УСТРОЙСТВО ОПТИЧЕСКОЕ ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ

Предлагаемая полезная модель относится к устройствам для сканирования биологических микрочипов с флуоресцентными метками и может быть использована для диагностики в медицине, ветеринарии, при контроле пищевых продуктов, в криминалистике.
Существуют схемы сканирования, использующие различные способы освещения образца (светлопольная и темнопольная схемы) и получения изображения (с применением механической развертки и одноэлементного фотоприемника либо имеющие матричный фотоприемник). Схемы сканирования с механической разверткой и одноэлементным фотоприемником имеют невысокую скорость проведения измерений, так как все точки биологического микрочипа просматриваются последовательно. Матричный фотоприемник обеспечивает одновременное измерение интенсивности люминесценции всех точек образца, что повышает скорость проведения измерений. Схемы со светлопольным освещением характеризуются высокой разрешающей способностью, критичностью к толщине образца благодаря малой глубине резкости, высокими требованиями к спектральному составу излучения возбуждения и применяемым светофильтрам, низким отношением сигнал/шум, относительно невысокой точностью. Схемы, имеющие темнопольное освещение, имеют при сравнимой разрешающей способности более высокое отношение сигнал/шум, точность и более низкие требования к применяемым светофильтрам и источникам излучения.
Известно устройство для диагностики с использованием биологических микрочипов, выполненное по патенту RU 2371721 С2 (МПК G01N 33/483, опубл. 27.12.2008 г. ). Устройство выполнено по темнопольной схеме, с использованием матричного фотоприемника. В нем освещение осуществляется набором из светодиодов, расположенных под углом к поверхности образца, а для увеличения использования излучения люминесценции под поверхностью образца расположен блок микропризм, действующих как уголковые отражатели и направляющих свет от тыльной поверхности образца в объектив. Оптическая система состоит из двух объективов и построена так, что между объективами существует параллельный пучок лучей, в котором установлен интерференционный светофильтр, пропускающий длину волны люминесценции. К недостаткам устройства можно отнести требование к прозрачности и высокой оптической однородности подложки образца, требование к большому световому диаметру интерференционного фильтра, малую мощность светодиодного осветителя, отсутствие самоконтроля, что приводит к малому отношению сигнал-шум и снижению точности устройства.
Известно также устройство для анализа люминесцирующих биологических микрочипов, выполненное по патенту RU 2510959 С2 (МПК G01N 21/64, опубл. 03.02.2010 г. ). Устройство выполнено по темнопольной схеме, с использованием матричного фотоприемника. В нем освещение образца осуществляется лазерными диодами с помощью волоконных световодов. Пучок волоконных световодов расщепляется на отдельные волокна, концы которых равномерно располагаются вокруг освещаемого образца таким образом, что свет падает на образец под углом. Приемная оптическая система устроена аналогично предыдущему патенту. Благодаря тому, что в качестве осветителя используются лазерные диоды, становится возможным получать большую интенсивность излучения, возбуждающего краситель, на поверхности образца. Это дает более высокую интенсивность люминесценции образца, что, в свою очередь, предъявляет менее высокие требования к светосиле оптической системы и чувствительности матричного приемника излучения. К недостаткам устройства можно отнести чувствительность к вибрациям, большое число волокон, требуемое для обеспечения заданной равномерности освещения, отсутствие самоконтроля, что приводит к снижению точности измерений.
Известно также устройство для сканирования биополимерного массива, выполненное по патенту US 7504072 (МПК G01N 21/64, опубл. 17.03.2009). Устройство использует светопольную схему освещения и механическую развертку изображения. В данном устройстве реализована задача улавливания излучения флуоресценции биополимерного массива с применением модулированного лазерного излучения, с этой целью в оптическую схему добавлены электрооптические модуляторы (110а, 110b) и поляризаторы (120а, 120b), причем сами лазеры работают непрерывно. При этом используются отдельные фотоприемники для каждой используемой длины волны. В отличие от устройства по патенту US 7504072, в предлагаемой полезной модели применено немодулированное лазерное излучение, отсутствуют электрооптические модуляторы (110а, 110b) и поляризаторы (120а, 120b), применен матричный фотоприемник вместо двух единичных фотоприемников. Недостатками устройства являются отсутствие самоконтроля, низкая скорость проведения измерения, высокие требования к юстировке, отсутствию вибраций, а также высокие требования к применяемым светофильтрам для разделения длин волн возбуждения и излучения красителя биологического микрочипа, что снижает отношение сигнал/шум и, как следствие, уменьшает повторяемость и точность измерений.
