ОЧИСТКА ИНСУЛИНА

1. Хроматографический способ выделения белковых компонентов белоксодержащего раствора, при этом указанный раствор содержит инсулиновый пептид и один или более чем один ди- или поливалентный ион металла, указанный инсулиновый пептид способен к самоассоциации и/или структурным изменениям в присутствии ди- или поливалентных ионов металлов, причем указанный способ включает следующие этапы:
CV
а. нанесение белоксодержащего раствора на колонку с хроматографическим твердофазным материалом, где нагрузка инсулиновым пептидом составляет по меньшей мере 6,0 г на литр объема колонки (г/л); и
б. элюция инсулинового пептида из указанного твердофазного материала с помощью элюента с pH максимум 8,5; и сбор пула инсулинового пептида, соответствующего по меньшей мере 75% по весу инсулиновому пептиду, нанесенному на колонку на этапе (а).
2. Хроматографический способ выделения белковых компонентов инсулинсодержащего раствора, при этом указанный раствор содержит инсулиновый пептид, способный к самоассоциации и/или структурным изменениям в присутствии цинка и двухвалентных ионов цинка, причем указанный способ включает следующие этапы:
CV
а. нанесение инсулинсодержащего раствора на колонку с анионообменным хроматографическим твердофазным материалом, где нагрузка инсулиновым пептидом, представляющим интерес, составляет по меньшей мере 6,0 г на литр объема колонки (г/л); и
б. элюция инсулинового пептида, представляющего интерес, из указанного твердофазного материала с помощью элюента с pH максимум 6,8; и сбор пула инсулинового пептида, представляющего интерес, соответствующего по меньшей мере 90% по весу инсулиновому пептиду, представляющему интерес, нанесенному на колонку на этапе (а).
2+
3. Способ по п.1 или 2, в котором дивалентный ион металла представляет собой Zn и концентрация ионов цинка в растворе находится в диапазоне 0,01-200 мМ, например 0,1-100 мМ, например, 0,5-75 мМ.
4. Способ по п.1 или 2, в котором соотношение эквивалентов заряда ионов цинка и инсулинового пептида обычно составляет от 0,1:1 до 50:1, например от 0,3:1 до 20:1, например от 0,4:1 до 15:1 или от 0,5:1 до 10:1.
5. Способ по п.1 или 2, в котором pH элюента составляет максимум 6,8, например, максимум 6,6, или максимум 6,4, или максимум 6,2, или максимум 6,0, или по меньшей мере 4,0, или по меньшей мере 4,4, или по меньшей мере 4,8, или по меньшей мере 5,0, например, в диапазоне 4,0-6,8, или 4,4-6,8, или 4,8-6,8, или 4,0-6,8, таком как 4,0-6,6, или 4,0-6,4, или 4,0-6,2, или 4,0-6,0, или 4,4-6,8, или 4,4-6,6, или 4,4-6,4, или 4,8-6,8, или 4,8-6,6, или 4,8-6,2, или 5,0-6,8, или 5,0-6,6.
6. Способ по пп.1 или 2, в котором пул инсулинового пептида, собранного на этапе (б), соответствует по меньшей мере 91% по весу, или по меньшей мере 92% по весу, или по меньшей мере 93% по весу, или по меньшей мере 94% по весу, или по меньшей мере 95% по весу, или по меньшей мере 96% по весу инсулиновому пептиду, нанесенному на колонку на этапе (а).
