СПОСОБ ОБРАБОТКИ МАТЕРИАЛА СЛАДКОЙ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ, СОДЕРЖАЩЕГО cGMP, И СООТВЕТСТВУЮЩИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО МАТЕРИАЛА, ИМЕЮЩЕГО ЗАДАННОЕ СООТНОШЕНИЕ ТРИПТОФАН/ТРЕОНИН
PROCESS FOR TREATING SWEET WHEY MATERIAL CONTAINING CGMP AND RELATED METHOD FOR PRODUCING PROTEIN MATERIAL HAVING TARGETED TRYPTOPHAN/THREONINE RATIO

Область техники
Изобретение относится к способу обработки материала сладкой молочной сыворотки, содержащего казеиногликомакропептид (cGMP), и соответствующему способу получения белкового материала из материала сладкой молочной сыворотки, содержащего казеиногликомакропептид (cGMP), где указанный белковый материал имеет заданное соотношение триптофан/треонин.
Предпосылки создания изобретения
Патент США № 687158 относится к способу экстракции гликомакропептида или казеиногликомакропептида (cGMP) из молочного сырьевого материала. cGMP - это фосфорилированный и частично сиалилированный макропептид, который образуется в результате воздействия протеазы, например, сычужного фермента, на каппа-казеин молока млекопитающих. На cGMP приходится около 20 мас.% белков в сладкой молочной сыворотке, получаемой после выделения казеина во время производства творога.
Этот способ включает в себя стадии удаления катионов из молочного сырьевого материала в течение достаточного количества времени для получения, по существу, деионизированного молочного сырьевого материала, имеющего значение pH от около 1 до 4,5; приведения, по существу, деионизированного молочного сырьевого материала в контакт с анионной смолой, имеющей гидрофобную матрицу, в течение достаточного количества времени и при достаточной температуре для удаления cGMP из, по существу, деионизированного молочного сырьевого материала и получения обработанного жидкого материала; отделения смолы из обработанного жидкого материала и промывания смолы для получения из нее cGMP. Фактически cGMP удаляется в количестве от 85 до 91% исходного количества cGMP.
Обработанный жидкий материал, получаемый из сладкой молочной сыворотки, имеет аминокислотный профиль с пониженным количеством треонина и повышенным количеством ароматических аминокислот, таких как триптофан. Он может использоваться в продукте для младенцев или диетическом продукте в качестве источника белка или сырьевого материала, в фармацевтической композиции в комбинации с антитромботическими, противодиарейными или антибактериальными агентами или в пищевой композиции в качестве эмульгирующего, желирующего или пенообразующего агента.
Однако из-за своего аминокислотного профиля, в частности содержания триптофана и треонина, обработанная жидкость не всегда подходит для гипоаллергенных составов, и производителю приходится смешивать ее с по меньшей мере одним другим источником белков и/или добавлять определенные аминокислоты.
Кроме того, продолжительность обработки, а также количество смолы и обрабатываемой жидкости выбирают в зависимости от композиции исходного материала и количества cGMP, подлежащего удалению. На практике это определяется экспериментальным путем непосредственно на месте производства, но четких теоретических правил, упрощающих процесс обработки, не существует.
Таким образом, одной из целей изобретения является обеспечение процесса обработки материала сладкой молочной сыворотки, содержащего cGMP, на основе простого и эффективного параметра или по меньшей мере обеспечение полезной альтернативы.
Другой, связанной с вышеуказанной, целью изобретения является обеспечение способа получения белкового материала из материала сладкой молочной сыворотки, содержащего cGMP, где указанный белковый материал имеет заданное содержащие триптофана и треонина, посредством применения указанного способа или по меньшей мере обеспечение полезной альтернативы.
Изложение сущности изобретения
В первом аспекте изобретения предложен способ обработки материала сладкой молочной сыворотки, содержащего казеиногликомакропептид (cGMP), включающий следующие стадии:
- удаление катионов из материала сладкой молочной сыворотки, чтобы получить сладкую молочную сыворотку, имеющую значение pH от 1 до 4,5;
- обработка указанной сладкой молочной сыворотки в реакторе с псевдоожиженным слоем, содержащим установленный объем анионной смолы, при температуре в диапазоне 10-18°C, где указанная сладкая молочная сыворотка контактирует с указанной смолой так, что смола абсорбирует от 0% до 100% cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке; и
- выделение белкового материала;
где обработку выполняют в течение достаточного времени, так что смола абсорбирует 30–42 г/л, предпочтительно 35–42 г/л, более предпочтительно 39–41 г/л cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке.
Авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что способ характеризуется ключевым параметром, который имеет, по существу, постоянное значение, независимо от осуществляемого процесса, соответствующее максимальному уровню абсорбции cGMP в смоле. Достижение этого максимального уровня происходит спустя достаточное количество времени. Это позволяет просто и эффективно осуществлять способ настоящего изобретения.
