, который транскрибирует РНК молекулы нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем описании. В одном воплощении нуклеотидная последовательность в векторе дополнительно включает хвост поли(А), например, хвост поли(А), описанный в настоящем описании, например, включающий примерно 150 аденозиновых оснований (SEQ ID NO: 312). В одном воплощении нуклеотидная последовательность в векторе дополнительно включает 3'UTR, например, 3'UTR, описанную в настоящем описании, например, включающую по меньшей мере один повтор 3'UTR, происходящей от человеческого бета-глобулина. В одном воплощении нуклеотидная последовательность в векторе дополнительно включает промотор, например, промотор Т2А.
В другом аспекте изобретение относится к клетке, включающей вектор, описанный в настоящем описании. В одном воплощении клетка представляет собой клетку, описанную в настоящем описании, например, иммунную эффекторную клетку, например, человеческую Т-клетку, описанную в настоящем описании, или человеческую NK-клетку, например, человеческую NK-клетку, описанную в настоящем описании. В одном воплощении человеческая Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку.
В другом воплощении CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, дополнительно экспрессирует другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агент может представлять собой агент, который ингибирует ингибирующую молекулу. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета. В одном воплощении агент, который ингибирует ингибирующую молекулу, включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении агент включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета, или фрагмент любой из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, включающий костимулирующий домен (например, 41ВВ, CD27 или CD28, например, как описано в настоящем описании) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дэета, описанный в настоящем описании). В одном воплощении агент включает первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем описании (например, сигнального домена CD28, описанного в настоящем описании, и/или сигнального домена CD3-дэета, описанного в настоящем описании).
В другом аспекте изобретение относится к способу получения клетки, включающему трансдукцию клетки, описанной в настоящем описании, например, иммунной эффекторной клетки, описанной в настоящем описании, например, Т-клетки или NK-клетки, описанной в настоящем описании, вектором, включющим нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании.
Настоящее изобретение также относится к способу получения популяции сконструированных методом РНК клеток, например, клеток, описанных в настоящем описании, например, Т-клеток или NK-клеток, временно экспрессирующих экзогенную РНК. Способ включает введение в клетку транскрибированной in vitro РНК или синтетической РНК, где РНК включает нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу CAR, описанную в настоящем описании.
В другом аспекте изобретение относится к способу предоставления противоопухолевого иммунитета млекопитающему, включающему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, клеток, экспрессирующих молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В одном воплощении клетка представляет собой иммунную эффекторную клетку, например, аутологичную Т-клетку. В одном воплощении клетка представляет собой аллогенную иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку. В одном воплощении млекопитающее представляет собой человека, например, пациента с онкологическим заболеванием кроветворной системы. В другом аспекте изобретение относится к способу лечения млекопитающего, имеющего заболевание, связанное с экспрессией CLL-1 (например, пролиферативное заболевание, предраковое состояние и показание, относящееся к неонкологическому заболеванию, связанное с экспрессией CLL-1), включающему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, клеток, экспрессирующих молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В одном воплощении млекопитающее представляет собой человека, например, пациента с онкологическим заболеванием кроветворной системы.
В одном воплощении заболевание является заболеванием, описанным в настоящем описании. В одном воплощении заболевание, связанное с экспрессией CLL-1, выбирают из рака кроветворной системы, такого как лейкоз, включая, но не ограничиваясь перечисленным, острый миелоидный лейкоз (AML), миелодиспластический синдром, миелопролиферативные неоплазмы, хронический миелоидный лейкоз (CML), неоплазму бластно-плазмоцитоидных дентдритных клеток, и заболевания, связанного с экспрессией CLL-1, включая, но не ограничиваясь перечисленным, атипичные и/или неклассические раки, злокачественности, предраковые состояния или пролиферативные заболевания с экспрессированием CLL-1, и их комбинации. В одном воплощении заболевание, связанное с экспрессией CLL-1, представляет собой рак кроветворной системы, выбранный из группы, включающей один или несколько острых лейкозов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, острый миелогенный лейкоз (или острый миелоидный лейкоз, AML), хронический миелогенный лейкоз (или хронический миелоидный лейкоз, CML), острый лимфоидный лейкоз (или острый лимфоцитарный лейкоз, ALL), хронический лимфоидный лейкоз (или хронический лимфоцитарный лейкоз, СLL) и миелодиспластический синдром, В-клеточный острый лимфоидный лейкоз («BАLL» или острый лимфобластный В-клеточный лейкоз), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз («ТАLL» или острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или несколько хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (СLL); другие онкологические заболевания кроветворной системы или гематологические состояния, включая, но не ограничиваясь перечисленным, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, неоплазму бластно-плазмоцитоидных дентдритных клеток, лимфомы, включая, но не ограничиваясь перечисленным, множественную миелому, неходжкинскую лимфому, лимфому Беркитта, мелкоклеточную фолликулярную лимфому и крупноклеточную фолликулярную лимфому, диффузную В-клеточную крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому маргинальной зоны, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, лимфому Ходжкина, плазмобластную лимфому, неоплазму бластно-плазмоцитоидных дентдритных клеток, плазмоцитарную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема и «предлейкоз», которые представляют собой разнообразный набор гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и заболевания, связанного с экспрессией CLL-1, включая, но не ограничиваясь перечисленным, атипичные и/или неклассические раки, злокачественности, предраковые состояния или пролиферативные заболевания с экспрессированием CLL-1, и их комбинации.
В другом аспекте изобретение относится к способу укрепления общего состояния субъекта перед трансплантацией клеток, включающему введение субъекту эффективного количества клеток, включающих молекулу CAR, раскрытую в настоящем описании. В одном воплощении трансплантация клеток представляет собой трансплантацию стволовых клеток. Трансплантация стволовых клеток представляет собой трансплантацию кроветворных стволовых клеток или трансплантацию костного мозга. В одном воплощении трансплантация клеток является аллогенной или аутологичной.
В одном воплощении укрепление общего состояния субъекта перед трансплантацией клеток включает снижение числа CLL-1-эксперссирующих клеток у субъекта. Эксперссирующие CLL-1 у субъекта клетки представляют собой здоровые CLL-1-экспрессирующие клетки или раковые CLL-1-экспрессирующие клетки, и в некоторых случаях укреплением общего состояния субъекта будет снижение как здоровых CLL-1-экспрессирующих клеток, так и раковых CLL-1-экспрессирующих клеток перед трансплантацией клеток.
В одном воплощении клетки, эспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с агентом, который повышает эффективность клеток, эспрессирующих молекулу CAR, например, агентом, описанным в настоящем описании.
В одном воплощении клетки, эспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с малой усиливающей иммунитет дозой ингибитора mTOR. Без желания привязываться к теории, полагают, что лечение малой усиливающей иммунитет дозой (например, дозой, которая недостаточна для полной супрессии иммунной системы, но достаточна для улучшения иммунной функции) сопровождается снижением числа PD-1-положительных клеток или увеличением PD-1-отрицательных клеток. PD-1-Положительные Т-клетки, но не PD-1-отрицательные клетки Т-клетки, могут быть истощены путем соединения с клетками, которые экспрессируют лиганд PD-1, например, PD-L1 или PD-L2.
В воплощении такой подход можно использовать для оптимизации работоспособности клеток CAR у субъекта, описанных в настоящем описании. Без желания привязываться к теории, полагают, что в воплощении работоспособность эндогенных немодифицированных иммунных клеток, например, Т-клеток, улучшается. Без желания привязываться к теории, полагают, что в воплощении работоспособность CLL-1-экспрессирующих клеток CAR улучшается. В других воплощениях клетки, например, Т-клетки, которые являются или будут экспрессировать CAR, можно обработать ex vivo путем контакта с неким количеством ингибитора mTOR, который повышает число PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или повышает отношение PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки.
В воплощении введение малой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора, например, RAD001, или каталитического ингибитора, начинают до введения CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании, например, Т-клеток. В воплощении CAR-клетки вводят через достаточное время или достаточной дозировки ингибитора mTOR, так что уровень PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или отношение PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки, по меньшей мере временно возрастает.
В воплощении изобретение относится к ингибитору mTOR для применения при лечении субъекта, при котором указанный ингибитор mTOR усиливает иммунную реакцию у указанного субъекта, и при котором указанный субъект получил, получает или близок к получению иммунных эффекторных клеток, которые экспрессируют CLL-1-CAR, как описано в настоящем описании.
В воплощении клетки, например, Т-клетки, сконструированные для экспрессии CAR, собирают через достаточное время или после достаточного дозирования малой повышающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, так что уровень PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или отношение PD-1-отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки, у субъекта или собранных у субъекта по меньшей мере временно возрастает.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с агентом, который уменьшает побочное действие, связанное с введением клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, агентом, описанным в настоящем описании.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с агентом, который лечит заболевание, связанное с CLL-1, например, агентом, описанным в настоящем описании. В другом воплощении клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с химиотерапевтическим средством, например. химиотерапевтическим средством, описанным в настоящем описании. В воплощении химиотерапевтическое средство вводят до введения клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. Например, в схемах приема терапевтических средств, по которым желательно более одного введения химиотерапевтического средства, прием химиотерапевтического средства начинают или завершают до введения клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В воплощениях химиотерапевтическое средство вводят по меньшей мере за 5 дней, 10 дней, 15 дней, 30 дней до введения клеток, экспрессирующих молекулу CAR. В воплощениях химиотерапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, которое повышает экспрессию CLL-1 на раковых клетках, например, опухолевых клетках, например, по сравнению с экспрессией CLL-1 на здоровых или нераковых клетках. Например, химиотерапевтическое средство представляет собой цитарабин (Ara-C). В воплощениях комбинацию химиотерапии и клеток, экспрессирующих молекулу CAR, описанную в настоящем описании, применяют для лечения рака кроветворной системы, например, лейкоза, например, AML, или минимального остаточного заболевания (MRD) рака кроветворной системы, описанного в настоящем описании.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR по изобретению, изолированной молекуле полипептида CAR по изобретению, вектору, включающему CAR по изобретению, и клетке, включающей CAR по изобретению, для применения в качестве лекарственного средства, например, как описано в настоящем описании. В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR по изобретению, изолированной молекуле полипептида CAR по изобретению, вектору, включающему CAR по изобретению, и клетке, включающей CAR по изобретению, для применения при лечении заболевания с экспрессией CLL-1, например, заболевания с экспрессией CLL-1, как описано в настоящем описании.
Другие особенности и воплощения вышеуказанных композиций и способов включают один или несколько пунктов из перечисленных далее.
В некоторых воплощениях молекула CAR к CLL-1 (например, CAR-нуклеиновой кислоты к CLL-1 или CAR-полипептида к CLL-1, описанным в настоящем описании) или CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании, включают один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), представленные в таблице 3, и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CLL-1 CAR-1, CLL-1 CAR-2, CLL-1 CAR-3, CLL-1 CAR-4, CLL-1 CAR-5, CLL-1 CAR-6, CLL-1 CAR-7, CLL-1 CAR-8, CLL-1 CAR-9, CLL-1 CAR-10, CLL-1 CAR-11, CLL-1 CAR-12, CLL-1 CAR-13 или 181268, представленные в таблице 4; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную вышеуказанным последовательностям или с до 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот, например, заменой (например, консервативной заменой)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CAR к CLL-1 (например, CAR-нуклеиновой кислоты к CLL-1 или CAR-полипептида к CLL-1, описанные в настоящем описании) или CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании, включают один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), представленные в таблице 5, и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CLL-1 CAR-1, CLL-1 CAR-2, CLL-1 CAR-3, CLL-1 CAR-4, CLL-1 CAR-5, CLL-1 CAR-6, CLL-1 CAR-7, CLL-1 CAR-8, CLL-1 CAR-9, CLL-1 CAR-10, CLL-1 CAR-11, CLL-1 CAR-12, CLL-1 CAR-13 или 181268, представленные в таблице 6; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную вышеуказанным последовательностям или с до 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот, например, заменой (например, консервативной заменой)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CAR для CLL-1 (например, CAR-нуклеиновой кислоты для CLL-1 или CAR-полипептида для CLL-1, описанные в настоящем описании) или CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании, включают один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HC CDR1, HC CDR2 и/или HC CDR3), представленные в таблице 7, и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LC CDR1, LC CDR2 и/или LC CDR3) из CLL-1 CAR-1, CLL-1 CAR-2, CLL-1 CAR-3, CLL-1 CAR-4, CLL-1 CAR-5, CLL-1 CAR-6, CLL-1 CAR-7, CLL-1 CAR-8, CLL-1 CAR-9, CLL-1 CAR-10, CLL-1 CAR-11, CLL-1 CAR-12, CLL-1 CAR-13 или 181268, представленные в таблице 8; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную вышеуказанным последовательностям или с до 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот, например, заменой (например, консервативной заменой)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанная в настоящем описании (например, CAR-нуклеиновой кислоты или CAR-полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 156, LC CDR2 SEQ ID NO: 169 и LC CDR3 SEQ ID NO: 182 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 157, LC CDR2 SEQ ID NO: 170 и LC CDR3 SEQ ID NO: 183 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 158, LC CDR2 SEQ ID NO: 171 и LC CDR3 SEQ ID NO: 184 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 159, LC CDR SEQ ID NO: 172 и LC CDR3 SEQ ID NO: 185 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 160, LC CDR2 SEQ ID NO: 173 и LC CDR3 SEQ ID NO: 186 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 161, LC CDR2 SEQ ID NO: 174 и LC CDR3 SEQ ID NO: 187 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 162, LC CDR2 SEQ ID NO: 175 и LC CDR3 SEQ ID NO: 188 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 163, LC CDR2 SEQ ID NO: 176 и LC CDR3 SEQ ID NO: 189 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 164, LC CDR2 SEQ ID NO: 177 и LC CDR3 SEQ ID NO: 190 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 165, LC CDR2 SEQ ID NO: 178 и LC CDR3 SEQ ID NO: 191 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 166, LC CDR2 SEQ ID NO: 179 и LC CDR3 SEQ ID NO: 192 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 167, LC CDR2 SEQ ID NO: 180 и LC CDR3 SEQ ID NO: 193 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 168, LC CDR2 SEQ ID NO: 181 и LC CDR3 SEQ ID NO: 194 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 202, LC CDR2 SEQ ID NO: 203 и LC CDR3 SEQ ID NO: 204 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (НC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 117, HC CDR2 SEQ ID NO: 130 и HC CDR3 SEQ ID NO: 143 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 118, HC CDR2 SEQ ID NO: 131 и HC CDR3 SEQ ID NO: 144 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 119, HC CDR2 SEQ ID NO: 132 и HC CDR3 SEQ ID NO: 145 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 120, HC CDR2 SEQ ID NO: 133 и HC CDR3 SEQ ID NO: 146 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 121, HC CDR2 SEQ ID NO: 134 и HC CDR3 SEQ ID NO: 147 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 122, HC CDR2 SEQ ID NO: 135 и HC CDR3 SEQ ID NO: 148 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 123, HC CDR2 SEQ ID NO: 136 и HC CDR3 SEQ ID NO: 149 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 124, HC CDR2 SEQ ID NO: 137 и HC CDR3 SEQ ID NO: 150 CLL-1-CAR-8; or
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 125, HC CDR2 SEQ ID NO: 138 и HC CDR3 SEQ ID NO: 151 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 126, HC CDR2 SEQ ID NO: 139 и HC CDR3 SEQ ID NO: 152 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 127, HC CDR2 SEQ ID NO: 140 и HC CDR3 SEQ ID NO: 153 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 128, HC CDR2 SEQ ID NO: 141 и HC CDR3 SEQ ID NO: 154 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 129, HC CDR2 SEQ ID NO: 142 и HC CDR3 SEQ ID NO: 155 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 199, HC CDR2 SEQ ID NO: 200 и HC CDR3 SEQ ID NO: 201 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанная в настоящем описании (например, CAR-нуклеиновой кислоты или CAR-полипептида), или CLL-1-связывающий домен включают
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 356, LC CDR2 SEQ ID NO: 370 и LC CDR3 SEQ ID NO: 384 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 357, LC CDR2 SEQ ID NO: 371 и LC CDR3 SEQ ID NO: 385 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 358, LC CDR2 SEQ ID NO: 372 и LC CDR3 SEQ ID NO: 386 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 359, LC CDR2 SEQ ID NO: 373 и LC CDR3 SEQ ID NO: 387 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 360, LC CDR2 SEQ ID NO: 374 и LC CDR3 SEQ ID NO: 388 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 361, LC CDR2 SEQ ID NO: 375 и LC CDR3 SEQ ID NO: 389 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 362, LC CDR2 SEQ ID NO: 376 и LC CDR3 SEQ ID NO: 390 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 363, LC CDR2 SEQ ID NO: 377 и LC CDR3 SEQ ID NO: 391 CLL-1 CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 364, LC CDR2 SEQ ID NO: 378 и LC CDR3 SEQ ID NO: 392 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 365, LC CDR2 SEQ ID NO: 379 и LC CDR3 SEQ ID NO: 393 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 366, LC CDR2 SEQ ID NO: 380 и LC CDR3 SEQ ID NO: 394 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 367, LC CDR2 SEQ ID NO: 381 и LC CDR3 SEQ ID NO: 395 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 368, LC CDR2 SEQ ID NO: 382 и LC CDR3 SEQ ID NO: 396 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 369, LC CDR2 SEQ ID NO: 383 и LC CDR3 SEQ ID NO: 397 of 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (НC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 314, HC CDR2 SEQ ID NO: 328 и HC CDR3 SEQ ID NO: 342 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 315, HC CDR2 SEQ ID NO: 329 и HC CDR3 SEQ ID NO: 343 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 316, HC CDR2 SEQ ID NO: 330 и HC CDR3 SEQ ID NO: 344 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 317, HC CDR2 SEQ ID NO: 331 и HC CDR3 SEQ ID NO: 345 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 318, HC CDR2 SEQ ID NO: 332 и HC CDR3 SEQ ID NO: 346 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 319, HC CDR2 SEQ ID NO: 333 и HC CDR3 SEQ ID NO: 347 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 320, HC CDR2 SEQ ID NO: 334 и HC CDR3 SEQ ID NO: 348 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 321, HC CDR2 SEQ ID NO: 335 и HC CDR3 SEQ ID NO: 349 CLL-1 CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 322, HC CDR2 SEQ ID NO: 336 и HC CDR3 SEQ ID NO: 350 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 323, HC CDR2 SEQ ID NO: 337 и HC CDR3 SEQ ID NO: 351 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 324, HC CDR2 SEQ ID NO: 338 и HC CDR3 SEQ ID NO: 352 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 325, HC CDR2 SEQ ID NO: 339 и HC CDR3 SEQ ID NO: 353 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 326, HC CDR2 SEQ ID NO: 340 и HC CDR3 SEQ ID NO: 354 CLL-1 CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 327, HC CDR2 SEQ ID NO: 341 и HC CDR3 SEQ ID NO: 355 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанная в настоящем описании (например, CAR-нуклеиновой кислоты или CAR-полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 440, LC CDR2 SEQ ID NO: 454 и LC CDR3 SEQ ID NO: 468 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 441, LC CDR2 SEQ ID NO: 455 и LC CDR3 SEQ ID NO: 469 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 442, LC CDR2 SEQ ID NO: 456 и LC CDR3 SEQ ID NO: 470 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 443, LC CDR2 SEQ ID NO: 457 и LC CDR3 SEQ ID NO: 471 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 444, LC CDR2 SEQ ID NO: 458 и LC CDR3 SEQ ID NO: 472 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 445, LC CDR2 SEQ ID NO: 459 и LC CDR3 SEQ ID NO: 473 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 446, LC CDR2 SEQ ID NO: 460 и LC CDR3 SEQ ID NO: 474 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 447, LC CDR2 SEQ ID NO: 461 и LC CDR3 SEQ ID NO: 475 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 448, LC CDR2 SEQ ID NO: 462 и LC CDR3 SEQ ID NO: 476 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 449, LC CDR2 SEQ ID NO: 463 и LC CDR3 SEQ ID NO: 477 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 450, LC CDR2 SEQ ID NO: 464 и LC CDR3 SEQ ID NO: 478 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 451, LC CDR2 SEQ ID NO: 465 и LC CDR3 SEQ ID NO: 479 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 452, LC CDR2 SEQ ID NO: 466 и LC CDR3 SEQ ID NO: 480 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 453, LC CDR2 SEQ ID NO: 467 и LC CDR3 SEQ ID NO: 481 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (НC), выбранные из одной из следующих групп:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 398, HC CDR2 SEQ ID NO: 412 и HC CDR3 SEQ ID NO: 426 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 399, HC CDR2 SEQ ID NO: 413 и HC CDR3 SEQ ID NO: 427 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 400, HC CDR2 SEQ ID NO: 414 и HC CDR3 SEQ ID NO: 428 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 401, HC CDR2 SEQ ID NO: 415 и HC CDR3 SEQ ID NO: 429 CLL-1 -AR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 402, HC CDR2 SEQ ID NO: 416 и HC CDR3 SEQ ID NO: 430 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 403, HC CDR2 SEQ ID NO: 417 и HC CDR3 SEQ ID NO: 431 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 404, HC CDR2 SEQ ID NO: 418 и HC CDR3 SEQ ID NO: 432 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 405, HC CDR2 SEQ ID NO: 419 и HC CDR3 SEQ ID NO: 433 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 406, HC CDR2 SEQ ID NO: 420 и HC CDR3 SEQ ID NO: 434 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 407, HC CDR2 SEQ ID NO: 421 и HC CDR3 SEQ ID NO: 435 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO:-408, HC CDR2 SEQ ID NO: 422 и HC CDR3 SEQ ID NO: 436 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 409, HC CDR2 SEQ ID NO: 423 и HC CDR3 SEQ ID NO: 437 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 410, HC CDR2 SEQ ID NO: 424 и HC CDR3 SEQ ID NO: 438 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 411, HC CDR2 SEQ ID NO: 425 и HC CDR3 SEQ ID NO: 439 181286.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, какие им обычно придают специалисты в данной области техники, к которым имеет отношение настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, схожие или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать при практическом или опытном использовании настоящего изобретения, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. Кроме того, кроме того, материалы, способы и примеры являются только пояснительными и не предназначены для ограничения. Заголовки, подзаголовки или нумерованные или обозначенные буквами элементы, например, (а), (b), (i) и т.д., присутствуют только для облегчения чтения. Использование заголовков или нумерованных или обозначенных буквами элементов в настоящем документе не требует, чтобы стадии или элементы выполнялись в алфавитном порядке или чтобы стадии или элементы обязательно отделялись друг от друга. Другие особенности, цели и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Приведенное далее подробное описание предпочтительных воплощений изобретения будут лучше пониматься при чтении в сочетании с прилагаемыми чертежами. В целях пояснения изобретения на чертежах показаны воплощения, которые предпочтительны в настоящее время. Однако следует представлять, что изобретение не ограничивается точным определенным порядком и оснащением воплощений, показанных на чертежах.
Фигура 1, включающая фигуры 1А, 1В и 1С, представляет собой ряд отображений, показывающих уровни люциферазы в мишень-положительных (PL21, THP1, HL60, U937) или мишень-отрицательных (К562) клеточных линиях, смешанных с клеточной линией JNL, трансдуцированной анти-CLL-1 CAR.
Фигура 2, включающая фигуры 2А, 2В и 2С, представляет собой ряд отображений, показывающих экспрессию CAR, определенную FACS, в клеточной линии JNL, трансдуцированной анти-CLL-1 CAR.
Фигура 3, включающая фигуры 3А и 3В, представляет собой ряд отображений, показывающих гистограммы относительной интенсивности флуоресценции по FACS, показавшему процент трансдуцированных Т-клеток. Фигура 3А показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием белка L. Фигура 3В показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием рекомбинантного белка CLL-1.
Фигура 4, включающая фигуры 4А, 4В и 4С, представляет собой ряд отображений, показывающих анти-CLL-1-CART-клеточный киллинг люциферизованных клеток PL21 (фиг. 4A), HL60 (фиг. 4B) и U87 (фиг. 4C).
Фигура 5, включающая фигуры 5А, 5В и 5С, представляет собой ряд отображений, показывающих продуцирование цитокинов в клетках CART-CLL-1. Нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) используют в качестве неспецифического контроля для фоновых действий Т-клеток. Измеряют TNF-альфа (фиг. 5A), IL-2 (фиг. 5B) и интерферон (IFN)-гамма (фиг. 5C).
low
dim
Фигура 6 представляет изображение, показывающее, что CLL-1 экспрессируется в большинстве первичных образцов от пациентов с AML (AML бласты «заперты» с использованием стандартных характеристих бокового разброса CD45). CLL-1 измеряют проточной цитометрией с использованием коммерчески доступных антител (клон HIM3-4, eBioscience).
Фигура 7, включающая фигуры 7А и 7В, представляет собой ряд отображений, показывающих эффективность трансдукции Т-клеток, трансдуцированных CAR.
Фигура 8, включающая фигуры 8А и 8В, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL1-CART клетки подвергают специфической дегрануляции CLL1+ клеточные линии и первичные образцы AML. Дегрануляцию CD107 измеряют проточной цитометрией (фиг. 8А). CLL1-CART клетки подвергают специфической дегрануляции ТНР1 и первичные образцы AML и не подвергают контрольную клеточную линию (фиг. 8В).
Фигура 9, включающая фигуры 9А и 9В, представляет собой ряд отображений, показывающих CLL1-CART клетки, продуцирующие TNF-α после инкубации с CLL1+ клеточной линией и первичными образцами AML.
Фигура 10, включающая фигуры 10А и 10В, представляет собой ряд отображений, показывающих CLL1-CART клетки, продуцирующие IL-2 после инкубации с CLL1+ клеточной линией и первичными образцами AML.
Фигура 11, включающая фигуры 11-11D, представляет собой ряд отображений, показывающих CLL1-CART клетки, специфически убивающие с CLL1+ клеточные линии MOLM14 и THP-1 и первичные образцы AML. CLL1-CART клетки приводят к специфическому лизису MOLM14 (фиг. 11D), THP-1 (фиг. 11A) и первичного образца AML (фиг. 11B), и не приводят к лизису контрольной клеточной линии JEKO (фиг. 11C), при указанных отношениях E:T.
Фигура 12, включающая фигуры 12А и 12В, представляет собой ряд отображений, показывающих быструю пролиферацию CLL-1-CART клеток в ответ на MOLM14, THP-1 и первичные образцы AML.
Фигура 13 представляет собой изображение, иллюстрирующее схематическую диаграмму анализа токсичности кроветворных стволовых клеток с использованием аутологичных ксенотрансплантатов.
Фигура 14, включающая фигуры 14А, 14В и 14С, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL-1 экспрессируется на различных миелоидных клеточных линиях и В-клетках у гуманизированных мышей. Показаны характерные схемы FACS анализа периферической крови одной мыши (фиг. 14А). CLL-1 экспрессируется на моноцитах (CD14+ клетки), миелоидных клетках (CD33+ и CD123+ клетки), B-клетках (CD19+ клетки), но не на тромбоцитах (CD41+ клетки) или T-клетках (CD3+ клетки). Показаны характерные гистограммы (фиг. 14B). Показано схематическое представление результатов анализа периферической крови у 24 мышей (фиг. 14C).
Фигура 15, включающая фигуры 15А, 15В, 15С и 15D, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL-1 экспрессируется на различных миелоидных клеточных линиях и В-клетках у гуманизированных мышей.
Фигура 16, включающая фигуры 16А, 16В, 16С и 16D, представляет собой ряд отображений, показывающих, что CLL-1 экспрессируется на различных миелоидных клетках-предшественниках и стволовых кроветворных клетках у гуманизированных мышей.
Фигура 17 представляет собой принципиальную схему анализа на токсичность стволовых кроветворных клеток CLL-1-CART клеток с использованием ксенотрансплантатов гуманизированной иммунной системы (HIS).
Фигура 18, включающая фигуры 18А и 18В, представляет собой ряд отображений, показывающих анализ костного мозга через 4 недели после инфузии CLL-1-CART клеток. Анализ методом проточной цитометрии выполнен в компоненте CD34+CD38- (кроветворные стволовые клетки) (фиг. 18A) и компоненте CD34+CD38+ (клетки-предшественники) (фиг. 18B).
Фигура 19, включающая фигуры 19А, 19В, 19С, 19D и 19Е, представляет собой ряд отображений, показывающих анализ костного мозга через 4 недели после Т-клеток.
Фигура 20 представляет собой изображение результатов анализа костного мозга у мышей HIS через 4 недели после Т-клеток. Показана токсичность кроветворных стволовых клеток CLL-1-CART клеток с использованием трансплантатов HIS.
Фигура 21, включающая фигуры 21А, 21В, 21С, 21D и 21Е, представляет собой ряд отображений, показывающих анализ костного мозга у мышей HIS через 4 недели после Т-клеток. Показаны характерные отображения костного мозга мышей, обработанных различными CART клетками.
Фигура 22, включающая фигуры 22А и 22В, представляет собой ряд гистограмм, показывающих относительную интенсивность флуоресценции из FACS анализа, показывающую процент трансдуцированных Т-клеток. Фигура 22А показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием белка L. 22В показывает детекцию экспрессии CART в первичных Т-клетках с использованием рекомбинантного белка CLL-1.
Фигура 23, включающая фигуры 23А и 23В, представляет собой две диаграммы, показывающие способность к пролиферации клеток CLL-1-CART при выращивании с клетками-мишенями.
Фигура 24 представляет собой график, показывающий развитие болезни AML на модели с ксенотрансплантатом PL-21-luc после обработки CLL-1-CART клетками. Средняя биолюминесценция (+/- SEM) опухолевых клеток, показывающая нагрузку на все животное, показана в виде фотон/секунда (ф/с) ROI (интересующий участок), которым является вся мышь.
+
+
+
Фигура 25, включающая фигуры 25А и 25В, представляет собой две диаграммы, показывающие количественное определение CD4 (фиг. 25A) и CD8 (фиг. 25B) CAR T-клеток в периферической крови мышей с опухолью PL-21-luc.
+
+
+
+
P
P
Фигура 26, включающая фигуры 26А, 26В, 26С и 26D, представляет собой столбиковую диаграмму количественного определения CD4 T-клеток (фиг. 26A), CD4 CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 26B), CD8 T-клеток (фиг. 26C) и CD8 CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 26D) в костном мозгу мышей с опухолью PL-21-luc. Показано среднее число T-клеток (+/- SEM) на миллион клеток костного мозга. Значимость вычисляют однофакторным ANOVA и выражают в виде *<0,05 и **<0,01.
+
+
+
+
P
P
Фигура 27, включающая фигуры 27А, 27В, 27С и 27D, представляет собой столбиковую диаграмму количественного определения CD4 T-клеток (фиг. 27A), CD4 CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 27B), CD8 T-клеток (фиг. 27C) и the CD8 CLL-1-CAR-экспрессирующих T-клеток (фиг. 27D) в селезенке мышей с опухолью PL-21-luc. Показано среднее число T-клеток (+/- SEM) на миллион спленоцитов. Значимость вычисляют однофакторным ANOVA и выражают в виде *<0,05 и **<0,01.
Фигура 28, включающая фигуры 28А, 28В, 28С и 28D, показывает, что лечение с индукционной химиотерапией и затем CLL-1-CAR-клетками приводит к уничтожению лейкоза в первичных ксенотрансплантатах AML. Фигура 28А является схематической иллюстрацией экспериментальной схемы комбинированной терапии из химиотерапии и CLL-1-CAR-клеток в первичных ксенотрансплантатах AML. Фигура 28В представляет собой столбиковую диаграмму, показывающую среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) CLL-1 в лейкозных клетках (компартмент живых huCD495dim). Фигура 28С представляет собой график, показывающий количественное определение числа лейкозных бластов в периферической крови на 1 мкл периферической крови (среднее +/- SD) в различные моменты времени после инъекции AML как указано. Стрелки обозначают введение Ara-C (тонкие стрелки) и введение Т-клеток (нетрансдуцированных или CLL-1-CAR-экспрессирующих Т-клеток, толстые стрелки). Фигура 28D представляет собой график, показывающий продолжительность существования трансплантатов AML.
Фигура 29, включающая фигуры 29А, 29В, 29С, 29D и 29Е, показывает различные конфигурации отдельного вектора, например, где shРНК регулируется U6 положительно или отрицательно CAR-кодирующими элементами, регулируемыми EF1-альфа. В примерах конструкций, отображенных на фиг. 29А и 29В, транскрипция происходит через промоторы U6 и EF1-альфа в одном и том же направлении. В примерах конструкций, отображенных на фиг. 29С и 29D, транскрипция происходит через промоторы U6 и EF1-альфа в различных направлениях. На фигуре 29Е shРНК (и соответствующий промотор U6) находится в первом векторе, и CAR (и соответствующий промотор EF1-альфа) находится во втором векторе.
Фигура 30 отображает структуры двух примеров конфигураций RCAR. Антигенсвязывающие члены включают антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен-переключатель. Внутриклеточные связывающие элементы включают домен-переключатель, костимулирующий сигнальный домен и первичный сигнальный домен. Две конфигурации показывают, что первый и второй домены-переключатели, описанные в настоящем описании, могут находиться в различной ориентации по отношению к антигенсвязывающему элементу и внутриклеточному связывающему элементу. В настоящем описании дополнительно описаны другие конфигурации RCAR.
Фигура 31 показывает, что пролиферация CAR-экспрессирующих трансдуцированных Т-клеток усиливается малой дозой в системе культивирования клеток. CARТ сокультивируются с клетками Nalm-6 в присутствии различных концентраций RAD001. Число CAR-положительных CD3-положительных Т-клеток (черные столбики) и всех Т-клеток (светлые столбики) оценивают через 4 дня после сокультивирования.
Фигура 32 отображает измерения роста опухоли клеток NALM-6-luc с ежедневным дозированием 0,3, 1, 3 и 10 мкг/кг (mpk) RAD001 или дозированием среды. Кружочки относятся к среде; квадраты обозначают дозу RAD001 10 мг/кг; треугольники обозначают дозу RAD001 3 мг/кг; перевернутые треугольники обозначают дозу RAD001 1 мг/кг; и ромбы обозначают дозу RAD001 0,3 мг/кг.
Фигура 33, включающая фигуры 33А и 33В, показывает фармакокинетические кривые, показывающие количество RAD001 в крови мышей NSG с опухолями NALM6. Фиг. 33А показывает РК в день 0 после первой дозы RAD001. Фиг. 33В показывает РК в день 14 после последней дозы RAD001. Ромбы обозначают дозу RAD001 0,3 мг/кг; квадраты обозначают дозу RAD001 1 мг/кг; треугольники обозначают дозу RAD001 3 мг/кг; и х обозначают дозу RAD001 10 мг/кг.
+
+
Фигура 34, включающая фигуры 34А и 34В, показывает пролиферацию in vivo гуманизированных CD19-CART клеток с дозированием RAD001 и без него. Малые дозы RAD001 (0,003 мг/кг) ежедневно ведут к усилению пролиферации CAR-T клеток выше нормального уровня пролиферации huCAR19. Фигура 34А показываетCD4 CAR T-клетки; фиг. 34B показываетCD8 CAR T-клетки. Кружочки обозначают PBS; квадраты обозначают huCTL019; треугольники обозначают huCTL019 с 3 мг/кг RAD001; перевернутые треугольники обозначают huCTL019 с 0,3 мг/кг RAD001; ромбы обозначают huCTL019 с 0,03 мг/кг RAD001; и темные кружочки обозначают huCTL019 с 0,003 мг/кг RAD001.
Подробное описание
Определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же самые значения, какие им обычно придают специалисты в данной области техники, к которым имеет отношение изобретение.
Неопределенные артикли единственного числа относятся к одному или более чем одному (т.е., по меньшей мере одному) из грамматических объектов работы. Как пример, «(аn) элемент» обозначает один элемент или более одного элемента.
Термин «примерно», когда относится к измеряемой величине, такой как количество, протяженность во времени и т.п., предназначен для включения вариаций±20%, или в некоторых случаях±10%; или в некоторых случаях±5%; или в некоторых случаях±1%; или в некоторых случаях±0,1% от указанной величины, когда такие вариации подходят для раскрытых способов.
Термин «химерный антигенный рецептор» или, с другой стороны, «CAR» относится к рекомбинантной полипептидной конструкции, включающей по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном описании «внутриклеточным сигнальным доменом»), включающий функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы, определенной ниже. В некоторых воплощениях домены в полипептидной конструкции CAR находятся в одной и той же полипептидной цепи, например, включают химерный слитый белок. В некоторых воплощениях домены в полипептидной конструкции CAR не сопряжены с другими, например, находятся в различных полипептидных цепях, например, как предоставлены в RCAR, описанной ниже.
В одном аспекте стимулирующая молекула CAR представляет собой дзета-цепь, связанную с комплексом Т-клеточных рецепторов. В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен включает первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3-дзета). В одном аспекте цитоплазматический сигнальный домен дополнительно включает один или несколько функциональных сигнальных доменов, образованных от по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, определенной ниже. В одном аспекте костимулирующую молекулу выбирают из 4 1BB (т.е., CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий функциональный сигнальный домен, происходящий от костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий функциональные сигнальные домены, происходящие от одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домены, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает химерный слитый белок, включающий внеклеточный узнающий антиген домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, происходящих от одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домены, происходящий от стимулирующей молекулы. В одном аспекте CAR включает необязательную лидерную последовательность по аминоконцу (N-ter) слитого белка CАR. В одном аспекте CAR включает дополнительно лидерную последовательность по N-концу внеклеточного узнающего антиген домена, причем лидерная последовательность необязательно отщепляется от узнающего антиген домена (например, ак scFv) во время клеточного процессинга и локализации CAR на клеточной мембране.
CAR, который включает антигенсвязывающий домен (например, scFv), однодоменное антитело или TCR (например, домен, связывающий TCR-альфа, или домен, связывающий TCR-бета), который специфически связывает специфический опухолевый маркер Х, где Х может представлять собой опухолевый маркер, описанный в настоящем описании, также называют XCAR. Например, CAR, который включает антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, называют CLL-1-CAR. CAR может экспрессироваться в любой клетке, например, иммунной эффекторной клетке, как описано в настоящем описании (например, Т-клетке или NK-клетке).
Термин «сигнальный домен» относится к функциональной части белка, которая действует путем передачи информации в клетке для регулирования клеточной активности через определенные пути передачи сигнала путем генерации вторичных мессенджеров или функционируя как эффекторы, реагируя на такие мессенджеры.
Используемый в настоящем описании термин «CLL-1» относится к лектиноподобной молекуле 1 С-типа, которая является антигенной детерминантной, обнаруживаемой в предшественниках лейкозных клеток и в здоровых иммунных клетках. Лектиноподобная молекула 1 С-типа (CLL-1) также известна как MICL, CLEC12A, CLEC-1, лектин 1, ассоциированный с дендритными клетками, и DCAL-2. Человеческие и мышиные аминокислотные и нуклеотидные последовательности можно найти в общедоступной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотную последовательность человеческого CLL-1 можно найти в UniProt/Swiss-Prot, инвентарный № Q5QGZ9, и нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий CLL-1, можно найти под инвентарными №№ NM 001207010.1, NM 138337.5, NM 201623.3 и NM 201625.1. В одном воплощении антигенсвязывающая часть CAR узнает и связывает эпитоп во внеклеточном домене белка CLL-1 или его фрагменте. В одном воплощении белок CLL-1 экспрессируется в раковой клетке.
Термин «антитело», используемый в настоящем описании, относится к белку или полипептидной последовательности, происходящей от молекулы иммуноглобулина, который специфически связывается с антигеном. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными, многоцепочечными и одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами и могут быть образованы от природных источников или от рекомбинантных источников. Антитела могут представлять собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов.
2
Термин «фрагмент антитела», используемый в настоящем описании, относится к по меньшей мере одной части интактного антитела или его рекомбинантных вариантов и относится к антигенсвязывающему домену, например, вариабельному участку, определяющему антигенность интактного антитела, которая является достаточной для придания способности к узнаванию и специфического связывания фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются перечисленным фрагменты Fab, Fab', F(ab') и Fv, фрагменты антитела scFv, линейные антитела, камелидные VHH домены и полиспецифические молекулы, образованные из фрагментов антител, таких как двухвалентный фрагмент, включающий два или больше, например, два, Fab-фрагментов, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирном участке, или два или больше, например, два, изолированных CDR или других соединенных эпитопсвязывающих фрагментов антитела. Фрагменты антител также могут быть включены в одноцепочечные доменные антитела, макситела, минитела, нанотела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger и Hudson, Nature Biotechnology, 23: 1126-1136, 2005). Фрагменты антител также могут быть привиты на каркасы на основе полипептидов, такие как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описываются фибронектиновые полипептидные минитела).
Термин «scFv» относится к слитому белку, включающему по меньшей мере одни фрагмент антитела, включающий вариабельный участок легкой цепи, и по меньшей мере одни фрагмент антитела, включающий вариабельный участок тяжелой цепи, причем вариабельные участки легкой и тяжелой цепи тесно связаны через короткий жесткий пептидный линкер, и способный экспрессироваться как одноцепочечный полипептид, и при этом scFv сохраняет специфичность интактного антитела, от которого он образован. Если не определено точно, при использовании в настоящем описании scFv может иметь вариабельные участки VL и VH в любом порядке, например, относительно Т- и С-концов полипептида, scFv может включать VL-линкер-VH или VH-линкер-VL.
Термин «участок, определяющий комплементарность» или «CDR», используемый в настоящем описании, относится к последовательностям аминокислот в вариабельных участков антитела, которые придают антигенспецифичность и аффинность связывания. Например, вообще имеются три CDR в каждом вариабельном участке тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и HCCDR3) и три CDR в каждом вариабельном участке легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и LCCDR3). Точные границы аминокислотных последовательностей данного CDR можно определить с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включая схемы, описанные Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации «Кабат»), Al-Lazikani et al., (1997), JMB 273, 927-948 (схема нумерации «Чотиа»), или их комбинации. По схеме нумерации по Кабату в некоторых воплощениях аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) нумеруются 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) нумеруются 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), и 89-97 (LCDR3). По схеме нумерации по Чотиа в некоторых воплощениях аминокислоты CDR в VH нумеруются 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки CDR в VL нумеруются 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). В комбинированной схеме нумерации по Кабату и Чотиа в некоторых воплощениях CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR по Кабату, CDR по Чотиа или по той и другой схеме. Например, в некоторых воплощениях CDR соответствуют аминокислотным остаткам 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в VH, например, VH млекопитающего, например, VH человека; и аминокислотным остаткам 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в VL, например, VL млекопитающего, например, VL человека.
Часть композиции CAR по изобретению, включающая антитело или фрагмент антитела, может существовать в различных формах, например, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется как часть полипептидной цепи, включая, например, фрагмент однодоменного антитела (sdAB), одноцепочечное антитело (scFv), например, человеческого антитела (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном аспекте антигенсвязывающий домен композиции CAR по изобретению включает фрагмент антитела. В другом аспекте CAR включает фрагмент антитела, который включает scFv.
Термин «связывающий домен», используемый в настоящем описании, или «молекула антитела» (также называемая в настоящем описании «анти-мишень (например, CLL-1) связывающий фрагмент») относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, включающим по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термин «связывающий домен» или «молекула антитела» охватывает антитела и фрагменты антител. В одном воплощении молекула антитела представляет собой молекулу полиспецифического антитела, например, она включает несколько последовательностей вариабельного домена иммуноглобулина, причем первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из нескольких имеет специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из нескольких имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичность в отношении не более двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая имеет специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа.
Термин «тяжелая цепь антитела» относится к более крупной из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях, и которая обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.
Термин «легкая цепь антитела» относится к меньшей цепи из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие цепи каппа (κ) и лямбда (λ) относятся к двум основным изотипам легкой цепи антитела.
Термин «рекомбинантное антитело» относится к антителу, которое получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК, такие как, например, антитело, экспрессируемое экспрессирующей системой бактериофагов или дрожжей. Термин также следует истолковывать как обозначающий антитело, которое получено синтезом молекулы ДНК, кодирующей антитело, и молекула такой ДНК экспрессирует белок антитело или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где ДНК или аминокислотную последовательность получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК или аминокислотных последовательностей, которые доступны и хорошо известны в технике.
Термин «антиген» или «Ag» относится к молекуле, которая вызывает иммунную реакцию. Иммунная реакция может включать или продуцирование антител или активацию специфических иммунокомпетентных клеток или то и другое. Специалистам в данной области техники будет понятно, что любая макромолекула, включая фактически все белки или пептиды, может служить в качестве антигена. Более того, антигены могут быть образованы из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалистам в данной области техники будет понятно, что любая ДНК, которая включает нуклеотидные последовательности или неполную нуклеотидную последовательность, кодирующие белок, который вызывает иммунную реакцию на них, кодирует «антиген», как этот термин используется в настоящем описании. Кроме того, специалистам в данной области техники будет понятно, что антиген необязательно кодируется только полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Достаточно очевидно, что настоящее изобретение включает, но не ограничивается перечисленным, применение неполных нуклеотидных последовательностей более одного гена, и что такие нуклеотидные последовательности выстраиваются в различных комбинациях для кодирования полипептидов, которые выявляют нужную иммунную реакцию. Более того, специалистам в данной области техники будет понятно, что антиген совсем необязательно кодируется «геном». Достаточно очевидно, что антиген можно получить синтетически или можно получить из биологического образца, или он может представлять собой макромолекулу помимо полипептида. Такой биологический образец может включать, но не ограничиваться перечисленным, образец ткани, образец опухоли, клетки или жидкость с другими биологическими компонентами.
Термин «противоопухолевое действие» относится к биологическому действию, которое может проявиться различными путями, включая, но не ограничиваясь перечисленным, например, снижение объема опухоли, снижение числа опухолевых клеток, снижение числа метастазов, увеличение вероятной продолжительности жизни, снижение пролиферации опухолевых клеток, снижение выживания опухолевых клеток или облегчение различных физиологических симптомов, связанных с раковым состоянием. «Противоопухолевое действие» также может проявиться способностью пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител по изобретению предупреждать появление опухоли в первую очередь.
Термин «аутологичный» относится к любому материалу, полученному от одного и того же индивидуума, которому позднее его вводят.
Термин «аллогенный» относится к любому материалу, полученному от другого животного того же вида, что и индивидуум, которому материал вводят. Двух или больше индивидуумов называют аллогенными друг другу, когда гены в одном или нескольких локусах не являются идентичными. В некоторых аспектах аллогенный материал от индивидуумов одного и того же вида может в значительной степени не подходить для антигенного взаимодействия.
Термин «ксеногенный» относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.
Термин «аферез», используемый в настоящем описании, относится к признанному в данной области техники экстракорпоральному способу, с помощью которого кровь донора или пациента берут у донора или пациента и пропускают через аппарат, который отделяет выбранную(ые) определенную(ые) составляющую(ие) крови и возвращает остальное в кровоток донора или пациента, например, ретрансфузией. Таким образом, в контексте «аферезный образец» относится к образцу, полученному с использованием афереза.
Тераин «комбинация» относится или к фиксированной комбинации в одной лекарственной форме или к комбинированному введению, когда соединение по настоящему изобретению и партнера по комбинации (например, другое лекарственное средство, как поясняется ниже, также называемое «терапевтическим средством» или «соагентом») могут вводиться независимо в одно и то же время или раздельно с временными интервалами, в особенности, когда такие временные интервалы учитывают, что партнеры по комбинации показывают совместное, например, синергитическое действие. Отдельные компоненты могут упаковываться в наборе или по отдельности. Один или оба компонента (например, порошки или жидкости) могут восстанавливаться или разбавляться до нужной дозы перед введением. Термины «совместное введение» или подобные, используемые в настоящем описании, предназначены для включения введения выбранного партнера по комбинации отдельному субъекту, нуждающемуся в этом (например, пациенту), и предназначены для включения схем приема лекарственных средств, в которых средства необязательно вводятся одинаковым путем введения или в одно и то же время. Термин «фармацевтическая композиция», используемый в настоящем описании, обозначает продукт, который является результатом смешивания или объединения более одного активного ингредиента, и включает как фиксированные, так и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин «фиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, например, соединение по настоящему изобретению и партнер по комбинации оба вводятся пациенту одновременно в форме единой сущности или лекарственной формы. Термин «нефиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, например, соединение по настоящему изобретению и партнер по комбинации оба вводятся пациенту в виде отдельных сущностей одновременно, совместно или последовательно без определенного предела по времени, причем такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также применимо для коктейльной терапии, например, введения трех или больше активных ингредиентов.
Термин «рак» относится к заболеванию, характеризуемому быстрым и неуправляемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распределяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных раковых заболеваний описаны в настоящем описании и включают, но не ограничиваются перечисленным, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, цервикальный рак, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почек, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легких и т.п.. Термины «опухоль» и «рак» в настоящем описании используются взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные и жидкие, например, диффузные или переносимые кровотоком опухоли. Используемые в настоящем описании термины «рак» или «опухоль» включают предзлокачественные, а также злокачественные раки и опухоли.
«Полученная из», как этот термин используется в настоящем описании, показывает соотношение между первой и второй молекулой. Как правило, термин относится к структурному сходству между первой и второй молекулой и не означает или не включает ограничение способа или источника первой молекулы, которую получают из второй молекулы. Например, в случае внутриклеточного сигнального домена, который получают из молекулы CD3-дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет достаточную структуру CD3-дзета, так что имеет требуемую функцию, а именно, способность генерировать сигнал в соответствующих условиях. Он не означает или не включает ограничение по определенному способу получения внутриклеточного сигнального домена, например, не означает, что для предоставления внутриклеточного сигнального домена необходимо исходить из последовательности CD3-дзета и делетировать нежелательную последовательность, или улучшить мутации для того, чтобы получить внутриклеточный сигнальный домен.
Выражение «заболевание, связанное с экспрессией CLL-1» включает, но не ограничивается перечисленным, заболевание, связанное с клеткой, которая экспрессирует CLL-1, или состояние, связанное с клеткой, которая экспрессирует CLL-1, включая, например, пролиферативные заболевания, такие как рак или злокачественность, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или неродственное раку показание, связанное с клеткой, которая экспрессирует CLL-1 (например, CLL-1 дикого типа или мутантный). Во избежание сомнений заболевание, связанное с экспрессией CLL-1, может включать состояние, связанное с клеткой, которая в настоящее время не экспрессирует CLL-1, например, поскольку экспрессия CLL-1 регулируется отрицательно, например, из-за лечения молекулой, таргетной для CLL-1, например, ингибитором CLL-1, описанным в настоящем описании, но которая какое-то время экспрессировала CLL-1. В одном аспекте рак, связанный с экспрессией CLL-1, представляет собой рак кроветворной системы. В одном аспекте рак кроветворной системы включает, но не ограничивается перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная лимфома, неходжкинская лимформа, лимфома Беркетта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома). Другие заболевания, связанные с экспрессией CLL-1, включают, но не ограничиваются перечисленным, например, атипичные и/или неклассические раковые заболевания, злокачественности, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, связанные с экспрессией CLL-1. Также могут быть включены неродственные раку показания, связанные с экспрессией CLL-1. В некоторых воплощениях опухолевые антигенэкспрессирующие клетки экспрессируют, или в любое время экспрессируют, мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном воплощении опухолевая антигенэкспрессирующая клетка продуцирует белок опухолевый антиген (например, дикого типа или мутантный), и опухолевый белок антиген может присутствовать на нормальных уровнях или пониженных уровнях. В одном воплощении опухолевая антигенэкспрессирующая клетка продуцирует детектируемые уровни опухолевого белка антигена в один момент и затем продуцирует по существу недетектируемые уровни опухолевого белка антигена.
Термины «консервативные модификации последовательности» или «консервативные замены» относятся к модификациям аминокислот, которые существенно не влияют или не изменяют связывающие характеристики антитела или фрагмента антитела, содержащих аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают замены, присоединения и делеции. Модификации можно ввести в антитело или фрагмент антитела по изобретению стандартными способами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, определены в технике. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или больше аминокислотных остатков в CAR по изобретению можно заменить другими аминокислотными остатками из семейства с такими же боковыми цепями, и измененный CDR можно проверить с использованием функциональных анализов, описанных в настоящем описании.
Термин «стимуляция» относится к первичной реакции, вызванной связыванием стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) с ее родственным лигандом, посредством чего опосредуется событие сигнальной трансдукции, такое как, но без ограничения, сигнальная трансдукция через комплекс TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать измененную экспрессию некоторых молекул, такую как отрицательная регуляция TGF-β, и/или реорганизация цитоскелетных структур, и т.п..
Термин «стимулирующая молекула» относится к молекуле, экспрессированной Т-клеткой, которая обеспечивает первичную(ые) цитоплазматическую(ие) сигнальную(ые) последовательность(и), которая(ые) регулирует(ют) первичную активацию комплекса TCR путем стимуляции в отношении по меньшей мере некоторого аспекта пути передачи сигнала Т-клетками. В одном аспекте первичный сигнал инициируют, например, путем связывания комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, нагруженной пептидом, и которое ведет к опосредованию Т-клеточной реакции, включая, но не ограничиваясь перечисленным, пролиферацию, активацию, дифференцировку и т.п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также называемая «первичным сигнальным доменом»), которая действует путем стимуляции, может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM-содержащей первичной цитоплазматической сигнальной последовательности, которая является отдельным применением в изобретении, включают, но не ограниваются перечисленным, последовательности TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известную как ʺICOSʺ), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12. В специфическом CAR по изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CARS по изобретению включает внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3-дзета. В специфическом CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 9, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п. В специфическом CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3-дзета представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п.
Термин «антигенпрезентирующая клетка» или «АРС» относится к клетке иммунной системы, такой как акцессорная клетка (например, В-клетка, дендритная клетка и т.п.), которая отображает чужеродный антиген в комплексе с главными комплексами гистосовместимости (ГКГС) на своей поверхности. Т-Клетки могут узнавать такие комплексы с использованием своих Т-клеточных рецепторов (TCR). АРС процессируют антигены и представляют их Т-клеткам.
«Внутриклеточный сигнальный домен» как термин, используемый в настоящем описании, относится к внутриклеточной части молекулы. Внутриклеточный сигнальный домен генерирует сигнал, который промотирует иммунную эффекторную функцию CAR-содержащей клетки, например, CART клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, в CART клетке, включают цитолитическую активность и хелперную активность, включая секрецию цитокинов. В воплощениях внутриклеточный сигнальный домен трансдуцирует сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение определенной функции. Хотя может быть использован весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях нет необходимости использовать полную цепь. До степени, до которой используют отсеченную часть внутриклеточного сигнального домена, такую отсеченную часть можно использовать вместо интактной цепи до тех пор, пока она трансдуцирует сигнал эффекторной функции. Таким образом, термин «внутриклеточный сигнальный домен» означает включение любой отсеченной части внутриклеточного сигнального домена, достаточной для трансдукции сигнала эффекторной функции.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен может включать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Примеры первичных внутриклеточных сигнальных доменов включают домены, полученные из молекул, ответственных за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен может включать костимулирующий внутриклеточный домен. Примеры костимулирующих внутриклеточных сигнальных доменов включают домены, полученные из молекул, ответственных за костимулирующие сигналы или антигеннезависимую стимуляцию. Например, в случае CART первичный внутриклеточный сигнальный домен может включать цитоплазматическую последовательность Т-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может включать цитоплазматическую последовательность из корецептора или костимулирующей молекулы.
Первичный внутриклеточный сигнальный домен может включать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM-содержащих первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают, но не ограничиваются перечисленным, последовательности, полученные из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как «ICOS»), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12.
Термин «дзета» или альтернативно «дзета-цепь», «CD3-дзета» или «TCR-дзета» определяется как белок, предоставленный GenBank, инв. № BAG36664.1, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п., и «дзета стимулирующий домен» или альтернативно «CD3-дзета стимулирующий домен» или «TCR-дзета стимулирующий домен» определяется как аминокислотные остатки из цитоплазматического домена дзета-цепи, которые являются достаточными для функциональной передачи начального сигнала, необходимого для активации Т-клеток. В одном аспекте цитоплазматический домен дзета включает остатки с 52 по 164 из GenBank, инв. № BAG36664.1, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п., которые являются их функциональными ортологами. В одном аспекте «дзета стимулирующий домен» представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 9. В одном аспекте «дзета стимулирующий домен» или «CD3-дзета стимулирующий домен» представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 10.
Термин «костимулирующая молекула» относится к близкому партнеру по связыванию на Т-клетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, посредством чего опосредуется костимулирующая реакция с помощью Т-клетки, такая как, но без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности иные, чем антигенные рецепторы или их лиганды, которые требуются для эффективной иммунной реакции. Костимулирующие молекулы включают, но не ограничиваются перечисленным, молекулу класса I ГКГС, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Толл-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83.
Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы.
Внутриклеточный сигнальный домен может включать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которой его получают, или его функциональный фрагмент.
Термин «4-1ВВ» относится к члену суперсемейства TNFR с аминокислотной последовательностью, представленной в GenBank, инв. № AAA62478.2, или эквивалентными остатками от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п.; и «4-1ВВ костимулирующий домен» определяется как аминокислотные остатки GenBank, инв. № AAA62478.2, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п.. В одном аспекте «4-1ВВ костимулирующий домен» представляет собой последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7, или эквивалентные остатки от видов, не являющихся человеком, например, мыши, грызуна, обезьяны и т.п..
«Иммунная эффекторная клетка» как термин, используемый в настоящем описании, относится к клетке, которая вовлечена в иммунную реакцию, например, в промотирование иммунной эффекторной реакции. Примеры иммунных эффекторных клеток включают Т-клетки, например, альфа/бета Т-клетки и гамма/дельта Т-клетки, В-клетки, природные киллерные (NK) клетки (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.
«Иммунная эффекторная функция или иммунная эффекторная реакция» как термин, используемый в настоящем описании, относится к функции или реакции, например, иммунной эффекторной клетки, которая усиливает или промотирует иммунную атаку клетки-мишени. Например, иммунная эффекторная функция или реакция относится к свойству Т- или NK-клетки промотировать киллинг или ингибирование роста или пролиферации клетки-мишени. В случае Т-клетки примерами эффекторной функции или реакции являются первичная стимуляция и костимуляция.
Термин «эффекторная функция» относится к определенной функции клетки. Эффекторной функцией Т-клетки, например, может являться цитолитическая активность или хелперная активность, включая секрецию цитокинов.
Термин «кодирование» относится к неотъемлемому свойству специфической последовательности нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, для служения в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих или определенную последовательность нуклеотидов (например, рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, проистекающие из этого. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей такому гену, продуцирует белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно предоставляется в списках последовательностей, так и некодирующая цепь, используемые в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут называться кодирующими белок или другой продукт такого гена или кДНК.
Если не оговорено иное, «нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность» включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга, и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Выражение «нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК, также может включать интроны» означает, что нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в каком-то варианте содержать интрон(ы).
Термины «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» используются в настоящем описании как взаимозаменяемые и относятся к количеству соединения, препарата, материала или композиции, описанных в настоящем описании, эффективному для достижения определенного биологического результата.
Термин «эндогенный» относится к любому материалу от или полученному в организме, клетке, ткани или системе.
Термин «экзогенный» относится к любому материалу от или полученному вне организма, клетки, такни или системы.
Термин «экспрессия» относится к транскрипции и/или трансляции определенной нуклеотидной последовательности, полученной с помощью промотора.
Термин «трансферный вектор» относится к композиции вещества, которая включает изолированную нуклеиновую кислоту, и которую можно использовать для доставки нуклеиновой кислоты в клетку. В технике известно много векторов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, линейные полинукелеотиды, полинукелеотиды, связанные с ионногенными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин «трансферный вектор» включает автономно реплицирующиеся плазмиду или вирус. Термин также следует истолковывать как включающий дополнительно неплазмидные и невирусные соединения, которые облегчают перенос нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое производное, липосома и т.п. Примеры вирусных трансферных векторов включают, но не ограничиваются перечисленным, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т.п.
Термин «экспрессирующий вектор» относится к вектору, включающему рекомбинантный полинуклеотид, включающий экспрессирующие регулярные последовательности, оперативно соединенные с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. Экспрессирующий вектор включает достаточные цис-действующие элементы для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут быть предоставлены клеткой-реципиентом или в in vitro экспрессирующей системе. Экспрессирующие векторы включают все векторы, известные в технике, включая космиды, плазмиды (например, открытые или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые включают рекомбинантный полинуклеотид.
Термин «лентивирус» относится к роду семейства Retroviridae. Лентивирусы уникальны среди ретровирусов по способности инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-реципиента, так что они являются одним из наиболее эффективных способов доставки вектора в ген. Примерами лентивирусов являются HIV, SIV и FIV.
Термин «лентивирусный вектор» относится к вектору, полученному из по меньшей мере части лентивирусного генома, включая в особенности самоинактивирующийся лентивирусный вектор, описанный в Milone et al., Mol. Ther., 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые можно использовать в клинических условиях, включают, но не ограничиваются перечисленным. например, технологию доставки генов LENTIVECTOR от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от Lentigen и т.п.. Неклинические типы векторов также доступны и должны быть известны специалистам в данной области техники.
Термин «гомологичность» или «идентичность» относится к идентичности субъединиц последовательности двух полимерных молекул, например, двух молекул нуклеиновых кислот или двух молекул РНК или двух полипептидных молекул. Когда позиция субъединицы в обеих из двух молекул занята одной и той же мономерной единицей, например, если позиция в каждой из двух молекул ДНК занята аденином, тогда они являются гомологичными или идентичными в этой позиции. Гомология между двумя последовательностями является прямой функцией числа совпадений или гомологичных позиций; например, если половина (например, пять позиций в полимере длиной в десять субъединиц) позиций в двух последовательностях являются гомологичными, две последовательности являются гомологичными на 50%; если 90% позиций (например, 9 из 10) совпадают или являются гомологичными, две последовательности являются гомологичными на 90%.
«Гуманизированные» формы не являющихеся человеческими (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2, или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части, гуманизированные антитела и фрагменты таких антител представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из определяющего комплементарность участка (CDR) реципиента заменяются остатками из CDR вида, не относящегося к человеку, такого как мышь, крыса или кролик, имеющего желательную специфичность, аффинность и потенциал. В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Более того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может включать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителе реципиента, ни в введенном CDR или каркасных последовательностях. Такие модификации могут дополнительно улучшать и оптимизировать действии антитела или фрагмента антитела. Вообще гуманизированное антитело или фрагмент такого антитела будет включать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина, и все или значительная часть участков FR представляют собой участки последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент такого антитела также может включать по меньшей мере часть константного участка (Fc) иммуноглобулина, типично участка иммуноглобулина человека. Другие подробности см. в Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.
«Полностью человеческий» относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, где вся молекула человеческого происхождения или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела или иммуноглобулина.
Термин «изолированный» означает измененный или извлеченный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, присутствующие по природе в живом организме, не являются «изолированными», но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отдельные от материалов, с которыми совместно существуют в своем природном состоянии, являются «изолированными». Изолированные нуклеиновая кислота или белок могут существовать по существу в чистой форме или могут существовать в ненативной окружающей среде, такой как, например, клетка-реципиент.
В контексте настоящего изобретения используются приведенные далее аббревиатуры для обычно используемых нуклеотидных оснований. «А» относится к аденозину, «С» относится к цитозину, «G» относится к гуанозину, «Т» относится к тимидину и «U» относится к уридину.
Термин «операбельно соединенный» или «транскрипционный контроль» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной нуклеотидной последовательностью, полученной при экспрессии последней. Например, первая нуклеотидная последовательность операбельно соединена со второй нуклеотидной последовательностью, когда первая нуклеотидная последовательность заменяется в функциональном соотношении второй нуклеотидной последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Операбельно соединенные ДНК-последовательности могут соприкасаться друг с другом и, например, где необходимо, соединять два кодирующих белок участка, находятся в одной и той же рамке считывания.
Термин «парентеральное» введение иммуногенной композиции включает, например, подкожную (s/c), внутривенную (i.v.) или интрастернальную инъекцию, внутриопухолевые или инфузионные методы.
Термин «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотид» относятся к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют свойства связывания, схожие с эталонной нуклеиновой кислотой, и метаболизируются подобно нуклеотидам, встречающимся в природе. Если не указано иное, определенная нуклеотидная последовательность также косвенно охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденного кодона), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также точно указанную последовательность. Конкретно замен вырожденного кодона можно достигнуть путем генерации последовательностей, в которых третья позиция одного или нескольких (или всех) выбранных кодонов заменена смешанными основными и/или дезоксинозиновыми остатками (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260: 2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8: 91-98 (1994)).
Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются как взаимозаменяемые и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно соединенных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и нет ограничения по числу аминокислот, которые могут составлять белковую или пептидную последовательность. Полипептиды включают любой пептид или белок, включающий две или больше аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Используемый в настоящем описании термин относится как к коротким цепям, которые обычно в технике называют пептидами, олигопептидами и олигомерами, например, так и к более длинным цепям, которые обычно называют в технике белками, которых существует множество типов. «Полипептиды» включают, например, среди прочих, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептидам, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.
Термин «протомер» относится к ДНК последовательности, узнаваемой синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом, требуемым для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.
Термин «промотор/регуляторная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая требуется для экспрессии генного продукта, операбельно соединенного с промотором/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях такая последовательность может представлять собой коровую промоторную последовательность, и в других случаях такая последовательность также может включать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые требуются для экспрессии генного продукта. Промотор/регуляторная последовательность может представлять собой элемент, который экспрессирует генный продукт в ткани специфически.
Термин «конститутивный» промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда операбельно связана с полинуклеотидом, который кодирует или точно определяет генный продукт, вызывает продуцирование генного продукта в клетке при большинстве или всех физиологических состояниях клетки.
Термин «индуцируемый промотор» относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда операбельно связана с полинуклеотидом, который кодирует или точно определяет генный продукт, вызывает продуцирование генного продукта в клетке по существу только тогда, когда в клетке присутствует индуктор, который соответствует промотору.
Термин «тканеспецифический» промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, когда операбельно связана с полинуклеотидом, который кодирует или точно определяет генный продукт, вызывает продуцирование генного продукта в клетке по существу только если клетка представляет собой клетку ткани типа, соответствующего промотору.
Термин «жесткий полипептидный линкер» или «линкер», используемый в контексте scFv, относится к полипептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как глицин и/или сериновые остатки, используемых отдельно или в комбинации, для соединения вариабельных участков тяжелой и легкой цепи. В одном воплощении жесткий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser и включает аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 38), где n равен положительному числу, равному или превышающему 1. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В одном воплощении жесткие полипептидные линкеры включают, но не ограничивается указанным, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO:27) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO:28). В другом воплощении линкеры включают несколько повторов (Gly2Ser), (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO:29). В объем изобретения также включены линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
7
При использовании в настоящем описании 5'-кэп (также называемый РНК-кэп, РНК-7-метилгуанозиновый кэп или РНК mG-кэп) представляет собой модифицированный нуклеотид гуанин, который добавлен к «фронту» или 5'-концу эукариотной матричной РНК вскоре после начала транскрипции. Состоит 5'-кэп из концевой группы, которая соединяется с первым транскрибированным нуклеотидом. Его присутствие критично для узнавания рибосомой и защиты от РНКаз. Добавление кэпа сочетается с транскрипцией и происходит котранскрипционно, так что одно влияет на другое. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец мРНК, будучи синтезированным, связывается синтезирующим кэп комплексом, связанным с РНК-полимеразой. Такой ферментный комплекс катализирует химические реакции, которые требуются для кэпирования мРНК. Синтез протекает как многостадийная биохимическая реакция. Кэпирующую группу можно модифицировать для модуляции функциональности мРНК, такой как стабильность или эффективность трансляции.
При использовании в настоящем описании «in vitro транскрибированная РНК» относится к РНК, предпочтительно, мРНК, которая синтезирована in vitro. Как правило, in vitro транскрибированную РНК генерируют из транскрипционного вектора in vitro. Транскрипционный вектор in vitro включает матрицу, которую используют для генерации in vitro транскрибированной РНК.
При использовании в настоящем описании «поли(А)» представляет собой ряд аденозинов, присоединенных путем полиаденилирования к мРНК. В предпочтительном воплощении конструкции для временной экспрессии поли-А предпочтительно представляет собой от 50 до 5000 (SEQ ID NO: 30), предпочтительно больше 64, предпочтительнее больше 100, наиболее предпочтительно больше 300 или 400. Последовательности поли(А) иожно модифицировать химически или ферментативно для модуляции функциональности мРНК, такой как локализация, стабильность или эффективность трансляции.
При использовании в настоящем описании «полиаденилирование» относится к ковалентной связи полиаденилильной части или ее модифицированного варианта с молекулой матричной РНК. В эукариотных организмах большинство молекул матричной РНК (мРНК) являются полиаденилированными по 3'-концу. Хвост 3'-поли(А) представляет собой длинную последовательность из адениновых нуклеотидов (обычно нескольких сотен), добавленных к пре-мРНК через действие фермента полиаденилатполимеразы. В высших эукариотах хвост поли(А) добавлен к транскриптам, которые содержат специфическую последовательность сигнал полиаденилирования. Хвост поли(А) и белок, связанный с ним, способствуют защите мРНК от разрушения экзонуклеазами. Полиаденилирование также важно для терминации транскрипции, экспорта мРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре непосредственно после транскрипции ДНК в РНК, но кроме того, также может происходить позднее в цитоплазме. После терминации транскрипции цепь мРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, ассоциированного с РНК-полимеразой. Сайт расщепления обычно характеризуется присутствием последовательности оснований AAUAAA вблизи сайта расщепления. После расщепления мРНК аденозиновые остатки присоединяются к свободному 3'-концу в сайте расщепления.
При использовании в настоящем описании «временная» относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение часов, дней или недель, где период времени экспрессии меньше, чем период времени экспрессии гена, если интегрирован в геном или содержится в устойчивом плазмидном репликоне в клетке-хозяине.
Используемые в настоящем описании термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к ослаблению или уменьшению интенсивности развития, тяжести и/или длительности пролиферативного расстройства или уменьшению интенсивности одного или нескольких симптомов (предпочтительно одного или нескольких видимых симптомов) пролиферативного расстройства, в результате введения одной или нескольких терапий (например, одного или нескольких терапевтических сресдств, таких как CAR по изобретению). В определенных воплощениях термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к уменьшению интенсивности по меньшей мере одного измеряемого параметра пролиферативного расстройства, такого как рост опухоли, необязательно заметного для пациента. В других воплощениях термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к ингибированию развития пролиферативного расстройства физически, например, путем стабилизации видимого симптома, физиологически, например, путем стабилизации физического параметра, или тому и другому. В других воплощениях термины «лечить», «лечение» и «лечащий» относятся к уменьшению или стабилизации размера опухоли или числа раковых клеток.
Термин «путь сигнальной трансдукции» относится к биохимическому соотношению между различными молекулами сигнальной трансдукции, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Выражение «рецептор клеточной поверхности» включает молекулы и комплексы молекул, способные принимать сигнал и передавать сигнал через мембрану клетки.
Термин «субъект» предназначен для включения живых организмов, в которых может быть вызвана иммунная реакция (например, млекопитающего, человека).
Термин «по существу очищенная» клетка относится к клетке, которая по существу свободна от других типов клеток. По существу очищенной клеткой также называется клетка, которая отделена от других типов клеток, с которыми она обычно связана в своем естественном состоянии. В некоторых случаях популяцией по существу чистых клеток называется гомогенная популяция клеток. В других случаях такой термин относится просто к клетке, которая отделена от клеток, с которыми она обычно связана в своем естественном состоянии. В некоторых аспектах клетки культивируют in vitro. В других аспектах клетки не культивируют in vitro.
Термин «терапевтический», используемый в настоящем описании, обозначает лечение. Терапевтическое действие получают путем уменьшения, супрессии, ремиссии или устранения болезненного состояния.
Термин «профилактический», используемый в настоящем описании, обозначает предупреждение или протективное лечение болезни или болезненного состояния.
В контексте настоящего изобретения «опухолевый антиген» или «антиген гиперолиферативного расстройства» или «антиген, ассоциированный с гиперолиферативным расстройством» относятся к антигенам, которые обычны для специфических гиперолиферативных расстройств. В некоторых аспектах антигены гиперолиферативного расстройства по настоящему изобретению происходят от раковых заболеваний, включая, но не ограничиваясь перечисленным, первичную или метастазирующую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легких, рак печени, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, лейкоз, рак матки, цервикальный рак, рак мочевого пузыря, рак почек, и аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы и т.п..
Термин «трансфицированный» или «трансформированный» или «трансдуцированный» относится к процессу, путем которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-реципиента. «Трансфицированная» или «трансформированная» или «трансдуцированная» клетка представляет собой клетку, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство.
Термин «специфически связывает» относится к антителу или лиганду, которые узнают и связываются со сходным партнером по связыванию (например, стимулирующей и/или костимулирующей молекулой, присутствующей в Т-клетке) белком, присутствующем в образце, но такие антитело или лиганд по существу не узнают или не связываются с другими молекулами в образце.
«Регулирующий химерный антигенный рецептор (RCAR)» при использовании в настоящем описании относится к набору полипептидов, типично двум в самых простых воплощениях, которые, когда находятся в иммунной эффекторной клетке, придают клетке специфичность в отношении клетки-мишени, обычно раковой клетке, и с генерацией регулируюющего внутриклеточного сигнала. В некоторых воплощениях RCAR включает по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в настоящем описании «внутриклеточным сигнальным доменом»), включающий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, определенных в настоящем описании в контексте в связи с молекулой CAR. В некоторых воплощениях полипептиды набора в RCAR не соприкасаются друг с другом, например, находятся в различных полипептидных цепях. В некоторых воплощениях RCAR включает молекулу димеризации, может соединять полипептиды друг с другом, например, может соединять антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых воплощениях RCAR экспрессируется в клетке (например, иммунной эффекторной клетке), описанной в настоящем описании, например, RCAR-экспрессирующей клетке (также называемой в настоящем описании «RCARХ-клеткой»). В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой Т-клетку и называется RCARТ-клеткой. В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCARN-клеткой. RCAR может предоставить RCAR-экспрессирующую клетку со специфичностью к клетке-мишени, обычно опухолевой клетке, и с генерацией регулирующего сигнала или пролиферации, что может оптимизировать иммунное эффекторное свойство RCAR-экспрессирующей клетки. В воплощениях RCAR-клетка опирается, по меньшей мере частично, на антигенсвязывающий домен для обеспечения специфичности к клетке-мишени, которая включает антиген, связываемый антигенсвязывающим доменом.
Термин «мембранный якорь» или «мембрансвязывающий домен», используемый в настоящем описании, относится к полипептиду или группе, например, миристоильной группе, достаточным для закрепления внеклеточного или внутриклеточного домена в плазматической мембране.
Термин «переключающий домен», используемый в настоящем описании, например, в связи с RCAR, относится к элементу, типично элементу на основе полипептида, который в присутствии димеризующей молекулы ассоциируется с другим переключающим доменом. Результатом ассоциации является функциональное сочетание первого элемента, соединенного с, например, слитого с, первым переключающим доменом, и второго элемента, соединенного с, например, слитого с, вторым переключающим доменом. Первый и второй переключающие домены вместе называются переключателем гомодимеризации. В воплощениях первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, например, они представляют собой полипептиды, имеющие одинаковую первичную последовательность, и вместе называются переключателем гомодимеризации. В воплощениях первый и второй переключающие домены отличаются друг от друга, например, они представляют собой полипептиды, имеющие различные первичные последовательности, и вместе называются переключателем гетеродимеризации. В воплощениях переключатель является внутриклеточным. В воплощениях переключатель является внеклеточным. В воплощениях переключающий домен представляет собой элемент на основе полипептида, например, FKBP или на основе FKB, и димеризующая молекула является небольшой молекулой, например, рапалогом. В воплощениях переключающий домен представляет собой элемент на основе полипептида, например, scFv, который связывает myc пептид, и димеризующая молекула представляет собой полипептид, его фрагмент или полимер полипептида, например, myc лиганд или полимеры myc лиганда, которые связывают один или больше myc scFv. В воплощениях переключающий домен представляет собой элемент на основе полипептида, например, myc рецептор, и димеризующая молекула представляет собой антитело или его фрагменты, например, myc антитело.
«Димеризующая молекула» как термин, используемый в настоящем описании, например, в связи с RCAR, относится к молекуле, которая промотирует ассоциацию первого переключающего домена со вторым переключающим доменом. В воплощениях димеризующая молекула не встречается по природе у субъекта или не встречается в концентрациях, которые приведут к существенной димеризации. В воплощениях димеризующая молекула является небольшой молекулой, например, рапамицина или раполога, например, RAD001.
Термин «биоэквивалент» относится к количеству агента иного, чем эталонное соединение (например, RAD001), требуемому для получения действия, эквивалентного действию, производимому эталонной дозой или эталонным количеством эталонного соединения (например, RAD001). В одном воплощении действие является уровнем ингибирования mTOR, например, при измерении по ингибированию киназы P70 S6, например, по оценке в анализе in vivo или in vitro, например, при измерении с помощью анализа, описанного в настоящем описании, например, анализа Boulay, или измерении уровней фосфорилированного S6 вестерн-блоттингом. В одном воплощении действием является изменение отношения PD-1-положительные/PD-1-отрицательные Т-клетки при измерении сортингом клеток. В одном воплощении биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR является количеством или дозой, которые достигают такого же уровня ингибирования киназы P70 S6, как эталонная доза или эталонное количество эталонного соединения. В одном воплощении биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR является количеством или дозой, которые достигают такого же уровня изменение отношения PD-1-положительные/PD-1-отрицательные Т-клетки, как эталонная доза или эталонное количество эталонного соединения.
Термин «малая иммуностимулирующая доза», когда используется в связи с ингибитором mTOR, например, аллостерическим ингибитором mTOR, например, RAD001 или рапамицином, или каталитическим ингибитором mTOR, относится к дозе ингибитора mTOR, которая частично, но не полностью, ингибирует активность mTOR, при измерении с помощью ингибирования активности киназы P70 S6. Способы оценки активности mTOR, например, с помощью ингибирования киназы P70 S6, обсуждаются в настоящем описании. Доза недостаточна для того, чтобы привести к полной иммунной супрессии, но достаточна для усиления иммунной реакции. В одном воплощении малая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к уменьшению числа PD-1-положительных Т-клеток и/или повышению числа PD-1-отрицательных Т-клеток, или повышает отношение PD-1-отрицательные Т-клетки/PD-1-положительные Т-клетки. В одном воплощении малая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к повышению числа наивных Т-клеток. В одном воплощении малая иммуностимулирующая доза ингибитора mTOR приводит к одному или нескольким из следующих изменений:
high
high
+
усиление экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62L, CD127, CD27 и BCL2, например, на Т-клетках памяти, например, предшественниках Т-клеток памяти;
уменьшение экспрессии KLRG1, например, на Т-клетках памяти, например, предшественниках Т-клеток памяти; и
high
high
+
повышение числа предшественников Т-клеток памяти, например, клеток с одной из комбинаций следующих характеристик: повышенный CD62L, повышенный CD127, повышенный CD27, сниженный KLRG1 и повышенный BCL2;
причем любое из изменений, описанных выше, происходит, например, по меньшей мере временно, например, по сравнению с субъектом, не получавшим лечение.
