Исследование количественных и качественных показателей семени трансгенных петухов

УДК 636.5:591.463.1

исследование количественных и качественных показателей семени трансгенных петухов

М.А. ЖИЛИНСКИЙ, аспирант (e-mail: naitkin888@mail.

ru)

A.Н. ВЕТОХ, младший научный сотрудник

Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, руководитель лаборатории

Б.С. ИОЛЧИЕВ, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

B.А. БАГИРОВ, доктор биологических наук, руководитель лаборатории

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, директор

Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубро-вицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

Резюме. Цель исследований заключалась в оценке влияния интеграции рекомбинантной ДНК на качественные и количественные показатели семени трансгенных петухов. Исследования проводили на базе вивария ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2015 г. Объектом исследований служили трансгенные петухи и их нетрансгенные аналоги кросса Шейвер Браун. Трансгенная птица была получена с использованием лентивирусного вектора, содержащего репортер-ный ген GFP (зеленый флюоресцирующий белок). Были изучены количественные и качественные показатели семени трансгенных петухов (n = 8) в сравнении с контролем (n = 8): объем эякулята, подвижность и концентрация спермиев в эякуляте; длина, ширина, периметр, площадь головки, длина хвоста и общая длина сперматозоидов; длина, ширина, периметр, площадь и сохранность акросом. Оценку по данным показателям проводили по стандартным методикам с использованием программного обеспечения NIS-ElementsBR4.30. Морфометрическийанализ сперматозоидов и оценка состояния акросом у трансгенныхпетухов и ихнетрансген-ныханалогов выявили увеличение у трансгенных особей площади головки сперматозоидов на 15% (Р > 0,95) при снижении площади акросом на 7%. При этом отклонений в сохранности акросом у трансгенных петухов, по сравнению с контролем, выявлено не было. Установлена тенденция снижения количественных показателей спермопродукции у трансгенных петухов: объем эякулята, концентрация и подвижность сперматозоидов у данных особей, по сравнению с контролем, были ниже на 20,5 и 16%, соответственно. Это может свидетельствовать о некотором негативном влиянии интеграции трансгена на функциональное состояние половых клеток у исследуемых трансгенных петухов. Ключевые слова: трансгенез, петухи, качество спермы, сперматозоид, акросома.

Для цитирования: Исследование количественных и качественных показателей семени трансгенных петухов / М.А. Жилинский, А.Н. Ветох, Н.А. Волкова, Б.С. Иолчиев, В.А. Багиров, Н.А. Зиновьева// Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 12. С. 98-99.

На сегодняшний день достигнуты значительные успехи в области трансгенеза сельскохозяйственной птицы. С использованием различных методических подходов получены трансгеные куры с интегрированными бактериальными генами LacZ, GFP, р-лактамазы, а также генами человека -а2Ь-интерферона, р-интерферона, гранулоцитарного коло-ниестимулирующего фактора, гормона роста и ряда других [1-5]. Вместе с тем, несмотря на достигнутую относительно высокую эффективность генетической модификации сельскохозяйственной птицы, при дальнейшем разведении таких особей может возникать ряд проблем, связанных с получением трансгенного потомства, в частности, его низкая жизнеспособность ил и

ограниченная возможность его получения. Это может быть обусловлено несколькими причинами. Одной из основных служит низкая фертильность исходных родительских форм. В этой связи, с точки зрения исследования данной проблемы, представляет интерес изучение воздействия трансгенеза на функциональное состояние половых клеток генетически модифицированных особей.

Цель исследований - оценка влияния интеграции рекомбинантной ДНК на качественные и количественные показатели спермопродукции петухов.

Условия, материалы, методы. Исследования проводили на базе вивария ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2015 г. Объектом исследований служили трансгенные петухи и их нетрансгенные аналоги кросса Шейвер Браун. Трансгенная птица была получена с использованием летивирусного вектора, содержащего репортерный ген GFP (зеленый флюоресцирующий белок). Были изучены количественные и качественные показатели семени трансгенных петухов (n = 8) в сравнении с контролем (n = 8). Перед получением семени петухов в течение 1 -2 недель подготавливали для выработки условного рефлекса спермоотдачи. Сперму получали методом абдоминального массажа с участием одного техника в подогретые до 30°С пенициллиновые флаконы. Кратность взятия семени составляла 1 раз в 2-3 дня. Объем эякулята измеряли градуированной пипеткой на 1,0 мл. Подвижность сперматозоидов оценивали после 5-кратного разбавления на нагревательном столике при температуре 38-40°С. Концентрацию рассчитывали с помощью камеры Горяева. Морфометрию проводили на свежеприготовленных зафиксированных препаратах сперматозоидов петухов под увеличением окуляра 40х, откалиброванного шаблонным микрометром. Использовали цифровую камеру Nikon DS-Qi2 с высоким разрешением (4908 х 3264). Расчеты морфометрических показателей проводили в программном обеспечении NIS-Elements BR 4.30 (Basic Research) по встроенным функциям (определение длин, площадей). Варьирующий показатель ширины головки сперматозоидов измеряли на всем ее протяжении в не менее чем 5-7 точках с определением среднего арифметического. Для каждого петуха контрольной и опытной групп исследовали по 100 сперматозоидов. Состояние и целостность акросом оценивали на зафиксированных препаратах сперматозоидов. Методика окрашивания включала применение набора для дифференциального окрашивания Diff Quick.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы MS Excel.

