СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД
METHOD OF PREPARING NUTRIENT BASE FOR MICROBIOLOGICAL MEDIA

Изобретение относится к биотехнологии, предназначено для получения основы для приготовления микробиологических питательных сред из сырья морского генеза и может быть использовано в медицинской и технической микробиологии, в научно-исследовательской и практической работе для выделения и культивирования микроорганизмов.
Проблема поиска субстратов из сырья морского генеза, пригодных для изготовления микробиологических питательных сред, является актуальной, так как направлена на использование альтернативных источников сырья, которые не используют важные для человека продукты питания. Гидролизаты из морепродуктов, например гидролизаты из рыбного сырья, относятся к таким источникам, а питательные среды, приготовленные на их основе, используются для биотехнологического производства вакцин, сывороток и др. медицинских и ветеринарных препаратов. В связи с тем, что рыбные гидролизаты недостаточно сбалансированы по ряду питательных элементов, например к аминокислотам, целесообразно создать основу из сырья морского генеза, которая отвечает по аминному азоту (не менее 600 мг %) рН и другим показателям, условиям использования для приготовления питательных, специальных и дифференцированно диагностических сред.
Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому изобретению «Способ получения питательной основы микробиологических сред» является «Способ получения основы микробиологических сред» (см. патент RU № 2001101, МПК C12N1/20), который включает измельчение рыбного сырья, приготовление гомогената рыбного сырья для гидролиза путем разведения измельченного рыбного сырья водой, гидролиз гомогената рыбного сырья при нагревании, прогревание гидролизата из рыбного сырья и отделение неразгидролизованных белков. Сущностью известного способа получения основы микробиологических сред является то, что измельченные внутренние органы промышленных рыб смешивают с водой в соотношении 1:1,5, выдерживают при 40-42°С в щелочной зоне рН 7,6-8,0 в присутствии хлороформа при перемешивании на протяжении 2-2,5 суток, с последующим прогреванием при 90°С на протяжении 5-10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, отделением неразгидролизованных белков и высушиванием конечного продукта.
Недостаток известного способа заключается в том, что в качестве сырья используют только непищевые отходы переработки рыбы, что ограничивает сырьевую базу, а с другой стороны, снижает качественный состав получаемых питательных сред из-за недостаточной сбалансированности по ряду аминокислот и других питательных элементов. Кроме того, наличие в технологическом процессе взрывоопасного и токсичного для персонала хлороформа не позволяет организовать экологически чистое производство.
В основу изобретения «Способ получения питательной основы микробиологических сред» поставлена задача путем расширения сырьевой базы улучшить качество основы питательной среды, ее сбалансированность по ряду аминокислот и других питательных элементов, а также обеспечить улучшение экологических условий производства путем исключения из технологического цикла пожаро- и взрывоопасных органических растворителей (хлороформ).
Поставленная задача достигается тем, что способ получения питательной основы для микробиологических сред включает измельчение рыбного сырья, приготовление гомогената рыбного сырья для гидролиза путем разведения измельченного рыбного сырья водой, гидролиз (автолиз) гомогената рыбного сырья при нагревании, прогревание гидролизата из рыбного сырья и отделение неразгидролизованных белков. При этом дополнительно получают щелочной гидролизат из моллюсков, а гидролиз гомогената рыбного сырья выполняют в кислотной среде и полученный кислотный гидролизат из рыбного сырья соединяют со щелочным гидролизатом из моллюсков в соотношении 1:3-3:1, чтобы количество аминного азота была в пределах 600-900 мг%. При приготовлении кислотного гидролизата из рыбного сырья к гомогенату рыбного сырья прибавляют 18-20%-ный раствор соляной кислоты до рН 4,5-5,0 и нагревают до 45-50°С на протяжении 22-26 ч, потом прибавляют концентрированную ортофосфорную кислоту до остаточной концентрации кислоты на уровне 2% и осуществляют прогревание гомогената рыбного сырья при 100°С на протяжении 22-26 ч, потом гидролизат из рыбного сырья нейтрализуют добавлением 40%-ного раствора едкого натра до рН 6,8-7,4. При приготовлении щелочного гидролизата из моллюсков к измельченному сырью из моллюсков прибавляют 1,0%-ный раствор едкого натра в соотношении 1:1 и осуществляют гидролиз при 80°С на протяжении 20-24 ч, потом гидролизат из моллюсков нейтрализуют добавлением концентрированной соляной кислоты до рН 6,8-7,4. Гидролиз сырья из моллюсков осуществляют до получения количества аминного азота в пределах 240-450 мг %. Объединение кислотного гидролизата из рыбного сырья со щелочным гидролизатом из моллюсков осуществляют до операции нейтрализации гидролизата из рыбного сырья со следующим корректированием кислотности биомассы до рН 6,8-7,4. Кислотность полученной основы для микробиологических питательных сред корректируют до рН 7,0.
