Разделение энантиомеров tv-производных аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием макроциклических антибиотиков

УДК 543.545

РАЗДЕЛЕНИЕ ЭНАНТИОМЕРОВ ^-ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИХ АНТИБИОТИКОВ

А.Ф. Прохорова, М.А. Кузнецов, Е.Н. Шаповалова, С.М. Староверов, О.А. Шпигун

Оценены возможности использования макроциклического антибиотика эремомицина как хирального селектора для разделения энантиомеров ^-производных аминокислот в капиллярном электрофорезе. Для выбора условий разделения изучено влияние основных факторов (состав и рН фонового электролита, концентрация хирального селектора, геометрия капилляра, величина приложенного напряжения) на миграцию производных аминокислот и энантиоселективность в присутствии эремомицина. На примере дансильных производных аминокислот проведено сравнение энантиоселективности ванкомицина и эремомицина в капиллярном электрофорезе.

Ключевые слова: капиллярный электрофорез, макроциклические антибиотики, энантиораспознавание, производные аминокислот.

Введение

Энантиоразделение аминокислот - важная задача, решение которой представляет интерес для медицинской, пищевой и фармацевтической промышленности. Разделение оптически активных аминокислот проводят главным образом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или капиллярным электрофорезом (КЭ) в виде производных. Наиболее важным фактором, определяющим успех разделения, является природа хирального селектора. В качестве хиральных селекторов (ХС) в КЭ используют цикло-декстрины и их производные, ациклические олигоса-хариды и полисахариды, макроциклические антибио-

Рис. 1. Структура эремомицина

тики (МА) [1]. Наличие нескольких хиральных центров позволяет МА разделять широкий круг разнообразных по структуре соединений, однако известно, что наибольшую энантиоселективность они проявляют по отношению к соединениям, содержащим кислотный или анионный остаток (например, карбоксильную группу). В литературе описан новый макроцикличес-кий антибиотик - эремомицин (рис. 1), он является структурным аналогом уже хорошо зарекомендовавшего себя ванкомицина. Из данных ВЭЖХ известно, что эремомицин проявляет селективность по отношению к энантиомерам немодифицированных а-аминокислот [2], потому представляется интересным оценить возможность его использования также и в КЭ. Энантиоселективные свойства эремомицина по отношению к производным аминокислот в литературе не описаны. Данная работа посвящена оценке энан-тиораспознавательной способности эремомицина к К-производным аминокислот методом КЭ и оптимизации условий разделения энантиомеров.

Экспериментальная часть

Реагенты и аппаратура. В работе использовали дансильные производные фенилаланина (дансил-БЬ-РИе), лейцина (дансил-БЬ-Ьеи) и треонина (дансил-БЬ-ТИг), а также карбоксибензильные производные аспарагиновой кислоты (КБЗ-БЬ-Азр) и аланина

(КБЗ-DL-Ala) («Sigma», США), натрия гидроксид, уксусную кислоту, натрия ацетат, калия дигидрофос-фат, натрия гидрофосфат дигидрат, натрия тетраборат декагидрат, калия гидроксид, фосфорную кислоту, соляную кислоту квалификации «х.ч.» («Реахим», Россия), Tris («Fluka», Швейцария), ацетон «для хроматографии» («Криохром», Россия). В качестве хи-ральных селекторов использовали ванкомицина гидрохлорид и эремомицина сульфат, предоставленные ЗАО «БиоХимМак СТ» (Россия).

Работу выполняли на системе капиллярного электрофореза «Капель-105» (НПФ АП «Люмэкс», Россия) со спектрофотометрическим детектором (190— 380 нм). Использовали кварцевые капилляры 58,5 см (эффективная длина 50 см) и 35 см (эффективная длина 27 см) с внутренним и внешним диаметрами 75 и 375 мкм соответственно («Polymicro Technologies», США). Детектирование проводили при длинах волн 240 и 254 нм. Температура термо-статирования капилляра 20°С. Для получения и обработки данных использовали программное обеспечение «Мультихром» 1.52h (ЗАО «Амперсенд», Россия). рН растворов контролировали на иономере ЭВ-74. Подготовку растворов проводили в УЗ-ванне «Сапфир» (НПФ «Сапфир», Москва).

Техника эксперимента. Стандартные растворы производных аминокислот (1 мг/мл) готовили растворением в дистиллированной воде точных навесок соединений. Для приготовления растворов фонового электролита (ФЭ) использовали 50 и 100 мМ фосфатные буферные растворы (рН в диапазоне 6,2-7,1), 50 мМ боратный буферный раствор (рН 9,2), 50 мМ раствор TRIS (рН 8,0). ФЭ получали растворением точной навески хирального селектора в буферном растворе. ФЭ фильтровали через фильтрующую насадку на шприц «MillexGV», мембрана «DuraporePVDF» («Millipore», Ирландия), размер пор 0,22 мкм. Все растворы дегазировали в УЗ-ванне.