Преимуществом способа является то, что получаемый белковый материал подходит для гипоаллергенных детских смесей. Нет необходимости, как это было ранее, удалять cGMP в большом количестве (от 85 до 91 мас.%), чтобы обработанный материал, по существу, не содержал cGMP, и указанную обработанную жидкость смешивать с по меньшей мере одним другим источником белков и/или аминокислот, чтобы она подходила для детских смесей. Другими словами, cGMP может частично присутствовать в белковом материале.
Кроме того, неожиданно было обнаружено, что, независимо от уровня абсорбции cGMP смолой, нежелательные продукты, такие как анионы (как правило, содержащиеся в молочной сыворотке), абсорбируются смолой во время процесса обработки в соответствии с изобретением, так что они присутствуют в приемлемых концентрациях (как следовые количества примесей) в белковом материале, независимо от процентного показателя абсорбции cGMP в смоле.
Во втором аспекте изобретения предложен способ получения белкового материала из материала сладкой молочной сыворотки, содержащего казеиногликомакропептид (cGMP), где указанный белковый материал имеет заданное соотношение триптофан/треонин, причем указанный способ включает следующие стадии:
- применение к материалу сладкой молочной сыворотки способа в соответствии с изобретением, в котором смола абсорбирует процентную долю P1 cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке, получение первого белкового материала, измерение содержания триптофана (Trp) и треонина (Thr) в первом белковом материале для определения соотношения Trp/Thr1;
- применение к материалу сладкой молочной сыворотки способа в соответствии с изобретением, в котором смола абсорбирует процентную долю P2 cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке, получение второго белкового материала, измерение содержания триптофана (Trp) и треонина (Thr) во втором белковом материале для определения соотношения Trp/Thr2;
- построение линейной калибровочной кривой на графике зависимости процентной доли cGMP, абсорбированного смолой, от соотношения Trp/Thr путем нанесения на график точек (Trp/Thr1;P1) и (Trp/Thr2; P2) и построения линии, проходящей через эти две точки;
- определение конкретной доли cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке, которая должна быть абсорбирована смолой, относительно заданного соотношения триптофан/треонин с помощью построенной линейной калибровочной кривой; и
- применение к материалу сладкой молочной сыворотки способа в соответствии с изобретением, в котором смола абсорбирует конкретную процентную долю cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке, чтобы получить белковый материал, имеющий заданное соотношение триптофан/треонин.
Преимуществом способа является то, что он позволяет адаптировать способ в соответствии с изобретением для каждого белкового материала сладкой молочной сыворотки, чтобы получить белковый материал с заданным соотношением триптофан/треонин. Указанное соотношение триптофан/треонин обычно выбирают таким образом, чтобы белковый материал подходил для использования в детских смесях, предпочтительно в гипоаллергенных детских смесях.
Без связи с какой-либо теорией считается, что выполнение способа по изобретению в течение достаточного времени, чтобы смола абсорбировала от 30 до 42 г/л cGMP, позволяет построить данную линейную калибровочную кривую.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 представлено схематическое изображение устройства для применения в способе настоящего изобретения.
На Фиг. 2 представлен график содержания триптофана (Trp) относительно содержания треонина (Thr), указана соответствующая процентная доля удаляемого cGMP (см. двунаправленные стрелки) для материала сладкой молочной сыворотки WPC 31.5.
На Фиг. 3 представлен график с двумя калибровочными кривыми, одна из которых отображает зависимость доли (в процентах) удаляемого cGMP от соотношения Trp/Thr для материала сладкой молочной сыворотки WP 31.5, а другая — зависимость доли (в процентах) удаляемого cGMP от соотношения Trp/Thr для материала сладкой молочной сыворотки WP 80.
Подробное описание
Для полного понимания настоящего изобретения и его преимуществ делаются ссылки на представленное ниже подробное описание изобретения.
Следует понимать, что различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть объединены с другими вариантами осуществления изобретения и являются лишь иллюстрацией определенных способов реализации и применения настоящего изобретения, но не ограничивают объем изобретения, который изложен в последующем подробном описании и формуле изобретения.
В настоящем описании следующим словам даны определения, которые должны быть приняты во внимание при чтении и интерпретации описания, примеров и формулы изобретения.
Для целей настоящего документа следующие термины имеют приведенные ниже определения.
Термин «подходящий для детских смесей» означает, что продукт можно непосредственно использовать в детских смесях без какой-либо адаптации. Это означает отсутствие необходимости смешивать продукт с по меньшей мере одним другим источником белков и/или добавлять определенные аминокислоты.
