ПРОИЗВОДНЫЕ МАЙТАНЗИНОИДА С САМОРАСЩЕПЛЯЮЩИМИСЯ ПЕПТИДНЫМИ ЛИНКЕРАМИ И ИХ КОНЪЮГАТЫ
MAITANZINOID DERIVATIVES WITH SELF-SPLITTING PEPTIDE LINKERS AND THEIR CONJUGATES

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка испрашивает приоритет по дате подачи заявки, в соответствии с 35 U.S.C. §119(e), Предварительной заявки США № 62/465118, поданной 28 февраля 2017 г. и Предварительной заявки США № 62/480209, поданной 31 марта 2017 г. Полное содержание каждой из указанных выше заявок включено в данный документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC) становятся высокоэффективным классом противоопухолевых агентов с максимальным эффектом для целого ряда раковых заболеваний. ADC, как правило, состоят из трех отдельных элементов: клеточно-связывающего агента; линкера; и цитотоксического агента. Линкерный компонент в ADC является важным компонентом в разработке целевых противораковых агентов, обладающих оптимальной широтой терапевтического действия, высокой активностью при низкой нетоксичной дозе.
Следовательно, существует необходимость в ADC с новым классом линкерного компонента.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к конъюгату клеточно-связывающего агента и цитотоксического агента, представленному следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой соли, где:
CB представляет собой клеточно-связывающий агент;
2
L отсутствует или представляет собой спейсер;
A представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;
1
2
1-3
R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил;
1
L представляет собой спейсер;
1
D-L-SH представляет собой цитотоксический агент; и
q равен целому числу от 1 до 20.
Данное изобретение также относится к соединению формулы (II):
или его фармацевтически приемлемой соли, где:
2
L’ отсутствует или представляет собой спейсер, несущий реакционноспособный фрагмент, который может образовывать ковалентную связь c клеточно-связывающим агентом;
А представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислот;
1
2
1-3
R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил;
1
L представляет собой спейсер;
1
D-L-SH представляет собой цитотоксический агент; и
q равен целому числу от 1 до 20.
Также включенным в данное изобретение является соединение формулы (III):
или его фармацевтически приемлемая соль, где:
A’ представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислот;
1
2
1-3
R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил;
1
L представляет собой спейсер;
1
D-L-SH представляет собой цитотоксический агент; и
q равен целому числу от 1 до 20.
Данное изобретение также относится к соединению формулы (IV):
или его фармацевтически приемлемой соли, где:
3
L представлен следующей формулой:
x
y
+
+
1-4
3
40
41
42
1-4
3
40
41
42
40
41
42
1-4
R’ и R’, для каждого случая, независимо представляют собой H, -OH, галоген, -O-(C алкил), -SOH, -NRRR или C алкил, необязательно замещенный -OH, галогеном, SOH или NRRR, при этом R, R и Rнезависимо каждый представляет собой H или C алкил;
k равен целому числу от 1 до 10;
А представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислот;
1
2
1-3
R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил;
1
L представляет собой спейсер;
1
D-L-SH представляет собой цитотоксический агент; и
q равен целому числу от 1 до 20.
Данное изобретение также относится к композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей конъюгат (например, конъюгат формулы (I)) или соединение (например, соединение формулы (II), (III) или (IV)) и носитель (фармацевтически приемлемый носитель). Данное изобретение также включает в себя композицию (например, фармацевтическую композицию), содержащую конъюгат (например, конъюгат формулы (I)) или соединение (например, соединение формулы (II), (III) или (IV)), описанные в данном документе, и носитель (фармацевтически приемлемый носитель), дополнительно содержащий второй терапевтический агент. Представленные композиции применимы для ингибирования аномального роста клеток или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего (например, человека). Представленные композиции применимы для лечения заболеваний, например, рака, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, реакции «трансплантант против хозяина» (РТПХ), отторжения трансплантата, волчанки, миозита, инфекционной болезни, иммунодефицитного состояния, например, СПИДа, и воспалительных болезней у млекопитающего (например, человека).
Данное изобретение также включает в себя способ ингибирования аномального роста клеток или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего (например, человека), включающий в себя введение в указанный идиобласт или указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества конъюгата (например, конъюгата формулы (I)) или соединения (например, соединения формулы (II), (III) или (IV)) или композиции вышеуказанных, в монотерапии или в комбинации со вторым терапевтическим агентом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 проиллюстрированы прошедшие испытание Ab-sSPDB-DM4 конъюгаты в сравнении с конъюгатами по данному изобретению.
На Фиг. 2 проиллюстрированы прошедшие испытание пептидные анилино-майтанзиноидные ADC в сравнении с конъюгатамипо данному изобретению.
На Фиг. 3 проиллюстрированы схемы синтеза для получения репрезентативных соединений майтанзиноида по данному изобретению, имеющих саморасщепляющиеся пептидные линкеры.
На Фиг. 4 проиллюстрирована схема синтеза для получения репрезентативного конъюгата по данному изобретению.
На Фиг. 5 проиллюстрированы схемы синтеза для получения репрезентативных соединений майтанзиноида по данному изобретению, имеющих саморасщепляющиеся пептидные линкеры.
На Фиг. 6 проиллюстрированы схемы синтеза для получения S-метилированного метаболита указанных конъюгатов по данному изобретению.
На Фиг. 7 проиллюстрирована аффинность связывания с репрезентативными конъюгатами по данному изобретению для мишени антигена на клетках T47D.
in vitro
На Фиг. 8 проиллюстрирована цитотоксичность  репрезентативных конъюгатов по данному изобретению в отношении клеток KB.
На Фиг. 9A, 9B, 9C и 9D проиллюстрировано проявление неспецифического цитолиза репрезентативных конъюгатов по данному изобретению.
in vivo
На Фиг. 10 проиллюстрирована противоопухолевая активность  репрезентативного конъюгата по данному изобретению у мышей, несущих большие 250 мм положительные по рецептору EGFR ксенотрансплантаты.
in vivo
На Фиг. 11A и 11B проиллюстрирована противоопухолевая активность  репрезентативных конъюгатов по данному изобретению у мышей, несущих ксенотрансплантаты CanAg+ HT-29, с дозировками 5 мг/кг (Фиг. 11A) и 2,5 мг/кг (Фиг. 11B).
in vivo
На Фиг. 12 проиллюстрирована противоопухолевая активность репрезентативного конъюгатапо данному изобретениюу мышей, несущих положительные по фолатному рецептору ксенотрансплантаты NCI-H2110. Мышам вводили конъюгаты 17c или 4bс дозировкой 3 мг/кг.
На Фиг. 13 проиллюстрированы изменения массы тела у мышей, получавших репрезентативный конъюгат по данному изобретению по сравнению с мышами, получавшими конъюгат 4b.
in vitro
На Фиг. 14 проиллюстрирована цитотоксичность репрезентативных конъюгатов по данному изобретению  по сравнению с 1a в отношении клеток CA922.
in vitro
На Фиг. 15 проиллюстрирована цитотоксичность метаболитов из 25a, 25b и 25c  по сравнению с молекулами метаболита 3 конъюгата Ab-sSPDB-DM4.
in vitro,
На Фиг. 16 проиллюстрированы молекулы метаболитов, обнаруженные в исследовании метаболизма конъюгата 17c  и предложены сайты расщепления.
in vivo
На Фиг. 17A и 17B проиллюстрирована противоопухолевая активность репрезентативного конъюгата по данному изобретению  у мышей, несущих ксенотрансплантаты яичников OV-90, с гетерогенной экспрессией FRa. В мышей дозированно вводили конъюгат 17c или конъюгат 4b с дозировкой 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг или 5 мг/кг.
На Фиг. 18 проиллюстрированы изменения массы тела у мышей, получавших репрезентативные конъюгаты по данному изобретению, имеющие разные пептидные линкеры по сравнению с мышами, получавшими конъюгат 1a.
На Фиг. 19 проиллюстрированы кривые СВЭЖХ для обработанного клеточного лизата DTT и NEM из клеток COLO205, которые не подвергались воздействию какого-либо конъюгата (вверху) и клеток COLO205, которые подвергались воздействию конъюгата 18c.
На Фиг. 20 проиллюстрирован спектр ЭХ/МС конъюгата 18c.
На Фиг. 21 проиллюстрирован спектр ЭХ/МС конъюгата 16c.
На Фиг. 22 проиллюстрирован спектр ЭХ/МС конъюгата 17c.
На Фиг. 23 проиллюстрирован спектр ЭХ/МС конъюгата 26c.
На Фиг. 24A проиллюстрированы массы тела (cреднее значение ± стандартное отклонение, г) мышей CD-I, получавших дозы 1200 мкг/кг huML66-GMBS-Ala3-Immol-DM (конъюгаты 16a, 16b, 16c и 16d) или huML66-s-SPDB-DM4 (конъюгат 1a).
На Фиг. 24B проиллюстрировано изменение массы тела (среднее значение ± стандартное отклонение, г) мышей CD-I, получавших дозы 1200 мкг/кг huME66-GMBS-Ala3-Immol-DM (конъюгаты 16a, 16b, 16c и 16d) или huML66-s- SPDB-DM4 (конъюгат 1a).
На Фиг. 25A проиллюстрированы массы тела (среднее значение ± стандартное отклонение, г) мышей CD-I, получавших дозы 1000 или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM (конъюгат 17c) или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1 (конъюгат 4b).
На Фиг. 25B проиллюстрировано изменение массы тела (cреднее значение ± стандартное отклонение, г) мышей CD-I, получавших дозы 1000 или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM (конъюгат 17c) или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1 (конъюгат 4b).
На Фиг. 25C проиллюстрировано изменение массы тела отдельных мышей CD-I, получавших дозы 1000 или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM (конъюгат 17c) или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1 (конъюгат 4b).
На Фиг. 25D проиллюстрирована индивидуальная масса тела мышей CD-I, получавших дозы 1000 или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM (конъюгат 17c) или 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1 (конъюгат 4b).
На Фиг. 26 проиллюстрированы фармакокинетические профили конъюгата 17c и M-SPDB-DM4 конъюгата у мышей.
На Фиг. 27 проиллюстрирована процентная доля нормализованной распадаемости в зависимости от времени для конъюгата 26c и M9346A-C442-mal-SPDB-DM4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Теперь будет сделано подробное справочное описание определенных вариантов осуществления данного изобретения, примеры которых проиллюстрированы в сопроводительных структурах и формулах. Хотя данное изобретение будет описано совместно с перечисленными вариантами осуществления изобретения, следует понимать, что эти варианты осуществления изобретения не предназначены для ограничения данного изобретения. Напротив, данное изобретение предназначено для охвата всех альтернативных вариантов, модификаций и эквивалентов, которые могут быть включены в объем данного изобретения, как определяется формулой изобретения. Специалист в данной области техники распознает много способов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным в указанном документе, которые могут быть использованы в практическом исполнении данного изобретения.
(например,
Следует понимать, что любые из вариантов осуществления изобретения, описанные в данном документе, включая те, которые описаны в различных аспектах данного изобретения  соединения, молекулы соединения с линкером, конъюгаты, композиции, способы получения и использования) и в разных частях описания (включая варианты осуществления изобретения, описанные только в Примерах) могут быть объединены с одним или большим количеством других вариантов осуществления данного изобретения, если явно не указано иное. Комбинации вариантов осуществления изобретения не ограничиваются этими конкретными комбинациями, заявленными многочисленными зависимыми пунктами формулы изобретения.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Используемый в данном документе, термин «лечение» или «обработка» включает в себя реверсию, уменьшение или прекращение симптомов, клинических проявлений и соответствующей патологии состояния в установленном порядке для улучшения или стабилизации состояния субъекта. Используемый в данном документе, а также понимаемый в данной области техники термин «лечение» - это подход для получения благоприятных или желаемых результатов, в том числе клинических результатов. Благоприятные или желаемые клинические результаты могут включать в себя, но не ограничиваются ими: частичное снятие симптомов, уменьшение интенсивности симптомов или замедление прогрессирования одного или большего количества симптомов или патологических состояний, связанных с заболеванием, например, раком, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности симптомов или временное облегчение болезненного состояния, а также ремиссию (будь то частичную или полную), будь то выявляемую или невыявляемую. «Лечение» также может означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если не получать лечение. Типовые благоприятные клинические результаты описаны в данном документе.
«Необязательный» или «необязательно» означает, что впоследствии описанное обстоятельство может или не может возникнуть, так что данная заявка включает в себя случаи, когда указанное обстоятельство возникает, и случаи, когда оно не возникает. Например, фраза «необязательно замещенный» означает, что неводородный заместитель может присутствовать или может не присутствовать на данном атоме, и, таким образом, данная заявка включает в себя структуры, в которых присутствует неводородный заместитель, и структуры, в которых неводородный заместитель не присутствует.
Если специально не указано как «незамещенный», то подразумевается, что ссылки на химические фрагменты в данном документе включают в себя замещенные варианты. Например, ссылка на «алкильную» группу или фрагмент в неявной форме включает в себя оба варианта: как замещенный, так и незамещенный. Примеры заместителей в отношении химических фрагментов включают в себя, но не ограничиваются ими: галогеновый, гидроксильный, карбонильный (например, карбоксильный, алкоксикарбонильный, формильный или ацильный), тиокарбонильный (например, сложный тиоэфирный, тиоацетатный или тиоформиатный), алкоксильный, алкилтио, ацилокси, фосфорильный, фосфатный, фосфонатный, амино, амидо, амидиновый, иминовый, циано, нитро, азидо, сульфогидрильный, алкилтио, сульфатный, сульфонатный, сульфамоильный, сульфонамидо, сульфонильный, гетероциклильный, аралкильный или арильный или гетероарильный фрагмент.
(например,
Используемый в данном документе термин «клеточно-связывающий агент» или «CBA» относится к соединению, которое способно связываться с клеткой  лиганд на поверхности клетки) или связывающему лиганду, связанному с клеткой или вблизи клетки, предпочтительно, специфическим образом. В определенных вариантах осуществления изобретения связывание с клеткой или лигандом на клетке или рядом с ней является специфическим. CBA может включать в себя пептиды и не-пептиды.
(например,
(например,
1
30
3
30
2
3
2
1
30
3
30
1
10
1
6
1
3
Термин «алкил», используемый в данном документе, относится к насыщенному одновалентному углеводородному радикалу с неразветвленной или разветвленной цепью. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения алкил с неразветвленной цепью или разветвленной цепью имеет тридцать или меньшее количество атомов углерода в своей основной цепи  C-C для неразветвленных цепей, C-C для разветвленных цепей), и более предпочтительно, двадцать или меньшее количество. Примеры алкила включают в себя, но не ограничиваются ими: метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил, 2-метил-1-пропил, -CHCH(CH), 2-бутил, 2-метил-2-пропил, 1-пентил, 2-пентил 3-пентил, 2-метил-2-бутил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-l-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил, 3,3-диметил-2-бутил, 1-гептил, 1-октил и т.п. Кроме того, термин «алкил», используемый по всему описанию, в примерах и пунктах формулы изобретения, предназначен включать в себя как «незамещенные алкилы», так и «замещенные алкилы», из которых последние относятся к алкильным фрагментам, имеющим заместители, замещающие атом водорода у одного или большего количества атомов углерода в основной цепи углеводорода. В определенных вариантах осуществления изобретения алкил с неразветвленной цепью или с разветвленной цепью имеет тридцать или меньшее количество атомов углерода в своей основной цепи  C-C для неразветвленных цепей, C-C для разветвленных цепей). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная цепь имеет десять или меньшее количество атомов углерода (C-C) в своей основной цепи. В других вариантах осуществления изобретения указанная цепь имеет шесть или меньшее количество атомов углерода (C-C) в своей основной цепи. В другом варианте осуществления изобретения указанная цепь имеет три или менее атомов углерода (C-C) в своей основной цепи.
(например,
(например,
1
30
3
30
1
30
3
30
1
10
1
6
1
3
Термин «алкилен», используемый в данном документе, относится к насыщенному двухвалентному углеводородному радикалу с неразветвленной или разветвленной цепью. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения алкилен с неразветвленной цепью или разветвленной цепью имеет тридцать или меньшее количество атомов углерода в своей основной цепи  C-C для неразветвленных цепей, C-C для разветвленных цепей), и более предпочтительно, двадцать или меньшее количество. Кроме того, термин «алкилен», используемый по всему описанию, в примерах, и пунктах формулы изобретения, предназначен включать в себя как «незамещенные алкилены», так и «замещенные алкилены», из которых последние относятся к алкиленовым фрагментам, имеющим заместители, замещающие водород у одного или большего количества атомов углерода основной цепи углеводорода. В определенных вариантах осуществления изобретения алкилен с неразветвленной цепью или разветвленной цепью имеет тридцать или меньшее количество атомов углерода в своей основной цепи  C-C для неразветвленных цепей, C-C для разветвленных цепей). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная цепь имеет десять или меньшее количество атомов углерода (C-C) в своей основной цепи. В других вариантах осуществления изобретения указанная цепь имеет шесть или меньшее количество атомов углерода (C-C) в своей основной цепи. В другом варианте осуществления изобретения указанная цепь имеет три или менее атомов углерода (C-C) в своей основной цепи.
2
2
2
Термин «алкенил» относится к одновалентному углеводородному радикалу с неразветвленной или разветвленной цепью, в котором от двух до двадцати атомов углерода имеют по меньшей мере один центр ненасыщенности, т.е. двойную углерод-углеродную связь, при этом алкенильный радикал включает в себя радикалы, имеющие «цис» и «транс» ориентации или в альтернативном варианте, «E» и «Z» ориентации. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими: этиленил или винил (-CH=CH), аллил (-CHCH=CH) и т.п. Предпочтительно, алкенил имеет от двух до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкенил имеет от двух до четырех атомов углерода.
2
Термин «алкенилен» относится к двухвалентному углеводородному радикалу с неразветвленной или разветвленной цепью, в которой от двух до двадцати атомов углерода имеют по меньшей мере один центр ненасыщенности, т.е. двойную углерод-углеродную связь, при этом алкенильный радикал включает в себя радикалы, имеющие «цис» и «транс» ориентации или в альтернативном варианте, «E» и «Z» ориентации. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими: этиленилен или винилен (-CH=CH-), аллилен (-CHCH=CH-) и т.п. Предпочтительно, алкенилен имеет от двух до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкенилен имеет от двух до четырех атомов углерода.
Термин «алкинил» относится к неразветвленному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу, имеющему от двух до двадцати атомов углерода по меньшей мере с одним центром ненасыщенности, т.е. тройной углерод-углеродной связью. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими: этинил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-пентинил, гексинил и т.п. Предпочтительно, алкинил имеет от двух до десяти атомов углерода. Более предпочтительно, алкинил имеет от двух до четырех атомов углерода.
Термин «алкинилен» относится к неразветвленному или разветвленному двухвалентному углеводородному радикалу, имеюшему от двух до двадцати атомов углерода по меньшей мере с одним центром ненасыщенности, т.е. тройной углерод-углеродной связью. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими: этинилен, пропинилен, 1-бутинилен, 2-бутинилен, 1-пентинилен, 2-пентинилен, 3-пентинилен, гексинилен и т.п. Предпочтительно, алкинилен имеет от двух до десять атомов углерода. Более предпочтительно, алкинилен имеет от двух до четырех атомов углерода.
Термин «карбоцикл», «карбоциклил» и «карбоциклическое кольцо» относится к одновалентному неароматическому, насыщенному или частично ненасыщенному кольцу, имеющему от 3 до 12 атомов углерода в виде моноциклического кольца или от 7 до 12 атомов углерода в виде бициклического кольца. Бициклические карбоциклы, имеющие от 7 до 12 атомов, могут быть расположены, например, в виде системы бицикло [4.5], [5.5], [5.6] или [6.6], и бициклические карбоциклы, имеющие 9 или 10 кольцевых атомов, могут быть расположены в виде системы бицикло [5.6] или [6.6] или в виде мостиковых систем, например, бицикло[2.2.1]гептан, бицикло[2.2.2]октан и бицикло[3.2.2]нонан. Примеры моноциклических карбоциклов включают в себя, но не ограничиваются ими: циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, l-циклопент-2-енил, l-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-l-енил, l-циклогекс-2-енил, l-циклогекс-3-енил, циклогексaдиенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, циклоундецил, циклододецил и т.п.
например,
Термины «циклический алкил» и «циклоалкил» могут быть использованы взаимозаменяемо. Используемый в данном документе термин относится к радикалу насыщенного кольца. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения циклоалкилы имеют 3-10 атомов углерода в структуре своего кольца, и более предпочтительно 5-7 атомов углерода в структуре кольца. В некоторых вариантах осуществления изобретения два циклических кольца могут иметь два или большее количество общих атомов,  указанные кольца представляют собой «конденсированные кольца». Подходящие циклоалкилы включают в себя: циклогептил, циклогексил, циклопентил, циклобутил и циклопропил. В некоторых вариантах осуществления изобретения циклоалкил является моноциклической группой. В некоторых вариантах осуществления изобретения циклоалкил является бициклической группой. В некоторых вариантах осуществления изобретения циклоалкил является трициклической группой.
например,
Термин «циклоалкилен» относится к двухвалентному радикалу насыщенного карбоцикла. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения циклоалкилены имеют 3-10 атомов углерода в структуре своего кольца, и более предпочтительно 5-7 атомов углерода в структуре кольца. В некоторых вариантах осуществления изобретения два циклических кольца могут иметь два или большее количество общих атомов,  кольца представляют собой «конденсированные кольца». Подходящие циклоалкилены включают в себя: циклогептилен, циклогексилен, циклопентилен, циклобутилен и циклопропилен. В некоторых вариантах осуществления изобретения циклоалкилен является моноциклической группой. В некоторых вариантах осуществления изобретения циклоалкилен является бициклической группой. В некоторых вариантах осуществления изобретения циклоалкилен является трициклической группой.
Термин «циклический алкенил» относится к радикалу карбоциклического кольца, имеющему по меньшей мере одну двойную связь в структуре кольца.
Термин «циклический алкинил» относится к радикалу карбоциклического кольца, имеющему по меньшей мере одну тройную связь в структуре кольца.
например,
например
Термин «арил», используемый в данном документе, включает в себя замещенные или незамещенные ароматические группы с одним кольцом, в которых каждым атомом кольца является углерод. Предпочтительно кольцо является 5- - 7-членным кольцом, более предпочтительно 6-членным кольцом Арильные группы включают в себя фенил, фенол, анилин, и т.п. Термин «арил» также включает в себя кольцевые системы «полициклила», «полицикла» и «полициклическую», имеющие два или большее количество колец, в которых два или большее количество атомов являются общими для двух примыкающих колец,  кольца являются «конденсированными кольцами», при этом по меньшей мере одно из колец является ароматическим, а другими циклическими кольцами могут быть, , циклоалкилы, циклоалкенилы, циклоалкинилы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения полициклы имеют 2-3 кольца. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения полициклические кольцевые системы имеют два циклических кольца, в которых оба кольца являются ароматическими. Каждое из колец полицикла может быть замещенным или незамещенным. В определенных вариантах осуществления изобретения каждое кольцо полицикла содержит от 3 до 10 атомов в кольце, предпочтительно от 5 до 7. Например, арильные группы включают в себя, но не ограничиваются ими: фенильную (бензольную), толильную, антраценильную, флуоренильную, инденильную, азуленильную и нафтильную, а также бензо-конденсированные карбоциклические фрагменты, например, 5,6,7,8-тетрагидронафтил и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения арил представляет собой ароматическую группу с одним кольцом. В некоторых вариантах осуществления изобретения арил представляет собой ароматическую группу с двумя кольцами. В некоторых вариантах осуществления изобретения арил представляет собой ароматическую группу с тремя кольцами.
Термин «арилен», используемый в данном документе, представляет собой двухвалентный радикал арильной группы, описанной выше.
например,
Термины «гетероцикл», «гетероциклил», и «гетероциклическое кольцо», используемые в данном документе, относятся к замещенной или незамещенной неароматической кольцевой структуре, содержащей 3- - 18-членные кольца, предпочтительно 3- - 10-членные кольца, более предпочтительно 3- - 7-членные кольца, причём эти кольцевые структуры включают в себя по меньшей мере один гетероатом, предпочтительно от одного до четырех гетероатомов, более предпочтительно один или два гетероатома. В определенных вариантах осуществления изобретения кольцевая структура может иметь два циклических кольца. В некоторых вариантах осуществления изобретения два циклических кольца могут иметь два или большее количество общих атомов,  кольца являются «конденсированными кольцами». Гетероциклильные группы включают в себя, например, пиперидин, пиперазин, пирролидин, морфолин, лактоны, лактамы и т.п. Гетероциклы описаны в Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W. A. Benjamin, New York, 1968), в частности, в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 по настоящее время), в частности, в томах 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. Примеры гетероциклических колец включают в себя, но не ограничиваются ими: тетрагидрофуран, дигидрофуран, тетрагидротиен, тетрагидропиран, дигидропиран, тетрагидротиопиранил, тиоморфолин, тиоксан, гомопиперазин, азетидин, оксетан, тиетан, гомопиперидин, оксепан, тиепан, оксазепин, диазепин, тиазепин, 2-пирролин, 3-пирролин, индолин, 2H-пиран, 4H-пиран, диоксанил, 1,3-диоксолан, пиразолин, дитиан, дитиолан, дигидропиран, дигидротиен, дигидрофуран, пиразолидинилимидазолин, имидазолидин, 3-азабицикло[3.1.0]гексанил, 3-азабицикло[4.1.0]гептан, и азабицикло[2.2.2]гексан. Спирофрагменты также включены в объём данного определения. Примеры гетероциклической группы, в которой кольцевые атомы замещены оксо (=O) фрагментами являются пиримидинон и 1,1-диоксо-тиоморфолин.
Термин «гетероциклилен» относится к двухвалентному радикалу гетероциклической группы, описанной выше.
(например,
например,
например
Термин «гетероарил», используемый в данном документе, относится к замещенным или незамещенным ароматическым структурам с одним кольцом, предпочтительно с 5- - 7-членными кольцами, более предпочтительно с 5- - 6-членными кольцами, причём эти кольцевые структуры включают в себя по меньшей мере один гетероатом  O, N или S), предпочтительно от одного до четырех или от одного до 3 гетероатомов, более предпочтительно один или два гетероатома. Когда в гетероарильном кольце присутствуют два или большее количество гетероатомов, они могут быть одинаковыми или отличными. Термин «гетероарил» также включает в себя кольцевые системы «полициклила», «полицикла» и «полициклическую», имеющие два или большее количество циклических колец, в которых два или большее количество атомов углерода являются общими для двух примыкающих колец,  кольца представляют собой «конденсированные кольца», при этом по меньшей мере одно из колец является гетероароматическим, а другие циклические кольца могут быть, , циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами, арилами и/или гетероциклилами. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения предпочтительные полициклы имеют 2-3 кольца. В определенных вариантах осуществления изобретения предпочтительные полициклические кольцевые системы имеют два циклических кольца, при этом оба кольца являются ароматическими. В определенных вариантах осуществления изобретения каждое кольцо полицикла содержит от 3 до 10 атомов в кольце, предпочтительно от 5 до 7. Например, гетероарильные группы включают в себя, но не ограничиваются ими: пиррол, фуран, тиофен, имидазол, оксазол, тиазол, пиразол, пиридин, пиразин, пиридазин, хинолин, пиримидин, индолизин, индол, индазол, бензимидазол, бензотиазол, бензофуран, бензотиофен, циннолин, фталазин, хиназолин, карбазол, феноксазин, хинолин, пурин и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетероарил является ароматической группой с одним кольцом. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетероарил является ароматической группой с двумя кольцами. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетероарил является ароматической группой с тремя кольцами.
Термин «гетероарилен» относится к двухвалентному радикалу гетероарильной группы, описанной выше.
Гетероцикл или гетероарильные группы могут быть присоединены к атому углерода (связаны с углеродом) или атому азота (связаны с азотом), где это возможно. В качестве примера, но не ограничения, связанные с углеродом гетероциклы или гетероарилы связаны в положении 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, в положении 3, 4, 5 или 6 пиридазина, в положении 2, 4, 5 или 6 пиримидина, в положении 2, 3, 5 или 6 пиразина, в положении 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, в положении 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, в положении 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, в положении 2 или 3 азиридина, в положении 2, 3 или 4 азетидина, в положении 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или в положении 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина.
В качестве примера, но не ограничения, связанные с азотом гетероциклы или гетероарилы связаны в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1H-индазола, в положении 2 изоиндола или изоиндолина, в положении 4 морфолина, и в положении 9 карбазола или O-карболина.
2
Гетероатомы, присутствующие в гетероариле или гетероциклиле, включают в себя окисленные формы, например, NO, SO и SO.
Термин «галогено» или «галоген» относится к фтору (F), хлору (Cl), брому (Br) или йоду (I).
(например,
Алкил, алкилен, алкенилен, алкин, алкинилен, циклический алкил, циклоалкилен, карбоциклил, арил, арилен, гетероциклил, гетероциклоалкилен, гетероарил и гетероарилен, описанные выше, необязательно могут быть замещенными одним или большим количеством заместителей  2, 3, 4, 5, 6 или большим количеством).
Термин «замещенный» относится к фрагментам, имеющим заместители, замещающие атом водорода у одного или большего количества атомов углерода основной цепи химического соединения. Понятно, что термин «замещение» или «замещенный» включает в себя неявное условие, что такое замещение соответствует допустимой валентности замещенного атома и заместителя, и что замещение приводит к устойчивому соединению, например, которое самопроизвольно не претерпевает преобразования, например, перегруппировки, циклизации, отщепления и т.д. Предполагается, что используемый в данном документе термин «замещенный» включает в себя все допустимые заместители органических соединений. В широком аспекте допустимые заместители включают в себя ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические заместители органических соединений. Допустимые заместители могут быть одним или несколькими и одинаковыми или разными для соответствующих органических соединений. Для целей данного изобретения гетероатомы, например, азот, могут иметь водородные заместители и/или любые допустимые заместители органических соединений, описанные в данном документе, которые удовлетворяют валентности гетероатомов. Заместители могут включать в себя любые заместители, описанные в данном документе, например, галоген, гидроксил, карбонил (например, карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (например, сложный тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкоксил, алкилтио, ацилокси, фосфорил, фосфат, фосфонат, амино, амидо, амидин, имин, циано, нитро, азидо, сульфогидрил, алкилтио, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, сульфонил, гетероциклил, аралкил или ароматический или гетероароматический фрагмент. Для иллюстрации, монофторалкил представляет собой алкил, замещенный фторзаместителем, а дифторалкил представляет собой алкил, замещенный двумя фторзаместителями. Следует признать, что если в заместителе имеется более одного замещения, то каждый неводородный заместитель может быть одним и тем же или отличным (если не указано иное). «Необязательный» или «необязательно» означает, что впоследствии описанный случай может или не может произойти, так что данная заявка включает в себя случаи, когда обстоятельство возникает, и случаи, когда оно не возникает. Например, фраза «необязательно замещенный» означает, что неводородный заместитель может присутствовать или может не присутствовать на данном атоме, и, таким образом, данная заявка включает в себя структуры, в которых неводородный заместитель присутствует, и структуры, в которых неводородный заместитель не присутствует. Если атом углерода заместителя описан как необязательно замещенный одним или большим количеством из списка заместителей, то один или большее количество атомов водорода на атоме углерода (если они есть) могут быть отдельно и/или вместе замещены независимо выбранным необязательным заместителем. Если атом азота заместителя описан как необязательно замещенный одним или большим количеством из списка заместителей, то один или большее количество атомов водорода на атоме азота (если они есть) каждый может быть замещен независимо выбранным необязательным заместителем. Один типовой заместитель может быть проиллюстрирован как -NR’R’’, где R’ и R’’ вместе с атомом азота, к которому они прикреплены, могут образовывать гетероциклическое кольцо. Гетероциклическое кольцо, образованное из R’ и R’’ вместе с атомом азота, которому они прикреплены, может быть частично или полностью насыщенным. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетероциклическое кольцо состоит из 3-7 атомов. В другом варианте осуществления изобретения гетероциклическое кольцо выбрано из группы, состоящей из: пирролила, имидазолила, пиразолила, триазолила, тетразолила, изоксазолила, пиридила и тиазолила.
В данном описании термины «заместитель» и «группа» используются взаимозаменяемо.
Если группа заместителей в совокупности описывается как необязательно замещенная одним или большим количеством из списка заместителей, то указанная группа может включать в себя: (1) незамещаемые заместители, (2) замещаемые заместители, которые не замещаются необязательными заместителями и/или (3) замещаемые заместители, которые замещаются одним или большим количеством необязательных заместителей.
