УСТРОЙСТВО МНОГОРАЗОВОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
MULTIPLE USE DEVICE FOR NUCLEIC ACIDS HYBRIDISATION AND APPLICATION THEREOF

Изобретение относится к процессам и аппаратам для сепарации, изоляции или обнаружения нуклеиновых кислот и в особенности имеет отношение к процессам и аппаратам, пригодным для регенерации устройств многоразового использования для гибридизации нуклеиновых кислот, далее биочипов или ДНК-чипов.
Гибридизационные ДНК-чипы представляют собой твердый носитель, например стекло, полимерный материал, кремний, на поверхности которого упорядоченно расположены зоны, в каждой из которых иммобилизовано множество копий определенных последовательностей ДНК.
Наиболее важной особенностью технологии ДНК-чипов или биочипов с точки зрения практической пользы является возможность анализа большого количества молекул ДНК или РНК в смеси на наличие уникальных последовательностей.
Современное развитие техники биочипов позволяет определять, какие гены работают в данной клетке на какой-либо стадии развития, а какие находятся в неактивном состоянии. Например, с помощью экспрессионных микрочипов установлены гены, принимающие участие в регуляции цикла деления клеток дрожжей, а также процессов метаболизма в бактерии Escherichia coli.
В разработанных экспрессионных микрочипах используют иммобилизованную ДНК двух типов: во-первых, относительно короткие ген-специфичные фрагменты ДНК длиной 20-25 нуклеотидов, например, олигонуклеотидные микрочипы фирмы Affymetrix; во-вторых, крупные фрагменты кодирующей ДНК длиной 300-500 нуклеотидов, получаемые в результате клонирования, ПЦР (полимеразная цепная реакция) - амплификации и очистки ДНК.
При использовании ДНК-чипов можно одновременно следить за изменением десятков тысяч генов в процессе развития клеток и тканей при различных физиологических и патологических ситуациях, при воздействии терапевтических средств и токсинов. Выявление четких маркеров патологии на уровне экспрессии генов и разработка диагностических ДНК-чипов - одна из приоритетнейших задач медико-биологических исследований. Работа над ней может способствовать решению ряда важнейших проблем здравоохранения.
К сожалению, дороговизна и сложность затрудняют использование этой техники.
Изобретение решает задачу разработки простых, недорогих и более доступных методов работы с ДНК-пробами, характеризующими определенные гены, чем работа с современными ДНК-микрочипами.
Предложен процесс идентифицикации нуклеиновой кислоты (НК), комплементарной другой НК. Процесс включает гибридизацию НК-пробы с носителем НК-пробы для того, чтобы сформировать единый комплекс НК-пробы с носителем НК-пробы.
Указанный комплекс помещают в компартмент (отсек, камеру), ограниченный с одной стороны перегородкой, выполненной из материала, проницаемого для НК-пробы и непроницаемого для указанного носителя НК-пробы и указанного комплекса.
Затем указанный комплекс денатурируют и НК-пробу транспортируют сквозь перегородку и приводят в контакт с НК-мишенью. В условиях гибридизации НК-проба гибридизуется с комплементарной НК-мишенью, в результате чего получается двунитчатый комплекс НК-проба - НК-мишень. НК-пробы, которые некомплементарны НК-мишени и по этой причине с ней не связаны, возвращают обратно в исходный компартмент, где обеспечивают условия, в которых указанные НК-пробы гибридизуются обратно на носитель НК-пробы.
Обнаружение комплексов НК-пробы как с НК-мишенью, так и с носителем НК-пробы используют для того, чтобы определить комплементарность НК-пробы к НК-мишени.
Предложенный НК-гибридизационный чип (устройство) многоразового использования содержит канал. Указанный канал имеет компартмент, в котором находится носитель НК-пробы. Канал обеспечивает контакт жидкостей, которые находятся в отсеке для НК-мишени и в отсеке для носителя НК-пробы. Указанные отсеки отделены от канала перегородками, проницаемыми для НК-пробы и непроницаемыми для НК-мишени и носителя НК-пробы. Носитель НК-пробы не может выйти за пределы компартмента, в котором он находится.
Устройство избирательно перемещает однонитчатую НК-пробу между указанными компартментами, содержащими НК-мишень и носитель НК-пробы.
