Средство для продуцирования органических соединений, обладающих антибактериальной и антигрибковой активностью
MEANS FOR THE PRODUCTION OF ORGANIC COMPOUNDS WITH ANTIBACTERIAL AND ANTIFUNGAL ACTIVITY

Изобретение относится к области биотехнологии, фармакологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для получения лекарственных препаратов с использованием микроорганизмов-продуцентов.
Инфекционные заболевания, вызываемые патогенами с множественной лекарственной устойчивостью, включая бактерии, паразитические простейшие и грибы, широко распространены и являются актуальной медицинской и социальной проблемой в мире [Р.K. Bhattacharya. Emergence of antibiotic-resistant bacterial strains, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, extended spectrum beta lactamases, and multi-drug resistance is a problem similar to global warming. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. (2014) 47(6):815-6. doi: 10.1590/0037-8682-0139-2014]. В настоящее время ведется интенсивный поиск новых и более эффективных биологически активных соединений для борьбы с этими патогенами. Внимание исследователей привлекают биологически активные соединения, имеющие естественное происхождение. Актинобактерии представляют собой самую многочисленную группу прокариот, которые являются лидерами среди естественных продуцентов биологически активных соединений. Вторичные метаболиты актинобактерий составляют около двух третей всех биоактивных продуктов естественного происхождения, имеющих фармацевтическое значение [K. Tiwari, R.K. Gupta. Rare actinomycetes: a potential storehose for novel antibiotics. Crit. Rev. Biotechnol., 32 (2) (2012), pp. 108-132]. Вторичные метаболиты актинобактерий проявляют ряд биологических активностей, включая антибактериальную, противогрибковую, противоопухолевую, цитотоксическую, противовоспалительную, противопаразитарную, антималярийную, противовирусную и антиоксидантную. [R. Salwan, V. Sharma. Molecular and biotechnological aspects of secondary metabolites in actinobacteria. Microbiol Res. 2020 Jan; 231:126374].
Corynebacterium - род грамположительных бактерий, который классифицируется как актинобактерий и филогенетически связан с микобактериями, родококками и нокардиями. Эта разнообразная группа палочковидных или булавовидных (коринеформных) микроорганизмов включает патогены человека, животных и растений, а также сапрофиты. Многочисленные коринебактерии относятся к непатогенным и являются представителями нормальной микрофлоры слизистых оболочек и кожи людей и животных.
В литературе имеются единичные данные о способности коринебактерий синтезировать соединения, обладающие антибактериальной активностью.
Известен штамм Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13, продуцирующий ингибирующее вещество (BLIS) с антимикробным действием в отношении S. aureus, S. epidermidis, С. diphtheriae и Propionibacterium spp. [P. Wysocki, A.K. Kwaszewska, E.M. Szewczyk. Influence of substances produced by lipophilic Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 on the microorganisms inhabiting human skin. Med Dosw Mikrobiol. 201 1; 63(1):45-52].
Известен штамм Corynebacterium pseudodiphtheriticum C. pseudodiphthe-riticum USU1, представитель нормальной носовой микробиоты, который обладает бактерицидной активностью в отношении S. aureus, включая устойчивый к метициллину S. aureus (MRSA) [L. Britney et al. Corynebacterium pseudodiphtheriticum Exploits Staphylococcus aureus Virulence Components in a Novel Polymicrobial Defense Strategy. mBio. 2019 Jan 8; 10(1):e02491-18. doi: 10.1128/mBio.02491-18].
Известен штамм Corynebacterium xerosis NS5 - продуцент циклического липопептида, проявляющего антибактериальную активность в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa [D. Dalili et al. Isolation and structural characterization of Coryxin, a novel cyclic lipopeptide from Corynebacterium xerosis NS5 having emulsifying and anti-biofilm activity. Colloids Surf В Biointerfaces. 2015 Nov 1; 135:425-432].
Общим недостатком описанных препаратов является узкий спектр антибактерицидного действия, а также отсутствие антигрибковой активности.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования органических соединений, обладающих антибактериальной и антигрибковой активностью.
Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Corynebacterium amycolatum ICIS 53, продуцирующего смесь азотсодержащих гетероциклических соединений групп 2,5-дикетопиперазина и 2-пирролидона, обладающую антибактериальной и антигрибковой активностью.
Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 53 выделен в феврале 2013 года из вагинального содержимого здоровой женщины в возрасте 24 лет г. Оренбурга, которая на момент обследования была клинически здорова, не имела в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний репродуктивного тракта и других систем органов.
Изучение штамма проводили в лаборатории биомедицинских технологий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.
Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 53 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ Ac-2844D.
Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 53 характеризуется, следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
При световом микроскопическом исследовании клетки имеют вид прямых или слегка изогнутых грамположительных полиморфных палочек, располагаются чаще одиночно, реже парами или стопками из нескольких параллельно лежащих клеток («палисадом»). Окрашиваются неравномерно, часто имеют метахроматические гранулы. На ГРМ агаре формирует круглые, кремовые колонии (1-3 мм). Края колоний ровные, поверхность выпуклая, сухая. Рост обильный. Штамм безвреден, не токсичен, авирулентен.
