Влияние предшественника синтеза изопреноидов на Ростовые и биосинтетические характеристики культуры клеток Polyscias fruticosa (L. ) Harms

УДК 576.5: 535.2

Е. С. Суханова, Д. В. Кочкин, Э. И. Гафиятова, А. М. Носов

ВЛИЯНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКА СИНТЕЗА ИЗОПРЕНОИДОВ НА РОСТОВЫЕ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS

В настоящей работе показано наличие в культуре клеток P. fruticosa (L.) Harms тритерпеновых гликозидов с олеаноловой кислотой в качестве агликона. Исследовано влияние на их синтез и накопление предшественника биосинтеза альтернативного пути образования изопреноидов - 2-С-метил-Б-эритритол-2,4-циклопирофосфата (МЭЦ). Показано повышение количественного содержания тритерпеновых соединений, а в некоторых случаях изменения в их качественном составе. Также выявлено влияние данного предшественника синтеза изопреноидов на рост культуры клеток: повышение ростовых характеристик при низких концентрациях вещества и угнетение роста при высоких.

Ключевые слова: Polyscias fruticosa (L.) Harms, Araliaceae, полисциас, метил-эритритол-циклопирофосфат, олеаноловая кислота, суспензионная культура клеток, тритерпеновые гликозиды, изореноиды, биосинтез изопреноидов.

E. S. Sukhanova, D. V. Kochkin, E. I. Gafiyatova, A M. Nosov

The isoprenoid synthesis precursor effect on growth and biosynthesis characteristics of Polyscias fruticosa (L.) Harms cell culture

There is shown that the P. fruticosa (L.) Harms cell culture contains triterpene glycosides with oleanolic acid as aglycon. It was analyzed the effect on their synthesis and accumulation of the biosynthes alternative pathways precursor of isoprenoids formation, 2-С-methyl-D-erythritol-2,4-cyclopirophosphate. There is shown the increase of quantitative triterpene glycosides content and, in some cases, qualitative variation. It was elicited the precursor effect on the growth of cell culture: increasing of growth characteristics in the cases of low concentration and growth depression in the cases of high concentration.

Key words: Polyscias fruticosa (L.) Harms, Araliaceae, Polyscias, methyl-erythritol-cyclopirophosphate, oleanolic acid, suspension cell culture, triterpene glycosides, isoprenoid, isoprenoid biosynthesis.

Одним из наиболее перспективных направлений современной фитобиотехнологии является использование культур клеток и тканей высших растений для получения биологически активных веществ. Обоснованность такого подхода определяется постоянно растущей потребностью медицины в уникальных по структуре и ак-

СУХАНОВА Елена Сергеевна - н. с. кафедры физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

E-mail: mushilda@mail.ru

КОЧКИН Дмитрий Владимирович - н. с. кафедры физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

E-mail: dima-kockin@rambler.ru

ГАФИЯТОВА Эльза Илшатовна - студент биологопочвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: ellzik13@mail.ru

НОСОВ Александр Михайлович - д. б. н., профессор кафедры физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

E-mail: al_nosov@mail.ru

тивности природных соединениях и низким уровнем естественных ресурсов растений-продуцентов, многие из которых являются редкими и исчезающими видами [1].

Культура клеток высших растений представляет собой экспериментально созданную популяцию соматических клеток. Практический интерес к культуре клеток высших растений в большой степени определен возможностью сохранения культивируемыми клетками способности к биосинтезу многих вторичных метаболитов, большинство из которых являются экономически важными веществами [2]. Данный подход имеет ряд преимуществ: экологическая чистота производства

культуры клеток, гарантированное производство биомассы независимо от сезона и погодных условий, отсутствие в биомассе токсичных веществ. Однако проблемой является низкая интенсивность вторичного метаболизма в условиях культуры клеток in vitro [3].