Изобретение поясняется иллюстрацией. На фиг.1 - содержание аминного азота в гидролизатах.
Способ, заявляемый как изобретение, характеризуется тем, что:
- гидролиз сырья из моллюсков осуществляют до получения количества аминного азота в пределах 240-450 мг %, а кислотный гидролизат из рыбного сырья смешивают с изготовленным щелочным гидролизатом из моллюсков, чтобы количество аминного азота питательной основы было в пределах 600-900 мг %;
- соединение кислотного гидролизата из рыбного сырья со щелочным гидролизатом из моллюсков осуществляют до операции нейтрализации гидролизата из рыбного сырья со следующим корректированием кислотности биомассы до рН 6,8-7,4;
- кислотность полученной основы для микробиологических питательных сред корректируют до рН 7,0.
Нашими исследованиями установлено, что для достижения оптимального качества основы для приготовления микробиологических питательных сред из сырья морского генеза целесообразно соединение щелочного гидролизата из моллюсков с кислотным гидролизатом из рыбного сырья. При этом экспериментально (см. фиг.) установлено, что:
1) соотношение объема щелочного гидролизата из моллюсков к объему кислотного гидролизата из рыбного сырья должно находиться в пределах 1:33:1 до достижения количества аминного азота в пределах 600-900 мг %;
2) при приготовлении кислотного гидролизата из рыбного сырья к гомогенату рыбного сырья следует прибавить раствор соляной кислоты в пределах 18-20% до рН в пределах 4,5-5,0;
3) гомогенат рыбного сырья следует нагревать в пределах 45-50°С на протяжении 22-26 ч;
4) добавление в гомогенат рыбного сырья концентрированной ортофосфорной кислоты до остаточной концентрации кислоты на уровне 2% является оптимальным;
5) прогревание гомогената рыбного сырья следует осуществлять при 100°С на протяжении 22-26 ч;
6) нейтрализацию гидролизата из рыбного сырья следует осуществлять добавлением 40%-ного раствора едкого натра до рН в пределах 6,8-7,4;
7) при приготовлении щелочного гидролизата из моллюсков к измельченному сырью из моллюсков следует прибавлять 1,0%-ный раствор едкого натра в соотношении 1:1;
8) гидролиз сырья из моллюсков оптимально осуществлять при 80°С на протяжении 20-24 ч;
9) нейтрализовать гидролизат из моллюсков целесообразно добавлением концентрированной соляной кислоты до рН в оптимальных границах 6,8-7,4;
100 гидролиз сырья из моллюсков следует осуществлять до получения количества. аминного азота в пределах 240-450 мг %;
11) с целью снижения содержимого солей в конечном продукте возможно соединение продуктов гидролиза рыбы с продуктами гидролиза мидий до стадии нейтрализации с последующим корректированием кислотности конечного продукта до рН 6,8-7,4;
12) корректирование кислотности полученной основы для микробиологических питательных сред до рН 7,0 обусловлено необходимостью получения основы с биологическими значениями рН;
Способ получения питательной основы микробиологических сред осуществляется таким образом. В качестве сырья используют любые мелкие виды промышленных рыб - тюльку, хамсу и т.п., преимущественно черноморский шпрот, а также моллюски, преимущественно мидии. Размерный состав рыбы, а также минимальная длина моллюсков, которые добывают на естественных банках, или культивируют в марихозяйствах, сезоны и районы их улова устанавливаются правилами рыболовства. Срок хранения сырья со дня улова до переработки определяется соответствующими технологическими инструкциями и санитарно-гигиеническими требованиями. В замороженном виде сырье сохраняется до шести месяцев. Свежую необработанную рыбу пропускают через измельчитель для получения фарша. Фарш засыпают в реактор из нержавеющий стали или стекла. Туда прибавляют дистиллированную воду в соотношении 1:1,5 объема фарша к воде и 18-20%-ный раствор соляной кислоты до рН 4,5-5,0 и нагревают до 45-50°С. Гидролиз фарша для приготовления сред проводят на протяжении 24 ч. Для прекращения действия литичных ферментов в автолизат прибавляют концентрированную ортофосфорную кислоту до конечной концентрации кислоты 2% и повышают нагрев смеси до 100°С на протяжении 24 ч для удаления неприятного запаха. Полученный гидролизат нейтрализуют добавлением 40%-ного раствора едкого натра (NaOH) до рН 6,8-7,4. Окончание гидролиза контролируют по содержимому аминного азота соответственно. Его количество должна быть в пределах 600-900 мг %. Полученные гидролизаты смешивают в соотношении 1:1 или 1:4 объема щелочного гидролизата из мидии к автолизату из рыбы, чтобы количество аминного азота была не менее 600 мг %. При этом возможно выпадение в осадок агрегатирующих высокомолекулярных полипептидов и изменение рН. Полученную основу питательной титровальной среды корректируют до рН 7,0 добавлением 40%-ного раствора едкого натра (NaOH). Осадок агрегирующих высокомолекулярных полипептидов отделяют центрифугированием. Жидкий надосадок фасуют в хорошо вымытые стеклянные флаконы, закупоривают резиновыми пробками, герметизируют колпачками алюминиевыми и выдерживают в автоклаве при 0,6 атм. на протяжении 30 мин.
