Способ диагностики нейропатии малых волокон у больных саркоидозом
METHOD FOR DIAGNOSING SMALL FIBER NEUROPATHY IN PATIENTS WITH SARCOIDOSIS

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, пульмонологии, и может быть использовано для выявления нейропатии малых волокон у больных саркоидозом.
У пациентов с саркоидозом органов дыхания наблюдается развитие системных полиорганных нарушений, значительно снижающих качество жизни и ухудшающих прогнозы заболевания. Одним из наиболее важных из них является поражение нервной системы с вовлечением нервных волокон наименьшего диаметра, что носит название нейропатии малых волокон (НМВ) [1-4]. Данное осложнение может проявляться в виде нейропатических болей и парестезий, а также в виде нарушения вегетативной регуляции внутренних органов, что имеет разнообразные клинические проявления и может затруднять постановку диагноза [5, 6].
В настоящий момент в медицинском сообществе отсутствуют общепринятые критерии диагностики НМВ. Представление о наличии у больного поражения малых нервных волокон формируется преимущественно на основании клинических критериев, таких как данные неврологического осмотра и опроса пациента по валидизированным шкалам (например, Small fiber neuropathy screening list) [7, 8]. Дополнительно может быть проведена электронейромиография для исключения поражения крупных нервных стволов, при этом диагностика непосредственно НМВ при проведении рутинного электрофизиологического исследования не представляется возможной. «Золотым стандартом» постановки диагноза является проведение иммунофлюоресцентного или иммуногистохимического анализа биоптата кожи с подсчетом плотности интраэпидермальных нервных волокон, однако данная методика требует специального обучения персонала, оборудования, существенных экономических и временных затрат [9, 10]. У больных с саркоидозом легких гистологические исследования плотности малых нервных волокон носят противоречивый характер, зачастую не проводится корреляция морфологических результатов с клинической составляющей, а также оценка наличия и выраженности аутоиммунного компонента заболевания.
Известна работа - Способ диагностики полиневропатии тонких волокон у пациентов с целиакией (патент РФ 2575835), характеризующийся проведением биопсии кожи, иммуногистохимического анализа и подсчета интраэпидермальной плотности нервных волокон. Однако иммуногистохимический метод является дорогостоящим и трудоемким методом. Кроме того, в данной работе авторы проводят диагностический комплекс без оценки неврологической симптоматики, что предполагает проведение данного исследования всем больным.
Задачей предлагаемого изобретения является диагностика нейропатии малых волокон у больных саркоидозом.
Задача решается за счет того, что проводят оценку выраженности неврологических симптомов у пациентов по количеству баллов, при их значении равном 2 и более баллов осуществляют биопсию кожи латеральной поверхности голени с дальнейшим выполнением иммунофлюоресцентного исследования биоптата и при плотности нервных волокон ниже 4,4 IENF/mm диагностируют нейропатию малых волокон.
Предлагаемый способ иллюстрирован примером реализации способа, где фиг. - пример окрашивания антителом PGP 9.5 нервных окончаний у пациента с саркоидозом, иммунофлюоресцентный анализ биоптата кожи.
Способ осуществляется следующим образом.
Этап I. Оценка очаговой неврологической симптоматики.
У пациентов проводится оценка двигательной и чувствительной сферы с анализом тонуса и силы основных групп мышц, оценка поверхностных и глубоких рефлексов; оценка болевой, температурной, тактильной, вибрационной чувствительности, суставно-мышечного чувства, чувства давления и веса, кинестезии кожи.
Для изолированной НМВ у пациента должны отсутствовать признаки поражения крупных нервных волокон (например, двигательные нарушения, тремор, изменение глубокой чувствительности).
Каждому из симптомов присваивается от 0 до 4 баллов, оценивающих как частоту развития симптомов, так и их интенсивность. Наличие неврологической симптоматики с выраженностью более 2 баллов является показанием на проведения биопсии кожи.
Этап II. Осуществление биопсии кожи.
Пункционная биопсия кожи (диаметром 3 мм) выполняется на коже голени (10 см проксимальнее латеральной лодыжки). Манипуляция проводится с той стороны тела, где проявляются более выраженные клинические симптомы.
Техника проведения биопсии кожи:
1) обезболивание кожи с применением 1% лидокаина;
2) обработка кожи спиртовым раствором хлоргексидина 0.5%;
3) взятие 3-4 мм пунктата кожи при помощи иглы для биопсии;
4) отсекание биоптата при помощи скальпеля;
5) помещение пунктата в 0.5 мл раствора Замбони в эппендорфе (4% параформальдегид и пикриновая кислота) 6) закрытие раны, наложение повязки.
Этап III. Проведение гистологического исследования с применением иммунофлюоресцентного анализа.