«Рефрактерный» при использовании в настоящем описании относится к заболеванию, например, раку, которое не реагирует на лечение. В воплощениях рефрактерный рак может быть резистентным к лечению до или при начале лечения. В других воплощениях рефрактерный рак может становиться резистентным во время лечения. Рефрактерным раком также называют резистентный рак.
«Рецидивный» или «рецидив» при использовании в настоящем описании относится к повторному появлению заболевания (например, рака) или признаков и симптомов заболевания, такого как рак, после периода улучшения или восприимчивости, например, после предыдущего курса терапии, например, противораковой терапии. Например, период восприимчивости может включать падение уровня раковых клеток ниже определенного порога, например, ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Повторное появление может включать уровень раковых клеток, превышающих определенный порога, например, выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%.
Интервалы: во всем настоящем раскрытии различные аспекты могут быть представлены в формате интервалов. Следует иметь в виду, что описание в формате интервалов дается только для удобства и краткости и не должно рассматриваться как неизменное ограничение объема изобретения. Соответственно, описание интервала следует рассматривать как конкретно раскрытые все возможные подинтервалы, а также отдельные числовые значения в таком интервале. Например, описание интервала, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как имеющее конкретно раскрытые подинтервалы, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также как отдельные числа в таком интервале, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Как другой пример, интервал, такой как идентичность 95-99%, включает что-то с идентичностью 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, и включает подинтервалы, такие как идентичность 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99%. Это применимо независимо от ширины интервала.
Описание
Настоящее изобретение относится к композициям веществ и способам для применения для лечения заболевания, такого как рак, с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR) CLL-1.
В одном аспекте изобретение относится к ряду химерных антигенных рецепторов (CAR), включающих антитело или фрагмент антитела, сконструированные для специфического связывания с белком CLL-1 или его фрагментом. В одном аспекте изобретение относится к клетке (например, иммунной эффекторной клетке, например, Т-клетке или NK-клетке), сконструированной для эеспрессии CAR, где CAR Т-клетки («CART») проявляют противоопухолевое свойство. В одном аспекте клетку трансформируют CAR, и по меньшей мере часть конструкции CAR экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых воплощениях клетка (например, иммунная эффекторная клетка, например, Т-клетка или NK-клетка) трансдуцирована вирусным вектором, кодирующим CAR. В некоторых воплощениях вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых воплощениях вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых воплощениях клетка может устойчиво экспрессировать CAR. В другом воплощении клетка (например, иммунная эффекторная клетка, например, Т-клетка или NK-клетка) трансфицирована нуклеиновой кислотой, например, мРНК, кДНК, ДНК, кодирующей CAR. В некоторых воплощениях клетка может временно экспрессировать CAR.
В одном аспекте связывающая часть человеческого анти-CLL-1 белка представляет собой фрагмент антитела scFv. В одном аспекте такие фрагменты антител являются функциональными в том отношении, что они сохраняют эквивалентную аффинность связывания, например, они связывают тот же антиген с эффективностью, сравнимой с антителом IgG, имеющим такие же вариабельные участки тяжелой и легкой цепи. В одном аспекте такие фрагменты антител являются функциональными в том отношении, что они обеспечивают биологическую реакцию, которая может включать, но не ограничиваться, активацию иммунной реакции, ингибирование происхождения сигнальной трансдукции из ее антигена-мишени, ингибирование киназной активности и т.п., что будет понятно специалистам в данной области техники.
В некоторых аспектах антитела по изобретению включаются в химерный антигенный рецептор (CAR). В одном аспекте CAR включает полипептидную последовательность, представленную в настоящем описании как SEQ ID NO: 91-103.
В одном аспекте анти-CLL-1 связывающий домен, например, человеческий scFv, часть CAR по изобретению кодируется трансгеном, последовательность которого является кодоном, оптимизированным для экспрессии в клетке млекопитающего. В одном аспекте вся конструкция CAR по изобретению кодируется трансгеном, полная последовательность которого является кодоном, оптимизированным для экспрессии в клетке млекопитающего. Оптимизация кодона относится к открытию, что частота появления синонимичных кодонов (т.е., кодонов, которые кодируют одну и ту же аминокислоту) в кодирующей ДНК смещена в различных видах. Такое вырождение кодонов допускает, чтобы идентичный полипептид был кодирован несколькими нуклеотидными последовательностями. Ряд способов оптимизации кодонов известен в технике и включает, например, способы, раскрытые, как минимум, в патентах США №№ 5786464 и 6114148.
В одном аспекте человеческий CLL-1-связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 39-51. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 39. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 40. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 41. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 42. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 43. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 44. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 45. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 46. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 47. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 48. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 49. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 50. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает часть scFv, представленную в SEQ ID NO: 51. В одном аспекте CAR по изобретению объединяют антигенсвязывающий домен специфического антитела с внутриклеточной сигнальной молекулой. Например, в некоторых аспектах внутриклеточная сигнальная молекула включает, но не ограничивается перечисленным, цепь CD3-дзета, сигнальные молекулы 4-1ВВ и CD28 и их комбинации. В одном аспекте антигенсвязывающий домен связывается с CLL-1. В одном аспекте CLL-1-CAR включает CAR, выбранный из последовательности, представленной в одной или нескольких SEQ ID NO: 91-103 или 197. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 91. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 92. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 94. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 96. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 97. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 99. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 101. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 102. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103. В одном аспекте CLL-1-CAR включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 197. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям CLL-1-CAR и их применению в лекарственных средствах и способах лечения, в числе других заболеваний, рака или любой злокачественности или аутоиммунных заболеваний с участием тканей или клеток, которые экспрессируют CLL-1.
В одном аспекте CAR по изобретению можно использовать для устранения CLL-1-экспрессирующих здоровых клеток, посредством чего они пригодны для применения в качестве терапии кондиционирования клеток перед трансплантацией клеток. В одном аспекте CLL-1-экспрессирующие здоровые клетки представляют собой CLL-1-экспрессирующие здоровые стволовые клетки, и трансплантация клеток является трансплантацией стволовых клеток.
В одном аспекте изобретение относится к клетке (например, иммунной эффекторной клетке, например, Т-клетке или NK-клетке), сконструированной для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) по настоящему изобретению, причем клетка (например, CAR-экспрессирующая иммунная эффекторная клетка, например, CAR Т-клетка, например, «CART») проявляет противоопухолевое свойство. Предочтительным антигеном является CLL-1. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает фрагмент человеческого анти-CLL-1 антитела. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает фрагмент человеческого анти-CLL-1 антитела, включающий scFv. В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает человеческий анти-CLL-1 scFv. Соответственно, изобретение относится к CLL-1-CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен и встроен в иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку или NK-клетку), и способам его применения для адоптивной терапии. В одном аспекте CLL-1-CAR включает человеческий анти-CLL-1 связывающий домен.
В одном аспекте CLL-1-CAR включает по меньшей мере один внутриклеточный домен, выбранный из группы из сигнального домена CD137 (4-1ВВ), сигнального домена CD28, сигнального домена CD3-дзета и их любой комбинации. В одном аспекте CLL-1-CAR включает по меньшей мере один внутриклеточный домен, выбранный из одной или нескольких костимулирующих молекул иных, чем CD137 (4-1ВВ) или CD28.
Химерный антигенный рецептор (CAR)
Настоящее изобретение относится к CAR (например, полипептиду CAR), который включает анти-CLL-1 связывающий домен (например, человеческий или гуманизированный анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, и где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HC CDR1), определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 2 (HC CDR2) и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 3 (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2. Анти-CLL-1 связывающий домен CAR может дополнительно включать участок легкой цепи 1 (LC CDR1), определяющий комплементарность участок легкой цепи 2 (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок легкой цепи 3 (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании, например, кодирующей CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен (например, человеческий или гуманизированный CLL-1-связывающий домен, описанный в настоящем описании), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, и где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HC CDR1), определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 2 (HC CDR2) и определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 3 (HC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен CAR может дополнительно включать участок легкой цепи 1 (LC CDR1), определяющий комплементарность участок легкой цепи 2 (LC CDR2) и определяющий комплементарность участок легкой цепи 3 (LC CDR3) любой из аминокислотных последовательностей легкой цепи анти-CLL-1 связывающего домена, внесенных в список в таблице 2.
В конкретных аспектах конструкция CAR по изобретению включает scFv домен, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, scFv, которому может предшествовать необязательная лидерная последовательность, такая как представленная в SEQ ID NO: 1, и за которым может следовать необязательная шарнирная последовательность, такая как представленная в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, трансмембранный участок, такой как представленный в SEQ ID NO: 6, внутриклеточный сигнальный домен, который включает SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и последовательность CD3-дзета, которая включает SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, например, где домены являются смежными и в одной и той же рамке считывания, образуя отдельный слитый белок. В изобретение также включена нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид каждого из фрагментов scFv, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51. В изобретение также включена нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид каждого из фрагментов scFv, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, и каждый из доменов SEQ ID NO: 1, 2 и 6-9. В одном аспекте пример конструкции CLL-1-CAR включает необязательную лидерную последовательность, внеклеточный антигенсвязывающий домен, шарнир, транмсембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен.
В некоторых воплощениях полноразмерные последовательности CAR также представлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 91-103, показанные в таблице 2.
Пример лидерной последовательности представлен как SEQ ID NO: 1. Пример шарнирной/спейсерной последовательности представлен как SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Пример последовательности транмсембранного домена представлен как SEQ ID NO: 6. Пример последовательности внутриклеточного сигнального домена белка 4-1ВВ представлен как SEQ ID NO: 7. Пример последовательности внутриклеточного сигнального домена CD27 представлен как SEQ ID NO: 8. Пример последовательности домена CD3-дзета представлен как SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.
В одном аспекте настоящее изобретение охватывает конструкцию рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, где молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую CLL-1-связывающий домен, например, описанный в настоящем описании, например, смежный с и в той же рамке считывания, что и нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен. В одном аспекте CLL-1-связывающий домен выбирают из одной или нескольких SEQ ID NO: 39-51. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 39. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 40. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 41. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 42. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 43. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 44. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 45. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 46. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 47. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 48. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 49. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 50. В одном воплощении CLL-1-связывающий домен включает SEQ ID NO: 51.
В одном аспекте настоящее изобретение охватывает конструкцию рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающую трансген, кодирующий CAR, где молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую анти-CLL-1 связывающий домен, выбранный из одной или нескольких последовательностей SEQ ID NO: 39-51, где последовательность является смежной с или в той же рамке считывания, что и нуклеотидная последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен. Пример внутриклеточного сигнального домена, который может быть использован в CAR, включает, но не ограничивается перечисленным, один или больше внутриклеточных сигнальных доменов, например, CD3-дзета, CD28, 4-1ВВ и т.п. В некоторых случаях CAR может включать любую комбинацию CD3-дзета, CD28, 4-1ВВ и т.п. В одном аспекте нуклеотидную последовательность конструкции CAR по изобретению выбирают из одной или нескольких SEQ ID NO: 104-116 или 198. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 104. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 105. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 106. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 107. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 108. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 109. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 110. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 111. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 112. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 113. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 114. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 115. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 116. В одном аспекте нуклеотидная последовательность конструкции CAR представляет собой SEQ ID NO: 198. Нуклеотидные последовательности, кодирующие нужные молекулы, можно получить с использованием рекомбинантных методов, известных в технике, таких как, например, скрининг библиотек из клеток, экспрессирующих ген, образование гена из вектора, известного как включающего их, или выделение прямо из клеток и тканей, содержащих их, с использованием стандартных методов. С другой стороны, представляющую интерес нуклеиновую кислоту можно получить синтетически, а не клонированием.
Настоящее изобретение включает конструкции ретровирусных и лентивирусных векторов, экспрессирующие CAR, которые могут быть непосредственно трансдуцированы в клетку.
Настоящее изобретение включает конструкцию РНК, которая может быть непосредственно трансдуцирована в клетку. Способ генерации мРНК для применения в трансфекции включает транскрипцию in vitro (IVT) матрицы с помощью специально созданных праймеров с последующим присоединением поли(А) для получения конструкции, содержащей 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность («UTR»), 5'-кэп и/или внутренний сайт входа рибосомы (IRES), нуклеиновую кислоту, которую экспрессируют, и хвост поли(А) типично в 50-2000 оснований в длину (SEQ ID NO: 35). Полученная таким образом РНК может эффективно трансфицировать различные виды клеток. В одном воплощении матрица включает последовательности для CAR. В одном воплощении РНК-CAR вектор трансдуцируют в Т-клетку путем электропорации.
Антигенсвязывающий домен
CAR по настоящему изобретению включают мишень-специфический связывающий домен. Выбор группы зависит от типа и числа лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен можно выбрать для узнавания лиганда, который действует как маркер клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с определенным болезненным состоянием. Так, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут действовать как лиганды для антигенсвязывающего домена в CAR по изобретению, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.
В одном аспекте CAR-опосредуемая Т-клеточная реакция может быть направлена на антиген, представляющий интерес, путем конструирования антигенсвязывающего домена, который спецфически связывает нужный антиген в CАR.
В одном аспекте CAR по настоящему изобретению включает связывающий домен, который специфически связывает CLL-1. В одном аспекте антигенсвязывающий домен специфически связывает человеческий CLL-1.
Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, включая, но не ограничиваясь перечисленным, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, его функциональный фрагмент, включая, но не ограничиваясь перечисленным, однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VНH) нанотела от камелидов, и с другой стороны, каркас, известный в технике как функционирующий как антигенсвязывающий домен, такой как домен рекомбинантного фибронектина, и т.п. В некоторых случаях благоприятно получать антигенсвязывающий домен от того же вида, в котором в конечном счете будет примнен CAR. Например, для применения людьми может быть благоприятно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR включал человеческие или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела.
В некоторых случаях благоприятно получать антигенсвязывающий домен из того же вида, в котором в конечном счете будет примнен CAR. Например, для применения людьми может быть благоприятно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR включал человеческие или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела. Так, в одном аспекте антигенсвязывающий домен включает человеческое антитело или фрагмент такого антитела.
4
Так, в одном аспекте антигенсвязывающий домен включает человеческое антитело или фрагмент такого антитела. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 легкой цепи (LC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 легкой цепи (LC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 легкой цепи (LC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, и/или один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческого анти-CLL-1-связывающего домена, включающего один или больше, например, все три, LC CDR и один или больше, например, все три, НC CDR. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает один или больше участков (например, все три) из определяющего комплементарность участка 1 тяжелой цепи (НC CDR1), определяющего комплементарность участка 2 тяжелой цепи (НC CDR2) и определяющего комплементарность участка 3 тяжелой цепи (НC CDR3) человеческого анти-CLL-1 связывающего домена, описанного в настоящем описании, например, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен имеет два вариабельных участка тяжелой цепи, причем каждый содержит НC CDR1, НC CDR2 и НC CDR3, описанные в настоящем описании. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает человеческий вариабельный домен легкой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 4), и/или человеческий вариабельный домен тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 3). В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает человеческий вариабельный домен тяжелой цепи, описанный в настоящем описании (например, в таблице 3), например, по меньшей мере два вариабельных участка тяжелой цепи, описанных в настоящем описании (например, в таблице 3). В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, включающий легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности из таблицы 4. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен (например, scFv) включает вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленной в таблице 4, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности из таблицы 4; и/или вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной в таблице 3, или последовательность с 95-99% идентичностью аминокислотной последовательности из таблицы 3. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий анти-CLL-1 связывающий домен, включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 52-64, или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например, в таблице 2, присоединяется к вариабельному участку тяжелой цепи, включающему аминокислотную последовательность, описанную в настоящем описании, например. в таблице 2, через линкер, например, линкер, описанный в настоящем описании. В одном воплощении человеческий анти-CLL-1 связывающий домен включает линкер (Gly-Ser)n, где n равен 1. 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельный участок легкой цепи - линкер - вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок тяжелой цепи - линкер - вариабельный участок легкой цепи.
В одном аспекте часть антигенсвязывающего домена включает одну или больше последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 39-41. В одном аспекте CAR выбирают из одной или нескольких последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 91-103 или 197.
В одном аспекте анти-CLL-1 связывающий домен характеризуется определенными функциональными особенностями или свойствами антитела или фрагмента антитела. Например, в одном аспекте часть композиции CAR по изобретению, которая включает антигенсвязывающий домен, специфически связывает человеческий CLL-1.
В одном аспекте изобретение относится к антигенсвязывающему домену, включающему антитело или фрагмент антитела, где связывающий домен антитела специфически связывается с белком CLL-1 или его фрагментом, где антитело или фрагмент антитела включает вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39-51. В одном аспекте антигенсвязывающий домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39-51. В некоторых аспектах scFv является смежным с и в той же рамке считывания, что и лидерная последовательность. В одном аспекте лидерная последовательность представляет собой полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.
В одном аспекте человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В одном аспекте человеческий анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой Fv, Fab, (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (см., например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol., 17, 105 (1987)). В одном аспекте антитела и их фрагменты по изобретению связывают белок CLL-1 или его фрагмент с аффинностью дикого типа или усиленной аффинностью.
В некоторых случаях человеческий scFv получают из библиотеки дисплеев. Библиотека дисплеев представляет собой набор элементов; каждый элемент включает доступный полипептидный компонент и возместимый компонент, который кодирует или идентифицирует полипептидный компонент. Полипептидный компонент варьируется таким образом, что представляются различные аминокислотные последовательности. Полипептидный компонент может иметь любую длину, например, от трех аминокислот до более 300 аминокислот. Элемент библиотеки дисплеев может включать более одного полипептидного компонента, например, две полипептидные цепи Fab. В одном примере воплощения библиотеку дисплеев можно использовать для идентификации человеческого CLL-1-связывающего домена. При отборе полипептидный компонент каждого члена библиотеки зондируют с CLL-1 или его фрагментом, и если полипептидный компонент связывается с CLL-1, член библиотеки дисплеев идентифицируют, типично путем удерживания на носителе.
Удержанные члены библиотеки дисплеев извлекают из носителя и анализируют. Анализ может включать амплификацию и последующую селекцию в схожих или различных условиях. Например, можно чередовать положительную и отрицательную селекции. Анализ также может включать определение аминокислотной последовательности полипептидного компонента, т.е., CLL-1-связывающего домена, и очистку полипептидного компонента для подробной характеризации.
Science,
et al.
J. Biol. Chem.,
et al.
Immunotechnology,
et al.
Immunol. Today,
Nat. Biotechnol.,
Ряд форматов можно использовать для библиотек дисплеев. Примеры включают фаговый дисплей. В фаговом дисплее белковый компонент типично ковалентно соединен с белком фаговой оболочки. Связь является результатом трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей белковый компонент, слитый с белком оболочки. Связь может включать жесткий пептидный линкер, протеазный сайт или аминокислоту, внедренную в результате супрессии стоп-кодона. Фаговый дисплей описан, например, в U.S. 5223409; Smith (1985),  228: 1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard  (1999),  274: 18218-30; Hoogenboom  (1998),  4: 1-20; Hoogenboom  (2000),  2: 371-8, и Hoet et al. (2005),  23(3), 344-8. Отображение бактериофагов белкового компонента можно вырастить и харвестировать с использованием стандартных методов получения фагов, например, преципитацией ПЭГ из культуральной среды. После селекции отдельных фаговых дисплеев нуклеиновую кислоту, кодирующую выбранные белковые компоненты, можно выделить из клеток, инфицированных выбранными фагами, или из самих фагов после амплификации. Отдельные колонии или бляшки можно пикировать, нуклеиновую кислоту изолируют и секвенируют.
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
et al.
Nat. Biotechnol.,
et al.
Methods Enzymol.,
et al.
J. Immunol. Methods,
E. coli
Другие форматы дисплеев включают клеточный дисплей (см., например, WO 03/029456), гибриды белок-нуклеиновая кислота (см., например, US 6207446), рибосомный дисплей (см., например, Mattheakis  (1994),  91: 9022; и Hanes  (2000),  18: 1287-92; Hanes  (2000)  328: 404-30; и Schaffitzel  (1999),  231(1-2): 119-35), и периплазматический дисплей  (2005, Nov. 22; PMID: 16337958).
В некоторых случаях sсFv можно получить согласно способу, известному в технике (см., например, Bird et al., (1988), Science, 242: 423-426; и Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883). Молекулы sсFv можно получить, соединяя участки VH и VL вместе с использованием жестких полипептидных ликеров. Молекулы sсFv включают линкер (например, линкер Ser-Gly) оптимизированной длины и/или композиции аминокислот. Длина линкера может существенно влиять как на сложение, так и на взаимодействие вариабельных участков sсFv. Действительно, если используют короткий полипептидный линкер (например, в 5-10 аминокислот), предотвращается внутрицепной (intrachain) фолдинг. Внутрицепной фолдинг также требуется для того, чтобы свести два вариабельных участка вместе с образованием функционального сайта связывания эпитопа. Например, об ориентации и размере линкера см., например, Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 6444-6448, публикации заявок на патент США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, и публикации PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, включенные в настоящее описание в качестве ссылок.
4
4
4
4
3
Фрагмент sсFv может включать между его участками VH и VL линкер с по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или большим числом аминокислотных остатков. Линкерная последовательность может включать любую встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых воплощениях линкерная последовательность включает аминокислоты глицин и серин. В другом воплощении линкерная последовательность включает наборы из повторов глицина и серина, таких как (GlySer)n, где n представляет собой положительное целое число, равное или больше единицы (SEQ ID NO: 25). В одном воплощении линкер может представлять собой (GlySer) (SEQ ID NO: 27) или (GlySer) (SEQ ID NO: 28). Изменение в длине линкера может сохранить или усилить активность, давая развитие превосходной эффективности в исследованиях активности.
Примеры конструкций человеческого CLL-1-CAR и антигенсвязывающих доменов
Примеры конструкций CLL-1-CAR, раскрытые в настоящем описании, включают scFv (например, человеческий scFv, как раскрыто в таблице 2 в настоящем описании, необязательно с предшествующей лидерной последовательностью, например, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 12, например, лидерными аминокислотной и нуклеотидной последовательностями, соответственно). Последовательности фрагментов человеческого scFv (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 39-51 и нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 52-64) приводятся в настоящем описании в таблице 2. Конструкция CLL-1-CAR может дополнительно включать необязательный шарнирный домен, например, шарнирный домен CD8 (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13); трансмембранный домен, например, трансмембранный домен CD8 (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17); внутриклеточный домен, например, 4-1ВВ внутриклеточный домен 4-1ВВ (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 18); и функциональный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или 10 или кодированный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 20 или 21). В некоторых воплощениях домены являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя отдельный слитый белок. В других воплощениях домены находятся в различных полипептидах, например, как в молекуле RCAR, как описано в настоящем описании.
В некоторых воплощениях полноразмерная молекула CLL-1-CAR включает аминокислотную последовательность или кодируется нуклеотидной последовательностью CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, приведенными в таблице 2, или последовательностью по существу идентичною (например, на 95-99%) им.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает аминокислотную последовательность scFv CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, приведенную в таблице 2, или включает аминокислотную последовательность scFv или кодируется нуклеотидной последовательностью CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, или последовательностью, по существу идентичную (например, на 95-99%) или с изменениями аминокислот до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами) в любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленные в таблице 2, или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и/или HCCDR3), представленных в таблице 3; и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и/или LCCDR3) CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленных в таблице 4; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и/или HCCDR3), представленных в таблице 5; и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и/или LCCDR3), CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленных в таблице 6; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
В некоторых воплощениях молекула CLL-1-CAR или анти-CLL-1 антигенсвязывающий домен включает один, два или три CDR из вариабельного участка тяжелой цепи (например, HCCDR1, HCCDR2 и/или HCCDR3), представленных в таблице 7; и/или один, два или три CDR из вариабельного участка легкой цепи (например, LCCDR1, LCCDR2 и/или LCCDR3), CLL-1-CAR-1, CLL-1-CAR-2, CLL-1-CAR-3, CLL-1-CAR-4, CLL-1-CAR-5, CLL-1-CAR-6, CL-L1-CAR-7, CLL-1-CAR-8, CLL-1-CAR-9, CLL-1-CAR-10, CLL-1-CAR-11, CLL-1-CAR-12, CLL-1-CAR-13, 181268, представленных в таблице 8; или последовательность по существу идентичную (например, на 95-99% идентичную или с изменениями аминокислот до 5, 4, 3, 2 или 1, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из вышеуказанных последовательностей.
Последовательности гуманизированных CDR доменов scFv приводятся в таблицах 3, 5 и 7 для вариабельных доменов тяжелой цепи и в таблицах 4, 6 и 8 для вариабельных доменов легкой цепи. «ID» обозначает соответствующий SEQ ID NO для каждого CDR.
CDR, приведенные в таблицах 3 и 4, соответствуют комбинации схем нумерации Кабата и Чотиа.
Таблица 3. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи
<b>Кандидат </b>
<b>HCDR1</b>
<b>ID </b>
<b>HCDR2</b>
<b>ID</b>
<b>HCDR3</b>
<b>ID</b>
CLL-1-CAR 9
ANTFSDHVMH
125
YIHAANGGTHYSQKFQD
138
GGYNSDAFDI
151
CLL-1-CAR 6
GGSFSGYYWS
122
EINHSGSTNYNPSLKS
135
GSGLVVYAIRVGSGWFDY
148
CLL-1-CAR 10
GFTFSSYSMN
126
YISSSSSTIYYADSVKG
139
DLSVRAIDAFDI
152
CLL-1-CAR 11
GFTFNSYGLH
127
LIEYDGSNKYYGDSVKG
140
EGNEDLAFDI
153
CLL-1-CAR 12
GFNVSSNYMT
128
VIYSGGATYYGDSVKG
141
DRLYCGNNCYLYYYYGMDV
154
CLL-1-CAR 1
GGTFSSYAIS
117
GIIPIFGTANYAQKFQ
130
DLEMATIMGGY
143
CLL-1-CAR 2
GFTFDDYAMH
118
LISGDGGSTYYADSVKG
131
VFDSYYMDV
144
CLL-1-CAR 3
GGSISSSSYYWG
119
SIYYSGSTYYNPSLKS
132
PGTYYDFLSGYYPFY
145
CLL-1-CAR 4
GFTFSSYWMS
120
NINEDGSAKFYVDSVKG
133
DLRSGRY
146
CLL-1-CAR 5
GGPVRSGSHYWN
121
YIYYSGSTNYNPSLEN
134
GTATFDWNFPFDS
147
CLL-1-CAR 7
GFTFSSYSMN
123
SISSSSSYIYYADSVKG
136
DPSSSGSYYMEDSYYYGMDV
149
CLL-1-CAR 8
GFTFSSYEMN
124
YISSSGSTIYYADSVKG
137
EALGSSWE
150
CLL-1-CAR 13
GYPFTGYYIQ
129
WIDPNSGNTGYAQKFQG
142
DSYGYYYGMDV
155
181268
GFTFSSYEMN
199
YISSSGSTIYYADSVKG
200
DPYSSSWHDAFDI
201
Таблица 4. CDR вариабельных доменов легкой цепи
<b>Кандидат </b>
<b>LCDR1</b>
<b>ID</b>
<b>LCDR2</b>
<b>ID</b>
<b>LCDR3</b>
<b>ID</b>
CLL-1-CAR 9
RASQDISSWLA
164
AASSLQS
177
QQSYSTPLT
190
CLL-1-CAR 6
RASQSISSYLN
161
AASSLQS
174
QQSYSTPPWT
187
CLL-1-CAR 10
QASQDISNYLN
165
DASNLET
178
QQAYSTPFT
191
CLL-1-CAR 11
QASQFIKKNLN
166
DASSLQT
179
QQHDNLPLT
192
CLL-1-CAR 12
RASQSISSYLN
167
AASSLQS
180
QQSYSTPPLT
193
CLL-1-CAR 1
TGTSSDVGGYNYVS
156
DVSNRPS
169
SSYTSSSTLDVV
182
CLL-1-CAR 2
RSSQSLVYTDGNTYLN
157
KVSNRDS
170
MQGTHWSFT
183
CLL-1-CAR 3
RASQGISSYLA
158
AASTLQS
171
QQLNSYPYT
184
CLL-1-CAR 4
RASQSISGSFLA
159
GASSRAT
172
QQYGSSPPT
185
CLL-1-CAR 5
RASQSISSYLN
160
AASSLQS
173
QQSYSTPWT
186
CLL-1-CAR 7
TGSSGSIASNYVQ
162
EDNQRPS
175
QSYDSSNQVV
188
CLL-1-CAR 8
QASQDISNYLN
163
DASNLET
176
QQYDNLPLT
189
CLL-1-CAR 13
RASQGISSALA
168
DASSLES
181
QQFNNYPLT
194
181268
RASQSVSSSYLA
202
GASSRAT
203
QQYGSSPLT
204
Таблица 5. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи согласно схеме нумерации Кабата (Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)
<b>Кандидат </b>
<b>HCDR1</b>
<b>ID</b>
<b>HCDR2</b>
<b>ID</b>
<b>HCDR3</b>
<b>ID</b>
146259-CLL-1-CAR9
DHVMH
322
YIHAANGGTHYSQKFQD
336
GGYNSDAFDI
350
139119-CLL-1-CAR6
GYYWS
319
EINHSGSTNYNPSLKS
333
GSGLVVYAIRVGSGWFDY
347
146261-CLL-1-CAR10
SYSMN
323
YISSSSSTIYYADSVKG
337
DLSVRAIDAFDI
351
146262-CLL-1-CAR11
SYGLH
324
LIEYDGSNKYYGDSVKG
338
EGNEDLAFDI
352
146263-CLL-1-CAR12
SNYMT
325
VIYSGGATYYGDSVKG
339
DRLYCGNNCYLYYYYGMDV
353
139115-CLL-1-CAR1
SYAIS
314
GIIPIFGTANYAQKFQG
328
DLEMATIMGGY
342
139116-CLL-1-CAR2
DYAMH
315
LISGDGGSTYYADSVKG
329
VFDSYYMDV
343
139118-CLL-1-CAR3
SSSYYWG
316
SIYYSGSTYYNPSLKS
330
PGTYYDFLSGYYPFY
344
139122-CLL-1-CAR4
SYWMS
317
NINEDGSAKFYVDSVKG
331
DLRSGRY
345
139117-CLL-1-CAR5
SGSHYWN
318
YIYYSGSTNYNPSLEN
332
GTATFDWNFPFDS
346
139120-CLL-1-CAR7
SYSMN
320
SISSSSSYIYYADSVKG
334
DPSSSGSYYMEDSYYYGMDV
348
139121-CLL-1-CAR8
SYEMN
321
YISSSGSTIYYADSVKG
335
EALGSSWE
349
146264-CLL-1-CAR13
GYYIQ
326
WIDPNSGNTGYAQKFQG
340
DSYGYYYGMDV
354
181268
SYEMN
327
YISSSGSTIYYADSVKG
341
DPYSSSWHDAFDI
355
Таблица 6. CDR вариабельных доменов легкой цепи согласно схеме нумерации Кабата (Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)
<b>Кандидат </b>
<b>LCDR1</b>
<b>ID</b>
<b>LCDR2</b>
<b>ID</b>
<b>LCDR3</b>
<b>ID</b>
146259-CLL-1-CAR9
RASQDISSWLA
364
AASSLQS
378
QQSYSTPLT
392
139119-CLL-1-CAR6
RASQSISSYLN
361
AASSLQS
375
QQSYSTPPWT
389
146261-CLL-1-CAR10
QASQDISNYLN
365
DASNLET
379
QQAYSTPFT
393
146262-CLL-1-CAR11
QASQFIKKNLN
366
DASSLQT
380
QQHDNLPLT
394
146263-CLL-1-CAR12
RASQSISSYLN
367
AASSLQS
381
QQSYSTPPLT
395
139115-CLL-1-CAR1
TGTSSDVGGYNYVS
356
DVSNRPS
370
SSYTSSSTLDVV
384
139116-CLL-1-CAR2
RSSQSLVYTDGNTYLN
357
KVSNRDS
371
MQGTHWSFT
385
139118-CLL-1-CAR3
RASQGISSYLA
358
AASTLQS
372
QQLNSYPYT
386
139122-CLL-1-CAR4
RASQSISGSFLA
359
GASSRAT
373
QQYGSSPPT
387
139117-CLL-1-CAR5
RASQSISSYLN
360
AASSLQS
374
QQSYSTPWT
388
139120-CLL-1-CAR7
TGSSGSIASNYVQ
362
EDNQRPS
376
QSYDSSNQVV
390
139121-CLL-1-CAR8
QASQDISNYLN
363
DASNLET
377
QQYDNLPLT
391
146264-CLL-1-CAR13
RASQGISSALA
368
DASSLES
382
QQFNNYPLT
396
181268
RASQSVSSSYLA
369
GASSRAT
383
QQYGSSPLT
397
Таблица 7. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи согласно схеме нумерации Чотиа (Al-Lazikani et al., (1997), JMB 273, 927-948)
<b>Кандидат </b>
<b>HCDR1</b>
<b>ID</b>
<b>HCDR2</b>
<b>ID</b>
<b>HCDR3</b>
<b>ID</b>
146259-CLL-1-CAR9
ANTFSDH
406
HAANGG
420
GGYNSDAFDI
434
139119-CLL-1-CAR6
GGSFSGY
403
NHSGS
417
GSGLVVYAIRVGSGWFDY
431
146261-CLL-1-CAR10
GFTFSSY
407
SSSSST
421
DLSVRAIDAFDI
435
146262-CLL-1-CAR11
GFTFNSY
408
EYDGSN
422
EGNEDLAFDI
436
146263-CLL-1-CAR12
GFNVSSN
409
YSGGA
423
DRLYCGNNCYLYYYYGMDV
437
139115-CLL-1-CAR1
GGTFSSY
398
IPIFGT
412
DLEMATIMGGY
426
139116-CLL-1-CAR2
GFTFDDY
399
SGDGGS
413
VFDSYYMDV
427
139118-CLL-1-CAR3
GGSISSSSY
400
YYSGS
414
PGTYYDFLSGYYPFY
428
139122-CLL-1-CAR4
GFTFSSY
401
NEDGSA
415
DLRSGRY
429
139117-CLL-1-CAR5
GGPVRSGSH
402
YYSGS
416
GTATFDWNFPFDS
430
139120-CLL-1-CAR7
GFTFSSY
404
SSSSSY
418
DPSSSGSYYMEDSYYYGMDV
432
139121-CLL-1-CAR8
GFTFSSY
405
SSSGST
419
EALGSSWE
433
146264-CLL-1-CAR13
GYPFTGY
410
DPNSGN
424
DSYGYYYGMDV
438
181268
GFTFSSY
411
SSSGST
425
DPYSSSWHDAFDI
439
Таблица 8. CDR вариабельных доменов легкой цепи согласно схеме нумерации Чотиа (Al-Lazikani et al., (1997), JMB 273, 927-948)
<b>Кандидат </b>
<b>LCDR1</b>
<b>ID</b>
<b>LCDR2</b>
<b>ID</b>
<b>LCDR3</b>
<b>ID</b>
146259-CLL-1-CAR9
SQDISSW
448
AAS
462
SYSTPL
476
139119-CLL-1-CAR6
SQSISSY
445
AAS
459
SYSTPPW
473
146261-CLL-1-CAR10
SQDISNY
449
DAS
463
AYSTPF
477
146262-CLL-1-CAR11
SQFIKKN
450
DAS
464
HDNLPL
478
146263-CLL-1-CAR12
SQSISSY
451
AAS
465
SYSTPPL
479
139115-CLL-1-CAR1
TSSDVGGYNY
440
DVS
454
YTSSSTLDV
468
139116-CLL-1-CAR2
SQSLVYTDGNTY
441
KVS
455
GTHWSF
469
139118-CLL-1-CAR3
SQGISSY
442
AAS
456
LNSYPY
470
139122-CLL-1-CAR4
SQSISGSF
443
GAS
457
YGSSPP
471
139117-CLL-1-CAR5
SQSISSY
444
AAS
458
SYSTPW
472
139120-CLL-1-CAR7
SSGSIASNY
446
EDN
460
YDSSNQV
474
139121-CLL-1-CAR8
SQDISNY
447
DAS
461
YDNLPL
475
146264-CLL-1-CAR13
SQGISSA
452
DAS
466
FNNYPL
480
181268
SQSVSSSY
453
GAS
467
YGSSPL
481
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанного в настоящем описании (например, CAR нуклеиновой кислоты или CAR полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранных из следующих:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 156, LC CDR2 SEQ ID NO: 169 и LC CDR3 SEQ ID NO: 182 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 157, LC CDR2 SEQ ID NO: 170 и LC CDR3 SEQ ID NO: 183 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 158, LC CDR2 SEQ ID NO: 171 и LC CDR3 SEQ ID NO: 184 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 159, LC CDR2 SEQ ID NO: 172 и LC CDR3 SEQ ID NO: 185 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 160, LC CDR2 SEQ ID NO: 173 и LC CDR3 SEQ ID NO: 186 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 161, LC CDR2 SEQ ID NO: 174 и LC CDR3 SEQ ID NO: 187 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 162, LC CDR2 SEQ ID NO: 175 и LC CDR3 SEQ ID NO: 188 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 163, LC CDR2 SEQ ID NO: 176 и LC CDR3 SEQ ID NO: 189 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 164, LC CDR2 SEQ ID NO: 177 и LC CDR3 SEQ ID NO: 190 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 165, LC CDR2 SEQ ID NO: 178 и LC CDR3 SEQ ID NO: 191 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 166, LC CDR2 SEQ ID NO: 179 и LC CDR3 SEQ ID NO: 192 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 167, LC CDR2 SEQ ID NO: 180 и LC CDR3 SEQ ID NO: 193 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 168, LC CDR2 SEQ ID NO: 181 и LC CDR3 SEQ ID NO: 194 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 202, LC CDR2 SEQ ID NO: 203 и LC CDR3 SEQ ID NO: 204 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (HC) одного из следующих:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 117, HC CDR2 SEQ ID NO: 130 и HC CDR3 SEQ ID NO: 143 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 118, HC CDR2 SEQ ID NO: 131 и HC CDR3 SEQ ID NO: 144 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 119, HC CDR2 SEQ ID NO: 132 и HC CDR3 SEQ ID NO: 145 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 120, HC CDR2 SEQ ID NO: 133 и HC CDR3 SEQ ID NO: 146 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 121, HC CDR2 SEQ ID NO: 134 и HC CDR3 SEQ ID NO: 147 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 122, HC CDR2 SEQ ID NO: 135 и HC CDR3 SEQ ID NO: 148 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 123, HC CDR2 SEQ ID NO: 136 и HC CDR3 SEQ ID NO: 149 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 124, HC CDR2 SEQ ID NO: 137 и HC CDR3 SEQ ID NO: 150 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 125, HC CDR2 SEQ ID NO: 138 и HC CDR3 SEQ ID NO: 151 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 126, HC CDR2 SEQ ID NO: 139 и HC CDR3 SEQ ID NO: 152 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 127, HC CDR2 SEQ ID NO: 140 и HC CDR3 SEQ ID NO: 153 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 128, HC CDR2 SEQ ID NO: 141 и HC CDR3 SEQ ID NO: 154 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 129, HC CDR2 SEQ ID NO: 142 и HC CDR3 SEQ ID NO: 155 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 199, HC CDR2 SEQ ID NO: 200 и HC CDR3 SEQ ID NO: 201 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанного в настоящем описании (например, CAR нуклеиновой кислоты или CAR полипептида), или CLL-1-связывющий домен включают
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранных из следующих:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 356, LC CDR2 SEQ ID NO: 370 и LC CDR3 SEQ ID NO: 384 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 357, LC CDR2 SEQ ID NO: 371 и LC CDR3 SEQ ID NO: 385 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 358, LC CDR2 SEQ ID NO: 372 и LC CDR3 SEQ ID NO: 386 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 359, LC CDR2 SEQ ID NO: 373 и LC CDR3 SEQ ID NO: 387 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 360, LC CDR2 SEQ ID NO: 374 и LC CDR3 SEQ ID NO: 388 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 361, LC CDR2 SEQ ID NO: 375 и LC CDR3 SEQ ID NO: 389 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 362, LC CDR2 SEQ ID NO: 376 и LC CDR3 SEQ ID NO: 390 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 363, LC CDR2 SEQ ID NO: 377 и LC CDR3 SEQ ID NO: 391 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 364, LC CDR2 SEQ ID NO: 378 и LC CDR3 SEQ ID NO: 392 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 365, LC CDR2 SEQ ID NO: 379 и LC CDR3 SEQ ID NO: 393 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 366, LC CDR2 SEQ ID NO: 380 и LC CDR3 SEQ ID NO: 394 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 367, LC CDR2 SEQ ID NO: 381 и LC CDR3 SEQ ID NO: 395 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 368, LC CDR2 SEQ ID NO: 382 и LC CDR3 SEQ ID NO: 396 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 369, LC CDR2 SEQ ID NO: 383 и LC CDR3 SEQ ID NO: 397 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (HC) одного их следующих:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 314, HC CDR2 SEQ ID NO: 328 и HC CDR3 SEQ ID NO: 342 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 315, HC CDR2 SEQ ID NO: 329 и HC CDR3 SEQ ID NO: 343 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 316, HC CDR2 SEQ ID NO: 330 и HC CDR3 SEQ ID NO: 344 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 317, HC CDR2 SEQ ID NO: 331 и HC CDR3 SEQ ID NO: 345 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 318, HC CDR2 SEQ ID NO: 332 и HC CDR3 SEQ ID NO: 346 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 319, HC CDR2 SEQ ID NO: 333 и HC CDR3 SEQ ID NO: 347 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 320, HC CDR2 SEQ ID NO: 334 и HC CDR3 SEQ ID NO: 348 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 321, HC CDR2 SEQ ID NO: 335 и HC CDR3 SEQ ID NO: 349 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 322, HC CDR2 SEQ ID NO: 336 и HC CDR3 SEQ ID NO: 350 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 323, HC CDR2 SEQ ID NO: 337 и HC CDR3 SEQ ID NO: 351 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 324, HC CDR2 SEQ ID NO: 338 и HC CDR3 SEQ ID NO: 352 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 325, HC CDR2 SEQ ID NO: 339 и HC CDR3 SEQ ID NO: 353 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 326, HC CDR2 SEQ ID NO: 340 и HC CDR3 SEQ ID NO: 354 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 327, HC CDR2 SEQ ID NO: 341 и HC CDR3 SEQ ID NO: 355 181286.
В некоторых воплощениях молекула CAR, описанного в настоящем описании (например, CAR нуклеиновой кислоты или CAR полипептида), включает
(1) один, два или три CDR легкой цепи (LC), выбранных из следующих:
(i) LC CDR1 SEQ ID NO: 440, LC CDR2 SEQ ID NO: 454 и LC CDR3 SEQ ID NO: 468 CLL-1-CAR-1;
(ii) LC CDR1 SEQ ID NO: 441, LC CDR2 SEQ ID NO: 455 и LC CDR3 SEQ ID NO: 469 CLL-1-CAR-2;
(iii) LC CDR1 SEQ ID NO: 442, LC CDR2 SEQ ID NO: 456 и LC CDR3 SEQ ID NO: 470 CLL-1-CAR-3;
(iv) LC CDR1 SEQ ID NO: 443, LC CDR2 SEQ ID NO: 457 и LC CDR3 SEQ ID NO: 471 CLL-1-CAR-4;
(v) LC CDR1 SEQ ID NO: 444, LC CDR2 SEQ ID NO: 458 и LC CDR3 SEQ ID NO: 472 CLL-1-CAR-5;
(vi) LC CDR1 SEQ ID NO: 445, LC CDR2 SEQ ID NO: 459 и LC CDR3 SEQ ID NO: 473 CLL-1-CAR-6;
(vii) LC CDR1 SEQ ID NO: 446, LC CDR2 SEQ ID NO: 460 и LC CDR3 SEQ ID NO: 474 CLL-1-CAR-7;
(viii) LC CDR1 SEQ ID NO: 447, LC CDR2 SEQ ID NO: 461 и LC CDR3 SEQ ID NO: 475 CLL-1-CAR-8; или
(ix) LC CDR1 SEQ ID NO: 448, LC CDR2 SEQ ID NO: 462 и LC CDR3 SEQ ID NO: 476 CLL-1-CAR-9;
(x) LC CDR1 SEQ ID NO: 449, LC CDR2 SEQ ID NO: 463 и LC CDR3 SEQ ID NO: 477 CLL-1-CAR-10;
(xi) LC CDR1 SEQ ID NO: 450, LC CDR2 SEQ ID NO: 464 и LC CDR3 SEQ ID NO: 478 CLL-1-CAR-11;
(xii) LC CDR1 SEQ ID NO: 451, LC CDR2 SEQ ID NO: 465 и LC CDR3 SEQ ID NO: 479 CLL-1-CAR-12;
(xiii) LC CDR1 SEQ ID NO: 452, LC CDR2 SEQ ID NO: 466 и LC CDR3 SEQ ID NO: 480 CLL-1-CAR-13;
(xiv) LC CDR1 SEQ ID NO: 453, LC CDR2 SEQ ID NO: 467 и LC CDR3 SEQ ID NO: 481 181286; и/или
(2) один, два или три CDR тяжелой цепи (HC) из следующих:
(i) HC CDR1 SEQ ID NO: 398, HC CDR2 SEQ ID NO: 412 и HC CDR3 SEQ ID NO: 426 CLL-1-CAR-1;
(ii) HC CDR1 SEQ ID NO: 399, HC CDR2 SEQ ID NO: 413 и HC CDR3 SEQ ID NO: 427 CLL-1-CAR-2;
(iii) HC CDR1 SEQ ID NO: 400, HC CDR2 SEQ ID NO: 414 и HC CDR3 SEQ ID NO: 428 CLL-1-CAR-3;
(iv) HC CDR1 SEQ ID NO: 401, HC CDR2 SEQ ID NO: 415 и HC CDR3 SEQ ID NO: 429 CLL-1-CAR-4;
(v) HC CDR1 SEQ ID NO: 402, HC CDR2 SEQ ID NO: 416 и HC CDR3 SEQ ID NO: 430 CLL-1-CAR-5;
(vi) HC CDR1 SEQ ID NO: 403, HC CDR2 SEQ ID NO: 417 и HC CDR3 SEQ ID NO: 431 CLL-1-CAR-6;
(vii) HC CDR1 SEQ ID NO: 404, HC CDR2 SEQ ID NO: 418 и HC CDR3 SEQ ID NO: 432 CLL-1-CAR-7;
(viii) HC CDR1 SEQ ID NO: 405, HC CDR2 SEQ ID NO: 419 и HC CDR3 SEQ ID NO: 433 CLL-1-CAR-8; или
(ix) HC CDR1 SEQ ID NO: 406, HC CDR2 SEQ ID NO: 420 и HC CDR3 SEQ ID NO: 434 CLL-1-CAR-9;
(x) HC CDR1 SEQ ID NO: 407, HC CDR2 SEQ ID NO: 421 и HC CDR3 SEQ ID NO: 435 CLL-1-CAR-10;
(xi) HC CDR1 SEQ ID NO: 408, HC CDR2 SEQ ID NO: 422 и HC CDR3 SEQ ID NO: 436 CLL-1-CAR-11;
(xii) HC CDR1 SEQ ID NO: 409, HC CDR2 SEQ ID NO: 423 и HC CDR3 SEQ ID NO: 437 CLL-1-CAR-12;
(xiii) HC CDR1 SEQ ID NO: 410, HC CDR2 SEQ ID NO: 424 и HC CDR3 SEQ ID NO: 438 CLL-1-CAR-13;
(xiv) HC CDR1 SEQ ID NO: 411, HC CDR2 SEQ ID NO: 425 и HC CDR3 SEQ ID NO: 439 181286.
В воплощениях анти-CLL-1 полностью человеческие одноцепочечные вариабельные фрагменты генерируют и клонируют в лентивирусные CAR-экспрессирующие векторы с внутриклеточным доменом CD3-дзета и внутриклеточным костимулирующим доменом 4-1ВВ. В таблице 1 приводятся названия примеров полностью человеческих CLL-1 scFv.
Таблица 1. Конструкции CAR-CLL-1
Конструкции ID
Название
139115
CLL-1 (или CLL-1-CAR-1)
139116
CLL-2 (или CLL-1-CAR-2)
139117
CLL-3 (или CLL-1-CAR-3)
139118
CLL-4 (или CLL-1-CAR-4)
139119
CLL-5 (или CLL-1-CAR-5)
139120
CLL-6 (или CLL-1-CAR-6)
139121
CLL-7 (или CLL-1-CAR-7)
139122
CLL-8 (или CLL-1-CAR-8)
146259
CLL-9 (или CLL-1-CAR-9)
146261
CLL-10 (или CLL-1-CAR-10)
146262
CLL-11 (или CLL-1-CAR-11)
146263
CLL-12 (или CLL-1-CAR-12)
146264
CLL-13 (или CLL-1-CAR-13)
3
4
В воплощениях порядок, в котором домены VL и VH появляются в scFv, изменяется (т.е., ориентация VL-VH или VH-VL), и где или три или четыре копии субъединицы «G4S» (SEQ ID NO: 25), в которых каждая субъединица включает последовательность GGGGS (SEQ ID NO: 25) (например, (G4S) (SEQ ID NO: 28) или (G4S)(SEQ ID NO: 27)), соединяют вариабельные домены для создания полного домена scFv, как показано в таблице 2.
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности CLL-1-scFv доменов и молекул CLL-1-CAR приводятся в таблице 2. Аминокислотные последовательности вариабельной тяжелой цепи и вариабельной легкой цепи для каждого scFv также приводятся в таблице 2. Отмечается, что фрагменты scFv (SEQ ID NO: 39-51) с лидерной последовательностью (например, аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12) также охватываются настоящим изобретением.
Лидерная (аминокислотная последовательность) SEQ ID NO: 1
MALPVTALLLPLALLLHAARP
Лидерная
(nucleic acid sequence) (SEQ ID NO: 12)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
Шарнирный CD8 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 2)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
Шарнирный CD8 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 13)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGA
Трансмембранный CD8 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
Трансмембранный CD8 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 17)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
Внутриклеточный домен 4-1BB (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 7)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
Внутриклеточный домен 4-1BB (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 18)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
Внутриклеточный домен CD28 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 482)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 482)
Внутриклеточный домен CD28 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 483)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 483)
Внутриклеточный домен ICOS (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 484)
T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L (SEQ ID NO: 484)
Внутриклеточный домен ICOS (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 485)
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA (SEQ ID NO: 485)
Домен CD3-дзета (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO: 9)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO: 20)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
Домен CD3-дзета (аминокислотная последовательность; эталонная последовательность NCBI NM_000734.3) (SEQ ID NO:10)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета (нуклеотидная последовательность; эталонная последовательность NCBI NM_000734.3); (SEQ ID NO:21)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccag
aaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttt
tggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaagga
agaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcgg
aggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggc
acgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgc
ccttcacatgcaggccctgccccctcgc
Шарнирный IgG4 (аминокислотная последовательность) (SEQ ID NO:36)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
Шарнирный IgG4 (нуклеотидная последовательность) (SEQ ID NO:37)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
В воплощениях такие клоны (например, в таблице 2) все содержат изменение остатка Q/K в сигнальном домене костимулирующего домена, полученного из цепи CD3-дзета.
Таблица 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности CLL-1-scFv доменов и молекул CLL-1-CAR
<b>Название/</b><b>Описание</b>
<b>SEQ ID NO:</b>
<b>Последовательность </b>
<b>146259</b>
<b>146259- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 9</b>
47
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKAPANTFSDHVMHWVRQAPGQRFEWMGYIHАANGGTHYSQKFQDRVTITRDTSANTVYMDLSSLRSEDTAVYYCARGGYNSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFNGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
<b>146259- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 9</b>
60
CАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTCАAGGАACCCGGAGCCTCCGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCTCCTGCCАACACTTTCTCGGACCACGTGATGCACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGCGCTTCGАATGGATGGGATACATTCATGCCGCCАATGGCGGTACCCACTACTCCCАAАAGTTCCAGGATAGAGTCACCATCACCCGGGACACCAGCGCCАACACCGTGTATATGGATCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGGCGGATACАACTCAGACGCGTTCGACATTTGGGGACAGGGTACTATGGTCACCGTGTCATCCGGGGGCGGTGGCAGCGGGGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCAGGGGGAGGAGGGTCCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCGTCATCGGTGTCCGCGTCCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACGTGTCGCGCCAGCCAGGACATCTCCTCGTGGTTGGCATGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTCATCTACGCCGCCTCCTCCCTTCАATCGGGAGTGCCCTCGCGGTTCАACGGАAGCGGАAGCGGGACAGATTTTACCCTGACTATTAGCTCGCTGCAGCCCGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCАACAGAGCTACTCCACCCCACTGACTTTCGGCGGGGGTACCАAGGTCGAGATCАAG
<b>146259- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 9</b>
73
QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKAPANTFSDHVMHWVRQAPGQRFEWMGYIHАANGGTHYSQKFQDRVTITRDTSANTVYMDLSSLRSEDTAVYYCARGGYNSDAFDIWGQGTMVTVSS
<b>146259- ак, VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 9</b>
86
DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFNGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
<b>146259- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 9</b>
99
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKAPANTFSDHVMHWVRQAPGQRFEWMGYIHАANGGTHYSQKFQDRVTITRDTSANTVYMDLSSLRSEDTAVYYCARGGYNSDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFNGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>146259- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 9</b>
112
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTCАAGGАACCCGGAGCCTCCGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCTCCTGCCАACACTTTCTCGGACCACGTGATGCACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGCGCTTCGАATGGATGGGATACATTCATGCCGCCАATGGCGGTACCCACTACTCCCАAАAGTTCCAGGATAGAGTCACCATCACCCGGGACACCAGCGCCАACACCGTGTATATGGATCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGGCGGATACАACTCAGACGCGTTCGACATTTGGGGACAGGGTACTATGGTCACCGTGTCATCCGGGGGCGGTGGCAGCGGGGGCGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGATCAGGGGGAGGAGGGTCCGACATCGTGATGACCCAGTCCCCGTCATCGGTGTCCGCGTCCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACGTGTCGCGCCAGCCAGGACATCTCCTCGTGGTTGGCATGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTCATCTACGCCGCCTCCTCCCTTCАATCGGGAGTGCCCTCGCGGTTCАACGGАAGCGGАAGCGGGACAGATTTTACCCTGACTATTAGCTCGCTGCAGCCCGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCАACAGAGCTACTCCACCCCACTGACTTTCGGCGGGGGTACCАAGGTCGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139119</b>
<b>139119- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 6</b>
44
QVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWVGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTАADTAVYYCARGSGLVVYAIRVGSGWFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGDSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLMYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVDIK
<b>139119- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 6</b>
57
CАAGTGCАACTTCАAGАATCAGGCGCAGGACTTCTCАAGCCATCCGАAACACTCTCCCTCACTTGCGCGGTGTACGGGGGАAGCTTCTCGGGATACTACTGGTCCTGGATTAGGCAGCCTCCCGGCАAAGGCCTGGАATGGGTCGGGGAGATCАACCACTCCGGTTCАACCАACTACАACCCGTCGCTGАAGTCCCGCGTGACCATTTCCGTGGACACCTCTАAGАATCAGTTCAGCCTGАAGCTCTCGTCCGTGACCGCGGCGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTCGGGGATCAGGACTGGTGGTGTACGCCATCCGCGTGGGCTCGGGCTGGTTCGATTACTGGGGCCAGGGАACCCTGGTCACTGTGTCGTCCGGCGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGAGACAGCGGTGGAGGGGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCATCCCAGAGCATTTCCAGCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCCGGАAAGGCCCCTАAGCTGTTGATGTACGCCGCCAGCAGCTTGCAGTCGGGCGTGCCGAGCCGGTTTTCCGGTTCCGGCTCCGGGACTGACTTCACCCTGACTATCTCATCCCTGCАACCCGAGGACTTCGCCACTTATTACTGCCAGCAGTCCTACTCАACCCCTCCCTGGACGTTCGGACAGGGCACCАAGGTCGATATCАAG
<b>139119- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 6</b>
70
QVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWVGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTАADTAVYYCARGSGLVVYAIRVGSGWFDYWGQGTLVTVSS
<b>139119- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 6</b>
83
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLMYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVDIK
<b>139119- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 6</b>
96
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLQESGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWVGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTАADTAVYYCARGSGLVVYAIRVGSGWFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGDSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLMYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPWTFGQGTKVDIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139119- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 6</b>
109
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTTCАAGАATCAGGCGCAGGACTTCTCАAGCCATCCGАAACACTCTCCCTCACTTGCGCGGTGTACGGGGGАAGCTTCTCGGGATACTACTGGTCCTGGATTAGGCAGCCTCCCGGCАAAGGCCTGGАATGGGTCGGGGAGATCАACCACTCCGGTTCАACCАACTACАACCCGTCGCTGАAGTCCCGCGTGACCATTTCCGTGGACACCTCTАAGАATCAGTTCAGCCTGАAGCTCTCGTCCGTGACCGCGGCGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTCGGGGATCAGGACTGGTGGTGTACGCCATCCGCGTGGGCTCGGGCTGGTTCGATTACTGGGGCCAGGGАACCCTGGTCACTGTGTCGTCCGGCGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGAGACAGCGGTGGAGGGGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCATCCCAGAGCATTTCCAGCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCCGGАAAGGCCCCTАAGCTGTTGATGTACGCCGCCAGCAGCTTGCAGTCGGGCGTGCCGAGCCGGTTTTCCGGTTCCGGCTCCGGGACTGACTTCACCCTGACTATCTCATCCCTGCАК,CCCGAGGACTTCGCCACTTATTACTGCCAGCAGTCCTACTCАACCCCTCCCTGGACGTTCGGACAGGGCACCАAGGTCGATATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАК,CTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>146261</b>
<b>146261- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 10</b>
48
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSVRAIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQAYSTPFTFGPGTKVEIK
<b>146261- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 10</b>
61
CАAGTGCАACTTGTTCАATCCGGTGGAGGTCTTGTGCAGCCCGGAGGATCACTCAGACTGTCGTGCGCCGCCTCTGGGTTCACTTTCTCCTCATACTCGATGАACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGАAAGGGCCTGGАATGGGTGTCATACATCTCCTCCTCATCCTCCACCATCTACTACGCCGATTCCGTGАAGGGCCGCTTCACTATTTCCCGGGACАACGCGАК,АAACTCGCTCTATCTGCАAATGАACTCCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGACCTGAGCGTGCGGGCTATTGATGCGTTCGACATCTGGGGACAGGGCACCATGGTCACAGTGTCCAGCGGAGGCGGCGGCAGCGGTGGAGGAGGATCAGGGGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGTGGCTCCGATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGTCGAGCCTCTCCGCCTCCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACGTGTCAGGCATCCCAGGACATTAGCАACTACCTGАATTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTACGACGCCTCCАACCTGGАAACCGGAGTGCCATCCAGGTTCTCGGGCAGCGGCTCGGGАК,CCGACTTCACTTTTACTATCTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCGACCTACTACTGCCAGCAGGCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGGCCGGGАACTАAGGTCGАAATCАAG
<b>146261- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 10</b>
74
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSVRAIDAFDIWGQGTMVTVSS
<b>146261- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 10</b>
87
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQAYSTPFTFGPGTKVEIK
<b>146261- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 10</b>
100
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSVRAIDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQAYSTPFTFGPGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>146261- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 10</b>
113
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTTGTTCАATCCGGTGGAGGTCTTGTGCAGCCCGGAGGATCACTCAGACTGTCGTGCGCCGCCTCTGGGTTCACTTTCTCCTCATACTCGATGАК,CTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGАAAGGGCCTGGАATGGGTGTCATACATCTCCTCCTCATCCTCCACCATCTACTACGCCGATTCCGTGАAGGGCCGCTTCACTATTTCCCGGGACАACGCGАAАAACTCGCTCTATCTGCАAATGАACTCCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGACCTGAGCGTGCGGGCTATTGATGCGTTCGACATCTGGGGACAGGGCACCATGGTCACAGTGTCCAGCGGAGGCGGCGGCAGCGGTGGAGGAGGATCAGGGGGAGGAGGTTCGGGGGGCGGTGGCTCCGATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGTCGAGCCTCTCCGCCTCCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACGTGTCAGGCATCCCAGGACATTAGCАACTACCTGАATTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTACGACGCCTCCАACCTGGАAACCGGAGTGCCATCCAGGTTCTCGGGCAGCGGCTCGGGАACCGACTTCACTTTTACTATCTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCGACCTACTACTGCCAGCAGGCCTACAGCACCCCTTTCACCTTCGGGCCGGGАACTАAGGTCGАAATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>146262</b>
<b>146262- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 11</b>
49
EVQLVQSGGGVVRSGRSLRLSCАК,SGFTFNSYGLHWVRQAPGKGLEWVALIEYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDKSKSTLYLQMDNLRAEDTAVYYCAREGNEDLAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQFIKKNLNWYQHKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFSGNRSGTTFSFTISSLQPEDVATYYCQQHDNLPLTFGGGTKVEIK
<b>146262- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 11</b>
62
GАAGTGCАATTGGTGCАATCAGGAGGAGGAGTGGTCAGATCTGGАAGАAGCCTGAGACTGTCATGCGCGGCTTCGGGCTTTACCTTCАACTCCTACGGCCTCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGАAАAGGCCTCGАATGGGTCGCACTGATTGAGTACGACGGGTCCАACАAGTACTACGGAGATAGCGTGАAGGGCCGCTTCACCATCTCACGGGACАAGTCCАAGTCCACCCTGTATCTGCАAATGGACАACCTGAGGGCCGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGАAGGАAACGАAGATCTGGCCTTCGATATTTGGGGCCAGGGTACTCTTGTGACCGTGTCGAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGTTCCGGCGGCGGGGGGAGCGАAATCGTGCTGACCCAGTCGCCTTCCTCCCTCTCCGCTTCCGTGGGGGACCGGGTCACTATTACGTGTCAGGCGTCCCАATTCATCАAGАAGАATCTGАACTGGTACCAGCACАAGCCGGGАAAGGCCCCCАAACTGCTCATCTACGACGCCAGCTCGCTGCAGACTGGCGTGCCTTCCCGGTTTTCCGGGАACCGGTCGGGАACCACCTTCTCATTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCGGAGGACGTGGCGACCTACTACTGCCAGCAGCATGACАACCTTCCACTGACTTTCGGCGGGGGCACCАAGGTCGAGATTАAG
<b>146262- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 11</b>
75
EVQLVQSGGGVVRSGRSLRLSCАASGFTFNSYGLHWVRQAPGKGLEWVALIEYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDKSKSTLYLQMDNLRAEDTAVYYCAREGNEDLAFDIWGQGTLVTVSS
<b>146262- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 11</b>
88
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQFIKKNLNWYQHKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFSGNRSGTTFSFTISSLQPEDVATYYCQQHDNLPLTFGGGTKVEIK
<b>146262- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 11</b>
101
MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVQSGGGVVRSGRSLRLSCАASGFTFNSYGLHWVRQAPGKGLEWVALIEYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDKSKSTLYLQMDNLRAEDTAVYYCAREGNEDLAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQFIKKNLNWYQHKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFSGNRSGTTFSFTISSLQPEDVATYYCQQHDNLPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>146262- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 11</b>
114
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАATTGGTGCАATCAGGAGGAGGAGTGGTCAGATCTGGАAGАAGCCTGAGACTGTCATGCGCGGCTTCGGGCTTTACCTTCАACTCCTACGGCCTCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGАAАAGGCCTCGАATGGGTCGCACTGATTGAGTACGACGGGTCCАACАAGTACTACGGAGATAGCGTGАAGGGCCGCTTCACCATCTCACGGGACАAGTCCАAGTCCACCCTGTATCTGCАAATGGACАACCTGAGGGCCGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGАAGGАAACGАAGATCTGGCCTTCGATATTTGGGGCCAGGGTACTCTTGTGACCGTGTCGAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGTTCCGGCGGCGGGGGGAGCGАAATCGTGCTGACCCAGTCGCCTTCCTCCCTCTCCGCTTCCGTGGGGGACCGGGTCACTATTACGTGTCAGGCGTCCCАATTCATCАAGАAGАATCTGАACTGGTACCAGCACАAGCCGGGАAAGGCCCCCАAACTGCTCATCTACGACGCCAGCTCGCTGCAGACTGGCGTGCCTTCCCGGTTTTCCGGGАACCGGTCGGGАACCACCTTCTCATTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCGGAGGACGTGGCGACCTACTACTGCCAGCAGCATGACАACCTTCCACTGACTTTCGGCGGGGGCACCАAGGTCGAGATTАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>146263</b>
<b>146263- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 12</b>
50
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАК,SGFNVSSNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGATYYGDSVKGRFTVSRDNSKNTVYLQMNRLTAEDTAVYYCARDRLYCGNNCYLYYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPLTFGQGTKVEIK
<b>146263- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 12</b>
63
CАAGTGCАACTCGTGGАATCAGGCGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGTTCCCTTAGACTGTCATGTGCCGCTTCCGGGTTCАATGTGTCCAGCАACTACATGACCTGGGTCAGACAGGCGCCGGGАAAGGGACTTGАATGGGTGTCCGTGATCTACTCCGGTGGAGCАACATACTACGGAGACTCCGTGАAAGGCCGCTTTACCGTGTCCCGCGATАACTCGАAGАACACCGTGTACTTGCAGATGАACAGGCTGACTGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGCGCCCGGGACAGGCTGTACTGTGGАAACАACTGCTACCTGTACTACTACTACGGGATGGACGTGTGGGGACAGGGCACTCTCGTCACTGTGTCATCCGGGGGGGGCGGTAGCGGTGGCGGAGGGTCCGGCGGAGGAGGCTCAGGGGGAGGCGGАAGCGATATCCAGGTCACCCAGTCTCCCTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTCACCATTACTTGCCGGGCGTCGCAGTCGATCAGCTCCTACCTGАACTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTGATCTACGCGGCCTCGTCCCTGCАAAGCGGCGTCCCGTCGCGGTTCAGCGGTTCCGGTTCGGGАACCGACTTCACCCTGACTATTTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCACCTCTGACCTTCGGCCАAGGАACCАAGGTCGАAATCАAG
<b>146263- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 12</b>
76
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFNVSSNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGATYYGDSVKGRFTVSRDNSKNTVYLQMNRLTAEDTAVYYCARDRLYCGNNCYLYYYYGMDVWGQGTLVTVSS
<b>146263- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 12</b>
89
DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPLTFGQGTKVEIK
<b>146263- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 12</b>
102
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFNVSSNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGATYYGDSVKGRFTVSRDNSKNTVYLQMNRLTAEDTAVYYCARDRLYCGNNCYLYYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>146263- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 12</b>
115
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTGGАATCAGGCGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGTTCCCTTAGACTGTCATGTGCCGCTTCCGGGTTCАATGTGTCCAGCАACTACATGACCTGGGTCAGACAGGCGCCGGGАAAGGGACTTGАATGGGTGTCCGTGATCTACTCCGGTGGAGCАACATACTACGGAGACTCCGTGАAAGGCCGCTTTACCGTGTCCCGCGATАACTCGАAGАACACCGTGTACTTGCAGATGАACAGGCTGACTGCCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGCGCCCGGGACAGGCTGTACTGTGGАAACАACTGCTACCTGTACTACTACTACGGGATGGACGTGTGGGGACAGGGCACTCTCGTCACTGTGTCATCCGGGGGGGGCGGTAGCGGTGGCGGAGGGTCCGGCGGAGGAGGCTCAGGGGGAGGCGGАAGCGATATCCAGGTCACCCAGTCTCCCTCCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTCACCATTACTTGCCGGGCGTCGCAGTCGATCAGCTCCTACCTGАACTGGTACCAGCAGАAGCCTGGАAAGGCCCCGАAGCTGCTGATCTACGCGGCCTCGTCCCTGCАAAGCGGCGTCCCGTCGCGGTTCAGCGGTTCCGGTTCGGGАACCGACTTCACCCTGACTATTTCCTCCCTGCАACCCGAGGATTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCACCTCTGACCTTCGGCCАAGGАACCАAGGTCGАAATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАК,ATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139115</b>
<b>139115- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 1</b>
39
EVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLEMATIMGGYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLDVVFGGGTKLTVL
<b>139115- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 1</b>
52
GАAGTGCАACTCCАACAGTCAGGCGCAGАAGTCАAGАAGCCCGGATCGTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCCTCCGGCGGАACCTTCAGCTCCTACGCАATCAGCTGGGTGCGGCAGGCGCCCGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGGTATCATTCCGATCTTTGGCACCGCCАATTACGCCCAGАAGTTCCAGGGACGCGTCACАATCACCGCCGACGАATCGACTTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCGTCCTTGAGGAGCGАAGATACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGGATCTGGAGATGGCCACTATCATGGGGGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTGTCCTCGGGAGGAGGGGGATCAGGCGGCGGCGGTTCCGGGGGAGGAGGАAGCCAGTCCGCGCTGACTCAGCCAGCTTCCGTGTCTGGTTCGCCGGGACAGTCCATCACTATTAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACGTGGGCGGCTACАACTATGTGTCATGGTACCAGCAGCACCCGGGGАAGGCGCCTАAGCTGATGATCTACGACGTGTCCАACCGCCCTAGCGGAGTGTCCАACAGATTCTCCGGTTCGАAGTCAGGGАACACTGCCTCCCTCACGATTAGCGGGCTGCАAGCCGAGGATGАAGCCGACTACTACTGCTCCTCCTATACCTCCTCCTCGACCCTGGACGTGGTGTTCGGAGGAGGCACCАAGCTCACCGTCCTT
<b>139115- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 1</b>
65
EVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLEMATIMGGYWGQGTLVTVSS
<b>139115- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 1</b>
78
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLDVVFGGGTKLTVL
<b>139115- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 1</b>
91
MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLEMATIMGGYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGНNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLDVVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139115- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 1</b>
104
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАACTCCАACAGTCAGGCGCAGАAGTCАAGАAGCCCGGATCGTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAAGCCTCCGGCGGАACCTTCAGCTCCTACGCАATCAGCTGGGTGCGGCAGGCGCCCGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGGTATCATTCCGATCTTTGGCACCGCCАATTACGCCCAGАAGTTCCAGGGACGCGTCACАATCACCGCCGACGАATCGACTTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCGTCCTTGAGGAGCGАAGATACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGGATCTGGAGATGGCCACTATCATGGGGGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTGTCCTCGGGAGGAGGGGGATCAGGCGGCGGCGGTTCCGGGGGAGGAGGАAGCCAGTCCGCGCTGACTCAGCCAGCTTCCGTGTCTGGTTCGCCGGGACAGTCCATCACTATTAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACGTGGGCGGCTACАACTATGTGTCATGGTACCAGCAGCACCCGGGGАAGGCGCCTАAGCTGATGATCTACGACGTGTCCАACCGCCCTAGCGGAGTGTCCАACAGATTCTCCGGTTCGАAGTCAGGGАACACTGCCTCCCTCACGATTAGCGGGCTGCАAGCCGAGGATGАAGCCGACTACTACTGCTCCTCCTATACCTCCTCCTCGACCCTGGACGTGGTGTTCGGAGGAGGCACCАAGCTCACCGTCCTTACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАК,GCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАК,GGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139116</b>
<b>139116- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 2</b>
40
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCАК,SGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSLISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARVFDSYYMDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSEIVLTQSPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLVYTDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSDTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQGTHWSFTFGQGTRLEIK
<b>139116- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 2</b>
53
GАAGTGCАATTGGTGGАAAGCGGAGGAGGAGTGGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCCTCGGGATTCACTTTCGATGACTACGCАATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGАAAGGGTCTGGАATGGGTGTCCCTCATCTCCGGCGATGGGGGTTCCACTTACTATGCGGATTCTGTGАAGGGCCGCTTCACАATCTCCCGGGACАATTCCАAGАACACTCTGTACCTTCАAATGАACTCCCTGAGGGTGGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCGAGAGTGTTTGACTCGTACTATATGGACGTCTGGGGАAAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGCGGTGGCGGTGGATCGGGGGGCGGCGGCTCCGGGAGCGGAGGTTCCGAGATTGTGCTGACTCAGTCGCCGTTGTCACTGCCTGTCACCCCCGGGCAGCCGGCCTCCATTTCATGCCGGTCCAGCCAGTCCCTGGTCTACACCGATGGGАACACTTACCTCАACTGGTTCCAGCAGCGCCCAGGACAGTCCCCGCGGAGGCTGATCTACАAAGTGTCАAACCGGGACTCCGGCGTCCCCGATCGGTTCTCGGGАAGCGGCAGCGACACCGACTTCACGCTGАAGATTTCCCGCGTGGАAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGTATGCAGGGCACCCACTGGTCGTTTACCTTCGGACАAGGАACTAGGCTCGAGATCАAG
<b>139116- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 2</b>
66
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCАASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSLISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARVFDSYYMDVWGKGTTVTVSS
<b>139116- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 2</b>
79
EIVLTQSPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLVYTDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSDTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQGTHWSFTFGQGTRLEIK
<b>139116- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 2</b>
92
MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCАASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSLISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCARVFDSYYMDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSEIVLTQSPLSLPVTPGQPASISCRSSQSLVYTDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSDTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQGTHWSFTFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139116- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 2</b>
105
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАATTGGTGGАAAGCGGAGGAGGAGTGGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCCTCGGGATTCACTTTCGATGACTACGCАATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCCGGАAAGGGTCTGGАATGGGTGTCCCTCATCTCCGGCGATGGGGGTTCCACTTACTATGCGGATTCTGTGАAGGGCCGCTTCACАATCTCCCGGGACАATTCCАAGАACACTCTGTACCTTCАAATGАACTCCCTGAGGGTGGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCGAGAGTGTTTGACTCGTACTATATGGACGTCTGGGGАAAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGCGGTGGCGGTGGATCGGGGGGCGGCGGCTCCGGGAGCGGAGGTTCCGAGATTGTGCTGACTCAGTCGCCGTTGTCACTGCCTGTCACCCCCGGGCAGCCGGCCTCCATTTCATGCCGGTCCAGCCAGTCCCTGGTCTACACCGATGGGАACACTTACCTCАACTGGTTCCAGCAGCGCCCAGGACAGTCCCCGCGGAGGCTGATCTACАAAGTGTCАAACCGGGACTCCGGCGTCCCCGATCGGTTCTCGGGАAGCGGCAGCGACACCGACTTCACGCTGАAGATTTCCCGCGTGGАAGCCGAGGACGTGGGCATCTACTACTGTATGCAGGGCACCCACTGGTCGTTTACCTTCGGACАAGGАACTAGGCTCGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139118</b>
<b>139118- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 3</b>
41
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVSISVDTSKNQFSLKLKYVTАADTAVYYCATPGTYYDFLSGYYPFYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYАASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPYTFGQGTKLEIK
<b>139118- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 3</b>
54
CАAGTGCAGCTTCАAGАAAGCGGTCCAGGACTCGTCАAGCCATCAGАAACTCTTTCCCTCACTTGTACCGTGTCGGGAGGCAGCATCTCCTCGAGCTCCTACTACTGGGGTTGGATTAGACAGCCCCCGGGАAAGGGGTTGGAGTGGATCGGTTCCATCTACTACTCCGGGTCGACCTACTACАACCCTTCCCTGАAATCTCGGGTGTCCATCTCCGTCGACACCTCCАAGАACCAGTTCAGCCTGАAGCTGАAATATGTGACCGCGGCCGATACTGCCGTGTACTATTGCGCCACCCCGGGАACCTACTACGACTTCCTCTCGGGGTACTACCCGTTTTACTGGGGACAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCCTCGGGCGGCGGAGGTTCAGGCGGTGGCGGATCGGGGGGAGGAGGCTCAGACATTGTGATGACCCAGAGCCCGTCCAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGCGATAGGGTCACGATTACTTGCCGGGCGTCCCAGGGАATCTCАAGCTACCTGGCCTGGTACCАACAGАAGCCCGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTATGCCGCTAGCACTCTGCAGTCCGGGGTGCCTTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCGGGCACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCACTGCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGCTGАACTCCTACCCTTACACATTCGGACAGGGАACCАAGCTGGАAATCАAG
<b>139118- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 3</b>
67
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVSISVDTSKNQFSLKLKYVTАADTAVYYCATPGTYYDFLSGYYPFYWGQGTLVTVSS
<b>139118- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 3</b>
80
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYАASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPYTFGQGTKLEIK
<b>139118- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 3</b>
93
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVSISVDTSKNQFSLKLKYVTАADTAVYYCATPGTYYDFLSGYYPFYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYАASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАК,GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139118- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 3</b>
106
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCAGCTTCАAGАAAGCGGTCCAGGACTCGTCАAGCCATCAGАAACTCTTTCCCTCACTTGTACCGTGTCGGGAGGCAGCATCTCCTCGAGCTCCTACTACTGGGGTTGGATTAGACAGCCCCCGGGАAAGGGGTTGGAGTGGATCGGTTCCATCTACTACTCCGGGTCGACCTACTACАACCCTTCCCTGАAATCTCGGGTGTCCATCTCCGTCGACACCTCCАAGАACCAGTTCAGCCTGАAGCTGАAATATGTGACCGCGGCCGATACTGCCGTGTACTATTGCGCCACCCCGGGАACCTACTACGACTTCCTCTCGGGGTACTACCCGTTTTACTGGGGACAGGGGACTCTCGTGACCGTGTCCTCGGGCGGCGGAGGTTCAGGCGGTGGCGGATCGGGGGGAGGAGGCTCAGACATTGTGATGACCCAGAGCCCGTCCAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGCGATAGGGTCACGATTACTTGCCGGGCGTCCCAGGGАATCTCАAGCTACCTGGCCTGGTACCАACAGАAGCCCGGАAAGGCACCCАAGTTGCTGATCTATGCCGCTAGCACTCTGCAGTCCGGGGTGCCTTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCGGGCACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCACTGCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGCTGАACTCCTACCCTTACACATTCGGACAGGGАACCАAGCTGGАAATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGA,CTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАК,GCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139122</b>
<b>139122- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 4</b>
42
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSAKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDLRSGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSISGSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGLGTKLEIK
<b>139122- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 4</b>
55
CАAGTGCАACTCGTGGАATCTGGTGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGATCATTGCGACTCTCGTGTGCGGCATCCGGCTTTACCTTTTCATCCTACTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCCGGGАAGGGACTGGАATGGGTCGCGАACATCАACGAGGACGGCTCGGCCАAGTTCTACGTGGACTCCGTGАAGGGCCGCTTCACGATCTCACGGGATАACGCCАAGАATTCCCTGTATCTGCАAATGАACAGCCTGAGGGCCGAGGACACTGCGGTGTACTTCTGCGCACGCGACCTGAGGTCCGGGAGATACTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCGAGCGGAGGAGGGGGGTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGTGGCGGCGGTAGCGАAATTGTGTTGACCCAGTCCCCTGGАACCCTGAGCCTGTCACCTGGAGGACGCGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCCAGAGCATCTCAGGGTCCTTCCTGGCTTGGTACCAGCAGАAGCCGGGACAGGCTCCGAGACTTCTGATCTACGGCGCCTCCTCGCGGGCGACCGGАATCCCGGATCGGTTCTCCGGCTCGGGАAGCGGАACTGACTTCACTCTTACCATTTCCCGCCTGGAGCCGGАAGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGGTCATCCCCTCCАACCTTCGGCCTGGGАACTАAGCTGGАAATCАAA
<b>139122- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 4</b>
68
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSAKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDLRSGRYWGQGTLVTVSS
<b>139122- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 4</b>
81
EIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSISGSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGLGTKLEIK
<b>139122- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 4</b>
94
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSAKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDLRSGRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSISGSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGLGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139122- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 4</b>
107
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTGGАATCTGGTGGAGGACTCGTGCАACCCGGAGGATCATTGCGACTCTCGTGTGCGGCATCCGGCTTTACCTTTTCATCCTACTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCCCCCGGGАAGGGACTGGАATGGGTCGCGАACATCАACGAGGACGGCTCGGCCАAGTTCTACGTGGACTCCGTGАAGGGCCGCTTCACGATCTCACGGGATАACGCCАAGАATTCCCTGTATCTGCАAATGАACAGCCTGAGGGCCGAGGACACTGCGGTGTACTTCTGCGCACGCGACCTGAGGTCCGGGAGATACTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCGAGCGGAGGAGGGGGGTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGTGGCGGCGGTAGCGАAATTGTGTTGACCCAGTCCCCTGGАACCCTGAGCCTGTCACCTGGAGGACGCGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCAGCCAGAGCATCTCAGGGTCCTTCCTGGCTTGGTACCAGCAGАAGCCGGGACAGGCTCCGAGACTTCTGATCTACGGCGCCTCCTCGCGGGCGACCGGАATCCCGGATCGGTTCTCCGGCTCGGGАAGCGGАACTGACTTCACTCTTACCATTTCCCGCCTGGAGCCGGАAGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGGTCATCCCCTCCАACCTTCGGCCTGGGАACTАATGGАAATCАAАACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139117</b>
<b>139117- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 5</b>
43
EVQLQQSGPGLVRPSETLSLTCTVSGGPVRSGSHYWNWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLENRVTISIDTSNNHFSLKLSSVTАADTALYFCARGTATFDWNFPFDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSDIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKLEIK
<b>139117- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 5</b>
56
GАAGTGCАACTCCАACАATCCGGTCCAGGACTCGTCAGACCCTCCGАAACTCTCTCGCTTACATGCACTGTGTCCGGCGGCCCTGTGCGGTCCGGCTCTCATTACTGGАACTGGATTCGCCAGCCCCCGGGACGCGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTATTACTCGGGGTCGACTАACTACАACCCGAGCCTGGАAАATAGAGTGACCATCTCАATCGACACGTCCАACАACCACTTCTCGCTGАAGTTGTCCTCCGTGACTGCCGCCGATACTGCCCTGTACTTCTGTGCTCGCGGАACCGCCACCTTCGACTGGАACTTCCCTTTTGACTCATGGGGCCAGGGGACCCTTGTGACCGTGTCCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGCGGGAGCGGTAGCGGCGGАAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCGTCCTCGCTGTCCGCATCCATTGGGGATCGGGTCACTATTACTTGCCGGGCGTCCCAGTCCATCTCGTCCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCAGGGАК,AGCCCCCАAGCTGCTGATCTACGCGGCCAGCAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCTTCАAGGTTTAGCGGCAGCGGATCGGGАACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTCCАACCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCGTGGACCTTCGGACAGGGАACCАAGCTGGAGATCАAG
<b>139117- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 5</b>
69
EVQLQQSGPGLVRPSETLSLTCTVSGGPVRSGSHYWNWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLENRVTISIDTSNNHFSLKLSSVTАADTALYFCARGTATFDWNFPFDSWGQGTLVTVSS
<b>139117- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 5</b>
82
DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKLEIK
<b>139117- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 5</b>
95
MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLQQSGPGLVRPSETLSLTCTVSGGPVRSGSHYWNWIRQPPGRGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLENRVTISIDTSNNHFSLKLSSVTАADTALYFCARGTATFDWNFPFDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSDIQMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYАASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139117- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 5</b>
108
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАACTCCАACАATCCGGTCCAGGACTCGTCAGACCCTCCGАAACTCTCTCGCTTACATGCACTGTGTCCGGCGGCCCTGTGCGGTCCGGCTCTCATTACTGGАACTGGATTCGCCAGCCCCCGGGACGCGGACTGGAGTGGATCGGCTACATCTATTACTCGGGGTCGACTАACTACАACCCGAGCCTGGАAАATAGAGTGACCATCTCАATCGACACGTCCАACАACCACTTCTCGCTGАAGTTGTCCTCCGTGACTGCCGCCGATACTGCCCTGTACTTCTGTGCTCGCGGАACCGCCACCTTCGACTGGАACTTCCCTTTTGACTCATGGGGCCAGGGGACCCTTGTGACCGTGTCCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGCGGGAGCGGTAGCGGCGGАAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCGTCCTCGCTGTCCGCATCCATTGGGGATCGGGTCACTATTACTTGCCGGGCGTCCCAGTCCATCTCGTCCTACCTGАACTGGTATCAGCAGАAGCCAGGGАAAGCCCCCАAGCTGCTGATCTACGCGGCCAGCAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCTTCАAGGTTTAGCGGCAGCGGATCGGGАACCGACTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTCCАACCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCTACTCCACCCCGTGGACCTTCGGACAGGGАACCАAGCTGGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139120</b>
<b>139120- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 7</b>
45
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSSSGSYYMEDSYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQVVFGGGTKLTVL
<b>139120- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 7</b>
58
GАAGTGCАATTGGTGGАATCTGGAGGAGGACTTGTGАAACCTGGTGGАAGCCTGAGACTTTCCTGTGCGGCCTCGGGATTCACTTTCTCCTCCTACTCCATGАACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGGАAGGGACTGGАATGGGTGTCATCCATCTCCTCCTCATCGTCGTACATCTACTACGCCGATAGCGTGАAGGGGCGGTTCACCATTTCCCGGGACАACGCTАAGАACAGCCTCTATCTGCАAATGАATTCCCTCCGCGCCGAGGACACTGCCGTGTACTACTGCGCGAGGGACCCCTCATCАAGCGGCAGCTACTACATGGAGGACTCGTATTACTACGGАATGGACGTCTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACGGTGTCCTCCGGTGGAGGGGGCTCCGGGGGCGGGGGATCTGGCGGAGGAGGCTCCАACTTCATGCTGACCCAGCCGCACTCCGTGTCCGАAAGCCCCGGАAAGACCGTGACАATTTCCTGCACCGGGTCCTCCGGCTCGATCGCATCАAACTACGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGCGCCCCCACCACTGTCATCTACGAGGATАACCAGCGGCCGTCGGGTGTCCCAGACCGGTTTTCCGGTTCGATCGATAGCAGCAGCАACAGCGCCTCCCTGACCATTTCCGGCCTCАAGACCGAGGATGAGGCTGACTACTACTGCCAGTCGTATGACTCCTCGАACCАAGTGGTGTTCGGTGGCGGCACCАAGCTGACTGTGCTG
<b>139120- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 7</b>
71
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSSSGSYYMEDSYYYGMDVWGQGTTVTVSS
<b>139120- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 7</b>
84
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQVVFGGGTKLTVL
<b>139120- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 7</b>
97
MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCАASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSSSGSYYMEDSYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQVVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139120- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 7</b>
110
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАATTGGTGGАATCTGGAGGAGGACTTGTGАAACCTGGTGGАAGCCTGAGACTTTCCTGTGCGGCCTCGGGATTCACTTTCTCCTCCTACTCCATGАACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGGАAGGGACTGGАATGGGTGTCATCCATCTCCTCCTCATCGTCGTACATCTACTACGCCGATAGCGTGАAGGGGCGGTTCACCATTTCCCGGGACАACGCTАAGАACAGCCTCTATCTGCАAATGАATTCCCTCCGCGCCGAGGACACTGCCGTGTACTACTGCGCGAGGGACCCCTCATCАAGCGGCAGCTACTACATGGAGGACTCGTATTACTACGGАATGGACGTCTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACGGTGTCCTCCGGTGGAGGGGGCTCCGGGGGCGGGGGATCTGGCGGAGGAGGCTCCАACTTCATGCTGACCCAGCCGCACTCCGTGTCCGАAAGCCCCGGАAAGACCGTGACATTTCCTGCACCGGGTCCTCCGGCTCGATCGCATCАAACTACGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGCGCCCCCACCACTGTCATCTACGAGGATАК,CCAGCGGCCGTCGGGTGTCCCAGACCGGTTTTCCGGTTCGATCGATAGCAGCAGCАК,CAGCGCCTCCCTGACCATTTCCGGCCTCАAGACCGAGGATGAGGCTGACTACTACTGCCAGTCGTATGACTCCTCGАACCАAGTGGTGTTCGGTGGCGGCACCАAGCTGACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>139121</b>
<b>139121- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 8</b>
46
QVNLRESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALGSSWEWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIK
<b>139121- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 8</b>
59
CАAGTGАACCTGAGAGАAAGCGGCGGAGGACTTGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCGTCCGGCTTCACCTTCTCGTCCTACGAGATGАACTGGGTCCGCCAGGCACCGGGCАAAGGACTGGАATGGGTGTCCTACATTTCCTCGTCCGGGTCCACCATCTATTACGCCGACTCCGTGA,GGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACАACGCCАAGАACTCCCTCTACCTCCАAATGАACTCACTGAGGGCAGAGGACACTGCGGTCTACTACTGCGCCCGCGАAGCTTTGGGTAGCTCCTGGGAGTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACCGTGTCCTCGGGTGGAGGGGGCTCCGGTGGCGGGGGTTCAGGGGGTGGCGGАAGCGATATCCAGATGACTCAGTCACCАAGCTCCCTGAGCGCCTCAGTGGGAGATCGGGTCACАATCACGTGCCAGGCGTCCCAGGACATTTCTАACTACCTCАATTGGTACCAGCAGАAGCCGGGGАAGGCCCCCАAGCTTCTGATCTACGATGCCTCCАACCTGGАAACCGGCGTGCCCTCCCGCTTCTCGGGATCGGGCAGCGGCACTGACTTCACCTTTACCATCTCGTCCCTGCАACCTGAGGACATCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTACGATАACCTCCCGCTGACTTTCGGAGGCGGАACTАAGCTGGAGATTАAG
<b>139121- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 8</b>
72
QVNLRESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALGSSWEWGQGTTVTVSS
<b>139121- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 8</b>
85
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIK
<b>139121- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 8</b>
98
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVNLRESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALGSSWEWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>139121- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 8</b>
111
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGАACCTGAGAGАAAGCGGCGGAGGACTTGTGCАACCTGGAGGАAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCGTCCGGCTTCACCTTCTCGTCCTACGAGATGАACTGGGTCCGCCAGGCACCGGGCАAAGGACTGGАATGGGTGTCCTACATTTCCTCGTCCGGGTCCACCATCTATTACGCCGACTCCGTGАAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACАACGCCАAGАACTCCCTCTACCTCCАAATGАACTCACTGAGGGCAGAGGACACTGCGGTCTACTACTGCGCCCGCGАAGCTTTGGGTAGCTCCTGGGAGTGGGGCCAGGGАACCACTGTGACCGTGTCCTCGGGTGGAGGGGGCTCCGGTGGCGGGGGTTCAGGGGGTGGCGGАAGCGATATCCAGATGACTCAGTCACCАAGCTCCCTGAGCGCCTCAGTGGGAGATCGGGTCACАATCACGTGCCAGGCGTCCCAGGACATTTCTАACTACCTCАATTGGTACCAGCAGАAGCCGGGGАAGGCCCCCАAGCTTCTGATCTACGATGCCTCCАACCTGGАAACCGGCGTGCCCTCCCGCTTCTCGGGATCGGGCAGCGGCACTGACTTCACCTTTACCATCTCGTCCCTGCАACCTGAGGACATCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTACGATАACCTCCCGCTGACTTTCGGAGGCGGАACTАAGCTGGAGATTАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАК,CGАК,CTCАК,TCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>146264</b>
<b>146264- ак,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 13</b>
51
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYPFTGYYIQWVRQAPGQGLEWMGWIDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDSYGYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQGISSALAWYQQKPGKPPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVEIK
<b>146264- нк,</b><b>ScFv-домен</b><b>CLL-1-CAR 13</b>
64
CАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTGАAАAAGAGCGGAGCCTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAGGCCTCCGGTTACCCCTTCACTGGATACTACATTCAGTGGGTCCGCCАAGCCCCGGGACAGGGTCTGGAGTGGATGGGGTGGATTGACCCTАACTCGGGАAATACGGGATACGCGCAGАAGTTCCAGGGCCGCGTGACCATGACCAGGАACACCTCGATCAGCACCGCCTACATGGАACTGTCCTCCCTGCGGTCGGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCTCCGATTCCTATGGGTACTACTACGGАATGGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCGGGAGGCGGAGGGAGCGGCGGGGGTGGATCGGGAGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCATCАAGCCTTAGCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACATTCACTTGTCGGGCGTCCCAGGGАATCTCCTCCGCTCTGGCTTGGTATCAGCAGАAGCCTGGGАAGCCTCCGАAGCTGTTGATCTACGACGCGAGCAGCCTGGАATCAGGGGTGCCCTCCCGGTTTTCCGGGTCCGGTTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATTTCGTCCCTCCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTTCАACАACTACCCGCTGACCTTCGGAGGAGGCACTАAGGTCGAGATCАAG
<b>146264- ак,</b><b>VH ScFv</b><b>CLL-1-CAR 13</b>
77
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYPFTGYYIQWVRQAPGQGLEWMGWIDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDSYGYYYGMDVWGQGTLVTVSS
<b>146264- ак,</b><b>VL ScFv</b><b>CLL-1-CAR 13</b>
90
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQGISSALAWYQQKPGKPPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVEIK
<b>146264- ак,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 13</b>
103
MALPVTALLLPLALLLHАARPQVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYPFTGYYIQWVRQAPGQGLEWMGWIDPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDSYGYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQGISSALAWYQQKPGKPPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>146264- нк,</b><b>полный CAR,</b><b>CLL-1-CAR 13</b>
116
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCАAGTGCАACTCGTCCAGTCCGGTGCAGАAGTGАAАAAGAGCGGAGCCTCAGTGАAAGTGTCCTGCАAGGCCTCCGGTTACCCCTTCACTGGATACTACATTCAGTGGGTCCGCCАAGCCCCGGGACAGGGTCTGGAGTGGATGGGGTGGATTGACCCTАACTCGGGАAATACGGGATACGCGCAGАAGTTCCAGGGCCGCGTGACCATGACCAGGАACACCTCGATCAGCACCGCCTACATGGАACTGTCCTCCCTGCGGTCGGAGGATACTGCCGTGTACTACTGCGCCTCCGATTCCTATGGGTACTACTACGGАATGGACGTCTGGGGACAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCCTCGGGAGGCGGAGGGAGCGGCGGGGGTGGATCGGGAGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCATCАAGCCTTAGCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACATTCACTTGTCGGGCGTCCCAGGGАATCTCCTCCGCTCTGGCTTGGTATCAGCAGАAGCCTGGGАAGCCTCCGАAGCTGTTGATCTACGACGCGAGCAGCCTGGАATCAGGGGTGCCCTCCCGGTTTTCCGGGTCCGGTTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATTTCGTCCCTCCАACCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTTCАACАACTACCCGCTGACCTTCGGAGGAGGCACTАAGGTCGAGATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАAGCАACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
<b>181268</b>
<b>181268- ак,</b><b>VH ScFv</b>
195
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYSSSWHDAFDIWGQGTMVTVSS
<b>181268- ак,</b><b>VL ScFv</b>
196
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVDIK
<b>181268- ак,</b><b>полный CAR</b>
197
MALPVTALLLPLALLLHАARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCАASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYSSSWHDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVDIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPАAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<b>181268- нк,</b><b>полный CAR</b>
198
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGАAGTGCАACTCGTGGАAAGCGGTGGAGGTCTTGTGCАACCTGGAGGTTCCTTGCGCCTGTCATGTGCAGCTTCCGGCTTCACTTTCTCCTCGTACGAGATGАATTGGGTGCGGCAGGCGCCTGGАAAGGGGCTGGАATGGGTGTCCTACATCTCАAGCTCCGGCTCGACCATCTACTACGCGGACAGCGTGАAGGGGCGGTTCACGATTTCGAGGGACАACGCCАAGАACTCGCTCTATCTGCАAATGАACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCCGGGACCCCTACTCCTCCTCATGGCACGACGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGАACCATGGTCACCGTCAGCAGCGGGGGCGGAGGTTCCGGGGGAGGGGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCCGAGATTGTGTTGACTCAGAGCCCGGGTACCCTGTCGCTGAGCCCCGGAGAGCGGGCCACCCTTTCATGCCGCGCCAGCCAGTCCGTGTCCTCATCCTACCTCGCGTGGTACCAGCAGАAACCTGGCCAGGCCCCGCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCTCGCGCGCАACCGGАATCCCCGACCGGTTCTCCGGGTCTGGCAGCGGАACCGACTTCACTCTCACCATTTCGAGGCTGGAGCCGGАAGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCTCCTCGCCACTGACTTTCGGCGGAGGАACCАAGGTCGATATCАAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTАAGCGCGGTCGGАAGАAGCTGCTGTACATCTTTАК,GCАК,CCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCАAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGАAGGCGGCTGCGАACTGCGCGTGАAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACАAGCAGGGGCAGАACCAGCTCTACАACGАACTCАATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACАAGCGGAGAGGACGGGACCCAGАAATGGGCGGGАAGCCGCGCAGАAAGАATCCCCАAGAGGGCCTGTACАACGAGCTCCАAАAGGATАAGATGGCAGАAGCCTATAGCGAGATTGGTATGАAAGGGGАACGCAGАAGAGGCАAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCАAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
В воплощениях фрагменты CAR scFv затем клонируют в лентивирусные векторы для создания конструкции полноразмерного CAR в одной кодирующей рамке и с использованием промтора EF1-альфа для экспрессии (SEQ ID NO: 11).
