Препарат рекомбинантного интерферона-альфа собаки для применения в терапии природных вирусных инфекций собак
RECOMBINANT INTERFERON-ALPHA DOG PREPARATION FOR USE IN THERAPY OF NATURAL VIRAL INFECTIONS OF DOGS

Настоящее изобретение относится к области фармацевтики и предназначается для использования в ветеринарии при лечении природных вирусных заболеваний собак. Предложен простой по составу, монокомпонентный в отношении действующего вещества (ДВ) препарат, представленный в инъекционной форме и содержащий в качестве активного начала одну высокоочищенную форму рекомбинантного интерферона собаки, относящуюся к субтипу альфа (сИФН-альфа 1-8). Новое средство характеризуется высокой эффективностью, безопасностью для организма животных и стабильностью при хранении. Применение предлагаемого препарата в лечении вирусных инфекций собак, как в комплексной терапии, так и в качестве самостоятельного лекарственного средства, обеспечивает ускорение купирования клинических признаков заболевания и сокращение сроков выздоровления животных, не вызывая при этом побочных реакций.
Введение.
Вирусные инфекции широко распространены у мелких домашних животных (МДЖ). К наиболее часто встречающимся у собак относятся такие природные заболевания вирусной природы, как парвовироз (парвовирусный энтерит), коронавирусный энтерит, чума, герпесвирусная и аденовирусная инфекции. Многие из перечисленных выше заболеваний тяжело переносятся животными и нередко приводят к летальному исходу, особенно у щенков. Так, например, коронавирусный энтерит у щенков в возрасте до 12 недель детален в большинстве случаев, их смертность при этом заболевании (в отсутствии своевременного лечения) достигает 50-60%; летальность при заболевании собак чумой (в зависимости от формы болезни) колеблется от 25 до 75%.; при парвовирусном энтерите гибель молодых животных в среднем составляет порядка 40%; герпесвирусная инфекция приводит к гибели щенков в 70-80% случаев; при заражении собак аденовирусом CAV2 (аденовирозе, инфекционном трахеобронхите) летальность у щенков может достигать 10-15%, а среди собак с инфекционным гепатитом, вызываемом аденовирусом CAV1, - более 20%.
Одним из важнейших инструментов в борьбе со вспышками таких опасных вирусных заболеваний собак, как чума, парвовирусный энтерит, коронавирусный энтерит и инфекционный гепатит, в течение многих лет была и остается вакцинация животных. Однако в последние годы многими ветеринарными врачами отмечается рост обращений владельцев животных в клиники с заболеваниями их питомцев чумой и парвовирусным энтеритом. Одной из возможных причин этого специалисты считают снижение эффективности используемых вакцин в связи с возникновением устойчивости к ним вируса-возбудителя в результате быстро происходящих мутационных процессов.
Традиционным методом лечения собак с наиболее опасными и тяжело протекающими вирусными заболеваниями является комплексная терапия, обычно предусматривающая применение средств для подавления процесса обезвоживания организма, медикаментов для устранения симптомов заболевания, средств для предотвращения размножения болезнетворных бактерий на фоне сниженного иммунитета, главным образом, антибиотиков, а также препаратов, поддерживающих сердечно-сосудистую систему. Что касается собственно противовирусной терапии, то в комплексное лечение острых вирусных инфекций часто рекомендуется дополнительно включать специфические (например, сыворотки с антителами к возбудителю) и неспецифические иммунные препараты, направленные на стимуляцию иммунного ответа организма у пациента (интерфероны, интерлейкины, интерфероногены).
Достижения современной молекулярной биологии и биотехнологии, позволяющие получать новые формы рекомбинантных цитокинов и исследовать тонкие механизмы действия этого класса белков в организме, обеспечивают сегодня надежную теоретическую и экспериментальную базу для успешного развития направления, связанного с применением иммуномодуляторов белковой природы, в частности интерферонов (ИФН).
Уровень техники
Согласно общепринятой классификации, основанной на способности ИФН взаимодействовать в организме с определенным типом клеточных рецепторов, интерфероны альфа, бета, дельта, омега, эпсилон, каппа, тау относят к интерферонам I типа; ИФН-гамма - к типу II, а интерфероны лямбда - к типу III. Показано, что для всех трех типов интерферонов характерна выраженная полифункциональность, представленная тремя видами биологической активности: противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей. Вместе с тем, названные виды активности проявляются интерферонами, относящимися к разным типам, в различной степени.
Функциональные исследования интерферонов типа I первоначально были сконцентрированы исключительно на представлении об их способности индуцировать природный (врожденный) иммунитет против вирусных инфекций (Haller et al. (1981) J. Exp. Med., 154, 199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol., 78, 181). Однако в более поздних исследованиях интерфероны типа I уже рассматриваются и как мощные иммунорегуляторные цитокины при адаптивном иммунном ответе (Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med, 178, 1655; Santini et al. (2000) J. Exp. Med., 191, 1777; Tough et al., (1996) Science, 272, 1947). Кроме того, в многочисленных исследованиях, проведенных на различных клеточных системах (in vitro) было показано, что ИФН I типа во многих случаях демонстрируют больший, в сравнении с другими типами, «прямой» противовирусный эффект на зараженных вирусом клетках (Hartshorn K. et al., (1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses, 3(2), 125-133; Todt D. et al. (2016) Antimicrob. Agents Chemother., 60(4), 2132-2139). В настоящее время не вызывает сомнений, что в живом организме они обеспечивают защиту от вирусных инфекций за счет двух одновременно действующих механизмов: путем подавления размножения возбудителя в результате ответа зараженной клетки и благодаря стимуляции иммунитета у пациента, причем как врожденного, так и адаптивного. В исследованиях, связанных с лечением вирусных инфекций у животных, в том числе и собак, I типу интерферонов сегодня уделяется большое внимание. При этом особое место в этих разработках отводится интерферонам субтипа альфа, возможно, как наиболее изученным противовирусным агентам в отношении широкого круга возбудителей вирусной природы (Yang et al. (2013), J. Int. Cytokine Res., 33 (12), 760-768).
