Аутоантитела: физиологическое значение в регуляции гомеостаза

УДК 612.017:616-097

АУТОАНТИТЕЛА: ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ В РЕГУЛЯЦИИ ГОМЕОСТАЗА

© 2007 г. Г. Т. Лютфалиева, Л. К. Добродеева

Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, г. Архангельск

У практически здоровых лиц методом иммуноферментного анализа определено содержание аутоантител к двухспиральной ДНК, рибонуклео-протеидам и тромбоцитам, аутогемаг-глютинины, аутолейкоагглютинины. Выявленная большая вариабельность концентраций аутоантител у практически здоровых лиц свидетельствует об адаптивных возможностях организма в регуляции гомеостаза. Показано, что аутоантителообразование является физиологической реакцией, а повышенное содержание аутоантител в определенных пределах является реакцией, направленной на сохранение гомеостаза.

Ключевые слова: аутоантитела, аутосенсибилизация, гомеостаз, практически здоровые люди, механизмы аутоантителообразования.

Изменение границ толерантности к своим собственным структурам, вне зависимости от механизмов формирования этого процесса, ведет к образованию аутоантител [15, 17]. Наличие в организме аутоантител не является фактором, достаточным для запуска аутоиммунного процесса [6, 9, 10, 16, 22]. Мнение о том, что аутоантитела участвуют только в формировании деструктивных процессов путем антителозависимого цитолиза, вероятнее всего, не совсем объективно [13, 14, 18, 21].

С появлением чувствительных методов исследования постепенно расширяется представление о спектре аутоантител и их концентрациях. В крови у практически здоровых людей выявлены аутоантитела к почти всем известным гормонам, ферментам, ДНК, РНК, рецепторам.

Содержание аутоантител у здоровых людей увеличивается с возрастом [19], при физических нагрузках [11], стрессовых ситуациях [7], под воздействием различных неблагоприятных факторов [1, 3, 4, 8, 12]. Более высокая частота выявления аутоантител различной специфичности установлена у лиц, проживающих в дискомфортных климатогеографических условиях Европейского Севера России [4, 5, 12].

Наличие аутоантител у практически здоровых людей свидетельствует о том, что образование их является физиологическим процессом [5,

17, 18]. Естественно, при этом возникают вопросы об их значимости. Представляло интерес определить спектр аутоантител у практически здоровых и больных с различными нозологическими формами заболеваний, их концентрации и пределы колебания, частоту выявления повышенных относительно нормы уровней. Сделана попытка оценить взаимосвязь содержания аутоантител с особенностями иммунологической реактивности у практически здоровых и больных людей. Получение доказательств о физиологическом антителообразовании имеет принципиальное значение и кардинально меняет представление о роли аутоантител в развитии патологии.

Материалы и методы

В настоящей работе использованы материалы иммунологического обследования, проведенного на базе отдела экологической иммунологии Института физиологии Уро РАН и медицинской компании «Биокор». Представлены результаты исследования иммунного гомеостаза 718 человек в возрасте от 15 до 80 лет, проживающих в г. Архангельске и Архангельской области; в том числе — 158 практически здоровых на момент обследования человек в возрасте от 20 до 75 лет и 560 больных.

Все больные были разделены на группы по основным патологическим состояниям: 160 пациентов с аутоиммунной патологией, 100 — с хроническими воспалительными, 100 — онкологическими,

85 — атопическими и 60 — с вирусными заболеваниями, а также 45 пациентов с острой хирургической патологией на 1—3 сутки после полостных операций, проведенных в хирургическом отделении Северного медицинского центра им. Н. А. Семашко. Диагнозы у всех больных верифицированы. Все обследования выполнены в стадии ремиссии.

Средний возраст и половой состав больных и практически здоровых достоверно не отличались (р < 0,05).

