ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕТА-ЛАКТАМАЗЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ IN VITRO И ВИЗУАЛИЗАЦИИ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ IN VIVO

1. Способ обнаружения патогенных бактерий в режиме реального времени у субъекта, включающий:
введение субъекту или во взятый у субъекта образец флуоресцентного, люминесцентного или колориметрического субстрата для бета-лактамазы патогенных бактерий;
визуализацию субъекта или образца на наличие продукта бета-лактамазной активности на субстрате; и
получение сигналов на длине волны, испускаемой бета-лактамазным продуктом; и обнаружение таким образом патогенных бактерий у субъекта.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий создание трехмерной реконструкции испускаемого сигнала для определения локализации патогенных бактерий у субъекта.
3. Способ по п. 1, дополнительно включающий диагностику в режиме реального времени патофизиологического состояния, связанного с патогенными бактериями, на основе интенсивности испускаемого сигнала, превышающей интенсивность измеренного контрольного сигнала.
4. Способ по п.3, в котором патофизиологическое состояние представляет собой туберкулез.
5. Способ по п.1, в котором флуоресцентный, люминесцентный или колориметрический субстрат представляет собой флуорогенный субстрат.
6. Способ по п.5, в котором флуорогенный субстрат представляет собой CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR7-ТАТ, каркасный люциферин, колориметрический реагент или их производное.
Bacteroides, Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Haemophilus, Legionella, Mycobacterium, Escherichia, Salmonella, Shigella
Listeria.
7. Способ по п.1, в котором патогенные бактерии включают виды бактерий или
8. Способ по п.1, в котором длина волны визуализации составляет от приблизительно 300 нм до приблизительно 900 нм.
9. Способ по п.1, в котором длина волны испускаемых сигналов составляет от приблизительно 300 нм до приблизительно 900 нм.
10. Способ диагностики патофизиологического состояния, связанного с патогенными бактериями у субъекта, включающий:
введение субъекту флуорогенного или люминесцентного субстрата для бета-лактамазы патогенных бактерий или приведение биологического образца, полученного у субъекта, в контакт с флуорогенным или люминесцентным субстратом для бета-лактамазы патогенных бактерий;
визуализацию субъекта на наличие продукта бета-лактамазной активности на субстрате; и
измерение в режиме реального времени интенсивности флуоресцентного, люминесцентного или колориметрического сигнала на длине волны, испускаемой продуктом; где интенсивность флуоресцентного, люминесцентного или колориметрического сигнала превышающая интенсивность измеренного контрольного сигнала, коррелирует с диагнозом патофизиологического состояния.
11. Способ по п.10, дополнительно включающий создание трехмерной реконструкции сигнала для определения локализации микробного патогена.
12. Способ по п.10, дополнительно включающий введение одного или более терапевтических соединений, эффективных для лечения патофизиологического состояния.
13. Способ по п.12, дополнительно включающий:
повторное введение флуорогенного субстрата субъекту или приведение биологического образца, полученного от субъекта, в контакт с указанным флуорогенным субстратом; и
визуализацию субъекта или указанного биологического образца для мониторинга эффективности терапевтического соединения; где понижение испускаемого сигнала по сравнению с сигналом при диагнозе указывает на терапевтическое воздействие на патофизиологическое состояние.
14. Способ по п.10, в котором патофизиологическое состояние представляет собой туберкулез.
Bacteroides, Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Haemophilus, Legionella, Mycobacterium, Escherichia, Salmonella, Shigella
Listeria.
15. Способ по п.10, в котором патогенные бактерии включают виды бактерий или
16. Способ по п.10, в котором флуорогенный субстрат представляет собой CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR7-ТАТ, CNIR9, CNIR10, каркасный люциферин, колориметрический реагент или их производное.
17. Способ по п.10, в котором длина волны визуализации составляет от приблизительно 300 нм до приблизительно 900 нм.
18. Способ по п.10, в котором длина волны испускаемых сигналов составляет от приблизительно 300 нм до приблизительно 900 нм.
19. Способ скрининга терапевтических соединений, эффективных для лечения патофизиологического состояния у субъекта, связанного с наличием патогенных бактерий у субъекта, который включает:
выбор потенциального терапевтического соединения для патогенных бактерий;
приведение бактериальных клеток в контакт с флуоресцентным, люминесцентным или колориметрическим агентом обнаружения;
приведение бактериальных клеток в контакт с потенциальным терапевтическим соединением; и
измерение флуоресцентного, люминесцентного или колориметрического сигнала, продуцируемого бактериальными клетками в присутствии потенциального терапевтического соединения и в его отсутствие; где понижение сигнала в присутствии терапевтического соединения по сравнению с сигналом в его отсутствие указывает на терапевтический эффект соединения против патогенных бактерий.
20. Способ по п.18, в котором патогенные бактерии представляют собой рекомбинантные бактерии, и указанная стадия приведения бактерий в контакт с флуоресцентным, люминесцентным или колориметрическим агентом обнаружения включает трансформирование бактерий дикого типа вектором экспрессии, который содержит флуоресцентный, люминесцентный или колориметрический агент обнаружения.
21. Способ по п.20, в котором вектор экспрессии содержит флуоресцентный белок.
22. Способ по п.21, в котором флуоресцентный белок представляет собой белок mPlum, mKeima, Mcherry или tdTomato.
