Способ детекции изолятов Mycobacterium tuberculosis Beijing 94-32-кластера в формате реального времени
METHOD FOR DETECTION OF ISOLATES MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS BEIJING 94-32-CLUSTER IN REAL TIME FORMAT

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к генотипу Beijing 94-32-кластер.
Возбудитель туберкулеза Mycobacterium tuberculosis характеризуется строго клональной структурой популяции, при этом, отдельные генотипы (семейства, сублинии, клональные кластеры) М. tuberculosis отмечены повышенной вирулентностью, трансмиссивностью, или способностью быстрого развития устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Характерной особенностью структуры популяции возбудителя туберкулеза в России и других странах постсоветского пространства является доминирование резистентных штаммов генетического семейства Beijing (также называемого Пекинским генотипом). В свою очередь, популяция Beijing в странах бывшего СССР включает два крупных клональных кластера, Beijing В0 (также называемый успешным российским клоном) и Beijing 94-32 (который можно определить как российско-среднеазиатский генотип М. tuberculosis). Этот последний определяется как тип #94-32 согласно интернет-ресурсу MIRU-VNTRplus.org на основании генотипирования 24 локусов тандемных повторов MIRU-VNTR и имеет числовой профиль 244233352644425153353823 (каждая цифра соответствует количеству повторов в 24 локусах VNTR в порядке расположения по часовой стрелке на хромосоме М. tuberculosis). Геновариант 94-32 и родственные ему производные субтипы образуют дендрограмму со звездной филогенией и их определяют как единому кластеру Beijing 94-32-кластер (Фиг. 1).
Штаммы 94-32-кластера являются заметным компонентом структуры популяции М. tuberculosis в России составляя 40-50% популяции семейства Beijing (Vyazovaya et al., 2015) и преобладают в странах Средней Азии, например, до 90% штаммов Beijing в Казахстане (Skiba et al., 2015). Более того, эти штаммы выявляют у иммигрантов из стран бывшего СССР в странах Европейского Союза, например, в Греции и Испании ( et al., 2016; Ioannidis et al., 2017). Ранее было высказано предположении о происхождении предка генотипа Beijing 94-32 в северо-западном Китае (Yin et al., 2016).
Сравнение с фенотипическими данными показывает ассоциацию штаммов Beijing 94-32-кластера с лекарственной устойчивостью (Merker et al., 2016; Vyazovaya et al., 2015) и, принимая во внимание их распространение в результате глобальных и региональных миграционных потоков, определяет практическое значение разработки способа их быстрой детекции.
Известно определение штаммов Beijing 94-32-кластера на основании анализа 24 локусов VNTR с последующим сравнением с ресурсом www.MIRU-VNTRplus.org. Этот подход ограничен трудоемкостью выполнения анализа, требующего проведения 24 реакций ПЦР с последующим гель-электрофорезом или, при использовании капиллярного секвенатора, ограничен стоимостью оборудования и также страдает достаточной трудоемкостью, как и любой подход на основании мультилокусного VNTR-типирования. Таким образом, разработка быстрого и простого способа детекции эпидемиологически и клинически значимого варианта М. tuberculosis Beijing 94-32-кластер является актуальной задачей программы контроля туберкулеза в России и мире.
G
A
Проведенный нами биоинформационный и филогенетический анализ данных полногогеномного секвенирования штаммов Mycobacterium tuberculosis различных генотипов, включая штаммы семейства Beijing и варианта Beijing 94-32-кластер (файлы fastq и vcf) позволил выявить однонуклеотидный полиморфизм (мутация G>A в гене sigE кодон 98CT>CT, позиция в гене 294, что соответствует позиции 1364706 в полном геноме референтного штамма H37Rv NC_000962.3), характерный и уникальный для филогенетической ветви, содержащей только штаммы Beijing 94-32-кластера.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing 94-32-кластер.
Задача реализуется за счет того, что определяют нуклеотидную замену G>A в гене sigE в позиции 294 с помощью ПЦР в формате реального времени для дискриминации дикого и мутантного аллелей с использованием олигонуклеотидных праймеров FOR (5'-GTCCTGGGATGAGCTGGTC), REV (5'-CGACCGGAACACCCTGATAA) и флуоресцентно-меченых зондов WT (FAM-5'-CGGCTGGCTTATCGGC-BHQ1) и MUT (НЕХ-5'-GTACCGGCTAGCTTATCG-BHQ2), с оценкой результатов ПЦР между 15-35 циклами путем регистрации сигнала флуоресценции по НЕХ-каналу с длиной волны 555 нм судят о принадлежности штамма к генотипу М. tuberculosis Beijing 94-32-кластер, а при регистрации экспоненциального роста сигнала флуоресценции по FAM-каналу с длиной волны 510 нм судят о принадлежности штамма М. tuberculosis к любому другому генотипу.
