СПОСОБ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА
IMMUNISATION METHOD OF ANIMALS AGAINST BRUCELLOSIS

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к профилактике бруцеллезной инфекции.
Бруцеллез - инфекционное заболевание, поражающее различные виды животных и человека. Заболевание передается только от животного к человеку или от животного к животному. Бруцеллез наносит существенный экономический ущерб животноводству, так как вызывает уменьшение продуктивности, снижение жизнеспособности приплода, а проводимые ветеринарно-санитарные мероприятия требуют значительных материальных затрат. Бруцеллез возникает в результате проникновения возбудителя (бруцелл) через желудочно-кишечный тракт или поврежденную кожу и слизистые оболочки.
Несмотря на более чем столетний период изучения и борьбы с бруцеллезной инфекцией, она все еще широко распространена в животноводческих хозяйствах.
Ущерб, причиняемый бруцеллезом, усугубляется заболеванием людей, которое ведет к потере трудоспособности и часто к пожизненной инвалидности.
Важнейшим элементом в комплексной системе борьбы с бруцеллезом является вакцинация. В настоящее время известен и наиболее широко применяется парентеральный способ введения противобруцеллезных вакцин. Для профилактики бруцеллеза в настоящее время используют живые вакцины из штаммов, находящихся в стабильной S-форме - В.abortus 19, B.melitensis Rev-1, из RS-штаммов бруцелл (из штамма 82, 75/79-АВ), убитая вакцина из штамма В.abortus KB 17/100), а также известна вакцина на основе антигенов выделенных из клеток бруцелл (бруцеллезная химическая вакцина). Данные вакцины при парентеральном введении в той или иной степени обладают серопозитивностью, т.е. способностью индуцировать специфические бруцеллезные антитела, которые длительно присутствуют в крови вакцинированных животных. В результате вакцинации в течение длительного времени затрудняется дифференциация вакцинированных животных от инфицированных (1, 2, 3).
Известен также конъюнктивальный метод применения живых противобруцеллезных вакцин из штаммов В.abortus 19, B.melitensis Rev-1. Однако конъюнктивальное применение живых вакцин не безопасно, так как живая культура при введении на конъюнктиву попадает не только на слизистую глаза и в окружающую среду, но и непосредственно на человека, проводящего данную манипуляцию (4).
Наиболее близким способом к предложенному является пероральное применение живой противобруцеллезной вакцины из штамма B.abortus 82 на оленях (5). Вакцину применяют однократно, однако применение живой вакцины связано с процессом фиксации животного и необходимостью строго соблюдать требования безопасности, чтобы уменьшить контаминацию окружающей среды и возможность аэрозольного попадания штамма бруцелл обслуживающему персоналу во время вакцинации (прототип).
Таким образом, применение различных способов введения противобруцеллезных вакцин полностью не решает проблему профилактической вакцинации и дифференциации вакцинированных животных от больных.
Задачей наших исследований является  снижение негативных последствий (длительной серопозитивности) вакцинации животных противобруцеллезными вакцинами, мешающих дифференциации инфицированных и вакцинированных животных существующими коммерческими диагностикумами при проведении оздоровления хозяйств от бруцеллезной инфекции.
Техническим результатом является снижение титров специфических антител у животных и упрощение проведения профилактической вакцинации.
Это достигается тем, что вакцинацию проводят ежедневно, перорально в течение 5-10 дней, через 7-15 дней после окончания вакцинации проводят однократную пероральную ревакцинацию специфическим бруцеллезным антигеном совместно с иммуностимулятором, антиген и иммуностимулятор можно задавать животным с кормом или водой.
В результате предлагаемого перорального способа иммунизации против бруцеллеза снижается индукция специфических бруцеллезных антител у животных, что позволит проводить диагностические исследования и выявлять инфицированных животных в более ранние сроки по сравнению с животными, привитыми традиционными способами введения противобруцеллезных вакцин.
