Исследование генетических факторов, сопряженных с прогнозом развития орального мукозита у пациентов с плоскоклеточным раком орофарингеальной области, получающих противоопухолевое лечение

Раздел - молекулярная медицина

Исследование генетических факторов, сопряженных с прогнозом развития орального мукозита у пациентов с плоскоклеточным раком орофарингеальной

области, получающих противоопухолевое лечение

12 12 ' Гвоздикова Е.Н., ' Аванесов А.М.

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России,117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Российский университет дружбы народов, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6

Информация об авторах Гвоздикова Евгения Николаевна

Аванесов Анатолий Михайлович, доктор медицинских наук

Контактное лицо: Гвоздикова Евгения Николаевна, kena-ravskaya200786@yandex.ru, 8-964-647-93-69 Резюме

Оральный мукозит - одно из самых распространенных и тяжелых осложнений проводимого противоопухолевого лечения. Среди этиологических факторов развития орального мукозита выделяют особенности противоопухолевого лечения злокачественных новообразований ротовой полости, состояние санированности полости рта, возраст пациента и другие. Определены основные механизмы патогенеза развития мукозитов. Но среди существующих теорий развития мукозита ни одна в полной мере не объясняет причины различий в степени тяжести клинических проявлений орального мукозита у различных пациентов. Таким образом, поиск новых факторов, определяющих развитие орального мукозита, является актуальной исследовательской проблемой. К таким факторам могут относиться генетические особенности пациентов.

С 2016 по 2017 год на базе Российского научного центра рентгенорадиологии (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России) нами проведено пилотное исследование по определению частот полиморфных вариантов в генах детоксикации ксенобитиков и генах иммунного ответа у 23 пациентов с плоскоклеточным раком орофарингеальной области, имеющих различные степени тяжести проявления орального мукозита. Выявлена ассоциация аллеля rs2070874-T гена IL4 с развитием мукозита тяжелой степени. Полученные результаты указывают на перспективность данного направления

исследований и свидетельствуют о необходимости проведения подобных работ на больших по объему выборках.

Ключевые слова: мукозит, полиморфизм, гены детоксикации ксенобиотиков, гены иммунного ответа, IL4

The study of genetic markers associated with the forecast for the development of oral mucositis in patients with squamous cell carcinoma of the oropharyngeal region, receiving anticancer treatment

19 19

Gvozdikova E.N., 1,2Avanesov A.M. 1Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Address: 117997 Moscow, Profsoyuznaya str., 86, Russian Scientific Center of Roentgenoradiology

Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Professional Education Peoples' Friendship University of Russia Address: 117198, Miklukho-Maklay str., 6 Summary

Oral mucositis is one of the most common and serious complications of cancer treatment. Etiological factors of oral mucositis due to cancer treatment include the state of the oral cavity, patients' age and many other factors. The existing theories of mucositis development do not fully explain differences in the severity of mucositis in different patients. The search for the factors linked with mucositis development is an important scientific task. Patients' genetic characteristics may be associated with the risk of mucositis development.

In 2016 - 2017 years, we carried out a pilot study of polymorphic variants in the genes of detoxification and the genes of the immune response in 23 patients with squamous cell carcinoma of the oropharyngeal region with varying severity symptoms of oral mucositis. The study was performed in the "Russian Scientific Center of Roentgenology and Radiology" of the Ministry of Health of the Russian Federation. The allele rs2070874-T of the IL4 gene appeared to be associated with the development of severe mucositis. These results show a perspective on future research directions.

Key words: mucositis, polymorphism, detoxification genes, genes of the immune response, IL4 Введение

Несмотря на значительный прогресс в разработке и применении щадящих методов лечения злокачественных новообразований и широком использовании

конформной лучевой терапии, противоопухолевое лечение часто сопровождается развитием осложнений. Известно, что присоединение осложнений и их лечение на этапе противоопухолевой терапии является глобальной проблемой. Частота возникновения осложнений неодинакова, наиболее часто встречаются энтеропатии (до 90%), развитие которых начинается с поражения полости рта в виде мукозита [1, 13, 4, 3]. Мукозит -частое и серьезное осложнение, которое в отдельных случаях может носить жизнеугрожающий характер в результате развития тяжелой нутритивной недостаточности и ее осложнений, либо вследствие сепсиса [6, 8, 16]. Кроме того, мукозиты различной степени тяжести существенно повышают расходы на лечение, увеличивая продолжительность госпитализации и потребность в нутритивной поддержке и медикаментах.

