СПОСОБ КОРРЕКТИРОВКИ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ КРИВОЙ ПРИ СНИЖЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ УСИЛИТЕЛЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
METHOD FOR ADJUSTING THE CHEMILUMINESCENCE CURVE WITH A DECREASE IN THE CONCENTRATION OF THE CHEMILUMINESCENCE AMPLIFIER

Изобретение относится к области биофизики и может найти применение при изучении механизмов и способов регулирования процессов перекисного окисления липидов, играющих ключевую роль при запуске ряда каскадов реакций, приводящих в итоге к гибели клеток. Неферментативное и канализируемое липоксигеназами перекисное окисление липидов играет важное роль в клеточной гибели по механизму ферроптоза [Proneth В., Conrad М. Ferroptosis and necroinflammation, a yet poorly explored link // Cell Death Differ. - 2019. - 26, 1. - P.: 14-24], наблюдающемуся помимо всего прочего и при действии на организм ионизирующего излучения [Lei G., Zhang Y., Koppula P., Liu X., Zhang J., Lin S.H., Ajani J.A., Xiao Q., et al. The role of ferroptosis in ionizing radiation-induced cell death and tumor suppression // Cell Res. - 2020. - 30. - P.: 146-162; Zhang X., Xing X., Liu H., Feng J., Tian M., Chang S., Liu P., Zhang H. Ionizing radiation induces ferroptosis in granulocyte-macrophage hematopoietic progenitor cells of murine bone marrow // Int J Radiat Biol. - 2020. - 96(5). - P.: 584-595.]. Соответственно, ингибирование ферроптоза поможет смягчить тяжесть лучевой болезни. Ферментативное перекисное окисление липидов играет ключевую роль на ранних стадиях апоптоза по митохондриальному пути, где оно катализируется цитохромом С, который при связывании с кардиолипином приобретает липопероксидазную активность. Поиск способов ингибирования перекисного окисления липидов необходим для разработки эффективных методов терапии и профилактики патологий, вызванных апоптозом нужных организму клеток, например дистрофических процессов, нейро- и кардиодегенеративных заболеваний. В свою очередь разработка методик запуска как ферментативного, так и неферментативного перекисного окисления липидов необходима для лечения онкологических заболеваний.
Наиболее удобным методом изучения свободнорадикальных реакций, по крайней мере на молекулярных моделях, является метод регистрации хемилюминесценции, которая в подавляющем большинстве случаев усиливается путем внесения в систему так называемых активаторов (усилителей) [Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. - 2009. - 49. - С: 341-388]. Однако зачастую эти усилители сами участвуют в протекающей реакции, их концентрация снижается с течением времени, а потому снижается и интенсивность хемилюминесценции. Это может быть ложно оттрактовано как снижение интенсивности перекисного окисления липидов в образце. Что, к примеру, при исследовании подавления данного процесса антиоксидантами может привести к ложному выводу об эффективности изучаемого препарата.
Поэтому необходимо иметь данные об изменении концентрации усилителя хемилюминесценции в исследуемой пробе. В случае снижения его концентрации необходимо провести определить зависимость остающейся в системе ее доли от времени и на основании этих данных вывести математическую функцию для придания хемилюминесцентной кривой такого вида, какой бы она имела в случае, если бы концентрация усилителя хемилюминесценции была бы постоянной.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ (патент РФ №2720807, опубликован 13.05.2020, МПК G01N 33/483, G01N 21/76, МПК G01N 33/483), в котором предлагается оценка химического участия усилителя хемилюминесценции в липопероксидазной реакции путем регистрации спектров поглощения реакционной смеси в разные моменты времени с последующим определением его концентрации в эти моменты.
Недостаток способа-прототипа заключается в том, что он не подразумевает непосредственного вычисления поправочных на расходование активатора хемилюминесценции функций и что он не позволяет оценить кинетику расходования усилителя хемилюминесценции в системе, в которой помимо перекиси водорода, катализатора липидной пероксидации, усилителя хемилюминесценции и липидного субстрата присутствует также вещество, играющее роль ингибитора перекисного окисления липидов или роль прооксиданта, в особенности, если это вещество значительно поглощает свет на длинах волн регистрации оптический плотности. Данный недостаток чрезвычайно важен, так как про- или антиоксиданты в указанной системе могут значительно изменить кинетику расходования усилителя хемилюминесценции. Это связано с тем, например, что антиоксидант может выступать в роли конкурентного по отношению к липиду и усилителю хемилюминесценции восстановительного субстрата фермента-пероксидазы, поэтому в его присутствии снижение концентрации усилителя хемилюминесценции будет происходить медленнее, и использование поправочной функции, выведенной для системы, не содержащей антиоксидант, будет некорректным. Причем необходимо учесть, что различные антиоксиданты могут влиять на кинетику расходования усилителя хемилюминесценции по-разному. Для дополнительного подтверждения этого тезиса можно привести данные, представленные в статье Ромодина Л.А. и Владимирова Ю.А. [Ромодин Л.А., Владимиров Ю.А. Дигидрокверцетин и тролокс как ингибиторы липопероксидазной активности комплекса цитохрома С с кардиолипином // Вестник новых медицинских технологий, Т. 28, №1. 2021, с. 69-71]: дигидрокверцетин вызывал дозозависимое снижение интенсивности хемилюминесценции на протяжении всего измерения, при этом свободнорадикальная реакция начиналась сразу после внесения Н2O2 в систему, тролокс вначале вызывал полное угнетение реакции (латентный период), однако потом имела место вспышка хемилюминесценции, идентичная по амплитуде (максимальной интенсивности) и продолжительности той, что наблюдалась без антиоксиданта. То есть как раз, видимо, вначале цитохром С, проявлявший в той системе свойства фермента-пероксидазы, реагировал с тролоксом, и, только когда тролокс полностью заканчивался, начинал катализировать, собственно, перекисное окисление липидов, а также взаимодействовать с производным кумарина, выполнявшей в той системе роль усилителя хемилюминесценции. Очевидно, что в данном случае применять поправочную на расходование производного кумарина функцию, выведенную на системе, в которой антиоксиданта не было, категорически нельзя - необходимо выводить корректирующую функцию для системы с тролоксом, причем для каждой концентрации тролокса необходимо собственная поправочная функция. Также различия в кинетике расходования кумаринового производного по сравнению с пробой без антиоксиданта вполне могут иметь место и в случае добавления в систему дигидрокверцетина. Поэтому для каждой системы необходимо выводить свою собственную поправочную функцию. Только в этом случае по завершению исследования экспериментатор будет иметь полностью адекватные данные. При этом, естественно, каждое измерение желательно проводить несколько раз, чтобы добиться статистической достоверности.
