СЕЛЕКТИВНОЕ СУЛЬФИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗОДИАЗЕПИНА

1. Способ получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, включающий стадии:
(a) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 1,9 до 5,0 с образованием модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью; и
(b) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент,
где D представляет собой иминсодержащее бензодиазепиновое соединение; и L является линкером.
2. Способ по п. 1, где D представляет собой иминсодержащий индолинобензодиазепин.
3. Способ по п. 1 или 2, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 2,9 до 4,0.
4. Способ по п. 1 или 2, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 2,9 до 3,7.
5. Способ по п. 1 или 2, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 3,1 до 3,5.
6. Способ по п. 1 или 2, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 3,2 до 3,4.
7. Способ по п. 1 или 2, где реакцию на стадии (а) проводят при рН 3,3.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где реакцию на стадии (а) проводят в присутствии буферного раствора.
9. Способ по п. 8, где буферный раствор представляет собой цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер.
10. Способ по п. 8, где буферный раствор представляет собой сукцинатный буфер.
11. Способ по любому из пп. 1-7, где реакцию на стадии (а) проводят в отсутствие буферного раствора.
12. Способ получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, включающий стадии:
(a) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе в отсутствие буфера для образования модифицированного цитотоксического агента, содержащего модифицированный иминный фрагмент, представленный следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью; и
(b) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента со связывающим клетки агентом с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент,
где D представляет собой иминсодержащее бензодиазепиновое соединение; и L является линкером.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где от 0,5 до 5 эквивалентов соли бисульфита или от 0,25 до 2,5 эквивалентов соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
14. Способ по п. 13, где от 0,8 до 2,0 эквивалентов соли бисульфита или от 0,4 до 1,0 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
15. Способ по п. 13, где от 1,1 до 1,6 эквивалентов соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
16. Способ по п. 13, где 1,4 эквивалента соли бисульфита или 0,7 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
17. Способ по п. 1 или 2, где реакцию стадии (а) проводят при рН от 2,9 до 3,7 и от 1,0 до 1,8 эквивалента соли бисульфита или от 0,5 до 0,9 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
18. Способ по п. 1 или 2, где реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,1 до 3,5 и от 1,1 до 1,6 эквивалента соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
19. Способ по п. 1 или 2, где реакцию на стадии (а) проводят при рН 3,3 и 1,4 эквивалента бисульфитной соли или 0,7 эквивалента метабисульфитной соли приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где реакцию стадии (а) проводят в смеси органического растворителя и воды.
21. Способ по п. 20, где реакцию стадии (а) проводят в смеси диметилацетамида (ДМА) и воды.
22. Способ по п. 20, где реакцию стадии (а) проводят в смеси ДМА и воды, где объемное соотношение ДМА и воды составляет 1:1.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где реакцию стадии (а) проводят в течение от 1 минуты до 48 часов.
24. Способ по п. 23, где реакцию на стадии (а) проводят в течение от 1 часа до 10 часов.
25. Способ по п. 24, где реакцию на стадии (а) проводят в течение от 1 часа до 4 часов.
26. Способ по любому из пп. 1-25, где на стадии (а) иминсодержащий цитотоксический агент приводят в реакцию с бисульфитом натрия.
27. Способ по любому из пп. 1-25, где на стадии (а) иминсодержащий цитотоксический агент приводят в реакцию с метабисульфитом натрия.
28. Способ по любому из пп. 1-27, где модифицированный цитотоксический агент не очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (b).
29. Способ по любому из пп. 1-27, где модифицированный цитотоксический агент очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (b).
30. Способ по любому из пп. 1-29, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 4 до 9.
31. Способ по п. 30, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 5 до 8,5.
32. Способ по п. 30, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 5,5 до 6,5.
33. Способ по любому из пп. 1-32, где конъюгат очищают фильтрацией в тангенциальном потоке с получением очищенного конъюгата.
34. Способ по п. 33, где очищенный конъюгат готовят в буфере для состава, содержащем бисульфитную соль.
35. Способ по п. 34, где буфер для состава содержит от 10 до 200 мкМ бисульфита натрия.
36. Способ по п. 33, где буфер для состава содержит от 40 до 80 мкМ бисульфита натрия.
37. Способ по п. 33, где буфер для состава содержит 50 мкМ бисульфита натрия.
38. Способ по любому из пп. 34-37, где буфер для состава имеет рН от 4 до 5.
39. Способ по п. 38, где буфер для состава имеет рН 4,2.
40. Способ по любому из пп. 1-39, где D представляет собой иминсодержащее соединение индолинобензодиазепина.
