ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И БЕСПЛОДИЯ КОРОВ
DIAGNOSTIC KIT FOR DETERMINING PREGNANCY AND INFERTILITY IN COWS

Изобретение относится к области ветеринарного акушерства и гинекологии, в частности к препаратам позволяющим определить беременность у коров.
В настоящее время основным способом диагностики беременности у крупных животных, например у коров, является ректальная пальпация развивающегося плода через прямую кишку. Данный способ дает возможность установления сроков беременности через 60-70 дней после оплодотворения. Использование УЗИ-сканеров для определения сроков беременности также ограничено из-за необходимости ввода электронного датчика через прямую кишку.
Ранняя и точная диагностика неудавшейся беременности животного, которое подвергают осеменению, имеет большое экономическое значение для промышленного животноводства. В связи с чем, существует значительная потребность в способе, с помощью которого можно точно определить, что животное не является беременным, чтобы не упустить возможности вновь осеменить животное в следующую стадию возбуждения полового цикла.
Известен способ иммунологической диагностики беременности и бесплодия коров и телок [2, 3], включающий обнаружение в сыворотке плацентарного гормона - хорионического гонадотропина в реакции ализариновых суспензионных антихориогонин-антител при помощи диагностикума, отличающийся тем, что гормон обнаруживается в моче животных, которую в объеме 5 мл вносят в пробирку, добавляют 1-2 капли диагностикума, содержимое пробирки перемешивают вращательными движениями до его однородного окрашивания в оранжевый цвет (10-15 с), далее пробы выдерживают при комнатной температуре в течение 15 мин и визуально учитывают реакцию, при этом положительная реакция на стельность - содержимое пробирки окрашивается в фиолетовый цвет, с последующим выпадением обильного осадка сиреневого или фиолетового цвета и просветлением надосадочной жидкости, отрицательная реакция - содержимое пробирки сохраняет изначальный оранжевый цвет и гомогенную консистенцию.
Известен способ определения ранней диагностики стельности включающий использование проб цельного молока, отобранные на 21 день после осеменения коров. Пробы наносили на мембранный носитель для получения сухих образцов [1].
Используя метод иммуноферментного анализа (ИФА) определяли количество образовавшихся пероксидазных иммунокомплексов с помощью однокомпонентного субстратного раствора на основе тетраметилбензидина (ТМБ). Интенсивность окраски образующегося продукта окисления ТМБ, регистрируемая на спектрофотометре, обратно пропорциональна концентрации прогестерона в анализируемом образце. В качестве стандартов использовали растворы, содержащие известную концентрацию прогестерона. Недостатком предлагаемого метода является то, что он требует наличия особого оборудования, которое в полевых условиях не всегда имеется.
Наиболее близким по своей технической сущности является диагностикумопределения беременности, основанный на способности церулоплазмина проявлять каталитическую активность как полифенолоксидазы. В результате окисления парафенилендиамина образуются вещества оранжевого цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации церулоплазмина [4].
Необходимые реактивы:
3
3
- раствор №1: 0,4М ацетатный буфер (рН 5,6). Для приготовления раствора берут 1 мл 0,4 М СНСООН и 7,2 мл 0,4 М CHCOONa.
2
- раствор №2: 1%-ный водный раствор парафенилендиаминасолянокислого. Берут 1 г парафенилендиамина солянокислого и растворяют в 99 мл НО.
2
- раствор №3: 25%-ный раствор едкого натра (NaOH). Берут 25 г NaOH и растворяют в 75 мл НО.
Способ осуществляется следующим образом.
В пробирки помещают 0,1 мл сыворотки крови, добавляют 1 мл 0,4 М ацететного буфера (рН 5.6) и 0,5 мл 1%-ного водного раствора парафенилендиамина солянокислого. Смешивают и помещают в водяную баню при 60°С. Через 10 мин реакцию останавливают добавлением 3,5 мл охлажденного 25%-ного раствора едкого натра. Полученную оранжевого цвета жидкость колориметрируют при 440 нм.
При значениях церрулоплазмина более 0,095 ед. оптической плотности диагностируют беременность (стельность) у коров на ранней стадии с высокой точностью и объективностью.