К постоянно востребованным, в фармакологическом отношении, вторичным метаболитам относятся тритерпеновые гликозиды. Эти соединения обладают весьма широким спектром терапевтической активности, воспроизвести который с помощью синтетических или полусинтетических препаратов до настоящего момента не удалось [4]. Наиболее ярким примером является Panax ginseng C. A. Meyer, относящийся к

семейству Araliaceae, уникальные свойства которого, обусловленные тритерпеновыми гликозидами дам-маранового ряда, известны в Юго-Восточной Азии уже несколько тысячелетий. Представители другого рода аралиевых - Polyscias - также хорошо известны в традиционной медицине Юго-Восточной Азии. Один из представителей рода, P.filicifolia Bailey, обладает тонизирующим, кардиотропным [5], антимутагенным [6] и рядом других лекарственных действий [7, 8, 9]. Изучение этого растения в нашей стране началось в начале 1970-х гг. с получения каллусной культуры [10]. Был проведен фитохимический анализ полученной культуры клеток, который показал наличие в биомассе большого количества водо- и спирторастворимых веществ, крахмала, свободных аминокислот, редуцирующих сахаров и тритерпеновых сапонинов [11].

Близкий к P. filicifolia Bailey вид, P. fruticosa (L.) Harms, используется как тонизирующее, повышающее работоспособность и сопротивляемость к инфекционным заболеваниям средство, а также как средство против головокружений [5]. В то же время P. fruticosa (L.) Harms изучен гораздо меньше, чем P. filicifolia Bailey, химический состав его экстрактов практически не исследован. В 2005 году в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН была впервые получена культура клеток P. fruticosa (L.) Harms [12].

Цель настоящей работы заключалась в выяснении способности суспензионной культуры клеток P. fruticosa (L.) Harms к синтезу тритерпеновых гликозидов, а также в изучении влияния предшественника альтернативного пути биосинтеза изопреноидов 2-С-метил-Э-эритритол-2,4-циклопирофосфата (МЭЦ) на накопление этих соединений и на рост культуры клеток.

Для работы была взята суспензионная культура клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms на 138 цикле выращивания, полученная из листовых эксплантов [12].

Выращивание проводили на среде Мурасиге и Скуга [13] с добавлением гидролизата казеина (0,5 г/л), инозита (0,1 г/л), 3 % сахарозы, витаминов по Уайту, БАП (1 мг/л) и 2,4-Д (2 мг/л). Культивирование проводили в темноте, при 26 оС, на качалке (100 об./мин.), в колбах объемом 250 мл (30-40 мл суспензии в колбе).

Для исследования ростовых характеристик культуры определяли такие параметры как содержание сухой и сырой биомассы в литре среды, концентрацию клеток в среде и жизнеспособность культуры.

Для определения содержания сырой и сухой биомассы в литре среды фиксированный объем суспензии (не меньше 15 мл, в 3-х повторностях) фильтровали через бумажный фильтр с помощью воронки Бюхнера, под вакуумом. Биомассу высушивали до постоянного веса при 60 оС.

Для подсчета концентрации клеток в среде 0,5 мл суспензии инкубировали с 2,0-2,5 мл 20 % раствора хромовой кислоты при 60 оС в течение 15-20 минут в зависимости от возраста суспензии.

Жизнеспособность культур клеток определяли, используя прижизненный краситель феносафранин (0,1 % раствор), путем подсчета живых (неокрашенных) и мертвых (окрашенных) культивируемых единиц под микроскопом [12].

Затем рассчитали такие параметры как индекс роста I:

I = (X -Xn)/Xn (1),

v max 0 0 \

где X и X. - максимальное и начальное значение одного

max 0

из критериев роста (в данной работе - содержание сухой биомассы в литре среды),

удельную скорость роста в экспоненциальной фазе ц:

ц = (lnX2-lnX1)/(t2-t1) (2),

где X2 и X1 - значения критерия роста (содержание сухой биомассы в литре среды) в момент времени t2 и tj, соответственно (рассчитывается для

экспоненциальной фазы роста),

время удвоения т:

т = 1п2/ц (3),

где ц - удельная скорость роста в экспоненциальной фазе,

экономический коэффициент Y:

Y = (Xmax-X0)/S (4)>

где X и X. - максимальное и начальное количество

max 0

сухой биомассы в среде (г/л), S - начальная концентрация субстрата (сахарозы) в среде (г/л среды) [14].

