Способ оценки безопасности химической продукции для здоровья человека
METHOD FOR ASSESSMENT OF SAFETY OF CHEMICAL PRODUCTS FOR HUMAN HEALTH

Изобретение относится к медицине, сфере исследований и испытаний безопасности химической продукции для здоровья человека, в частности, к лабораторной технике, и может быть использовано для выявления у тестируемой химической продукции способности вызывать повреждение (раздражение) кожных покровов.
Отдельные виды продукции обоснованно считаются потенциально опасными для здоровья человека. К ним относятся химические вещества, лекарственные препараты и косметические средства. В России и в мире законодательно закреплено, что оборот таких продуктов (ввоз в страну или производство) может быть разрешен только после предварительных лабораторных испытаний, устанавливающих степень их опасности (безопасности) для здоровья человека. Такие испытания проводятся в сертифицированных лабораториях по специально установленным методикам.
В настоящее время все используемые на территории РФ химические вещества должны проходить процедуру токсикологических исследований, соответствовать ряду санитарно-гигиенических требований и требованиям безопасности. Процесс установления таких требований регулируется государственным стандартом (ГОСТ) 32419-2013 «Классификация опасности химической продукции. Общие требования». Согласно этому документу, в отношении химической продукции в обязательном порядке должна быть оценена ее потенциальная опасность для здоровья человека. При этом должны быть оценены следующие виды возможного повреждающего действия химической продукции на организм человека:
- острая токсичность при общем воздействии на организм;
- способность вызывать раздражение или разъедание (коррозию) кожи;
- способность вызывать серьезные повреждения/раздражение глаз;
- сенсибилизирующее действие;
- мутагенность;
- канцерогенность;
- негативное влияние на репродуктивную функцию;
- избирательная токсичность в отношении органов-мишеней при однократном и продолжительном воздействии;
- опасность при аспирации.
Настоящее изобретение касается испытаний безопасности химической продукции в части раздражающего/коррозивного действия на кожу. При этом под коррозией кожи (разъеданием кожи) подразумевается крайнее проявление раздражающего действия.
Известен способ оценки наличия раздражающего/коррозивного действия тестируемой химической продукции в лабораторных тестах с использованием лабораторных животных (тест Драйза) [1]. Метод заключается в поверхностном нанесении исследуемого химического вещества на кожу кроликов и последующей визуальной оценке необратимых или обратимых изменений кожи животного в баллах.
Недостатками данного метода является необходимость использования значительного количества лабораторных животных, создание необходимых условий для их содержания, причинение страданий лабораторным животным, а также неточность результата, определяемая особенностями видоспецифического ответа кожи животных и человека на однотипное воздействие, а также индивидуальными особенностями реакции на воздействие различных организмов одного и того же вида.
Важно отметить, что метод Драйза не направлен на анализ системного ответа организма на тестируемое воздействие, а учитывает лишь локальный местный ответ конкретного органа - кожи. Поэтому, с развитием клеточной биологии, стал актуальным вопрос о возможности испытаний влияния ряда продуктов на кожу человека в тестах in vitro. В результате, на смену теста Драйза пришли альтернативные методические подходы для оценки безопасности химических веществ в отношении кожных покровов, не предполагающие использование лабораторных животных.
Известен способ оценки общей токсичности химических веществ с использованием в качестве объекта исследований кератиноцитов человека клеточной линии НаСаТ. Клетки данной линии представляют собой нераковые иммортализованные кератиноциты человека, обладающие многими морфологическими и функциональными особенностями нормальных кератиноцитов человека. В отличие от первичных культур кератиноцитов, полученных от различных доноров и отличающихся высокой вариабельностью характеристик, клетки линии НаСаТ способны неограниченно делиться, что определяет возможность получения стандартизованного объекта исследований и целесообразность их использования в качестве клеточной модели кожи in vitro [2]. Объектом исследования являются клетки контрольных клеточных культур и испытуемые клетки - после воздействия исследуемого вещества в известной концентрации.