7. Способ по п.1 или 2, в котором инсулиновый пептид выбран среди инсулиновых производных, которые являются природным инсулином или его аналогом с боковой цепью, присоединенной к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или к ε-аминогруппе остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина, при этом боковая цепь имеет общую формулу:
- W-X-Y-Z,
где W представляет собой:
- α-аминокислотный остаток с карбоксильной группой в боковой цепи, который формирует через одну из его карбоксильных групп амидную группу вместе с α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или вместе с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина;
- цепь, состоящую из двух, трех или четырех α-аминокислотных остатков, связанных друг с другом посредством амидных связей, которая через амидную связь связана с α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина, при этом аминокислотные остатки W выбраны из группы аминокислотных остатков с нейтральной боковой цепью и аминокислотных остатков с карбоксильной группой в боковойцепи, так что W имеет по меньшей мере один аминокислотный остаток с карбоксильной группой в боковой цепи; либо
- ковалентную связь от Х к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или к ε-аминогруппе остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина;
X представляет собой
C
- -O-;
C
- -СН(COOH)O-;
2
2
C
- -N(СНСООН)CHO-;
2
2
2
2
C
- -N(CHCOOH)CHCON(CHCOOH)CHO-;
2
2
2
2
C
- -N(CHCHCOOH)CHCHO-;
2
2
2
2
2
2
2
2
C
- -N(CHCHCOOH)CHCHCON(CHCHCOOH)CHCHO-;
2
4
C
- -NHCH(COOH)(CH)NHO-;
2
2
2
C
- -N(CHCHCOOH)CHO-; или
2
2
2
C
- -N(CHCOOH)CHCHO-,
что
а) когда W представляет собой аминокислотный остаток или цепь аминокислотных остатков, он через связь с подчеркнутым карбонильным углеродом образует амидную связь с аминогруппой в W, или
б) когда W представляет собой ковалентную связь, он через связь с подчеркнутым карбонильным углеродом образует амидную связь с N-концевой α-аминогруппой в B-цепи или с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина;
Y представляет собой:
2
m
- -(CH)-, где m представляет собой целое число в диапазоне от 6 до 32;
- двухвалентную углеводородную цепь, содержащую 1, 2 или 3 -CH=CH- группы, и число групп -CH2-, достаточное, чтобы дать общее число атомов углерода в цепи в диапазоне от 10 до 32;
2
v
6
4
2
w
- двухвалентную углеводородную цепь формулы -(CH)CH(CH)-, где v и w являются целыми числами или один из них равен нулю, так что сумма v и w находится в диапазоне от 6 до 30; а также
Z представляет собой:
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
2
- -CH(COOH);
2
2
- -N(CHCOOH);
3
- -SOH; или
3
- -POH;
2+
и любым их комплексом с Zn.
8. Способ по п.1 или 2, в котором инсулиновый пептид представляет собой человеческий инсулин 1 LysB29(Nε-гексадекандиол-γ-Glu) des(B30).
9. Хроматографический способ по п.1 или 2 для выделения белковых компонентов инсулинсодержащего раствора, при этом указанный раствор содержит человеческий инсулин LysB29(Nε-гексадекандиол-γ-Glu) des(B30) и двухвалентные ионы цинка, а указанный способ включает следующие этапы:
CV
а. нанесение инсулинсодержащего раствора на колонку с анионообменным хроматографическим твердофазным материалом, где нагрузка инсулиновым пептидом, представляющим интерес, составляет по меньшей мере 6,0 г на литр объема колонки (г/л); и
б. элюция инсулинового пептида, представляющего интерес, из указанного твердофазного материала с помощью элюента с pH в диапазоне от 6,4 до 6,8; и сбор пула человеческого инсулина LysB29(Nε-гексадекандиол-γ-Glu) des(B30), соответствующего по меньшей мере 90% по весу человеческому инсулину LysB29(Nε-гексадекандиол-γ-Glu) des(B30), нанесенному на колонку на этапе (а).
10. Способ по п.1 или 2, в который включен этап промывки после этапа (а), но до этапа (б) с применением промывочного буфера, содержащего этанол и триэтаноламин.
11. Способ по п.1 или 2, в котором инсулиновый пептид представляет собой производное инсулина, имеющее формулу:
,
где Ins представляет собой фрагмент родительского инсулина, а
1
2
2
n
1
2
n
3
2
n
2
2
n
4
2
n
3
2
n
5
2
n
1
2
Q-Q-[CH]-X-[CH]-Q-[CH]-X-[CH]-Q-[CH]-X-[CH]-Q-[CH]-Z представляет собой заместитель, и где Ins присоединен к заместителю через амидную связь между α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка из B-цепи Ins или ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в A- или B-цепи Ins, и CO-группой в Q или Q заместителя;
каждый n независимо представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
1
Q является:
