НОВЫЕ АРИЛИРОВАННЫЕ КАМФЕНЫ, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
NEW ARYLATED CAMPHENES, METHODS FOR PRODUCING AND USING THEM

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к арилированным камфенам, способам их получения и их применениям для получения лекарственных средств для лечения заболеваний, нарушений или состояний, которые связаны со стимуляцией рецепторов СВ2 или на которые благоприятно влияет стимуляция рецепторов СВ2.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Следующие публикации являются релевантными для описания уровня техники в области техники, к которой относится настоящее изобретение:
1. Arevalo-Martin A, Garcia-Ovejero D, Gomez O, Rubio-Araiz A, Navarro-Galve B, Guaza C, Molina-Holgado E, Molina-Holgado F. СВ2 cannabinoid receptors as an emerging target for demyelinating diseases: from neuroimmune interactions to cell replacement strategies. Br J Pharmacol. 153, 216-25 (2008).
2. Avraham Y, Israeli E, Gabbay E, Okun A, Zolotarev O, Silberman I, Ganzburg V, Dagon Y, Magen I, Vorobia L, Pappo O, Mechoulam R, Ilan Y, Berry EM. Endocannabinoids affect neurological and cognitive function in thioacetamide - induced hepatic encephalopathy. Neurobiol. Disease, 21, 237-245 (2006).
3. Ashton JC, Glass M. The cannabinoid СВ2 receptor as a target for inflammation-dependent neurodegeneration. Current Neuropharmacol. 5, 73-80 (2007).
4. Ashton JC, Rahman RM, Nair SM, Sutherland BA, Glass M, Appleton I. Cerebral hypoxia-ischemia and middle cerebral artery occlusion induce expression of the cannabinoid СВ2 receptor in the brain. Neurosci Lett. 412, 114-7 (2007).
5. Bartlett, PD, Knox, LH. Org. Synth. Coll. Vol.5, 689 (1973).
6. Benito С, Tolon RM, Pazos MR, Nunez E, Castillo AI, Romero J. Cannabinoid СВ2 receptors in human brain inflammation. Brit. J. Pharmacol. 153, 277-285 (2008).
7. Bilsland LG, Dick JR, Pryce G, Petrosino S, Di Marzo V, Baker D, Greensmith L. Increasing cannabinoid levels by pharmacological and genetic manipulation delay disease progression in SOD1 mice. FASEB J. 20,1003-5 (2006).
8. Centonze D, Rossi S, Finazzi-Agro A, Bernardi G, Maccarrone M. The (endo)cannabinoid system in multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Int Rev Neurobiol. 82,171-86 (2007).
9. Chen Y, Constantini S, Trembovler V, Weinstock M and Shohami E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits, J. Neurotrauma 13, 557-568 (1996).
10. Dagon Y, Avraham Y, Ilan Y, Mechoulam R, Berry EM. Cannabinoids ameliorate cerebral disfunction following liver failure via AMP-activated protein kinase. FASEB J. 21,2431-2441(2007).
11. Docagne F, Mestre L, Lorfa F, Hemangomez M, Correa F, Guaza C. Therapeutic potential ofCB2 targeting in multiple sclerosis. Expert Opin Ther Targets. 12, 185-95 (2008).
12. Dominianni SJ, Ryan, CW, DeArmitt CW. Synthesis of 5-(tert-alkyl)resorcinols. J. Org. Chem. 42, 344-346 (1977).
13. Femandez-Ruiz J, Gonzalez S, Romero J, Ramos JA, Cannabinoids in neurodegeneration and neuroprotection. In R. Mechoulam (Ed.) "Cannabinoids as Therapeutics". Birkhauser, Basel, 2005, pp 79-109.
14. Femandez-Ruiz J, Pazos MR, Garcia-Arencibia M, Sagredo O, Ramos JA. Role of CB2 receptors in neuroprotective effects of Cannabinoids, Mol Cell. Endocrin. 286 (Suppi 1), S91-S96 (2008).
15. Hanus L, Breuer A, Tchilibon S, Shiloah S, Goldenberg DM, Horowitz M, Pertwee RG, Ross RA, Mechoulam R, Fride E. HU -308: A specific agonist for CB2, a peripheral cannabinoid receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. (US), 96, 14228-14233 (1999).
16. Hanus LO, Tchilibon S, Ponde DE, Breuer A, Fride E, Mechoulam R. Enantiomeric cannabidiol derivatives: Synthesis and binding to cannabinoid receptors. Org. Biomol. Chem. 3, 1116-1123 (2005).
17. Hertzog DL. Recent advances in the Cannabinoids. Expert Opin. Ther. Patents, 14, 1435-1452 (2004).
18. Klegeris A, Bissonnette CJ, McGeerPL. Reduction of human monocytic cell neurotoxicity and cytokine secretion by ligands of the cannabinoid-type CB2 receptor Br J Pharmacol. 139, 775-86 (2003).
19. Kogan NM, Mechoulam R. The chemistry of endocannabinoids. J. Endocrinol. Investig. 29 (Suppl. 3) 3-14 (2006).
20. Kogan, NM, Mechoulam, R. Cannabinoids in health and disease. Dialogues Clin. Neurosci. 9,413-430(2007).
21. Lotersztajn S, Teixeira-Clerc F, Julien B, Deveaux V, Ichigotani Y, Manin S, Tran-Van-Nhieu J, Karsak M, Zimmer A, Mallat A. CB2 receptors as new therapeutic targets for liver diseases. Brit. J. Pharmacol., 153, 286-289 (2008).
22. McMurry JE, Scott WJ. A method for the regiospecific synthesis of enol Inflates by enolate trapping. Tetrahedron Lett. 24, 979-982 (1983).
23. Mechoulam R, Braun P, Gaoni Y. Syntheses of Д1-ТНС and related cannabinoids. J. Am. Chem. Soc., 94, 6159-6165 (1972).
24. Mechoulam R, Sumariwalla PF, Feldmann M, Galilly R. Cannabinoids in models of chronic inflammatory conditions. Phytochem. Revs 4, 11-18 (2005).
25. Ofek O, Karsak, M, Leclerc N, Fogel M, Frenkel B, Wright K, Tarn J, Attar-Namdar M, Kram V, Shohami E, Mechoulam R, Zimmer A, Bab I. Peripheral CB2 cannabinoid receptor regulates bone mass. Proc. Natl. Acad. Sci., Proc. Natl. Acad. Sci. (US) 103, 696-701 (2006).
26. Pacher P, Hasko G. Endocannabinoids and cannabinoid receptors in ischaemia-reperfusion injury and preconditioning. Br J Pharmacol. 153:252-62 (2008).
27. Palazuelos J, Aquado T, Egia A, Mechoulam R, Guzman M, Galve-Roperh I. Non-psychoactive CB2 cannabinoid agonists stimulate neural progenitor proliferation. FASEB J. 580,4337-4345 (2006).
28. Palazuelos J, Davoust N, Julien B, Hatterer E, Aguado T, Mechoulam R, Benito C, Romero J, Silva A, Guzman M, Nataf S, Galve-Roperh I. The CB2 cannabinoid receptor controls myeloid progenitor trafficking. Involvement in the pathogenesis of an animal model of multiple sclerosis. J Biol Chem. 283, 13320-13329 (2008).
29. Steffens S, Mach F. Cannabinoid receptors in atherosclerosis. Curr. Opinion Lipidology, 17, 519-526, 2006.
c
30. Steffens S, Veillard NR, Amaud C, Pelli G, Burger F, Staub C, Karsak M, Zimmer A, Frossard JL, Mach F. Low dose oral cannabinoid therapy reduces progression of atherosclerosis in mice. NatuR 434, 782-786 (2005).
31. Thoren S. 4 Isomeric alpha-hydroxybomanones. Acta Chemica Scandinavica. 24, 93-98 (1970).
32. van Sickle MD, Duncan M, Kingsley PJ, Mouihate A, Urbani P, Mackie K, Stella N, Makriyannis A, Piomelli D, Davison JS, Mamett LJ, Di Marzo V, Pittman QJ, Patel KD, Sharkey KA. Identification and functional characterization of brain stem cannabinoid CB2 receptors. Science, 310, 329-332 (2005).
33. Yamamoto W, Mikami T, Iwamura H. Involvement of central cannabinoid CB2 receptor in reducing mechanical allodynia in a mouse model of neuropathic pain. Eur. J. Pharmacol. 583, 56-61 (2008).
34. Zhang M, Martin BR, Adier MW, Razdan RK, Ganea D, Tuma RF. Modulation of the balance between cannabinoid CB1 and CB2 receptor activation during cerebral ischemic/reperfusion injury. Neurosci. 152, 753-760 (2008).
35. Pertwee RG, Gibson TM, Stevenson LA, Ross RA, Banner WK, Saha B, Razdan RK and Martin BR. 0-1057, a potent water-soluble cannabinoid receptor agonist with antinociceptive properties. Br J Pharmacol. 129,1577-1584 (2000).
36. Shohami E, Gallily R, Mechoulam R, Bass R and Ben-Hur T. Cytokine production in the brain following closed head injury: dexanabinol _ HU-211/ is a novel TNF-a inhibitor and an effective neuroprotectant. J. Neuroimmunol. 72,169-177 (1997).
37. Ross RA, Brockie НС, Stevenson LA, Murphy VL, Templeton F, Makriyannis A and Pertwee RG. Agonist-inverse agonist characterization at CB1 and CB2 cannabinoid receptors ofL759633, L759656 and AM630. Br J Pharmacol. 126, 665-672 (1999).
38. Beni-Adani L, Gozes I, Cohen Y, Assaf Y, Steingart RA, Brenneman DE, Eizenberg O, Trembolver V and Shohami E. A peptide derived from activity-dependent neuroprotective protein (ADNP) ameliorates injury response in closed head injury in mice. J Pharmacol Exp Ther. 296, 57-63 (2001).
До настоящего времени хорошо охарактеризованы были два каннабиноидных рецептора - рецептор CB1, который присутствует, главным образом, в центральной нервной системе (ЦНС) (и, в меньшей степени, в периферической нервной системе), и рецептор CB2, который в основном рассматривают в качестве периферического рецептора. Естественная стимуляция рецептора CB1, который продуцируется эндогенными каннабиноидами в требуемое время в требуемом месте, является важной для многих физиологических систем. Тем не менее экзогенное введение агонистов CB1 (например, содержащегося в марихуане ТНС (тетрагидроканнабинола)) может приводить к нежелательным побочным эффектам. Таким образом, агонисты CB1, которые воздействуют на центральную нервную систему, имеют ограниченную терапевтическую ценность (см. последний обзор Kogan and Mechoulam, 2007).
Рецептор CB2 присутствует в малых количествах в ЦНС, в основном в глиальных клетках. Тем не менее было показано, что ряд неврологических состояний вызывает экспрессию этого рецептора в мозге. Некоторыми из указанных состояний являются церебральная гипоксия-ишемия, окклюзия мозговых артерий, болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Также было показано, что стимуляция рецептора CB2 не сопровождается нежелательным действием на ЦНС или другим нежелательным действием, например, обширным и/или вредным психотропным действием, связанным, как правило, со стимуляцией рецептора CB1 (Эштон и Гласе, 2007).
Следовательно, существует потребность в селективных стимуляторах рецептора СВ2, подходящих для применения для лечения заболеваний, нарушений или состояний, которые связаны со стимуляцией рецепторов СВ2 или на которые благоприятно влияет такая стимуляция рецепторов СВ2.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложено соединение общей формулы (I):
где
каждый из , ,  независимо представляет собой одинарную или двойную связь;
a
1
5
2
5
2
5
d
2
1
5
R выбран из линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного С-С алкенила, линейного или разветвленного С-С алкинила и -C(=O)R, каждый из которых возможно замещен по меньшей мере одной группой, выбранной из -ОН, -СООН, -NH, C-C амина, галогена, фенила, гетероарила; где
d
1
5
2
5
2
5
1
5
e
f
R выбран из группы, состоящей из -Н, -ОН, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-C алкенила, линейного или разветвленного C-C алкинила, линейного или разветвленного C-C алкокси, -NRR;
c
f
1
5
каждый из R и R независимо выбран из Н и линейного или разветвленного C-C алкила; и
b
c
g
h
i
5
15
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
p
q
каждый из R и R независимо выбран из -Н, -ОН,=O,=CRR,=NR,=S, -C-C, арильного кольца, замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -ОН, -OC(=O)R и -C(=O)R; где
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного С-С алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси и NH; и
b
c
5
15
при условии, что по меньшей мере один из R и R представляет собой указанное замещенное -C-C арильное кольцо.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения по меньшей мере один из , ,  представляет собой двойную связь.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения  в соединении формулы (I) представляет собой двойную связь. Следовательно, соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I'):
a
b
c
где заместители R, R и R такие, как определено выше в настоящем описании.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения  в соединении формулы (I) представляет собой одинарную связь. Следовательно, соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I''):
a
b
c
где заместители R, R и R такие, как определено выше в настоящем описании.
Согласно одному из вариантов реализации  представляет собой двойную связь. Согласно этому варианту реализации  представляет собой одинарную связь, а  может представлять собой одинарную или двойную связь.
Согласно другому варианту реализации  представляет собой двойную связь. Согласно этому варианту реализации  представляет собой одинарную связь, а  может представлять собой одинарную или двойную связь.
