ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ IL-4 И IL-4δ2 С РЕЦЕПТОРАМИ IL-4R I И II ТИПОВ IN SILICO И ИХ ЭФФЕКТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК IN VITRO

Изучение взаимодействия IL-4 и IL-482 с рецепторами IL-4R I и II типов in silico и их эффектов на функциональную активность мононуклеарных клеток in vitro

Горемыкин К.В.1, Силков А.Н.2, Шилов Б.В.1, Серебров В.ЮЛ Сазонов А.Э.1,

2

Сенников С. В.

Study of the IL-4 and IL-482 interaction with the IL-4R receptors of the I and II types in silico and the effect on the functional activity of mononuclear cells in vitro

Goremykin K.V., Silkov A.N., Shilov B. V., Serebrov V.Yu., Sazonov A.E., Sennikov S.V.

1 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

2 НИИ клинической иммунологии СО РАН, г. Новосибирск

© Горемыкин К.В., Силков А.Н., Шилов Б.В. и др.

Исследование продуктов альтернативного сплайсинга цитокинов представляет значительный научный интерес. Продукт альтернативного сплайсинга интерлейкина-4 (IL-4) — IL-452 обладает антагонистическим по сравнению с IL-4 действием на пролиферативную активность мононуклеарных клеток крови человека и продукцию ими IL-6.

Сочетание биохимических и компьютерных методов исследования позволило подтвердить и объяснить наличие у IL-452 свойств антагониста по отношению к своему полноразмерному варианту — IL-4.

Ключевые слова: IL-452, IL-4, AutoDock, мононуклеарные клетки крови, В-лимфоциты.

Alternatively spliced interleukins are very actively studied over the last years. Splice form of IL-4 — IL-452 has antagonistic effects to its full form on proliferative activity of human mononuclear blood cells and their IL-6 production.

Antagonistic effects between IL-4 and IL-452 were confirmed and explained in this study due to combination of biochemical and computer methods.

Key words: IL-452, IL-4, AutoDock, mononuclear blood cells, B-lymphocytes.

УДК 578.245:577.152]:57.085.2

Введение

Интерлейкин-4 (ГЬ-4) вовлечен в онтогенез В-лимфоцитов: вызывает их активацию, пролиферацию и дифференцировку [12]. В Т-клетках ГЬ-4 переключает дифференцировку Т-хелперов типа 0 в сторону Т-хелперов типа 2, усиливает экспрессию IL-4R.

Широкий спектр эффектов, оказываемых ГЬ-4 на различные клетки, опосредуется двумя вариантами рецептора ГЬ-4 (IL-4R), состоящими из трех видов субъединиц: IL-4Ra, IL-2Ry и IL-13Ra.

Субъединица IL-2Ry, или белок ус, является общим компонентом для рецепторов ГЬ-2, ГЬ-4, ГЬ-7 и

некоторых других. Объединяясь, IL-4Ra и ус формируют IL-4R I — высокоаффинный рецептор первого типа, который экспрессируется на поверхности широкого спектра иммунокомпетентных и гемопоэтических клеток: Т- и В-лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов [16].

Второй тип рецептора к ¡Ь-4 — IL-4R II формируется субъединицами IL-13Ra и IL-4Ra. IL-4R II является низкоаффинным, экспрессируется преимущественно на поверхности клеток нелимфоидного происхождения и может связывать как ГЬ-4, так и ГЬ-13. Предполагается, что данное явление обеспечивает известное перекрывание эффектов этих цитокинов

[10]. В список иммунопатологических состояний, в которых ГЬ-4 играет важную роль, включены аллергические (атопическая астма, ринит) [17], аутоиммунные (ревматоидный артрит, системный склероз) болезни [8], а также некоторые хронические инфекции [18].