Для подготовки нового капилляра к работе его последовательно промывали 0,1 М раствором соляной кислоты, водой, 0,1 М раствором гидроксида натрия, водой, раствором фонового электролита, не содержащего хиральный селектор (по 30 мин каждым раствором). Ежедневно перед началом работы для приведения в состояние равновесия поверхности капилляра проводили промывку 0,1 М раствором гидроксида натрия, водой, ФЭ (по 5 мин каждым раствором). Между анализами капилляр промывали ФЭ (23 мин). Пробу вводили гидродинамическим способом (125 мбар-с) с входного конца капилляра. Маркер ЭОП - 3 об.% раствор ацетона в ФЭ. Из получен-

ных электрофореграмм находили время миграции, далее рассчитывали электрофоретическую подвижность, коэффициент селективности, число теоретических тарелок (Ы) и разрешение пиков по известным формулам [3].

Результаты и обсуждение

Методом ВЭЖХ показано, что эремомицин энан-тиоселективен по отношению к профенам, иминокис-лотам и немодифицированным а-аминокислотам, особенно ароматическим [2, 4]. Для выбора условий разделения энантиомеров тестовых Н-производных аминокислот варьировали природу и рН фонового электролита, длину капилляра, величину приложенного напряжения и концентрацию хирального селектора.

Влияние состава и рН фонового электролита. Значение изоэлектрической точки эремомицина составляет 7,6 (100 мМ фосфатный буферный раствор). В области рН < 7,6 эремомицин имеет положительный заряд и обладает собственной электрофоретичес-кой подвижностью в направлении катода. Как известно, миграция хирального селектора в направлении, противоположном миграции вещества (в нашем случае это отрицательно заряженные производные аминокислот, которые мигрируют к аноду), представляет дополнительное условие для разделения энантиоме-ров, поскольку увеличивает разницу в электрофоре-тической подвижности свободного и связанного энан-тиомеров. Таким образом, фосфатные буферные растворы с рН 6,2-7,1 перспективны как фоновые электролиты при использовании хирального селектора - эремомицина. Однако при введении МА в фоновый электролит с рН < 7,2 серьезной проблемой является адсорбция ХС на стенках капилляра из-за отрицательного заряда его поверхности. Для подавления адсорбции используют достаточно концентрированные (50-100 мМ) буферные растворы. При столь высокой концентрации фонового электролита с увеличением приложенного напряжения растет сила тока (до 140 мкА), что приводит к большому выделению джоулева тепла и повышению температуры внутри капилляра, а следовательно, к ухудшению условий разделения энантиомеров. Поэтому максимальная концентрация буферного раствора в фоновом электролите зависит от природы электролита: она достигает 100 и 50 мМ для фосфатных и боратных растворов соответственно.

При использовании фосфатного буферного раствора с рН 7,1 исследуемые вещества имеют низкую подвижность, поэтому для получения пиков на электро-фореграмме необходимо прикладывать внешнее

давление 10-15 мбар. Время миграции производных аминокислот при этом составляет 17-26 мин. Повышение приложенного напряжения уменьшает время миграции, но при этом растет сила тока. В процессе исследования использовали напряжение 10 кВ, при этом сила тока не превышала 90 мкА. Использование в качестве ФЭ фосфатного буферного раствора с рН 7,1 позволило разделить все исследованные производные аминокислот (табл. 1). Селективность разделения энантиомеров возрастает в ряду дансил-БЬ-РИе < дансил-ЭЬ-Ьеи < дансил-ЭЬ-ТИг. При использовании буферного раствора с рН 6,2 время миграции несколько уменьшается, однако ухудшаются эффективность и селективность разделения энан-тиомеров. Таким образом, данный ФЭ менее удобен для работы.

Для снижения времени анализа применяли более короткий капилляр общей длиной 35 см. Разделить энантиомеры дансил-аминокислот удалось при использовании 50 мМ фосфатного буферного раствора (рН 7,1), при напряжении 7 кВ и внешнем давлении 10 мбар. В этих условиях происходит разделение энан-тиомеров всех исследованных дансил-аминокислот с хорошей воспроизводимостью времени миграции и базовой линии, но разрешение уменьшается в 2-4 раза по сравнению с длинным капилляром (см. табл. 1).

