ЛПС ВАКЦИНА
LPS VACCINE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новой вакцине, пригодной для профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями, такими как Salmonella и E. coli. В частности, настоящее изобретение относится к способу иммунизации нечеловекообразных животных, в частности птиц, путем применения в качестве защитного антигена структуры, содержащей О-антиген (например, липополисахарид), полученный от грамотрицательных бактерий.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бактерии имеют различное сродство к красителям в зависимости от разных составов клеточной стенки при тестировании окрашивания по Граму и делятся на две основные группы грамотрицательных и грамположительных бактерий на основании различий в их сродстве к красителям. В случае грамотрицательных бактерий клеточная стенка состоит из внешней мембраны и слоя пептидогликана на внутренней стороне внешней мембраны. Внешняя мембрана состоит из фосфолипидов, липополисахаридов (ЛПС), липопротеинов и протеинов мембраны. Единица мембранной структуры внешней мембраны состоит из фосфолипидов и липополисахаридов. Липополисахариды находятся в наружном слое мембраны, а фосфолипиды в его наружном слое. Липополисахариды состоят из липида с высокой молекулярной массой, называемого Липидом А, и связанного с ним полисахарида. Липид А составляет внешний слой наружной мембраны, в то время как полисахарид выступает из наружной мембраны. Типы сахаридов отличаются друг от друга в наружной части и части, близкой к Липиду А. Наружная часть называется О-частью цепи полисахаридов (О-антиген), а внутренняя часть называется полисахаридным ядром. Сахарид, состоящий из О-антигена, представляет собой в основном гексозу и пентозу, и базовая структура, состоящая из 3-5 видов этих сахаридов, повторяется. В ядре полисахарида присутствуют сахариды, в добавление к этим сахаридам уникальные для соответствующей бактерии, такие как октоза, например кетодеоксиоктонат, и гептоза. Липид А представляет собой липид, уникальный для соответствующих бактерий, который включает сахарид, то есть две молекулы глюкозамина, которые связаны друг с другом связями β-1,6, и фосфорную кислоту, а также жирную кислоту, связанную с указанным сахаридом. Липид А связан с полисахаридом ядра по 6ʹ-позиции сахарида.
Существует множество видов грамотрицательных бактерий. Salmonella и E.coli, принадлежащих к Enterobacteriaceae, и Haemophilus, принадлежащий к Pasteurella, также включены в грамотрицательные бактерии.
Salmonella, вторая по величине бацилла с перитрихиальными жгутиками, делится на две группы по типу О-антигена и дополнительно делится на подгруппы по типам Н-антигена, обнаруживая более 2000 видов серотипов. Спектр хозяев Salmonella довольно широк, и различные виды Млекопитающих, включая человека и птиц, заражаются или являются носителями Salmonella. Когда заражаются цыплята, Salmonella может вызывать септические заболевания у молодых цыплят. В случаях с взрослыми цыплятами, тем не менее, у цыплят-носителей это протекает бессимптомно, что позволяет избежать отбраковки, что приводит к тому, что мясо цыплят и яйца, полученные от них, зараженные Salmonella, распространяются и вызывают пищевые отравления у людей через продукты, выпускаемые из них.
Пищевое отравление Salmonella развивается после инкубационного периода от 12 до 48 часов после приема контаминированной еды. Инкубационный период может варьироваться в зависимости от количества поглощенных бактерий, состояния и возраста пациентов. Симптомы в основном представляют собой симптомы острого гастроэнтерита, а главными симптомами являются диарея, боль в животе, рвота и лихорадка. Таким образом, вакцина от Salmonella для цыплят не предотвращает развитие заболевания у цыплят, но является важной вакциной, используемой в здравоохранении.
Среди стандартных вакцин против Salmonella можно назвать цельноклеточную вакцину, которая включает клетки инактивированных Salmonella. Цельноклеточная вакцина, тем не менее, может вызывать побочные эффекты, поскольку она содержит части, которые не обладают антигенными свойствами. В случае цыплят, которые разводятся в стае, с целью трудосберегающего вакцинирования, имеется сильная потребность в мультивалентной вакцине, которая может предотвратить множество заболеваний при помощи одной инъекции. Также мультивалентная вакцина может привести к снижению стресса у цыплят, поскольку она снижает число инъекций. Тем не менее, хотя мультивалентная вакцина имеет данное преимущество, она ответственна за вызывание вакцинальной реакции в области введения, в частности, когда она содержит такие бактерии, как Salmonella.
В этих обстоятельствах проводятся исследования компонентов вакцины против Salmonella, среди которых исследуют применение липополисахарида (О-антигена). Для примера, существует отчет, в котором конъюгат О-антигена, полученного из Salmonella Typhimurium, связанный с белком-переносчиком, вводят мышам для подтверждения его эффективности (Непатентная ссылка 1). Также существует отчет, в котором полученный от Salmonella Typhi липополисахарид вводят мышам для подтверждения его эффективности (Ссылка на патент 1). Кроме Salmonella имеется отчет о том, что полученный от Burkholderia thailandesis или Burkholderia pseudomallei липополисахарид вводят мышам для подтверждения его эффективности (Ссылка на патент 2, непатентная ссылка 2).
Тем не менее, контаминации липополисахаридом избегают при помощи тщательного аккуратного обращения с лекарственным средством, применяемым для живого организма, поскольку липополисахарид может клинически вызывать различные заболевания с высокой летальностью, такие как септический шок, диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС) и полиорганную недостаточностью (MOF), а также может стать причиной лихорадки даже в следовых количествах (Непатентная ссылка 3). На практике существует отчет, что более 90% мышей умирают в течение 72 часов после введения липополисахарида (Ссылка на патент 3).
При этих обстоятельствах идеи применять липополисахарид как есть в качестве антигена вакцины в целом не возникает.
ССЫЛКИ НА ПАТЕНТЫ
Ссылка на патент 1: WO2004/052394
Ссылка на патент 2: WO2010/082020
Ссылка на патент 3: Японская Публикация Патента № 2001-26602
НЕПАТЕНТНЫЕ ССЫЛКИ
Непатентная ссылка 1: Infect. Immun, 60, pp4679-4686, 1992
Непатентная ссылка 2: Vaccine, 28, pp7551-7555, 2010
Непатентная ссылка 3: Bull. Natl. Inst. Health Sci., 126, pp19-33, 2008
Непатентная ссылка 4: AVIAN DISEASES, 52, pp281-286, 2009
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача, решаемая изобретением
Целью настоящего изобретения является создание возможности получения мультивалентной вакцины и смешанной вакцины для вакцинирования от грамотрицательных бактерий, таких как Salmonella и E. coli, а также для снижения инокуляционных реакций.