Примеры реализации способа
Пример № 1.
700 г замороженного шпрота пропускали через электромясорубку для получения фарша. Фарш засыпали в стакан и прибавляли 1100 мл дистиллированной воды. При беспрерывном перемешивании к смеси прибавляли 6 мл 20%-ного раствора соляной кислоты до рН 4,85. Смесь поместили в 2-х литровую колбу в термостат и нагревали до 45-50°С. Гидролиз фарша проводили на протяжении 24 ч. Для прекращения действия литических ферментов в автолизат домешивали 39,5 мл 95%-ной ортофосфорной кислоты и повысили нагревание смеси до 100°С. Гидролиз проводили на протяжении 24 ч до удаления неприятного запаха. Полученный гидролизат нейтрализовали добавлением 35 мл 40%-ного раствора едкого натра (NaOH) до рН 6,86.
Нейтрализованный гидролизат фильтровали для отделения костных остатков и негидролизованного остатка. Фильтрат осветляли центрифугированием. Супернатант переносили в делительную воронку, где декантацией отделяли жир. Выход составил 1250 мл готового продукта, удерживающего 12,7% сухого вещества и 0,9% аминного азота.
1,1 кг замороженной мидии пропустили через электромясорубку для получения фарша. Фарш засыпали в реактор из нержавеющий стали и прибавляли 1100 мл 2%-ного раствора едкого натра в соотношении 1:1 объема фарша к раствору щелочи. Гидролиз вели на протяжении 24 ч при температуре 80°С. Конец гидролиза контролировали по содержимому аминного азота. Его количество должно быть в пределах 240-450 мг %. Гидролизат отделяли от створки фильтрованием. Фильтрат нейтрализовали 80 мл 37%-ной соляной кислоты до рН 6,9. Механические примеси и осадок отделяли центрифугированием. Выход составил 1800 мл готового продукта, удерживающего 10,6% сухого вещества и 0,27% аминного азота.
100 мл щелочного гидролизата мидии смешивали с 300 мл автолизата шпрота. Осадок агрегирующих белков отделяли центрифугированием. Выход составил 395 мл готового продукта, который содержал 11,8% сухого вещества и 0,74% аминного азота.
Пример № 2.
700 г свежемороженого шпрота измельчали на электромясорубке и смешивали с 1200 мл дистиллированной воды. К смеси прибавляли 3,5-4 мл концентрированной соляной кислоты для доведения рН до 4,5-5,0. Смесь переносили в стеклянную колбу объемом 2 л, горловину затыкали стерильной ватной пробкой и колбу помещали в термостат на 24 ч при температуре 45-50°С. Через 24 ч в колбу прибавляли 40 мл 95%-ной ортофосфорной кислоты и температуру повышали до 100°С. Гидролиз продолжали на протяжении 24 ч. Полученный гидролизат отделяли фильтрованием от непереваренных костных остатков.
1 кг замороженной мидии заливали 1 л 2%-ного раствора едкого натра и гидролизовали на протяжении 24 ч. Полученный гидролизат отделяли от створок мидий фильтрованием.
Кислый автолизат шпрота нейтрализовали щелочным гидролизатом мидии и рН доказывали к нейтральному добавлением 3-5 мл соляной кислоты. Раствор освещали центрифугированием при 3000 об/мин на протяжении 30 мин. Супернатант обезжиривали декантацией в делительной воронке. Выход готового продукта 3,6 л.
Полученная композиция гидролизата представляет собой прозрачную жидкость желто-коричневого цвета и содержит комплекс аминокислот, пептидов, витаминов, макро- и микроэлементов и предназначена для использования как основа для приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов при изготовлении ветеринарных иммунобиологических препаратов, а также как основа для приготовления специальных и дифференцированно диагностических сред для культивирования микроорганизмов с целью определения возбудителей заболеваний в диагностических лабораториях.
При использовании изобретения достигнут технический результат, который заключается в расширении сырьевой базы при получении питательной основы для микробиологических сред и улучшения экологических условий производства. В заявленном технологическом процессе не используется такое взрывоопасное и токсичное для персонала вещество как хлороформ.
Заявлена основа питательной среды, изготовленная из сырья морского генеза. Она обогащена трофическими ценными веществами из гидролизатов организмов разных таксономических групп, преимущественно рыб и моллюсков, и содержит аминный азот не менее 600 мг %. Основа может быть разбавлена водой, например, к содержимому аминного азота в питательной среде до 60-120 мг %. Это обеспечит содержимое хлорида натрия в готовой среде на равные, что не превышает 0,5%, и будет отвечать составу мясопептонов, рекомендованных для культивирования большого количества видов бактерий.