Способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY INTESTINAL DISEASES IN CHILDREN

Изобретение относится к области медицинской иммунологии, а именно к иммунологическим способам дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК).
Изобретение может быть использовано в медицине для различения больных с ВЗК и другой патологией.
К воспалительным заболеваниям кишечника, согласно МКБ-10, относят болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Накопление данных об этиологии и патогенезе ВЗК способствовали разработке методов диагностики и лечения, позволивших существенно улучшить качество жизни таких пациентов [1, 2, 3]. Классическим способом диагностики ВЗК является проведение эндоскопии и последующее гистологическое исследование биоптата [4]. Этот метод является инвазивным, а взятие биоптата из воспаленного участка кишки часто сопровождается кровотечением, что потенциально опасно для пациента. Считают, что формирование хронического воспаления при ВЗК опосредуется нарушением нормального иммунного ответа на кишечную микробиоту у генетически предрасположенных индивидуумов [5]. Существует патент на набор синтетических олигонуклеотидов, позволяющих выявлять маркерные участки генов бактерий, ассоциированных с ВЗК [6]. Однако индивидуальный спектр кишечной микрофлоры сильно колеблется, а выявление той или иной микрофлоры не является диагнозом ВЗК. Существует патент на диагностику ВЗК с помощью УЗИ-методов [7]. Однако заявленные признаки являются признаками воспаления в стенке кишки, далеко не все признаки наблюдаются у каждого пациента с ВЗК и не обнаруживаются при других причинах воспаления кишечника. Существует способ диагностики ВЗК с помощью инфракрасной спектроскопии слюны или сыворотки крови, причем диагноз устанавливают на основании вычисления соотношение определенных пиков [8, 9]. Однако непонятно, какова природа этих пиков и что конкретно они характеризуют, поэтому не вполне ясно, насколько специфичен данный метод. Курьезно выглядит способ дифференциальной диагностики ВЗК по рисунку растрескивания пятна высохшей сыворотки крови [10]. Способ, очевидно, ничего не стоит как в смысле материальных затрат, так и научной ценности.
В научной литературе гликопротеин 2 (GP2) был описан как главный белок зимогеновых гранул поджелудочной железы [11]. Далее было показано, что анти-GP2 IgG- и IgA-антитела обнаруживаются в сыворотке крови больных с БК (чаще) и ЯК [12]. Более того, GP2 был описан как рецептор М-клеток кишечника, осуществляющий контроль микробиоты за счет трансцитоза FimH+ бактерий и запуска иммунного ответа против них [13]. Проведенные исследования на большом количестве пациентов с ВЗК показали, что анти-GP2 IgG- и IgA-антитела в сыворотке крови больных с ВЗК встречаются далеко не у всех пациентов и уровень этих антител очень сильно колеблется от пациента к пациенту [14]. В связи с этим, возлагавшиеся было надежды на этот показатель как на дифференциально-диагностический критерий ВЗК, оказались сильно преувеличенными. Также было показано, что имеющиеся тест-системы для определения анти-GP2 IgG- и IgA-антител методом ИФА в сыворотке крови могут определять эти антитела и в стуле [15] больных ВЗК осложненных формированием свища. Кроме того, было показано, что определение, например, цитокинов в копроэкстрактах больных ВЗК более информативно, чем определение этих же цитокинов в сыворотках крови тех же больных по сравнению с пациентами с дисбиозом кишечника [16]. Однако про- и противовоспалительные цитокины реагируют на любое воспаление, поэтому не могут быть расценены как специфические маркеры именно при ВЗК, тем не менее, примененный подход выглядит вполне перспективным.
Технической проблемой, решаемой изобретением, является разработка неинвазивного способа дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей, позволяющего различить больных с ВЗК и другой патологией.
Поставленная задача достигается путем разработки способа дифференциальной диагностики ВЗК у детей на основании оценки относительного уровня анти-GP2 IgA-антител в копроэкстрактах, определяемых методом иммуно-ферментного анализа.
