4-[(Пурин-6-ил)аминополиметиленкарбонил]-производные 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, обладающие противоопухолевой активностью
4-[(PURIN-6-YL)AMINOPOLYMETHYLENECARBONYL]-DERIVATIVES OF 3,4-DIHYDRO-3-METHYL-7,8-DIFLUORO-2H-[1,4]BENZOXAZINE WITH ANTITUMOR ACTIVITY

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым азотсодержащим гетероциклическим соединениям, которые обладают противоопухолевой активностью и могут найти применение в медицине.
CA: Cancer J. Clin.
Распространенность онкологических заболеваний в мире колоссальна. Несмотря на имеющиеся успехи в области терапии опухолей, число зарегистрированных случаев рака увеличивается с каждым годом. По данным Международного агентства по изучению рака, в 2020 г. выявлено около 19,3 миллионов новых случаев заболевания раком; смертность от онкологических заболеваний достигла в 2020 г. 10 миллионов человек. Значительную долю в числе летальных случаев занимают рак легкого (18,0%), толстого кишечника и прямой кишки (9,4%), печени (8,3%), желудка (7,7%) и молочной железы (6,9%) [ 2021, doi 10.3322/caac.21660].
Создание новых средств для лечения онкологических заболеваний, в первую очередь наиболее летальных форм, представляет собой исключительно важную задачу. Получение новых соединений, обладающих высокой токсичностью в отношении опухолевых клеток и хорошо переносимых в терапевтических дозах, способно заложить основу для новых схем лечения онкологических заболеваний и содействовать снижению смертности от рака.
Пуринсодержащие соединения (например, нуклеиновые кислоты) играют важную роль в обмене веществ и жизнедеятельности клеток. Этим обусловлено то, что среди производных пурина обнаружено немало соединений, обладающих антинеопластической активностью. К производным пурина, используемым в клинической практике для лечения онкологических заболеваний, относятся меркаптопурин, кладрибин, клофарабин и другие.
Acta Chim. Slov.
67
Int. J. Mol. Sci.
21
in vitro
Bioorg. Med. Chem.
24
2020
2020
1
2016
В последние годы обнаружено, что некоторые производные пурина, имеющие в структуре остатки гетероциклических аминов (в том числе пиперазина, морфолина), обладают высокой токсичностью в отношении опухолевых клеток [Kucukdumlu A. et al. , , 70; Salas C.O. et al. , , 161]. Среди производных пурина, содержащих остатки длинноцепочечных ω-аминоалкановых кислот, имеющих структурное сходство с соединениями общей формулы , известны соединения, обладающие заметной противоопухолевой активностью в опытах  [Yang Z. et al. Патент WO 03/014296 A2 (приоритет 03.08.2001)], а также ингибиторы гистон-деацетилазы с антипролиферативной активностью [Liu R. et al. , , 1446].
N
Наиболее близким аналогом (прототипом) нашего технического решения являются амиды -(2-аминопурин-6-ил)-6-аминокапроновой кислоты, обладающие противоопухолевой активностью [Краснов В.П. и др. Патент RU 2015101582 (приоритет 21.01.2015)].
Задача предлагаемого изобретения - получение новой группы соединений, обладающих противоопухолевой активностью и низкой токсичностью, расширяющей арсенал известных противоопухолевых средств.
H
Техническим результатом данного изобретения является создание новой группы химических соединений - 4-[(пурин-6-ил)аминополиметиленкарбонил]-производных 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2-[1,4]бензоксазина общей формулы 1.
Соединения формулы 1, их физико-химические характеристики, а также способ получения в литературе не описаны.
H
N
H
Соединения формулы 1 могут быть получены исходя из рацемического 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2-[1,4]бензоксазина (2) и соответствующих ω-фталимидокислот 3a-c. Например, в результате ацилирования амина 2 кислотами 3a-c с использованием хлорангидридного метода синтезированы рацемические -(6-фталимидополиметиленкарбонил) производные 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2-[1,4]бензоксазина 5a-c. В результате удаления фталоильной защиты гидразинолизом и последующей реакции нуклеофильного замещения с 6-хлорпурином получены соответствующие конъюгаты пурина 1a-c (с общим выходом 28-46%, считая на две стадии).
Общая методика осуществления получения соединений 1a-c
3a,b
2019
Tetrahedron
75
Фталоил-аминокислоты  получают из соответствующих ω-аминокислот в соответствии с литературным методом [Tomar R. et al. , , 2447-2465].
O
3
4
К раствору циклопентадеканона (4,94 г, 22,0 ммоль) в муравьиной кислоте (25 мл) добавляют суспензию гидроксиламин--сульфоновой кислоты (4,33 г, 33,0 ммоль) в муравьиной кислоте (25 мл). Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 12-20 ч, затем выливают в 200 мл воды и экстрагируют этилацетатом (3 × 30 мл). Объединенные органические слои промывают водным раствором NaHCO (5 × 20 мл), водным раствором NaCl (3 × 20 мл), сушат MgSO и упаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат), получая лактам 15-аминопентадекановой кислоты (выход 74-82%).