Термин «удаление соединения» означает, что соединение, содержащееся в продукте, абсорбируется в смоле, в результате чего получается продукт, имеющий пониженное содержание этого соединения. Соответствующая процентная доля представляет собой процентную долю соединения в продукте, удаляемую из продукта посредством абсорбции в смоле.
Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев.
Термин «детская смесь» означает продукт питания, специально предназначенный для применения в пищу младенцами в течение первых четырех – шести месяцев жизни и сам по себе удовлетворяющий потребности в питании этой категории лиц (статья 1.2 Директивы Европейской комиссии 91/321/EEC от 14 мая 1991 г. о детских смесях первого уровня и смесях для прикармливаемых детей). См. также исключение из Директивы ЕС.
В данном описании слова «содержит», «содержащий» и аналогичные слова не следует интерпретировать в исключительном или исчерпывающем смысле. Иными словами, под ними подразумевается «включая, без ограничений».
Любую ссылку на документы предшествующего уровня техники в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такой предшествующий уровень техники является широко известным или составляет часть общеизвестных знаний в области.
В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением обработку осуществляют в течение достаточного времени, так что смола абсорбирует 10–90% cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке.
Смола преимущественно абсорбирует по меньшей мере 90% анионов, содержащихся в сладкой молочной сыворотке. Указанные анионы обычно выбирают из группы, состоящей из анионов хлора, фосфора, цитрата, сульфата и лактата. В частности, смола преимущественно абсорбирует по меньшей мере 90% хлора и фосфора, содержащихся в сладкой молочной сыворотке.
В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением обработку сладкой молочной сыворотки в реакторе с псевдоожиженным слоем проводят при соотношении белка и смолы от 0,10 до 0,35, предпочтительно от 0,20 до 0,35 кг белка/л смолы.
В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением обработку сладкой молочной сыворотки в реакторе с псевдоожиженным слоем проводят при соотношении, составляющем от 0,25 до 1,25 кг сухой массы на литр смолы.
В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением P1 составляет 55%, а P2 составляет 90%.
Стадия удаления катионов, по существу, не приводит к изменениям в содержании анионов или cGMP в материале сладкой молочной сыворотки. Таким образом, абсорбция cGMP и анионов в смоле может относиться либо к их содержанию в материале сладкой молочной сыворотки, либо к их содержанию в смоле. В настоящем документе имеется в виду их содержание в сладкой молочной сыворотке.
Соотношение количества cGMP и смолы позволяет адаптировать процесс в соответствии с изобретением и способ в соответствии с изобретением для любого реактора с псевдоожиженным слоем, поскольку количество cGMP является характеристикой материала сладкой молочной сыворотки, а смола является характеристикой конструкции реактора.
Максимальное количество cGMP, которое может связать смола, помогает пользователю определить количество материала на основе сладкой молочной сыворотки, подлежащее обработке, если известен объем смолы.
Продолжительность реакции можно отслеживать путем ВЭЖХ-анализа жидкости, находящейся в реакторе с псевдоожиженным слоем, чтобы проверять содержание cGMP в указанной жидкости. Продолжительность реакции также можно отслеживать путем измерения значения pH указанной жидкости: по достижении постоянного значения pH реакцию прекращают. Тем не менее, ВЭЖХ-анализ является предпочтительным, поскольку отслеживание посредством ВЭЖХ является более точным.
Можно изначально измерить содержание cGMP в материале сладкой молочной сыворотки либо определить его по приблизительной оценке как 20% содержания белков материала сладкой молочной сыворотки. В соответствии с изобретением предпочтительным является начальное измерение cGMP посредством ВЭЖХ.
В соответствии с изобретением материал сладкой молочной сыворотки может представлять собой один из вариантов: сладкая молочная сыворотка, получаемая после выделения казеина в результате коагуляции сычужным ферментом, концентрат сладкой молочной сыворотки, сладкая молочная сыворотка или подобная сыворотка, деминерализованная посредством электродиализа, ионного обмена, обратного осмоса, электродеионизации или комбинации этих процедур, концентрат сладкой молочной сыворотки, деминерализованной посредством электродиализа, ионного обмена, обратного осмоса, электродеионизации или комбинации этих процедур, концентрат белков, по существу, не содержащей лактозу сладкой молочной сыворотки, полученный посредством ультрафильтрации с последующей диафильтрацией (ультрафильтрация с промывкой), маточные жидкости после кристаллизации лактозы из сладкой молочной сыворотки, пермеат, получаемый в результате ультрафильтрации сладкой молочной сыворотки, продукт гидролиза (под воздействием протеазы) нативного казеина, полученного из обезжиренного молока посредством осаждения неорганической кислотой или посредством биологического закисления, полученный из обезжиренного молока посредством микрофильтрации, или продукт гидролиза казеината под воздействием протеазы. После удаления из нее катионов сладкая молочная сыворотка предпочтительно имеет содержание твердых веществ от около 6 до 30 процентов по массе.