- амидом аминокислоты с карбоксильной кислотой в боковой цепи или аминокислоты с незаряженной боковой цепью, остаток которой через его карбоксильную группу формирует амидную группу вместе с α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка из B-цепи Ins или вместе с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в А- или B-цепи Ins, либо
- цепью, состоящей из двух, трех или четырех амидов α-аминокислот или аминокислотных остатков, как указано выше, связанных друг с другом с помощью амидной связи, при этом цепь через амидную связь связана с α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка B-цепи Ins или с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в А- или B-цепи Ins, или
- связью,
2
Q представляет собой:
2
- -COCH(CONH)-;
2
2
2
- -COCHN(CHCONH)-;
2
2
2
2
2
2
- -COCHN(CHCONH)COCHN(CHCONH);
2
2
2
2
2
- -COCHCHN(CHCHCONH)-;
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
- -COCHCHN(CHCHCONH)-COCHCHN(CHCHCONH)-;
2
2
2
2
- -COCHN(CHCHCONH)-;
2
2
2
2
- -COCHCHN(CHCONH)-;
2
2
- -COCHOCHCONH-;
5
6
1-6
1-4
- -CO-((CRR)-NH-CO)-;
5
6
5
6
1-6
1-4
3
2
1-6
3
2
3
2
1-6
3
- -СО-((CRR)-CO-NH)- где R независимо может быть H, -CH, -(CH)CH или -CONH, а R независимо может представлять собой H, -CH, -(CH)CH; или
- связь
при условии, что
1
2
- по меньшей мере один из Q или Q не является связью, и
2
2
2
1
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
- что Q не является -CO-(СН)-CO-NH-, где n составляет 0 или 1, X представляет собой связь, a Q представляет собой (CHCHO)- (CHCHO)- или (CHCHOCHCHCHCHO)- и
1
2
- что если амин в Q или Q образует связь с остальной частью заместителя, амин должен быть связан с остальной частью заместителя через карбонильную группу;
3
4
5
Q, Q и Q каждый независимо друг от друга может представлять собой
2
m
- -(CH)-, где m представляет собой целое число в диапазоне от 6 до 32;
2
- двухвалентную углеводородную цепь, содержащую 1, 2 или 3 -СН=СН- группы и число -CH- групп, достаточное, чтобы дать общее число атомов углерода в цепи в диапазоне от 4 до 32;
5
6
1-6
- -СО-((CRR)-NH-CO)-;
5
6
5
6
1-6
1-4
3
2
1-6
3
2
3
2
1-6
3
- -(СО-(CRR)-CO-NH)-, где R независимо может быть H, -CH, -(СН)СН или -CONH, а R независимо может быть Н, -CH, -(СН)СН;
2
0-3
2
0-3
3
1-6
3
2
3
1-6
3
1
2
1
2
1
2
- -СО-(СН)-Ar-(СН)-, где Ar может быть ариленом или гетероариленом, который может быть заменен одной или двумя группами, выбранными из группы, состоящей из -CH, -(CH)-СН, -CONRR или -SONRR, где R и R независимо друг от друга могут быть H, -CH или -(CH)-CH;
2
2
y
2
2
2
y
2
2
2
2
y
2
2
2
2
2
2
y
2
2
2
2
2
2
2
y
2
2
y
- (CHCHO)- (CHCHCHO)-; (CHCHCHCHO)-; (CHCHOCHCHCHCHO)- или (CHCHCHOCHCHCHCHO)-; -(CHOCH)- где у составляет 1-20;
3
1-6
3
2
3
1-6
3
1
2
1
2
1
2
- арилен или гетероарилен, который может быть заменен одной или двумя группами, выбранными из группы, состоящей из -CH, -(CH)-СН, -CONRR или -SONRR, где R и R независимо друг от друга может быть Н, -CH или -(CH)-СН;
- цепь формулы
2
s
1
v1
2
2
w
3
v2
4
2
t
5
v3
6
2
z
1
6
2
1
2
3
1
6
2
1
-(CH)-Y-(Ar)-Y-(CH)-Y-(Ar)-Y-(CH)-Y-(Ar)-Y-(CH)-, где Ar имеет вышеуказанное значение, Y-Y независимо друг от друга могут быть О, S, S=O, SO или связью; где s, w, t и z независимо друг от друга составляют ноль или целое число от 1 до 10, так что сумма s, w, t и z находится в диапазоне от 4 до 30, a v, v, и v независимо друг от друга могут быть равны нулю или 1, при условии, что Y-Y не связаны друг с другом, и что структура -O-(CH)-O- не происходит; либо
- связь;
3
5
при условии, что по меньшей мере один из Q-Q не является связью;
1
2
3
X, X и X независимо друг от друга представляют собой
- О;
- -С=O;
- связь;
1
1
3
1-6
3
- NCOR, где R может быть H, -CH или -(CH)-CH; или
-  или ,
1-3
2-3
2-3
где R представляет собой водород, C-алкин, C-алкенил или C-алкинил;
с условием, что
1
2
3
- X, X и X не могут быть связаны с Z, и
1
2
3
1
2
3
3
4
5
- если X, X и X представляют собой О, то X, X и X не связаны напрямую с О в Q, Q и Q
и
2
2
2
3
3
3
2
3
2
1
Z представляет собой: -COOH; -CO-Asp; -CO-Glu; -CO-Gly; -CO-Sar; -CH(COOH), -N(CHCOOH); -SOH; -OSOH; -OPOH; -POH; -тетразол-5-ил или -O-W,
1
3
2
1-6
3
2
1-6
3
2
2
2
1-6
3
2
1-6
3
2
1
1
3
4
3
4
3
4
2+
где W представляет собой арилен или гетероарилен, который может быть заменен одной или двумя группами, выбранными из группы, состоящей из тетразо-5-лил, -COOH, -SOH, -(СН)-SOH, -(CH)-О-POH-CONRR или -SONRR, где R и R, независимо друг от друга могут быть H, -(CH)-SOH, или -(СН)-O-POH; при условии, что если Z представляет собой -O-W, то Q должен присутствовать, и любой их Zn-комплекс.
