Способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro
METHOD FOR FORMING OF COMBINED PERIODONTAL ANAEROBIC BACTERIA BIOFILM UNDER FLUID CONDITIONS IN VITRO

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии для формирования микробной биопленки в анаэробных условиях in vitro.
Известно, что бактерии, находящиеся в составе микробных сообществ и, в частности, биопленок, становятся менее доступными для действия различных внешних факторов, включая антибиотики, пестициды, биоциды и др. Процесс роста и формирования биопленок зависит от характеристики раствора, свойств носителя, состава популяции микроорганизмов и разнообразия адгезивных механизмов при использовании различных поверхностей.
Известны способы формирования биопленки in vitro в аэробных (но не анаэробных) условиях, которые предполагают нанесение планктонных форм в виде бактериальной взвеси на пластиковые или стеклянные поверхности, погруженные в жидкую (полужидкую) питательную среду или на плотной питательной среде, погруженной в жидкую среду (двухфазная питательная среда).
8
Так, например, из уровня техники известен способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента, включающий формирование биопленок на твердом носителе, отличающийся тем, что биопленку создают на покровных стеклах, установленных наклонно под углом 10-12° к вертикальной оси в количестве 8-9 штук, которые помещают между витками пружинообразного приспособления, размещенного внутри емкости объемом 100 мл, затем емкость заполняют экспериментальной средой в объеме 40-50 мл до полного погружения покровных стекол, добавляют в емкость суспензию холерных вибрионов и инкубируют при конечной концентрации холерных вибрионов в n×10 КОЕ/мл с доведением до минимального порога чувствительности 0,1 КОЕ/мл при комнатной температуре (Патент РФ №2559546 от 10.08.2015).
Известен способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы, включающий окрашивание сформировавшихся биопленок красителем с последующим экстрагированием связавшегося с биопленками красителя этиловым спиртом и оценкой интенсивности окрашивания спиртового раствора на фотометре, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют биологический субстрат - измельченные и простерилизованные натуральные почечные камни различной химической природы (Патент РФ №2461631 от 20.09.2012).
Известен способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде (Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Дисс. к.м.н. Оренбург, 2009).
Известен способ оценки характера межмикробных взаимодействий, отличающийся тем, что тестируемые моно- и смешанные культуры микроорганизмов культивируют в лунках полистиролового планшета на LB-бульоне до формирования биопленки, осуществляют промывание сформированных биопленок, окрашивание в течение 45 мин в темноте красителем, в качестве которого используют 0,1% раствор генцианвиолета, трехкратное промывание биопленок с последующим высушиванием планшета, краситель элюируют спиртом и определяют оптическую плотность элюатов на спектрофотометре, усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок сравнивают с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур, и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии (Патент РФ №2448161, 20.04.2012).
Все эти модели не позволяют воссоздать анаэробные условия и потому не пригодны для изучения пародонтопатогенной микрофлоры, которая по современным данным является этиологическим фактором пародонтита.
Весьма относительные условия анаэробиоза (отсутствия кислорода в среде) удалось создать при использовании полужидких редуцирующих сред, в частности, пулированной слюны, на которой были получены моно- и мультивидовые биопленки, растущие на гидроксиапатите (Guggenheim В et al., 2009). Инновационные подходы в искусственной слюне разработали Peyyala R. с соавторами (2012, 2013), которые применили подобные модели биопленок для демонстрации различий цитокинового и хемокинового ответов на различные бактериальные биопленки, а также  М.Т. с соавт., 2013 - для выявления факторов патогенности у компонентов биопленки (Guggenheim В., Gmur R., Galicia J.C., Stathopoulou PG, Benakanakere MR, etal. (2009) In vitro modeling of host-parasite interactions: the 'subgingival' biofilmchallenge of primary human epithelial cells. BMC Microbiol 9: 280; Peyyala, R.; Kirakodu, S.S.; Novak, K.F.; Ebersole, J.L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine 2012, 58, 65-72; Peyyala R., Kirakodu S.S., Novak K.F., Ebersole J.L. Oral epithelial cell responses to multispecies microbial biofilms // J Dent. Res. - 2013. - Vol. 92, N 3. - 235-240;  M.T., Paino A., Ihalin R. Environmental stimuli shape biofilm formation and the virulence of periodontal pathogens // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - Vol. 14, N 8. - P. 17221-17237).
Однако во всех перечисленных способах моделирования биопленок отсутствует решение двух важнейших моментов, которые непосредственно связаны с патологией полости рта:
1. Биопленки в ротовой полости формируются при движении жидкой фазы, то есть в условиях текучей среды;
2. Возбудителями пародонтита являются анаэробные бактерии, а создание анаэробиоза не предусмотрено в предложенных моделях.
