Средство для стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum
MERISTEM CULTURE SOLANUM TUBEROSUM GROWTH STIMULATOR

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к регуляторам роста растений, содержащих микроорганизмы или вещества полученные из них и может быть использовано в биотехнологическом производстве, сельском хозяйстве и биологии.
Современным трендом в растениеводстве является переход к принципиально новым, экологически "чистым" препаратам стимулирующим рост растений. Биотехнологический синтез препаратов стимулирующих рост растений на основе микроорганизмов и их метаболитов являются одним из наиболее перспективных таких направлений.
Известен и описан ряд штаммов стимулирующих рост растений использующихся в растениеводстве.
Известен патент №2495119 «Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов» [2]. Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А, депонированный в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ под номером RCAM 00876. Он обладает ростостимулирующей активностью по отношению к различным сельскохозяйственным культурам.
Известен патент №2551968 «Штамм бактерий Bacillus pumillus А 1.5 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами» [3]. Штамм обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям и грибам и ростостимулирующей активностью по отношению к растениям. Для обработки семян сельскохозяйственных растений на основе штамма Bacillus pumillus А 1.5 готовится препарат «Эндохит» с титром
8
бактерий не менее 3×10 КОЕ/мл. Обработка семян производится 10% раствором препарата.
Известен патент №2284353 «Штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней», положительно влияющий на рост растений [1]..
Известен патент №2624032 "Штамм микроорганизма Bacillus cereus 875 TS в качестве средства повышения продуктивности растений", повышающий продуктивность зерновых [4].
Задачей изобретения является использование штамма микроорганизма Bacillus cereus в сельском хозяйстве, в качестве средства стимулятора роста меристемной культуры Solanum tuberosum. Поставленная задача решается благодаря тому, что применяется штамм бактерий Bacillus cereus ВКПМ В-12401 в качестве средства для стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum.
Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика за № В-12401 выделен из многолетнемерзлых пород (серого ожелезненного песка ниже торфяного горизонта, глубина места отбора пробы 2 м. ниже берегового растительного покрова) при отборе проб с правого берега реки Чара на 9 км. выше по течению реки от поселка Новая Чара (Читинская обл.), координаты: (N560 45, 688', Е 1180 11, 440').
Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401. Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем. Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.
Культивирование штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25 до +36°С 24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.
Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401: каталаза+, оксидаза+, рост на среде ЖСА+, лецитиназа-, желатиназа-, рост на кровяном агаре+, гемолиз+, рост на среде МПБ+, рост на среде МПА+, анаэробный рост-, рост на цитратной среде+, глюкоза К+, арабиноза К+, ксилоза К+, крахмал-, казеин+, восстановление нитратов+, сероводород-, индол-.
Чувствительность к антибиотикам: штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину, эритромицину, налидиксовой кислоте, линкомицину, устойчив к стрептомицину.
Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 в холодильнике (2°С - 5°С) 2 месяца.
Штамм бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 не является зоопатогенным или фитопатогенным.
Метаболиты штамма бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 были проверены в лабораторных условиях на способность стимулировать рост меристемной культуры Solanum tuberosum, путем ее предварительной обработки их раствором.
Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.
Культивирование штамма бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 №В-12401 осуществляли по описанной выше методике. Штамм бактерий высевали штрихом в 5 пробирок на скошенный, приготовленный стандартным
методом питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 48 часа при t=26°C. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1х109 м.к./мл (микробных клеток в 1 мл физиологического раствора). Затем суспензию клеток замораживали на 24 часа при Т-15°С после чего ее оттаивали при Т-22°С в течение 18 часов. Цикл замораживания-оттаивания повторяли 3 раза. По нашим экспериментальным данным этот способ увеличивает выход вторичных метаболитов бактерий в водную среду в 2 раза. Общая масса пептидных комплексов в фильтратах определялась биуретовым методом и методом жидкостной препаративной хроматографии на хроматографе фирмы «Gilson») и составляла 200 мкг/мл.
Получали стерильный раствор метаболитов методом фильтрования бактериальной суспензии через фильтр фирмы «Millipor» с диаметром пор 0,22 мкм (Durapore membrane filters, type 0.22 mm GV). Полученные фильтраты, содержащие метаболиты, использовали для дальнейшей работы. Для проведения исследований по влиянию метаболитов бактерий на развитие меристемных растений картофеля их в количестве (дозе) 250 мкл. (50 мкг по пептидным комплексам) раскапывали (наносили) на поверхность питательной среды Мурасиге-Скуга, разлитую в пробирки по 5 мл. В контрольном варианте, в том же объеме, добавляли отфильтрованный смыв с поверхности питательного агара для культивирования микроорганизмов. Через 60 минут в эти пробирки начинали высаживать микрочеренки меристемных растений Solanum tuberosum.
Исследование влияния микробных метаболитов проводилось на меристемных культурах Solanum tuberosum сорта «Жуковский ранний»,
селекции Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха. Микроклоны получали, вырезая участок побега каллусных растений с пазушной почкой размером 15 мм, с последующим их культивированием на среде Мурасиге-Скуга без гормонов. На поверхность среды, после высадки микрочеренков, добавляли по 250 мкл раствора бактериальных метаболитов (50 мкг по пептидным комплексам). В контрольном варианте, в том же объеме, добавляли отфильтрованный смыв с поверхности питательного агара для культивирования микроорганизмов. Оценка результатов эксперимента проводилась через 10, 20 и 30 суток. Критериями оценки являлись морфометрические показатели меристемной культуры Solanum tuberosum: общая масса и длина корней, а так же площадь корневой системы и листовой поверхности.
Статистический обсчет материала проводился согласно международным требованиям, предъявляемым к обработке результатов данных научных исследований, при помощи программы для персональных компьютеров «SPSS 11,5 for Windows».
По сравнению с контрольной группой меристемных растений на всех этапах оценки в динамике эксперимента меристемные растения предварительно обработанные раствором метаболитами штамма бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 обладали статистически достоверно (р<0,05) более высокими значениями общей массы и длины корней, а так же площадью корневой системы и листовой поверхности. Данные факты однозначно указывают на способность метаболитов штамма бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 в лабораторных условиях стимулировать, при предварительной обработке их раствором, рост меристемной культуры Solanum tuberosum.
Технико-экономическая эффективность предлагаемого технического решения, обусловлена ускорением роста общей массы и длины корней, а так же площади корневой системы и листовой поверхности меристемной
культуры Solanum tuberosum, что безусловно существенно сокращает сроки ее производства и увеличивает его экономическую эффективность.
Источники информации
1. Патент РФ №2005113784/13, 05.05.2005. Иванов А.А., Темнова О.В., Быкова Н.В., Орлова Н. А. Штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от болезней // Патент России №2284353. 2006. Бюл. №27.
2. Патент РФ №2012151104/10, 29.11.2012. Чеботарь В.К., Михеева М.А., Чижевская Е.П., Щербаков А.В., Петров В.Б, Быкова Н.В., Орлова Н.A., Темнова О.В. Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов // Патент России №2495119. 2013. Бюл. №28.
3. Патент РФ №2013136149/10, 01.08.2013. Чеботарь В.К., Ерофеев С.B., Щербаков А.В., Чижевская Е.П. Штамм бактерий Bacillus pumillus А 1.5, в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами // Патент России №2551968. 2015. Бюл. №16.
4. Патент РФ №2016114388, 13.04.2016. Субботин А.М, Нарушко М.В., Петров С.А., Симонова Е.О., Доманская О.В. Штамм микроорганизма Bacillus cereus 875 TS в качестве средства повышения продуктивности растений // Патент России №2624032. 2017. Бюл. №19.