К факторам риска раннего возникновения и развития тяжелых побочных эффектов можно отнести истощение и тяжелое психологического состояние больного, пожилой возраст, сопутствующие заболевания, травмы слизистых полости рта и глотки, наличие кариозных зубов, курение и прием алкоголя [10, 17, 13, 22]. Другую группу факторов высокого риска возникновения побочных эффектов формируют характеристики опухолевого процесса (локализация, распространение и т.д.) [14, 19]. По данным различных авторов важнейшими факторами развития осложнений в полости рта является зависимость их от разовых и суммарных доз ионизирующего излучения и противоопухолевых препаратов, путей и режимов их введения [5, 2, 20, 23, 7, 12, 6].

В качестве факторов риска развития осложнений противоопухолевого лечения могут рассматриваться также генетические особенности пациентов, которые могут влиять на ответ на химиотерапию или лучевую терапию. Полиморфные варианты генов, участвующих, например, в регуляции метаболизма и детоксикации ксенобиотиков, репарации, иммунной системы и других, могут рассматриваться как потенциальные модификаторы эффектов противоопухолевого лечения. Известно, что в метаболизме метотрексата участвует фермент метилентетрагидрофолатредуктаза - продукт гена MTHFR. Ulrich и соавторы в своей работе показали, что при проведении профилактики реакции «трасплантат против хозяина» после аллогенной трансплантации костного мозга метотрексатом у 220 пациентов с хроническим миелолейкозом риск развития мукозита был значительно выше при наличии минорного гомозиготного варианта rs1801133-TT гена MTHFR, контролирующего синтез соответствующего фермента с пониженной биологической активностью [18].

Возникновение карцином головы и шеи во многом связано с увеличением канцерогенной нагрузки на организм при курении и алкоголизме. Особую роль в

реализации онкогенных рисков играют ферменты цитохрома Р450 - ферменты первой стадии детоксикации ксенобиотиков. Однако эти ферменты, при дисбалансе систем первой и второй стадий детоксикации, могут увеличивать канцерогенный потенциал некоторых химических веществ. Поэтому исследование генетических вариантов ферментов цитохрома Р450 актуально в аспекте развития и лечения различных видов рака [9, 11, 15, 21].

В литературе мы не встретили ни одной работы, указывающей на возможность наличия зависимости между генетическими факторами и степенью тяжести оральных мукозитов. Роль и значение генетических факторов в возникновении лучевых и химиотерапевтических мукозитов практически не изучена.

Цель исследования

Провести пилотное исследование по определению прогностического значения частоты аллелей в генах, кодирующих ферменты биотрансформации и детоксикациии ксенобиотиков и иммунного ответа у онкологических пациентов с проявлениями орального мукозита.

Материалы и методы исследования

С января 2016 по май 2017 года проводилось генетическое исследование у 23 пациентов с диагнозом плоскоклеточный рак орофарингеальной области отделения лучевой терапии Российского научного центра рентгенорадиологии.

Средний возраст больных с морфологически подтвержденным диагнозом плоскоклеточного рака орофарингеальной области составил 54 года, соотношение мужчин и женщин 60,9 % (n = 14) и 39,4 % (n = 9) соответственно. По локализации преобладали поражения языка (30,4 %), ротоглотки (26,1 %) и дна полости рта (17,4 %). Большинство больных имели стадии заболевания Т2ШМ0 (39,1 %), Т3ШМ0 (17,4 %) и Т3ШМ0 (21,7%). Отягощенный соматический анамнез наблюдался у большинства пациентов старше 50 лет. Более половины больных (65,2%, 15 человек) имели сопутствующие хронические заболевания, среди них преобладали пациенты (78,3%) с несколькими патологиями: заболеваниями сердечно-сосудистой системы, хроническими неспецифическими заболеваниями легких, патологией желудочно-кишечного тракта, сахарным диабетом.

Противоопухолевое лечение больных раком слизистой оболочки полости рта осуществляли согласно стандартам лечения злокачественных новообразований. Применялись дистанционная лучевая терапия в самостоятельном варианте. Лучевая терапия выполнялась на линейных ускорителях Clinac С2100 (Varían) в режиме тормозного излучения с энергией фотонов 6 MV. Местное лечение оральных мукозитов

проводилось с помощью препаратов пролонгированного действия на растительной основе «Тонзинал» и пластин «ЦМ-1».

Определение частот аллелей генов, кодирующих ферменты биотрансформации и детоксикации и генов иммунного ответа, проводились с помощью технологии биологических микрочипов (биочипов), которые, подобно электронным микрочипам, обрабатывающим огромные массивы цифровой информации, предназначены для молекулярного считывания и обработки больших объемов биологической информации. Данная технология Биочипов разработана в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) в 2009 г.

