СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДГЕЗИВНОЙ КУЛЬТУРЫ НЕЙРАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ОБОНЯТЕЛЬНОЙ ВЫСТИЛКИ НОСА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТРАВМ СПИННОГО МОЗГА
METHOD FOR OBTAINING ADHESIVE CULTURE OF NEURAL STEM/PROGENITOR CELLS OF OLFACTORY NOSE OF MAMMALS FOR TREATMENT OF SPINAL CORD INJURIES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной нейротрансплантологии, и может быть использовано для лечения травм спинного мозга.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
На сегодняшний день наблюдается постоянный рост численности пострадавших в результате травм спинного мозга, наблюдаются высокая летальность и инвалидизация таких пациентов. В результате посттравматических механических повреждений спинного мозга пациенты частично или полностью теряют подвижность и чувствительность тела, ухудшается не только их физическое, но и психосоциальное состояние. Медикаментозное лечение и хирургическое вмешательство не всегда позволяют добиться желаемых результатов, поскольку при травматических повреждениях происходит гибель большого числа функциональных нейронов. В связи с этим перспективным направлением для лечения травм спинного мозга может стать клеточная терапия. Клеточная трансплантация может вызывать регенерацию аксонов, способствовать замене утраченных нейронов, снижать риск нарушений после травмы спинного мозга посредством секреции нейротрофических факторов [1, 2]. Для восполнения утраченных нейронов многообещающей стратегией считается трансплантация нейральных стволовых /прогениторных клеток (НСПК) [3].
Наиболее перспективными могут быть НСПК обонятельной выстилки носа. Получение обонятельной выстилки является процедурой доступной и безопасной для пациентов. Данные клетки являются тканеспецифичными и аутологичными, так как они могут быть получены от пациента с травмой спинного мозга и после наращивания в культуре и направленной дифференцировки трансплантированы тому же самому пациенту.
Обонятельная выстилка носа содержит постоянно регенерирующий нейроэпителий. НСПК обонятельного эпителия обладают мультипотентностью и дифференцируются в нейроны и другие типы клеток, экспрессируют маркеры нестин, sox-2 [4]. В экспериментальных исследованиях по регенерации спинного мозга после повреждения чаще всего используют НСПК в суспензионной культуре нейросфер. Серия экспериментов in vitro показала, что клетки, образующие нейросферы, быстро делятся и имеют высокий уровень выживаемости [4-6]. Клетки нейросфер после трансплантации выживают, мигрируют и интегрируются в спинной мозг хозяина, вырабатывают NGF и BDNF, способствуют регенерации и реиннервации аксонов, что приводит к восстановлению двигательных функций конечностей [7, 8].
Однако при терапии с использованием нейросфер затруднен анализ их клеточного состава, а именно оценка процентного содержания НСПК и образующихся из них нейронов, морфологический анализ трансплантируемых клеток и определение общего количества клеток. Методы получения чистых популяций НСПК in vitro отсутствуют, разработка их невозможна, так как НСПК in vitro способны дифференцироваться в зрелые нейроны, а также в глиальные клетки и олигодендроциты [9, 10]. Так как для увеличения эффективности клеточной трансплантации обязательна оценка чистоты культуры и количества клеток вводимого препарата, необходима разработка протоколов получения двухмерных адгезивных культур НСПК, что позволит охарактеризовать клеточный препарат по данным параметрам. Как известно, βΙΙΙ-тубулин экспрессируется в незрелых и зрелых обонятельных нейронах in vivo, нестин является маркером НСПК [11, 12]. Таким образом, выявляя в полученных адгезивных культурах нестин и βΙΙΙ-тубулин - положительные клетки, можно определить процентное содержание НСПК и дифференцирующихся из них нейронов, т.е. все клетки нейрональной дифференцировки. На сегодняшний день не существует единого протокола для получения адгезивной культуры НСПК обонятельной выстилки. Также накоплено недостаточно данных о влиянии условий культивирования на пролиферацию и дифференцировку этих клеток.
Существуют различные способы для получения культуры НСПК из обонятельной выстилки носа млекопитающих.
