ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ НА ОСНОВЕ РАЗРЯЖЕННЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ
FLUORESCENT METHOD FOR DETERMINING CALCIUM CONCENTRATION ON BASIS OF DISCHARGED PHOTOPROTEINS

Изобретение относится к области биофизики и может быть использовано в биологических и медицинских исследованиях для количественного определения концентрации кальция в различных средах.
2
2
4
Известен способ определения концентрации кальция, основанный на том, что оксалаты (соли щавелевой кислоты HCO) и сама щавелевая кислота образуют с солями кальция белые нерастворимые осадки [А.П.Крешков, А.А.Ярославцев. Курс аналитической химии, количественный анализ. Изд.: Москва «Химия», 1982].
-6
Известен биолюминесцентный способ определения концентрации кальция. В данном способе используются ферменты кишечнополостных - фотопротеины. Способ основан на том, что в присутствии ионов кальция запускается биолюминесцентная реакция, и интенсивность биолюминесценции зависит от концентрации кальция. [В.А.Illarionov, L.A.Frank, V.A.Illarionova, V.S.Bondar, E.S.Vysotski, J.R.Blinks Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator / J. Methods in enzymology. - 2000. - №. 277. - P.223-249]. В этом способе к 1 мл раствора, содержащего неизвестную концентрацию кальция, добавляют 10 мкл раствора 5·10 М обелина в 20 мМ TrisHCl буфере, рН 7. Далее регистрируют интенсивность биолюминесценции с помощью биохемилюминометра. По калибровочной зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации кальция определяют концентрацию кальция в тестируемом растворе.
Недостатками этого способа являются невозможность количественного определения кальция в системах in vivo и необходимость проведения химической реакции для каждого измерения.
Техническим результатом изобретения является разработка способа определения концентрации кальция в различных средах по интенсивности флуоресценции разряженного фотопротеина.
Указанный технический результат достигается тем, что при флуоресцентном способе определения концентрации кальция на основе разряженных фотопротеинов, включающем проведение биолюминесцентной реакции фотопротеинов и ионов кальция, измерение интенсивности флуоресценции раствора, построение калибровочной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах и определение значения логарифма концентрации кальция по логарифму интенсивности свечения, новым является то, что флуоресценцию инициируют источником света после завершения биолюминесцентной реакции, измеряют интенсивность флуоресценции при заданной длине волны возбуждения и регистрации.
Заявляемый способ использует флуоресценцию разряженного фотопротеина, что позволяет проводить непрерывные измерения концентрации кальция в системах in vivo. Это отличие позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна».
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».
Сущность изобретения поясняется чертежами:
На фиг.1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции в спектрах испускания разряженного фотопротеина обелина от концентрации кальция. Длина волны возбуждения 310 нм, длина волны регистрации 510 нм.
На фиг.2 представлена зависимость интенсивности флуоресценции в спектрах возбуждения разряженного фотопротеина обелина от концентрации кальция. Длина волны регистрации 470 нм, длина волны возбуждения 350 нм.
Аналогичные зависимости получены и при варьировании вязкости среды при добавлении в исследуемый раствор глицерина с образованием 1, 3, 5, 10 процентных растворов глицерина в водной среде.
Заявляемый способ определения концентрации кальция по интенсивности флуоресценции в спектре испускания осуществляется следующим образом.
-9
-8
-8
-7
-7
-6
-6
-5
-4
-3
-5
Пример 1. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина обелина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 10 М, 10 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин обелин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина измеряют при длине волны регистрации в диапазоне 460-540 нм и фотовозбуждении длинной волны в диапазоне 335-365 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах (фиг.1).
-5
Пример 1.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.
Пример 1.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. Целентеразин, являясь гидрофобным, проникает через мембрану, связываясь с синтезирующимся в клетке апообелином с образованием фотопротеина обелина. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.
-9
-8
-8
-7
-7
-6
-6
-5
-4
-3
-5
Пример 2. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина акворина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 10 М, 10 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин акворин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина измеряют при длине волны регистрации в диапазоне 440-530 нм и фотовозбуждении длинной волны в диапазоне 320-350 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.