Пациенты были разделены на две группы в зависимости от тяжести мукозита по RTOG (Radiation Therapy Oncology Group ). Первую группу (I) составили пациенты с 0- 2 степенью мукозита (14 пациентов, 63,6 %); во вторую группу (II) были включены пациенты с 3-4 степенью тяжести мукозита (9 пациентов, 36,4 %). Учитывая небольшую выборку и дизайн исследования - серия случаев (case-only study design), соответствие распределения генотипов равновесию Харди Вайнберга не рассчитывалось.

Материалом для исследования служил соскоб буккального эпителия пациентов.

Забор материала осуществлялся с помощью щеточек для цитологического забора материала и стерильных пробирок, после чего материал замораживался при температуре 18-20 градусов по Цельсию ниже нуля. Молекулярно-генетическое исследование было выполнено на базе Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. ДНК выделяли набором QIamp DNA Minikit (Qiagen, США) по протоколу разработчика. Концентрацию измеряли на флоуриметреQubit набором Quant-iT™ (Invitrogen, США). Для наработки фрагментов ДНК использовали двух этапную мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Первый этап ПЦР проводили для получения ПЦР-продукта с геномной ДНК. На втором этапе проводили асимметричную ПЦР с добавлением флуоресцентно меченого дезоксинуклеотидтрифосфата Су5-дУТФ, встраивающегося в de novo синтезируемую цепь ДНК. Полученные флуоресцентно меченые продукты использовали для гибридизации на биологическом микрочипе согласно инструкции по применению.

Генотипирование проводили с использованием Набора реагентов для анализа полиморфизма генов системы биотрансформации «ПФ-Биочип», который позволяет выявлять 17 аллельных вариантов в генах CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, ABCB1 (MDR1), NAT2, MTHFR,, TPMT. Идентификацию полиморфных вариантов в генах иммунного ответа осуществляли с использованием тест-системы «Иммуно-Биочип»,

которая позволяет выявлять аллельные варианты в генах PTPN22, TLR1, TLR2, TLR4, IL4, IL10 и некоторых других.

Результаты гибридизации регистрировали с помощью универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК) для анализа изображений диагностических микрочипов (ТУ 9443-004-02699501-2006). Генотип анализируемого образца определяли по комбинации ячеек, имеющих положительный флуоресцентный сигнал.

Ассоциации генотипов со степенью тяжести мукозита охарактеризованы традиционным показателем OR (odds ratio - отношение шансов) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для проверки статистической значимости различий частот использовался двусторонний точный критерий Фишера. В связи с малым объемом выборки оценивали только аддитивную модель наследования. Исследование имеет пилотный характер и направлено на поиск направления дальнейших исследований в данной области, поэтому поправка на множественность сравнений не учитывалась. Отсутствие ассоциации может быть связано с недостаточной статистической мощностью теста.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Результаты генотипирования по генам метаболизма и биотрасформации ксеноботиков в исследуемых группах

Ген, вариант, генотип I группа II группа P (аддитивная модель) OR 95% ДИ

N

CYP1A1 4887 C>A rs1799814 n = 14 n = 9 0,19 17,69 1,20 - 259,80 0,19 17,69 1,20 - 259,80 0,494 1,84

