Цитофизиологический анализ начала морфогенеза в андроклинных каллусах пшеницы in vitro

УДК 577.175.1

ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАЧАЛА МОРФОГЕНЕЗА В АНДРОКЛНННЫХ КАЛЛУСАХ ПШЕНИЦЫ IN VITRO

© 2011 Д.Ю. Зайцев

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа Поступила 29.07.2011

Приведены данные гистологического анализа начала морфогенеза in vitro в андроклинных каллусах пшеницы в сопоставлении с данными локализации цитокининов. Установлено участие цитокининов на начальных этапах всех путей морфогенеза in vitro.

Ключевые слова: морфогенез, культура in vitro, пыльник, каллус, меристема, пшеница.

Современное развитие инновационных направлений биотехнологии растений требует новых фундаментальных данных о морфогенезе как в естественных условиях, так и в культуре in vitro.

Однако интенсивные исследования морфогенеза растений затруднены интегральным характером морфогенетических процессов, зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов и их взаимодействий [1].

Принципиально важное свойство морфогенеза -универсальность его путей как в естественных условиях in vivo, так и в условиях культуры in vitro [2]. Такая универсальность позволяет выбрать более простую, чем целый организм, модель для изучения особенностей морфогенетических процессов, например, пыльник [3].

Удобной моделью могут служить каллусы, в том числе андроклинные, полученные в культуре in vitro изолированных пыльников из микроспор/клеток пыльцевого зерна на основе биологического феномена андрогенеза in vitro, или, корректнее, андроклинии [4].

Несмотря на то, что к настоящему времени накоплен значительный фактический материал, касающийся различных аспектов исследования андроклинных каллусов [5], многие вопросы остаются открытыми. Так, до сих пор не выявлены инициальные клетки/группы клеток андроклинных каллусов, в которых индуцируются пути морфогенеза in vitro, и факторы, стимулирующие морфогенез этих клеток. Далеким от окончательного решения остается и вопрос об участии фитогормонов в реализации морфогенетического потенциала клеток андроклинных каллусов. Полностью отсутствуют данные о локализации гормонов в каллусах (и не только андроклинных) в динамике развития in vitro.

Согласно литературным данным, необходимое условие для приобретения культивируемыми клетками каллусов злаков морфогенетической компе тентности - присутствие в питательных средах экзогенных ауксинов, роль же цитокининов при этом минимальна.

При этом морфогенетическая компетентность клеток может достаточно долго поддерживаться

Зайцев Денис Юрьевич, канд. биол. наук; e-mail: denis.zaytsev@anrb.ru

при культивировании in vitro каллусов на питательных средах, содержащих в качестве гормональных добавок только экзогенные ауксины. Однако для дальнейшей дифференциации морфогене-тически компетентных клеток каллусов необходимы цитокинины, причем иногда достаточно наличие только эндогенных (в составе каллуса) цитокининов [6]. Известно, что цитокинины повышают аттрагирующую способность клеток, то есть способность аккумулировать питательные вещества за счет их транспорта из других тканей [7], что, в свою очередь, по нашему мнению, может способствовать дальнейшему развитию культивируемых клеток каллуса. Кроме того, известно, что аттраги-рующая способность, как правило, характерна для меристематических клеток [7]. Исходя из этого, логично предположить, что в составе андроклинных каллусов имеются меристематические клетки, являющиеся инициальными при реализации различных путей морфогенеза in vitro, и характеризующиеся преимущественной локализацией в них цитокининов. В связи с этим цель данной работы заключалась в выявлении локализации цитокининов в клетках развивающихся in vitro андроклинных каллусов яровой мягкой пшеницы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве материала для исследования использовали гибридную линию яровой мягкой пшеницы Фотос, характеризующуюся высокой частотой образования in vitro андроклинных каллусов. Для получения андроклинных каллусов использовали метод культуры in vitro изолированных пыльников, модифицированный с учетом эмбриологических нюансов [8].

Цитокинины в клетках андроклинных каллусов выявляли методом иммунолокализации фитогормонов с помощью антител, меченных коллоидным золотом [9].

Постоянные препараты, полученные согласно общепринятой методике [10], просматривали с применением микроскопа проходящего света Axio Imager.Al (Carl Zeiss, Jena).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В культивируемых андроклинных каллусах

Биотехнология

пшеницы наблюдали следующие пути морфогенеза in vitro: эмбриоидогенез - формирование эмбриои-дов (зародышеподобных структур), гемморизогенез (формирование почки и корня), геммогенез (формирование почки), ризогенез (формирование корня). Именно такие же пути морфогенеза in vitro клеток андроклинных каллусов были выявлены нами ранее на примере других сортов и гибридных линий яровой мягкой пшеницы [11, 12], а также в культуре in vitro каллусов зародышевого происхождения у ряда сортов яровой мягкой пшеницы [13]. Такие наблюдения еще раз дают основания поддержать положение об универсальности путей морфогенеза растений как в естественных условиях in vivo, так и в культуре in vitro.

