Особенности врожденного иммунитета у новорожденных с дыхательными расстройствами, находящихся на искусственной вентиляции легких

Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи

УДК 616.89-008.481-053

М.В. Дударева, В.А. Линде

ОСОБЕННОСТИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У НОВОРОЖДЕННЫХ С ДЫХАТЕЛЬНЫМИ РАССТРОЙСТВАМИ, НАХОДЯЩИХСЯ НА ИСКУССТВЕННОЙ

ВЕНТИЛЯЦИИ ЛЕГКИХ

Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии

С целью раннего прогнозирования исхода дыхательных расстройств у новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции легких, определяли уровни экспрессии ^П-подобных рецепторов моноцитами периферической крови и содержание натуральных киллеров методом проточной цитометрии.

Материалы и методы. Программа обследования включала определение содержания натуральных киллеров - NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) и экспрессии Толл-подобных рецепторов на моноцитах периферической крови новорожденных с дыхательными расстройствами. Определение экспрессии Толл-подобных рецепторов и содержания натуральных киллеров выполнено у 185 доношенных новорожденных.

Результаты. В периферической крови новорожденных с респираторными нарушениями выявлена сниженная экспрессия TLR-2 (CD14+CD282+) и TLR-4 (CD14+CD284+). Наиболее высокие показатели процентного содержания TLR-2 регистрировались у новорожденных с дыхательными расстройствами, осложненных сепсисом.

Выводы. Полученные данные свидетельствуют о важной роли механизмов локальной защиты в течении и исходе дыхательных расстройств у новорожденных.

Ключевые слова: новорожденные, дыхательные расстройства, ^П-подобные рецепторы, натуральные киллеры.

М.У. Dudareva, ^А. Linde

PECULIARITIES OF INBORN IMMUNITY IN NEWBORNS WITH RESPIRATORY DISTRESS AND WITH ARTIFICIAL LUNG

VENTILATION

Rostov Scientific and Research Institute of Obstetrics and Pediatrics

The levels of expression of Toll-like receptors by monocytes of peripheral blood and the content of natural killer cells were determined by flow cytometry for the purpose of early prediction of the outcome of respiratory distress in newborns with artificial lung ventilation.

Materials and methods. The program of examination included the determination of the content of natural killer cells - NK(CD3-CD16+56+) and T-NK(CD3+CD16+56+) and the expression of Toll-like receptors at the monocytes of the peripheral blood of newborns with respiratory distress. The expression of Toll-like receptors and the content of natural killer cells were determined in 185 full-term newborns.

Results. Reduced expression of TLR-2 (CD14+CD282+) and TLR-4 (CD14+CD284+) was detected in the peripheral blood of newborns with respiratory distress. The highest indices of the percentage of TLR-2 were registered in the newborns with respiratory distress complicated by sepsis.

Summary. The received data indicate an important role of the mechanisms of local protection in the course of respiratory distress in newborns and in the outcome of it.

Key words: newborns, respiratory distress, Toll-like receptors, natural killer cells.

оригинальные статьи

Журнал фундаментальной медицины и биологии

Введение

Последнее десятилетие характеризуется бурным развитием перинатальной медицины, усовершенствованием существующих диагностических и лечебных методов и интенсивным внедрением в практику новых, высокоэффективных технологий выхаживания новорожденных детей. Все это способствует неуклонному снижению показателей младенческой смертности [1]. Достигнут значительный прогресс и в совершенствовании медицинских технологий по выхаживанию новорожденных детей с дыхательными расстройствами. При этом в структуре заболеваемости и смертности новорожденных детей остается высоким процент летальных исходов вследствие гнойно-воспалительных заболеваний различной этиологии и локализации. Наиболее уязвимыми для бактериальных инфекций являются новорожденные с дыхательными расстройствами вследствие применения этим детям искусственной вентиляции легких и большого количества инвазивных процедур. Ин-фекционно-воспалительные осложнения, развивающиеся при применении искусственной вентиляции легких у новорожденных с дыхательными нарушениями, являются одной из основных причин смерти у этих детей.

Доказана ведущая роль иммунной системы в развитии, клиническом течении и исходе гнойно-воспалительных заболеваний у новорожденных детей [2].

В настоящее время изучение механизмов врожденного иммунитета является важной задачей клинической иммунологии. Система врожденного иммунитета филогенетически более древняя линия защиты организма от патогенов и функционирует, опираясь на воспаление и фагоцитоз. Механизмы врожденного иммунитета обеспечивают быструю элиминацию патогенов и предотвращение инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще отсутствуют [3-6].

Цель исследования - сравнительное изучение параметров врожденного иммунитета у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств (СДР), обусловленных мекониальной аспирацией и у здоровых новорожденных.

Материалы и методы

Исследование выполнено на базе отделения реанимации и интенсивной терапии научно-исследовательского института акушерства и педиатрии. Дети, рожденные в родильных домах города Ростова-на-Дону и области, поступали в течение первых суток жизни в реанимационное отделение РНИИАП.

