СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ГЕМОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНАЗ
METHOD FOR OBTAINING BIOSPECIFIC HEMOSORBENT FOR ISOLATING PROTEINASE

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ. Гемосорбент используют для удаления протеолитических ферментов из водных растворов, включая кровь, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, бронхиальную астму и т.п.
Известен способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0.1-0.9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7.0-12.0% мас. акриламида и 0.5-1.1% мас. N,N'-метиленбисакриламида, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Авторское свидетельство СССР №1137388 A, G01N 33/50, Бюл. №4, 1985]. Емкость гемосорбента составляет 0.8-1.0 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.
Используемый овомукоид является ингибитором протеолитических ферментов и относится к классу гликопротеинов. Он имеет молекулярную массу 31000 и содержит 12.5% глюкозамина и 7.8% других сахаров. Его выделяют из белка утиных яиц по методике [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В., Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе, Биохимия, 1981. Т. 46. №3. С. 473-480]. Одна молекула овомукоида способна одновременно связать одну молекулу химотрипсина и две молекулы трипсина.
Этот гемосорбент под названием «Овосорб» находит практическое применение для удаления протеолитических ферментов из крови, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая общий гнойный перитонит, острый деструктивный панкреатит, обширные гнойно-некротические процессы мягких тканей, ожоговая болезнь, синдром сдавливания, синдром отторжения после трансплантации органов и тканей, лучевая болезнь, острая печеночная недостаточность, острая и хроническая почечная недостаточность, бронхиальная астма и т.д. Овомукоид эффективно связывает трипсин, химотрипсин, катепсин, панкреатическую и нейтрофильную эластазы, а также бактериальные протеиназы, не изменяя концентрации предшественников и ингибиторов этих ферментов. Клинические данные свидетельствуют о высокой эффективности антипротеиназного биоспецифического гемосорбента «Овосорб» в коррекции нарушений белкового метаболизма и связанных с ними системных нарушений. Селективно удаляя из гемоциркуляции активные формы протеиназ, «Овосорб» в отличии от угольных гемосорбентов не обладает свойством неспецифической сорбции ингибиторов протеиназ и других индивидуальных белков плазмы. Одновременно уменьшается выраженность функциональных нарушений основных органов и систем жизнеобеспечения, происходит нормализация метаболических процессов поддержания гомеостаза в целом.
Недостатком известного способа является невысокая тромборезистентность гемосорбента. Время свертывания крови при контакте с гемосорбентом составляет 5-7 минут.В связи с этим, для предотвращения свертывания крови в процессе проведения операции гемосорбции пациентам вводят антикоагулянт крови - гепарин, в количестве порядка 1.0 мг на 1 кг массы с последующей его нейтрализацией.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре водного раствора, содержащего 7.0-10.0% масс. акриламида, 0.1-0.9% масс. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 0.5-1.0% масс. N,N'-метиленбисакриламида и 0.01-0.08% масс. модифицирующей добавки с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Патент Российской Федерации №2484475. G01N 33/53. Бюл. №16. 2013].
В качестве модифицирующей добавки используют меркаптоуксусную кислоту, которая при полимеризации встраивается в полимерные цепи, обеспечивая повышение емкости гемосорбента до 1.75 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.
Недостатком известного способа является невысокая тромборезистентность гемосорбента. Время свертывания крови при контакте с гемосорбентом составляет 5-7 минут.
Задачей изобретения является повышение тромборезистентности гемосорбента.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение тромборезистентности гемосорбента.
Технический результат достигается тем, что в способе получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0% мас. акриламида и 0,5-1,1% мас. N,N'-метиленбисакриламида в присутствии 0.01-0.08% масс. модифицирующей добавки, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, в качестве модифицирующей добавки используют гирудин, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты.
