Способ получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium, обогащенной железом, используемой в качестве сырья для получения биологически активных добавок к пище
METHOD FOR OBTAINING BIOMASS OF DIATOMIC ALGAE CYLINDROTHECA CLOSTERIUM, ENRICHED BY IRON USED AS RAW MATERIALS FOR OBTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVES TO FOOD

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium с высоким содержанием железа в органической форме, используемой в качестве сырья для получения биологически активных добавок к пище.
Микроводоросль С. closterium является ценным сырьем для получения биологически активных веществ. Ее биомасса содержит ценные полиненасыщенные жирные кислоты и каротиноиды [5]. С. closterium способна к накоплению железа как в органической, так и в неорганической форме. Культура С. closterium обладает высокой продуктивностью до 1,2 г/л в сутки, что предполагает возможность ее интенсивного культивирования в промышленных масштабах.
В недавних исследованиях показано, что дефицит железа в организме человека встречается довольно часто [2]. В результате дефицита железа в организме человека развиваются болезни крови, появляются упадок сил, общее ухудшение самочувствия, неестественная бледность кожи. Поэтому создание биологически активных веществ на основе микроводорослей, имеющих высокую концентрацию железа в органической форме, является актуальной задачей.
Содержание железа в диатомовых водорослях варьирует в широких пределах в зависимости от условий культивирования. Известно, что содержание железа увеличивается и достигает максимальной величины при переходе диатомовых водорослей в стационарную фазу роста при высокой концентрации железа в питательной среде [3].
Известен способ [7], в котором диатомовые водоросли Т. pseudonana и P. tricornutum аккумулируют до 70% железа, присутствующего в питательной среде. При выращивании Т. pseudonana и P. tricornutum на среде F/2 с концентрацией железа 3,1 мг/л в питательной среде в колбах объемом 2 л, при температуре 21°С и освещении 3 клк максимальное содержание общего железа в Т. pseudonana и P. tricornutum достигает 52,56±6,48 и 52,3±12,3 мкМ железа на 1 миллион клеток соответственно. Обедненная питательная среда F/2 не позволяет поучать интенсивную плотную культуру микроводорослей в промышленных масштабах, а также биомассу, обогащенную железом.
Известен способ [6], в котором диатомовые водоросли Ph. tricornutum аккумулируют до 60% железа, присутствующего в питательной среде AQUIL, при выращивании с концентрацией железа 450 нМ в питательной среде в трубчатых фотобиореакторах объемом 2 л, при температуре 20°С, освещенности 10 клк. В таких условиях максимальное содержание общего железа в P. tricornutum достигает 58±12 нг/г сухой массы соответственно. Недостаток данного метода заключается в получении биомассы водорослей с невысоким содержанием общего железа из-за использования обедненной питательной среды AQUIL [4].
Известен, например, способ получения сине-зеленой водоросли спирулины (Spirulina platensis), содержащей физиологически активные микроэлементы, предусматривающий культивирование спирулины на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора и микроэлементы, в присутствии физиологически активного элемента соли ванадия. Из солей ванадия используют ванадат натрия, или нитрат ванадия, или ванадил сернокислый в концентрации 100-200 мг/л. Соль ванадия вводят в процессе приготовления питательной среды или соль ванадия вводят на экспоненциальной стадии роста спирулины при концентрации клеток не менее 1 г/л АСВ или соль ванадия вводят в стационарной стадии роста при концентрации клеток не менее 2 г/л АСВ или соль ванадия вводят порционно на экспоненциальной стадии роста спирулины (патент РФ №2198215, МПК C12N1/12, опубл. 10.02.2003 г.) [9].
Таким образом, из уровня техники известен прием введения физиологически активного микроэлемента в начале накопительного культивирования в экспоненциальной и стационарной фазах роста водорослей для их обогащения. Однако накопительная кривая кроме перечисленных фаз роста характеризуется еще фазой замедления роста. Именно в этой фазе происходит кардинальное изменение биохимического состава клеток - скорость биосинтеза белков снижается, а скорость накопления липидов увеличивается. Поэтому для максимального накопления микроэлемента в органической форме его необходимо вводить именно в фазе замедления роста.
