СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРОДУКТА ИЗ СЫРЫХ ПАНТОВ
METHOD OF PREPARING BIOLOGICALLY ACTIVE PRODUCT OF RAW VELVET ANTLERS

Изобретение относится к технологии переработки пантов марала, изюбра, северного оленя с получением биологически активного порошка с высоким содержанием гормонов и факторов роста и может быть использовано в косметической промышленности, а также в медицине и ветеринарии.
Известен способ получения биологически активного продукта (пантолизата) путем кислотно-ферментативного гидролиза измельченных пантов в искусственном желудочном соке (См. патент РФ № 2112396, МПК A23J 3/34, А61К 35/32, опубл. 06.10.1998).
Известен способ получения биологически активного продукта (пантокрина) путем экстракции пантов 50%-ным этиловым спиртом и 0,5% уксусной кислотой и настаиванием в течение 6 суток (См. патент РФ № 2045269, МПК А61К 35/32).
Однако использование в процессе получения биологически активного продукта кислот и спирта приводит к частичной денатурации белкового комплекса. Кроме этого при использовании кислоты необходима операция нейтрализации кислоты и удаления солей. Вышеуказанные способы длительны и не обеспечивают надлежащего выхода активных веществ, в частности гормонов и факторов роста.
Известен способ приготовления биологически активного препарата из пантов, исключающий наличие в технологии приготовления продукта агрессивных сред. Способ включает ферментативный гидролиз измельченных пантов (пантовой муки) суспензией поджелудочной железы из расчета 10% к массе пантов в течение 6 часов при 38-40°С с последующей водной экстракцией гидролизата при соотношении гидролизат : вода 1:5 в течение 6 часов. Перед фильтрацией экстракт центрифугируют, а перед ферментацией размолотые панты замачивают водой на 1,5-2 часа. Данный способ разработан для использования в качестве сырья консервированных пантов (См. патент РФ № 2268059, А61К 35/32, опубл. 20.01.2006, Бюл. № 2).
Однако сравнительные исследования биологической активности консервированных и сырых (свежесрезанных или замороженных) пантов показали, что гонадотропная и стимулирующая активность сырых пантов значительно выше, чем у консервированных. При существующих приемах консервирования (включающих водную варку при температуре, близкой к 100°С, жаровые сушки) в связи с выщелачиванием и высокой температурой стимулирующая активность снижается на 20%, а гонадотропная до 27%. По гипотензивному тесту как сырые, так и консервированные панты одинаковы. Следует отметить, что необходимость консервирования обусловлена в основном малым сроком хранения сырых пантов после срезки (до 3-4 часов в зависимости от температуры окружающей среды). Однако нельзя отрицать и то, что температурное воздействие при водной варке и жаровых сушках благоприятно влияет на выход свободных аминокислот в связи с автолитическим распадом белков, что необходимо учитывать при отработке оптимальных параметров технологического процесса при получении биологически активного продукта из сырых пантов. Следует также сказать, что в настоящее время еще не налажен выпуск применяемого в качестве фермента ферментативного комплекса поджелудочной железы, что может затруднить переработку пантов в промышленном масштабе.
В процессе отработки оптимальных параметров способа было отмечено, что интенсификация процесса ферментации в значительной степени зависит от степени предферментативной подготовки пантовой муки, длительности всего процесса получения биологически активного продукта, включая время сушки, которое зависит от количества воды в системе.
Известен способ получения биологически активных веществ из сырых пантов, включающий измельчение пантов, экстракцию биологических веществ в экстрагентном, удаление нерастворимых веществ из экстракта, при этом перед измельчением панты замораживают, а после измельчения высушивают. Измельчение пантов проводят до порошкообразного состояния, а в качестве экстрагента используют подкисленную до рН 2,0-6,5 воду, в экстракт вводят этанол до 30-60%-ной концентрации. Полученную смесь выдерживают при (+4)-(20)°С, затем разделяют на жидкую фракцию - спиртовой экстракт биологически активных веществ и осадок, из которого удаляют спирт и высушивают (См. патент РФ № 2054292, МПК А61К 35/32, опубл. 20.02.1996 - прототип). Однако, длительное (24-64 часа) воздействие этилового спирта на порошок из пантов в данном способе оказывает отрицательное влияние на выход биологически активных веществ. Кроме этого, процесс длителен и требует наличия холодильного оборудования (при охлаждении этанола до минус 15°С и в период отстоя до минус 20°С).
Необходима разработка способа получения биологически активного продукта из сырых пантов, обеспечивающего его высокое качество, без использования агрессивной среды при сокращении длительности, упрощении технологических приемов процесса, расширит область применения биологически активных препаратов из пантов в связи с высоким содержанием гормонов и факторов роста.
