СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АБСОЛЮТНОГО КОЛИЧЕСТВА ПОЛИПЕПТИДОВ, ПРИСУТСТВУЮЩИХ В НЕБОЛЬШОМ КОЛИЧЕСТВЕ, С ПРИМЕНЕНИЕМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
METHODS FOR DETERMINING THE ABSOLUTE AMOUNT OF POLYPEPTIDES PRESENT IN A SMALL AMOUNT USING MASS SPECTROMETRY

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на выдачу патента США №62/514587, поданной 2 июня 2017 г., раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники
В настоящем изобретении предусмотрены способы определения абсолютного количества полипептидов, присутствующих в небольшом количестве, посредством анализа с помощью жидкостной хроматографии/масс–спектрометрии (LC/MS) пептидных продуктов, полученных из простых или сложных смесей полипептидов.
Предпосылки изобретения
Многообразный ряд методов основе масс–спектрометрии (MS) для количественного определения полипептидов известен из уровня техники. Например, полипептиды можно количественно определять с применением методов, основанных на метаболизме (например,введение метки стабильного изотопа в клеточную культуру с помощью меченых аминокислот (SILAC)), методов на основе пептидных стандартов (например,мониторинг выбранных реакций (SRM) и мониторинг множественных реакций (MRM)) и методов на основе меток (например,тандемные массовые метки (TMT)). Эти способы имеют хорошо описанные в литературе недостатки, такие как ограниченные источники образца для SILAC, дорогие разработка и стоимость SRM и MRM и дополнительная обработка образца и выход значений относительного количества у методов на основе меток.
Методы количественного определения на основе MS без использования меток были разработаны для упрощения способов количественного определения полипептидов на основе MS и для преодоления некоторых из вышеуказанных ограничений. Однако существующие в настоящее время методы количественного определения без использования меток могут обладать недостатком, заключающимся в низкой точности и высокой вариабельности, и большинство методов без использования меток могут обеспечивать только отношение относительного количества между двумя или более образцами (например,спектральный подсчет).
et al.
Mol Cell Proteomics
Один подход к определению абсолютного количества белков на основе MS без использования меток предусматривает применение белкового стандарта для создания одноточечного калибровочного измерения, которое применяют для последующих анализов с помощью масс–спектрометрии для определения абсолютного количества других белков. J. C. Silva , , 5, 144–56, 2006; патент США №8271207. Однако применение одноточечной калибровки и различия, образованные в результате отличных ферментативных расщеплений образца и белкового стандарта, могут быть основными источниками вариабельности количественного определения для данного способа.
Таким образом, в данной области техники существует необходимость в улучшенных методах определения абсолютного количества на основе MS без использования меток, которые являются чувствительными, точными и достоверными и могут применяться для широкого диапазона образцов полипептидов высокопроизводительным образом.
Все литературные источники, цитируемые в данном документе, в том числе патентные заявки и публикации, включены с помощью ссылки во всей своей полноте.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предусмотрены способы определения абсолютного количества без использования меток для полипептидов, присутствующих в небольшом количестве, в образце, содержащем другой полипептид, присутствующий в относительно большом количестве. Например, в настоящем изобретении предусмотрены способы количественного определения белков клетки–хозяина, присутствующих в небольшом количестве, в системе клеточных культур или полученного из них продукта, содержащего клетку–хозяина, способную давать рекомбинантный полипептид, такой как терапевтический полипептид. В способах применяют концентрирование и сигналы MS пептидного продукта, полученного из полипептида, присутствующего в большом количестве, и сигналы MS пептидного продукта, полученного из полипептида, присутствующего в небольшом количестве, для расчета абсолютного количества полипептида, присутствующего в небольшом количестве.
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид, где первый полипептид присутствует в количестве, которое в по меньшей мере 10 раз меньше, чем количество второго полипептида, при этом способ включает (a) проведение анализа пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, при нескольких значениях количества загруженного образца с применением метода жидкостной хроматографии/масс–спектрометрии (LC/MS) с получением сигналов MS ионов пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, при каждом из нескольких значений количества загруженного образца, где несколько значений количества загруженного образца предусматривают первое количество загруженного образца и второе количество загруженного образца, и при этом первое количество загруженного образца больше, чем второе количество загруженного образца; (b) расчет среднего значения или суммы значений сигналов MS для (i) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); (ii) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); (iii) среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и (iv) среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и рассчитывают с применением среднего значения или все из них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS; и (c) определение абсолютного количества первого полипептида при первом количестве загруженного образца на основе следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)],
или ее математических эквивалентов.
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид, где первый полипептид присутствует в количестве, которое в по меньшей мере 10 раз меньше, чем количество второго полипептида, при этом способ включает (a) получение сигналов MS ионов пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, причем указанные сигналы MS ионов пептидных продуктов получают путем проведения анализа пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, с применением метода жидкостной хроматографии/масс–спектрометрии (LC/MS), причем сигналы MS пептидных продуктов получают для каждого из нескольких значений количества загруженного образца, предусматривающих первое количество загруженного образца и второе количество загруженного образца, и при этом первое количество загруженного образца больше, чем второе количество загруженного образца; (b) расчет среднего значения или суммы значений сигналов MS для (i) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); (ii) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); (iii) среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и (iv) среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и рассчитывают с применением среднего значения или все из них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS; и (c) определение абсолютного количества первого полипептида при первом количестве загруженного образца на основе следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)],
или ее математических эквивалентов.
В некоторых вариантах осуществления среднее значение сигнала MS применяют для определения абсолютного количества первого полипептида.
В некоторых вариантах осуществления сумму значений сигналов MS применяют для определения абсолютного количества первого полипептида.
В некоторых вариантах осуществления средний набор подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, выбирают на основе погрешности количественного определения подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при нескольких значениях количества загруженного образца или первом количестве загруженного образца и/или втором количестве загруженного образца.
m
n
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы осуществления выбора набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид присутствует в количестве, которое в по меньшей мере 10 раз меньше, чем количество второго полипептида, при этом способ включает (a) проведение анализа пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, при нескольких значениях количества загруженного образца с применением метода жидкостной хроматографии/масс–спектрометрии (LC/MS) с получением сигналов MS ионов пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, при каждом из нескольких значений количества загруженного образца, причем несколько значений количества загруженного образца предусматривают первое количество загруженного образца и второе количество загруженного образца, и при этом первое количество загруженного образца больше, чем второе количество загруженного образца; и (b) осуществление выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при этом средний набор подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, выбирают на основе погрешности количественного определения подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при нескольких значениях количества загруженного образца или первом количестве загруженного образца и/или втором количестве загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают осуществления выбора верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца.
В некоторых вариантах осуществления каждый верхний набор подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов отличается от каждого среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов.
В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой интенсивность ионизации, или высоту пика, или площадь пика, или объем пика.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают получение образца.
В некоторых вариантах осуществления образец был очищен или обогащен. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают осуществление обработки нескольких полипептидов в образце с получением пептидных продуктов. В некоторых вариантах осуществления обработка образца включает одно или несколько из следующего: (a) центрифугирование образца с выделением нескольких полипептидов; (b) осуществление очистки нескольких полипептидов в образце; (c) удаление из образца компонентов, несовместимых с последующими обработкой и анализом с помощью масс–спектрометрии; (d) расщепление нескольких полипептидов с получением пептидных продуктов и (e) осуществление очистки пептидных продуктов.
В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS предусматривает разделение пептидных продуктов посредством метода жидкостной хроматографии.
В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS предусматривает обработку полученных сигналов MS пептидных продуктов.
В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS дополнительно предусматривает одно или несколько из следующего: (a) идентификация пептидных продуктов по аминокислотной последовательности; (b) идентификация первого полипептида по белковому идентификатору и (c) идентификация одного или нескольких из нескольких полипептидов по белковому идентификатору.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают определение абсолютного количества второго полипептида.
В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой белок клетки–хозяина или биомаркер. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид присутствует в количестве, которое в по меньшей мере 100 раз меньше, чем количество второго полипептида.
В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой рекомбинантный полипептид, продуцируемый клеткой–хозяином, или терапевтический полипептид, или сывороточный альбумин. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид экспрессируется из вектора, трансфицированного в клетку–хозяина, такую как клетка–хозяин млекопитающего, такая как клетка яичника китайского хомячка (CHO).
В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец клеточной культуры, или образец крови или сыворотки, или фармацевтический продукт или его промежуточное вещество.
В некоторых вариантах осуществления пептидные продукты, полученные из нескольких полипептидов, в образце получают посредством расщепления образца перед проведением анализа пептидных продуктов с применением метода LC/MS. В некоторых вариантах осуществления пептидные продукты представляют собой триптические пептидные продукты, полученные из нескольких полипептидов.