Технический результат - увеличение точности результата и достоверности и адекватности полученных данных.
Техническое решение заявленного объекта заключается в том, что в отличие от известного способа-прототипа, спектрофотометрическое исследование участия усилителя хемилюминесценции в липопероксидазной реакции производится с учетом влияния на этот процесс про- или антиоксиданта, добавленного в систему, а также то, что данный способ подразумевает выведение откорректированной хемилюминесцентной кривой, реально отражающей интенсивность протекания перекисного окисления липидов в исследуемом образце. А потому становится возможным анализ действия этого про- или антиоксиданта на интенсивность перекисного окисления липидов, которую отражает значение интенсивности хемилюминесценции, откорректированное с учетом уменьшения концентрации ее усилителя в сравнении с начальным значением этой концентрации.
Способ заключается в регистрации серии спектров оптической плотности реакционной смеси при регистрации хемилюминесцентного сигнала от смеси идентичного состава. На основании серии спектров оптической плотности производится вычисление концентраций усилителя хемилюминесценции в конкретные моменты времени реакции. Реакция запускается внесением в систему пероксида. После чего производится регистрация серии спектров оптической плотности реакционной смеси.
Также на основании указанной серии спектров возможно и вычисление концентраций антиоксиданта или дополнительного прооксиданта, внесенного в систему, и катализатора липидной пероксидации, например, фермента-пероксидазы. Заметим, что определение, скажем, концентрации антиоксиданта в различные моменты времени реакции позволит исследовать также и кинетику его участия в реакции и, таким образом, - механизм его действия, что позволит разработать более эффективные методы его клинического применения. На основании данных о снижении концентрации усилителя хемилюминесценции необходимо вывести функции для вычисления поправочных коэффициентов на уменьшение его концентрации и с их помощью обработать результат измерения интенсивности этого свечения. Серии спектров оптической плотности регистрируются на спектрофотометре при использовании следующих параметров: продолжительность регистрации спектра - 1 минута, скорость регистрации -5 нм/с, дискрета (шаг) - 0,5 или 1 нм, в зависимости от технических возможностей спектрофотометра, диапазон длин волн 300-600 нм. Временные промежутки между измерениями составляют: 10 секунд - с первого по седьмое измерение, 60 секунд - с 7-го по 30-е измерения, 120 секунд - с 30-го измерения. Всего следует проводить от 35 до 70 измерений.
Во время между запуском реакции внесением в систему пероксида и началом регистрации первого спектра оптической плотности реакционную смесь следует перемешать пипетированием в течение 5-15 секунд.
Регистрацию первого спектра оптической плотности следует начинать проводить не более чем через 15 секунд после начала реакции
В случае, если максимумы поглощения веществ, концентрацию которых необходимо определять, находятся за пределами диапазона длин волн 300-600 нм, данный диапазон необходимо расширить, но при этом скорректировать скорость регистрации спектра таким образом, что время регистрации спектра составляло 1 минуту.
Вычисление концентраций веществ следует проводить с использованием математического выражения закона Бугера-Ламберта-Бера для смеси веществ. Это позволит определить концентрации активатора хемилюминесценции, фермента-пероксидазы и, при необходимости, других участников реакции. Формулы для вычисления этих веществ выводятся путем решения системы уравнений, число которых в ней соответствует числу веществ, концентрации которых необходимо учитывать при анализе значений оптической плотности смеси. Для анализа концентраций следует использовать значения оптической плотности смеси на длинах волн, на которых значения коэффициентов молярного поглощения (коэффициентов молярной экстинкции) этих компонентов различны. В случае, если вклад в оптическую плотность смеси каких-либо компонентов много меньше, чем таковой для анализируемого усилителя хемилюминесценции, пероксидазы, антиоксиданта и пр., то для большей простоты расчета им можно пренебречь. В этом случае число уравнений в системе сократится. В общем виде система указанная система уравнений для смеси веществ, обозначаемых числами 1,2, 3 и т.д. до обозначения последнего вещества буквой п, оптическая плотность которой известна на длинах волн, обозначаемых числами 1, 2, 3 до га, выглядит следующим образом:
,
1
2
3
m
1
2
3
n
11
12
1n
mn
где A, А, A, A - оптическая плотность смеси на соответствующих длинах волн, C, С, С, С - концентрации соответствующих веществ ε, ε, ε, ε - коэффициент молярного поглощения вещества 1 на длине волны l, вещества 2 на длине волны l, вещества n на длине волны l, вещества n на длине волны m и т.д., l - длина оптического пути (толщина спектрофотометрической кюветы).
