УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗА ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ
DEVICE FOR ANALYSING LUMINESCENT BIOLOGICAL MICROCHIPS

Область техники
Изобретение относится к устройствам для анализа люминесцирующих биологических микрочипов, в частности для серийного анализа однотипных биологических микрочипов в свете их люминесценции с выводом изображения на цифровую камеру с последующей обработкой изображения с помощью компьютерной программы.
Предшествующий уровень техники
Для получения изображения люминесцирующих объектов, в частности люминесцирующих биологических микрочипов (далее - биочипов), используют два типа приборов. В одном из них изображение получают путем сканирования объекта тонким лучом либо светящейся щелью, возбуждая люминесценцию малого участка освещаемого объекта. Затем полное изображение объекта воссоздается с помощью компьютерной обработки индивидуальных сигналов. Такой тип приборов называется конфокальным люминесцентным микроскопом или при анализе больших поверхностей - сканатором. Один из примеров выполнения устройств такого типа представлен в US 6329661 B1.
В других типах приборов возбуждение люминесценции объекта производят, освещая сразу весь объект, а люминесцентное изображение объекта получают, строя это изображение на матрице цифровой камеры. Такой тип приборов называется широкопольным люминесцентным анализатором (ШЛА).
При любом сканировании объекта производится воссоздание изображения из множества индивидуальных измерений. Достоинством сканаторов является их более высокая чувствительность по сравнению с ШЛА. В основном это связано с тем, что при сканировании лучом в каждый данный момент освещается и, соответственно, измеряется люминесценция лишь малой части объекта, поэтому уровень фона, возникающий из-за рассеяния возбуждающего луча существенно меньше, вследствие чего уменьшается влияние свечения соседних участков. Однако недостатком сканаторов, связанным с их чувствительностью, является существенно более длительное время анализа, объект сканируется либо по точкам, либо узкой щелью. Кроме того, в сканаторах обязательно использование движущихся механических элементов, то есть необходимо наличие моторов, приводов, прецизионных скользящих поверхностей и т.д., сопряженных с системой съема сигналов, что, безусловно, увеличивает стоимость прибора и уменьшает его ресурс.
При сравнении абсолютной чувствительности обнаружения ячеек с определенным количеством флуорохрома с помощью коммерческих сканаторов (например, фирмы Packard Instruments) и с помощью анализаторов биочипов, работающих по принципу ШЛА, установлено, что анализаторы биочипов по чувствительности примерно в 3-5 раз уступают сканаторам. Разница в чувствительности приборов, работающих на принципах сканатора или ШЛА, может быть существенна при работе с очень слабыми сигналами, например, с очень слабо люминесцирующими объектами. Такими объектами могут быть, например, экспрессионные биочипы. Однако эта разница в чувствительности не существенна при работе с более сильно люминесцирующими объектами, например с гибридизационными трехмерными биочипами, поскольку в этом случае сигналы достаточно велики, и эффективность работы прибора не определяется его абсолютной чувствительностью.
При практическом использовании биочипов преимуществом ШЛА является быстрота получения результата, что позволяет проводить сотни измерений за одну рабочую смену. Это является актуальной задачей, например, при анализе с помощью биочипов больших групп населения (групп риска) или идентификации ДНК возбудителя туберкулеза у больных в туберкулезном диспансере.
Известно устройство для анализа люминесцирующих биологических микрочипов, описанное в US 6620623, работающее по принципу ШЛА. Это устройство содержит держатель объекта, средство его освещения, включающее в себя лазерные источники возбуждения флуоресцентного излучения и волоконно-оптическую систему распределения излучения лазеров, оптическую систему с фильтром для выделения света люминесценции образца и средство фиксации изображения образца на приемнике информации в виде ПЗС камеры. Свет от источника возбуждающего излучения с помощью оптических волокон, расположенных в виде веера, подводится к торцам стеклянной подложки и распространяется в толще этой подложки, отражаясь от границы стекла с воздухом вследствие разницы в коэффициентах преломления воздуха и стекла согласно закону полного внутреннего отражения. В местах, где на поверхности стекла имеются какие-либо объекты, имеющие показатель преломления более высокий, чем показатель преломления воздуха, свет выходит из стекла и возбуждает люминесценцию красителя, содержащегося в указанных объектах. Оптическая схема прибора собирает изображение поверхности стекла в свете люминесценции и направляет это изображение на матрицу ПЗС камеры.
