СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОХРОМНОЙ СПЕКТРАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КОЛБОЧЕК И ПАЛОЧЕК СЕТЧАТКИ ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА IN VIVO
METHOD OF DETERMINING MONOCHROMIC SPECTRAL SENSITIVITY OF CONE CELLS AND ROD CELLS OF HUMAN RETINA IN VIVO

Изобретение относится к области оптических информационных технологий и биомедицинских диагностических технологий, в частности к бесконтактному измерению фотохромной спектральной чувствительности глаза человека in vivo, обусловленным соответствующим поглощением пигмента колбочек и палочек.
Исследования спектральных характеристик глаза человека, несомненно, важны, например, для разработки оптических систем цветного видеоизображения, включая разработку различных типов мониторов, цветной полиграфической фотоиндустрии.
В настоящее время установлено, что в сетчатке нормального человеческого глаза содержатся три типа цветовых фоторецепторных клеток «синих», «зеленых» и «красных» с максимумами спектральной чувствительности 419-450 нм, 530-550 нм, 570-590 нм соответственно для колбочек, а палочки имеют максимум в области длин волн 510 нм (A.M.Шамшинова, В.В.Волков. Функциональные методы исследования в офтальмологии, М.: Медицина, 1999). Хромофор, определяющий спектр поглощения фоторецепторных клеток, обусловлен альдегидной формой витамина А (ретиналем), связанного с белком опсином, составляющем родопсин (Ф.Хуго. Нейрохимия М.: Мир. 1990, Хьюбел Д.Н. Глаз, мозг, видение. Пер. с англ. М.: Мир, 1990, 234 с.). Пигмент колбочек содержит тот же 11-цис-ретаналь, но белковая часть пигмента отличается, поэтому пигменты колбочек называются иодопсины.
Известен способ определения спектральной чувствительности зрения человека, основанный на пространственном сравнении интенсивности зондирующего излучения на различных длинах волн с фиксированным уровнем мощности (Шамшинова A.M., Волков В.В. Функциональные методы исследования в офтальмологии. М.: Медицина, 1999, 415 с.).
Однако такой субъективный колорометрический метод не позволяет определить спектральные характеристики глаза человека, так как фотохромные молекулярные белковые сенсибилизаторы, определяющие красные и зеленые, а также зеленые и синие колбочки, спектрально перекрываются. Такой метод позволяет определить только дефекты цветового зрения.
Известен способ определения спектральной чувствительности поглощения колбочек глаза, основанный на измерении мембранного потенциала колбочек с помощью технологии электрических микрозондов при воздействии на колбочки перестраиваемого по длинам волн оптического излучения (Tomita Т., Kaneko A., Murakami М. Spectral response curves of single cones in the carp//Vis.Res. 1967, v.7, N 7-8, p.519-531).
Однако основным недостатком данного способа является зондовая технология, повреждающая сетчатку, и поэтому измерения спектрального отклика были произведены у фоторецепторных клеток рыб in vitro.
Известен способ определения спектральной ширины поглощения отдельных фоторецепторных клеток колбочек, основанный на измерении спектров отражения света зрительными пигментами, экстрагированными из сетчатки in situ (Rushton W. The cone pigments of the human fovea in color blind and normal. Visual problems of color. 1957, v.1, p.71-78).
Способ экстракции эффективен, когда экстрагируется только один пигмент, родопсин, но такой способ невозможен для анализа пигментов колбочек.
Известен способ определения спектральной ширины поглощения отдельных фоторецепторных клеток колбочек и палочек in vitro из препаратов сетчатки человека на основе микроспектрометрических измерений при зондировании перестраиваемым по длинам волн оптическим излучением и исследовании спектров пропускания (Brown W., Wald G. Visual pigments in single rods and cones of the human retina. Science, 1964, v.144, N3614, p.45-46).
Основным недостатком данного способа для диагностики глаза человека является возможность измерения спектральных характеристик только для препаратов сетчатки.
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения спектральной чувствительности глаза человека, основанный на измерении спектров отражения отдельных фоторецепторных клеток сетчатки глаза человека, имеющих размер порядка микрона, при зондировании широкополосным спектральным оптическим излучением с диапазоном 390-800 нм на основе микроспектрофотометрических измерений был определен спектр поглощения отдельных «красных», «синих» и «зеленых» колбочек (J.D.Mollon. Color vision //Ann.Res. Phsyhol, 1982, v.33, p.41-85).
