СТАБИЛИЗАТОР ФЕРМЕНТНЫХ БЕЛКОВ
ENZYMATIC PROTEIN STABILISER

Изобретение относится к биотехнологической, медицинской, пищевой, комбикормовой и легкой промышленности.
Ферменты - биологические катализаторы, широко используются в различных областях хозяйственной деятельности человека. Одной из отрицательных сторон использования ферментов является свойственная им нестабильность в денатурирующих условиях. Активность ферментных белков зависит от сохранения нативной структуры, которая может быть нарушена физическими, химическими и биологическими воздействиями, такими как нагревание, замораживание, окисление, восстановление, действием растворителей, ионов металлов, ионной силой растворов, ферментативной модификацией и деградацией. Применение ферментов в различных областях человеческой практики предполагает сохранение ими активности в широком диапазоне температур, рН, высоких концентраций солей и других параметров среды, выходящих за пределы оптимальных для катализа.
Обеспечить стабилизацию белковой молекулы можно следующими способами:
1. иммобилизацией ферментов на твердых носителях;
2. использованием добавок, стабилизирующих конформацию белка;
3. химической модификацией молекулы;
4. приемами белковой инженерии через сайт - направленный мутагенез.
Добавление стабилизирующих веществ в растворы белков является наиболее простым способом сохранения активности ферментов в денатурирующих или неоптимальных для катализа условиях.
Известно использование для стабилизации аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы водных растворов аминокислот - валина или пролина или их комбинации (ЕР 1136550, 2001).
Эффект стабилизации выражается в сохранении достаточно высокой остаточной активности после хранения ферментных растворов при 45°С в течение 4 дней.
В патенте RU 2008354, 1994 для сохранения водных растворов протеиназ используют диметилсулфоксид (20-30% об.). В патенте RU 2020154, 1991 при хранении дезоксирибонуклеазы в ее раствор в качестве стабилизатора вносят смесь гидрохлорида пиридоксина (5-10% вес.) и борной кислоты (1-2% вес.). Недостатком этих известных стабилизирующих веществ является необходимость их использования в высокой концентрации.
Известно использование для стабилизации протеолитических ферментов водорастворимых полиолов (US 4169817, 1979). Эффективность применения полиолов выражается в увеличении остаточной активности при хранении ферментов в течение года, а также в повышении совместимости протеаз с различными детергентами.
В патенте ЕР 0821058, 2002 для сохранения высокой ферментативной активности деполимераз и рестриктаз при высоких значениях температуры используют стабилизирующие вещества, обладающие функциями химических шаперонов, к которым относят сахара, полиольные спирты, аминокислоты и их производные, а также используют белки-шапероны. Недостатком известных веществ является то, что стабильность ферментативной активности проявляется лишь при супраоптимальных температурах.
7
Известно применение С-алкилоксибензола в виде его раствора в этаноле в качестве стабилизатора ферментов, в частности, его использование для стабилизации и активации РНКазы и химотрипсина ("Микробиология", 2000, том 69, №2, 224-230).
Ближайшим аналогом настоящего изобретения является патент ЕР 0189838 1996, в котором для термостабилизации водного раствора α-амилазы применяют некоторые амфифильные соединения.
Действие описанных в патенте стабилизаторов позволяет сохранять высокую ферментативную активность при воздействии высоких, в том числе денатурирующих, значений температуры. Однако действие этих стабилизаторов сопровождается снижением каталитической активности.
Недостатками известных технических решений является то, что стабилизация ферментов ориентирована в основном на их хранение, т.е. обеспечивается функциональная стабильность, но эффекты стабилизации, как правило, сопровождаются снижением каталитической активности. Кроме того, известные стабилизаторы не обеспечивают расширения рабочего диапазона катализа с сохранением высокой активности в области неоптимальных (высоких или низких) значений температуры и рН.
Задачей настоящего изобретения является разработка стабилизаторов ферментов, которые способны повысить устойчивость ферментов к инактивирующим воздействиям температуры, рН и других неблагоприятных факторов и сохранить высокую активность ферментов при неоптимальных для катализа параметрах реакции.
Поставленная задача решается применением описываемых пяти вариантов стабилизаторов ферментных белков на основе алкилфенолов, которые содержат смесь следующих соединений в количестве от 1% до 99%:
1. смесь 3-гидрокси-4-гексилфенола и 2,2'-дигидрокси-5,5'-дигексил-4,4'-бифенола.
