СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBSIELLA
METHOD OF ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BACTERIA OF GENUS KLEBSIELLA

Изобретение относится к области биотехнологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению и идентификации бактерий рода Klebsiella и производстве питательных сред для этих исследований.
Известен способ идентификации клебсиелл на основе специфической хромогенной реакции с 5-аминосалициловой кислотой. Эта хромогенная реакция была открыта нами в 1985 году. На основе этой уникальной реакции была разработана хромогенная питательная среда, защищенная авторским свидетельством СССР (Сиволодский Е.П. А.с. СССР №1313874, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 1.02.1987 г., опубликовано 30.05.1987 г., Бюллетень №20, С.106 с приоритетом от 25.02.1985 г.). В 1993 году это авторское свидетельство было переоформлено в патент на изобретение РФ №1313874. Нами также был выявлен биохимический механизм хромогенной реакции и открыт уникальный родоспецифический для клебсиелл фермент, вызывающий эту реакцию: 5-аминосалицилатдекарбоксилаза (Сиволодский Е.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н., Микробиология, 1994. Т.63. Вып.3. С.489-494). В соответствии с патентом на изобретение РФ №1313874 идентификация бактерий рода Klebsiella осуществляется путем посева исследуемого материала на питательную среду, содержащую сухой питательный агар, бромтимоловый синий, дистиллированную воду при рН 6,8-7,2 с последующим инкубированием посевов при 35-37°С и идентификацией искомых бактерий по характеру окрашивания, отличающийся тем, что в качестве источника углеводов используют L-арабинозу и дополнительно вносят в питательную среду 5-аминосалициловую кислоту при следующем соотношении ингредиентов, г/л: сухой питательный агар 32,0-35,0; L-арабиноза; бромтимоловый синий 0,06-0,08; 5-аминосалициловая кислота 4,5-5,5; дистиллированная вода до 1 л; посев инкубируют в течение 18-24 ч до образования темно-коричневой зоны вокруг колоний, по которой идентифицируют бактерии рода Klebsiella. Аналитическая чувствительность способа 100 КОЕ/мл, диагностическая чувствительность 91,7±2%, специфичность 100%. На основе указанного способа производится с 1999 г. отечественная хромогенная среда «Клебсиелла 5-АСК» (НИИЭМ им. Пастера, г.Санкт-Петербург).
Известна также модификация хромогенной питательной среды для выявления и идентификации клебсиелл, основанной на обнаружении родоспецифического для клебсиелл фермента 5-аминосалицилатдекарбоксилазы (патент на изобретение РФ №2416635, авторы Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю., опубликован 20.04.2011 г., приоритет от 14.10.2008 г.). В соответствии с изобретением питательная среда содержит источник азота, 5-аминосалициловую кислоту, бромтимоловый синий, агар микробиологический, дистиллированную воду и отличается тем, что дополнительно содержит глюкозу, парааминобензойную кислоту, экстракт кормовых дрожжей, трис-буфер, натрий углекислый, бриллиантовый зеленый, а в качестве источника азота - сухой питательный агар при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: питательный агар сухой 35,0-40,0; глюкоза 5,0-6,0; 5-аминосалициловая кислота 2,0-3,0; экстракт кормовых дрожжей 3,0-5,0; парааминобензойная кислота 0,01-0,02; бромтимоловый синий 0,08-0,09; трис-буфер 1,0-1,5; натрий углекислый 0,6-0,7; бриллиантовый зеленый 0,0001-0,0002; агар микробиологический 2,5-3,0. Данный состав питательной среды обеспечивает четкую дифференциацию клебсиелл (коричневая окраска) от других бактерий группы кишечной палочки и протеев (желтая окраска).
