ФИТАЗА, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ, КОРМ И КОРМОВАЯ ДОБАВКА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ, СОДЕРЖАЩИЕ ЕЕ
PHYTASE, ITS APPLICATION, FEED AND FEED ADDITIVE FOR ANIMALS, CONTAINING IT

Настоящее изобретение относится к комбикормовой промышленности, более конкретно к фитазе, ее применению, корму и кормовой добавке для животных, содержащих фитазу. нуклеотидных последовательностей, кодирующих фитазы, и касается способа получения и применения фитаз, а также кормов для животных, содержащих эти фитазы.
Фосфор - важный элемент для роста живых существ. В животноводстве, как правило, в корм приходится добавлять неорганический фосфор, чтобы получить хорошие показатели роста. В зерновых и бобовых фосфор сохраняется в основном в форме фитата. Однако животные с однокамерным желудком, как, например, свиньи, птицы и рыбы, не в состоянии непосредственно потреблять фитат или фитиновую кислоту, так что в результате происходит выделение фитата, что означает избыточное обогащение фосфором в регионах, где интенсивным образом разводят сельскохозяйственных животных. Кроме того, связывая металлы, такие как кальций, медь или цинк, фитиновая кислота отрицательно влияет на обмен веществ у животных с однокамерным желудком. Чтобы скомпенсировать дефицит фосфата у этих животных и обеспечить достаточный рост и удовлетворительное здоровье, животным в корм добавляют неорганический фосфат. Это добавление неорганического фосфата является дорогостоящим и ведет к дополнительной нагрузке на окружающую среду. Применение фитазы в корме для животных обеспечивает гидролиз фитата, и в результате содержание инозитолфосфата и неорганических фосфатов в навозе снижается. Добавка фосфата к корму для животных улучшает доступность фосфора из органических соединений и снижает нагрузку на окружающую среду, вызванную выделяемыми фосфатами, связанными с фитатом. В литературе описан целый ряд природных фитаз как грибкового, так и бактериального происхождения.
Фитазы, называемые также мио-инозитол-гексакисфосфат-фосфогидролазами, представляют собой класс фосфатаз, которые способны отщеплять от фитата по меньшей мере один фосфатный остаток.
В европейской заявке ЕР 420358 описаны в общем виде клонирование и экспрессия микробных фитаз, в международной заявке WO 2006/38062 описаны микробные фитазы, происходящие из Citrobakter freundii, в качестве добавки к кормам для животных, в международной заявке WO 2007/112739 описаны фитазы на основе природной фитазы из Citrobakter braakii, а также способ их получения и применение в кормах для животных.
В публикации Haefher et al. (Haefher S., Knietsch A., Scholten E., Braun J., Lohscheidt M. and Zelder O. (2005) Biotechnological production and application of phytases. Appl Microbiol Biotechnol 68:588-597) описано множество известных вариантов применения фитаз в области питания человека и животных. Другие способы применения фитаз, как, например, применение для гидролиза биомассы или крахмала при производстве биологического этанола, описаны в международной заявке WO2008/097620.
В международной заявке на патент WO 2008/116878 приведено описание фитазы из Hafnia alvei и ее белковая последовательность. В публикации Zinin et al. (FEMS Microbiology Letters (2004) 236:283-290) изложено описание фитазы из Obesumbacterium proteus, последовательность которой внесена в базу данных UNIPROT под входящим номером Q6U677. В международных заявках на патент WO 2006/043178, WO 2008/097619 и WO 2008/092901 описаны фитазы, происходящие из различных Buttiauxella sp. К природным фитазам с самой высокой на настоящий момент удельной активностью относятся природные фитазы из Yersinia intermedia (WO2007/128160) и Yersinia pestis (WO02/048332).
Все эти доступные на сегодняшний день фитазы, однако, не демонстрируют тех свойств, которые необходимы для изготовления кормовых добавок для животных. Доступные на настоящий момент фитазы не обладают достаточной термостабильностью, чтобы их можно было применить при изготовлении гранулирован- ных кормов для животных без значительной потери активности. При изготовлении кормовых гранул для животных фитазу при высоких температуре и влажности спрессовывают вместе с остальными обычными компонентами корма для животных, чтобы давать животным в совокупности. При этой горячей и влажной прессовке происходит значительная потеря активности фитазы. Возможность предотвратить эту потерю активности состоит в трудоемком нанесении покрытия на частицы фитазы, чтобы они были защищены от воздействия тепла. Это нанесение покрытия на фитазные добавки вызывает значительные дополнительные расходы на применяемые в нанесении покрытия жиры или полимеры.
Поэтому одна из задач настоящего изобретения состояла в том, чтобы обеспечить фитазу, которая обладает достаточной термостабильностью, так чтобы ее можно было бы применять при изготовлении кормовых гранул без дополнительных защитных мероприятий, например, нанесения покрытия. Кроме того, задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы обеспечить фитазу с достаточно высокой удельной активностью, так чтобы общее количество фитазы, которую необходимо добавлять при производстве кормов, было по возможности малым. Еще одна задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы обеспечить фитазу, которую можно применять в широком диапазоне pH, чтобы ее можно было использовать в характеризующихся различными значениями pH участках пищеварительного тракта различных видов животных, и которая бы сохраняла свою активность в том числе и при колебаниях pH из-за варьирования компонентов корма.
