СИСТЕМА РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ, СПОСОБ КАЛИБРОВКИ СИСТЕМЫ И ОДНОВРЕМЕННОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ ОСТАТКОВ АНТИБИОТИКОВ И ИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ В МОЛОКЕ
REAL-TIME SYSTEM, METHOD OF CALIBRATING SYSTEM AND SIMULTANEOUS DETECTION OF RESIDUES OF ANTIBIOTICS AND THEIR CONCENTRATION IN MILK

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области оценивания качества молока и определения остатков, присутствующих в молоке.
Уровень техники
Антибиотики используются для лечения воспалительных процессов и в некоторых странах как пищевые добавки в сельскохозяйственную продукцию. Неправильное использование антибиотиков может привести к их появлению в молоке и, соответственно, загрязнению молока, что, в свою очередь, может вызвать проблемы, связанные со здоровьем, и риски развития устойчивости микроорганизмов; а также проблемы в молочной отрасли путем оказания воздействия на процессы ферментации. Чтобы устранить проблемы, связанные с загрязнением молока, установлены максимальные остаточные уровни (MRL) для антибиотиков в молоке (Постановление Европейского Совета №2377/90).
Для определения остатков антибиотиков в молоке используются следующие известные способы:
а) испытания на уменьшение действия микроорганизмов (Delvotest, BrTest и т.д.; ЕР0005891, US5454805, ЕР0285792, ЕР1216307) для проведения, скрининга и качественного анализа на фермах. Эти испытания основаны на колориметрических реакциях, имеющих место во время роста микроорганизмов, используемых в испытаниях (время испытания 2-3 часа);
b) «быстрые испытания», позволяющие обнаружить, в основном, β-lactam антибиотики в течение 10-15 минут, основанные на различных технологиях (испытания Penzym, Betastar, Charm II; ЕР0538447, US6043048);
c) хроматографические анализы, позволяющие осуществить и качественное, и количественное определение остатков антибиотиков. Эти анализы очень дорогие и требуют много времени (предварительная обработка проб и их анализ занимает 1-2 дня).
Также остатки антибиотиков можно определить с помощью технологий QSM (Park и др., Биодатчики и Биоэлектроника. 19, 667-674, 2004) или SPR (Gaudin и др., Analitica Chimica Acta. 436, 191-198, 2001), основанных на биодатчиках.
Ни одна из вышеупомянутых технологий не позволяет обнаружить остатки антибиотиков или определить их концентрации в реальном времени, т.е. во время доения коровы, и не делает возможным производить сепарацию нестандартного молока в реальном времени.
Наиболее близкой к настоящему изобретению является система обнаружения антибиотиков, основанная на применении гаптенов (неполноценных антигенов) в качестве системы биологического опознавания в массиве биодатчиков (Knecht и др., Analytical Chemistry. 76, 646-654, 2004). В данном массиве биодатчиков различные моноклональные антитела фиксируются на стеклянной подложке. Эти антитела, отбираемые по отношению к конкретным антибиотикам, генерируют хемилюминесцентные сигналы в присутствии антибиотиков. Такой массив дает возможность одновременно обнаружить 10 различных антибиотиков. Система очень чувствительна и требуется только 5 минут для обнаружения антибиотиков. Основным недостатком системы является низкая скорость регенерации системы, поэтому система не применяется для приспособлений реального времени.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение предлагает систему реального времени, способ калибровки системы и одновременное обнаружение остатков антибиотиков и их концентраций в молоке. Изобретение позволяет оценивать качество молока в реальном времени и сепарацию нестандартного молока в реальном времени, чтобы не допустить загрязнение молочной продукции.