Определяли аутоантитела к двухспиральной ДНК (ds-DNA), нуклеопротеидам (RNP) и тромбоцитам, аутогемагглютинины, аутолейкоагглютинины. Аутоантитела выявляли с помощью иммуноферментно-го анализа (ИФА) с использованием набора ENA Profile фирмы «Bio-Rad» (США). Учет результатов проводили на спектрофотометре серии Multiskan (Финляндия). Уровни аутоантител к двухспиральной ДНК и нуклеопротеидам, согласно предложенным концентрациям в образцах используемых наборов, регистрировались в МЕ/мл: к ds-DNA — до 50 МЕ/мл, к RNP — до 1 МЕ/мл.

Сывороточные аутоантитела к лейкоцитам и эритроцитам определяли в реакциях лейко- и гемагглю-тинации, результаты которых учитывали в препарате типа «толстая капля». Аутоантитела к тромбоцитам, аутогемагглютинины и лейкоагглютинины определяли в разведениях 1/5, 1/20, 1/40, 1/80, 1/60 и т. д., титры которых регистрировали в log2.

Методом «конкурентного» иммуноферментного анализа (ИФА) исследовали концентрацию общего IgE с использованием набора «Dr. Fooke» (Германия). Цитокины (интерлейкин-1-1Ь-1, интерлейкин-2 IL-2, фактор некроза опухоли — TNF-a) исследовались с использованием реактивов BCM-Diagnostics и Biosource (Europe S. A.).

Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини [20] с антисыворотками Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии, а также предприятия биологических препаратов «Биомед» им. И. И. Мечникова (г. Н. Новгород). Исследовали также содержание в сыворотке крови белков системы комплемента (С3, С4), трансферрина. Содержание сывороточных белков определяли на иммунохимическом анализаторе «Эррей» фирмы «BECMAN» (США) реактивами той же фирмы.

Гемограммы, моноцитограмммы подсчитывали в мазках крови, окрашенных по Романовскому

— Гимзе. Моноцитограмму определяли по методике О. Н. Григоровой [2]. Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли с помощью тест-набора химической компании «Реакомплекс» (г. Чита). Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови проводили в реакции иммунопреципитации в среде полиэтиленг-ликоля (ПЭГ-6000). Фенотипирование лимфоцитов

проводили в непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБио-Спектр» г. Москва).

Полученные результаты обработаны с помощью пакета программ «SPSS for Windows. Версия 12». Вычислялась одномерная описательная статистика для каждого из исследуемых показателей, производилась оценка распределений признаков на нормальность. Достоверность различий между группами определяли по критерию t-Стьюдента (с поправкой Бонферони при множественном сравнении) и с использованием непараметрических тестов Mann-Whitney Test, Kruskal-Wallis Test. Сравнение частот проводилось с использованием критерия %2. Проводился корреляционный анализ с определением коэффициентов линейной корреляции Пирсона, непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты исследований и обсуждение

Проведенный нами анализ лабораторных исследований практически здоровых жителей Северо-Запада РФ от 20 до 75 лет выявил широкий спектр аутоантител различной специфичности, который включает в себя образование аутоантител к двухспиральной ДНК, рибонуклеопротеидам, тромбоцитам, аутоге-магглютининов, аутолейкоагглютининов.

Повышенный уровень аутоантител обнаружен в среднем у 31 % практически здоровых северян. Частота регистрации повышенных концентраций их у практически здоровых колеблется от 10,39 % при обнаружении аутоантител к тромбоцитам до 31,43 % при обнаружении аутолейкоагглютининов.

Частота выявления аномально высоких концентраций аутоантител у больных и практически здоровых резко отличалась (р < 0,001). У больных она была более значительной и колебалась в пределах 50—100 % в зависимости от нозологии. У оперированных больных в раннем послеоперационном периоде частота обнаружения повышенных концентраций аутоантител достигает 100 %, у больных со злокачественными новообразованиями — 87 %, что значительно выше, чем при аутоиммунной патологии и других патологических состояниях (рисунок). Это вызвано тем, что объем тканевой травмы, стресс от оперативного вмешательства, операционная крово-потеря оказывают иммуносупрессивное действие на иммунокомпетентные клетки на фоне повышения концентрации продуктов клеточного распада и определяют реакцию иммунной системы на антигенное раздражение повышением уровней и спектра содержания аутоантител.

