КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОМОТИРОВАНИЯ БИОСИНТЕЗА ЭЛАСТИНА И КОЛЛАГЕНА В СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
COMPOSITION FOR PROMOTING ELASTIN AND COLLAGEN BIOSYNTHESIS IN CONNECTIVE TISSUE

Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции для промотирования биосинтеза эластина и/или коллагена, и конкретнее, к композиции для промотирования биосинтеза эластина или коллагена, содержащей глицин, L-пролин и ионы двухвалентного металла.
Описание уровня техники
Эластин представляет собой белок, который присутствует в соединительной ткани вместе с коллагеном и имеет эластичность, подобную резине, и вовлечен в упругость и эластичность тканей, благодаря этим свойствам может вернуть их исходную форму даже после растяжения или сокращения, и играет важную роль в эластичности кожи, предупреждении образования морщин, сужении и релаксации кровеносных сосудов, сжатии и релаксации легких и т.п..
Эластические волокна состоят из эластина и фибриллина, которые состоят из простых аминокислот, таких как глицин, валин, аланин и пролин. Эластин продуцируется через связь между рядом тропоэластинов. Аминокислоты, составляющие эластин, являются гидрофобными аминокислотами, включая такие аминокислоты, как глицин и пролин. Эти аминокислоты сшиваются лизиновыми остатками с образованием гидрофобных участков, которые могут свободно перемещаться.
За биосинтез эластина in vivo ответственны фибробласты, клетки эндотелия, клетки гладких мышц и хондроциты. Эластин может растянуться до своей 7-кратной длины, вернуться в свой исходный размер без существенной молекулярной деформации и теоретически повторять это растяжение и восстановление бесконечно.
Между тем, основным тканеобразующим белком является коллаген, который заполняет внеклеточную область различных соединительных тканей в организме животного. Коллаген также является наиболее распространенным белком, который отвечает за 25%-35% всего белка у млекопитающих. В зависимости от степени минерализации, коллаген может быть твердым, подобно кости, может быть упругим, подобно сухожилиям, или может колебаться от твердого до упругого подобно хрящу. Коллаген принимает форму очень длинных фибрилл, обычно обнаруживается в волокнистых тканях, таких как сухожилия, связки и кожа, и также обнаруживается в роговице, хряще, костях, кровеносных сосудах, пищеварительном тракте, межпозвоночных дисках и дентине зубов. Коллаген является основным компонентом эндомизия в мышечной ткани. Коллаген отвечает за 1-2% мышечной ткани и 6% сильных мышц со множеством сухожилий. Коллаген продуцируют и секретируют фибробласты, которые являются самыми обычными клетками в организме.
Старение кожи и фотостарение вызывают морщины на поверхности кожи, и сетчатая структура эластических волокон, расположенных в дистальной части (ретикулярный слой дермы) кожной ткани, ослабевает, что приводит к существенной потери общей упругости кожи, в конечном счете снижая способность соединительной ткани кожи адаптироваться к механическому растяжению и вызывая провисание ткани и потерю упругости кожи.
Ген (ELN-ген), кодирующий белок тропоэластин, который является предшественником эластина, кодирует различные формы тропоэластина, и ген начинает экспрессироваться в эмбриональной стадии и остается активным в течение первых 5 лет жизни, и затем его активность быстро падает и прекращается (Bashir MM et al., J. Biol. Chem., 264: 8887, 1989). Иными словами, синтез эластичных элементов соединительной ткани, особенно дермы, слизистой оболочки, хрящевой ткани, внутренней оболочки кровеносных сосудов, легких и соединительной ткани клапанов/миокарда, прекращается на ранней стадии жизни. Пополнение не происходит за исключением случаев, когда происходит тяжелое повреждение ткани, такое как ожоги или сильное фотостарение, и такие случаи включают, например, сверхэкспрессию генов LOX (лизиноксидазы), которые кодируют пять различных ферментов, которые катализируют окисление лизиновых остатков среди молекул предшественников тропоэластинов, и такая экспрессия является стадией, необходимой для синтеза функционального эластина и его последующего внедрения в микрофибриллы, которые прилипают к поверхности клетки. В частности, ферментзависимый процесс состоит из окисления лизина и одновременного образования шиффовых оснований между аминогруппами L-LYS и альдозой с образованием поперечных внутримолекулярных связей (Maki et al., Am. J. Pathol., 167: 927, 2005). Эластин является белком только соединительной ткани, который практически незаменим, и остается в таком состоянии в течение более 70 лет (при средней продолжительности жизни 74 года).