Обследованы 185 доношенных новорожденных с гестационным возрастом от 39 до 41 недели, массой тела от 3700 до 4200 г, с оценкой по шкале Апгар 3,2+1,6 баллов. Тяжесть состояния новорожденных была обусловлена преимущественно тяжелой дыхательной недостаточностью, обусловленной мекониальной аспирацией. Все дети были переведены на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) в родильном зале и транспортированы в отделение реанимации. Новорожденные поступили в от-

деление в тяжелом и крайне тяжелом состоянии, с выраженными нарушениями деятельности дыхательной, сердечно-сосудистой, нервной системы, с глубокими метаболическими расстройствами. Режимы ИВЛ подбирались соответственно данным кислотно-основного состояния крови и динамического клинического наблюдения за состоянием ребенка. Неврологическая симптоматика отмечалась у 100% новорожденных основной группы, вошедших в исследование.

Всем пациентам в процессе нахождения в отделении реанимации осуществлялось динамическое клинико-лабораторное и иммунологическое обследование при поступлении, на 3-5-е сутки и 20-е сутки (или исходе заболевания).

У новорожденных детей при поступлении не было зарегистрировано клинических признаков бактериального инфицирования. При наблюдении в динамике на основании клинико-лабораторных данных было установлено, что к 3-5 суткам пребывания в реанимационном отделении у 11—ти новорожденных детей развился неонатальный сепсис. При постановке диагноза сепсис клинико-анамнестические и лабораторные данные были подтверждены положительной гемокультурой, в 3-х случаях — положительным посевом ликвора при отрицательной гемо-культуре. В 3-х случаях одновременно выделялись возбудители в крови и ликворе, в 5-ти случаях — в крови и в аспирате из трахеи. Наиболее часто выявлялись Pseudomonas aeruginosa, Kl. pneumoniae, Strept. epidermidis.

Обследуемые новорожденные родились у женщин с отягощенным соматическим и акушерско-ги-некологическим анамнезом при осложненном течении беременности и родов.

У матерей детей основной группы экстрагени-тальная патология была представлена следующим образом: вегетососудистая дистония составила 36,96%, заболевания мочевыделительной системы — 27,7%, заболевания ЛОР-органов — 8,6%, хронический гастрит — 6,8%, ожирение II — III степени — 11,8%.

Анализ гинекологической заболеваемости у матерей детей основной группы показал, что у них чаще всего встречался кольпит — 20,63%, бактериальный вагиноз — 17%, аднексит — 11,34%, эндоцервицит — 8,16%, эрозия шейки матки — 2,72%.

Из осложнений течения данной беременности у матерей детей основной группы наиболее часто регистрировалась фетоплацентарная недостаточность (ФПН) — 42%, поздний гестоз —18,8%, угроза прерывания — 25,9%, анемия — 22,7%, многоводие — 12,2%, нарушение маточно-плацентарного кровообращения — 8,6%, хроническая внутриутробная гипоксия плода — 22%.

Очевидно, что фетоплацентарная недостаточность, хроническая гипоксия плода, ранний и поздний гестоз, угроза прерывания беременности наиболее часто отягощали течение беременности у матерей детей основной группы.

Контрольную группу для новорожденных с дыхательными расстройствами составили доношенные здоровые новорожденные. У новорожденных контрольной группы отмечалось физиологическое

Журнал фундаментальной медицины и биологии

оригинальные статьи

течение периода адаптации. Все они не имели соматических, неврологических нарушений и были выписаны домой в удовлетворительном состоянии на 4-5 сутки жизни.

29 матерей детей контрольной группы (76,3%) не имели соматической патологии, в то время как у 9 (23,7%) имелась соматическая патология: вегето-сосудистая дистония - 5,3%, заболевания мочевыде-лительной системы — 2,6%, хронический гастрит — 5,3%, хронический тонзиллит — 2,6%, ожирение II — III степени у 7,9%. Необходимо отметить, что у матерей детей контрольной группы только в 2,63% случаев встречался аднексит, а фетоплацентарная недостаточность и хроническая гипоксия плода отмечалась только в 2,6% случаев.

Исследование было одобрено этическим комитетом РНИИАП. У родителей пациентов было получено информированное согласие на все проводимые исследования.

Исследования проводили на 3-х цветном проточном цитометре "Beckman Coulter" (США) с использованием реагентов фирмы "Beckman Coulter". Лизис осуществляли ручным методом раствором "OptiLyse C" "Beckman Coulter". Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности, живым моноцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию.

При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для связанных групп. В расчет принимались случаи при максимальном уровне ошибки первого рода <0,05.

Результаты и обсуждение

Нами была определена экспрессия TLR-2 (CD282+) и TLR-4 (CD284+) на моноцитах периферической крови у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств (СДР) и у здоровых новорожденных. Установлено достоверное снижение экспрессии TLR-2 (54,98+0,78% против 78±0,67%) и TLR-4 (44,11+0,98% против 65,05+0,7%) у новорожденных с СДР по сравнению со здоровыми новорожденными (р<0,05). Следствием снижения уровня экспрессии на моноцитах рецепторов, распознающих патоген, может стать отсутствие адекватной реакции на проникновение чужеродных агентов, персистенция инфекции и хронизация процесса.

