СПОСОБЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

1. Способ количественного определения содержания полипептида, содержащего участок константной области тяжелой цепи антитела, в образце, включающий
(а) расщепление образца, содержащего полипептид, включающий участок константной области тяжелой цепи антитела, где участок константной области тяжелой цепи антитела содержит сконструированную мутацию, и где в результате расщепления образуется пептидный фрагмент, полученный из константной области тяжелой цепи антитела, который имеет длину от 5 до 26 аминокислот и содержит сконструированную мутацию; и
(b) анализ расщепленного образца масс-спектрометрией для определения количества пептидного фрагмента, тем самым определения количества полипептида, составляющего участок константной области тяжелой цепи антитела, в образце.
2. Способ по п.1, где пептидный фрагмент не содержит метионин (М) или цистеин (С).
3. Способ по п.1 или 2, где пептидный фрагмент не содержит аспарагин (N), за которым следует глицин (G) или серин (S).
4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий очистку и концентрирование расщепленного образца перед масс-спектрометрическим анализом.
5. Способ по п.4, где расщепленный образец очищают и концентрируют посредством твердофазной экстракции (SPE).
6. Способ по п.4, где расщепленный образец очищают и концентрируют посредством SISCAPA (стабильные изотопные стандарты с захватом антипептидными антителами).
7. Способ по любому из пп.1-6, где образец представляет собой образец цельной крови, образец сыворотки, образец плазмы или образец ткани.
8. Способ по любому из пп.1-7, где образец отобран у мыши, примата, отличного от человека, или человека.
9. Способ по п.8, где примат, отличный от человека, представляет собой обезьяну cynomolgus или макаку-резус.
10. Способ по любому из пп.1-9, где образец расщепляют, по меньшей мере, одним ферментом.
11. Способ по п.9, где, по меньшей мере, один фермент представляет собой трипсин, химотрипсин, глутамилэндопептидазу, лизилэндопептидазу, Asp-N, Arg-C, Glu-C, цианогенбромид (CnBr) или их комбинации.
12. Способ по любому из пп.1-11, где масс-спектрометрия представляет собой жидкостную хроматографию-тандемную масс-спектрометрию (ЖХ-МС/МС).
13. Способ по любому из пп.1-12, где полипептид содержит домен CH1, и где домен CH1 включает сконструированную мутацию.
14. Способ по любому из пп.1-12, где полипептид содержит домен CH2, и где домен CH2 включает сконструированную мутацию.
15. Способ по любому из пп.1-12, где полипептид содержит домен СН3, и где домен СН3 включает сконструированную мутацию.
16. Способ по п.15, где сконструированная мутация в домене CH3 константной области тяжелой цепи антитела представляет собой T366Y, T366W, T366S, L368A, T394W, T394S, F405A, F405W, Y407T, Y407V или Y407A.
17. Способ по п.16, где сконструированная мутация в домене СН3 константной области тяжелой цепи антитела представляет собой Y407V, и где домен СН3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6 (DGSFFLVS).
18. Способ по п.17, где в результате расщепления образуется пептидный фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность TTPPVLDSDGSFFLVSK (SEQ ID NO: 7), DGSFFLVSKLTV (SEQ ID NO: 8) или GSFFLVSKLTVD (SEQ ID NO: 9).
19. Способ по п.18, где образец расщепляют трипсином, и где в результате расщепления образуется пептидный фрагмент, состоящий из аминокислотной последовательности TTPPVLDSDGSFFLVSK (SEQ ID NO: 7).
20. Способ по п.18, где образец расщепляют Asp-N, и где в результате расщепления образуется пептидный фрагмент, состоящий из аминокислотной последовательности DGSFFLVSKLTV (SEQ ID NO: 8).
21. Способ по п.18, где образец расщепляют Glu-C, и в результате расщепления образуется пептидный фрагмент, состоящий из аминокислотной последовательности GSFFLVSKLTVD (SEQ ID NO: 9).
22. Способ по любому из пп.16-21, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.
23. Способ по п.15, где сконструированной мутацией в домене СН3 константной области тяжелой цепи антитела является N434S.
24. Способ по п.23, где образец расщепляют Glu-C и трипсином, и где в результате расщепления образуется пептидный фрагмент, состоящий из аминокислотной последовательности ALHSHYTQK (SEQ ID NO: 11).