Первой целью изобретения является система реального времени для одновременного обнаружения антибиотиков и определения их концентрации в молоке, которая содержит каналы для притока и оттока молока и термостатированные параллельные идентичные каналы для потока молока, каждый из которых содержит кислородный датчик, интегрированный с разным ферментом, и вместе образуют массив биодатчиков. Система содержит устройство обработки сигналов, которое соединено со средством для сепарации нестандартного молока. Чтобы осуществить одновременное обнаружение различных антибиотиков и определение их концентраций в реальном времени, в течение времени доения, система содержит дополнительный параллельный канал для потока молока, включающий в себя кислородный датчик без фермента. Все кислородные датчики, используемые в изложенной системе, могут быть оптическими, амперометрическими или потенциометрическими. Также система содержит термостатированное гидролизное устройство, расположенное между каналом притока молока и параллельными каналами потока молока, которое включает в себя физическое и/или химическое средство стимулирования гидролиза лактозы для генерации равных заданных концентраций глюкозы и галактозы во всех пробах молока. Физическое средство может быть прибором, генерирующим ультразвук, импульсное магнитное поле или электрическое поле, химическим средством может быть катализатор (как β-галактозидаза или другой фермент, катализирующий гидролиз лактозы).
В массиве биодатчиков каждому кислородному датчику присоединен разный фермент, катализирующий окисление глюкозы и галактозы (глюкозооксидаза, оксидаза галактозы или другой фермент, принадлежащий к классу оксидоредуктаз), каталитическая активность которого повышается или понижается, когда антибиотики присутствуют в пробе молока. Количество ферментов должно быть достаточным для генерации уменьшения переходной фазы концентрации кислорода, которое измеряется с определенной (заданной) точностью перед тем, как анализируемое молоко смешивается с молоком высокого качества.
Второй целью изобретения является способ калибровки вышеизложенной системы, содержащий следующие этапы:
а) лактоза в пробе молока без антибиотиков и в пробе молока, которая загрязняется определенным количеством различных антибиотиков, быстро гидролизируется для генерации определенных (заданных) равных концентраций продуктов гидролиза лактозы, глюкозы и галактозы, превышающих концентрации глюкозы и галактозы в необработанном молоке, по меньшей мере, в 10 раз. Этот гидролиз позволяет получить равные концентрации глюкозы и галактозы во всех пробах молока, так как типичная концентрация лактозы в молоке очень стабильна (140±3 тМ) и превышает типичные концентрации глюкозы и галактозы в молоке более чем в 1000 раз;
b) каждая проба молока, полученная на этапе а) (т.е. пробы, в которых концентрации глюкозы и галактозы достигли определенных (заданных) значений после гидролиза лактозы), направляется в параллельные каналы потока молока, где благодаря каталитической активности ферментов, присутствующих в биодатчиках, глюкоза и галактоза окисляются молекулярным растворенным кислородом, и уменьшения концентрации кислорода в переходной фазе во время реакции окисления в каждом параллельном канале потока молока измеряются массивом биодатчиков в каждой пробе молока;
c) первоначальная концентрация молекулярного растворенного кислорода в каждой пробе молока, полученная на этапе а), измеряется одновременно с помощью кислородного датчика без ферментов;
d) для проб молока без антибиотиков вычисляются параметр стационарного состояния и кинетический параметр для каждой реакции, протекающей в другом биодатчике и катализируемой ферментом, имеющимся в этом биодатчике, на основе уменьшения переходной фазы концентрации кислорода во время реакции окисления глюкозы и галактозы и концентрации молекулярного растворенного кислорода, измеряемой кислородным датчиком без ферментов, и эти вычисленные параметры для различных биодатчиков комбинируются для формирования характерного образа пробы молока без антибиотиков;
е) для проб молока, загрязненных определенными количествами различных антибиотиков, вычисляются параметр стационарного состояния и кинетический параметр для каждой реакции, протекающей в другом биодатчике и катализируемой ферментом, имеющимся в этом биодатчике, на основе уменьшения переходной фазы концентрации кислорода во время реакции окисления глюкозы и галактозы и концентрации молекулярного растворенного кислорода, измеряемой кислородным датчиком без ферментов. На основании комбинации этих вычисленных параметров для различных биодатчиков формируется характерный образ или характерный признак каждого антибиотика и его концентрации.
