Методика обработки и контроля качества биоматериала при трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3

цированного подхода к проведению заместительной терапии. Это вызвано индивидуальными особенностями не только катаболизма ФУШ:С в тесте фармакокинетики, но и возможностью

его взаимодействия с другими белками плазмы, отвечающими за пространственно-скоростные характеристики роста сгустка, запускаемые через VIIa-ТФ в тесте тромбодинамики.

Дифференциация клинических фенотипов у больных тяжелой формой гемофилии А с использованием

модифицированного теста генерации тромбина

К.Г. Копылов1, И.Д. Тарандовский2, М.А. Кумскова1, А.Н. Баландина1, О.П. Плющ1, Т.В. Северова1,Н.И. Коняшина1.

1 ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России;

2 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва

Введение. Клинические проявления геморрагического синдрома у больных, с тяжелой формой гемофилии, могут значительно варьировать между различными индивидами как по частоте их возникновения, так и по интенсивности. Большинство больных получают массивную заместительную терапию фактором ФVIII от 120 до 480 тыс. МЕ в год из-за частых рецидивов кровоизлияний, однако от 5 до 15% больных имеют "атипично-легкое" течение заболевания, несмотря на низкое содержание ФVIII:C в плазме. Механизмы, лежащие в основе формирования легкого фенотипа, остаются неизвестными. Возможность диагностики фенотипов позволит не только предсказать тяжесть клинического течения заболевания, но и определить объем предстоящей гемостатической терапии. Цель исследования - определение различия в работе системы гемостаза между легким и тяжелым клиническим фенотипом гемофилии А.

Материалы и методы. Исследование проводили у 20 взрослых больных, страдающих гемофилией А ^VIII менее 1%): у 10 - с легким и у 10 с тяжелым клиническим фенотипом. При легком фенотипе отмечено отсутствие функциональных нарушений суставов и редкое использование анти-гемофильных препаратов с детского возраста. Проводили анализ состояния системы свертывания крови через 5 дней после последней инъекции ФVIII. Образцы крови забирали в пластиковые пробирки с цитратом натрия (рН 5,5) в соотношении и с трипсиновым ингибитором ФХП из кукурузы (конечная концентрация игнибитора в крови 200 мкг/мл). Ис-

пользовали следующие лабораторные методы: определение прокоагулянтной активности ФVIII:C и АЧТВ; определение ингибитора к ФVIII; тест эндогенного тромбинового потенциала (на богатой и бедной тромбоцитами плазме: активация с помощью тканевого фактора и каолина); тромбоэластогра-фия на цельной крови (активация тканевым фактором); определение пространственного роста сгустка-тромбодинамика (на бедной тромбоцитами плазме).

Результаты и обсуждение. Исследования, проведенные на бедной тромбоцитами плазме, не выявили различий между легким и тяжелым фенотипом заболевания, включая тест тромбодинамики и тромбоэластографию. Тест генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме был модифицирован добавлением диметилсульфоксида (1,6%) с целью пролонгации процесса активации тромбоцитов.

Заключение. На тромбограмме образуется два пика: первый за счет плазмы и фосфолипидов, второй за счет тромбоцитов. Амплитуда второго пика была выше у больных с легким фенотипом (42 ± 11 nM), чем у больных, страдающими тяжелым клиническим фенотипом гемофилии (28 ± 10 nM; p < 0,02).

Заключение. Полученные результаты исследований демонстрируют наличие компенсаторного механизма системы гемостаза благодаря участию тромбоцитарного звена в тесте генерации тромбина у больных тяжелой формой гемофилии А, имеющих легкий клинический фенотип. В то же время, в плазменном звене гемостаза не выявлено наличия каких-либо механизмов компенсации гемостаза.

Методика обработки и контроля качества биоматериала при трансплантации аутологичных

гемопоэтических стволовых клеток

Е.В. Коротаев, А.А. Степанов, В.И. Рабинович, Л.П. Астахова, С.А. Пономарев АУ Югорский НИИ клеточных технологий с банком стволовых клеток, Ханты- Мансийск

Введение. Трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) - является одним из эффективных методов лечения больных с различными формами гемобластозов. Одним из наиболее важных факторов, определяющих успех ауто-ТГСК, является количество способных к репродукции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), трансплантированных больному. Основным методом контроля, позволяющим оценить количественный состав ГСК и их жизнеспособность в трансплантате, является проточная цитометрия. Однако, по различным данным, сходные методы криоконсервации трансплантационного материала приводят к значительно отличающимся друг от друга результатам. Существует необходимость оценить эти различия, а в дальнейшем определить их причины и оптимизировать технологические подходы. Цель исследования - оценка с помощью проточной цитометрии влияния общепринятой технологии замораживания и размораживания продукта лей-коцитафереза, проведенного у больных с онкогематологической патологией в ходе ауто-ТГСК, на количество в нем жизнеспособных ГСК.

Материалы и методы. Объектом исследования служил продукт лейкоцитафереза, предназначенный для ауто-ТГСК. Лейкоцитаферез осуществляли на аппарате Haemonetics МС8+ до получения общепринятой достаточной дозы ГСК (более 2 х 106 кл/кг). Продукт лейкоцитафереза, полученный за одну операцию лейкоцитафереза в асептических условиях распределяли в 5-6 криопакетов. Конечная концентрация криоконсерваната диметилсульфоксид (ДМСО),

введенного в криопакет, составила 7,5%. Криоконсервацию проводили на программном замораживателе по общепринятой методике с компенсацией выделения латентного тепла. Разморозку продукта лейкоцитафереза перед его аутотрансфузией, осуществляли на водяной бане при температуре 37-40°С. Нами проведен ретроспективный сравнительный анализ количества жизнеспособных ГСК в продукте лейко-цитафереза, до его заморозки и после разморозки при 16 ауто-ТГСК. Исследованию подвергли 91 криопакет. До распределения продукта лейкоцитафереза по криопакетам, а также после его размораживания и трансфузии больному, но уже из каждого криопакета брали предварительно хорошо перемешанную аликвоту, для оценки количества жизнеспособных ГСК в трансплантационном материале. ГСК определяли методом проточной цитометрии на проточном цитометре Cytomics FC 500, с использованием набора реагентов Stem-Kit Reagents по международному протоколу ISHAGE.

Результаты и обсуждение. Сравнительный анализ количественного состава жизнеспособных ГСК в криопакетах (п = 91) показал среднюю выживаемость ГСК - 76,4 ± 23,2%. При этом, количество трансплантированных ГСК всегда соответствовало рекомендуемой дозе - не менее 2 х 106 кл/кг.

Заключение. Значительная дисперсия полученных результатов свидетельствует о недостаточной управляемости применяемых технологий, а возможно, и методов контроля количества способных к репродукции ГСК.

116