Систему, состоящую более чем из трех уравнений целесообразно решать методом Гаусса, используя при этом ЭВМ.
В случае, если основной вклад в оптическую плотность смеси вносят фермент-пероксидаза, усилитель хемилюминесценции и про- или антиоксидант, то система сводится к трем уравнениям. Обозначив 3 вещества буквами X, Y и Z вместо цифр 1, 2 и 3, получаем решение системы уравнений в следующем виде:
На основании полученных значений концентрации необходимо вычислить, приняв начальную концентрацию за единицу, долю концентрации, остающуюся в системе в различные моменты времени реакции. Доля концентрации равна отношению значения концентрации в какой-то момент времени к ее значению в начальный момент реакции. Так как концентрация усилителя хемилюминесценции намного меньше концентрации других участников реакции, то константу скорости его разрушения можно вычислять как константу скорости реакции псевдопервого порядка. В случае ферментативного катализа липопероксидазной реакции концентрация пероксидазы может быть и меньше концентрации усилителя хемилюминесценции, однако в силу того, что ее концентрация как фермента не уменьшается или уменьшается незначительно в процессе реакции, то получается, что можно считать, что скорость разрушения усилителя хемилюминесценции не зависит от концентрации фермента-пероксидазы.
Таким образом, используя вычисленную константу скорости реакции псевдопервого порядка для разрушения усилителя хемилюминесценции к, можно вывести зависимость значения их концентрации С от времени t при помощи общеизвестного уравнения для необратимой химической реакции первого порядка:
0
-kt
С=Ce
0
, С - начальная концентрация, е - основание натурального логарифма. Размерность константы скорости первого порядка k равна обратным единицам времени.
0
cor
Принимая значение С в формуле за единицу, мы получим функцию, характеризующую долю активатора хемилюминесценции, остающуюся в системе в момент времени t. А разделив единицу на эту функцию, мы получаем функцию поправочного коэффициента K на уменьшение концентрации усилителя хемилюминесценции:
cort
Поправочный коэффициент для конкретного момента времени K можно рассчитать и не вычисляя эффективных констант скорости:
t
, где C - доля от начальной концентрации усилителя хемилюминесценции в момент времени t. В этом случае можно получить таблицу поправочных коэффициентов, на которые следует умножать значения интенсивности хемилюминесценции в соответствующие моменты времени.
e
c
Умножая на данные поправочные коэффициенты для соответствующих моментов времени зарегистрированные на хемилюминометре значения интенсивности люминесценции J, экспериментатор получит значения J, какие бы были в эти моменты времени у интенсивности хемилюминесценции, если бы ее усилитель не расходовался в процессе реакции. Поправочная функция в общем виде выглядит следующим образом:
В силу того, что приведенный способ выведения поправочной функции включает в себя ряд допущений, мы считаем целесообразным в некоторых системах выводить различные функции для различных временных отрезков от начала реакции. И если временной диапазон начинается не с момента запуска реакции, то в формуле появляется дополнительный технический коэффициент А, который равен частному единицы и доли усилителя хемилюминесценции, остающейся в системе на момент времени, равный первому значению временного диапазона, для которого актуальна константа скорости реакции разрушения усилителя. Поправочная функция для интенсивности хемилюминесценции на уменьшение концентрации ее усилителя с учетом этого приобретает вид:
,
1
1
1
2
где при t=0 А=1, а при t>0 А>1, a t и t - время от начала реакции, соответствующее начальной и конечной границе временного диапазона, в котором константа k адекватна.
Примеры использования метода.
Пример 1. Изучение ингибирования тролоксом липидной пероксидации, катализируемой комплексом цитохрома С с кардиолипином как факультативной пероксидазой, методом регистрации хемилюминесценции, усиленной coumarin-334.
2
2
Допустим, необходимо изучить антиоксидантные свойства тролокса на системе, в которой протекает липопероксидазная реакция, катализируемая комплексом цитохрома С с кардиолипином (цитохром С является факультативной пероксидазой, катализирующей липопероксидазную реакцию при связывании с кардиолипином), методом регистрации усиленной coumarin-334 (хинолизидин[5,6,7-gh]3-ацетилкумарином) хемилюминесценции. В данном примере на место coumarin-334 можно поставить любое производное кумарина: coumarin-314 (хинолизидин[5,6,7-gh]3-этоксикарбонилкумарин), coumarin-525 (хинолизидин[5,6,7-gh]3,2'-бензимидазолилкумарин), 3-(2-нитровинил),7-диэтиламино-кумарин, охратоксин-А или любое другое. Известно, что данные вещества являются субстратами цитохрома С, проявляющего пероксидазную активность при связывании с кардиолипином [Ромодин Л.А., Владимиров Ю.А., Шангин С.В., Владимиров Г.К., Лысенко Н.П., Демихов Е.И. Изохинолизиновые производные кумарина в качестве активаторов хемилюминесценции в реакциях липидной пероксидации // Биофизика. - 2020. - Т. 65, №4. С: 680-690], однако внесение тролокса в систему, почти не снижая максимальной интенсивности свечения, дозозависимо задерживает наступление вспышки при внесении в систему НО [Ромодин Л.А., Владимиров Ю.А. Дигидрокверцетин и тролокс как ингибиторы липопероксидазной активности комплекса цитохрома С с кардиолипином // Вестник новых медицинских технологий, Т. 28, №1. 2021, с. 69-71], это наталкивает на мысль, что в первые секунды реакции цитохром С реагирует только с тролоксом, не реагируя ни с coumarin-334, ни с липидами, а потому для этой системы необходимо вычислить собственную поправочную на снижение концентрации coumarin-334 функцию. Для изучения особенностей расходования coumarin-334 в данной системе следует выполнить следующий алгоритм (объемы приведены для кюветы объемом 3 мл):
1. В кювету спектрофотометра добавить 300 мкл 100 мкМ раствора цитохрома С.
