Структурно-функциональные особенности углеводсвязывающих сайтов галактозоспецифичного лектина мидии Crenomytilus grayanus

Научная смена

Вестник ДВО РАН. 2015. № 6

Буйновская Нина Сергеевна

Будучи студенткой второго курса Дальневосточного федерального университета, Н.С. Буйновская пришла на работу в лабораторию морской биохимии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. За время обучения в ДВФУ с отличием защитила две курсовые и дипломную работу, выполненные под руководством к.б.н. Л.А. Балабановой и к.б.н. В.А. Голотина. Дипломная работа была рекомендована к публикации. Окончив университет в 2015 г. по специальности «биохимия», поступила в аспирантуру ТИБОХ ДВО РАН в ту же лабораторию и продолжает научные исследования под руководством к.б.н. В.А. Рассказова.

Область научных интересов - получение принципиально новых гибридных белков, изучение их физико-химических свойств и применения в молекулярной биологии и медицине. За время работы в лаборатории Нина Сергеевна успешно освоила методы молекулярной биологии, генной инженерии, микробиологии, белковой инженерии и иммунологии.

УДК 577.2

Н С. БУЙНОВСКАЯ

Структурно-функциональные особенности углеводсвязывающих сайтов галактозоспецифичного лектина мидии Crenomytilus grayanus

Представлены результаты работы по изучению структурно-функциональных особенностей лектина мидии Crenomytilus grayanus методом сайт-направленного мутагенеза. Показана роль каждого из сайтов при связывании с лигандом и образующих их аминокислотных остатков.

Ключевые слова: CGL, лектины, GalNAc, агглютинация, лектин-ферментный анализ, сайт-направленный мутагенез.

Structural and functional features of carbohydrate-binding sites of galactose-specific lectin of Crenomytilus grayanus mussel. N.S. BUINOVSKAYA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

БУЙНОВСКАЯ Нина Сергеевна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии им Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). E-mail: ninok1993@mail.ru

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы «Дальний Восток» (проект № 14-04-00696).

This paper presents the results ofthe study on the structural and functional characteristics of lectin from Crenomytilus grayanus sea mussel by the site-directed mutagenesis method. The role of its ligand-binding sites and site-forming amino acid residues has been shown.

Key words: CGL, lectins, GalNAc, agglutination, lectin-enzyme assay, site-directed mutagenesis.

В современном представлении лектины - это обширный класс белков и глико-протеинов, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры [2, 4, 5]. Благодаря высокой избирательности связывания с углеводными участками клеточной мембраны, лектины принимают участие в самых тонких процессах на клеточном, субклеточном и органном уровнях в живых организмах. Эти процессы включают клиренс гликопротеинов из циркуляторной системы, адгезию инфекционных агентов к клетке хозяина, доставку лейкоцитов к очагам воспаления, клеточное взаимодействие в иммунной системе, процессы, происходящие при малигнизации и метастазировании. Выделенные практически из всех живых организмов, от вирусов до человека, лектины могут стать ценными биохимическими реагентами для использования в экспериментальной цитохимии, при диагностике некоторых заболеваний и, наконец, в биотехнологических процессах получения некоторых сложных углеводсодержащих веществ [3]. Лектины являются сложными мультидоменными белками, но при этом способностью связывать углеводы обладают лишь некоторые участки белковой молекулы - углеводраспознающие домены. Именно данные о строении углеводраспознающих доменов, а также об условиях, необходимых для их функционирования, лежат в основе современной классификации лектинов. В настоящее время выделяют восемь семейств зоолектинов: лектины Р-, C-, I-, L-, M-типов, пентраксины, калнексины и галектины [8, 10-13, 17, 18]. Однако разнообразие зоолек-тинов не ограничивается известными семействами. Ранее был выделен лектин из мидии Crenomytilus grayanus (CGL) с молекулярной массой 17 кДа, установлена нуклеотидная последовательность кодирующих его кДНК и гена, а также полная аминокислотная последовательность CGL [15]. Показано, что CGL является первым представителем нового семейства зоолектинов с третичной структурой «р-трилистник», он имеет три вероятных сайта связывания с N-ацетилгалактозамином (GalNAc), агглютинирует все типы человеческих эритроцитов и обладает высоким сродством к гликопротеинам муцинового типа. Отмечено, что ген CGL экспрессируется в мантии, гонадах, жабрах и гепатопанкреасе мидии C. grayanus [15].