-6
Однако основным недостатком данного неинвазивного способа определения спектральных характеристик глаза человека in vivo является малая точность, обусловленная, с одной стороны, малой величиной отраженной оптической интенсивности, составляющей менее 10 от зондируемых фоторецепторов, и крайне сложной интерпретацией спектральных результатов измерения, так как колбочки и палочки морфологически расположены во внутреннем предпоследнем слое сетчатки, состоящей от 3-х до 10 клеточных слоев (см. фиг.1). Следует отметить, что зондирующий оптический пучок, проходя эти пространственно-неоднородные слои, испытывает сильное рассеяние, которое трудно учесть, используя даже последние достижения низкокогерентной томографии (см. фиг.2).
Задачей изобретений является неинвазивность и экспрессность определения спектральной ширины чувствительности палочек и селективной спектральной ширины поглощения «красных», «зеленых» и «синих» колбочек сетчатки глаза человека.
Технический результат заключается в измерении спектральной чувствительности колбочек и палочек глаза человека, что позволяет оптимизировать цветные оптические системы видеоизображения.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения фотохромной спектральной чувствительности колбочек и палочек сетчатки глаза человека, включающем зондирование макулярной области сетчатки глаза человека широкополосным 390-800 нм оптическим излучением, согласно решению для селективного определения спектральной ширины чувствительности палочек Δλ на сетчатке формируют интерференционные полосы с фиксированным пространственным периодом не менее 10 угловых минут, уменьшают интенсивность оптического излучения до появления черно-белых интерференционных полос, устанавливают импульсную модуляцию интенсивности пучков с частотой следования 12-13 Гц и скважностью два, определяют число пульсирующих черно-белых интерференционных полос N и рассчитывают спектральную ширину чувствительности палочек из соотношения:
,
где: λ=510 нм длина волны, соответствующая максимальной чувствительности палочек;
R
G
B
R
G
B
i
для определения спектральной ширины чувствительности «красных» - Δλ, «зеленых» - Δλ и «синих» - Δλ колбочек соответственно, модулируют интенсивность световых пучков на частоте 44-46 Гц, увеличивают интенсивность пучков до появления мерцаний на частоте 44-46 Гц центральной неокрашенной полосы, далее устанавливают частоту модуляции 22-23 Гц и определяют число пульсирующих интерференционных полос красного цвета N, зеленого N и синего N соответственно и определяют спектральную ширину чувствительности цветных колбочек Δλ из соотношения
,
i
R
G
B
i
R
G
B
где: N=N, N, N, a λ - длина волны, соответствующая максимальной чувствительности для «красных» колбочек λ=600 нм, для «зеленых» λ=530 нм и «синих» λ=450 нм.
Изобретение поясняется чертежами, на фиг.1 представлен гистологический срез макулярной области сетчатки (В.Кюнель. Цветной атлас по цитологии, гистологии и микроскопической анатомии, 2006), на фиг.2 представлена макулярная область сетчатки глаза, измеренная с помощью низкокогерентного оптического томографа Stratus 3000 (Carl Zeiss), на фиг.3 изображена блок-схема устройства для реализации предлагаемого способа определения фотохромной спектральной ширины чувствительности колбочек и палочек глаза человека in vivo, на фиг.4 изображены интерференционные полосы, формируемые на сетчатке глаза человека с помощью интерферометра Жамена с перестраиваемым пространственным периодом при зондировании высококогерентным (монохроматическим) излучением He-Ne лазера (λ=633 нм) при условии, что спектральная ширина зондирующего излучения на много порядков меньше спектральной ширины фотодетекторов; период интерференционных полос отградуирован в единицах остроты зрения: (а) - 0.1 соответствует 10 угловым минутам, (б) - 0.3 соответствует 30 угловым минутам; (острота зрения, равная 1, соответствует одной угловой минуте); контрастность интерференционных полос достигает 0.97,
где:
1 - наружная пограничная мембрана;
2 - слой колбочек и палочек;
3 - внутренний ядерный слой;
4 - клетки Мюллера;
5 - ядра нейроглиальных клеток;
6 - внутренняя пограничная пластинка;
7 - отростки клеток Мюллера;
8 - ганглиозные клетки зрительного нерва;
9 - пучок волокон зрительного нерва;
10 - внутренняя сетчатая пластинка;
11 - наружная сетчатая пластинка;
12 - ядро палочки;
13 - ядро колбочки;
14 - наружный сегмент палочки;
15 - внутренний сегмент палочки;
16 - внутренний сегмент колбочки;
17 - наружный сегмент колбочки;
18 - полупроводниковый широкополосный светодиод со спектральной полосой излучения не менее 390-800 нм;
19 - источник постоянного напряжения;
20 - генератор прямоугольных импульсов;
21 - коллиматор;
22 - два поляроида со спектральным диапазоном 390-800 нм;
23, 24 - плоскопараллельные кварцевые пластины интерферометра Жамена;
25 - оптический клин на основе плосковыпуклых и плосковогнутых линз;
26 - поворотная призма Дове;
27 - объектив с трансфокатором;
28 - поворотное зеркало;
29 - исследуемый глаз.
