ПОПУЛЯЦИЯ СВИНЕЙ С НИЗКИМИ УРОВНЯМИ СВИНОГО ЭНДОГЕННОГО РЕТРОВИРУСА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
POPULATION OF PIGS WITH LOW LEVELS OF PORCINE ENDOGENOUS RETROVIRUS AND ITS APPLICATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам отбора и поддержания популяции свиней с низким числом копий свиного эндогенного ретровируса и применению таких свиней в качестве источника клеток, тканей и/или органов, пригодных для ксенотрансплантации. Также изобретение относится к способам отбора клеток, тканей и/или органов от таких свиней на их пригодность для применения в ксенотрансплантации.
Уровень техники
Трансплантация органов является эффективным способом лечения конечной стадии органной недостаточности, но она существенно ограничивается недостатком донорских органов. Ежегодно большое количество людей погибает, ожидая орган. Кроме того, трудности, существующие при получении донорских органов, высокая стоимость трансплантации органов также ограничивают количество выполняемых операций по поводу трансплантации органов.
Возможность того, что животные могут быть альтернативным источником донорских органов и тканей, вызывает большие дебаты. Совершенно очевидно, что ксенотрансплантация может привести к снижению страданий и смертности, связанных с недостатком донорских органов, однако существуют вопросы безопасности, связанные с данным вмешательством. Они включают риск инфицирования реципиента ксенотрансплантата и для тех, кто имеет контакт с реципиентом и, следовательно, для больших групп населения.
Наиболее серьезным вопросом является возможность передачи возбудителей инфекции, включая микроорганизмы, от ксенотрансплантата реципиенту и последующая возможность появления новой инфекции человека и возможно заболевания. Основной причиной того, что свиньи рассматриваются в качестве животных-доноров выбора в предпочтении приматам, не относящимся к человеку, является низкая микробиологическая нагрузка, которую они несут. Следует отметить, что риск передачи микроорганизмов не является уникальным для ксенотрансплантации. Имеются сообщения о передаче микроорганизмов, вызывающих заболевания, во время аллотрансплантации.
Однако межвидовая инфекция (зооноз) имеет особое значение по сравнению с передачей инфекции внутри вида, поскольку невозможно прогнозировать поведение возбудителя инфекции у ксеногенного хозяина по его патогенности в природном хозяине. Микроорганизмы, рассматриваемые в качестве «доброкачественных» в их природном хозяине, могут привести к высокой смертности при сценарии развития зооноза. Примеры включают потенциально смертельные инфекции для людей при заражении вирусом Nipah свиней, герпесвирусом В приматов и гантавирусом грызунов (1).
Риск возникновения межвидовой инфекции также усиливается за счет того, что, как правило, у реципиента ксенотрансплантата имеется состояние иммуносупрессии.
Микроорганизмы, которые могут передаваться вместе с органом, тканью или клеточной популяцией, варьируют по их способности к инфицированию реципиента. Такие вирусы, как лимфотропный герпесвирус (PLHV), свиной цитомегаловирус (PCMV) и свиной цирковирус (PCV), которые все могут иметь очень широкое распространение в популяции свиней (см., например, пример 2), способны вызывать устойчивые инфекции, и они рассматриваются в качестве потенциально онкогенных вирусов. На основании данных по активации цитомегаловируса при трансплантации органа от свиньи примату можно предположить, что PCMV может представлять собой важный патоген у реципиентов ксенотрансплантата с иммуносупрессией (3). Также сообщалось, что PCV типа 2 может передаваться в человеческие клетки в условиях in vitro (4).
Однако наибольший риск инфицирования может возникнуть от таких микроорганизмов, которые обладают способностью передаваться в виде бессимптомных латентных микроорганизмов в органе. Такие микроорганизмы включают эндогенные ретровирусы (ERV) и герпесвирусы. Свиные эндогенные ретровирусы (PERV) являются основным источником беспокойства и представляют, возможно, наиболее важную проблему с точки зрения безопасности при ксенотрансплантации, так как сообщалось, что два из трех семейств PERV приводят к инфицированию человеческих клеток в условиях in vitro (5).
В отличие от других возбудителей инфекций, которые могут иметь место у свиней, вирусы PERV не передаются от животного животному в качестве возбудителя инфекции, а в большей степени наследуются всеми животными в качестве части их зародышевой ДНК. Таким образом, данные вирусы составляют часть генома и, следовательно, находятся в каждой клетке. Количество присутствующего вируса варьирует между видами свиней, но было установлено, что в среднем в каждой клетке находится примерно 50 копий вируса и в обычных условиях разведения невозможно удалить данные вирусы из популяций свиней (6). Таким образом, наличие инфекционных микроорганизмов и, в частности, PERV в свиных клетках представляет потенциальный барьер для будущего ксенотрансплантации.
Следовательно, было бы желательным иметь способ получения свиных клеток, тканей и/или органов, пригодных для ксенотрансплантации, которые имеют существенно более низкое число микроорганизмов, которые способны передаваться человеку-реципиенту, и тем самым существенно снизить риск развития ксенозоонозной инфекции. Конкретнее, было бы желательным получить свиные клетки, ткани и/или органы для ксенотрансплантации, которые имеют низкое число копий PERV, тем самым, сведя до минимума его передачу реципиенту ксенотрансплантата. Целью изобретения является изыскание пути достижения этой цели и/или обеспечения населения пригодным выбором.
Сущность изобретения
С удивлением было обнаружено, что стадо свиней Оклендских островов обладает уникальным преимуществом по сравнению с другими породами свиней в отношении эндогенных микроорганизмов. В частности, данное стадо включает новую подгруппу животных, которые имеют необычно низкое число копий PERV. Следовательно, полагается, что избирательное разведение таких животных будет давать потомство с дополнительно низким содержанием микроорганизмов, включая число копий PERV. Таким образом, такие свиньи будут особенно пригодными для ксенотрансплантации.
Следовательно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу разведения стада свиней, которые свободны от инфекционных микроорганизмов и имеют число копий PERV в пределах от 0 до 30, где указанный способ включает стадии:
(а) отбора хряка и свиноматки из свиней Оклендских островов с благоприятным профилем микроорганизмов,
(b) спаривания хряка и свиноматки, отобранных на стадии (а),
(с) отбора потомства, полученного на стадии (b), с благоприятным профилем микроорганизмов и числом копий PERV в пределах от 0 до 30;
посредством чего потомство, отобранное на стадии (с), является пригодным для применения в ксенотрансплантации.
Хряки и/или свиноматки со стадии (b) и/или потомство со стадии (с) может иметь число копий PERV предпочтительно в пределах от 0 до 25; в пределах от 0 до 20; в пределах от 0 до 18; в пределах от 0 до 16; в пределах от 0 до 14; в пределах от 0 до 12; в пределах от 0 до 10; в пределах от 0 до 8; в пределах от 0 до 7; в пределах от 0 до 6; наиболее предпочтительно в пределах от 0 до 5.
Благоприятный профиль микроорганизмов на стадии (а) и стадии (с) включает отсутствие детектируемых количеств герпесвируса, лимфотропного герпесвируса (PLHV), свиного цитомегаловируса (PCMV), вируса энцефаломиокардита (EMCV), свиного цирковируса (PCV), вируса гепатита Е (HEV), токсоплазм, эперитрозоонов, бактерий рода Brucella, бактерий рода Listeria, микобактерий ТВ, бактерий рода Leptospira, Haemophilus suis, любого вируса, вызывающего респираторно-репродуктивный синдром, любого вируса бешенства, любого вируса ложного бешенства, парвовируса, вируса энцефаломиокардита, любого вируса, вызывающего везикулярную болезнь свиней, свиного полиовируса (тешен), любого вируса, вызывающего гемагглютинирующий энцефаломиокардит, вируса свиного гриппа типа А, аденовируса, вируса трансмиссивного гастроэнтерита и вируса везикулярного стоматита.
Хряков и свиноматок потомства, отобранного на стадии (с), можно спарить на стадии (b) с получением дополнительного потомства для применения в ксенотрансплантации для поддержания стада.
Способ может необязательно включать дополнительный скрининг в отношении определенных групп крови для совместимости с потенциальным реципиентом ксенотрансплантата или совместимости с антигенным профилем сыворотки, используемой для культивирования в условиях in vitro, в целях снижения отторжения ткани и/или повреждения клеток в результате иммунных реакций.
Предпочтительно свиньи, отобранные на стадии (а), и более предпочтительно потомство, отобранное на стадии (с), имеют группу крови О.
Предпочтительно у свиней, отобранных на стадии (а), и более предпочтительно у потомства, отобранного на стадии (с), отсутствует PERV-C.
Более предпочтительно свиньи, отобранные на стадии (а), и еще более предпочтительно потомство, отобранное на стадии (с), имеют группу крови О и у них отсутствует PERV-C.
Способ может необязательно включать дополнительный скрининг в отношении иммуногенных антигенов, присутствующих на поверхности клеток, таких как антиген МНС группы I, вновь в целях снижения отторжения органов, тканей или клеток или повреждения в условиях in vivo или in vitro.
