ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ОКСИДАЗЫ ИЗ BACILLUS PUMILUS
PHOTOMETRIC METHOD OF DETERMINING CONCENTRATION OF TOTAL BULIRUBIN IN BLOOD PLASMA USING BACTERIAL OXIDASE FROM BACILLUS PUMILUS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно - к лабораторной диагностике, и может применяться как для диагностических целей, так и терапевтического наблюдения.
Уровень техники
Билирубин - один из нескольких желчных пигментов, образуется в ретикулоэндотелии печени и селезенки при распаде гемоглобина. В сыворотке крови билирубин присутствует в виде двух основных форм: конъюгированного (связанного с глюкуроновой кислотой) и неконъюгированного (несвязанного, непрямого или свободного) билирубина. Вместе обе формы билирубина составляют общий билирубин крови. Для лабораторной диагностики используют измерения общего и конъюгированного билирубина. Разница между этими показателями составляет величину неконъюгированного билирубина. Определение концентрации различных форм билирубина в крови позволяет судить о количестве разрушающихся эритроцитов, функции клеток печени и транспорте желчи. В связи с этим разработка простого, надежного и экологически безопасного способа определения концентрации билирубина является актуальной.
Известны несколько способов определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови фотометрическими методами. Наибольшее распространение получили прямой фотометрический метод, биохимический диазометод и ферментативный метод.
Прямой (безреагентный) фотометрический метод основан на поглощении сине-зеленого света билирубином и применяется, главным образом, в педиатрии (Yamanouchi I, Yamauchi Y, Igarashi I. Transcutaneous bilirubinometry: Preliminary studies of noninvasive bilirubin meter in the Okayama National Hospital // Pediatrics. 1980. Vol.65. P.195-202).
Диазометод (метод Йендрашика-Грофа или его модификации; Watson D. Analytic methods for bilirubin in blood plasma //Clin. Chem. 1961. Vol.7. P.603-625) основан на реакции билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой, 3,5-дихлорфенилдиазонием или 2,4-дихлоранилином с образованием окрашенного продукта (диазобилирубина). Интенсивность окраски раствора конечного продукта пропорциональна концентрации общего билирубина и измеряется фотометрически.
Недостатками известных методов являются: прямой метод - неудовлетворительная воспроизводимость в пограничных с патологией концентрациях билирубина (норма для общего билирубина 8,5-20,5 мкмоль/л), диазометод - высокая токсичность исходных реагентов и нестабильность самого диазореагента (при использовании сульфаниловой кислоты - реагент стабилен не более 7 дней при температуре 2-8°С, для дихлоранилина - не более 10 дней при комнатной температуре). Указанные недостатки устранены в ферментативном способе определения билирубина, прототипе заявляемого способа. В известном способе определение концентрации билирубина основывается на реакции окисления билирубина до биливердина ферментом билирубин оксидазой BOX (КФ 1.3.3.5; Otsuji S. et al. A new enzymatic approach for estimating total and direct bilirubin. Clin. Biochem. 1988. Vol.21. P.33-38). Наблюдаемое в ходе реакции уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 450 нм прямо пропорционально концентрации общего билирубина в сыворотке. Благодаря высокой специфичности фермента к билирубину другие компоненты крови не оказывают влияние на величину измерения. Недостатком прототипа является быстрая инактивация известных в настоящее время билирубин оксидаз (активность BOX, выделенной из грибов Myrothecium verrucaria и используемой в коммерчески доступных наборах, снижается уже при температуре выше 37°С и сохраняется не более 5 дней при 5°С, Tanaka N., Murao S. Purification and some properties of bilirubin oxidase of Myrothecium verrucaria MT-1 // Agric. Biol. Chem. 1982. Vol.46, P.2499-2503).
Сущность изобретения
Технической задачей предлагаемого изобретения является использование в ферментативном способе определения общего билирубина в сыворотке крови термостабильной оксидазы из непатогенных почвенных бактерий Bacillus pumilus, обладающей высокоспецифичной билирубин оксидазной активностью.