Между тем, коллаген типа I является коллагеном, который отвечает за большую часть человеческого коллагена, представляет собой белок, который обнаруживается в различных областях, таких как кожа, кровеносные сосуды, органы и кости, и играет важную роль в организации внеклеточного матрикса (ЕСМ) и структурном и функциональном сохранении в соединительной ткани. Недостаточность коллагена типа I тесно связана с потерей питания и эластичности человеческой кожи, особенно в случае дегенерации кожи, типичной при старении и фотостарении кожи.
Известно, что некоторые аминокислоты и олигопептиды промотируют экспрессию генов, вызывающих биосинтез соединительных тканей кожи и эпидермиса, особенно коллагена и тропоэластина, при соответствующей доставке и применении местно или перорально (Lupo MP et al., Cosmeceutical peptides. Dermatol. Ther., 20: 343, 2007), и раскрыты топические или пероральные композиции с использованием смеси аминокислот, содержащей глицин, пролин, аланин, валин, лейцин и гидрохлорид лизина, смешанные в соответствующем соотношении, но промотирование синтеза коллагена и эластина не раскрывается (см. WO 2016/088078A, EP 2033689A и WO 2007/048522A, и т.д.).
Поэтому в результате значительных усилий по разработке композиции, содержащей оптимальную аминокислоту, которая способна промотировать биосинтез эластина и коллагена, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при обработке фибробластов композицией, содержащей глицин, пролин и ионы двухвалентного металла, уровни экспрессии эластина и коллагена типа I повышаются. Настоящее изобретение завершено на основе этого открытия.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является композиция для промотирования биосинтеза эластина или коллагена.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения вышеуказанной и других целей можно добиться путем предоставления композиции для промотирования биосинтеза эластина или коллагена, содержащей глицин, L-пролин и ион двухвалентного металла, причем отношение содержания глицина к L-пролину составляет 1:0,9 – 1:1,1.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для промотирования биосинтеза эластина или коллагена, включающей указанную композицию.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к функциональной косметической композиции для промотирования биосинтеза эластина или коллагена, включающей указанную композицию.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к косметическому продукту или здоровому функциональному питанию для предупреждения заболеваний скелетно-мышечной системы, содержащим композицию для промотирования биосинтеза эластина или коллагена в качестве активного ингредиента.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу промотирования биосинтеза эластина или коллагена, включающему введение указанной композиции.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к применению указанной композиции для усиления биосинтеза эластина или коллагена.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к применению указанной композиции для получения лекарственного средства для промотирования биосинтеза эластина или коллагена.
Краткое описание чертежей
Вышеуказанные и другие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения будут поняты более четко из последующего подробного описания, приведенного в сочетании с прилагаемыми чертежами, кратко описанными далее.
Фиг.1 показывает результаты, подтверждающие способность композиции по настоящему изобретению в отношении роста фибробластов (клетки Hs27).
Фиг.2 показывает результаты кПЦР, подтверждающие изменение уровней экспрессии генов COL1A2, ELN и COL4A1 в фибробластах после обработки композицией согласно настоящему изобретению.
Фиг.3 показывает результаты вестерн-блоттинга, подтверждающие эффективность продуцирования белков коллагена типа I и эластина после обработки композицией согласно настоящему изобретению.
Подробное описание изобретения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, которые им придают специалисты в данной области техники, для которых предназначается настоящее изобретение. Как правило, номенклатура, используемая в настоящем описании, хорошо известна в технике и широко используется.
Что касается усиления биосинтеза коллагена и эластина, которые являются компонентами ткани кожи, то известно, что когда некоторые аминокислоты и олигопептиды должным образом транспортируются и применяются местно или перорально, промотируется экспрессия генов, вызывающих биосинтез соединительных тканей кожи и эпидермиса, особенно коллагена и тропоэластина. Однако исследование оптимальной комбинации аминокислот, которая может промотировть продуцирование коллагена и эластина в фибробластах, и поддерживающей его минеральной композиции является недостаточным. В настоящем изобретении обнаружено, что композиция, содержащая глицин, L-пролин и ион двухвалентного металла, усиливает экспрессию генов, вовлеченных в биосинтез коллагена и эластина в фибробластах, и промотирует продуцирование белков коллагена и белков эластина в фибробластах.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для промотирования биосинтеза эластина или коллагена, содержащей глицин, L-пролин и ион двухвалентного металла, причем отношение содержания глицина к L-пролину составляет 1:0,9 – 1:1,1.
