Некоторые закономерности адаптивного ответа растущих популяций Saccharomyces cerevisiae на действие ионизирующего излучения

Некоторые закономерности адаптивного ответа растущих популяций Эассйаготусев сегеу!в1ае на действие ионизирующего излучения

Горшкова Т. А.

ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск

Представлены результаты исследования адаптивной реакции у популяций диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. Выявлено существование пороговой мощности дозы, вызывающей последующий адаптивный ответ, и интервала доз и мощностей доз у-излучения, в котором проявление адаптивной реакции на последующее облучение выражено в наибольшей степени. Адаптивный ответ у делящихся дрожжевых клеток регистрировался при предварительном облучении не только малыми, но и повреждающими дозами. Адаптивная реакция проявлялась не только в увеличении выживаемости, но и ускорении формирования макроколоний.

Введение

Адаптивная реакция - один из широко известных эффектов малых доз - проявляется в том, что предварительное воздействие на клетки или организмы повреждающего агента в малых дозах увеличивает их устойчивость к повторному воздействию этого же, а иногда и другого агента в больших дозах [4-7]. Общие закономерности проявления адаптивного ответа на уровне клеточных систем были исследованы на различных объектах, в том числе на культивируемых клетках млекопитающих [1, 3, 10], в меньшей степени - на популяциях дрожжевых клеток, находящихся в логарифмической [2] и стационарной [8, 9] стадиях роста. Детальное изучение особенностей адаптивного ответа у делящихся дрожжевых клеток дает возможность выявить общие закономерности проявления адаптивной реакции растущими клеточными популяциями. Исследование возможности формирования адаптивного ответа делящимися клетками в условиях фракционирования дозы может оказаться актуальным для оптимизации условий фракционированного облучения в лучевой терапии онкологических заболеваний.

Целью настоящего исследования являлось выявление границ диапазона мощностей доз хронического у-облучения, вызывающих адаптивную реакцию у делящейся популяции дрожжевых клеток и оценка возможности проявления адаптивного ответа клетками, предварительно облученными дозами, вызывающими остановку роста и гибель части клеточной популяции.

Задачи, поставленные для достижения этой цели в ходе исследования, были следующими.

1. Изучить влияние различных комбинаций пролонгированного и острого ионизирующего излучения на степень выраженности адаптивного ответа у Бассаготусеэ сегеу1э1ае, используя показатели выживаемости, фактора изменения дозы и динамики роста потомков облученных клеток.

2. Выявить зависимость степени проявления адаптивной реакции растущей популяции дрожжевых клеток от мощности и величины дозы предварительного облучения.

Материалы и методы

В работе были использованы диплоидные дрожжевые клетки дикого типа Saccaromyces cerevisiae, штамм XS800. Клетки, культивированные 3-4 суток на твердой питательной среде (2 % глюкозы, 2 % дрожжевого экстракта, 1 % пептона, 2 % агар-агара), перед началом опыта помещали в жидкую питательную среду (аналогичного состава, но без агар-агара) в условия, благоприятные для размножения. При длительном хроническом облучении и в контроле популяции делящихся клеток находились 24 часа в суховоздушном термостате с температурой 30 С, успевая достичь конца логарифмической фазы роста к моменту острого облучения. Если интервал времени адаптирующего хронического облучения был сокращен до 2,5^5 часов или применяли острое облучение в качестве адаптирующего, в эксперименте использовали клеточные популяции, культивированные в течение 7-8 часов перед опытом в жидкой питательной среде при 30 С и находившиеся к началу опыта в середине логарифмической фазы роста. 2,5^5 часовое хроническое облучение клеток проводили при температуре 30 С, острое облучение - при комнатной температуре (10^20 °С).

Начальная концентрация клеток в жидкой питательной среде составляла 102^105 клеток/мл в зависимости от условий облучения, определяющих степень размножения и гибели клеток. После прекращения облучения концентрация клеток составляла 106^107 клеток/мл.

Источниками хронического у-излучения служили изотопы 137Cs и 60Со. Мощности адаптирующих доз 24-часового хронического облучения составили ряд от 10-6 до 40 Гр/ч. Более кратковременное (2,5^5 часов) хроническое воздействие осуществляли с мощностями 40^70 Гр/ч. Для острого адаптирующего облучения использовали установку «Исследователь» с мощностью у-излучения 60Со 53,7 Гр/мин. Адаптирующее воздействие применяли к популяциям клеток, находящимся в жидкой питательной среде. Последующее острое облучение клеток у-квантами 60Со с мощностью дозы 53,7^62,3 Гр/мин проводили в дистиллированной воде при концентрации 106 клеток/мл.