-1
2
3
2
3
2
4
2
2
4
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому способу по технической сущности является способ получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium, предусматривающий получение инокулята и культивирование культуры в накопительном режиме на питательной среде F. Культуру диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium выращивают в течение 7-10 суток в плоскопараллельных культиваторах с рабочей толщиной слоя 2-5 см и при круглосуточном освещении 13,5 клк на модифицированной питательной среде, имеющей состав, г⋅л: NaSiO×9HO - 3,00; NaNO - 7,50; NaO×2HO - 0,50; NaEDTA - 0,872; FeSO×7HO - 0,63; NaMoO×HO - 0,063; CuSO×5HO - 0,10; ZnSO×7HO - 0,22; CoCl×6HO - 0,1; MnCl×4HO - 0,18 (патент РФ №2582182, опубл. 20.04.2016) [8].
Однако при таком способе культивирования Cylindrotheca closterium наблюдается ингибирование роста клеток железом, поскольку в питательной среде используется сверхвысокая концентрация железного купороса (0,63 г/л). Кроме того, указанный способ предполагает внесение навески (0,63 г/л) железного купороса в начале накопительного культивирования, что в значительной мере увеличивает вероятность гибели культуры или времени адаптации клеток в лаг-фазе.
Задачей изобретения, касающегося способа получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium, обогащенной железом, является создание более оптимальных условий культивирования водоросли С. closterium и получение биомассы с высоким содержанием железа.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение содержания железа в органической форме в биомассе выращенной диатомовой водоросли С. closterium, а также снижение вероятности гибели клеток культуры или времени адаптации клеток при увеличении концентрации соли железа в питательной среде RS.
3
2
3
2
2
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
4
2
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium, обогащенной железом, предусматривающем интенсивное накопительное культивирование Cylindrotheca closterium в течение 7-10 суток в плоских фотобиореакторах с толщиной рабочего слоя 5-8 см при круглосуточном освещении 7-13,5 клк и температуре 20-22°С на питательной среде RS (см. табл. 1), приготовленной на основе стерильной морской воды и имеющей следующее содержание компонентов: NaNO, NaSiO×9HO, NaHPO4×2HO, NaEDTA, FeSO×7HO, CuSO×5HO, ZnSO×7HO, CoCl×6HO, MnCl×4HO, NaMoO×2HO, согласно изобретению в фазе замедления роста культуры диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium увеличивают концентрацию соли железа в питательной среде RS в диапазоне от 150 до 350 мг/л.
-1
3
2
4
2
2
3
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
4
2
Питательная среда RS (на начальной стадии культивирования) имеет следующее количественное содержание компонентов, г⋅л: NaNO - 0,971; NaHPO×2HO - 0,0643; NaSiO×9HO - 0,3865; NaEDTA - 0,0872; FeSO×7HO - 0,05; CuSO×5HO - 0,0002; ZnSO×7HO - 0,00044; CoCl×6HO - 0,0002; MnCl×4HO - 0,00036; NaMoO×HO - 0,00012. В качестве соли железа используют железный купорос.
-1
Объем культуры в фотобиореакторе составляет 2 л. В процессе выращивания культура непрерывно барботировалась воздухом с помощью компрессора со скоростью 0,5 л⋅мин. При данных условиях культивирования в конце стационарной фазы роста концентрация общего железа в биомассе составляет 55 мг на 1 г сухой массы, при этом доля железа в органической форме составляет 54-59%. Процесс культивирования осуществляют в течение 10 суток.
Состав питательных сред AQUIL (Morel at. al. 1979) [4] и RS (Геворгиз, 2016) [1]
В работах Sutak et al., 2012 [7] и Soria-Dengg et al., 1995 [6] показано, что использование обедненной питательной среды F/2 и AQUIL для получения биомассы диатомовых водорослей, в частности С. closterium, с высоким содержанием железа нецелесообразно.