Промтор EF1-альфа
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
Gly/Ser (SEQ ID NO:25)
GGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:26): эта последовательность может охватывать 1-6 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Gly Ser»
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO:29)
GGGS
ПолиA:
(SEQ ID NO:30)
5000
(A)
Эта последовательность может охватывать 50-5000 аденинов.
ПолиA:
(SEQ ID NO:31)
100
(T)
ПолиA
(SEQ ID NO:32)
5000
: (T)
Эта последовательность может охватывать 50-5000 тиминов.
ПолиA:
(SEQ ID NO:33)
5000
(A)
Эта последовательность может охватывать 100-5000 аденинов.
ПолиA:
(SEQ ID NO:34)
400
(A)
ПолиA:
(SEQ ID NO:35)
2000
(A)
Gly/Ser (SEQ ID NO:38): эта последовательность может охватывать 1-10 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Ser»
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
В одном воплощении CLL-1-CAR может включать один или больше, например, одни, два или три, CDR вариабельного домена тяжелой цепи и/или один или больше, например, одни, два или три, CDR вариабельного домена легкой цепи или вариабельную тяжелую цепь (VH) или вариабельную легкую цепь (VL) анти-CLL-1 (CLEC12A) антитела, раскрытого в публикации РСТ WO2014/051433, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Фрагменты CAR csFv можно клонировать в лентивирусные векторы для создания конструкции полноразмерного CAR в одной кодирующей рамке и с использованием промтора EF1-альфа для экспрессии (SEQ ID NO: 11).
Конструкция CAR может включать линкер Gly/Ser, имеющий одну или несколько из следующих последовательностей: GGGGS (SEQ ID NO:25); охватывающую 1-6 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Gly Ser», например, GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27); GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 28); GGGS (SEQ ID NO: 29); или охватывающую 1-10 повторяющихся звеньев «Gly Gly Gly Ser», например, GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 38). В воплощениях конструкция CAR включает последовательность поли(А), например, последовательность, охватывающую 50-5000 или 100-5000 аденинов (например, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35), или последовательность, охватывающую 50-5000 тиминов (например, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32). С другой стороны, конструкция CAR может включать, например, линкер, включающий последовательность GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 486).
Биспецифические CAR
В одном воплощении молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичность в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется последовательностью первого вариабельного домена иммуноглобулина, который имеет специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и последовательностью второго вариабельного домена иммуноглобулина, который имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, одном и том же белке (или субъединице полимерного белка). В одном воплощении первый и второй эпитопы перекрываются. В одном воплощении первый и второй эпитопы не перекрываются. В одном воплощении первый и второй эпитопы находятся в различных антигенах, например, различных белках (или различных субъединицах полимерного белка). В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые имеют специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые имеют специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает половину антитела, имеющую специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и половину антитела, имеющую специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает половину антитела или ее фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и половину антитела или ее фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении второго эпитопа. В одном воплощении молекула биспецифического антитела включает scFv или его фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и scFv или его фрагмент, имеющие специфичность связывания в отношении второго эпитопа.
В некоторых воплощениях молекула антитела является молекулой полиспецифического (например, биспецифического или триспецифического) антитела. Протоколы для получения молекул биспецифических или триспецифических антител известны в технике, включая, но не ограничиваясь перечисленным, например, подход «застежка-кнопка», описанный, например, в US 5731168; спаривание Fc с использованием электростатического взаимодействия, описанное, например, в WO 09/089004, WO 06/106905 и WO 2010/129304; образование гетеродимера доменами, сконструированными с обменом цепей (SEED), описанное, например, в WO 07/110205; обмен антигенсвязыващими фрагментами Fab, описанный, например, в WO 08/119353, WO 2011/131746 и WO 2013/060867; конъюгирование двух антител, например, путем сшивания антител, с образованием биспецифической структуры с использованием гетеробифункционального реагента, имеющего аминную реакционную группу и сульфгидрильную реакционную группу, описанное, например, в US 4433059; протоколы детерминант биспецифических антител, полученных рекомбинацией половин антител (пар тяжелая-легкая цепь или Fab) из различных антител через цикл восстановления и окисления дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями, как описано, например, в US 4444878; трифункциональных антител, например, трех Fab'-фрагментов, сшитых через сульфгидрильные реакционные группы, описанный, например, в US 5273743; биосинтетических связывающих белков, например, пары scFv, сшитых по С-концевым хвостам, предпочтительно, через химическое сшивание по дисульфидным или аминным реакционным группам, как описано, например, в US 5534254; бифункциональных антител, например, Fab-фрагментов с различными специфичностями связывания, димеризованных через лейциновые молнии (например, c-fos и c-jun), в которых заменен константный домен, как описано, например, в US 5582996; биспецифических и олигоспецифических моно- и олиговалентных рецепторов, например, участков VH-CH1 двух антител (двух Fab-фрагментов), соединенных через полипептидный спейсер между участком СН1 одного антитела и участком VH другого антитела, типично с ассоциированными легкими цепями, как описано, например, в US 5591828; биспецифических конъюгатов ДНК-антитело, например, от сшивания антител или Fab-фрагментов через двухцепочечный отрезок ДНК, как описано, например, в US 5635602; биспецифических слитых белков, например, экспрессирующей конструкции, содержащей два scFv с гидрофильным спиральным пептидным линкером между ними и полным константным участком, как описано, например, в US 5637481; поливалентных и полиспецифических связывающих белков, например, димера полипептидов, имеющих первый домен со связывающим участком вариабельного домена тяжелой цепи Ig и второй домен со связывающим участком вариабельного домена легкой цепи Ig, обычно называемых диателами (структуры более высокого порядка также охватываются как создающие биспецифические, триспецифические или тетраспецифические молекулы, как описано, например, в US 5837242; конструкций минител с соединенными VL и VH цепями, дополнительно соединенными пептидными спейсерами с шарнирным участком антитела и участком CD3, которые могут быть димеризованы с образованием биспецифических/поливалентных молекул, как описано, например, в US 5837821; VH и VL доменов, соединенных коротким пептидным линкером (например, в 5 или 10 аминокислот) или без линкера вовсе в любой ориентации, которые могут образовывать димеры с образованием биспецифических диател, тримеры и тетрамеры, как описано, например, в US 5844094; нити VH-доменов (или VL-доменов в членах семейства), соединенных пептидными связями со сшивающими группами по С-концу, дополнительно ассоциированных с VL-доменами, с образованием ряда FV (или scFv), как описано, например, в US 5864019; и одноцепочечные связывающие полипептиды как с VH-, так и с VL-доменом, соединенными через пептидный линкер, объединяют в поливалентные структуры через нековалентное или химическое сшивание с образованием, например, гомобивалентных, гетеробивалентных, тривалентных и тетравалентных структур, с использованием формата типа двух scFv или диател, как описано, например, в US 5869620. Другие примеры полиспецифических и биспецифических молекул и способы их получения находят, например, в US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1. Перечисленные выше заявки полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.
1
1
2
2
1
1
2
2
1
1
2
2
1
1
2
2
1
2
1
1
2
2
1
2
1
1
2
2
4
В каждом антителе или фрагменте антитела (например, scFv) молекулы биспецифического антитела VH может располагаться выше или ниже VL. В некоторых воплощениях верхнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VH (VH) выше его VL (VL), и нижнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VL (VL) выше его VH (VH), так что вся молекула биспецифического антитела имеет аранжировку VH-VL-VL-VH. В других воплощениях верхнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VL (VL) выше его VH (VH), и нижнее антитело или фрагмент антитела (например, scFv) выстраивают в ряд с его VH (VH) выше его VL (VL), так что вся молекула биспецифического антитела имеет аранжировку VL-VH-VH-VL. Необязательно между двумя антителами или фрагментами антител (например, scFv), располагается линкер, например, между VL и VL, если конструкция выстроена в виде VH-VL-VL-VH, или между VН и VН, если конструкция выстроена в виде VL-VH-VH-VL. Линкер может представлять собой линкер, описанный в настоящем описании, например, линкер (Gly-Ser)n, где n равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 64). Как правило, линкер между двумя scFv должен быть достаточно длинным для того, чтобы избежать ошибочного спаривания между доменами двух scFv. Необязательно линкер располагается между VL и VH первого scFv. Необязательно линкер располагается между VL и VH второго scFv. В конструкциях, в которых имеется несколько линкеров, любые два или больше линкеров могут быть одинаковыми или различными. Соответственно, в некоторых воплощениях биспецифический CAR включает VL, VH и, необязательно, один или больше линкеров в ряду, как описано в настоящем описании.
В одном аспекте молекула биспецифического антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, например, scFv, которая имеет специфичность связывания в отношении CLL-1, например, включает scFv, описанный в настоящем описании, например, описанный в таблице 2, или включает CDR легкой цепи и/или CDR тяжелой цепи из CLL-1-scFv, описанного в настоящем описании, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, например, scFv, которая имеет специфичность связывания в отношении второго эпитопа в другом антигене. В некоторых аспектах вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении антигена, экспрессированного на клетках AML, например, антигена иного, чем CLL-1. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении CD33. Как другой пример, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении FLT3. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении фолатного рецептора бета. В некоторых аспектах вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина имеет специфичность связывания в отношении антигена, экспрессированного на В-клетках, например, CD19, CD20, CD22 или ROR1.
Химерный TCR
В одном аспекте антитела к CLL-1 и фрагменты антител по настоящему изобретению (например, описанные в таблице 2) могут быть привиты на один или несколько константных доменов цепи Т-клеточного рецептора («TCR»), например, цепи TCR-альфа или TCR-бета, для создания химерного TCR, который специфически связывается с CLL-1. Без связи с какой-либо теорией, полагают, что химерные TCR будут передавать сигнал через комплекс TCR после связывания антигена. Например, CLL-1-scFv, раскрытый в настоящем описании, можно привить на константный домен, например, по меньшей мере часть внеклеточного константного домена, трансмембранный домен и цитоплазматический домен цепи TCR-альфа, например, цепи TCR-альфа и/или цепи TCR-бета. Как другой пример, фрагмент антитела к CLL-1, например, VL домен, описанный в настоящем описании, можно привить на константный домен цепи TCR-альфа, и фрагмент антитела к CLL-1, например, VН домен, описанный в настоящем описании, можно привить на константный домен цепи TCR-бета (или альтернативно, VL домен можно привить на константный домен цепи TCR-бета, и VН домен можно привить к цепи TCR-альфа). Как другой пример, CDR антитела к CLL-1 или фрагмент антитела, например, CDR антитела к CLL-1 или фрагмента антитела, описанные в таблицах 3, 4, 5, 6, 7 и 8, можно привить к цепи TCR-альфа и/или бета-цепи для создания химерного TCR, который специфически связывается с CLL-1. Например, LCDR, раскрытые в настоящем описании, можно привить на вариабельный домен цепи TCR-альфа, и НCDR, раскрытые в настоящем описании, можно привить на вариабельный домен цепи TCR-бета, или наоборот. Такие химерные TCR можно получить способами, известными в технике (см., например, Willemsen RA et al., Gene Therapy, 2000; 7: 1369-1377; Zhang T. et al., Cancer Gene Ther., 2004; 11: 487-496; Aggen et al., Gene Ther., 2012, Apr; 19(4): 365-74).
Трансмембранный домен
Что касается трансмембранного домена, в различных воплощениях можно создать CAR, включающий трансмембранный домен, который соединен с внеклеточным доменом CAR. Трансмембранный домен может включать одну или больше дополнительных аминокислот, соседних с трансмембранным участком, например, одну или больше аминокислот, ассоциированных с внеклеточным участком белка, из которого который трансмембранный белок получают (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внеклеточного участка), и/или одну или больше дополнительных аминокислот, ассоциированных с внутриклеточным участком белка, из которого получен трансмембранный белок (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внутриклеточного участка). В одном аспекте трансмембранный домен является доменом, который ассоциирован с одним из других доменов, которые используются в CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен можно выбрать или модифицировать путем аминокислотной замены для того, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одних и тех же или различных поверхностных мембранных белков, например, для минимизации взаимодействий с другими членами рецепторного комплекса. В одном аспекте трансмембранный домен способен к гомодимеризации с другим CAR на поверхности клетки CART. В другом аспекте аминокислотная последовательность трансмембранного домена может быть модифицирована или заменена так, чтобы минимизировать взаимодействия со связывающими доменами нативного партнера по связыванию, присутствующего в той же CART.
Трансмембранный домен можно получить или из природного или из рекомбинантного источника. Когда источник является природным, домен можно получить из любого мембрансвязанного или трансмембранного белка. В одном аспекте трансмембранный домен способен передавать сигнал к внутриклеточному(ым) домену(ам), всякий раз, когда CAR связан с мишенью. Трансмембранный домен для определенного применения в настоящем изобретении может включать по меньшей мере трансмембранный(е) участок(ки), например, цепи альфа, бета или дзета Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8 (например, CD8-альфа, CD8-бета), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых воплощениях трансмембранный домен может включать по меньшей мере трансмембранный(е) участок(ки) костимулирующей молекулы, например, молекулы ГКГС I класса, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83.
В некоторых случаях трансмембранный домен может присоединяться к внеклеточному участку CAR, например, антигенсвязывающему домену CAR, через шарнир, например, шарнир из человеческого белка. Например, в одном воплощении ширнир может представлять собой шарнир человеческого Ig (иммуноглобулина), например, шарнир IgG4, или шарнир CD8. В одном воплощении шарнир или спейсер включает (например, состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В одном аспекте трансмембранный домен включает (например, состоит из) трансмембранный домен SEQ ID NO: 6.
В одном аспекте шарнир или спейсер включает шарнир IgG4. Например, в одном воплощении шарнир или спейсер включает шарнир аминокислотную последовательность ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (SEQ ID NO: 3). В некоторых воплощениях шарнир или спейсер включает шарнир, кодированный нуклеотидной последовательностью GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (SEQ ID NO: 14).
В одном аспекте шарнир или спейсер включает шарнир IgD. Например, в одном воплощении шарнир или спейсер включает шарнир аминокислотной последовательности RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH (SEQ ID NO:4). В некоторых воплощениях шарнир или спейсер включает шарнир, кодированный нуклеотидной последовательностью AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT (SEQ ID NO:15).
В одном аспекте трансмембранный домен может быть рекомбинантным, и в таком случае он будет включать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В одном аспекте в каждом конце рекомбинантного домена могут быть обнаружены триплет фенилаланина, триптофана и валина.
Необязательно короткий олиго- или полипептидный линкер от 2 до 10 аминокислот в длину может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим участком CAR. Дублет глицин-серин предоставляет особенно подходящий линкер. Например, в одном аспекте линкер включает аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5). В некоторых воплощениях линкер кодирован нуклеотидной последовательностью GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 16).
В одном аспекте шарнир или спейсер включает шарнир KIR2DS2.
Цитоплазматический домен
Цитоплазматический домен или участок CAR по настоящему изобретению включает внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен, как правило, ответственен за активацию по меньшей мере одной из естественных эффекторных функций иммунной клетки, в которую введен CAR.
Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR по изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторы, которые действуют сообща для инициации сигнальной трансдукции после сцепления антигена с рецептором, а также любое производное или вариант таких последовательностей и любую рекомбинантную последовательность, которая имеет такую же функциональную способность.
Известно, что сигналы, генерированные через один TCR, являются недостаточными для полной активации Т-клетки, и что также требуется вторичный и/или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клетки опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: последовательностями, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), и последовательностями, которые действуют антигеннезависимо, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичный цитоплазматический сигнальный домен, например, костимулирующий домен).
Первичный сигнальный домен регулирует первичную активацию комплекса TCR или путем стимуляции или путем ингибирования. Первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые действуют путем стимуляции, содержат сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные активирующие мотивы на основе тирозина или ITAM.
Примеры ITAM, содержащих первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые особенно используются в изобретении, включают ITAM TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известный как «ICOS»), FcεRI, DAP10, DAP12 и CD66d. В одном воплощении CAR по изобретению включает внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен CD3-дзета.
В одном воплощении первичный сигнальный домен включает модифицированный домен ITAM, например, мутированный домен ITAM, который имеет измененную (например, увеличенную или уменьшенную) активность по сравнению с нативным доменом ITAM. В одном воплощении первичный сигнальный домен включает модифицированный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, оптимизированный и/или усеченный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен. В одном воплощении первичный сигнальный домен включает одни, два, три, четыре или больше мотивов ITAM.
Другие примеры молекул, содержащих первичный внутриклеточный сигнальный домен, которые имеют особое применение в изобретении, включают молекулы DAP10, DAP12 и CD32.
Внутриклеточный сигнальный домен CAR может включать первичный сигнальный домен, например, CD3-дзета сигнальный домен сам по себе или может быть объединен в любым(и) другим(и) нужным(и) внутриклеточным(и) сигнальным(и) доменом(амии), применимым(и) в контексте CAR по изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может включать первичный сигнальный домен, например, часть цепи CD3-дзета, и костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, включающей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности иную, чем антигенный рецептор или его лиганды, которая требуется для эффективной реакции лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецеторы NK-клетки, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается с CD83, и т.п.. Например, показано, что костимуляция CD27 усиливает экспансию, эффекторную функцию и выживаемость человеческих клеток CART in vitro и увеличивает стойкость и противоопухолевую аетивность in vivo (Song et al., Blood, 2012, 119(3): 696-706). Внутриклеточные сигнальные последовательности в цитоплазматической части CAR по изобретению могут соединяться друг с другом произвольно или в определенном порядке. Необязательно короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот), может образовывать связь между внутриклеточными сигнальными последовательностями. В одном воплощении в качестве подходящего линкера можно использовать одну аминокислоту, например, аланин, глицин.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий два или больше, например, 2, 3, 4, 5 или больше, костимулирующих сигнальных доменов. В одном воплощении два или больше, например, 2, 3, 4, 5 или больше, костимулирующих сигнальных доменов разделены линкерной молекулой, например, линкерной молекулой, описанной в настоящем описании. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает два костимулирующих домена. В некоторых воплощениях линкерная молекула представляет собой глициновый остаток. В некоторых воплощениях линкер представляет собой аланиновый остаток.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1ВВ. В одном аспекте сигнальный домен CD3-дзета представляет собой сигнальный домен SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (человеческий CD3-дзета дикого типа).
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD27. В одном аспекте сигнальный домен CD27 включает аминокислотную последовательность QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO: 8). В одном аспекте сигнальный домен CD27 кодируется нуклеотидной последовательностью AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 19).
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В одном аспекте сигнальный домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном аспекте сигнальный домен CD28 кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 483.
В одном аспекте внутриклеточный сигнальный домен создают как включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен ICOS. В одном аспекте сигнальный домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484. В одном аспекте сигнальный домен ICOS кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 485.
В одном аспекте CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, может дополнительно включать второй CAR, например, CAR, который включает другой антигенсвязывающий домен, например, для той же мишени (CLL-1) или другой мишени (например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета). В одном воплощении второй CAR включает антигенсвязывающий домен к мишени, экспрессированной в клетках острого миелоидного лейкоза, таких как, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета. В одном воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает первый CAR, который специфически связывает первый антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и второй CAR, который специфически связывает второй отличный от первого антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. Без желания привязываться к теории, размещение костимулирующего сигнального домена, например, 4-1BB, CD28, CD27, ICOS или OX-40, в первом CAR и первичного сигнального домена, например, CD3-дзета, во втором CAR может ограничить активность CAR для клеток, где экспрессируется обе мишени. В одном воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает первый CLL-1-CAR, который включает CLL-1-связывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и второй CAR, который специфически связывает антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает первый CLL-1-CAR, который включает CLL-1-связывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и второй CAR, который специфически связывает антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатного рецептора бета), и включает антигенсвязывающий домен для антигена, трансмембранный домен и костимулирующий домен.
В одном воплощении CAR-экспрессирующая клетка включает CLL-1-CAR, описанный в настоящем описании, и ингибирующий CAR. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, находящийся на здоровых клетках, но не на раковых клетках, например, здоровых клетках, которые также экспрессируют CLL-1. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный сигнальный домен ингибирующей молекулы может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета.
В одном воплощении, когда CAR-экспрессирующая клетка включает два или больше различных CAR, антигенсвязывающие домены различных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй CAR, может иметь антигенсвязывающий домен первого CAR, например, фрагмент, например, scFv, который не образует ассоциацию с антигенсвязывающим доменом второго CAR, например, антигенсвязывающий домен второго CAR представляет собой VHH.
В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен включает антигенсвязывающие однодоменные молекулы (SDAB), определяющие комплементарность участки которых являются частью одного полипептидного домена. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, вариабельные домены тяжелой цепи, связывающие молекулы, по природе лишенные легких цепей, отдельные домены, образованные от обычных 4-цепочечных антител, сконструированные домены и однодоменные каркасы иные, чем каркасы, образованные от антител. Молекулы SDAB могут быть из любых молекул, известных в технике, или любых будущих однодоменных молекул. Молекулы SDAB можно получить от любого вида, включая, но не ограничиваясь перечисленным, мышь, человека, верблюда, ламу, рыбу, акулу, козу, кролика и корову. Этот термин также включает встречающиеся в природе молекулы однодоменных антител вида иного, чем камелиды и акулы.
В одном аспекте молекулу SDAB можно получить из вариабельного участка иммуноглобулина, находящегося в рыбе, такого как, например, который получают из изотипа иммуноглобулина, известного как новый антигенный рецептор (NAR), обнаруженного в сыворотке акулы. Способы получения однодоменных молекул, образованных из вариабельного участка NAR («IgNARs»), описаны в WO 03/014161 и Streltsov (2005), Protein Sci., 14: 2901-2909.
Согласно другому аспекту молекула SDAB представляет собой встречающуюся в природе однодоменную антигенсвязывающую молекулу, известную как тяжелоцепочечная, лишенная легких цепей. Такие однодоменные молекулы раскрываются в WO 9404678 и Hamers-Casterman C. et al. (1993), Nature, 363: 446-448, например. Для ясности, такой вариабельный домен, образованный от тяжелоцепочечной молекулы, по природе лишенной легких цепей, известен в данном случае как VHH или нанотело, для того, чтобы отличить его от обычного VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такую VHH молекулу можно получить от вида верблюдовых, например, верблюда, ламы, дромедара, альпаки и гуанако. Кроме верблюдовых, продуцировать тяжелоцепочечные молекулы, по природе лишенные легких цепей, могут другие виды; такие VHH входят в объем изобретения.
Молекулы SDAB могут быть рекомбинантными, с присоединенными CDR, гуманизированными, камелизированными, деиммунизированными и/или генерированными in vitro (например, выбранные с помощью фагового дисплея).
Также обнаружено, что существуют клетки, имеющие несколько химерных внедренных в мембрану рецепторов, включающих антигенсвязывающий домен, в которых могут быть нежелательными взаимодействия между антигенсвязывающими доменами рецепторов, например, поскольку они ингибирует способность одного или нескольких антигенсвязывающийх доменов связывать свой родственный антиген. Соответственно, в настоящем описании раскрываются клетки, имеющие первый и второй невстречающиеся в природе локализованные в мембране химерные рецепторы, включающие антигенсвязывающие домены, которые минимизируют такие взаимодействия. В настоящем описании также раскрываются нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй не встречающиеся в природе локализованные в мембране химерные рецепторы, включающие антигенсвязывающие домены, которые минимизируют такие взаимодействия, а также способы получения и применения таких клеток и нуклеиновых кислот. В одном воплощении антигенсвязывающий домен одного из указанных первого и второго не встречающихся в природе локализованных в мембране химерных рецепторов, включает scFv, и другой включает одно-VH домен, например, верблюда, акулы, или одно-VH домен миноги, или одно-VH домен, полученный из человеческой или мышиной последовательности.
В некоторых воплощениях изобретение относится к первому и второму CAR, где антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR не включает вариабельный легкий домен и вариабельный тяжелый домен. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR представляет собой scFv, а другой не является scFv. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает одно-VH домен, например, верблюда, акулы, или одно-VH домен миноги, или одно-VH домен, полученный из человеческой или мышиной последовательности. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает нанотело. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает камелидный VHH домен.
В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает scFv, и другой включает одно-VH домен, например, верблюда, акулы, или одно-VH домен миноги, или одно-VH домен, полученный из человеческой или мышиной последовательности. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает scFv, и другой включает нанотело. В некоторых воплощениях антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго СAR включает scFv, и другой включает камелидный VHH домен.
В некоторых воплощениях, при наличии на поверхности клетки, связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR с его родственным антигеном по существу не ослабляется присутствием указанного второго CAR. В некоторых воплощениях связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR с его родственным антигеном в присутствии указанного второго CAR составляет 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от связывания антигенсвязывающего домена указанного первого CAR с его родственным антигеном в отсутствие указанного второго CAR.
В некоторых воплощениях, при наличии на поверхности клетки, антигенсвязывающие домены указанного первого CAR и указанного второго CAR ассоциируются друг с другом слабее, чем если бы оба домена представляли собой scFv антигенсвязывающие домены. В некоторых воплощениях, при наличии на поверхности клетки, антигенсвязывающие домены указанного первого CAR и указанного второго CAR ассоциируются друг с другом на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньше, чем если бы оба домена представляли собой scFv антигенсвязывающие домены.
В другом аспекте CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, может дополнительно экспрессировать другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агент может представлять собой агент, который подавляет ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например, PD1, могут, в некоторых воплощениях, снижать способность CAR-экспрессирующей клетки подготавливать иммунную эффекторную реакцию. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном воплощении агент, который подавляет ингибирующую молекулу, включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении агент включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета, или фрагмент любой из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, включающий костимулирующий домен (например, 4-1BB, CD27, ICOS или CD28, описанные в настоящем описании), и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании). В одном воплощении агент включает первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем описании (например, сигнальный домен CD28, описанный в настоящем описании, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании). В воплощениях CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, включает переключающий костимулирующий рецептор, например, описанный в WO 2013/019615, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. PD1 представляет собой ингибирующий член семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., 1996, Int. Immunol., 8: 765-75). Показано, что два лиганда для PD1 - PD-L1 и PD-L2 отрицательно регулируют активацию T-клеток после связывания с PD1 (Freeman et al., 2000, J. Exp. Med., 192: 1027-34; Latchman et al., 2001, Nat. Immunol., 2: 261-8; Carter et al., 2002, Eur. J. Immunol., 32: 634-43). PD-L1 обилен в раковых клетках человека (Dong et al., 2003, J. Mol. Med., 81: 281-7; Blank et al., 2005, Cancer Immunol. Immunother., 54: 307-314; Konishi et al., 2004, Clin. Cancer Res., 10: 5094). Иммунную супрессию можно реверсировать путем ингибирования локального взаимодействия PD1 с PD-L1.
В одном воплощении агент включает внеклеточный домен (ECD) ингибирующей молекулы, например, запрограммированной гибели 1 (PD1), который может быть слит с трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом, такими как 41ВВ и CD3-дзета (также называемым в настоящем описании PD1-CAR). В одном воплощении PD1-CAR, когда используется в комбинациях с CLL-1-CAR, описанным в настоящем описании, улучшает стойкость CAR-экспрессирующей клетки, например, Т-клетки или NK-клетки. В одном воплощении CAR представляет собой PD1-CAR, включающий внеклеточный домен PD1, указанный как подчеркнутый в SEQ ID NO: 24. В одном воплощении PD1-CAR включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:24).
В одном воплощении PD1-CAR включает аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 22).
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlv
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:22).
В одном воплощении агент включает нуклеотидную последовательность, кодирующую PD1-CAR, например, PD1-CAR, описанный в настоящем описании. В одном воплощении нуклеотидная последовательность для PD1-CAR показана ниже, причем ниже в SEQ ID NO: 23 PD1-ECD почеркнут.
cccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtc
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccaacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (SEQ ID NO: 23).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к популяции CAR-экспрессирующих клеток, например, клеток CART или CAR-экспрессирующих NK-клеток. В некоторых воплощениях популяция CAR-экспрессирующих клеток включает смесь клеток, экспрессирующих различные CAR. Например, в одном воплощении популяция CAR-экспрессирующих клеток (например, клеток CART или CAR-экспрессирующих NK-клеток) может включать первую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий другой анти-CLL-1 связывающий домен, например, анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, который отличается от анти-CLL-1 связывающего домена в CAR, экспрессированном первой клеткой. Как другой пример, популяция CAR-экспрессирующих клеток может включать первую клетку, экспрессирующую CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен, например, описанный в настоящем описании, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который включает антигенсвязывающий домен для мишени иной, чем CLL-1, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета). В одном воплощении популяция CAR-экспрессирующих клеток включает, например, первую клетку, экспрессирующую CAR, который включает первичный внутриклеточный сигнальный домен, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который включает вторичный сигнальный домен, например, костимулирующий сигнальный домен.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к популяции клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, и вторая клетка экспрессирует другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агент может представлять собой агент, который подавляет ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например, в некоторых воплощениях снижают способность CAR-экспрессирующей клетки подготавливать иммунную эффекторную реакцию. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном воплощении агент, который подавляет ингибирующую молекулу, включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении агент включает первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета, или фрагмент любой из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании (например, включающий костимулирующий домен (например, 4-1BB, CD27, ICOS или CD28, описанные в настоящем описании), и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании). В одном воплощении агент включает первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем описании (например, сигнальный домен CD28, описанный в настоящем описании, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем описании).
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим введение популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, клеток CART или CAR-экспрессирующих NK-клеток), например, смеси клеток, экспрессирующих различные CAR, в комбинации с другим агентом, например, ингибитором киназы, таким как ингибитор киназы, описанный в настоящем описании. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам, включающим введение популяции клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий противораковый ассоциированный антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, и вторая клетка экспрессирует другой агент, например, агент, который усиливает активность CAR-экспрессирующих клеток, в комбинации с другим агентом, например, ингибитором киназы, таким как ингибитор киназы, описанный в настоящем описании.
CAR рецептора природной клетки-киллера (NKR)
В одном воплощении молекула CAR, описанная в настоящем описании, включает один или больше компонентов рецептора природной клетки-киллера (NKR), посредством чего образуется NKR-CAR. Компонент NKR может представлять собой трансмембранный домен, шарнирный домен или цитоплазматический домен любого из следующих рецепторов природной клетки-киллера: иммуноглобулиноподобный рецептор клетки-киллера (KIR), например, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 и KIR3DP1; природный цитотоксический рецептор (NCR), например, NKp30, NKp44, NKp46; сигнальную молекулу активации лимфоцитов (SLAM) семейства рецепторов иммунных клеток, например, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME и CD2F-10; Fc-рецептор (FcR), например, CD16 и CD64; и рецепторы Ly49, например, LY49A, LY49C. Молекулы NKR-CAR, описанные в настоящем описании, могут взаимодействовать с адапторной молекулой или внеклеточным сигнальным доменом, например, DAP12. Примеры конфигураций и последовательностей молекул CAR, включающих компоненты NKR, описаны в публикации № WO2014/145252, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Стратегии регуляции химерных антигенных рецепторов
Существует много способов, которыми можно регулировать активности CAR. В некоторых воплощениях регулируемый CAR (RCAR), где активность CAR можно регулировать, желателен для оптимизации безопасности и эффективности CAR-терапии. Например, индукцию апоптоза с использованием, например, каспазы, слитой с димеризованным доменом (см., например, Di et al., N. Engl. J. Med., 2011, Nov. 3; 365(18): 1673-1683), можно использовать как переключатель безопасности в CAR-терапии по настоящему изобретению. В другом примере CAR-экспрессирующие клетки могут также экспрессировать индуцируемую молекулу каспазы-9 (и-каспаза-9), которая после введения лекарственного средства димеризатора (например, римидусида (также называемого АР1903 (Bellicum Pharmaceuticals) или АР20187 (Ariad) ведет к активации каспазы-9 и апоптозу клеток. Молекула каспазы-9 содержит домен, связывающий химический индуктор димеризации (CID), который опосредует димеризацию в присутствии CID. Это приводит к индуцируемому и селективному истощению CAR-экспрессирующих клеток. В некоторых случаях молекула и-каспазы-9 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты отдельно от CAR-кодирующего(их) вектора(ов). В некоторых случаях молекула и-каспазы-9 кодируется той же молекулой нуклеиновой кислоты, что и CAR-кодирующий ветор. Переключатель безопасности обеспечивает и-каспаза-9 для того, чтобы избежать какую-либо токсичность CAR-экспрессирующих клеток. См., например, Song et al. Cancer Gene Ther., 2008; 15(10): 667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; и Di Stasi et al., N. Engl. J. Med., 2011; 365: 1673-83.
Альтернативные стратегии регулирования CAR-терапии по настоящему изобретению включают использование небольших молекул или антител, которые дезактивируют или заглушают активность CAR, например, путем делеции CAR-экспрессирующих клеток, например, путем индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АDCC). Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут экспрессировать антиген, который узнается молекулами, способными индуцировать гибель клетки, например, АDCC или коплементиндуцированную гибель клетки. Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут экспрессировать рецептор, способный нацеливаться антителом или фрагментом антитела. Примеры таких рецепторов включают EpCAM, VEGFR, интегрины (например, ανβ3, α4, αI¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), члены суперсемейства рецепторов TNF (например, TRAIL-R1, TRAIL-R2), рецептор PDGF, интерфероновый рецептор, фолатный рецептор, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, рецептор IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1 a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE рецептор, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/базигин, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7 и EGFR и их усеченные варианты (например, варианты, сохраняющие один или больше внеклеточных эпитопов, но утрачивающие один или больше участков в цитоплазматическом домене). Например, CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, также могут экспрессировать усеченный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), который утрачивает способность передавать сигнал, но сохраняет эпитоп, который узнается молекулой, способной индуцировать АDCC, например, цетуксимаб (ERBITUX), так что введение цетуксимаба индуцирует АDCC и последующее истощение CAR-экспрессирующих клеток (см., например, WO2011/056894 и Jonnalagadda et al., Gene Ther., 2013; 20(8), 853-860). Другая стратегия включает экспрессию комплекса высококомпактный маркер/суицидный ген, который объединяет эпитопы-мишени из антигенов как CD32, так и CD20 в CAR-экспрессирующих клетках, описанных в настоящем описании, который связывает ритуксимаб, приводя к селективному истощению CAR-экспрессирующих клеток, например, путем ADCC (см., например, Philip et al., Blood, 2014; 124(8), 1277-1287). Другие способы истощения CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании, включают введение САМРАТН - моноклонального анти-CD52 антитела, которое селективно связывает и метит зрелые лимфоциты, например, CAR-экспрессирующие клетки, для деструкции, например, путем индукции ADCC. В других воплощениях CAR-экспрессирующая клетка может быть селективно таргетирована с использованием CAR-лиганда, например, антиидиотипического антитела. В некоторых воплощениях антиидиотипическое антитело может вызывать активность эффекторных клеток, например, активности ADCC или ADC, посредством чего уменьшается число CAR-экспрессирующих клеток. В других воплощениях CAR-лиганд, например, антиидиотипическое антитело, может быть соединено с агентом, который индуцирует киллинг клеток, например, токсином, посредством чего уменьшается число CAR-экспрессирующих клеток. С другой стороны, молекулы CAR сами могут иметь такую конфигурацию, что активность можно регулировать, например, включать и выключать, как описано ниже.
В некоторых воплощениях RCAR включает набор полипептидов, типично два в самых простых воплощениях, в которых компоненты стандартного CAR, описанного в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, распределены по отдельным полипептидам или членам. В некоторых воплощениях набор полипептидов включает переключатель димеризации, который в присутствии димеризующей молекулы может соединять полипептиды один с другим, например, может соединять антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. Дополнительное описание и примеры конфигураций таких регулируемых CAR приводятся в настоящем описании и в международной публикации № WO 2015/090229, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном аспекте RCAR включает два полипептида или члена: 1) внутриклеточный сигнальный член, включающий внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании, и первый переключающий домен; 2) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен, например, который специфически связывает опухолевый антиген, описанный в настоящем описании, и второй переключающий домен. Необязательно RCAR включает трансмембранный домен, описанный в настоящем описании. В одном воплощении трансмембранный домен может располагаться на внутриклеточном сигнальном домене, на антигенсвязывающем домене или на обоих. (Если не указано иное, когда члены или элементы RCAR описываются в настоящем описании, порядок может быть такой, как описан, но включены также другие порядки. Иными словами, в одном воплощении порядок представляет собой набор как из текста, но в других воплощениях порядок может быть иным. Например, порядок элементов на одной стороне трансмембранного участка может отличаться от примера, например, размещение переключающего домена относительно внутриклеточного сигнального домена может быть иным, например, обратным).
В одном воплощении первый и второй переключающие домены могут образовывать внутриклеточный или внеклеточный димеризующий переключатель. В одном воплощении димеризации переключатель может представлять собой гомодимеризующий переключатель, например, когда первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, или гетеродимеризующий переключатель, например, когда первый и второй переключающие домены отличаются один от другого.
В одном воплощении RCAR может включать «мультипереключатель». Мультипереключатель может включать гетеродимеризующие переключающие домены или гомодимеризующие переключающие домены. Мультипереключатель включает несколько, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 переключающих доменов, независимо на первом члене, например, антигенсвязывающем члене, и втором члене, например, внутриклеточном сигнальном члене. В одном воплощении первый член может включать несколько первых переключающих доменов, например, переключающих доменов на основе FKBP, и второй член может включать несколько вторых переключающих доменов, например, переключающих доменов на основе FRB. В одном воплощении первый член может включать первый и второй переключающий домен, например, переключающий домен на основе FKBP и переключающий домен на основе FRB, и второй член может включать первый и второй переключающий домен, например, переключающий домен на основе FKBP и переключающий домен на основе FRB.
В одном воплощении внутриклеточный сигнальный член включает один или больше внутриклеточных сигнальных доменов, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен и один или больше костимулирующих сигнальных доменов.
В одном воплощении антигенсвязывающий член может включать один или больше внутриклеточных сигнальных доменов, например, один или больше костимулирующих сигнальных доменов. В одном воплощении антигенсвязывающий член включает несколько, например, 2 или 3 костимулирующих сигнальных домена, описанных в настоящем описании, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40, и в воплощениях, без первичного внутриклеточного сигнального домена. В одном воплощении антигенсвязывающий член включает следующие костимулирующие сигнальные домены из внеклеточной или внутриклеточной области: 4-1BB-CD27; 4-1BB-CD27; CD27-4-1BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB или 4-1BB-CD28. В одном таком воплощении RCAR включает (1) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен и первый переключающий домен; и (2) внутриклеточный сигнальный домен, включающий трансмембранный домен или мембрансвязанный домен и по меньшей мере один первичный сигнальный домен, и второй переключающий домен.
Одно воплощение относится к RCAR, в котором антигенсвязывающий член не связан с поверхностью CAR-клетки. Это позволяет клетке, имеющей внутриклеточный сигнальный член, удобно образовывать пару с одним или несколькими антигенсвязывающими доменами без трансформации клетки последовательностью, которая кодирует антигенсвязывающий член. В таких воплощениях RCAR включает 1) внутриклеточный сигнальный член, включающий первый переключающий домен, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен, и первый переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен и второй переключающий домен, причем антигенсвязывающий член не включает трансмембранный домен или мембрансвязанный домен, и, необязательно, не включает внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых воплощениях RCAR дополнительно может включать 3) второй антигенсвязывающий член, который связывает антиген иной, чем антиген, который связывается антигенсвязывающим доменом; и второй переключающий домен.
Также раскрываются RCAR, в которых антигенсвязывающий член включает способность к биспецифической активации и таргетингу. В таком воплощении антигенсвязывающий член может включать несколько, например, 2, 3, 4 или 5 антигенсвязывающих доменов, например, scFv, где каждый антигенсвязывающий домен связывается с антигеном-мишенью, например, различными антигенами или одним и тем же антигеном, например, одними и теми же или различными эпитопами на одном и том же антигене. В одном воплощении несколько антигенсвязывающих доменов находятся в тандеме, и необязательно, линкерный или шарнирный участок располагается между всеми антигенсвязывающими доменами. Подходящие линкерные и шарнирные участки описаны в настоящем описании.
Одно воплощение относится к RCAR, имеющим конфигурацию, которая допускает переключение пролиферации. В таком воплощении RCAR включает 1) внутриклеточный сигнальный член, включающий, необязательно, трансмембранный домен или мембрансвязанный домен; один или больше костимулирующих сигнальных доменов, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40, и переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий член, включающий антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета, причем антигенсвязывающий член не включает переключающий домен или не включает переключающий домен, который димеризуется с переключающим доменом на внутриклеточном сигнальном домене. В одном воплощении антигенсвязывающий член не включает костимулирующий сигнальный домен. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает переключающий домен из гомодимеризующего переключателя. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает первый переключающий домен гетеродимеризующего переключателя, и RCAR включает второй внутриклеточный сигнальный член, который включает второй переключающий домен гетеродимеризующего переключателя. В таких воплощениях второй внутриклеточный сигнальный член включает те же внутриклеточные сигнальные домены, что и внутриклеточный сигнальный член. В одном воплощении димеризующий переключатель является внутриклеточным. В одном воплощении димеризующий переключатель является внеклеточным.
В любой из конфигураций RCAR, описанных в настоящем описании, первый и второй переключающие домены включают переключатель на основе FKBP-FRB, как описано в настоящем описании.
Изобретение также относится к клеткам, включающим RCAR, описанный в настоящем описании. Любая клетка, которая сконструирована для экспрессии RCAR, может быть использована как RCARХ-клетка. В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой Т-клетку и называется RCARТ-клеткой. В одном воплощении RCARХ-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCARN-клеткой.
Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и векторам, включающим RCAR-кодирующие последовательности. Последовательность, кодирующая различные элементы RCAR, может располагаться на одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, например, одной и той же плазмиде или векторе, например, вирусном векторе, например, лентивирусном векторе. В одном воплощении (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий член, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен, могут присутствовать в одной и той же нуклеиновой кислоте, например, векторе. Продуцирования соответствующих белков можно достигнуть, например, путем использования отдельных промоторов или путем использования бицистронного продукта транскрипции (который может привести к продуцированию двух белков путем расщепления одного продукта трансляции или путем трансляции двух отдельных белковых продуктов). В одном воплощении последовательность, кодирующая способный расщепляться пептид, например, последовательность Р2А или F2A, располагается между (i) и (ii). В одном воплощении последовательность, кодирующая IRES, например, EMCV или EV71 IRES, располагается между (i) и (ii). В таких воплощениях (i) и (ii) тарнскрибируются как одна РНК. В одном воплощении первый промотор операбельно связан с (i), и второй промотор операбельно связан с (ii), так что (i) и (ii) транслируются как отдельные мРНК.
С другой стороны, последовательность, кодирующая различные элементы RCAR, может располагаться на различных молекулах нуклеиновой кислоты, например, различных плазмидах или векторах, например, вирусном векторе, например, лентивирусном векторе. Например, (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий член, может присутствовать в первой нуклеиновой кислоте, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен, может присутствовать во второй нуклеиновой кислоте, например, втором векторе.
Димеризирующие переключатели
Димеризирующие переключатели могут быть нековалентными или ковалентными. В нековалентном димеризирующем переключателе димеризующая молекула промотирует нековалентное взаимодействие между переключающими доменами. В ковалентном димеризирующем переключателе димеризующая молекула промотирует ковалентное взаимодействие между переключающими доменами.
Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein и characterization of a critical serine residue
В одном воплощении RCAR включает димеризирующий переключатель на основе FKBP/FRAP или FKBP/FRB. FKBP12 (связывающий белок FKBP или FK506) представляет собой распространенный цитоплазматический белок, который служит в качестве исходной внутриклеточной мишени для природного продукта иммуносупрессорного лекарственного средства рапамицина. Рапамицин связывается с FKBP и с крупным PI3K, гомологичным FKBP (RAFT, mTOR). FKB представляет собой часть FKBP в 93 аминокислоты, которая является достаточной для связывания комплекса FKBP-рапамицин (Chen J., Zheng X.F., Brown E.J. & Schreiber S.L. (1995), . Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 92: 4947-51).
В воплощениях в переключателе на основе FKBP/FRAP, например, FKBP/FRВ, можно использовать димеризующую молекулу, например, рапамицин или аналог рапамицина.
Аминокислотная последовательность FKBP следующая:
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 205).
В воплощениях FKBP-переключающий домен может включать фрагмент FKBP, имеющий способность связываться с FRВ или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, например, подчеркнутой частью SEQ ID NO: 205, которая представляет собой
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO: 206).
Аминокислотная последовательность FRB следующая:
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID NO: 207).
«Переключатель на основе FKBP/FRAP, например, FKBP/FRВ» как термин, используемый в настоящем описании, относится к димеризующему переключателю, включающему первый переключающий домен, который включает фрагмент FKBP или его аналог, имеющий способность связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, например, RAD001, и имеет по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность или отличается не более, чем на 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток от последовательности FKBP SEQ ID NO: 54 или 55; и второй переключающий домен, который включает фрагмент FRB или его аналог, имеющий способность связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, и имеет по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность или отличается не более, чем на 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток от последовательности FRB SEQ ID NO: 56. В одном воплощении RCAR, описанный в настоящем описании, включает один переключающий домен, который включает аминокислотные остатки, раскрытые в SEQ ID NO: 205 (или SEQ ID NO: 206), и один переключающий домен, который включает аминокислотные остатки, раскрытые в SEQ ID NO: 207.
В воплощениях FKBP/FRAP димеризующий переключатель включает модифицированный FRB-переключающий домен, который показывает измененное, например, усиленное, комплексообразование между переключающим доменом на основе FRB, например, модифицированным FRB-переключающим доменом, переключающим доменом на основе FKBP, и димеризующей молекулой, например, рапамицином или рапалогом, например, RAD001. В одном воплощении модифицированный FRB-переключающий домен включает одну или больше мутаций, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше, выбранных из мутаций в аминокислотной(ых) позиции(ях) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 и F2108, где аминокислота дикого типа мутирована на любую другую встречающуюся в природе аминокислоту. В одном воплощении мутант FRB включает E2032, где E2032 мутирована на фенилаланин (E2032F), метионин (E2032M), аргинин (E2032R), валин (E2032V), тирозин (E2032Y), изолейцин (E2032I), например, SEQ ID NO: 208, или лейцин (E2032L), например, SEQ ID NO: 209. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию в T2098, где T2098 мутирована на фенилаланин (T2098F) или лейцин (T2098L), например, SEQ ID NO: 210. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию в E2032 и в T2098, где E2032 мутирована на любую аминокислоту, и где T2098 мутирована на любую аминокислоту, например, SEQ ID NO: 211. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию E2032I и T2098L, например, SEQ ID NO: 212. В одном воплощении мутант FRB включает мутацию E2032L и T2098L, например, SEQ ID NO: 213.
Таблица 9. Примеры мутантного FRB, имеющего повышенную аффинность к димеризующей молекуле
<b>Мутант FRB </b>
<b>Аминокислотная последовательность</b>
<b>SEQ ID NO:</b>
Мутант E2032I
ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS
208
Мутант E2032L
ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS
209
Мутант T2098L
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS
210
Мутант E2032, T2098
ILWHEMWHEGL<b><u>X</u></b>EASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDL<b><u>X</u></b>QAWDLYYHVFRRISKTS
211
Мутант Е2032I, T2098L
ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS
212
Мутант E2032L, T2098L
ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS
213
Другие подходящие димеризующие переключатели включают димеризующий переключатель на основе GyrB-GyrB, димеризующий переключатель на основе гиббереллина, димеризующий переключатель tag/связка и димеризующий переключатель галоген-tag/snap-tag. После указаний, приведенных в настоящем описании, такие переключатели и релевантные димеризующие молекулы будут очевидны для специалиста в данной области техники.
Димеризующая молекула
Ассоциация между двумя переключающими доменами промотируется димеризующей молекулой. В присутствии димеризующей молекулы взаимодействие или ассоциация между переключающими доменами допускает сигнальную трансдукцию между полипептидом, ассоциированным, например, слитым, с первым переключающим доменом, и полипептидом, ассоциированным, например, слитым, со вторым переключающим доменом. В присутствии димеризующей молекулы сигнальная трансдукция усиливается в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 раз, например, при измерении в системе, описанной в настоящем описании.
В качестве димеризующих молекул в димеризующем переключателе на основе FKBP/FRB, описанном в настоящем описании, можно использовать рапамицин и аналоги рапамицина (иногда называемые рапалогами), например, RАD001. В одном воплощении димеризующую молекулу можно выбрать из рапамицина (сиролимуса), RАD001 (эверолимуса), зотаролимуса, темсиролимуса, АР-23573 (ридафоролимуса), биолимуса и АР21967. Другие аналоги рапамицина, подходящие для применения с димеризующими переключателями на основе FKBP/FRB, описаны также в разделе, озаглавленном «Комбинированные терапии», или в разделе, озаглавленном «Комбинация с малой дозой ингибитора mTOR».
Расщепленный CAR
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующая клетка использует расщепленный CAR. Подход с расщеленным CAR описан подробнее в публикациях WO2014/055442 и WO2014/055657, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Коротко, система расщепленного CAR включает клетку, экспрессирующую первый CAR, имеющий первый антигенсвязывающий домен и костимулирующий домен (например, 41ВВ), и клетка также экспрессирует второй CAR, имеющий второй антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, CD3-дзета). Когда клетка сталкивается с первым антигеном, костимулирующий домен активируется, и клетка пролиферирует. Когда клетка сталкивается со вторым антигеном, активируется внутриклеточный сигнальный домен, и появляется активность убийства клеток. Таким образом, CAR-экспрессирующая клетка полностью активирована только в присутствии обоих антигенов. В воплощениях первый антигенсвязывающий домен узнает CLL-1, например, включает антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, и второй антигенсвязывающий домен узнает антиген, экспрессированный на клетках острого миелоидного лейкоза, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета. В воплощениях первый антигенсвязывающий домен узнает CLL-1, например, включает антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, и второй антигенсвязывающий домен узнает антиген, экспрессированный на В-клетках, например, CD19, CD20, CD22 или ROR1.
Устойчивость и мутации
Устойчивость CLL-1-связывающего домена, например, молекул scFv (например, растворимого scFv), можно оценить, обратившись к биофизическим свойствам (например, теплоустойчивости) общепринятой контрольной молекулы scFv или полноразмерного антитела. В одном воплощении человеческий scFv имеет теплоустойчивость, которая выше на примерно 0,1, примерно 0,25, примерно 0,5, примерно 0,75, примерно 1, примерно 1,25, примерно 1,5, примерно 1,75, примерно 2, примерно 2,5, примерно 3, примерно 3,5, примерно 4, примерно 4,5, примерно 5, примерно 5,5, примерно 6, примерно 6,5, примерно 7, примерно 7,5, примерно 8, примерно 8,5, примерно 9, примерно 9,5, примерно 10 градусов, примерно 11 градусов, примерно 12 градусов, примерно 13 градусов, примерно 14 градусов или примерно 15 градусов по Цельсию, чем у контрольной связывающей молекулы (например, общепринятой контрольной молекулы scFv) в описанных анализах.
Улучшенная теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, по существу присуща всей конструкции CLL-1-CAR, что ведет к улучшенным терапевтическим свойствам конструкции CLL-1-CAR. Теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, может быть улучшена по меньшей мере на примерно 2°С или 3°С по сравнению с обычным антителом. В другом воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, имеет улучшенную на 2°С теплоустойчивость по сравнению с обычным антителом. В другом воплощении scFv имеет теплоустойчивость, улучшенную на 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15°C по сравнению с обычным антителом. Сравнение можно осуществить, например, между молекулами scFv, описанными в настоящем описании, и полноразмерными антителами. Теплоустойчивость можно измерить с использованием способов, известных в технике. Например, в одном воплощении можно измерить Tm. Способы измерения Tm и другие способы определения устойчивости белков, описаны подробнее ниже.
Мутации в scFv изменяют устойчивость scFv и улучшают общую устойчивость scFv и конструкции CART-CLL-1. Устойчивость человеческого scFv определяют с использованием измерений, таких как Tm, температуры денатурации и температуры агрегации.
Связывающую способность мутантных scFv можно определить с использованием анализов, описанных в примерах.
В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает по меньшей мере одну такую мутацию, что мутированный scFv приобретает улучшенную устойчивость для конструкции CART-CLL-1. В другом воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мутаций, появляющихся в процессе гуманизации, так что мутированный scFv приобретает улучшенную устойчивость для конструкции CART-CLL-1.
Способы оценки устойчивости белков
et al
et al
Устойчивость антигенсвязывающего домена можно оценить с использованием, например, способов, описанных ниже. Такие способы допускают определение нескольких переходов теплового развертывания, где наименее устойчивый домен или развртывется первым или ограничивает порог общей устойчивости многодоменной единицы, которая развертывается кооперативно (например, мультидоменный белок, который показывает один переход развертывания). Наименее устойчивый домен можно идентифицировать рядом дополнительных путей. Можно выполнить мутагенез для зондирования домена, который ограничивает общую устойчивость. Дополнительно можно определить протеазорезистентность мультидоменного белка в условиях, в которых, наименее устойчивый белок действительно развертывается, как известно из ДСК или других спектроскопических методов (Fontana ., (1997), Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi . (2009), J. Mol. Biol., 393: 672-692). Как только наименее устойчивый белок идентифицирован, последовательность, кодирующую этот домен (или его часть), можно использовать как тестовую последовательность в других способах.
а) Термоустойчивость
Термоустойчивость композиций можно анализировать с использованием ряда не являющихся ограничительными биофизических или биохимических методов, известных в технике. В некоторых воплощениях термоустойчивость оценивают методами аналитической спетроскопии.
Примером методов аналитической спетроскопии является дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). В ДСК используют калориметр, который чувствителен к поглощению тепла, которое сопровождает развертывание большинства белков или белковых доменов (см., например, Sanchez-Ruiz et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988). Для того, чтобы определить термоустойчивость белка, образец белка вставляют в калориметр, и поднимают температуру до тех пор, пока Fab или scFv не развернется. Температура, при которой белок развертывается, является показателем общей устойчивости белка.
Другим примером методов аналитической спетроскопии является спектроскопия кругового дихроизма (КД). КД спектрометрией измеряют оптическую активность композиции как функцию возрастающей температуры. Спектроскопией кругового дихроизма (КД) измеряют различия в абсорбции левоциркулярно поляризованного света против правоциркулярно поляризованного света, которая появляется из-за структурной асимметрии. Разупорядоченная или развернутая структура приводит к КД-спектру, сильно отличающемуся от спектра упорядоченной или складчатой структуры. КД-спектр отражает чувствительность белков к денатурирующим действиям повышающейся температуры и поэтому явялется показателем термоустойчивости белков (см. van Mierlo и Steemsma, J. Biotechnol., 79(3): 281-98, 2000).
Другим примером методов аналитической спетроскопии для измерения термоустойчивости является флуоресцентная эмиссионная спектроскопия (см. van Mierlo и Steemsma, цит. выше). Еще одним примером методов аналитической спетроскопии для измерения термоустойчивости является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (см., например, van Mierlo и Steemsma, цит. выше).
Термоустойчивость композиции можно измерить биохимически. Примером биохимического метода оценки термоустойчивости является анализ с тепловой стимуляцией. В «анализе с тепловой стимуляцией» композицию подвергают воздействию интервала повышенных температур в течение установленного периода времени. Например, в одном воплощении испытываемые молекулы scFv или молекулы, включающие молекулы scFv, подвергают воздействию повышающихся температур, например, в течение 1-1,5 часов. Затем оценивают активность белка соответсвующим биохимическим анализом. Например, если белок является связывающим белком (например, scFv или scFv-содержащим полипептидом), связывающую активность связывающего белка можно определить функциональным или количественным ELISA.
E. сoli
Такой анализ можно выполнить в высокопроизводительном формате и форматах, раскрытых в примерах, с использованием  и высокопроизводительного скрининга. Можно создать библиотеку анти-CLL-1 связывающего домена, например, вариантов scFv, с использованием методов, известных в технике. Можно индуцировать экспрессию анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, и анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, можно подвергнуть тепловой стимуляции. Стимулированные испытываемые образцы можно анализировать на связывание, и те анти-CLL-1 связывающие домены, например, scFv, которые являются устойчивыми, можно размножить и охарактеризовать дополнительно.
Термоустойчивость оценивают путем измерения температуры плавления (Tm) композиции с использованием любого из вышеуказанных способов (например, методов аналитической спектроскопии). Температура плавления представляет собой температуру в средней точке кривой температурного перехода, где 50% молекул композиции находятся в свернутом состоянии (см. Dimasai et al. (2009), J. Mol. Biol., 393: 672-692). В одном воплощении величины Tm анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, составляют примерно 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. В одном воплощении величины Tm для IgG составляют примерно 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C.
Термоустойчивость также оценивают путем измерения удельной теплоемкости или теплоемкости (Ср) композиции с использованием аналитического калориметрического метода (например, ДСК). Удельная теплоемкость композиции представляет собой энергию (например, в ккал/моль), которая требуется для повышения температуры на 1°C 1 моля воды. Большая Ср является признаком денатурированной или инактивированной белковой композиции. Изменение теплоемкости (ΔСр) композиции измеряют путем определения удельной теплоемкости композиции до и после ее теплового перехода. Термоустойчивость также можно оценить путем измерения или определения других параметров термоидинамической устойчивости, включая свободную энергию Гиббса развертывания (ΔG), энтальпию развертывания (ΔН) или энтропию развертывания (ΔS). Один или несколько из вышеуказанных биохимических анализов (например, анализ с тепловой стимуляцией) используют для определения температуры (т.е., величины Тс), при которой 50% композиции сохраняет свою активность (например, связывающую активность).
Кроме того, мутации в анти-CLL-1 связывающем домене, например, scFv, изменяют теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, по сравнению с немутированным анти-CLL-1 связывающим доменом, например, scFv. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает одну мутацию, которая придает теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающему домену, например, scFv. В другом воплощении анти-CLL-1 связывающий домен, например, scFv, включает несколько мутаций, которые придают теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающему домену, например, scFv. В одном воплощении несколько мутаций в анти-CLL-1 связывающем домене, например, scFv, оказывают аддитивное действие на теплоустойчивость анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv.
b) Агрегация, %
Устойчивость композиции можно определить путем измерения ее склонности к агрегации. Агрегацию можно измерить рядом не являющихся ограничительными биохимических или биофизических методов. Например, агрегацию композиции можно оценить с использованием хроматографии, например, гель-проникающей хроматографии (ГПХ). ГПХ разделяет молекулы на основании их размера. Колонку заполняют полутвердыми гранулами полимерного геля, который будет вмещать в себе ионы и небольшие молекулы, но не крупные молекулы. Когда белковую композицию вносят в верхнюю часть колонки, компактно свернутые белки (т.е., неагрегированные белки) распределяются в большем объеме растворителя, чем объем, доступный для крупных агрегатов белков. В результате крупные агрегаты быстрее продвигаются по колонке, и таким образом смесь может быть разделена или фракционирована на ее компоненты. Каждую фракцию можно отдельно определить количественно (например, с помощью светорассеяния), когда она элюируется из геля. Соответственно, % агрегации композиции можно определить путем сравнения фракции с общей концентрацией белка, внесенного в гель. Устойчивая композиция элюируется из колонки по существу как одна фракция, и появляется по существу один пик на профиле элюции или хроматограмме.
с) Аффинность связывания
et al.
et al
Устойчивость композиции можно оценить путем определения ее аффинность связывания с мишенью. В технике известен широкий ряд способов определения аффинности связывания. В примере способа определения аффинности связывания используется поверхностный плазмонный резонанс. Поверхностный плазмонный резонанс представляет собой оптическое явление, которое допускает анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени путем детекции изменений в концентрациях белка в биосенсорной матрице, например, с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden и Piscataway, N.J.). Дополнительное описание см. в Jonsson U. et al. (1993), Ann. Biol. Clin., 51: 19-26; Jonsson U. (1991), Biotechniques, 11: 620-627; Johnsson B.  (1995), J. Mol. Recognit., 8: 125-131; и Johnnson B. . (1991), Anal. Biochem., 198: 268-277.
В одном аспекте антигенсвязывающий домен CAR включает аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности антигенсвязывающего домена, описанного в настоящем описании, и антигенсвязывающий домен сохраняет нужные функциональные свойства фрагментов анти-CLL-1 антитела, описанного в настоящем описании. В одном конкретном аспекте композиция CAR по изобретению включает фрагмент антитела. В другом аспекте такой фрагмент антитела включает scFv.
