КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОАРТРИТА
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к композициям и способам для лечения патологических состояний суставов в животном, где это патологическое состояние сустава вовлекает мышечно-скелетные суставы животного. В частности, это изобретение относится к лечению патологических состояний мышечно-скелетных суставов, включающих остеоартрит, ревматоидный артрит и локальное воспаление суставов, и облегчению симптомов, ассоциированных с такими патологическими состояниями мышечно-скелетных суставов. Эта заявка включает также модулирование генов, дифференциально экспрессируемых в животных, например, генов, дифференциально экспрессируемых в артритных животных, в сравнении с неартритными животными, введением композиции согласно данному изобретению. Данное изобретение относится также к идентификации новых биомаркеров в домашних животных, в том числе собаках и кошках, диагностическим способам, композициям и наборам, относящимся к ним.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В научном сообществе обычно признается, что гены играют роль в развитии животных и что регуляция экспрессии генов играет ключевую роль в развитии некоторых заболеваний или состояний, которые влияют на здоровье и самочувствие животного. Подобным образом, дифференциальная экспрессия генов является одним фактором в развитии таких заболеваний и состояний, и оценивание типов экспрессии генов стало широко признанным в качестве решающего для понимания развития и контроля таких заболеваний и состояний на молекулярном уровне. Для продвижения вперед понимания генов и их связи с заболеванием был разработан ряд способов для исследования дифференциальной экспрессии генов, например, микроматрицы ДНК, секвенирование экспрессируемых маркерных последовательностей (EST), серийный анализ генной экспрессии (SAGE), субтрактивная (вычитательная) гибридизация, субтрактивное клонирование и дифференциальный дисплей (DD) для мРНК, РНК-случайно праймированная ПЦР (RAP-PCR), Репрезентативный Анализ Различия (RDA), двухмерный гель-электрофорез, масс-спектрометрия и связывание антител с белками на основе микроматриц белков.
Фактически все суставы в теле млекопитающего имеют хрящ. Хрящ является поддерживающей структурой тела и состоит из толстых пучков фибриллярного белка (коллагена), которые сотканы для образования поверхности сустава. Протеогликаны заполняют внеклеточные пространства, не занятые коллагеном. Такие протеогликаны состоят из комбинации белка и сахара. Каждая субъединица протеогликана содержит белковый кор (белковую сердцевину), состоящий из длинных цепей модифицированных сахаров, известных как гликозаминогликаны (GAG). Глюкозамин является единственным наиболее важным компонентом и предшественником GAG. Синтез коллагена телом зависит от синтеза GAG. Хондроциты в хряще используют глюкозамин для продуцирования N-ацетилглюкозамина (NAG) и глюкуроновой кислоты, которые используются организмом для образования гиалурона. Гиалурон придает скользящее свойство суставу в теле животного.
Хрящ является важным в теле животных для обеспечения гибкости, сжимаемости под давлением, смягчения, прочности на разрыв, диапазона движения и гладкости движения в суставах. Примеры суставов, имеющих хрящ, включают пальцы рук и пальцы ног, шею, колено, бедро, плечо и т.п. Животные могут страдать от ряда состояний, в которых хрящ деградируется, вызывая посредством этого уменьшение гибкости, сжимаемости и часто приводя к генерализованному воспалению сустава и/или ткани, окружающей этот сустав, и в некоторых случаях развитию таких состояний, как остеоартрит и ревматоидный артрит. Затем такие животные имеют существенную потерю функции сустава и испытывают боль.
Артрит является мышечно-скелетным нарушением. Остеоартрит является наиболее обычным типом артрита у животных и людей. Остеоартрит является дегенеративным заболеванием суставов, обычно встречающимся в людях и домашних животных, и это заболевание характеризуется дегенеративными изменениями в суставном хряще, с потерей протеогликана и коллагена и пролиферации новообразования кости в суставных краях. Эти изменения сопровождаются вариабельной воспалительной реакцией в синовиальной мембране. Главным дефектом в гиалиновом хряще в поверхности сустава является изменение в соотношении содержания гликозаминогликанов и коллагенового волокна матрикса. Кости, лежащие непосредственно под хрящом в суставах, называют субхондральными костями. Эти субхондральные кости питают покрывающий их хрящ, который сам лишен кровеносных сосудов, нервов или лимфатической ткани.
С возрастом происходит естественная эрозия хряща, но она может происходить также из избыточных нагрузок, налагаемых на суставы, ожирения, наследственности, травмы, уменьшенного кровообращения, неправильного совмещения костей, и повторяющийся стресс может обострять состояние сустава. Постулируется, что повреждение свободными радикалами может способствовать развитию остеоартрита.
Клетки гиалинового хряща, известные как хондроциты, продуцируют и поддерживают внеклеточный матрикс. Поддержание гомеостаза хрящевого матрикса зависит от катаболизма белков матрикса, таких как коллаген типа II и аггрекан. Эти белки расщепляются и заменяются новыми белками, синтезируемыми хондроцитами. Катаболизм частично проводится протеолитическими ферментами, такими как белки матриксная металлопротеиназа (MMP) и аггреканаза. В нормальном животном достигается баланс между синтезом и деградацией, поддерживающий посредством этого здоровый хрящ. При смещении этого баланса к деградации происходит патогенез, и он может приводить к воспалению сустава и остеоартриту.
Гомеостатическое состояние в хряще зависит от регуляции посредством межклеточной передачи сигнала между хондроцитами. Таким образом, хондроциты продуцируют молекулы передачи сигнала и отвечают на молекулы передачи сигнала. Такие передающие сигнал молекулы могут содержать цитокины и факторы роста, которые могут непосредственно влиять на клеточный метаболизм. Межклеточная передача сигнала является комплексной и не охарактеризована полностью. Молекулы факторов роста, такие как TGF-бета, участвуют в продуцировании и, как считается, стимулируют продуцирование коллагена типа II и ингибируют расщепление коллагена. Цитокины, такие как TNF-альфа и IL-1-бета, также играют роль. Считается, что эти цитокины стимулируют продуцирование протеаз, которые могут деградировать хрящ. Считается, что многочисленные другие комплексные взаимодействия происходят как результат межклеточной передачи сигналом.
Вследствие комплексности процесса межклеточной передачи сигналов, в высокой степени желательно понять на генетическом уровне взаимодействия, которые имеют место. Детектирование генов с нарушенной регуляцией в пре-артритном или артритном состоянии способствует пониманию биологии патологических мышечно-скелетных нарушений суставов, в частности, на основе всего генома. Более подробное понимание участвующих биологических путей через анализ экспрессии генов будет способствовать развитию полезных фармацевтических, нутрицевтических и питательных (диетических) вмешательств в эти патологические пути. Эти подходы могут сделать возможными предупреждение, раннее детектирование и лечение лежащих в основе патологических состояний мышечно-скелетных суставов, а также мониторинг прогноза таких патологических нарушений мышечно-скелетных суставов, особенно в остеоартрите. Гены с нарушенной регуляцией, участвующие в патологии таких нарушений, могут служить в качестве важных биомаркеров для оптимизации выбора подходящих фармацевтических, нутрицевтических и питательных (диетических) вмешательств.
Все еще необходимой является идентификация лекарственного средства, которое обращает ход остеоартрита. Существующие доступные терапевтические агенты используются для уменьшения воспаления и/или облегчения боли. Существующая терапия использует класс лекарственных средств, известных как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), для лечения нарушений мышечно-скелетных суставов, таких как остеоартрит, но эти терапии имеют различные недостатки, в том числе, в частности, желудочно-кишечные нарушения, и они могут также ингибировать образование хряща.
У больших собак может развиваться артрит по мере старения. Породы больших собак являются более чувствительными к артриту вследствие их увеличенной массы и/или генетической предрасположенности. Большие собаки не являются единственными животными, имеющими риск артрита и других состояний хряща. Артрит и другие дегенеративные заболевания суставов обычно наблюдаются в собаках, и было показано, что такие состояния преобладают у кошек. Животные при риске развития поражающих хрящ патологических мышечно-скелетных нарушений суставов включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих, таких как виды собак, кошек, лошадей, коз, овец, свиней, коров, человек и виды приматов, не являющиеся человеком, и птицы, в том числе индейки и куры.
Диета играет важную роль в этиологии и прогрессировании заболевания, так как она фундаментальным образом участвует в метаболизме. Регулируемые заболеванием гены на некотором уровне регулируются пищевыми факторами. Таким образом, компоненты рациона, присутствующие в продуктах в качестве нутриентов, могут регулировать экспрессию генов на транскрипционном и трансляционном уровне, а также в некоторых посттрансляционных модификациях. Подобным образом, они могут участвовать в деградации и ферментативных активностях. Уровни нутриентов могут влиять на равновесие метаболических путей. Метаболические пути часто являются комплексными и могут включать многие избыточности и взаимосвязи среди различных метаболических путей. Изменение концентрации единственного фермента, фактора роста, цитокина или метаболита может действовать на ряд метаболических путей, участвующих в связанной с заболеванием физиологии. Хорошо известно, что гормоны и другие молекулы передачи сигнала регулируются рационом, а также, как известно, участвуют в развитии и прогрессировании заболевания.
Один и тот же фенотип заболевания может происходить из нарушений в различных метаболических путях, и организация генетического материала каждого животного является различной, вызывая тем самым вариацию в реакциях на одни и те же факторы, в том числе пищевые факторы и факторы окружающей среды. Взаимодействие генетических, пищевых факторов и факторов окружающей среды является важным в понимании этиологии, предупреждения, лечения и прогрессирования заболеваний в животных. Нахождение реакций экспрессии генов на нутриенты, ассоциированных с различными заболеваниями и нарушениями, делает возможным приготовление рационов для животных, чувствительных к заболеванию, например, патологическим мышечно-скелетным нарушениям суставов, и, кроме того, делает возможными диагностику, лечение и мониторинг прогноза лежащего в основе заболевания.
Пищевые компоненты влияют на экспрессию генов, в том числе продуцирование мРНК (транскрипцию), процессинг мРНК, продуцирование белка (трансляцию) и посттрансляционные модификации, влияя тем самым на общий метаболический статус животного. В результате, применение биомаркеров для раннего обнаружения и мониторинга прогрессирования заболевания и/или рационов на основе генотипа может позволить предупреждение или лечение заболеваний, а также развитие новых терапий для животных, в частности, домашних животных. Рацион является доказуемо наиболее важным фактором окружающей среды, действующим на фенотип животного, в том числе на чувствительность к заболеванию.
Экспрессия генов может регулироваться через нестабильные процессы, которые контролируются регуляторами и репрессорами функции генов. Состояние питания может вызывать значительные изменения в скоростях транскрипции генов. Макронутриенты, такие как глюкоза, жирные кислоты и аминокислоты, и микронутриенты, такие как железо, цинк и витамины, могут регулировать экспрессию генов. Различные биоактивные компоненты пищи, такие как каротиноиды, флавоноиды, монотерпены и феноловые кислоты, могут действовать в качестве факторов транскрипции, влияющих на экспрессию генов. Эти вещества имеют тенденцию влиять непосредственно на экспрессию генов. В других ситуациях такие вещества, как диетическая клетчатка, которая ферментируется в кишечнике бактериями, могут приводить к продуцированию нутриентов, таких как жирные кислоты с короткими цепями. Такие вещества могут действовать в качестве непрямых активаторов или репрессоров экспрессии генов.
Идентификация нутриентсвязанных изменений после транскрипции и трансляции может быть детектирована в экспериментах типа, описанного в этом описании. Ввиду экстенсивного ряда генов, анализируемых в примерах этого описания, изменения в экспрессии генов и количественное определение легко детектируются способами, описанными в этом описании. Так, диетические и метаболические сигнатуры (отличительные признаки) экспрессии генов могут быть легко получены с использованием способов, описанных в примерах этого описания изобретения. Биомаркеры согласно данному изобретению являются белками и/или нуклеиновыми кислотами, которые дифференциально (по-разному) экспрессируются в животных. Экспрессия биомаркера может оцениваться на уровне белка или на уровне нуклеиновых кислот с использованием различных способов, известных квалифицированному в данной области специалисту.
До настоящего времени проводилось только очень ограниченное исследование в скрининге геномов семейств собачьих и кошачьих в отношении профилей экспрессии генов в ответ на пищевые компоненты в рационе этих домашних животных. Исследование проводили в области рака с использованием микроматрицы генов семейства собачьих для CG-анализа опухолей. Thomas R. et al. A canine cancer gene microarray for CGH analysis tumors, Cyrogenet. Genome Res., 2003; 102:254-260. Further works has been done in the area of dilated cardiomyopathy. Oyayma, M.A. et al., Genomic expression patterns of cardiac tissue from dogs with dilated cardiomyopathy, Am. J. Vet. Res. 2005; 66:1140-1155. До настоящего времени исследование генома семейства собачьих относительно остеоартрита было очень ограниченным. В одном исследовании было обнаружено, что ген MIG-6 был повышенным в собаках в группе высокого риска остеоартрита, и была высказана гипотеза, что этот ген может участвовать в деградации хряща и в продуцировании хряща в собаках. Mateescu, R.G. et al., Increased MIG-6 mRNA transcipts in osteoarthritic cartilage. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005; 332:482-486.
Исследования на здоровых популяциях животных против популяций, имеющих заболевание, такое как патологические мышечно-скелетные нарушения суставов, описанные в этом описании изобретения, не проводились экстенсивно. Небольшое количество данных доступно в отношении генома семейства собачьих и гораздо меньше данных в отношении генома семейства кошачьих. Данные по экспрессии генов, содержащиеся в этом описании изобретения, идентифицируют гены, ассоциированные с деградацией хряща в собаках и кошках. Такие данные по экспрессии генов позволяют идентифицировать пищевые композиции, способные модулировать экспрессию таких генов благоприятным образом. Это относится также к генам, обычно ассоциируемым с воспалением. Аналогичные данные для кошачьих представлены дополнительно в этом описании, фигурах и примерах данного описания.
Данные по экспрессии генов, содержащиеся в данном описании и в данных примерах, делают возможными различные желаемые изобретения на основе профилей экспрессии генов, описанных здесь. Эти данные делают возможными идентификацию и количественное определение продуктов экспрессии генов в качестве биомаркеров питания, а также предотвращение заболевания, идентификацию и лечение лежащего в основе патологического состояния мышечно-скелетного сустава. Данные по экспрессии генов, полученные как результат применения на практике способов согласно данному изобретению, также позволяют выполнять мониторинг прогрессирования таких патологических нарушений мышечно-скелетных суставов. Эти изобретения дополнительно включают генетическое тестирование для идентификации чувствительных субпопуляций животных, которые имеют вероятность поражения такими патологическими нарушениями мышечно-скелетных суставов, для идентификации оптимальных диет (рационов) для предупреждения или лечения таких нарушений, для идентификации фармацевтических, нутрицевтических и пищевых (диетических) вмешательств на основе открытий, представленных в данном описании, для лечения лежащих в основе заболеваний и воспаления. Эти изобретения включают также биомаркеры для раннего обнаружения заболевания, нацеленные лекарственные средства, диагностические реагенты и наборы для анализа образцов ткани и крови из животных, чувствительные к таким патологическим нарушениям мышечно-скелетных суставов или имеющих такие патологические нарушения мышечно-скелетных суставов.
В создании кормовых продуктов для животных, например, домашних животных, таких как кошки и собаки, важной задачей является оптимальное здоровье или самочувствие, достигаемые при помощи хорошего питания. Однако даже наиболее питательный корм для животного имеет низкую ценность, если животное отвергает или отказывается есть этот корм, или если прием животным этого корма является ограниченным вследствие того, что животное находит более вкусным другой корм. Таким образом, изобретения, представленные в этом описании, дополнительно содержат пищевые композиции, способные улучшать здоровье и самочувствие животных, чувствительных к таким патологическим мышечно-скелетным нарушениям суставов или имеющих такие патологические мышечно-скелетные нарушения суставов. Таким образом, это изобретение включает годные в пищу пищевые композиции для домашних животных, которые имеют терапевтическую и профилактическую эффективность и обладают улучшенным вкусом относительно продаваемых в настоящее время на рынке кормовых продуктов для домашних животных.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Это изобретение относится к композициям, содержащим по меньшей мере одну омега-3 жирную кислоту, по меньшей мере один гликозаминогликан, по меньшей мере один аминосахар, по меньшей мере один антиоксидант, и карнитин или ацетилкарнитин. Это изобретение включает, но не ограничиваются ими, пищевые композиции, диетические добавки, нутрицевтики и лакомства для введения животным, в частности, домашним животным.
Это изобретение относится также к способам лечения животных, имеющих патологическое мышечно-скелетное состояние сустава, предусматривающим введение этому субъекту по меньшей мере одной из композиций согласно данному изобретению.