В последние несколько лет обозначилось новое направление в исследованиях цитокинов, связанное с изучением изоформ как самих цитокинов, так и их рецепторов, образующихся при альтернативном сплайсинге транскриптов. Альтернативный сплайсинг активно участвует в формировании полиморфизма системы цито-киновой регуляции, а сплайс-изоформы белков цитокинов и их рецепторов значительно расширяют регу-ляторные функции различных цитокинов, поскольку обладают свойствами, отличными (или противоположными) от полноразмерных белков. Исследования в данном направлении могут серьезно дополнить современное представление о регуляции гемо- и имму-нопоэза новыми сведениями о механизмах контроля эффекторных функций цитокинов, а также предоставить клиническим иммунологам специфические биологические препараты с новыми свойствами [5].

Сказанное выше в полной мере можно отнести к сплайс-варианту ГЬ-4 человека с делецией второго экзона — ГЬ-452. Образование ГЬ-452 имеет тканеспе-цифический характер, детектируется в различных типах иммунокомпетентных клеток [13].

Экспрессия мРНК ГЬ-452 обнаружена в мононук-леарных клетках периферической крови (МНКПК), в Т-лимфоцитах [4] и В-лимфоцитах [14], в клетках легких, кишечника и тимуса [7]. Кроме того, экспрессия мРНК обоих форм ГЬ-4 обнаружена в тканях плаценты, децидуальной ткани, причем количественное соотношение двух форм мРНК в этих линиях различное [14]. Установлено, что нестимулированные МНКПК экс-прессируют обе формы мРНК ГЬ-4, при этом количество мРНК ГЬ-4 в 3,5 раза больше, чем мРНК ГЬ-452 [3].

В экспериментах с В-лимфоцитами было показано, что ГЬ-452 проявляет себя как антагонист своего полноразмерного варианта. Действие ГЬ-452 приводит к снижению синтеза иммуноглобулина Е, опосредованного ГЬ-4. На основании этих данных было высказано предположение, что ГЬ-452 связывается с рецептором ГЬ-4Я, но не вызывает конформа-ционных изменений в рецепторе и не обеспечивает трансдукцию сигнала в клетку [4]. Однако оконча-

тельно механизм антагонистического действия ГЬ-452 не установлен.

Для моделирования взаимодействия биологических объектов с 70-х гг. ХХ в. используется вычислительная техника. В биологии и медицине компьютерное исследование принято обозначать т &Шсо. Взаимодействие двух и более молекул между собой может быть смоделировано с использованием методов квантовой химии или молекулярной механики.

Молекулярная механика — это совокупность методов априорного определения геометрического строения и энергии молекул на основе модели, в которой (в отличие от методов квантовой химии) электроны системы не рассматриваются. Потенциальная энергия, которая в квантово-химических моделях подлежит прямому расчету, здесь аппроксимируется набором эмпирических функций разной степени сложности, представляющих собой, например, суммы парных потенциалов взаимодействия атомов. Такая аппроксимация позволяет экономить вычислительные ресурсы и добиваться достоверных результатов. Таким образом, является актуальным использование методов молекулярной механики для моделирования взаимодействия ГЬ-4 и ГЬ-452 с рецепторами ГЬ-4Я Г и ГЬ-4Я П.

В связи с вышеизложенным цель работы — изучить взаимодействие цитокинов ГЬ-4 и ГЬ-452 с рецепторами ГЬ-4Я Г и ГЬ-4Я ГГ на компьютерной модели их лиганд-рецепторных взаимодействий, охарактеризовать биологическую активность рекомбинантного белка ГЬ-452 в культуре мононуклеарных клеток крови по влиянию на их пролиферативную активность, продукцию ими цитокинов.

Материал и методы

Модели ГЬ-4, ГЬ-4Я Г типа, ГЬ-4 ГГ типа были получены через сеть Интернет из базы данных ЯС8В РБВ [9], где они находятся в свободном доступе. Оригинальная модель ГЬ-452, структура которого была создана на компьютере исходя из физико-химических закономерностей, предоставлена создателем — А. Денесюком (Университет Турку, Финляндия). Расчет лиганд-рецепторных взаимодействий осуществлялся при помощи программы АШоБоск 4.0 в составе пакета программ ЫвЬТоок 1.4.5 [15] на суперкомпьютере СуЪепа в Томском государственном университете.