Известна синтетическая питательная среда для выделения клебсиелл (Калина Г.П. Среды узконаправленного действия для обнаружения и количественного учета клебсиелл. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1980. - №6. - С.28-32). В ее состав входят, г/л: раффиноза 5,0; мочевина 1,0; хлорид натрия 5,0; сульфат магния 0,2; сульфат калия 0,2; однозамещенный фосфат калия 0,8; двузамещенный фосфат калия 2,0; бромтимоловый синий 0,08; кристаллический фиолетовый 0,0002; агар 20,0; вода дистиллированная 1 л. На этой среде после 16-18 ч инкубации при 37°С клебсиеллы (K.pneumoniae, K.oxytoca) образуют блестящие слизистые колонии различной окраски (желтые, зеленые, голубые). Однако подавляется рост бактерий Enterobacter aerogenes (Klebsiella mobilis) и наблюдается рост мелких колоний других энтеробактерий (Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii).
Известна также селективная синтетическая питательная среда для выделения клебсиелл (Ибрагимов Ф.Х., Журавлева Л.А., Богановский В.А., Резаев А.А. Патент на изобретение РФ №2265056, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений и опубликован 27.11.2005 г.). Питательная среда включает агар, сульфат магния, бромтимоловый синий, углевод, источник азота, дистиллированную воду; отличается тем, что дополнительно содержит антибиотик карбенициллин, в качестве источника углевода содержит сахарозу, в качестве источника азота - нитрат калия при следующем соотношении компонентов, г/л: агар 15,0-20,0; сульфат магния 0,15-0,2; нитрат калия 1,8-2,0; сахароза 15,0-20,0; бромтимоловый синий 1% водный раствор 4-5 мл; карбенициллин 0,01-0,015; дистиллированная вода до 1 л, рН  7,6-7,8. Питательная среда обладает хорошей аналитической чувствительностью в отношении K.pneumoniae subsp.pneumoniae, но полностью подавляет рост K.mobilis (Enterobacter aerogenes). Селективные свойства карбенициллина недостаточны для подавления роста многих энтеробактерий и других бактерий.
Прототипом заявляемого способа нами избран способ по патенту на изобретение РФ №1313874 (автор Сиволодский Е.П.), так как в обоих способах выделение и идентификацию клебсиелл проводят по хромогенной реакции с использованием хромогенного субстрата 5-аминосалициловой кислоты и L-арабинозы, а различия отличительных признаков относятся только к источникам азота, углерода и солевой основе питательной среды.
Недостатком прототипного способа является отсутствие стандартности состава хромогенной питательной среды в связи с неопределенным составом питательного агара, используемого в качестве источника азота и углерода.
Недостатками других аналогов также является отсутствие стандартности состава источников азота и углерода питательных сред: в аналоге по патенту РФ №2416635 используют сухой питательный агар и экстракт кормовых дрожжей неопределенного состава; в аналогах на основе синтетических питательных сред используют в качестве источников азота и углерода различные субстраты - мочевину и рафинозу (среда К-2 Калины Г.П.) или нитрат калия и сахарозу (по патенту РФ №2265056), при этом подавляется рост некоторых актуальных видов клебсиелл - K.mobilis (E.aerogenes).
Целью изобретения является повышение стандартности исследования по выделению и идентификации бактерий рода Klebsiella. Повышение стандартности исследования состоит в достижении полной определенности и постоянства состава хромогенной питательной среды, используемой для выделения и идентификации бактерий рода Klebsiella, при сохранении ее высоких диагностических характеристик.
2
4
2
4
2
4
4
2
3
2
2
3
2
2
4
2
4
2
4
4
В соответствии с изобретением поставленная цель достигается тем, что исследуемый материал засевают на питательную среду, содержащую в качестве источника азота и углерода L-пролин и L-глютамат натрия, а также дополнительно NaCl, NaSO, KHPO, KHPO, MgSO, NaCO·10HO, 5-аминосалициловую кислоту, L-арабинозу, агар микробиологический, дистиллированную воду при следующем содержании ингредиентов, г/л: L-пролин 2,0-2,5; L-глютамат натрия 5,0-6,0; L-арабиноза 10,0; 5-аминосалициловая кислота 3,0-5,0; NaCO·10HO- 2,0-3,3; NaCl 5,0; NaSO 2,0; KHPO 0,5; KHPO 2,0; MgSO 0,1; агар микробиологический 12,0; вода дистиллированная 1 л; рН 7,2±0,2; при этом порошок смеси ингредиентов, кроме суплементов 5-аминосалициловой кислоты и углекислого натрия, растворяют при нагревании, добавляют суплементы, кипятят в течение 5 минут, разливают в стерильные чашки Петри; посевы инкубируют при 35°С в аэробных условиях в течение 24-48 ч, затем определяют принадлежность бактерий к роду Klebsiella по наличию вокруг колоний или газона бактерий зоны темно-коричневой окраски питательной среды. Примечание: бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; для положительного контроля используют штамм K.pneumoniae subsp.pneumoniae, имеющий заведомо положительную хромогенную реакцию с 5-аминосалициловой кислотой; для отрицательного контроля применяют штамм Escherichia coli; исследование проводят по методике заявляемого способа.
