Запрограммированная гибель лейкоцитов периферической крови в норме и при психической дезадаптации

© ВЯЛОВА Н.М., ИВАНОВА С. А.

ЗАПРОГРАММИРОВАННАЯ ГИБЕЛЬ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В НОРМЕ И ПРИ ПСИХИЧЕСКОЙ ДЕЗАДАПТАЦИИ

Н.М. Вялова, С. А. Иванова ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН, Томск директор - акад. РАМН В.Я. Семке; лаборатория клеточных и молекулярно-биологических

исследований, зав.- д.м.н. С.А. Иванова.

Резюме. Проведено комплексное исследование процессов апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови у здоровых и лиц с психической дезадаптацией: посттравматическими стрессовыми расстройствами и расстройствами адаптации с преобладанием депрессивных реакций. Показано усиление экспрессии рецептора СБ95 - маркера апоптотического сигнала и увеличение содержания лимфоцитов и нейтрофилов с морфологическими признаками фрагментации ядра у лиц с психической дезадаптацией. Исследование гормонального статуса пациентов выявило значительное увеличение концентрации кортизола у лиц с посттравматическими стрессовыми расстройствами и снижение содержания ДГЭС в группах лиц с психической дезадаптацией.

Ключевые слова: апоптоз, лимфоциты, нейтрофилы, стресс, расстройство адаптации.

Актуальность настоящего исследования объясняется всё большим распространением в последнее время социально-стрессовых расстройств и возникающей в связи с этим необходимостью изучения индивидуальных реакций на психический стресс [1, 4].

Проявления психической дезадаптации в основе своей являются комплексом гомеостатических и адаптационных реакций и имеют под собой материальную основу, никогда не протекая на чисто функциональной основе. Невротические и депрессивные расстройства, представляя собой срыв адаптации, вне зависимости от причины, ее вызвавшей, развиваются по механизмам адаптации биологической системы, к изменившимся условиям внешней или внутренней среды.

В реализации механизмов адаптации организма к воздействию различных стрессогенных факторов играет важную роль апоптоз или запрограммированная клеточная гибель. Апоптоз является физиологическим процессом, имеет широкое биологическое значение, вносит вклад в реакцию клеток на неблагоприятные внешние воздействия.

Целью данной работы явилось исследование апоптоза лейкоцитов периферической крови у здоровых лиц и пациентов с психической дезадаптацией.

Материалы и методы

Проведено исследование 54 соматически и психически здоровых лиц: 33 женщин (средний возраст - 36,43±2,22 лет) и 21 мужчины (31,33±2,36), не имеющих хронических заболеваний и не состоящих на диспансерном учете, без признаков перенесенных острых инфекционных заболеваний, и которые, по определению Р.В. Петрова и А. А. Михайленко (1990), «на момент обследования выполняли полный объем своих профессиональных обязанностей и вели привычный образ жизни».

Также осуществлено исследование 102 лиц с психической дезадаптацией. Под психической дезадаптацией понимали расстройства, которые определяются на основании наличия одного или другого из двух причинных факторов: исключительно сильного стрессового жизненного события, вызывающего острую стрессовую реакцию, или значительного изменения в жизни, приводящего к продолжительно сохраняющимся неприятным обстоятельствам, в результате чего развивается расстройство адаптации. Обследовано 39 лиц с посттравматическими стрессовыми расстройствами: 7 женщин (средний возраст - 48,43±3,65 лет) и 32 мужчины (42,71±2,19), проходивших курс лечения в отделении пограничных состояний клиник НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН (руководитель - акад. РАМН, проф. В.Я. Семке) и 70 - с расстройством адаптации с преобладанием депрессивных реакций: 60 женщин (47,76±2,19) и 10 мужчин (55,00±4,97), проходивших курс реабилитации в отделении аффективных состояний клиник НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН (руководитель отделения - д.м.н. Е.Д. Счастный). Исследование выполнялось при поступлении пациентов в стационар, до начала проводимой реабилитации.