Использование 50 мМ боратного буфера (рН 9,2) позволяет увеличить подвижность аналитов. В этом случае возможно определение без дополнительного внешнего давления, хотя продолжительность анализа довольно велика. Например, разделение энатиомеров дансил-ЭЬ-Ьеи достигается за 40 мин. Селективность разделения при этом незначительно уменьшается, а эффективность повышается до 60 000 ТТ/м. Данный эффект связан с отрицательным зарядом эремомици-

на при рН > 7,6 и уменьшением адсорбции ХС на одноименно заряженных стенках капилляра. К сожалению, щелочные растворы эремомицина неустойчивы, поэтому следует ежедневно готовить свежий раствор ФЭ и менять его через 2-3 ч работы. Использование 50 мМ боратного буфера (рН 9,2) позволило разделить энантиомеры всех дансил-аминокислот без использования внешнего давления в коротком капилляре. Разрешение пиков энантиомеров составило: 2,64 (дансил-DL-Phe); 1,59 (дансил-DL-Leu) и 1,80 (дансил-DL-Thr).

В последнее время в литературе все чаще рекомендуют использовать ФЭ на основе органических буферных растворов [5]. Использование 50 мМ раствора Tris (рН 8,0) в качестве ФЭ позволяет значительно уменьшить величину тока во время анализа за счет небольшой электропроводности, что, безусловно, способствует повышению стабильности системы, однако при этом уменьшаются энантиоселективность и эффективность капилляра. Разрешение пиков энантиомеров дансил-аминокислот составляет 1,6-1,9 (наибольшее значение получено для дансил-DL-Thr).

Для разделения производных аминокислот по совокупности факторов (время анализа, селективность и эффективность) оптимальным оказался буферный раствор с рН 7,1. На рис. 2 показано разделение энантиомеров дансил-DL-Leu для исследованных буферных растворов с использованием короткого капилляра. Сопоставление данных, приведенных в табл. 1, позволяет сделать вывод о том, что использование короткого капилляра полезно для уменьшения времени анализа, но при разделении веществ с близкими значениями электрофоретической подвижности следует отдать предпочтение более универсальному длинному капилляру, чтобы успели сформироваться зоны этих веществ.

Т а б л и ц а 1

Влияние длины капилляра на разделение дансил-производных аминокислот

^~~\Капилляр ¿общ/Дзф, см Соединение 58,5/50 35/27

^мигр, мин а Rs ЧТТ/м мин а Rs ЧТТ/м

Дансил-DL-Thr 21,47 1,6 4,2 15200 17000 5,57* 1,4 1,0 4800 5800

Дансил-DL-Leu 17,93 1,7 1,4 10400 15000 7,10 1,4 1,2 4100 5600

Дансил-DL-Phe 17,17 2,4 1,5 12100 14900 7,06 1,5 0,8 6800 9420

Примечания. ФЭ - 100 мМ фосфатный буфер (рН 7,1), 2,5 мМ эремомицин. Длинный капилляр - 10 кВ, 15 мбар; короткий капилляр - 7 кВ, 10 мбар (*15 мбар).

А , мЕд. абс.

5 10 15 20 25 30

t, мин

Рис. 2. Разделение энантиомеров дансил-DL-Leu: а - 100 мМ фосфатный буфер (рН 7,1), внешнее давление 10 мбар, +7 кВ; á - 50 мМ TRIS (рН 8,0), внешнее давление 10 мбар, +10 кВ; в - 50 мМ боратный буфер (рН 9,2), внешнее давление 0 мбар, +10 кВ. Фоновый электролит содержит 2,5 мМ эремомицина. Ввод пробы 125 мбар-с, кварцевый капилляр 35/27 см, 75 мкм

Влияние концентрации хирального селектора на разделение энантиомеров. Разрешение пиков энантиомеров зависит от концентрации селектора, которую изменяли в интервале 1-5 мМ. Полученные данные приведены в табл. 2. Видно, что время миграции производных аминокислот и ацетона (маркера ЭОП) возрастает с увеличением концентрации эремомицина, что указывает на образование диастереомер-ных комплексов аналитов с хиральным селектором. Заметное влияние на ЭОП и значение времени миграции аналитов с изменением содержания ХС в ФЭ оказывают вязкость раствора, температура и ^-потен-циал двойного электрического слоя.

Селективность разделения и разрешение энантиомеров дансил-БЬ-Ьеи и дансил-БЬ-ТИг увеличиваются с ростом содержания эремомицина. Такое поведение аналитов согласуется с литературными данными [6, 7]. Разрешение и селективность разделения дан-сил-БЬ-РИе несколько уменьшаются при увеличении концентрации ХС от 2,5 до 5 мМ. Таким образом, лучшее значение разрешения энантиомеров получено при концентрации селектора 2,5 мМ.

