СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ
METHOD FOR EVALUATING THE GENETIC USEFULNESS OF SPERMATOZOA

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов, их выбраковки и недопустимости использования для искусственного осеменения.
Оценку качества спермы проводят по органолептическим признакам, концентрации, подвижности и переживаемости сперматозоидов, наличию морфологических отклонений, осмотической резистентности, устойчивости (толерантности) к холодовому и другим видам стресса, содержанию высокоэнергетических молекул, активности дегидрогеназ и гидролаз (гиалуронидазы, акрозина и другие), суммарной антиокислительной активности, фрагментации (целостности) окрашенного хроматина/ДНК сперматозоидов путем измерения размера гало, метилированию ДНК и др. [1-5].
Основная задача в оценке физиологического статуса клеток, связанного с характеристикой жизнеспособности и функциональной активности, заключается в выборе интегрального показателя, характеризующего состояние метаболизма, антиоксидантной, репарационной и других функциональных систем клетки. Для сперматозоидов с различным уровнем функциональной активности таким интегральным показателем может выступать способность связываться с гиалуроновой кислотой. Известно, что с гиалуроновой кислотой связываются лишь зрелые, функционально активные сперматозоиды, имеющие специфические рецепторы к ее остаткам [6].
Гиалуроновая кислота - природное соединение, которое получают из соединительной ткани животных или с помощью специальных бактерий и используют в свободном или связанном виде. Известна флуоресцентная форма гиалуроновой кислоты, представляющая собой гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином (Hyaluronate fluorescein, Sigma):
х
m
Для гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, характерно возбуждение Е при длине волны 470 нм и эмиссии E при 494-518 нм. Гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином, вследствие высокой аффинности рецепторов гиалуроновой кислоты в метастазирущих клетках используется для связывания и выявления клеток злокачественной мезотелиомы у человека. Показано, что рецепторы гиалуроновой кислоты экспрессируются только на клетках злокачественной мезотелиомы, но не на нормальных мезотелиальных клетках [7].
Гиалуроновая кислота с флуоресцентной меткой обладает слабой и быстро гаснущей флуоресценцией. При воздействии гиалуронидазы, расщепляющей гиалуроновую кислоту и в результате этого снижающей миграцию энергии между молекулами флуоресцеина, флуоресценция пробы, содержащей клетки и гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, возрастает [8].
Таким образом, применение гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, с целью связывания с наружной поверхностью мембраны сперматозоида, содержащей экспонированные рецепторы к гиалуроновой кислоте, является обоснованным и может выступать в качестве эффективного приема для оценки генетической полноценности и функциональной зрелости сперматозоидов на молекулярном уровне как способа молекулярной и клеточной диагностики.
Известен способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, в котором применен комплексный подход для оценки генетической полноценности сперматозоидов, основанный на определении риска окислительных модификаций ДНК, образовании сшивок, фрагментация хроматина, обусловленных высоким уровнем свободнорадикальных процессов, включая перекисное окисление липидов и образование активных форм кислорода, запуск процессов апоптоза в сперматозоидах [9].
Однако молекулярно-генетические исследования, несмотря на максимальную точность результатов, требуют применения сложной и дорогостоящей аппаратуры и не могут быть воспроизведены в зоотехнических и ветеринарных лабораториях.
Технический результат заключается в повышении эффективности оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе оценки генетической полноценности сперматозоидов, в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом при 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми и генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считаются генетически неполноценными
m
Способ осуществляется следующим образом. Полученный препарат спермы разбавляют в среде для разбавления с рН 6,8-7,2, которая может быть либо лактозо-желточно-глицериновой, либо глюкозо-хелатоцитратной, либо другой, рекомендованной производителями до концентрации 1-5 млн. клеток в 1 мл. Полученный препарат спетматозоидов делят на две равные части. Одну пробу оставляют в нативном состоянии (контроль), а ко второйдобавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в конечной концентрации 0,5-1,0 ммоль. Пробы инкубируют при 37°С в течение 5-10 мин и регистрируют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения с максимумом при 470 нм и эмиссии E при 495 нм. При интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми и генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными. При интенсивности флуоресценции пробы в пределах 36-49 а.u. сперматозоиды также пригодны для искусственного осеменения, как и сперматозоиды первой группы, однако при этом возрастает риск наличия у них структурно-функциональных нарушений. Оценку генетической полноценности сперматозоидов проводят при температуре 37°С, выявляя в сперматозоидах полученных образцов с помощью комплекса методик структурные изменения ядра и хроматина, модификации ДНК. При анализе генетической полноценности сперматозоидов используются методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258 и пропидиума иодида, определяется фрагментация ДНК методом Гало и с помощью флуоресцентного красителя акридинового оранжевого, анализируется интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [10-12].
Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л). Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.
При выявлении высокой интенсивности флуоресценции до 50-60 а.u. сперматозоиды оценивают как генетически полноценные, характеризующиеся высоким уровнем жизнеспособности клеток с низким апоптотическим индексом, рассчитываемым как соотношение числа клеток в состоянии апоптоза к 100 клеткам в % (ниже 80%), отсутствием одноцепочечных разрывов хроматина, с низким содержанием ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л), отсутствием внеклеточной ДНК и обладающие максимальным оплодотворяющим потенциалом. В случае если интенсивность флуоресценции пробы будет иметь величину ниже 30-35 а.u., это характеризует сперматозоиды как функционально малоактивные, имеющие высокий уровень запущенности программы апоптоза, фрагментированности ДНК, модификации белков, липидов и ДНК продуктами свободнорадикального окисления, включая перекисное окисление липидов, что свидетельствует о наличии генетических дефектов и неполноценности сперматозоидов. При интенсивности флуоресценции пробы в пределах 36-49 а.u. сперматозоиды также пригодны для искусственного осеменения, как и сперматозоиды первой группы, однако при этом возрастает риск наличия у них структурно-функциональных нарушений.
По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.
Источники информации:
1. ABS Global, Inc. Руководство по искусственному осеменению. Пятое издание, 2002.
2. Руководство ВОЗ для лабораторного исследования и обработки человеческой спермы, 2010.
3.  Muriel L., Rivero M.T., Goyanes V.,  et al. // The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation // J. Androl., 2003; 24: 59-66.
4. WO 2009059327, G01N 33/48, 30 December, 2009.
5. RU 2278382, МПК G01N 33/487, опубл. 20.06.2006.
6. Husar G., Ozensi C.C., Cayli S. et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status. Fertil Steril 2003; 79 Suppl 3: 1616-24.
7. Asplund Т., Heldin P. Hyaluronan receptors are expressed on human malignant mesothelioma cells but not on normal mesothelial cells. Cancer Res. 1994 Aug 15; 54(16): 4516-23.
8. Fudala R., Mummert M.E., Gryczynski Z., Rich R., Borejdo J., Gryczynski I. Lifetime-based sensing of the hyaluronidase using fluorescein labeled hyaluronic acid. J. Photochem Photobiol B. 2012. Jan 5; 106:69-73.
9. RU 2568845, МПК G01N 33/48, опубл. 20.11.2015.
10. Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1H NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39.
11. Fernandez J.L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66.
12. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, Pages 515-540.