НОВАЯ ВИРУСНАЯ ВЕКТОРНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ НЕЙРОНСПЕЦИФИЧЕСКОГО ОПТИМИЗИРОВАННОГО НЕПРЕРЫВНОГО СИНТЕЗА DOPA IN VIVO

1. Одновекторная система экспрессии, содержащая:
первую и вторую кассеты экспрессии,
причем указанная первая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую первую промоторную последовательность, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью,
причем первая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1; ЕС 3.5.4.16) или его биологически активный фрагмент или вариант, и
причем указанная вторая кассета экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, содержащую вторую промоторную последовательность, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью,
причем указанная вторая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид тирозингидроксилазы (ТН; ЕС 1.14.16.2) или его биологически активный фрагмент или вариант, и
причем вектором является аденоассоциированный вектор (AAV), и
причем указанная вторая нуклеотидная последовательность функционально связана с посттранскрипционным регуляторным элементом вируса гепатита сурков (WPRE), и
причем и указанный первый, и указанный второй промоторы являются промоторами синапсина 1.
2. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1; ЕС 3.5.4.16) или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 и SEQ ID NO. 6, и причем указанный полипептид тирозингидроксилазы (ТН; ЕС 1.14.16.2) или его биологически активный фрагмент или вариант по меньшей мере на 70% идентичен полипептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 и SEQ ID NO. 14.
3. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем указанный вектор не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC).
4. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем указанный вектор обладает способностью к упаковке от 1 до 40 т.п.н., например, от 1 до 30 т.п.н., такой как от 1 до 20 т.п.н., например, от 1 до 15 т.п.н., такой как от 1 до 10, например, от 1 до 8 т.п.н., такой как от 2 до 7 т.п.н., например, от 3 до 6 т.п.н., такой как от 4 до 5 т.п.н., такой как от 4,5 до 4,8 т.п.н.
5. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем аденоассоциированным вектором (AAV) является вектор AAV2, который преимущественно упаковывается в капсид AAV, отличный от капсида AAV2.
6. Одновекторная система экспрессии по п.5, причем вектор AAV2 упаковывается в капсид AAV5.
7. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем указанным биологически активным вариантом является мутированный полипептид тирозингидроксилазы, причем один или несколько из остатков S19, S31, S40 или S404 изменены на другой аминокислотный остаток.
8. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем указанная первая кассета экспрессии или указанная вторая кассета экспрессии дополнительно содержит последовательность полиаденилирования.
9. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем указанная первая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид GTP-циклогидролазы 1 (GCH1) или его биологически активный фрагмент или вариант, содержит последовательность SEQ ID NO. 18.
10. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем указанная вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид тирозингидроксилазы (ТН) или его биологически активный фрагмент или вариант, содержит последовательность SEQ ID NO. 21.
11. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем указанный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков содержит последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 85 процентной идентичностью последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90-95 процентной идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 99 процентной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO: 22.
12. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем кассеты экспрессии одновекторной системы содержат 5'-концевой повтор и 3'-концевой повтор.
13. Одновекторная система экспрессии по п.12, причем указанные обращенные концевые повторы содержат последовательности SEQ ID NO. 15 и SEQ ID NO. 16.
14. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем отношение TH:GCH1 составляет по меньшей мере 3:1, такое как по меньшей мере 4:1, например, по меньшей мере 5:1, такое как по меньшей мере 6:1, например, по меньшей мере 7:1, такое как по меньшей мере 10:1, например, 15:1, такое как 20:1, например, 25:1, такое как 30:1, например, 35:1, такое как 40:1, например, 45:1, такое как 50:1.
15. Одновекторная система экспрессии по п.14, причем отношение определено измерением активности экспрессируемых ферментов ТН и GCH1.
16. Одновекторная система экспрессии по любому из предыдущих пунктов, причем одновекторной системой является вектор, определенный на фигуре 6.
17. Одновекторная система экспрессии по п.1, причем одновекторной системой является минимально интегрирующийся вектор.
18. Применение одновекторной системы экспрессии по любому из пп.1-17 для для лечения заболевания, ассоциированного с катехоламиновой дисфункцией.
19. Применение по п.18, причем указанным заболеванием, ассоциированным с катехоламиновой дисфункцией, является заболевание, нарушение или повреждение центральной и/или периферической нервной системы.
20. Применение по п.19, причем указанным заболеванием, нарушением или повреждением центральной и/или периферической нервной системы является нейродегенеративное нарушение.
21. Применение по п.18, причем указанным заболеванием, ассоциированным с катехоламиновой дисфункцией, является заболевание базальных ганглиев.
22. Применение по п.18, причем указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), DOPA-чувствительной дистонии, ADHD, шизофрении, депрессии, сосудистого паркинсонизма, эссенциального тремора, хронического стресса, генных аномалий допаминового рецептора, хронического употребления опиода, кокаина, спирта или конопли, недостаточности надпочечников, гипертензии, недостаточности норадреналина, посттравматического стрессового нарушения, пристрастия к азартным играм, деменции, деменции с тельцами Леви.
23. Фармацевтическая композиция для применения в способе лечения болезни Паркинсона, причем указанная композиция содержит одновекторную систему экспрессии по пп.1-17 и состав для доставки указанной системы в базальные ганглии.
24. Фармацевтическая композиция по п.23, причем композиция содержит маннит, гепарин или контрастные средства для МРТ на основе гадолиния.
25. Фармацевтическая композиция по п.23, дополнительно содержащая трофические факторы или обратимо действующие ингибиторы протеасом.
26. Фармацевтическая композиция по п.23, причем рН композиции составляет от рН 4 до рН 10.
10
12
27. Фармацевтическая композиция по п.23, причем дозировка одновекторной системы составляет от 1,5·10 до 2,2·10 геномных копий одновекторной системы на миллилитр серого вещества скорлупы.
28. Способ определения соотношения экспрессии полипептида GTP-циклогидроксилазы 1 (SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 и 6) и полипептида тирозингидроксилазы (SEQ ID NO. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14), соответственно, или их вариантов, причем указанный полипептид кодируется одновекторной системой экспрессии по пп.1-17, предусматривающий измерение:
ферментной активности полипептидов, или
4
количества продуцированного BH, или
экспрессируемого количества указанных полипептидов, или
содержания транскрибированной мРНК, соответствующей полипептиду GTP-циклогидроксилазы 1 и полипептиду тирозингидроксилазы, соответственно.
29. Способ по п.28, причем отношение определяют по сочетанию активности указанных полипептидов и имеющегося количества указанных полипептидов.