Одним из важнейших условий перехода планктонных бактерий из взвеси в биопленкообразующую колонию считается истощение среды. Однако, в естественных природных условиях (в том числе, в организме человека) биопленка формируется в условиях омывания жидкими секретами, то есть в условиях текучих сред. Это обеспечивает дифференцировку клеточных слоев биопленки и постоянный приток питательных веществ, и отток продуктов метаболизма. При патологии пародонта биопленка является смешанной (мультивидовой). Однако воссоздание этого условия было технически не выполнимо при попытке получения биопленки из анаэробных бактерий, ибо не удавалось обеспечить движение жидкости (питательной среды) в анаэростатах, используемых для культивирования анэробных бактерий, или создать необходимый температурный режим 37°С.
Задачей нашего изобретения является изучение межмикробных взаимоотношений в анаэробной биопленке, воссозданной в условиях in vitro при движении жидкой фазы среды.
Технический результат изобретения заключается в воссоздании модели микробной биопленки в анаэробных условиях in vitro при движении жидкой фазы среды.
6
8
Технический результат заключается в том, что способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro осуществляется следующим образом, бактериальную взвесь из чистой культуры, разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий, в концентрации 10-10 КОЕ/мл помещать на подложку из полимерных материалов (метилметакрилат, полиуретан, триацетат или плотную агаровую питательную среду) в замкнутой емкости, которая помещается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который в свою очередь помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту при постоянной температуре культивирования биопленки 37°С; и при этом формирование смешанной биопленки осуществляется в несколько этапов, на начальном производится внесение микроба с высокой адгезивной активностью - Streptococcus sanguinis с последующим культивированием 48 часов, на следующем этапе проводят внесение микроба-промежуточного колонизатора - Fusobacterium nucleatum с культивированием 72 часа, и на заключительном этапе внесение микроба-пародонтопатогена Porphyromonas gingivalis (или Aggregatibacter actinomycetemcomitans, или Tannerella forsythia, или Prevotella intermedia, или их комбинации) с последующим культивированием в течение 5 суток для получения смешанной биопленки.
Преимущества данного способа - воспроизводимость, рост на биологически релевантных субстратах и средах, формирование биопленки в форме, похожей на зубной налет. При этом получается ограниченное число бактериальных видов (3-7), что позволяет при необходимости оценить вклад каждого вида в индукцию медиаторов воспаления, факторов патогенности или резистентности к антибиотикам.
Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro осуществляется следующим образом:
6
8
1. Помещают бактериальную взвесь чистой культуры - Str. sanguinis, разведенной 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий, в концентрации 10-10 КОЕ/мл на подложку из полимерных материалов в чашку Петри.
2. Полученная композиция устанавливается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.
3. Микроанаэростат помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий постоянную температуру культивирования монобиопленки 37°С и возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту на 48 часов.
6
8
4. Добавляют к ранее культивированной монобиопленке бактериальную взвесь чистой культуры - F. nucleatum, разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС) 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий в концентрации 10-10 КОЕ/мл на подложку из полимерных материалов в чашку Петри.
5. Полученная композиция устанавливается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.
6. Микроанаэростат помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий постоянную температуру культивирования биопленки разных видов 37°С и возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 50-100 движений в минуту, на 72 часа. 4.
6
8
7. Добавляют к ранее культивированной биопленке, состоящей из двух видов бактерий, бактериальную взвесь чистой культуры пародонтопатогенного вида - P. gingivalis (или Aggregatibacter actinomycetemcomitans, или Tannerella forsythia, или Prevotella intermedia, или их комбинации), разведенной в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне (BHI, LIM или АС), содержащей 0,01% менадиона и 0,1% гемина - стимуляторов роста анаэробных бактерий в концентрации 10-10 КОЕ/мл на подложку из полимерных материалов в чашку Петри.
8. Полученная композиция устанавливается в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа.
9. Микроанаэростат помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий постоянную температуру культивирования биопленки 37°С и возвратно-поступательные движения в заданном режиме, в диапазоне 60-120 движений в минуту, на 5 суток.
10. После получения смешанной (мультивидовой) биопленки от 3-х до 6-и видов на протяжении 1-2 месяцев проводят контроль ее жизнеспособности с использованием сканирующей электронной микроскопии.
КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 1
пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Porphyromonas gingivalis.
КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 2
пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 3
пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Tannerella forsythia.
КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 4
пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют штамм Prevotella intermedia.
КЛИНИЧЕСКИЙ ПРИМЕР 5
пп. 1-6, 8-10 - повторить, п. 7 - в качестве пародонтопатогена используют смесь штаммов Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia и Prevotella intermedia.