В некоторых вариантах осуществления несколько значений количества загруженного образца предусматривают значения количества загруженного образца, находящиеся в диапазоне приблизительно 0,1–25 мкг общего белка. В некоторых вариантах осуществления первое количество загруженного образца составляет приблизительно 10 мкг общего белка. В некоторых вариантах осуществления второе количество загруженного образца составляет от приблизительно 0,5 мкг до 10 мкг, или от 3 мкг до 6 мкг, или 1 мкг, 2 мкг, 3 мкг, 4 мкг, 5 мкг или 6 мкг общего белка.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают осуществление выбора второго количества загруженного образца на основе сигналов MS для второго набора пептидных продуктов.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают осуществление выбора первого количества загруженного образца на основе сигналов MS для первого набора пептидных продуктов.
В некоторых вариантах осуществления каждое из нескольких значений количества загруженного образца характеризуется одинаковым общим объемом.
n
n
В некоторых вариантах осуществления  равняется 1 или больше, или  равняется 3.
m
m
В некоторых вариантах осуществления  равняется 1 или больше, или  равняется 3.
В некоторых вариантах осуществления средний набор подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученный из второго полипептида, выбирают на основе последовательностей каждого из пептидных продуктов.
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы обнаружения загрязняющего полипептида при получении терапевтического полипептида, при этом способ включает (a) получение образца, содержащего терапевтический полипептид; (b) определение наличия загрязняющего полипептида в образце; где определение наличия загрязняющего полипептида основано на определении абсолютного количества загрязняющего полипептида в образце с применением способов количественного определения, представленных в данном документе.
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены системы для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем первый полипептид и второй полипептид, при этом система содержит (a) масс–спектрометр; (b) компьютер, содержащий (c) энергонезависимый считываемый компьютером носитель, содержащий инструкции, хранящиеся на нем, которые при выполнении осуществляют обработку, включающую расчет среднего значения или суммы значений сигналов MS для (i) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); (ii) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); (iii) среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и (iv) среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и рассчитывают с применением среднего значения или все из них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS; и определение абсолютного количества первого полипептида при первом количестве загруженного образца на основе следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)],
или ее математических эквивалентов. В некоторых вариантах осуществления системы дополнительно содержат жидкостной хроматограф.
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены энергонезависимые считываемые компьютером носители, содержащие инструкции, хранящиеся на них, которые при выполнении осуществляют обработку для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем первый полипептид и второй полипептид, причем обработка включает расчет среднего значения или суммы значений сигналов MS для (i) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); (ii) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); (iii) среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и (iv) среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и рассчитывают с применением среднего значения или все из них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS; и определение абсолютного количества первого полипептида при первом количестве загруженного образца на основе следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)],
или ее математических эквивалентов.
Эти и другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания и приложенной формулы изобретения. Следует понимать, что один, несколько или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, можно комбинировать с получением других вариантов осуществления настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
фиг. 1
На  показана гистограмма площадей пиков MS для сорока наиболее распространенных ионов пептидных продуктов, наблюдаемых при анализе LC/MS образца, содержащего сфингомиелинфосфодиэстеразу (ASM), при различных значениях количества загруженного образца (количество загруженного образца на анализ LC/MS установлено в размере 1 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг, 7,5 мкг, 10 мкг, 12,5 мкг, 15 мкг, 18 мкг и 20 мкг, слева направо для каждого набора полос для пептидных продуктов). Средняя погрешность в процентах для каждого иона пептидного продукта при различных значениях количества загруженного образца показана над набором полос для пептидного продукта.
фиг. 2
2
На  показана суммарная площадь пиков среднего набора для трех пептидных продуктов (Middle–3; квадраты) и верхнего набора для трех пептидных продуктов (Top–3; ромбы) для шести точек концентрации. R для линейной регрессии пептидных продуктов из Middle–3 составляет 0,98, а для пептидных продуктов из Top–3 составляет 0,87.
фиг. 3A–3B
фиг. 3A
фиг. 3B
фиг. 3A
фиг. 3B
На  показано сравнение способов количественного определения Hi–3 () и Mid–3 () для четырех образцов (партия 1, партия 2, партия 3, партия 4, слева направо для каждого набора полос) при четырех различных вариантах анализа (вариант A, вариант B, вариант C, вариант D). Для способа Hi–3 () относительное стандартное отклонение составляло 82%, и для способа Mid–3 () относительное стандартное отклонение составляло 16%.
фиг. 4
На показана относительное количество 8 присутствующих в наибольшем количестве идентифицированных белков клетки–хозяина в различных производственных партиях терапевтического белка.
фиг. 5
На  показана относительное количество идентифицированных белков клетки–хозяина на стадиях процесса очистки для терапевтического белка.
Подробное описание изобретения
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В настоящем изобретении предусмотрены способы определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид, при этом способы включают определение абсолютного количества первого полипептида в образце на основе среднего значения или суммы значений сигналов MS для верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и  рассчитывают с применением среднего значения или все их них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид присутствует в меньшем количестве, чем второй полипептид в образце. В некоторых вариантах осуществления абсолютное количество первого полипептида определяют с помощью следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)].
Способы по настоящему изобретению также называются в данном документе Mid–3. При использовании в данном документе "подходящий в результате качественного определения", при ссылке на ионы, относится к ионам пептидных продуктов, которые являются подходящими для способов количественного определения, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления подходящие в результате качественного определения ионы пептидных продуктов не допускают ионы нетриптических пептидных продуктов или ионы пептидных продуктов с посттрансляционными модификациями.
et al.
.
n
Способы по настоящему изобретению, описанные в данном документе, обеспечивают, например, повышенную точность и воспроизводимость количественного определения полипептидов в большем динамическом диапазоне концентраций полипептидов в образце по сравнению со способами определения абсолютного количества без использования меток, известными из уровня техники (например,Hi–3; J. C. Silva , выше) Без ограничения какой–либо теорией способы определения абсолютного количества без использования меток основаны на идее, что предполагая эквимолярное количество каждого из нескольких полипептидов в образце, средний сигнал детектора MS для верхних  наиболее распространенных ионов пептидного продукта, полученного из полипептида, подобен для каждого из нескольких полипептидов (т. е.концентрация пептидного продукта коррелирует с сигналом детектора). Таким образом, количество полипептида с неизвестной концентрацией можно определить путем сравнения со стандартным полипептидом с известной концентрацией. Однако применение наиболее распространенных ионов пептидных продуктов, полученных из стандартного полипептида, для определения абсолютного количества может привести к низкой точности и плохой воспроизводимости. Например, неточность количественного определения может возникать из–за наблюдения нелинейного поведения для присутствующих в наибольшей концентрации ионизированных пептидных продуктов из–за насыщения детектора MS. Кроме того, такие способы могут основываться на применении добавок с известным количеством стандартного полипептида или анализе известного количества образца стандартного белка при анализе LC/MS отдельно от образца, содержащего полипептид с неизвестной концентрацией. Оба подхода могут приводить к снижению точности количественного определения и повышению вариабельности. Например, обеспечение воспроизводимости при отборе аликвот известного количества стандартного полипептида для любого количества образцов может быть трудным, и калибровка расчета количественного определения на основе стандартного полипептида, который расщепляют с помощью ферментативной реакции отдельно от образца, содержащего неизвестный полипептид, может создавать дополнительную вариацию в зависимости от степени завершения расщепления.
n
В настоящем изобретении предусмотрены способы количественного определения, в которые интегрированы элементы для достижения улучшенной точности и воспроизводимости количественного определения полипептида. Во–первых, в способах определения абсолютного количества по настоящему изобретению используют преимущества систем отбора образцов полипептидов, предусматривающие полипептид с известной концентрацией и присутствующий в большом количестве по сравнению с другими полипептидами в образце (например,терапевтический белок в промышленном образце или альбумин в образце сыворотки) и не требуют сравнения с добавленным в виде добавки или отдельно анализируемым стандартным полипептидом. Во–вторых, в способах определения абсолютного количества по настоящему изобретению используют измерения MS при двух концентрациях, чтобы избежать насыщения детектора MS верхними ионами пептидного продукта, полученного из полипептида, присутствующего в большом количестве. В–третьих, в способах определения абсолютного количества по настоящему изобретению дополнительно используют средний набор ионов пептидного продукта со сниженной погрешностью количественного определения по сравнению с верхними пептидами со снижением общей погрешности количественного определения. Преимущества способов по настоящему изобретению продемонстрировали в непосредственном сравнении со способом определения абсолютного количества без использования меток, известным из уровня техники (т. е.Hi–3). Например, как показано в примере 2, в рядах анализов и образцов способы, раскрытые в настоящем изобретении, обеспечивают достижение 16% относительного стандартного отклонения, тогда как способ Hi–3 характеризовался 82% относительным стандартным отклонением.
