Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии
METHOD FOR PREDICTION OF ENDOMETRIAL READINESS FOR SUCCESSFUL EMBRYO IMPLANTATION IN FEMALES WITH UTERINE INFERTILITY USING COMPUTER MORPHOMETRY

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии и может быть использовано для оценки имплантационных возможностей эндометрия при лечении бесплодия и подготовки пациенток к вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ).
Изобретение обеспечивает возможность коррекции тактики ведения женщин с маточной формой бесплодия на этапе прегравидарной подготовки и подготовки к ВРТ.
Нарушение имплантации человеческого эмбриона в связи с нерецептивным эндометрием является наиболее значимой причиной репродуктивных неудач вспомогательных репродуктивных технологий, занимая в их структуре до 70%, при переносе эмбрионов хорошего качества [Регистр ВРТ РАРЧ. Отчет за 2017 год: [Электронный ресурс].- СПб., 2018.- 48 С. – Режим доступа : http://www.rahr.ru. Боярский, К.Ю. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ. Обзор литературы/ К.Ю.Боярский, С.Н.Гайдуков, Н.А. Пальченко // Проблемы репродукции.- 2013.- № 4.- С. 3-7]. Потому в последние годы в фокусе научного интереса находятся исследования, посвященные изучению ультраструктурных морфологических характеристик рецептивности эндометрия при патологии имплантации. Активизация «окна  имплантации» характеризуется значительными ультраструктурными изменениями клеток ламинарного эпителия. В этот период плазменные мембраны покровного эпителия эндометрия теряют микроворсинки и апикальные поверхности клеток формируют куполоподобные выпячивания – пиноподии. При использовании сканирующей электронной микроскопии пиноподии определяются в 78% биопсий эндометрия на 6-й постовуляторный день у женщин с регулярным менструальным циклом [Носенко, Е.Н. Особенности формирования пиноподий в эндометрии в зависимости от наличия в нем хронических воспалительных и гиперпролиферативных процессов у женщин хороших ответчиков с неудачными попытками вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в анамнезе /Е.Н. Носенко, А.И. Саенко, О.И. Парницкая [и др.] //Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 6. – С. 1158.]. Формирование пиноподий в период имплантации зависит от наличия в нем таких патологических процессов, как хроническое воспаление и гиперплазия, однако даже при их отсутствии отличается от такового у здоровых фертильных женщин. Общими отличительными чертами эндометрия женщин с бесплодием и репродуктивными неудачами является снижение количества зрелых пиноподий, повышение численности созревающих пиноподий; наличие на апикальной поверхности участков отсутствия пиноподий; мозаицизм их размеров, формы и стадии развития [Дюжева, Е.В. Гормональная подготовка с учетом морфофункционального состояния эндометрия у пациенток с неэффективными попытками ЭКО в анамнезе /Е.В. Дюжева, Е.А. Калинина, Е.А. Коган [и др.] //Материалы IV  Международный конгресс по репродуктивной медицине. – Москва, 2010. – С. 255–256. Левиашвили, М.М. Оценка  рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными программами экстракорпорального оплодотворения в анамнезе /М.М. Левиашвили, Т.А. Демура, Н.Г. Мишиева //Акушерство и гинекология. – 2012. – № 4/1. – С. 65–68.].
Стандартная процедура гистологического исследования образцов эндометрия заключается в том, что материал берется из полости матки без деления на зоны. Затем происходит фиксация, обезвоживание, уплотнение материала для приготовления гистосрезов с последующим их окрашиванием гематоксилином и эозином и оценкой структуры клеток с помощью световой микроскопии.
Однако далеко не всегда можно визуально оценить рецептивность эндометрия.
Аналогами
данного изобретения являются описанные в научно-медицинской и патентной литературе способы оценки рецептивности эндометрия путем исследования апикальной поверхности клеток ламинарного эпителия эндометрия в трансмиссионном электронном микроскопе с определением количества, и степени зрелости пиноподий.