2. В кювету спектрофотометра добавить кардиолипин и липидный субстрат.  случае, если используется кардиолипин с мононенасыщенными или насыщенными ацилами, целесообразно вносить 150 мкл 6000 мкмоль/л раствора кардиолипина и 150 мкл 6000 мкмоль/л раствора легкоокисляемого липида, например дилинолеилфосфатидной кислоты, если же используется кардиолипин с мононенасыщенными ацилами, можно вносить 300 мкл 6000 мкмоль/л раствора кардиолипина, который будет выступать и в роли кардиолипина-кофактора, обеспечивающего проявление цитохром С пероксидазной активности.
3. Добавить в кювету спектрофотометра добавить 1800 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера.
4. Добавить в кювету 75 мкл 1000 мкмоль/л раствора coumarin-334.
5. Внести в кювету 300 мкл раствора тролокса, целесообразно вносить растворы концентрациями в диапазоне 2-50 мкмоль/л для получения начальных концентраций тролокса в системе в диапазоне 0,2-5 мкмоль/л. В контрольную пробу вместо антиоксиданта вносится 300 мкл фосфатного буфера.
6. Добавить в кювету спектрофотометра 300 мкл раствора перекиси водорода, концентрацией 2150 мкмоль/л (при изучении квазилипоксигеназной реакции - 300 мкл буферного раствора), перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд, после чего начать первую регистрацию спектра оптической плотности, продолжительность регистрации составляет 1 минуту, диапазон измерения: 300-600 нм при скорости измерения 5 нм/с, дискрета - 0,5 нм, ширина оптической щели - 5 нм.
7. Через 10 секунд после завершения первой регистрации провести вторую;
8. После завершения второй регистрации с интервалами, равными 10 секундам, провести еще 6 регистраций спектра оптической плотности;
9. Далее с временным интервалом, равным 1 минуте, провести регистрацию спектра оптической плотности 23 раза.
10. Далее с временным интервалом, равным 2 минутам, провести регистрацию спектра оптической плотности 5-40 раз.
Для каждого спектра оптической плотности вычисляются концентрации coumarin-334 и цитохрома С решением системы уравнений, составляемой для каждого полученного спектра, исходя из того, что максимум поглощения цитохрома С находится на длине волны 409 нм, а coumarin-334-460 нм, в случае использования другого производного кумарина длина волны может быть иной, максимум поглощения определяется спектрофотометрически, для coumarin-314 эта длина волны составляет 447,5 нм, для coumarin-525 - 460 нм:
кум
1
2
1цитC
2цитC
1кум
2кум
цитC
, где С - концентрация coumarin-334, моль/л; A - значение оптической плотности (поглощения) на длине волны 409 нм; А - значение оптической плотности (поглощения) на длине волны 460 нм; ε - коэффициент молярного поглощения цитохрома С на длине волны 409 нм; ε - коэффициент молярного поглощения цитохрома с на длине волны 460 нм; ε - коэффициент молярного поглощения кумарина С-334 на длине волны 409 нм; ε - коэффициент молярного поглощения кумарина С-334 на длине волны 460 нм; l - толщина кюветы (длина оптического пути), см; С - концентрация цитохрома С, моль/л.
Параллельная регистрация хемилюминесценции, при условии, что общий объем кюветы равен 1 мл:
1. В кювету хемилюминометра добавить 100 мкл 100 мкмоль/л раствора цитохрома С;
2. В кювету хемилюминометра добавить кардиолипин и липидный субстрат.В случае, если используется кардиолипин с мононенасыщенными или насыщенными ацилами, целесообразно вносить 50 мкл 6000 мкмоль/л раствора кардиолипина и 50 мкл 6000 мкмоль/л раствора легкоокисляемого липида, например дилинолеилфосфатидной кислоты, если же используется кардиолипин с мононенасыщенными ацилами, можно вносить 100 мкл 6000 мкмоль/л раствора кардиолипина, который будет выступать и в роли кардиолипина-кофактора, обеспечивающего проявление цитохром С пероксидазной активности;
3. Добавить в кювету хемилюминометра добавить 600 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера
4. В кювету хемилюминометра добавить 25 мкл 1000 мкмоль/л раствора coumarin-334.
5. Внести в кювету 100 мкл раствора тролокса, целесообразно вносить растворы концентрациями в диапазоне 2-50 мкмоль/л для получения начальных концентраций тролокса в системе в диапазоне 0,2-5 мкмоль/л. В контрольную пробу вместо антиоксиданта вносится 100 мкл фосфатного буфера.
6. Запустить регистрацию хемилюминесценции и регистрировать сигнал в течение 30-60 секунд.
7. Добавить в кювету хемилюминометра 100 мкл раствора перекиси водорода, концентрацией 2150 мкмоль/л (в контрольную пробу - 100 мкл буферного раствора), продолжить регистрацию хемилюминесцентного сигнала.
8. Регистрировать хемилюминесцентный сигнал в течение 130 минут (регистрацию можно прекратить раньше, если значение интенсивности хемилюминесценции стабильно вернулось к фоновому значению).
