СРЕДСТВО И СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА ЖИЗНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
MEANS AND METHOD FOR IMPROVING QUALITY OF LIFE OF MAMMALS

Заявляемая группа изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с применением этого средства» относится к медицине и биотехнологии, преимущественно к медицинской генетике, а именно к средствам и способам для увеличения продолжительности жизни и может быть использовано для замедления процесса старения.
Увеличение продолжительности жизни человека является одной из важнейших задач геронтологии и, в целом, современной профилактической медицины. В последнее время большое внимание уделяется поиску и изучению препаратов, обладающих свойствами, замедляющими старение.
Согласно современным представлениям, в основе старения лежит наступающая с возрастом потеря соматическими клетками организма способности к репликации (Hayflick and Moorhead, 1961, Exp.Cell Res. 25: 585-621; Hayflick, 1965, Exp.Cell Res. 37: 614-636; and Hayflick, 1970, Exp. Geront. 5: 291-303) и сопутствующее этому изменение профиля экспрессии генов в стареющих клетках (West, 1994, Arch. Derm. 130: 87-95), что ведет к нарушению их характерных функций. Наступающее с возрастом накопление подобных клеток в органах и тканях организма (причем в первую очередь это касается высокоспециализированных клеток) формирует основу проявления болезней и патологических состояний, характерных для стареющего организма.
Причины возрастной потери или извращения репликативной активности клеток до конца не раскрыты. В соответствии с современными представлениями в основе этого могут лежать либо механизмы, детерминирующие лимит репликативной активности клеток, (Harley, 1991, Telomere loss: Mitotic clock or genetic time bomb. Mut. Res. 256:271-282), либо вероятностные механизмы, например, связанное с возрастом накопление соматических мутаций в геноме соматических клеток (Woodruff R.C., et al., J Anti Aging Med, 2003 Spring 6: pp. 29-39).
В ряде исследований, проведенных на модельных организмах, таких как мышь, дрозофила, нематода удалось показать благотворное влияние на процессы старения различных синтетических и природных антиоксидантов или индукторов антиоксидантных ферментов. В пожилом и старческом возрасте резко увеличивается вероятность проявлений различных патологий, совместимых с жизнью, но понижающих ее качество. У млекопитающих к таким патологиям относятся, в частности, потеря зрения (катаракта), ухудшение кожно-волосяного покрова (аллопеция), старческое снижение веса вследствие гибели мышечных и жировых клеток.
Известно, что витамин Е снижает количество оксидативно-поврежденных белков, липидов и ДНК млекопитающих, в частности мышей (Porta Е.А., Joun N.S., Nitta R.T. Effect of the type of dietary fat at two levels of vitamin E in Wistar male rats during development and aging. I. Life span, serum biochemical parameters and pathological changes // Mech. Ageing Dev. 1980. V. 13. P. 1-39).
Недостатком применения витамина E является то, что он, увеличивая качество жизни, не изменяет максимальную продолжительность жизни млекопитающих.
Известны также различные способы замедления старения, основанные на применении антиоксидантов, иммуномодуляторов, гормонов, метаболических модуляторов (Ann. N.Y. Acad. Sci., 2002; vol. 959).
Известны современные способы лекарственного увеличения продолжительности жизни, которые воздействуют на внутриклеточный генетический аппарат клеток. Таковы, например, способы ингибиторования фермента поли (АДФ-рибоза) полимеразы (Патент US 5874444) или активация фермента теломеразы (Заявка: WO 0031238).
Недостатком способов активного лекарственного воздействия на генетический аппарат стареющей клетки является опасность непредсказуемых побочных эффектов (Cellular senescence, aging and cancer. Campisi J, Scientific World Journal, 2001, Jan 11:1 Suppl 3 65).
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis 1779, близкий к используемому в заявляемом изобретении штамму, выделенный в естественных условиях, проявляющий широкий спектр антагонистической активности, а также иммуномодулирующую активность.
Известен также штамм бактерий Bacillus macroides Excel 00, выделенный из мицелия гриба Agaricus Blazei Murill, проявляющий иммуномодулирующую активность, геропротекторные свойства, и ряд других качеств.
Недостатком известных описанных выше аналогов, такие как штамм бактерий Bacillus subtilis 1779, близкий к используемому штамму, выделенный в естественных условиях, проявляющий широкий спектр антагонистической активности, а также иммуномодулирующую активность и штамм бактерий Bacillus macroides Excel 00, выделенный из мицелия гриба Agaricus Blazei Murill, также проявляющий иммунную активность и геропротекторные свойства, и ряд других свойств имеют ограниченный диапазон питательных средств для культивирования и отсутствие данных о иммуномодулирующей способности и фармакокинетике в исследованиях in vivo, кроме того, сложности работы с живыми культурами вынуждают вести поиск иных микроорганизмов с более высокими потребительскими характеристиками.