В первых работах по успешному включению в схему лечения вирусных инфекций у собак интерферона-альфа использовался ИФН человека. Так, в патенте США (US) 5,830,456; 03.11.1998 приводятся сведения о положительных результатах применения собакам альфа-интерферона человека при герпесвирусной инфекции, а также при парвовирусном энтерите, где пероральный прием цитокина, по данным авторов, демонстрировал лечебный эффект при использовании как человеческого, так и бычьего ИФН-альфа.
В целом интерфероны субтипа альфа, принято считать белками, не обладающими строгой видоспецифичностью, поскольку многие представители этого класса цитокинов в той или иной степени проявляют свое противовирусное действие на клетках нескольких видов животных (например, ИФН-альфа человека активен на зараженных вирусом клетках быка, мыши, лошади, кошки (Bridgman R. et al. (1988) J. Int. Res., 8, 1-4; Sen G. et al. (1984), J. Virol., 50(2), 45-50). Однако в любом случае «перекрестное» применение ИФН-альфа определенного вида животного, как минимум, не обеспечивает той эффективности действия, которую цитокин проявляет благодаря наибольшей аффинности связывания с рецепторами «собственного» вида (Aguet М. (1984) Virology, 132(1), 211-216), а при терапии заболеваний, требующих длительных курсов лечения, часто вызывает побочные эффекты, связанные с накоплением антител (Zeidner, N. et al. (1990) Antimicrob. Agents Chemother., 34, 1749-1756).
С учетом этого, наилучших результатов, как с точки зрения эффективности, так и в плане безопасности, закономерно ожидать при использовании в терапии вирусных заболеваний животных «собственных» альфа-интерферонов. Тем более, что альфа-интерферон собак, как показано в целом ряде исследований (Himmler et al. (1987), J Interferon Res., 7(2): 173-83; Bridgman R. et al. (1988); Taira O. et al. (2005), J. Vet. Med. Sci, 67 (10), 1059-1062) как раз относится к числу «нетипичных» представителей ИФН I типа и демонстрирует исключительно высокий уровень видоспецифичности, проявляя значимый противовирусный эффект практически только на клетках собаки.
IFN-α собаки представлен 8 формами (1-8) с высокой степенью гомологии аминокислотных последовательностей (от 93 до 100%). Первые три из них (сИФН альфа 1, 2, 3) получены и описаны в работе Himmler A. et al. (1987), а остальные 5 (сИФН альфа 4, 5, 6, 7 и 8) - в работе Taira O. et al, 2005. Все 8 изоформ имеют одинаковую структуру молекулы: 6 цистеинов с консервативным расположением, из которых четыре (во всех случаях 24-122 и 52-160) образуют S-S связи, а два другие (во всех случаях 92 и 109) - позиции для гликозилирования, которое, как показано в целом ряде работ (ЕР 0186098 (В1), (1992); CN 321169 (2012); Taira О., (2005) J. Vet. Med. Sci. 65(10), 1059-1062) не сказывается на противовирусной активности белков, определяемой на зараженных вирусом клеточных культурах. Однако по сходству положений аминокислотных замен в последовательности белка семейство альфа интерферонов собаки условно подразделяют на две группы, где первая включает формы 1, 2 и 7, а вторая - формы 3, 4, 5, 6, и 8.
Несмотря на то, что к настоящему времени достаточно хорошо исследована и структура, и функциональная активность сИФН-альфа, сведения, касающиеся вопросов практического использования их в терапии вирусных инфекций у собак, крайне ограничены и по существу сводятся
либо к недостаточно обоснованным гипотезам, базирующимся исключительно на первичных результатах исследований их активности in vitro (CN 102321169 (2012); Na Z. et al., (2008), Appl Microbiol Biotechnol., 78(2):221-6 и др.),
либо к разработкам средств, предназначенных для наружного или орального применения сИФН-альфа в малых дозах при лечении ограниченного круга заболеваний собак, в основном вызываемых смешанной или бактерйальной инфекцией (US 8,992,905; 31.03.2015; Ito A. et al., (2010), J. Vet. Med. Sci. 72 (9), 1145-1151; Dec M. et al., (2008) Pol. J. Vet. Sci.; 11(2): 175-86),
либо к описаниям представленных на ветеринарном рынке комплексных препаратов, включающих сИФН-альфа в различных комбинациях с другими ДВ.
