Особенности биотехнологий клостридиальных коллагеназ - перспективных ферментов медицинского назначения

А.Д. Конон, С.В. Петровский, М.Ю. Шамбурова, А.В. Уварова, Ю.О. Козлова, М.В. Григорьева, Б.В. Москвичев

Особенности биотехнологий клостридиальных коллагеназ -перспективных ферментов медицинского назначения

ФГУП «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России, г. Санкт-Петербург

A.D. Konon, S.V. Petrovskiy, M.Yu. Shamburova, A.V. Uvarova, Yu.O. Kozlova, M.V. Grigoryeva, B.V. Moskvichev

Features of clostridial collagenase' biotechnology - emerging enzymes for medical application

Federal State Unitary Enterprise (FSUE) «Saint Petersburg Research Institute of Vaccines and Sera & Enterprise for Production of Bacterial Preparations» of the Federal Medico-Biological Agency St. Petersburg, Russia

Ключевые слова: коллагеназа, Clostridium, питательная среда, растительный пептон, рубцовые образования.

Прорывом в лечении рубцовых образований, например контрактуры Дюпюитрена и болезни Пейрони, может стать применение коллагеназ Clostridium histolyticum. В обзоре приведена общая характеристика клостридиальных коллагеназ. Обобщены данные по биосинтезу на традиционных субстратах на основе компонентов животного происхождения. Приведены собственные экспериментальные данные по культивированию представителей рода Clostridium в средах с растительными пептонами, дрожжевым экстрактом, рыбным желатином. Полученные результаты могут быть основой для усовершенствования технологии микробных коллагеназ.

Среди протеолитических ферментов особое внимание ученых привлекает коллагеназа — эндопептидаза, расщепляющая тройную спираль молекулы нерастворимого природного белка коллагена [22; 39; 55; 58].

Коллаген имеет особую макроструктуру, образованную тройной спиралью, в состав которой в основном входит трипетид Gly-Pro-X (Х — остаток пролина или гидроксипролина). Благодаря такой сложной структуре коллаген как субстрат доступен только для высокоспецифического фермента коллагеназы.

Keywords: collagenase, Clostridium, growing medium, plant peptone, cicatrical formation.

The breakthrough in the treatment of scar formation, such as Dupuytren's contracture and Peyronie's disease may become an application of of Clostridium histolyticum collagenase. General description of clostridial collagenase is presented in review. Reviewed and analysed published data on Clostridium biothinthesis on traditional media of an animal origin. Our own experimental Clostridium cultivation we conducted in various media: -plantpeptone, -yeast extract, -fish gelatin. The obtained results way be important for the upgrade in existing mi-crobial collagenase technology.

Коллагеназа может найти широкое применение в офтальмологии, косметологии, хирургии для профилактики и лечения рубцовых образований, адгезивного капсулита, келоидных рубцов, гипертрофированных рубцов, послеоперационных спаек, морщин, целлюлита и т.д. [50].

Особое внимание уделяется перспективности использования коллагеназы в лечении контрактуры Дюпюитрена — заболевания кисти, связанного с рубцовым перерождением и укорачиванием ладонных сухожилий [12; 55; 58].

Инъекции коллагеназы в зарубцевавшуюся фасцию, покрывающую сухожилие, приводят к ее распаду и, как следствие, к исчезновению рубца. Использование коллагеназы в лечении контрактуры Дюпюитрена позволяет отказаться от стандартного операционного вмешательства и исключить долгосрочное послеоперационное восстановление. Согласно современным литературным данным большинство исследований находятся на стадии клинических испытаний [6]. Например, изучается возможность одновременного лечения двух и более контрактур в одной руке пациента [24], подбираются способы введения [5] и т.д.

Кроме того, получены положительные результаты применения клостридиальной коллагеназы для лечения болезни Пейрони [22; 30], капсулярного фиброза, вызванного силиконовыми имплантатами (исследования на животных) [23], трансплантации островков поджелудочной железы, что является важным шагом в лечении диабета I типа [4]. Коллагеназа может быть использована в диагностических и лабораторных целях, например для дезинтеграции тканей in vitro [47; 54].

С учетом перспективности использования коллагеназы в составе препаратов медицинского назначения актуальными являются разработка и постоянное усовершенствование технологий получения данной эндопептидазы.

Коллагеназа была выделена из тканей млекопитающих, ракообразных (крабы, креветки) [56], насекомых, отходов переработки рыбы [15], а также из микроорганизмов (грибы, бактерии), в том числе рекомбинантных [3; 20].

Среди микроорганизмов наиболее изученными продуцентами коллагеназы являются анаэробные бактерии рода Clostridium, в частности Clostridium histolyticum. Бактериальные коллагеназы имеют такие преимущества перед эукариотическими, как более широкая субстратная специфичность, способность расщеплять нативный и денатурированный коллаген [2], высокая коллагенолитическая активность, оптимальное значение рН для использования в медицинских целях [51].

Микробные коллагеназы выделяют из куль-туральной жидкости после выращивания продуцентов на средах, содержащих компоненты мясного происхождения. Однако согласно последним мировым тенденциям при производ-

стве препаратов медицинского назначения все компоненты животного происхождения по возможности должны быть заменены на альтернативные [11; 17; 18; 40], поэтому в последнее время появляется все больше публикаций, посвященных разработке технологий коллаге-наз с использованием растительных пептонов [44; 50; 51].

Исходя из изложенного, цель настоящего обзора — обобщить данные об особенностях культивирования продуцентов коллагеназ на традиционных и альтернативных субстратах.

Общая характеристика

клостридиальных коллагеназ

Еще в конце XIX в., на этапе зарождения бактериологии, было известно о клостридиаль-ных протеолитических ферментах, однако до 1930-х годов, даже с усовершенствованием методик исследования, их природа и свойства были изучены слабо [27].

В 1931 и 1932 гг. M. Weinberg и A. Randin сообщили о способности фильтратов анаэробных C. histolyticum и аэробных Bacillus an-thracoides расщеплять пяточное сухожилие, однако данные результаты не привлекли внимания широкого круга ученых [60].

Интерес к микробным протеазам возобновился с появлением работ Е. Maschmann [34], а впоследствии R. MacFarlane и J. MacLennan, посвященных изучению свойств фильтратов Clostridium perfringens (известен также как Clostridium welchii) [31]. Исследование коллагеназы продолжили C. Oakley с соавт. [41], E. Bidwell c соавт. [9] и д.р.

