БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
BIOTECHNOLOGICAL METHOD OF OBTAINING LACTIC ACID

Изобретение относится к способам получения молочной кислоты с помощью микроорганизмов, обладающих способностью молочнокислого брожения, а также к композициям питательных сред, предназначенным для производства молочной кислоты.
Молочная кислота широко используется в пищевых целях, для фармацевтических препаратов и т.п., и также широко применяется в промышленности в качестве мономерного материала для получения полимолочной кислоты, которая является биоразлагаемой пластмассой, так что ее потребление увеличивается. Как известно, молочная кислота вырабатывается при ферментации микроорганизмов, которые преобразуют углеводсодержащие субстраты на основе глюкозы в молочную кислоту. Из «Уровня техники» известен способ получения молочной кислоты, в котором готовят исходный затор, содержащий 15% рафинадной патоки, который осветляют и очищают активированным углем. Уголь затем отделяют последовательно на фильтр-прессе и нутч-фильтре, а осветленный и очищенный от зольных элементов затор направляют в чан для стерилиации, которую проводят 2 часа при 85-90°С. Далее затор заквашивают молочнокислыми бактериями при 50°С. Начавший бродить затор через 6-12 часов размешивают воздухом и через 24 часа, когда кислотность достигнет 0,4-0,5%, проводят электродиализ с биполярными и аннионитовыми мембранами. Электродиализ проводят 6-8 раз в сутки по мере необходимости нейтрализации избытка кислоты. В диализат добавляют азотистое питание и исходный затор для выравнивания концентрации сахара. Концентрат, содержащий 10-12% молочную кислоту, подают в вакуум-аппараты на упаривание до 40-45% в течение 6-8 часов (см. А.С. СССР №501056, опубл. 09.12.1976).
Недостатки известного способа заключаются в том, что он не позволяет снизить расход дефицитного сырья и дорогостоящих материалов, является сложным, имеет большое количество отходов производства. Кроме того, огромным недостатком является низкое качество получаемой молочной кислоты.
Кроме того, из «Уровня техники» известен способ производства молочной кислоты, в котором используют штамм HI003, проводят непрерывную ферментацию молочной кислоты с использованием устройства для культивирования. Удаление фильтрата из емкости для мембранного разделения проводят, используя насос Masterflex. В качестве среды используют среду исходного сырья с сахаром (70 г/л Yutosei (произведенную MUSO Co., Ltd.), 1,5 г/л сульфата аммония). Перед использованием эту среду исходного сырья с сахаром автоклавируют при температуре 121°С в течение 15 минут при высоком давлении (2 атм). В качестве участника пористого мембранного элемента используют формованное изделие, изготовленное из нержавеющей стали и полисульфоновой смолы, и в качестве пористой мембраны используют половолоконную мембрану. Удаление культуральной среды при помощи насоса Masterflex начинали через 50 часов после начала культивирования, и культивирование продолжалось до 500 часов после начала культивирования. Из культуральной среды клетки удаляют центрифугированием, и затем добавляли по каплям концентрированную серную кислоту к культуральной среде до рН 1,9 с последующим перемешиванием образующейся смеси в течение 1 часа при 25°С. Преобразуют лактат кальция в культуральной среде в молочную кислоту и сульфат кальция. Затем осажденный сульфат кальция отделяют фильтрованием преципитата. Фильтрат вливают в резервуар для сырьевой жидкости устройства для мембранной фильтрации. Осуществляют дистилляцию полученного фильтрата при давлении от 10 Па до 30 кПа и температуре от 25 до 200°С для извлечения молочной кислоты (см. патент РФ №2574783, опубл. 10.02.2016).
Недостатки известного способа заключаются в том, что он является сложным, имеет большое количество отходов производства. Кроме того, огромным недостатком является низкое качество получаемой молочной кислоты. Использование в способе лактата кальция приводит к образованию нерастворимых хлопьев, которые в процессе биосинтеза молочной кислоты существенно снижают скорость реакции.
Задачей настоящего изобретения является устранение вышеуказанных недостатков.
Технический результат заключается в снижении стадийности, минимизировании отходов производства.