2
2
2
Однако данное устройство работает только с чипами, расположенными на прозрачной (стеклянной) подложке, и не может работать с чипами, расположенными на непрозрачной подложке. Это очень сильно ограничивает область применения прибора, поскольку многие фирмы выпускают чипы, расположенные на непрозрачной подложке. Вторым недостатком прибора является тот факт, что поскольку свет от источника излучения распространяется по всем стеклу, освещается очень большая площадь (для предметного стекла 18,75 см). В то же время диагностический чип часто занимает площадь менее 1 см (например, стандартные диагностические чипы, выпускаемые фирмой Aconni, занимают площадь 20-50 мм, то есть примерно в 50-100 раз меньше). Это приводит к излишнему расходу энергии.
При использовании данной системы возбуждения люминесценции освещаются все объекты, находящиеся на поверхности стекла. Это неизбежно приводит к увеличению уровня фона и, как следствие, к уменьшению чувствительности данного устройства. Кроме того, использование стекла в качестве подложки имеет ряд недостатков. Стекло является хрупким материалом и может раскалываться, при этом могут пораниться руки оператора. Обычное стекло имеет неоднородности структуры, что приводит к большому количеству брака. При массовых анализах применение химически обработанного стекла в качестве подложки существенно удорожает стоимость изготавливаемых биочипов.
Задачей изобретения является создание устройства для анализа люминесцирующих биологических микрочипов, позволяющего проводить серийный анализ большого количества однотипных биологических микрочипов с достаточной чувствительностью без перенастройки оптической системы и обладающего высокой надежностью при уменьшенных по сравнению с известными устройствами энергозатратах и габаритах. Кроме того, данное устройство должно обеспечивать возможность работы с использованием подложек, материал которых отличен от стекла, например с подложками из металла или пластика.
Раскрытие изобретения
Указанная задача решена за счет того, что в устройстве для анализа люминесцирующих биологических микрочипов, содержащем держатель образца, средство освещения, включающее в себя лазерные источники возбуждения люминесцентного излучения и волоконно-оптическую систему распределения излучения лазеров, устройство фиксации изображения образца, фильтр для выделения света люминесценции образца и оптическую систему для проецирования люминесцентного изображения образца на устройство фиксации изображения, согласно изобретению средство освещения кольцевую опору, в которой по ее окружности расположены концы волокон волоконно-оптической системы распределения излучения лазеров, при этом волоконно-оптическая система включает в себя несколько пучков оптических волокон, так что каждому лазеру соответствует один пучок волокон, причем каждый пучок со стороны, обращенной в сторону образца, когда он установлен в держатель, разделен на отдельные волокна, а концы волокон от разных лазеров расположены по окружности кольцевой опоры с чередованием и ориентированы в сторону анализируемого образца, когда он установлен в держатель, под острым углом к оси этой кольцевой опоры.
Такое выполнение средства освещения позволяет увеличить равномерность освещенности разных участков биочипа при его освещении различными лазерами за счет возможности освещения образца возбуждающим светом с разных сторон при использовании индивидуальных лазеров или любой комбинации лазеров.
Предпочтительно лазерные источники возбуждения люминесцентного излучения включают в себя лазеры, излучающие в разных длинах волн.
Преимущественно держатель образца содержит три взаимно перпендикулярные опорные плоскости и три упругих элемента для прижатия образца к этим плоскостям. Такое выполнение держателя позволяет обеспечить позиционирование образца по трем измерениям таким образом, что образец устанавливается в одно и то же положение и вынимается простым движением руки, не требуя дополнительных регулировок по высоте. При этом значительно сокращается время установки образца для получения его изображения.
Кроме того, кольцевая опора может быть закреплена на оправе объектива, входящего в состав оптической системы.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 схематично показано устройство для анализа люминесцирующих биологических микрочипов в соответствии с настоящим изобретением, вид сбоку частичным разрезом;
на фиг.2 схематично показан держатель образца, вид сверху;
на фиг.3 схематично показано сечение по А-А на фиг.1.
Вариант осуществления изобретения
Как показано на фиг.1, устройство для анализа люминесцирующих биологических микрочипов согласно изобретению содержит держатель 1 образца 2, средство его освещения 3, оптическую систему, включающую в себя два объектива 4, 5 и двухполосный фильтр 6, и устройство 7 фиксации изображения образца. В дальнейшем под образцом 2 понимается люминесцирующий биологический микрочип 8 (биочип), расположенный на подложке 9.
Держатель 1 образца 2 предназначен для точного позиционирования образца в устройстве. Поскольку в образце 2 биочип расположен на верхней поверхности подложки, которая может иметь различную толщину, необходимо для каждой подложки обеспечить попадание биочипа в фокус оптической системы.
