Экспериментальная модель умеренной гипергомоцистеинемии для изучения патогенеза тромботических осложнений при травме опорно-двигательного аппарата

6. Fourrier F., Chopin C., Goudemand J., Hendrycx S., Caron C., Rime A., et al. Septic shock, multiple organ failure, and disseminated intravascular coagulation. Compared patterns of antithrombin III, protein C, and protein S deficiencies // Chest. - 1992. - V. 101 (3). -P. 816-823.

7. Han Y. Y., Doughty L. A., Kofos D. et al. // Pediatric critical care medicine. - 2003. - V. 4. - P. 21-25.

8. Kirpalani H., Lennox H. Huang. Manual of pediatric intensive care // PMPH-USA. - 2009. - P. 977.

9. Kitchens C. S., Alving B. M., Kessler C. M. // Disseminated intravascular coagulation. Consultative haemostasis and thrombosis, Philadelphia. WB.: Saunders Company. - 2004. -P. 165-178.

10. Leteutre S., Marinot A., Duhamel A. et al. // Lancet. - 2003. -V. 362 - P. 192.

11. LeviM., de Jonge E., van der Poll T. Disseminated Intravascular coagulation // Thrombosis and haemostasis. - 1999. - V. 82. -P. 695-705.

12. Levi M., de Jonge E., van der Poll T. New treatment strategies for disseminated intravascular coagulation based on current understanding of the pathophysiology // Ann med. - 2004. - V. 36 (1). -P. 41-49.

13. Levi M., Ten Cate H. Disseminated intravascular coagulation // N. engl. j. med. - 1999. - V. 341 (8). - P. 586-592.

14. Matsuda T. Clinical aspects of DIC--disseminated intravascular coagulation // Pol. j. pharmacol. - 1996. - V. 48 (1). - P. 73-75.

15. Oren H., Cingoz I., et al. Disseminated intravascular coagulation in pediatric patients: clinical and laboratory features and prognostic factors influencing the survival pediatric // Hematology-oncology. - 2005. - V. 22 (8). - P. 679-688.

16. Rennie J. M., Roberton N. R. C. Manual of neonatal intensive care // Oxford univ. pr. - 2001/ - P. 576.

17. Sacha Zeerleder, M. D. et al. Disseminated intravascular coagulation in sepsis // Chest. - 2005. - V. 128 (4). - P. 2864-2875.

18. Taylor F. B., Ton C. H., Hoots W. K., et al. // Scientific and standardization committe communications: towards a definition. Clinical and laboratory criteria, and a scoring system for disseminated intravascular coagulation. Scientific subcommitte on disseminated intravascular coagulation (DIG) of the international Society on thrombosis and haemostasis. - Thromb haemost. - Nov/ 2009. - V. 86 (5). - P. 1327-1330.

19. The purpose of the international sepsis forum on sepsis in infants and children // Pediatric critical care medicine. - 2005. - V. 6 (3). - P. 3-164.

20. Watson R. S., et al. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States // Am j. respir. crit. care med. - 2003. -Vol. 167. - P. 695-701.

Поступила 15.07.2011

Д. П. БЕРЕЗОВСКИЙ1, В. Ю. МАЖУГИН1, К. М. КУРАЯН2,

м. б. кураян3, н. н. крайнова4, о. в. Хабарова4, т. а. варавва5, и. в. корниенко56

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОдЕЛЬ УМЕРЕННОЙ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ дЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПАТОГЕНЕЗА тромботических осложнений при травме опорно-двигательного аппарата

1 .-жппггт I iiiiim пгтпппп  пгггт пгп мммпг мш мггпмгм г^тпгт гтпмгм пгшпппгпмш тпггггпп ш п  мшц 344022,  мшмг>ш-пмщ ПШ к птгггппгппг, 29. E-mail: dpb@mail.ru,

ПШ: (863) 263-23-91, 250-41-04, пш (863) 253-06-11;

2 пппггт штпппп п ппптштпшп ггмгмт-п ini пмгм пппгт гп п   п^ пгггшгшмш тпгггтп гп ,

ЕШЦ 344006,   тптшп-пшц, Ш з тШШ  ПЩ 105/42;

3ллл оПтп ггттР,  мгп мг-ш-п мщ 4го  пгтт пт птггп пп тгп-ггппгмт пггтпг птп ц тщ 344010,  тпт-пп-пшц, ш м тпппгппг 127.