Отличительный существенный признак способа - использование в питательной среде в качестве источника азота и углерода аминокислот L-пролина 2-2,5 г/л и L-глютамата натрия 5-6 г/л.
Отличительный существенный признак способа не применялся в прототипе, аналогах и не известен из уровня техники.
Отличительный существенный признак способа не следует явным образом из уровня техники. Он установлен нами экспериментально в ходе исследований профилей утилизации всех белковых аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода, выполненных на 25 штаммах K.pneumoniae subsp.pneumoniae, 16 штаммах K.oxytoca и 16 штаммах K.mobilis. Оказалось, что только сочетание L-пролина и L-глютамата натрия обеспечивает на синтетической питательной среде рост всех штаммов изученных видов клебсиелл.
Отличительный существенный признак способа непосредственно определяет достижение поставленной цели: повышается стандартность исследования ввиду замены сухого питательного агара из естественного сырья неопределенного состава питательной среды прототипа аминокислотами L-пролином L-глютаматом натрия известного химического строения в известном количестве, то есть создается и используется хромогенная синтетическая среда строго определенного состава. При этом хромогенная синтетическая питательная среда заявляемого способа превосходит по диагностической чувствительности синтетические среды аналогов, которые подавляют рост клебсиелл вида K.mobilis.
2
4
2
4
2
4
4
2
3
2
Второй отличительный существенный признак - использование в составе питательной среды дополнительно комплекса минеральных солей, NaCl 5,0 г; NaSO 2,0 г; KHPO 0,5 г; KHPO 2,0 г; MgSO 0,1 г; NaCO·10HO 2,0-3,3 г; на 1 л дистиллированной воды. Эти компоненты необходимы для обеспечения утилизации бактериями L-пролина и L- -глютамата натрия в составе синтетической среды и содержатся в ней в точно определенном количестве. Этот признак не применялся в прототипе.
2
3
2
Существенными признаками способа являются другие компоненты питательной среды: 5-аминосалициловая кислота является хромогенным субстратом для уникального фермента клебсиелл, осуществляющего хромогенную реакцию; L-арабиноза является протектором окисления хромогенного субстрата кислородом воздуха и обеспечивает стабильность исходной окраски среды при ее хранении, а также служит одним из источников углерода; NaCO·10HO превращает 5-аминосалициловую кислоту в ее натриевую соль и обеспечивает стабильный оптимальный рН для хромогенной реакции.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа.
Пример 1. Исследуемый материал - суточную агаровую культуру бактерий засевают петлей в виде бляшки диаметром 6 мм на сектор питательной среды заявляемого способа (1/6 часть чашки Петри), состав и приготовление указаны в примечании; инкубируют в аэробных условиях в течение 24 ч при 35°С, после чего учитывают результат - наличие вокруг газона бактерий широкой зоны темно-коричневой окраски питательной среды на фоне прозрачной бесцветной среды указывает на принадлежность бактерий к роду Klebsiella. Контрольная идентификация культуры тестами видовой идентификации показала ее принадлежность к виду K.oxytoca.