Согласно другому варианту реализации  представляет собой одинарную связь и  представляет собой одинарную связь.
b
c
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
2
1
5
1
5
2
1
5
b
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
2
1
5
1
5
2
1
5
c
g
h
i
5
15
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
p
q
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
c
1
12
2
12
2
12
1
12
2
1
5
1
5
2
1
5
b
g
h
i
5
15
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
p
q
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
Согласно другому варианту реализации изобретения по меньшей мере один из R и R представляет собой фенильное кольцо, замещенное по меньшей мере двумя заместителями, выбранными из линейного или разветвленного C-C алкила, С-С алкенила, С-С алкинила, C-C алкокси, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -С(=O)ОН, -C(=O)NH, -С(=O)(C-Cалкила), -С(=O)(С-Салкокси), -ОСOН, -OC(=O)NH, -ОС(=O)(С-Салкила). Таким образом, согласно одному из вариантов реализации R представляет собой фенильное кольцо, замещенное по меньшей мере двумя заместителями, выбранными из линейного или разветвленного C-C алкила, С-С алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -СООН, -CONH, -С(=O)(С-Салкила), -С(=O)(С-Салкокси), -ОСОН, -OC(=O)NH, -ОС(=O)(С-Салкила), a R выбран из -Н, -ОН, =O, =CRR, =NR, =S, -C-C арильного кольца, замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -OC(=O)R и -C(=O)R; где каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси и NH. Согласно другому варианту реализации R представляет собой фенильное кольцо, замещенное по меньшей мере двумя заместителями, выбранными из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси-СООН, -CONH, -С(=O)(С-Салкила), -С(=O)(С-Салкокси), -ОСОН, -OC(=O)NH, -ОС(=O)(С-Салкила), a R выбран из -Н, -ОН,=O,=CRR,=NR,=S, -C-C арильного кольца, замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -OC(=O)R и -C(=O)R; где каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси и -NH.
b
c
1
12
2
12
2
12
1
12
2
1
5
1
5
2
1
5
Согласно другому варианту реализации изобретения по меньшей мере один из R и R представляет собой фенильное кольцо, замещенное по меньшей мере тремя заместителями, выбранными из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, -С(=O)ОН, -C(=O)NH, -С(=O)(С-Салкила), -С(=O)(C-Салкокси), -ОС(=O)Н, -OC(=O)NH, -ОС(=O)(С-Салкила).
b
c
5
15
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
p
q
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, если все , ,  представляют собой одинарную связь, то по меньшей мере один из R и R представляет собой -C-C арильное кольцо, замещенное по меньшей мере двумя заместителями, выбранными из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -OC(=O)R и -C(=O)R; где каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного С-С алкокси и NH.
b
c
5
15
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
p
q
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
Согласно другим вариантам реализации изобретения, если все , ,  представляют собой одинарную связь, то по меньшей мере один из R и R представляет собой -C-C арильное кольцо, замещенное по меньшей мере тремя заместителями, выбранными из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -OC(=O)R и -C(=O)R; где каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси и NН.
b
c
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из R и R представляет собой группу формулы (II):
j
k
n
n
t
1
5
2
j
k
m
6
12
5
9
1
7
2
t
1
5
2
где каждый из R и R независимо выбран из Н и -OR, R выбран из Н, -COOR, линейного или разветвленного C-C алкила, возможно замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из -СООН, -NH, при условии, что по меньшей мере один из R и R отличается от Н; a R выбран из линейного или разветвленного С-С алкила, линейного или разветвленного С-С алкокси, линейного или разветвленного C-Cпростого эфира, каждый из которых возможно замещен по меньшей мере одной группой, выбранной из -СООН, -NH; a R выбран из Н, C-С алкила и -NH.
Таким образом, соединение согласно настоящему изобретению может представлять собой соединение любой из формул (III), (IV), (V) или (VI):
и
j
k
n
n
t
1
5
2
j
k
m
6
12
t
1
5
2
где каждый из R и R независимо представляет собой Н или -OR, где R выбран из Н, -COOR, линейного или разветвленного C-C алкила, возможно замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из -СООН, -NH, при условии, что по меньшей мере один из R и R отличается от Н; a R представляет собой линейный или разветвленный С-С алкил, a R выбран из Н, C-C алкила и -NH.
a
1
5
d
2
1
5
d
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения R выбран из линейного или разветвленного C-C алкила и -C(=O)R, каждый из которых возможно замещен по меньшей мере одной группой, выбранной из -ОН, -СООН, -NH, C-C амина, галогена, фенила, гетероарила, a R такой, как определено выше в настоящем описании.
b
c
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из R и R представляет собой группу формулы (II') или (II"):
j
k
mm
n
n
t
1
5
2
j
k
m
3
12
3
9
1
7
t
1
5
2
где каждый из R, R и R независимо выбран из Н и -OR, где R выбран из Н, -COOR, линейного или разветвленного C-C алкила, возможно замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из -СООН, -NH, при условии, что по меньшей мере один из R и R отличается от Н; a R выбран из возможно замещенного линейного или разветвленного С-С алкила, возможно замещенного линейного или разветвленного С-С алкокси, возможно замещенного линейного или разветвленного C-C сложного эфира; a R выбран из Н, C-C алкила и -NH.
b
c
g
h
5
15
1
12
3
12
2
12
1
12
p
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
b
c
5
15
b
c
5
15
Согласно другому варианту реализации соединения формулы (I), если  представляет собой одинарную связь, то каждый из R и R независимо выбран из -Н, -ОН, =O, =CRR, =NR, =S, -C-C арильного кольца, замещенного по меньшей мере двумя заместителями, выбранными из линейного или разветвленного C-C алкила, С-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, -OC(=O)R и -C(=O)Rq; где каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси и -NH; при условии, что по меньшей мере один из R и R представляет собой указанное -C-C арильное кольцо. Согласно другому варианту реализации указанный R представляет собой =O, таким образом соединение согласно настоящему изобретению может представлять собой соединение формулы (VII), где R представляет собой указанное замещенное -C-C арильное кольцо:
c
b
5
15
Согласно другому варианту реализации R представляет собой =O, таким образом, соединение согласно настоящему изобретению может представлять собой соединение формулы (VIII), где R представляет собой указанное замещенное -C-C арильное кольцо:
Согласно одному из вариантов реализации соединение согласно настоящему изобретению выбрано из следующего списка:
- метил-2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат;
- метил-2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат;
- 2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен;
- (2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло [2.2.1] гепт-2-ен-1-ил)метанол;
- (2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-ил)метанол;
- 2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота;
2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота;
- 3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен;
3-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-он;
- 3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло [2.2.1]гептан-2-он;
3-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ол;
- 3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло [2.2.1] гептан-2-ол;
- (3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-ил)метанол;
- 3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло [2.2.1] гепт-2-ен-1-карбоновая кислота;
- метил-3-(2,б-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат;
- (3-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-ил)метанол;
- 3-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота;
- 5-(2-метилоктан-2-ил)-2-(4,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-2-ил)бензол-1,3-диол;
- 2-(4-(гидроксиметил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-2-ил)-5-(2-метилоктан-2-ил)бензол-1,3-диол;
- 3-(2,6-дигидрокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота;
- 2-(4-(гидроксиметил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил)-5-(2-метилоктан-2-ил)бензол-1,3-диол;
- 5-(2-метилоктан-2-ил)-2-(4,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил)бензол-1,3-диол; и
- 3-(2,6-дигидрокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гептан-1-карбоновая кислота.
В изобретении также предложено соединение общей формулы (I):
где:
каждый из , ,  независимо представляет собой одинарную
или двойную связь;
a
1
5
2
5
2
5
d
1
5
R выбран из линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного С-С алкенила, линейного или разветвленного С-С алкинила и - C(=O)R, каждый из которых возможно замещен по меньшей мере одной группой, выбранной из -ОН, -СООН, -NH, C-C амина, галогена, фенила, гетероарила; где
d
1
5
2
5
2
5
1
5
e
f
R выбран из группы, состоящей из -Н, -ОН, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-C алкенила, линейного или разветвленного C-C алкинила, линейного или разветвленного C-C алкокси, -NRR;
e
f
1
5
каждый из R и R независимо выбран из Н и линейного или разветвленного C-C алкила; и
b
c
g
h
i
5
15
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
p
q
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
каждый из R и R независимо выбран из -Н, -ОН, =O, =CRR, =NR, =S, -C-C арильного кольца, замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из линейного или разветвленного C-C алкила, С-С алкенила, С-С алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -ОН, -OC(=O)R и -C(=O)R; где каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси и -NH;
a
b
или R и R могут образовывать кольцо совместно с атомами углерода, к которым они присоединены; указанное кольцо может представлять собой циклоалкил, циклогетероалкил, циклогетероалкенил, циклоалкенил, циклоалкинил, циклогетероалкинильное кольцо; согласно некоторым вариантам реализации указанное кольцо представляет собой 6-12-членное кольцо;
b
c
5
15
при условии, что по меньшей мере один из R и R представляет собой указанное замещенное -C-C арильное кольцо.
Согласно некоторым вариантам реализации соединение согласно настоящему изобретению имеет общую формулу (XII):
где  представляет собой одинарную или двойную связь;
c
g
h
i
5
15
1
12
2
12
2
12
1
12
1
12
p
q
g
h
i
p
q
1
5
1
5
2
R выбран из -Н, -ОН, =O, =CRR, =NR, =S, -C-C арильного кольца, замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из линейного или разветвленного C-C алкила, C-C алкенила, C-C алкинила, C-C алкокси, амина, C-C алкоксикарбоновой кислоты, -OC(=O)R и -C(=O)R; где каждый из R, R, R, R и R независимо выбран из Н, линейного или разветвленного C-C алкила, линейного или разветвленного C-С алкокси и -NH;
j
n
n
t
1
5
2
t
1
5
2
R выбран из Н и -OR, где R выбран из Н, -COOR, линейного или разветвленного C-C алкила, возможно замещенного по меньшей мере одной группой, выбранной из -СООН, -NH; a R выбран из Н, C-C алкила и -NH;
m
6
12
5
9
1
7
2
R выбран из линейного или разветвленного С-С алкила, линейного или разветвленного C-C алкокси, линейного или разветвленного C-C простого эфира; каждый из которых возможно замещен по меньшей мере одной группой, выбранной из -СООН, -NH;
1
2
1
5
каждый из Z и Z независимо выбран из -O-, линейного или разветвленного C-С алкилена, -S-, -С(=O)- и -C(=S)-.
Согласно другим вариантам реализации соединение согласно настоящему изобретению может быть выбрано из группы, состоящей из:
,
,
,
.
Используемый в настоящем описании термин «алкил» относится к углеводороду с линейной или разветвленной цепью, содержащему от одного до пяти атомов углерода, или от одного до семи атомов углерода, или от пяти до девяти атомов углерода, или от шести до двенадцати атомов углерода. Примеры «ал/сила», используемые в настоящей заявке, включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, н-бутил, н-пентил, изобутил и изопропил, трет-бутил и т.д.
Используемый в настоящем описании термин «алкенил» представляет собой разветвленную или линейную углеводородную группу, содержащую от 2 до 5 или от 2 до 12 атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь. Примеры подобных групп включают, но не ограничиваются ими, этенил, 1-пропенил, 2-пропенил, изопропенил, 1,3-бутадиенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 1-гексенил, 2-гексенил и т.д.
Используемый в настоящем описании термин «алкинил» представляет собой разветвленную или линейную углеводородную группу, содержащую от 2 до 5 или от 2 до 12 атомов углерода и по меньшей мере одну тройную связь. Примеры подобных групп включают, но не ограничиваются ими, этинил, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 1-гексинил, 2-гексинил и т.д.
Используемый в настоящем описании термин «арил» относится к ароматическим моноциклическим или полициклическим группам, содержащим от 5 до 15 атомов углерода. Арильные группы включают, но не ограничиваются ими, группы, такие как незамещенный или замещенный флуоренил, незамещенный или замещенный фенил и незамещенный или замещенный нафтил. Если указанный арил называют замещенным, то указанное замещение может происходить в любом положении кольца, отличном от места присоединения к другой системе колец соединения согласно настоящему изобретению. Таким образом, любой атом водорода арильного кольца может быть замещен на заместитель, определенный согласно настоящему изобретению. Согласно вариантам реализации, в которых арил представляет собой фенильное кольцо, указанное замещение может происходить в мета- и/или орто- и/или пора-положении относительно места присоединения.
Используемый в настоящем описании термин «гетероарил» относится к моноциклической или полициклической системе колец, согласно конкретным вариантам реализации, содержащей примерно от 5 до 15 членов, где один или более, согласно одному из вариантов реализации от 1 до 3, атом системы колец представляет собой гетероатом, который представляет собой элемент, отличный от углерода, включающий, но не ограничивающийся ими, азот, кислород или серу. Гетероарильная группа может быть конденсирована с бензольным кольцом. Гетероарильные группы включают, но не ограничиваются ими, фурил, имидазолил, пиримидинил, тетразолил, тиенил, пиридил, пирролил, тиазолил, изотиазолил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, хинолинил и изохинолинил.
1
12
1
12
Используемый в настоящем описании термин «С-С алкоксикарбоновая кислота» относится к радикалу -O-(C-C алкилен)-СООН.
1-5
Используемый в настоящем описании термин «алкилен» относится к насыщенной бивалентной разветвленной или линейной углеводородной группе, содержащей от одного до пяти атомов углерода. Неограничивающие примеры С алкиленовых групп включают метилен, этилен, 1,2-пропилен, 1,3-пропилен, бутилен, изобутилиден, пентилен, гексилен и т.д.
Понимают, что используемый в настоящем описании термин «сложный эфир» включает группу -COOR, где R представляет собой алкил, определенный выше в настоящем описании.
1
7
1
7
Используемый в настоящем описании термин «простой эфир» относится к группе -R'OR, где R' представляет собой C-C линейную или разветвленную алкиленовую группу, а R представляет собой C-C линейную или разветвленную алкильную группу.
Используемый в настоящем описании термин «алкокси» относится к RO- группе, где R представляет собой алкил, определенный выше.
1
7
1
7
Используемый в настоящем описании термин «C-Cамид» относится к моноалкиламиду (-CONHR) или диалкиламиду (-CONRR'), где R и R' независимо представляют собой C-C линейный или разветвленный алкил.
1
5
1
5
Используемый в настоящем описании термин «C-C амин» относится к группе - NHR или -NRR', где R и R' независимо представляют собой C-C линейный или разветвленный алкил.
2
1
5
Термин «возможно замещенный», используемый в настоящем описании, означает, что рассматриваемые группы являются незамещенными или замещены одним или более заместителем, таким как, например, заместители, описанные выше, а также фенил, замещенный фенил, арил, гетероарил, циклоалкил, гетероциклоалкил, галоген (-F, -Сl, -Вr, -I), -СООН, -NH, -NHR и -NRR', где каждый из R и R' независимо представляет собой линейный или разветвленный C-C алкил. Если группы замещены более чем одним заместителем, то заместители могут быть одинаковыми или различными, и указанное замещение может происходить в любом положении замещенной группы (т.е. в терминальном или любом промежуточном положении или в обоих положениях).
Термин «циклоалкил» относится к циклическому кольцу, содержащему от 6 до 12 атомов углерода, соединенных только простыми связями.
Термин «циклоалкенил» относится к циклическому кольцу, содержащему от 6 до 12 атомов углерода, соединенных при помощи по меньшей мере одной двойной связи.
Термин «циклоалкинил» относится к циклическому кольцу, содержащему от 6 до 12 атомов углерода, соединенных при помощи по меньшей мере одной тройной связи.
Термин «циклогетероалкил» относится к циклическому кольцу, содержащему от 6 до 12 атомов углерода, соединенных только простыми связями, где по меньшей мере один атом углерода замещен на гетероатом, выбранный из N, О, S.
Термин «циклогетероалкенил» относится к циклическому кольцу, содержащему от 6 до 12 атомов углерода, соединенных при помощи по меньшей мере одной двойной связи, где по меньшей мере один атом углерода замещен на гетероатом, выбранный из N, О, S.
