Способ микрокапсулирования хлореллы
CHLORELLA MICROCAPSULATION METHOD

Изобретение относится к области нанотехнологии и пищевой промышленности.
В настоящее время известен способ получения нанокапсул экстракта хлореллы в альгинате натрия, характеризующийся тем, что в качестве оболочки используется альгинат натрия, а в качестве ядра – хлорелла (Патент Р.Ф. №2655620, авт. Кролевец А.А. – 2018г.). Недостатком данного способа является использование в технологическом процессе сухого экстракта хлореллы, биологические свойства которой значительно уступают нативной форме хлореллы, а также применение петролейного эфира, вещества обладающего токсичностью и огнеопасностью.
В качестве прототипа выбран способ нанокапсулирования хлореллы в пектине (Патент Р.Ф. №2672065, авт. Кролевец А.А. и др.). Данный способ характеризуется тем, что в качестве оболочки нанокапсул используется высоко – или низкоэтерифицированный яблочный или цитрусовый пектин, а в качестве ядра – экстракт хлореллы. При этом экстракт хлореллы добавляют в суспензию пектина в гексане в присутствии поверхностно активного вещества Е472с и перемешивают при 1000 об/мин. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре.
К недостаткам способа, взятого за прототип, можно отнести: использование в качестве ядра сухого экстракта хлореллы, имеющего относительно низкие биологические свойства по сравнению с нативной формой хлореллы; использование в технологическом процессе гексана, являющегося токсичным, огнеопасным и взрывоопасным веществом.
Технической задачей изобретения является повышение биологических свойств препарата за счет микрокапсулирования нативной формы хлореллы и использования в технологическом процессе безопасных веществ.
Решение технической задачидостигается тем, что 5,0 мл концентрата нативной формы хлореллы с содержанием 1,5 – 2,0 млрд/мл живых клеток диспергируют в 15,0 мл 50% -ного водного раствора поливинилпирролидона до образования однородной устойчивой суспензии. Полученную суспензию с использованием специального устройства–дозатора нашей конструкции (Патент Р.Ф. №194572 – 2019 г., авт. О.Б. Сеин и др.) вносят в 10-15 мл 30% -ного водного раствора танина с высоты 20-25 см при постоянном перемешивании в магнитной мешалке со скоростью вращения 50-60 об/мин в течение 30-60 мин. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С. Микрокапсулы представляют собой сферические образования желто-серого цвета.
Выход готовых микрокапсул составляет 100%. Массовое соотношение в микрокапсулах ядро : оболочка составляет 1:3.
Отличительной особенностью разработанного способа получения микрокапсул хлореллы является использование в качестве ядра микрокапсул нативной формы хлореллы которая, в отличие от сублимированной сухой  формы, содержит большое количество биологически активных веществ неразрушающихся в процессе микрокапсулирования.
Использованная в способе микроводоросль хлорелла содержит большое количество биологически активных веществ. В состав её клеток входят заменимые и незаменимые аминокислоты. Более 70% жирных кислот хлореллы относятся к ненасыщенным кислотам, являющихся предшественниками простагландинов и обеспечивающих гормональную регуляцию многих физиологических процессов. В хлорелле содержатся много каротина (провитамина А), витаминов группы В, витаминов С, К, РР, Е, пантотеновой кислоты, фолиевой кислоты и биотина. Хлорелла богата макро- и микроэлементами. В ней содержится много хлорофилла. Экспериментально подтверждено, что хлорелла профилактирует дисбактериоз, нормализует функциональную активность печени и кишечника, является мощным иммуномодулятором. На основе хлореллы в настоящее время производятся биодобавки и фитонапитки, рекомендуемые для пожилых людей и спортсменов («Хлорелла aLIVE», «Красный клён», Россия; «Now Foods», США).
Поливинилпирролидон был выбран в качестве оболочки микрокапсул в связи с тем, что он не токсичен и индифферентен для организма. Поливинилпирролидон хорошо растворим в неорганических растворителях, в том числе и в воде. В виде добавки Е1201 он разрешен к применению в пищевой промышленности в качестве загустителя, стабилизатора, а также как диспергирующий агент. Попадая в организм с продуктами питания, поливинилпирролидон не расщепляется ферментами, не всасывается в кровь и практически в неизменном виде выводится через кишечник. Раздражающего действия на слизистые оболочки поливинилпирролидон не оказывает.
Используемый в заявляемом технологическом процессе танин относится к водорастворимым полифенолам растительного происхождения. Получают его из коры дуба, каштана и акации. В пищевой промышленности танин используют в виде добавки Е-181 для придания вяжущего вкуса при изготовлении различных напитков. В медицине танин применяют как кровоостанавливающее, противодиарейное и антигеморроидальное средство.