Указанные задачи решают с помощью синтетической фитазы, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID 18. Температурный оптимум фитазы согласно изобретению находится на уровне по меньшей мере 63°C, и она обладает термостабильностью по меньшей мере при 65°C и, таким образом, пригодна для применения при изготовлении гранулированного корма для животных, не претерпевая значительной потери своей активности из-за горячей и влажной среды при гранулировании. Кроме того, она отличаются широким диапазоном pH более 3 единиц, в котором она сохраняет по меньшей мере 50% своей относительной активности, так что ее можно применять для кормления множества видов животных и в сочетании с самыми разными компонентами корма без ухудшения активности фитаз и, соответственно, усиленного выделения фосфата животными.
Степень идентичности между двумя белковыми последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот определяется как степень, которую рассчитывает программа needle в редакции версии, доступной с октября 2009 г. Needle - это часть общедоступного программного пакета EMBOSS, который можно загрузить с интернет-страницы . Используют стандартные параметры: gapopen 10.0 ("штраф за открытие гэпа"), gapextend 0.5 ("штраф за расширение гэпа"), файл данных EBLOSUM62 (Matrix) для белка и файл данных EDNAFULL (Matrix) для ДНК.
Согласно предпочтительной форме выполнения настоящего изобретения синтетическая фитаза отличается изменением аминокислоты по меньшей мере в одном из положений, выбранных из группы, состоящую из положений 1, 6, 12, 17, 84, 89, 92, 109, 137, 138, 140, 142, 143, 149, 156, 202, 205, 207, 208, 209, 228, 234, 243, 247, 248, 251, 255, 256, 261, 270, 304, 314, 320, 349, 356, 373, 382, 399, 402 и 413, соответствующих положениям в SEQ ID 18 SEQ ID 18. Под изменением в смысле настоящего изобретения подразумевают замену исходной аминокислоты, которая указана в протоколе последовательности SEQ ID 18, на другую аминокислоту. При этом аминокислоты обозначены обычным однобуквенным кодом. Благодаря изменению одной или нескольких кислот возможно дополнительно повысить термостабильность синтетической фитазы, либо же расширить область оптимума pH, или повысить удельную активность.
Предпочтительно синтетическая фитаза отличается по меньшей мере 5 изменениями в аминреокислотной последовательности в сравнении с последовательностью SEQ ID 18, в частности, в ней имеются по меньшей мере 10, по меньшей мере 12,
по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, и особенно предпочтительно по меньшей мере 20 изменений.
Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна из аминокислот в положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 1, 6, 12, 17, 84, 89, 92, 109, 137, 138, 140, 142, 143, 149, 156, 202, 205, 207, 208, 209, 228, 234, 243, 247, 248, 251, 255, 256, 261, 270, 304, 314, 320, 349, 356, 373, 382, 399, 402 и 413, соответствующих положениям в SEQ ID 18, была заменена на одну из нижеследующих аминокислот, причем предпочтительно, чтобы в положении 1 вновь введенные аминокислоты представляли собой аминокислоты N, D, Q, Н, в положении 6 - аминокислоты V, I, L, Т, S, в положении 12 - аминокислоты N, D, Q, Н, S, в положении 17 - аминокислоты N, D, Q, Н в положении 84 - аминокислоты V, I, L, Т, S, в положении 89 - аминокислоты Т, S, V, в положении 92 - аминокислоты Е, Q, K, R, N, Р, A, S, G, Н, в положении 109 - аминокислоты K, R, Е, D, в положении 137 - аминокислоты L, I, V, в положении 138 - аминокислоты N, Q, Н, S, в положении 140 - аминокислоты Р, А, N, в положении 142 - аминокислоты Т, S, V, в положении 143 - аминокислоты Y, F, W, в положении 149 - аминокислоты Н, N, S, в положении 156 - аминокислоты R, K, Е, D, в положении 202 - аминокислоты S, Т, А, V, в положении 205 - аминокислоты R, K, Е, D, в положении 207 - аминокислоты Е, Q, D, R, N, Т, S, V, А, I, L, М, в положении 208 - аминокислоты М, L, I, в положении 209 - аминокислоты S, Т, в положении 228 - аминокислоты Y, F, W, в положении 234 - аминокислоты N, D, Q, Н, S, I, V, L, М, в положении 243 - аминокислоты K, R, D, в положении 247 - аминокислоты K, R, Е, в положении 248 - аминокислоты L, I, М, V, в положении 251 - аминокислоты N, D, Q, Н, S, I, V, L, М, в положении 255 - аминокислоты V, I, L, Т, S, в положении 256 - аминокислоты Y, F, W, Н, N, S, в положении 261 - аминокислоты Е, Q, D, K, R, N, в положении 270 - аминокислоты K, R, Е, D, в положении 304 - аминокислоты V, I, L, Т, S, в положении 314 - аминокислоты G, А, в положении 320 - аминокислоты L, I, М, V, в положении 349 - аминокислоты R, K, Е, D, в положении 356 - аминокислоты L, I, М, V, в положении 373 - аминокислоты I, V, L, М, в положении 382 - аминокислоты G, А, в положении 399 - аминокислоты I, V, L, М, в положении 402 - аминокислоты N, D, Q, H, S, а в положении 413 - аминокислоты L, I, M, V, Q, E, N, K, R.