Известен способ получения НСПК в суспензионной культуре нейросфер из обонятельной выстилки носа человека [13], заключающийся в том, что ткань обонятельной выстилки диссоциировали механически и затем обрабатывали в течение 60 мин при 37°С раствором ферментов: коллагеназой, диспазой, ДНКазой I и гиалуронидазой в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла и субстрате Хэма F-12 (DMEM / F12). Полученные клетки растили на чашках, покрытых поли (2- гидроксиэтил метакрилатом), чтобы предотвратить их прикрепление к пластику, в среде DMEM/F 12, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), добавку В27, 20 нг / мл основного фактора роста фибробластов, 20 нг / мл эпидермального фактора роста и антибиотик - антимикотический раствор. Нейрональную дифференцировку выявляли с помощью иммунофлуоресцентной окраски на специфические маркеры нейронов- Tuj 1, МАР2.
Основным недостатком данного способа является то, что при получении первичной культуры клеток не отделяли собственную пластинку от обонятельного эпителия, что не позволяет получить более чистую культуру НСПК, так как в собственной пластинке эпителия содержится достаточно много других типов клеток. Недостатком известного способа является и обработка целым коктейлем ферментов, а именно коллагеназой, диспазой, ДНКазой I и гиалуронидазой, что может сказаться на выживаемости клеток при получении первичной культуры. Определение клеток нейрональной дифференцировки только по маркерам зрелых нейронов Tujl, МАР2 не позволяет выявить целый пул их предшественников, а именно НСПК и незрелых нейронов, которые несомненно могут быть значимыми при использовании данной культуры для клеточной терапии при травмах спинного мозга. В результате применения данного метода НСПК получают в виде суспензионной культуры, что существенно затрудняет их использование для клеточной терапии.
2
2
2
2
2
Известен также способ получения НСПК из ткани обонятельной выстилки носа человека [14], заключающийся в том, что полученную от пациентов с травмами спинного мозга ткань обонятельной выстилки инкубировали в течение 45 мин при 37°С в растворе диспазы II 2,4 ед / мл. Затем обонятельный эпителий отделяли от подлежащей собственной пластинки эпителия. Далее механически диссоциированный обонятельный эпителий инкубировали в 0,25 мг / мл коллагеназы Η в течение 10 мин при 37°С. Полученные клетки в среде НАМ /F12, содержащей 10% FBS и пенициллин /стрептомицин помещали на пластик, предварительно обработанный поли-L-лизином. Через 7-10 дней получали первичные нейросферы. Клетки, полученные при диссоциации этих нейросфер, культивировали в виде адгезивных культур в различных условиях: на пластике без покрытия или с покрытием из коллагена IV (5 мкг/см), фибронектина (10 мкг/см), ламинина (3,5 мкг/см), поли-L-лизина (2 мкг/см), или полиорнитина (10 мкг/см). После 5 дней в культуре пролиферация клеток была разной в зависимости от условий культивирования. На пластике без покрытия плотность клеток была ниже в бессывороточной среде DMEM по сравнению со средой с 10% FBS, фактором роста фибробластов-2 (FGF2) или трансформирующим фактором роста альфа (TGFα). Плотность клеток была самой низкой, когда клетки были выращены в среде с сывороткой на полилизине и полиорнитине. Ламинин, фибронектин и коллаген не влияли на плотность клеток, по сравнению с непокрытым пластиком. Клетки, полученные при диссоциации нейросфер, культивировали на непокрытом матриксами пластике в течение 5 дней в среде DMEM с сывороткой и без сыворотки с добавкой инсулина, трансферрина, селенита натрия (ITS), 25нг/мл цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), 50 нг/мл фактора роста нервов (NGF) и 0,1 и 1 мкг/мл ретиноевой кислоты. Различные комбинации среды смещали дифференцировку НСПК в астроглиальном, олигодендроглиальном или нейрональном направлениях. Авторами было показано, что выявленная по экспрессии βΙΠ- тубулину наибольшая доля нейронов (25,33%) была получена при добавлении NGF к бессывороточной среде DMEM.
Основным недостатком данного способа является то, что авторы получали адгезивные культуры из первичных нейросфер, этап получения которых (7-10 дней) значительно удлиняет время получения адгезивных культур. Определение клеток нейрональной дифференцировки только по маркеру незрелых и зрелых нейронов βIII-тубулину не позволяет выявить их предшественники - НСПК, которые также важны для клеточной терапии при травмах спинного мозга. Помимо этого в полученной адгезивной культуре доля нейронов (25,33%) не велика, это может быть связано с тем, что факторы роста применяли на культурах, выращиваемых на пластике без применения матриксов.