В настоящем изобретении отношение содержания глицина к L-пролину предпочтительно составляет 1:0,9 – 1:1,1, предпочтительнее 1:0,95 – 1:1,05 и наиболее предпочтительно 1:0,99 – 1:1,01.
Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, включающей L-аланин, L-валин, L-лейцин и гидрохлорид L-лизина, и отношение содержания каждой аминокислоты к глицину по массе предпочтительно является следующим:
-L-аланин: 0,40 – 0,90,
-L-валин: 0,30 – 0,80,
-L-лейцин: 0,10 – 0,30,
- гидрохлорид L-лизина: 0,10 – 0,25;
предпочтительнее
-L-аланин: 0,60 – 0,85,
-L-валин: 0,40 – 0,75,
-L-лейцин: 0,15 – 0,25,
- гидрохлорид L-лизина: 0,12 – 0,20; и
наиболее предпочтительно
-L-аланин: 0,70 – 0,80,
-L-валин: 0,55 – 0,70,
-L-лейцин: 0,18 – 0,23,
- гидрохлорид L-лизина: 0,14 – 0,18.
Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать 0,1-30,0 мас.%, предпочтительно 0,5-25,0 мас.%, предпочтительнее 1,0-20,0 мас.% L-цистеина или N-ацетил-L-цистеина относительно всей композиции аминокислот.
Композиция согласно настоящему изобретению может иметь общее содержание аминокислот 1-700 г/л, предпочтительно 5-650 г/л, предпочтительнее 10-600 г/л и наиболее предпочтительно 15-500 г/л, но без ограничения указанным.
В настоящем изобретении двухвалентный металл можно выбрать из группы, включающей медь (Cu), кобальт (Co), кальций (Ca), магний (Mg), марганец (Mn) и цинк (Zn). Ион двухвалентного металла может присутствовать в количестве 0,001-5,0 мас.%, предпочтительно 0,003-4,5 мас.% и наиболее предпочтительно 0,005-4,0 мас.% иона металла относительно всей композиции, но без ограничения указанным.
Предпочтительно ион двухвалентного металла, присутствующий в композиции согласно настоящему изобретению, представляет собой медь. Медь может присутствовать сама в виде металла меди, но предпочтительно присутствует в форме соли меди или ее гидрата, предпочтительнее в форме гидрата сульфата меди и наиболее предпочтительно в форме пентагидрата сульфата меди, но без ограничения указанным.
+
2+
Медь (Cu), используемая в композиции по настоящему изобретению, является незаменимым микроминералом, присутствующим как часть различных белков в организме, включая ферменты, хотя происходит конверсия между элементами с двумя валентностями (Cu и Cu), подобно железу. Медь вовлечена в продуцирование АТФ в конечном процессе системы переноса электронов в митохондриях, и медь связана с пероксид-дисмутазой (SOD) и таким образом имеет функцию антиоксиданта по предотвращению окислительного повреждения клеток и дополнительно функцию по отложению пигмента меланина в коже вместе с марганцем и тирозином (аминокислоты).
В одном воплощении настоящего изобретения, при обработке фибробластов (клетки Hs27) композицией, содержащей глицин, L-пролин и медь, и детекции изменений в уровнях экспрессии гена COL1A2, который является геном, вовлеченным в биосинтез коллагена типа I, гена ELN, который является геном, вовлеченным в биосинтез эластина, и гена COL4A1 через кПЦР, обнаружено, что экспрессия гена COL1A2 и гена ELN возрастает (см. фиг.2).