3
4
Лактам 15-аминопентадекановой кислоты (4,09 г, 17,1 ммоль) растворяют в 6 н. HCl (150 мл) и кипятят с обратным холодильником в течение 19 ч, затем охлаждают до 20°C. Осадок отфильтровывают, суспендируют в 100 мл воды и нейтрализуют водным раствором NaHCO. Осадок отфильтровывают и промывают на фильтре охлажденной смесью вода-ДМСО (1 : 1), получая 15-аминопентадекановую кислоту () (выход 55-65%).
4
3c
Смесь 15-фталимидопентадекановой кислоты () (2,57 г, 10,0 ммоль) и фталевого ангидрида (1,48 г, 10,0 ммоль) нагревают в течение 2 ч при 170-190°C. Реакционную смесь охлаждают до 20-30°C, обрабатывают гексаном. Осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси вода-этанол, получая кислоту  (выход 67-75%).
N
2H
N,N-
3a-c
2
3a-c
3
4
К раствору -фталоиламинокислоты  (3,90 ммоль) в дихлорметане (8 мл) добавляют оксалилхлорид (0,82 мл, 9,75 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 15-25°C в течение 6 ч, затем упаривают досуха. Остаток растирают в сухом гексане, отфильтровывают и растворяют в дихлорметане (20 мл). Полученный раствор добавляют к раствору 3-метил-7,8-дифтор-3,4-дигидро--1,4-бензоксазина () (0,72 г, 3,90 ммоль) и диэтиланилина (0,63 мл, 3,90 ммоль) в дихлорметане (20 мл). Реакционную смесь перемешивают при температуре 15-25°C в течение 6-48 ч, затем промывают водным раствором HCl (3 × 5 мл), насыщенным водным раствором NaCl (5 × 10 мл), водным раствором NaHCO (3 × 10 мл) и водой (3 × 10 мл). Органический слой отделяют, сушат MgSO и упаривают при пониженном давлении. Остаток очищают флеш-хроматографией на силикагеле (элюент гексан-этилацетат или бензол-этилацетат), получая амиды  (выход 60-70%).
5a-c
н
н
н
3
K раствору соответствующего амида  (1,91 ммоль) в этаноле (14 мл) добавляют гидразин гидрат (0,17 мл, 3,43 ммоль). Реакционную смесь кипятят в течение 80-140 мин, затем упаривают досуха. К остатку добавляют диэтиловый эфир (25 мл) и выдерживают в холоде в течение 12 ч. Осадок отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром (3 × 3 мл). Фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в -бутаноле (4 мл). К раствору добавляют 6-хлорпурин (0,12 г, 0,80 ммоль) и раствор триэтиламина (0,19 мл, 1,35 ммоль) в -бутаноле (4 мл). Реакционную смесь нагревают при 80-110°C в течение 10 ч, затем охлаждают и добавляют -бутанол (4 мл). Раствор промывают водным раствором HCl (3 × 5 мл), насыщенным водным раствором NaCl (5 × 10 мл), водой (3 × 10 мл) и упаривают досуха. Остаток очищают флеш-хроматографией на силикагеле (элюент CHCl-EtOH).
Полученные соединения анализируют следующими методами.
1
19
13
1
19
13
3
2
J
Температуры плавления определяют на приборе SMP3 (Barloworld Scientific, UK). Удельное вращение определяют на поляриметре Perkin Elmer 341. Элементный анализ проводят на анализаторе Perkin Elmer 2400 серии II. Спектры ЯМР H, F и C регистрируют на приборе Bruker Avance 500 (рабочая частота 500, 470 и 125 МГц соответственно) в (CD)SO с использованием тетраметилсилана и гексафторбензола в качестве внутренних стандартов. Спектры ЯМР H и F регистрируют при температуре 100°C (соединения 1a-c, 5a-с) или 25°C (соединения 3a-c, 4). Спектры ЯМР C регистрируют при температуре 25°C. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (м.д.), константы спин-спинового взаимодействия () - в герцах.
Характеристики новых соединений 1a-c, 3c, 4, 5а-c приведены в примерах конкретного выполнения.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1.
3c
Синтез 15-фталимидопентадекановой кислоты ().
Лактам 15-аминопентадекановой кислоты
(стадия 1).