Основные исследования по изучению свойств, способов культивирования продуцентов, особенностей очистки коллагеназы начались с 1950-х годов. Первый и долгое время единственный коммерческий препарат на основе коллагеназы для использования в медицинских исследованиях был разработан Worthington Biochemical Corporation в 1959 г. [13].

За это время накопилось достаточно информации о свойствах и классификации кло-стридиальных пептидаз.

M. Bond и H. Van Wart разделили коллагеназы по субстратной специфичности на два класса: класс I — расщепляют высокомолекулярный коллаген, класс II — менее структурированный желатин [10]. Считается, что коллаге-

назы этих двух классов синергично действуют на нативный коллаген [29]. Коллагеназа I имеет одну полипептидную цепочку, состоящую из 1000 аминокислот с молекулярной массой 115 Да. Коллагеназа II имеет одну полипептидную цепочку, состоящую из примерно 1000 аминокислот с молекулярной массой 110 кДа [44]. В конце 1990-х — начале 2000-х годов было установлено, что за синтез двух классов коллагеназ отвечают два различных гена: colG и colH соответственно [35—37].

Различают шесть изоформ коллагеназы, относящихся к классам I (а, ß, у) и II (ô, s, Q. Установлено, что изоформы ß и Ç имеют более высокую молекулярную массу, а другие изо-формы (а, у, ô и s) получены путем усечения их полипептидной цепи [47].

Известно, что важную роль в конформации, структурной стабильности и ферментативной активности коллагеназы играют катионы кальция [42; 52].

Широкая субстратная специфичность кол-лагеназы обусловлена тем, что данный фермент не только раскручивает тройную спираль коллагена, но и расщепляет его цепи до небольших фрагментов — олигопептидов [21; 52]. Более подробно взаимодействие коллагеназы с коллагеном описано у U. Eckhardс соавт. [21].

Что касается классификации, микробные коллагеназы относятся к семье M9 пептидаз MEROPS, включающей бактериальные метал-лопептидазы представителей рода Vibrio и рода Clostridium. Семья М9 подразделяется на два подсемейства — M9A и M9B, при этом кло-стридиальные коллагеназы относятся к типам M09.002 (коллагеназа I) и M09.003 (коллагеназа II) подсемейства M9B. Согласно номенклатуре Комитета международного союза биохимии и молекулярной биологии (NC-IUBMB) данным эндопептидазам присвоен квалификационный номер EC 3.4.24.3 [19].

Традиционные субстраты

для культивирования C. histolyticum

Для получения коллагеназ из C. histolyti-cum используют питательные среды, основными компонентами которых являются сердечно-мозговой экстракт, триптоза и протеозопептон (смесь энзиматически расщепленных белков животного происхождения), мясной экстракт, казеин, желатин. Дополнительно вносят неор-

ганические соли, витамины, глюкозу, дрожжевой экстракт, тиогликолят натрия, сульфат железа и т.д. [51].

«Классическая» питательная среда для культивирования клостридий в целях получения коллагеназы была предложена в 1953 г. J. Mac-Lennan [32] (г/л): триптиказо-соевая основа — 15, протеозопептон — 50, Na2HPO4 — 9, KH2PO4 - 1,92, MgSO4x7H2O - 0,08, раствор витаминов — 5 мл, раствор FeSO4x7H2O — 100 мл, 10 N HCl — 6 мл, pH 7,4. Состав раствора витаминов (мг/л): пантотенат кальция — 200, никотиновая кислота — 200, пиридоксин — 200, тиамин — 200, рибофлавин — 20.

Показано, что максимальный выход кол-лагеназы при культивировании C. histolyticum Н-4 на питательной среде MacLennan наблюдали при 37°С через 17—18 ч [32]. При этом коллагенолитическую активность оценивали качественно по степени разведения фильтрата культуральной жидкости, необходимого для полного расщепления кусочка ахиллового сухожилия кролика.

Установлено, что выход фермента существенно зависел от концентрации катионов железа и пептона в составе питательной среды, в то время как витамины оказывали меньшее влияние. Выдвинуто предположение, что катионы кальция, магния и кобальта могут также положительно влиять на синтез протеиназы

[45].

На следующем этапе была предпринята попытка замены дорогих компонентов питательной среды на более дешевые, например печеночный перевар, однако выход коллагеназы при этом значительно снизился [45]. Природу факторов роста, присутствующих в протеозо-пептоне и положительно влияющих на биосинтез фермента, установить не удалось.

Отметим, что впоследствии культура C. histolyticum Н-4 стала считаться традиционной «мясной культурой», а штамм был депонирован в коллекции ATCC в 1956 г. лабораторией Mandl Колумбийского университета под номером 21000 [50].

«Классическую» питательную среду для культивирования штамма ATCC 21000 с целью получить коллагеназу для дальнейшего создания мазей на ее основе использовали авторы патента [45]. C. histolyticum ATCC 21000 выращивали в колбах при 37°С, 21—26 ч, рН 6,5—7,5. В по-

лученной культуральной жидкости биомассу отделяли центрифугированием, фермент из су-пернатанта осаждали сульфатом аммония, образовавшийся осадок собирали и подвергали диализу, затем лиофильно высушивали. Колла-геназная активность 1 г сухого препарата составляла 40 000 единиц (Е).

S. Berman исследовал синтез протеаз тремя штаммами — C. histolyticum H-4, C. histolyticum 230-2 и C. histolyticum CHT — в средах, предложенных J. MacLennan (среда на основе протеозопептона) и M.J. Boyd (среда на основе казеина), и в их модифицированных вариантах [8].

Показано, что исключение из питательной среды MacLennan триптиказо-соевого бульона (15 г/л) приводило к снижению синтеза азо-казеиназы и овомуциназы на 47 и 87% соответственно, в то время как наиболее высокую активность азоказеиназы (717 Е/мл) и жела-тиназы (256 Е/мл) наблюдали при отсутствии неорганических солей (среда PTV (г/л): трипти-казо-соевая основа — 15, протеозопептон — 50, а также 5 мл раствора витаминов и 12 мл раствора FeSO4x7H2O). Кроме того, авторы показали, что снижение концентрации протео-зопептона с 5 до 2% и замена триптиказо-сое-вого бульона на казаминокислоты (смесь аминокислот и фрагментов пептидов, полученная при гидролизе казеина) в концентрации 2% существенно не влияли на выход протеиназ, однако позволяли снизить себестоимость питательной среды. Максимальный синтез колла-геназы (2500 Е/мл) наблюдали при выращивании C. histolyticum H-4 в среде PTV через 14-16 ч при рН 8,0 и 30°С [8]. Выделение коллагеназы из культуральной жидкости, полученной после культивирования C. histolyticum H-4 в средах, описанных S. Berman, путем ступенчатого фракционирования сульфатом аммония исследовали D. Conklin с соавт. [14].