Возможность осуществления изобретения с реализацией указанного назначения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Белых мышей весом 18-19 грамм вакцинировали в течение 5 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл из штамма B.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,02 мл. Через 7 дней после окончания введения антигена мышей перорально ревакцинировали суспензией бруцелл в той же концентрации в объеме 0,02 мл и иммуностимулятора Полиоксидония в дозе 0,8 мг/кг веса. Через 5 дней после ревакцинации определяли иммунологическую реактивность мышей по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) путем введения 0,01 мл бруцеллина в подушечку левой задней лапы и 0,01 мл физраствора в подушечку правой задней лапы. Через сутки мышей усыпляли, брали кровь, фекалии, отрезали лапки по пяточному бугру, взвешивали и определяли индекс ГЗТ согласно методике (6, 7). ГЗТ является одной из форм защиты организма от инфекции, в основе нее лежит специфическое воспаление, которое развивается в сенсибилизированном организме. В реакции агглютинации определяли специфические бруцеллезные антитела в крови и фекалиях. В качестве контроля служили интактные мыши, которых не вакцинировали. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты исследований по пероральной иммунизации белых мышей
Пример №
Вес левой лапки M±m
Вес правой лапки M±m
Индекс ГЗТ
Титр антител
В фекалиях
В сыворотке крови
1
183,7+5,3
172,8+4,3
5,9
37,3
-
2
214.3+11,3
191,3+7,6
10,7
46,7
-
3
242,7+9,3
218,1+6,4
10,1
44,0
-
4
188,5+5,0
178,1+4,3
5,5
21,3
-
5
184,4+18,4
169,5+11,2
8,1
22,7
-
6
162,8+7,7
159,8+9,1
1,8
16,0
-
7
180,3+12,1
177,5+7,9
1,6
12,7
-
8
145,7+4,6
145,9+6,7
0,5
6,4
-
9
170,3+9,8
168,1+7,4
1,3
4,0
-
10
169,5+4,6
168,3+5,7
0,7
4,0
-
11
181,3+9,7
178,6+11,3
1,4
12,0
-
12
171,5+7,1
169,4+8,6
1,2
8,6
-
13
179,3+5,7
177,1+8,4
1,2
5,6
Интактные животные
121,3+5,3
119,4+6,1
1,5
-
-
Пример 2. Аналогичен примеру 1, только пероральную ревакцинацию  проводили через 15 дней и в качестве иммуностимулятора использовали Гликопин, который вводили из расчета 0.2 мг/кг. Результаты в таблице 1.
Пример 3. Аналогичен примеру 1, но в качестве антигена использовали адъювант вакцину из штамма KB 17/100, которую задавали перорально вместе с кормом в объеме 0,02 мл, а в качестве иммуностимулятора - Гликопин. Результаты в таблице 1.
Пример 4. Аналогичен примеру 1, только вакцинацию вели бруцеллезным глюкопротеидным антигеном, полученным по А.С. СССР №691056, A61K 39/10, 1974 г., в дозе 0,05 мг в течение 10 дней. Результаты в таблице 1.
Пример 5. Аналогичен примеру 1, только белых мышей вакцинировали в течение 10 дней бруцеллезным белково-полисахаридным антигеном, полученным по А.С. СССР №467933, A61K 39/10, 1977 г., путем ежедневного выпаивания в дозе 0,05 мг в объеме 0,02 мл. Через 15 дней после окончания введения антигена мышей перорально ревакцинировали этим же антигеном совместно со стимулятором Гликопином. Результаты в таблице 1.
Пример 6. Белых мышей вакцинировали в течение 2 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл из штамма В.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,02 мл. Через 7 дней после окончания введения антигена, мышей перорально ревакцинировали этой же суспензией бруцелл (0,02 мл) и иммуностимулятора Полиоксидония в дозе 0,8 мг/кг веса. Результаты в таблице 1.
Пример 7. Белых мышей вакцинировали в течение 20 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл из штамма В.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,02 мл. Через 15 дней после окончания введения антигена мышей перорально ревакцинировали суспензией бруцелл (0,05 мл) и иммуностимулятора Полиоксидония в дозе 0,8 мг/кг веса. Результаты в таблице 1.
Пример 8. Белых мышей вакцинировали в течение 10 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл штамма В.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,02 мл без иммуностимулятора. Через 5 дней после вакцинации определяли иммунологическую реактивность мышей по реакции ГЗТ. Результаты в таблице 1.
Пример 9. Белых мышей вакцинировали в течение 5 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл штамма В.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,02 мл. Через 7 дней после окончания введения антигена мышей перорально ревакцинировали суспензией бруцелл (0,02 мл) без иммуностимулятора. Результаты в таблице 1.
Пример 10. Белых мышей вакцинировали в течение 5 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл штамма B.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,02 мл вместе с иммуностимулятором Полиоксидоний в дозе 0,8 мг/кг веса. Результаты в таблице 1.
Пример 11. Белых мышей вакцинировали в течение 10 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл штамма B.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,02 мл, в конце курса иммунизации ввели иммуностимулятор Полиоксидония в дозе 0,8 мг/кг веса. Результаты в таблице 1.