В качестве биологического теста была выбрана выживаемость, определяемая по способности клеток образовывать видимые невооруженным глазом макроколонии на твердой питательной среде в чашках Петри.

Для построения кривых выживаемости клетки облучали в нескольких дозах, при посеве на питательную среду использовали по 3-5 чашек на каждую экспериментальную точку. Каждый опыт повторяли 2-4 раза. Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excell 2000.

Результаты и обсуждение

Зависимость адаптивного ответа дрожжевых клеток от интенсивности адаптирующей дозы была изучена ранее для небольшой области мощностей доз у-излучения 60Со: от 1,6 до 18 Гр/ч [2]. В ходе настоящего исследования нами были получены кривые зависимости выживаемости клеточных популяций, предварительно хронически облученных в течение 24 часов

с мощностями доз 10' +40 Г р/ч, от дозы последующего острого облучения. Сравнение проводили с контролем, культивированным 24 часа перед острым облучением в условиях естественного радиационного фона (примерно 10-7 Гр/ч). Кривые дозовой зависимости выживаемости однократно облученных популяций клеток и популяций, предварительно хронически облученных в адаптированных дозах в течение 24 часов, представлены на рис. 1.

Доза острого облучения

Доза острого облучения

Доза острого облучения

Доза острого облучения

Доза острого облучения

,100

л

о 10 о

5

е а ш 1 и

Н

л

т 0,1

,100

л

т с о

5

е а ш 1

.0

“ 0,1

ФИД=2,7^-\ £ 10 Гр/ч

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Доза острого облучения

40 Гр/ч

ФИД=2,4 *

Доза острого облучения

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Доза острого облучения

Рис. 1. Адаптивная реакция хронически облученных в течение 24 часов диплоидных дрожжевых клеток () по сравнению с контролем (•). Значения мощности дозы хронического облучения приведены в углу каждого графика.

Для сравнения эффективности хронического адаптирующего воздействия для полученных дозовых кривых был определен фактор изменения дозы (ФИД) для 10%-выживаемости облученных популяций. На рис. 2 приведена кривая зависимости ФИД10% от мощности адаптирующей дозы. Из представленного рисунка видно, что существует пороговая мощность дозы, вызывающая адаптивную реакцию дрожжевых клеток к последующему острому облучению. Для культивированной в течение 24 часов в условиях хронического облучения популяции она находится в диапазоне 10-5^10-4 Гр/ч. Далее с нарастанием мощности дозы степень выраженности адаптивного ответа увеличивается, достигая максимума при мощности дозы хронического облучения 10 Гр/ч (ФИД для данного уровня мощности дозы составляет 2,7). Следует отметить, что при мощностях хронического 24-часового облучения выше 1 Гр/ч скорость размножения клеток в опыте снижалась в сравнении с контролем. При облучении популяции в течение суток с мощностью дозы 40 Гр/ч радиационное поражение клеток превалировало над их размножением, но для выжившей части популяции было заметно увеличение радиорезистентности по сравнению с контролем. В данном случае количество жизнеспособных после хронического облучения клеток было принято за 100 %. Таким образом, в данной серии экспериментов проявление адаптивного ответа наблюдали не только в диапазоне малых мощностей доз, не вызывающих повреждения популяции, но и для мощностей у-облучения, далеко выходящих за пределы области малых мощностей доз.

10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102

Мощность адаптирующей дозы

Рис. 2. Зависимость фактора изменения дозы (ФИД) от мощности дозы 24-часового

адаптирующего воздействия.

При 2,5^5 часовом облучении популяций клеток, находившихся в середине логарифмической фазы, с мощностями доз 40, 60 и 70 Гр/ч преобладания гибели клеток в популяции над размножением выявлено не было, хотя скорость размножения хронически облученных клеток была значительно ниже, чем в контроле. При последующем остром воздействии был обнаружен адаптивный ответ облученных клеточных популяций по сравнению с необлученным кон-

тролем. Кривые зависимости выживаемости предварительно адаптированных в течение 5 часов и контрольной популяций клеток от дозы острого облучения показаны на рис. 3. Отмечена слабая зависимость величины проявления адаптивного ответа от мощности дозы, выходящей далеко за пределы диапазона малых мощностей доз. В серии опытов по пролонгированному адаптирующему воздействию на дрожжевые клетки максимальная величина проявления адаптивной реакции (ФИД=3,6) была зафиксирована после острого облучении суспензии размножавшихся клеток, находившихся в течение 4 часов в условиях хронического облучения с мощностью дозы 40 Гр/ч по сравнению с необлученным контролем. Это свидетельствует, вероятно, о существовании наиболее эффективного для проявления адаптивного ответа временного интервала адаптирующего хронического облучения и требует дополнительного изучения.

