Способность к адгезии типовых и биопленочных культур токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriaе

Способность к адгезии типовых и биопленочных культур токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae

Харсеева Г.Г.1 • Алиева А.А.1 • Сылка О.И.1 • Тюкавкина С.Ю.1 • Алексеева Л.П.2

Актуальность. Адгезия и способность к образованию биопленки рассматриваются среди ведущих факторов патогенности Corynebacterium diphtheriaе, обусловливающих формирование бактерионосительства. Именно за счет бактерионосительства осуществляется циркуляция штаммов возбудителя дифтерии в межэпидемический период. Цель - определение и сравнительный анализ адгезивной активности типовых и биопленочных культур токсигенных штаммов C. diphtheriae. Материал и методы. Исследованы типовые и биопленочные (120-и 720-часовые) культуры штаммов C. diphtheriae. Их тестирование на способность формировать биопленку проводили по методике Р. ШаМск (2000). Способность к адгезии исследовали на культуре клеток карциномы фарингеального

эпителия HEp-2 при различных временных экспозициях (2, 8, 18 часов). Количество C. diphtheriae, адгезированных на клетках НЕр-2, определяли путем высева смыва на 20% сывороточный агар с последующим подсчетом среднего количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Результаты. Все типовые и биопленочные культуры исследованных штаммов токсигенных C. diphtheriae обладали адгезивной активностью разной степени выраженности. При этом наиболее высокие показатели адгезии обнаружены у циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+ (от 0,26 ± 0,01 до 203,3 ± 3,3 КОЕ/мл), что отличалось от аналогичных показателей у других исследованных штаммов (от 0,03 ± 0,003 до 0,20 ± 0,01 КОЕ/мл). Наименьшей адгезивной активностью при 2-часовой экспозиции

культивирования обладали как типовая, так и биопленочные культуры штамма C. diphtheriae gravis tox+ № 6765, при 8- и 18-часовой - штаммов C. diphtheriae gravis с «молчащим» tox-геном и C. diphtheriae mitis tox+ № 269. У всех культур токсигенных штаммов C. diphtheriae способность к адгезии в динамике статистически значимо (р < 0,05) увеличивалась к 8- и 18-му часу культивирования. Заключение. Наиболее выраженные адгезивные свойства из всех исследованных токсигенных штаммов возбудителя дифтерии характерны для циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+.

Ключевые слова: Corynebacterium diphtheriaе, адгезия, типовые и биопленочные культуры

doi: 10.18786/2072-0505-2017-45-2-154-158

Циркуляция токсигенных штаммов СотупеЬа^епыт й1рЫкепае в популяции сохраняется несмотря на проведение вакцинопрофилактики дифтерийным анатоксином. Это связано с тем, что он не содержит компонентов поверхностных структур бактериальной клетки, не способен прерывать процесс адгезии возбудителя дифтерии и, как следствие, формирование бактерионосительства [1].

Адгезия С. ЛрЫкепае играет важнейшую роль в колонизации возбудителем слизистой оболочки зева, а это необходимое условие для дальнейшего развития инфекционного процесса [2]. Способность к адгезии у возбудителя дифтерии рассматривается как один из ведущих факторов патогенности [3, 4]. Различная способность токсигенных штаммов С. ЛрЫкепае к адгезии

обусловлена непосредственно компонентами клеточной стенки, а также поверхностными структурами коринебактерий - пили (фимбрии), липо-арабиноманнан (С^ЬАМ), поверхностные белки Б1Р0733 (или 67-72р) и Б1Р1281 [5, 6]. Главным структурным компонентом коринебактерий, способствующим их адгезии, признаны пили (фимбрии), которые ковалентно связаны с пепти-догликаном клеточной стенки. С^ЬАМ, расположенный на поверхности клеточной оболочки С. ЛрЫкепае, определяет связывание с эпителиальными клетками хозяина и активирует дендритные клетки и Т-хелперы, взаимодействуя с ТЬЯ2 [5, 7]. Белок Б1Р0733 (или 67-72р), обнаруженный у штаммов С. ЛрЫкепае, лишенных фимбрий [7-9], способен распознавать и специфически связываться не только с клетками респираторного тракта, но и с эритроцитами человека,

вызывая их гемагглютинацию [8]. Токсигенные штаммы C. diphtheriae обладают более выраженными адгезивными свойствами, чем нетоксиген-ные [10].