2
2
2
3
3
2
2
2
n
2
2
n
2
3
2
3
100
101
102
101
102
100
101
101
101
102
101
101
101
102
101
+
+
101
102
103
104
104
100
101
102
103
104
102
103
101
101
101
101
(например,
Если заместитель описан как необязательно замещенный неводородными заместителями вплоть до определенного их количества, то этот заместитель может быть (1) незамещенным; или (2) замещенным неводородными заместителями вплоть до определенного их количества или вплоть до максимального количества замещаемых положений на заместителе, независимо от того, что меньше. Таким образом, например, если заместитель описан как гетероарил, необязательно замещенный неводородными заместителями вплоть до 3, то любой гетероарил с менее чем 3 замещаемыми положениями будет необязательно замещен только таким количеством неводородных заместителей, сколько указанный гетероарил имеет замещаемых положений. Такие заместители, в неограничивающих примерах, могут быть выбраны из: неразветвленного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющих от 1 до 10 атомов углерода, арила, гетероарила, гетероциклила, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -OR, NRR, -NO-, NRCOR, -SR, сульфоксида, представленного посредством -SOR, сульфона, представленного посредством -SOR, сульфоната -SOM, сульфата -OSOM, сульфонамида, представленного посредством -SONRR, циано, азидо, -COR, -OCOR, -OCONRR и полиэтиленгликолевого звена (-CHCHO)R, где M представляет собой H или катион (например, Na или K); R, R и R независимо каждый выбран из H, неразветвленного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, имеющих от 1 до 10 атомов углерода, полиэтиленгликолевого звена (-CHCHO)R, где n равен целому числу от 1 до 24, арил имеет от 6 до 10 атомов углерода, гетероциклическое кольцо имеет от 3 до 10 атомов углерода и гетероарил имеет от 5 до 10 атомов углерода; и Rпредставляет собой H или неразветвленный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, при этом алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил и гетероциклил в группах, представленные посредством R, R, R, RиR, необязательно замещены одним или большим количеством  2, 3, 4, 5, 6 или большим количеством) заместителей, независимо выбранных из галогена, -OH, -CN, -NO и незамещенного неразветвленного или разветвленного алкила, имеющего от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительно, заместители для необязательно замещенного алкила, алкенила, алкинила, циклического алкила, циклического алкенила, циклического алкинила, карбоциклила, арила, гетероциклила и гетероарила, описанных выше, включают в себя галоген, -CN, -NRR, -CF, -OR, арил, гетероарил, гетероциклил, -SR, -SOR, -SOR и -SOM.
(например,
Термин «соединение» или «цитотоксическое соединение» используются взаимозаменяемо. Они предназначены включать в себя соединения, для которых структура или формула, или любое их производное раскрыты в данном изобретении, или структура или формула, или любое их производное включены посредством ссылки. Термин также включает в себя стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры, сольваты, метаболиты, соли  фармацевтически приемлемые соли) и пролекарства, а также пролекарственные соли соединения всех формул, раскрытых в данном изобретении. Термин также включает в себя любые сольваты, гидраты и полиморфы любого из вышеуказанного. Конкретное перечисление «стереоизомеров», «геометрических изомеров», «таутомеров», «сольватов», «гидратов» или «полиморфов» в определенных аспектах данного изобретения, описанных в данной заявке, не должно интерпретироваться как намеренное упущение этих форм в других аспектах данного изобретения, где термин «соединение» используется без перечисления этих других форм.
Термин «конъюгат», используемый в данном документе, относится к соединению, описанному в данном документе, или его производному, которое связано с клеточно-связывающим агентом.
Термин «связываемый с клеточно-связывающим агентом», используемый в данном документе, относится к соединениям, описанным в данном документе, или их производным, содержащим по меньшей мере одну связывающую группу или ее прекурсор, подходящие для связывания этих соединений или их производных с клеточно-связывающим агентом.
Термин «прекурсор» данной группы относится к любой группе, который может привести к этой группе посредством чего-либо: снятия защитных групп, химической модификации или реакции сочетания.
Термин «связанный с клеточно-связывающим агентом» относится к молекуле конъюгата, содержащей по меньшей мере одно из соединений, описанных в данном документе или его производное, связанное с клеточно-связывающим агентом через подходящую связывающую группу или ее прекурсор.
Термин «хиральная» относится к молекулам, обладающим свойством несовпадения при наложении партнера по зеркальному отображению, при этом термин «ахиральный» относится к молекулам, которые совпадают при наложении на партнера по зеркальному отображению.
Термин «стереоизомер» относится к соединениям, которые имеют идентичное химическое строение и связываемость, но разные ориентации их атомов в пространстве, которые не могут быть взаимно преобразованы вращением вокруг одинарных связей.
например,
Термин «диастереомер» относится к стереоизомеру с двумя или большим количеством хиральных центров, молекулы которого не являются зеркальными отображениями друг друга. Диастереомеры имеют разные физические свойства,  точки плавления, точки кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереомеров можно разделить аналитическими методами с высоким разрешением, например, кристаллизацией, электрофорезом и хроматографией.
Термин «энантиомеры» относятся к двум стереоизомерам соединения, которые не являются наложенными друг на друга зеркальными отображениями.
т.е.
Стереохимические определения и условные обозначения, используемые в данном документе, как правило, взяты из S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. и Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds,” John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Соединения по данному изобретению могут содержать симметричные или хиральные центры, и таким образом, существовать в различных стереоизомерных формах. Предполагается, что все стереоизомерные формы соединений по данному изобретению, включая, но не ограничиваются ими: диастереомеры, энантиомеры и атропоизомеры, а также смеси вышеуказанных, например, рацемические смеси, составляют часть данного изобретения. Много органических соединений существует в оптически активных формах,  они имеют способность вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения используются приставки D и L или R и S, чтобы обозначить абсолютную конфигурацию молекулы вокруг ее хирального(ых) центра(ов). Префиксы d и l или (+) и (-) используются для обозначения знака вращения плоскополяризованного света соединением, где (-) или 1 означает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры идентичны, за исключением того, что они являются зеркальным отображением друг друга. Конкретный стереоизомер может также упоминаться как энантиомер, а смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров в соотношении 50:50 называется рацемической смесью или рацематом, который может возникнуть, если не было стереоселекции или стереоспецифичности в химической реакции или процессе. Термины «рацемическая смесь» и «рацемат» относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных компонентов, лишенной оптической активности.
Термин «таутомер» или «таутомерная форма» относится к структурным изомерам с различными энергиями, которые взаимопревращаемы через низкоэнергетический барьер. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают в себя взаимопревращения через миграцию протона, например, кето-енольную и имин-енаминовую изомеризации. Валентные таутомеры включают в себя взаимопревращения посредством перегруппировки некоторых связывающих электронов.
например,
et al.,
et al.,
Термин «пролекарство», используемый в данной заявке, относится к прекурсору или производной форме соединения по данному изобретению, способным к ферментативной или гидролитической активации, или превращению в более активную родительскую форму. См.,  Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, стр. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella  “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt  (ed.), стр. 247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по данному изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими: содержащие сложный эфир пролекарства, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, пролекарства с модифицированной D-аминокислотой, гликозилированные пролекарства, P-лактамсодержащие пролекарства, необязательно содержащие замещенный феноксиацетамид пролекарства, необязательно содержащие замещенный фенилацетамид пролекарства, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное цитотоксическое лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови. Примеры цитотоксических лекарственных веществ, которые могут быть преобразованы в пролекарственную форму для применения по данному изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими: соединения по данному изобретению и химиотерапевтические агенты, например, описанные выше.
in vitro
in vivo
2
2
Также подразумевается, что термин «пролекарство» включает в себя производное соединения, которое может гидролизоваться, окисляться или иным образом вступать в реакцию в биологических условиях (или) для получения соединения по данному изобретению. Пролекарства могут становиться активными только в процессе такой реакции в биологических условиях, или они могут проявлять активность в своих непрореагировавших формах. Примеры пролекарств, рассматриваемых в данном изобретении, включают в себя, но не ограничиваются ими: аналоги или производные соединений по любой из формул, раскрытых в данном документе, которые содержат биогидролизуемые фрагменты, например, биогидролизуемые амиды, биогидролизуемые сложные эфиры, биогидролизуемые карбаматы, биогидролизуемые карбонаты, биогидролизуемые уреиды и биогидролизуемые фосфатные аналоги. Другие примеры пролекарств включают в себя производные соединений по любой из формул, раскрытых в данном документе, которые содержат фрагменты -NO, -NO, -ONO или -ONO. Пролекарства, как правило, могут быть получены с использованием хорошо известных способов, например, описанных в Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5th ed.); см. также Goodman and Gilman’s, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8th ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, “Biotransformation of Drugs.”
Фраза «фармацевтически приемлемая соль», используемая в данном документе, относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям соединения по данному изобретению. Типовые соли включают в себя, но не ограничиваются ими, соли: сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат «мезилат», этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, памоат (т.е. 1,1’-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)), соли щелочных металлов (например, натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, магния) и соли аммония. Фармацевтически приемлемая соль включать в себя другую молекулу, например, ацетат-ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоион может быть любым органическим или неорганическим фрагментом, который стабилизирует заряд исходного соединения. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь более одного заряженного атома в своей структуре. В случаях, когда несколько заряженных атомов являются частью фармацевтически приемлемой соли, может иметься несколько противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или большее количество заряженных атомов и/или один или большее количество противоионов.
Если соединение по данному изобретению является основанием, то желаемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, доступным в данной области техники, например, обработкой свободного основания неорганической кислотой, например, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой, метансульфокислотой, фосфорной кислотой и т.п. или органической кислотой, например, уксусной кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, миндальной кислотой, фумаровой кислотой, малоновой кислотой, пировиноградной кислотой, щавелевой кислотой, гликолевой кислотой, салициловой кислотой, пиранозидиловой кислотой, например, глюкуроновой кислотой или галактуроновой кислотой, альфа-гидрокси кислотой, например, лимонной кислотой или винной кислотой, аминокислотой, например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой, ароматической кислотой, например, бензойной кислотой или коричной кислотой, сульфоновой кислотой, например, п-толуолсульфоновой кислотой или этансульфоновой кислотой или т.п.
Если соединение по данному изобретению является кислотой, то желаемая фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим способом, например, обработкой свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, например, амином (первичным, вторичным или третичным), гидроксидом щелочного металла или гидроксидом щелочноземельного металла или т.п. Иллюстративные примеры подходящих солей включают в себя, но не ограничиваются ими: органические соли, полученные из аминокислот, например, глицин и аргинин, аммиак, первичные, вторичные и третичные амины и циклические амины, например, пиперидин, морфолин и пиперазин, и неорганические соли, полученные из натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития
Используемый в данном документе термин «сольват» означает соединение, которое дополнительно включает в себя стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, например, воды, изопропанола, ацетона, этанола, метанола, DMSO, этилацетата, уксусной кислоты и этаноламина дихлорметана, 2-пропанола или т.п., связанного нековалентными межмолекулярными силами. Сольваты или гидраты соединений легко получают добавлением к соединению по меньшей мере одного молярного эквивалента гидроксильного растворителя, например, метанола, этанола, 1-пропанола, 2-пропанола или воды, что приводит к сольватации или гидратации иминного фрагмента.
например
Термины «аномальный рост клеток» и «пролиферативное расстройство» используются взаимозаменяемо в данной заявке. Термины «аномальный рост клеток», используемый в данном документе, если не указано иное, относится к росту клеток, который не зависит от нормальных регуляторных механизмов (, потери контактного торможения). Он включает в себя, например, аномальный рост: (1) опухолевых клеток (опухолей), которые размножаются посредством экспрессии мутированной тирозинкиназы или сверхэкспрессии рецепторной тирозинкиназы; (2) доброкачественных и злокачественных клеток других пролиферативных заболеваний, при которых происходит аберрантная активация тирозинкиназы; (3) любых опухолей, которые размножаются рецепторными тирозинкиназами; (4) любых опухолей, которые размножаются посредством аберрантной активации серин-треониновой киназы; и (5) доброкачественных и злокачественных клеток других пролиферативных заболеваний, при которых происходит аберрантная активация серин-треониновой киназы.
Термины «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое патологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Термин «опухоль» включает в себя одну или большее количество раковых клеток и/или доброкачественных или предраковых клеток.
Термин «терапевтический агент» охватывает как биологический агент, например, антитело, пептид, белок, фермент, так и химиотерапевтический агент.
«Химиотерапевтический агент» - это химическое соединение, применяемое при лечении ракового заболевания.
«Метаболит» - это продукт, получаемый в результате обмена веществ в организме из заявленного соединения, его производного или конъюгата или его соли. Метаболиты соединения, его производного или его конъюгата могут быть идентифицированы с использованием общепринятых методик, известных в данной области техники и их действие определяется при испытаниях, например, тех, которые описаны в данном документе. Такие продукты могут быть получены, например, в результате окисления, гидроксилирования, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, этерификации, деэтерификации, ферментативного расщепления и т.п. введенного соединения. Соответственно, данное изобретение включает в себя метаболиты соединений, их производных или их конъюгатов по изобретению, включая соединения, их производные или их конъюгаты, полученные способом, включающим в себя приведение в контакт соединения, его производного или конъюгата по данному изобретению с млекопитающим в течение периода времени, достаточного для получения продукта метаболизма вышеуказанных.
Фраза «фармацевтически приемлемая» указывает на то, что вещество или композиция должны быть химически и/или токсикологически совместимыми с другими ингредиентами, содержащими препарат, и/или с млекопитающим, которого ими лечат.
см.
Термин «защитная группа» или «защитный фрагмент» относится к заместителю, как правило, используемому для блокирования или защиты определенной функциональности при взаимодействии других функциональных групп соединения, его производного или его конъюгата. Например, «аминозащитная группа» или «аминозащитный фрагмент» представляет собой заместитель, прикрепленный к аминогруппе, который блокирует или защищает указанную амино функциональность в соединении. Такие группы хорошо известны в данной области техники (см., например, P. Wuts and T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ) и в качестве примера можно привести карбаматы, например, метил и этилкарбамат, FMOC, замещенные этилкарбаматы, карбаматы, расщепленные 1,6-β-элиминированием (также называемые «саморасщепляющимися»), мочевины, амиды, пептиды, алкильные и арильные производные. Подходящие аминозащитные группы включают в себя: ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (BOC), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Общее описание защитных групп и их использование  в P. G.M. Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007.
Термин «уходящая группа» относится к группе заряженных или незаряженных фрагментов, которые уходят в процессе замещения или вытеснения. Такие уходящие группы хорошо известны в данной области техники и включают в себя, но не ограничиваются ими: галогены, сложные эфиры, алкокси, гидроксил, тозилаты, трифлаты, мезилаты, нитрилы, азид, карбамат, дисульфиды, сложные тиоэфиры, простые тиоэфиры и соединения диазония.
Bioconjugation
2
3
Термин «бифункциональный сшивающий агент», «бифункциональный линкер» или «сшивающие агенты» относится к модифицирующим агентам, которые обладают двумя реакционноспособными группами; одна из которых способна вступать в реакцию с клеточно-связывающим агентом, при этом другая вступает в реакцию с цитотоксическим соединением, чтобы связать вместе два фрагмента. Такие бифункциональные перекрестносшивающие линкеры хорошо известны в данной области техники (см., например, Isalm and Dent in  chapter 5, стр. 218-363, Groves Dictionaries Inc., New York, 1999). Например, бифункциональные сшивающие агенты, которые обеспечивают связывание через тиоэфирную связь, включают в себя: N-сукцинимидил-4- (N-малеимидометил) -циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) для введения малеимидовых групп или N-сукцинимидил-4-(йодацетил)-аминобензоат (SIAB) для введения йодацетильных групп. Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые вводят малеимидовые группы или галогенацетильные группы в клеточно-связывающий агент, хорошо известны в данной области техники (см. Патентные заявки США 2008/0050310, 20050169933, имеющиеся у Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA) и включают в себя, но не ограничиваются ими: бис-малеимидополиэтиленгликоль (BMPEO), BM(PEO), BM(PEO), сложный эфир N-(β-малеимидопропилокси)сукцинимида (BMPS), N-сукцинимидиловый сложный эфир γ-малеиминомасляной кислоты (GMBS), N-гидроксисукцинимидный сложный эфир ε-малеимидокапроновой кислоты (EMCS), 5-малеимидовалериановую кислоту NHS, HBVS, N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который представляет собой «длинноцепочечный» аналог SMCC (LC-SMCC), сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBS), гидразид или HCl соль 4-(4-N-малеимидофенил)-масляной кислоты (MPBH), N-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP), N-сукцинимидил йодацетат (SIA), N-сукцинимидиловый сложный эфир κ-малеимидундекановой кислоты (KMUA), N-сукцинимидил 4-(п-малеимидофенил)-бутират (SMPB), сукцинимидил-6-(β-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH), сукцинимидил-(4-винилсульфонил)бензоат (SVSB), дитиобис-малеимидоэтан (DTME), 1,4-бис-малеимидобутан (BMB), 1,4 бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан (BMDB), бис-малеимидогексан (BMH), бис-малеимидоэтан (BMOE), сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфосукцинимидил(4-йод-ацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB), сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-MBS), сложный эфир N-(γ-малеимидобутилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBS), сложный эфир N-(ε-малеимидокапроилокси)сульфосукцинимида (сульфо-EMCS), сложный эфир N-(κ-малеимидоундеканоилокси)сульфосукцинимида (сульфо-KMUS), и сульфосукцинимидил 4-(p-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB).
(например,
Гетеробифункциональные сшивающие агенты являются бифункциональными сшивающими агентами, имеющими две разные реакционноспособные группы. Гетеробифункциональные сшивающие агенты, содержащие как N-гидроксисукцинимидную группу, вступающую в реакцию с амином (NHS группу), так и гидразиновую группу, вступающую в реакцию с карбонилом, также могут быть использованы для связывания цитотоксического соединения, описанного в данном документе, с клеточно-связывающим агентом  антителом). Примеры таких коммерчески доступных гетеробифункциональных сшивающих агентов включают в себя: сукцинимидил 6-гидразиноникотинамид ацетон гидразон (SANH), сукцинимидил 4-гидразидотерефталат гидрохлорид (SHTH) и сукцинимидил гидразиния никотинат гидрохлорид (SHNH). Примеры бифункциональных сшивающих агентов, которые могут быть использованы, включают в себя: сукцинимидил-п-формил бензоат (SFB) и сукцинимидил-p-формилфеноксиацетат (SFPA).
Бифункциональные сшивающие агенты, которые создают возможность связывания клеточно-связывающего агента с цитотоксическим соединением через дисульфидные связи для введения дитиопиридильных групп, известны в данной области техники и включают в себя: N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB). Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые могут быть использованы для введения дисульфидных групп, известны в данной области техники и раскрыты в Патентах США 6913748, 6716821 и Патентных публикациях США 20090274713 и 20100129314, которые включены в данный документ посредством ссылки. В альтернативном варианте также могут быть использованы сшивающие агенты, которые вводят тиольные группы, например, 2-иминотиолан, гомоцистеинтиолактон или S-ацетилсукциновый ангидрид.
Термин «реакционноспособный фрагмент» или «реакционноспособная группа», определенный в данном документе, относится к химическому фрагменту, который образует ковалентную связь с другой химической группой. Например, реакционноспособный фрагмент может вступать в реакцию с определенными группами в клеточно-связывающем агенте, (CBA) с образованием ковалентной связи. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакционноспособный фрагмент представляет собой реакционноспособную в отношении амина группу, которая может образовывать ковалентную связь с ε-амином лизинового остатка, расположенного на CBA. В другом варианте осуществления изобретения реакционноспособный фрагмент представляет собой реакционноспособную в отношении альдегида группу, которая может образовывать ковалентную связь с альдегидной группой, расположенной на CBA. Еще в одном варианте осуществления изобретения реакционноспособный фрагмент представляет собой реакционноспособную в отношении тиола группу, которая может образовывать ковалентную связь с тиольной группой цистеинового остатка, расположенного на CBA.
Термин «линкер», «линкерный фрагмент» или «связывающая группа», определенный в данном документе, относится к фрагменту, который соединяет две группы, например, клеточно-связывающий агент и цитотоксическое соединение, вместе. Как правило, линкер по существу является инертным в условиях, при которых две группы, которые он соединяет, связаны. Бифункциональный сшивающий агент может содержать две реакционноспособные группы, по одной на каждом конце линкерного фрагмента, таким образом, что одна реакционноспособная группа сначала может вступить в реакцию с цитотоксическим соединением с получением соединения, несущего линкерный фрагмент, а затем вторая реакционноспособная группа может вступить в реакцию с клеточно-связывающим агентом. В альтернативном варианте, один конец бифункционального сшивающего агента сначала может вступить в реакцию с клеточно-связывающим агентом с получением клеточно-связывающего агента, несущего линкерный фрагмент, а затем вторая реакционноспособная группа может вступить в реакцию с цитотоксическим соединением. Линкерный фрагмент может содержать химическую связь, которая позволяет высвобождать цитотоксический фрагмент на конкретном сайте. Подходящие химические связи хорошо известны в данной области техники и включают в себя: дисульфидные связи, тиоэфирные связи, кислотные лабильные связи, фотолабильные связи, пептидазные лабильные связи и эстеразные лабильные связи (см., например, Патенты США 5208020; 5475092; 6441163; 6716821; 6913748; 7276497; 7276499; 7368565; 7388026 и 7414073). Предпочтительными являются дисульфидные связи, тиоэфирные и пептидазные лабильные связи. Другие линкеры, которые могут быть использованы в данном изобретении, включают в себя неспособные к расщеплению линкеры, например, те, которые подробно описаны в Публикации США номер 20050169933эж или заряженные линкеры, или гидрофильные линкеры, описанные в Публикациях US 2009/0274713, US 2010/01293140 и WO 2009/134976, каждая из которых намеренно включена в данный документ посредством ссылки.
например
Термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые позднее модифицируются, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, селиноцистиен и О-фосфосерин. Аналоги минокислот относятся к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота, т.е. углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R, например, гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид, метионин метилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные основные цепи, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. В частности, одна аминокислота, которая может быть использована, представляет собой цитруллин, который является производным аргинина и участвует в образовании мочевины в печени. Аминокислотные миметики относятся к химическим соединениям, структура которых отличается от общей химической структуры аминокислоты, но функционирует подобно аминокислоте, встречающейся в природе. Термин «аминокислота не природного происхождения» предназначен для обозначения «D» стереохимической формы двадцати встречающихся в природе аминокислот, описанных выше. Также понятно, что термин аминокислота не природного происхождения включает в себя гомологи встречающихся в природе аминокислот или их D-изомеры и синтетически модифицированные формы встречающихся в природе аминокислот. Синтетически модифицированные формы включают в себя, но не ограничиваются ими: аминокислоты, имеющие боковые цепи, укороченные или удлиненные до двух атомов углерода, аминокислоты, содержащие необязательно замещенные арильные группы, и аминокислоты, содержащие галогенированные группы, предпочтительно галогенированные алкильные и арильные группы, а также N замещенные аминокислоты, , N-метил-аланин. Аминокислота или пептид могут быть присоединены к линкеру/спейсеру или клеточно-связывающему агенту через концевой амин или концевую карбоновую кислоту аминокислоты или пептида. Аминокислота также может быть присоединена к линкеру/спейсеру или клеточно-связывающему агенту через реакционноспособную группу боковой цепи, такую как, но не ограничиваясь только этими: тиольная группа цистеина, эпсилонамин лизина или гидроксилы боковой цепи серина или треонина.
2
aa’
aa
aa
aa’
aa
aa’
aa
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислота представлена посредством NH-C(RR)-C(=O)OH, где R и R независимо каждый представляет собой H, необязательно замещенный неразветвленный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, имеющий от 1 до 10 атомов углерода, арил, гетероарил или гетероциклил, или R и N-концевой атом азота вместе могут образовывать гетероциклическое кольцо  как у пролина). Термин «аминокислотный остаток» относится к соответствующему остатку, когда один атом водорода удален из амина и/или гидроксильная группа удалена из карбокси-конца аминокислоты, например, -NH-C(RR)-C(=O)O-.
Используемая в данном документе аминокислота может быть L или D изомером. Если не указано иное, когда делается ссылка на аминокислоту, то это может быть её L или D изомер или их смесь. В определенных вариантах осуществления изобретения, когда на пептид ссылается его аминокислотная последовательность, каждая из аминокислот может представлять собой L или D изомер, если не указано иное. Если одна из аминокислот в пептиде указана как D-изомер, то другая(ие) аминокислота(ы) является(ются) L-изомером(ами), если не указано иное. Например, пептид D-Ala-Ala означает D-Ala-L-Ala.
Аминокислоты и пептиды могут быть защищены блокирующими группами. Блокирующая группа представляет собой атом или химический фрагмент, который защищает N-конец аминокислоты или пептида от нежелаемых реакций и может быть использована в процессе синтеза конъюгата лекарственного средства с лигандом. Она должна оставаться присоединенной к N-концу на протяжении всего синтеза и может быть удалена после завершения синтеза конъюгата лекарственного средства в химических или других условиях, в которых выборочно достигают её удаления. Блокирующие группы, подходящие для защиты N-конца, хорошо известны в области химии пептидов Типовые блокирующие группы включают в себя, но не ограничиваются ими: метиловые сложные эфиры, трет-бутиловые сложные эфиры, 9-флуоренилметилкарбамат (Fmoc) и карбобензокси (Cbz).
например,
et al. Science
et al. Meth. Enzymol.
et al. Meth. Enzymol.
Meth. Enzymol.
et al. Meth. Enzymol.
et al. Meth. Enzymol.
et al. Meth. Enzymol.
et al,
et al.
Термин «пептид, расщепляемый протеазой» относится к пептидам, содержащим узнаваемую последовательность для расщепления протеазой. В данном описании протеаза представляет собой фермент, который может расщеплять пептидную связь. Узнаваемая последовательность для расщепления протеазой представляет собой специфическую аминокислотную последовательность, узнаваемую протеазой в процессе протеолитического расщепления. В данной области техники известно много сайтов расщепления протеазами, и эти и другие сайты расщепления могут быть включены в линкерный фрагмент. См.,  Matayoshi  247: 954 (1990); Dunn  241: 254 (1994); Seidah  244: 175 (1994); Thornberry,  244: 615 (1994); Weber  244: 595 (1994); Smith  244: 412 (1994); Bouvier  248: 614 (1995), Hardy  в AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT, AGING, AND ALZHEIMER'S DISEASE, ed. Masters  стр. 190-198 (1994).
in vitro,
in vitro
Последовательность пептида выбрана исходя из ее способности расщепляться протеазой, неограничивающие примеры которой включают в себя катепсины B, C, D, H, L и S и фурин. Предпочтительно, последовательность пептида способна расщепляться подходящей выделенной протеазой что может быть протестировано с использованием анализов протеазного расщепления , известных в данной области. техники.
В другом варианте осуществления изобретения последовательность пептида выбрана исходя из ее способности расщепляться лизосомальной протеазой. Лизосомная протеаза представляет собой протеазу, расположенную преимущественно в лизосомах, но также может быть расположена в эндосомах. Примеры лизосомальной протеазы включают в себя, но не ограничиваются ими: катепсины B, C, D, H, L и S и фурин.
in vitro
В другом варианте осуществления изобретения последовательность пептида выбрана исходя из ее способности расщепляться опухолеассоциированной протеазой, например, протеазой, которая обнаружена на поверхности раковой клетки или вне клеток в непосредственной близости от опухолевых клеток. Неограничивающие примеры таких протеаз включают в себя: тиметолигопептидазу (TOP), CD10 (неприлизин), матриксную металлопротеазу (например, MMP2 или MMP9), трансмембранную сериновую протеазу II типа (например, гепсин, тестизин, TMPRSS4 или матриптазу/MT-SP1), легумаин и ферменты, описанные по приведенной ниже ссылке (Current Topics in Developmental Biology: Cell Surface Proteases, vol. 54 Zucker S. 2003, Boston, MA). Способность пептида расщепляться опухолеассоциированной протеазой может быть протестирована с использованием анализов протеазного расщепления , известных в данной области техники.
(например,
и т.д.),
(например,
и т.д.)
(например,
и т.д.).
+
+
2+
2+
3+
Термин «катион» относится к иону с положительным зарядом. Катион может быть одновалентным  Na, K двухвалентным  Ca, Мг или многовалентным  Al В некоторых вариантах осуществления изобретения катион является одновалентным.
Термин «терапевтически эффективное количество» означает, то количество активного соединения или конъюгата, которое вызывает желаемый биологический отклик у субъекта. Такой отклик включает в себя частичное снятие симптомов заболевания или расстройства, подвергаемого лечению, профилактику, торможение или задержку рецидива симптома заболевания или самого заболевания, увеличение продолжительности жизни субъекта по сравнению с продолжительностью жизни при отсутствии лечения, или профилактику, торможение или задержку развития симптома заболевания или самого заболевания. Определение эффективного количества хорошо известно специалистам в данной области техники, особенно в свете подробного раскрытия, предложенного в данном документе. Токсичность и терапевтическая эффективность соединения I может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами на культурах клеток и на подопытных животных. Эффективное количество соединения или конъюгата по данному изобретению или другого терапевтического агента для введения субъекту будет зависеть от стадии, категории и статуса множественной миеломы и характеристик субъекта, например, общего состояния здоровья, возраста, пола, массы тела и переносимости препарата. Эффективное количество соединения или конъюгата по данному изобретению или другого терапевтического агента для введения также будет зависеть от способа введения и лекарственной формы. Количество и интервал дозировки могут быть отрегулированы индивидуально для обеспечения уровней активного соединения в плазме, которые являются достаточными для поддержания желаемых терапевтических эффектов.
КОНЪЮГАТЫ КЛЕТОЧНО-СВЯЗЫВАЮЩЕГО АГЕНТА И ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО АГЕНТА
В первом аспекте, в данном изобретении предложены конъюгаты клеточно-связывающего агента и цитотоксического агента, содержащие клеточно-связывающий агент, описанный в данном документе, ковалентно связанный с одной или большим количеством молекул цитотоксического соединения, описанного в данном документе.
В первом варианте осуществления изобретения конъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
CB представляет собой клеточно-связывающий агент;
2
L отсутствует или представляет собой спейсер;
A представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;
1
2
1
2
1-6
1-3
R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил (например, R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил);
1
L представляет собой спейсер;
1
D-L-SH представляет собой цитотоксический агент; и
q равен целому числу от 1 до 20.
1
1
1
1
В одном из вариантов осуществления изобретения L представляет собой -L’-C(=O)-; причём L’ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен, при этом группа -C(=O)- в L присоединена к D.
1
2
1
2
В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из R и R представляет собой H. В более конкретном варианте осуществления изобретения один из R и R представляет собой H, а другой представляет собой Me.
1
2
1
2
В 1-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I), R и R независимо каждый представляет собой H или Me. В более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой H.
1
1
1
1
1
1-10
1
1-20
Во 2-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I), L представляет собой -L’-C(=O)-; причём L’ представляет собой алкилен или циклоалкилен, при этом группа -C(=O)- в L присоединена к D; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения L’ представляет собой C алкилен. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L’ представляет собой C алкилен.
1
2
1-8
3
4
3
4
3
4
В 3-м конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I) L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)-; Rи Rнезависимо каждый представляет собой H или Me; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения Rи Rоба представляют собой Me.
1
2
2-5
2
3-5
3
4
3
4
3
4
3
4
3
4
В 4-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I) L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)- или -CRR-(CH)-C(=O)-; R и R независимо каждый представляет собой H или Me; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой Me. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения Rи Rоба представляют собой H.
1
2
4-6
В 5-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I), L представляет собой -(CH)-C(=O)-; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
2
В 6-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I), L представлен следующей структурной формулой:
где:
a
R представляет собой алкилен, циклоалкилалкилен, арилен, гетероарилен или гетероциклилен;
B
C
R и R независимо каждый отсутствует, представляет собой алкилен, циклоалкилен или арилен;
2
2
P
2
2
P
V и V’ независимо каждый представляет собой -(O-CH-CH)- или -(CH-CH-O)-;
p равен 0 или целому числу от 1 до 10;
W отсутствует,
a
B
C
CB
A
где s2’ обозначает сайт, присоединенный к V, R или J, а s3’ обозначает сайт, присоединенный к R, V’, R или J;
A
где s1 обозначает сайт, присоединенный к клеточно-связывающему агенту CB, а s2 обозначает сайт, присоединенный к R;
a
b
c
e
R, R, R и R, для каждого случая, независимо представляют собой H или алкил;
Ja представляет собой -C(=O)-; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом или 5-ом конкретномварианте осуществления изобретения.
A
В более конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгатов 6-го конкретного варианта осуществления изобретения R представляет собой алкилен, циклоалкилалкилен или арилен; W отсутствует или представляет собой
C
В более конкретном варианте осуществления изобретения p равен 0, а R отсутствует; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 6-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
cb
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения J представляет собой -C(=O)- или  остальные переменные являются такими, как описано выше в 6-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
2
В 7-ом варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I) L представлен следующими структурными формулами:
где:
x
y
x’
y’
+
+
1-4
3
40
41
42
1-4
3
40
41
42
40
41
42
1-4
R, R, R и R для каждого случая, независимо представляют собой H, -OH, галоген, -O-(Cалкил), -SOH, -NRRR или Cалкил, необязательно замещенный -OH, галогеном, -SOH или NRRR, при этом R, R и R независимо каждый представляет собой H или Cалкил;
l и k независимо каждый равен целому числу от 1 до 10;
s1 обозначает сайт, который присоединен к CBA, а s3 обозначает сайт, который присоединен к группе A;
и остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом или 5-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
x
y
x’
y’
В более конкретном варианте осуществления изобретения R, R, R и R все представляют собой H; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 7-ом конкретномварианте осуществления изобретения.
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения l и k независимо каждый равен целому числу от 2 до 6; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 7-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
x
y
x’
y’
В еще более конкретном варианте осуществления изобретения R, R, R и R все представляют собой H; l и k независимо каждый равен целому числу от 2 до 6; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 7-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
2
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L представлена следующей структурной формулой:
где:
x
y
R и R оба представляют собой H;
l и l1 независимо каждый равен целому числу от 1 до 10; и
k1 равен целому числу от 1 до 12 (например, 2, 4, 6, 8, 10 или 12).
(например,
В одном из вариантов осуществления изобретения l и l1 каждый равен целому числу от 2 до 6; и k1 равен целому числу от 2 до 6  2, 4 или 6).
В 8-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I) A представляет собой пептид, расщепляемый протеазой; остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом или 7-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой пептид, расщепляемый протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани.
1
2
1
2
1
1
В 9-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I) A представляет собой пептид, содержащий аминокислоту, которая ковалентно связана с -NH-CRR-S-L-D, выбранную из группы, состоящей из: Ala, Arg, Asn, Asp, Cit, Cys, селино-Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val, независимо каждая в виде L или D изомера; остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом или 7-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислота, присоединенная к -NH-CRR-S-L-D, представляет собой L аминокислоту.