41. Способ по любому из пп. 1-40, где D представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
один из L', L'' и L''' представлен следующей формулой:
2
2
n
2
2
2
3
3
2
c
а два других каждый независимо выбраны из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -OR, -NR'R'', -NO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SOR', -SOH, -OSOH, -SONR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R';
1
2
5
один из Z и Z представляет собой -С(=O)-, а другой представляет собой -NR-;
1
P представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;
x1
R представляет собой необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;
e
k
k
101
101
102
101
102
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(СН-СН-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино-(например, -NHR) или третичную амино- (-NRR) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R и R каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;
2
2
n
c
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
2
2
2
n
c
R' и R'' каждый независимо выбран из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
c
R представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода;
n представляет собой целое число от 1 до 24;
1
2
2
n
c
X' выбран из -Н, аминозащитной группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(СНСНО)-R, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
1
Y' выбран из -Н, оксогруппы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов;
1
2
3
4
1
2
3
4
2
2
n
2
2
2
3
3
2
c
-
R, R, R, R, R', R', R' и R' каждый независимо выбран из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -OR, -NR'R'', -NO, -NCO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SOR', -SOH, -OSOH, -SONR'R'', пиано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R'';
6
2
R представляет собой -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO или галоген;
G представляет собой -CH- или N-;
5
5
А и А' являются одинаковыми или различными и независимо выбраны из -О-, оксо(-С(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR и -CRR'N(R)-; и
5
R в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода.
42. Способ по п. 41, где D представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
1
6
2
43. Способ по п. 41 или 42, где один из L', L'' и L''' представлен формулой (А') или (D'), а другие представляют собой -Н, линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, галоген, -ОН, (С-С)алкокси или -NO.
44. Способ по п. 43, где L' представлен формулой (A'); a L'' и L''' оба представляют собой -Н.
45. Способ по п. 43, где L' представлен формулой (D'); a L'' и L''' оба представляют собой -Н.
x1
3
1
3
1
3
1
3
46. Способ по любому из пп. 41-45, где R представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, -SOH, (С-С)алкилом, (С-С)алкокси, галоген(С-С)алкилом, или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q.
47. Способ по любому из пп. 43-46, где L' представлен следующей формулой:
где:
a
b
1
3
каждый из R и R в каждом случае независимо представляет собой -Н, (С-С)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;
s представляет собой целое число от 1 до 6;
s1' представляет собой 0 или целое число от 1 до 6; и
1
3
1
3
1
3
Су представляет собой циклический алкил с 5 или 6 кольцевыми атомами углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, (С-С)алкилом, (С-С)алкокси или галоген(С-С)алкилом.
a
b
5
48. Способ по п. 47, где R и R оба представляют собой Н; Су в формулах (В2') и (С2') представляет собой циклогексан; и R представляет собой Н или Me.
49. Способ по п. 47 или 48, где s1' равен 0 или 1.
3
3
3
2
3
2
3
2
3
2
2
2
11
12
11
12
14
15
16
14
15
16
14
16
+
-
+
-
-
50. Способ по любому из пп. 41-49, где заряженный заместитель или ионизируемая группа Q представляют собой i) -SOH, -Z'-SOH, -ОРОН, -Z'-OPOH, -РОН, -Z'-POH, -СОН, -Z'-COH, -NRR или -Z'-NRR или их фармацевтически приемлемую соль; или ii) -NRRRX или -Z'-NRRRX; Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен, необязательно замещенный циклоалкилен или необязательно замещенный фенилен; каждый из R-R независимо представляет собой необязательно замещенный алкил; а X представляет собой фармацевтически приемлемый анион.
3
51. Способ по п. 50, где Q представляет собой -SOH или ее фармацевтически приемлемую соль.
1
52. Способ по любому из пп. 41-51, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков.
1
53. Способ по п. 52, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
1
9
9
54. Способ по п. 53, где P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe и Gln-Ala.
1
55. Способ по п. 54, где P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.
1
1
56. Способ по любому из пп. 41-55, где X' выбран из группы, состоящей из -Н, -ОН, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, и фенила; и Y' выбран из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода.
1
1
3
1
3
1
1
3
1
3
57. Способ по п. 56, где X' представляет собой -Н, -ОН, (С-С)алкил, галоген(С-С)алкил или фенил; и Y' представляет собой -Н, оксогруппу, (С-С)алкил или галоген(С-С)алкил.
1
1
58. Способ по п. 56, где X' представляет собой -Н, -ОН или Me; и Y' представляет собой -Н или оксо.
