Механизмы влияния -амилоидного пептида на ретроградный аксонный транспорт

Механизмы влияния р-амилоидного пептида на ретроградный аксонный транспорт

М.А. Мухамедьяров 1, З.З. Сафиуллов 1, Р.П. Утяшева 1, А.А. Ризванов 2,

А.Л. Зефиров 1, Р.Р. Исламов 1

1 Казанский государственный медицинский университет, Казань

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

The mechanism of p-amyloid peptide influence on the retrograde axon transport

M.A. Mukhamedyarov1, ZZ. Safiullov1, R.P. Utyasheva 1, A.A. Rizvanov2, A.L. Zefirov1, R.R. Islamov1

1 Kazan State Medical University, Kazan

2 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan

Нарушение аксонного транспорта является широко распространенным явлением и ранним событием при многих нейродегенеративных заболеваниях. Целью данной работы стало изучение механизмов нарушения ретроградного аксонного транспорта в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга мыши после аппликации р-амилоидного пептида (вАП) (25-35) на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва.

Под общим наркозом мышам перерезали левый седалищный нерв в средней трети бедра, а затем на центральный отрезок нерва апплицировали раствор, в зависимости от экспериментальной группы животных, содержащий ретроградный флуоресцентный маркер НиогодоШ (5%), либо вАП (25-35) (10-6 М), либо и то и другое. Через 24 ч после операции поясничный отдел спинного мозга процессиро-вали для морфометрического и иммуногистохимического анализа.

В контроле количество Fluoгogold-позитивных мотонейронов составило 1223,7±162,7 (п = 7), тогда как при аппликации вАП (25-35) — 393,2±85,3 (п = 5, р < 0,01), что говорит о выраженном угнетении ретроградного аксонного транспорта. Окраска поликлональными антителами к каспазе-3 не выявила мотонейронов в состоянии апоптоза, а окраска моноклональными антителами к вАП (25-35) была отрицательна как на оперированной, так и на интактной стороне спинного мозга.

Таким образом, выявленное нами угнетающее действие вАП (25-35) на ретроградный аксонный транспорт не связано с апоптотической гибелью нейронов или накоплением вАП (25-35) в теле нейрона, а, вероятно, обеспечивается внутриаксонными эффектами. Полученные данные имеют важное значение для понимания механизмов патогенеза болезни Альцгеймера.

Ключевые слова: в-амил°идный пептид, болезнь Альцгеймера, ретроградный аксонный транспорт, мотонейрон, каспаза-3.

Внутриклеточный транспорт веществ и органелл является необходимым условием существования всех клеток млекопитающих, но наибольшую важность этот процесс имеет для нейронов. Это связано с наличием у нейронов отростков и их значительной длиной (длина аксона мотонейрона может составлять более 1 м). Выделяют антероградный и ретроградный аксонный транспорт. Антероградный транспорт обеспечивает доставку материалов из тела нейрона в различные компартменты аксона (натриевые каналы — преимущественно в перехваты Ранвье, синаптические белки — в окончание аксона, и др.), а ретроградный — в обратном направлении (интерна-

е-таП: maratm80@list.ru

Impairment of axon transport is widespread and early event in a number of neurodegenerative diseases. The goal of study is to investigate the mechanisms of retrograde axon transport impairment in mouse spinal motoneurons after application of p-amyloid peptide (pAP) (25-35) on the central stump of transected sciatic nerve.

Retrograde fluorescent tracer Fluorogold (5%), pAP (25-35) (10-B M), or mix was applied to the proximal stump of the transected sciatic nerve of mouse under the general anesthesia. At 24 hours after surgery lumbar spinal cord was processed for morphometric and immunohistochemical analysis.

The amount of Fluorogold-positive motoneurons at control was 1223,7±162,7 (n = 7), whereas after application of pAP(25-35) — 393,2±85,3 (n = 5, p < 0,01), which certifies pronounced inhibition of retrograde axonal transport. Staining with polyclonal antibodies against caspase-3 did not reveal motoneurons in apoptotic state. Staining with monoclonal antibodies against the pAP (25-35) was negative both at operated and intact sides of spinal cord.

Thus, revealed inhibitory action of pAP (25-35) on the retrograde axon transport is not related to apoptotic death of neurons or accumulation of pAP (25-35) inside the neuronal soma, but, evidently, is mediated by intraaxonal effects. Obtained data has great importance for understanding of mechanisms of Alzheimer's disease pathogenesis.