9
9
1
2
2
1
В 10-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I), A выбран из группы, состоящей из: Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, D-Val-Ala, Val-Cit, D-Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID № 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID № 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID № 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val- D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, D-Ala-Pro и D-Ala-tBu-Gly, при этом первая аминокислота в каждом пептиде присоединена к группе L, а последняя аминокислота в каждом пептиде присоединена к -NH-CRR-S-L-D; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом или 7-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly.
В 11-ом конкретном варианте осуществления изобретения для конъюгата формулы (I) D представляет собой майтанзиноид; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом, 8-ом, 9-ом или 10-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В 12-ом конкретном варианте осуществления изобретения конъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
2
(например,
представляет собой клеточно-связывающий агент, присоединенный к группе L через аминогруппу  аминогруппу Lys);
2
(например,
представляет собой клеточно-связывающий агент, присоединенный к группе L через тиольную группу  тиольную группу Cys);
3
4
R и R независимо каждый представляет собой H или Me;
m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 1 до 10;
m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 1 до 19;
t3 равен целому числу от 1 до 12;
1
D представлен следующей формулой:
A является таким, как описано выше в 8-ом, 9-ом или 10-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1 и r1 независимо каждый равен целому числу от 1 до 6; а m2, n2, p2, и r2 независимо каждый равен целому числу от 1 до 7.
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly); причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 12-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения m1, r1, n1, p1 и m3 независимо каждый равен целому числу от 2 до 4; а m2, p2, n2 и r2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен 5.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10, а m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6, а m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6, а m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6.
В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 12. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 4. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 12. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 4.
В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и r1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен целому числу от 3 до 5 и r1 равен целому числу от 2 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен целому числу от 3 до 5 и r1 равен целому числу от 2 до 4. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4 и r1 равен 2. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4 и r1 равен 3. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4 и r1 равен 4. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4 и r1 равен 5. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4 и r1 равен 6.
3
4
3
4
Еще в одном более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой Me. В альтернативном варианте R и R оба представляют собой H.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения конъюгат представлен следующей формулой:
где:
r1 и t1 каждый равен целому числу от 2 до 10;
r2 и t2 каждый равен целому числу от 2 до 19; и
(например,
t3 равен целому числу от 2 до 12  t3 равен 2, 4, 6, 8, 10 или 12).
(например,
В более конкретном варианте осуществления изобретения r1 и t1 каждый равен целому числу от 2 до 6; r2 и t2 каждый равен целому числу от 2 до 5; и t3 равен целому числу от 2 до 6  t3 равен 2, 4 или 6).
В 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения конъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly), и
1
D представлен следующей формулой:
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
Также в 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения конъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly), и
1
D представлен следующей формулой:
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения конъюгат представлен следующей формулой:
1
где: D представлен следующей формулой:
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения для конъюгатов по данному изобретению, описанных выше  конъюгатов, описанных в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом, 8-ом, 9-ом, 10-ом, 11-ом, 12-ом или 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения), клеточно-связывающие агенты (CBA) могут быть любым из клеточно-связывающих агентов (CBA), описанных в данном документе.
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения для конъюгатов по данному изобретению, описанных выше  конъюгатов, описанных в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом, 8-ом, 9-ом, 10-ом, 11-ом, 12-ом или 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения), клеточно-связывающий агент (CBA) связывается с клетками-мишенями, выбранными из следующих: опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки, инфицированные микроорганизмами клетки, инфицированные паразитами клетки, аутоимунные клетки, активированные клетки, миелоидные клетки, активированные T-клетки, B клетки или меланоциты; клетки, экспрессирующие антигены CA6, CAK1, CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD123, CD138, CanAg, CALLA, CEACAM5, FGFR3, LAMP1, p-кадгерин, CA6, TROP-2, DLL-3, CDH6, AXL, SLITRK6, ENPP3, BCMA, тканевой фактор (TF), CD352, Her-2 или Her-3; или клетки, экспрессирующие рецептор фактора роста инсулина, рецептор эпидермального фактора роста, нектин-4, мезотелин, GD3, рецептор пролактина и рецептор фолата.
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения для конъюгатов по данному изобретению, описанных выше  конъюгатов, описанных в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом, 8-ом, 9-ом, 10-ом, 11-ом, 12-ом или 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения), клеточно-связывающий агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, одноцепочечное антитело, фрагмент одноцепочечного антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, химерное антитело, фрагмент химерного антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, доменное антитело, фрагмент доменного антитела который специфически связывается с клеткой-мишенью, проантитело, наноантитело, лимфокин, гормон, витамин, фактор роста, колониестимулирующий фактор, молекулу, переносящую питательные вещества, пептид Bicycles или пентарин.
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения для конъюгатов по данному изобретению, описанных выше  конъюгатов, описанных в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом, 8-ом, 9-ом, 10-ом, 11-ом, 12-ом или 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения), клеточно-связывающий агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В других вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело с изменённой поверхностью или фрагмент этого антитела с изменённой поверхностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой гуманизированное антитело или фрагмент гуманизированного антитела. В других вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой химерное антитело или фрагмент химерного антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к рецептору фолата или фрагмент этого антитела, антитело к EGFR или фрагмент этого антитела, антитело к CD33 или фрагмент этого антитела, антитело к CD 19 или фрагмент этого антитела, антитело к Mucl или фрагмент этого антитела или антитело к CD37 или фрагмент этого антитела.
В одном из вариантов осуществления изобретения конъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:
где Ab представляет собой антитело к рецептору фолата.
В другом варианте осуществления изобретения конъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:
1
2
3
1
2
3
где Ab представляет собой антитело к рецептору фолата. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата содержит (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащую GYFMN (SEQ ID № 4); CDR2 тяжелой цепи, содержащую RIHPYDGDTFYNQXaaFXaaXaa (SEQ ID № 5); и CDR3 тяжелой цепи, содержащую YDGSRAMDY (SEQ ID № 6); и (b) CDR1 лёгкой цепи, содержащую KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID № 7); CDR2 лёгкой цепи, содержащую RASNLEA (SEQ ID № 8); и CDR3 лёгкой цепи, содержащую QQSREYPYT (SEQ ID № 9); при этом Xaa выбран из K, Q, H и R; Xaa выбран из Q, H, N и R; и Xaa выбран из G, E, T, S, A и V. Предпочтительно, последовательность CDR2 тяжелой цепи содержит RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID № 10). В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 14, и вариабельный домен лёгкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 15 или SEQ ID № 16. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата содержит тяжелую цепь, имеюющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 11, и лёгкую цепь, имеюющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 12 или SEQ ID № 13. Предпочтительно, указанное антитело содержит тяжелую цепь, имеюющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 11, и лёгкую цепь, имеюющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 13 (huFOLR1). В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата кодируется плазмидной ДНК, депонируемой в ATCC 7 апреля 2010 г. и имеющей ATCC номера депонирования PTA- 10772 и PTA- 10773 или 10774. См. WO2011/106528, включенный в данный документ посредством ссылки.
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения для конъюгатов по данному изобретению, описанных выше  конъюгатов, описанных в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом, 8-ом, 9-ом, 10-ом, 11-ом, 12-ом или 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения), q равен целому числу от 1 до 10, от 1 до 8 или от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения для конъюгатов, которые ковалентно связаны с цитотоксическим агентом через тиольную группу Cys, q равен 1 или 2. В одном из вариантов осуществления изобретения q равен 2.
(например,
(т.е.,
В некоторых вариантах осуществления изобретения для композиций (например, фармацевтических композиций), содержащих конъюгаты по данному изобретению, описанные выше  конъюгаты, описанные в первом варианте осуществления изобретения или в 1-ом, 2-ом, 3-м, 4-ом, 5-ом, 6-ом, 7-ом, 8-ом, 9-ом, 10-ом, 11-ом, 12-ом или 13-ом конкретном варианте осуществления изобретения), среднее количество цитотоксического агента на клеточно-связывающий агент (CBA, например, антитело)  среднее значение q), также известное как отношение лекарственного средства к антителу (DAR) в композициях находится в диапазоне от 1,0 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления изобретения DAR находится в диапазоне от 1,0 до 5,0, 1,0 до 4,0, 1,0 до 3,4, 1,0 до 3,0, 1,5 до 2,5, 2,0 до 2,5 или 1,8 до 2,2.
СОЕДИНЕНИЯ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ
Во втором аспекте, в данном изобретении предложены производные майтанзиноида, описанные в данном документе.
Во втором варианте осуществления изобретения соединения по данному изобретению представлены формулой (II), (III) или (IV):
или их фармацевтически приемлемой солью, где:
2
L’ отсутствует или представляет собой спейсер, несущий реакционноспособный фрагмент, который может образовывать ковалентную связь с клеточно-связывающим агентом;
A представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;
1
2
1
2
1-6
1-3
R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил (например, R и R независимо каждый представляет собой H или C алкил);
1
L представляет собой спейсер;
1
D-L-SH представляет собой цитотоксический агент;
q равен целому числу от 1 до 20;
A’ представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислот;
3
L представлен следующей формулой:
x
y
+
+
1-4
3
40
41
42
1-4
3
40
41
42
40
41
42
1-4
R и R, для каждого случая, независимо представляют собой H, -OH, галоген, -O-(C алкил), -SOH, -NRRR или C алкил, необязательно замещенный -OH, галогеном, SOH или NRRR, при этом R, R и R независимо каждый представляет собой H или Cалкил; и
k равен целому числу от 1 до 10.
1
1
1
1
В одном из вариантов осуществления изобретения L представляет собой -L’-C(=O)-; причём L’ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен или гетероарилен, при этом группа -C(=O)- в L присоединена к D.
1
2
1
2
В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из R и R представляет собой H. В более конкретном варианте осуществления изобретения один из R и R представляет собой H, а другой представляет собой Me.
1
2
1
2
В 14-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), R и R независимо каждый представляет собой H или Me; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой H.
1
1
1
1
1
1-10
1
1-20
В 15-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), L представляет собой -L’-C(=O)-; причём L’ представляет собой алкилен или циклоалкилен, при этом группа -C(=O)- в L присоединена к D; при этом остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения L’ представляет собой C алкилен. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L’ представляет собой C алкилен.
1
2
1-8
3
4
3
4
3
4
В 16-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)-; Rи R независимо каждый представляет собой H или Me; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом конкретномварианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения Rи R оба представляют собой Me.
1
2
2-5
2
3-5
3
4
3
4
3
4
3
4
3
4
В 17-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)- или -CRR-(CH)-C(=O)-; R и R независимо каждый представляет собой H или Me; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой Me. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой H.
1
2
4-6
В 18-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), L представляет собой -(CH)-C(=O)-; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
В 19-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), A или A’ представляет собой пептид, расщепляемый протеазой; остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом, 15-ом, 16-ом, 17-ом или 18-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения A или A’ представляет собой пептид, расщепляемый протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани.
1
2
1
2
1
1
В 20-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), A или A’ представляет собой пептид, содержащий аминокислоту, которая ковалентно связана с -NH-CRR-S-L-D, выбранную из группы, состоящей из: Ala, Arg, Asn, Asp, Cit, Cys, селино-Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val, независимо каждая в виде L или D изомера; остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом, 15-ом, 16-ом, 17-ом или 18-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная аминокислота, присоединенная к -NH-CRR-S-L-D, является L аминокислотой.
9
9
1
2
2
1
В 21-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), A или A’ выбран из группы, состоящей из: Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, D-Val-Ala, Val-Cit, D-Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Ala, Phe-N- тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala- Leu-Ala-Leu (SEQ ID № 1), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID № 2), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID № 3), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, D-Ala-Pro и D-Ala-tBu-Gly, при этом первая аминокислота в каждом пептиде присоединена к группе L, а последняя аминокислота в каждом пептиде присоединена к -NH-CRR-S-L-D; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом, 15-ом, 16-ом, 17-ом или 18-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly.
2
1
3
3
3
1
2
Для A, описанного в данном документе, когда указана конкретная аминокислотная или пептидная последовательность, это означает аминокислотный остаток или пептид, содержащий аминокислотный остаток, в котором атом водорода удален из аминового конца аминокислоты, присоединенной к группе L, а гидроксильная группа удалена из карбоксильного конца аминокислоты, присоединенной к -NH-CRR-S-L-D. Например, когда A представлен посредством Ala-Ala-Ala, он относится к -NH-CH(CH)-C(=O)-NH-CH(CH)-C(=O)-NH-CH(CH)-C(=O)-.
1
2
1
2
3
3
3
Для A’, описанного в данном документе, когда указана конкретная аминокислотная или пептидная последовательность, это означает аминокислотный остаток или пептид, содержащий аминокислотный остаток, в котором гидроксильная группа удалена из карбоксильного конца аминокислоты, присоединенной к -NH-CRR-S-L-D. Например, когда A’ представлен посредством Ala-Ala-Ala, он относится к NH-CH(CH)-C(=O)-NH-CH(CH)-C(=O)-NH-CH(CH)-C(=O)-.
В 22-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II), (III) и (IV), D представляет собой майтанзиноид; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом, 15-ом, 16-ом, 17-ом, 18-ом, 19-ом, 20-ом или 21-ом конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
2
В 23-м конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II) L представлен следующей структурной формулой:
где:
a
R представляет собой алкилен, циклоалкилалкилен, арилен, гетероарилен или гетероциклилен;
B
C
R и R независимо каждый отсутствует, представляет собой алкилен, циклоалкилен или арилен;
2
2
P
2
2
P
V и V’ независимо каждый представляет собой -(O-CH-CH)- или -(CH-CH-O)-;
p равен 0 или целому числу от 1 до 10;
A
B
c
A;
s2’ обозначает сайт, присоединенный к V, R или Jcb, а s3’ обозначает сайт, присоединенный к R, V’, R или J
a
b
c
e
R, R, R и R, для каждого случая, независимо представляют собой H или алкил;
1
(например,
X представляет собой галоген  -Cl, -Br или -I);
COE представляет собой реакционноспособный сложный эфир;
Ja представляет собой -C(=O)-; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом, 15-ом, 16-ом, 17-ом, 18-ом, 19-ом, 20-ом, 21-м или 22-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
A
В более конкретном варианте осуществления изобретения для соединений 23-го конкретного варианта осуществления изобретения, R представляет собой алкилен, циклоалкилалкилен или арилен; W отсутствует или представляет собой
а остальные переменные являются такими, как описано выше в 23-м конкретном варианте осуществления изобретения.
c
В более конкретном варианте осуществления изобретения p равен 0 и R отсутствует; а остальные переменные являются такими, как описано выше в 23-м конкретном варианте осуществления изобретения.
cb
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения J’ представляет собой -C(=O)OH, -COE или ; а все остальные переменные являются такими, как описано выше в 23-м конкретном варианте осуществления изобретения.
2
В 24-ом варианте осуществления изобретения для соединений формулы (II) L’ представлен следующими структурными формулами:
где:
1-4
3
40
41
42
1-4
3
40
41
42
40
41
42
1-4
+
+
Rx, Ry, Rx’ и Ry’ для каждого случая, независимо представляют собой H, -OH, галоген, -O-(Cалкил), -SOH, -NRRR или Cалкил, необязательно замещенный -OH, галогеном, -SOH или NRRR, при этом R, R и R независимо каждый представляет собой H или Cалкил;
l и k независимо каждый равен целому числу от 1 до 10;
cb
J’ представляет собой -C(=O)OH или -COE;
причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом, 15-ом, 16-ом, 17-ом, 18-ом, 19-ом, 20-ом, 21-м, 22-ом или 23-м конкретном варианте осуществления изобретения.
x
y
x
y
В более конкретном варианте осуществления изобретения R, R, R и R все представляют собой H; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 24-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения 1 и k независимо каждый равен целому числу от 2 до 6; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 24-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
x
y
x
y
В еще более конкретном варианте осуществления изобретения R, R, R и R все представляют собой H; 1 и k независимо каждый равен целому числу от 2 до 6; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 24-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
2
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L’ представлен следующей структурной формулой:
где:
x
y
R и R оба представляют собой H;
1 и 11 каждый равен целому числу от 1 до 10; и
k1 равен целому числу от 1 до 12.
В еще более конкретном варианте осуществления изобретения 1 и 11 каждый равен целому числу от 2 до 6.
x
y
В 25-ом конкретном варианте осуществления изобретения для соединений формулы (IV), R и R оба представляют собой H; причём остальные переменные являются такими, как описано выше во втором варианте осуществления изобретения или в 14-ом, 15-ом, 16-ом, 17-ом, 18-ом, 19-ом, 20-ом, 21-м или 22-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
В более конкретном варианте осуществления изобретения k равен целому числу от 2 до 6; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 25-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения k равен 3; причём остальные переменные являются такими, как описано выше в 25-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
В 26-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединения формулы (II) представлены следующей формулой:
или их фармацевтически приемлемой солью, где:
3
4
R и R независимо каждый представляет собой H или Me;
m1, m3, n1, r1, p1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 1 до 10;
m2, n2, r2, p2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 1 до 19;
t3 равен целому числу от 1 до 12;
Jcb’ представляет собой -C(=O)OH или -COE;
1
D представлен следующей формулой:
причём остальные переменные являются такими, как описано во втором варианте осуществления изобретения или в 19-ом, 20-ом или 21-м конкретном варианте осуществления изобретения.
В более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, и r1 независимо каждый равен целому числу от 1 до 6; а m2, n2, p2, и r2 независимо каждый равен целому числу от 1 до 7.
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения m1, p1, r1, nl и m3 независимо каждый равен целому числу от 2 до 4; а m2, p2, n2 и r2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен 5.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10 и m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6 и m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m1, m3, p1, n1, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6, и m2, n2, p2, r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 6.
В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 12. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 4. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 12. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и t2 независимо каждый равен целому числу от 3 до 5, r1 и t1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6 и t3 равен целому числу от 1 до 4.
В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 и r1 независимо каждый равен целому числу от 2 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен целому числу от 3 до 5 и r1 равен целому числу от 2 до 6. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен целому числу от 3 до 5 и r1 равен целому числу от 2 до 4. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4, а r1 равен 2. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4, а r1 равен 3. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4, а r1 равен 4. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4, а r1 равен 5. В более конкретном варианте осуществления изобретения r2 равен 4, а r1 равен 6.
3
4
3
4
Еще в одном более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой Me. В альтернативном варианте R и R оба представляют собой H.
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения указанное соединение представлено следующей формулой:
где:
rl и t1 каждый равен целому числу от 2 до 10;
r2 и t2 каждый равен целому числу от 2 до 19; и
(например,
t3 равен целому числу от 2 до 12  t3 равен 2, 4, 6, 8, 10 или 12).
(например,
В более конкретном варианте осуществления изобретения r1 и t1 каждый равен целому числу от 2 до 6; r2 и t2 каждый равен целому числу от 2 до 5; и t3 равен целому числу от 2 до 6  t3 равен 2, 4 или 6).
В 27-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединения формулы (II) представлены следующими формулами:
или их фармацевтически приемлемой солью, где:
A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly),
cb
J' представляет собой -C(=O)OH или -COE; и
1
D представлен следующей формулой:
1
В еще более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
Также в 27-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединения формулы (II) представлены следующими формулами:
или их фармацевтически приемлемой солью, где:
A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly),
cb
J' представляет собой -C(=O)OH или -COE; и
1
D представлен следующей формулой:
1
В еще более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В другом более конкретном варианте осуществления изобретения указанное соединение представлено следующими формулами:
1
где D представлен следующей формулой:
(например,
(например,
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения -COE представляет собой реакционноспособный сложный эфир, выбранный из сложного эфира N-гидроксисукцинимида, сложного эфира N-гидроксисульфосукцинимида, сложного эфира нитрофенила  2 или 4-нитрофенила), сложного эфира динитрофенила  2,4-динитрофенила), сложного эфира сульфотетрафторфенила  4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенила) и сложного эфира пентафторфенила. Более конкретно, -COE представляет собой сложный эфир N-гидроксисукцинимида или сложный эфир N-гидроксисульфосукцинимида.
В 28-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединения формулы (III) представлены следующей формулой:
или их фармацевтически приемлемой солью, где:
3
4
R и R независимо каждый представляет собой H или Me;
m2 равен целому числу от 1 до 19; и
1
D представлен следующей формулой:
причём остальные переменные являются такими, как описано во втором варианте осуществления изобретения или в 19-ом, 20-ом или 21-м конкретном варианте осуществления изобретения.
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m2 равен целому числу от 2 до 10. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения m2 равен целому числу от 1 до 7. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения m2 равен целому числу от 2 до 6. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения m2 равен целому числу от 2 до 5. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения m2 равен 4.
3
4
3
4
Еще в одном более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой Me. В альтернативном варианте R и R оба представляют собой H.
В 29-ом конкретномварианте осуществления изобретения соединение формулы (III) представлено следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
A’ представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly),
1
D представлен следующей формулой:
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
Также В 29-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (III) представлено следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
A’ представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly),
1
D представлен следующей формулой:
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
В 30-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (IV) представлено следующей формулой:
;
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
3
4
Rи R независимо каждый представляет собой H или Me;
m3 равен целому числу от 1 до 10;
m2 равен целому числу от 1 до 19;
1
D представлен следующей формулой:
причём остальные переменные являются такими, как описано во втором варианте осуществления изобретения или в 19-ом, 20-ом или 21-м конкретном варианте осуществления изобретения. В более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly.
В более конкретном варианте осуществления изобретения m3 равен целому числу от 1 до 6, и m2 равен целому числу от 1 до 7. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения m3 равен целому числу от 2 до 4; и m2 равен целому числу от 3 до 5. В более конкретном варианте осуществления изобретения m3 равен целому числу от 2 до 10 и m2 равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m3 равен целому числу от 3 до 6, а m2 равен целому числу от 2 до 10. В более конкретном варианте осуществления изобретения m3 равен целому числу от 3 до 6 и m2 равен целому числу от 3 до 6.
3
4
3
4
Еще в одном более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой Me. В альтернативном варианте R и R оба представляют собой H.
В 31-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (IV) представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly) и
1
D представлен следующей формулой:
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
Также в 31-ом конкретном варианте осуществления изобретения соединение формулы (IV) представлено следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly (более конкретно, A представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly) и
1
D представлен следующей формулой:
1
В более конкретном варианте осуществления изобретения D представлен следующей формулой:
МЕТАБОЛИТЫ
(например,
1
2
В определенных вариантах осуществления изобретения конъюгаты по данному изобретению могут высвобождать свободный цитотоксический агент  майтанзиноид) через расщепление связи в пептидном фрагменте, представленном переменной A, с последующим саморасщеплением фрагмента -NH-CRR-S-, чтобы высвободить свободный цитотоксический агент, имеющий тиольную группу, которая может быть в дальнейшем метилирована.
Соответственно, в третьем варианте осуществления данное изобретение относится к соединению формулы (V):
где:
1
L представляет собой спейсер;
0
0
0
1
2
q
2
2
3
2
1
2
2
2
2
3
2
1
Z представляет собой H или Me, при условии, что когда Z представляет собой H, L не является -C(=O)-(CH)- или -C(=O)-CH-CH-C(CH)-, где q равен целому числу от 1 до 3; и когда Z представляет собой Me, L не является -C(=O)-(CH)- или -C(=O)-CH-CH-C(CH)-; и D-L-SH представляет собой цитотоксический агент.
1
1
1
1
1-10
1
1-20
В 32-ом конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -L’-C(=O)-; причём L’ представляет собой алкилен или циклоалкилен. Более конкретно, L’ представляет собой Cалкилен. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L’ представляет собой Cалкилен.
1
2
1-8
3
4
3
4
В 33-м конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)-; причём RиR независимо каждый представляет собой H или Me.
1
2
2-5
2
3-5
3
4
3
4
3
4
3
4
В 34-ом конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)- или -CRR-(CH)-C(=O)-. В более конкретном варианте осуществления изобретения Rи R оба представляют собой Me. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения R и R оба представляют собой H.
1
2
2-10
1
2
4-6
1
2
5
1
2
6
1
2
7
1
2
8
1
2
10
1
2
15
В 35-ом конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=0)-. В более конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=O)-. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=O)-. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=O)-. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=O)-. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=O)-. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=0)-. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения L представляет собой -(CH)-C(=O)-.
В 36-ом конкретном варианте осуществления изобретения для указанного соединения формулы (V) D представлен следующей формулой:
При этом определение для остальных переменных является таким, как описано во втором варианте осуществления изобретения или в 32-ом, 33-м, 34-ом или 35-ом конкретном варианте осуществления изобретения.
Более конкретно, D представлен следующей формулой:
В 37-ом конкретномварианте осуществления изобретения соединение формулы (V) представлено следующей формулой:
КЛЕТОЧНО-СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ
т.д.
например
Эффективность конъюгатов по данному изобретению в качестве терапевтических агентов зависит от тщательного выбора подходящего клеточно-связывающего агента. Клеточно-связывающие агенты могут быть любого типа из известных в настоящее время или приобретающих известность, включая пептиды и непептиды. Как правило, это могут быть антитела (например, поликлональные антитела и моноклональные антитела, в частности, моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины (например, фолат и , которые могут связываться с рецептором на клеточной поверхности, например, рецептором фолата), переносящие питательные вещества молекулы (, трансферрин) или любая другая клеточно-связывающая молекула или вещество.
et al., Leukemia Res.,
Выбор подходящего клеточно- связывающего агента - это вопрос выбора, который частично зависит от конкретной популяции клеток, являющихся мишенями, но во многих (однако не во всех) случаях человеческие моноклональные антитела являются хорошим выбором, если соответствующие имеются. Например, моноклональное антитело MY9 представляет собой мышиное антитело IgG1, которое специфически связывается с антигеном CD33 (J.D. Griffin  8:521 (1984)), и может быть использовано, если клетки-мишени экспрессируют CD33, как при заболевании острым миелогенным лейкозом (AML).
9
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент не является белком. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент может быть витамином, который связывается с рецептором витамина, например, рецептором клеточной поверхности. В этом отношении, витамин А связывается с ретинолсвязывающим белком (RBP) с образованием комплекса, этот комплекс в свою очередь связывает рецептор STRA6 с высокой аффинностью и повышает поглощение витамина А. В другом примере фолиевая кислота/фолат/витамин B связывает на клеточной поверхности рецептор фолата (FR), например, FRα, с высокой аффинностью. Фолиевая кислота или антитела, которые связываются с FRα, могут быть использованы для нацеливания на рецептор фолата, экспрессируемого на яичниках и других опухолях. Кроме того, витамин D и его аналог связываются с рецептором витамина D.
2
2
2
В других вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой белок или полипептид, или соединение, содержащее белок или полипептид, включая антитело, белок, не являющийся антителом, или полипептид. Предпочтительно, белок или полипептиды содержат один или большее количество остатков Lys с группой боковой цепи -NH. -NH-группы боковой цепи Lys могут быть ковалентно связаны с бифункциональными перекрестносшивающими линкерами, которые, в свою очередь, связаны с димерными соединениями по изобретению, таким образом, конъюгируя клеточно-связывающие агенты с димерными соединениями по изобретению. Каждый из клеточно-связывающих агентоов на основе белка может содержать множество NH-групп боковой цепи Lys, доступных для связывания соединений по изобретению через бифункциональные перекрестносшивающие линкеры.
В некоторых вариантах осуществления изобретения GM-CSF, лиганд/фактор роста, который связывается с миелоидными клетками, может быть использован в качестве клеточно-связывающего агента для больных клеток от острого миелогенного лейкоза. IL-2, который связывается с активированными T-клетками, может быть использован для профилактики отторжения при трансплантировании, для терапии и профилактики болезни «трансплантат против хозяина», а также для лечения острого Т-клеточного лейкоза. MSH, который связывается с меланоцитами, может быть использован для лечения меланомы, как могут антитела, направленные на меланомы. Эпидермальный фактор роста может быть использован для борьбы с плоскоклеточными раковыми заболеваниями, например, сквамозной карциномой легкого, головы и шеи, и десен. Соматостатин может быть использован для борьбы с нейробластомами и другими типами опухолей. Эстроген (или аналоги эстрогена) может быть использован для борьбы с раком молочной железы. Андроген (или аналоги андрогена) может быть использован для борьбы с раком яичек.
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент может быть лимфокином, гормоном, факторм роста, колониестимулирующим фактором или молекулой, переносящей питательные вещества.
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой миметик антител, например, белок с анкириновым повтором, центирин или аднектин/монотело.
(например,
В других вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело, одноцепочечное антитело, фрагмент антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело, фрагмент моноклонального антитела (или «антигенсвязывающий участок»), который специфически связывается с клеткой-мишенью, химерное антитело, фрагмент химерного антитела (или «антигенсвязывающий участок»), который специфически связывается с клеткой-мишенью, доменное антитело sdAb) или фрагмент доменного антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью.
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой гуманизированное антитело, гуманизированное одноцепочечное антитело или фрагмент гуманизированного антитела (или «антигенсвязывающий участок»). В конкретном варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело представляет собой huMy9-6 или другое относящееся к нему антитело, описанное в Патентах США №№ 7342110 и 7557189. В другом конкретном варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело представляет собой антитело к рецептору фолата, описанное в WO2011/106528 и Патентах США №№ 8557966, 9133275, 9598490, 9657100, 9670278, 9670279 и 9670280. Идеи всех этих заявок в полном объёме включены в данный документ посредством ссылки.
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело с изменённой поверхностью, одноцепочечное антитело с изменённой поверхностью, фрагмент антитела с изменённой поверхностью (или «антигенсвязывающий участок») или биспецифическое антитело.
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой миниантитело, авиантитело, диантитело, триантитело, тетраантитело, наноантитело, проантитело, доменное антитело или униантитело.
(например,
(например,
(например,
(например,
(например,
(например,
et al.
J. Biol. Chem.
(например,
et al., Cancer Res.
et al., J. Biol. Chem.
Nature Biotechnology
например,
et al., Blood,
et al., Arthritis Rheum,
et al., J. Mol. Biol.,
(Methods in Enzymol.
Другими словами, типовой клеточно-связывающий агент может включать в себя антитело, одноцепочечное антитело, фрагмент антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело, фрагмент моноклонального антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, химерное антитело, фрагмент химерного антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, биспецифическое антитело, доменное антитело, фрагмент доменного антитела, который специфически связывается с клеткой-мишенью, интерферон α, β, γ), лимфокин  IL-2, IL-3, IL-4 и IL-6), гормон  инсулин, гормон, высвобождающий тиротропин (TRH), меланоцитстимулирующий гормон (MSH) и стероидный гормон (например, андроген и эстроген)), витамин  фолат), фактор роста  EGF, TGF-альфа, FGF, VEGF), колониестимулирующий фактор, молекулу, переносящую питательные вещества  трансферрин; см O'Keefe  (1985)  260:932-937, включенный в данный документ посредством ссылки), центирин (белковый каркас, основанный на консенсусной последовательности повторов фибронектина типа III (FN3); см. Патентные публикации США 2010/0255056, 2010/0216708 и 2011/0274623, включенные в данный документ посредством ссылки), белок с анкириновым повтором  сконструированный белок с анкириновым повтором, известный как DARPин; см. Патентные публикации США №№ 2004/0132028, 2009/0082274, 2011/0118146 и 2011/0224100, включенные в данный документ посредством ссылки, а также см. C. Zahnd  (2010) 70:1595-1605; Zahnd  (2006) 281(46):35167- 35175; и Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A.,  (2005) 23:1257- 1268; включенные в данный документ посредством ссылки), белок с повтором, подобным анкириновому или синтетический пептид (см.  Патентную публикацию США № 2007/0238667; Патент США № 7101675; WO 2007/147213; и WO 2007/062466, включенные в данный документ посредством ссылки), аднектин (каркасный белок домен фибронектина; см. Патентные публикации США №№ 2007/0082365; 2008/0139791, включенные в данный документ посредством ссылки), Авиантитело (включая диантитела, триантитела и тетраантитела; см. публикации США №№ 2008/0152586 и 2012/0171115), переориентирующиеся молекулы с двойным рецептором (DART) (P.A. Moore  2011; 117(17):4542-4551; Veri MC,  2010 Mar 30; 62(7): 1933-43; Johnson S, 2010 Apr 9;399(3):436-49), проникающие в клетку перегруженные белки 502, 293-319 (2012)), и другие клеточно-связывающие молекулы или вещества.
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент может быть лигандом, который связывается с фрагментом на клетке-мишени, например, рецептором клеточной поверхности. Например, лиганд может быть фактором роста или его фрагментом, который связывается с рецептором фактора роста; или может быть цитокином или его фрагментом, который связывается с рецептором цитокина. В определенных вариантах осуществления изобретения рецептор фактора роста или рецептор цитокина является рецептором клеточной поверхности.
