УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КОНТРОЛЯ В РЕАЛЬНОМ МАСШТАБЕ ВРЕМЕНИ МНОЖЕСТВА АМПЛИФИКАЦИЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
DEVICE FOR REAL TIME SIMULTANEOUS CONTROL OF PLURALITY OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATIONS

Изобретение относится к приборам для качественного и количественного анализа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), в которых использован метод полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени. Такие приборы широко используются в медицинской практике и в исследовательских целях:
- при диагностике инфекционных, онкологических и генетических заболеваний человека и животных;
- при анализе продуктов, содержащих генетически модифицированные организмы;
- при мониторинге экспрессии генов с диагностическими и исследовательскими целями и т.д.
Известен патент на прибор и метод для автоматизированной термообработки образцов жидкостей (патент США №8797526 В2, кл. G01N 1/10, 05.08.2014 г.). В описании этого прибора приведены традиционные технические решения. Прибор содержит термоблок, оснащенный системой контроля температуры и контейнером для множества пробирок с образцами, при этом конструкция контейнера обеспечивает термический контакт контейнера с установленными в нем пробиркам. Прибор содержит модуль регистрации света, излучаемого образцами и устройство сопряжения с множеством оптоволоконных световодов для передачи излучаемого света на устройство регистрации. Прибор содержит устройство перемещения модуля регистрации света и контейнера, которое позволяет варьировать расстояние между ними для того, чтобы устанавливать пробирки с образцами в контейнер или вынимать их оттуда, а также регистрировать свет, излучаемый образцами, содержащимися в пробирках, установленных в контейнере.
Контейнер имеет тепловой контакт через плиту основания с верхней поверхностью термоэлектрического элемента (элемента Пельтье). Нижняя поверхность термоэлектрического элемента соединена с теплообменником (радиатором). Выше ячеек с образцами расположена нагревательная плита с нагревательным элементом (термокрышка). В отверстиях термокрышки расположены оптоволоконные световоды возбуждения и приема излучения.
Согласно формуле изобретения предложен метод автоматизированной термообработки образцов жидкостей, который включает в себя метод варьирования расстояния между терморегулируемым контейнером для загрузки множества пробирок с образцами и концами оптоволоконных световодов. Остальные отличительные признаки относятся к модулю регистрации света: каждый оптоволоконный световод имеет первый и второй конец, каждый первый и каждый второй конец оптоволоконного световода фиксируются относительно друг друга и служат для передачи света, варьирование межячеечного расстояния позволяет загружать и выгружать пробирки и регистрировать свет от образцов, содержащихся в одной или нескольких пробирках, установленных в контейнере, причем вторые концы световодов располагаются стохастически.
Недостаток этого прибора и метода заключается в отсутствии технических решений, направленных на повышение скоростей нагрева и охлаждения образцов.
Известен прибор The LightCycler 480 Real-Time PCR System (www.roche-applied-science.com), в котором использована прослойка типа теплового насоса, обеспечивающая эффективный перенос тепла между элементами Пельтье и радиатором. Держатель пробирок выполнен из серебра.
Недостатком этого прибора является низкая скорость нагрева и охлаждения образцов, поскольку принятые меры незначительно повышают скорость нагрева и охлаждения образцов.
Известен держатель пробирок с реагентами с уменьшенной массой и повышенной скоростью изменения температуры образцов, используемых при термоциклировании при проведении полимерной цепной реакции (патент США №7632464 В2, кл. США 422/99, 422/102, 422/130, 15.12.2009 г.). Уменьшение массы достигается за счет добавления отверстий в двух перпендикулярных направлениях.
Недостатки этого устройства заключаются в незначительном уменьшении массы и теплоемкости держателя пробирок и в незначительном повышении скорости изменения температуры.
Известно устройство, имеющее название «Облегченная матрица для плашек, применяемая в ПЦР-амплификаторе» (патент на полезную модель РФ №133835, МПК С12М 1/38, опубл. 27.10.2013 г.). Матрица для плашек с реагентами, используемых при термоциклировании при проведении полимеразной цепной реакции, отличается тем, что она изготовлена из алюминиевого сплава, а между лунками для плашек с реагентами во взаимно перпендикулярных направлениях выполнены пазы треугольной формы.
Недостаток этого устройства заключается в уменьшении поверхности матрицы для плашек с реагентами, прилегающей к элементам Пельтье, что приводит к снижению скорости нагрева и охлаждения образцов.
Известно устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификации нуклеиновой кислоты (патент на изобретение РФ №2304277, МПК G01N 21/63, опубл. 10.08.2007 г.).