Средства для Решения Проблем
Авторы настоящего изобретения подробно изучили проблемы, обозначенные выше, и, как результат, обнаружили, что отек в месте инъекции неожиданно ограничивается, когда вакцину, включающую в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген (например: липополисахарид), полученный от грамотрицательных бактерий, вводят птицам. А именно структура, содержащая О-антиген, высвобождается из клеток, содержащихся в культуре грамотрицательных бактерий (например, Salmonella), например, путем разрушения ультразвуком или обработки фенолом, и далее собирается в колонку, к которой указанная структура адгезируется. Композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента вышеупомянутую структуру, далее получают при помощи стадии эмульгирования, если необходимо. Настоящие изобретатели обнаружили, что таким образом приготовленная композиция вакцины может обеспечивать птицам (например, цыплятам) иммунизацию против указанных грамотрицательных бактерий, и иммунизация проходит в то же время без побочных эффектов для завершения настоящего изобретения.
Настоящее изобретение включает следующие изобретения.
[1] Композицию вакцины для птиц, включающую в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от грамотрицательных бактерий, обеспечивающий то, что указанная структура не содержит целую клетку.
[2] Композиция вакцины по п.[1], где структура, содержащая О-антиген, представляет собой липополисахарид.
[3] Композиция вакцины по п. [1] или [2], где грамотрицательные бактерии представляют собой Enterobacteriaceae или Pasteurella.
[4] Композиция вакцины по п.[3], где Enterobacteriaceae представляет собой Salmonella или E. coli.
[5] Композиция вакцины по п.[4], где Salmonella представляет собой одну или более выбираемую из группы, состоящей из 04, 07 и 09 Групп.
[6] Композиция вакцины по п. [4] или [5], где Salmonella представляет собой одну или более, выбираемую из группы, состоящей из Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium и Salmonella Infantis.
[7] Композиция вакцины по п. [4] или [5], где структура, содержащая О-антиген, полученный от грамотрицательных бактерий, представляет собой смесь структур, содержащих О-антиген, полученный от Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium и Salmonella Infantis.
[8] Композиция вакцины по п.[4], где E. coli представляет собой E. coli, имеющую О-антиген О78.
[9] Композиция вакцины по п. [3], где Pasteurella представляет собой Haemophilus.
[10] Композиция вакцины по п. [9], где Haemophilus представляет собой Haemophilus paragallinatum.
[11] Композиция вакцины по любому из пп. [1]-[10], где структура, содержащая О-антиген, представляет собой структуру, содержащую О-антиген, содержащийся в по меньшей мере 5 400 МЕ/мл от каждой Salmonella в композиции вакцины.
[12] Композиция вакцины по любому из пп.[1]-[11], где композиция вакцины дополнительно включает антиген, полученный от одного или более патогенов, выбираемых из группы, состоящей из вируса ньюкаслской болезни, вируса птичьего инфекционного бронхита, Mycoplasma gallisepticum, вируса синдрома сниженной несучести и Haemophylus paragallinarum.
[13] Способ получения композиции вакцины для птиц, включающей в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от грамотрицательных бактерий, процесс, включающий стадии (1)-(4), как следует далее:
(1) стадию культивирования грамотрицательных бактерий (стадия культивирования);
(2) стадию высвобождения вышеупомянутой структуры из клеток, содержащихся в растворе после указанного культивирования (стадия высвобождения);
(3) стадию сбора вышеупомянутой структуры из раствора после указанного высвобождения (стадия сбора); и
(4) стадию получения раствора после указанного сбора для получения композиции вакцины (стадия приготовления).
[14] Способ по п.[13], где стадия высвобождения вышеупомянутой структуры представляет собой стадию разрушения ультразвуком или стадию обработки фенолом.
[15] Способ по п. [13] или [14], дополнительно включающий стадию инактивации клеток (стадию инактивации) и/или стадию эмульгирования вышеупомянутой структуры (стадия эмульгирования).
[16] Способ по п.[15], где стадию инактивации проводят после стадии культивирования и стадию эмульгирования проводят после стадии сбора.
[17] Способ по любому из пп.[13]-[16], дополнительно включающий стадию измерения количества вышеупомянутой структуры (стадия измерения).
[18] Способ по п.[17], где стадию измерения проводят после стадии сбора.
[19] Способ по любому из пп.[13]-[18], дополнительно включающий стадию удаления Липида А (стадия удаления Липида А).
[20] Способ по п.[19], где стадию удаления Липида А проводят после стадии сбора.
ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При использовании структуры, содержащей О-антиген (например, липополисахарид), полученный от грамотрицательных бактерий, в качестве активного ингредиента композиции вакцины становится возможным уменьшить отек в области инъекции по сравнению с обычной цельноклеточной вакциной. Кроме того, путем получения компонента вакцины становится возможно дополнительно увеличить число других антигенов для смешивания без повышения объема инъекции.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 показывает уровень отека в области инъекции для смешанной вакцины из липополисахаридов, полученных от Salmonella Enteritidis, Salmonella Infantis и Salmonella Typhimurium (трехвалентная ЛПС вакцина) или вакцины, включающей другие антигены в дополнение к трехвалентной ЛПС вакцине (10-валентная смешанная ЛПС вакцина).
Фиг. 2 показывает количество клеток, выделенных при провокационном тесте с Salmonella Typhimurium, проводимом для трехвалентной ЛПС вакцины, где символ «звездочка» * показывает значимое отличие от контрольной группы (р<0,05).
Фиг. 3 показывает количество клеток, выделенных при провокационном тесте с Salmonella Enteritidis, проводимом для трехвалентной ЛПС вакцины, где символ «звездочка» * показывает значимое отличие от контрольной группы (р<0,05).
Фиг. 4 показывает количество клеток, выделенных при провокационном тесте с Salmonella Infantis, проводимом для трехвалентной ЛПС вакцины, где символ «звездочка» * показывает значимое отличие от контрольной группы (р<0,05).
Фиг. 5 показывает число клеток, выделенных при провокационном тесте с Salmonella Enteritidis, проводимом для 10-валентной ЛПС вакцины, где символ «звездочка» * показывает значимое отличие от контрольной группы (р<0,05).
Фиг. 6 показывает число клеток, выделенных при провокационном тесте с Salmonella Infantis, проводимом для 10-валентной ЛПС вакцины, где символ «звездочка» * показывает значимое отличие от контрольной группы (р<0,05).
ЛУЧШИЙ РЕЖИМ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция вакцины
Первый вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой композицию вакцины для птиц, включающую в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от грамотрицательных бактерий.
В соответствии с настоящим изобретением в композиции вакцины, включающей в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген (в частности, липополисахарид), полученный от Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis или Salmonella Enteritidis, выделение клеток снижается по сравнению с провокацией с соответствующими клетками. Считают, что это происходит из-за сохранения антигенности против соответствующих структур, полученных от различных грамотрицательных бактерий, даже если соответствующие структуры смешаны друг с другом. Кроме того, в 10-валентной смешанной вакцине, включающей трехвалентную вакцину, смешанную с антигенами, отличными от вышеупомянутых структур, антигенность против клеток, которые предоставляют вышеупомянутые структуры, сохраняется. Считают, что это происходит из-за сохранения антигенности против вышеупомянутых структур, даже если смешанная вакцина включает антигены, отличные от вышеупомянутых структур.