Из известных способов наиболее близким по технической сущности к предложенному способу является способ получения НСПК из собственной пластинки крыс [11], заключающийся в том, что ткань обонятельной выстилки обрабатывали 2,4 ед./мл диспазой II в течение 30 минут при 37°С, затем механически отделяли обонятельный эпителий от собственной пластинки, после чего обонятельный эпителий инкубировали с 0,05% трипсин-ЭДТА в растворе Рингера с низким содержанием кальция в течение 5-10 минут при 37°С и затем обрабатывали в течение 15 мин при 37°С раствором ферментов коллагеназой, гиалуронидазой и ингибитором трипсина (1, 1,5, 0,1 мг / мл соответственно) в растворе Рингера, затем ресуспендировали 10-20 раз чтобы разделить клетки. Суспензию клеток центрифугировали при 200 × г в течение 10 минут и клеточный осадок ресуспендировали и высаживали в культуральной среде DMEM/F12 (1:1), содержащей 2% FBS, добавку N2 и 25 нг / мл эпидермальный фактор роста (EGF), на пластик, покрытый поли -D -лизином. Далее из полученных культур на сортере с помощью специфических антител были выделены глобозные базальные клетки, которые культивировали далее, как адгезивную культуру.
Недостатком известного способа является обработка ткани обонятельного эпителия целым коктейлем ферментов, а именно трипсином, коллагеназой, гиалуронидазой, что может сказаться на выживаемости клеток при получении первичной культуры. Наиболее существенным недостатком известного способа является получение только одного типа клеток, а именно глобозных базальных, которые являются предшественниками обонятельных рецепторных нейронов, что может значительно снизить терапевтическую эффективность такого клеточного препарата.
Техническая проблема, на решение которой направлено предложенное изобретение, заключается в создании способа получения адгезивной культуры нейральных стволовых/ прогениторных клеток из обонятельной выстилки млекопитающего, устраняющего недостатки предыдущих аналогов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Технический результат заявленного изобретения заключается в возможности получения адгезивной культуры, обогащенной нейральными стволовыми/ прогениторными клетками, в достаточном для дальнейшей трансплантации количестве и обладающих высокой выживаемостью.
Указанный технический результат достигается предложенным способом получения НСПК из обонятельной выстилки носа млекопитающих для лечения травм спинного мозга, включающим этапы на которых: получают образцы ткани из обонятельной выстилки носа млекопитающего; промывают их; инкубируют ткань с 3,6 ед./мл диспазы II в течение 1 часа при 37°; переносят ткань в среду DMEM:F12(1:1) с антибиотиками и механически отделяют обонятельный эпителий от собственной пластинки; ткань обонятельного эпителия инкубируют с раствором 500 ед./мл коллагеназы в течение 10 минут при 37°С, инактивируют фермент средой с сывороткой, ресуспендируют и центрифугируют 2 минуты при 900 g; клетки помещают на пластик и культивируют в течение 5 дней в среде DMEM:F 12(1:1), содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина и 60 мкг/мл гентамицина, смену среды производят каждые два дня; после образования монослоя клетки обонятельного эпителия снимают с помощью 0,25% раствора трипсина, помещают на пластик, покрытый 50 мкг/мл фибронектином и культивируют 1-2 дня в нейробазальной среде, содержащей 2 мМ L-глутамина, 1% ITS, 2% В27, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина, 60 мкг/мл гентамицина, 50 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 50 нг/мл эпидермального ростового фактора (EGF), полученные клетки охарактеризовывают по маркерам нестин- и βIII-тубулин. При необходимости после получения образцов ткани и до момента начала эксперимента по получению первичной культуры, образцы ткани обонятельной выстилки носа млекопитающего транспортируют в питательной среде DMEM:F12(1:1) и хранят при +4°С не более 2 часов. Промывание образцов ткани обонятельной выстилки осуществляют в среде DMEM:F12(1:1) с антибиотиками 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина не менее 3-х раз. Механическое отделение обонятельного эпителия от собственной пластинки производят посредством микрошпателя в чашке Петри со средой DMEM:F12(1:1) с антибиотиками 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина.