Источником мононуклеарных клеток (МНК) послужила гепаринизированная (50 ЕД гепарина на 1 мл крови) венозная кровь доноров. МНК выделяли стандартным методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина. Затем МНК культивировали в среде RPMI-1640.

В работе использованы рекомбинантные человеческие белки: rhIL-4 (R & D System, Великобритания) и изоформа интерлейкина-4 — rhIL-452, любезно предоставленная Л.Р. Птицыным (ГосНИИ «Генетика», г. Москва) [1].

Пролиферативную активность МНК оценивали по включению 3Н-тимидина. Подсчет радиоактивности экспериментального материала производили в жидкостном сцинтиляционном счетчике SL-30 (Intertechnic, Франция). Результаты представляли в виде среднего счета (импульсов в минуту) из трех идентичных культур. Для исследования влияния IL-4 и IL-452 на про-лиферативную активность МНК клетки культивировали в присутствии рекомбинантных белков в системах без митогена и в присутствии субоптимальных доз митогена конканавалина А (КонА) (Pharmacia, Швеция).

Уровень цитокинов определяли в культуральной среде МНКПК после 48 ч культивирования в 24-луночных планшетах. Клетки осаждали центрифугированием, собирали кондиционную среду и хранили при температуре -20 °С до проведения анализа. Количественную оценку уровней цитокинов в кондиционных средах проводили на электрохемилюминометре ORIGEN Analyzer (IGEN Inc., США), как описано в работе С.В. Сенникова и соавт. [19].

Полученные данные представлены как среднее выборочное значение M и стандартная ошибка среднего m. Для статистической обработки результатов культуральных исследований использовали дисперсионный анализ и критерии множественных сравнений, лиганд-рецепторных взаимодействий, непараметрический ^/-критерий Манна—Уитни (поскольку, по данным критерия Колмогорова—Смирнова, закон распределения полученных данных не соответствовал нормальному), с помощью программы Statistica 6.0 for Windows. Расчет показателя RMSD для оценки качества контрольного докинга выполняли в программе AutoDock.

Результаты и обсуждение

Для каждой пары лиганд — рецептор был 50 раз проведен расчет межмолекулярных взаимодействий. В рамках каждого расчета анализировались 2,5 млн различных конформаций лиганда в лиганд-связывающем центре рецептора. Из этих 2,5 млн конформаций отбиралась одна наиболее энергетически выгодная кон-формация, т.е. конформация с наименьшим значением изменения свободной энергии Гиббса. Таким образом, по завершении расчетов было получено 50 наилучших конформаций для каждой пары рецептор — лиганд.

В результате анализа данных были выявлены значения средней энергии связывания для каждой пары лиганд — рецептор (рис. 1).

1Ы ,^1111(11 IL-4S2 р < 0,001 ¿<0,001_

0 г^ i *

Н idgEfr

[-РФ

S -20 Щ Я

Ё. -25 Я ЩШ

-24,67

m

1(1 -

— 11 QQ

' ^ Рецептор II.-4R 1 типа IвЫСОКОаффн::пIIнI  Рецептор IL-4R II типа (низкоаффинный) X Стандартная ошибка среднего

Рис. 1. Свободная энергия связывания IL-4 и IL-452 с рецепторами IL-4R I и II типов

На основании отрицательных значений энергии связывания (рис. 1) было показано, что IL-452 способен связываться с рецепторами обоих типов. Как и ожидалось [20], IL-4 связывался с высокоаффинным рецептором более прочно, чем с низкоаффинным. Исследование in silico показало, что участки, ответственные за связывание с IL-4Ra — основным компонентом рецепторов обоих типов, формируют практически такую же поверхность, как и в полноразмерном варианте IL-4. Критически важные для связывания с IL-4Ra аминокислоты Glu9 и Lys12 располагаются в IL-452 практически в том же положении, что и в полноразмерном IL-4, несмотря на поворот aA-спирали, в которой они расположены, на 180°.