Это изобретение дополнительно относится к способам задержки возникновения в животном или уменьшения боли у животного, имеющего патологическое мышечно-скелетное состояние сустава, предусматривающим введение этому субъекту по меньшей мере одной из композиций по данному изобретению.
В одном варианте осуществления это изобретение включает композицию корма для домашних животных, представляющих собой собак, содержащую по меньшей мере одну омега-3 жирную кислоту, по меньшей мере один гликозаминогликан, по меньшей мере один аминосахар, по меньшей мере один антиоксидант, и карнитин или ацетилкарнитин.
В другом варианте осуществления это изобретение включает композицию корма для домашних животных, представляющих собой кошек, содержащую по меньшей мере одну омега-3 жирную кислоту, по меньшей мере один гликозаминогликан, по меньшей мере один аминосахар, по меньшей мере один антиоксидант, и карнитин или ацетилкарнитин.
Другой вариант осуществления включает способ лечения или предупреждения патологического мышечно-скелетного состояния сустава в животном, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Еще один вариант осуществления включает способ лечения или предупреждения патологического мышечно-скелетного состояния сустава, выбранного из группы, состоящей из остеоартрита, ревматоидного артрита и локального воспаления сустава, в животном, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Еще один вариант осуществления данного изобретения включает способ лечения или предупреждения патологического мышечно-скелетного состояния сустава, выбранного из группы, состоящей из остеоартрита, ревматоидного артрита и локального воспаления сустава, в домашнем животном, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления данного изобретения включает способ лечения или предупреждения патологического мышечно-скелетного состояния сустава, выбранного из группы, состоящей из остеоартрита, ревматоидного артрита и локального воспаления сустава, в представителе семейства собачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления данного изобретения включает способ лечения или предупреждения патологического мышечно-скелетного состояния сустава, выбранного из группы, состоящей из остеоартрита, ревматоидного артрита и локального воспаления сустава, в представителе семейства кошачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления данного изобретения включает способ лечения или предупреждения остеоартрита в представителе семейства собачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления данного изобретения включает способ лечения или предупреждения остеоартрита в представителе семейства кошачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления данного изобретения включает способ лечения или предупреждения ревматоидного артрита в представителе семейства собачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления данного изобретения включает способ лечения или предупреждения ревматоидного артрита в представителе семейства кошачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления изобретения включает способ лечения или предупреждения воспаления сустава в представителе семейства собачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления изобретения включает способ лечения или предупреждения воспаления сустава в представителе семейства кошачьих, нуждающемся в этом, композицией согласно данному изобретению.
Другой вариант осуществления изобретения включает один или несколько генов или сегментов генов, которые дифференциально экспрессируются в животных, имеющих патологическое нарушение мышечно-скелетного сустава, которое может включать остеоартрит, ревматоидный артрит или локальное воспаление сустава, в сравнении с животными, не имеющими такого патологического мышечно-скелетного нарушения сустава.
Другой вариант осуществления изобретения включает комбинации двух или более полинуклеотидов или полипептидов, которые дифференциально экспрессируются в животных, имеющих патологическое мышечно-скелетное нарушение сустава, которое может включать остеоартрит, ревматоидный артрит или локальное воспаление сустава, в сравнении с животными, не имеющими такого патологического нарушения мышечно-скелетного сустава.
Другой вариант осуществления изобретения включает композиции двух или более полинуклеотидных или полипептидных зондов, подходящих для детектирования экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в животных, имеющих патологическое мышечно-скелетное нарушение сустава, которое может включать, например, остеоартрит, ревматоидный артрит или локальное воспаление сустава, в сравнении с животными, не имеющими такого патологического нарушения мышечно-скелетного сустава.
Другой вариант осуществления изобретения включает способы и композиции для детектирования дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в животных, имеющих патологическое нарушение мышечно-скелетного сустава, которое может включать, например, остеоартрит, ревматоидный артрит или локальное воспаление сустава, в сравнении с животными, не имеющими такого патологического нарушения мышечно-скелетного сустава.
Другой вариант осуществления изобретения включает способы измерения действия тест-вещества на профиль экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в животных, имеющих патологическое нарушение мышечно-скелетного сустава, которое может включать, например, остеоартрит, ревматоидный артрит или локальное воспаление сустава, в сравнении с животными, не имеющими такого патологического нарушения мышечно-скелетного сустава, в качестве способа для скрининга тест-вещества для определения, имеется ли вероятность его использования для модуляции такого нарушения в таком животном.
Другой вариант осуществления изобретения включает способы формулирования прогноза, что животное имеет вероятность развития патологического мышечно-скелетного нарушения сустава, которое может включать, например, остеоартрит, ревматоидный артрит или локальное воспаление сустава, или в развитии диагноза, что животное имеет такое мышечно-скелетное нарушение сустава.
Дополнительным аспектом данного изобретения является то, что оно относится к идентификации новых биомаркеров патологических нарушений мышечно-скелетных суставов, в частности, остеоартрита, в животных, в частности, домашних животных, а также к способам детектирования патологических нарушений мышечно-скелетных суставов в таких животных на основе характерного распределения экспрессии генов таких маркеров in vivo. Конкретно, способы по данному изобретению предусматривают детектирование дифференциальной экспрессии, в сравнении с уровнем контрольной экспрессии, по меньшей мере одного биомаркера, в образце, полученном из организма, предпочтительно образце крови, где это детектирование дифференциальной экспрессии такого биомаркера специфически идентифицирует животных, которые имеют патологическое мышечно-скелетное нарушение сустава, в частности, остеоартрит. Таким образом, такие способы основаны на детектировании по меньшей мере одного биомаркера, который дифференциально экспрессируется при патологическом нарушении мышечно-скелетного сустава в сравнении с клетками из нормальных или контрольных животных.
Одним вариантом осуществления изобретения является также модуляция различных биомаркеров представителей семейства собачьих, связанных с патологическим состоянием мышечно-скелетного сустава, в частности, остеоартритом, ревматоидным артритом или состоянием локального воспаления сустава, введением композиции согласно данному изобретению животному, нуждающемуся в этом, в количестве, эффективном для модуляции этого биомаркера. Примеры биомаркеров, связанных с патологическим нарушением мышечно-скелетного сустава, которые могут быть модулированы, включают, но не ограничиваются ими, Аннексин A1, Катепсин D, Катепсин F, Катепсин S, RELA, HMGB1, IL-1β, TNFα, TNFβ, TLR-2, TLR-4, p38 MAPK, TIMP-1, TIMP-2, MMP-1, MMP-2, MMP-13, IL-15 и IL-17-рецептор, COL2A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, MMP-13, TIMP-2, MMP-2, C2C, C1,2C, FLAP, PLA2, MAPK1, MAPK2 и Аггрекан.
Биомаркеры согласно данному изобретению являются белками и/или нуклеиновыми кислотами, которые дифференциально экспрессируются в животном, имеющем патологическое мышечно-скелетное нарушение сустава или имеющем вероятность развития патологического нарушения мышечно-скелетного сустава, в частности, остеоартрита, ревматоидного артрита или локального воспаления сустава.
Здесь дополнительно обсуждается, что способы по данному изобретению могут быть использованы в комбинации с традиционными диагностическими способами, которые способны детектировать физические и морфологические характеристики дегенеративного заболевания мышечно-скелетных суставов. Так, например, характеристика дифференциальной экспрессии в генах биомаркеров остеоартрита в клетках, полученных из образца крови животного, может быть объединена с общепринятыми диагностическими (например, радиологическими) способами для подтверждения диагноза остеоартрита.
В следующем аспекте это изобретение относится к композициям, содержащим один или несколько зондов нуклеиновых кислот, которые специфически гибридизуются с нуклеиновой кислотой, или ее фрагментом, кодирующей биомаркер по данному изобретению.
В дополнительном аспекте это изобретение относится к композициям, содержащим антитела, которые специфически связываются с полипептидом, кодируемым геном, экспрессирующим биомаркер по данному изобретению.
Это изобретение относится также к наборам для диагностики патологического состояния мышечно-скелетного сустава в животном, содержащим компонент, который может быть использован для детектирования экспрессии биомаркеров по данному изобретению, в том числе, но не только, композиции и микроматрицы, описанные здесь.
В другом аспекте обсуждается также, что это изобретение относится к способам идентификации биоактивных диетических (алиментарных) компонентов или других природных соединений (называемых далее "диетическими (алиментарными) компонентами" или "компонентами")), которые могут быть тестированы на их способность лечить или уменьшать интенсивность патологического состояния мышечно-скелетного сустава в животном, предусматривающим: (а) контактирование клетки, способной экспрессировать РНК или белковый продукт одного или нескольких биомаркеров, описанных в таблице 2 и/или таблице 3 (см. в конце описания), с тест-соединением; (b) определение количества указанных РНК и/или продукта, продуцируемых в клетках, контактированных с этим тест-компонентом, и (с) сравнение количества указанных РНК и/или белкового продукта в клетках, контактированных с этим тест-компонентом, с количеством этих РНК или белкового продукта, присутствующим в соответствующей контрольной клетке, которая не была контактирована с этим тест-компонентом; причем, если это количество РНК или белкового продукта является измененным относительно количества в контроле, этот компонент идентифицируется как компонент, подлежащий тестированию на его способность лечить или ослаблять патологическое нарушение мышечно-скелетного сустава, в частности, остеоартрит, ревматоидный артрит или локальное воспалительное состояние сустава.
Следующим аспектом данного изобретения является способ диагностики и/или прогноза остеоартрита в животном, причем этот способ предусматривает стадии: получения по меньшей мере одного образца (пробы) ткани или образца биологической жидкости из этого животного; определения количества одного или нескольких маркеров, выбранных из таблицы 2 и/или таблицы 3, в указанных по меньшей мере одной пробе или одном образце, полученных из этого животного, где указанным биомаркером является полипептид, белок, РНК, ДНК, полинуклеотид или их метаболит. Еще одним вариантом осуществления является такой способ, в котором такие один или несколько биомаркеров выбраны из группы, состоящей из Аннексина A1, Катепсина D, Катепсина F, Катепсина S, RELA, HMGB1, IL-1β, TNFα, TNFβ, TLR-2, TLR-4, p38 MAPK, TIMP-1, TIMP-2, MMP-1, MMP-2, MMP-13, IL-15 и IL-17-рецептора.
Еще одним вариантом осуществления данного изобретения является набор для диагностики и/или прогноза остеоартрита в животном, в частности, для проведения способа диагностики и/или прогноза остеоартрита в животном, предусматривающего стадии: получения по меньшей мере одного образца (пробы) ткани или образца биологической жидкости из этого животного; определения количества одного или нескольких маркеров, выбранных из таблицы 2 и/или таблицы 3, в указанных по меньшей мере одной пробе или одном образце, полученных из этого животного, где указанным биомаркером является полипептид, белок, РНК, ДНК, полинуклеотид или их метаболит, и, необязательно, содержащий дополнительно детектируемый агент, связанный с указанным биомаркером.
Еще одним вариантом осуществления данного изобретения является реагент для диагностики и/или прогноза остеоартрита в животном, в частности, для проведения способа диагностики и/или прогноза остеоартрита в животном, предусматривающего стадии: получения по меньшей мере одного образца (пробы) ткани или образца биологической жидкости из этого животного; определения количества одного или нескольких маркеров, выбранных из таблицы 2 и/или таблицы 3, в указанных по меньшей мере одной пробе или одном образце, полученных из этого животного, где указанным биомаркером является полипептид, белок, РНК, ДНК, полинуклеотид или их метаболит, и, необязательно, содержащий дополнительно детектируемый агент, связанный с указанным биомаркером.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является применение одного или нескольких полипептидов, белков, РНК, ДНК, полинуклеотида или их метаболитов, показанных в таблице 2 и/или таблице 3, в качестве биомаркера для диагностики и/или прогноза патологического мышечно-скелетного нарушения сустава, в частности, для образования набора для диагностики и/или прогноза патологического мышечно-скелетного нарушения суставов. Одним следующим вариантом осуществления является набор, в котором один или несколько биомаркеров выбраны из группы, состоящей из Аннексина A1, Катепсина D, Катепсина F, Катепсина S, RELA, HMGB1, IL-1β, TNFα, TNFβ, TLR-2, TLR-4, p38 MAPK, TIMP-1, TIMP-2, MMP-1, MMP-2, MMP-13, IL-15 и IL-17-рецептора. Еще одним вариантом осуществления является такой набор, в котором реагенты и оборудование включают материалы для анализа микроматриц (микроэрреев) ДНК, в том числе микроматрицы олигонуклеотидов, микроматрицы кДНК и чипа сфокусированных генов, или их комбинации.
Другим вариантом данного изобретения является способ детектирования остеоартрита в животном, предусматривающий получение образца из этого животного, содержащей пробу ткани или образец биологической жидкости; детектирование уровней биомаркера, показанного в таблице 2 и/или таблице 3, который является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом, в этой пробе или в этом образце; и сравнение уровней указанного биомаркера в этой пробе или в этом образце с уровнями указанного биомаркера в контрольной пробе; где экспрессия биомаркера имеет по меньшей мере 1-кратное или большее различие экспрессии генов в сравнении с экспрессией в клетке контрольного животного.
Еще одним вариантом данного изобретения является способ детектирования остеоартрита в животном, предусматривающий контактирование пробы или образца вышеуказанного способа с первым праймером, который содержит полинуклеотидную последовательность, которая гибридизуется селективно с указанным биомаркером, и вторым праймером, содержащим полинуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с указанным биомаркерным полинуклеотидом, выполнение реакции амплификации и определение количества продукта амплификации этого биомаркерного полинуклеотида в этой пробе или в этом образце.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ оценивания эффективности хода лечения или алиментарного лечения у животного, страдающего от остеоартрита, предусматривающий (a) измерение первого уровня биомаркерного полипептида, белка, РНК, ДНК, полинуклеотида или их метаболита, показанных в таблице 2 и/или таблице 3, в пробе ткани или образце биологической жидкости из указанного животного в первой временной точке во время курса лечения, (b) измерение второго уровня указанного биомаркера в указанной пробе или указанном образце из указанного животного во второй временной точке во время курса лечения, и (c) сравнение измерений этого биомаркера в указанной первой точке и указанной второй точке; причем экспрессия этого биомаркера имеет по меньшей мере 1-кратное или большее различие экспрессии генов в сравнении с экспрессией в клетке контрольного животного.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ оценивания прогрессирования хода лечения или алиментарного лечения для животного, страдающего от остеоартрита, предусматривающий (a) измерение первого уровня биомаркерного полипептида, белка, РНК, ДНК, полинуклеотида или их метаболита, показанных в таблице 2 и/или таблице 3, в пробе ткани или образце биологической жидкости из указанного животного в первой временной точке во время курса лечения, (b) измерение второго уровня указанного биомаркера в указанной пробе или указанном образце из указанного животного во второй временной точке во время курса лечения, и (c) сравнение измерений этого биомаркера в указанной первой точке и указанной второй точке; причем экспрессия этого биомаркера имеет по меньшей мере 1-кратное или большее различие экспрессии генов в сравнении с экспрессией в клетке контрольного животного.
Следующим вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации молекулы для диагностики остеоартрита в животном, предусматривающий (1) получение образца (пробы) ткани или образца биологической жидкости из указанного животного, содержащей биомаркер, показанный в таблице 2 и/или таблице 3, который является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом; (2) контактирование этой пробы или этого образца с тест-молекулой; (3) определение, связывается ли эта тест-молекула с указанным биомаркером или связывается ли тест-молекула указанным биомаркером; причем экспрессия этого биомаркера имеет по меньшей мере 1-кратное или большее различие с экспрессией указанного биомаркера контрольного животного.
Следующим вариантом осуществления данного изобретения является способ для скрининга на остеоартрит в животном, предусматривающий стадии: i) получения образца (пробы) ткани или образца биологической жидкости из указанного животного и определения профиля экспрессии генов одного или нескольких биомаркерных полипептидов, белков, РНК, ДНК, полинуклеотидов или метаболитов в этой пробе; и ii) сравнения профиля экспрессии генов указанных одного или нескольких биомаркеров в этой пробе с положительным контролем, содержащим средний уровень экспрессии генов указанных одного или нескольких биомаркеров во множестве ссылочных образцов, которые произведены из животных, обнаруживающих симптомы остеоартрита, для определения дифференциальной экспрессии генов между этой пробой и положительным контролем, причем присутствие остеоартрита указывается, если нет статистически значимой дифференциальной экспрессии генов между профилем экспрессии генов одного или нескольких биомаркеров в этой пробе и положительном контроле, причем эти биомаркеры содержат один или несколько генов таблицы 2 и/или таблицы 3.