Так, композиция вакцины настоящего изобретения включает:
(А) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента вышеупомянутую структуру, полученную из одной грамотрицательной бактерии (здесь и далее также называется «моновалентной вакциной»);
(В) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента вышеупомянутую структуру, полученную из множества грамотрицательных бактерий (здесь и далее также называется «поливалентной вакциной»);
(С) композицию вакцины, включающую моновалентную вакцину или поливалентную вакцины вместе с антигенами, отличными от вышеупомянутой структуры (здесь и далее также называется «смешанной вакциной»).
(1) Бактериальные клетки
Композиция вакцины настоящего изобретения включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген. Таким образом, композиция вакцины настоящего изобретения может широко применяться в отношении грамотрицательных бактерий, имеющих вышеупомянутую структуру. Для примера, грамотрицательные бактерии, как применяют в настоящем изобретении, могут включать грамотрицательные факультативные анаэробные палочки, Anaplasmataceae, Arcobacter, Bartonellaceae, Brachyspira, Buchnera, Campylobacter, Chlamydiales, Chloroflexus, грамотрицательные аэробные бактерии, грамотрицательные анаэробные бактерии, грамотрицательные кислородные фотосинтезирующие бактерии, Helicobacter, бактерии Lawsonia, Methylosinus, Oceanospirillaceae, Ornithobacterium, Piscirickettsiaceae, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodovulum, Rickettsiaceae, Roseobacter, Spirillaceae и Tenericutes, предпочтительно грамотрицательные факультативные анаэробные палочки.
Грамотрицательные факультативные анаэробные палочки могут включать Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae, Actinobacillus, Aeromonadaceae, Azoarcus, Capnocytophaga, Cardiobacteriaceae, Chromobacterium, Eikenella, Gardnerella, Moritella, Rahnella, Shewanella, Streptobacillus, Vibrionaceae и Zymomonas, предпочтительно Enterobacteriaceae и Pasteurellaceae.
Enterobacteriaceae могут включать Salmonella, Escherichia, Calymmatobacterium, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Morganella, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Proteus, Providencia, Serratia, Shigella, Wigglesworthia, Xenorhabdus и Yersinia, предпочтительно Salmonella и Escherichia.
Salmonella разделена на группы по типам О-антигена и дополнительно разделена по типам Н-антигена, включая О2 группу (а), О4 группу (В), О7 группу (С1, С4), О8 группу (С2, С3), О9 группу (D1) и О3/О10 Группу (Е1, Е2, Е3), как показано в Таблице 1 и Таблице 2 (старые обозначения показаны в скобках).
Таблица 1
О-Серотип
Серотип
О-Антиген (опционально удален)
О2 (А)
Salmonella Paratyphi A
1, 2, 12
О4 (В)
Salmonella Paratyphi B
1, 4, (5), 12
Salmonella Stanley
1, 4, (5), 12, 27
Salmonella Derby
1, 4, (5), 12
Salmonella Agona
1, 4, 12
Salmonella Typhimurium
1, 4, (5), 12
Salmonella Heidelberg
1, 4, (5), 12
О7 (С1, С4)
Salmonella Paratyphi C
6, 7, (Vi)
Salmonella Choleraesuis
6, 7
Salmonella Braenderup
6, 7, 14
Salmonella Montevideo
6, 7, 14
Salmonella Thompson
6, 7, 14
Salmonella Virchow
6, 7
Salmonella Infantis
6, 7, 14
Salmonella Bareilly
6, 7, 14
Salmonella Tennessee
6, 7, 14
Таблица 2
О-Серотип
Серотип
О-Антиген (опционально удален)
О8 (С2, С3)
Salmonella Narashino
6, 8
Salmonella Newport
6, 8, 20
Salmonella Lichfield
6, 8
О9 (D1)
Salmonella Sendai
1, 9, 12
Salmonella Typhi
9, 12, (Vi)
Salmonella Enteritidis
1, 9, 12
Salmonella Panama
1, 9, 12
Salmonella enterica subsp. salamae
1, 9, 12
Salmonella Gallinarum
1, 9, 12
О3/О10(Е1, Е2, Е3)
Salmonella Anatum
3, 10, (15), (15, 34)
Salmonella Meleagridis
3, 10, (15), (15, 34)
Salmonella London
3, 10, (15)
Salmonella Give
3, 10, (15), (15, 34)
Salmonella Weltevreden
3, 10, (15)
В соответствии с настоящим изобретением в трехвалентной вакцине, включающей в качестве активного ингредиента структуру, включающую О-антигены, полученные от Salmonella Typhimurium (О4 группа), Salmonella Infantis (О7 группа) и Salmonella Enteritidis (О9 группа), выделение клеток снижается по сравнению с провокацией соответствующими клетками. Считают, что это происходит из-за сохранения антигенности против соответствующих структур, изготовленных в процессе приготовления настоящего изобретения, независимо от типов О-антигена. Так, считается, что композицию вакцины настоящего изобретения можно применять к Salmonella в целом, но не ограничиваясь Salmonella из Группы О4, Группы О7 и Группы О9.
В непатентной ссылке 4 у птиц, иммунизированных вакциной, включающей клетки Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis и Salmonella Enteritidis, выделение клеток снижается по сравнению не только с соответствующими вакцинными штаммами, но также и по сравнению с Salmonella Heidelberg, принадлежащей к той же О-антигенной группе (Группа О4), что и Salmonella Typhimurium. Так, считается, что вакцина также может быть эффективна в отношении клеток, имеющих О-антиген, гомологичный такому из вакцинных штаммов, но принадлежащих к различным серотипам. А именно, в случае вакцины от Salmonella, считается, что вакцина также может быть эффективна в отношении клеток, имеющих О-антиген, гомологичный такому в вакцинных штаммах, другими словами, в отношении клеток такой же О-антигенной группы, что и вакцинные штаммы. Таким образом, композицию вакцины настоящего изобретения при применении в отношении Salmonella, также можно применять в другим клеток Salmonella, принадлежащим к Группе О4, Группе О7 и Группе О9.
Таким образом, композиция вакцины настоящего изобретения включает:
(А) моновалентную вакцину, включающую в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от Salmonella;
(В) поливалентную вакцину, включающую в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от Salmonella;
(С) моновалентную вакцину, включающую в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от Salmonella, принадлежащий к Группе О4, Группе О7 или Групп О9;
(D) поливалентную вакцину, включающую в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный из двух или более Salmonella, выбираемых из групп, состоящих из Группы О4, Группы О7, Группы О9; и
(Е) смешанную вакцину, включающую вышерасположенную моновалентную вакцину или поливалентную вакцину вместе с антигенами, отличными от вышеупомянутой структуры.