Предложен также процесс копирования описанных в данном изобретении гибридизационных НК-чипов многоразового использования. Внутри камеры, заполненной гелем и содержащей, по крайней мере, один электрод для электрофореза, создают множество копий молекулы НК. После этого камеру контактируют с другой подобной камерой, содержащей, как минимум, один электрод. Прикладывая электрическое поле, обеспечивают переход части копий НК из указанной первой камеры в указанную вторую камеру. После разделения камер получают две камеры, содержащие копии НК. Изобретение позволяет таким образом одновременно копировать множество изолированных друг от друга камер.
Сущность изобретения далее детализирована с помощью следующих чертежей, которые иллюстрируют конкретные варианты воплощений настоящего изобретения. Они не предназначены для того, чтобы ограничить изобретение, описанное выше, а скорее обеспечить иллюстрацию по существу заявляемых пунктов формулы изобретения.
Краткое описание.
Фиг.1(a)-(p) - схематически и по шагам показывают последовательность работы предложенных НК-чипов с подвижными НК-пробами;
Фиг.2 - схематически изображает многоканальный НК-чип, предложенный в настоящем изобретении;
Фиг.3(a)-(d) - схематически показывают в поперечном сечении различные варианты воплощения НК-чипа, содержащего множество электрофоретических камер, предложенные в настоящем изобретении;
Фиг.4 - показывает схематически ряд камер с разводкой проводов, обеспечивающих электрический контакт с каждой парой электродов;
Фиг.5 - представляет собой разнесенный вид комбинации пластин, которые в совокупности формируют НК-чип, содержащий такие электрофоретические камеры, как показанные на Фиг.4;
Фиг.6(a)-(d) - схематически показывают последовательные шаги процедуры копирования НК-чипов, в результате которой происходит перемещение молекул нуклеиновой кислоты из исходного НК-чипа в его копию;
Фиг.7(a)-(r) - схематически показывают последовательные шаги диагностики с использованием такого электрофоретического варианта НК-чипа, предложенного в настоящем изобретении, в котором камеры, содержащие как НК-носители НК-пробы, так и камеры, содержащие НК-мишени, частично или полностью заполнены гелем.
Детальное описание предпочтительных вариантов изобретения.
Существующие НК-чипы можно подразделить на следующие два вида. ДНК-чипы, на поверхности которых ДНК-пробы организованы в виде пятен. Внутри каждого такого пятна однонитчатые ДНК молекулы иммобилизованы одним концом на поверхности НК-чипа. Второй тип НК-чипов это олигонуклеотидные чипы, на поверхности которых иммобилизованы относительно короткие олигонуклеотиды.
Оба типа НК-чипов используют так, что НК-мишень гибридизуют с НК-пробой непосредственно на поверхности НК-чипа. С точки зрения функциональной роли молекул НК, вовлеченных в процедуру диагностики, современные методы используют только два типа молекул нуклеиновой кислоты: НК-пробы и НК-мишени.
Настоящее изобретение вводит третий тип молекулы нуклеиновой кислоты, а именно такой носитель однонитчатой НК-пробы, что при соответствующих условиях НК-носитель и НК-проба способны образовать полностью комплементарную двунитчатую нуклеиновую кислоту.
Изобретение использует НК-носитель НК-пробы и тем самым позволяет НК-пробам в определенных условиях существовать в виде свободных молекул в растворе. Одновременно с этим использование НК-носителя НК-пробы позволяет использовать НК-мишени не только в виде свободных молекул в растворе, как это необходимо в существующих методах, но и в виде молекул, иммобилизованных на поверхности или находящихся внутри пористой среды, например в геле, в которую свободные молекулы НК-проб могут легко проникнуть.
В результате настоящее изобретение позволяет упростить методы использования и изготовления таких НК-чипов, разработать разнообразные простые варианты управления ими и разработать как одноразовые устройства, так и НК-чипы для многоразового использования.
В соответствии с изобретением можно приготовить комплекс НК-носитель с НК-пробой следующим образом. Вначале изготовить длинную двунитчатую молекулу НК, которая имеет повторенную первичную структуру. В этой структуре повторяющейся единицей в одной из нитей является структура НК-пробы, ограниченная последовательностями-сигналами, которые опознает какая-либо однонитчатая рестриктаза таким образом, что после обработки этой рестриктазой в этих местах появятся однонитчатые разрезы. В результате указанная двунитчатая молекула НК превратится в одну длинную однонитчатую НК, к которой последовательно присоединено множество НК-проб.