Отличия заявленного способа от ранее известных из уровня техники состоят в том, что ткань обонятельной выстилки подвергают обработке ферментом диспазой II для того, чтобы можно было механически отделить обонятельной эпителий от собственной пластинки с целью получить более чистую культуру НСПК. Чтобы не подвергать ткань обонятельного эпителия дополнительной ферментной обработке в заявленном изобретении применяется только один фермент - коллагеназа, а не коктейль ферментов, применение которых может негативно сказаться на выживаемости клеток при получении первичной культуры. Для получения большего количества клеток производят наращивание первичной культуры обонятельного эпителия в течение 5 дней. Данное изобретение выгодно отличается от представленных, так как не содержит стадии первичных нейросфер, этап получения которых (7-10 дней) значительно удлиняет время получения адгезивных культур, и значительно (более чем в три раза) превосходит по содержанию клеток нейрональной дифференцировки. В данном изобретении процентное содержание клеток нейрональной дифференцировки при культивировании на фибронектине в нейробазальной среде составляет 79,11%, тогда как у Murrell W. и соавторов - 25,33%. Кроме того, полученная культура НСПК более точно охарактеризована по одновременной экспрессии двух маркеров нестин- и βIII-тубулин, что позволяет выявить все клетки нейральной дифференцировки, а именно - незрелые и зрелые нейроны и их предшественники - НСПК, что крайне важно для дальнейшего применения в клеточной терапии. Отличия заявленного способа от ранее известных из уровня техники состоят и в том, что определены сроки культивирования адгезивной культуры (в течение 1-2 дней) с наибольшим процентом НСПК, т.е. когда культура наиболее чистая для дальнейшей трансплантации.
Дополнительным преимуществом изобретения является и возможность аутологичного применения НСПК при взятии материала обонятельной выстилки у пациентов с травмой спинного мозга, получения из этого материала НСПК и дальнейшей клеточной трансплантации этим же пациентам.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Предложенный способ иллюстрируется чертежами, где
на фиг. 1 - Первичная культура клеток обонятельного эпителия обонятельной выстилки крыс (фазово-контрастная микроскопия);
на фиг. 2 - НСПК, полученные из обонятельного эпителия крыс (II - а, b, с, d) были выявлены по одновременной экспрессии маркеров Sox2 (IIc) и Nestin (IIa);
на фиг. 3 - Адгезивная культура обонятельного эпителия крыс при различных условиях культивирования: а - на ламинине в DMEM:F12, б - на ламинине в нейробазальной среде, в - на фибронектине в среде DMEM:F12, г - на фибронектине в нейробазальной среде, scal bar- 50 μm, (×100).
на фиг. 4 - а - Клетки в адгезивных культурах, окрашенные антителами к βΙΙΙ-тубулину, б - клетки в адгезивных культурах, окрашенные антителами к нестину. Ядра окрашены DAPI. (×630), seal bar - 10 μm;
на фиг. 5 - Количество клеток в разных условиях культивирования, ****Р<0,0001;
на фиг. 6 - Процентное содержание нестин- и βΙΙΙ-тубулин -положительных клеток при различных условиях культивирования, *Р<0,05, **Р<0,01;
на фиг. 7 - Процентное содержание нестин- и sox2- положительных клеток в адгезивной культуре НСПК;
на фиг. 8 - Первичная культура клеток обонятельного эпителия обонятельной выстилки человека (фазово-контрастная микроскопия);
на фиг. 9 - НСПК, полученные из обонятельного эпителия человека (I - а, b, с, d) были выявлены по одновременной экспрессии маркеров Sox2 (Ic) и Nestin (Ia);
на фиг. 10 - Адгезивная культура НСПК из обонятельной выстилки человека, культивируемая на фибронектине в нейробазальной среде в течение 2 дней (фазово-контрастная микроскопия);
на фиг. 11 - МРТ изображение формирования посттравматической кисты спинного мозга через 4 недели после травмы спинного мозга (область кисты указана);
на фиг. 12 - Динамика восстановления двигательной активности задних конечностей крыс после трансплантации НСПК человека и крыс в кисты 4 недель формирования, представлена по изменениям баллов (дельта ВВВ). На графике указаны средние значения со стандартными отклонениями;
на фиг. 13 - МРТ визуализация посттравматических кист спинного мозга до (слева) и через 4 недели после трансплантации 200 тысяч НСПК крыс (справа);