В другом воплощении настоящего изобретения фибробласты (клетки Hs27) обрабатывают композицией, содержащей глицин, L-пролин и медь, и изменения в продуцировании коллагена типа I и эластина детектируют вестерн-блоттингом. В результате обнаружено, что способность продуцировать коллаген типа I и эластин усиливается (см. фиг.3).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для промотирования биосинтеза эластина или коллагена, включающей указанную композицию.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения или лечения связанных с эластином заболеваний, гипертензии, вызванной пониженной эластичностью сосудов и сниженным кровотоком, пониженной эластичности сухожилий и связок, пониженной эластичности суставов, эластофиброза из-за фотостарения, эпидермальной атрофии, атрофического заболевания кожи, ожогов, радиационных ожогов, повреждений кожи, пролежней, аплазии кожи, вызванной введением лекарств, или повреждений мышц и суставов, но без ограничения указанным.
Кроме того, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для улучшения эластичности кровеносных сосудов путем индукции эластина и/или коллагена и лечения заболеваний или улучшения состояния здоровья за счет этого.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получить для перорального введения, внутримышечной инъекции, чрескожной инъекции, как лекарственное средство для наружного применения или медицинское устройство для инъекции или наружного применения.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также содержит гиалуроновую кислоту или ее соль, особенно гиалуроновую кислоту или ее соль, предпочтительно натриевую соль гиалуроновой кислоты, имеющие среднюю молекулярную массу 500000-3000000 Да, в количестве 0,01-3 мас.% от всей композиции.
Композиция, содержащая смесь вышеуказанных аминокислот и гиалуроновой кислоты или ее соли, подходит для применения в форме для перорального введения, внутримышечной инъекции, чрескожной инъекции, лекарственного средства для наружного применения или медицинского устройства, и может быть составлена в форме, подходящей для них, и использована.
Неограничивающие примеры препаратов, которые можно использовать, включают инъекции, гели, мази, эмульсии, трансдермальные пэтчи, стерильные растворы, пломбировочные материалы, раневые покрытия и порошки аминокислот, созданные как восстанавливающиеся стерильным водным раствором гиалуроновой кислоты или ее соли.
Препараты для инъекции получают путем растворения аминокислоты в форме порошка в стерильном растворе гиалуроновой кислоты или ее соли предпочтительно путем прямого введения гиалуроновой кислоты или ее соли, предпочтительно геля гиалуроната натрия, во флакон, содержащий порошок (например, с использованием шприца для пересадки кожи). После полного растворения полученный гелевый раствор инъецируют в кожный участок. Стерильный водный раствор гиалуроновой кислоты или ее соли может содержать рН-регулирующий буфер (например, фосфатный буфер) или агент, регулирующий осмотическое давление (например, хлорид натрия), и другие технические адъюванты, которые могут обеспечить физико-химическую и тканевую совместимость, требуемую для стерильных фармацевтических препаратов для инъекции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к косметической композиции, в частности, функциональной косметической композиции, включающей композицию для промотирования биосинтеза эластина или коллагена согласно настоящему изобретению.
Функциональную косметическую композицию согласно настоящему изобретению можно использовать для улучшения эластичности кожи и удаления морщин и/или морщин на лице, но без ограничения указанным.
В зависимости от цели применения и ее функций косметическую композицию по настоящему изобретению можно получить в различных формах, таких как раствор (композиция типа лосьона), концентрированный раствор, гель, мазь, эмульсия (крем, эмульсия), дисперсия везикул, порошок, компактный порошок, паста или твердое вещество, и можно предоставить как функциональное косметическое средство.
Конкретно, косметическое средство, содержащее косметическую композицию согласно настоящему изобретению, включает все продукты, включая кремы, такие как кремы для лица, кремы для рук, увлажняющие кремы и солнцезащитные кремы, растворы или концентрированные растворы, лосьоны, крем-пудру, тональные кремы, микроэмульсии, мази, пасты, маски и спреи, но без ограничения указанным.
Когда композицию по настоящему изобретению используют для улучшения эластичности и удаления морщин и морщин на лице и в качестве увлажняющего агента, композиции для этих применений предпочтительно предоставляются в форме эмульсий, таких как кремы, гели, лосьоны, мази или дисперсии везикул, и могут дополнительно включать другие фармацевтические или функциональные активные ингредиенты.
