СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПЛАСТИНЫ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОЙ КСЕНОГЕННОЙ ПОДСЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ КИШКИ
METHOD FOR MAKING PLATE FROM MODIFIED XENOGENEIC ENTERAL SUBMUCOSA

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к протезированию пораженных участков органов и тканей, стоматологии, комбустиологии, а также к области тканевой инженерии, в частности к изготовлению подложек, скаффолдов для заселения их клетками донора.
Известно множество способов обработки подслизистой оболочки тонкой кишки с целью ее дальнейшего применения в медицине.
6
Так, один из патентов описывает тканевый трансплантат, включающий оболочку подслизистой основы отрезка тонкой кишки теплокровного позвоночного. Оболочка подслизистой основы слойно отделяется от мышечной оболочки и, по крайней мере, от полостной части слизистой оболочки (Пат. РФ 2037317 С1, МПК, A61B 17/00). Далее биоматериал помещают в раствор неомицин сульфата. Недостаток настоящего метода подготовки тканевого трансплантата состоит в том, что ткань не подвергается децеллюляризации и химической обработке, которые позволили бы снизить степень иммуногенности биоматериала, а также контролировать ее биодеградацию. Также материал не проходит обработку стабилизирующими агентами, после чего его прочность повышается.
Близким к заявляемому способу изготовления подслизистой оболочки тонкой кишки является способ, описанный в патенте РФ 2438713, по которому проводят механическую обработку тонкой кишки, ее стерилизацию, обезжиривание, фиксацию с поперечным сшиванием, минимизацию антигенной активности и присоединение активного слоя. Однако настоящий метод обработки биоткани не предусматривает полное удаление клеточных элементов из коллагеновой матрицы, что может привести к возможному иммунному ответу в организме пациента.
Предлагаемый способ предусматривает механическую очистку тонкой кишки от слизистого и мышечного слоев, предварительную обработку в гипертонических растворах солей хлорида натрия с одновременным воздействием ультразвука, ферментативную обработку подслизистой оболочки тонкой кишки, отмывку в растворе уксусной кислоты и гидрокарбоната натрия, обработку хлоридом натрия, дополнительное воздействие ультразвука и повторную ферментативную обработку с последующим выдерживанием биоматериала в растворе уксусной кислоты и растворе гидрокарбоната натрия, выдержку в растворе антимикробного, а затем сшивающего агента.
Целью данного способа является снижение риска иммунного ответа на трансплантат, частичное разрушение коллагеновой структуры подслизистой оболочки тонкой кишки для обеспечения более быстрого и беспрепятственного прорастания сосудов и тканей организма пациента в пластину на основе модифицированной ксеногенной подслизистой оболочки тонкой кишки.
Сущность способа состоит в том, что биоткань перед ферментативной обработкой очищают механическим путем и помещают в гипертонические растворы хлорида натрия и подвергают воздействию ультразвука, по крайней мере, однократно, в течение 20-300 минут, затем обрабатывают протеолитическим ферментом в концентрации 0,1-10 ПЕ на 1 грамм влажной биоткани, отмывают в растворе уксусной кислоты и гидрокарбоната натрия, выдерживают в гипертонических растворах хлорида натрия, затем дополнительно подвергают воздействию ультразвука и ферментативной обработке в ацетатном буферном растворе с концентрацией фермента не менее 10,1 ПЕ на один грамм влажной биоткани с последующим выдерживанием биоматериала в растворе уксусной кислоты и растворе гидрокарбоната натрия, после чего подслизистую оболочку тонкой кишки обрабатывают антимикробным агентом и многократно заменяющимися растворами глутарового альдегида возрастающих концентраций в расправленном виде между двумя пластинами из пористого нетканого материала (например, пористый пленочный материал, изготовленный на основе смеси ацетатов целлюлозы) и стерилизуют.
Механическую очистку тонкой кишки от мышечного и слизистого слоя проводят путем воздействия на кишку набором валов, сжимающих и выдавливающих вышеуказанные слои. Также возможно применение других методов механической очистки тонкой кишки для получения из нее подслизистой оболочки: растирание, соскабливание и прочее.
При предварительной обработке в гипертонических растворах хлорида натрия очищенная подслизистая оболочка тонкой кишки подвергается ультразвуковой обработке, по крайней мере, однократно в течение 20-300 минут, а ферментативную обработку проводят в ацетатном буферном растворе, применяя к 0,1-10 ПЕ протеолитического фермента на один грамм влажной биологической ткани.