В настоящее время отсутствуют какие-либо способы, которые проявляли бы способствовать увеличению продолжительности жизни млекопитающих и человека или эффективно замедлить наступление болезненных состояний, связанных с увеличением возраста млекопитающих, в том числе человека. В связи с этим отсутствует возможность принять какое-либо известное техническое решение за прототип настоящего изобретения.
Технической проблемой настоящего изобретения является создание эффективного способа замедления наступления болезненных состояний, связанных с увеличением возраста млекопитающих, при отсутствии прямого воздействия на генетический аппарат стареющих клеток, в частности снижения половой активности и способности к воспроизводству, климакса, изменения глюкозотолерантности, снижения когнитивных и/или мнестических функций, снижения резистентности к стрессу, развития склероза органов и тканей.
Техническим результатом заявленной группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» является расширение арсенала средств для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и разработка способа их применения для замедления процесса старения.
1. Поставленный технический результат достигается тем, что, согласно изобретению, средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих содержит действующее вещество, в концентрации 15.0-20.0 мг/л, в качестве которого используют лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., причем, согласно изобретению, он включает влияние на биохимические показатели жизнедеятельности клеток действующего вещества, которое берут в концентрации 15-20 мг/л, а в качестве действующего вещества используют лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp.на протяжении всей жизни, посредством перорального введения и/или для восстановления барьерной функции кожи, посредством местного введения лизата, непосредственно, в кожу субъекта, а также используют для повышения физиологической активности и продления жизни, и применяют в качестве пищевой добавки в лиофилизированном виде и/или в качестве раствора.
В отличие от известных аналогов штамм микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. (см. RU №2413760, опубл. 10.11.2010) по настоящему изобретению, выявленный авторами-заявителями, имеет неограниченный диапазон питательных средств для его культивирования. Благодаря многочисленным исследованиям, в данном штамме были определены иммуностимулирующие и геропротекторные свойства. Расширенный арсенал средств для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и разработка способа их применения для замедления процесса старения решает техническую проблему, и достигает поставленный технический результат посредством использования лизированного штамма реликтовых почвенных бактерий-сапрофитов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., с отчетливо выраженными иммуностимулирующими и геропротекторными свойствами. Штамм реликтовых почвенных бактерий-сапрофитов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. задепонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика.
В отличие от аналога - штамма бактерий Bacillus subtilis 1779, близкого к используемому штамму микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., выделенному в естественных условиях, преимуществом штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., является то, что, именно, благодаря его способности индуцировать полезное действие на пищеварительный тракт человека, а также на организм в целом, которое, в свою очередь, способствует увеличению мышечной силы, физической и умственной активности, а также стимулирует деятельность иммунной системы, он может быть использован для увеличения продолжительности жизни млекопитающих, в частности мышей, крыс, кроликов и других животных, и человека, в том числе. В экспериментах с его культурой на млекопитающих наблюдается увеличение мышечной силы, увеличение физической и умственной активности, которое может быть использовано для замедления процесса старения. Таким образом, заявляемое изобретение «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» может быть использовано для увеличения качества и продолжительности жизни млекопитающих и человека. Кроме того, в отличие от аналогов, преимущества заявляемой группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» обеспечивает повышение качества жизни для млекопитающих пациентов, т.к., используя влияние биохимических показателей жизнедеятельности клеток, посредством перрорального введения действующего вещества, обеспечивает возможность менее травматичного и надежного оказания медицинских услуг, что, в свою очередь, не только дает значительное расширение области применения, но и существенно повышает качество оказания услуг, а также повышает качество жизни пациентов в целом.
Таким образом, можно сделать общий вывод, что заявителем достигнуты поставленный технический результат заявленной группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» в виде расширения арсенала средств для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и разработан способ применения расширенного арсенала средств для замедления процесса старения млекопитающих, продуцируемого штаммом микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. - вещества, действующего долговременно, а также достигнуто решение технической проблемы в виде создания эффективного способа замедления наступления болезненных состояний, связанных с увеличением возраста млекопитающих, при отсутствии прямого воздействия на генетический аппарат стареющих клеток, в частности замедления наступления снижения половой активности и способности к воспроизводству, климакса, изменения глюкозотолерантности, снижения когнитивных и/или мнестических функций, снижения резистентности к стрессу, замедления наступления развития склероза органов и тканей.
