Субпопуляции В-лимфоцитов у больных раком молочной железы: Lec-специфичные B-клетки

СУБПОПУЛЯЦИИ В-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: 1ЕС-СПЕЦИФИЧНЫЕ В-КЛЕТКИ

Н.А. Гадецкая, Л.Ю. Гривцова, З.Г. Кадагидзе, В.П. Летягин, Н.Н.Тупицын

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

B-LYMPHOCYTIC SUBPOPULATIONS IN PATIENTS WITH BREAST CANCER: Lec-SPECIFIC B CELLS

N.A. Gadetskaya, L.Yu. Grivtsova, Z.G. Kadagidze, V.P. Letyagin, N.N. Tupitsyn N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

The paper’s evidence suggests the B lymphocytes are heterogenic in patients with breast cancer. They were similar to those from donors in most markers; only the proportion of CD23-positive B-cells was more significant in patients with breast cancer.

Binding of the fluorescently labeled Gal?1-3GlcNAc disaccharide to B lymphocytes from patients with breast cancer and donors was observed. The membrane receptors of CD5-positive B lymphocytes have been first shown to be able to bind Gal?1-3GlcNAc disaccharide. This may be evidence for the involvement of this cell population in an antitumor immune response to cancer cells expressing the study carbohydrate determinant on the membrane.

At present, the authors are now investigating Lec-specific antibodies in the serum from patients with breast cancer.

В последние годы проявляется повышенный интерес к исследованию гуморального противоопухолевого иммунитета у больных раком молочной железы (РМЖ) [1]. Это обусловлено рядом причин.

Многие опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены клеток РМЖ по своей химической структуре относятся к углеводным детерминантам в составе мембранных гликопротеинов (например, муцинов) [2]. Эти детерминанты являются иммуногенными (развивается гуморальный иммунный ответ), против многих из них получены моноклональные антитела (МКА), которые эффективно используются в клинике при определении у больных уровней сывороточных карбогид-ратных (СА) маркеров, например, СА 15.3 [3].

Доказано, что гуморальный иммунный ответ на опухолевые антигены может развиваться непосредственно в ткани РМЖ (формирование фолликулов, выраженная плазмоклеточная реакция, секреция В-клетками и плазмоцитами антител), что наглядно продемонстрировано при медуллярном раке [4, 5].

Накапливается все больше данных относительно роли так называемого естественного гуморального иммунитета, обусловленного полиреак-тивными пентамерными ^М, продуцируемыми CD5-положительными В-лимфоцитами, в противоопухолевой защите при РМЖ [2].

Оценка на клеточном уровне специфических показателей гуморального иммунитета к углеводным детерминантам у больных РМЖ представляет достаточно сложную и методически во многом не решенную задачу. Это обусловлено тем, что относительное содержание В-лимфоцитов в периферической крови больных РМЖ невелико (около 10%), и специфические клоны в пределах них представляют минорную фракцию. Кроме того, очень важна точная идентификация углеводной детерминанты-мишени на клетках опухоли, по отношению к которой развивается гуморальный иммунный ответ.

В 1994 г. работами P.D. Rye и соавт. [7] было установлено существование иммуногенной детерминанты в составе 230 кД гликопротеина мембраны клеток РМЖ и получены МКА LU-BCRU-G7. Антиген отсутствовал в ткани нормальной молочной железы, определялся в 57% случаев РМЖ и был ассоциирован с неблагоприятным прогнозом при ранних стадиях заболевания. Исследования, проведенные нами при ранних стадиях РМЖ (T1—2N0M0) и длительном (более 8 лет) наблюдении за больными после операции, подтвердили прогностическое значение маркера [8]. По химической структуре антиген соответствовал дисахариду Gaipi-3GlcNAc (Lec) [9].

В настоящей работе нами представлены результаты исследования субпопуляционного состава В-лимфоцитов крови больных РМЖ, особое внимание уделено оценке способности В-лимфо-цитов специфически связывать флюоресцентно меченный дисахарид Lec.

Показатели В-клеточного звена иммунитета были проанализированы у 21 первичной больной РМЖ (до лечения).

