ИНКУБАЦИОННАЯ СИСТЕМА ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗОВ

Предлагаемая полезная модель относится к медицинской технике, а именно к устройствам, обеспечивающим поддержание жизнеспособности переживающих срезов биологических объектов при проведении их исследований. Система была разработана сотрудниками ФГБУ науки Института физиологии им. И.П.Павлова РАН при фотометрической оценке реакций переживающих срезов мозга лабораторных животных.
При изучении свойств биообъектов используют методы морфологической диагностики состояния срезов тканей этих объектов, базирующиеся на сопоставлении контрольного и опытного образцов, находящихся в одинаковых условиях, или сопоставлении одинаковых образцов, находящихся в различных условиях. Одним из важных условий получения достоверной информации о состоянии объектов является проведение исследований в конкретный период онтогенеза, при котором необходимо одновременное изучение свойств сопоставляемых препаратов.
Однако, как показали результаты патентного поиска в исследуемой области, к настоящему времени созданы устройства указанного назначения, позволяющие проводить только последовательное исследование свойств препаратов. Основными элементами известных устройств являются узлы, обеспечивающие размещение и фиксацию исследуемого препарата в инкубационной среде; регулирование уровня инкубационной жидкости; стабильность заданной температуры раствора; насыщение раствора кислородом (или карбогеном).
Известна, например, камера для инкубирования переживающих срезов мозга (см. а.с. SU №1602538, МКИ A61M 1/00, опубл. 30.10.1990), содержащая: рабочий и теплообменный резервуары, подающие трубки, сточную емкость, оптические стекла, подставочную сетку, зажимные цилиндрические кольца, распределитель-регулятор, термостат, источник и распылители газовой смеси.
Известна также инкубационная система по пат. RU на полезную модель №81199, МПК C12M 1/00, опубл. 10.03.2009, содержащая односекционную инкубационную камеру, трубку для подачи в нее физраствора и отводящую трубку для отработанного физраствора, узел подачи в камеру кислорода, водяную баню, крышку с отверстием над рабочей зоной камеры, а также узлы контроля в камере температуры, уровня жидкости и кислорода.
В качестве прототипа предлагаемого решения выбрана стандартная инкубационная система с камерой, рассчитанной на инкубацию одного среза мозга. Система описана в кн. Митюшова М.И. «Переживающий срез мозга как объект нейрофизиологического и нейрохимического исследования». - Л.: Наука, 1986, С.40-43.
Известная инкубационная система содержит односекционную рабочую камеру (резервуар), внутри которой фиксируется с помощью нейлоновой сетки исследуемый препарат. Через трубки подачи и откачивания инкубационной среды, камера соединяется соответственно с резервуаром с инкубационным раствором и сборным резервуаром. Под камерой размещена водяная баня с термоэлементом и осветительный прибор. Для изготовления камеры и водяной бани могут быть использованы органическое стекло, полиэтилен, фторопласт или другие пластические материалы. Это связано с тем, что они не обладают токсичностью, легко обрабатываются и прозрачны для светового потока. Объем рабочей камеры описываемого вида выбирается опытным путем от 1 до 10 мл в зависимости от задачи исследования и размеров срезов.
Система работает следующим образом.
Из резервуара с инкубационной жидкостью по трубке подачи жидкость втекает в рабочую камеру. При этом она нагревается до необходимой температуры и насыщается карбогеном с помощью узлов термостабилизации и аэрации соответственно. Омывая срез, расположенный на нейлоновой сетке, жидкость через трубку откачивания перистальтическим насосом подается в сборный резервуар.
Общим недостатком известных аналогов, в том числе и прототипа, является невозможность проведения с их помощью одновременного исследования контрольных и интактных пар микроскопируемых препаратов в одной или как минимум в 2-х различных средах. Во всех приведенных системах для исследования сопоставляемых препаратов поступают следующим образом: измеряют необходимые характеристики на группе объектов, затем меняют инкубационную среду и опять измеряют те же самые характеристики. В фармакологических экспериментах на инкубируемых срезах мозга различие во времени, и связанные с ним инертность диффузионных процессов в камере, многофазность реагирования объекта на вещество и многие другие факторы могут существенно исказить окончательный результат.
