СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕОГРАФИЧЕСКОГО РЕГИОНА ПРОИЗРАСТАНИЯ КОФЕЙНЫХ ЗЕРЕН
METHOD OF DETERMINATION OF THE GEOGRAPHICAL REGION OF THE PRODUCTION OF COFFEE BEANS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам установления географического региона произрастания кофейных зерен с использованием газовой хроматографии в сочетании с изотопной масс-спектрометрией, и может быть использовано в практике испытательных аналитических лабораторий и лабораторий пищевой промышленности.
Уровень техники
Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам установления географического региона произрастания кофейных зерен на основе определения изотопного состава углерода хлорогеновой кислоты и кофеина, выделенных из образцов кофе.
Известен способ установления места происхождения марихуаны (Патент US 5252490 А, 12.10.1993), включающий выявление профилей сложных образцов из сырья растений марихуаны из различных стран или различных географических регионов с использованием капиллярного газо-хроматографического/масс-спектрометрического анализа с применением метода внутреннего стандарта. В основу способа положено сравнение выявленного «главного» профиля с установленным положением профилей неизвестных образцов. Извлечение компонентов марихуаны проводится органическим растворителем с добавлением внутреннего стандарта с последующим масс-спектрометрическим детектированием.
Недостатком способа является сложность и неоднозначность сопоставления «главного» и установленных профилей вследствие их отличия, даже при использовании однотипного оборудования.
13
15
2
Известен способ определения происхождения зеленых кофейных зерен (McLeod R. J., Garland M., Hale R.V., Steiman S., Frew R. D. Determining the most effective combination of chemical parameters for differentiating the geographic origin of food products: an example using coffee beans. // J. Food Chem. Nutr. 2013. Vol. 01. N 2. P. 49-61), сущность которого заключается в том, что с помощью многопараметрического статистического анализа образцы кофейных зерен группируются в многомерном пространстве с использованием многоэлементных изотопных отношений углерода, азота и водорода (δС, δN, δН), а также концентраций жирных кислот и элементов.
Недостатками данного способа являются неоднозначность вопроса о том, какая комбинация установленных показателей позволит отличить регионы произрастания кофейных зерен друг от друга с наибольшей достоверностью и длительность анализа, вследствие определения изотопных отношений нескольких элементов (углерода, азота и водорода).
13
18
18
2
Известен способ, позволяющий различить регионы произрастания кофейных зерен (Weckerle В., Richling Е., Heinrich S., Schreier P. Origin assessment of green coffee (Coffea arabica) by multi-element stable isotope analysis of caffeine. // Anal. Bioanal. Chem. 2002. Vol. 374. Issue 5. P. 886-890), который основан на жидкость-жидкостной экстракции кофеина из зерен зеленого кофе хлороформом (5 часов), высушивании органической фазы над безводным сульфатом натрия и концентрировании при пониженном давлении с последующей перекристаллизацией из метанола и установлении соотношений δС к δ О и δО к δН с помощью масс-спектрометра в сочетании с элементным анализатором, работающим в режиме «сгорания» и «пиролиза». Указанный способ является наиболее близким к заявленному изобретению.
13
18
2
Основными недостатками данного способа являются длительность пробоподготовки и увеличение продолжительности анализа за счет определения изотопных отношений нескольких элементов (δС, δO, δН).
Сущность изобретения
Задачей данного изобретения является разработка относительно простого способа, позволяющего достоверно определять регион произрастания кофейных зерен при сокращении продолжительности анализа.
13
13
Техническим результатом изобретения является способ определения географического региона произрастания кофейных зерен, отличающийся тем, что из образцов обжаренных кофейных зерен выделяют кофеин и хлорогеновую кислоту, определяют изотопный состав углерода выделенных компонентов методом газовой хроматографии в сочетании с изотопной масс-спектрометрией, полученные значения представляют в двумерной системе координат (δС кофеина от δС хлорогеновой кислоты) и определяют регион произрастания путем сопоставления с предварительно установленными областями значений, характеризующими Африку, Южную и Центральную Америку.
13
Предлагаемый способ отличается от известных тем, что для установления региона произрастания кофейных зерен используют обжаренные зерна, что позволяет существенно сократить продолжительность пробоподготовки за счет уменьшения времени, необходимого для экстракции, и определяют изотопные отношения углерода δС двух выделенных компонентов кофе - кофеина и хлорогеновой кислоты, что позволяет повысить достоверность определения.
