СПОСОБ КОРРЕКЦИИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА У ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ПРИРОДНЫМ ГАЗОМ
METHOD FOR SPERMATOGENESIS CORRECTION IN ANIMALS IN CHRONIC NATURAL GAS POISONING

Изобретение относится к области медицины, а именно к области молекулярной физиологии и биохимии и может быть использовано для нормализации сперматогенеза у животных в условиях хронической интоксикации природным газом.
Известен способ улучшения репродуктивной функции животных по патенту 2352110 РФ от 20.04.09, Бюл. №11, заключающийся в применении витаминно-минерального комплекса, добавляемого в пищу животных. Однако известный способ имеет следующие недостатки:
- предлагаемый биокомплекс слишком емок по своему составу, а потому и эффективность его обусловлена не столько направленностью действия, сколько его общим стимулирующим эффектом на весь организм;
- кроме того, витаминная составляющая не содержит таких важнейших антиоксидантов, способных компенсировать процессы окислительного радикалообразования, как витамин Е и С;
- минеральная основа лишена таких важнейших для сперматогенеза элементов, как цинк Zn и селен Se.
Также известны способы коррекции сперматогенеза, заключающиеся в комплексном применении селена и витамина Е, добавляемых в суточный рацион боровов (Marin-Guzman J., Mahan D.C., Chung Y.K., Pate J.L., Pope W.F. Effects of dietry selenium and vitamin E on boar performance and tissue responses, semen quality, and subsequent fertilization rates in mature gilts // J. Anim. Sci. - 1997. - Vol.75, №11. - P.2994-3003; Echeverria-Alonzo S., Santos-Ricalde R., Centurion-Castro F., Ake-Lopez R., Alfaro-Gamboa M., Rodriquez-Buenfil J. Effects of dietary selenium and vitamin E on semen quality and sperm morphology of young boars during warm and fresh season // Journal of Animal and Veterinary Advances. - 2009. - Vol.8, №11. - P.2311-2317).
Однако известные способы имеют следующие недостатки:
- данные способы коррекции не были изучены в условиях воздействия токсических агентов, вызывающих развитие окислительного стресса;
- в качестве антиоксиданта предлагается всем известный витамин E, проявляющий антиоксидантные свойства в отношении целого ряда систем организма и, в том числе, репродуктивной системы.
Известен также способ-прототип коррекции сперматогенеза, заключающийся в использовании селенсодержащего соединения (селенит натрия), добавляемого в условиях хронической интоксикации сероводородсодержащим газом Астраханского газового месторождения (Ушакова М.В. Функционирование репродуктивной системы самцов крыс при хроническом воздействии природных токсикантов: автореферат дис. … канд. биол. наук. - Астрахань, 2002. - 22 с.).
Прототип имеет следующие недостатки:
- в качестве протектора автором предлагается неорганическая форма селена (селенит натрия), которая, в отличие от органической, является трудноусвояемой;
- сам селенсодержащий протектор не дополнен никаким известным витамином-антиоксидантом (витамин E, аскорбиновая кислота), способным усилить протекторные свойства селена.
Предлагаемое изобретение направлено на уменьшение токсических эффектов природного газа в отношении репродуктивной функции мужских гонад (на модели с экспериментальными животными). Предлагаемый способ позволяет в более заметной степени снизить токсические эффекты природного газа на репродуктивный аппарат по морфологическим и кинетическим показателям сперматогенеза. Особенно заметно это проявляется в отношении подвижных форм сперматозоидов, относительное и абсолютное количество которых удается повысить с помощью предлагаемого способа, по сравнению с аналогичными показателями после воздействия газом. Предлагаемым нами способом удается в значительно большей степени достичь улучшения подвижности сперматозоидов, чем способом, описанным в прототипе.
3
Указанный технический результат достигается тем, что в качестве корректора применяют селексен в сочетании с аскорбиновой кислотой, которые вводят перорально самцам белых крыс соответственно в дозах 1,5 и 500 мг/кг массы тела животного 1 раз в сутки в течение 50 дней, а параллельно с третьей недели введения селексена и аскорбиновой кислоты воздействуют сероводородсодержащим природным газом в концентрации 10 мг/м в течение 30 дней по 240 минут ежедневно, затем по окончании экспериментальных воздействий исследуют морфологические и кинетические показатели сперматогенеза.