Типичные Salmonella, включенные в Salmonella Группы О4, Группы О7, Группы О9, могут включать клетки, показанные в Таблице 1 и Таблице 2. Предпочтительно, Salmonella представляет собой принадлежащие к Группе О4, Группе О7 и Группе О9. Также, предпочтительно, Группу О4 представляет собой Salmonella Typhimurium, Группу О7 представляет собой Salmonella Infantis и Группу О9 представляет собой Salmonella Enteritidis.
E. coli классифицируют по комбинации из трех антигенов, О-антигена, К-антигена и Н-антигена. Известно приблизительно 160 типов для О-антигена, приблизительно 100 типов для К-антигена и приблизительно 56 типов для Н-антигена. Конкретные типы E.coli могут вызывать диарею и гастроэнтерит, а также могут быть причиной пищевого отравления. Такие E. coli в целом классифицируются на энтеротоксигенные E. coli, энтероинвазивные E. coli, энтерогеморрагические E. coli, энтеропатогенные E. coli, энтероаггрегирующие E. coli и диффузно адгезирующие E. coli. Группы, принадлежащие к энтеротоксигенным E. coli включают О18, О26, О44, О55, О86, О111, О112, О114, О119, О125, О126, О127, О128а и О142. Энтеротоксигенные E. coli включают О4, О6, О7, О8, О9, О15, О18, О20, О25, О27, О63, О77, О78, О80, О85, О114, О115, О126, О128а, О139, О148, О153, О159, О167, О168 и О169. Энтероинвазивные E.coli включают О28с, О29, О112а, О124, О136, О143, О144, О152, О164 и О167. Энтерогеморрагические E. coli включают О1018, О26, О91, О111, О113, О114, О115, О117, О119, О121, О128, О145 и О157. Такой E. coli предпочтительно является О78.
Pasteurellaceae включают Haemophilus, Mannheimia и Pasteurella, предпочтительно Haemophilus.
Haemophilus включает Haemophilus paragallinarum, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenza, Haemophilus paraphrophilus, Haemophilus parasuis и Haemophilus somnus, предпочтительно Haemophilus paragallinarum.
(2) Структура, содержащая О-антиген.
Композиция вакцины настоящего изобретения включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген. Поскольку О-антиген в основном отвечает за антигенность, структурой, содержащей О-антиген, может быть любая структура, если она содержит О-антиген, предоставляемый таким образом, что это структура, которая не содержит целую клетку. Для примера, структура, содержащая О-антиген, включает липополисахариды, и структуру, содержащую липополисахариды, за исключением Липида А (например, структуру, состоящую из О-антигена или О-антигена и полисахарида ядра). В том случае, если стадию удаления Липида А не применяют с целью эффективной выработки, композиция вакцины настоящего изобретения предпочтительно включает в качестве активного ингредиента липополисахариды. Хотя нет уверенности о побочных эффектах композиции вакцины настоящего изобретения, композиция вакцины настоящего изобретения предпочтительно включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую липополисахариды, из которых для большей безопасности исключен Липид А.
(3) Моновалентная вакцина
Композиция вакцины настоящего изобретения включает композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента вышеупомянутую структуру, полученную из одного вида граммотрицательной бактерии (моновалентная вакцина).
В случае моновалентной вакцины грамотрицательную бактерию можно подходящим образом выбрать из клеток грамотрицательных бактерий, как описано выше. грамотрицательная бактерия предпочтительно представляет собой Enterobacteriaceae или Pasteurella. Enterobacteriaceae предпочтительно представляет собой Salmonella или E. coli. Salmonella предпочтительно представляет собой Salmonellaу, принадлежащую к Группе О4, О7 и О9. Salmonella, принадлежащая к Группе О4 предпочтительно представляет собой Salmonella Typhimurium, Salmonella, принадлежащая к Группе О7, представляет собой Salmonella Infantis. Salmonella, принадлежащая к Группе О9, предпочтительно представляет собой Salmonella Enteritidis. E. coli предпочтительно представляет собой E. coli, имеющую О-антиген, из О78. Pasteurella предпочтительно представляет собой Haemophilus, в частности, Haemophilus paragallinarum.
Так, моновалентная вакцина настоящего изобретения включает:
(А) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа грамотрицательной бактерии;
(В) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа Enterobacteriaceae;
(С) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа Pasteurella;
(D) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа Salmonella;
(Е) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа E. coli;
(F) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа Salmonella, принадлежащего к Группе О4;
(G) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа Salmonella, принадлежащего к Группе О7;
(H) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа Salmonella, принадлежащего к Группе О9;
(I) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella Typhimurium;
(J) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella Infantis;
(K) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella Enteritidis;
(L) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа E. coli, имеющей О-антиген, из О78;
(M) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от одного типа Haemophilus; и
(N) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Haemophilus paragallinarum.
(4) Поливалентная вакцина
Композиция вакцины настоящего изобретения включает композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента вышеупомянутую структуру, полученную от нескольких видов грамотрицательных бактерий (поливалентная вакцина).
В случае поливалентной вакцины типы грамотрицательной бактерии, из которой получают структуру, содержащую О-антиген, представлены предпочтительно 2 или более, 3 или более, 4 или более или 5 или более. Предпочтительно они составляют 2 (бивалентная вакцина), 3 (трехвалентная вакцина), 4 (четырехвалентная вакцина) или 5 (пятивалентная вакцина) типов.
Трехвалентная вакцина против Salmonella предпочтительно включает вышеупомянутые структуры, полученные от Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis и Salmonella Enteritidis.
Грамотрицательные бактерии можно подходящим образом выбирать из клеток грамотрицательных бактерий, как описано выше. Грамотрицательными бактериями предпочтительно являются Enterobacteriaceae или Pasteurella. Enterobacteriaceae предпочтительно представляют собой Salmonella или E. coli. Salmonella предпочтительно представляет собой Salmonellaу, принадлежащую у Группам О4, О7 и О9. Salmonella, принадлежащая к О4 Группе, представляет собой Salmonella Typhimurium, Cальмонелла, принадлежащая к О7 Группе, представляет собой Salmonella Infantis, и Cальмонелла, принадлежащая к О9 Группе, представляет собой Salmonella Enteritidis. E. coli предпочтительно представляет собой E. coli, имеющую О-антиген, из О78. Pasteurella предпочтительно представляет собой Haemophilus, в частности, Haemophilus paragallinarum.