Однако данный диагностикум позволяет определять беременность в более поздние сроки, что ведет к потере времени на проведение повторного оплодотворения животных.
Задачей заявленного изобретения является расширение ассортимента диагностических реактивов и получение диагностического набора для определения беременности и бесплодия животных. В этом аспекте изобретение представляет диагностический набор определения беременности у животных по наличию хориального гонадотропина в биологических жидкостях (молоко).
Техническим результатом заявленного изобретения является точность постановки диагноза на беременность коров и телок на более ранних сроках стельности.
Достижение указанного технического результата возможно с применением диагностического набора для определения беременности и бесплодия коров, включающего буферный раствор и препарат натрия, который дополнительно содержит кристаллическую целлюлозу, бычий альбумин, краситель ализарин и сыворотку крови от иммунизированных животных при следующем соотношении компонентов, об. %:
Фосфатно-буферный раствор
65-80
Кристаллическая целлюлоза
10-25
1%-ный бычий альбумин
1,0-2,0
Краситель ализарин
1,0-2,0
Бензоат натрия
0,5-1,0
Сыворотка крови от
иммунизированных животных
остальное
Для отработки количественного соотношения компонентов в наборе было сформирована группа стельных коров - из 20. Проверку на стельность проводили предлагаемым препаратом, содержащим разный количественный состав компонентов. Положительная реакция на беременность сопровождается образованием крупных хлопьев в пробах, в случае отсутствия хлопьев ставим диагноз на бесплодие у проверяемой коровы или телки.
Первый опыт ставили на пробах молока, которые смешивали с диагностическим препаратом, содержащий об. %: фосфатно-буферный раствор - 80; кристаллическая целлюлоза - 15; 1%-ного бычьего альбумина 0,5; красителя ализарина - 0,5; бензоат натрия - 0,5; сыворотку крови от иммунизированных животных - остальное.
Во втором опыте молоко смешивали с предлагаемым диагностическим препаратом, содержащим, об. %: фосфатно-буферный раствор - 70; кристаллическая целлюлоза - 25; 1%-ного бычьего альбумина - 1; красителя ализарина - 1,0; бензоата натрия - 0,5; сыворотку крови от иммунизированных животных - остальное.
В третьем опыте молоко смешивали с предлагаемым диагностическим препаратом, содержащим, об. %: фосфатно-буферный раствор - 65; кристаллическая целлюлоза - 25; 1%-ного бычьего альбумина - 2,0; красителя ализарина - 2,0; бензоат натрия - 1,0; сыворотку крови от иммунизированных животных - остальное.
По результатам анализа диагностических тестов выявлено расхождение в постановке диагноза на стельность. Так набор, используемый в первом опыте был менее эффективен, погрешность составила 24,6%.
Набор препаратов, используемый во втором и третьем опыте показал одинаковую эффективность, при которой погрешность составила 4%.
Предложенный диагностический набор готовят следующим образом:
В 80 мл фосфатно-буфера растворяем 15 г кристаллической целлюлозы, затем вносим 1 г 1%-ного бычьего альбумина, тщательно перемешиваем. Далее в стерильном флаконе к готовому раствору добавляем 1 г красителя ализаринаи 1 г бензонат натрия смешиваю путем взбалтывания, а затем сыворотку крови от иммунизированных животных, доводя их объем состава до 100 мл.
Полученный таким образом препарат готов к применению.
Срок годности препарата - 8-12 месяцев, при хранении темном и прохладном месте (режиме 2+5°С).
Рабочее название диагностического препарата «Удин» (универсальный диагностический инновационный набор).
Набор включает в себя упаковку, которая вмещает тестируемую поверхность, такую как предметное стекло или многолуночные планшеты, где на указанную поверхность наносится 1 капля (0,05 мл) диагностикума «Удин», содержащего антитела к хориальному гонадотропину, которое будет связываться с эпитопом хориального гонадотропина исследуемого биологического материала (0,05 мл). В присутствии реагента, который при контакте с антителом способствует визуальному определению относительного количества присутствия хориального гонадотропина, указывающее на наличие или отсутствие беременности.