Устройство содержит термоциклер с теплопроводящим элементом, термокрышкой, устройством автоматического управления температурным режимом, оптической системой. В теплопроводящем элементе имеются углубления для пробирок с реакционными смесями. Оптическая система включает источник излучения, волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок и детектор. Световоды выполнены в виде оптических волокон с коаксиально расположенными центральной частью и периферийной частью для сбора флуоресценции. Центральная часть световода апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирках.
Недостатком этого устройства является отсутствие технических решений, повышающих скорость циклического изменения температуры для пробирок с реакционными смесями. Другой недостаток известного устройства вызван применением традиционных реакционных пробирок для ПЦР, которые имеют относительно длинные цилиндрическую и коническую части и выполнены из полимерного материала. Полимерный материал этих пробирок замедляет теплопередачу от теплопроводящего элемента к реакционной смеси, что не позволяет реализовать быстрые термические циклы.
Ближайшим из известных по технической сущности и назначению является устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификации нуклеиновой кислоты (патент на изобретение РФ №2418289, МПК G01N 21/64, опубл. 10.05.2011 г.).
Устройство содержит термоциклер, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышку и устройство автоматического управления температурным режимом. Также устройство содержит оптическую систему, включающую источник излучения, коаксиальные волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок, детектор для детектирования флуоресценции. При этом центральная передающая свет возбуждения часть световода апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирках, установленных в углублениях теплопроводящего элемента. Причем объем пробирок соответствует максимальному объему реакционной смеси. При этом между пробирками и термокрышкой установлена сменная теплоизолирующая перегородка с отверстиями, оси которых совпадают с осями пробирок, а диаметры равны внешнему диаметру световодов для передачи излучения флуоресценции из пробирок.
Предлагаемое изобретение решает задачу сокращения времени анализа, повышения чувствительности устройства и уменьшения необходимого для проведения ПЦР количества реакционной смеси.
Недостатком этого устройства является отсутствие технических решений для выравнивания скоростей нагрева и охлаждения образцов. Почти во всех известных устройствах автоматического управления температурным режимом приборов, в которых использован метод ПЦР в реальном времени, применяются термоэлектрические элементы (элементы Пельтье), которые обладают эффектом значительного различия скоростей нагрева и охлаждения образцов. Этот эффект объясняется тем обстоятельством, что термоэлектрические элементы обладают для режима охлаждения малой тепловой производительностью (переносом тепловой энергии за единицу времени). В режиме нагрева тепловая производительность этих элементов сильно увеличивается за счет суммирования перенесенной тепловой энергии и тепловой энергии элементов, получаемой от источника питания.
Предлагаемое изобретение решает задачу увеличения скорости изменения температуры в режиме охлаждения и тем самым позволяет повысить быстродействие и производительность этого устройства путем сокращения времени анализа. Далее приведены два варианта решения указанной задачи.
1. Указанная задача решается за счет того, что известное устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификации нуклеиновой кислоты, содержащее термоциклер, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышку и устройство автоматического управления температурным режимом, оптическую систему, включающую источник излучения и приемник излучения, коаксиальные волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок, центральная передающая свет возбуждения часть световода апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирках, установленных в углублениях теплопроводящего элемента, объем пробирок соответствует максимальному объему реакционной смеси, между пробирками и термокрышкой установлена сменная теплоизолирующая перегородка с отверстиями, микропроцессорное устройство управления и персональный компьютер, снабжено пневмогидравлической системой, которая содержит две емкости, частично заполненные жидкостью, трубопроводы, воздушный компрессор, четыре электромагнитных клапана, радиаторы и контроллер, воздушные фильтры, при этом теплопроводящий элемент имеет сквозные внутренние каналы, первый выход первой емкости соединен трубопроводом через первый электромагнитный клапан с окружающей средой, воздушный компрессор через воздушный фильтр соединен трубопроводами с первым входом первой емкости и с входом второго электромагнитного клапана, первый выход второй емкости через воздушный фильтр соединен трубопроводом с окружающей средой, выход второго электромагнитного клапана соединен трубопроводом с входами внутренних каналов теплопроводящего элемента, второй выход первой емкости соединен трубопроводами через третий электромагнитный клапан с теми же входами внутренних каналов теплопроводящего элемента, выходы внутренних каналов теплопроводящего элемента соединены трубопроводом с входом второй емкости, второй выход второй емкости соединен трубопроводами через четвертый электромагнитный клапан со вторым входом первой емкости, первая и вторая емкости имеют термический контакт с радиаторами, контроллер соединен с воздушным компрессором, четырьмя электромагнитными клапанами и микропроцессорным устройством управления.