Так, поливалентная вакцина настоящего изобретения включает:
(А) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от двух и более типов грамотрицательных бактерий;
(В) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от двух и более типов Enterobacteriaceae;
(С) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от двух и более типов Pasteurella;
(D) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от двух и более типов Salmonella;
(Е) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от двух и более типов E. coli;
(F) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella, принадлежащей к Группе О4 и Salmonella, принадлежащей к Группе О7;
(G) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella, принадлежащей к Группе О4 и Salmonella, принадлежащей к Группе О9;
(H) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella, принадлежащей к Группе О7 и Salmonella, принадлежащей к Группе О9;
(I) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella, принадлежащей к Группе О4, Salmonella, принадлежащей к Группе О.7 и Salmonella, принадлежащей к Группе О9;
(J) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella Typhimurium и Salmonella Infantis;
(K) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella Typhimurium и Salmonella Enteritidis;
(L) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella Infantis и Salmonella Enteritidis;
(М) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis и Salmonella Enteritidis;
(N) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от двух и более типов E. coli, имеющей О-антиген, из О78; и
(О) композицию вакцины, включающую в качестве активного ингредиента О-антиген, полученный от двух и более типов Haemophilus.
(5) Смешанная вакцина.
Композиция вакцины настоящего изобретения включает композицию вакцины, включающую моновалентную вакцину или поливалентную вакцину вместе с антигенами, отличными от вышеупомянутых структур (смешанная вакцина).
Такие антигены включают аттенуированный патоген, инактивированный патоген, протеин, пептид, нуклеиновую кислоту и вирусоподобную частицу. Моновалентную вакцину или поливалентную вакцину настоящего изобретения можно применять в качестве смешанной вакцины в комбинации с по меньшей мере одной вакциной, выбираемой из группы, состоящей из вакцин против других вирусов (например, вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного бурсита, вируса птичьего энцефаломиелита, вируса синдрома сниженной несучести, вируса ньюкаслской болезни, птичьего реовируса, вируса птичьего гриппа, вируса болезни Марека, вируса инфекционного ларинготрахеита, птичьего пневмовируса и вируса оспы кур), бактерий (например, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium septicum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni и Campylobacter fetus) и простейших (например, Leucocytozoon caulleryi, Eimeria tenella, Eimeria maxima и Eimeria necatrix).
(6) Концентрация и соотношение активного ингредиента
Композиция вакцины настоящего изобретения включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген. Концентрация вышеупомянутой структуры определяют по помощи единицы эндотоксина (=EU) в качестве индекса. EU измеряют в соответствии со 2-(6) стадиями измерения, как описано ниже. Концентрация вышеупомянутой структуры, содержащейся в композиции вакцины, в случае поливалентной вакцины, может варьировать в зависимости от типа вышеупомянутой структуры или может быть такой же. Концентрация вышеупомянутой структуры составляет предпочтительно по меньшей мере 5400 EU/мл, и более предпочтительно 54000 EU/мл, для соответствующей структуры.
В случае поливалентной вакцины соотношение вышеупомянутой структуры (EU соотношение) может быть как равным, так и отличным соотношением. В случае трехвалентной вакцины, включающей в качестве активного ингредиента вышеупомянутую структуру, полученную от Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis или Salmonella Enteritidis, соотношение вышеупомянутой структуры составляет предпочтительно Salmonella Typhimurium: Salmonella Infantis: Salmonella Enteritidis (1:1:1).
(7) Субъект для введения
В соответствии с настоящим изобретением выделение клеток в выделениях слепой кишки у цыплят, иммунизированных трехвалентной вакциной, снижается, как в Примере 1. Таким образом, композицию вакцины настоящего изобретения можно применять для птиц. Птицы включают выращенных для коммерческих и некоммерческих целей. Примеры птиц включают Galliformes (например, цыплят, перепелок, индеек), Anseriformes (например, утку и гуся), Charadriiformes (например, чайку, полосатую трехперстку и ржанку), Columbiformes (например, голубя), Struthioniformes (например, страуса), Passeriformes (например, ворону, вьюрка, воробья, скворца и ласточку), Psittaciformes (например, воробья), Falconiformes (например, орла и сокола), Strigiformes (например, сову), Sphenisciformes (например, пингвина) и Psittaciformes (длиннохвостого попугая и попугая), предпочтительно цыплят.
(8) Путь введения
Композиция вакцины настоящего изобретения вызывает отек в области введения, ограничивающийся уровнем, приемлемым в качестве вакцины. Таким образом, можно предлагать разнообразие путей введения для композиции вакцины настоящего изобретения, включая, например, введение в ногу, грудь, сплетение, пероральное, ректальное, перкутанное, энтеральное введение, внутримышечные, подкожные, интрамедуллярные инъекции, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, интраперитонеальные, интраназальные и внутриглазные инъекции. Нога представляет собой удобное место для введения композиции вакцины. Таким образом, предпочтительным путем введения является нога.
(9) Носитель
Композиция вакцины настоящего изобретения может включать фармакологически приемлемый носитель, любой носитель, применяемый для производства вакцины можно применять без ограничений. А именно, носитель включает физиологический раствор, буферированный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, изотонический водный буфер и комбинацию вышеперечисленных веществ. В дополнение к этому композиция вакцины настоящего изобретения может дополнительно включать эмульгирующее средство, консервирующее средство (например, тимеросал), изотоническое средство, регулятор рН, инактивирующее средство (например, формалин), и адъювант. Адъювант предпочтительно представляет собой масляный адъювант.
(10) Белок-носитель
Структура, содержащая О-антиген, может опционально быть связанной с белком-носителем с целью усиление иммунизирующей реакции при введении. Такой белок-носитель включает дифтерийный анатоксин (DT), столбнячный анатоксин (TT), холерный токсин (CT) и CRM197. Связывание с белком-носителем может происходить при помощи связывающего средства (например, SPDP или ADH), или структура может быть связана напрямую с белком-носителем. В качестве примера раскрыто связывание с белком-носителем (DT/TT/CT) при помощи SPDP или ADH с применением бромистого циана (Непатентная ссылка 1).
2. Процесс приготовления композиции вакцины
Второй вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой процесс приготовления композиции вакцины для птиц, включающей в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от грамотрицательных бактерий.
Процесс настоящего изобретения включает стадию культивирования грамотрицательных бактерий (стадия культивирования); стадию высвобождения вышеупомянутой структуры из клеток, содержащихся в растворе после указанной культуры (стадия высвобождения); стадию сбора вышеупомянутой структуры из раствора после указанного высвобождения (стадия сбора) и стадию приготовления раствора после указанного сбора для получения композиции вакцины (стадия приготовления). В дополнение к вышеупомянутым стадиям процесс может дополнительно включать стадию инактивации клеток (стадия инактивации) и/или стадию эмульгирования вышеупомянутой структуры (стадия эмульгирования). Предпочтительно стадию инактивации проводят после стадии эмульгирования, а стадию эмульгирования проводят после стадии сбора. Кроме того, процесс предпочтительно включает стадию измерения количества вышеупомянутой структуры (стадия измерения) после стадии сбора. В случае, если вышеупомянутая структура не содержит Липид А, процесс предпочтительно включает стадию удаления Липид А (стадия удаления Липида А). Стадию удаления Липида А предпочтительно проводят после стадии сбора.