Изобретение дополнительно относится к одной или более свиньям, полученным способом по изобретению.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к одной или более свиньям, свободным от инфекционных микроорганизмов и имеющим число копий PERV в пределах от 0 до 30, где указанная одна или более свиней получены способом, включающим стадии:
(а) отбора хряка и свиноматки из свиней Оклендских островов с благоприятным профилем микроорганизмов,
(b) спаривания хряка и свиноматки, отобранных на стадии (а),
(с) отбора потомства, полученного на стадии (b), с благоприятным профилем микроорганизмов и числом копий PERV в пределах от 0 до 30.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к одной или более свиньям, свободным от инфекционных микроорганизмов и имеющим число копий PERV в пределах от 0 до 30 и группу крови О и/или у которых отсутствует PERV-С, где указанная одна или более свиней получены способом, включающим стадии:
(а) отбора хряка и свиноматки из свиней Оклендских островов с благоприятным профилем микроорганизмов,
(b) спаривания хряка и свиноматки, отобранных на стадии (а),
(с) отбора потомства, полученного на стадии (b), с благоприятным профилем микроорганизмов и числом копий PERV в пределах от 0 до 30.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает органы, ткани или клетки, выделенные от одной или более свиней, полученных способом по изобретению, где указанные органы, ткани или клетки свободны от инфекционных микроорганизмов, имеют число копий PERV в пределах от 0 до 30 и являются особенно пригодными для трансплантации ксеногенному субъекту, включая человека.
Предпочтительно один или более органов, тканей или клеток выделяют от одной или более свиней, где указанные одна или более свиней представляют новорожденных поросят в возрасте от 7 до 21 суток.
Органы, ткани и клетки можно отобрать или выделить из группы, состоящей из печени, легких, сердца, мозга, поджелудочной железы, мышц, крови, кости, семенников и яичников.
Предпочтительно органы для ксенотрансплантации целого органа выбраны из печени, легких и сердца.
Предпочтительно ткани и клетки для ксенотрансплантации выбраны из островков Лангерганса поджелудочной железы, гепатоцитов, непаренхиматозных клеток печени, эпителиальных клеток желчного пузыря, эндотелиальных клеток желчного пузыря, эпителиальных клеток желчных протоков, эндотелиальных клеток желчных протоков, эпителиальных клеток сосудов печени, эндотелиальных клеток сосудов печени, синусоидных клеток, клеток сосудистого сплетения, клеток Сертоли, хромаффинных клеток надпочечников и мышечных клеток.
Настоящее изобретение также относится к имплантируемой композиции, содержащей, по меньшей мере, один выделенный орган, ткань или клетку свиньи по настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Композиция может дополнительно включать питающие клетки, такие как фибробласты или клетки Сертоли, выделенные от свиней, полученных способом по изобретению.
Изобретение дополнительно относится к применению, по меньшей мере, одного выделенного органа, ткани или клетки, выделенных от одной или более свиней, полученных способом по изобретению, где указанный орган, ткань или клетка свободны от инфекционных микроорганизмов и имеют число копий PERV в пределах от 0 до 30, в получении имплантируемой композиции или средства для лечения пациента, страдающего или предрасположенного к развитию заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа.
Предпочтительно, по меньшей мере, один выделенный орган, ткань или клетка выделены от новорожденного поросенка в возрасте от 7 до 21 суток.
По дополнительному аспекту изобретения обеспечивается способ лечения пациента, страдающего или предрасположенного к развитию заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа, ткани или клетки, включающий имплантацию пациенту, нуждающемуся в этом, органа, ткани или клетки, выделенных от одной или более свиней, полученных способом по изобретению.
По дополнительному аспекту изобретения обеспечивается способ лечения пациента, страдающего или предрасположенного к развитию заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа, включающий введение эффективного количества одной или более имплантируемых композиций по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
В одном варианте осуществления недостаточность или отсутствие относится к функции печени, и имплантируемая композиция содержит гепатоциты, непаренхиматозные клетки печени, клетки желчного пузыря, клетки желчных протоков, клетки сосудов печени или синусоидные клетки. В альтернативном варианте осуществления указанная недостаточность или отсутствие относится к функции поджелудочной железы, и имплантируемая композиция содержит клетки островков Лангерганса поджелудочной железы. В альтернативном варианте осуществления указанная недостаточность или отсутствие относится к неврологической функции, и имплантируемая композиция содержит клетки сосудистого сплетения.
В широком смысле можно сказать, что данное изобретение состоит из частей, элементов и признаков, относящихся или указанных в описании заявки, индивидуально или в совокупности, и любой или всех комбинаций любых двух или более указанных частей, элементов или признаков, где указанные целые числа, которые упомянуты здесь, имеют эквиваленты, известные в данной области, к которой относится данное изобретение, такие известные эквиваленты предполагаются для включения здесь, как это представлено ниже.
Краткое описание фигур
На чертеже представлен в виде схемы способ идентификации вируса в популяции свиней и, таким образом, средство отбора подходящих хряка и свиноматки для разведения и поддержания стада свиней по настоящему изобретению.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к отбору донорного стада свиней, которые свободны от инфекционных микроорганизмов и, в частности, имеют число копий PERV в пределах от 0 до 30 (и предпочтительно в пределах от 0 до 30). Такие свиньи будут представлять особенно подходящий источник органов, тканей и клеток для ксенотрансплантации.
Ранее предпринимались попытки получить свиней, подходящих для ксенотрансплантации. Например, в патенте США № 6867347 (6) раскрывается стадо инбредных свиней с дефектом в отношении передачи свиного эндогенного ретровируса (PERV). Однако среднее число копий PERV в данном стаде является высоким, составляющим примерно 50 копий вируса в каждой клетке. Кроме того, не раскрывается статус данного стада в отношении инфекционных микроорганизмов, и остается неизвестным, насколько данные свиньи свободны от распространенных свиных вирусов PCMV, PLHV, EMCV, HEV И PCV типа 1 и типа 2.
Аналогично, в патенте США № 6469229 (7) раскрываются инбредные минисвиньи, которые являются гомозиготными в отношении гаплотипа главного комплекса гистосовместимости. Однако вновь среднее число копий PERV в данном стаде является высоким, и не раскрывается статус данного стада в отношении инфекционных микроорганизмов, не указывается, что данные свиньи свободны от всех распространенных свиных вирусов, описанных выше.
С удивлением в настоящее время заявители установили, что новозеландская инбредная линия свиней имеет очень низкое число копий широко распространенного ретровируса, свиного эндогенного ретровируса (PERV). Данная линия свиней также свободна от вирусов, возбудителей распространенных инфекций свиней, включая PCMV, PLHV, EMCV, HEV И PCV.
Данная линия постоянно обитает на отдаленных Оклендских островах, субантарктической группе островов, принадлежащих Новой Зеландии, которые в течение примерно 200 лет являются очень изолированными, и она относится здесь к свиньям AI.
Сообщалось, что эндогенные ретровирусы (ERV) являются составляющим компонентом нормальной ДНК у каждого вида позвоночных, включая свиней и людей. Нормальный цикл развития ретровирусов включает стабильную интеграцию генетического материала ретровирусов в хромосомную ДНК клетки-хозяина. В тех случаях, когда клетка представляет собой клетку зародышевой линии, то нуклеиновокислотный материал вируса (или провирус) будет затем наследоваться всем потомством обычным образом, как в случае любого другого гена согласно менделевским законам. Было высказано предположение, что если конкретный провирус присутствует в ДНК клетки зародышевой линии, то потомство при избирательном неблагоприятном положении не будет выживать в течение эволюционных периодов времени и не ожидается присутствие данного ERV в последующем пуле генов. Присутствие ERV в настоящее время в зародышевой линии животных не является патогенным для их собственных видов. Отдельные локусы ERV также имеют тенденцию к дефектной репликации за счет мутаций, имеющихся в их геноме. Однако также было высказано предположение, что существует вероятность того, что отдельные дефектные локусы будут взаимодействовать посредством комплементации и рекомбинации с образованием инфекционного вируса. Несмотря на то что ERV могут быть не патогенными для их обычных видов хозяев, те же самые вирусы могут изменять их патогенность при межвидовой передаче.
Утверждалось, что все свиные клетки, включая выделенные от минисвиней NIH, Yucatan, свиней многих пастбищных пород и животных, используемых в настоящее время в клинических испытаниях, за единственным исключением в отношении клеточной линии ST-IOWA, продуцируют PERV, способный к инфицированию и репликации в человеческих клетках (6). Позднее клетки от различных пород свиней оценивали на присутствие инфекционных частиц PERV, и было идентифицировано несколько из них, которые не содержали инфекционные частицы PERV, например, см. представленные в таблице I ниже.
<b>Таблица I</b><b>Присутствие инфекционных частиц PERV у различных пород свиней</b>
Порода свиней
Клетки
Инфекционный PERV
Ландрас
Эндотелиальные клетки
+
Ландрас
Клетки островков Лангерганса
+
Крупная белая/ландрас
Клетки островков Лангерганса
+
Минисвиньи
PBMC
+
Крупная белая
Клетки островков Лангерганса
-
Йоркширская
PBMCНейроны плодов
-
Минисвиньи D/D
PBMC
-
Камбруг
РВМС, клетки Сертоли, клетки островков Лангерганса
-
РВМС=мононуклеарные клетки периферической крови
Кроме того, утверждалось, что несмотря на то, что применение программы по разведению животных, свободных от специфических патогенов (SPF), будет приводить к элиминации большей части патогенов, которые могут передаваться во время ксенотрансплантации, такие патогены, как PERV, которые передаются через зародышевую линию, не будут подвергаться элиминации, и в результате одним из потенциальных рисков при применении органов свиней будет передача таких патогенов (6).
Является принципиально важным, что в настоящее время заявители установили, что свиньи AI, описанные здесь, имеют необычно низкое число копий свиного эндогенного ретровируса (PERV), значение которого ниже по сравнению с ранее имеющимися сообщениями. Кроме того, в результате проведенных экспериментов не было показано ни продукции инфекционных частиц PERV, ни передачи PERV в условиях in vitro с использованием совместного культивирования или не наблюдали передачу в условиях in vivo реципиентам ксенотрансплантатов при использовании клеток от свиней AI, отобранных способами по настоящему изобретению.