Одним из факторов, предрасполагающих к длительной персистенции бактерий в человеческом организме, считается их способность образовывать биопленки. Однако биопленкообразующая активность возбудителя дифтерии в литературе описана не достаточно [11, 12]. Предположительно, способность к биопленко-образованию играет важную роль в генезе дифтерийного бактерионосительства. В составе биопленки C. diphtheriae обладают меньшими размерами, располагаясь в виде плотно сцепленных кластеров, покрытых общим матриксом. Они оказывают ингибирующее воздействие на функциональную активность макрофагов, индуцируя процессы их апоптоза, а также становятся более устойчивыми к воздействию антибиотиков [12-15].

В связи с этим целью настоящего исследования было определение и сравнительный анализ адгезивной активности типовых и биопленочных культур токсигенных штаммов C. diphtheriae.

Материал и методы

Исследованы типовые и биопленочные (120-и 720-часовые) культуры штаммов: C. diphtheriae gravis tox+ № 665, C. diphtheriae gravis tox+ № 6765, C. diphtheriae mitis tox+ № 269, полученных из Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича; C. diphtheriae gravis tox+, выделенного от больного с диагнозом локализованной формы дифтерии бактериологической лабораторией ФГУ «1002 центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Северо-Кавказского военного округа» Минобороны России г. Ростова-на-Дону; C. diphtheriae gravis с «молчащим» tox-геном (отрицательный в тесте Элека и положительный в полимеразной цепной реакции при определении гена дифтерийного токсина), предоставленного МБУЗ «Городская больница № 1 им. Н.А. Семашко города Ростова-на-Дону».

Культивирование штаммов C. diphtheriae осуществляли в стеклянных (гидрофильных) пробирках, содержащих 3 мл 20% сывороточного бульона. Тестирование штаммов C. diphtheriae на способность формировать биопленку проводили по методике P. Watnick и соавт. (2000) [16]. Предварительно по стандарту Мак-Фарланда готовили микробную взвесь C. diphtheriae густотой

Харсеева Галина Георгиевна - д-р

мед. наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии и вирусологии № 21 Алиева Анна Александровна -старший лаборант кафедры микробиологии и вирусологии № 21 * 344015, г. Ростов-на-Дону, ул. Еременко, 58-74, Российская Федерация. Тел.: +7 (928) 192 02 06. Б-таИ:

anna1976rita@mail.ru Сылка Ольга Ивановна - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии № 21 Тюкавкина Светлана Юрьевна - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии № 21 Алексеева Людмила Павловна - д-р биол. наук, профессор, заведующая

лабораторией гибридом2

1 ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России; 344022,

г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29, Российская Федерация

2 ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора; 344002, г. Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40, Российская Федерация

109 КОЕ/мл. Полученную микробную взвесь в разведении 1:100 вносили в объеме 0,1 мл в пробирки с 3 мл 20% сывороточного бульона и инкубировали в термостате при +37 °С 120 и 720 часов.

Способность к адгезии штаммов C. diphtheriae исследовали в соответствии с указаниями L. Ott и соавт. [3, 17] на культуре клеток карциномы фарингеального эпителия HEp-2 при различных временных экспозициях (2, 8, 18 часов). Непосредственно перед опытом C. diphtheriae культивировали на кровяном агаре (рН 7,6-7,8) в течение 18 часов. Взвесь C. diphtheriae густотой 109 КОЕ/мл вносили в сывороточный бульон (рН 7,6-7,8), выдерживали в термостате (+37 °С) в течение 24 часов. Готовили взвесь дифтерийных микробов в среде RPMI-1640 с добавлением 5% сыворотки эмбриональной бычьей в концентрации 106 КОЕ/мл и по 1 мл вносили в лунки с разреженным монослоем HEp-2. Количество C. diphtheriae, адгезированных на клетках НЕр-2, определяли путем высева смыва на 20% сывороточный агар с последующим подсчетом среднего количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл.

Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью программы Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0) по общеизвестным методам вариационной статистики с оценкой статистической значимости показателей и различий по критерию Стьюдента для независимых выборок. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при p < 0,05. В тексте и таблицах результаты экспериментов представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M ± m).

Результаты

В проведенных нами ранее исследованиях [12, 15] установлено, что пик образования межмикробного матрикса музейным штаммом C. diphtheriae gravis tox+ № 665 приходился на ранние сроки (120-й час культивирования), а циркулирующим - на более поздние (720-й час культивирования). В соответствии с этим и было проведено исследование адгезивных свойств 120- и 720-часовых биопленочных культур различных токси-генных штаммов C. diphtheriae.

Все типовые и биопленочные культуры исследованных токсигенных штаммов C. diphtheriae обладали адгезивной активностью разной степени выраженности (таблица), при этом наиболее высокие показатели адгезии ((КОЕ ± m) х 102) среди всех культур обнаружены у циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+. Так, при 2-часовой экспозиции культивирования типовой культуры

Харсеева П., Алиева А.А., Сылка О.И., Тюкавкина С.Ю., Алексеева Л.П.

Способность к адгезии типовых и биопленочных культур токсигенных штаммов Corynebacterium ё'рЫЬепае

Адгезивные свойства типовых и биопленочных (120- и 720-часовых) культур штаммов СогупеЬааепит дфЫЬепае при различных экспозициях, (КОЕ ± т) х 102

Штаммы

Типовые культуры

120-часовые биопленочные культуры

720-часовые биопленочные культуры

2 часа 8 часов 18 часов 2 часа 8 часов 18 часов 2 часа 8 часов 18 часов

C. diphtheriae 0,26 ± 0,01 33,3 ± 3,3" 193,3 ± 3,3" gravis tox

C. diphtheriae 0,13 ± 0,01 26,8 ± 0,36" 113,3 ± 3,3" gravis tox+ № 665

C. diphtheriae 0,03 ± 0,003 20,2 ± 2,86" 60,0 ± 5,8" gravis tox+ № 6765

C. diphtheriae 0,20 ± 0,01 14,5 ± 0,1" 27,7 ± 0,34" gravis

с «молчащим» tox-геном

C. diphtheriae mitis 0,17 ± 0,01 18,02 ± 0,04" 18,9 ± 0,27" tox+ № 269

0,24 ± 0,01 32,3 ± 3,3" 203,3 ± 3,3*, " 0,26 ± 0,01 34,12 ± 0,14" 201,41 ±

0,35*, "

0,14 ± 0,01 27,8 ± 0,36** 120,0 ± 0,01*, ** 0,17 ± 0,02 20,72 ± 0,24*** 112,0 ± 0,1"

0,096 ± 0,01 20,2 ± 2,87** 61,0 ± 0,6** 0,05 ± 0,05 19,87 ± 0,17** 60,6 ± 0,57**

0,21 ± 0,01 13,7 ± 0,1** 26,7 ± 0,31** 0,19 ± 0,01 15,96 ± 0,08** 18,0 ± 0,01*,

0,22 ± 0,09 17,8 ± 0,04** 19,6 ± 0,22** 0,23 ± 0,01 13,03 ± 0,14*** 25,0 ± 0,01*,

" Статистическая значимость отличий

циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+ этот показатель составил 0,26 ± 0,01 КОЕ/мл, что отличалось (р < 0,05) от результатов определения адгезии других исследованных штаммов (от 0,03 ± 0,003 до 0,20 ± 0,01 КОЕ/мл). Аналогичные результаты получены при 8- и 18-часовых экспозициях культивирования типовых и биопленочных (120- и 720-часовых) культур C. diphtheriae. Наименьшей адгезивной активностью при 2-часовой экспозиции культивирования обладали как типовая, так и биопленочные культуры штамма C. diphtheriae gravis tox+ № 6765, при 8- и 18-часовой - штаммов C. diphtheriae gravis с «молчащим» tox-геном и C. diphtheriae mitis tox+ № 269.