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения биологически активного продукта из сырых пантов, характеризуется тем, что сырые замороженные панты очищают от механических загрязнений, моют, сушат при комнатной температуре при одновременном размораживании, затем измельчают до частиц размером 100 мкм, смешивают измельченные панты с водой в соотношении 1:5, смесь гомогенизируют в течение 5 минут и экстрагируют в течение 4 часов при температуре 90-93°С, охлаждают до 40°С и проводят ферментативный гидролиз при температуре 38-40°С и рН 4,5 в присутствии папаина активностью 30 тыс. ЕД из расчета 1-2% от веса пантов в течение 5 часов, после окончания гидролиза гидролизат центрифугируют и фильтруют, фильтрат выдерживают в течение 30 минут при 70°С и сушат при температуре 45-50°С в вакууме 0,9 атм.
Для отработки оптимальных параметров процесса был проведен ряд опытов. В первом опыте была выявлена биологическая активность продукта при 3-4-5-часовой экстракции размолотых сырых пантов при температуре 95-96°С и разведении панты: вода 1:4; 1:5; 1:6 (при наличии 5-минутной гомогенизации смеси) без проведения ферментации. Гомогенизация смеси перед экстракцией обеспечивала необходимую степень гомогенности без деструкции биологических составляющих смеси. При дальнейшем увеличении времени гомогенизации появлялись первые признаки деструкции.
В таблице 1 отражены результаты опыта.
Таблица 1
Показатели
Время экстракции (час) при соотношении панты: вода
3
4
5
1:4
1:5
1:6
1:4
1:5
1:6
1:4
1:5
1:6
Общие аминокислоты (мг/г)
251,1
278,4
282,6
277,3
356,1
360,4
328,2
349,0
358,1
Свободные аминокислоты (мг/г)
76,6
94,2
95,1
95,5
121,1
123,9
53,7
117,5
119,5
Липиды (мг/100 г)
1,8
2,7
2,75
2,6
3,9
4,0
2,7
3,7
3,7
Коллаген (мг/г)
326,4
375,1
370,1
370,2
402,6
412,3
362,5
397,0
403,4
Жирные кислоты, (г/100 г)
21,8
31,7
32,3
29,9
41,2
42,1
28,8
40,8
41,6
Витамины(мг/100 г)
281,1
314,4
318,3
309,6
532,3
540,8
288,5
515,3
522,5
Макроэлементы (мгк/г)
9924,0
104112,4
10314,6
10011,1
11322,4
11582,8
9694,3
11084,6
11228,7
Микроэлементы (мгк/г)
18,3
24,63
24,8
23,8
26,6
27,0
23,8
25,8
26,3
Гормоны (пг/г)
3713,6
4218,8
4245,4
4200,0
3925,2
3991,9
3768,8
3727,1
3809,1
Факторы роста (усл.ед)
1011,7
1262,1
1274,7
1204,2
1285,6
1315,2
1126,2
1262,4
1287,6
Биологическая активность, (%)
18,9
22,4
22,6
21,8
27,2
27,6
21,3
26,6
26,9
Как видно из таблицы 1, оптимальным режимом предферментативной подготовки экстракта следует считать 4-часовую экстракцию при разведении 1:5. Биологическая активность экстракта при этом находилась в пределах 27,2%. Следует отметить, что с увеличением времени экстракции наблюдалось снижение уровня гормонов в экстракте. Так, при сравнении уровня гормонов при 3 и 5-часовой экстракции (при разведении 1:5) уменьшение составило 11,7%. В данном случае возможно предположить отрицательное влияние высокой температуры и длительности экстракции. Поэтому в дальнейшем температура была снижена до 90-93°С, при этом процент снижения гормонов в оптимальном режиме составил всего 3%. Проведение высокотемпературной экстракции перед ферментацией было обусловлено тем, что согласно опыту консервирования пантов температурный фактор положительно влияет на автолитический процесс, а следовательно, и на выход свободных аминокислот. Далее, при разведении 1:6 во всех трех случаях (при 3-, 4-и 5 часовой экстракции) незначительно (на 1-2%) возрастало содержание полезных веществ, однако, с учетом того, что при этом количество воды в экстракте увеличивается на 20% (увеличивается и длительность сушки), данный параметр нельзя считать оптимальным.