Далее необходимо разделить все значения концентрации coumarin-334 на начальное значение, получив значения доли от начальной концентрации coumarin-334 в системе в различные моменты времени реакции. Разделив единицу на эти значения, экспериментатор получит таблицу поправочных коэффициентов, на которые следует умножать значения интенсивности хемилюминесценции. Однако для более адекватной корректировки хемилюминесцентной кривой необходимо знать значения этих коэффициентов, соответствующие значениям времени с промежутками не более нескольких секунд. Для этого необходимо провести математическое моделирование снижения доли от начальной концентрации coumarin-334, определив эффективные константы скорости его разрушения. В этом случае возможно вывести поправочную функцию, являющуюся обратной функции остающейся доли от начальной концентрации coumarin-334, с помощью которой можно придать хемилюминесцентной кривой такой вид, какой бы она имела в случае постоянства концентрации coumarin-334 в системе на всем протяжении измерения хемилюминесценции.
Пример 2. Изучение участия coumarin-314 в квазилипоксигеназной реакции, катализируемой комплексом цитохрома С с кардиолипином как факультативной пероксидазой.
Допустим, необходимо изучить возможное участие хинолизидин[5,6,7-gh]3-этоксикарбонилкумарина, известного в литературе как coumarin-314, в квазилипоксигеназной реакции, катализируемой комплексом цитохрома С с тетраолеилкардиолипином. Субстратом квазилипоксигеназной реакции являются липидные гидроперекиси. Небольшое, но достаточное их число может содержаться в препарате фосфатидной кислоты. Желательно использовать такую фосфатидную кислоту, в состав которой входит хотя бы один полиненасыщенный ацил, однако, может подойти и диолеилфосфатидная кислота. Вместо фосфатидной кислоты можно использовать другие фосфолипиды с непредельными, крайне желательно -полиненасыщенными, ацилами.
Для изучения особенностей расходования coumarin-314 в данной системе следует выполнить следующий алгоритм (объемы приведены для кюветы объемом 3 мл):
1. В кювету спектрофотометра добавить 300 мкл 100 мкМ раствора цитохрома С.
2. В кювету спектрофотометра добавить 150 мкл 6000 мкмоль/л раствора тетраолеилкардиолипина.
3. Добавить в кювету спектрофотометра добавить 2250 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера.
4. Добавить в кювету 150 мкл 500 мкмоль/л раствора coumarin-314.
5. Добавить в кювету спектрофотометра 150 мкл раствора фосфатидной кислоты или другого легкоокисляемого фосфолипида, концентрацией 6000 мкмоль/л, перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд, после чего начать первую регистрацию спектра оптической плотности, продолжительность регистрации составляет 1 минуту, диапазон измерения: 300-600 нм при скорости измерения 5 нм/с, дискрета - 0,5 нм, ширина оптической щели - 5 нм.
6. Через 10 секунд после завершения первой регистрации провести вторую;
7. После завершения второй регистрации с интервалами, равными 10 секундам, провести еще 6 регистраций спектра оптической плотности;
8. Далее с временным интервалом, равным 1 минуте, провести регистрацию спектра оптической плотности 23 раза;
9. Далее с временным интервалом, равным 2 минутам, провести регистрацию спектра оптической плотности 5-40 раз.
Для каждого спектра оптической плотности вычисляются концентрации coumarin-314 и цитохрома С решением системы уравнений, составляемой для каждого полученного спектра, исходя из того, что максимум поглощения цитохрома С находится на длине волны 409 нм, а coumarin-314 - на 447,5 нм:
кум
1
2
1цитC
2цитC
1кум
2кум
цитC
, где С - концентрация coumarin-314, моль/л; A - значение оптической плотности (поглощения) на длине волны 409 нм; А - значение оптической плотности (поглощения) на длине волны 447,5 нм; ε - коэффициент молярного поглощения цитохрома С на длине волны 409 нм; ε - коэффициент молярного поглощения цитохрома С на длине волны 447,5 нм; ε - коэффициент молярного поглощения кумарина С-314 на длине волны 409 нм; ε - коэффициент молярного поглощения кумарина С-314 на длине волны 447,5 нм; l - толщина кюветы (длина оптического пути), см; С - концентрация цитохрома С, моль/л.
Параллельная регистрация хемилюминесценции, при условии, что общий объем кюветы равен 1 мл:
1. В кювету хемилюминометра добавить 100 мкл 100 мкмоль/л раствора цитохрома С.
2. В кювету хемилюминометра добавить 50 мкл 6000 мкмоль/л раствора тетраолеилкардиолипина.
3. Добавить в кювету спектрофотометра добавить 750 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера.
4. В кювету хемилюминометра добавить 50 мкл 500 мкмоль/л раствора coumarin-314.
5. Добавить в кювету хемилюминометра 50 мкл раствора фосфатидной кислоты или другого легкоокисляемого фосфолипида, концентрацией 6000 мкмоль/л, перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд, после чего запустить регистрацию хемилюминесценции и регистрировать сигнал в течение 5-130 минут (регистрацию можно прекратить раньше, если значение интенсивности хемилюминесценции стабильно вернулось к фоновому значению).
-1
Далее необходимо разделить все значения концентрации coumarin-314 на начальное значение, получив значения доли от начальной концентрации coumarin-314 в системе в различные моменты времени реакции. Разделив единицу на эти значения, экспериментатор получит таблицу поправочных коэффициентов, на которые следует умножать значения интенсивности хемилюминесценции. При этом снижения концентрации крайне незначительно. Константа скорости реакции псевдопервого порядка для разрушения coumarin-314 равна (0,0002±0,0001) с. Таким образом, в случае квазилипоксигенаной реакции, катализируемой комплексом цитохрома С с тетраолеилкардиолипином поправочную на расход coumarin-314 функцию можно не использовать. Если же требуется ее применение, то она имеет вид:
,
c
e.