1
1
59. Способ по п. 56, где X' представляет собой -Н; и Y' представляет собой -Н.
60. Способ по любому из пп. 41-59, где А и А' являются одинаковыми или разными и выбраны из -О- и -S-.
61. Способ по п. 60, где А и А' представляют собой -О-.
6
62. Способ по любому из пп. 41-61, где R представляет собой -ОМе.
1
2
3
4
1
2
3
4
2
1
3
1
3
1
3
63. Способ по любому из пп. 41-62, где R, R, R, R, R', R', R' и R' независимо представляют собой -Н, галоген, -NO, -ОН, (C-С)алкил, галоген(С-С)алкил или (С-С)алкокси.
1
2
3
4
1
2
3
4
64. Способ по п. 63, где R, R, R, R, R', R', R' и R' все представляют собой -Н.
5
1
3
65. Способ по любому из пп. 41-64, где каждый из R, R', R'' и R независимо представляет собой -Н или (С-С)алкил.
66. Способ по любому из пп. 41-55, где:
1
2
3
4
1
2
3
4
R, R, R, R, R', R', R' и R' все представляют собой -Н;
6
R представляет собой -ОМе;
1
1
X' и Y' оба представляют собой -Н; и
А и А' представляют собой -О-.
67. Способ по п. 41, где D представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
68. Способ по любому из пп. 1-67, где -L- представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
23
24
R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;
m' представляет собой целое число от 0 до 10; и
h'
R представляет собой Н или необязательно замещенный алкил.
23
24
69. Способ по п. 68, где R и R оба представляют собой Н; и m' представляет собой целое число от 1 до 6.
h'
70. Способ по п. 68 или 69, где R представляет собой Н.
71. Способ по п. 68, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
72. Способ по любому из пп. 1-40, где иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, а модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
73. Способ по п. 72, где модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или их натриевой или калиевой солью.
74. Способ по п. 73, где модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:
75. Способ по любому из пп. 1-40, где D представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
X' выбран из группы, состоящей из -Н, -ОН, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, фенила и аминозащитной группы;
Y' выбран из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;
А и А' выбраны из -О- и -S-;
e
e
e
e
2
2
W' отсутствует или выбран из -О-, -N(R)-, -N(R)-C(=O)-, -N(C(=O)R)-, -S- или -CH-S-, -CHNR-;
x
R отсутствует или выбран из линейного, разветвленного или циклического алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;
e
k
k
101
101
102
101
102
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH-CH-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино- (например, -NHR) или третичную амино- (-NRR) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R и R каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;
n представляет собой целое число от 1 до 24;
G выбран из -СН- или -N-;
6
2
R представляет собой -Н, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO или галоген; и
2
2
n
c
c
R представляет собой -Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CHCHO)-R, где n представляет собой целое число от 1 до 24, и R представляет собой линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;
g'
c
g'
c
2
2
n
2
2
n
R' и R' каждый независимо выбран из -Н, -ОН, -OR, -NRR, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из О, S, N и Р, группы ПЭГ -(CHCHO)-R, a R представляет собой -Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CHCHO)-R.
76. Способ по п. 75, где D представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
77. Способ по п. 75 или 76, где:
X' и Y' оба представляют собой -Н;
А и А' оба представляют собой -О-;
6
R представляет собой -ОМе;
e
e
W' представляет собой -N(R)- или -N(R)-C(=O)-;
e
k
k
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода или -(CH-CH-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;
n представляет собой целое число от 2 до 6; и
x
R представляет собой линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода.
78. Способ по п. 75, где D представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
79. Способ по любому из пп. 75-78, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D, a s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
10
11
q
Е представляет собой -(CRR)-, циклоалкил или циклоалкилалкил;
2
9
9
2
9
9
9
2
2
p
9
2
2
р
2
2
p
9
2
2
p
9
Z отсутствует, представляет собой -SONR-, -NRSO-, -C(=O)-NR-, -NR-С(=O)-, -С(=O)-O-, -O-С(=O)-, -C(=O)-NR-(CHCHO)-, -NR-С(=O)-(CHCHO)-, -(OCHCH)-C(=O)NR- или -(OCHCH)-NR-C(=O)-;
р представляет собой целое число от 1 до 24;
Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;
9
10
11
12
13
R, R, R, R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил; и
q и r в каждом случае независимо представляет собой целое число от 0 до 10.
10
11
q
80. Способ по п. 79, где Е представляет собой -(CRR)-.
81. Способ по п. 79, где Е представляет собой
9
9
82. Способ по любому из пп. 79-81, где Z представляет собой -C(=O)-NR- или -NR-C(=O)-.