Еще одним вариантом осуществления данного изобретения является способ для скрининга на остеоартрит в животном, предусматривающий стадии: i) получения образца (пробы) ткани или образца биологической жидкости из указанного животного и определения профиля экспрессии генов одного или нескольких биомаркерных полипептидов, белков, РНК, ДНК, полинуклеотидов или метаболитов в этой пробе; и ii) сравнения профиля экспрессии генов указанных одного или нескольких биомаркеров в этой пробе с положительным контролем, содержащим средний уровень экспрессии генов указанных одного или нескольких биомаркеров во множестве ссылочных образцов, которые произведены из животных, не обнаруживающих симптомы остеоартрита, для определения дифференциальной экспрессии генов между этой пробой и ссылочной пробой указанных контрольных животных, причем присутствие остеоартрита указывается, если имеется 1-кратная дифференциальная экспрессия между профилем экспрессии генов одного или нескольких биомаркеров в этой пробе и положительном контроле, причем эти биомаркеры содержат один или несколько генов таблицы 2 и/или таблицы 3.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является анализ для скрининга агента на его способность лечить или предотвращать один или несколько симптомов остеоартрита, предусматривающий стадии: i) выделения контрольного образца нуклеиновой кислоты из образца ткани указанного животного, который продуцирует профиль дифференциальной экспрессии генов, репрезентативный для остеоартрита, и определения уровня экспрессии генов в этой контрольной пробе; ii) подвергания этого образца ткани действию указанного агента; iii) выделения тест-образца нуклеиновой кислоты из указанного образца ткани после подвергания указанного образца ткани действию агента стадии (ii) и определения уровня экспрессии генов в этой тест-пробе; iv) сравнения продуцирования, стабильности, деградации и/или активации экспрессии генов между этой тест-пробой и контрольной пробой; причем профиль дифференциальной экспрессии генов между этой тест-пробой в сравнении с контрольной пробой указывает способность этого агента предотвращать или лечить один или несколько симптомов остеоартрита.
Еще одним вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации множества генов, которые дифференциально экспрессируются между образцами тканей, для применения в информативной матрице (эррее), предусматривающий: предоставление первого набора гетерогенных зондов нуклеиновых кислот, полученных из первого образца ткани; предоставление второго набора гетерогенных зондов нуклеиновых кислот, полученных из второго образца ткани; гибридизацию матрицы нуклеиновых кислот, содержащую множество последовательностей, полученных из генов биологического процесса с первым набором зондов, и определение первого уровня экспрессии для последовательностей этой матрицы (эррея); гибридизацию этой матрицы (эррея) со вторым набором зондов и определение второго уровня экспрессии для последовательностей этой матрицы (эррея); идентификацию множества генов, которые дифференциально экспрессируются в указанном биологическом процессе сравнением первого уровня экспрессии с указанным вторым уровнем экспрессии для гибридизованных последовательностей; и установление ранжирования идентифицированных генов посредством стадии, выбранной из группы стадий, состоящих из: определения абсолютной величины различия между первым уровнем экспрессии и вторым уровнем экспрессии, и ранжирования генов, имеющих более высокое различие относительно генов, имеющих более низкое различие; и определения стандартного отклонения различия между первым уровнем экспрессии и вторым уровнем экспрессии, и ранжирования генов, имеющих более высокое стандартное отклонение относительно генов, имеющих более низкое стандартное отклонение, где эти гены включают один или несколько генов таблицы 2 и/или таблицы 3.
Другим вариантом данного изобретения является способ превращения матрицы (эррея) нуклеиновых кислот в информационную матрицу, предусматривающий: предоставление первого набора гетерогенных зондов нуклеиновых кислот, полученных из первого образца ткани; предоставление отличающегося второго набора гетерогенных зондов нуклеиновых кислот, полученных из второго образца ткани; гибридизацию матрицы (эррея) нуклеиновых кислот, содержащей множество последовательностей, с первым набором зондов и определение первого уровня экспрессии для последовательностей этой матрицы; гибридизацию этой матрицы (эррея) с указанным вторым набором зондов и определение второго уровня экспрессии для последовательностей этой матрицы; идентификацию множества генов, которые дифференциально экспрессируются в указанном биологическом процессе, на основе различия между первым уровнем экспрессии и вторым уровнем экспрессии для идентифицированных генов, посредством стадии, выбранной из группы стадий, состоящих из: определения абсолютной величины для различия между первым уровнем экспрессии и вторым уровнем экспрессии, и ранжирования генов, имеющих более высокое стандартное отклонение относительно генов, имеющих более низкое различие; и определения стандартного отклонения этого различия между первым уровнем экспрессии и вторым уровнем экспрессии, и ранжирования генов, имеющих более высокое стандартное отклонение, относительно генов, имеющих более низкое стандартное отклонение; и отбора генов из множества идентифицированных дифференциально экспрессируемых генов для включения в информационную матрицу (эррей), где указанные гены выбраны из генов, перечисленных в таблице 2 и/или таблице 3.
Еще одним вариантом осуществления данного изобретения является осуществляемый компьютером способ для анализа экспрессии генов для скрининга на остеоартрит, предусматривающий стадии: i) компилирования данных, содержащих множество измеряемых сигналом экспрессии генов, полученных из анализа микроматрицы нуклеиновых кислот, выбранной из группы, состоящей из олигонуклеотидной микроматрицы, кДНК-микроматрицы, и анализа чипа сфокусированных генов, или их комбинации, образцов тканей в форму, подходящую для анализа на основе компьютера; и ii) анализа этих компилированных данных, причем этот анализ предусматривает идентификацию сетей генов из ряда повышающим образом регулируемых биомаркерных генов и понижающим образом регулируемых биомаркерных генов, где эти биомаркерные гены являются генами, которые были идентифицированы как ассоциирующиеся с присутствием или тяжестью остеоартрита, причем указанные гены включают гены, перечисленные в таблице 2 и/или таблице 3.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ скрининга in vitro кандидатного лекарственного средства, предусматривающий определение способности этого кандидата модулировать экспрессию выбранного гена или активность продукта экспрессии выбранного гена, где этот выбранный ген или продукт экспрессии гена является биомаркером остеоартрита или продуктом экспрессии гена, выбранного из группы, состоящей из генов или продуктов генов, перечисленных в таблице 2 и/или таблице 3.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ скрининга in vitro питательного пищевого продукта, диетической надбавки, нутрицевтика или лакомства, предусматривающий определение способности этого кандидата модулировать экспрессию выбранного гена или активность выбранного продукта экспрессии, где этот выбранный ген или продукт экспрессии гена является биомаркером остеоартрита или продуктом экспрессии гена, выбранного из группы, состоящей из генов или продуктов генов, перечисленных в таблице 2 и/или таблицы 3.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ скрининга in vitro кандидатного лекарственного средства, предусматривающий a) сбор по меньшей мере двух биологических образцов; где первый образец имитирует остеоартрит и второй образец имитирует здоровое состояние; b) контактирование по меньшей мере одного образца или смеси образцов с одним или несколькими кандидатными лекарственными средствами, подлежащими тестированию; c) измерение уровня экспрессии генов или продукта экспрессии генов или активности генов, перечисленных в таблице 2 и/или таблицы 3, или активности в биологических образцах или смеси, полученных в b); и d) отбор кандидатных лекарственных средств, которые способны модулировать уровень экспрессии генов или продукта экспрессии генов или активности, измеренных в образцах или смеси, полученных в b), и сравнение этих уровней с образцом, не смешанным с кандидатным лекарственным средством.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ скрининга in vitro питательного пищевого продукта, диетической надбавки, нутрицевтика или лакомства, предусматривающий a) сбор по меньшей мере двух биологических образцов; где первый образец имитирует остеоартрит и второй образец имитирует здоровое состояние; b) контактирование по меньшей мере одного образца или смеси образцов с одним или несколькими из питательного пищевого продукта, диетической надбавки, нутрицевтика или лакомства, подлежащих тестированию; c) измерение уровня экспрессии генов или продукта экспрессии генов или активности генов, перечисленных в таблице 2 и/или таблицы 3, или активности в биологических образцах или смеси, полученных в b); и d) отбор питательного пищевого продукта, диетической надбавки, нутрицевтика или лакомства, которые способны модулировать уровень экспрессии генов или продукта экспрессии генов или активности, измеренных в образцах или смеси, полученных в b), и сравнение этих уровней с образцом (пробой), не смешанным с питательным пищевым продуктом, диетической надбавкой, нутрицевтиком или лакомством.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ определения in vitro чувствительности животного к остеоартриту, предусматривающий сравнение уровней экспрессии генов или продукта экспрессии генов или активности биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из генов и продуктов генов, перечисленных в таблице 2 и/или таблице 3.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ приготовления композиции для лечения остеоартрита, предусматривающий приготовление композиции, содержащей модулятор биомаркеров остеоартрита, выбранных из группы, состоящей из генов и продуктов генов, перечисленных в таблице 2 и/или таблице 3.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ определения эффективности лечения остеоартрита, предусматривающий стадии: (a) предоставления биологического образца животного, пораженного остеоартритом, которое было подвергнуто указанному лечению, (b) определения уровня в указанной пробе одного или нескольких биомаркеров остеоартрита для создания профиля экспрессии для указанного животного, и (c) сравнения указанного профиля экспрессии с: i) сравнимым профилем экспрессии, полученным из указанного тест-животного перед началом указанного лечения, и/или ii) сравнимым профилем экспрессии, полученным из указанного тест-животного в более ранней стадии указанного лечения, и/или iii) сравнимым профилем экспрессии, характерным для субъекта, который не поражен остеоартритом, причем эти один или несколько биомаркеров для остеоартрита включают продукты экспрессии одного или нескольких генов, показанных в таблице 2 или таблице 3.
Другим вариантом осуществления данного изобретения является способ отбора пищевой композиции для животного на ее способность лечить или предотвращать один или несколько симптомов остеоартрита, предусматривающий стадии: i) оценивания по меньшей мере одной базы данных, которая содержит первый набор данных, относящихся к профилю экспрессии генов образца ткани или образца биологической жидкости из животного, имеющего остеоартрит; ii) оценивания по меньшей мере одной базы данных, которая содержит второй набор данных, относящихся к действиям биоактивных диетических компонентов на указанный профиль экспрессии генов; и iii) при помощи первого алгоритма использования указанного первого и указанного второго набора данных обработки указанного первого и указанного второго набора данных для получения питательной формулы (смеси), применимой для отбора и приготовления пищевой композиции для указанного животного; и iv) хранение или применение указанной питательной формулы (смеси) в читаемом пользователем формате.
Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества данного изобретения будут вполне очевидными для квалифицированных в данной области специалистов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГУРА 1 изображает уменьшение экспрессии различных генов, ассоциированных с деградацией хряща в собаках, которых кормили по меньшей мере одной композицией согласно данному изобретению, обозначенной как композиция для собак j/d.
ФИГУРА 2 изображает уменьшение экспрессии различных генов, ассоциированных с деградацией хряща в собаках, которых кормили по меньшей мере одной композицией согласно данному изобретению, обозначенной как композиция для собак j/d.
ФИГУРА 3 изображает увеличение экспрессии различных генов, ассоциированных с воспалением, в артритных кошках в сравнении с неартритными кошками.
ФИГУРА 4 изображает один вариант композиций данного изобретения, обозначенной как композиция j/d.
ФИГУРА 5 изображает повышающую регуляцию гена C2C в артритных собаках в сравнении с нормальными собаками.
ФИГУРА 6 изображает повышающую регуляцию гена C1,2C в артритных собаках в сравнении с неартритными собаками.
ФИГУРА 7 изображает некоторые гены, экспрессирующие белки, ассоциированные с артритом, в артритных собаках в сравнении с неартритным хрящом в собаках.
ФИГУРА 8 изображает некоторые гены, экспрессирующие белки, ассоциированные с артритом, в артритных собаках в сравнении с неартритным хрящом в собаках.
ФИГУРА 9 изображает сывороточные уровни EPA и DHA после кормления собак кормовой композицией для собак j/d течение дней 14 и 18, соответственно.
ФИГУРА 10 изображает модуляцию экспрессии гена C2C после кормления собак композицией для собак j/d в течение периода 14 дней.
ФИГУРА 11 изображает модуляцию экспрессии гена C1,2C после кормления собак композицией для собак j/d в течение периода 14 дней.
ФИГУРА 12 изображает модуляцию экспрессии гена CTX-II после кормления собак композицией для собак j/d в течение периода 14 дней.
ФИГУРА 13 изображает повышающую регуляцию гена C2C в артритных кошках в сравнении с неартритными кошками.
ФИГУРА 14 изображает повышающую регуляцию гена CTX-II в артритных кошках в сравнении с неартритными кошками.
ФИГУРА 15 изображает повышающую регуляцию различных генов, ассоциированных с репарацией хряща, в артритных кошках в сравнении с неартритными кошками.
ФИГУРА 16 изображает увеличение мобильности кошек после получения композиции для кошек j/d.
ФИГУРА 17 изображает уменьшение активности собак в ночное время, указывающее на больший комфорт у собак, которые получали кормовую композицию для собак j/d.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к композициям и способам лечения патологических состояний в животном, где это патологическое состояние влияет на мышечно-скелетные суставы этого животного. Эти композиции могут быть приготовлены для перорального введения, в том числе, но не только, в виде кормов для животных. Эти корма для животных могут предоставляться любому типу животного, для которого были приготовлены эти композиции. Например, корма могут быть приготовлены для домашних животных, в том числе, но не только, для собак или кошек.
В данном контексте аномальным животным является животное, которое было диагностировано как животное, страдающее от состояния, или животное, явно страдающее от состояния, которое действует на мышечно-скелетные суставы в животном, или для которого данные экспрессии генов, содержащиеся здесь, предполагают предрасположенность в отношении такого состояния. Например, собака или кошка, диагностированные как имеющие остеоартрит или явно страдающие от остеоартрита, могут рассматриваться как аномальные животные.
Композиции по данному изобретению содержат по меньшей мере одну омега-3 жирную кислоту. Омега-3 жирные кислоты хорошо известны в данной области. Омега-3 жирные кислоты являются незаменимыми нутриентами для здоровья животных, и такие жирные кислоты не могут быть произведены или не могут быть произведены в достаточных количествах животными. Такие жирные кислоты используют в качестве диетического компонента или диетических компонентов в композициях и способах, описанных здесь в качестве изобретений. Приготовление питательных композиций, содержащихся здесь, основано частично на действии таких питательных композиций на экспрессию генов в животных, страдающих от нарушений мышечно-скелетных суставов описанных здесь типов. Примеры омега-3 жирных кислот включают, но не ограничиваются ими, альфа-линолевую кислоту (ALA), докозагексаеновую кислоту (DHA) и эйкозапентаеновую кислоту (EPA). В одном варианте осуществления данного изобретения эта композиция содержит одну из ALA, DHA или EPA. В другом варианте осуществления эта композиция содержит по меньшей мере две из ALA, DHA или EPA. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эта композиция содержит все три из ALA, DHA и EPA.
Эти композиции содержат также по меньшей мере один гликозаминогликан (GAG). GAG хорошо известны в данной области, и считается, что они являются неразветвленными полисахаридами, содержащими повторяющиеся дисахаридные звенья. При условии того, что этот полисахарид является неразветвленным и содержит повторяющиеся дисахаридные звенья, считается, что эта молекула или этот полимер является гликозаминогликаном. Примеры GAG включают, но не ограничиваются ими, хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератансульфат, гепарин, гепарансульфат и гиалуронан. В одном варианте осуществления данного изобретения эта композиция содержит один из хондроитинсульфата, дерматансульфата, кератансульфата, гепарина, гепарансульфата или гиалуронана. В другом варианте осуществления данного изобретения эта композиция содержит по меньшей мере два из хондроитинсульфата, дерматансульфата, кератансульфата, гепарина, гепарансульфата или гиалуронана. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эта композиция содержит по меньшей мере три из хондроитинсульфата, дерматансульфата, кератансульфата, гепарина, гепарансульфата или гиалуронана. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эта композиция содержит по меньшей мере четыре, пять или все из хондроитинсульфата, дерматансульфата, кератансульфата, гепарина, гепарансульфата или гиалуронана.
Эти композиции содержат также по меньшей мере один аминосахар. Аминосахар хорошо известен в данной области и обозначает просто сахарную часть молекулы, в которой гидроксил заменен аминогруппой, или аминогруппа встречается, наряду с гидроксильной группой. Примеры аминосахаров включают, но не ограничиваются ими, галактозамин, глюкозамин, сиаловую кислоту и N-ацетилглюкозамин. В одном варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат по меньшей мере один из галактозамина, глюкозамина, сиаловой кислоты или N-ацетилглюкозамина. В другом варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат по меньшей мере два из галактозамина, глюкозамина, сиаловой кислоты или N-ацетилглюкозамина. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат по меньшей мере три из галактозамина, глюкозамина, сиаловой кислоты или N-ацетилглюкозамина. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат все из галактозамина, глюкозамина, сиаловой кислоты или N-ацетилглюкозамина.