В определенных вариантах осуществления изобретения, где клеточно-связывающий агент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий участок (включая производные антитела) или определенные миметики антител, CBA может связываться с лигандом на клетке-мишени, например, с лигандом клеточной поверхности, включая рецепторы клеточной поверхности.
v
6
(например,
(например,
Конкретные типовые антигены или лиганды могут включать в себя: ренин; гормон роста (например, человеческий гормон роста и бычий гормон роста); фактор, высвобождающий гормон роста; гормон паращитовидной железы; гормон, стимулирующий щитовидную железу; липопротеин; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; фактор свертывания крови (например, фактор vmc, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда); фактор против свертывания крови (например, белок С); предсердный натрийуретический фактор; лёгочный сурфактант; активатор плазминогена (например, урокиназу, активатор плазминогена мочи человека или тканевого типа); бомбезин; тромбин; кроветворный фактор роста; фактор некроза опухоли -альфа и -бета; энкефалиназу; RANTES (т.е. регулируемые по активации нормально экспрессируемые и секретируемые Т-клетками); воспалительный белок-1-альфа макрофагов человека; сывороточный альбумин (человеческий сывороточный альбумин); ингибирующее вещество Мюллера; А-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок (бета-лактамаза); ДНКазы; IgE; цитотоксический ассоциированный с Т-лимфоцитами антиген (например, CTLA-4); ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; рецептор гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидный фактор; нейротрофический фактор (например, нейротрофический фактор, полученный из кости, нейротрофин-3, -4, -5 или -6), фактор роста нервов (например, NGF-β); тромбоцитарный фактор роста; фактор роста фибробластов (например, aFGF и bFGF); рецептор фактора роста фибробластов 2; эпидермальный фактор роста; трансформирующий фактор роста (например, TGF-альфа, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 и TGF-β5); инсулиноподобный фактор роста-I и -II; дез(1-3)-IGF-I (IGF-I мозга); белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста; меланотрансферрин; CA6, CAK1, CAEEA, CAECAM5, GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; STEAP; CEA; TENB2; рецептор EphA; рецептор EphB рецептор; рецептор фолата; FOLR1; мезотелин; крипто; альфабета; интегрины; VEGF; VEGFR; EGFR; FGFR3; LAMP1, п-кадгерин, рецептор трансферрина; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; CD белки CD2, CD3, CD4, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD123, CD134, CD137, CD138 и CD152), один или большее количество опухоль-ассоциированных антигенов или рецепторы клеточной поверхности (см. Публикацию США № 2008/0171040 или Публикацию США № 2008/0305044, включенные в данный документ в полном объёме посредством ссылки); эритропоэтин; остеоиндуктивный фактор; иммунотоксин; костный морфогенетический белок; интерферон (например, интерферон-альфа, -бета и -гамма); колониестимулирующий фактор (например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF); интерлейкины (например, от IL-1 до IL-10); супероксиддисмутазу; рецептор Т-клеток; белок поверхностной мембраны; фактор ускорения распада; вирусный антиген (например, участок оболочки ВИЧ); транспортный белок, «хоминг»-рецептор; адрессит; регуляторный белок; интегрин (например, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM;) опухолеассоциированный антиген рецептор HER2, HER3 и HER4); эндоглин; c-Met; c-kit; 1GF1R; PSGR; NGEP; PSMA; PSCA; TMEFF2; LGR5; B7H4; TROP-2, DLL-3, CDH6, AXL, SLITRK6, ENPP3, BCMA, тканевой фактор, CD352 и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.
Используемый в данном документе термин «антитело» включает в себя молекулы иммуноглобулина (Ig). В определенных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело, которое содержит четыре полипептидные цепи, а именно: две тяжелые цепи (HC) и две легкие цепи (LC), связанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области лёгкой цепи (LCVR или VL) и константной области легкой цепи, которая состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (области CDR). Такие области перемежаются более консервативными каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех областей CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.
В определенных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой IgG, IgA, IgE, IgD или IgM. В определенных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4; или IgA1 или IgA2.
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой «антигенсвязывающий участок» моноклонального антитела, совместно использующий последовательности, важные для связывания антигена с антителом (например, huMy9-6 или родственные ему антитела, описанные в Патентах США №№ 7342110 и 7557189; huMov19 или родственные ему антитела, описанные в Патентах США №№ 8557966, 9133275, 9598490, 9657100, 9670278, 9670279 и 9670280 и WO2011106528, все из которых включены в данный документ посредством ссылки).
(например,
(например,
(т.е.,
et al.,
2
Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий участок» антитела (или иногда взаимозаменяемо называемый «фрагментами антител») включает в себя один или большее количество фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться определенными фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий участок» антитела, включают в себя (не ограничиваясь только ими): (i) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов  антитело, расщепленное папаином, дает три фрагмента: два антигенсвязывающих Fab фрагмента, и один Fc фрагмент, который не связывает антиген); (ii) F(ab’) фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанный дисульфидным мостом в шарнирной области  антитело, расщепленное пепсином, дает два фрагмента: двухвалентный антигенсвязывающий F(ab’)2 фрагмент, и pFc’ фрагмент, который не связывает антиген) и связанное с ним моновалентное звено F (ab’); (iii) Fd фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1  тот участок тяжелой цепи, который включен в Fab); (iv) Fv фрагмент, состоящий из доменов VL и VH однорукого антитела, и относящийся к нему связанный с дисульфидом Fv; (v) фрагмент dAb (доменного антитела) или sdAb (однодоменного антитела) (Ward  Nature 341:544-546, 1989), который состоит из домена VH; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). В определенных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий участок представляет собой sdAb (однодоменное антитело).
В определенных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий участок также включает в себя определенные сконструированные или рекомбинантные производные (или «производные антитела»), которые также включают в себя один или большее количество фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, в дополнение к элементам или последовательностям, которые могут отсутствовать в существующих в природе антителах.
например,
et al.
et al.,
Например, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH кодируются отдельными генами, они могут быть объединены с использованием стандартных способов рекомбинанирования синтетическим линкером, который позволяет им быть образованными в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см.,  Bird Science 242:423-426, 1988: и Huston  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988).
(т.е.,
(т.е.,
Во всех вариантах осуществления изобретения, описанных в данном документе, N-конец scFv может быть доменом VH  N-VH-VL-C) или доменом VL  N-VL-VH-C).
Двухвалентные (или бивалентные) одноцепочечные вариабельные фрагменты (ди-scFvs, би-scFvs) могут быть сконструированы посредством связывания двух scFvs. Это приводит к образованию одной пептидной цепи с двумя областями VH и двумя областями VL, в результате чего образуется тандем scFvs (tascFv). Аналогичным образом можно получить больше тандемных повторов, например, три-scFv, связав три или большее количество scFv связью по системе «голова-хвост».
например,
et al.,
et al.,
В определенных вариантах осуществления изобретения scFv могут быть связаны через линкерные пептиды, которые являются слишком короткими (около пяти аминокислот) для того, чтобы две вариабельные области складывались вместе, заставляя scFv димеризоваться и образовывать диантитела (см.,  Holliger  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444- 6448, 1993; Poljak  Structure 2:1121-1123, 1994). Показано, что константы диссоциации диантител в 40 раз ниже, чем у соответствующих scFv, т.е. диантитела имеют гораздо более высокую аффинность к мишени.
Еще более короткие линкеры (одна или две аминокислоты) приводят к образованию тримеров, или так называемых триантител. Тетраантитела также были получены аналогичным образом. Они демонстрируют даже более высокую аффинность к своим мишеням, чем диантитела. Диантитела, триантитела и тетраантитела иногда в совокупности называют клеточно-связывающие агенты «АВИАНТИТЕЛО™» (или кратко «АВИАНТИТЕЛО»). То есть, АВИАНТИТЕЛО с двумя, тремя или четырьмя областями связывания мишеней (областями TBR) являются широко известными как ди-, три- и тетраантитела. См., например, более подробное описание в Публикациях США №№ 2008/0152586 и 2012/0171115, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
Все эти форматы могут быть составлены из вариабельных фрагментов со специфичностью для двух или большего количества различных антигенов, и в этом случае они представляют собой типы би- или мультиспецифических антител. Например, некоторые биспецифичные тандемные ди-scFvs известны как биспецифичные сцепки T-клеток (BiTE).
В определенных вариантах осуществления изобретения каждый scFv в тандеме с scFv или диантителом/триантителом/тетраантителом может иметь одну и ту же или отличную специфичность связывания, и каждый может независимо иметь N-концевую VH или N-концевую VL.
Одноцепочечный Fv (scFv) также может быть слит с фрагментом Fc, например, фрагментом Fc человеческого IgG, для получения IgG-подобных свойств, однако, тем не менее, они все еще кодируются одним геном. Поскольку временная продукция таких белков scFv-Fc у млекопитающих может легко достигать количества в миллиграммах, этот формат производных антител особенно подходит для многих исследовательских областей применения.
Fcab представляют собой фрагменты антител, сконструированные из константной области Fc антитела. Fcab могут быть экспрессированы в виде растворимых белков, или они могут быть сконструированы обратно в полноразмерное антитело, например, IgG, для создания mAb2. mAb2 представляет собой полноразмерное антитело с Fcab вместо нормальной области Fc. С этими дополнительными сайтами связывания биспецифичные моноклональные антитела mAb2 могут связываться с двумя разными мишенями одновременно.
В определенных вариантах осуществления изобретения сконструированные производные антител имеют уменьшенный размер антигенсвязывающих рекомбинантных белков, полученных из Ig («миниатюризированных» полноразмерных mAb), полученных посредством удаления доменов, которые считаются несущественными для функционирования. Одним из лучших примеров являются SMIP.
Иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера или SMIP представляет собой искусственный белок, в основном состоящий из частей антител (иммуноглобулинов), и предназначенный для использования в качестве фармацевтического препарата. SMIP имеют такой же биологический период полураспада, что и антитела, но они меньше антител и, следовательно, могут иметь лучшие свойства проникновения в ткани. SMIP представляют собой одноцепочечные белки, которые содержат одну область связывания, одну шарнирную область в качестве соединителя и один эффекторный домен. Область связывания содержит модифицированный одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), а остальная часть белка может быть сконструирована из Fc (например, CH2 и CH3 в качестве эффекторного домена) и шарнирной области антитела, например, IgG1. Генетически модифицированные клетки продуцируют SMIP в виде антителоподобных димеров, которые приблизительно на 30% меньше, чем настоящие антитела.
in vivo.
Другим примером такого сконструированного миниатюризированного антитела является «униантитело», в котором шарнирная область удалена из молекул IgG4. Молекулы IgG4 нестабильны и могут обмениваться гетеродимерами легкой и тяжелой цепи друг с другом. Удаление шарнирной области полностью предотвращает спаривание тяжелой цепи с тяжелой цепью, оставляя высокоспецифичные моновалентные легкий/тяжелый гетеродимеры, сохраняя при этом область Fc для обеспечения стабильности и периода полураспада
H
nar
Однодоменное антитело (sdAb, включая, но не ограничиваясь так называемым наноантителом от Ablynx), представляет собой фрагмент антитела, состоящий из одного мономерного вариабельного домена антитела. Как и целое антитело, оно способно селективно связываться со специфическим антигеном, но является намного меньшим из-за его молекулярной массы, составляющей всего 12-15 кДа. В определенных вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело сконструировано из антител с тяжелой цепью (hcIgG). Первый такой sdAb был сконструирован на основе hcIgG, обнаруженного у животных семейства верблюдовых, называемого фрагментами VH. В определенных вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело сконструировано из IgNAR («новый антигенный рецептор иммуноглобулина», см. ниже) с использованием фрагмента V. Хрящевые рыбы (например, акула) имеют такие антитела с тяжелой цепью IgNAR. В определенных вариантах осуществления изобретения sdAb сконструирован посредством расщепления димерных вариабельных доменов из общего иммуноглобулина G (IgG), например, доменов человека или мыши, на мономеры. В определенных вариантах осуществления изобретения наноантитело получено из вариабельного домена тяжелой цепи. В определенных вариантах осуществления изобретения наноантитело получено из вариабельного домена лёгкой цепи. В определенных вариантах осуществления изобретения sdAb получают путем скрининга библиотеки однодоменных последовательностей тяжелой цепи (например, человеческих однодеменных HC) на предмет связывания с антигеном-мишенью.
nar
nar
NAR
NAR
(например,
Одиночные фрагменты вариабельных доменов антител новых антигенных рецепторов (VS или V домены) получены из антител нового антигенного рецептора иммуноглобулина (IgNARs) хрящевой рыбы  акулы). Будучи одним из самых маленьких известных белковых каркасов на основе иммуноглобулина, такие однодоменные белки демонстрируют благоприятный размер и свойства распознавания криптического эпитопа. Зрелые антитела IgNAR состоят из гомодимеров одного вариабельного домена нового антигенного рецептора (V) и пяти постоянных доменов нового антигенного рецептора (C). Эта молекула обладает высокой устойчивостью и эффективными характеристиками связывания. Присущая ей устойчивость, вероятно, может быть приписана как (i) лежащему в основе каркасу Ig, который содержит значительное количество заряженных и гидрофильных экспонированных на поверхности остатков по сравнению с обычными VH и VL доменами антител, обнаруженными в мышиных антителах; так и (ii) стабилизации структурных особенностей в петлях комплементарной определяющей области (CDR), включая межпетлевые дисульфидные мостики, и структуры внутрипетлевых водородных связей.
in vivo
et al., Cancer Res.
Миниантитело представляет собой сконструированный фрагмент антитела, содержащий домен scFv, связанный с CH, например, CH3y1 (CH3 домен из IgG1) или CH4s (CH4 домен из IgE). Например, scFv, специфичный для карциноэмбрионального антигена (CEA), был связан с CH3y1 для создания миниантитела, которое ранее продемонстрировало, что обладает превосходным нацеливанием на опухоль в сочетании с быстрым клиренсом (Hu  56:3055-3061, 1996). ScFv может иметь N-концевой VH или VE. Соединение может представлять собой короткий пептид (например, двух-аминокислотный линкер, например, ValGlu), который приводит к нековалентному бесшарнирному миниантителу. В альтернативном варианте, соединение может представлять собой шарнир IgG1 и пептидный линкер GlySer, который продуцирует ковалентное шарнирное миниантитело.
Природные антитела являются моноспецифичными, но двухвалентными, поскольку они экспрессируют два идентичных антигенсвязывающих домена. В противоположность этому, в определенных вариантах осуществления изобретения, определенные сконструированные производные антител являются би- или мульти-специфичными молекулами, обладающими двумя или большим количеством различных антигенсвязывающих доменов, каждый из которых обладает различной специфичностью к мишени. Биспецифичные антитела могут быть получены путем слияния двух продуцирующих антитела клеток, каждая из которых обладает определенной специфичностью. Эти «квадромы» продуцировали множество молекулярных частиц, так как две разные легкие цепи и две разные тяжелые цепи могли свободно рекомбинировать в квадромах во множестве конфигураций. С тех пор биспецифичные Fabs, scFvs и полноразмерные mAb создавались с использованием различных технологий (см. выше).
et al., Methods Mol. Biol.,
Белок иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig) представляет собой вид двойного специфического IgG, который одновременно нацелен на два антигена/эпитопа (DiGiammarino  899:145-56, 2012). Указанная молекула содержит область Fc и константные области в конфигурации, аналогичной конфигурации обычного IgG. Однако белок DVD-Ig уникален тем, что каждая рука молекулы содержит два вариабельных домена (VD). VD в руке связаны в тандем и могут обладать различной специфичностью связывания.
Молекулы производных триспецифичных антител также могут быть получены, например, путем экспрессии биспецифичных антител с двумя различными Fab и Fc. Одним из примеров является мышиная IgG2a анти-Ep-CAM, крысиная IgG2b анти-CD3 квадрома, называемая BiUII, которая, как полагают, позволяет совместно локализовать опухолевые клетки, экспрессирующие Ep-CAM, T-клетки, экспрессирующие CD3, и макрофаги, экспрессирующие FCyRI, тем самым усиливая костимуляторные и противоопухолевые функции иммунных клеток.
et al., Sci. Transl. Med.,
Проантитела представляют собой полностью рекомбинантные замаскированные моноклональные антитела, которые остаются инертными в здоровой ткани, но активируются специфически в микросреде заболевания (например, посредством расщепления протеазой, обогащенной или специфичной в микросреде заболевания). См. Desnoyers  5:207, 144, 2013. Аналогичные методы маскировки могут быть использованы для любого из антител или их антигенсвязывающих участков, описанных в данном документе.
Интраантитело представляет собой антитело, которое было модифицировано для внутриклеточной локализации, для работы внутри клетки для связывания с внутриклеточным антигеном. Интраантитело может оставаться в цитоплазме, или может иметь клеточный сигнал внутриядерной локализации, или может иметь последовательность KDEL для ER нацеливания. Интраантитело может быть одноцепочечным антителом (scFv), модифицированными доменами VL иммуноглобулина с повышенной стабильностью, выбранным антителом, устойчивым к более редуцирующей внутриклеточной среде, или экспрессироваться в виде белка слияния с мальтозосвязывающим белком или другими стабильными внутриклеточными белками. Такая оптимизация улучшила стабильность и структуру интраантител и может иметь общую применимость к любому из антител или их антигенсвязывающих участков, описанных в данном документе.
d
off
k
Антигенсвязывающие участки или производные антител по данному изобретению могут иметь по существу одинаковые или идентичные (1) области CDR3 легкой цепи и/или тяжелой цепи; (2) области CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи и/или тяжелой цепи; или (3) области легкой цепи и/или тяжелой цепи по сравнению с антителом, из которого они получены/сконструированы. Последовательности в пределах этих областей могут содержать консервативные аминокислотные замены, включая замены в областях CDR. В определенных вариантах осуществления изобретения имеется не более 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных замен. В альтернативном варианте, антигенсвязывающие участки или производные антител имеют область лёгкой цепи и/или область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на около 90%, 95%, 99% или 100% идентична антителу, из которого они получены/сконструированы. Эти антигенсвязывающие участки или производные антител могут иметь по существу такую же специфичность связывания и/или аффинность к антигену-мишени по сравнению с антителом. В определенных вариантах осуществления изобретения значения K и/или  антигенсвязывающих участков или производных антител находятся в пределах 10-кратного (выше или ниже), 5-кратного (выше или ниже), 3-кратного (выше или ниже) или 2-кратного (выше или ниже) антитела, описанного в данном документе.
В определенных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие участки или производные антител могут быть получены/сконструированы из полностью человеческих антител, гуманизированных антител или химерных антител и могут быть получены любыми известными в данной области техники способами.
(см., например,
et al.,
et al.,
et al.,
Методы с использованием моноклональных антител позволяют получать чрезвычайно специфические клеточно-связывающие агенты в форме специфических моноклональных антител. В данной области техники особенно хорошо известны методы создания моноклональных антител, полученных иммунизацией мышей, крыс, хомяков или любого другого млекопитающего антигеном, представляющим интерес, например, интактной клеткой-мишенью, антигенами, выделенными из клетки-мишени, цельным вирусом, аттенуированным цельным вирусом и вирусными белками, например, белками вирусной оболочки. Также могут быть использованы сенсибилизированные клетки человека. Другой способ создания моноклональных антител представляет собой использование фаговых библиотек scFv (одноцепочечная вариабельная область), в частности, человеческого scFv  Griffiths  Патенты США №№ 5885793 и 5969108; McCafferty  WO 92/01047; Liming  WO 99/06587). Кроме того, также могут быть использованы антитела с измененной поверхностью, раскрытые в патенте США № 5639641, а также химерные антитела и гуманизированные антитела.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al., Mol. Cancer. Ther.
Клеточно-связывающим агентом также могут быть пептиды, полученные из фагового дисплея (см., например, Wang  (2011) 108(17), 6909-6914) или методами библиотеки пептидов (см., например, Dane  (2009) 8(5): 1312-1318).

В определенных вариантах осуществления изобретения CBA по данному изобретению также включает в себя миметик антител, например, DARPин, аффитело, аффилин, аффитин, антикалин, авимер, финомер, пептид домена Кунитца, моноантитело, нанофитин, пептид Bicycles, например, описанные в US2014/0163201 (включенном в данный документ посредством ссылки), и пентарин, например, описанный в Abstract 3674, AACR 106th Annual Meeting 2015; April 18-22, 2015; Philadelphia, PA (включенном в данный документ посредством ссылки).
12
et al.
Cancer Res.,
et al.
J. Biol. Chem.,
Nature Biotechnology,
Используемые в данном документе термины «DARPin» и «(сконструированный) белок с анкириновым повтором» используются взаимозаменяемо для обозначения определенных генетически сконструированных белков-миметиков антител, как правило, демонстрирующих преимущественное (иногда специфическое) связывание с мишенью. Указанной мишенью может быть белок, углевод или другие химические структурные единицы, причём аффинность связывания может быть довольно высокой. DARPины могут быть получены из натуральных белков, содержащих анкириновый повтор, и предпочтительно состоят по меньшей мере из трех, как правило, четырех или пяти мотивов анкириновых повторов (как правило, около 33 остатков в каждом мотиве анкиринового повтора) этих белков. В определенных вариантах осуществления изобретения DARPин содержит около четырех или пяти повторений, и может иметь молекулярные массы около 14 или 18 кДа, соответственно. На уровне ДНК могут быть созданы библиотеки DARPинов с рандомизированными потенциальными остатками взаимодействия с мишенями с разнообразием более 10 вариантов для использования при выборе DARPинов, которые связывают желаемые мишени (например, выступая в качестве агонистов или антагонистов рецепторов, обратных агонистов, ингибиторов ферментов или простых связующих белки-мишени) с пикомолярной аффинностью и специфичностью с использованием различных методик, например, рибосомный дисплей или фаговый дисплей с узнающей сигнал частицей (SRP). См., например, Патентные публикации США №№ 2004/0132028, 2009/0082274, 2011/0118146, и 2011/0224100, WO 02/20565 и WO 06/083275 для получения DARPина (каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки), а также см. C. Zahnd  (2010)  70:1595-1605; Zahnd  (2006)  281(46):35167-35175; и Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005)  23:1257-1268 (все включены в данный документ посредством ссылки). Также см. Патентную публикацию США № 2007/0238667; Патент США № 7101675; WO 2007/147213; и WO 2007/062466 (каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки), для родственных анкиринподобных повторений белка или синтетического пептида.
Молекулы аффитела представляют собой небольшие белки, сконструированные для связывания с большим количеством белков-мишеней или пептидов с высокой аффинностью, имитирующих моноклональные антитела. Аффитело состоит из трех альфа-спиралей с 58 аминокислотами и имеет молярную массу около 6 кДа. Было показано, что они выдерживают высокие температуры (90°C) или кислотные и щелочные условия (pH 2,5 или pH 11), причём связующие вещества с аффинностью вплоть до поднаномолярного диапазона были получены из упрощенных выборок библиотеки, а связующие вещества с пикомолярной аффинностью были получены после созревания аффинности. В определенных вариантах осуществления изобретения аффитела конъюгированы со слабыми электрофилами для ковалентного связывания с мишенями.
Монотела (также известные как аднектины) представляют собой генетически сконструированные белки-миметики антител, способные связываться с антигенами. В определенных вариантах осуществления изобретения монотела состоят из 94 аминокислот и имеют молекулярные массы около 10 кДа. Они основаны на структуре человеческого фибронектина, более конкретно, на его десятом внеклеточном домене типа III, который имеет структуру, аналогичную вариабельным доменам антител, с семью бета-листами, образующими бочку, и тремя открытыми петлями на каждой стороне, соответствующими трем определяющим комплементарность областям. Монотела со специфичностью к различным белкам могут быть адаптированы посредством модификации петель BC (между вторым и третьим бета-листами) и FG (между шестым и седьмым листами).
Триантитело представляет собой самособираемый миметик антител, разработанный на основе С-концевой суперспиральной области мышиного и человеческого белка хрящевого матрикса (CMP), который самособирается в параллельный тримерный комплекс. Это высокостабильный тримерный нацеливающий лиганд, созданный посредством слияния специфического связывающего мишень фрагмента с доменом тримеризации, полученным из CMP. Получающиеся в результате слитые белки могут эффективно самостоятельно собираться в четко определенный параллельный гомотример с высокой стабильностью. Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) тримерных нацеливающих лигандов продемонстрировал значительно улучшенную прочность связывания с мишенью по сравнению с соответствующими мономерами. Исследования связывания клеток подтвердили, что такие триантитела обладают превосходной прочностью связывания с соответствующими рецепторами.
et al., Protein Eng. Des. Sei.,
Центирин представляет собой другой миметик антитела, который может быть получен с использованием библиотеки, построенной на основе согласованной последовательности домена FN3 (Diem  2014). В этой библиотеке используются различные позиции в пределах С-цепи, CD-петли, F-цепи и FG-петли домена FN3, и против конкретных мишеней могут быть выбраны варианты с высокой аффинностью центирина.
1
2
3
1
2
3
В некоторых вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к рецептору фолата. Более конкретно, антитело к рецептору фолата представляет собой гуманизированное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который специфически связывает человеческий рецептор фолата 1 (также известный как альфа-рецептор фолата (FR-α)). Термины «человеческий рецептор фолата 1», «FOLR1», или «альфа-рецептор фолата (FR-α)», используемые в данном документе, относятся к любому природному человеческому FOLR1, если не указано иное. Таким образом, все эти термины могут относиться к последовательности белка либо нуклеиновой кислоты, как указано в данном документе. Термин «FOLR1» охватывает «полноразмерный», необработанный FOLR1 а также любую форму FOLR1, которая является результатом обработки внутри клетки. Антитело FOLR1 содержит: (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащую GYFMN (SEQ ID № 4); CDR2 тяжелой цепи, содержащую RIHPYDGDTFYNQXaaFXaaXaa (SEQ ID № 5); и CDR3 тяжелой цепи, содержащую YDGSRAMDY (SEQ ID № 6); и (b) CDR1 легкой цепи, содержащую KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID № 7); CDR2 легкой цепи, содержащую RASNLEA (SEQ ID № 8); и CDR3 легкой цепи, содержащую QQSREYPYT (SEQ ID № 9); при этом Xaa выбран из K, Q, H и R; Xaa выбран из Q, H, N и R; и Xaa выбран из G, E, T, S, A и V. Предпочтительно, последовательность тяжелой цепи CDR2 содержит RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID № 10).
В другом варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает человеческий рецептор фолата 1, содержащий тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYD GDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID № 11). В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность тяжёлой цепи имеет С-концевой лизин после последнего глицина в SEQ ID № 11.
В другом варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, кодируемый плазмидной ДНК, депонированной в АТСС 7 апреля 2010 г. и имеющей ATCC номера депонирования PT A-10772 и PT A-10773 или 10774. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к рецептору фолата содержит тяжелую цепь HC, которая кодируется плазмидной ДНК, имеющей депозит АТСС № PT A-10772, и лёгкую цепь LC, которая кодируется плазмидной ДНК, имеющей депозит АТСС № PT A-10773 или 10774. В другом варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата содержит тяжелую цепь HC, которая кодируется плазмидной ДНК, имеющей депозит АТСС № PT A-10772, и лёгкую цепь LC, которая кодируется плазмидной ДНК, имеющей депозит АТСС № PT A-10773. Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата содержит тяжелую цепь HC, которая кодируется плазмидной ДНК, имеющей депозит АТСС № PT A-10772, и лёгкую цепь LC, которая кодируется плазмидной ДНК, имеющей депозит АТСС № PT A-10774.
В другом варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает человеческий рецептор фолата 1, содержащий лёгкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASN LEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID № 12); или
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASN LEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID № 13).
В другом варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает человеческий рецептор фолата 1, содержащий тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 11, и лёгкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 12 или SEQ ID № 13. Предпочтительно, антитело содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 11, и лёгкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 13 (hu FOLR1). В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность тяжелой цепи из hu FOLR1 (huMov19) содержит C-концевой лизин после последнего глицина из SEQ ID № 11.
В другом варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает человеческий рецептор фолата 1, и содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, по меньшей мере на около 90%, 95%, 99% или 100% идентичный QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDG DTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSS (SEQ ID № 14), и вариабельный домен лёгкой цепи, по меньшей мере на около 90%, 95%, 99% или 100% идентичный DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNL EAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID № 15); или DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNL EAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID № 16).
В другом варианте осуществления изобретения антитело к рецептору фолата представляет собой huMovl9 или M9346A или M антитело (см., например, Патенты США №№ 8709432, 8557966, 9133275, 9598490, 9657100, 9670278, 9670279 и 9670280 и WO2011106528, все включены в данный документ посредством ссылки).
В другом варианте осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к EGFR или фрагмент этого антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к EGFR представляет собой неантагонистическое антитело, включая, например, антитела, описанные в WO2012058592, включенном в данный документ посредством ссылки. В другом варианте осуществления изобретения антитело к EGFR представляет собой нефункциональное антитело, например, гуманизированное ML66 или EGFR-8. Более конкретно, антитело к EGFR представляет собой huML66.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к EGFR содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 17 и лёгкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID № 18. Используемые в данном документе подчеркнутые двойной линией последовательности представляют вариабельные области (т.е. вариабельную область тяжёлой цепи или HCVR, и вариабельную область лёгкой цепи или LCVR) последовательностей тяжелой или лёгкой цепи, при этом выделенные жирным шрифтом последовательности представляют области CDR (т.е. от N-конца к C-концу, CDR1, CDR2, и CDR3, соответственно, последовательностей тяжелой цепи или лёгкой цепи).
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к EGFR содержит CDR1-CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID № 17 и/или CDR1-CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID № 18, и предпочтительно специфически связывает EGFR.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к EGFR содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 17, и/или последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 18, и предпочтительно специфически связывает EGFR.
В другом варианте осуществления изобретения антитело к EGFR представляет собой антитела, описанные в 8790649 и WO 2012/058588, включенных в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к EGFR представляет собой антитело huEGFR-7R.
QVQLVQSGAEVAKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLECIGTIYPGD GDTTYTQKFQGKATLTADKSSSTAYMQLSSLRSEDSAVYYCARYDAPGYAMDYW GQGTLVTVSS
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к EGFR содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAAEGCEVKDYFPEPVTVSWNSGAET SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID №19) и область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLAWYQHKPGKGPKEEIHYTSTLHPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISSLEPEDIATYYCLQYDNLLYTFGQGTKEEIKR
TVAAPSVFTFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID №20) или область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLAWYQHKPGKGPKEETHYTSTLHPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISSLEPEDIATYYCLQYDNLLYTFGQGTKEEIKR
TVAAPSVFTFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID №21).
В другом варианте осуществления изобретения антитело к EGFR содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID № 19, и область лёгкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №20.
В другом варианте осуществления изобретения антитело к EGFR содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID № 19, и область лёгкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №21.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к EGFR содержит CDR1-CDR3 тяжелой цепи, имеющую SEQ ID № 19, и/или CDR1-CDR3 легкой цепи, имеющую SEQ ID № 20 или 21, и предпочтительно специфически связывает EGFR.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к EGFR содержит последовательность вариабельной области тяжёлой цепи (HCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 19, и/или последовательность вариабельной области лёгкой цепи (LCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 20 или 21, и предпочтительно специфически связывает EGFR.
В другом варианте осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к CD19, например, как описано в Патенте США № 8435528 и WO2004/103272, включенных в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD19 содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID № 22) и область лёгкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID № 23).
ID № В другом варианте осуществления изобретения антитело к CD19 представляет собой антитело huB4.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD19 содержит CDR1-CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID № 22, и/или CDR1-CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID № 23, и предпочтительно специфически связывает CD19.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD19 содержит последовательность вариабельной области тяжёлой цепи (HCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 22, и/или последовательность вариабельной области лёгкой цепи (LCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID №23, и предпочтительно специфически связывает CD19.
QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA
Еще в одном варианте осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к Mucl, например, как описано в Патенте США № 7834155, WO 2005/009369 и WO 2007/024222, включенных в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к Mucl содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAAEGCEVKDYFPEPVTVSWNSGAETSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID №24) и область лёгкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность
EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKEELKR
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID №25).
В другом варианте осуществления изобретения антитело к Mucl представляет собой антитело huDS6.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к Mucl содержит CDR1-CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID № 24, и/или CDR1-CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID № 25, и предпочтительно специфически связывает Mucl.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к Mucl содержит последовательность вариабельной области тяжёлой цепи (HCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 24, и/или последовательность вариабельной области лёгкой цепи (LCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 25, и предпочтительно специфически связывает Mucl.
В другом варианте осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к CD33 или его фрагмент, например, антитела или их фрагменты, описанные в Патентах США №№ 7557189, 7342110, 8119787 и 8337855 и W02004/043344, включенных в данный документ посредством ссылки. В другом варианте осуществления изобретения антитело к CD33 представляет собой антитело huMy9-6.
QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKEEIKR
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD33 содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID №26), и область лёгкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID №27).
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD33 содержит CDR1-CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID № 26 и/или CDR1-CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID № 27, и предпочтительно специфически связывает CD33.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD33 содержит последовательность вариабельной области тяжёлой цепи (HCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 26, и/или последовательность вариабельной области лёгкой цепи (LCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 27, и предпочтительно специфически связывает CD33.
В другом варианте осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к CD37 или фрагмент этого антитела, например, как описано в Патенте США № 8765917 и WO 2011/112978, включенных в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD37 представляет собой антитело huCD37-3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD37 содержит область лёгкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность
DIQMTQSPSSLSVSVGERVTITCRASENIRSNLAWYQQKPGKSPKLLVNVATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQPEDFGTYYCQHYWGTTWTFGQGTKLFIKR
QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHPSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSS
QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSS
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID №28) и область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQID№29) или область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность ASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQID№30)
В другом варианте осуществления изобретения антитело к CD37 содержит область лёгкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №28 и область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №29.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD37 содержит область лёгкой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №28, и область тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №30.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD37 содержит CDR1-CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID № 29 или 30, и/или CDR1-CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID № 28, и предпочтительно специфически связывает CD37.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD37 содержит последовательность вариабельной области тяжёлой цепи (HCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 29 или 30, и/или последовательность вариабельной области лёгкой цепи (LCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 28, и предпочтительно специфически связывает CD37.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD37 содержит область лёгкой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность
EIVLTQSPATMSASPGERVTMTCSATSSVTYMHWYQQKPGQSPKRWIYDTSNLPYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSDNPPTFGQGTKLEIKR
QVQLQESGPGLLKPSQSLSLTCTVSGYSITSGFAWHWIRQHPGNKLEWMGYILYSGSTVYSPSLKSRISITRDTSKNHFFLQLNSVTAADTATYYCARGYYGYGAWFAYWGQGTLVTVSA
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID №31) и область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID №32).