В предпочтительном варианте выполнения синтетическая фитаза имеет по меньшей мере одно из следующих изменений в сравнении с аминокислотной последовательностью SEQ ID 18: SIN; A6V; K12N; S17N; A84V; А89Т; D92E; D92P; D92A D92N; Q109K; M137L; D138N; S140P; А142Т; H143Y; Q149H; T156R; N202S; N202T; G205R; К207Е; К207Т; K207I; V208M; A209S; H228Y; K234N; K234I; Е243К; D247K; S248L; K251N; K251I; A255V; Q256Y; Q256H; S261E; N270K; A304V; S314G; T320L; Q349R; F356L; S373I; E382G; T399I; K402N; H413L; H413Q.
При этом аминокислоту из последовательности SEQ ID 18, указанную перед данным конкретным номером положения, заменяют на аминокислоту, указанную после номера положения. При этом возможно сочетание каждой возможной указанной замены аминокислоты с каждым из остальных изменений.
Предпочтительно, чтобы синтетическая фитаза по настоящему изобретению включала в себя по меньшей мере 5 из вышепоименованных изменений, в особенности по меньшей мере 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19, а наиболее предпочтительно 20 таких изменений.
Крайне предпочтительные варианты выполнения синтетических фитаз характеризуются одним из следующих суммарных изменений сравнительно с последовательностью SEQ ID 18:
a) А89Т/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q,
b) А89Т/D92N/А142Т/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q.
c) А89Т/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q или
d) А89Т/D92A/А142Т/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q.
Конкретные отдельные или кумулятивные мутации, в зависимости от положения и замененной аминокислоты, могут обеспечить повышение термостабильности синтетической фитазы на 1-11°С, так что, выбирая соответствующее количество и вид мутаций, можно выбрать желательную термостабильность фитазы, соответствующую данному конкретному применению.
Эти особенно предпочтительные кумулятивные мутации синтетической фитазы под номером А-518, А-521, А-534 и А-519 (определения смотрите в таблице 1) в каждом случае обеспечивают повышение термостабильности по меньшей мере на 10°С в сравнении с синтетической фитазой SEQ ID 18 (Fus5#2). Таким образом, получается, что эти особенно предпочтительные варианты выполнения обладают термостабильностью при температуре по меньшей мере на 10°С выше 65°С, при которых уже была достигнута термостабильность для фитазы Fus5#2 (последовательность SEQ ID 18). Температурный профиль, профиль рН и термостабильность фитазы с последовательностью SEQ ID 18 представлены на Фиг.1, 2 и 3, соответственно.
В одном из вариантов выполнения в синтетической фитазе имеется по меньшей мере одна консервативная замена аминокислоты в указанных положениях в сравнении с вышеописанными фитазами:
S1N; A6V; K12N; S17N; A84V; А89Т; D92E; D92P; D92A D92N; Q109K; M137L; D138N; S140P; А142Т; H143Y; Q149H; T156R; N202S; N202T; G205R; K207E; K207T; K207I; V208M; A209S; H228Y; K234N; K234I; E243K; D247K; S248L; K251N; K251I; A255V; Q256Y; Q256H; S261E; N270K; A304V; S314G; T320L; Q349R; F356L; S373I; E382G; T399I; K402N; H413L; H413Q;
А89Т/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q;
А89Т/D92N/А142Т/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q;
А89Т/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q и
А89Т/D92A/А142Т/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q, в сравнении с последовательностью SEQ ID 18,
причем синтетическая фитаза может характеризоваться по меньшей мере одним из указанных изменений по отдельности или одной из указанных групп изменений. В смысле настоящего изобретения консервативной является замена аминокислоты G на А; А на G, S; V на I, L, A, T, S; I на V, L, M; L на I, M, V; M на L, I, V; P на A, S, N; F на Y, W, H; Y на F, W, H; W на Y, F, H; R на K, E, D; K на R, E, D; H на Q, N, S; D на N, E, K, R, Q; E на Q, D, K, R, N; S на Т, А; Т на S, V, A; С на S, T, A; N на D, Q, H, S; Q на E, N, H, K, R. При этом каждую консервативную замену одной аминокислоты можно комбинировать с каждой консервативной заменой другой аминокислоты.
Предпочтительно, чтобы синтетическая фитаза представляла собой выделенную фитазу. Допустимо также, чтобы синтетическая фитаза находилась не в виде очищенной выделенной фитазы, а в виде ферментационного бульона, причем биомасса может быть отделена полностью, частично или вообще не отделена. При этом бульон, выводя из него жидкость, можно сгустить или полностью высушить. Эти неочищенные или частично очищенные растворы фитаз или фитазы в виде твердого вещества можно применять в качестве добавок в различные продукты.
Предпочтительно синтетическая фитаза согласно изобретению отличается повышенной термостабильностью и/или повышенной удельной активностью в сравнении с обеими фитазами дикого типа из организмов Yersinia mollaretii и Hafnia sp., которые были основой для конструирования конструкции синтетической фитазы согласно SEQ ID 18.