Технический результат заключается в том, что заявленный способ дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника у детей, осуществляемый на основании оценки относительного уровня анти-GP2 IgA-антител в копроэкстрактах, позволяет различить больных с ВЗК и другой патологией. Разработанный способ дифференциальной диагностики облегчает и ускоряет процесс постановки диагноза ВЗК, позволяет исключить другие диагнозы кишечных заболеваний. При этом диагностика проводится неинвазивным методом, путем анализа копроэкстракта, тогда как классические методы диагностики подразумевают колоноскопию и биопсию с последующей гистологией. Данный способ позволяет с чувствительностью 97,7% и специфичностью 98,6% выделить группу больных ВЗК.
Сущность изобретения заключается в следующем:
Для выявления уровней анти-GP2 IgA-антител в копроэкстрактах было обследовано 110 детей (64 мальчика и 46 девочек) в возрасте от 2,6 до 17,9 лет. Согласно установленным диагнозам эти дети были разделены на 3 группы:
* 36 пациентов с болезнью Крона составили группу 1,
* 30 пациентов с язвенным колитом вошли в группу 2,
* 44 пациента с дисбиозом кишечника были отнесены в контрольную группу 3.
Для получения водно-солевого копроэкстракта один объем фекалий смешивали с 3 объемами забуференного фосфатами физиологического раствора и осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин (разведение составляло 1:4 в контрольной группе), для детей групп 1 и 2 рабочее разведение составляло 1:40. Надосадок использовали для определения уровня антител. Определение уровней анти-GP2 IgA-антител проводили методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческих тест-систем (Generic Assays, Dahlewitz/Berlin, Germany), согласно инструкции производителя. Определение уровней секреторных IgA-антител (sIgA) в копроэкстрактах проводили также иммуноферментным методом с помощью коммерческих тест-систем (Вектор-Бест, Россия).
Анти-GP2 IgA антитела были обнаружены у всех обследованных детей независимо от диагноза (Фигура 1). Однако, количество sIgA в копроэкстрактах больных с ВЗК и дисбиозом кишечника различалось. Соотношение GP2-IgA/sIgA у пациентов с ВЗК оказалось значительно ниже, чем у детей с дисбиозом (Фигура 2). Для детей с БК этот показатель составил 0,326, для детей с ЯК - 0,327, а для детей с дисбиозом кишечника - 2,332. Очевидно, что по исследуемому критерию нет различий между детьми с БК и ЯК, но они значительно отличаются от детей, не имеющих диагноза ВЗК (р<0,001). В связи с этим, группы 1 и 2 были объединены в одну группу ВЗК для дальнейшего анализа. Для выяснения информативности предложенного критерия относительного количества GP2-IgA/sIgA в копроэкстрактах больных с ВЗК по сравнению с больными с дисбиозами, был проведен ROC-анализ полученных данных. Была продемонстрирована высокая вероятность правильного выделения группы больных ВЗК, площадь под ROC кривой (AUC) составила 0,998 (0,993-1,002) (р<0,05). Далее был произведен расчет для определения уровня порогового значения (cut-off) относительного уровня GP2-IgA/sIgA. Был получен уровень cut-off=0,784 (показан жирной черной линией на фигуре 2), который с чувствительностью 97,7% и специфичностью 98,6% позволяет выделить группу больных ВЗК.
Осуществление способа изобретения поясняется на следующем примере.
Пример.
В качестве примера в Таблице 1 приведены рассчитанные показатели GP2-IgA/sIgA в копроэкстрактах детей с неизвестным анамнезом, проходивших обследование в отделении детской гастроэнтерологии. Используя значения порогового критерия (0,784), находим, что обследованные дети №7, 8 и 10 имеют значения расчетного показателя GP2-IgA/sIgA ниже порогового критерия, что должно быть расценено как ВЗК. Дети под №1, 2, 3, 4, 6 и 9 имеют значения расчетного показателя GP2-IgA/sIgA, который существенно выше порогового критерия, что должно быть расценено как отсутствие ВЗК. Ребенок под №5 имеет значение расчетного показателя близкое (0,809), но все-таки чуть выше, чем пороговый критерий (0,784), что должно быть расценено как сомнительный результат.