Предлагаемые НК-носители обладают способностью специфически и обратимо связывать НК-пробы. В составе НК-чипов (устройств) такие НК-носители НК-проб могут быть локализованы на поверхности или в ограниченном объеме.
Структура предлагаемых НК-носителей НК-проб позволяет использовать следующий метод получения НК-проб. Однонитчатая НК-проба способна присоединять к себе с образованием двунитчатой структуры только комплементарные последовательности НК. Поэтому в случае обработки такого НК-носителя раствором смеси статистически приготовленных олигонуклеотидов (например, имеющих длину от 5 до 50 оснований), только комплементарные последовательности гибридизуются с НК-носителем и образуют комплекс НК-носителя с НК-пробой.
Использованный в изобретении термин "носитель НК-пробы" определен как некое вещество, которое способно специфически и обратимо связываться с НК-пробой и, в частности, включает в себя комплементарные НК-пробе однонитчатые нуклеиновые кислоты, другие органические молекулы и пористые структуры. В настоящем изобретении такой носитель рассматривается как комплексный носитель, который может быть использован как свободные молекулы в растворе, иммобилизованные молекулы и пористые структуры.
Разнообразие молекул другой природы, нежели нуклеиновая кислота, способных присодиняться к НК-носителю НК-проб в соответствии с настоящим изобретением, практически неограничено. Эти молекулы могут нести в своем составе такие группы, которые обеспечивают такие функции, как специфическое опознавание и связывание с различными субстратами и НК-пробами, спектроскопически активные метки и их комбинации.
Расположение носителей НК-пробы не только на плоскости, но и в пространстве предоставляет новые возможности как изготовления, так и функционирования предлагаемых ПК-чипов (устройств).
Например, НК-носители могут быть последовательно соединены конец в конец, образуя длинную нитевидную структуру, в которой многократно повторены одинаковые НК-носители или заранее определенная комбинация разных НК-носителей. Эта структура может включать в себя специальные разграничительные участки, которые, например, устраняют возможные стерические припятствия в работе соседних НК-носителей и позволяют, при необходимости, заменять одни НК-носители на другие без повреждения этих НК-носителей.
Изобретение учитывает, что для НК-носителей НК-проб такими разграничителями могут быть сайты опознавания рестриктаз.
Использование НК-носителей НК-проб, представляющих собой длинные однонитчатые молекулы НК, позволяет исключить проблемы, возникающие при попытках гибридизовать однонитчатые молекулы НК в непосредственной близости к той поверхности, к которой одна из этих молекул иммобилизована. В результате предлагаемые НК-носители НК-проб должны быть полезны при использовании особенно длинных НК-проб, например, при длинах НК-проб более чем 60 оснований.
Предлагаемые НК-носители НК-проб могут быть иммобилизованы на поверхности НК- чипа таким же образом, как на обычных ДНК-чипах (в виде пятен). Использование предлагаемых НК-носителей позволяет осуществить переход от двумерного расположения молекул НК-проб к расположению в пространстве. В настоящее время такой переход происходит при изготовлении гелевых чипов, существенным ограничением для которых является то, что молекулы ДНК-мишеней должны диффундировать внутрь геля, для того чтобы гибридизоваться с ДНК-пробами, иммобилизованными внутри этого геля. Настоящее изобретение учитывает возможность иммобилизации носителей не только на какой-либо поверхности, но и в объеме геля или пористого материала.
Для идентификации предлагаемых НК-носителей НК-проб можно использовать не только их пространственное позиционирование. Например, эти НК-носители НК-проб могут упорядоченно двигаться сквозь детектор, который их опознает. Опознавание может осуществляться по различным признакам, например, размеры и конформация молекул, различные метки и разные комбинации этих признаков. Детектор может также определять время или последовательность прохода носителей сквозь детектор.
Благодаря тому что однонитчатые НК-мишени согласно предлагаемому изобретению взаимодействуют не с иммобилизованными комплементарными им НК, но со свободными НК-пробами, появляется возможность упростить процедуру подготовки НК-мишени к процедуре гибридизации. Например, можно использовать для гибридизации НК-мишени, которые находятся внутри геля или иммобилизованы на поверхности частиц. Например, это могут быть парамагнитные, металлические, полупроводниковые и полимерные частицы. В частности, это могут быть парамагнитные частицы, которые общепринято использовать в процедурах очистки и амплификации НК.