Следовательно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу разведения стада свиней, которые свободны от инфекционных микроорганизмов и имеют число копий PERV в пределах от 0 до 30, где указанный способ включает стадии:
(а) отбора хряка и свиноматки из свиней Оклендских островов с благоприятным профилем микроорганизмов,
(b) спаривания хряка и свиноматки, отобранных на стадии (а),
(с) отбора потомства, полученного на стадии (b), с благоприятным профилем микроорганизмов и числом копий PERV в пределах от 0 до 30;
посредством чего потомство, отобранное на стадии (с), является пригодным для применения в ксенотрансплантации.
Существует три различные группы PERV: PERV-А, PERV-В и PERV-С. Три группы различаются по области оболочки PERV. Вирусная оболочка представляет основную детерминанту ряда хозяев и имеет значение для инфицирования. Два основных типа свиного ретровируса, PERV-А и PERV-В, широко распространены среди различных пород свиней (8). Вирусы PERV-А и PERV-В имеют более широкий ряд хозяев, включая несколько человеческих клеточных линий, по сравнению с вирусами PERV-С, которые приводят к заражению только двух свиных клеточных линий (9). Недавно было показано, что PERV-А и PERV-C могут подвергаться рекомбинации и образовывать вариант с новыми инфекционными характеристиками (10).
Было бы желательным, чтобы у свиньи-донора отсутствовал PERV-С для предупреждения любой возможной рекомбинации с существующим PERV-А. Предпочтительно, чтобы процесс отбора включал разведение свиней, у которых отсутствует вариант PERV-С, и/или отбор донорного потомства, у которого отсутствует вариант PERV-С.
Свиней, свободных от инфекционных микроорганизмов, и их поддержание проводят способами, хорошо известными в животноводстве для сведения до минимума проникновения потенциальных патогенов. Такие способы включают барьерное содержание и изоляцию в дополнение к специализированным методам разведения, таким как гистеротомия в подходящих единицах содержания. Предпочтительно поддержание свободного от инфекционных микроорганизмов статуса стада включает регулярное обследование поголовья на наличие инфекционных микроорганизмов. Методы определения присутствия или отсутствия инфекционных микроорганизмов являются хорошо известными в данной области, и они включают иммунологические тесты и тесты анализа нуклеиновых кислот, такие как методы на основе ПЦР.
Методы определения присутствия или отсутствия инфекционных микроорганизмов можно использовать для оценки профиля микроорганизмов у животного, например для установления его пригодности для включения в способ разведения по изобретению или его использования в качестве донора ксенотрансплантата. Благоприятный профиль в отношении микроорганизмов на стадии (а) и стадии (с) включает отсутствие детектируемых количеств герпесвируса, PLHV, PCMV, EMCV, PCV, HEV, токсоплазм, эперитрозоонов, бактерий рода Brucella, бактерий рода Listeria, микобактерий ТВ, бактерий рода Leptospira, Haemophilus suis, любого вируса, вызывающего респираторно-репродуктивный синдром, любого вируса бешенства, любого вируса ложного бешенства, парвовируса, вируса энцефаломиокардита, любого вируса, вызывающего везикулярную болезнь свиней, свиного полиовируса (тешен), любого вируса, вызывающего гемагглютинирующий энцефаломиокардит, вируса свиного гриппа типа А, аденовируса, вируса трансмиссивного гастроэнтерита и вируса везикулярного стоматита.
Примерный способ определения пригодности потенциального донорного стада для ксенотрансплантации представлен на чертеже. Данный примерный способ включает определение того, присутствует ли патоген в стране источника, и если да, то в стаде источника. Если он находится в стаде источника, то следует установить, присутствует ли патоген в донорной группе и, в частности, в органах, тканях или клетках, предназначенных для трансплантации. Также является важным установить, насколько патоген может передаваться в клетку-реципиент, например человеческую клетку, и, таким образом, реципиенту, например человеку.
Применение отобранных животных и, в частности, потомства в результате такого разведения в качестве источника донорного стада для ксенотрансплантации является предпочтительным, поскольку низкое число копий PERV с сочетании с отсутствием передаваемого PERV безопаснее по сравнению с использованием доноров с более высоким числом копий PERV.
Заявители полагают, без желания связываться с какой-либо теорией, что при применении способа разведения по изобретению, например, многократным образом будет возможно разводить и отбирать потомство от каждого последующего поколения с еще более низким числом копий PERV. Кроме того, заявители полагают, вновь без желания связываться с какой-либо теорией, что таким образом будет возможно разводить и отбирать потомство без наличия копий PERV в их геноме.
Свиньи AI, описанные здесь, также свободны от ряда свиных вирусов с эндемичным или широким распространением среди популяций свиней во всем мире.
Herpesviridae
Например, свиной цитомегаловирус (PCMV) представляет собой бета-герпесвирус (семейства ), и он считается повсеместно распространенным вирусом, которым заражено, по меньшей мере, 98% всех обследованных свиней в Великобритании (11). PCMV выделили из дыхательных путей свиней, и он может быть ассоциирован с атрофическим ринитом или ринитом с включениями, распространенным синдромом, поражающим в последнее время поросят-отъемышей. Синдром чихания после отъема и признаки легкого ринита являются очень частыми явлениями у поросят в Новой Зеландии. Важное значение инфекции, вызванной человеческим CMV, у реципиентов аллогенных трансплантатов поднимает вопрос о том, что свиной цитомегаловирус может вести себя аналогично у реципиентов ксенотрансплантатов (12).
Важно, что заявители установили, что стадо AI, описанное здесь, свободно от PCMV. Следовательно, не может происходить передачи PCMV с органами, тканями или клетками, полученными от донорного стада AI, реципиенту ксенотрансплантата.
Herpesviridae
В другом примере сообщалось, что инфекция, вызываемая свиным лимфотропным герпесвирусом (PLHV), является эндемичной при наличии вируса в товарных стадах (13). PLHV относится к подсемейству гамма-герпесвирусов (). Основные свойства данных герпесвирусов, включая инфекционность для других видов, еще не установлены. В филогенетическом отношении они очень близки к овечьему и бычьему лимфотропным герпесвирусам, которые вызывают лимфопролиферативное заболевание у их хозяев (14).
Важно, что заявители установили, что стадо AI, описанное здесь, свободно от PLHV. Следовательно, не может происходить передачи PLHV с органами, тканями или клетками, полученными от донорного стада AI, реципиенту ксенотрансплантата.
Picornaviridae
Cardiovirus
Вирус энцефаломиокардита (EMCV) () является широко распространенным вирусом, относящимся к роду . Полагают, что имеет место межвидовое инфицирование EMCV и свиной EMCV может приводить к заражению человеческих клеток миокарда (15). Сообщалось, что EMCV имеет место в Новой Зеландии (16).
Заявители установили, что стадо AI, описанное здесь, свободно от EMCV. Следовательно, не может происходить передачи EMCV с органами, тканями или клетками, полученными от донорного стада AI, реципиенту ксенотрансплантата.
Недавно вирус гепатита Е (HEV) удалили из семейства Caliciviridae, и в настоящее время он не классифицирован. Появляется все больше доказательств того, что свиной HEV может быть зоонозным. Следовательно, данный вирус должен быть исключен перед использованием ткани для ксенотрансплантации.
Заявители установили, что стадо AI, описанное здесь, свободно от HEV. Следовательно, не может происходить передачи HEV с органами, тканями или клетками, полученными от донорного стада AI, реципиенту ксенотрансплантата.
Circiviridae
Свиной цирковирус (PCV) принадлежит к семейству . Впервые свиной цирковирус был открыт в 1974 в качестве загрязнителя стабильной клеточной линии свиных почечных клеток, РК15 (17), и сообщались результаты последующих серологических исследований сыворотки крови свиней из Германии, Канады, Новой Зеландии, Великобритании, Северной Ирландии и США, свидетельствующие о том, что в 25-98% из них были обнаружены антитела против PCV1 у откормочных и взрослых свиней (18). Было высказано предположение, что инфицирование PCV является широко распространенным во всем мире. Не было установлено ассоциированного с ним заболевания. Однако имеется несколько противоречивых сообщений о зоонозных свойствах свиного цирковируса. Сообщалось об антителах против PCV типа 1 у человека, мышей и крупного рогатого скота (18). Сообщалось, что примерно 20% здоровых взрослых людей и 30% госпитализированных пациентов в Германии и 24% госпитализированных пациентов в Канаде являются серопозитивными на PCV-подобный антиген. Однако ни у одного вида млекопитающих, иного, чем свиньи, ни вирус, ни вирусный геном не были детектированы. Было высказано предположение, что антитела против PCV1, обнаруженные у людей или других видов, могут быть неспецифическими.
in vitro
У свиней с мультисистемным синдромом истощения, возникающим после отъема (PMWS), был обнаружен новый штамм свиного цирковируса, названный свиным цирковирусом типа 2 (19). Чаще всего PMWS поражает 5-12-недельных поросят, и он характеризуется прогрессирующей потерей массы тела, желтухой и симптомами со стороны дыхательной системы. Позднее PCV2 был ассоциирован с миокардитом у мертворожденных поросят (20). Совершенно ясно, что необходимо проведение дополнительных исследований для выяснения патогенеза ассоциированных с PCV2 заболеваний у свиней. Сообщалось, что PCV2 может инфицировать человеческие клетки в условиях  (21) и мышей Balb/c в эксперименте (22). Данный установленный факт имеет особое значение для ксенотрансплантации и связан с риском инфицирования.
Заявители установили, что стадо AI, описанное здесь, свободно от PCV1 и PCV2. Следовательно, не может происходить передачи PCV1 и PCV2 с органами, тканями или клетками, полученными от донорного стада AI, реципиенту ксенотрансплантата.
