Способ оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов
METHOD FOR ASSESSING THE DEGREE OF EXTERNALIZATION OF PHOSPHATIDYLSERINE ON THE SURFACE OF ERYTHROCYTE MEMBRANES

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования и может использоваться для оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов.
Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны (Op den Kamp J.A. Annu. Rev. Biochem.1979. Vol. 48. P.47-71). Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood.1997. Vol. 89. P.1121-1132).
Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям. Нарушение асимметричного расположения фосфолипидов в эритроцитах приводит к их апоптозу и исчезновению из кровотока (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell.Mol.Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 971-988).
Одним из ранних признаков апоптоза является экстернализация на поверхность плазматических мембран анионного фосфолипида – фосфатидилсерина, который, как известно, может регулировать поверхностный заряд и локализацию белков мембраны (Yeung T., Gilbert G.E., Shi J., Silvius J., Kapus A., Grinstein S. Science.2008. Vol. 319. P. 210-213).
Известен способ оценки экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флуоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флуоресценции с помощью проточного цитофлуориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua M. et al. Blood. 1996.Vol. 87. P. 1179-1183). Аннексин V имеет высокое сродство для отрицательно заряженного фосфатидилсерина. Однако он связывается с фосфатидилсерином только в присутствии высоких концентраций кальция (2.5 мМ).
Для определения экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов требуется дорогостоящее оборудование (проточный цитофлуориметр) и дорогие флуоресцирующие реактивы.
.
Лантан, являясь трехвалентным катионом, также имеет высокое сродство к фосфатидилсерину и в низких концентрациях избирательно связывается с отрицательно заряженным фосфатидилсерином (Bentz J., Alford O., Cohen J., Duzgunes N. Biophys. J 1988. Vol.5. P. 593-607).
Принцип предлагаемого способа оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов основан на электростатическом взаимодействии положительно заряженного трехвалентного лантана (в низких концентрациях) с отрицательным фосфатидилсерином. В результате взаимодействия лантана с фосфатидилсерином происходит агрегация эритроцитов. Чем больше фосфатидилсерина на поверхности мембран эрироцитов, тем сильнее степень агрегации клеток.
В качестве прототипа выбран способ оценки степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ оценки степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. Патент RU 2701520. 2019), который включает фиксацию эритроцитов с помощью раствора глутарового альдегида в течение 30 минут, их отмывание забуференным физиологическим раствором, помещение в кювету агрегометра, добавление хлористого лантана в финальных концентрациях 15-25 мкМ, включение перемешивающего устройства, перемешивание в кювете агрегометра в течение 30 с, остановку перемешивания, процесс оседания агрегатов эритроцитов регистрирует в виде агрегатограммы, о степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов судят по максимальной амплитуде агрегатограммы.
Однако этот способ требует наличия высокочувствительного агрегометра. Кроме этого, существенным недостатком способа является то, что для процесса оседания эритроцитов требуется сильная агрегация клеток. Слабая агрегация эритроцитов не приводит к быстрому оседанию эритроцитов.
Этих недостатков лишен предлагаемый способ оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов.
Задача предполагаемого изобретения - совершенствование способа.
Техническим результатом является автоматизация способа определения степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов, повышающая точность оценки их агрегации.
Технический результат достигается за счет того, что в способе оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов, включающем фиксацию эритроцитов глутаровым альдегидом, для оценки степени экстернализации фосфатидилсерина эритроциты фиксируют глутаровым альдегидом в течение 30 минут, затем один раз отмывают забуференным физиологическим раствором с рН 7.4, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут, добавляют хлористый лантан в финальной концентрации 15-25 мкМ, перемешивают, агрегаты эритроцитов помещают в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получают изображение, которое обрабатывают и анализируют с применением алгоритмов компьютерного зрения, о степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов судят по показателю, равному отношению площади агрегированных к площади не агрегированных клеток.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 0.25% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 30 минут при комнатной температуре. После фиксации эритроциты один раз отмывают забуференным физиологическим раствором (10 мМ трис-НCI, 150 мМ NaCI, рН 7.4) с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут. К 0.9 мл 0.5 % суспензии фиксированных эритроцитов в забуференном физиологическом растворе добавляют 0.1 мл хлористого лантана в финальных концентрациях 15-25 мкМ, перемешивают, агрегаты эритроцитов помещают в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получают изображение, которое обрабатывают и анализируют с применением алгоритмов компьютерного зрения, о степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов судят по показателю агрегации, равному отношению площади агрегированных к площади не агрегированных клеток.