O
J. Med. Chem.
14
3
4
2
2
2
2
2
15
29
1971
1
К раствору циклопентадеканона (4,94 г, 22,0 ммоль) в муравьиной кислоте (25 мл) добавляют суспензию гидроксиламин--сульфоновой кислоты (4,33 г, 33,0 ммоль) в муравьиной кислоте (25 мл). Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч, затем выливают в 200 мл воды и экстрагируют этилацетатом (3 × 30 мл). Объединенные органические слои промывают 5% раствором NaHCO (5 × 20 мл), насыщенным раствором NaCl (3 × 20 мл), сушат MgSO и упаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат). Выход 4,11 г (78%). Бесцветный порошок, 134-135°С (лит. т. пл. 134-135,5°С [, , 501]). Спектр ЯМР H: δ = 1,20-1,32 (м, 20 H, 10×CH); 1,32-1,40 (м, 2 H, CH); 1,45-1,55 (м, 2 H, CH); 2,02-2,06 (м, 2 H, CHCO); 3,04-3,12 (м, 2 H, CHN); 7,72-7,80 (м, 1 H, NH) м. д. Найдено: C 75,26; H 12,21; N 5,85. Вычислено для CHNO (M 239,40): C 75,43; H 12,43; N 5,81.
15-Аминопентадекановая кислота (4)
(стадия 2).
3
2
2
2
15
31
2
Eur. J. Org. Chem.
1999
1
Раствор лактама 15-аминопентадекановой кислоты (4,09 г, 17,1 ммоль) в 6 н. HCl (150 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 19 ч, затем охлаждают до 20°C. Осадок отфильтровывают, суспендируют в 100 мл воды и добавляют 5% раствор NaHCOдо pH 6. Осадок отфильтровывают и промывают на фильтре охлажденной смесью вода-ДМСО (1:1). Выход 2,64 г (60%). Бесцветный порошок, т. пл. 180-181°С (лит. т. пл. 180-182°С [, 87]). Спектр ЯМР H: δ = 1,26-1,42 (м, 20 H, 10×CH); 1,57-1,66 (м, 2 H, CH); 1,66-1,74 (м, 2 H, CH); 2,33-2,39 (м, 2 H, 2×H-2); 3,02-3,10 (м, 2H, 2×H-15). Найдено: C 70,16; H 12,01; N 5,32. Вычислено для CHNO (M 257,42): C 69,99; H 12,14; N 5,44.
15-Фталимидопентадекановая кислота (3c) (стадия 3).
1
13
2
2
2
2
23
33
4
Смесь 15-фталимидопентадекановой кислоты (4) (2,57 г, 10,0 ммоль) и фталевого ангидрида (1,48 г, 10,0 ммоль) нагревают в течение 2 ч при 180°C. Реакционную смесь охлаждают до 20°C, обрабатывают гексаном. Осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси вода-этанол. Выход 2,75 г (71%). Бесцветный порошок, т. пл. 95-96 °С. Спектр ЯМР H: δ = 1,16-1,30 (м, 20 H, 10×CH); 1,42-1,52 (м, 2 H, CH); 1,52-1,63 (м, 2 H, CH); 2,13-2,22 (м, 2 H, 2×H-2); 3,52-3,59 (м, 2 H, 2×H-15); 7,80-7,90 (м, 4 H, Phth); 11,96 (с, 1 H, COH) м. д. Спектр ЯМР C: δ = 24,5; 26,2; 27,8; 28,4; 28,5; 28,7; 28,8; 28,9 (2С); 29,0 (2C); 33,6; 37,3; 122,9 (2С); 131,6 (2С); 134,3 (2С); 167,9 (2С); 174,5. Найдено: C 71,37; H 8,81; N 3,75. Вычислено для CHNO (M 387,52): C 71,29; H 8,58; N 3,61.
Пример 2.
1a
3a
Синтез соединения  из кислоты .
RS
2H
()-3,4-Дигидро-3-метил-4-(11-фталимидоундеканоил)-7,8-дифтор--[1,4]бензоксазин (5a) (стадия 1).