Поставленная техническая задача достигается тем, что данный фермент выделяется из предварительно сконструированного штамма-продуцента Escherichia coli 109/рВР4. Штамм-продуцент конструируют с помощью стандартных генно-инженерных методов: ген, кодирующий оксидазу, клонируют с помощью ПЦР-метода в векторную плазмиду pUC18. В результате получается рекомбинантная плазмида рВР4. Клетки штамма E.coli 109, содержащие плазмиду рВР4, и есть искомый штамм-продуцент оксидазы - E.coli 109/рВР4. Способ выделения фермента включает: выращивание клеток, инкубирование клеток в присутствии ИПТГ (индуктора экспрессии оксидазы), получение биомассы центрифугированием и разрушение ее ультразвуком, термообработку грубого экстракта при 70°С, хроматографию на анионообменных смолах, концентрирование конечного препарата.
Сущность предлагаемого способа определения концентрации общего билирубина заключается в следующем: 1) тестируемый образец смешивают с раствором фосфатного буфера, содержащего детергент, проводят измерение оптической плотности полученного раствора при 450 нм на любом фотометрическом оборудовании; 2) к смеси добавляют оксидазу, выдерживают 5 мин при 42°С; 3) проводят вторичное измерение оптической плотности раствора при 450 нм. Разность в величине оптической плотности при первом и втором измерениях прямо пропорциональна концентрации билирубина. Расчет проводят с использованием калибратора или калибровочного графика.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Конструирование штамма-продуцента E.coli 109/рВР4.
Клетки бактерий штамма Bacillus pumilus АТСС 7061 (штамм депонирован в ВКМ под номером В508) выращивают в пробирках со средой LB на качалке при 37°С, собирают центрифугированием и из полученной биомассы стандартным способом (обработка фенолом, хлороформом и осаждение этанолом) выделяют хромосомную ДНК. Ген, кодирующий оксидазу (открытая рамка считывания в геноме В. pumilus под номером ВАТ 3525, нуклеотидную последовательность которого можно найти в базе данных GenBank), амплифицируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Реакционная смесь содержит выделенную хромосомную ДНК в качестве матрицы и два олигонуклеотидных праймера, содержащих сайты рестриктаз EcoRI и HindIII, комплементарных началу и концу гена, соответственно. ДНК векторной плазмиды pUC18 и ПЦР-продукт подвергают исчерпывающему гидролизу рестриктазами EcoRI и HindIII и затем лигируют. Лигированную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM109. Отбор положительных клонов проводят при помощи ПЦР-анализа с использованием специфических праймеров, с последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и HindIII. В результате получают штамм-продуцент E.coli 109/рВР4.
Пример 2. Выделение оксидазы.
Клетки штамма-продуцента E.coli 109/рВР4 выращивают в среде LB с добавлением ампициллина до 100 мкг/мл в течение 12-14 часов, инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1:50, растят культуру до мутности 0,8 при 30°С на качалке при 200 об/мин. К культуре добавляют ИГПТ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию при 25°С при 100 об/мин в течение 3-6 часов. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере (0,05 М натрий фосфатный буфер pH 7,6) из расчета 3,5 мл на 1 г биомассы и подвергают ультразвуковой дезинтеграции на дезинтеграторе (MSE, Англия) при температуре 4-5°С. Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин 30 мин на центрифуге J-21 (Beckman, США). Супернатант подвергают термообработке в течение 15 мин при 70°С. Осадок отделяют центрифугированием. Режим центрифугирования, как описано выше. Дальнейшую очистку оксидазы проводят путем хроматографии вначале на Q-сефарозе FF и затем на DEAE-сефарозе FF (Amersham Biosciences). Белок элюируют линейным градиентом 0,1-0,5М NaCl. Пиковые фракции объединяют и концентрируют на мембране (Amicon, 30 kDa). За единицу билирубин оксидазной активности фермента принимают минимальное количество оксидазы, которое в течение 1 мин окисляет 1 мкмоль билирубина при комнатной температуре. Полученный препарат фермента имеет удельную активность по отношению к билирубину 5,6 ед./мг белка и показывает высокую термостабильность (стабилен при 80°С в течение получаса). Полученный препарат фермента сохраняет исходный уровень активности в течение не менее 6 месяцев при температуре 2-8°С.