Однако IL-452 связывался с обоими типами рецепторов слабее (р < 0,001), чем полноразмерный вариант IL-4. Этот факт можно объяснить тем, что не-

достаток в кодирующей ГЬ-452 мРНК второго экзона приводит к формированию белка, отличающегося от исходной формы (ГЬ-4) отсутствием в ГЬ-4 петли АВ и р-складки А (располагаются между аА- и аВ-спира-лями в полноразмерном варианте). Это существенно меняет поверхность сайта (включает аминокислоты А^121 и Туг124), ответственного за взаимодействие с ГЬ-2Яус и ГЬ-13Яа — компонентами, входящими в состав ГЬ-4Я Г и ГГ типов соответственно и повышающими сродство к этим рецепторам многократно.

Кроме того, ГЬ-452 образует лишь четыре водородные связи с аминокислотами лиганд-связывающего центра ГЬ-4Я Г типа. Для сравнения: ГЬ-4 образует

11 водородных связей в лиганд-связывающем центре ГЬ-4Я Г типа, в том числе посредством аминокислоты А^121.

По причине отсутствия взаимодействия ключевых аминокислот ГЬ-452 — А^121 и Туг124 с добавочными цепями рецептора ГЬ-4Я Г типа ГЬ-452, вероятно, не способен активировать рецептор ГЬ-4Я Г типа.

При этом ГЬ-452, как и ГЬ-4, возможно, способен активировать низкоаффинный рецептор ГЬ-4Я ГГ типа. Это заключение можно сделать на основании того, что ГЬ-452, как и ГЬ-4, образует большое число водородных связей в лиганд-связывающем центре ГЬ-4Я ГГ типа, в том числе по А^121.

Таким образом, антагонистический эффект ГЬ-452 формируется за счет конкурентного связывания с рецептором Г типа без его активации.

Для подтверждения расчетов, выполненных т sШсо, были проведены молекулярно-биологические исследования действия рекомбинантных белков ГЬ-4 и ГЬ-452 на пролиферативную активность МНКПК человека и продукцию ими некоторых цитокинов. Результаты экспериментов для оценки эффектов реком-бинантных белков на пролиферативную активность МНКПК, проведенных в 14 различных культурах, представлены на рис. 2. Введение в культуру ГЬ-4 достоверно повышало уровень пролиферации МНКПК человека относительно нестимулированного контроля. При совместном применении ГЬ-4 и ГЬ-452 последний отменял стимулирующее влияние ГЬ-4 в дозозависи-мой манере. При этом сам ГЬ-452 не оказывал значимого влияния на пролиферативную активность МНКПК.

Поскольку ГЬ-4 известен как эффективный кости-мулятор клеточной пролиферации [12], проведено исследование эффекта действия ГЬ-4 и ГЬ-452 на про-лиферативную активность МНКПК, стимулированных субоптимальными дозами митогена КонА в культуре (рис. 3). В предварительных экспериментах была определена субоптимальная доза КонА, которая составила 5 мкг/мл.

0 5 5 5 0 0 0 0 100 500 0 500 Дозы рекомбинатных белков, пг/мл

Рис. 2. Влияние гЫЬ-4 и гЫЬ-452 на пролиферацию МНКПК человека. Клетки культивировали 72 ч в концентрации 1 • 106 клеток в 1 мл. Использованные дозы рекомбинантных белков указаны под гистограммой. Результаты представлены для культур 14 доноров: * — статистически значимые отличия от контрольной группы

Рис. 3. Влияние гЫЬ-452 на костимулированную пролиферацию МНКПК человека на фоне стимуляции КонА в дозе 5 мкг/мл

В представленной серии экспериментов продемонстрирован эффект действия ГЬ-4 и ГЬ-452 на пролиферацию МНКПК, аналогичный полученному в культурах без митогенной стимуляции. ГЬ-4 выступал

костимулятором клеточной пролиферации, а ГЬ-452 отменял его стимулирующий эффект, при этом не демонстрируя достоверного влияния на пролиферацию МНК. Кроме того, при использовании митогенов в культуре МНК эффекты рекомбинантных белков были менее выраженными, особенно в случае использования Т-клеточного митогена — КонА (рис. 3).