2. Указанная задача решается за счет того, что устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты, содержащее термоциклер, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышку и устройство автоматического управления температурным режимом, оптическую систему, включающую источник излучения и приемник излучения, коаксиальные волоконно-оптические световоды для передачи света возбуждения от источника и излучения флуоресценции из пробирок, центральная передающая свет возбуждения часть световода апертурно согласована с количеством реакционной смеси в пробирках, установленных в углублениях теплопроводящего элемента, объем пробирок соответствует максимальному объему реакционной смеси, между пробирками и термокрышкой установлена сменная теплоизолирующая перегородка с отверстиями, микропроцессорное устройство управления и персональный компьютер, отличающееся тем, что устройство снабжено пневмогидравлической системой, которая содержит емкость, частично заполненную жидкостью, четыре электромагнитных или обратных клапана, два поршневых или мембранных насоса и воздушный фильтр, при этом при этом теплопроводящий элемент имеет сквозные внутренние каналы, первый вход емкости соединен через фильтр с окружающей средой, первый насос с помощью трубопроводов через первый клапан соединен с первым выходом емкости и через второй клапан соединен с входами внутренних каналов теплопроводящего элемента, второй насос с помощью трубопроводов через третий клапан соединен со вторым выходом емкости и через четвертый клапан соединен с теми же входами внутренних каналов теплопроводящего элемента, выходы внутренних каналов теплопроводящего элемента соединены трубопроводом со вторым входом емкости, контроллер соединен с воздушным компрессором, четырьмя электромагнитными клапанами и микропроцессорным устройством управления.
Изобретение поясняется чертежами, на которых представлены:
на фиг. 1 - принципиальная схема заявляемого устройства для одновременного контроля множества амплификаций нуклеиновой кислоты;
на фиг. 2 - схема сопряжения одной из множества пробирок с реакционными смесями с коаксиальными волоконно-оптическими световодами заявляемого устройства;
на фиг. 3 - схема пневмогидравлической системы первого варианта возможного исполнения заявляемого устройства;
на фиг. 4 - схема пневмогидравлической системы второго варианта возможного исполнения заявляемого устройства;
на фиг. 5 - диаграмма изменения температуры термоциклера с пробирками во время температурного цикла;
на фиг. 6 - таблица работы составных частей заявляемого устройства во время температурного цикла.
Заявленное устройство для одновременного контроля множества амплификаций нуклеиновой кислоты (фиг. 1) состоит из устройства для термоциклирования 1 (далее - термоциклер) с пробирками 2, оптической системы 3 с источником излучения 4 и приемником излучения 5, микропроцессорного устройства управления 6, персонального компьютера с программным обеспечением 7 и пневмогидравлической системы 8. Микропроцессорное устройство управления 6 соединено с термоциклером 1, оптической системой 3, персональным компьютером 7 и пневмогидравлической системой 8. Источник излучения 4 и приемник излучения 5 содержат галогенную лампу или белый светодиод 9, двухлинзовые конденсоры 10 и 11, между линзами которых установлены интерференционные светофильтры возбуждения 12 и эмиссии 13, многоканальный фотоприемник 14 и световодный жгут 15. Угол α - угол между крайними лучами конического светового пучка оптической системы 3.
Термоциклер 1 содержит теплопроводящий элемент 16 с расположенными в его углублениях пробирками 2, устройство автоматического управления температурным режимом 17 и термокрышку 18. Между теплопроводящим элементом 16 и термокрышкой 18 установлена сменная теплоизолирующая перегородка 19.
Пневмогидравлическая система 8 содержит контроллер 20 соединенный с микропроцессорным устройством управления 6. Пневмогидравлическая система 8 соединена с теплопроводящим элементом 16.
Одна из множества пробирок 2 изображена в увеличенном виде (фиг. 2). Пробирка 2 с реакционной смесью 21 закрыта крышкой 22 и установлена в углубление теплопроводящего элемента 16. В термокрышке 18 имеются отверстия, в которые вставляются концы коаксиальных волоконно-оптических световодов с центральной 23 и периферийной 24 частями.
Центральные части световодов 23 используются для передачи света возбуждения от источника излучения 4, а периферийные части 24 - для передачи излучения из пробирок в приемник излучения 5.
Теплоизолирующая перегородка 19 имеет отверстия, оси которых совпадают с осями пробирок, а диаметры равны внешнему диаметру периферийной части световодов 24. Центральная передающая свет возбуждения часть световода 23 апертурно согласована с количеством реакционной смеси 21 в пробирке 2: перегородка 19 имеет вертикальный размер, при котором обеспечивается максимальный угол α между крайними лучами конического светового пучка на выходе из центральной части световода, падающего на поверхность реакционной смеси с диаметром d, одновременно обеспечивается минимальное влияние тепловой крышки на температуру реакционной смеси.