Каждая из соответствующих стадий объясняется ниже. По обстоятельствам, соответствующие стадии не обязательно проводят в порядке, обозначенном ниже, некоторые стадии можно пропустить, а некоторые произвести повторно. Например, стадию эмульгирования нет необходимости проводить, когда не применяют масляный адъювант. Стадию инактивации и стадию высвобождения можно проводить одновременно (например, разрушение ультразвуком и обработка формалином проводятся в обеих стадиях).
(1) Стадия культивирования
Стадию культивирования можно подходящим образом модифицировать для типа культуральной среды и условий роста (время, температура, концентрация кислорода, концентрация углекислого газа, рН и концентрация солей) в зависимости от типа грамотрицательных бактерий. В случае Salmonella, клетки культивируют на культуре TPB при 35-43°С (предпочтительно при 37°С) в течение 8-24 часов (предпочтительно 16 часов). В случае E. coli клетки культивируют на культуре LB при 30-43°С (предпочтительно при 37°С) в течение 8-24 часов (предпочтительно 16 часов).
(2) Стадия инактивации
Стадию инактивации можно подходящим образом модифицировать в зависимости от типа грамотрицательных бактерий. Для примера, это можно сделать при помощи физической обработки (например, облучения рентгеновскими лучами, термообработки или разрушения ультразвуком) или химической обработки (например, обработки формалином, обработки ртутью, обработки спиртом или обработки водородом). Любые из этих обработок можно произвести по отдельности или в комбинации. Обработка формалином является предпочтительной.
(3) Стадия высвобождения
Стадией высвобождения могут быть любые процедуры, обеспечивающие поддержание антигенности для вышеупомянутой структуры. Процедуры и условия можно подходящим образом выбирать в зависимости от грамотрицательных бактерий или свойств вышеупомянутой структуры. Для примера, она включает разрушение ультразвуком, обработку фенолом, механическую обработку, заморозку и разморозку, компрессию и декомпрессию, осмотическое давление, распад клеточной стенки (например, обработку лизосомами, раскрытую в Непатентной ссылке 1 и Непатентной ссылке 2) и обработку сурфактантом как по отдельности, так и в комбинации, предпочтительно распад клеточной стенки, разрушение ультразвуком и обработку фенолом.
Разрушение ультразвуком можно проводить в любых условиях, сохраняющих предоставляемую антигенность вышеупомянутой структуры. Для примера, его можно проводить при 25°С или менее, предпочтительно в ледяной воде в течение 5-30 минут, предпочтительно в течение 15 минут. Раствор после разрушения ультразвуком можно подвергать центрифугированию для удаления примесей.
Обработку фенолом можно проводить в любых условиях, сохраняющих предоставляемую антигенность вышеупомянутой структуры. Для примера, ее можно проводить с 45-100%, предпочтительно 100% фенолом при 4-80°С, предпочтительно при 68°С в течение 5-30 минут, предпочтительно в течение 15 минут. Во время процедуры контейнер можно перемешивать через регулярные промежутки времени. Раствор после реакции можно подвергать центрифугированию для удаления примесей. Раствор после обработки фенолом можно подвергать диализу с подходящим буфером (например, PBS).
Нуклиолитическую обработку (например, обработку ДНКазой или РНКазой) или протеолитическую обработку (обработку протеазой) можно проводить после стадии высвобождения, как раскрыто в Непатентной ссылке 1 и Непатентной ссылке 2. Нуклеиновые кислоты можно удалить при помощи фракционирования этанолом. Удаление протеинов и удаление боковых цепей жирных кислот Липида А можно производить путем обработки уксусной кислотой.
(4) Стадия сбора
Стадию сбора можно подходящим образом модифицировать в зависимости от свойств вышеупомянутой структуры. Для примера, липополисахарид в целом заряжен отрицательно как включающих многие фосфатные группы и, таким образом, легко абсорбируется на положительно заряженные вещества. Таким образом, вышеупомянутую структуру можно собрать путем абсорбирования, используя такие свойства, как аффинная хроматография и абсорбция с положительно заряженной мембраной. Для примера. Полимиксин В, гистидин, гистамин, лизин, амидированные сферы поли(-метил-L-глутаминовой кислоты) и положительно заряженную мембрану с представленными аммонийными группами можно предлагать для положительно заряженного вещества.
Альтернативно, вышеупомянутую структуру можно собирать путем использования гидрофобности Липида А. Гидрофобная субстанция включает полипропилен, полиэтилен, полистирен и мембрану PTEE. Для сбора вышеупомянутой структуры также предлагается то, что вещество, связывающееся с липополисахаридом, используют, включая анти-ЛПС антитело, анти-ЛПС фактор от Limulus polyphemus, BPI (бактерицидный белок, увеличивающий проницаемость клеточной мембраны) белок, CAP18 (катионный антибактериальный протеин в 18 кДа) и LPB (ЛПС-связывающий протеин). Можно применять хроматографию с носителем, с которым это вещество связано.
Сбор вышеупомянутой структуры может быть проведен с применением имеющихся в продаже продуктов. Для примера, можно применять ET-clean (зарегистрированный товарный знак; Chisso Corporation). Сбор также можно производить при помощи ультрацентрифугирования, как раскрыто в Непатентной ссылке 1.
Стадия удаления Липида А
Структура, содержащая О-антиген, может быть той, которая содержит Липид А (например, липополисахарид) или той, которая не содержит Липид А (например, О-антиген, О-антиген плюс полисахарид ядра). В случае если структура не содержит Липид А, стадия удаления Липида А предпочтительно включена.
Стадия удаления Липида А включает, в качестве примера, тепловую обработку с добавлением кислоты. Типичный процесс включает обработку 1% уксусной кислотой при 100°С в течение 90 минут (Непатентная ссылка 1). Этот процесс комбинируют с процессом выделения Липида А после удаления. Типичный процесс выделения Липида А включает ультрацентрифугирование (Непатентная ссылка 1).
(6) Стадия измерения
Типичный процесс измерения липополисахарида можно проводить, как описано ниже. Раствор вышеупомянутых структур, разведенных дистиллированной водой, и образец для сравнения набора CSE-L (E. coli O113: эндотоксин, полученный из Н10) добавляют на микропланшет. Добавляют LAL реагент набора Endospecy ES-50M (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION). Планшет накрывают для реагирования при 37°С в течение 30 минут. Добавляют смесь нитрита натрия/соляной кислоты, раствора сульфамата аммония и смесь N-(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлорида/N-метил-2-пирролидона в наборе Toxicolor System (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION) и микропланшет хорошо встряхивают. Абсорбцию измеряют на двух длинах волны 545 нм и 630 нм (Molecular Devices Japan, VersaMax) для определения эндотоксина.