9
83. Способ по п. 82, где R представляет собой -Н.
84. Способ по любому из пп. 79-83, где Q представляет собой:
i) Н;
3
3
3
2
3
2
3
2
3
2
2
2
11
12
14
15
ii) -SOH, -Z'-SOH, -ОРОН, -Z'-OPOH, -РОН, -Z'-POH, -СОН, -Z'-СОН, -NRR или -Z'-NRR, или их фармацевтически приемлемую соль; или
+
-
+
-
14
15
16
14
15
16
iii) -NRRRX или -Z'-NRRRX;
Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен, необязательно замещенный циклоалкилен или необязательно замещенный фенилен;
14
15
16
R, R и R каждый независимо представляют собой необязательно замещенный алкил; и
-
X представляет собой фармацевтически приемлемый анион.
3
85. Способ по п. 84, где Q представляет собой Н или -SOH или ее фармацевтически приемлемую соль.
9
10
11
12
13
86. Способ по любому из пп. 78-85, где R, R, R, R и R все представляют собой Н; и q и r каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6.
87. Способ по п. 79, где:
12
13
1
3
каждый R и R в каждом случае независимо представляет собой Н или (С-С)алкил;
3
Q представляет собой Н или -SOH или ее фармацевтически приемлемую соль;
9
9
Z представляет собой -C(=O)-NR- или -NR-C(=O)-;
9
1
3
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
10
11
q
Е представляет собой -(CRR)-.
10
11
1
3
R и R, в каждом случае независимо представляют собой Н или (С-С)алкил; и
q и r представляют собой целые числа от 1 до 5.
88. Способ по п. 79, где L представлен любой из следующих структурных формул:
или его фармацевтически приемлемой солью.
89. Способ по любому из пп. 75-79, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
19
20
21
22
R, R, R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;
m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;
h
R представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;
L
2
2
j
P представляет собой необязательно замещенный алкилен, -(CH-CH-O)- (где атом кислорода связан с -(С=O)-группой, связанной с Р), аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков; и
j является целым числом от 1 до 24.
19
20
21
22
90. Способ по п. 89, где R, R, R и R каждый представляют собой Н; a m и n каждый независимо представляют собой целое число от 1 до 6.
L
91. Способ по п. 89 или 90, где P представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков.
L
92. Способ по п. 91, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
L
9
9
93. Способ по п. 92, где P выбран из группы, состоящей из: Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Cit-Val, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala., Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Val-Ala и β-Ala-Gly-Gly-Gly.
L
94. Способ по п. 93, где P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Val-Ala или β-Ala-Gly-Gly-Gly.
95. Способ по п. 89, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
96. Способ по любому из пп. 1-40, где иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, а модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
97. Способ по п. 96, где модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его натриевой или калиевой солью.
98. Способ по п. 97, где модифицированный цитотоксический агент представлен следующей формулой:
99. Способ по любому из пп. 1-39, где D представляет собой иминсодержащее соединение пирролобензодиазепина (ПБД).
100. Способ по п. 99, где D представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
2
2
W выбран из С=О, C=S, СН, ВН, SO и SO;
1
2
2
n
c
X' выбран из -Н, аминозащитной группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(СНСНО)-R, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
1
Y' выбран из -Н, оксогруппы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов;
6
2
R представляет собой -Н, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO или галоген;
5
5
А и А' являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из -О-, оксо (-С(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR и -CRR'N(R)-,
2
2
n
c
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
2
2
2
n
c
R' и R'' каждый независимо выбран из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
c
R представляет собой -Н или замещенный или незамещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, или связующую группу с реакционноспособной группой, связанной с ней;
n представляет собой целое число от 1 до 24;
5
R в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;
0
0
2
2
n
D и D' являются одинаковыми или разными и независимо отсутствуют или выбраны из группы, состоящей из необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, аминокислоты, пептида, содержащего от 2 до 6 аминокислот, и полиэтиленгликолевого звена (-OCHCH)-;
2
2
n
L отсутствует, представляет собой линкер, полиэтиленгликолевое звено (-ОСНСН)-, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил или алкенил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенную фенильную группу, необязательно замещенное 3-18-членное гетероциклическое кольцо или 5-18-членное гетероарильное кольцо, имеющее от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
a
a'
b
b'
a
a'
b
b'
R, R, R и R являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из группы, состоящей из -Н, галогенида или необязательно замещенного разветвленного, линейного или циклического алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода; или R и R и/или R и R вместе образуют двойную связь, содержащую группу =В и =В' соответственно;
=В и =В' являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из необязательно замещенной разветвленной или линейной алкенильной или карбонильной группы;
1
2
Q представляет собой Q-Ar-Q;
1
2
Q' представляет собой Q'-Ar'-Q';
1
1
Q и Q' каждый независимо отсутствует, представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил с 1-6 атомами углерода или -CH=СН звено;
Ar и Ar' каждый независимо отсутствует или представляют арильную группу;
2
2
2
2
n
2
2
2
3
3
2
c'
c
Q и Q' каждый независимо выбран из -Н, линкера, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -R-(OCHCH)-R или заместителя, выбранного из галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -R, -OR, -NR'R'', -NO, -NCO, -NR'COR'', NR'(C=O)OR'' -SR, сульфоксида, представленного -SOR', сульфона, представленного -SOR', сульфоната -SOM, сульфата -OSOM, сульфонамида, представленного SONR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' или -OCONR'R''; и
c'
R отсутствует или выбран из линейного, разветвленного алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 5 атомов углерода.