Аллель-специфическая ПЦР основана на использовании сконструированных нами двух праймеров - прямого и обратного (по отношению к специфической мутации для генотипа Beijing 94-32-кластер) и двух флуоресцентно-меченых зондов для выявления наличия аллеля дикого типа G или мутантного аллеля А в геномной позиции 1364706 G>A (согласно хромосоме референтного штамма H37Rv NC_000962.3). Преимущества предлагаемого способа: 1. быстрота (меньше одного дня от момента выделения ДНК); 2. простая и однозначная интерпретация результатов; 3. возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к кластеру Beijing 94-32 с диагностической целью и при популяционных исследованиях, 4. Возможность выявления контаминации и микс-инфекции.
Изобретение поясняется чертежами, где Фиг. 1 - Филогенетическое древо профилей 24-MIRU-VNTR штаммов М. tuberculosis на котором кластер Beijing 94-32 выделен серым фоном, Фиг. 2 - Схема ПЦР (не в масштабе), где тонкие стрелки - позиции праймеров и зондов в геноме референс-штамма H37Rv; а широкая стрелка обозначает позицию нуклеотидной замены G>A в гене sigE в позиция 294 (кодон 98). Фиг. 3 - накопление сигнала флуоресценции: (а) по специфическому (HEX) каналу детекции, на М. tuberculosis Beijing 94-32-кластер и (б) контрольному (FAM) каналу детекции, на штамм другого генотипа М. tuberculosis. Вода служит отрицательным контрольным образцом.
Способ осуществляется следующим образом. Выделение ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Иенсена, проводят по van Embden et al. [1993]: суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ x1 и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. Полученный клеточный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ x1.
Были использованы следующие сконструированные нами праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени (Фиг. 2) для проведения реакции ПЦР и детекции флуоресценции по двум каналам в одной пробирке одновременно: FOR (5'-GTCCTGGGATGAGCTGGTC), REV (5'-CGACCGGAACACCCTGATAA) и флуоресцентно-меченых зондов WT (FAM-5'-CGGCTGGCTTATCGGC-BHQ1) и MUT (HEX-5'-GTACCGGCTAGCTTATCG-BHQ2).
Для детекции штамма генотипа Beijing 94-32-кластер служил зонд MUT (Фиг. 2), детекцию сигнала проводили по НЕХ-каналу детекции (длина волны 555 нм) (Фиг. 3а).
Для детекции штамма любого другого генотипа М. tuberculosis служил зонд WT (Фиг. 2); детекцию сигнала проводили по FAM-каналу (длина волны 510 нм) (Фиг. 3б).
2
Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл) содержащей 1,5 mM MgCl, 1 U Taq ДНК полимеразы для ПЦР в реальном времени в режиме «горячего старта», 200 μМ каждого из дНТФ, праймеры и зонды (по 5 пмоль каждый). ПЦР проводили в термоциклере RotorGene6000 (Corbette Research) в следующих условиях: 95°С, 10 мин; далее 40 циклов 94°С, 15 с; 60°С, 40 с. Считывание сигнала флуоресценции - при 60°С по каналам 510 и 555 нм.
Оценка результатов.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала между 15-35 циклом по двум каналам - анализируют с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. По каналу HEX (длина волны 555 нм) - регистрируется накопление продукта амплификации фрагмента ДНК, специфического для генотипа М. tuberculosis Beijing 94-32-кластер (Фиг. 3а), по каналу FAM (длина волны 510 нм) - фрагмента ДНК, специфического для любого другого генотипа М. tuberculosis (Фиг. 3б).
При отсутствии сигнала флуоресценции по обоим каналам (510 и 555 нм) делается вывод о недостаточном количестве и/или качестве ДНК или ингибировании реакции ПЦР и невозможности какого-либо вывода о наличии или отсутствии ДНК штамма Beijing 94-32-кластера в образце.
Обязательная амплификация одного или другого продукта ПЦР является контролем качества: при отсутствии сигнала судят о деградированной ДНК или ингибировании реакции, при наличии сигнала по обоим каналам делают вывод о микс-образце (контаминация на каком-либо из этапов исследования или выделение двух штаммов от одного больного).