Приведенные примеры осуществления заявленной группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» показывают эффективность лизата и бактерий штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. при использовании по назначению в области ветеринарии и медицины. Применение заявленной группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» при медицинском вмешательстве основано на применении средств для увеличения продолжительности жизни и разработки способа применения этих средств для замедления процесса старения, продуцируемого штаммом микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. - вещества, действующего долговременно, с наименьшим ущербом для здоровья пациентов, с повышением их (пациентов) качества жизни. Таким образом, заявленная группа изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружены средства для увеличения продолжительности жизни для млекопитающих, в том числе и человека, и способа их применения для замедления процесса старения, с применением лизата и бактерий предлагаемого продуцируемого штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. - вещества, действующего долговременно, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в описании изобретения, включая характеристику назначения. Применение по основному назначению заявленной группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства», в том числе для замедления процесса старения, с применением лизата и бактерий продуцируемого штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., как вещества, действующего долговременно, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения при медицинском вмешательстве, имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с признаками заявленного технического решения, и не установлена известность влияния этих признаков на указанный технический результат.
Заявленная группа изобретений может быть реализована в промышленном производстве в деятельности организаций животноводства и здравоохранения, посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к заявляемой группе изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства».
Сущность заявленной группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» поясняется примерами конкретного выполнение и заключается в том, что оно относится, непосредственно, к применению бактерии и полученного лизата бактерии штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp.
Данные примеров конкретного применения средства отражены в таблицах 1, 2, 3 (см. в графической части).
Из бактерий штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., которые предварительно выращивали в условиях культивирования, готовили лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., которым являлся стерильный фильтрат культуральной жидкости. Лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. приготавливали следующим образом. Первоначально бактерии штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. культивировали в течение 2-х месяцев при температуре 37°С, после чего их спонтанно лизировали, культуральную жидкость фильтровали и затем выделяли полученный продукт, для чего полученный стерильный фильтрат высушивали. Из высушенного стерильного фильтрата изготавливали «наружное лекарственное средство», т.е. лекарственное средство, содержащее лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp, который наносили на кожу млекопитающих или человека. Предпочтительно, предложенное наружное лекарственное средство заявляемой группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с использованием этого средства» может быть использовано для увеличения качества и продолжительности жизни млекопитающих и человека.
В средстве для увеличения продолжительности жизни млекопитающих лизат пробиотической бактерии продуцируемого штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. применяли также перорально как пищевую добавку для повышения физиологической активности и продления жизни, а также для местного нанесения на кожу для улучшения и/или восстановления барьерной функции кожи. В способе увеличения продолжительности жизни млекопитающих для повышения физиологической активности и продления жизни млекопитающих применяли указанный лизат. Кроме того, указанный лизат использовали для улучшения и/или восстановления барьерной функции кожи в составе косметической композиции, фармацевтической композиции для местного применения, композиции, составленной для введения в кожу.
Также указанный лизат использовали в составе противобактериальной композиции для применения в кишечнике при инфекциях сальмонеллы и стафилококка (Salmonella и Staphylococcus). Поскольку кишечник млекопитающихся является интенсивно колонизированным бактериями, микробиота кишечника играет множество ролей в нормальной физиологии, включая нутриентную секвестрацию (Backhed, F., R.E. Ley, J.L. Sonnenburg, D.A Peterson, and J.I. Gordon. 2005. Host-Bacterial Mutualism in the Human Intestine. Science 307:1915-1920) и развитие нормальных иммунных ответов (Helgeland, L, J.T. Vaage, В. Rolstad, Т. Midtvedt, and P. Brandtzaeg. 1996. Microbial colonization influences composition and T-cell receptor V beta repertoire of intraepithelial lymphocytes in rat intestine. Immunology 89:494-501).
В микробиоте нормального кишечника имеются так называемые пробиотические бактерии. Их прием внутрь предотвращает или лечит желудочно-кишечные нарушения, такие как ассоциированная с антибиотиком диарея (Valdez, J.С, М.С. Peral, М. Rachid, М. Santana, and G. Perdigon. 2005. Interference of Lactobacillus plantarum with Pseudomonas aeruginosa in vitro and in infected burns: the potential use of probiotics in wound treatment. Clinical Microbiology & Infection 11:472-479) и воспалительные заболевания кишечника (Peral, М.С, М.М. Rachid, N.M. Gobbato, M.A. H. Martinez, and J.C. Valdez. 2009. Interleukin-8 production by polymorphonuclear leukocytes from patients with chronic infected leg ulcers treated with Lactobacillus plantarum. Clinical Microbiology and Infection 16:281-286). Механизмы, лежащие в основе этих эффектов, являются, по большей части, неизвестными, тем не менее, в ходе исследований было предположено, что пробиотики могут ингибировать колонизацию кишечника патогенами.
