Устройство для иммунохроматографической экспрессной внелабораторной диагностики заболевания винограда, вызываемого вирусом скручивания листьев

Полезная модель относится к диагностике вирусных и бактериальных патогенов растений и может быть использована для экспрессной внелабораторной диагностики заболевания винограда, вызываемого вирусом скручивания листьев серотипа 3 (ВСЛВ-3).
Устройство предназначено для иммунохроматографической экспрессной внелабораторной диагностики приоритетного заболевания винограда, вызываемого ВСЛВ-3.
Вирусные болезни винограда - одна из основных угроз при возделывании этой культуры. Виноградники поражает более 60 видов патогенов вирусной природы. Дополнительные риски заражения виноградников обусловлены тем, что виноград является многолетней вегетативно размножаемой культурой. В связи с этим в течение всего срока эксплуатации виноградников происходит накопление патогенов в результате поражения насекомыми-переносчиками, с посадочным материалом при закладке новых виноградников или при прививке, механического распространения вирусов через воду и почву.
Вирусное заболевание скручивание листьев винограда приводит к снижению урожайности на 15-40%. Вирусы скручивание листьев винограда включены в перечень контролируемых патогенов винограда Европейской и Средиземноморской организацией по карантину и защите растений (European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO). Возбудителями этого заболевания являются вирусы семейства Closteroviridae, часто совместно поражающие растения. На территории РФ представлены преимущественно вирусы скручивания листьев серотипов 1 и 3. ВСЛВ-3 относиться к роду Ampelovirus, семейства Closteroviridae. Частицы ВСЛВ-3 представляют собой нитевидные структуры длиной 1800 и диаметром 12 нм со спиральным расположением повторяющихся белковых субъединиц (10 субъединиц на один оборот спирали, шаг спирали 3,5 нм).
Пораженные ВСЛВ растения отстают в росте. У них уменьшается площадь листовой поверхности, развиваются слабые побеги, что приводит к снижению продолжительности их жизни и урожайности. У пораженного растения изменяется окраска листьев. Из-за отсутствия в них хлорофилла снижается фотосинтетическая активность, в результате чего содержание Сахаров в ягодах уменьшается на 30%. Ягоды становятся мельче, время их созревания увеличивается на 3-4 недели, что приводит к снижению товарной ценности столовых сортов винограда, которые используются для употребления в свежем виде, в производстве изюма и вина. Потери урожая при поражении ВСЛВ зависят от сорта, подвоя, наличия смешанной инфекции, от климатических и почвенных условий и составляют от 20 до 40% ежегодно.
Традиционные подходы к диагностике заболевания винограда основаны на визуальном определении симптомов. Однако вирусные заболевания очень вариабельны по внешней симптоматике, а также могут проходить бессимптомно. Успешное решение задач по контролю вирусных инфекций возможно только с использованием иммунодиагностических подходов, основанных на специфических взаимодействиях антиген - антитело, и молекулярных методов диагностики, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Среди иммунодиагностических методов доминирует иммуноферментный анализ, молекулярно-генетических методов - ПЦР с обратной транскрипцией и количественная ПЦР с обратной транскрипцией. Эти методы характеризуются трудоемкостью, методической сложностью, необходимостью значительных расходов на реагенты и приборное обеспечение, потребностью в квалифицированном персонале и могут быть реализованы только в лабораторных условиях.
Простой формой иммунохимического анализа является иммунохроматографический анализ (ИХА), который обнаруживает присутствие антигена (вируса) в соке (водном экстракте) растения за 10-15 минут.ИХА основан на движении жидкой пробы вдоль мембраны, которое приводит к образованию на разных участках мембраны специфических иммунных комплексов. Конъюгированный со специфическими антителами окрашенный маркер (коллоидное золота) распределяется по мембране, и его наличие в определенных участках по окончании анализа является основанием для вывода о полученных результатах. Использование ИХА для детекции фитопатогенов обеспечивает достижение ряда преимуществ - проведение эффективной диагностики во внелабораторных условиях, экспрессность проведения анализа при минимальной пробоподготовке, проведение анализа в одну стадию без необходимости в дополнительных реагентах и манипуляциях и простоту детектирования и интерпретации результатов анализа.
Несмотря на то, что ИХА активно разрабатывается и применяется для диагностики вирусных и бактериальных патогенов растений, в литературе нет описаний разработки иммунохроматографических тест-системы для диагностики вирусов винограда.
Наиболее близким аналогом является иммунохроматографическая тест-система «GLRaV-3 AgriStrip-magnetio) фирмы Bioreba, Швейцария (http://www.cultek.com/inf/otros/perfil-proveedores/Perfil%20Bioreba/GLRaV3/Bioreba_GLRaV_AgriStrip_magnetic_e_V2.pdf), основанная на реакции антиген-антитело в сочетании с магнитным концентрированием.