В группе пациентов с психической дезадаптацией и в контрольной группе здоровых лиц забор производили из локтевой вены, утром, натощак. Проведено комплексное исследование процессов апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов в обследованных группах: изучение экспрессии FAS-рецептора как маркера апоптоза лимфоцитов непрямым иммунофлюоресцентным методом с использованием моноклональных антител к антигену CD95 (ТОО «Сорбент», Москва); оценка морфологических признаков апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов методом световой микроскопии мазков крови. Было проведено определение концентрации кортизола и дегидроэпиандростерона сульфата в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа гормонов основных стрессреализующих и стресслимитирующих систем.

Результаты и обсуждение

Определение содержания клеток с маркером апоптоза CD95 непрямым иммунофлюоресцентным методом показало, что в периферической крови у здоровых лиц рецептор экспрессирован на 11,64±0,31% лимфоцитов (0,34±0,03*109/л).

Наряду с оценкой готовности к апоптозу проведен цитологический анализ апоптотических форм нейтрофилов и лимфоцитов. В мазках крови здоровых лиц наблюдали полиморфно-ядерные лейкоциты с морфологическими признаками, характерными для клеток, подвергшихся апоптозу. Такие нейтрофилы имели меньший размер, округлую форму, в некоторых случаях в цитоплазме выделяется несколько крупных вакуолей на одном полюсе. Картина изменений ядерного вещества выражалась в уменьшении ядра с конденсацией и грануляцией хроматина по периметру его границы. Уровень спонтанного апоптоза нейтрофилов в мазках, наблюдаемый у здоровых лиц, составил 0,40±0,15% (0,007±0,003х109/л).

Также в мазках крови обнаружены лимфоциты с морфологическими признаками апоптоза. В лимфоцитах происходила деградация ядерного материала, наблюдалась фрагментация хроматина на несколько частей. Лимфоциты с фрагментированным ядром в мазках крови здоровых лиц обнаружены в 0,88±0,18% случаев (0,026±0,007*109/л).

Нами рассчитан индекс реализации апоптоза, т. е. доля клеток с морфологическими признаками апоптоза в процентах от общего числа клеток, экспрессирующих рецепторы готовности к апоптозу. Индекс реализации апоптоза лимфоцитов у здоровых лиц составил 7,74±1,65%.

Определение содержания в сыворотке крови гормонов - основных физиологических регуляторов апоптоза - установило, что концентрация кортизола у здоровых лиц составляет 443,13±23,00 нмоль/л, содержание дегидроэпиандростерона сульфата (ДГЭАС) - 2,44±0,24 пкг/мл. Соотношение ДГЭАС/кортизол составило 0,60±0,07.

Также выполнялось исследование процессов апоптоза и уровня гормонов, участвующих в модуляции апоптоза, у здоровых лиц в зависимости от пола и возраста. В первую группу обследованных вошли мужчины и женщины до 25 лет, во вторую - от 25 до 45, в третью - старше 45.

В результате анализа показателей апоптотической гибели лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови здоровых лиц, рандомизированных по полу и возрасту, установлено что относительное и абсолютное содержание в кровотоке лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы готовности к Fas-зависимому апоптозу, не отличаются (табл. 1). Также не отмечено значимых отличий в процентном и абсолютном содержании в циркуляции лимфоцитов и нейтрофилов с

морфологическими признаками фрагментации ядра. Среди изучаемых показателей,

характеризующих процесс апоптоза, у здоровых лиц разных возрастных групп, значимые изменения выявлены лишь со стороны индекса реализации апоптоза лимфоцитов у мужчин старшей возрастной группы, значение которого составило 17,81±0,86%.

Таблица 1

Сравнительная характеристика процессов запрограммированной гибели лимфоцитов и

нейтрофилов в крови здоровых лиц

Примечание: группа 1 - до 25 лет; 2 - 26-45; 3 - старше 45.