Доза острого облучения

Рис. 3. Зависимость выживаемости предварительно адаптированных в течение 5 часов (, ) и контрольной (•) популяций клеток от дозы острого облучения.

В углу указаны мощности дозы адаптирующего хронического воздействия.

Была также поставлена серия экспериментов по выявлению закономерностей адаптивной реакции при использовании в качестве адаптирующего предварительного облучения высокой мощности дозы. Мощность дозы адаптирующего и последующего ударного облучения были равны и составляли 53,7 Гр/мин. Дозы адаптирующего облучения представляли ряд 80, 160 и 500 Гр. Выживаемость растущих популяций дрожжевых клеток, облученных такими дозами, снижается до примерно 60^70, 50 и 10 % соответственно. Однократно облученные и необлу-ченные контрольные популяции помещали на 4 часа в благоприятные условия - в суховоздушный термостат с температурой 30 С. В течение этого времени выжившие клетки продолжали размножаться. Затем следовало острое облучение дозой 1200 Гр. Зависимость выживаемости клеточных популяций, облученных дозой 1200 Гр, от величины предварительной острой дозы представлена на рис. 4. Расчет выживаемости производился от принятых за 100 % величин концентраций клеток в каждой пробе перед дозой 1200 Гр. Из приведенных данных видно, что

клетки, выжившие после облучения дозами 80+500 Гр, проявляют адаптивную реакцию к последующему облучению. Данный факт снова свидетельствует о том, что увеличение радиорезистентности к последующему облучению свойственно клеточным популяциям, облученным не только малыми, но и высокими дозами, вызывающими гибель большой части популяции.

к

X

Ф -0 £ О С

0 ю 5 о

Ф О щ О

1

і £ ш ш о с а> е; о о

Доза предварительного острого облучения

Рис. 4. Выживаемость клеточных популяций, адаптированных острыми дозами, при последующем облучении дозой 1200 Гр по сравнению с контролем.

Анализ полученных данных также позволяет сделать вывод о существовании дозового диапазона, наиболее благоприятного для проявления адаптивного ответа растущей популяцией дрожжевых клеток при кратковременном адаптирующем воздействии. При 4-часовом промежутке между облучениями этот диапазон находится в пределах от нуля до порядка 100 Гр для первого облучения.

Способность облученных дрожжевых клеток к проявлению адаптивного ответа на последующее воздействие в высокой дозе оценивалась нами не только по фактору изменения дозы и выживаемости, но также по различиям в динамике образования макроколоний однократно (в контроле) и дважды облученными клетками.

На рис. 5 представлены кривые, отражающие зависимость количества видимых невооруженным глазом колоний на твердой питательной среде в чашках Петри от продолжительности культивирования клеток после высокой дозы острого облучения. За 100 % принято количество макроколоний в чашках Петри для каждой из проб на 6 сутки роста на питательной среде. Полученные результаты свидетельствуют о том, что потомки выживших после хронического облучения клеток делятся и образуют колонии быстрее, чем потомки клеток, размножавшихся в условиях фона, при остром воздействии на них большой дозой и последующем высеве на питательную среду. Более заметное опережение в образовании макроколоний адаптированными пробами по сравнению с однократно облученными клетками наблюдается в данном случае при более высокой дозе 2200 Гр.

Время

Рис. 5. Зависимость количества выросших макроколоний после облучения адаптированных () и контрольных (•) популяций дрожжевых клеток дозами 800 Гр (сплошная линия) и 2200 Г р (пунктир) от времени после высева на питательную среду.

При кратковременном адаптирующем воздействии дозами 80 и 160 Гр и последующей через 4 часа дозе 1200 Гр, снижающей выживаемость однократно облученной растущей популяции клеток до 1,9 %, также были выявлены различия в динамике образования макроколоний однократно и дважды облученными клетками. На рис. 6 представлены кривые зависимости количества макроколоний, образованных адаптированными и контрольными клетками, от времени после посева на твердую питательную среду. За 100 % по вертикальной оси принято количество видимых невооруженным глазом колоний в чашках Петри для каждой из проб на 7 сутки роста. Из представленных данных видно, что предварительное облучение дрожжевых клеток дозами 80 и 160 Гр за 4 часа перед воздействием в дозе 1200 Гр ускоряет формирование макроколоний потомками адаптированных клеток по сравнению с неадаптированными. При предварительном облучении клеток дозой 500 Гр динамика дорастания макроколоний оказалась такой же, как и для однократно облученных дозой 1200 Гр клеток.