Заявляемое устройство позволяет получить новый по сравнению с прототипом технический результат, заключающийся в повышении достоверности проводимых исследований за счет обеспечения возможности одновременного исследования нескольких пар микроскопируемых препаратов в одинаковых или различных условиях. Для достижения указанного технического результата при проведении исследований препаратов в одинаковой среде в инкубационной системе для микроскопических исследований переживающих срезов, (содержащей, так же как и прототип, рабочий резервуар, внутри которого фиксируются с помощью узла фиксации исследуемые препараты, и размещенную под ним водяную баню, при этом рабочий резервуар через трубки притока и оттока инкубационной среды и перистальтический насос соединен соответственно с выходами и входами резервуара с инкубационной средой, а через трубку подачи газа - с резервуаром аэрации, в свою очередь рабочий резервуар установлен под объективом микроскопа с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости), в отличие от прототипа рабочий резервуар разделен непроницаемой перегородкой на две одинаковых секции, при этом каждая секция снабжена отдельными трубками притока и оттока инкубационного раствора и подачи газа. Для обеспечения возможности проведении исследований препаратов в различных средах инкубационная система содержит дополнительный резервуар с инкубационной средой, соединенный соответственно со второй секцией рабочего резервуара. Для предотвращения распространения света вглубь инкубационной среды рабочий резервуар выполнен из светопоглощающего химически инертного материала. Для обеспечения возможности визуального или автоматизированного позиционирования исследуемой зоны под объективом микроскопа узел фиксации в каждой из двух секций выполнен в виде прижимной рамки с сеткой, на которую нанесены реперные отметки. Для создания оптимальных условий проведения исследований система выполнена с возможностью обеспечения скорости протока инкубационной жидкости в пределах 1,4-1,6 мл/мин при объеме рабочего резервуара 1,9-2,1 мл.
Сущность предлагаемой полезной модели заключается в возможности создания двух изолированных друг от друга проточных инкубационных сред одинакового или различного химического состава для двух групп переживающих срезов, причем обе группы доступны для сканирования контактным световым микроскопом. Такое решение позволяет разместить попарно-симметрично, поверхностями общего среза, обращенными к объективу микроскопа до 6-ти пар последовательно изготовленных на микротоме срезов. При этом срезы, расположенные в одной секции могут служить контролем для соответствующих срезов второй секции, имеющей иные (экспериментальные) условия инкубации.
Таким образом, двухкамерная инкубационная система для нескольких пар срезов, наряду с обеспечением возможности их оптимальной для эксперимента укладки позволяет, во-первых, повысить продуктивность эксперимента и, во-вторых, одновременно анализировать и контрольную и экспериментальную группы идентичных срезов в одном эксперименте, что обеспечивает наилучшие условия для выделения сигнала из шума.
Сопоставление предлагаемого устройства с прототипом показало, что поставленная задача - повышение достоверности проводимых исследований за счет обеспечения возможности одновременного исследования нескольких пар микроскопируемых препаратов в одинаковых или различных условиях решается в результате новой совокупности признаков, что доказывает соответствие заявляемой полезной модели критерию «новизна».
Сущность технического решения поясняется чертежом, где на фиг.1 дано схематическое изображение предлагаемой системы.
Инкубационная система (фиг.1) состоит из рабочего резервуара 1, разделенного непроницаемой перегородкой 2 на две равных секции; подводов притока инкубационной жидкости 3 и аэрации 4; выводов оттока 5; узла поддержки и фиксации 6 (подложки и прижимной сетки с системой реперов); водяной бани 7; изоляции водяной бани 8; нагревающего элемента 9 (элемента Пельтье); термометра 10, соединенного с термореле 11 и нагревателем 9; индикатора нагрева 12; полости 13 для радиатора и отвода холода от Пельтье; препаратоводителя 14; узла фиксации рабочего резервуара с водяной баней 15; контактного микроскопа 16; узла питания системы термостабилизации водяной бани 17; перистальтического насоса 18 для подачи инкубационного раствора; резервуаров с инкубационными растворами 19; узла аэрации с баллоном и редуктором 20.