101. Способ по п. 100, где D выбран из одного из следующих:
или их фармацевтически приемлемой соли, где:
один из L', L'' и L''' в формуле (ПБД5), (ПБД6), (ПБД7) или (ПБД8) представлен следующей формулой:
2
2
n
2
2
2
3
3
2
c
а два других каждый независимо выбраны из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -OR, -NR'R'', -NO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SOR', -SOH, -OSOH, -SONR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R';
2
2
один из Q и Q' в формуле (ПБД9) или (ПБД10) представлен следующей формулой:
2
2
а другой выбран из -Н, -R, -OR, -NR'R '', -NO, -NR'(С=О)OR'', -SR или -NO;
1
2
5
один из Z и Z представляет собой -С(=O)-, а другой представляет собой -NR-;
1
P представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;
x1
R представляет собой необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;
e
k
k
101
101
102
101
102
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(СН-СН-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино-(например, -NHR) или третичную амино- (-NRR) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R и R каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;
c
R представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода;
5
R в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода.
a
b
R'' и R'' являются одинаковыми или разными и выбраны из -Н и -Me; и
n' выбран из 0, 1, 2 и 3.
1
6
2
2
2
1
6
2
102. Способ по п. 101, где один из L', L'' и L''' в формуле (ПБД5), (ПБД6), (ПБД7) или (ПБД8) представлен формулой (А') или (D'), а два других представляют собой -Н, линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, галоген, -ОН, (C-С)алкокси или -NO; или один из Q и Q' в формуле (ПБД9) или (ПБД10) представлен формулой (A'), (D') или (Е'); а другой представляет собой -Н, линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, галоген, -ОН, (C-С)алкокси или -NO.
103. Способ по п. 102, где:
L'' и L''' оба представляют собой -Н; a L' в формуле (ПБД5), (ПБД6), (ПБД7) или (ПБД8) представлен следующей формулой:
2
2
один из Q и Q' в формуле (ПБД9) или (ПБД10) представлен следующей формулой:
где:
a
b
1
3
каждый из R и R в каждом случае независимо представляет собой -Н, (С-С)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;
s представляет собой целое число от 1 до 6;
s1' представляет собой 0 или целое число от 1 до 6; и
1
3
1
3
1
3
Су представляет собой циклический алкил с 5 или 6 кольцевыми атомами углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, (С-С)алкилом, (С-С)алкокси или галоген(С-С)алкилом.
a
b
5
104. Способ по п. 103, где R и R оба представляют собой Н; Су в формулах (В2') и (С2') представляет собой циклогексан; R представляет собой Н или Me; и s1' представляет собой 0 или 1.
3
105. Способ по любому из пп. 101-104, где Q представляет собой -SOH или ее фармацевтически приемлемую соль.
1
106. Способ по любому из пп. 101-105, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
1
9
9
107. Способ по п. 106, где P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe и Gln-Ala.
1
108. Способ по п. 107, где P обозначает Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D- Ala-D-Ala.
109. Способ по любому из пп. 100-108, где:
6
R представляет собой -ОМе;
1
1
X' и Y' оба представляют собой -Н; и
А и А' представляют собой -О-.
110. Способ по п. 100, где D представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
111. Способ по любому из пп. 100-110, где -L- представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
23
24
R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;
m' представляет собой целое число от 0 до 10; и
h'
R представляет собой Н или необязательно замещенный алкил.
23
24
112. Способ по п. 111, где R и R оба представляют собой Н; и m' представляет собой целое число от 1 до 6.
h'
113. Способ по п. 111 или 112, где R представляет собой Н.