Результатом предлагаемого способа является получение микрокапсул хлореллы в поливинилпирролидоне имеющих высокие биологические свойств.
Пример получения микрокапсул хлореллы с использованием разработанного способа и способа прототипа.
Пример 1 (разработанный способ)
5,0 мл концентрата нативной формы хлореллы с содержанием 2,0 млрд/мл живых клеток диспергируют в 15,0 мл 50% -ного водного раствора поливинилпирролидона до образования устойчивой суспензии. Полученную суспензию с использованием специального устройства–дозатора диспергируют со скоростью 2,0 мл/ мин в 15 мл 30%-ного водного раствора танина с высоты 20 см. Процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании в магнитной мешалке со скоростью вращения 60 об/мин в течение 30 мин. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают и высушивают при 30-35°С. Микрокапсулы представляют собой сферические образования жёлто-серого цвета. Выход микрокапсул составляет 100%, при массовом соотношении ядро : оболочка 1:3.
Пример 2 (способ прототип)
1,0 экстаркта хлореллы медленно добавляют в суспензию 3,0 низкоэтерифицированного яблочного пектина в гексане в присутствии 0,01 г препарата Е472с в качестве поверхностно-активного вещества при перемешивании 1000 об/мин. Полученную суспензию отфильтровывают и сушат при комнатной температуре. Микрокапсулы представляют собой сфорические образования желто-серого цвета. Выход микрокапсул составляет 100%, при массовом соотношении ядро : оболочка 1:3.
Пример сравнительной оценки разработанного микрокапсулированного препарата хлореллы и препарата – прототипа на лабораторных животных (кроликах).
Испытания препаратов проводили в условиях вивария Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова. Было сформировано три группы кроликов – аналогов 3-месячного возраста породы советская шиншилла  по 7 голов в каждой.
Животные 1 (контрольной) группы получали основной рацион. Кролики 2 группы получали препарат-прототип, а 3 группы – разработанный препарат в одинаковой дозировке 20 г/гол один раз в день в течение 20 дней подряд. Скармливали препараты в виде болюсов из хлебного мякиша.
Кролики всех групп содержались в типовых клетках расположенных в одном помещении. Основной рацион включал люцерно-клеверное сено и дерть ячменную.
До начала и в конце (21 день) эксперимента у кроликов брали кровь с использованием вакуумных пробирок TERUMO (Бельгия). В крови определяли общие гематологические показатели (скорость оседания эритроцитов, эритроциты, лейкоциты, гемоглобин) с применением общепринятых методик. Биохимические компоненты крови исследовали с использованием наборов ДиаВетТест (Россия) и Био-Ла-Тест (Чехия) и автоматического анализатора, ILAB-650.
В ходе проведенных исследований было установлено, что общее состояние, поведенческие реакции, аппетит у кроликов всех групп в период эксперимента находились в пределах физиологических норм.
При постановке подопытных животных на эксперимент абсолютная масса тела у них была практически одинаковой и колебалась в границах 2,51-2,53 кг. Однако в период эксперимента у кроликов опытных групп отличалась более высокая энергия роста. Так, если абсолютный прирост живой массы у животных контрольной группы за период эксперимента составил 262,0 г, то у кроликов 2 и 3 опытных групп он соответственно достигал 357,0 г и 380,0 г.
12
Исследование общих гематологических показателей свидетельствует (таблица 1), что у кроликов получавших микрокапсулированные препараты была более высокой гематокритная величина, содержалось больше эритроцитов и гемоглобина по сравнению с контрольными животными и фоновыми показателями. В то же время достоверные различия (p<0,05) отмечались только в содержании эритроцитов и гемоглобина у кроликов 3 опытной группы. В содержании лейкоцитов существенных изменений в крови кроликов «участвующих» в эксперименте выявлено не было, их показатели находились в пределах физиологических границ (6,5-9,5×10/л).
Анализ биохимических компонентов крови указывает на то (таблица 2), что у кроликов получивших разработанный препарат в крови содержалось достоверно больше (р<0,05) общего белка, альбуминов, общих иммуноглобулинов, общего кальция, неорганического фосфора, каротина и витамина А по сравнению с контрольными животными. У кроликов 2 опытной группы достоверное увеличение (р<0,05) отмечалась только со стороны общего кальция, неорганического фосфора, каротина и витамина А.
Таким образом разработанный способ микрокапсулированной хлореллы, несмотря на одинаковый выход препарата со способом-прототипом (100%), позволяет получать препарат оказывающий более выраженное стимулирующее действие на метаболизм у подопытных кроликов. В частности, после его применения у животных повышается (р<0,05) содержание общего белка и альбуминов. Достоверное (р<0,05) увеличение общих иммуноглобулинов свидетельствуют о положительном влиянии разработанного  препарата на факторы неспецифической резистентности организма животных.