2H
N,N-
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
3
4
2
2
28
32
2
2
4
1
13
19
К раствору 11-фталимидоундекановой кислоты (3a) (1,29 г, 3,90 ммоль) в дихлорметане (8 мл) добавляют оксалилхлорид (0,82 мл, 9,75 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 15-25°C в течение 6 ч, затем упаривают досуха. Остаток растирают в сухом гексане, отфильтровывают и растворяют в дихлорметане (20 мл). Полученный раствор добавляют к раствору 3-метил-7,8-дифтор-3,4-дигидро--1,4-бензоксазина (2) (0,72 г, 3,90 ммоль) и диэтиланилина (0,63 мл, 3,90 ммоль) в дихлорметане (20 мл). Реакционную смесь перемешивают при 20°C в течение 48 ч, затем промывают 4 н. HCl (3 × 5 мл), насыщенным водным раствором NaCl (5 × 10 мл), 5% раствором NaHCO (3 × 10 мл) и водой (3 × 10 мл). Органический слой отделяют, сушат MgSO и упаривают при пониженном давлении. Остаток очищают колоночной флеш-хроматографией на силикагеле (элюент бензол-этилацетат от 95 : 5 к 9 : 1). Выход 1,26 г (65%). Бесцветный порошок, т. пл. 87-88°С. Спектр ЯМР H: δ = 1,12 (д,  6,9 Гц, 3 H, Me бензоксазин); 1,20-1,35 (м, 12 H, 6×CH); 1,52-1,66 (м, 4 H, 4×CH); 2,42-2,48 (м, 1 H, H-2B ундеканоил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,57 (д. т, 15,9, 7,3 Гц, 1 H, H-2A ундеканоил); 3,54-3,60 (м, 2H, 2×H-11 ундеканоил); 4,13 (д. д, 10,9, 2,8 Гц, 1 H, H-2B бензоксазин); 4,33 (д. д, 10,9,1,5 Гц, 1 H, H-2A бензоксазин); 4,73 (к. д. д, 7,0, 2,8, 1,5 Гц, 1 H, H-3 бензоксазин); 6,84 (д. д. д,  9,9,9,8, 8,2 Гц, 1 H, H-6 бензоксазин); 7,52-7,58 (м, 1 H, H-5 бензоксазин); 7,76-7,86 (м, 4 H, Phth) м.д. Спектр ЯМР C: δ = 15,1; 24,6; 26,1; 27,8; 28,4; 28,5; 28,6; 33,4; 37,3; 44,8; 69,8; 106,7 (д, 17,9 Гц); 119,2; 121,8; 122,9 (2С); 131,5 (2С); 134,3 (2С); 135,7 (д,  7,8 Гц); 138,9 (д. д, 243,3, 15,4 Гц); 146,5 (д. м,  242,5 Гц); 167,8 (2С); 170,9 м.д. Спектр ЯМР F: δ = 1,97 (д. д. д,  20.9, 8.2,2.4 Гц, 1F, F-8); 20,00-20,15 (м, 1 F, F-7) м.д. Найдено: C 67,25; H 6,70; F 7,31; N 5,51. Вычислено для CHFNO (M 498,57): C 67,45; H 6,47; F 7,62; N 5,62.
RS
2H
()-3,4-Дигидро-3-метил-4-[11-(пурин-6-иламино)ундеканоил]-7,8-дифтор--[1,4]бензоксазин (1a) (стадия 2).
н
н
н
J =
J =
J =
J =
J =
d
J =
J =
J =
J =
J =
3
2
2
6
23
28
2
6
2
1
13
19
K раствору амида 5a (0,95 г, 1,91 ммоль) в этаноле (14 мл) добавляют гидразин гидрат (0,17 мл, 3,43 ммоль). Реакционную смесь кипятят в течение 120 мин, затем упаривают досуха. К остатку добавляют диэтиловый эфир (25 мл) и выдерживают при температуре -16°C в течение 12 ч. Осадок отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром (3 × 3 мл). Фильтрат упаривают досуха, остаток растворяют в -бутаноле (4 мл). К раствору добавляют 6-хлорпурин (0,12 г, 0,80 ммоль) и раствор триэтиламина (0,19 мл, 1,35 ммоль) в -бутаноле (4 мл). Реакционную смесь нагревают при 80-110°C в течение 10 ч, затем охлаждают и добавляют -бутанол (4 мл). Раствор промывают 4 н. HCl (3 × 5 мл), насыщенным раствором NaCl (5 × 10 мл), водой (3 × 10 мл) и упаривают досуха. Остаток очищают колоночной флеш-хроматографией на силикагеле (элюент CHCl-EtOH). Выход 0,41 г (47%). Светло-желтый порошок, т. пл. 74-75°С. Спектр ЯМР H: δ = 1,12 (д,  6,9 Гц, 3 H, Me бензоксазин); 1,22-1,38 (м, 12 H, 6×CH); 1,52-1,66 (м, 4 H, 4×CH); 2,42-2,48 (м, 1 H, H-2B ундеканоил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,52-2,62 (м, 1H, H-2A ундеканоил); 3,52-3,60 (м, 2 H, 2×H-11 ундеканоил); 4,13 (д. д, 10,9, 2,9 Гц, 1 H, H-2B бензкосазин); 4,33 (д. д,  10,9, 1,4 Гц, 1 H, H-2A бензкосазин); 4,74 (к. д. д,  6,8, 2,7, 1,4 Гц, 1 H, H-3 бензоксазин); 6,84 (д. д. д,  9,8, 9,8, 8,3 Гц, 1 H, H-6 бензкосазин); 6,94 (уш. с, 1 H, NH-6 пурин); 7,53-7,58 (м, 1 H, H-5 бензоксазин); 7,95 (с, 1 H, H-8 пурин); 8,15 (с, 1 H, H-2 пурин); 12,42 (уш. с, 1 Н, NH-9 пурин) м.д. Спектр ЯМР C: δ = 15,1; 24,6; 26,4; 28,5; 28,7 (2C); 28,8; 28,9; 29,1; 33,4; 39,5 (перекрывание с сигналом ДМСО-); 44,6; 69,9; 106,7 (д,  17,9 Гц); 118,6; 119,2; 121,8; 135,7 (д. д,  9,7,2,5 Гц); 138,4; 138,9 (д. д,  243,4, 15,4 Гц); 146,5 (д. м,  242,5 Гц); 149,3; 152,3; 154,5; 171,0 м.д. Спектр ЯМР F: δ = 1,98 (д. д. д,  21,0, 8,2,2,4 Гц, 1 F, F-8); 20,02-20,16 (м, 1 F, F-7) м.д. Найдено: C 60,33; H 6,35; F 8,51; N 18,58. Вычислено для CHFNO (M 458,51): C 60,25; H 6,16; F 8,29; N 18,33.