В различных аспектах антигенсвязывающий домен CAR конструируют путем модификации одной или нескольких аминокислот в одном или обоих вариабельных участках (например, VH и/или VL), например, в одном или нескольких CDR участках и/или одном или нескольких каркасных участках. В одном конкретном аспекте композиция CAR по изобретению включает фрагмент антитела. В другом аспекте такой фрагмент антитела включает scFv.
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что антитело или фрагмент антитела по изобретению можно дополнительно модифицировать таким образом, что изменяется аминокислотная последовательность (например, от дикого типа), но не нужная активность. Например, в белке можно сделать дополнительные замены нуклеотидов, ведущие к аминокислотным заменам «заменимых» аминокислотных остатков. Например, заменимый аминокислотный остаток в молекуле может быть заменен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В другом воплощении ряд аминокислот может быть заменен структурно схожим рядом, который отличается порядком и/или составом членов семейства боковых цепей, например, можно осуществить консервативную замену, при которой аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь.
Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, определены в технике как включающие основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Процент идентичности в контексте двух или больше нуклеотидных или аминокислотных последовательностей относится к двум или больше одинаковым последовательностям. Две последовательности являются «по существу идентичными», если две последовательности имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, 60% идентичность, необязательно, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность в определенном участке или, когда не конкретизировано, во всей последовательности), когда сравнивают и выравнивают для максимального соответствия в окне сравнения, или обозначенном участке при измерении с использованием одного или нескольких следующих далее алгоритмов сравнения последовательностей или выравнивания вручную и визуальной проверки. Необязательно идентичность существует в участке, который имеет по меньшей мере примерно 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот) в длину, или предпочтительнее участке, который имеет по меньшей мере 100-500 или 1000 или больше нуклеотидов (или 20, 50, 200 или больше аминокислот) в длину.
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность действует как эталонная последовательность, с которой сравнивают испытываемые последовательности. Когда используют алгоритм сравнения последовательностей, испытываемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты последовательностей и создают параметры программы алгоритма последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию, или можно разработать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для испытываемой последовательности относительно эталонной последовательности на основании параметров программы. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в технике. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно провести, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по Smith и Waterman (1970), Adv. Appl. Math., 2:482c, с помощью алгоритма гомологического выравнивания по Needleman и Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48: 443, поиском методом подобия по Pearson и Lipman (1988), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85: 2444, с помощью компьютеризированных разработок таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или выравнивания вручную и визуальной проверки (см., например, Brent et al. (2003), Current Protocols in Molecular Biology).
Двумя примерами алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, являются алкгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1977), Nuc. Acids Res., 25: 3389-3402; и Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215: 403-410, соответственно.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями также можно определить с использованием алгоритма в E. Meyers и W. Miller (1988), Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием весовой таблицы остатков PAM120, штрафа за удлинение гэпа 12 и штрафа за гэп 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с использованием алгоритма по Needleman и Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 48: 444-453, который включен в программу GAP в пакете программ GCG (доступен на www.gcg.com), с использованием или матрицы Blossom 62 или матрицы PAM250 и гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и удлинения гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к модификациям аминокислотной последовательности исходного антитела или фрагмента (например, scFv), которые генерируют функционально эквивалентные молекулы. Например, VH или VL анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv, включенного в CAR, можно модифицировать для сохранения по меньшей мере примерно 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности исходных VH или VL каркасного участка анти-CLL-1 связывающего домена, например, scFv. Настоящее изобретение относится к модификациям всей конструкции CAR, например, модификациям в одной или нескольких аминокислотных последовательностях различных доменов конструкции CAR для того, чтобы генерировать функционально эквивалентные молекулы. Конструкцию CAR можно модифицировать для сохранения по меньшей мере примерно 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности исходной коснтрукции CAR.
Трансфекция РНК
В настоящем изобретении раскрываются способы получения in vitro CAR с транскрибированной РНК. Настоящее изобретение также включает CAR, кодирующий конструкцию РНК, которую можно непосредственно трансфицировать в клетку. Способ генерации мРНК для применения в трансфекции может включать in vitro транскрипцию (IVT) матрицы с помощью специально созданных праймеров с последующим добавлением полиА для получения конструкции, содержащей 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность («UTR»), 5'-кэп и/или внутренний сайт входа рибосомы (IRES), нуклеиновую кислоту для экспрессии и хвост полиА, обычно длиной в 50-2000 оснований (SEQ ID NO: 35). Полученная таким образом РНК может эффективно трансфицировать различные виды клеток. В одном аспекте матрица включает последовательности для CAR.
В одном аспекте анти-CLL-1 CAR кодируется матричной РНК (мРНК). В одном аспекте мРНК, кодирущую анти-CLL-1 CAR, вводят в Т-клетку для получения клетки CART.
В одном воплощении in vitro CAR с транскрибированной РНК можно ввести в клетку как форму временной трансфекции. РНК получают транскрипцией in vitro с использованием матрицы, полученной полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Представляющую интерес ДНК из любого источника можно непосредственно конвертировать ПЦР в матрицу для синтеза мРНК in vitro с использованием соответствующих праймеров и РНК-полимеразы. Источником ДНК может являться, например, геномная ДНК, плазмидная ДНК, фаговая ДНК, кДНК, синтетическая ДНК-последовательность или любой другой соответствующий источник ДНК. Желательной матрицей для транскрипции in vitro является CAR по настоящему изобретению. Например, матрица для РНК CAR включает внеклеточный участок, включающий одноцепочечный вариабельный домен противоопухолевого антитела, шарнирный участок, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен CD8a) и цитоплазматический участок, который включает внутриклеточный сигнальный домен, например, включающий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1ВВ.
В одном воплощении ДНК, используемая для ПЦР, содержит открытую рамку считывания. ДНК может быть из ДНК-последовательности, встречающейся в природе, из генома организма. В одном воплощении нуклеиновая кислота включает некоторые или все 5'- и/или 3'-нетранслируемые участки (UTR). Нуклеиновая кислота может включать экзоны и интроны. В одном воплощении ДНК, используемая для ПЦР, представляет собой человеческую нуклеотидную последовательность. В другом воплощении ДНК, используемая для ПЦР, представляет собой человеческую нуклеотидную последовательность, включающую 5'- и 3'-UTR. С другой стороны, ДНК может представлять собой искусственную ДНК-последовательность, которая по природе не экспрессируется во встречающемся в природе организме. Примером искусственной ДНК-последовательности является последовательность, которая содержит части генов, которые лигированы вместе с образованием открытой рамки считывания, которая кодирует слитый белок. Части ДНК, которые лигированы вместе, могут быть из одного организма или из более, чем одного организма.
ПЦР используют для генерации матрицы для тарнскрипции in vitro мРНК, которую используют для трансфекции. Способы выполнения ПЦР известны в технике. Праймеры для использования в ПЦР создают как имеющие участки, которые по существу комплементарны участкам ДНК, используемой в качестве матрицы для ПЦР. «По существу комплементарны», как используется в настоящем описании, относится к последовательностям нуклеотидов, где большинство или все основания в праймерной последовательности являются комплементарными, или одно или несколько оснований являются некомплементарными или ошибочными. По существу комплементарные последовательности способны отжигаться или гибридизировать с предполагаемой ДНК-мишенью в условиях отжига, используемых для ПЦР. Праймеры могут быть созданы как являющиеся по существу комплементарными любой части ДНК-матрицы. Например, праймеры могут быть созданы для амплификации части нуклеиновой кислоты, которая естественно транскрибирована в клетках (открытая рамка считывания), включающая 5'- и 3'-UTR. Праймеры также можно создать для амплификации части нуклеиновой кислоты, которая кодирует определенный представляющий интерес домен. В одном воплощении праймеры создают для амплификации кодирующего участка кДНК, включая все или части 5'- и 3'-UTR. Праймеры, применимые для ПЦР, можно получить методами синтеза, которые хорошо известны в технике. «Прямые праймеры» являются праймерами, которые содержат участок нуклеотидов, которые по существу комплементарны нуклеотидам ДНК-матрицы, которые находятся в обратном направлении последовательности ДНК, которую амплифицируют. «В обратным направлении» используется в настоящем описании как относящееся к местоположению 5 для последовательности ДНК, которую амплифицируют, относительно кодирующей цепи. «Обратные праймеры» являются праймерами, которые содержат участок нуклеотидов, которые по существу комплементарны двухцепочечной ДНК-матрице, которые находятся в прямом направлении последовательности ДНК, которую амплифицируют. «В прямом направлении» используется в настоящем описании как относящееся к местоположению 3' для последовательности ДНК, которую амплифицируют, относительно кодирующей цепи.
Любую ДНК-полимеразу, применимую для ПЦР, можно использовать в способах, раскрытых в настоящем описании. Реагенты и полимераза являются коммерчески доступными из ряда источников.
Также можно использвать химические структуры, способные промотировать устойчивость и/или эффективность трансляции. РНК предпочтительно имеет 5'- и 3'-UTR. В одном воплощении 5'-UTR составляет от одного до 3000 нуклеотидов в длину. Длину последовательностей 5'- и 3'-UTR, добавляемых к кодирующему участку, можно изменять различными способами, включая, но не ограничиваясь перечисленным, создание праймеров для ПЦР, которые отжигаются к различным участкам UTR. С использованием такого подхода специалист в данной области техники может модифицировать длину 5'- и 3'-UTR, требуемых для достижения оптимальной эффективности трансляции после трансфекции транскрибированной РНК.
5'- и 3'-UTR могут быть встречающимися в природе эндогенными 5'- и 3'-UTR для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. С другой стороны, последовательности UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, могут быть добавлены путем внедрения последовательностей UTR в прямые и обратные праймеры или путем других модификаций матрицы. Использование последовательностей UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, можно применить для модификации устойчивости и/или эффективности трансляции РНК. Например, известно, что богатые AU элементы в последовательностях 3'-UTR могут снизить устойчивость мРНК. Поэтому 3'-UTR можно выбрать или создать для повышения устойчивости транскрибированной РНК на основании свойств UTR, которые хорошо известны в технике.
В одном воплощении 5'-UTR может содержать последовательность Козак эндогенной нуклеиновой кислоты. С другой стороны, когда 5'-UTR, которая не является эндогенной для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, добавляют с помощью ПЦР, как описано выше, консенсусную последовательность Козак можно перепланировать путем добавления последовательности 5'-UTR. Последовательности Козак могут повышать эффективность трансляции некоторых транскриптов РНК, но не требуются для всех РНК для возможности эффективной трансляции. Требование последовательностей Козак для многих мРНК известно в технике. В других воплощениях 5'-UTR может представлять собой 5'-UTR РНК вируса, геном РНК которого устойчив в клетках. В других воплощениях в 3'- или 5'-UTR можно использовать различные нуклеотидные аналоги для препятствования разрушению мРНК эндонуклеазами.
Для возможности синтеза РНК из ДНК-матрицы без необходимости клонирования гена к ДНК-матрице необходимо присоединить промотор транскрипции в прямом направлении транскрибируемой последовательности. Когда последовательность, которая функционирует как промотор для РНК-полимераз, добавляют к 5'-концу прямого праймера, РНК-полимеразный промотор становится внедренным в продукт ПЦР в обратном направлении открытой рамки считывания, которую следует транскрибировать. В одном предпочтительном воплощении промотор представляет собой полимеразный промотор Т7, как описано в другом месте в настоящем описании. Другие применимые промоторы включают, но не ограничиваются пеерчисленным Т3 и SP6 РНК-полимеразные промоторы. Консенсусные нуклотидные последовательности для промоторов Т7, Т3 и SP6, известны в технике.
В предпочтительном воплощении мРНК имеет как кэп на 5'-конце, так и хвост 3'-поли(А), которые определяют связывание рибосомы, инициацию трансляции и устойчивость мРНК в клетке. На кольцевой ДНК-матрице, например, плазмидной ДНК, РНК-полимераза продуцирует длинный конкатамерный продукт, который не подходит для экспрессии в эукариотных клетках. Транскрипция плазмидной ДНК, линеаризованной в конце 3'-UTR, приводит к мРНК нормального размера, которая неэффективна в эукариотной транскрипции, даже если она полиаденилирована после транскрипции.
На линейной ДНК-матрице фаговая Т7 РНК-полимераза может наращивать 3'-конец транскрипта позади последнего основания матрицы (Schenborn и Mierendorf, Nuc. Acids Res., 13: 6223-36 (1985); Nacheva и Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003).
Обычным способом интеграции отрезков полиА/Т в ДНК-матрицу является молекулярное клонирование. Однако последовательность полиА/Т, итегрированная в плазмидную ДНК, может вызвать неустойчивость плазмиды, в силу чего матрицы плазмидных ДНК, полученные из бактериальных клеток, часто являются весьма загрязненными делециями и другими отклонениями. Это делает процедуры клонирования не только трудоемкими и затратными по времни, но часто ненадежными. Вот почему весьма желателен способ, который допускает конструирование ДНК-матриц с отрезком полиА/Т без клонирования.
Сегмент полиА/Т транскрипционной ДНК-матрицы можно получить во время ПЦР путем использования обратного праймера, содержащего хвост полиТ, такой как хвост 100Т (SEQ ID NO: 31) (размер может составлять 50-5000 Т (SEQ ID NO: 32)), или после ПЦР любым другим способом, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лигирование ДНК или рекомбинацию in vitro. Хвосты поли(А) также придают устойчивость РНК и снижают их разрушение. Как правило, длина хвоста поли(А) положительно коррелирует с устойчивостью транскрибированной РНК. В одном воплощении хвост поли(А) составляет от 100 до 5000 адкнозинов (SEQ ID NO: 33).
Хвосты поли(А) РНК можно дополнительно нарастить после транскрипции in vitro с использованием поли(А)-полимеразы, такой как полиА-полимераза E. cоli (Е-РАР). В одном воплощении увеличение длины хвоста поли(А) от 100 нуклеотидов до 300-400 нуклеотидов (SEQ ID NO: 34) приводит к примерно двукратному возрастанию эффективности трансляции РНК. Кроме того, присоединение различных химических групп к 3'-концу может увеличить устойчивость мРНК. Такое присоединение может содержать модифицированные/искусственные нуклеотиды, аптамеры и другие соединения. Например, в хвост поли(А) можно включить аналоги АТФ с использованием поли(А)-полимеразы. Аналоги АТФ могут дополнительно повышать устойчивость РНК.
Кэпы 5' также придают устойчивость молекулам РНК. В предпочтительном воплощении РНК, полученные способами, раскрытыми в настоящем описании, включают 5'-кэп. Кэп 5' обеспечивается с использованием методов, известных в технике, и описанных в настоящем описании (Cougot et al., Trends in Biochem. Sci., 29: 436-444 (2001); Stepinski et al., RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330: 958-966 (2005)).
РНК, полученные способами, раскрытыми в настоящем описании, также могут содержать внутренний сайт входа рибосомы IRES). Последовательность IRES может быть вирусной, хромосомной или искусственно созданной последовательностью, которая инициирует кэп-независимое связывание рибосомы с мРНК и облегчает инициацию транскрипции. Могут быть включены любые растворяемые вещества, подходящие для электропорации клеток, которые могут содержать факторы, облегчающие проницаемость и жизнеспособность клеток, такие как сахара, пептиды, липиды, белки, антиоксиданты и поверхностно-активные вещества.
РНК можно ввести в клетки-мишени с использованием любого из ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают, но не ограничиваются перечисленным, электропорацию (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) или Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.) мультипоратором (Eppendort, Hamburg Germany), трансфекцию, опосредованную катионными липосомами, с использованием липофекции, инкапсуляцию в полимерах, пептидопосредованную трансфекцию или системы доставки с биолистическими частицами, такие как «генные пушки» (см., например, Nishikawa et al. Hum. Gene Ther., 12(8): 861-70 (2001).
Невирусные способы доставки
В некоторых аспектах можно использовать невирусные способы для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании, в клетку или ткань или субъекту.
В некоторых воплощениях невирусный способ включает использование транспозона (также называемого транспозонным элементом). В некоторых воплощениях транспозон представляет собой часть ДНК, которая может сама встраиваться в местоположение в геноме, например, часть ДНК, которая способна к саморепликации и встраиванию своей копии в геном, или часть ДНК, которую можно сплайсировать из более длинной нуклеиновой кислоты и встроить в другое место в геноме. Например, транспозон включает ДНК-последовательность, полученную из генов, фланкирующих инвертированные повторы для транспозиции.
Примеры способов доставки нуклеиновой кислоты с использованием транспозона, включают транспозонную систему Sleeping Beauty (SBTS) и транспозонную систему piggyBac (PB). См., например, Aronovich et al., Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011): R14-20; Singh et al., Cancer Res., 15 (2008): 2961-2971; Huang et al., Mol. Ther., 16 (2008): 580-589; Grabundzija et al., Mol. Ther., 18 (2010): 1200-1209; Kebriaei et al., Blood, 122.21(2013): 166; Williams, Molecular Therapy, 16.9(2008): 1515-16; Bell et al., Nat. Protoc., 2.12(2007): 3153-65; и Ding et al., Cell, 122.3(2005): 473-83, которые все включены в настоящее описании в качестве ссылок.
SBTS включает два компонента: (1) транспозонсодержащий трансген и (2) источник фермента транспозазы. Транспозон может транспонировать транспозон из плазмиды-носителя (или другого донора ДНК) в ДНК-мишень, такую как хромосома/геном клетки-реципиента. Например, транспозаза связывается с плазмидой-носителем/донором ДНК, вырезает транспозон (включая трансген(ы)) из плазмиды и встраивает его в геном клетки-реципиента. См., например, Aronovich et al., цит. выше.
Примеры транспозонов включают транспозон на основе рТ2. См., например, работы Grabundzija et al., Nucleic Acids Res., 41.3(2013): 1829-47; и Singh et al., Cancer Res., 68.8(2008): 2961-2971, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок. Примеры транспозаз включают транспозазу типа Тс1/mariner, например, транспозазу SB10 или транспозазу SB11 (гиперактивная транспозаза, которая может быть экспрессирована, например, из цитомегаловирусного промотора). См., например, работы Aronovich et al.; Kebriaei et al.; и Grabundzija et al., которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Применение SBTS делает возможной эффективную интеграцию и экспрессию трансгена, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в настоящем описании. Предлагаются способы получения клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, которая устойчиво экспрессирует CAR, описанный в настоящем описании, например, с использованием транспозонной системы, такой как SBTS.
В соответствии со способами, описанными в настоящем описании, в некоторых воплощениях в клетку (например, Т- или NK-клетку) доставляют одну или больше нуклеиновых кислот, например, плазмид, содержащих компоненты SBTS. Например, нуклеиновую(ые) кислоту(ы) доставляют стандартными способами доставки нуклеиновой кислоты (например, плазмидной ДНК), например, способами, описанными в настоящем описании, например, электропорацией, трансфекцией или липофекцией. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота содержит транспозон, включающий трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в настоящем описании. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота содержит транспозон, включающий трансген (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в настоящем описании), а также нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент тарнспозазу. В других воплощениях предлагается система с двумя нуклеиновыми кислотами, например, двухплазмидная система, например, в которой первая плазмида содержит транспозон, включающий трансген, и вторая плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент тарнспозазу. Например, первая и вторая нуклеиновые кислоты доставляются в клетку совместно.
В некоторых воплощениях получают клетки, например, Т- или NK-клетки, которые экспрессируют CAR, описанный в настоящем описании, путем использования комбинации встраивания гена с использованием SBTS и генетического редактирования с использованием нуклеазы (например, нуклеаз «цинковый палец» (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), системы CRISPR/Cas или хоминг-эндонуклеаз, повторно сконструированных сконструированными мегануклеазами.
В некоторых воплощениях применение невирусного метода доставки делает возможным перепрограммирование клеток, например, Т- или NK-клеток, и прямую инфузию клеток субъекту. Преимущества невирусных векторов включают, но не ограничиваются перечисленным, простоту и относительно низкую стоимость получения достаточных количеств, необходимых для удовлетворения популяции пациентов, устойчивость при хранении и отсутствие иммуногенности.
Конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим одну или несколько конструкций CAR, описанных в настоящем описании. В одном аспекте молекула нуклеиновой кислоты предоставляется как транскрипт матричной РНК. В одном аспекте молекула нуклеиновой кислоты предоставляется как конструкция ДНК.
Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR включает анти-CLL-1 связывающий домен (например, человеческий анти-CLL-1 связывающий домен), транмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий стимулирующий домен, например, костимулирующий сигнальный домен и/или первичный сигнальный домен, например, дзета-цепь. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен представляет собой анти-CLL-1 связывающий домен, описанный в настоящем описании, например, анти-CLL-1 связывающий домен, который включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен белка, описанный в настоящем описании, например, выбранный из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном воплощении трансмембранный домен включает SEQ ID NO: 6 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен соединяется с трансмембранным доменом шарнирным участком, например, шарниром, описанным в настоящем описании. В одном воплощении шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 или последовательность с 95-99% идентичностью им. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В одном воплощении костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен белка, описанный в настоящем описании, например, выбранный из группы, включающей молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается CD83.
В одном воплощении костимулирующий домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 или последовательность с 95-99% идентичностью ей. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и функциональный домен CD3-дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 или последовательность с 95-99% идентичностью им, и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или последовательность с 95-99% идентичностью им, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде одной полипептидной цепи.
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию CAR, включающую лидерную последовательность SEQ ID NO: 1, домен scFv, имеющий последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51 (или последовательность с 95-99% идентичностью им), шарнирный участок SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 (или последовательность с 95-99% идентичностью им), трансмембранный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, или костимулирующий домен CD27, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), или костимулирующий домен CD28, имеющий последовательность SEQ ID NO: 482 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), или костимулирующий домен ICOS, имеющий последовательность SEQ ID NO: 483 (или последовательность с 95-99% идентичностью ей), и стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 (или последовательность с 95-99% идентичностью им).
В другом аспекте изобретение относится к изолированной молекуле полипептида, кодированной молекулой нуклеиновой кислоты. В одном воплощении изолированная молекула полипептида включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 91-103, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу химерного антигенного рецептора (CAR), которая включает анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, включающий стимулирующий домен, и где указанный анти-CLL-1 связывающий домен включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
В одном воплощении кодированная молекула CAR дополнительно включает последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В одном воплощении костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, включающей молекулу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается CD83. В одном воплощении костимулирующий домен 4-1ВВ включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном воплощении костимулирующий домен CD27 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном воплощении костимулирующий домен CD28 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 482. В одном воплощении костимулирующий домен ICOS включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 484.
В одном воплощении трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен белка, выбранного из группы, включающей альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, молеклу ГКГС класса I, белки рецептора TNF, иммуноглобулиноподобные белки, цитокиновые рецепторы, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфически связывается CD83. В одном воплощении трансмембранный домен включает последовательность SEQ ID NO: 6. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает функциональный сигнальный домен 4-1ВВ и функциональный сигнальный домен дзета. В одном воплощении внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность SEQ ID NO: 9, где последовательности, включающие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде одной полипептидной цепи. В одном воплощении анти-CLL-1 связывающий домен соединен с трансмембранным доменом шарнирным участком. В одном воплощении шарнирный участок включает SEQ ID NO: 2. В одном воплощении шарнирный участок включает SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
В другом аспекте изобретение относится к кодированной молекуле CAR, включающей лидерную последовательность SEQ ID NO: 1, домен scFv, имеющий последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 39-51, или последовательность с 95-99% идентичностью им, шарнирный участок SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, трансмембранный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, костимулирующий домен 4-1ВВ, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, или костимулирующий домен CD27, имеющий последовательность SEQ ID NO: 8, и стимулирующий домен CD3-дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном воплощении кодированная молекула CAR включает последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 91-93, или последовательность с 95-99% идентичностью им.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие нужные молекулы, можно получить с использованием способов, известных в технике, например, путем скрининга библиотек из клеток, экспрессирующих ген, путем дериватизации гена из вектора, известного как включающего их, или путем выделения прямо из клеток и тканей, содержащих их, с использованием стандартных методов. С другой стороны, ген, представляющий интерес, можно получить синтетически, а не клонированием.
Настоящее изобретение также относится к векторам, в которые встроена ДНК по настоящему изобретению. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долговременного переноса гена, устойчивой интеграции трансгена и его размножения в дочерних клетках. Лентивирусные векторы имеют дополнительное преимущество перед векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мыши, в том, что они могут трансдуцировать непрофилирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также имеют дополнительное преимущество низкой иммуногенности. Ретровирусный вектор также может представлять собой, например, гамма-ретровирусный вектор. Гамма-ретровирусный вектор может включать, например, промотор, сигнал упаковки (ψ), сайт связывания праймера (PBS), один или больше (например, два) длинных концевых повторов (PBS) и трансген, представляющий интерес, например, ген, кодирующий CAR. Гамма-ретровирусный вектор может утратить вирусные структурные гены, такие как gag, pol и env. Примеры гамма-ретровирусных векторов включают вирус лейкоза мыши (MLV), вирус, формирующий фокус на селезенке (SFFV), и вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV), и векторы, полученные из них. Другие гамма-ретровирусные векторы описаны, например, в Tobias Maetzig et al., «Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology и Application», Viruses», 2011 Jun; 3(6): 677-713.
Nature Reviews Immunology,
В другом воплощении вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую нужный CAR, представляет собой аденовирусный вектор (А5/35). В другом воплощении экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, можно выполнить с использованием трнаспазонов, таких как sleeping beauty, crisper, CAS9 и нуклеазы «цинковые пальцы». См. ниже работу June et al., 2009, 9.10: 704-716, включеченную в настоящее описание в качестве ссылки.
Как краткий итог, экспрессии природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, обычно достигают путем операбельного соединения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CAR или его части, с промотором и включения конструкции в экспрессирующий вектор. Векторы могут подходить для репликации и интеграции эукариот. Типичные клонирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициирующие последовательности и промоторы, применимые для регуляции экспрессии нужной нуклеотидной последовательности.
Экспрссирующие конструкции по настоящему изобретению также можно использовать для иммунизации нуклеиновой кислотой и генной терапии с использованием стандартных протоколов доставки генов. Способы доставки генов известны в технике. См., например, пат. США №№ 5399346, 5580859, 5589466, полностью включенные в насоящее описание в качестве ссылок. В другом воплощении изобретение относится к вектору для генной терапии.
Нуклеиновую кислоту можно клонировать в ряд типов векторов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включая, но не ограничиваясь перечисленным, плазмиду, фагемид, производное фага, зоовирус и космиду. Векторы, представляющие определенный интерес, включают экспрессирующие векторы, векторы для репликации, векторы для получения зондов и векторы для секвенирования.
Кроме того, экспрессирующий вектор может быть предоствлен клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в технике и описана, например, в Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY, и других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые применимы в качестве векторов, включают, но не ограничиваются перечисленным, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. Как правило, подходящий вектор содержит ориджин репликации, функциональный по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные сайты для рестрикционных эндонуклеаз и один или несколько селектируемых маркеров (см., например, WO 01/96584; WO 01/29058 и пат. США № 6326193).
Разработан ряд систем на основе вирусов для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, удобную платформу для систем доставки генов обеспечивают ретровирусы. Выбранный ген можно встроить в вектор и упаковать в ретровирусные частицы с использованием методов, известных в технике. Затем рекомбинантный вирус можно выделить и доставить в клетки субъекта или in vivo или ex vivo. В технике известен ряд ретровирусных систем. В некоторых воплощениях используются аденовирусные векторы. В технике известен ряд аденовирусных векторов. В одном воплощении используются лентивирусные векторы.
Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Обычно они локализуются в участке 30-110 п.о. в обратном направлении от стартового сайта, хотя показано, что ряд промоторов также содержат функциональные элементы в прямом направлении от стартового сайта. Спейсинг между промоторными элементами часто является жестким, так что промоторная функция сохраняется, когда элементы инвертированы или сдвинуты относительно друг друга. В тимидинкиназном (tk) промоторе спейсинг между промоторными элементами может быть увеличен до 50 п.о. до того, как активность начинает снижаться. В зависимости от промотора оказывается, что отдельные элементы могут функционировать или кооперативно или независимо, активируя транскрипцию.
Примером промотора, который способен экспрессировать трансген CAR в Т-клетке млекопитающего, является промотор EF1a. Нативный промотор EF1a управляет экспрессией альфа-субъединицы комплекса фактора элонгации 1, который ответственен за ферментную доставку аминоацил-тРНК в рибосому. Промотор широко используется в экспрессирующих плазмидах млекопитающих, и как показано, эффективен при управлении экспрессии СAR от трансгенов, клонированных в лентивирусный вектор. См., например, Milone et al., Mol. Ther., 17(8): 1453-1464 (2009). В одном аспекте промотор EF1a включает последовательность, предоставленную как SEQ ID NO: 11.
Другим примером промотора является последовательность немедленно раннего цитомегаловирусного (CMV) промотора. Такая промоторная последовательность представляет собой сильную конститутивную промоторную последовательность, способную запустить высокие уровни экспрессии любой нуклеотидной последовательности, оперативно соединенной с нею. Однако также можно использовать другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь перечисленным, ранний промотор обезьянего вируса 40 (SV40), вирус опухоли мышиной молочной железы (MMTV), промотор длинного концевого повтора вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза птиц, немедленно ранний промотор вируса Эпштейна-Барра, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, но без ограничения, актиновый промотор, миозиновый промотор, промотор фактора элонгации 1α, гемоглобиновый промотор и креатинкиназный промотор. Кроме того, изобретение не должно ограничиваться применением конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть изобретения. Применение индуцируемого промотора обеспечивает молекулярный переключатель, способный запускать экспрессию нуклеотидной последовательности, которая оперативно соединена с ним, когда такая экспрессия желательна, или выключать экспрессию, когда такая экспрессия нежелательна. Примеры индуцируемых промоторов включают, но не ограничиваются перечисленным, металлотиониновый промотор, глюкокортикоидный промотор, прогестероновый промотор и тетрациклиновый промотор.
Другим примером промотора является фосфоглицераткиназный (PGK) промотор. В воплощениях может быть желателен усеченный PGK промотор (например, PGK промотор с одной или несколькими, например, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 или 400 делециями нуклеотидов, при сравнении с последовательностью PGK промотора дикого типа). Нуклеотидные последовательности примеров PGK промоторов приводятся ниже.
Промотор WT PGK
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(SEQ ID NO: 487)
Примеры усеченных PGK промоторов
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(SEQ ID NO: 488)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(SEQ ID NO: 489)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(SEQ ID NO: 490)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(SEQ ID NO: 491)
Также может быть включен вектор, например, сигнальная последовательность, для облегчения секреции, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (например, из гена бычьего гормона роста (BGH)), элемент, делающий возможной эписомальную репликацию и репликацию в прокариотах (например, ориджин SV40 и ColE1, или другие, известные в технике), и/или элементы для возможности селекции (например, ген устойчивости к ампициллину и/или зеоциновый маркер).
Для того, чтобы оценить экспрессию полипептида CAR или его частей, экспрессирующий вектор, который вводят в клетку, также может содержать или ген селектируемый маркер или репортерный ген или тот и другой для облегчения идентификации и селекции экспрессирующих клеток из популяции клеток, найденных как трансфицированные или инфицированные через вирусные векторы. В других аспектах селектируемый маркер может находиться на отдельной части ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для возможности экспрессии в клетках-реципиентах. Применимые селектируемые маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиоткам, такие как neo, и подобные.
Репортерные гены используются для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. Вообще репортерный ген представляет собой ген, который не присутствует или не экспрессируется организмом или тканью реципиента, и который кодирует полипептид, экспрессия которого обнаруживается по легко детектируемому свойству, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена проверяют в подходящее время после того, как ДНК введена в клетки реципиента. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретированную щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (см., например, Ui-Tei et al., 2000, FEBS Letters, 479: 79-82). Подходящие системы для экспрессии хорошо известны и могут быть получены с использованием известных методов или получены коммерчески. Как правило, конструкцию с минимальным 5'-фланкирующим участком, показывающую наивысший уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные участки могут быть соединены с репортерным геном и использованы для оценки агентов на способность модулировать транскрипцию, управляемую промотором.
В одном воплощении вектор доаолнительно может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR. В одном воплощении второй СAR включает антигенсвязывающий домен для мишени, экспрессированной на клетках острого миелоидного лейкоза, такой как, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета. В одном воплощении вектор включает нуклеотидную последовательность, кодирующую первый CAR, который специфически связывает первый антиген, и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфически связывает второй отличный от первого антиген, и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. В одном воплощении вектор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую первый CLL-1-CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфически связывает второй антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом воплощении вектор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую первый CLL-1-CAR, который включает анти-CLL-1 связывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второй CAR, который специфически связывает второй антиген иной, чем CLL-1 (например, антиген, экспрессированный на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатный рецептор бета), и включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен.
В одном воплощении вектор включает нуклеиновую кислоту, кодирующую CLL-1-CAR, описанный в настоящем описании, и нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибирующий CAR. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, обнаруженный на здоровых клетках, но не на раковых клетках, например, здоровых клетках, которые также экспрессируют CLL. В одном воплощении ингибирующий CAR включает антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный сигнальный домен ингибирующего CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета.
В воплощениях вектор может включать две или больше нуклеотидных последовательностей, кодирующих CAR, например, CLL-1-CAR, описанный в настоящем описании, и второй CAR, например, ингибирующий CAR, который специфически связывается с антигеном иным, чем CLL-1 (например, антигеном, экспрессированным на клетках AML, например, CD123, CD33, CD34, FLT3 или фолатным рецептором бета). В таких воплощениях две или более нуклеотидных последовательностей кодирующих CAR, кодированы одной нуклеиновой молекулой в той же рамке считывания, что и одна полипептидная цепь. В таком аспекте два или больше CAR могут, например, разделяться одним или несколькими сайтами расщепления пептида (например, сайтом ауторасщепления или субстрата для внутриклеточной протеазы). Примеры сайтов расщепления пептидов включают указанные далее, где остатки GSG являются необязательными.
T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 492)
P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 493)
E2A: (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 494)
F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 495)
Способы введения и экспрессии генов в клетке известны в технике. В контексте экспрессирующего вектора вектор можно легко ввести в клетку-реципиента, например, млекопитающего, бактериальную, дрожжевую клетку или клетку насекомого, любым способом, известным в технике. Например, экспрессирующий вектор можно перенести в клетку-реципиента физическими, химическими или биологическими способами.
Физические способы введения полинуклеотида в клетку-реципиента включают кальцийфосфатную преципитацию, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и подобные способы. Способы получения клеток, включающих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в технике. См., например, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY. Предпочтительным способом введения полинуклеотида в клетку-реципиента является кальцийфосфатная трансфекция.
Биологические способы введения полинуклеотида в клетку-реципиента включают использование ДНК- и РНК-векторов. Вирусные векторы, в особенности, ретровирусные векторы, стали наиболее широко используемым способом встраивания генов в клетки млекопитающих, например, клетки человека. Другие вирусные векторы можно получить из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов, аденоассациированных вирусов и т.п. См., например, пат. США №№ 5350674 и 5585362.
Химические средства введения полинуклеотида в клетку-реципиента включают коллоидные дисперсные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Примером коллоидной системы для применения в качестве среды для доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула). Доступны другие способы искусственной таргетной доставки нуклеиновых кислот, такие как доставка полинуклеотидов таргетными наночастицами, или другая подходящая система доставки субмикронного размера.
В случае, когда используют невирусную систему доставки, примером среды для доставки является липосома. Предполагается применение липидных композиций для введения нуклеиновых кислот в клетку-реципиента (in vitro, ех vitro или in vivo). В другом аспекте нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с липидом. Нуклеиновая кислота, ассоциированная с липидом, может быть инкапсулирована в водную внутреннюю часть липосомы, помещена в липидный бислой липосомы, присоединена к липосоме через молекулу, которая ассоциирована как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, захвачена в липосому, включена в комплекс с липосомой, диспергирована в растворе, содержащем липид, смешана с липидом, объединена с липидом, содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться или образовывать комплекс с мицеллой или иначе ассоциирована с липидом. Липидные, липидные/ДНК или ассоциированные липидные/экспрессирующий вектор композиции не ограничиваются какой-либо определенной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в двухслойной структуре, в виде мицелл или «сплющенной» структуры. Они также могут быть помещены в раствор, возможно, с образованием агрегатов, которые неоднородны по размеру или форме. Липиды представляют собой жировые вещества, которые могут встречаться в природе, или синтетические липиды. Например, липиды включают жировые капли, которые встречаются в природе в цитоплазме, а также класс соединений, которые содержат длинноцепные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.
Липиды, подходящие для применения, можно получить из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин («DMPC») можно получить от Sigma, St. Louis, MO; дицетилфосфат («DCP») можно получить от K & K Laboratories (Plainview, NY); холестерин («Choi») можно получить от Calbiochem-Behring; димеристилфосфатидилглицерол («DMPG») и другие липиды можно получить от Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Исходные растворы липидов в хлороформе или смеси хлороформ/метанол можно хранить при примерно -20°С. Хлороформ используют как единственный растворитель, так как его легче выпарить, чем метанол. «Липосома» является общим термином, включающим различные одно- и многослойные липидные везикулы, образованные путем получения замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы можно охарактеризовать как имеющие везикулярные структуры с фосфолипидной двуслойной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются спонтанно, когда фосфолипиды суспендируют в избытке водного раствора. Липидные компоненты претерпевают самоперегруппировку перед образованием закрытых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., 1991, Glycobiology, 5: 505-10). Однако композиции, которые имеют в растворе структуры иные, чем обычная везикулярная структура, также охватываются. Например, липиды могут принимать мицеллярную структуру или существовать только в виде неоднородных агрегатов липидных молекул. Также рассматриваются комплексы липофектамин-нуклеиновая кислота.
Независимо от способа, используемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-реципиента, или иного представления клетки ингибитору по настоящему изобретению, для того, чтобы подтвердить присутствие последовтельности рекомбинантной ДНК в клетке-реципиенте, можно выполнить ряд анализов. Такие анализы включают, например, «молекулярные биологические» анализы, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как саузерн- или нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; «биохимические» анализы, такие как обнаружение присутствия или отсутствия определенного пептида, например, иммунологическими средствами (ELISA и вестерн-блоттинг), или анализами, описанными в настоящем описании для идентификации агентов, попадающих в объем изобретения.
Настоящее изобретение также относится к вектору, включающему кодирующую CAR молекулу нуклеиновой кислоты. В одном аспекте вектор CAR может быть непосредственно введен в клетку, например, иммунную эффекторную клетку, например, Т- иил NK-клетку. В одном аспекте вектор является клонирующим или экспрессирующим вектором, например, вектором, включающим, но без ограничения, одну или несколько плазмид (например, экспрессирующие плазмиды, клонирующие векторы, миникруги, минивекторы, двойные микрохромосомы), ретровирусные и лентивирусные векторные конструкции. В одном аспекте вектор способен к экспрессии конструкции CAR в Т-клетках млекопитающего. В одном аспекте Т-клетки млекопитающего являются Т-клетками человека.
Источники клеток
Перед экспансией и генетической модификацией получают у субъекта источник клеток (например, иммунных эффекторных клеток, например, Т- или NK-клеток). Термин «субъект», как предполагается, включает живые организмы, у которых можно вызывать иммунную реакцию (например, млекопитающих). Примеры субъектов включают людей, собак, мышей, крыс и их трансгенные виды. Получить Т-клетки можно из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатического узла, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из места инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли.
В некоторых аспектах настоящего изобретения можно использовать любой ряд линий эффекторных клеток (например, Т- иил NK-клеток), доступных в технике. В некоторых аспектах настоящего изобретения Т-клетки можно получить из порции крови, собранной у субъекта, с использованием любого из ряда методов, известных специалистам в данной области техники, таких как сепарация с фиколлом™. В одном предпочтительном аспекте клетки из кровотока индивидуума получают аферезом. Продукт афереза обычно содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие белые клетки крови, красные клетки крови и тромбоциты. В одном аспекте клетки, собранные аферезом, можно промыть для удаления фракции плазмы и поместить клетки в соответствующий буфер или среды для последующих стадий обработки. В одном аспекте изобретения клетки промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). В альтернативном аспекте раствор для промывки не содержит кальций и может не содержать магний, или может быть лишен многих, если не всех, двухвалентных катионов. Начальные стадии активации в отсутствие кальция могут привести к увеличенной активации. Как легко признать специалистам в данной области техники, стадию промывки можно выполнять способами, известными в технике, такими как с использованием полуавтоматизированной «проточной» центрифуги (например, процессора клеток Cobe 2991, Baxter CytoMate или Haemonetics Cell Saver 5), согласно инструкциям изготовителя. После промывки клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как, например, PBS без Са и без Mg, PlasmaLyte A или другой солевой раствор с буфером или без. С другой стороны, нежелательные компоненты образца после афереза можно удалить, и непосредственно ресуспендировать клетки в культуральных средах.
et al
Clinical & Translational Immunology
Выяснено, что в способах по заявке можно использовать условия выращивания в средах, включающие 5% или меньше, например, 2%, человеческой сыворотки АВ и использовать известные условия выращивания в средах и композиции, например, описанные в работе Smith ., «Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement», (2015), 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.
В одном аспекте Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса красных клеток крови и деплеции моноцитов, например, путем центрифугирования в градиенте PERCOLLTM или путем отстаивания в противоточной центрифуге. Специфическую субпопуляцию Т-клеток, такую как клетки CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и CD45RO+T, можно выделить дополнительно методами положительной или отрицательной селекции. Например, в одном аспекте Т-клетки выделяют путем инкубации с анти-CD3/анти-CD28 (например, 3×28) конъюгированными гранулами, такими как DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T, в течение времени, достаточного для положительной селекции нужных Т-клеток. В одном аспекте период времени составляет примерно 30 минут. В другом аспекте период времени колеблется от 30 минут до 36 часов или долее, и все промежуточные величины. В еще одном предпочтительном аспекте период времени составялет 10-24 часа. В одном аспекте время инкубации составляет 24 часа. Более длительное время инкубации можно использовать для выделения Т-клеток в любой ситуации, где имеется несколько Т-клеток, которые стравнивают с другими типами клеток, таких как при выделении опухолевых инфильтрующихся лимфоцитов (TIL) из опухолевой ткани или от индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Кроме того, использование более длительного времени инкубации может повысить эффективность захвата CD8+ Т-клеток. Таким образом, просто за счет сокращения или удлинения времени, Т-клеткам дают возможность связываться с CD3/CD28-гранулами, и/или путем уменьшения или увеличения отношения гранул к Т-клеткам (как описано в настоящем описании далее), можно преимущественно отобрать субпопуляции Т-клеток для или против инициации культивирования или в другие моменты времени во время процесса. Кроме того, путем уменьшения или увеличения отношения анти-CD3/анти-CD28 антител на гранулах или другой поверхности можно преимущественно отобрать субпопуляции Т-клеток для или против инициации культивирования или в другие нужные моменты времени. Специалисты в данной области техники поймут, что в контексте настоящего изобретения также можно использовать несколько циклов селекции. В некоторых аспектах может быть желательно выполнение процедуры селекции и использование «невыделенных» клеток в процессе активации и экспансии. «Невыделенные» клетки также можно подвергнуть дополнительным циклам селекции.
Обогащение Т-клеточной популяции путем отрицательной селекции можно выполнить с помощью комбинации антител, направленных на маркеры поверхности, уникальные для отрицательно выделенных клеток. Одним из способов является сортинг клеток и/или селекция через отрицательную магнитную иммуноадгезию или проточную цитометрию, в которых используется коктейль из моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на отрицательно выделенных клетках. Например, для обогащения в отношении CD4+ клеток путем отрицательной селекции коктейль из моноклональных антител типично включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых аспектах может быть желательно обогащение в отношении положительно выделенных регуляторных Т-клеток, которые типично экспрессируют CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ и FoxP3+. С другой стороны, в некоторых аспектах регуляторные Т-клетки истощаются гранулами, конъюгированными с анти-C25, или другим подобным способом селекции.
Способы, описанные в настоящем описании, могут включать, например, селекцию специфической субпопуляции иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, которые представляют собой популяцию, истощенную регуляторными Т-клетками, клетки, истощенные CD25+, с использованием, например, метода отрицательной селекции, например, описанного в настоящем описании. Предпочтительно популяция, истощенная регуляторными Т-клетками, содержит менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток.
В одном воплощении регуляторные Т-клетки, например, CD25+ Т-клетки, удаляют из популяции с использованием анти-CD25 антитела или его фрагментов, или CD25-связывающего лиганда IL-2. В одном воплощении анти-CD25 антитело или его фрагмент или CD25-связывающий лиганд конъюгированы с субстратом, например, гранулой, или иначе нанесены на субстрат, например, гранулу. В одном воплощении анти-CD25 антитело или его фрагмент конъюгированы с субстратом, как описано в настоящем описании.
В одном воплощении регуляторные Т-клетки, например, CD25+ Т-клетки, удаляют из популяции с использованием CD25-истощающего реагента от Miltenyi™. В одном воплощении отношение клеток к CD25-истощающему реагенту составляет 1e7 клеток к 20 мкл, или 1e7 клеток к 15 мкл, или 1e7 клеток к 10 мкл, или 1e7 клеток к 5 мкл, или 1e7 клеток к 2,5 мкл, или 1e7 клеток к 1,25 мкл. В одном воплощении, например, для регуляторных Т-клеток, например, деплеции CD25+, используют более 500 миллионов клеток на мл. В другом аспекте используют концентрацию клеток 600, 700, 800 или 900 миллионов клеток на мл.
9
9
10
9
9
8
8
7
7
В одном воплощении популяция иммунных эффекторных клеток, которые истощаются, включает примерно 6×10 CD25+ Т-клеток. В других аспектах популяция иммунных эффекторных клеток, которые истощаются, включает примерно 1×10-1×10CD25+ Т-клеток и любую целую величину в промежутке. В одном воплощении полученная популяция истощенных регуляторных Т-клеток имеет 2×10регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, или меньше (например, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 CD25+ клеток).
В одном воплощении регуляторные Т-клетки, например, CD25+ клетки, удаляют из популяции с использованием системы CliniMAC с тюбинг-набором для истощения клеток, таким как тюбинг 162-01. В одном воплощении система CliniMAC представляет серию для настройки на истощение, такую как, например, DEPLETION2.1.
REG
REG
REG
Без желания привязываться к какой-либо определенной теории, снижение уровня отрицательных регуляторов иммунных клеток (например, снижение числа нежелательных иммунных клеток, например, T-клеток) у субъекта перед аферезом или во время изгтовления продукта CAR-экспрессирующих клеток может уменьшить опасность рецидива у субъекта. Например, способы истощения T-клеток известны в технике. Способы уменьшения T-клеток включают, но не ограничиваются перечисленным, циклофосфамид, анти-GITR антитела (анти-GITR антитела, описанные в настоящем описании), истощение CD25 и их комбинации.
REG
REG
В некоторых воплощениях способы изготовления включают уменьшение числа (например, истощение) T-клеток перед изготовлением CAR-экспрессирующей клетки. Например, способы изготовления включают контактирование образца, например, аферезного образца, с анти-GITR антителом и/или анти-CD25 антителом (или их фрагментом, или CD25-связывающим лигандом), например, для истощения T-клеток перед изготовлением CAR-экспрессирующего клеточного продукта (например, Т-клеток, NK-клеток).
REG
REG
В одном воплощении субъекта предварительно лечат одной или несколькими терапиями, которые уменьшают число T-клеток, перед сбором клеток для изготовления CAR-экспрессирующего клеточного продукта, посредством чего у субъекта снижается опасность рецидива на лечение CAR-экспрессирующими клетками. В одном воплощении способы уменьшения числа T-клеток включают, но не ограничиваются перечисленным, введение субъекту одной или нескольких позиций из циклофосфамида, анти-GITR антитела, истощения CD25 или их комбинации. Введение одной или нескольких позиций из циклофосфамида, анти-GITR антитела, истощения CD25 или их комбинации может иметь место до, во время или после инфузии CAR-экспрессирующего клеточного продукта.
В одном воплощении субъекта предварительно лечат циклофосфамидом перед сбором клеток для CAR-экспрессирующего клеточного продукта, посредством чего у субъекта снижается опасность рецидива на лечение CAR-экспрессирующими клетками. В одном воплощении субъекта предварительно лечат анти-GITR антителами перед сбором клеток для CAR-экспрессирующего клеточного продукта, посредством чего у субъекта снижается опасность рецидива на лечение CAR-экспрессирующими клетками.
В одном воплощении популяция клеток, которые удаляют, не представляет ни регуляторные Т-клетки, ни опухолевые клетки, но клетки, которые иначе отрицательно влияют на экспансию и/или функцию CART-клеток, например, клетки, экспрессирующие CD14, CD11b, CD33, CD15 или другие маркеры, экспрессируемые возможно иммуносупрессивными клетками. В одном воплощении такие клетки намечают для удаления вместе с регуляторными Т-клетками и/или опухолевыми клетками или после указанного истощения или в другом порядке.
Способы, описанные в настоящем описании, могут включать более одной стадии селекции, например, более одной стадии истощения. Обогащение Т-клеточной популяции путем отрицательной селекции можно выполнить, например, с помощью комбинации антител, направленных на маркеры поверхности, уникальные для отрицательно выделяемых клеток. Одним из способов является сортинг клеток и/или селекция через отрицательную магнитную иммуноадгезию или проточную цитометрию, в которых используется коктейль из моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на отрицательно выделенных клетках. Например, для обогащения в отношении CD4+ клеток путем отрицательной селекции коктейль из моноклональных антител может включать антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8.
Способы, описанные в настоящем описании, также могут включать удаление клеток из популяции, которая экспрессирует опухолевый антиген, например, опухолевый антиген, который не включает CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 или CD11b, посредством чего получают популяцию, истощенную регуляторными Т-клетками, например, истощенную CD25+, и с клетками, истощенными опухолевым антигеном, которые подходят для экспрессии CAR, например, CAR, описанного в настоящем описании. В одном воплощении экспрессирующие опухолевый антиген клетки удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например, CD25+ клетками. Например, анти-CD25 антитело или его фрагмент и антитело против опухолевого антигена или его фрагмент можно присоединить к одному и тому же субстрату, например, грануле, который можно использовать для удаления клеток, или анти-CD25 антитело или его фрагмент или антитело против опухолевого антигена или его фрагмент можно присоединить к отдельным гранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других воплощениях удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, и удаление экспрессирующих опухолевый антиген клеток следуют одно за другим и могут происходить, например, в любом порядке.
Также предлагаются способы, которые включают удаление клеток из популяции, которая экспрессирует реперный ингибитор, например, реперный ингибитор, описанный в настоящем описании, например, один или несколько из PD1+ клеток, LAG3+ клеток и TIM3+ клеток, посредством чего получают популяцию истощенных Т-регуляторных, например, истощенных CD25+ клеток, и клетки, истощенные реперным ингибитором, например, PD1+, LAG3+ и/или TIM3+. Примеры реперных ингибиторов включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (e.g., CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном воплощении клетки, экспрессирующие реперный ингибитор, удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например, CD25+ клетками. Например, анти-CD25 антитело или его фрагмент и антитело против реперного ингбитора или его фрагмент можно присоединить к одной и той же грануле, которую можно использовать для удаления клеток, или анти-CD25 антитело или его фрагмент или антитело против реперного ингбитора или его фрагмент можно присоединить к отдельным гранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других воплощениях удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток, и удаление экспрессирующих реперный ингибитор клеток следуют одно за другим и могут происходить, например, в любом порядке.
В одном воплощении можно выбрать популяцию Т-клеток, которая экспрессирует один или несколько из IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, гранзима B и перфорина, или другие соответствующие молекулы, например, другие цитокины. Способы скрининга на экспрессию клеток можно определить, например, способами, описанными в публикации РСТ № WO 2013/126712.
Для выделения нужной популяции клеток путем положительной или отрицательной селекции концентрация клеток и поверхность (например, частиц, таких как гранулы) могут изменяться. В некоторых аспектах может быть желательно существенно уменьшить объем, в котором гранулы и клетки смешиваются вместе (например, увеличить концентрацию клеток), для гарантии максимального контакта клеток и гранул. Например, в одном аспекте используют концентрацию клеток 1 миллиард на мл. В другом аспекте используют свыше 100 миллионов клеток на мл. В другом аспекте используют концентрацию клеток 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50 миллионов клеток на мл. В еще одном аспекте используют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток на мл. В других аспектах используют концентрации 125 или 150 миллионов клеток. Использование высоких концентраций может привести к повышенному выходу, активации клеток и экспансии клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток дает возможность более эффективного захвата клеток, которые могут слабо экспрессировать антигены-мишени, представляющие интерес, таких как CD28-отрицательные Т-клетки, или из образцов, где присутствует много опухолевых клеток (например, лейкозной крови, опухолевой ткани и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и может быть желательно их получение. Например, использование высоких концентраций клеток дает возможность более эффективной селекции CD8+ T-клеток, которые обычно имеют слабую экспрессию CD8.
5
6
В родственном аспекте может быть желательно использовать меньшие концентрации клеток. Путем значительного разбавления смеси Т-клеток и поверхностных частиц (например, частиц, таких как гранулы) взаимодействия между частицами и клетками сводят к минимуму. Это выбор для клеток, которые экспрессируют большие количества нужных антигенов, которые связываются с частицами. Например, CD4+ Т-клетки экспрессируют высокие уровни CD28 и захватываются более эффективно, чем CD8+ клетки в меньших концентрациях. В одном аспекте концентрация используемых клеток составляет 5×10е6/мл. В других аспектах используемая концентрация может составлять от примерно 1×10/мл до 1×10/мл и любую целую величину в промежутке.
В других аспектах клетки могут быть ингибированы во вращательном устройстве для изменения длительности при различных скоростях или при 2-10°С или при комнатной температуре.
Для стимуляции Т-клетки также можно заморозить после стадии промывки. Без связи с какой-либо теорией, замораживание и последующая стадия оттаивания дают более однородный продукт за счет удаления из клеточной популяции гранулоцитов и до некоторой степени моноцитов. После стадии промывки, которая удаляет плазму и тромбоциты, клетки можно суспендировать в растворе для замораживания. Хотя в технике известны и будут применяться в настоящем контексте многие растворы для замораживания и параметры, один из способов включает использование PBS, содержащего 20% ДМСО и 8% человеческого сывороточного альбумина, или среды для выращивания, содержащие 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% ДМСО, или 31,25% плазмалита-А, 31,25% декстрозы, 0,45% NaCl, 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% ДМСО, или другие подходящие среды для замораживания клеток, содержащие, например, геспан и ПлазмаЛит А, затем клетки замораживают при -80°С со скоростью 1° в минуту и хранят в емкости для хранения в парах жидкого азота. Можно использовать другие способы управляемого замораживания, а также неуправляемого замораживания сразу до -20°С или в жидком азоте.
В некоторых аспектах криоконсервированные клетки оттаивают и промывают, как описано в настоящем описании, и оставляют на один час при комнатной температуре перед активацией с использованием способов по настоящему изобретению.
В контексте изобретения также рассматривается взятие образцов крови или продукта афереза у субъекта в период времени до того, когда размноженные клетки, описанные в настоящем описании, могут понадобиться. Как таковой, источник клеток для размножения может быть собран в любой необходимый момент времени, и нужные клетки, такие как иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, выделяют и замораживают для более позднего использования в клеточной терапии, например, Т-клеточной терапии, для любого ряда заболеваний или состояний, которые могут получить благоприятный эффект от клеточной терапии, например, Т-клеточной терапии, такие, как описанные в настоящем описании. В одном аспекте образец крови или афереза берут у генетически здорового субъекта. В некоторых воплощениях образец крови или афереза берут у вообще здорового субъекта, который имеет опасность развития у него заболевания, но у которго заболевание еще не развилось, и клетки, представляющие интерес, выделяют и замораживают для более позднего использования. В некоторых аспектах иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, могут быть размножены, заморожены и использованы позднее. В некоторых аспектах образцы берут у пациента вскоре после диагноза определенного заболевания, описанного в настоящем описании, но до какого-либо лечения. В другом аспекте клетки выделяют из образца крови или афереза субъекта перед любым числом релевантных способов лечения, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лечение такими средствами, как натализумаб, эфализумаб, антивирусные средства, химиотерапию, облучение, лечение иммуносупрессивными средствами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммуноаблативными средствами, такими как САМРАТН, анти-CD3-антитела, цитоксан, флударбин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228, и облучение.
В другом аспекте настоящего изобретения Т-клетки получают от пациента непосредственно после лечения, после которого у субъекта остаются функциональные Т-клетки. В этом отношении отмечено, что после некоторых видов лечения рака, в частности, лечения лекарственными средствами, которые причиняют вред иммунной системе, вскоре после лечения в течение периода, когда пациенты могут естественно восстанавливаться от лечения, качество полученных Т-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности размножаться ex vivo. Подобным образом, после манипуляции ex vivo с использованием способов, описанных в настоящем описании, такие клетки могут находиться в предпочтительном состоянии для усиленной прививки и экспансии in vivo. Таким образом, в контексте настоящего изобретения рассматривается собирание клеток крови, включая Т-клетки, дендритные клетки или другие клетки гемопоэтической линии дифференцировки, во время такой фазы восстановления. Далее, в некоторых аспектах мобилизацию (например, с GM-CSF) и установление режимов можно использовать для создания состояния у субъекта, которое содействует репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или экспансии определенных типов клеток, в особенности, во время определенного временного окна после терапии. Характерные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.
В одном воплощении иммунные эффекторные клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, получают от субъекта, который получил малую усиливающую иммунитет дозу ингибитора mTOR. В одном воплощении популяцию иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, сконструированных для экспрессии CAR, харвестируют через достаточный промежуток времени или после достаточной дозировки малой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, так что уровень PD1 отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или отношение PD1 отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD1 положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки, у субъекта или харвестированных у субъекта, возрастает, по меньшей мере временно.
В других воплощениях популяцию иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, которые сконструированы или будут сконструированы для экспрессии CAR, можно обработать ex vivo посредством контакта с количеством ингибитора mTOR, которое повышает число PD1 отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток, или повышает отношение PD1 отрицательные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки/PD1 положительные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки.
В одном воплощении популяция Т-клеток является дефицитной по диаглицеролкиназе (DGK). Дефицитные по DGK клетки включают клетки, которые не экспрессируют РНК или белок DGK или имеют сниженную или подавленную DGK-активность. Дефицитные по DGK клетки можно получить с помощью генетических подходов, например, введением интерферирующих РНК агентов, например, мРНК, shРНК, миРНК, для снижения или предотвращения экспансии DGK. С другой стороны, DGK-дефицитные клетки можно получить путем обработки ингибиторами DGK, описанными в настоящем описании.
В одном воплощении популяция Т-клеток является дефицитной по Ikaros. Дефицитные по Ikaros клетки включают клетки, которые не экспрессируют РНК или белок Ikaros или имеют сниженную или подавленную активность Ikaros. Дефицитные по Ikaros клетки можно получить с помощью генетических подходов, например, введением интерферирующих РНК агентов, например, мРНК, shРНК, миРНК, для снижения или предотвращения экспрессии Ikaros. С другой стороны, Ikaros-дефицитные клетки можно получить путем обработки ингибиторами Ikaros, например, леналидомидом.
В воплощениях популяция Т-клеток является дефицитной по DGK и дефицитной по Ikaros, например, не экспрессирует DGK и Ikaros или имеет сниженную или подавленную DGK и Ikaros активность. Такие DGK- и Ikaros-дефицитные клетки можно получить любыми способами, описанными в настоящем описании.
В одном воплощении NK-клетки получают от субъекта. В другом воплощении NK-клетки представляют собой NK-клеточную линию, например, клеточную линию NK-92 (Conkwest).
Аллогенный CAR
В воплощениях, описанных в настоящем описании, иммунная эффекторная клетка может быть аллогенной иммунной эффекторной клеткой, например, Т-клеткой или NK-клеткой. Например, клетка может представлять собой аллогенную Т-клетку, например, аллогенную Т-клетку, утратившую экспрессию функционального Т-клеточного рецептора (TCR) и/или человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), например, HLA класса I и/или HLA класса II.
Утратившую функциональный TCR Т-клетку можно, например, сконструировать так, что она не экспрессирует какой-либо функциональный TCR на своей поверхности, сконструировать так, что она не экспрессирует одну или больше субъединиц, которые включают функциональный TCR (например, сконструировать так, что она не экспрессирует (или показывает ослабленную экспрессию) TCR-альфа, TCR-бета, TCR-гамма, TCR-дельта, TCR-эпсилон или TCR-дзета), или сконструировать так, что она продуцирует очень мало функционального TCR на своей поверхности. С другой стороны, Т-клетка может экспрессировать по существу ухудшенный TCR, например, экспрессируя мутированные или усеченные формы одной или нескольких субъединиц TCR. Термин «по существу ухудшенный TCR» означает, что такой TCR не будет вызывать вредную иммунную реакцию у реципиента.
Описанная в настоящем описании Т-клетка может быть, например, сконструирована так, что она не экспрессирует HLA на своей поверхности. Например, Т-клетка, описанная в настоящем описании, может быть сконструирована так, что экспрессия HLA на поверхности клетки, например, HLA класса I и/или HLA класса II, регулируется отрицательно. В некоторых аспектах отрицательную регуляцию HLA можно выполнить путем уменьшения или устранения экспрессии бета-2-микроглобулина (В2М).
В некоторых воплощениях Т-клетка может утратить функциональный TCR и функциональный HLA, например, HLA класса I и/или HLA класса II.
Модифицированные Т-клетки, которые утратили экспрессию функционального TCR и/или HLA, можно получить любым подходящим способом, включая нокаут или нокдаун одной или нескольких субъединиц TCR или HLA. Например, Т-клетка может включать нокдаун TCR и/или HLA с использованием мРНК, shРНК, регулярно расположенных группами коротких палиндромных повторов (CRISP), эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или эндонуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN).
В некоторых воплощениях аллогенная клетка может представлять собой клетку, которая не экспрессирует или экспрессирует на низких уровнях ингибирующую молекулу, например, клетку, сконструированную любым способом, описанным в настоящем описании. Например, клетка может представлять собой клетку, которая не экспрессирует или экспрессирует на низких уровнях ингибирующую молекулу, например, которая может снижать способность CAR-экспрессирующей клетки поддерживать иммунную эффекторную реакцию. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. Подавление ингибирующих молекул, например, путем ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка, может оптимизировать производительность CAR-экспрессирующей клетки. В воплощениях можно использовать ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, дцРНК, например, мРНК или shРНК, регулярно расположенные группами короткие палиндромные повторы (CRISP), эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), или эндонуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN).
мРНК и shРНК для ингибирования TCR или HLA
В некоторых воплощениях экспрессию TCR и/или экспрессию HLA в клетке можно ингибировать с использованием мРНК или shРНК, которые таргетируют нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR и/или HLA, и/или ингибирующей молекулы, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
Экспрессии мРНК и shРНК в Т-клетках можно добиться с использованием любой обычной экспрессирующей системы, например, такой, как лентивирусная экспрессирующая система.
Примеры shРНК, которые отрицательно регулируют экспрессию компонентов TCR, описаны, например, в публикации US № 2012/0321667. Примеры мРНК и shРНК, которые отрицательно регулируют экспрессию генов HLA класса I и/или HLA класса II, описаны, например, в публикации US № 2007/0036773.
CRISPR для ингибирования TCR или HLA
«CRISPR» или «CRISPR для TCR и/или HLA» при использовании в настоящем описании относятся к набору регулярно расположенных группами коротких палиндромных повторов или системе, включающей такой набор повторов. «Cas» при использовании в настоящем описании относится CRISPR-ассоциированному белку. Системой «CRISPR/Cas» называют систему, полученную из CRISPR и Cas, которую можно использовать для сайленсинга или мутирования гена TCR и/или HLA и/или ингибирующей молекулы, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
et al.
BMC Bioinformatics
et al.
Science
et al.
Science
Встречающиеся в природе системы CRISPR/Cas обнаружены в приблизительно 40% секвенированных геномах эубактерий и 90% секвенированных архей. Grissa  (2007), , 8: 172. Такая система представляет собой тип иммунной системы прокариот, которая предоставляет устойчивость к чужеродным генетическим элементам, таким как плазмиды и фаги, и обеспечивает форму приобретенного иммунитета. Barrangou  (2007), ,315: 1709-1712; Marragini (2008), , 322: 1843-1845.
et al.
Nature
Система CRISPR/Cas модифицирована для применения при редактивровании гена (сайленсинге, усилении или изменении специфических генов) в эукариотах, таких как мыши или приматы. Wiedenheft  (2012), , 482: 331-8. Это осуществляют путем введения в эукариотную клетку плазмиды, содержащей специфически созданный CRISPR и один или несколько соответствующих Cas.
Последовательность CRISPR, иногда называемая локусом CRISPR, включает изменяющиеся повторы и спейсеры. В CRISPR, встречающемся в природе, спейсеры обычно включают последовательности, чужеродные для бактерии, такие как плазмидная или фаговая последовательность; в CRISPR/Cas системе TCR и/или HLA спейсеры получают из генной последовательности TCR или HLA.
et al.
Science
et al.
Biology Direct.,
Science
РНК из локуса CRISPR конститутивно экспрессируется и процессируется белками Cas в малые РНК. Они включают спейсер, фланкированный повторяющейся последовательностью РНК, направляют другие белки Cas к молчащим экзогенным генетическим элементам на уровне ДНК или РНК. Horvath  (2010), , 327: 167-170; Makarova  (2006),  1: 7. Таким образом, спейсеры служат в качестве матриц для молекул РНК аналогично мРНК. Pennisi (2013), , 341: 833-836.
et al.
PLoS Comput. Biol.
et al.
Genome Biol.
et al.
J. Mol. Evol.
et al.
Microbiol.
Microbiol.
et al.
Trends. Genet
Science
Science
Так как они встречаются в природе во многих различных типах бактерий, точные порядки CRISPR и структура, функция и ряд генов Cas и их продукт иногда отличаются от вида к виду. Haft  (2005), , 1: e60; Kunin  (2007), , 8: R61; Mojica  (2005), , 60: 174-182; Bolotin  (2005), , 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005), , 151: 653-663; и Stern  (2010), ., 28: 335-340. Например, белки Cse (подтип Cas, E. coli) (например, CasA) образуют функциональный комплекс Cascade, который процессирует РНК-транскрипты CRISPR в единицы повтор-спейсер, которые Cascade сохраняет. Brouns et al. (2008), , 321: 960-964. В других прокариотах Cas6 процессирует транскрипт CRISPR. Фаговой активации на основе CRISPR в E. coli требуется Cascade и Cas3, но не Cas1 или Cas2. Белки Cmr (модуль Cas RAMP) в Pyrococcus furiosus и других прокариотах образуют функциональный комплекс CRISPR с малыми РНК, который узнает и расщепляет комплементарные РНК-мишени. Более простая система с CRISPR основана на белке Cas9, который представляет собой нуклеазу с двумя активнми сайтами разрезания по одному на каждой нити двойной спирали. Комбинирование Cas9 и модифицированной РНК локуса CRISPR можно использовать в системе для редактирования гена. Pennisi (2013), , 341: 833-836.
Таким образом, систему CRISPR/Cas можно использовать для редактирования гена TCR и/или HLA (добавления или делеции пары оснований) или введения преждевременного прекращения, которое таким образом снижает экспрессию TCR и/или HLA. С другой стороны, систему CRISPR/Cas можно использовать подобно интерференции РНК, выключая ген TCR и/или HLA по обратимому типу. В клетке млекопитающего, например, РНК может направлять белок Cas к промотоу TCR и/или HLA, пространственно блокируя РНК-полимеразы.
Можно получить искусственные системы CRISPR/Cas, которые ингибируют TCR и/или HLA, с использованием технологии, известной в технике, например, описанной в публикации US № 20140068797 и в Cong (2013), Science, 339: 819-823. Также можно получить другие искусственные системы CRISPR/Cas, которые известны в технике, и которые ингибируют TCR и/или HLA, например, описанные в Tsai (2014), Nature Biotechnol., 32:6, 569-576, и патентах США №№ 8871445, 8865406, 8795965, 8771945 и 8697359.
TALEN для ингибирования TCR и/или HLA
«TALEN» или «TALEN для HLA и/или TCR» или «TALEN для ингибирования HLA и/или TCR» относятся к эффекторной нуклеазе, подобной активатору транскрипции, искусственной нуклеазе, которую можно использовать для редактирования гена HLA и/или TCR, и/или ингибирующей молекуле, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
Nature Biotech
Science
Science
TALEN получают искусственно путем слияния ДНК-связывающего домена TAL-эффектора с доменом расщепления ДНК. Эффекторы, подобные активатору транскрипции (TALE), можно сконструировать для связывания любой нужной ДНК-последовательности, включая часть гена HLA или TCR. Путем объединения сконструированный TALE с доменом расщепления ДНК можно получить рестрикционный фермент, который является специфическим для любой нужной ДНК-последовательности, включая последовательность HLA или TCR. Затем их можно ввести в клетку, в которой их можно использовать для редактирования генома. Boch (2011), ., 29: 135-6; и Boch et al. (2009), , 326: 1509-12; Moscou et al. (2009), , 326: 3501.
TALE представляют собой белки, секретированные бактериями Xanthomonas. Связывающий домен ДНК содержит повторяющуюся высоко консервативную последовательность 33-34 аминокислот, за исключением 12-ой и 13-ой аминокислот. Эти две позиции являются весьма изменчивыми, показывая высокую корреляцию с узнаванием специфического нуклеотида. Таким образом, их можно сконструировать для связывания с нужной ДНК-последовательностью.
Nucl. Acids Res.
Nature Biotech
Nature Biotech
Science,
,
Nature Methods,
,
Nature Biotech.,
,
J. Mol. Biol.,
Для того, чтобы получить TALEN, белок TALE гибридизируют с нуклеазой (N), которая представляет собой эндонуклеазу дикого типа или мутированную FokI. Сделано несколько мутаций FokI для ее применения в TALEN; они, например, улучшают специфичность или активность расщепления. Cermak et al. (2011), , 39: e82; Miller et al. (2011), ., 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011), ., 29: 731-734; Wood et al. (2011),  333: 307; Doyon et al. (2010) 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) 25: 786-793; и Guo et al. (2010) 200: 96.
Nature Biotech.
Домен FokI функционирует как димер, требующий две конструкции с уникальными ДНК-связывающими доменами для сайтов в геноме мишени с надлежащей ориентацией и размещением. Оказывается, что как число аминокислотных остатков между ДНК-связывающим доменом TALE и доменом расщепления FokI, так и число оснований между двумя отдельными сайтами связывания TALEN являются важными параметрами для достижения высоких уровней активности. Miller et al. (2011), , 29: 143-8.
TALEN HLA или TCR можно использвать в клетке для получения двухнитевого разрыва (DSB). Можно ввести мутацию в сайт разрыва, если механизмы репарации ошибочно восстанавливают разрыв через соединение с негомологичным концом. Например, ошибочная репарация может ввести мутацию сдвига рамки. С другой стороны, чужеродную ДНК можно ввести в клетку вместе с TALEN; в зависимости от последовательностей чужеродной ДНК и хромосомной последовательности, этот процесс можно использовать для исправления дефекта в гене HLA или TCR или введения такого дефекта в wt ген HLA или TCR, снижая таким образом экспрессию HLA или TCR.
Nature Biotech.
PLoS ONE
TALEN, специфические для последовательностей в HLA или TCR, можно сконструировать с использованием любого способа, известного в технике, включая различные схемы с использованием модульных компонентов. Zhang et al. (2011), , 29: 149-53; Geibler et al. (2011), , 6: e19509.
Нуклеаза с цинковыми пальцами для ингибирования HLA и/или TCR
«ZFN» или «нуклеаза с цинковыми пальцами» или «ZFN для HLA и/или TCR» или «ZFN для ингибирования HLA и/или TCR» относятся к нуклеазе с цинковычми пальцами - искусственной нуклеазе, которую можно использовать для редактирования гена HLA и/или TCR, и/или ингибирующей молекуле, описанной в настоящем описании (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозина и TGFR-бета).
Genetics Society of America
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Подобно TALEN, ZFN включает домен нуклеазы FokI (или его производное), слитый с ДНК-связывающим доменом. В случае ZFN ДНК-связывающий домен включает один или несколько цинковых пальцев. Carroll et al. (2011), , 188: 773-782; и Kim et al. (1996), , 93: 1156-1160.
Цинковый палец представляет собой небольшой мотив белковой структуры, стаблизированный одним или несколькими ионами цинка. Цинковый палец может включать, например, Cys2His2, и может узнавать последовательность в приблизительно 3 п.о. Различные цинковые пальцы известной специфичности можно объединить и получить полипептиды с несколькими пальцами, которые узнают последовательности в примерно 6, 9, 12, 15 или 18 п.о. Доступны различные методы селекции и модульной сборки для получения цинковых пальцев (и их комбинаций), узнающих специфические последовательности, включающие фаговый дисплей, дрожжевые одногибридные системы, бактериальные одногибридные и двугибридные системы и клетки млекопитающих.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Подобно TALEN, ZFN следует димеризовать для расщепления ДНК. Таким образом, требуется пара ZFN для нацеливания на сайты непалиндромной ДНК. Два отдельных ZFN должны связывать противоположные нити ДНК с их нуклеазами должным образом обособленно. Bitinaite et al. (1998), , 95: 10570-5.
Также подобно TALEN, ZFN может создавать двухнитевой разрыв в ДНК, который может создать мутацию сдвига рамки, если восстановлен ошибочно, что ведет к снижению экспрессии и количества HLA и/или TCR в клетке. ZFN также можно использовать с гомологичной рекомбинацией для мутирования в гене HLA или TCR.
Mol. Ther.
J. Mol. Biol.
ZFN, специфические для последовательностей в HLA или TCR, можно сконструировать с использованием любого способа, известного в технике. См., например, Provasi (2011), Nature Med., 18: 807-815; Torikai (2013), Blood, 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008), , 16: 1200-7; Guo et al. (2010), , 400: 96; публикация патента США 2011/0158957; и публикация патента США 2012/0060230.
Экспрессия теломеразы
Без желания привязываться к какой-либо теории, в некоторых воплощениях терапевтическая Т-клетка имеет краткосрочное существование у пациента из-за укороченных теломер в Т-клетке; соответственно, трансфекция геном теломеразы может удлинить теломеры Т-клетки и улучшить продолжительность существования Т-клетки у пациента. См. Carl June, «Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic», Journal of Clinical Investigation, 117: 1466-1476 (2007). Так, в одном воплощении иммунная эффекторная клетка, например, Т-клетка, экспрессирует со смещением субъединицу теломеразы, например, каталитическую субъединицу теломеразы, например, TERT, например, hTERT. В некоторых аспектах такое раскрытие дает способ получения CAR-экспрессирующей клетки, включающий контактирование клетки с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, каталитическую субъединицу теломеразы, например, TERT, например, hTERT. Клетку можно ввести в контакт с нуклеиновой кислотой до, одновременно или после контактирования с конструкцией, кодирующей CAR.
В одном аспекте раскрытие показывает способ получения популяции иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток). В одном воплощении способ включает предоставление популяции иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток), контактирование популяции иммунных эффекторных клеток с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, и контактирование популяции иммунных эффекторных клеток с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, hTERT, в условиях, которые допускают экспрессию CAR и теломеразы.
В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, представляет собой ДНК. В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая субъединицу теломеразы, включает промотор, способный вести экспрессию субъединицы теломеразы.
В одном воплощении hTERT представляет собой аминокислотную последовательность белка GenBank Protein ID AAC51724.1 (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells и during Immortalization», Cell, Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795), которая приводится далее:
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (SEQ ID NO: 214).
В одном воплощении hTERT имеет последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96^, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 214. В одном воплощении hTERT имеет последовательность SEQ ID NO: 214. В одном воплощении hTERT включает делецию (например, не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) в N-конце, С-конце или обоих концах. В одном воплощении hTERT включает трансгенную аминокислотную последовательность (например, из не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) в N-конце, С-конце или обоих концах.
В одном воплощении hTERT кодирован нуклеотидной последовательностью GenBank, инвентарный № AF018167 (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells и during Immortalization», Cell, Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa (SEQ ID NO: 215).
В одном воплощении hTERT кодирован нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности SEQ ID NO: 215. В одном воплощении hTERT кодирован нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 215.
Активация и экспансия Т-клеток
Как правило, Т-клетки можно активировать и размножить с использованием способов, описанных, например, в патентах США 6352694, 6534055, 6905680, 6692964, 5858358, 6887466, 6905681, 7144575, 7067318, 7172869, 7232566, 7175843, 5883223, 6905874, 6797514, 6867041 и публикации заявки на патент США № 20060121005.
Как правило, Т-клетки по изобретению можно размножить путем контактирования с поверхностью, имеющий присоединенный к ней агент, который стимулирует сигнал, ассоциированный с комплексом CD3/TCR, и лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, популяции Т-клеток можно стимулировать так, как описано в настоящем описании, например, путем контакта с анти-CD3 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, или анти-CD2 антителом, иммобилизованным на поверхности, или путем контакта с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в конъюгации с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяцию Т-клеток можно ввести в контакт с анти-CD3 антителом и анти-CD28 антителом в условиях, соответствующих стимуляции пролиферации Т-клеток. Для того, чтобы стимулировать пролиферацию или CD4+ Т-клеток или CD8+ Т-клеток, можно использовать анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело. Примеры анти-CD28 антитела включают 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, France), которые можно использовать как и другие способы, обычно известные в технике (Berg et al., Transplant Proc., 30(8): 3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med., 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth., 227(1-2): 53-63, 1999).
В некоторых аспектах первичный стимулирующий сигнал и костимулирующий сигнал для Т-клетки могут быть обеспечены различными протоколами. Например, агенты, предоставляющие каждый сигнал, могут находиться в растворе или соединены на поверхности. При соединении на поверхности агенты могут соединяться с одной и той же поверхностью (т.е., в «цис» формации) или с отдельными поверхностями (т.е., в «транс» формации). С другой стороны, один агент может быть соединен с поверхностью, а другой агент может находиться в растворе. В одном аспекте агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, связан с поверхностью клетки, и агент, обеспечивающий первичный сигнал активации, находится в растворе или соединен с поверхностью. В некоторых аспектах оба агента могут находится в растворе. В одном аспекте агенты могут находиться в растворимой форме и затем сшиты с поверхностью, такие как клеточные экспрессирующие Fc-рецепторы или антитело или другой связывающий агент, который будет связываться с агентами. В этом отношении см., например, публикации заявок на патент США №№ 20040101519 и 20060034810 для искусственных антигенпрезентирующая клеток (aAPC), которые в настоящем изобретении рассматриваются для применения при активации и экспансии Т-клеток.