Выяснение наличия в культуре клеток полисциаса тритерпеновых гликозидов проводили с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого 150 мг измельченной воздушно-сухой биомассы экстрагировали смесью этанола и воды (70:30, по объему) под действием ультразвука в течение 30 минут. После центрифугирования 10-15 мкл полученного экстракта наносили на хроматографическую пластинку Kieselgel 60 (Merck, Германия) и элюировали в системе растворителей этилацетат: ледяная уксусная кислота : вода (50:25:25, по объему). Проявление хроматограммы проводили 1%-ным раствором анисового альдегида в смеси этанол : концентрированная серная кислота (10:1, по объему) с последующим нагреванием при 125 оС, 3-5 мин.

Для идентификации агликона была выделена суммарная фракция гликозидов. 1,5-2,0 г воздушносухой биомассы исчерпывающе экстрагировали 70% этиловым спиртом. Спиртовой экстракт упаривали

досуха под вакуумом и растворяли в воде, после чего последовательно экстрагировали этилацетатом и н-бу-танолом, насыщенным водой. Бутанольный экстракт упаривали досуха и подвергали кислотному гидролизу в смеси Килиани (соляная кислота : ледяная уксусная кислота : вода - 10:З5:55, по объёму) при 80 оС в течение 18 ч. Агликоны экстрагировали этилацетатом. Анализ агликонов проводили с помощью ТСХ на стеклянных пластинках Kieselgel 6О в хроматографических системах: 1) бензол : ацетон (З:1, по объёму); 2) бензол: этилацетат (1:1, по объёму). В качестве стандарта использовали олеаноловую кислоту (Sigma, США). Обнаружение проводили 2О %-ным раствором серной кислоты в этаноле с последующим прокаливанием при 110 оС З-5 мин.

В качестве предшественника пластидного пути биосинтеза изопреноидов использовали 2-С-метил^-эритритол-2,4-циклопирофосфата (МЭЦ) в концетра-циях З0, 100 и З00 мг/л. МЭЦ растворяли в воде, стерилизовали фильтрацией (через фильтр с d=0,22 нм) и добавляли в среду культивирования в начале цикла выращивания.

Анализ изменений качественного и относительного количественного состава тритерпеновых сапонинов в культуре клеток in vitro на 14 сутки роста проводили с помощью ТСХ. Для этого 50 мг воздушно-сухой биомассы экстрагировали в 1 мл смеси этанол : вода (70: З0, по объему) под действием ультразвука в течение З0 минут. После центрифугирования (11000

об./мин, 5 минут) 10 мкл супернатанта наносили на хроматографическую пластинку Kieselgel 60 (Merck, Германия) в двух повторностях. Элюирование и проявление хроматограммы осуществляли по приведенной выше методике. Сравнение качественного и

количественного состава сапонинов в пробах биомассы, выращенной в присутствии различных концентраций МЭЦ, проводили визуально.

На тонкослойных хроматограммах экстрактов из биомассы культуры клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms обнаруживаются два основных пятна, имеющих типичную для тритерпеноидов синюю окраску и относительные подвижности Rf 0,17 и 0,28. При этом ТСХ анализ гидролизатов суммарной гликозидной фракции показал наличие в качестве основного компонента вещества с хроматографической подвижностью, идентичной подвижности олеаноловой кислоты: Rf в системе 1 - 0,63, а в системе 2 - 0,48. Все эти данные убедительно свидетельствуют о способности культуры клеток P. fruticosa (L.) Harms к накоплению, по крайней мере, двух тритерпеновых гликозидов, агликоном которых является олеаноловая кислота.

По полученным результатам ростовых характеристик были построены кривые роста для контрольного варианта и для 3-х вариантов с различными концентрациями МЭЦ в среде (Рис. 1-4). На кривых роста отображены динамика накопления сырой (Fw), сухой биомассы (Dw) и числа клеток, а также изменение жизнеспособности в процессе цикла выращивания.

