ГЕНЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ УСТОЙЧИВОСТЬ ПОДСОЛНЕЧНИКА К ЛОЖНОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЕ
GENES PROVIDING IMMUNITY OF SUNFLOWER TO DOWNY MILDEW

Настоящее изобретение относится к генам устойчивости к ложной мучнистой росе у подсолнечника, и, в особенности, к растениям подсолнечника, устойчивым к ложной мучнистой росе. Настоящее изобретение также относится к способу получения таких растений подсолнечника, устойчивых к ложной мучнистой росе, и применению указанных генов для обеспечения устойчивости к ложной мучнистой росе у подсолнечника.
Helianthus L. представляет собой род растений семейства Asteraceae (Астровые), содержащий примерно 52 вида. Общее название "подсолнечник" обычно используется для обозначения однолетнего вида Helianthus annuus (подсолнечник однолетний). Helianthus annuus и другие виды, такие как Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus, земляная груша), выращивают в регионах с умеренным климатом в качестве продовольственных культур и декоративных растений. Окультуренный подсолнечник, Helianthus annuus, является самым известным видом рода Helianthus L. Helianthus annuus выращивают как в декоративных целях, так и для получения растительного масла из семян.
Ложная мучнистая роса, обычное деструктивное заболевание подсолнечника, способна приводить к гибели растения или остановке его роста, уменьшая урожайность на корню и приводя к существенной потере урожая (вплоть до 50-95%). Подсолнечник является наиболее чувствительным к ложной мучнистой росе на полях, находящихся под проливным дождем в течение 2-3 недель после посадки.
Ложная мучнистая роса относится к любому из нескольких типов оомицетных патогенов, являющихся облигатными паразитами растений. Ложная мучнистая роса принадлежит исключительно к семейству Peronosporaceae (Переноспоровые). Патоген ложной мучнистой росы, обычно вызывающий заболевание ложной мучнистой росы у окультуренных видов подсолнечника, называется Plasmopara halstedii или Plasmopara helianthi.
В области техники, связанной с выведением и культивированием подсолнечника, имеется постоянная потребность в определении новых генов устойчивости к ложной мучнистой росе. Однако выявленные гены, обладающие наибольшей устойчивостью, представляют собой гены моногенно наследуемой доминантной устойчивости, при этом устойчивость, обусловленная этими генами, обычно быстро исчезает в результате эволюционирования и высокой адаптации патогенов ложной мучнистой росы, что позволяет этим патогенам успешно инфицировать растение-хозяина. Следовательно, в данной области техники постоянно имеется потребность в новых генах устойчивости, предпочтительно генах, обеспечивающих устойчивость, которая не исчезает быстро вследствие адаптации патогенов.
Недостатком известных генов устойчивости подсолнечника является то, что помимо обеспечения устойчивости к патогену, эти гены часто связаны с нежелательным фенотипом, таким как низкорослость или спонтанно возникающие случаи гибели клеток. Следовательно, в данной области техники постоянно имеется потребность в новых генах, которые обеспечивая устойчивость, не приводят к появлению нежелательного фенотипа.
Одной из многих прочих задач настоящего изобретения является удовлетворение, если не полностью, то по меньшей мере частично, вышеуказанных потребностей уровня техники.
Эта задача настоящего изобретения, помимо прочих задач, решается путем предоставления растений подсолнечника и генов устойчивости, охарактеризованных в прилагаемой формуле изобретения.
В частности, эта задача настоящего изобретения, помимо прочих задач, решается согласно первому аспекту путем предоставления растений подсолнечника, устойчивых к патогену ложной мучнистой росы, которые содержат ген, обеспечивающий устойчивость к ложной мучнистой росе, кодирующий (а) белок(белки), содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или ген, обеспечивающий устойчивость к ложной мучнистой росе, кодирующий белок(белки) с более чем 90% идентичностью последовательности, предпочтительно с более чем 94% идентичностью последовательности, более предпочтительно с более чем 96% идентичностью последовательности к последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, причем экспрессия такого обеспечивающего устойчивость гена снижена по сравнению с экспрессией обеспечивающего устойчивость гена у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы у растений, или ферментативная активность такого белка снижена по сравнению с ферментативной активностью белка у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы у растений.
Исследования, которые привели к созданию настоящего изобретения, неожиданно показали, что сниженный уровень экспрессии заявленных генов или сниженная ферментативная активность заявленных белков обусловливала продолжительную устойчивость к широкому спектру патогенов ложной мучнистой росы у растений подсолнечника.
