СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD FOR PHOTO-ACTIVATED TREATMENT OF TUMOUR CELLS FOR PRODUCING CELLULAR AGENTS

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной онкологии и может быть использовано при фотодинамической обработке клеток для приготовления клеточных препаратов.
Известен способ фотодинамической обработки клеток для приготовления клеточных препаратов, состоящий из двухэтапной фотодинамической обработки клеток ex vivo (WO 2016/131960, опубл. 25.08.2016).
Недостатком данного способа является введение фотосенсибилизатора непосредственно в культуральную клеточную среду, что не учитывает фармакокинетику фотосенсибилизатора в организме животного.
Техническим результатом изобретения является возможность создания клеточных препаратов из опухолевых клеток с учетом фармакокинетики фотосенсибилизатора в организме животного, исследование зависимости уровня накопления фотосенсибилизатора от введенной дозы и времени накопления.
2
Указанный технический результат достигается в способе фотодинамической обработки опухолевых клеток для приготовления клеточных препаратов, включающий обработку клеток фотосенсибилизатором и последующую их фотоактивацию, отличающийся тем, что перевиваемые клетки опухоли Эрлиха вводят в организм мыши подкожно, после достижения размера опухоли 10х10 мм вводят фотосенсибилизатор радахлорин в дозе 10 мг/кг или фотодитазин в дозе 5 мг/кг в организм мыши, после извлечения опухоли из организма животного, до или послеприготовления из опухоли взвеси опухолевых клеток, проводят фотоактивацию клеток опухоли путем облучения лазером с длиной волны 662 нм в дозе 300 Дж/см.
Способ подтверждается следующими экспериментальными примерами.
Пример 1. Способ фотодинамической обработки клеток карциномы Эрлиха ex vivo при введении фотосенсибилизатора (ФС, Радахлорин, ООО «РАДА-ФАРМА», Россия) мышам-самкам линии BALB/c с привитой подкожно опухолью Эрлиха.
5
3
Мышам-самкам линии BALB/c проводили подкожную перевивку опухоли Эрлиха в область бедра в количестве 5×10 опухолевых клеток. При достижении размера опухоли 10×10 мм животным однократно вводили фотосенсибилизатор (Радахлорин, 10 мг/кг). Накопление ФС оценивается с помощью системы неинвазивной визуализации флуоресценции «Флуовизор» (ООО «Аткус», Россия) с длиной волны возбуждения - 660 нм и регистрацией флуоресценции в инфракрасном диапазоне длин волн. Через 6 часов после накопления фотосенсибилизатора в опухолевой ткани при высокой интенсивности флуоресценции фотосензибилизатора в опухоли (Табл.) проводится эвтаназия, выделяется опухоль. Из выделенной опухоли готовится взвесь опухолевых клеток. Опухолевые кусочки измельчают с помощью ножниц, протирают через простерилизованное мелкоячеистое металлическое сито. К полученной измельченной опухолевой ткани добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида. Взвесь клеток собирают в стерильный шприц и дополнительно измельчают путем пропускания ее с помощью шприца через иглы меньших диаметров. Проводят контроль клеточности полученной суспензии (подсчет в камере Горяева). Полученная взвесь клеток подвергается фотоактивации облучением лазером Алод (ООО «Алком медика», Россия) с длиной волны 662 нм. Лазерное излучение подводят световодом с линзой для наружного облучения (ООО «Полироник», Россия), которая формирует равномерное пятно в зоне воздействия диаметром от 10 до 20 мм в зависимости от размера опухоли. Мощность излучения составляла от 0,5 до 1,2 Вт, время - от 8 до 13 мин. Плотность энергии или доза энергии во всех экспериментах составила 300 Дж/см. Получали препарат клеток для последующего применения.
Гибель всех или части клеток подтверждается следующими экспериментальными примерами.
Пример 2. Способ фото динамической обработки клеток карциномы Эрлиха ex vivo при введении фотосенсибилизатора (Фотодитазин) с получением препарата клеток в виде взвеси после фотоактивации лазерным облучением и последующей имплантацией мышам с оценкой приживаемости.
