Изменение морфофункционального состояния мембраны лимфоцитов у больных бронхиальной астмой под действием излучения He-Ne лазера

МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА

Вестн. Ом. ун-та. 2013. № 2. С. 133-136.

УДК 612.111.94:616.248:577.344:57.086

Р.Р. Гильметдинов, А.В. Глотов, Н.А. Давлеткильдеев, И.А. Лобов, Г. С. Трушников

ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАНЫ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИЗЛУЧЕНИЯ HE-NE ЛАЗЕРА

Методом атомно-силовой микроскопии изучено влияние дозы излучения гелий-неонового лазера на шероховатость мембраны, модуль упругости и силу адгезии зонда к мембране лимфоцитов у больных бронхиальной астмой. Установлено, что динамика изменения параметров морфофункционального состояния мембраны лимфоцитов у больных бронхиальной астмой и здоровых доноров с ростом дозы излучения имеет различный характер. Отличие в поведении параметров клеток у больных бронхиальной астмой объясняется наличием у лимфоцитов устойчивых механизмов адаптации, к которым относятся различные мембрано-стабилизирующие эффекты.

Ключевые слова: лимфоциты, бронхиальная астма, излучение He-Ne лазера, атомно-силовая микроскопия, силовая спектроскопия, модуль упругости, шероховатость мембраны, сила адгезии.

Многочисленные исследования поседних лет показывают, что низкоинтенсивная лазерная терапия вносит весомый вклад в процесс лечения и реабилитации больных бронхиальной астмой (БА). В возникновении и прогрессировании БА большую роль играет воспалительный процесс в бронхолегочной системе, влекущий за собой изменение активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Усиление процессов ПОЛ приводит к деструкции липидного бислоя мембран клеток, нарушению мембранной проницаемости, активности важнейших ферментов и изменению функционального состояния мембранно-рецепторного комплекса.

При поглощении световой энергии низко интенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в мембранах клеток происходит индуцирование фотосен-сибилизированных свободнорадикальных реакций, приводящих к инициации процессов ПОЛ с образованием первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Накопление в мембранах продуктов ПОЛ, в частности гидроперекисей, стимулирует выработку клеточных ферментов антиоксидантной защиты, снижающих активность процессов ПОЛ. Предполагается, что терапевтический эффект при воздействии лазерного излучения определенной дозы возникает именно в результате стимуляции клеточных ферментов антиоксидантной защиты. В результате компенсации процессов липидной пероксидации должно происходить заметное изменение мор-фофункционального состояния клеточной мембраны.

Цель работы заключалась в выявлении с помощью метода атомно-силовой микроскопии изменений морфофункционального состояния ци-топлазматической мембраны лимфоцитов крови у больных БА при воздействии излучением гелий-неонового лазера различной дозы.

Облучению in vitro подвергалась венозная гепаринизированная кровь шести больных БА и трех здоровых доноров в качестве контроля. Образцы для исследования готовились в виде фиксированных и окрашенных по методу Май - Грюнвальда мазков крови на стекле. Лимфоциты в мазке выявлялись по специфической окраске ядра и цитоплазмы.

Исследование мембраны лимфоцитов осуществлялось методом контактной атомно-силовой микроскопии (АСМ) на воздухе с помощью сканирующего зондового микроскопа Solver Pro (NT-MDT). В работе использовались кремниевые кантилеверы марки СSG01 (NT-MDT) с жесткостью 0,03 Н/м и радиусом закругления кончика зонда 10 нм.

© Р.Р. Гильметдинов, А.В. Глотов, Н.А. Давлеткильдеев, И.А. Лобов, Г. С. Трушников, 2013

В каждом мазке выполнялось сканирование не менее десяти клеток с различными размерами поля сканирования. На основе анализа топографических изображений размером 500 х 500 нм2 рассчитывались параметры шероховатости мембраны лимфоцитов. Обработка АСМ-изображений и расчёт среднеквадратичной шероховатости мембран эритроцитов производились в пакете программ NOVA (NT-MDT).