В одном аспекте два агента иммобилизованы на гранулах: или на одной грануле, т.е., «цис», или на отдельных гранулах, т.е., «транс». Например, агент, обеспечивающий первичный сигнал активации, представляет собой анти-CD3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, представляет собой анти-CD28 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и оба агента соиммобилизованы на одной и той же грануле в эквивалентных молекулярных количествах. В одном аспекте используют отношение 1:1 каждого антитела, связанного с гранулами, для экспансии CD4+ T-клеток и роста T-клеток. В некоторых аспектах настоящего изобретения используют такое отношение анти-CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, что наблюдают повышение экспансии Т-клеток по сравнению с экспансией, наблюдаемой с использованием отношения 1:1. В одном частном аспекте наблюдают повышение от примерно 1 до примерно 3 раз по сравнению с экспансией, наблюдаемой с использованием отношения 1:1. В одном аспекте отношение анти-CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, колеблется от 100:1 до 1:100 со всеми целыми величинами в промежутке. В одном аспекте настоящего изобретения с частицами связано больше анти-CD28 антител, чем анти-CD3 антител, т.е., отношение CD3:CD28 меньше единицы. В некоторых аспектах изобретения отношение анти-CD28 антител к анти-CD3 антителам, связанным с гранулами, превышает 2:1. В одном частном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:100. В одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:75. В другом аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:50. В одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:30. В одном предпочтительном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:10. В одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 1:3. В еще одном аспекте используют отношение CD3:CD28 антител, связанных с гранулами, 3:1.
Отношения частиц к клеткам от 1:500 до 500:1 и любые целые величины в промежутке могут использоваться для стимуляции Т-клеток или других клеток-мишеней. Как могут легко признать специалисты в данной области техники, отношение частиц к клеткам может зависеть от размера частиц относительно клетки-мишени. Например, гранулы небольшого размера могут связывать только несколько клеток, в то время как более крупные гранулы могут связывать много клеток. В некоторых аспектах отношение клеток к частицам колеблется от 1:100 до 100:1 и любой целой величины в промежутке, и в других аспектах отношение включает значения 1:9-9:1 и любые целые величины в промежутке, которые также могут использоваться для стимуляции Т-клеток. Отношение анти-CD3- и анти-CD28-соединенных частиц к Т-клеткам, которое приводит к стимуляции Т-клеток, может изменяться, как отмечалось выше, однако некоторые предпочтительные значения включают 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1, причем одно предпочтительное отношение составляет по меньшей мере 1:1 на Т-клетку. В одном аспекте используют отношение частиц к клеткам 1:1 или меньше. В одном отдельном аспекте предпочтительное отношение частицы:клетки составляет 1:5. В других аспектах отношение частиц к клеткам может изменяться в зависимости от дня стимуляции. Например, в одном аспекте отношение частиц к клеткам составляет от 1:1 до 10:1 в первый день, и затем к клеткам добавляют дополнительные частицы каждый день или через день в течение до 10 дней до конечных отношений от 1:1 до 1:10 (на основании числа клеток в день добавления). В одном отдельном аспекте отношение частиц к клеткам составляет 1:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:5 к третьему и пятому дню стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют ежедневно или через день, основываясь на конечном отношении 1:1 в первый день и 1:5 на третий и пятый дни стимуляции. В одном аспекте отношение частиц к клеткам составляет 2:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:10 на третий и пятый дни стимуляции. В одном аспекте частицы добавляют ежедневно или через день, основываясь на конечном отношении 1:1 в первый день и 1:10 на третий и пятый дни стимуляции. Специалисты в данной области техники признают, что множество других отношений могут подходить для применения в настоящем изобретении. В частности, отношения будут изменяться в зависимости от размера частиц и размера и типа клеток. В одном аспекте наиболее типичные отношения для использования составляют приблизительно 1:1, 2:1 и 3:1 в первый день.
В других аспектах настоящего изобретения клетки, такие как Т-клетки, комбинируют с гранулами с нанесенным агентом, затем гранулы и клетки разделяют, и затем клетки культивируют. В другом аспекте перед культивированием гранулы с нанесенным агентом и клетки не разделяют, а культивируют вместе. В другом аспекте гранулы и клетки сначала концентрируют путем применения силы, такой как магнитная сила, что приводит к повышенному лигированию маркеров клеточной поверхности, посредством чего вызывается стимуляция клеток.
4
9
Как пример, белки клеточной поверхности можно лигировать, допуская парамагнитные гранулы, к которым присоединены анти-CD3 и анти-CD28 (3×28 гранул), к контакту с Т-клетками. В одном аспекте клетки (например, 10-10 Т-клеток) и гранулы (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T парамагнитные гранулы в отношении 1:1) объединяют в буфере, например, PBS (без двухвалентных катионов, таких как катионы кальция и магния). Снова специалисты в данной области техники легко поймут, что можно использовать любую концентрацию клеток. Например, клетка-мишень может быть очень редкой в образце и составлять только 0,01% в образце, или образец полностью может включать клетку-мишень, представляющую интерес (т.е., 100%). Соответственно, любое число клеток находится в контексте настоящего изобретения. В некоторых аспектах может быть желательно существенное уменьшение объема, в котором частицы и клетки смешивают вместе (т.е., повышение концентрации клеток), для гарантии макимального контакта клеток и частиц. Например, в одном аспекте используют концентрацию клеток примерно 10 миллиардов клеток/мл, 9 миллиардов/мл, 8 миллиардов/мл, 7 миллиардов/мл, 6 миллиардов/мл, 5 миллиардов/мл или 2 миллиарда клеток/мл. В одном аспекте используют концентрацию клеток свыше 100 миллионов клеток/мл. В другом аспекте используют концентрацию клеток 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В еще одном аспекте используют концентрацию клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В других аспектах можно использовать концентрации 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может привести к повышенному выходу клеток, активации клеток и экспансии клеток. Дополнительно использование высоких концентраций дает возможность более эффективного захвата клеток, которые могут слабо экспрессировать антигены-мишени, представляющие интерес, таких как CD28-отрицательные Т-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность и могут быть желательны для получения в некоторых аспектах. Например, использование высоких концентраций дает возможность более эффективной селекции CD28+ Т-клеток, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.
В одном воплощении клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в настоящем описании, размножают, например, способом, описанным в настоящем описании. В одном воплощении клетки размножают в культуре в течение периода от нескольких часов (например, примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 час) до примерно 14 дней (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней). В одном воплощении клетки размножают в течение периода 4-9 дней. В одном воплощении клетки размножают в течение периода 8 дней или меньше, например, 7, 6 или 5 дней. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки являются более эффективными, чем такие же клетки, выращенные в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования. Эффективность можно определить, например, по различным функциям Т-клеток, например, пролиферации, киллинге клеток-мишеней, продуцированию цитокинов, активации, миграции или их комбинациям. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размноженные в течение 5 дней, показывают по меньшей мере одно-, дву-, трех- или четырехкратное повышение удвоения клеток после антигенной стимуляции по сравнению с такими же клетками, выращенными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки показывают более высокое продуцирование провоспалительных цитокинов, например, уровней IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с такими же клетками, выращенными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования. В одном воплощении клетки, например, CLL-1-CAR клетки, описанные в настоящем описании, размноженные в течение 5 дней, показывают по меньшей мере одно-, дву-, трех-, четырех-, пяти-, десятикратное или большее повышение, в пг/мл, продуцирования провоспалительных цитокинов, например, уровней IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с такими же клетками, выращенными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования.
2
В одном аспекте настоящего изобретения смесь можно культивировать в течение от нескольких часов (например, 3 часов) до примерно 14 дней или любой целой величины в прмежутке. В одном аспекте смесь можно культивировать в течение 21 дня. В одном аспекте изобретения гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение примерно восьми дней. В одном аспекте изобретения гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение примерно 2-3 дней. Также могут быть желательны несколько циклов стимуляции, так что время культивирования Т-клеток может составлять 60 дней или долее. Условия, соответствующие культиврованию Т-клеток, включают соответствующие среды (например, минимальные поддерживающие среды или среды RPMI 1640 или X-vivo 15, (Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнестойкости, включая сыворотку (например, плода коровы или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-β, и TNF-α или любые другие добавки для роста клеток, известные специалистам в данной области техники. Другие добавки для роста клеток включают, но не ограничиваюся перечисленным, поверхностно-активные вещества, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, и X-Vivo 20, Optimizer, с добавлением аминокислот, пирувата натрия и витаминов, или бессыворотчные или с добавлением соответствующего количества сыворотки (или плазмы) или определенного набора гормонов, и/или некоего количества цитокина(ов), достаточного для роста и экспансии Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры, которые должны вводиться субъекту. Клетки-мишени поддерживаются в условиях, необходимых для поддержания роста, например, соответствующей температуре (например, 37°С) и атмосфере (например, с добавлением 5% СО).
В одном воплощении клетки размножают в соответствующих средах (например, средах, описанных в настоящем описании), которые включают один или несколько интерлейкинов, что приводит к по меньшей мере 200-кратному (например, 200-кратному, 250-кратному, 300-кратному, 350-кратному) увеличению числа клеток за 14-дневный период экспансии, например, при измерении способом, описанным в настоящем описании, таким как проточная цитометрия. В одном воплощении клетки размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7 (например, IL-15 и IL-7).
В воплощениях способы, описанные в настоящем описании, например, способы получения CAR-экспрессирующих клеток, включают удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ Т-клеток, из клеточной популяции, например, с использованием анти-CD25 антитела или его фрагментов, или CD25-связывающего лиганда IL-2. Способы удаления регуляторных Т-клеток, например, CD25+ Т-клеток, из клеточной популяции описаны в настоящем описании. В воплощениях способы, например, способы получения, дополнительно включают контактирование клеточной популяции (например, популяции, в которой регуляторные Т-клетки, такие как CD25+ Т-клетки, истощены; или клеточной популяции, которая предварительно контактировала с анти-CD25 антителом, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) с IL-15 и/или IL-7. Например, клеточную популяцию (например, которая предварительно контактировала с анти-CD25 антителом, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7.
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид интерлейкин-15 (IL-15), полипептид рецептор альфа интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинацией как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид IL-15, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид hetIL-15, во время получения CAR-экспрессирующей клетки, например, ex vivo.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид hetIL-15, во время экспансии ex vivo. В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей полипептид IL-15, во время экспансии ex vivo. В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в контакт с композицией, включающей как полипептид IL-15, так и полипептида IL-15Ra, во время экспансии ex vivo. В одном воплощении контактирование приводит к выживанию и пролиферации субпопуляции лимфоцитов, например, CD8+ Т-клеток.
Подвергавшиеся стимуляции в течение различного времени Т-клетки могут показывать различные свойства. Например, типичные образцы крови или аферезные продукты мононуклеарных клеток периферической крови имеют популяцию хелперных Т-клеток (ТН, CD4+), которая больше популяции цитотоксических или супрессорных Т-клеток (ТС, CD8+). Экспансия Т-клеток ex vivo путем стимуляции рецепторов CD3 и CD28 продуцирует популяцию Т-клеток, которая априорно до примерно дней 8-9 состоит преимущественно из ТН-клеток, в то время как после примерно дня 8-9 популяция Т-клеток включает значительно большую популяцию ТС-клеток. Соответственно, в зависимости от цели лечения может быть выгодна инфузия субъекту Т-клеточной популяции, включающей преимущественно ТН-клетки. Подобным образом, если выделено антигенспецифические подмножество ТС-клеток, может быть благопрятным размножение этого подмножества до более высокой степени.
Далее, кроме маркеров CD4 и CD8 существенно изменяются другие фенотипические маркеры, но по большей части, воспроизводимо в ходе процесса экспансии клеток. Таким образом, такая воспроизводимость дает возможность получать продукт активированные Т-клетки для конкретных целей.
Как только CLL-1-CAR сконструирована, можно использовать различные анализы для оценки активности молекулы, такой как, но без ограничения, способность размножать Т-клетки после антигенной стимуляции, продолжать экспансию Т-клеток в отсутствие рестимуляции и противораковая активность на соответствующих животных моделях in vitro. Анализы для оценки действий CLL-1-CAR описаны более подробно ниже.
et al
Анализ методом вестерн-блоттинга экспрессии CAR в первичных Т-клетках можно использовать для обнаружения присутствия мономеров и димеров. См., например, Milone ., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). Очень коротко, Т-клетки (смесь 1:1 CD4+ и CD8+ Т-клеток), экспрессируюищх CAR, размножают in vitro в течение долее 10 дней с последующим лизисом и SDS-PAGE в условиях восстановления. Содержащий CAR полноразмерный цитоплазматический домен TCR-ζ и цепь эндогенного TCR-ζ обнаруживают вестерн-блоттингом с использованием антитела к цепи TCR-ζ. Те же подмножества Т-клеток используют для анализа SDS-PAGE в условиях без восстановления для возможности оценки образования ковалентных димеров.
+
+
+
+
+
+
+
et al
Экспансию CAR Т-клеток in vitro после антигенной стимуляции можно измерить проточной цитометрией. Например, смесь CD4 и CD28 Т-клеток стимулируют αCD3/αCD28 aAPC с последующей трансдукцией лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP под контролем анализируемых промоторов. Примеры промоторов включают ген CMV IE, EF-1α, убиквитин C или фосфоглицерокиназные (PGK) промоторы. Флуоресценцию GFP оценивают проточной цитометрией в день 6 культивирования в подмножествах CD4 и/или CD8 T-клеток. См., например, Milone ., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). С другой стороны, смесь CD4 и CD8 T-клеток стимулируют покрытыми αCD3/αCD28 магнитными гранулами в день 0, и трансдуцируют CAR в день 1 с использованием бицистронного лентивирусного вектора, экспрессирующего CAR вместе с eGFP, с использованием последовательности 2A рибосомного перепрыгивания. Культуры можно повторно стимулировать CLL-1-экспрессирующими клетками.
+
et al
Также можно оценить длительную экспансию CAR Т-клеток в отсутствие повторной стимуляции. См., например, Milone ., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). Коротко, средний объем Т-клеток (f1) измеряют в день 8 культивирования с использованием счетчика частиц Coulter Multisizer III, Nexcelom Cellometer Vision или Millipore Scepter, после стимуляции покрытыми αCD3/αCD28 магнитными гранулами в день 0 и трансдукции указанным CAR в день 1.
+
Также можно использовать животные модели для измерения активности CART. Например, можно использовать модель с ксенотрансплантатом с использованием человеческих CLL-1-специфических CAR Т-клеток для лечения первичного AML человека у иммунодефицитных мышей. Очень коротко, после установления опухолей мышей рандомизируют по группам лечения. CLL-1-CARТ клетки инъецируют иммунодефицитным мышам, например, внутривенно. Животных оценивают на раковые клетки с недельными интервалами. Число CLL-1-экспрессирующих клеток AML периферической крови измеряют у мышей, которым инъецировали CLL-1-CARТ клетки или mock-трансдуцированные Т-клетки. Кривые выживания для групп сравнивают с использованием log рангового критерия.
et al
Цитотоксичность можно оценить стандартным анализом на высвобождение 51Cr. См., например, Milone ., Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009). Коротко, клетки-мишени нагружают 51Cr (в виде NaCrO4, New England Nuclear, Boston, MA) при 37°С в течение 2 часов при быстром перемешивании, дважды промывают полной RPMI и высевают в титрационные микропалншеты. Эффекторные Т-клетки смешивают с клетками-мишенями в лунках в полной RPMI при различных отношениях эффекторная клетка:клетка-мишень (Е:Т). Также готовят дополнительные лунки, содержащие только среды (спонтанное высвобождение, SR) или 1% раствор детергента тритона-Х 100 (общее высвобождение, TR). После 4-часовой инкубации при 37°С собирают супернатант из каждой лунки. Затем измеряют высвобожденный 51Cr с использованием счетчика гамма-частиц (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Каждое условие выполняют по меньшей мере трижды, и процент лизиса вычисляют с использованием формулы % лизиса=(ER-SR)/(TR-SR), где ER представляет среднее высвобожденного 51Cr для каждого условия эксперимента.
et al
-/-
+
+
Технологию визуализации изображений можно использовать для оценки специфического сосредоточения и пролиферации CAR на животных моделях с опухолями. Такие анализы описаны, например, в Barrett ., Human Gene Therapy, 22: 1575-1586 (2011). Кортко, мышам NOD/SCID/γc (NSG) инъецируют IV клетки Nalm-6, и через 7 дней Т-клетки через 4 часа после электропорации конструкций CAR. Т-Клетки устойчиво трансфицируют лентивирусной конструкцией для экспрессии люциферазы светляка, и мышей визуализируют в случае биолюминесценции. С другой стороны, терапевтическую эффективность и специфичность одной инъекции CAR Т-клеток на модели с ксенотрансплантатом Nalm-6 можно измерить следующим образом: мышам NSG инъецируют Nalm-6, трансдуцированные для устойчивой экспрессии люциферазы светляка, с последующей одной инъекцией Т-клеток, электропорированных CLL-1-CAR, через 7 дней. Животных визуализируют в различные моменты времени после инъекции. Например, можно получить карты плотности тепловых фотонов с люциферазой светляка при лейкозе у представленных мышей в день 5 (за 2 дня до лечения) и день 8 (24 часа после CAR PBL).
Другие анализы, включая анализы, описанные в настоящем описании в резделе «Примеры», а также анализы, известные в технике, также можно использовать для оценки конструкций CLL-1-CAR по изобретению.
С другой стороны или в комбинации со способами, описанными в настоящем описании, раскрываются одна или больше позиций из следующих: детекция и/или количественное определение CAR-экспрессирующих клеток (например, in vitro или in vivo (например, клинический мониторинг)); экспансия и/или активация иммунных клеток и/или CAR-специфическая селекция, которые включают применение лиганда CAR. В одном примере воплощения лиганд CAR представляет собой антитело, которое связывается с молекулой CAR, например, связывается с антигенсвязывающим доменом CAR (например, антителом, которое связывается с антигенсвязывающим доменом, например, антиидотипическое антитело; или антитело, которое связывается с константным участком внеклеточного связывающего домена). В других воплощениях лиганд CAR представляет собой молекулу антигена CAR (например, молекулу антигена CAR, описанную в настоящем описании).
В одном аспекте раскрывается способ детекции и/или количественного определения CAR-экспрессирующих клеток. Например, можно использовать лиганд CAR для детекции и/или количественного определения CAR-экспрессирующих клеток in vitro или in vivo (например, клинический мониторинг CAR-экспрессирующих клеток у пациента или дозируемых пациенту). Способ включает
предоставление лиганда CAR (необязательно, меченного лиганда CAR, например, лиганда CAR, который включает метку, гранулу, радиоактивную или флуоресцентную метку);
приобретение CAR-экспрессирующей клетки (например, приобретение образца, содержащего CAR-экспрессирующие клетки, такого как изготовленный образец или клинический образец);
контактирование CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR в условиях, в которых происходит связывание, посредством чего детектируется уровень (например, количество) присутствующих CAR-экспрессирующих клеток. Связывание CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR можно обнаружить с использованием стандартных методов, таких как FACS, ELISA и т.п.
В другом аспекте раскрывается способ экспансии и/или активации клеток (например, иммунных эффекторных клеток). Способ включает
предоставление CAR-экспрессирующей клетки (например, первой CAR-экспрессирующей клетки или временно экспрессирующей CAR клетки);
контактирование указанной CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, например, лигандом CAR, описанным в настоящем описании, в условиях, в которых происходит экспансия и/или пролиферация иммунных клеток, посредством чего продуцируется популяция активированных и/или размноженных клеток.
В некоторых воплощениях лиганд CAR находится сверху (например, иммобилизован или присоединен к субстрату, например, субстрату, невстречающемуся в природе). В некоторых воплощениях субстрат представялет собой неклеточный сусбстрат. Неклеточный сусбстрат может представлять собой твердый носитель, выбранный из, например, планшета (титрационного микропланшета), мембраны (например, нитроцеллюлозной мембраны), матрицы, чипа или гранулы. В воплощениях лиганд CAR присутствует в субстрате (например, на поверхности субстрата). Лиганд CAR может быть иммобилизован, присоединен или связан ковалентно или нековалентно (например, сшит) с субстратом. В одном воплощении лиганд CAR присоединен (например, ковалентно присоединен) к грануле. В вышеуказанных воплощениях популяцию иммунных клеток можно размножить in vitro или ex vivo. Способ также может включать культивирование популяции иммунных клеток в присутствии лиганада молекулы CAR, например, с использование любого из способов, описанных в настоящем описании.
В других воплощениях способ экспансии и/или активации клеток дополнительно включает добавление второй стимулирующей молекулы, например, CD28. Например, лиганд CAR и вторую стимулирующую молкулу можно иммобилизовать на субстрате, например, одной или нескольких гранулах, посредством чего получают повышенную экспансию и/или активацию клеток.
В еще одном аспекте предлагается способ селекции или обогащения в отношении CAR-экспрессирующей клетки. Способ включает контактирование CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, как описано в настоящем описании; и селекцию клетки на основе связывания лиганда CAR.
В еще других воплощениях предлагается способ истощения, уменьшения и/или киллинга CAR-экспрессирующей клетки. Способ включает контактирование CAR-экспрессирующей клетки с лигандом CAR, как описано в настоящем описании; и таргетинг клетки на основе связывания лиганда CAR, посредством чего уменьшается число CAR-экспрессирующих клеток и/или происходит киллинг CAR-экспрессирующей клетки. В одном воплощении лиганд CAR соединяют с токсичным агентом (например, токсином или клеточно-аблативным лекарственным средством). В другом воплощении антиидиотипическое антитело может вызвать активность эффекторной клетки, например, активность ADCC или ADC.
Примеры анти-CAR антител, которые можно использовать в способах, описанных в настоящем описании, описаны, например, в WO 2014/190273 и в Jena et al., «Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials», PLOS, March, 2013, 8: 3 e57838, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. В одном воплощении молекула антиидиотипического антитела узнает молекулу анти-CD19 антитела, например, анти-CD19 scFv. Например, молекула антиидиотипического антитела может конкурировать за связывание с CD19-специфическим клоном CAR mAb № 136.20.1, описанным в Jena et al., PLOS, March 2013, 8: 3 e57838; может иметь такие же CDR (например, один или больше, например, все, VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, используя определение по Кабату, определение по Чотиа или комбинацию определений по Кабату и Чотиа), как CD19-специфический клон CAR mAb № 136.20.1; может иметь один или больше (например, 2) вариабельных участка как CD19-специфический клон CAR mAb № 136.20.1, или может включать CD19-специфический клон CAR mAb № 136.20.1. В некоторых воплощениях антиидиотипическое антитело получают согласно способу, описанному Jena et al. В другом воплощении молекула антиидиотипического антитела представляет собой молекулу антиидиотипического антитела, описанную в WO 2014/190273. В некоторых воплощениях молекула антиидиотипического антитела имеет такие же CDR (например, один или больше, например, все, VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3), как молекула антитела в WO 2014/190273, такая как 136.20.1; может иметь один или больше (например, 2) вариабельных участка молекулы антитела в WO 2014/190273, или может включать CD19- молекулу антитела в WO 2014/190273, такую как 136.20.1. В других воплощениях анти-CAR антитело связывается с константным участком внеклеточного связывающего домена молекулы CAR, например, как описано в WO 2014/190273. В некоторых воплощениях анти-CAR антитело связывается с константным участком внеклеточного связывающего домена молекулы CAR, например, константным участком тяжелой цепи (например, шарнирным участком СН2-СН3) или константным участком легкой цепи. Например, в некоторых воплощениях анти-CAR антитело конкурирует за связывание с моноклональным антителом 2D3, описанным в WO 2014/190273, имеет такие же CDR (например, один или больше, например, все, VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3), как 2D3, или имеет один или больше (например, 2) вариабельных участка 2D3, или включает 2D3, как описано в WO 2014/190273.
+
+
В некоторых аспектах и воплощениях композиции и способы по настоящему изобретению оптимизированы для специфического подмножества Т-клеток, например, как описано в US, регистрационный № 62/031699, поданной 31 июля 2014, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых воплощениях оптимизированные подмножества Т-клеток отображают повышенную продолжительность существования по сравнению с контрольной Т-клеткой, например, Т-клеткой другого типа (например, CD8 или CD4), экспрессирующей такую же конструкцию.
+
+
+
+
В некоторых воплощениях CD4 Т-клетка включает CAR, описанный в настоящем описании, и такой CAR включает внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для (например, оптимизированный для, например, ведущий к повышенной продолжительности существования в) CD4 Т-клетки, например, домен ICOS. В некоторых воплощениях CD8 Т-клетка включает CAR, описанный в настоящем описании, и такой CAR включает внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для (например, оптимизированный для, например, ведущий к повышенной продолжительности существования в) CD8 Т-клетки, например, домен 4-1ВВ, домен CD28 или другой костимулирующий домен иной, чем домен ICOS. В некоторых воплощениях CAR, описанный в настоящем описании, включает антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, CAR, включающий антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, CAR из таблицы 2.
В одном аспекте в настоящем описании описывается способ лечения субъекта, например, субъекта, у которого рак. Способ включает введение указанному субъекту эффективного количества
+
CD4+
1) CD4 Т-клетки, включающей CAR (CAR),
включающей
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2;
трансмембранный домен и
внутриклеточный сигнальный домен, например, первый костимулирующий домен, например, домен ICOS; и
+
CD8+
2) CD8 Т-клетки, включающей CAR (CAR), включающий
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2;
трансмембранный домен и
внутриклеточный сигнальный домен, например, второй костимулирующий домен, например, домен 4-1ВВ, домен CD28 или другой костимулирующий домен иной чем домен ICOS;
CD4+
CD8+
где CAR и CAR отличаются друг от друга.
Необязательно способ также включает введение
+
CD8+
3) второй CD8 Т-клетки, включающей CAR (второй CAR), включающией
антигенсвязывающий домен, например, антигенсвязывающий домен, описанный в настоящем описании, например, антигенсвязывающий домен, который специфически связывает CLL-1, например, антигенсвязывающий домен из таблицы 2;
трансмембранный домен и
CD8+
CD8+
внутриклеточный сигнальный домен, причем второй CAR включает внутриклеточный сигнальный домен, например, костимулирующий сигнальный домен, отсутствующий в CAR, и, необязательно, не включает сигнальный домен ICOS.
Терапевтическое применение
Ассоциированные с CLL-1 заболевания и/или расстройства
Настоящее изобретение относится, среди прочего, к композициям и способам лечения рака. В одном аспекте рак представляет собой гематологический рак, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз, острый лимфобластный В-клеточный лейкоз (В-клеточный острый лимфоидный лейкоз, BALL), острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз (Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз (ТALL), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, плазмоцитарная миелома и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная лимфома).
Терапевтические применения
В одном аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания, связанного с экспрессией CLL-1. В одном аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания, при котором часть опухоли является отрицательной в отношении CLL-1, и часть опухоли является положительной в отношении CLL-1. Например, CAR по изобретению применим для лечения субъектов, которые подвергались лечению от заболевания, связанного с повышенной экспрессией CLL-1, причем субъект, который подвергался лечению в случае повышенных уровней CLL-1, показывал заболевание, связанное с повышенными уровнями CLL-1. В воплощениях CAR по изобретению применим для лечения субъектов, которые подвергались лечению от заболевания, связанного с повышенной экспрессией CLL-1, причем субъект, который подвергался лечению, связанному с экспрессией CLL-1, показывал заболевание, связанное с экспрессией CLL-1.
В одном аспекте изобретение относится к вектору, включающему CLL-1-CAR, операбельно связанный с промотором для экспрессии у млекопитающего иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток или NK-клеток. В одном аспекте изобретение относится к рекомбинантным иммунным эффекторным клеткам, например, Т-клеткам или NK-клеткам, экспрессирующим CLL-1-CAR для применения при лечении CLL-1-экспрессирующих опухолей, причем рекомбинантные иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, экспрессирующие CLL-1-CAR, называются CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой). В одном аспекте CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) по изобретению способна контактировать с опухолевой клеткой по меньшей мере одним CLL-1-CAR по изобретению, экспрессированным на ее поверхности, так что CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) таргетирует опухолевую клетку, и рост опухоли подавляется.
В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста CLL-1-экспрессирующей опухоллевой клетки, включающему контактирование опухолевой клетки с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по настоящему изобретению, так что CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) активируется в ответ на антиген и таргетирует раковую клетку, причем рост опухоли подавляется.
В одном аспекте изобретение относится к способу лечения рака у субъекта. Способ включает введение субъекту CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по настоящему изобретению, так что субъект лечится от рака. Примером рака, который поддается лечению CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению является рак, ассоциированный с экспрессией CLL-1. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией CLL-1, представляет собой гематологический рак. В одном аспекте гематологический рак включает, но не ограничивается перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная лимфома). В других воплощениях гематологический рак может включать минимальное остаточное заболевание MRD, например, лейкоза, например, AML или MDS.
Изобретение включает тип клеточной терапии, где иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку или NK-клетку, генетически модифицируют для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), и CLL-1-CAR-экспрессирующую клетку (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующую NK-клетку) вводят инфузией реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная инфузией клетка способна убивать опухолевые клетки у реципиента. В отличие от терапий с применением антител CAR-модифицированные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) способны к репликации in vivo, приводящей к длительной персистенции, которая может привести к стабильному регулированию опухоли. В различных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), введенные пациенту, или их потомство сохраняются у пациента в течение по меньшей мере четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одинадцати месяцев, двенадцати месяцев, тринадцати месяцев, четырнадцати месяцев, пятнадцати месяцев, шестнадцати месяцев, семнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, девятнадцати месяцев, двадцати месяцев, двадцати одного месяца, двадцати двух месяцев, двадцати трех месяцев, двух лет, трех лет, четырех лет или пяти лет после введения пациенту иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток).
Изобретение также включает тип клеточной терапии, где иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) модифицируют, например, с помощью in vitro транскрибированной РНК для временной экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), и CLL-1-CAR-экспрессирующую клетку (например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующую NK-клетку) вводят инфузией реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная инфузией клетка способна убивать опухолевые клетки у реципиента. Таким образом, в различных аспектах иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), введенные пациенту, присутствуют в течение менее одного месца, например, три недели, две недели, одну неделю, после введения пациенту иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток).
Без желания привязываться к какой-либо определенной теории, противоопухолевая иммунная реакция, вызванная CAR-модифицированными иммунными эффекторными клетками (например, Т-клетками или NK-клетками), может представлять собой активную или пассивную иммунную реакцию, или с другой стороны, может происходить вследствие прямой против косвенной иммунной реакции. В одном аспекте CAR-трансдуцированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) проявляют специфическую секрецию провоспалительных цитокинов и сильную цитолитическую активность в ответ на экспрессию CLL-1 раковых клеток человека, сопротивление ингибированию растворимого CLL-1, опосредование сочувствия киллингу и умеренную регрессию установленной опухоли человека. Например, безантигенные опухолевые клетки в гетерогенной области CLL-1-экспрессирующей опухоли могут быть чувствительны к косвенной деструкции CLL-1-перенацеленными иммунными эффекторными клетками (например, Т-клетками или NK-клетками), которые ранее прореагировали против соседних антигенположительных раковых клеток.
В одном аспекте полностью человеческие CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) по изобретению могут представлять собой тип вацины для иммунизации ex vivo и/или терапии in vivo для млекопитающего. В одном аспекте млекопитающим является человек.
Что касается иммунизации ex vivo, перед введением клетки млекопитающему происходит по меньшей мере одно из следующего: i) экспансия клеток, ii) введение в клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, или iii) криоконсервация клеток.
Процедуры ex vivo хорошо известны в технике и полнее обсуждаются ниже. Коротко, клетки берут у млекопитающего (например, человека) и генетически модифицируют (т.е., трансдуцируют или трансфицируют in vitro) вектором, экспрессирующим CAR, раскрытый в настоящем описании. CAR-Модифицированную клетку можно ввести реципиенту-млекопитающему для предоставления терапевтической пользы. Реципиент-млекопитающее может представлять собой человека, и CAR-модифицированная клетка может быть аутологична в отношении реципиента. С другой стороны, клетки могут быть аллогенными, сингенными или ксеногенными в отношении реципиента.
Процедура экпансии ex vivo кроветворных стволовых клеток и клеток-предшественников описана в пат. США № 5199942, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, и может быть применена к клеткам по настоящему изобретению. В технике известны другие подходящие способы, поэтому настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным способом экспансии клеток ex vivo. Коротко, культивирование и экспансия клеток ex vivo включают (1) собирание CD34+ кроветворных стволовых клеток и клеток-предшественников из забора периферической крови млекопитающего или эксплантатов костного мозга; и (2) размножение таких клеток ex vivo. Кроме клеточных факторов роста, описанных в пат. США № 5199942, для культивирования и экспансии клеток можно использовать другие факторы, такие как flt3 L, IL-1, IL-3 и лиганд c-kit.
Кроме применения вакцины на основе клеток в смысле иммунизации ex vivo, настоящее изобретение также относится к композициям и способам для иммунизации in vivo для вызывания иммунной реакции, направленной против антигена у пациента.
Как правило, клетки, активированные и размноженные так, как описано в настоящем описании, можно использовать при лечении и предупреждении заболеваний, которые появляются у индивидуумов, которые являются индивидуумами с ослабленным иммунитетом. В частности, CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) по изобретению используют при лечении заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CLL-1. В некоторых аспектах клетки по изобретению используют при лечении пациентов в опасности развития заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CLL-1. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CLL-1, включающим введение субъекту, наждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества CAR-модифицированных иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток) по изобретению. В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки, например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки, по изобретению можно использовать для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак или злокачественность, или предракового состояния, такого как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или прелейкозное гиперпролиферативное расстройство, гиперплазия или дисплазия, которые характеризуются анормальным ростом клеток.
В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по изобретению используют для лечения рака, причем рак представляет собой гематологический рак. Гематологические раковые состояния являются типами рака, такого как лейкоз и злокачественные лимфопролиферативные состояния, которые поражают кровь, костный мозг и лимфатическую систему.
В одном аспекте композиции и CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по настоящему изобретению особенно применимы для лечения миелоидных лейкозов, AML и его подтипов, хронического миелоидного лейкоза (CML) и миелодиспластического синдрома (MDS).
Лейкоз можно классифицировать как острый лейкоз и хронический лейкоз. Острый лейкоз можно дополнительно классифицироать как острый миелогенный лейкоз (AML) и острый лимфоидный лейкоз (ALL). Хронический лейкоз включает хронический миелогенный лейкоз (CML) и хронический лимфоидный лейкоз (CLL). Другие родственные состояния включают миелодиспластический синдром (MDS, раньше известный как «предлейкоз»), которые составляют разнотипную коллекцию гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и опасностью трансформации в AML.
Лимфомы представляют собой группу опухолей клеток крови, которые развиваются из лимфоцитов. Примеры лимфом включают неходжкинскую лимфому и ходжкинскую лимфому.
AML - злокачественная трансформация и нерегулируемая пролиферация анормально дифференцированных долгоживущих миелоидных клеток-предшественников приводит к высокому числу незрелых форм клеток крови в кровотоке и замещению здорового костного мозга злокачественными клетками. Симптомы включают усталость, бледность, слабые гематомы и кровотечение, лихордку и инфекцию; симтомы лейкозной инфильтрации присутствуют только у 5% пациентов (часто в виде кожных проявлений). Диагностической является проверка мазка периферической крови и костного мозга. Существующее лечение включает индукционную химиотерапию для достижения ремиссии и постремисионную химиотерапию (с трансплантацией стволовых клеток или без нее) для того, чтобы избежать рецидива.
AML имеет ряд подтипов, которые отличаются друг от друга морфологией, иммунофенотипом и цитохимией. Описано пять классов на основании превалирующего типа клеток, включающих классы миелоидный, миелоидмоноцитарный, моноцитарный, эритроидный и мегакариоцитарный.
Степени индукции ремиссии колеблются от 50 до 85%. Длительное выживание без болезни, как сообщается, имеет место у 20-40% пациентов и повышается до 40-50% у более молодых пациентов с трансплантацией стволовых клеток.
Прогностические факторы помогают определить протокол и интенсивность лечения; пациентам с сильно отрицательными прогностическими особенностями обычно дают более интенсивные формы терапии, поскольку возможное благоприятное действие, как полагают, оправдывает повышенную токсичность лечения. Наиболее важным прогностическим фактором является кариотип лейкозных клеток; благоприятные кариотипы включают t(15;17), t(8;21) и inv16 (p13;q22). Негативные факторы включают возраст, предшествующую миелодиспластическую фазу, вторичный лейкоз, высокое число WBC и отсутствие телец Ауэра.
Начальная терапия пытается вызвать ремиссию и отличается больше всего в случае ALL тем, что AML реагирует на немногие лекарственные средства. Основная схема индукции включает цитарабин непрерывной IV инфузией или в высоких дозах в течение 5-7 дней; в это же время дают даунорубицин или идарубицин IV в течение 3 дней. Некоторые схемы включают 6-тиогуанин, этопозид, винкристин и преднизон, но их вклад неясен. Лечение обычно приводит к существенной миелосупрессии с инфекцией или кровотечением; существует значительная латентность перед извлечением костного мозга. В это время жизненно важным является тщательное превентивное и поддерживающее лечение.
Хронический миелогенный (или миелоидный) лейкоз (CML) также известен как хронический гранулоцитарный лейкоз и характеризуется как рак белых клеток крови. Обычные схемы лечения CML включают ингибиторы тирозинкиназ Ber-Abl, иматиниб (Gleevec), дазатиниб и нилотиниб. Ингибиторы тирозинкиназ Ber-Abl специфически применимы для больных CML с транслокацией филадельфийской хромосомы.
Миелодиспластические синдромы (MDS) представляют собой гематологические клинические состояния, характеризующиеся нарушенным и неэффективным гемопоэзом или продуцированием крови. Так, необратимо снижается число и качество кровеобразующих клеток. У некоторых пациентов с MDS может развиться тяжелая анемия, в то время как другие являются бессимптомными.
Схема классификации MDS известна в технике, причем критерии обозначают отношение или частоту встречаемости определенных типов клеток крови, например, миелобластов, моноцитов и предшественников красных клеток. MDS включает рефрактерную анемию, рефрактерную анемию с кольцевыми сидеробластами, рефрактерную анемию с избыточными бластами, рефрактерную анемию с избыточными бластами при трансформации, хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML).
Лечение MDS изменяется в связи с тяжестью симптомов. Агрессивные формы лечения для пациентов, испытывающих тяжелые симптомы, включают трансплантаты костного мозга и поддерживающее лечение с поддержкой продуктами крови (например, переливаниями крови) и гемопоэтическими факторами роста (например, эритропоэтином). Часто используют другие средства для лечения MDS: 5-азацитидин, децитабин и леналидомид. В некоторых случаях также можно вводить хелаторы железа (десферал) и деферазирокс (Exjade).
+
+
В другом воплощении CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по настоящему изобретению используют для лечения раковых заболеваний или лейкозов лейкозными стволовыми клетками. Например, лейкозными стволовыми клетками являются CD34/CD38 лейкозные клетки.
Настоящее изобретение относится, среди прочего, к композициям и способам лечения рака. В одном аспекте рак представляет собой гематологический рак включающий, но не ограничивающийся перечисленным, лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная лимфома).
В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки (например, клетки CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки) по изобретению можно использовать для лечения других раковых заболеваний и злокачественностей, таких как, но без ограничения, напримет, острый лейкоз, включая, но не ограничиваясь перечисленным, В-клеточный острый лимфоидный лейкоз («BALL»), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз («ТALL»), острый лимфоидный лейкоз (ALL); один или больше хронических лейкозов, включая, но не ограничиваясь перечисленным, например, хронический миелогенный лейкоз (CLL); другие гематологические раковые заболевания или гематологические состояния, включая, но не ограничиваясь перечисленным, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, неоплазму бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфому Беркетта, диффузную крупно-В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волсковоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфому, лимфому из клеток мантии, лимфому маргинальной зоны, множественную лимфому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, неоплазму плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и «предлейкоз», которые представляют собой разнотипную коллекцию гематологических состояний, объединенных неэффективным продуцированием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т.п.. CAR-модифицированные иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) по настоящему изобретению можно вводить или одни или в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины, или клеточные популяции.
Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции CLL-1-экспрессирующих клеток, включающим контактирование популяции клеток, включающей CLL-1-экспрессирующую клетку, с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, клеткой CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции CLL-1-экспрессирующих клеток, включающим контактирование популяции CLL-1-экспрессирующих раковых клеток с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, клеткой CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации или уменьшения популяции раковых CLL-1-экспрессирующих клеток, включающим контактирование популяции CLL-1-экспрессирующих раковых клеток с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой (например, клеткой CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клеткой) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В некоторых аспектах CLL-1-CAR-экспрессирующая клетка (например, клетка CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующая NK-клетка) по изобретению уменьшает количество, число, количество или процент клеток и/или раковых клеток по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%, у субъекта с или животной модели миелоидного лейкоза или другого рака, ассоциированного с CLL-1-экспрессирующими клетками, относительно отрицательного контроля. В одном аспекте субъектом является человек.
Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения и/или оказания помощи при заболевании, ассоциированном с CLL-1-экспрессирующими клетками (например, гематологическом раке или атипичном раке с экспрессией CLL-1), включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте субъектом является человек. Неограничительные примеры расстройств, связанных с CLL-1-экспрессирующими клетками, включают аутоиммунные расстройства (такие как волчанка), воспалительные расстройства (такие как аллергии и астма) и раковые заболевания (такие как гематологические раковые заболевания или атипичные раковые заболевания с экспрессией CLL-1).
Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения и/или оказания помощи при заболевании, ассоциированном с CLL-1-экспрессирующими клетками, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте субъектом является человек.
Настоящее изобретение относится к способам предупреждения рецидива рака, ассоциированного с CLL-1-экспрессирующими клетками, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки) по изобретению, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой. В одном аспекте способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки (например, клетки CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующей NK-клетки), описанной в настоящем описании, которая связывается с CLL-1-экспрессирующей клеткой, в комбинации с эффективным количеством другого лечения лекарственными средствами.
Комбинированные терапии
CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в комбинации с другими известными средствами и терапиями. Вводимое «в комбинации» при использовании в настоящем описании означает, что субъекту доставляют два (или больше) различных лечения в ходе недуга субъекта от расстройства, например, два или больше лечения доставляют субъекту после того, как у субъекта диагностировано расстройство, и до того, как расстройство вылечили или устранили, или лечение прекратили по другим причинам. В некоторых воплощениях все еще происходит доставка одного лечения, когда начинается доставка второго лечения, так что имеет место перекрывание в смысле введения. Иногда в настоящем описании это называется «совместной» или «одновременной доставкой». В некоторых воплощениях любого случая лечение является более эффективным из-за комбинированного введения. Например, второе лечение является более эффективным, например, равнозначный эффект виден с менее значительным вторым лечением, или второе лечение ослабляет симптомы в большей степени, чем это можно видеть, если второе лечение дают в отсутствие первого лечения, или аналогичную ситуацию видят с первым лечением. В некоторых воплощениях доставка такова, что ослабление симптома или другого параметра, связанного с расстройствам, большее, чем можно было бы наблюдать с одним лечением, доставленным в отсутствие другого. Эффект двух лечений может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или большим, чем аддитивный. Доставка может быть такой, что эффект от первого доставленного лечения все еще обнаруживается, когда доставляют второе лечение.
CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство можно вводить совместно в одной или в отдельных композициях, или последовательно. В случае последовательного введения CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно вводить первой, и дополнительное средство можно вводить вторым, или порядок введения может быть обратным.
CAR-терапию и/или другие терапевтические средства, процедуры или способы воздействия можно назначать в периоды активного расстройства или в период ремиссии или менее активной болезни. CAR-терапию можно назначать до другого лечения, одновременно с лечением, после лечения или во время ремиссии расстройства.
При назначении в комбинации CAR-терапию и дополнительное средство (например, второе или третье средство) или все можно вводить в количестве или дозе, которая выше, ниже или такая же, как количество или дозировка каждого средства, используемого отдельно, например, как монотерапию. В некоторых воплощениях количество или дозировка CAR-терапии, дополнительного средства (например, второго или третьего средства) или всех ниже (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%), чем количество или дозировка каждого средства, используемого отдельно, например, как монотерапию. В других воплощениях количество или дозировка CAR-терапии, дополнительного средства (например, второго или третьего средства) или всех, которые приводят к желательному эффекту (например, лечению рака), ниже (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%), чем количество или дозировка каждого средства, используемого отдельно, например, как монотерапию, требуемое для достижения такого же терапевтического эффекта.
В других аспектах CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в схеме лечения в комбинации с операцией, химиотерапией, облучением, иммуносупрессивными средствами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антитела или другие иммунологические средства, такие как САМРАТН, анти-CD3-антитела или другие терапии антителами, цитоксин, флударабин, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228, цитокины, и излучением, пептидной вакциной, такой как описанная в Izumoto et al., 2008, J. Neurosurg., 108: 963-971.
В некоторых случаях соединения по настоящему изобретению комбинируют с другими терапевтическими средствами, такими как другие противораковые средства, противоаллергические средства, средства от тошноты (или противорвотные средства), средства от боли, цитопротекторы и их комбинации.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в комбинации с химиотерапевтическим средством. Примеры химиотерапевтических средств включают антрациклин (например, доксорубицин (например, липосомальный доксорубицин)), винкаалкалоид (например, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин), алкилирующее средство (например, циклофосфамид, декарбазин, мелфалан, ифосфамид, темозоллмид), антитело к иммунной клетке (например, алемтузамаб, гемтузумаб, ритуксимаб, офатумумаб, тозитумомаб, брентуксимаб), антиметаболит (включая, например, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозиндеаминазы (например, флударабин), ингибитор mTOR, агонист белка, родственного TNFR, индуцированного гликокортикоидом TNFR (GITR), ингибитор протеасом (например, аклациномицин А, глитотоксин или бортезомиб), иммуномодулятор, такой как талидомид или производное талидомида (например, леналидомид).
Основные химиотерапевтические средства, рассматриваемые для применения в комбинированных терапиях, включают анастрозол (аримидекс), бикалутамид (касодекс), блеомицина сульфат (блеоксан), бусульфан (милеран), инъекцию бисульфана (бусуфлекс), капецитабин (кселода), N4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (параплатин), кармустин (BiCNU), хлорамбуцил (лейкеран), цисплатин (платинол), кладрибин (лейстатин), циклофосфамид (цитоксан или неозар), цитарабин, цитозин-арабинозид (цитозар-U), цитарабина липосомами инъекцию (DepoCyr), дакарбазин (DTIC-Dome), дактиномицин (актиномицин D, космеган), даунорубицина гидрохлорид (церубицин), даунорубицина цитрата липосомами инъекцию (DaunoXome), дексаметазон, доцетаксел (таксотер), доксорубицина гидрохлорид (адриамицин, рубекс), этопозид (вепезид), флударабина фосфат (флудара), 5-фторурацил (адруцил, эфудекс), флутамид (эулексин), тезактибин, гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевину (гидреа), идарубицин (идамицин), ифосфамид (IPEX), иринотекан (камптосар), L-аспарагиназу (ELSPAR), лейковорин кальция, мелфалан (алкеран), 6-меркаптопурин (пуринэтол), метотрексат (фолекс), митоксантрон (новантрон), милотарг, паклитаксел (таксол), фоеникс (иттрий90/МХ-DTPA), пентостатин, полифепрозан с кармустином имплантат (глиадел), тамоксифена цитрат (нолвадекс), тенипозид (вумон), 6-тиогуанин, тиотепу, тирапазамин (тиразон), топотекана гидрохлорид для инъекции (гикамтин), винбластин (велбан), винкристин (онковин) и винорелбин (навелбин).
Лечение комбинацией химиотерапевтического средства и клетки, экспрессирующей молекулу CLL-1-CAR, описанную в настоящем описании, можно использовать для лечения гематологического рака, описанного в настоящем описании, например, AML. В воплощениях комбинация химиотерапевтического средства и клетки, экспрессирующей CLL-1-CAR, применима для таргетинга, например, киллинга, раковых стволовых клеток, например, лейкозных стволовых клеток, например, у субъектов с AML. В воплощениях комбинация химиотерапевтического средства и клетки, экспрессирующей CLL-1-CAR, применима для лечения минимального остаточного заболевания (MRD). MRD соотносится с небольшмм числом раковых клеток, которые остаются у субъекта во время лечения, например, химиотерапии, или после лечения. MRD часто является основной причиной рецидива. Настоящее изобретение относится к способу лечения рака, например, MRD, включающему введение химиотерапевтического средства в комбинации с CLL-1-CAR-экспрессирующей клеткой, например, описанной в настоящем описании.
В одном воплощении химиотерапевтическое средство вводят до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В схемах приема химиотерапевтического средства, где желательно более одного введения химиотерапевтического средства, схема приема химиотерапевтического средства начинается или завершается до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании. В воплощениях химиотерапевтическое средство вводят по меньшей мере за 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 20 дней, 25 дней или 30 дней до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR. В воплощениях схема приема химиотерапевтического средства начинается или завершается по меньшей мере за 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 20 дней, 25 дней или 30 дней до введения клетки, экспрессирующей молекулу CAR. В воплощениях химиотерапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, которое усиливает экспрессию CLL-1 на раковых клетках, например, опухолевых клетках, например, по сравнению с экспрессией CLL-1 на здоровых или нераковых клетках. Экспрессию CLL-1 можно определить, например, анализом методом иммуногистохимического окрашивания или проточной цитометрии. Например, химиотерапевтическое средство представляет собой цитарабин (Ara-C).
Противораковые средства, особенно интересные для комбинаций с соединениями по настоящему изобретению, включают антиметаболиты; лекарственные средства, которые ингибируют или кальций-зависимую фосфатазу кальцинеурин или киназу р7056 (FK506), или ингибирует киназу р7056; алкилирующие средства; ингибиторы mTOR; иммуномодуляторы; антрациклины; винкаалкалоиды; ингибиторы протеосом; агонисты GIFR; ингибиторы протеинтирозинфосфатазы; ингибитор киназы CDK4; ингибитор киназы ВТК; ингибитор киназы MKN; ингибитор киназы DGK или онколитический вирус.
Примеры антиметаболитов включают, без ограничения, антагонисты фолиевой кислоты (также называемые в настоящем описании антифолатами), аналоги пиримидина, аналоги пурина и ингибиторы аденозиндеаминазы; метотрексан (ревматрекс, трексал), 5-фторурацил (адруцил, эфудекс, флюороплекс), флоксуридин (FUDF), цитарабин (цитозар-U, тарабин PFS), 6-меркаптопурин (пуринетол)), 6-тиогуанидин (тиогуанин таблоид), флударабина фосфат (флудара), пентостатин (нипент), пеметрексед (алимта), ралтитрексед (томудекс), кладрибин (клофарекс, клолар), капецетабин (кселода), неларабин (арранон), азацитидин (видаза) и гемцитабин (гемзар). Предпочтительные антиметаболиты включают, например, 5-фторурацил (адруцил, эфудекс, флюороплекс), флоксуридин (FUDF), капецетабин (кселода), пеметрексед (алимта), ралтитрексед (томудекс) и гемцитабин (гемзар).
Примеры алкилирующих средств включают, без ограничения, азотные аналоги горчичного газа, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазины; урацилмустард (аминоурацилмустард, хлорэтаминацил, деметилдопан, десметилдопан, Haemanthamine, нордопан, Uracil nitrogene mustard, Uracillost, Uracilmostaza, урамустин), хлорметил (мустарген), циклофосфамид (цитоксан, неозар, клафен, эндоксан, процитокс, ревиммун™), ифосфамид (митоксана), мелфалан (алкеран), хлорамбуцил (лейкеран), пипоброман (амедел, верцит), триэтиленмеламин (Hemel, гексален, гексастат), триэтилентиофосфорамин, темозоломид (темодар), тиотепу (тиоплекс), бусульфан (бусилвекс, милеран), кармустин (BiCNU), ломустин (CeeNU), стрептозоцин (заносар) и дакарбазин (DTIC-Dome). Дополнительные примеры алкилирующих средств включают, без ограничения, оксалиплатин (элоксатин), темозоломид (темодар и темодал), дактиномицин (также известный как актиномицин-D, космеген), мелфалан (также известный как L-PAM, L-сарколизин и фенилаланин мустард, алкеран), алтретамин (также известный как гексаметилмеламин (НММ), гексален) кармустин (BiCNU), бендамустин (треанда), бусульфан (бусуфлекс и милеран), карбоплатин (параплатин), ломустин (также известный как CCNU, CeeNU), цисплатин (также известный как CDDP, платинол и платинол-AQ), хлорамбуцил (лейкеран), циклофосфамид (цитоксан и неозар), дакарбазин (также известный как DTIC, DIC и карбоксамид имидазола, DTIC-Dome), ифосфамид (ифекс), преднумустин, прокарбазин (матулан), мехлорэтамин (также известный как азотистый иприт, мкстин и мехлорэтамина гидрохлорид, мустарген), стрептозоцин (заносар), тиотепу (также известную как тиофосфамид, TESPA и TSPA, тиоплекс), циклофосфамид (эндоксан, цитоксан, неозар, процитокс, ревиммун) и бендамустин HCl (треанда).
IgV
IgV
H
H
2
2
2
2
2
2
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с флударабином, циклофосфамидом и/или ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с флударабином, циклофосфамидом и ритуксимабом (FCR). В воплощениях субъект имеет CLL. Например, субъект имеет делецию в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах субъект не имеет del(17p). В воплощениях у субъекта имеется лейкозная клетка, включающая мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (). В других воплощениях у субъекта не имеется лейкозной клетки, включающей мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (). В воплощениях флударабин вводят в дозировке примерно 10-15 мг/м (например, примерно 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 или 45-50 мг/м), например, внутривенно. В воплощениях циклофосфамид вводят в дозировке примерно 200-300 мг/м (например, примерно 200-225, 225-250, 250-275 или 275-300 мг/м), например, внутривенно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 400-600 мг/м (например, примерно 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/м), например, внутривенно.
IgV
IgV
H
H
2
2
2
2
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с бендамустином и ритуксимабом. В воплощениях субъект имеет CLL. Например, субъект имеет делецию в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах субъект не имеет del(17p). В воплощениях у субъекта имеется лейкозная клетка, включающая мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (). В других воплощениях у субъекта не имеется лейкозной клетки, включающей мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (). В воплощениях бендамустин вводят в дозировке примерно 70-110 мг/м (например, примерно 70-80, 80-90, 90-100 или 100-110 мг/м), например, внутривенно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 400-600 мг/м (например, примерно 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/м), например, внутривенно.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом, циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и/или кортикостероидом (например, преднизоном). В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом, циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизоном (R-CHOP). В воплощениях субъект имеет диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL). В воплощениях субъект имеет необъемную ограниченную стадию диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (например, включаеющую опухоль, имеющую размер/диаметр менее 7 см). В воплощениях субъекта лечат облучением в комбинации с R-CHOP. Например, субъекту вводят R-CHOP (например, 1-6 циклов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов R-CHOP) с последующим облучением. В некоторых случаях субъекту вводят R-CHOP (например, 1-6 циклов, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 циклов R-CHOP) после облучения.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с этопозидом, преднизоном, винкристином, циклофосфамидом, доксорубицином и/или ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с этопозидом, преднизоном, винкристином, циклофосфамидом, доксорубицином и ритуксимабом (EPOCH-R). В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с подобранной дозой EPOCH-R (DA-EPOCH-R). В воплощениях субъект имеет В-клеточную лимфому, например, агрессивную В-клеточную лимфому с реаранжированным Myc.
2
2
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом и/или леналидомидом. Леналидомид ((RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион) является иммуномодулятором. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом и леналидомидом. В воплощениях субъект имеет фолликулярную лимфому (FL) или лимфому из клеток мантии (MCL). В воплощениях субъект имеет FL и предварительно не лечился противораковой терапией. В воплощениях леналидомид вводят в дозировке примерно 10-20 мг (например, 10-15 или 15-20 мг), например, ежедневно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 350-550 мг/м (например, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м), например, внутривенно.
R
R
S
R
R
S
S
R
E
R
R
R
S
E
E
Z
S
S
R
транс
d
H
N
H
4,9
2
Примеры ингибитора mTOR включают, например, темсиролимус, ридафоролимус (формально известный как деферолимус (1,2,4)-4-[(2)-2-[(1,9,12,15,16,18,19,21,23,24,26,28,30,32,35)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30.3.1.0] гексатираконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексилдиметилфосфинат, также известный как AP23573 и MK8669, и описанный в публикации PCT № WO 03/064383); эверолимус (афинитор или RAD001); рапамицин (AY22989, сиролимус); симапимод (CAS 164301-51-3); эмсиролимус, (5-{2,4-бис[(3S)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил}-2-метоксифенил)метанол (AZD8055); 2-амино-8-[-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метилпиридо[2,3-]пиримидин-7(8)-он (PF04691502, CAS 1013101-36-4); и -[1,4-диоксо-4-[[4-(4-оксо-8-фенил-4-1-бензопиран-2-ил)морфолиний-4-ил]метокси]бутил]-L-аргинилглицин-L-α-аспартил-L-серин (SEQ ID NO: 313), внутреннюю соль (SF1126, CAS 936487-67-1) и XL765.
Примеры иммуномодуляторов включают, например, афутузумаб (доступный от Roche); пегфилграстим (Neulasta); леналидомид (CC-5013, ревимид); талидомид (таломид), актимид (CC4047) и IRX-2 (смесь цитокинов человека, включающая интерлейкин 1, интерлейкин 2 и интерферон γ, CAS 951209-71-5, доступный от IRX Therapeutics).
Примеры антрациклинов включают, например, доксорубицин (адриамицин и Rubex); блеомицин (леноксан); даунорубицин (даунорубицина гидрохлорид, дауномицин и рубидомицина гидрохлорид, церубидин); даунорубицин липосомальный (липосомальная форма даунорубицина цитрата, DaunoXome); митоксантрон (DHAD, новантрон); эпирубицин (елленце™; идарубицин (идамицин, идамицин PFS); митомицин C (мутамицин); гелданамицин; гербимицин; равидомицин и дезацетилраыидомицин.
Примеры винкаалкалоидов включают, например, винорелбина тартрат (навелбин), винкристин (онковин) и виндезин (элдизин)), винбластин (также известный как винбластина сульфат, винкалейкобластин и VLB, алкабан-AQ и велбан) и винорелбин (навелбин).
S
N
S
S
R
S
O
N
O
N
S
R
Примеры ингибиторов протеосом включают бортезомиб (велкад), карфизомиб (PX-171-007, ()-4-метил--(()-1-((()-4-метил-1-(()-2-метилоксиран-2-ил)-1-оксопентан-2-ил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)-2-(()-2-(2-морфолиноацетамидо)-4-фенилбутанамидо)пентанамид); маризомиб (NPI-0052); иксазомиба цитрат (MLN-9708); деланзомиб (CEP-18770) и -метил--[(2-метил-5-тиазолил)карбонил]-L-серил--метил--[(1)-2-[(2)-2-метил-2-оксиранил]-2-оксо-1-(фенилметил)этил]-L-серинамид (ONX-0912).
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с брентуксимабом. Брентуксимаб представляет собой антителосодержащее лекарственное средство - конъюгат анти-CD30 антитела и монометилауристатина Е. В воплощениях субъект имеет ходжкинсую лимфому (HL), например, рецидивную или рефрактерную HL. В воплощениях у субъекта имеется CD30+ HL. В воплощениях субъект претерпел трансплантацию аутологичных стволовых клеток (ASCT). В воплощениях субъект не подвергался ASCT. В воплощениях брентуксимаб вводят в дозировке примерно 1-3 мг/кг (например, примерно 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 или 2,5-3 мг/кг), например, внутривенно, например, каждые 3 недели.
2
2
2
2
2
2
2
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с брентуксимабом и дакарбазином или в комбинации с брентуксимабом и бендамустином. Дакарбазин представляет собой алкилирующее средство с химическим названием 5-(3,3-диметил-1-триазенил)имидазол-4-карбоксамид. Бендамустин представляет собой алкилирующее средство с химическим названием 4-[5-[бис(2-хлорэтил)амино]-1-метилбензимидазол-2-ил]бутановая кислота. В воплощениях субъект имеет ходжкинсую лимфому (HL). В воплощениях субъекта ранее не лечили противораковой терапией. В воплощениях субъект в возрасте по меньшей мере 60 лет, например, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или старше. В воплощениях дакарбазин вводят в дозировке примерно 300-450 мг/м (например, примерно 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425 или 425-450 мг/м), например, внутривенно. В воплощениях бендамустин вводят в дозировке примерно 75-125 мг/м (например, примерно 75-100 или 100-125 мг/м, например, примерно 90 мг/м), например, внутривенно. В воплощениях брентуксимаб вводят в дозировке примерно 1-3 мг/м (например, примерно 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 или 2,5-3 мг/м), например, внутривенно, например, каждые 3 недели.
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором CD20, например, анти-CD20 антителом (например, анти-CD20 моно- или биспецифическим антителом) или его фрагментом. Примеры анти-CD20 антител включают, но не ограничиваются перечисленным, ритуксимаб, офатумумаб, окрелизумаб, велтузумаб, обинутузумаб, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), окаратузумаб и Pro131921 (Genentech). См., например, Lim et al., Haematologica, 95.1(2010): 135-43).
В некоторых воплощениях анти-CD20 антитело включает ритуксимаб. Ритуксимаб представляет собой химерное мышиное/человеческое антитело IgG1-каппа, которое связывается с CD20 и вызывает цитолиз CD20-экспрессирующей клетки, например, как описано в www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ритуксимабом. В воплощениях субъект имеет CLL или SLL.
2-
2
2-
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят внутривенно, например, внутривенной инфузией. Например, каждая инфузия предоставляет 500-2000 мг (например, примерно 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900 или 1900-2000 мг) ритуксимаба. В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят в дозе 150 мг/м750 мг/м, например, примерно 150 мг/м750 мг/м, e.g., about 150-175 мг/м, 175-200 мг/м, 200-225 мг/м, 225-250 мг/м, 250-300 мг/м, 300-325 мг/м, 325-350 мг/м, 350-375 мг/м, 375-400 мг/м, 400-425 мг/м, 425-450 мг/м, 450-475 мг/м, 475-500 мг/м, 500-525 мг/м, 525-550 мг/м, 550-575 мг/м, 575-600 мг/м, 600-625 мг/м, 625-650 мг/м, 650-675 мг/м или 675-700 мг/м, где м показывает площадь поверхности тела субъекта. В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят с интервалами между дозами в по меньшей мере 4 дня, например, 4, 7, 14, 21, 28, 35 дней, или большими. Например, ритуксимаб вводят с интервалом между дозами в по меньшей мере 0,5 недели, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 недель, или большим. В некоторых воплощениях ритуксимаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в течение периода времени, например, по меньшей мере 2 недели, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 недель или дольше. Например, ритуксимаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в целом по меньшей мере 4 дозы на цикл лечения (например, по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или больше доз на цикл лечения).
В некоторых воплощениях анти-CD20 антитело включает офатумумаб. Офатумумаб представляет собой анти-CD20 IgG1-κ человеческое моноклональное антитело с молекулярной массой приблизительно 149 кД. Например, офатумумаб получают с использованием технологии с трансгенными мышами и гибридомной технологии, и экспрессируют и очищают из рекомбинантной муриновой клеточной линии (NSO). См., например, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf, и идентификатор клинического испытания номер NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352 и NCT01397591. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с офатумумабом. В воплощениях субъект имеет CLL или SLL.
В некоторых воплощениях офатумумаб вводят внутривенной инфузией. Например, каждая инфузия предоставляет примерно 150-3000 мг (например, примерно 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800 или 2800-3000 мг) офатумумаба. В воплощениях офатумумаб вводят в начальной дозировке примерно 300 мг, затем 2000 мг, например, примерно 11 доз, например, в течение 24 недель. В некоторых воплощениях офатумумаб вводят с интервалом между дозами в по меньшей мере 4 дня, например, 4, 7, 14, 21, 28, 35 дней или больше. Например, офатумумаб вводят с интервалом между дозами в по меньшей мере 1 неделю, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 недель или больше. В некоторых воплощениях офатумумаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в течение периода времени, например, по меньшей мере 1 неделю, например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 недель или дольше, или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 меяцев или дольше, или 1, 2, 3, 4, 5 лет или дольше. Например, офатумумаб вводят в дозе и интервалом между дозами, описанными в настоящем описании, в целом по меньшей мере 2 дозы на цикл лечения (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 или больше доз на цикл лечения).
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает окрелизумаб. Окрелизумаб представляет собой гуманизированное анти-CD20 моноклональное антитело, например, описанное в идентификаторе клинического испытания №№ NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, и в Kappos et al., Lancet, 19.378(2011): 1779-87.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает велтузумаб. Велтузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против CD20. См., например, идентификатор клинического испытания №№ NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, и Goldenberg et al., Leuk. Lymphoma, 51(5)(2010): 747-55.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает GA101. GA101 (также называемый обинутузумабом или RO5072759) представляет собой гуманизированное гликоинженерное анти-CD20 моноклональное антитело. См., например, Robak, Curr. Opin. Investig. Drugs, 10.6(2009): 588-96; идентификатор клинического испытания №№ NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422 и NCT01414205; и www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает АМЕ-133v. АМЕ-133v (также называемый LY2469298 или окаратузумабом) представляет собой гуманизированное IgG1 моноклональное антитело против CD20 с повышенной аффинностью в отношении рецептора FcγRIIIa, и усиленной антителозависмой клеточной цитотоксической (ADCC) активностью по сравнению с ритуксимабом. См., например, Robak et al., BioDrugs, 25.1(2011): 13-25; и Forero-Torres et al., Clin Cancer Res., 18.5(2012): 1395-403.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает PRO131921. PRO131921 представляет собой гуманизированное анти-CD20 моноклональное антитело, сконструированное как имеющее более хорошее связывание с FcγRIIIa и усиленной ADCC по сравнению с ритуксимабом. См., например, Robak et al., BioDrugs, 25.1(2011): 13-25; и Casulo et al., Clin. Immunol., 154.1(2014): 37-46; и идентификатор клинического испытания № NCT00452127.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело включает TRU-015. TRU-015 представляет собой анти-CD20 слитый белок, полученный из доменов антитела против CD20. TRU-015 меньше, чем монокллональные антитела, но сохраняет Fc-опосредуемые эффекторные функции. См., например, Robak et al., BioDrugs, 25.1(2011): 13-25. TRU-015 содержит анти-CD20 одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), соединенный с шарниром человеческого IgG1, доменами CH2 и CH3, но утрачивает домены CH1 и CL.
В некоторых случаях анти-CD20 антитело, описанное в настоящем описании, конъюгировано или иначе связано с терапевтическим средством, например, химиотерапевтическим средством (например, цитоксаном, флударабином, ингибитором гистондеацтилазы, деметилирующим средством, пептидной вакциной, противоопухолевым антибиотиком, ингибитором тирозинкиназы, алкилирующим агентом, антимикротубулярным средством или антимитотическим средством), противоаллергическим средством, средством от тошноты (или противорвотным средством), средстовм от боли или цитопротектором, описанными в настоящем описании.
N
b
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором В-клеточной лимфомы 2 (BCL-2) (например, венетоклаксом, также называемым АВТ-199 или GDC-0199) и/или ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с венетоклаксом и ритуксимабом. Венетоклакс является небоьшой молекулой, которая ингибирует антиапоптозный белок BCL-2. Структура венетоклакса (4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)--({3-нитро-4-[(тетрагидро-2H-пиран-4-илметил)амино]фенил}сульфонил)-2-(1H-пирроло[2,3-]пиридин-5-илокси)бензамида) показана ниже.
2
2
В воплощениях субъект имеет CLL. В воплощениях субъект имеет рецидивный CLL, например, субъект ранее получал противораковую терапию. В воплощениях венетоклакс вводят в дозировке примерно 15-600 мг (например, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500 или 500-600 мг), например, ежедневно. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 350-550 мг/м (например, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м), например, внтуривенно, например, ежемесячно.
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с онколитическим вирусом. В воплощениях онколитические вирусы способны селективно реплицироваться в и запускать гибель или ослабление роста раковой клетки. В некоторых случаях онколитические вирусы не оказывают действия или минмально действуют на нераковые клетки. Онколитический вирус включает, но не ограничивается перечисленным, онколитический аденовирус, онколитический вирус простого герпеса, онколитический ретровирус, онколитический парвовирус, онколитический вирус коровьей оспы, онколитический вирус Синбис, онколитический вирус гриппа или онколитический РНК-вирус (например, онколитический реовирус, онколитический вирус ньюкаслской болезни (NDV), онколитический вирус кори или онколитический вирус везикулярного стоматита (VSV)).
В некоторых воплощениях онколитический вирус представляет собой вирус, например, рекомбинантный онколитический вирус, описанный в US 2010/0178684 А1, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых воплощениях рекомбинантный онколитический вирус включает нуклеотидную последовательность (например, гетерологичную нуклеотидную последовательность), кодирующую ингибитор иммунной или воспалительной реакции, например, как описано в US 2010/0178684 А1, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В воплощенях рекомбинантный онколитический вирус, например, онколитический NDV, включает проапоптозный белок (например, апоптин), цитокин (например, GM-CSF, интерферон-гамма, интерлейкин 2 (IL-2), фактор некроза опухоли альфа), иммуноглобулин (например, антитело против ED-B фибронектина), опухольассоциированный антиген, биспецифический адаптерный белок (например, биспецифическое антитело или фрагмент антитела, направленные против белка NDV HN, и Т-клеточный костимулирующий рецептор, такой как CD3 или CD28; или слитый белок человеческого IL-2 и одноцепочечного антитела, направленного против белка NDV HN). См., например, работу Zamarin et al., Future Microbiol., 7.3(2012): 347-67, полностью включенную в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых воплощениях онколитический вирус представляет собой химерный онколитический NDV, описанный в US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1 или US 2014/0271677 A1, которые все полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.
В некоторых воплощениях онколитический вирус включает условно реплицирующийся аденовирус (CRAd), который создан для репликации исключительно в раковых клетках. См., например, Alemany et al., Nature Biotechnol., 18 (2000): 732-27. В некоторых воплощениях онколитический аденовирус включает вирус, описанный в таблице 1 на с.725 в работе Alemany et al., полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Примеры онколитических вирусов включают, но не ограничиваются перечисленным, следующее:
онколитический аденовирус группы В (ColoAd1) (PsiOxus Therapeutics Ltd.) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT02053220);
ONCOS-102 (называвшийся прежде CGTG-102), который представляет собой аденовирус, включающий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (Oncos Therapeutics) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01598129);
VCN-01, который представляет собой генетически модифицированный онколитический аденовирус человека, кодирующий гиалуронидазу PH20 человека (VCN Biosciences, S.L.) (см., например, идентификаторы клинического испытания NCT02045602 и NCT02045589);
условно реплицирующийся аденовирус ICOVIR-5, который представляет собой вирус, полученный из серотипа 5 аденовируса человека (Had5), который модифицирован для селективной репликации в раковых клетках с разрегулированным путем ретинобластома/E2F (Institut Català d'Oncologia) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01864759);
Celyvir, который включает полученные из костного мозга аутологичные мезинхимальные стволовые клетки (MSC), инфицированные ICOVIR5, онколитический аденовирус (Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, Madrid, Spain/Ramon Alemany) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01844661);
CG0070, который представляет собой условно реплицирующийся онколитический аденовирус серотипа 5 (Ad5), в котором человеческий промотор E2F-1 управляет экспрессией незаменимых вирусных генов E1a, посредством чего ограничивается репликация вируса и цитотоксичность для опухолевых клеток с дефицитом пути Rb (Cold Genesys, Inc.) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT02143804); или
DNX-2401 (официальное название Delta-24-RGD), который представляет собой аденовирус, сконструированный для селективной репликации в ретинобластомных клетках с дефицитом пути (Rb) и для инифицирования клеток, которые экспрессируют некоторые RGD-связывающие интегрины более эффективно (Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/ DNAtrix, Inc.) (см., например, идентификатор клинического испытания NCT01956734).
В некоторых воплощениях онколитический вирус, описанный в настоящем описании, вводят инъекцией, например, подкожной, интраартериальной, внутривенной, внутримышечной, интратекальной или интраперитонеальной инъекцией. В воплощениях онколитический вирус, описанный в настоящем описании, вводят интратуморально, интрадермально, трансмукозально, перорально, интраназально или путем легочного введения.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие CAR, описанный в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с молекулой, которая уменьшает клеточную популяцию Treg. Способы уменьшения числа (например, истощения) клеток Treg известны в технике и включают, например, деплецию CD25, введение циклофосфамида, модуляцию функции GITR. Без желания привязываться к какой-либо теории, полагают, что уменьшение числа клеток Treg у субъекта перед аферезом или перед введением CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, снижает число нежелательных иммунных клеток (например, Treg) в окружающей микросреде опухоли и снижает опасность рецидива у субъекта.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетки, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с молекулой, таргетирующей GITR и/или модулирующей функции GITR, такой как агонист GITR и/или антитело к GITR, которые истощают регуляторные Т-клетки (Treg). В воплощениях клетки, экспрессирующие CAR, описанный в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с циклофосфамидом. В одном воплощении GITR-связывающие молекулы и/или молекулы, модулирующие функции GITR (например, агонист GITR и/или антитела к GITR, истощающие Treg) вводят перед введением CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агонист GITR можно ввести до афереза клеток. В воплощениях циклофосфамид вводят субъекту перед введением (например, инфузии или реинфузии) CAR-экспрессирующей клетки или перед аферезом клеток. В воплощениях циклофосфамид и анти-GITR антитело вводят субъекту перед введением (например, инфузии или реинфузии) CAR-экспрессирующей клетки или перед аферезом клеток. В одном воплощении субъект имеет рак (например, солидный рак или гемптологический рак, такой как ALL или CLL). В одном воплощении субъект имеет CLL. В воплощениях субъект имеет ALL. В воплощениях субъект имеет солидный рак, например, солидный рак, описанный в настоящем описании. Примеры агонистов GITR включают, например, слитые белки GITR и анти-GITR антител (например, двухвалентных анти-GITR антител), такие как, например, слитый белок GITR, описанный в патенте США № 6111090, европейском патенте № 090505B1, патенте США № 8586023, публикациях PCT №№ WO 2010/003118 и 2011/090754, или anti-GITR антитело, описанное, например, в патенте США № 7025962, европейском патенте № 1947183B1, патенте США № 7812135, патенте США № 8388967, патенте США № 8591886, европейском патенте № EP 1866339, публикации PCT № WO 2011/028683, публикации PCT № WO 2013/039954, публикации PCT WO2005/007190, публикации PCT № WO 2007/133822, публикации PCT № WO2005/055808, публикации PCT № WO 99/40196, публикации PCT № WO 2001/03720, публикации PCT № WO99/20758, публикации PCT № WO2006/083289, публикации PCT № WO 2005/115451, патенте США № 7618632 и публикации PCT № WO 2011/051726.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором mTOR, например, ингибитором mTOR, описанным в настоящем описании, например, рапалогом, таким как эверолимус. В одном воплощении ингибитор mTOR вводят перед введением CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении ингибитор mTOR можно ввести перед аферезом клеток.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с агонистом GITR, например, агонистом GITR, описанным в настоящем описании. В одном воплощении агонист GITR вводят перед введением CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении агонист GITR вводят перед аферезом клеток.
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором протеинтирозинфосфатазы, например, ингибитором протеинтирозинфосфатазы, описанным в настоящем описании. В одном воплощении ингибитор протеинтирозинфосфатазы представляет собой ингибитор SHP-1, например, ингибитор SHP-1, описанный в настоящем описании, такой как, например, стибоглюконат натрия. В одном воплощении ингибитор протеинтирозинфосфатазы представляет собой ингибитор SHP-2, например, ингибитор SHP-2, описанный в настоящем описании.
H
d
d
R
S
H
H
N
H
трет
H
d
-
H
N
В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, можно использовать в комбинации с ингибитором киназы. В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор CDK4, например, ингибитор CDK4, описанный в настоящем описании, такой как, например, ингибитор CDK4/6, такой как, например, гидрохлорид 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8-пиридо[2,3-]пиримидин-7-она (также называемый палбоциклибом или PD0332991). В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор ВТК, например, ингибитор ВТК, описанный в настоящем описании, такой как, например, ибрутиниб. В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор mTOR, например, ингибитор mTOR, описанный в настоящем описании, такой как, например, рапамицин, аналог рапамицина, OSI-027. Ингибитор mTOR может представлять собой, например, ингибитор TORC1 и/или ингибитор TORC2, например, ингибитор TORC1 и/или ингибитор TORC2, описанный в настоящем описании. В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор MNK, например, ингибитор MNK, описанный в настоящем описании, такой как, например, 4-амино-5-(4-фторанилино)-пиразоло[3,4-]пиримидин. Ингибитор MNK может представлять собой, например, ингибитор MNK1a, MNK1b, MNK2a и/или MNK2b. В одном воплощении ингибитором киназы является двойной ингибитор PI3K/mTOR, описанный в настоящем описании, такой как, например, PF-04695102. В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор DGK, например, ингибитор DGK, описанный в настоящем описании, такой как, например, DGKinh1 (D5919) или DGKinh2 (D5794). В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор CDK4, выбранный из алоизина A; флавопиридола или HMR-1275, 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(3S,4R)-3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил]-4-хроменона; кризотиниба (PF-02341066; гидрохлорида 2-(2-хлорфени)-5,7-дигидрокси-8-[(2,3)-2-(гидроксиметил)-1-метил-3-пирролидинил]-4-1-бензопиран-4-она (P276-00); 1-метил-5-[[2-[5-(трифторметил)-1-имидазол-2-ил]-4-пиридинил]окси]--[4-(трифторметил)фенил]-1-бензимидазол-2-амина (RAF265); индисулама (E7070); росковитина (CYC202); палюоциклиба (PD0332991); динациклиба (SCH727965); N-[5-[[(5--бутилоксазол-2-ил)метил]тио]тиазол-2-ил]пиперидин-4-карбоксамида (BMS 387032); 4-[[9-хлор-7-(2,6-дифторфенил)-5-пиримидо[5,4-][2]бензазипин-2-ил]амино]бензойной кислоты (MLN8054); 5-[3-(4,6-дифтор-1H-бензимидазол-2-ил)-1H-индазол-5-ил]-N-этил-4-метил-3-пиридинметанамина (AG-024322); N-(пиперидин-4-ил)амида 4-(2,6-дихлорбензоиламино)-1H-пиразол-3-карбоновой кислоты (AT7519); 4-[2-метил1-(1-метилэтил)-1-имидазол-5-ил]--[4-(метилсульфонил)фенил]-2-пиримидинамина (AZD5438) и XL281 (BMS908662).
,
В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор CDK4, например, палбоциклиб (PD0333991), и палбоциклиб вводят в дозе примерно 50 мг, 60 мг, 70 мг, 75 мг, 80 мг, 90 мг, 100 мг, 105 мг, 110 мг, 115 мг, 120 мг, 125 мг, 130 мг, 135 мг (например, 75 мг, 100 мг или 125 мг) ежедневно в течение периода времени, например, ежедневно в течение 14-21 дня 28-дневного цикла или ежедневно в течение 7-12 дней 21-дневного цикла. В одном воплощении вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12 или больше циклов палбоциклиба.
В воплщениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с инигибитором циклинзависимой киназы (CDK) 4 или 6, например, инигибитором CDK4 или инигибитором CDK6, описанным в настоящем описании. В воплщениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с инигибитором CDK4/6 (например, инигибитором, который таргетирует как CDK4, так и CDK6), например, инигибитором CDK4/6, описанным в настоящем описании. В одном воплощении субъект имеет MCL. MCL представляет собой агрессивный рак, который плохо реагирует на терапии, доступные в настоящее время, т.е., по существу неизлечимый. Во многих случаях MCL экспрессируется циклин D1 (регулятор CDK4/6) (например, из-за хромосомальной транслокации, включающей гены иммуноглобулина и циклина D1) в клетках MCL. Таким образом, без связи с теорией, полагают, что клетки MCL весьма чувствительны к ингибированию CDK4/6 с высокой специфичностью (т.е., минимальным воздействием на здоровые иммунные клетки). Ингибиторы CDK4/6 одни имеют некотрую эффективность при лечении MCL, но достигается только частичная ремиссия с высокой степенью рецидива. Примером инигибитора CDK4/6 является LEE011 (также называемый рибоциклибом), структура которого показана ниже.
Без связи с теорией, полагают, что введением CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, с ингибитором CDK4/6 (например, LEE011 или другим ингибитором CDK4/6, описанным в настоящем описании) можно достигнуть более высокой восприимчивости, например, более высоких степеней ремиссии и/или меньших степеней рецидива, например, по сравнению с одним ингибитором CDK4/6.
2
В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор ВТК, выбранный из ибрутиниба (PCI-3765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774 и LFM-A13. В предпочтительном воплощении ингибитор BTK не снижает или не ингибирует киназную активность киназы, индуцируемой интерлейкином-2 (ITK), и выбран из GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774 и LFM-A13.
В одном воплощении ингибитором киназы является ингибитор ВТК, например, ибрутиниб (PCI-32765). В одном воплощении CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором ВТК (например, ибрутинибом). В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ибрутинибом (также называемым PCI-32765). Структура ибрутиниба ((1-[(3R)-3-[4-амино-3-(4-феноксифенил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-1-ил]пиперидин-1-ил]проп-2-ен-1-она) показана ниже.
0
4
th
В воплощениях субъект имеет CLL, лимфому из клеток мантии (MCL) или лимфому из малых лимфоцитов (SLL). Например, субъект имеет делецию в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах субъект не имеет del(17p). В воплощениях субъект имеет рецидивную CLL или SLL, например, субъекту ранее назначали противораковую терапию (например, ранее назначали одну, две, три или четыре терапии). В воплощениях субъект имеет рефрактерную CLL или SL. В других воплощениях субъект имеет фолликулярную лимфому, например, рецидивную или рефрактерную фолликулярную лимфому. В некоторых воплощениях вводят ибрутиниб в дозировке примерно 300-600 мг/день (например, примерно 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550 или 550-600 мг/день, например, примерно 420 мг/день или примерно 5 мг/день), например, перорально. В воплощениях ибрутиниб вводят в дозе примерно 250 мг, 300 мг, 350 мг, 40 мг, 420 мг, 40 мг, 460 мг, 480 мг, 500 мг, 520 мг, 540 мг, 560 мг, 580 мг, 600 мг (e.g., 250 мг, 420 мг или 560 мг) ежедневно в течение некоторого периода времени, например, ежедневно в течение 21-дневного цикла или ежедневно в течение 28-дневного цикла. В одном воплощении вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше циклов ибрутиниба. В некоторых воплощениях ибрутиниб вводят в комбинации с ритуксимабом. См., например, Burger et al. (2013), Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated и Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675 presented at 55 ASH Annual Meeting и Exposition, New Orleans, LA 7-10 Dec. Без связи с теорией, полагают, что добавление ибрутиниба усиливает Т-клеточную пролиферативную реакцию и может сдвинуть фенотип Т-клеток от Т-хелперных 2 (Th2) к Т-хелперным 1 (Th1). Th1 и Th2 являются фенотипами Т-клеток, причем Th1 и Th2 управляют различными путями иммунной реакции. Фенотип Th1 ассоциируется с провоспалительными реакциями, например, для киллинга клеток, таких как внутриклеточные патогенны/вирусы или раковые клетки, или закрепляет аутоиммунные реакции. Фенотип Th2 ассоциируется с накоплением эозинофилов и противовоспалительными реакциями.
В некоторых воплощениях способов, применений и композиций в настоящем описании ингибитор ВТК представляет собой ингибитор ВТК, описанный в международной заявке WO/2015/079417, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Например, в некоторых воплощениях ингибитор ВТК представляет собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль
(I),
где в указанной формуле
R1 представляет собой водород, (C1-C6)алкил, необязательно замещенный гидрокси;
R2 представляет собой водород или галоген;
R3 представляет собой водород или галоген;
R4 представляет собой водород;
R5 представляет собой водород или галоген;
или R4 и R5 соединяются друг с другом и обозначают связь, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH=CH-, -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH- или -CH2-CH2-CH2-;
R6 и R7 независимо один от другого обозначают H, (C1-C6)алкил, необязательно замещенный гидроксилом, (C3-C6)циклоалкил, необязательно замещенный галогеном или гидрокси, или галоген;
R8, R9, R, R', R10 и R11 независимо один от другого обозначают H или (C1-C6)алкил, необязательно замещенный (C1-C6)алкокси; или любые два из R8, R9, R, R', R10 и R11 вместе с атомом углерода, с которым они связаны, могут образовывать 3-6-членный насыщенный карбоцикл;
R12 представляет собой водород или (C1-C6)алкил, необязательно замещенный галогеном или (C1-C6)алкокси;
или R12 и любой один из R8, R9, R, R', R10 или R11 вместе с атомами, с которыми они связаны, могут образовывать 4-, 5-, 6- или 7-членный азацикл, который необязательно может быть замещен галогеном, циано, гидроксилом, (C1-C6)алкилом или (C1-C6)алкокси;
n равен 0 или 1; и
R13 представляет собой (C2-C6)алкенил, необязательно замещенный (C1-C6)алкилом, (C1-C6)алкокси или N,N-ди(C1-C6)алкиламино; (C2-C6)алкинил, необязательно замещенный (C1-C6)алкилом или (C1-C6)алкокси; или (C2-C6)алкиленилоксид, необязательно замещенный (C1-C6)алкилом.
В некоторых воплощениях ингибитор BTК формулы I выбран из группы, включающей N-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-3-ил)окси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (E)-N-(3-(6-амино-5-((1-(бут-2-еноил)азетидин-3-ил)окси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-((1-пропиолоилазетидин-3-ил)окси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-((1-(бут-2-иноил)азетидин-3-ил)окси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(5-((1-акрилоилпиперидин-4-ил)окси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилакриламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (E)-N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилбут-2-енамидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилпропиоламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (E)-N-(3-(6-амино-5-(2-(4-метокси-N-метилбут-2-енамидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилбут-2-инамидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(2-((4-амино-6-(3-(4-циклопропил-2-фторбензамидо)-5-фтор-2-метилфенил)пиримидин-5-ил)окси)этил)-N-метилоксиран-2-карбоксамид; N-(2-((4-амино-6-(3-(6-циклопропил-8-фтор-1-оксоизохинолин-2(1H)-ил)фенил)пиримидин-5-ил)окси)этил)-N-метилакриламид; N-(3-(5-(2-акриламидоэтокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-этилакриламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(2-(N-(2-фторэтил)акриламидо)этокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(5-((1-акриламидоциклопропил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(5-(2-акриламидопропокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(6-амино-5-(2-(бут-2-инамидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилакриламидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(6-амино-5-(2-(N-метилбут-2-инамидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(3-(N-метилакриламидо)пропокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(5-((1-акрилоилпирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(6-амино-5-((1-(бут-2-иноил)пирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-2-(3-(5-((1-акрилоилпирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)-6-циклопропил-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-он; N-(2-((4-амино-6-(3-(6-циклопропил-1-oxo-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)пиримидин-5-ил)окси)этил)-N-метилакриламид; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(((2S,4R)-1-(бут-2-иноил)-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; 2-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)-6-циклопропил-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-он; N-(3-(5-(((2S,4S)-1-акрилоил-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(((2S,4S)-1-(бут-2-иноил)-4-метоксипирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-фторпирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(6-амино-5-(((2S,4R)-1-(бут-2-иноил)-4-фторпирролидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-N-(3-(6-амино-5-((1-пропиолоилазетидин-2-ил)метокси)пиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (S)-2-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)-6-циклопропил-3,4-дигидроизохинолин-1(2H)-он; (R)-N-(3-(5-((1-акрилоилазетидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; (R)-N-(3-(5-((1-акрилоилпиперидин-3-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(5-(((2R,3S)-1-акрилоил-3-метоксипирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-акрилоил-4-цианопирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид и N-(3-(5-(((2S,4S)-1-акрилоил-4-цианопирролидин-2-ил)метокси)-6-аминопиримидин-4-ил)-5-фтор-2-метилфенил)-4-циклопропил-2-фторбензамид.
Если не указано иное, химические термины, использованые выше при описании ингибитора BTK формулы I, использованы согласно их значениям, указанным в международной заявке WO/2015/079417, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
R
R
S
R
R
S
S
R
E
R
R
R
S
E
E
Z
S
S
R
транс
d
H
N
H
4,9
2
В одном воплощении ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, выбранный из темсиролимуса, ридафоролимуса, (1,2,4)-4-[(2)-2-[(1,9,12,15,16,18,19,21, 23,24,26,28,30,32,35)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаaметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30.3.1.0]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексилдиметилфосфината, также известного как AP23573 и MK8669; эверолимуса (RAD001); рапамицина (AY22989); симапимода; (5-{2,4-бис[(3S)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил}-2-метоксифенил)метанола (AZD8055); 2-амино-8-[-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метилпиридо[2,3-]пиримидин-7(8)-она (PF04691502) и -[1,4-диоксо-4-[[4-(4-oксo-8-фенил-4-1-бензопиран-2-ил)морфолиний-4-ил]метокси]бутил]-L-аргинилглицил-L-α-аспартил-L-серина (SEQ ID NO: 313), внутренней соли (SF1126) и XL765.
В одном воплощении ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, например, рапамицин, и рапамицин вводят в дозе примерно 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг (например, 6 мг) ежедневно в течение некоторого периода времени, например, ежедневно в течение 21-дневного цикла или ежедневно в течение 28-дневного цикла. В одном воплощении вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше циклов рапамицина. В одном воплощении ингибитор киназы представляет собой ингибитор mTOR, например, эверолимус, и эверолимус вводят в дозе примерно 2 мг, 2.5 мг, 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг, 11 мг, 12 мг, 13 мг, 14 мг, 15 мг (например, 10 мг) ежедневно в течение некоторого периода времени, например, ежедневно в течение 28-дневного цикла. В одном воплощении вводят 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше циклов эверолимуса.
d
d
В одном воплощении ингибитор киназы представляет собой ингибитор MNK, выбранный из CGP052088; 4-амино-3-(п-фторфениламино)пиразоло[3,4-]пиримидина (CGP57380); церкоспорамида; ETC-1780445-2 и 4-амино-5-(4-фторанилино)пиразоло[3,4-]пиримидина.
S
H
H
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором фосфоинозитид-3-киназы (Р13К) (например, ингибитором Р13К, описанным в настоящем описании, например, иделалисибом или дувелисибом) и/или ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с иделалисибом и ритуксимабом. В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с дувелисибом и ритуксимабом. Иделалисиб (также называемый GS-1101 или CAL-101; Gilead) представляет собой малую молекулу, которая блокирует дельта-изоформу Р13К. Структура иделалисиба (5-фтор-3-фенил-2-[(1)-1-(7-пурин-6-иламино)пропил]-4(3)-хиназолинона) показана ниже.
Дувелисиб (также называемый IPI-145; Infinity Pharmaceuticals and Abbvie) представляет собой малую молекулу, которая блокирует PI3K-δ,γ. Структура дувелисиба (8-хлор-2-фенил-3-[(1S)-1-(9H-пурин-6-иламино)этил]-1(2H)изохинолинона) показана ниже.
IgV
IgV
H
H
2
2
В воплощениях субъект имеет CLL. В воплощениях субъект имеет рецидивный CLL, например, субъекту ранее назначали противораковую терапию (например, ранее вводили анти-CD20 антитела или ранее вводили ибрутиниб). Например, субъект имеет делецию в коротком плече хромосомы 17 (del(17p), например, в лейкозной клетке). В других примерах субъект не имеет del(17p). В воплощениях у субъекта имеется лейкозная клетка, включающая мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (). В других воплощениях у субъекта не имеется лейкозной клетки, включающей мутацию в гене вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина (). В воплощениях субъект имеет делецию в длинном плече хромосомы 11 (del(11q)). В других воплощениях субъект не имеет del(11q). В воплощениях иделалисиб вводят в дозировке примерно 100-400 мг (например, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375 или 375-400 мг), например, BID. В воплощениях дувелисиб вводят в дозировке примерно 15-100 мг (например, примерно 15-25, 25-50, 50-75 или 75-100 мг), например, дважды в день. В воплощениях ритуксимаб вводят в дозировке примерно 350-550 мг/м (например, примерно 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 или 475-500 мг/м), например, внутривенно.
H
В одном воплощении ингибитор киназы представляет собой двойной ингибитор фосфатидилинозит-3-киназы (Р13К) и mTOR, выбранный из 2-амино-8-[транс-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3-пиридинил)-4-метилпиридо[2,3-d]пиримидин-7(8H)-она (PF-04691502); N-[4-[[4-(диметиламино)-1-пиперидинил]карбонил]фенил]-N'-[4-(4,6-ди-4-морфолинил-1,3,5-триазин-2-ил)фенил]мочевины (PF-05212384, PKI-587); 2-метил-2-{4-[3-метил-2-оксо-8-(хинолин-3-ил)-2,3-дигидро-1-имидазо[4,5-c]хинолин-1-ил]фенил}пропаннитрила (BEZ-235); апитолисиба (GDC-0980, RG7422); 2,4-дифтор-N-{2-(метилокси)-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамида (GSK2126458); 8-(6-метоксипиридин-3-ил)-3-метил-1-(4-(пиперазин-1-ил)-3-(трифторметил)фенил)-1H-имидазо[4,5-c]хинолин-2(3H)-он-малеиновой кислоты (NVP-BGT226); 3-[4-(4-морфолинилпиридо[3',2':4,5]фуро[3,2-d]пиримидин-2-ил]фенола (PI-103); 5-(9-изопропил-8-метил-2-морфолино-9H-пурин-6-ил)пиримидин-2-амина (VS-5584, SB2343) и N-[2-[(3,5-диметоксифенил)амино]хиноксалин-3-ил]-4-[(4-метил-3-метоксифенил)карбонил]аминофенилсульфонамида (XL765).
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором киназы анапластической лимфомы (ALK). Примеры киназ ALK включают, но не ограничиваются перечисленным, кризотиниб (Pfizer), церитиниб (Novartis), алектиниб (Chugai), бригатиниб (также называемый AP26113; Ariad), энтректиниб (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 (Tesaro) (см., например, идентификатор клинического испытания № NCT02048488), CEP-37440 (Teva) и X-396 (Xcovery). В некоторых воплощениях субъект имеет солидный рак, например, солидный рак, описанный в настоящем описании, например, рак легких.
R
N
N
2
4
2
4
Химическое название кризотиниба 3-[(1)-1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси]-5-(1-пиперидин-4-илпиразол-4-ил)пиридин-2-амин. Химическое название церитиниба 5-хлор--[2-изопропокси-5-метил-4-(4-пиперидинил)фенил]--[2-(изопропилсульфонил)фенил]-2,4-пиримидиндиамин. Химическое название алектиниба 9-этил-6,6-диметил-8-(4-морфолинопиперидин-1-ил)-11-оксо-6,11-дигидро-5H-бензо[b]карбазол-3-карбонитрил. Химическое название бригатиниба 5-хлор-N-{4-[4-(диметиламино)-1-пиперидинил]-2-метоксифенил}-N-[2-(диметилфосфорил)фенил]-2,4-пиримидиндиамин. Химическое название энтректиниба N-(5-(3,5-дифторбензил)-1H-индазол-3-ил)-4-(4-метилпиперазин-1-ил)-2-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)бензамид. Химическое название PF-06463922 (10R)-7-амино-12-фтор-2,10,16-триметил-15-оксо-10,15,16,17-тетрагидро-2H-8,4-(метено)пиразоло[4,3-h][2,5,11]бензоксадиазациклотетрадецин-3-карбонитрил. Химическая структура CEP-37440 (S)-2-((5-хлор-2-((6-(4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил)-1-метокси-6,7,8,9-тетрагидро-5H-бензо[7]аннулен-2-ил)амино)пиримидин-4-ил)амино)-N-метилбензамид. Химическое название X-396 (R)-6-амино-5-(1-(2,6-дихлор-3-фторфенил)этокси)-N-(4-(4-метилпиперазин-1-карбонил)фенил)пиридазин-3-карбоксамид.
et al
et al
et al
Также можно использовать лекарственные средства, которые ингибируют или кальцийзависимую фосфатазу кальцинеурин (циклоспорин и FK506) или киназу р70S6, что важно для передачи сигнала, вызванного фактором роста (рапамицин) (Liu ., Cell, 66: 807-815, 1991; Henderson ., Immun., 73: 316-321, 1991; Bierer ., Curr. Opin. Immun., 5: 763-773, 1993). В другом аспекте композиции клеток по настоящему изобретению можно вводить пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, Т-клеточной аблативной терапией с использованием химиотерапевтических средств, таких как флударабин, наружной лучевой терапии (XRT), циклофосфамида и/или антител, таких как ОКТ3 или САМРАТН. В одном аспекте композиции клеток по настоящему изобретению вводят после В-клеточной аблативной терапии, такой как средства, которые реагируют с CD20, например, ритуксаном. Например, в одном воплощении субъекты могут подвергаться стандартному лечению с высокой дозой химиотерапии с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых воплощениях после трансплантации субъекты получают инфузию размноженных иммунных клеток по настоящему изобретению. В другом воплощении размноженные клетки вводят до последующей операции.
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с ингибитором индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO). IDO представляет собой фермент, который катализирует разрушение аминокислоты L-триптофана до кинуренина. При многих раковых заболеваниях сверхэеспрессируются IDO, например, при раке предстательной железы, колоректальном раке, раке поджелудочной железы, цервикальном раке, раке желудка, яичников, головы и легких. Экспрессировать IDO могут pDC, макрофаги и дендритные клетки (DC). Без связи с теорией, полагают, что уменьшение количества L-триптофана (например, катализируемое IDO) приводит к иммуносупрессивной среде путем индукции Т-клеточных анергии и апоптоза. Таким образом, без связи с теорией, полагают, что ингибитор IDO может усилить эффективность CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, например, путем снижения супрессии или гибели CAR-экспрессирующей иммунной клетки. В воплощениях субъект имеет солидный рак, например, солидный рак, описанный в настоящем описании, например, рак предстательной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, цервикальный рак, рак желудка, яичников, головы и легких. Примеры ингибиторов IDO включают, но не ограничиваются перечисленным, 1-метилтриптофан, индоксимод (NewLink Genetics) (см., например, идентификатор клинического испытаня №№ NCT01191216; NCT01792050) и INCB024360 (Incyte Corp.) (см., например, идентификатор клинического испытаня №№ NCT01604889; NCT01685255).
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с модулятором супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). MDSC накапливаются на периферии и в месте опухоли многих солидных опухолей. Такие клетки подавляют Т-клеточные реакции, посредством чего мешают эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками. Без связи с теорией, полагают, что введение модулятора MDSC повышает эффективность CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании. В одном воплощении субъект имеет солидный рак, например, солидный рак, описанный в настоящем описании, например, глиобластому. Примеры модуляторов MDSC включают, но не ограничиваются перечисленным, MCS110 и BLZ945. MCS110 представляет собой моноклональное антитело (mAb) против макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF). См., например, идентификатор клинического испытания № NCT00757757. BLZ945 представляет собой низкомолекулярный ингибитор рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R). См., например, Pyonteck et al., Nat. Med., 19 (2013): 1264-72. Структура BLZ945 показана ниже.
8
В воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с CD19-CART клеткой (например, CTL019, например, как описано в WO2012/079000, включенной в настоящее описание в качестве ссылки). В воплощениях субъект имеет острый миелоидный лейкоз (AML), например, CD19-положительный AML или CD19-отрицательный AML. В воплощениях субъект имеет CD19+ лимфому, например, CD19+ неходжкинскую лимфому (NHL), CD19+ FL или CD19+ DLBCL. В воплощениях субъект имеет рецидивную или рефрактерную CD19+ лимфому. В воплощениях субъекту назначают противолимфомную (lymphodepleting) терапию до, одновременно или после введения (например, инфузии) CD19-CART клеток. В одном примере противолимфомную терапию субъекту назначают перед введением CD19-CART клеток. Например, противолимфомная терапия заканчивается за 1-4 дня (например, 1, 2, 3 или 4 дня) до инфузии CD19-CART клеток. В воплощениях вводят несколько доз CD19-CART клеток, например, как описано в настоящем описании. Например, одна доза включает примерно 5×10 CD19-CART клеток. В воплощениях противолимфомную терапию субъекту назначают до, одновременно или после введения (например, инфузии) CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, например, не-CD19-CAR-экспрессирующей клетки. В воплощениях CD19-CART вводят до, одновременно или после введения (например, инфузии) не-CD19-CAR-экспрессирующей клетки, например, не-CD19-CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании.
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с CD19-CAR-экспрессирующей клеткой, например, CTL019, как описано в WO2012/079000, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, для лечения заболевания, связанного с экспрессией CLL-1, например, рака, описанного в настоящем описании. Без связи с теорией, полагают, что введение CD19-CAR-экспрессирующей клетки в комбинации с CAR-экспрессирующей клеткой улучшает эффективность CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, путем таргетинга ранней линии раковых клеток, например, раковых стволовых клеток, модуляции иммунной реакции, истощения регуляторных В-клеток и/или улучшения окружающей микросреды опухоли. Например, CD19-CAR-экспрессирующая клетка таргетирует раковые клетки, которые экспрессируют маркеры ранней клеточной линии, например, раковых стволовых клеток, и CD19-экспрессирующие клетки, в то время как CAR-экспрессирующая клетки, описанная в настоящем описании, таргетирует раковые клетки, которые экспрессируют маркеры поздней клеточной линии, например, CLL-1. Такой обусловленный подход может улучшить эффективность CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании. В таких воплощениях CD19-CAR-экспрессирующую клетку вводят до, одновременно или после введения (например, инфузии) CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании.
В воплощениях CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем описании, также экспрессирует CAR, таргетирующий CD19, например, CD19-CAR. В одном воплощении клетку, экспрессирующую CAR, описанную в настоящем описании, и CD19-CAR вводят субъекту для лечения рака, описанного в настоящем описании, например, AML. В одном воплощении конфигурации одной или обеих молекул CAR включает первичный внутриклеточный сигнальный домен и костимулирующий сигнальный домен. В одном воплощении конфигурации одной или обеих молекул CAR включает первичный внутриклеточный сигнальный домен и 2, 3, 4 или 5 или больше костимулирующих сигнальных доменов. В таких воплощениях молекула CAR, описанная в настоящем описании, и CD19-CAR могут иметь одинаковые или различные первичные внутриклеточные сигнальные домены, одинаковые или различные костимулирующие сигнальные домены или одинаковое число или различное число костимулирующих сигнальных доменов. С другой стороны, CAR, описанный в настоящем описании, и CD19-CAR сформированы как расщепленный CAR, в котором одна или больше молекул CAR включают антигенсвязывающий домен и костимулирующий домен (например, 4-1ВВ), в то время как другая молекула CAR включает антигенсвязывающий домен и первичный внутриклеточный сигнальный домен (например, CD3-дзета).
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, вводят субъекту в комбинации с полипептидом интерлейкином-15 (IL-15), полипептидом рецептором альфа интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинацией как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetIL-15 представляет собой гетеродимерный ковалентный комплекс IL-15 и IL-15Ra. hetIL-15 описан, например, в U.S. 8124084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413 и U.S. 2011/0081311, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. В воплощениях het-IL-15 вводят подкожно. В воплощениях субъект имеет рак, например, солидный рак, например, меланому или рак толстой кишки. В воплощениях субъект имеет метастазирующий рак.
В воплощениях субъекту, имеющему заболевание, описанное в настоящем описании, например, гематологическое расстройство, например, AML или MDS, вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации со средством, например, цитотоксическим или химиотерапевтическим средством, биологической терапией (например, терапией антителами, например. моноклональными антителами, или клеточной терапией) или ингибитором (например, ингибитором киназы). В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с цитотоксическим средством, например, CPX-351 (Celator Pharmaceuticals), цитарабином, даунорубицином, возароксином (Sunesis Pharmaceuticals), сапацитабином (Cyclacel Pharmaceuticals), идарубицином или митоксантроном. CPX-351 представляет собой липосомальный препарат, включающий цитарабин и даунорубицин в молярном соотношении 5:1. В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с гипометилирующим средством, например, ингибитором ДНК-метилтрансферазы, например, азацитидином или децитабином. В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с биологической терапией, например, терапией антителами или клеточной терапией, например, 225Ac-линтузимабом (актимаб-A; Actinium Pharmaceuticals), IPH2102 (Innate Pharma/Bristol Myers Squibb), SGN-CD33A (Seattle Genetics) или гемтузумабом озогамицином (Mylotarg; Pfizer). SGN-CD33A представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), включающий димер пирролобензодиазепина, который присоединен к анти-CD33 антителу. Актимаб-A представляет собой анти-CD33 антитело (линтузимаб), меченное актинием. IPH2102 представляет собой моноклональное антитело, которое таргетирует киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы (KIR). В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с ингибитором FLT3, например, сорафенибом (Bayer), мидостаурином (Novartis), квизартинибом (Daiichi Sankyo), креноланибом (Arog Pharmaceuticals), PLX3397 (Daiichi Sankyo), AKN-028 (Akinion Pharmaceuticals) или ASP2215 (Astellas). В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с ингибитором изоцитратдегидрогеназы (IDH), например, AG-221 (Celgene/Agios) или AG-120 (Agios/Celgene). В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с регулятором клеточного цикла, например, ингибитором полоподобной киназы 1 (Plk1), например, воласертибом (Boehringer Ingelheim); или ингибитором циклинзависимой киназы 9 (Cdk9), например, алвоцидибом (Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis). В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с ингибитором сигнальной сети В-клеточного рецептора, например, ингибитором В-клеточной лимфомы 2 (Bcl-2), например, венетоклаксом (Abbvie/Roche); или ингибитором тирозинкиназы Брутона (Btk), например, ибрутинибом (Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical). В воплощениях субъекту вводят CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с ингибитором M1 аминопептидазы, например, тозедостатом (CTI BioPharma/Vernalis); ингибитором гистондеацетилазы (HDAC), например, прациностатом (MEI Pharma); ингибитором поликиназы, например, ригосертибом (Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio); или обратным агонистом CXCR4, например, BL-8040 (BioLineRx). В воплощениях субъекту вводят CLL-1-таргетирующую CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, в комбинации с CAR-экспрессирующей клеткой, которая специфически связывает антиген иной, чем CLL-1, например, CLL, BCMA, CD123, CD19, FLT-3 или фолатный рецептор бета.
В другом воплощении субъект получает инфузию композиций с CLL-1-экспрессирующей клеткой по настоящему изобретению перед трансплантацией клеток, например, трансплантацией аллогенных стволовых клеток. В предпочтительном воплощении CLL-1-экспрессирующие клетки временно экспрессируют CLL-1-CAR, например, путем электропорации мРНК CLL-1-CAR, посредством чего экспрессия CLL-1 обрывается перед инфузией донорских стволовых клеток, для того, чтобы избежать неудачного приживления трансплантата.
Некоторые пациенты могут испытывать аллергические реакции на соединения по настоящему изобретению и/или другое(ие) противораковое(ые) средство(а) во время или после введения, поэтому обычно вводят антиаллергические средства для минимизации опасности аллергической реакции. Подходящие антиаллергические средства включают кортикостероиды, такие как дексаметазон (например, декадрон), беклометазон (например, бекловент), гидрокортизон (также известный как кортизон, гидрокортизона натрийсукцинат, гидрокортизона натрйфосфат и продаваемый под торговыми наименованиями Ala-Cort, гидрокортизона фосфат, Solu-Cortef, Hydrocort Acetate и Lanacor), преднизон (продаваемый под торговыми наименованиями Delta-Cortel, орапред, педиапред и прелон), преднизон (продаваемый под торговыми наименованиями делтасон, Liquid Red, метикортен и оразон), метилпреднизолон (также известный как 6-метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, метилпреднизолона натрийсукцинат, продаваемый под торговыми наименованиями дуралон, медралон, медрол, M-преднизол и солумедрол); антигистаминные средства, такие как дифенгидрамин (например, бенадрил), гидроксизин и ципрогептадин; и бронходилататоры, такие как агонисты бета-адренергических рецепторов, альбутерол (например, провентил) и тербуталин (Brethine).
Некоторые пациенты могут испытывать тошноту во время или после введения соединения по настоящему изобретению и/или другого(их) противоракового(ых) средства(средств); поэтому используют противорвотные средства для предупреждения тошноты (верхний отдел желудка) и рвоты. Подходящие противорвотные средства включают апрепитант (Emend), ондансетрон (Zofran), гранисетрон HCl (Kytril), лоразепам (Ativan), дексаметазон (Decadron), прохлорперазин (Compazine), казопитант (резоник и Zunrisa) и их комбинации.
Во время периода лечения обычно выписывают лекарственные средства для облегчения боли, чтобы пациенту было комфортнее. Обычно используют традиционные продаваемые без рецепта аналгетики, такие как тиленол. Однако в случае средней или тяжелой боли также применяют опиодиные аналгезирующие лекарственные средства, такие как гидрокодон/парацетамол или гидрокодон/ацетаминофен (например, викодин), морфин (например, астраморф или авинза), оксидон (например, оксиконтин или перкоцет), оксиморфона гидрохлорид (опана) и фентанил (например, дюрогезик).
В попытке защитить здоровые клетки от токсичности лечения и ограничить токсическое действие на органы, как вспомогательную терапию можно использовать цитозащитные средства (такие как нейропротеторы, поглотители свободных радикалов, кардиопротекторы, нейтрализаторы экстравазации антрациклинов, питательные вещества и т.п.). Подходящие цитозащитные средства включают амифостин (этиол), глутамин, димесну (тавоцепт), месну (меснекс), дексразоксан (зинекард или тотект), ксалипроден (ксаприла) и лейковорин (также известный как лейковорин кальций, цитроворум-фактор и фолиновая кислота).
Структуру активных соединений, идентифицированных кодовыми номерами, родовые или торговые наименования можно узнать из текущего издания стандартного краткого руководства «The Merck Index» или из баз данных, например, Patents International (например, IMS World Publications).
Вышеупомянутые соединения, которые можно использовать в комбинации с соединением по настоящему изобретению, можно получать и вводить так, как описано в технике, например, и документах, цитированных выше.
В одном воплощении настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим по меньшей мере одно соединение по настоящему изобретению (например, соединение по настоящему изобретению) или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым носителем, подходящим для введения пациенту человеку или животному, или одни или вместе с другими противораковыми средствами.
В одном воплощении настоящее изобретение относится к способам лечения пациентов людей или животных, страдающих от клеточного пролиферативного заболевания, такого как рак. Настоящее изобретение относится к способам лечения пациента человека или животного, нуждающегося в таком лечении, включающем введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению (например, соединения по настоящему изобретению) или его фармацевтически приемлемой соли или одних или в комбинации с другими противораковыми средствами.
В частности, композиции будут или составляться вместе как комбинация терапевтическх средств или вводиться по отдельности.
В комбинированной терапии соединение по настоящему изобретению и другое(ие) противораковое(ые) средство(а) можно вводить совместно, одновременно или последовательно без конкретных пределов по времени, причем такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента.
В предпочтительном воплощении соединение по настоящему изобретению и другое(ие) противораковое(ые) средство(а) обычно вводят последовательно в любом порядке инфузией или перорально. Схема приема может изменяться в зависимости от стадии заболевания, физической формы пациента, профилей безопасности отдельных лекарственных средств и переносимости отдельных лекарственных средств, а также других критериев, хорошо известных штатным врачам и практикующим врачам, вводящим комбинацию. Соединение по настоящему изобретению и другое(ие) противораковое(ые) средство(а) можно вводить порознь друг за другом в пределах минут, часов, дней или даже недель, в зависимости от определенного цикла, используемого для лечения. Кроме того, во время лечебного цикла можно включать введение одного лекарственного средства чаще, чем другого, и в различных дозах на введение лекарственного средства.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к наборам, которые включают одно или несколько соединений по настоящему изобретению и партнера по комбинации, как раскрыто в настоящем описании. Характерные наборы включают (а) соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, (b) по меньшей мере одного партнера по комбинации, например, указанного выше, в силу чего такой набор может включать упаковку-вкладыш или другую этикетку, включающую указания по введению.
Соединение по настоящему изобретению также можно использовать преимущественно в комбинации с известными терапевтическими способами, например, введением гормонов или, особенно, излучения. Соединение по настоящему изобретению, в частности, можно использовать в качестве радиосенсибилизатора, в особенности, для лечения опухолей, которые показывают слабую чувствительность к радиотерапии.
В одном воплощении пациенту может быть введено средство, которое снижает или ослабляет побочное действие, связанное с введением CAR-экспрессирующей клетки. Побочное действие, связанное с введением CAR-экспрессирующей клетки, включает, но не ограничивается перечисленным, CRS и гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (HLH), также называемый синдромом активации макрофагов (MAS). Симптомы CRS включают сильную лихорадку, тошноту, временную гипотензию, гипоксию и т.п. CRS может включать клинические конституциональные признаки и симптомы, такие как лихорадка, усталость, анорексия, миалгии, артралгии, тошнота, рвота и головная боль. CRS может включать клинические кожные проявления и симптомы, такие как сыпь. CRS может включать клинические желудочнокишечные проявления и симптомы, такие как тошнота, рвота и диарея. CRS может включать клинические респираторные признаки и симптомы, такие как тахипноэ и гипоксемия. CRS может включать клинические сердечно-сосудистые проявления и симптомы, такие как тахикардия, разброс пульсового давления, гипотензия, повышенный сердечный выброс (ранний) и потенциально уменьшенный сердечный выброс (поздний). CRS может включать клинические признаки и симптомы коагуляции, такие как поднявшийся d-димер, гипофибриногенемия с кровотечением или без. CRS может включать клинические ренальные признаки и симптомы, такие как азотемия. CRS может включать клинические проявления и симптомы со стороны печени, такие как трансаминит и гипербилирубинемия. CRS может включать клинические неврологические признаки и симптомы, такие как головная боль, изменения психического состояния, спутанность сознания, делирий, затруднение в поиске слов или выраженная афазия, галлюцинации, тремор, dymetria, изменившаяся походка и эпилептические припадки. Соответственно, способы, описанные в настоящем описании, могут включать введение субъекту CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, и дополнительное введение одного или нескольких средств для управления повышенными уровнями растворимого фактора в результате лечения CAR-экспрессирующей клеткой. В одном воплощении растворимым фактором, повышенным у пациента, является один или больше из IFN-γ, TNFα, IL-2 и IL-6. В одном воплощении фактором, повышенным у пациента, является один или больше из IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 и фракталкина. Следовательно, средство, вводимое для лечения такого побочного действия, может представлять собой средство, которое нейтрализует один или несколько таких растворимых факторов. В одном воплощении средство, которое нейтрализует одну или несколько таких растворимых форм, представляет собой антитело или антитело к нему. Примеры таких средств включают, но не ограничиваются перечисленным, стероид (например, кортикостероид), ингибитор TNFα и ингибитор IL-6. Примером ингибитора TNFα является молекула анти-TNFα антителоа, такая как инфликсимаб, адалимумаб, церолизумаб, пегол и голимумаб. Другими примером ингибитора TNFα является слитый белок, такой как энтанерсепт. Низкомолекулярный ингибитор TNFα включает, но не ограничивается перечисленным, производные ксантина (например, пентоксифиллин) и бупропион. Примером ингибитора IL-6 является молекула анти-IL-6 антитела, такая как токлизумаб (ток), сарилумаб, элсилимомаб, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 и FM101. В одном воплощении молекулой анти-IL-6 антитела является токлизумаб. Примером ингибитора на основе IL-1R является анакинра.
В одном воплощении пациенту может быть введено средство, которое усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном воплощении средство может представлять собой средство, которое подавляет ингибирующую молекулу, например, средство представляет собой реперный ингибитор. Ингибирующие молекулы, например, запрограммированной гибели 1 (PD1), могут в некоторых воплощениях снижать способность CAR-экспрессирующей клетки готовить иммунную эффекторную реакцию. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, ГКГС класса I, ГКГС класса II, GAL9, аденозин и TGFR-бета. Подавление ингибирующей молекулы, например, путем ингибирования ДНК, РНК или уровня белка, может оптимизировать производительность CAR-экспрессирующей клетки. В воплощениях для ингибирования экспрессии ингибирующей молекулы в CAR-экспрессирующей клетке можно использовать ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, дцРНК, например, мРНК или shРНК. В одном воплощении инигибитор представляет собой shРНК. В одном воплощении ингибирующую молекулу ингибируют в CAR-экспрессирующей клетке. В таких воплощениях молекула дцРНК, которая ингибирует экспрессию ингибирующей молекулы, соединяется с нуклеиновой кислотой, которая кодирует компонент, например, все компоненты, CAR.
,
et al
Science
et al
Nat. Biotechnol
Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA
В одном воплощении молекулв нуклеиновой кислотой, которая кодирует молекулу дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, операбельно соединена с промотором, например, промотором, полученным из Н1 или U6, так что в CAR-экспрессирующей клетке экспрессируется молекула дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию. См., например, Tiscornia G.«Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA», Chapter 3, in  (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp T.R. . (2002), , 296: 550-553; Miyagishi M. . (2002), ., 19: 497-500. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, присутствует на том же векторе, например, лентивирусном векторе, который включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует компонент, например, все компоненты, CAR. В таком воплощении молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, располагается на векторе, например, лентивирусном векторе, 5'- или 3'- к нуклеиновой кислоте, которая кодирует компонент, например, все компоненты, CAR. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, может быть транскрибирована в том же или другом направлении, что и нуклеиновая кислота, которая кодирует компонент, например, все компоненты, CAR. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, присутствует на векторе ином, чем вектор, который включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует компонент, например, все компоненты, CAR. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, временно экспрессируется в CAR-экспрессирующей клетке. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует молекулу дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, устойчиво интегрирована в геном CAR-экспрессирующей клетки. Фигуры 29А-29Е отображают примеры векторов для экспрессии компонента, например, всех компонентов, CAR с молекулой дцРНК, которая ингибирует экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию.
Примеры молекул дцРНК, применимых для ингибирования экспрессии молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, где молекула, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, представляет собой PD1, приводятся ниже.
Ниже в таблице 10 приводятся названия агентов PDCD1 (PD1) RNAi (полученных из их позиции в последовательности NM_008798.2 гена мышиного PDCD1) вместе с SEQ ID NOs: 216-263, представляющими ДНК-последовательность. В таблице представлены как смысловые (S), так и антисмысловые (AS) последовательности, представленные как последовательности 19mer и 21mer. Также отмечается, что позиция (PoS, например, 176) получена из числа позиций в последовательности NM_008798.2 гена мышиного PDCD1. SEQ ID NO: указаны в группах по 12, которые соответствуют «смысловым 19» SEQ ID NO: 216-227; «смысловым 21» SEQ ID NO: 228-239; «антисмысловым 21» SEQ ID NO: 240-251; «антисмысловым 19» SEQ ID NO: 252-263.
Таблица 10. Последовательности shРНК мышиного PDCD1 (PD1)
Позиция на NM_008798.2
Участок-мишень
Смысловые 19
Смысловые 21
Антисмысловые 21
Антисмысловые 19
176
CDS
GGAGGTCCCTCAC CTTCTA (SEQ ID NO: 216)
CTGGAGGTCCC TCACCTTCTA(SEQ ID NO: 228)
TAGAAGGTGAGG GACCTCCAG(SEQ ID NO: 240)
TAGAAGGTGAGG GACCTCC (SEQ ID NO: 252)
260
CDS
CGGAGGATCTTAT GCTGAA (SEQ ID NO: 217)
GTCGGAGGATCT TATGCTGAA(SEQ ID NO: 229)
TTCAGCATAAGA TCCTCCGAC(SEQ ID NO: 241)
TTCAGCATAAGA TCCTCCG(SEQ ID NO: 253)
359
CDS
CCCGCTTCCAGAT CATACA(SEQ ID NO: 218)
TGCCCGCTTCC AGATCATACA(SEQ ID NO: 230)
TGTATGATCTGG AAGCGGGCA(SEQ ID NO: 242)
TGTATGATCTGG AAGCGGG(SEQ ID NO: 254)
528
CDS
GGAGACCTCAACA AGATAT (SEQ ID NO: 219)
CTGGAGACCTC AACAAGATAT(SEQ ID NO: 231)
ATATCTTGTTGA GGTCTCCAG(SEQ ID NO: 243)
ATATCTTGTTGA GGTCTCC(SEQ ID NO: 255)
581
CDS
AAGGCATGGTCAT TGGTAT(SEQ ID NO: 220)
TCAAGGCATGG TCATTGGTAT(SEQ ID NO: 232)
ATACCAATGACC ATGCCTTGA(SEQ ID NO: 244)
ATACCAATGACC ATGCCTT(SEQ ID NO: 256)
584
CDS
GCATGGTCATTGG TATCAT (SEQ ID NO: 221)
AGGCATGGTCA TTGGTATCAT(SEQ ID NO: 233)
ATGATACCAATG ACCATGCCT(SEQ ID NO: 245)
ATGATACCAATG ACCATGC(SEQ ID NO: 257)
588
CDS
GGTCATTGGTATC ATGAGT (SEQ ID NO: 222)
ATGGTCATTGG TATCATGAGT(SEQ ID NO: 234)
ATGGTCATTGGT ATCATGAGT(SEQ ID NO: 246)
ATGGTCATTGGT ATCATGA (SEQ ID NO: 258)
609
CDS
CCTAGTGGGTATC CCTGTA (SEQ ID NO: 223)
GCCCTAGTGGG TATCCCTGTA(SEQ ID NO: 235)
GCCCTAGTGGGT ATCCCTGTA(SEQ ID NO: 247)
GCCCTAGTGGGT ATCCCTG(SEQ ID NO: 259)
919
CDS
GAGGATGGACATT GTTCTT(SEQ ID NO: 224)
ATGAGGATGGA CATTGTTCTT(SEQ ID NO: 236)
ATGAGGATGGAC ATTGTTCTT(SEQ ID NO: 248)
ATGAGGATGGAC ATTGTTC(SEQ ID NO: 260)
1021
3'UTR
GCATGCAGGCTAC AGTTCA (SEQ ID NO: 225)
GAGCATGCAGG CTACAGTTCA(SEQ ID NO: 237)
GAGCATGCAGGC TACAGTTCA(SEQ ID NO: 249)
GAGCATGCAGGC TACAGTT(SEQ ID NO: 261)
1097
3'UTR
CCAGCACATGCAC TGTTGA (SEQ ID NO: 226)
TTCCAGCACAT GCACTGTTGA(SEQ ID NO: 238)
TTCCAGCACATG CACTGTTGA(SEQ ID NO: 250)
TTCCAGCACATG CACTGTT(SEQ ID NO: 262)
1101
3'UTR
CACATGCACTGTT GAGTGA (SEQ ID NO: 227)
AGCACATGCAC TGTTGAGTGA(SEQ ID NO: 239)
AGCACATGCACT GTTGAGTGA(SEQ ID NO: 251)
AGCACATGCACT GTTGAGT(SEQ ID NO: 263)
Ниже в таблице 11 приводятся названия агентов PDCD1 (PD1) RNAi (полученных из их позиции в последовательности гена PDCD1 человека) вместе с SEQ ID NO: 264-322, представляющими ДНК-последовательность. В таблице представлены как смысловые (S), так и антисмысловые (AS) последовательности, представленные как последовательности 19mer и 21mer. SEQ ID NO: указаны в группах по 12, которые соответствуют «смысловым 19» SEQ ID NO: 264-275; «смысловым 21» SEQ ID NO: 276-287; «антисмысловым 21» SEQ ID NO: 288-299; «антисмысловым 19» SEQ ID NO: 300-311.
Таблица 11. Последовательности shРНК мышиного PDCD1 (PD1)
Позиция на NM_005018.2
Участок-мишень
Смысловые 19
Антимысловые 19
Смысловые 21
Антимысловые 21
145
CDS
GGCCAGGATGGT TCTTAGA (SEQ ID NO: 264)
TCTAAGAACCAT CCTGGCC(SEQ ID NO: 276)
GCGGCCAGGATG GTTCTTAGA(SEQ ID NO: 288)
TCTAAGAACCAT CCTGGCCGC(SEQ ID NO: 300)
271
CDS
GCTTCGTGCTAA ACTGGTA(SEQ ID NO: 265)
TACCAGTTTAGC ACGAAGC(SEQ ID NO: 277)
GAGCTTCGTGCT AAACTGGTA(SEQ ID NO: 289)
TACCAGTTTAGC ACGAAGCTC(SEQ ID NO: 301)
393
CDS
GGGCGTGACTTC CACATGA(SEQ ID NO: 266)
TCATGTGGAAGT CACGCCC(SEQ ID NO: 278)
ACGGGCGTGACT TCCACATGA(SEQ ID NO: 290)
TCATGTGGAAGT CACGCCCGT(SEQ ID NO: 302)
1497
3'UTR
CAGGCCTAGAGA AGTTTCA(SEQ ID NO: 267)
TGAAACTTCTCT AGGCCTG(SEQ ID NO: 279)
TGCAGGCCTAGA GAAGTTTCA(SEQ ID NO: 291)
TGAAACTTCTCT AGGCCTGCA(SEQ ID NO: 303)
1863
3'UTR
CTTGGAACCCAT TCCTGAA(SEQ ID NO: 268)
TTCAGGAATGGG TTCCAAG(SEQ ID NO: 280)
TCCTTGGAACCC ATTCCTGAA(SEQ ID NO: 292)
TTCAGGAATGGG TTCCAAGGA(SEQ ID NO: 304)
1866
3'UTR
GGAACCCATTCC TGAAATT(SEQ ID NO: 269)
AATTTCAGGAAT GGGTTCC(SEQ ID NO: 281)
TTGGAACCCATT CCTGAAATT(SEQ ID NO: 293)
AATTTCAGGAAT GGGTTCCAA(SEQ ID NO: 305)
1867
3'UTR
GAACCCATTCCT GAAATTA(SEQ ID NO: 270)
TAATTTCAGGAA TGGGTTC(SEQ ID NO: 282)
TGGAACCCATTC CTGAAATTA(SEQ ID NO: 294)
TAATTTCAGGAA TGGGTTCCA(SEQ ID NO: 306)
1868
3'UTR
AACCCATTCCTG AAATTAT(SEQ ID NO: 271)
ATAATTTCAGGA ATGGGTT(SEQ ID NO: 283)
GGAACCCATTCC TGAAATTAT(SEQ ID NO: 295)
ATAATTTCAGGA ATGGGTTCC(SEQ ID NO:307)
1869
3'UTR
ACCCATTCCTGA AATTATT(SEQ ID NO: 272)
AATAATTTCAGG AATGGGT(SEQ ID NO: 284)
GAACCCATTCCT GAAATTATT(SEQ ID NO: 296)
AATAATTTCAGG AATGGGTTC(SEQ ID NO: 308)
1870
3'UTR
CCCATTCCTGAA ATTATTT(SEQ ID NO: 273)
AAATAATTTCAG GAATGGG(SEQ ID NO: 285)
AACCCATTCCTG AAATTATTT(SEQ ID NO: 297)
AAATAATTTCAG GAATGGGTT(SEQ ID NO: 309)
2079
3'UTR
CTGTGGTTCTAT TATATTA(SEQ ID NO: 274)
TAATATAATAGA ACCACAG(SEQ ID NO: 286)
CCCTGTGGTTCT ATTATATTA(SEQ ID NO: 298)
TAATATAATAGA ACCACAGGG(SEQ ID NO: 310)
2109
3'UTR
AAATATGAGAGC ATGCTAA(SEQ ID NO: 275)
TTAGCATGCTCT CATATTT(SEQ ID NO: 287)
TTAAATATGAGA GCATGCTAA(SEQ ID NO: 299)
TTAGCATGCTCT CATATTTAA(SEQ ID NO: 311)
В одном воплощении ингибитор ингибирующего сигнала может представлять собой, например, антитело или фрагмент антитела, который связывается с ингибирующей молекулой. Например, средство может представлять собой антитело или фрагмент антитела, который связывается с PD1, PD-L1, PD-L2 или CTLA4 (например, ипилимумаб (также называемый MDX-010 и MDX-101, и продаваемый как Yervoy; Bristol-Myers Squibb; тремилимумаб (моноклональное антитело IgG2, доступное от Pfizer, официально известное как тиклимумаб CP-675206)). В одном воплощении средство представляет собой антитело или фрагмент антитела, который связывается с LAG3. В воплощениях средство, которое усиливает активность CAR-экспрессирующей молекулы, вводят в комбинации с аллогенным CAR, например, аллогенным CAR, описанным в настоящем описании (например, описанным в настоящем описании в разделе «Аллогенный CAR»).
PD-1 является ингибирующим членом семейства CD28 рецепторов, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., 1996, Int. Immunol., 8: 765-75). Показано, что два лиганда для PD-1 PD-L1 и PD-L2 отрицательно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al., 2000, J. Exp. Med., 192: 1027-34; Latchman et al., 2001, Nat. Immunol., 2: 261-8; Carter et al., 2002, Eur. J. Immunol., 32: 634-43). PD-1 распространен при раковых заболеваниях человека (Dong et al., 2003, J. Mol. Med., 81: 281-7; Blank et al., 2005, Cancer Immunol. Immunother., 54: 307-314; Konishi et al., 2004, Clin. Cancer Res., 10: 5094). Иммунную супрессию можно реверсировать путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 и PD-L1. Антитела, фрагменты антител и другие ингибиторы PD-1, PD-L1 и PD-L2 доступны в технике и могут использоваться в комбинации с CAR по настоящему изобретению, описанными в настоящем описании. Например, ниволумаб (также называемый BMS-936558 или MDX1106; Bristol-Myers Squibb) представляет собой полное человеческое моноклональное антитело IgG4, которое специфически блокирует PD-1. Ниволумаб (клон 5С4) и другие человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с PD-1, описаны в US 8008449 и WO2006/121168. Пидилизумаб (CT-011; Cure Tech) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG1k, которое связывается с PD-1. Пидилизумаб и другие гуманизированные моноклональные антитела раскрыты в WO2009/101611. Пембролизумаб (официально известный как ламбролизумаб, и также называемый MK03475; Merck) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG4, которое связывается с PD-1. Пембролизумаб и другие гуманизированные анти-PD-1 антитела раскрыты в US 8354509 and WO2009/114335. MEDI4736 (медиммун) представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывается с PDL1 и ингибирует взаимодействие лиганда с PD1. MDPL3280A (Genentech/Roche) представляет собой человеческое моноклональное антитело IgG1, оптимизированное Fc, которое связывается с PD-L1. MDPL3280A и другие человеческие моноклональные антитела к PD-L1 раскрыты в патенте США № 7943743 и публикации U.S № 20120039906. Другие анти-PD-L1 связывающие агенты включают YW243.55.S70 (вариабельные участки тяжелой и легкой цепи показаны в SEQ ID NO: 20 и 21 в WO2010/077634) и MDX-1 105 (также называемый BMS-936559, и, например, анти-PD-L1 связывающие агенты, раскрытые в WO2007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; амплиммун; например, раскрытый в WO2010/027827 и WO2011/066342) представляет собой PD-L2-Fc слитый растворимый рецептор, который блокирует взаимодействие между PD-1 и B7-H1. Другие анти-PD-1 антитела включают AMP 514 (амплиммун), и среди других, например, анти-PD-1 антитела, раскрытые в US 8609089, US 2010028330 и/или US 20120114649.
TIM3 (Т-клеточный иммуноглобулин 3) также отрицательно регулирует Т-клеточную функцию, в частности, в IFN-g секретирующих CD4+ хелперных T- и цитотоксических 1 CD8+ T-клетках, и играет критичную роль в истощении Т-клеток. Ингибирование взаимодействия между TIM3 и его лигандами, например, галектином-9 (Gal9), фосфотидилсерином (PS) и HMGBI может усилить иммунную реакцию. Антитела, фрагменты антител и другие ингибиторы TIM3 и его лигандов доступны в технике и могут использоваться в комбинации с CD19-CAR, описанным в настоящем описании. Например, антитела, фрагменты антител, малые молекулы или ингибиторы пептидов, которые таргетируют TIM3, связываются с доменом IgV TIM3 и ингибируют взаимодействие с его лигандами. Антитела и пептиды, которые ингибируют TIM3, раскрыты в WO2013/006490 и US20100247521. Другие анти-TIM3 антитела включают гуманизированные варианты RMT3-23 (раскрыты в Ngiow et al., 2011, Cancer Res., 71: 3540-3551) и клон 8B.2C12 (раскрыт в Monney et al., 2002, Nature, 415: 536-541). Биспецифические антитела, которые ингибируют TIM3 и PD-1, раскрыты в US20130156774.
PLoS One
В других воплощениях средство, которое усиливает антивность CAR-экспрессирующей клетки, представляет собой ингибитор CEACAM (например, ингибитор CEACAM-1, CEACAM-3, и/или CEACAM-5). В одном воплощении ингибитор CEACAM представляет собой молекулу анти-CEACAM антитела. Примеры анти-CEACAM-1 антител описаны в WO 2010/125571, WO 2013/082366, WO 2014/059251 и WO 2014/022332, например, моноклональные антитела 34B1, 26H7 и 5F4; или их рекомбинантные формы, описанные, например, в US 2004/0047858, US 7132255 и WO 99/052552. В других воплощениях анти-CEACAM антитело связывается с CEACAM-5, как описано в, например, Zheng et al., ., 2010, Sep. 2; 5(9), pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), или вступает в перекрестную реакцию с CEACAM-1 и CEACAM-5, как описано, например, в WO 2013/054331 и US 2014/0271618.
et al
J. Immunol
J. Immunol
Immunology
Cancer Immunol. Immunother
Mol. Cancer Ther
J. Immunol
PLoS One
et al
Nature
et al
Без желания привязываться к теории, полагают, что факторы адгезии клеток с карциноэмбриональным антигеном (СЕАСАМ), такие как СЕАСАМ-1 и СЕАСАМ-5, опосредуют по меньшей мере ингибирование противоопухолевой иммунной реакции (см., например, Markel ., ., 2002, Mar, 15; 168(6): 2803-10; Markel et al., ., 2006, Nov, 1; 177(9): 6062-71; Markel et al., , 2009, Feb; 126(2): 186-200; Markel et al., ., 2010, Feb; 59(2): 215-30; Ortenberg et al., ., 2012, Jun; 11(6): 1300-10; Stern et al., ., 2005, Jun 1; 174(11): 6692-701; Zheng et al., , 2010, Sep. 2; 5(9). pii: e12529). Например, CEACAM-1 описан как гетерофильный лиганд для TIM-3 и как играющий роль в TIM-3-опосредованной переносимости и истощения T-клеток (см., например, WO 2014/022332; Huang . (2014), , doi:10.1038/nature13848). В воплощениях показано, что совместная блокада CEACAM-1 и TIM-3 усиливает противоопухолевую иммунную реакцию на моделях с ксенотрансплантатом колоректального рака (см., например, WO 2014/022332; Huang ., (2014), цит. выше). В других воплощениях совместная блокада CEACAM-1 и PD-1 снижает Т-клеточную переносимость, как описано, например, в WO 2014/059251. Таким образом, ингибиторы CEACAM можно использовать с другими иммуномодуляторами, описанными в настоящем описании (например, анти-PD-1 и/или анти-TIM-3 ингибиторами), для усиления иммунной реакции против рака, например, меланомы, рака легких (например, NSCLC), рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака яичников и других раковых заболеваний, как описано в настоящем описании.
LAG3 (ген активации лимфоцитов 3 или CD223) представляет собой молекулу клеточной поверхности, экспрессированную на активированных Т-клетках и В-клетках, которые, как показано, играют роль в истощении CD8+ T-клеток. Антитела, фрагменты антител и другие ингибиторы LAG3 и его лиганды доступны в технике и могут использоваться в комбинации с CD19-CAR, описанным в настоящем описании. Например, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) представляет собой моноклональное антитело, которое таргетирует LAG3. IMP701 (иммутеп) является антителом антагонистом LAG3, и IMP731 (иммутеп и глаксосмиткляйн) является антителом, истощающим LAG3. Другие ингибиторы LAG3 включают IMP321 (иммутеп), который представляет собой рекомбинантный слитый белок растворимой части LAG3 и Ig, который связывается с молекулами ГКГС класса II и активирует антигенпрезентирующие клетки (APC). Другие антитела раскрыты, например, в WO2010/019570.
В некоторых воплощениях средство, которое усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки, может представлять собой, например, слитый белок, включающий первый домен и второй домен, причем первый домен представляет собой ингибирующую молекулу или ее фрагмент, и второй домен представляет собой полипептид, который ассоциирован с положительным сигналом, например, полипептид, включающий внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем описании. В некоторых воплощениях полипептид, который ассоциирован с положительным сигналом, может включать костимулирующий домен из CD28, CD27, ICOS, например, внутриклеточный сигнальный домен CD28, CD27 и/или ICOS, и/или первичный сигнальный домен, например, CD3-дзета, например, описанный в настоящем описании. В одном воплощении слитый белок экспрессируется клеткой, например, Т-клеткой, которая не экспрессирует анти-CLL-1-CAR.
В одном воплощении средство, которое усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, представляет собой miR-17-92.
В одном воплощении средство, которое усиливает активность CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании, представляет собой цитокин. Цитокины имеют важные функции, связанные с экспансией, дифференцировкой, выживанием и гомеостазом Т-клеток. Цитокины, которые можно вводить субъекту, получающему CAR-экспрессирующую клетку, описанную в настоящем описании, включают IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18 и IL-21 или их комбинацию. В предпочтительных воплощениях вводимый цитокин представляет собой IL-7, IL-15 или IL-21 или их комбинацию. Цитокин можно вводить один раз в день или чаще, чем один раз в день, например, дважды в день, три раза в день или четыре раза в день. Цитокин можно вводить более, чем один день, например, цитокин вводят 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели или 4 недели. Например, цитокин вводят один раз в день в течение 7 дней.
В воплощениях цитокин вводят в комбинации с CAR-экспрессирующими Т-клетками. Цитокин можно вводить совместно или одновременно с CAR-экспрессирующими Т-клетками, например, вводить в один и тот же день. Цитокин можно получить в тех же фармацевтических композициях, что и CAR-экспрессирующие Т-клетки, или можно получить в отдельной фармацевтической композиции. С другой стороны, цитокин можно вводить вскоре после введения CAR-экспрессирующих Т-клеток, например, через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней после введения CAR-экспрессирующих Т-клеток. В воплощениях, в которых цитокин вводят по схеме, когда введение происходит дольше, чем один день, первый день схемы введения цитокина может быть тем же днем, когда вводят CAR-экспрессирующие Т-клетки, или первый день схемы введения цитокина может иметь место через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней после введения CAR-экспрессирующих Т-клеток. В одном воплощении в первый день субъекту вводят CAR-экспрессирующие Т-клетки, и на второй день вводят цитокин один раз в день в течение следующих 7 дней. В предпочтительном воплощении цитокин для введения в комбинации с CAR-экспрессирующими Т-клетками представляет собой IL-7, IL-15 или IL-21.
В других воплощениях цитокин вводят через некоторое время после введения CAR-экспрессирующих Т-клеток, например, по меньешй мере через 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель, 8 недель, 10 недель, 12 недель, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев или 1 год после введения CAR-экспрессирующих Т-клеток. В одном воплощении цитокин вводят после оценки реакции субъекта на CAR-экспрессирующие клетки. Например, субъекту вводят CAR-экспрессирующие клетки согласно дозировкам и схемам, описанным в настоящем описании. Реакцию субъекта на терапию CAR-экспрессирующими клетками оценивают через 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель, 8 недель, 10 недель, 12 недель, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев или 1 год или долее после введения CAR-экспрессирующих Т-клеток с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании, включая рост опухоли, снижение числа опухолевых клеток в кровотоке или регрессию опухоли. Субъектам, которые не показывают достаточную реакцию на терапию CAR-экспрессирующими клетками, можно ввести цитокин. Введение цитокина субъекту с субоптимальной реакцией на терапию CAR-экспрессирующими клетками улучшает эффективность CAR-экспрессирующих клеток или противораковую активность. В предпочтительном воплощении цитокин, вводимый после введения CAR-экспрессирующих клеток, представляет собой IL-7.
Комбинация с малой иммуностимулирующей дозой ингибитора mTOR
В способах, описанных в настоящем описании, используются малые иммуностимулирующие дозы ингибиторов mTOR, например, аллостерических ингибиторов mTOR, включая рапалоги, такие как RAD001. Введение малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR (например, дозы, которая недостаточна для полной супрессии иммунной системы, но достаточна для улучшения иммунной функции) может оптимизировать производительность иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток или CAR-экспрессирующих клеток, у субъекта. Способы измерения ингибирования mTOR, дозировки, схемы лечения и подходящие фармацевтические композиции описаны в заявке на патент США № 2015/01240036, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном воплощении введение малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR может привести к одному или более из следующих явлений:
i) уменьшение числа PD-1 положительных иммунных эффекторных клеток;
ii) повышение числа PD-1 отрицательных иммунных эффекторных клеток;
iii) повышение отношения PD-1 отрицательные иммунные эффекторные клетки/PD-1 положительные иммунные эффекторные клетки;
iv) повышение числа наивных Т-клеток;
high
high
+
v) усиление экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62L, CD127, CD27 и BCL2, например, в Т-клетках памяти, например, предшественниках Т-клеток памяти;
vi) уменьшение экспрессии KLRG1, например, в Т-клетках памяти, например, предшественниках Т-клеток памяти; или
high
high
+
vii) повышение числа предшественников Т-клеток памяти, например, клеток с одной из комбинаций следующих характеристик: повышенный CD62L, повышенный CD127, повышенный CD27, сниженный KLRG1 и повышенный BCL2;
причем любое из явлений, описанных выше, например, i), ii), iii), iv), v), vi) или vii), происходит, например, по меньшей мере временно, например, по сравнению с субъектом, не получавшим лечение.
В другом воплощении введение малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR приводит к усиленной или продленной пролиферации или персистенции CAR-экспрессирующих клеток, например, в культуре или у субъета, например, по сравнению с необработанными CAR-экспрессирующими клетками или субъектом, не получавшим лечение. В воплощении усиленная пролиферация ассоциируется с повышением числа CAR-экспрессирующих клеток. Способы измерения усиленной или продленной пролиферации описаны в примерах 8 и 9. В другом воплощении введение малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR приводит к усиленному киллингу раковых клеток CAR-экспрессирующими клетками, например, в культуре или у субъета, например, по сравнению с необработанными CAR-экспрессирующими клетками или субъектом, не получавшим лечение. В воплощении усиленный киллинг раковых клеток ассоциируется с уменьшением объема опухоли. Способы измерения усиленного киллинга раковых клеток описаны в примере 2.
В одном воплощении клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, описанную в настоящем описании, вводят в комбинации с малой иммуностимулирующей дозой ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора mTOR, например, RАD001, или каталитического ингибитора mTOR. Например, введение малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR может быть инициировано до введения CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; завершено до введения CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; начато в то же время, что и введение CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; может перекрывать введение CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании; или продолжаться после введения CAR-экспрессирующей клетки, описанной в настоящем описании.
С другой стороны или кроме того, введение малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR может оптимизировать инженеринг иммунных эффекторных клеток для экспрессии молекулы CAR, описанной в настоящем описании. В таких воплощениях введение малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора mTOR, например, RАD001, или каталитического ингибитора mTOR, начинают или завершают до сбора у субъекта иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток или NK-клеток, для конструирования для экспрессии молекулы CAR, описанной в настоящем описании.
В другом воплощении иммунные эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, которые конструируют для экспрессии молекулы CAR, описанной в настоящем описании, например, после сбора у субъекта, или CAR-экспрессирующие эффекторные клетки, например, Т-клетки или NK-клетки, например, до введения субъекту, можно культивировать в присутствии малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR.
В одном воплощении введение субъекту малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR включает введение, например, один раз в неделю, например, в лекарственной форме с немедленным высвобождением 0,1-20, 0,5-10, 2,5-7,5, 3-6 или примерно 5 мг RАD001 или его биоэквивалентной дозы. В одном воплощении введение субъекту малой иммуностимулирующей дозы ингибитора mTOR включает введение, например, один раз в неделю, например, в лекарственной форме с пролонгированным высвобождением 0,3-60, 1,5-30, 7,5-22,5, 9-18 или примерно 15 мг RАD001 или его биоэквивалентной дозы.
В одном воплощении доза ингибитора mTOR связана с или обеспечивает ингибирование mTOR по меньшей мере на 5, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 10, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 15, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 20, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 30, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 40, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 50, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 60, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 70, но не более, чем на 90%, по меньшей мере на 5, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 10, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 15, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 20, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 30, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 40, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 50, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 60, но не более, чем на 80%, по меньшей мере на 5, но не более, чем на 70%, по меньшей мере на 10, но не более, чем на 70%, по меньшей мере на 15, но не более, чем на 70%, по меньшей мере на 20, но не более, чем на 70%, по меньшей мере на 30, но не более, чем на 70%, по меньшей мере на 40, но не более, чем на 70%, по меньшей мере на 50, но не более, чем на 70%, по меньшей мере на 5, но не более, чем на 60%, по меньшей мере на 10 но не более, чем на 60%, по меньшей мере на 15, но не более, чем на 60%, по меньшей мере на 20, но не более, чем на 60%, по меньшей мере на 30 но не более, чем на 60%, по меньшей мере на 40, но не более, чем на 60%, по меньшей мере на 5, но не более, чем на 50%, по меньшей мере на 10 но не более, чем на 50%, по меньшей мере на 15, но не более, чем на 50%, по меньшей мере на 20, но не более, чем на 50%, по меньшей мере на 30, но не более, чем на 50%, по меньшей мере на 40, но не более, чем на 50%, по меньшей мере на 5, но не более, чем на 40%, по меньшей мере на 10, но не более, чем на 40%, по меньшей мере на 15, но не более, чем на 40%, по меньшей мере на 20, но не более, чем на 40%, по меньшей мере на 30, но не более, чем на 40%, по меньшей мере на 35, но не более, чем на 40%, по меньшей мере на 5, но не более, чем на 30%, по меньшей мере на 10, но не более, чем на 30%, по меньшей мере на 15, но не более, чем на 30%, по меньшей мере на 20, но не более, чем на 30%, или по меньшей мере на 25, но не более, чем на 30%.
Степень ингибирования mTOR может быть передана как или соответствует степени ингибирования киназы S6, например, степень ингибирования mTOR можно определить по уровню снижения активности киназы S6, например, по уменьшению фосфорилирования субстрата киназы S6. Уровень ингибирования mTOR можно оценить различными способами, такими как измерение активности киназы P70 S6 анализом Boulay, как описано в заявке на патент США № 2015/01240036, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, или как описано в патенте США № 7727950, включенном в настоящее описание в качестве ссылки; измерение уровня фосфорилированной S6 вестерн-блоттингом или оценка изменения в отношении PD1 отрицательные иммунные эффекторные клетки/PD1 положительные иммунные эффекторные клетки.
Используемый в настоящем описании термин «ингибитор mTOR» относится к соединению или лиганду или его фармацевтически приемлемой соли, которые ингибируют киназу mTOR в клетке. В одном воплощении ингибитор mTOR представялет собой аллостерический ингибитор. Аллостерические ингибиторы mTOR включают нейтральное трициклическое соединение рапамицин (сиролимус), родственные рапамицину соединения, т.е., соединения, имеющие структурное и функциональное подобие рапамицину, включая, например, производные рапамицина, аналоги рапамицина (также называемые рапалогами) и другие макролидные соединения, которые ингибируют активность mTOR. В одном воплощении ингибитор mTOR представялет собой каталитический ингибитор.
Рапамицин явялется известным макролидным антибиотиком, продуцируемым Streptomyces hygroscopicus, имеющим структуру, показанную формулой А.
(A)
См., например, McAlpine J.B. et al., J. Antibiotics (1991), 44: 688; Schreiber S.L. et al., J. Am. Chem. Soc. (1991), 113: 7433; патент СШЩА № 3929992. Существуют различные схемы, предложенные для рапамицина. Для того, чтобы избежать путаницы, когда в настоящем описании называются конкретные аналоги рапамицина, названия даны со ссылкой на рапамицин с использованием схемы нумерации формулы А.
1
1
Аналоги рапамицина, применимые в изобретении, представляют собой, например, О-замещенные аналоги, в которых гидроксильная группа на циклогексильном цикле рапамицина замещена OR, в которой R представляет собой гидроксиалкил, гидроксиалкоксиалкил, ациламиноалкил или аминоалкил; например, RAD001, также известный как эверолимус, как описано в US 5665772 и WO94/09010, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Другие подходящие аналоги рапамицина включают аналоги, замещенные в положении 26 или 28. Аналог рапамицина может представлять собой эпимер аналога, указанного выше, в частности, эпимер аналога, замещенного в положении 40, 28 или 26, и необязательно может быть дополниетльно гидрирован, например, как описано в US 7091213, WO98/02441 и WO01/14387, включенных в настоящее описание в качестве ссылок, например, AP23573, также известный как ридафоролимус.
Примеры аналогов рапамицина из US 5665772, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются перечисленным, 40-O-бензил-рапамицин, 40-O-(4'-гидроксиметил)бензилрапамицин, 40-O-[4'-(1,2-дигидроксиэтил)]бензилрапамицин, 40-O-аллилрапамицин, 40-O-[3'-(2,2-диметил-1,3-диоксолан-4(S)-ил)-проп-2'-ен-1'-ил]рапамицин, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-дигидроксипент-2'-ен-1'-ил)рапамицин, 40-O-(2-гидрокси)этоксикарбонилметилрапамицин, 40-O-(2-гидрокси)этилрапамицин, 40-O-(3-гидрокси)пропилрапамицин, 40-O-(6-гидрокси)гексилрапамицин, 40-O-[2-(2-гидрокси)этокси]этилрапамицин, 40-O-[(3S)-2,2-диметилдиоксолан-3-ил]метилрапамицин, 40-O-[(2S)-2,3-дигидроксипроп-1-ил]-рапамицин, 40-O-(2-ацетокси)этилрапамицин, 40-O-(2-никотиноилокси)этилрапамицин, 40-O-[2-(N-морфолино)ацетокси]этилрапамицин, 40-O-(2-N-имидазолилацетокси)этилрапамицин, 40-O-[2-(N-метил-N'-пиперазинил)ацетокси]этилрапамицин, 39-O-десметил-39,40-O,O-этиленрапамицин, (26R)-26-дигиро-40-O-(2-гидрокси)этилрапамицин, 40-O-(2-аминоэтил)рапамицин, 40-O-(2-ацетаминоэтил)рапамицин, 40-O-(2-никотинамидоэтил)рапамицин, 40-O-(2-(N-метилимидазо-2'-илкарбэтоксамидо)этил)рапамицин, 40-O-(2-этоксикарбониламиноэтил)рапамицин, 40-O-(2-толилсульфонамидоэтил)рапамицин и 40-O-[2-(4',5'-дикарбоэтокси-1',2',3'-триазол-1'-ил)этил]рапамицин.
Другие аналоги рапамицина, применимые в настоящем изобретении, представляют собой аналоги, в которых гидроксильная группа на циклогексильном цикле рапамицина и/или гидроксигруппа в положении 28 заменена сложной гидроксиэфирной группой, например, аналоги рапамицина, найденные в US RE44768, например, темсиролимус.
Другие аналоги рапамицина, применимые в настоящем изобретении, включают аналоги, в которых метоксигруппа в положении 16 заменена другим заместителем, предпочтительно (необязательно гидроксизамещенным) алкинилокси, бензилом, ортометоксибензилом или хлорoбензилом, и/или где метоксигруппа в положении 39 удалена вместе с углеродом 39, так что циклогексильный цикл рапамицина становится циклопентильным циклом, утрачивая метоксигруппу в положении 39; например, как описано в WO95/16691 и WO96/41807, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Аналоги также могут быть модифицированы так, что гидрокси в положении 40 рапамицина алкилируется и/или восстанавливается карбонил 32.
Аналоги рапамицина из WO95/16691 включают, но не ограничиваются перечисленным, 16-деметокси-16-(пент-2-инил)оксирапамицин, 16-деметокси-16-(бут-2-инил)оксирапамицин, 16-деметокси-16-(пропаргил)оксирапамицин, 16-деметокси-16-(4-гидроксибут-2-инил)оксирапамицин, 16-деметокси-16-бензилокси-40-O-(2-гидроксиэтил)рапамицин, 16-деметокси-16-бензилоксирапамицин, 16-деметокси-16-ортометоксибензилрапамицин, 16-деметокси-40-O-(2-метоксиэтил)-16-пент-2-инил)оксирапамицин, 39-деметокси-40-дезокси-39-формил-42-норрапамицин, 39-деметокси-40-дезокси-39-гидроксиметил-42-норрапамицин, 39-деметокси-40-дезокси-39-карбокси-42-норрапамицин, 39-деметокси-40-дезокси-39-(4-метилпиперазин-1-ил)карбонил-42-норрапамицин, 39-деметокси-40-дезокси-39-(морофлин-4-ил)карбонил-42-норрапамицин, 39-деметокси-40-дезокси-39-[N-метил,N-(2-пиридин-2-илэтил)]карбамоил-42-норрапамицин и 39-деметокси-40-дезокси-39-(п-толуолсульфонилгидразонометил)-42-норрапамицин.
Аналоги рапамицина из WO96/41807 включают, но не ограничиваюся перечисленным, 32-дезоксорапамицин, 16-O-пент-2-инил-32-дезоксорапамицин, 16-O-пент-2-инил-32-дезоксо-40-O-(2-гидроксиэтил)рапамицин, 16-O-пент-2-инил-32-(S)-дигидро-40-O-(2-гидроксиэтил)рапамицин, 32(S)-дигидро-40-O-(2-метокси)этилрапамицин и 32(S)-дигидро-40-O-(2-гидроксиэтил)рапамицин.
Другим подходящим аналогом рапамицина является умиролимус, описанный в US2005/0101624, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
RAD001, иначе известный как эверолимус (афинитор), имеет химическое название (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-дигидрокси-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-гидроксиэтокси)-3-метоксициклогексил]-1-метилэтил}-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаметил-11,36-диокса-4-азатрицикло[30.3.1.04,9]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-2,3,10,14,20-пентаон, как описано в US 5665772 и WO94/09010, включенных в настоящее описание в качестве ссылок.
Другие примеры аллостерических ингибиторов mTOR включают сиролимус (рапамицин, AY-22989), 40-[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метил пропаноат]рапамицин (также называемый темсиролимусом или CCI-779) и ридафоролимус (AP-23573/-8669). Другие примеры аллостерических ингибиторов mTOR включают зотаролимус (ABT578) и умиролимус.
С другой стороны или дополнительно обнаружено, что АТФ-конкурентные ингибиторы mTOR таргетируют непосредственно домен киназы mTOR, и таргетируют как mTORС1, так и mTORС2. Они также являются более эффективными ингибиторами mTORС1, чем такие аллостерические ингибиторы mTOR, как рапамицин, поскольку они модулируют устойчивые к рапамицину действия mTORС1, такие как фосфорилирование 4ЕВР1-Т37/46 и кэпзависимая трансляция.
Каталитические ингибиторы включают BEZ235 или 2-метил-2-[4-(3-метил-2-оксо-8-хинолин-3-ил-2,3-дигидроимидазо[4,5-c]хинолин-1-ил)фенил]пропионитрил или форму соли монотозилата. Синтез BEZ235 описан в WO2006/122806; CCG168 (иначе известный как AZD-8055, Chresta C.M., et al., Cancer Res., 2010, 70(1), 288-298), который имеет химическое название {5-[2,4-бис-((S)-3-метилморфолин-4-ил)пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил]-2-метокси-фенил}метанол; 3-[2,4-бис[(3S)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил]-N-метилбензамид (WO09104019); 3-(2-аминобензо[d]оксазол-5-ил)-1-изопропил-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-4-амин (WO10051043 и WO2013023184); A N-(3-(N-(3-((3,5-диметоксифенил)амино)хиноксалин-2-ил)сульфамоил)фенил)-3-метокси-4-метилбензамид (WO07044729 и WO12006552); PKI-587 (Venkatesan A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645), который имеет химическое название 1-[4-[4-(диметиламино)пипридин-1-карбонил]фенил]-3-[4-(4,6-диморфолино-1,3,5-триазин-2-ил)фенил]мочевина; GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43), который имеет химическое название 2,4-дифтор-N-{2-метокси-5-[4-(4-пиридазинил)-6-хинолинил]-3-пиридинил}бензолсульфонамид; 5-(9-изопропил-8-метил-2-морфолино-9H-пурин-6-ил)пиримидин-2-амин (WO10114484); (E)-N-(8-(6-амино-5-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1-(6-(2-цианопропан-2-ил)пиридин-3-ил)-3-метил-1H-имидазо[4,5-c]хинолин-2(3H)-илиден)цианамид (WO12007926).
Другие примеры каталитических ингибиторов mTOR включают 8-(6-метоксипиридин-3-ил)-3-метил-1-(4-пиперазин-1-ил-3-трифторметил-фенил)-1,3-дигидроимидазо[4,5-c]хинолин-2-он (WO2006/122806) и Ku-0063794 (Garcia-Martinez JM et al., Biochem. J., 2009, 421(1), 29-42. Ku-0063794 является специфическим ингибитором мишени рапамицина у млекопитающего (mTOR). WYE-354 представляет собой другой пример каталитического ингибитора mTor (Yu K. et al. (2009), Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240).
Ингибиторы mTOR, применимые согласно настоящему изобретению, также включают их пролекарства, производные, фармацевтически приемлемые соли или аналоги любого из указанных выше.
Ингибиторы mTOR, такие как RAD001, можно ввести в композиции для доставки на основе хорошо известных способов в технике, основанных на определенных дозировках, описанных в настоящем описании. В частности, в патенте США 6004973 (включенном в настоящее описание в качестве ссылки) приводятся примеры композиций, которые можно применять с ингибиторами mTOR, описанными в настоящем описании.