Известно, что характерный для моноцитов/ макрофагов поверхностный антиген CD14++ функционирует как патогенраспознающий рецептор. Однако ввиду отсутствия трансмембранного и ци-топлазматического доменов для передачи сигнала он нуждается в ко-рецепторах, роль которых выполняют TLR-2 и TLR-4. Есть данные, указывающие на то, что микробные компоненты в первую очередь взаимодействуют с CD14++, а затем с рецепторами TLR. Нами установлено, что у детей с СДР отмечалось достоверное снижение экспрессии

CD14++ по сравнению со здоровыми новорожденными (74,35+1,89% против 89,55+0,45%) (р<0,05).

У новорожденных с СДР осложненных сепсисом в процессе динамического наблюдения на 3-5-е сутки происходило достоверное увеличение экспрессии TLR-2 по сравнению с 1-ми сутками (81,69+1,38% против 71,33+1,27%) (р<0,05), но при этом происходило достоверное снижение экспрессии CD14++ (47,45+2,13% против 63,43+2,29%) (р<0,05). На 20-е сутки заболевания хоть и наблюдалось незначительное снижение экспрессии TLR-2 по сравнению с 3-5-ми сутками (79,7+1,21% против 81,69+1,38%) и увеличение экспрессии CD14++ по сравнению с 3-5-ми сутками (58,47+3,42% против 47,45+2,13%), но носило не достоверный характер. Интересно отметить, что по TLR-4 значимых отличий между 1-ми, 3-5-ми сутками и 20-ми сутками не получено, уровень экспрессии соответствовал возрастной норме (65,05+0,7%). Экспрессия TLR-2 превышала уровень экспрессии TLR-4. Это можно объяснить более широким спектром микробных лигандов, распознаваемых TLR-2, а также его димеризацией с TLR-1 и TLR-6.

Таким образом, при сепсисе у новорожденных существенное и быстрое увеличение экспрессии TLR-2 на моноцитах прослеживается уже при первоначальных признаках воспаления и измерение экспрессии CD14+CD282+ может служить ранним маркером развития бактериального осложнения. Не исключено, что такой высокий уровень экспрессии TLR-2 индуцирует выработку цитокинов, вызывает опосредованный цитокинами апоптоз иммуноком-петентных клеток и различные осложнения.

Натуральные киллеры ^К) являются третьей популяцией лимфоцитов иммунной системы, это клетки врожденного иммунитета. Механизм действия NK- клеток заключается в индукции апоптоза и пер-форин-зависимом лизисе. T-NK(CD3+CD16+56+) — уникальный подкласс как Т-клеток, так и NK-клеток, которые регулируют продукцию, а также сами являются продуцентами важнейших цитоки-нов, направляющих течение иммунной реакции. Их значение важно у детей раннего возраста, когда система адаптивного иммунитета только формируется.

Следует отметить, что у новорожденных детей с СДР было достоверно снижено как абсолютное, так и относительное содержание NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных (1,98+0,22% против 7,44+0,31% и 0,05+0,01 109/л против 0,25+0,01109/л; 0,61+0,04% против 2,52+0,06% и 0,014+0,002 109/л и 0,08+ 0,002 109/л) (р<0,05). На 3-5-е сутки динамического наблюдения и к 20-м суткам заболевания не наблюдалось увеличения содержания в периферической крови NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженной редукции клеток, обладающих киллерной активностью.

У новорожденных с СДР и документированным сепсисом отмечалось достоверно значимое снижение абсолютного и относительного содержания натуральных киллеров - NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных (р<0,05). В про-

оригинальные статьи

Журнал фундаментальной медицины и биологии

продолжалось

Выводы

цессе динамического наблюдения достоверное снижение NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) во все сроки наблюдения. Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что эта особенность эффекторного звена иммунологического реагирования, по-видимому, свидетельствует о напряжении защитной функции натуральных киллеров на фоне бактериальной инфекции и может лежать в основе сниженной резистентности новорожденных детей к инфекционным агентам.

Таким образом, из приведенного выше текста следует:

1. Измерение экспрессии CD14+CD282+ на моноцитах может служить ранним маркером развития бактериального осложнения.

2. TLR могут служить новыми маркерами осложнений при респираторной патологии, а также потенциальной мишенью терапевтических вмешательств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Володин Н.Н. и соавт. Применение Ронколейкина в комплексной терапии неонаталь-ного сепсиса // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии. - 2003. - Т.2., №1. - С. 62-65.

2. Guntur A. Role of immune response in sepsis and septic shock // Inter. Immunorehabilit. - 2002. Уо1. 4, № 3. - P. 370-374.

3. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варидова А.С. Врождённые компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и при патологии. Журнал микробиоогии. - 2005. № 4. -С. 96-104.

4. Кокряков В.Н. Очерки о врождённом иммунитете. - СПб., 2006. 261 с.

5. Хаитов Р.М., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Биология рецепторов врожденной иммунной системы // Физиология и патология иммунной системы. - 2008. - Т. 12, № 6. - C. 3-28.

6. Хаитов Р.М., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Роль паттернра-спознающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете // Иммунология. - 2009. - Т.30, №1. - С. 66-76.