Наиболее близким к рассматриваемому устройству является устройство считывания биологического микромассива, выполненное по патенту WO 02/35441 А2, (МПК G06F 19/00, опубл. 02.05.2002). В данной системе используется механическая развертка, набор поворотных зеркал для направления излучения от источников излучения, светлопольная схема освещения, разрешающая способность определяется размером точечной диафрагмы (467). Схема имеет два лазерных источника излучения возбуждения с длиной волны 635 нм (420 А) и 532 нм (420 В), фильтры излучения возбуждения (425 А, 425 В), поворотное зеркало на пути луча лазера (424), объединитель лучей (430), дихроичное зеркало (436), поворотное зеркало перископа (438), зеркало механической развертки (440) и зеркало на конце поворотного рычага (442), объектив (445), детектор излучения возбуждения (410), револьверную головку с фильтрами (460), объектив детектора (465), точечную диафрагму (467), детектор излучения люминесценции (415). Дихроичное зеркало (436) разделяет излучение возбуждения и излучение люминесценции образца. Детектор излучения возбуждения (410) позволяет контролировать мощность излучения лазеров (420 А, 420 В). Недостатками системы является низкая скорость считывания из-за примененного принципа развертки, отсутствие самоконтроля, низкая чувствительность из-за ограничения светового потока точечной диафрагмой и потерь света на многочисленных оптических элементах, использование светлопольной схемы освещения и считывания изображения, что предъявляет высокие требования к юстировке, отсутствию вибраций, снижает отношение сигнал/шум и уменьшает точность и повторяемость измерений.
Задачей, решаемой предлагаемой полезной моделью, являются повышение повторяемости и точности измерения устройства для считывания биологических микрочипов.
Техническим результатом является использование самоконтроля устройства для повышения повторяемости и точности измерения устройства для считывания биологических микрочипов.
Указанный технический результат достигается тем, что устройство оптическое для анализа биологических микрочипов содержит лазерные источники возбуждения люминесцентного излучения с разными длинами волн, узел держателя образца биологических микрочипов, приемную оптическую систему регистрации люминесцентного излучения с набором светофильтров и матричный приемник излучения с блоком обработки сигнала, между источниками света и узлом держателя образца расположены дихроичное зеркало, объектив и поворотное зеркало, и отличается тем, что узел держателя образца дополнительно снабжен калибровочной пластиной.
В частном случае выполнения поверхность калибровочной пластины выполнена однородно люминесцирующей с калиброванным коэффициентом люминесценции, а в наборе светофильтров содержится узкополосный светофильтр на длину волны люминесценции красителя калибровочной пластины.
В другом частном случае выполнения в наборе светофильтров содержится фильтр на длину волны излучения лазера, а поверхность калибровочной пластины выполнена с калиброванным коэффициентом отражения.
В третьем частном случае выполнения в наборе светофильтров содержится калиброванный нейтральный фильтр, а поверхность калибровочной пластины выполнена с калиброванным коэффициентом отражения.
В четвертом частном случае выполнения в наборе светофильтров содержится комбинация узкополосного фильтра и калиброванного нейтрального фильтра, а поверхность калибровочной пластины выполнена с калиброванным коэффициентом отражения.
Дихроичное зеркало необходимо для объединения излучения лазерных источников возбуждения с разными длинами волн. Оно должно быть рассчитано на области длин волн используемых лазерных источников.
Применение отдельного поворотного зеркала дает возможность настроить оптимальное положение пучка излучения осветителей на образце.
Объектив служит для создания изображения образца на чувствительной поверхности матричного приемника излучения.
В качестве лазерных источников могут быть применены полупроводниковые лазеры, твердотельные лазеры, газовые лазеры.