2
2
2
Клетки иммортализованной клеточной линии НаСаТ высаживают в 75 см флаконы (например, Corning, США) в 15 мл питательной среды, рекомендованной для культивирования кератиноцитов (например, ДМЕМ/F12, содержащей 10% ФБС и Glutamax (Gibco, США)). Культивирование проводят в CO-инкубаторе (при температуре 37±1°С, влажности 90±10%, содержании 5.0±1.0% CO). После достижения 60-70% конфлюэнтности, культуральную среду отбирают, а клетки подвергают воздействию предварительно подготовленного раствора испытуемого вещества в питательной среде в различных концентрациях. К контрольным образцам добавляют свежую питательную среду. Время воздействия веществ на клетки может быть разным, но чаще составляет 48 часов. Затем жизнеспособность клеток оценивают методом МТТ или по поглощению нейтрального красного и определяют значение IC50 (концентрация испытуемого вещества, вызывающая 50%-ное снижение жизнеспособности клеток) [2].
Недостатком данного способа является то, что он позволяет охарактеризовать общетоксическое действие химического вещества, но не его способность вызывать раздражение/повреждение кожных покровов.
Ближайшим аналогом к заявленному способу оценки безопасности химической продукции является способ, описанный в методических инструкциях Организации Экономического сотрудничества и развития [3] и нормативных документах РФ [4]. Способ основан на применении в качестве объекта исследований клеточных моделей реконструированного эпителия человека. Таких как продукт EpiSkin™, EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE и epiCS или аналогов. Они представляют собой коммерчески доступные в странах Европы и США клеточные модели кожи человека, выращенные по специальным протоколам из нормальных кератиноцитов человека на мембранных вставках для культуральных планшетов типа transwell, имеющие стандартизованное (постоянное) строение и хорошо выраженный роговой слой. Клеточные модели имеют многослойное строение: сразу над мембраной располагаются несколько слоев ядросодержащих клеток, на поверхности которых имеется не менее 5 слоев роговых чешуек. Способ основан на регистрации способности тестируемого вещества разрушать роговой слой клеточной модели, что приводит к снижению жизнеспособности нижерасположенных ядросодержащих клеток, которая, в свою очередь, оценивается количественными методами, например, методом МТТ [4].
Способ осуществляется следующим образом:
Тестируемое вещество равномерно наносят на поверхность клеточной модели кожи человека (КМКЧ), смочив исследуемое вещество дистиллированной водой для того чтобы обеспечить его хороший контакт с роговым слоем. На две клеточные модели тестируемое вещество воздействует в течение 3 минут, на две другие клеточные модели - в течение часа. После окончании воздействия тестируемое вещество тщательно смывают с поверхности клеточных моделей нейтральным раствором, например, 0,9% раствором NaCl.
Затем методом МТТ оценивают жизнеспособность клеток в составе клеточных моделей. Исследуемое химическое вещество признается раздражающим для кожи, если:
- жизнеспособность клеток КМКЧ после 3 минут воздействия составляет менее 50% или
- жизнеспособность клеток КМКЧ после 3 минут воздействия больше или равна 50%, но жизнеспособность клеток КМКЧ после 1 часа воздействия составляет менее 15%.
Исследуемое вещество признается не раздражающим для кожи если:
- жизнеспособность клеток КМКЧ после 3 минут воздействия больше или равна 50% и жизнеспособность клеток КМКЧ после 1 часа воздействия больше или равна 15%.
Недостатком данного метода является необходимость использования в качестве объекта испытаний дорогостоящей высокотехнологической биоинженерной конструкции - клеточной модели эпидермиса человека. Кроме того, о наличии негативного воздействия тестируемого химического вещества на эпидермис человека можно судить только на основании гибели клеток в эксперименте, что не позволяет прогнозировать потенциальную опасность для здоровья человека химических соединений в субтоксических концентрациях.