114. Способ по п. 113, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
115. Способ по любому из пп. 100-114, где иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
116. Способ по п. 100, где D представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
1
X' выбран из группы, состоящей из -Н, -ОН, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, фенила и защитной группы амина;
1
Y' выбран из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;
2
2
2
2
n
2
2
2
3
3
2
x
c
один из Q и Q' в формуле (ПБД15) или (ПБД16) представляет собой W'-R-S-; а другой выбран из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -OR, -NR'R'', -NO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SOR', -SOH, -OSOH, -SONR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR' и -OCONR'R'';
e
e
e
e
2
2
W' отсутствует или выбран из -О-, -N(R)-, -N(R)-C(=O)-, -N(C(=O)R)-, -S- или -CH-S-, -CHNR-;
x
R отсутствует или выбран из линейного, разветвленного или циклического алкила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода;
e
k
k
101
101
102
101
102
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или -(CH-CH-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный разветвленный циклический алкил, имеющий 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино- (например, -NHR) или третичную амино- (-NRR) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R и R каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода;
n представляет собой целое число от 1 до 24;
6
2
R представляет собой -Н, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO или галоген; и
2
2
n
c
c
R представляет собой -Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CHCHO)-R, где n представляет собой целое число от 1 до 24, и R представляет собой линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;
g'
c
g'
c
2
2
n
2
2
n
R' и R' каждый независимо выбран из -Н, -ОН, -OR, -NRR, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из О, S, N и Р, группы ПЭГ -(CHCHO)-R, a R представляет собой -Н, необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, или группу ПЭГ -(CHCHO)-R.
117. Способ по п. 116, где
1
1
X' и Y' оба представляют собой -Н;
6
R представляет собой -ОМе;
e
e
W' представляет собой -N(R)- или -N(R)-C(=O)-;
e
k
k
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода или -(CH-CH-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный или разветвленный алкил с 1-4 атомами углерода;
n представляет собой целое число от 2 до 6; и
x
R представляет собой линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода.
118. Способ по п. 116 или 117, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D, a s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
10
11
q
Е представляет собой -(CRR)-, циклоалкил или циклоалкилалкил;
2
9
9
2
9
9
9
2
2
p
9
2
2
р
2
2
p
9
2
2
p
9
Z отсутствует, представляет собой -SONR-, -NRSO-, -C(=O)-NR-, -NR-С(=O)-, -С(=O)-O-, -O-С(=O)-, -C(=O)-NR-(CHCHO)-, -NR-С(=O)-(CHCHO)-, -(OCHCH)-C(=O)NR- или -(OCHCH)-NR-C(=O)-;
р представляет собой целое число от 1 до 24;
Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;
9
10
11
12
13
R, R, R, R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил; и
q и r в каждом случае независимо представляет собой целое число от 0 до 10;
10
11
q
119. Способ по п. 118, где Е представляет собой -(CRR)-.
9
9
120. Способ по п. 118 или 119, где Z представляет собой -C(=O)-NR- или -NR-С(=O)-.
9
121. Способ по п. 120, где R представляет собой -Н.
3
122. Способ по любому из пп. 118-121, где Q представляет собой Н или -SOH или ее фармацевтически приемлемую соль.
9
10
11
12
13
123. Способ по любому из пп. 118-122, где R, R, R, R и R все представляют собой Н; и q и r каждый независимо представляет собой целое число от 1 до 6.
124. Способ по п. 118, где:
12
13
1
3
каждый R и R в каждом случае независимо представляет собой Н или (С-С)алкил;
3
Q представляет собой Н или -SOH или ее фармацевтически приемлемую соль;
9
9
Z представляет собой -C(=O)-NR- или -NR-C(=O)-;
9
1
3
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
10
11
q
Е представляет собой -(CRR)-.
10
11
1
3
R и R, в каждом случае независимо представляют собой Н или (С-С) алкил; и
q и r представляют собой целые числа от 1 до 5.
125. Способ по п. 118, где L представлен любой из следующих структурных формул:
или его фармацевтически приемлемой солью.
126. Способ по п. 116 или 117, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
19
20
21
22
R, R, R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;
m и n каждый независимо представляет собой целое число от 0 до 10;
h
R представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;
L
2
2
j
P представляет собой необязательно замещенный алкилен, -(CH-CH-O)- (где атом кислорода связан с -(С=O)-группой, связанной с Р), аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков; и
j является целым числом от 1 до 24.