Устройство для реализации предлагаемого способа состоит из полупроводникового широкополосного светодиода 18, один электрод которого соединен с положительным потенциалом источника постоянного напряжения 19, а другой электрод соединен с «землей» (нулевым потенциалом). Генератор прямоугольных импульсов 20 через разделительную емкость соединен с положительным электродом светодиода 18. Из p-n перехода светодиода 18 излучается широкополосное оптическое излучение во всем видимом диапазоне и с помощью коллиматора 21, в фокусе которого находится поверхность p-n перехода светодиода 18, формируется оптический пучок. Соосно с коллиматором 21 оптически связанны два поляроида 22 и интерферометр Жамена, состоящий из двух плоскопараллельных кварцевых пластин 23 и 24. Устройство также содержит оптический клин 25, расположенный между плоскопараллельными кварцевыми пластинами 23 и 24, оптически связанную поворотную призму Дове 26, объектив с трансфокатором 27 и поворотное зеркало 28.
Способ осуществляется следующим образом.
Устанавливают ток инжекции в полупроводниковом широкополосном светодиоде 18, соответствующий значению выходной оптической мощности светодиода с помощью источника постоянного напряжения 19. Импульсный режим излучения в светодиоде устанавливается при подаче последовательности прямоугольных импульсов напряжения с регулируемой длительностью от 200 мс до 10 мс со скважностью два с помощью генератора прямоугольных импульсов 20 через разделительную емкость на положительный электрод светодиода. Коллиматор 21 позволяет получить пространственно-когерентный оптический пучок при его тщательной фокусировке на p-n переход светодиода 18. С помощью двух поляроидов 22 со спектральным диапазоном 390-800 нм при их соответствующем повороте регулируется интенсивность прошедшего оптического излучения. Интерферометр Жамена представляет собой две плоскопараллельные кварцевые пластины 23, 24, позволяющие сформировать два интерферирующих оптических пучка, пространственный период в которых регулируется с помощью оптического клина 25, состоящего из плосковыпуклой и плосковогнутой линз. С помощью поворотной призмы Дове 26 осуществляется осевой поворот интерферирующих полос, возникающих на сетчатке глаза человека 29 при фокусировке пучков с помощью объектива с трансфокатором 27 и поворотного зеркала 28 в различные области макулы в сетчатке.
с
Методическую основу способа измерения спектральной ширины чувствительности фоторецепторных палочек и колбочек при зондировании широкополосным оптическим излучением составляет однозначная связь между спектром оптического излучения и корреляционной функцией оптического поля (Ахманов С.А., Дъяков Ю.Е., Чиркин А.С. Введение в статистическую радиофизику и оптику. М.: Наука, 1981, 42-342) и использование соотношения Хинчина-Винера Δν·Δτ≈1, связывающего ширину спектра излучения Δν со временем когерентности зондирующего излучения Δτ (или длиной когерентности L=с·Δτ), адаптированного для линейных систем на случай спектрально-ограниченной ширины фотодетектора.