Наряду с определением морфологических параметров проводились измерения вязкоупругих свойств мембраны лимфоцитов с помощью метода силовой спектроскопии. Для этого на поверхности клеток регистрировался ряд (порядка 200) кривых подвода-отвода, по которым рассчитывались модуль Юнга (по кривой подвода) и сила адгезии зонда к мембране лимфоцита (по кривой отвода). Сканирование методом силовой спектроскопии проводилось на горизонтальных участках поверхности клеток. Время сканирования одной кривой составляло 2 с, диапазон перемещения сканера по высоте составлял -300...+300 нм.

Расчет модуля Юнга проводился на основе решения задачи Герца для полусферического зонда [1], согласно которому давящая сила зависит от глубины индентирова-ния зонда в образец следующим образом:

44т

F =

3

-Eh2 ,

где К - сила, действующая на образец со стороны зонда; г - радиус закругления зонда; Е - модуль упругости образца; Н - глубина индентирования зонда в образец. Определение модуля Юнга проводилось путем подгонки кривой, рассчитанной на основе выражения (1), к экспериментальной силовой кривой индентирования. Последняя определялась разностью между кривой подвода на участок клетки и кривой подвода на стеклянную подложку.

Сила адгезии зонда к мембране лимфоцита определялась по участку силовой кривой отвода, соответствующему отрицательному изгибу кантилевера перед отрывом от поверхности клетки. Предполагается, что доминирующий вклад в величину силы адгезии вносит микровязкость мембраны лимфоцита.

На рис. 1 в качестве примера представлены типичные АСМ-изображения лимфоцитов периферической крови здорового донора и больного БА. Каких либо достоверных отличий в морфологических параметрах (диаметре, высоте над подложкой) клеток контрольной группы и у больных БА как до облучения, так и после облучения выявлено не было. Это, очевидно, связано с большим многообразием лимфоидных клеток, циркулирующих в кровеносном русле человека.

101'шп

1,0

0,8

0,6

0,4

0 г 4 Б В 10 10'nm

а

Ю'пт^ | Ю'пт

'Щ

1,0 0,8 0,6 0,4

0,2

б

Рис. 1. Типичные АСМ-изображения лимфоцитов периферической крови а) здорового донора и б) больного БА

На рис. 2-4 показана динамика изменения морфофункциональных параметров мембраны лимфоцитов с увеличением дозы облучения.

Из представленных результаты видно, что до лазерного воздействия среднеквадратичная шероховатость, модуль упругости и сила адгезии мембраны лимфоцитов у больных БА существенно меньше, чем аналогичные параметры у здоровых доноров. Данное соотношение параметров отражает изменения в фосфолипидном составе мембраны лимфоцитов при БА.

Согласно результатам работы [2], при БА в фосфолипидах мембраны лимфоцитов значительно увеличивается содержание ненасыщенных жирных кислот и уменьшается содержание насыщенных, при этом снижается микровязкость липидной фазы и повышаются жидкостные свойства мембраны. Повышение текучести липидного бислоя способствует погружению рецепторов в мембрану и уменьшению ее шероховатости.

Существенное уменьшение модуля упругости мембраны лимфоцитов у больных БА может быть также связано с уменьшением содержания холестерина в мембране лим-

Изменение морфофункционального состояния мембраны лимфоцитов..

135

фоцитов. В работе [2] показано, что при БА в плазматических мембранах клеток снижается содержание холестерина, основная функция которого заключается в создании определенной степени жесткости мембраны и поддержании ее стабильности. Изменения в содержании холестерина могут приводить к существенным нарушениям физического состояния мембраны лимфоцита.