Далее было оценено влияние рекомбинантных белков ГЬ-4 и ГЬ-452 на продукцию цитокинов культурой МНКПК. ГЬ-4 является одним из ключевых цито-кинов Т-хелперов типа 2 и имеет влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток, в том числе и опосредованно, через продукцию других цитокинов. Влияние ГЬ-452 на продукцию цитокинов ранее не изучалось. В связи с этим проведена количественная оценка продукции цитокинов в кондиционных средах 48-часовых культур МНКПК человека, культивированных в присутствии ГЬ-4 и (или) ГЬ-452. В проведенных исследованиях не обнаружено значимых эффектов ГЬ-452 на продукцию ГЬ-1р, ГЬ-2, ГЬ-10 и ин-терферона-у.

Уровень синтеза ГЬ-6 в культуре МНКПК достоверно понижался в присутствии ГЬ-4, а ГЬ-452 дозоза-висимо отменял ингибиторное влияние ГЬ-4, подтверждая тем самым гипотезу естественного антагониста (рис. 4). Следует отметить, что в противоположность результатам, полученным при исследовании пролифе-ративной активности клеток, в данном случае изо-форма обладала выраженным стимулирующим действием на уровень секреции ГЬ-6.

6000

5 000

4 000

—

Я 000

S

2000

I 000

О

rhIL-4 rhIL-462

* * A

X Стандартная — ошибка среднего

mm I

0 5 0 5 5

0 0 500 100 500

Дозы рекомбинатных белков, ш/мл

Рис. 4. Эффект гЫЬ-4 и гЫЬ-452 на продукцию ГЬ-6 в культуре МНКПК. Представлены результаты измерения уровня ГЬ-6 в кондиционных средах для 20 культур МНК, полученных от разных доноров: * — статистически значимые изменения ф < 0,001)

Позитивная регуляция IL-452 продукции IL-6 обнаружена впервые и не соответствует принятому в настоящий момент мнению о роли IL-452 как антагониста полноразмерного варианта. Это явление предположительно обусловлено активацией низкоаффинных рецепторов (IL-4R II типа) в мембране МНК. Возможность активации IL-4R II типа посредством IL-452 была показана в представленной работе в ходе компьютерного моделирования.

Заключение

По данным исследования in silico, IL-452 связывается с рецепторами IL-4 как I, так и II типов, но менее прочно (свободная энергия связывания составила -10,46 и -8,74 ккал/моль соответственно), чем полноразмерный вариант (-27,99 и -24,67 ккал/моль).

Эффекты действия IL-4 в отношении пролифера-тивной активности культивированных мононуклеар-ных клеток периферической крови отменяются при внесении IL-452, что свидетельствует о наличии у этой изоформы свойств антагониста IL-4R II типа. Дозоза-висимая манера IL-452 ингибировать активность IL-4 объясняется его свойствами конкурентного ингибитора.

Установлено, что IL-452 не только дозозависимо отменяет ингибирующее действие IL-4 на продукцию IL-6 мононуклеарными клетками, но и обладает способностью стимулировать его продукцию. Этот эффект IL-452 может быть опосредован IL-4R II типа.

Литература

1. Птицын Л.Р., Смирнов С.В., Альтман И.Б. и др. Продукция рекомбинантного hIL-452 клетками Escherichia coli // Биоорган. химия. 1999. Т. 25. С. 623—629.

2. Степанов Н.Ф., Пупышев В.И. Квантовая механика молекул и квантовая химия. М.: Изд-во МГУ, 1991. 384 с.

3. Alms W.J., Atamas S.P., Yurovsky V.V. et al. Generation of a variant of human interleukin-4 by alternative splicing // Mol. Immunol. 1996. V. 33. P. 361—370.

4. Arinobu Y., Atamas S.P., Otsuka T. et al. Antagonistic effects of an alternative splice variant of human IL-4, IL-4delta2, on IL-4 activities in human monocytes and B cells // Cell. Immunol. 1999. V. 191. P. 161—167.