Функциональная косметическая композиция может содержать модифицированные или немодифицированные масла из животных или растительных масел. Примеры таких масел включают масло сладкого миндаля, масло авокадо, касторовое масло, оливковое масло, масло жожоба, подсолнечное масло, масло пшеницы, сезамовое масло, арахисовое масло, масло из виноградных косточек, соевое молоко, сафлоровое масло, кокосовое масло, кукурузное масло, масло лесного ореха, масло Каритэ, пальмовое масло, масло абрикосовых косточек, масло калофилла или пергидроксисквален. Кроме того, масляная фаза может представлять собой неорганическое масло, такое как жидкий парафин или жидкий вазелин. Масло может представлять собой эфир жирной кислоты, такой как изопропилмиристат, изопропилпальмитат, 2-этилгексилпальмитат, пенициллиновое масло (стеарилоктонат), ненасыщенную жирную кислоту, такую как олеиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, бегеновая кислота, линолевая кислота и линоленовая кислота, или летучий или нелетучий изопарафин, такой как жирная кислота или изопарафин С8-С16. Масло может представлять собой жирный спирт С12-С18, такой как олеиловый спирт, цетиловый спирт или стеариловый спирт.
Когда композиция предоставляется в виде эмульсии, эмульгированная композиция по настоящему изобретению содержит масляную фазу и водную фазу. Масляная фаза предпочтительно предоставляется в диапазоне примерно 1 – примерно 75 мас.%, предпочтительнее примерно 5 – примерно 60 мас.% и наиболее предпочтительно примерно 40 – примерно 60 мас.% относительно всей массы композиции.
Водная фаза содержит адъювант, обычно используемый в водных гелях и косметических эмульсиях. Водная фаза может быть предоставлена в количестве от примерно 0,5 до примерно 20 мас.%, и может включать низшие С2-С6 моноспирты и/или полиолы, такие как глицерин, бутиленгликоль, изопренгликоль, пропиленгликоль, этиленгликоль и т.п..
Для получения эмульгированной косметической композиции можно использовать эмульгатор. Косметически приемлемый эмульгатор можно использовать в любом количестве до тех пор, пока он проявляет желательное эмульгирующее действие. Эмульгатор выбирают из известных солей и поверхностно-активных веществ. Эмульгатор предпочтительно выбирают из стеариновой кислоты, сесквиолеата сорбитана, полиэтиленгликоля (ПЭГ-30), диполигидроксистеарата, лецитина, стеарата магния и их производных и смесей. Эмульгатор предпочтительно предоставляется в диапазоне примерно 0,5 – примерно 30 мас.% относительно всей массы композиции, предпочтительнее примерно 1 – примерно 12 мас.% и предпочтительнее примерно 4 – примерно 8 мас.%.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к функциональному здоровому питанию, содержащему в качестве активного ингредиента композицию для промотирования биосинтеза эластина или коллагена согласно настоящему изобретению.
Функциональное здоровое питание согласно настоящему изобретению можно использовать для здоровья кожи, улучшения кровообращения, регулирования кровяного давления или предупреждения и лечения заболеваний скелетно-мышечной системы, включая заболевания суставов, специфического улучшения эластичности кожи, удаления морщин, удаления морщин на лице, облегчения гипертензии, улучшения кровообращения, улучшения эластичности сухожилий и связок, улучшения эластичности суставов и предупреждения или лечения эластофиброза из-за фотостарения, эпидермальной атрофии, атрофического заболевания кожи, ожогов, радиационных ожогов, повреждений кожи, пролежней и аплазии кожи или повреждений мышц и суставов, вызванных введением лекарств, и предпочтительно можно использовать для косметического применения или для предупреждения болезней суставов.
Кроме того, функциональное питание по настоящему изобретению можно использовать в различных применениях, включая лекарственные средства, продукты питания и напитки, для предупреждения окисления. Функциональное питание по настоящему изобретению можно использовать, например, в различных продуктах питания, конфетах, шоколаде, напитках, жвачке, чае, витаминных комплексах, добавках для здоровья и т.п., и можно использовать в форме порошков, гранул, таблеток, капсул или напитков.
Композиция по настоящему изобретению включает различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), корригенты, такие как синтетические отдушки и натуральные отдушки, красители и наполнители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, и органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты, вещества для газирования, используемые в газированных напитках, и подобное. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может содержать мякоть плодов для получения натурального фруктового сока, натуральных плодово-ягодных напитков и овощных напитков. Эти ингредиенты можно использовать независимо или в комбинации.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу промотирования биосинтеза эластина или коллагена, включающему введение композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции для усиления биосинтеза эластина или коллагена.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции для получения лекарственного средства для промотирования биосинтеза эластина или коллагена.