Во втором опыте экстракт, полученный при оптимальном режиме (4-часовая экстракция при разведении 1:5) с биологической активностью 27,2% был подвергнут ферментации при 40°С. В качестве фермента был использован папаин активностью 30 тыс. ЕД при рН 4,5 и соотношении папаин: панты 1:500, 1:200, 1:100, 1:50 при 3-, 4-, 5-часовой длительности процесса (табл.2). Папаин - монотиоловая цистеиновая протеаза, которую получают из тропического многолетнего пальмоподобного растения - папайи или дынного дерева. Папаин содержит липазу, хитиназу, лизоцим, комплекс протеолитических ферментов, включающий: пептидазу (расщепляет белки на ди- и полипептиды), ренинподобный коагулирующий фермент (свертывает казеин молока), амилолитический фермент, свертывающий фермент, подобный пектазе, липолитический фермент. По характеру ферментативного действия его называют «растительным пепсином», но в отличие от пепсина он активен не только в кислых, но и в нейтральных и щелочных средах (диапозон рН 3-12, оптимум при рН 5). Папаин расщепляет белки до полипептидов и аминокислот, причем гидролизует любые пептидные связи. Он обладает большей способностью к расщеплению белка по сравнению с другими протеазами животного и бактериального происхождения.
Как видно из таблицы 2, оптимальным режимом процесса ферментации экстракта следует считать 5-часовую ферментацию при соотношении папаин : панты 1:100-1:50 (100 и 50 г пантов содержится в 600 и 300 г экстракта, полученного в оптимальном режиме экстракции). Основанием для данного вывода служит то, что при этом технологическом режиме степень гидролиза белков была на уровне 69-79% и наблюдался высокий выход жирных кислот, гормонов и факторов роста. Биологическая активность при этом составила 44,7-45,3%. Следует отметить, что биологическая активность продукта из консервированных пантов по заявленному способу составила 34,4%. Степень роста прочих показателей была несколько ниже. Так при сравнении показателей 4- и 5-часовой ферментации (соотношение 1:100) рост жирных кислот, гормонов и факторов роста составил 39,8, 37,2, 17,5%, соответственно, в то время, как рост витаминов и липидов 13,2 и 13,5%. Факторы роста, подобно гормонам, обладают широким спектром биологического воздействия на многие клетки организма. Они стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис и дифференцировку клеток. В данной работе было представлено суммарное содержание инсулиноподобных (1 и 2), эпидермального, α-, β-трансформирующих, цилиарного нейротрофического факторов роста, а также факторов роста нервов и костного морфогенетического протеина. Действие факторов роста необходимо рассматривать в связи с другими стимуляторами и, прежде всего, с гормонами. Так, инсулиноподобный фактор роста-1 является, например, важнейшим эндокринным посредником действия соматотропного гормона. В частности факторы роста стимулируют развитие костно-мышечной системы, обеспечивают лечение заболеваний пищеварительного тракта, оказывают омолаживающее действие на организм и т.д.
В связи с выявленным (различными исследованиями) спектром действия гормонов и факторов роста их высокое содержание в сухих продуктах, изготовленных из сырых пантов по заявленному способу, в свою очередь может расширить область применения биологически активных препаратов из пантов.
В процессе разработки способа содержание гормонов и факторов роста определяли иммуноферментным методом с применением стандартных диагностических наборов немецкой фирмы JBL, американской DSL, EGF, B&D Systems, CHEMICON, австрийской Benoler Medsystems по общепринятым методикам, жирокислотный состав - методом газожидкостной хромотографии, витамины - методом инфракрасной спектроскопии, минеральный состав - методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (МС-ИСП) и атомно-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (АЭС-ИСП), аминокислотный состав - на аминоанализаторе «Hitachi L 8800», общие аминокислоты и коллаген анализатором «Hitachi-835», биологическая активность по фармстатье ФС 42-0041-0860-01.
Пример. Два килограмма сырых замороженных пантов очищали от механических загрязнений с последующей мойкой и сушкой пантов при комнатной температуре при одновременном размораживании. Далее панты измельчали на костедробилке, а затем на мельнице до частиц размером 100 мкм. К 2 кг пантовой муки добавляли 10 л дистиллированной воды (при соотношении 1:5) и гомогенизировали взвесь в течение 5 минут, после чего в течение 4 часов при 90-93°С экстрагировали в экстракторе ЭКО-5. По истечении времени экстракции экстракт охлаждали до 40°С, добавляли 40 г папаина активностью 30 тыс. ЕД (2% к массе пантов) и ферментировали в течение 5 часов при постоянном, каждые 30 минут, перемешивании гидролизата и температуре 38-40°С. По окончанию процесса гидролизат подвергали центрифугированию и фильтрованию. Фильтрат нагревали до 70°С и выдерживали 30 минут для инактивации папаина. Сушку фильтрата проводили в вакуумной сушилке при температуре 45-50°С и 0,9 атм. Сухой порошок влажностью 4-5% расфасовывали в герметичную вакуумную упаковку.
Таким образом, технологические приемы заявленного способа получения биологически активного продукта из сырых пантов обеспечивают его высокое качество без использования агрессивной среды (этилового спирта), сокращают длительность и упрощают процесс получения конечного продукта, что при высоком содержании гормонов и факторов роста обеспечивает расширение спектра использования продукта. В способе отработан фермент, более приемлемый в настоящее время в промышленной переработке пантов.