Результаты сравнительного анализа бактериологических методов исследований какао-порошка на наличие бацилл, вызывающих порчу продуктов питания (бвппп)

и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения. Материалы V Международной научно-практической конференции.-Ульяновск: Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина, 2013.- С. 146-154.

5. Симанова, Н.Г. К методике преподавания курса анатомии домашних животных / Н.Г. Симанова // Юбилейный сборник к 75-летию профессора Н.А. Жеребцова.-Ульяновск, 2005.- С. 38-40

6. Скрипник, Т.Г. Закономерности постнатальных изменений миелоархитектоники блуждающего нерва животных / Т.Г. Скрипник, Н.Г. Симанова // Актуальные вопросы аграрной науки и образования. Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА.- Ульяновск, 2008.- С. 27-31.

7. Сравнительный морфогенез нейро-цитов краниального шейного и звездчатого ганглиев собаки / С.Н.Хохлова, Н.Г. Симанова, А.А. Степочкин, А.Н.Фасахутдинова // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.- 2013.- № 1 (21).- С. 64-69.

8. Структурно-функциональные изме-

нения некоторых симпатических ганглиев у плотоядных в разные возрастные периоды / С.Н. Хохлова, Н.Г. Симанова, А.Н. Фасахутди-нова, Е.М. Марьин, О.Н. Марьина // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.-2010.- № 1.- С. 96-100.

9. Фасахутдинова, А.Н.Возрастные особенности скелетотопии спинного мозга собаки и кролика / А.Н .Фасахутдинова, С.Г. Писалева // Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации государственной программы развития сельского хозяйства на 2008-2012гг. Материалы международной научно-практической конференции. - Оренбург. - 2008. - С 117-118.

10. Фасахутдинова, А.Н. Скелетотопия спинного мозга собаки и кролика/А.Н. Фасахутдинова, С.Г. Писалева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.- 2010. - С 39-41.

11. Фасахутдинова, А.Н. Материалы по возрастной морфологии спинного мозга кролика / А.Н .Фасахутдинова //Юбилейный сборник (к 75-летию профессора Н.А. Жеребцова). - Ульяновск: Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия, 2005. - С 29-31.

УДК 602.3:579.8

РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ КАКАО-ПОРОШКА НА НАЛИЧИЕ БАЦИЛЛ,

вызывающих порчу продуктов питания

Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»

Басильев дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»

Золотухин Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»

ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.: 8(422)559547, e-mail: feokna@yandex.ru

Ключевые слова: какао-порошок, порча продуктов питания, бациллы, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacullis subtilis,Bacillus mesentericus (pumilus),Bacillus megaterium, бактериофаги, методика, культура.

В статье представлены результаты исследований по подбору оптимальной методики для изучения качественного и количественного состава бацилл, вызывающих порчу продуктов питания на основе какао-порошка, как одного из основных компонентов рецептуры кондитерских изделий. Микробиологическая оценка качества какао-порошка, проведенная нами по 11 партиям, показала, что количество бактерий рода BacШusв исследованных пробах какао-порошка изменяется в пределах от 5,1х102КОЕ/г до 6,2х105КОЕ/г. Изученные биологические свойства выделенных культур позволили отнести их к видам Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus (mesentericus), Bacillus mycoides, Bacillus megaterium. Показано, что срок бактериологического исследования по традиционной схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы (Gordon, 1973) составляет 107 часов при значительных экономических затратах. Применение «Ключа для первичной дифференциации бактерий рода Bacillus» занимает 77 часов. Схема фагоидентификации составляет 29 часов. Эффективность применения трех методик аналогичная.

Введение

Считалось, что кондитерские изделия из-за большой концентрации сахара (осмотического давления), применяемого при производстве, могут не вызывать опасений на предмет бактериологической опасности. Однако в последнее десятилетие экспертами Всемирной организации здравоохранения в рамках Комиссии Кодекс Алимен-тариус создана классификация пищевых продуктов - причин пищевых отравлений бактериальной этиологии, которая отнесла какао-порошок, шоколад, шоколадные изделия, какао-продукты и шоколадные конфеты ко второй категории, т.е. они являются оптимальной средой для культивирования возбудителей токсикоинфекций и токсикозов [1,2].