Анализ количественных концентраций аутоантител также выявил некоторые различия. Средние концентрации аутоантител у практически здоровых жителей Северо-Запада РФ не превышают физиологических пределов, однако границы колебания их значений смещены в сторону более высоких уровней. Содержание аутоантител к ds-DNA у практически

здоровых варьирует в широких пределах — от 22 до 94 МЕ/мл. Среднее содержание не превышает уровня физиологической границы (50 МЕ/мл) и составляет (44,79 ± 1,20) МЕ/мл. Средний уровень аутоантител к нуклеопротеидам составляет 0,59 МЕ/мл, пределы колебаний среднего — 0,18—1,66 МЕ/мл. Подобная закономерность выявляется в отношении всех исследуемых аутоантител.

100%

£ 80% s'

S

я

а 60%

н

S

Я 40% f-

е

S-

ЕТ 20%

0%

ААТкДНК ААТкРНК ААТк АГА АЛА

тромбоцитам

ШИ Аллергические заболевания I I Оперированные больные

Частота регистрации повышенных концентраций аутоантител при различных патологических состояниях

Средние уровни почти всех исследуемых аутоантител у больных вне зависимости от патологии выше физиологических пределов и значительно отличаются от средних уровней аутоантител у практически здоровых лиц (р < 0,001). У пациентов вне зависимости от нозологии концентрации аутоантител соответственно составили: (53,43 ± 0,5) МЕ/мл, (0,98 ± 0,03) МЕ/мл, (5,65 ± 0,06) log2, (6,88 ± 0,06) log2, (6,46 ± 0,07) log2. При этом размах колебаний определяемых аутоантител у больных и практически здоровых достоверно не отличается, что свидетельствует о достаточно широких пределах колебаний уровней аутоантител у практически здоровых жителей Севера.

Большая вариабельность концентраций аутоантител у практически здоровых лиц свидетельствует об адаптивных возможностях организма в регуляции гомеостаза. Расширение предела физиологического отклонения делает грань между физиологической реакцией и патологией хрупкой, прозрачной, увеличивая риск для лиц, менее приспособленных к дискомфортным условиям. Возможно, именно сокращение границы между нормой и патологией увеличивает степень риска развития аутоиммунной патологии на Севере. Только индивиды с нейтральными в пределах физиологических границ изменениями способны сохранить баланс и здоровье.

Сравнительный и корреляционный анализ позволил выявить особенности формирования аутосенсибилизации во взаимосвязи с показателями гемограммы, клеточного и гуморального иммунитета. Установлено, что повышение уровня аутоантител у больных и практически здоровых сопряжено с рядом аналогичных

изменений в иммунной системе, более выраженных у больных.

Сравнительный анализ иммунологических показателей в группе практически здоровых людей с аномально высокими концентрациями аутоантител и в группе практически здоровых лиц, уровень аутоантител у которых не превышал физиологической границы, показал, что увеличение содержания аутоантител сопряжено с достоверным снижением содержания фагоцитирующих клеток (лейкоцитов, лимфоцитов) и сочетается с процессами пролиферации и активизации молодых форм моноцитов (г = 0,26 и 0,35, р < 0,001). Можно предположить, что активизация моноцитарной системы вызывается повышенным содержанием аутоантител.

Проведенные исследования показали, что аутосенсибилизация формируется на фоне подавления процессов дифференцировки и апоптоза иммуноком-петентных клеток. Об этом свидетельствует статистически достоверная обратная взаимосвязь между содержанием аутоантител и концентрацией фенотипов лимфоцитов CD5+ (г = —0,43, р < 0,001), CD3+ (г = -0,44, р < 0,001), НЬА DR+ (г = -0,36, р < 0,001), а также CD8+ (г = -0,40, р < 0,001), CD16+ (г = -0,43, р < 0,001), CD95+ (г = -0,26, р < 0,05). Содержание цитотоксических лимфоцитов СD8+ и естественных киллеров СD16+ достоверно ниже у практически здоровых лиц с аномально высокими концентрациями аутоантител - (0,39 ± 0,05) х 109/л и (0,30 ± 0,03) х 109/л соответственно (р < 0,001), чем аналогичные показатели у лиц с нормальным содержанием аутоантител — (0,56 ± 0,03) х 109/л и (0,45 ± 0,02) х 109/л. Среднее содержание Т-лимфоцитов с рецептором к фактору некроза опухоли (СD95+) достоверно ниже -(0,46 ± 0,060) х 109/л у лиц с повышенным содержанием аутоантител.