В начале 1970-х годов G. Mead изучал способность 30 видов рода Clostridium катаболи-зировать аминокислоты, добавленные в среду с 3% гидролизированного казеина. По этому признаку бактерии были разделены на четыре группы, при этом C. histolyticum отнесли ко II группе, способной утилизировать аргинин и/или глицин [38].

Кроме основного состава питательной среды на биосинтез коллагеназы могут влиять при-

сутствие глюкозы, а также аэрация [51]. Известно, что глюкоза является основным источником углерода для сахаролитических клостридий, тогда как у пептолитиков может ингибировать синтез протеиназ, например, как у Clostridium difficile. Однако встречаются прописи питательных сред для культивирования представителей рода Clostridium в целях получения коллагеназ, в состав которых входит глюкоза. Это связано с тем, что в лабораторных условиях и на производстве не всегда есть возможность создать строгие анаэробные условия, необходимые для синтеза протеолитических ферментов, поэтому в жидкие питательные среды вносят перевар мяса, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, соли железа и другие компоненты, которые адсорбируют кислород [51]. Так, S. Takahashi и S. Seifert описали состав питательной среды для культивирования C. histolyticum, содержащей тиогликолят натрия и бисульфит натрия в соотношении 1:1 [57].

Для получения максимальной концентрации коллагеназы не только проводится оптимизация состава питательной среды, но и создаются рекомбинантные микроорганизмы. Так, в заявке на патент США 2008/0233614 [48] описывается способ максимального повышения уровня экспрессии коллагеназы С. histolyticum в бактериях Escherichia coli. Авторы сообщают, что выход фермента составлял 140 мг/л, однако всего 75% фермента было в активной форме.

Другие авторы получали рекомбинантный продуцент коллагеназы путем трансформации E. coli K12 клостридиальными генами colG. Полученный микроорганизм культивировали в питательной среде, содержавшей 12 г/л трипто-на, 24 г/л дрожжевого экстракта, 0,4% глицерина, 17 мМ KH2PO4 и 72 мМ K2HPO4. Дополнительно вносили ампициллин (100 мкг/мл) и глюкозу (0,1-0,2%). При таких условиях культивирования продуцента концентрация колла-геназы в активной форме после очистки составила 140 мг/л [47].

Таким образом, еще во второй половине ХХ в. были подобраны оптимальные условия для культивирования клостридий, однако исследования продолжаются и сегодня. Так, в патенте RU 2180002 [1] описан способ получения коллагеназы штамма C. histolyticum 468 в казеиново-соево-пепсиновой среде. Культиви-

рование проводили в ферментере объемом 160 л в течение 72 ч при 37°С в среде следующего состава ( г/л) : гидролизат казеина и соевого шрота — 969, NaH2PO4 — 1,5, K2HPO4 — 1,5, пиридоксин — 0,0020, рибофлавин — 0,0020, тиамина бромид — 0,0020, фолиевая кислота — 0,0020, пантотенат кальция — 0,0020, никотиновая кислота — 0,0020, липоевая кислота — 0,0020, биотин — 0,0010. Фермент очищали и концентрировали на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кДа, полученный концентрат лиофильно высушивали. Активность 1 мг готового препарата составляла 0,20—0,25 ед. лейцина за 20 мин инкубации в реакционной смеси [1]. Отметим, что сложность использования данной питательной среды в промышленных масштабах состоит в необходимости предварительной подготовки соевого шрота, а также в использовании дорогостоящих витаминов.

Кроме C. histolyticum продуцентами, способными синтезировать коллагеназу, являются Clostridium collagenovorans и Clostridium pro-teolyticum [26]. Так, авторы патента WO 2003/025136 [49] исследовали влияние электричества (0,75; 1,5; 3,0 В) на синтез коллагеназы C. collgenovoransDSM3089 (ATCC 49001) в электрохимическом ферментере объемом 1,5 л (при 37°C, 50—100 rpm, в атмосфере азота (0,1—0,5 vvm), pH 7,0), содержавшем 1 л питательной среды следующего состава (г/л) : желатин — 10, KH2PO4 — 1,5, K2HPO4 — 2,9, NaCl — 0,9, MgCl2x6H20 — 0,2, Са^ — 0,1, NH4Cl — 1,0, раствор микроэлементов — 9 мл, раствор витаминов — 5 мл, 0,2% резазурин — 1 мл, 10% Na2S — 5 мл; раствор микроэлементов (г/л): нитрилтриуксусная кислота — 12,8, FeSO4x7H2O — 0,1, MnCl2x4H2O — 0,1, CoCl2x6H2O — 0,17, CaCl2x2H2O — 0,1, ZnCl2 — 0,1, NiSO4x2H2O — 0,026, CuCl2 — 0,02, H3BO4 — 0,01, NaMoO4x2H2O — 0,01, NaCl - 1,0, Na2SeO3 — 0,06; раствор витаминов (мг/л): биотин — 10, пантотенат кальция — 0,025, ли-поевая кислота — 0,025, фолиевая кислота — 0,01, тиамин — 0,025, рибофлавин — 0,025, пиридоксина гидрохлорид — 0,05, цианокоба-ламин — 0,00005, никотиновая кислота — 0,025, парааминобензойная кислота — 0,025.

Показано, что при обработке 1,5 В на 12 ч культивирования коллагеназная активность

штамма DSM3089 увеличивалась в 1,72 раза (до 236 мЕ/мл) по сравнению с показателями без обработки. Отметим, что питательная среда для получения коллагеназы, представленная в патенте [49], имеет сложный состав, а это значительно удорожает промышленное производство фермента.

Несмотря на то что условия биосинтеза коллагеназ изучены достаточно хорошо, можно отметить несколько проблем их получения.

Проблемы биосинтеза коллагеназ

на традиционных субстратах

Известно, что представители рода Clostri-dium синтезируют комплекс протеиназ (кол-лагеназу, клострипаин, желатиназу, эластазу и др.) [47; 28]. Это значительно усложняет процесс выделения и очистки целевого фермента.

Особое внимание исследователей привлекает клострипаин — цистеиновая протеиназа (EC 3.4.22.8), которая изучается как фактор вирулентности патогенных клостридий [33], препарат для изоляции островков [16], выделение фибробластов кожи [59]. Вместе с тем в присутствии клострипаина происходит разрушение коллагеназы, которая является для него субстратом.