При исследовании адгезивных свойств типовых и биопленочных (120- и 720-часовых) культур внутри каждой временной экспозиции (2, 8, 18 часов) при культивировании в течение 2 часов статистически значимых различий обнаружено не было. При 8-часовой экспозиции культивирования адгезивные свойства биопленочных культур исследованных штаммов C. diphtheriae не изменялись по сравнению с типовыми, за исключением 720-часовых биопленочных культур штаммов C. diphtheriae gravis tox+ № 665 и C. diphtheriae mitis tox+ № 269, у которых адгезивность снижалась (р < 0,05). К 18-му часу культивирования адгезивная активность увеличивалась (р < 0,05) у 120- и 720-часовых биопленочных культур

штамма C. diphtheriae gravis tox+ (циркулирующий), 120-часовой биопленочной культуры штамма C. diphtheriae gravis tox+ № 665 и 720-часовой биопленочной культуры штамма C. diphtheriae mitis tox+ № 269. Снижение адгезивных свойств отмечено у 720-часовой биопленочной культуры С. diphtheriae gravis с «молчащим» tox-геном.

Изучение способности к адгезии в динамике показало: и у типовых, и у биопленочных культур всех исследованных штаммов C. diphtheriae она статистически значимо (р < 0,05) увеличивалась к 8- и 18-му часу культивирования.

Обсуждение

Как известно, токсигенные штаммы возбудителя дифтерии обладают более выраженными адгезивными свойствами, чем нетоксигенные. Однако процесс адгезии более интенсивно протекает у убитых культур токсигенных штаммов C. diphtheriae, чем у живых, что сопряжено с повреждающим действием дифтерийного экзотоксина на клетки [3, 17]. В связи с этим в нашем исследовании мы использовали культуру клеток карциномы фарингеального эпителия НЕр-2, не чувствительную к действию токсина. Установлено, что при исследовании типовых культур C. diphtheriae наиболее высокие показатели адгезии при всех временных экспозициях обнаружены у циркулирующего

штамма C. diphtheriae gravis tox+, низкие - у штаммов C. diphtheriae gravis tox+ № 6765 (при экспозиции 2 часа), а также C. diphtheriae gravis с «молчащим» tox-геном и C. diphtheriae mitis tox+ № 269 (при экспозиции 8 и 18 часов). Аналогичные результаты получены при изучении биопленочных культур C. diphtheriae. Таким образом, адгезивный потенциал циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+, выделенного от больного, выше такового не только штаммов биовара mitis, но и музейных C. diphtheriae gravis tox+, а также штамма C. diphtheriae gravis с «молчащим» tox-геном, не способного продуцировать токсин. Поскольку межмикробный матрикс при формировании биопленки возбудителем дифтерии

имеет преимущественно белковую природу, можно предположить, что в его образовании важную роль играют адгезины.

Заключение

Наиболее выраженные адгезивные свойства из всех исследованных токсигенных штаммов возбудителя дифтерии обнаружены у циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+, у которого высока и интенсивность биопленкообразования. Выраженная способность к адгезии и, как следствие, к биопленкообразованию позволяет возбудителю колонизировать слизистую оболочку зева и длительно персистировать в организме при бактерионосительстве. ф

Литература

1. Харсеева ГГ, Москаленко ЕП, Трухачев АЛ, Митрофанова ТВ. Патогенные свойства С. diphtheriae, циркулирующих в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006;(6):6-9.

2. Костюкова НН, Карась СР. Адгезивная активность дифтерийных штаммов в зависимости от особенностей вызываемого ими инфекционного процесса. Журнал микробиологии. 1991 ;(11):24-7.