Тест-система «GLRaV-3 AgriStrip-magnetic» представляет собой набор, включающий
тест-полоску с нанесенными иммунореагентами,
пробирку с суспензией магнитных частиц (МЧ) с иммобилизованными на них специфичными к ВСЛВ-3 моноклональными антителами,
буферы для экстракции образца и проведения анализа,
пакет для растирания образца и
пипетку.
Тест-полоска «GLRaV-3 AgriStrip-magnetic» представляет собой мультимембранный композит, который состоит из
рабочей мембраны на твердой основе с нанесенными в контрольную зону поликлональными антимышиными антителами и нанесенными в аналитическую зону специфичными к ВСЛВ-3 моноклональными антителами;
мембраны для впитывания и сепарации исследуемого образца;
конечной адсорбирующей мембраны для впитывания компонентов образца после прохождения реакции.
Анализ проводят следующим образом.
1. Гомогенизируют образец ткани виноградной лозы (зрелые осенние листья или соскобы коры во время покоя) в течение 5-7 секунд в экстрагирующем буфере («Extraction Buffer Grapevine» фирмы Bioreba) в пропорции 1:30 (мас./об.).
2. Экстракт переносят в пробирку, содержащую конъюгат МЧ со специфичными к ВСЛВ-3 моноклональными антителами, и инкубируют в течение 7 мин.
3. Осаждают образовавшиеся комплексы МЧ-антитела-вирус с помощью магнита в течение 3 мин на стенки пробирки.
4. Удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют комплексы МЧ-антитела-вирус в буфере.
5. Помещают тест-полоску в ресуспендированный образец и проводят анализ в течение 10-20 мин.
Интерпретация результатов анализа.
1. Если через 10-20 мин на тест-полоске образуется две линии, окрашенные в желтый цвет, то результат анализа считается положительным, т.е. в образце содержится ВСЛВ-3.
2. Если через 10-20 мин на тест-полоске образуется одна желтая линия (контрольная), то результат анализа считается отрицательным, т.е. в образце не содержится ВСЛВ-3 или его концентрация ниже предела обнаружения.
3. Если через 10-20 мин на тест-полоске не образуется ни одной окрашенной линии, то результат анализа считается недействительным.
Суммарное время анализа тест-системы «GLRaV-3 AgriStrip-magnetic» составляет 20-30 мин без подготовки пробы, что в 2-3 раза дольше, чем в предлагаемой нами полезной модели тест-системы. Также анализ с использованием тест-системы «GLRaV-3 AgriStrip-magnetic» предполагает стадию магнитной сепарации, что технически усложняет анализ по сравнению с анализом с использованием предлагаемой нами полезной модели. Технической задачей заявленной полезной модели является упрощение процедуры анализа.
Технический результат заявленной полезной модели состоит в уменьшении времени анализа.
Предлагается устройство для иммунохроматографической экспрессной внелабораторной диагностики заболевания винограда, вызываемого ВСЛВ-3. Устройство представляет собой мультимембранный композит с нанесенными иммунореагентами (тест-полоску). Мультимембранный композит состоит из рабочей нитроцеллюлозной мембраны на твердой основе с нанесенными иммунореагентами, стекловолоконной мембраны с нанесенными иммунореагентами, мембраны для впитывания и сепарации исследуемого образца и конечной адсорбирующей мембраны для впитывания компонентов образца после прохождения реакции.
Указанный технический результат достигается тем, что
в контрольную зону (К.З.) нанесена смесь поликлональных козьих антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши и кролика;
в аналитическую зону (А.З.) нанесена смесь моноклональных мышиных и поликлональных кроличьих антител, специфичных к ВСЛВ-3;
на стекловолоконную мембрану нанесен конъюгат смеси моноклональных мышиных и поликлональных кроличьих антител, специфичных к ВСЛВ-3, с коллоидным золотом.
На прилагаемом чертеже (рис. 1) представлено заявляемое устройство, где 1 - твердая основа рабочей мембраны из полистирола, 2 - рабочая нитроцеллюлозная мембрана, 3 -конечная адсорбирующая мембрана для впитывания компонентов образца после прохождения реакции, 4 - стекловолоконная мембрана с нанесенным и высушенным конъюгатом смеси моноклональных мышиных и поликлональных кроличьих антител, специфичных к ВСЛВ-3, с коллоидным золотом, 5 - мембрана для впитывания и сепарации исследуемого образца, А - К.З. с нанесенной смесью поликлональных козьих антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши и кролика, Б - А.З. с нанесенной смесью моноклональных мышиных и поликлональных кроличьих антител, специфичных к ВСЛВ-3.