Материал сладкой молочной сыворотки обычно представляет собой жидкость, которую можно получить путем дисперсии и/или растворения твердых порошков молочной сыворотки в жидкости.
Перед приведением в контакт со сладкой молочной сывороткой смолу преимущественно обрабатывают щелочным материалом. Предпочтительно сладкую молочную сыворотку приводят в контакт со смолой в реакторе при медленном перемешивании и температуре менее 50 °C в течение от одного до десяти часов, чтобы на смоле абсорбировалось приемлемое количество cGMP. Подходящая смола обладает свойствами основания и имеет форму макропористого геля или поперечносшитого макрогеля. Сладкую молочную сыворотку обычно приводят в контакт со смолой на период, пока pH обработанного жидкого материала не достигнет постоянного значения в диапазоне от около 4,2 до около 5,8, что будет означать завершение реакции. Преимуществом является то, что сладкая молочная сыворотка и смола присутствуют в объемном соотношении от 1 : 1 до 30 : 1, предпочтительно от 1 : 2 до 1 : 10.
Белковый материал, полученный способом в соответствии с изобретением, представляет собой источник белка, предназначенный для применения людьми, в частности младенцами, в продуктах питания, в частности в детских смесях. Термин «предназначенный для применения» (кем-либо) означает, что продукт специально адаптирован для потребностей целевой популяции людей в питании. Специалисту в данной области известны ингредиенты, применимые для таких питательных композиций, дополнительно к белковому материалу в соответствии с изобретением, чтобы сделать их подходящими для использования в качестве добавок или полноценных питательных композиций.
Эти продукты питания соответствуют всем диетическим и/или нормативным требованиям. Это означает, что они дополнительно к этому источнику белка содержат дополнительные компоненты, такие как источник доступных углеводов и источник липидов.
Содержание хлора белкового материала обычно составляет от 1 мг/100 г, предпочтительно находится в диапазоне от 5 до 80 мг/100 г, и/или содержание фосфора белкового материала находится в диапазоне от 50 до 150 мг/100 г, предпочтительно в диапазоне от 90 до 160 мг/100 г.
Соотношение триптофана и треонина белкового материала обычно составляет 0,240–0,450, более предпочтительно 0,300–0,430.
Точность аналитической методики измерения содержания аминокислот белкового материала обычно составляет от +/– 8,5% до 11% (по массе). Точность аналитической методики измерения содержания треонина в белковом материале обычно составляет приблизительно +/– 8,5%. Точность аналитической методики измерения содержания триптофана в белковом материале обычно составляет приблизительно +/– 11%.
Белковый материал предпочтительно подходит для получения гипоаллергенной детской смеси. Стадию гидролиза обычно применяют к этому белковому материалу перед его введением в указанную детскую смесь. Указанная стадия гидролиза хорошо известна специалисту в данной области. Такой гидролиз не приводит к изменению аминокислотного профиля, в частности соотношения Trp/Thr. В общем случае к белковому материалу перед его введением в указанную детскую смесь можно применить несколько стадий, поскольку это не приводит к изменению указанного аминокислотного профиля, в частности соотношения Trp/Thr. Преимуществом изобретения является то, что не требуется добавления другого источника белка или аминокислот в белковый материал, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением.
На Фиг. 1 показано устройство для применения в способе настоящего изобретения. Реактор 1 в своей верхней секции имеет основной бак 2, соединенный с нижней частью, имеющей отделение 3, через меньший диаметр, чем у бака 2. Бак 2 имеет входной канал 4 для ополаскивающей жидкости, входной канал 5 для подачи сжатого газа, предохранительный клапан 6 для регулировки давления газа в реакторе 1. Вблизи основания бака 2 находится сетчатый фильтр 7 предварительной очистки и канал 8 для отвода жидкости.
Соединенный с отделением 3, реактор имеет pH-метр 9, входной канал 10 для газа, трехходовой клапан 11, соединенный с входным каналом 12 для жидкости, подлежащей обработке, и выходной канал 13 для выведения обработанной жидкости. Основание отделения 3 имеет решетку или перфорированную пластину 14, на которой собираются гранулы 15 смолы. Под решеткой 14 находится отводящий канал 16, по которому жидкость перекачивается с помощью насоса 17 в буферный бак 18, имеющий устройство 19 контроля уровня. По каналу 20 жидкость выкачивается с помощью насоса 21 из буферного бака 18. Канал 20 соединен либо с каналом 12, либо с системой перелива 22.
Далее описан способ с использованием устройства, который применялся в примерах, представленных ниже.