Пример 3. Аналогично примеру 2 из соединения 3b получают соединение 1b через промежуточное соединение 5b.
RS
2H
()-3,4-Дигидро-3-метил-4-(12-фталимидододеканоил)-7,8-дифтор--[1,4]бензоксазин (5b).
1
13
19
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
2
2
29
34
2
2
4
Выход 1,40 г (70%). Бесцветный порошок, т. пл. 63-64°С. Спектр ЯМР H: δ = 1,12 (д,  6,9 Гц, 3 H, Me бензоксазин); 1,20-1,33 (м, 14 H, 7×CH); 1,53-1,65 (м, 4 H, 4×CH); 2,43-2,50 (м, 1 H, H-2B додеканоил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,57 (д. т,  15,6, 7,3 Гц, 1 H, H-2A додеканоил); 3,43-3,60 (м, 2 H, 2×H-12 додеканоил); 4,13 (д. д, 10.9,2.9 Гц, 1 H, H-2B бензоксазин); 4,33 (д. д, 10,9, 1,4 Гц, 1 H, H-2A бензоксазин); 4,74 (к.д. д,  6,9, 2,7, 1,5, 1 H, H-3 бензоксазин); 6,84 (д. д. д,  9,8, 9,7, 8,3, 1 H, H-6 бензоксазин); 7,52-7,60 (м, 1 H, H-5 бензоксазин); 7,77-7,85 (м, 4 H, Phth) м. д. Спектр ЯМР C: δ = 15,1; 24,6; 26,1; 27,8; 28,4; 28,5; 28,7 (2C); 28,8 (2С); 33,4; 37,3; 44,9; 69,8; 106,7 (д,  17,9 Гц); 119,2; 121,8; 122,9 (2С); 131,5 (2С); 134,3 (2С); 135,7 (д. д,  9,7, 2,5 Гц); 138,9 (д. д,  243,3, 15,4 Гц); 146,5 (д. м,  241,9 Гц); 167,8 (2С); 171,0 м. д. Спектр ЯМР F: δ = 1,97 (д. д. д,  21,1, 8,2, 2,3 Гц, 1 F, F-8); 20,02-20,16 (м, 1 F, F-7) м. д. Найдено: C 67,89; H 6,64; F 7,50; N 5,26. Вычислено для CHFNO (M 512,60): C 67,95; H 6,69; F 7,41; N 5,47.
RS
2H
J =
J =
J =
J =
d
J =
J =
J =
J =
J =
1
13
19
2
2
6
26
34
2
6
2
()-3,4-Дигидро-3-метил-4-[12-(пурин-6-иламино)додеканоил]-7,8-дифтор--[1,4]бензоксазин (1b). Выход 0,27 г (66%). Светло-желтый порошок, т. пл. 62-63°С. Спектр ЯМР H: δ = 1,12 (д,  6,9 Гц, 3 H, Me бензоксазин); 1,20-1,40 (м, 14 H, 7×CH); 1,53-1,65 (м, 4 H, 2×CH); 2,42-2,50 (м, 1 H, H-2B додеканоил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,53-2,62 (м, 1 H, H-2A додеканоил); 3,51-3,62 (м, 2 H, 2×H-12 додеканоил); 4,13 (д. д,  10,9, 2,7 Гц, 1 H, H-2B бензоксазин); 4,33 (д,  11,0 Гц, 1 H, H-2A бензоксазин); 4,70-4,78 (м, 1 H, H-3 бензоксазин); 6,84 (д. д. д,  9,8, 9,7, 8,4 Гц, 1 H, H-6 бензоксазин); 6,94 (уш. с, 1 H, N6H пурин); 7,50-7,60 (м, 1 H, H-5 бензоксазин); 7,94 (с, 1 H, H-8 пурин); 8,14 (с, 1 H, H-2 пурин); 12,49 (уш. с, 1 H, N9H пурин) м. д. Спектр ЯМР C: δ = 15,1; 24,6; 26,4; 28,5; 28,8 (2C); 28,9 (2C); 29,0; 29,1; 33,4; 40,0 (перекрывание с сигналом ДМСО-); 44,7; 69,9; 106,8 (д,  17,9 Гц); 118,7; 119,3; 121,8; 135,7 (д,  8,4 Гц); 138,4; 138,9 (д. д,  243,4, 15,4 Гц); 146,5 (д. м,  240,4 Гц); 149,3; 152,3; 154,4; 171,0 м. д. Спектр ЯМР F: δ = 1,98 (д. д. д,  21,0, 8,3, 1,9 Гц, 1 F, F-8); 20,00-20,20 (м, 1 F, F-7). Найдено: C 62,29; H 6,75; F 7,51; N 17,01. Вычислено для CHFNO (M 500,59): C 62,38; H 6,85; F 7,59; N 16,79.