Недостатком первой группы предложений является то, что результат определяемого in vitro «прямого» воздействия интерферона на размножение вируса в зараженной клетке не может быть «автоматически» перенесен на условия in vivo, где подавление вирусного заражения, как известно, осуществляется за счет совокупного действия различных механизмов. Кроме того, в качестве модельных систем при определении противовирусного действия ИФН in vitro для заражения клеток обычно применяются стандартные методы, использующие весьма ограниченный круг возбудителей (вирус везикулярного стоматита, аденовирус, вирус герпеса), в который, как правило, не входят возбудители, например, таких распространенных заболеваний собак, как парвовироз, чума, коронавирусная инфекция.
Недостатком второй группы работ является то, что предлагаемые в них лекарственные формы применимы только к ограниченному кругу относительно легко протекающих бактериальных или смешанных инфекций (кератоконъюнктивиты, гингивостоматиты) и не могут быть использованы при острых формах многих распространенных вирусных заболеваний собак, особенно сопровождающихся анорексией, рвотой, полным отсутствием аппетита, диареей и т.д. Кроме того, применение указанных лекарственных форм не может обеспечить уверенности в точном дозировании препарата.
4
Третья группа разработок по применению сИФН-альфа в терапии инфекционных заболеваний собак немногочисленна и фактически ограничивается производимыми компанией ПроБиоТех (республика Беларусь) ветеринарными препаратами «Ципрофан» и «Фанниферон». Оба предлагаемых разработчиком средства для лечения заболеваний собак являются комбинированными препаратами. Так, в «Ципрофане» альфа ИФН собаки представлен в комбинациии с антимикробным агентом - ципрофлоксацином, который во всех описаниях позиционируется как основной, тогда как сИФН определяется лишь как дополняющий и улучшающий его свойства. Препарат «Фанниферон» согласно инструкции (Инструкция по применению препарата, разработанная РУП "Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского" и ООО "Научно-производственный центр ПроБиоТех", 2014; режим доступа: https://probiotech.ru/product/fanniferon; http://www.webvet.ru/preparats/fanniferon/) содержит в качестве действующего начала неопределенную смесь рекомбинантных белков собачьих альфа- и гамма-интерферонов (без указания конкретной формы или форм альфа ИФН, а также количественного соотношения между двумя типами ИФН) и рекомендуется для профилактики и лечения при желудочно-кишечных и острых респираторных заболеваниях вирусной этиологии у МДЖ. Противовирусная активность предлагаемой комбинации (сумма активностей сИФН альфа и сИФН гамма) характеризуется величиной, составляющей «не менее 1×10 МЕ/мл», что в целом значительно уступает противовирусной активности, которую способен обеспечить рекомбинантный сИФН-альфа (Taira О., 2005; CN 102321169, 18.01. 2012; Ito А., 2010). Лечебный эффект препарата, описанный в отчете о его клинических испытаниях, выражается в сокращении срока до выздоровления на 2-3 дня. Между тем, как показано в настоящем изобретении, присущая интерферону альфа совокупность свойств (прямой противовирусный эффект, иммуномодулирующая активность и антибактеральное действие), полностью достаточна для обеспечения, как минимум, такого же лечебного эффекта. При этом очевидно, что получение и комбинирование двух рекомбинантных белков требует значительно больших материальных и временных затрат, и, соответственно, существенно повышает себестоимость продукта в сравнении с препаратом, содержащим в качестве ДВ только один сИНФ альфа. Недостатком «Фанниферона» также является короткий срок хранения, согласно инструкции составляющий всего 12 месяцев, причиной чего может, в частности, являться его многокомпонентный состав.
Данных об инъекционном препарате для лечения природных вирусных инфекций собак, включающем в качестве ДВ только одну высокоочищенную изоформу сИФН альфа, в общедоступных источниках нами не обнаружено.
Задачей настоящего изобретения была разработка эффективного и безопасного препарата на основе сИФН-альфа, простого по составу как ДВ (монокомпонентного), так и вспомогательных веществ, и пригодного для использования при терапии широкого круга вирусных инфекций собак в любых формах их проявления.
Раскрытие изобретения
Поставленная задача была решена путем разработки монокомпонентного (в отношении ДВ) инъекционного препарата, содержащего в качестве действующего вещества одну высокоочищенную рекомбинантную изоформу интерферона собаки, относящуюся к субтипу альфа (сИФН-альфа 1-8) и представленную в количестве, достаточном для достижения терапевтически эффективной дозы при введении животному, и минимальный набор вспомогательных компонентов, необходимый для растворения субстанции и придания раствору физиологичности и стабильности.
а) Альфа-интерферон собаки был избран в качестве ДВ настоящего изобретения по результатам анализа информации, содержащейся в научно-технической и патентной документации (см. раздел Уровень техники). Выбор для лечения заболеваний собак видоспецифичного для данного вида животных интерферона основан на многочисленных результатах исследований и находится в русле современных представлений о том, что применение «собственных» интерферонов обеспечивает максимально возможную эффективность и безопасность их действия в организме (вне зависимости от схемы применения). Акцент на использовании именно ИФН субтипа альфа связан с установленными экспериментально фактами, свидетельствующими как о его высокой противовирусной активности в отношении зараженных вирусом клеток, так и проявляемой им способности стимулировать в организме иммунный ответ, причем за счет механизмов как адаптивного, так и врожденного иммунитета.