Термин «циклогетероалкинил» относится к циклическому кольцу, содержащему от 6 до 12 атомов углерода, соединенных при помощи по меньшей мере одной тройной связи, где по меньшей мере один атом углерода замещен на гетероатом, выбранный из N, О, S.
Специалистам в данной области очевидно, что конкретные соединения согласно настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере один стереогенный атом углерода. Таким образом, следует отметить, что настоящее изобретение охватывает все возможные стереоизомеры подобных соединений, включая все возможные их смеси (например, рацемические смеси, диастереомерные смеси, нерацемические смеси и т.д.). Также следует отметить, что соединения согласно настоящему изобретению могут содержать двойную связь. Таким образом, настоящее изобретение охватывает любые стереоизомеры (цис, транс, Е или Z стереоизомеры) подобных соединений, включая любые их смеси.
В изобретении также предложены способы получения соединений согласно настоящему изобретению.
Согласно одному из аспектов в изобретении предложен способ получения соединения общей формулы (I), определенного выше в настоящем описании, включающий:
(а) обеспечение соединения, имеющего общую формулу (X) или (X'):
a
b
c
где R, R и R имеют значения, определенные выше; Х представляет собой галид, псевдогалид, функциональную уходящую группу (например, -OTf и аналогичные функциональные группы, которые возможно легко удалить в реакции сочетания); а каждый из , ,  независимо представляет собой одинарную или двойную связь;
(b) взаимодействие соединения (X) или (X') с соединением, имеющим общую формулу (XI) или (ХI'), соответственно:
1
5
где каждый из Y независимо выбран из ОН, C-C алкокси или оба могут образовывать циклическое диалкокси-кольцо совместно с атомом бора, к которому они присоединены,
в присутствии катализатора; тем самым получая соединение формулы (I).
Согласно другому аспекту в изобретении предложен способ получения соединения формулы (I), определенного выше в настоящем описании, включающий:
(а) обеспечение соединения, имеющего общую формулу (X) или (X'):
a
b
c
где R, R и R имеют значения, определенные выше в настоящем описании;
Х представляет собой галид, псевдогалид, функциональную уходящую группу (например, -OTf и аналогичные функциональные группы, которые возможно легко удалить в реакции сочетания); а каждый из , ,  независимо представляет собой одинарную или двойную связь;
c
b
(b) сочетание соединения (X) или (X') с R-H или R-H, соответственно; тем самым получая соединение формулы (I). Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ сочетания представляет собой процесс обмена галоген-металл, подробно описанный далее.
Указанные способы включают, например, реакции кросс-сочетания по Сузуки, представленные далее:
1. Метилирование (±) кетопиновой кислоты метилйодидом и карбонатом калия в диметилформамиде, которое приводит к получению (±) метилкетопината;
2. Енолизация (±) камфор/(±) эпикамфор/(±) метилкетопината диизопропиламидом лития и присоединение фенилтрифлимида в тетрагидрофуране с получением соответствующего (±) винилтрифлата;
3. Литирование 2,6-диметилового эфира 4-алкилрезорцина н-бутиллитием и получение арилборонового эфира с применением изопропилпинаколбората в тетрагидрофуране;
4. Реакция кросс-сочетания между арилбороновым эфиром и (±) винилтрифлатом, катализируемая тетракис(трифенилфосфин)палладием в присутствии фторида трет-бутиламмония в тетрагидрофуране с получением соответствующего (±) арилированного борнена;
5. Восстановление (±) арилированного метилкетопината алюмогидридом лития в тетрагидрофуране с получением соответствующего спирта;
6. Гидролиз (±) арилированного метилкетопината гидроксидом лития в смеси метанол/вода с получением соответствующей кислоты.
Другой альтернативный способ получения соединений согласно настоящему изобретению включает процесс обмена галоген-металл, представленный далее:
1. Сочетание 2,6-диметиловый эфир-4-алкилрезорцина, ускоренное литированием н-бутиллитием и металлированием йодидом меди, с (+) 3-бромкамфорой в диэтиловом эфире и диметилсульфоксиде с получением арилированной камфоры;
2. Восстановление карбонилсодержащей камфоры алюмогидридом лития в тетрагидрофуране с получением соответствующего спирта.
Типовые способы получения соединений согласно настоящему изобретению представлены на Схемах 1 и 2.
а
Схема 1. Реакция кросс-сочетания в положении С2 камфорного фрагмента.
а
2
3
2
4
2
3
3
4
4
2
Реагенты и условия: (a) n-BuLi, ТГФ, 0°C, PINBOP, -78°C. (b) NaCO, HO, KMnO, кипячение с обратным холодильником, (с) КСО, ДМФ, Mel, KT. (d) LDA, ТГФ, -78°C, фенилтрифлимид, от 0°C до KT. (е) Ра(РРh), t-BuNF, ТГФ, кипячение с обратным холодильником. (f) LiAlH, ТГФ, от 0°С до KT. (g) LiOH, MeOH/HO 3:1, 200°С.
а
Схема 2. Реакции кросс-сочетания в положении С3 камфорного фрагмента.
,
a
3
4
4
Реагенты и условия: (a) LDA, ТГФ, -78°С, фенилтрифлимид, от 0°С до KT. (b) Рd(РРh), t-BuNF, ТГФ, кипячение с обратным холодильником, (с) n-BuLi, диэтиловый эфир, от 0°С до KT, CuI, диэтиловый эфир/ДМСО. (d) LiAlH, диэтиловый эфир, от 0°С до кипения.
Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению способно стимулировать рецептор СВ.
Понимают, что термин «рецептор СВ» включает каннабиноидные рецепторы, связанные с G-белком, определенные по способности связываться с каннабиноидами и/или эндоканнабиноидами. Согласно одному из вариантов реализации указанный рецептор представляет собой рецептор СВ2 (каннабиноидный рецептор 2 Типа). Согласно другому варианту реализации указанная стимуляция рецептора СВ2 связана с лечением заболевания, нарушения или состояния.
Понимают, что «стимуляция» рецептора СВ композицией согласно настоящему изобретению включает любую степень возбуждения рецептора СВ, которая обеспечивает активацию указанного рецептора, например, агонистическое действие соединения согласно настоящему изобретению на указанный рецептор СВ. Следует отметить, что для достижения указанной стимуляции необходимо установление связи между соединением согласно настоящему изобретению и указанным рецептором. Соединение согласно настоящему изобретению может ассоциировать с указанным рецептором при помощи любого типа взаимодействия, например, ковалентных связей, электростатических связей (например, водородных связей), или (взаимодействий, лондоновских дисперсионных сил, ван-дер-Ваальсовых сил и т.д.), ионных связей, металлический связей и т.д.
Было показано, что стимуляция рецептора СВ2 имеет значимую медицинскую ценность (Эштон и Гласе (Ashton and Glass), 2007). Некоторые действия, важные для настоящего патента, перечислены далее:
1. Селективная стимуляция рецептора СВ2 оказывает сильное противовоспалительное действие для широкого диапазона животных моделей (Эштон и Гласе (Ashton and Glass), 2007; Бенито с соавторами (Benito et al.), 2008); снижает невропатическую боль (Ямамото с соавторами (Yamamoto et al.), 2008); ингибирует секрецию провоспалительных цитокинов (Клегерис с соавторами (Klegeris et al.), 2003).
2. Агонисты рецептора СВ2 стимулируют функцию остеобластов и ингибируют остеокласты, что приводит к повышенному остеогенезу. Эти действия имеют большое значение при остеопорозе (Офек с соавторами (Ofek et al.), 2005).
3. Стимуляция рецептора СВ2 замедляет прогрессирование атеросклероза на животных моделях (Стефенс с соавторами (Stefens et al.), 2005; Стефенс и Max (Stefens and Mach), 2006). Так как церебральная гипоксия-ишемия и окклюзия средней мозговой артерии индуцируют экспрессию рецептора СВ2, указанные агонисты могут снижать действие этих состояний (Эштон с соавторами (Ashton et al.), 2006).
4. Показано, что селективная стимуляция рецептора СВ2 снижает гепатическую энцефалопатию (невропсихиатрическое осложнение, возникающее при острой и хронической печеночной недостаточности) и обладает антифибриногенным действием (Авраам с соавторами (Avraham et al.), 2006; Дагон с соавторами (Dagon et al.), 2007; Лотерштайн с соавторами (Lotersztajn et al.), 2008).
5. Стимуляция рецептора СВ2 обладает потенциалом для блокирования развития болезни Альцгеймера (Бенито с соавторами (Benito et al.), 2008), болезни Хантингтона (Femandez-Ruiz et al., 2005), амиотропного латерального склероза Bilsland et al., 2006; (Centonze et al., 2007), рассеянного склероза (Docagne et al., 2008) и поражений миелина (Arevalo-Martin et al., 2008). См. общий обзор (Femandez-Ruiz et al., (2008).
6. Активация каннабиноидного рецептора СВ2 снижает вероятность церебрального инфаркта на модели фокальной ишемии/реперфузии у мышей, а антагонист СВ1 совместно с агонистом СВ2 улучшают кровообращение головного мозга (Zhang et al., 2008).
7. Стимуляция рецептора СВ2 помогает установить ишемическое прекондиционирование (высокоактивная эндогенная форма защиты тканей от ишемии-реперфузии в различных органах) (Pacher and Hasko, 2008).
8. Стимуляция рецептора СВ подавляет тошноту (van Sickle et al., 2005).
9. Агонисты каннабиноидного рецептора СВ2 стимулируют пролиферацию нейронных прогениторных клеток (Palazuelos et al., 2006, 2008). Это действие может быть связано с восстановлением нейронных повреждений.
В рамках настоящего изобретения понимают, что термин «лечение» включает содержание и уход за пациентом для борьбы с заболеванием, нарушением или состоянием. Термин включает замедление развития заболевания, нарушения или состояния, снижение или ослабление симптомов и осложнений и/или лечение или устранение заболевания, нарушения или состояния. Пациент, подвергаемый лечению, предпочтительно представляет собой млекопитающее, в частности, человека. Термин «лечение» относится к введению терапевтического количества соединения согласно настоящему изобретению, которое является эффективным для одного из следующих действий: снижения нежелательных симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или патологическим состоянием; эффективным для предотвращения проявления подобных симптомов до их возникновения; эффективным для замедления прогрессирования заболевания или нарушения; эффективным для замедления усиления степени тяжести заболевания, нарушения или состояния; эффективным для продолжения периода ремиссии; эффективным для замедления необратимых повреждений, вызываемых на прогрессирующей стадии хронического нарушения; эффективным для задержки проявления указанной прогрессирующей стадии; эффективным для снижения тяжести или лечения заболевания или нарушения; эффективным для увеличения выживаемости индивидуумов, инфицированных заболеванием, или эффективным для профилактики сопутствующих форм заболеваний (например, у индивидуумов, склонных к заболеванию) или для комбинации двух или более вышеуказанных действий.
Таким образом, согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание, нарушение или состояние выбрано из воспаления, боли, аллергии, неврологических и нейродегенеративных заболеваний, заболеваний печени, повреждений мозга, рака, васкуляризации сетчатки, эндометрита, нарушений аппетита, метаболического синдрома, диабета, атеросклероза; нарушений, связанных с антифибриногенным действием, воспалительной болезни кишечника, артрита и тошноты или любой их комбинации.
Согласно другому варианту реализации указанное заболевание, нарушение или состояние представляет собой повреждение головного мозга. Согласно другому варианту реализации указанное повреждение головного мозга представляет собой травму головного мозга, выбранную из закрытой травмы черепа, проникающей травмы мозга, контузию, церебральную ишемию-реперфузию, постоперационную травму мозга, кровоизлияние в мозг.
Согласно другому варианту реализации указанное соединение согласно настоящему изобретению может снижать вторичный вред, вызванный травмой головного мозга.
Понимают, что термины «повреждение головного мозга», «травма головного мозга» или «травматическое повреждение мозга», используемые в настоящем описании, взаимозаменяемы, охватывают любые травматические повреждения мозга, которые могут быть вызваны внешним ударным воздействием (таким как быстрое ускорение или замедление, удар, ударные волны или попадание снаряда) или заболеванием или нарушением (таким как, например, ишемия, инсульт, инфекция или аневризм).
Травмы мозга можно классифицировать по степени тяжести, механизму (закрытое или проникающее повреждение головы) или по другим признакам (например, по возникновению в конкретном анатомическом участке или в обширной области мозга). Повреждения головы также можно классифицировать по тяжести слабые, средние или тяжкие, которые могут быть диагностированы при помощи измерения Международных шкал, например, уровня сознания пациента, имеющего повреждение.
Кроме повреждений, вызываемых в момент повреждения, травма мозга вызывает вторичный вред (вторичный вред, вызванный травмой мозга), который проявляется в ряде осложнений, во3Никающих через несколько минут и/или дней после повреждения. Эти процессы, которые включают изменения кровообращения головного мозга и внутричерепного давления, существенно дополняют повреждение от первоначальной травмы. В результате функция мозга может быть временно или постоянно нарушена, а структурные повреждения могут быть детектируемыми или недетектируемыми.
Ослабление функции мозга и неврологических функций мозга может быть связано не только с первичным повреждением мозга (повреждением, которое возникает в момент травмы, когда происходит растяжение, сжатие или разрыв тканей и кровяных сосудов), но также со вторичным повреждением, выраженным совокупностью клеточных процессов и биохимических каскадов, которые происходят через несколько минут или дней после травмы. Эти вторичные процессы могут существенно ухудшать повреждение, вызванное первичной травмой, и вызывать значительное количество устойчивых нарушений, а также смерть. Вторичные осложнения включают, но не ограничиваются ими, повреждения гематоэнцефалического барьера, высвобождение факторов, которые вызывают воспаление, повышенное содержание свободных радикалов, повышенное высвобождение нейротрансмиттера глутамата (эксайтотоксичность), поступление ионов кальция и натрия в нейроны и дисфункция митохондрии. Поврежденные аксоны белого вещества мозга могут отделяться от клеточного тела в результате вторичного повреждения, которое потенциально может привести к смерти нейронов. Другими факторами вторичных повреждений являются изменения кровообращения мозга; ишемия (недостаточное кровообращение); церебральная гипоксия (недостаточное содержание кислорода в мозге), отек головного мозга (набухание мозга); и повышенное внутричерепное давление (давление внутри черепа). Внутричерепное давление может увеличиваться в результате набухания или масс-эффекта, возникающего в результате нарушения, такого как кровоизлияние. В результате церебральное перфузионное давление (давление кровотока в мозге) снижается, что приводит к ишемии. Если давление внутри черепа является очень высоким, то может вызывать смерть или вклинение мозга, при котором доли мозга сдавливаются черепными структурами.
Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению применяют в качестве лекарственного средства.
Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению применяют для лечения заболевания, нарушения или состояния, выбранного из воспаления, боли, аллергии, неврологических и нейродегенеративных заболеваний, заболеваний печени, повреждений мозга, рака, васкуляризации сетчатки, эндометрита, нарушений аппетита, метаболического синдрома, диабета, атеросклероза; нарушений, связанных с антифибриногенным действием, воспалительной болезни кишечника, артрита и тошноты или любой их комбинации. Согласно одному из вариантов реализации соединение согласно настоящему изобретению применяют для лечения повреждения головного мозга. Согласно одному из вариантов реализации указанное повреждение мозга выбрано из закрытого повреждения головы, проникающего повреждения головы, контузии, церебральной ишемии-реперфузии, постоперационного повреждения мозга, кровоизлияния в мозг. Согласно другому варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению применяют для снижения вторичного вреда, вызванного травмой мозга.
Согласно одному из аспектов в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно настоящему изобретению.
Согласно одному из вариантов реализации указанная фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для лечения заболевания, нарушения или состояния, выбранного из воспаления, боли, аллергии, неврологических и нейродегенеративных заболеваний, заболеваний печени, повреждений мозга, рака, васкуляризации сетчатки, эндометрита, нарушений аппетита, метаболического синдрома, диабета, атеросклероза; нарушений, связанных с антифибриногенным действием, воспалительной болезни кишечника, артрита и тошноты или любой их комбинации. Согласно другому варианту реализации указанное заболевание, нарушение или состояние представляет собой повреждение головного мозга. Согласно другому варианту реализации указанное повреждение головного мозга выбрано из закрытого повреждения головы, проникающего повреждения головы, контузии, церебральной ишемии-реперфузии, постоперационного повреждения мозга, кровоизлияния в мозг. Согласно другому варианту реализации фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют для снижения вторичного вреда, вызванного травмой мозга.
Согласно другому аспекту изобретения предложено применение соединения согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции.
Согласно некоторым вариантам реализации указанная фармацевтическая композиция предназначена для стимуляции роста костей, костной массы, регенерации кости или предотвращения потери костной массы.
Согласно другому аспекту в изобретении предложено применение соединения согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства (или фармацевтической композиции), которая может стимулировать рецептор СВ. Согласно одному из вариантов реализации рецептор представляет собой рецептор СВ2.
Согласно другому аспекту в изобретении предложено применение соединения согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения повреждения головного мозга.
Согласно другому аспекту в изобретении предложено применение соединения согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для снижения вторичного вреда, вызванного травмой мозга.
Согласно одному из аспектов в изобретении предложено применение соединения согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для стимуляции роста костей, костной массы, регенерации кости или предотвращения потери костной массы.
Согласно другому аспекту изобретения предложено соединение согласно настоящему изобретению, применяемое для стимуляции роста костей, костной массы, регенерации кости или предотвращения потери костной массы.
Согласно одному из аспектов в изобретении предложен способ стимуляции роста костей, костной массы, регенерации кости или предотвращения потери костной массы, включающий введению субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения согласно настоящему изобретению.
Согласно некоторым вариантам реализации указанная стимуляция роста костей, костной массы, регенерации кости или предотвращения потери костной массы связана с лечением по меньшей мере одного заболевания или нарушения, выбранного из остеопении, остеопороза, перелома кости или дефицита костной ткани, первичного или вторичного гиперпаратиреоидизма, остеоартрита, пародонтоза или периодонтального нарушения, остеолитической потери костной массы, последствий пластической хирургии, последствий ортопедической хирургии, последствий челюстно-лицевой хирургии, последствий ортопедической имплантации и последствий зубной имплантации, первичного или метастатического рака кости, остеомиелита или любых их комбинаций.
Согласно другим вариантам реализации по меньшей мере одно указанное заболевание или нарушение выбрано из остеопении и остеопороза.
Понимают, что термин «стимуляция роста костей, костной массы, регенерации кости» включает любое количественное и/или качественное ускорение роста костной ткани, любое количественное и/или качественное увеличение массы костной ткани и любое количественное и/или качественное ускорение регенерации кости (например, в случае повреждения или перелома костной ткани, например, после воздействия или в результате заболевания, состояния или любого побочного эффекта внешнего лечения) у позвоночных на любой стадии развития (от эмбриональной стадии до старости). Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция предназначена для увеличения костной массы у субъекта, нуждающегося в этом. Согласно другим вариантам реализации фармацевтическая композиция предназначена для ускорения регенерации кости.
Понимают, что термин «предотвращение потери костной массы» включает любое количественное и/или качественное сдерживание потери костной ткани у позвоночных на любой стадии развития (от эмбриональной стадии до старости).
Неограничивающими примерами медицинских состояний, на которые благоприятно влияют стимуляция роста кости, прирост костной массы, профилактика и восстановление потери костной массы и регенерация костной массы, являются остеопения, остеопороз, перелом кости или дефицит костной ткани, первичный или вторичный гиперпаратиреоидизм, остеоартрит, пародонтоз или периодонтальное нарушение, остеолитическая потеря костной массы, последствия пластической хирургии, последствия ортопедической хирургии, последствия челюстно-лицевой хирургии, последствия ортопедической имплантации и последствия зубной имплантации, первичный или метастатический рак кости, остеомиелит или любая их комбинация. Согласно некоторым вариантам реализации медицинское состояние, на которое благоприятно влияет стимуляция роста кости, представляет собой остеопению или остеопороз.
Следует понимать, что фармацевтические композиции, содержащие соединение согласно настоящему изобретению, включают смеси соединений согласно настоящему изобретению с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами и, возможно, другими терапевтическими агентами. Вспомогательные вещества должны быть «приемлемыми» с точки зрения совместимости с другими ингредиентами композиции и безвредности для потребителей.
Фармацевтические композиции включают композиции, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (включая чрескожное, трансбуккальное и подъязычное), вагинального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное или внутрикожное) введения или введения в виде имплантата. Композиции можно получать при помощи любых способов, хорошо известных в области фармацевтики. Эти способы включают стадию смешения соединений, применяемых согласно настоящему изобретению, или их комбинаций со вспомогательным агентом.
Вспомогательный(е) агент(ы), также называемый(е) дополнительным(и) агентом(ами), включает(ют) агенты, общепринятые в данной области, такие как носители, наполнители, связывающие вещества, разбавители, разрыхлители, смазки, красители, ароматизаторы, антиоксиданты и увлажнители.
Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде раздельных дозируемых форм, таких как пилюли, таблетки, драже или капсулы, или в виде порошка или гранул или в виде раствора или суспензии. Активный ингредиент также может присутствовать в виде болюса или пасты. Композиции можно дополнительно обрабатывать с получением суппозиториев или клизм для ректального введения.
Изобретение также включает фармацевтическую композицию, описанную выше в настоящей заявке, в комбинации с упаковочным материалом, включая инструкции по применению композиции согласно представленному выше описанию.
Подходящие для парентерального введения композиции включают водные и неводные стерильные инъекции. Композиции могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, в герметичных пробирках или ампулах, также могут храниться в высушенном на холоде (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды, перед применением.
Для чрескожного введения можно описать, например, гели, пластыри или спреи. Композиции или составы, подходящие для внутрилегочного введения, например, путем назальной ингаляции, включают мелкодисперсные порошки или аэрозоли, которые вводят при помощи аэрозольного дозирующего ингалятора под давлением, небулайзера или инсуффлятора.
Точная доза и режим введения композиции, безусловно, зависят от требуемого терапевтического или нутрицевтического действия и могут изменяться в зависимости от конкретной формулы, способа введения и возраста и состояния конкретного субъекта, которому вводят композицию.
Согласно другому аспекту в изобретении предложен способ стимуляции рецептора СВ у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. Согласно одному из вариантов реализации указанный рецептор СВ представляет собой рецептор СВ2.
Согласно одному из аспектов в изобретении предложен способ лечения заболевания, нарушения или состояния, которое выбрано из воспаления, боли, аллергии, неврологических и нейродегенеративных заболеваний, заболеваний печени, повреждений мозга, рака, васкуляризации сетчатки, эндометрита, нарушений аппетита, метаболического синдрома, диабета, атеросклероза; нарушений, связанных с антифибриногенным действием, воспалительной болезни кишечника, артрита и тошноты или любой их комбинации, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту в изобретении предложен способ лечения повреждения головного мозга у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. Согласно одному из вариантов реализации указанное повреждение головного мозга выбрано из закрытого повреждения головы, проникающего повреждения головы, контузии, церебральной ишемии-реперфузии, постоперационного повреждения мозга, кровоизлияния в мозг.
Согласно другому аспекту в изобретении предложен способ снижения вторичного вреда, вызванного травмой мозга, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту в изобретении предложен способ воздействия на образование цАМФ у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению.
Следует понимать, что действие соединения согласно настоящему изобретению, называемое «влиянием на образование цАМФ», описывает стимуляцию или ингибирование индуцированного форсколином накопления цАМФ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Для понимания изобретения и реализации его на практике далее будут описаны варианты реализации при помощи исключительно неограничивающих примеров со ссылкой на прилагаемые чертежи, в которых:
35
На Фиг.1A-1G представлены графики связывания GTPyS рецептора СВ2 человека соединениями согласно настоящему изобретению: HU-308 (Фиг.1А), HU-909 (Фиг.1В), HU-910 (Фиг.1C), HU-911 (Фиг.1D), HU-913 (Фиг.1E), HU-926 (Фиг.1F) и HU-928 (Фиг.1G). Данные представлены как связывание [S]jGTPγS, отнесенное к максимальному связыванию HU-308 в аналогичных экспериментальных условиях.
На Фиг.2 представлен уровень восстановления (измеренный как ANSS (уровень неврологических симптомов (Neurological Severity Score))=NSS(1 ч)-NSS(t)) в период между 24 часами и 21 днем после закрытой травмы головы (CHI) у групп, которым вводили различные дозы HU-910 (14b), (c1=0,1 мг/кг, с2=1 мг/кг, с3=10 мг/кг, инъецированные интраперитонеально (i.p.) через 1 час после CHl). Контрольной группе (нос.) вводили только носитель (этанол:кремофор:солевой раствор в отношении 1:1:18).
На Фиг.3 представлен уровень восстановления (измеренный как ΔNSS (уровень неврологических симптомов)=NSS(1 ч)-NSS(t)) в период между 24 часами и 14 днем после закрытой травмы головы (CHI) у групп, которым вводили: 10 мг/кг HU-910 (14b) (инъецированные i.p.через 1 час после CHI), 1 мг/кг антагониста СВ2 SR 144528 индивидуально, 1 мг/кг антагониста СВ2 SR144528 и 10 мг/кг HU-910 через 10 минут). Контрольной группе (нос.) вводили только носитель (этанол:кремофор:солевой раствор в соотношении 1:1:18).
На Фиг.4 представлено восстановление четырех групп, измеренное как ΔNSS (измеренный как ANSS (уровень неврологических симптомов)=NSS(1 ч)-NSS(1)) в период между 1 часом и 28 днем после CHI.
На Фиг.5 представлена оценка уровня неврологических симптомов (ΔNSS=NSS(14)-NSS(t)) в период между 24 ч и 21 днем после CHI.
На Фиг.6 представлен уровень восстановления четырех групп (измеренный как ΔNSS=NSS(l4)-NSS(t), в период между 24 ч и 28 днем после CHI).
На Фиг.7 представлена оценка уровня неврологических симптомов (NSS) в период между 1 ч и 14 днем после CHI.
На Фиг.8A-8D представлено продуцирование ФНО-(после CHI в левой доле (Фиг.8А), левом гиппокампе (Фиг.8В), правой доле (Фиг.8С) и правом гиппокампе (Фиг.8D).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ
В следующих Примерах представлены способы, применяемые авторами настоящего изобретения, при реализации аспектов настоящего изобретения. Следует понимать, что несмотря на то, что эти способы являются типовыми для предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения, специалистам в данной области с учетом настоящего описания станет понятно, что можно произвести ряд модификаций в рамках сущности и объема изобретения.
Пример 1: Способы получения
Материалы и методы
Все реагенты приобретали в Sigma-Aldrich (Израиль) и Acros (Израиль) и применяли без дополнительной очистки. (±)-Камфору и (+)-3-бромкамфору приобретали в Sigma- Aldrich (Израиль). (±)-Камфор-10-сульфонилхлорид и (±)-камфорхинон приобретали в Acros (Израиль).
Все растворители приобретали в Bio-Lab (Израиль).
Все безводные реакции проводили в атмосфере азота в стерилизованной пламенем лабораторной посуде с применением безводных растворителей.
Силикагель 60Å 0,063-0,2 меш приобретали в BioLab (Израиль) и применяли для колоночной хроматографии.
254
Препаративную тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах с силикагелем PLC 60 Å F, 2 мм, приобретенных в Merck (Германия).
254
Чистоту промежуточных веществ и конечных соединений устанавливали при помощи аналитической ТСХ на алюминиевых пластинах с покрытием силикагеля 60 Å, F, 200 мкм, приобретенных в Merck (Германия), хроматограммы проявляли в ультрафиолете и при помощи фосфомолибденовой кислоты.
Температуру плавления определяли при помощи капиллярного электротермального устройства для определения температуры плавления, значения не корректировали.
1
3
Спектры Н ЯМР получали на спектрометре Varian Unity Nova 300 МГц и обсчитывали при помощи программного обеспечения MestReC. Все спектры ЯМР получали с применением CDCl в качестве растворителя, если не указано иное, химические сдвиги представлены в ррm относительно тетраметилсилана, применяемого в качестве внешнего стандарта. Мультиплетность представлена как s (синглет), d (дублет), dd (дублет дублетов), ddd (дублет дублетов дублетов), dddd (дублет дублетов дублетов дублетов), t (триплет), m (мультиплет), а константы спин-спинового взаимодействия (J) представлены в герцах (Гц).
Масс-спектры получали на ЖХ/МС системе Hewlett-Packard G2000 с газовым хроматографом HP-5971 с детектором с ионизацией электронным ударом.
Элементный анализ проводили на анализаторе Perkin-Elmer 2400 series в микроаналитической лаборатории кафедры химии Иерусалимского университета.
Примеры получения Соединений (3) и (4):
2-(2,6-диметокси-4-(2-метилгептан-2-ил)фенил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (3).
4
3
27
34
3
1
К раствору диметилового эфира 4-алкилрезорцина 1 (0,132 г, 0,5 ммоль) в 4 мл ТГФ добавляли n-BuLi (0,34 мл, 0,55 ммоль, 1,6М раствор в гексане) при 0°С. После дополнительного перемешивания в течение 1 часа при 0°С реакционную смесь охлаждали до -78°С и полностью за один раз добавляли раствор PINBOP (0,15 мл, 0,75 ммоль). Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение ночи. Реакционную смесь обрабатывали водным NUtCl, экстрагировали 3 порциями диэтилового эфира, затем промывали солевым раствором и водой. Органическую фазу сушили над MgSO и концентрировали в вакууме. Продукт получали в виде 0,19 г неразделимой смеси пинаколарилбороната 3 и диметилового эфира 4-алкилрезорцина 1 (в соотношении 4:3 по данным анализа ЖХ-МС) и применяли, как таковую, в реакции сочетания по Сузуки. H ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,41 (s, 2H), 3,76 (s, 6H), 1,51-1,58 (m, 2H), 1,37 (s, 6H), 1,25 (s, 6H), 1,24 (s, 6H), 1,13-1,21 (m, 8H), 0,84 (t, J=6,87 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/е 390,29; экспериментальная 390,80.