Существует несколько подходов к снижению негативного влияния клострипаина: направленный синтез целевого фермента (подбор оптимальных условий культивирования продуцента), добавление ингибиторов протеиназ (например, лейпептина), позволяющих обеспечить устойчивость коллагеназы в процессе ее очистки, а также получение мутантных штаммов-продуцентов, не синтезирующих побочных протеаз.

Так, путем воздействия химического мутагенного фактора на C. histolyticum K-26 был создан новый мутантный штамм C. histolyticum K-26 clo 88, не синтезирующий клострипаин [43]. Штамм K-26 clo 88 культивировали в ферментере объемом 2 л при 30°С, 10 ч, рН 8,7, в питательной среде следующего состава (г/л): протеозопептон — 50, триптон-соевый бульон — 15, раствор витаминов — 5 мл, тиогли-колят натрия — 0,57. Полученный фильтрат культуральной жидкости обладал коллагеназной активностью 4,4 Е/мл, активности клострипаина не выявлено. После многоступенчатой

очистки фильтрата получили две фракции, обладающие коллагеназной активностью 34,2 и 10,5 Е/мл соответственно [43].

Кроме того, ведутся поиски новых ингибиторов сериновых протеиназ. H. Gusmana с соавт. [25] показали, что кроме лейпептина эффективным ингибитором клострипаина является гистатин 5 — низкомолекулярный белок, содержащийся в человеческой слюне.

Также на традиционных субстратах наблюдаются низкий выход целевого продукта и низкая воспроизводимость (отличие показателей от партии к партии) [7; 47; 51].

К тому же использование материалов животного происхождения при получении медицинских препаратов может привести к повышению риска инфицирования и анафилактических реакций, а также к передаче губчатой энцефалопатии в конечный продукт [11; 44; 51]. Согласно статье EMA/410/01 rev.3, опубликованной в Официальном журнале Европейского союза в 2011 г., возможность передачи губчатой энцефалопатии через материалы, используемые в процессе производства лекарственных средств, должна быть сведена к минимуму [40]. Данная цель может быть достигнута за счет использования сырья с минимальным риском заражения либо, при возможности, материалов неживотного происхождения. Использование в производстве лекарственных средств материалов, относящихся к категории с высокой вероятностью инфицирования (головной и спинной мозг, кишечник, миндалины и т.д.), должно быть обосновано и дано объяснение о невозможности применения другого сырья

[11; 40].

В Европейском союзе принята законодательная база об управлении рисками по передаче губчатой энцефалопатии: Directive 2001/82/EC of the European Parliament and of the council of 6 November 2001 on the Community code relating to veterinary medicinal products и Directive 2001/83/EC of the European Parliament and of the council of 6 November 2001 on the Community code relating to medicinal products for human use [17; 18]. Кроме того, в Европейскую фармакопею включена статья «Products with risk of transmitting agents of animal spongiform encephalopathies», которая является основой для выдачи сертификата на продукцию соответствующего качества [53].

Для устранения всех перечисленных «узких мест» при получении коллагеназы в последнее время все больше внимания уделяется культивированию представителей рода Clostri-dium в средах на основе растительных пептонов [46; 50; 51]. Такой подход позволяет заменить компоненты животного происхождения в составе питательных сред на растительные, снизить синтез побочных протеиназ и получить коллагеназу с достаточно высокой активностью.

Синтез коллагеназ в средах

с растительными пептонами

Пептон - смесь водорастворимых компонентов, полученных путем ферментативного или кислотного гидролиза протеинов, содержащихся в животных материалах, растениях, молоке, микробной массе, до аминокислот [28]. Растительные пептоны могут стать альтернативой компонентам животного происхождения в питательных средах для культивирования клостридий благодаря богатому аминокислотному составу. В основном в патентах последних лет описаны составы питательных сред, содержащие пептоны из сои, гороха, пшеницы, картофеля и т.д. [44; 50; 51]. Для обозначения пептонов из растительных материалов используют различные термины: «веджетон» (растительный пептон), «фитон» (пептон, полученный из сои), «пептон из соевых бобов» и т.д.

В патенте W02007/089851 описываются условия культивирования двух штаммов С. histolyticum в среде с растительными пептонами для получения коллагеназы двух типов -ABC/AUX I и ABC/AUX II, способы их очистки и создание лекарственных композиций на их основе [50].

На первых этапах культивирование проводили в ферментере объемом 5 л, используя две стратегии подпитки: «long batch phase/short fed-batch phase» (высокая концентрация компонентов в питательной среде в начале процесса, подпитка с низкой концентрацией фитона, дрожжевого экстракта и глюкозы, начиная с 10 ч) и «short batch phase/long fed-batch phase» ( концентрация компонентов в подпитке превышала начальную на порядок, дополнительно субстрат вводили через 6 ч). Установлено, что максимальный выход коллагеназы ABC I и ABC II (132 и 158 мг/л соответственно) полу-

чали при использовании второй стратегии. Данные показатели в три раза превышали значения, полученные после культивирования периодическим способом без подпитки [50].

В дальнейшем концентрации компонентов в питательной среде были оптимизированы

[50]:

— основная среда: фитон — 65,45, дрожжевой экстракт - 21,80, К2НР04 - 1,89, Ма2НР04 - 5,30, КН2Р04 - 2,91, ^С1 -3,79, МёЯ04х7Н20 - 0,12, Ре80/7Н20 -0,01818, пантотенат кальция - 0,00152, пиридоксин - 0,00152, тиамин - 0,00152, рибофлавин - 0,000758, ниацин - 0,00152, пимелиновая кислота - 0,00152;

- подпитка: глюкоза - 17,86, фитон - 151,43, дрожжевой экстракт - 127,14. Культивирование проводили при рН 7,0,

37°С, в атмосфере азота (~ 0,2 ууш) при перемешивании (100 грш).

На следующем этапе сравнивали показатели синтеза коллагеназы и роста С. histolyticum 004 и С. histolyticum 013 в среде на основе смеси протеинов животного происхождения - про-теозопептоне (протеозопептон - 50 г/л, трипти-казо-соевый бульон - 15 г/л, Ма2НР04 -3,5 г/л, КН2Р04 - 1,92 г/л, М§Я04х7Н20 -0,08 г/л, раствор витаминов - 10 мл/л) и растительном пептоне. Установлено, что после культивирования продуцентов в среде с фито-ном показатели оптической плотности биомассы и концентрации фермента на 50 и 48-78% выше, чем в среде с мясными компонентами, однако при таких условиях активность кло-стрипаина увеличивалась на порядки [50].