3. Ott L, Holler M, Gerlach RG, Hensel M, Rhein-laender J, Schaffer TE, Burkovski A. Coryne-bacterium diphtheriae invasion-associated protein (DIP1281) is involved in cell surface organization, adhesion and internalization in epithelial cells. BMC Microbiol. 2010;10:2. doi: 10.1186/1471-2180-10-2.

4. Rogers EA, Das A, Ton-That H. Adhesion by pathogenic corynebacteria. Adv Exp Med Biol. 2011;715:91-103. doi: 10.1007/978-94-007-0940-9_6.

5. Burkovski A. Cell envelope of corynebacteria: structure and influence on pathogenicity. ISRN Microbiol. 2013;2013:935736. doi: 10.1155/2013/935736.

6. Mandlik A, Swierczynski A, Das A, Ton-That H. Pili in Gram-positive bacteria: assembly, involvement in colonization and biofilm devel-

opment. Trends Microbiol. 2008;16(1):33-40. doi: 10.1016/j.tim.2007.10.010.

7. Moreira LO, Mattos-Guaraldi AL, Andrade AF. Novel lipoarabinomannan-like lipoglycan (CdiLAM) contributes to the adherence of Corynebacterium diphtheriae to epithelial cells. Arch Microbiol. 2008;190(5):521-30. doi: 10.1007/s00203-008-0398-y.

8. Colombo AV, Hirata R Jr, de Souza CM, Mon-teiro-Leal LH, Previato JO, Formiga LC, Andrade AF, Mattos-Guaraldi AL. Corynebacterium diphtheriae surface proteins as adhesins to human erythrocytes. FEMS Microbiol Lett. 2001;197(2):235-9. doi: 10.1111/j.1574-6968.2001.tb10609.x.

9. Sabbadini PS, Assis MC, Trost E, Gomes DL, Moreira LO, Dos Santos CS, Pereira GA, Nagao PE, Azevedo VA, Hirata Júnior R, Dos Santos AL, Tauch A, Mattos-Guaraldi AL. Cory-nebacterium diphtheriae 67-72p hemagglu-tinin, characterized as the protein DIP0733, contributes to invasion and induction of apop-tosis in HEp-2 cells. Microb Pathog. 2012;52(3): 165-76. doi: 10.1016/j.micpath.2011.12.003.

10. Харсеева ГГ, Алиева АА. Адгезия Corynebacterium diphtheriaе: роль поверхностных структур и механизм формирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014;(4):109-17.

11. Sued BP, Pereira PM, Faria YV, Ramos JN, Bi-natti VB, Santos KR, Seabra SH, Hirata R Júnior,

Vieira VV, Mattos-Guaraldi AL, Pereira JA. Sphygmomanometers and thermometers as potential fomites of Staphylococcus haemolyt-icus: biofilm formation in the presence of antibiotics. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2017;112(3): 188-95. doi: 10.1590/0074-02760160381.

12. Харсеева ГГ, Миронов АЮ, Фролова ЯН, Лабушкина АВ. Биологические свойства Corynebacterium diphtheriaе в составе биопленки. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012;(4):88-91.

13. Pizarro-Cerda J, Cossart P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 2006;124(4): 715-27. doi: 10.1016/j.cell.2006.02.012.

14. Харсеева ГГ, ред. Дифтерия: микробиологические и иммунологические аспекты. М.: Практическая медицина; 2014. 241 с.

15. Харсеева ГГ, Миронов АЮ, Фролова ЯН, Ла-бушкина АВ. Способность к формированию биопленки возбудителем дифтерии. Клиническая лабораторная диагностика. 2013;(2): 36-8.

16. Watnick P, Kolter R. Biofilm, city of microbes. J Bacteriol. 2000;182(10):2675-9. doi: 10.1128/ JB.182.10.2675-2679.2000.

17. Ott L, Holler M, Rheinlaender J, Schaffer TE, Hensel M, Burkovski A. Strain-specific differences in pili formation and the interaction of Corynebacterium diphtheriae with host cells. BMC Microbiol. 2010;10:257. doi: 10.1186/1471-2180-10-257.