E-mail: joom.rokdc.ru, пШ: (863) 255-79-32, 255-79-49;

5кйй гпттлп   пмгм пггггп! ! I тпггггпп гп п 344090, п тпт-пп-птп. пп тпгпп, 194/1;

616-г пп mini I гтппг птп г i г г |^пггпппптпп п пшппппшгп пгтппп ттггп пс

тт гмгпгмт штщ пггщ 344000, г. мшт-пп-пт! ш цтптптгппг 60

Описывается диетоиндуцированная модель умеренной гипергомоцистеинемии на лабораторных животных для изучения особенностей патогенеза формирования тромбооккпюзивных осложнений при травме опорно-двигательного аппарата. Ежедневное внутрижелудочное введение метионина в концентрации 24,6 г/кг в течение 6 недель приводит к увеличению концентрации гомоцистеина в крови до 12,14±0,92 ммоль/л в сочетании с переломом большеберцовой кости до 23,5±1,2 ммоль/л. Как повышенный уровень гомоцистеина в крови, так и сформированный перелом большеберцовой кости способствовали повышенному тромбообразованию.

Ключевые слова: гипергомоцистеинемия, тромбоз, травма.

Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011 уДК 616-7-001-005.6-06

Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011

D. P. BEREZOVSKY1, V. У. MAJUGIN1, К. M. KURAJAN2, М. B. KURAJAN3, N. N. KRAINOVA4, О. V. HABAROVA4, T. A. VARAVVA5, I. V. KORNIENKO56

THE EXPERIMENTAL MODEL OF MODERATE HYPERHOMOCYSTEINEMIA TO STUDY THE PATHOGENESIS OF THROMBOTIC COMPLICATIONS IN TRAUMA OF THE LOCOMOTOR

APPARATUS

1Chair of forensic medicine with a course of jurisprudence the Rostov state medical university,

Russia, 344022, Rostov-on-Don, the lane Nakhichevan 29.

E-mail: dpb@mail.ru, tel.: (863) 263-23-91, 250-41-04, fax (863) 253-06-11;

2Southern federal university, department of biochemistry and microbiology, faculty of biology and soil,

Russia, 344006, Rostov-on-Don, st. Bolshaya Sadovaya, 105/42;

3«Geotechnics Ltd», Rostov-on-Don;

4GUZ Regional consultative and diagnostic centre,

Russia, 344010, Rostov-on-Don, str. Pushkinskaya, 127. E-mail: joom.rokdc.ru, tel.: (863) 255-79-32, 255-79-49; 5Scientific Research Institute of biology of Southern federal university,

Russia, 344090, Rostov-on-Don, Stachki ave, 194/1;

616 National centre for forensic and forensics southern military district,

Russia, 344000, Rostov-on-Don, str. Lermontov, 60

In the article it is described diet-induced model moderate hyperhomocysteinemia on the laboratory animals for studying features of pathogenesis formations of thromboocclusive complications at a trauma of the skeleton. Daily intragastric conducting methionine in concentration of 24,6 g/kg within 6 weeks leads to concentration increase homocysteine in blood to 12,14±0,92 mmol/l, in a combination with crisis of cruse bone to 23,5±1,2 mmol/l. Both the raised level hyperhomocysteine in blood, and the generated crisis of cruse bones promoted raised formation of thrombs.

Key words: hyperhomocysteinemia, thrombosis, trauma.