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD37 содержит CDR1-CDR3 тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID № 32, и/или CDR1-CDR3 легкой цепи с последовательностью SEQ ID № 31, и предпочтительно специфически связывает CD37.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD37 содержит последовательность вариабельной области тяжёлой цепи (HCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 32, и/или последовательность вариабельной области лёгкой цепи (LCVR), по меньшей мере на около 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентичную последовательности SEQ ID № 31, и предпочтительно специфически связывает CD37.
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело к CD37 представляет собой антитело huCD37-50.
В одном из вариантов осуществления изобретения клеточно-связывающий агент представляет собой антитело к CD123 или фрагмент этого антитела, например, как описано в WO2017/004026, включенном в данный документ посредством ссылки.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к CD123 или фрагмент этого антитела содержит: a) вариабельную область тяжёлой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SSIMH (SEQ ID №33), вариабельную область тяжёлой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность YIKPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID №34), и вариабельную область тяжёлой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность EGGNDYYDTMDY (SEQ ID №35); и b) вариабельную область лёгкой цепи CDR1, содержащую аминокислотную последовательность RASQDINSYLS (SEQ ID №36), вариабельную область лёгкой цепи CDR2, содержащую аминокислотную последовательность RVNRLVD (SEQ ID №37), и вариабельную область лёгкой цепи CDR3, содержащую аминокислотную последовательность LQYDAFPYT (SEQ ID №38).
aa
aa
В другом варианте осуществления изобретения антитело к CD123 или фрагмент этого антитела содержит вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID №39), и вариабельную область лёгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKR (SEQ ID №40). В определенных вариантах осуществления изобретения X (или X), второй остаток от N-конца последовательности SEQ ID №39, представляет собой Phe (F). В определенных вариантах осуществления изобретения X (или X) в SEQ ID №39 представляет собой Val (V).
В другом варианте осуществления изобретения антитело к CD123 или фрагмент этого антитела содержит вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID №39, и вариабельную область лёгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKR (SEQ ID №41).
aa
В другом варианте осуществления изобретения антитело к CD123 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLCLSPG (SEQ ID №42) и лёгкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID №43). В некоторых вариантах осуществления изобретения X (или X), второй остаток от N-конца последовательности SEQ ID № 42 представляет собой Val.
aa
В другом варианте осуществления изобретения антитело к CD123 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID №44) и лёгкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID №43. В некоторых вариантах осуществления изобретения X (или X), второй остаток от N-конца последовательности SEQ ID № 44 представляет собой Val.
(например,
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент по данному изобретению антитело) имеет N-концевой серин, который может быть окислен окислителем с образованием окисленного клеточно-связывающего агента, имеющего N-концевую альдегидную группу.
На стадии (a) способов, описанных выше, могут быть использованы любые окислители. В определенных вариантах осуществления изобретения окислителем является периодат. Более конкретно, указанным окислителем является периодат натрия.
(например,
Может быть использован избыток молярных эквивалентов окислителя относительно клеточно-связывающего агента. В определенных вариантах осуществления изобретения может быть использовано около 2-100, 5-80, 10-50, 1-10 или 5-10 молярных эквивалентов окислителя. В определенных вариантах осуществления изобретения может быть использовано около 10 или около 50 эквивалентов окислителя. Если используется большое количество окислителя, то используется короткое время реакции во избегание переокисления. Например, если используется 50 эквивалентов окислителя, то реакцию окисления проводят от около 5 до около 60 минут. В альтернативном варианте, если используется 10 эквивалентов окислителя, то реакцию окисления проводят от около 30 минут до около 24 часов. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется 5-10 молярных эквивалентов окислителя и реакцию окисления проводят от около 5 до около 60 минут  от около 10 до около 30 минут, от около 20 до около 30 минут).
В определенных вариантах осуществления изобретения реакция окисления не приводит к значительному нецелевому окислению. Например, незначительная степень (например, менее чем 20%, менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1%) метионина и/или гликанов окисляется в процессе окисления N-терминального серина для создания окисленного клеточно-связывающего агента, имеющего N-концевую альдегидную группу.
(например,
(например,
(например,
В определенных вариантах осуществления изобретения клеточно-связывающий агент по данному изобретению антитело) имеет рекомбинантно сконструированный остаток Cys, например, остаток Cys в позиции 442 нумерации EU/OU антитела. Таким образом термин «сконструированное с цистеином антитело» включает в себя антитело по меньшей мере с одним Cys, который обычно не присутствует в данном остатке легкой цепи или тяжелой цепи антитела. Такие Cys, которые также могут называться «сконструированными Cys», могут быть сконструированы с использованием любой обычной технологии молекулярной биологии или технологии рекомбинантных ДНК  посредством замены кодирующей последовательности для не-Cys остатка на остатке-мишени кодирующей последовательностью для Cys). Например, если исходным остатком является Ser с кодирующей последовательностью 5’-UCU-3’, то указанная кодирующая последовательность может быть мутирована  посредством сайт-направленного мутагенеза) до 5’-UGU-3’, которая кодирует Cys. В определенных вариантах осуществления изобретения сконструированное с Cys антитело по данному изобретению имеет сконструированный Cys в тяжелой цепи. В определенных вариантах осуществления изобретения сконструированный Cys находится в или вблизи домена CH3 тяжелой цепи. Последовательность тяжелой (или легкой) цепи сконструированного антитела может быть вставлена в подходящий рекомбинантный вектор экспрессии для получения сконструированного антитела, имеющего сконструированный остаток Cys на месте исходного остатка Ser.
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ СОЕДИНЕНИЙ И КОНЪЮГАТОВ
in vitro.
in vitro
et al.,
50
Цитотоксические соединения и конъюгаты по данному изобретению клеточно-связывающего агента с лекарственным веществом могут быть оценены по их способности подавлять пролиферацию клеток различных линий рака  Например, клеточные линии, например, клетки хориокарциномы человека JEG-3, могут быть использованы для оценки цитотоксичности этих соединений и конъюгатов. Клетки, подлежащие оценке, могут подвергаться воздействию соединений или конъюгатов в течение 1-5 дней, а выжившие фракции клеток измеряют в прямых анализах известными способами. Значения IC затем могут быть рассчитаны по результатам анализов. В альтернативном варианте или в дополнение, экран чувствительности клеточной линии , например, описанный Национальным институтом онкологии США (см. Voskoglou-Nomikos 2003, Clinical Cancer Res. 9: 42227-4239, включенный в данный документ посредством ссылки) может быть использован в качестве одного из руководств для определения типов рака, которые могут быть чувствительными к лечению соединениями или конъюгатами по данному изобретению.
in vitro
Примеры активности  и специфичности к мишеням конъюгатов антител с цитотоксическим агентом по данному изобретению описаны в Примере 6. Антиген-негативные клеточные линии оставались жизнеспособными при воздействии тех же конъюгатов.
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
(например,
(например,
(например,
Данное изобретение включает в себя композицию  фармацевтическую композицию), содержащую новые соединения майтанзиноида, описанные в данном документе, их производные или их конъюгаты (и/или их сольваты, гидраты и/или соли), а также носитель (фармацевтически приемлемый носитель). Данное изобретение также включает в себя композицию  фармацевтическую композицию), содержащую новые соединения майтанзиноида, описанные в данном документе, их производные или их конъюгаты (и/или их сольваты, гидраты и/или соли), а также носитель (фармацевтически приемлемый носитель). Представленные композиции применимы для ингибирования аномального роста клеток или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего  человека).
(например,
Данное изобретение включает в себя способ ингибирования аномального роста клеток или лечения пролиферативного расстройства у млекопитающего  человека), включающий в себя введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества новых соединений майтанзиноида, описанных в данном документе, их производных или их конъюгатов (и/или их сольватов и солей) или их композиции.
В данном изобретении также предложены способы лечения, включающие в себя введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества любого из конъюгатов, описанных выше.
Аналогично, в данном изобретении предложен способ индукции гибели клеток в выбранных популяциях клеток, включающий в себя контактирование клеток-мишеней или ткани, содержащей клетки-мишени, с эффективным количеством цитотоксического агента, содержащим любой из агентов, связывающих цитотоксическое соединение с клетками по данному изобретению, их соль или сольват. Клетки-мишени - это клетки, с которыми может связаться клеточно-связывающий агент.
Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и эксципиенты хорошо известны и могут быть определены специалистами в данной области техники, как того требует клиническая ситуация.
Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или эксципиентов включают в себя: (1) фосфатный буферизованный соляной раствор Дульбекко, pH около 7,4, содержащий или не содержащий от около 1 мг/мл до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0,9% раствора соли (0,9% мас./об. NaCl), и (3) 5% (мас./об.) декстрозы; а также может содержать противоокислитель например, триптамин и стабилизатор, например, Твин 20.
in vitro, in vivo
ex vivo.
Способ индукции гибели клеток в выбранных клеточных популяциях может применяться на практике или
in vitro
Примеры применения  включают в себя методы обработки мозгового вещества аллогенной кости до ее трансплантации одному и тому же пациенту с целью уничтожения больных или злокачественных клеток: лечение клеток костного мозга до их трансплантации с целью уничтожения компетентных Т-клеток и профилактики болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD); методы обработки клеточных культур для уничтожения всех клеток, за исключением желаемых вариантов, которые не экспрессируют антиген-мишень; или для уничтожения вариантов, которые экспрессируют нежелательный антиген.
in vitro
Условия неклинического применения  легко определяются специалистом в данной области техники.
ex vivo
т.е.
Примерами клинического применения  являются удаление опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга перед аутологичной трансплантацией при лечении рака или лечении аутоиммунного заболевания, или удаление Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологичного или аллогенного костного мозга или ткани до пересадки с целью профилактики GVHD. Лечение может проводиться следующим образом. Костный мозг отбирают у пациента или другого человека и затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, в которую добавляют цитотоксический агент по изобретению, в концентрациях в диапазоне от около 10 мкМ до 1 пМ, в течение от около 30 минут до около 48 часов при около 37°C. Точные условия концентрации и инкубационный период,  доза, легко определяются специалистом в данной области техники. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают пациенту внутривенно в соответствии с известными способами. В тех случаях, когда пациент получает другое лечение, например, курс аблятивной химиотерапии или облучение всего тела между временем сбора костного мозга и реинфузией обработанных клеток, обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте с использованием стандартного медицинского оборудования.
in vivo
Для клинического применения  цитотоксический агент по данному изобретению будет поставляться в виде раствора или лиофилизированного порошка, которые проверяются на стерильность и уровни эндотоксина.
(например,
(например,
(например,
(например,
(например,
(например,
В некоторых вариантах осуществления изобретения соединения и конъюгаты по данному изобретению могут быть использованы для лечения таких видов рака:  рак почки, рак молочной железы  тройной негативный рак молочной железы (TNBC)), рак толстой кишки, рак головного мозга, рак предстательной железы, рак эндометрия, рак шейки матки, рак почки, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак головы и шеи, меланома, колоректальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, сквамозно-клеточная карцинома, рак легких (например, немелкоклеточный рак легкого и мелкоклеточный рак легкого), тестикулярный рак, хориоидкарцинома, карцинома из клеток Меркеля, саркома  остеосаркома, хондросаркома, липосаркома, и лейомиосаркома), глиобластома, нейробластома, лимфома  неходжкинская лимфома), миелодиспластический синдром (MDS), перитонеальный рак, рак фаллопиевой трубы, рак матки или лейкоз  острый миелоидный лейкоз (AML), острый моноцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, эозинофильный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз  B-ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и хронический миелоидный лейкоз (CML)).
АНАЛОГИ И ПРОИЗВОДНЫЕ
Специалист в области цитотоксических агентов легко поймет, что каждый из описанных в данном документе цитотоксических агентов может быть модифицирован таким образом, что полученное соединение все еще сохраняет специфичность и/или активность исходного соединения. Специалист в данной области техники также поймет, что многие из этих соединений могут быть использованы вместо цитотоксических агентов, описанных в данном документе. Таким образом, цитотоксические агенты по данному изобретению включают в себя аналоги и производные соединений, описанных в данном документе.
Все ссылки, цитируемые в данном документе и в следующих ниже примерах, прямо включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение базового раствора DM-H (7)
Майтанзинол (5,0 г, 8,85 ммоль) растворили в безводном DMF (125 мл), затем охладили на водяной бане. После этого добавили N-карбоксиангидрид N-метилаланина (5,7 г, 44,25 ммоль), безводный DIPEA (7,70 мл, 44,25 ммоль) и трифторметансульфонат цинка (22,5 г, 62 ммоль) при магнитном перемешивании в атмосфере аргона. Ледяную баню убрали и реакционной смеси дали нагреться при перемешивании. Через 16 ч добавили деионизированную воду (10 мл). Через 30 минут при интенсивном перемешивании добавили раствор 1:1 насыщенного водного раствора бикарбоната натрия : насыщенного водного раствора хлорида натрия (190 мл) и этилацетат (250 мл). Смесь перенесли в делительную воронку и оставили органический слой. Водный слой экстрагировали этилацетатом (100 мл), после чего органические слои объединили и промыли насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл). Органический слой концентрировали до приблизительно 1/4 его объема посредством ротационного выпаривания под вакуумом без подогрева испарительной ванны, очистку не проводили. Концентрацию раствора приблизительно рассчитали делением ммолей майтанзинола, использованного в реакции (1,77 ммоль), на объем (150 мл), дающих исходный раствор DM-H (0,06 ммоль/мл). Аликвоты базового раствора сразу же распределили, после чего использовали в реакциях или хранили в морозильной камере при -80°С, а затем размораживали при необходимости.
Пример 2. Синтез тио-пептид-майтанзиноидов
2
2
Соединения типа FMoc-пептид-NH-CH-OAc получили в качестве примера посредством FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-OAc.
Соединения FMoc-пептид-OAc
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-OAc (9a): FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-Gly-OH (500 мг, 0,979 ммоль) растворили в DMF (2 мл), к которому добавили ацетат меди (II) (17,8 мг, 0,098 ммоль) и уксусную кислоту (84 мкл, 1,47 ммоль) при перемешивании магнитной мешалкой в атмосфере аргона. После растворения твердых веществ добавили тетраацетат свинца (434 мг, 0,979 ммоль), Реакции дали возможность протекать при 60°C в течение 20 мин, затем очистили на колонке C18 30 микрон, с картриджем 450 г, с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты, и линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 55% в течение 26 минут с расходом 125 мл/мин. Фракции, содержащие чистый желаемый продукт, заморозили и лиофилизировали с получением 178 мг (выход 34%) твердого вещества белого цвета. МСВР (масс-спектрометрия высокого разрешения) (M + Na) расч. 547,2163; обнаружено 547,2160. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,20 (qd,  7,5, 6,9, 4,2Гц, 9H), 1,91 - 2,05 (m, 3H), 3,26 - 3,38 (m, 1H), 4,05 (q,  7,3Гц, 1H), 4,23 (td,  11,9, 10,7, 6,4Гц, 5H), 5,07(ddd,  11,2, 6,9, 4,3Гц, 2H), 7,32 (q, 7,5Гц, 2H), 7,41 (q,  7,4Гц, 2H), 7,52 (t,  6,8Гц, 1H), 7,71 (q,  7,5, 7,0Гц, 2H), 7,82-8,08 (m, 4H), 8,84 (q,  7,1Гц, 1H).
2
+
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-OAc (9b): МСВР (M+Na)расч. 547,2163, обнаружено 547,2167
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,23 (dd,  12,5, 7,4Гц, 9H), 1,95 (s, 2H), 4,00 -4,13 (m, 1H), 4,17 - 4,38 (m, 6H), 5,06 (q,  8,8Гц, 2H), 7,33 (t,  7,3Гц, 2H), 7,42 (t,  7,4Гц, 2H), 7,62 (d,  6,8Гц, 1H), 7,71 (t,  8,6Гц, 2H), 7,85 - 8,01 (m, 3H), 8,21 (d,  7,0Гц, 1H), 8,69 (d,  6,9Гц, 1H).
2
+
1
J =
J =
J
J
J
J
J
J
J
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-OAc (9c): МСВР (M+Na)расч. 547,2163, обнаружено 547,2168 H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,16 - 1,24 (m, 9H), 1,97 (s, 3H), 4,07 (q, 7,0Гц, 1H), 4,16 - 4,34 (m, 5H), 5,00 - 5,16 (m, 2H), 7,33 (td,  7,4, 1,1Гц, 2H), 7,42 (t,  = 7,4Гц, 2H), 7,58 (d,  = 7,0Гц, 1H), 7,72 (t,  = 8,1Гц, 2H), 7,90 (d,  = 7,5Гц, 2H), 8,03 (d,  = 7,5Гц, 1H), 8,14 (d,  = 7,2Гц, 1H), 8,85 (t,  = 6,9Гц, 1H).
2
+
1
J
J
J =
J
J
J
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH-OAc (9d): МСВР (M+Na)расч. 547,2163, обнаружено 547,2167. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,18-1,25 (m, 9H), 1,97 (s, 3H), 3,96-4,15 (m, 1H), 4,17 - 4,36 (m, 5H), 5,09 (d,  = 6,9Гц, 2H), 7,34 (t,  = 7,4Гц, 2H), 7,42 (t, 7,4Гц, 2H), 7,57 (d,  = 7,2Гц, 1H), 7,71 (d,  = 7,3Гц, 2H), 7,90 (d,  = 7,5Гц, 2H), 8,07 (s, 2H), 8,86 (s, 1H).
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J
J
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH-OAc (9f): МСВР (M+Na)расч. 476,1792, обнаружено 476,1786.H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,13 (dd,  7,1, 1,4Гц, 6H), 1,89 (s, 3H), 3,99 (q,  7,1Гц, 1H), 4,10-4,29 (m, 4H), 4,95 - 5,08 (m, 2H), 7,26 (t,  7,4, 1,3Гц, 2H), 7,35 (t,  7,4Гц, 2H), 7,49 (d,  7,2Гц, 1H), 7,66 (t,  7,6Гц, 2H), 7,82 (d,  7,5Гц, 2H), 8,11 (d,  = 7,7Гц, 1H), 8,76 (t,  = 7,0Гц, 1H).
2
+
1
J =
J =
J
J
J
J
J =
J=
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH-OAc (9g): МСВР (M+Na)расч. 476,1792, обнаружено 476,1788. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,21 (dd,  7,1, 1,4Гц, 6H), 1,96 (s, 3H), 4,08 (t,  7,1Гц, 1H), 4,17 - 4,36 (m, 4H), 5,05 -5,14 (m, 2H), 7,26 - 7,38 (m, 2H), 7,42 (t,  = 7,4Гц, 2H), 7,56 (d,  = 7,3Гц, 1H), 7,73 (t,  = 7,6Гц, 2H), 7,90 (d,  = 7,6Гц, 2H), 8,18 (d, 7,8Гц, 1H), 8,83 (t,  6,9Гц, 1H).
2
+
1
J
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH-OAc (9h): МСВР (M+H)расч. 455,4877, обнаружено 455,2051 H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,14 (dd,  = 7,1, 3,3Гц, 6H), 1,21 (d, 7,2Гц, 1H), 1,81 (s, 1H), 1,91 (s, 2H), 4,01 (q,  7,7Гц, 1H), 4,09 - 4,27 (m, 5H), 4,95 - 5,10 (m, 1H), 7,26 (td,  7,4, 1,2Гц, 3H), 7,35 (t,  7,4Гц, 3H), 7,45 (d,  7,6Гц, 1H), 7,65 (t,  7,1Гц, 3H), 7,82 (d,  6,4Гц, 2H), 7,96 (d,  7,4Гц, 1H), 8,78 (t,  7,0Гц, 1H).
Соединения FMoc-пептид-COOH
2
2
n
2
2
2
5
2
Соединения типа FMoc-пептид-NH-CH-S-(CH)-COH получили в качестве примера посредством FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH.
2
2
5
2
2
в вакууме,
J =
J
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
+
1
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10a): 6-меркаптогексановую кислоту (287 мкл, 2,07 ммоль) растворили в растворе TFA:дихлорметан 1:4 (5 мл), затем добавили во флакон, содержащий FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-OAc (178 мг, 0,339 ммоль). Реакции дали возможность протекать при магнитном перемешивании в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 20 мин. Сырой материал концентрировали  перерастворили в минимальном объеме DMF и очистили на колонке C18 30 микрон, с картриджем 30 г, с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты, и линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% более 13 минут при 35 мл/мин. Фракции, содержащие чистый желаемый продукт, заморозили и лиофилизировали с получением 200 мг (выход 96%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M + H) расч. 613,2690; обнаружено 613,2686. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ1,20 (dt,  7,1, 4,9Гц, 10H), 1,31 (tt, = 10,1, 6,0Гц, 2H), 1,49 (dq,  12,5, 7,4Гц, 4H), 2,18 (t,  7,3Гц, 2H),4,05 (t, 7,3Гц, 1H), 4,16 - 4,30 (m, 7H), 7,33 (td,  7,4, 1,2Гц, 2H), 7,42 (td,  7,3, 1,1Гц, 2H), 7,54 (d,  7,4Гц, 1H), 7,72 (t,  7,0Гц, 2H), 7,89 (d,  7,5Гц, 2H), 7,94 - 8,07 (m, 2H), 8,44 (t, 6,1Гц, 1H).
2
2
5
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10b): МСВР (M+Na)расч. 635,2510, обнаружено 635,2515. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,15 (d,  6,8Гц, 3H), 1,18-1,25 (m, 10H), 2,18 (q,  7,5Гц, 4H), 2,40-2,48 (m, 1H), 2,70 (t,  7,2Гц, 1H), 4,15-4,30 (m, 6H), 6,29 (s, 2H), 7,34 (q,  7,3Гц, 3H), 7,42 (t,  7,4Гц, 3H), 7,63 - 7,78 (m, 1H), 7,85 (d,  7,3Гц, 2H), 7,89 (d,  7,5Гц, 3H), 8,37 - 8,46 (m, 1H).
2
2
5
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10c):МСВР (M+Na)расч. 635,2510, обнаружено 635,2514. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,18 - 1,23 (m, 10H), 1,34 (q, 3,4Гц, 5H), 2,24 (s, 2H), 2,44 (s, 2H), 4,05 (t, 7,1Гц, 1H), 4,16 - 4,35 (m, 8H), 7,33 (t,  7,4Гц, 2H), 7,42 (t,  7,5Гц, 2H), 7,58 (d,  7,0Гц, 1H), 7,71 (t,  8,4Гц, 2H), 7,90 (s, 1H), 7,98 (d,  7,5Гц, 1H), 8,15 (d,  7,3Гц, 1H), 8,39 (t,  6,2Гц, 1H), 11,98 (s, 1H).
2
2
5
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10d):МСВР (M+Na)расч. 635,2510, обнаружено 635,2510. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,15 (d,  6,9Гц, 3H), 1,21 (d,  7,1Гц, 9H), 1,28 - 1,38 (m, 3H), 1,44 - 1,60 (m, 5H), 2,13 - 2,22 (m, 3H), 3,33 (q,  6,9Гц, 1H), 4,20 (s, 2H), 6,29 (s, 2H), 7,29 - 7,40 (m, 3H), 7,38 - 7,47 (m, 3H), 7,85 (d,  7,5Гц, 2H), 7,89 (d,  7,5Гц, 2H), 8,26 (d,  7,6Гц, 1H), 8,48 (d,  6,2Гц, 1H).
2
2
5
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10g): МСВР (M+H)расч. 542,2319, обнаружено 542,2316. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,13 (dd,  7,1, 1,7Гц, 6H), 1,16-1,25 (m, 2H), 1,32- 1,47 (m, 4H), 2,08 (t,  7,3Гц, 2H), 3,25 (s, 2H), 3,99 (p,  7,0Гц, 1H), 4,07 - 4,27 (m, 6H), 7,26 (t,  7,4, 1,2Гц, 2H), 7,35 (t,  7,4Гц, 2H), 7,52 (d, 7,0Гц, 1H), 7,65 (t,  7,3Гц, 2H), 7,82 (d,  7,5Гц, 2H), 8,08 (d,  7,7Гц, 1H), 8,27 (t,  6,2Гц, 1H), 11,82 (s, 1H).
2
2
5
2
+
1
J =
J =
J =
J
J
J
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10f): МСВР (M+H)расч. 542,2319, обнаружено 542,2321. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,13 (dd,  7,1, 1,8Гц, 7H), 1,17- 1,26 (m, 2H), 1,32- 1,48 (m, 5H), 2,08 (t,  7,3Гц, 2H), 3,99 (p,  7,1Гц, 1H), 4,07 - 4,26 (m, 7H), 7,26 (t,  = 7,4Гц, 2H), 7,35 (t,  = 7,4Гц, 2H), 7,53 (d,  = 7,1Гц, 1H), 7,65 (t,  7,3Гц, 2H), 7,82 (d,  7,4Гц, 2H), 8,10 (d, 7,7Гц, 1H), 8,28 (t,  6,3Гц, 1H).
2
2
5
2
+
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10h): (16,7мг, 0,031 ммоль, выход 70%). МСВР (M+H)расч. 542,2319, обнаружено 542,2318.
2
2
3
2
+
1
J
J =
J =
J=
J =
J=
J
J =
J =
J
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH(10j):МСВР (M+H)расч.585,2377, обнаружено 585,2367. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,14 - 1,26 (m, 9H), 1,75 (p, = 7,3Гц, 2H), 2,27 (t,  7,3Гц, 2H), 2,54 (d, 7,7Гц, 2H), 3,97 - 4,10 (m, 1H), 4,13- 4,34 (m, 7H), 7,33 (t,  7,5Гц, 2H), 7,42 (t,  7,5Гц, 2H), 7,57 (d,  6,9Гц, 1H), 7,71 (t,  = 8,4Гц, 2H), 7,89 (d,  7,6Гц, 2H), 7,97 (d,  7,5Гц, 1H), 8,14 (d,  = 7,0Гц, 1H), 8,41 (s, 1H), 12,06 (s, 1H).
2
2
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J = 1,1
J =
J =
J =
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COH (10i): МСВР (M+H)расч. 500,1850, обнаружено 500,1843. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ1,20 (dd,  7,2, 1,9Гц, 6H), 2,53 (d,  7,1Гц, 2H), 2,70 (t, 7,1Гц, 2H), 4,07 (q,  7,0Гц, 1H), 4,17 - 4,26 (m, 4H), 4,29 (d, 6,8Гц, 2H), 7,33 (t,  7,4Гц, 2H), 7,41 (t,  7,5Гц, 2H), 7,56 (d, 7,1Гц, 1H), 7,72 (t, Гц, 2H), 7,89 (d,  7,5Гц, 2H), 8,14 (d,  7,6Гц, 1H), 8,42 (t,  6,3Гц, 1H), 12,22 (s, 1H).
Синтез
2
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-OAc (9c):
Стадия 1: FMoc-L-Ala-D-Ala-OtBu (9c1):
2
2
FMoc-L-аланин (10 г, 32,1 ммоль) и D-Ala-OtBu, HC1 (7,00 г, 38,5 ммоль) растворили в CHC1 (100 мл), обработали COMU (20,63 г, 48,2 ммоль) и DIPEA (11,22 мл, 64,2 ммоль). Реакции дали возможность протекать в атмосфере аргона при комнатной температуре. Через 2 часа установили завершение реакции посредством СВЭЖХ, реакционную смесь разбавили 2-MeTHF (50 мл), промыли 10% водной лимонной кислотой (2 x 100 мл), водой (100 мл), а затем солевым раствором (100 мл). Органический слой высушили над сульфатом магния, отфильтровали и концентрировали, чтобы получить сырой FMoc-L-Ala-D-Ala-OtBu, принимая, что выход составил 100%.
Стадия 2: FMoc-L-Ala-D-Ala (9c2)
FMoc-EAla-DAla-OtBu (11,25 г, 25,7 ммоль) обработали TFA:водой (95:5) (50 мл). Реакции дали возможность протекать при комнатной температуре в атмосфере аргона. Через 4 часа установили завершение реакции посредством UPEC, разбавили толуолом (25 мл) и совместно выпарили трижды (3x) с получением FMoc-E-Ala-D-Ala, принимая, что выход составил 100%.
Стадия 3: FMoc-L-Ala-Gly-OtBu
(9c3)
Z-L-Ala-ONHS (10 г, 31,2 ммоль) и трет-бутилглицинат, (6,28 г, 37,5 ммоль) растворили в CH2Cl2 (100 мл), обработали DIPEA (10,91 мл, 62,4 ммоль). Реакции дали возможность протекать в атмосфере аргона при комнатной температуре. Через 2 часа установили завершение реакции посредством СВЭЖХ, реакционную смесь разбавили 2-MeTHF (50 мл), промыли 10% водной лимонной кислотой (100 мл), насыщенным раствором бикарбоната натрия (2 x 100 мл), водой (100 мл), раствором соли (100 мл). Органический слой высушили над сульфатом магния, отфильтровали и концентрировали с получением Z-L-Ala-Gly-OtBu, принимая, что выход составил 100%.
Стадия 4. L-Ala-Gly-OtBu (9c4)
под вакуумом,
Z-Ala-Gly-OtBu (10,05 г, 29,9 ммоль) растворили в MeOH:воде 95:5 (50 мл), перенесли в колбу для гидрогенизации, обработали Pd/C (1,272 г, 11,95 ммоль). Колбу для гидрогенизации поместили на шейкер, воздух удаляли под вакуумом при встряхивании колбы. Колбу заполнили водородом до 30 фунтов/кв.дюйм (2,086 бар), колбу встряхивали в течение 2 минут и водород удалили под вакуумом. Это повторили еще 2 раза. Водороду дали заполнить колбу до 30 фунтов/кв.дюйм (2,086 бар) и допустили встряхивание. Через 4 часа установили завершение реакции посредством СВЭЖХ, реакционную смесь отфильтровали через целитовую пробку,  повторно растворили в 2-MeTHF, концентрировали с получением LAla-Gly-OtBu, принимая, что выход составил 100%.
Стадия 5: FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OtBu (9c5)
2
2
2
2
FMoc-L-Ala-D-ALa-OH (0,959 г, 2,508 ммоль) и L-Ala-Gly-OtBu (0,718 г, 3,01 ммоль) растворили в CHC1 (10 мл), обработали COMU (1,181 г, 2,76 ммоль) и DIPEA (0,876 мл, 5,02 ммоль). Реакции дали возможность протекать в атмосфере аргона при комнатной температуре. Через 2 часа установили завершение реакции. Рекционную смесь концентрировали для удаления CHC1, повторно растворили в 2мл DMF и очистили на C18 CombiFlash с использованием линейного градиента, продукт объединили с получением FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OtBu (660 мг, выход 46%).
Стадия 6. FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH (9c6)
FMoc-LAla-DAla-LAla-GlyOtBu (200 мг, 0,353 ммоль) обработали TFA : водой (95:5) (2 мл). Реакции дали возможность протекать в атмосфере аргона при комнатной температуре. Через 1 час установили завершение реакции посредством СВЭЖХ, разбавили толуолом (1 мл), совместно выпарили дважды (2x) с толуолом с получением FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH, принимая, что выход составил 100%.
Стадия
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH
-OAc (9c7)
2
7.
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH (2,65 г, 5,19 ммоль) растворили в DMF (20мл), обработали ацетатом меди (II) (0,094 г, 0,519 ммоль) и уксусной кислотой (0,446 мл, 7,79 ммоль). После того как все реагенты были растворены, реакционную смесь обработали тетраацетатом свинца (3,45 г, 7,785 ммоль). Реакции дали возможность протекать в атмосфере аргона при 60°C в течение 30 минут. Сырую реакционную смесь очистили через CombiFlash Rf 200i с использованием колонки C18 450 г с расходом 125 мл/мин с деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и ацетoнитрил в качестве растворителей с использованием градиента, как указано ниже (время в минутах, процентная доля ацетoнитрила) (0,5) (8,50) (26,55). Желаемый продукт, имеющий время удерживания 11 минут, фракции продукта сразу же заморозили и лиофилизировали с получением FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH-OAc (843 мг, 1,607 ммоль, выход 31,0%). МСВР (M+Na) расч. 547,2163, обнаружено 547,2167. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 1,23 (dd,  12,5,7,4Гц, 9H), 1,95 (s, 2H), 4,00-4,13 (m, 1H), 4,17 - 4,38 (m, 6H), 5,06 (q,  8,8Гц, 2H), 7,33 (t,  7,3Гц, 2H), 7,42 (t,  7,4Гц, 2H), 7,62 (d,  6,8Гц, 1H), 7,71 (t,  8,6Гц, 2H), 7,85 - 8,01 (m, 3H), 8,21 (d,  7,0Гц, 1H), 8,69 (d,  6,9Гц, 1H).
Соединения FMoc-пептид-May-NMA
2
2
n
2
2
2
5
Соединения типа FMoc-пептид-NH-CH-S-(CH)-CO-DM получили в качестве примера посредством FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM.