2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3?2-диоксаборолан (4).
1
3
27
34
3
Титульное соединение получали при помощи общего способа для получения соединения 3, применяя диметиловый эфир 4-алкилрезорцина 2 (0,104 г, 0,5 ммоль) в 4 мл ТГФ, n-BuLi (0,34 мл, 0,55 ммоль, 1,6М раствор в гексане) и PINBOP (0,15 мл, 0,75 ммоль). Продукт получали в виде 0,165 г неразделимой смеси пинаколарилбороната 4 и диметилового эфира 4-алкилрезорцина 2 (в соотношении 4:3 по данным анализа ЖХ-МС) и применяли, как таковую, в реакции сочетания по Сузуки. Н ЯМР (300 МГц, СDСl) δ ppm 6,28 (s, 2H), 3,76 (s, 6H), 2,55 (t, J=7,53 Гц, 2H), 1,55-1,63 (m, 2H), 1,27 (s, 6H), 1,26 (s, 6H), 1,24 (m, 4H), 0,87 (m, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/е 334,23; экспериментальная 334,62.
Примеры получения Соединения (7):
2
3
3
4
3
11
16
3
1
(1R,4S)-метил-7,7-диметил-2-оксобицикло[2.2.1]гептан-1-карбоксилат (7а). К смеси кетопиновой кислоты 6а (0,182 г, 1 ммоль) и КСО (1,1 г, 8 ммоль), перемешиваемой в 10 мл ДМФ, добавляли МеI (0,125 мл, 0,284 г, 2 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 18 часов при температуре окружающей среды. Реакционную смесь растворяли в воде 80 мл и экстрагировали в 3×30 мл порциях диэтилового эфира. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaHCO, сушили над MgSO и концентрировали в вакууме с получением желтой маслянистой жидкости (0,184 г, 94%). Н ЯМР (300 МГц, СDСl) δ ppm 3,75 (s, 3H), 2,53 (ddd, J=18,29, 3,7 Гц, 1Н), 2,36 (ddd, J=14,99, 11,82, 3,99 Гц, 1Н), 2,10 (t, J=4,4 Гц, 1H), 2,02 (m, 1H), 1,92-1,98 (d, J=18,40 Гц, 1H), 1,79 (ddd, J=14,16, 9,35, 4,95 Гц, 1H), 1,41 (ddd, J=12,65, 9,49, 4,26 Гц, 1H), 1,15 (s, 3H), 1,07 (s, 3H). Точная масса, рассчитанная для СНО m/e 196,11; экспериментальная 196,22.
1
3
11
16
3
(1S,4R)-метил-7,7-диметил-2-оксобицило[2.2.1]гептан-1-карбоксилат (7b). Титульное соединение получали из 6b при помощи общего способа, описанного для соединения 7а. Желтая маслянистая жидкость (96%). H ЯМР (300 МГц, CDCl) (ppm 3,75 (s, 3H), 2,53 (ddd, J=18,29, 3,7 Гц, 1H), 2,36 (ddd, J=14,99, 11,82, 3,99 Гц, 1Н), 2,10 (t, J=4,4 Гц, 1H), 2.02 (m, 1H), 1,92-1,98 (d, J=18,40 Гц, 1H), 1,79 (ddd, J=14,16, 9,35, 4,95 Гц, 1H), 1,41 (ddd, J=12,65, 9,49, 4,26 Гц, 1H), 1,15 (s, 3H), 1,07 (s, 3H). Точная масса, рассчитанная для СНО m/e 196,11; экспериментальная 196,22.
Примеры получения Соединений (9) и (10):
1
3
12
15
3
5
(1R,4S)-метил-7,7-диметил-2-(трифторметилсульфонилокси)бицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат (9а). Предварительно охлажденный (0°С) раствор метилового эфира 7а (0,06 г, 0,3 ммоль) в 1,5 мл ТГФ добавляли к раствору LDA (0,17 мл, 0,34 ммоль, 2М раствор) в 2 мл ТГФ при -78°С и полученный раствор оставляли перемешиваться в течение 2 часов. Добавляли раствор фенилтрифлимида (0,115 г, 0,32 ммоль) в 2 мл ТГФ и реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 3 часов и дополнительно оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 15 часов. После удаления растворителя на роторном испарителе полученную желтую маслянистую жидкость очищали путем хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) с получением коричневатой маслянистой жидкости (0,07 г, 71%). Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 5,81 (d, J=3,74, 1H), 3,77 (s, 3Н), 2,51 (t, J=3,67 Гц, 1Н), 2,39 (ddd, J=3,71, 8,76, 12,47 Гц, 1H), 2,03-2,13 (m, 1H), 1,65 (ddd, J=3,68, 9,18, 12,65 Гц, 1H), 1,24 (ddd, J=3,72, 9,18, 12,64 Гц, 1H), 1,11 (s, 3H), 0,97 (s, 3Н). Точная масса, рассчитанная для CHFOS m/e 328,06; экспериментальная 328,44.
1
3
12
15
3
5
(1S,4R)-метил-7,7-диметил-2-(трифторметилсульфонилокси)бицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат (9а). Титульное соединение получали из 7b при помощи общего способа, описанного для соединения 9а. Коричневатая маслянистая жидкость (68%). Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 5,81 (d, J=3,74, 1H), 3,77 (s, Н), 2,51 (dd, J=3,67, 3,67 Гц, 1H), 2,39 (ddd, J=3,71, 8,76, 12,47 Гц, 1H), 2,03-2,13 (m, 1H), 1,65 (ddd, J=3,68, 9,18, 12,65 Гц, 1H), 1,24 (ddd, J=3,72, 9,18, 12,64 Гц, 1H), 1,1 l(s, 3Н), 0,97 (s, 3Н). Точная масса, рассчитанная для CHFOS m/e 328,06; экспериментальная 328,44.
Способы получения Соединений (11), (12) и (13):
3
4
3
28
42
4
28
42
4
1
(1R,4S)-метил-2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат (11а). 0,474 г пинаколарилбороната 3 (в смеси с диметиловым эфиром 4-алкилрезорцина 1), трифлат енола 9а (0,328 г, 1,00 ммоль), Рd(РРh) (0,07 г, 0,006 ммоль) и t-BuNF (1,5 мл, 1,5 ммоль, 1М раствор в ТГФ) в 15 мл ТГФ кипятили с обратным холодильником в течение 15 часов. Реакционную смесь фильтровали через Целит, и фильтрат концентрировали в вакууме. Дополнительная очистка путем колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) приводила к получению целевого продукта в виде светло-желтой маслянистой жидкости (0,288 г, 65%). Н ЯМР (300 МГц, СDСl) δ ppm 6,45 (s, 2H), 6,28 (d, J=3,42 Гц, 1Н), 3,72 (s, 6H), 3,45 (s, 3Н), 2,43 (m, 2H), 1,80-2,03 (m, 1H), 1,53-1,58 (m, 2H), 1,26 (s, 6H), 1,13-1,22 (m, 7H), 1,11 (s, 3Н), 0,98-1,08 (m, 3Н), 0,97 (s, 3Н), 0,84 (t, J=6,79 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для CHO m/e 442,31; экспериментальная 442,92. Элем. анализ, рассчитанный для CHO: С, 75,98; Н, 9,56; экспериментальный: С, 76,14; Н, 9,65.
1
3
29
42
4
(1R,4S)-метил-2-(2,б-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат (11b, HU-912). Титульное соединение получали из 9b при помощи общего способа, описанного для соединения 11а. Желтоватая маслянистая жидкость (69%). Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,45 (s, 2H), 6,28 (d, J=3,42 Гц, 1H), 3,72 (s, 6H), 3,45 (s, 3H), 2,43 (m, 2H), 1,80-2,03 (m, 1H), 1,53-1,58 (m, 2H), 1,26 (s, 6H), 1,13-1,22 (m, 7H), 1,11 (s, 3Н), 0,98-1.08 (m, 3Н), 0,97 (s, 3Н), 0,84 (t, J=6,79 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для CHO m/e 442,31; экспериментальная 442,91.
28
42
4
Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 75,98; Н, 9,56; экспериментальный: С, 75,58; Н, 9,70.
3
4
3
24
34
4
24
34
4
1
(1R,4S)-метил-2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат (13а, HU-971). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 11а (HU-911), с применением пинаколарилбороната 4 (в смеси с 2, 0,244 г), трифлата енола 9а (0,2 г, 0,61 ммоль), Рd(РРh) (0,042 г, 0,037 ммоль) и t-BuNF (0,91 мл, 0,91 ммоль, 1М раствор в ТГФ) с получением бесцветной маслянистой жидкости (170 мг, 72%). Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,33 (s, 2H), 6,26 (d, J=3,42 Гц, 1H), 3,71 (s, 6H), 3,47 (s, 3Н), 2,55 (t, J=7,70 Гц, 2H), 2,38-2,46 (m, 2H), 1,81-2,03 (m, 2H), 1,56-1,66 (m, 2H), 1,30-1,35 (m, 4H), 1,12 (s, 3Н, син), 1,07-1,16 (m, 1H), 0,97 (s, 3Н, анти), 0,90 (t, J=6,84 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO при помощи общего способа, описанного для СНO: С, 74,58; Н, 8,87; экспериментальная: С, 74,61; Н, 9,04.
1
3
24
34
4
24
34
4
(1S,4R)-метил-2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло [2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоксилат (13b, HU-972). Титульное соединение получали из 9b при помощи общего способа, описанного для соединения 13а (HU-971). Бесцветная маслянистая жидкость (69%). Н ЯМР (300 МГц, СDСl) δ ppm 6,33 (s, 2H), 6,26 (d, J=3,42 Гц, 1H), 3,71 (s, 6H), 3,47 (s, 3Н), 2,55 (t, J=7,70 Гц, 2H), 2,38-2,46 (m, 2H), 1,81-2,03 (m, 2H), 1,56-1,66 (m, 2H), 1,30-1,35 (m, 4H), 1,12 (s, 3Н, син), 1,07-1,16 (m, 1H), 0,97 (s, 3Н, анти), 0,90 (t, J=6,84 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/е 386,25; экспериментальная 386,67. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 74,58; Н, 8,87; экспериментальный: С, 74,31; Н, 8,90.
3
4
пл
3
27
42
2
1
(1R,4R)-2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен (12а, HU-907). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 11а, с применением пинаколарилбороната 3 (в смеси с 1, 0,755 г), энолтрифлата камфоры 10а (0,5 г, 1,76 ммоль), Pd(PPh) (0,122 г, 0,011 ммоль) и t-BuNF (2,64 мл, 2,64 ммоль, 1М раствор в ТГФ) с получением желтоватой маслянистой жидкости (0,525 г, 75%), которую отверждали при выдерживании при -20°С с получением желтого твердого вещества. Т 34-36°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,50 (s, 2H), 5,87 (d, J=3,27 Гц, 1H), 3,74 (s, 6H), 2,37 (t, J=3,46, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,61 (m, 2H), 1,55 (m, 1H), 1,30 (s, 6H), 1,15 (m, 1H), 1,19-1,26 (m, 6H), 1,07-1,18 (m, 2H), 1,05 (s, 3H), 0,86 (t, J=6,71 Гц, 3Н), 0,83 (s, 3Н), 0,82 (s, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 398,32; экспериментальная 398,79.
27
42
2
ЭKем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 81,35; Н, 10,62; экспериментальный: С, 81.08; Н, 10,69.
пл
3
27
42
2
27
42
2
1
(1S,4S)-2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен (12b, HU-908). Титульное соединение получали из 10b при помощи общего способа, описанного для соединения 12а (HU-907). Белое твердое вещество (81%). Т 35-37°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,50 (s, 2H), 5,87 (d, J=3,27 Гц, 1H), 3,74 (s, 6H), 2,37 (t,J=3,46, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,61 (m, 2H), 1,55 (m, 1H), 1,30 (s, 6H), 1,15 (m, 1H), 1,19-1,26 (m, 6H), 1,07-1,18 (m, 2H), 1,05 (s, 3H), 0,86 (t,J=6,71 Гц, 3H), 0,83 (s, 3H), 0,82 (s, 3H). Точная масса, рассчитанная для СНO m/е 398,32; экспериментальная 398,79. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 81,35; Н, 10,62; экспериментальный: С, 81,47; Н, 10,85.
Примеры получения Соединений (14) и (15):
4
4
пл
3
27
42
3
27
42
3
1
(1R,4S)-(2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-ил)метанол (14а, HU-909). Раствор метилового сложного эфира 11а (0,790 г, 1,79 ммоль) в 20 мл ТГФ охлаждали до 0°С. После добавления UA1H4 (3,58 мл, 3,58 ммоль, 1М раствор в диэтиловом эфире) реакционную смесь оставляли нагреваться до температуры окружающей среды и перемешивали в течение 18 часов. Реакционную смесь обрабатывали небольшим количеством насыщенного раствора MgSO и экстрагировали в этилацетате. Органическую фазу промывали солевым раствором и водой, сушили над MgSO и концентрировали в вакууме. Продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) с получением маслянистой жидкости (0,460 г, 62%), которую отверждали при выдерживании при -20°С с получением желтого твердого вещества. Т 49-51°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,52 (s, 2H), 5,90 (d, J=3,24 Гц, 1H), 3,75 (s, 6H), 3,65 (m, 2H), 2,35 (t, J=3,39, 1H), 2,25 (dd, J=7,29, J=5,01, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,53- 1,59 (m, 5H), 1,27 (s, 6H), 1,21 (s, 3Н), 1,0-1,19 (m, 7H), 0,94 (s, 3H), 0,85 (t,J=6,71 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 414,31; экспериментальная 414,87. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 78,21; Н, 10,21; экспериментальный: С, 78,31; Н, 10,31.
пл
3
27
42
3
27
42
3
1
(1S,4R)-(2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-ил)метанол (14b, HU-910). Титульное соединение получали из 11b (HU-912) при помощи общего способа, описанного для соединения 14а (HU-909). Белое твердое вещество (64%). Т 48-50°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,52 (s, 2H), 5,90 (d, J=3,24 Гц, 1H), 3.75 (s, 6H), 3,65 (m, 2H), 2,35 (t, J=3,39, 1H), 2,25 (dd, J=7,29, J=5,01,1H), 1,93 (m, 1H), 1,53-1,59 (m, 5H), 1,27 (s, 6H), 1,21 (s, 3H), 1,0-1,19 (m, 7H), 0,94 (s, 3H), 0,85 (t, J=6,71 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 414,31; экспериментальная 414,86. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 78,21; Н, 10,21; экспериментальный: С, 78,08; Н, 10,32.