Результаты многочисленных работ показывают наличие ассоциации между уровнем ДГЭАС и возрастом. Динамика настолько характерна, что по уровню ДГЭАС можно определить возраст человека. В проведенном нами исследовании зависимости концентрации стероидных гормонов от возраста и пола установлено, что для сульфатной формы ДГЭА половые различия в молодом возрасте отсутствуют, а в возрасте после 45 лет его уровень у женщин значительно ниже, чем у мужчин (табл. 2). Концентрация кортизола во всех исследованных группах доноров мужского и женского пола находилась на одном уровне. Величина соотношения ДГЭАС/кортизол также значимо не отличалась в группах обследованных здоровых, лишь у женщин после 45 лет наблюдали значительное падение этого показателя, что может быть сопряжено с прогнозом процесса старения.

Таблица 2

Уровень кортизола и дегидроэпиандростерона сульфата у здоровых лиц разных возрастных

категорий

Примечание: * - p<0,05 по сравнению с лицами противоположного пола данной возрастной группы; группа 1 - до 25 лет; 2 - 26-45; 3 - старше 45.

Таким образом, выявлено, что уровень показателей апоптотической гибели лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови здоровых лиц не зависит от пола и возраста.

При комплексном обследовании в общей группе лиц с посттравматическими стрессовыми расстройствами обнаружено статистически значимое по сравнению с контролем усиление экспрессии рецептора CD95 - маркера апоптотического сигнала (18,30±0,72%, в контроле -11,64±0,31%, p<0,05; 0,65±0,07*109/л, в контроле - 0,34±0,03*109/л, p<0,05) и повышение содержания нейтрофилов с морфологическими признаками апоптоза (1,02±0,30%, в контроле -

0,40±0,15%; 0,02±0,007*109/л, в контроле - 0,007±0,003*109/л, p<0,05) (табл. 3). Уровень апоптоза лимфоцитов у лиц с посттравматическими стрессовыми расстройствами достоверно отличался от значений, наблюдаемых в контроле (3,14±0,44%, в контроле - 0,88±0,18%, p<0,05;

0,09±0,014*109/л, в контроле - 0,026±0,007*109/л, p<0,05). Индекс реализации апоптоза лимфоцитов в группе с посттравматическими стрессовыми расстройствами составил 17,69±2,40%, в контроле - 7,74±1,65%, p<0,05.

Таблица З.

Характеристика процессов апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов в крови здоровых лиц и

лиц с психической дезадаптацией

Примечание: * - p<0,05 по сравнению со здоровыми лицами.

Как видно из таблицы 3., относительное и абсолютное содержание в кровотоке лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы готовности к Fas-зависимому апоптозу в группе лиц с расстройством адаптации с преобладанием депрессивных реакций существенно превышает аналогичный показатель здоровых лиц, что отражает процессы активации лимфоцитов.

Процентное и абсолютное содержание в циркуляции лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра в группе с расстройством адаптации двукратно превышает соответствующие показатели здоровых лиц (1,83±0,29%, в контроле - 0,88±0,18%, p<0,05; 0,04±0,008*109/л, в контроле - 0,026±0,007*109/л, p<0,05). На основании проведенного анализа можно предположить, что при высокой готовности иммуноцитов к апоптозу при расстройствах адаптации с преобладанием депрессивных реакций у пациентов достаточно активно работают механизмы, контролирующие и ограничивающие процессы программированной клеточной смерти, в результате чего индекс реализации готовности к апоптозу находился в пределах нормы (табл. 3). Содержание апоптозных нейтрофилов в мазках крови лиц с расстройством адаптации существенно не отличалось от значений, наблюдаемых у здоровых лиц (1,01±0,23%, в контроле -0,40±0,15%; 0,02±0,005х109/л, в контроле - 0,026±0,007х109/л).