[Примеры]
Далее настоящее изобретение будет описываться подробнее с обращением к примерам. Однако для специалистов в данной области техники будет очевидно, что эти примеры предоставлены для пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1. Подтверждение токсичности для фибробластов композиции согласно настоящему изобретению
Получают композиции согласно настоящему изобретению, указанные ниже в таблице 1, и определяют токсичность для фибробластов композиций из таблицы 1.
Фибробласты, используемые в настоящем примере, представляют собой фибробласты человека Hs27 (ATCC, #CRL 1634), и клетки культивируют в DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), содержащей 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 1% пенициллина-стрептомицина.
Лекарственный препарат для обработки клеток в дозе 1000 мкг/10 мкл разбавляют в бессывороточной среде DMEM, содержащей 1% пенициллина-стрептомицина.
Таблица 1
Ингредиент
Содержание каждого ингредиента в препарате(мкг/10 мкл)
d
EL1
EL4
EL11
EL12
Глицин
302
266,7
266,7
266,7
266,7
L-пролин
227
266,7
266,7
266,7
266,7
L-аланин
228
200
200
200
200
L-валин
168
166,7
166,7
166,7
166,7
L-лейцин
42
56,7
56,7
56,7
56,7
L-лизин∙HCl
33
43,3
43,3
43,3
43,3
Сумма
1000
1000,1
1000,1
1000,1
1000,1
Пентагидрат сульфата меди
0
0
3,3
1,67
0,33
Всего
1000
1000,1
1003,4
1001,77
1000,43
5
Клетки, 1×10 клеток Hs27, высевают в 48-луночный планшет и культивируют в течение 24 часов. Через 24 часа клетки обрабатывают лекарственным средством, полученным как описано выше. Для того, чтобы оценить цитотоксичность, используют набор EZ-cytox (Dogen Bio, Корея) для измерения жизнеспособности клеток через 24 часа, 48 часов и 72 часа. Обрабатывают содержащимися в наборе водорастворимыми солями тетразолия (WST), которые взаимодействуют с ферментами, присутствующими в жизнеспособных клетках, измеряют поглощение при 450 нм и вычисляют жизнеспособность клеток.
В результате, как видно на фиг.1, при сравнении с группой NC, обработанной только растворителем, обнаруживают, что клетки, обработанные d, EL1, EL11 и EL12, не показывают цитотоксичности ни через 24 часа, ни через 48 часов или через 72 часа. Обнаружено, что клетки, обработанные EL4, не показывают токсичность через 24 часа или 48 часов, но жизнеспособность клеток постепенно снижается через 72 часа.
Пример 2. Определение уровней экспрессии генов COL1A2, COL4A1 и ELN после обработки композицией согласно настоящему изобретению
Определяют изменения в уровнях экспрессии генов, вовлеченных в биосинтез коллагена и эластина, в клетках Hs27 в соответствии с обработкой композицией согласно настоящему изобретению.
6
Клетки, 1×10 клеток Hs27, высевают в чашке 100п и культивируют в течение 24 часов. Через 24 часа клетки обрабатывают полученными композициями (d, EL1, EL11 и EL12). Через 72 часа для определения уровня экспрессии гена экстрагируют РНК с использованием TRIzol. По 1 мкг РНК, экстрагированной из каждого образца, синтезируют в кДНК, используя для кДНК обратную транскриптазу, и определяют уровни экспрессии генов COL1A2, ELN, COL4A1 и ACTB с использованием системы детекции с ПЦР в реальном времени (Biorad CFX Connect). Для того, чтобы идентифицировать каждый ген, используют праймеры из таблицы 2, и вычисляют относительные уровни экспрессии с использованием ACTB (β-актин) в качестве внутреннего контроля.