В способе используется питательная среда RS, разработанная авторами [1] специально для интенсивного культивирования микроводоросли С. closterium. Добавка железа вносится в питательную среду в фазе замедления роста культуры, когда в значительной мере изменяется биохимический состав клеток.
При увеличении концентрации соли железа менее 150 мг/л в фазе замедления роста культуры диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium не наблюдается значительного накопления железа в клетках микроводорослей, а при увеличении концентрации соли железа свыше 350 мг/л наблюдается подавление биохимических процессов клеток микроводорослей из-за токсичности железа.
Ниже приведены примеры 1 и 2 осуществления заявляемого способа.
Пример 1.
3
2
3
2
2
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
4
2
3
2
3
2
2
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
4
2
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
6
Для получения инокулята культуру водоросли Cylindrotheca closterium в течение 7 суток выращивали методом накопительной культуры в колбах объемом 0,5 л при освещении 6 клк на питательной среде F, приготовленной на стерильной морской воде: NaNO - 150 мг⋅л, NaSiO×9HO - 60 мг⋅л, NaHPO4×2HO - 10 мг⋅л, NaEDTA - 8,72 мг⋅л, FeSO×7HO - 6,3 мг⋅л, CuSO×5HO - 20 мкг⋅л, ZnSO×7HO - 44 мкг⋅л, CoCl×6HO - 20 мкг⋅л, MnCl×4HO - 36 мкг⋅л, NaMoO×2HO - 12,6 мкг⋅л. Полученную культуру переносили в питательную среду RS (NaNO - 0,971 г⋅л, NaSiO×9HO - 0,0643 г⋅л, NaHPO4×2HO - 0,3865 г⋅л, NaEDTA - 0,0872 г⋅л, FeSO×7HO - 0,05 г⋅л, CuSO×5HO - 0,0002 г⋅л, ZnSO×7HO - 0,00044 г⋅л, CoCl×6HO - 0,0002 г⋅л, MnCl×4HO - 0,00036 г⋅л, NaMoO×2HO - 0,00012 г⋅л) в культиваторы плоскопараллельного типа объемом 2 л с рабочей толщиной слоя 5 см. Суспензию клеток вносили в культиваторы из такого расчета, чтобы начальная плотность культур составляла не менее 0,1 г сухого вещества на 1 л культуры и продолжали выращивать в течение 10 суток при освещении 13 клк при непрерывном барботаже воздухом со скоростью 1 л в минуту на 1 л культуры, при температуре 20-21°С до плотности 4 г сухой биомассы на литр. После достижения фазы замедления роста в культуру добавляли навеску железного купороса из расчета 150 мг/л. Концентрация общего железа в конце стационарной фазы роста (на десятые сутки культивирования) составила 25 мг на 1 г сухой массы, при этом доля железа в органической форме достигала 38%. Таким образом, содержание железа в биомассе Cylindrotheca closterium в предлагаемом способе в 10. В работе Soria-Dengg et al., 1995 [6] получена биомасса Phaeodactylum tricornutum с концентрацией железа в нг, в нашем случае получена биомасса с концентрацией железа мг/г, т.е. в 1000000 раз выше, чем в указанном аналоге.
Пример 2.