23. Способ по п.18, в котором вектор экспрессии содержит ген бета-галактозидазы, и указанный способ дополнительно включает приведение рекомбинантных бактериальных клеток в контакт с флуорофором, который эффективно излучает флуоресцентный сигнал в присутствии фермента бета-галактозидазы.
24. Способ по п.23, в котором флуорофор представляет собой C2FDG, C12RG, DDAOG или их производное.
25. Способ по п.18, в котором вектор экспрессии содержит ген люциферазы, причем указанный способ дополнительно включает приведение рекомбинантных бактериальных клеток в контакт с D-люциферином.
26. Способ по п.25, в котором люцифераза представляет собой люциферазу светлячка, люциферазу жука-щелкуна красного или rLuc8.
27. Способ по п.18, в котором флуоресцентный агент обнаружения представляет собой флуорогенный субстрат бактериальной бета-лактамазы.
in vivo
28. Способ по п.27, в котором патогенные бактерии приводятся в контакт с флуорогенным субстратом CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR-ТАТ, каркасным люциферином, колориметрическим реагентом или их производным.
in vitro
29. Способ по п.18, в котором патогенные бактерии приводятся в контакт с флуорогенным субстратом CC1, CC2, CHPQ, CR2, CNIR1, CNIR6 или их производным.
Bacteroides, Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Haemophilus, Legionella, Mycobacterium, Escherichia, Salmonella, Shigella
Listeria.
30. Способ по п. 18, в котором патогенные бактерии включают виды бактерий или
31. Способ по п.18, в котором патофизиологическое состояние представляет собой туберкулез.
32. Способ визуализации патогенных бактерий, включающий:
приведение патогенных бактерий в контакт с флуорогенным субстратом для их фермента бета-лактамазы;
воздействие на патогенные бактерии длиной волны возбуждения, для вызова бета-лактамазной активности на субстрате;
получение флуоресцентных, люминесцентных или колориметрических сигналов, излучаемых продуктом; и
получение трехмерной реконструкции полученных сигналов, за счет чего осуществляется визуализация патогенных бактерий.
Bacteroides, Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Haemophilus, Legionella, Mycobacterium, Escherichia, Salmonella, Shigella
Listeria.
33. Способ по п.32, в котором патогенные бактерии включают виды бактерий или
34. Способ по п.32, в котором длина волны возбуждения составляет от приблизительно 540 нм до приблизительно 730 нм.
35. Способ по п.32, в котором длина волны испускаемых сигналов составляет от приблизительно 650 нм до приблизительно 800 нм.
in vivo
36. Способ по п.32, в котором патогенные бактерии приводятся в контакт с флуорогенным субстратом CNIR2, CNIR3, CNIR4, CNIR5, CNIR5-QSY22, CNIR7, CNIR9, CNIR10, CNIR-ТАТ, каркасным люциферином, колориметрическим реагентом или их производным.
in vitro
37. Способ по п.32, в котором патогенные бактерии приводятся в контакт с флуорогенным субстратом CC1, CC2, CHPQ, CR2, CNIR1, CNIR6 или их производным.
38. Флуорогенный субстрат для бактериальной бета-лактамазы, представляющий собой CNIR-7, CNIR7-ТАТ или их производное.
39. Способ обнаружения у субъекта патогенных бактерий в режиме реального времени, включающий:
введение субъекту субстрата, радиоактивно меченного изотопом, связанным с гамма-излучением; где субстрат предназначен для бета-лактамазы или другого фермента или белка, специфичных для патогенных бактерий;
визуализацию субъекта на наличие гамма-излучения от радиоактивно меченого субстрата во время активности на нем;
получение сигналов, генерируемых испускаемыми гамма-лучами; и
создание трехмерной реконструкции концентрации у субъекта радиоактивной метки на основе интенсивности сигнала, генерируемого гамма-излучением; за счет чего осуществляется обнаружение патогенных бактерий.
40. Способ по п.39, дополнительно включающий диагностику в режиме реального времени патофизиологического состояния, связанного с патогенными бактериями, которая основана на их обнаружении.
41. Способ по п.40, дополнительно включающий введение одного или более терапевтических соединений, эффективных для лечения патофизиологического состояния.
42. Способ по п.41, дополнительно включающий:
повторное введение радиоактивно меченого субстрата субъекту; и
повторную визуализацию субъекта с целью мониторинга эффективности терапевтического соединения; где понижение гамма-излучения по сравнению с гамма-излучением при диагнозе указывает на терапевтическое воздействие на патофизиологическое состояние.
43. Способ по п.40, в котором патофизиологическое состояние представляет собой туберкулез.
44. Способ по п.39, в котором радиоактивная метка представляет собой излучающий позитроны изотоп, и визуализацию осуществляют посредством позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).
45. Способ по п.39, в котором радиоактивная метка представляет собой изотоп, непосредственно испускающий гамма-излучение, и визуализацию осуществляют посредством однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ).
46. Способ по п.39, в котором другой фермент или белок представляют собой бета-лактамазоподобный фермент или связывающий пенициллин белок.
Bacteroides, Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Haemophilus, Legionella, Mycobacterium, Escherichia, Salmonella, Shigella
Listeria.
47. Способ по п.39, в котором патогенные бактерии включают виды бактерий или
48. Радиоактивно меченый субстрат для бактериальной бета-лактамазы, подходящий для ПЭТ или визуализации ОФЭКТ.
49. Радиоактивно меченый субстрат по п.48, в котором радиоактивная метка представляет собой фтор-18, азот-13, кислород-18, углерод-11, технеций-99m, йод-123 или индий-111.