2
2
2
2
5
+
1
J =
J
J
J =
J =
J=
J=
J =
J =
J =
J =
J =
J=
J =
J =
J =
J =
J = 7,5
J=
J=
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)5-CO-DM (11a): В базовый раствор DM-H (8,2 мл, 0,49 ммоль) добавили FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-COOH (300 мг, 0,49 ммоль), EDC (94 мг, 0,490 ммоль) и DIPEA (90 мкл, 0,49 ммоль). Реакции дали возможность протекать при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 2 ч. Сырой материал концентрировали посредством ротационного выпаривания под вакуумом и остаток поместили в минимальный объем DMF, затем очистили на C18, 30 микрон, с картриджем 30 г с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 50% в течение 25 мин. Фракции, содержащие чистый желаемый продукт, заморозили и лиофилизировали с получением 151 мг (выход 37,2%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M + Na)расч. 1266,5170; обнаружено 1266,5141. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,77 (s, 3H), 1,12 (d, 6,4Гц, 3H), 1,14-1,22 (m, 12H), 1,22- 1,30 (m, 3H), 1,35- 1,49 (m, 4H), 1,50-1,55 (m, 1H), 1,59 (s, 3H), 2,00 - 2,07 (m, 1H), 2,14 (ddd,  = 15,6, 8,7, 5,9Гц, 1H), 2,40 (dtd, = 17,0, 7,9, 7,0, 4,9Гц, 3H), 2,69 (s, 3H), 2,79 (d,  9,6Гц, 1H), 3,08 (s, 3H), 3,20 (d, 12,6Гц, 1H), 3,24 (s, 3H), 3,43 (d,  12,4Гц, 2H), 3,48 (d,  8,9Гц, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,08 (ddd,  20,8, 10,8, 5,0Гц, 3H), 4,14 - 4,24 (m, 4H), 4,26 (d,  6,0Гц, 3H), 4,52 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,34 (q,  6,7Гц, 1H), 5,56 (dd,  14,7, 9,0Гц, 1H), 5,91 (s, 1H), 6,50-6,66 (m, 3H), 6,88 (s, 1H), 7,17 (d,  1,8Гц, 1H), 7,33 (td, 7,5, 1,2Гц, 2H), 7,41 (t,  7,4Гц, 2H), 7,53 (d,  7,4Гц, 1H), 7,72 (t,  7,0Гц, 2H), 7,89 (d, Гц, 3H), 7,99 (d,  7,3Гц, 1H), 8,36 (t,  6,3Гц, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J = 6,8
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11b): МСВР (M+Na) расч. 1266,5170, обнаружено 1266,5164. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,78 (s, 3H), 1,14 (dd, 14,6, 6,5 Гц, 6H), 1,22 (t,  Гц, 10H), 1,33 - 1,57 (m, 4H), 1,59 (s, 3H), 2,04 (d, 13,5 Гц, 1H), 2,27 - 2,44 (m, 1H), 2,69 (s, 3H), 2,80 (d,  9,7 Гц, 1H), 3,08 (s, 3H), 3,14 - 3,28 (m, 5H), 3,37 - 3,55 (m, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,98 - 4,16 (m, 3H), 4,20 (dd,  15,6, 7,6 Гц, 7H), 4,52 (d,  12,7 Гц, 1H), 5,34 (d,  6,9 Гц, 1H), 5,57 (dd,  14,7, 9,0 Гц, 1H), 5,92 (s, 1H), 6,46 - 6,72 (m, 4H), 6,88 (s, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,33 (t,  7,5 Гц, 3H), 7,41 (t,  7,4 Гц, 3H), 7,60 - 7,75 (m, 4H), 7,80 - 7,93 (m, 4H), 8,12 (t, 1H), 8,29 (d,  6,9 Гц, 1H).
2
2
5
+
1
J = 5,8
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11c): МСВР (M+Na)расч. 1266,5170, обнаружено 1266,5170. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,96 - 1,16 (m, 10H), 1,16-1,51 (m, 10H), 1,52 (s, 4H), 1,82-2,16 (m, 1H), 2,17 - 2,56 (m, 11H), 2,62 (d, Гц, 4H), 2,68 - 2,87 (m, 3H), 2,92 - 3,04 (m, 4H), 3,09 - 3,22 (m, 7H), 3,24 (d, 7,4Гц, 1H), 3,33 - 3,50 (m, 2H), 3,73 - 3,89 (m, 4H), 3,92 - 4,07 (m, 2H), 4,07 - 4,25 (m, 2H), 4,45 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,40 - 5,55 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,33 - 6,66 (m, 4H), 6,81 (s, 2H), 7,03 - 7,19 (m, 1H), 7,19 - 7,43 (m, 2H), 7,62 (d, 11,6Гц, 1H), 7,73-7,85 (m, 1H).
2
2
5
+
1
,3
J =
J =
J=
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11d): МСВР (M+Na) расч. 1266,5170, обнаружено 1266,5158. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ,7,0,3,4Гц,5,9,2,3,4,5,8Гц,6,8,6Гц,0,2,3– 3,52 (m, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,99 - 4,40 (m, 4H), 4,52 (d,  11,1 Гц, 1H), 5,34 (d,  6,8 Гц, 1H), 5,57 (dd,  14,5, 9,2 Гц, 1H), 5,92 (s, 1H), 6,53 - 6,64 (m, 2H), 6,88 (s, 2H), 7,17 (d, 1,9 Гц, 1H), 7,33 (t,  7,3 Гц, 3H), 7,42 (t,  7,4 Гц, 3H), 7,57 (d,  7,4 Гц, 1H), 7,72 (s, 3H), 7,89 (d,  7,6 Гц, 3H), 7,99 (d,  7,6 Гц, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,35 (s, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11g): МСВР (M+H)расч. 1173,4980, обнаружено 1173,4964. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,79 (s, 3H), 1,06 - 1,34 (m, 13H), 1,36 -1,54 (m, 4H), 1,60 (s, 2H), 1,88-2,10 (m, 1H), 2,10 - 2,23 (m, 1H), 2,31 - 2,51 (m, 13H), 2,71 (s, 3H), 2,80 (d,  9,6Гц, 1H), 3,10 (s, 3H), 3,26 (s, 4H), 3,33 - 3,66 (m, 3H), 3,98 - 4,32 (m, 4H), 4,53 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,35 (q,  6,7Гц, 1H), 5,49 - 5,65 (m, 1H), 6,51 - 6,67 (m, 3H), 6,89 (s, 1H), 7,19 (d,  1,8Гц, 1H), 8,25 (s, 2H), 8,34 (d,  7,1Гц, 1H), 8,58 (t, 6,3Гц, 1H).
2
2
5
+
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11f):МСВР (M+H)расч. 1173,4980, обнаружено 1173,4969.
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J=
J =
J =
J =
J
J =
J =
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11h): МСВР (M+Na)расч. 1195,4907, обнаружено 1195,4799. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,71 (s, 3H), 1,00 - 1,22 (m, 13H), 1,28 - 1,45 (m, 2H), 1,52 (s, 3H), 1,91-2,14 (m, 1H), 2,26 (t,  1,9Гц, 5H), 2,48 (t,  1,8Гц, 2H), 2,62 (s, 3H), 2,66 - 2,77 (m, 2H), 3,01 (s, 2H), 3,10 - 3,21 (m, 5H), 3,28 - 3,47 (m, 2H), 3,86 (d,  6,7Гц, 4H), 3,93 - 4,25 (m, 10H), 4,37 - 4,54 (m, 1H), 5,27 (d,  6,7Гц, 1H), 5,40-5,56 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,31-6,66 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d,  1,8Гц, 1H), 7,26 (t,  7,4Гц, 2H), 7,35 (t,  7,4Гц, 2H), 7,45 (d,  7,5Гц, 1H), 7,65 (t,  = 7,1Гц, 2H), 7,82 (d,  7,5Гц, 2H), 7,89 (d,  7,3Гц, 1H).
2
2
3
+
1
J =
J =
J =
J =
J=
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11j): МСВР (M+H)расч. 1216,5038, обнаружено 1216,4999. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,78 (s, 3H), 0,95 - 1,29 (m, 16H), 1,37 (d,  3,4Гц, 1H), 1,46 (t,  12,5Гц, 2H), 1,59 (s, 3H), 1,62 - 1,90 (m, 1H), 1,99 - 2,07 (m, 1H), 2,08 (s, 2H), 2,18 - 2,43 (m, 1H), 2,50 - 2,59 (m, 1H), 2,69 (s, 3H), 2,73 - 2,83 (m, 1H), 3,10 (s, 2H), 3,25 (s, 3H), 3,38 - 3,55 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,99 - 4,13 (m, 4H), 4,12 - 4,35 (m, 7H), 4,52 (dd,  12,0, 2,9Гц, 1H), 5,34 (q,  6,7Гц, 1H), 5,48 - 5,65 (m, 1H), 5,92 (s, 1H), 6,48 - 6,70 (m, 3H), 6,88 (s, 1H), 7,17 (d,  1,7Гц, 1H), 7,33 (t,  7,5Гц, 2H), 7,41 (t,  7,4Гц, 2H), 7,58 (d,  7,0Гц, 1H), 7,71 (t,  8,3Гц, 2H), 7,89 (d,  7,5Гц, 3H), 7,95 (d, 7,6Гц, 1H), 8,15 (d,  7,2Гц, 1H), 8,29-8,38 (m, 1H), 8,41 (s, 1H).
2
2
2
+
1
J=
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (11i): МСВР (M+H)расч. 1131,4510, обнаружено 1131,4507.H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,76 (s, 3H), 1,08 - 1,21 (m, 12H), 1,24 (d,  13,9Гц, 1H), 1,38- 1,52 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 1,99-2,09 (m, 1H), 2,33 - 2,44 (m, 1H), 2,68 (s, 3H), 2,80 (dd,  14,4, 8,6Гц, 2H), 3,08 (s, 3H), 3,17 (d,  12,5Гц, 1H), 3,23 (s, 3H), 3,46 (t,  10,3Гц, 2H), 3,91 (s, 3H), 4,00 - 4,13 (m, 3H), 4,13 - 4,34 (m, 5H), 4,52 (dd,  12,0, 2,9Гц, 1H), 5,30 (q,  6,8Гц, 1H), 5,55 (dd, 13,4, 9,1Гц, 1H), 5,91 (s, 1H), 6,55 (dd,  7,4, 5,7Гц, 3H), 6,87 (s, 1H), 7,16 (d,  1,8Гц, 1H), 7,32 (tt, 7,4, 1,5 Гц, 2H), 7,41 (tt,  7,5, 1,5Гц, 2H), 7,57 (d,  7,0Гц, 1H), 7,71 (dd,  10,5, 7,5Гц, 2H), 7,88 (d,  7,5Гц, 2H), 8,14 (d,  7,6Гц, 1H), 8,37 (t,  6,3Гц, 1H).
Амино-пептид-майтанзиноиды
2
2
2
2
2
2
2
5
Соединения типа HN-пептид-NH-CH-S-(CH)n-CO-DM получили в качестве примера посредством HN-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM.
2
2
2
5
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HN-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12a): FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (151 мг, 0,121 ммоль) обработали 20% морфолиномв DMF (2 мл). Реакции дали возможность протекатьпри перемешивании магнитной мешалкой в атмосфере аргонапри комнатной температурев течение 1 ч. Сырой материал очистили наколонке с картриджем C18, 30 микро, 150 г с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрилаот 5% до 50% в течение 26 мин. Фракции, содержащиежелаемыйпродукт, сразу же заморозили и лиофилизировалис получением 46 мг (выход 37,1%) бесцветного масла. МСВР (M + H)расч. 1022,4670; обнаружено 1022,4669. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,78 (s, 3H), 1,12 (d, 6,3Гц, 3H), 1,13-1,21 (m, 10H), 1,21 - 1,31 (m, 3H), 1,37- 1,50 (m, 4H), 1,51- 1,57 (m, 1H), 1,59 (s, 3H), 2,04 (dd,  14,4, 2,8Гц, 1H), 2,15 (ddd,  15,9, 8,7, 6,0Гц, 1H), 2,38 (td,  7,0, 3,6Гц, 2H), 2,70 (s, 3H), 2,79 (d,  9,6Гц, 1H), 3,09 (s, 3H), 3,21 (d,  12,5Гц, 1H), 3,25 (s, 3H), 3,33-3,55 (m, 8H), 3,93 (s, 3H), 4,01 - 4,33 (m, 5H),4,52(dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,34 (q,  6,7Гц, 1H), 5,57 (dd,  14,6, 9,0Гц, 1H), 5,95 (s, 1H), 6,48-6,65 (m, 3H), 6,89 (s, 1H), 7,18 (d,  1,8Гц, 1H), 8,07 (d,  7,5Гц, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,40 (t,  6,3Гц, 1H).
2
2
2
5
+
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HN-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12b): МСВР (M+H) расч. 1022,4670, обнаружено 1022,4675. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,05 (dd,  6,7, 3,1Гц, 7H), 1,08-1,16 (m, 10H), 1,19 (t,  8,1 Гц, 3H), 1,30- 1,50 (m, 6H), 1,52 (s, 3H), 1,97 (d,  13,3 Гц, 1H), 2,01 - 2,21 (m, 2H), 2,34 (s, 3H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d, 9,8 Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,14 (d,  12,5 Гц, 1H), 3,33 - 3,48 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,95 - 4,23 (m, 7H), 4,45 (dd,  13,1 Гц, 1H), 5,27 (q,  6,8 Гц, 1H), 5,41 - 5,58 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,39-6,63 (m, 4H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,8 Гц, 1H), 8,02 (s, 1H), 8,13 (d, 7,7 Гц, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,36 (t,  6,2 Гц, 1H).
2
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HN-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12c): МСВР (M+H) расч. 1022,4670, обнаружено 1022,4680. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,01 - 1,26 (m, 19H), 1,25- 1,50 (m, 6H), 1,52 (s, 3H), 1,97 (d,  13,7 Гц, 1H), 2,02-2,22 (m, 1H), 2,35 (dd,  17,2, 9,5 Гц, 2H), 2,47 (d,  11,5 Гц, 1H), 2,63 (s, 4H), 2,73 (d,  9,6 Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,10 - 3,24 (m, 6H), 3,32 - 3,50 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,95 - 4,18 (m, 4H), 4,45 (dd,  12,1, 2,6 Гц, 1H), 5,27 (q,  6,9 Гц, 1H), 5,44 - 5,55 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,42 - 6,59 (m, 4H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,7 Гц, 1H), 8,02 (s, 1H), 8,13 (d,  7,7 Гц, 1H), 8,36 (t,  6,3 Гц, 1H).
2
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J=
J =
J =
HN-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12d): МСВР (M+H)расч. 1022,4670, обнаружено 1022,4675. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,98 - 1,14 (m, 13H), 1,14 - 1,26 (m, 2H), 1,30 - 1,49 (m, 4H), 1,52 (s, 3H), 2,24 - 2,41 (m, 2H), 2,44 (d,  1,8Гц, 16H), 2,63 (s, 2H), 2,73 (d,  9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 2H), 3,08 - 3,21 (m, 4H), 3,32 - 3,49 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,92 - 4,23 (m, 3H), 4,45 (d,  11,8Гц, 1H), 5,26 (t,  6,7Гц, 1H), 5,40-5,57 (m, 1H), 5,86 (s, 1H), 6,41-6,66 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,7Гц, 1H), 8,02 (s, 1H), 8,10 (d,  7,7Гц, 1H), 8,35 (t,  6,3Гц, 1H).
2
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J
HN-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12g):МСВР (M+H)расч. 951,4299, обнаружено 951,4289. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,79 (s, 3H), 1,06 - 1,34 (m, 13H), 1,36 - 1,54 (m, 4H), 1,60 (s, 2H), 1,88 - 2,10 (m, 1H), 2,10 - 2,23 (m, 1H), 2,31 - 2,51 (m, 13H), 2,71 (s, 3H), 2,80 (d,  9,6Гц, 1H), 3,10 (s, 3H), 3,26 (s, 4H), 3,33 - 3,66 (m, 3H), 3,98 - 4,32 (m, 4H), 4,53 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,35 (q,  6,7Гц, 1H), 5,49 - 5,65 (m, 1H), 6,51 - 6,67 (m, 3H), 6,89 (s, 1H), 7,19 (d,  1,8Гц, 1H), 8,25 (s, 2H), 8,34 (d,  7,1Гц, 1H), 8,58 (t,  =6,3Гц, 1H).
2
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HN-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12f):МСВР (M+H)расч. 951,4226, обнаружено 951,1299. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,00-1,13 (m, 11H), 1,19 (t,  8,9Гц, 3H), 1,29- 1,45 (m, 4H), 1,52 (s, 3H), 1,92-2,03 (m, 1H), 2,07 (dd,15,7, 8,7Гц, 1H), 2,23 - 2,39 (m, 1H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,7Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,07 -3,32 (m, 14H), 3,34 - 3,47 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,95 - 4,21 (m, 4H), 4,45 (dd, 11,9, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,8Гц, 1H), 5,50 (dd,  14,7, 9,0Гц, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,40 - 6,61 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,8Гц, 1H), 8,41 (t, 6,1Гц, 1H).
2
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HN-D-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12h): МСВР (M+H)расч. 950,4226, обнаружено 951,4299. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,96 - 1,14 (m, 14H), 1,19 (t,  8,9Гц, 3H), 1,38 (q,  10,5, 7,0Гц, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,88-2,02 (m, 1H), 2,02- 2,18 (m, 1H), 2,22-2,41 (m, 2H), 2,48 (s, 1H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,08 - 3,22 (m, 4H), 3,34 - 3,48 (m, 2H), 3,86 (s, 4H), 3,95 - 4,23 (m, 5H), 4,45 (dd,  11,9, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q, 6,7Гц, 1H), 5,41 - 5,60 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,40-6,65 (m, 4H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,8Гц, 1H), 8,44 (t, 6,1Гц, 1H).
2
2
2
3
+
HN-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12j): МСВР (M+H)расч. 994,4357, обнаружено 994,4330.
2
2
2
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J=
J =
HN-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (12i):МСВР (M+H)расч. 909,3830, обнаружено 909,3826. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,77 (s, 3H), 1,12 (d,  6,7Гц, 6H), 1,17 (dd, 7,0, 5,2Гц, 6H), 1,25 (d, 13,3Гц, 1H), 1,40-1,51 (m, 2H), 1,59 (s, 3H), 2,04 (dd,  14,4, 2,9Гц, 1H), 2,41 (ddt, 18,6, 10,1, 5,4Гц, 1H), 2,61 - 2,70 (m, 1H), 2,72 (s, 3H), 2,76 - 2,90 (m, 3H), 3,09 (s, 3H), 3,20 (d,  12,4Гц, 1H), 3,25 (s, 3H), 3,33 (q,  6,9Гц, 1H), 3,39 - 3,64 (m, 3H), 3,93 (s, 3H), 4,03 -4,16 (m, 2H), 4,24 (dt, 15,1, 7,6 Гц, 2H), 4,53 (dd,  12,0, 2,9Гц, 1H), 5,32 (q,  6,8Гц, 1H), 5,51 - 5,64 (m, 1H), 5,93 (s, 1H), 6,49-6,62 (m, 2H), 6,88 (s, 1H), 7,19 (d,  1,8Гц, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,55 (t, 6,3Гц, 1H).
SPDB-пептид-майтанзиноиды
2
2
n
2
2
2
5
Соединения типа SPDB-пептид-NH-CH-S-(CH)-CO-DM получили в качестве примера посредством SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM.
2
2
5
2
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13a): HN-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (46 мг, 0,045 ммоль) растворили в DMF (2 мл), к которому добавили SPDB (14,7мг, 0,045 ммоль) и проводили реакцию при комнатной температуре при магнитном перемешивании в атмосфере аргона в течение 1 ч. Сырой материал очистили на C18, 430 микро, с картриджем30 г с элюированием деионизированной водой, содержащей0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 35 мин. Фракции, содержащие чистый желаемый продукт, заморозили и лиофилизировали с получением 38 мг, (выход 68,5%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M + H)расч. 1233,4796; обнаружено 1233,4783. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,78 (s, 3H), 1,12 (d, 6,4Гц, 3H), 1,14-1,21 (m, 10H), 1,22- 1,30 (m, 3H), 1,44 (qd, 10,2, 4,5Гц, 5H), 1,50 - 1,56 (m, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,84 (p,  7,3Гц, 2H), 2,04 (dd,  14,4, 2,7Гц, 1H), 2,15 (ddd,  15,8, 8,6, 5,9Гц, 2H), 2,24 (t,  7,2Гц, 2H), 2,39 (dtdd,  18,1, 13,2, 8,1, 4,7Гц, 3H), 2,70 (s, 3H), 2,76 - 2,86 (m, 3H), 3,09 (s, 3H), 3,21 (d,  12,5Гц, 1H), 3,25 (s, 3H), 3,43 (d,  12,4Гц, 1H), 3,48 (d,  9,0Гц, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,13 (s, 2H), 4,19 (h,  6,6Гц, 4H), 4,52 (dd,  12,1, 2,8Гц, 1H), 5,34 (q,  6,8Гц, 1H), 5,56 (dd,  14,7, 9,0Гц, 1H), 5,92 (s, 1H), 6,49 - 6,66 (m, 3H), 6,85 - 6,97 (m, 2H), 7,18 (d, 1,8Гц, 1H), 7,23 (ddd, 7,3, 4,8, 1,2Гц, 1H), 7,76 (dt, 8,1, 1,2Гц, 1H), 7,78 - 7,91 (m, 2H), 8,00 (d,  7,1Гц, 1H), 8,09 (d,  7,0Гц, 1H), 8,33 (t,  6,3Гц, 1H), 8,44 (dt,  4,7, 1,3Гц, 1H), 8,50 (s, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J
J
J
SPDB-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13b): МСВР (M+H)расч. 1233,4796, обнаружено 1233,4799. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,01 - 1,22 (m, 13H), 1,27- 1,45 (m, 2H), 1,52 (s, 3H), 1,91-2,16 (m, 1H), 2,26 (d, 7,4Гц, 7H), 2,26 (t,  1,9Гц, 4H), 2,48 (t, 1,8Гц, 2H), 2,57 - 2,65 (m, 3H), 2,65 - 2,77 (m, 2H), 3,01 (s, 2H), 3,13 (d,  12,2Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,32 - 3,47 (m, 2H), 3,86 (d,  6,7Гц, 4H), 3,93-4,11 (m, 3H), 4,18 (t,  11,2Гц, 7H), 4,39 - 4,50 (m, 1H), 5,27 (d,  6,7Гц, 1H), 5,50 (dd,  14,7, 8,8Гц, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,37 - 6,61 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d, 1,8 Гц, 1H), 7,26 (t,  7,4Гц, 2H), 7,35 (t,  7,4Гц, 2H), 7,45 (d,  7,5Гц, 1H), 7,65 (t,  = 7,1Гц, 2H), 7,82 (d,  = 7,5Гц, 2H), 7,89 (d,  = 7,3Гц, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J=
J =
J =
J
J =
J =
SPDB-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13c): МСВР (M+H)расч. 1233,4796, обнаружено 1233,4795. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,02 - 1,25 (m, 18H), 1,29- 1,50 (m, 6H), 1,52 (s, 3H), 1,70- 1,87 (m, 2H), 1,87 - 2,14 (m, 2H), 2,13 - 2,22 (m, 2H), 2,27 - 2,40 (m, 3H), 2,63 (s, 3H), 2,69-2,84 (m, 4H), 3,02 (s, 3H), 3,14 (d, 12,3Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,32 - 3,45 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,95 - 4,07 (m, 2H), 4,07 - 4,19 (m, 4H), 4,45 (dd,  11,9, 2,7Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44 - 5,55 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,42 - 6,59 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,13-7,19 (m, 1H), 7,68 (d,  8,2, 2,7 Гц, 1H), 7,72 - 7,80 (m, 1H), 7,88 (t,  6,6Гц, 1H), 8,04 (d,  6,4Гц, 1H), 8,09 (d, = 7,4Гц, 1H), 8,25 (t,  6,3Гц, 1H), 8,37 (dd,  5,0, 1,9Гц, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
SPDB-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13d): МСВР (M+H)расч. 1233,4796, обнаружено 1233,4797. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,72 (d,  3,3Гц, 3H), 0,98- 1,28 (m, 22H), 1,30- 1,46 (m, 3H), 1,53 (s, 3H), 1,78 (q,  7,1Гц, 2H), 1,86-2,16 (m, 2H), 2,19 (q,  7,4, 5,6Гц, 2H), 2,26-2,41 (m, 2H), 2,41 - 2,55 (m, 4H), 2,64 (d, 3,2Гц, 2H), 2,81-2,92 (m, 1H), 3,02 (s, 2H), 3,14 (d,  12,0Гц, 1H), 3,26 (s, 1H), 3,31- 3,48 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,97 - 4,30 (m, 7H), 4,46 (dd,  11,8, 3,2Гц, 1H), 5,24 - 5,36 (m, 1H), 5,45-5,62 (m, 1H), 5,86 (s, 1H), 6,40-6,65 (m, 3H), 6,82 (d,  3,4Гц, 1H),7,11 (d,  3,2Гц, 1H), 7,18 (d,  12,1, 6,1, 4,9Гц, 2H), 7,69 (d, 8,1Гц, 1H), 7,75 (t,7,6Гц, 2H), 7,89 (d,  7,8, 3,2Гц, 1H), 7,95 - 8,04 (m, 2H), 8,26 (d,  6,1Гц, 1H), 8,33 - 8,47 (m, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
SPDB-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13g):МСВР (M+H)расч. 1162,4425, обнаружено 1162,4405. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,08 (dt,  13,9, 6,9Гц, 15H), 1,15-1,25 (m, 3H), 1,28- 1,44 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,77 (p,  7,2Гц, 2H), 1,91- 2,02 (m, 1H), 2,02 - 2,13 (m, 1H), 2,17 (t,  7,2Гц, 2H), 2,22 - 2,40 (m, 2H), 2,63 (s, 3H), 2,68 - 2,80 (m, 3H), 3,02 (s, 3H), 3,13 (d,  12,3Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,33 - 3,45 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,95-4,16 (m, 5H), 4,45 (dd,  12,1, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44-5,56 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,43 -6,60 (m, 3H), 6,82 (s, 1H), 7,11 (d,  1,8Гц, 1H), 7,12-7,18 (m, 1H), 7,65 - 7,79 (m, 2H), 8,06 - 8,16 (m, 2H), 8,30 (t,  6,3Гц, 1H), 8,35 - 8,40 (m, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J=
J=
J =
J
J =
J =
J =
SPDB-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13f):МСВР (M+H)расч. 1162,4399, обнаружено 1162,455. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,02 - 1,13 (m, 12H), 1,14 - 1,25 (m, 3H), 1,31 - 1,44 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,77 (p, 7,3Гц, 2H), 1,97 (d, 14,3, 2,7 Гц, 1H), 2,02 -2,13 (m, 1H), 2,17 (t,  7,2Гц, 2H), 2,28 - 2,40 (m, 3H), 2,43 (m,  3,2Гц, 3H), 2,63 (s, 3H), 2,69 - 2,80 (m, 3H), 3,02 (s, 3H), 3,13 (d,  12,4Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,39 (dd,  21,0, 10,7Гц, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,96 - 4,18 (m, 5H), 4,45 (dd,  12,1, 2,8 Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,45 - 5,55 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,43 - 6,60 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,10 (d,  1,8Гц, 1H), 7,16 (t,  = 7,2, 4,9Гц, 1H), 7,68 (d, 8,1Гц, 1H), 7,71-7,79 (m, 1H), 8,02 - 8,15 (m, 2H), 8,28 (t,  6,3Гц, 1H), 8,37 (d,  4,8, 1,7Гц, 1H).
2
2
5
+
1
J =
J
J =
J =
J =
J =
J =
J =
SPDB-D-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13h): МСВР (M+H)расч. 1162,4399, обнаружено 1162,455. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,02-1,16 (m, 13H), 1,14- 1,25 (m, 3H), 1,28- 1,49 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,77 (p,  7,2Гц, 2H), 1,92 - 2,14 (m, 2H), 2,17 (t,  = 7,2Гц, 2H), 2,23 - 2,40 (m, 2H), 2,46 - 2,54 (m, 1H), 2,63 (s, 3H), 2,65 - 2,85 (m, 4H), 3,02 (s, 3H), 3,03 - 3,16 (m, 2H), 3,18 (s, 3H), 3,28 - 3,45 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,95-4,20 (m, 5H), 4,45 (dd,  12,1, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44 - 5,55 (m, 1H), 5,82 - 5,88 (m, 1H), 6,42 - 6,59 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d,  1,9Гц, 1H), 7,14 - 7,20 (m, 1H), 7,67 - 7,72 (m, 1H), 7,72 - 7,80 (m, 1H), 7,88 (d,  7,6Гц, 1H), 7,99 (d,  7,1Гц, 1H), 8,28 (t,  6,3Гц, 1H), 8,35 - 8,40 (m, 1H).
2
2
3
+
1
J =
J =
J =
J =
SPDB-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13j): МСВР (M+H)расч.1203,4337, обнаружено 1203,4315. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,94 - 1,24 (m, 20H), 1,38 (s, 3H), 1,52 (s, 3H), 1,57- 1,87 (m, 1H), 1,89-2,08 (m, 1H), 2,26 (t, 15,1Гц, 1H), 2,50 (d,  5,2Гц, 2H), 2,54 - 2,79 (m, 7H), 3,05 (d,  3,8Гц, 3H), 3,18 (s, 5H), 3,29 - 3,46 (m, 3H), 3,86 (d,  6,1Гц, 4H), 4,00 (s, 3H), 4,05 - 4,24 (m, 4H), 4,33 - 4,54 (m, 1H), 5,17 - 5,38 (m, 1H), 5,39 - 5,58 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,29 - 6,58 (m, 4H), 6,63 (s, 1H), 6,81 (s, 1H), 7,04 - 7,19 (m, 1H), 7,90 (s, 1H), 8,14 - 8,39 (m, 1H), 8,45 (s, 1H).
2
2
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
SPDB-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (13i):МСВР (M+H)расч. 1120,3955, обнаружено 1120,3951. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,74 - 0,82 (m, 3H), 1,10 - 1,22 (m, 13H), 1,25 (d,  14,1Гц, 1H), 1,46 (t, 10,9Гц, 2H), 1,56- 1,63 (m, 3H), 1,85 (ddd,  14,4, 9,0, 5,1Гц, 2H), 2,00 (ddd,  14,7, 9,3, 5,4Гц, 9H), 2,24 (dt,  10,8, 5,0Гц, 2H), 2,72 (d,  3,6Гц, 2H), 2,94 (dq,  10,7, 7,2, 5,7Гц, 9H), 3,10 (d,  3,7Гц, 3H), 3,20 (d,  3,4Гц, 1H), 3,25 (d,  3,6Гц, 3H), 3,32 (d,  3,7Гц, 1H), 3,47 (td,  10,7, 10,0, 3,8 Гц, 2H), 3,93 (t,  4,6Гц, 3H), 4,02 - 4,25 (m, 6H), 4,49 - 4,57 (m, 1H), 5,28 - 5,37 (m, 1H), 5,53 - 5,62 (m, 1H), 5,92 (d,  3,6Гц, 1H), 6,57 (q,  5,4, 4,5Гц, 3H), 6,85 - 6,93 (m, 1H), 7,17 (d,  3,3Гц, 1H), 7,25 (dq,  8,0, 4,9Гц, 6H), 7,72-7,87 (m, 11H), 8,16 (dt,  15,4, 4,9Гц, 2H), 8,45 (tt,  9,9, 5,9Гц, 6H).
Тио-пептид-майтанзиноиды
2
3
2
2
n
2
2
3
2
2
5
Соединения типа HS-(CH)CO-пептид-NH-CH-S-(CH)-CO-DM получили в качестве примера посредством HS-(CH)CO-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM.
2
2
2
5
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)3CO-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14a): SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (38 мг, 0,031 ммоль) растворили в DMSO (1 мл) к которому добавили раствор DTT (19 мг, 0,12 ммоль) в 100 мМ фосфата калия, 2 мM буфера EDTA pH 7,5 (1 мл). Реакции дали возможность протекать при комнатной температуре при перемешивании магнитной мешалкой в атмосфере аргона в течение 1 ч. Сырую реакционную смесь очистили на C18, 30 микрон, с картриджем 30 г с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 35 мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, сразу же заморозили и лиофилизировали с получением 18,2 мг, (выход 52,5%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M + H) расч. 1124,4809; обнаружено обнаружено 1124,4798. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,78 (s, 3H), 1,12 (d, 6,4Гц, 3H), 1,14-1,21 (m, 10H), 1,22- 1,30 (m, 3H), 1,37- 1,50 (m, 5H), 1,51 - 1,57 (m, 1H), 1,59 (s, 3H), 1,74 (p,  7,2Гц, 2H), 2,04 (dd,  14,4, 2,8 Гц, 1H), 2,09-2,18 (m, 1H), 2,18-2,24 (m, 2H), 2,27 (t,  7,6Гц, 1H), 2,38 (td,  7,1, 4,7Гц, 2H), 2,44 (t,  7,3Гц, 2H), 2,70 (s, 3H), 2,79 (d,  9,6Гц, 1H), 3,09 (s, 3H), 3,21 (d,  12,6Гц, 1H), 3,25 (s, 3H), 3,43 (d,  12,4Гц, 1H), 3,49 (d,  9,0Гц, 1H), 3,93 (s, 3H), 4,08 (ddd,  21,6, 11,4, 4,1Гц, 2H), 4,13-4,28 (m, 4H), 4,52 (dd, 12,1, 2,8 Гц, 1H), 5,34 (q,  6,7Гц, 1H), 5,56 (dd,  14,7, 9,0Гц, 1H), 5,91 (d,  1,4Гц, 1H), 6,48 - 6,66 (m, 3H), 6,88 (s, 1H), 7,18 (d,  1,8Гц, 1H), 7,86 (d,  7,5Гц, 1H), 7,96 (d,  7,3Гц, 1H), 8,05 (d,  7,1Гц, 1H), 8,33 (t,  6,3Гц, 1H).
2
3
2
2
5
+
1
J =
J = 9,6
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)CO-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14b):МСВР (M+Na)расч. 1146,4629, обнаружено 1146,4591. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,03 - 1,25 (m, 19H), 1,30- 1,45 (m, 6H), 1,52 (s, 4H), 1,65 (p,7,3Гц, 2H), 1,91-2,02 (m, 1H), 2,02 -2,13 (m, 1H), 2,12 - 2,19 (m, 4H), 2,29 - 2,39 (m, 4H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d, Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,14 (d,  12,5Гц, 1H), 3,33 - 3,47 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 4,01 (td,  10,4, 9,7, 4,3Гц, 2H), 4,04-4,16 (m, 5H), 4,45 (dd,  12,0, 2,9Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,43 -5,56 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,38 - 6,61 (m, 4H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d,  1,8Гц, 1H), 7,82 (d,  7,7Гц, 1H), 7,97 (t,  6,3Гц, 1H), 8,10 (d, 6,0Гц, 1H), 8,25 (d,  6,9Гц, 1H).