на фиг. 14 - Выживаемость НСПК человека в кистах через 4 недели после трансплантации. А - наложение В, С, D. Наблюдается миграция клеток в близлежащие ткани спинного мозга (отмечено стрелкой). Б - окрашивание ядер DAPI, В - окрашивание с антителами к b-III-tubulin, Г - РКН26-меченые НСПК. Область кисты отмечена звездочкой.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
2
НСПК обонятельной выстилки носа крыс получают известным способом. Производят наркотизацию крыс линии Wistar интраперитонеальным введением смеси реланиум/кетамин 1:1 (1 мкл/гр). Затем производят декапитацию животных. Далее производят сечение черепа в сагиттальной плоскости на уровне носовой перегородки и забор материала обонятельной выстилки животного. Затем ткань промывают в среде DMEM:F12 (1:1) не менее 3 раз. Затем ткань инкубируют с 3,6 ед./мл диспазы II в течение 1 часа при +37°С, после чего механически отделяют обонятельный эпителий от собственной пластинки. Механическое отделение обонятельного эпителия от собственной пластинки производят посредством микрошпателя в чашке Петри со средой DMEM:F12(1:1) с антибиотиками 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина. Полученную ткань обонятельного эпителия переносят в 15 мл. пробирку с раствором 500 ед./мл коллагеназы, инкубируют в течение 10 минут при 37°С, инактивируют фермент средой с сывороткой, ресуспендируют и центрифугируют 2 минуты при 900 g. Полученные клетки помещают на пластик и культивируют в течение 5 дней в среде DMEM:F12(1:1), содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина и 60 мкг/мл гентамицина в инкубаторе при 5% СО, +37°С и поддержании влажности 95% (фиг.1). При этом смену среду производят каждые два дня. Полученную первичную культуру обонятельного эпителия крыс охарактеризовывают по общепринятым маркерам sox-2 и нестину на наличие нейральных/ стволовых прогениторных клеток. Sox-2 и нестин-позитивно окрашенные клетки выявляют, их процентное содержание составляет 5-7% от общего количества клеток (фиг. 2). Клетки подсчитывают в 10 полях зрения в 3 независимых экспериментах. Общее количество клеток определяют по подсчету ядер, визуализацию ядер проводят с помощью DAPI.
После образования монослоя клетки обонятельного эпителия промывают раствором Версена 3 раза, инкубируют клетки с 0,05% раствором трипсина 2 минуты при 37°С, переносят суспензию с клетками в пробирку, для инактивации трипсина добавляют среду DMEM:F12(1:1) с 10% FBS, ресуспендируют и далее центрифугируют 2 минуты при 900g. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют и далее полученные клетки культивируют в различных условиях для выбора оптимального способа получения адгезивной культуры, обогащенной НСПК в достаточном для дальнейшей трансплантации количестве: на фибронектине в среде DMEM:F12, на фибронектине в нейробазальной среде (Neurobasal), на ламинине в DMEM:F12, на ламинине в нейробазальной среде. Клетки с одинаковой плотностью помещают на пластик, покрытый ламинином (0.5 мкг/мл) или фибронектином (50 мкг/мл). Культивирование клеток проводят в бессывороточных средах DMEM/F12 и нейробазальной, с одинаковыми добавками - 1% ITS, 2% В27, 50 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 50 нг/мл эпидермального ростового фактора (EGF), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина и 60 мкг/мл гентамицина (фиг. 3). На 5 день культивирования клетки снимают с помощью 0,25% раствора трипсина и подсчитывают в камере Горяева. В других адгезивных культурах, полученных аналогичным способом, проводят выявление нестин- и βIII- тубулин положительных клеток (фиг. 4).
Подсчет общего количества клеток показывает, что на фибронектине и ламинине в нейробазальной среде клеток было больше (24094 и 23019 клеток/мл соответственно) по сравнению с культурами, растущими на фибронектине и ламинине (6871 и 6586 клеток/мл соответственно) в среде DMEM:F12 (фиг. 5). Таким образом, различные матриксы, примененные в данной работе, не влияют на пролиферацию клеток. При этом культивирование в нейробазальной среде способствовует увеличению пролиферации. Пролиферация клеток была максимальна при культивировании на обоих матриксах в нейробазальной среде.