,
n
n
m
Как обсуждается более подробно ниже, в настоящем изобретении предусмотрены способы, пригодные для определения абсолютного количества на основе MS без использования меток полипептидов, присутствующих в небольшом количестве (например,первого полипептида), с применением информации от другого полипептида (напримервторого полипептида), который характеризуется известной концентрацией и более высоким относительным количеством, чем полипептиды, присутствующие в небольшом количестве, при этом способы включают любое одно или несколько из следующего: (a) осуществление изучения загрузки с определением двух концентраций загруженного образца, при которых данные получают и/или анализируют для количественного определения полипептидов, присутствующих в небольшом количестве (например,первое количество загруженного образца и второе количество загруженного образца); (b) осуществление выбора подходящих в результате качественного определения ионов пептидного продукта для количественного определения полипептида (например,верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, и средний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида) и (c) определение абсолютного количества полипептида, присутствующего в небольшом количестве, с применением сигналов MS (например,сигналов MS пептидных продуктов, полученных из первого полипептида и второго полипептида).
Осуществление изучения загрузки с определением первого количества загруженного образца и второго количества загруженного образца.
n
m
В настоящем изобретении предусмотрены способы осуществления изучения загрузки образца в необходимом динамическом диапазоне анализа. Информация о сигналах MS, полученная при изучении загрузки, позволяет, например, выбирать первое количество загруженного образца, причем пептидные продукты, полученные из первого полипептида, являются обнаружимыми (первый полипептид характеризуется низким количеством относительно второго полипептида), выбирать второе количество загруженного образца, причем верхнее  число подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, присутствующих в наибольшем количестве, полученных из второго полипептида, не насыщают детектор MS, и выбирать первое количество загруженного образца и второе количество загруженного образца, причем средний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, демонстрирует сниженную погрешность количественного определения (т. е.повышенный линейный характер относительно ионов пептидных продуктов, присутствующих в наибольшем количестве).
В некоторых вариантах осуществления способы включают проведение анализа пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, при нескольких значениях количества загруженного образца с применением метода жидкостной хроматографии/масс–спектрометрии (LC/MS) с получением сигналов MS ионов пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, при каждом из нескольких значений количества загруженного образца, где несколько значений количеств загруженного образца предусматривают первое количество загруженного образца и второе количество загруженного образца, и при этом первое количество загруженного образца больше, чем второе количество загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой интенсивность ионизации. В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой высоту пика. В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой площадь пика. В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой объем пика.
В некоторых вариантах осуществления информация, полученная при изучении загрузки, может применяться для последующих анализов образцов для количественного определения полипептида (например,выбора 2 количеств загруженного образца для дополнительных анализов образцов посредством метода LC/MS).
В некоторых вариантах осуществления несколько значений количества загруженного образца предусматривают по меньшей мере 2 значения количества загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления несколько значений количества загруженного образца предусматривают 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 значений количества загруженного образца.
Значения количества загруженного образца могут изменяться в зависимости от используемого оборудования для LC/MS (например,на основе емкости загрузки хроматографической колонки). В некоторых вариантах осуществления несколько значений количества загруженного образца предусматривают значения количества загруженного образца, находящиеся в диапазоне от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 100 мкг, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 75 мкг, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 50 мкг, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 40 мкг, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 30 мкг, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 20 мкг, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 15 мкг, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 10 мкг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 30 мкг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 20 мкг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 15 мкг или от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мкг.
В некоторых вариантах осуществления количество загруженного образца составляет приблизительно 0,5 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 1,5 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 2,5 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 3,5 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 4,5 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 5,5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 6,5 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 7,5 мкг, приблизительно 8 мкг, приблизительно 8,5 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 9,5 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 10,5 мкг, приблизительно 11 мкг, приблизительно 11,5 мкг, приблизительно 12 мкг, приблизительно 12,5 мкг, приблизительно 13 мкг, приблизительно 13,5 мкг, приблизительно 14 мкг, приблизительно 14,5 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 16 мкг, приблизительно 17 мкг, приблизительно 18 мкг, приблизительно 19 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 21 мкг, приблизительно 22 мкг, приблизительно 23 мкг, приблизительно 24 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг или приблизительно 30 мкг.
В некоторых вариантах осуществления несколько значений количества загруженного образца предусматривают первое количество загруженного образца и второе количество загруженного образца, где первое количество загруженного образца составляет приблизительно 10 мкг, и при этом второе количество загруженного образца составляет от приблизительно 0,5 мкг до 10 мкг, или от 3 мкг до 6 мкг, или 1 мкг, 2 мкг, 3 мкг, 4 мкг, 5 мкг или 6 мкг.
В некоторых вариантах осуществления первое количество загруженного образца выбирают на основе сигналов MS пептидных продуктов, полученных из первого полипептида. В некоторых вариантах осуществления первое количество загруженного образца выбирают на основе сигналов MS пептидных продуктов, полученных из второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления первое количество загруженного образца выбирают на основе сигналов MS пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, и сигналов MS пептидных продуктов, полученных из второго полипептида.
В некоторых вариантах осуществления второе количество загруженного образца выбирают на основе сигналов MS пептидных продуктов, полученных из второго полипептида.
В некоторых вариантах осуществления последующие количества загруженного образца, анализируемые при изучении загрузки, основаны на данных от ранее анализируемого количества загруженного образца.
Объем для каждого количества загруженного образца может зависеть от используемого оборудования для LC/MS (например,на основе размера пробоотборной петли). В некоторых вариантах осуществления каждое из нескольких значений количества загруженного образца характеризуется одинаковым общим объемом. В некоторых вариантах осуществления объем каждого из нескольких значений количества загруженного образца составляет от приблизительно 1 мкл до приблизительно 60 мкл, от приблизительно 10 мкл до приблизительно 60 мкл, от приблизительно 20 мкл до приблизительно 50 мкл или от приблизительно 30 мкл до приблизительно 50 мкл. В некоторых вариантах осуществления объем каждого из нескольких значений количества загруженного образца является одинаковым и составляет от приблизительно 1 мкл до приблизительно 60 мкл, от приблизительно 10 мкл до приблизительно 60 мкл, от приблизительно 20 мкл до приблизительно 50 мкл или от приблизительно 30 мкл до приблизительно 50 мкл. В некоторых вариантах осуществления объем каждого из нескольких значений количества загруженного образца составляет приблизительно 5 мкл, 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл, 25 мкл, 30 мкл, 35 мкл, 40 мкл, 45 мкл, 50 мкл, 55 мкл или 60 мкл.
Осуществление выбора подходящих в результате качественного определения ионов пептидного продукта, полученного из первого полипептида и второго полипептида.
n
n
m
В настоящем изобретении предусмотрены способы осуществления выбора наборов подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид присутствует в меньшем количестве, чем второй полипептид. Например, в настоящем изобретении предусмотрены способы осуществления выбора любого одного из верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, и среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида.
n
В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают осуществление выбора верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшим значением сигнала MS при первом количестве загруженного образца.
n
В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают осуществление выбора верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца.
n
n
n
n
Число идентифицируемых с помощью MS пептидных продуктов, полученных из полипептида, может изменяться в зависимости от концентрации и характеристик полипептида. В некоторых вариантах осуществления концентрация и характеристики первого полипептида могут приводить к идентификации ограниченного числа пептидных продуктов при первом количестве загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления  равняется 1 или больше, причем  является целым числом. В некоторых вариантах осуществления  равняется 3. В некоторых вариантах осуществления  равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
n
n
В некоторых вариантах осуществления подходящие в результате качественного определения ионы пептидных продуктов с наивысшими значениями сигнала MS могут исключать ионы пептидных продуктов с определенными характеристиками, включая, например, пропущенные ферментативные расщепления, посттрансляционные модификации и наложение профилей элюирования при LC и изотопные распределения. Например, если образец расщепляется трипсином и пептидный продукт с наивысшим значением сигнала MS является нетриптическим пептидным продуктом, этот пептидный продукт может исключаться из выбора верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, или верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления подходящие в результате качественного определения ионы пептидного продукта с наивысшими значениями сигнала MS могут исключать ионы пептидных продуктов, полученные из частей полипептида, которые не присутствуют воспроизводимо как часть исходного полипептида (например,пептидный продукт, полученный из продукта расщепления полипептида, и, таким образом, может не присутствовать в образце при такой же концентрации как и исходный полипептид).
m
m
m
m
n
В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают осуществление выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, причем средний набор подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, выбирают на основе погрешности количественного определения подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при нескольких значениях количества загруженного образца или первом количестве загруженного образца и/или втором количестве загруженного образца. Как правило, каждый ион пептидного продукта в среднем наборе из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, выбирают на основе наличия наименьшей погрешности количественного определения относительно общего набора ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления каждый ион пептидного продукта из среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, характеризуется более низкой погрешностью количественного определения, чем ион пептидного продукта, присутствующего в наибольшем количестве, полученного из второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления ионы пептидных продуктов из среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, характеризуются более низкой погрешностью количественного определения, чем верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида с наивысшими значениями сигнала MS.