Наличие дополнительной калибровочной пластины обеспечивает самоконтроль устройства по заранее известным свойствам ее поверхности: калиброванному коэффициенту отражения либо калиброванному коэффициенту люминесценции, что увеличивает повторяемость и точность измерения в течение всего срока службы прибора.
В отличие от устройства по патенту WO 02/35441 А2, в предлагаемой полезной модели используется темнопольная схема освещения вместо светлопольной, лазеры без фильтров излучения возбуждения, дихроичное зеркало соединяет излучение от двух лазерных источников вместо того, чтобы разделять излучение возбуждения и излучение люминесценции образца, применяется матричный фотоприемник вместо механической развертки, единичного фотоприемника и точечной диафрагмы, и используется калибровочная пластина. Применение калибровочной пластины позволяет получить большую повторяемость и точность измерения, чем в устройстве по патенту WO 02/35441 А2.
Сущность полезной модели поясняется чертежом, на котором изображена схема устройства.
Устройство оптическое для анализа биологических микрочипов содержит лазерные источники возбуждения люминесцентного излучения 1 и 2 с различными длинами волн (лазеры), узел держателя 3 образца с биологическим микрочипом 4, приемную оптическую систему регистрации люминесцентного излучения 5 с набором светофильтров 6 и матричный фотоприемник 7 с блоком обработки сигнала (изображения) 8. Между лазерными источниками возбуждения люминесцентного излучения 1 и 2 и узлом держателя образца 3 расположены дихроичное зеркало 9, объектив 10 и поворотное зеркало 11, формирующие поток возбуждающего излучения на биологическом микрочипе 4. Узел держателя образца 3 дополнительно содержит калибровочную пластину 12. Оптическая система регистрации люминесцентного излучения 5 состоит из двух объективов 13 и 14, между которыми размещен набор светофильтров 6. В набор светофильтров входят фильтры, имеющие длину волны пропускания, соответствующую длине волны люминесценции исследуемых образцов, в качестве которых могут применяться нейтральные фильтры, полосовые обычные фильтры или интерференционные светофильтры. Калибровочная пластина 12 в частных случаях может быть выполнена с однородно люминесцирующей поверхностью с заранее известной интенсивностью люминесценции или с однородной диффузно отражающей поверхностью с заранее известным коэффициентом отражения. При использовании пластины с однородно люминесцирующей поверхностью в набор светофильтров входит узкополосный светофильтр на длину волны люминесценции красителя калибровочной пластины. При использовании пластины с однородной диффузно отражающей поверхностью в набор светофильтров входит фильтр на длину волны излучения лазера, или нейтральный фильтр, или комбинация узкополосного фильтра и нейтрального фильтра.
Биологический микрочип 4 (образец) освещается лазерными источниками возбуждения люминесцентного излучения 1 и 2 с различными длинами волн, соответствующими длине волны возбуждения флуоресцентных меток биологического микрочипа, с помощью объектива 10 и поворотного зеркала 11. Применение отдельного поворотного зеркала дает возможность настроить оптимальное положение пучка излучения осветителей на образце, а также уменьшить габариты устройства. Объединение излучения двух лазерных источников возбуждения люминесцентного излучения происходит на дихроичном зеркале 9. Лазерные источники возбуждения люминесцентного излучения 1 и 2 могут включаться раздельно или одновременно для обеспечения возможности использования различных флуоресцентных меток с разными длинами волн возбуждения. Ток лазерных источников возбуждения люминесцентного излучения стабилизируется электрической схемой устройства.
Обработка полученного изображения, предварительная проверка работоспособности, компенсация неоднородности освещения и вывод на внешнее устройство производится в блоке обработки изображения 8, к которому подключен матричный фотоприемник 7. Взаимное расположение источников и приемников излучения соответствует темнопольной схеме измерений.
