СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕМОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ
METHOD FOR ASSESSING HEMOSTATIC ACTIVITY

Изобретение относится к области медицины, в частности к гемостазиологии. Способ позволяет объективизировать и повысить диагностическую значимость оценки функциональных свойств тромбоцитов в процессе свертывания крови и формирования сгустка. Изобретение относится к медицине, а точнее - к гемостазиологии, и предназначено для оценки функциональных свойств тромбоцитов и их вклада в процесс свертывания крови. Предложенное решение может быть использовано в комплексе с другими тестами для исследования системы гемостаза с целью диагностики нарушений процессов свертывания крови и контроля эффективности проводимых лечебных мероприятий, а также в экспериментальной медицине при испытании новых антиагрегационных фармакологических препаратов.
Известны способы оценки агрегационных свойств тромбоцитов. Наиболее простые из них - «ручные» методы: после добавления в пробирку с плазмой, содержащей тромбоциты, индуктора агрегации тромбоцитов (АДФ - аденозиндифосфат, тромбин, адреналин, коллаген, ристомицин и т.д.) включают секундомер и фиксируют время появления агрегатов тромбоцитов в виде мелкодисперсных хлопьев (Смоляницкий А.Я. Методы исследования системы гемостаза // Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, с. 152-154). Однако характер информации, получаемый этим способом, крайне недостаточен и не соответствует современным требованиям оценки агрегационных свойств тромбоцитов.
Другим способом является способ оценки агрегационных свойств кровяных пластинок с помощью анализатора агрегации тромбоцитов, оснащенного компьютером и соответствующим программным обеспечением (Анализатор агрегации тромбоцитов Биола. Инструкция по определению агрегационной активности тромбоцитов. - М., 2008). При этом процесс агрегации, сопровождающийся снижением оптической плотности анализируемого образца, непрерывно регистрируется, и получаемые результаты представляются в виде кривой агрегации тромбоцитов, характеризующей кинетику этого процесса. По окончании процедуры сканирования препарата на агрегатограмме фиксируется показатель степени агрегации тромбоцитов (%) и скорости агрегации кровяных пластинок за первые 30 с процесса агрегации клеток (%/мин). Агрегация проводится как минимум с двумя индукторами агрегации - АДФ (по характеру кривой судят о способности тромбоцитов к агрегации) и коллагеном (оценка секреторной функции тромбоцитов - «реакция высвобождения»). При этом для оценки агрегационной способности тромбоцитов последовательно используют растворы АДФ в двух или трех вариантах концентрации реагента - в низкой, средней и высокой дозе.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ оценки агрегационных свойств кровяных пластинок с помощью метода тромбоэластографии (Инструкция по эксплуатации анализатора гемостаза TEG 5000, ООО «МК»). При этом регистрируется ответ тромбоцитов на стимуляцию арахидоновой кислотой и АДФ, позволяя оценить эффективность терапии такими антиагрегантами, как аспирин, плавикс и тиклид. При выполнении этого анализа появляется возможность оценить не только агрегацию тромбоцитов между собой после стимуляции АДФ или арахидоновой кислотой, но и то, как в процессе терапии антиагрегантами изменяются свойства тромбоцитов по встраиванию в тромбоцитарно-фибриновый сгусток.
Однако метод имеет недостатки. Для выполнения анализа требуется постановка 3-х или 4-х тестов на двухканальном приборе TEG 5000 (Haemoscopecopr.) или 4-канальная тромбоэластографическая установка из двух приборов, что малодостижимо. Поскольку запись единичной тромбоэластограммы требует не менее 40 минут, правильность результатов из 3-й и 4-й проб снижается под влиянием хранения.
К недостаткам способа-прототипа следует отнести большое число манипуляций с пробой, индукторами и блокаторами агрегации тромбоцитов, предлагаемых для данного исследования в коммерческом наборе Platelet Mapping (Haemoscopecopr.), что также способно негативно повлиять на точность конечного результата.
Кроме того, строгая зависимость результатов от компьютерной обработки данных исключают выбор иных индукторов агрегации тромбоцитов и жестко предопределяют использование тех или иных каналов прибора.
Задачей настоящего изобретения является создание простого и доступного метода для комплексной оценки гемостатических свойств тромбоцитов в режиме point-of-care, основанного на результатах измерения количественных параметров тромбоэластограммы, что позволит объективизировать и повысить диагностическую значимость способа для характеристики функциональных свойств кровяных пластинок у пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии, хирургии, родовспоможения, в лабораториях экспресс-диагностики и централизованных лабораториях.
Эта задача решается за счет того, что результатом анализа является сравнение одноименных показателей тромбоэластограммы, характеризующих различные стадии образования сгустка, полученных в тестах без и со стимуляцией тромбоцитов различными индукторами. Результат для удобства может быть выражен в процентах. Различие результатов теста без стимуляции индуктором и результата, полученного вследствие стимуляции тромбоцитов индуктором агрегации, расценивают как диагностически значимое.