Brucella suis
Заявители также установили, что стадо AI, описанное здесь, свободно от возбудителей инфекционных везикулярных заболеваний, которые поражают свиней (ящура, везикулярного стоматита, везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней), бешенства, , свиной лихорадки, ложного бешенства и губчатых энцефалопатий, в дополнение к 45 другим патогенам, многие из которых создают актуальные проблемы в ветеринарной практике. Очевидно, понятно, что стадо AI, описанное здесь, имеет характеристики, способные обеспечить отдельных животных, выбранных из них как пригодных для использования, в качестве источника донорного стада для ксенотрансплантации.
Способы установления или определения числа копий PERV включают различный скрининг генома и другие методы, известные в данной области, в качестве подходящих для установления или определения числа копий определенной нуклеиновокислотной последовательности в геноме организма. Примеры таких методов представлены здесь в примерах.
Настоящее изобретение дополнительно относится к органам, тканям или клеткам, выделенным от одной или более свиней, полученных способом по изобретению, где указанные органы, ткани или клетки свободны от инфекционных микроорганизмов и имеют число копий PERV в пределах от 0 до 30, и они особенно пригодны для трансплантации ксеногенному субъекту, включая человека.
Указанные одна или более свиней свободны от инфекционных микроорганизмов, в том числе патогенов, которые поражают людей, и они включают, но не ограничиваются ими, один или более патогенов из следующих групп патогенов: паразиты, бактерии, микоплазмы и вирусы. Свинья может быть свободна, например, от таких паразитов, как токсоплазмы и эперитерозооны или микоплазмы, такие как M. hyopneumonia. Примеры бактерий, от которых могут быть свободны свиньи, включают бактерии рода Brucella, бактерии рода Listeria, микобактерии ТВ, бактерии рода Leptospira и Haemophilus suis. Кроме того, свиньи могут быть свободны от вирусов, таких как зоонозные вирусы, вирусы, которые могут проникать через плаценту у супоросных свиноматок, и нейротропных вирусов. Зоонозные вирусы, например, включают вирус, относящийся к группе вирусов бешенства, герпесподобный вирус, который вызывает ложное бешенство, вирус энцефаломиокардита, вирус гриппа типа А, вирус трансмиссивного гастроэнтерита, вирус парагриппа 3 и вирус везикулярного стоматита. Вирусы, которые могут проникать через плаценту, включают, например, вирусы, которые вызывают респираторно-репродуктивный синдром у свиней, вирус, относящийся к группе вирусов бешенства, герпесподобный вирус, который вызывает ложное бешенство, парвовирус, вирус, который вызывает везикулярную болезнь у свиней, тешен (свиной полиовирус), вирус гемагглютинирующего энцефаломиокардита, цитомегаловирус, вирус оспы свиней и вирус гриппа типа А. Нейротропные вирусы включают, например, вирус, относящийся к группе вирусов бешенства, герпесподобный вирус, который вызывает ложное бешенство, парвовирус, вирус энцефаломиокардита, вирус, который вызывает везикулярную болезнь у свиней, свиной полиовирус (тешен), вирус, вызывающий гемагглютинирующий энцефаломиокардит, аденовирус, вирус парагриппа 3. Конкретные примеры вирусов, от которых свиньи свободны, включают: вирус, который вызывает (или приводит к развитию) респираторно-репродуктивный синдром, вирус, относящийся к группе вирусов бешенства, герпесподобный вирус, который вызывает ложное бешенство, парвовирус, вирус энцефаломиокардита, вирус, который вызывает везикулярную болезнь у свиней, свиной полиовирус (тешен), вирус, вызывающий гемагглютинирующий энцефаломиокардит, цитомегаловирус, вирус гриппа А у свиней, аденовирус, вирус трансмиссивного гастроэнтерита, вирус, вызывающий вирусную диарею крупного рогатого скота, и вирус везикулярного стоматита.
В одном варианте осуществления указанная одна или более свиней свободны от следующих микроорганизмов: герпесвируса, токсоплазм, эперитрозоон, бактерий рода Brucella, бактерий рода Listeria, микобактерий ТВ, бактерий рода Leptospira, Haemophilus suis, любого вируса, вызывающего респираторно-репродуктивный синдром у свиней, любого вируса, вызывающего бешенство, любого вируса, вызывающего ложное бешенство, парвовируса, вируса энцефаломиокардита, любого вируса, вызывающего везикулярную болезнь свиней, свиного полиовируса (тешен), любого вируса, вызывающего гемагглютинирующий энцефаломиокардит, вируса оспы свиней, вируса гриппа типа А, аденовируса, вируса трансмиссивного гастроэнтерита и вируса везикулярного стоматита.
Органы, ткани или клетки, выделенные от указанной одной или более свиней, можно получить от эмбрионов (т.е. плодов), новорожденных (в неонатальном периоде) или взрослых свиней. В большинстве случаев, когда орган свиньи предназначен для ксенотрансплантации, то предпочтительно можно использовать орган взрослой свиньи, поскольку его большие размеры делают его более подходящим для извлечения, обращения и имплантации.
Ткани и клетки новорожденных, как правило, будут особенно предпочтительными для ксенотрансплантации, поскольку их извлечение, как правило, является менее проблематичным по сравнению с таковыми у плодов, кроме того, выживаемость после выделения, например в культуре ткани или после ксенотрансплантации, обычно выше по сравнению с тканями или клетками взрослых. У поросят, как правило, неонатальный период продолжается в первые 7-21 суток после рождения. Аналогично органы новорожденных, как правило, будут предпочтительными для ксенотрансплантации по сравнению с органами плодов, поскольку их извлечение является менее проблематичным.
Как правило, органы, ткани или клетки свиных эмбрионов выделяют на выбранных стадиях супоросности. Например, орган, ткани и клетки можно выделить на стадии развития свиного эмбриона, когда можно различить клетки, ткань или орган или когда степень роста и/или дифференциации клеток, тканей или органов становится пригодной для желаемого применения. Например, органы, ткани или клетки выделяют в период примерно между 20 и примерно 25 сутками супоросности и при рождении поросенка.
Выделенные клетки по изобретению можно поддерживать в виде функционально жизнеспособной клеточной культуры. Примеры методов, с помощью которых можно культивировать клетки по изобретению, приведены в WO 01/52871 (23); WO 02/32437 (24); WO 2004/113516 (25); WO 03/027270 (26); WO 00/66188 (27) и в патенте Новой Зеландии 532057/532059/535131 (28), включенных здесь для сведения в полном объеме. Среды, которые можно использовать для поддержания роста свиных клеток, включают культуральные среды для клеток млекопитающих, например минимальную эссенциальную среду Дульбекко и минимальную эссенциальную среду. Среда может быть бессывороточной, но предпочтительно она должна быть обогащена сывороткой животного, такой как фетальная телячья сыворотка, или более предпочтительно свиной сывороткой (т.е. аутологичной сывороткой).
При выделении от свиньи-донора клетки по изобретению сохраняют их фенотип и/или способны осуществлять их функцию. Например, клетки печени свиньи по изобретению способны, среди прочих функций, подвергаться пролиферации, секретировать белки плазмы крови, такие как альбумин и фактор VIII, и экспрессировать рецепторы липопротеинов низкой плотности и, таким образом, связываться с липопротеинами низкой плотности. Предпочтительно выделенные клетки способны поддерживать дифференцированные функции в условиях in vitro и in vivo и прикрепляться к субстратам, таким как культуральные чашки.
Предпочтительно указанные одна или более свиней имеют группу крови, которая не индуцирует или при которой сводится до минимума опосредуемое комплементом немедленное гуморальное отторжение при трансплантации реципиенту. У свиней существует только две группы крови, А и О. Наличие антигена группы крови А в сочетании с отсутствием антител к данному антигену указывает на группу крови А. Отсутствие антигена группы крови А в сочетании с присутствием антител к данному антигену указывает на группу крови О. Заявители установили, что стадо AI демонстрирует полиморфизм в отношении группы А и для углеводсодержащих поверхностных антигенов. Предпочтительно органы, ткани или клетки, используемые для ксенотрансплантации, получают от доноров с группой О.
Фенотип группы крови О наследуется в виде менделевского рецессивного признака, при котором спаривание:
свиней АА×АА дает помет в 100% случаев с группой крови А;
свиней АА×АО дает помет в 100% случаев с группой крови А (существует вероятность, что 50% будет гетерозиготами АО);
свиней АА×ОО дает помет в 100% случаев с группой крови А (АО);
свиней АО×АО дает помет с 75% вероятностью группы крови А (25% АА и 50% АР) и 25% группы крови О (ОО);
свиней ОО×АО дает помет с 50% вероятностью группы крови А (АО) и 50% вероятностью группы крови О (ОО);
свиней ОО×ОО дает помет в 100% случаев с группой крови О.
Предпочтительно с помощью способа избирательного разведения по изобретению можно получить потомство, которое, в дополнение к низкому числу копий PERV, имеет клетки, которые содержат поверхностные антигены, которые не индуцируют или сводят до минимума опосредуемое комплементом отторжение у реципиентов. Например, с помощью способов избирательного разведения по изобретению можно получить потомство с группой крови О. Следовательно, для получения потомства с группой крови О необходимо спарить хряка и свиноматку, которые являются носителями аллели О. Предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, один из них или более предпочтительно оба, хряк и свиноматка, подвергающиеся спариванию, имели группу крови О (были гомозиготными в отношении аллели О). См. пример 4.
Способы определения группы крови у млекопитающих хорошо известны в данной области, и типичные способы, подходящие для определения группы крови у свиней, представлены в примерах.