Проведено исследование гормонального статуса пациентов с психической дезадаптацией. Показано, что в группе с посттравматическими стрессовыми расстройствами концентрация кортизола в сыворотке крови значительно превышает показатели здоровых лиц (545,14±33,51нмоль/л, в контроле - 443,13±23,00 нмоль/л, p<0,05). В группе пациентов с

расстройством адаптации данный показатель находился в пределах нормы (433,33±26,27 нмоль/л).

Стресс-реакция организма сопровождается усилением поступления и циркуляции в крови глюкокортикоидов. На тканевом уровне ответ кроветворной клеточной популяции формируется по типу клеточной регенерации, включая генетически запрограммированную гибель. Для стадии продолжительного стресса характерно усиление процессов апоптоза.

Концентрация ДГЭАС снижена в группах пациентов с социально-стрессовыми расстройствами (1,29±0,14 пкг/мл, в контроле - 2,44±0,24 пкг/мл, p<0,05) и расстройством адаптации (1,89±0,20 пкг/мл, в контроле - 2,44±0,24 пкг/мл). Величина соотношения ДГЭАС/кортизол минимальна в группе с посттравматическими стрессовыми расстройствами (0,28±0,04, в контроле - 0,60±0,07, p<0,05) и незначительно снижена по сравнению с контролем у лиц с расстройством адаптации (0,47±0,05). По мнению большинства исследователей, именно соотношение этих двух стероидов характеризует состояние организма, его устойчивость к различным нарушениям (2). Известно, что ДГЭАС обладает антиглюкокортикоидным действием. Среди биологических эффектов ДГЭАС также выделяют антидепрессивное действие, снятие напряжения страха и стресса. Сниженные содержание ДГЭАС и соотношение ДГЭАС/кортизол, выявленные нами в обследованных группах лиц, свидетельствует о воздействии сильных стрессоров и необходимости проведения своевременной реабилитации.

Таким образом, содержание в кровотоке лимфоцитов, несущих на поверхности маркер апоптоза CD95 у психически и соматически здоровых лиц, составляет 11,64±0,31% (0,34±0,03*109/л). Лимфоциты и нейтрофилы с фрагментированным ядром в мазках крови здоровых лиц выявлены в

0,88±0,18% и 0,40±0,15% случаев соответственно. Индекс реализации апоптоза лимфоцитов у здоровых лиц составил 7,74±1,65%. Уровень показателей апоптотической гибели лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови здоровых лиц не зависит от пола и возраста. Концентрация кортизола у здоровых лиц составляет 443,13±23,00 нмоль/л, содержание дегидроэпиандростерона сульфата - 2,44±0,24 мкг/мл. Соотношение ДГЭАС/кортизол составило 0,60±0,07. У лиц с психической дезадаптацией показано значимое по сравнению со здоровыми лицами усиление экспрессии рецептора CD95 и увеличение содержания лимфоцитов и нейтрофилов с морфологическими признаками фрагментации ядра. При посттравматических стрессовых расстройствах наблюдается повышение концентрации кортизола. Снижение содержания ДГЭАС характерно для посттравматических стрессовых расстройств и расстройства адаптации с преобладанием депрессивных реакций.

PROGRAMMED DEATH OF LEYCOCYTES OF PERIPHERAL BLOOD IN NORM AND

IN PSYCHICAL DISADAPTATION

N.M. Vyalova, S, A, Ivanova Scientific institute of mental health The complex research of apoptosis of lymphocytes and neutrophils of peripheral blood of healthy persons and persons with psychical disadaptation (posttraumatic stress disorder, adaptation disorder with depressive reactions) was done. It was revealed intensification of receptor CD95 expression -marker of apoptotic signal and increase of lymphocytes and neutrophils content with morphological signs of nucleus fragmentation in persons with psychic disadaptation. The research of hormonal status of patients showed increase of cortisol concentration in persons with posttraumatic stress disorder and decrease of dehydroisoandrosterone sulphate in groups with psychic disadaptation.