В качестве корректора нами выбран именно селексен, поскольку селен в нем находится в хорошо усвояемой органической форме. Кроме того, в органической форме селен малотоксичен (Саноцкий И.В. Незаменимый селен. - М.: Ассоциация АКМ, 2001, - 96 с.). В настоящее время доказано наличие синергизма селена и аскорбиновой кислоты, а также способность последней выводить избыток селена (Bebne D. Studies in the distribution and characteristics of new mammalian selenium-containing proteins // Analyst. - 1995. - Vol.120. - P.823-825). Животным вводили селен из расчета 350 мкг селена на 1 кг массы тела животного в сутки, что адекватно для половозрелых крыс с точки зрения уровня их метаболизма (Ушакова М.В. Функционирование репродуктивной системы самцов крыс при хроническом воздействии природных токсикантов: автореферат дис. … канд. биол. наук. - Астрахань, 2002. - 22 с.). Аскорбиновую кислоту давали животным в умеренно повышенной дозе, опираясь на еще давние исследования Л.Полинга и его школы о роли высоких доз витамина С в регуляции физиологических процессов и, в том числе, репродуктивных (Полинг Л. Витамин С и здоровье. М.: Наука, 1974. - 74 с.). Витамин С улучшает «качество» спермы, благотворно влияет на андрогенез и увеличивает подвижность сперматозоидов (Sharaf A., Gomaa N. Androgenicity in vitamins // Qualitas plantarum et material vegetabiles. - 1970. - Vol.19, №4. - P.369-374; Yousef M.I., Abdallah G.A., Kamel K.I. Effect of ascorbic acid and vitamin E supplementation on semen quality and biochemical parameters of male rabbits // Anim. Reprod. Sci. - 2003. Vol.76, №1-2. - P.99-111). Высокие дозы витамина С трансформируют селенит натрия (неорганический селен) в практически неусваиваемый элементарный селен, выводящийся с фекалиями, чего не наблюдается в случае селена в органической форме. Это также определило выбор нами именно селексена в качестве источника селена. Сама аскорбиновая кислота, кроме того, способна регулировать уровень селена в организме и выводить его избыток из организма (Bebne D. Studies in the distribution and characteristics of new mammalian selenium-containing proteins // Analyst. - 1995. - Vol.120. - P.823-825).
3
Селексен в сочетании с витамином С вводили один раз в сутки в указанных дозах, что полностью покрывало суточную потребность животных в данных нутриентах, которые равномерно распределялись в течение суток по всему организму. Учитывая, что сперматогенный цикл у крыс составляет 48 дней (ВОЗ, 1967), животным была назначена 50-дневная диета, обогащенная селексеном и витамином С. Через 2 недели после начала введения аскорбиновой кислоты и селексена начали воздействовать сероводородсодержащим газом в концентрации 10 мг/м. Указанная концентрация газа в экспозиции до нескольких часов в сутки в течение длительного срока (обычно более двух недель) определяет квалификационную категорию воздействия «хроническая интоксикация» (Асфандияров Р.И., Бучин В.Н., Лазько А.Е. и др. Острые отравления серосодержащими газами. - Астрахань, 1995. - 156 с.). Само воздействие сероводородсодержащим газом осуществлялось «внутри» самого курса введения селексена и аскорбиновой кислоты (с третьей недели в течение 30 дней), что позволяло плавно ввести токсикант в экспериментальную модель, избежав, таким образом, погрешностей, вызванных токсическими эффектами газа в отсутствие корректоров (селексена и аскорбиновой кислоты).
3
3
Создание способа коррекции сперматогенной функции осуществлялось на 40 половозрелых самцах белых крыс массой 200±10 г на базе кафедры общей и биоорганической химии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ». Животные были разделены на 4 группы. Первая группа была контрольная (10 шт.). Во вторую группу (10 шт.) вошли животные, получавшие перорально селексен в сочетании с аскорбиновой кислотой в дозах соответственно 1,5 и 500 мг/кг массы тела животного в сутки в течение 50 дней. Третью группу составили животные, подвергавшиеся воздействию сероводородсодержащим (в течение 30 дней по 4 часа), концентрация которого в затравочной камере поддерживалась на уровне 10 мг/м. В четвертую группу вошли животные, получавшие селексен в сочетании с аскорбиновой кислотой в дозах соответственно 1,5 и 500 мг/кг массы тела животного в сутки в течение 50 дней, а параллельно с третьей недели введения указанных препаратов подвергавшиеся воздействию сероводородсодержащим газом в концентрации 10 мг/м в течение 30 дней по 240 минут ежедневно.
Для оценки протекторных свойств селексена в сочетании с аскорбиновой кислотой в условиях воздействия сероводородсодержащим токсикантом мы исследовали эякулят белых крыс. Для этого мы по окончании опытов из хвостовой части эпидидимисов, разрезая их вдоль, вымывали семенную жидкость дозированным количеством физиологического раствора (эмпирически для крыс это количество 2-4 мл) (И.В.Саноцкий, В.Н.Фоменко. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. - М.: Медицина, 1979. - С.79-80) и получали суспензию (эпидидимальные сперматозоиды у животных третьей группы выделяли на 7-й день после окончания воздействия газом). На часовом стекле в течение 2 минут эпидидимис активно перемещают для освобождения от части сперматозоидов (во избежание артефактов стеклянные палочки применять нельзя, используют отрезки отмытой резиновой трубки). Взвесь сперматозоидов наносят на предметные стекла, подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают любым красителем. Подсчет дегенеративных форм ведут по отношению к количеству просчитанных в полях зрения сперматозоидов. Подсчет общего числа эпидидимальных сперматозоидов в суспензии производили в камере Горяева под окуляром светового микроскопа при увеличении 600×. Число спермиев подсчитывали в 5 больших квадратах камеры Горяева по диагонали. Кроме того, в нативной сперме определялось процентное соотношение между различными морфологическими формами сперматозоидов (дефективные, подвижные и мертвые), а также давалась общая характеристика морфофункционального состояния самих семенных канальцев на основе гистологических срезов. Срезы семенников толщиной 7 мкм изготавливали на микротоме "Microm НМ-400" (Германия). Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Полученные препараты изучались на универсальном микроскопе "Nu" (Германия), соединенным с цветной телевизионной камерой "Pixera" (США).