Технический результат также обеспечивается тем, что биотехнологический способ получения молочной кислоты с использованием питательной среды включает культивирование в ферментерах в нестерильных условиях. При этом питательную среду предварительно стерилизуют с фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм и подают в ферментер. Затем вводят культуру лактобактерий Lactococcus lactis ВКПМ В-1700, и/или Lactococcus lactis ВКПМ В-2017, и/или Lactococcus lactis ВКПМ В-2018. Режим культивирования поддерживают автоматически по параметрам рН, температуры, уровня глюкозы, нейтрализацию молочной кислоты в процессе ее наработки проводят 5% раствором гидроокиси натрия, после достижения концентрации лактата натрия по меньшей мере 3% через по меньшей мере 6 часов ферментационную среду частично выводят из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме. Далее осуществляют ступенчатое центрифугирование культуральной среды, на котором из культуральной жидкости выделяют лактобактерий и переносят в новую питательную среду, освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран, в котором присутствующий в культуральной жидкости лактат натрия диссоциирует на ионы, а готовые продукты в виде гидроокиси натрия и молочной кислоты собирают в камерах электродиализного блока. Очищенную культуральную жидкость возвращают в ферментер, гидроокись натрия возвращают и используют в процессе нейтрализации молочной кислоты. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку на ионообменных смолах, затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80% и фасуют. Способ осуществляют следующим образом.
Биотехнологический способ получения и выделения молочной кислоты включает культивирование в ферментерах в нестерильных условиях. При этом используют питательную среду, содержащую глюкозу, экстракт дрожжей, фосфатный буфер, микроэлементы, гликолят аммония, и соль сурьмы. Качественный и количественный состав питательных сред представлен в Таблицах 1-2.
Питательную среду готовят в емкости с мешалкой, в которую заливают дистиллированную воду и все остальные компоненты.
В качестве дрожжевого экстракта может быть использован Дрожжевой экстракт, BioChemica, AppliChem либо Дрожжевой экстракт тип Д, порошок, для микробиологии, Biospringer.
Питательные среды, существенно увеличивающие осмотолерантность кокковых форм молочнокислых бактерий. В Таблицах 4 и 5 среда с гликолятом алюминия обозначена №1, среда с гликолированным диглицерином - №2, среда с соли сурьмы - №3. В эксперименте гликолят и лактат сурьмы показали схожие свойства по увеличению осмотолерантности лактобактерий. Установлено, что заявленные композиции питательных сред позволяют увеличить осмотическое сопротивление мембраны микробной клетки и повысить концентрацию лактатов в культуральной среде. Исследовано влияние добавок (в концентрациях 0,2% и 0,5%) на динамику рН, концентрации молочной кислоты (см. Таблицу 3) и лактата натрия (см. Таблицу 4) в процессе культивирования лактококков.
Питательную среду по всем вариантам предварительно стерилизуют холодным методом с фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм и подают в ферментер.
Затем вводят культуру лактобактерий. В качестве продуцентов молочной кислоты используют лактобактерий, охарактеризованные в Таблице 5.
Под культуральной жидкостью гриба Fusarium sambucinum следует понимать культуральную жидкость, описанную в патенте РФ №2259209, согласно которому химический состав культуральной жидкости гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F -867) является следующим:
Общий анализ:
Сухие вещества
- 1,5%
Органические кислоты
- 10-12 г/л
Жирные кислоты
2,5 г/л
Микроэлементы, в мг/л:
К
- 800-1000
Na
- 300-400
Са
- 200-300
N
- 200
Mg
- 30-40
Fe
- 0,1
Cu
- 0,05
Zn
- 0,4-0,6
Mn
- 0,03
Ni
- 0,003
Co
- 0,008
Рв
- н/обн
Pg
- н/обн
As
- н/обн
Режим культивирования поддерживают автоматически по параметрам рН, температуры, уровня глюкозы. Корректировку параметра рН производят гидроксидом натрия.
Нейтрализацию молочной кислоты в процессе ее наработки проводят 5% раствором гидроокиси натрия. Лактат натрия является водорастворимой солью. В отличие от лактата кальция его использование не приводит к образованию нерастворимых хлопьев, которые в известных процессах биосинтеза молочной кислоты существенно снижают скорость реакции. После достижения концентрации лактата натрия по меньшей мере 3% через 6 часов ферментационную среду частично выводят из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме.