Литература

1. Александровский Ю.А. Пограничные психические расстройства. - М: Медицина. 2000 -496 с.

2. Гончаров Н. П., Кация Г. В., Нижник А.Н. Дегидроэпиандростерон и функции мозга // Вест. Рос. АМН. - №8. - 2005. - С. 37-43.

3. Петров Р. В., Михайленко А. А. Оценка состояния здоровья практически здоровых лиц с помощью иммунологических показателей // Иммунология. - 1990. - С.60-64.

4. Семке В.Я. Психогении современного общества. - Томск: Томского ун-та, 2003. -350 с.

Работа поддержана грантом РГНФ №06-06-00691а "Разноуровневые системокомплексы психической дезадаптации как фенотипический вариант предрасположенности к стрессовым расстройствам ".

Таблица 1

Сравнительная характеристика процессов запрограммированной гибели __________лимфоцитов и нейтрофилов в крови здоровых лиц____________________

Величина показателей в исследуемых группах

Показатели 1 2 3

женщины мужчины женщины мужчины женщины мужчины

СD95, % 11,43±0,84 11,68±0,81 12,08±0,40 11,80±0,87 11,41±0,87 10,00±1,15

СD95, абс. 0,38±0,12 0,37±0,08 0,35±0,02 0,34±0,05 0,28±0,06 0,45±0,03

% лимфоцитов с фрагментацией ядра 1,08±0,43 0,59±0,29 0,94±0,37 0,43±0,18 0,91±0,30 1,76±0,31

% нейтрофилов с признаками апоптоза 0,22±0,12 0,86±0,36 0,32±0,12 0,98±0,33 0,00±0,00 0,00±0,00

Индекс реализации апоптоза лимфоцитов, % 8,65±3,08 5,05±2,72 8,35±3,28 4,99±1,52 7,19±2,72 17,81±0,86*

Примечание: группа 1 - до 25 лет; 2 - 26-45;3 - старше 45.

Таблица 2

Уровень кортизола и дегидроэпиандростерона сульфата у здоровых лиц разных _____________________________возрастных категорий_________________________________

Средние величины показателей в исследуемых группах

Покзатели 1 2 3

женщины мужчины женщины мужчины женщины мужчины

Кортизол, нмоль/л 426,00±48,23 459,00±121,90 392,71±49,11 514,78±41,99 405,83±35,77 396,00±37,35

ДГЭАС, пкг/мл 2,73±0,67 2,36±0,77 2,15±0,35 3,47±0,44 1,11±0,20* 3,50±0,41

ДГЭАС/кортизол, % 0,72±0,21 0,51±0,17 0,61±0,10 0,74±0,15 0,27±0,04* 0,98±0,31

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с лицами противоположного пола данной возрастной группы; группа 1 - до 25 лет; 2 - 26-45; 3 - старше 45.

Таблица 3.

Характеристика процессов апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов в крови ___________здоровых лиц и лиц с психической дезадаптацией__________

Величины показателей в исследуемых группах

Показатели Здоровые лица С социальнострессовыми расстройствами С расстройством адаптации

СD95, % 11,64±0,31 18,30±0,72* 17,16±0,75*

СD95 абс., х109/л 0,34±0,03 0,65±0,07* 0,71±0,02*

% лимфоцитов с фрагментацией ядра 0,88±0,18 3,14±0,44* 1,83±0,29*

Абс. число лимфоцитов с фрагментацией ядра, х 109/л 0,026±0,007 0,09±0,014* 0,04±0,008*

% нейтрофилов с признаками апоптоза 0,40±0,15 1,02±0,30 1,01±0,23

Абс. число нейтрофилов с признаками апоптоза, х109/л 0,026±0,007 0,09±0,014* 0,02±0,005

Индекс реализации апоптоза 7,74±1,65 17,69±2,40* 11,50±1,92

лимфоцитов, %

Примечание: * - p<0,05 по сравнению со здоровыми лицами.