Недостатками данного метода являются:
• длительная и трудоемкая подготовка материала, требующая соответствующей подготовки лаборантов;
• наличие дорогостоящего оборудования;
• невозможность оценки всего препарата;
• невозможность применения в рутинной практике.
Известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии гонадотропин - рилизинг гормона (GnRG) и рецептора гонадотропин - рилизинг гормона (GnRGR)  в «окно имплантации» в эндометрии женщин с бесплодием и неудачными попытками программ ЭКО. Гистологическое датирование эндометрия, оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий осуществляют на том же световом микроскопе при увеличении ×400 в 5 полях зрения. Пиноподии оцениваются как изобилующие, умеренные и незначительные в зависимости от % занимаемой ими поверхности эндометрия (>40, 20-40 и <20, соответственно) [патент RU 2617515].
Недостатки: необходимость проведения ИГХ исследования, отсутствие данных о методе подсчета клеток, имеющих пиноподии.
Наиболее близким аналогом (прототипом)является описанный в зарубежной литературе метод ручного подсчета количества клеток, имеющих на поверхности пиноподии (в зависимости от площади, занимающей эпителиальный покров, пиноподии характеризуются как изобилующие (более 50%), умеренные (от 20 до 50%) и не выраженные (менее 20%) и визуальное определение их характера: созревающие, зрелые и увядающие. (Achache, H. Endometrium receptivity  markers, the journey to successful embryo implantation / H. Achache, A. Revel // Hum Reprod Update. –2006. – Vol.  12 (6). – P. 731–746).
Недостатками способа являются длительность и субъективность подсчета клеток, имеющих пиноподии и определение их характера, используются только два показателя, а также отсутствие математического моделирования, позволяющего делать прогноз с высокой точностью.
В настоящее время в литературе имеются данные об использовании программ для компьютерной морфометрии в практическом здравоохранении, что делает возможным быструю и объективную оценку площади и высоты пиноподий а так же площади капилляров в ламинарном эпителии.
Задачей изобретения является разработка способа готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии на основании данных о площади, высоте пиноподий и площади капилляров, полученных с использованием методов компьютерной морфометрии и метода математического моделирования.
Технический результат при использовании изобретения – повышение эффективности прогнозирования репродуктивных неудач у женщин с маточной формой бесплодия.
Заявляется способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия, с использованием компьютерной морфометрии отличающийся тем, что измерение площади и высоты пиноподий, площади сосудов проводят на микрофотографии гистологического препарата, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI =10,63- Х1×0,082- Х2×0,202- Х3×0,776,
где:
Х1 – площадь пиноподий, %,
Х2 – средняя высота пиноподий, пиксели,
Х3 – площадь сосудов, %,
10,63 – Const,
при PI более 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач  в программах ВРТ, а при PI менее 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.
Способ поясняется фигурами иллюстраций.
На Фиг. 1 представлена микрофотография ламинарного эпителия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении ×200, обработанная в программе ImageJ, где: 1  – строма эндометрия, 2  – ламинарный эпителий, 3 – пиноподии на апикальной поверхности клеток.
На Фиг.2 представлена микрофотография ламинарного эпителия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении ×200, обработанная в программе ImageJ, , где: 1 – строма эндометрия, 2 – ламинарный эпителий, 4 – участок эпителия, имеющий пиноподии на апикальной поверхности, 5  – участок эпителия, не имеющий пиноподий на апикальной поверхности
На Фиг.3 представлена микрофотография ламинарного эпителия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении 400, обработанная в программе  ImageJ, где: 1  – строма эндометрия, 3 – пиноподии на апикальной поверхности клеток (показаны стрелками).
На Фиг.4 представлена микрофотография секреторного эндометрия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении 200, отражающая положительную экспрессию CD34 в капиллярах эндометрия, где 1  – строма эндометрия, 6 – капилляры с CD34+ экспрессией (показаны стрелками).