Эти композиции содержат также по меньшей мере один антиоксидант. Антиоксиданты хорошо известны в данной области. Примеры антиоксидантов включают, но не ограничиваются ими, витамин С, витамин Е (токоферолы и/или токотриенолы), глутатион, липоевую кислоту, мелатонин, карнитин и бета-каротин. В одном варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат по меньшей мере один из витамина С, витамина Е (токоферолов и/или токотриенолов), глутатиона, липоевой кислоты, мелатонина, карнитина или бета-каротина. В другом варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат по меньшей мере два из витамина С, витамина Е (токоферолов и/или токотриенолов), глутатиона, липоевой кислоты, мелатонина, карнитина или бета-каротина. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат три из витамина С, витамина Е (токоферолов и/или токотриенолов), глутатиона, липоевой кислоты, мелатонина, карнитина или бета-каротина. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат по меньшей мере четыре из витамина С, витамина Е (токоферолов и/или токотриенолов), глутатиона, липоевой кислоты, мелатонина, карнитина или бета-каротина. Еще в одном варианте осуществления данного изобретения эти композиции содержат по меньшей мере пять или более из витамина С, витамина Е (токоферолов и/или токотриенолов), глутатиона, липоевой кислоты, мелатонина, карнитина и/или бета-каротина.
Композиции по данному изобретению содержат также карнитин или ацетилкарнитин, которые являются соединениями четвертичного аммония с антиоксидантными действиями.
В выбранных вариантах осуществления эти композиции дополнительно содержат по меньшей мере одно диетическое минеральное вещество и/или по меньшей мере одну природную аминокислоту. Примеры диетических минеральных веществ хорошо известны. Примеры диетических минеральных веществ включают, но не ограничиваются ими, кальций, хлорид, магний, фосфор, калий, натрий, кобальт, медь, фтор, йод, железо, марганец, молибден, никель, селен, серу, цинк и ванадий. В одном варианте осуществления эта композиция содержит по меньшей мере один из кальция, хлорида, магния, фосфора, калия, натрия, кобальта, меди, фтора, йода, железа, марганца, молибдена, никеля, селена, серы, цинка или ванадия. В другом варианте осуществления эта композиция содержит по меньшей мере два из кальция, хлорида, магния, фосфора, калия, натрия, кобальта, меди, фтора, йода, железа, марганца, молибдена, никеля, селена, серы, цинка или ванадия. Еще в одном варианте осуществления эта композиция содержит по меньшей мере три из кальция, хлорида, магния, фосфора, калия, натрия, кобальта, меди, фтора, йода, железа, марганца, молибдена, никеля, селена, серы, цинка или ванадия. В еще одном варианте осуществления эта композиция содержит по меньшей мере четыре из кальция, хлорида, магния, фосфора, калия, натрия, кобальта, меди, фтора, йода, железа, марганца, молибдена, никеля, селена, серы, цинка или ванадия. Еще в одном варианте осуществления эта композиция содержит по меньшей мере пять или более из кальция, хлорида, магния, фосфора, калия, натрия, кобальта, меди, фтора, йода, железа, марганца, молибдена, никеля, селена, серы, цинка или ванадия.
Природные аминокислоты хорошо известны в данной области и являются аминокислотами, обнаруживаемыми в белках. В одном конкретном варианте осуществления эта композиция содержит незаменимую аминокислоту, где термин незаменимая аминокислота относится к виду этого субъекта. Например, незаменимые аминокислоты для собак и кошек включают Аргинин, Метионин, Гистидин, Фенилаланин, Изолейцин, Треонин, Лейцин, Триптофан, Лизин и Валин. Таурин может также рассматриваться как незаменимая аминокислота в кошках.
В одном варианте осуществления кормовая композиция для собак j/d включает композицию, представленную в общем виде на фигуре 4, и включает гликозаминогликан в форме хондроитинсульфата и аминосахар в форме гидрохлорида глюкозамина, а также карнитин и по меньшей мере один антиоксидант. Эта композиция может также содержать дополнительные источники нутриентов, например: Ground Whole Grain Corn (измельченные цельные зерна кукурузы), Chicken By-Product Meal (муку из побочных куриных продуктов), семена льна, Soybean Mill Run (размолотый продукт сои), Brewers Rice (пивоваренную рисовую крупку), соевую муку, свиной жир (консервированный смешанными токоферолами и лимонной кислотой), Chicken Liver Flavor (ароматизатор куриной печени), порошкообразную целлюлозу, рыбий жир, хлорид калия, L-лизин, карбонат кальция, холинхлорид, йодированную соль, DL-метионин, добавку витамина Е, витамины (L-аскорбил-2-полифосфат (источник витамина С), добавку витамина Е, ниацин, тиамин-мононитрат, добавку витамина А, кальций-пантотенат, биотин, добавку витамина B12, пиридоксингидрохлорид, рибофлавин, фолиевую кислоту, добавку витамина D3), L-треонин, таурин, лецитин сои, глюкозамингидрохлорид, минеральные вещества (сульфат двухвалентного железа, оксид цинка, сульфат меди, оксид марганца, йодат кальция, селенит натрия), L-триптофан, L-карнитин, консервированные смешанными токоферолами и лимонной кислотой, хондроитинсульфат, бета-каротин, экстракт розмарина.
Кормовые композиции для кошек j/k согласно данному изобретению, используемые в примерах, содержали омега-3 жирные кислоты, омега-6 жирные кислоты, а также содержали альфа-линоленовую кислоту. Эта композиция содержала гликозаминогликан в форме хондроитинсульфата и аминосахар в форме гидрохлорида глюкозамина. Кроме того, эта композиция содержала карнитин и предпочтительно один антиоксидант, например, витамин С и бета-каротин.
Термин "животное" обозначает человека или животного (не человека), в том числе птиц, коров, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец, приматов и свиней.
2
Термин "антитело" обозначает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, в том числе антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Этот термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные, гетероконъюгатные антитела, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифические антитела, диатела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab’, F(ab’) и Fv или другие антигенсвязывающие фрагменты.
Термин "матрица (эррей)" обозначает упорядоченное размещение по меньшей мере двух зондов на субстрате. По меньшей мере один из этих зондов является контролем или стандартом и по меньшей мере один из этих зондов является диагностическим зондом. Размещение от приблизительно двух до приблизительно 40000 зондов на субстрате гарантирует, что размер и интенсивность сигнала каждого меченого комплекса, образованного между зондом полинуклеотидом или полипептидом образца, является индивидуально различимым.
Термин "дифференциальная экспрессия" или "дифференциально экспрессируемые" обозначает увеличенную или повышающим образом регулируемую экспрессию генов или обозначает уменьшенную или понижающим образом регулируемую экспрессию генов, детектируемую по отсутствию, присутствию или по меньшей мере двухкратному, или по меньшей мере по 1,5-, 1,4-, 1,3-, 1,2-, 1,1- или 1-кратному изменению количества транскрибируемой мессенджер-РНК или транслируемого белка в пробе.
Термин "кратная" при использовании в качестве меры дифференциальной экспрессии генов обозначает величину экспрессии генов в животном, которая является множественной (многократной) величиной или является частью величины экспрессии генов в сравнении с величиной экспрессии генов в сравниваемом животном, например, в артритном животном в сравнении с неартритным животным. Например, ген, который экспрессируется в три раза больше в этом животном в сравнении со сравниваемым животным, имеет 3-кратную дифференциальную экспрессию гена, и ген, который экспрессируется как одна треть в этом животном в сравнении со сравниваемым животным, также имеет 3-кратную дифференциальную экспрессию гена.
Термин "фрагмент" обозначает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая является частью полной последовательности и которая имеет ту же самую или сходную активность в отношении конкретного применения, что и полная полинуклеотидная последовательность, или (2) пептидную или полипептидную последовательность, которая является частью полной последовательности и которая имеет ту же самую или сходную активность в отношении конкретного применения, что и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут содержать любое количество нуклеотидов или аминокислот, предполагаемое подходящим для конкретного применения. Обычно олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат по меньшей мере приблизительно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат по меньшей мере приблизительно 4, 10, 20 или 50 последовательных аминокислот из полной последовательности. Этот термин включает полинуклеотидные и полипептидные варианты этих фрагментов.
Термин "ген" или "гены" обозначает полный или частичный сегмент ДНК, участвующий в продуцировании полипептида, включающий районы, предшествующие кодирующему району и следующие после кодирующего района (лидер и трейлер) и промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Этот термин включает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с комплементом кодирующих гены последовательностей.
Термин "гомолог" обозначает (1) полинуклеотид, включающий полинуклеотиды из одних и тех же или разных видов животных, имеющие более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходство последовательности с полинуклеотидом и имеющие те же самые или по существу те же самые свойства и выполняющие ту же самую или по существу ту же самую функцию, что и полный полинуклеотид, или имеющие способность специфически гибридизоваться с полинуклеотидом при строгих условиях, или (2) полипептид, включающий полипептиды из одних и тех же или разных видов животных, имеющие более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходство последовательности с полипептидом и имеющие те же самые или по существу те же самые свойства и выполняющие ту же самую или по существу ту же самую функцию, что и полный полипептид, или имеющие способность специфически связываться с полипептидом, идентифицированным экспрессией полинуклеотидов. Сходство последовательности двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей определяют с использованием способов, известных квалифицированным в данной области специалистам, например, с использованием алгоритма Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Для получения имеющих гэпы сопоставлений для целей сравнения может быть использована программа Gapped Blast, как описано в Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST используются параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://ww.ncbi.nlm.nih.gov.
Термин "гибридизационный комплекс" обозначает комплекс, который образуется между полинуклеотидами образца при связывании водородной связью пуринов одного полинуклеотида с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, 5’-A-G-T-C-3’ образуют пары с 3’-T-C-A-G-5’. Степень комплементарности и использование нуклеотидных аналогов влияют на эффективность и строгость реакций гибридизации.
Термин "вместе" означает, что лекарственное средство, пищевой продукт или другое вещество вводят животному (1) вместе в композиции, в частности, в пищевой (кормовой) композиции, или (2) раздельно при той же самой частоте или при разной частоте с использованием одних и тех же или разных способов введения приблизительно в одно и то же время или периодически. "Периодически" означает, что это вещество вводят в схеме введения доз, приемлемой для конкретного вещества. "Приблизительно в одно и то же время" обычно означает, что это вещество (пищевой продукт или лекарственное средство) вводят в то же самое время или в пределах приблизительно 72 часов друг от друга. Термин "вместе" конкретно включает схемы введения, в которых вещества, такие как лекарственные средства, вводят в течение предписанного периода, а композиции по данному изобретению вводят в течение неопределенного времени (до бесконечности).
Термин "полинуклеотид" или "олигонуклеотид" обозначает полимер нуклеотидов. Этот термин включает молекулы ДНК и РНК (в том числе кДНК и мРНК), либо одноцепочечные, либо двухцепочечные, и, если они являются одноцепочечными, их комплементарную последовательность в линейной или кольцевой форме. Этот термин включает также фрагменты, варианты, гомологи и аллели, уместные для последовательностей, которые имеют те же самые или по существу те же самые свойства и выполняют ту же самую или по существу ту же самую функцию, что и исходная последовательность. Эти последовательности могут быть полностью комплементарными (без ошибочных спариваний) при сопоставлении или могут иметь до приблизительно 30% ошибочного спаривания. Предпочтительно, для полинуклеотидов, эта цепь содержит от приблизительно 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно, для олигонуклеотидов, эта цепь содержит от приблизительно 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от различных факторов и от конкретного применения и использования полинуклеотида или олигонуклеотида. Этот термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезированы и которые выделены и очищены из природных источников. Термин "полинуклеотид" включает "олигонуклеотид".
Термин "полипептид", "пептид" или "белок" обозначает полимер аминокислот. Этот термин включает природные и не встречающиеся в природе (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или более аминокислот заменены искусственными химическими миметиками. Этот термин включает также фрагменты, варианты и гомологи, которые имеют те же самые или по существу те же самые свойства и выполняют ту же самую или по существу ту же самую функцию, что и исходная последовательность. Этот термин включает полимеры любой длины, предпочтительно полимеры, содержащие от приблизительно 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 5 до 500 аминокислот. Этот термин включает полимеры аминокислот, которые синтезированы и которые выделены и очищены из природных источников.
Термин "зонд" обозначает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, либо РНК, либо ДНК, независимо от того, встречается он в природе, например, в очищенном продукте рестрикционных ферментов, или получен синтетически, который способен отжигаться или специфически гибридизоваться с полинуклеотидом с последовательностями, комплементарными этому зонду, или (2) пептид или полипептид, способный специфически связывать конкретный белок или фрагмент белка для существенного исключения других белков или фрагментов белков. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть либо одноцепочечным, либо двухцепочечным. Точная длина этого зонда будет зависеть от многих факторов, включающих температуру, источник и применение. Например, для диагностических применений, в зависимости от комплексности последовательности-мишени, олигонуклеотидный зонд обычно содержит приблизительно 10-100, 15–50 или 15–25 нуклеотидов. В некоторых диагностических применениях полинуклеотидный зонд содержит приблизительно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 300 нуклеотидов. Зонды здесь выбирают таким образом, чтобы они были комплементарны разным цепям конкретной последовательности-мишени. Это означает, что эти зонды должны быть достаточно комплементарными для специфической гибридизации или отжига с их соответствующими последовательностями-мишенями при наборе заранее заданных условий. Таким образом, последовательность этого зонда не должна отражать точную комплементарную последовательность мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5’- или 3’-концу этого зонда, причем остальная последовательность зонда является комплементарной последовательности-мишени. Альтернативно некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть рассеяны в зонде, при условии, что последовательность зонда имеет достаточную комплементарность с последовательностью полинуклеотида-мишени для специфического отжига с этим полинуклеотидом-мишенью. Пептидный или полипептидный зонд может быть молекулой, с которой специфически связывается белок или пептид, в том числе ДНК (для ДНК-связывающих белков), антителами, рецепторами клеточных мембран, пептидами, кофакторами, лектинами, сахарами, полисахаридами, клетками, мембранами клеток, органеллами и мембранами органелл.
Термин "образец" или "проба" обозначает любую ткань или жидкость животного, содержащую, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и т.п., в том числе клетки и другую ткань, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают кровь, хрящ, соединительную ткань, эпителиальную ткань, лимфоид, мышцу, нерв, слюну и т.п. Образец может быть твердым веществом или жидкостью и может быть ДНК, РНК, кДНК, биологической жидкостью, такой как кровь или моча, препаратами клеток или их растворимыми фракциями или аликвотами сред, хромосомами, органеллами и т.п.
Термин "отдельная упаковка" обозначает, что компоненты набора физически ассоциированы в одном или нескольких контейнерах и рассматриваются как элемент для приготовления, распространения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничиваются ими, пакеты, боксы, бутылки, упаковки из усадочной пленки, сшитые скобками или скрепленные иным образом компоненты или их комбинации. Отдельной упаковкой могут быть контейнеры отдельных пищевых композиций, физически ассоциированных таким образом, что они рассматриваются как элемент приготовления, распространения, продажи или применения.
Термин "применимые вариации" означает (1) для полинуклеотида, компоненты этого полинуклеотида; гомологи этого полинуклеотида и их комплементы; варианты этого полинуклеотида, их комплементы и их гомологи; и фрагменты этого полинуклеотида, их комплементы, их гомологи и их варианты, и (2) для полипептида, гомологи этого полипептида; варианты этого полипептида и их гомологи; и фрагменты этого полипептида, их гомологи и их варианты.
Термин "виртуальная упаковка" означает, что компоненты набора ассоциированы указаниями на одном или нескольких компонентах физического или виртуального набора, инструктирующими пользователя о том, как получить другие компоненты, например, в мешке, содержащем один компонент, и указаниями, инструктирующими пользователя о том, к какому web-сайту он должен обратиться для контакта с записанным сообщением, просмотра визуального сообщения или контакта с ответственным лицом или инструктором для получения инструкции о том, каким образом использовать этот набор.
Термин "стандарт" обозначает (1) контрольную пробу, которая содержит ткань из нормального животного, если, например, тестируется артритное животное, или ткань, например, из артритного животного, если тестируется нормальное животное, или (2) контрольную пробу, которая содержит ткань из нормального или, например, артритного животного, которое не подвергалось действию тест-вещества, исследуемого в соответствующем нормальном или, например, артритном животном, для определения, вызывает ли тест-вещество дифференциальную экспрессию генов, в соответствии с контекстом его применения.
