СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ИМПРИНТИРОВАННОГО ПОЛИМЕРА
METHOD FOR PRODUCING MOLECULAR-IMPRINTED POLYMER

Изобретение относится к области аналитической химии и молекулярной биологии и может быть использовано для получения полимера, содержащего отпечатки (импринтинг) молекул, с последующим его применением для анализа и разделения  молекулярного материала.
Молекулярно-импринтированный полимер (МИП) - это искусственный рецептор, получающийся при отпечатывании молекул шаблона (зачастую молекулы целевого аналита) в слое на поверхности полимера и их последующем удалении путём деструкции и  промывки. Образовавшийся отпечаток представляет собой селективный сайт, который демонстрирует предпочтительное сродство к молекуле шаблону по сравнению с другими молекулами. К основным достоинствам МИП относятся: повышенная структурная прочность, устойчивость к высокой температуре и давлению, инертность к агрессивным средам, сохранение нативных свойств при хранении в течение нескольких лет, а также снижение затрат на производство и использование. Реализация этих положительных факторов обусловлена созданием жесткой полимерной сетки, выступающей в качестве МИП-матрицы.
В общем случае синтез МИП в себя три основные стадии:
1) образование комплекса между молекулой-шаблоном и остатками функциональных мономеров;
2) полимеризация полученного комплекса и сшивающего агента, приводящая в результате к образованию жесткого полимерного каркаса, содержащего участки с фиксированным расположением функциональных групп, задаваемым шаблоном;
3) удаление шаблона и получение полимера с отпечатком шаблона.
Важный этап успешного создания МИП - выбор подходящего функционального мономера, который при взаимодействии с молекулой шаблоном на стадии предварительной полимеризации способен образовать комплекс и возможность исключения из синтеза кросс линкеров.
2
Известен способ получения молекулярно-импринтированного полимера (патент РФ 2385889 по кл. МПК C09D 163/02, опуб. 10.04.2010), включающий подготовку реакционной смеси, содержащей капрон, молекулу-шаблон и растворитель, полимеризацию смеси, нанесение последней на твердый носитель, высушивание и удаление шаблона, отличающийся тем, что готовят реакционную смесь, содержащую 0,5-10% капрона, 0,5-5% порообразующей добавки и растворитель, в которую добавляют молекулу-шаблон до конечной концентрации 0,001-0,5 г/л, смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 5-10 мин, а удаление шаблона осуществляют путем последовательных промывок водой и этиловым спиртом, при этом в качестве растворителя используют моноспирт общей формулы R-CHal-СНХ-ОН, где Hal - атом галогена, a R и/или Х - атом водорода; атом галогена; гидроксильная группа; цианогруппа; линейные алкильные заместители, в том числе прерывающиеся гетероатомами, например кислородом, серой, азотом, в качестве порообразующей добавки используют полимерные соединения, выбранные из следующих: полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин, поливинилпирролидон или растворители, скорость испарения которых отличается от скорости испарения моноспирта, выбранные из протонных: вода, бутанол или апротонных: пиридин, диметилсульфоксид, глицерин, диметилформамид, а в качестве шаблона используют нуклеотиды или белки.
Недостатком способа является синтез в среде органического растворителя, что может влиять на устойчивость конформации молекулы шаблона и невозможность получения равномерной тонкой пленки МИП одностадийным синтезом на поверхности подложки с высокой удельной поверхностью.
Известен способ получения молекулярно импринтированного полимера на основе о-фенилендиамина для использования в электрохимическом биосенсоре для прямой регистрации миоглобина (патент РФ №2604688 по кл. МПК G01N 33/543, опуб. 10.11.2016), заключающийся в электрополимеризации о-фенилендиамина в присутствии миоглобина, как молекулы-шаблона, удалении миоглобина из полимера с последующей электрохимической регистрацией миоглобина в анализируемых водных буферных растворах за счет взаимодействия миоглобина с полостями в полимере, соответствующими молекуле миоглобина.
Недостатком способа является использование концентрированного щелочного раствора этилового спирта, который может изменять конформацию шаблона при инкубации и снижать таким образом специфичность и сорбционную ёмкость МИП.