Пример 3. Определение общего билирубина на спектрофотометре.
а) Приготовление буферного раствора: 0,52 г натрий фосфорнокислый 1-замещенный 2-водный, 3,47 г натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, 0,11 г натрий додецилсульфат (детергент, SDS) растворяют в 100 мл дистиллированной или деионизованной воды. Раствор не токсичен, стабилен при комнатной температуре не менее 1 года. Допускается выпадение осадка (детергента), поэтому перед использованием флакон с буфером следует прогреть при 40-50°С до полного растворения осадка.
б) Проведение измерений: 1) опытная проба - 100 мкл анализируемого образца (сыворотка или белковый раствор калибратора) смешивают с 1000 мкл буферного раствора, добавляют 10 мкл фермента (1000 ед./мл), перемешивают и инкубируют 5 мин при 42°С, проводят измерение оптической плотности при 450 нм на спектрофотометре, в качестве контроля используют воду; 2) контрольная проба - все операции проводят аналогично опытной пробе, но без добавления фермента; 3) концентрацию билирубина в образце рассчитывают путем сравнения разницы между величиной оптической плотности контрольной и опытной проб с калибровочным графиком. При содержании билирубина в сыворотке крови выше 350 мкмоль/л пробу разводят физиологическим раствором, полученный результат умножают на разведение. Калибровочный график строят на основе калибровочных растворов билирубина, приготовленных на растворе альбумина (20 г/л). При определении концентрации билирубина с использованием калибратора (раствор билирубина с известной концентрацией) концентрацию (С) билирубина в опытной пробе рассчитывают по формуле:
2
1
4
3
С=(А-А/А-А)×Сk,
2
1
где А, А - поглощение опытной пробы после инкубации без и с ферментом, соответственно;
4
3
А, А - поглощение калибратора после инкубации без и с ферментом, соответственно;
Сk - концентрация билирубина в калибраторе.
Пример 4. Определение общего билирубина на полуавтоматическом анализаторе.
Способ осуществляют аналогично примеру 3 за исключением того, что количество реагентов и анализируемой пробы следует пропорционально изменить в зависимости от объема используемой кюветы (соотношение сыворотки крови к буферу составляет 1:10).
Пример 5. Для проверки точности предлагаемого способа в качестве анализируемого материала используют контрольную сыворотку (уровень 2, фирма "Вектор-Бест-Европа", Россия) с аттестованным средним значением концентрации общего билирубина, например равным 73,9±4,8 мкмоль/л, измеренным по методу Йендрашика-Грофа. Концентрация общего билирубина, определенная с помощью предлагаемого способа, в данном примере в среднем составляет 71,2±1,7 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения не превышает 4%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить концентрацию общего билирубина в сыворотке крови на фотометрическом приборе с использованием нетоксичных, стабильных реагентов, при сохранении высокой точности анализа.
В связи с тем, что использование существенных признаков предлагаемого способа в известных научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данное техническое решение отвечает критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".
Пояснение чертежа
На чертеже представлены данные по линейности определения билирубина, которую оценивают следующим образом: вначале готовят разведения растворов калибратора или сыворотки с известными значениями билирубина (диапазон разведения - 7-244 и 18,5-274 мкмоль/л, соответственно), далее определяют концентрацию билирубина в разведениях предлагаемым способом, затем на основании полученных значений концентраций билирубина строят соответствующий график и рассчитывают уравнение линейной регрессии. На чертеже по оси ординат (у) указаны значения концентраций билирубина, полученные предлагаемым способом, а по оси абсцисс (х) - ожидаемые значения согласно разведению раствора билирубина с известной его концентрацией. Вычисленные уравнения линейной регрессии из графических данных: у=0,971 х+1,292; r=0,998 и у=1,048х-2,626; r=0,995 - для калибратора и сыворотки, соответственно. Высокое значение коэффициента корреляции (r>0,99) в данном диапазоне разведения означает, что линейная область определения билирубина имеет место, по крайней мере, до 274 мкмоль/л. Нижний предел определения - 7,0 мкмоль/л.