На Фиг.5 представлена микрофотография секреторного эндометрия, выполненная с использованием программного обеспечения AxioVision при увеличении 400, обработанная в программе ImageJ, где 6 – капилляры с CD34+ экспрессией (показаны стрелками).
Способ осуществляют следующим образом: изготавливаются обычные парафиновые срезы образцов эндометрия, полученных путем Пайпель биопсии или при гистероскопии, толщиной до 0,2 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. Приготовленные срезы при увеличении ×400-1000 фотографируются так, чтобы в кадр попадал ламинарный эпителий. Затем с использованием программ компьютерной морфометрии производится оценка изображений при использовании программы ImageJ 1,50d (Java-based).  Первым шагом идет определение единиц измерения, это могут быть пиксели или любая другая единица измерения, определяемая путем наложения морфометрической решетки или измерения заведомо известных параметров, например диаметра эритроцита.
Затем проводят поэтапное измерение длины ламинарного эпителия в препарате (Фиг. 1) и длины отрезков эпителиоцитов, имеющих на апикальной поверхности пиноподии. (Фиг. 2). Измерение высоты пиноподий производится путем измерения от апикальной поверхности до верхушки (Фиг. 3) не менее чем в 10 полях зрения и выводится среднее значение.
На втором этапе с парафинового блока  изготавливаются срезы, которые окрашиваются моноклональными мышиными антителами к CD34 (QBEnd/1 Leica Biosystems Newcastle Ltd.) по стандартной методике на иммуногистостейнере закрытого типа Bond Max,  полученные препараты фотографируются так, чтобы капилляры были максимально контрастны. В программе ImageJ 1,50d (Java-based). С помощью последовательности команд Image→Type→8-bit→ Image→Adjust→Threshold корректируется цвет и контрастность таким образов, чтобы на фотографии остались только капилляры. Затем с помощью команды Analyze → Analyze Particles анализируются количество, периметр и площадь капилляров, и рассчитывают их процент от общей площади препарата.
Нами проведено исследование 52 образцов эндометрия женщин, полученных на 20-22 день менструального цикла в период предполагаемого окна имплантации: в 1-ю группу включены 26 женщин с маточной формой бесплодия, 2-ю группу составили 26 фертильных женщин, имеющие детей.
При формировании групп учитывали сопоставимость женщин по возрасту, длительности менструального цикла, сопутствующим заболеваниям. Иммуногистохимические (ИГХ) реакции проводили на серийных депарафинированных срезах толщиной 3-4 мкм по общепринятым методикам (DAKO protocols).
В результате проведенных исследований выявлены наиболее информативные морфометрические показатели эндометрия репродуктивных неудач у женщин с маточной формой бесплодия. С использованием метода дискриминантного анализа разработана математическая модель прогнозирования данной патологии, заключающаяся в определении прогностического индекса (PI) по формуле:
PI =10,63 - Х
×0,082- Х
×0,202- Х
×0,776, где:
1
2
3
1
Х – площадь пиноподий, %;
2
Х – средняя высота пиноподий, пиксели;
3
Х– площадь сосудов, %;
10,63 – Const.
При PIболее0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач  в программах ВРТ, а при PIменее 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.
Чувствительность предлагаемого способа составляет 84,46%, специфичность – 87,2%. Эффективность способа – 82,69%.
Пример 1 Пациентка Б., 39 лет (история болезни 8808, диагноз первичное бесплодие 1 в течение 6 лет, две неудачные попытки ЭКО в анамнезе, гипоплазия эндометрия). Жалоб пациентка не предъявляла, Соматически не отягощена. Материал получен методом Пайпель биопсии на 20 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют начальной стадии фазы секреции, единичные железы – средняя секреция. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности -20%, средняя высота пиноподий – 19,36 пикс, средняя площадь капилляров 2,071%
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 10,63-20×0,082 -19,36×0,202-2,071×0,776 = 3,47
PI > 0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач в программах ВРТ.
Пациентке рекомендовано проведение лечения.
