Анализ полиморфизма -238(G/A)TNF при раке молочной железы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 618.19-006.04:575.174.015.3.08

Т.Ф. Маливанова, Е.В. Скоромыслова, В.А. Юрченко, И.Б. Кононенко, Л.В. Манзюк,

Н.Н. Мазуренко

анализ полиморфизма -238(g/a)tnf при раке молочной железы

ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Фактор некроза опухолей (TNF) - это воспалительный цитокин, вовлеченный в патогенез злокачественных новообразований. Полиморфизм однонуклеотидной замены -238(G/A)TNF (rs361525) изучается для определения предрасположенности к инфекционным, аутоиммунным и онкологическим заболеваниям. Задачей исследования было изучение влияния -238(G/A)TNF на прогноз рака молочной железы (РМЖ). Аллельные варианты -238(G/A) TNF определяли методом ПЦР-ПДРФ. Мы не обнаружили различий в распределении генотипов в группах больных РМЖ с различными стадиями заболевания, разным уровнем экспрессии рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона и рецепторов эпидермального фактора роста. Во всех выделенных группах встречаемость AG-генотипа составила около 10%, гомозигот AA обнаружено не было. В то же время 5-летняя выживаемость носителей AG-генотипа оказалась существенно ниже, чем у носителей GG-генотипа для больных РМЖ со II стадией заболевания и с опухолями, положительными по рецепторам эстрогенов. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что полиморфизм -238(G/A)TNF не вносит значительного вклада в предрасположенность к заболеванию, однако является существенным фактором прогноза у больных РМЖ.

К л ю ч е в ы е с л о в а : фактор некроза опухолей, полиморфизм, рак молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний и 20% в структуре заболеваемости женского населения России [1]. РМЖ гетерогенен и объединяет ряд подтипов, отличающихся своими факторами риска и прогнозом заболевания. В настоящее время на основе профиля экспрессии генов выделены молекулярно-генетические подтипы, связанные с такими биологически активными молекулами, участвующими в патогенезе РМЖ, как рецепторы эстрогенов (РЭ), рецептора прогестерона (РП) и рецептора эпи-дермального фактора роста HER2/neu [18]. В то же время уровни экспрессии этих молекул в опухолевой ткани наряду со стадией заболевания являются традиционно используемыми в клинике маркерами прогноза и терапевтическими мишенями, определяющими тактику лечения.

Фактор некроза опухолей (TNF) - это воспалительный цитокин, принимающий участие в патогенезе злокачественных новообразований, в том числе РМЖ. В высоких дозах TNF способен индуцировать апоптоз, а при хронической низкой продукции - пролиферацию опухолевых клеток [6]. Ген TNF располагается на хромосоме 6 в области генов HLA Ill класса (6p21.3). В промоторной области гена TNF выявлен ряд сайтов однонуклеотидных замен, полиморфизм которых оказывает влияние на уровень экспрессии TNF. Полиморфизм области гена TNF активно исследуется для определения предрасположенности к различным инфекционным, ауто-

иммунным и онкологическим заболеваниям. Ранее мы изучали ассоциацию микросателлитного маркера TNFa и -308(G/A)TNF (rs1800629) с клинико-патологическими особенностями РМЖ. Мы не обнаружили связи этих полиморфных сайтов области гена TNF с развитием спорадического РМЖ, однако нам впервые удалось показать их ассоциацию с наследственным характером заболевания и гистологическим типом [3], а также с рецепторным статусом опухоли [4]. Кроме того, обнаружено, что для больных с III стадией РМЖ общая выживаемость существенно выше при наличии высокоэкспресси-рующего, чем низкоэкспрессирующего генотипа -308(G/A)TNF [5].

Однонуклеотидная замена G на A в положении -238 п. н. (rs361525) способна снижать уровень транскрипции TNF в экспериментах in vitro [11]. Данные литературы об ассоциации полиморфизма -238(G/A)TNF с РМЖ имеют противоречивый характер. Не обнаружено ассоциации полиморфизма -238(G/A)TNF с риском РМЖ для латиноамериканок [8], представительниц белой расы США, Австралии, Европы [9] и для хорватской популяции [17]. В то же время метаанализ трех указанных исследований, в том числе [9], выявил слабую ассоциацию этого полиморфизма с развитием РМЖ [10]. При исследовании индийской популяции была обнаружена ассоциация с РМЖ для дравидианской, но не индоевропейской группы [15], тогда как другие исследователи [14] обнаружили такую тенденцию для женщин индоевропейской группы. Не обнаружено ассоциации -238(G/A)TNF с фиброзно-кистозной мастопатией [16], карциномой in situ [9], РЭ- и РП-статусом РМЖ [9]. Изучение влияния полиморфизма -238(G/A)TNF на выживаемость больных РМЖ ранее не проводилось.