Сравнение характеристик энантиораспознава-ния ванкомицина и эремомицина. Ванкомицин успешно используется для разделения широкого круга оптически активных соединений в течение уже более

десятка лет [6]. По сравнению с другими антибиотиками ванкомицин недорог, хорошо зарекомендовал себя в ЖХ и КЭ. Свойства ванкомицина и эремомицина близки, поэтому решено было сравнить их энан-тиоселективные свойства. Предварительно установлено, что лучшее разделение производных аминокислот достигается в длинном капилляре при использовании фосфатного ФЭ (рН 7,1; концентрация ХС 5 мМ). Разделение энантиомеров занимает около 20 мин и разрешение пиков составляет 1,4 для дансил-БЬ-ТИг и дансил-БЬ-РИе, а для для дансил-БЬ-Ьеи - 1,8. Сопоставление параметров разделения энантиомеров производных аминокислот с эремомицином (табл. 1, 2) и ванкомицином свидетельствует, что при использовании эремомицина получены большие значения коэффициента селективности разделения энантиомеров, при этом концентрация хирального селектора меньше в два раза. В присутствии эремомицина возможно успешное разделение КБЗ-БЬ-Лзр и КБЗ-БЬ-Л1а (см. табл. 2), ванкомицин в выбранных условиях не позволяет разделить данные энантиомеры.

Таким образом, эремомицин является хиральным селектором с высокой энантиоселективностью по отношению к К-производным аминокислот и может быть рекомендован для разделения оптических изомеров аминокислот.

*Условия представлены в табл.1.

Авторы благодарят фирму «Люмэкс» за предоставленное оборудование и канд. хим. наук А.В. Шпака

за консультации.

Т а б л и ц а 2

Влияние концентрации эремомицина на разделение энантиомеров дансил-аминокислот*

^^.Концентрация эремомицина, мМ Соединение 1 2,5 5

^мт-р, мин а Rs Ами^ мин а Rs Am^ мин а Rs

Ацетон 11,5 - - 16,3 - - 17,0 - -

Дансил--DL-Phe 13,8 1,3 1,5 17,2 2,0 1,5 19,5 2,4 1,1

Дансил-DL-Leu 13,5 1,3 1,4 17,9 1,7 2,4 18,9 1,9 2,3

Дансил-DL-Thr 14,7 1,3 1,5 21,5 1,6 4,3 21,9 2,0 4,8

КБЗ-аспарагиновая кислота 21,37 1,1 2,3 - - - - - -

КБЗ-аланин 14,96 1,4 3,2 - - - - - -

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gubitz G., SchmidM.G. // J. Chromatogr. A. 2008. 1204. P. 140.

2. Кузнецов M.A., Нестеренко П.Н., Васиярое Г.Г., Староверов СМ. // ЖАХ. 2008. 63. С. 64.

3. WeinbergerR. Practical Capillary Electrophoresis. N.Y., 2000.

4. Petrusevska K., Kuznetsov M.A. Gedicke K., Meshko V., Staroverov S.M., Seidel-Morgenstern A. // J. Sep. Sci. 2006. 29. P. 1447.

5. Bednar P., Aturki Z., Stransky Z., Fanali F. // Electrophoresis. 2001. 22. P. 2129.

6. Armstrong D.W., Tang Y., Chen S., Zhou Y., Bagwill C., Chen J.-R. // Anal. Chem. 1994. 66. P. 1473.

7. RisleyD.S., Trelli-SeifertL., McKenzie Q.J. // Electrophoresis. 1999. 20. P. 2749.

nocTynKra b pe^aKunro 23.04.09

ENANTIOSEPARATIONS OF ^-BLOCKED AMINO ACIDS BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS USING MACROCYCLIC ANTIBIOTICS

A.F. Prokhorova, M.A. Kuznetsov, Ye.N. Shapovalova, S.M. Staroverov, O.A. Shpigun

The macrocyclic antibiotic eremomycin has been evaluated as a chiral selector for the separation of the some N-blocked amino acids. To obtain efficient separation, the effect of varying buffer parameters, chiral selector concentration, capillary length, and applied voltage has been investigated. The comparison of the vancomycin- and eremomycin-based enantioseparations of dansylated amino acids has been made.

Key words: capillary electrophoresis; macrocyclic antibiotics; enantiorecognition; amino acids derivatives.

Сведения об авторах: Прохорова Александра Федоровна - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ (alexapro@gmail.com); Кузнецов Михаил Александрович - сотр. ЗАО "Биохиммак СТ", канд. хим. наук (kuznetsov@bcmst.ru); Шаповалова Елена Николаевна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (shapovalova@analyt.chem.msu.ru); Староверов Сергей Михайлович - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (staroverov@bcmst.ru); Шпигун Олег Алексеевич - профессор химического факультета МГУ, чл.-корр. РАН, докт. хим. наук (shpigun@analyt.chem.msu.ru).