В работе in vitro было предположено, что пробиотики используют различные механизмы для ингибирования патогенов, включая прямое конкурирование за связывающие участки на эпителиальных клетках (Coconnier, М.Н., M.F. Bernet, S. Kernels, G. Chauviere, J. Fourniat, and A.L. Servin. 1993. Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to human intestinal Caco-2 cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasion. FEMS microbiology letters 110:299-306) и конкурирование с патогенными бактериями за нутриенты. Пробиотические организмы также способны вырабатывать ингибирующие вещества, такие как бактериоцины и органические кислоты (Karska-Wysocki, В., М. Bazo, and W. Smoragiewicz. 2010. Antibacterial activity of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Microbiological Research 165:674-86), которые могут уничтожать или ограничивать рост патогенов.
Некоторые пробиотики повышающе регулируют выработку муцина эпителиальными клетками, тем самым предотвращая прикрепление патогена (Mack, D.R., S. Michail, S. Wei, L. McDougall, and M. A. Hollingsworth. 1999. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coll adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 276:G941-950).
Пробиотики могут также вырабатывать биологические поверхностно-активные вещества, которые позволяют прикрепление пробиотика к клеткам, при этом ингибируя прикрепление патогенных бактерий к клеткам (Peral, М.С, М.М. Rachid, N.M. Gobbato, М.А. Н. Martinez, and J.C. Valdez. 2009. lnterleukin-8 production by polymorphonuclear leukocytes from patients with chronic infected leg ulcers treated with Lactobacillus plantarum. Clinical Microbiology and Infection 16:281-286).
Следует отметить, что ряд бактерий, живущих в кишечнике, обитают и в окружающей среде, в частности, в мерзлых породах. К ним относятся и некоторые представители рода Bacillus, в том числе и пробиотические бактерии продуцируемого штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. В криосфере Земли во льду, мерзлых породах и отрицательно-температурных водах (криопэгах) установлены многочисленные и разнообразные живые палеомикроорганизмы: прокариоты, зеленые водоросли, цианобактерии, актиномицеты, грибы и дрожжи. Это единственные известные организмы, сохранившие жизнеспособность в течение геологического времени. Они обнаружены во всех полярных регионах до глубин 400 м (Канадская Арктика), среднегодовых температурах до пород до -250С (Антарктида) и концентрации солей NaCl до 170-300 г/л (Колымская низменность), Возраст их соответствует возрасту льда или длительности пребывания пород в мерзлом состоянии, а самые древние предположительно датируются 3 млн. лет в погребенных ледниках и заключенных в них грунтовых горизонтах в Антарктиде. Предлагаемый штамм микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. при 370°С палочковидный, спорообразующий, споры центрально-терминальные.