Способы и биомеркеры для оценки эффективности CAR или пригодности образцов
В другом аспекте изобретение относится к способу оценки или контроля эффективности терапии CAR-экспрессирующими клетками (например, терапии CLL-1-CAR) для пациента (например, пациента, имеющего рак, например, гематологический рак) или пригодности образца (например, образца афереза) для CAR-терапии (например, терапии CLL-1-CAR). Способ включает получение величины эффективности терапии CAR или пригодности образца, в котором указанная величина является показателем эффективности или пригодности терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В воплощениях величина эффективности терапии с CAR или пригодности образца включает измерение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести или более (всех) параметров из следующих:
EFF
REG
(i) уровень активности одной, двух, трех или больше (например, всех) покоящихся клеток T, покоящихся клеток T, молодых T-клеток (например, молодых CD4 или CD8 клеток или гамма/дельта T-клеток), или ранних Т-клеток памяти или их комбинации в образце (например, аферезном образце или образце продукта, произведенного CAR-экспрессирующей клеткой);
EFF
REG
(ii) уровень активности одной, двух, трех или больше (например, всех) активированных T-клеток, активированных T-клеток, старых T-клеток (например, старых CD4 или CD8 клеток или гамма/дельта T-клеток), или поздних Т-клеток памяти или их комбинации в образце (например, аферезном образце или образце продукта, произведенного CAR-экспрессирующей клеткой);
(iii) уровень активности маркера истощения иммунных клеток, например, одного, двух или больше иммунных реперных ингибиторов (например, PD-1, PD-L1, TIM-3 и/или LAG-3) в образце (например, аферезном образце или образце продукта, произведенного CAR-экспрессирующей клеткой) (В одном воплощении иммунная клетка имеет истощенный фенотип, например, коэкспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, например, коэкспрессирует PD-1 и TIM-3. В других воплощениях иммунная клетка имеет истощенный фенотип, например, коэкспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, например, коэкспрессирует PD-1 и LAG-3.);
(iv) уровень активности CD27 и/или CD45RO- (например, CD27+ CD45RO-) иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD4+ или CD8+ T-клеток в образце (например, аферезном образце или образце продукта, произведенного CAR-экспрессирующей клеткой);
(v) уровень активности одного, двух, трех, четырех, пяти, десяти, двадцати или больше биомаркеров, выбранных из CCL20, IL-17a и/или IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1;
(vi) уровень активности цитокинов (например, качества репертуара цитокинов) в образце продукта CAR-экспрессирующей клетки, например, образце продукта CLL-1-экспрессирующей клетки;
(vii) эффективность трансдукции CAR-экспрессирующей клетки в образце продукта, произведенного CAR-экспрессирующей клеткой.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, терапия CAR-экспрессирующими клетками включает множество (например, популяцию) CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток, например, множество (например, популяцию) Т-клеток или NK-клеток или их комбинацию. В одном воплощении терапия CAR-экспрессирующими клетками представляет собой терапию CLL-1-CAR.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, меру одного или нескольких (i)-(vii) получают из аферезного образца, взятого у субъекта. Аферезный образец можно оценить перед инфузией или реинфузией.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, меру одного или нескольких (i)-(vii) получают из образца продукта, произведенного CAR-экспрессирующей клеткой, например, образца продукта CLL-1-CAR-экспрессирующей клетки. Продукт, произведенный CAR-экспрессирующей клеткой, можно оценить перед инфузией или реинфузией.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, оценивают состояние субъекта до получения, во время или после получения терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, мера одного или нескольких (i)-(vii) оценивает профиль экспрессии одного или нескольких из генов, проточной цитометрии или экспрессии белка.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, способ дополнительно включает идентификацию субъекта как респондер, нереспондер, переносящего рецидив или непереносящего рецидив на основании меры одного или нескольких (i)-(vii).
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, респондер (например, полный респондер) имеет или идентифицирован как имеющий более высокий уровень активности одного, двух или больше (всех) GZMK, PPF1BP2 или наивных Т-клеток, по сравнению с нересондером.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, нереспондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий уровень активности одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или больше (например, всех) из IL22, IL-2RA, IL-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, эффекторных T-клеток или регуляторных Т-клеток, по сравнению с респондером.
В некоторых воплощениях переживающий рецидив представляет собой пациента, имеющего, или пациента, который идентифицирован как имеющий, по сравнению с непереживающим рецидив, повышенный уровень экспрессии одного или нескольких (например, 2, 3, 4 или всех) из следующих генов: MIR199A1, MIR1203, uc021ovp, ITM2C и HLA-DQB1, и/или пониженные уровни экспрессии, по сравнению с непереживающим рецидив, одного или нескольких (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или всех) из следующих генов: PPIAL4D, TTTY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNA00185, SULT1E1 и EIF1AY.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, полный респондер имеет или идентифицирован как имеющий, более высокий, например, статистически значимый более высокий, процент CD8+ T-клеток по сравнению с эталонной величиной, например, процентом CD8+ T-клеток у нереспондера.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, полный респондер имеет или идентифицирован как имеющий, более высокий, например, статистически значимый более высокий, процент CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD8+, по сравнению с эталонной величиной, например, числом CD27+ CD45RO- иммунных эффекторных клеток у нереспондера.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, полный респондер или неполный респондер имеет или идентифицирован как имеющий, более высокий, например, статистически значимый более высокий, процент CD4+ T-клеток по сравнению с эталонной величиной, например, процентом CD4+ T-клеток у нереспондера.
EFF
REG
EFF
REG
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, полный респондер имеет или идентифицирован как имеющий, более высокий процент одной, двух, трех или больше (например, всех) покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, молодых T-клеток (например, молодых CD4 или CD8 клеток или гамма/дельта T-клеток) или ранних T-клеток памяти или их комбинации по сравнению с эталонной величиной, например, числом покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, молодых T-клеток (например, молодых CD4 или CD8 клеток) или ранних T-клеток памяти у нереспондера.
EFF
REG
EFF
REG
,
,
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, нереспондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент одной, двух, трех или больше (например, всех) активированных T-клеток, активированных T-клеток, старых T-клеток (напримерстарых CD4 или CD8 клеток) или поздних T-клеток памяти или их комбинации по сравнению с эталонной величиной, например, числом активированных T-клеток, активированных T-клеток, старых T-клеток (напримерстарых CD4 или CD8 клеток) или поздних T-клеток памяти у респондера.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, нереспондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент маркера истощения иммунных клеток, например, одного, двух или больше иммунных реперных ингибиторов (например, PD-1, PD-L1, TIM-3 и/или LAG-3). В одном воплощении нереспондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент PD-1, PD-L1, TIM-3 и/или LAG-3 экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, CD4+ Т-клеток и/или CD8+ Т-клеток) (например, CAR-экспрессирующих CD4+ клеток и/или CD8+ Т-клеток) по сравнению с процентом PD-1 и/или LAG-3 экспрессирующих иммунных эффекторных клеток у респондера.
В одном воплощении нереспондаер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент иммунных клеток, имеющих истощенный фенотип, например, иммунных клеток, которые коэкспрессируют по меньшей мере два маркера истощения, например, коэкспрессируют PD-1, PD-L1 и/или TIM-3. В других воплощениях нереспондаер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент иммунных клеток, имеющих истощенный фенотип, например, иммунных клеток, которые коэкспрессируют по меньшей мере два маркера истощения, например, коэкспрессируют PD-1 и LAG-3.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, нереспондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент PD-1/PD-L1+/LAG-3+ в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CLL-1-CAR клеток) по сравнению с респондером (например, полным респондером) для терапии CAR-экспрессирующими клетками.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, неполный респондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент PD-1/PD-L1+/LAG-3+ клеток, чем репондер, в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CLL-1-CAR+ клеток).
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, нереспондер имеет или идентифицирован как имеющий истощенный фенотип PD-1/PD-L1+/CAR+ и коэкспрессию LAG-3 в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CLL-1-CAR+ клеток).
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, нереспондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий процент PD-1/PD-L1+/TIM-3+ клеток в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CLL-1-CAR+ клеток), по сравнению с респондером (например, полным респондером).
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, неполный респондер имеет или идентифицирован как имеющий более высокий, чем респондер, процент PD-1/PD-L1+/TIM-3+ клеток в популяции CAR-экспрессирующих клеток (например, популяции CLL-1-CAR+ клеток).
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, присутствие CD8+ CD27+ CD45RO- T-клеток в аферезном образце является положительным предсказанием реакции субъекта на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию CLL-1-CAR).
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, высокий процент PD1+ CAR+ и LAG3+ или TIM3+ T-клеток в аферезном образце является плохим прогностическим предсказанием реакции субъекта на терапию CAR-экспрессирующими клетками (например, терапию CLL-1-CAR).
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, респондер (например, полный или неполный респондер) имеет один, два, три или больше (или все) из следующих профилей:
(i) имеет большее число CD27+ иммунных эффекторных клеток по сравнению с эталонной величиной, например, числом CD27+ иммунных эффекторных клеток у нереспондера;
(ii) имеет большее число CD8+ Т-клеток по сравнению с эталонной величиной, например, числом CD8+ Т-клеток у нереспондера;
(iii) имеет меньшее число иммунных клеток, экспрессирующих один или несколько реперных ингибиторов, например, реперных ингибиторов, выбранных из PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 или KLRG-1 или их комбинации, по сравнению с эталонной величиной, например, числом клеток, экспрессирующих один или несколько реперных ингибиторов, у нереспондера;
EFF
REG
EFF
REG
(iv) имеет большее число одной, двух, трех, четырех или больше (всех) покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, наивных CD4 клеток, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти или их комбинации по сравнению с эталонной величиной, например, числом покоящихся T-клеток, покоящихся T-клеток, наивных CD4 клеток, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти у нереспондера.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, уровень цитокинов или активность (vi) выбирают для одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или больше (или всех) цитокинов CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSF, IFNγ, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 или TNFα или их комбинации. Цитокин можно выбрать из одного, двух, трех, четырех или больше (или всех) цитокинов IL-17a, CCL20, IL2, IL6 или TNFα. В одном воплощении повышенный уровень или активность цитокина выбирают для одного или обоих из IL-17a и CCL20, и это является показателем повышенной чувствительности или сниженного рецидива.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, эффективность трансдукции в (vii) 15% или выше является показателем повышенной чувствительности или сниженного рецидива.
В некоторых воплощениях любого из способов, раскрытых в настоящем описании, эффективность трансдукции в (vii) 15% или ниже является показателем пониженной чувствительности или повышенного рецидива.
В воплощениях респондера, нереспондера, переживающего рецидив или непереживающего рецидив, идентифицированного способами по настоящему изобретению, можно дополнительно оценить согласно клиническим критериям. Например, полный респондер представляет собой или идентифицирован как субъект, имеющий заболевание, например, рак, который показывает завершенную реакцию, например, полную ремиссию, на лечение. Завершенную реакцию можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines или по Cheson et al., J. Clin. Oncol., 17: 1244 (1999); и Cheson et al., «Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma», J. Clin. Oncol., 25: 579-586 (2007) (обе работы полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок), как описано в настоящем описании. Неполный респондер представляет собой или идентифицирован как субъект, имеющий заболевание, например, рак, который показывает частичную реакцию, например, частичную ремиссию, на лечение. Частичную ремиссию можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines или критерия Cheson, как описано в настоящем описании. Нереспондер представляет собой или идентифицирован как субъект, имеющий заболевание, например, рак, который не показывает реакцию на лечение, например, пациент имеет стабильное заболевание или прогрессирующее заболевание. Нереспондер может быть идентифицирован, например, с использованием NCCN Guidelines или критерия Cheson, как описано в настоящем описании.
Альтернативно или в комбинации со способами, раскрытыми в настоящем описании, чувствительными к указанной величине, выполняют одно, два, три, четыре или больше действий из
назначения, например, респондеру или нереспондеру терапии CAR-экспрессирующими клетками;
введения изменных доз при терапии CAR-экспрессирующими клетками;
изменения схемы или длительности курса терапии CAR-экспрессирующими клетками;
введения, например, нереспондеру или неполному респондеру дополнительного средства в комбинации с терапией CAR-экспрессирующими клетками, например, реперного ингибиторв, например, реперного ингибиторв, описанного в настоящем описании;
назначения нереспондеру или неполному респондеру терапии, которая повышает число молодых Т-клеток у субъекта перед лечением терапией CAR-экспрессирующими клетками;
модификации процесса производства терапии CAR-экспрессирующими клетками, например, обогащая молодыми Т-клетами перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, или повышая эффективность трансдукции, например, у субъекта, идентифицированного как нереспондер или неполный респондер;
назначения альтернативной терапии, например, для нереспондера или неполного респондера или переживающего рецидив; или
REG
если субъект представляет собой или идентифицирован как нереспондер или переживающий рецидив, снижения популяции Т-клеток и/или сигнатуры гена T, например, путем одного или нескольких действий из истощения CD25, введения циклофосфамида, анти-GITR антитела или их комбинации.
В некоторых воплощениях субъекта предварительно лечат анти-GITR антителами. В некоторых воплощениях субъекта лечат анти-GITR антителами преде инфузией или реинфузией.
Способы доставки биополимеров
В некоторых воплощениях одну или несколько CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании, можно вводить или доставлять субъекту через биополимерный каркас, например, биополимерный имплантат. Биополимерные каркасы могут поддерживать или усиливать доставку, экспансию и/или рассредоточение CAR-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем описании. Биополимерный каркас включает биосовместимый (например, по существу не вызывающий воспалительной или иммунной реакции) и/или биоразлагаемый полимер, который может встречаться в природе или быть синтетическим.
Примеры подходящих биополимеров включают, но не ограничиваются перечисленным, агар, агарозу, альгинат, смесь альгинат/кальцийфосфатный цемент (СРС), бета-галактозидазу (β-GAL), (1,2,3,4,6-пентаацетил-a-D-галактозу), целлюлозу, хитин, хитозан, коллаген, эластин, желатин, гиалуроновую кислоту-коллаген, гидроксиапатит, сополимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата (РНВРРх), полилактид, поликапролактон (PCL), сополимер лактида и гликолида (PLG), полиэтиленоксид (ПЭО), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLCA), полипропиленоксид (ППО), поливиниловый спирт (ПВС), шелк, соевый белок и изолят соевого белка, одни или в комбинации с любой другой полимерной композицией в любой концентрации и в любом соотношении. Биополимер может быть дополнен или модифицирован молекулами, промотирующими адгезию или миграцию, например, коллагенимитирующими пептидами, которые связываются с коллагеновым рецептором лимфоцитов, и/или подобными молекулами, которые усиливают доставку, экспансию или функцию, например, противораковую активность клеток, которые доставляются. Биополимерный каркас может быть инъецируемым, например, гелем или полутвердым веществом, или представлять собой твердую композицию.
Nature Biotechnology
В некоторых воплощениях CAR-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем описании, высевают на биополимерный каркас перед доставкой субъекту. В воплощениях биополимерный каркас дополнительно включает одно или два дополнительных терапевтических средства, описанных в настоящем описании (например, другую CAR-экспрессирующую клетку, антитело или малую молекулу), или средства, которые усиливают активность CAR-экспрессирующей клетки, например, внедренной или конъюгированной с биополимерами каркаса. В воплощениях биополимерный каркас инъецируют, например, внутропухолево, или хирургически имплантируют в опухоль или достаточно близко к опухоли, для опосредования противоопухолевого действия. Другие примеры биополимерных композиций и способов их доставки описаны в Stephan et al., , 2015, 33: 97-101; и WO2014/110591.
Фармацевтические композиции и лечение
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать CAR-экспрессирующую клетку, например, множество CAR-экспрессирующих клеток, как описано в настоящем описании, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или эксципиентами. Такие воплощения могут включать забуференный физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТК или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Композиции по настоящему изобретению в одном аспекте получают для внутривенного введения.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить способом, подходящим для заболевания, от которого лечат (или которое предупреждают). Количество композиции и частота введения будут определяться такими факторами, как состояние пациента и тип и тяжесть заболевания пациента, хотя соответствующие дозировки можно определить клиническими испытаниями.
В одном воплощении фармацевтическая композиции по существу свободна, например, не имеется детектируемых уровней примеси, например, выбранной из группы, включающей эндотоксин, микоплазму, репликационно-компетентный лентивирус (RCL), p24, VSV-G нуклеиновую кислоту, ВИЧ gag, остаточные гранулы, покрытые анти-CD3/анти-CD28, мышиные антитела, собранную сыворотку человека, бычий сывороточный альбумин, сыворотку коровы, компоненты культуральных сред, компоненты клетки, пакующей вектор, или плазмиды, бактерии и грибы. В одном воплощении бактерия представляет собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, включающей Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia и Streptococcus pyogenes группы A.
4
9
5
6
Когда указывается «иммунологически эффективное количество», «противораковое эффективное количество», «опухольингибирующее эффективное количество» или «терапевтическое количество», точное количество вводимых композиций по настоящему изобретению может определить врач с учетом индивидуальных отличий в возрасте, массе, размере опухоли, степени заражения или метастазирования и состояния пациента (субъекта). Как правило, можно установить, что фармацевтическую композицию, включающую Т-клетки, описанные в настоящем описании, можно вводить в дозировке 10-10 клетки/кг массы тела, в некоторых случаях 10-10 клетки/кг массы тела, включая все целые величины в указанных интервалах. Композиции с Т-клетками также можно вводить несколько раз в таких дозировках. Клетки можно вводить, используя методы инфузии, которые обычно известны в иммунотерапии (см., например Rosenberg et al., New Eng. J. of Med., 319: 1676, 1988).
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
В некоторых аспектах может быть желательно введение субъекту активированных Т-клеток и затем по существу повторно взять кровь (или иметь выполненный аферез), активировать Т-клетки из нее согласно настоящему изобретению и реинфузировать пациенту такими активированными и выращенными Т-клетками. Такой процесс можно выполнять несколько раз каждые несколько недель. В некоторых аспектах можно активировать Т-клетки из вытяжек крови от 10 см до 400 см. В некоторых аспектах Т-клетки активируют из вытяжек крови 20 см, 30 см, 40 см, 50 см, 60 см, 70 см, 80 см, 90 см или 100 см.
Введение композиций субъекту можно выполнить любым удобным способом, включая аэрозльную ингаляцию, инъекцию, проглатывание, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Композиции, описанные в настоящем изобретении, можно вводить пациенту трансартериально, подкожно, интрадермально, внутриопухолево, интранодулярно, интрамедулярно, внутримышечно, внутривенной (i.v.) инъекцией или интраперитонеально. В одном аспекте композиции Т-клеток по настоящему изобретению вводят пациенту интрадермальной или подкожной инъекцией. В одном аспекте композиции CAR-экспрессирующих клеток (например, Т-клеток или NK-клеток) по настоящему изобретению вводят i.v. инъекцией. Композиции CAR-экспрессирующих клеток (например, Т-клеток или NK-клеток) можно инъецировать непосредственно в опухоль, лимфоузел или место заражения.
В примере определенного аспекта субъекты могут подвергаться лейкаферезу, когда лейкоциты собирают, обогащают или деплетируют ex vivo для селекции и/или выделения интересующих клеток, например, иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток). Ткие изоляты иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток или NK-клеток) можно размножить способами, известными в технике, и обработать так, что можно ввести одну или несколько конструкций CAR по изобретению, причем посредством этого создают CAR-экспрессирующую клетку (например, CAR-Т-клетку или CAR-экспрессирующую NK-клетку) по изобретению. Затем субъектов, нуждающихся в этом, подвергают стандартному лечению высокой дозой химиотерапии с последующей тансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых аспектах после или одновременно с трансплантатом субъекты получают инфузию размноженных CAR-экспрессирующих клеток (например, CAR-Т-клеток или CAR-экспрессирующих NK-клеток) по настоящему изобретению. В другом аспекте выращенные клетки вводят перед последующей операцией.
Дозировка при вышеуказанных лечениях, вводимая пациенту, будет изменяться в связи с точной природой состояния, от которого лечат, и реципиента лечения. Изменение размера дозировки для введения человеку можно выполнить согласно практике, установленной в технике. Доза в случае САМРАТН, например, как правило, будет находиться в интервале 1 - примерно 100 мг для взрослого пациента, вводимая обычно ежедневно в течение периода от 1 до 30 дней. Предпочтительная суточная доза составляет 1-10 мг в день, хотя в некоторых случаях могут использоваться большие дозы до 40 мг в день (описано в патенте США № 6120766).
В одном воплощении CAR внедряют в иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), например, с использованием транскрипции in vitro, и субъект (например, человек) получает начальное введение CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток) по изобретению и одно или два последующих введения CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток) по изобретению, причем одно или два последующих введения назначают менее, чем через 15 дней, например, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 дня после предыдущего введения. В одном воплощении субъекту (например, человеку) назначают более одного введения CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток) по изобретению в неделю, например, 2, 3 или 4 введения CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток) по изобретению в неделю. В одном воплощении субъект (например, человек) получает более одного введения CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток) по изобретению в неделю (например, 2, 3 или 4 введения в неделю) (также называемого в настоящем описании циклом) с последующими недельными введениями CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток), и затем субъекту назначают одно или несколько дополнительных введений CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток) (например, более одного введения CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток) в неделю). В другом воплощении субъект (например, человек) получает более одного цикла CAR-экспрессирующих иммунных эффекторных клеток (например, Т-клеток, NK-клеток), и время между каждыми циклами составляет менее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 дней. В одном воплощении CAR-экспрессирующие иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки, NK-клетки) вводят через день 3 введения в неделю. В одном воплощении CAR-экспрессирующие иммунные эффекторные клетки (например, Т-клетки, NK-клетки) по изобретению вводят в течение по меньшей мере двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более недель.
В одном аспекте CLL-1-CAR-экспрессирующие клетки, например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующие NK-клетки, получают с использованием лентивирусных векторов, таких как лентивирус. Получают CAR-экспрессирующие клетки, например, CLL-1-CARТ или CLL-1-CAR-экспрессирующие NK-клетки, которые будут иметь стабильную экспрессию CAR.
В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки, например, CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки, получают с использованием вирусного вектора, такого как гамма-ретровирусный вектор, например, гамма-ретровирусный вектор, описанный в настоящем описании. С использованием таких векторов получают CAR-экспрессирующие клетки, например, CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки, которые будут иметь стабильную экспрессию CAR.
В одном аспекте CAR-экспрессирующие клетки, например, CARТ или CAR-экспрессирующие NK-клетки, временно экспрессируют CAR-векторы в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней после трансдукции. Временная экспрессия CAR может быть эффективна за счет доставки РНК CAR-вектора. В одном аспекте CAR РНК трансдуцируют в Т-клетку электропорацией.
Возможной проблемой, которая может возникнуть у пациентов, которых лечат с использованием временно экспрессирующих CAR-экспрессирующих клеток, например, CARТ или CAR-экспрессирующих NK-клеток (в особенности с CARТ, имеющим мышиный scFv), является анафилаксия после нескольких лечений.
Без связи с такой теорией, полагают, что такая анафилактическая реакция может вызываться за счет развития у пациента гуморальной анти-CAR реакции, т.е., анти-CAR антител, имеющих изотип анти-IgE. Полагают, что клетки пациента, продуцирующие антитела, претерпевают смещение класса от изотипа IgG (который не вызывает анафилаксию) к изотипу IgE, когда имеется десяти-четырнадцатидневная пауза в воздействии на антиген.
Если у пациента иммется высокий риск образования реакции на анти-CAR антитела по ходу лечения терапией CAR (таких, какие образуются путем трансдукции РНК), перерывы в инфузии CART не должны длиться долее десяти-четырнадцати дней.
Примеры
Изобретение описано с дополнительными подробностями путем обращения к следующим далее экспериментальным примерам. Такие примеры предлагаются только в целях пояснения и не предназначены для ограничения, если конкретно не указано иное. Таким образом, изобретение не должно никоим образом рассматриваться как ограниченное последующими примерами, а должно рассматриваться как охватывающее любые и все варианты, которые становятся очевидными в результате указаний, приведенных в настоящем описании.
Без дополнительного описания предполагается, что специалист в данной области техники может с использованием предшествующего описания и последующих пояснительных примеров получить и использовать соединения по настоящему изобретению и осуществить на практике заявленные способы. Следующие далее рабочие примеры конкретно указывают на различные аспекты настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом остальную часть раскрытия.
Пример 1. Получение конструкций CAR
Получают полные человеческие анти-CD33 одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) и клонируют в лентивирусный эксперссирующий вектор с цепью внутриклеточного CD3-дзета и внутриклеточным костимулирующим доменом 4-1ВВ, и дают названия, приведенные в таблице 1 (которая показана в разделе «Подробное описание»).
3
4
Порядок, в котором домены VH и VL появляются в scFv, изменяют (т.е., ориентация VL-VH или VH-VL), и где или три или четыре копии субъединицы «G4S» (SEQ ID NO: 25), где каждая субъединица включает последовательность GGGGS (SEQ ID NO: 25) (например, (G4S) (SEQ ID NO: 28) или (G4S) (SEQ ID NO: 27)), соединяют вариабельные домены с образованием частицы домена scFv, как показано в таблице 2.
Последовательности фрагментов scFv человека (SEQ ID NO: 39-51) приводятся в настоящем описании в таблице 2 (в разделе «Подробное описание»). Указанные клоны все содержат замену остатка Q/K в сигнальном домене костимулирующего домена, полученного из цепи CD3-дзета. Затем фрагменты CAR scFv клонируют в лентивирусные векторы для создания полноразмерной конструкции CAR в сигнальной кодирующей рамке, и используя промотор EF1-альфа для экспрессии (SEQ ID NO: 11).
Последовательности конструкций CAR и последовательности их доменов перечислены в разделе «Подробное описание». Анализ конструкций CAR человека проводят так, как описано в примерах 2-5.
Пример 2. Анализ и активность in vitro scFv человека, содержащего CART
Анти-CLL-1-CAR конструкции оценивают на активность с использованием линии клеток Юкарта, содержащей люциферазный репортер, полученный с помощью промотора NFAT (названы клетками JNL). Активность CAR измеряют как активацию такого NFAT-полученного репортера. Лентивирусные супернатанты, содержащие контсрукции CARТ, добавляют к клеткам JNL для трансдукции. Через 4-6 дней после трансдукции клетки JNL оценивают на экспрессию CAR FACS, как описано ниже (фиг. 2А, 2В и 2С), или смешивают с мишень-положительными (PL21, THP1, HL60, U937) или мишень-отрицательными (К562) клеточными линиями в указанном отношении эффектора (JNL) к клеточной линии-мишени (Е:Т) для запуска активации. После 20-часовой совместной инкубации измеряют люциферазный сигнал с использованием люциферазного анализа Bright-Glo™ Luciferase Assay на приборе EnVision (фиг. 1A, 1B и 2C).
Оптимальные анти-CLL-1-CAR конструкции отбирают на основании количества и качества эффекторных Т-клеточных реакций CLL-1-CAR-трансдуцированных Т-клеток («CARТ-CLL-1» или «CARТ-CLL-1 Т-клеток») в ответ на CLL-1-экспрессирующие («CLL-1+») мишени. Эффекторные Т-клеточные реакции включают, но не ограничиваются перечисленным, экспансию, пролиферацию, удвоение, продуцирование цитокинов и киллинг клеток-мишеней или цитолитическую активность (дегрануляцию).
Генерация CARТ-CLL-1
Человеческий scFv, кодирующий лентивирусные трансферные векторы, используют для получения геномного материала, упакованного в VSV псевдотипированные лентивирусные частицы. ДНК лентивирусного трансферного вектора смешивают с тремя пакующими компонентами VSVg, gag/pol и rev в комбинации с реагентом липофектамином для их трансфекции вместе в клетках Lenti-X 293T (Clontech).
2.
6
Через 30 часов среды собирают, фильтруют и хранят при -80°С. Терапевтические CARТ-CLL-1 получают, исходя из крови здорового аферезного донора, чьи наивные Т-клетки получают отрицательной селекцией в отношении Т-клеток, CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Такие клетки активируют гранулами CD3×28 Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28, Invitrogen) в отношении 1:3 в RPMI 1640, 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS), 2 мM L-глутамина, 1× пенициллина/стрептомицина, 100 мкM заменимых аминокислот, 1 мM пирувата Na, 10 мM Hepes и 55 мкM 2-меркаптоэтанола, при 37°C, 5% COТ-Клетки культивируют при 1×10 T-клеток в 0,5 мл среды на лунку 24-луночного планшета. Через 24 часа Т-клетки дробятся, и добавляют 0,5 мл вирусного супернатанта. T-Клетки начинают делиться по логарифмическому типу роста, который контролируют, измеряя число клеток на мл, и Т-клетки разбавляют свежей средой каждые два дня. Когда Т-клетки начинают оставаться без изменений приблизительно через 10 дней, логарифмический рост ослабевает. Комбинация замедления скорости роста и объема Т-клеток, приближающегося к ~300 фл, определяет состояние Т-клеток для криоконсервации для дальнейших анализов.
Перед криоконсервацией определяют процент трансдуцированных клеток (экспрессирующих анти-CLL-1-CAR на клеточной поверхности) и их относительную интенсивность флуоресценции экспрессии анализом методом проточной цитометрии на BD LSRFortessa или BD-FACSCanto с использованием или белка L (фиг. 3A и 22A) или биотинилированного рекомбинантного человеческого белка CLL-1 как реагентов детекции (фиг. 3B и 22B). Строят гистограммы относительной интенсивности флуоресценции, из которых FACS показывает процент трансдуцированных T-клеток. Результат трансдукции в интервале CART положительных клеток 10-50%.
Оценка цитолитической активности и секреции цитокинов CART-CLL-1 перенаправленных Т-клеток
Ддля того, чтобы оценить способности CART-CLL-1 Т-клеток к уничтожению и секреции цитокинов, клетки оттаивают и оставляют на ночь для восстановления.
Киллинг Т-клетками направлен на CLL-1-экспрессирующие клеточные линии острого миелоидного лейкоза PL21 (фиг. 4А) и HL-60 (фиг. 4В), стабильно экспрессирующие люциферазу. Неэкспрессирующие CLL-1 клетки U87 используют в качестве контроля (фиг. 4С), и нетрансдуцированные Т-клетки используют для определения фоновых уровней неспецифического киллинга. Цитолитическую активность CART-CLL-1 определяют в виде титрования отношений эффектор:клетка-мишень 10:1 и 3-кратных разведений по нисходящей Т-клеток, где эффекторные клетки определяют как Т-клетки, экспрессирующие анти-CLL-1 химерный рецептор. Через 20 часов измеряют люциферазный сигнал с использованием люциферазного анализа Bright-Glo™ на приборе EnVision.
Сравнение таких кривых киллинга, тирование количества эффекторных клеток показывает, что эти экспрессирующие CLL-1 клетки разрушаются. Т-Клетки от того же донора, которые трансдуцированы любыми CAR-CLL-1-клетками, имеющими человеческий scFv, способны селективно убивать CLL-1+ мишени. Представляет интерес, что активны не все клетки CART-CLL-1. Клетки CART, содержащие клон 13, в таком анализе неактивны даже в присутствии мишень-экспрессирующих клеток.
Для измерения продуцирования цитокинов клетками CART-CLL-1 клетки оттаивают и оставляют на ночь для восстановления. Нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) используют в качестве неспецифического контроля за фоновыми эффектами Т-клеток. Т-Клетки направлены на клетки HL-60, PL21 или U87. Выполняют анализ отношения эффектор:мишень 1:1 или 10:1, как отмечалось, где эффекторы определяют как Т-клетки, экспрессирующие анти-CLL-1-CAR. Анализ проводят через 24 часа после смешивания клеток, когда среды удаляют для анализа цитокинов TNF-альфа (фиг. 5А), IL-2 (фиг. 5B) и INF-гамма (фиг. 5C), с использованием набора CBA-Flex для детекции цитокинов человека.
Когда клетки культивируют с раковыми клеткми, эндогенно экспрессирующими CLL-1, все CLL-1-CARТ, за исключением CLL-1-13, продуцируют цитокины в ответ на мишень-экспрессирующие клетки. Различие в реакционноспособности различных клонов CLL-1-CARТ в отношении слвбо CLL-1-экспрессирующих клеток-мишеней может объяснить более хорошую клиническую эффективность CART клеток, трансдуцированных такими конструкциями.
Оценка пролиферативной способности CART-CLL-1
CART-CLL-1 Т-клетки проверяют на их способность к пролиферации в ответ на воздействие антигена на клетках-мишенях. Проверяют несколько конструкций CLL-1-CAR - CLL-6, CLL-9, CLL-10, CLL-11, CLL-12 и CLL-13. Клетки-мишени включают клетки U937, PL-21, HL60 и Molm13. В день анализа (день 0) клетки-мишени считают и переносят в 50-мл пробирку в 6 мл Т-клеточных сред при 3е6 клетки/мл. Клетки-мишени облучают на льду 10000 рад. После облучения клетки-мишени дважды промывают в Т-клеточных средах, считают и ресуспендируют до 5е5 клетки/мл в клеточных средах на льду.
2
Замороженные трансдуцированные Т-клетки оттаивают, промывают в 10 мл полной Т-клеточной среды, центрифугируют при 300g в течение 10 мин и аккуратно ресуспендируют в 3 мл полной Т-клеточной среды при RT. Затем Т-клетки считают в Cellometer и ресуспендируют до 2,5 е6/мл в 10 мл среды. В 96-луночном планшете с лунками с U-образным дном комбинируют 25000 облученных клеток-мишеней и 25000 трансдуцированных CAR T-клеток (отношение 1:1) в лунках при двукратном повторе. В отдельной лунке к 25000 трансдуцированных T-клеток добавляют 75000 анти-CD3/CD28 гранул в 100 мкл среды для создания отношения клетки-к-гранулам 1:3 как положительного контроля; в другой лунке к 25000 трансдуцированных T-клеток добавляют 100 мкл одной среды как контроль только среда. Клетки инкубируют в течение 4 суток при 37°С, 5% СО.
В день 4 клетки харвестируют, и дупликаты объединяют пипетированием и переносом в одну и ту же лунку на планшете с лунками с U-образным дном для окрашивания для FACS CD4, CD8 и CAR с использованием белка L или рекомбинантного белка CLL1 человека. После окрашивания клетки ресуспендируют в 120 мкл буфера MACS+0,5% BSA, и в каждую лунку добавляют 20 мкл/лунка контросветлящих гранул. Пролиферацию измеряют как число FACS положительных клеток, детектированных за период времени, используемый для подсчета 2500 гранул.
Как видно на фигурах 23А и 23В, клетки, экспрессирующие конструкции CLL-1-CAR CLL-6, CLL-9, CLL-10, CLL-11 и CLL-12, пролиферируют в присутствии различных клеток-мишеней.
Пример 3. Исследования токсичности CLL-1
CLL-1 измеряют проточной цитометрией с использованием коммерчески доступного антитела (клон HIM3-3, eBioscience). Результаты в настоящем описании показывают, что CLL-1 экспрессируется в большинстве первичных образцов от пациентов с AML (AML бласты не выпускают с использованием характеристик бокового рассеяния малых CD45dim) (фиг. 6).
Т-Клетки от двух различных доноров трансдуцируют CLL-1 (фиг. 6), и получают эффективность трансдукции 35-45%. Т-Клетки сначала стимулируют CD3/CD28 Dynabeads (Invitrogen) и поддерживают в средах, свободных от Т-клеток, вместе с носителем IL-2. Затем на следующий день Т-клетки трансдуцируют CLL-1 (фиг. 6) CAR с использованием лентивирусного вектора и размножают в средах в течение примерно 10 дней. Затем Т-клетки замораживают, когда средний объем клеток приблизится к 300 фл. Экспрессию CAR на Т-клетках детектируют проточной цитометрией с использованием биотинилированного белка CLL-1 (Sino Biological) с вторичным окрашиванием с использованием стрептавидина. Результаты, представленные в настоящем описании, показывают эффективность трансдукции Т-клеток, трансдуцированных CAR (фиг. 7А и 7В).
Клетки CART123, CLL1-CART и нетрансдуцированные T-клетки инкубируют с клеточной линией CD123+/CLL1+ THP-1, двумя первичными образцами AML, которые представляют собой CLL1+/CD123+, и контрольной клеточной линией ALL NALM6 в течение 4 часов. Дегрануляцию CD107a измеряют проточной цитометрией (8A). CLL-1 CART клетки подвергают специфической дегрануляции THP1 и первичные образцы AML, но не контрольную клеточноую линию (фиг. 8B). Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что клетки CLL1-CART подвергают специфической дегрануляции клеточные линии CLL1+ и первичные образцы AML.
Клетки CART123, CLL1-CART и нетрансдуцированные T-клетки инкубируют с клеточной линией CD123+/CLL1+ THP-1, двумя первичными образцами AML, которые представляют собой CLL1+/CD123+, и контрольной клеточной линией ALL NALM6 в течение 4 часов. Затем клетки харвестируют, и интрацитоплазматический TNFa измеряют проточной цитометрией. Большая часть клеток CLL-1 CART продуцирует TNF-α после инкубации специфически с THP1 и первичными образцами AML, а не с контрольной клеточной линией. Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что клетки CLL1-CART продуцируют TNF-a после инкубации с клеточной линией CLL1+ и первичными образцами AML (фиг. 9A и 9B).
Клетки CART123, CLL1-CART и нетрансдуцированные T-клетки инкбируют с клеточной линией CD123+/CLL1+ THP-1, двумя первичными образцами AML, которые представляют собой CLL1+/CD123+, и контрольной клеточной линией ALL NALM6 в течение 4 часов. Интрацитоплазматический IL-2 измеряют проточной цитометрией. Большая часть клеток CLL-1 CART продуцирует IL-2 после инкубации специфически с THP1 и первичными образцами AML, а не с контрольной клеточной линией. Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что клетки CLL1-CART продуцируют IL-2 после инкубации с клеточной линией CLL1+ и первичными образцами AML (фиг. 10A и 10B).
Клетки CART123, CLL1-CART и нетрансдуцированные T-клетки инкубируют с клеточными линиями CD123+/CLL1+ THP-1 и MOLM14, первичным образцом AML, который представляют собой CLL1+/CD123+, и контрольной клеточной линией лимфомы из клеток мантии JEKO в течение 24 часов. Затем клетки харвестируют, и добавляют 7-AAD и гранулы для подсчета. Затем определяют киллинг с использованием анализа на основе проточной цитометрии после мечения CFSE опухолевых клеток (см., например, Cao et al., Cytometry, Part A, 2010; 7&A: 534-545) или путем инкубации CART клеток с экспрессирующими люциферазу клетками-мишенями при различных соотношениях эффектор-к-мишени в течние до 20 часов, с последующей оптической визуализацией фотонов, испускаемых клетками-мишенями. В таком последнем анализе число живых клеток-мишеней коррелирует с числом испускаемых фотонов. Клетки CLL1-CART приводят к специфическому лизису MOLM14 (фиг. 11D), THP-1 (фиг. 11A) и первичного образца AML (фиг. 11B), а не контрольной клеточной линии JEKO (фиг. 11C), при указанных соотношениях E:T. Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что клетки CLL1-CART специфически убивают клеточные линии CLL-1+ MOLM14 и THP-1 и первичные образцы AML (фиг. 11A-11D).
Пролиферацию клеток CART123, CART33 и CLL1-CART измеряют в реакции на MOLM14, THP-1 и два первичных образца AML. T-Клетки метят CFSE и инкубируют с мишенями в течение 120 часов при отношении эффектор:мишень 1:1. Клетки CLL1-CART претерпевают специфическую пролиферацию в ответ на MOLM14, THP-1 и первичные образцы AML. Непролиферированные Т-клетки сохраняют один четкий пик экспрессии CFSE (по зеленой флуоресценции в канале FTTC), в то время как пролиферирующие клетки CART имеют более одного пика CFSE и экспрессию, которая ниже базовой линии. Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что клетки CLL1-CART пролиферируют в ответ на MOLM14, THP-1 и первичные образцы AML (фиг. 12A и 12В).
Фигура 13 представляет схематическую диаграмму анализа токсичности кроветворных стволовых клеток CLL1-CART с использованием аутологичных трансплантатов. Мыши NSGS (NOD-SCID-гамма мыши, трансгенные для IL-3, GM-CSF, фактора стволовых клеток) получают бусульфан i.p. и затем, на следующий день, Т-клетки, извлеченные из костного мозга здорового донора. Приживление подтверждают анализом проточной цитометрией периферической крови через 4 недели и определяют как CD45 положительные клетки в кровотоке, которых >1%. Затем мышей обрабатывают аутологичными Т-клетками внутривенной инъекцией в хвостовую вену. Получают Т-клетки от того же донора и трансдуцируют CART33, CLL-1-CAR или UTD. Четвертая группа не получает обработку. Затем у мышей берут ретроорбитальную кровь в день 7, день 14 и день 21.
Экспрессию CLL-1 измеряют на различных клетках периферической крови из гуманизированных ксенотрансплантатов. У мышей берут кровь из ретроорбитальной вены после анестезии с использованием стандартных методов. Затем стандартный объем крови 50-60 мкл лизируют в 1 мл буфера для лизиса АСК. Затем кровь окрашивают с использованием флуоресцентно меченных антител, и определяют экспрессию CLL-1 на различных клетках периферической крови с использованием проточной цитометрии. Такой анализ выполняют как базовый после приживления обедненного Т-клетками костного мозга здорового донора и перед любыми обработками. Показаны характерные схемы FACS анализа периферической крови мыши (фиг. 14А). CLL-1 экспрессируется на моноцитах (CD14+ клетки) или Т-клетках (CD3+ клетки). Показана характерная гистограмма (фиг. 14В). Показано схематическое представление анализа периферической крови от 24 мышей (фиг. 14С). Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что CLL-1 экспрессируется на различных линиях миелоидных клеток и В-клетках у гуманизированной мыши.
Токсичность кроветворных стволовых клеток CLL-1-CART определяют с использованием аутологичной модели. Приводится характерная схема анализа периферической крови методом проточной цитометрии. Обработка клеток CART33 или CLL10CART приводит к существенному снижению числа миелоидных клеток (CD123+, CD33+, CLL1+) и CD14+ моноцитов. Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что CLL-1 экспрессируется на различных линиях миелоидных клеток и В-клетках у гуманизированной мыши.
dim
-
Анализируют экспрессию CLL-1 на различных клетках-предшественниках костного мозга из гуманизированных ксенотрансплантатов. После 4 недель обработки Т-клетками мышей умервщляют, и костный мозг собирают и анализируют. Костный мозг собирают промывкой бедренных костей. Образцы костного мозга от контрольных необработанных животных используют как эталон для анализа экспрессии CLL-1 на клетках-предшественниках. Затем образцы окрашивают с использованием флуоресцентно меченных антител, и определяют экспрессию CLL-1 на различных клетках-предшественниках с использованием проточной цитометрии. CLL-1 экспрессируется на CD34+CD38+ кроветворных стволовых клетках, CD123 bright, CD123dim и CD33 положительных клетках. Закрыты CD45, LIN, живые клетки. Результаты, представленные в настоящем описании, показывают, что CLL-1 экспрессируется на различных миелоидных клетках-предшественниках и кроветворных стволовых клетках у гуманизированных мышей (фиг. 16А-16D).
Фигура 17 представляет схематическую диаграмму анализа токсичности кроветворных стволовых клеток CLL-1-CART клеток с использованием ксенотрансплантатов гуманизированной иммунной системы (HIS). У мышей HIS берут ретроорбитально кровь через 6-8 недель после инъекции CD34+ (клеток) плодной печени, подтверждают приживление клеток человека и затем обрабатывают любыми из CLL1-CART, CART123, CART33-CD8 шарнира, CART33-IgG4 шарнира, нетрансдуцированных Т-клеток или не обрабатывают. Затем у мышей еженедельно берут ретроорбитально кровь. Затем мышей умервщляют в день 28, и органы собирают и анализируют.
Костный мозг анализируют через 4 недели после инфузии Т-клеток. Токсичность кроветворных стволовых клеток CLL-1-CART клеток оценивают с использованием ксенотрансплантатов HIS. Мышей умервщляют через 4 недели после инфузии Т-клеток, бедренные кости собирают и промывают для получения костного мозга. Затем образцы окрашивают с использованием флуоресцетно меченных антител. Отображают схематично всех мышей, обработанных различными CART клетками. Обработка CLL-1-CART приводит к существенному снижению CD34+CD38- компонента (кроветворные стволовые клетки) (фиг. 18А) и CD34+CD38+ компонента (клетки-предшественники) (фиг. 18В). Показаны характерные отображения костного мозга мышей, обработанных различными CART клетками. Закрыты живые CD45dim LIN- клетки (фиг. 19A-19E).
Костный мозг мышей HIS анализируют через 4 недели после инфузии Т-клеток. Токсичность кроветворных стволовых клеток оценивают с использованием ксенотрансплантатов HIS. Мышей умервщляют через 4 недели после инфузии Т-клеток, бедренные кости собирают и промывают для получения костного мозга. Затем образцы окрашивают с использованием флуоресцетно меченных антител. Показаны схематично все мыши, обработанные различными CART клетками (фиг. 20). Обработка CLL-1-CART клетками не приводит к существенному снижению популяции CD123 bright. Затем образцы окрашивают с использованием флуоресцетно меченных антител. Показаны характерные отображения костного мозга мышей, обработанных различными CART клетками (фиг. 21).
Пример 4. Оценка CLL-1-CART клеток in vivo
Prkdc
Il2rg
/
scid
tm1Wjl
PL-21 представляет собой клеточную линию острого миелоидного лейкоза человека, выделенную из периферической крови 24-летнего пациента мужчины с рефрактерным острым промиелоцитарным лейкозом, и которую можно вырастить как ксенотрансплантат в мыши с ослабленным иммунитетом. Ксенотрансплантат имитирует заболевание в костном мозгу как у людей, сздавая модель, с которой проверяют эффективность терапий в отношении AML в кости. Таких мышей можно использовать в испытании эффективности химерного антигенного рецептора (CAR) Т-клеток, специфических для клеточных маркеров, обнаруженных на клетках острого миелоидного (или промиелоцитарного) лейкоза, таких как СLL-1 (молекула типа лектина С-типа). Клетки PL-21 метят репортерным геном люциферазы светляков и используют в ортотипической модели острого миелоидного лейкоза (AML) у мышей NOD.Cg-SzJ (NSG) для испытания эффективности CAR Т-клеток, специфических для СLL-1.
Экспрессию СLL-1 проверяют на клетках PL-21, и такие клетки используют в анализах in vitrо для того, чтобы проверить способность СLL-1-специфических CAR Т-клеток узнавать и реагировать на мишень. Клетки PL-21 растут in vivo, когда имплантированы внутривенно через хвостовую вену, и рост ограничивается главным образом костным мозгом. Через одну неделю после того, как опухолевые клетки имплантированы, заболевание послностью смещается в кости и начинает усиливаться экспоненциально. Ооставшиеся необработанными мыши начнут отображать клинические симптомы и паралич задних конечностей через 4-6 недель после имплантации опухоли. Исследование, описанное в этом примере, изучает, показывает ли какой-нибудь из СLL-1-специфических клонов scFv из скрининга in vitro активность против опухолей на такой модели с ксенотрансплантатом in vivo.
Указанные далее материалы и способы используют в экспериментах, описанных в настоящем описании.
Материалы и способы
Клеточная линия PL-21
. Клеточную линию PL-21AML человека выделяют из периферической крови пациента с острым миелоидным лейкозом. Затем клетки метят люциферазой светляков. Такие клеточные суспензии растут в RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы.
Мыши
Prkdc
Il2rg
scid
tm1Wjl
. Мышей NSG (NOD.Cg-/SzJ) в возрасте 6 недель получают у Jackson Laboratory (номер линии 005557). Животным дают акклиматизироваться в благоприятных для животных условиях по Novartis NIBRI в течение по меньешей мере 3 дней пред опытами. Животных содержат согласно правилам и указаниям Novartis.
Имплантация опухоли
6
6
. Клетки PL-21-luc выращивают и размножают in vitro в RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы. Затем клетки переносят в 50-мл коническую пробирку и дважды промывают холодным стерильным PBS. Затем клетки PL-21-luc считают и ресуспендируют в концентрации 10×10 клеток на миллитр PBS. Клетки помещают на лед и сразу же (в пределах одного часа) имплпнтируют мышам. Клетки PL-21-luc инъецируют внутривенно в хвостовую вену в объеме 100 мкл в целом 1×10 клеток на мышь.
Дозирование CAR T-клеток
6
+
+
6
+
6
+
6
+
. Мышам вводят 5×10 CAR T-клеток через 8 дней после импалнтации опухоли. Клетки частично оттаивают на водяной бане при 37 градусах по Цельсию и затем полностью оттаивают, добавляя 1 мл холодного стерильного PBS в пробирку, содержащую клетки. Оттаявшие клетки переносят в 15-мл пробирку фалькон и доводят до конечного объема 10 мл PBS. Клетки дважды промывают при 1000 об/мин в течение 10 минут каждый раз и затем считают на гемоцитометре. CAR T клетки нормализуют для трансдукции CAR так, что каждая группа имеет один и тот же процент CAR T-клеток. Затем 5×10 CAR T-клеток ресуспендируют в концентрации 50×10 CAR T-клеток на мл холодного PBS и держат на льду до тех пор, пока не дают мышам. Мышам инъецируют внутривенно в хвостовую вену 100 мкл CAR T клеток для дозы 5×10 CAR T-клеток на мышь
Восемь мышей на группу обрабатывают 100 мкл одного PBS (PBS), CD19 контрольных CAR T-клеток (CD19), CLL-1-6 (клон 6) CAR T-клеток, CLL-1-9 (клон 9) CAR T-клеток, CLL-1-10 (клон 10) CAR T-клеток, CLL-1-11 (клон 11) CAR T-клеток и CLL-1-12 (клон 12) CAR T-клеток. Все T-клетки получают от одного и того же донора человека параллельно.
Контроль за животными
текущая
начальная
начальная
. Состояние здоровья мышей контролируют ежедневно, включая измерения массы тела дважды в неделю. Процент изменения массы тела вычисляют как (BW-BW)/(BW)×100%. Опухолевую нагрузку контролируют дважды в неделю с помощью биолюминисцентной визуализации. Мышам интраперитонеально инъецируют D-люциферин за 10 минут до введения и визуализации мышей с помощью ксеногена. Бремя заболевания вычисляют, вычисляя биолюминесценцию опухолевых клеток (фотоны/секунда).
Величины обработка/контроль (Т/С), в процентах, вычисляют с использованием следующих формул:
>
% T/C=100×ΔT/ΔC, если ΔT 0;
начальная
% регрессии=100×ΔT/T, есил ΔT <0 ;
начальная
где T=средняя люминисценция в группе, обработанной лекарственным средством, в последний день исследования; T=средняя люминисценция в группе, обработанной лекарственным средством в первый день дозирования; ΔT=средняя люминисценция в группе, обработанной лекарственным средством в последний день исследования - средняя люминисценция в группе, обработанной лекарственным средством в первый день; C=средняя люминисценция в контрольной группе в последний день исследования и ΔC=средняя люминисценция в контрольной группе в последний день исследования - средняя люминисценция в контрольной группе в первый день дозирования.
Величины T/C в интервале 100% - 42% интерперетируются как отсутствие или минимальная противоопухолевая активность; величины T/C ≤42% и >10% интерперетируются как наличие противоопухолевой активности или ингибрования роста опухоли. Величины T/C ≤10% или величины регрессии ≥-10% интерперетируются как наличие стаза опухоли. Величины регрессии <-10% сообщаются как регрессия.
FACS анализ периферической крови
+
+
+
. Также контролируют Т-клетки в периферической крови мышей. У мышей берут кровь еженедельно из хвостовой вены в сенсибилизированные ЭДТК пробирки, которые держат на льду. Из пробирок 10 мкл крови помещают в 96-луночные планшеты на льду. Красные клетки крови лизируют с буфером для лизиса АСК (Life Technologies, каталожный номер A10492-01) и затем дважды промывают холодным PBS. Клетки инкубируют с Fc блокирующей смесью Fc-блока человека и мыши (Miltenyi Biotec, каталожные номера 130-059-901 и 130-092-575) в течение 30 минут и затем инкубируют с антимышиным CD11b, античеловеческим CD45, античеловеческим CD4, античеловеческим CD8 и CLL-1-Fc или антителами к белку L, и затем еще раз. Клетки фиксируют 2% раствором параформальдегида в течение 20 минут, промывают и хранят в PBS+2% FBS в течение ночи перед анализом на BD Fortessa, с последующим дополнительным анализом с использованием программы анализа FlowJo FACS. Клетки анализируют для определения числа клеток CAR CD4 и CD8 T-клеток на миллилитр крови у мышей NSG с опухолью PL-21-luc. Число Т-клеток в крови сообщают как среднее+среднеквадратическая ошибка (SEM).
Результаты
6
Противоопухолевую активность панели CLL-1-специфических CAR Т-клеток (клон 6, 9, 10, 11 и 12) оценивают и непосредственно сравнивают с PL-21 моделью AML человека. После имплантации опухоли в день 0 мышей произвольно распределяют по группам обработки и обрабатывают 5×10 CAR+ Т-клеток внутривенно в день 8. Бремя заболевания AML и здоровье животного контролируют до тех пор, пока животные не достигнут конечной точки. Мышей в контрольных PBS и C19 группах вместе с группами CLL-1-11 и CLL-1-12 умервщляют в день 18 после дозирования CAR Т клеток (26 дней после имплантации опухоли), когда бремя заболевания в контрольных группах было вблизи максимальной люминесценции при визуализации. Мышей в остальных группах, обработанных CLL-1-CAR T-клетками (CLL-1-6, CLL-1-9 и CLL-1-10), умервщляют в день 25 после дозирования CAR Т клеток (33 дня после имплантации опухоли) для возможности сравнения конечных образцов всех групп.
P ≤
P
P
P
P
P
Задержку в развитии заболевания наблюдают между контрольными группами и обработанными CLL-1-6, CLL-1-9 и CLL-1-10 группами, и замедление роста опухоли в поздние моменты времени в группах, обработанных CLL-1-11 и CLL-1-12 CAR Т-клетками. По вычислениям в последний момент времени со всеми представленными группами (день 18 после дозы CAR Т-клеток), все группы с CLL-1-CAR T-клетками существенно отличаются от контрольных групп. По сравнению с мышами, обработанными PBS, группа, обработанная CD19 CAR Т-клетками, не показывает значимости с величиной Р 0,496. Все группы, обработанные CLL-1-CAR T-клетками, по сравнению с PBS имеют 0,01 (клон 6 =0,0008; клон 9 =0,0006; клон 10 =0,0006; клон 11 =0,0013; клон 12 =0,0109). Три клона CLL-1, которые показывают начальльную задержку в развитии опухоли, клоны 6, 9 и 10, показывают стаз в росте опухоли в день 18 после дозы CAR T-клеток. Другие два клона, клоны 11 и 12, показывают противоопухолевую активность в этот момент времени, хотя в более ранние моменты они не показывали кукую-либо задержку в развитии опухоли. Вычисленные на день 18 после дозы T-клеток, величины процента дельта Т/С для каждой обработанной группы по сравнению с контрольной группой PBS следующие: 98,38% для CD19, 3,15% для CLL-1-6, 2,04% для CLL-1-9, 4,92% для CLL-1-10, 13,42% для CLL-1-11 и 25,19% для CLL-1-12. На основании этих величин, группа, обработанная CD19 CAR T-клетками, не показывает активности, группы, обработанные CLL-1-6, -9 и -10 CAR T-клетками, показывают стаз в росте опухоли, и группы, обработанные CLL-1-11 и -12 CAR T-клетками, показывают противоопухолевую активность.
Результаты биолюминесцентной визуализации в этом исследовнии показаны на фигуре 24. Группа, обработанная PBS, которая не получала какие-либо Т-клетки, показывает базовую линию кинетики роста опухоли PL-21 у имплантированных внутривенно мышей NSG. Группа обработки C19 получила контрольные CD19 CAR T-клетки, неспецифичные для клеток PL-21, которые претерпевают такой же процесс экспансии in vitro, что и CAR T-клетки. Эти клетки служат в качестве контрольных Т-клеток для демонатрации неспецифической реакции на Т-клетки у такой модели опухоли. Группы, обработанные как PBS, так и CD19 CAR T-клетками, показывают непрерывное развитие опухоли в ходе эеспермента.
+
+
+
+
+
Кроме контроля бремени заболевания по биолюминесценции, число CAR T-клеток в каждой группе также контролировалось анализом FACS периферической крови. Результаты FACS в этом исследовании показаны на фигурах 25А и 25В. Группы, которые показывают самую большую противоопухолевую активность и задержку роста опухоли после обработки CAR T-клетками, показывают возрастание как CD4CAR (фигура 25A), так и CD8CAR T-клеток (фигура 25B) в периферической крови в поздние моменты времени. Ограниченное число клеток наблюдают в периферической крови в ранние моменты времени. AML имеет место преимущественно в костном мозгу, и CAR T-клетки также могут находиться в костном мозгу в такие моменты времени. В конечный момент времени не имеется размножающейся популяции CAR T-клеток в периферической крови для групп CLL-1-6, CLL-1-9 и CLL-1-10.
В конце исследования у мышей собирают селезенки и клетки костного мозга и анализируют для определения, сохраняются ли CAR T-клетки. Как видно на фигурах 26А-26D, CD4 и CD38 CAR+ T-клетки отмечаются в заметном числе в обработанных группах CLL-1-9 и CLL-1-10. Экспансия Т-клеток также видна в некоторых других группах, в частности, в группе, обработанной CLL-1-12 CAR T-клетками. Однако, хотя большое число CD4+, так и CD8+ T-клеток видно в костном мозгу этой группы, клетки не являются CAR+, что указывает на неспецифическую экспансию T-клеток у таких мышей. CLL-1-6, CLL-1-9 и CLL-10 показывают самое большое противоопухолевое действие и задержку в росте опухоле, и это соответствует конечному числу CAR+ T-клеток в костном мозгу. Как замечание, CLL-1-6 CAR не детектировали, так что число CAR+ в этой группе может быть недооценено. Незначительная персистенция как CD4, так и CD8 T-клеток в группе CLL-1-11 и наибольшее число этих клеток в группе CLL-1-12 может коррелировать с неспецифической поздней стадией активности на опухолях, приводящей к незначительному падению опухолевой нагрузки, видной в последние моменты времени на фигуре 24.
+
+
+
В конце исследования также определяют фенотип клеток в селезенке. Подобно тому, что наблюдают в образцах костного мозга этих мышей, группами с заметным числом CD4 и CD8 CAR T-клеток в селезенке являются только CLL-1-9 и CLL-1-10 группы, как видно на фигурах 27А-27D. Они также являются единственными группами, которые имеют большое число CD4 и CD8 T-клеток в селезенке. Группы CLL-1-11 и CLL-1-12 не показывают накопление не-CAR Т-клеток в селезенке, которое наблюдают в образцах костного мозга. Из-за большого изменения CAR+ Т-клеток, детектируемых в образцах селезенки мышей CLL-1-10, эта группа не коррелирует, так как существенно отличается при сравнении с контрольными группами.
Обсуждение
+
+
+
+
+
+
Противоопухолевую активность новых CLL-1-CAR трансдуцированных Т-клеток оценивают в исследовании эффективности на модели AML человека на мышах NSG с ксенотрансплантатом. Такие исследования показывают, что модель PL-21-luc повторяет AML человека у мышей NSG и способна являться мишенью для CLL-1-CAR Т-клеток (фигура 24). Исследование показывает, что три варианта CLL-1-CAR (CLL-1-6, CLL-1-9 и CLL-1-10) способны усиливать противоопухолевую реакцию на модели с ксенотрансплантатом AML (фигура 24). Минимальное число CAR Т-клеток обнаружено в крови всех четырех групп, однако в последние моменты времени CAR Т-клетки в группах CLL-1-6, CLL-1-9 и CLL-1-10 видны в возрастающем числе (фигуры 25А и 25В). Группы, обработанные такими тремя типами CAR Т-клеток, и в частности, CLL-1-9 и CLL-1-10, показывают значительное число CAR Т-клеток в последних образцах костного мозга и селезенки в конце исследования (фигуры 26А-26D и 27А-27D). Группа CLL-1-6 также показывает начальную и продолжающуюся задержку роста опухоли, но конечное число CAR Т-клеток нельзя точно вычислить из-за различий в детекции экспрессии scFv на поверхности Т-клеток. Взятые вместе группы CLL-1-9 и CLL-1-10 показывают задержку роста опухоли, возрастание числа CD4 CAR Т-клеток и CD8 CAR T-клеток в периферической крови наряду со значительным числом CD4 CAR Т-клеток и CD8 CAR T-клеток в последних образцах костного мозга и селезенки. Только группа CLL-1-9 имеет существенно различные количества CD4 CAR Т-клеток и CD8 CAR T-клеток как в костном мозгу, так и в селезенке по сравнению с контрольными группами.
Пример 5. Химиотерапия и комбинированная терапия с CLL-1-CAR
Действие CLL-1-CAR терапии в сочетании с химиотерапией проверяют с использованием мышиной модели AML in vivo. Обработка сначала химиотерапией, а затем CLL-1-CARТ клетками (клон 6) приводит к уничтожению первичных ксенотрансплантатов AML.
6
5
Мышам NSG, которые дополнительно являются трансгенными для фактора стволовых клеток, GM-CSF и IL-3 (NSG-S), инъецируют первичные бласты AML (3×10 инъекцией в хвостовую вену, день 0). Через 4-6 недель берут периферическую кровь (РВ) для подтверждения прижживления, которое определяют как присутствие в кровотоке >1% лейкозных клеток (живые человеческие клетки CD45dim). Затем ксенотрансплантаты AML обрабатывают цитарабином (Ara-C, 60 мг/кг интраперитонеальной инъекцией, ежедневно между днями 35-39). Отсчеты для периферической крови контролируют, и затем эти ксенотрансплантаты рандомизируют для получения направленных на CLL1 CARТ клеток или контрольных нетрансдуцированных Т-клеток (1×10 I.V.) в день 55. После этого выполняют ряд заборов ретрорбитальной крови, и вычисляют абсолютное число лейкозных бластов как меру бремени заболевания, и ксенотрансплантаты оставляют до выживания.
Фигура 33В включает характерные графики средней интенсивности флуоресценции (MFI) CLL1 в лейкозных клетках (компартмент живых huCD45dim), и показывает, что обработка химиотерапией приводит к положительной регуляции антигена CLL-1 в оставшемся AML. Имеется существенное возрастание в CLL1-MFI в ксенотрансплантатах AML через две недели после обработки химиотерапией циторабином.
Мыши, которых обрабатывали индукционной химиотерапией, а затем нетрансдуцированными Т-клетками, не показывают снижения числа лейкозных бластов в периферической крови. Напротив, мыши, обработанные индукционной химиотерапией, а затем CLL-1-CART, имеют в результате существенное снижение числа лейкозных бластов в периферической крови и исчезновение лейкоза в ксенотрансплантатах AML, как показано на фигуре 33С. Графики представляют абсолютное число лейкозных бластов на 1 мкл периферической крови (среднее +/- SD) в различные моменты времени после инъекции AML, как показано. Анализ общей выживаемости также показывает, что индукционная химиотерапия с последующей терапией CLL-1-CART, но не нетрансдуцированными Т-клетками, приводит к существенному преимуществу в общей выживаемости у ксенотрансплантатов AML (фигура 33В).
Пример 6. Малая доза RAD001 стимулирует пролиферацию CART в модели клеточной культуры
Действие малой дозы RAD001 на пролиферацию CAR T-клеток in vitro оценивают путем сокультивирования CART-экспрессирующих клеток с клетками-мишенями в присутствии различной концентрации RAD001.
Материалы и способы
Получение CAR-трансдуцированных Т-клеток
Гуманизированный античеловеческий CD19 CAR (huCART19) лентивирусный трансферный вектор используют для получения геномного материала, упакованного в VSVg псевдотипированные лентивирусные частицы. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность гуманизированного античеловеческого CD19 CAR (huCART19) представляют собой CAR 1, ID 104875, описанный в публикации РСТ WO2014/153270, поданной 15 марта, 2014, и обоазначены в ней SEQ ID NO. 85 и 31.
ДНК лентивирусного трансферного вектора смешивают с тремя пакующими компонентами VSVg env, gag/pol и rev в комбинации с реагентом липофектамином для трансфекции клеток Lenti-X 293T. Среду затем заменяют через 24 часа и 30 час, вируссодержащие среды собирают, фильтруют и хранят при -80°С. CART получают путем трансдукции свежих или замороженных наивных Т-клеток, полученных отрицательной магнитной селекцией крови здорового донора или лейкопака. Т-Клетки активируют инкубацией с анти-CD3/анти-CD28 гранулами в течение 24 час, после чего вирусный супернатант или концентрированный вирус (MOI=2 или 10, соответственно) добавляют к культурам. Модифицированным Т-клеткам дают размножаться в течение примерно 10 дней. Процент трансдуцированных клеток (экспрессирующих CAR на клеточной поверхности) и уровень экспрессии CAR (относительная интенсивность флуоресценции, Geo Man) определяют анализом методом проточной цитометрии между днями 7 и 9. Комбинация ослабления скорости роста и объема Т-клеток, приближающегося к ~350 фл, определяет состояние Т-клеток для криоконсервации для дальнейших анализов.
Оценка пролиферации CART
Ддля того, чтобы оценить функциональность CART, Т-клетки оттаивают и считают, и оценивают жизнеспособность Cellometer. Число CAR-положительных клеток в каждой культуре нормализуют с использованием нетарнсдуцированных Т-клеток (UTD). Влияние RAD001 на CART проверяют титрованием с RAD001, начиная с 50 нМ. Линией клеток-мишеней, используемой во всех экспериментах с сокультивированием, является Nalm-6, клеточная линия пре-В-клеточного острого лимфобластного лейкоза человека (ALL), экспрессирующая CD19 и трансдуцированная для экспрессии люциферазы.
Для измерения пролиферации CART Т-клетки культивируют с клетками-мишенями в соотношении 1:1. Анализ проводят в течение 4 дней, когда клетки окрашивают для экспрессии CD3, CD4, CD8 и CAR. Число Т-клеток оценивают проточной цитометрией с использованием гранул для подсчета в качестве эталона.
Результаты
Пролиферативную способность клеток CART оценивают анализом в день 4 сокультивирования. Число CAR положительных CD3-положительных Т-клеток (темные столбики) и общее число CD3-положительных Т-клеток (светлые столбики) оценивают после культивирования CAR-трансдуцированных и нетрансдуцированных Т-клеток с Nalm-6 (фиг. 31). Клетки huCART19 размножаются при культивировании в присутствии менее 0,016 нМ RAD001 и в меньшей степени при более высоких концентрациях соединения. Важно, что как при 0,0032 нМ, так и при 0,0016 нМ RAD001 пролиферация более высокая, чем наблюдаемая без добавления RAD001. Нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) не показывают детектируемой экспансии.
Пример 7. Малая доза RAD001 стимулирует экспансию CART in vivo
В этом примере оценивается способность клеток huCART19 к пролиферации in vivo с различными концентрациями RAD001.
Материалы и способы
Клетки NALM6-luc
. Клеточную линию острого лимфобластного лейкоза (ALL) человека NALM6 получают из периферической крови пациента с рецидивным ALL. Затем клетки метят люциферазой светляков. Такие суспендированные клетки растут в RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы.
Мыши
Prkdc
Il2rg
scid
tm1Wjl
. Мышей NSG (NOD.Cg-/SzJ) в возрасте 6 недель получают в Jackson Laboratory (номер линии 005557).
Имплантация опухоли
6
6
. Клетки NALM6-luc выращивают и размножают in vitro в RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы. Затем клетки переносят в 15-мл коническую пробирку и дважды промывают холодным стерильным PBS. Затем клетки NALM6-luc считают и ресуспендируют в концентрации 10×10 клеток на миллитр PBS. Клетки помещают на лед и сразу же (в пределах одного часа) имплантируют мышам. Клетки NALM6-luc инъецируют внутривенно в хвостовую вену в объеме 100 мкл в целом 1×10 клеток на мышь.
Дозирование CAR T-клеток
6
6
6
. Мышам вводят 5×10 CAR T-клеток через 7 дней после импалнтации опухоли. Клетки частично оттаивают на водяной бане при 37 градусах по Цельсию и затем полностью оттаивают, добавляя 1 мл холодного стерильного PBS в пробирку, содержащую клетки. Оттаявшие клетки переносят в 15-мл пробирку фалькон, и доводят до конечного объема 10 мл PBS. Клетки дважды промывают при 1000 об/мин в течение 10 минут каждый раз и затем считают на гемоцитометре. Затем Т-клетки ресуспендируют в концентрации 50×10 CAR Т-клеток на миллитр холодного PBS и держат на льду до тех пор, пока не дают мышам. Мышам инъецируют внутривенно в хвостовую вену 100 мкл CAR T клеток для дозы 5×10 CAR T-клеток на мышь.
Дозирование RAD001
. Получают концентрированную микроэмульсию 50 мг, равнозначных 1 мг RAD001, и затем ресуспендируют в DSM (5% декстрозы в воде) на время дозирования. Мышам ежедневно перорально (через оральный зонд) в 200 мкл дают нужные дозы RAD001.
Анализ РК
. Мышам ежедневно дают RAD001, начиная с 7 дня после имплантации опухоли. Группы получают следующие дозы: 0,3 мг/кг, 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг. У мышей берут кровь в дни 0 и 14 после первой и последней дозы RAD001, в следующие моменты времени для анализа РК: 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов и 24 часа.
Результаты
Экспансию и фармакокинетику RAD001 проверяют на мышах NSG с опухолями NALM6-luc. Ежедневное пероральное дозирование одного RAD001 не оказывает влияния на рост опухолей NALM6-luc (фигура 32). Анализ фармакокинетики RAD001 показывает, что она довольно устойчива в крови мышей с опухолями (фигура 33А и 33В). Анализы РК как в день 0, так и в день 14 показывают, что концентрации RAD001 в крови превышают 10 нМ даже через 24 часа после дозирования в самой малой испытываемой дозе (0,3 мг/кг).
Основываясь на таких дозах, клетки huCAR19CART дозируют с RAD001 и без него для того, чтобы определить способность этих клеток к пролиферации. Самая высокая используемая доза составляет 3 мг/кг, на основании уровней RAD001 в крови через 24 часа после дозирования. Так как концентрация RAD001 составляет выше 10 нМ через 24 часа после конечной дозы RAD001, для исследования с CAR T-клетками in vivo используют несколько меньшие дозы RAD001. Клетки CART дают IV за день до начала ежедневного перорального дозирования RAD001. Мышей контролируют FACS на экспансию Т-клеток.