На фиг. 3 показаны термоэлектрические элементы 25 (элементы Пельтье) и радиатор 26, которые входят в устройство автоматического управления температурным режимом 17 и с помощью которых обеспечивается циклический температурный режим теплопроводящего элемента 16.
Пневмогидравлическая система 8 (первый вариант) содержит две емкости 27, 28, частично заполненные жидкостью, трубопроводы 29, воздушный компрессор 30, четыре электромагнитных клапана 31-34, радиаторы 35, 36, контроллер 20 и воздушные фильтры 38, 39. Теплопроводящий элемент 16 имеет сквозные внутренние каналы.
Первый выход первой емкости 27 соединен трубопроводом через первый электромагнитный клапан 31 с окружающей средой.
Воздушный компрессор 30 через воздушный фильтр 37 соединен трубопроводами с первым входом первой емкости 27 и с входом второго электромагнитного клапана 32.
Первый выход второй емкости 28 через воздушный фильтр 38 соединен трубопроводом с окружающей средой.
Выход второго электромагнитного клапана 32 соединен трубопроводом с входами внутренних каналов теплопроводящего элемента 16.
Второй выход первой емкости 27 соединен трубопроводами через третий электромагнитный клапан 33 с теми же входами внутренних каналов теплопроводящего элемента 16.
Выходы внутренних каналов теплопроводящего элемента 16 соединены трубопроводом с входом второй емкости 28.
Второй выход второй емкости 28 соединен трубопроводами через четвертый электромагнитный клапан 34 со вторым входом первой емкости 27.
Первая и вторая емкости 27, 29 имеют термический контакт с радиаторами 35, 36.
Контроллер 20 соединен с воздушным компрессором 30 и электромагнитными клапанами 31-34.
На фиг. 4 показаны термоэлектрические элементы 25 (элементы Пельтье) и радиатор 26, которые входят в устройство автоматического управления температурным режимом 17 и с помощью которых обеспечивается циклический температурный режим теплопроводящего элемента 16.
Пневмогидравлическая система 8 (второй вариант) содержит емкость 27, частично заполненную жидкостью, четыре электромагнитных или обратных клапана 31-34, два поршневых или мембранных насоса 39, 40, радиатор 35, контроллер 20 и воздушный фильтр 37. Теплопроводящий элемент 16 имеет сквозные внутренние каналы.
Первый вход емкости 27 соединен через воздушный фильтр 37 с окружающей средой.
Первый насос 39 с помощью трубопроводов через первый клапан 31 соединен с первым выходом емкости 27 и через второй клапан 32 соединен с входами внутренних каналов теплопроводящего элемента 16.
Второй насос 40 с помощью трубопроводов через третий клапан 33 соединен со вторым выходом емкости 27 и через четвертый клапан 34 соединен с теми же входами внутренних каналов теплопроводящего элемента 16.
Выходы внутренних каналов теплопроводящего элемента 16 соединены трубопроводом со вторым входом емкости 27.
Контроллер 20 соединен с клапанами 31-34, насосами 39, 40.
Заявляемое устройство работает следующим образом.
При работе множество пробирок 2 (фиг. 1) помещается в углубления теплопроводящего элемента 16. Пример размещения одной из этих пробирок изображен на фиг. 2. Пробирка 2, которая содержит реакционную смесь 21 с набором химических реагентов и фрагментом нуклеиновой кислоты, герметично закрывается крышкой 22. Термокрышка 18 со сменной теплоизолирующей перегородкой 19, ограничивающей объем воздуха над пробиркой, обеспечивает дополнительный подогрев крышки 22 пробирки 2 и предотвращает конденсацию на ней капелек воды. С помощью микропроцессорного устройства управления 6 задается температурный цикл термоциклера 1, который имеет четыре температурных режима: нагрев во временном интервале t1-t2, стабилизация температуры Т2 на верхнем уровне во временном интервале t2-t3, охлаждение во временном интервале t3-t5 и стабилизация температуры Т1 на нижнем уровне во временном интервале t5-t7 (фиг. 5).
Работа устройства дополнительно поясняется таблицей работы составных частей заявляемого устройства во время температурного цикла (фиг. 6). Знаком «+» обозначены интервалы времени, когда компрессор и насосы находятся в рабочем состоянии, а клапаны открыты.
Микропроцессорное устройство управления 6 передает циклические сигналы для синхронизации работы контроллера 20.