Кроме того, изобретение включает в себя выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует одну из фитаз согласно изобретению, содержащую в соответствии с вышеприведенным описанием указанные возможные изменения в единичных или многих положениях, в частности, кодирует фитазу с изменениями в следующих положениях аминокислот, относящихся к последовательности SEQ ID 18:
a) A89T/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q, или
b) A89T/D92N/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q, или
c) A89T/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q, или
d) A89T/D92A/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q.
Другим объектом настоящего изобретения является кормовая добавка для животных, которая содержит по меньшей мере одну из вышеописанных фитаз согласно изобретению, а также другие обывчные вещества-добавки, т.е. стандартные вспомогательные вещества для кормов, например, для крупного рогатого скота, птиц или свиней. Под стандартными вспомогательными веществами понимаются, например, витамины, микроэлементы или другие добавки.
Дальнейшим объектом настоящего изобретения является корм для животных, который содержит по меньшей мере одну из вышеописанных фитаз согласно изобретению наряду с прочими обычными компонентами корма для животных. При этом допустимы
все компоненты кормов, которые обычно применяют в гранулированных кормах для откорма крупного рогатого скота, молочных коров, птицы или свиней.
Еще одним объектом настоящего изобретения является применение одной из вышеописанных фитаз согласно изобретению или вышеописанной кормовой добавки или корма для животных для снижения содержания фосфата в навозе сельскохозяйственных животных.
Описанные варианты выполнения предназначены для разъяснения и для лучшего понимания изобретения, и их никоим образом не следует рассматривать как ограничения. Прочие признаки изобретения следуют из нижеприведенного описания предпочтительных вариантов выполнения в сочетании с зависимыми пунктами формулы изобретения. При этом в каждом случае возможна реализация одного или нескольких отдельных признаков изобретения в одном варианте выполнения, и это никоим образом не ограничивает настоящее изобретение до описанного варианта выполнения. Пункты формулы изобретения раскрывают объекты настоящего изобретения, изложенные в описании заявки.
Описание чертежей
На фигуре 1 показан температурный профиль фитазы Fus5#2. В каждом случае определяют активность фитазы при указанной температуре. Для определения значений относительной активности максимальную измеренную активность приравнивают к 100%.
На фигуре 2 показан рН-профиль фитазы Fus5#2. В каждом случае определяют активность фитазы при указанном рН. Для определения значений относительной активности максимальную измеренную активность приравнивают к 100%.
На фигуре 3 показана температурная стабильность фитазы Fus5#2. Фитазу при рН 5,5 в течение 20 минут нагревают до указанной температуры. После охлаждения определяют остаточную активность при рН 5,5 и 37°С. Для определения относительной остаточной активности активность пробы сравнения, которую инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре, приравнивают к 100%.
На фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды pFus5#2. На фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды pH6-pFus5#2. На фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды pGLA53-pFus5#2.
Примеры
Клонирование фитазы из Hafhia sp. LU11047
Среди энтеробактерий проводят поиск фитаз с помощью ПЦР аналогично публикациям Huang et al. (2006) A novel phytase with preferable characteristics from Yersinia intermedia. Biochem Biophys Res Commun 350: 884-889; Shi et al. (2008) A novel phytase gene appA from Buttiauxella sp. GC21 isolated from grass carp intestine. Aquaculture 275:70-75 и международной заявке WO2008116878 (пример 1) с помощью дегенерированных олигонуклеотидов Haf1090 5'-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3' (SEQ ID NO:1) и Haf1092 5'-GGNGTRTTRTCNGGYTG-3' (SEQ ID NO:2) при температурах отжига между 40°С и 50°С.Образовавшиеся продукты ПЦР используют как матрицу для полугнездовой ПЦР с олигонуклеотидами Haf1090 5'-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3' (SEQ ID NO:1) и Haf1091 5'-GCDATRTTNGTRTCRTG-3' (SEQ ID NO:3). Из штамма бактерий рода Hafhia (Hafnia sp. LU11047) можно выделить фрагмент. Выделенный фрагмент подвергают субклонированию и последующей секвенации с помощью набора „ТОРО ТА Cloning  Kit" (Invitrogen) согласно указаниям производителя. Исходя из этой частичной последовательности, проводят амплификацию последовательности фитазы полной длины посредством так называемого метода TAIL-ПЦР ((Yao-Guang Liu и Robert F. Whittier (1995) Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from PI and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25, 674-681). Для этого используют следующие олигонуклеотиды:
Амплификация 3'-конца:
1. Haf1165 (5'-WCAGNTGWTNGTNCTG-3', SEQ ID NO:4) и
Haf1167 (5'-CTTCGAGAGCCACTTTATTACCGTCG-3', SEQ ID NO:5)
2. Haf1165 (5'-WCAGNTGWTNGTNCTG-3', SEQ ID NO:4) и
Haf1168 (5'-CCAATGTTGTGCTGCTGACAATAGG-3', SEQ ID NO:6)
3. Haf1165 (5'-WCAGNTGWTNGTNCTG-3', SEQ ID NO:4) и
Haf1169 (5'-CCGAACTCATCAGCGCTAAAGATGC-3', SEQ ID NO:7)
Амплификация 5'-конца:
1. Haf1077 (5'-CAWCGWCNGASASGAA-3', SEQ ID NO:8) и
Haf1170 (5'-CGCAGTTTGACTTGATGTCGCGCACG-3', SEQ ID NO:9)
2. Haf1077 (5'-CAWCGWCNGASASGAA-3', SEQ ID NO:8) и
Haf1171 (5'-GTCGCGCACGCCCTATATCGCCAAGC-3', SEQ ID NO:10)
3. Haf1077 (5'-CAWCGWCNGASASGAA-3', SEQ ID NO:8) и
Haf1172 (5'-CTGCAAACCATCGCACACGCACTGG-3', SEQ ID NO:11)
Полученные фрагменты ДНК клонируют и подвергают секвенированию с помощью набора „ТОРО ТА Cloning  Kit" (Invitrogen). Нуклеотидные последовательности дают ген с последовательностью SEQ ID NO:12, кодирующий фитазу из Hafnia sp. LU11047. Полученная из него аминокислотная последовательность SEQ ID NO:13 на 98% идентична последовательности фитазы Hafnia alvei из международной заявки WO200811678.