результаты и обсуждение. Визуальная оценка семени петухов контрольной и опытной групп не выявила каких-либо существенных отклонений: цвет и запах исследуемых эякулятов соответствовали установленным нормативным требованиям, что свидетельствует об отсутствии каких-либо значительных нарушений в системе содержания исследованной птицы. Вместе с тем, были выявлены некоторые различия между контрольной и опытной группами по количественным

Таблица 1. количественные и качественные показатели семени трансгенных и контрольных петухов

Группа Объем эякулята, мл Подвижность сперматозоидов, % Концентрация сперматозоидов, млрд/мл Сохранность акросом, %

Контрольная Опытная 0,25 ± 0,15 0,20 ± 0,07 9 9 О U1 1+ 1+ 6 9 2,91 ± 0,72 2,46 ± 0,77 99,3 ± 0,22 99,1 ± 0,28

Таблица 2. Морфометрический анализ сперматозоидов

Показатель Группа

контрольная опытная

Морфометрия головки сперматозоидов

Длина, мкм 13,68 ± 0,40 13,79 ± 0,20

Ширина, мкм средняя 0,87 ± 0,03 0,98 ± 0,02**

минимальная 0,65 ± 0,03 0,82 ± 0,02***

максимальная 1,07 ± 0,04 1,15 ± 0,02

Периметр, мкм 28,70 ± 0,88 29,18 ± 0,43

Площадь, мкм2 12,22 ± 0,64 14,05 ± 0,38*

Морфометрия акросомы сперматозоидов

Длина, мкм 1,90 ± 0,11 1,95 ± 0,07

Ширина, мкм 0,83 ± 0,036 0,74 ± 0,025*

Периметр, мкм 4,27 ± 0,24 4,35 ± 0,13

Площадь, мкм2 1,17 ± 0,09 1,09 ± 0,06

Морфометрия сперматозоидов

Длина хвоста, мкм 68,20 ± 3,04 67,17 ± 1,20

Общая длина сперматозоида, мкм 81,87 ± 3,20 80,95 ± 1,31

Достоверность разницы с контролем: * - Р > 0,95,

- Р > 0,99,

- Р > 0,999

показателям семени (табл. 1). У трансгенных петухов, по сравнению с контролем, отмечали снижение объема эякулята и концентрации сперматозоидов на 20 и 16%, соответственно. Подвижность сперматозоидов у трансгенных петухов также была снижена, по сравнению с контролем,на 5%.

Был проведен морфометрический анализ сперматозоидов (табл. 2).

Сперматозоиды трансгенных петухов характеризовались увеличением площади головки на 15%, по сравнению с контролем (Р > 0,95). Повышение данного показателя происходило, преимущественно, за счет увеличения ширины головки на 12,6% (Р > 0,99). У трансгенных петухов отмечали также и тенденцию к увеличению длины головки сперматозоидов, однако различия по данному показателю между экспериментальными группами составили менее 1%. При этом отмечено незначительное уменьшение длины хвоста сперматозоидов и, как следствие, общей длины сперматозоидов (-1,1%).

Морфометрический анализ акросом сперматозоидов трансгенных петухов и их не-трансгенных аналогов выявил недостоверное уменьшение размеров данной структурной единицы у трансгенных особей: различия по площади акросом между экспериментальными группами составили 7%. Снижение данного показателя у трансгенных петухов, по сравнению с контролем, было обусловлено, преимущественно, уменьшением ширины акросом сперматозоидов на 11% (Р > 0,95). При этом следует отметить, что данные морфометрические изменения акросом не оказывали значительного влияния на их сохранность: сохранность акросом сперматозоидов у петухов обеих экспериментальных групп была практически одинаковой и составила у трансгенных петухов 99,1%, у нетрансгенных - 99,3%.

