СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕОВАСКУЛЯРИЗАЦИИ СЕТЧАТКИ И ЗРИТЕЛЬНОГО НЕРВА У КРОЛИКОВ
METHOD FOR STIMULATING NEOVASCULARISATION OF RETINA AND OPTIC NERVE IN RABBITS

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для моделирования неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва у кроликов. Полученная модель может быть использована для оценки влияния терапевтических агентов и лазерного излучения на эволюцию новообразованных сосудов заднего отдела глаза в эксперименте.
Уровень техники.
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ того же назначения, включающий имплантацию в стекловидное тело кроликов полимерного импланта, содержащего определенное количество рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста (Alikacem N., Yoshizawa Т., Nelson К. D., et al. Quantitative MR imaging study intravitreal sustained release of VEGF in rabbits. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2000. - Vol.41, №6. - P.1561-1569).
Полимерные импланты изготовлены из биодеструктирующегося сополимера полилактидгликолида, состоящего на 50% из L-лактида и 50% гликолида. В их структуру включен рекомбинантный человеческий сосудистый эндотелиальный фактор роста. Полимерные импланты получали путем растворения 0,31 г полилактидгликолида в 1,2 мл метилена хлорида. 230 мкг сосудистого эндотелиального фактора роста растворяли в 1,0 мл солевого раствора, содержащего 27,9 мг бычьего сывороточного альбумина и 61 мг поливинилалкоголя. Далее эти два раствора смешивали, подвергали эмульгированию в течение 2 минут и быстро замораживали. Замороженную эмульсию лиофилизировали в течение 24 часов для получения похожей на губку полимерной структуры. Полученный материал спрессовывали в «таблетки» весом 20 мг, содержащие 14,9 мкг VEGF и 1,8 мг бычьего сывороточного альбумина.
Эти таблетки имплантировали в стекловидное тело опытных животных (кроликов) в условиях операционной, под наркозом. Проводили разрез оболочек глаза в области плоской части цилиарного тела, через сформированную хирургическую склеротомию интравитреально вводили полимерный имплант, фиксированный швом к склере. Наблюдение за состоянием сосудов глазного дна опытных животных осуществляли с помощью офтальмоскопии, цветного фотографирования, флюоресцентной ангиографии, а также магнитно-резонансной томографии с использованием контрастного вещества. Перед интравитреальной имплантацией полимерных таблеток опытным животным в эксперименте in vitro была изучена динамика высвобождения действующего вещества (сосудистого эндотелиального фактора роста) из полимерного носителя. Данная модель позволила оценить влияние сосудистого эндотелиального фактора роста на состояние ретинальных сосудов кроликов, зафиксировать сроки нарушения проницаемости сосудов сетчатки и появления новообразованных сосудов в заднем отделе глаза, а также ориентировочно сопоставить появление подобных патологических изменений с определенной дозой выделившегося в стекловидное тело сосудистого эндотелиального фактора роста (по данным исследования in vitro).
Недостатками данного способа индукции роста новообразованных сосудов сетчатки и зрительного нерва являются: достаточно трудоемкий метод изготовления полимерных имплантов, «нагруженных» действующим веществом (сосудистым эндотелиальным фактором роста), необходимость проведения хирургической операции по имплантации «таблеток» в стекловидное тело опытных животных, невозможность прерывания патологического процесса на отдельных стадиях его развития без повторной операции по извлечению полимерного импланта из витреальной полости кроликов.
Раскрытие изобретения.
Задачей изобретения является разработка усовершенствованного способа моделирования неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва у кроликов.