Автором экспериментально обнаружено, что если измерять корреляционную функцию оптического поля широкополосного источника излучения с шириной спектра больше ширины спектра фотодетектора, то число интерференционных полос будет определяться спектральной шириной фотодетектора. В заявляемом способе в качестве спектрально-ограниченного фотодетектора выступают спектральные характеристики фоторецепторных клеток (палочки и колбочки) при условии, что оптическая ширина спектра зондирующего излучателя больше ширины спектра поглощения фоторецепторов. При этом, чем уже спектральная полоса фотодетектора, тем больше число наблюдаемых контрастных интерференционных полос. Ширина спектра поглощения фоторецепторов определяется по числу наблюдаемых интерференционных полос, измеренных на уровне половины максимальной интенсивности. В основе способа измерения спектральной ширины чувствительности палочек или колбочек лежит измерение числа интерференционных полос, для которых контрастность достигает половины от максимальной величины, при этом используются физиологические свойства, определяющие быстродействие глаза. Известно, что интенсивность света (т.е. число фотонов в единицу времени) в результате селективного фотохимического поглощения хромофором (родопсином) фоторецепторных клеток преобразуется в изменение мембранного потенциала палочки или колбочки и через биполярную клетку кодируется в определенное число миллисекундных нервных импульсов, генерируемых ганглиозными клетками сетчатки и поступающих по аксонам зрительного нерва в зрительную кору головного мозга, что воспринимается мозгом человека как соответствующая локальная яркость света (A.M.Шамшинова, В.В.Волков. Функциональные методы исследования в офтальмологии, М.: Медицина, 1999; Хьюбел Д.Н. Глаз, мозг, видение. Пер. с англ. М.: Мир, 1990, 234 с.; Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Дрофа, 2006, с.225-229). В отличие от аналоговых или цифровых фотодетекторов (фотодиодов), в которых интенсивность поглощенного света линейно связана с фототоком, в живых оптических системах (система функционально-связанных колбочек и палочек, биполярных и ганглиозных клеток сетчатки) эта связь нелинейная, это позволяет детектировать изменение интенсивности излучения с динамическим диапазоном в пять-шесть порядков, что на два-три прядка лучше, чем, например, в полупроводниковых приборах с зарядовой связью (ПЗС), видеоматрицах профессиональных цифровых фотоаппаратов или видеокамер. Однако длительность зрительных нервных импульсов составляет более 10 мс, поэтому максимальное число генерируемых импульсов при максимально ярком свете для нормальных цветных колбочек ограничено числом 44-46 генерируемых нервных импульсов, что экспериментально определяется человеком по слиянию частоты мерцаний при воздействии импульсного света с регулируемой частотой пульсаций (Шамшинова A.M., Волков В.В. Функциональные методы исследования в офтальмологии. М.: Медицина, 1999, 415 с.). Поэтому измерение спектральной чувствительности колбочек, когда их чувствительность уменьшается вдвое, производят на основе измерения числа пульсирующих (мерцающих) интерференционных полос на частоте 22-23 Гц, что соответствует изменению контрастности интерференционных полос вдвое. Физиологическое быстродействие палочек существенно меньше колбочек, поэтому измерение числа пульсирующих черно-белых интерференционных полос необходимо производить на частоте 12-13 Гц.
Из физиологии зрения человека известно (Шамшинова A.M., Волков В.В. Функциональные методы исследования в офтальмологии. М.: Медицина, 1999, 415 с.), что максимальное угловое разрешение, равное одной минуте, обусловлено функциональной и морфологической организацией матрицы фоторецепторных клеток сетчатки, поскольку в центральной (фовеальной - менее одного градуса) области сетчатки размером менее 1 мм (см. фиг.2), соответствующей максимальному угловому разрешению (острота зрения 1 для нормального глаза человека), колбочки со средним поперечным размером ≈1 мкм и расстоянием между монохромными клетками порядка 4 мкм взаимно-однозначно связаны с ганглиозными клетками (см. фиг.1) (Хьюбел Д.Н. Глаз, мозг, видение. Пер. с англ. М.: Мир, 1990. 234 с.). Угловое разрешение для палочек не превышает 0.2, поэтому в предложенном методе измерения пространственный период интерференционных полос устанавливается равным 0.1, т.е. 10 угловых минут (см. фиг.4).
В результате проведенных измерений на основе предложенного способа с помощью устройства, показанного на фиг.3, были получены следующие результаты.
R
G
B
R
G
B
Спектральная ширина палочек, измеренная in vivo, составляет величину Δλ=102 нм при условии, что максимальная чувствительность соответствует 510 нм. Измеренные спектральные ширины полос колбочек составляют: для «красных», «зеленых» и «синих» колбочек соответственно Δλ=120 нм, Δλ=106 нм, Δλ=93 нм, при максимальном поглощении пигментами (иодопсинами) колбочек с длиной волны для «красных» колбочек λ=600 нм, для «зеленых» λ=530 нм и «синих» λ=450 нм.
R
G
B
Спектральные ширины чувствительности колбочек, измеренные с помощью разрушающего метода по спектрам отражения, составляют Δλ=133 нм, Δλ=121 нм, Δλ=100 нм (J.D.Mollon. Color vision. Ann.Res. Phsyhol., 1982, v.33, p.41-85).
R
G
B
Спектральные ширины чувствительности колбочек на основе спектрального анализа пигмента, измеренные с помощью разрушающего метода, составляют Δλ=117 нм, Δλ=113 нм, Δλ=76 нм (Brown W., Wald G. Visual pigments in single rods and cones of the human retina. Science, 1964, v.144, N3614, p.45-46).
Таким образом, предлагаемый неинвазивный и экспрессный способ определения фотохромной спектральной ширины чувствительности колбочек и палочек сетчатки глаза человека in vivo позволяет получить достоверную информацию о спектральной чувствительности нормального глаза человека in vivo и может быть использован также для диагностики патологий цветного зрения.