Введение

В настоящее время повышенному содержанию го-моцистеина (ГЦ) в плазме крови отводится большое значение, так как ГЦ считается независимым фактором риска развития тромбоокклюзивных заболеваний [5, 9]. По прогнозу, составленному медицинским информационно-аналитическим центром (МИАНЦ) РАМН на ближайшее десятилетие, перспективными научными разработками в разделе «Механизмы развития патологических процессов. Дизрегуляционная патология. Создание экспериментальных моделей и разработка эффективных методов патогенетической диагностики и терапии» планируется спектр исследований по созданию экспериментальных моделей, в том числе и состояний, связанных с гипергомоцистеинемией (ГГЦ).

ГГЦ может быть обусловлена многими причинами, среди которых выделяют генетические, метаболические, алиментарные и прочие факторы. К самым часто встречающимся наследственным причинам относят мутации генов, кодирующих цистатионин-р-синтетазу [12], 5-мети-лентетрагидрофолат-редуктазу (MTHFR) [4], метиленте-трагидрофолат-дегидрогеназу1 (MTHFD1) [10]. К алиментарным причинам относят дефицит фолиевой кислоты, витаминов В12 и В6, поступающих с пищей. Вредные привычки: курение, чрезмерное употребление алкоголя и кофе - также могут стать причиной повышения ГЦ в крови как за счет уменьшения содержания витаминов группы В, так и за счет снижения активности печеночных ферментов, участвующих в процессах обмена ГЦ [1]. Однако особенности морфологии органов и тканей, в частности, при травматическом воздействии или при развитии травматической болезни, в доступной литературе не освещены в полном объеме. Знание же этих особенностей позволит клиницистам предвидеть возможные тромбооккпюзивные осложнения, а морфологам - констатировать причину этих осложнений. Таким образом, для изучения закономерно-

стей реакции организма на внешнее травматическое воздействие при ГГЦ требуется экспериментальная модель.

Для изучения влияния ГГЦ на клеточном и тканевом уровнях в зависимости от поставленных задач нами в научной литературе были найдены экспериментальные модели, обуславливающие ГГЦ за счет: 1) специальных диет, способствовавших увеличению метаболизма путем введения большего количества аминокислоты метионина [2], ограничению активности цистатион-р-синтетазы для преобразования ГЦ в цистатион за счет уменьшения в пище витамина B6, ограничению активности метионин-синтетазы для реметилирования ГЦ с использованием диеты с пониженным содержанием фолиевой кислоты или витамина В12, ограничение активности бетаин-ГЦ-метилтрансферазы для реметилирования ГЦ путем уменьшения концентрации холина в пище [3], либо путем добавления ГЦ в воду для питья, либо сочетание нескольких диет [2]. При этом Национальный исследовательский совет (США) для содержания лабораторных животных (мышей или крыс) рекомендует пищевой рацион, содержащий 5 г/кг метионина, 0,5 мг/кг фолиевой кислоты, 10 г/кг витамина В12 и 7 мг/кг витамина В6 [11]; 2) использование нокаутированных лабораторных животных - с мутациями в гене, ответственном за синтез цистатион-р-синтетазы (Cbs -/- mice), связанный с увеличением концентрации ГЦ в крови до 200 ммоль/л [15]. Мутация в гене MTHFR у лабораторных животных (Mthfr -/+ mice) связана с повышением ГЦ до 30 ммоль/л [6].

Исходя из вышеизложенного, мы поставили перед собой цель - оценить уровень ГЦ в плазме экспериментальных животных при травматическом воздействии. Нашей задачей являлась адаптация известных экспериментальных моделей с ГГЦ для изучения особенностей патогенеза тромботических осложнений при травме опорно-двигательного аппарата (ОДА) с целью

решения «пограничных» практических задач травматологии и судебной медицины.