–
Из исходного материала сладкой молочной сыворотки (дисперсия порошка молочной сыворотки в воде) предварительно удаляли катионы посредством колонок с катионообменными смолами в следующем порядке: слабые / сильные / сильные. Полученную сладкую молочную сыворотку подавали по каналу 12 в реактор 1. Воздух вводили посредством барботирования в отделение 3 через основание по входному каналу 10, через обратный клапан 23. Создавали псевдоожиженный слой из гранул 15 смолы, содержащий слабую анионную смолу из гидрофобной матрицы на основе полистирола (IMAC HP 661, Rohm & Haas, восстановленная в виде OH). Гранулы 15 смолы перемешивали в течение 4 ч при контакте с дисперсией благодаря вихревому движению, создаваемому псевдоожижением. Значение pH жидкости непрерывно контролировали посредством pH-метра 9. В ходе непрерывного анализа сладкой молочной сыворотки посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (не показан) был выявлен момент, когда в процессе реакции было удалено 55% cGMP, содержащегося в сладкой молочной сыворотке. К этому моменту времени было удалено желаемое количество cGMP, подачу воздуха во входной канал 10 прекратили и подавали воздух через входной канал 5 в верхней части реактора, над уровнем 24 жидкости. Жидкость находилась под давлением, и гранулы смолы оседали в нижней части отделения 3 реактора 2, где они удерживались решеткой 14. Обработанный жидкий материал отводился самотеком и/или посредством откачивания через канал 8 и через канал 16 с помощью насоса 17 в направлении буферного бака 18. Затем обработанный жидкий материал выводился через канал 20 с помощью насоса 21 и направлялся к выпускному отверстию по каналам 12 и 13.
Обработанный жидкий материал стандартизировали, доводили pH до нужного уровня, концентрировали посредством выпаривания или нанофильтрации, а концентрат высушивали распылением в сушильной башне.
Извлечение cGMP является необязательным. Тем не менее, этот процесс показан на Фиг. 1. Для извлечения cGMP реактор и смолу промывали деионизированной водой, подаваемой по входному каналу 25, через клапан 26 и по входному каналу 4, и пропускали через реактор по каналам 12 и 13. cGMP элюировали дважды по тому же контуру с использованием 2% водного раствора NaOH, подаваемого по каналу 27 через клапан 28, и промывали с использованием 30 л деионизированной воды. После объединения элюата и промывных жидкостей полученный объем концентрировали посредством ультрафильтрации или нанофильтрации с использованием мембраны, имеющей номинальный предел пропускания 3000 дальтон, для получения ретентата и фильтрата. Ретентат сублимировали.
–
Смолу можно периодически подвергать кислотной регенерации (вслед за щелочной регенерацией) после обработки объема материала, эквивалентного 10 объемам слоя смолы. После элюирования cGMP щелочным раствором, как описано выше, смолу промывали концентрированным водным раствором HCl, который подавался по каналу 29 через клапан 30, а затем промывали водой, которая подавалась по каналу 25 через клапан 26. Смолу превращали в форму OH путем пропускания через нее концентрированного водного раствора NaOH, который подавался по каналу 27, с последующей подачей воды через канал 25 в канал 4. Растворы выводились из реактора 1 через канал 16 и перекачивались с помощью насоса 17 в буферный бак 18. Из буферного бака 18 растворы откачивались с помощью насоса 21 и выводились через канал 20 и систему перелива 22 в систему очистки стоков. После этой операции смола была готова к следующему циклу обработки.
Обработанную жидкость выводили и использовали как белковый материал в соответствии с изобретением.
Изобретение далее описано со ссылкой на следующие примеры. Следует понимать, что настоящее изобретение в заявленном виде не должно быть каким-либо образом ограничено этими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 (в соответствии с изобретением). Способ удаления различных процентных долей cGMP из материала сладкой молочной сыворотки WPC 31.5 и способ получения белкового материала, имеющего заданное соотношение Trp/Thr, начиная с материалов WPC 31.5 и WPC 80 сладкой молочной сыворотки, содержащих cGMP
Материал сладкой молочной сыворотки представлял собой концентрат молочной сыворотки WPC 31.5. Из него удаляли катионы с помощью слабых / сильных / сильных катионообменных смол. Слабая смола представляла собой IMAC HP 336, сильная смола представляла собой IMAC 1110Na; обе смолы поставляются компанией Dow Chemical (ранее Rohm & Haas). В этой сладкой молочной сыворотке содержание белка составляло приблизительно 31,5% в пересчете на сухое вещество (DM), общее содержание твердых веществ составляло 18%, значение pH составляло 1,75. 4420 кг этой сладкой молочной сыворотки закачивали в реактор 1, содержащий 7500 литров слабой анионообменной смолы (HP 661 пищевого класса). Весь объем сладкой молочной сыворотки приводили в контакт со смолой. Смолу и сладкую молочную сыворотку суспендировали вместе в течение 4 часов при температуре от 15 до 18°C. За 4 часа взаимодействия уровень pH повысился с 1,75 до конечного значения 5,1–5,3. Процесс удаления cGMP контролировали с помощью ВЭЖХ.