Особый интерес в качестве материала для МИП на белковые молекулы представляет полианилин (ПАНИ). ПАНИ относится к проводящим полимерам и обладает уникальными электрическим и электрохимическими свойствами. Помимо этого, ПАНИ широко используется для изготовления сенсоров из-за лёгкого процесса полимеризации, механической стабильности и устойчивости. Перспективность применения ПАНИ в конструировании МИП в том числе обусловлена механизмом захвата целевых молекул полученным ПАНИ-МИП. Высокая прочность водородных связей, образующихся между полимерной плёнкой и функциональными группами молекул аналита, а также геометрическая конфигурация селективного сайта ПАНИ-МИП, позволяют с высокой эффективностью сорбировать целевые молекулы из исследуемых образцов.
Известен (Biosensors and Bioelectronics Volume 94, 15 August 2017, Pages 39-46) способ получения диспергируемых в воде молекулярных импринтированных проводящих частиц ПАНИ путем макромолекулярной совместной сборки ПАНИ с амфифильным сополимером и электрохимический сенсор на их основе. Амфифильный сополимер синтезируется с использованием 2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфоновой кислоты и стирола в качестве мономера, в дальнейшем осуществляется самосборка сополимера с частицами ПАНИ в водном растворе для получения частиц ПАНИ, подвижных в электрическом поле. При этом, в раствор добавляется яичный альбумин в качестве шаблона и происходит связывание альбумина с модифицированными частицами ПАНИ, что приводит к образованию молекулярно импринтированных частиц ПАНИ. В дальнейшем полученные частицы ПАНИ МИП наносятся на поверхность электрода и приводится измерение электрохимического отклика. Время отклика полученного сенсора составляет менее 3 минут.
Недостатком метода является многостадийность и длительность процедуры, а также получение ПАНИ МИП в диспергированной форме, что требует дополнительной стадии нанесения полученного МИП на подложку для создания сенсорного устройства.
Известен способ получения биомиметического молекулярно импринтированного полимера (Synthetic Metals, 2019, Volume 256, 116136), заключающийся вэлектрополимеризации проводящей сополимерной матрицы анилина и карбоксилированного анилина на электроде оксида графена в присутствии тропонина Т методом циклической вольтамперометрии. Линейный диапазон определения тропонина T находится в диапазоне от 0,02 до 0,09 нг/мл, с пределом обнаружения 0,008 нг/мл.
Однако использование оксида графена в качестве материала для поверхности электрода не позволяет достичь хорошей воспроизводимости результата синтеза,  значительно увеличивает время синтеза и усложняет процесс.
Известен способ получения ПАНИ МИП на основе молекулярно-импринтированных нанопроволок ПАНИ, используемого в электрохимическом биосенсоре для обнаружения хлорамфеникола(Journal of The Electrochemical Society, 2020, 167(2), 027527.). ПАНИ нанопроволоки выращивают на рабочем золотом электроде с использованием циклической вольтамперометрии. Синтез ПАНИ на электроде происходит посредством диффузионно-управляемого процесса с медленной кинетикой.
Недостатком способа является необходимость использования электрохимического метода синтеза ПАНИ МИП, что подразумевает невозможность синтеза подобных структур на непроводящих поверхностях и крайне затрудняет использование данного способа для создания перспективных оптических МИП сенсоров.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ синтеза молекулярно импринтированных полимеров, специфичных к пероксидазе хрена (ПХ) (Химия биологически активных веществ. Межвуз. сб. науч. трудов II Всерос. конф. 2019. С. 299-301.), который был выбран в качестве прототипа. Синтез ПАНИ МИП проводят в два этапа: на первом этапе осуществляют предварительную модификацию поверхности плотной электропроводной пленкой ПАНИ. На втором этапе осуществляют синтез ПАНИ МИП на поверхности полученного на первом этапе слоя ПАНИ. Для этого вводят раствор ПХ в качестве молекулы-шаблона в раствор для синтеза ПАНИ методом окислительной полимеризации.
Недостатком способа является невозможность его использования для синтеза МИП с большой обменной емкостью специфичных к белкам, не относящимся к классу оксиредуктаз, но представляющих основной интерес при анализе биологических жидкостей, например альбуминов и иммуноглобулинов. Данный эффект вероятнее всего связан с особенностями механизма окисления анилина в присутствии оксиредуктаз, молекулы которых непосредственно участвуют в синтезе ПАНИ, при этом на поверхности нанопроволок ПАНИ образуются специфические сайты связывания.