где е - основание натурального логарифма; t - время от начала реакции; J - откорректированное значение интенсивности хемилюминесценции в момент времени t; J - ее значение, измеренное хемилюминометром, в момент времени t
Пример 3. Изучение участия coumarin-314 в липопероксидазной реакции, катализируемой комплексом цитохрома С с кардиолипином как факультативной пероксидазой.
Допустим, необходимо изучить возможное участие хинолизидин[5,6,7-gh]3-этоксикарбонилкумарина, известного в литературе как coumarin-314, в липопероксидазной реакции, катализируемой комплексом цитохрома С с тетраолеилкардиолипином. Так как тетраолеилкардиолипин является достаточно трудноокисляемым фосфолипидом, то целесообразно вносить в систему дополнительный, более легкоокисляемый, липидный субстрат. В качестве такового можно использовать фосфатидную кислоту. Желательно использовать такую фосфатидную кислоту, в состав которой входит хотя бы один полиненасыщенный ацил, однако, может подойти и диолеилфосфатидная кислота. Вместо фосфатидной кислоты можно использовать другие фосфолипиды с непредельными, крайне желательно -полиненасыщенными, ацилами.
Для изучения особенностей расходования coumarin-314 в данной системе следует выполнить следующий алгоритм (объемы приведены для кюветы объемом 3 мл):
1. В кювету спектрофотометра добавить 300 мкл 100 мкМ раствора цитохрома С.
2. В кювету спектрофотометра добавить 150 мкл 6000 мкмоль/л раствора тетраолеилкардиолипина.
3. Добавить в кювету спектрофотометра добавить 1950 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера.
4. Добавить в кювету 150 мкл 500 мкмоль/л раствора coumarin-314.
5. Добавить в кювету спектрофотометра 150 мкл раствора фосфатидной кислоты или другого легкоокисляемого фосфолипида, концентрацией 6000 мкмоль/л, перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд.
2
2
6. Добавить в кювету 300 мкл 2150 мкмоль/л НО, после чего начать первую регистрацию спектра оптической плотности, продолжительность регистрации составляет 1 минуту, диапазон измерения: 300-600 нм при скорости измерения 5 нм/с, дискрета - 0,5 нм, ширина оптической щели - 5 нм.
7. Через 10 секунд после завершения первой регистрации провести вторую;
8. После завершения второй регистрации с интервалами, равными 10 секундам, провести еще 6 регистраций спектра оптической плотности;
9. Далее с временным интервалом, равным 1 минуте, провести регистрацию спектра оптической плотности 23 раза;
10. Далее с временным интервалом, равным 2 минутам, провести регистрацию спектра оптической плотности 5-40 раз.
Для каждого спектра оптической плотности вычисляются концентрации coumarin-314 и цитохрома С решением системы уравнений, составляемой для каждого полученного спектра, исходя из того, что максимум поглощения цитохрома С находится на длине волны 409 нм, а coumarin-314 - на 447,5 нм:
,
кум
1
2
1итC
2цитC
1кум
2кум
цитC
где С - концентрация coumarin-314, моль/л; A - значение оптической плотности (поглощения) на длине волны 409 нм; А - значение оптической плотности (поглощения) на длине волны 447,5 нм; ε - коэффициент молярного поглощения цитохрома С на длине волны 409 нм; ε - коэффициент молярного поглощения цитохрома с на длине волны 447,5 нм; ε - коэффициент молярного поглощения кумарина С-314 на длине волны 409 нм; ε - коэффициент молярного поглощения кумарина С-314 на длине волны 447,5 нм; l - толщина кюветы (длина оптического пути), см; С - концентрация цитохрома С, моль/л.
Параллельная регистрация хемилюминесценции, при условии, что общий объем кюветы равен 1 мл:
1. В кювету хемилюминометра добавить 100 мкл 100 мкмоль/л раствора цитохрома С;
2. В кювету хемилюминометра добавить кардиолипин и липидный субстрат. В случае, если используется кардиолипин с мононенасыщенными или насыщенными ацилами, целесообразно вносить 50 мкл 6000 мкмоль/л раствора кардиолипина и 50 мкл 6000 мкмоль/л раствора легкоокисляемого липида, например дилинолеилфосфатидной кислоты, если же используется кардиолипин с мононенасыщенными ацилами, можно вносить 100 мкл 6000 мкмоль/л раствора кардиолипина, который будет выступать и в роли кардиолипина-кофактора, обеспечивающего проявление цитохром С пероксидазной активности;
3. Добавить в кювету хемилюминометра добавить 500 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера
4. В кювету хемилюминометра добавить 25 мкл 1000 мкмоль/л раствора coumarin-334.
5. Добавить в кювету хемилюминометра 50 мкл раствора фосфатидной кислоты или другого легкоокисляемого фосфолипида, концентрацией 6000 мкмоль/л, перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд, после чего запустить регистрацию хемилюминесценции и регистрировать сигнал в течение 5 минут (регистрацию можно прекратить раньше, если значение интенсивности хемилюминесценции стабильно вернулось к фоновому значению).
6. Добавить в кювету хемилюминометра 100 мкл раствора перекиси водорода концентрацией 2150 мкмоль/л (в контрольную пробу - 100 мкл буферного раствора), продолжить регистрацию хемилюминесцентного сигнала.
7. Регистрировать хемилюминесцентный сигнал в течение 130 минут (регистрацию можно прекратить раньше, если значение интенсивности хемилюминесценции стабильно вернулось к фоновому значению).