13
Необходимым условием, обеспечивающим получение достоверных результатов изотопного анализа, является отсутствие фракционирования изотопа углерода в ходе обжарки и пробоподготовки кофейных зерен. Для подтверждения этого факта исследовали кофейные зерна зеленого кофе марки "Shazili" производства Турция. Образец делили на три части, одну из которых обжарке не подвергали, вторую обжаривали 5 минут при температуре 230°C (цвет зерна - коричневый, степень обжарки - средняя), третью - 10 минут при температуре 230°C (цвет зерна - темно-коричневый, степень обжарки - высокая). Полученные образцы экстрагировали метанолом, выделяли фракции, содержащие кофеин и хлорогеновую кислоту, дериватизировали раствором бис-триметилсилилтрифторацетамида в ацетонитриле (1:1) и определяли δС выделенных компонентов методом газовой хроматографии в сочетании с изотопной масс-спектрометрией. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Из данных таблицы 1 следует, что при обжарке кофейных зерен изотопный состав углерода кофеина и хлорогеновой кислоты, выделенных из зеленого кофе разной степени обжарки, не изменяется.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показаны области, характеризующие три географические региона произрастания кофейных зерен (Африка, Южная и Центральная Америка), полученные на основе результатов измерений изотопного состава углерода кофеина и хлорогеновой кислоты, выделенных из 30 образцов обжаренных кофейных зерен.
На фиг. 2 показано сопоставление результатов измерений изотопного состава углерода кофеина и хлорогеновой кислоты, выделенных из контрольных образцов кофе, с областями, характеризующими регион произрастания (Африка, Южная и Центральная Америка).
Заявленный способ осуществляют следующим образом.
-1
-1
В виалах вместимостью 15 мл взвешивают по 0,5 г образца измельченных обжаренных кофейных зерен, вносят по 5,0 мл метанола и тщательно перемешивают содержимое с использованием орбитального шейкера. Экстракцию проводят в течение 20 минут, помещая виалы с пробами в ультразвуковую ванну, после чего центрифугируют в течение 10 минут при 4400 об⋅мин с помощью центрифуги. Отбирают шприцем верхний надосадочный слой и отфильтровывают через фильтровальные насадки 0,2 мкм. Полученные метанольные экстракты переносят в виалы вместимостью 2,0 мл и помещают в автодозатор высокоэффективного жидкостного хроматографа UltiMate 3000 (Thermo Scientific, Германия), оборудованного дегазатором, четырехканальным насосом, диодно-матричным детектором и полупрепаративным коллектором фракций. 30 мкл метанольного экстракта вводят в жидкостной хроматограф. Разделение проводят на хроматографической колонке ZORBAX Extend-C18 (Agilent Technologies) длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм, размер зерна сорбента 5 мкм. Условия градиентного элюирования следующие: 100% «А» (деионизованная вода) в течение 2 минут, от 100% до 0% «А» за 8 минут, 100% «В» (ацетонитрил) в течение 3 минут и 100% «А» в течение 4 минут. Скорость потока элюента через хроматографическую колонку 0,25 мл⋅мин, колонку термостатируют при 35°C. Собирают фракцию, содержащую кофеин и хлорогеновую кислоту. Детектирование кофеина проводят при длине волны 273 нм, хлорогеновой кислоты - 326 нм. Время удерживания определяют по результатам анализа стандартных образцов хлорогеновой кислоты и кофеина производства Phytolab (Германия).
Полученную фракцию упаривают досуха в токе азота и дериватизируют 50 мкл раствора бис-триметилсилилтрифторацетамида в ацетонитриле (1:1) в течение 30 мин при 75°C. Содержимое переносят в стеклянные вставки вместимостью 0,2 мл, которые помещают в 2 мл виалы и анализируют методом газовой хроматографии в сочетании с изотопной масс-спектрометрией.
-1
-1
Изотопный состав углерода выделенных компонентов кофейных зерен определяют с использованием масс-спектрометра DELTA V Advantage в сочетании с интерфейсом сжигания GC IsoLink и газовым хроматографом Trace GC Ultra (Thermo Fisher Scientific, Германия), оснащенным кварцевой капиллярной колонкой VF 35MS (30 м 0,25 мм 0,25 мкм) с интегрированной предколонкой длиной 5 м (Agilent Technologies). Разделение проводят в условиях программирования температуры: начальная температура термостата колонки 40°C (1 мин), затем нагрев со скоростью 10°C⋅мин до 270°C (35 мин). Пробу вводят без деления потока при температуре инжектора 260°C. Скорость потока газа-носителя (гелия) составляет 1 мл⋅мин. Температура окислительного реактора в интерфейсе сжигания составляет 1030°C.
В качестве стандартных образцов используют стандартный образец кофеина IAEA  и стандартный образец хлорогеновой кислоты производства Phytolab (Германия) .
13
Расчет изотопного состава углерода δС проводят по формуле (1):
o6p
ст
13
12
где R и R - отношения распространенностей изотопов С/С в анализируемом образце и стандарте соответственно.