Повышенный уровень аутоантителообразования формируется подавлением Т- и В-клеточной лимфо-пролиферации, определяемой по содержанию в крови лимфоцитов - (г = -0,35, р < 0,001), СD10 + (г = -0,49, р < 0,001), CD22+ (г = -0,31, р <

0,01), уровню РБТЛ с ФГА (г = -0,37, р < 0,001) и конканавалином-А - (г = -0,34, р < 0,001). Абсолютное содержание лимфоцитов - (1,85 ± 0,15) х 109/л, CD10+ (0,22 ± 0,02) х 109л достоверно ниже в группе практически здоровых с повышенным содержанием аутоантител - (2,24 ± 0,09; 0,28 ±

0,02 и 45,82 ± 1,59, при р < 0,001).

Содержание антителообразующих клеток, фе-нотипируемых как СD22 + , у лиц с повышенным содержанием аутоантител достоверно ниже - (0,39 ± 0,03) х 109/л и 31,03 %, чем в группе сравнения

- (0,51 ± 0,020) х 109/л, 58,9 %, (р < 0,001). Уровень бласттрансформации В-лимфоцитов составляет в среднем (51,14 + 3,62) % у лиц с повышенным содержанием аутоантител против (64,91 ± 2,39) % в сравниваемой группе (р < 0,001). Данные факты

свидетельствуют о том, что аутосенсибилизация развивается на фоне дефицита Т- и В-клеточной лимфопролиферации.

Токсическая концентрация ЦИК регистрируется в 84,38 % случаев у лиц с повышенным содержанием аутоантител. Концентрация аутоантител находится в прямой зависимости с содержанием средних и крупных ЦИК (г = 0,36, р < 0,001), т. е. растет в условиях, когда организм не справляется с их элиминацией.

Как известно, иммуноглобулины являются одним из факторов, регулирующих пролиферацию. В анализируемых группах практически здоровых лиц старшей возрастной группы и больных, вне зависимости от нозологии, регистрируется прямая взаимосвязь уровней и спектра содержания аутоантител с IgG (г = 0,34, р < 0,05), ^М (г = 0,16, р < 0,05). Повышение содержания иммуноглобулинов и ЦИК, прямые корреляционные взаимосвязи с содержанием аутоантител свидетельствуют об активизации системы комплемента классическим путем.

Кроме того, у больных, вне зависимости от патологии, установлена прямая взаимосвязь между содержанием аутоантител и пропердином (г = 0,32, р < 0,01). Следовательно, аутосенсибилизация сопровождается активизацией комплемента, которая может проходить не только классическим, но и альтернативным путем.

Проведенные исследования выявили взаимосвязи между содержанием аутоантител и провоспалительных цитокинов. Данные взаимосвязи устанавливаются при повышенных концентрациях провоспалительных цитокинов у практически здоровых людей и у больных вне зависимости от патологии. Всегда регистрируются прямые связи уровней содержания аутоантител и 1Ь-2 (г = 0,16, р < 0,05), а также Т№-а (г = 0,19, р < 0,001). В пользу наличия прямой взаимосвязи между содержанием аутоантител и степенью деструкции ткани свидетельствует также факт увеличения содержания аутоантител при ряде заболеваний не аутоиммунной природы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что уровень аутосенсибилизации отражает степень некробиоза. При этом механизм участия аутоантител в процессах утилизации продуктов некробиоза реализуется за счет активации комплемента классическим и альтернативным путем, а также за счет пролиферации и дифференцировки системы моноцитов. Стимуляция синтеза аутоантител определяется необходимостью связывания того или иного субстрата при увеличении его концентрации для элиминации, транспорта или блокады активности.