2
3
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14c):МСВР (M+Na)расч. 1146,4629, обнаружено 1146,4553. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,99 - 1,26 (m, 21H), 1,31-1,45 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,67 (p, 7,2Гц, 2H), 1,89-2,02 (m, 1H), 2,02 - 2,24 (m, 4H), 2,25 - 2,46 (m, 3H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,7Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 3,32 - 3,51 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,96 - 4,18 (m, 7H), 4,45 (dd,  12,0, 2,9 Гц, 1H), 5,27 (q,  6,8Гц, 1H), 5,44 - 5,63 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,37 - 6,59 (m, 4H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d,  1,8Гц, 1H), 7,89 (d,  7,7Гц, 1H), 8,03 (d,  6,5Гц, 1H), 8,08 (d,  7,3Гц, 1H), 8,27 (t,  6,3Гц, 1H).
2
3
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)CO-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14d): МСВР (M+Na)расч. 1146,4629, обнаружено 1146,4519. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,95 - 1,24 (m, 20H), 1,27 - 1,45 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,67 (p,  7,3Гц, 2H), 1,93 - 2,01 (m, 1H), 2,02 - 2,22 (m, 4H), 2,22 - 2,41 (m, 5H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,18 (s, 4H), 3,39 (dd,  21,4, 10,7Гц, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,94 - 4,24 (m, 6H), 4,45 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44 - 5,57 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,37 - 6,65 (m, 3H), 6,81 (s, 1H),7,11 (d, 1,8Гц, 1H), 7,89 (d,  7,6Гц, 1H), 7,93 - 8,05 (m, 2H), 8,26 (t, 6,4Гц, 1H).
2
3
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14g):МСВР (M+H)расч. 1053,4438, обнаружено 1053,4426. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,01 - 1,15 (m, 13H), 1,15-1,27 (m, 3H), 1,31-1,44 (m, 5H), 1,53 (s, 3H), 1,67 (p,  7,1Гц, 2H), 1,93- 2,03 (m, 1H), 2,03 - 2,23 (m, 4H), 2,22 - 2,41 (m, 5H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,7Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,14 (d,  12,5Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,32 - 3,46 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,92 - 4,20 (m, 6H), 4,45 (dd,  11,9, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,42 - 5,58 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,42-6,60 (m, 3H), 6,81 (s, 1H),7,12 (d, 1,8Гц, 1H), 8,05 (d, 6,5Гц, 1H), 8,10 (d,  7,8Гц, 1H), 8,30 (t,  6,3Гц, 1H).
2
3
2
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)CO-L-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14f):МСВР (M+H)расч. 1053,4366, обнаружено 1053,4438. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,02 - 1,14 (m, 13H), 1,19 (t,  9,7Гц, 3H), 1,31-1,43 (m, 6H), 1,53 (s, 3H), 1,67 (p, 7,3Гц, 2H), 1,91 - 2,02 (m, 1H), 2,02 - 2,22 (m, 4H), 2,34 - 2,39 (m, 4H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,5Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,19 (d,  4,2Гц, 4H), 3,30 - 3,47 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,94 - 4,20 (m, 6H), 4,45 (d,  11,8, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44 - 5,56 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,40 - 6,61 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (s, 1H), 8,03 (d,  6,5Гц, 1H), 8,08 (d,  7,8Гц, 1H), 8,29 (t,  6,2Гц, 1H).
2
3
2
2
5
+
1
J =
J =
J=
J=
J=
J =
J
J =
HS-(CH)CO-D-Ala-D-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14h): МСВР (M+H)расч. 1053,4366, обнаружено 1053,4438. H ЯМР (400 МГц, DMSFO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,02-1,15 (m, 13H), 1,14 - 1,24 (m, 3H), 1,30 - 1,45 (m, 5H), 1,53 (s, 3H), 1,67 (p,  7,1Гц, 2H), 1,90 - 2,01 (m, 1H), 2,01 - 2,24 (m, 4H), 2,27 - 2,33 (m, 1H), 2,33 - 2,42 (m, 4H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,7Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,10 - 3,21 (m, 4H), 3,33 - 3,46 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,95-4,18 (m, 6H), 4,45 (dd,  11,9, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44 - 5,55 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,42-6,59 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,8Гц, 1H), 8,05 (d,  6,5Гц, 1H), 8,10 (d,  = 7,8Гц, 1H), 8,30 (t,  6,3Гц, 1H).
2
3
2
2
3
+
1
J=
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14j): МСВР (M+H)расч. 1096,4496, обнаружено 1096,4464. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,78 (s, 3H), 1,02 - 1,31 (m, 19H), 1,35 - 1,55 (m, 2H), 1,60 (s, 3H), 1,74 (p,  7,4Гц, 3H), 1,78 - 1,93 (m, 1H), 2,14 - 2,33 (m, 4H), 2,41 - 2,49 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 2,80 (d,  9,6Гц, 1H), 3,12 (s, 3H), 3,22 (d,  12,7Гц, 1H), 3,26 (s, 3H), 3,47 (dd,  21,3, 10,6Гц, 2H), 3,93 (s, 4H), 4,03 -4,13 (m, 3H), 4,13 - 4,25 (m, 3H), 4,52 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,35 (q,  6,8Гц, 1H), 5,50-5,64 (m, 1H), 5,92 (s, 1H), 6,47 - 6,69 (m, 4H), 6,88 (s, 1H), 7,18 (d,  1,7Гц, 1H), 7,94 (d,  7,3Гц, 1H), 8,09 (d,  6,4Гц, 1H), 8,15 (d,  7,3Гц, 1H), 8,32 (t, 6,3Гц, 1H).
2
3
2
3
2
2
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HS-(CH)CO-(CH)-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (14i): МСВР(M+H)расч. 1011,3969, обнаружено 1011,3961. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,77 (s, 3H), 1,12 (d, 6,4Гц, 3H), 1,17 (dd,  7,0, 5,1Гц, 9H), 1,25 (d, 13,0Гц, 1H), 1,40-1,51 (m, 2H), 1,59 (s, 3H), 1,74 (q,  7,2Гц, 2H), 2,00 - 2,08 (m, 1H), 2,23 (dt,  16,8, 7,6Гц, 3H), 2,43 (q,  7,4Гц, 2H), 2,62 - 2,69 (m, 1H), 2,72 (s, 3H), 2,76 - 2,88 (m, 2H), 3,10 (s, 3H), 3,20 (d,  12,6Гц, 1H), 3,25 (s, 3H), 3,31 (s, 3H), 3,39 - 3,54 (m, 2H), 3,93 (s, 3H), 4,01 - 4,26 (m, 5H), 4,53 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,32 (q,  6,8Гц, 1H), 5,49 - 5,63 (m, 1H), 5,92 (d,  1,4Гц, 1H), 6,48-6,62 (m, 3H), 6,88 (s, 1H), 7,18 (d,  1,8Гц, 1H), 8,10 (d,  6,5Гц, 1H), 8,16 (d,  7,7Гц, 1H), 8,41 (t,  6,3Гц, 1H).
NHS-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May
2
3
2
n
2
2
3
2
2
5
Соединения типа HOOC-(CH)-CO-пептид-NH-CH2-S-(CH)-CO-DM получили в качестве примера посредством HOOC-(CH)-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM.
2
3
2
2
5
2
2
5
+
1
J =
J = 9,5
J =
J =
J =
J =
HOOC-(CH)-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (19a): L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (17,25 мг, 0,017 ммоль) обработали глутаровым ангидридом (38,5 мг, 0,337 ммоль) и проводили реакцию при комнатной температуре при перемешивании магнитной мешалкой в атмосфере аргона в течение ночи. Сырую реакционную смесь очистили посредством ВЭЖХ с использованием колонки XDB-C18, 21,2 x 5 мм, 5 микрон с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащие чистый желаемый продукт, сразу же объединили, заморозили и лиофилизировали с получением 3 мг (выход 15%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H) расч. 1136,4987, обнаружено 1136,4954. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,92 - 1,27 (m, 20H), 1,26 - 1,48 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,63 (q, 7,1Гц, 2H), 1,83-2,20 (m, 7H), 2,23-2,41 (m, 5H), 2,63 (s, 4H), 2,73 (d, Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,36 - 3,50 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,91 - 4,24 (m, 7H), 4,45 (d, 11,8Гц, 1H), 5,27 (q, 6,7Гц, 1H), 5,41 - 5,57 (m, 1H), 5,86 (s, 1H), 6,32-6,66 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (s, 1H), 8,06 (t,9,1Гц, 2H), 8,35 (d, 11,6Гц, 1H), 8,62 (s, 1H).
2
2
2
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HOOC-(CH)3-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)5-CO-DM (19g): МСВР (M+H) расч. 1136,4987, обнаружено 1136,4962.H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 0,97 - 1,14 (m, 13H), 1,14-1,26 (m, 3H), 1,28- 1,45 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,62 (p,  7,5 Гц, 2H), 1,93- 2,00 (m, 1H), 2,08 (dt,  13,1, 7,4 Гц, 6H), 2,25 - 2,41 (m, 3H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d, 9,5Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 3,31 - 3,48 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,93 - 4,19 (m, 6H), 4,45 (dd,  12,0, 2,8 Гц, 1H), 5,27 (q,  6,8 Гц, 1H), 5,43 - 5,58 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,40-6,61 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d, 1,8 Гц, 1H), 8,03 (d,  6,5 Гц, 1H), 8,13 (d,  7,8 Гц, 1H), 8,34 (t,  6,3 Гц, 1H), 11,94 (s, 1H).
2
3
2
2
3
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
HOOC-(CH)-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (19i): МСВР (M+H)расч. 1108,4674, обнаружено 1108,4634. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,78 (s, 3H), 1,04 - 1,32 (m, 16H), 1,45 (d, 12,6Гц, 2H), 1,60 (s, 3H), 1,69 (p, 7,2Гц, 3H), 1,77-1,95 (m, 1H), 1,99 - 2,07 (m, 1H), 2,11 - 2,20 (m, 4H), 2,20 - 2,39 (m, 1H), 2,55 (s, 1H), 2,71 (s, 3H), 2,80 (d,  9,5Гц, 1H), 3,12 (s, 3H), 3,40 (d,  21,0Гц, 8H), 3,49 (d,  9,1Гц, 1H), 3,93 (s, 3H), 4,02 - 4,27 (m, 6H), 4,48 - 4,61 (m, 1H), 5,34 (q,  6,6Гц, 1H), 5,48 - 5,65 (m, 1H), 5,92 (s, 1H), 6,50-6,71 (m, 3H), 6,88 (s, 1H), 7,18 (s, 1H), 7,99 (d,  7,6Гц, 1H), 8,08 (d,  6,5Гц, 1H), 8,22 (d,  7,4Гц, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,42 (s, 1H).
2
3
2
2
n
2
2
3
2
2
5
Соединения типа NHS-OOC-(CH)-CO-пептид-NH-CH-S-(CH)-CO-DM получили в качестве примера посредством NHS-OOC-(CH)-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM.
2
3
2
2
5
2
3
2
2
5
1
J
J =
J =
J =
J
J =
J=
J =
J =
J =
J
NHS-OOC-(CH)-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (20g): HOOC-(CH)-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (8 мг, 7,5 мкмоль) растворили в DMSO (1 мл), обработали NHS (0,9 мг, 7,51 мкмоль) и EDC (1,4 мг, 7,51 мкмоль). Реакции дали возможность протекать при комнатной температуре при магнитном перемешивании в атмосфере аргона в течение 2 часов. Сырой материал очистили методом ВЭЖХ с использованием колонки XDB-C18, 21,2 x 5 мм, 5 мкм с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединили и сразу же заморозили и лиофилизировали с получением 6,5 мг (выход 74%) твердого вещества белого цвета. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,00 - 1,14 (m, 13H), 1,14 - 1,25 (m, 3H), 1,29- 1,46 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,75 (p,  = 7,5Гц, 2H), 1,92 - 2,12 (m, 2H), 2,16 (t,  7,3Гц, 2H), 2,22 - 2,39 (m, 3H), 2,62 (d,  10,8Гц, 5H), 2,73 (d,  10,5Гц, 5H), 3,02 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 3,32 - 3,47 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,95 - 4,19 (m, 6H), 4,45 (dd, = 12,0, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  6,8Гц, 1H), 5,42 - 5,57 (m, 1H), 5,82 - 5,87 (m, 1H), 6,41 -6,60 (m, 4H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d,  1,7Гц, 1H), 8,05 (d, 6,5Гц, 1H), 8,10 (d,  7,7Гц, 1H), 8,20 (d,  4,8Гц, 1H), 8,29 (t,  = 6,3Гц, 1H).
2
3
2
2
5
+
NHS-OOC-(CH)-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (20g): МСВР (M+H)расч. 1233,5151, обнаружено 1233,5135.
2
3
2
2
3
+
NHS-OOC-(CH)-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (20i): МСВР (M+H) расч. 1205,4838, обнаружено 1205,4808.
2
2
n
2
2
2
2
5
Соединения типа HN-O-CH2-CO-пептид-NH-CH2-S-(CH)-CO-DM получили в качестве примера посредством HN-O-CH-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH)-CO-DM.
2
2
2
2
5
HN-O-CH-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (22c):
2
2
2
5
+
1
J =
J =
J = 2,0
J
J
J
J=
J=
J=
J=
J=
HN-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH-S-(CH)-CO-DM (23 мг, 0,022 ммоль) растворили в DMF (1 мл), обработали FMoc-aминоксиуксусной кислотой (14,09 мг, 0,045 ммоль), и EDC (8,62 мг, 0,045 ммоль). Реакции дали возможность протекать при комнатной температуре при перемешивании магнитной мешалкой в атмосфере аргона в течение 3 ч. Сырой материал обработали 20% морфолином в DMF (1 мл) и дали реакции продолжится в течение 2 ч. Сырой материал очистили методом полупрепаративной ВЭЖХ с использованием XDB-C18, 21,2 x 5 мм, 5 мкм с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединили и сразу же заморозили и лиофилизировали с получением 5,5 мг (выход 22%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H) расч. 1095,4834, обнаружено 1095,4795. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,71 (s, 3H), 1,00 - 1,14 (m, 13H), 1,14-1,25 (m, 6H), 1,31-1,43 (m, 4H), 1,52 (s, 3H), 1,92-2,02 (m, 1H), 2,02 - 2,14 (m, 1H), 2,23 - 2,39 (m, 3H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,14 (d, 12,5 Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,29 - 3,46 (m, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,90 (d, Гц, 2H), 3,95 - 4,20 (m, 6H), 4,25 (p,  = 7,7, 7,2Гц, 1H), 4,45 (dd,  = 12,0, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q,  = 6,8Гц, 1H), 5,44 - 5,58 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,30 (s, 2H), 6,43 - 6,60 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,7Гц, 1H), 7,82 (d,  7,4Гц, 1H), 7,97 (d,  7,6Гц, 1H), 8,10 (d,  7,2Гц, 1H), 8,29 (t,  6,3Гц, 1H).
2
2
2
2
3
+
1
J =
J =
J =
J=
J=
J =
J =
J =
J
J =
J =
J =
HN-O-CHCO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (22i): МСВР (M+H)расч. 1067,4521, обнаружено 1067,4484. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,71 (s, 3H), 1,01 - 1,26 (m, 18H), 1,30 - 1,46 (m, 2H), 1,52 (s, 3H), 1,55 - 1,69 (m, 1H), 1,69 - 1,84 (m, 1H), 1,97 (d,  14,4, 2,8Гц, 1H), 2,15 - 2,31 (m, 1H), 2,56 - 2,61 (m, 1H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d, 9,6Гц, 1H), 3,04 (s, 3H), 3,14 (d,  12,6Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,36 (d,  12,3Гц, 1H), 3,42 (dd,  9,1, 3,3Гц, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,90 (d,  2,3Гц, 2H), 3,95-4,05 (m, 3H), 4,06 - 4,17 (m, 2H), 4,15- 4,35 (m, 2H), 4,45 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q, 6,7 Гц, 1H), 5,44 - 5,56 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,30 (s, 2H), 6,42 - 6,61 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,11 (d,  = 1,7Гц, 1H), 7,82 (d,  7,3Гц, 1H), 7,96 (d,  7,6Гц, 1H), 8,11 (d,  7,2Гц, 1H), 8,22-8,40 (m, 1H).
2
3
2
2
5
2
2
2
5
+
1
J=
J =
J =
J =
J=
J =
J =
J
J
Mal-(CH)-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-DM (23c): HN-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH-S-(CH)-CO-DM (8 мг, 7,82 мкмоль)растворили в DMF (2 мл), обработали 3-малеимидопропионовойкислотой (1,32 мг, 7,82 мкмоль), EDC (2,25 мг, 0,012 ммоль) и HOBt (1,198 мг, 7,82 мкмоль). Реакции дали возможность протекать при комнатной температурепри перемешивании магнитной мешалкойв атмосфере аргона в течение 2 ч.Сырой материал очистили методом полупрепаративной ВЭЖХ с использованием XDB-C18, 21,2x5 мм, 5 мкмс элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрилаот 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащиежелаемыйпродукт, сразу же объединили,заморозили и лиофилизировали с получением 1,8мг (выход 19,60%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H)расч. 1173,4940, обнаружено 1173,4931. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,02- 1,14 (m, 15H), 1,16-1,25 (m, 3H), 1,30- 1,44 (m, 5H), 1,52 (s, 3H), 1,92-2,03 (m, 1H), 2,03 - 2,17 (m, 1H), 2,23 - 2,39 (m, 4H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,18 (s, 4H), 3,33 - 3,46 (m, 2H), 3,52 (t,  7,3Гц, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,95 - 4,17 (m, 7H), 4,45 (dd, 12,0, 2,9Гц, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44 - 5,56 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,39 - 6,64 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 6,86 (s, 1H), 6,92 (s, 2H),7,11 (d,  1,7Гц, 1H), 7,89 (d,  7,4Гц, 1H), 8,10 (d,  7,3Гц, 1H), 8,17 (d,  = 6,7Гц, 1H), 8,28 (t,  = 6,3Гц, 1H), 8,43 (s, 1H).
Mal2-LAla-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May
Mal-C5-L-Ala-D-Ala-L-Ala-lmm-C6-May:
2
2
5
+
Взаимодействие между L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH-S-(CH)-CO-MayNMA (соединение I-la) (25 мг, 0,024 ммоль), и 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-lH-пиррол-l-ил)гексаноатом 2,5-диоксопирролидин-1-ила (7,54 мг, 0,024 ммоль) дало Mal-C5-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May (соединение I-2a) (20,8 мг, 0,017 ммоль, выход 70,0%). МСНР (M+H) расч. 1215,52, обнаружено 1216,4.
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J = 9,0
J =
J =
J =
J =
J =
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,71 (s, 3H), 1,05 (d,  6,4Гц, 3H), 1,07-1,14 (m, 14H), 1,15-1,25 (m, 3H), 1,39 (t,  9,2Гц, 10H), 1,52 (s, 3H), 2,01 (t,  7,6Гц, 3H), 2,26 (t, 1,9Гц, 1H), 2,28 - 2,38 (m, 2H), 2,57 - 2,62 (m, 1H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d, 9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,14 (d,  12,5Гц, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,29 (t,  7,1Гц, 2H), 3,36 (d, 12,5Гц, 1H), 3,42 (d, Гц, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,96 - 4,05 (m, 1H), 4,04 - 4,15 (m, 4H), 4,41 - 4,48 (m, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,46 - 5,54 (m, 1H), 5,82-5,88 (m, 1H), 6,47-6,50 (m, 2H), 6,54 (t,  11,4Гц, 2H), 6,82 (s, 1H), 6,92 (s, 2H), 7,11 (d, 1,8Гц, 1H), 7,86-7,93 (m, 2H), 7,95 (s, 1H), 8,05 (d,  7,4Гц, 1H), 8,24 (t,  6,2Гц, 1H).
2
2
2
Mal-(CH)-PEG-CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA
Mal-(CH
)
-PEG
-CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH
-S-(CH
)
-CO-MayNMA:
2
2
2
2
2
5
2
2
2
2
2
2
2
2
5
Взаимодействие между L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)5-CO-MayNMA (соединение I-la) (25 мг, 0,024 ммоль) и Mal-амидо-PEG-NHS (10,40 мг, 0,024 ммоль) дало Mal-(CH)-PEG-CO2-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH-S-(CH)-CO-MayNMA (соединение I-3a) (14,1 мг, 10,58 мкмоль, выход 43,3%).
+
МСНР (M+H) расч. 1332,58, обнаружено 1332,95.
1
J =
J =
J=
J=
J =
J =
J=
J=
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,71 (s, 4H), 1,05 (d,  6,3Гц, 4H), 1,07-1,14 (m, 15H), 1,18 (d, 9,0Гц, 2H), 1,37 (d,  11,8Гц, 6H), 1,52 (s, 3H), 2,23 - 2,38 (m, 5H), 2,63 (s, 4H), 2,72 (d,  9,7Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,07 (q,  5,7Гц, 2H), 3,18 (s, 3H), 3,39 (s, 4H), 3,41 (d,  9,9Гц, 2H), 3,47 - 3,56 (m, 4H), 3,86 (s, 4H), 3,95 - 4,08 (m, 2H), 4,08 - 4,19 (m, 3H), 4,41 - 4,51 (m, 1H), 5,23 - 5,31 (m, 1H), 5,44 - 5,54 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,46 - 6,50 (m, 2H), 6,54 (t,  11,3Гц, 2H), 6,83 (s, 1H), 6,93 (s, 2H), 7,12 (s, 1H), 7,88 - 8,00 (m, 2H), 8,01 - 8,08 (m, 2H), 8,27 (t,  6,2Гц, 1H).
2
2
4
2
2
5
Mal-(CH)-PEG-CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH-S-(CH)-CO-MayNMA
Mal-(CH
)
-PEG
-CO
-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH
-S-(CH
)
-CO-MayNMA:
2
2
4
2
2
2
5
2
2
5
2
2
4
2
2
5
Взаимодействие между L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH-S-(CH)-CO-MayNMA (соединение I-la) (25 мг, 0,024 ммоль) и Mal-амидо-PEG4-NHS (12,55 мг, 0,024 ммоль) дало Mal-(CH)-PEG-CO2-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH-S-(CH)-CO-MayNMA Mal-PEG4-CO2-C6-LDL-DM (соединение I-3b) (22,3 мг, 0,016 ммоль, выход 64,2%).
+
МСНР (M+H) расч. 1420,63, обнаружено 1420,06
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,71 (s, 4H), 1,05 (d,  6,4Гц, 3H), 1,07 - 1,16 (m, 14H), 1,19 (t, 8,1Гц, 2H), 1,31-1,50 (m, 2H), 1,52 (s, 4H), 1,98 (s, 1H), 2,02-2,17 (m, 2H), 2,20 - 2,40 (m, 7H), 2,63 (s, 4H), 2,73 (d,  9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,05 - 3,12 (m, 2H), 3,18 (s, 3H), 3,28 - 3,36 (m, 1H), 3,37 - 3,45 (m, 15H), 3,47 - 3,57 (m, 4H), 3,86 (s, 4H), 3,94 - 4,08 (m, 2H), 4,12 (ddt,  14,5, 7,3, 3,6Гц, 4H), 4,41 - 4,49 (m, 1H), 5,27 (q,  6,7Гц, 1H), 5,45 - 5,55 (m, 1H), 5,86 (s, 1H), 6,42 - 6,60 (m, 4H), 6,83 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 7,12 (d, 1,8Гц, 1H), 7,89 - 8,00 (m, 2H), 8,00 - 8,09 (m, 2H), 8,26 (t,  6,2Гц, 1H).
Пример 3. Синтез метаболитов
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
DM-CO-(CH)-SH (24a): В базовый раствор DM-H (1,5 мл, 0,100 ммоль), добавили EDC (29 мг, 0,150 ммоль) и DIPEA (17,5 мкл, 0,100 ммоль) при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем добавили 6-меркаптогексановую кислоту (13,8 мкл, 0,100 ммоль). Через 30 мин сырой материал очистили методом полупрепаративной ВЭЖХ с использованием XDB-C18, 21,2 x 5 мм, 5 мкм с элюированием деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, сразу же объединили, заморозили и лиофилизировали с получением 12 мг (выход 15%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H) расч. 780,3291, обнаружено 780,3281. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,79 (s, 3H), 1,06 - 1,21 (m, 5H), 1,21 - 1,57 (m, 6H), 1,60 (s, 2H), 2,00 - 2,12 (m, 2H), 2,12 - 2,27 (m, 2H), 2,27 - 2,37 (m, 2H), 2,50 (s, 4H), 2,70 (s, 3H), 2,74 - 2,91 (m, 2H), 2,91 - 3,09 (m, 1H), 3,10 (s, 2H), 3,19 - 3,24 (m, 2H), 3,26 (s, 3H), 3,39 - 3,53 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 4,03-4,11 (m, 1H), 4,52 (dd,  12,0, 2,9Гц, 1H), 5,35 (q,  6,8Гц, 1H), 5,52 - 5,62 (m, 1H), 5,93 (d, 1,3Гц, 1H), 6,49 - 6,67 (m, 3H), 6,89 (s, 1H), 7,20 (d, 1,8 Гц, 1H).
2
5
2
5
+
1
J =
J =
J =
J =
DM-CO-(CH)-SMe (25a): DM-CO-(CH)-SH (12 мг, 0,015 ммоль) растворили в DMF (2 мл), обработали DIPEA (24 мкл, 0,139 ммоль) и йодметаном (2,88 мкл, 0,046 ммоль), реакцию проводили в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2 ч. Сырой материал очистили через колонку XDB-C18, 21,2 x 5 мм, 5 мкм при расходе 20 мл/мин. С использованием деионизированной воды с 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединили, заморозили и лиофилизировали с получением 2 мг (выход 16%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H) расч. 794,3448, обнаружено 794,3440. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,01 - 1,13 (m, 6H), 1,13 - 1,27 (m, 3H), 1,27- 1,50 (m, 6H), 1,53 (s, 3H), 1,87 (s, 2H), 1,93-2,04 (m, 2H), 2,04 - 2,15 (m, 1H), 2,15 - 2,27 (m, 2H), 2,27 - 2,41 (m, 1H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,6Гц, 1H), 3,02 (s, 3H), 3,10 - 3,22 (m, 5H), 3,33 - 3,49 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,94 - 4,06 (m, 1H), 4,45 (dd,  12,1, 2,8Гц, 1H), 5,28 (q,  6,7Гц, 1H), 5,44 - 5,56 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,42-6,62 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,13 (d,  1,7Гц, 1H).
2
3
2
3
(3267-50-R1):
J =
J=
J=
J
J =
J =
J=
+
1
DM-CO-(CH)-SSPy (26): DM-CO-(CH)-SSPy  SPDB (30,1 мг, 0,092 ммоль) добавили в базовый раствор DM-H (0,81 мл, 0,046 ммоль) при комнатной температуре при перемешивании магнитной мешалкой. Через 30 мин раствор очистили на колонке XDB-C18, 21,2 x 5 мм, 5 мкм при расходе 20 мл/мин. С использованием деионизированной воды с 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединили, заморозили и лиофилизировали с получением 6 мг (выход 15%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H) расч. 861,2964, обнаружено 861,2963. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ0,70 (s, 3H), 1,02 - 1,12 (m, 7H), 1,13 - 1,21 (m, 1H), 1,31 - 1,45 (m, 3H), 1,52 (s, 3H), 1,70 - 1,90 (m, 2H), 1,96 (dd,  14,2, 2,9Гц, 1H), 2,19 - 2,31 (m, 1H), 2,62 (s, 3H), 2,68 - 2,81 (m, 4H), 3,00 (s, 2H), 3,18 (s, 4H), 3,34 (d,  12,4Гц, 1H), 3,41 (d,  9,1Гц, 1H), 3,87 (s, 3H), 4,00 (t,  = 11,2Гц, 1H), 4,44 (dd,  12,0, 2,9Гц, 1H), 5,25 (q,  6,8Гц, 1H), 5,41 -5,52 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,43 -6,53 (m, 3H),6,81 (s, 1H), 7,09 (d,  1,8Гц, 1H), 7,12 -7,19(m, 1H), 7,50-7,61 (m, 1H), 7,66 - 7,76 (m, 1H), 8,31 - 8,39 (m, 1H).
2
3
2
3
+
1
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
DM-CO-(CH)-SH (24b): DM-CO-(CH)-SSPy (6 мг, 6,96 мкмоль) добавили в раствор DTT (1,1 мг, 6,96 мкмоль) в DMSO:фосфат калия 2:1, 2 мм буфера EDTA pH 7,5 (0,5 мл) и при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 20 мин. Сырой раствор очистили на колонке XDB-C18, 21,2 x 5 мм, 5 мкм при расходе 20 мл/мин. С использованием деионизированной воды с 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 95% в течение 30 мин при 20 мл/мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединили, заморозили и лиофилизировали с получением 5 мг (выход 95%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H)расч. 752,2978, обнаружено 752,2962. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (d,  1,9Гц, 3H), 1,08 (dd,  18,6, 6,6Гц, 7H), 1,18 (d,  12,4Гц, 2H), 1,27- 1,49 (m, 3H), 1,52 (d,  2,7Гц, 4H), 1,55-1,68 (m, 1H), 1,77 (14,2, 8,5, 6,5Гц, 1H), 1,91-2,05 (m, 1H), 2,15 (t,  7,9Гц, 1H), 2,38 (s, 2H), 2,44 - 2,60 (m, 1H), 2,64 (s, 2H), 2,66 - 2,84 (m, 1H), 3,03 (d,  12,6Гц, 3H), 3,09-3,18 (m, 1H), 3,18 (s, 3H), 3,36 (d,  12,2Гц, 1H), 3,42 (d,9,0Гц, 1H), 3,86 (s, 2H), 3,93 - 4,08 (m, 1H), 4,45 (dd,  12,0, 2,8Гц, 1H), 5,27 (q, 1H), 5,42 - 5,58 (m, 1H), 5,85 (d,  1,3Гц, 1H), 6,40-6,61 (m, 4H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,8Гц, 1H).
2
3
2
3
+
1
J =
J =
J=
J =
J =
J =
J =
DM-CO-(CH)-SMe (25b): DM-CO-(CH)-SH (5мг, 6,65мкмоль), растворили в безводном DMF (0,3мл),к которому добавили DIPEA (3,57мкл, 0,020ммоль) и йодметан (1,2мкл, 0,020ммоль) при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре. Через 1 ч сырой растворочистили на колонке XDB-C18, 21,2x5 мм, 5мкм при расходе20мл/мин. С использованием деионизированной воды с 0,1% муравьиной кислоты и с линейным градиентомацетонитрилаот5% до 95%в течение 30 мин при 20мл/мин. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединили, заморозили и лиофилизировали с получением1мг (выход19%) твердого вещества белого цвета. МСВР (M+H)расч.766,3135, обнаружено766,3121. H ЯМР (400МГц, DMSO-d6) δ 0,71 (s, 3H), 1,08 (dd,  18,1, 6,6Гц, 7H), 1,18 (d,  12,9Гц, 1H), 1,30- 1,47 (m, 2H), 1,53 (s, 3H), 1,56- 1,68 (m, 1H), 1,68- 1,78 (m, 1H), 1,78 (s, 3H), 1,91-2,05 (m, 1H), 2,18 - 2,31 (m, 1H), 2,33 - 2,41 (m, 2H), 2,63 (s, 3H), 2,73 (d,  9,7Гц, 1H), 3,05 (s, 3H), 3,18 (s, 4H), 3,33 - 3,48 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 4,00 (t,  11,5Гц, 1H), 4,45 (dd,  12,1, 2,8Гц, 1H), 5,28 (q,  6,7Гц, 1H), 5,43 - 5,57 (m, 1H), 5,85 (s, 1H), 6,41 - 6,62 (m, 3H), 6,81 (s, 1H), 7,12 (d,  1,8Гц, 1H), 8,47 (s, 1H).
Пример 4. Получениеконъюгатов ADC (16a - 16i, 17a - 17i, 18a-18i).
Получение растворов майтанзиноида для получения конъюгатов
ADC (16a- 16i, 17a- 17i, 18a-18i)
Сульфо-GMBS и одно из тиол-несущих соединений (14a - 14j) растворили в растворе 3:7 (50 мм сукцината натрия, pH 5,0: DMA) с получением концентрации 1,5 мм и 1,9 мм каждого, соответственно. Раствор осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем избыток тиола погасили посредством доведения раствора до 0,5 мМ в N-этилмалеимиде (NEM) при осторожном перемешивании в течение 10 мин.
Получение конъюгатов
ADC (16a- 16i, 17a- 17i, 18a-18i)
К раствору антитела (2,5 мг/мл) в 60 мМ EPPS, содержащем 15% по объему N,N-диметилацетамида (DMA), pH 8,0 добавили 6,5 моль экв. раствора майтанзиноида. Через 16 ч реакционную смесь очистили с использованием колонки NAP-G25, которую предварительно сбалансировали и обработали 10 мМ сукцинатом натрия, pH 5,5, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы и 0,01% буфера Твин-20. Очищенный конъюгат проанализировали для определения соотношения майтанзиноида к антителу (MAR), процентной доли агрегированного конъюгата, уровней свободного майтанзиноида и единиц эндотоксина (EU), как описано ранее в Widdison W. et. al. J Med Chem (2006) 49, 4392-408. Уровни агрегатов белка во всех конъюгатах были ниже 3%, уровни свободного майтанзиноида были ниже 1%, а уровни эндотоксина были ниже 0,2 EU/мг.
Конъюгаты ADC la-1d и 4a-4c были использованы в качестве компараторов для оценки конъюгатов по данному изобретению. Конъюгаты ADC la-1d и 4a-4c приготовили как описано в Widdison W., et. al., Bioconjugate Chem., (2015), 26, 2261-2278.