Технической проблемой заявляемого изобретения является расширение функциональных возможностей способа получения молекулярно-импринтированного полимера за счёт создания полимера для широкого круга молекул, включая белковые, в т.ч. альбумины и глобулины, и обеспечивающего возможность создания широкого спектра сенсорных элементов и систем разделения и концентрирования.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении стабильного по своим свойствам в течение длительного времени слоя молекулярно-импринтированного полимера  на основе полианилина, в том числе на белковые молекулы на электропроводящих поверхностях, а также на поверхностях органических и неорганических неэлектропроводных полимерных материалов при упрощении и удешевлении процедуры синтеза ПАНИ МИП.
-5
-3
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения молекулярно импринтированного полимера на основе полианилина на подложке, заключающемуся в очистке подложки и проведении её модификации путём окислительной полимеризации анилина либо его производных в присутствии окислителя до образования на подложке плотной электропроводной пленки полианилина, удалении остатков окислителя и анилина либо его производных, проведении дальнейшего синтеза в смеси, состоящей из анилина, либо его производных и окислителя в кислой среде, согласно изобретению, модификацию подложки проводят при рН от 3 и менее, при этом в смесь для синтеза перед внесением окислителя добавляют белковые молекулы-шаблоны классов глобулинов или альбуминов и дополнительно вводят молекулы класса оксиредуктаз в молярном соотношении к белковым молекулам-шаблонам от 0,1:1 до 2,5:1, а синтез проводят при концентрации анилина или его производных и окислителя в диапазоне от 10 до 10 моль/литр.
Синтез проводят при РН не менее 4,5.
Модификацию проводят до образования электропроводной плёнки полианилина толщиной 50-2500 нм.
Значение рН от 3 и менее при проведении модификации обеспечивает необходимые условия для получения однородной плотной электропроводной плёнки ПАНИ
Выбор молярного соотношения от 0,1:1 до 2,5:1 обеспечивает образование молекулярно импринтированных полимеров с наилучшей сорбционной емкостью.
-5
-3
Выбор значения концентрации анилина или его производных и окислителя в диапазоне от 10 до 10  моль/литр обеспечивает синтез молекулярно импринтированного полимера с наибольшей удельной площадью поверхности.
Способ осуществляется следующим образом.
На первом этапе образец органического или неорганического полимера, например стекла, для изготовления МИП подвергают процедуре предварительной очистки с помощью пероксидно-кислотных растворов, растворов ПАВ, дистиллированной и деионизованной воды. Далее проводят синтез ПАНИ методом окислительной полимеризации анилина, либо его производных, например анилинхлорида в присутствии сильного окислителя, например пероксодисульфата аммония в кислой среде. Избыток окислителя удаляют обработкой растворами восстановителей, например аскорбиновой кислоты, после чего образцы с нанесенным первым слоем ПАНИ промывают фосфатно-соляным буфером (ФСБ) и бидистиллированной водой до нейтральной реакции среды. Далее проводят второй этап с получением структур конечных ПАНИ МИП. При этом, в раствор анилина либо его производных, например анилинхлорида, и окислителя, например пероксодисульфата аммония, вводят белковые молекулы-шаблоны и молекулы класса оксиредуктаз, например ПХ  в молярном соотношении молекул класса оксиредуктаз к белковым молекулам-шаблонам от 0,1:1 до 2,5:1, при этом синтез проводят при рН не менее 4,5 с использованием сильно разбавленных кислот. В результате на поверхности изначально синтезированного плотного равномерного слоя ПАНИ образуется слой ПАНИ с развитой структурой, состоящий, например, из нанопроволок ПАНИ МИП, с большой удельной поверхностью и обменной емкостью по отношению к молекулам шаблонам. Присутствие на поверхности нанопроволок ПАНИ МИП специфичных сайтов к пероксидазе хрена не оказывает влияния на сорбционные характеристики полученного ПАНИ МИП по отношению к молекулам, использованным в качестве шаблонов и на аналитические характеристики возможных сенсорных устройств ввиду отсутствия пероксидазы хрена в образцах биологических жидкостей.