В одном из режимов использования предлагаемых НК-чипов предложено гибридизовать однонитчатые НК-пробы с однонитчатой НК-мишенью в растворе и после этого отделить двунитчатые комплексы мишень-проба от однонитчатых НК-проб. Эти свободные однонитчатые НК-пробы предложено гибридизовать в другом месте с НК-носителями для получения двунитчатых комплексов носитель-проба.
Изобретение учитывает, что в таком режиме работы НК-мишени могут быть иммобилизованы на поверхности другого НК-чипа, например, изготовленного для работы с другими НК-пробами; на поверхности парамагнитных частиц, которые широко используют при сепарации и амплификации НК; а также внутри геля, как это бывает при электрофорезе нуклеиновых кислот.
Результаты гибридизации можно определять, анализируя появление или отсутствие комплексов как НК-мишень с НК-пробой, так и комплексов НК-носитель с НК-пробой. Возможно также обнаружение свободных НК-проб, которые находятся или движутся между НК-мишенью и НК-носителем.
Еще одним режимом работы может быть такой, при котором НК-носитель иммобилизован на открытой поверхности или внутри пор пористого тела и гибридизован с НК-пробой, образуя двунитчатую НК. Предложено денатурировать такой комплекс НК-носитель с НК-пробой и высвобождать НК-пробу для того, чтобы она в свободном состоянии обнаруживала НК-мишень и гибридизовалась с ней. Способами денатурации, например, могут быть нагрев, изменение pH среды и приложение электрического поля.
На Фиг.1 показана последовательность шагов работы одиночного канала НК-чипа (устройства), предложенного в настоящем изобретении.
Изобретение учитывает, что хотя на Фиг.1 показано, что весь раствор перемещается из одного компартмента в другой, существует возможность, приложив к компартментам, заполненным электролитом, электрическое поле, перемещать между компартментами только заряженные молекулы. Аналогично этому возможно использовать электрическое поле для случая, показанного на Фиг.2.
В тех случаях, когда для перемещения молекул используют электрическое поле, возможно обойтись без использования оптических и других методов визуализации молекул, которые требуют специфически модифицировать нуклеиновые кислоты. Вместо этого можно измерять такие параметры, как ионный ток и другие неспецифические характеристики движущихся электрически заряженных полимерных молекул нуклеиновых кислот.
Канал, показанный на Фиг.1, это одноканальное устройство, которое в общем виде обозначено как 10. Устройство 10 имеет канал 2, заполненный жидкостью и имеющий пористую перегородку 14, которая проницаема для НК-проб 28 и непроницаема для НК-носителей 30 и НК-мишеней 32. Одна сторона пористой перегородки 14 обозначена как 16, а вторая 18. Пористая перегородка 14 отделяет содержащий НК-носители компартмент 20 от содержащего НК-мишени компартмента 22. Если необходимо, содержащий НК-носители компартмент 20 отгорожен проницаемой для жидкости пористой перегородкой 24, которая непроницаема для НК-носителей 30, НК-проб 28 и НК-мишеней 32. Подобным образом, если необходимо, содержащий НК-мишени компартмент 22 отгорожен проницаемой для жидкости пористой перегородкой 24', которая непроницаема для НК-носителей, НК-проб и НК-мишеней. Аппарат 26, индуцирующий движение нуклеиновых кислот, необходим для того, чтобы обеспечивать перемещение НК-проб 28 из компартмента 20 в 22 и обратно. Природа аппарата 26 может быть различной в зависимости от того, какова природа сил, выбранных для перемещения нуклеиновых кислот между компартментами. Например, в тех случаях, когда НК-пробы 28 перемещаются между компартментами 20 и 22 вместе с потоком жидкости, аппарат 26 представляет собой насос.
Альтернативно, в тех случаях, когда НК-пробы 28 перемещаются между компартментами 20 и 22 под влиянием электростатического потенциала, аппарат 26 представляет собой источник питания с электродами, которые индуцируют электрическое поле между перегородками 24 и 24'. Для иллюстративных целей аппарат 26 показан, как насос, перемещающий НК-пробы 28 вместе с потоком жидкости.