выводы. Морфометрический анализ сперматозоидов и оценка состояния акросом у трансгенных петухов и их нетрансгенных аналогов выявили увеличение площади головки сперматозоидов на 15% (Р > 0,95) утрансгенных особей при снижении площади акросом на 7%. При этом отклонений в сохранности акросом у трансгенных петухов, по сравнению с контролем, выявлено не было. Установлена тенденция к снижению количественных показателей спермопродукции у трансгенных петухов: объем эякулята, концентрация и подвижность сперматозоидов у данных особей, по сравнению с контролем, были ниже на 20, 5 и 16%, соответственно, что может свидетельствовать о некотором негативном влиянии трансгенеза на функциональное состояние половых клеток у исследуемых трансгенных петухов.

Литература.

1. Трансгенные сельскохозяйственные животные: современное состояние исследований и Н.А. Волкова, В.А. Багиров, Г. Брем// Экологическая генетика. 2015. Т. 13. № 2. С. 58-76.

2. Chicken oviduct-specific expression of transgene by a hybrid ovalbumin enhancer and the Tet D. Nishimiya, K. Nishijima, et al.// J Biosci Bioeng. 2012. V. 113 (2). P. 146-153.

3. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase / P.E. Mozdziak, J.N. Petitte//Dev. Dyn. V. 2003. Vol. 226. P. 439-445.

4. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) /S.C. Kwon, J.W. Choi, H.J. Jang, S.S. Shin, S.K. Lee, T.S. Park, I.Y. Choi, G.S. Lee, G. Song, J.Y. 2010. Vol. 82. P. 1057-1064.

5. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens / S.J. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011. Vol. 75 (4). P. 646-649.

перспективы/Н.А. Зиновьева,

expression system / D. Kodama,

S. Borwornpinyo, D.W. McCoy,

from transgenic quail egg white Han // Biology of Reproduction.

Byun, S.W. Kim, K.W. Kim, et al.

INVESTIGATION OF QuANTITATIVE AND QuALITATIVE CHARACTERISTICS OF SEMEN OF TRANSGENIC ROOSTERS

M.A. Zhilinsky, A.N. Vetokh, N.A. Volkova, B.S. Iolchiev, V.A. Bagirov, N.A. Zinovieva

L.K Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podolsky r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation Summary. The aim of the study was to evaluate the influence of integration of the recombinant DNA on the qualitative and quantitative characteristics of semen of transgenic roosters. The studies were carried out at the vivarium of L.K. Ernst Institute of Animal Husbandry in 2015. Transgenic roosters and their non-transgenic analogues of the cross Shaver Brown were the objects of the study. The transgenic chickens were produced by using a lentiviral vector, which contained the reporter gene GFP (green fluorescent protein). We examined the following quantitative and qualitative characteristics of semen of transgenic (n = 8) and non-transgenic (control) roosters (n = 8): the volume of ejaculate, sperm motility and their concentration; length, width, perimeter, head area, tail length and the total spermatozoa length; length, width, perimeter, area and acrosome preservation. The evaluation of these characteristics was carried out according to the standard techniques using software NlS-Elements BR 4.30. The morphometric analysis of spermatozoa and assessment of the acrosome status in the transgenic and non-transgenic roosters showed the increase in sperm head area by 15% (P is more than 0.95) with the decrease in acrosome area by 7% in transgenic roosters. At the same time, deviations in acrosome preservation in transgenic roosters compared to the control were not revealed. It was registered the tendency to the reduction of sperm quantitative characteristics among transgenic roosters: the volume of ejaculate, concentration and motility of spermatozoa compared to the control were lower by 20, 5 and 16%, correspondingly. This may indicate a certain negative influence of transgene integration on the functional capacity of germ cells in test transgenic roosters. Keywords: transgenesis, roosters, semen quality, spermatozoon, acrosome.

Author Details: M.A. Zhilinsky, post-graduate student (e-mail: naitkin888@mail.ru); A.N. Vetokh, junior research fellow; N.A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; B.S. Iolchiev, D. Sc. (Biol.), leading research fellow; V.A. Bagirov, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), director.

For citation: Zhilinsky M.A., Vetokh A.N., Volkova N.A., Iolchiev B.S., Bagirov V.A., Zinovieva N.A. Investigation of Quantitative and Qualitative Characteristics of Semen of Transgenic Roosters. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. Vol. 29. No 12. Pp. 98-99 (in Russ.).