19
20
21
22
127. Способ по п. 126, где R, R, R и R каждый представляют собой Н; a m и n каждый независимо представляют собой целое число от 1 до 6.
L
128. Способ по п. 126 или 127, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
L
9
9
129. Способ по п. 128, где P выбран из группы, состоящей из: Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Cit-Val, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala., Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Val-Ala и β-Ala-Gly-Gly-Gly.
130. Способ по п. 126, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью.
131. Способ по любому из пп. 1-39, где иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
пунктирные линии указывают необязательное наличие двойной связи;
3''
3-12
R представляет собой С алкиленовую группу,
каждый X' в каждом случае независимо представляет собой -О-, -S- или -N(H)-;
2
1'
1'
1'
1'
1'
2
a
a
2
2
2
2
каждый R независимо выбран из -Н, -ОН, -CN, -R, -OR, -O-SO-R, -COR, -COR или галогена, или оба R, взятые вместе, представляют собой =O,=СН, =CH-R или =C(R);
2'
1'
1'
1'
1'
1'
2
2
каждый R независимо выбран из -Н, -ОН, -CN, -R -OR, -O-SO-R, -COR, -COR или галогена;
4b
6'
4'
4'
4'
5'
4'
5',
4'
5'
4'
4'
5'
4'
4'
5'
6'
6'
4'
2
3
3
R представляет собой уходящую группу, выбранную из -OR, -OCOR, -OCOOR, -OCONRR, -NRR -NRCOR, -NRNRR, необязательно замещенного 5-или 6-членного азотсодержащего гетероцикла (например, пиперидина, тетрагидропиррола, пиразола, морфолина), гуанидиния, представленного -NR(C=NH)NRR, аминокислоты или пептида, представленного -NRСОР', где Р' представляет собой аминокислоту или полипептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных звеньев, -SR, -SOR, -SOM, -SOM, -OSOM, галогена, циано и азидо;
L
R представляет собой линкер, несущий малеимидный фрагмент, который может образовывать ковалентную связь со связывающим клетки агентом (СКА);
6
9
1'
1'
1'
1'
1'
3'
2
2
3
R и R независимо выбраны из -Н, -R, -ОН, -OR, -SH, -SR, -NH, -NHR, -NRR, -NO, MeSn и галогена; и
1'
3'
1'
3'
1'
3'
6
9
1-12
3-20
5-20
2
р
R и R каждый независимо выбран из необязательно замещенных C алкильных, С гетероциклильных или Сарильных групп и необязательно в связи с группой -NRR, R и R вместе с азотом атом, к которому они присоединены, образует необязательно замещенное 4-, 5-, 6- или 7-членное гетероциклическое кольцо; или любая пара соседних групп от R до R вместе образует группу -O-(СН)-O-, где р равен 1 или 2;
4'
5'
6'
6'
6'
6
b
2
2
2
n
R и R каждый независимо выбран из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена -(CHCHO)-R или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, имеющего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N или Р;
6'
b
2
2
n
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющего от 1 до 10 атомов углерода, -(CHCHO)-R, необязательно замещенного арила, имеющего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы, и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N или Р;
a
1'
1'
1'
2
2
R независимо выбран из -R, -COR, -COR, -СНО, -СОН или галогена;
b
R представляет собой -Н или замещенный или незамещенный линейный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода;
М представляет собой Н или фармацевтически приемлемый катион; и
n является целым числом от 1 до 24.
132. Способ по п. 131, где иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:
3''
3-5
или его фармацевтически приемлемой солью, где R представляет собой С алкилен.
L
1
1
2
133. Способ по п. 131 или 132, где R представляет собой  где L представляет собой расщепляемый линкер, А представляет собой соединительную группу, несущую малеимид, способный связывать L со связывающим клетки агентом, L представляет собой ковалентную связь или вместе с -ОС(=O)- образует саморасщепляющийся линкер.
1
134. Способ по п. 133, где L представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
1
135. Способ по п. 134, где L выбран из группы, состоящей из Phe-Lys, Val-Ala, Val-Lys, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Arg, Trp-Cit, Lys-Lys, Phe-Ala, Phe-N9-тозил-Arg, Phe-N9-нитро-Arg, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Gly-Gly-Gly, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 2) и Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 3).
2
136. Способ по любому из пп. 131-135, где -С(=O)O- и L вместе образуют группу:
1
где звездочка обозначает точку присоединения к позиции N10, волнистая линия обозначает точку присоединения к линкеру L, Y' обозначает -NH-, -О-, -С(=O)NH- или -С(=О)О-, а n равен от 0 до 3.