Для этого держатель 1 образца 2 (фиг.2) содержит три взаимно перпендикулярные опорные плоскости: плоскость 10 (фиг.1), лежащую в фокальной плоскости объектива 4, ближайшего к держателю 1, и две другие плоскости 11 и 12. Кроме того, держатель 1 содержит три упругих элемента 13, 14 (фиг.1) и 15 (фиг.2) для прижатия образца к этим плоскостям, причем одна из опорных плоскостей расположена в фокальной плоскости объектива, ближайшего к держателю объекта. Такое выполнение держателя 1 позволяет обеспечить позиционирование образца по трем измерениям таким образом, что образец устанавливается в одно и то же положение и вынимается простым движением руки, не требуя дополнительных регулировок по высоте. При этом значительно сокращается время на установку и снятие образца. При реализации такой схемы позиционирования образца объектив всегда фокусировался на плоскости верхней поверхности биочипа, и местоположение ячеек биочипа в поле зрения объектива воспроизводилось с точностью не хуже ±20 мкм.
Средство 3 освещения образца включает в себя лазерные источники возбуждения флуоресцентного излучения 16, 17 и 18 (далее - лазеры 16, 17 и 18) и волоконно-оптическую систему распределения излучения лазеров.
При использовании для освещения лазеров диаметр исходящего от них пучка света необходимо значительно увеличить. Следует учесть, что в поперечном сечении пучок света лазера сильно неоднороден. В нем имеется характерное для каждого лазера поперечное распределение яркости, т.е. в реальных лазерных пучках яркость в поперечном направлении имеет сильно неоднородный характер, что обусловлено целым рядом естественных причин. В связи с этим одной из основных задач, решаемых устройством согласно изобретению, является достижение максимально равномерной освещенности разных участков биочипа.
Установлено, что наилучшим является освещение объекта с помощью кольцевого оптоволоконного осветителя.
В соответствии с этим средство 4 освещения объекта в соответствии с настоящим изобретением включает в себя лазеры 16, 17 и 18, волоконно-оптическую систему распределения излучения лазеров и кольцевую опору 19.
Волоконно-оптическая система содержит несколько пучков 20-22 волокон, так что каждому лазеру 16-18 соответствует один пучок 20-22 волокон, соответственно.
Как схематично показано на фиг.3, торцы пучков 20-22 волокон освещаются лазерами 16-18. Каждый пучок 20-22 волокон раздвоен, причем раздвоенные концы волокон от разных лазеров расположены по окружности кольцевой опоры 19 с чередованием и ориентированы в сторону анализируемого образца 2, когда он установлен в держатель 1.
Хотя на фиг.3 показано, что концы пучков волокон со стороны, идущей к объекту, раздвоены, однако преимущественно каждый пучок волокон разбивают на несколько, например на 8, ветвей и вставляют в кольцевую опору 19 с 24-мя отверстиями, соответственно, через каждые 15°, через которые идет освещение объекта со всех сторон под углом к объекту и к оптической оси устройства. Таким образом, на объект направлены 24 ветви оптических волокон, по 8 от каждого лазера. Кольцевая опора 19 устанавливается горизонтально на оправе (условно не показана) нижнего объектива 4 таким образом, что все ветви световодов освещают биочип 8, расположенный в фокальной плоскости объектива 4.
Кольцевая опора 19 преимущественно выполняется из металла и состоит из нескольких стыкуемых при сборке частей (условно не показано) с предварительно выполненными в них соответствующими отверстиями и каналами, в которых располагаются волокна.
В устройстве преимущественно используются две длины волны: через два пучка волокон идет освещение двумя лазерами 16 и 17 с длиной волны 655 нм, а через одно волокно - лазером 18 с длиной волны 532 нм.
В качестве красителей в биочипе используются флуорохромы Су3 (возбуждение в районе 530 нм, излучение 540 нм) и Су5 (возбуждение в районе 640 нм, излучение в районе 660 нм).
Для Су3 оптимальными являются твердотельные лазеры с длиной волны 532 нм, например лазеры PGL-FS-532nm-20mW CW компании Changchun New Industries Optoelectronics Tech.Co.,Ltd. (http://www. cnilaser.com).
Для Су5 оптимальными являются лазеры с длиной волны 655 нм, например VM65014 компании Midwest Laser Products, США.
При необходимости анализа при еще одной длине волны (например, с использованием более длинноволнового красителя типа Су7) можно задействовать для третьей длины волны одну из двух ветвей, используемую для красного цвета.
Как указано выше, оптическая система содержит два объектива, направленных навстречу друг другу, и двухполосный интерференционный фильтр 6 (при использовании лазеров 16-18 с двумя длинами волн использовали фильтр XF3066 фирмы Omega Opticals USA). Нижний объектив 4 собирает излучение биочипа и направляет его на верхний объектив 5, который, в свою очередь, строит изображение биочипа на поверхности ПЗС или КМОП матрицы 23 устройства 7 фиксации изображения образца, выполненного в виде цифровой камеры.