Далее осуществляют ступенчатое центрифугирование культуральной среды, на котором из культуральной жидкости выделяют лактобактерий и переносят в новую питательную среду.
Это принцип центрифугирования основан на различиях в скоростях седиментации. Разделяемый материал центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения. В конце каждой стадии осадок отделяют от культуральной жидкости.
Освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран. При этом каждая биполярная мембрана состоит из гетерогенной сильноосновной ионообменной подложки и тонкого катионообменного слоя. Катионообменный слой выполнен в виде пленки толщиной 9 мкм из гомогенного сульфированного перфторуглеродного полимера, сформированной на предварительно обезжиренной и активированной поверхности мембраны-подложки. В блоке биполярных диэлектрических мембран, присутствующий в культуральной жидкости лактат натрия диссоциирует на ионы, а готовые продукты в виде гидроокиси натрия и молочной кислоты собирают в камерах электродиализного блока.
Очищенную культуральную жидкость возвращают в ферментер, что снижает стадийность, минимизирует отходы производства. Гидроокись натрия возвращают и используют в процессе корректировки рН и нейтрализации молочной кислоты. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку на ионообменных смолах (Способ 1950 г. Г.С. Захаровой и Г.Н. Силина очистки молочной кислоты методом ионного обмена с использованием катионитовьгх и анионитовых ионообменных смол описан на с. 115 в книге ЛАБУТИНА А.Л. "КОРРОЗИЯ И СПОСОБЫ ЗАЩИТЫ ОБОРУДОВАНИЯ В ПРОИЗВОДСТВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ", Москва, 1959 г., Государственное научно-техническое издание химической литературы). Затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80%, фасуют и направляют потребителю. Сущность настоящего изобретения поясняется следующими примерами.
Пример 1
Биотехнологический способ получения и выделения молочной кислоты включает культивирование в нестерильных условиях в ферментере, имеющем объем 20 л.
При этом используют питательную среду при следующем соотношении исходных компонентов, мас. %: дрожжевой экстракт - 2%; глюкоза - 6%;
фосфат калия двузамещенного - 1%;
культуральная жидкость гриба Fusarium sambucinum - 0,1%;
4
2
MgSO×7HO - 0,1%;
4
2
MnSO×5HO - 0,05%;
2
4
NaHPO - 0,5%;
гликолят алюминия - 0,2%;
вода дистиллированная - остальное до 100%.
Питательную среду предварительно стерилизуют холодным методом с фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм и подают в ферментер. Затем вводят культуру лактобактерий Lactococcus lactis ВКПМ В-1700. Режим культивирования поддерживают автоматически по параметрам рН, температуры, уровня глюкозы. Корректировку водородного показателя до рН=5 производят гидроксидом натрия. Температуру регулируют в пределах 30-32°С (предпочтительно 31,5°С). Уровень глюкозы поддерживают в пределах 2-4,5%.
Нейтрализацию молочной кислоты в процессе ее наработки проводят 5% раствором гидроокиси натрия.
После достижения концентрации лактата натрия 3% через 6 часов ферментационную среду частично выводят с помощью насоса из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме.
Далее осуществляют ступенчатое центрифугирование культуральной среды, на котором из культуральной жидкости выделяют лактобактерий и переносят в новую питательную среду.
Освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран в непрерывном режиме. В блоке биполярных диэлектрических мембран, присутствующий в культуральной жидкости лактат натрия диссоциирует на ионы, а готовые продукты в виде гидроокиси натрия и молочной кислоты собирают в камерах электродиализного блока.
Очищенную культуральную жидкость возвращают в ферментер. Гидроокись натрия возвращают и используют в процессе корректировки рН и нейтрализации молочной кислоты. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку на ионообменных смолах. Затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80%, фасуют и направляют потребителю.
Пример 2
Биотехнологический способ получения и выделения молочной кислоты включает культивирование в нестерильных условиях в ферментере, имеющем объем 20 л.