Физиолого-биохимические признаки.
Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, некислотоустойчивые, каталазоположительные палочки. Облигатный аэроб.
Оптимальная температура роста 37°С, рН=7,2-7,4.
Ферментирует глюкозу, фруктозу, мальтозу, маннозу. Не восстанавливает нитраты, арабинозу, ксилозу, рамнозу, галактозу, лактозу, раффинозу, салицин не ферментирует. Не обладает гемолитическими свойствами и лецитиназной активностью.
Условия и среды для культивирования.
Заявленный штамм микроорганизма культивируется 24 ч при 37°С в шейкер-инкубаторе на ГРМ бульоне (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки 8,0, пептон сухой ферментативный 8,0, натрия хлорид 4,0), рН=7,0-7,2; на Триптон-соевом бульоне (г/л): гидролизат казеина 17,00 папаиновый перевар соевой муки 3,00, натрия хлорид 5,00, калия гидрофосфат 2,50, глюкоза 2,50, рН=7,0-7,2; на Лурии Бертани бульоне (г/л): триптон 10,0, дрожжевой экстракт 5,0, натрий хлорид 5,0, глюкоза 3,6, рН=7,0±0,2. Для приготовления твердой среды необходимо добавить к указанным выше ингредиентам 15,0 г/л агар-агара.
Антибиотикорезистентность штамма.
Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 53 чувствителен к: цефалексину, олеандомицину, энрофлоксацину, бензилпеницилину и мономицину. Устойчив к оксациллину.
Генетическая характеристика предлагаемого штамма.
Проведено полногеномное секвенирование ДНК штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 на секвенаторе MiSeq (Illumina) с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью SPAdes genome assembler (St. Petersburg genome assembler, version 3.9.0) и the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok]. Поиск генов, кодирующих факторы вирулентности (на основе нуклеотидной последовательности) проведен с использованием базы данных факторов вирулентности патогенных бактерий человека [Во Liu et al., VFDB 2019: a comparative patho-genomic platform with an interactive web interface, Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, Pages D687-D692, https://doi.org/10.1093/nar/gky1080]. Поиск генов устойчивости к антибиотикам выполнен с использованием инструмента RGI (Resistance Gene Identifier) [В. Jia et al., CARD 2017: expansion and model-centric curation of the comprehensive antibiotic resistance database, Nucleic Acids Res. 45 (D1) (2016) D566-D573.31].
Результаты проведенного биоинформатического анализа показали:
Размер генома - 2,460,257 bp;
G+C состав - 58.98%;
Количество генов - 2,173
Количество rRNA оперонов - 5, 1, 1 (5S, 16S, 23S);
Количество tRNAs - 53;
Последовательность генома Corynebacterium amycolatum ICIS 53 не содержала факторов вирулентности и генов устойчивости к антибиотикам, подтверждая его безопасность.
Полногеномная последовательность размещена в открытых базах данных DDBJ/ENA/GenBank под номером MIFV00000000.
BioProject ID: PRJNA339674
BioSample: SAMN05601680
Sample name: Corynebacterium amycolatum ICIS 53
На основе проведенного полногеномного секвенирования и культурально-морфологических признаков Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 53 идентифицирован как штамм вида Corynebacterium amycolatum.
Штамм является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом.
Условия хранения штамма: штамм бактерий Corynebacterium amycolatum ICIS 53 хранят в пробирках на скошенном питательном агаре (ГРМ агар) при температуре 4±2°С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60%. Периодические пересевы, до 2 недель. В криогенном состоянии в 50% глицерине при - 70°С с периодичностью обновления 1 раз в год.
Авторами экспериментально установлено, что выделенный ими новый штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 53 продуцирует смесь азотсодержащих гетероциклических соединений групп 2,5-дикетопиперазина и 2-пирролидона, которая обладает антибактериальной и антигрибковой активностью.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Культивирование штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 (ВКМ Ac-2844D)
Культивирование продуцента проводят в жидкой питательной среде следующего состава (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт - 5,0; натрий хлорид - 5,0; глюкоза - 5,0, рН=7,0±0,2. Ферментацию осуществляют в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл на качалке со скоростью вращения 220 об/мин и при температуре +37°С. Объем питательной среды в колбе 100 мл. Продолжительность ферментации 72 часа. Объем посевного материала 10%. Состав среды для получения и выращивания посевного материала (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлорид - 5,0; глюкоза - 3,6, рН=7,0±0,2. Продолжительность выращивания посевного материала 48 часов на качалке со скоростью вращения 220 об/мин и при температуре +37°С. Микроморфология штамма ВКМ Ac-2844D Corynebacterium amycolatum ICIS 53 приведена на фигуре 1.