Задачей настоящего исследования было изучение ассоциации -238(G/A)TNF с известными факторами прогноза (стадией заболевания, РЭ-, РП- и HER2/neu-статусом) и определение прогностической значимости этого полиморфизма для РМЖ.

Материалы и методы

В ходе работы была протестирована коллекция геномной ДНК, полученная от 323 первичных больных РМЖ. Средний возраст больных составил 54,9 года (от 23 до 78 лет). Для всей выборки имелись сведения о стадии заболевания, для 278 больных был известен статус опухоли по РЭ и РП, для 83 - по HER2/neu. Кроме того, были доступны сведения о состоянии 265 больных за период не менее 60 мес с момента госпитализации.

Образцы геномной ДНК были выделены из лейкоцитов венозной крови с использованием протеиназы-К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Для определения аллельных вариантов -238(G/A)TNF использовали метод ПЦР-ПДРФ. ПЦР проводили с использованием праймеров F238 5'-AAACAGACCACAGACCTGGTC-3' и R238 5'-CTCACACTCCCCATCCTCCCG-GATC-3' [13] в режиме 94°С - 5 мин; 35 циклов: 94°С - 60 с, 60°С - 60 с и 72°С - 60 с; 72°С - 5 мин. Образующийся продукт ПЦР размером 155 п.о. подвергали дальнейшей рестрикции эндонуклеазой BamH1 (СибЭнзим, Новосибирск). Полученные фрагменты были проанализированы в 3% агарозном геле (см. рисунок). Аллель А определяли по наличию фрагмента размером 155 п. о., аллель G - фрагмента размером 135 п. о. В качестве положительного контроля в каждом эксперименте использовали образцы ДНК больных РМЖ из нашей коллекции, генотип по -238(G/A)TNF у которых был подтвержден секвени-рованием.

Сравнение распределения генотипов -238(G/A)TNF в выделенных группах проводили с помощью критерия х2. Критерием оценки прогностической значимости изучаемого полиморфизма являлись показатели общей выживаемости. Анализ общей выживаемости больных РМЖ проводили методом Каплана-Майера в программе GraphPad Prism (Version 4.00), для сравнения отдельных групп пациентов использовали лог-ранговый критерий. Пятилетнюю выживаемость определяли как количество больных, выживших за период 60 мес с момента госпитализации; для сравнения отдельных групп пациентов использовали точный критерий Фишера. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

В нашей выборке минорный аллель A был обнаружен только в составе гетерозиготного генотипа у 32 (9,9%) женщин (см. таблицу). Полученное распределение генотипов не отличалось от ожидаемого распределения по Hardy-Weinberg и представленного ранее другими авторами распределения в группе здоровых женщин и больных РМЖ ЗападноСибирского региона (p > 0,05) [2]. Указанные авторы

Электрофоретическое разделение фрагментов рестрикции ВатН1 в 3% агарозном геле. 1—4 - рестрикцированные фрагменты продуктов ПЦР ДНК больных РМЖ; К - контроль на полноту рестрикции эндонуклеазой ВатН1.

не обнаружили ассоциации полиморфизма -238(G/A) TNF с РМЖ. В свою очередь мы не обнаружили различий распределения генотипов в группах с различными стадиями заболевания, РЭ-, РП- и HER2/ neu-статусом (см. таблицу). Во всех выделенных группах встречаемость AG-генотипа была близка к 10%, за исключением HER2/neu (+), в которой такой генотип не встречался. В то же время статистически значимых различий между группами с опухолями, положительными и отрицательными по HER2/neu, не обнаружено.

При анализе 5-летней выживаемости для 265 больных РМЖ значимых различий между носителями генотипов AG и GG не обнаружено (см. таблицу). Разница в 5-летней выживаемости между носителями генотипов AG и GG составила более 10% (65,4 и 78,2% соответственно), однако различие оказалось статистически незначимым (p = 0,05).

При разделении выборки в соответствии со стадией заболевания в группе со II стадией РМЖ выживаемость больных с генотипом AG была ниже, чем у больных с генотипом GG (44,4 и 86,1%, соответственно, p = 0,007). Для носителей обоих генотипов прогноз в группе больных с I стадией РМЖ оказался весьма благоприятен, тогда как для больных с III-IV стадией 5-летняя выживаемость была низкой независимо от генотипа -238(G/A)TNF (см. таблицу).