Органы, ткани или клетки, полученные от указанных одной или более свиней, можно инкапсулировать или изолировать иначе от иммунной системы реципиента, как здесь описано для подавления отторжения тканей или клеток при трансплантации ксеногенному реципиенту. Например, иммуносупрессию с использованием хорошо известных в данной области иммуносупрессоров, таких как описано в патенте США № 6610288 (29) (включен здесь в полном объеме для сведения), как правило, будут применять в случае трансплантированного органа(ов) свиней. Перед введением субъекту ткани или клетки можно модифицировать для подавления иммунологического отторжения, например, как описано в (29).
Следовательно, изобретение относится к имплантируемой композиции, содержащей, по меньшей мере, один выделенный орган, ткань или клетку свиньи по настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Композиции по изобретению можно помещать в устройство для доставки, которое облегчает введение клеток и/или композиций субъекту. Такие устройства для доставки включают трубки, например катетеры, для инфузии или введения клеток и жидкостей в организм реципиента. В одном варианте осуществления трубки дополнительно снабжены иглой, например шприцом, с помощью которого можно вводить клетки по изобретению субъекту в желаемое местоположение. Композиции по изобретению можно помещать в устройство для доставки, например шприц, например шприцевой насос, в различных формах. Например, клетки можно суспендировать в растворе или включить в вещество-носитель при помещении в такое устройство для доставки. Как используется в данном описании, термин «раствор» включает фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, в котором клетки по изобретению остаются жизнеспособными. Фармацевтически приемлемые носители и разбавители включают стерильный физиологический раствор или водные буферные растворы. Применение таких носителей и разбавителей хорошо известно в данной области. Предпочтительно раствор является стерильным и представляет собой жидкость, которая легко проходит через шприц. Предпочтительно раствор стабилен в условиях производства и при хранении и устойчив к обсеменению микроорганизмами, такими как бактерии и грибы, за счет применения, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тримерозала и тому подобного. Растворы по изобретению можно приготовить включением свиных клеток, описанных здесь, в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, при необходимости, с использованием других ингредиентов, указанных выше, с последующей стерилизацией фильтрованием.
Композиции и устройства по изобретению, содержащие органы, ткани или клетки по изобретению, подходящие для имплантации, способствуют выживанию клеток при трансплантации. В случае ксенотрансплантированных клеток это, как правило, достигается защитой клеток от воздействия иммунной системы реципиента. В частности, изобретение относится к применению композиций и устройств в виде:
инкапсулированной в альгинате форме
- для обеспечения дополнительной защиты трансплантированных свиных клеток от иммунной системы. Методология микроинкапсулирования клеток островков Лангерганса от новорожденных поросят и их трансплантация описаны в (23) - такое инкапсулирование в альгинате обеспечивает эффективные, безопасные и функциональные способы ксенотрансплантации;
имплантатов для подкожного введения
, обеспеченных разработанным предварительно васкуляризованным, аллогенным резервуаром из коллагена для помещения композиций свиных клеток. Предпочтительно имплантат представляет собой непроницаемое для клеток, но проницаемое для белков или секретируемых факторов устройство, такое как «TheraCyte», устройство производства TheraCyte, Inc., Irvine, California;
препаратов в матриксе
- в которых композиции свиных клеток культивируют в матриксе из желатина, коллагена и/или других материалов с добавлением природных углеводных полимеров;
сгустка плазмы, образовавшегося под действием тромбина,
- аллогенные сгустки плазмы, образованные аллогенным тромбином в качестве биосовместимого устройства-хранилища.
В композициях и устройствах по изобретению можно использовать носители-матриксы, в которые можно включать или погружать свиные клетки, и они включают матриксы, которые являются совместимыми с реципиентом и которые подвергаются деградации в продукты, не являющиеся токсичными для реципиента. Природные и/или синтетические биодеградируемые матриксы являются примерами таких матриксов. Природные биодеградируемые матриксы включают коллагеновые матриксы. Синтетические биодеградируемые матриксы включают синтетические полимеры, такие как полиангидриды, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Такие матриксы обеспечивают носитель и защиту клеток в условиях in vivo.
Следовательно, дополнительно изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего или предрасположенного к развитию заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа, включающему введение эффективного количества одной или более имплантируемых композиций по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
Также изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего или предрасположенного к развитию заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа, включающему имплантирование пациенту, нуждающемуся в этом, органа, ткани или клетки, выделенных от одной или более свиней, полученных способом по изобретению.
С помощью таких способов лечения по изобретению можно предпочтительно восстановить или улучшить функцию клетки, ткани или органа у реципиента ксенотрансплантата, одновременно сведя до минимума риск передачи ксенозоонозных инфекционных агентов, включая PERV. Специалистам в данной области из способов предшествующего уровня известно количество клеток или количество ткани, необходимых для трансплантации, частота введения трансплантатов и т.п. для восстановления или улучшения функции органа, ткани или клетки.
Органы, ткани, клетки, композиции и способы лечения по настоящему изобретению пригодны для длительного, физиологически реактивного обеспечения функции органа, ткани или клетки за счет того, что все органы, ткани и клетки остаются жизнеспособными и секретируют необходимые биологические факторы.
Ткани, клетки, композиции и способы лечения по настоящему изобретению особенно пригодны для ксенотрансплантации, поскольку они свободны от ксенозоонозных инфекционных агентов и имеют пониженное число копий PERV. Терапия имплантацией клеток имеет преимущество по сравнению с традиционными способами трансплантации органов, которое заключается в том, что доступность клеток, подходящих для имплантации, не ограничивается по сравнению с соответствующими органами от трупов или живых доноров органов.
Кроме того, несмотря на то что клетки, предназначенные для имплантации, могут быть чужеродными для хозяина, разработаны различные способы для предупреждения действия иммунной системы хозяина от атаки и, тем самым, гибели имплантированных клеток, например, посредством помещения клеток в агрегаты или устройства, которые обеспечивают физический барьер между клетками и иммунной системой хозяина ((23), (24), (25), (26), (27) и (28)).
Следовательно, изобретение относится к выделенным свиным органам, тканям или клеткам, которые подходят для введения ксеногенному реципиенту. Данные органы, ткани или клетки можно использовать для лечения заболеваний, которые характеризуются недостаточностью или отсутствием функции органа, ткани или клеток. Как используется в данном описании, термин «выделенные» относится к органам, тканям или клеткам, которые отделены от их природной среды. Данный термин включает грубое физическое отделение от их природной среды, например удаление у животного-донора, или изменение связи органов, тканей или клеток с прилегающими клетками, с которыми они находятся в прямом контакте, например, посредством разъединения.
Как используется в данном описании, термин «свиной» используется взаимозаменяемо с терминами «поросенок» и «свинья» и относится к млекопитающим в семействе Suidae. Такие млекопитающие включают полностью или частично инбредных свиней, предпочтительно представителей стада свиней AI, описанного в данном документе.
Термин «лечение», как он используется в данном описании, включает подавление или ослабление, по меньшей мере, одного побочного эффекта или симптома заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа, ткани или клетки. Например, в случае заболеваний, нарушений или состояний, ассоциированных с недостаточностью или отсутствием функции поджелудочной железы, примеры побочных эффектов или симптомов включают высокий уровень глюкозы в крови, ожирение, нарушенную чувствительность к глюкозе и/или отсутствие чувствительности к глюкозе, аномальные концентрации инсулина, микрососудистые и макрососудистые нарушения, характерные для диабета, нарушенную секрецию липазы, аномальные уровни секретина, аномальные уровни холецистокинина, стеаторею, аномальные концентрации гастрина и нарушенную холинергическую и/или адренергическую функцию.
Следовательно, ткани, клетки или композиции по изобретению трансплантируют пациенту, страдающему или предрасположенному к развитию заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа, ткани или клетки, в таком количестве, что имеется, по меньшей мере, частичное подавление или ослабление, по меньшей мере, одного побочного эффекта или симптома заболевания, нарушения или состояния.
Как используется в данном описании, термины «введение», «внедрение» и «трансплантация» используются взаимозаменяемо и относятся к помещению органов, тканей, клеток или композиций по изобретению у субъекта, например ксеногенного субъекта, способом или путем, которые приводят к расположению органов, тканей, клеток или композиций по изобретению в желаемом месте. Органы, ткани, клетки или композиции по изобретению можно вводить субъекту любым подходящим путем, который приводит к доставке клеток в желаемое местоположение у субъекта, где, по меньшей мере, часть клеток остается жизнеспособной. Предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, примерно 5%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 20%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 30%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 40% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 50% или более клеток остается жизнеспособными после введения субъекту. Период сохранения жизнеспособности клеток после введения субъекту может быть таким коротким, как несколько часов, например от 24 часов до нескольких суток, и таким длительным, как от нескольких недель до месяцев. Способы введения, внедрения и трансплантации органов, тканей, клеток или композиций по изобретению хорошо известны в данной области. Клетки можно вводить в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе.
Термин «реципиент», как он используется в данном описании, относится к млекопитающим, в частности людям, страдающим или предрасположенным к развитию заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с недостаточностью или отсутствием функции органа, ткани или клеток. Термин «реципиент» также включает млекопитающих, у которых иммунный ответ направлен против аллогенных или ксеногенных клеток. Примеры реципиентов включают приматов (например, людей и обезьян). «Ксеногенный реципиент» (также относится здесь к «реципиенту-субъекту» или «субъекту»), в том смысле, в котором здесь используется данный термин, представляет реципиента, которому вводят или предназначены для введения клетки другого вида.
Как используется в данном описании, выражение «заболевание, нарушение или состояние, ассоциированное с недостаточностью или отсутствием функции органа, ткани или клеток» включает нарушение, при котором имеет место аномальная функция органа. Такая аномальная функция органа включает нарушение или отсутствие нормальной функции органа или наличие аномальной функции органа.