Следующей целью изложенного изобретения является способ одновременного обнаружения в реальном времени различных антибиотиков и определения их концентраций в молоке с использованием вышеизложенной системы.
Способ содержит следующие этапы:
a) лактоза в исследуемых термостатированных пробах молока быстро гидролизируется для получения определенных (заданных) равных концентраций глюкозы и галактозы, превышающих концентрации глюкозы и галактозы в необработанном молоке, по меньшей мере, в 10 раз;
b) уменьшение переходной фазы концентраций кислорода во время реакций окисления глюкозы и галактозы измеряется массивом биодатчиков в исследуемой пробе молока;
c) концентрация молекулярного растворенного кислорода в исследуемой пробе молока одновременно измеряется с помощью кислородного датчика без ферментов;
d) для исследуемых проб молока вычисляются параметр стационарного состояния и кинетический параметр для каждой реакции, протекающей в другом биодатчике и катализируемой ферментом, имеющимся в этом биодатчике, на основе уменьшения переходной фазы концентрации кислорода во время реакции окисления глюкозы и галактозы и концентрации молекулярного растворенного кислорода, измеряемой кислородным датчиком без ферментов, и на основании комбинации всех параметров для различных биодатчиков формируется характерный образ исследуемой пробы молока;
e) образ исследуемой пробы молока сравнивается с калиброванными характерными признаками различных антибиотиков, и если образ исследуемой пробы и калиброванный характерный признак антибиотика идентичны или подобны, обнаруживается присутствие остатков антибиотиков;
f) концентрация остатка антибиотиков в исследуемой пробе молока вычисляется в диапазоне изменения параметров, формирующих характерный признак антибиотика;
g) если концентрация антибиотика превышает его определенную концентрацию, устройство обработки сигнала активирует средство сепарации нестандартного молока в реальном времени. Определенная (заданная) концентрация антибиотиков в исследуемых пробах молока определяется в соответствии с законом.
Изложенная в настоящем изобретении система реального времени, способ ее калибровки и одновременного обнаружения различных антибиотиков и определения их концентраций в молоке имеют несколько преимуществ в сравнении с известными решениями, так как они позволяют
- обнаружить в реальном времени потенциальные остатки антибиотиков в молоке;
- определить качество молока в реальном времени;
- удалить нестандартное молоко перед выливанием молока в резервуар.
Система проста в применении, не требует специального обучения, может быть полностью автоматизирована, обеспечивает сохранение данных и может быть многократно использована. Если требуется, система может быть легко регенерирована и обновлена за пару минут.
Краткое описание чертежей
На чертеже показана система реального времени для одновременного обнаружения различных антибиотиков и определения их концентраций в молоке.
1 - канал притока молока
2 - параллельные идентичные каналы потока молока
3а - кислородный датчик
3b - биодатчик
4 - массив биодатчиков
5 - средство сепарации нестандартного молока
6 - устройство обработки сигналов
7 - канал оттока молока
8 - кислородный датчик с носителем фермента, но без фермента
9 - устройство гидролиза
Осуществление изобретения
Для обнаружения антибиотиков в молоке  сконструировали систему, откалибровали ее в отношении различных изученных антибиотиков и измерили концентрации различных антибиотиков в пробах молока.
Система содержит канал 1 притока молока и термостатированные параллельные каналы 2 потока молока, каждый из которых содержит кислородный датчик 3а с различными ферментами, формирующий биодатчик 3b, вместе формирующие массив 4 биодатчиков 3b. Для интеграции ферментов, катализирующих окисление глюкозы и галактозы,  фиксировали различные ферменты на нерастворимом носителе и присоединяли их с этим носителем к каждому кислородному датчику 3а в массиве 4 биодатчиков 3b. В канале, параллельном вышеупомянутым параллельным идентичным каналам 2 потока молока, имеется кислородный датчик 8 без ферментов, к которому  присоединили носитель без ферментов, подобный носителю, используемому для фиксации ферментов.