Сопоставление данных детального цито-гистологического анализа всех путей морфогенеза in vitro андроклинных каллусов пшеницы показало, что начальный этап всех путей универсален и состоит в обособлении в каллусе зоны меристемати-ческих клеток, отличающихся от остальных клеток каллуса плотной цитоплазмой и центральным расположением ядра. Для этих клеток характерны интенсивные деления. Такая зона клеток обозначена нами как морфогенетический очаг (рис.).

Методом иммунолокализации гормонов установлено, что цитокинины локализуются преимущественно именно в клетках такой меристематиче-ской зоны (рис., б), тогда как клетки периферической зоны не демонстрируют специфическую окраску на цитокинины.

Рис. Локализация цитокининов в морфогенетическом очаге андроклинного каллуса пшеницы: а - контроль.

Установлено, что в ходе дальнейшего развития андроклинных каллусов в условиях in vitro цитокинины локализуются также преимущественно в клетках меристем этической зоны, и, кроме того, в клетках развивающихся органов (апексов побега и корня) и клетках развивающихся эмбриоидов (вплоть до глобулярной стадии развития эмбриои-да).

Таким образом, нами проведен детальный цито-гистологический анализ всех выявленных путей морфогенеза in vitro андроклинных каллусов в сопоставлении с данными локализации цитокининов.

Полученные данные продемонстрировали участие этих фитогормонов именно на начальных этапах всех путей морфогенеза in vitro, связанных с активными митотическими делениями и дифференциацией клеток меристематической зоны каллуса. Более того, самый начальный этап всех путей морфогенеза in vitro андроклинных каллусов универсален и состоит в обособлении в каллусе центральной меристематической зоны, преимущественно в клетках которой локализуются цитокинины. Такие данные еще раз подтверждают важную (и, по-видимому, определяющую) роль цитокининов в индукции митотической активности и дифференциации клеток как в естественных условиях [14], так и в условиях культуры in vitro [15].

б - наличие специфической окраски на цитокинины.

Таким образом, преимущественная локализация цитокининов в клетках меристематических зон андроклинных каллусов является одним из основных факторов, влияющих на дальнейшую дифференциацию клеток при морфогенезе in vitro.

Исследование поддержано грантом РФФИ № 08-04-97045 и программой «Ведущие научные школы РФ» (грант № НШ 7637.2010.4. лидер Школы -член-корр. РАН Т.Б. Батыгина, БИН РАН, Санкт-Петербург).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бутенко Р.Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro II I Чайлахяновские чтения. Пущино, 1994. С. 7-26.

2. Батыгина Т.Б., Бутенко Р.Г. Морфогенетические потенции зародыша покрытосемянных растений // Ботан. журн. 1981. Т. 66. № 11. С. 1531-1547.

3. Батыгина Т.Б. Пыльник как модель изучения морфоге-нетических потенций и путей морфогенеза // Эмбриология цветковых растений. Т. 1. СПб., 1994. С. 120-121.

4. Хохлов С.С. Общие вопросы гаплоидии // Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976. С. 5-14.

5. Кругпова H.H., Сельднмнрова O.A. Морфогенез в андроклинных каллусах злаков // Успехи современной биологии. 2010. Т. 130. № 3. С. 247-257.

6. Кругпова H.H., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов // Успехи современной биологии. 1999. Т. 119. № 6. С. 567-577.

7. Медведев С.С. Физиология растений. СПб.: Изд. Санкт-Петербургского ун-та, 2004. 335 с.

8. Круглова H.H., Батыгина Т.Е. Методические рекомендации по использованию морфогенетического потенциала пыльника в биотехнологических исследованиях яровой мягкой пшеницы. Уфа, 2002. 39 с.

9. Веселое С.Ю., Вальке P.C., Ван Онкелен X., Кудоярова Г.Р. Содержание и локализация цитокининов в листьях исходных и трансгенных растений табака // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 1. С. 34-40.

10. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1988. 170 с.

11. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы / H.H. Круглова, Т.Е. Батыгина, В.Ю. Горбунова, Г.Е. Титова,

O.A. Сельдимирова. М.: Наука, 2005. 99 с.

12. От микроспоры к сорту / Т.Е. Батыгина, H.H. Круглова,

B.Ю. Горбунова, Г.Е. Титова, O.A. Сельдимирова. М.: Наука. 2010. 178 с.

13. Круглова H.H., Катасонова A.A. Незрелый зародыш как морфогенетически компетентный эксплант // Физиология и биохимия культурных растений 2009. Т. 41. № 2.

C. 124-131.

14. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений // Успехи современной биологии. 1982. Т. 95. Вып. 1. С. 23-34.

15. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., 1999. 160 с.

CYTOPHYSIOLOGICAL ANALYSIS OF THE BEGINNING OF MORPHOGENESIS IN WHEAT ANDROCLINAL CALLUSES IN VITRO

© 2011 D.Yu. Zaitsev

Detailed histological analysis of the beginning of morphogenesis in vitro in wheat androclinal calluses in comparison with the date of cytokinin localization was made. It was established the participation of cytokinins at the initial stages of all morphogenesis in vitro pathways.

Key words', morphogenesis, culture in vitro, anther, callus, meristem, wheat.

ZaitsevDenis Yurievich, Candidate of Biology; e-mail: denis.zaytsev@anrb.ru