На Фиг.1(a) показано множество копий НК-пробы 28, которые гибридизованы с НК-носителем 30 и находятся в компартменте 20. Изобретение учитывает, что НК-носитель 30 может находиться в компартменте 20 в виде молекул, свободных в растворе, молекул, иммобилизованных на перегородке 24 или/и перегородке 14 со стороны 16, или находится внутри пористых перегородок 24 или/и 14.
Как показано на Фиг.1(b), комплекс НК-пробы 28 с НК-носителем 30 денатурирован, чтобы освободить НК-пробу 28 в объем раствора компартмента 20. Денатурацию комплексов НК-проб 28 с НК-носителем 30 можно осуществить разными методами, например нагреванием, изменением pH, электрическим полем.
На Фиг.(1c) показано, что НК-пробы 28 перемещены в компартмент 22. Как изображено на этом чертеже, такое перемещение может быть обеспечено за счет накачивания жидкости в компартмент 22 с помощью насоса через канал 2 или за счет отсасывания жидкости из компартмента 22.
Как показано на Фиг.1(d), молекулы НК-мишени 32 вносят в компартмент 22 с помощью диспенсера 34, который, например, может быть микропипеткой, микродиспенсером или другим подобным устройством. Изобретение учитывает, что однонитчатые молекулы НК-мишени 32 могут быть помещены в компартмент 22 до того, как туда помещают НК-пробы 28. В варианте, показанном на Фиг.1, молекулы однонитчатых НК-проб 32 иммобилизованы на парамагнитных частицах 36.
На Фиг.1(e) показано, что молекулы НК-пробы 32, иммобилизованные на парамагнитных частицах 36, взаимодействуют с множеством копий НК-пробы 28. Как это видно на Фиг.1(f), взаимодействие происходит в условиях гибридизации, которые позволяют образование двунитчатых комплексов между комплементарными НК-мишенями и НК-пробами. Методы и условия гибридизации хорошо известны и, например, могут быть обеспечены за счет специальных режимов изменения температуры, pH, ионной силы.
Изобретение учитывает, что на этой стадии содержимое компартмента 22 можно извлечь и исследовать вне описываемого устройства различными хорошо известными методами для того, чтобы определить результаты гибридизации НК-мишени и НК-пробы.
Однако в предпочтительном варианте, как изображено на Фиг.1(g), раствор переводят из компартмента 22 обратно в компартмент 20, ожидая следующий результат. Если НК-проба 28 комплементарна хотя бы части НК-мишени 30, то НК-пробы 28 останутся в компартменте 22 в составе комплекса НК-мишени с НК-пробой, для которого перегородка 14 непроницаема.
Непосредственное обнаружение НК-носителя 30 в условиях гибридизации обычными методами, например, с использованием флуоресцентных красителей, может позволить определить, вернулись ли НК-пробы 28 в компартмент 20. Если окажется, что НК-проба 28 вернулась в компартмент 20 и образовала двунитчатые комплексы с НК-носителем 30, то это будет означать, что НК-пробы 28 некомплементарны НК-мишени 32. В том случае, если НК-пробы 28 некомплементарны НК-мишени 32, удаление этой мишени и в случае необходимости дополнительная промывка компартмента 22 вернут канал 10 к исходному состоянию, показанному на Фиг.1(а). В случае, если НК-проба оказалась комплементарна тестируемой НК-мишени, то перед удалением НК-мишени из компартмента 20 понадобится денатурация комплекса НК-мишени с НК-пробой и перемещение освобожденной НК-пробы в компартмент 22.
Таким образом, в случае, если НК-пробы 28 комплементарны НК-мишени 30, компартмент 22 необходимо вновь заполнить жидкостью, как это показано на Фиг.1(h). Денатурацию двунитчатых комплексов НК-пробы с НК-мишенью, показанную на Фиг.1(i), можно осуществить в тех же условиях, что описаны для Фиг.1(b).