Выводы

1. У жителей Севера Европейской территории РФ в сыворотке крови определяется широкий спектр различных аутоантител и высокий уровень регистрации повышенных их концентраций (от 10,39 до 31,43 % в зависимости от специфичности).

2. Большая вариабельность концентраций аутоан-

тител у практически здоровых лиц свидетельствует об адаптивном участии аутоантител в регуляции гомеостаза.

3. Иммунные реакции, связанные с синтезом аутоантител у практически здоровых людей, не отличаются от таковых при иммунном ответе на экзогенные антигены; результат реакции с участием аутоантител определяется их концентрацией.

4. Содержание аутоантител повышается на фоне подавления процессов Т- и В-клеточной лимфопро-лиферации, дифференцировки и апоптоза иммуно-компетентных клеток и повышенных концентраций провоспалительных цитокинов.

5. Механизм участия аутоантител в процессах утилизации продуктов некробиоза осуществляется стимуляцией системы мононуклеарных фагоцитов при активизации комплемента классическим и альтернативным путем, пролиферации и дифференцировки.

6. Повышение концентраций аутоантител имеет биологический смысл, является защитным физиологическим механизмом, и лишь отсутствие патологических реактивных изменений делает данный механизм рациональным.

Список литературы

1. Аленова А. Х. Влияние атмосферных загрязнений на клинико-иммунологические показатели / А. Х. Аленова, Н. И. Буравлева, С. И. Болгова, Г. Г. Деревянко // Здравоохранение Казахстана. - 1992. - № 8. - С. 18-19.

2. Григорова О. П. Роль моноцитарной системы в реактивности человека / О. П. Григорова // М. : Медицина, 1956. - 189 с.

3. Добродеева Л. К. Аутоантитела у практически здоровых людей / Л. К. Добродеева, Г. А. Суслонова // Иммунология. - 1990. - № 2. - С. 52-55.

4. Добродеева Л. К. Иммунологическая реактивность, состояние здоровья населения Архангельской области / Л. К. Добродеева, Л. П. Жилина. - Екатеринбург, 2004.

- С. 230.

5. Добродеева Л. К. Содержание аутоантител у практически здоровых людей / Л. К. Добродеева, Л. В. Сенькова, Г. Т. Лютфалиева и др.// Физиология человека. - 2006.

- Т. 32, № 1. - С. 99-107.

6. Дядык А. И. Патогенез системной красной волчанки: настоящее и будущее / А. И. Дядык, А. Э. Багрий, И. В. Ракитская // Укр. ревматол. журн. - 2003. -№ 1. - С. 3-9.

7. Гофман В. Р. Иммунодефицитные состояния / В. Р Гофман, Н. М. Калинина, С. А. Кетлинский и др.; под ред. В. С. Смирнова, И. С. Фрейдлин. - СПб. : Фолиант, 2000. - 568 с.

8. Зашихин А. Л. Морфофункциональные аспекты влияния факторов целлюлозно-бумажного производства на состояние различных систем организма / А. Л. Зашихин, Ю. В. Агафонов, Л. А. Заостровская // Экология Северной Двины. - Архангельск, 1999. - С. 210-216.

9. Насонов Е. Л. Современные подходы к иммунологической диагностике аутоиммунных и иммунокомплексных болезней / Е. Л. Насонов, В. В. Сура // Терапевт. арх.

- 2000. - № 4. - С. 144-150.

10. Сучков С. В. ДНК-абзимы и механизмы цитотоксичности при системной красной волчанке / С. В. Сучков,

A. Г. Габибов, Н. В. Гнучев // Иммунология. — 2001. — № 4. - С. 47-51.

11. Шубик В. М. Иммунитет и здоровье спортсменов /

B. М. Шубик, М. Я. Левин. — М. : Физкультура и спорт, 1985. — 175 с.

12. Шубик В. М. Проблемы экологической иммунологии / В. М. Шубик. — М., 1976. — 240 с.

13. Abuaf N. Autoimmunite normale et pathologique: Physiologie et genetigue / N. Abuaf isen, A.-M. Rouquette, B. Rajoely // Eurobiologiste. — 2001. — N 255—256. — P. 3—13.

14. Bach J. F. Are there unique autoantigens triggering autoimmune diseases / J. F. Bach, S. Koutouzov, P M. van Endert // Immunol.Rev. — 1998. — Vol. 750 — P. 265.

15. Boyden S. V. Natural antibodies and the immune response / S. V. Boyden // Advanc. Immunol. — 1996.

— Vоl. 24, N 5. — P. 1—28.

16. Giang Phan T. Autoantibodies to extractable nuclear antigens: Making detection and interpretation more meaningful / Phan T. Giang, Richard C. W. Wong, Stephen Adelstein // Clin. and Diagn. Lab. Immunol. — 2002. — Vol. 9, N 1.

— P 1—7.

17. Grabar P. Hypothesis. Auto-antibodies and immunological theories: an analytical review / P. Grabar // Clin. Immunol. Immunopathol. — 1975. — Vol. 4. — P. 453—466.

18. Rodman T. C. Innate natural antibodies. Primary roles indicated by specific epitopes. // T. C. Rodman, E Stephen, J. J. Sullivan, R. Winston // Hum. Immunol. — 1997. — Vol. 55, N 2. — P. 87—95.

19. Kasjanova A. Antibodies against ssDNA in persons of various age / A. Kasjanova, L. Cebecauer, V. Balaz // Mechanisms of ageing and development. — 1984. — Vol. 28. —P. 289—295.

20. Manchini G. Immunochemical. Quanitation of antigens bi the single radial immunodiffusion / G. Manchini, A. O. Carbonara, I. F. Heremans // Immunochemistry.

— 1965. — Vol. 2. — P. 235—254.

21. Ohmori H. Mechanisms leading to autoantibody production: link between inflammation and autoimmunity / H. Ohmori, N. Kanayama // Curr. Drug. Targets Inflamm. Allergy. — 2003. — P 232—241.

22. Schwartz M. Autoimmunity can benefit selfmaintenance / M. Schwartz, I. R. Cohen // Immunol. Today.

— 2000. — N 6. — P. 265—268.

AUTOANTIBODIES: PHYSIOLOGICAL IMPORTANCE IN REGULATION OF HOMEOSTASIS

G. T. Lyutfalieva, L. K. Dobrodeeva

Institute of Environmental Physiology Ural Branch RAS, Arkhangelsk

Serum levels of autoantibodies to double-stranded DNA (ds-DNA), anti-RNP, autoantibodies to thrombocytes, autoleukoagglutinins and autohemagglutinins were determined in healthy subjects by ELISA. It was concluded that variety concentration of autoantibodies in healthy persons show adaptive reaction of human in regulation of homeostasis. The immune reactions connected with synthesis of autoantibodies in healthy persons are no different from response to exogenous antigens in pathology. The mechanism of elimination products of necrobiosis by autoantibodies relates with classical and alternative pathway activation of complement system and also with activation of proliferation and differentiation of monocytes. It was shown that the production of autoantibodies is physiological response and high level of autoantibodies to certain limits is physiological reaction directed to maintenance of the homeostasis

Key words: autoantibodies, autosensitization, homeostasis, practically healthy people, mechanisms of autoantibodies’ formation.

Контактная информация:

Лютфалиева Гюльнара Тельмановна — кандидат биологических наук, заведующая лабораторией иммунологии Института физиологии природных адаптаций УрО РАН Адрес: 163061, г. Архангельск, пр. Ломоносова, д. 249 Тел. (8182) 21-04-58, факс (8182) 21-02-42 Е-mail: ifpa@atnet.ru

Статья поступила 20.09.2006 г.