Из полученных данных видно, что лаг-фаза присутствует только при концентрациях МЭЦ 100 и 300 мг/л и длится до 5 суток. Возможно, это вызвано стрессом клеток, связанным с высокой концентрацией предшественника и их адаптацией к изменившемуся составу среды. Для всех полученных нами кривых следует отметить замедление экспоненциальной фазы роста и начало стационарной фазы на 10-11-е сутки. Фаза деградации наступает после 18 суток (Рис. 1-3), а для варианта с наибольшей концентрацией МЭЦ

Рис. 1. Ростовые характеристики суспензионной культуры P. fruticosa

Рис. 2. Ростовые характеристики суспензионной культуры P. fruticosa (L.) Harms, с добавлением 30 мг/л МЭЦ

120 г/л

о

О 5 10 15 20

Дни субкультивирования

Рис. З. Ростовые характеристики суспензионной культуры P.fruticosa (L.) Harms, с добавлением 100 мг/л МЭЦ

- с 14 суток (Рис. 4), что может свидетельствовать об угнетающем действии данной концентрации на клетки. Для всех вариантов следует отметить наличие некоторой «ступеньки» на 7 сутки. Возможно, это связано с наличием двух субпопуляций клеток в культуре, либо с особенностью утилизации сахарозы - ее расщеплением в среде с дальнейшим последовательным потреблением глюкозы и фруктозы. Такое явление было описано ранее для культуры клеток женьшеня [15]. Жизнеспособность во всех вариантах составляла 90-95%.

В то же время добавление МЭЦ в концентрациях 30 и 100 мг/л вызвало увеличение максимального содержания биомассы (до 8 г/л по сухому весу, по сравнению с 7 г/л для контрольного варианта), что, возможно, свидетельствует о его включении в метаболические пути клеток.

По полученным данным были рассчитаны такие параметры роста как индекс роста, удельная скорость роста в экспоненциальной фазе, время удвоения и экономический коэффициент (табл.).

Из представленных результатов следует, что увеличение концентрации МЭЦ до 100 мг/л заметно повышает ростовые характеристики (увеличение индекса роста, удельной скорости роста в экспоненте, снижение времени удвоения); а также повышает экономический коэффициент (доля сахарозы, идущей на построение клеток).

Анализ качественного состава тритерпеновых гликозидов культуры клеток P.fruticosa (L.) Harms, выращенной на средах с добавлением МЭЦ в различных концентрациях, показал, что доминирующим во всех пробах был гликозид с Rf 0,17. Исключение составлял только вариант культуры, выращенной в присутствии 300 мг/л МЭЦ. В данном случае содержание гликози-

0 5 10 15 20

Дни субкультивирования

Рис. 4. Ростовые характеристики суспензионной культуры P.fruticosa (L.) Harms, с добавлением 300 мг/л МЭЦ

дов с Rf 0,17 и 0,28 было практически одинаковым, однако на хроматограмме обнаруживается появление двух небольших дополнительных пятен с Rf 0,19 и 0,31. Связано ли появление этих минорных гликозидов с изменениями в процессе биосинтеза тритерпеноидов в присутствии интермедиата пластидного пути биосинтеза изопреноидов, или они являются продуктами гидролиза мажорных гликозидов, происходящего вследствие нарушения компартментации ферментов при гибели клеток, предстоит выяснить.

Из данных предварительного количественного анализа следует, что наибольшее накопление гликозида с Rf 0,17 отмечается на среде, содержащей 100 мг/л 2-митил-эритритол-2,4-циклопирофосфата (увеличение содержания в 1,5-2 раза по сравнению с контролем). При содержании этого предшественника в среде в концентрации 300 мг/л количество гликозида с Rf

0,17 менялось слабо, однако наблюдалось 2-кратное по сравнению с контролем увеличение накопления гликозида с Rf 0,28.

Таким образом, можно заключить, что культура клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms содержит глико-зиды олеаноловой кислоты, однако для выяснения их структуры требуются дополнительные исследования. При этом установлена возможность управлять их накоплением, добавляя в среду культивирования интермедиата одного из путей биосинтеза изопренои-дов. Показано влияние МЭЦ на рост культуры -стимулирующий эффект при небольших концентрациях (до 100 мг/л) и угнетающий эффект при более высоких.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 11-04-90432-Укр_ф_а «Исследование особенностей метаболизма тритерпеновых гликозидов в культурах

клеток растений семейства Araleaceae и механизмов его регулирования»; МЦП ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии», контракт № 16.М04.12.0003 «Развитие национальных коллекций культур клеток растений для развития методов современной селекции и сохранения редких генотипов» Шифр «2011-16-МЦП/03».

Л и т е р а т у р а

1. Verpoorte R., Contin A., Memelink J. Biotechnology for the production of plant secondary metabolites // Phytochemistry Reviews. - 2002. - № 1. - P.13-25.

2. Бутенко Р. Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С. 3-20.

3. Носов А. М. Культура клеток высших растений

- уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений. - 1999. - № 6. - С. 837-844.

4. Yun T. K., Brief introduction of Panax ginseng C. A. Meyer // J. Korean Med Sci. - 2001. - № 16. - P. 2-5.

5. Котин А. М. В поисках средства от всех заболеваний. -Спб: ЗАО НПФ «Биофармтокс», 2001. - 28 с.

6. Duhan O.M., Baryliak I.R., Nester T.I. and others. The antimutagenic activity of biomass extracts from the cultured cells of medicinal plants in the Ames test // Tsitol. Genet. - 1999. - V. 33. - № 6. - P.19-25.

7. Лекис А. В., Машанаускас Т. К., Иванов Л. Л. и др. Влияние культивируемых клеток полисциаса на биосинтез белка в печени кроликов // Химико-фармацевтический журнал. - 1988. - Т. 22. - №. 8. - С. 970-973.

8. Furmanowa M., Nosov A. M., Oreshnikov A. V. and others. Antimicrobial activity of Polyscias filicifolia Bailey cell biomass extracts // Pharmazie. - 2QQ2. - V. 57(6). - P. 424-426.

9. Kasauskas A., Rodovicius H., Viezeliene D. Effect of anoxia and Polyscias filicifolia Bailey biomass tincture on the activity of tRNA and aminoacyl-tRNA synthetases in isolated pig heart // Medicina (Kaunas). - 2QQ9. - V. 45(6). - P. 486-492.

1Q. Слепян Л. И., Арнаутов Н. Н., Грушвицкий И. В. Культура тканей некоторых видов рода Polyscias J. R. et G. Forst. (Araliaceae) // Растительные ресурсы. - 1975. - Т. 11. - В.

2. - С. 198-2Q4.

11. Слепян Л. И., Джабава Л. А., Лощилина И. А. Химическое и фармакологическое изучение биомассы культуры тканей Polyscias filicifolia Bailey // Растительные ресурсы. - 1975. - Т.

11. - В. 4. - С. 523-528.

12. Суханова Е. С., Черняк Н. Д., Носов А. М. Получение и характеристика каллусных и суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia Bailey и Polyscias fruticosa (L.) Harms. // Биотехнология. - 2Q1Q. - № 4 - С. 44-5Q.

13. Murashige T., Scoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Culture // Physiology Plantarum. - 1962. - V.15. - P. 473-497.

14. Носов А. М. Культура клеток высших растений: от фундаментальных исследований к практическому применению // Методы культивирования клеток. Под ред. Пинаева Г. П., Богдановой В. П. - Спб.: Изд-во Политехи. ун-та. - 2QQ8.

- С. 95-118.

15. Yi-Heng Zhang, Jian-Jiang Zhong, Jun-Tang Yu. Enhacement of ginseng C. A. Meyer saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng Wall.: manipulation of medium sucrose // Journal of Biotechnology. - 1996. - V. 51. - P. 49-56.