Распределение генотипов -238(G/A)TNF и показатели общей выживаемости в группах больных РМж с разными стадиями

заболевания, РЭ-, Рп- и HER2/neu-статусом

Группа Частота генотипов -238(G/A)TNF Пятилетняя выживаемость Лог-ранговый

больных

n GG, % AG, % P n GG, % AG, % P критерий, p

Все 323 90,10 9,90 268 78,20 65,40 снз снз

I стадия 69 89,90 10,10 снз 64 93,00 100,00 снз снз

II стадия 147 91,20 8,80 125 86,10 44,40 0,007 0,0012

III стадия 91 89,00 11,00 79 52,20 60,00 снз снз

IV стадия 16 87,50 12,50

РЭ+ 177 89,30 10,70 снз 132 86,80% 62,50% 0,024 0,013

РЭ- 101 89,10 10,90 91 65,50 66,70 снз снз

РП+ 145 89,00 11,00 снз 106 86,00 75,00 снз снз

РП- 133 89,50 10,50 117 69,50 50,00 снз снз

HER2 (+) 15 100,00 0,00 снз

HER2 (-) 68 91,20 8,80

Примечание. снз - статистически незначимо.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таким образом, для носителей генотипа GG выживаемость оказалась значительно ниже при поздних (III-IV) стадиях заболевания (52,2%), чем для больных с ранними (I и II) стадиями (93 и 86,1% соответственно). Иная ситуация наблюдалась для носителей генотипа AG; только больные с I стадией заболевания имели благоприятный прогноз и 5-летняя выживаемость была значительно ниже как при II стадии, так и при III—IV стадий заболевания. По-видимому, для носителей низкоэкспрессирующего генотипа AG характерно более агрессивное течение заболевания, чем для носителей генотипа GG. Наши результаты соответствуют данным экспериментов in vitro, в которых было показано, что обработка низкими концентрациями TNF приводит к повышению инвазивности фенотипа культуры клеток карциномы молочной железы MCF7 [19]. Таким образом, низ-коэкспрессирующий генотип AG ассоциирован с ранней прогрессией и плохим прогнозом РМЖ. Мы не обнаружили статистически значимых различий в выживаемости больных со II стадией (до 44,4%) по сравнению с таковой у больных с III—IV стадией заболевания (до 60%) среди носителей генотипа AG, что может быть связано с низкой встречаемостью такого генотипа и соответственно немногочисленностью исследуемой группы.

При разделении выборки в соответствии с рецеп-торным статусом значимое различие между носителями генотипов AG и GG наблюдалось в группе больных с РЭ-положительным статусом опухоли (62,5 и 86,8%; p = 0,024), в то время как значения 5-летней выживаемости в группе с РЭ-отрицательным статусом были очень близки (p = 1). При разделении на группы по РП-статусу значимых различий по показателям общей выживаемости для носителей генотипов AG и GG мы не обнаружили. Необходимо отметить, что 5-летняя выживаемость в группе с РП-статусом опухоли была почти на 20% ниже для носителей генотипа AG по сравнению с носителями генотипа GG (50 и 69,5% соответственно), однако различие оказалось незначимым. Таким образом, для носителей генотипа AG 5-летняя выживаемость оказалась одинаково низкой как при РЭ-положительных, так и при РЭ-отрицательных опухолях, т. е. не зависела от рецепторного статуса опухоли. По данным литературы, в экспериментах на рецепторположительной стабильной клеточной линии карциномы молочной железы T47D, TNF способен усиливать эстрогензави-симую пролиферацию опухолевых клеток [16]. Более низкая выживаемость для носителей генотипа AG с РЭ-положительными опухолями может указывать на такой механизм резистентности к гормонотерапии, стандартно назначаемой в случае рецепторположи-тельных опухолей. Известно, что до 50% таких опухолей не поддаются лечению тамоксифеном, и сигнальные пути, вовлеченные в этот процесс, активно изучаются [12]. Возможно, полиморфизм области гена TNF также вносит свой вклад в чувствительность к терапии этой группы опухолей молочной железы, и этот вопрос требует дальнейшего исследования. Вместе с тем низкая эндогенная продукция TNF, обусловленная генотипом AG, по-видимому, не обеспечивает реализацию противоопухолевого эффекта этого цито-кина, молекулярные механизмы которого включают

TNF-индуцированную программируемую клеточную смерть, индукцию цитотоксических факторов (оксид азота и свободные радикалы кислорода) и других ци-токинов (интерлейкинов 1, 6 и 8) [6].