Выбор инъекционной лекарственной формы для препарата по изобретению обусловлен тем, что она применима для более широкого круга заболеваний, чем топикальная, оральная и назальная, и может быть использована при любых формах заболевания, включая острые, сопровождающиеся анорексией, рвотой, полным отсутствием аппетита, диареей и т.д. Кроме того, при использовании инъекционной формы лекарственного средства обеспечивается точное дозирование ДВ.
Планируемая при разработке нового препарата простота его состава могла быть достигнута не только за счет количества используемых ДВ, но и путем возможного ограничения числа вспомогательных компонентов. При этом дополнительно было принято во внимание, что избыточное расширение состава включаемых добавок, имеющих различную химическую природу и, соответственно, реакцию на внешние воздействия (свет, pH, температуру) в определенной степени осложняет решение вопроса о стабильности препарата и, как показывает практика, часто сокращает сроки его хранения.
б) В настоящем изобретении для получения рекомбинантного сИФН используют бактериальную систему экспрессии. При этом применяемый конкретный метод биосинтеза белка (путем прямой экспрессии гена ИФН или через получение и расщепление гибридного предшественника) не является критичным, поскольку для последующего использования в составе фармацевтического препарата принципиальными являются высокие показатели чистоты субстанции (согласно ОФС. 1.7.1.0007.15 Государственной Фармакопеи №13 от 2017 г. - не менее 92,5% по мономеру и не менее 95% с учетом димеров) и специфической (противовирусной) активности, достижение которых в значительной степени зависит от удачно подобранной комбинации методов выделения и очистки продукта. В частном воплощении изобретения рекомбинантные изоформы сИФН альфа с требуемыми характеристиками были получены с помощью экспрессионной системы, методов выделения и очистки белка, раскрытых в патенте РФ №2604796 С1 от 10.12.2016 (ООО НПК «СКиФФ») (см. пример 1).
7
8
в) Анализ противовирусного действия очищенных рекомбинантных сИФН оценивали по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (VSV) на линии клеток собаки MDCK. В результате было установлено, что определяемая в данной системе специфическая активность для всех полученных изоформ сИФН (5×10-2×10 МЕ/мг) соответствовала данным, приводимым в литературных источниках, и была достаточной для включения их в состав фармацевтических препаратов (см. пример 2).
г) При разработке лекарственных композиций исходили из подбора состава, обеспечивающего, во-первых, наилучшую растворимость интерферона и, во-вторых, стабильность препарата при хранении и применении. В качестве растворителя использовали фосфатный буфер/ЭДТА (pH 7,0-7,5). Из числа вспомогательных ингредиентов, кроме растворителя, в состав включали только вещества, традиционно применяемые в данной области для придания раствору физиологичности и повышения стабильности препарата при получении и хранении: NaCl, один-два нейтральных носителя, выбранных из сорбитола, маннитола, полисорбата, поливинилпирролидона, декстрана, твина и др., и консервант, традиционно применяемый в данной области (бензиловый спирт, бензоат натрия, метакрезол). По итогам проверки растворимости ДВ и стабильности полученного препарата были определены составы (см. пример 3), на которых далее было проведено исследование токсичности и лечебного эффекта.
д) Исследование на острую токсичность препарата проводилось путем внутрижелудочного и внутримышечного введения белым мышам и накожного нанесения белым крысам; изучение субхронической токсичности - по результатам 30-дневного внутримышечного введения препарата крысам. При этом оценивалось общее состояние и поведение животных, прирост массы тела, а также данные микроскопического исследования тканей (печень, легкие, почки, сердце, мышцы), и проводилось определение значений LD50. По совокупности полученных данных предлагаемые составы были признаны малотоксичными и согласно общепринятой гигиенической классификации отнесены к 4 классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76. (см. пример 4).
5
е) Проверка лечебного эффекта нового препарата включала (1) эксперимент с искусственным заражением животных вирусом чумы плотоядных и терапией заболевания только препаратом по изобретению и (2) опыт по лечению щенков с природной парвовирусной инфекцией, где сИФН-альфа применялся в комплексной терапии заболевания. Учет клинического проявления заболеваний включал полный клинический осмотр животных, общий анализ крови (ОАК), биохимический анализ крови (БАК) и данные ПЦР перед началом лечения и после его завершения, а также ежедневное наблюдение за состоянием животных в ходе лечения с контролем температуры тела и оценкой выраженности клинических симптомов. При определении терапевтически эффективной дозы препарата ориентировались на ранее полученные нами и зарубежными исследователями данные по лечению вирусных инфекций собак препаратами с кошачьим интерфероном, учитывая при этом различия в специфической активности используемых субстанций in vitro. В большинстве проведенных испытаний терапевтически эффективным оказалось внутримышечное введение препарата в разовой (суточной) дозе 0,5-1×10 МЕ/кг (см. пример 5).
ж) При оценке лечебного эффекта препарата учитывали динамику улучшения общего клинического состояния и продолжительность лечения до клинического выздоровления, данные ПЦР, а также результаты клинического и биохимического анализов крови. (пример 5).