Пример 4. Аналогично примеру 2 из соединения 3c получают соединение 1c через промежуточное соединение 5c.
RS
2H
J
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
1
13
19
2
2
32
40
2
2
4
()-3,4-Дигидро-3-метил-4-(15-фталимидопентадеканоил)-7,8-дифтор--[1,4]бензоксазин (5c). Выход 1,30 г (60%). Бесцветный порошок, т. пл. 86-87°С. Спектр ЯМР H: δ = 1,12 (д,  = 6,9 Гц, 3 H, Me бензоксазин); 1,20-1,34 (м, 20 H, 10×CH); 1,54-1,65 (м, 4 H, 2×CH); 2,42-2,50 (м, 1 H, H-2B пентадеканоил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,57 (д. т,  15,8, 7,2 Гц, 1 H, H-2A пентадеканоил); 3,54-3,60 (м, 2 H, 2×H-15 пентадеканоил); 4,13 (д. д,  10,9,3,0 Гц, 1 H, H-2B бензоксазин); 4,33 (д. д,  10,9, 1,5 Гц, 1 H, H-2A бензоксазин); 4,74 (к. д. д,  6,8, 2,7, 1,5 Гц, 1 H, H-3 бензоксазин); 6,84 (д. д. д,  9,8, 9,8,8,3 Гц, 1 H, H-6 бензоксазин); 7,52-7,58 (м, 1 H, H-5 бензоксазин); 7,78-7,85 (м, 4 H, Phth) м. д. Спектр ЯМР C: δ = 15,1; 24,6; 26,1; 27,8; 28,4; 28,5; 28,7 (2С); 28,8 (2С); 28,9 (3С); 33,4; 37,3; 44,7; 69,9; 106,7 (д,  17,9 Гц); 119,2; 121,8; 122,9 (2С); 131,5 (2С); 134,3 (2С); 135,7 (д,  8,5 Гц); 138,9 (д. д,  243,4, 15,4 Гц); 146,5 (д. м,  239,3 Гц); 167,9 (2С); 171,0 м. д. Спектр ЯМР F: δ = 1,99 (д. д. д, 21,0, 8,3, 2,3 Гц, 1 F, F-8); 20,00-20,18 (м, 1 F, F-7) м. д. Найдено: C 69,37; H 7,39; F 6,78; N 4,84. Вычислено для CHFNO (M 554,68): C 69,29; H 7,27; F 6,85; N 5,05.
RS
H
J =
J =
J =
J =
J =
d
J =
J =
J =
J =
J =
1
13
19
2
2
6
29
40
2
6
2
2
()-3,4-Дигидро-3-метил-4-[15-(пурин-6-иламино)пентадеканоил]-7,8-дифтор-3,4-дигидро-2-1,4-бензоксазин (1c). Выход 0,20 г (46%). Светло-желтый порошок, т. пл. 65-66°С. Спектр ЯМР H: δ = 1,12 (д,  6,9 Гц, 3 H, Me бензоксазин); 1,20-1,40 (м, 20 H, 10×CH); 1,52-1,70 (м, 4 H, 2×CH); 2,40-2,50 (м, 1 H, H-2B пентадеканоил, перекрывание с сигналом ДМСО); 2,53-2,63 (м, 1 H, H-2A пентадеканоил); 3,55-3,65 (м, 2 H, м, 2×H-15 пентадеканоил); 4,13 (д. д, 11,0, 2,8 Гц, 1 H, H-2B бензоксазин); 4,33 (д. д,  10,9, 1,4 Гц, 1 H, H-2A бензоксазин); 4,74 (к. д. д,  6,9, 2,6, 1,4 Гц, 1 H, H-3 бензоксазин); 6,84 (д. д. д,  9,8, 9,8,8,3 Гц, 1 H, H-6 бензоксазин); 7,50-7,58 (м, 1 H, H-5 бензоксазин); 7,61 (уш. с, 1 H, N6H пурин); 8,08 (с, 1 H, H-8 пурин); 8,23 (с, 1 H, H-2 пурин) м. д. (сигнал N9H пурина не проявляется). Спектр ЯМР C: δ = 15,1; 24,6; 26,3; 28,5; 28,7; 28,8; 28,9 (6С); 33,4; 40,3 (перекрывание с сигналом ДМСО-); 44,8; 69,9; 106,8 (д,  17,9 Гц); 116,3; 119,3; 121,8; 135,7 (д,  8,6 Гц); 139,0 (д. д,  243,4, 15,4 Гц); 140,0; 146,5 (д. м, 239,3 Гц); 149,4; 150,5; 153,0; 171,0 м. д. Спектр ЯМР F: δ = 2,00 (д. д. д, 21,0, 8,2,2,2 Гц, 1 F, F-8); 20,00-20,22 (м, 1F, F-7) м. д. Найдено: C 63,81; H 7,37; F 6,67; N 15,36. Вычислено для CHFNO×0,2HO (M 546,28): C 63,76; H 7,45; F 6,96; N 15,38.