Наименьшие дозы RAD001 показывают усиленную пролиферацию CAR T-клеток. Такая усиленная пролиферация более очевидна и продолжительна с CD4+ CAR T-клетками, чем с CD8+ CAR T-клетками. Однако с CD8+ CAR T-клетками усиленная пролиферация может быть обнаружена в более ранние моменты времени после дозы CAR T-клеток.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Раскрытия каждого и каждый патент, заявка на патент и публикация, цитированные в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. Хотя настоящее изобретение раскрыто с обращением к конкретным аспектам, очевидно, что другие аспекты и варианты настоящего изобретения могут быть разработаны специалистами в данной области техники без отхода от сущности и объема изобретения. Предполагается, что прилагаемая формула изобретения составлена так, что включает все такие аспекты и эквивалентные варианты.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> NOVARTIS AG
THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA
<120> ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА CLL-1
<130> N2067-7044WO3
<140> PCT/US2015/041337
<141> 2015-07-21
<150> PCT/CN2014/090500
<151> 2014-11-06
<150> PCT/CN2014/082602
<151> 2014-07-21
<160> 495
<170> Версия PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 2
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1               5                   10                  15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20                  25                  30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35                  40                  45
<210> 3
<211> 230
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225                 230
<210> 4
<211> 282
<212> PRT
<213> Искусственная последователльность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 4
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1               5                   10                  15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20                  25                  30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35                  40                  45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50                  55                  60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85                  90                  95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100                 105                 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115                 120                 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130                 135                 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165                 170                 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180                 185                 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195                 200                 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210                 215                 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225                 230                 235                 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260                 265                 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275                 280
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 6
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                   10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35                  40
<210> 8
<211> 48
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 8
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1               5                   10                  15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20                  25                  30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35                  40                  45
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 9
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 11
<211> 1184
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 11
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt       60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg      120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa      180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa      240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt      300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg      360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg      420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg      480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt      540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg      600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc      660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg      720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg      780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat      840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct      900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc      960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg     1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga     1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc     1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga                      1184
<210> 12
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 12
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga       60
ccc                                                                     63
<210> 13
<211> 135
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 13
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg       60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg      120
gacttcgcct gtgat                                                       135
<210> 14
<211> 690
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 14
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc       60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag      120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac      180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc      240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa      300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag      360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc      480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg      540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag      600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg                                       690
<210> 15
<211> 847
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 15
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca       60
gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc      120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc      180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag      240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag      300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg      360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga      420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca      480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat      540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc      600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc      660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt      720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc      780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact      840
gaccatt                                                                847
<210> 16
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 16
ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc                                        30
<210> 17
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 17
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc       60
accctttact gc                                                           72
<210> 18
<211> 126
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечаниеe="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<400> 18
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa       60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt      120
gaactg                                                                 126
<210> 19
<211> 123
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 19
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc       60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc      120
tcc                                                                    123
<210> 20
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 20
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc       60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc      120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat      180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc      240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc      300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc                                336
<210> 21
<211> 336
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 21
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc       60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc      120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat      180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc      240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc      300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc                                336
<210> 22
<211> 373
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 22
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1               5                   10                  15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20                  25                  30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35                  40                  45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50                  55                  60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85                  90                  95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100                 105                 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115                 120                 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130                 135                 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165                 170                 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180                 185                 190
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
195                 200                 205
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
210                 215                 220
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
225                 230                 235                 240
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
245                 250                 255
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
260                 265                 270
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
275                 280                 285
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
290                 295                 300
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
305                 310                 315                 320
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
325                 330                 335
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
340                 345                 350
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
355                 360                 365
Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 23
<211> 1182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечаниеe="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 23
atggccctcc ctgtcactgc cctgcttctc cccctcgcac tcctgctcca cgccgctaga       60
ccacccggat ggtttctgga ctctccggat cgcccgtgga atcccccaac cttctcaccg      120
gcactcttgg ttgtgactga gggcgataat gcgaccttca cgtgctcgtt ctccaacacc      180
tccgaatcat tcgtgctgaa ctggtaccgc atgagcccgt caaaccagac cgacaagctc      240
gccgcgtttc cggaagatcg gtcgcaaccg ggacaggatt gtcggttccg cgtgactcaa      300
ctgccgaatg gcagagactt ccacatgagc gtggtccgcg ctaggcgaaa cgactccggg      360
acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg      420
gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg      480
cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg      540
actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct      600
gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg      660
gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc      720
aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa      780
accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc      840
gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac      900
cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg      960
cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg     1020
tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga     1080
gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag     1140
gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc                        1182
<210> 24
<211> 394
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro
20                  25                  30
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
35                  40                  45
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
50                  55                  60
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
65                  70                  75                  80
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe
85                  90                  95
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
100                 105                 110
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser
115                 120                 125
Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
130                 135                 140
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala
165                 170                 175
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
180                 185                 190
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
195                 200                 205
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
210                 215                 220
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
225                 230                 235                 240
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
245                 250                 255
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
260                 265                 270
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
275                 280                 285
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
290                 295                 300
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
305                 310                 315                 320
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
325                 330                 335
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
340                 345                 350
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
355                 360                 365
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
370                 375                 380
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
385                 390
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 1-6 'Gly Gly Gly Gly Ser'
повторяющихся звеньев, где некоторые позиции могут отсутствовать"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. определение, представленное для подробного описания
замен и предпочтительных воплощений"
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20                  25                  30
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 29
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 30
<211> 5000
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-5000 нуклеотидов,
где некоторые позиции могут отсутствовать"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. определение, представленное для подробного описания
замен и предпочтительных воплощений"
<400> 30
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                 5000
<210> 31
<211> 100
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 31
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt       60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt                            100
<210> 32
<211> 5000
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-5000 нуклеотидов,
где некоторые позиции могут отсутствовать"
<400> 32
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt       60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt      960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     1980
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2040
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2100
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2160
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2220
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2280
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2340
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2400
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2460
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2520
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2580
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2640
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2700
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2760
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2820
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2880
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     2940
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3000
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3060
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     3960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt     4980
tttttttttt tttttttttt                                                 5000
<210> 33
<211> 5000
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 100-5000 нуклеотидов,
где некоторые позиции могут отсутствать"
<400> 33
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2400
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2460
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2520
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     2940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     4980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                 5000
<210> 34
<211> 400
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последователльности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(400)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 100-400 нуклеотидов,
где некоторые позиции могут отсутствовать"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. определение, представленное для подробного описания
замен и предпочтительных воплощений"
<400> 34
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                            400
<210> 35
<211> 2000
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2000)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-2000 нуклеотидов,
где некоторые позиции могут отсутствовать"
<400> 35
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                 2000
<210> 36
<211> 230
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 36
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225                 230
<210> 37
<211> 690
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 37
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc       60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag      120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac      180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc      240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa      300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag      360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc      480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg      540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag      600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg                                       690
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> ичточник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 1-10 'Gly Gly Gly Ser'
повторяющихся звеньев, где некоторые позиции могут отсутствовать"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Смю определение, представленное для подробного описания
замен и предпочтительных воплощений"
<400> 38
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20                  25                  30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35                  40
<210> 39
<211> 247
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 39
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Glu Met Ala Thr Ile Met Gly Gly Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser
130                 135                 140
Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His
165                 170                 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro
180                 185                 190
Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala
195                 200                 205
Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210                 215                 220
Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Asp Val Val Phe Gly Gly
225                 230                 235                 240
Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 40
<211> 245
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Phe Asp Ser Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
130                 135                 140
Pro Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145                 150                 155                 160
Ser Leu Val Tyr Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln
165                 170                 175
Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180                 185                 190
Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Asp
195                 200                 205
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr
210                 215                 220
Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 41
<211> 247
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Lys Tyr Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Thr Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Leu Ser Gly Tyr Tyr Pro
100                 105                 110
Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
130                 135                 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145                 150                 155                 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
165                 170                 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
180                 185                 190
Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195                 200                 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210                 215                 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
225                 230                 235                 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 42
<211> 239
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Ala Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Arg Ser Gly Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
130                 135                 140
Ser Pro Gly Gly Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165                 170                 175
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp
180                 185                 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195                 200                 205
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly
210                 215                 220
Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225                 230                 235
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 43
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Pro Val Arg Ser Gly
20                  25                  30
Ser His Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Glu Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Asn Asn His Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Phe
85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Thr Ala Thr Phe Asp Trp Asn Phe Pro Phe Asp Ser
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
130                 135                 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145                 150                 155                 160
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
165                 170                 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
180                 185                 190
Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195                 200                 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210                 215                 220
Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 44
<211> 249
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечаниеe="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Ser Gly Leu Val Val Tyr Ala Ile Arg Val Gly Ser Gly Trp
100                 105                 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130                 135                 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145                 150                 155                 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp
165                 170                 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210                 215                 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe
225                 230                 235                 240
Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
245
<210> 45
<211> 255
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Met Glu Asp Ser Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130                 135                 140
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
165                 170                 175
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
180                 185                 190
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
195                 200                 205
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
210                 215                 220
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
225                 230                 235                 240
Ser Asn Gln Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245                 250                 255
<210> 46
<211> 239
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 46
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Ala Leu Gly Ser Ser Trp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
130                 135                 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
165                 170                 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
180                 185                 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
195                 200                 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp
210                 215                 220
Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225                 230                 235
<210> 47
<211> 246
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Ala Asn Thr Phe Ser Asp His
20                  25                  30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile His Ala Ala Asn Gly Gly Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr
130                 135                 140
Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln
165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Asn Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 48
<211> 248
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Val Arg Ala Ile Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
130                 135                 140
Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145                 150                 155                 160
Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp
165                 170                 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala
180                 185                 190
Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195                 200                 205
Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210                 215                 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly
225                 230                 235                 240
Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 49
<211> 246
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Ser Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Leu Ile Glu Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Glu Asp Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
130                 135                 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Phe Ile Lys Lys Asn Leu Asn Trp Tyr Gln
165                 170                 175
His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Asn Arg Ser Gly Thr
195                 200                 205
Thr Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr
210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 50
<211> 255
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Arg Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Asn Asn Cys Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr
100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130                 135                 140
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
165                 170                 175
Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
180                 185                 190
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
195                 200                 205
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
210                 215                 220
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser
225                 230                 235                 240
Thr Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245                 250                 255
<210> 51
<211> 247
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asp Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130                 135                 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145                 150                 155                 160
Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr
165                 170                 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
180                 185                 190
Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195                 200                 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210                 215                 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly
225                 230                 235                 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 52
<211> 741
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 52
gaagtgcaac tccaacagtc aggcgcagaa gtcaagaagc ccggatcgtc agtgaaagtg       60
tcctgcaaag cctccggcgg aaccttcagc tcctacgcaa tcagctgggt gcggcaggcg      120
cccggacagg gactggagtg gatgggcggt atcattccga tctttggcac cgccaattac      180
gcccagaagt tccagggacg cgtcacaatc accgccgacg aatcgacttc caccgcctac      240
atggagctgt cgtccttgag gagcgaagat accgccgtgt actactgcgc tcgggatctg      300
gagatggcca ctatcatggg gggttactgg ggccagggga ccctggtcac tgtgtcctcg      360
ggaggagggg gatcaggcgg cggcggttcc gggggaggag gaagccagtc cgcgctgact      420
cagccagctt ccgtgtctgg ttcgccggga cagtccatca ctattagctg taccggcacc      480
agcagcgacg tgggcggcta caactatgtg tcatggtacc agcagcaccc ggggaaggcg      540
cctaagctga tgatctacga cgtgtccaac cgccctagcg gagtgtccaa cagattctcc      600
ggttcgaagt cagggaacac tgcctccctc acgattagcg ggctgcaagc cgaggatgaa      660
gccgactact actgctcctc ctatacctcc tcctcgaccc tggacgtggt gttcggagga      720
ggcaccaagc tcaccgtcct t                                                741
<210> 53
<211> 735
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 53
gaagtgcaat tggtggaaag cggaggagga gtggtgcaac ctggaggaag cctgagactg       60
tcatgtgccg cctcgggatt cactttcgat gactacgcaa tgcactgggt ccgccaggcc      120
cccggaaagg gtctggaatg ggtgtccctc atctccggcg atgggggttc cacttactat      180
gcggattctg tgaagggccg cttcacaatc tcccgggaca attccaagaa cactctgtac      240
cttcaaatga actccctgag ggtggaggac accgctgtgt actactgcgc gagagtgttt      300
gactcgtact atatggacgt ctggggaaag ggcaccaccg tgaccgtgtc cagcggtggc      360
ggtggatcgg ggggcggcgg ctccgggagc ggaggttccg agattgtgct gactcagtcg      420
ccgttgtcac tgcctgtcac ccccgggcag ccggcctcca tttcatgccg gtccagccag      480
tccctggtct acaccgatgg gaacacttac ctcaactggt tccagcagcg cccaggacag      540
tccccgcgga ggctgatcta caaagtgtca aaccgggact ccggcgtccc cgatcggttc      600
tcgggaagcg gcagcgacac cgacttcacg ctgaagattt cccgcgtgga agccgaggac      660
gtgggcatct actactgtat gcagggcacc cactggtcgt ttaccttcgg acaaggaact      720
aggctcgaga tcaag                                                       735
<210> 54
<211> 741
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
полинуклеотид"
<400> 54
caagtgcagc ttcaagaaag cggtccagga ctcgtcaagc catcagaaac tctttccctc       60
acttgtaccg tgtcgggagg cagcatctcc tcgagctcct actactgggg ttggattaga      120
cagcccccgg gaaaggggtt ggagtggatc ggttccatct actactccgg gtcgacctac      180
tacaaccctt ccctgaaatc tcgggtgtcc atctccgtcg acacctccaa gaaccagttc      240
agcctgaagc tgaaatatgt gaccgcggcc gatactgccg tgtactattg cgccaccccg      300
ggaacctact acgacttcct ctcggggtac tacccgtttt actggggaca ggggactctc      360
gtgaccgtgt cctcgggcgg cggaggttca ggcggtggcg gatcgggggg aggaggctca      420
gacattgtga tgacccagag cccgtccagc ctgagcgcct ccgtgggcga tagggtcacg      480
attacttgcc gggcgtccca gggaatctca agctacctgg cctggtacca acagaagccc      540
ggaaaggcac ccaagttgct gatctatgcc gctagcactc tgcagtccgg ggtgccttcc      600
cgcttctccg gctccggctc gggcaccgac ttcaccctga ccatttcctc actgcaaccc      660
gaggacttcg ccacttacta ctgccagcag ctgaactcct acccttacac attcggacag      720
ggaaccaagc tggaaatcaa g                                                741
<210> 55
<211> 717
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 55
caagtgcaac tcgtggaatc tggtggagga ctcgtgcaac ccggaggatc attgcgactc       60
tcgtgtgcgg catccggctt taccttttca tcctactgga tgtcctgggt cagacaggcc      120
cccgggaagg gactggaatg ggtcgcgaac atcaacgagg acggctcggc caagttctac      180
gtggactccg tgaagggccg cttcacgatc tcacgggata acgccaagaa ttccctgtat      240
ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggac actgcggtgt acttctgcgc acgcgacctg      300
aggtccggga gatactgggg acagggcacc ctcgtgaccg tgtcgagcgg aggagggggg      360
tcgggcggcg gcggttccgg tggcggcggt agcgaaattg tgttgaccca gtcccctgga      420
accctgagcc tgtcacctgg aggacgcgcc accctgtcct gccgggccag ccagagcatc      480
tcagggtcct tcctggcttg gtaccagcag aagccgggac aggctccgag acttctgatc      540
tacggcgcct cctcgcgggc gaccggaatc ccggatcggt tctccggctc gggaagcgga      600
actgacttca ctcttaccat ttcccgcctg gagccggaag atttcgccgt gtactactgc      660
cagcagtacg ggtcatcccc tccaaccttc ggcctgggaa ctaagctgga aatcaaa         717
<210> 56
<211> 735
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 56
gaagtgcaac tccaacaatc cggtccagga ctcgtcagac cctccgaaac tctctcgctt       60
acatgcactg tgtccggcgg ccctgtgcgg tccggctctc attactggaa ctggattcgc      120
cagcccccgg gacgcggact ggagtggatc ggctacatct attactcggg gtcgactaac      180
tacaacccga gcctggaaaa tagagtgacc atctcaatcg acacgtccaa caaccacttc      240
tcgctgaagt tgtcctccgt gactgccgcc gatactgccc tgtacttctg tgctcgcgga      300
accgccacct tcgactggaa cttccctttt gactcatggg gccaggggac ccttgtgacc      360
gtgtccagcg gaggaggagg ctccggtggt ggcgggagcg gtagcggcgg aagcgacatc      420
cagatgaccc agtcaccgtc ctcgctgtcc gcatccattg gggatcgggt cactattact      480
tgccgggcgt cccagtccat ctcgtcctac ctgaactggt atcagcagaa gccagggaaa      540
gcccccaagc tgctgatcta cgcggccagc agcctgcagt caggagtgcc ttcaaggttt      600
agcggcagcg gatcgggaac cgacttcacc ctgaccattt cctccctcca acccgaggat      660
ttcgccacct actactgcca gcagtcctac tccaccccgt ggaccttcgg acagggaacc      720
aagctggaga tcaag                                                       735
<210> 57
<211> 747
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 57
caagtgcaac ttcaagaatc aggcgcagga cttctcaagc catccgaaac actctccctc       60
acttgcgcgg tgtacggggg aagcttctcg ggatactact ggtcctggat taggcagcct      120
cccggcaaag gcctggaatg ggtcggggag atcaaccact ccggttcaac caactacaac      180
ccgtcgctga agtcccgcgt gaccatttcc gtggacacct ctaagaatca gttcagcctg      240
aagctctcgt ccgtgaccgc ggcggacacc gccgtctact actgcgctcg gggatcagga      300
ctggtggtgt acgccatccg cgtgggctcg ggctggttcg attactgggg ccagggaacc      360
ctggtcactg tgtcgtccgg cggaggaggt tcggggggcg gagacagcgg tggagggggt      420
agcgacatcc agatgaccca gtccccgtcc tcgctgtccg cctccgtggg agatagagtg      480
accatcacct gtcgggcatc ccagagcatt tccagctacc tgaactggta tcagcagaag      540
cccggaaagg cccctaagct gttgatgtac gccgccagca gcttgcagtc gggcgtgccg      600
agccggtttt ccggttccgg ctccgggact gacttcaccc tgactatctc atccctgcaa      660
cccgaggact tcgccactta ttactgccag cagtcctact caacccctcc ctggacgttc      720
ggacagggca ccaaggtcga tatcaag                                          747
<210> 58
<211> 765
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 58
gaagtgcaat tggtggaatc tggaggagga cttgtgaaac ctggtggaag cctgagactt       60
tcctgtgcgg cctcgggatt cactttctcc tcctactcca tgaactgggt cagacaggcc      120
cctgggaagg gactggaatg ggtgtcatcc atctcctcct catcgtcgta catctactac      180
gccgatagcg tgaaggggcg gttcaccatt tcccgggaca acgctaagaa cagcctctat      240
ctgcaaatga attccctccg cgccgaggac actgccgtgt actactgcgc gagggacccc      300
tcatcaagcg gcagctacta catggaggac tcgtattact acggaatgga cgtctggggc      360
cagggaacca ctgtgacggt gtcctccggt ggagggggct ccgggggcgg gggatctggc      420
ggaggaggct ccaacttcat gctgacccag ccgcactccg tgtccgaaag ccccggaaag      480
accgtgacaa tttcctgcac cgggtcctcc ggctcgatcg catcaaacta cgtgcagtgg      540
taccagcagc gcccgggcag cgcccccacc actgtcatct acgaggataa ccagcggccg      600
tcgggtgtcc cagaccggtt ttccggttcg atcgatagca gcagcaacag cgcctccctg      660
accatttccg gcctcaagac cgaggatgag gctgactact actgccagtc gtatgactcc      720
tcgaaccaag tggtgttcgg tggcggcacc aagctgactg tgctg                      765
<210> 59
<211> 717
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 59
caagtgaacc tgagagaaag cggcggagga cttgtgcaac ctggaggaag cctgagactg       60
tcatgtgccg cgtccggctt caccttctcg tcctacgaga tgaactgggt ccgccaggca      120
ccgggcaaag gactggaatg ggtgtcctac atttcctcgt ccgggtccac catctattac      180
gccgactccg tgaagggacg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctctac      240
ctccaaatga actcactgag ggcagaggac actgcggtct actactgcgc ccgcgaagct      300
ttgggtagct cctgggagtg gggccaggga accactgtga ccgtgtcctc gggtggaggg      360
ggctccggtg gcgggggttc agggggtggc ggaagcgata tccagatgac tcagtcacca      420
agctccctga gcgcctcagt gggagatcgg gtcacaatca cgtgccaggc gtcccaggac      480
atttctaact acctcaattg gtaccagcag aagccgggga aggcccccaa gcttctgatc      540
tacgatgcct ccaacctgga aaccggcgtg ccctcccgct tctcgggatc gggcagcggc      600
actgacttca cctttaccat ctcgtccctg caacctgagg acatcgccac ctattactgc      660
cagcagtacg ataacctccc gctgactttc ggaggcggaa ctaagctgga gattaag         717
<210> 60
<211> 738
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 60
caagtgcaac tcgtccagtc cggtgcagaa gtcaaggaac ccggagcctc cgtgaaagtg       60
tcctgcaaag ctcctgccaa cactttctcg gaccacgtga tgcactgggt gcgccaggcg      120
ccgggccagc gcttcgaatg gatgggatac attcatgccg ccaatggcgg tacccactac      180
tcccaaaagt tccaggatag agtcaccatc acccgggaca ccagcgccaa caccgtgtat      240
atggatctgt ccagcctgag gtccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggggcgga      300
tacaactcag acgcgttcga catttgggga cagggtacta tggtcaccgt gtcatccggg      360
ggcggtggca gcgggggcgg aggctctggc ggaggcggat cagggggagg agggtccgac      420
atcgtgatga cccagtcccc gtcatcggtg tccgcgtccg tgggagacag agtgaccatc      480
acgtgtcgcg ccagccagga catctcctcg tggttggcat ggtaccagca gaagcctgga      540
aaggccccga agctgctcat ctacgccgcc tcctcccttc aatcgggagt gccctcgcgg      600
ttcaacggaa gcggaagcgg gacagatttt accctgacta ttagctcgct gcagcccgag      660
gacttcgcta cttactactg ccaacagagc tactccaccc cactgacttt cggcgggggt      720
accaaggtcg agatcaag                                                    738
<210> 61
<211> 744
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 61
caagtgcaac ttgttcaatc cggtggaggt cttgtgcagc ccggaggatc actcagactg       60
tcgtgcgccg cctctgggtt cactttctcc tcatactcga tgaactgggt gcgccaggcg      120
ccgggaaagg gcctggaatg ggtgtcatac atctcctcct catcctccac catctactac      180
gccgattccg tgaagggccg cttcactatt tcccgggaca acgcgaaaaa ctcgctctat      240
ctgcaaatga actccctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgggacctg      300
agcgtgcggg ctattgatgc gttcgacatc tggggacagg gcaccatggt cacagtgtcc      360
agcggaggcg gcggcagcgg tggaggagga tcagggggag gaggttcggg gggcggtggc      420
tccgatatcg tgctgaccca gagcccgtcg agcctctccg cctccgtcgg cgacagagtg      480
accatcacgt gtcaggcatc ccaggacatt agcaactacc tgaattggta ccagcagaag      540
cctggaaagg cacccaagtt gctgatctac gacgcctcca acctggaaac cggagtgcca      600
tccaggttct cgggcagcgg ctcgggaacc gacttcactt ttactatctc ctccctgcaa      660
cccgaggatt tcgcgaccta ctactgccag caggcctaca gcaccccttt caccttcggg      720
ccgggaacta aggtcgaaat caag                                             744
<210> 62
<211> 738
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 62
gaagtgcaat tggtgcaatc aggaggagga gtggtcagat ctggaagaag cctgagactg       60
tcatgcgcgg cttcgggctt taccttcaac tcctacggcc tccactgggt gcgccaggcc      120
cccggaaaag gcctcgaatg ggtcgcactg attgagtacg acgggtccaa caagtactac      180
ggagatagcg tgaagggccg cttcaccatc tcacgggaca agtccaagtc caccctgtat      240
ctgcaaatgg acaacctgag ggccgaggat actgccgtgt actactgcgc ccgcgaagga      300
aacgaagatc tggccttcga tatttggggc cagggtactc ttgtgaccgt gtcgagcgga      360
ggcggaggct ccggtggagg aggatcgggg ggtggtggtt ccggcggcgg ggggagcgaa      420
atcgtgctga cccagtcgcc ttcctccctc tccgcttccg tgggggaccg ggtcactatt      480
acgtgtcagg cgtcccaatt catcaagaag aatctgaact ggtaccagca caagccggga      540
aaggccccca aactgctcat ctacgacgcc agctcgctgc agactggcgt gccttcccgg      600
ttttccggga accggtcggg aaccaccttc tcattcacca tcagcagcct ccagccggag      660
gacgtggcga cctactactg ccagcagcat gacaaccttc cactgacttt cggcgggggc      720
accaaggtcg agattaag                                                    738
<210> 63
<211> 765
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 63
caagtgcaac tcgtggaatc aggcggagga ctcgtgcaac ccggaggttc ccttagactg       60
tcatgtgccg cttccgggtt caatgtgtcc agcaactaca tgacctgggt cagacaggcg      120
ccgggaaagg gacttgaatg ggtgtccgtg atctactccg gtggagcaac atactacgga      180
gactccgtga aaggccgctt taccgtgtcc cgcgataact cgaagaacac cgtgtacttg      240
cagatgaaca ggctgactgc cgaggacacc gccgtgtatt attgcgcccg ggacaggctg      300
tactgtggaa acaactgcta cctgtactac tactacggga tggacgtgtg gggacagggc      360
actctcgtca ctgtgtcatc cggggggggc ggtagcggtg gcggagggtc cggcggagga      420
ggctcagggg gaggcggaag cgatatccag gtcacccagt ctccctcctc gctgtccgcc      480
tccgtgggcg accgcgtcac cattacttgc cgggcgtcgc agtcgatcag ctcctacctg      540
aactggtacc agcagaagcc tggaaaggcc ccgaagctgc tgatctacgc ggcctcgtcc      600
ctgcaaagcg gcgtcccgtc gcggttcagc ggttccggtt cgggaaccga cttcaccctg      660
actatttcct ccctgcaacc cgaggatttc gccacttact actgccagca gtcctactcc      720
accccacctc tgaccttcgg ccaaggaacc aaggtcgaaa tcaag                      765
<210> 64
<211> 741
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 64
caagtgcaac tcgtccagtc cggtgcagaa gtgaaaaaga gcggagcctc agtgaaagtg       60
tcctgcaagg cctccggtta ccccttcact ggatactaca ttcagtgggt ccgccaagcc      120
ccgggacagg gtctggagtg gatggggtgg attgacccta actcgggaaa tacgggatac      180
gcgcagaagt tccagggccg cgtgaccatg accaggaaca cctcgatcag caccgcctac      240
atggaactgt cctccctgcg gtcggaggat actgccgtgt actactgcgc ctccgattcc      300
tatgggtact actacggaat ggacgtctgg ggacagggca ccctcgtgac cgtgtcctcg      360
ggaggcggag ggagcggcgg gggtggatcg ggaggaggcg gctccggcgg cggcggtagc      420
gacatccaga tgacccagtc accatcaagc cttagcgcct ccgtgggcga cagagtgaca      480
ttcacttgtc gggcgtccca gggaatctcc tccgctctgg cttggtatca gcagaagcct      540
gggaagcctc cgaagctgtt gatctacgac gcgagcagcc tggaatcagg ggtgccctcc      600
cggttttccg ggtccggttc tggcaccgat ttcaccctga ccatttcgtc cctccaaccc      660
gaggacttcg ccacttacta ctgccagcag ttcaacaact acccgctgac cttcggagga      720
ggcactaagg tcgagatcaa g                                                741
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 65
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Glu Met Ala Thr Ile Met Gly Gly Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Phe Asp Ser Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 125
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
полипептид"
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Lys Tyr Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Thr Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Leu Ser Gly Tyr Tyr Pro
100                 105                 110
Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210> 68
<211> 116
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
полипептид"
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Ala Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Arg Ser Gly Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 123
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 69
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Pro Val Arg Ser Gly
20                  25                  30
Ser His Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Glu Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Asn Asn His Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Phe
85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Thr Ala Thr Phe Asp Trp Asn Phe Pro Phe Asp Ser
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 70
<211> 126
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Ser Gly Leu Val Val Tyr Ala Ile Arg Val Gly Ser Gly Trp
100                 105                 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210> 71
<211> 129
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Met Glu Asp Ser Tyr
100                 105                 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210> 72
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 72
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Ala Leu Gly Ser Ser Trp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 119
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Ala Asn Thr Phe Ser Asp His
20                  25                  30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile His Ala Ala Asn Gly Gly Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Ser Val Arg Ala Ile Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 75
<211> 119
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Ser Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Leu Ile Glu Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Glu Asp Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 76
<211> 127
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Arg Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Asn Asn Cys Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr
100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210> 77
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asp Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 78
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 78
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20                  25                  30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85                  90                  95
Ser Thr Leu Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 79
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 79
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Thr
20                  25                  30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85                  90                  95
Thr His Trp Ser Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 80
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> 81
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ser
20                  25                  30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> 83
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100                 105
<210> 84
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 84
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35                  40                  45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85                  90                  95
Ser Asn Gln Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 86
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Asn Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 87
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 88
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Phe Ile Lys Lys Asn
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Asn Arg Ser Gly Thr Thr Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Asn Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 89
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 89
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 91
<211> 491
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 91
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val
20                  25                  30
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly
35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser
85                  90                  95
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Glu Met Ala Thr Ile Met Gly
115                 120                 125
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu
145                 150                 155                 160
Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile
165                 170                 175
Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
180                 185                 190
Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp
195                 200                 205
Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys
210                 215                 220
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp
225                 230                 235                 240
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Asp
245                 250                 255
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro
260                 265                 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275                 280                 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290                 295                 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325                 330                 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340                 345                 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355                 360                 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370                 375                 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405                 410                 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420                 425                 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435                 440                 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450                 455                 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465                 470                 475                 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 92
<211> 489
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 92
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85                  90                  95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Phe Asp Ser Tyr Tyr Met Asp Val
115                 120                 125
Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145                 150                 155                 160
Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser
165                 170                 175
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Leu
180                 185                 190
Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
195                 200                 205
Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210                 215                 220
Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
225                 230                 235                 240
Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp Ser Phe Thr
245                 250                 255
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260                 265                 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275                 280                 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290                 295                 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305                 310                 315                 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325                 330                 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340                 345                 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355                 360                 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370                 375                 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385                 390                 395                 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405                 410                 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420                 425                 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435                 440                 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450                 455                 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465                 470                 475                 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 93
<211> 491
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 93
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20                  25                  30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
35                  40                  45
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro
50                  55                  60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr
85                  90                  95
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Lys Tyr Val Thr Ala Ala Asp
100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Leu
115                 120                 125
Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130                 135                 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165                 170                 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
180                 185                 190
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
195                 200                 205
Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210                 215                 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225                 230                 235                 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro
245                 250                 255
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
260                 265                 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275                 280                 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290                 295                 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325                 330                 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340                 345                 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355                 360                 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370                 375                 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405                 410                 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420                 425                 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435                 440                 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450                 455                 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465                 470                 475                 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 94
<211> 483
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 94
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Ala Lys Phe
65                  70                  75                  80
Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85                  90                  95
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu Arg Ser Gly Arg Tyr Trp Gly
115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
165                 170                 175
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
180                 185                 190
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala
195                 200                 205
Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
210                 215                 220
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys
245                 250                 255
Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
260                 265                 270
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
275                 280                 285
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
290                 295                 300
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
325                 330                 335
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
340                 345                 350
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
355                 360                 365
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
370                 375                 380
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
385                 390                 395                 400
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
405                 410                 415
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
420                 425                 430
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
435                 440                 445
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
450                 455                 460
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
465                 470                 475                 480
Pro Pro Arg
<210> 95
<211> 489
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 95
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
20                  25                  30
Val Arg Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
35                  40                  45
Pro Val Arg Ser Gly Ser His Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro
50                  55                  60
Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr
85                  90                  95
Ser Asn Asn His Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
100                 105                 110
Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Thr Ala Thr Phe Asp Trp Asn
115                 120                 125
Phe Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp
165                 170                 175
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
180                 185                 190
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195                 200                 205
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210                 215                 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
225                 230                 235                 240
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
245                 250                 255
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260                 265                 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275                 280                 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290                 295                 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305                 310                 315                 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325                 330                 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340                 345                 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355                 360                 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370                 375                 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385                 390                 395                 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405                 410                 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420                 425                 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435                 440                 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450                 455                 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465                 470                 475                 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 96
<211> 493
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 96
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Gly Leu
20                  25                  30
Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly
35                  40                  45
Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85                  90                  95
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100                 105                 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Gly Leu Val Val Tyr Ala Ile Arg
115                 120                 125
Val Gly Ser Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
130                 135                 140
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
165                 170                 175
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
180                 185                 190
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
195                 200                 205
Leu Met Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
210                 215                 220
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
245                 250                 255
Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Thr Thr
260                 265                 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275                 280                 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290                 295                 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305                 310                 315                 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325                 330                 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340                 345                 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355                 360                 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370                 375                 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405                 410                 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420                 425                 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435                 440                 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450                 455                 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465                 470                 475                 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 97
<211> 499
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 97
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20                  25                  30
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85                  90                  95
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr
115                 120                 125
Met Glu Asp Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
130                 135                 140
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser
165                 170                 175
Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly
180                 185                 190
Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser
195                 200                 205
Ala Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
210                 215                 220
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser
225                 230                 235                 240
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
245                 250                 255
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Gln Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
260                 265                 270
Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
275                 280                 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
290                 295                 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305                 310                 315                 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
325                 330                 335
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
340                 345                 350
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
355                 360                 365
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
370                 375                 380
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405                 410                 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420                 425                 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
435                 440                 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450                 455                 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
465                 470                 475                 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485                 490                 495
Pro Pro Arg
<210> 98
<211> 483
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 98
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85                  90                  95
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Leu Gly Ser Ser Trp Glu Trp
115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
145                 150                 155                 160
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
165                 170                 175
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
180                 185                 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu
195                 200                 205
Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
210                 215                 220
Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
245                 250                 255
Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
260                 265                 270
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
275                 280                 285
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
290                 295                 300
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
325                 330                 335
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
340                 345                 350
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
355                 360                 365
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
370                 375                 380
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
385                 390                 395                 400
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
405                 410                 415
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
420                 425                 430
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
435                 440                 445
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
450                 455                 460
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
465                 470                 475                 480
Pro Pro Arg
<210> 99
<211> 490
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 99
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20                  25                  30
Lys Glu Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Ala Asn
35                  40                  45
Thr Phe Ser Asp His Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50                  55                  60
Arg Phe Glu Trp Met Gly Tyr Ile His Ala Ala Asn Gly Gly Thr His
65                  70                  75                  80
Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser
85                  90                  95
Ala Asn Thr Val Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Asp
115                 120                 125
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
165                 170                 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp
180                 185                 190
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
195                 200                 205
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Asn Gly
210                 215                 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225                 230                 235                 240
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
245                 250                 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala
260                 265                 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275                 280                 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290                 295                 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325                 330                 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340                 345                 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355                 360                 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370                 375                 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385                 390                 395                 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405                 410                 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420                 425                 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435                 440                 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450                 455                 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465                 470                 475                 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 100
<211> 492
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 100
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu
20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85                  90                  95
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Ser Val Arg Ala Ile Asp Ala
115                 120                 125
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
130                 135                 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
165                 170                 175
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser
180                 185                 190
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
195                 200                 205
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
210                 215                 220
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Thr
245                 250                 255
Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr
260                 265                 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275                 280                 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290                 295                 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305                 310                 315                 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325                 330                 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340                 345                 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355                 360                 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370                 375                 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385                 390                 395                 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405                 410                 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420                 425                 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435                 440                 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450                 455                 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465                 470                 475                 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 101
<211> 490
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 101
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
20                  25                  30
Val Arg Ser Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Asn Ser Tyr Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Glu Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser
85                  90                  95
Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asn Glu Asp Leu Ala Phe Asp
115                 120                 125
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
165                 170                 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Phe Ile Lys Lys Asn
180                 185                 190
Leu Asn Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
195                 200                 205
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
210                 215                 220
Asn Arg Ser Gly Thr Thr Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225                 230                 235                 240
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Asn Leu Pro Leu
245                 250                 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala
260                 265                 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275                 280                 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290                 295                 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325                 330                 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340                 345                 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355                 360                 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370                 375                 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385                 390                 395                 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405                 410                 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420                 425                 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435                 440                 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450                 455                 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465                 470                 475                 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 102
<211> 499
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 102
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Asn Val Ser Ser Asn Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys
85                  90                  95
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala
100                 105                 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Asn Asn Cys Tyr
115                 120                 125
Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130                 135                 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro
165                 170                 175
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
180                 185                 190
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
195                 200                 205
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
210                 215                 220
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
225                 230                 235                 240
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
245                 250                 255
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
260                 265                 270
Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
275                 280                 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
290                 295                 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305                 310                 315                 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
325                 330                 335
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
340                 345                 350
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
355                 360                 365
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
370                 375                 380
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405                 410                 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420                 425                 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
435                 440                 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450                 455                 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
465                 470                 475                 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485                 490                 495
Pro Pro Arg
<210> 103
<211> 491
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 103
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20                  25                  30
Lys Lys Ser Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35                  40                  45
Pro Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asp Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser
85                  90                  95
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met
115                 120                 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165                 170                 175
Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
180                 185                 190
Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu
195                 200                 205
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210                 215                 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225                 230                 235                 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro
245                 250                 255
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
260                 265                 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275                 280                 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290                 295                 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325                 330                 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340                 345                 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355                 360                 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370                 375                 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385                 390                 395                 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405                 410                 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420                 425                 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435                 440                 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450                 455                 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465                 470                 475                 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485                 490
<210> 104
<211> 1473
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 104
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
cccgaagtgc aactccaaca gtcaggcgca gaagtcaaga agcccggatc gtcagtgaaa      120
gtgtcctgca aagcctccgg cggaaccttc agctcctacg caatcagctg ggtgcggcag      180
gcgcccggac agggactgga gtggatgggc ggtatcattc cgatctttgg caccgccaat      240
tacgcccaga agttccaggg acgcgtcaca atcaccgccg acgaatcgac ttccaccgcc      300
tacatggagc tgtcgtcctt gaggagcgaa gataccgccg tgtactactg cgctcgggat      360
ctggagatgg ccactatcat ggggggttac tggggccagg ggaccctggt cactgtgtcc      420
tcgggaggag ggggatcagg cggcggcggt tccgggggag gaggaagcca gtccgcgctg      480
actcagccag cttccgtgtc tggttcgccg ggacagtcca tcactattag ctgtaccggc      540
accagcagcg acgtgggcgg ctacaactat gtgtcatggt accagcagca cccggggaag      600
gcgcctaagc tgatgatcta cgacgtgtcc aaccgcccta gcggagtgtc caacagattc      660
tccggttcga agtcagggaa cactgcctcc ctcacgatta gcgggctgca agccgaggat      720
gaagccgact actactgctc ctcctatacc tcctcctcga ccctggacgt ggtgttcgga      780
ggaggcacca agctcaccgt ccttaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct      840
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt      900
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg      960
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt     1020
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa     1080
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc     1140
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctacaagc aggggcagaa ccagctctac     1200
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg     1260
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag     1320
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga     1380
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat     1440
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg                                  1473
<210> 105
<211> 1467
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 105
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
cccgaagtgc aattggtgga aagcggagga ggagtggtgc aacctggagg aagcctgaga      120
ctgtcatgtg ccgcctcggg attcactttc gatgactacg caatgcactg ggtccgccag      180
gcccccggaa agggtctgga atgggtgtcc ctcatctccg gcgatggggg ttccacttac      240
tatgcggatt ctgtgaaggg ccgcttcaca atctcccggg acaattccaa gaacactctg      300
taccttcaaa tgaactccct gagggtggag gacaccgctg tgtactactg cgcgagagtg      360
tttgactcgt actatatgga cgtctgggga aagggcacca ccgtgaccgt gtccagcggt      420
ggcggtggat cggggggcgg cggctccggg agcggaggtt ccgagattgt gctgactcag      480
tcgccgttgt cactgcctgt cacccccggg cagccggcct ccatttcatg ccggtccagc      540
cagtccctgg tctacaccga tgggaacact tacctcaact ggttccagca gcgcccagga      600
cagtccccgc ggaggctgat ctacaaagtg tcaaaccggg actccggcgt ccccgatcgg      660
ttctcgggaa gcggcagcga caccgacttc acgctgaaga tttcccgcgt ggaagccgag      720
gacgtgggca tctactactg tatgcagggc acccactggt cgtttacctt cggacaagga      780
actaggctcg agatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc      840
atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc      900
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt      960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag     1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag     1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa     1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa     1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca     1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa     1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc     1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct     1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg                                         1467
<210> 106
<211> 1473
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 106
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtgc agcttcaaga aagcggtcca ggactcgtca agccatcaga aactctttcc      120
ctcacttgta ccgtgtcggg aggcagcatc tcctcgagct cctactactg gggttggatt      180
agacagcccc cgggaaaggg gttggagtgg atcggttcca tctactactc cgggtcgacc      240
tactacaacc cttccctgaa atctcgggtg tccatctccg tcgacacctc caagaaccag      300
ttcagcctga agctgaaata tgtgaccgcg gccgatactg ccgtgtacta ttgcgccacc      360
ccgggaacct actacgactt cctctcgggg tactacccgt tttactgggg acaggggact      420
ctcgtgaccg tgtcctcggg cggcggaggt tcaggcggtg gcggatcggg gggaggaggc      480
tcagacattg tgatgaccca gagcccgtcc agcctgagcg cctccgtggg cgatagggtc      540
acgattactt gccgggcgtc ccagggaatc tcaagctacc tggcctggta ccaacagaag      600
cccggaaagg cacccaagtt gctgatctat gccgctagca ctctgcagtc cggggtgcct      660
tcccgcttct ccggctccgg ctcgggcacc gacttcaccc tgaccatttc ctcactgcaa      720
cccgaggact tcgccactta ctactgccag cagctgaact cctaccctta cacattcgga      780
cagggaacca agctggaaat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct      840
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt      900
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg      960
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt     1020
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa     1080
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc     1140
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctacaagc aggggcagaa ccagctctac     1200
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg     1260
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag     1320
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga     1380
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat     1440
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg                                  1473
<210> 107
<211> 1449
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 107
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtgc aactcgtgga atctggtgga ggactcgtgc aacccggagg atcattgcga      120
ctctcgtgtg cggcatccgg ctttaccttt tcatcctact ggatgtcctg ggtcagacag      180
gcccccggga agggactgga atgggtcgcg aacatcaacg aggacggctc ggccaagttc      240
tacgtggact ccgtgaaggg ccgcttcacg atctcacggg ataacgccaa gaattccctg      300
tatctgcaaa tgaacagcct gagggccgag gacactgcgg tgtacttctg cgcacgcgac      360
ctgaggtccg ggagatactg gggacagggc accctcgtga ccgtgtcgag cggaggaggg      420
gggtcgggcg gcggcggttc cggtggcggc ggtagcgaaa ttgtgttgac ccagtcccct      480
ggaaccctga gcctgtcacc tggaggacgc gccaccctgt cctgccgggc cagccagagc      540
atctcagggt ccttcctggc ttggtaccag cagaagccgg gacaggctcc gagacttctg      600
atctacggcg cctcctcgcg ggcgaccgga atcccggatc ggttctccgg ctcgggaagc      660
ggaactgact tcactcttac catttcccgc ctggagccgg aagatttcgc cgtgtactac      720
tgccagcagt acgggtcatc ccctccaacc ttcggcctgg gaactaagct ggaaatcaaa      780
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg      840
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt      900
gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg      960
ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt     1020
aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg     1080
ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat     1140
gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga     1200
gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg     1260
cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa     1320
gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg     1380
taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg     1440
ccgcctcgg                                                             1449
<210> 108
<211> 1467
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 108
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
cccgaagtgc aactccaaca atccggtcca ggactcgtca gaccctccga aactctctcg      120
cttacatgca ctgtgtccgg cggccctgtg cggtccggct ctcattactg gaactggatt      180
cgccagcccc cgggacgcgg actggagtgg atcggctaca tctattactc ggggtcgact      240
aactacaacc cgagcctgga aaatagagtg accatctcaa tcgacacgtc caacaaccac      300
ttctcgctga agttgtcctc cgtgactgcc gccgatactg ccctgtactt ctgtgctcgc      360
ggaaccgcca ccttcgactg gaacttccct tttgactcat ggggccaggg gacccttgtg      420
accgtgtcca gcggaggagg aggctccggt ggtggcggga gcggtagcgg cggaagcgac      480
atccagatga cccagtcacc gtcctcgctg tccgcatcca ttggggatcg ggtcactatt      540
acttgccggg cgtcccagtc catctcgtcc tacctgaact ggtatcagca gaagccaggg      600
aaagccccca agctgctgat ctacgcggcc agcagcctgc agtcaggagt gccttcaagg      660
tttagcggca gcggatcggg aaccgacttc accctgacca tttcctccct ccaacccgag      720
gatttcgcca cctactactg ccagcagtcc tactccaccc cgtggacctt cggacaggga      780
accaagctgg agatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc      840
atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc      900
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt      960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag     1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag     1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa     1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa     1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca     1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa     1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc     1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct     1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg                                         1467
<210> 109
<211> 1479
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 109
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtgc aacttcaaga atcaggcgca ggacttctca agccatccga aacactctcc      120
ctcacttgcg cggtgtacgg gggaagcttc tcgggatact actggtcctg gattaggcag      180
cctcccggca aaggcctgga atgggtcggg gagatcaacc actccggttc aaccaactac      240
aacccgtcgc tgaagtcccg cgtgaccatt tccgtggaca cctctaagaa tcagttcagc      300
ctgaagctct cgtccgtgac cgcggcggac accgccgtct actactgcgc tcggggatca      360
ggactggtgg tgtacgccat ccgcgtgggc tcgggctggt tcgattactg gggccaggga      420
accctggtca ctgtgtcgtc cggcggagga ggttcggggg gcggagacag cggtggaggg      480
ggtagcgaca tccagatgac ccagtccccg tcctcgctgt ccgcctccgt gggagataga      540
gtgaccatca cctgtcgggc atcccagagc atttccagct acctgaactg gtatcagcag      600
aagcccggaa aggcccctaa gctgttgatg tacgccgcca gcagcttgca gtcgggcgtg      660
ccgagccggt tttccggttc cggctccggg actgacttca ccctgactat ctcatccctg      720
caacccgagg acttcgccac ttattactgc cagcagtcct actcaacccc tccctggacg      780
ttcggacagg gcaccaaggt cgatatcaag accactaccc cagcaccgag gccacccacc      840
ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca      900
gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc      960
cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag     1020
cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact     1080
actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa     1140
ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag     1200
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga     1260
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac     1320
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa     1380
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac     1440
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg                            1479
<210> 110
<211> 1497
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 110
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
cccgaagtgc aattggtgga atctggagga ggacttgtga aacctggtgg aagcctgaga      120
ctttcctgtg cggcctcggg attcactttc tcctcctact ccatgaactg ggtcagacag      180
gcccctggga agggactgga atgggtgtca tccatctcct cctcatcgtc gtacatctac      240
tacgccgata gcgtgaaggg gcggttcacc atttcccggg acaacgctaa gaacagcctc      300
tatctgcaaa tgaattccct ccgcgccgag gacactgccg tgtactactg cgcgagggac      360
ccctcatcaa gcggcagcta ctacatggag gactcgtatt actacggaat ggacgtctgg      420
ggccagggaa ccactgtgac ggtgtcctcc ggtggagggg gctccggggg cgggggatct      480
ggcggaggag gctccaactt catgctgacc cagccgcact ccgtgtccga aagccccgga      540
aagaccgtga caatttcctg caccgggtcc tccggctcga tcgcatcaaa ctacgtgcag      600
tggtaccagc agcgcccggg cagcgccccc accactgtca tctacgagga taaccagcgg      660
ccgtcgggtg tcccagaccg gttttccggt tcgatcgata gcagcagcaa cagcgcctcc      720
ctgaccattt ccggcctcaa gaccgaggat gaggctgact actactgcca gtcgtatgac      780
tcctcgaacc aagtggtgtt cggtggcggc accaagctga ctgtgctgac cactacccca      840
gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg      900
gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc      960
gatatctaca tttgggcccc tctggctggt acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg     1020
atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc     1080
atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag gacggctgtt catgccggtt cccagaggag     1140
gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac     1200
aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac     1260
gtgctggaca agcggagagg acgggaccca gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat     1320
ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag     1380
attggtatga aaggggaacg cagaagaggc aaaggccacg acggactgta ccagggactc     1440
agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg        1497
<210> 111
<211> 1449
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 111
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtga acctgagaga aagcggcgga ggacttgtgc aacctggagg aagcctgaga      120
ctgtcatgtg ccgcgtccgg cttcaccttc tcgtcctacg agatgaactg ggtccgccag      180
gcaccgggca aaggactgga atgggtgtcc tacatttcct cgtccgggtc caccatctat      240
tacgccgact ccgtgaaggg acggttcacc atctcccggg acaacgccaa gaactccctc      300
tacctccaaa tgaactcact gagggcagag gacactgcgg tctactactg cgcccgcgaa      360
gctttgggta gctcctggga gtggggccag ggaaccactg tgaccgtgtc ctcgggtgga      420
gggggctccg gtggcggggg ttcagggggt ggcggaagcg atatccagat gactcagtca      480
ccaagctccc tgagcgcctc agtgggagat cgggtcacaa tcacgtgcca ggcgtcccag      540
gacatttcta actacctcaa ttggtaccag cagaagccgg ggaaggcccc caagcttctg      600
atctacgatg cctccaacct ggaaaccggc gtgccctccc gcttctcggg atcgggcagc      660
ggcactgact tcacctttac catctcgtcc ctgcaacctg aggacatcgc cacctattac      720
tgccagcagt acgataacct cccgctgact ttcggaggcg gaactaagct ggagattaag      780
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg      840
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt      900
gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg      960
ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt     1020
aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg     1080
ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat     1140
gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga     1200
gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg     1260
cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa     1320
gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg     1380
taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg     1440
ccgcctcgg                                                             1449
<210> 112
<211> 1470
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 112
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtgc aactcgtcca gtccggtgca gaagtcaagg aacccggagc ctccgtgaaa      120
gtgtcctgca aagctcctgc caacactttc tcggaccacg tgatgcactg ggtgcgccag      180
gcgccgggcc agcgcttcga atggatggga tacattcatg ccgccaatgg cggtacccac      240
tactcccaaa agttccagga tagagtcacc atcacccggg acaccagcgc caacaccgtg      300
tatatggatc tgtccagcct gaggtccgag gataccgccg tgtactactg cgcccggggc      360
ggatacaact cagacgcgtt cgacatttgg ggacagggta ctatggtcac cgtgtcatcc      420
gggggcggtg gcagcggggg cggaggctct ggcggaggcg gatcaggggg aggagggtcc      480
gacatcgtga tgacccagtc cccgtcatcg gtgtccgcgt ccgtgggaga cagagtgacc      540
atcacgtgtc gcgccagcca ggacatctcc tcgtggttgg catggtacca gcagaagcct      600
ggaaaggccc cgaagctgct catctacgcc gcctcctccc ttcaatcggg agtgccctcg      660
cggttcaacg gaagcggaag cgggacagat tttaccctga ctattagctc gctgcagccc      720
gaggacttcg ctacttacta ctgccaacag agctactcca ccccactgac tttcggcggg      780
ggtaccaagg tcgagatcaa gaccactacc ccagcaccga ggccacccac cccggctcct      840
accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg      900
gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct      960
ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg     1020
aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag     1080
gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg     1140
aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac     1200
gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac     1260
ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc     1320
caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga     1380
ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac     1440
gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg                                      1470
<210> 113
<211> 1476
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 113
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtgc aacttgttca atccggtgga ggtcttgtgc agcccggagg atcactcaga      120
ctgtcgtgcg ccgcctctgg gttcactttc tcctcatact cgatgaactg ggtgcgccag      180
gcgccgggaa agggcctgga atgggtgtca tacatctcct cctcatcctc caccatctac      240
tacgccgatt ccgtgaaggg ccgcttcact atttcccggg acaacgcgaa aaactcgctc      300
tatctgcaaa tgaactccct gcgcgccgag gacaccgccg tgtactactg cgcccgggac      360
ctgagcgtgc gggctattga tgcgttcgac atctggggac agggcaccat ggtcacagtg      420
tccagcggag gcggcggcag cggtggagga ggatcagggg gaggaggttc ggggggcggt      480
ggctccgata tcgtgctgac ccagagcccg tcgagcctct ccgcctccgt cggcgacaga      540
gtgaccatca cgtgtcaggc atcccaggac attagcaact acctgaattg gtaccagcag      600
aagcctggaa aggcacccaa gttgctgatc tacgacgcct ccaacctgga aaccggagtg      660
ccatccaggt tctcgggcag cggctcggga accgacttca cttttactat ctcctccctg      720
caacccgagg atttcgcgac ctactactgc cagcaggcct acagcacccc tttcaccttc      780
gggccgggaa ctaaggtcga aatcaagacc actaccccag caccgaggcc acccaccccg      840
gctcctacca tcgcctccca gcctctgtcc ctgcgtccgg aggcatgtag acccgcagct      900
ggtggggccg tgcatacccg gggtcttgac ttcgcctgcg atatctacat ttgggcccct      960
ctggctggta cttgcggggt cctgctgctt tcactcgtga tcactcttta ctgtaagcgc     1020
ggtcggaaga agctgctgta catctttaag caacccttca tgaggcctgt gcagactact     1080
caagaggagg acggctgttc atgccggttc ccagaggagg aggaaggcgg ctgcgaactg     1140
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc     1200
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga     1260
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac     1320
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc     1380
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc     1440
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg                               1476
<210> 114
<211> 1470
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 114
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
cccgaagtgc aattggtgca atcaggagga ggagtggtca gatctggaag aagcctgaga      120
ctgtcatgcg cggcttcggg ctttaccttc aactcctacg gcctccactg ggtgcgccag      180
gcccccggaa aaggcctcga atgggtcgca ctgattgagt acgacgggtc caacaagtac      240
tacggagata gcgtgaaggg ccgcttcacc atctcacggg acaagtccaa gtccaccctg      300
tatctgcaaa tggacaacct gagggccgag gatactgccg tgtactactg cgcccgcgaa      360
ggaaacgaag atctggcctt cgatatttgg ggccagggta ctcttgtgac cgtgtcgagc      420
ggaggcggag gctccggtgg aggaggatcg gggggtggtg gttccggcgg cggggggagc      480
gaaatcgtgc tgacccagtc gccttcctcc ctctccgctt ccgtggggga ccgggtcact      540
attacgtgtc aggcgtccca attcatcaag aagaatctga actggtacca gcacaagccg      600
ggaaaggccc ccaaactgct catctacgac gccagctcgc tgcagactgg cgtgccttcc      660
cggttttccg ggaaccggtc gggaaccacc ttctcattca ccatcagcag cctccagccg      720
gaggacgtgg cgacctacta ctgccagcag catgacaacc ttccactgac tttcggcggg      780
ggcaccaagg tcgagattaa gaccactacc ccagcaccga ggccacccac cccggctcct      840
accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg      900
gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct      960
ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg     1020
aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag     1080
gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg     1140
aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac     1200
gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac     1260
ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc     1320
caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga     1380
ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac     1440
gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg                                      1470
<210> 115
<211> 1497
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 115
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtgc aactcgtgga atcaggcgga ggactcgtgc aacccggagg ttcccttaga      120
ctgtcatgtg ccgcttccgg gttcaatgtg tccagcaact acatgacctg ggtcagacag      180
gcgccgggaa agggacttga atgggtgtcc gtgatctact ccggtggagc aacatactac      240
ggagactccg tgaaaggccg ctttaccgtg tcccgcgata actcgaagaa caccgtgtac      300
ttgcagatga acaggctgac tgccgaggac accgccgtgt attattgcgc ccgggacagg      360
ctgtactgtg gaaacaactg ctacctgtac tactactacg ggatggacgt gtggggacag      420
ggcactctcg tcactgtgtc atccgggggg ggcggtagcg gtggcggagg gtccggcgga      480
ggaggctcag ggggaggcgg aagcgatatc caggtcaccc agtctccctc ctcgctgtcc      540
gcctccgtgg gcgaccgcgt caccattact tgccgggcgt cgcagtcgat cagctcctac      600
ctgaactggt accagcagaa gcctggaaag gccccgaagc tgctgatcta cgcggcctcg      660
tccctgcaaa gcggcgtccc gtcgcggttc agcggttccg gttcgggaac cgacttcacc      720
ctgactattt cctccctgca acccgaggat ttcgccactt actactgcca gcagtcctac      780
tccaccccac ctctgacctt cggccaagga accaaggtcg aaatcaagac cactacccca      840
gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg      900
gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc      960
gatatctaca tttgggcccc tctggctggt acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg     1020
atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc     1080
atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag gacggctgtt catgccggtt cccagaggag     1140
gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac     1200
aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac     1260
gtgctggaca agcggagagg acgggaccca gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat     1320
ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag     1380
attggtatga aaggggaacg cagaagaggc aaaggccacg acggactgta ccagggactc     1440
agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg        1497
<210> 116
<211> 1473
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 116
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
ccccaagtgc aactcgtcca gtccggtgca gaagtgaaaa agagcggagc ctcagtgaaa      120
gtgtcctgca aggcctccgg ttaccccttc actggatact acattcagtg ggtccgccaa      180
gccccgggac agggtctgga gtggatgggg tggattgacc ctaactcggg aaatacggga      240
tacgcgcaga agttccaggg ccgcgtgacc atgaccagga acacctcgat cagcaccgcc      300
tacatggaac tgtcctccct gcggtcggag gatactgccg tgtactactg cgcctccgat      360
tcctatgggt actactacgg aatggacgtc tggggacagg gcaccctcgt gaccgtgtcc      420
tcgggaggcg gagggagcgg cgggggtgga tcgggaggag gcggctccgg cggcggcggt      480
agcgacatcc agatgaccca gtcaccatca agccttagcg cctccgtggg cgacagagtg      540
acattcactt gtcgggcgtc ccagggaatc tcctccgctc tggcttggta tcagcagaag      600
cctgggaagc ctccgaagct gttgatctac gacgcgagca gcctggaatc aggggtgccc      660
tcccggtttt ccgggtccgg ttctggcacc gatttcaccc tgaccatttc gtccctccaa      720
cccgaggact tcgccactta ctactgccag cagttcaaca actacccgct gaccttcgga      780
ggaggcacta aggtcgagat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct      840
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt      900
ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg      960
gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt     1020
cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa     1080
gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc     1140
gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctacaagc aggggcagaa ccagctctac     1200
aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg     1260
gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag     1320
ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga     1380
agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat     1440
gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg                                  1473
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 117
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1               5                   10
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 118
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
1               5                   10
<210> 119
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 119
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1               5                   10
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 120
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser
1               5                   10
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 121
Gly Gly Pro Val Arg Ser Gly Ser His Tyr Trp Asn
1               5                   10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательностт: синтетический
пептид"
<400> 122
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser
1               5                   10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 123
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1               5                   10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 124
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Met Asn
1               5                   10
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 125
Ala Asn Thr Phe Ser Asp His Val Met His
1               5                   10
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 126
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1               5                   10
<210> 127
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 127
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Gly Leu His
1               5                   10
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 128
Gly Phe Asn Val Ser Ser Asn Tyr Met Thr
1               5                   10
<210> 129
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 129
Gly Tyr Pro Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile Gln
1               5                   10
<210> 130
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 130
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 131
Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 132
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 133
Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Ala Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 134
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 134
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn
1               5                   10                  15
<210> 135
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 135
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 136
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 137
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 137
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 138
Tyr Ile His Ala Ala Asn Gly Gly Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Asp
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 139
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 140
Leu Ile Glu Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 141
Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 142
Trp Ile Asp Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 143
Asp Leu Glu Met Ala Thr Ile Met Gly Gly Tyr
1               5                   10
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 144
Val Phe Asp Ser Tyr Tyr Met Asp Val
1               5
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 145
Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Leu Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Tyr
1               5                   10                  15
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 146
Asp Leu Arg Ser Gly Arg Tyr
1               5
<210> 147
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
пептид"
<400> 147
Gly Thr Ala Thr Phe Asp Trp Asn Phe Pro Phe Asp Ser
1               5                   10
<210> 148
<211> 18
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 148
Gly Ser Gly Leu Val Val Tyr Ala Ile Arg Val Gly Ser Gly Trp Phe
1               5                   10                  15
Asp Tyr
<210> 149
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 149
Asp Pro Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Met Glu Asp Ser Tyr Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 150
Glu Ala Leu Gly Ser Ser Trp Glu
1               5
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 151
Gly Gly Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 152
Asp Leu Ser Val Arg Ala Ile Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 153
Glu Gly Asn Glu Asp Leu Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 154
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 154
Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Asn Asn Cys Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1               5                   10                  15
Met Asp Val
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 155
Asp Ser Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210> 156
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 156
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210> 157
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 157
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210> 158
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 158
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210> 159
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 159
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ser Phe Leu Ala
1               5                   10
<210> 160
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 160
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 161
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 161
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 162
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 162
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1               5                   10
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 163
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 164
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 164
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1               5                   10
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 165
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 166
Gln Ala Ser Gln Phe Ile Lys Lys Asn Leu Asn
1               5                   10
<210> 167
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 167
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 168
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1               5                   10
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 169
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1               5
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 170
Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser
1               5
<210> 171
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 171
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1               5
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 172
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 173
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 174
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 175
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1               5
<210> 176
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 176
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1               5
<210> 177
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 177
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 178
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1               5
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 179
Asp Ala Ser Ser Leu Gln Thr
1               5
<210> 180
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 180
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 181
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1               5
<210> 182
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 182
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Asp Val Val
1               5                   10
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 183
Met Gln Gly Thr His Trp Ser Phe Thr
1               5
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 184
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 185
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr
1               5
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 186
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210> 187
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 187
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 188
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Gln Val Val
1               5                   10
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 189
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1               5
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 190
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 191
Gln Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 192
Gln Gln His Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1               5
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
пептид"
<400> 193
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
пептид"
<400> 194
Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 195
<211> 122
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
полипептид"
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Tyr Ser Ser Ser Trp His Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 196
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
полипептид"
<400> 196
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100                 105
<210> 197
<211> 489
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
полипептид"
<400> 197
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85                  90                  95
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Tyr Ser Ser Ser Trp His Asp
115                 120                 125
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly
130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
145                 150                 155                 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
165                 170                 175
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu
180                 185                 190
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
195                 200                 205
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210                 215                 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
225                 230                 235                 240
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
245                 250                 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260                 265                 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275                 280                 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290                 295                 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305                 310                 315                 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325                 330                 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340                 345                 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355                 360                 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370                 375                 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385                 390                 395                 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405                 410                 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420                 425                 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435                 440                 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450                 455                 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465                 470                 475                 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 198
<211> 1467
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательность: синтетический
полинуклеотид"
<400> 198
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg       60
cccgaagtgc aactcgtgga aagcggtgga ggtcttgtgc aacctggagg ttccttgcgc      120
ctgtcatgtg cagcttccgg cttcactttc tcctcgtacg agatgaattg ggtgcggcag      180
gcgcctggaa aggggctgga atgggtgtcc tacatctcaa gctccggctc gaccatctac      240
tacgcggaca gcgtgaaggg gcggttcacg atttcgaggg acaacgccaa gaactcgctc      300
tatctgcaaa tgaactccct gagagccgag gacaccgctg tgtattactg cgcccgggac      360
ccctactcct cctcatggca cgacgccttt gatatctggg gccagggaac catggtcacc      420
gtcagcagcg ggggcggagg ttccggggga gggggctccg gcggaggagg ctccgagatt      480
gtgttgactc agagcccggg taccctgtcg ctgagccccg gagagcgggc caccctttca      540
tgccgcgcca gccagtccgt gtcctcatcc tacctcgcgt ggtaccagca gaaacctggc      600
caggccccgc ggctgctgat ctacggcgcc tcctcgcgcg caaccggaat ccccgaccgg      660
ttctccgggt ctggcagcgg aaccgacttc actctcacca tttcgaggct ggagccggaa      720
gatttcgccg tgtactactg ccagcagtac ggctcctcgc cactgacttt cggcggagga      780
accaaggtcg atatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc      840
atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc      900
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt      960
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag     1020
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag     1080
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa     1140
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa     1200
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca     1260
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa     1320
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc     1380
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct     1440
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg                                         1467
<210> 199
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 199
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Met Asn
1               5                   10
<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 200
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 201
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 201
Asp Pro Tyr Ser Ser Ser Trp His Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 202
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 202
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210> 203
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 203
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 204
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
<210> 205
<211> 132
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 205
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ser Pro Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Val Ser Arg Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly
20                  25                  30
Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr
35                  40                  45
Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg
50                  55                  60
Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly
65                  70                  75                  80
Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu
85                  90                  95
Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile
100                 105                 110
Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu
115                 120                 125
Glu Thr Ser Tyr
130
<210> 206
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 206
Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys
1               5                   10                  15
Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly
20                  25                  30
Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met
35                  40                  45
Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln
50                  55                  60
Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu
85                  90                  95
Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Thr Ser
100                 105
<210> 207
<211> 93
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 207
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85                  90
<210> 208
<211> 95
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 208
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 209
<211> 95
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 209
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 210
<211> 95
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 210
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 211
<211> 95
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Любая аминокислота
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> Любая амнокислота
<400> 211
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Xaa Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Xaa Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 212
<211> 95
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 212
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 213
<211> 95
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 213
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20                  25                  30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35                  40                  45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50                  55                  60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85                  90                  95
<210> 214
<211> 1132
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 214
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1               5                   10                  15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20                  25                  30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35                  40                  45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50                  55                  60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85                  90                  95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100                 105                 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115                 120                 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130                 135                 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145                 150                 155                 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165                 170                 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180                 185                 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195                 200                 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210                 215                 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225                 230                 235                 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245                 250                 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260                 265                 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275                 280                 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290                 295                 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305                 310                 315                 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325                 330                 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340                 345                 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355                 360                 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370                 375                 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385                 390                 395                 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405                 410                 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420                 425                 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435                 440                 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450                 455                 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465                 470                 475                 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485                 490                 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500                 505                 510
Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515                 520                 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530                 535                 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545                 550                 555                 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565                 570                 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580                 585                 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595                 600                 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610                 615                 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625                 630                 635                 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645                 650                 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660                 665                 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675                 680                 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690                 695                 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705                 710                 715                 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725                 730                 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740                 745                 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755                 760                 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770                 775                 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785                 790                 795                 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805                 810                 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820                 825                 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835                 840                 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850                 855                 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865                 870                 875                 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885                 890                 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900                 905                 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915                 920                 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930                 935                 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945                 950                 955                 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965                 970                 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980                 985                 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn  Ile Tyr Lys Ile Leu  Leu Leu Gln
995                 1000                 1005
Ala Tyr  Arg Phe His Ala Cys  Val Leu Gln Leu Pro  Phe His Gln
1010                 1015                 1020
Gln Val  Trp Lys Asn Pro Thr  Phe Phe Leu Arg Val  Ile Ser Asp
1025                 1030                 1035
Thr Ala  Ser Leu Cys Tyr Ser  Ile Leu Lys Ala Lys  Asn Ala Gly
1040                 1045                 1050
Met Ser  Leu Gly Ala Lys Gly  Ala Ala Gly Pro Leu  Pro Ser Glu
1055                 1060                 1065
Ala Val  Gln Trp Leu Cys His  Gln Ala Phe Leu Leu  Lys Leu Thr
1070                 1075                 1080
Arg His  Arg Val Thr Tyr Val  Pro Leu Leu Gly Ser  Leu Arg Thr
1085                 1090                 1095
Ala Gln  Thr Gln Leu Ser Arg  Lys Leu Pro Gly Thr  Thr Leu Thr
1100                 1105                 1110
Ala Leu  Glu Ala Ala Ala Asn  Pro Ala Leu Pro Ser  Asp Phe Lys
1115                 1120                 1125
Thr Ile  Leu Asp
1130
<210> 215
<211> 4027
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 215
caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc       60
cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc      120
tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg      180
gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg      240
cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg      300
cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg      360
cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct      420
acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc      480
gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg      540
tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca      600
ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg      660
cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga      720
ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg      780
ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga      840
cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag      900
ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc      960
agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc     1020
ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc     1080
ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg     1140
agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc     1200
tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc     1260
agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag     1320
cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg     1380
acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt     1440
acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc     1500
acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca     1560
agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca     1620
ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg     1680
ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt     1740
atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga     1800
gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt     1860
cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc     1920
gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag     1980
ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt     2040
tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg     2100
gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc     2160
cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc     2220
aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc     2280
gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc     2340
acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg     2400
agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca     2460
gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg     2520
gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct     2580
gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc     2640
tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa     2700
ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga     2760
agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga     2820
tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg     2880
tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc     2940
gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt     3000
gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct     3060
acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc     3120
atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc     3180
tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg     3240
ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc     3300
tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc     3360
agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg     3420
cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg     3480
agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc     3540
ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct     3600
gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc     3660
tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc     3720
agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc     3780
cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc     3840
caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt     3900
gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg     3960
ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa     4020
aaaaaaa                                                               4027
<210> 216
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 216
ggaggtccct caccttcta                                                    19
<210> 217
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 217
cggaggatct tatgctgaa                                                    19
<210> 218
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 218
cccgcttcca gatcataca                                                    19
<210> 219
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 219
ggagacctca acaagatat                                                    19
<210> 220
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 220
aaggcatggt cattggtat                                                    19
<210> 221
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 221
gcatggtcat tggtatcat                                                    19
<210> 222
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 222
ggtcattggt atcatgagt                                                    19
<210> 223
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 223
cctagtgggt atccctgta                                                    19
<210> 224
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 224
gaggatggac attgttctt                                                    19
<210> 225
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 225
gcatgcaggc tacagttca                                                    19
<210> 226
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 226
ccagcacatg cactgttga                                                    19
<210> 227
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 227
cacatgcact gttgagtga                                                    19
<210> 228
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 228
ctggaggtcc ctcaccttct a                                                 21
<210> 229
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 229
gtcggaggat cttatgctga a                                                 21
<210> 230
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 230
tgcccgcttc cagatcatac a                                                 21
<210> 231
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 231
ctggagacct caacaagata t                                                 21
<210> 232
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 232
tcaaggcatg gtcattggta t                                                 21
<210> 233
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 233
aggcatggtc attggtatca t                                                 21
<210> 234
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 234
atggtcattg gtatcatgag t                                                 21
<210> 235
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 235
gccctagtgg gtatccctgt a                                                 21
<210> 236
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 236
atgaggatgg acattgttct t                                                 21
<210> 237
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 237
gagcatgcag gctacagttc a                                                 21
<210> 238
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 238
ttccagcaca tgcactgttg a                                                 21
<210> 239
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 239
agcacatgca ctgttgagtg a                                                 21
<210> 240
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 240
tagaaggtga gggacctcca g                                                 21
<210> 241
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 241
ttcagcataa gatcctccga c                                                 21
<210> 242
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 242
tgtatgatct ggaagcgggc a                                                 21
<210> 243
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 243
atatcttgtt gaggtctcca g                                                 21
<210> 244
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 244
ataccaatga ccatgccttg a                                                 21
<210> 245
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 245
atgataccaa tgaccatgcc t                                                 21
<210> 246
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 246
atggtcattg gtatcatgag t                                                 21
<210> 247
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 247
gccctagtgg gtatccctgt a                                                 21
<210> 248
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 248
atgaggatgg acattgttct t                                                 21
<210> 249
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 249
gagcatgcag gctacagttc a                                                 21
<210> 250
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 250
ttccagcaca tgcactgttg a                                                 21
<210> 251
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 251
agcacatgca ctgttgagtg a                                                 21
<210> 252
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 252
tagaaggtga gggacctcc                                                    19
<210> 253
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 253
ttcagcataa gatcctccg                                                    19
<210> 254
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 254
tgtatgatct ggaagcggg                                                    19
<210> 255
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 255
atatcttgtt gaggtctcc                                                    19
<210> 256
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 256
ataccaatga ccatgcctt                                                    19
<210> 257
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 257
atgataccaa tgaccatgc                                                    19
<210> 258
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 258
atggtcattg gtatcatga                                                    19
<210> 259
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 259
gccctagtgg gtatccctg                                                    19
<210> 260
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 260
atgaggatgg acattgttc                                                    19
<210> 261
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 261
gagcatgcag gctacagtt                                                    19
<210> 262
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 262
ttccagcaca tgcactgtt                                                    19
<210> 263
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 263
agcacatgca ctgttgagt                                                    19
<210> 264
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 264
ggccaggatg gttcttaga                                                    19
<210> 265
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 265
gcttcgtgct aaactggta                                                    19
<210> 266
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 266
gggcgtgact tccacatga                                                    19
<210> 267
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 267
caggcctaga gaagtttca                                                    19
<210> 268
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 268
cttggaaccc attcctgaa                                                    19
<210> 269
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 269
ggaacccatt cctgaaatt                                                    19
<210> 270
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 270
gaacccattc ctgaaatta                                                    19
<210> 271
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 271
aacccattcc tgaaattat                                                    19
<210> 272
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 272
acccattcct gaaattatt                                                    19
<210> 273
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 273
cccattcctg aaattattt                                                    19
<210> 274
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 274
ctgtggttct attatatta                                                    19
<210> 275
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 275
aaatatgaga gcatgctaa                                                    19
<210> 276
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 276
tctaagaacc atcctggcc                                                    19
<210> 277
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 277
taccagttta gcacgaagc                                                    19
<210> 278
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 278
tcatgtggaa gtcacgccc                                                    19
<210> 279
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 279
tgaaacttct ctaggcctg                                                    19
<210> 280
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 280
ttcaggaatg ggttccaag                                                    19
<210> 281
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 281
aatttcagga atgggttcc                                                    19
<210> 282
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 282
taatttcagg aatgggttc                                                    19
<210> 283
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 283
ataatttcag gaatgggtt                                                    19
<210> 284
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 284
aataatttca ggaatgggt                                                    19
<210> 285
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 285
aaataatttc aggaatggg                                                    19
<210> 286
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 286
taatataata gaaccacag                                                    19
<210> 287
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 287
ttagcatgct ctcatattt                                                    19
<210> 288
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 288
gcggccagga tggttcttag a                                                 21
<210> 289
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 289
gagcttcgtg ctaaactggt a                                                 21
<210> 290
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 290
acgggcgtga cttccacatg a                                                 21
<210> 291
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 291
tgcaggccta gagaagtttc a                                                 21
<210> 292
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 292
tccttggaac ccattcctga a                                                 21
<210> 293
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 293
ttggaaccca ttcctgaaat t                                                 21
<210> 294
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 294
tggaacccat tcctgaaatt a                                                 21
<210> 295
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 295
ggaacccatt cctgaaatta t                                                 21
<210> 296
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 296
gaacccattc ctgaaattat t                                                 21
<210> 297
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 297
aacccattcc tgaaattatt t                                                 21
<210> 298
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 298
ccctgtggtt ctattatatt a                                                 21
<210> 299
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 299
ttaaatatga gagcatgcta a                                                 21
<210> 300
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 300
tctaagaacc atcctggccg c                                                 21
<210> 301
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 301
taccagttta gcacgaagct c                                                 21
<210> 302
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 302
tcatgtggaa gtcacgcccg t                                                 21
<210> 303
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 303
tgaaacttct ctaggcctgc a                                                 21
<210> 304
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 304
ttcaggaatg ggttccaagg a                                                 21
<210> 305
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 305
aatttcagga atgggttcca a                                                 21
<210> 306
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 306
taatttcagg aatgggttcc a                                                 21
<210> 307
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 307
ataatttcag gaatgggttc c                                                 21
<210> 308
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 308
aataatttca ggaatgggtt c                                                 21
<210> 309
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 309
aaataatttc aggaatgggt t                                                 21
<210> 310
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 310
taatataata gaaccacagg g                                                 21
<210> 311
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
олигонуклеотид"
<400> 311
ttagcatgct ctcatattta a                                                 21
<210> 312
<211> 150
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 312
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa       60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                       150
<210> 313
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 313
Arg Gly Asp Ser
1
<210> 314
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 314
Ser Tyr Ala Ile Ser
1               5
<210> 315
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 315
Asp Tyr Ala Met His
1               5
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 316
Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1               5
<210> 317
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 317
Ser Tyr Trp Met Ser
1               5
<210> 318
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 318
Ser Gly Ser His Tyr Trp Asn
1               5
<210> 319
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 319
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1               5
<210> 320
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 320
Ser Tyr Ser Met Asn
1               5
<210> 321
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 321
Ser Tyr Glu Met Asn
1               5
<210> 322
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 322
Asp His Val Met His
1               5
<210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 323
Ser Tyr Ser Met Asn
1               5
<210> 324
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 324
Ser Tyr Gly Leu His
1               5
<210> 325
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 325
Ser Asn Tyr Met Thr
1               5
<210> 326
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 326
Gly Tyr Tyr Ile Gln
1               5
<210> 327
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 327
Ser Tyr Glu Met Asn
1               5
<210> 328
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 328
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 329
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 329
Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 330
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 330
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 331
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 331
Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Ala Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 332
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 332
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn
1               5                   10                  15
<210> 333
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 333
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 334
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 334
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 335
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 335
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 336
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 336
Tyr Ile His Ala Ala Asn Gly Gly Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Asp
<210> 337
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 337
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 338
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 338
Leu Ile Glu Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 339
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 339
Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210> 340
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 340
Trp Ile Asp Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 341
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 341
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 342
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 342
Asp Leu Glu Met Ala Thr Ile Met Gly Gly Tyr
1               5                   10
<210> 343
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 343
Val Phe Asp Ser Tyr Tyr Met Asp Val
1               5
<210> 344
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 344
Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Leu Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Tyr
1               5                   10                  15
<210> 345
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 345
Asp Leu Arg Ser Gly Arg Tyr
1               5
<210> 346
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 346
Gly Thr Ala Thr Phe Asp Trp Asn Phe Pro Phe Asp Ser
1               5                   10
<210> 347
<211> 18
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 347
Gly Ser Gly Leu Val Val Tyr Ala Ile Arg Val Gly Ser Gly Trp Phe
1               5                   10                  15
Asp Tyr
<210> 348
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 348
Asp Pro Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Met Glu Asp Ser Tyr Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210> 349
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 349
Glu Ala Leu Gly Ser Ser Trp Glu
1               5
<210> 350
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 350
Gly Gly Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 351
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 351
Asp Leu Ser Val Arg Ala Ile Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 352
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 352
Glu Gly Asn Glu Asp Leu Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 353
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 353
Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Asn Asn Cys Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1               5                   10                  15
Met Asp Val
<210> 354
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 354
Asp Ser Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210> 355
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 355
Asp Pro Tyr Ser Ser Ser Trp His Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 356
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 356
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1               5                   10
<210> 357
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
peptide"
<400> 357
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210> 358
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 358
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210> 359
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 359
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ser Phe Leu Ala
1               5                   10
<210> 360
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 360
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 361
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 361
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 362
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 362
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1               5                   10
<210> 363
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 363
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 364
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 364
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1               5                   10
<210> 365
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 365
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 366
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственная последовательности: синтетический
пептид"
<400> 366
Gln Ala Ser Gln Phe Ile Lys Lys Asn Leu Asn
1               5                   10
<210> 367
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 367
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 368
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 368
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1               5                   10
<210> 369
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 369
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210> 370
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 370
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1               5
<210> 371
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 371
Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser
1               5
<210> 372
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 372
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1               5
<210> 373
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 373
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210> 374
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 374
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 375
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 375
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 376
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 376
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1               5
<210> 377
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<221> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 377
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1               5
<210> 378
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 378
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 379
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 379
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1               5
<210> 380
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 380
Asp Ala Ser Ser Leu Gln Thr
1               5
<210> 381
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 381
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210> 382
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 382
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1               5
<210> 383
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 383
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210> 384
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 384
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Asp Val Val
1               5                   10
<210> 385
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 385
Met Gln Gly Thr His Trp Ser Phe Thr
1               5
<210> 386
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 386
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210> 387
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 387
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr
1               5
<210> 388
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 388
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210> 389
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 389
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210> 390
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 390
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Asn Gln Val Val
1               5                   10
<210> 391
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 391
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1               5
<210> 392
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 392
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 393
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 393
Gln Gln Ala Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210> 394
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 394
Gln Gln His Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1               5
<210> 395
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 395
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210> 396
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 396
Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 397
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
<210> 398
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 398
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210> 399
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 399
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
1               5
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 400
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210> 401
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 401
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210> 402
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 402
Gly Gly Pro Val Arg Ser Gly Ser His
1               5
<210> 403
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 403
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
1               5
<210> 404
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 404
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210> 405
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 405
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210> 406
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 406
Ala Asn Thr Phe Ser Asp His
1               5
<210> 407
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 407
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210> 408
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 408
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
1               5
<210> 409
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 409
Gly Phe Asn Val Ser Ser Asn
1               5
<210> 410
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 410
Gly Tyr Pro Phe Thr Gly Tyr
1               5
<210> 411
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 411
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1               5
<210> 412
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 412
Ile Pro Ile Phe Gly Thr
1               5
<210> 413
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 413
Ser Gly Asp Gly Gly Ser
1               5
<210> 414
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 414
Tyr Tyr Ser Gly Ser
1               5
<210> 415
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 415
Asn Glu Asp Gly Ser Ala
1               5
<210> 416
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 416
Tyr Tyr Ser Gly Ser
1               5
<210> 417
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 417
Asn His Ser Gly Ser
1               5
<210> 418
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 418
Ser Ser Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210> 419
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 419
Ser Ser Ser Gly Ser Thr
1               5
<210> 420
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 420
His Ala Ala Asn Gly Gly
1               5
<210> 421
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 421
Ser Ser Ser Ser Ser Thr
1               5
<210> 422
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 422
Glu Tyr Asp Gly Ser Asn
1               5
<210> 423
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 423
Tyr Ser Gly Gly Ala
1               5
<210> 424
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 424
Asp Pro Asn Ser Gly Asn
1               5
<210> 425
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 425
Ser Ser Ser Gly Ser Thr
1               5
<210> 426
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 426
Asp Leu Glu Met Ala Thr Ile Met Gly Gly Tyr
1               5                   10
<210> 427
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 427
Val Phe Asp Ser Tyr Tyr Met Asp Val
1               5
<210> 428
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 428
Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Leu Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Tyr
1               5                   10                  15
<210> 429
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 429
Asp Leu Arg Ser Gly Arg Tyr
1               5
<210> 430
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 430
Gly Thr Ala Thr Phe Asp Trp Asn Phe Pro Phe Asp Ser
1               5                   10
<210> 431
<211> 18
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 431
Gly Ser Gly Leu Val Val Tyr Ala Ile Arg Val Gly Ser Gly Trp Phe
1               5                   10                  15
Asp Tyr
<210> 432
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 432
Asp Pro Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Met Glu Asp Ser Tyr Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Gly Met Asp Val
20
<210> 433
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 433
Glu Ala Leu Gly Ser Ser Trp Glu
1               5
<210> 434
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 434
Gly Gly Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 435
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 435
Asp Leu Ser Val Arg Ala Ile Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 436
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 436
Glu Gly Asn Glu Asp Leu Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 437
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 437
Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Asn Asn Cys Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1               5                   10                  15
Met Asp Val
<210> 438
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 438
Asp Ser Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210> 439
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 439
Asp Pro Tyr Ser Ser Ser Trp His Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210> 440
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 440
Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1               5                   10
<210> 441
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 441
Ser Gln Ser Leu Val Tyr Thr Asp Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210> 442
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 442
Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210> 443
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 443
Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ser Phe
1               5
<210> 444
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 444
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210> 445
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 445
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210> 446
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 446
Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr
1               5
<210> 447
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 447
Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1               5
<210> 448
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 448
Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp
1               5
<210> 449
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 449
Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1               5
<210> 450
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 450
Ser Gln Phe Ile Lys Lys Asn
1               5
<210> 451
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 451
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210> 452
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 452
Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
1               5
<210> 453
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 453
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210> 454
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 454
Asp Val Ser
1
<210> 455
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 455
Lys Val Ser
1
<210> 456
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 456
Ala Ala Ser
1
<210> 457
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 457
Gly Ala Ser
1
<210> 458
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 458
Ala Ala Ser
1
<210> 459
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 459
Ala Ala Ser
1
<210> 460
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 460
Glu Asp Asn
1
<210> 461
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 461
Asp Ala Ser
1
<210> 462
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 462
Ala Ala Ser
1
<210> 463
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 463
Asp Ala Ser
1
<210> 464
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 464
Asp Ala Ser
1
<210> 465
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 465
Ala Ala Ser
1
<210> 466
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 466
Asp Ala Ser
1
<210> 467
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 467
Gly Ala Ser
1
<210> 468
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 468
Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Asp Val
1               5
<210> 469
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 469
Gly Thr His Trp Ser Phe
1               5
<210> 470
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 470
Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr
1               5
<210> 471
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 471
Tyr Gly Ser Ser Pro Pro
1               5
<210> 472
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 472
Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
1               5
<210> 473
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 473
Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Trp
1               5
<210> 474
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 474
Tyr Asp Ser Ser Asn Gln Val
1               5
<210> 475
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 475
Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
1               5
<210> 476
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 476
Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
1               5
<210> 477
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 477
Ala Tyr Ser Thr Pro Phe
1               5
<210> 478
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 478
His Asp Asn Leu Pro Leu
1               5
<210> 479
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 479
Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Leu
1               5
<210> 480
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 480
Phe Asn Asn Tyr Pro Leu
1               5
<210> 481
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 481
Tyr Gly Ser Ser Pro Leu
1               5
<210> 482
<211> 41
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 482
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1               5                   10                  15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20                  25                  30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35                  40
<210> 483
<211> 123
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 483
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc       60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc      120
tcc                                                                    123
<210> 484
<211> 35
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 484
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1               5                   10                  15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20                  25                  30
Val Thr Leu
35
<210> 485
<211> 105
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 485
acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga       60
gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta                      105
<210> 486
<211> 18
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 486
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210> 487
<211> 521
<212> ДНК
<213> Unknown
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Unknown:
Wild-type PGK promoter полинуклеотид"
<400> 487
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga      240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg      300
ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat      360
cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc      420
cgcggcgacg caaagggcct tggtgcgggt ctcgtcggcg cagggacgcg tttgggtccc      480
gacggaacct tttccgcgtt ggggttgggg caccataagc t                          521
<210> 488
<211> 118
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 488
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtg        118
<210> 489
<211> 221
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 489
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac g                          221
<210> 490
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 490
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga      240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg      300
ttccttggaa gggctgaatc cccg                                             324
<210> 491
<211> 422
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид"
<400> 491
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct       60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg      120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc      180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga      240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg      300
ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat      360
cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc      420
cg                                                                     422
<210> 492
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
peptide"
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> /replace=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> /примечание="Различные остатки, данные в последовательности,не имеют
предпочтения перед остатками в аннотациях для различных позиций"
<400> 492
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1               5                   10                  15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 493
<211> 22
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> /replace=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> /примечание="Различные остатки, данные в последовательности, не имеют
предпочтения перед остатками в аннотациях для различных позиций"
<400> 493
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1               5                   10                  15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 494
<211> 23
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> /replace=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> /примечание="Различные остатки, данные в последовательности, не имеют
предпочтения перед остатками в аннотациях для различных позиций"
<400> 494
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 495
<211> 25
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: синтетический
peptide"
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(3)
<223> /replace=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> /примечание="Различные остатки, данные в последовательности, не имеют
предпочтения перед остатками в аннотациях для различных позиций"
<400> 495
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20                  25
<---