Key words: p-amyloid peptide, Alzheimer's disease, retrograde axon transport, motoneuron, caspase-3.

лизированные синаптические везикулы, сигнальные молекулы и т.д.).

Установлено, что аксонный транспорт нарушается при большинстве распространенных нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероза, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и др.) [1—2]. Чаще всего, такие нарушения связаны с накоплением патологических белковых агрегатов внутри аксонов, однако детальные механизмы дефектов аксонного транспорта при разных патологиях различны. Нарушения аксонного транспорта описаны на ранних стадиях заболевания у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгей-

мера [3—4], вместе с тем, механизмы описанных феноменов не ясны. Предполагается, что нарушения аксонного транспорта при болезни Альцгеймера связаны с эффектами р-амилоидного пептида фАП) и гиперфосфорилированного тау-белка, которые играют центральную роль в патогенезе данного заболевания [1, 5].

В данной работе мы исследовали эффекты и механизмы влияния рАП на ретроградный аксонный транспорт в спинномозговых мотонейронах мыши.

Материал и методы

Методика операции. Эксперименты проводились на трех группах лабораторных мышей дикого типа. Под общим наркозом мышам перерезали левый седалищный нерв в средней трети бедра и на центральный отрезок нерва надевали силиконовую трубку длиной 5 мкм. Далее, в зависимости от экспериментальной группы, трубку заполняли 5 мкл 5% раствора ретроградного флуоресцентного маркера Fluorogold (группа «FG-контроль»), либо 5 мкл 5% раствора Fluorogold с добавлением 10-6 M рАП (25-35) (группа «FG-рАП»), либо 5 мкл 10-6 М раствора р-амилоидного пептида (2535) (группа «рАП»). Свободный конец трубки запечатывали вазелином. Через 24 ч животных под наркозом перфузировали фосфатно-солевым буфером, а затем 4% раствором параформальдегида в фосфатно-солевом буфере. Далее, выделяли поясничный отдел спинного мозга, фиксировали в 4% растворе параформальдегида, а затем хранили в 30% растворе глюкозы для последующего морфологического анализа.

Подсчет Fluomgold-позитивных мотонейронов. Для подсчета Fluorogold-позитивных мотонейронов в спинном мозге мышей групп «FG-контроль» и «FG-РАП» готовили серийные поперечные срезы поясничного отдела спинного мозга (30 мкм) на виброслай-сере (WPI, США). Количество Fluorogold-позитивных мотонейронов подсчитывали при помощи флуоресцентного микроскопа Olympus BX51WI с использованием ультрафиолетового фильтра (рис. А), а затем вычисляли их суммарное количество во всех срезах спинного мозга одного животного. Статистическую обработку производили при помощи программного комплекса Origin 7.5. Достоверность различий между величинами оценивалась по t-критерию Стьюдента, при этом различия считали статистически достоверными при р < 0,05.

Иммуногистохимия. Для выявления рАП (25-35) и каспазы-3 (маркер апоптоза) проводилииммуногисто-химическое окрашивание поперечных парафиновых срезов (5 мкм) спинного мозга мышей группы «рАП» непрямым иммунопероксидазным методом. Для выявления каспазы-3 использовали поликлональные антитела (Sigma-Aldrich, 1:1000, США), для выявления рАП (25-35) — моноклональные антитела (GenScript, 1:100, США). Иммунную реакцию с первичными антителами проводили с помощью стрептавидин-биотинового комплекса (Elite ABC Kit, Vector Laboratories, США). Иммунопреципитат визуализировали с помощью диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase, Vector Laboratories, США). Для контроля проводили окрашивание без первичных или вторичных антител (отрицательный контроль). Готовые срезы изучали под микроскопом Olympus BX51WI.

Б

Спинной мозг оперированных животных:

А - тела мотонейронов, содержащие краситель Flurogold;

Б - интактная сторона поясничного отдела. Ретроградное окрашивание с помощью флуоресцентного маркера Пигодо^.

Ув.: х40

Результаты и обсуждение

В контроле (группа <^») количество Fluorogold-позитивных мотонейронов составило 1223,7±162,7 (п = 7). В группе <^-рАП» количество Fluorogold-позитивных мотонейронов было снижено примерно в 3 раза и составило 393,2±85,3 (п = 5, р < 0,01) (рис.). Таким образом, мы впервые получили данные о том, что рАП (25-35) обладает выраженным угнетающим эффектом на ретроградный аксонный транспорт в мотонейронах.