Последующий анализ диагнозов у обследованных детей, поставленных в соответствии с существующими медицинскими стандартами показал, что у ребенка №7 - БК, у ребенка №8 - ЯК, у ребенка №10 - БК, то есть они были правильно отнесены в группу ВЗК согласно предложенному критерию. У ребенка №1 - гепатит, у ребенка №2 - дисбиоз кишечника, ребенок №3 - оказался здоровым, проходившим диспансеризацию, у ребенка №4 - нарушение моторики кишечника, у ребенка №6 - цирроз печени и у ребенка №9 - гликогеновая болезнь.
Можно заключить, что в этой группе были как здоровые дети, так и дети, страдающие различной патологией желудочно-кишечного тракта, но в ней не оказалось ни одного больного ВЗК, что и следовало из уровня предложенного критерия. Ребенок №5, имевший уровень критерия лишь немного выше порогового значения и расцененный как сомнительный, тем не менее, оказался с диагнозом периодическая болезнь (то есть не ВЗК), а значит, даже небольшое превышение критерия отношения GP2-IgA/sIgA в копроэкстракте позволяет исключить диагноз ВЗК.
Таким образом, используя пороговый критерий для отношения GP2-IgA/sIgA в копроэкстракте, удалось правильно отделить детей, страдающих ВЗК, от группы здоровых и детей с иной патологией желудочно-кишечного тракта. При этом определение отношения GP2-IgA/sIgA в копроэкстрактах является неинвазивным и легко воспроизводимым методом. Нам не удалось получить значимых различий между детьми с различными нозологическими формами ВЗК. С другой стороны, предложенный критерий позволяет отдифференцировать пациентов с ВЗК от другой патологии желудочно-кишечного тракта. Ранняя постановка диагноза позволяет раньше начать лечение и получить лучшие результаты от терапии этой тяжелой патологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. С.Abraham, J. Н. Cho, Inflammatory Bowel Disease The New England Journal of Medicine 2009; 361:2066-2078.
2. Elgbratt K., Kurlberg G., Hahn-Zohric M. et al. Rapid migration of thymic emigrants to the colonic mucosa in ulcerative colitis patients // Clin Exp Immunol - Nov 2010. - Vol. 162, №2. - P. 325-336.
3. Lierop P.P., Samson J.N., Escher J.C. et al. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease // J Pediatr Gastroenterol Nutr - 2009. - Vol. 48, №2. - P. 142-151.
4. Патент 2125264 Российской Федерации МПК G01N 33/48. Способ диагностики болезни Крона у детей. / Фадеев М.Ю., Смирнов В.П., Потехин П.П.; патентообладатель Нижегородский медицинский базовый колледж. (RU) №97102090/14, заявл. 10.02.1997, опубл. 20.01.1999.
5. Шумилов П.В. Нерешенные вопросы патогенеза воспалительных заболеваний кишечника у детей. Роль пристеночной микрофлоры кишечника // Педиатрическая фармакология. - 2010. - Т. 7. - №5. - С. 54-58.