Пример 1 Пациентка А., 37 лет (амбулаторная карта 502, диагноз первичное бесплодие 1 в течение 7 лет, попытки ЭКО не предпринимались. Диагноз эндометриоз, гипоплазия эндометрия). Жалобы на скудные болезненные менструации. Соматически генетическая тромбофилия: гены MTR AG, MTHFR AC. Материал получен методом Пайпель биопсии на 20 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют начальной стадии фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности - 15%, средняя высота пиноподий – 12,23 пикс, средняя площадь капилляров 3,12%
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 10,63-15×0,082-12,23×0,202-3,12×0,776 = 4,51
PI > 0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач, в программах ВРТ.
Женщина была пролечена в течение трех месяцев. Результат расширенного гистологического и ИГХ исследования с применением компьютерной морфометрии после лечения: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности - 75%, средняя высота пиноподий – 29,52 пикс, средняя площадь капилляров 4,42%
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 10,63-75×0,082-29,52×0,202-4,42×0,776 = -4,913
PI < 0, что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.
Через 2 месяца криоперенос эмбриона – диагностирована прогрессирующая маточная беременность.
Пример 3. В. 30 лет (история болезни 825) Обратилась в связи с диагностированной кистой в яичнике. В анамнезе 2 года назад срочные роды в сроке 37 нед, мальчик 3250 г, 52 см, 7/8 по Апгар, растет и развивается в соответствии с возрастом. Соматически не отягощена, отмечает аллергическую реакцию на пенициллин – высыпаня и зуд. Материал получен методом Пайпель биопсии на 22 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии-поздней фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: площадь клеток имеющих пиноподии на апикальной поверхности -80%, средняя высота пиноподий – 42,65 пикс, средняя площадь капилляров 5,063%.
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 10,63-80×0,082-42,65×0,202-2,071×0,776 = -8,474
PI < 0, что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия.
Таким образом, прогнозирование готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии, предлагаемым способом позволит уменьшить количество неэффективных протоколов лечения и циклов ВРТ.
Заявляемый способ прост в исполнении, включает объективную оценку морфометрических параметров, не требует дорогостоящего оборудования.
В отличие от прототипа:
- не требует длительной и трудоемкой подготовки образцов перед исследованием и наличия громоздкого оборудования,  дополнительных сред
- позволяет использовать программы компьютерной морфометрии, имеющиеся в свободном доступе и проводить объективную оценку рецептивности эндометрия
- используется в повседневной клинической практике без специальной подготовки врача-патоморфолога.
Источники информации
1. Боярский, К.Ю. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ // Проблемы репродукции.  2013. № 4. С. 3-7
2. Дюжева,  Е.В, Калинина Е.А., Коган Е.А. Гормональная  подготовка  с  учетом  морфофункционального  состояния  эндометрия  у  пациенток  с  неэффективными  попытками  ЭКО  в  анамнезе // Материалы IV  Международный конгресс по репродуктивной медицине. Москва, 2010. С. 255–256.
3. Левиашвили,  М.М.  Оценка  рецептивности  эндометрия  у  пациенток  с  безуспешными  программами  экстракорпорального  оплодотворения  в  анамнезе // Акушерство и гинекология. 2012. № 4/1. С. 65–68.)
4. Носенко Е.Н.  ,  Саенко А.И.  ,  Парницкая О.И.  Особенности  формирования  пиноподий  в  эндометрии  в  зависимости  от  наличия  в  нем  хронических  воспалительных  и  гиперпролиферативных  процессов  у  женщин  хороших  ответчиков  с  неудачными попытками вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)  в  анамнезе //  Современные проблемы науки и образования. 2014. № 6. С. 1158
5. Регистр ВРТ РАРЧ. Отчет за 2017 год: [Электронный ресурс].- СПб., 2018.- 48 С. – Режим доступа: http://www.rahr.ru.
6. Achache, H. Endometrium receptivity  markers, the journey to successful  embryo implantation // Hum Reprod Update. 2006. Vol.  12 (6). P. 731–746.