Через 4 часа взаимодействия полученную деминерализованную и обедненную cGMP молочную сыворотку выкачивали из реактора. Выводили белковый материал, после этого смолу промывали водой, чтобы уменьшить потерю белков и сухого вещества. cGMP извлекали на объединенной стадии элюирования и регенерации с использованием 4% NaOH. После регенерации NaOH выводили, пропуская через реактор воду, и промывали его водой до тех пор, пока значение pH не достигло приблизительно 10,5. После достижения этого значения pH реактор был готов к следующему циклу производства. После стандартной нейтрализации с использованием NaOH и KOH продукт подвергали термообработке, выпаривали и высушивали распылением.
Относящиеся к способу данные сведены в таблице 1 ниже.
Загрузка в пересчете на сухое вещество (DM) (кг)
4420
Количество смолы HP 661 (л)
7500
DM на литр смолы (кг/л)
0,60
Кол-во белка на литр смолы (кг/л)
0,19
Кол-во связанного cGMP на литр смолы (г/л)
39
NaOH (100%) на кг DM (г/л)
85
Время реакции (часы)
4
Время цикла (часы)
12
Соотношение Trp/Thr
0,42
Процесс повторяли несколько раз для получения нескольких точек, по которым строили график, показанный на Фиг. 2, представляющий зависимость содержания триптофана (Trp) от содержания треонина (Thr) для материала сладкой молочной сыворотки WPC 31.5. Каждая точка данных на графике кривой соответствует измеренным значениям Trp и Thr в белковом материале, полученном с использованием процесса обработки в соответствии с изобретением, примененного относительно заданного значения cGMP. Соответствующая процентная доля удаляемого cGMP условно указана на Фиг. 2 (см. двунаправленные стрелки). Эта кривая показала линейную зависимость между содержанием Trp и содержанием Thr.
На основании данных Фиг. 2 была построена калибровочная кривая, изображенная на Фиг. 3 для материала сладкой молочной сыворотки WPC 31.5. Калибровочная кривая отображает зависимость доли (в процентах) удаляемого cGMP от соотношения Trp/Thr для материала сладкой молочной сыворотки WP 31.5. Эта кривая показала линейную зависимость между процентной долей удаляемого cGMP и соотношением Trp/Thr. Аналогичным образом была построена другая линейная калибровочная кривая на основании данных, полученных в примерах 4 (точка (0,411; 90%)) и 5 (точка (0,36; 55%)) для материала сладкой молочной сыворотки WP 80, путем построения линии, проходящей через эти две точки.
Калибровочные кривые, показанные на Фиг. 3, используются в соответствии с изобретением для определения конкретной доли cGMP, которую следует удалить из заданного материала сладкой молочной сыворотки, содержащего cGMP (в данном случае — WPC 31.5 или WPC 80), чтобы получить белковый материал, имеющий заданное соотношение триптофан/треонин.
Пример 2 (в соответствии с изобретением). Способ в соответствии с изобретением для удаления 90% cGMP из материала сладкой молочной сыворотки
Этот пример основан на тех же параметрах, что и пример 1: материал WPC 31.5, доля удаляемого cGMP 90%. Однако, использовался другой реактор и другая предварительная обработка материала молочной сыворотки.
Материал сладкой молочной сыворотки представлял собой концентрат молочной сыворотки WPC 31.5. Его подвергали электродиализу с последующим удалением катионов с помощью слабых / сильных / сильных катионообменных смол, а затем подвергали ультрафильтрации. Слабая смола представляла собой IMAC HP 336, сильная смола представляла собой IMAC 1110Na; обе смолы поставляются компанией Dow Chemical (ранее Rohm & Haas). В этой сладкой молочной сыворотке содержание белка составляло приблизительно 31,5% в пересчете на сухое вещество (DM), общее содержание твердых веществ составляло 18%, значение pH составляло 1,85. 5900 кг этой сладкой молочной сыворотки закачивали в реактор, содержащий 8500 литров слабой анионообменной смолы (HP 661 пищевого класса). Весь объем сладкой молочной сыворотки приводили в контакт со смолой. Смолу и сладкую молочную сыворотку суспендировали вместе в течение 4 часов при температуре от 15 до 18°C. За 4 часа взаимодействия уровень pH повысился с 1,85 до конечного значения 5,25. Процесс удаления cGMP контролировали с помощью ВЭЖХ.