При этом используют питательную среду при следующем соотношении исходных компонентов, мас. %:
дрожжевой экстракт - 5%;
глюкоза - 10%;
фосфат калия двузамещенного - 2%;
культуральная жидкость гриба Fusarium sambucinum - 0,15%;
4
2
MgSO×7HO - 0,3%;
4
2
MnSO×5HO - 0,07%;
2
4
NaHPO - 0,8%;
гликолят алюминия - 0,5%;
вода дистиллированная - остальное до 100%.
Питательную среду предварительно стерилизуют холодным методом с фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм и подают в ферментер. Затем вводят культуру лактобактерий Lactococcus lactis ВКПМ В-2017. Режим культивирования поддерживают автоматически по параметрам рН, температуры, уровня глюкозы. Корректировку водородного показателя до рН=5 производят гидроксидом натрия. Температуру регулируют в пределах 30-32°С (предпочтительно 32°С). Уровень глюкозы поддерживают в пределах более 6%.
Нейтрализацию молочной кислоты в процессе ее наработки проводят 5% раствором гидроокиси натрия.
После достижения концентрации лактата натрия 4% через 24 часа, ферментационную среду частично выводят с помощью насоса из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме.
Далее осуществляют ступенчатое центрифугирование культуральной среды, на котором из культуральной жидкости выделяют лактобактерий и переносят в новую питательную среду.
Освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран в непрерывном режиме. В блоке биполярных диэлектрических мембран, присутствующий в культуральной жидкости лактат натрия диссоциирует на ионы, а готовые продукты в виде гидроокиси натрия и молочной кислоты собирают в камерах электродиализного блока.
Очищенную культуральную жидкость возвращают в ферментер. Гидроокись натрия возвращают и используют в процессе корректировки рН и нейтрализации молочной кислоты. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку на ионообменных смолах. Затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80%, фасуют и направляют потребителю.
Пример 3
Биотехнологический способ получения и выделения молочной кислоты включает культивирование в нестерильных условиях в ферментере, имеющем объем 20 л.
При этом используют питательную среду при следующем соотношении исходных компонентов, мас. %:
дрожжевой экстракт - 5%;
глюкоза - 10%;
фосфат калия двузамещенного - 2%;
культуральная жидкость гриба Fusarium sambucinum - 0,15%;
4
2
MgSO×7HO - 0,3%;
4
2
MnSO×5HO - 0,07%;
2
4
NaHPO - 0,8%;
гликолированный диглицерин - 0,5%;
вода дистиллированная - остальное до 100%.
Питательную среду предварительно стерилизуют холодным методом с фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм и подают в ферментер. Затем вводят культуры лактобактерий: Lactococcus lactis ВКПМ В-1700, Lactococcus lactis ВКПМ В-2017, Lactococcus lactis ВКПМ В-2018. Режим культивирования поддерживают автоматически по параметрам рН, температуры, уровня глюкозы. Корректировку водородного показателя до рН=5 производят гидроксидом натрия. Температуру регулируют в пределах 30-32°С (предпочтительно 31,5°С). Уровень глюкозы поддерживают в пределах более 6%.
Нейтрализацию молочной кислоты в процессе ее наработки проводят 5% раствором гидроокиси натрия.
После достижения концентрации лактата натрия 4,5% через 24 часа ферментационную среду частично выводят с помощью насоса из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме.
Далее осуществляют ступенчатое центрифугирование культуральной среды, на котором из культуральной жидкости выделяют лактобактерий и переносят в новую питательную среду.
Освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран в непрерывном режиме. В блоке биполярных диэлектрических мембран, присутствующий в культуральной жидкости лактат натрия диссоциирует на ионы, а готовые продукты в виде гидроокиси натрия и молочной кислоты собирают в камерах электродиализного блока.
Очищенную культуральную жидкость возвращают в ферментер. Гидроокись натрия возвращают и используют в процессе корректировки рН и нейтрализации молочной кислоты. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку на ионообменных смолах. Затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80%, фасуют и направляют потребителю.
Пример 4
Биотехнологический способ получения и выделения молочной кислоты включает культивирование в нестерильных условиях в ферментере, имеющем объем 20 л.