Последующие шаги обеспечивают разделение НК-мишени 32, которая была помещена в компартмент 22 так, как это показано на Фиг.1(d), и НК-проб 28, которые в результате денатурации были освобождены из комплекса с НК-мишенью. Изобретение учитывает, что такое разделение может быть обеспечено вне канала 10 хорошо известными методами, например, такими, как электрофорез и хроматография, а также за счет использования парамагнитных частиц, на которых НК-мишень иммобилизована. Однако в предпочтительном варианте, показанном на Фиг.1(j), освобожденные НК-пробы 28 перемещают из компартмента 22 в компартмент 20. После этого в компартменте 20 обеспечивают гибридизацию НК-пробы 28 с НК-носителем 30, как это показано на Фиг.1(k). После этого компартмент 22 заполняют жидкостью так, чтобы молекулы НК-мишеней 32, иммобилизованные на парамагнитных частицах 36, оказались плавающими в растворе, как это показано на Фиг.1(l).
На Фиг.1(m) показано, что в компартмент 22 введен магнит 40, к поверхности которого прилипли все парамагнитные частицы 36. На следующей Фиг.1(n) показано, что магнит 40, удаленный из компартмента 22, унес на своей поверхности все парамагнитные частицы 36 и иммобилизованные на них НК-мишени 32. Как показано на Фиг.1(o), удаление раствора из компартмента 22 возвращает канал 10 к исходному состоянию, показанному на Фиг.1(a).
Последующая денатурация комплекса НК-носитель 30 с НК-пробой 28 и заполнение компартмента 22 раствором, содержащим НК-пробу 22, подготавливает канал 10 к работе со следующей НК-мишенью 32'. Как показано на Фиг.1(p), следующая НК-мишень 32' может быть, например, иммобилизована на парамагнитных частицах.
На Фиг.2 показан схематически многоканальный НК чип (устройство), в котором отдельные каналы функционируют так, как это было описано для Фиг.1. Номера на Фиг.2. имеют те же объяснения, что и на Фиг.1.
Множество пар компартментов НК-носителей 20 и НК-мишеней 22 образуют двумерный или трехмерный НК-чип (устройство). Преимуществом многоканального НК-чипа (устройства) 50, схематически показанного на Фиг.2, является то, что наличие множества пар компартментов 20 и 22 позволяет автоматизировать устройство и повысить производительность его работы.
Существенной особенностью изобретения является то, что НК-пробы курсируют между компартментами 20 и 22 и не расходуются. Предложенный НК-чип является простым устройством для многоразового использования, пригодным для разработки множественных вариантов недорогой и надежной массовой диагностики.
Множество вариантов многоканального использующего электрофорез НК-чипа (устройства) показано на Фиг.3(a)-3(d). Указанный многоканальный НК-чип (устройство) имеет компартмент для НК-носителя 60, ограниченный торцевым электродом 62. Компартмент 60 предназначен для НК-носителей или НК-мишеней. Пористый материал 64 практически непроницаем для НК-носителей и НК-мишеней, но проницаем для НК-проб. Компартмент 60 может быть полностью или частично заполнен гелем 66, в котором могут быть заключены длинные и по этой причине практически не сдвигаемые в электрическом поле молекулы НК-носителей или НК-мишеней. При неполном заполнении компартмента 60 гелем 66 и при использовании пористого материала 64 компартмент 60 содержит также раствор 63. Компартмент 60 содержит также два (или больше) расположенных по бокам компартмента электрода 68 и 70.
Как показано на Фиг.4, первая пластина, подобная 72, которая представлена на Фиг.3d, содержит набор компартментов, к которым подведены электропроводящие провода 74, обеспечивающие контакт жидкости в компартментах с электродами 68 и 70, которые были показаны также на Фиг.3.
На Фиг.5 представлен разнесенный вид комбинации пластин 72 и 78, которые совместно образуют электрофоретические камеры, описанные на Фиг.3.
На Фиг.6(a)-6(d) схематически показана процедура копирования НК-чипа (устройства), каждый компартмент которого содержит множество копий какого-либо НК-носителя НК-пробы или НК-мишени. Цифровые обозначения совпадают с описанными для Фиг.3-5.
НК 80 амплифицирована с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) внутри компартмента 60 таким образом, что он содержит множество копий этой нуклеиновой кислоты. После этого НК-чип (устройство) 72, который содержит в компартментах 60 множество копий НК, погруженных в гель 66, приводят в соприкосновение с таким же НК-чипом 72' и 78', который имеет концевые электроды 62'. Как показано на Фиг.6(b), в электрическом поле, сформированном между электродами 62 и 62', часть НК 80 будет перемещаться из компартмента 60 в компартмент 60'. После перемещения части НК 80 в компартмент 60' пластины 70 и 72 разъединяют, как это показано на Фиг.6(c). После этого с помощью ПЦР небольшое количество ПК 80, которое было перемещено в компартменты 60', размножают до количеств, соответствующих количеству этих НК 80 в НК-чипе (устройстве), образованном пластинами 72 и 78. Таким образом получают полную копию исходного НК-чипа (устройства).