Получение C242-sGMBS-LDL-DM (ADC 18c)
Перед конъюгированием получили sGMBS-LDL-DM посредством смешивания базового раствора сульфо-GMBS (соединение 15 на Фиг. 4) в N-N-диметилацетамиде (DMA, SAFC) с базовым раствором LDL-DM (соединение 14c на Фиг. 3) в DMA в присутствии сукцинатного буфера pH 5,0 с получением 60/40 органического/водного раствора и конечных концентраций 1,5 мМ сульфо-GMBS и 1,95 мМ LDL-DM. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 2°C. Сырую смесь sGMBS-LDL-DM добавили в раствор, содержащий антитело C242 в фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7,4 с пятикратным (5x) внесением раствора 300 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновой кислоты (EPPS) pH 8,0 и 15% DMA (об./об.) до конечного соотношения, составляющего 7,5 моль сульфо-GMBS-LDL-DM к 1 молю антитела C242. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 25°C.
Реакцинную смесь очищали в буфере для составов из 10 мМ сукцината, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% Твин-20, pH 5,5 с использованием обессоливающих колонок NAP (GE Healthcare) и отфильтровали через шприцевой фильтр с мембраной PVDF 0,22 мкм.
C242-sGMBS-LDL-DM
проиллюстрирован на Фиг. 20.
Обнаружили, что очищенный конъюгат имеет 3,8 моль LDL-DM/моль антитела посредством UV-Vis, на 95% мономер посредством ЭХ, и менее 1% лекарственного вещества, не связанного с белками плазмы крови методом ВЭЖХ анализом на колонке Hisep. Спектр ЭХ/МС для
Получение ML66-sGMBS-LDL-DM (ADC 16c)
Перед конъюгированием получили sGMBS-LDL-DM посредством смешивания базового раствора сульфо-GMBS (соединение 15 на Фиг. 4) в N-N-диметилацетамиде (DMA, SAFC) с базовым раствором LDL-DM (соединение 14c на Фиг. 3) в DMA в присутствии сукцинатного буфера pH 5,0 с получением 60/40 органического/водного раствора и конечных концентраций 1,5 мМ сульфо-GMBS и 1,95 мМ LDL-DM. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при 25°C. Сырую смесь sGMBS-LDL-DM добавили в раствор, содержащий антитело ML66 в фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7,4 с пятикратным (5x) внесением раствора 300 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновой кислоты (EPPS) pH 8,0 и 15% DMA (об./об.) до конечного соотношения, составляющего 8,0 моль сульфо-GMBS-LDL-DM к 1 молю антитела ML66. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 25°C.
Реакцинную смесь очищали в буфере для составов из 10 мМ сукцината, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% Твин-20, pH 5,5 с использованием обессоливающих колонок NAP (GE Healthcare) и отфильтровали через шприцевой фильтр с мембраной PVDF 0,22 мкм.
C242-sGMBS-LDL-DM
проиллюстрирован на Фиг. 21.
Обнаружили, что очищенный конъюгат имеет 3,7 моль LDL-DM/моль антитела посредством UV-Vis, на 98% мономер посредством ЭХ, и менее 1% лекарственного вещества, не связанного с белками плазмы крови методом ВЭЖХ анализом на колонке Hisep. Спектр ЭХ/МС для
Получение M9346A-sGMBS-LDL-DM (конъюгат 17c)
Перед конъюгированием получили sGMBS-LDL-DM (соединение 15 на Фиг. 4) посредством смешивания базового раствора сульфо-GMBS в N-N-диметилацетамиде (DMA, SAFC) с базовым раствором LDL-DM (соединение 14c на Фиг. 3) в DMA в присутствии сукцинатного буфера pH 5,0 с получением 60/40 органического/водного раствора и конечных концентраций 3 мМ сульфо-GMBS и 3,9 мМ LDL-DM. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч при 25°C. Сырую смесь sGMBS-LDL-DM добавили в раствор, содержащий антитело M9346A в фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7,4 с внесением 5x раствора 300 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновой кислоты (EPPS) pH 8,5 и 10% DMA (об./об.) до конечного соотношения, составляющего 9,5 моль сульфо-GMBS-LDL-DM к 1 молю антитела M9346A. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 25°C.
Реакцинную смесь очищали в буфере для составов из 10 мМ сукцината, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% Твин-20, pH 5,5 с использованием обессоливающих колонок NAP (GE Healthcare) и отфильтровали через шприцевой фильтр с мембраной PVDF 0,22 мкм.
C242-sGMBS-LDL-DM
проиллюстрирован на Фиг. 22.
Обнаружили, что очищенный конъюгат имеет 3,7 моль LDL-DM/моль антитела посредством UV-Vis, на 99% мономер посредством ЭХ, и менее 1% лекарственного вещества, не связанного с белками плазмы крови посредством ЭХ/двухколоночного анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Спектр ЭХ/МС для
Получение
M9346A-C442-MalC5-LDL-DM (конъюгат 26c)
M9346A-C442 (антитело антифолат с сконструированным Cys в положении 442) в фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7,4 (Life Technologies) обработали 50 молярными эквивалентами трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP, Sigma-Aldrich) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. TCEP удалили посредством обессоливающих колонок NAP (GE Healthcare) и добавили 100 молярных эквивалентов дегидроаскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich) к очищенному восстановленному M9346A-C442 в PBS pH 7,4, 2 мм EDTA (Sigma-Aldrich) и инкубировали от 90 минут до 4 часов при 25°C. Восстановленный и повторно окисленный раствор антитела использовали сразу же для конъюгации до MalC5-LDL-DM (соединение I-2a, показанное выше).
В повторно окисленное антитело M9346A-C442 внесли PBS pH 6,0, 2 мМ EDTA и провели конъюгацию в 90% водном растворе с 10% N-N-диметилацетамидом (DMA, SAFC) и 5 эквивалентами MalC5-LDL-DM. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 25°C.
После завершения реакции конъюгат очистили в буфере для составов из 10 мМ ацетата, 9% сахарозы, 0,01% Твин-20, pH 5,0 с использованием обессоливающих колонок NAP (GE Healthcare) и отфильтровали через шприцевой фильтр с мембраной PVDF 0,22 мкм.
C242-sGMBS-LDL-DM
Обнаружили, что очищенный конъюгат имеет 2 моль LDL-DM/моль антитела посредством UV-Vis, на 97% мономер посредством ЭХ, и менее 3% лекарственного вещества, не связанного с белками плазмы крови посредством ЭХ/двухколоночного анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Спектр ЭХ/МС для  проиллюстрирован на Фиг. 23.
Пример 5. Анализ связывания клеток
Связывание голого антитела или конъюгатов ADC с антиген-положительными клетками оценивали методом анализа косвенной иммунофлюоресценции с использованием проточной цитометрии. Клетки (5×104 на лунку) высевали в круглодонный 96-луночный планшет и инкубировали при 4°С в течение 3 ч с серийными разведениями испытуемого продукта в 0,2 мл альфа-MEM с добавлением 2% (об./об.) нормальной козьей сыворотки (Sigma, St., Louis, MO). Каждый образец проанализировали в трех экземплярах. Контрольные лунки испытывали недостаток в испытуемом продукте. Затем клетки промыли холодной средой (4°С) объемом 0,2 мл и окрашивали меченным флуоресцеином козьим антителом в отношении человеческого иммуноглобулина G (IgG) в течение 1 ч при 4°C. Клетки снова промыли средой, закрепили в 1% растворе формальдегида/PBS и проанализировали методом FACS с использованием проточного цитометра Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA).
Как проиллюстрировано на Фиг. 7, конъюгация лишь умеренно влияла на аффинность связывания голого антитела.
in vitro
Пример 6. Анализы цитотоксичности  для конъюгатов ADC и метаболитов
-8
-14
2
2
Анализы проводили в 96-луночных планшетах с плоским дном в трех экземплярах для каждой экспериментальной точки. Испытуемые продукты сначала развели в полной среде для культивирования клеток с использованием серии 5-кратных разведений и в каждую лунку добавляли 100 мкл. Конечные концентрации, как правило, находились в диапазоне от 3x10 M до 8 x 10 M. Затем в испытуемые продукты добавили клетки-мишени в количестве 1500 - 3000 клеток на лунку в 100 мкл полной культуральной среды. Смеси инкубировали при 37°C в увлажненном 5% CO-инкубаторе в течение 5 дней. Жизнеспособность оставшихся клеток определили методом WST-8 (тетразолиевая соль-8; 2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолий) основываясь на колориметрическом анализе с использованием набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD). WST-8 восстанавливается дегидрогеназой в живых клетках с образованием продукта формазана желтого цвета, который растворим в тканевых культуральных средах. Количество красителя формазана прямо пропорционально количеству живых клеток. WST-8 добавляли до конечного объема 10% и планшеты инкубировали при 37°C в увлажненном 5% CO-инкубаторе в течение дополнительных 4 ч. Затем сигналы WST-8 измеряли с использованием считывающего устройства для микропланшетов при оптической плотности 450 нм. Выжившую фракцию рассчитали посредством деления значения каждого обработанного образца на среднее значение необработанных контрольных образцов и нанесли на график в зависимости от концентраций испытуемого продукта на полулогарифмическом графике для каждой обработки. Значения IC50 определили с использованием нелинейной регрессии (подгонки кривой) с использованием программы GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).
in vitro
Как проиллюстрировано на Фиг. 8, конъюгаты по данному изобретению являются сильнодействующими в отношении клеток KB и цитотоксичность  является антиген-специфической, поскольку добавление голого антитела значительно уменьшило цитотоксичность конъюгатов.
in vitro
1
Цитотоксичность конъюгатов по данному изобретению  сравнили с конъюгатом Ab-sSPDB-DM4, имеющим способный к расщеплению дисульфидный линкер, и пептидным анилино-майтанзиноидным конъюгатом (таблица 1). Как показано в таблице 1, конъюгаты по данному изобретению являются, как правило, более цитотоксичными, чем конъюгат Ab-sSPDB-DM4. К тому же, длина алкильной цепи в спейсерной группе L мало влияет на цитотоксичность по отношению к антиген-положительным клеткам.
Таблица 1.
IC<sub>50</sub> (нM)
KB
Igrov-1
Jeg-3
SKOV-6
ADC
+ Блок
ADC
+ Блок
ADC
+ Блок
ADC
+ Блок
lb
0,5
3
2
8
5
9
3
7
4b
0,2
>50
0,3
20
0,2
10
0,9
10
17h
0,4
>50
30
>50
0,5
>50
>10
>50
17i
0,3
>50
50
>50
0,7
>50
>10
>50
17g
0,3
>50
3
>50
0,5
>50
>10
>50
17c
0,3
>50
7
>50
0,6
>50
>10
>50
in vitro
1
2
Цитотоксичность конъюгата по данному изобретению  также испытали в отношении клетки CA922. Как проиллюстрировано на Фиг. 14, D-Ala в пептидном линкере конъюгата оказывает негативное воздействие на цитотоксичность, если присоединен непосредственно к отщепляющемуся азоту в -NH-CRR-S- участке конъюгата формулы (I).
in vitro
1
Цитотоксичность  преобладающих метаболитов ADC испытали в отношении клеток Colo720E, H1703, H1975 и COLO704 и данные проиллюстрированы на Фиг. 15 и в таблице 2 ниже. Данные предполагают, что увеличение гидрофобности метаболита (более длинная алкильная цепь в спейере L) увеличивает цитотоксичность метаболита.
in vitro
Таблица 2 Цитотоксичность  преобладающих метаболитов ADC на клетках H1703, H1975 и COLO704
ic<sub>50</sub>(M)
Метаболит
Клетки H1703
Клетки H1975
Клетки COLO704
25a
2,27 x 10<sup>-12</sup>
8,93 x 10<sup>-13</sup>
3,04 x 10<sup>-12</sup>
25b
5,92 x 10<sup>-12</sup>
5,60 x 10<sup>-12</sup>
6,88 x 10<sup>-12</sup>
25c
5,02 x 10<sup>-11</sup>
4,78 x 10<sup>-11</sup>
3,99 x 10<sup>-11</sup>
3
3,70 x 10<sup>-12</sup>
1,78 x 10<sup>-12</sup>
5,06 x 10<sup>-12</sup>
in
vo
Пример 7. Исследования эффективности  vi
in vivo
3
3
3
Эффективность  конъюгатов ADC оценивали на мышах, несущих установленный ксенотрансплантат (H1703 250 мм), HT-29 (100 мм) или NCI-H2110 (100 мм). Самок мышей SCID инокулировали подкожно в правый бок желаемым типом клеток в бессывороточной среде/матригеле. Опухоли были выращены до указанного размера. Затем животных рандомно разделили на группы (6 животных в группе). Контрольных мышей обработали фосфатно-солевым буфером. Мышам вводили ADC в концентрациях мг/кг, указанных в исследованиях. Все дозировки в моделях ксенотрансплантата были основаны на весе компонента антитела конъюгата. Все средства для лечения были введены посредством внутривенной инъекции в хвостовую вену. Размеры опухолей измеряли два раза в неделю в трех измерениях с использованием штангенциркуля, объемы опухолей выражены в мм и были рассчитаны по формуле V = 1/2 (длина х ширина х высота). Вес тела также измеряли два раза в неделю.
in vivo
Как проиллюстрировано на Фиг. 10, 11 A, 11B и 12, конъюгаты по данному изобретению очень активны в отношении опухолей ксенотрансплантата H1703 (Фиг. 10), HT-29 (Фиг. 11A и 1 IB), NCI-H2110 (Фиг. 12) в мышиной модели . Конъюгат 17с хорошо переносится по сравнению с пептидным анилино-майтанзиноидным конъюгатом (см. Фиг. 13).
Были также проведены исследования переносимости мышами конъюгатов по данному изобретению с другим пептидным линкером (т.е. А в формуле (I)). Вес тела мышей, которым вводили конъюгаты, измеряли. Как проиллюстрировано на Фиг. 18, переносимость у мышей снижается, если пептидный линкер содержит последовательные L-аланины.
in vitro
Пример 8. Биологические испытания на неспецифический цитолиз
Биологические испытания на неспецифический цитолиз, в котором определенное количество антиген-отрицательных клеток остается постоянным в присутствии разного количества антиген-положительных клеток, проводились, как описано ранее, с использованием соотношения антиген-положительных и антиген-отрицательных клеток, обозначенных на соответствующих фигурах. Вариант этого биологического испытания, в котором антиген-отрицательные и антиген-положительные клетки поддерживали постоянными, выполняли следующим образом: клетки 3000 EGFR+ Ca9-22 смешали с клетками 2000 EGFR- MCF7 и смесь клеток икубировали с 0,66 нM указанных конъюгатов ADC в течение 4 дней. Жизнеспособные клетки определяли количественно с использованием биологического испытания WST-8. В том же биологическом испытании также оценивали цитотоксическую активность ADC в отношении клеток Ca9-22 или MCF7; все конъюгаты ADC убивали клетки EGFR+ Ca9-22 на одинаковом уровне, но не оказывали влияния на клетки EGFR- MCF7, если не были добавлены антиген-положительные клетки.
В другом эксперименте смешивали различные соотношения клеток FRa(+)/FRa(-) в U-образных лунках с низкой адгезией и подвергали воздействию 2 нМ конъюгата по данному изобретению, который не токсичен для клеток FRa(-) (Namalwa, посеяно 1000 клеток) но убивает все клетки FRa(+) (JEG-3, 150K FRa ABC). Выживаемость клеток FRa(-) измерили посредством анализа Cell Titer Gio (Promega) через 4 дня. Данные проиллюстрированы на Фиг. 9C. В частности, неспецифический цитолиз для конъюгата по данному изобретению сравнили с конъюгатом пептид-анилин-майтанзиноида, данные представлены в таблице 3 ниже.
Таблица 3
Конъюгат
Клетки # Jeg-3, необходимые, чтобы убить 100% клеток FRa(-)
4b
3000
17c
1000
Как проиллюстрировано на Фиг. 9A, 9B и 9C, конъюгат по данному изобретению имеет больший эффект неспецифического цитолиза, чем конъюгат Ab-sSPDB-DM4, конъюгат, имеющий расщепляемый дисульфидный линкер и пептидный анилино-майтанзиноидный конъюгат. К тому же, когда другие факторы остаются постоянными, увеличение гидрофобности метаболитов увеличивает цитотоксичность метаболитов, что повышает неспецифический цитолиз соответствующих конъюгатов. Кроме того, данные, по-видимому, показывают, что конъюгат по данному изобретению отличается от конъюгата Ab-sSPDB-DM4 и пептидного анилино-майтанзиноидного конъюгата по типам высвобождаемых метаболитов и эффективности высвобождения. Эффект неспецифического цитолиза конъюгата по данному изобретению является большим, чем у пептидного анилино-майтанзиноидного конъюгата, у которого в свою очередь больше, чем у Ab-sSPDB-DM4 (17g>4b>1b).
1
2
Как проиллюстрировано на Фиг. 9D, D-Ala в пептидном линкере конъюгата оказывает негативное воздействие на неспецифический цитолиз, если присоединен непосредственно к отщепляющемуся азоту в -NH-CRR-S-участке конъюгата формулы (I).
in vitro
Пример 9. Исследование метаболизма
FRa-экспрессирующие KB клетки обработали насыщающим количеством конъюгата 17c в течение 24 часов. Среду, содержащую катаболит, инкубировали с 5 мМ NEM, чтобы закрыть любой присутствующий свободный тиол, а затем захватывали предварительно связанным белком А-анти-майтанзиноидным комплексом анител. Катаболиты высвобождали посредством экстракции ацетоном и анализировали методом УВЭЖХ/МСВР.
Обнаруженные метаболиты и предполагаемые сайты расщепления проиллюстрированы на Фиг. 16. Большей частью выведенных катаболитов, идентифицированных в средах для культивирования клеток, были молекулы DM-SMe (25a) и DM-SH.
3
2
5
В другом эксперименте, конъюгат 18c (анти-CanAg-LDL-DM) инкубировали с клетками COLO205 с последующим клеточным лизисом и уменьшением любых дисульфидных связей и кэппингом образующихся тиолов N-этилмалеимидом ранее описанным способом (см. Erickson HK, Park PU, Widdison WC, Kovtun YV, Garrett LM, Hoffman K, et al. Antibody-maytansinoid conjugates are activated in targeted cancer cells by lysosomal degradation and linker-dependent intracellular processing. Cancer Res 2006;66(8):4426-33). Также проводили необработанный контроль, когда клетки COLO205, не обработанные конъюгатом, лизировали и восстанавливали дисульфидные связи, затем полученные тиолы кэппировали N-этилмалеимидом. Оба образца проанализировали методом СВЭЖХ/MS с использованием набора спектрометров Thermo Q-Exactive Mass для Pos, Neg, DDA Top-10. МС/МС обнаружение проводили сериями с использованием Dionex UltiMate 3000 СВЭЖХ, которое было оснащено Waters UPLC BEH C8, 1,8 микрометра, колонка 100 х 2,1 мм. Колоночное отделение установили на 30 градусов Цельсия, а ультрафиолетовый детектор установили на 252 нм. Объем инъекции составлял 40 мкл. Колонку элюировали деионизированной водой, содержащей 0,1% муравьиной кислоты, с линейным градиентом ацетонитрила, содержащего 0,1% муравьиной кислоты, от 20% до 100% в течение 20 минут с расходом 0,35 мл/мин с последующей промывкой 100% ацетонитрилом, содержащим 0,1% муравьиной кислоты, в течение 10 мин. Как проиллюстрировано на Фиг. 19, Верхний след СВЭЖХ представляет собой лизат клеток, обработанный DTT и NEM, из клеток COLO205, которые не подвергались воздействию какого-либо конъюгата. Нижний след СВЭЖХ представляет собой лизат клеток, обработанный DTT и NEM, из клеток COLO205, которые были обработаны конъюгатом 18с. Пик времени удерживания 12,73 мин имел то же время удерживания и масс-спектр, что и соединение CHS(CH)CO-DM (соединение 25a), полученное в лаборатории.
В аналогичном эксперименте, в 100 нM C242-sGMBS-LDL-DM (18c) добавили клеточную культуру Colo205 и инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Клетки и среду раздели, а катаболиты извлекли с аффинным захватом и ресуспендировали с 20% ацетонитрила. Катаболиты проанализировали методом УВЭЖХ/МСВР. Большая часть молекул катаболита, идентифицированных в клеточных средах, включает в себя DM-SMe, окисленный DM-SMe и кислотную форму лекарственного вещества, не связанного с белками плазмы крови (см. структуры ниже).
39
57
3
11
+
Химическая Формула: CHCINOS
Точная масса: 810,34
Окисленный DM-SMe
60
88
8
18
2
+
Химическая Формула: CHCINOS
Точная масса: 1307,53
Кислотная форма лекарственного вещества, не связанного с белками плазмы крови
in vivo
Пример 10. Эффективность  в модели яичника OV-90
in vivo
Эффективность конъюгата по данному изобретению  оценивали на мышах, несущих ксенотрансплантат OV-90, с использованием процедур, аналогичных описанным в Примере 7.
Как проиллюстрировано на Фиг. 17A и 17B и в таблице 4, конъюгат по данному изобретению проявляет повышенную активность в отношении гетерогенной модели ксенотрансплантата опухоли яичника с относительно низким уровнем экспрессии FRa (H-показатель 35) по сравнению с пептид-анилин-майтанзиноидным конъюгатом.
Таблица 4.
Группа
Доза Ab (мг/кг)
%T/C
PR
CR
Результат
17c
5
5
5/6
0/6
Высоко активный
2,5
5
5/6
0/6
Высоко активный
1,25
24
0/6
0/6
Активный
4b
5
11
2/6
0/6
Активный
2,5
15
0/6
0/6
Активный
1,25
35
0/6
0/6
Активный
Пример 11. Исследование переносимости у мышей
Переносимость 1200 мкг/кг huML66-GMBS-LAlaLAlaLAla-Immol-DM (16a), huML66-GMBS-DAlaLAlaLAla-Immol-DM (16b), huML66-GMBS-LAlaDAlaLAla- Immol-DM (16c), huML66-GMBS-LAlaLAlaDAla-Immol-DM (16d), и huML66-sSPDB- DM4 (la) испытали на самках мышей CD-I.
Материалы:
huML66-GMBS-LAlaLAlaLAla-Immol-DM (16a)(16b)Концентрация DM1:83,39 мкг/млКонцентрация антитела: 4,3 мг/млСоотношение лекарственного вещества к антителу: 3,8 DM/AbЭндотоксин: 0,37 EU/мгМономер: 99,0%Лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови: не обнаруженоhuML66-LAlaDAlaLAla-Immol-DM (16c)(16d)Концентрация DM1: 70,27 мкг/млКонцентрация антитела: 3,6 мг/млСоотношение лекарственного вещества к антителу: 3,8 DM/AbЭндотоксин: 0,27 EU/мгМономер: 98,7%Лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови: не обнаруженоhuML66-s-SPDB-DM4 (la)Концентрация DM1: 84,35 мкг/млКонцентрация антитела: 4,6 мг/млСоотношение лекарственного вещества к антителу: 3,4 DM/AbЭндотоксин: 0,46 EU/мгМономер: 99,2%Лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови: не обнаружено
huML66-GMBS-DAlaLAlaLAla-Immol-DMКонцентрация DM1: 60,36 мкг/млКонцентрация антитела: 3,4 мг/млСоотношение лекарственного вещества к антителу: 3,5 DM/AbЭндотоксин: 0,29 EU/мгМономер: 97,9%Лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови: не обнаруженоhuML66-LAlaLAlaDAla-Immol-DMКонцентрация DM1: 69,52 мкг/млКонцентрация антитела: 3,7 мг/млСоотношение лекарственного вещества к антителу: 3,6 DM/AbЭндотоксин: 0,33 EU/мгМономер: 98,1%Лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови: не обнаружено
Группы и средства для лечения: (2 мыши/в группе)
1. Контроль растворителя
2. huML66-GMBS-LAlaLAlaLAla-Immol-DM (16a), 1200 мкг/кг
3. huML66-GMBS-DAlaLAlaLAla-Immol-DM (16b), 1200 мкг/кг
4. huML66-GMBS-LAlaDAlaLAla-Immol-DM (16c), 1200 мкг/кг
5. huML66-GMBS-LAlaLAlaDAla-Immol-DM (16d), 1200 мкг/кг
6. huML66-sSPDB-DM4 (la), 1200 мкг/кг
Особенности проведения исследования:
Тридцать мышей распределили по 6 группам случайным образом (2 мыши в группе) по массе тела. Массы тела находились в диапазоне от 24,4 до 27,5 г (26,2 ± 0,96, среднее значение ± стандартное отклонение). Мышей в каждой группе идентифицировали по цветной метке на меху. Лечение было начато на 15 день после поступления. Мышам вводили конъюгат в зависимости от индивидуальной массы тела. Введение всех конъюгатов или PBS проводили внутривенно шприцом объемом 1,0 мл, снабженным иглой 1/2 дюйма 27 калибра. Из-за данных доз лечение было разделено на 2 инъекции с интервалом в 2 часа. Мышам не позволяется вводить более 350 мкл за инъекцию.
Вес тела мышей, которым вводили конъюгаты, был измерен и проиллюстрирован на Фиг. 24А и 24В.
b. Переносимость 1000 мкг/кг и 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM (17c) и 1250 мкг/кг Mov19v1,6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1 (4b) испытали на самках мышей CD-I.
Материалы:
Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM Концентрация DM1: 63,18 мкг/млКонцентрация антитела: 3,5 мг/млСоотношение лекарственного вещества к антителу: 3,6 DM/AbЭндотоксин: <0,14 EU/мгМономер: 98,7%Лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови: не обнаружено
Mov19v1,6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1Концентрация DM1: 40,01 мкг/млКонцентрация антитела: 2,5 мг/млСоотношение лекарственного вещества к антителу: 3,5 DM/AbЭндотоксин: 0,67 EU/мгМономер: 98,3%Лекарственное вещество, не связанное с белками плазмы крови: Не обнаружено
Группы и средства лечения: (8 мышей/в группе)
1. Контроль растворителя
2. Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM, 1250 мкг/кг
3. Mov19v1,6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM, 1000 мкг/кг
4. Mov19v1,6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1, 1250 мкг/кг
Особенности проведения исследования:
Тридцать две мыши распределили по 4 группам случайным образом (8 мышей в группе) по массе тела. Массы тела находились в диапазоне от 23,4 до 27,3 г (25,5 ± 1,02, среднее значение ± стандартное отклонение). Мышей в каждой группе идентифицировали по насечке на ухе. Лечение было начато на 8 день после поступления. Мышам вводили конъюгат в зависимости от индивидуальной массы тела. Введение всех конъюгатов или PBS проводили внутривенно шприцом объемом 1,0 мл, снабженным иглой 1/2 дюйма 27 калибра. Из-за данных доз лечение было разделено на 2 инъекции с интервалом в 2 часа. Мышам не позволяется вводить более 350 мкл за инъекцию.
Вес тела мышей, которым вводили конъюгаты, был измерен и проиллюстрирован на Фиг. 25A-25D.
Пример 12. Фармакокинетические исследования
Конъюгат 17c
Фармакокинетика M-LDL-IMM-DM (конъюгата 17c) и M-SPDB-DM4 была оценена у самок мышей CD-I. Мышей распределили случайным образом по массе тела на 2 группы по 6 мышей. Мыши в группе А получали однократную внутривенную инъекцию 10 мг/кг M-LDL-IMM-DM через хвостовую вену. Мыши в группе B получали однократную внутривенную инъекцию 10 мг/кг M-SPDB-DM4 через хвостовую вену. Кровь собирали через 2 минуты, 6, 24, 48, 72, 168, 336, 504, 672 и 840 часов. У мышей по очереди брали кровь, чтобы убедиться, что ни у одной мыши не отбирали кровь более двух раз в течение 24 часов. Сыворотку отделили от крови и образцы заморозили при - 80°С до анализа методом ИФА (метод иммуноферментного анализа на основе использования энзим-связанного иммуносорбента). Общие анализы ИФА для антитела и ADC проводили на образцах, причём графики зависимости концентрации от времени проиллюстрированы на Фиг. 26. Общим анализом ИФА для антитела производят количественный анализ антитела, несущего по меньшей мере один майтанзиноид, а также антитела без прикрепленных майтанзиноидов. Концентрацию определили посредством захвата с использованием антитела человеческого IgG, а затем определяют количественно с использованием меченного ферментом антитела человеческого IgG. ИФА ADC включает в себя захват конъюгата, несущего по меньшей мере один присоединенный майтанзиноид, с использованием майтанзиноидного антитела, после чего компонент антитела конъюгата захватывается и обнаруживается с меченным ферментом антителом человеческого FC. Для того чтобы быть обнаруженным, конъюгат должен содержать по меньшей мере один ковалентно связанный майтанзиноид.
Параметры PK были получены с использованием стандартных алгоритмов модельно-независимой программы фармакокинетического анализа Phoenix WinNonlin, Professional v 6.1 (Certara, Princeton, NJ) и представлены в таблице 5.
Таблица 5
ADC/ИФА
C<sub>макс</sub>(мкг/мл)
T<sub>1/2</sub>(ч)
AUC<sub>0-∞,</sub>(ч*мкг/мл)
Cl(мл/ч/кг)
V<sub>ss</sub>(мл/кг)
17c Ab ИФА
153,8
366,4
31,341
0,32
162
17c ADC ИФА
188,1
261,2
24,454
0,41
145
M-SPDB-DM4 AbИФА
173,4
305,5
24,256
0,41
184
M-SPDB-DM4 ADCИФА
224,4
142,4
15,535
0,64
112
Конъюгат 26c
in vivo
Мышам CD-I инъектировали однократную дозу 26c или M9346A-C442-mal-SPDB-DM4, составляющую 10 мг/кг. Кровь собирали через 2 минуты, 24 часа и 72 часа после инъекции. Конъюгаты ADC были очищены от плазмы с использованием аффинного захвата со слитым белком рецептора фолата a-Fc, и образцы были проанализированы методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ) и масс-спектрометрии (МС). Потерю DM или DM4 измерили как нормализованную процентную распадаемость в зависимости от времени и проиллюстрировали графиком на Фиг. 27. Устойчивость конъюгата 26c больше, чем у M9346A-C442-mal-SPDB-DM4 как продемонстрировали меньшей наблюдаемая распадаемость в 2 минуты (-0,2 по сравнению с 7,3%) и 24-часовые временные точки (5,2 по сравнению с 16,5%). 72-часовая концентрация образца для M9346A-C442-mal-SPDB-DM4 была слишком разбавленной, чтобы иметь возможность получить нормализованное процентное значение распадаемости.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ИММУНОДЖЕН, ИНК.
<120> ПРОИЗВОДНЫЕ МАЙТАНЗИНОИДА С САМОРАСЩЕПЛЯЮЩИМИСЯ ПЕПТИДНЫМИ ЛИНКЕРАМИ И ИХ
КОНЪЮГАТЫ
<130> 121162-04220
<140> PCT/US2018/019874
<141> 2018-02-27
<150> 62/480,209
<151> 2017-03-31
<150> 62/465,118
<151> 2017-02-28
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 1
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Beta-Ala
<400> 2
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 3
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 4
Gly Tyr Phe Met Asn
1               5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> /replace="Gln" or "His" or "Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> /replace="His" or "Asn" or "Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (17)..(17)
<223> /replace="Glu" or "Thr" or "Ser" or "Ala" or "Val"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> /note="Variant residues given in the sequence have no
preference with respect to those in the annotations
for variant positions"
<400> 5
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 6
Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr
1               5
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 7
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His
1               5                   10                  15
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 8
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala
1               5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 9
Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 10
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210> 11
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 12
<211> 218
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 15
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 16
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210> 17
<211> 445
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ala Ser Asn
20                  25                  30
Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Asn His Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Ile Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Val
85                  90                  95
Arg Lys Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115                 120                 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165                 170                 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180                 185                 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 18
<211> 213
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 18
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Ala Ser His Arg Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Asn Asp Pro Trp Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 448
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Cys Ile
35                  40                  45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Asp Ala Pro Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
His Tyr Thr Ser Thr Leu His Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 21
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
His Tyr Thr Ser Thr Leu His Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 22
<211> 450
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210> 23
<211> 211
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Tyr Met
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Ser Tyr Thr Phe Gly
85                  90                  95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100                 105                 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115                 120                 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130                 135                 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145                 150                 155                 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165                 170                 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180                 185                 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195                 200                 205
Gly Glu Cys
210
<210> 24
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 24
Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Ser Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210> 25
<211> 213
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala His Ser Ser Val Ser Phe Met
20                  25                  30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 27
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser
20                  25                  30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85                  90                  95
Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210> 28
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Arg Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35                  40                  45
Asn Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Trp Gly Thr Thr Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 29
<211> 444
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 29
Gln Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser
20                  25                  30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Lys Lys Asp His Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Lys Gly Gly Tyr Ser Leu Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115                 120                 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130                 135                 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165                 170                 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180                 185                 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195                 200                 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440
<210> 30
<211> 444
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 30
Gln Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser
20                  25                  30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Lys Lys Asp His Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Lys Gly Gly Tyr Ser Leu Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115                 120                 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130                 135                 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165                 170                 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180                 185                 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195                 200                 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440
<210> 31
<211> 213
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Thr Tyr Met
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Asn Leu Pro Tyr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Pro Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 449
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20                  25                  30
Phe Ala Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35                  40                  45
Met Gly Tyr Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Ser Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 33
Ser Ser Ile Met His
1               5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 34
Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 35
Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr
1               5                   10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 36
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1               5                   10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 37
Arg Val Asn Arg Leu Val Asp
1               5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 38
Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr Thr
1               5
<210> 39
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 39
Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser
20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210> 41
<211> 108
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 41
Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210> 42
<211> 450
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 42
Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser
20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Cys Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly
450
<210> 43
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ala Phe Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 44
<211> 450
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid
<220>
<221> source
<223> /note="See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments"
<400> 44
Gln Xaa Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser
20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly
450
<---