25. Способ по п.23 или 24, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
26. Способ по любому из пп.1-5, где полипептид, содержащий участок константной области тяжелой цепи антитела, представляет собой антитело, Fc-слитый белок или иммуноадгезин.
27. Способ по п.26, где полипептид, содержащий участок константной области тяжелой цепи антитела, представляет собой антитело.
28. Способ по п.27, где антитело представляет собой терапевтическое антитело.
29. Способ по п.27 или 28, где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.
30. Способ по любому из пп.27-29, где антитело представляет собой моноспецифическое антитело, биспецифическое антитело, триспецифическое антитело или мультиспецифическое антитело.
31. Способ по п.30, где антитело представляет собой триспецифическое антитело.
L2
1
L1
2
L
H1
3
H2
4
H1
H2
H3
H3
H1
H2
H3
L3
L
L1
L2
L3
H1
H2
H3
L
Н1
Н1
1
2
3
4
32. Способ по п.31, где триспецифическое антитело содержит четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих участка, которые специфически связывают одну или более антигенов-мишеней или белков-мишеней, где первый полипептид содержит структуру, представленную формулой: V-L-V-L-C; вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой: V-L-V-L-C-шарнирная область-C-C; третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой: V-C-шарнирная область-C-C; четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой: V-C, где V представляет первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина; V представляет второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина; V представляет третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина; V представляет первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина; V представляет второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, V представляет третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина; C представляет константный домен легкой цепи иммуноглобулина; С представляет константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина С; и L, L, L и L представляют аминокислотные линкеры; где первый и второй полипептиды образуют пару легкая цепь-тяжелая цепь в ориентации крест-накрест; и где вторая полипептидная цепь или третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность TTPPVLDSDGSFFLVSK (SEQ ID NO: 7), DGSFFLVSKLTV (SEQ ID NO: 8) или GSFFLVSKLTVD (SEQ ID NO: 9).
33. Способ по п.32, где первый полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12; второй полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13; третий полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и четвертый полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.
34. Способ по любому из пп.27-33, где антитело конъюгировано с лекарственным средством или меткой.
35. Способ по п.34, где лекарственное средство выбрано из химиотерапевтического агента, цитотоксического агента или агента, ингибирующего рост.
36. Способ по п.35, где метка представляет собой радиоизотоп, флуоресцентный краситель или фермент.
37. Способ по любому из пп.27-36, где антитело представляет собой IgG антитело человека.
38. Способ по п.37, где IgG антитело представляет собой IgG1 антитело человека или IgG4 антитело человека.
39. Способ по любому из пп.27-32 и 34-38, где антитело связывается с A2AR, APRIL, ATPDазой, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4/VTCN1, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1a, CCL4/MIP-1b, CCL5/RANTES, CCL7/MCP-3, CCL8/mcp-2, CCL11/эотаксином, CCL15/MIP-1d, CCL17/TARC, CCL19/MIP-3b, CCL20/MIP-3a, CCL21/MIP-2, CCL24/MPIF-2/эотаксином-2, CCL25/TECK, CCL26/эотаксином-3, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23/FCER2, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80/B7-1, CD86/B7-2, CD122, CD137/41BB, CD137L, CD152/CTLA4, CD154/CD40L, CD160, CD272, CD273/PDL2, CD274/PDL1, CD275/B7H2, CD276/B7H3, CD278/ICOS, CD279/PD-1, CDH1/E-кадгерином, хитиназой, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1/M-CSF, CSF-2/GM-CSF, CSF-3/GCSF, CX3CL1/SCYD1, CXCL12/SDF1, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролазой 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb/IL25, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4/интегрином-b4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, лептином, LPFS2, MHC класса II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDазой-1, OX40, OX40L, PD-1H, рецептором тромбоцитов, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2/рецептором для IL33, STEAP2, киназой Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP/ IL7Ra, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM или XCR/GPR5/CCXCR1.
40. Способ по любому из пп.1-39, где способ предназначен для применения в фармакокинетическом исследовании полипептида, содержащего константную область тяжелой цепи антитела у мыши, примата, отличного от человека, и человека.