Контроль Больные ЬЛ

Я 5

Р 4

а. 2

Дот Дж/см2

Рис. 2. Изменение среднеквадратичной шероховатости мембраны лимфоцитов здоровых доноров (контроль) и у больных БА с ростом дозы облучения

зоо

« 250 С

2 200

§ 150 л

5 50

Контроль Больвые ЬЛ

Контроль

(вольные К Л

1.5

Дот Дж/см2

Рис. 3. Изменение модуля Юнга лимфоцитов здоровых доноров (контроль) и у больных БА с ростом дозы облучения

8

7

в 6

£ 5

I 4

Я

5 3 5 2

1.5

Доза, Дж/см1

Рис. 4. Изменение силы адгезии зонда АСМ к мембране лимфоцитов здоровых доноров (контроль) и у больных БА с ростом дозы облучения

Уменьшение среднеквадратичной шероховатости, модуля упругости и силы адгезии мембраны лимфоцитов здоровых доноров при облучении дозой 1,5 Дж/см2 (рис. 2-4) можно связать с активацией процессов ПОЛ, протекающих в мембране клеток при воздействии малых доз низкоинтенсивного лазерного излучения [3]. При дальнейшем увеличении дозы облучения до 4,5 Дж/см2 наблюдается существенное возрастание параметров мембраны клеток здоровых доноров, что может быть связано со стимуляцией выработки основных клеточных ферментов ан-тиоксидантной защиты, компенсирующих процессы липидной пероксидации [3].

Динамика изменения параметров мор-фофункционального состояния мембраны лимфоцитов у больных БА с ростом дозы облучения имеет иной характер (рис. 2-4). При облучении дозой 1,5 Дж/см2 существенно возрастают шероховатость мембраны и модуль Юнга, в то время как сила адгезии практически не претерпевает изменений. Дальнейшее увеличение дозы облучения до 4,5 Дж/см2 не приводит к изменению параметров мембраны клеток у больных БА.

Наблюдаемое поведение параметров мембраны лимфоцитов у больных БА при облучении можно объяснить следующим образом. При БА в силу ее повышенной хро-низации и частоты повторяющихся приступов лимфоидные клетки приобретают устойчивые механизмы адаптации, к которым относятся различные мембрано-стабилизи-рующие эффекты. Помимо включения механизма антиоксидантной защиты, в лимфоцитах у больных БА могут возникать адаптационно-компенсаторные реакции, такие как накопление некоторых легкоокис-ляемых форм липидов, направленные на поддержание структурной целостности и функциональной активности мембраны. Возможно, поэтому дальнейшее увеличение дозы облучения не приводит к изменению параметров морфофункционального состояния лимфоцитов крови у больных БА.

Таким образом, в работе исследовано влияние дозы излучения гелий-неонового лазера на шероховатость мембраны, модуль упругости и силу адгезии зонда к мембране лимфоцитов здоровых доноров и у больных бронхиальной астмой. Показано, что динамика изменения параметров морфофунк-ционального состояния мембраны лимфоцитов у больных БА и здоровых доноров с ростом дозы излучения имеет различный характер. Немонотонное поведение параметров морфофункционального состояния мембраны лимфоцитов у здоровых доноров с ростом дозы излучения связывается с протеканием двух конкурирующих процессов: перекисного окисления липидов и выработкой ферментов антиоксидантной защиты. Наблюдаемое специфическое поведение параметров лимфоцитов у больных бронхиаль-

ной астмой объясняется наличием у лимфо-идных клеток устойчивых механизмов адаптации, к которым относятся различные мембрано-стабилизирующие эффекты.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Kuznetsova T. G., Starodubtseva M. N., Yegoren-kov N. I., Chizhik S. A., Zhdanov R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity // Micron. 2007. V. 38. P. 824-833.

[2] Кузьмичева Л. В., Киселева Р. Е., Новожилова О. С. Изменения фосфолипидного состава мембран лимфоцитов при бронхолегочных заболеваниях // Иммунология. 2005. № 5. С. 304308.

[3] Бриль Г. Е. Молекулярно-клеточные основы терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения. Саратов : Изд-во Саратовского мед. ун-та, 2000. 43 с.