References

1. Harseeva GG, Moskalenko EP, Truhachev AL, Mitrofanova TV. Pathogenic properties of Corynebacterium diphtheriae circulating in Rostov-on-Don city and Rostov Region during interepidemic period. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2006;(6): 6-9. Russian.

2. Kostyukova NN, Karas' SR. Adhesivity of diphtheria strains depending on specifics of related infectious process. Journal of Microbiology. 1991;(11):24-7. Russian.

3. Ott L, Höller M, Gerlach RG, Hensel M, Rheinlaender J, Schäffer TE, Burkovski A. Coryne-

bacterium diphtheriae invasion-associated protein (DIP1281) is involved in cell surface organization, adhesion and internalization in epithelial cells. BMC Microbiol. 2010;10:2. doi: 10.1186/1471-2180-10-2.

4. Rogers EA, Das A, Ton-That H. Adhesion by pathogenic corynebacteria. Adv Exp Med Biol.

Харсеева Г.Г., Алиева А.А., Сылка О.И., Тюкавкина С.Ю., Алексеева Л.П.

Способность к адгезии типовых и биопленочных культур токсигенных штаммов Corynebacterium сИрЫИепае

2011;715:91-103. doi: 10.1007/978-94-007-0940-9_6.

5. Burkovski A. Cell envelope of corynebacte-ria: structure and influence on pathogenicity. ISRN Microbiol. 2013;2013:935736. doi: 10.1155/2013/935736.

6. Mandlik A, Swierczynski A, Das A, Ton-That H. Pili in Gram-positive bacteria: assembly, involvement in colonization and biofilm development. Trends Microbiol. 2008;16(1):33-40. doi: 10.1016/j.tim.2007.10.010.

7. Moreira LO, Mattos-Guaraldi AL, Andrade AF. Novel lipoarabinomannan-like lipoglycan (CdiLAM) contributes to the adherence of Corynebacterium diphtheriae to epithelial cells. Arch Microbiol. 2008;190(5):521-30. doi: 10.1007/s00203-008-0398-y.

8. Colombo AV, Hirata R Jr, de Souza CM, Mon-teiro-Leal LH, Previato JO, Formiga LC, An-drade AF, Mattos-Guaraldi AL. Corynebacteri-um diphtheriae surface proteins as adhesins to human erythrocytes. FEMS Microbiol Lett. 2001;197(2):235-9. doi: 10.1111/j.1574-6968.2001.tb10609.x.

9. Sabbadini PS, Assis MC, Trost E, Gomes DL, Moreira LO, Dos Santos CS, Pereira GA, Nagao PE, Azevedo VA, Hirata Júnior R, Dos Santos AL, Tauch A, Mattos-Guaraldi AL. Cory-nebacterium diphtheriae 67-72p hemagglutinin, characterized as the protein DIP0733, contributes to invasion and induction of apop-tosis in HEp-2 cells. Microb Pathog. 2012;52(3): 165-76. doi: 10.1016/j.micpath.2011.12.003.

10. Kharseeva GG, Alieva AA. Adhesion of Cory-nebacterium diphtheriae: the role of surface structures and formation mechanism. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immuno-biology. 2014;(4): 109-17. Russian.

11. Sued BP, Pereira PM, Faria YV, Ramos JN, Bi-natti VB, Santos KR, Seabra SH, Hirata R Júnior, Vieira VV, Mattos-Guaraldi AL, Pereira JA. Sphygmomanometers and thermometers as potential fomites of Staphylococcus haemolyt-icus: biofilm formation in the presence of antibiotics. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2017;112(3): 188-95. doi: 10.1590/0074-02760160381.

12. Kharseeva GG, Mironov AJ, Frolova JN, La-bushkina AV. Biological properties of Coryne-

bacterium diphtheriae in the composition of biofilm. Immunopathology, allergology, infec-tology. 2012;(4):88-91. Russian.

13. Pizarro-Cerda J, Cossart P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 2006;124(4): 715-27. doi: 10.1016/j.cell.2006.02.012.

14. Kharseeva GG, editor. Diphtheria: microbiological and immunological aspects. Moscow: Prakticheskaya meditsina; 2014. 241 p. Russian.