На настоящий момент накоплено немалое количество экспериментальных данных, подтверждающих проангиогенные свойства сосудистого эндотелиального фактора роста и его влияние на проницаемость стенки сосудов. In vivo ростовой фактор повышает проницаемость посткапиллярных венул и капилляров, вызывая фенестрацию эндотелиального слоя при введении в кожу или в мышечную ткань. Доказано, что сосудистый эндотелиальный фактор роста способен повышать проницаемость сосудистой стенки в 50000 раз активнее гистамина [Senger D.R., Connoly D., Van De Water L. et al. Purification and NH2-terminal amino acid sequence of guinea pig tumor secreted VPF // Cancer Res. - 1990. - Vol.50, №6. - P.1774-1778]. Ростовой фактор проявляет свойства митогена в культуре клеток эндотелия, стимулирует их миграцию и образование структур, подобных сосудам, так называемый «ангиогенез in vitro». Сосудистый эндотелиальный фактор роста также активирует синтез коллагеназы, тканевого активатора плазминогена и рецепторов к урокиназе в эндотелиальных клетках. Коллагеназа и тканевый активатор плазминогена являются протеазами, которые облегчают миграцию клеток эндотелия через интерстиций или фибринозный экссудат в процессе новообразования сосудов [Schlingemann R.О., van Hinsberg V.W. Role of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in eye disease // Br. J. Ophthalmol. - 1997. - Vol.81, №6. - P.501-512]. Эти результаты экспериментальных исследований послужили предпосылкой для разработки предлагаемого способа индукции роста новообразованных сосудов заднего отдела глаза у кроликов.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является последовательное нарушение проницаемости ретинальных сосудов и индукция роста новообразованных сосудов сетчатки и зрительного нерва у кроликов с возможностью анализа патологических изменений во времени и оценкой нарушения проницаемости стенки кровеносных сосудов, стимуляцией миграции и пролиферации клеток эндотелия с образованием «порочных» новообразованных сосудов.
Технический результат достигается за счет шестикратного введения в стекловидное тело опытных животных водного раствора рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста в определенные сроки от начала эксперимента и с использованием определенных доз, а также упрощения способа с повышением экономической эффективности.
В отличие от ближайшего аналога, предлагаемый нами способ не требует изготовления специальных полимерных имплантов, содержащих сосудистый эндотелиальный фактор роста, интравитреальное введение осуществляется инъекционной иглой, что не требует формирования склеротомии с последующей шовной герметизацией разреза, а дробность введения ростового фактора обеспечивает возможность выявления четкой связи между развитием тех или иных изменений на глазном дне опытных животных и дозой препарата, а также прерывания патологического процесса на любом интересующем исследователя этапе. Используемые нами дозы рекомбинантного человеческого сосудистого эндотелиального фактора роста и сроки введения были отработаны в ходе эксперимента и основывались на данных, получаемых при офтальмоскопии и флюоресцентной ангиографии глазного дна кроликов. Особенностью предлагаемой схемы введения сосудистого эндотелиального фактора роста является последовательность развития изменений на глазном дне, четкая зависимость их от вводимой дозы. Неоваскуляризация сетчатки и зрительного нерва возникала только после введения шестой, высокой, разрешающей дозы фактора роста (5,0 мкг) на фоне имеющихся изменений ретинальных сосудов с нарушением их проницаемости, спровоцированных введением предыдущих доз препарата. Это отличает предлагаемый способ от ближайшего аналога, где в процессе биодеградации полимерного импланта сосудистый эндотелиальный фактор роста высвобождается постепенно, неравномерно (80% фактора роста выделяется в первые 3 недели после введения импланта), что затрудняет выявление связи между точной дозой фактора роста, находящейся в стекловидной полости, и имеющимися изменениями на глазном дне.
Осуществление изобретения.
Способ осуществляют следующим образом.
Опытным животным (кроликам) интравитреально вводят рекомбинантный человеческий VEGF. В качестве растворителя используют стерильную воду для инъекций из расчета 100 мкг лиофилизированного белка в 1,0 мл. Путем дальнейшего разведения получают необходимое количество вещества в 0,05-0,1 мл раствора. Интравитреальное введение VEGF, как это принято, осуществляют с помощью иглы 26 gauge, в 4 мм от лимба, в меридиане 12 часов. Курс включает в себя шесть инъекций препарата, проводимых по следующей схеме: в первые и третьи сутки эксперимента вводят 3 мкг VEGF, на седьмые и одиннадцатые сутки - 1,5 мкг VEGF, на пятнадцатые сутки - 1,0 мкг препарата. На двадцать четвертые сутки после начала эксперимента производится инъекция разрешающей дозы VEGF - 5,0 мкг. Суммарная доза VEGF составляет 15 мкг.
Пример.