2
4
Термин "строгие условия" обозначает (1) гибридизацию в 50% (об./об.) формамиде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Фиколлом, 0,1% поливинилпирролидоном, 50 мМ натрий-фосфатным буфером при рН 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ натрий-цитратом при 42°C, (2) гибридизацию в 50% формамиде, 5x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M натрий-цитрат), 50 мМ натрий-фосфате рН 6,8), 0,1% натрий-пирофосфате, 5x растворе Денхардта, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% декстрансульфате при 42°C; с промывками при 42°C в 0,2x SSC и 0,1% ДСН или промывками 0,015 M NaCl, 0,0015 M натрий-цитратом, 0,1% NaSO при 50°C или аналогичных процедурах с использованием промывающих агентов сходной низкой ионной силы и высокой температуры и сходных денатурирующих агентов.
Термин "вещество" обозначает элемент, соединение, молекулу или их смесь или любой другой материал, который мог бы потенциально быть применим для диагностики, прогнозирования или модуляции возникновения или тяжести патологического состояния суставов в животном, в том числе любое лекарственное средство, химическое соединение или биологический компонент.
Термин "siRNA" обозначает полинуклеотид, который образует двухцепочечную РНК, которая уменьшает или ингибирует экспрессию гена при экспрессии этой siRNA в той же клетке, в которой находится этот ген. Этот термин включает двухцепочечную РНК, образуемую комплементарными цепями. Эти комплементарные siRNA части, которые гибридизуются с образованием двухцепочечной молекулы, обычно имеют существенную или полную идентичность. Обычно siRNA содержит по меньшей мере приблизительно 15-50 нуклеотидов, а двухцепочечная siRNA содержит приблизительно 15-50 пар оснований, предпочтительно приблизительно 20-30 нуклеотидов и пар оснований.
Термин "специфически связываются" обозначает особое и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в частности, их молекулярных боковых групп, например, интеркаляцию регуляторного белка в большую бороздку ДНК-молекулы, образование водородной связи вдоль скелета между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.
Термин "специфически гибридизуются" обозначает ассоциацию между двумя одноцепочечными полинуклеотидами достаточно комплементарной последовательности для позволения такой гибридизации при заранее выбранных условиях, обычно используемых в данной области (иногда называемой "по существу комплементарной"). Например, этот термин может относиться к гибридизации полинуклеотидного зонда с по существу комплементарной последовательностью, содержащейся в одноцепочечной ДНК- или РНК-молекуле согласно одному аспекту данного изобретения, для существенного исключения гибридизации этого полинуклеотидного зонда с одноцепочечными полинуклеотидами некомплементарной последовательностью.
Термин "вариант" обозначает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, вариацию, модификацию, вытеснение, делецию или добавление одного или нескольких нуклеотидов из полинуклеотидной последовательности или в полинуклеотидную последовательность, и содержащую те же самые или по существу те же самые свойства и выполняющую ту же самую или по существу ту же самую функцию, что и исходная последовательность, и (2) полипептидную последовательность, содержащую любую замену, вариацию, модификацию, вытеснение, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот из полипептидной последовательности или в полипептидную последовательность, и содержащую те же самые или по существу те же самые свойства и выполняющую ту же самую или по существу ту же самую функцию, что и исходная последовательность. Таким образом, этот термин включает однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные замены аминокислот в полипептидах. Этот термин включает также химическую дериватизацию полинуклеотида или полипептида и замену нуклеотидов или аминокислот нуклеотидами или аминокислотами, которые не встречаются природно, если необходимо.
Это изобретение не ограничивается конкретными методологией, протоколами и реагентами, описанными здесь, так как они могут варьироваться. Кроме того, используемая здесь терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема данного изобретения. В данном контексте и в прилагаемой формуле изобретения единственные формы включают множественную ссылку, если контекст явно не диктует другое, например, ссылка на "вариант" включает множество вариантов. Далее, определенные термины включают вариации этих терминов, используемые в правильном грамматическом контексте, например, термин "специфически связывается" включает "специфическое связывание" и другие формы этого термина. Подобным образом слова "содержат", "содержит" и "содержащий" должны интерпретироваться как включающие, а не как исключающие.
Если нет других определений, все технические и научные термины и любые используемые здесь акронимы имеют значения, обычно понимаемые специалистом с обычной квалификацией в области данного изобретения. Хотя любые композиции, способы, изделия или другие средства или материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь, могут использоваться в практике данного изобретения, здесь описаны предпочтительные композиции, способы, изделия или другие средства или материалы.
Все патенты, заявки на патент, публикации и другие ссылки, цитируемые или приводимые здесь, включены в настоящее описание посредством ссылки до той степени, которая допускается законом. Обсуждение этих ссылок предназначено только для суммирования сделанных здесь утверждений. Не делается признание, что любые такие патенты, заявки на патент, публикации или ссылки или любая их часть является релевантным прототипом для данного изобретения, и право оспаривания точности и применимости таких патентов, заявок на патент, публикаций и других ссылок специфически сохраняется.
В одном варианте осуществления данное изобретение включает один или несколько генов или сегментов генов ("генов", как определено здесь), которые дифференциально экспрессируются в отклоняющихся от нормы (аномальных) животных в сравнении с нормальными животными. Это изобретение основывается на открытии полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются в аномальных животных в сравнении с нормальными животными. Эти гены были идентифицированы сравнением экспрессии генов в лимфоцитах из животных, диагностированных как аномальные, с генами в лимфоцитах из животных, диагностированных как нормальные, с использованием технологии Affymetrix GeneChip.
Эти полинуклеотиды и гены идентифицируют измерением различий в экспрессии генов из лимфоцитов из собачьих, диагностированных как аномальные, с экспрессией генов в лимфоцитах из собачьих, диагностированных как нормальные. Изменения в экспрессии генов могут быть определены любым способом, известным квалифицированным специалистам. Обычно изменения в экспрессии генов определяют измерением транскрипции (определением количества мРНК, продуцируемого геном) или измерением трансляции (определением количества белка, продуцируемого геном). Количество РНК или белка, продуцируемых геном, может быть определено с использованием любого способа, известного квалифицированным в данной области специалистам для количественного определения полинуклеотидов и белков. Обычно экспрессию РНК определяют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) (включающей, без ограничения, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и количественную ПЦР реального времени (кПЦР)), защиты от РНКазы, Нозерн-блоттинга и любых других способов гибридизации. Обычно РНК измеряют в форме мРНК или обратно-транскрибированной мРНК. Экспрессию белка или полипептида определяют с использованием различных колориметрических и спектроскопических анализов и таких способов, как анализ Лоури, биуретовая реакция, анализы флуоресценции, турбидиметрические способы, бицинхониновый анализ, технология чипа белков, оптическая плотность в инфракрасной области спектра, нингидриновый анализ, анализ Бредфорда и оптическая плотность в ультрафиолете. В предпочтительном способе определяют изменения экспрессии генов с использованием микрочипов Affymetrix генов Canine-1 и Canine-2, доступных из Affymetrix, Inc., и инструкций для использования таких чипов для определения экспрессии генов.
Обычно дифференциальную экспрессию генов в аномальных животных в сравнении с нормальными животными определяют измерением экспрессии по меньшей мере одного гена. Предпочтительно измеряют экспрессию двух или более дифференциально экспрессируемых генов для предоставления распределения экспрессии генов или профиля экспрессии генов. Более предпочтительно измеряют экспрессию множества дифференциально экспрессируемых генов для предоставления дополнительной информации для более значительного распределения или профиля экспрессии генов.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает устройство, подходящее для детектирования экспрессии множества генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы (аномальных) животных в сравнении с нормальными животными. Это устройство содержит субстрат, имеющий множество олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов по данному изобретению, прикрепленных к этому субстрату в известных местоположениях. Это устройство является по существу иммобилизованной версией описанных здесь олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов. Это устройство применимо для быстрого и специфического детектирования генов и полинуклеотидов и их распределений и профилей экспрессии. Обычно такие зонды связаны с субстратом или сходным твердым носителем, и пробу, содержащую один или несколько полинуклеотидов (например, ген, продукт ПЦР, продукт лигазной цепной реакции (LCR), ДНК-последовательность, которая была синтезирована при помощи способов амплификации, или их смесь), подвергают действию этих зондов таким образом, что этот образец полинуклеотида (полинуклеотидов) может гибридизоваться с этими зондами. Либо эти зонды, полинуклеотид (полинуклеотиды) образца, либо и те, и другие метят, обычно флуорофором или другой меткой, такой как стрептавидин, и детектируют посредством детектирования связанной флуоресценции. Если зонды являются мечеными, гибридизация может быть обычно детектирована гашением метки. Если полинуклеотид (полинуклеотиды) как зонда, так и образца являются мечеными, гибридизацию обычно детектируют мониторингом смещения окраски, происходящим из близости этих двух связанных меток. Квалифицированным специалистам известны различные стратегии и метки, в частности, флуоресцентные метки. Предпочтительно эти зонды иммобилизуют на субстратах, подходящих для образования матрицы (эррея) (известной под несколькими названиями, включающими ДНК-микроматрица (микроэррей), чип генов, биочип, ДНК-чип и матрица генов (эррей генов)), сравнимой с матрицами, известными в данной области.
Полипептидные зонды могут быть приготовлены в соответствии с общепринятыми способами, например, с использованием данных нуклеотидных последовательностей, обеспеченных для полинуклеотидов по данному изобретению, и способов, известных в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, выделение непосредственно из клеток, выделение или синтез ДНК или РНК, кодирующих эти полипептиды, и использование этой ДНК или РНК для продуцирования рекомбинантных продуктов, синтез полипептидов химически из отдельных аминокислот и получение полипептидных фрагментов химическим расщеплением существующих полипептидов.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает устройство для детектирования экспрессии множества генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы (аномальных) животных в сравнении с нормальными животными. Это устройство содержит субстрат, имеющий множество пептидных или полипептидных зондов по данному изобретению, прикрепленных к этому субстрату в известных местоположениях. Это устройство является по существу иммобилизованной версией описанных здесь пептидных или полипептидных зондов. Это устройство применимо для быстрого и специфического детектирования белков и их распределений экспрессии. Обычно такие зонды связаны с субстратом, и пробу, содержащую один или несколько белков, подвергают действию этих зондов таким образом, что белки образца могут гибридизоваться с этими зондами. В некоторых вариантах осуществления эти зонды, белки образца или и те, и другие метят обычно флуорофором или другим агентом, известным квалифицированным в данной области специалистам, и детектируют. Обычно те же самые способы и то же самое оборудование, используемое для считывания полинуклеотидных микроматриц, применимы для белковых матриц. Предпочтительно эти зонды иммобилизованы на субстрате, подходящем для образования матрицы.
Способы определения количества или концентрации белка в пробе известны квалифицированным в данной области специалистам. Такие способы включают радиоиммуноанализы, анализы конкурентного связывания, Вестерн-блот-анализ и анализы ELISA. Для способов, которые используют антитела, пригодны поликлональные и моноклональные антитела. Такие антитела могут быть иммунологически специфическими в отношении белка, эпитопа белка или фрагмента белка.
Некоторые варианты осуществления согласно данному изобретению используют антитела для детектирования и количественного определения белков, продуцируемых экспрессией полинуклеотидов по данному изобретению. Хотя белки могут быть детектированы иммунопреципитацией, аффинным разделением, Вестерн-блот-анализом, белковыми матрицами и т.п., предпочтительный способ использует технологию ELISA, в которой антитело иммобилизуют на твердом носителе и белок-мишень или пептид-мишень подвергают действию этого иммобилизованного антитела. Либо зонд, либо эта мишень, либо и те, и другие могут быть помечены с использованием известных способов.
В некоторых вариантах осуществления паттерны (распределения) или профили экспрессии множества генов, экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, наблюдают с использованием матрицы (эррея) зондов для детектирования полинуклеотидов или полипептидов. В одном варианте осуществления могут быть использованы матрицы олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов, тогда как другой вариант осуществления может использовать матрицы антител или других белков, которые специфически связываются с продуктами дифференциально экспрессируемых генов по данному изобретению. Такие матрицы могут быть коммерчески доступны или могут быть изготовлены на заказ с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, например, синтеза in situ на твердом носителе или прикреплением предварительно синтезированных зондов к твердому носителю с использованием способов микропринтинга. В различных вариантах осуществления матрицы (эрреи) полинуклеотидных или полипептидных зондов изготавливают на заказ для специфического детектирования транскриптов или белков, продуцируемых дифференциально экспрессируемых генов по данному изобретению.
В одном варианте осуществления матрицы (эрреи) полинуклеотидных или полипептидных зондов изготавливают на заказ для специфического детектирования транскриптов или белков, продуцируемых двумя или более полинуклеотидами или генами, идентифицированными в таблице 2 и/или таблице 3. Эти зонды предназначены для детектирования генов, ассоциированных с путями метаболизма липидов и глюкозы в животных. В другом варианте осуществления матрицы (эрреи) полинуклеотидных или полипептидных зондов изготавливают на заказ для специфического детектирования транскриптов или белков, продуцируемых двумя или более полинуклеотидами или генами, идентифицированными в таблице 3. Эти зонды предназначены для детектирования генов, которые являются особенно релевантными для отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными.
В следующем аспекте это изобретение обеспечивает способ детектирования дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в пробе. Этот способ предусматривает (a) гибридизацию комбинации, содержащей множество полинуклеотидных зондов, которые дифференциально экспрессируются в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, с полинуклеотидами в пробе для образования одного или нескольких гибридизационных комплексов; (b) необязательно, гибридизацию комбинации, содержащей множество полинуклеотидных зондов, которые дифференциально экспрессируются в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, с полинуклеотидами в стандарте для образования одного или нескольких гибридизационных комплексов; (c) детектирование этих гибридизационных комплексов из образца и, необязательно, стандарта из стадии (b); и (d) сравнение этих гибридизационных комплексов из образца с гибридизационными комплексами из стандарта, причем различие в количестве гибридизационных комплексов между стандартом и пробой указывает на дифференциальную экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в этой пробе.
Стадия (b) и часть стадии (c) являются необязательными и используются, если должно проводиться относительно одновременное сравнение двух или более тест-систем. Однако, в предпочтительном варианте осуществления, стандарт, используемый для сравнения, основан на данных, полученных ранее с использованием этого способа.
Эти зонды подвергают действию образцы для образования гибридизационных комплексов, которые детектируют и сравнивают с гибридизационными комплексами стандарта. Различия между гибридизационными комплексами из образца и стандарта указывают на дифференциальную экспрессию полинуклеотидов и, следовательно, генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в этой пробе. В предпочтительном варианте осуществления зонды готовят для специфического детектирования полинуклеотидов или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или фрагментами генов, идентифицированных по данному изобретению. Способы детектирования гибридизационных комплексов известны квалифицированным специалистам.
В одном варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает подвергание животного или образца действию тест-вещества перед гибридизацией. В этом случае это сравнение показывает, изменило ли это тест-вещество экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в частности, аномально-ассоциированных генов, в этой пробе.
В другом аспекте это изобретение обеспечивает способ детектирования дифференциальной экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в пробе. Этот способ предусматривает (a) реакцию комбинации, содержащей множество полипептидных зондов, с белками в пробе при условиях, которые делают возможным осуществление специфического связывания между этими зондами и этими белками, причем белки, связанные этими зондами, дифференциально экспрессируются в отклоняющемся от нормы животном в сравнении с нормальным животным; (b) необязательно, реакцию комбинации, содержащей множество полипептидных зондов, с белками в стандарте при условиях, которые делают возможным осуществление специфического связывания между этими зондами и этими белками, причем белки, связанные этими зондами, дифференциально экспрессируются в отклоняющемся от нормы животном в сравнении с нормальным животным; (c) детектирование специфического связывания в этой пробе и, необязательно, в стандарте из стадии (b); и (d) сравнение специфического связывания в этой пробе со специфическим связыванием стандарта, причем различия между специфическим связыванием в этом стандарте и в этой пробе указывают на дифференциальную экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в этой пробе.
Эти зонды подвергают действию образцы для образования специфического связывания, которое детектируют и сравнивают со специфическим связыванием стандарта. Различия между специфическим связыванием из этого образца и стандарта указывают на дифференциальную экспрессию белков и, следовательно, генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в частности, аномально-ассоциированных генов, в этой пробе. В предпочтительном варианте осуществления зонды готовят для специфического детектирования белков или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или фрагментами генов, идентифицированных в данном изобретении.
В одном варианте осуществления этот способ предусматривает дополнительно подвергание животного или образца действию тест-вещества перед реакцией этих полипептидов с этими белками. В этом случае сравнение показывает, изменило ли это тест-вещество экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в частности, аномально-ассоциированных генов, в этой пробе.