Полученные данные позволили сделать вывод о том, что предлагаемое в настоящем изобретении лекарственное средство, представляющее собой простой по составу инъекционный препарат на основе одной (из 8 известных) рекомбинантной изоформы интерферона альфа собаки, демонстрирует выраженный лечебный эффект в отношении таких распространенных природных вирусных инфекций собак, как чума, аденовироз и парвовирусный энтерит, сокращая время купирования клинических симптомов и облегчая течение заболевания, а также уменьшая срок, необходимый для полного выздоровления животного примерно на 30%. При этом за все время наблюдения ни у одного из подвергавшихся лечению сИФН-альфа животных не было обнаружено каких-либо побочных эффектов, что служило подтверждением безопасности применения предлагаемого препарата в терапевтически эффективной дозе.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - Динамика изменения температуры тела в ходе лечения щенков с парвовирусным энтеритом.
- контрольная группа животных (симптоматическое лечение)
- опытная группа животных (симптоматическое лечение + сИФН-альфа)
По оси абсцисс: время лечения (в сутках)
По оси ординат: t° тела (среднее арифметическое значение для группы)
Фиг. 2 - Динамика изменения выраженности клинических признаков в ходе лечения щенков с парвовирусным энтеритом
- контрольная группа животных (симптоматическое лечение)
- опытная группа животных (симптоматическое лечение + сИФН-альфа)
По оси абсцисс: время лечения (в сутках)
По оси ординат: оценка выраженности клинических признаков заболевания (в баллах)
Осуществление изобретения
Сведения о получении и лабораторных исследованиях предлагаемого препарата, а также результаты его испытаний при лечении конкретных заболеваний собак представлены ниже в виде примеров осуществления, которые не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Получение сИФН-альфа и определение чистоты продукта.
Для получения в Е. coli рекомбинантных форм сИФН-альфа с необходимыми показателями чистоты и активности использовали способы экспрессии (через гибридный предшественник), выделения и очистки рекомбинантных белков, подробно описанные ранее в патенте RU 2604796 С1 от 10.12.2016 (ООО НПК «СКиФФ»). Изоформу сИФН альфа1 получали непосредственно культивированием раскрытого в указанном патенте рекомбинантного штамма E.coliBL21(DE3)/pGEMEX-l/GLSΔ23-caINF(1), включающего генетическую конструкцию, которая кодирует гибридный белок-предшественник интерферона собаки альфа1 (ABF68838.1). Для экспрессии других изоформ (5 и 7) в рекомбинантном векторе pGEMEX-1/GLSΔ23-caINF(1) осуществляли замену синтетического гена альфа-1 на оптимизированную для экспрессии в E. coli нуклеотидную последовательность, кодирующую, соответственно, зрелую форму белка сИФН-альфа 5 и 7, аминокислотные последовательности которых известны из уровня техники. Созданными конструкциями трансформировали клетки Е. coli BL21(DE3) с получением двух новых рекомбинантных штаммов - продуцентов гибридных предшественников для изоформ 5 и 7. Все гибридные белки, полученные в виде телец включения, подвергали растворению, рефолдингу и гидролизу специфической протеазой (Ulp1). Выделение и очистку конечных продуктов (сИФН альфа 1, 5 и 7) осуществляли в полном соответствии со схемой, разработанной ранее для ИФН человека (RU 2604796 С1). Выход рекомбинантного белка для всех трех изоформ составлял не менее 5 мг/(л*ОП.)
Очищенные белки хранились в виде лиофилизата (при +4°С) или в виде замороженного раствора (при минус 20°С). Молекулярные массы полученных продуктов, определенные методом электрофореза в ПААГ по Лэмли, где они были представлены одной полосой, полностью соответствовали рассчитываемым из аминокислотных последовательностей зрелых форм и составляли около 20 кДа, что являлось подтверждением отсутствия в структуре интерферонов углеводных остатков. Чистота полученных препаратов, определенная методом ВЭЖХ, во всех трех случаях по основному компоненту (мономеру) составляла 95%.
Пример 2. Определение специфической активности препаратов сИФН-алъфа
7
8
8
Анализ противовирусного действия очищенных рекомбинантных сИФН оценивали по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (VSV) на линии клеток собаки MDCK известным методом (Armstrong, Methods in Enzymol., 1981, v. 78 (PtA), pp. 381-387). В результате было установлено, что определяемые в данной системе величины удельной активности изоформ 1, 5 и 7 составляли интервал значений от 0,5×10-2×10 МЕ/мг. При этом показатели специфической активности образцов сИФН альфа1 и сИФН альфа7, относящихся к первой группе альфа-сИФН и имеющих аминокислотные последовательности, различающиеся лишь 2 аминокислотными остатками (О. Taira, 2005), были практически одинаковыми и располагались в интервале 1,5-2,0×10 МЕ/мг, тогда как активность образцов IFN-альфа 5, принадлежащего ко второй группе данного семейства, характеризовалась в среднем несколько более низкими значениями.
Пример 3. Приготовление и оценка композиций (составов)
В качестве растворителя использовали 10 мМ фосфатный буфер (Na2HPO4/KH2PO4), pH 7,0-7,6, с ЭДТА-Na (0,2 mM). Для повышения стабильности препарата и придания раствору физиологичности в состав включали NaCl, один-два нейтральных носителя, выбранных из сорбитола, полисорбата, маннитола, поливинилпирролидона, декстрана и твина, и консервант из числа традиционно применяемых в данной области (бензиловый спирт, бензоат натрия, метакрезол).
Для проверки стабильности препарата во время его хранения через определенные интервалы времени в тесте in vitro проводилось определение специфической активности, а также при помощи метода ИФА в образцах измерялось содержание интерферона. За стабильностью интерферона в различных составах наблюдали в условиях хранения при температуре 4°С.