Приведенная на рис. 6 зависимость динамики роста макроколоний от дозы предварительного облучения коррелирует с данными на рис. 4 и также свидетельствует о существующем диапазоне максимального проявления адаптивного ответа в пределах доз, вызывающих гибель части популяции.

Время

Рис. 6. Зависимость количества макроколоний, образованных после облучения дозой 1200 Гр контрольными клетками (•) и клетками, адаптированными острыми дозами 80 Гр () и 160 Гр (), от времени после высева на питательную среду.

Таким образом, впервые продемонстрирована возможность проявления адаптивной реакции делящимися дрожжевыми клетками после адаптирующего воздействия в широком диапазоне мощностей доз хронического облучения: от десятитысячных долей до десятков Гр/ч. Найдена пороговая величина мощности дозы предварительного облучения, вызывающая последующий адаптивный ответ. Впервые показана возможность формирования адаптивного ответа у клеток, предварительно остро или хронически облученных высокими уровнями доз и мощностей доз, вызывающими заметные радиационные повреждения в делящихся клеточных популяциях. Выявлено существование интервалов доз и мощностей доз острого и хронического адаптирующего воздействия, вызывающих максимальное проявление адаптивного ответа у делящихся дрожжевых клеток.

Литература

1. Боднарчук И.А. Гипотеза о механизме индукции адаптивного ответа при облучении клеток млекопитающих в малых дозах //Радиационная биология. Радиоэкология. - 2002. - Т. 42, № 1. - С. 36-42.

2. Зюзиков Н.А., Корогодин В.И., Корогодина В.Л. Особенности действия малых доз у-излучения на дрожжевые клетки //Радиационная биология. Радиоэкология. - 1999. - Т. 39, № 6. - С. 619-622.

3. Семенец Т.Н., Семина О.В., Саенко А.С. Феномен адаптивной резистентности к у-облучению колониеобразующих единиц (КОЕ-С): условия проявления в экзотесте //Радиационная биология. Радиоэкология. - 1993. - Т. 33, Вып. 4. - С. 525-528.

4. Серебряный А.М., Морозова И.С., Зоз Н.Н. К природе адаптивного ответа у растений //Радиационная биология. Радиоэкология. - 1994. - Т. 34, Вып. 6. - С. 818-826.

5. Спитковский Д.М. Биологическое действие малых доз ионизирующей радиации //Радиобиология. -1992. - Т. 32, № 3. - С. 382-400.

6. Филиппович И.В. Феномен адаптивного ответа клеток в радиобиологии //Радиобиология. - 1991. - Т. 31, № 3. - С. 803-814.

7. Эйдус Л.Х. О едином механизме инициации различных эффектов малых доз ионизирующего излучения //Радиационная биология. Радиоэкология. - 1996. - Т. 36, Вып. 6. - С. 874-882.

8. Durand J.L., Van Broock M., Frati D.L. et al. Adaptive response to ionising radiation on Saccharomyces cerevisiae //Radiobiologia. - 2002. - V. 2, N 1. - P. 18-22.

9. Dutta K. Exposure to low dose of gamma radiation enchances the excision repair in Saccaromyces cerevisiae //J. Gen. Appl. Microbiol. - 1998. - V. 44, N 4. - P. 243-249.

10. Ryabchenco N.I., Antochina M.M., Fesenco E.V. et al. Cytogenetic adaptive response in cultured human lymphocytes: dependence on the time of exposure to adapting and challenging doses of y-rais //Mutat. Res. - 1998. - V. 418, N 1. - P. 7-19.

Certain regularities of adaptive response of dividing populations of Saccharomyces cerevisiae to ionizing radiation

Gorshkova T.A.

Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk

The results of adaptive response investigation for dividing cell populations of diploid yeast Saccharomyces cerevisiae are presented. The existence of both the smallest dose rate producing the adaptive response and the range of doses and dose rates of y-radiation within which the adaptive response to the following irradiation was the highest. The adaptive response of dividing yeast cells was registered by pretreatment not only by low but also high damaging doses. Adaptive response was expressed in increase of survival and in acceleration of colony appearance produced by irradiated cells.