5. Atamas S.P. Alternative splice variants of cytokines: making a list // Life Sci. 1997. V. 61. P. 1105—1112.

6.Atamas S.P., Choi J., Yurovsky V.V. et al. An alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation // J. Immunol. 1996. V. 156. P. 435—441.

7. Atamas S.P., White B. Interleukin 4 in systemic sclerosis: not just an increase // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. V. 6. P. 658—659.

8.Barrera P., Faure S., Prud'homme J.F. et al. European genetic study on rheumatoid arthritis: is there a linkage of the interleukin-1 (IL-1), IL-10 or IL-4 genes to RA? // Clin. Exp. Rheumatol. 2001. V. 19. P. 709—714.

9. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z. et al. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. № 1. P. 235—242.

10. Callard R.E., Matthews D.J., Hibbert L. IL-4 and IL-13 receptors: are they one and the same? // Immunol. Today. 1996. V. 17. P. 108—110.

11. Chomarat P., Banchereau J. An update on interleukin-4 and its receptor // Eur. Cytokine Netw. 1997. V. 8. P. 333—344.

12. Isakson P.C., Pure E., Vitetta E.S. et al. T cell-derived B cell differentiation factor(s). Effect on the isotype switch of mur-ine B cells // J. Exp. Med. 1982. V. 155. P. 734—748.

13. Klein S.C., Golverdingen J.G., Bouwens A.G. et al. An alternatively spliced interleukin 4 form in lymphoid cells // Im-munogenetics. 1995. V. 41. P. 57.

14. Klein S.C., Golverdingen J.G., van Wichen D.F. et al. Expression of two interleukin 4 mRNA isoforms in B lymphoid cells // Cell. Immunol. 1996. V. 167. P. 259—268.

15.Morris G.M., Huey R., Olson A.J. Using AutoDock for ligand-receptor docking // Curr Protoc Bioinformatics. 2008. V. 11, № 3. P. 34—37.

16. Russell S.M., Keegan A.D., Harada N. et al. Interleukin-2 receptor gamma chain: a functional component of the inter-leukin-4 receptor // Science. 1993. V. 262. P. 1880—1883.

17. Seah G.T., Gao P.S., Hopkin J.M. et al. Interleukin-4 and its alternatively spliced variant (IL-4 delta 2) in patients with atopic asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001. V. 164. P. 1016—1018.

18. Seah G.T., Rook G.A. High levels of mRNA encoding IL-4 in unstimulated peripheral blood mononuclear cells from tuberculosis patients revealed by quantitative nested reverse transcriptase-polyme rase chain reaction; correlations with serum IgE levels // Scand. J. Infect. Dis. 2001. V. 33. P. 106—109.

19. Sennikov S. V., Krysov S.V., Injelevskaya T. V. et al. Quantitative analysis of human immunoregulatory cytokines by elec-trochemiluminescence method // J. Immunol. Methods. 2003. V. 275. P. 81—88.

20. Zav'yalov V.P., Denesyuk A.I., White B. et al. Molecular model of an alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, a naturally occurring inhibitor of IL-4-stimulated T cell proliferation // Immunol lett. 1997. V. 58. P. 149— 152.

Поступила в редакцию 18.09.2009 г. Утверждена к печати 17.03.2010 г.

Сведения об авторах

Горемыкин К.В. — аспирант кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (г. Томск).

Силков А.Н. — канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии НИИ клинической иммунологии СО РАН (г. Новосибирск).

Шилов Б.В. — канд. мед. наук, доцент кафедры биологии и генетики СибГМУ (г. Томск).

Серебров В.Ю. — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой биохимии и молекулярной биологии СибГМУ (г. Томск). Сазонов А.Э. — д-р мед. наук, зам. зав. ЦНИЛ СибГМУ (г. Томск).

Сенников С.В. — д-р мед. наук, профессор, зав. лабораторией молекулярной иммунологии НИИ клинической иммунологии СО РАН (г. Новосибирск).

Для корреспонденции

Горемыкин Константин Викторович, тел. 8-923-418-1510, e-mail: covigo@mail.ru.