(7) Стадия эмульгирования
Стадия эмульгирования представляет собой процесс смешивания вместе раствора, содержащего вышеупомянутую структуру, масла и эмульгирующего средства. Эмульгирующее средство включает Tween 80 (зарегистрированный товарный знак), Tween 60 (зарегистрированный товарный знак), Brij 721 (зарегистрированный товарный знак), Eumulgin B2 (зарегистрированный товарный знак), Arlacel 165 FL (зарегистрированный товарный знак), Tefose 1500 (зарегистрированный товарный знак), Glucamate SSE20 (зарегистрированный товарный знак), Surfhope C-1216 (зарегистрированный товарный знак), Surfhope C-1811 (зарегистрированный товарный знак), Surfhope SE Pharma D-1816 (зарегистрированный товарный знак), Surfhope SE Pharma D-1616 (зарегистрированный товарный знак), Span 60 (зарегистрированный товарный знак), Olepal isostearique (зарегистрированный товарный знак), Glucate SS (зарегистрированный товарный знак) и Surfhope C-1205 (зарегистрированный товарный знак), предпочтительно сорбитанмоноолеат. Масло включает растительное масло, синтетическое масло и кремниевое масло, предпочтительно легкий жидкий парафин.
(8) Стадия изготовления
Стадия изготовления представляет собой в случае поливалентной вакцины процесс смешивания композиций, включающих соответствующие вышеупомянутые структуры, полученные от специфических микробных клеток, как получено в описанных выше стадиях. Для примера. В случае трехвалентной вакцины, включающей в качестве активного ингредиента вышеупомянутые структуры, полученные от Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis и Salmonella Enteritidis, смешивают вместе композицию, включающую вышеупомянутую структуру, полученную от Salmonella Typhimurium, композицию, включающую вышеупомянутую структуру, полученную от Salmonella Infantis и композицию, включающую структуру, полученную от Salmonella Enteritidis.
Полученную вакцину можно применять по отдельности как сальмонеллезную вакцину для птиц или применять как смешанную вакцину в комбинации с по меньшей мере одной вакциной, выбираемой из группы, состоящей из вакцин против вирусов (например, вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционного бурсита, вируса птичьего энцефаломиелита, вируса синдрома сниженной несучести, вируса ньюкаслской болезни, птичьего реовируса, вируса птичьего гриппа, вируса болезни Марека, вируса инфекционного ларинготрахеита, птичьего пневмовируса и вируса оспы кур), бактерий (например, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium septicum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni и Campylobacter fetus) и простейших (например, Leucocytozoon caulleryi, Eimeria tenella, Eimeria maxima и Eimeria necatrix).
В случае поливалентной вакцины и смешанной вакцины соотношение соответствующих композиций, включающих вышеупомянутую структуру (EU соотношение), может быть как равным, так и отличным соотношением, или соотношение специфической композиции может быть сниженным или повышенным.
Настоящее изобретение объясняется в больших деталях при помощи следующих Примеров, но ими не ограничивается.
Пример 1
(1) Приготовление антигена
1) Стадия культивирования
8
9
На каждые 50 мл LB среды (включающей хлорид натрия 10 г, Bact Tryptone 10 г, Bact Yeast Extract 5 г в 1000 мл культуральной среды) культивируют Salmonella Enteritidis (здесь и далее называемая «SE»), Salmonella Infantis (здесь и далее называемая «SI») и Salmonella Typhimurium (здесь и далее называемая «ST») (37°C, 16-24 часа, 4×10-4×10 КОЕ/мл).
2) Стадия инактивации
Формалин добавляют в соответствующую культуру в виде 0,4% формалина для обработки при 37°С в течение 16 часов для инактивации клеток.
3) Стадия высвобождения
Инактивированные клетки подвергаются разрушению ультразвуком или обработке фенолом для высвобождения липополисахарида.
Разрушение ультразвуком (Branson, Sonifier 350) клеток проводится в ледяной воде в течение 15 минут. Далее проводят центрифугирование (TOMY SEIKO Co, Ltd., 10000 Х г, 15 минут) и надосадочную жидкость используют в стадии сбора.
Обработку фенолом клеток проводят путем смешивания 20 мл раствора клеток после инактивации формалином и эквивалентного объема раствора насыщенного фенола и нагревания смеси при 68°С в течение 15 минут при помешивании каждые 3 минуты. Далее после подведения смеси к стандартным 4°С в течение 1 дня проводят центрифугирование (TOMY SEIKO Co, Ltd., 10000 Х г, 15 минут). Для дополнительного удаления примесей центрифугируют надосадочную жидкость (TOMY SEIKO Co, Ltd., 10000 Х г, 15 минут). Далее надосадочную жидкость диализируют при помощи PBS в течение 3 дней и применяют в стадии сбора.
4) Стадия сбора
Каждые 30 мл надосадочной жидкости добавляют к ET-clean L-колонке (Chisso Corporation, каталог № 20015). После промывание колонки фосфатным буфером, содержащим 0,15 моль NaCl (NaCl 8,76 г в 1000 мл раствора), липополисахарид вымывается фосфатным буфером, содержащим 2 моль NaCl (NaCl 117,54 г в 1000 мл раствора).
(2) Определение эндотоксина
Раствор соответствующих антигенов, разведенных дистиллированной водой, и образец для сравнения набора CSE-L (E. coli O113: эндотоксин, полученный из Н10), добавляют на микропланшет. Добавляют LAL реагент набора Endospecy ES-50M (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION). Планшет накрывают для реагирования при 37°С в течение 30 минут. Добавляют смесь нитрита натрия/соляной кислоты, раствора сульфамата аммония и смесь N-(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлорида/N-метил-2-пирролидона в наборе Toxicolor System DIA (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION) и микропланшет хорошо встряхивают. Абсорбцию измеряют на двух длинах волны 545 нм и 630 нм (Molecular Devices Japan, VersaMax) для определения единиц эндотоксина.
(3) Стадия эмульгирования и стадия приготовления
Каждые 3,6 мл раствора антигена смешивают и эмульгируют с 14,4 мл масляного адъюванта (смеси легкого жидкого парафина, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80). Эквивалентное количество соответствующих вакцин смешивают вместе для приготовления вакцины от Salmonella, включающей три типа липополисахаридов (трехвалентная ЛПС вакцина). Для указанной вакцины изготавливают вакцину, включающую каждые 54000 EU/мл, вакцину, включающую каждые 5400 EU/мл и вакцину, включающую каждые 540 EU/мл липополисахарида, полученного от SE, ST или SI.