пл
3
23
34
3
23
34
3
1
(1R,4S)-(2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-ил)метанол (15а, HU-969). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 14а (HU-909), с применением метилового сложного эфира 13а (HU-971) (0,1 г, 0,259 ммоль) в 3 мл сухого ТГФ и UA1H4 (0,51 мл, 0,518 ммоль, 1М раствор в диэтиловом эфире). Продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) с получением маслянистой жидкости (0,086 г, 93%), которую отверждали при выдерживании при -20°С с получением белого твердого вещества. Т 28-29°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,40 (s, 2H), 5,88 (d, J=3,24 Гц, 1H), 3,74 (s, 6H), 3,65 (d, J=2,51 Гц, 2H), 2,58 (t, J=7,70 Гц, 2H), 2,35 (t, J=3,41 Гц, 1H), 1,89-1,98 (m, 1H), 1,54-1,66 (m, 4H), 1,32-1,38 (m, 4H), 1,23 (s, 3H), 1,11-1,19 (m, 1H), 0,94 (s, 3Н), 0,92 (t, J=6,84 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 358,25; экспериментальная 358,67. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 77,05; Н, 9,56; экспериментальный: С, 77,06; Н, 9,72.
пл
3
12
34
3
23
34
3
1
(1S,4R)-(2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-ил)метанол (15b, HU-970). Титульное соединение получали из 10b при помощи общего способа, описанного для соединения 13b (HU-972). Маслянистая жидкость (83%), которую отверждали при выдерживании при -20°С. Т 26-27°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,40 (s, 2H), 5,88 (d, J=3,24 Гц, 1H), 3,74 (s, 6H), 3,65 (d, J=2,51 Гц, 2H), 2,58 (t, J=7,70 Гц, 2H), 2,35 (t, J=3,41 Гц, 1H), 1,89-1,98 (m, 1H), 1,54-1,66 (m, 4H), 1,32-1,38 (m, 4H), 1,23 (s, 3H), 1,11-1,19 (m, 1H), 0,94 (s, 3H), 0,92 (t, J=6,84 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 358,25; экспериментальная 358,71. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 77,05; Н, 9,56; экспериментальный: С, 76,25; Н, 9,55.
Примеры получения соединений (16) и (17):
4
пл
3
28
42
4
28
42
4
1
(1R,4S)-2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота (16а, HU-913). Метиловый эфир 11а (HU-911) (0,103 г, 0,233 ммоль) и LiOH (0,111 г, 4,66 ммоль) в 2 мл MeOH/HiO 3:1 нагревали при 200°С в течение 48 часов в пробирке с закручивающейся крышкой в атмосфере воздуха. Воду добавляли к реакционной смеси и экстрагировали несколько раз в диэтиловом эфире. Органические фазы собирали, сушили над MgSO и концентрировали в вакууме. Продукт очищали путем препаративной ТСХ (гексан/этилацетат) с получением желтого твердого вещества (0,026 г, 26%). Т 101-102°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,46 (s, 2H), 6,32 (d, J=3,40 Гц, 1Н), 3,71 (s, 6H), 2,46 (t, J=3,44 Гц, 1Н), 2,38-2,44 (m, 1H), 1,80-2,03 (m, 1Н), 1,53-1,58 (m, 2H), 1,26 (s, 6H), 1,16-1,24 (m, 7H), 1,14 (s, 3H), 1,03-1,12 (m, 3H), 1,00 (s, 3H), 0,85 (t, J=6,74 Гц, 3H). Точная масса, рассчитанная для CHO m/e 428,29; экспериментальная 428,98. Элем. анализ, рассчитанный для CHO: С, 75,66; Н, 9,414 экспериментальный: С, 75,50; Н, 9,48.
пл
3
28
42
4
28
42
4
1
(1S,4R)-2-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота (16b, HU-914). Титульное соединение получали из 11b (HU-912) при помощи общего способа, описанного для соединения 16а (HU-913). Желтое твердое вещество (25%). Т 100-101°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,46 (s, 2H), 6,32 (d, J=3,40 Гц, 1Н), 3,71 (s, 6H), 2,46 (t, J=3,44 Гц, 1Н), 2,38-2,44 (m, 1Н), 1,80-2,03 (m, 1Н), 1,53-1,58 (m, 2H), 1,26 (s, 6H), 1,16-1,24 (m, 7H), 1,14 (s, 3H), 1,03-1,12 (m, 3H), 1,00 (s, 3H), 0,85 (t, J=6,74 Гц, 3H). Точная масса, рассчитанная для CHO m/e 428,29; экспериментальная 428,98. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 75,66; Н, 9,414 экспериментальный: С, 74,81; Н, 9,40.
2
пл
3
23
32
4
23
32
4
1
(1R,4S)-2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота (17а, HU-973). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 16а (HU-913), с применением метилового эфира 13а (HU-971) (0,075 г, 0,194 ммоль) и LiOH (0,093 г, 3,89 ммоль) в 1,5 мл MeOH/HO 3:1. Продукт очищали путем препаративной ТСХ (гексан/этилацетат) с получением желтоватого твердого вещества (0,010 г, 14%). Т 85-87°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,33 (s, 2H), 6,28 (d, J=3,39 Гц, 1H), 3,69 (s, 6H), 2,55 (t, J=7,80 Гц, 2Н), 2,45 (t, J=3,48 Гц, 1H), 2,36-2,44 (m, 1H), 1,82-2,03 (m, 2H), 1,55-1,65 (m, 2H), 1,30-1,35 (m, 4H), 1,14 (s, 3H), 1,06-1,12 (m, 1H), 1,00 (s, 3Н), 0,90 (t, J=6,84 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 372,23; экспериментальная 372,92. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 74,16; Н, 8,66; экспериментальный: С, 73,91; Н, 8,80.
пл
3
23
32
4
23
32
4
1
(1S,4R)-2-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-7,7-диметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-1-карбоновая кислота (17b, HU-974). Титульное соединение получали из 13b (HU-972) при помощи общего способа, описанного для соединения 17а (HU-973). Желтоватое твердое вещество (21%). Т 84-86°С; Н ЯМР (300 МГц, СDCl) (ppm 6,33 (s, 2H), 6,28 (d, J=3,39 Гц, 1H), 3,69 (s, 6H), 2,55 (t, J=7,80 Гц, 2H), 2,45 (t, J=3,48 Гц, 1H), 2,36-2,44 (m, 1H), 1,82-2,03 (m, 2H), 1,55-1,65 (m, 2H), 1,30-1,35 (m, 4H), 1,14 (s, 3Н), 1,06-1,12 (m, 1H), 1,00 (s, 3Н), 0,90 (t, J=6,84 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 372,23; экспериментальная 372,92. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 74,16; Н, 8,66; экспериментальный: С, 73,60; Н, 8,70.
Примеры получения Соединения (19):
1
3
11
15
3
3
(1S,4S)-4,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-2-ил трифторметансульфонат (19а). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 9а, с применением кетона 18а (0,375 г, 2,35 ммоль), LDA (1,29 мл, 2,58 ммоль, 2М раствор) и фенилтрифлимида (0,943 г, 2,64 ммоль). Продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) с получением маслянистой жидкости (0,514 г, 77%). Н ЯМР (300 МГц, СDСl) δ ppm 5,37 (d, J=1,04 Гц, 1H), 2,45 (d, J=3,48 Гц, 1H), 1,93 (dddd, J=3,43, 3,43, 7,85, 11,61 Гц, 1Н), 1,70 (ddd, J=3,12, 8,52, 11,84 Гц, 1H), 1,19-1,38 (m, 2H), 1,08 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 0,78 (s, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНFОS, 284,07, экспериментальная 284,77.
1
3
11
15
3
3
(1R,4R)-4,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен-2-ил трифторметансульфонат (19b). Титульное соединение получали из 18b при помощи общего способа, описанного для соединения 19а. Коричневатая маслянистая жидкость (73%). H ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 5,37 (d, J-1,04 Гц, 1H), 2,45 (d, J=3,48 Гц, 1H), 1,93 (dddd, J=3,43, 3,43, 7,85, 11,61 Гц, 1H), 1,70 (ddd, J=3,12, 8,52, 11,84 Гц, 1H), 1,19-1,38 (m, 2H), 1,08 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 0,78 (s, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНFОS, 284,07, экспериментальная 284,77.
Примеры получения Соединения (20):
3
4
пл
3
27
42
2
27
42
2
1
(1S,4S)-3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен (20а, HU-917). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 11а (HU-911), с применением пинаколарилбороната 3 (в смеси с диметиловым эфиром 4-алкилрезорцина 1, 0,755 г), трифлата енола 19а (0,17 г, 0,598 ммоль), Pd(PPh) (0,041 г, 0,036 ммоль) и t-BuNF (0,9 мл, 0,9 ммоль, 1М раствор в ТГФ). Продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) с получением маслянистой жидкости (0,185 г, 78%), которую отверждали при выдерживании при -20°С. Т 33-34°С.Н ЯМР (300 МГц, CDCl) (ppm 6,50 (s, 2H), 5,79 (d,6 J=3,00 Гц, 1H), 3,76 (s, 6H), 2,60 (d, J=3,51, 1H), 1,81 (m, 1H), 1,64 (m, 1H), 1,60 (m, 1H), 1,55 (m, 2H), 1,31 (m, 1H), 1,28 (s, 6H), 1,17-1,25 (m, 8H), 1,08 (s, 3Н), 0,99 (s, 3Н), 0,86 (t, J=6,69 Hz, 3Н), 0,81 (s, 3H). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 398,32; экспериментальная 398,82. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 81,35; Н, 10,62; экспериментальный: С, 81,50; Н, 10,71.
пл
3
27
42
2
27
42
2
1
(1R,4R)-3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ен (20b, HU-918). Титульное соединение получали из 19b при помощи общего способа, описанного для соединения 20а (HU-917). Желтоватое твердое вещество (77%). Т 32-33°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,50 (s, 2H), 5,79 (d, J=3,00 Гц, 1H), 3,76 (s, 6H), 2,60 (d, J=3,51, 1H), 1,81 (m, 1H), 1,64 (m, 1H), 1,60 (m, 1H), 1,55 (m, 2H), 1,31 (m, 1H), 1,28 (s, 6H), 1,17-1,25 (m, 8H), 1,08 (s, 3H), 0,99 (s, 3H), 0,86 (t, J=6,69 Гц, 3H), 0,81 (s, 3H). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 398,32; экспериментальная 398,84. Элем. анализ, рассчитанный для СНО: С, 81,35; Н, 10,624 экспериментальный: С, 81,56; Н, 10,85.
Примеры получения Соединений (22, HU-936) и (23, HU-926):
4
4
пл
3
23
34
3
23
34
3
1
(1R,4R)-3-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-он (22, HU-936). n-BuLi (0,6 мл, 0,96 ммоль, 1,6М в гексане) добавляли к предварительно охлажденному (0°С) раствору 2 (0,2 г, 0,96 ммоль) в 3 мл диэтилового эфира. Полученный раствор оставляли перемешиваться в течение 2,5 часов при комнатной температуре. Раствор затем охлаждали до 0°С и переносили по каплям через шприц в суспензию Cul (0,092 г, 0,48 ммоль) в 2 мл диэтилового эфира при 0°С. Полученный раствор оставляли перемешиваться в течение 30 минут и добавляли 5 мл безводного ДМСО. Затем добавляли раствор 3-бромкамфоры 21 (0,086 г, 0,3.7 ммоль) в 1 мл диэтилового эфира и 1 мл ДМСО при 0°С по каплям через мембрану. Реакционную смесь затем оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 15 часов. Реакцию гасили путем добавления 5 мл насыщенного водного NHCl. Водную фазу экстрагировали трижды в диэтиловом эфире. Объединенные органические слои промывали трижды солевым раствором, сушили над MgSO и растворитель удаляли в вакууме. Дополнительная очистка путем колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) приводила к получению белых кристаллов 22 (HU-936) (0,093 г, 70%). Т 62°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,37 (s, 2H), 3.89 (d, J=4,23 Гц, 1H), 3,72 (s, 6H), 2,55 (t, J=7,87 Гц, 2Н), 2,19 (t, J=4,11 Гц, 1Н), 1,71-1,76 (m, 2H), 1,63 (m, 1H), 1,59 (m, 2H), 1,37 (m, 1H), 1,33-1,36 (m, 4H), 1,02 (s, 3H), 1,002 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 0,91 (t,.7=6,93 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 358,25; экспериментальная 358,67. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 77,05; Н, 9,56; экспериментальный: С, 77,20; Н, 9,63.
пл
3
27
42
3
27
42
3
1
(1R,4R)-3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-он (23, HU-926). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 22 (HU-936), с применением 1 (0,23 г, 0,87 ммоль), n-BuLi (0,54 мл, 0,87 ммоль, 1,6М в гексане), CuI (0,083 г, 0,44 ммоль), 3-бромкамфоры 21 (0,069 г, 0,3 ммоль). Дополнительная очистка путем колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир/диэтиловый эфир) с получением белых кристаллов 23 (HU-926) (0,081 г, 65%). Т 64-65°С; H ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,49 (s, 2H), 3,89 (d, J=4,23 Гц, 1H), 3,72 (s, 6H), 2,19 (tJ=4,11 Гц, 1H), 1,71-1,76 (m, 1H), 1,53-1,68 (m, 4H), 1,30-1,42 (m, 1H), 1,26 (s, 6H), 1,15-1,24 (m, 8H), 1,01 (s, 3H), 1,00 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 0,85 (t, J=6,73 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 414,31; экспериментальная 414,84. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 78,21; Н, 10,21; экспериментальный: С, 78,39; Н, 10,27.
Примеры получения Соединений (24, HU-938) и (25, HU-928):
4
(1R,4R)-3-(2,6-диметокси-4-пентилфенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ол (24, HU-938). Кетон 22 (HU-936) (0,085 г, 0,23 ммоль) в 1 мл диэтилового эфира добавляли к предварительно охлажденному (0°С) раствору LiAlH (0,14 мл, 0,14 ммоль, 1М раствор в диэтиловом эфире) в 2 мл диэтилового эфира. После перемешивания при кипячении в течение 1 часа реакционную смесь охлаждали до 0°С и гасили путем добавления EtOAc.