С помощью программного обеспечения SignalP 2.0 дан прогноз, что сигнальный пептид - это аминокислоты 1-33. Следовательно, зрелый фермент начинается с серина в положении 34.
1. Синтетическая фитаза Fus5#2
Клонирование фитазы Fus5#2
На основании хромосомной ДНК из Hafnia sp. LU11047 с помощью ПЦР амплифицировали фрагмент фитазы в границах оснований 1-1074 (SEQ ID NO:14). Из последовательности ДНК потенциальной фитазы (либо кислой фосфатазы) из Yersinia mollaretii ATCC43969, NCBI последовательность ID ZP_00824387, получают олигонуклеотиды для амплификации нуклеотидов 1057-1323. Таким образом, амплифицируют второй фитазный фрагмент хромосомной ДНК из Yersinia mollaretii ATCC 43969 (SEQ ID NO:15). При амплификации обоих фрагментов фитазы как на 3'-конце фрагмента Hafnia, так и на 5'-конце фрагмента Yersinia с помощью применяемого олигонуклеотида создают перекрывание в 20 пар оснований с соответствующим другим фрагментом фитазы. Таким способом оба фрагмента посредством слияния с помощью ПЦР можно объединить в фитазную последовательность SEQ ID NO:16, которая кодирует синтетическую фитазу Fus5#2. С помощью программного обеспечения SignalP 2.0 для полученной на ее основании аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17 дан прогноз, что сигнальный пептид - это аминокислоты 1-33. Зрелую фитазу Fus5#2 (SEQ ID NO:18) кодирует нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:19.
Для клоннрования экспрессионной плазмиды для Е.coli на 5'-конце фрагмента ДНК фитазы с последовательностью SEQ ID NO:16 создают сайт рестрикции NdeI, а на 3'-конце - стоп-кодон и сайт рестрикции HindIII. Последовательности, дополнительно необходимые для этого, создают с помощью ПЦР с использованием праймера и фитазы с последовательностью SEQ ID NO:16 в качестве матрицы. С применением этих сайтов ген, кодирующий фитазу, клонируют в экспресссионный вектор Е.coli pET22b (Novagen). Благодаря применению сайта рестрикции NdeI и благодаря введению стоп-кодона сигнальную последовательность pelB удаляют из вектора и препятствуют прочтению находящегося на плазмиде маркера 6xHis. Изготовленная таким образом плазмида pFus5#2 (SEQ ID NO:20) трансформируется в штамм Е.coli BL21(DE3) (Invitrogen).
Чтобы улучшить очистку фитазного белка, клонируют вариант фитазы с N-концевым маркером 6xHis. Продукт ПЦР амплифицируют, используя смысловой олигонуклеотид PrimerH6: 5'-ctatggatccgcatcatcatcatcatcacagtgataccgcccctgc-3' (SEQ ID NO:21), вводящий как маркер 6xHis, так и сайт BamHI, и кодирующую зрелый фитазный белок SEQ ID NO:19 в качестве матрицы. На 3'-конце продукта ПЦР, используя тот же антисмысловой олигонуклеотид, что и ранее, опять вводят стоп-кодон и сайт рестрикции NdeI. Изготовленный таким образом фрагмент клонируют через BamHI/NdeI в вектор pET22b и получают плазмиду pH6-Fus5#2 (SEQ ID NO:22), которую также трансформируют в Е.coli BL21(DE3). В случае такой конструкции содержащуюся в pET22b сигнальную последовательность pelB используют для транспортировки в периплазму.
Экспрессия фитазы Fus5#2 в Escherichia coli
Штаммы Е.coli BL21(DE3), несущие плазмиду с экспрессионной кассетой фитазы, выращивают в среде LB с ампициллином (100 мг/л) при 37°С. Экспрессию фитазы запускают при оптической плотности 0,6 (600 нм) добавлением 1 мМ MIPTG. По прошествии 4 ч индукции добавляют 10% (об./об.) 10-кратного раствора BugBuster (Novogen) и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. После центрифугирования супернатант используют для определения активности фитазы.