Безопасность пищевых продуктов, в частности кондитерских изделий и полуфабрикатов, в настоящее время оценивается по 4 группам микроорганизмов, куда входят санитарно-показательные (КМАФАнМ (количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов) и БГКП (бактерий группы кишечной палочки)), патогенные (в том числе Salmonella), плесени и дрожжи и условно-патогенные (Staph. aureus, Bacillus cereus и др.) [3].

Из литературных данных известно, что спорообразующие аэробные бактерии, к которым относятся бактерии Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus (mesentericus), Bacillus mycoides, Bacillus megaterium, являются активными продуцентами разнообразных гидролитических ферментов и используют в качестве питательных вещества

белки, жиры, углеводы, глюкозиды, спирты и органические кислоты [4-7]. Повышенное содержание бацилл, вызывающих порчу продуктов питания (БВППП), является причиной изменения органолептических свойств сырья, полуфабрикатов и готовых кондитерских изделий, основным рецептурным компонентом которых является какао-порошок, что сказывается на сроках годности и доброкачественности готовой продукции.

Цель наших исследований - изучение качественного (видовой состав бактерий) и количественного состава БВППП какао-порошка различных партий.

Задачи:

- подобрать оптимальную методику (по временным и экономическим показателям) для изучения качественного и количественного состава БВППП какао-порошка;

- определить количество БВППП какао-порошка;

- изучить видовое разнообразие БВППП какао-порошка, включая патогенный для человека вид Bacillus cereus.

Объекты и методы исследований

В соответствии с рекомендациями Международной комиссии по микробиологическим спецификациям пищевых продуктов ICMSF оценка качества какао-порошка проводилась по 11 партиям, из средней пробы каждой партии брались 3 навески, которые высевались в двух повторностях. 1-7 партия - какао-порошок производства Россия; 8-11 - импортного производства.

Для выделения БВППП использовали две схемы дифференциации бактерий рода Bacillus (по методикам GordonR. [8]

и R.A.Slepecky, H.T. Hemphill [9] ), которые включали обширный список биохимических свойств (табл. 3 и рис. 1).

Фагоидентификацию бактерий рода Bacillus осуществляли по методикам, модифицированным Васильевым Д.А., Золотухиным С.Н. с соавт. [10-11]. Статистическую обработку результатов опытов проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP).

В исследовании применяли разработанные нами фаговые биопрепараты на основе Phagum Bacillus megaterium Bm - 10 УГСХА-Депи Phagum Bacillus megaterium Bm

- 1 УГСХА-Деп для идентификации Bacillus megaterium; Phagum Bacillus subtilis Bs - 13 УГСХА-Депи Phagum Bacillus subtilis Bs - 16 УГСХА-Деп для идентификации Bacillus subtilis; Phagum Bacillus mycoides B. myc - 3 УГСХА-Депи Phagum Bacillus mycoides B.myc-5УГСХА-Деп Bacillus mycoides для идентификации Bacillus mycoides; Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm - 3 УГСХА-Депи Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm

- 8 УГСХА-Деп для идентификации Bacillus mesentericus (pumilus), выделены и изучены нами.

Результаты исследований

Известно, что технология производства какао-порошка требует охлаждения жмыха до 200С и отделения крупных частиц в воздушно-инерционных классификаторах, что «заставляет» бактериальную клетку образовывать спору, с последующей длительной лаг-фазой для прорастания. Поэтому первоначально каждая навеска была подвергнута термостатированию при 370С в течение 10-18 часов для перехода споро-

вой формы искомых бактерий в вегетативную (соотношение 1:10 в среде обогащения (Claus, 1955)). В 100 см3дистиллированной воды растворяли 10 г KNO3, 5 г пептона, 3 г мясного экстракта. Устанавливали рН 7,0, разливали в пробирки по 9 мл, стерилизовали при 120°С 15 минут.