2. смесь 2,2'-дигидрокси-5,5'-дигексил-4,4'-бифенола и бициклогексадиена-3,5.
3. смесь 3-гидрокси-5-метилфенола и 2,2'-дигидрокси-6,6'-диметил-4,4'-бифенола.
4. смесь 2,2'-дигидрокси-6,6'-диметил-4,4'-бифенола и бициклогексадиена-3,5.
5. смесь гидроксиэтилфенола и 5,5'-дигидроксиэтил-2,2'-бифенола.
Все пять заявленных вариантов стабилизаторов ферментных белков позволяют обеспечить достижение технического результата, заключающегося в том, что за счет модификации пространственной структуры ферментных белков (как моно-, так и полисубъединичных) обеспечивается их устойчивость к инактивирующим воздействиям химической, физической и биологической природы и сохранение высокой активности при неоптимальных для катализа значениях температуры и рН.
По химической природе все химические соединения, входящие в состав заявленных стабилизаторов, являются соединениями с одним или несколькими шестиатомными углеродными циклами с различными заместителями, не менее чем один из которых является гидроксилом или оксигруппой.
Заявленные варианты композиций АФ1-АФ5 могут быть получены например, путем смешения компонентов I-VIII, входящих в их состав приобретенных коммерчески (например: http://www.reaxys.com; http://mntc.ru/synthesis.html и http://chemexpress.fatal.ru/Navigator/Deliver.html). Активность модифицирующих композиций проявляется при наличии указанных выше АФ I-VIII в количествах от 1% до 99% от суммарного содержания АФ при любом их соотношении.
В таблице 1 представлены заявленные варианты стабилизаторов (далее используется условное обозначение АФ) и входящие в их состав химические соединения, при этом радикалы R1-R5 относятся к первому кольцу, радикалы R'1-R'5 - ко второму, R"1-R"5 - к третьему.
Применение предлагаемых стабилизаторов можно осуществить двумя способами: 1) смешивая растворы ферментов и стабилизаторов; 2) путем введения растворов стабилизаторов в реакционную смесь одновременно с растворами фермента и субстрата.
Заявленные стабилизаторы не обладают токсическим действием и могут действовать на ферменты даже в составе живых организмов.
Достижение технического результата продемонстрировано с помощью конкретных примеров и проиллюстрировано на представленных фиг.1-3.
Примеры использования заявленных стабилизаторов
Пример 1. Влияние АФ-5 и АФ-1 на активность жидкого ФП α-амилазы (α-malt-LKu5038, Германия) при различных значениях температуры (операционная стабильность)
Ферментативную активность α-амилазы определяют по количеству редуцирующих веществ (метод с 3,5-динитросалициловой кислотой), образующихся при гидролизе крахмала. Реакционная смесь включает 2.5 мл раствора фермента (5 ед./мл), 1.5 мл раствора АФ №5 или АФ №1 с концентрацией 0.04 г/л и с концентрацией 0.3 г/л, соответственно, 5 мл 1% раствора крахмала. Гидролиз проводят в течение 10 мин при рН 6.0. Реакцию останавливают добавлением равного объема 0.2 н. HCl.
опт
Гидролиз ведут при различных температурах в интервале 20-80°С. Результаты представлены в табл.2. Активность стабилизированного АФ №5 (0.3 г/л) фермента больше чем в 2 раза при всех температурах реакции, стабилизированного АФ №1 (0.04 г/л) - в 1,5 раза. Температурный оптимум гидролиза не изменяется, но существенно расширяется рабочий Т-диапазон катализа. Активность стабилизированного фермента в интервале температур 35-75°С равна или больше, чем максимальная активность нестабилизированной амилазы при Т=60°С.