В дальнейшем исследовали возможность замены фитона на альтернативные источники из растительного сырья ( протеозопептон рас-тигельный, триптон растительный, овощной экстракт, овощной гидролизат). Показано, что при культивировании клостридий в средах с такими субстратами синтез коллагеназы отсутствовал. Такое явление авторы объяснили высокой концентрацией альтернативных пептонов, в результате чего синтез основного фермента подавлялся. При снижении концентрации источников углерода и азота в два раза (до 50 г/л) синтеза фермента не наблюдали, поэтому в дальнейшем исследователи использовали среду с фитоном [50].

Учитывая, что в среде с растительным пептоном синтезировалось на порядки больше клострипаина, чем в среде с мясными компонентами, авторы предположили, что на производство данного пептида могут влиять определенные компоненты, содержащиеся в субстратах. Поскольку растительные пептоны более бедные по аминокислотному составу ( в особенности по глутамину, аспарагину и триптофану), чем животные, в дальнейшем данные аминокислоты вносили дополнительно в среду с фитоном. Показано, что в таких условиях культивирования концентрация коллагеназы не изменялась, однако активность клострипаина уменьшалась с 56,4 до 15,2 Е/мл [50].

Другие ученые исследовали влияние глюкозы, неорганических солей и витаминов на синтез коллагеназы C. histolyticum АТСС 21000 в среде, содержавшей растительные пептоны (фитон, веджетон и т.д.) и дрожжевой экстракт

[44].

Синтез коллагеназы и побочных протеаз (клострипаина) оценивали по результатам электрофореза в полиакриламидном геле, активность коллагеназы определяли методом с нингидрином, активность клострипаина -в реакции с ВАЕЕ, а казеиназы - путем измерения общей протеолитической активности с казеином в качестве субстрата.

Показано, что максимальный синтез целевого фермента и низкую концентрацию кло-стрипаина через 22 ч инкубации наблюдали при использовании питательной среды, содержавшей 103 г/л растительного пептона, 17 г/л дрожжевого экстракта, 1,92 г/л КН2Р04, 1,25 г/л К2НР04, 3,5 г/л Ма2НР04, 2,5 г/л МаС1, 10 мл раствора микроэлементов и витаминов ( 8 г МёЯ04, 1,2 г РеЯ04, 0,05 г рибофлавина, 0,1 г ниацина, 0,1 г пантотената кальция, 0,1 г пи-мелиновой кислоты, 0,1 г пиридоксина, 0,1 г тиамина на 1100 мл воды) без дополнительного внесения глюкозы. Удаление неорганических солей и/или внесение 10 г/л глюкозы приводило к увеличению синтеза как клострипаина, так и казеиназ. После выделения и очитки путем осаждения сульфатом аммония и хромато-графическими методами коллагеназная активность составила 2888 Е/мг препарата [44].

В патенте португальских ученых WO 2013177647 А1 описана питательная среда на основе соевого пептона и дрожжевого экстракта

для культивирования C. histolyticum ATCC 21000 и C. histolyticum T248 в целях получения коллагеназы [51].

На первых этапах сравнивали влияние природы пептона (из сои, хлопка, пшеницы, подсолнечника, риса, арахиса, фасоли, гороха, картофеля, кукурузы), его концентраций, дополнительных компонентов (солей, витаминов, аминокислот) на синтез коллагеназы [10]. Показано, что в оптимальный состав питательной среды входили соевый пептон (3%), дрожжевой экстракт (3%) и цистеин (0,0625%). Дополнительное внесение NaCl, КО, ^^РО^ NaH^^ KH 2РО4, КНРО^ MgSО2, FeSО2,

2 4 2 4 2 4 4 4

MnSО2, витаминов (биотина, пимелиновой кислоты, никотинамида, пантотената кальция, фолиевой кислоты, тиамина нитрата, рибофлавина, п-аминобензойной кислоты), аминокислот практически не влияло на показатели синтеза протеазы [51].

Оптическую плотность биомассы (OD при 600 нм) , полученную в среде с растительным пептоном, сравнивали с показателями в среде с животными компонентами (протеозопептон № 3 или гидролизат казеина — 20 г, дрожжевой экстракт — 5 г, глюкоза — 5 г, тиогликолят натрия — 250 мг, рН 7,0). Установлено, что после выращивания С. histolyticum АТСС 21000 в среде на основе соевого пептона показатель OD увеличивался до 3—4 [51].

Максимальные показатели синтеза колла-геназы (5000 мЕ/мл, OD 5) наблюдали при дополнительном внесении 0,375% аргинина в среду с соевым пептоном. При дальнейшем масштабировании процесса после культивирования в анаэробных условиях (подача азота) в течение 14 ч при 37°С, рН 7, в присутствии аргинина активность коллагеназы была на 30% выше, чем в среде без аминокислоты [51].

Кроме сред на основе растительных пептонов и дрожжевого экстракта, используемых для синтеза коллагеназы клостридиями, в литературе встречаются данные о культивировании продуцентов в средах с растительными пептонами и желатином [46]. Учитывая, что желатин является необратимо гидролизиро-ванной формой белка коллагена, можно предположить, что данный белок не только используется микроорганизмами как источник азота, но и выступает индуктором синтеза протеоли-тических ферментов.

Основными источниками желатина являются млекопитающие, такие как крупный рогатый скот, свиньи и лошади, однако известно, что данный белок могут получать из чешуи и плавательных пузырей рыб. Рыбный желатин отличается от обычного желатина млекопитающих по аминокислотному составу: содержит меньшее количество пролина и гидроксипро-лина [46].

В патенте US 8236356 B2 описано использование смеси растительных пептонов и рыбного желатина в качестве основных компонентов питательной среды для культивирования клостридий и получения ферментов с коллаге-назной активностью [46]. В указанной работе использовали в различных комбинациях растительные пептоны, полученные из гороха, сои, картофеля, в концентрации до 5%, а также рыбный желатин с высокой молекулярной массой, жидкий рыбный желатин, желатин из кошерного вида рыб в концентрации 2—10%. Показатели синтеза коллагеназы в средах с растительными пептонами сравнивали с таковыми в среде с животными компонентами (сердечно-мозговой бульон, 3,7%) [46].