Автоматизированный анализ изображения включает в себя предобработку изображения для устранения шумов, бинаризацию изображения для поиска объектов, определение границ найденных объектов, классификацию объектов на два класса –одиночные клетки (эритроциты) и агрегаты, а также расчет значения показателя, отражающего степень агрегации эритроцитов.
На этапе предобработки изображения для устранения импульсного шума применяется медианный фильтр и выполняется адаптивное выравнивание гистограммы для повышения контрастности и качества изображения.
Для бинаризации изображения применяется метод Оцу. В связи с цветовой неоднородностью искомых объектов в результате бинаризации изображения внутри объектов образуются разрывы, снижающие качество распознавания объектов на изображении. С целью устранения разрывов и улучшения качества бинаризации для каждого пикселя изображения исследуется окрестность в форме круга, рассчитывается процентное отношение черных и белых пикселей в этой окрестности. Если полученное значение отношения больше порогового значения, равного 80%, то считается, что найден объект, внутри которого есть разрыв, и все пиксели внутри исследуемой окрестности закрашиваются черным цветом.
Для выделения и визуализации найденных объектов на изображении выполняется построение контуров связных областей, в которых у каждого пикселя имеется минимум один сосед, принадлежащий данному множеству пикселей.
Для классификации найденных объектов на одиночные клетки и агрегаты выполняется следующее: определяются центры масс каждого объекта, рассчитываются расстояния от центра масс до каждой точки контура объекта и вычисляются отклонения полученных расстояний от их среднего значения. Если отклонение близко к 0, объект считается одиночным эритроцитом (объект в форме круга – форме одиночного эритроцита), в противном случае – агрегатом клеток (объект сложной формы).
Рассчитывается значение показателя, характеризующего степень агрегации эритроцитов, определяемое отношением площади агрегированных клеток к площади одиночных клеток.
По показателю степени агрегации эритроцитов судят о степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов. Связано это с тем, что, чем больше фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, тем больше отрицательных участков для связывания положительно заряженного лантана. Результатом этого взаимодействия является агрегация эритроцитов. Чем сильнее агрегация клеток, тем большее количество фосфатидилсерина появилось на поверхности мембран эритроцитов.
Известно, что инкубация отмытых эритроцитов при 370°С в течение 24 ч приводит к экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов (Klarl B.A. et al. Am.J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 290.P.244-253).
Пример 1.
Нормальные эритроциты фиксировали глутаровым альдегидом. К 0.9 мл 0.5% суспензии нормальных фиксированных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, перемешивали, агрегаты эритроцитов помещали в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получали изображение, которое обрабатывали с применением алгоритмов компьютерного зрения (фиг. 1). Показатель экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран нормальных эритроцитов составил 2.1.
Пример 2.
Суспензию эритроцитов инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После этого эритроциты фиксировали глутаровым альдегидом. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, перемешивали, агрегаты эритроцитов помещали в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получали изображение, которое обрабатывали с применением алгоритмов компьютерного зрения (фиг. 2). Показатель экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов составил 11. Содержание фосфатилсерина эритроцитов на поверхности мембран увеличилось в 5 раз по сравнению с контролем.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить степень экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов человека и может найти применение для изучения эритроцитов при различных патологических состояниях, в опытах in vitro по изучению механизмов эриптоза.