-1
-1
-1
-1
-1
Далее необходимо разделить все значения концентрации coumarin-314 на начальное значение, получив значения доли от начальной концентрации coumarin-314 в системе в различные моменты времени реакции. Разделив единицу на эти значения, экспериментатор получит таблицу поправочных коэффициентов, на которые следует умножать значения интенсивности хемилюминесценции. Константа скорости реакции псевдопервого порядка для разрушения coumarin-314 равна (0,0027±0,0006) с при t∈(0;325] с, (0,00039±0,00012) с при t∈(300;570] с, (0,00014±0,00002) с при t∈(570;1200] с, (0,000065±0,000006) с при t∈(1200;1905] с, (0,000031±0,000003) с при t∈(1905;3600] с, а поправочная функция на разрушение coumarin-314 в данной системе имеет вид:
,
c
e.
где е - основание натурального логарифма; t - время от начала реакции; J -откорректированное значение интенсивности хемилюминесценции в момент времени t; J - ее значение, измеренное хемилюминометром, в момент времени t
Пример 4. Изучение участия родамина 6G в пероксидазной реакции, катализируемой лактопероксидазой как истинной пероксидазой, в присутствии ретинола.
Определение участия усилителя хемилюминесценции родамина 6G в катализируемой лактопероксидазой пероксидазной реакции в присутствии витамина А. Для этого необходимо провести регистрацию спектра оптической плотности реакционной смеси по следующему алгоритму:
1. В кювету спектрофотометра добавить 300 мкл 100 мкМ раствора лактопероксидазы.
2. В кювету спектрофотометра добавить 300 мкл 10 мМ раствора йодида калия. Данное вещество выступает в роли восстановительного субстрата в каталитическом цикле лактопероксидазы.
3. Добавить в кювету спектрофотометра добавить 1650 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера.
4. Добавить в кювету 150 мкл 500 мкмоль/л раствора родамина 6G.
5. Внести в кювету 300 мкл раствора ретиноола, допустимо вносить иные формы витамина А, например ретиналь, ретиноевую кислоту, ретинолацетат или ретинолпальмиат. Целесообразно вносить растворы концентрациями в диапазоне 2-50 мкмоль/л для получения начальных концентраций тролокса в системе в диапазоне 0,2-5 мкмоль/л. В контрольную пробу вместо антиоксиданта вносится 300 мкл фосфатного буфера.
6. Добавить в кювету спектрофотометра 300 мкл раствора перекиси водорода, концентрацией 2150 мкмоль/л (при изучении квазилипоксигеназной реакции - 300 мкл буферного раствора), перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд, после чего начать первую регистрацию спектра оптической плотности, продолжительность регистрации составляет 1 минуту, диапазон измерения: 300-600 нм при скорости измерения 5 нм/с, дискрета - 0,5 нм, ширина оптической щели - 5 нм.
7. Через 10 секунд после завершения первой регистрации провести вторую;
8. После завершения второй регистрации с интервалами, равными 10 секундам, провести еще 6 регистраций спектра оптической плотности;
9. Далее с временным интервалом, равным 1 минуте, провести регистрацию спектра оптической плотности 23 раза.
10. Далее с временным интервалом, равным 2 минутам, провести регистрацию спектра оптической плотности 5-40 раз.
Для каждого спектра оптической плотности вычисляются концентрации витамина А, лактопероксидазы и родамина 6G путем решения систем уравнений, составляемых для каждого полученного спектра, исходя из того, что максимум поглощения лактопероксидазы находится на длине волны 409 нм, а родамина 6G - 524 нм, ретинола - 325 нм. У других форм витамина А максимум поглощения находится на других длинах волн: ретиналя - 375 на, ретиноевой кислоты - 347 нм, ретинолацетата и ретинолпальмиата - 326 нм. Однако для любой формы витамина А может быть допустима оценка концентрации по значению оптической плотности на длине волны 330 нм. Формула определения концентраций в данной системе имеет вид:
,
1
2
3
A
P
R
1A
1P
1R
2A
2P
2R
3A
3P
3R
где A - оптическая плотность смеси на длине волны, соответствующей максимуму поглощению витамина А: 325 нм для ретинола, 375 нм для ретиналя, 347 нм для ретиноевой кислоты, 326 нм для ретинолацетата и ретинолпальмиата, для форм витамина А допустимо использование значений оптической плотности на длине волны 330 нм, А и А - оптическая плотность в максимумах поглощения лактопероксидазы и родамина 6G: 409 нм (полоса Соре) и 524 нм; С, С и C - концентрация витамина А, лактопероксидазы и родамина 6G соответственно; ε, ε, ε - коэффициент молярного поглощения витамина А, лактопероксидазы, родамина 6G на длине волны, соответствующей максимуму поглощения витамина А, ε, ε, ε - коэффициенты молярного поглощения данных веществ на длине волны 409 нм, ε, ε, ε - коэффициенты молярного поглощения данных веществ на длине волны 524 нм, l - толщина кюветы, см.
Параллельная регистрация хемилюминесценции, при условии, что общий объем кюветы равен 1 мл:
1. В кювету хемилюминометра добавить 100 мкл 100 мкмоль/л раствора лактопероксидазы.
2. В кювету хемилюминометра добавить 100 мкл 10 мМ раствора йодида калия.
3. Добавить в кювету хемилюминометра добавить 550 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера
4. В кювету хемилюминометра добавить 50 мкл 500 мкмоль/л раствора родамина 6G.
5. Внести в кювету 100 мкл раствора ретиноола, допустимо вносить иные формы витамина А, например ретиналь, ретиноевую кислоту, ретинолацетат или ретинолпальмиат.Целесообразно вносить растворы концентрациями в диапазоне 2-50 мкмоль/л для получения начальных концентраций тролокса в системе в диапазоне 0,2-5 мкмоль/л. В контрольную пробу вместо антиоксиданта вносится 300 мкл фосфатного буфера.