4
6
4
6
6
4
Спорообразование активное на твердой агаризованной среде. Значительно хуже спорулирует в жидкой среде. На плотных питательных средах образуют непрозрачные блестящие мягкие колонии желтоватого цвета. Морфологические признаки: неподвижные прямые палочки с закругленными концами, 1-1,2×3-10 мкм, по 1-2, цепочки до 7, эндоспоры бациллярного типа. Грамположительные. При пассировании через кровь животных клетки утолщаются и становятся короче (до 3 мкм). Изначальный анализ штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp.выявил криптическую копийную плазмиду размером приблизительно 2 тпо и обладает высокой устойчивостью к разрушению ультразвуком и ферментативной обработке. Хорошо хранится. Лиофильное высушивание в среде САЖ (желатин - 12 г/л, сахароза - 100 г/л) - хранение при 4-10°С. Хранение в 15% глицерине при (-60°С). Проведено тестирование штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. на млекопитающих, в частности на лабораторных мышах, у которых оценивалось его влияние на продолжительность жизни и на морфофизиологическую активность тимуса и селезенки, активность клеточного и гуморального иммунитета, мышечная сила, поведенческие реакции др. показатели. Кроме того, штамм микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. исследовали в качестве иммуномодулирующих биокорректоров, способных запускать врожденный иммунный ответ и вызывать противоопухолевое действие на животных моделях млекопитающих. Активация врожденного иммунного ответа была исследована в экспериментах: 1) - по изменению метаболической активности макрофагов под действием клеток штаммов микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., введенных интраперитонеально мышам линии СВА (самкам); 2) - по изменению неспецифического цитотоксического действия Т-лимфоцитов, активированных путем интраперитонеального введения штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. мышам линии СВА, против клеток опухоли RLS. Установлено, что интраперитонеальное введение его животным, в диапазоне доз 10-5×10 микробных тел на животное, приводит к дозозависимой активации метаболизма интраперитонеальных макрофагов в 1.3-2.3 раза. Цитотоксическое действие Т-лимфоцитов, полученных из селезенки животных после интраперитонеального введения штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. в диапазоне доз 10-5×10 микробных тел, было исследовано in vitro против клеток лимфосаркомы мыши RLS. Было обнаружено, что достоверная активация неспецифического клона Т-лимфоцитов происходит при дозе 5×10 микробных тел: цитотоксическое действие таких Т-лимфоцитов против клеток лимфосаркомы мыши RLS было в 1.8 раз выше, чем действие Т-лимфоцитов без активации бактериями. Таким образом, усиление метаболизма макрофагов и активация цитотоксического действия Т-лимфоцитов под действием штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp.свидетельствует об активации врожденного иммунитета. Эксперименты по противоопухолевому действию штамма, проведенные на модели гепатомы А1 мышей (мыши линии A/Sn), показали, что подкожное однократное введение в дозе 2×10 микробных тел на животное приводит к снижению веса опухоли у самок (на 10-20%).
Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили, что действие штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. повышает качества и жизни млекопитающих и он может быть использован для увеличения продолжительности жизни, т.е. для замедления процесса старения.
Лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. является продуктом расщепления бактериальных клеток на фрагменты, которые включают в себя фрагменты клеточной стенки бактерий и их внутриклеточного содержимого. Частички клеточной стенки взаимодействуют с рецепторами иммунокомпетентных клеток, то есть тех клеток, которые, находясь в разных слоях слизистой оболочки дыхательных путей и в покрывающей ее слизи обеспечивают защиту дыхательных путей от вирусов и бактерий, проникающих вместе с вдыхаемым воздухом, т.е. бактериальные лизаты штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. подходят для лечения детей, так как они не наносят вреда микрофлоре, не вызывают побочных реакций и хорошо сочетаются с другими лекарствами: жаропонижающими, сосудосуживающими, антибиотиками. При лечении неосложненных инфекций они помогают вообще избежать применения антибиотиков. Иммуномодуляторы на основе лизатов бактерий штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. эффективны на любой стадии болезни. Применение упомянутых лизатов для профилактики ОРВИ снижает риск развития неприятных осложнений. Кроме того, лизаты штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. не могут вызывать воспалительную реакцию, т.к. не являются живыми микроорганизмами, и распознаются вполне однозначно рецепторами иммунных клеток, как угроза к развитию заболевания. Кожные симбионты могут ограничивать колонизацию кожи патогенными бактериями (Vanderhoof, J.A., D.B. Whitney, D.L. Antonson, T.L. Hanner, J.V. Lupo, and R.J. Young. 1999. Lactobacillus GG in the prevention of antibiotic-associated diarrhoea in children. The Journal of Pediatrics 135:564-568).