m
В некоторых вариантах осуществления подходящие в результате качественного определения ионы пептидных продуктов с наименьшей погрешностью количественного определения могут исключать ионы пептидных продуктов с определенными характеристиками, включая, например, пропущенные ферментативные расщепления, посттрансляционные модификации и наложение профилей элюирования при LC и изотопные распределения. Например, в некоторых вариантах осуществления, если образец расщепляется трипсином, и пептидный продукт с наименьшей погрешностью количественного определения является нетриптическим пептидным продуктом, данный пептидный продукт может исключаться из выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления подходящие в результате качественного определения ионы пептидного продукта с наивысшими значениями сигнала MS могут исключать ионы пептидных продуктов, полученные из частей полипептида, которые не присутствуют воспроизводимо как часть исходного полипептида (например,пептидный продукт, полученный из продукта расщепления полипептида, и, таким образом, может не присутствовать в образце при такой же концентрации как и исходный полипептид).
m
m
m
m
m
В некоторых вариантах осуществления осуществление выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, основано на погрешности количественного определения, полученной при изучении загрузки. В некоторых вариантах осуществления осуществление выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, основано на погрешности количественного определения, полученной от нескольких значений количества загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления погрешность количественного определения представляет собой среднюю погрешность в процентах для нескольких значений количества загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления осуществление выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, основано на погрешности количественного определения, полученной от первого количества загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления осуществление выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, основано на погрешности количественного определения, полученной от второго количества загруженного образца. В некоторых вариантах осуществления осуществление выбора среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, основано на погрешности количественного определения, полученной от первого количества загруженного образца и второго количества загруженного образца.
m
m
m
m
В некоторых вариантах осуществления  равняется 1 или больше, причем  является целым числом. В некоторых вариантах осуществления  равняется 3. В некоторых вариантах осуществления  равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
n
m
n
m
n
m
n
m
n
m
В некоторых вариантах осуществления  равняется . В некоторых вариантах осуществления  не равняется . В некоторых вариантах осуществления  и  равняются 2 или больше, причем  и  являются целыми числами. В некоторых вариантах осуществления  и  равняются 3.
В некоторых вариантах осуществления каждый из верхних наборов подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, отличается от каждого из средних наборов подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления подходящий в результате качественного определения ион пептидного продукта является членом верхнего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, и среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида.
В некоторых вариантах осуществления подходящий в результате качественного определения ион пептидного продукта содержит карбамидометилированный цистеин. В некоторых вариантах осуществления подходящий в результате качественного определения ион пептидного продукта содержит карбоксиметилированный цистеин.
Определение абсолютного количества полипептида для полипептидов, присутствующих в небольшом количестве
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В настоящем изобретении предусмотрены способы расчета абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид, при этом способы включают определение абсолютного количества первого полипептида в образце на основе среднего значения или суммы значений сигналов MS для верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и  рассчитывают с применением среднего значения или все из них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS.
В некоторых вариантах осуществления абсолютное количество первого полипептида определяют на основе следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)],
или ее математических эквивалентов.
A
B
C
D
A
B
C
D
В некоторых вариантах осуществления все из , ,  и  рассчитывают с применением среднего значения сигналов MS. В некоторых вариантах осуществления все из , ,  и  рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS.
В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой интенсивность ионизации. В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой высоту пика. В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой площадь пика. В некоторых вариантах осуществления сигнал MS представляет собой объем пика.
n
n
m
n
B
D
В некоторых вариантах осуществления верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS определяют предварительно. В некоторых вариантах осуществления верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS определяют предварительно. В некоторых вариантах осуществления средний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, определяют предварительно. В некоторых вариантах осуществления отношение верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца () и среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца () определяют предварительно.
n
A
n
B
m
C
D
В некоторых вариантах осуществления среднее значение или сумму значений сигналов MS для верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца () определяют из 2 анализов с помощью LC/MS образца. В некоторых вариантах осуществления выполняют дополнительные повторы анализов для 2 анализов с помощью LC/MS.
n
A
n
B
m
C
D
В некоторых вариантах осуществления среднее значение или сумму значений сигналов MS для верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца () определяют из 2 анализов с помощью LC/MS образца, где анализы с помощью LC/MS не являются частью изучения загрузки. В некоторых вариантах осуществления выполняют дополнительные повторы анализов для 2 анализов с помощью LC/MS.
В некоторых вариантах осуществления способ количественного определения предусматривает сигналы MS от двух или более полипептидов в известном количестве.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают определение абсолютного количества второго полипептида. Способы определения количества белка для второго полипептида включают, например, ELISA и вестерн–блоттинг.
n
A
n
Предполагается, что в одном анализе можно идентифицировать и количественно определить больше одного полипептида с неизвестной концентрацией с применением способов по настоящему изобретению. Например, в уравнении, раскрытом выше, верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца () можно заменить на верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из другого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца для расчета количества другого полипептида.
Образцы и получение образцов
Способы по настоящему изобретению являются пригодными для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид, причем первый полипептид присутствует в меньшем количестве, чем второй полипептид.
9
В некоторых вариантах осуществления первый полипептид присутствует в количестве, которое в по меньшей мере приблизительно 10 раз меньше, чем количество второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид присутствует в количестве, которое в по меньшей мере приблизительно 100 раз меньше, чем количество второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид присутствует в количестве, которое в по меньшей мере приблизительно 1000 раз меньше, чем количество второго полипептида. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид присутствует в количестве, которое от по меньшей мере приблизительно в 2 раза до приблизительно 1×10 раз меньше, чем количество второго полипептида. Например, первый полипептид присутствует в количестве, измеренном как одна часть на миллиард.
9
9
В некоторых вариантах осуществления второй полипептид присутствует в количестве в по меньшей приблизительно 10 раз большем, чем первый полипептид. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид присутствует в количестве в по меньшей приблизительно 100 раз большем, чем первый полипептид. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид присутствует в количестве в по меньшей приблизительно 1000 раз большем или в 1×10 раз большем, чем первый полипептид. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид присутствует в количестве от по меньшей приблизительно в 2 раза до приблизительно 1×10 раз большем, чем первый полипептид.
Методы получения образцов, необходимые для получения пептидных продуктов, полученных из нескольких полипептидов, в образце для анализа посредством методов LC/MS, известны из уровня техники.
В некоторых вариантах осуществления пептидные продукты, полученные из нескольких полипептидов, в образце получают посредством расщепления образца перед анализом пептидных продуктов с применением метода LC/MS. В некоторых вариантах осуществления расщепление образца включает ферментативное расщепление с применением протеазы. В некоторых вариантах осуществления ферментативное расщепление проводят с применением одного или нескольких из трипсина, Lys–C, IdeS, IdeZ, PNGазы F, термолизина, пепсина, эластазы, Arg–C, TEV, Glu–C, Asp–N и фактора Xa. В некоторых вариантах осуществления пептидные продукты, полученные из нескольких полипептидов, в образце представляют собой триптические пептидные продукты.
В некоторых вариантах осуществления расщепление образца включает химическое расщепление, такое как кислотный гидролиз.
В некоторых вариантах осуществления способы включают получение образца. Методы получения образцов для анализа с помощью LC/MS известны из уровня техники и включают, например, забор ткани (например,крови, плазмы) и клеточную культуру.
В некоторых вариантах осуществления образец был очищен или обогащен. В некоторых вариантах осуществления способы включают осуществление обработки нескольких полипептидов в образце с получением пептидных продуктов. В некоторых вариантах осуществления осуществление обработки нескольких полипептидов в образце включает одно или несколько из (a) центрифугирования образца с выделением нескольких полипептидов; (b) очистки нескольких полипептидов в образце; (c) удаления из образца компонентов, несовместимых с последующей обработкой и анализом с помощью LC/MS; (d) расщепления нескольких полипептидов с получением пептидных продуктов и (e) очистки пептидных продуктов перед анализом с помощью LC/MS.
В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой белок клетки–хозяина. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой рекомбинантный полипептид, продуцируемый клеткой–хозяином. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой терапевтический полипептид, такой как антитело (например,рекомбинантное антитело), или фермент (например,рекомбинантный фермент), или пептид (например,инсулин). В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсид вирусной частицы (например, такой как предназначенный для генной терапии). В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец клеточной культуры. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой фармацевтический продукт или его промежуточное вещество.
В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой биомаркер, такой как циркулирующий биомаркер. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой сывороточный альбумин. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец крови или сыворотки.
Методы жидкостной хроматографии/масс–спектрометрии (LC/MS)
В настоящем изобретении рассмотрен разнообразный ряд методов LC/MS для создания тандемного масс–спектра образца, содержащего несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид.