Таблица 2
Активность стабилизированного АФ-5 и АФ-1 жидкого ФП α-амилазы α-malt-LKu5038 при различных температурах(операционная стабильность)
Температура гидролиза, °С
Концентрация глюкозы в гидролизате, г/л
без АФ
с АФ-5, 0.3 г/л
с АФ-5, 1.5 г/л
с АФ-1, 0.04 г/л
с АФ-1, 0.15 г/л
20
0.20
0.66
0.47
0.32
0.25
30
0.27
0.71
0.64
0.46
0.35
40
0.34
0.87
0.82
0.82
0.63
50
0.62
1.25
1.17
0.93
0.81
60
0.77
1.38
1.27
1.05
0.90
70
0.56
1.15
1.03
1.0
0.91
80
0.23
0.60
0.40
0.51
0.38
Пример 2. Влияние АФ-4 на активность жидкого ФП α-амилазы (α-malt-LKu5038, Германия) при различных значениях рН (операционная стабильность)
опт
Опыты проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что гидролиз ведут в интервале рН 2.5-7.5. Результаты представлены в табл.3. Активность стабилизированного АФ-4 (0.2 и 1.5 г/л) фермента при различных значениях рН реакционной смеси существенно выше по сравнению с контролем при рН 3.5-4.0 (более чем в 2 раза). Это указывает на повышение стабильности модифицированного фермента в широком диапазоне неоптимальных значений рН.
Таблица 3
Активность стабилизированного АФ-4 жидкого ФП α-амилазы при различных значениях рН (операционная стабильность)
рН гидролиза
Концентрация глюкозы в гидролизате, г/л
без АФ
с АФ-4, 0,2 (1.5)г/л
2.5
0.30
0.73 (0.77)
3.5
0.37
0.81 (0.85)
4.7
0.33
0.76 (0.81)
5.5
0.27
0.70 (0.75)
6.5
0.14
0.61 (0.70)
7.5
0
0.47 (0.50)
Пример 3. Влияние АФ-2, 3, 5 на термостабильность диоксигеназ (функциональная стабильность)
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Активность метилпирокатехин - 1,2-диоксигеназы (МПК - 1,2-ДО) определяют модифицированным методом Хаяиси. Реакционная смесь содержит в 50 мМ буфере Tris-HCl (рН 7.2) 0.25 мМ пирокатехин или замещенный пирокатехин, 1.3 мМ ЭДТА и фермент. Реакцию начинают добавлением фермента. Активность фермента рассчитывают по скорости образования продукта (цис, цис-муконовой кислоты или замещенных муконатов) спектрофотометрически при длине волны 260 нм. При расчете активностей используют коэффициенты молярной экстинкции, определенные Дорном и Кнакмуссом: 16800 М · см для пирокатехина; 17100 М · см для 3-хлорпирокатехина; 12400 М · см для 4-хлорпирокатехина; 12000 M · см для 3,5-хлорпирокатехина; 18000 М · см для 3-метилпирокатехина; 13900 M · см для 4-метилпирокатехина. Единицу активности определяют как количество фермента, катализирующее превращение 1 мкмоля субстрата или образование 1 мкмоля продукта в минуту. Термостабильность ферментов определяют при использовании АФ в концентрациях, которые максимально увеличивают скорость протекания реакции ферментов с пирокатехином: АФ-2 - 0.36 г/л; АФ-3 - 0.42 г/л; АФ-5 - 0.8 г/л. Влияние АФ на термостабильность ферментов изучена после их прогревания при 50°С. Остаточную активность определяют в районе значений температурного максимума. Ферменты инкубируют с АФ при 50°С в течение 9 час, пробы отбирают каждые 10-30 мин, реакцию начинают добавлением пирокатехина. В контрольном варианте фермент инкубируют без добавления АФ в тех же условиях.
Метилпирокатехин - 1,2-диоксигеназа (МПК1,2-ДО), инкубируемая при 50°С в отсутствие АФ (контрольный вариант), практически инактивируется через 1.5 ч (фиг.1). АФ-2, 3, 5 повышают термостабильность МПК 1,2-ДО при 50°С: в присутствии АФ-2 фермент инактивируется через 2 ч; в присутствии АФ-3 - через 2.5 ч, а в присутствии АФ-5 - только через 3 ч.
Данный пример показывает, что использование заявленных вариантов АФ значительно удлиняет время активности ферментов за счет увеличения их функциональной стабильности (сохранения функции после денатурирующих воздействий).
Пример 4. Влияние АФ-4 на термостабильность пероксидазы (функциональная стабильность).