Исследования показывают, что некоторые кожные заболевания (такие как вульгарные угри и атопический дерматит) могут быть связаны с разрушениями нормальной микрофлоры (Balma-Mena, А., I. Lara-Corrales, J. Zeller, S. Richardson, M.J. McGavin, M. Weinstein, and E. Pope. 2011. Colonization with community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in children with atopic dermatitis: a cross-sectional study. International Journal of Dermatology 50:682-688). (Bek-Thomsen, M., H.B. Lomholt, and M. Kilian. 2008. Acne is Not Associated with Yet-Uncultured Bacteria. Journal of Clinical Microbiology 46:3355-3360), (Burkhart, C. N.. and C.G. Burkhart. 2003. Microbiology's principle of biofilms as a major factor in the pathogenesis of acne vulgaris. International Journal of Dermatology 42:925-927). Следовательно, кожная микрофлора может подвергаться модуляции с применением специфических кожных симбионтов для стимулирования здоровья или ингибирования заболевания (Lai, Y., A.L. Cogen, K.А. Radek, H.J. Park, D.T. MacLeod, A. Leichtle, A.F. Ryan, A. Di Nardo, and R.L. Gallo. 2010. Activation of TLR2 by a Small Molecule Produced by Staphylococcus epidermidis Increases Antimicrobial Defense against Bacterial Skin Infections. J Invest Dermatol 30:2211-2221). (Lai, Y., A. Di Nardo, T. Nakatsuji, A. Leichtle, Y. Yang, A. L. Cogen, Z.-R. Wu, L.V. Hooper, R. R. Schmidt, S. von Aulock, K.A. Radek, C.-M. Huang, A.F. Ryan, and R.L. Gallo. 2009. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med 15:1377-1382). Однако, кожные симбиотические бактерии при некоторых обстоятельствах могут являться патогенными (Edmond, М.В., S.E. Wallace, D.K. McClish, M.A. Pfaller, R.N. Jones, and R.P. Wenzel. 1999. Nosocomial Bloodstream Infections in United States Hospitals: A Three-Year Analysis. Clinical Infectious Diseases 29:239-244). В отличие от этого, пробиотики, как правило, считаются безопасными (GRAS) и, следовательно, такие бактерии потенциально могут быть применены местно, если они имеют терапевтическое значение (FAO/WHO. 2002. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food: Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food).
Общепринятые пробиотические бактерии могут иметь существенное значение при применении на кожу. Например, местное нанесение лизата штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp.или В. longum reuter индуцирует клиническое улучшение "реактивной кожи", которая представляет собой кожу, более чувствительную к физическим изменениям, таким как атмосферная температура, и к химическим изменениям, таким как наблюдаемые с наносимыми местно продуктами (Gueniche, А., Р. Bastien, J.M. Ovigne, М. Kermici, G. Courchay, V. Chevalier, L. Breton, and I. Castiel-Higounenc. 2010. Bifidobacterium longum lysate, a new ingredient for reactive skin. Experimental Dermatology 19:e1-e8). Местное нанесение описанного лизата штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. демонстрирует, что улучшается восстановление тканей в мышиной модели ожога и предотвращается инфекция в хронических ножных язвах, а также улучшается восстановление тканей при ожогах у людей (Peral, М.С, M.A. Huaman Martinez, and J.С.Valdez. 2009. Bacteriotherapy with Lactobacillus plantarum in burns. International Wound Journal 6:73-81). Peral, М.С, M.M. Rachid, N.M. Gobbato, M.A. H. Martinez, and J.C. Valdez. 2009. Interleukin-8 production by polymorphonuclear leukocytes from patients with chronic infected leg ulcers treated with Lactobacillus plantarum. Clinical Microbiology and Infection 16:281-286). (Shornikova, A.V., I.A. Casas, E. Isolauri, H. Mykkanen, and T. Vesikari. 1997. Lactobacillus reuteri as a therapeutic agent in acute diarrhoea in young children. J Pediatr Gastroenterol Nutr 24:399-404).
9
10
Для решения поставленной задачи авторы-заявители использовали лизированный штамм микроорганизмов реликтовых почвенных бактерий-сапрофитов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. с отчетливо выраженными иммуностимулирующими и геропротекторными свойствами, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика. Тестирование лизата культуры штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. на высших организмах осуществлялось в Тюменском научном центре СО РАН, в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. В частности, эксперименты на мышах F1 CBA/Black-6 показали, что штамм микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. в лизированной культуре способствует увеличению индексов тимуса и селезенки. Культура в малой дозе стимулирует фагоцитарную активность селезеночных макрофагов, во всех дозах способствует увеличению функциональной активности и активизации клеточного и гуморального иммунитета. При этом вес тела у животных опытной группы оказался выше, чем у животных контрольной группы, на 60% увеличилась мышечная сила, и наблюдались другие позитивные реакции. О повышении у млекопитающих способности к ориентации в пространстве и исследовательской активности свидетельствовало более частое посещение ими внутренних секторов открытого поля, увеличение числа вертикальных стоек, посещения норок, и другие показатели. Увеличилась продолжительность жизни мышей, в среднем на 20%, что, однозначно, свидетельствует о присутствии в культуре штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. геропротекторов, что подтверждает увеличения продолжительности жизни млекопитающих при использовании заявляемой группы изобретений. Кроме того, Лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., как уже упоминалось, характеризуется также высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, в том числе и сальмонеллы. Подтверждены предположения о его антивирусной и противоопухолевой активности. Оптимальные количества микробных клеток штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. в 1 мл физиологического раствора составляют лизированных клеток 10-10, при их объемном содержании 92-98%. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток в лизате не изменяет существенным образом специфическую активность препарата. Препарат характеризуется безвредностью для млекопитающих, его летальные дозы в экспериментах установить не удалось.