Культивирование штамма C. histolyticum BMTU 1175 (полученного из ATCC 21000) проводили в анаэробных условиях в атмосфере азота в инкубаторах при 30°С. В питательную среду дополнительно вносили 1 мМ CaCl2. На первом этапе сравнивали показатели синтеза коллагеназы в среде с животными и растительными компонентами без желатина. Показано, что максимальная активность коллагеназы в среде с гороховым пептоном (5%) или смеси горохового (2,5%) и соевого (2,5%) пептонов составляла 451 и 446 Е/л соответственно и была ниже, чем в сердечно-мозговом бульоне (449—493 Е/л) [46].

Дополнительное внесение желатина позволило увеличить синтез целевого фермента до 1064—1405 Е/л в среде со смесью горохового и соевого пептонов, что превышало показатели в среде с животными компонентами более чем в 2 раза (табл. 1).

На предприятии ФГУП СПбНИИВС ФМБА производится препарат Коллализин, основным действующим веществом которого является коллагеназа, полученная из культураль-ной жидкости после выращивания штамма C. histolyticum 468 в среде с животными ком-

Таблица 1 Влияние природы пептона и желатина на синтез коллагеназы [46]

Пептон Концентрация пептона, % Желатин Концентрация желатина, % Коллагеназная активность, Е/л

Соевый 1,5 Высокомолекулярный рыбный 5 1405

Гороховый 1,5

Соевый 1,5 Высокомолекулярный рыбный 4 1064

Гороховый 1,5

Сердечно-мозговой бульон 3,7 Высокомолекулярный рыбный 3 563

Сердечно-мозговой бульон 3,7 Свиной 3 562

понентами (среда Рамона). В своей экспериментальной работе мы исследовали возможность замены компонентов животного происхождения в составе питательной среды для культивирования штамма C. histolyticum 468 на растительные.

Культивирование штамма C. histolyticum 468 проводили на традиционной среде Рамона с животными компонентами и в альтернативных средах, описанных в работах [46] (среда 1), [44] (среда 2) и [51] (среда 3), а также модифицированных вариантах.

Показано, что среды 1—3 могут быть использованы для культивирования исследуемого нами штамма C. histolyticum 468 в целях получения коллагеназы, при этом коллагеназная активность фильтратов была выше на 40-50% по сравнению с показателями в среде с животными компонентами.

Модификация питательной среды 2 позволила снизить активность клострипаина на порядок (до 45-60 Кл/мл) и достичь уровня, полученного на среде Рамона. Кроме того, фильтрат коллагеназы после культивирования штамма 468 в модифицированной среде 2 содержал более низкую концентрацию пигмента, что значительно облегчало дальнейшую очистку хроматографическим методом.

По предварительным данным, снижение концентрации основных компонентов в питательной среде 1 приводило к увеличению показателя синтеза коллагеназы, что можно объяснить лучшим соотношением углерода и азота в питательной среде. Отметим, что такая модификация значительно снижала себестоимость среды 1.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана принципиальная воз-

можность замены компонентов животного происхождения на растительные пептоны в среде для культивирования штамма C. histolyticum 468 в целях получения коллагеназы. Предметом наших дальнейших исследований будут подбор оптимального соотношения компонентов для синтеза коллагеназы штамма C. histolyticum 468, а также поиск альтернативных, более дешевых питательных сред.

В таблице 2 обобщены данные по показателям синтеза коллагеназы на различных питательных средах, содержащих растительные компоненты. Обращает на себя внимание достаточно разнообразный состав питательных сред ( от самого простого до сложных многокомпонентных), что значительно влияет на себестоимость конечного продукта. Наиболее привлекательными для промышленного производства являются среды на основе смеси растительного пептона и дрожжевого экстракта (желатина в минимальных количествах) без внесения дорогостоящих факторов роста.

Литература

1. Пат. RU 2180002. Способ получения кол-лагеназы / Ефимова Н.П.; Николаева А.М.; Колпакова Е.Г. Опубл. 27.02.2002.

2. Руденская Г.Н., Можина Н.В. Коллагено-литические ферменты патогенных микроорганизмов // Биомедицинская химия. 2004. № 6. С. 539-553.

3. Alipour H., Raz A., Djadid N.D. et al. Codon optimization of Col H gene encoding Clostridium histolyticum collagenase to express in Escherichia coli // PeerJ PrePrints. 2014. URL: https://peerj.com/preprints/754v1.pdf (accessed: 01.07.2015).

СЛ

а

0 я

Л

Ьэ

5«

1

о

05 <"5

Я

Яг

f to а

05^

3

CS

05 ф S 05

Ц

03 Р

Таблица 2 Показатели синтеза коллагеназы в средах на основе растительного пептона

Продуцент Состав питательной среды, г/л Способ культивирования Показатели синтеза Источник литературы

С. histolyticum АТСС 21000 Соевый пептон — 30, дрожжевой экстракт — 30, цистеин — 0,625, аргинин — 3,75 В колбах 5000 мЕ/мл супернатанта культуральной жидкости, ОБ культуральной жидкости — 5 [51]

С. histolyticum АТСС 21000 и С. histolyticum Т248 В ферментере объемом 3 л 5000—6000 мЕ/мл супернатанта культуральной жидкости, ОБ культуральной жидкости — 4—4,5 [51]

С. histolyticum 004 и С. histolyticum 013 Основная среда: фитон — 65,45, дрожжевой экстракт — 21,80, К2НР04- 1,89, №2НР04 - 5,30, КН2Р04-2,91, N30-3,79, М^О/ТП^О - 0,12" Ре804х7Н20 - 0,01818, раствор витаминов. Подпитка: глюкоза — 17,86, фитон — 151,43, дрожжевой экстракт — 127,14 В ферментере объемом 5, 20 и 200 л 280 мг/л [50]

С. histolyticum АТСС 21000 Веджетон — 103, дрожжевой экстракт — 17, КН2Р04 - 1,92, К2НР04 - 1,25, №2НР04 - 3,5, N3« - 2,5. Раствор микроэлементов и витаминов — 10 мл Не указано 2888 Е/мг очищенного препарата [44]

С. histolyticum штамм BMTU 1175 Соевый пептон —15, гороховый пептон —15, высокомолекулярный рыбный желатин — 50, СаС1, — 0,111 В колбах 1405 Е/л супернатанта культуральной жидкости, ОБ культуральной жидкости — 5,5 [46]

Примечание: состав растворов витаминов и микроэлементов см. в тексте, ОБ — оптическая плотность.

4. Antonioli B., Fermo I., Cainarca S. et al. Characterization of collagenase blend enzymes for human islet transplantation // Transplantation. 2007. Vol. 84. P. 1568-1575.