При получении адгезивной культуры известным способом было обнаружено, что при культивировании на фибронектине в нейробазальной среде процентное содержание нестин- положительных клеток было максимально (52,22%) по сравнению с другими условиями культивирования (на фибронектине в среде DMEM:F12 - 16,67%, на ламинине в DMEM:F12 - 41%, на ламинине в нейробазальной среде - 26,88%). Процентное содержание βΙΙΙ-тубулин - положительных клеток было максимально и примерно одинаково при культивировании на фибронектине в нейробазальной среде и в DMEM:F12 (79,11% и 83,52% соответственно), тогда как при культивировании на ламинине в нейробазальной среде и в DMEM:F12 - значительно меньше (60,86% и 63,33% соответственно). При этом среда DMEM:F12 незначительно меняла дифференцировку в нейрональном направлении, как на фибронектине, так и на ламинине (фиг. 6). Культивирование в нейробазальной среде на разных матриксах не выявило влияние именно этой среды на процентное содержание нестин и βΙΙΙ-тубулин - положительных клеток. Однако культивирование в нейробазальной среде на фибронектине показало лучшие результаты и по пролиферативной активности клеток, и по содержанию в культуре НСПК и дифференцирующихся из них нейронов. Культивирование адгезивных культур НСПК в нейробазальной среде на фибронектине позволяет получить наиболее чистую культуру, максимально обогащенную НСПК и дифференцирующимися из них нейронами, в достаточном для дальнейшей трансплантации количестве.
Далее для установления сроков культивирования с максимальным содержанием НСПК было проведено культивирование клеток обонятельного эпителия крыс на фибронектине в нейробазальной среде. На 1, 2 и 5 день культивирования методом иммунофлуоресценции было оценено процентное содержание нестин- и sox2- положительных клеток. Количество sox2-положительных клеток было примерно одинаковым, тогда как наибольшее количество нестин- положительных клеток наблюдалось в культуре на 1 и 2 день культивирования. Таким образом, мы можем рекомендовать для дальнейшей трансплантации адгезивные культуры, полученные по нашему протоколу и обогащенные НСПК, на 1 и 2 день культивирования (фиг. 7).
Пример 2.
НСПК обонятельной выстилки носа человека получают известным способом.
2
2
Образцы ткани обонятельной выстилки получают из операционного материала области верхнего и среднего носового ходов при проведении плановых хирургических вмешательств. Площадь образцов, необходимая для проведения научного исследования составляет 5-25 мм. При необходимости после получения образцов ткани и до момента начала эксперимента по получению первичной культуры, образцы ткани обонятельной выстилки носа человека транспортируют в питательной среде DMEM:F12(1:1) и хранят при +4°С не более 2 часов. Затем ткань промывают в среде DMEM:F12(1:1) не менее 3 раз. Затем ткань инкубируют с 3,6 ед./мл диспазы II в течение 1 часа при +37°С, после чего механически отделяют обонятельный эпителий от собственной пластинки. Механическое отделение обонятельного эпителия от собственной пластинки производят посредством микрошпателя в чашке Петри со средой DMEM:F12(1:1) с антибиотиками 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина. Полученную ткань обонятельного эпителия переносят в 15 мл. пробирку с раствором 500 ед./мл коллагеназы, инкубируют в течение 10 минут при 37°С, инактивируют фермент средой с сывороткой, ресуспендируют и центрифугируют 2 минуты при 900 g. Полученные клетки помещают на пластик и культивируют в течение 5 дней в среде DMEM:F12(1:1), содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина и 60 мкг/мл гентамицина в инкубаторе при 5% CO, +37°С и поддержании влажности 95% (фиг. 8). При этом смену среду производят каждые два дня. Полученную первичную культуру обонятельного эпителия крыс охарактеризовывают по общепринятым маркерам sox-2 и нестину на наличие нейральных/ стволовых прогениторных клеток. Sox-2 и нестин-позитивно окрашенные клетки выявляют, их процентное содержание составляет 5-7% от общего количества клеток (фиг. 9). Клетки подсчитывают в 10 полях зрения в 3 независимых экспериментах. Общее количество клеток определяют по подсчету ядер, визуализацию ядер проводят с помощью DAPI.