Гирудин - полипептид, выделяемый из слюнных желез медицинских пиявок или получаемый рекомбинантным способом, состоит из 65 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 12000. Основная биологическая функция гирудина заключается в предотвращение свертывания крови за счет нейтрализации свертывающей активности тромбина при образовании комплекса тромбин-гирудин [Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin. // Methods in Enzymol. 1970. V. 19. P. 924-932]. Гирудин является антикоагулянтом прямого действия. В отличие от известного антикоагулянта крови - гепарина, он не вступает в реакцию с другими факторами системы свертывания крови и оказывает свое ингибирующее действие на тромбин без участия каких-либо находящихся в крови компонентов. В связи с этим, в последние годы этот препарат получил широкое распространение при лечении заболеваний или состояний, при которых гепаринотерапия оказывается недостаточно эффективной, например в остром периоде инфаркта миокарда, при нестабильной стенокардии и т.д.
Ацилирование гирудина проводят путем растворения 0.1 г гирудина в 50 мл бикарбонатного буфера при рН 8,0 и добавлением к раствору 0,1 мл хлорангидрида акриловой кислоты при перемешивании (4°С, 30 минут). Ацилированный гирудин выделяют путем лиофильного высушивания.
Ацилирование овомукоида проводят аналогичным способом.
Пример 1. В 89 мл дистиллированной воды при комнатной температуре и перемешивании растворяют 0.1 г овомукоида, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 8.0 г акриламида, 1.0 г N,N'-метиленбисакриламида и 0.01 г гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты. После полного растворения всех веществ в раствор добавляют катализатор: 0,08 г персульфата аммония и 0,08 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. Раствор вакуумируют при 10-12 мм рт.ст. и выдерживают при комнатной температуре (18-21°С) в течение 5 часов. Полученный гель извлекают из сосуда, измельчают продавливанием через сито с диаметром пор 1 мм и промывают бикарбонатным буфером с рН=8,0 до полного удаления непрореагировавших веществ. Полноту удаления контролируют спектрофотометрически.
Количество иммобилизованного в гемосорбенте овомукоида определяют по разнице между исходной концентрацией овомукоида и его концентрацией в промывных водах.
Для изучения емкости гемосорбента его помещают в колонку объемом 25 мл и через колонку пропускают водный раствор с рН 7,4 или плазму крови человека, содержащие 2,0 мг трипсина и 1,1 мг α-химотрипсина в 3.0 мл, до полного насыщения сорбента. Количество сорбированных ферментов определяют путем смывания их с колонки водным раствором с рН 1,5.
Для определения времени свертывания крови в стеклянной пробирке 2.0 г гемосорбента инкубируют с 5.0 мл крови и определяют время образования сгустка крови.
Состав исходного раствора и свойства сорбента приведены в таблице.
Примеры 2-7. Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества исходных соединений.
Состав исходных растворов и свойства сорбентов приведены в таблице.
Примеры 8-10 (контрольные). Процесс проводят по способу-прототипу без добавления гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты.
*- сорбция из водного раствора, рН=7,4
** - сорбция из плазмы крови человека
Из таблицы видно, что использование гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, который в процессе полимеризации встраивается в полимерные цепи гемосорбента, приводит к существенному повышению тромборезистентности гемосорбента. Время образования тромбинового сгустка при контакте гемосорбента с кровью увеличивается по сравнению с гемосорбентом, полученным по способу-прототипу, с 5-7 до 24-25 минут при сохранении эффективности связывания протеиназ иммобилизованным овомукоидом порядка 1.6-2.1 мг протеиназы на 1 мг овомукоида.
Предельные значения ацилированного гирудина в исходной смеси определяются тем, что при его концентрации ниже 0,01% мас. время свертывания крови увеличивается незначительно, а при повышении концентрации выше 0.08% время свертывания крови не изменяется.
Таким образом, предложенный способ позволяет получать биоспецифический гемосорбент, обладающий повышенной тромборезистентностью по сравнению с гемосорбентом, полученным по способу-прототипу.