При этом используют питательную среду при следующем соотношении исходных компонентов, мас. %:
дрожжевой экстракт - 2%;
глюкоза - 6%;
фосфат калия двузамещенного - 1%;
культуральная жидкость гриба Fusarium sambucinum - 0,1%;
4
2
MgSO×7HO - 0,1%;
4
2
MnSO×5HO - 0,05%;
2
4
NaHPO - 0,5%;
гликолят сурьмы - 0,2%;
вода дистиллированная - остальное до 100%.
Питательную среду предварительно стерилизуют холодным методом с фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм и подают в ферментер. Затем вводят культуры лактобактерий: Lactococcus lactis ВКПМ В-1700, Lactococcus lactis ВКПМ В-2017, Lactococcus lactis ВКПМ В-2018. Режим культивирования поддерживают автоматически по параметрам pH, температуры, уровня глюкозы. Корректировку водородного показателя до рН=5 производят гидроксидом натрия. Температуру регулируют в пределах 30-32°С (предпочтительно 31,5°С). Уровень глюкозы поддерживают в пределах 3-4%.
Нейтрализацию молочной кислоты в процессе ее наработки проводят 5% раствором гидроокиси натрия.
После достижения концентрации лактата натрия 3% через 6 часов ферментационную среду частично выводят с помощью насоса из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме.
Далее осуществляют ступенчатое центрифугирование культуральной среды, на котором из культуральной жидкости выделяют лактобактерий и переносят в новую питательную среду.
Освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран в непрерывном режиме. В блоке биполярных диэлектрических мембран присутствующий в культуральной жидкости лактат натрия диссоциирует на ионы, а готовые продукты в виде гидроокиси натрия и молочной кислоты собирают в камерах электродиализного блока.
Очищенную культуральную жидкость возвращают в ферментер. Гидроокись натрия возвращают и используют в процессе корректировки рН и нейтрализации молочной кислоты. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку на ионообменных смолах. Затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80%, фасуют и направляют потребителю.
Пример 5
Биотехнологический способ получения и выделения молочной кислоты включает культивирование в нестерильных условиях в ферментере, имеющем объем 20 л.
При этом используют питательную среду при следующем соотношении исходных компонентов, мас. %:
дрожжевой экстракт - 5%;
глюкоза - 10%;
фосфат калия двузамещенного - 2%;
культуральная жидкость гриба Fusarium sambucinum - 0,15%;
4
2
MgSO×7HO - 0,3%;
4
2
MnSO×5HO - 0,07%;
2
4
NaHPO - 0,8%;
лактат сурьмы - 0,5%;
вода дистиллированная - остальное до 100%.
Питательную среду предварительно стерилизуют холодным методом с фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм и подают в ферментер. Затем вводят культуры лактобактерий: Lactococcus lactis ВКПМ В-1700, Lactococcus lactis ВКПМ В-2017, Lactococcus lactis ВКПМ В-2018. Режим культивирования поддерживают автоматически по параметрам рН, температуры, уровня глюкозы. Корректировку водородного показателя до рН=5 производят гидроксидом натрия. Температуру регулируют в пределах 30-32°С (предпочтительно 31,5°С). Уровень глюкозы поддерживают в пределах более 6%.
Нейтрализацию молочной кислоты в процессе ее наработки проводят 5% раствором гидроокиси натрия.
После достижения концентрации лактата натрия 4,2% через 24 часа ферментационную среду частично выводят с помощью насоса из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме.
Далее осуществляют ступенчатое центрифугирование культуральной среды, на котором из культуральной жидкости выделяют лактобактерий и переносят в новую питательную среду.
Освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран в непрерывном режиме. В блоке биполярных диэлектрических мембран, присутствующий в культуральной жидкости лактат натрия диссоциирует на ионы, а готовые продукты в виде гидроокиси натрия и молочной кислоты собирают в камерах электродиализного блока.
Очищенную культуральную жидкость возвращают в ферментер. Гидроокись натрия возвращают и используют в процессе корректировки рН и нейтрализации молочной кислоты. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку на ионообменных смолах. Затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80%, фасуют и направляют потребителю.