4
пл
3
23
36
3
23
36
3
1
К реакционной смеси добавляли воду и экстрагировали в 3 порциях диэтилового эфира, затем промывали водной 10% НСl. Органическую фазу сушили над MgSO и концентрировали в вакууме. Дополнительная очистка путем колоночной хроматографии на силикагеле (диэтиловый эфир/петролейный эфир) с получением белых кристаллов 24 (HU-938) (0,078 г, 92%). Т 58-60°С; Н ЯМР (300 МГц. CDCl) δ ppm 6,44 (s, 2H), 4,52 (d,J=6,96 Гц,J=1,87 Гц, 1H), 4,14-4,17 (m, 2H), 3,82 (s, 6H), 2,56 (t,J=7,70 Гц, 2H), 2,19 (t,J=4,11 Гц, 1H), 1,77-1,89 (m, 2H), 1,63 (m, 1H), 1,46-1,70 (m, 3Н), 1,23-1,41 (m, 4H), 1,06 (s, 3Н), 0,94 (s, 3Н), 0,92 (s, 3Н), 0,90 (t,J=6,93 Гц, 3Н,). Точная масса, рассчитанная для СНО m/e 360,27; экспериментальная 360,65. Элем. анализ, рассчитанный для СНО: С, 76,62; Н, 10,06; экспериментальный: С, 76,46; Н, 10,11.
4
пл
3
27
44
3
27
44
3
1
(1R,4R)-3-(2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ол (25, HU-928). Титульное соединение получали при помощи общего способа, описанного для соединения 24 (HU-938), с применением кетона 23 (HU-926) (0,238 г, 0,57 ммоль), LiAlH (0,345 мл, 0,34 ммоль). Дополнительная очистка путем колоночной хроматографии на силикагеле (диэтиловый эфир/петролейный эфир) приводила к получению белых кристаллов 25 (HU-928) (0,208 г, 88%). Т 96-98%; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 6,55 (s, 2H), 4,58 (dd,J=8,88 Гц, 1H), 4,14-4,17 (m, 2H), 3,82 (s, 6H), 1,78-1,88 (m, 2H), 1,48-1,61 (m; 5H), 1,29-1,33 (m, 1H), 1,27 (s, 6H), 1,16-1,25 (m, 7H), 1,06 (s, 3Н), 0,94 (s, 3Н), 0,92 (s, 3Н), 0,85 (t,J=6,74 Гц, 3Н). Точная масса, рассчитанная для СНO m/e 416,33; экспериментальная 416,90. Элем. анализ, рассчитанный для СНO: С, 77,83; Н, 10,644 экспериментальный: С, 78,10; Н, 10,82.
Пример 2: Связывание с каннабиноидными рецепторами in vitro
Выращивание и содержание клеточной линии
(www.cdna.org)
Клоны кДНК НА-меченых рецепторов СВ1 и СВ2 человека получали в Missouri S&T cDNA Resource Center  в клонирующем векторе pcDNA3.1+. Вектор, содержащий рецептор СВ2 человека, трансфицировали непосредственно в клетки СНО-K.I, полученные в АТСС. НА-меченую последовательность рецептора СВ1 человека субклонировали в вектор pef4-V5-HisA с применением рестрикционных ферментов Kpn1 и Pmel и затем транфицировали в клетки CHO-K.I. Клетки разделяли по клонам путем ограниченного разбавления и исследовали экспрессию НА-метки путем иммуноцитохимии. Клоны, экспрессировавшие метку НА, затем исследовали при помощи ОТ-ПЦР для подтверждения экспрессии мРНК рецепторов hCBl и hCB2 (данные не представлены).
Клетки выдерживали в среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), 100 частиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L- глутамина. Трансфицированные клеточные линии выдерживали в среде, дополнительно содержащей 150 мкг/мл зеоцина в случае pEF HA-CB1 трансфицированных клеток, и 500 мкг/мл G-418 в случае pcDNA НА-СВ2 трансфицированных клеток (все реагенты получали в Invitrogen).
Получение мембран
Клетки выращивали до достижения конфлюэнтности и собирали в ледяной фосфатный буферный солевой раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА. Клетки центрифугировали при 200 x g в течение 10 минут и замораживали при -80°С до применения. Клеточную массу размораживали в холодной 0,32М сахарозе и гомогенизировали при помощи стеклянного гомогенизатора. Гомогенат центрифугировали при 1000 x g в течение 10 минут при 4°С, надосадочную жидкость центрифугировали в ультрацентрифуге Sorvall в течение 30 минут при 100000 xg. Затем клеточную массу промывали ледяной водой и дважды повторно центрифугировали. Полученную клеточную массу повторно суспендировали в 50 мМ Tris pH 7,5, 0,5 мМ ЭДТА. Концентрацию белка определяли с применением набора для определения белков DC (BioRad, Hercules, CA, USA).
Исследование конкурентного связывания с мембранами
i
2
Значения Кд СР 55940 в выделенных мембранах, экспрессирующих рецепторы СВ1 и СВ2, были определены ранее и составляли 2,3 нМ и 1,5 нМ, соответственно (см. Пертви Р.Г. (Pertwee, R.G.) Current Medicinal Chemistry 6 635-664 (1999)). Исследования конкурентного связывания при 2,5 нМ [3H]-СР 55940 (PerkinElmer) проводили для определения значений К для исследуемых соединений. Мембраны (5-10 мкг) инкубировали с радиолигандом и исследуемыми соединениями в различных концентрациях в буфере для связывания (50 мМ Tris pH 7,4, 5 мМ MgCl, 1 мМ ЭДТА), содержащем 0,5% (масс./об.) альбумина бычьей сыворотки (БСА) (ICP Bio, New Zealand) при 30°С в течение 60 минут. Маточные растворы предполагаемых каннабиноидных лигандов получали в диметилсульфоксиде в концентрации 10 мМ. Применяли соединения в шести различных конечных концентрациях в диапазоне от 50 мкМ до 0,1 нМ. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мкМ нерадиоактивных СР 55940 (Tocris Cookson). Исследования прекращали путем добавления 2 мл ледяного буфера для связывания и фильтрования через фильтры GF/C (Whatman), смоченные в холодном буфере для связывания и последующего двукратного промывания тем же буфером.
Радиоактивность определяли путем инкубации фильтров со сцинтилляционной жидкостью Irgasafe (PerkinElmer) и сцинтилляционных измерений при помощи Wallac Trilux с применением программного обеспечения Microbeta Trilux. Данные анализировали с применением программы Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Исследования цАМФ
2
3
Клетки в количестве 10000 клеток на лунку помещали в обработанные поли-L-лизином 96-луночные планшеты для культур (BD Biosciences). На следующий день клетки инкубировали в 40 мкл DMEM/F12, содержащей 0,5% (масс./об.) БСА и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут перед 15-минутной стимуляцией 50 мМ форсколина (Tocris Cookson) и исследуемыми соединениями в различных концентрациях при 37°С, 5% СO. Исследования останавливали путем удаления среды и добавления 100% ледяного этанола. Планшеты затем замораживали, как минимум, на два часа перед полным выпариванием этанола. Содержимое лунок затем повторно растворяли в 50 мкл буфера для исследования цАМФ (20 нм HEPES рН 7,5 и 5 мМ ЭДТА). Половину растворенного образца переносили в круглодонные 96-луночные планшеты (Greiner Bio-One GmbH), содержащие 0,01% (масс./об.) РКА (цАМФ зависимая протеинкиназа (Sigma-Aldrich)) в 1 мМ цитрате Na рН 6,5, содержащем 2 мМ дитиотреита и 25 мкл [H]-цАМФ (с концентрацией 22 нМ в буфере для исследования цАМФ) (GE Healthcare, Life Sciences), и оставляли отстаиваться для установления равновесия в течение 3-18 часов. Затем к образцам добавляли суспензию активированного угля (5% (масс./об.) активированного угля и 0,2% (масс./об.) БСА в буфере для исследования цАМФ) и планшеты центрифугировали при 3000 x g, 4°C в течение 5 минут. Затем определяли радиоактивность надосадочной жидкости согласно описанию, представленному для исследования конкурентного связывания.
35
Исследование связывания мембраны [S]GTPγS
2
2
35
Мембраны СНО-К1, экспрессирующие СВ2 человека (5 мкг в инкубируемой смеси), разбавляли в 50 мМ Tris-HCl (рН 7,5) и 0,5 мМ ЭДТА и добавляли к HU-соединениям в предварительно перемешанной смеси для инкубирования. Конечные инкубируемые концентрации составляли 55 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl, 0,5% БСА, 50 мкМ GDP, 0,2 нМ [S]GTPyS (PerkinElmer) с различными концентрациями HU-соединений и 5 мкг мембран. Инкубирование продолжали в течение 60 минут при 30°С на встряхиваемой водяной бане. Исследования прекращали путем добавления 2 мл ледяного буфера для промывания (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5 и 5 мМ MgCl) и фильтрования через предварительно смоченные фильтры GF/C (Whatman) с последующими двумя промываниями. Радиоактивность определяли согласно описанию исследований конкурентного связывания.
Статистический анализ
50
50
i
50
50
max
Данные анализировали при помощи программы Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Значения IС и ЕС, определяемые по сигмоидальным кривым, получали для концентраций лекарственных средств, построенных на логарифмической шкале. Несмотря на то что стандартную ошибку среднего (SEM) или стандартное отклонение этих значений можно рассчитать, если значения представлены в логарифмической форме, превращение в мольные (линейные) значения становится неявным и ошибку невозможно выразить в виде «плюс-минус» рассчитанного значения. Существует возможность представления данных в виде среднего плюс-минус стандартная ошибка среднего в логарифмической форме тем не менее не эту величину не просто перевести или сравнить с другими Значениями. По этой причине решили рассчитывать 95% доверительный интервал для среднего значения в логарифмической форме, а затем переводить нижний предел, среднее значение и верхний предел в мольную (линейную) шкалу. Несмотря на то что диапазон, описываемый в этом формате данных, часто охватывает широкий диапазон концентраций, он является наиболее легким в использовании способом представления данных, и данные, представленные в этом разделе, сравнимы с другими аналогичными опубликованными результатами в достоверных источниках (Пертви с соавторами, (Pertwee et al.), 2000). Двусторонние критерии Стьюдента для статистического анализа энантиомерных пар соединений определяли для значений К СВ2. Критерий Пирсона, показатель линейности, определяли для результатов К; и IС или ЕС, полученных для рецепторов СВ2, в исследованиях связывания, цАМФ или GTPγS, соответственно. Для определения значимости различий значений E и значения для HU-308 проводили однофакторный ANOVA с последующим определением критерия Бонферрони для выбранных пар.
Результаты
Эффективность и аффинность связывания с рецепторами СВ1 и СВ2
i
50
d
Все данные анализировали при помощи Prism 4.02. В случае данных связывания К определяли по значениям IС, полученным по данным конкурентного связывания, с применением одностороннего сравнительного анализа нелинейной регрессии при помощи Prism 4.02 с применением значений К, полученных выше.
50
Значения pIC определяли из исследований цАМФ путем построения сигмоидальной кривой зависимости от концентрации с применением Prism 4.02.
50
50
max
Результаты, представленные в Таблицах 1 и 2, получали путем определения среднего двух независимых значений рIС. Данные представлены в виде IC (95% доверительный интервал). Значения E рассчитывали в виде процента от максимального ответа, определенного в параллельных исследованиях цАМФ с HU-210 (1,1-диметилгептил-11-гидрокситетрагидроканнабинол или (6аR)-транс-3-(1,1-диметилгептил)-6а, 7,10,10а-тетрагидро-1-гидрокси-6,6-диметил-6Н-дибензо[b,d]пиран-9-метанол) или HU-308 ([(1R,2R,5R)-2-[2,6-диметокси-4-(2-метилоктан-2-ил)фенил]-7,7-диметил-4-бицикло[3.1.1]гепт-3-енил]метанол) для клеток, экспрессирующих СВ1 и СВ2, соответственно. Данные представлены в виде среднего ±SEM.
Таблица 1
Эффективность и аффинность соединений согласно настоящему изобретению в отношении рецепторов СВ1 и СВ2 человека
Соединение
HU
Исследование конкурентного связывания
Исследование цАМФ
Рецептор СВ2
Рецептор СВ1
Рецептор СВ2
Рецептор СВ1
К<sub>i</sub> (нМ)
95% Доверит. интервал
К<sub>i</sub>(мкМ)
95% Доверит. интервал
IC<sub>50</sub> (нМ)
95% Доверит. интервал
E<sub>max</sub>
IC<sub>50 </sub>(мкМ)
95% Доверит .интервал
E<sub>max</sub>
12а
HU-907
2514
(829,7630)
ОС
-
ОС
-
-
ОС
-
-
12b
HU-908
ОС
-
ос
-
ос
-
-
ОС
-
-
14а
HU-909
56,8
(24,4, 132)
11.7
(4,90, 27,9)
425
(233,774)
95±6%
ОС
-
-
14b
HU-910
6
(5,25, 6)
1,37
(0,53, 3,56)
162
(87,9, 300)
105±12%
ос
-
-
На
HU-911
84,6<sup>§</sup>
(34,9, 204)
ОС
-
385
(200,751)
86±9%
ос
-
-
llb
HU-912
77,1<sup>§</sup>
(30.0, 199)
>10 мкМ
-
239
(159,358)
107±4%
3,37
(2,79,4,06)
112±8%
16а
HU-913
81,5
(69,6, 95,6)
ОС
-
330
(195,557)
101±11%
ОС
-
-
16b
HU-914
1500
(870,2570)
ОС
-
2290
(1710,3050)
82±7%
ос
-
-
20а
HU-917
ОС
-
ОС
-
ОС
-
-
ос
-
-
20b
HU-918
ОС
-
ос
-
ОС
-
-
ос
-
-
23
HU-926
106
(55,3, 204)
ос
-
321
(203,511)
100±13%
ос
-
-
25
HU-928
230
(36,7, 1450)
ос
-
925
(550,1560)
101±11%
ос
-
-
22
HU-936
1720
(827,3560)
ос
-
ОС
-
-
ос
-
-
24
HU-938
7910
(4610,13600)
ос
-
ОС
-
-
ос
-
-
15а
HU-969
6460
(4800,7890)
ос
-
ОС
-
-
ос
-
-
15b
HU-970
1270
(634,2530)
ос
-
1150
(664,1980)
38±2%*
ос
-
-
13a
HU-971
704
(314,1580)
ос
-
1530
(810,2900)
31±4%*
ос
-
-
13b
HU-972
168
(115,247)
ос
-
313
(220,446)
48±5%*
ос
-
-
17a
HU-973
1150
(596,2210)
ос
-
2090
(1340,3260)
40±6%*
ос
-
-
17b
HU-974
>10 мкМ
-
ос
-
ОС
-
-
ос
-
-
HU-308
14
(8,7, 22,8)
ос
-
117
(89,5, 153)
100±0%
ос
-
-
HU-210
0,00294
Исследования конкурентного связывания проводили с клеточными мембранами СНО-СВ1 или СНО-СВ2, а исследования цАМФ - с цельными клетками, экспрессирующие указанный рецептор. Данные связывания (К<sub>i</sub>) и активности (ЕС<sub>50</sub>) представлены в виде среднего с 95% доверительным интервалом в скобках. Производные данные эффективности цАМФ (E<sub>max</sub>) представлены в виде среднего ±SEM. Все данные рассчитывали по меньшей мере по трем независимым повторностям. * Р<0,01 по сравнению с E<sub>max</sub> HU-308.§ Пара энантиомеров без статистического уровня значимости. ОС=Отсутствие связывания или активности, определенное в концентрациях до 50 мкМ.>10 мкМ=Замена радиоактивного лиганда определена для высоких концентраций конкурентного лиганда, но полные кривые замещения не получены
Эффективность связывания рецепторов СВ2
50
mах
mах
i
50
35
35
Данное исследование проводили для выбранных высокоактивных соединений. Значения ЕС определяли в исследованиях [S]GTPγS путем построения сигмоидальных кривых зависимости ответа от концентрации (Таблица 2 и Фигуры 1A-1G). Значения Е рассчитывали как процент от максимального ответа, детектированного в параллельных исследованиях []STPγS для HU-308. Так как Значения Е определены в линейной шкале (не log %), они представлены в виде среднего ±SEM. Критерий Пирсона, составляющий 0,9268, показывал хорошую корреляцию между данными, получали путем построения зависимости значений К соединений от их EC, определенных путем исследования GTPγS.