Препарат можно рекомендовать к использованию в качестве дополнительного витамино-минерального источника при интенсивных физических нагрузках и в восстановительный период после соревнований спортсменов, а также во время реабилитации после перенесенных заболеваний.
Таблица 1. Общие гематологические показатели кроликов получивших препарат – прототип и разработанный препарат
Группа, показатели
Время исследования
до начала эксперимента
на 21 день эксперимента
<u>1 контрольная</u>СОЭ мм/часГематокрит %Эритроциты∙10¹²/лЛейкоциты∙10<sup>12</sup>/лГемоглобин∙г /л
1,80 ± 0,838,5 ± 2,126,10 ± 0,258,11 ± 0,53106,5 ± 2,11
2,00 ± 0,0838,0 ± 2,036,00 ± 0,368,19 ± 0,45103,0 ± 2,18
<u>2 опытная (препарат-прототип)</u>СОЭ мм/часГематокрит %Эритроциты∙10¹²/лЛейкоциты∙10<sup>12</sup>/лГемоглобин∙г /л
1,91 ± 0,0738,3 ± 1,906,14 ± 0,218,20 ± 0,44103,7 ± 2,05
1,90 ± 0,0739,7 ± 2,126,48 ± 0,308,11 ± 0,39108,6 ± 2,10
<u>3 контрольная (разработанный препарат)</u>СОЭ. мм/часГематокрит %Эритроциты∙10¹²/лЛейкоциты∙10<sup>12</sup>/лГемоглобин∙г /л
1,85 ± 0,0738,4 ± 2,106,11 ± 0,208,17 ± 0,51103,2 ± 2,07
1,75 ± 0,08 40,4 ± 2,04    7,03 ± 0,24*<sup>•</sup>  8,20 ± 0,63     111,0 ± 2,00*<sup>•</sup>
Примечание: * - при р<0,05 по сравнению с показателями контрольной группы; ∙ - при р< 0,05 по сравнению с показателями до начала эксперимента
Таблица 2. Биохимические показатели у кроликов получавших препарат- прототип и разработанный препарат
Группа, показатели
Время исследования
до начала эксперимента
на 21 день эксперимента
<u>1 контрольная</u>Общий белок, г/лАльбумины, г/лИммуноглобулины, г/лГлюкоза, ммоль/лХолестерин, ммоль/лОбщий кальций, ммоль/лНеорганический фосфор, ммоль/лКаротин, мкг/100млВитамин А, мкг/100мл
68,4 ± 2,1531,1 ± 1,1027,3 ± 0,974,45 ± 0,391,40 ± 0,192,33 ± 0,281,07 ± 1,190,23 ± 0,041,03 ± 0,05
<sup />
67,0 ± 2,1031,0 ± 1,0527,7 ± 0,884,50 ± 0,311,51 ± 0,172,41 ± 0,331,12 ± 1,170,25 ± 0,041,09 ± 0,06
<u>2 опытная (препарат-прототип)</u>Общий белок, г/лАльбумины, г/лИммуноглобулины, г/лГлюкоза, ммоль/лХолестерин, ммоль/лОбщий кальций, ммоль/лНеорганический фосфор, ммоль/лКаротин, мкг/100млВитамин А, мкг/100мл
68,8 ± 2,0331,5 ± 1,0027,7 ± 0,894,38 ± 0,371,49 ± 0,102,32 ± 0,141,10 ± 1,200,20 ± 0,041,06 ± 0,06
70,7 ± 1,8433,4 ± 1,1428,6 ± 0,774,53 ± 0,401,38 ± 0,152,77 ± 0,18*<sup>•</sup>1,94 ± 0,17*<sup>•</sup>0,41 ± 0,05*<sup>•</sup>1,98 ± 0,07*<sup>•</sup>
<u>3 контрольная (разработанный препарат)</u>Общий белок, г/лАльбумины, г/лИммуноглобулины, г/лГлюкоза, ммоль/лХолестерин, ммоль/лОбщий кальций, ммоль/лНеорганический фосфор, ммоль/лКаротин, мкг/100млВитамин А, мкг/100мл
68,3 ± 2,0131,0 ± 1,1526,9 ± 0,754,40 ± 0,801,44 ± 0,192,35 ± 0,111,09 ± 1,260,24 ± 0,031,05 ± 0,07
74,4 ± 1,42*<sup>•</sup>37,4 ± 1,06*<sup>•</sup>28,8 ± 0,84<sup>•</sup>5,11 ± 0,771,30 ± 0,162,80 ± 0,11<sup>•</sup>*2,15 ± 0,19*<sup>•</sup>0,55 ± 0,05*<sup>•</sup>2,47 ± 0,08*<sup>•</sup>