Способ идентификации клеток крови
METHOD FOR IDENTIFICATION OF BLOOD CELLS

Изобретение относится к медицине и биологическим исследованиям, в частности, к лабораторной диагностике и может быть использовано для обнаружения и идентификации клеток крови с использованием мультиспектральной микроскопии.
Известен способ, примером реализации которого является использование устройства [US 6690466, 02.08.2001г.] включающего предметный столик, осветитель, содержащий несколько источников излучения, и оптическую систему доставки излучения этих источников до оптической поверхности предметного столика, оптическую систему формирования изображения, электронный приемник изображения, расположенный так, что его приемная площадка через оптическую систему формирования изображения оптически сопряжена с оптической поверхностью предметного столика, а также блок управления и обработки изображения, электрически соединенный с электронным приемником изображения и источниками излучения. В качестве осветителя в устройстве использована спектральная проекционная система, а источниками излучения являются светодиоды, способные излучать свет в различных спектральных диапазонах.
Недостатком этого способа является относительно узкая область применения, не позволяющая, в частности, осуществлять идентификацию клеток крови на основании нативных образцов.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ регистрации изображения с помощью устройства для проведения микроскопии [RU 65495, C12Q 1/00, 05.03.2007г.], содержащего оптический микроскоп с тринокулярным тубусом, предметный столик, широкополосный осветитель, установленную на тринокулярном тубусе цифровую видеокамеру, соединенный с ней компьютер, программный блок управления, и состоящий в том, что исследуемый препарат размещают на оптической поверхности предметного столика, освещают исследуемый препарат излучением осветителя, формируют изображение исследуемого предмета на приемной площадке электронного приемника изображения, преобразуют электрические сигналы с выхода электронного приемника изображения в массив цифровых данных изображения исследуемого препарата с выводом на монитор компьютера, реализация перечисленных выше операцией обеспечивается соответствующим программным обеспечением.
Особенностью данного способа является то, что в устройстве используется предметный столик с автоматизированным управлением, цифровая камера с прямым подключением к монитору компьютера, на неимерсионном объективе исследуется окрашенный мазок крови, который разбивают на отдельные поля зрения, вводят их в память управляющего компьютера в виде серии цифровых кадров, которые анализируют, идентифицируют, статистически обрабатывают и сохраняют в базе данных компьютера.
Недостатком наиболее близкого технического решения является относительно узкая область применения, не позволяющая, в частности, осуществлять идентификацию клеток крови на основании нативных образцов. Способ предназначен для исследований только окрашенных мазков крови, что значительно увеличивает время подготовки пробы к анализу,  снижает точность идентификации и не позволяет производить счет и анализ значительного количества клеток образца из-за ограниченных возможностей при приготовлении мазков – проб.
Задачей, которая решается в изобретении, является расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации и счета клеток и расширении на этой основе области применения способа путем обеспечения возможности его применения, в том числе, и для нативных образцов.
Требуемый технический результат заключается в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации и счета клеток крови и расширении на этой основе области применения способа путем обеспечения возможности его применения для нативных образцов, что повышает точность и оперативность идентификации.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается  тем, что, исследуемый препарат  размещают на оптической поверхности предметного столика, освещают его излучением осветителя и проводят микроскопию исследуемого препарата, для чего формируют изображение исследуемого препарата на приемной площадке электронного приемника изображения и преобразуют электрические сигналы с выхода электронного приемника изображения в массив цифровых данных изображения исследуемого препарата, согласно изобретению,  микроскопию исследуемого препарата проводят вначале при длине волны излучения осветителя, равной 240 нм, и определяют границы клеток исследуемого препарата, а затем проводят  микроскопию исследуемого препарата при длине волны излучения осветителя, равной 280 нм и 260 нм и получают по два изображения клеток, одно из которых в пределах границ клеток вычитают из другого для определения оптической плотности клеток, которое коррелирует с содержанием в них белков и нуклеиновых кислот, и проводят идентификацию клеток исследуемого препарата.
На чертеже представлены:
на фиг. 1 – функциональная схема устройства для реализации заявленного способа;
на фиг. 2 – изображение клеток препарата при длине волны излучения осветителя 240нм.
на фиг. 3 – изображение клеток препарата при длине волны излучения осветителя 260нм.
на фиг. 4 – изображение клеток препарата при длине волны излучения осветителя 280нм.
на фиг. 5 – результат послойного вычитания  изображений.
Устройство для реализации заявленного способа содержит источник 1 монохроматического излучения, фокусирующий и модулирующий блок 2, исследуемый препарат 3, размещенный на оптической поверхности предметного столика, мультиспектральный регистратор 4 с функцией получения электронного изображения клеток, блок 5 идентификации клеток с функцией обработки электронного изображения клеток.
Предложенный способ идентификации клеток крови реализуется следующим образом.
На фиг. 1 представлена функциональная схема устройства для реализации заявленного способа, где источник 1 монохроматического излучения позволяет проводить исследование в диапазоне волн 215 – 900нм.
Вначале проводят микроскопию исследуемого препарата 3, размещенного на оптической поверхности предметного столика, при длине волны 240 нм. Это позволяет точно определить границы отдельных клеток, так как все основные составляющие клетки (липиды, белки и нуклеиновые кислоты) имеют значительное поглощение на используемой длине волны. В результате можно наблюдать контрастное изображение клетки целиком (фиг. 2).
Затем получают ряд изображений с изменяющейся яркостью источника монохроматического излучения на длинах волн 280 нм и 260 нм. Так как нуклеиновые кислоты имеют максимум поглощения при 260 нм, а белки при 280 нм., то вычитая одно изображение из другого (или используя нормированные усредненные изображения) находим распределение оптической плотности, которое коррелирует с содержанием белков и нуклеиновых кислот. В результате получаем изображение (фиг. 5), на котором хорошо видно распределение нуклеиновых кислот в клетке и белков.  Распределение нуклеиновых кислот в первом приближении соответствует форме ядра клетки, белков – гранулам. По изображению клетки, с хорошо видимым ядром и гранулами легко идентифицировать тип клетки крови. Это позволяет их идентифицировать.
Дальнейший анализ формы и распределения ДНК и белков в клетке позволяет определить размеры и формы ядра клетки и с помощью, например, нейросетевых алгоритмов, обученных на образцовых снимках произвести идентификацию того или иного типа клеток.
Для некоторых иных типов клеток возможно использование дополнительной длины волны для регистрации. Например, для эритроцита это может быть диапазон длин волн 520-550 нм, при которой максимальное поглощение света имеет белок гемоглобин – основной белок в составе эритроцита.
Дополнительным эффектом микроскопии в ультрафиолетовом диапазоне волн, помимо возможности идентификации клеток непосредственно в испытываемом образце без предварительной процедуры окрашивания, является значительно более высокое достижимое разрешение изображения. В общем случае для микроскопии проходящего света разрешение двух точек изображения ограничено расстоянием равным половине длины волны света, в котором проводится наблюдение. Так для видимого диапазона волн 400-500нм. Минимально различимые компоненты составляют 200-250нм. Для длины волны 260-280 нм. минимально различимые компоненты составляют уже 130-140нм, что улучшает разрешение микроскопического снимка в 2 раза по сравнению с обычной микроскопией в видимом свете.
Таким образом, благодаря предложенным усовершенствованиям достигается требуемый технический результат, заключающийся в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации и счета клеток и расширении на этой основе области применения способа путем обеспечения возможности его применения для нативных образцов.