2
2
Термостабильность пероксидазы определяют при ее модификации АФ №4 в концентрациях 0.05-2.0 г/л. Фермент, модифицированный и контрольный (без АФ), подвергают прогреванию при температурах 60°С, 20 минут и 70°С, 10 минут, охлаждают до комнатной температуры и проводят ферментативную реакцию. Для окисления субстрата, о-дианизидингидрохлорида, готовят на фосфатном буфере 0.05 М (рН 7.0) растворы: субстрата - о-дианизидингидрохлорида - 5 мг/мл; АФ - с диапазоном концентраций от 0.018 до 0.36 мг/л, ферментного препарата - 0.002 мг/мл. Реакционная смесь включает 840 мкл 0.05 М К-фосфатного буфера (рН 7.0); 10 мкл 3% HO; 100 мкл субстрата, по 25 мкл ферментного препарата и раствора определенных концентраций АФ. В течение 5 мин измеряют изменение поглощения при 436 нм. В контрольных вариантах вместо раствора АФ вносят 25 мкл 0.05 М К-фосфатного буфера. Активность в контроле принимают за 100%. Результаты представлены в таблице 4.
Модифицированный фермент (0.05 г/л) сохраняет функциональную активность после термообработки 60°С 20 минут практически полностью (98%), тогда как у контрольного фермента она снижается на 27%. Термообработка при 70°С в течение 10 минут модифицированного фермента при всех концентрациях АФ-4 показала сохранение активности на 13-19% выше контрольного.
Таблица 4
Термостабильность пероксидазы, модифицированной АФ-4
Концентрация АФ, г/л
Активность пероксидазы, % от активности до термообработки
До термообработки
60° 20 мин
70° 10 мин
0
100
73
32
0.05
100
98
45
0.12
100
77
40
2.0
100
76
41
Пример 5. Влияние АФ-3 на стабильность дезоксирибонуклеазы при хранении
Одной из проблем в практике применения фермента ДНКазы является быстрая потеря ее активности в растворах. Исследовали сохранение активности ДНКазы, модифицированной АФ-3, в растворах, хранившихся в течение 24, 48 и 144 часов в стеклянной или пластмассовой посуде при температурах 25°С и 4°С. Фермент стабилизируют АФ-3 в концентрациях 0.05-0.5 г/л.
Ферментативную активность ДНКазы определяют по количеству кислоторастворимых веществ, освобождаемых ферментом при гидролизе ДНК в стандартных условиях (37°С, 30 мин). В реакционную смесь вносят по 0.25 мл субстрата (ДНК, 2 мг/мл воды) и 0.15 мл 0.2 М трис-буфера рН 7.0, 0.1 мл раствора стабилизированного АФ фермента. Реакцию останавливают внесением 0.5 мл 1 М раствора хлорной кислоты. В контрольном варианте фермент не стабилизируют. После охлаждения и центрифугирования из надосадочного слоя отбирают 0.5 мл раствора, прибавляют 2.5 мл воды и измеряют поглощение при 260 нм. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое вызывает увеличение оптической плотности на 1 ед. при 260 нм за 1 час инкубации.
На фиг.2 представлены результаты зависимости стабильности ДНКазы от концентрации АФ при хранении растворов при комнатной температуре.
Активность фермента при хранении в стеклянной посуде через 24 часа составляла до 25% от исходной и была на 21% выше, чем в контроле, а через 48 часов составляла 14% и была на 11% выше контрольной. При хранении раствора фермента в пластмассовой посуде активность фермента сохранялась на уровне 11%, тогда как в контрольном варианте была нулевой.
При хранении тех же образцов при температуре 4°С активность модифицированной ДНКазы сохранялась на более высоком уровне: при концентрации АФ 0.1 г/л через 48 ч сохранялась до 25% от исходной активности, что на 22% больше, чем в контроле. Соответствующие данные проиллюстрированы на фиг.3.
Пример 6. Влияние стабилизатора АФ-3 на стабильность амилаз зерна при осахаривании солода
Затирание готовят, смешивая 40 г дробленного солода с 450 мл воды, проводят температурную паузу при 45°С в течение 30 минут, затем поднимают температуру до 55°С и выдерживают 20 минут, затем поднимают температуру до 65°С и выдерживают 20 минут. После этого затор разделяют фильтрованием на жидкую и густую часть. Жидкую часть инкубируют с препаратом АФ-3 (0.1, 0.3, 0.6, 1.2 г/л) в течение 20 минут. В это время постепенно поднимают температуру густой отварочной части до 70°С, затем охлаждают до 65°С и объединяют с жидкой частью. Поднимают температуру общего затора до 70°С, доливают 20 мл воды (70°С) и проводят осахаривание затора.