Полученные образцы обрабатывают раствором восстановителя, например аскорбиновой кислоты, промывают бидистиллированной водой и высушивают в токе аргона. Подготовленные таким образом сенсорные элементы пригодны к длительному хранению при температуре не более 5 градусов Цельсия. При этом, в качестве основы для синтеза ПАНИ МИП могут быть использованы как планарные подложки, так и подложки на основе поликапилляров, микроструктурных (фотонно кристаллических) оптических волокон (волноводов), пористой керамики, мембран и т.п., изготовленных из электропроводных и неэлектропроводных органических и неорганических полимерных материалов и металлов.
Пример 1.
2
4
2
2
6
8
4
2
2
8
6
8
4
2
2
8
4
2
2
8
6
8
6
-4
-3
-4
Синтез ПАНИ МИП на поверхности планарного стекла проводят следующим образом. Перед синтезом ПАНИ МИП стёкла обрабатывают раствором: HSO (ω = 97 %) + HO(ω = 25 %) в объёмном соотношении 1:1 для удаления возможных загрязнений и следовых остатков стеклянной пыли Синтез первого слоя ПАНИ на поверхности подложки проводят следующим образом: готовят растворы анилинхлорида (CHClN), (10 мл, 7.2 × 10 М) и пероксодисульфата аммония ((NH)SO), (10 мл, 1.25 × 10 М) в HCl (0,2 M), после чего в раствор CHClN вносят раствор (NH)SO в объёмном соотношении 1:1. В полученную смесь вертикально устанавливают образцы планарного стекла. Через 1,5 мин. извлекают стекла, промывают бидистиллированной водой (20 мл) и раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (20 мл, pH = 7.4) до достижения нейтральной реакции среды. Для удаления избытка (NH)SO применяют реакцию восстановления. Для этого образцы стекла вертикально устанавливают в раствор аскорбиновой кислоты (CHO) (20 мл, 5.5 × 10 М). После восстановления стёкла обрабатывают бидистиллированной водой и ФСБ, аналогично описанному выше образу для достижения нейтральных значений pH.
6
8
4
2
2
8
6
8
4
2
2
8
-5
-5
-3
Синтез ПАНИ МИП специфичного к сорбции яичного сывороточного альбумина (ОВА) осуществляют со следующими параметрами: CHClN (10 мл, 1.5 × 10 М) и (NH)SO (10 мл, С = 1.8 × 10 М) в HCl (0,6 × 10 M). Формирование селективных сайтов на поверхности ПАНИ осуществляют с добавлением раствора ПХ и молекул ОВА в качестве молекулы шаблона (C = 1 мг/мл, молярное соотношение ПХ к ОВА 0,5:1) в раствор CHClN непосредственно перед внесением (NH)SO.
6
8
6
-4
В реакционную смесь вертикально устанавливают стёкла на 60 мин. Дальнейшую очистку полученных сайтов связывания от молекул ПХ и ОВА осуществляют обработкой раствором CHO (40 мл, 5.6 × 10 М) в течение 30 мин. Регенерацию ПАНИ МИП после использования проводят аналогичным образом с добавлением этапа удаления неспецифически связанных молекул ПХ и ОВА промывкой раствором ФСБ с добавлением поверхностно активного вещества, например Triton X100: (0.02 % вес., 200 мл) в течение 15 мин.
2
Сорбционная емкость для ПАНИ-МИП на планарном стекле, полученного указанным способом, составляет 80-280 мкг/см.
Пример 2.
Синтез ПАНИ МИП на пористом керамическом носителе (ПК) проводят следующим образом. Образец ПК помещают в стеклянную трубку для возможности его обработки растворами в проточном режиме. Для удаления возможных загрязнений внутри ПК каждый образец промывают раствором ФСБ (50 мл, pH = 7.4).