Изобретение включает приведенное выше и также предусматривает конструкции, приведенные ниже, примеры которых даются только для иллюстрации и без ограничения объема изобретения.
Пример 1
В данном примере приводится подробная характеристика вирусного статуса в отношении низкого числа копий PERV в стаде свиней AI.
Материалы и методы
Экстракция нуклеиновых кислот
Подвергшиеся обработке образцы материала от свиней включали ткань, мононуклеарные клетки периферической крови, плазму и фекалии.
Экстракция из тканей
: образцы тканей (30 мг) для экстракции РНК гомогенизировали с 1 мл реагента TRIZOL (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) или лизирующим буфером производства Qiagen Rneasy Kit (Qiagen) с использованием стеклянного гомогенизатора (Wheaton). РНК экстрагировали с использованием набора Qiagen Rneasy Kit (Qiagen) или реагента TRIZOL (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD). ДНК экстрагировали из ткани с использованием набора Puregene DNA Isolation Kit (Gentra) согласно рекомендациям изготовителя.
Экстракция из клеток крови
: ДНК экстрагировали из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с использованием набора Puregene DNA Isolation Kit (Gentra). РНК экстрагировали из РВМС с использованием реагента TRIZOL (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD).
Экстракция из фекалий
: РНК экстрагировали из фекалий с использованием реагента TRIZOL (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) согласно рекомендованному изготовителем протоколу.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Все полимеразные цепные реакции (ПЦР) проводили с использованием термоциклира Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400.
ПЦР PCMV
-2
: для PCMV заявители использовали ПЦР, разработанную Hamel (30). Чувствительность ПЦР и «гнездовой» ПЦР определяли с использованием клеточной ДНК, экстрагированной из РВМС (мононуклеарных клеток периферической крови) зараженных свиней. Чувствительность определяли при ограничивающем разведении 10 мкг ДНК на реакцию.
ПЦР PLHV
-4
: для идентификации PLHV использовали ПЦР, разработанную Ehlers (31). Чувствительность ПЦР для PLHV определяли при ограничивающем разведении с использованием ДНК PLHV, экстрагированной у зараженных свиней. Была установлена чувствительность ПЦР для PLHV, равная 10 мкг ДНК на реакцию.
ОТ-ПЦР EMCV
-2
: для идентификации вируса использовали ПЦР, разработанную Vanderhallen & Koenen (32). Чувствительность ОТ-ПЦР определяли при ограничивающем разведении РНК, экстрагированной из клеточной культуры, зараженной EMCV. Была установлена чувствительность, равная 10 мкг РНК на реакцию.
ПЦР PCV
-6
: для идентификации вируса использовали ПЦР, разработанную Larochelle (33). Праймеры для «гнездовой» ПЦР конструировали в лаборатории заявителей. Прямой праймер представлял 5'-TGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAA-3', обратный праймер представлял 5'-CAAGGCTACCACAGTCACAAC-3'. Чувствительность ПЦР для PCV определяли при ограничивающем разведении с использованием ДНК, экстрагированной из тканей (легких, печени) зараженных свиней. Была установлена чувствительность ПЦР для PCV, равная 10 мкг ДНК на реакцию.
Обратная транскрипция-ПЦР HEV
-2
: для идентификации вируса использовали ПЦР, разработанную Elker (34). Чувствительность ОТ-ПЦР определяли при ограничивающем разведении РНК, экстрагированной из фекалий зараженных свиней. Была установлена чувствительность, равная 10 мкг РНК на реакцию.
Секвенирование продуктов ПЦР
Для проверки специфичности конкретной ПЦР амплифицированные продукты выделяли с использованием набора High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer) согласно протоколу, рекомендованному изготовителем, и затем секвенировали на секвенаторе ABI 373A (Centre for Gene Technology, Auckland University). Компьютерный анализ проводили с использованием программ BLASTN и DNASTAR.
ELISA для детектирования антител против HEV
IgG-антитела против HEV у свиней определяли с помощью набора для постановки ELISA с использованием рекомбинантного GST-ORF2.1 в качестве иммобилизованного антигена. Альтернативно, IgG-антитела против HEV определяли иммуноферментным методом (EIA), как описано ранее (13).
Животные и ткани
Свиньи для исследований происходили из новозеландских товарных стад (породы крупная белая и камбруг), стада с высоким уровнем благополучия (HHS) (порода камбруг) и представляли диких свиней, находящихся на дальних Оклендских островах (стадо AI).
Подвергшиеся анализу ткани свиней включали кровь, печень, селезенку, поджелудочную железу, легкие и сердце от поросят в возрасте одной недели. Фекалии, кровь и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) анализировали от более старших поросят. Все ткани отбирали во время операции и сразу же замораживали в жидком азоте и затем хранили при -70°C до анализа. Кровь от поросят в возрасте 1 недели отбирали пункцией сердца и порциями по 5 мл помещали в пробирки c цитратом декстрозой (ACD) или ЭДТА. Кровь от поросят в возрасте 20 недель и свиноматок отбирали из яремной вены в пробирки с ЭДТА. Фекалии от свиней собирали в стерильные контейнеры и хранили на льду. Фекалии обрабатывали в день отбора проб. Две пробы спермы хряка использовали для определения PCV. Все манипуляции с животными проводили согласно правилам Institutional animal welfare.
Для каждого тестируемого вируса исследовали ряд тканей от свиней различного возраста.
Результаты
Свиной цитомегаловирус (PCMV)
РВМС от 15 поросят в возрасте 20 недель и свиноматок из стада HHS и 20 поросят из стада AI анализировали на присутствие PCMV. Также анализу подвергали легкие, печень и селезенку от 10 поросят в возрасте 1 недели из стада HHS и от 5 поросят из стада AI. 70% проб РВМС от свиноматок и поросят в возрасте 20 недель было позитивным. Образцы РВМС, легких, печени и селезенки от поросят в возрасте 1 недели и выделенных клеток островков Лангерганса были негативными на присутствие ДНК PCMV (таблица II). Все тестированные свиньи из стада AI были негативными на вирус.
<b>Таблица II</b><b>Результаты тестирования на PCMV</b>
Возраст поросенка
Количество поросят
Стадо источника
Подвергшиеся анализу ткани
Результаты
1 неделя
10
HHS
Легкие, печень, селезенка, РВМС
Не обнаружено
1 неделя
5
AI
Легкие, печень, селезенка, РВМС
Не обнаружено
>20 недель
15
HHS
РВМС
70% позитивных
>6 месяцев
20
AI
РВМС
Не обнаружено
Свиной лимфотропный герпесвирус (PLHV)
РВМС от 5 поросят в возрасте 1 недели и 10 поросят в возрасте 20 недель из стада HHS, а также от 20 свиней в возрасте 6 месяцев из стада AI и 10 свиней старше 6 месяцев из товарного стада анализировали на присутствие PLHV. Также анализировали легкие, печень, РВМС и селезенку от 10 поросят в возрасте 1 недели из стада HHS и от 5 поросят в возрасте 1 недели из стада AI. В первоначальных опытах позитивные контроли сознательно опустили для избегания любого возможного обсеменения. В стаде HHS у 95% поросят в возрасте 20 недель была обнаружена вирусная ДНК в РВМС (таблица III). В результате филогенетического анализа ампликонов выявлена 100% аналогия с PLHV типа 2 (2). Не было обнаружено PLHV типа 1. Поросята в возрасте 1 недели были негативными на вирусную ДНК. Поросята из стада AI были негативными на вирус PLHV.
<b>Таблица III</b><b>Результаты тестирования на PLHV</b>
Возраст поросенка
Количество поросят
Стадо источника
Подвергшиеся анализу ткани
Результаты
1 неделя
10
HHS
РВМС, легкие, печень, селезенка
Не обнаружено
1 неделя
5
HHS
РВМС
Не обнаружено
1 неделя
5
AI
Легкие, печень, селезенка
Не обнаружено
20 недель
10
HHS
РВМС
95% позитивных
6 месяцев
20
AI
РВМС
Не обнаружено
>6 месяцев
10
Товарное
РВМС
95% позитивных
Вирус энцефаломиокардита (EMCV)
Поросят из стада HHS и стада AI обследовали на присутствие EMCV.
Стадо HHS: тестированию подвергали ткань миокарда от 20 поросят в возрасте 1 недели и фекалии от 11 поросят в возрасте 10-12 недель.
Стадо AI: тестированию подвергали ткань миокарда от 3 поросят в возрасте 1 недели и фекалии от 10 поросят в возрасте 12-14 недель. В образцах миокарда у поросят в возрасте 1 недели или фекалиях поросят-отъемышей не было обнаружено EMCV (таблица IV).
<b>Таблица IV</b><b>Результаты тестирования на ECMV</b>
Возраст поросенка
Количество поросят
Стадо источника
Подвергшиеся анализу ткани
Результаты
1 неделя
20
HHS
Сердце
Не обнаружено
10-14 недель
11
HHS
Фекалии
Не обнаружено
12-14 недель
10
AI
Фекалии
Не обнаружено
1 неделя
3
AI
Сердце
Не обнаружено
Свиной цирковирус типа 1 и 2 (PCV)
Исследовали следующие ткани:
стадо HHS: 14 проб фекалий от поросят в возрасте 14-16 недель, 4 образца легких и 4 пробы фекалий от поросят в возрасте 1 недели;
товарное стадо: 14 проб фекалий от поросят в возрасте 14-16 недель;
стадо AI: 10 проб фекалий от взрослых свиней.