Пример 12. Белых мышей вакцинировали в течение 7 дней путем ежедневного скармливания вместе с кормом бруцеллезного белково-полисахаридного антигена, полученного по А.С. СССР №467933, A61K 39/10, 1977 г., в дозе 0,05 мг. Через 30 дней после окончания введения антигена мышей перорально ревакцинировали антигеном совместно с иммуностимулятором Гликопином в дозе 0,2 мг/кг веса. Результаты в таблице 1.
Пример 13. Белых мышей вакцинировали в течение 7 дней путем ежедневного выпаивания бруцеллезного белково-полисахаридного антигена, полученного по А.С. СССР №467933, A61K 39/10, 1977 г., в дозе 0,05 мг, растворенного в объеме 0,02 мл. Через 3 дня после окончания введения антигена мышей перорально ревакцинировали антигеном совместно с иммуностимулятором Полиоксидонием в дозе 0,8 мг/кг веса. Результаты в таблице 1.
Таким образом, из опытов на мышах видно, что наибольший иммунный ответ на парентеральное введение бруцеллезного антигена развивается при ежедневном введении антигена в течение 5-10 дней и последующей ревакцинации через 7-15 дней. Варьирование сроков введения и кратности не приводит к положительному результату -  усилению иммунного ответа организма.
100
Пример 14. В качестве биологической модели при проверке иммуногенности бруцеллезных вакцин используют морских свинок. Возможность перорального метода введения противобруцеллезных антигенов испытывали на морских свинках весом 250-300 грамм. Морских свинок вакцинировали в течение 5 дней путем ежедневного выпаивания суспензии убитой культуры бруцелл из штамма B.abortus 82 в концентрации 10 млрд микробных клеток в объеме 0,5 мл. Через 7 дней после окончания курса пероральной вакцинации морских свинок перорально ревакцинировали суспензией бруцелл (0,5 мл) совместно с иммуностимулятором Полиоксидонием в дозе 0,8 мг/кг веса. Через 45 дней после ревакцинации определяли устойчивость морских свинок к экспериментальному заражению 10 ИД вирулентного штамма B.abortus 54. После заражения животных убивали и проводили бактериологическое исследование паренхиматозных органов и лимфатических узлов (всего 10 объектов). При выделении заражающего штамма хотя бы из одного объекта животное считалось не иммунным.
Сыворотку крови исследовали в реакции агглютинации на наличие специфических бруцеллезных антител. В качестве контролей служили  следующие группы морских свинок: однократно парентерально вакцинированные коммерческой вакциной из штамма B.abortus 82 в дозе 1 млрд микробных клеток; морские свинки перорально вакцинированные вакциной из штамма B.abortus 82 в дозе 2 млрд микробных клеток. Отрицательным контролем заражения служили интактные морские свинки, которых не подвергали вакцинации. Результаты представлены в таблице 2.
Пример 15. Аналогичен примеру 14, но морских свинок вакцинировали бруцеллезным белково-полисахаридным антигеном, полученным по №467933, A61K 39/10, 1977 г., в течение 10 дней, в качестве иммуностимулятора применяли Гликопин из расчета 0,2 мг/кг веса.
Пример 16. Аналогичен примеру 14, но ревакцинацию проводили через 10 дней, вводили иммуностимулятор Гликопин и бруцеллезный глюкопротеидный антиген, полученный по А.С. СССР №691056, A61K 39/10, 1974 г., в дозе 0,5 мг вместе с кормом.
Пример 17. Аналогичен примеру 14, но при ревакцинации не вводили иммуностимулятор.
Пример 18. Аналогичен примеру 14, но морских свинок вакцинировали в течение 2 дней бруцеллезным белково-полисахаридным антигеном, полученным по А.С. СССР №467933, A61K 39/10, 1977 г., и вводили иммуностимулятор Гликопин.
Пример 19. Аналогичен примеру 14, но морских свинок ревакцинировали через 4 дня и использовали бруцеллезный белково-полисахаридный антиген, полученный по А.С. СССР №467933, A61K 39/10, 1977 г.
Пример 20. Аналогичен примеру 14, но морских свинок вакцинировали в течение 10 дней, а ревакцинировали через 30 дней.
Пример 21. Аналогичен примеру 14, но морских свинок вакцинировали в течение 20 дней и в конце курса вакцинации вводили иммуностимулятор гликопин из расчета 0,2 мг/кг веса.