Систему монтируют следующим образом. Резервуар 1 объемом 1,9-2,1 мл устанавливают в герметичной алюминиевой термостабилизирующей камере - в бане 7, заполненной водой и оснащенной узлами 8-12, которые обеспечивают поддержание равных температурных условий инкубации всех срезов на уровне 37 град С. Собранный узел с помощью винтовой фиксации устанавливают на столике-препаратоводителе 14 микроскопа. Узел притока и оттока инкубационных растворов и аэрирующего газа, состоящий из системы капилляров, соединенных входными просветами с системой многоканального перистальтического насоса 18, а выходными с ячейками рабочего резервуара 1, обеспечивает непрерывную циркуляцию инкубационной жидкости. Объем секций рабочего резервуара 1, диаметр и длина капилляров и производительность перистальтического насоса 18 подобраны таким образом, чтобы создать ламинарный поток раствора со скоростью 1,4-1,6 мл/мин и затратить минимум времени на его проведение по системе капилляров. Полная высота инкубационной камеры вместе с устройством позиционирования оптимизирована, исходя из ограничений на величину подъема объектива контактного микроскопа. Узел поддержки и фиксации срезов в секциях рабочего резервуара выполнен в виде вкладываемых в них рамок, толщиной 0,5 мм, на каждой из которых по продольной оси закреплены две параллельные капроновые нити толщиной 80 мкм, делящие площадь между боковыми гранями рамки на 3 равные части и предназначенные для «поджатия» срезов и ограничения их возможных смещений. На нитях с интервалом 2 мм нанесены контрастные реперные точки, что обеспечивает возможность визуального или автоматизированного позиционирования исследуемой зоны при двухкоординатном перемещении камеры в фокальной плоскости объектива микроскопа. В качестве материала для изготовления рабочего резервуара может быть использован светопоглощающий, химически инертный и теплопроводный материал, например, черный поликарбонат, препятствующий нежелательному распространению света за пределы резервуара и между его ячейками.
При исследовании состояния переживающих срезов с помощью заявляемой системы срезы определенных отделов мозга (неокортекс, гиппокамп и др.) толщиной около 400 мкм, изготовленные по стандартным методикам на микротоме, разбивают на две группы и каждую группу размещают в отдельной секции рабочего резервуара попарно-симметрично, поверхностями одинакового среза в сторону объектива микроскопа. Условия инкубации позволяют поддерживать в срезах жизнеспособность и реактивность в течение нескольких часов. С помощью прижимной рамки 6 с нитями вся серия срезов в каждой секции фиксируется на подложке, причем реперная маркировка одной из двух или обеих прижимных нитей в каждой ячейки, попадая в поле зрения микроскопа, позволяет при выборе каждого из множества анализируемых микроучастков на срезах «запомнить» его координаты относительно ближайшего репера. Это создает возможность при повторных многократных сканированиях быстро отыскивать выбранные микроучастки исследуемой ткани, которые, обладая низкой естественной контрастностью, с трудом обнаруживались бы без использования указанной системы.
Как указывалось выше, заявляемая полезная модель была создана при разработке методики, позволяющей проводить фотометрическую оценку динамики уровня связанного кальция на переживающих срезах мозга лабораторных крыс в ответ на предъявление тестирующих реагентов, таких, как агонисты или антагонисты глутаматных рецепторов нервных клеток. Система была апробирована в лабораторных условиях и показала хорошие результаты, что позволяет сделать вывод о ее промышленной применимости.
Предложенная полезная модель может быть использована в физиологии и экспериментальной медицине.