5. Atroshi I., Nordenskjöld J., Lauritzson A. et al. Collagenase treatment of Dupuytren's contracture using a modified injection method: a prospective cohort study of skin tears in 164 hands, including short-term outcome // Acta Orthopaedica. 2015. Vol. 86. No. 3. P. 310-315.

6. Badalamente M.A., Hurst L.C., Benhaim P., Cohen B.M. Efficacy and safety of collagenase Clostridium histolyticum in the treatment of proximal interphalangeal joints in dupuytren contracture: combined analysis of 4 phase 3 clinical trials // Journal of Hand Surgery. 2015. Vol. 40. No. 5. P. 975-983.

7. Barnett M.J., Zhai X., LeGatt D.F. et al. Quantitative assessment of collagenase blends for human islet isolation // Transplantation. 2005. Vol. 80. No. 6. P. 723-728.

8. Berman S., Lowenthal J.P., Webster M.E. et al. Factors affecting the elaboration by Clostridium histolyticum of proteinases capable of debriding third degree burn eschars on guinea pigs // Journal of Bacteriology. 1961. Vol. 82. P. 582-588.

9. Bidwell E., Van Heyningen W.E. The biochemistry of the gas gangrene toxins. 5. The K-toxin (collagenase) of Clostridium welchii // Biochemical Journal. 1948. Vol. 42. P. 140-151.

10. Bond M.D., Van Wart H.E. Purification and separation of individual collagenases of Clos-tridium histolyticum using red dye ligand chromatography // Biochemistry. 1984. Vol. 23. P. 3077-3083.

11. Certificate of Origin Policy (TSE/BSE) 01-000-014 Rev. 1 Effective Date: August 3, 2005 // Sigma-Aldrich. URL: https://www. sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/countries/italy/certOfOriginPolicy. pdf (accessed: 01.07.2015).

12. Coleman S., Gilpin D., Tursi J. et al. Multiple concurrent collagenase Clostridium histolyticum injections to Dupuytren's cords: an exploratory study // BMC Musculoskeletal Disorders. 2012. Vol. 13. No. 61. URL: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC3409044/pdf/1471-2474-13-61.pdf (accessed: 01.07.2015).

13. Collagenase. Manual Text // Worthington Biochemical Corporation. URL: http://www. worthington-biochem.com/cls/default.html (accessed: 01.07.2015).

14. Conklin D.A., Webster M.E., Altieri P.L. et al. Large scale purification of proteinases from Clostridium histolyticum filtrates // Journal of Bacteriology. 1961. Vol. 82. No. 4. P. 589-594.

15. Daboor S.M., Budge S.M., Ghaly A.E. et al. Isolation and activation of collagenase from fish processing waste// Advances in Bioscience and Biotechnology. 2012. Vol. 3. P. 191-203.

16. Dendo M., Maeda H., Yamagata Y. et al. Synergistic effect of neutral protease and clostripain on rat pancreatic islet isolation // Transplantation. 2015. Vol. 99. No. 7. P. 1349-1355.

17. Directive 2001/82/EC of the European Parliament and of the council of 6 November 2001 on the Community code relating to veterinary medicinal products // Official Journal of the European Communities. 28 November 2001. URL: http://ec.europa.eu/ health/files/eudralex/vol-5/dir_2001_82/ dir_2001_82_en.pdf (accessed: 01.07.2015).

18. Directive 2001/83/EC of the European Parliament and of the council of 6 November 2001 on the Community code relating to medicinal products for human use // Official Journal of the European Communities. 28 November 2001. P. 67. URL: http://ec.europa. eu/health/files/eudralex/vol-1/dir_2001_ 83_consol_2012/dir_2001_83_cons_2012_ en.pdf (accessed: 01.07.2015).

19. Duarte A.S., Correia A., Esteves A.C. Bacterial collagenases: A review // Critical Reviews in Microbiology. 2014. [Epub ahead of print].

20. Ducka P., Eckhard U., Schönauer E. et al. A universal strategy for high-yield production of soluble and functional clostridial collage-nases in E. coli // Applied Microbiology and Biotechnology. 2009. Vol. 83. P. 1055-1065.

21. Eckhard U., Huesgen P.F., Brandstetter H., Overall C.M. Proteomic protease specificity profiling of clostridial collagenases reveals their intrinsic nature as dedicated degraders of collagen // Journal of Proteomics. 2014. Vol. 100. P. 102-114.

22. Egui Rojo M.A., Moncada Iribarren I., Car-ballido Rodriguez J., Martinez-Salamanca J.I. Experience in the use of collagenase Clostridium histolyticum in the management of Peyronie's disease: current data and future prospects // Therapeutic Advances in Urology. 2014. Vol. 6. No. 5. P. 192-197.

23. Fischer S., Hirsch T., Diehm Y. et al. The collagenase of the bacterium Clostridium histolyticum for the treatment of capsular fi-brosis after silicon implants // Plastic and Reconstructive Surgery. 2015. [Epub ahead of print].

24. Gaston R.G., Larsen S.E., Pess G.M. et al. The efficacy and safety of concurrent collagenase Clostridium histolyticum Injections for 2 Dupuytren contractures in the same hand: a prospective, multicenter study // Journal of Hand Surgery. 2015. [Epub ahead of print].

25. Gusmana H., Grogana J., Kaganb H.M. et al. Salivary histatin 5 is a potent competitive inhibitor of the cysteine proteinase clostripain // FEBS Letters. 2001. Vol. 489. P. 97-100.

26. Jain M.K., Zeikus J.G. Taxonomic distinction of two new protein specific, hydrolytic anaerobes: isolation and characterization of Clostridium proteolyticumsp. nov. and Clostridium collagenovorans sp. nov. // Systematic and Applied Microbiology. 1988. Vol. 10. No. 2. P. 134-141.

27. Jennison M.W. The collagenase activity of culture filtrates of Clostridium histolyticum // Journal of Bacteriology. 1947. Vol. 54. No. 1. P. 55-56.

28. Jozwiak J., Grzela T., Jankowska-Steifer E. et al. Lethal factor of Clostridium histolyticum kills cells by apoptosis // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2007. Vol. 49. P. 296-303.

29. Kono T. Purification and partial characterization of collagenolytic enzymes from Clostridium histolyticum // Biochemistry. 1968. Vol. 7. P. 1106-1114.

30. Langston J. P., Carson C.C. 3rd Peyronie's disease: review and recent advances // Ma-turitas. 2014. Vol. 78. No. 4. P. 341-343.