Времени обработки биоматериала ультразвуком, меньшего чем 20 минут, не достаточно для эффективного разрушения клеточных элементов, а время более 300 минут является не целесообразным, т.к. процесс разрушения клеточных элементов будет окончен.
Применение ферментативной обработки гарантированно обеспечивает разрушение оставшихся после ультразвуковой обработки клеточных элементов подслизистой оболочки тонкой кишки и белков как основных носителей антигенности.
Концентрация протеолитического фермента менее 0,1 ПЕ может быть не эффективной для разрушения оставшихся клеток биоткани и белков. Концентрация более 10 ПЕ является не целесообразной, т.к. концентрации фермента в 10 ПЕ достаточно для процесса полного разрушения клеток.
С целью инактивации воздействия протеолитического фермента на подслизистую оболочку тонкой кишки изменяют параметры, от которых напрямую зависит активность фермента, а именно температуру ацетатного буферного раствора, уровень pH. Для этого биоматериал выдерживают в охлажденном кислотном растворе и многократно промывают в проточной дистиллированной воде.
Для нейтрализации оставшейся после промывания уксусной кислоты на биоматериале подслизистую оболочку тонкой кишки помещают в раствор гидрокарбоната натрия, затем выдерживают в гипертонических растворах солей для извлечения продуктов протеолиза клеток и белков из ткани и промывают дистиллированной водой.
Повторное воздействие ультразвука на подслизистую оболочку тонкой кишки и повторная обработка раствором фермента в концентрации более 10,1 ПЕ на один грамм влажной биоткани с последующим выдерживанием биоматериала в растворе уксусной кислоты и растворе гидрокарбоната натрия приводит к частичному разрушению коллагеновой структуры подслизистой оболочки тонкой кишки без значительных изменений ее физико-механических свойств, что обеспечит более быстрое проникновение клеток ткани реципиента в трансплантат и беспрепятственное прорастание сосудов и тканей организма пациента в постоперационном периоде. Концентрация протеолитического фермента менее 10,1 ПЕ на один грамм влажной биоткани является не достаточной для начала разрушения коллагеновых волокон.
Выдерживание подслизистой оболочки тонкой кишки в антимикробном агенте позволит устранить микробную активность на поверхности подслизистой оболочки тонкой кишки. В качестве антимикробного агента могут выступать антибиотики широкого или узкого спектра действия, либо агенты на основе серебра.
Обработка подслизистой оболочки тонкой кишки растворами глутарового альдегида возрастающих концентраций необходима для стабилизации ткани, снижения ее иммуногенности. Выдерживание подслизистой оболочки тонкой кишки в растворах глутарового альдегида осуществляется в расправленном виде между двумя пластинами из пористого нетканого материала. Это позволяет получить ровную пластину, без складок, равномерно пропитанную сшивающим агентом. Использование пористого материала обеспечивает достаточную степень контакта подслизистой оболочки тонкой кишки с раствором глутаровго альдегида.
Способ изготовления пластины на основе модифицированной ксеногенной подслизистой оболочки тонкой кишки подслизистой оболочки тонкой кишки осуществляется следующим способом.
Тонкую кишку несколько раз тщательно промывают с внешней и внутренней сторон проточной водой и разрезают в продольном направлении. Затем производят деление тонкой кишки на участки длиной 10-40 см путем ее разрезания.
Далее проводят механическую очистку тонкой кишки от мышечного и слизистого слоев путем их выдавливания между двумя валами. Также возможно применение других методов механической очистки тонкой кишки для получения из нее подслизистой оболочки: растирание, соскабливание и прочее.