После образования монослоя клетки обонятельного эпителия промывают раствором Версена 3 раза, инкубируют клетки с 0,05% раствором трипсина 2 минуты при 37°С, переносят суспензию с клетками в пробирку, для инактивации трипсина добавляют среду DMEM:F12(1:1) с 10% FBS, ресуспендируют и далее центрифугируют 2 минуты при 900g. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют и далее полученные клетки помещают на пластик, покрытый 50 мкг/мл фибронектином и культивируют 1-2 дня в нейробазальной среде, содержащей 2 мМ L-глутамина, 1% ITS, 2% В27, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина, 60 мкг/мл гентамицина, 50 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 50 нг/мл эпидермального ростового фактора (EGF). В результате получают адгезивную культуру НСПК, пригодную для дальнейшей трансплантации при травмах спинного мозга (фиг. 10-фаза).
Пример 3.
Полученные адгезивные культуры НСПК крыс и человека используют для лечения экспериментальных травм спинного мозга крыс. Модель экспериментальных травм представляет собой посттравматические кисты спинного мозга крыс.
Моделирование посттравматических кист спинного мозга крыс проводят по разработанной нами методике на половозрелых самках крыс линии Wistar, весом от 200 грамм. В течение операции соблюдают стерильные условия. Все манипуляции, причиняющие животным болевую или иную травму, выполняют при обезболивании, животных наркотизируют интраперитонеальным введением смеси реланиум/кетамин (1 мкл/гр). Перед закреплением животного на операционном столе глубину наркоза определяют выраженностью моргательного и вибрисс рефлексов. Производят подготовку операционного поля с помощью электробритвы и протирания кожи спиртом. Производят срединный надрез вдоль позвоночника на уровне Th9-Th10, частичную резекцию мышц с двух сторон от остистого отростка, при незначительных выделениях крови используют 3% раствор перекиси водорода и марлевые тампоны. Удаляют остистый отросток Th10 с помощью хирургических кусачек, открывают доступ к спинному мозгу. Производят воздействие ударным механизмом силой 200 kilodynes (Precision Systems and Instrumentation LLC, Fairfax, VA). Края операционной раны сводят и закрепляют с помощью скрепляющих скоб и обрабатывают раствором бриллиантовой зеленой. Для общей профилактики послеоперационных инфекционных осложнений используют 300 мкл раствора цефазолина внутримышечно. Образование кисты подтверждают с помощью томографа для животных (ClinScan, Bruker BioSpin) через 4 недели после операции (фиг. 11).
В полость образовавшейся кисты животным трансплантируют НСПК крыс. Для оценки терапевтического эффекта трансплантируют по 200 тысяч полученных клеток в 20 мкл DMEM:F12(1:1), содержащей 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина. Животным контрольной группы вводят 20 мкл DMEM:F12(1:1), содержащей 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина. После трансплантации клеток в место повреждения проводят оценку восстановления двигательной активности задних конечностей крыс. Основным инструментом для оценки восстановления моторной функции является 21-балльная шкала открытого поля, разработанная D. Basso, Μ. Beattie и J. Bresnahan (BBB), которая позволяет изучить динамику восстановления опорно-двигательного аппарата (9). Динамику восстановления двигательной активности задних конечностей крыс оценивают с помощью теста ВВВ раз в неделю в течение 3 недель. У крыс, которым трансплантируют клеточный препарат, наблюдается значительное улучшение двигательной активности задних конечностей по тестам ВВВ (фиг. 12).
Пример 4.
Полученные адгезивные культуры НСПК крыс и человека используют для трансплантации в сформировавшиеся кисты 4 недель и через 4 недели после трансплантации с помощью метода МРТ проводят оценку размеров кист. Анализ МРТ-изображений проводят по срезам фронтальной и сагиттальной проекциям спинного мозга крыс с шагом сканирования 0.5 мм в программе Vidar Dicom Viewer. В каждом срезе выделяют область, соответствующую обнаруженной кисте. Программа автоматически вычисляет площадь выбранного участка. Для определения объема кисты считают средние значения площадей кист фронтальной и сагиттальной проекций и умножают на шаг сканирования. Через 4 недели после трансплантации НСПК крыс и человека не было выявлено статистически значимых изменений размеров кист. Интересно отметить, что некоторые животные с кистами показывают уменьшение объема площади кисты на 4-й неделе после трансплантации 200000 НСПК крыс (фиг. 13). По-видимому, можно говорить только об индивидуальных способностях крыс к регенерации, когда у некоторых животных после трансплантации клеток кисты уменьшаются.
Пример 5.