12. Способ контроля формы пика при ионообменной хроматографии инсулиновых пептидов, способных к самоассоциации и/или структурному изменению в присутствии ди- или поливалентных ионов металлов с использованием
а. ди- или поливалентных ионов металлов для получения оптимального разделения инсулинового пептида и родственных примесей, где двухвалентные ионы металлов были добавлены, чтобы закрепить форму передней части пика инсулинового пептида, где родственные примеси элюируются перед инсулиновым пептидом.
13. Способ по п.12, в котором инсулиновый пептид выбран среди инсулиновых производных, которые являются природным инсулином или его аналогом с боковой цепью, присоединенной к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или к ε-аминогруппе остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина, при этом боковая цепь имеет общую формулу:
- W-X-Y-Z,
где W представляет собой:
- α-аминокислотный остаток с карбоксильной группой в боковой цепи, который формирует через одну из его карбоксильных групп амидную группу вместе с α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или вместе с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина;
- цепь, состоящую из двух, трех или четырех α-аминокислотных остатков, связанных друг с другом посредством амидных связей, которая через амидную связь связана с α-аминогруппой N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина, при этом аминокислотные остатки W выбраны из группы аминокислотных остатков с нейтральной боковой цепью и аминокислотных остатков с карбоксильной группой в боковой цепи, так что W имеет по меньшей мере один аминокислотный остаток с карбоксильной группой в боковой цепи; либо
- ковалентную связь от Х к α-аминогруппе N-концевого аминокислотного остатка B-цепи или к ε-аминогруппе остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина;
Х представляет собой
C
- -O-;
С
- -CH(COOH)О-;
2
2
C
- -N(СНСООН)CHO-;
2
2
2
2
C
- -N(CHCOOH)CHCON(CHCOOH)CHO-;
2
2
2
2
С
- -N(СНСНСООН)СНСНО-;
2
2
2
2
2
2
2
2
С
- -N(СНСНСООН)CHCHCON(СНСНСООН)СНСНО-;
2
4
C
- -NHCH(COOH)(CH)NHO-;
2
2
2
С
- -N(CHCHCOOH)СНО- или
2
2
2
С
- -N(CHCOOH)СНСНО-,
что
а) когда W представляет собой аминокислотный остаток или цепь аминокислотных остатков, он через связь с подчеркнутым карбонильным углеродом образует амидную связь с аминогруппой в W, или
б) когда W представляет собой ковалентную связь, он через связь с подчеркнутым карбонильным углеродом образует амидную связь с N-концевой α-аминогруппой в B-цепи или с ε-аминогруппой остатка Lys, присутствующего в B-цепи родительского инсулина;
Y представляет собой:
2
m
- -(CH)- где m представляет собой целое число в диапазоне от 6 до 32;
- двухвалентную углеводородную цепь, содержащую 1, 2 или 3 -CH=CH- группы, и число групп -CH2-, достаточное, чтобы дать общее число атомов углерода в цепи в диапазоне от 10 до 32;
2
v
6
4
2
w
- двухвалентную углеводородную цепь формулы -(CH)CH(CH)-, где v и w являются целыми числами или один из них равен нулю, так что сумма v и w находится в диапазоне от 6 до 30; а также
Z представляет собой:
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
2
- -CH(COOH);
2
2
- -N(CHCOOH);
3
- -SOH; или
3
- -POH;
2+
и любых их комплексов с Zn.
14. Способ по любому из пп.12 и 13, в котором инсулиновый пептид представляет собой человеческий инсулин LysB29(Nε-гексадекандиол-γ-Glu) des(B30).
15. Очищенный инсулиновый пептид, полученный в процессе или способом по любому из предыдущих пп.