13
Для хлорогеновой кислоты осуществляют пересчет полученных изотопных отношений δС, используя формулу (2), так как она детектируется в виде соответствующего дериватизированного производного:
нс
13
где: δ - значение δС нативного соединения;
дс
13
δ - значение δС дериватизированного соединения;
да
13
13
δ - значение δС дериватизирующего агента (δС=-34,70);
- число атомов углерода в молекуле нативного соединения ;
- число атомов углерода в молекуле дериватизированного соединения ;
- число атомов углерода, добавляемых к молекуле нативного соединения при дериватизизации .
13
13
Результаты изотопного анализа образцов кофейных зерен представляют в двумерной системе координат δС кофеина от δС хлорогеновой кислоты и определяют регион произрастания путем сопоставления с областями значений, характеризующими Африку, Южную и Центральную Америку (фиг. 1).
Данные, на основании которых построена фиг. 1, представлены в таблице 2. Они получены экспериментальным путем по результатам изотопного анализа 30 образцов обжаренных кофейных зерен, принадлежащих к трем различным географическим регионам: Африка (Танзания, Кения, Эфиопия); Южная Америка (Бразилия, Колумбия, Перу) и Центральная Америка (Куба, Гватемала, Мексика, Никарагуа, Коста-Рика).
ср
ср
13
13
На фиг. 1 четко выделяются три области: Африка, Южная Америка, Центральная Америка, очерченные следующим образом: Х±3σ, где Х - средние значения δС кофеина и хлорогеновой кислоты, представленные в таблице 2, σ - среднеквадратическое отклонение среднего значения δС кофеина и хлорогеновой кислоты. Значения σ увеличены в три раза для того, чтобы области описывали 99% попадание результата в заданную область.
Оценку значимости различий между областями проводили с помощью критерия Стьюдента, который рассчитывали на основании данных таблицы 2. Полученные результаты представлены в таблице 3. Все полученные значения больше критического, следовательно, различия между областями, описывающими регион произрастания кофейных зерен, статистически значимы и достоверны.
Пример 1
-1
В виалах вместимостью 15 мл взвешивают по 0,5 г контрольного образца №1 (африканский сорт кофейных зерен «Замбия АА Чисоба»), вносят по 5,0 мл метанола и тщательно перемешивают содержимое с использованием орбитального шейкера. Экстракцию проводят в течение 20 минут, помещая виалы с пробами в ультразвуковую ванну, после чего центрифугируют в течение 10 минут при 4400 об⋅мин. Отбирают шприцем верхний надосадочный слой и отфильтровывают через фильтровальные насадки 0,2 мкм. Полученные метанольные экстракты переносят в виалы вместимостью 2,0 мл и помещают в автодозатор высокоэффективного жидкостного хроматографа. 30 мкл метанольного экстракта вводят в жидкостный хроматограф и проводят разделение. Собирают фракцию, содержащую кофеин и хлорогеновую кислоту (детектирование кофеина проводят при длине волны 273 нм, хлорогеновой кислоты при - 326 нм, время удерживания определяют по результатам анализа стандартных образцов хлорогеновой кислоты и кофеина). Полученную фракцию упаривают досуха в токе азота и дериватизируют 50 мкл раствора бис-триметилсилилтрифторацетамида в ацетонитриле (1:1) в течение 30 мин при 75°C. Содержимое переносят в стеклянные вставки вместимостью 0,2 мл, которые помещают в 2 мл виалы и определяют изотопный состав углерода выделенных компонентов кофейных зерен с использованием масс-спектрометра в сочетании с интерфейсом сжигания и газовым хроматографом.
13
13
Полученные значения δС кофеина  и δС хлорогеновой кислоты  контрольного образца №1 представляют в двумерной системе координат и сопоставляют с областями, характеризующими определенный регион произрастания (Африка, Южная и Центральная Америка). Полученный результат представлен на фиг. 2.
13
Как видно на фиг. 2, значения δС кофеина и хлорогеновой кислоты контрольного образца №1 попали в область, описывающую регион «Африка», что соответствует заявленному региону произрастания.
Пример 2
13
13
Определение географического региона произрастания контрольного образца №2 (индонезийский сорт кофейных зерен «Суматра Линтонг») осуществляют аналогично примеру 1. Полученные значения δС кофеина  и δС хлорогеновой кислоты  контрольного образца №2 представляют в двумерной системе координат и сопоставляют с областями, характеризующими определенный регион произрастания (фиг. 2).
13
Значения δС кофеина и хлорогеновой кислоты образца №2 не попали ни в одну область, следовательно, географически не принадлежат ни одному из описанных регионов.
13
13
Таким образом, разработанный способ позволяет методом газовой хроматографии в сочетании с изотопной масс-спектрометрией определять значения δС кофеина и δС хлорогеновой кислоты, выделенных из образцов обжаренных кофейных зерен, и на их основе достоверно устанавливать регион произрастания кофейных зерен, при этом продолжительность анализа не превышает 2,5 часов.