В процессе подбора вспомогательных компонентов для композиции было испытано более 15 комбинаций. По результатам проведенных испытаний было определено несколько составов со сходными показателями по растворимости ИФН и стабильности препарата, для которых срок хранения (без потери активности) составлял не менее 24 месяцев. Ниже приведены примеры составов, которые были отобраны для проведения дальнейших исследований:
Пример 4. Определение токсичности препаратов с ИФН альфа собаки
Для проведения экспериментов по определению острой токсичности использовали лиофилизированные или замороженные образцы препарата. Препарат однократно вводили мышам (самцам) внутрижелудочно или внутримышечно в количестве 25000 и 50000 мг/кг веса, а также крысам (самцам) на кожу в дозе 5000 и 10000 мг/кг веса и оценивали общее состояние и поведение животных, а также прирост массы тела в течение 14 суток. По результатам проведенных испытаний определено, что значение LD50 в первых двух случаях для обоих вариантов препарата составляет более 50000 мг/кг, а при накожном применении - более 10000 мг/кг. Соответственно, согласно общепринятой гигиенической классификации исследуемые составы относятся к 4 классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76. В ходе исследований было также установлено, что однократное нанесение препаратов в дозах 5000 и 10000 мг/кг не оказывает раздражающего действия на кожу и на мышечную ткань крыс и дает слабый аллергизирующий эффект лишь в дозе, десятикратно превышающей терапевтическую.
Эксперименты по определению субхронической токсичности включали ежедневное внутримышечное введение препарата крысам в течение 30 дней в дозах 1000 и 5000 мг/кг с постоянным наблюдением за общим состоянием и поведением животных, регистрацией массы тела, определением гематологических и биохимических показателей, а также макро- и микроскопическим исследованием органов животного по окончании эксперимента и через 14 дней после его завершения. По совокупности полученных данных был сделан вывод, что оба варианта препарата в дозах 5000 и 1000 мг/кг не оказывают неблагоприятных воздействий на организм животных.
Пример 5. Применение сИФН альфа в лечении вирусных заболеваний собак
До начала исследований на животных была определена переносимость ими сИФН-содержащих препаратов, для чего препараты с концентрацией, в 3 раза превышающей расчетную терапевтическую дозу, внутримышечно вводили здоровым животным и через 1, 3 и 7 дней проводили их осмотр. При этом ни в одном случае неблагоприятных реакций зарегистрировано не было.
Эксперимент 1 Применение сИФН-альфа 5 для лечения чумы у собак.
Животные
Для проведения эксперимента были отобраны 4 беспородные собаки в возрасте 5 месяцев, весом 12±0,5 кг. Животным предварительно было проведено скрининговое обследование (полный клинический осмотр, ИФА на антитела (AT) к чуме плотоядных и аденовирусу собак). При клиническом осмотре у животных было отмечено умеренное угнетение, легкая степень исхудания, у некоторых - незначительные истечения из глаз; явных клинических симптомов какого-либо заболевания ни у одной из собак выявлено не было. По результатам ИФА у всех животных установлено отсутствие AT к вирусу чумы и наличие AT к аденовирусу. Присутствие в организме собак аденовируса не стало основанием для отказа от включения животных в эксперимент, поскольку специалистам известно, что при искусственном заражении собак вирусом чумы заболевание развивается не всегда (или протекает бессимптомно) и что его проявлению способствует присутствие в организме животного других вирусов, ослабляющих иммунный ответ организма, в частности аденовируса.
Заражение вирусом чумы и установление диагноза.
После проведения первичного обследования животные были помещены в карантин. Во время карантина животные содержались в изолированных клетках, получали кормление кормом марки «Педигри» и «Чаппи» и имели свободный доступ к воде. Заражение животных вирусом чумы плотоядных проводилось в виварии испытательного центра ГНУ ВНИИВВИМ (г. Покров).
На 7-ой день после заражения проводилось обследование животных на наличие признаков проявления заболевания, по результатам которого состояние животных было оценено по тяжести как среднее. Наблюдаемые у зараженных вирусом собак симптомы включали в себя умеренную вялость, снижение аппетита, потерю массы тела на 1-1,5 кг, незначительные выделения из носа белого цвета, потускнение роговицы, повышение температуры тела до 39,5-39,7°С
По данным ПЦР-проб на наличие вируса чумы во всех образцах получен положительный результат (таблица 2). На основании совокупности результатов проведенного обследования на этом этапе всем животным был поставлен диагноз - чума плотоядных.
Лечение и его результаты
6
6
6
После проведенного мониторинга и постановки диагноза (на 7-ой день после заражения) было начато лечение двух собак препаратом с сИНФ-альфа 5 (1×10 МЕ/мл), которое продолжалось в течение 7 дней и включало ежедневную внутримышечную инъекцию, где собаке №1 вводили 1 мл препарата сИФН (доза 1×10 МЕ/гол), а собаке №2 - 0,5 мл (доза 0,5×10 МЕ/гол). Собакам №3 и №4 (без лечения) вводили, соответственно, 1 мл и 0,5 мл полного состава растворителя, используемого для приготовления препарата. Ежедневно после начала лечения проводился общеклинический осмотр животных с измерением температуры, результаты которого представлены в таблице 3.