Полученную подслизистую оболочку тонкой кишки помещают в тару с гипертоническим раствором хлорида натрия в концентрации 1-10% и оставляют на 24-76 ч, меняя каждый день гипертонический раствор хлорида натрия в таре. Во время проведения этой обработки подслизистую оболочку подвергают воздействию ультразвука в течение 50 минут. После окончания обработки биоматериал промывают в дистиллированной воде. Далее проводят обработку протеолитическим ферментом. Для этого рассчитывают количество протеолитического фермента, необходимого для процесса: 0,1-10 ПЕ на 1 грамм влажной биоткани - и растворяют его в ацетатном буферном растворе, нагретом до 37°C. После обработки ферментом подслизистую оболочку выдерживают в инактивирующем растворе (6-60 г уксусной кислоты, 100 г хлорида натрия, 840-894 г дистиллированной воды) не менее чем 20 минут, промывают в дистиллированной воде и помещают в 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия, затем промывают дистиллированной водой. Далее проводят постферментативную обработку гипертоническими растворами хлорида натрия 2%-ной и 7%-ной концентрации в течение 24-76 ч, после чего подвергают воздействию ультразвука в течение 40 минут, промывают в проточной дистиллированной воде и производят повторную ферментативную обработку в растворе с концентрацией протеолитического фермента 10,1 ПЕ на один грамм биоткани с последующим выдерживанием биоматериала в растворе уксусной кислоты и растворе гидрокарбоната натрия, промывают в проточной дистиллированной воде. Затем производят обработку подслизистой оболочки тонкой кишки триклозаном и растворами глутарового альдегида возрастающих концентраций в расправленном виде между двумя пористыми неткаными пластинами.
Пример 1.
Тонкую кишку очищают от мышечного и слизистого слоев путем соскабливания, получая на выходе подслизистую оболочку тонкой кишки, которую помещают в тару с гипертоническим раствором хлорида натрия в концентрации 3% и оставляют на 68 ч, производя ежедневно замену гипертонического раствора хлорида натрия, затем проводят смену на 7%-ный раствор хлорида натрия и оставляют подслизистую оболочку тонкой кишки на 5 часов в данном растворе. Во время обработки биоткань однократно подвергают воздействию ультразвука в течение 110 минут. По истечении времени предварительной обработки образцы многократно промывают в дистиллированной воде и проводят ферментативную обработку. Для этого рассчитывают количество протеолитического фермента, необходимого для процесса: 1 ПЕ на 1 грамм влажной биоткани - и растворяют его в ацетатном буферном растворе, нагретом до 37°C. После ферментативной обработки биоматериал выдерживают в инактивирующем растворе уксусной кислоты (6-60 г уксусной кислоты, 100 г хлорида натрия, 840-894 г дистиллированной воды) не менее 20 мин, промывают многократно в дистиллированной воде и помещают в 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия и снова промывают дистиллированной водой. Затем материал помещают в гипертонические растворы солей в концентрациях 3% и 7% в течение 15 и 6 ч соответственно и промывают в проточной дистиллированной воде. Далее проводят дополнительное воздействие ультразвука на подслизистую оболочку тонкой кишки в течение 60 минут и повторную ферментативную обработку с концентрацией протеолитического фермента 12,5 ПЕ на один грамм влажной биоткани в течение 5 минут с последующим выдерживанием биоматериала в растворе уксусной кислоты и растворе гидрокарбоната натрия, как описано выше. Затем подслизистую оболочку тонкой кишки выдерживают в 0,3%-ном растворе триклозана в течение 24 часов и помещают в раствор глутарового альдегида низкой концентрации в расправленном виде между двумя пластинами из пористого нетканого материала на 72 ч, далее производят смену раствора глутарового альдегида низкой концентрации на раствор глутарового альдегида более высокой концентрации.
Пример 2.
Отличается от примера 1 тем, что подслизистую оболочку тонкой кишки помещают в тару с гипертоническим раствором хлорида натрия в концентрации 3% на 48 ч, а затем в 7% гипертонический раствор хлорида натрия на 12 ч, подвергают действию ультразвука в течение 50 минут, обработку протеолитическим ферментом проводят при 5 ПЕ на 1 грамм влажной биоткани, а повторную ферментативную обработку проводят при 10,2 ПЕ на один грамм влажной биоткани в течение 10 минут.
Пример 3.
Отличается от примера 1 тем, что подслизистую оболочку тонкой кишки обрабатывают противомикробным агентом, в качестве которого выступает гентамицин.
Пример 4.
Отличается от примера 1 тем, что тонкую кишку очищают от мышечного и слизистого слоев путем продавливания через валы.
Применение заявляемого способа изготовления пластины на основе модифицированной ксеногенной подслизистой оболочки тонкой кишки позволит получить неиммуногенный, равномерно прошитый по всему объему биоматериал с частично разрушенной коллагеновой структурой, что обеспечит более быстрое проникновение клеток реципиента в трансплантат и беспрепятственное прорастание сосудов и тканей организма пациента в постоперационном периоде.
Источники информации
- Патент РФ №2037317,
- Патент РФ №2438713.