В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы заявляемого устройства.
Анализ проводят следующим образом.
1. Гомогенизируют образец ткани виноградной лозы (зрелые осенние листья или соскобы коры во время покоя) в течение 10-12 с в экстрагирующем буфере (0,2 М трис-буфер, рН 8,2, содержащий 0,8% хлорида натрия, 2,0% поливинилпиролидона PVP-25, 1,0% полиэтиленгликоля, 0,05% твина 20 и 0,02% азида натрия) в пропорции 1:10 (мас./об.). 2.100-120 мкл жидкого экстракта переносят в пробирку.
3. Тест-полоску погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5-0,6 см в жидкий экстракт и инкубируют при комнатной температуре в течение 1-1,5 мин.
4. Вынимают тест-полоску и помещают ее на сухую горизонтальную поверхность на 8,5-9 мин.
5. Через 10 мин после начала движения жидкости по тест-полоске результат анализа фиксируют визуально или с использованием детектора с видеоцифровой регистрацией. Заявляемое устройство функционирует следующим образом:
Если в образце присутствует ВСЛВ-3, то он с потоком жидкости перемещается по впитывающей мембране (5), доходит до стекловолоконной мембраны (4) и реагирует с конъюгатом коллоидного золота с антителами, специфичными к ВСЛВ-3, с образованием двойного окрашенного комплекса антиген-антитела, меченные коллоидным золотом. Образовавшийся двойной окрашенный комплекс под действием капиллярных сил движется вдоль рабочей нитроцеллюлозной мембраны (2) и взаимодействует с иммобилизованными в А.З. (Б) антителами, специфичными к ВСЛВ-3, с образованием тройного комплекса антитела-антиген-антитела, меченные коллоидным золотом. Избыток не связавшегося двойного окрашенного комплекса продолжает двигаться вдоль рабочей нитроцеллюлозной мембраны (2) и взаимодействует с антивидовыми антителами, иммобилизованными в К.З. (А), с образованием двойного комплекса антивидовые антитела-антитела, меченные коллоидным золотом. Результат анализа интерпретируют следующим образом.
1. Если через 10 мин на тест-полоске образуется две линии, окрашенные в красный цвет (А.З., Б, и К.З., А), то результат анализа считается положительным, т.е. в образце содержится ВСЛВ-3.
2. Если через 10 мин на тест-полоске образуется одна красная линия (К.З., А), то результат анализа считается отрицательным, т.е. в образце не содержится ВСЛВ-3 или его концентрация ниже предела обнаружения.
3. Если через 10 мин на тест-полоске не образуется ни одной окрашенной линии или образуется одна красная линия (А.З., Б), то результат анализа считается недействительным.
Эффективность данного подхода подтверждается следующим представленным ниже примером:
Пример (исследование времени получения положительного результата анализа с использованием заявляемого устройства).
С использованием заявляемого устройства проводят анализ экстракта ткани виноградной лозы, содержащего ВСЛВ-3. 100 мкл экстракта вносят в пробирку. Заявляемое устройство (тест-полоску) погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5 см в жидкий экстракт и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин. Вынимают тест-полоску и помещают ее в паз выдвижной каретки детектирующего устройства для видеоцифровой регистрации. Результат анализа оценивают через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 с помощью программного обеспечения видеоцифрового детектора. Время анализа контролируют с помощью секундомера. Анализ проводят в пяти повторностях, используя тест-полоски пяти разных серий (полоски №№1-5). Результаты анализа приведены в таблице 2. Интенсивности окрашивания зон связывания нормированы на среднее значение, полученное через 10-15 мин после начала анализа.
Из приведенных экспериментальных данных видно, что через 10 мин после начала анализа интенсивности окрашивания зон связывания достигают 99,0-101,0% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут, т.е. время анализа с использованием заявленного устройства составляет 10 мин.
Краткое описание чертежей
На рис. 1 изображена схема устройства для иммунохроматографической экспрессной внелабораторной диагностики заболевания винограда, вызываемого ВСЛВ-3. 1 - твердая основа рабочей мембраны из полистирола; 2 - рабочая нитроцеллюлозная мембрана; 3 -конечная адсорбирующая мембрана для впитывания компонентов образца после прохождения реакции; 4 - стекловолоконная мембрана с нанесенным и высушенным конъюгатом коллоидныго золота со смесью моноклональных мышиных и поликлональных кроличьих антител, специфичных к ВСЛВ-3; 5 - мембрана для впитывания и сепарации исследуемого образца; А - К.З. с нанесенной смесью поликлональных козьих антител, специфичных к иммуноглобулинам мыши и кролика, Б - А.З. с нанесенной смесью моноклональных мышиных и поликлональных кроличьих антител, специфичных к ВСЛВ-3.