Набор согласно изобретению для диагностики статуса беременности с помощью определения относительного уровня индуцируемого при беременности гормона, такого как хориальный гонадотропин, в тестируемом образце по сравнению с контролем может быть получен различными способами, которые будут очевидны специалистам в данной области при прочтении описания.
Пример 1. Для ранней диагностики стельности подобрали группу коров, которых оплодотворили путем трансцервикального искусственного осеменения. На 22 день отбирали пробы цельного молока от исследуемых коров с целью постановки диагноза на беременность с использованием диагностического препарата «Удин». Для подтверждения диагноза отбирали образцы крови (10 мл) посредством венепункции яремной вены в пробирки "vacutainer", содержащие EDTA с последующим исследования сыворотки на специфический для беременности белок при помощи ИФА.
Для выявления стельности в качестве стандартного метода и контроля на 65-70 сутки после осеменения использовали ректальный метод диагностики. Полученные данные сведены в таблицу №1.
Из 34 исследованных коров при ректальной диагностике диагноз на наличие беременности был поставлен у 25 голов. Из них у 92% предварительный диагноз на стельность был поставлен при тестировании сыворотки крови в ИФА и при использовании набора для диагностики «УДИН», что свидетельствует о высокой достоверности метода.
Пример 2. Во второй серии тестов с целью диагностики беременности использовали слюну стельных коров с реагентами препарата «Удин». Для подтверждения диагноза отбирали образцы крови (10 мл) посредством венепункции яремной вены в пробирки "vacutainer", содержащие EDTA с последующим исследования сыворотки на специфический для беременности белок при помощи ИФА.
Для выявления стельности в качестве стандартного метода и контроля на 65-70 сутки после осеменения использовали ректальный метод диагностики. Полученные данные сведены в таблицу №2.
Из 34 коров при ректальной диагностики диагноз на наличие беременности был поставлен у 25 голов. Из них у 28% от общего числа исследованных животных были получены несовпадающие результаты диагностики стельности при использовании реагентов предлагаемого препарата со слюной коров.
Считаем, что применять предлагаемый диагностический набор целесообразно с пробой цельного молока (0,05 мл) с постановкой реакции на предметном стекле. Использование других биологических материалов (слюна и т.д.) не имеет смысла на ранних сроках стельности.
Пример 3. Было сформирована группа стельных коров - из 20. Проверку на стельность проводили предлагаемым препаратом содержащим разный количественный состав компонентов. Первый опты ставили на пробах молока, которые смешивали с диагностическим препаратом, содержащий об. %: фосфатно-буферный раствор - 80; кристаллическая целлюлоза - 15; 1%-ного бычьего альбумина 0,5; ализарина- 0,5; бензоат натрия - 0,5; сыворотку крови от иммунизированных животных - остальное.
Во втором опыте молоко смешивали с предлагаемым диагностическим препаратом, содержащим, об. %: фосфатно-буферный раствор - 70; кристаллическая целлюлоза - 25; 1%-ного бычьего альбумина - 1; ализарина- 1,0; бензоата натрия - 0,5; сыворотку крови от иммунизированных животных - остальное.
В третьем опыте молоко смешивали с предлагаемым диагностическим препаратом, содержащим, об. %: фосфатно-буферный раствор - 65; кристаллическая целлюлоза - 25; 1%-ного бычьего альбумина - 2,0; ализарина - 2,0; бензоат натрия - 1,0; сыворотку крови от иммунизированных животных - остальное.
По результатам анализа диагностических тестов выявлено расхождение в постановке диагноза на стельность. Так, диагностический набор, используемый в первом опыте был менее эффективен, погрешность составила 24,6%.
Диагностический набор, используемый во втором и третьем опыте показал одинаковую эффективность при которой погрешность составила 4%.
Источники информации
1. М. Sheldon. Pregnancy diagnosis in cattle. InPregtice. 2002. 24. 310-317.
2. Богданов И.И. Иммунологический экспресс-тест на беременность и бесплодие коров. / И.И. Богданов, М.А. Богданова, А.Н. Фомин. - Вестник ветеринарии. 2011. 59(4). 11-12.
3. Заявка на патент №2011134963. Метод иммунологической диагностики беременности и бесплодия коров и телок.
4. Патент на изобретение №2306701. Способ диагностики беременности у коров.