Чтобы выяснить, не связан ли обнаруженный эффект с апоптотической гибелью мотонейронов, мы провели иммуногистохимическую оценку наличия активированной каспазы-3 — одного из маркеров апоптоза в срезах спинного мозга. Анализ имму-ногистохимической реакции не выявил различий в окраске ядер между мотонейронами передних рогов оперированной и интактной сторон. Учитывая литературные данные о том, что при активации каспаза-3 перемещается из цитоплазмы в ядро и именно в ядре выполняет свои ключевые про-апоптотические функции [6-8], можно сделать вывод о том, что аппликация рАП (25-35) на культю седалищного нерва,

как и перерезка нерва, не вызывает апоптоз мотонейронов.

Далее, при помощи иммуногистохимического метода мы оценили возможность ретрогарадного транспорта рАП (25-35) по аксону в тела мотонейронов в наших экспериментальных условиях. Окраска антителами к вАП (25-35) была негативна в мотонейронах передних рогах как на оперированной, так и на интактной стороне спинного мозга.

Таким образом, выявленное нами угнетающее действие вАП (25-35) на ретроградный аксонный транспорт не связано с апоптотической гибелью нейронов или накоплением вАП в теле клетки, а, вероятно, обеспечивается внутриаксонными эффектами вАП. Возможными механизмами выявленного феномена могут быть взаимодействие вАП с белками, обеспечивающими ретроградный аксонный транспорт (динеин и др.), затруднение прохождения ретроградно транспортируемых материалов из-за накопления фибрилл вАП внутри аксона, и др.

Хорошо известно, что вАП секретируется и накапливается во внеклеточном пространстве. Вместе с тем, ряд исследований последних лет доказывает,

что рАП может накапливаться и внутри клетки. Двумя основными источниками внутринейронного рАП может быть внутриклеточная продукция рАП и его захват из внеклеточного пространства путем эндо-цитоза [9]. Эти данные свидетельствуют о важном значении полученных нами результатов. Нарушение ретроградного аксонного транспорта под действием РАП может значительно усиливать нейрональную дисфункцию, в частности, за счет нарушения связи между телом нейрона и пресинаптическим окончанием аксона.

Полученные данные имеют важное значение для понимания клеточных эффектов внутринейронного РАП, а также механизмов патогенеза болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с накоплением рАП, в целом.

Благодарности

Работа поддержана грантом РФФИ № 10-0400883, государственным контрактом ФЦП с Минобрнауки России 16.512.11.2082, грантами Президента РФ №№ НШ-4670.2012.4 и МК-760.2011.4.

ni/ITEPATYPA

1. De Vos K.J., Grierson A.J., Ackerley S. et al. Role of axonal transport in neurodegenerative diseases. Annu. Rev. Neurosci. 2008; 31: 151-73.

2. Morfini G.A., Burns M., Binder L.I. et al. Axonal transport defects in neurodegenerative diseases. J. Neurosci. 2009; 29(41): 12776-86.

3. Stokin G.B., Lillo C., Falzone T.L. et al., Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science 2005; 307(5713): 1282-8.

4. Lazarov O., Morfini G.A., Pigino G. et al. Impairments in fast axonal transport and motor neuron deficits in transgenic mice expressing familial Alzheimer's disease-linked mutant presenilin 1. J. Neurosci. 2007; 27(26): 7011-20.

5. Querfurth H.W., LaFerla F.M. Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 2010; 362(4): 329-44.

6. Kamada S., Kikkawa U., Tsujimoto Y. et al. Nuclear translocation of caspase-3 is dependent on its proteolytic activation and recognition of a substrate-like protein(s). J. Biol. Chem. 2005; 280(2): 857-60.

7. Zheng T.S., Schlosser S.F., Dao T. et al. Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo. PNAS USA 1998; 95(23): 13618-23.

8. Woo M., Hakem R., Soengas M.S. et al. Essential contribution of caspase 3/CPP32 to apoptosis and its associated nuclear changes. Genes Dev. 1998; 12(6): 806-19.

9. Bayer T.A., Wirths O. Intracellular accumulation of amyloid-Beta -a predictor for synaptic dysfunction and neuron loss in Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 2010; 2: 8.

Поступила13.08.2012