При осмотре глаз кроликов на следующий день после первого введения 3 мкг VEGF наблюдалось расширение и извитость сосудов сетчатки (Фиг.1). Интравитреально вводился рекомбинантный человеческий VEGF производства фирм "ProSpec", Израиль, "Pierce", США. После интравитреального введения 6 мкг препарата (две инъекции по 3 мкг VEGF) через 1 неделю после начала эксперимента, помимо имеющихся изменений сосудов отмечалось появление ретинальных кровоизлияний (Фиг.2). Присоединение геморрагического компонента на фоне уже имеющихся изменений сосудов сетчатки свидетельствовало о нарушении внутреннего гематоретинального барьера после суммарного введения 6 мкг фактора роста. По данным ФАГ, проведенной на 14 день эксперимента после суммарного введения 9 мкг рекомбинантного человеческого VEGF (всего четыре инъекции), выявлялось обогащение сосудистой сети сетчатки по сравнению с контрольными глазами за счет открытия в норме не функционирующих капилляров сетчатки (обозначено стрелками на фиг.3). Экстравазального выхода флюоресцеина не было. При офтальмоскопии на 21 день эксперимента после суммарного введения 10 мкг VEGF выявлялось сужение сосудов сетчатки, неравномерность их калибра, кровоизлияния отсутствовали. На фоне подобных изменений проводилось одномоментное введение 5,0 мкг VEGF (шестая инъекция). На следующий день после введения разрешающей дозы препарата при осмотре выявлялись частичный гемофтальм, множественные ретинальные геморрагии, расширение сосудов сетчатки.
При флюоресцентной ангиографии, проведенной на 4 день после введения 5,0 мкг препарата, отмечалось интенсивное гомогенное просачивание красителя из собственных ретинальных сосудов (Фиг.4). При повторном исследовании через 1 неделю после введения разрешающей дозы VEGF наблюдалось некоторое снижение интенсивности ликеджа флюоресцеина из сосудов сетчатки. Одновременно обнаруживалась гиперфлюоресценция диска зрительного нерва, усиливающаяся в поздней фазе исследования, что достоверно свидетельствовало о развитии неоваскуляризации. Энуклеация производилась на 35 сутки после начала эксперимента и через 10 дней после инъекции 5,0 мкг VEGF. Перед выведением животных из эксперимента офтальмоскопически отмечались расширение сосудов сетчатки, единичные ретинальные геморрагии, взвесь форменных элементов крови в стекловидном теле, перед диском зрительного нерва и по ходу медуллярных волокон определялась избыточная ярко-белая ткань.
По данным патоморфологических исследований в глазах опытных животных отмечались выраженные изменения диска зрительного нерва. Поверхность его была неровной, с многочисленными выростами. Последние представляли собой скопления пролиферирующих сосудов, которые прорастали на поверхность диска и образовывали своеобразную его продольную исчерченность. Внутренняя пограничная мембрана Эльшнига не дифференцировалась. Над диском в стекловидном теле выявлялось скопление новообразованных сосудов (отмечены стрелками) с тонкой стенкой капиллярного типа, формирующих паутинообразные структуры (Фиг.5). Отмечалось врастание сосудов диска зрительного нерва в стекловидное тело в виде своеобразных почек (отмечены стрелками на фиг.6). Вблизи диска зрительного нерва сетчатка была утолщена, на поверхности ее выявлялась эпиретинальная мембрана, состоящая из многочисленных сосудов, окруженных воспалительной инфильтрацией, и пронизанная разрастаниями волокнистых элементов (Фиг.7). Обращает внимание появление многочисленных новообразованных сосудов в сетчатке, прорастание их на ее поверхность и формирование сосудистой эпиретинальной мембраны. Внутренняя пограничная мембрана не дифференцируется. На внутренней поверхности сосудистой мембраны отмечалось образование тонкой волокнистой ткани, которая, видимо, обладая тракционными свойствами, способствовала складчатости сетчатки и формированию ее плоской отслойки. Закономерным в данном процессе являлось прорастание новообразованных сосудов через внутреннюю пограничную мембрану на поверхность сетчатки с формированием тонкого паутиноподобного образования из тонкостенных сосудов. Таким образом, в эпиретинальной мембране наряду с сосудами, обладающими полноценной стенкой, встречаются капилляры с очень тонкой стенкой, узким просветом, редко расположенными эндотелиоцитами и отсутствием кровотока в большей их части (Фиг.8). При врастании сосудов на внутреннюю поверхность сетчатки отмечается образование выростов в виде почек, прорывающих внутреннюю пограничную мембрану. В структуре почек определяются пролиферирующие эндотелиоциты, которые можно рассматривать в качестве предшественников новообразованных сосудов. Прослеживается связь эндотелиоцитов новообразованных сосудов сетчатки с формирующимися почками (Фиг.9).
Таким образом, предлагаемый способ моделирования неоваскуляризации сетчатки и зрительного нерва у кроликов является технически доступным, легко воспроизводимым, позволяет проследить все этапы патологического процесса, приводящего к формированию новообразованных сосудов заднего отдела глаза.