На Фиг.7(a)-(r) показаны последовательные этапы диагностики для случая, когда НК-носитель НК-проб и НК-мишени погружены каждый в своем компартменте внутрь геля так, что под действием электрического поля НК-пробы могут входить в и выходить из соответствующего компартмента, в то время как НК-носители и НК-мишени практически не будут сдвигаться с места.
Диагностический НК-чип, который состоит из пластин 72 и 78, содержащих концевой электрод 62 и боковые электроды 68 и 70, в соответсвии с описаниями, приведенными для предыдущих чертежей, имеет компартмент 60, содержащий множество копий коротких НК-проб 28, гибридизованных с длинными однонитчатыми НК-носителями 30. Компартмент 60, заполненный гелем 66, обозначен на чертеже как 86.
Компартмент, содержащий НК-мишень 30, помещенную в гель 66, обозначен как 88. Как показано на Фиг.7(b), комплекс НК-пробы 28 и НК-носителя 30 помещен в условия, при которых он денатурирует с образованием однонитчатых НК-пробы 28 и НК-носителя 30.
На Фиг.7(d) показано, что пластину 90 вместе с присоединенной к ней пластиной 78' приводят в контакт с пластиной 72 и прикладывают электрические потенциалы к электродам 62 и 62', в результате чего НК-пробы 28 начинают перемещаться из компартмента 86 в компартмент 88, который содержит НК-мишени. На Фиг.7(e) показано, что в результате электрофореза все НК-пробы 28 покидают компартмент 86 и скапливаются в компартменте 88. После этого, как это показано на Фиг.7(f), пластину 90 отделяют от пластины 72.
Далее пластину с компартментами 88 помещают в условия гибридизации, при которых могут образоваться комплексы НК-проб 28 с НК-мишенями 34. Комплементарные НК-пробы 28 и НК-мишени 34 в результате гибридизации образуют двунитчатые комплексы, как это показано на Фиг.7(g). После этого пластину 90 вновь контактируют с пластиной 72, как показано на Фиг.7(h), и проводят электрофорез в направлении, обратном тому, что показано на Фиг.7(d), с целью вернуть все свободные НК-пробы 28 из компартмента 88 обратно в компартмент 86 с НК-носителями.
Как показано на Фиг.7(i), пластина 90 вновь отделена от пластины 72 и в компартментах 86 организовано горизонтальное электрическое поле, для того чтобы двигать свободные НК-пробы 28. После этого направление горизонтального электрофореза меняют на обратное, как это показано на Фиг.7(k). В обоих случаях электрофорез организован так, что позволяет измерять электрические характеристики движущихся НК-проб 28, например, величину ионного тока. После этого как показано на Фиг.7(l) в компартментах 86 обеспечивают условия гибридизации для образования комплексов между НК-пробами 28 и НК-носителями 30.
После этого компартменты 88, содержащие двунитчатые комплексы НК-мишеней 34 с НК-пробами 28, помещают в условия денатурации. Пластины 90 и 72 вновь контактируют и организуют электрическое поле между электродами 62 и 62' в том же направлении, как на Фиг.7(h), для того чтобы обеспечить перемещение НК-проб 28, комплементарных НК-мишени 34, обратно в компартмент 86. На Фиг.7(o) показано, что после того как все НК-пробы 28 вернутся в компартмент 86, электрическое поле выключают.
Пластины 90 и 72 после этого разъединяют. Содержимое компартментов 88 в пластине 90 становится таким же, как оно было в начале процедуры на Фиг.7(a).
На Фиг.7(q) показано, что в компартментах 86 обеспечены условия гибридизации, в результате чего все НК-пробы 28, которые комплементарны НК-мишени 34, образовали двунитчатые НК комплексы с НК-носителями 30. Таким образом на Фиг.7(r) показано, что НК-чип (устройство), содержащее компартменты 86, полностью готово к диагностике другой НК-мишени; аналогично компартменты 88 готовы для тестирования других НК-проб.