Способ был апробирован на коллекциях ДНК клинических изолятов М. tuberculosis из коллекции лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИЭМ им. Пастера, представляющих страны с различными популяциями возбудителя и различной долей штаммов Beijing и Beijing 94-32-кластер, что показано на примерах ниже. Все изоляты были ранее генотипированы методом мультилокусного VNTR-анализа позволяющим точно определить принадлежность штамма
Пример 1 Анализ ДНК изолятов М. tuberculosis из Северо-Запада России, региона с известным и достаточно высоким уровнем Beijing 94-32 в популяции (~50% от всех Beijing) (Vyazovaya et al., 2015).
Всего было проверено 80 образцов ДНК изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing, выделенных от больных туберкулезным спондилитом, находившихся на лечении в Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмонологии в 2009-2012 годах. Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) с последующим сравнением с базой данных MIRU-VNTRplus.org. Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР в формате реального времени для выявления штаммов Beijing 94-32-кластера. В результате проведения ПЦР было установлено, что 35 изолятов относились к Beijing 94-32-кластеру, что полностью соответствовало результатам 24-MIRU-VNTR анализа.
Пример 2. Анализ ДНК изолятов М. tuberculosis из Казахстана, страны с известным доминированием варианта Beijing 94-32 (примерно 90% от всех Beijing и 47% от всей популяции) (Skiba et al., 2015).
Изучено 130 изолятов М. tuberculosis разных генотипов (Beijing, LAM, CAS, Ural, New-1) от больных туберкулезом легких из Казахстана. Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом сполиготипирования (Kamerbeek et al., 1997) и 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) с последующим сравнением с базой данных MIRU-VNTRplus.org. Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР в формате реального времени для выявления штаммов Beijing 94-32-кластера. В результате проведения ПЦР было установлено, что 69 изолятов относились к Beijing 94-32-кластеру, что полностью соответствовало результатам 24-MIRU-VNTR анализа.
Пример 3. Анализ ДНК изолятов М. tuberculosis из Китая, страны с крайне незначительной долей российских и среднеазиатских вариантов М. tuberculosis Beijing 94-32 (Yin et al., 2016).
Изучено 67 изолятов M. tuberculosis генотипа Beijing от больных туберкулезом легких из северного Китая (Пекин и соседние провинции).
Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом сполиготипирования (Kamerbeek et al., 1997) и 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) с последующим сравнением с базой данных MIRU-VNTRplus.org. Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР в формате реального времени для выявления штаммов Beijing 94-32-кластера. В результате проведения ПЦР, изолятов Beijing 94-32-кластера выявлено не было, что полностью соответствовало результатам 24-MIRU-VNTR анализа.
Литература
Ioannidis Р, van Soolingen D, Mokrousov I, et al. Multidrug-resistant/extensively drug-resistant tuberculosis in Greece: predominance of Mycobacterium tuberculosis genotypes endemic in the Former Soviet Union countries. Clin Microbiol Infect. 2017 Jul 8. pii: S1198-743X(17)30357-9. doi: 10.1016/j.cmi.2017.07.002. [Epub ahead of print]
Jiao WW, Mokrousov 1, Sun GZ, et al. Evaluation of new variable-number tandem-repeat systems for typing Mycobacterium tuberculosis with Beijing genotype isolates from Beijing, China. J Clin Microbiol. 2008; 46(3): 1045-9.
Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997; 35: 907-14.
Merker, M. Feuerriegel S., Cox H., et al. 2016. Anticipating the second-line antibiotic era: drug resistant tuberculosis strain drives epidemic in Central Asia. 37th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. Scientific Program including Abstract. Agency KONSENS Ltd. p. 48-49.
L,  M,  S, et al. Urgent Implementation in a Hospital Setting of a Strategy To Rule Out Secondary Cases Caused by Imported Extensively Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains at Diagnosis. J Clin Microbiol. 2016; 54(12):2969-2974.
Skiba Y, Mokrousov I, Ismagulova G, et al. Molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population in Kazakhstan: a country-wide study. Tuberculosis (Edinb). 2015; 95(5):538-46.
Supply P, Allix C, Lesjean S, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2006; 44(12):4498-510.
Vyazovaya, A. Mokrousov I, Solovieva N, et al. Tuberculous spondylitis in Russia and prominent role of multidrug-resistant clone Mycobacterium tuberculosis Beijing B0/W148. Antimicrob. Agents Chemother. 2015; 59: 2349-57.
Yin QQ, Liu HC, Jiao WW, Li QJ, Han R, Tian JL, Liu ZG, Zhao XQ, Li YJ, Wan KL, Shen AD, Mokrousov I. Evolutionary History and Ongoing Transmission of Phylogenetic Sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype in China. Sci Rep.2016; 6:34353.