Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для анализа маркеров метилирования, ассоциированных с раком щитовидной железы, методом GLAD-ПЦР анализа

1. Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для анализа маркеров метилирования, ассоциированных со злокачественным поражением щитовидной железы, методом GLAD-ПЦР анализа путем определения в образцах ДНК наличия и количества копий последовательности R(5mC)GY в заданных положениях регуляторных областей генов ALX4, BVES, CACNA2D4, CBLN1, CCNA1, CCND2, CEBPD, CYP24A1, DCDC2B (negen1-31), EID3, EPHA7, HLTF, HOXA5, NEK9, NR2F1, OTX1, RARB, SDC2, SKOR1, SOCS3, SOX11, TCF21, TEAD1 и VIM включающий: а)геномный праймер и флюоресцентно-меченый зонд, структура которых и определяемый сайт RCGY в регуляторной области (промотор или первый экзон) генов ALX4, BVES, CACNA2D4, CBLN1, CCNA1, CCND2, CEBPD, CYP24A1, DCDC2B (negen1-31), EID3, EPHA7, HLTF, HOXA5, NEK9, NR2F1, OTX1, RARB, SDC2, SKOR1, SOCS3, SOX11, TCF21, TEAD1 и VIM находятся в участке генома протяженностью не более 250 нуклеотидов; б) гибридный праймер, структура которого представляет собой 19-нуклеотидную последовательность следующего состава: 5’-CCTGCTCTTTCATCGgYNN-3’, где подчеркиванием выделена четырехнуклеотидная часть gYNN (Y=С или T; N=A или G или С или T), комплементарная геномной последовательности в точке гидролиза ДНК метилзависимой ДНК эндонуклеазой GlaI по сайту 5’-R(5mC)^GY-3’ (точка гидролиза помечена символом ^), а оставшаяся 15-нуклеотидная часть праймера неизменна и комплементарна универсальному олигонуклеотидному адаптеру 5’-CCTGCTCTTTCATCG-3’/3’-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5’ (где p - фосфат).
2. Набор по п. 1, включающий олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды, имеющие структуру SEQ NO1- SEQ NO24, а именно:
1 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера ALX4
GP: 5'-CGTCAACAACCTCTCATCC-3'  (19)
Z: 5'-FAM-TCCATTTCTTATTTCAGTTTGCCACCA-BHQ1-3' (27)
HP10: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGC 3' (19)
2 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера BVES
GP: 5'-CCGGCGGCATTCGTCGTT-3' (18)
Z: 5'-FAM-CCCTACCCGGACCGCACTTCTCGAA-BHQ1-3' (25)
HP10: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGC 3' (19)
3 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера CACNA2D4
GP: 5'-CCATCCGGGAGGCCAACG-3' (18)
Z: 5'-FAM-CGTGGAGTGCGGGCCCTGCC-BHQ1-3' (20)
HP7: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCCG 3' (19)
4 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера CBLN1
GP: 5'-CGGAGTGATCGTGAAATCTAAGGCT-3' (25)
Z: 5'-FAM-CAGAGCACGACGGCATTGACAAGCA-BHQ1-3' (25)
HP32: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTT 3' (19)
5 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера CCNA1
GP: 5'-GGCCCCGGCTTTGGAAGG-3' (18)
Z: 5'-FAM-CCGTGACCCGTTCTCCCAACAGCC-BHQ1-3' (24)
HP29: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTA 3' (19)
6 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера CCND2
GP: 5'-GAAAGGCAACCCCCCCCAA-3' (19)
Z: 5'-FAM-CGTCTTGGCCTCAGGTCCCCGC-BHQ1-3' (22)
HP11: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGG 3' (19)
7 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера CEBPD
GP: 5'-CGAGGAGGTTCCAAGCCCACAAAC-3' (24)
Z: 5'-FAM-CACTCCCTCTGCCAGCACTCCA-BHQ1-3' (22)
HP15: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCTG 3' (19)
8 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера CYP24A1
GP: 5'-GCCCCGACTCCCACTAGCACC-3' (21)
Z: 5'-FAM-ACCTCGCCCCACCCCATCCTCC-BHQ1-3' (22)
HP11: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGG 3' (19)
9 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера DCDC2B (negen1-31)
GP: 5'-ATCGGCTCATAGACTCGTCCCTGA-3' (24)
Z: 5'-FAM-TGAGCCTGCCTGTGCCTTTGAGCC-BHQ1-3' (24)
HP30: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTC 3' (19)
10 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера EID3