Далее из предварительно «подро-щенного» материала делали ряд последовательных десятикратных разведений: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4. 1 мл разведения высевался на чашку Петри при добавлении 9 мл мясопептонного агара с глюкозой и дрожжевым экстрактом температурой 38-420С и производили посев штрихом на среду Донована, которую готовили без добавления полимик-сина. Посевы культивировали в условиях термостата в течение 18 часов. Результаты исследований представлены в табл. 1 и показывают, что количество БВППП в исследованных пробах какао-порошка изменяется в пределах от 5,1х102КОЕ/г до 6,2х105КОЕ/г.

С чашек Петри было взято для дальнейших исследований по 1-2 типичных для изучаемых бактерий колонии. Выделение «чистой культуры» проводили по методу Дригальского.

У выделенных культур были изучены тинкториальные свойства. Установлено, что все выделенные бактерии - это крупные грамположительные палочки, расположенные цепочками или попарно, кислотоустойчивые. Затем изучаемые культуры были сгруппированы по культуральным свойствам (рост на жидкой и плотной питательных средах) в условные группы, описанные в табл. 2.

Следующий этап исследований был посвящен изучению биохимических свойств

Таблица 1

Количество бактерий, выделенных из проб какао-порошка

Номер пробы Количество БВППП, КОЕ/г Номер пробы Количество БВППП, КОЕ/г

1 3,6х104±0,6х104 7 1,6х104±0,4х104

2 6,2х105±1,1х105 8 7,4х102±1,6х102

3 0,8х105±0,1х105 9 4,0х103±0,8х103

4 1,9х104±0,5х104 10 5,1х102±1,3х102

5 4,9х103±1,2х103 11 6,4х102±1,5х102

6 6,7х103±0,9х103

Таблица 2

Культуральные свойства выделенных бактерий рода Bacillus

Тип колоний Характерные культуральные свойства Количество выделенных культур одного типа

особенности роста на мясо-пептонном агаре с глюкозой и дрожжевым экстрактом особенности роста на мясо-пептонном бульоне

тип 1 (условная группа B. cereus) Колонии плотной консистенции, белые, восковидные, круглые Среда мутная, осадок трудноразбиваемый, крошковатый, прочные пленка и пристеночное кольцо. При образовании пленки среда просветляется/ 2

тип 2 (условная группа B.megaterium) Колонии слизистые, желтовато-белые Растет в виде осадка на дне пробирки с помутнением среды 2

тип 3 (условная группа B.pumilus) Толстые матовобелые морщинистые колонии Бульон остается почти прозрачным, на поверхности среды морщинистая пленка 1

тип 4 (условная группа B.mycoides) Войлоковидные наложения, ползущие по поверхности среды Помутнения среды нет, на дне ватообразный осадок, пленки не образует 2

тип 5 (условная группа B.subtilis) Колонии белые или сероватые, морщинистые Бульон мутный, при образовании пленки среда просветляется 1

выделенных культур. Для типирования мы применяли ключ R.A. Slepecky, H.T. Hemphill [9], разработанный для первичной дифференциации бактерий родов Bacillus и Paeni-bacillus (табл.3).

Алгоритм применения ключа: при положительном результате определения какого-либо биохимического свойства следующий этап, рекомендованный авторами, обозначен арабской цифрой по горизонтали и отражен буквенным обозначением по вертикали. Заключительным этапом дифференциации по ключу служит название вида микроорганизма.

Параллельно мы проводили исследования по дифференциации выделенных бактерий по схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы (рис. 1) по классической методике, составляющей основу идентификационных тестов для бактерий рода Bacillus в «Определителе бактерий Берджи».

Наоснове изученных нами биологиче-

ских свойств выделенные культуры отнесли к видам Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus (mesentericus), Bacillus mycoides, Bacillus megaterium. Время исследования с применением «Ключа для первичной дифференциации бактерий рода Bacillus» составило 77 часов. Исследования по схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы [8] составляет 107 часов. Значительные временные и материальные затраты не позволяют применять данные методики в производственных лабораториях, в виду невозможности останавливать технологический процесс производства кондитерских изделий до получения результата бактериологического исследования с ККТ (критической контрольной точки) системы обеспечения безопасности пищевой продукции НАССР.