Материалы и методы исследования

В эксперименте использовались лабораторные крысы-самцы репродуктивного периода с первоначальной массой 220-250 г. Нокаутированные животные для решений поставленной задачи не могли соответствовать требованиям, так как уровень ГЦ у данных животных был повышен по отношению к обычным животным, имевшим «дикий» генотип уже с рождения. Поэтому наиболее адекватной моделью можно было считать использование диетоиндуцированных моделей. К тому же в работе Angela M. Devlin и соавторов (2004 г.) в эксперименте на лабораторных животных [2] было показано, что повышенный уровень ГЦ существенно не отличался у лабораторных животных с различным генотипом MTHFR+/- и MTHFR +/+ при использовании одной из диетиндуцирующих ГГЦ. При этом генотипы MTHFR+/- и MTHFR +/+ у этих лабораторных животных имели сходство с полиморфизмом 677 CT MTHFR у человека.

Мы использовали модель с метионином путем вну-трижелудочного введения метионина из расчета 24,6 г/ кг в течение шести недель, что, по данным литературы, способствовало увеличению концентрации ГЦ в плазме до уровня 240-334 ммоль/л [14].

С целью унификации воздействия травмирующего агента было разработано механическое устройство для формирования однотипных переломов с травмати-зацией мягких тканей задней конечности. Подана заявка на патент данного устройства.

Для подтверждения рабочей гипотезы об особенностях тромботических осложнений при травме ОДА все лабораторные животные были рандомизированы в одну из четырех экспериментальных групп:

I группа (Contr) - контрольная (интактные животные);

II группа (Traum) - животные, которым не вводили внутрижелудочно при помощи зонда метионин, однако был сформирован закрытый перелом костей голени спустя две недели от момента начала эксперимента;

III группа (Hhcy) - животные, которым ежедневно вводили внутрижелудочно при помощи зонда метионин в концентрации 24,6 г/кг [14] в течение шести недель;

IV группа (Hhcy+Traum) - животные, которым в течение первых четырех недель внутрижелудочно вводили метионин, затем после четырех недель от начала эксперимента формировали закрытый перелом костей

голени и еще в течение двух недель внутрижелудочно продолжали вводить метионин.

По окончании эксперимента животных декапитиро-вали под эфирным наркозом. Уровень ГЦ в крови определяли методом C. M. Pfeiffer et al. [13] с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для гистологического исследования изымали мягкие ткани из зоны сформированного перелома, а также интактной конечности. Окраску препаратов проводили по стандартной методике гематоксилин-эозином. При микроскопии полученных срезов определяли толщину стенки и диаметр артерии, капилляра и вены.

Определяли среднее значение полученных цифровых значений, ошибку среднего, t-критерий Стьюдента (p<0,05), между значениями морфометрических показателей и концентрацией ГЦ в плазме рассчитывали коэффициент корреляции (r).

Результаты исследования и обсуждение

Концентрация ГЦ в контрольной группе указана в таблице. Значения концентрации ГЦ для интактных животных и для здоровых людей оказались сопоставимы между собой [7, 8]. В третьей экспериментальной группе животных, которые получали внутрижелудочно метионин, концентрация ГЦ превышала контрольные значения примерно в 1,5 раза (1,46), что может быть расценено как умеренная ГГЦ, и наши данные не противоречили сведениям из литературных источников в той части, что повышенная концентрация метионина способствует увеличению плазменного ГЦ [2, 14]. В то же время, несмотря на использование той же концентрации метионина в опыте (24,6 г/кг), мы получили на порядок меньшие значения: 12,14±0,92 ммоль/л (p<0,05) против 240-334 ммоль/л [14]. Однако наши значения согласуются с результатами, опубликованными M. Angela et al. [2], но они использовали примерно в 5 раз меньшую концентрацию метионина. По всей видимости, такие различия могут быть связаны со способом введения метионина и выбором лабораторных животных, у которых имеется различная активность ферментов, принимающих участие в работе фолатного цикла. В группе животных, получивших травму ОДА, мы отметили также повышение ГЦ в плазме крови в 1,1 раза, однако эти значения были статистически не значимыми. Не исключается, что это повышение можно объяснить гиподинамией животных в связи с формированным переломом [7, 8].