Проблемой, на решение которой направлено изобретение, является прогнозирования наличия (отсутствия) у тестируемой химической продукции способности вызывать повреждение /раздражение) кожных покровов человека.
Технический результат - повышение точности за счет использования экспериментально установленных контрольных параметров, характеризующих изменение протеома кератиноцитов человека при воздействии химической продукции, способной вызывать раздражение/повреждение кожных покровов.
В результате собственных исследований установлен перечень белков, которые стабильно появляются в кератиноцитах человека клеточной линии НаСаТ при воздействии различных химических веществ, обладающих способностью вызывать раздражение кожных покровов человека. Все эти белки отсутствуют в неповрежденных (интактных) клетках. Появление этих белков в клетках линии НаСаТ при воздействии тестируемого химического вещества служит основанием для заключения о наличии у него способности вызывать раздражение/повреждение кожных покровов.
Новизна данного технического решения заключается в использовании специфических протеомных маркеров, характерных для повреждения кератиноцитов человека химическими веществами, способными вызывать раздражение/повреждение кожных покровов. Неочевидность предложенного технического решения вытекает из недостаточности современных представлений об изменениях протеома клеток, повергающихся токсическому воздействию химических веществ.
Способ осуществляют следующим образом. Объектом исследования являются нормальные кератиноциты человека иммортализованной клеточной линии НаСаТ. Используются клетки интактных (контрольных) клеточных культур и испытуемые клетки - после воздействия исследуемого вещества в известной концентрации.
2
2
2
Клетки высаживают в 75 см флаконы (например, Corning, США) в достаточном объеме питательной среды (чаще - 15 мл), рекомендованной для культивирования кератиноцитов (например, ДМЕМ/F12, содержащей 10% ФБС и Glutamax (Gibco, США)). Культивирование проводят в СО-инкубаторе (при температуре 37±1°С, влажности 90±10%, содержании 5.0±1.0% СО). После достижения 60-70% конфлюэнтности, культуральную среду отбирают, а клетки подвергают воздействию предварительно подготовленного раствора испытуемого вещества в питательной среде с известной концентрацией. К контрольным образцам добавляют свежую питательную среду. Время воздействия веществ на клетки составляет 48 часов.
После завершения эксперимента готовят лизаты клеток контрольных и испытуемых культур любым известным способом, позволяющим обеспечить сохранность белков в клеточных лизатах. Например, при помощи ультразвука. Определение содержания белков в клетках контрольных и испытуемых культур проводится любым из известных способов, доступных исходя из уровня развития техники, позволяющих выполнить измерение данного параметра с достаточной чувствительностью (например, масс-спектрометрия, хроматография, электрофорез, ИФА-анализ и др.), при условии, что при получении экспериментальных данных используется один метод. Допускается также использование методов, позволяющих зафиксировать не сами белки, а факт экспрессии в клетках РНК, кодирующих эти белки, например, исследование методом по-лимеразной цепной реакции. Количество измерений для каждой контрольной и испытуемой клеточной культуры должно быть достаточным для получения статистически корректного результата, что достигается использованием технических повторов (не менее трех для каждого эксперимента).
О наличии раздражающего действия испытуемого вещества судят на основании выявления в лизатах испытуемых клеток трех белков:
- СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN),
- фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN),
- базигин (BASI_HUMAN).