Очистка никель - аффинной хроматографией
2
Для очистки вариантов фитазы, помеченных 6xHis, в культуральный бульон индуцированной экспрессирующей фитазу Е.coli добавляют 300 мМ NaCl, ингибитор протеазы без EDTA Complete™ (согласно данным изготовителя, Roche Applied Science) и 10% (об./об.) 10-кратного раствора BugBuster (Novogen) и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. После центрифугирования супернатант связывают с колонками Ni-NTA (Qiagen) по инструкциям изготовителя. Элюцию после отмывки проводят холодным элюционным буфером (50 мМ натрия-ацетатного буфера, 300 мМ NaCl, 500 мМ имидазола, 1 мМ CaCl). До определения содержания белка в образце меняют буфер посредством диализа на цитрата натрия 2 мМ, рН 5,5.
Экспрессия фитазы Fus5#2 в Aspergillus niger
Для экспрессии фитазы Fus5#2 в Aspergillus niger сначала создают экспрессионную конструкцию, которая содержит ген фитазы под контролем промотора глюкоамилазы А. niger (glaA), фланкированный ничего не кодирующим участком 3'-glaA. Таким способом эту конструкцию подготавливают к интеграции в участок 3'-glaA в А. niger. В качестве сигнальной последовательности для внеклеточной секреции белка применяют сигнальную последовательность фитазы A. ficuum. В качестве основы для экспрессионной конструкции используют подробно описанную в европейской заявке ЕР0635574 В1 плазмиду pGBGLA-53, которая в международной заявке WO9846772 также называется pGBTOPFYT-1. С помощью известных специалисту методов клонирования на основе ПЦР в pGBGLA-53 участок гена фитазы A. ficuum, кодирующий зрелый белок фитазы, начинающийся с последовательности аминокислот ASRNQSS, заменяют на кодирующий зрелую фитазу Fus5#2 участок гена SEQ ID NO:19. Получают итоговую плазмиду pGLA53-Fus5#2 (SEQ ID NO:23). Совместную трансформацию линейной экспрессионной кассеты, выделенной из полученной плазмиды путем HindIII, с маркерной кассетой amdS, выделенной из плазмиды pGBLA50 (ЕР0635574 В1) / pGBAAS-1 (обозначение той же самой плазмиды в международной заявке WO9846772), в экспрессионный штамм A. niger с делецией по glaA и последующую экспрессию фитазы в колбах со встряхиванием проводят так, как описано в обеих процитированных публикациях патентов. Активность фитазы в супернатанте культуры после отделения клеток центрифугированием определяют ежедневно. Максимум активности достигается между 3-м и 6-м днем.
Определение удельной активности
2
2
4
Определение активности фитазы проводят на микротитровальных пластинах Очищенный образец фермента разводят в реакционном буфере (250 мМ ацетата натрия, 1 мМ CaCl, 0,01% Tween 20, рН 5,5). 10 мкл раствора фермента в течение 20 минут инкубируют при 60°С со 110 мкл раствора субстрата (6 мМ фитата натрия (Sigma P3168) в реакционном буфере). Реакцию останавливают добавлением 80 мкл раствора трихлоруксусной кислоты (15% вес/вес). Для детектирования высвобожденного фосфата к 20 мкл реакционного раствора после остановки реакции добавляют 280 мкл свежеприготовленного цветового реагента (60 мМ L-аскорбиновой кислоты (Sigma A7506), 2,2 мМ тетрагидрата молибдата аммония, 325 мМ HSO), в течение 25 минут инкубируют при 50°С, а затем определяют поглощение при длине волны 820 нм. Для получения величины сравнения (холостой пробы) буфер субстрата инкубируют в одиночку при 37°С, а 10 мкл пробы фермента добавляют только после остановки с помощью трихлоруксусной кислоты. Цветовую реакцию проводят аналогично. Количество высвободившегося фосфата определяют по калибровочной кривой цветовой реакции с раствором фосфата известной концентрации. Ферментативную активность, которая в этих условиях высвобождает 1 мкмоль фосфата в минуту, обозначают как 1 ЕД. Концентрацию белка в высвободившемся растворе фитазы определяют на основании поглощения при длине волны 280 нм. Для этого с помощью программного обеспечения „Vector NTI" (Invitrogen, версия 10.3.0) определяют молекулярный коэффициент экстинкции фитазы.
Удельная активность фитазы Fus5#2 составляет 2300+/-200 ЕД/мг.
Количественный анализ фитазы
2
Определение активности фитазы проводят на микротитровальных пластинах Образец фермента разводят в реакционном буфере (250 мМ ацетата натрия, 1 мМ CaCl, 0,01% Tween 20, рН 5,5). 10 мкл раствора фермента в течение 1 ч инкубируют при 37°С со 140 мкл раствора субстрата (6 мМ фитата натрия (Sigma P3168) в реакционном буфере). Реакцию останавливают добавлением 150 мкл раствора трихлоруксусной кислоты (15% вес/вес). Для детектирования высвобожденного фосфата к 20 мкл реакционного раствора после остановки реакции добавляют 280 мкл свежеприготовленного цветового реагента (60 мМ L-аскорбиновой кислоты (Sigma A7506), 2,2 мМ тетрагидрата молибдата аммония, 325 мМ H2S04), в течение 25 минут инкубируют при 50°С, а затем определяют поглощение при длине волны 820 нм. Для получения величины сравнения (холостой пробы) буфер субстрата инкубируют в одиночку при 37°С, а 10 мкл пробы фермента добавляют только после остановки с помощью трихлоруксусной кислоты. Цветовую реакцию проводят аналогично определению остальных значений. Количество высвободившегося фосфата определяют по калибровочной кривой цветовой реакции с раствором фосфата известной концентрации.