GP: 5'-GCTCCGCGGGAAGACAGCC-3' (19)
Z: 5'-FAM-CCCGGCCCAGCCACAAGC-BHQ1-3' (18)
HP28: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTGT 3' (19)
11 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера EPHA7
GP: 5'-CCCAGCCCGCGGAGGTTC-3' (18)
Z: 5'-FAM-CCAAGCACGGAGCCCGGACAGTGA-BHQ1-3' (24)
HP9: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGA 3' (19)
12 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера HLTF
GP: 5'-AACAAAACACCGGCACCGCA-3' (20)
Z: 5'-FAM-CAGTCGCACTCCTGGGGCCTCGT-BHQ1-3' (23)
HP11: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGG 3' (19)
13 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера HOXA5
GP: 5'-CGCAGGGCTGGGAGAAATGA-3' (20)
Z: 5'-FAM-CCCCCCTCTCTTCTCTGCCGCCC-BHQ1-3' (23)
HP9: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGA 3' (19)
14 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера NEK9
GP: 5'-GGTATTGTCCATGAAGTGATTGTAGTAGGC-3' (30)
Z: 5'-FAM-TTCTGGCACTGCTGCAGCACGACAA-BHQ1-3' (25)
HP23: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTCG 3' (19)
15 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера NR2F1
GP: 5'-GGCCAGTTGAAGCTGCTCCCA-3' (21)
Z: 5'-FAM-CCCCCATCGAAACTCTCATCCGCG-BHQ1-3' (24)
HP2: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCAC 3' (19)
16 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера OTX1
GP: 5'-CCAAAACCAGGGAACAAAACAACAAA-3' (26)
Z: 5'-FAM-CCCAGGCCCCAAACCCAGTTCCAA-BHQ1-3' (24)
HP11: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGG 3' (19)
17 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера RARB
GP: 5'-TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC-3' (23)
Z: 5'-FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1-3' (26)
HP30: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTC 3' (19)
18 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера SDC2
GP: 5'-GCGATTGCGGCTCAGGCT-3' (18)
Z: 5'-FAM-CCCCGAGCCCGAGTCCCCG-BHQ1-3' (19)
HP30: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTC 3' (19)
19 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера SKOR1
GP: 5'-GCCGAGCGGGTTCCAGGA-3' (18)
Z: 5'-FAM-CCTCTTCCCCCTCCTCGGTTCCGGT-BHQ1-3' (25)
HP30: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTC 3' (19)
20 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера SOCS3
GP: 5'-CAGTCCCGGGGGCCCTTCT-3' (19)
Z: 5'-FAM-TGCTCCCCACCCGGCCACACTCC-BHQ1-3' (23)
HP11: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGG 3' (19)
21 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера SOX11
GP: 5'-CCGGACGAGGAGGACGAGGA-3'(20)
Z: 5'-FAM-CCCCGGCGGCTGCAGGAGCT-BHQ1-3' (20)
HP31: 5' CCTGCTCTTTCATCGGTTG 3' (19)
22 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера TCF21
GP: 5'-CCAGCCTGAGCGTGTCCAGC-3' (20)
Z: 5'-FAM-TGCCCCCCGACACCAAGCTCTCC-BHQ1-3' (23)
HP9: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGA 3' (19)
23 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера TEAD1
GP: 5'-CATTTCCAACTCTCCAGCGGCT-3' (22)
Z: 5'-FAM-CTCCCCCATCCTCTTCAGCCCTCCA-BHQ1-3' (25)
HP4: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCAT 3' (19)
24 для специфических праймеров и зонда на участки регуляторных областей гена-онкомаркера VIM
GP: 5'-TCCGCAGCCATGTCCACCA-3' (19)
Z: 5'-FAM-CCGTGTCCTCGTCCTCCTACCGCAG-BHQ1-3' (25)
HP10: 5' CCTGCTCTTTCATCGGCGC 3' (19)
где GP - геномный праймер (genome primer); Z - флуоресцентно-меченый зонд; HP* - гибридный праймер (hybrid primer); FAM - флуоресцеин; BHQ1 - гаситель флуоресценции (Black Hole Quencher 1).
3. Набор по пп. 1, 2, в котором структура гибридного праймера помимо части, комплементарной универсальному адаптеру, включает часть, комплементарную геномной последовательности в точке гидролиза ДНК метилзависимой ДНК эндонуклеазой GlaI, состоящую из 5 и более нуклеотидов.
4. Набор по пп. 1-3, в котором в структуре гибридных праймеров часть, комплементарная универсальному адаптеру, изменена в соответствии со структурой используемого универсального адаптера.