Также система содержит средство 5 сепарации нестандартного молока, подключенное к устройству 6 обработки сигналов, канал 7 для оттока молока и устройство 9 гидролиза, расположенное между каналом 1 притока молока и параллельными каналами 2 потока молока (см. чертеж).
Ферментами, используемыми в биодатчиках 3b, являлись оксидаза глюкозы (GOD, EC 1.1.3.4.) и оксидаза галактозы (GAO, ЕС 1.1.3.9). Эти ферменты были ковалентно зафиксированы на нитях нейлон-6,6 с помощью диметилсульфата и глутарового альдегида. Нейлоновые нити, содержащие фиксированные ферменты, были намотаны вокруг наружной поверхности оптического кислородного датчика (ЕЕ04250 B1). Использовали нити вышеупомянутых ферментов длиной 25 см, специфическая активность которых составила (0.014±0.001) IU/cm и (0.63±0.02) IU/cm соответственно. 25 сантиметров носителя без ферментов было намотано вокруг наружной поверхности кислородного датчика 8 без ферментов. Волоконно-оптические кислородные датчики были использованы в качестве кислородных датчиков 3а и датчиков 8 без ферментов.
Между каналом 1 притока молока и параллельными каналами 2 потока молока находилось устройство 9 гидролиза, в котором применялся ультразвук для увеличения скорости гидролиза лактозы, катализированного β-галактозидазой (β-GAL, ЕС 3.2.1.23).
Система была термостатирована при 38°С.
Калибровка системы
а) Гидролиз лактозы
Для ускоренного гидролиза лактозы молока в глюкозу и галактозу  использовали ультразвук для повышения скорости ферментативного гидролиза, катализированного β-галактозидазой, концентрация которой составляла 10.1 IU/cm. Для частичного гидролиза лактозы  использовали ультразвук в течение 30 секунд (средний выходной сигнал 12.6 Вт). В результате происходил гидролиз 1% лактозы, и концентрации глюкозы и галактозы в пробах молока увеличивались на 1.4 мМ. При прикладывании более высоких или более низких выходных ультразвуковых сигналов ускорение гидролиза лактозы было меньше. Также ультразвук вызывал уменьшение концентрации растворенного кислорода в пробах молока, но оставшееся количество растворенного кислорода в пробах было достаточным для окисления глюкозы и галактозы. В некоторых случаях  также добавляли 1.6 М NaCl для ускорения гидролиза лактозы.
Ускорение ферментного гидролиза лактозы импульсным электрическим полем или магнитным полем было менее эффективным, чем ультразвуком.
Изучили скорость гидролиза лактозы, кинетику реакций окисления глюкозы и галактозы в массиве 4 биодатчиков 3b и чувствительность биодатчиков 3b при низких температурах (4-38°С), чем 38°С, используемых в системе. Хотя время проведения анализа было более длительным, чем при более высоких температурах, можно было использовать систему даже при 4°С (температура молока в резервуарах с молоком), так как молоко хранится в резервуарах в течение более длительного времени.
b) Измерение концентрации кислорода
Гидролизированные пробы молока направлялись в параллельные каналы 2 потока молока: в первом канале находился биодатчик 3b, содержащий волоконно-оптический кислородный датчик 3а и оксидазу глюкозы; во втором канале находился биодатчик 3b, содержащий волоконно-оптический датчик 3а и оксидазу галактозы; и в третьем канале находился волоконно-оптический кислородный датчик 8 с носителем фермента, но без фермента.
Когда параллельные каналы 2 потока молока наполнялись пробами молока, канал 7 оттока молока закрывался и начиналось измерение концентрации кислорода в пробе. В каналах 2 потока молока, которые содержали биодатчики, концентрация растворенного кислорода начинала уменьшаться благодаря реакциям окисления, катализированным фиксированными ферментами в биодатчиках 3b, формирующих массив 4. Так как ферменты имели различную селективность в отношении глюкозы, галактозы и лактозы, уменьшение концентрации кислорода было различным в разных каналах потока молока.