Определение температурного оптимума
Для определения температурного оптимума образец фермента разводят в реакционном буфере (250 мМ ацетата натрия, 1 мМ CaCl2, 0,01% Tween 20, рН 5,5). 10 мкл предварительно выдержанного (5 мин, температура данной реакции) раствора фермента в течение 30 минут инкубируют со 110 мкл раствора предварительно выдержанного субстрата (6 мМ фитата натрия (Sigma P3168) в реакционном буфере). Инкубацию проводят при различных температурах в градиентном нагревательном блоке. Реакцию останавливают добавлением 80 мкл раствора трихлоруксусной кислоты (15% вес/вес). Для детектирования высвобожденного фосфата к 20 мкл реакционного раствора после остановки реакции добавляют 280 мкл свежеприготовленного цветового реагента (60 мМ L-аскорбиновой кислоты (Sigma А7506), 2,2 мМ тетрагидрата молибдата аммония, 325 мМ H2SO4), в течение 25 минут инкубируют при 50°С, а затем определяют поглощение при длине волны 820 нм. Для получения величины сравнения (холостой пробы) буфер субстрата инкубируют в одиночку при указанной температуре, а 10 мкл пробы фермента добавляют только после остановки с помощью трихлоруксусной кислоты. Цветовую реакцию проводят аналогично определению других значений. Для определения относительной активности максимальную измеренную активность приравнивают к 100%. Результаты представлены на фигуре 1.
Температурный профиль фитазы Fus5#2:
Температура [°С]
49,4
51
53,3
56,2
59,4
62,6
65,8
68,5
70,8
72,2
72,6
Относительная активность [%]
72,3
77,4
82,2
89,6
95,5
100, 0
96,5
73,1
31,7
16,9
15,9
Температурный оптимум фитазы Fus5#2 находится на уровне около 63°С.
Определение оптимума рН
2
Для определения оптимума рН для количественного анализа фитазы применяют модифицированный реакционный буфер (100 мМ ацетата натрия, 100 мМ глицина, 100 мМ имидазола, 1 мМ CaCl, 0,01% Tween 20), рН которого доводят до значений в пределах 1,5-7 разбавленной соляной кислотой. Для определения относительной активности максимальную измеренную активность приравнивают к 100%. Результаты представлены на Фиг.2.
рН-профиль фитазы Fus5#2:
Значение рН
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
Относительная активность [%]
0,8
2,8
43,2
76,1
81,1
81,5
100,0
88,9
66,1
37,2
15,9
4,1
Оптимум рН фитазы Fus5#2 находится на уровне рН 4,5.
Определение термостабильности (Т50)
2
Для регистрации кривой термической инактивации пробу фермента, растворенную в реакционном буфере (250 мМ ацетата натрия, 1 мМ CaCl, 0,01% Tween 20, рН 5,5), на 20 минут нагревают до соответствующей температуры, а затем охлаждают до 4°С. Пробу сравнения, не подвергающуюся термической обработке, оставляют на 20 минут при комнатной температуре, а затем также охлаждают до 4°С. После предварительной термической обработки определяют ферментативную активность проб с помощью метода количественного анализа фитазы. Активность пробы сравнения принимают за 100%. Термостабильность различных вариантов фитазы характеризуют так называемым значением Т50. Т50 означает температуру, при которой после термической инактивации сохраняется еще 50% остаточной активности в сравнении с не проходившей термическую обработку пробой сравнения. Изменения в термостабильности двух вариантов фитазы, выраженные в °С, получаются из разности соответствующих значений Т50. Результаты представлены на Фиг.3.
Определение Т50 фитазы Fus5#2:
Температура [°С]
21
53,8
55,9
58,6
61,5
64,5
67,4
69,9
72
73,3
73,7
Остаточная активность [%]
100
88
86
83
77
57
15
2
1
2
3
Из этого следует значение Т50 для фитазы Fus5#2 65°С.
2. Варианты фитазы Fus5#2
Варианты фитазы создают мутацией генной последовательности SEQ ID NO:19 с помощью ПЦР. Для целенаправленного мутагенеза применяют набор „Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit" (Stratagene). С помощью набора „GeneMorph II Random Mutagenesis Kit" (Stratagene) всю кодирующую последовательность SEQ ID NO:19 или же только ее часть подвергают случайному мутагенезу. Желательный уровень мутагенеза в 1-5 мутаций задают посредством количества применяемой матричной ДНК. Множественные мутации вызывают целенаправленным сочетанием отдельных мутаций или последовательным проведением нескольких серий мутагенеза.
Созданные таким образом варианты гена фитазы клонируют в экспрессионный вектор Е.coli pET22b (Novagen) аналогично исходной фитазе Fus5#2, а затем экспрессируют с помощью штамма Е.coli BL21(DE3).