-5
Пример 2.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.
Пример 2.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. Целентеразин, являясь гидрофобным, проникает через мембрану, связываясь с синтезирующимся в клетке апоакворином с образованием фотопротеина акворина. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.
-9
-8
-8
-7
-7
-6
-6
-5
-4
-3
-5
Пример 3. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина клитина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 10 М, 10 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин клитин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре испускания разряженного клитина измеряют при длине волны регистрации в диапазоне 400-500 нм и фотовозбуждении длинной волны в диапазоне 320-350 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.
-5
Пример 3.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного фотопротеина клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.
Пример 3.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. Целентеразин, являясь гидрофобным, проникает через мембрану, связываясь с синтезирующимся в клетке апоклитином с образованием фотопротеина клитина. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре испускания при длинах волн регистрации и возбуждения, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре испускания разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.
Заявляемый способ определения концентрации кальция по интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения осуществляется следующим образом.
-9
-8
-8
-7
-7
-6
-6
-5
-4
-3
-5
Пример 4. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина обелина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 10 М, 10 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин обелин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» обелина измеряют при длине волны возбуждения в диапазоне 335-365 нм и регистрации на длине волны в диапазоне 460-540 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах (фиг.2).
-5
Пример 4.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина обелина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.
Пример 4.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного обелина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для обелина.
-9
-8
-8
-7
-7
-6
-6
-5
-4
-3
-5
Пример 5. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина акворина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 10 М, 10 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин акворин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения разряженного акворина измеряют при длине волны возбуждения в диапазоне 320-350 нм и регистрации на длине волны в диапазоне 440-530 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.
-5
Пример 5.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина акворина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.
Пример 5.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного акворина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для акворина.
-9
-8
-8
-7
-7
-6
-6
-5
-4
-3
-5
Пример 6. Построение калибровочного графика для определения концентрации кальция с использованием фотопротеина клитина. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл водного раствора кальция разных концентраций (5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 5·10 М, 10 М, 10 М, 10 М) вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. В каждом случае раствор тщательно перемешивают в течение 1 мин для полного проведения биолюминесцентной реакции, в результате которой образуется флуоресцентный продукт, называемый разряженный фотопротеин клитин. Измерение флуоресценции проводят при непрерывном облучении раствора светом. Интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения разряженного клитина измеряют при длине волны возбуждения, входящей в диапазон 320-350 нм и регистрации на длине волны, входящей в диапазон 400-500 нм. Строят калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения «Са-разряженного» клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах.
-5
Пример 6.1. В системе in vitro, при комнатной температуре, в 230 мкл пробы, в которой нужно определить концентрацию кальция, вносят 20 мкл раствора, содержащего 5·10 М фотопротеина клитина, 20 мМ буфера TrisHCl или PIPES, рН 7. Тщательно перемешивают в течение 1 мин. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.
Пример 6.2. В систему in vivo вводят 0,1 мг целентеразина на 1 г клеток. При непрерывном облучении светом измеряют интенсивность флуоресценции в спектре возбуждения при длинах волн возбуждения и регистрации, которые использовались при построении калибровочного графика. Считают логарифм интенсивности флуоресценции. Полученное значение логарифма интенсивности подставляют в калибровочный график (зависимость интенсивности флуоресценции в спектре возбуждения разряженного клитина от концентрации кальция в двойных логарифмических координатах) и находят соответствующее ему значение логарифма концентрации кальция. Чтобы определить молярную концентрацию кальция, необходимо десять возвести в степень значения логарифма концентрации кальция, найденного по калибровочному графику для клитина.
Преимущества заявляемого способа заключаются:
- в возможности непрерывного использования первоначально введенного индикатора в течение биохимического процесса любой длительности в живых клетках;
- в бóльшей интенсивности сигнала;
- фотолюминесценция удобнее в регистрации, поскольку измерения не связаны с проведением дополнительных биохимических процессов;
- и существует возможность использовать флуоресцентный репортер кальция в сочетании с биолюминесцентным анализом.