6
6
Как следует из данных таблицы 3, у животного №1, получавшего препарат в дозе 10 МЕ/гол, температура тела нормализовалась уже на 2-ой день лечения и оставалась нормальной до конца эксперимента, у собаки №2 (ИФН в дозе 0,5×10 МЕ/гол) температура тела пришла в норму после 3-ьего дня применения препарата; у обеих собак (№3 и №4), не получавших лечения интерфероном, температура тела нормализовалась только к 5-ому дню. Данные изменения температуры коррелировали с результатами общеклинического осмотра. Животные, проходившие лечение сИФН, уже на второй-третий день опыта проявляли удовлетворительную двигательную активность, улучшение аппетита, имели физиологически нормальный пульс и частоту дыханий; к 5-ому дню от начала лечения у обоих щенков был отмечен прирост массы тела на 1-1,5 кг. У собак №3 и №4 (без лечения) первые признаки улучшения состояния наблюдались лишь на 4-5-ый день.
После окончания эксперимента у всех собак было произведено контрольное взятие крови для ОАК и БАК, а также смывов с носоглотки - для определения ДНК методом ПЦР. Результаты контроля эффективности действия интерферона лабораторными методами представлены в таблице 4.
6
Результаты ПЦР-анализа позволяют сделать вывод о выраженном противовирусном действии препарата в условиях in vivo, причем как в отношении введенного искусственным путем вируса чумы плотоядных, так и в отношении природного заражения аденовирусом (таблица 4). Наблюдение за динамикой изменения температуры тела позволило выявить более быструю нормализацию этого клинического признака заболевания у животных, получавших лечение интерфероном, в сравнении с естественной скоростью процесса у контрольных собак. При этом было отмечено, что применение интерферона в дозировке 1×10 МЕ/гол (животное №1) было более эффективно, чем в случае использования вдвое меньшей разовой дозы (животное №2) (таблица 3). Признаками лечебного эффекта сИФН следует также считать прирост живой массы за время применения сИФН на 1-1,5 кг и нормализацию мышечного тонуса у собак, получавших препарат.
За время эксперимента у опытных животных не было отмечено никаких внешних негативных реакций, связанных с получаемым лечением, а соответствие показателей ОАК и БАК лабораторной норме (таблица 4) после завершения 5-дневного курса применения сИФН свидетельствует о том, что препарат не вызывает неблагоприятных изменений и в обмене веществ. Таким образом, можно заключить, что повторные ежедневные инъекции препарата, по меньшей мере, в течение используемых сроков лечения безопасны для организма животного.
Эксперимент 2 Применение сИФН-альфа1 в лечении парвовирусного энтерита у собак
Животные
Исследования проводились на базе приюта для бездомных животных «Кожухово» (Москва). Во время вспышки заболевания с признаками, характерными для вирусных инфекции, в том числе для парвовироза (рвота, диарея, вялость, нарушение аппетита, жажда, исхудание), было отобрано 17 щенков разного пола в возрасте 6-8 месяцев со средним весом около 7 кг. Выбор указанной возрастной границы был обусловлен тем, что собаки старше 1 года болеют парвовирозом преимущественно в бессимптомной форме.
9
Всем отобранным животным был проведен общий клинический осмотр, термометрия, аускультация сердца и легких, подсчет пульса и частоты дыханий в минуту и взяты пробы биологического материала для проведения общего анализа крови (ОАК), биохимического анализа крови (БАК) и определения вирусной ДНК методом ПЦР. На основании данных анамнеза, клинического осмотра и результатов ОАК, где у всех животных были отмечены признаки лимфопении (количество лимфоцитов менее 0,7×10/л), был поставлен предварительный диагноз парвовирусного энтерита, который был подтвержден положительными результатами ПЦР на наличие ДНК парвовируса собак у всех обследованных животных. Кроме того, результаты статистического анализа всей совокупности исследованных показателей (возраст, масса, клинические признаки, ОАК, БАК, ПЦР), проведенного с помощью пакета программ STATISTICA 10, позволили установить, что в отобранной группе щенков ни по одному из определяемых показателей нет достоверных отличий между особями, и признать данную популяцию однородной и пригодной для проведения дальнейших исследований.
Больные парвовирозом щенки были случайным образом (методом жеребьевки) разделены на 2 группы, где исходно в контрольную группу было включено 7 животных, а в опытную -10. Однако в течение первых двух дней эксперимента, с момента отбора животных (день 0, он же 1-ый день лечения интерфероном) до завершения 2-го дня лечения, в опытной группе пало 5, а в контрольной - 3 животных. Таким образом, полностью прошли курс лечения, которое завершилось выздоровлением, 5 животных опытной и 4 животных контрольной группы.
Лечение.
В соответствии с установленным диагнозом всем щенкам контрольной и опытной групп было назначено одинаковое (симптоматическое) лечение, включавшее инфузионную терапию (р/р Рингера, дисоль, глюкоза 5%), синулокс или цефазолин, метронидазол, амонокапроновую к-ту, серению, этамзилат, ацилок, аминтостерил, катозал, филграстим (при выраженной лейкопении).
6
Животные опытной группы дополнительно получали в течение 5 дней сИФН-альфа1 в виде ежедневной внутримышечной инъекции 1 мл препарата с содержанием сИФН альфа-1 5 мкг/мли активностью 10 МЕ/мл).