При обнаружении в исследуемых образцах клеток испытуемых культур всех трех вышеперечисленных белков испытуемое вещество признается веществом, обладающим раздражающим действием на кожу. Если в клетках после воздействия тестируемого химического вещества не выявляются белки из перечня, делается заключение об отсутствии у данного химического вещества способности вызывать раздражение/повреждение кожи человека. При обнаружении одного или двух белков из перечня проводится дополнительный эксперимент - концентрация исследуемого вещества увеличивается в два раза. Если при этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаруживается три белка из определенного перечня, испытуемое вещество признается обладающим раздражающим действием на кожу. В случае повторного обнаружения одного или двух белков из перечня проводится второй дополнительный эксперимент - концентрация исследуемого вещества увеличивается в пять раз по сравнению с исходной. Если при этом в исследуемых образцах обнаруживается три белка из определенного перечня, испытуемое вещество в исходной концентрации признается веществом, обладающим раздражающим действием на кожу. В противном случае испытуемое вещество признается не обладающим раздражающим действием на кожу.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека у раствора Тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 25 мкг/мл по способу - прототипу и заявленному способу.
Тритон Х-100 - поверхностно-активное вещество (ПАВ), относящееся к группе неионных ПАВ. Его способность раздражать кожу хорошо известна, в связи с чем целью эксперимента было сравнение информативности способа-прототипа и заявляемого способа при прогнозировании этой способности у Тритона Х-100 в эксперименте.
Исследование согласно способу-прототипу:
Объектом исследования служила стандартизованная модель эпидермиса человека «VitroSkin» в формате 24-луночного планшета. Исследование проводили в соответствии с вышепредставленным описанием. Кроме тестируемого вещества, использовали два контрольных вещества: вещество, не вызывающее повреждение кожи (0.9% NaCl, отрицательный контроль) и вещество, обладающее выраженным раздражающим действием на кожу человека (ледяная уксусная кислота, положительный контроль). На клеточные модели тестируемое и контрольные вещества наносили на 3 минуты и на 1 час (каждый эксперимент проводили в двух повторах). После окончания воздействия тестируемое вещество тщательно смывают с поверхности клеточных моделей нейтральным раствором, например, 0,9% раствором NaCl. По завершении времени эксперимента жизнеспособность клеток в составе КМКЧ оценивали методом МТТ. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты исследования влияния раствора Тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 25 мкг/мл на кожу человека по способу - прототипу. Данные представлены в виде среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего (m).
При воздействии отрицательного контрольного вещества жизнеспособность клеток КМКЧ не снижалась ни в одном из сроков наблюдения. Напротив, воздействие ледяной уксусной кислоты (положительный контроль) приводило к резкому снижению жизнеспособности клеток, которая составила 2-3% от исходных значений. Тестируемое вещество - тритон Х-100 в концентрации 25 мкг/мл, через 3 минуты после нанесения на КМКЧ лишь незначительно снизило жизнеспособность клеток (до 87% от исходного уровня. Однако более длительное воздействие (в течение часа) привело к существенному снижению жизнеспособности клеток КМКЧ, что позволило отнести тестируемое вещество к химическим веществам, способным вызвать раздражение кожи человека.
Таким образом, исследование по способу-прототипу позволило прийти к заключению о том, что тритон Х-100 способен вызвать раздражение кожи человека.
Исследование согласно заявленному способу:
Клетки иммортализованной клеточной линии НаСаТ высаживали в 96-луночные планшеты (Corning) по 2000 клеток в 200 мкл среды ДМЕМ/F12, содержащей 10% ФБС и Glutamax (Gibco), в лунку. Через 96 часов культивирования среду из лунок отбирали и добавляли по 200 мкл раствора Тритон Х-100 (Sigma) в полной питательной среде в концентрации 25 мкг/мл и инкубировали в течение 48 часов. К контрольным образцам добавляли свежую питательную среду.
Затем снимали клетки с поверхности культуральных флаконов тремя миллилитрами смеси трипсина-ЭДТА (3-5 мин. при 37°С), отмывали фосфатным буфером. Водные суспензии клеток гомогенизировали при помощи ультразвука при 4°С, на ультразвуковой установке BANDELIN sonoplus HD2070 (Германия). Гомогенаты клеток НаСаТ (175 мкг белка в пробе) подвергали триптическому гидролизу. Содержание белка в гомогенатах клеток НаСаТ определяли по методу с бицинхониновой кислотой, с использованием БСА в качестве стандарта [5].