Биологическая активность
Новые соединения исследованы в федеральном государственном бюджетном учреждении «Национальный медицинский исследовательский центр имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Москва) и в Центре биологических исследований и биоинженерии центральной научно-исследовательской лаборатории федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» (г. Томск).
in vitro
Изучение противоопухолевой активности в опытах соединений проводились с использованием МТТ-теста на моделях линий клеток:
- A549 (карцинома легкого человека (немелкоклеточный рак));
- SK-BR-3 (аденокарцинома молочной железы человека);
- SNU-1 (карцинома желудка человека);
- Jurkat (острый Т-лимфобластный лейкоз);
- СТ-26 (колоректальная карцинома мыши);
- MDA-MB231 (аденокарцинома молочной железы человека);
- 4Т1 (карцинома молочной железы мыши);
- COLO201 (колоректальная аденокарцинома человека);
- HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека);
- WI-38 (фибробласты легкого человека, здоровые клетки).
Клеточные линии A549, SK-BR-3, SNU-1, WI-38, CT-26, MDA-MB231, 4T1 и HepG2 являются адгезионными клеточными культурами. Клеточные линии Jurkat и COLO201 являются частично адгезионными и частично суспензионными культурами.
МТТ-тест основан на способности дегидрогеназ живых метаболически активных клеток восстанавливать бесцветный водорастворимый 3-(4,5-метилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромид (МТТ) в нерастворимый формазан. Оптическая плотность растворенных в органических растворителях (например, диметилсульфоксиде) кристаллов формазана пропорциональна количеству метаболически активных клеток, что является адекватным показателем жизнеспособности клеток в культуре. Данный метод позволяет оценить специфическую гибель клеток, вызванную тем или иным цитотоксическим агентом.
2
Клетки культивировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO. Состав полных питательных сред для культивирования каждой из исследуемых клеточных линий представлен в табл. 1.
Для открепления с флаконов адгезионных культур использовали раствор Трипсин-ЭДТА (ПанЭко). Подсчитывали клетки в камере Горяева.
Для постановки МТТ-теста клетки в полной питательной среде (200 мкл для культур A549, SK-BR-3, SNU-1, Jurkat и WI-38 или 90 мкл для культур CT-26, MDA-MB231, 4T1, COLO201, HepG2) рассаживали в плоскодонные планшеты по 10 тыс. клеток на лунку (культуры A549, SK-BR-3, SNU-1, WI-38, CT-26, MDA-MB231, 4T1, HepG2) или по 20 тыс. на лунку (культуры Jurkat, COLO201).
−4
−10
−3
−8
На первом этапе эксперимента через сутки в лунки с клетками добавляли препараты в конечных концентрациях от 1×10 до 1×10 моль/л (культуры A549, SK-BR-3, SNU-1, Jurkat и WI-38) или от 1×10 до 1×10 моль/л (культуры CT-26, MDA-MB231, 4T1, COLO201, HepG2), растворенные в ДМСО (концентрация ДМСО в лунках в итоге составляла 1%). В контрольные лунки добавляли ДМСО в той же концентрации, что и в опытных лунках, и полную питательную среду. В качестве неспецифического положительного контроля в соответствующие лунки вносили по 10 мкл 0,1% раствора детергента Тритон Х-100.
2
После внесения тестируемых соединений планшеты с клетками инкубировали в течение 72 ч в атмосфере 5% CO. После инкубирования из лунок удаляли питательную среду (в случае клеточных линий SNU-1, Jurkat и COLO201 предварительно выполняли центрифугирование планшетов при 1500 об/мин в течение 6 мин) и вносили в каждую лунку раствор MTT-реагента [3-(4,5-метилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромида] в полной питательной среде до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Планшеты термостатировали при 37°C в течение 2 ч (в случае культур CT-26, MDA-MB231, 4T1, COLO201, HepG2) или 4 ч (в случае культур A549, SK-BR-3, SNU-1, Jurkat, WI-38), затем удаляли надосадочную жидкость и растворяли осадок формазана в ДМСО. Оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли при длине волны 540 нм и референсной длине волны 650 нм. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток.