6. Патент 2601132 Российской Федерации МПК C12Q 1/68. Набор синтетических олигонуклеотидов для диагностики болезни Крона и неспецифического язвенного колита путем выявления маркерных участков бактериальной ДНК методом полимеразной цепной реакции / Алексеев Д.Г., Павленко А.В., Каныгина А.В.; патентообладатель Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)» (МФТИ) (RU) №2015151029/10, заявл. 27.11.2015 опубл. 27.10.2016 Бюл. №30
7. Патент 2556573 Российской Федерации МПК А61В 8/08, А61В 8/06. Способ дифференциальной диагностики хронических воспалительных заболеваний кишечника у детей. / Пыков М.И., Колисниченко М.М., Горячева О.А.; патентообладатель Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия постдипломного образования» МЗ РФ (ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России) (RU) №2014125632/14, заявл. 25.06.2014, опубл. 10.07.2015 Бюл №19
8. Патент 2366956 Российской Федерации МПК G01N 33/52 Способ дифференциальной диагностики неспецифического язвенного колита и болезни Крона у детей. / Федулова Э.Н., Гордецов А.С., Тутина О.А., Лебедев А.В.; патентообладатель Федеральное государственное учреждение «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Росмедтехнологий» (RU) №2007126007/15, заявл. 09.07.2007, опубл. 20.01.2009 Бюл. №2.
9. Патент 2558067 Российской Федерации МПК G01N 33/487 Способ дифференциальной диагностики неспецифического язвенного колита и болезни Крона у детей. / Федулова Э.Н., Гордецов А.С., Красникова О.В., Тутина О.А.; патентообладатели: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Нижегородский научно-исследовательский институт детской гастроэнтерологии» МЗ РФ (ФГБУ «ННИИДГ» Минздрава России (RU), Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» МЗ РФ (ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России) (RU) №2014128388/15, заявл. 10.07.2014, опубл. 27.05.2015 Бюл. №21.
10. Патент 2251694 Российской Федерации МПК G01N 33/49 Способ дифференциальной диагностики язвенного колита и болезни Крона. / Шатохина С.Н., Мишуровская Т.С., Цоденков Г.В., Шабалин В.Н.; патентообладатель Российский НИИ геронтолгии Минздрава РФ (RU) №2003112588/15, заявл. 30.04.2003, опубл. 27.10.2004 Бюл. №30.
11. Roggenbuck D., Hausdorf G., Martinez-Gamboa L., Reinhold D.,  Jungblut P.R., Porstmann Т., Laass M.W., Henker j.,  et al. Identification of GP2, the major zymogen granule membrane glycoprotein, as the autoantigen of pancreatic antibodies in Crohn's disease. Gut 2009.58: 1620-1628.
12. Roggenbuck D., Reinhold D., Wex T., Goihl A., von Arnim U., Mafertheiner P.,  Porstmann Т., Porstmann S., Liedvogel В., et al. Autoantibodies to GP2, the major zymogen granule membrane glycoprotein, are new markers in Crohn's disease. Clin. Chim. Acta 2011. 412: 718-724.
13. Hase K., Kawano K., Nochi Т., Pontes G.S., Fukuda S., Ebisawa M. et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH+ bacteria by M-cells initiates mucosal immune response, Nature 2009 462: 226-230.
14. P. Pavlidis, O. Romanidou, D. Roggenbuck, M.G. Mytilinaiou, F. Al-Sulttan, C. Liaskos, D.S. Smyk, A.L. Koutsoumpas, E.I. Rigopoulou, K. Conrad, A. Forbes, D.P. Bogdanos Ileal Inflammation May Trigger the Development of GP2-Specific Pancreatic Autoantibodies in Patients with Crohn's Disease. Clin Dev Immunol. 2012; 2012: 640835. doi: 10.1155/2012/640835
15. Werner L, Sturm A, Roggenbuck D, Yahav L, Zion T, Meirowithz E, Ofer A, Guzner-Gur H, Tulchinsky H, Dotan I. Antibodies against glycoprotein 2 are novel markers of intestinal inflammation in patients with an ileal pouch. J Crohns Colitis. 2013 Dec; 7(11):e522-32. doi: 10.1016/j.crohns.2013.03.009.
16. Топтыгина А.П., Семикина Е.Л., Бобылева Г.В., Мирошкина Л.В., Петричук С.В. Цитокиновый профиль у детей с воспалительными заболеваниями кишечника. Биохимия, 2014, том 79, №12, с. 1673-1679.