Пример 2. Выделение экзаметаболитов штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 (ВКМ Ac-2844D)
По окончании срока ферментации культуральную жидкость сливают из колб в пробирки и центрифугируют при 9000 об/мин при t +4°С, затем фильтруют сначала через стерильные мембранные фильтры Millipore (Merk) с диаметром пор 0,22 мкм, закисляют 2 N HCl до рН 2,0 и оставляют на ночь при +4°С. Фильтрат культуральной жидкости экстрагируют смесью органических растворителей (хлороформа, бутилацетата, метанола и диэтилового эфира в соотношении 2:2:1:1) при соотношении экстрагента к культуральной жидкости 1:1 в течение 6 часов при температуре 25°С и постоянном перемешивании со скоростью 220 об/мин. Полученные экстракты упаривают досуха под вакуумом при температуре не выше 40°С. После фильтрования и упаривания под вакуумом получают конечный продукт - сухой сырец.
Пример 3. Определение антибактериальной активности смеси экзаметаболитов штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 (ВКМ Ac-2844D) в отношении штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий
Для определения антибиотической активности используют метод дисков [Егоров, 2004]. Диски пропитывают препаратом, растворенном в 60% водном растворе диметилсульфоксида (ДМСО) и сушат их на воздухе в стерильных условиях.
Тест-объектами берут коллекционные штаммы условно-патогенных и патогенных грамположительных и грамотрицательных бактерий - Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae. Контролем служат стандартные диски с амоксициллином («НИИ Пастера», 20 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают через 24 часа. Чашки Петри с патогенными и условно-патогенными бактериями и инкубируют при 37°С на среде ГРМ.
Экстракты культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 обладают широким спектром антибактериальной активности в отношении патогенных и условно-патогенных видов бактерий. Величины зоны подавления роста тест-культур Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium - 13 мм, 14 мм и 10 мм, соответственно и грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae - 13 мм, 9 мм и 13 мм соответственно. Штамм ингибирует рост всех условно-патогенных и патогенных тест-культур, но особенно эффективен против S. epidermidis, P. aeruginosa АТСС 27853 и Kl. pneumoniae (Таблица 1).
Продуктивность биомассы по сырцу комплекса составила 93 мг на грамм абсолютной сухой биомассы.
Пример 4. Определение фунгицидной активности штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 (ВКМ Ac-2844D) в отношении штаммов условно-патогенных и патогенных дрожжевых грибов.
Опыт проводят согласно примеру 1, но в качестве тест-объектов используют штаммы патогенных дрожжевых микроскопических грибов Candida albicans и C. tropicales. Контролем служат стандартные диски с итраконазолом («НИИ Пастера», 10 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают через 24 часа (Таблица 2). Чашки Петри с дрожжами инкубируют при 37°С на среде Сабуро.
Величины зоны подавления роста тест-культур С. albicans и С. tropicales - 13 мм и 10 мм, соответственно.
Пример 5. Выделение и идентификация органических соединений в смеси экстракта культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53
Для определения химического состава сухого сырца, выделенного из культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 согласно примеру 1, применяют метод масс-спектрометрии.
Для анализа пробы используют хроматомасс-спектрометр с диапазоном массовых чисел от 1,5 до 1090 а.е.м., разрешающей способностью не более 2 а.е.м., автоматической настройкой детектора с использованием калибровочного стандарта перфтортрибутиламина, хроматографической капиллярной колонкой длинной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Запись спектра ведут в режиме электронной ионизации. Энергия ионизирующих электронов 70 эВ, газ носитель - гелий, скорость газа-носителя 1,5 мл/мин. Температура ионного источника 200°С, температура испарителя хроматографа 250°С, температура интерфейса детектора 250°С. Температура термостата колонки: выдерживание при 40°С в течение 4 мин, повышение температуры со скоростью 25°С/мин до 250°С, выдержка при конечной температуре в течение 35 минут. Деление потока 1:20. Образцы растворяют в метаноле.
Идентификацию пиков, соответствующих веществам, проводят с использованием библиотеки масс-спектров NIST (The NIST Mass Spectral Search Program for the NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library Version 2.0 g build May 19 2011).
Масс-спектр экстракта культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 53 (сухого сырца) приведен на фигуре 2.
Результаты расшифровки спектра с указанием соотношения компонентов в пересчете на сухую массу экстракта приведены в таблице 3.
Таким образом, основными веществами в смеси органических соединений сухого сырца экзаметаболитов, обладающими выраженными антибактериальными и антигрибковыми свойствами, являются азотсодержащие гетероциклические вещества 3-изобутилгексагидропирроло[1,2-α]пиразин-1,4-дион (группа 2,5-дикетопиперазина) и 5-пирролидино-2-пирролидон (группа 2-пирролидона), структуры которых представлены на фигуре 3. Содержание гетероциклических соединений в сырце не менее 40%.