В другом аспекте этот способ детектирования экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в пробе используют для мониторинга прогрессирования животных при попытке модуляции количества, например, артритной ткани на животном в ответ на программу модуляции хрящевой ткани. Этот способ выполняют с интервалами, предпочтительно установленными интервалами, во время программы модуляции, и прогресс животного подвергают мониторингу сравнением результатов этого способа в двух или более временных точках по время программы модуляции. Изменение экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в частности, аномально-ассоциированных генов, или в распределении экспрессии генов, или отсутствие какого-либо изменения, происходящего из этого сравнения, указывает на эффективность программы модуляции.
Тест-веществами могут быть любые вещества, которые проявляют действие на полинуклеотиды или гены, дифференциально экспрессируемые в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в частности, аномально-ассоциированные гены. Тест-вещества включают, но не ограничиваются ими, аминокислоты; белки, пептиды, полипептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, малые молекулы, макромолекулы, витамины, минеральные вещества, простые сахара; комплексные сахара; полисахариды; углеводы; триглицериды со средней длиной цепи (MCT); триацилглицериды (TAG); n-3 (омега-3) жирные кислоты, в том числе DHA, EPA, ALA; n-6 (омега-6) жирные кислоты, в том числе LA, γ-линоленовую кислоту (GLA) и ARA; SA, конъюгированную линолевую кислоту (CLA); источники холина, такие как лецитин; жирорастворимые витамины, в том числе витамин А и его предшественники, такие как каротиноиды (например, β-каротин), источники витамина D, такие как витамин D2 (эргокальциферол) и витамин D3 (холекальциферол), источники витамина Е, такие как токоферолы (например, α-токоферол) и токотриенолы, и источники витамина K, такие как витамин K1 (филлохинон) и витамин K2 (менадион); водорастворимые витамины, в том числе витамины В, такие как рибофлавин, ниацин (в том числе никотинамид и никотиновая кислота), пиридоксин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, биотин и кобаламин; и витамин С (аскорбиновую кислоту); антиоксиданты, в том числе некоторые из перечисленных выше витаминов, в частности, витамины Е и С; а также биофлавоноиды, такие как катехин, кверцитин и теафлавин; хиноны, такие как убихинон; каротиноиды, такие как ликопен и ликоксантин; ресвератрол; и α-липоевую кислоту; L-карнитин; D-лимонен; глюкозамин; S-аденозилметионин и хитозан. В одном предпочтительном варианте осуществления тест-вещества являются нутриентами, которые могут добавляться к пище или употребляться в качестве добавки. Примеры включают, но не ограничиваются ими, жирные кислоты, такие как омега-3 жирные кислоты (например, DHA и EPA) и омега-6 жирные кислоты (например, ARA), карнитин, метионин, витамин С, витамин Е и витамин D.
В одном предпочтительном варианте осуществления вещества, применимые для действия на экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в частности, аномально-ассоциированных генов, могут быть идентифицированы с использованием способов, описанных в находящейся в процессе одновременного рассмотрения предварительной заявке на патент США № 60/657980, поданной 2 марта 2005 года, и любой следующей заявке на патент США или поданной в другое зарубежное ведомство, которые заявляют приоритет в отношении этой заявки.
Профиль экспрессии для нормальных животных, используемых в этом сравнении, может быть получен из одного или нескольких нормальных животных одновременно с профилем экспрессии для тестируемого животного из базы данных профилей экспрессии нормального животного. Предпочтительно база данных профилей экспрессии для нормальных животных, накопленная на протяжении времени, является доступной для использования в качестве ссылки.
Определение, экспрессируются ли полинуклеотиды или полипептиды дифференциально, может выполняться детектированием этих полинуклеотидов или полипептидов с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, некоторые из которых описаны здесь.
В другом аспекте это изобретение предоставляет композицию, подходящую для манипулирования генома животного. Эта композиция содержит одно или несколько веществ, которые препятствуют экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, в частности, аномально-ассоциированных генов.
В другом варианте осуществления это изобретение включает способ модуляции экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в животных, имеющих патологические нарушения мышечно-скелетных суставов, в сравнении с нормальными животными, в частности, ассоциированных с патологическими нарушениями мышечно-скелетных суставов генов. В предпочтительных вариантах осуществления эта композиция содержит, в миллиграммах на килограмм массы тела в день (мг/кг/день), DHA в количествах от приблизительно 1 до приблизительно 30, предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 15; EPA в количествах от приблизительно 1 до приблизительно 30, предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 15; EPA/DHA Combo (соотношение 1,5:1) в количествах от приблизительно 4/2 до приблизительно 30/45, предпочтительно от приблизительно 9/6 до приблизительно 18/12; ALA в количествах от приблизительно 10 до приблизительно 100, предпочтительно от приблизительно 30 до приблизительно 60; LA в количествах от приблизительно 30 до приблизительно 600, предпочтительно от приблизительно 60 до приблизительно 300; ARA в количествах от приблизительно 5 до приблизительно 50, предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 30; SA в количествах от приблизительно 3 до приблизительно 60, предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 30; и CLA (в качестве контроля) в количествах от приблизительно 6 до приблизительно 120, предпочтительно от приблизительно 12 до приблизительно 60. Эта композиция может вводиться животному любым способом или в любой форме, подходящей для этой композиции. Предпочтительно эта композиция может вводиться животному перорально в форме кормовой композиции или добавки. Эта кормовая композиция может находиться в любой форме, например, в форме питательно сбалансированной кормовой композиции, известной в данной области, такой как сухие корма, полумокрые корма и мокрые корма для животных, в частности, для домашних животных, таких как животные семейств кошачьих и собачьих. Добавки включают лекарственные формы, такие как таблетки, капсулы и подобные формы. В следующем аспекте эту композицию вводят в комбинации с одним или несколькими лекарственными средствами или другими веществами, которые модулируют количество хрящевой ткани в животном.
В другом аспекте это изобретение предоставляет композицию, подходящую для модуляции экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в животных, имеющих патологические нарушения мышечно-скелетных суставов в сравнении с нормальными животными, в частности, ассоциированных с патологическими нарушениями мышечно-скелетных суставов генов, или модуляции количества хрящевой ткани в животном. Эта композиция содержит модулирующее экспрессию генов или ткань количество одного или нескольких компонентов из DHA, EPA, EPA и DHA, ALA, LA, ARA и SA. В различных вариантах осуществления эта композиция содержит, в миллиграммах на килограмм массы тела в день (мг/кг/день), DHA в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 1 до приблизительно 30; EPA в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 1 до приблизительно 30; EPA/DHA Combo (соотношение 1,5:1) в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 4/2 до приблизительно 30/45; ALA в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 10 до приблизительно 100; LA в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 30 до приблизительно 600; ARA в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 5 до приблизительно 50; SA в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 3 до приблизительно 60; и CLA (в качестве контроля) в количествах, достаточных для введения животному от приблизительно 6 до приблизительно 120. Такие вещества могут быть применимы для модуляции количества хрящевой ткани в животном. Предпочтительно эти вещества влияют на экспрессию множества таких генов. В одном варианте осуществления эта композиция дополнительно содержит одно или несколько лекарственных средств или других веществ, которые модулируют количество хрящевой ткани в животном.
В следующем аспекте данное изобретение предоставляет наборы, подходящие для определения дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в животных, имеющих патологические нарушения мышечно-скелетных суставов в сравнении с нормальными животными, в частности, генов, ассоциированных с патологическими нарушениями мышечно-скелетных суставов, в тест-системе.
Пример 1: Определение действия различных веществ или ингредиентов на экспрессию генов в клеточных линиях собачьих
Affymetrix-чипы генов собачьих Canine Genome-1 и Canine Genome-2 используют для определения действия различных тест-веществ или ингредиентов, таких как MCT; TAG; ALA; EPA; DHA; линолевая кислота; стеариновая кислота (SA), конъюгированная линолевая кислота (CLA), γ-линоленовая кислота GLA; арахидоновая кислота; лецитин; витамин A, витамин D, витамин E, витамин K, рибофлавин, ниацин, пиридоксин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, биотин, витамин С, катехин, кверцетин, теафлавин; убихинон; ликопен, ликоксантин; ресвератрол; α-липоевая кислота; L-карнитин; D-лимонен; глюкозамин; S-аденозилметионин; хитозан, различные материалы, содержащие один или несколько из этих соединений, и их различные комбинации, на экспрессию генов в четырех клеточных линиях собачьих и соответствующих контролях. Каждый ингредиент тестировали в двух концентрациях, как иллюстрировано для выбранных ингредиентов образцов, показанных в таблице 1 (см. в конце описания). В качестве контроля использовали растворитель при более высокой из этих двух концентраций. Использовали четыре линии клеток собачьих: CCL34 (почка), CRL1430 (вилочковая железа), CCL183 (кость) (полученные из Американской Коллекции Типовых Культур) и CTAC (щитовидная железа) (см. Measurement of NK Activity in Effector Cells Purified from Canine Peripheral Lymphocytes, Veterinary Immunology and Immunopathology, 35 (1993) 239-251). Клеточную линию, обработанную ингредиентом в конкретной концентрации, называют "обработка" и необработанную пробу называют "контроль". Слова "гены" и "зонды" используют в этом способе как синонимы. Экспрессию генов измеряют для клеточных линий обработки и контроля с использованием инструкций, обеспеченных с Affymetrix-чипами. Подробная информация о последовательностях для каждого уникального идентификационного номера зонда доступна от изготовителя.
Для каждой конкретной обработки данные об экспрессии генов определяются как регулируемые повышающим образом ("up") или понижающим образом ("down"). Решение о том, регулируется ли ген повышающим или понижающим образом, основано на кратном изменении, которое рассчитывают как интенсивность обработки/интенсивность контроля для каждого отдельного образца. Это кратное изменение считается даун (down)-регулируемым, если его величина <1/1,5 (для анализа всех 4 клеточных линий) или <1/2 (для анализа в пределах клеточных линий), и ап (up)-регулируемым, если его величина >1,5 (для анализа всех 4 клеточных линий) или >2 (для анализа в пределах клеточных линий). Кроме того, зонд считают значимым для дальнейшего исследования, если он вызывается как присутствующий только в одном из сравниваемых условий (обработка или контроль) и "отсутствующий" или "незначительный" в другом, и кратное изменение является значимым в соответствии с используемым программным обеспечением. Зонды, которые, по-видимому, регулируются в противоположных направлениях в этих двух обработках, исключаются из дальнейшего анализа.
Эти необработанные данные анализируют с использованием программы GeneSpring version 7.0 (GS) (Agilent Corporation) и валидируют с использованием программного обеспечения R-Bioconductor (RB) самого пользователя. Оба пакета программ используют для расчета интенсивностей зондов из CEL-файлов, генерируемых Affymetrix Instrument. Присутствующие/Отсутствующие/Незначительные запросы на зонд и Р-величины вычисляют с использованием программы R-Bioconductor и GeneSpring отдельно.
Для анализа данных использовали две схемы. Первая: "по всем клеточным линиям" и "в пределах отдельных клеточных линий". В первой схеме гены отбирают для оценивания при условии, что обнаружено, что они являются значимыми и общими по всем клеточным линиям. Эта схема "по всем клеточным линиям" дает наивысшие доверительные интервалы с минимальным шумом и может обеспечивать наилучшие возможные критерии в отношении того, на какие гены влияли индивидуальные ингредиенты. Во второй схеме оцениваются только те гены, которые показывают значимое кратное изменение в этих двух обработках согласно обоим пакетам программ в пределах индивидуальных клеточных линий. Проба этого результата, полученного из этих экспериментов, показана в таблице 2. Таблица 2 показывает корреляцию между веществом обработки (Столбец 1), Зондом (звено данных) (Столбец 2), Направлением (Столбец 3), Наилучшей аннотацией BLAST (определенной статистически) (Столбец 4) и Номером доступа человека (Колонка 5). Информация в отношении всех тестированных ингредиентов хранится в базе данных для ссылки.
На основе физиологического состояния собачьих (диагноза, как патологического) и сравнения информации из таблиц 1-2, т.е. обращения внимания на гены, на которые влияют тест-вещество или ингредиент и которые также дифференциально экспрессируются в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными, питательная смесь, применимая для выбора и приготовления кормовой композиции для отклоняющихся от нормы собачьих, может содержать один или несколько из следующих ингредиентов в следующих количествах (количества in vivo в миллиграммах на килограмм массы тела в день (мг/кг/день) на основе экстраполяции из количеств, используемых in vitro), например: DHA - от приблизительно 1 до приблизительно 30; EPA - от приблизительно 1 до приблизительно 30; EPA/DHA Combo (отношение 1,5:1) - от приблизительно 4/2 до приблизительно 30/45; ALA - от приблизительно 10 до приблизительно 100; LA - от приблизительно 30 до приблизительно 600; ARA - от приблизительно 5 до приблизительно 50; и SA - от приблизительно 3 до приблизительно 60. На основании этих данных кормовая композиция и соответствующий рацион, содержащие один или несколько из этих ингредиентов, могут быть приготовлены и использованы для регуляции генов, которые дифференциально экспрессируются в отклоняющихся от нормы животных в сравнении с нормальными животными. Такая регуляция будет вызывать модуляцию патологических нарушений мышечно-скелетных суставов в животных и, следовательно, в одном варианте осуществления, стимулировать смещение в сторону желаемого или нормального статуса и стимулировать лучшее здоровье и самочувствие этого животного.
Пример 2: Процедуры выделения РНК
Материалы и способы. Следующие общие процедуры могут быть использованы для выделения РНК из образцов тканей собак и кошек для анализа экспрессии генов с использованием микрочипов генов, как описано далее в примерах этого описания. Лицу с обычной квалификацией в данной области будет очевидно, что эти процедуры или их модификации, общепризнанные в данной области, могут быть применены для выделения РНК из образцов ткани или биологических жидкостей для дополнительного анализа экспрессии генов с использованием различных аналитических процедур, доступных лицу с обычной квалификаций в данной области, в частности, технологий микроматриц (микроэрреев).
Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) из ткани
Образцы ткани могут быть собраны, заморожены в жидком азоте, оттаяны и затем гомогенизированы и обработаны с использованием способа экстракции РНК с TRIzol для получения РНК хорошего качества, которую затем подвергают дальнейшему анализу.
Материалы: лед, жидкий азот, замороженная ткань собачьих или кошачьих, лизисный реагент TRIzol, хлороформ минимально 99%, изопропиловый спирт, 70% этанол (приготовленный с абсолютным этанолом и деионизованной не содержащей РНКаз водой), РНКаза Zap, деионизованная вода, раствор РНК для хранения, из Ambion.
Оборудование: гомогенизатор Ultra-Turrax T25 Power, центрифуга Beckman Coulter Allegra 25R, центрифуга Эппендорфа, пинцет, скальпель, твердая поверхность для резания, т.е. доска для резки, не содержащие ДНКазы и РНКазы стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, одноразовые пропиленовые пробирки, не содержащие ДНКазы и РНКазы, объемом 50 мл, пипетки Rainin Pipetman P1000, P200, P20, P10 и P2, кончики для фильтрующих пипеток P1000, P200, P20, P10 и P2, не содержащие ДНКазы и РНКазы, и не содержащие корпия (адсорбирующего материала) салфетки.
Приготовления: Приготовьте полипропиленовые пробирки на 50 мл с 4 мл TRIzol (одна пробирка для каждой ткани, выбранной для выделения РНК).
Гомогенизация ткани: наполните контейнер, способный удерживать жидкий азот, 3-4 ложечками для взвешивания жидкого азота. Поместите кусочек замороженной ткани непосредственно в вышеупомянутый контейнер (ткань должна иметь приблизительно размер горошины) и поместите эту ткань в подходящую помеченную полипропиленовую пробирку на 50 мл (которая уже содержит 4 мл TRIzol). Немедленно начинайте гомогенизацию с использованием гомогенизатора Ultra-Turrax T25 Power. Гомогенизируйте на самой высокой установке (6) в течение 10-15 секунд. Охладите эту пробу на льду в течение дополнительных 10-15 секунд и затем повторите гомогенизацию. Продолжайте повторять, пока эта ткань не будет полностью гомогенизирована и раствор не станет мутным. После полной гомогенизации закройте крышкой пробирку на 50 мл и возвратите на лед. Инкубируйте эти гомогенизированные ткани при комнатной температуре в течение 5 минут перед продолжением процедуры выделения.
Пример 3: Процедуры получения РНК
Выделение РНК: В основном выполняют процедуры, описанные в инструкциях Invitrogen, обеспечиваемых с реагентом TRIzol. Разделите гомогенизированную пробу на четыре аликвоты по 1 мл в четыре микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл. Добавьте 200 мкл хлороформа в каждую аликвоту 1 мл.
