СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО И АВАРИЙНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
DIAGNOSTIC METHOD OF CHRONICAL AND ACCIDENTAL SOILS POLLUTION BY THE HEAVY METALS BY MEANS OF DEHYDROGENASE ENZYME ACTIVITY ANALYSIS

Изобретение относится к области геоэкологии и может быть использовано при оценке экологической ситуации на территориях функционирования промышленных объектов и осуществляется путем оперативной диагностики хронического и аварийного загрязнения почв тяжелыми металлами через анализ активности фермента дегидрогеназы. При этом учитывается то обстоятельство, что загрязнение почв тяжелыми металлами происходит главным образом через газопылевые выбросы высокотемпературных технологических процессов (пирометаллургии, обжига цементного сырья, сжигания угля, нефти, нефтяного попутного газа, бензина, дизельного и котельного топлива и др.), которые путем седиментации и атмосферными осадками попадают на рельеф местности.
Известен способ определения участков, загрязненных тяжелыми металлами и токсичными элементами (Патент на изобретение №2469359. Способ определения участков загрязнения тяжелыми металлами и токсичными элементами. Рыбас О.В., Бердников Н.В.). Существенным недостатком известного способа является то, что в нем для определения так называемых полей распределения концентраций тяжелых металлов и токсичных элементов на исследуемой территории, в качестве атрибутивной информации используются данные анализа содержания этих веществ в поверхностных водах, которые загрязняются в результате стока в них вод атмосферных осадков с территории водосбора. Получаемые при этом результаты никаким образом не могут характеризовать хроническое или аварийное загрязнение почвы, в которую вещества поступают в основном с газопылевыми выбросами и значительная часть которых сорбируется почвенным поглощающим комплексом.
Известен другой способ определения техногенного загрязнения почв и донных осадков металлами (Патент на изобретение №2110068. Способ определения техногенного загрязнения почв и донных осадков металлами. Молостовский Э.А., Еремин В.Н.). Существенным недостатком известного способа является то, что здесь производится всего лишь косвенное определение степени загрязнения тяжелыми металлами почв и донных осадков путем измерения магнитной восприимчивости этих природных сред на фоновом и исследуемом участках. Получаемые при этом результаты также не позволяют установить факт хронического или аварийного загрязнения тяжелыми металлами почв или донных осадков. Кроме того, данный способ не может быть применим к широкому спектру почв, так как последние различаются по своей магнитной восприимчивости, зависящей от соотношения в них диа-, пара- и ферромагнетиков, то есть значение этого показателя возрастает в почвах, богатых окристаллизованными оксидами железа и снижается в оглеенных почвах, органических почвенных горизонтах и при возрастании выветрелости первичных пород.
Целью предлагаемого нами изобретения является решение технической задачи оперативной диагностики факта хронического и аварийного загрязнения почв тяжелыми металлами посредством анализа активности фермента дегидрогеназы.
Данная техническая задача решена благодаря тому, что на исследуемой территории, по карте-схеме крупного масштаба (M 1:200000 и крупнее), выделяют первый типичный участок без явного источника эмиссии тяжелых металлов и второй типичный участок с явным источником эмиссии приоритетных тяжелых металлов. Затем с этих двух участков отбирают соответственно усредненные пробы №1 и №2 почвы и оперативно (в течение 1 суток) определяют в них активность фермента дегидрогеназы спектрофотометрическим методом.
При этом о хроническом загрязнении почвы тяжелыми металлами, как о перманентном явлении, судят по повышению активности фермента в пробе №2 относительно пробы №1. Этот феномен объясняется адаптацией микроорганизмов, как продуцентов фермента дегидрогеназы, к хроническому загрязнению почвы, что происходит путем естественного отбора резистентных (устойчивых) к тяжелым металлам форм микроорганизмов, снижения токсичности тяжелых металлов посредством их сорбции клеточными оболочками микроорганизмов и восстановления микроорганизмами ионов тяжелых металлов до элементарной металлической формы. Более того свойство резистентности микроорганизмов к тяжелым металлам не утрачивается, то есть это свойство генетически передается от одной генерации микроорганизмов к другой.
Об аварийном загрязнении почвы тяжелыми металлами, как об эпизодическом явлении, судят по снижению активности фермента в пробе №2 относительно пробы №1. Этот феномен объясняется «шоковым» эффектом залпового аварийного газопылевого выброса тяжелых металлов на микроорганизмы почвы, попадающие в нее седиментацией и атмосферными осадками. «Шоковый» эффект выражается в прямом ингибировании каталитической активности дегидрогеназы и задержке продуцирования данного фермента микроорганизмами, вследствие подавления их роста и размножения под действием смеси различных тяжелых металлов.