В связи с низкой частотой НЕИ2/пеи-поло-жительного РМЖ и, соответственно, небольшим количеством больных с НЕК2/пеи-позитивными опухолями в нашей выборке (n = 15), мы не смогли оценить влияние полиморфизма -238(G/A)TNF на 5-летнюю выживаемость в группах с различным HER2/neu-статусом РМЖ. Это, однако, представляется важным и требует дальнейших исследований, так как известно о взаимодействии сигнальных путей, активируемых TNF и HER2/neu на уровне транскрипционного фактора NF-kB [7].

Таким образом, нам не удалось обнаружить ассоциации встречаемости аллелей -238(G/A)TNF со стадией заболевания, РЭ-, РП- и НЕИ2/пеи-статусом, однако этот полиморфизм оказывал существенное влияние на 5-летнюю выживаемость больных РМЖ со II стадией заболевания и с РЭ-положительными опухолями. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что однонуклеотидная замена в сайте -238(G/A)TNF не вносит значительного вклада в предрасположенность к заболеванию, однако является существенным фактором прогноза у больных РМЖ.

Сведения об авторах:

Маливанова Татьяна Федоровна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр., лаб. онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, e-mail: tmali-vanova@yandex.ru

Скоромыслова Елена Викторовна - лаборант-исследователь, лаб. онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, e-mail: sko-romyslovalena@yandex.ru

Юрченко Валентина Александровна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр., отд. эпидемиологии опухолей, НИИ канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Кононенко Инесса Борисовна - канд. мед. наук, врач-онколог, отд-ние изучения новых противоопухолевых лекарств, НИИ клинической онкологии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Манзюк Людмила Валентиновна - д-р мед. наук, проф., рук., отд-ние изучения новых противоопухолевых лекарств, НИИ клинической онкологии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Мазуренко Наталья Николаевна - д-р биол. наук, проф., рук., лаб. онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН, e-mail: nn-mazurenko@mail.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. 2011; 22 (3, прил.1): 54-93.

2. Голованова О.В., Коненков В.И., Шевченко А.В. и др. // Иммунология. 2009; 30 (2): 92-4.

3. МаливановаТ. Ф., ОсташкинА. С., ЮрченкоВ. А., МазуренкоН. Н. Вопросы онкологии. 2007; 53 (6): 664-7.

4. Маливанова Т. Ф., Осташкин А. С., Юрченко В. А. и др. Молекулярная медицина. 2009; 3: 18-23.

5. Маливанова Т. Ф., Юрченко В. А., СкоромысловаЕ. В., Мазуренко Н.Н. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2012; 23 (1): 40-4.

6. Bertazza L., Mocellin S. Curr. Med. Chem. 2010; 17: 3337-52.

7. BiswasD.K., Iglehart J.D. J. Cell. Phyiol. 2006; 209: 645-52.

8. ErdeiE., KangH., Meisner A. et al. Cytokine. 2010; 51: 18-24.

9. Gaudet M., Milne R., Cox A. et al. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2009; 18 (5): 1610-6.

10. Guo J., MengH, Pei J., ZhuM. Breast Care. 2011; 6: 126-9.

11. HajeerA.H., HutchinsonI.V. Hum. Immunol. 2001; 62: 1191-9.

12. Hicks Ch., KumarR., PannutiA., Miele L. Breast Cancer: Basic Clin. Res. 2012; 6: 47-66.

13. Jatoi A., Dakhil S.R., Nguyen P.L. et al. Cancer. 2007; 110: 1396403.

14. KohaarI., TiwariP., KumarR. et al. Breast Cancer Res. Treat. 2009; 114: 347-55.

15. Pooja S., Francis A., BidH. et al. Breast Cancer Res. Treat. 2011; 126: 739-47.

16. RubioM.F., Werbajh S., CafferataE.G.A. et al. Oncogene. 2006; 25: 1367-77.

17. Sirotkovic-Skerlev M., Cacev T., Krizanac S. et al. Exp. Mol. Pathol. 2007; 83: 54-8.

18. Sorlie T., Perou C.M., TibshiraniR. et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98: 10869-74.

19. Yin Y., ChenX., Shu Y. Biomed. Pharmacother. 2009; 63: 421-8.

Поступила 15.07.12

ANALYSIS OF THE -238(G/A)TNF POLYMORPHISM IN BREAST CANCER PATIENTS

T.F. Malivanova, E.V. Skoromyslova, VA. Yurchenko, I.B. Kononenko, L.V. Manzyuk, NN. Mazurenko