В ходе лечения ежедневно проводилось наблюдение за поведением и состоянием животных с оценкой (в баллах) выраженности клинических симптомов, а также взвешивание и измерение температуры тела. При наблюдении за степенью проявления клинических признаков заболевания во внимание принимались следующие симптомы: вялость, апатия, нарушение (отсутствие) аппетита, нарушение самостоятельнго приема воды, рвота, диарея, исхудание, болезненность брюшной стенки. Начисление баллов (от 0 до 3, где 0 означает отсутствие симптома; 1 - слабое проявление; 2 - умеренное проявление; 3 - выраженное проявление) проводилось по каждому из перечисленных признаков для всех животных одной (опытной или контрольной) группы, после чего определялось среднее арифметическое по данному признаку. Сумма средних арифметических значений по всем симптомам использовалась в качестве характеристики клинического состояния животных в исследуемой группе на данный момент.
На 5-ый день лечения было проведено повторное полное обследование животных, включавшее клинический осмотр, термометрию, аускультацию сердца и легких, подсчет пульса и частоты дыханий в минуту, ОАК и БАК
Результаты и их оценка.
Ниже представлены результаты общего (таблица 5) и биохимического (таблица 6) анализа крови после 5 дней лечения животных.
Примечание:
n - число вариантов выборки; М - среднее значение вариационного ряда; m - стандартное отклонение от М.
Из полученных данных ОАК с очевидностью следует, что в группе щенков, получавших дополнительное лечение интерфероном, наблюдается достоверное повышение (относительно интервала значений для здоровых собак) количества лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов, тогда как в контрольной группе эти показатели находятся в пределах лабораторной нормы. Число лимфоцитов (WBC) в опытной группе животных, хотя и не превышает верхнюю границу допустимого интервала, однако также, как и по другим отмеченным выше показателям, в 2-3 раза превосходит их количество в контроле. Этот факт является указанием на то, что в ходе лечения сИФН-альфа эффективен и проявляет присущее ему иммуномодулирующее действие.
n - число вариантов выборки; М - среднее значение вариационного ряда; m - стандартное отклонение от М.
Данные, представленные в таблице 6, позволяют сделать 2 основных вывода, первый из которых состоит в том, что, помимо имеющейся тенденции к некоторому снижению (в обеих группах) содержания билирубина и общего белка и незначительному повышению активности ACT, средние величины определяемых показателей (с учетом стандартных отклонений) находятся в пределах лабораторной нормы, что указывает на отсутствие неблагоприятных влияний проведенного лечения на основные процессы обмена веществ. Тот факт, что между опытной и контрольной группой щенков ни по одному из исследованных (в том числе и отмеченных выше) показателей не обнаружено достоверных отличий, является свидетельством безопасности применения предлагаемого препарата сИФН-альфа в комплексной терапии парвовирусного энтерита.
Результаты, характеризующие динамику купирования клинических симптомов заболевания в ходе лечения, отражены на фиг. 1 (динамика изменения температуры тела) и фиг. 2 (динамика изменения выраженности клинических признаков).
Из данных по определению температуры тела следует, что гипертермия в опытной группе, начиная со 2-го дня лечения, была более низкой и купировалась быстрее, чем в контрольной группе, что говорит о более благоприятном течении заболевания у животных, получавших лечение препаратом сИФН-альфа. Из сравнения двух кривых на фиг. 2 с очевидностью следует значительно более быстрое купирование клинических симптомов заболевания у щенков опытной группы в сравнении с контрольной. Кроме того, полная нормализация состояния животных, указывающая на их выздоровление, наступает в группе щенков, получавших дополнительное лечение интерфероном, как минимум, на 2 дня раньше, чем у щенков, которым применялась традиционная терапия. И, наконец, характер «контрольной» кривой указывает на то, что после полного выздоровления животных опытной группы (5 дней) у собак контрольной группы в течение еще нескольких дней сохраняются слабо выраженные клинические признаки перенесенного заболевания.
На основании приведенных выше результатов применения сИФН-альфа в комплексном лечении парвовирусного энтерита можно заключить, что оно во всех отношениях более эффективно, чем классическое лечение по схеме, применяемой в данном исследовании. А в совокупности с результатами систематического наблюдения за состоянием пациентов, а также с выше приведенными результатами ОАК и БАК, где не было выявлено отрицательного влияния применения препарата на организм животных, может быть сделан вывод, что включение рекомбинантного интерферона альфа собаки в комплексную терапию при парвовирусной инфекции, не сопровождающееся никакими побочными эффектами, является не только эффективным, но и полностью безопасным.
Заключение
Таким образом, показано, что предлагаемое в настоящем изобретении средство для лечения природных вирусных инфекций собак демонстрирует выраженный лечебный эффект и полностью отвечает требованиям, предъявляемым к безопасности ветеринарных препаратов. При этом инъекционное средство по изобретению является простым по составу ДВ (один компонент) и вспомогательных компонентов, стабильным при хранении и применении, что выгодно отличает его от известных сегодня комбинированных сИФН альфа-содержащих препаратов, которые оно превосходит по противовирусной активности и, как минимум, не уступает им в плане достигаемого лечебного эффекта при комплексной терапии опасных инфекций, но при этом может применятся и в виде монопрепарата.