Для приготовления средства для увеличения продолжительности жизни млекопитающих применяли бактерии и или лизат продуцируемого штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. в виде - 55%й смеси, а также растворенные в 98% этиловом спирте 45% смеси аминокислот, белков, нуклеиновых оснований полисахаридов, пептидогликанов и других биологически активных веществ. Таким образом, полученное средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих настоящего изобретения содержит лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp в смеси с другими вспомогательными компонентами. Эксперименты применения средства - лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. для увеличения продолжительности жизни млекопитающих, в частности, на мышах F1 CBA/Black-6 подтвердили, что штамм микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. в лизированной культуре способствует увеличению индексов тимуса и селезенки. Культура в малой дозе стимулирует фагоцитарную активность селезеночных макрофагов и во всех дозах способствует увеличению функциональной активности и активизации клеточного и гуморального иммунитета. Продолжительности жизни млекопитающих, в частности мышей, увеличилась, в среднем на 20%, что свидетельствует о присутствии в культуре штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. геропротекторов, что подтверждает решение поставленной технической проблемы у заявленной группы изобретений и также решает поставленный технический результат. Лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., как уже отмечалось, характеризуется также высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонеллы. На основании проведенных экспериментов сделан вывод не только о его антивирусной активности, но и противоопухолевой активности. Эксперименты с млекопитающими (мышами) показали, также то, что заявляемое средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих характеризуется безвредностью для всем исследуемых животных.
Таким образом, неоднократно подтверждается достижение технического результата настоящего изобретения, которым является расширение арсенала средств для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и разработка способа их применения для замедления процесса старения.
Предпочтительно, эффективное количество средства для увеличения продолжительности жизни млекопитающих составляет от 0,45 до 0,50 мас.%. Более предпочтительно от 0,50 до 0,55 мас.%. Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих может дополнительно содержать вспомогательные компоненты, например, такие компоненты включают, но не ограничиваются, гелеобразователями, консервантами, красителями, отдушками, регуляторами рН, регуляторами осмоляльности, антиоксидантами. Предпочтительно, содержание вспомогательных компонентов в средстве для увеличения продолжительности жизни млекопитающих фармацевтической композиции настоящего изобретения составляет 0,45 до 1,5 мас. %, более предпочтительно 0,5 до 1,5 мас. %.
Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих, согласно изобретению, может быть приготовлено в виде различных лекарственных форм. Примеры таких форм включают, но не ограничиваются, растворами, гелями, эмульсиями, мазями, пластырями, или формами, позволяющими осуществлять контролируемое высвобождение активных компонентов штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp.
Гелеобразователи относится к веществам или композициям веществ, обладающих способностью в определенных условиях образовывать гели. Примерами гелеобразователей являются сополимеры акриловой кислоты (Карбополы), карбоксиэтилцеллюлоза, полисахариды, хитозан, и другие гидрофильные полимеры, способные к образованию структурированной дисперсной системы с водной дисперсионной средой.
В средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих входят компоненты лизата штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp., которые очень хорошо абсорбируются кожей и органами пищеварения млекопитающих, а также человека в терапевтически эффективных концентрациях, вследствие чего средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих с компонентами лизата штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. в целом эффективно, как при наружном, так и при внутреннем применении.
Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих, по настоящему изобретению, приготавливают способами, хорошо известными из уровня техники. Например, лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-1030, родов Bacillus sp. бензалкония хлорид в качестве консерванта, и карбоксиэтилцеллюлоза в качестве гелеобразователя растворяются в очищенной воде, взятой в качестве фармацевтически приемлемого разбавителя. Полученный гель формуется в виде единичных дозированных форм.
Сущность заявляемой группы изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с применением этого средства» подтверждается примерами конкретного выполнения, в которых демонстрируют применение заявленного изобретения. Примеры конкретного выполнения средства для увеличения продолжительности жизни млекопитающих представлены только для иллюстрации, и, никоим образом, не ограничивают пределы изобретения.
Пример 1
Демонстрирует средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих, содержащее лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp, изготовленное в форме геля для наружного применения. Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих включает: лизат штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. карбоксиэтилцеллюлоза в качестве гелеобразователя, бензалконий хлорид, ЭДТА вносятся в воду и перемешиваются. Полученный в форме геля продукт помещается в тубы.