В случае применения отражающей калибровочной пластины после включения устройства работа происходит следующим образом - вместо биологического микрочипа 4 в узел держателя образца 3 устанавливается равномерно отражающая пластина 12, с заранее известным (калиброванным) коэффициентом отражения. Из набора светофильтров 6 в оптическую систему 5 устанавливается нейтральный светофильтр с известным (калиброванным) коэффициентом пропускания. Включается лазер 1 или 2 с любой длиной волны в области спектральной чувствительности матричного фотоприемника 7.
В случае применения люминесцирующей калибровочной пластины вместо биологического микрочипа 4 в узел держателя образца 3 устанавливается равномерно люминесцирующая пластина 12, с заранее известной интенсивностью люминесценции.
В качестве светофильтра 6 в приемную оптическую систему 5 устанавливается полосовой светофильтр на длину волны люминесценции красителя калибровочной пластины. Включается лазер 1 или 2 с длиной волны, соответствующей длине волны возбуждения красителя калибровочной пластины.
Производится считывание изображения с матричного фотоприемника 7. Блок обработки изображения записывает в память распределение интенсивности, считанное приемником излучения для пластины 12, и в дальнейшем использует это распределение для коррекции неравномерности освещенности образца.
После проведения самоконтроля по калибровочной пластине проводят сканирование биологического микрочипа. В узел держателя образца 3 устанавливается биологический микрочип 4 с флуоресцентными метками. Из набора светофильтров 6 устанавливается светофильтр с длиной волны пропускания, соответствующей длине волны излучения образца. Включается лазер 1 или 2, с длиной волны, соответствующей длине волны возбуждения флуоресцентных меток биологического микрочипа 4. Делается снимок изображения матричным фотоприемником 7. Блок обработки сигнала 8 сопоставляет полученное изображение с матричного фотоприемника и изображение, записанное в память во время предыдущего этапа, и корректирует неоднородность освещенности полученного изображения. Определяя положение флуоресцентных меток на образце, блок обработки сигнала строит координатную сетку, в вершинах которой находятся все флуоресцентные метки образца. Максимальная интенсивность свечения флуоресцентных меток принимается за 100% результата измерения, интенсивность свечения пространства между метками - за 0%, а интенсивность свечения остальных флуоресцентных меток распределяется между этими значениями. Номер флуоресцентной метки в координатной сетке сопоставляется блоком обработки сигнала с заранее внесенными в него наименованиями реагентов или определяемых веществ. Результатом измерения является номер флуоресцентной метки в координатной сетке, сопоставленный с номером наименования. Относительную интенсивность блок обработки сигнала выводит на внешнее устройство (индикатор, дисплей, принтер, внешний компьютер, устройство внешней памяти, на чертеже не показано). Блок обработки сигнала также может записать результат во внутреннюю память с целью повторной выдачи или для сравнения с другим результатом измерения.
Предложенное устройство было реализовано для анализа биологических микрочипов с красителями Су5 и Су3.
В качестве лазерных источников возбуждения люминесцентного излучения были использованы полупроводниковые лазерные диоды с длинами волн 532 нм и 650 нм. Узел держателя образца состоит из рамки, прижима и пружины для фиксации биологических микрочипов и калибровочной пластины. Калибровочная пластина представляет собой стекло предметное ГОСТ 9284-75, покрытое красителем Су5 или эмалью ПФ-115 белой ГОСТ 6465-76. Набор светофильтров включает в себя фильтры на длины волн 570±10 нм для красителя Су3. модель DDC-t570/10 ООО «Фотооптик», 670±10 для красителя Су5, модель 14IF55-670-10 производства Standa, нейтральный фильтр 14 NDF-15-1 производства Standa. Использованы дихроичное зеркало модели 140-1-W57-45-2 производства Standa, объектив модели «Т-55» производства «ЛОМО». Поворотное зеркало использовано с внешним отражением, имеющее напыление из алюминия на стеклянной подложке. Регистрация проводилась матричным фотоприемником OV5647 фирмы Omni Vision (2592×1944 точки) с блоком обработки сигнала Raspberry Pi2B фирмы Raspberry Pi.
Таким образом, использование в предлагаемом устройстве калибровочной пластины и проведение самоконтроля перед проведением измерений обеспечивает увеличение повторяемости и точности измерений устройства для считывания биологических микрочипов по сравнению с прототипом.