Поставленная задача решается тем, что способ оценки гемостатической активности тромбоцитов, включающий регистрацию методом тромбоэластографии процесса образования сгустка в тромбоцитсодержащих средах, в котором берут тромбоцитсодержащие образцы биологических жидкостей, имеющих в своем составе фибриноген или другие высокомолекулярные коагулируемые тромбином белки, включая кровь, ее производные или продукты на ее основе, и с учетом различий в пробоподготовке, но без последующих различий в последовательности записи тромбоэластограммы, при этом оценку гемостатической активности тромбоцитов ведут путем сравнения двух параллельно получаемых тромбоэластограмм от двух одинаково подготовленных проб или разделения на две части одной подготовленной пробы, регистрируют показатели тромбоэластограммы: R - время реакции, K - время образования сгустка, угол, кинетика образования сгустка, градусы, МА - максимальная амплитуда тромбоэластограммы, а затем производят сравнение одноименных данных в виде отношения, а именно результат в пробе с раствором кальция и раствором аденозиндифосфат к результату в пробе с раствором кальция, разведенным дистиллированной водой в соотношении 2:1.
Способ можно осуществить следующим образом.
В качестве примеров будет показано как использовать три вида образцов биологических жидкостей, имеющих в своем составе фибриноген или другие высокомолекулярные коагулируемые тромбином белки, например, таких как 1 - цельная кровь, 2 - богатая тромбоцитами плазма (БТП) или 3 - тромбоцитный концентрат (ТК).
ПРИМЕР 1
Отбор пробы венозной крови из периферической вены производят в пробирку, содержащую раствор натрия цитрата 3,2%. Соотношение «кровь: цитрат» должно составлять 9:1, поэтому рекомендуется использование стандартизованных вакуумных систем (например, производства «Сарштедт», Германия). Если проба крови отбирается из центрального катетера, необходимо исключить возможность попадания гепарина в пробирку.
Заполнение пробирки кровью происходит самотеком и в строго рассчитанном объеме, определенном производителем. После заполнения пробирки ее отсоединяют от иглы или канюли катетера. Содержимое (кровь и антикоагулянт) смешивают путем вращения пробирки между ладонями в течение 1-2 минут. Запрещается переворачивание пробирки и взбалтывание содержимого.
Не допускается анализ крови, имеющей сгустки и/или полученной более 2 ч назад.
Перед отбором пробы следует произвести повторное перемешивание содержимого путем вращения пробирки между ладонями в течение 1-2 минут. Пробу для исследования отбирают дозатором из середины столба крови, содержащегося в пробирке.
ПРИМЕР 2
БТП получают из цельной крови по стандартной методике, предполагающей центрифугирование цельной крови при 1500G при комнатной температуре в течение 7 мин. Пробу для исследования отбирают дозатором из верхней части надосадочной жидкости (плазмы), но не более половины из образовавшегося объема надосадочной жидкости.
ПРИМЕР 3
ТК специальной пробоподготовки не требует. Пробу для исследования отбирают дозатором из середины объема, содержащегося в пробирке.
Для постановки теста с любой из проб 1-3 используют следующие реагенты:
Раствор хлорида кальция 0,2М (например, производства «ТехнологияСтандарт», Россия; готов к использованию).
Приготовление раствора индуктора (на примере индуктора АДФ производства «Технология-Стандарт», Россия). В один флакон АДФ внести 2 мл растворителя для АДФ и развести содержимое при комнатной температуре (+18…+25°С) и легком покачивании в течение 2 мин. В результате получают раствор АДФ с конечной концентрацией 1 мг/мл, который хранят при температуре -6…-18°С до 1 мес и размораживают по мере необходимости (Инструкция по применению АДФ).
Все реагенты перед исследованием должны быть выдержаны при комнатной температуре не менее 15 минут.
Проведение анализа. Исследуемая проба разделяется на два образца, объемом 340 мкл каждый, для последующей одновременной записи тромбоэластограмм. Необходимо тщательно перемешать каждую пробу перед исследованием катанием пробирок между ладоней.

Постановка теста не имеет принципиальных отличий в порядке и правилах манипуляций, определенных «Инструкцией по эксплуатации анализатора гемостаза TEG 5000 (ООО «МК»). В кювету, установленную на Канал 1 тромбоэластографа, внести 20 мкл раствора кальция хлорида (0.2М), воды дистиллированной 6,7 мкл и 340 мкл пробы. Запустить запись тромбоэластограммы, как это указано в «Инструкции» к прибору TEG5000. В кювету, установленную на Канал 2 тромбоэластографа, внести 20 мкл раствора кальция хлорида (0.2М), раствор АДФ (концентрация 1 мг/мл) в количестве 6,7 мкл и 340 мкл пробы. Запустить запись тромбоэластограммы, как это указано в «Инструкции» к прибору TEG5000.