Средний возраст больных составлял 56,8± 2,4 года (от 35 до 75 лет, медиана —56 лет). Характеристика больных по стадиям заболевания представлена в табл. 1. Инфильтрирующий протоковый рак диагностирован у 15 больных, дольковый — у 2, аденогенный рак — у 1 больной. Еще у 3 больных диагноз РМЖ верифицирован цитологически.

Контрольная группа включала 9 женщин в возрасте от 27 до 49 лет (6 здоровых доноров, 3 пациентки с фиброаденомой молочной железы).

У всех пациенток были оценены уровни экспрессии основных активационных антигенов в пределах В-клеток (CD 19+).

Характеристика субпопуляций В-лимфоцитов в пределах CD19+ В-клеток проводилась с помощью трехцветной проточной цитометрии.

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МАММОЛОГИЯ 2 ’2006

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МАММОЛОГИЯ 2 ’2006

Таблица 1. Характеристика больных РМЖ по стадиям заболевания

Стадия TNM Число абс. больных %

І ТШ0М0 3 14

ІІа ТЩ1М0 4 33

Т2ШМ0 3

ІІЬ Т2ШМ0 2 10

ІІІа Т2ЮМ0 2 14

Т3ШМ0 1

ІІІЬ Т4ШМ0 1 24

Т4ЮМ0 4

IV Т2ШМ1 1 5

Общую популяцию лейкоцитов выделяли путем стандартного лизиса эритроцитов, монону-клеарную фракцию — путем центрифугирования в

Таблица 2. Панель исследованных антигенов

градиенте фиколл-верографин. Из 5 мл гепарини-зированной периферической крови больных РМЖ выделяли фракцию мононуклеаров. Для этого кровь, разведенную в 2 раза забуференным физиологическим раствором с добавлением бычьего сывороточного альбумина (ЗФР-БСА), наслаивали на фиккол-верографин и центрифугировали при 1000 g 40 мин при комнатной температуре. Мононуклеары собирали пастеровской пипеткой из интерфазы и дважды отмывали ЗФР-БСА.

С выделенными клетками проводили прямую реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) в 96-луночном планшете. Для этого в каждую из 12 лунок вносили взвесь клеток в количестве не менее 100 000. Далее в каждую лунку добавляли коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспензировали пипеткой. Каждое МКА брали в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке — 30 мкл. Клетки инкубирова-

Антиген Экспрессия в норме Функция

СD 19 Пре-В-клетки, зрелые В-лимфоциты (маркер В-клеток) Играет главную роль в регуляции уровня пороговой чувствительности мембранных рецепторов В-кле-ток. Также регулирует созревание, активацию и дифференцировку В-клеток

СD 20 Большинство В-клеток, зрелые В-клетки, сохраняет- Фосфопротеин, образует ионный канал в мембране

ся на них до их плазмоклеточной дифференцировки клеток, субстрат протеинкиназы С. Передает сигнал

В-клеткам к активации

HLA DR В-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты, мо- Рецептор для HLA II

ноциты, клетки-предшественники

CD 5 Т-лимфоциты, субпопуляция В-лимфоцитов На Т-клетках структурно и функционально связан с

Т-клеточным рецепторным комплексом, передает как стимулирующие, так и ингибирующие сигналы, зависящие от типа клеток и стадии их развития. CD5+ В-клетки продуцируют «естественные» антитела ^М класса — неспецифичные низкоафинные антитела

CD 10 Пре-В-клетки, клетки фолликулярных центров лимфоузлов, гранулоциты, лимфоидные клетки-предшественники Мембранная металлопептидаза, маркер клеток фолликулярного центра, общий антиген ОЛЛ

CD 23 Активированные зрелые В-клетки, моноциты/макрофаги, тромбоциты, фолликулярные дендритные клетки Низкоафинный рецептор для ^Е, регулирует синтез ^Е. Запускает высвобождение цитокинов (ФНО, ИЛ1, ИЛ6) у моноцитов. Стимулирует дифференци-ровку В-клеток в плазмоциты

CD 38 Активированные В- и Т-лимфоциты, плазматические клетки, лимфоидные клетки-предшественники, МК-клетки, тимоциты Гликопротеин с молекулярной массой 45 кД, осуществляет позитивную и негативную регуляцию активации и пролиферации клеток. Участвует в адгезии лимфоцитов к эндотелию

CD 71 Все пролиферирующие клетки, эритроидные клетки, активированные Т- и В-лимфоциты, макрофаги Рецептор трансферрина. Присутствует на всех активно пролиферирующих клетках (доброкачественных и злокачественных), способствует транспорту железа внутрь клетки

CD 95 Активированные Т- и В-лимфоциты Рецептор для FasL, активирует апоптоз при связывании с Fas-лигандом

Каппа цепь ^ Мембранная экспрессия на В-лимфоцитах Легкая цепь ^ типа каппа

Лямбда цепь ^ Мембранная экспрессия на В-лимфоцитах Легкая цепь ^ типа лямбда

ли с антителами в течение Таблица 3. Комбинации использованных МКА

30 мин при 4°С. По окончании времени инкубации клетки дважды отмывали от несвязавших-ся антител путем центрифугирования в течение 5—7 мин при 1000 ^ Затем клетки переносили в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре.

Реакцию оценивали на проточном 5-параметровом цитометре FACScan (BD, США).

Сбор и анализ клеток осуществлялся в гейте CD19+ клеток, включающем только популяцию В-лимфоцитов. Субпопуляции В-лимфоцитов в пределах CD19+ В-клеток характеризовались на основании коэкс-прессии антигенов, представленных в табл. 2. Абсолютное число клеток в 1 мкл крови под-

Таблица 4. Показатели периферической крови больных РМЖ

№ пробирки Проба FITC

1 ДО1 — IgG1

2 CD45 — CD19

3 ДО1 ДО1 CD19

4 CD5 CD20 CD19

5 CD23 HLA-DR CD19

6 CD38 CD10 CD19

7 CD71 CD95 CD19

8 І8 І8 CD19

9 ДО CD5 CD19

10 ^М CD5 CD19

11 ^ CD5 CD19

12 Лактозамин FITC CD5 CD19

13 CD5 CD19

Показатель Среднее Медиана Разброс Норма Количество

± ошибка среднего образцов

Лейкоциты, х103 кл/мкл 7,949±0,56 7,170 5,0-14,7 4,8-10,8 19

Лимфоциты, % 25,6±2,9 22,1 18-47 19,0-48,0 20

В-клетки,%

от общего числа 7,6±0,8 7,5 0,7-13,8 5,0-19,0 21

лимфоцитов

от числа лейкоцитов 2,16±0,36 1,9 0,26-5,9 — 21

считывали на основании числа лейкоцитов и процентного соотношения лимфоцитов в гемограмме на день исследования.

В большинстве случаев использованы следующие комбинации МКА (табл. 3).

На первом этапе анализа идентифицировали В-клетки и определяли их процентное содержание в пределах лейкоцитов CD45 + + , как показано на рис. 1. Далее в пределах гейта В-лимфоцитов определяли экспрессию различных дифференцировочных антигенов на клетках.

Показатели крови и содержание В-клеток у больных РМЖ представлены в табл. 4, в контрольной группе эти параметры были в пределах нормы.

В целом по группе В-клетки (CD 19+) характеризовались, как и следовало ожидать, мономорф-ной экспрессией CD 20, НLА DR, большинство В-клеток были ^М+. Содержание В-лимфоцитов с

Иммунофенотипическая характеристика

Таблица 5.

В-лимфоцитов у больных РМЖ

Антиген В - к л е т к и , % P

больные РМЖ доноры

CD 10 11,1±2,9 (0,0-49,7) 12,7±1,4 (6,7-17,4) 0,75

CD 71 22,4±3,5 (0,9-55,8) 12,6±2,7 (2,2-21,2) 0,10

СD 95 9,2±1,5 (0,1-25,1) 8,4± 1,9 (1-16,1) 0,77

CD23 59,5±5,5 (1,9-94,5) 39,3±4,8 (21,4-58,9) 0,039

CD5 21,9±3,3 (4,6-48,3) 23,2±5,0 (8,5-50,9) 0,83

CD20 97,0±0,5 (90,3-99,9) 97,9±0,6 (95-100) 0,31

CD38 49,2±6,8 (7,1-98,3) 44,1±4,1 (25-58,7) 0,66

Примечание. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего,

в скобках - разброс.

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МАММОЛОГИЯ 2 ’2006

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МАММОЛОГИЯ 2 ’2006

б $

!=Ч

: -Ос-к -

10е

—.—

101

I

102

CD 19 PER CP

Ы2

1—

'

104

Рис. 1. Гейт для анализа субпопуляционного состава В-клеток. а — выделение гейта лейкоцитов на основании экспрессии СБ45 (ось Х — экспрессия СБ45 ПТС, гейт Я1, на цитограмме выделен красным цветом); б — гейт В-клеток (СБ19+ ) — Я2, по оси абсцисс — экспрессия В-клеточно-го антигена СБ19 РЕ/Су5; в — контрольный образец окрашивания ^01-РЕ/Су5

Рис. 2. Пример яркой экспрессии Ьвс на В-лимфоцитах. СБ19+ В- лимфоциты накоплены в гейте Я2. Оценка экспрессии СБ5

различными изотипами иммуноглобулинов было следующим: ^М — 85,2±2,8% (49,2—99,4%), IgG — 18,7±5,7% (1,2-96,7), ^ - 10,4±1,3% (1,9-22,4%).

В-клетки были поликлональны: ^к в среднем 62,6±2,3%, ^ - 36,3±2,1%.

В 18 (90%) из 20 изученных образцов на В-клетках выявлялась экспрессия активационного антигена CD23 (от 32,8 до 94,5%) одновременно с экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости II типа (HLA DR; табл. 5).

В 7 (36,8%) из 19 образцов на В-клетках (CD19+, CD20+) выявлялась экспрессия антигена CD5 (от 22,1 до 48,3%); в 14 (73,6%) из 19 образцов В-клетки коэкспрессировали активационный антиген CD38 с разбросом от 25,4% до моно-морфной экспрессии (98,3%).

Экспрессия молекул CD71, CD10, CD95 была достаточно гетерогенной.

Достоверных различий между сравниваемыми группами по большинству популяций не выявлено. Вместе с тем содержание CD23- и Н^ DR-положительных клеток было выше у больных РМЖ.

У всех пациенток нами проанализировано наличие специфических рецепторов к дисахариду Lec на мембране В-лимфоцитов на основании способности В-клеток связывать опухолеассоциированный дисахарид Galp1-3GlcNAc (Lec) в составе флюорохромного зонда Lec-PAA-flu (в дальнейшем обозначаемым просто Lec). В качестве контроля к Lec использовали меченный флюорохромом лактозамин дисахарид, схожий по структуре с Lec (Galp1-4GlcNAc). Флюоресцентно меченные пробы были любезно предоставлены профессором Н.В. Бовиным (ИБХ, Москва).

У 85% (18 из 21) больных РМЖ и у 75% (6 из 8) доноров выявлялись В-клетки, связывающие дисахарид Lec.

Средние уровни Lec-связывающих В-клеток у больных РМЖ составляли 6,0% (0,73 — 32,0%, медиана — 2,5%), у доноров — 5,4% (1,5—16,0%), различия недостоверны (р = 0,31). В-клетки, связывающие большие количества Lec и дающие яркий флюоресцентный сигнал при проточно-цито-метрическом анализе, выявлены в 78% (14 из 18) позитивных образцов, полученных от больных РМЖ (0,6—3,9%; медиана - 0,9%).

Пример связывания Lec с В-клетками, включая клетки с ярким флюоресцентным сигналом, представлен на рис. 2.

Одним из направлений работы явилась оценка связывания ^с с субпопуляцией CD5+ В-кле-ток. Именно эти клетки, как известно, во многом определяют антительный ответ на углеводные антигены и продуцируют так называемые естественные антитела класса ^М.

Lec+ CD5+ В -клетки были оценены у 12 больных. Во всех случаях рецепторы к Lec+

были экспрессированы как на CD5 + , так и на CD5- В-лимфоцитах. CD5+ В-клетки составляли в среднем 50% от В-клеток, высокоаффинных к Lec+.

Таким образом, полученные в работе данные свидетельствуют о гетерогенности В-лим-фоцитов у больных РМЖ. По большинству маркеров они были сходны с донорской группой, лишь доля CD23+ В-клеток была большей у больных РМЖ.

Отмечено связывание флюоресцентно меченного дисахарида Galp1-3GlcNAc В-лимфоцитами больных РМЖ и В-лимфоцитами доноров. Впервые показано, что мембранные рецепторы CD5+ В-лимфоцитов способны связывать дисахарид Galp1-3GlcNAc. Это может служить указанием на участие данной популяции клеток в противоопухолевом иммунном ответе на раковые клетки, экспрессирующие изучаемую углеводную детерминанту на мембране.

В настоящее время нами проводится изучение специфических антител к Lec в сыворотке крови больных РМЖ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Scanlan M.J., Gout I., Gordon C.M. et al. Humoral immunity to human breast cancer: antigen definition and quantitative analysis of mRNA expression. Cancer Immun 2001;1:4-20.

2. Ho S.B., Kim Y.S. Encyclopedia of cancer 1997;2:309-24.

3. Hilgers J., von Mensdorff-Pouilly S., Verstraeten A.A. et al. Quantitation of polymorphic epithelial mucin: a challenge for biochemists and immunologists. Scand J Clin Lab Invest Suppl 1995; 221:81-6.

4. Coronella J.A., Spier C., Welch M. et al. Antigen-driven oligoclonal expansion of tumor-infiltrating B cells in infiltrating

ductal carcinoma of the breast. J Immunol 2002;169:1829-36.

5. Hansen M.H., Nielsen H., Ditzel H.J. The tumor-infiltrating B cell response in medullary breast cancer is oligoclonal and directed against the autoantigen actin exposed on the surface of apoptotic cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98(22):12659-664.

6. Brandlein S., Pohle T., Ruoff N. et al. Natural IgM antibodies and immunosur-veillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res 2003;63:7995-8005.

7. Rye P.D., Walker R.A. Prognostic value of a breast cancer-associated glyco-

protein detected by monoclonal antibody LU-BCRU-G7. Eur J Cancer 1994;30(A):1007-12.

8. Шинкарев С.А. Прогностическая роль маркера LU-BCRU-G7 при ранних стадиях рака молочной железы рТ1-2№Ж0. Автореф. дис... канд. мед. наук. М., 2004.

9. Rye P.D., Bovin N.V., Vlasova E.V. et al. Breast cancer-associated antibody LU BCRU G7 recognises the terminal disaccharide Gal beta 1-3GlcNAc and can be used to isolate tumour cells from body fluids by an immunomagnetic bead procedure. Biochem Soc Trans 1995;23(4):584S.

P М А Ц И Я

Редакция приносит извинения за допущенные опечатки в журнале «Маммология» №1/2006.

В статье Е.М. Погодиной, И.В. Высоцкой, И.А. Сосновских, А.Д. Зикиряходжаева «Рак Педжета молочной железы» на стр. 69, схемa 2 следует читать: при гормонотерапии РПМЖ в случае ЭР+ используются антиэстрогены, ингибиторы ароматазы. При ЭР — гормонотерапия не проводится.

В статье В.П. Летягина «Стратегия лечения больных ранним раком молочной железы» на стр. 86, правая колонка, 22-я строка. Вместо напечатанной суммарной дозы 2 Гр за 15 мин. следует читать 20 Гр за 15 мин.

Приглашаем авторов к активному сотрудничеству в журнале «Маммология». Ждем ваших статей и откликов на публикации.

Редколлегия

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МАММОЛОГИЯ 2 ’2006