Закройте эти пробирки крышками, встряхивайте в течение 15 секунд на вортексе и затем встряхивайте с донышка на крышку. Результатом должны быть розовая молочная жидкость. Инкубируйте эти пробирки при комнатной температуре в течение 2-3 минут. Центрифугируйте эти пробирки в течение 15 минут при 14000 об/мин и 4°С. Перенесите водную фазу (верхний слой) в стерильную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. Типичный объем водной фазы, которая подлежит перенесению в новую пробирку, равен 500 мкл. Будьте уверены, что не происходит переноса промежуточной или нижней фазы. Осадите РНК из раствора добавлением 500 мкл изопропилового спирта в каждую микроцентрифужную пробирку, содержащую этот водный слой. Встряхивайте эти пробирки вверх-вниз в течение по меньшей мере 20 секунд. Инкубируйте эти образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифугируйте эти образцы в течение 10 минут при 14000 об/мин при 4°С. Осторожно удалите супернатант аспирацией жидкости, стараясь не потерять осадок. Добавьте 1 мл 70% этанола для промывания осадка. Сместите этот осадок пощелкиванием по пробирке (или постукиванием пробиркой по лабораторному столу) и встряхивайте для перемешивания. Центрифугируйте в течение 5 минут, 8200 об/мин при 4°С. Удалите осторожно этот супернатант аспирацией жидкости, стараясь не потерять осадок. Используйте не содержащую корпия салфетку для осторожного впитывания избытка этанола для гарантии того, что этот осадок является сухим. Ресуспендируйте каждый осадок в 30 мкл раствора для хранения РНК. Смешивайте осторожно пипетированием, пока РНК не перейдет опять в раствор, и затем храните при -80°C. Может быть необходимым встряхивание этого образца на вортексе в течение нескольких секунд при низкой скорости для облегчения ресуспендирования этой РНК. Если необходимо, центрифугируйте образцы с использованием микроцентрифуги перед замораживанием.
Очистка РНК: Процедуры, приведенные в руководстве RNeasy Mini Handbook, являются следующими.
Выделение РНК из клеток, культивируемых в камерах OptiCell с использованием мининабора RNeasy.
Клетки, культивированные из клеточных линий млекопитающих, используют для выделения РНК хорошего качества, которую затем используют для будущего более позднего анализа геном. Вся работа, связанная с культивированием этих клеток, должна выполняться при строгих асептических условиях.
2
Реагенты: 10X ЗФР, деионизованная НО, абсолютный спирт, раствор РНК для хранения, β-меркаптоэтанол, RNase Zap, буфер RLT и буфер RW1, и буфер RPE (обеспечиваемые в мининаборе RNeasy).
Оборудование/Материалы: Мининабор RNeasy, спин-колонки QIAshredder, нож OptiCell, стерильный шприц на 20 мл, кончики OptiCell, клеточный скрепер, пипетка P1000 Pipetman, Rainin, пипетка P200 Pipetman, Rainin, фильтрующие кончики пипетки на 100-100 мкл, фильтрующие кончики пипеток на 1-200 мкл, пипетки для стерильного переноса, стерильный резервуар на 55 мл раствора, стерильные микроцентрифужные пробирки на 5 мл и микроцентрифуги Эппендорфа.
Растворы: Буфер RLT (исходный ТВ, обеспечиваемый в мининаборе RNeasy); - добавьте 100 мкл β-меркаптоэтанола на 10 мл буфера RLT перед началом протокола. 70% этанол: приготовьте 50 мл 70% этанола добавлением 35 мл абсолютного этанола к 15 мл деионизованной не содержащей РНКаз воды. 1X ЗФР: не содержащая РНКаз вода. Отфильтруйте этот раствор с использованием фильтра 0,22 мкм.
Процедура: Удаление клеток из камеры OptiCell (продолжайте это с одной OptiCell каждый раз). Проверяйте эти клетки под микроскопом для гарантии того, что эти клетки являются живыми перед выделением РНК. Удаляйте и выбрасывайте среду культуры клеток. С использованием ножа OptiCell отрежьте верхнюю мембрану, обнажая клетки на нижней мембране. Промойте эту мембрану, к которой прикреплены клетки, три раза 1Х ЗФР. Пипетируйте 600 мкл раствора буфера RLT (содержащего β-Меркаптоэтанол) на центр мембраны, к которой прикреплены клетки. С использованием клеточного скребка (скрепера) осторожно распределите буфер RLT по всей поверхности этой мембраны и затем соберите эту жидкость в одном углу. Удалите пипеткой весь объем буфера RLT и поместите в спин-колонку (колонку для центрифугирования) QIAshredder.
Выделение РНК: центрифугируйте спин-колонки QIAshredder при 14000 об/мин в течение 2 минут. Выбросите спин-колонку, но сохраните пробирку для сбора и ее содержимое. Добавьте 600 мкл 70% этанола в пробирку для сбора и перемешайте хорошо пипетированием (общий объем теперь равен 1,2 мл). Перенесите 600 мкл этого клеточного лизата в миниколонку RNeasy и центрифугируйте в течение 15 секунд при 14000 об/мин. Выбросите проходящий через колонку раствор, но сохраните пробирку для сбора и спин-колонку. Перенесите остальной объем клеточного лизата (~600 мкл) на эту спин-колонку и повторите это центрифугирование. Выбросите проходящий через колонку раствор, но сохраните пробирку для сбора и спин-колонку. Добавьте 700 мкл буфера RW1 к этой спин-колонке. Центрифугируйте в течение 15 секунд при 14000 об/мин для промывания этой колонки. Выбросите проходящий через колонку раствор и пробирку для сбора. Перенесите эту спин-колонку в новую пробирку для сбора на 2 мл и добавьте 500 мкл буфера RPE в эту колонку. Центрифугируйте в течение 15 секунд при 14000 об/мин. Выбросите проходящий через колонку раствор, сохраните пробирку для сбора/колонку. Добавьте еще 500 мкл буфера RPE в эту колонку. Центрифугируйте в течение 2 минут при 14000 об/мин. Перенесите эту спин-колонку в пробирку для сбора на 1,5 мл. Добавьте 30 мкл раствора для хранения РНК непосредственно на мембрану из силикагеля и центрифугируйте в течение 1 минуты при 14000 об/мин для элюции этой РНК. Храните конечную РНК при -70°C.
Анализ RNA 6000 nano
С использованием биоанализатора Agilent 2100 и анализа RNA 6000 nano анализируйте РНК, выделенную из культивируемых клеток млекопитающего, лимфоцитов или тканей, на качество.
Реагенты: гелевый матрикс RNA 6000 Nano, концентрат красителя RNA 6000 Nano, маркер RNA 6000 Nano, (все из вышеуказанных реагентов содержатся в наборе для анализа 6000 Nano Assay kit, Agilent), лэддер RNA 6000, RNase Zap и не содержащая РНКаз вода, из Ambion.
Оборудование/другие материалы: Установка для праймирования чипа (Agilent Chip Priming Station), Agilent, чип RNA 6000, Agilent, очищающие электроды реагенты, P2, P10, P200 и P1000 пипетки Rainin Pipetman, стерильные, не содержащие ДНКаз/РНКаз кончики фильтрующих пипеток, микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл, стерильные, вортекс, вортексный смеситель IKA, микроцентрифуга и нагревающий блок.
Процедура: Эта процедура предоставляется в Reagent Kit Guide, RNA 6000 Nano Assay, Edition November 2003 технологиями Agilent Technologies. Эти процедуры выполняют, как указано в этом руководстве, со следующими модификациями: приготовление геля, с. 17 – не разделяя отфильтрованный гель на аликвоты 65 мкл, каждая, держите этот исходный отфильтрованный гель в первоначальной микроцентрифужной пробирке и берите аликвоты 65 мкл по мере необходимости. Нанесение маркера RNA 6000 Nano, с. 22 – добавьте 1 мкл не содержащей РНКаз воды (вместо маркерв RNA 6000 Nano) к каждой лунке для образцов, которые не будут содержать образцы. Это не только сберегает количество используемого маркера, но также служит в качестве отрицательного контроля, чтобы видеть, что ни один из этих реагентов не загрязнен, в том числе не содержащая РНКаз вода. Нанесение лэддера и образцов, с. 23 – денатурируйте нагреванием эти образцы и лэддер RNA 6000 в течение дополнительных 30 секунд (в целом 2,5 минут) при 71°C. Начало Chip-эксперимента, с. 26 – выберите опцию "Eukaryote Total RNA Nano" из меню этого анализа.
Пример 4: Анализ Affymetrix GeneChip-экспрессии
Экспрессию генов анализируют с использованием ген-чипа Affymetrix (Canine 1 и Canine 2 GeneChip), матриц, которые коммерчески доступны из Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA 95051. Тотальную РНК обратно транскрибируют в кДНК. Эту кДНК используют для генерирования кРНК, которую фрагментируют и используют в качестве зондов для гибридизации ген-чипа. Этот ген-чип промывают, и сигнал гибридизации измеряют лазерным сканером Affymetrix. Затем данные гибридизации валидируют и нормализуют для дальнейшего анализа.
Материалы: Affymetrix обеспечивает большинство этих реагентов и набор. Другие реагенты, перечисленные в руководстве Affymetrix Manual, но не поставляемые в этом наборе, могут быть получены отдельно (см. GeneChip Expression Analysis Technical Manual (701021 Rev.4) в отношении подробностей), RNase Zap и деионизованная вода.
Оборудование: Микроцентрифуга Эппендорфа, не содержащие ДНКаз и РНКаз стерильные микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл, одноразовые не содержащие ДНКаз и РНКаз полипропиленовые пробирки на 50 мл, пипетки Rainin Pipetman Р1000, Р200, Р20, Р10 и Р2, фильтрующие кончики пипеток для P1000, P200, P20, P10 и P2, не содержащие ДНКаз и РНКаз, и термоциклер Peltier PTC-200.
Процедура: Точно следуйте всем процедурам, описанным в GeneChip Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix Copyright 1999-2003). Используйте 5 микрограммов тотальной РНК для синтеза первой цепи кДНК. Используйте либо термоциклер Peltier PTC-200, либо блок нагревания для контроля температуры при реакциях и денатурации зондов. Контроль качества выполняют с использованием чипов RNA NanoDrop с BioAnalyer 2100. Используйте Формат 100 (Мидиэррей) для собачьего ген-чипа.
Пример 5: Процедуры анализа в случае кошек
Цельную кровь получают из кошек в исследованиях, обеспеченных здесь, с использованием пробирок для РНК PAXgene™, и тотальную РНК выделяют из образцов цельной крови с использованием набора для выделения РНК PAXgene™ в соответствии со способами, описанными ниже.
Выделение РНК крови PAXgene™: пробирки для РНК крови PAXgene™ и набор для РНК крови PAXgene™ (Qiagen) используют вместе для выделения и очистки внутриклеточной РНК из цельной крови, полученной из кошек, как описано ниже (см. также справочник PAXgene™ Blood RNA Kit Handbook, PreAnalytix, June 2005). Вкратце, кровь собирают с использованием иглы Vacutainer, непосредственно в пробирку для РНК крови PAXgene™ и затем подвергают нескольким раундам стадий центрифугирования, промывки и очистки, которые приводят к РНК высокого качества. Затем эту РНК подвергают стадии контроля качества и затем используют в будущих количественных анализах ПЦР реального времени и/или анализах микроматриц с использованием изготовленного на заказ патентованного кошачьего ген-чипа, производимого на платформе Affymetrix.
Приготовления к анализу:
Инкубируйте пробирки PAXgene™ (содержащие кровь) в течение минимально 2 часов при комнатной температуре перед началом этого анализа. Если эти пробирки замораживают и не дают им инкубироваться в течение 2 часов перед замораживанием, они должны находиться при комнатной температуре для оттаивания в течение дополнительных 2 часов. Переворачивайте каждую пробирку PAXgene™ 8-10 раз перед первым центрифугированием. При использовании буфера BR4 (буферы включены с набором для РНК крови PAXgene™) в первый раз, добавьте 4 объема 96-100% этанола к концентрированному буферу для получения рабочего раствора. Предварительно нагрейте два блока нагревания перед началом этого анализа - 65°C и 55°C. Приготовьте исходный раствор ДНКазы I (набор не содержащих РНКазы ДНКаз включен с набором для РНК крови PAXgene™). Растворите твердый фермент ДНКазу I в 550 мкл не содержащей РНКазы воды, обеспечиваемой этим набором. Будьте уверены, что вы не потеряете ДНКазу I при удалении крышки. Перемешайте осторожно переворачиванием этой пробирки. Не встряхивайте вортексом или центрифугированием. Приготовьте смесь фермента ДНКазы I и буфера RDD (компонента набора) (достаточный объем для количества образцов, обрабатываемых на одну партию). Каждый образец требует 70 мкл буфера RDD и 10 мкл ДНКазы I (т.е. 20 образцов могли бы требовать коктейль (смесь) из 1,4 мл буфера RDD и 200 мкл ДНКазы I). Этот коктейль должен храниться при 2-8°C до использования. Воссозданный фермент является хорошим в течение периода до 6 недель при 2-8°C.
Хранение образцов:
Пробирки PAXgene™ (содержащие кровь) могут храниться при комнатной температуре в течение периода до 3 дней перед обработкой. В соответствии с вкладышем продукта, обеспечиваемым с пробирками для РНК крови PAXgene™, клеточный профиль РНК является стабильным в этих условиях в течение периода до 3 дней. Однако он может варьироваться между видами. Пробирки PAXgene™ могут также храниться при 4°С в течение периода до 5 дней. Если требуется долгосрочное хранение, пробирки PAXgene™ могут храниться при -20°C или –70°C в течение периода до 6 месяцев. Пробирки должны замораживаться в рыхлой проволочной сетке в вертикальном положении. Рекомендуется замораживать сначала при -20°C и затем переносить на -70°С, если пробирки будут храниться при -70°C. После изъятия этих пробирок из холодильника они должны быть оттаяны при комнатной температуре (температуре, не превышающей 22°C). Каждая пробирка должна быть перевернута 10 раз перед продолжением анализа.
Выделение РНК из цельной крови:
Центрифугируйте пробирки для РНК крови PAXgene™ при 4000 × g в течение 10 минут. Удалите супернатант декантированием и выбросите. Промокните избыток супернатанта, оставшийся на крае пробирки PAXgene™. Добавьте 4 мл не содержащей РНКазы воды к осадку и закройте новой крышкой Hemogard. Ресуспендируйте осадок при помощи вортекса и затем центрифугируйте при 4000 × g в течение 10 минут. Удалите супернатант декантированием и выбросите. Промокните избыток супернатанта, оставшийся на крае пробирки PAXgene™. Добавьте 360 мкл буфера BR1 (компонента набора) к этому осадку и осторожно пипетируйте, пока осадок не ресуспендируется полностью. Перенесите этот образец в стерильную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и добавьте 300 мкл буфера BR2 (компонента набора) и 40 мкл протеиназы K (не смешивайте буфер BR2 и протеиназу K перед добавлением к образцу). Перемешайте каждую пробирку тщательно при помощи вортекса и поместите в термомиксер, предварительно нагретый до 55°C. Инкубируйте/встряхивайте эти пробирки в течение 10 минут при 1400 об/мин. Пипетируйте этот лизат в спин-колонку QIAshredder, помещенную в пробирку для сбора на 2 мл. Центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 3 минут. Перенесите супернатант проходящей фракции в стерильную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. Добавьте 350 мкл 96-100% этанола и осторожно перемешайте пипетированием. Добавьте 700 мкл образца в спин-колонку PAXgene™, помещенную в пробирку для сбора на 2 мл, и центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 1 минуты. Перенесите спин-олонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора на 2 мл и отбросьте проходящий через колонку раствор и старую пробирку для сбора. Добавьте оставшийся объем этого образца в спин-колонку PAXgene™. Центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 1 минуты.
Выбросите старую пробирку для сбора и проходящий через колонку раствор из центрифугирования спин-колонки, описанного непосредственно выше. Поместите спин-колонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора на 2 мл. Добавьте 350 мкл буфера BR3 (компонента набора) в спин-колонку PAXgene™ и центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 1 минуты. Выбросите проходящий через колонку раствор и пробирку для сбора. Поместите эту колонку в новую пробирку для сбора на 2 мл и добавьте 80 мкл коктейля ДНКаза I/буфер RDD (см. "Приготовления к анализу") непосредственно на мембрану колонки и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавьте другие 350 мкл буфера BR3 в спин-колонку PAXgene™. Центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 1 минуты. Перенесите спин-колонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора на 2 мл и выбросите старую пробирку для сбора и проходящий через колонку раствор.