Для разделения и идентификации пептидов использовали хроматографическую систему Ultimate 3000 nano-flow HPLC (Dionex, США), совмещенную с масс-спектрометром Orbitrap Exactive (Thermo Scientific) с источником электростатической ионизации Nanospray Flex NG ion source (Thermo Scientific) (по три технических повтора для каждой пробы). При MS/MS-сканировании исключали однозарядные ионы и ионы с неопределенным состоянием заряда [5].
Масс-спектры в "raw" формате обрабатывали с использованием программного обеспечения Progenesis LC-MS (Nonlinear Dynamics Ltd, Великобритания). Поиск пептидов и белков осуществляли в программе "Mascot", используя следующие параметры поиска: база данных "Swiss-Prot" (SP, версия 2012_11, ".fasta" формат) для вида Homo sapiens; расщепляющий фермент - трипсин; точность совпадения теоретической и экспериментальной массы пептида - ±15 ppm; точность совпадения теоретической и экспериментальной массы фрагментарных ионов - ±0.01 Да; значение зарядового состояния ионов пептида - "2+, 3+ и 4+"; количество возможных пропущенных участков расщепления трипсином - 1; фиксированная модификация - пиридилэтилирование цистеина, окисленный метионин в качестве вариабельной модификации. Поиск проводили по базе данных инвертированных и рандомных последовательностей аминокислот (decoy), процент ложноположительных результатов (false discovery rate, FDR) <1%. Белки с индексом достоверности (Mascot score) <13 считали недостоверными. Выходные данные Mascot в формате "xml" реимпортировали в программу Progenesis LC-MS ("Nonlinear Dynamics Ltd.", Великобритания) [5].
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия тритона Х-100 в концентрации 25 мкг/мл были обнаружены все три белка из перечня, а именно: СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN), фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN), базигин (BASI_HUMAN). На основании чего был сделан вывод о том, что тритон Х-100 способен вызвать раздражение кожи человека.
Таким образом, исследования безопасности раствора тритона Х-100 в концентрации 25 мкг/мл в отношении кожных покровов человека по способу-прототипу и заявленному способу были одинаково информативны и позволили прийти к заключению, что данное химическое вещество способно вызывать раздражение/повреждение кожи человека.
Пример 2. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека раствора тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 12,5 мкг/мл по способу - прототипу и заявленному способу.
Как и в примере 1, целью эксперимента было сравнение информативности способа-прототипа и заявляемого способа при прогнозировании способности тритона X-100 раздражать/повреждать кожу человека.
Исследование согласно способу-прототипу проводили также, как в примере 1, используя меньшую концентрацию раствора Тритон Х-100 (12,5 мкг/мл).
Результаты исследования приведены в таблице 2.
Таблица 2. Результаты исследования влияния раствора Тритона Х-100 (Sigma) в концентрации 12,5 мкг/мл на кожу человека по способу - прототипу. Данные представлены в виде среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего (m).
При воздействии отрицательного контрольного вещества жизнеспособность клеток не снижалась ни в одном из сроков наблюдения. Напротив, воздействие ледяной уксусной кислоты (положительный контроль) приводило к резкому снижению жизнеспособности клеток, которая составила 2-3% от исходных значений. Тестируемое вещество - тритон Х-100 в концентрации 12,5 мкг/мл, через 3 минуты после нанесения на КМКЧ лишь незначительно снизило жизнеспособность клеток (до 93% от исходного уровня. Воздействие тестируемого вещества в течение часа привело к более выраженному снижению жизнеспособности клеток КМКЧ (до 28%), но при этом величина показателя превышала 15%, что не позволило отнести тестируемое вещество к химическим веществам, способным вызвать раздражение кожи человека.
В результате был сделан вывод о том, что раствор тритона Х-100 не способен вызвать раздражение кожи человека.
Исследование согласно заявленному способу проводили как указано в примере 1.