6
2
На первом этапе девяти мышам подкожно имплантировали 10 клеток опухоли Эрлиха. Через 7-10 дней после перевивки, когда размеры опухоли составляли 10×10 мм, мышам вводили Фотодитазин (5 мг/кг, ООО «Вета Гранд», Россия) внутрибрюшинно однократно за 4 часа до выделения клеток и их фотоактивации (время определено как оптимальное в дополнительных опытах по накоплению ФС). Спустя 4 часа от введения ФС опухоль выделяли из организма мыши. Далее из опухолевой ткани без макроскопических признаков некроза готовили препарат в виде взвеси опухолевых клеток (как в примере 1), проводили подсчет в камере Горяева. Затем по 4,5 млн клеток от каждой опухоли помещали в 2 лунки 6-луночного плоскодонного культурального планшета с низкой адгезией. В одной лунке опухолевые клетки подвергали лазерной фотоактивации, а вторая служила контролем. Фотоактивация ФС осуществлялась с помощью лазерного аппарата Алод (ООО «Алком медика», Россия), длина волны лазера - 662 нм. Световодом с линзой для наружного облучения (ООО «Полироник», Россия) формировали равномерное пятно в зоне воздействия диаметром от 11 до 25 мм в зависимости от размера объекта облучения, мощность излучения составляла от 0,6 до 1,5 Вт, плотность энергии, или доза облучения во всех экспериментах составила 300 Дж/см.
3
3
3
На втором этапе по 1,5 млн опухолевых клеток из каждой лунки перевивали трем здоровым мышам подкожно. За мышами вели наблюдение с регистрацией размеров опухоли в течение 32 суток. Приживаемость опухолевой взвеси в данной модификации способа составила 100% во всех группах. При введении мышам-реципиентам препарата клеток без фотоактивации фотодитазина объем опухоли к 32-м суткам составил 3,14±1,47 см, а при его фотоактивации уменьшался до 1,67±0,26 см. В группе контроль с воздействием лазером к 32-м суткам объем опухоли достигал 2,74±0,29 см. Таким образом, получено торможение роста опухоли 39% по сравнению с контролем с фотоактивацией, свидетельствующее о гибели большой части клеток в полученном препарате и/или цитостатическом эффекте в отношении опухолевых клеток в полученном препарате.
Пример 3. Способ фото динамической обработки клеток карциномы Эрлиха ex vivo при введении фотосенсибилизатора (Фотодитазин) с выделением кусочка ткани опухоли из организма мыши, проведения фотоактивации лазерным облучением и приготовлением препарата клеток в виде взвеси с последующей имплантацией их мышам с оценкой приживаемости.
6
На первом этапе девяти мышам подкожно имплантировали 10 клеток опухоли Эрлиха. Через 7-10 дней после перевивки, когда размеры опухоли составляли 10×10 мм, мышам вводили Фотодитазин (5 мг/кг, ООО «Вета Гранд», Россия) внутрибрюшинно однократно за 4 часа до выделения кусочка опухоли и его фотоактивации (время определено как оптимальное в дополнительных опытах по накоплению ФС). Спустя 4 часа от введения ФС опухоль выделяли из организма мыши, получали кусочек без макроскопических признаков некроза.
После проведения фотоактивации из кусочка опухоли готовили препарат в виде взвеси опухолевых клеток (как в примере 1), проводили подсчет клеточности в камере Горяева.
На втором этапе по 1,5 млн опухолевых клеток из каждой лунки перевивали трем здоровым мышам подкожно. За мышами вели наблюдение с регистрацией размеров опухоли в течение 32 суток. Приживаемость опухолевой взвеси второй модификации в группе с фотоактивацией составила 33,3%, в группе без лазерного воздействия - 83,3%, что свидетельствует о цитотоксическом эффекте в отношении опухолевых клеток в полученном препарате.
Способ обеспечивает возможность создания клеточных препаратов из опухолевых клеток с учетом фармакокинетики фотосенсибилизатора в организме животного, исследование зависимости уровня накопления фотосенсибилизатора от введенной дозы и времени накопления.