Для выявления структурно-функциональных особенностей лектина CGL проводили мутагенез in silico с помощью программы МОЕ (http://www.chemcomp.com/) на основе кристаллической структуры лектина нового класса Mytilec из мидии Mytilus galloprovin-cialis (Mytilec) (код PDB: 3WMV) [15]. Структура характеризуется тремя внутренними симметричными повторами в одной субъединице. Белки со структурой р-трилистника состоят из шести двуцепочечных р-шпилек, три из которых формируют структуру бочонка, в то время как остальные находятся в треугольном массиве, накрывающем бочонок [16]. Эта модель была использована в данной работе для предсказывания мутаций и выявления структурно-функциональных особенностей CGL. Для определения роли каждого сайта связывания в CGL были предположены варианты аминокислотных замен, разрушающие сайты связывания галактозы в активном центре CGL (рис. 1).

В соответствии с результатами мутагенеза in silico были получены генно-инженерные конструкции трех мутантов CGL с заменами аминокислотных остатков H16A, P17A, G19A (1-й сайт связывания), H64A, P65A, G67A (2-й сайт), H108A, P109A, G111A (3-й сайт). Предположительно, эти мутации разрушают сайты связывания лектина с лигандом (рис. 1).

Мутации вводили в ген CGL методом сайт-направленного мутагенеза с использованием двух геноспецифических олигонуклеотидов, включающих по три аминокислотные замены для каждого сайта связывания: H16A/P17A/G19A, H64A/P65A/G67A и H108A/

Рис. 1. Модель белка CGL и его сайтов связывания. А - 3D-модель комплекса CGL-GalNAc. Структура белка показана в виде ленточной диаграммы. Структура субстрата GalNAc показана палочками. Б - 2D-диаграмма сайтов связывания

P109A/G111A (см. таблицу). Генно-инженерные конструкции получали на основе плаз-миды PET 40 b+, как описано ранее [1, 7, 14]. Последовательность генов в векторах для синтеза рекомбинантных лектинов выверяли методом секвенирования с использованием набора реактивов ABI Prism big dye terminator 3.1 cycle sequencing kit (Applied biosystems, США) для автоматического секвенатора ABIPrism 310 genetic analyzer.

Праймеры для получения рекомбинантных плазмид

Праймер Последовательность

Site 1-dir 5-AAGGCCAGTGGAAAGTTTCTTGCTGCATACGCTGGCAGTAGCAAC-3

Site 1-rev 5-AGCAGGGTTGCTACTGCCAGCGTATGCAGCAAGAAACTTTCCAC-3

Site 2-dir 5-GTTGCAAGTGGAAAAATTGTCGCTGCCTACGCCGGACAAGCTAAT-3

Site 2-rev 5-TGGTGGATTAGCTTGTCCGGCGTAGGCAGCGACAATTTTTCCAC-3

Site 3-dir 5-CACAAAGGAGGTAAATACATCGCCGCCAAGGCAGGATCCCCGAAT-3

Site 3-rev 5-CGGTGGATTCGGGGATCCTGCCTTGGCGGCGATGTATTTACCTC-3

CGL-dir 5-AGCTGAGCTCGATGACGATGACAAGATGACAACGTTTCTTATCAAACACAAGGCCAGTG-3

CGL-rev 5-AGCTGTCGACTTAGGCATAAACTAAAACGCGCTTGTCTTT-3

Экспрессию мутантных рекомбинантных плазмид проводили в клетках Escherichia coli штамма Rosetta(DE3) в течение ночи (12 ч) при 16 оС в 20 мл питательной среды LB, содержащей 25 мг/мл канамицина, с добавлением индуктора экспрессии ИПТГ (изопропил-Р-В-1-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 0,2 мМ. В качестве контроля культивировали клетки E. coli Rosetta(DE3), трансформированные плазмидой без лектина и плазмидой, несущей дикий тип лектина CGL.

После экспрессии во всех клеточных экстрактах была замерена методом Брэдфорд [9] концентрация белка и проведен скрининг на наличие углеводсвязывающей активности в мутантных белках реакцией прямой гемагглютинации и путем твердофазного лектин-ферментного анализа (ТЛФА) с использованием в качестве лиганда муцина желудка свиньи (PSM), как описано ранее [6, 7, 14].

Результаты гемагглютинации показали, что мутантные белки не проявляют гемагглютинирующей активности, что свидетельствует о критическом значении всех сайтов связывания для проявления гемагглютинирующих свойств CGL (рис. 2).

Рис. 2. Результаты реакции прямой гемагглютинации. При положительной реакции в лунке образуется осадок с неровными краями - «зонтик», при отрицательной - ровный осадок в виде «пуговки»

По данным ТЛФА, мутации, разрушающие сайты связывания 1 и 2, уменьшают углеводсвязывающую активность в 18 и 32 раза соответственно, а мутация, разрушающая сайт 3, - в 6 раз, что свидетельствует о существенном вкладе всех трех сайтов при связывании с лигандом PSM (рис. 3).