Согласно настоящему изобретению уровень экспрессии снижается по сравнению с уровнем экспрессии обеспечивающего устойчивость гена у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы у растений. Термин "не является устойчивым" указывает на уровень устойчивости, который определяется в тесте чувствительности к соответствующему заболеванию, при этом используется соответствующее растение сравнения, такое как материнское растение, имеющее более низкий уровень устойчивости по сравнению с наблюдаемым у заявленных растений. Следовательно, заявленная устойчивость также может быть определена как увеличенная устойчивость к ложной мучнистой росе. Подходящими растениями сравнения согласно настоящему изобретению, помимо материнского растения, могут также быть растения, которые в данной области техники, как правило, считаются растениями, чувствительными к ложной мучнистой росе.
Подходящий тест на чувствительность к заболеванию представляет собой инокулирование растений патогенами ложной мучнистой росы и последующее выявление случаев появления симптомов заболевания, таких как большие, угловатые или неоднородные по структуре желтые области, видимые на верхней поверхности листьев или разрушенная листовая ткань.
Уровни экспрессии у растений по изобретению и растений сравнения можно определять, используя подходящие и хорошо известные методы молекулярной биологии, такие как количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) или гибридизация мРНК.
Согласно настоящему изобретению ферментативная активность снижена по сравнению с активностью белка у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы. Термин "не является устойчивым" указывает на уровень устойчивости, который определяется в тесте чувствительности к соответствующему заболеванию, при этом используется соответствующее растение сравнения, такое как материнское растение, имеющее более низкий уровень устойчивости по сравнению с наблюдаемым у заявленных растений. Следовательно, заявленная устойчивость также может быть определена как увеличенная устойчивость к ложной мучнистой росе. Подходящими растениями сравнения согласно настоящему изобретению, помимо материнского растения, также могут быть растения, которые в данной области техники, как правило, считаются растениями, чувствительными к ложной мучнистой росе. Подходящий тест на чувствительность к заболеванию представляет собой инокулирование растений патогенами ложной мучнистой росы и последующее выявление случаев появления симптомов заболевания, таких как большие, угловатые или неоднородные по структуре желтые области, видимые на верхней поверхности листьев или разрушенная листовая ткань.
2
2
2
Заявленные белки имеют активность 2-оксоглутарат FE(II)-зависимой оксигеназы. Фермент имеет абсолютную потребность в Fe(II) и катализирует двухэлектронное окисления, в том числе гидроксилирование, реакции десатурации и окислительного замыкания кольца. Окисление 'основного' субстрата связано с превращением 2ОG в сукцинат и CО. Один атом кислорода молекулы О встраивается в сукцинат. В случае реакции десатурации, другой атом кислорода этой молекулы предположительно участвует в образовании воды. В реакции гидроксилирования при частичном включении кислорода из молекулы О в спиртовой продукт наблюдаются высокие уровни обмена кислорода, определяемые по воде. Следовательно, сниженную активность можно определить, используя анализ измерения соединений, которые являются либо исходными соединениями, либо соединениями, образующимися в результате ферментативной реакции. В качестве подходящей альтернативы, уровни белка, являющиеся показателем сниженной активности, можно определять хорошо известными специалистам в данной области методами ELISA или гибридизации белков.
В контексте настоящего изобретения растения подсолнечника приобретают устойчивость к ложной мучнистой росе, индивидуально или в комбинации, через сниженный уровень экспрессии или активности, благодаря присутствующим белкам или генам, кодирующим эти белки.
Заявленные растения подсолнечника могут быть получены мутагенезом растения, чувствительного к ложной мучнистой росе, или растений, устойчивых ложной мучнистой росе, таким образом увеличивая их устойчивости. Например, в эти растения могут быть введены мутации, либо на уровне экспрессии, либо на уровне белка, путем использования мутагенных веществ, таких как этилметансульфонат (ЭМС), или путем облучения растительного материала гамма лучами или быстрыми нейтронами. Получаемые мутации могут быть направленными или случайными. В последнем случае мутированные растения, содержащие мутации в имеющихся генах устойчивости, можно быстро определить с помощью метода TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) (McCallum et al. (2000) Targeted screening for induced mutations. Nat. Biotechnol. 18, 455-457, and Henikoff et al. (2004) TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636). Вкратце, этот способ основан на ПЦР амплификации представляющего интерес гена из геномной ДНК большого набора мутированных растений в М2 поколении. Путем секвенирования ДНК или сканирования точечных мутаций, используя нуклеазу, специфичную к однонитевой ДНК, такую как нуклеаза CEL-I (Till et al. (2004) Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases. Nucleic Acids Res. 32, 2632-2641), определяют отдельные растения, содержащие мутацию в имеющихся генах.