6. Запустить регистрацию хемилюминесценции и регистрировать сигнал в течение 30-60 секунд.
7. Добавить в кювету хемилюминометра 100 мкл раствора перекиси водорода, концентрацией 2150 мкмоль/л (в контрольную пробу - 100 мкл буферного раствора), продолжить регистрацию хемилюминесцентного сигнала.
8. Регистрировать хемилюминесцентный сигнал в течение 130 минут (регистрацию можно прекратить раньше, если значение интенсивности хемилюминесценции стабильно вернулось к фоновому значению).
Далее необходимо разделить все значения концентрации родамина 6G на начальное значение, получив значения доли от начальной концентрации родамина 6G в системе в различные моменты времени реакции. Разделив единицу на эти значения, экспериментатор получит таблицу поправочных коэффициентов, на которые следует умножать значения интенсивности хемилюминесценции. Однако для более адекватной корректировки хемилюминесцентной кривой необходимо знать значения этих коэффициентов, соответствующие значениям времени с промежутками не более нескольких секунд. Для этого необходимо провести математическое моделирование снижения доли от начальной концентрации родамина 6G, определив эффективные константы скорости его разрушения. В этом случае возможно вывести поправочную функцию, являющуюся обратной функции остающейся доли от начальной концентрации родамина 6G, с помощью которой можно придать хемилюминесцентной кривой такой вид, какой бы она имела в случае постоянства концентрации родамина 6G в системе на всем протяжении измерения хемилюминесценции.
Пример 5. Изучение расходования родамина 6G в системе, в которой протекает ферментативная липоксигеназная реакция
Ферменты-липоксигеназы катализируют реакции окисления двойных связей между атомами углерода в алифатических группировках до пероксида. В живых клетках образовавшиеся липидные перекиси могут становится окислительными субстратами ферментов-пероксидаз в квазилипоксигеназной реакции или же запускать процесс неферментативной липидной пероксидации. Допустим, нужно изучить интенсивность липидной пероксидации в системе, в которой происходит наработка липидных перекисей под действием ферментативной липоксигеназной реакции методом регистрации хемилюминесценции, усиленной родамином 6G. В качестве конкретного примера можно рассмотреть окисление арахидоновой кислоты под действием арахидонат 15-липоксигеназы (арахидонат:кислород 15-оксидоредуктазы), окисляющей исключительно двойную связь в положении 15. По аналогии можно изучать любую другую липоксигеназу.
Исследование следует по следующему алгоритму:
1. В кювету спектрофотометра добавить 300 мкл 100 мкМ раствора арахидонат 15-липоксигеназы.
2. Добавить в кювету спектрофотометра добавить 1950 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера.
3. Добавить в кювету 150 мкл 500 мкмоль/л раствора родамина 6G.
4. Добавить в кювету спектрофотометра 600 мкл раствора арахидоновой кислоты концентрацией 6000 мкмоль/л, перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд, после чего начать первую регистрацию спектра оптической плотности, продолжительность регистрации составляет 1 минуту, диапазон измерения: 300-600 нм при скорости измерения 5 нм/с, дискрета - 0,5 нм, ширина оптической щели - 5 нм.
5. Через 10 секунд после завершения первой регистрации провести вторую;
6. После завершения второй регистрации с интервалами, равными 10 секундам, провести еще 6 регистраций спектра оптической плотности;
7. Далее с временным интервалом, равным 1 минуте, провести регистрацию спектра оптической плотности 23 раза;
8. Далее с временным интервалом, равным 2 минутам, провести регистрацию спектра оптической плотности 5-40 раз.
Для каждого спектра оптической плотности вычисляются концентрации родамина 6G и арахидонат 15-липоксигеназы:
,
R
1
2
1Lox
2Lox
1R
2R
Lox
где C - концентрация родамина 6G, моль/л; A - значение оптической плотности (поглощения) в максимуме поглощения липоксигеназы; А - в максимуме поглощения родамина 6G; ε - коэффициент молярного поглощения липоксигеназы в максимуме ее поглощения; ε - коэффициент молярного поглощения липоксигеназы в максимуме поглощения родамина 6G; ε - коэффициент молярного поглощения родамина 6G в максимуме поглощения липоксигеназы; ε - коэффициент молярного поглощения родамина 6G в его максимуме поглощения; l - толщина кюветы (длина оптического пути), см; C - концентрация липоксигеназы, моль/л. Параллельная регистрация хемилюминесценции, при условии, что общий объем кюветы равен 1 мл:
1. В кювету хемилюминометра добавить 100 мкл 100 мкМ раствора арахидонат 15-липоксигеназы.
2. Добавить в кювету хемилюминометра добавить 650 мкл 20 ммоль/л фосфатного буфера.
3. Добавить в кювету 50 мкл 500 мкмоль/л раствора родамина 6G.
4. Добавить в кювету хемилюминометра 200 мкл раствора арахидоновой кислоты концентрацией 6000 мкмоль/л, перемешать раствор пипетированием в течение 5-15 секунд, после чего запустить регистрацию хемилюминесценции и регистрировать сигнал в течение 5-130 минут (регистрацию можно прекратить раньше, если значение интенсивности хемилюминесценции стабильно вернулось к фоновому значению).
Далее необходимо разделить все значения концентрации родамина 6G на начальное значение, получив значения доли от начальной концентрации родамина 6G в системе в различные моменты времени реакции. Разделив единицу на эти значения, экспериментатор получит таблицу поправочных коэффициентов, на которые следует умножать значения интенсивности хемилюминесценции. А вычислив константу скорости реакции разрушения родамина 6G, можно вывести поправочную на уменьшение его концентрации функцию.