Так, A. Czajkowska с соавторами сообщает, что содержание уровня ГЦ у людей, имеющих повышенную

Уровень концентрации гомоцистеина в опытных группах лабораторных животных (ммоль/л) и некоторые морфометрические показатели

сосудистой стенки

Показатель Номер группы

I II III IV

Уровень гомоцистеина крови 8,27±1,18 9,21±0,7 12,14*±0,92 23,5*±1,2

Толщина стенки капилляра 3,35±0,28 3,88±0,07 4,7*±0,235 3,08±0,08

Толщина стенки вены 4,3±0,17 6,22*±0,45 8,85*±0,63 7,5*±0,1

Толщина стенки артерии 8,68±0,12 6,39*±0,35 7,45*±0,48 6,17*±0,22

Диаметр капилляра 9,95±0,45 10,4±0,34 14,51 *±0,88 13,71*±0,80

Диаметр вены 30,4±1,26 35,62*±1,64 34±2,72 32,1±0,7

Диаметр артерии 25,25±0,75 22,2±1,43 21,6±1,16* 25±0,7

Примечание: * - p<0,05.

Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011

УДК 616.7-001-008.9-07 Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011

физическую активность, была ниже по сравнению с группой, не выполнявшей физическую нагрузку, в 1,26 раза (8,7± 1,8 ммоль/л против 11,0± 3,5 ммоль/л) [7].

В таком случае в смешанной группе животных, находившихся на диетоиндуцированной диете, надо было ожидать значений ГЦ в пределах тех цифр, что и в группе III, однако мы получили примерно в 3 раза большее значение, чем в контрольной группе, что может говорить о наличии дополнительного механизма, способствующего увеличению ГЦ на фоне уже имевшейся умеренной ГГЦ.

Считается, что ГГЦ вызывает дисфункцию эндотелия. В частности, для артерий требуется большее время на сокращение стенки и уменьшения диаметра при воздействии медиаторов (ацетилхолина) [2, 16]. Используя традиционную морфометрию гистопрепаратов с рутинной окраской гематоксилин-эозином, установили, что диаметр мелких артерий задней конечности животных в группе III был уменьшен в 1,17 раза, что, соответственно, должно приводить к уменьшению притока крови к конечности. Диаметр артерий в опытной группе II был также уменьшен, что можно расценивать как реакция на механическое воздействие. Данное значение в группе

IV было сопоставимо с контрольными цифрами. Диаметр вен в опытных группах II-IV, напротив, был больше по сравнению с контролем соответственно на 17,17% 11,84% и 5,59%. В исследуемых гистопрепаратах частота встречаемости тромбов в сосудах задней конечности составила 9% от общего количества во II группе, а в IV этот показатель составил уже 30%. Коэффициент корреляции между морфометрическими показателями и концентрацией ГЦ колебался в пределах 0,2-0,3.

Таким образом, данная модифицированная экспериментальная модель диетоиндуцированной ГГЦ может быть использована для изучения особенностей патогенеза тромбообразования при травме ОДА в условиях умеренной ГГЦ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Баранова И. Е., Большакова О. О. Клиническое значение го-моцистеинемии // Артериальная гипертензия - 2004. - № 10 (1). -С. 45-50.

2. Angela M., Devlin A. M., Arning E., Bottiglieri T., Faraci F. M., Rozen R., Lentz S. R. Effect of Mthfr genotype on diet-induced hyperhomocysteinemia and vascular function in mice // Blood. - 2004. -Vol. 103. № 2624. - 2629 p.

3. Anne S. Henkel, Marc S. Elias and Richard M. Green. Homocysteine supplementation attenuates the unfolded protein response in a murine nutritional model of steatohepatitis // J. biol. chem. - 2009. - November 13, № 284 (46). - P. 31807-31816.

4. Canepa A., Carrera A. Homocysteine, folate, vitamin B12, and C677T MTHFR mutation in children with renal failure // Pediatr nephrol. -2003. - №18. - C. 225-229.

5. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia and venous thromboembolism // Semin thromb hemost. - 2006. - № 32. - P. 716-723.

6. Chen Z., Karaplis A. C., Ackerman S. L., Pogribny I. P., Melnyk S., Lussier-Cacan S., Chen M. F., PaiA., John S. W., Smith R. S., Bottiglieri T., Bagley P., Selhub J., Rudnicki M. A., James S. J., Rozen R. Mice deficient in methylenetetrahydrofolate reductase exhibit hyperhomocysteinemia and decreased methylation capacity, with neuropathology and aortic lipid deposition // Hum. mol. genet. - 2001. - № 10. - P. 433- 443.

7. Czajkowska A., Lutoslawska G., Mazurek K., Ambroszkiewicz J., Zmijewski P. The relationship between physical activity and plasma homocysteine level in young men // Pediatr endocrinol diabetes metab. - 2008. - № 14 (3). - P. 177-180.

8. Dankner R., Geulayov G., Farber N., Novikov I., Segev S., Sela B. A. Cardiorespiratory fitness and plasma homocysteine levels in adult males and females // Isr. med. assoc. j. - 2009. - Feb, №11 (2). - P. 78-82.

9. Den Heijer M., Willems H. P., Blom H. J., Gerrits W. B., Cattaneo M., Eichinger S. et al. Homocysteine lowering by B vitamins and the secondary prevention of deep vein thrombosis and pulmonary embolism: A randomized, placebo-controlled, double-blind trial // Blood. - 2007. - № 109. - P. 139-144.

10. De Marco P., Merello E., Calevo M. G., Mascelli S., Raso A., Cama A., Capra V. Evaluation of a methylenetetrahydrofolate-dehydrogenase 1958G>A polymorphism for neural tube defect risk // J. hum genet. - 2005. - №51 (2). - P. 98-103.

11. Nutrient requirement of the mouse. In: Subcommittee on animal nutrition, board on agriculture, national research council. Nutrient requirements of laboratory animals. Fourth rev ed. Washington, DC: National academy press. - 1995. - P. 80-102.

12. Nygard O., Vollset S., Refsum H. et al. Total homocysteine and cardiovascular disease // J. intern. med. - 1999. - № 246. - P. 425-454.

13. Pfeiffer C. M., Twite D., Shih J., Holets-McCormack S. R., Gunter E. W. Method comparison for total plasma homocysteine between the Abbott IMx analyzer and an HPLC assay with internal standardization // Clin. chem. - 1999. - Jan., № 45 (1). - P. 152-153.

14. Sanjana D. and Steven R. Lentz Murine. Models of hyperhomocysteinemia and their vascular phenotypes // Arterioscler thromb. vasc. biol. - 2008. - № 28. - P. 1596-1605.

15. Watanabe M., Osada J., Aratani Y., Kluckman K., Reddick R., Malinow M. R., Maeda N. Mice deficient in cystathionine synthase: animal models for mild and severe homocyst(e)inemia // Proc. natl. acad. Sci U S A. - 1995. - № 92. - P. 1585-1589.

16. Zhang F., Slungaard A., Vercellotti G. M., ladecola C. Superoxide-dependent cerebrovascular effects of homocysteine // Am j. physiol. - 1998. - № 274. - P. 1704-1711.

Поступила 15.07.2011

д. п. березовский1, в. ю. мажугин1, т. г. Фалеева16, к. м. кураян2, н. н. крайнова3, о. в. Хабарова3, г. л. Волошина45, т. а. варавва5, и. в. корниенко56

УРОВЕНЬ ГОМОЦИСТЕИНА ПРИ ТРАВМЕ ОПОРНО-дВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОдЕЛЬ НА ЛАБОРАТОРНых

животных в условиях метиониновой диеты)

1мшгггп 111111 гл пгтпппп  пгггт пгп I мтпг ггп гмтггл ггтппгт мгппггг пшппппгпгш гпптгтп ш п гшц 344022,  гшш-ш-пищ пт к птггтптпп, 29.