ДНК РCV2 амплифицировали из проб фекалий от поросят в возрасте 14-16 недель (таблица V). Пробы фекалий от 14-16-недельных поросят были позитивными в 100% случаев в товарном стаде и стаде HHS. Позитивными на PCV типа 2 были 3 из 4 образцов ткани легких от 1-недельных поросят и 4 из 5 проб фекалий от тех же поросят. Филогенетический анализ секвенированных продуктов показал 98% гомологию с уже описанным штаммом РCV2 (U49186). Поросята из стада AI были свободны от вируса.
<b>Таблица V</b><b>Результаты тестирования на PCV2</b>
Возраст поросенка
Количество поросят
Стадо источника
Подвергшиеся анализу ткани
Результаты
14-16 недель
14
HHS
Фекалии
Позитивные
14-16 недель
14
Товарное
Фекалии
Позитивные
1 неделя
4
HHS
Фекалии, легкие
Позитивные
>6 месяцев
10
AI
Фекалии
Не обнаружено
Вирус гепатита Е (HEV)
Антитела против HEV анализировали в сыворотках крови от 24 свиноматок, 23 поросят в возрасте 1 недели и 25 поросят в возрасте 20 недель из стада HHS, 66 сыворотках крови от 22 свиней из товарного стада и 6 поросят из стада AI в возрасте 6 месяцев. Пробы фекалий от 21 10-недельных, 7 20-недельных и 17 7-недельных поросят из товарного стада и стада HHS анализировали на РНК HEV.
HEV был обнаружен в стаде HHS, и преимущественно его выделяли у поросят в возрасте 12 недель. Результаты секвенирования вируса показали, что новозеландский свиной штамм сегрегировал с человеческими штаммами HEV из неэндемичных районов. Поросята из стада AI были свободны от вируса.
Пример 2
В данном примере приведены данные по определению числа копий PERV у свиней стада AI.
Методы
Для определения числа провирусных частиц PERV в геноме свиней использовали две методики: LightCycler (Roche) и ПЦР с ограничивающим разведением (PLDA) в сочетании с компьютерным анализом с использованием программы QUALITY (Rodrigo et al., ubik.microbiol.washington.edu/computing).
Результаты
Результаты обеих методик хорошо согласовывались в отношении числа включившихся провирусных частиц. Среднее количество копий у свиней в стаде AI составляло соответственно 14 или 19 при использовании LightCycler и PLDA.
Также было установлено, что число копий PERV варьировало у отдельных свиней в стаде AI. Число копий PERV колебалось в пределах от 3 до 37 (37, 16, 10, 4, 12, 16, 20, 3, 14) копий при использовании LightCycler и от 4 до 30 копий при использовании PLDA. Было показано присутствие всех трех групп PERV (PERV-А, -В, -С) у свиней стада AI.
PERV присутствует в геноме свиней каждой породы. Чаще всего обнаруживают примерно 50 копий вируса в каждой клетке (6). Указанные выше данные сравнивали с числом копий PERV в стаде инбредных свиней HHS и товарном стаде свиней. Среднее число копий в стаде HHS составляло 43 (30, 56) и 30 в товарном стаде.
Таким образом, отбор хряков и свиноматок с самым низким числом копий PERV для разведения будет обеспечивать донорное стадо свиней с необычно низким числом копий PERV, и это в совокупности с тем, что их потомство свободно от инфекционных микроорганизмов, делает их очень пригодными для применения в ксенотрансплантации.
Пример 3
В данном примере приведены данные анализа группы крови у свиней стада Оклендских островов.
Методы
Для определения группы крови у свиней использовали две методики. В первой методике используют моноклональные антитела для детектирования антигенов групп крови, присутствующих в образцах ткани щек, отобранных у отдельных свиней. В качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные анти-А- и анти-В-антитела от Diagnostic Scotland ALBA-clone. Данные первичные антитела детектировали с помощью меченного флуоресцентной меткой антимышиного IgFITC, используемого в качестве вторичных антител.
С помощью второго метода детектировали присутствие в пробах сыворотки крови антител, реагирующих с синтетическими антигенами групп крови, находящимися на фетальных свиных клетках. Фетальные свиные клетки с синтетическими молекулами поверхностного антигена группы крови А (Ар) или синтетическими молекулами В (Вр) или без всего (Ор) тестировали против сыворотки крови от 65 свиней стада AI в реакции агглютинации. Полагали, что образцы сыворотки крови, не реагирующие с клетками группы Ар, относятся к группе А, таковые, реагирующие против клеток Ар, относили к группе О.
Результаты
Гибридизация in situ
В таблице VI ниже приведены результаты, полученные при гибридизации in situ с использованием моноклональных анти-А- и анти-В-антител. Флуоресцентное окрашивание указывало на присутствие первичных антител и, таким образом, присутствие соответствующего антигена в пробе.
<b>Таблица VI</b><b>Результаты гибридизации in situ для антигенов групп крови в образцах ткани щек</b>
Микроскопический препарат
1° Антитела
Количество снимков
Флуоресценция в баллах
Группа крови АВО
P
-A
4
0,2+,3+,1-2+
A
P
-B
2
0,0
172
-A
3
1-2+,1-2+,1-2+
A
172
-B
4
0,0,0,0
184
-A
3
0,0,0
O
184
-B
2
0,0
Реакция агглютинации
В таблице VIII ниже приведены результаты, полученные при постановке реакции агглютинации. Данные реакции агглютинации указывали на присутствие в пробе сыворотки антител, перекрестно реагирующих с соответствующим антигеном, присутствующим на поверхности клеток. Было принято 6 следующих степеней агглютинации: 4=один сильный агглютинат; 3=средний сильный агглютинат; 2=средний агглютинат; 1=слабый агглютинат; w=очень слабый агглютинат; 0=отсутствие агглютината. Наличие агглютината против клеток с Ар указывало на группу крови О.
<b>Таблица VIII</b><b>Результаты реакции агглютинации для антител против антигенов групп крови</b>
Проба
22С
Результаты
Ар
Вр
Ор
4
0
0
0
A
5
0
0
0
A
8
0
0
0
A
9
0
0
0
A
10
0
0
0
A
11
0
0
0
A
13
0
0
0
A
16
0
0
0
A
17
0
0
0
A
18
0
0
0
A
19
0
0
0
A
22
0
0
0
A
23
0
0
0
A
33
0
0
0
A
34
0
0
0
A
35
0
0
0
A
36
0
0
0
A
44
0
0
0
A
51
0
0
0
A
62
0
0
0
A
7
1
0
0
О
12
2
0
0
О
15
3
0
0
О
24
4
0
0
О
28
2
0
0
О
37
3
0
0
О
40
2
0
0
О
63
3
0
0
О
64
2
0
0
О
65
4
0
0
О
Результаты
В данном примере показано, что примерно 60% тестированных свиней AI были позитивными на углеводсодержащие поверхностные антигены, указывающие на группу крови А. Отбор свиней AI с группой крови О является преимущественным, поскольку они будут более совместимыми с потенциальными реципиентами ксенотрансплантатов и при этом будет снижаться риск отторжения трансплантата. Кроме того, отбор свиней AI с группой крови О будет приводить к меньшему повреждению клеток в результате иммунной реакции, когда клетки и ткани от таких выбранных свиней выращивают в культуре, содержащей сыворотку крови для аналогично отобранных (с группой крови О) свиней.
Пример 4
В данном примере приведены данные анализа группы крови потомства, полученного в результате опытного спаривания свиней из стада Оклендских островов.
Методы
Отбирали одного хряка и одну свиноматку из стада AI для спаривания, основываясь на их группах крови. Хряка с группой крови А (АО) спаривали со свиноматкой с группой крови О (ОО). Затем определяли группу крови у потомства.
Результаты
В результате данного спаривания было получено 4 поросенка: поросенок #232 (ОО), поросенок #233 (АО), поросенок #234 (ОО) и поросенок #235 (ОО). Результатом данного спаривания явилось то, что 75% помета имело группу крови О, что является лучшим результатом по сравнению с предполагаемыми 50%.
Пример 5
В данном примере приведены данные по характеристике передачи PERV в условиях in vitro из клеток, выделенных от свиней-доноров из стада Оклендских островов.
Методы
Способность к передаче у PERV исследовали с использованием совместного культивирования в условиях in vitro. Клетки островков Лангерганса и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) новорожденных поросят выделяли, стимулировали РНА/РМА и совместно культивировали с человеческой клеточной линией-мишенью НЕК 293. Анализировали пролиферацию клеток и активность ОТ для подтверждения стимуляции. Плазму крови также оценивали на присутствие РНК PERV. Анализ ПЦР использовали для подтверждения передачи PERV в клетки-мишени.
Результаты
Через 18-20 недель совместного культивирования не было признаков присутствия PERV или свиного клеточного маркера (субъединицы II цитохромоксидазы) в клеточной линии-мишени.
Пример 6
В данном примере приведены данные по характеристике передачи PERV в условиях in vivo из клеток, выделенных от свиней-доноров из стада Оклендских островов.
Методы
Клетки островков Лангерганса новорожденных поросят, выделенные от поросят-доноров с низким числом копий PERV, инкапсулировали в альгинат, затем трансплантировали киномологичным обезьянам. Затем оценивали передачу PERV.
Результаты
Через 6 месяцев после трансплантации отсутствовали признаки передачи PERV экспериментальным животным.
Пример 7
В данном примере приведены данные определения числа копий PERV у потомства, полученного в результате опытного спаривания отобранных свиней из стада Оклендских островов.
Методы
Отбирали одного хряка и одну свиноматку из стада AI с низким числом копий PERV для спаривания. Число копий PERV у родителей и потомства определяли, как описано в примере 2. Число копий PERV у хряка и свиноматки определяли с помощью PLDA. Число копий у поросят определяли с использованием Light Cycler, как описано в примере 2. Оба метода дают сравнимые значения числа копий.