В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS предусматривает разделение пептидных продуктов посредством метода жидкостной хроматографии. Методы жидкостной хроматографии, рассматриваемые в настоящей заявке, включают способы разделения полипептидов и методы жидкостной хроматографии, совместимые с методами масс–спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления метод жидкостной хроматографии предусматривает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления метод жидкостной хроматографии предусматривает метод ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления метод жидкостной хроматографии предусматривает метод жидкостной хроматографии с большим расходом. В некоторых вариантах осуществления метод жидкостной хроматографии предусматривает метод жидкостной хроматографии с низким расходом, такой как метод микропроточной жидкостной хроматографии или метод нанопроточной жидкостной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления метод жидкостной хроматографии предусматривает метод жидкостной хроматографии в режиме реального времени, соединенной с масс–спектрометром. В некоторых вариантах осуществления метод жидкостной хроматографии в режиме реального времени представляет собой метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления метод жидкостной хроматографии в режиме реального времени представляет собой метод ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии.
В некоторых вариантах осуществления методы капиллярного электрофореза (CE), или электрораспыление, или методы MALDI можно применять для введения образца в масс–спектрометр.
В некоторых вариантах осуществления метод масс–спектрометрии предусматривает метод ионизации. Методы ионизации, рассматриваемые в настоящей заявке, включают методы, способные придавать заряд полипептидам и пептидным продуктам. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления метод ионизации представляет собой ионизацию электрораспыления. В некоторых вариантах осуществления метод ионизации представляет собой ионизацию наноэлектрораспыления. В некоторых вариантах осуществления метод ионизации представляет собой химическую ионизацию под атмосферным давлением. В некоторых вариантах осуществления метод ионизации представляет собой фотоионизацию под атмосферным давлением. В некоторых вариантах осуществления метод ионизации представляет собой матрично–активированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI). В некоторых вариантах осуществления метод масс–спектрометрии включает метод ионизации методом электрораспыления, ионизации наноэлектрораспыления или матрично–активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI).
В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает анализ пептидных продуктов посредством метода масс–спектрометрии. Масс–спектрометры, рассматриваемые в настоящем изобретении, с которыми связан метод жидкостной хроматографии в режиме реального времени, включают масс–спектрометры с высоким разрешением и масс–спектрометры с низким разрешением. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой времяпролетный (TOF) масс–спектрометр. В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой квадрупольный времяпролетный (Q–TOF) масс–спектрометр. В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой времяпролетный (QIT–TOF) масс–спектрометр с квадрупольной ионной ловушкой. В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой ионную ловушку. В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр является одноквадрупольным. В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр является трехквадрупольным (QQQ). В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой орбитальную ионную ловушку. В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой квадрупольную орбитальную ионную ловушку. В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой масс–спектрометр ионного циклотронного резонанса с Фурье–преобразованием (FT). В некоторых вариантах осуществления масс–спектрометр представляет собой квадрупольный масс–спектрометр ионного циклотронного резонанса с Фурье–преобразованием (Q–FT). В некоторых вариантах осуществления метод масс–спектрометрии предусматривает режим определения положительных ионов. В некоторых вариантах осуществления метод масс–спектрометрии предусматривает режим определения отрицательных ионов. В некоторых вариантах осуществления метод масс–спектрометрии предусматривает метод времяпролетной (TOF) масс–спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления метод масс–спектрометрии предусматривает метод квадрупольной времяпролетной (Q–TOF) масс–спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления метод масс–спектрометрии предусматривает метод масс–спектрометрии подвижности ионов. В некоторых вариантах осуществления являются подходящими метод масс–спектрометрии с низким разрешением, такой как с применением ионной ловушки или одно– или трехквадрупольного подхода.
В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS предусматривает обработку полученных сигналов MS пептидных продуктов. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает обнаружение пика. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает определение интенсивности ионизации пептидного продукта. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает определение высоты пика пептидного продукта. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает определение площади пика пептидного продукта. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает определение объема пика пептидного продукта. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает идентификацию пептидных продуктов по аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает ручную проверку присвоений аминокислотных последовательностей пептидных продуктов. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает идентификацию первого полипептида по идентификатору белка. В некоторых вариантах осуществления метод LC/MS включает идентификацию одного или нескольких из нескольких полипептидов по идентификатору белка, который можно определить в поиске по базе данных или библиотечном поиске.
В некоторых вариантах осуществления идентификация пептидных продуктов от полипептида может достигаться с применением спектральных библиотек. Как правило, применение спектральных библиотек позволяет оценивать знания, собранные касательно системы полипептидов, и приводит к повышению скорости анализа данных и снижению погрешности.
Применение способов определения абсолютного количества
Способы определения абсолютного количества на основе MS без использования меток, раскрытые в данном документе, являются особенно подходящими для вариантов применения, включающих количественное определение полипептида, присутствующего в небольшом количестве, в образце, содержащем полипептид, присутствующий в небольшом количестве, и другой полипептид, присутствующий в относительно большом количестве. Способы определения абсолютного количества на основе MS без использования меток, раскрытые в данном документе, могут, например,составлять одну стадию в многостадийном способе, таком как количественное определение белка, присутствующего в небольшом количестве, при очистке терапевтического белка.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы обнаружения загрязняющего полипептида при получении терапевтического полипептида, при этом способы включают (a) получение образца, содержащего терапевтический полипептид; (b) определение наличия загрязняющего полипептида в образце, где определение наличия загрязняющего полипептида основано на определении абсолютного количества загрязняющего полипептида в образце с применением способов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок клетки–хозяина. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления в образце осуществляют обнаружение более одного загрязняющего полипептида (например,и общее количество загрязняющих полипептидов в образце количественно определяют). В одном варианте осуществления образец отбирают на различных стадиях в способе получения рекомбинантного полипептида (например,терапевтического полипептида) с проведением анализа чистоты рекомбинантного полипептида на различных стадиях. Более низкое определяемое количество загрязняющих полипептидов (например,полипептидов клетки–хозяина) будет указывать на большую чистоту рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы получения терапевтического полипептида, при этом способы включают (a) получение образца, содержащего терапевтический полипептид, со стадии способа производства, например,стадии сбора клеточной культуры или очистки; (b) идентификацию загрязняющего полипептида в образце; (c) определение уровня содержания загрязняющего полипептида в образце, где уровень содержания загрязняющего полипептида основан на определении абсолютного количества загрязняющего полипептида в образце с применением способов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок клетки–хозяина. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления в образце осуществляют обнаружение более одного загрязняющего полипептида (например,и общее количество загрязняющих полипептидов в образце количественно определяют). В одном варианте осуществления образец отбирают на различных стадиях в способе получения рекомбинантного полипептида (например,терапевтического полипептида) с проведением анализа чистоты рекомбинантного полипептида на различных стадиях. Более низкое определяемое количество загрязняющих полипептидов (например,полипептидов клетки–хозяина) будет указывать на большую чистоту рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы очистки терапевтического полипептида, при этом способы включают (a) получение образца, содержащего терапевтический полипептид, с одной или нескольких стадий способа очистки, например, стадии сбора клеточной культуры или очистки; (b) идентификацию загрязняющего полипептида в образце; (c) определение уровня содержания загрязняющего полипептида в образце на одной или нескольких стадиях способа очистки, при этом уровень содержания загрязняющего полипептида основан на определении абсолютного количества загрязняющего полипептида в образце с применением способов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок клетки–хозяина. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления в образце осуществляют обнаружение более одного загрязняющего полипептида (например, и общее количество загрязняющих полипептидов в образце количественно определяют). В одном варианте осуществления образец отбирают на различных стадиях в способе получения рекомбинантного полипептида (например, терапевтического полипептида) с проведением анализа чистоты рекомбинантного полипептида на различных стадиях. Более низкое определяемое количество загрязняющих полипептидов (например, полипептидов клетки–хозяина) будет указывать на большую чистоту рекомбинантного полипептида.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы обнаружения загрязняющего полипептида в продукте для генной терапии. Способы включают, например, (a) получение образца, содержащего вектор для генной терапии, с одной или нескольких стадий способа очистки, например,стадии сбора клеточной культуры или очистки; (b) идентификацию загрязняющего полипептида в образце; (c) определение уровня содержания загрязняющего полипептида в образце на одной или нескольких стадиях способа очистки, при этом уровень содержания загрязняющего полипептида основан на определении абсолютного количества загрязняющего полипептида в образце с применением способов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления продукт для генной терапии ассоциирован с вирусным белком, таким как капсид. В некоторых вариантах осуществления продукт для генной терапии содержит вирусный белок, такой как капсид. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии ассоциирован с вирусным белком, таким как капсид. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии является частью вирусной частицы, содержащей вирусный белок, такой как капсид. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок клетки–хозяина. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, который не ассоциирован с продуктом для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, который не является частью продукта для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок вируса–помощника. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления в образце осуществляют обнаружение более одного загрязняющего полипептида (например,и общее количество загрязняющих полипептидов в образце количественно определяют). В одном варианте осуществления образец отбирают на различных стадиях в ходе способа получения продукта для генной терапии с проведением анализа чистоты продукта для генной терапии на различных стадиях. Более низкое определяемое количество загрязняющих полипептидов (например,полипептидов клетки–хозяина) будет указывать на большую чистоту продукта для генной терапии.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы получения продукта для генной терапии. Способы включают, например, (a) получение образца, содержащего вектор для генной терапии, с одной или нескольких стадий способа очистки, например,стадии сбора клеточной культуры или очистки; (b) идентификацию загрязняющего полипептида в образце; (c) определение уровня содержания загрязняющего полипептида в образце на одной или нескольких стадиях способа очистки, при этом уровень содержания загрязняющего полипептида основан на определении абсолютного количества загрязняющего полипептида в образце с применением способов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления продукт для генной терапии ассоциирован с вирусным белком, таким как капсид. В некоторых вариантах осуществления продукт для генной терапии содержит вирусный белок, такой как капсид. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии ассоциирован с вирусным белком, таким как капсид. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии является частью вирусной частицы, содержащей вирусный белок, такой как капсид. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок клетки–хозяина. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, который не ассоциирован с продуктом для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, который не является частью продукта для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок вируса–помощника. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления в образце осуществляют обнаружение более одного загрязняющего полипептида (например,и общее количество загрязняющих полипептидов в образце количественно определяют). В одном варианте осуществления образец отбирают на различных стадиях в ходе способа получения продукта для генной терапии с проведением анализа чистоты продукта для генной терапии на различных стадиях. Более низкое определяемое количество загрязняющих полипептидов (например,полипептидов клетки–хозяина) будет указывать на большую чистоту продукта для генной терапии.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы очистки продукта для генной терапии. Способы включают, например, (a) получение образца, содержащего вектор для генной терапии, с одной или нескольких стадий способа очистки, например,стадии сбора клеточной культуры или очистки; (b) идентификацию загрязняющего полипептида в образце; (c) определение уровня содержания загрязняющего полипептида в образце на одной или нескольких стадиях способа очистки, при этом уровень содержания загрязняющего полипептида основан на определении абсолютного количества загрязняющего полипептида в образце с применением способов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления продукт для генной терапии ассоциирован с вирусным белком, таким как капсид. В некоторых вариантах осуществления продукт для генной терапии содержит вирусный белок, такой как капсид. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии ассоциирован с вирусным белком, таким как капсид. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии является частью вирусной частицы, содержащей вирусный белок, такой как капсид. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок клетки–хозяина. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, который не ассоциирован с продуктом для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой вирусный белок, который не является частью продукта для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления загрязняющий полипептид представляет собой белок вируса–помощника. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой вирусный белок, такой как капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления в образце осуществляют обнаружение более одного загрязняющего полипептида (например,и общее количество загрязняющих полипептидов в образце количественно определяют). В одном варианте осуществления образец отбирают на различных стадиях в ходе способа получения продукта для генной терапии с проведением анализа чистоты продукта для генной терапии на различных стадиях. Более низкое определяемое количество загрязняющих полипептидов (например,полипептидов клетки–хозяина) будет указывать на большую чистоту продукта для генной терапии.
В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, дополнительно включают регулирование протокола на основе наличия загрязняющего полипептида. Например, способ очистки можно регулировать на основе наличия идентифицированного и количественно определенного загрязняющего полипептида. Такие регулирования обеспечивают для способов увеличение чистоты целевого полипептида, такого как терапевтический полипептид.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения заболевания у субъекта, где субъект выбирают для лечения на основе количества биомаркера у субъекта. В некоторых вариантах осуществления биомаркер определяют количественно в образце сыворотки. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой биомаркер. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой сывороточный альбумин.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы оценки заболевания у субъекта, где субъекта оценивают на основе количества биомаркера у субъекта. В некоторых вариантах осуществления количество биомаркера определяют в образце сыворотки. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой биомаркер. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой сывороточный альбумин.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы диагностики заболевания у субъекта, где у субъекта диагностируют заболевание на основе количества биомаркера у субъекта. В некоторых вариантах осуществления количество биомаркера определяют в образце сыворотки. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид представляет собой биомаркер. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой сывороточный альбумин.
Системы
В настоящем изобретении предусмотрены системы и энергонезависимые считываемые компьютером носители, пригодные для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем несколько полипептидов, предусматривающих первый полипептид и второй полипептид.
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена система для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем первый полипептид и второй полипептид, при этом система содержит (a) масс–спектрометр; (b) компьютер, содержащий (c) энергонезависимый считываемый компьютером носитель, содержащий инструкции, хранящиеся на нем, которые при выполнении осуществляют обработку, включающую расчет среднего значения или суммы значений сигналов MS для (i) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); (ii) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); (iii) среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и (iv) среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и рассчитывают с применением среднего значения или все из них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS; и определение абсолютного количества первого полипептида при первом количестве загруженного образца на основе следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)],
или ее математических эквивалентов. В некоторых вариантах осуществления система дополнительно содержит жидкостной хроматограф.
n
A
n
B
m
C
D
A
B
C
D
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены энергонезависимый считываемый компьютером носитель, содержащий инструкции, хранящиеся на нем, которые при выполнении осуществляют обработку для определения абсолютного количества первого полипептида в образце, содержащем первый полипептид и второй полипептид, причем обработка включает расчет среднего или суммы значений сигналов MS для (i) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из первого полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при первом количестве загруженного образца (); (ii) верхнего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, с наивысшими значениями сигнала MS при втором количестве загруженного образца (); (iii) среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при первом количестве загруженного образца () и (iv) среднего набора подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, при втором количестве загруженного образца (), причем все из , ,  и рассчитывают с применением среднего значения или все из них рассчитывают с применением суммы значений сигналов MS; и определение абсолютного количества первого полипептида при первом количестве загруженного образца на основе следующей формулы:
A
C
D
[()/()] * (количество второго полипептида в молях при первом количестве загрузки) * [()/(B)],
или ее математических эквивалентов.
Специалисты в данной области техники поймут, что возможны несколько вариантов осуществления в пределах объема и сущности настоящего изобретения. Настоящее изобретение будет далее описано более подробно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Следующие примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение, но, конечно, не должны рассматриваться как ограничивающие его объем каким–либо образом.
Как применяется в данном документе, термин "полипептид" относится к полимеру, содержащему аминокислоты, ковалентно соединенные посредством пептидных связей. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой белок. В некоторых случаях белок содержит два или более полипептидов (например,мультимерный белок, гомомерный белок, мультибелковый комплекс). Полипептиды можно дополнительно модифицировать с помощью фрагментов, отличных от аминокислот. Например, полипептид может дополнительно содержать опосредованные ферментами модификации и/или химические модификации (например,ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинирование, формилирование, гликозилирование, окисление). Такие модификации могут возникать, например, в клеточных средах или как результат обработки образца и/или методик анализа.
Как применяется в данном документе, термин "пептидный продукт" относится к полимеру, содержащему две или более аминокислот, ковалентно соединенных посредством пептидных связей, полученных после обработки с разложением полипептида. Например, пептидные продукты получают после обработки с разложением полипептида, включающей химическое разложение (например,кислотный гидролиз) или ферментативное разложение (например,разложение с помощью трипсина). В некоторых вариантах осуществления пептидный продукт представляет собой триптический пептид. В некоторых вариантах осуществления пептидный продукт представляет собой концевой фрагмент большего полипептида. В некоторых вариантах осуществления пептидный продукт представляет собой внутренний фрагмент полипептида.
Термин "содержит" используют в данном документедля обозначения того, что другие компоненты, ингредиенты, стадии и т. д. необязательно присутствуют. Например, изделие,"содержащее" компоненты A, B и C, может состоять из (т. е.содержатьтолько) компонентов A, B и C или может содержать не только компоненты A, B и C, но такжеодин или нескольких других компонентов. Понятно, что "содержит" и его грамматические эквиваленты включают "состоящий из" или "состоящий по сути из".
Если представлен диапазон значения, понимается, что каждое промежуточное значение,до десятых долей единицы от нижнего предела, если контекст явно не указывает иное,между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим указанным или промежуточным значениемв этом указанном диапазоне, охватывается в настоящем изобретении с учетом любого специально исключенногопредела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны,исключающие любой или оба из этих включенных пределов, также включены в настоящее изобретение.
Ссылка на "приблизительно" в отношении значения или параметра в данном документе включает (и описывает) варианты, которые направлены на данное значение или параметр per se. Например, описание, относящееся к "приблизительно X", включает описание "X".
Как применяется в данном документе и в приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не указывает иное.