Добавьте 500 мкл буфера BR4 (компонента набора) в спиновую колонку PAXgene™. Центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 1 минуты. Перенесите спин-колонку PAXgene™ в новую пробирку для сбора на 2 мл и выбросите старую пробирку для сбора и проходящий через колонку раствор. Добавьте другие 500 мкл буфера BR4 (компонента набора) в спин-колонку PAXgene™. Центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 3 минут для сушки мембраны спин-колонки. Выбросите пробирку для сбора и проходящий через колонку раствор и поместите эти колонки в другую пробирку для сбора. Центрифугируйте эти образцы опять при 14000 об/мин в течение дополнительной минуты для дополнительной сушки мембраны колонки. Выбросите проходящий через колонку раствор и пробирку для сбора. Перенесите спин-колонку PAXgene™ в пробирку для элюата на 1,5 мл. Добавьте 40 мкл буфера BR5 (компонента набора) непосредственно на мембрану спин-колонки PAXgene™. Центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 1 минуты. Выньте спин-колонку PAXgene™ и пипетируйте элюат в пробирку на 1,5 мл на ту же самую спин-колонку PAXgene™. Возвратите эту спин-колонку PAXgene™ в ту же самую пробирку для элюата на 1,5 мл и центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 1 минуты. Инкубируйте конечный элюат при 65°C в течение 5 минут и немедленно охладите на льду. Храните конечную пробу РНК при -80°C для будушего применения.
Пример 6: Экспрессия генов в кошках с остеоартритом в сравнении с контрольными кошками
Исследования проводят в соответствии с примером 5 с использованием неартритных кошек и кошек с остеоартритом для определения лежащих в основе различий экспрессии генов между неартритными кошками и кошками с остеоартритом. В первом исследовании выполняют фоновое сравнение между этими двумя группами кошек для определения лежащих в основе различий между неартритными кошками и кошками с остеоартритом. Процедуры, описанные в основном в примерах этого описания, можно использовать для получения образцов тканей и биологических жидкостей.
Что касается исследований, предоставленных здесь, кошек с остеоартритом классифицировали в соответствии с ранее опубликованным способом, т.е. все неартритные кошки являются кошками "степени 0", указывающей, что сустав, по-видимому, является нормальным, кошки с остеоартритом имеют степени, которые являются либо степенью 1 (присутствие малого количества энтезофитов и малого количества остеофитов) или степенью 2 (более явные энтезофиты и остеофиты). Кошек с тяжелым остеоартритом (степени 3) не включают в это исследование.
Патентованный, изготовленный на заказ ген-чип кошачьих (Affymetrix) используют для оценивания фоновой экспрессии генов в кошках с остеоартритом или без остеоартрита (10 нормальных, 10 артритных животных). Как указывалось выше, анализы с ген-чипом выполняют с использованием общепринятых способов и в соответствии с инструкциями производителя для получения фонового сравнения между этими двумя группами для определения лежащих в основе различий экспрессии генов между неартритными кошками и кошками с остеоартритом.
Необработанные данные ген-чипа нормализуют с использованием алгоритма нормализации Robust Multiarray Average (RMA) (Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264) и затем подвергают статистическому анализу с использованием алгоритма Support Vector Machine (SVM) (Partek Genomic Suite, Version 6) для определения различий экспрессии генов, которые могут дифференцироваться между артритными и неартритными животными. Гены, идентифицирующие биомаркеры ОА, отбирают на основе предела р-величины и кратного изменения (FC).
Анализ экспрессии генов проводят в артритных и неартритных кошках, и эти результаты представлены на фигурах 3 и 15. Гены, в отношении которых было обнаружено, что они повышающим образом регулируются более чем 1-кратно в артритных кошках, были следующими: IL-1-бета, TNF, HMGB1, p38, TLR2 и TLR4. Эти гены и их генные продукты ассоциированы с воспалительными процессами и могли бы рассматриваться как маркеры патологических нарушений мышечно-скелетных суставов, в частности, остеоартрита. Кроме того, было обнаружено, что следующие гены повышающим образом регулируются более чем 1-кратно в артритных кошках: COL2A1, COL1A1, COL3A1, COL4A1 и Аггрекан. Эти гены и их генные продукты ассоциированы с деградацией хряща и могли бы служить в качестве маркеров патологических нарушений мышечно-скелетных суставов, в частности, остеоартрита.
Эти результаты из исследования, проводимого в соответствии с примером 6, указывают на то, что экспрессия генов может быть использована для различения между нормальными кошками и кошками с остеоартритом. Дифференциально экспрессируемые гены, ассоциированные с воспалением в артритных кошках, показаны на фигурах 3 и 15. Таким образом, эти идентифицированные гены могут служить в качестве биомаркеров в кошках для описанных здесь изобретений и включают следующие гены: IL-1-бета, TNF, HMGB1, p38, TLR2, TLR4, COL2A1, COL1A1, COL3A1, COL4A1 и Аггрекан.
Пример 7: Средняя активность артритных кошек после введения кормовой композиции j/d для кошек.
Клинические данные, полученные из исследований действия пищевых композиций, включающих артритных и неартритных кошек, описанные в примере 6, указывают на то, что введение с кормом может влиять на мобильность артритных кошек и увеличивать мобильность артритных кошек. Кошки, которых кормили рационом кормовой композиции для кошек j/d согласно данному изобретению, показали статистически значимое увеличение активности в сравнении с кошками, которых кормили контрольным рационом. Эти результаты клинического исследования представлены на фигуре 16. На основе данных наблюдений кошки, вскармливаемые кормовой композицией j/d по данному изобретению, обнаруживали большее, чем 30% увеличение в подвижности, что свидетельствовало о достижении улучшения лежащей в основе симптоматологии остеоартрита посредством введения тестируемой диеты согласно данному изобретению. На основании данных, представленных на фигуре 16, квалифицированный специалист может сделать вывод, что эти кошки имели более высокую подвижность, меньшую боль и воспаление в результате введения в рацион тестируемой кормовой композиции j/d.
Пример 8. Активность в ночное время у собак после введения композиции j/d.
Клиническое испытание, включающее введение кормовой композиции j/d для собак согласно данному изобретению, проводили на собаках. Проводили наблюдения активности в ночное время артритных собак, получавших кормовую композицию j/d, и регистрировали в сравнении с собаками, получавшими контрольный корм, и собаками, не получавшими лекарственной терапии. Измерения выполняли с использованием устройств ACTIWATCH. Эти устройства являются регистрирующими устройствами основанных на актиграфии данных, которые регистрируют интегрированное цифровым образом измерение макроскопической двигательной активности. Каждое устройство использует принципы актиграфии для обеспечения вариабельности режима сна, статистики количества и качества и распределения активности дневного времени. Эти устройства собирают объективные данные, относящиеся к амбулаторной среде животного. Результаты этого клинического испытания продемонстрировали значимое уменьшение активности в ночное время артритных собак, демонстрируя тем самым, что собаки, получавшие кормовую композицию j/d для собак, имели большее облегчение и комфорт от лежащей в основе артритной симптоматологии, включающей тугоподвижность и боль суставов. Данные из этого клинического испытания представлены на фигуре 17.
Пример 9: Уровни белковых маркеров в собаках после получения кормовой композиции j/d
для собак.
Фоновые уровни двух белковых маркеров, ассоциированных с деградацией хряща в собаках, C2C и C1,C2, получали в артритных и неартритных собаках. Брали образцы крови этих животных и тестировали их общепринятым способом, описанным в этом документе. Результаты этого тестирования продемонстрировали, что продукты генов этих маркеров увеличивались в артритных собаках и могли бы использоваться в качестве маркеров для определения эффективности питательных компонентов на экспрессии генов. Эти фоновые данные представлены на фигурах 5 и 6.
Клинические данные, полученные из исследований действия кормовых композиций, включающих артритных и неартритных собак. Тест-собаки, описанные в этом примере, получали рацион по данному изобретению, который был обозначен как кормовая композиция j/d на фигуре 4. Производили оценивания уровней артритных маркеров C2C и C1,C2 и уровня другого белкового маркера, о котором известно, что он является релевантным в отношении патологических нарушений мышечно-скелетных суставов, а именно коллагена CTX-II. Данные, изображенные на фигурах 10, 11 и 12, представляют уровни белковых маркеров, определяемых в крови тест-животных и контрольных животных. Собаки, получавшие кормовую композицию j/d для собак, как представлено на фигуре 4, показали статистически значимое уменьшение в уровнях C2C, C1,C2 и CTX-II в плазме, как показано на фигурах 10, 11 и 12. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что данные этого биомаркера поддерживают клиническое наблюдение, что собаки, получавшие кормовые композиции по данному изобретению, в частности, кормовую композицию j/d, как показано в этом примере, обнаруживают улучшение в клинической симптомопатологии лежащего в основе заболевания патологического процесса, в этом случае остеоартрита, которое коррелирует с понижающей регуляцией определенных генов и уменьшенной экспрессией определенных генных продуктов, которые были ассоциированы с деградацией хряща и состояниями локального воспаления суставов, в том числе остеоартрита.
Пример 10: Ген-чип-анализы повышающим образом и понижающим образом регулируемых генов семейства собачьих в артритных и неартритных собачьих.
Коммерчески доступный чип (микропроцессор) генов семейства собачьих (Affymetrix GeneChip2) использовали для оценивания исходной (фоновой) экспрессии генов в двух группах собак с артритом и без артрита, определяемой в соответствии со стандартными клиническими диагностическими критериями, известными в данной области. Ген-чип-анализы выполняли с использованием общепринятых способов и в соответствии с инструкциями изготовителя. С использованием общих процедур анализа экспрессии примера 1 и аналитических способов, описанных в общем виде в других примерах, представленных в этом описании, выполняли анализ экспрессии генов для получения фонового сравнения между этими двумя группами для определения лежащих в основе различий экспрессии между неартритными собаками и артритными собаками.
В соответствии со стандартными процедурами тестирования питания животных, известными квалифицированному в данной области специалисту, артритным и нормальным собакам предоставляли тестируемые диеты, содержащие кормовую композицию, названную j/d, и затем анализировали изменения в экспрессии генов в животных с использованием кОТ-ПЦР.
Необработанные данные чипа генов нормализуют с использованием алгоритма нормализации Robust Multiarray Average (RMA) (Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264) и затем подвергают статистическому анализу с использованием алгоритма Support Vector Machine (SVM) (Partek Genomic Suite, Version 6) для определения различий экспрессии генов, которые могут дифференцироваться между артритными и неартритными животными. Гены, идентифицирующие биомаркеры артрита, отбирают на основе предела р-величины и кратного изменения (FC).
Необработанные данные чипа генов нормализуют с использованием алгоритма нормализации Robust Multiarray Average (RMA) (Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264) и затем подвергают статистическому анализу с использованием алгоритма Support Vector Machine (SVM) (Partek Genomic Suite, Version 6) для определения различий экспрессии генов, которые могут дифференцироваться между артритными и неартритными животными. Гены, идентифицирующие биомаркеры ОА, отбирают на основе предела р-величины и кратного изменения (FC).
Результаты из этих исследований указывают на то, что экспрессия генов может быть использована для различения между нормальными собаками и собаками с артритом. Дифференциально экспрессируемые гены, ассоциированные с воспалением в артритных собаках, можно видеть на фигурах 1, 2, 7 и 8. Не ограничивая обобщенное раскрытие, представленное в этой заявке, гены, представленные на фигурах 1, 2, 7 и 8, могут служить в качестве биомаркеров для описанных здесь изобретений и включают аннексин А1, катепсин D, катепсин F, катепсин S, RELA, HMGB1, IL-15, IL-17-рецептор, TLR4, COL2A1, COL1A1, COL4A1, MMP-13, TIMP-2, MMP-2, FLAP, PLA2, MAPK1, MAPK2.
Пример 11: Ген-чип-анализы повышающим образом и понижающим образом регулируемых генов семейства собачьих в артритных и неартритных собачьих, получавших в качестве рациона кормовую композицию j/d
Коммерчески доступный чип (микропроцессор) генов семейства собачьих (Affymetrix GeneChip2) использовали для оценивания экспрессии генов в двух группах собак с остеоартритом и без остеоартрита. В целом исследовали 30 артритных собак и 31 неартритную собаку. Ген-чип-анализы выполняли с использованием общепринятых способов и в соответствии с инструкциями изготовителя. С использованием общих процедур анализа экспрессии примера 1 и аналитических способов, описанных в общем виде в других примерах, представленных в этом описании, выполняли анализ экспрессии генов. Было определено, что первая группа из 30 тестируемых животных является артритной в соответствии с клиническими диагностическими процедурами, которые хорошо известны в данной области. Считали, что вторая группа собак является неартритной в соответствии с теми же самыми клиническими диагностическими критериями. После стандартных процедур тестирования питания животных, известных специалисту с обычной квалификацией в данной области, артритным и нормальным собакам предоставляли тест-диеты, содержащие кормовую композицию, названную j/d, и затем изменения в экспрессии генов в этих животных анализировали с использованием кОТ-ПЦР.
После стандартных процедур тестирования питания животных, известных квалифицированному в данной области специалисту, артритным и нормальным собакам предоставляли тест-диеты, содержащие кормовую композицию, названную j/d, и затем изменения в экспрессии генов в этих животных анализировали с использованием кОТ-ПЦР.
Что касается кОТ-ПЦР, используют технологию Taqman-зондов, и все анализы проводят с использованием устройства ПЦР реального времени Applied Biosystems 7500. Данные анализируют с использованием версии 1.2.2. пакета программ для детектирования последовательностей, обеспечиваемой изготовителем.
С использованием образцов тканей, приготовленных, как описано в примерах, коммерчески доступный чип (микропроцессор) генов семейства собачьих (Affymetrix GeneChip2) используют для оценивания экспрессии генов в собаках с артритом и без артрита. Необработанные данные чипа генов нормализуют с использованием алгоритма нормализации Robust Multiarray Average (RMA) (Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264) и затем подвергают статистическому анализу с использованием алгоритма Support Vector Machine (SVM) (Partek Genomic Suite, Version 6) для определения различий экспрессии генов, которые могут дифференцироваться между артритными и неартритными животными. Гены, идентифицирующие биомаркеры артрита и воспаления, отбирают на основе предела р-величины и кратного изменения (FC).
Данные из этого примера представлены в таблице 3. Эти данные содержат 2383 регистраций, когда используется предел кратного изменения 1,1, предел р-величины 0,05 и предел Q-величины 0,3. С использованием этих аналитических критериев кратное изменение, большее 1, подразумевает, что эти зонды является повышающим образом (UP) регулируемыми в образцах, взятых из группы артритных собак. Данные, представленные в таблице 3, идентифицируют в первой колонке уникальный идентификационный номер зонда Affymetrix, и, соответственно, после этого p-величины, q-величины, кратное изменение, величины 1/кратных изменений, аннотацию Top BLAST, процент совпадений, номер доступа человека, наивысшее совпадение номера доступа, символ гена и описание гена. Квалифицированный специалист будет расшифровывать из этих данных следующую информацию с использованием только ординарного экспериментального анализа: критерии предела кратного изменения, представляющие интерес гены, которые повышающим образом или понижающим образом регулировались, и идентификацию таких генов посредством аннотации BLAST, родственные номера доступа человека и последовательность для каждого такого идентифицированного гена, а также соответствующие продукты генов и последовательности таких продуктов генов на основе информации, доступной от изготовителя, а также из баз данных последовательностей генов, которые легко доступны квалифицированному в данной области специалисту. Кроме того, последовательности уникальных зондов, используемых в матрицах (эрреях) Affymetrix, публично доступны с использованием ссылки на опубликованные источники изготовителя. Подобным образом, опубликованная информация о последовательностях и идентификация соответствующих зондов, используемых в версиях 1 и 2 чипов Affymetrix, являются легко доступными от изготовителя, так же, как и сравнение наборов зондов друг с другом. Из этих данных квалифицированный работник может идентифицировать и использовать такие данные об экспрессии генов, идентифицированные гены, которые имели нарушенную регуляцию, и их соответствующие продукты генов в практике приготовления и использования композиций и изделий по данному изобретению, а также в практике способов изготовления и применения открытий, описанных в этом описании изобретения. Без намерения ограничения степени изобретений, раскрытых и заявленных в этой заявке, некоторые представляющие интерес гены и продукты генов могут быть идентифицированы как связанные в высокой степени с артритными состояниями у собак и кошек. Эти и другие гены и продукты генов, описанные в данных, представленных в таблице 3, могут предположительно считаться генами, оказывающими благоприятное действие на лежащем в основе патологическом нарушении мышечно-скелетных суставов, в частности, артритных состояниях, испытываемых собаками и кошками, когда эти животные получают композиции согласно данному изобретению, в частности, кормовые композиции, обозначаемые j/d, которые модулируют представляющие интерес гены, представленные в таблице 3.