2
4
2
4
2
4
4
2
3
2
Примечание к примеру 1. Методика приготовления хромогенной синтетической питательной среды заявляемого способа. В 1 л дистиллированной воды вносят порошок смеси ингредиентов, содержащий: L-пролин 2,0 г; L-глютамат натрия 5,0 г; L-арабинозу 10,0 г; NaCl 5,0 г; NaSO 2,0 г; KHPO 0,5 г; KHPO 2,0 г; MgSO 0,1 г; агар микробиологический 12,0 г; растворяют при нагревании, добавляют суплементы: 5-аминосалициловую кислоту 3,0 г и NaCO·10HO  2,0 г; кипятят в течение 5 минут, разливают в стерильные чашки Петри. Среда прозрачная, бесцветная, пригодна к использованию в течение 15 суток при хранении от 4°С до 8°С. Контроль питательной среды - наличие при использовании контрольного штамма K.pneumomae subsp.pneumoniae NCTC 9127 (180110 ГИСК) по методике примера 1 широкой зоны темно-коричневой окраски вокруг газона бактерий на бесцветном фоне среды; отрицательный контроль - отсутствие зоны темно-коричневой окраски питательной среды вокруг газона контрольного штамма E.coli.
-3
Пример 2. Исследуемый материал - мочу больного в разведении 10 0,1 мл засевают на поверхность питательной среды заявляемого способа, имеющей состав ингредиентов по примечанию к примеру 1, растирают шпателем, инкубируют в аэробных условиях при 35°С в течение 48 ч, после чего учитывают результат - наличие изолированных колоний бактерий диаметром 2-3 мм, окруженных зоной темно-коричневой окраски питательной среды на бесцветном фоне, указывает на принадлежность их к роду Klebsiella. Контрольная проверка изолятов из колоний с темно-коричневой зоной тестами видовой идентификации показала принадлежность их к виду K.mobilis.
2
3
2
Пример 3. Исследуемый материал - отделяемое раны засевают петлей на поверхность питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды:L-пролин 2,5 г; L-глютамат натрия 6,0 г; 5-аминосалициловую кислоту 5 г; NaCO·10HO 3,3 г; остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1; инкубируют в аэробных условиях при 35°С в течение 48 ч, после чего учитывают результат - наличие среди бесцветных колоний различных бактерий изолированных колоний, окруженных зоной темно-коричневой окраски питателной среды, указывает на принадлежность их к роду Klebsiella. Контрольная проверка изолятов из колоний, окруженных темно-коричневой зоной, тестами видовой идентификации выявила принадлежность их к виду K.pneumoniae subsp.pneumoniae.
2
3
2
Таким образом, при всех предельных концентрациях основных ингредиентов питательной среды заявляемого способа (L-пролина, L-глютамата натрия, 5-аминосалициловой кислоты, NaCO·10HO) и времени инкубации (24-48 ч) получены четкие результаты выделения и идентификации бактерий рода Klebsiella.
-1
Изучение аналитической чувствительности питательной среды заявляемого способа в сравнении со средой ГРМ-агар, проведенное с использованием бактерий K.pneumoniae subsp.pneumoniae, K.oxytoca, К.mobilis (по 3 штамма каждого вида), показало ее высокую аналитическую чувствительность со всеми изученными видами клебсиелл: 1-2 КОЕ/мл.
Изучение диагностической чувствительности питательной среды заявляемого способа в клинико-диагностической лаборатории в сравнении с выделением клебсиелл на средах Эндо, Плоскирева и идентификацией выделенных культур микробиологическим анализатором Vitek 2 показало, что ее диагностическая чувствительность составляет 95,3±1,7%. Не выявлено бактерий других родов, имеющих ложно-положительную хромогенную реакцию на хромогенной питательной среде заявляемого способа, то есть ее специфичность 100%.
Хромогенная синтетическая среда заявляемого способа подавляет рост грамположительных бактерий, в том числе спорообразующих бактерий рода Bacillus, поэтому не требует стерилизации в паровом стерилизаторе. Ввиду стандартности состава, обеспечивающего стабильность оптимального рН питательной среды, среда не содержит рН-индикатора бромтимолового синего, что позволяет более четко выявлять специфическую хромогенную окраску.