Млекопитающему пациенту (белая мышь) с пролежнями и старческими пятнами наносили 1 мл геля на участок кожи один раз в день в течение 7 дней. На восьмой день исчезли пролежни, старческие пятна стали значительно светлее.
Пример 2
Трем женщинам 35, 40 и 50 лет наносили средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих с составом, соответствующим примеру 1, ежедневно 2 мл геля в одно и то же время, в течение четырех недель на кожу лица. После окончания курса нанесения средства значительно улучшились внешний вид кожи лица, улучшилась функция сальных желез, исчезли морщины под глазами и носогубные складки. У женщины возраста 50 лет старческое пятно (2 см в диаметре) на щеке обесцветилось.
Пример 3
Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих, с составом, соответствующим примеру 1, и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с применением этого средства продемонстрированы на примере 3. Эффективность средства для увеличения продолжительности жизни млекопитающих, с составом, соответствующим примеру 1, была изучена в клинических испытаниях. В исследовании участвовали 25 особей белых мышей, из них 10 мужских особей в возрасте от 4,2 до 4,5 лет и 15 женских от 2,8 до 3-х лет. Легкая степень тяжести больных животных облысение в области живота и шеи, средняя - коросты и язвы от драк и тяжелая - новообразования (качественные опухоли) между пальцев лапок больных мышей. Длительность заболевания составляла от 0,5 до 3 лет.
Гель наносили всем особям ежедневно 4 раза в день, соответственно, в течение двух недель (7+7 дней) на предварительно обработанную антисептиком кожу. Кроме того, в первый день лечения внутримышечно вводили 0,1 мл, 5% раствора геля в дистиллированной воде животным с легкой степенью тяжести. Животным со средней степенью тяжести в течение первых 5 дней внутримышечно вводили 0,2 мл, 5% раствора геля в дистиллированной воде. Животным с тяжелой степенью тяжести в течение первых 10 дней, вводили 0,2 мл. 5% раствора геля в дистиллированной воде. Значительное улучшение наблюдали у всех больных животных с легкой степенью тяжести (100%) и в большинстве случаев у больных (84%) со средней степенью тяжести. У животных с тяжелой степенью тяжести улучшение наблюдали у (68%) больных. Хорошую переносимость препарата и отсутствие местных реакций наблюдали в 94,7% случаев. В качестве побочных эффектов, судя по поведению животных, наблюдался кратковременный зуд в области нанесения геля. Не наблюдалось характерных для внутримышечного введения побочных эффектов, таких как раздражение и боль в месте укола, пирогенный эффект, и наличие нежелательного системного иммуномодулирующего эффекта. При этом эффективность лечения при наружном применении была не ниже, чем описываемая в литературе для внутримышечного применения.
Пример 4
Для определения возможности иммунологической активности заявляемого способа оценивали влияние штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. по отдельности, и взятых в соотношении (1:1) на продукцию IFN-гамма с применением планшетной иммуноферментной тест-системы производства ООО «Цитокин» (Россия). Для исследования продукции ООО «Цитокин» (цитокинов) IFN-гамма с применением планшетной иммуноферментной тест-системы использовали цельную кровь, взятую у млекопитающих и (из локтевой вены добровольца - одного из авторов-заявителей) в силиконовые пробирки с гепарином. Оптическую плотность определяли на иммуноферментном анализаторе. Расчет количества IFN-гамма (в пг/мл) проводили стандартно по калибровочной кривой. Используя уровни спонтанной и индуцированной продукции цитокинов, рассчитывали индекс влияния (ИВ) лизата штамма микроорганизмов Bacillus species F, ВКПМ В-10130, родов Bacillus sp. при добавлении его на продукцию цитокинов вычисляли, как отношение показателя спонтанной или индуцированной секреции IFN-гамма при инкубации с препаратом, к показателю спонтанной продукции без препарата. Данные исследования продукции цитокинов, где использовали цельную кровь, показали, что смесь лизатов (1:1) проявляет более выраженную иммуномодулирующую активность в конечной концентрации 0,01%, чем отдельные лизаты, взятые каждый в той же конечной концентрации 0,01%.
Таким образом, предложенная группа изобретений «Средство для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и способ увеличения продолжительности жизни млекопитающих с применением этого средства» позволяет решить поставленную техническую проблему по созданию эффективного способа замедления наступления болезненных состояний, связанных с увеличением возраста млекопитающих, а также достичь поставленного технического результата в виде расширения арсенала средств для увеличения продолжительности жизни млекопитающих и разработки способа их применения для замедления процесса старения.