Результаты
В результате спаривания было получено 5 поросят с числами копий PERV, представленными ниже в таблице IX.
Следовательно, спаривание хряка с низким числом копий PERV со свиноматкой с низким числом копий PERV дает потомство с низкими числами копий PERV.
Пример 8
В данном примере приведены данные определения группы PERV у свиней из стада Оклендских островов. Как здесь уже было указано, будет преимущественным иметь свиней-доноров с отсутствием PERV-С.
Методы
pol
Группу определяли с использованием методов, описанных здесь для определения числа копий PERV (см. пример 2). Число копий PERV определяли с использованием специфических праймеров для -области провируса. С помощью данного метода можно определять копии провирусных частиц различных групп PERV А, В и С.
Результаты
Было установлено, что два поросенка из стада AI (поросенок #102 и #212) были негативными в отношении PERV-С. Преимущественно поросенок #102 также имел группу крови О и за счет этого он является прекрасным кандидатом для разведения доноров.
Заключение
С помощью способов разведения по изобретению возможно получать свиней, особенно подходящих для применения в качестве доноров для ксенотрансплантации. Можно выделить органы, ткани или клетки от таких свиней, и предпочтительно они свободны от инфекционных микроорганизмов, имеют низкое число копий PERV, у них отсутствует PERV-С, и они имеют группу крови О. Можно ожидать, что такие клетки будут особенно пригодными для ксенотрансплантации, по меньшей мере, частично за счет очень низкого потенциального риска передачи инфекционных агентов и/или иммунологического отторжения.
Публикации
1. Mills JN, et al., 1999. Eraerg Infect Dis, 5:135-42.
2. Allan GM., & JA Ellis., 2000. Porcine circoviruses: a review. J. Vet. Diagn. Investig. 12:3-14.
3. Mueller NJ, et al., 2002. Activation of cytomegalovirus in pig-to-primate organ transplantation. J. Virol. 76:4734-4740.
4. Hattermann K, et al., 2004. Infection studies on human cell lines with porcine circovirus type 1 and porcine circovirus type 2. Xenotransplantation 11:284-294.
5. Patience C, et al., 1997. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat. Med. 3:282-286.
6. US 6867347.
7. US 6469229.
8. LeTissier PJ et al. 1997. Two sets of human-tropic pig retrovirus. Nature, 389:681-682.
9. Takeuchi Y et al. 1998. Host vrange and interferences studies of three classes of pig endogenous retrovirus J Virol, 72:9986-9991.
10. Gemeniano M et al., The infectivity and host range of the ecotopic porcine endogenous retrovirus, PERV-C, is modulated by residues in the C-terminal region of its surface envelope protein. 2006. Virology 346(1):108-17.
th
11. Edington N, 1999. Cytomegalovirus. In: Straw BE, D'Állaire S, Mengeling WL, Taylor DJ, editors. Diseases of swine (8 edition). Ames, Iowa: Iowa State University Press, p. 125-131.
12. Ho M, & Drummer JS, 1995. Infections in transplant recipients. In: Mandell L, Bennett JE, Dolin R, editors. Mandell, Douglas and Bennett's principles and practice of infectious diseases. New York: Churchill Livingstone, p. 35-107.
13. Garkavenko O, et al., 2004, Monitoring for Potentially Xenozoonotic Viruses in New Zealand Pigs. J Med Virol. 72:338-344.
14. Ulrich S, et al., 1999. Characterisation of the DNA polymerase loci of the novel porcine lymphotropic herpesviruses 1 and 2 in domestic and feral pigs. J Gen Virol 80(12):3199-3205.
15. Brewer LA, et al., 2001. Porcine encephalomyocarditis virus persists in pig myocardium and infects human myocardial cells. J Virology 75(23): 11621-11629.
16. Horner G, 1991. Pig circovirus antibodies present in New Zealand pigs. Survey Wellington 18:23.
17. Tischer I, et al., 1974. Characterisation of papovavirus- and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines. Zentralblatt fur Bacteriologie Microbiologie und Hygiene seres A 226:153-167.
18. Tischer I, et al., 1995. Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle. Arch Virol 140:1427-1439.
19. Rodrigez-Arrioja GM, et al., 1999. Aujeszky's disease virus infection concurrent with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs. Vet Rec 144:152-453.
20. O'Connor B, et al., 2001, Multiple porcine circovirus 2-associated abortions and reproductive failure in a multisite swine production unit. Can Vet J 42:551-553.
th
st
21. Hatterman K, & Mankertz A., 2002. Infection studies on human cell-lines with porcine circovirus type 1 and type 2. The World of Microbes, Paris, 27 July-1 August 2002, V-385:132.
22. Kiupel M, et al., 2001. Viral replication and lesions in BALB/c mice experimentally inoculated with porcinecirco virus isolated from a pig with postweaning multisystemic wasting disease. Vet Pathol 38:74-82.
23. WO 01/52871.
24. WO 02/32437.
25. WO 2004/113516.
26. WO 03/027270.
27. WO 00/66188.
28. NZ 532057/532059/535131.
29. US 6610288.
30. Hamel AL, et al., 1999. PCR assay for detecting porcine cytomegalovirus. J Clin Microbiol 37:3767-3768.
31. Ehlers B, et al., 1999. Detection of two novel porcine herpesviruses with high similarity to gammaherpesviruses. J Gen Virol 80:971-978.
32. Vanderhallen H, & Koenen F, 1998. Identification of encephalomyocarditis virus in clinical samples by reverse transcription-PCR followed by genetic typing using sequence analysis. J Clin Microbiol 36:3463-3467.
33. Larochelle R, et al., 1999. Typing of porcine circovirus in clinical specimens by multiplex PCR. J Virol Methods 80: 69-75.
34. Erker JC, et al., 1999. Rapid detection of hepatitis E virus RNA by reverse transcription-polymerase chain reaction using universal oligonucleotide primers. J Virol Methods 81:109-113.
Все патенты, публикации, научные статьи и другие документы и материалы, цитированные или упомянутые здесь, указывают на уровень специалистов в данной области, к которой относится изобретение, и каждый из таких цитированных документов и материалов включен здесь для сведения в той степени, как если бы он был включен для сведения в полном объеме самостоятельно или включен здесь в полном объеме. Заявители сохраняют за собой право физически включать в данное описание любой или все материалы и информацию из любого из таких патентов, публикаций, научных статей, сайтов в Интернете, из электронных средств информации и других цитированных материалов или документов.
Конкретные способы и композиции, описанные здесь, представляют различные варианты осуществления или предпочтительные варианты осуществления, и они приводятся только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема изобретения. Другие предметы, аспекты, примеры и варианты осуществления станут очевидными специалистам в данной области при рассмотрении данного описания, и они входят в сущность изобретения, определяемого объемом формулы изобретения. Очевидно, специалисты в данной области понимают, что можно сделать различные замены и модификации в отношении изобретения, раскрытого здесь, не отступая от объема и сущности изобретения. Изобретение, иллюстративно описанное здесь, соответственно можно использовать на практике при отсутствии любого элемента или элементов или ограничения или ограничений, которые здесь конкретно не раскрыты как основные. Так, например, в каждом случае в вариантах осуществления или примерах по настоящему изобретению любой из терминов «включающий», «состоящий в основном из» и «состоящий из» можно заменить на любой из двух других терминов в описании. Также термины «состоящий», «включающий», «содержащий» и т.п. следует трактовать широко и без ограничения. Способы и процессы, иллюстративно описанные здесь, соответственно можно использовать на практике в различных последовательностях стадий, и они необязательно сводятся к последовательностям стадий, указанных здесь или в формуле изобретения. Также, как использовано здесь и в прилагаемой формуле изобретения, формы в единственном числе «а», «an» и «the» включают множественные формы, если только контекст четко указывает на иное. Так, например, выражение «клетка-хозяин» включает множество (например, культуру или популяцию) таких клеток-хозяев и т.д. Ни при каких обстоятельствах патент не следует толковать как ограничивающийся конкретными примерами или вариантами осуществления или способами, описанными здесь. Ни при каких обстоятельствах патент не следует толковать как ограничивающийся любым заявлением, сделанным экспертом, или другим официальным лицом, или представителем Бюро по патентам или торговым названиям, если только такое заявление конкретно и без изменения или без оговорок одобрено в соответствующей письменной форме заявителями.
Использованные термины и выражения применяются в качестве терминов описания, а не ограничения, и при использовании таких терминов и выражений не исключается любой эквивалентный вариант признаков, приведенных и описанных, или их частей, но, очевидно, понятно, что возможны различные модификации, которые входят в объем заявленного изобретения. Так, очевидно, понятно, что, несмотря на то что настоящее изобретение конкретно раскрыто в предпочтительных вариантах осуществления и необязательных признаках, можно сделать модификации или вариации концепций, раскрытых здесь, специалистами в данной области и что такие модификации или вариации следует рассматривать в качестве входящих в объем изобретения, определенного прилагаемой формулой изобретения.
Изобретение раскрыто здесь широко и носит общий характер. Каждый более узкий вид и подродовые группы, попадающие в общее раскрытие, также составляют часть изобретения. Это включает общее описание изобретения, при условии или отрицательном ограничивающем удалении любого предмета из рода, независимо от того, действительно ли удаленный материал конкретно цитирован здесь.
Другие варианты осуществления находятся в последующей формуле изобретения. Кроме того, в тех случаях когда признаки или аспекты изобретения описаны в терминах Markush групп, то очевидно, что специалисты в данной области понимают, что изобретение также описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов Markush группы.