Примеры
Пример 1
Изучение загрузки ASM, демонстрирующее улучшенный линейный ответный сигнал MS среднего набора ионов пептидного продукта, полученного из ASM
В данном примере продемонстрировано изучение загрузки с применением образца, содержащего сфингомиелинфосфодиэстеразу (ASM), для выбора первого количества загруженного образца и второго количества загрузки. Кроме того, в данном примере показан улучшенный линейный ответный сигнал MS среднего набора ионов пептидного продукта, полученного из ASM, по сравнению с верхним набором ионов пептидного продукта, присутствующего в наибольшем количестве, полученного из ASM.
В трех повторах, образец ASM денатурировали, восстанавливали и алкилировали перед расщеплением с помощью LysC и трипсина. Анализ LC/MS проводили на подвергнутых расщеплению образцах весом 1 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг, 7,5 мкг, 10 мкг, 12,5 мкг, 15 мкг, 18 мкг и 20 мкг. Хроматографию проводили с помощью ACQUITY UPLC с колонкой 2,1 на 150 мм, заполненной материалом CSH130 C18 1,7 мкм. Данные получали с применением переменных сканов с низкой и повышенной энергией столкновений на Xevo Q–Tof G2–XS с генерированием информации об ионе–предшественнике и фрагментном ионе. Рассчитывали площади пиков MS и среднюю погрешность в процентах для каждого иона пептидного продукта по всему диапазону значений количества образца из 40 верхних ионов пептидных продуктов, присутствующих в наибольшем количестве, полученных из ASM.
фиг. 1
На  показана гистограмма площадей пиков MS для сорока наиболее распространенных ионов пептидных продуктов, наблюдаемых при анализе LC/MS образца, содержащего сфингомиелинфосфодиэстеразу (ASM), при различных значениях количества загруженного образца (количество загруженного образца на анализ LC/MS установлено в размере 1 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг, 7,5 мкг, 10 мкг, 12,5 мкг, 15 мкг, 18 мкг и 20 мкг, слева направо для каждого набора полос для пептида). Средняя погрешность в процентах для каждого иона пептидного продукта для всех значений количества загруженного образца показана над набором полос для пептида.
фиг. 1
Как показано на , пептидные продукты с наибольшей интенсивностью, полученные из ASM, характеризуются большей погрешностью относительно всех ионов пептидных продуктов, особенно при повышении общего количества образца. Пептиды в середине распределения ионов пептидного продукта характеризуются более линейным поведением и более низкой погрешностью относительно всех ионов пептидных продуктов, даже до значений общего количества загруженного образца, составляющего 20 мкг.
n
m
n
m
С применением данных, полученных при изучении загрузки, можно выбрать верхний набор из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида, и среднего набора из  числа подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из второго полипептида. Например, верхний набор из  числа, например 3, подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из ASM, может включать ионы пептидного продукта, выбранные из пептида A (z=4), пептида B (z=3) и пептида C (z=4). Средний набор из  числа, например 3, подходящих в результате качественного определения ионов пептидных продуктов, полученных из ASM, может включать ионы пептидного продукта, выбранные из пептида D (z=2), пептида M (z=4), пептида O (z=1), пептида M (z=3), пептида B (z=2), пептида L (z=2), пептида P (z=1) и пептида Q (z=1).
фиг. 2
2
Кроме того, с применением данных, собранных при изучении загрузки ASM, строили график зависимости суммарной площади пика от количества образца, загруженного в колонку (мкг), для каждого количества загруженного образца с применением верхнего набора из 3 ионов пептидных продуктов, присутствующих в наибольшем количестве (Top–3), и среднего набора из 3 ионов пептидных продуктов (Middle–3) (). Нелинейное поведение для набора пептидных продуктов Top–3 можно хорошо увидеть ниже оптимального количества загруженного образца (10 мкг). Набор пептидных продуктов Middle–3 имел линейное поведение при всех значениях количества загруженного образца в ходе изучении загрузки, таким образом демонстрируя, что ионы пептидных продуктов Middle–3 подходят для методик количественного определения по настоящему изобретению. R для линейной регрессии также улучшен при применении набора пептидных продуктов Middle–3 (0,98 для набора пептидных продуктов Middle–3 по сравнению с 0,87 для набора пептидных продуктов Top–3).
таблице 1
Погрешность в процентах для каждого набора пептидных продуктов при каждой концентрации относительно загрузки 2,5 мкг представлена в . Погрешность в процентах между ожидаемым отношением и наблюдаемым отношением для набора пептидных продуктов Middle–3 была ниже, чем для набора пептидных продуктов Top–3 для всех значений количества загруженного образца.
Таблица 1
. Погрешность в процентах набора пептидных продуктов Top–3 и набора пептидных продуктов Middle–3 при каждом количестве загруженного образца относительно 2,5 мкг загрузки набора пептидных продуктов.
Пример 2
Способы определения количества полипептидов
В данном примере продемонстрировано улучшение воспроизводимости количественного определения способа Mid–3 по сравнению со способом Hi–3, с применением четырех производственных партий белка для терапевтического белкового продукта, которые анализировали в четырех различных вариантах.
E. coli
Четыре производственные партии белка X (партия 1, партия 2, партия 3, партия 4) получали и анализировали, как описано в примере 1. Для способа Hi–3 200 фмоль стандартных пептидных продуктов, полученных из ClpB ( Chaperone ClpB), добавляли в виде добавки в каждый образец в качестве внутреннего стандарта.
фиг. 3A
При измерении с помощью способа Hi–3 наносили на график общее число ppm белка клетки–хозяина относительно количества добавленного в виде добавки пептидных продуктов, полученных из ClpB, для каждой партии продукционного белка (). Измерения количественного определения в способе Hi–3 характеризуются 82% относительным стандартным отклонением.
фиг. 3B
Для измерения с помощью способа Mid–3 наносили на график общее число ppm белка клетки–хозяина (HCP) для каждой производственной партии белка (). Измерения количественного определения в способе Mid–3 характеризуются 16% относительным стандартным отклонением.
Уравнение, применяемое для расчета количества полипептида для способа Mid–3, было следующим:
[(Суммарная площадь пика верхних 3 ионов пептидных продуктов, полученных из HCP, при высокой количественной загрузке образца)/(Суммарная площадь пика средних 3 ионов пептидных продуктов, полученных из терапевтического белкового продукта при высокой количественной загрузке образца)] * (количество терапевтического белкового продукта в фмолях при высокой количественной загрузке образца) * [(Суммарная площадь пика средних 3 ионов пептидных продуктов, полученных из терапевтического белкового продукта, при низкой количественной загрузке образца)/(Суммарная площадь пика верхних 3 ионов пептидных продуктов, полученных из терапевтического белкового продукта, при низкой количественной загрузке образца)].
Применение способа Hi–3 с 200 фмоль пептидов ClpB в качестве внутреннего стандарта обеспечивало большую погрешность по сравнению со способом Mid–3. Определение абсолютного количества было намного более воспроизводимым с применением способа Mid–3. Наибольшая вариабельность была обусловлена присутствием добавленного в качестве добавки внутреннего стандарта, хотя различия при ферментативном расщеплении также могли возникать. При 10 мкг в колонке средний набор пептидных продуктов был более подходящим для применения для количественного определения, поскольку они имели линейное поведение.
Пример 3
Применение способа количественного определения Mid–3 для обнаружения и отслеживания белков клетки–хозяина при очистке терапевтического белка
масса/заряд
В данном примере продемонстрировано применение способа количественного определения Mid–3, раскрытого в данном документе, для высокопроизводительного обнаружения и отслеживания загрязняющих белков клетки–хозяина (HCP) на нескольких стадиях в ходе способа очистки терапевтического белка, в том числе от образцов, собранных при сборе клеточной культуры, до образцов, собранных после конечного протокола обессоливания. В данном примере дополнительно продемонстрировано применение программного обеспечения для отслеживания пептидов, полученных из HCP, по времени удержания и значению  для количественного определения без использования меток HCP в образцах после очистки на последней стадии и применение поисков на основе спектральных библиотек для дополнительного улучшения производительности и оптимизации определения абсолютного количества.