Через 4 часа взаимодействия получили деминерализованную сладкую молочную сыворотку, в которой содержание cGMP уменьшилось на 55%, и этот белковый материал выкачивали из реактора. Выводили белковый материал, после этого смолу промывали водой, чтобы уменьшить потерю белков и сухого вещества. cGMP извлекали на объединенной стадии элюирования и регенерации с использованием 4% NaOH. После регенерации NaOH выводили, пропуская через реактор воду, и промывали его водой до тех пор, пока значение pH не достигло приблизительно 10,5. После достижения этого значения pH реактор был готов к следующему циклу производства. После стандартной нейтрализации с использованием NaOH и KOH продукт подвергали термообработке, выпаривали и высушивали распылением.
Относящиеся к способу данные сведены в таблице 2 ниже.
Загрузка в пересчете на сухое вещество (DM) (кг)
5900
Количество смолы (л)
8500
DM на литр смолы (кг/л)
0,69
Кол-во белка на литр смолы (кг/л)
0,22
Кол-во связанного cGMP на литр смолы (г/л)
39
NaOH (100%) на кг DM (г/л)
63
Время реакции (часы)
4
Время цикла (часы)
12
Соотношение Trp/Thr
0,416
С учетом точности измерения соотношение Trp/Thr идентично результатам, полученным в примере 1.
Пример 3 (в соответствии с изобретением). Способ в соответствии с изобретением для удаления 55% cGMP из материала сладкой молочной сыворотки
Материал сладкой молочной сыворотки представлял собой концентрат молочной сыворотки WPC 31.5. Из него удаляли катионы с помощью слабых / сильных / сильных катионообменных смол. Слабая смола представляла собой IMAC HP 336, сильная смола представляла собой IMAC 1110Na; обе смолы поставляются компанией Dow Chemical (ранее Rohm & Haas). В этой сладкой молочной сыворотке содержание белка составляло приблизительно 31,5% в пересчете на сухое вещество (DM), общее содержание твердых веществ составляло 18%, значение pH составляло 1,75. 6785 кг этой сладкой молочной сыворотки закачивали в реактор, содержащий 8500 литров слабой анионообменной смолы (HP 661 пищевого класса). Весь объем сладкой молочной сыворотки приводили в контакт со смолой. Смолу и сладкую молочную сыворотку суспендировали вместе в течение 4 часов при температуре от 15 до 18°C. За 4 часа взаимодействия уровень pH повысился с 1,75 до конечного значения 4,90. Процесс удаления cGMP контролировали с помощью ВЭЖХ.
Через 4 часа взаимодействия получили деминерализованную сладкую молочную сыворотку, в которой содержание cGMP уменьшилось на 55%, и этот белковый материал выкачивали из реактора. Выводили белковый материал, после этого смолу промывали водой, чтобы уменьшить потерю белков и сухого вещества. cGMP извлекали на объединенной стадии элюирования и регенерации с использованием 4% NaOH. После регенерации NaOH выводили, пропуская через реактор воду, и промывали его водой до тех пор, пока значение pH не достигло приблизительно 10,5. После достижения этого значения pH реактор был готов к следующему циклу производства. После стандартной нейтрализации с использованием NaOH и KOH продукт подвергали термообработке, выпаривали и высушивали распылением.
Относящиеся к способу данные сведены в таблице 3 ниже.
Загрузка в пересчете на сухое вещество (DM) (кг)
6785
Количество смолы (л)
8500
DM на литр смолы (кг/л)
0,80
Кол-во белка на литр смолы (кг/л)
0,25
Кол-во связанного cGMP на литр смолы (г/л)
39
NaOH (100%) на кг DM (г/л)
55
Время реакции (часы)
4
Время цикла (часы)
12
Соотношение Trp/Thr
0,36
Пример 4 (в соответствии с изобретением). Способ в соответствии с изобретением для удаления 90% cGMP из материала сладкой молочной сыворотки
Материал сладкой молочной сыворотки представлял собой концентрат молочной сыворотки WPC 80. Из него удаляли катионы с помощью слабых / сильных / сильных катионообменных смол. Слабая смола представляла собой IMAC HP 336, сильная смола представляла собой IMAC 1110Na; обе смолы поставляются компанией Dow Chemical (ранее Rohm & Haas). В этой сладкой молочной сыворотке содержание белка составляло приблизительно 82% в пересчете на сухое вещество (DM), общее содержание твердых веществ составляло 12%, значение pH составляло 3,40. 3100 кг этой сладкой молочной сыворотки закачивали в реактор, содержащий 11 600 литров слабой анионообменной смолы (HP 661 пищевого класса). Весь объем сладкой молочной сыворотки приводили в контакт со смолой. Смолу и сладкую молочную сыворотку суспендировали вместе в течение 4 часов при температуре от 15 до 18°C. За 4 часа взаимодействия уровень pH повысился с 3,40 до конечного значения 5,1–5,3. Процесс удаления cGMP контролировали с помощью ВЭЖХ.