3
2
3
2
2
4
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
4
2
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
6
Для получения инокулята С. closterium полученную из музея культур микроводорослей ИМБИ РАН (г. Севастополь) адаптировали к питательной среде RS на люминостате при постоянной температуре 20-21°С и круглосуточном освещении люминесцентными лампами ЛБ-40. После адаптации культуру использовали в качестве инокулята для накопительного культивирования в промышленном фотобиореакторе типа «бассейн» и продолжали выращивать на среде RS (NaNO - 0,971 г⋅л, NaSiO×9HO - 0,0643 г⋅л, NaHPO×2HO - 0,3865 г⋅л, NaEDTA - 0,0872 г⋅л, FeSO×7HO - 0,05 г⋅л, CuSO×5HO - 0,0002 г⋅л, ZnSO×7HO - 0,00044 г⋅л, CoCl×6HO - 0,0002 г⋅л, MnCl×4HO - 0,00036 г⋅л, NaMoO×2HO - 0,00012 г⋅л) в течение 10 суток до плотности 5 г сухой биомассы на 1 л культуры. Затем после достижения фазы замедления роста в культуру добавляли навеску железного купороса из расчета 350 мг/л. Рабочий объем суспензии составлял 580 л, рабочий слой - 0,08 м, освещаемая поверхность - 7,3 кв.м. В качестве источника освещения использовались лампы ДРЛ-700, которые давали среднюю освещенность на поверхности культуры 7,1 клк. Концентрация железа в конце стационарной фазы роста (на пятнадцатые сутки культивирования) составила 55 мг на 1 г сухой массы, при этом доля железа в органической форме достигала 59%. Таким образом, содержание железа в биомассе Cylindrotheca closterium в предлагаемом способе в 10. В работе Soria-Dengg et al., 1995 [6] получена биомасса Phaeodactylum tricornutum с концентрацией железа в нг, в нашем случае получена биомасса с концентрацией железа мг/г, т.е. в 1000000 раз выше, чем в указанном аналоге.
Из полученной биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium, обогащенной железом, удаляется влага стандартными методами (например, распылительной или конвективной сушкой), а полученный сухой материал измельчается до порошкообразного состояния, фасуется в стерильных условиях и используется в качестве биологически активной добавки к пище.
Источники информации:
1. Геворгиз Р.Г., Железнова С.Н., Зозуля Ю.В., Уваров И.П., Репков А.П., Лелеков А.С.Промышленная технология производства биомассы морской диатомеи Cylindrotheca closterium (Ehrenberg) Reimann & Lewin с использованием газовихревого фотобиореактора / Актуальные вопросы биологической физики и химии БФФХ - 2016. Материалы XI международной научно-технической конференции (25-29 апреля 2016 г., Севастополь) - Т. 1. - С. 73-77.
2. Abbaspour N., Hurrell R., Kelishadi R. Review on iron and its importance for human health // J Res Med Sci. - 2014. - 19(2). - P. 164-74.
3. Anderson M.A., Morel F.M.M. The influence of aqueous iron chemistry on the uptake of iron by the coastal diatom Thalassiosira weissflogii // Limnol. Oceanogr. - 1982. - 27, P. 789-813.
4. Morel F.M.M., Rueter J.G., Anderson D.M., Guillard R.R.L. Aquil: a chemically defined phytoplankton culture medium for trace metal studies // J. Phycol. - 1979. - Vol. 15. - P. 135-141.
5. Pasquet V.,  J.-R., Farhat F.,  V., Piot J.-M.,.  J.-B, Kaas R., Serive В., Patrice Т., Cadoret J.-R, Picot L. Study on the microalgal pigments extraction process: Performance of microwave assisted extraction // Process Biochem. - 2011. - 46. - P. 59-67.
6. Soria-Dengg S., Horstmann U. Ferrioxamines В and E as iron sources for the marine diatom Phaeodactylum tricornutum // Mar Ecol Progr Ser. - 1995. - 127. - P. 269-277.
7. Sutak R., Botebol H., Blaiseau P.L.,  Т., Bouget F.Y., Camadro J.M., Lesuisse E. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: iron binding at the cell surface is a critical step // Plant Physiol. - 2012. - 160 (4). - P. 2271-84.
8. Патент РФ №2582182, МПК C12N 1/12, A01G 33/00, C12R 1/89. Способ получения биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium / опубл. 20.04.2016, Бюл. №11 (прототип).
9. Патент РФ №2198215, МПК C12N 1/12, Способ получения спирулины, обогащенной ванадием / Нечаева С.В., Мазо В.К., Голубев М.А., Булгаков Ш.Х. - Заявка: 2000132047/13, 21.12.2000 заявл. 21.12.2000 опубл. 10.02.2003 г.