6
8
4
2
2
8
6
8
4
2
2
8
4
2
2
8
6
8
6
-4
-3
-4
Синтез сорбирующего слоя ПАНИ проводят следующим образом. Готовят растворы CHClN (0,5 мл, 7.5 × 10 М) и (NH)SO (0,5 мл, 1.3 × 10 М) в HCl (0.2 M), после чего в раствор CHClN вносят раствор (NH)SO в объёмном соотношении 1:1. Получившуюся смесь вносят в ПК и выдерживают в течение 0,5 мин. Для удаления избытка (NH)SO применяют реакцию восстановления, образцы ПК промывают раствором CHO (6 × 10 М) путем прокачки насосом в течение 15 мин. После восстановления ПК обрабатывают раствором ФСБ (20 мл, pH = 7.4), для достижения нейтральных значений pH.
6
8
4
2
2
8
6
8
4
2
2
8
6
8
6
-5
-5
-3
-4
Синтез ПАНИ-МИП специфичного к сорбции иммуноглобулина (IgG) осуществляют следующим образом: CHClN (0,5 мл, 1.5 × 10 М) и (NH)SO (0,5 мл, 1.8 × 10 М) в HCl (0,6×10 M). Формирование селективных сайтов на поверхности ПАНИ осуществляют с добавлением раствора ПХ и молекул IgG в качестве молекулы шаблона (1 мг/мл, молярное соотношение ПХ к IgG 0,6:1) в раствор CHClN непосредственно перед внесением (NH)SO. Реакционную смесь вносят в ПК и выдерживают в течение 30 мин. Очистку полученных сайтов связывания от молекул шаблона осуществляют обработкой раствором CHO (С = 6 × 10 М) путем прокачки раствора насосом в течение 30 мин. Регенерацию ПАНИ МИП после использования проводят аналогичным образом с добавлением этапа удаления неспецифически связанных молекул ПХ и ОВА промывкой раствором ФСБ с добавлением поверхностно активного вещества, например Triton X100: 0.02 % масс., 200 мл в течение 30 мин.
2
Сорбционная емкость ПАНИ МИП на пористом керамическом носителе,  полученного указанным способом, составляет 150-360 мкг/см.
Пример 3.
Синтез ПАНИ МИП на поверхности пластины из металлического никеля проводят следующим образом. Для удаления возможных загрязнений пластину промывают последовательно растворами: соляной кислоты (0,5 М), бидистиллированной воды и раствором ФСБ (5 мл, pH = 7.4).
6
8
4
2
2
8
6
8
4
2
2
8
6
8
6
-4
-3
-4
Синтез сорбирующего слоя ПАНИ проводят следующим образом. Готовят растворы CHClN, (1 мл, 9 × 10 М) и (NH)SO (1 мл, 1.4 × 10 М) в HCl (0.2 M), после чего в раствор CHClN добавляют раствор (NH)SO в объёмном соотношении 1:1. Получившуюся смесь наносят на пластину и выдерживают в течение 1 мин. Далее пластину промывают раствором CHO (8 × 10 М) в течение 30 мин. и раствором ФСБ (pH = 7.4), для достижения нейтральных значений pH.
6
8
4
2
2
8
4
2
2
8
6
8
6
-5
-5
-3
-4
Синтез ПАНИ МИП осуществляют следующим образом: CHClN (1мл, 1.5 × 10 М) и (NH)SO (1 мл, 1.75 × 10 М) в HCl (0.5×10 M). Формирование селективных сайтов на поверхности ПАНИ осуществляют с добавлением раствора ПХ и молекул бычьего сывороточного альбумина в качестве молекулы шаблона (C = 1 мг/мл, молярное соотношение ПХ к бычьего сывороточного альбумина 0,9:1) в раствор C6H8ClN непосредственно перед внесением (NH)SO. Реакционную смесь наносят на поверхность пластины и выдерживают 60 мин. Дальнейшую очистку полученных сайтов связывания от молекул ПХ и ОВА осуществляют обработкой раствором CHO (5.6 × 10 М) в течение 30 мин. Регенерацию ПАНИ МИП после использования проводят аналогичным образом с добавлением этапа удаления неспецифически связанных молекул ПХ и ОВА промывкой раствором ФСБ с добавлением поверхностно активного вещества, например Triton X100: (0.02 % вес.) в течение 15 мин.
2
Сорбционная емкость ПАНИ МИП на подложке из пластины металлического никеля полученного указанным способом, составляет 176-370 мкг/см.