Полученные экспериментальные данные коррелируют с данными молекулярного докинга, показывающего потерю водородной связи аминокислотных остатков Н16, Н64 и Н108 с молекулой GalNAc и увеличение расчетной энергии связывания комплекса CGL-GalNAc (рис. 1, 3).

Таким образом, методом сайт-направленного мутагенеза впервые

установлены некоторые структурно-функциональные особенности активного центра га-лактозосвязывающего лектина нового класса, включающего три углеводсвязывающих сайта связывания. Дальнейшие исследования свойств лектина мидии CGL позволят расширить фундаментальные представления об особенностях взаимодействия «лектин-ли-ганд».

0,1 0,15 0,1 0.25

Рис. 3. Зависимость образования лектин-субстратных комплексов с лигандом Р8М от концентрации гибридного лектина CmAP/CGL и его мутантов. На вертикальной оси - относительная активность гибрида CmAP/CGL, измеренная по активности щелочной фосфатазы СтАР

ЛИТЕРАТУРА

1. Балабанова Л.А., Рассказов В.А. Плазмида 40Ph, определяющая синтез щелочной фосфатазы CmAP, штамм E. coli Rosetta(DE3)/40Ph - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной щелочной фосфатазы CmAP, и способ ее получения: пат. RU 2447151. Заявл. 29.12.2010; опубл. 10.04.2012, Бюлл. № 10.

2. Королев Н.П. Функции лектинов в клетке // Итоги науки и техники. Серия «Общие проблемы физ.-хим. биологии». М.: Наука, 1984. Т. 1. С. 41.

3. Лукьянов П.А., Черников О.В., Кобелев С.С., Чикаловец И.В., Молчанова В.И., Ли В. Углеводсвязываю-щие белки морских беспозвоночных // Биоорг. химия. 2007. T. 33, № 1. C. 172-181.

4. Луцик М.Д., Панасюк Е.Д., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Высш. шк., 1981. 153 с.

5. Луцик А.Д., Детюк Е.С, Луцик М.Д. Лектины в гистохимии. Львов: Высш. шк., 1989. 139 с.

6. Чикаловец И.В., Черников О.В., Молчанова В.И., Лукьянов П.А., Богданович Р.Н., Васьковский В.Е. Разработка лектин-ферментных методов анализа для диагностики онкозаболеваний // Фундаментальные исследования в интересах биомедицины на Дальнем Востоке России: материалы науч. сес. Общего собр. ДВО РАН «Фундаментальные науки - медицине», 2006 г. Владивосток: Дальнаука, 2008. С. 43-51.

7. Balabanova L., Golotin V., Kovalchuk S., Bulgakov A., Likhatskaya G., Son O., Rasskazov V. A novel bifunc-tional hybrid with marine bacterium alkaline phosphatase and Far Eastern holothurian mannan-binding lectin activities // PLos One. 2014. Vol. 9, N 11. doi:10.1371/journal.pone.0112729.

8. Belogortseva N.I., Molchanova V.I., Kurika A.V., Skobun A.S., Glazkova V.E. Isolation and characterization of new GalNAc/Gal-specific lectin from the sea mussel Crenomytilus grayanus // Comp. Biochem. Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1998. Vol. 119. P. 45-50.

9. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

10. Drickamer K., Taylor M.E. Biology of animal lectins // Annu. Rev. Cell. Biol. 1993. Vol. 9. P. 237-264.

11. Drickamer K. Evolution of Ca2+-dependent animal lectins // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1993. Vol. 45. P. 207-232.

12. Drickamer K., Fadden A.J. Genomic analysis of C-type lectins // Biochem. Soc. Symp. 2002. Vol. 69. P. 59-72.

13. Drickamer K. Increasing diversity of animal lectin structures // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. Vol. 5. P. 612-615.

14. Golotin V., Balabanova L., Likhatskaya G., Rasskazov V. Recombinant production and characterization of a highly active alkaline phosphatase from marine bacterium Cobetia marina // Mar Biotechnol. 2015. Vol. 17. P. 130-143.

15. Kovalchuk S., Chikalovets I., Chernikov O., Molchanova V., Wei Li, Rasskazov V., Lukyanov P. cDNA cloning and structural characterization of a lectin from the mussel Crenomytilus grayanus with a unique amino acid sequence // Fish and Shellfish Immunology. 2013. - http://dx.doi:10.1016/j.fsi.2013.07.011.

16. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. beta-Trefoil fold. Patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interleukins-1 beta and 1 alpha and fibroblast growth factors. // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 223, iss. 2. P. 531-543.

17. Sharon N., Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules // Glycobiology. 2004. Vol. 14, N 11. P. 53-62.

18. Sharon N., Lis H. Lectins. Dordrecht, Netherlands: Springer, 2007. 454 p.