В каждой пробе регистрируются стандартные показатели тромбоэластограммы: R - время реакции (мин), K - время образования сгустка (мин), Angle - угол, кинетика образования сгустка, градусы, МА - максимальная амплитуда тромбоэластограммы (мм). Затем производят сравнение одноименных данных в виде отношения «результат в пробе с раствором кальция и раствором АДФ к результату в пробе с раствором кальция, разведенным дистиллированной водой в соотношении 2:1».
Конечные результаты - ΔR, ΔK, ΔAngle и ΔМА - выражают в %.
Результаты исследования трактуют следующим образом. При этом значения менее 11,1% в сочетании с увеличением значений показателей ΔAngle и ΔМА более чем на 22,0% свидетельствует об общем повышении способности кровяных пластинок к агрегации, о возрастании способности тромбоцитов участвовать в «реакции высвобождения», и, следовательно, о высоких потенциальных способностях клеток высвобождать в окружающую среду специфическое содержимое гранул тромбоцитов. Удлинение величин показателей ΔR и ΔK более чем на 22,0% при том, что показатели ΔAngle и ΔМА либо увеличились не более чем на 11,1%, либо вообще демонстрируют уменьшение, свидетельствует о противоположном эффекте, т.е. об общем снижении способности кровяных пластинок к агрегации, участию в образовании сгустка и формировании специфических свойств последнего.
Также диагностическое значение имеют сравнительные изменения отдельных показателей. Так, удлинение/укорочение показателя ΔR отражает чувствительность тромбоцитов к стимуляции индуктором; удлинение/укорочение показателя ΔK - влияние активированных тромбоцитов на процесс тромбообразования; увеличение/уменьшение показателя ΔAngle свидетельствует о степени вовлечения тромбоцитов в процесс формирования сгустка, опосредованное, например, тромбоцитарной реакцией высвобождения; увеличение/уменьшение показателя ΔМА характеризует конечную степень участия только активированных тромбоцитов (из всего пула кровяных пластинок) в образовании сгустка.
Анализ, выполненный на материале 53 здоровых доноров (венозная кровь), 60 пациентов с онкогематологической патологией и 50 образцов тромбоконцентрата показал, что показатели ΔR, ΔK, ΔAngle и ΔМА варьируют в пределах от -68,9 до 161%. Параллельное тестирование тех же образцов методом лазерной агрегометрии (анализатор агрегации тромбоцитов Биола, оснащенный компьютером и соответствующим программном обеспечением. Инструкция по определению агрегационной активности тромбоцитов. - Москва, 2008) зафиксировал состояния гипо-, нормо- и гиперагрегации тромбоцитов. Это позволило установить, что
- для состояния гипоагрегации тромбоцитов значения показателей ΔR, ΔK, ΔAngle и ΔМА варьируют от отрицательных значений до +11,1%, но не превышают последнее;
- для состояния нормоагрегации тромбоцитов характерны значения показателей ΔR, ΔK, ΔAngle и ΔМА в диапазоне от +11,1% до 22,0%, но не превышают последнее;
- для состояния гиперагрегации тромбоцитов значения показателей ΔR, ΔK, ΔAngle и ΔМА превышают величину 22,0%
Выявленные диапазоны величин показателей ΔR, ΔK, ΔAngle и ΔМА, характерные для состояний гипо-, нормо- и гиперагрегации тромбоцитов, статистически значимо различались между собой (для всех сравнений: р<0,05).
Основываясь на данных, параллельно полученных предлагаемым методом и методом лазерной агрегометрии, можно предложить применение определения показателей ΔR, ΔK, ΔAngle и ΔМА в качестве диагностического теста для оценки гемостатической активности тромбоцитов со следующей трактовкой изменений отдельных показателей:
- удлинение/укорочение показателя ΔR отражает чувствительность тромбоцитов к стимуляции индуктором;
- удлинение/укорочение показателя ΔK отражает влияние активированных тромбоцитов на процесс тромбообразования;
- увеличение/уменьшение показателя ΔAngle свидетельствует степени вовлечения тромбоцитов в процесс формирования сгустка, опосредованное, например, тромбоцитарной реакцией высвобождения;
- увеличение/уменьшение показателя ΔМА характеризует конечную степень участия только активированных тромбоцитов (из всего пула кровяных пластинок) в образовании сгустка.
При этом значения менее 11,1% в сочетании с увеличением значений показателей ΔAngle и ΔМА более чем на 22,0% свидетельствует об общем повышении способности кровяных пластинок к агрегации, о возрастании способности тромбоцитов участвовать в «реакции высвобождения» и, следовательно, о высоких потенциальных способностях клеток высвобождать в окружающую среду специфическое содержимое гранул тромбоцитов.
Удлинение величин показателей ΔR и ΔK более чем на 22,0% при том, что показатели ΔAngle и ΔМА либо увеличились не более чем на 11,1%, либо вообще продемонстрировали уменьшение вплоть до отрицательных величин, свидетельствует о противоположном эффекте, т.е. об общем снижении способности кровяных пластинок к агрегации, участию в образовании сгустка и формировании специфических свойств последнего.