Таблица 2
Последовательности праймеров для детекции уровня экспрессии гена
Ген
Прямые
Обратные
COL1A2
CCA AAT CTG TCT CCC CAG AA(SEQ ID NO: 1)
TCA AAA ACG AAG GGG AGA TG(SEQ ID NO: 2)
ELN
CCA TGT CCA CAC AAG GAC AG(SEQ ID NO: 3)
GCC AGA GTG GCT TTC TCA AC(SEQ ID NO: 4)
COL4A1
GCT TGA AAA GGG TTG AGC AG(SEQ ID NO: 5)
TTG AGT CCC GGT AGA CCA AC(SEQ ID NO: 6)
ACTB
GAG GCC TGG ACT CTC AAC TG(SEQ ID NO: 7)
AAT GAA TGG GGG TTG AAT GA(SEQ ID NO: 8)
В результате, как видно на фиг.2, при сравнении с группой NC, обработанной только растворителем, обнаруживают, что не имеется через 72 часа существенного изменения в уровнях экспрессии гена COL1A2 и гена ELN в клетках, обработанных композициями d, EL1 и EL12, и обнаруживают, что уровни экспрессии гена COL1A2 и гена ELN в группах клеток, обработанных EL4 и EL11, существенно возрастают через 72 часа. Кроме того, в отличие от гена COL1A2 и гена ELN, обнаруживают, что в уровне экспрессии гена COL4A1 не имеется изменения при всех условиях обработки композициями.
Пример 3. Подтверждение способности COL1A2, COL4A1 и ELN продуцировать белок после обработки композицией согласно настоящему изобретению
Определяют изменение способности продуцирования белков коллагена и эластина в клетках Hs27 после обработки композицией согласно настоящему изобретению.
6
Клетки, 1×10 клеток Hs27, высевают в чашке 100п и культивируют в течение 24 часов. Через 24 часа клетки обрабатывают полученными композициями (d, EL1, EL11 и EL12). Через 72 часа для определения уровня экспрессии белок экстрагируют с использованием буфера для лизиса белка (клеточная сигнализация, #9803). Вестерн-блоттинг для идентификации белков коллагена типа I, эластина и β-актина выполняют на каждый белок следующим далее методом.
Коллаген типа I: для определения уровни экспрессии белка коллагена типа I выполняют вестерн-блоттинг в нативной окружающей среде (неденатурирующие условия). Образец получают путем разведения 30 мкг экстрагированного белка в буфере для нативного образца. (Biorad, #1610738).
Выполняют электрофорез с использованием 8% акриламидного геля, не содержащего SDS, и буфера для камеры (трис-глициновый буфер), и белок, отделенный в геле, переносят на мембрану из ПВДФ и затем блокируют снятым латексом в течение 2 часов. После этого белок оставляют стоять при 4°С в течение ночи с использованием антитела против коллагена I (abcam, ab34710) и затем вводят во взаимодействие с вторичным антителом в течение 1 часа. Взаимодействие антитела детектируют с использованием раствора ECL и системы визуализации Amersham Imager 600.
Эластин и β-актин: для детекции уровней белков эластина и β-актина выполняют вестерн-блоттинг в общей среде для вестерн-блоттинга (ненативной и денатурирующей). Образец получают путем разведения 30 мкг экстрагированного белка в 4× буфере для образцов по Лаеммли (Biorad, #1610747). Электрофорез выполняют с использованием 10% акриламидного геля, содержащего SDS, и буфера для камеры (трис-глициновый буфер). Затем отделенный в геле белок переносят на мембрану из ПВДФ и затем блокируют снятым латексом в течение 2 часов. Затем белок оставляют стоять при 4°С в течение ночи с использованием антитела против эластина (Santacruz, sc-166543) и антитела против β-актина (Santacruz, sc-47778), и затем вводят во взаимодействие с вторичным антителом в течение 1 часа. Взаимодействие антитела детектируют с использованием раствора ECL и системы визуализации Amersham Imager 600.
В результате, как видно на фиг.3, при сравнении с группой NC, обработанной растворителем, обнаружено, что клетки, обработанные композициями d, EL1 и EL12, показывают увеличение уровня экспрессии белка коллагена типа I через 72 часа. Эластин не изменяется в группах, обработанных d и EL1, но существенно повышается в группах, обработанных композициями EL4, EL11 и EL12.
Промышленная применимость
Композиция согласно настоящему изобретению может усиливать биосинтез эластина и коллагена фибробластов и таким образом применима для восстановления эластичности кожи, деградированной из-за старения или от воздействия света, и для удаления морщин и морщин на лице.
Хотя конкретные формы настоящего изобретения описаны подробно, специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее описание приводится для показа предпочтительных воплощений в целях пояснения и не должно рассматриваться как ограничивающее объем настоящего изобретения. Поэтому существенный объем настоящего изобретения определяется пунктами прилагаемой формулы изобретения и их эквивалентами.