С целью оптимизации процесса идентификации бацилл, вызывающих порчу продуктов питания, мы использовали специфические бактериофаги, выделенные и селекционированные нами ранее по отработан-

Таблица 3

Ключ для первичной дифференциации бактерий родов Bacillus и Paenibacillus

1. Каталаза: положительный........................................2

отрицательный......................................................17

2. Voges-Proskauer: положительный.................................3

отрицательный.....................................................10

3. Рост в анаэробном агаре: положительный.................4

отрицательный......................................................9

4. Рост при50°С: положительный....................................5

отрицательный.....................................................6

5. Рост в7% NaCl: положительный...............................B.licheniformis

отрицательный..................................................B. coagulans

6. Кислота и газ из глюкозы (неорганический N): положительный.B. polymyxa

отрицательный....................................................7

7. РедукцияNOз доNOз: положительный.............................8

отрицательный..................................................Paenibacillusalvei

8. Параспоральное тело в спорангии: положительный................B. thuringiensis

отрицательный....................................................B. cereus

9. Гидролиз крахмала: положительный..............................B. subtilis

отрицательный....................................................B. pumilus

10. Рост при65°С: положительный............................B. stearothermophilus

отрицательный....................................................11

11. Гидролиз крахмала: положительный.............................12

отрицательный....................................................15

12. Кислота и газ из глюкозы (неорганический N): положительный.B. macerans

отрицательный....................................................13

13. Ширина палочки 1.0цт или больше: положительный........B. megaterium

отрицательный....................................................14

14. Рост при pH<6.0: положительный......................B. circulans

отрицательный.......................................B. firmus

15. Рост в анаэробных условиях: положительный..............B. laterosporus

отрицательный.........................................16

16.Образование кислоты из глюкозы (неорганический азот).....B. brevis

отрицательный................................................B. sphaericus ..

17. Рост при 65°C: положительный:.........................B. stearothermophilus

отрицательный...........................................18

18. Разложение казеина: положительный.......................Р. larvae

отрицательный..........................................19

19. Параспоральное тело в спорангии: положительный..........Р. popilliae

отрицательный...............................................B. lentimorbus______

ной методике фагоидентификации [12-13].

На поверхность подсушенного мясопептонного агара в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 10-часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ста-

вили в термостат для подсушивания газона культуры на 20-30 минут при 37 0С.

Чашку делили бактериологическим карандашом на шесть секторов. На поверхность засеянной среды, в зоне первого-пято-го секторов, пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаги, на шестой сектор в качестве контроля наноси-

Таблица 4

Эффективность методов идентификации бактерий рода Bacillus

Метод идентификации бактерий Время исследования, час Вид бактерий

B. cereus B.megaterium B.pumilus B.mycoides B.subtilis

Фагоиде нтифи кация 29 2 2 1 2 1

«Ключ для первичной дифференциации бактерий рода Bacillus» 77 2 2 1 2 1

Схема выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы 107 2 2 1 2 1

ли стерильный мясопептонный. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 20-30 минут и помещали в термостат на 18 часов при 37 0С.

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с возможно вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат - отсутствие лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствие лизиса в контроле. При положительном результате культуру относили к тому виду бактерий, для которого специфичен «сработавший» бактериофаг.