31. MacFarlane R.G., MacLennan J.D. The toxemia of gas-gangrene // The Lancet. 1945. Vol. 2. P. 328-331.

32. MacLennan J.D., Mandl I., Howes E.L. Bacterial digestion of collagen // Journal of

Clinical Investigation. 1953. Vol. 32. No. 12. P. 1317-1322.

33. Manabe S., Nariya H., Miyata S. et al. Purification and characterization of a clostri-pain-like protease from a recombinant Clostridium perfringens culture // Microbiology. 2010. Vol. 156. P. 561-569.

34. Maschmann E. Uber Bakterienproteasen II // Biochemische Zeitschrift. 1937. Vol. 295. P. 1-10.

35. Matsushita O., Jung C.M., Katayama S. et al. Gene duplication and multiplicity of collage-nases in Clostridium histolyticum // Journal of Bacteriology. 1999. Vol. 181. P. 923-933.

36. Matsushita O., Jung C.M., Minami J. et al. A study of the collagenbinding domain of a 116-kDa Clostridium histolyticum collagenase // The Journal of Biological Chemistry. 1998. Vol. 273. P. 3643-3648.

37. Matsushita O., Koide T., Kobayashi R. et al. Substrate recognition by the collagen-binding domain of Clostridium histolyticum class I collagenase // The Journal of Biological Chemistry. 2001. Vol. 276. P. 8761-8770.

38. Mead G.C. The amino acid-fermenting Clostridia // Journal of General Microbiology. 1971. Vol. 67. P. 47-56.

39. Murphy A., Lalonde D.H., Eaton C. et al. Minimally invasive options in Dupuytren's contracture: aponeurotomy, enzymes, stretching, and fat grafting // Plastic and Reconstructive Surgery. 2014. Vol. 134. No. 5. P. 822-829.

40. Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encepha-lopathy agents via human and veterinary medicinal products (EMA/410/01 rev.3) // Official Journal of the European Union. 5 March 2011. URL: http://www.ema. europa.eu/docs/en_GB/document_library/ Scientific_guideline/2009/09/WC500003700. pdf (accessed: 01.07.2015).

41. Oakley C.L., Warrack G.H., Van Heyningen W.E. The collagenase (K toxin) of Cl. welchii Type A // The Journal of Pathology and Bacteriology. 1946. Vol. 58. P. 229-235.

42. Ohbayashi N., Yamagata N., Goto M. et al. Enhancement of the structural stability of full-length clostridial collagenase by calcium ions // Applied and Environmental Microbiology. 2012. Vol. 78. No. 16. P. 5839-5844.

43. Pat. EP 0468411 A2 A mutant of bacterium Clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase / M. Hol-jevac, I. Udovicic, S. Cizmek,V. Sojak-Der-kos, S. Gamulin, V. Delic. 29 January 1992.

44. Pat. US 20120237497 A1 Compositions and methods for producing clostridial collage-nases / T.L. Wegman, Bo Yu. 20 September 2012.

45. Pat. US 3821364 Process of producing collagenase / A.A. Chiulli, E. Wegman. 28 June 1974.

46. Pat. US 8236356 B2 Growth medium for Clostridium histolyticum / B. Suppmann, W. Hoelke, A. Hoffmann, T. Marx, K. Sonn, J.-P. Thalhofer. 7 August 2012.

47. Pat. US 8715985 B2 Clostridium histolyti-cum recombinant collagenases and method for the manufacture thereof / F. Bertuzzi, A. Cuttitta, G. Ghersi, S. Mazzola, M. Sala-mone, G. Seidita. 6 May 2014.

48. Pat. US20080233614 A1 Codon-optimized genes designed to help maximize expression level; making collegenase / R.M. Cranenburgh, G.L. Sabatino, B.J. Del Tito. 25 September 2008.

49. Pat. WO 2003025136 A2 Method of enzyme production by microorganisms / K. Jain Ma-hendra, S. Shin Hyoun. 8 June 2004.

50. Pat. WO 2007089851 A2 Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases / G.L. Sabatino, T.Jr.B.J. Del, P.J. Bassett, H.A. Tharia, A.G. Hitchcock. 9 August 2007.

51. Pat. WO 2013177647 A1 Meio de cultura para bactérias do gênero clostridium livre de componentes de origem animal e processo para produçao de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica / M.C. Alegria, L.C. Fardelone, M.B.R. Delalana, J.E. Thiemann, F.S. As-tolfi, R.C.D. Moreira, O. De Castro Pacheco. 5 December 2013.

52. Philominathan S.T.L., Matsushita O., Gensure R., Sakon J. Ca2+ induced linker transformation leads to compact and rigid collagen binding domain of Clostridium histolyticum collagenase // FEBS Journal. 2009. Vol. 276. No. 13. P. 3589—3601.

53. Products with risk of transmitting agents of animal spongiform encephalopathies 01/2005:1483 European Pharmacopoeia 5.0. P. 577—578.

54. Salamone M., Saladino S., Pampalone M. et al. Tissue dissociation and primary cells isolation using recombinant collagenases class I and II // Chemical Engineering Transactions. 2014. Vol. 38. P. 247—252.

55. Schulze S.M., Tursi J.P. Postapproval clinical experience in the treatment of Dupuy-tren's contracture with collagenase clostridium histolyticum (CCH): the first 1,000 days // Hand (NY). 2014. Vol. 9. No. 4. P. 447—458.

56. Souchet N., Laplante S. Recovery and characterization of a serine collagenolytic extract from snow crab ( Chionoecetes opilio) byproducts // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2011. Vol. 163. P. 765—779.

57. Takahashi S., Seifter S. New culture conditions for Clostridium histolyticum leading to production of collagenase of high specific activity // Journal of Applied Bacteriology. 1972. Vol. 35. No. 4. P. 647—657.

58. Van Doren S.R. Matrix metalloproteinase interactions with collagen and elastin // Matrix Biology. 2015. Vol. 44—46. P. 224—231.

59. Wang H., Van Blitterswijk C.A., Bertrand-De Haas M. et al. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes // In Vitro Cellular & Developmental Biology — Animal. 2004. Vol. 40. No. 8—9. P. 268—277.

60. Weinberg M., Randin A. Proprietes physicochimiques du ferment fibrolytique d'origine microbienne // Comptes rendus Société de biologie. 1932. Vol. 110. P. 352.

Контакты:

Конон Анастасия Дмитриевна, ведущий инженер-технолог цеха «Комбинированные вакцины» ФГУП «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России, кандидат технических наук. Тел. раб.: (812) 660-06-21. E-mail: Kononspbniivs@yandex.ru