Через 4 часа взаимодействия получили деминерализованную сладкую молочную сыворотку, в которой содержание cGMP уменьшилось на 55%, и этот белковый материал выкачивали из реактора. Выводили белковый материал, после этого смолу промывали водой, чтобы уменьшить потерю белков и сухого вещества. cGMP извлекали на объединенной стадии элюирования и регенерации с использованием 4% NaOH. После регенерации NaOH выводили, пропуская через реактор воду, и промывали его водой до тех пор, пока значение pH не достигло приблизительно 10,5. После достижения этого значения pH реактор был готов к следующему циклу производства. После стандартной нейтрализации с использованием NaOH и KOH продукт подвергали термообработке, выпаривали и высушивали распылением.
Относящиеся к способу данные сведены в таблице 4 ниже.
Загрузка в пересчете на сухое вещество (DM) (кг)
3100
Количество смолы (л)
11 600
DM на литр смолы (кг/л)
0,27
Кол-во белка на литр смолы (кг/л)
0,22
Кол-во связанного cGMP на литр смолы (г/л)
39
NaOH (100%) на кг DM (г/л)
168
Время реакции (часы)
4
Время цикла (часы)
12
Соотношение Trp/Thr
0,411
Таким образом, неожиданно было обнаружено, что белковый материал, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением, в котором удалено 55% cGMP, имеет такой же профиль минеральных веществ, как после процесса удаления 90% cGMP. Благодаря этому данный белковый материал подходит для использования в качестве источника белка в гипоаллергенных детских смесях.
Пример 5 (в соответствии с изобретением). Способ в соответствии с изобретением для удаления 55% cGMP из материала сладкой молочной сыворотки
Материал сладкой молочной сыворотки представлял собой концентрат молочной сыворотки WPC 80. Из него удаляли катионы с помощью слабых / сильных / сильных катионообменных смол. Слабая смола представляла собой IMAC HP 336, сильная смола представляла собой IMAC 1110Na; обе смолы поставляются компанией Dow Chemical (ранее Rohm & Haas). В этой сладкой молочной сыворотке содержание белка составляло приблизительно 82% в пересчете на сухое вещество (DM), общее содержание твердых веществ составляло 12%, значение pH составляло 3,40. 4235 кг этой сладкой молочной сыворотки закачивали в реактор, содержащий 11 600 литров слабой анионообменной смолы (HP 661 пищевого класса). Весь объем сладкой молочной сыворотки приводили в контакт со смолой. Смолу и сладкую молочную сыворотку суспендировали вместе в течение 4 часов при температуре от 15 до 18°C. За 4 часа взаимодействия уровень pH повысился с 3,40 до конечного значения 4,80. Процесс удаления cGMP контролировали с помощью ВЭЖХ.
Через 4 часа взаимодействия получили деминерализованную сладкую молочную сыворотку, в которой содержание cGMP уменьшилось на 55%, и эту сладкую молочную сыворотку выкачивали из реактора. Выводили сладкую молочную сыворотку, после этого смолу промывали водой, чтобы уменьшить потерю белков и сухого вещества. cGMP извлекали на объединенной стадии элюирования и регенерации с использованием 4% NaOH. После регенерации NaOH выводили, пропуская через реактор воду, и промывали его водой до тех пор, пока значение pH не достигло приблизительно 10,5. После достижения этого значения pH реактор был готов к следующему циклу производства. После стандартной нейтрализации с использованием NaOH и KOH продукт подвергали термообработке, выпаривали и высушивали распылением.
Относящиеся к способу данные сведены в таблице 5 ниже.
Загрузка в пересчете на сухое вещество (DM) (кг)
4235
Количество смолы (л)
11 600
DM на литр смолы (кг/л)
0,37
Кол-во белка на литр смолы (кг/л)
0,30
Кол-во связанного cGMP на литр смолы (г/л)
39
NaOH (100%) на кг DM (г/л)
123
Время реакции (часы)
4
Время цикла (часы)
12
Соотношение Trp/Thr
0,36
Таким образом, неожиданно было обнаружено, что белковый материал, полученный с помощью способа в соответствии с изобретением, в котором удалено 55% cGMP, имеет такой же профиль минеральных веществ, как после процесса удаления 90% cGMP. Благодаря этому данный белковый материал подходит для использования в качестве источника белка в гипоаллергенных детских смесях.
Хотя изобретение описано при помощи примеров, следует понимать, что возможно внесение изменений и модификаций без отклонения от объема изобретения, определяемого формулой изобретения. Кроме того, если существуют известные эквиваленты конкретных элементов, такие эквиваленты включены так, как если бы они были конкретно упомянуты в настоящем описании.