В табл. 4 представлены результаты фагоидентификации выделенных нами бактерий в сравнении с двумя ранее применяемыми нами методиками. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения специфических бактери-офаговых препаратов с целью типирования бактерий рода Bacillus, так как сокращение времени исследования и снижение трудозатрат на фоне экономии дорогостоящих питательных сред и реактивов, не снижает качества исследования, что было продемонстрировано нами в данном эксперименте. выводы

Оценка микробиологических показателей качества какао-порошка, проведенная нами по образцам 11 партий, показала, что количество БВППП в исследованных пробах какао-порошка изменяется в пределах

от 5,1х102КОЕ/г до 6,2х105КОЕ/г. Повышенная контаминация отечественного какао-порошка в сравнении с импортным может, на наш взгляд, объясняться рядом причин: во-первых, такие технологические операции, как обжарка и последующее отделение какаовеллы - это неотъемлемая часть производства какао-порошка вне зависимости от географического положения, температурные параметры которых недостаточны для инактивации выделенных нами бактерий видов Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus (mesentericus), Bacillus mycoides, Bacillus megaterium, как следствие, речь может идти о наличии в объектах исследований дебактеризаторов.

Во-вторых, контаминация оборудования при дроблении и размоле и сложность санитарной обработки технологической линии приводит к экзогенному загрязнению сырья, полуфабриката и готового продукта БВППП.

Нами доказано, что срок бактериологического исследования по традиционной схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы (Gordon, 1973), составляет 107 часов при значительных экономических затратах. Модифицированная схема ускоренной идентификации БВППП с применением «Ключа для первичной дифференциации бактерий рода Bacillus» составляет 77 часов. Схема предлагаемой нами фагоидентификации составляет 29 часов.

На рис. 1 показана сравнительная характеристика трех методов исследований по идентификации бацилл, вызывающих порчу продуктов питания (БВППП), к которым от-

Рис.1 - Схема ускоренной идентификации БВППП с помощью селекционированных нами бактериофагов

носятся виды Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus (mesentericus), Bacillus my-coides, Bacillus megaterium. Также мы предлагаем использовать «Ключ...» в симбиозе с методом фагоидентификации при отрицательном результате фаготипирования выделенной культуры без приостановления исследований.

Библиографический список

1. Codex alimentarius. Мед, сахара, какао-продукты и шоколад. - М.: «Весь мир», 2007. - с. 31-37.

2. Леонова, И.Б. Характеристика качества шоколада и какао-порошка по микробиологическим критериям / автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук / Российская экономическая академия им. Г. В. Плеханова. - Москва, 1993. - С. 3-5.

3. Скокан, Л.Г. Технологические аспекты обеспечения качества кондитерских изделий/ автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук /Московский государственный институт пищевых производств. - Москва, 2004. -С. 4-8.

4. Васильев, Д.А. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2012. - № 3. - С. 69-73.

5. Васильев, Д.А. Биосенсорнаядетек-ция бактерий рода Bacillus в молоке и молочных продуктах для предупреждения их порчи / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 4 (24). - С. 36-43.

6. Калдыркаев, А.И. Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного ми-

кроорганизма / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, А.В. Алешкин // В книге: «Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека». - Ульяновск, 2013. - С. 211-225.

7. Петрукова, Н.А. Биоиндикация содержания бактерий Bacillus megaterium в молоке и молочных продуктах / Н.А. Петру-кова, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // «Экология родного края: проблемы и пути их решения»: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Киров, 2014. - С. 375377.

8. Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In: Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio), 1973. V.1. P.71-88.

9. Slepecky, R.A. The Genus Bacillus-Nonmedical / R.A. Slepecky, H.T. Hemphill // Prokaryotes. - 2006. - № 4. - Р. 530-562.

10. Романова, Н.А. Сравнительная эффективность методов выделения фагов бактерий Bacillusmegaterium / Н.А. Романова, Н.А. Феоктистова, С.Н. Золотухин [и др.] // Вестник ветеринарии. - 2013. - № 1 (64). - С. 26-27.

11. Васильев, Д.А. Характеристика биологических свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 1. - С. 79-83.

12. Феоктистова, Н.А. Методы выделения бактериофагов рода Bacillus / Н.А. Феоктистова, В.А. Макеев, М.А. Юдина [и др.] // Вестник ветеринарии. - 2011. - Т. 59. - № 4.

- С. 88-89.

13. Феоктистова, Н.А. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus / Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2011.

- Т. 4. - № 32-1. - С. 288-290.

И