Способы
E. coli
После получения терапевтического белка (белка X) на основе клеточной культуры образцы собирали при сборе клеточной культуры и на 5 стадиях способа очистки белка, в том числе образцов конечного лекарственного вещества. Применение трех повторов обеспечивало статистическую мощность для дальнейших измерений, в том числе данных о воспроизводимости и выходе. После сбора образцов образцы сбора культуры фильтровали через фильтр 3k MWCO Amicon Ultra–15 (EMD Millipore) согласно инструкциям изготовителя с концентрированием и удалением добавок, которые создают препятствия для масс–спектрометрического анализа, перед денатурацией и разложением с остальной частью образца. Вкратце, завершали стадию промывки водой устройств Amicon, а затем добавляли 400 мкг общего белка или терапевтического белка на образец с 50 мM бикарбонатом аммония (Ambic), добавленного сверху до общего объема 15 мл. Затем завершали промывку с помощью 15 мл 50 мM Ambic перед конечной стадией центрифугирования. Конечные концентрации измеряли как составляющие от 1,4 до 1,7 мг/мл общего белка или терапевтического белка. По три аликвоты каждого образца (от сбора культуры, отфильтрованной через Amicon, до лекарственного вещества (DS), а также продукт расщепления в качестве холостой пробы) разбавляли до 1 мг/мл в 50 мM Ambic, и смешивали 1:1 с Rapigest (Waters, восстановленного с помощью 50 мM Ambic до концентрации 0,1%) с получением конечного раствора с 0,5 мг/мл белка в 0,05% Rapigest, 50 мM Ambic. Образцы инкубировали при 60ºC в течение 15 минут с обеспечением денатурации белков. Восстановление дисульфидов проводили с помощью 10 мM 1,4–дитиотреитола (DTT) (Pierce) в 50 мM Ambic при 60ºC в течение 1 часа. Обеспечивали охлаждение образцов до комнатной температуры перед алкилированием с помощью 20 мM 2–йодацетамида (IAA) (Pierce) в 50 мM Ambic и их инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Lys–C (Promega, 15 мкг/пробирку) восстанавливали в 50 мM Ambic при концентрации 0,125 мкг/мкл и добавляли в каждый образец при соотношении фермент:субстрат 1:50. Образцы инкубировали в течение ночи при 37ºC. На следующее утро получали раствор трипсина (Promega, 100 мкг/пробирку) при 0,4 мкг/мкл в 50 мM Ambic и добавляли в образец при соотношении 1:25 и инкубировали при 37ºC в течение 3 часов. Rapigest удаляли кислотным расщеплением с помощью добавления 2,05% муравьиной кислоты (EMD Millipore). Образцы инкубировали в течение 30 минут при 37ºC перед центрифугированием при 12000 об./мин. в течение 15 минут с осаждением расщепленного Rapigest и любого нерасщепленного белка. В каждой пробирке автоматического пробоотборника получали 20 мкг подвергнутого расщеплению образца, 400 фмоль стандарта  для Hi3 (Waters) и полученное разбавляли до конечного объема 60 мкл с помощью 0,1% муравьиной кислоты для впрыска в LC–MS.
Подвергнутые расщеплению образцы (30 мкл или 10 мкг на колонке) впрыскивали в систему Waters ACQUITY H–Class UPLC, присоединенную к масс–спектрометру Waters XEVO G2–XS QTof для анализа с помощью LC–MS с применением колонки с 1,7 мкм CSH C18 (2,1 мм X 150 мм, Waters). Масс–спектрометр устанавливали для сбора данных MSE в диапазоне масс от 50 до 2000 со сканами 0,3 секунды в режиме чувствительности. Все образцы прогоняли в произвольном порядке на стадии очистки (т. е.холостые пробы и лекарственное вещество рандомизировали вместе и прогоняли первыми; образцы элюата из колонки посередине способа рандомизировали и прогоняли следующими и материал сбора клеточной культуры рандомизировали и прогоняли последним). В UPLC использовали воду и ацетонитрил (ACN) с 0,1% муравьиной кислотой в качестве добавок и градиент 5–40% ACN в течение 30 минут с повышением до 85% ACN в течение 5 минут, удерживанием в течение 2 минут, и возвращением к исходным условиям в течение 3 минут, и удерживанием в течение 5 минут с расходом 250 мкл/мин., и при этом общее время градиента 45 минут.
Файлы с данными MS импортировали в программное обеспечение Progenesis Qi для протеомики (Nonlinear Dynamics) для отбора пиков и выравнивания предшественника/иона продукта перед поиском в базах данных последовательностей с применением поискового алгоритма MSE (Waters). В базах данных были объединены последовательности терапевтических белковых продуктов, распространенных загрязняющих белков, база данных Uniprot для китайского хомячка и обратные варианты каждого из них (всего 69916 последовательностей). Идентификации проводили с требованием 3 фрагментов на пептид, 7 фрагментов на белок и по меньшей мере 2 пептидов на белок с 4% или меньше FDR. Использовали дополнительное фильтрование с получением <1% FDR с применением балла для пептида >5 и погрешности для массы пептида <10 ppm. Как правило, идентификации пептидов получали в наиболее ранних образцах из способа, например,образцах сбора культуры, но это не всегда было так. Пептиды, которые не соответствовали трендам для белка, не включали для количественного определения. Белки количественно определяли на основе количества верхних трех пептидов на белок (во всех трех впрыскиваниях) по сравнению с верхними тремя пептидами для ClpB (Hi–3) или пептидами с линейным поведением для продукта (Mid–3) для определения относительного количества белков, присутствующих в каждом образце.
Результаты и обсуждение
Nature methods
Одним риском применения средств программного обеспечения для обнаружения в протеомике для анализа HCP, присутствующих в относительно небольшом количестве, в смеси терапевтических белковых продуктов является то, что ионы, присутствующие в большом количестве, полученные из терапевтического белка, могут неправильно идентифицироваться как HCP. Недавно было показано, что вследствие артефактов белки, присутствующие в большом количестве, могут быть идентифицированы неправильно как другие белки на уровне, намного превышающем уровень ложноположительных результатов (Kong et al. . 2017;14(5):513–520). Также возможно, что HCP можно также правильно идентифицировать на белковом уровне, но некоторые пептиды для этих HCP могут быть неправильными или они могут подвергаться воздействию других ионов, поэтому их нельзя будет использовать для количественного определения.
масса/заряд
В способе, раскрытом в данном документе, используется ортогональное физико–химическое свойство паттерна интенсивности в ходе способа очистки для отфильтровывания таких ложноположительных идентификаций, а также пептидов с нежелательными взаимодействиями. В Progenesis Qi для протеомики каждый пептид был указан вместе с показателем–идентификатором и точностью по массе, а также визуализацией тренда для пептида во всем эксперименте. Изображение, показывающее обнаружение каждого пептида по значению и времени удержания, также показано, так что можно наблюдать другие нежелательным образом воздействующие ионы. Пептиды, напримерс наблюдаемым нежелательным воздействием, не использовали для количественного определения.
фиг. 4
Время анализа с помощью LC–MS для анализа образцов из всего способа очистки составляло приблизительно два дня (время анализа с помощью LC–MS для одного образца составляло приблизительно 45 минут). Проверка вручную идентификации всех пептидов, включая пептиды, полученные из HCP, занимает приблизительно две недели. После проверки проводили количественное определение конечного перечня идентифицированных HCP из производственных образцов терапевтического белка. Как показано на , распространенные HCP идентифицировали в семи производственных партиях. Проводили статистические анализы для понимания способа очистки, например,анализ основных компонентов (PCA), который обеспечивает иллюстрацию удаления HCP на каждой стадии способа очистки. Последующий анализ HCP включал иерархическую кластеризацию по группам белков, которые имеют подобное поведение в способе очистки. Иерархическая кластеризация обеспечивала исследование узлов для обнаружения того, какие белки удалялись на каждой стадии способа очистки. Эти данные использовали для понимания и оптимизации способов очистки для подтверждения, что конкретные HCP исключались из конечного терапевтического белкового продукта. HCP, которые не были удалены из терапевтического белка на достаточном уровне, удаляли путем оптимизации способа очистки на основе, например,физико–химических свойств HCP, включая pI, молекулярную массу, гидрофобность, активность и иммуногенность. Программное обеспечение также использовали для автоматического контроля наличия HCP в ходе способа очистки.
Наибольшим источником вариабельности при определении абсолютного количества HCP между вариантами анализа было либо количество добавленного в виде добавки внутреннего стандарта, либо количество такого внутреннего стандарта на пептидном уровне для HCP, которые являются расщепленными белками. Добавленный в виде добавки внутренний стандарт обычно представлял собой пептиды ClpB Hi–3, которые предполагаются для использования при определении абсолютного количества. Большое внимание было уделено растворению, отбору аликвот и хранению стандарта, но вариабельность может возникать из–за различий при отмеривании пипеткой, например,у разных операторов или из–за изменений в ферментативном расщеплении при разных вариантах анализа. Вместо применения добавленного в виде добавки внутреннего стандарта, как показано в данном документе, можно использовать пептиды, полученные из терапевтического белка, однако пептиды, присутствующие в наибольшем количестве, полученные из терапевтического белка, зачастую присутствуют в таком количестве, которое выходит за пределы динамического диапазона масс–спектрометра, т. е.пептиды, присутствующие в наибольшем количестве, полученные из терапевтического белка, могут насыщать детектор масс–спектрометра. При применении способа с пептидами, присутствующими в наибольшем количестве (способ Hi–3), наблюдали, что пептиды, присутствующие в наибольшем количестве, имели нелинейное поведение из–за, например,насыщения детектора. Напротив, наблюдали, что пептиды, находящиеся посредине распределения ионов, которые называются пептиды Mid–3, имели линейное поведение сигнала на основе содержания. Как показано в данном документе, способ с пептидами Mid–3, который включает данные от пептидов Mid–3, обеспечивал меньшую погрешность и показал линейное поведение до 18 мкг в колонке.