В полученном заторе определяют продолжительность осахаривания по капельной йодной пробе. После того как йод перестает изменять цвет, затор фильтруют до появления трещин. В полученном жидком сусле определяют содержание сухих веществ (СВ) весовым методом, титруемую кислотность, рН, цветность, а также скорость фильтрования сусла.
Как видно из таблицы 5, происходит значительное снижение (на 32.0%) продолжительности осахаривания в варианте внесения АФ-3 в количестве 0.5% от массы зернопродуктов, скорость фильтрования при этом остается почти неизменной. Выход экстракта у всех опытных образцов лучше, чем у контрольного образца. Пример доказывает стабилизацию комплекса амилолитических ферментов, участвующих в процессе осахаривания солодового затора при высоких температурах (65-70°С).
Пример 7. Влияние стабилизатора АФ-3 на сохранение активности глюкоамилазы (Сан-Ультра Л, Novozyme, Дания) в денатурирующих условиях температуры и рН (функциональная стабильность).
Ферментативную активность определяют по количеству редуцирующих веществ (с 3,5-динитросалициловой кислотой), образующихся при гидролизе крахмала, как в примере 1. Для определения термостабильности и рН-стабильности глюкоамилазу - жидкий концентрированный препарат с активностью 2.5 ед./мл, модифицируют добавлением раствора АФ-3 (1 и 20 г/л). Полученный раствор экспонируют (0-60 мин) при температуре 70°, затем охлаждают и определяют активность при стандартной температуре (30°С). В варианте определения рН-стабильности ферментный раствор экспонируют (0-60 мин) при рН 2 или 9.5, затем нейтрализуют и определяют активность при рН 6.0 (оптимуме). Из таблиц 6 и 7 видно, что активность модифицированного фермента в условиях термо- или рН-денатурации была выше, чем немодифицированного (контроль) на протяжении всего времени экспонирования. Эффективность дозы 20 г/л была существенно выше чем 1 г/л.
Таблица 6
Влияние АФ-3 на термостабильность жидкого ФП глюкоамилазы (Сан-Ультра Л, Novozyme, Дания) (функциональная стабильность)
Время прогревания (70°С), мин
Концентрация глюкозы в гидролизате, г/л
без АФ
с АФ, 20 г/л (1 г/л)
0 (контроль)
0.3
0.38 (0.33)
20
0.22
0.28 (0.24)
40
0.20
0.29 (0.22)
60
0.18
0.28 (0.20)
Таблица 7
Влияние стабилизатора АФ - 3 на рН стабильность жидкого ФП глюкоамилазы (Сан-Ультра Л, Novozyme, Дания) (функциональная стабильность)
Время рН-денатурации (рН 9.5)
Концентрация глюкозы в гидролизате, г/л
Без АФ
С АФ, 20 г/л (1 г/л)
0
0.3
0.38 (0.32)
30
0.25
0.38 (0.28)
60
0.20
0.30 (0.22)
Таким образом, заявленные варианты стабилизаторов позволяют не только повысить устойчивость макромолекул к инактивирующим воздействиям, но и обеспечивает сохранение высокой каталитической активности ферментов при неоптимальных условиях (Т°С и рН) катализа, что в свою очередь позволяет расширить рабочий температурный и рН диапазоны ферментативных реакций, включая область низких температур.
Краткое описание чертежей:
Фиг.1. Влияние АФ на термостабильность фермента МПК1,2-ДО при 50°С: 1 - контроль; 2 - АФ-3 (0.42 г/л); 3 - АФ-5 (0.8 г/л); 4 - №2 (0.36 г/л).
По оси ординат отложена остаточная активность фермента, в % от исходной, до прогрева при 50°С.
Фиг.2. Активность модифицированных АФ-3 препаратов ДНКазы после хранения в течение 24 и 48 часов при температуре 25°С.
Фиг.3. Активность модифицированных АФ-3 препаратов ДНКазы после хранения в течение 24, 48 и 144 часов при температуре 4°С.