Полученные адгезивные культуры НСПК человека используют для трансплантации в сформировавшиеся кисты 4 недель и через 4 недели после трансплантации 200 тысяч клеток изучают их выживаемость и миграцию в близлежащие ткани. Для изучения выживаемости НСПК в спинном мозге после трансплантации в кисты используют прижизненный мембранный краситель РКН26 (Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling was obtained from Merck /Sigma-Aldrich, USA). PKH26 - меченые НСПК человека трансплантируют в кисты спинного мозга 4 недель формирования. Клетки вводят в 10 мкл среды DMEM/F-12 (1:1). Контрольным животным вводят то же количество среды без клеток. Выживаемость трансплантированных НСПК изучают в течение 4 недель. Через 4 недели после трансплантации животных выводят из эксперимента, спинной мозг фиксируют в 4% формальдегиде. С помощью вибротома ("Thermo Fisher Scientific") получают серийные срезы спинного мозга в области травмы. Толщина срезов составляет 40 мкм. Для визуализации ткани спинного мозга используют первичные антитела к маркеру зрелых нейронов b-III-тубулину (1:300) и вторичные антитела, меченные Alexa Fluor 488 (1:500), визуализацию ядер проводят с помощью DAPI. Через 4 недели после трансплантации НСПК выявляют в области около посттравматических кист спинного мозга (фиг. 14). В течение 4 недель НСПК человека выживают в кистах спинного мозга и мигрируют в близлежащие ткани. Высокая выживаемость и возможность получения НСПК из обонятельной выстилки пациентов для создания аутологичного препарата позволяют рассматривать их в качестве перспективного материала для лечения пациентов с посттравматическими кистами спинного мозга.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Voronova AD, Stepanova OV, Chadin AV, Reshetov IV, Chekhonin VP. The Cell Therapy in Traumatic Spinal Cord Injury. Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk. 2016; 71(6):420-426.
2. Pearse DD, Bunge MB. Designing cell- and gene-based regeneration strategies to repair the injured spinal cord. J Neurotrauma. 2006; 23(3-4):438-452.
3. Reier PJ. Cellular transplantation strategies for spinal cord injury and translational neurobiology. NeuroRx. 2004; 1: 424-451.
4. Zhang X, Klueber KM, Guo Z, Lu C, Roisen FJ. Adult human olfactory neural progenitors cultured in defined medium. Exp Neurol. 2004; 186(2):112-123.
5. Marshall CT, Guo Z, Lu C, Klueber KM, Khalyfa A, Cooper NG, Roisen FJ. Human adult olfactory neuroepithelial derived progenitors retain telomerase activity and lack apoptotic activity. Brain Res. 2005; 1045(1-2):45-56.
6. Othman M, Lu C, Klueber K, Winstead W, Roisen F. Clonal analysis of adult human olfactory neurosphere forming cells. Biotech Histochem. 2005; 80: 189-200.
7. Xiao M, Klueber KM, Lu C, Guo Z, Marshall CT, Wang H, Roisen FJ. Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery. Exp Neurol. 2005; 194(l):12-30.
8. Xiao M, Klueber KM, Guo Z, Lu C, Wang H, Roisen FJ. Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery. Neurobiol Dis. 2007; 26(2):363-374.
9. Carter LA, MacDonald JL, Roskams AJ. Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype. J Neurosci. 2004; 24: 5670-5683.
10. Chen X, Fang H, Schwob J. Multipotency of purified, transplanted globose basal cells in olfactory epithelium. J Comp Neurol.2004; 469:457 474.
11. Muniswami DM, Kanakasabapathy I, Tharion G. Globose basal cells for spinal cord regeneration. Neural Regen Res. 2017; 12(11):1895-1904.
12. Borgmann-Winter KE, Rawson NE, Wang HY, Wang H, Macdonald ML, Ozdener MH et al. Human olfactory epithelial cells generated in vitro express diverse neuronal characteristics. Neuroscience. 2009; 158: 642-653.
13. Ohnishi Y, Iwatsuki K, Shinzawa K, Ishihara M, Shikina T, Shinzawa K, Moriwaki T, Ninomiya K, Ohkawa T, Umegaki M, Kishima H, Yoshimine T. Isolation of human adult olfactory sphere cells as a cell source of neural progenitors. Stem Cell Res. 2015; 15:23-29.
14. Murrell W, Feron F, Wetzig A, Cameron N, Splatt K, Bellette B, Bianco J, Perry C, Lee G, Mackay-Sim A. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa. Dev Dyn. 2005; 233:496-515.