Некоторые избранные варианты фитазы экспрессируют аналогично исходной фитазе Fus5#2 с помощью соответствующей экспрессионной конструкции Aspergillus niger.
Созданные варианты фитазы с помощью теста с высокой пропускной способностью проверяют на фитазную активность и температурную стабильность. Для этого клоны Е.coli BL21(DE3), полученные после трансформации с экспрессионной конструкцией на основе pET22b, инкубируют на микротитровальных пластинах с 96 ячейками в среде LB Medium (2% глюкозы, 100 мг/л ампициллина, 30°С, 900 об/мин, размах встряхивания 2 мм). При OD (600 нм) около 0,5 проводят индукцию, применяя 1 мМ IPTG в течение 4 ч. Затем добавляют 10% (об./об.) 10-кратного раствора BugBuster (Novogen) и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Определяют активность фитазы и остаточную активность после 20-минутного температурного стресса. У вариантов с повышенной относительной остаточной активностью определяют термостабильность (Т50). Для некоторых избранных вариантов фитазы определяют дополнительные характеристики (например, температурный оптимум, удельную активность, оптимум рН).
Термостабильность
Повышение термостабильности отдельных вариантов фитазы выражают через ΔT, причем ΔT означает повышение в °С величины Т50 в сравнении с фитазой Fus5#2. Данные о мутации относятся к исходной молекуле Fus5#2.
Таблица 1
Повышение термостабильности вариантов фитазы с 1-14 мутациями в сравнении с синтетической фитазой Fus5#2 в °С
Номера мутантов
Мутация
ΔT [°С]
Fus5#2
посл. №18
0
А-4
Q349R
1
А-10
A84V/A304V
1
А-66
H228Y
1
А-73
N202S
1
С-7
T320L/H413L
1
С-40
K234N
1
Х-1
Q256Y
1
Х-2
K207E/A209S/N270K
1
А-164
A6V
1
В-16
K207E
1
В-378
H143Y
1
С-79
Q109K/D247K
1
А-11
Q256H/K402N
1,5
Х-6
K207E/A209S
1,5
В-320
M137L/K207T
1,5
А-508
Q349R/H228Y/A304V
1,5
А-8
K234I/K251N/H413Q
2
А-20
D92E
2
А-507
N202S/H228Y
2
X-3
D92P
2,5
А-505
D92E/N202S
2,5
А-501
D92E/K234I/K251N/H413Q
3
А-407
A89T/D92A/N270K
3
А-502
D92E/Q256H
3,5
Х-4
A89T/D92A
3
А-408
А89Т/D92A/K207E/A209S
3,5
А-415
A89T/D92A/S261E
3,5
А-501
D92E/K234I/K251N/H413Q
3,5
А-409
А89Т/D92A/S248L/Q256Y
4
А-503
D92E/K234I/K251N/Q256H/H413Q
5
А-406
А89Т/D92A/Q256Y
5
А-510
D92E/N202S/K234I/K251N/Q256Y/H413Q/K207E/A209S
5
А-515
D92E/N202S/A209S/K234I/Q256Y/H413Q
5
D-5
D92E/А142Т/K234I/K251N/Q256H/H413Q
5,5
D-34
S1N/S17N/D92E/K234I/K251N/Q256H/H413Q
5,5
F-161
K12N/D92E/K234I/K251N/Q256H/H413Q
5,5
А-504
D92E/N202S/K234I/K251N/Q256H/H413Q
6
D-192
D92E/S140P/K207I/K234I/K251N/Q256H/H413Q
6
А-511
D92E/M137L/N202S/K234I/K251N/Q256H/H413Q
6
А-514
D92E/N202S/K234I/K251N/Q256H/K402N H413Q
6
А-516
D92E/N202S/K234I/E243K/K251N/Q256H/H413Q
6
F-41
D92E/D138N/K234I/K251N/Q256H/H413Q
6,5
D-207
D92E/Q149H/K234I/K251N/Q256H/H413Q
6,5
D-268
D92E/T156R/K234I/K251N/Q256H/H413Q
6,5
F-150
D92E/K234I/K251N/A255V/Q256H/H413Q
6,5
1-117
D92E/N202T/K234I/K251N/Q256H/S373I/E382G/T399I/H413Q
6,5
А-509
А89Т/D92A/N202S/K234I/K251N/Q256H/H413Q
6,5
Н-107
D92E/N202S/K234I/K251N/Q256H/H413Q
7
Н-159
А89Т/D92A/N202S/K207E/K234I/K251N/Q256H
7
Н-456
А89Т/D92A/K207E/K234I/K251N/Q256H/H413Q
7
А-512
D92E/H143Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q
7
Н-464
А89Т/D92A/G205R/K207E/V208M/K251N/Q256H
7,5
А-513
D92E/H/228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q
7,5
А-518
А89Т/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q
10
А-521
А89Т/D92N/А142Т/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q
10
А-534
А89Т/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q
11
А-519
А89Т/D92A/А142Т/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q
11
Таблица 2
Повышение удельной активности вариантов фитазы в сравнении с синтетической фитазой Fus5#2.
Номера мутанта
Мутация
Относительная удельная активность [%]
Fus5#2
SEQ ID NO:18
100
А-8
K234I/K251I/H413Q
111
Х-5
D92N
120