Окрашивание малых волокон производится с помощью антител к продукту белка гена 9.5 (protein gene product 9.5, PGP 9.5), являющегося нейрональной формой убиквитиновой карбоксил-терминальной гидроксилазы, транспортируемой медленным компонентом аксонального транспорта. Специфичность и чувствительность метода варьируются от 88 до 92%.
После фиксации биоптата в растворе Замбони на 10 минут производится его трехкратная отмывка раствором TBS (tris-buffered saline) с последующим погружением в 15% раствор сахарозы. Замораживание биоптата производится в жидком азоте с последующим проведением криотомии с толщиной среза 40-50 мкм. Далее - внесение срезов в лунки 24-луночного планшета для клеточных культур с вставленными в них колодцами для клеточных культур, заполненные антифризом. Осуществляется Трехкратная отмывка раствором TBS с интервалом 10 минут. Срезы инкубируются в блокирующем растворе 4 часа при комнатной температуре. Затем производится инкубация в растворе первичных антител (анти-PGP 9.5 в разведении 1:300) в течение 12 часов в холодильнике. После трехкратной отмывки раствора TBS с интервалом в 10 минут - инкубация в растворе вторичных антител (AlexaFluor Goat-anti Rb в разведении 1:200) в течение 4 часов в темноте. Затем вновь осуществляется трехкратная отмывка раствором TBS с интервалом в 10 минут, после чего срезы помещаются на стекло с последующим нанесением покровного стекла. Хранение препаратов осуществляется при температуре +4 градуса.
Этап IV. Оценка результатов биопсии и постановка диагноза
Наличие плотности волокон ниже 4,4 IENF/mm (intraepidermal nerve fibers/mm, количество внутриэпидермальных нервных волокон в миллиметре) свидетельствует о повреждении волокон, что требует назначения соответствующего лечения или коррекции терапии.
Предлагаемый способ отвечает критерию изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников научно-технической и патентной литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого изобретения, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.
Техническим результатом предлагаемого способа является то, что он позволяет с высокой точностью осуществлять диагностику нейропатии тонких волокон у больных с гранулематозными заболеваниями легких. Предлагаемым способом на базе ФГБУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава РФ и СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница №2». В исследование было включено 98 больных, страдающих саркоидозом легких и здоровых добровольцев. Среди них было 42 мужчин и 56 женщин, средний возраст которых составил 38,4±7,2 года. Первую группу составили больные с саркоидозом легких (n=25, средний возраст 33,4±8,5 лет), во вторую группу вошли здоровые добровольцы (n=73, средний возраст 55,8±13,9 лет). Статистически значимых различий по полу и возрасту среди пациентов не отмечалось.
Все пациенты прошли комплекс обследования, включавший клиническую оценку заболевания, мультиспиральную компьютерную томографию (МСКТ) органов грудной клетки, лабораторные исследования крови, стандартный комплекс обследования на туберкулез, гистологическую верификацию изменений в легких и внутригрудных лимфатических узлах по показаниям (с применением чрезбронхиальной и видеоторакоскопической биопсии).
Пациентам был проведен сбор анамнеза для исключения иных причин НМВ, неврологическое обследование с оценкой поверхностной и глубокой чувствительности, мышечной силы и мышечно-тонических рефлексов. Для оценки выраженности клинической симптоматики был применен опросник с оценкой частоты и интенсивности симп томов от 0 до 4 баллов.
Гистологическое исследование проводилось при наличии неврологических симптомов и с забором биопсии кожи голени (диаметром 3 мм) 10 см проксимальнее латеральной лодыжки) с последующим проведением иммунофлюоресцентого исследования. Манипуляция проводится с той стороны тела, где проявлялись более выраженные клинические симптомы.
С целью подготовки материала для иммунофлюоресцентного исследования, проводилось окрашивание малых волокон с помощью антител к продукту белка гена 9.5 (protein gene product 9.5, PGP 9.5), являющегося нейрональной формой убиквитиновой карбоксил-терминальной гидроксилазы, транспортируемой медленным компонентом аксонального транспорта. Специфичность и чувствительность метода варьируются от 88 до 92%.
Плотность нервных волокон, а также общее морфологическое строение кожного среза, плотность субэпидермальных сплетений и иннервация потовых желез проводилась с учетом возраста пациентов. Наличие в диагностическом материале плотности нервных волокон у пациентов ниже 4,4 IENF/mm свидетельствовало о повреждении волокон малого диаметра.
При тестировании больных средний балл у пациентов с саркоидозом составил 2.0 (0.0;7.0), у здоровых добровольцев - 0 (0;0) баллов (Табл. 1).
При сравнении показателей с помощью U-критерия Манна-Уитни, были выявлены различия в результатах пациентом с саркоидозом и здоровых добровольцев (р<0.0001).
Основным клиническим симптомам НМВ, были: боль и изменение температуры тела и конечностей, нарушение моторики желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы, ощущение перебоев и остановок в работе сердца. Балльная оценка выраженности симптомов представлена в таблице 2.
17 больным с клинической неврологической симптоматикой проведена биопсия кожи. В результате их исследования снижение плотности малых нервных волокон было выявлено у 6 (35.3%) пациентов, у которых обнаружена положительная корреляция между плотностью малых нервных волокон ниже 4,4 IENF/mm и выраженностью неврологической симптоматики от 2 и более баллов (коэффициент корреляции Спирмена, р=0,04, r=0,375, CI от -0,1365 до 0,8234).
Примеры конкретного использования предлагаемого способа.
Клинический пример 1.
Пациентка Б., 28 лет. Саркоидоз легких впервые диагностирован по результатам комплексного обследования: проба Манту с 2 ТЕ - р 3 мм; проба с диаскинтестом - отрицательная; рентгенологически определялись увеличенные внутригрудные лимфатические узлы до 13 см обычной структуры и плотности, а также множественные очаги в правом и левом легком.
По данным гистологического исследования легочной ткани имели место гранулемы без признаков казеозного некроза. Гормональную терапию пациентка не получала. По данным неврологического осмотра у пациентки определялось резкое покраснение лица (4 балла), размытость зрения (2 балла), жжение в нижних отделах голени (3 балла). При оценке гистологического материала биопсии кожи плотность волокон составляла 4,2 IENF/mm, что ниже диагностического значения. Был поставлен диагноз «нейропатии малых волокон», что потребовано назначения симптоматической терапии и дальнейшего наблюдения невролога.
Клинический пример 2.
Пациент Б., 35 лет. Саркоидоз легких диагностирован впервые по данным комплексного обследования: проба Манту с 2 ТЕ - р 4 мм; проба с Диаскинтестом - отрицательная; рентгенологически определялись увеличение внутригрудных лимфоузлов и очаговые изменения правого легкого. По данным гистологического исследования легочной ткани имели место гранулемы без признаков казеозного некроза. По данным неврологического осмотра у пациента определялось покалывание (1 балл) преимущественно в дистальных отделах верхних конечностей с лучевой стороны и по задней поверхности нижних конечностей, преимущественно справа, изменение цвета кожных покровов рук (1 балл).
При оценке гистологического материала биопсии кожи плотность волокон составляла 11,5 IENF/mm, что выше диагностического значения и не свидетельствовало о наличии нейропатии малых волокон.
Клиническая симптоматики явилась проявлением остеохондроза, осложненного грыжеобразованием, что нашло подтверждение при проведении магнитно-резонансной томографии позвоночника.
Источники информации.
1. Abdelrazek М.А.. Chwalisz В., Oaklander A.L., Venna N. Evidence of small-fiber neuropathy (SFN) in two patients with unexplained genital sensory loss and sensory urinary cystopathy. J Neurol Sci. 2017; (380): 82-84.
2. Birnbaum J., Bingham C.O. Non-length-dependent and length-dependent small-fiber neuropathies associated with tumor necrosis factor (TNF) inhibitor therapy in patients with rheumatoid arthritis: Expanding the spectrum of neurological disease associated with TNF-inhibitors. Semin Arthritis Rheum. 2014; 43(5): 638-647.
3. Blackmore D., Siddiqi Z.A. Diagnostic Criteria for Small Fiber Neuropathy. J Clin Neuromuscul Dis. 2017; 18(3): 125-131.
4. Brouwer B.A., Bakkers M., Hoeijmakers J.G.J., Faber C.J., Merkies I.S.J. Improving assessment in small fiber neuropathy. Journal of the Peripheral Nervous System. 2015; (20): 333-340.
5. Gibbons C.H. Small Fiber Neuropathies. Continuum (Minneap Minn). 2014; 20(5): 1398-1412.
6. Hoitsma E., de Vries J., Drent M. The small fiber neuropathy screening list: construction and cross-validation in sarcoidosis. Respiratory medicine. 2010; (105): 95-100.
7. Lauria G., Bakkers M., Schmitz C., Lombardi R., Penza P., Devigili G., Smith A.G., Hsieh S-T, Mellgren S.I., Umapathi Т., Ziegler D., Faber C.G., Merkies I.S.J. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. Journal of the Perif Nerv Syst. 2010; (15): 202-207.
8. Lauria G. Lombardi R, Camozzi F, Devigili G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 2009; (54): 273-285.
9. Oaklander A.L. Immunotherapy Prospects for Painful Small-fiber Sensory Neuropathies and Ganglionopathies. Neurotherapeutics. 2016; (13):108-111.
10. Sene D. Small fiber neuropathy: diagnosis, causes and treatment. Joint Bone Spine. 2018; 85(5): 553-559.