50
50
На втором этапе исследования для более точного определения IC (концентрации, вызывающей гибель 50% клеток) оценивали цитотоксический эффект субстанций в концентрациях, близких к найденной на 1 этапе IC.
50
50
Исследование цитотоксической активности каждого вещества в отношении клеток каждой линии проводили в трех параллелях; для расчета IC использовали среднее значение. Определение жизнеспособности клеток в диапазоне значения IC проводили в двух параллелях.
Расчет жизнеспособности клеток после инкубации в присутствии тестируемых соединений выполняли в отношении жизнеспособности клеток в контрольных экспериментах. Процентное содержание жизнеспособных клеток (ЖС, %) рассчитывали по формуле (1):
ТО/ПС
где ОП - оптическая плотность растворов в лунках, содержавших исследуемые соединения;
К
ОП - оптическая плотность растворов в контрольных лунках, не содержавших исследуемых соединений.
50
−4
Обработку экспериментальных данных проводили с использованием программных пакетов GraphPad Prism 5.0, GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc., США) и Microsoft Office Excel. Для всех данных применяли описательную статистику. Нормальность распределения данных проверяли с использованием теста Шапиро-Уилкса. Согласно руководству по проведению доклинических исследований, новое потенциальное противоопухолевое соединение считается цитотоксически активным, если его IC ≤ 1×10 моль/л [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая (под ред. А.Н. Миронова). - М.: Гриф и К, 2013. - 944 с.].
1a-c
1a
1a-c
−4
Инкубация опухолевых клеток различных линий в присутствии соединений  в течение 72 ч приводит к выраженному цитотоксическому эффекту. Наиболее высокую чувствительность к исследуемым веществам среди клеточных линий, использованных в эксперименте, проявили клетки линии карциномы молочной железы мыши 4Т1, карциномы желудка человека SNU-1 и острого Т-лимфобластного лейкоза Jurkat. Наибольшую активность проявляло соединение . Клеточная линия нормальных фибробластов (WI-38) менее чувствительна к действию соединений  в концентрации 1×10 моль/л по сравнению с большинством опухолевых клеточных линий.
50
50
1a-c
В таблице 2 представлены значения IC для соединений  в отношении клеток различных опухолевых линий, а также фибробластов человека WI-38, рассчитанные на основании данных МТТ-теста, в диапазоне концентраций близких к IC.
50
RS
H
1a
1b
−4
Сравнение значений IC показывает, что исследуемые пуринил-производные ()-ω-аминоалканоил-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2-[1,4]бензоксзаина, в особенности соединения  и , обладают выраженным цитотоксическим действием в отношении клеток тестируемых линий. Токсичность в отношении большинства культур опухолевых клеток в экспериментах превосходила токсичность в отношении нормальных клеток (фибробласты легкого человека WI-38). Клеточная линия нормальных фибробластов WI-38 оказалась менее чувствительной к наиболее высокой исследованной концентрации 1×10 моль/л, чем опухолевые клеточные линии (21 % выживших клеток против 6-8%).
1a-c
1a-c
50
50
50
50
50
50
−7
−5
−6
−6
−6
−6
−5
Таким образом, установлена высокая цитотоксическая активность соединений  в отношении клеток опухолевых линий CT-26, MDA-MB231, 4T1, COLO201, HepG2. Рассчитанное значение IC для всех тестируемых веществ составляет 4,9×10÷9,9×10 моль/л. Установлено, что наибольшей чувствительностью к соединениям  среди изученных клеточных линий обладает линия карциномы молочной железы мыши 4Т1 (IC ≤ 2,3×10 моль/л), колоректальной аденокарциномы человека COLO201 (IC ≤ 3,5×10 моль/л), рака желудка SNU-1 (IC ≤ 6,0×10 моль/л), гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 (IC ≤ 9,7×10 моль/л) и Т-лимфобластного лейкоза Jurkat (IC ≤ 5,2×10 моль/л).
1
H
50
−4
−4
Производные пурина общей формулы , содержащие остаток 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2-[1,4]бензоксзаина и остатки ω-аминоалкановых кислот в качестве линкера, обладают высокой цитотоксической активностью. В исследовании использовали клеточные линии опухолей человека (рак легкого, рак молочной железы, рак желудка, лейкоз) и клеточную линию нормальной ткани (фибробласты легкого). IC в отношении широкого круга культур опухолевых клеток не превышают 1×10моль/л. Показано, что фибробласты менее чувствительны к действию тестируемых соединений в концентрации 1×10моль/л, чем опухолевые клетки. Установлено, что клеточные линии обладают разной чувствительностью к исследованным веществам (высокочувствительными являются клеточные линии карциномы молочной железы мыши 4Т1, колоректальной аденокарциномы человека COLO201, гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, рака желудка SNU-1 и Т-клеточного лейкоза Jurkat).