В целом, рассматриваемый способ диагностики акцентирует свое основное внимание на установлении факта хронического или аварийного загрязнения почв тяжелыми металлами в концентрациях, не вызывающих их химическую стерилизацию, ведущую к уничтожению почвенной «живой фазы» (флоры и фауны), и позволяющих с течением времени в результате различных процессов самоочищения почвы (миграции, сорбции и трансформации тяжелых металлов) вернуться в изначальное функциональное состояние, то есть к статусу до аварийного загрязнения.
В данном способе диагностики в качестве метода анализа используют определение активности фермента дегидрогеназы отобранных проб почвы с применением реактивов - карбоната кальция, водных растворов глюкозы и 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида, насыщенного щелочного раствора пирогаллола и этилового спирта.
Способ осуществляют следующим образом. Отбирают пробы почвы, а именно: пробу №1 из участка без явного источника эмиссии тяжелых металлов и пробу №2 из участка с явным источником эмиссии тяжелых металлов в 6-кратной повторности.
Активность дегидрогеназы проб анализируют с помощью модифицированной колбы Эрленмейера (1) с коленчатым отростком (2), изображенной на фиг. 1.
С целью анализа активности дегидрогеназы, по 1 г пробы отдельно из каждого вышеназванного варианта помещают в модифицированные колбы Эрленмейера (1), в которые затем последовательно добавляют 0,1 г тонко измельченного карбоната кальция, по 1 мл 1%-х водных растворов глюкозы и 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида, бесцветного вещества (а), и все это перемешивают встряхиванием. Далее в коленчатый отросток (2) с помощью шприца вводят насыщенный щелочной раствор пирогаллола (б). Колбы герметизируют, используя вакуумную смазку и ставят на инкубирование в термостат при 30°С на одни сутки.
После завершения инкубирования проб производят экстракцию образующегося в них 2,3,5-трифенилформазана, вещества красного цвета, с помощью этилового спирта (5 раз по 4 мл). Экстракты каждой пробы объединяют до объема 25 мл и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре (при длине волны λ=490 нм). Затем по заранее подготовленному калибровочному графику для концентраций 2,3,5-трифенилформазана (например, 1-30 мкг/л) рассчитывают количество образованного вещества, выражаемое в единицах мкг или мг 2,3,5-трифенилформазана/(г⋅сут), различающееся в различных вариантах, что в результате позволяет судить о факте хронического или аварийного загрязнения почвы тяжелыми металлами.
По результатам этого эксперимента выявляют факт хронического загрязнения почвы тяжелыми металлами, когда активность дегидрогеназы выше в пробе №2, чем в пробе №1, и факт аварийного загрязнения почвы, когда активность дегидрогеназы ниже в пробе №2, чем в пробе №1.
Так, нами на территории с локализацией объекта металлургического производства было установлено, что факт хронического загрязнения почвы участка с явным источником эмиссии смеси приоритетных тяжелых металлов выражается в повышении содержания меди, никеля и свинца соответственно в 2,3, 1,8 и 4,5 раза по сравнению с почвой участка без явного источника эмиссии тяжелых металлов (табл. 1). При этом количество микроорганизмов, продуцирующих дегидрогеназу, в почве участка с явным источником эмиссии тяжелых металлов оказалось выше (на один порядок), чем в почве участка без явного источника эмиссии тяжелых металлов. Активность дегидрогеназы положительно коррелировала с количеством микроорганизмов, то есть в почве участка с явным источником эмиссии тяжелых металлов она оказалась также выше (на 65%), чем в почве участка без явного источника эмиссии тяжелых металлов.
Дальнейшие наблюдения позволили установить факт аварийного загрязнения почвы участка с явным источником эмиссии смеси приоритетных тяжелых металлов, вследствие непредвиденного отключения фильтров газопылевой очистки объекта металлургического производства, что выразилось в повышении содержания меди, никеля и свинца соответственно в 16,6, 12,0 и 37,9 раз по сравнению с почвой участка без явного источника эмиссии тяжелых металлов (табл. 2). При этом количество микроорганизмов, продуцирующих дегидрогеназу, в почве участка с явным источником эмиссии тяжелых металлов оказалось ниже (на 2 порядка), чем в почве участка без явного источника эмиссии тяжелых металлов. Активность дегидрогеназы положительно коррелировала с количеством микроорганизмов, то есть в почве участка с явным источником эмиссии тяжелых металлов она оказалась также ниже (на 50%), чем в почве участка без явного источника эмиссии тяжелых металлов.
Заявляемое техническое решение позволяет корректно диагностировать факт хронического или аварийного загрязнения почв тяжелыми металлами, а также сократить время, повысить точность и качество оценки экологической ситуации на территориях функционирования промышленных объектов.