Согласно предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения патогены ложной мучнистой росы представляют собой Plasmopara halstedii и/или Plasmopara helianthi. Однако в контексте настоящего изобретения рассматриваются и другие патогены, относящиеся к семейству Peronosporaceae и способные вызывать заболевание ложной мучнистой росы у подсолнечника.
Согласно другому предпочтительному варианту первого аспекта настоящего изобретения имеющаяся сниженная ферментативная активность обусловливается одной или несколькими мутациями в кодирующей последовательности заявленных генов, в результате чего образуется укороченный или нефункциональный белок. Укороченные белки можно с легкостью определить, анализируя транскрипты гена на уровне мРНК или кДНК, а нефункциональные белки можно определить с помощью ферментативного анализа или, используя конформационно зависимые антитела. Мутации, которые можно анализировать на уровне транскриптов, представляют собой, например, аминокислотные замены, сдвиг рамки считывания или кодоны преждевременной терминации.
Согласно особо предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения, мутации, приводящие к сниженной активности белков представляют собой мутации, приводящие к отсутствию или замене(ам) аминокислот в мотиве "WRDYLR" или Trp-Arg-Asp-Tyr-Leu-Arg кодирующей последовательности заявленного обеспечивающего устойчивость гена (см. фиг.1 и 2). Имеющийся мотив может быть обнаружен в положениях 107-112 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и положениях 116-121 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4. Авторы изобретения обнаружили, что мутации в этой области имеют особое влияние на фенотип устойчивости к ложной мучнистой росе, т.е. наблюдаемому уровню устойчивости. В особенности, мутации, включающие Y (Tyr) и/или R (Arg) сильно коррелируют с фенотипом устойчивости к ложной мучнистой росе, т.е. наблюдаемым уровнем устойчивости.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения, сниженная экспрессия обусловливается одной или несколькими мутациями в регуляторных областях или некодирующих последовательностях заявленных генов. Примеры регуляторных областей заявленных генов представляют собой промоторные и терминаторные области, а примеры некодирующих областей представляют собой интроны и, в особенности, присутствующие в них мотивы, влияющие на сплайсинг.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение предоставляет семена, ткани растений или части описанных выше растений подсолнечника, или получаемые из описанных выше растений подсолнечника, содержащие ген, обеспечивающий устойчивость к ложной мучнистой росе, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или ген, обеспечивающий устойчивость к ложной мучнистой росе, кодирующий белок с более чем 90% идентичностью последовательности, предпочтительно с более чем 94% идентичностью последовательности, более предпочтительно с более чем 96% идентичностью последовательности к последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, причем экспрессия указанного обеспечивающего устойчивость гена снижена по сравнению с экспрессией обеспечивающего устойчивость гена у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы у растений, или ферментативная активность указанного белка снижена по сравнению с ферментативной активностью белка у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы у растений.
Согласно третьему аспекту, настоящее изобретение относится к способам получения устойчивых растений подсолнечника или способам увеличения устойчивости растений подсолнечника к патогенам ложной мучнистой росы, причем указанные способы содержат этап введения в растение подсолнечника ген, обеспечивающий устойчивость к ложной мучнистой росе, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или ген, обеспечивающий устойчивость к ложной мучнистой росе, который кодирует белок с более чем 90% идентичностью последовательности, предпочтительно с более чем 94% идентичностью последовательности, более предпочтительно с более чем 96% идентичностью последовательности к последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, причем экспрессия указанного обеспечивающего устойчивость гена снижена по сравнению с экспрессией обеспечивающего устойчивость гена у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы у растений, или ферментативная активность указанного белка снижена по сравнению с ферментативной активностью белка у растения подсолнечника, которое не является устойчивым к патогену ложной мучнистой росы у растений.
Согласно четвертому аспекту, настоящее изобретение относится к применению гена или его кДНК последовательности, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или гена, обеспечивающего устойчивость к ложной мучнистой росе, кодирующего белок с более чем 90% идентичностью последовательности, предпочтительно с более чем 94% идентичностью последовательности, более предпочтительно с более чем 96% идентичностью последовательности приведенной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, для получения растений подсолнечника, устойчивых или имеющих увеличенную устойчивость к ложной мучнистой росе растений.
Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4.
Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.
Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение относится к гену, кодирующему белок, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.