Теоретически, изображение объекта на матрицу камеры может проектироваться любой оптической системой, поскольку для определения яркости свечения отдельных ячеек компьютерная программа анализа изображения не нуждается в высококачественном регулярном расположении ячеек. Более того, даже качество изображения может быть не очень хорошим, допустимы дисторсии и виньетирование. Все эти искажения можно убрать с помощью компьютерной обработки, однако при этом существенно уменьшается динамический диапазон обработанных сигналов изображения, что сужает область применения устройства, к тому же пользователь зачастую хочет увидеть хорошее изображение биочипа, а это может ему дать только достаточно хорошая оптика.
Оптимальной для получения качественного неискаженного изображения биочипа является схема с двумя одинаковыми объективами 4 и 5, направленными навстречу друг другу. В качестве примера могут использоваться два фотографических объектива с фокусными расстояниями 50 мм, например, Nikkor 50/1,4. Объект (биочип) расположен в задней фокальной плоскости первого объектива 4 (как бы на месте матрицы в цифровом фотоаппарате). Этот объектив 4 собирает изображение биочипа в свете его люминесценции и посылает его параллельным пучком. Второй объектив 5 установлен навстречу первому, расстояние между ними не существенно, поскольку лучи, выходящие из первого объектива, идут параллельно. Второй объектив 5 собирает все лучи после первого объектива 4 и строит изображение в своей задней фокальной плоскости. В этой плоскости стоит матрица 23 цифровой камеры средства 7 фиксации изображения образца. Если объективы одинаковы, то изображение проецируется на матрицу камеры в масштабе 1:1. Величина поля при этом соответствует размеру матрицы. При изменении размеров матрицы автоматически меняется размер поля. Если объективы 4 и 5 не одинаковы (имеют разное фокусное расстояние), то на матрице камеры фокусируется изображение с увеличением или уменьшением, соответствующим соотношению фокусных расстояний объективов.
Как указано выше, схема с двумя фотообъективами, расположенными навстречу друг другу, обладает следующими преимуществами.
1. Позволяет полностью использовать апертуру объектива.
2. Объективы, в частности фотографические, дают минимальную дисторсию и виньетирование при малых полях зрения, определяемых размерами матрицы цифровой камеры.
3. При необходимости перейти к другому увеличению один объектив просто заменяется другим с другим фокусным расстоянием без изменения конструкции всего устройства.
4. Стандартные фотообъективы чаще всего планапохроматичны. При работе в видимой и далекой красной областях спектра фокусировка практически не меняется при смене длины волны.
5. Хроматические и сферические аберрации при использовании двух одинаковых объективов не усиливаются, а компенсируют друг друга.
Объективы с меньшим фокусным расстоянием требуют меньшего расстояния до объекта, что конструктивно неудобно для создания равномерного освещения. Объективы с увеличенным фокусным расстоянием увеличивают размер устройства.
Поскольку освещение биочипов и возбуждение их люминесценции производится с помощью лазеров, имеющих очень узкий спектральный диапазон эмиссии, применение возбуждающих фильтров не требуется. Нужны лишь запирающие фильтры, отсекающие возбуждающий свет и расположенные между объектом и матрицей цифровой камеры. Теоретически, интерференционные фильтры полагается ставить в параллельном свете, т.е. между объективами, однако при этом их диаметр должен быть достаточно большим, чтобы перекрыть всю апертуру объектива. Установлено, что интерференционные фильтры 6 можно устанавливать непосредственно перед ПЗС или КМОП матрицей камеры без существенного ухудшения измеряемого соотношения сигнал/фон.
Тем не менее, как вариант, фильтр 6' (показан пунктирными линиями на фиг.1) может быть установлен и между объективами 4 и 5.
В описываемом примере осуществления изобретения интерференционный фильтр 6 (6') выполнен двухполосным (для длин волн 532 нм и 655 нм), однако при необходимости анализа при еще одной длине волны (например, с использованием более длинноволнового красителя типа Су7) фильтр 6 (6') может быть выполнен трехполосным.
В устройстве согласно настоящему изобретению могут быть использованы, например, двухполосные фильтры XF 3066, фирмы Omega Opticals, США, которые поглощают в областях излучения лазеров (532 нм и 655 нм) и пропускают, соответственно, в областях флуоресценции красителей Су3 и Су5.
Использование двухполосного (многополосного) фильтра позволяет переходить от анализа с одним красителем к другому только путем включения или выключения соответствующих лазеров без механического перемещения оптических компонентов прибора.
В устройстве в соответствии с настоящим изобретением анализируемый объект (биочип) располагается на поверхности подложки, соответствующей размеру стандартного предметного стекла для микроскопов 25×75 мм. Этот размер весьма удобен для самых разнообразных объектов, в частности, биологических микрочипов, поскольку позволяет размещать много ячеек (до тысяч) и в то же время соответствует размерам человеческой руки (пальцев), что удобно пользователю.