В предлагаемом способе достигнуты следующие результаты. Количество и морфо-функциональное состояние эпидидимальных сперматозоидов у белых крыс в норме и в условиях экспериментальных воздействий отражено в таблице 1. Изменение количества эпидидимальных сперматозоидов под влиянием сероводородсодержащего природного газа, селенсодержащего биокомплекса (селексен + витамин С) и их сочетания отражено на рисунке 1. У животных, подвергнутых воздействию газом, на 7-й день после прекращения воздействия таковым отмечено резкое уменьшение общего количества эпидидимальных сперматозоидов более чем в 1,7 раз, в сравнении с контролем (Р<0,001) (таблица 1, рис.1). В популяции сперматозоидов отмечалось увеличение процентного содержания дефективных форм (44,4%), подвижные сперматозоиды почти отсутствовали (0,4%). Также почти в 11,5 раз увеличилось содержание мертвых сперматозоидов (55,2%) по сравнению с контролем (4,8%) (Р<0,001). Отсутствие подвижности сперматозоидов связано с таким дефектом, как облом хвоста сперматозоидов, что можно объяснить усилением процесса липопероксидации в условиях развития окислительного стресса, вызванного сероводородсодержащим газом. Вместе с тем, предварительное потребление животными селенсодержащего биокоимплекса способствовало снижению токсических эффектов сероводородсодержащего газа. Достоверно значимых отклонений от контроля по количеству сперматозоидов у животных, подвергавшихся воздействию газом и предварительно получавших указанный биопротектор, нами не было зафиксировано. В группе животных, подвергавшихся воздействию газом и предварительно получавших селенсодержащий комплекс, наблюдалось некоторое улучшение соотношения между разными формами сперматогенных клеток в сравнении с группой животных, подвергавшихся воздействию только газом. До уровня нормы соотношение между разными формами сперматогенных клеток не успевало восстанавливаться на 7-й день после отмены токсического воздействия, что можно объяснить особенностями кинетики репаративных процессов.
Структура извитых канальцев семенников животных, подвергнутых воздействию сероводородсодержащим газом, отражена на рисунке 2 (окраска гематоксилин-эозином; увел. 200×). В условиях воздействия сероводородсодержащим газом наблюдался отек интерстициальной ткани, полнокровие сосудов семенников и гибель половых клеток. Семенные канальцы располагались на значительном расстоянии друг от друга. Наблюдалось отслоение базальной мембраны и хаотичное расположение клеток сперматогенного эпителия (а в ряде случаев и вообще запустевание семенных канальцев) (рис.2).
Структура извитых канальцев семенников животных, подвергнутых воздействию газом и получавших предварительно селексен в сочетании с витамином С, отражена на рисунке 3 (окраска гематоксилин-эозином; увел. 200×), из которого следует, что предварительное введение селенсодержащего биокомплекса способствует заметному снижению токсических эффектов, вызываемых одним только токсикантом.
Все вышеуказанные обстоятельства свидетельствует в пользу протекторных свойств селексена в сочетании с повышенными дозами аскорбиновой кислоты в отношении мужской репродуктивной функции в условиях экстремальных воздействий сероводородсодержащих поллютантов, вызывающих развитие оксидативного стресса.
Таким образом, предлагаемым способом коррекции сперматогенеза в условиях хронической интоксикации природным газом достигается снижение токсических эффектов газа в отношении репродуктивной функции самцов экспериментальных животных (крыс), что выражается в улучшении морфофункциональных показателей эпидидимальных сперматозоидов и означает повышение качества спермы в неблагоприятных условиях окружающей среды.
Таблица 1
Показатели состояния эпидидимальных сперматозоидов
Контроль (n=10)
Биокомплекс (селексен + витамин С) (n=10)
Воздействие сероводородсодержащим газом (n=10)
Воздействие газом + биокомплекс (n=10)
Общее количество, млн
50,0±6,51
54,3±6,0
*** 28,4±2,44
ΔΔ 41,0±4,51
Дефективные, %
20,2±2,22
*** 13,1±0,62
*** 44,4±3,83
ΔΔΔ 42,0±3,52
Подвижные, %
81,0±6,2
88,0±6,11
*** 0,4±0,12
ΔΔΔ 54,5±4,22
Мертвые, %
4,8±0,82
4,7±0,72
*** 55,2±4,11
45,4±3,31
*** Р<0,001 - в сравнении с контролем; ΔΔ Р<0,01; ΔΔΔ Р<0,001 - в сравнении с группой животных, подвергавшихся воздействию газом