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия Тритон Х-100 в концентрации 12,5 мкг/мл были обнаружены все три белка из перечня.
На основании этого был сделан вывод о том, что тритон Х-100 способен вызвать раздражение кожи человека.
Таким образом, исследование безопасности раствора тритон Х-100 по заявленному способу позволило прогнозировать наличие способности вызывать раздражение кожи человека в субтоксической концентрации (12,5 мкг/мл), не приводящей к гибели клеток. В то время как способ-прототип оказался не информативным - не позволил прийти к верному заключению.
Пример 3. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека у раствора ДСН (Sigma) в концентрации 12,5 мкг/мл по заявленному способу.
ДСН - химическое вещество из группы ПАВ анионного типа. Его способность раздражать кожу человека и лабораторных животных, как и в случае с тритоном Х-100, хорошо известна. Однако, это свойство легко регистрируется в испытаниях с использованием токсических и субтоксических концентраций вещества (>50 мкг/мл). С целью оценки чувствительности заявленного способа в данном эксперименте использовалась низкая концентрация ДСН - 12,5 мкг/мл.
Исследование согласно заявленному способу проводили как указано в примере 1.
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия ДСН в концентрации 12,5 мкг/мл были обнаружены два белка из перечня - СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN) и фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN). Белок базигин (BASI_HUMAN) обнаружен не был. В соответствии с заявленным способом, концентрацию ДСН увеличили в 2 раза (до 25 мкг/мл) и провели повторное исследование. При этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаружили три белка из определенного перечня. В результате, исследование по заявленному способу позволило прийти к заключению, что ДСН обладает раздражающим действием на кожу.
Пример 4. Оценка наличия раздражающего действия на кожу человека у раствора ДСН (Sigma) в концентрации 4 мкг/мл по заявленному способу.
В данном эксперименте были проведены испытания ДСН для кожи человека в еще более низкой концентрации (4 мкг/мл).
Исследование согласно заявленному способу проводили как указано в примере 1.
В результате в лизатах клеток НаСаТ после воздействия ДСН в концентрации 4 мкг/мл были обнаружены два белка из перечня - СоА-лигаза длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN) и фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN). Белок базигин (BASI_HUMAN) обнаружен не был. В соответствии с заявленным способом концентрация ДСН была увеличена в 2 раза - до 8 мкг/мл. При этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаружили два белка из определенного перечня: СоА-лигазу длинноцепочечной жирной кислоты 3 (ACSL3_HUMAN) и фактор инициации трансляции эукариот 4, гамма 1 (IF4G1_HUMAN). Белок базигин (BASI_HUMAN) обнаружен не был. В соответствии с заявленным способом, концентрация ДСН была увеличена в пять раз - до 20 мкг/мл. При этом в исследуемых образцах клеток испытуемых культур обнаружили три белка из определенного перечня. В результате, исследование по заявленному способу позволило прийти к заключению, что ДСН обладает раздражающим действием на кожу.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Draize J.H. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin an mucous membranes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1944; 82:377-390.
2. Rusanov A.L., Luzgina N.G., Lisitsa A.V. Sodium Dodecyl Sulfate Cytotoxicity towards HaCaT Keratinocytes: Comparative Analysis of Methods for Evaluation of Cell Viability, Bull Exp Biol Med. 2017; 163(2):284-288.
3. OECD, 2013a. OECD Guideline for the Testing of Chemicals (No. 431.): In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (Rhe) Test Method, OECD, Paris.
4. ГОСТ 32634-2014. Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro. Дата введения в действие: 01.06.2015.
5. Rusanov A.L., Petushkova N.A., Poverennaya E.V., Nakhod K.V., Larina O.V., Lisitsa A.V., Luzgina N.G. Proteomic profiling of HaCaT keratinocytes exposed to skin damaging detergents, Biomeditsinskaya khimiya, 2017, 63(5); 405-412.