При работе пневмогидравлической системы 8 контроллер 20 (фиг. 3) с помощью воздушного компрессора 30 через воздушный фильтр 37 в течение времени нагрева, стабилизации температуры на верхнем уровне и охлаждения создает и поддерживает повышенное воздушное давление в первой емкости 27.
В режиме охлаждения контроллер 20 открывает клапан 33. Из первой емкости 27 через трубопровод 29 под давлением поступает жидкость на входы внутренних каналов теплопроводящего элемента 16. Жидкость протекает через каналы теплопроводящего элемента 16 и выходов внутренних каналов теплопроводящего элемента 16 с помощью трубопровода поступает на вход второй емкости 28, в которой поддерживается нормальное давление с помощью фильтра 38. Протекающая через каналы теплопроводящего элемента жидкость значительно повышает скорость изменения температуры в режиме охлаждения. В конце режима охлаждения в момент времени t4 контроллер 20 выключает клапан 33 и включает клапан 32. Жидкость из внутренних каналов теплопроводящего элемента 16 удаляется во вторую емкость 28. Радиаторы 36 и 35 обеспечивают двухступенчатое охлаждение жидкости, нагретой при теплообмене с теплопроводящим элементом 16. Жидкость в емкости 28 охлаждается с помощью радиатора 36.
В режиме стабилизация температуры на нижнем уровне контроллер 20 в момент времени t5 останавливает воздушный компрессор 26, нагнетание воздуха прекращается. Контроллер 20 открывает клапан 31 для снижения давления в первой емкости 27, затем в момент времени t6 включает клапан 34, при этом избыток жидкости из второй емкости 28 переливается в первую емкость 27. Жидкость в емкости 27 охлаждается с помощью радиатора 35 до комнатной температуры.
В режиме нагрева и стабилизации температуры на верхнем уровне контроллер 20 закрывает все клапаны и включает воздушный компрессор 30 для создания повышенного давления в первой емкости 27. Затем температурные циклы многократно повторяются.
При работе пневмогидравлической системы 8 (фиг. 4) с помощью контроллера 20 через клапаны 31, 33 в течение времени стабилизации температуры на нижнем уровне, нагрева и стабилизации температуры на верхнем уровне насосы 39, 40 заполняются с выходов емкости 27 соответственно воздухом или жидкостью. В режиме охлаждения насос 40 через клапан 34 обеспечивает заполнение жидкостью и проточный режим каналов теплопроводящего элемента 16. В конце режима охлаждения в момент времени t4 насос 40 останавливается, а насос 39 через клапан 32 обеспечивает удаление жидкости из каналов теплопроводящего элемента 16 в емкость 27. Затем температурные циклы многократно повторяются.
При всех температурных режимах термоциклера активно работают термоэлектрические элементы 25 устройства автоматического управления температурным режимом 17. В режиме охлаждения температура теплопроводящего элемента и пробирок, содержащих реакционную смесь, должна измениться от 95 до 60°С.
В режиме охлаждения обеспечивается поток жидкости через внутренние каналы теплопроводящего элемента. Заполняющая емкости жидкость с помощью радиаторов поддерживается на уровне окружающей среды, которая может находиться в диапазоне 10-35°С. При протекании жидкости через внутренние каналы теплопроводящего элемента активно происходит теплообмен между нагретым теплопроводящим элементом с пробирками и жидкостью, обладающей значительно меньшей (комнатной) температурой. Длительность режима охлаждения значительно снижается, при этом сокращается общее время анализа.
В режимах стабилизации температуры на нижнем уровне, нагрева и стабилизации температуры на верхнем уровне жидкость во внутренних каналах теплопроводящего элемента отсутствует. За счет внутренних каналов уменьшается вес и теплоемкость теплопроводящего элемента, при этом также снижается длительность режима нагрева.
Скорость изменения температуры определяется как приращение температуры °С за секунду. При сокращении времени охлаждения скорость изменения температуры возрастает.
Предложенная конструкция устройства позволяет увеличить скорость изменения температуры в режиме охлаждения и тем самым повысить быстродействие и производительность этого устройства путем сокращения времени анализа.
Источники информации
1. Патент США №8797526 В2, кл. G01N 1/10, 05.08.2014 г.
2. The LightCycler 480 Real-Time PCR System (http://www.roche-applied-science.com).
3. Патент США №7632464 B2, кл. США 422/99, 422/102, 422/130, 15.12.2009 г.
4. Патент на полезную модель РФ №133835, МПК7 С12М 1/38, опубл. 27.10.2013 г.
5. Патент на изобретение РФ №2304277, МПК G01N 21/63, опубл. 10.08.2007 г.
6. Патент на изобретение РФ №2418289, МПК G01N 21/64, опубл. 10.05.2011 г.