Концентрация растворенного кислорода в пробах молока, впускаемых в каналы потока молока, измерялась кислородным датчиком 8 с носителем фермента, но без фермента. Уменьшение кислорода в каналах потока молока измерялось в течение 20 секунд. В течение этого периода концентрация растворенного кислорода в пробах молока без антибиотиков уменьшилась, по меньшей мере, на 5%.
с) Вычисление параметров стационарного состояния и кинетических параметров реакции и комбинирование этих параметров реакции для формирования характерного образа для проб молока без антибиотиков и для формирования образов или характерных признаков для проб молока, которые загрязняются определенными количествами различных антибиотиков.
Параметр стационарного состояния (параметр А) и кинетический параметр (параметр В) вычислялись для каждой реакции, протекающей в различных биодатчиках для каждой пробы молока на основании уменьшения переходной фазы концентрации кислорода, вызываемого реакциями окисления, и концентрации молекулярного растворенного кислорода, измеренной кислородным датчиком без ферментов.  Использовали динамическую модель биодатчиков (Rinken and Tenno, Biosensors and Bioelectronics. 16, 53-59, 2001), которая была дополнена факторами, характеризующими волоконно-оптические кислородные датчики для вычисления вышеупомянутых параметров, так как эта модель позволяет производить вычисления параметра стационарного состояния и кинетического параметра реакции из параметров сигналов переходной фазы биодатчика.
-1
-1
При комбинировании параметров А и В для различных биодатчиков для проб молока, где концентрации глюкозы и галактозы составляли 1.4 мМ, получили образ для проб молока без антибиотиков (в нашей системе GOD биодатчик А=0.159 и В=222.2 сек; GAO биодатчик А=0.640 и В=53.0 сек).
-1
-1
Когда определенное количество антибиотика (бензилпенициллин, стрептомицин или хлорамфеникол) добавлялось в пробу молока, комбинации параметров реакции изменялись - некоторые параметры увеличивались, а некоторые уменьшались в зависимости от природы добавленного антибиотика и сущности параметра [параметра А или параметра В]. Например, значения двух параметров А и В биодатчика GOD уменьшались с увеличением концентрации бензинпенициллина в пробах молока (например, при концентрации бензинпенициллина 1000 ppb значение параметра стационарного состояния А составляло 0.141, а значение кинетического параметра составляло 146.0 сек), но, что касается биодатчика GAO, значение параметра А уменьшалось, а значение параметра В увеличивалось (например, при концентрации бензинпенициллина 1000 ppb значение установившегося параметра А составляло 0.435, а значение кинетического параметра составляло 97.8 сек).
Диапазон изменений значений этих параметров был изучен в случае, когда стрептомицин, хлорамфеникол или смеси пенициллина и стрептомицина добавлялись в пробы молока.
Обнаружение остатков антибиотиков и определение их концентраций в молоке
Систему применяли для анализа проб молока от коров, которых лечили антибиотиками (Penstrep внутримышечные инъекции), и молоко этих коров проверили на положительную реакцию на антибиотики путем проведения Delvotest. Последнюю обработку антибиотиками провели раньше на 24-72 часа.
Результаты анализа молока, проведенного с помощью вышеупомянутой системы и Delvotest, были в хорошей корреляции. Среднее время анализа, проведенного с помощью системы, составило 30-40 секунд, что позволило произвести сепарацию нестандартного молока в реальном времени до его смешивания с молоком высокого качества.
Концентрация остатков антибиотиков в молоке, которая считается нестандартной, определяется в соответствии с количеством животных, молоко которых собирается в один и тот же резервуар, но также с учетом экономических расчетов. Оптимальная концентрация определенного антибиотика в молоке одной коровы примерно в 10 раз выше, чем MRL (максимальные остаточные уровни) для того же антибиотика.
Изложенные варианты иллюстрируют принципы изобретения и не являются исчерпывающими или ограничивающими изобретение представленной формой; предполагается, что сущность изобретения определяется пунктами приложенной формулы и их эквивалентами.