(4) Иммунизационный тест
9
9
9
Каждые 0,5 мл соответствующих вакцин вводят SPF цыплятам в возрасте 5 недель в мышцы нижней части бедра. В качестве контроля применяют трехвалентную смешанную цельноклеточную вакцины, включающую инактивированные цельные клетки SE, ST и SI. Трехвалентную смешанную цельноклеточную вакцину изготавливают путем культивирования соответствующих клеток, инактивации клеток, разведения клеток при помощи PBS при 54000 ЕU/мл липополисахарида и смешивания и эмульгирования инактивированных клеток при помощи масляного адъюванта. Также предоставляется группа, которой вакцина не вводится. Область введения находится под наблюдением в течение 10 недель после введения, и оценивается безопасность. Через 4 недели после иммунизации цыплятам перорально вводится Salmonella SE (9,1×10 КОЕ/цыпленок), SI (2,3×10 КОЕ/цыпленок) или ST (1,2×10 КОЕ/цыпленок) для оценки эффективности. Для оценки эффективности на 1, 4, 7, 10 и 14 сутки после введения собирают кал и измеряют число разрушенных клеток в фекалиях при помощи метода, описанного ниже.
(5) Измерение числа клеток
Собранный кал разводят HTT средой при 20% эмульсии, и 50 мкл эмульсии применяют на чашку с DHL агаром для культивирования (37°С, 16-24 часа). На следующий день число выросших колоний подсчитывают для измерения числа клеток в выделениях из прямой кишки (КОЕ/г). Для тех образцов, которые не дали колоний после этого прямого культивирования, предоставляются обогащенные культуры в течение 1 дня, и число клеток определяется путем наличия колоний (те образцы, которые дали колонии после этого культивирования, имели число клеток 50 КОЕ/г). Для тех образцов, которые не дали колоний после обогащенной культуры в течение 1 дня, проводится отсроченное вторичное культивирование и число клеток определяется путем наличия колоний (те образцы, которые дали колонии после этого культивирования, имели число клеток 10 КОЕ/г, а те образцы, которые не дали колонии после этого культивирования, имели число клеток 0 КОЕ/г).
(6) Метод оценки отека ног
За областью введения наблюдают в течение 10 недель и оценивают безопасность по шкале отека ног. По шкале отека: 1 Балл соответствует легкому отеку (отек ограниченной области нижней части бедра) в области введения, 2 балла соответствуют умеренному отеку (отек всей нижней части бедра) и 3 балла соответствуют выраженному отеку (в дополнение к отеку всей нижней части бедра прибавляется пальпаторные признаки водянки). Баллы определяются визуально и пальпаторно.
(7) Результаты
Результаты наблюдения отека ног показаны на Фиг. 1. Результаты, полученные после введения ST, показаны на Фиг. 2. Результаты, полученные после провокации с SE, показаны на Фиг. 3. Результаты, полученные после провокации с SI, показаны на Фиг. 4. Как показано на Фиг. 1, уменьшение отека ног доказано для трехвалентной ЛПС-вакцины по сравнению с трехвалентной смешанной цельноклеточной вакциной. Отек ног дополнительно регрессировал для трехвалентной ЛПС-вакцины, в которой дополнительно удалены такие примеси, как протеины при помощи стадии выделения фенолом. С оглядкой на эффективность, разрушение клеток значительно снижается во всех провокационных тестах на введение ST, SE и SI для группы введения трехвалентной ЛПС-вакцины с выделением фенола для доказательства того, что структура, содержащая О-антиген (в частности, липополисахарид), является полезной в качестве антигена для вакцины от Salmonella.
Пример 2
(1) Приготовление антигена
8,4
6,4
6,4
7,4
6,7
50
50
50
50
50
Вакцину, приготовленную в Примере 1, включающую каждые 54000 EU/мл липополисахаридов, полученных от SE, ST или SI, смешивают с OILVAX 7 (зарегистрированный товарный знак; The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute; включает Nerima штамм вируса инфекционного бронхита, TM штамм, Mycoplasma gallisepticum, вирус синдрома сниженной несучести и инфекционный ринит А и С (рекомбинантный антиген)). Полученная смесь является 10-валентной смешанной ЛПС-вакциной, включающей каждый 7200 EU/мл липополисахаридов, полученных от SE, ST или SI, 10EID/мл, или более вируса ньюкасловской болезни, 10EID/мл, или более штамма Nerima вируса инфекционного бронхита, 10 EID/мл, или более TM штамма, 10 EID/мл, или более Mycoplasma gallisepticum, 10 EID/мл, или более вируса синдрома сниженной несучести и 2,4 мкг/мл, или более инфекционного ринита А и С (рекомбинантный антиген).
(2) Иммунизационный тест
9
9
9
Каждые 0,5 мл 10-валентной смешанной ЛПС-вакцины, приготовленной выше, вводят SPF цыплятам в возрасте 5 недель в мышцы нижней части бедра. В качестве контроля предоставляют группу введения OILVAX 7 или трехвалентной ЛПС-вакцины (каждая 5400 EU/мл липополисахарида от SE, ST и SI) и группу, которой вакцина не вводится. За отеком ног наблюдают в течение 10 недель после введения для оценки безопасности. Через четыре недели после иммунизации цыплятам перорально вводится Salmonella SE (9,1×10 КОЕ/цыпленок), SI (2,3×10 КОЕ/цыпленок) или ST (2,3×10 КОЕ/цыпленок) для оценки эффективности. Для оценки эффективности на 1, 4, 7, 10 и 14 сутки после введения собирают кал и измеряют число разрушенных клеток в фекалиях при помощи метода измерения числа клеток, описанного в Примере 1. Размер отека оценивают, как описано в Примере 1.
(3) Результаты
Результаты наблюдения за отеком ног показаны на Фиг. 1. Результаты, полученные после провокации с SE, показаны на Фиг. 5. Результаты, полученные после провокации с SI, показаны на Фиг. 6. Как показано на Фиг. 1, уменьшение отека ног доказано для 10-валентной смешанной ЛПС вакцины, когда липополисахарид дополнительно очищают путем добавления стадии выделения фенолом. В результате наблюдения за местом введения в течение 10 недель после иммунизации, не наблюдается проблемный отек данной области, вызывающий дисстазию (3 балла), у 10-валентной смешанной ЛПС-вакцины, включающей липополисахарид, не обработанный фенолом, для подтверждения безопасности 10-валентной смешанной ЛПС-вакцины. С оглядкой на эффективность, снижение разрушения клеток, эквивалентное трехвалентной ЛПС-вакцине, наблюдается в провокационных тестах с SE или с SI для подтверждения эффективности 10-валентной смешанной ЛПС-вакцины.
УСЛОВИЕ ПАТЕНТОСПОСОБНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вакцина, включающая в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген (например, липополисахарид), полученный от грамотрицательных бактерий, позволяет снизить побочные эффекты в области введения. Кроме того, путем смешивания вышеупомянутых структур, полученных из множества грамотрицательных бактерий, становится возможно производить поливалентную вакцину и смешанную вакцину без увеличения количества для инъекции.