Таблица 2
Результаты исследований по пероральной иммунизации морских свинок
Морские свинки, вакцинированные по примеру №
К-во голов
Титр антител в сыворотке крови
Индекс инфицированности
% иммунных
14
10
-
2
90
15
12
-
3,3
91,6
16
10
-
6
80
17
8
-
18,5
50,0
18
10
-
30
40
19
10
-
24
60
20
12
-
26,6
50
21
9
-
31,1
44,4
Вакцинированные парентерально живой вакциной из шт. B.abortus 82
15
82,9+21,6
7,3
86,7
Вакцинированные перорально живой вакциной из шт. B.abortus 82
14
40,0+7,6
15
78,6
Интактные морские свинки
10
-
78
0
100
Пример 22. Овец в возрасте 3-5 месяцев разделили на группы. Овец опытной группы вакцинировали перорально, путем ежедневного скармливания в течение 10 дней инактивированной нагреванием вакцины из штамма В.abortus 19 в дозе 100 млрд м.к., через 7 дней провели пероральную ревакцинацию путем однократного скармливания инактивированной вакцины и дозе 100 млрд м.к. и иммуностимулятора полиоксидония в дозе 30 мг. В качестве контролей служили группа интактных животных и группа животных, вакцинированных парентерально живой вакциной из штамма В.abortus 19 в дозе 40 млрд м.к. У животных на 7, 15, 30 день брали кровь и исследовали в серологических реакциях (РБП, РА, РСК) на наличие специфических бруцеллезных антител. Через 30 дней после ревакцинации всех животных экспериментально заразили 10 ИД вирулентного штамма В.abortus 54. После заражения животных убивали и проводили бактериологическое исследование паренхиматозных органов и лимфатических узлов. При выделении заражающего штамма хотя бы из одного объекта животное считалось не иммунным. Результаты представлены в таблице 3.
Как следует из таблиц, при пероральном способе иммунизации специфические бруцеллезные антитела индуцируются до недиагностического уровня, что в дальнейшем позволит проводить дифференциацию между больным и здоровым поголовьем животных сразу после проведения профилактических мероприятий.
Таблица 3
Результаты применения пероральной иммунизации против бруцеллеза на овцах
Метод вакцинации
К-во голов
Титр антител
Индекс инфицированности
% иммунных
РА
РСК
РБП
Пероральный
12
0
0
отр
0
100
Парентеральный
10
680±162
-
пол
0
100
Интактные животные
8
56,7
0
Представленные данные свидетельствуют также о том, что пероральная иммунизация животных инактивированной противобруцеллезной вакциной из штамма B.abortus 82 или бруцеллезными антигенами предложенным способом позволяет вызывать эффективную защиту от экспериментального заражения бруцеллезом. Длительность первичной ежедневной вакцинации 5-10 дней и интервал между вакцинацией и ревакцинацией 7-15 являются оптимальными, иммунный ответ организма при этом по своей эффективности не уступает реакции организма на введение живой противобруцеллезной вакцины. В то же время данный способ позволяет проводить профилактическую вакцинацию животных путем добавления в корм вакцинирующего препарата, что значительно сокращает затраты на проведение профилактических мероприятий против бруцеллеза особенно овец при отарном пастбищном содержании, а также с целью профилактики бруцеллеза у диких животных в заповедниках и заказниках. Дозы антигенов, вводимых животным перорально, зависят от свойств и вида антигена.
Предложенный способ апробирован с положительным результатом на лабораторных животных, работы проводили в период с 2009 по 2013 год на опытной базе ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук в Вышнем Волочке, в соответствии с Российской Научно-технической программой по фундаментальным и приоритетным прикладным исследованиям по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК), задание 08.02.01.
Способ пероральной иммунизации путем введения в корм инактивированных противобруцеллезных вакцин или антигенов может найти применение при проведении массовой профилактической вакцинации сельскохозяйственных и диких животных.
Источники информации
1. Ж. Ветеринария, 1963, №6, с.23-26.
2. Труды ВИЭВ, М., 1967 г., том 33, с.105-115.
3. Искандаров М.И. Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук «Бруцеллез животных в России: эпизоотологические особенности и совершенствование специфической профилактики» Москва, 2012 г., с.382.
4. Доклады ВАСХНИЛ. М., 1988, №3, с.44-46.
5. Слепцов Е.С. Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук «Иммунопрофилактика бруцеллеза животных с использованием вакцин из штаммов Br.abortus 19, 104М, 82 и Br.suis 61» Санкт-Петербург, 1992 г., с.371.
6. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств / М. Медицина, 2005 г., с.63.
7. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище. МУК 2.3.2721-9S МЗ России. 1999 г., с.4.
8. А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №691056, A61K 39/10, 1974 г.
9. А.С. СССР «Способ получения антигена» №467933, A61K 39/10, 1977 г.