2
137. Способ по п. 136, где -С(=O)O- и L вместе образуют группу:
1
2
138. Способ по п. 136, где L и L вместе с -ОС(=O) составляют группу, выбранную из:
1
где звездочка обозначает точку присоединения к позиции N10, а волнистая линия обозначает точку присоединения к оставшейся части линкера L или точку присоединения к А.
139. Способ по любому из пп. 131-138, где А представлен следующей структурной формулой:
1
(i)  где звездочка обозначает точку присоединения к L, а р равен от 1 до 6;
1
(ii)  где звездочка указывает точку присоединения к L, r равен 0 или 1, a s равен от 0 до 30.
140. Способ по п. 139, где р равен от 4 до 6; r равен 1; и s равен от 1 до 10.
141. Способ по п. 131, где иминсодержащий цитотоксический агент представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где s равен от 2 до 8.
142. Способ по п. 141, где s равен 7.
143. Способ по любому из пп. 1-142, где связывающий клетки агент представляет собой антитело или фрагмент антитела.
144. Способ по любому из пп. 1-142, где связывающий клетки агент представляет собой антитело, имеющее сконструированный остаток цистеина.
145. Способ по п. 144, где сконструированный остаток цистеина находится в позиции 442 согласно нумерации EU/OU одной или обеих тяжелых цепей антитела.
146. Способ по п. 145, где сконструированный остаток цистеина находится в обеих тяжелых цепях.
147. Способ по п. 145, где сконструированный остаток цистеина находится в одной из тяжелых цепей.
148. Способ по любому из пп. 143-147, где антитело представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело с измененной поверхностью или антитело человека.
149. Способ по п. 148, где антитело представляет собой антитело против CD123.
150. Способ по п. 149, где антитело против CD123 содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и область легкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
151. Способ по любому из пп. 1-39, отличающийся тем, что он предназначен для получения конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, представленного следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, при этом способ включает стадии:
(а) взаимодействие иминного фрагмента в иминсодержащем цитотоксическом агенте, представленном следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, с диоксидом серы, бисульфитной солью или солью метабисульфита в водном растворе при рН от 3,1 до 3,5 с образованием модифицированного цитотоксического агента, представленного следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью; и
(b) взаимодействие модифицированного цитотоксического агента или его фармацевтически приемлемой соли со связывающим клетки агентом Ab с образованием конъюгата связывающий клетки агент-цитотоксический агент, где:
Ab представляет собой антитело против CD123, содержащее область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и область легкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и
w равен 1 или 2.
152. Способ по п. 151, где реакцию на стадии (а) проводят при рН от 3,2 до 3,4.
153. Способ по п. 151, где реакцию на стадии (а) проводят при рН 3,3.
154. Способ по любому из пп. 151-153, где реакцию на стадии (а) проводят в присутствии буферного раствора.
155. Способ по п. 154, где буферный раствор представляет собой цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер или фосфатный буфер.
156. Способ по п. 155, где буфер представляет собой сукцинатный буфер.
157. Способ по любому из пп. 151-156, где от 1,1 до 1,6 эквивалента соли бисульфита или от 0,55 до 0,8 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
158. Способ по п. 157, где от 1,3 до 1,5 эквивалента соли бисульфита или от 0,65 до 0,75 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
159. Способ по п. 157, где 1,4 эквивалента соли бисульфита или 0,7 эквивалента соли метабисульфита приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
160. Способ по любому из пп. 151-159, где реакцию стадии (а) проводят при рН от 3,2 до 3,4 и от 1,3 до 1,5 эквивалента соли бисульфита натрия приводят в реакцию с 1 эквивалентом иминсодержащего цитотоксического агента.
161. Способ по любому из пп. 151-160, где реакцию стадии (а) проводят в смеси диметилацетамида (ДМА) и воды.
162. Способ по любому из пп. 151-161, где реакцию на стадии (а) проводят при комнатной температуре.
163. Способ по любому из пп. 151-162, где модифицированный цитотоксический агент не очищают перед реакцией со связывающим клетки агентом на стадии (b).
164. Способ по любому из пп. 151-163, где реакцию на стадии (b) проводят при рН от 5,5 до 6,5.
165. Способ по любому из пп. 151-164, где конъюгат очищают фильтрацией в тангенциальном потоке с получением очищенного конъюгата.
166. Способ по п. 165, где очищенный конъюгат готовят в буфере для состава, содержащем от 40 до 80 мкМ бисульфита натрия, имеющего рН от 4 до 5.
167. Способ по п. 166, где буфер для состава содержит 50 мкМ бисульфита натрия, имеющего рН 4,2.