N.N. Blokhin Russian cancer research Center RAMS, Moscow, RF

TNF is an inflammatory cytokine that involved in pathogenesis of different malignancies. Promoter single nucleotide polymorphism -238(G/A)TNF (rs361525) is investigated for the detection of susceptibility to the infectious, autoimmune and oncological diseases. The goal of the study was to investigate the association of -238(G/A)TNF polymorphism (rs361525) with breast cancer (BC) prognosis. -238(G/A) TNF allelic variants were detected by PCR-RFLP. We failed to reveal the genotype distributions disparity among groups with different stages of the disease, ER, PR or Her2/neu positive versus negative status. The AG genotype frequency was about 10% and there were no BC patients with AA genotype in all separated groups. However the overall survival was significantly lower for AG then for GG carriers with II stage or ER-positive BC. Our data suggest that -238(G/A)TNF polymorphism perhaps is not involved in the initiation of malignancies but it is a substantial factor of BC prognosis.

Key words: tumor necrosis factor TNF, polymorphism, breast cancer

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.881.3:579.25].083.1

В.А. Рар1, Т.И. Епихина1, Н.М. Пуховская 2, Н.П. Высочина2, Л.И. Иванов2

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ Из СЕМЕЙСТВА ANAPLASMATACEAE, ОБНАРУжЕННЫХ У КЛЕЩЕЙ РОДА HAEMAPHYSALIS И DERMACENTOR НА ТЕРРИТОРИИ ДАЛьНЕГО ВОСТОКА

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; 2Хабаровская противочумная

станция Роспотребнадзора

Методом двухраундовой полимеразной цепной реакции были исследованы образцы от 484 Haemaphysalis japonica, 359 Hae-maphysalis concinna и 221 Dermacentor silvarum, собранных на территории Амурской обл. и Хабаровского края, на наличие ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae. Все положительные образцы были охарактеризованы посредством анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и/или groESL оперона. В 49 образцах от H. japonica и в 3 - от H. concinna была обнаружена ДНК двух новых генетических вариантов Ehrlichia spp., которые на основании анализа последовательностей как гена 16S рРНК, так и groESL оперона были наиболее схожи с генетическими вариантами эрлихий, обнаруженными в клещах рода Haemaphysalis на территории Японии. В 4 образцах от H. concinna была выявлена ДНК нового генетического варианта Anaplasma bovis, который соответствовал генетическому варианту, обнаруженному у красно-серой полевки и у бурундука на территории Дальнего Востока. В трех образцах от H. concinna и 9 - от D. silvarum была обнаружена ДНК нетипичных бактерий, которых на основании анализа ну-клеотидных последовательностей гена 16S рРНК нельзя отнести ни к одному из родов семейства Anaplasmataceae. Выявленные нетипичные бактерии существенно отличались друг от друга по последовательностям гена 16S рРНК и не образовывали отдельной генетической группы.

Ключевые слова: семейство Anaplasmataceae, эрлихии, Anaplasma bovis, иксодовые клещи, генетические варианты

В семейство Anaplasmataceae входят внутриклеточные грамотрицательные облигатные внутриклеточные бактерии, размножающиеся внутри вакуолей в цитоплазме эукариотических клеток. В состав семейства входят переносимые гельминтами бактерии рода Neorickettsia, эндосимбионты беспозвоночных рода Wolbachia, а также переносимые иксодовыми клещами бактерии родов Anaplasma, Ehrlichia и от-

дельного филогенетического кластера "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" [11, 19].

В соответствии с современной классификацией род Anaplasma объединяет бактерии шести видов, а род Ehrlichia - пяти видов [5]. Кроме того, в последние годы в различных видах клещей и млекопитающих была обнаружена ДНК новых генетических вариантов эрлихий, не относящихся ни к одному из общепризнанных видов [8, 9, 15, 16, 21, 23].

В России на территории различных областей у таежных клещей Ixodes persulcatus и мелких млекопитающих была обнаружена ДНК возбудителя гранулоци-тарного анаплазмоза человека Anaplasma phagocyto-philum, предполагаемого возбудителя моноцитарного эрлихиоза человека Ehrlichia muris и патогенных для людей бактерий "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" [1, 3, 4, 6, 17, 18].

На Дальнем Востоке популяция иксодовых клещей представлена клещами, относящимся к нескольким родам - Ixodes, Haemaphysalis и Dermacentor. На территории Хабаровского и Приморского краев у таежных клещей и мелких млекопитающих были обнаружены бактерии тех же видов, что и на территории других областей [4, 17]. Кроме того, в крови мелких млекопитающих на территории Хабаровского края была обнаружена ДНК нового генетического варианта Ehrlichia spp. Khabarovsk [17], а в клещах Haema-physalis concinna на территории Приморского края -ДНК A. bovis [4].

Целью данной работы являлось изучение распро-