15. Kharseyeva GG, Mironov AYu, Frolova YaN, Labushkina AV. The ability of diphtheria causative agent to form biofilm. Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 2013;(2):36-8. Russian.

16. Watnick P, Kolter R. Biofilm, city of microbes. J Bacteriol. 2000;182(10):2675-9. doi: 10.1128/ JB.182.10.2675-2679.2000.

17. Ott L, Holler M, Rheinlaender J, Schaffer TE, Hensel M, Burkovski A. Strain-specific differences in pili formation and the interaction of Corynebacterium diphtheriae with host cells. BMC Microbiol. 2010;10:257. doi: 10.1186/1471-2180-10-257.

Adhesivity оf standard and biofilm cultures of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains

Kharseeva G.G.1 • Alieva A.A.1 • Sylka O.I.1 • Tyukavkina S.Yu.1 • Alekseeva L.P.2

Background: Adhesion and ability to form a biofilm are considered among the leading pathogenicity factors of Corynebacterium diphtheriae, responsible for bacterial carriage. It is exactly bacterial carriage that ensures the circulation of diphtheria pathogen strains in the inter-epidemic periods. Aim: To assess and compare adhesivity of standard and biofilm cultures of toxigenic C. diphtheriae strains. Materials and methods: We studied standard and biofilm (120 and 720 hour) cultures of C. diphtheriae strains. Their ability to form a biofilm was tested according to P. Watnick (2000). Adhesivity was assessed in the pharyngeal epithelial carcinoma Hep-2 cell culture with various time exposures (2, 8, and 18 hours). The amounts of C. diphtheriae adhered to Hep-2 cells were measured by culturing the swabs in the 20% serum agar with subsequent calculation of mean numbers of colony-forming units (CFU) per 1 mL. Results: All standard and biofilm cultures of the studied toxigenic strains of C. diphtheriae had adhesive properties of various degrees. The highest adhesivity was

found in a circulating strain C. diphtheriae gravis tox+ (from 0.26 ± 0.01 to 203.3 ± 3.3 CFU/mL), which differed from the same parameters in other strains studied (from 0.03 ± 0.003 to 0.20 ± 0.01 CFU/mL). The lowest adhesivity after a 2-hour exposure was found both in the standard and biofilm cultures of C. diphtheriae gravis tox+ 6765, whereas after the exposure of 8 and 18 hours, the lowest adhesion properties were demonstrated by C. diphtheriae gravis with a "silent" tox gene and C. diphtheriae mi-tis tox+ 269. All cultures of toxigenic C. diphtheriae strains showed a statistically significant increase in their adhesivity (p < 0.05) by 8 and 18 hour of cultivation. Conclusion: Circulating C. diphtheriae gravis tox+ strain demonstrated the highest adhe-sivity among all toxigenic strains of the diphtheria pathogens studied.

Key words: Corynebacterium diphtheriae, adhesion, typical and biofilm cultures

doi: 10.18786/2072-0505-2017-45-2-154-158

Kharseeva Galina G. - MD, PhD, Professor, Head of the Chair of Microbiology and Virology No. 21

Alieva Anna A. - Senior Laboratory Assistant, Chair

of Microbiology and Virology No. 21

* 58-74 Eremenko ul., Rostov-on-Don, 344015,

Russian Federation. Tel.: +7 (928) 192 02 06.

E-mail: anna1976rita@mail.ru

Sylka Ol'ga I. - MD, PhD, Associate Professor, Chair

of Microbiology and Virology No. 21

Tyukavkina Svetlana Yu. - MD, PhD, Associate Professor, Chair of Microbiology and Virology No. 21 Alekseeva Lyudmila P. - Doctor of Biol. Sci., Professor, Head of the Laboratory of Hybridomas2

1 Rostov State Medical University;

29 Nakhichevanskiy pereulok, Rostov-on-Don, 344022, Russian Federation

2 Rostov-on-Don Plague Control Research Institute; 117/40 M. Gor'kogo ul., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation