УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭКСПРЕСС-МОНИТОРИНГА ИНДЕКСА БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА

Устройство для экспресс-анализа индекса биохимического потребления кислорода относится к области экологии и может быть использовано для контроля процессов очистки сточной воды и состояния поверхностных вод.
При мониторинге водных объектов основная проблема заключается в определении индекса биохимического потребления кислорода, что связано с длительностью (минимум 5 суток) стандартных способов анализа [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. - 25 с.], [РД 52.24.420-2006. Биохимическое потребление кислорода в водах. Методика выполнения измерений скляночным методом. - Ростов-на-Дону: Росгидромет, 2006. - 14 с.]. Широкое применение в мониторинге индекса биохимического потребления кислорода находит манометрический датчик OxiTop, предложенный фирмой WTW, за счет снижения трудоемкости операций анализа, однако данная аналитическая система не избавляет от главного недостатка - пятисуточной инкубации. [МВИ 224.01.17.133.2009 Методика выполнения измерений биохимического потребления кислорода в природных и сточных водах по изменению давления газовой фазы (манометрический метод). - М.: 2009. - 16 с.].
Ввиду длительности стандартного способа анализа возможны экологически опасные ситуации, поэтому для экспресс определения индекса биохимического потребления кислорода предлагают использовать биосенсорные анализаторы, с помощью которых электрохимически измеряется количество растворенного кислорода, необходимое для окисления органических соединений микроорганизмами, иммобилизованными на рабочем электроде.
Известна модель экспресс анализатора биохимического потребления кислорода, состоящая из кислородного электрода с иммобилизованными микроорганизмами [Арляпов В.А., Каманин С.С., Алферов С.В., Алферов В.А. Устройство для экспресс-определения биохимического потребления кислорода. Патент РФ №106898 от 27.07.2011]. Устройство состоит из измерительной кюветы, магнитной мешалки, биосенсорной системы, включающей кислородный электрод, на котором иммобилизованы дрожжи D. hansenii. Признаками этого устройства, совпадающими с существенными признаками заявляемого технического решения, является амперометрический способ измерения биохимического потребления кислорода и использование дрожжевых клеток D. hansenii в качестве биоматериала сенсора. Недостаток данного устройства связан с использованием кислородного электрода - высокий рабочий потенциал восстановления кислорода (-0,7 В) может стать причиной побочных реакций с участием электроактивных примесей, к другим недостаткам следует отнести зависимость электродной реакции от рН.
Наиболее близким по своим признакам, принятое за прототип, является устройство для экспресс-определения биохимического потребления кислорода природных вод, описанное в работе [Nakamura H. et al. A new BOD estimation method employing a double-mediator system by ferricyanide and menadione using the eukaryote Saccharomyces cerevisiae // Talanta. - 2007. - T. 72. - №1. - С. 210-216]. Устройство состоит из измерительной кюветы, магнитной мешалки, биосенсорной системы, включающей рабочий печатный электрод с иммобилизованными дрожжами Saccharomyces cerevisiae. Измерения проводятся при потенциале 0,9 В в присутствии двухмедиаторной системы (витамин К3 - феррицианид калия), введенной в виде раствора в измерительную кювету.
3
Данный биосенсор позволяет определять индекс биохимического потребления кислорода в диапазоне 6,6-220 мг/дм (без разбавления пробы), срок эксплуатации рабочего печатного электрода составляет 14 суток.
Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого устройства, является замена кислородного электрода на рабочий электрод с иммобилизованными дрожжевыми клетками и использование бимедиаторного переноса электронов с биоматериала на электрод. Рабочий потенциал, при котором происходит анализ индекса биохимического потребления кислорода, определяется окислительно-восстановительными свойствами используемых медиаторов. Недостатками этого устройства является высокая нижняя граница определяемых значений биохимического потребления кислорода, низкий срок эксплуатации рабочего электрода, а также высокий рабочий потенциал, который может стать причиной протекания побочных реакций.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение является улучшение технических характеристик БПК-сенсора, за счет снижения рабочего потенциала, увеличения чувствительности и срока эксплуатации рабочего электрода.
Данная задача решается за счет того, что заявленное устройство для экспресс-мониторинга индекса биохимического потребления кислорода, характеризующееся тем, что содержит измерительную систему с магнитной мешалкой, биосенсорную систему с иммобилизованными на рабочем электроде дрожжевыми клетками, причем дрожжевыми клетками являются клетки Debaryomyces hansenii, а рабочим электродом является углеродопастовый, модифицированный медиатором ферроценом электрод, также устройство дополнительно содержит хлоридсеребряный электрод сравнения и введенный в измерительную кювету раствор медиатора тионина.
Технический результат заявляемого устройства заключается в улучшении технических характеристик, за счет снижения рабочего потенциала с 0,9 В (прототип) до 0,25 В (заявляемое техническое решение), уменьшении почти в 1,5 раза нижней границы определяемых значений БПК (увеличении чувствительности) и увеличении в 2,5 раза срока эксплуатации рабочего электрода по сравнению с прототипом. Кроме того, заявляемое устройство обеспечивает стабильные результаты измерения (величина относительного стандартного отклонения не более 3%), при этом длительность единичного сигнала не превышает 7 минут. В таблице 1 представлены характеристики прототипа и заявляемого устройства биохимического потребления кислорода.
Снижение рабочего потенциала связано с используемой бимедиаторной системой ферроцен-тионин. В отличие от описанной в прототипе системы феррицианид калия - витамин К3, в предложенной системе реакция окисления ферроцена, являющегося конечным акцептором электронов, протекает при значении потенциала меньшем, чем потенциал окисления феррицианида калия. Увеличение чувствительности заявляемого устройства связано с тем, что совместно с бимедиаторной системой применяются дрожжи D. hansenii. За счет введения второго медиатора используемые микроорганизмы в условиях бимедиаторного переноса электронов способны окислять широкий спектр, потенциально присутствующих в пробе органических загрязнителей, количество которых оценивается при определении показателя биохимического потребления кислорода. Кроме того, по сравнению с описанными в прототипе дрожжами S. cerevisiae, клетки D. hansenii более устойчивы к воздействию негативных факторов окружающей среды. Данная особенность является одной из причин увеличения срока эксплуатации рабочего электрода.
Заявляемое устройство состоит из следующих элементов: углеродопастового электрода, модифицированного медиатором ферроценом, и иммобилизованными на поверхности электрода клетками штамма Debaryomyces hansenii BKM Y-2482. Рабочий электрод и хлоридсеребряный электрод сравнения помещены в измерительную кювету объемом 4 мл. Перемешивание раствора с медиатором тионином осуществляется с помощью магнитной мешалки.
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является улучшение технических характеристик за счет снижения рабочего потенциала до 0,25 В, что связано с использованием бимедиаторной системы ферроцен-тионин, в которой конечным акцептором электронов служит медиатор ферроцен, электрохимическая реакция с переносом заряда которого протекает при 0,25 В. Кроме того, в 1,5 раза снижена нижняя граница определяемых значений биохимического потребления кислорода и в 2,5 раза увеличен срок эксплуатации рабочего электрода по сравнению с прототипом, что связано с возможностью использования бимедиаторной системы ферроцен-тионин с дрожжами D. hansenii.
Для регистрации сигнала биосенсорной системы используют электрохимический преобразователь потенциостат, регистрирующий зависимость силы тока от времени - IPC Micro, к которому подключаются электроды. Измерения проводят при постоянном потенциале 0,25 В.
Для формирования рабочего электрода готовят пасту на основе графитовой пудры и минерального масла, которой заполняют пластиковую трубку. Клетки микроорганизмов D. hansenii адсорбируют на рабочей поверхности электрода и фиксируют диализной мембраной при помощи пластикового кольца.
Принцип работы устройства для экспресс-определения биохимического потребления кислорода заключается в следующем: рабочий электрод с иммобилизованными клетками штамма Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, погружают совместно с хлоридсеребряным электродом сравнения в измерительную кювету объемом 5 мл с 0,3 мМ раствором медиатора тионина в 30 мМ калий-натрий фосфатном буфером растворе (рН 6,8). Измерения проводят при непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки при комнатной температуре. При постоянном рабочем потенциале 0,25 В регистрируют зависимость силы тока от времени, отражающую эндогенные процессы в клетке (фоновой сигнал). После чего вносят пробу, содержащую биоразлогаемые органические вещества (100 мкл). Измерения проводят до тех пор, пока сила тока перестанет изменяться.
3
3
2
После регистрации аналитического сигнала биосенсора (зависимости силы тока от времени) кювету промывают буферным раствором. Рассчитывают скорость биоразложения органических субстратов по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) и определяют значение биохимического потребления кислорода по предварительно построенной с помощью модельного глюкозо-глутаматного раствора калибровочной кривой. В соответствии с ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97 значение биохимического потребления кислорода модельного раствора, содержащего суммарно 300 мг/дм глюкозы и глутаминовой кислоты (1:1), соответствует 205 мгО/дм [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. - 25 с.].
3
Таким образом, заявляемое устройство для экспресс-определения биохимического потребления кислорода не требует привлечения высококвалифицированного персонала и позволяет осуществлять экспресс-мониторинг индекса биохимического потребления кислорода за время не более 7 минут, при этом нижняя граница определяемых значений БПК составляет 4,6мг/дм.