Таблица 2
Эффективность соединений согласно настоящему изобретению в отношении рецептора СВ2 человека -
Соединение
HU
ЕС<sub>50</sub> (нМ)
Е<sub>maх</sub>
14а
HU-909
135,5 (45,4,404)
76±7%*
14b
HU-910
26,4 (10,7, 65,5)
121±7%
На
HU-911
126,2(50,7,315)
94±4%
16а
HU-913
343,6(151,785)
98±3%
23
HU-926
184,9(72,1,474)
51±6%**
25
HU-928
576,8(291,1140)
95±5%
HU-308
18,3(11,6,28,8)
100±0%
Данные представлены в виде средних значений ЕС<sub>50</sub> с 95% доверительным интервалом, представленным в скобках. Средние значения E<sub>max</sub> (±SEM) приводили к Е<sub>mах</sub> ответу HU-308. n=5 *Р<0,05, **Р<0,001
35
На Фиг.1A-1G представлены графики связывания GTPyS рецептора СВ2 человека соединениями согласно настоящему изобретению: HU-308 (Фиг.1А), HU-909 (Фиг.1В), HU-910 (Фиг.1C), HU-911 (Фиг.1D), HU-913 (Фиг.1E), HU-926 (Фиг.1F) и HU-928 (Фиг.1G). Данные представлены в виде связывания [S]GTPγS, приведенного к максимальному связыванию HU-308 в аналогичных экспериментальных условиях.
Пример 3: Действие HU-910 на закрытое повреждение головы in vitro
Модель закрытого повреждения головы и нейроповеденческая оценка
Исследование проводили согласно руководству Institutional Animal CaRe Committee of the Hebrew University. Во всех экспериментах применяли самцов мышей Sabra с массой от 35 до 50 г. Животных содержали в управляемых условиях смены дня и ночи с циклом 12 ч/12 ч свет/темнота. Экспериментальное закрытое повреждение головы (CHI) наносили с применением модифицированного устройства с падающим грузом, разработанным в нашей лаборатории, описанным ранее (Чен с соавторами (Chen et al.), 1996). Через 1 час после CHI функциональное состояние мышей оценивали при помощи комплекса из 10 нейроповеденческих заданий, а именно, оценки уровня неврологических симптомов (NSS). Эта оценка основана на способности мышей выполнять 10 различных заданий (Бени-Адани с соавторами (Beni-Adani et al.), 2001), в которых оцениваются их моторная способность, баланс и внимательность. Одно очко дается за невыполнение задания. Тяжесть повреждения, которую определяли по начальной NSS, оцениваемой через 1 час после CHI, является надежным прогнозом дальнейших результатов. 10 очков соответствует максимальному неврологическому нарушению, а снижение NSS во время периода восстановления свидетельствует о частичном восстановлении функции.
Статистический анализ
Данные анализировали при помощи программы Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Данные выражены в виде среднего ±SEM, а статистическую значимость определяли при помощи однофакторного анализа вариаций (ANOVA) с последующим анализом Даннета полученных результатов для уровня ФНО-α. Непараметрические значения NSS сравнивали в двух группах для каждого временного интервала. Эти данные анализировали для определения различий между группами в конкретный интервал (а не в зависимости от времени внутри группы). Таким образом, тесты Манна-Уитни применяли для проведения сравнения.
In vivo эксперимент 1
В этом исследовании четырем группам мышей наносили CHI (n=10/группу, в контрольном испытании п=9), после чего вводили следующие агенты:
- Группа 1 (Контроль)', только носитель (этанол:кремофор:солевой раствор в соотношении 1:1:18), через 1 ч после CHI.
- Группа 2: HU-910, 0,1 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 3: HU-910, 1,0 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 4: HU-910, 10,0 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
Оценку уровня неврологических симптомов (NSS) проводили в течение 21 дня и степень восстановления (определенную как ΔNSS=NSS(14)-NSS(t)) рассчитывали и обобщали на Фиг.2. Следует отметить, что наиболее эффективная доза HU-910 составляла 10 мг/кг. На 5 и 7 день после травмы у мышей, которые получали лечение, наблюдали значительно большее восстановление по сравнению с контрольными группами (которым вводили носитель) или группами, которым вводили меньшую дозу (HU-910 в концентрации 0,1 и 1 мг/кг).
In vivo эксперимент 2
В этом исследовании четырем группам мышей наносили CHI (n=9/группу), после чего вводили следующие агенты:
- Группа 1 (Контроль)', только носитель (этанол:кремофор:солевой раствор в соотношении 1:1:18), через 1 ч после CHI.
- Группа 2: HU-910, 10 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 3: Специфический антагонист СВ2 SR144528 (N-[(1S)-эндо-1,3,3-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил]-5-(4-хлор-3-метилфенил)-1-(4-метилбензил)пиразол-3-карбоксамид), (см. М. Риналди-Кармона с соавторами (М. Rinaldi-Carmona, et al.) J. Pharmacol. Exp.Ther. 284 (1998) 644-650), 1 мг/кг, i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 4: Специфический антагонист СВ2 (SR144528, N-[(15)-эндо-1,3,3-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил]-5-(4-хлор-3-метилфенил)-1-(4-метилбензил)пиразол-3-карбоксамид), 1 мг/кг, i.p. через 1 ч после CHI и HU-910 10 мг/кг, которое вводили через 10 минут после введения антагониста. Следует отметить, что группам 3 и 4 проводили введение для подтверждения того, что HU-910 в действительности действует на рецептор СВ2.
На Фиг.3 представлена степень восстановления для четырех групп (измеренная как ΔNSS=NSS(1ч)-NSS(t) в период от 24 часов до 14 дней после CHI), из представленных данных очевидно, что в присутствии только антагониста (Группа 3) восстановление было значительно снижено по сравнению с контрольной группой (Группа 1), которой вводили только носитель. Более того, благоприятное действие HU-910 снижалось аналогично в присутствии антагониста (Группа 4). Согласно этим данным предполагают, что HU-910 обладает действием на рецептор СВ2. Таким образом, предполагается, что эндогенные лиганды, 2-AG и анандамид, оказывающие нейрозащитное действие путем стимуляции рецепторов СВ2, обеспечивают защиту в период после CHI, таким образом, что если рецептор СВ2 блокируется (например, антагонистом), то их действие также прекращается, что приводит к замедленному восстановлению.
In vivo эксперимент 3
В этом исследовании четырем группам мышей наносили CHI (n=7-8/группу), после чего вводили следующие агенты:
- Группа 1 (Контроль): Только носитель (диметилсульфоксид (ДМСО): Tween 80: солевой раствор в соотношении 1:1:18), i.p. через 1 час после CHI.
- Группа 2: HU-910, 10 мг/кг, растворено в Носителе, i.p. через 1 час после CHI.
- Группа 3: Специфический антагонист/обратный агонист СВ2 АМ630 (6-йод-2-метил-1-[2-(4-морфолинил)этил]-1H-индол-3 -ил] -(4-метоксифенил)метанон) (Росс с соавторами (Ross et al.), 1999)), растворенный в Носителе, 1 мг/кг, i.p. через 1 ч после CHI и HU-910, растворенное в Носителе, 10 мг/кг, которое вводили через 10 минут после введения антагониста/обратного агониста.
- Группа 4: Специфический антагонист/обратный агонист СВ2 АМ630 (6-йод-2-метил-1-[2-(4-морфолинил)этил]-1H-индол-3-ил]-(4-метоксифенил)метанон), растворенный в Носителе, 1 мг/кг, i.p. через 1 ч после CHI. Следует отметить, что группам 3 и 4 проводили введение для подтверждения того, что HU-910 в действительности действует на рецептор СВ2.
На Фиг.4 представлено восстановление четырех групп, измеренное как ANSS в период от 1 часа до 28 дней после CHI, из представленных данных очевидно, что благоприятное действие HU-910 (Группа 2) снижалось аналогично в присутствии антагониста/обратного агониста (Группа 3). Согласно этим данным предполагают, что HU-910 обладает действием на рецептор СВ2.
Действие HU-914 на закрытое повреждение головы in vivo
In vivo эксперимент 4
В этом исследовании четырем группам мышей наносили CHI (n=10/группу), после чего вводили следующие агенты:
- Группа 1 (Контроль)'. Только носитель (этанол:кремофор:солевой раствор в соотношении 1:1:18), через 1 ч после CHI.
- Группа 2: HU-914, 5 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 3: HU-914, 10 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 4: HU-914, 20 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
Оценку уровня неврологических симптомов (ANSS) проводили в течение 21 дня, данные представлены на Фиг.5. Наиболее эффективная доза HU-914 составляла 5 мг/кг. Начиная с 3 дня после нанесения травмы, у мышей, которым вводили 5 мг/кг HU-914, наблюдали значительно большее восстановление по сравнению с контрольными группами (которым вводили носитель) или группами, которым вводили большие дозы (HU-914 10 мг/кг и 20 мг/кг).
In vivo эксперимент 5
В этом исследовании четырем группам мышей наносили CHI (n=10/группу), после чего вводили следующие агенты:
- Группа 1 (Контроль): только носитель (этанол:кремофор:солевой раствор в соотношении 1:1:18), через 1 ч после CHI.
- Группа 2: HU-914, 5 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 3: Специфический антагонист/обратный агонист СВ2 (SR144528, N-[(15)-эндо-1,3,3-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил]-5-(4-хлор-3-метилфенил)-1-(4-метилбензил)пиразол-3-карбоксамид), 1 мг/кг, i.p. через 1 ч после CHI и HU-914 5 мг/кг, которое вводили через 10 минут после введения антагониста/обратного агониста.
На Фиг.6 представлена степень восстановления четырех групп (измеренная как ANSS=NSS(l4)-NSS(t) в период от 24 часов до 28 дней после CHI), из представленных данных очевидно, что в присутствии антагониста/обратного агониста (Группа 3) восстановление, осуществляемое HU-914 (Группа 2), прекращалось и снижалось до уровня контрольной группы (Группа 1), которой вводили только носитель. Согласно этим данным предполагают, что по меньшей мере частично HU-914 оказывает действие на рецептор СВ2.
In vivo эксперимент 6
В этом исследовании четырем группам самцов мышей С57 В1 наносили CHI (n=7-10/группу), после чего вводили следующие агенты:
- Группа 1 (Контроль): Только носитель (этанол:кремофор:солевой раствор в соотношении 1:1:18), i.p.через 1 ч после CHI.
- Группа 2: HU-914, 2,5 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 3: HU-914, 5 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 4: HU-914, 10 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI. Оценку уровня неврологических симптомов (NSS) проводили в течение 14 дней, данные представлены на Фиг.7. Следует отметить, что наиболее эффективные дозы HU-914 для конкретной линии мышей составляли 2,5 мг/кг и 5 мг/кг. Через 14 дней после травмы у мышей, которым вводили HU-914 (2,5 мг/кг и 5 мг/кг), наблюдали значительно большее восстановление по сравнению с контрольными группами (которым вводили носитель) или группами, которым вводили большие дозы (10 мг/кг HU-914). Аналогично исследованию мышей Sabra в этом исследовании показано дозозависимое действие HU-914 у мышей С57 В1, которое при более низких дозах (2,5 и 5 мг/кг HU-914) является более эффективным по сравнению с более высокой дозой (10 мг/кг HU-914) или носителем.
Действие HU-914 на продуцирование ФНО-α после CHI
Активность ФНО-α может быть индуцирована в результате ишемического или травматического повреждения мозга, начиная с 1-2 ч и достигая пика через 4 часа после CHI (Шохами с соавторами (Shohami et al.), 1997). На следующей стадии исследовали действие HU-914 па продуцирование ФНО-α после CHI.
Трем группам мышей (n=5-6) наносили CHI:
- Группа 1 (Контроль): Мнимые контрольные группы подвергали только анестезии и проводили разрез кожи.
- Группа 2: только носитель этанол:кремофор:солевой раствор в соотношении 1:1:18), i.p. через 1 ч после CHI.
- Группа 3: HU-914, 5 мг/кг, растворенное в носителе (1:1:18 этанол:кремофор:солевой раствор), i.p. через 1 ч после CHI.
3
4
Животных умерщвляли через 4 часа после CHI путем декапитации. Мозг быстро удаляли и разделяли на ипсилатеральные и контралатеральные фрагменты коры и гиппокампа, которые замораживали в жидком азоте и хранили при -78°С. Ткани мозга гомогенизировали в ледяном лизисном буфере (смесь 50 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 0,5 мМ NаVO, 0,1% 2-меркаптоэтанола, 1% Triton X-100, 50 мМ NaF, 5 мМ пирофосфата натрия, 10 мМ β-глицеропирофосфата натрия, 0,1 мМ фенилметансульфонилхлорида и ингибитора протеазы) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). После обработки ультразвуком во льду в течение 45 секунд и центрифугирования при 12000 об./мин в течение 20 минут определяли концентрацию белка в надосадочной жидкости при помощи способа Бредфорда (Bio-Rad Laboratories, Munich, Germany). Надосадочные жидкости анализировали путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на продуцирование ФНО-α с применением цитокин-специфического набора, производство R&D Systems (Minneapolis, MN). HU-914 ингибировало продуцирование ФНО-α в гиппокампе поврежденного левого полушария, но не влияло на уровень цитокина в левом участке коры. Повышение уровня ФНО-α в правом участке коры или гиппокампе не детектировали (Фиг.8).