C/C 14

C/A 0

A/A 0

CYP1A1 4889 A>G rs1048943 n = 14 n = 9

A/A 14

A/G 0

G/G 0

CYP1A1 6235 T>C rs4649903 n = 14 n = 9

T/T 9

Т/С 5 (35,8) 3 (33,3) 0,50 - 6,76

С\С 0

CYP2D6 1934 О>Л п = 14 п = 9 0,728

^3892097 о/о 10 (71) 6 (66,7) 1,41

О/Л 2 (14,5) 1 (11,1) 0,38 - 5,27

Л/Л 2

MDR 3435 С>Т п = 14 п = 9 0,761

ге1045642 Т/Т 5 (35,7) 4 (44,4) 0,77

С/Т 7 (50,0) 4 (44,4) 0,23 - 2,59

С/С 2

NAT2 341 Т>С п = 14 п = 9 0,378

ге1801280 Т/Т 3 (21,4) 4 (44,4) 0,55

Т/С 7 (50,0) 3 (33,3) 0,17 - 1,79

С/С 4

NAT2 590 О>Л п = 14 п = 9 0,666

ге1799930 о/о 11 (78,5) 6 (66,7) 1,67

О/Л 3 (21,5) 3 (33,3) 0,34 - 8,19

Л/Л 0

MTHFR 677 С>Т п = 14 п = 9 0,739

гб1801133 С/С 6 (42,9) 5 (55,5) 0,71

С/Т 8(57,1) 4 (44,5) 0,19 - 2,71

Т/Т 0

CYP2C9 430С>Т п = 14 п = 9 0,144

ге1799853 С/С 10 (71,4) 9 (100 ) 0,15

С/Т 4 (29,6) 0 (0) 0,01 - 2,15

Т/Т 0

Таблица 2. Результаты генотипирования по генам иммунного ответа в

исследуемых группах

Ген, вариант, генотип I группа II группа Р (аддитивная

N (%) N (%) модель) ОЯ 95% ДИ

PTPN22 1693С>Т п = 14 п = 9 1,00

Arg620Trp ге2476601 G/G 10 (71,4) 7 (77,8) 0,75 0,14 - 3,99

A/G 4

Л/Л 0

ПЯ2 2258G>A Arg753Gln (ге5743708) п = 14 п = 9 0,513

G/G 12

G/A 2

Л/Л 0

1Ш4 896A>G Asp299Gly ге498679) п = 14 п = 9 0,513

Л/Л 12

^ 2

G/G 0

1Ш4 1196C>T Thr399Ile ге4986791 п = 14 п = 9 0,513

С/С 12

С/Т 2

Т/Т 0

И4 589C>T rs2243250 п = 14 п = 9

С/С 14

С/Т 0

Т/Т 0

И433C>T rs2070874 п = 14 п = 9 0,008 10,40 2,02 - 53,42

С/С 12

С/Т 2

Т/Т 0

И10 1117Л^ rs1800896 п = 14 п = 9 0,072 0,29 0,08 - 1,00

Л/Л 2

^ 8

G/G 4

«-» полученные распределения частот генотипов не позволяют выполнить статистический анализ.

Из таблицы 1 видно, что во всех исследованиях аллелей генов метаболизма и детоксикации ксенобитиков статистически значимых результатов не получено. Таблица 2 демонстрирует, что полиморфный вариант гена ^4 (ге2070874) ассоциирован с риском развития орального мукозита тяжелой степени.

У пациентов с плоскоклеточным раком орофарингеальной области, получающих противоопухолевую терапию и местное лечение орального мукозита, с применением препаратов пролонгированного действия на растительной основе, имеются проявления орального мукозита различной степени тяжести. Данный факт послужил основой для разделения пациентов на 2 группы: I группа - пациенты с 0-2 степенью тяжести мукозита по RTOG , II группа - пациенты с 3-4 степенью тяжести мукозита по RTOG. Обе группы были статистически не различимы по другим факторам риска развития осложнений противоопухолевого лечения (возраст, пол, стадия заболевания, локализация процесса, методика лечения). Аллель rs2070874-T гена IL4 оказался ассоциированным с развитием орального мукозита тяжелой степени. Данный вариант находится в промоторном участке гена противовоспалительного цитокина IL4 и может влиять на его экспрессию.

Выводы

Получены предварительные результаты, подтверждающие вероятность наличия генетических предпосылок развития орального мукозита у онкологических пациентов, получающих противоопухолевое лечение. Данное пилотное исследование определяет перспективность научно-клинического направления по определению прогностического значения генетических факторов в развитии оральных мукозитов и разработке эффективных методов их профилактики и лечения на основе генетического скрининга, что требует проведения подобных исследований на большей выборке пациентов.

Список литературы

1. Блохин Н.Н., Петерсон Б.Е. Клиническая онкология. Москва: Медицина. 2008. 440 с.

2. Васильева В.А., Кузьмина Л.А., Клясова Г.А., Паровичникова Е.Н. Опыт применения фосфата кальция у больных после высокодозной полихимиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Гематология и трансфузиология. 2012. № 3. С.11-13.

3. Геворков А.Р. Основные принципы ведения больных с мукозитом и дерматитом при лучевом лечении с лекарственной модификацией больных плоскоклеточным раком орофарингеальной области. Опухоли головы и шеи. 2016. № 3. C.9-16.

4. Гершанович М.Л. Коррекция желудочно-кишечных осложнений химиотерапии. Сборник научных работ III ежегодной Российской онкологической конференция. С-Петербург. 1999. C.221.

5. Гилева М. А. , Гвоздева Л. М. Методы лечения химиотерапевтических поражений слизистой полости рта у детей с острыми лейкозами. Российский стоматологический журнал. 2003. № 1. С. 30-33.

6. Нуриева Н. С. Особенности протезировния после хирургического лечения злокачественных опухолей орофарингеальной зоны. Уральский медицинский журнал. 2010. № 12. С.105-108.

7. Пейпл А. Д., Параскевич В. Л. Дентальная имплантология.Москва: МИА. 2006. С. 28-31.

8. Чиссов В.И., Давыдов М.И. Онкология. Национальное руководство. Москва: Гэотар-Медиа.2017. 576 с.

9. Abu-Bakar A., Hakkola J., Juvonen R. et al. Function and regulation of the Cyp2a5/CYP2A6 genes in response to toxic insults in the liver. Curr Drug Metab.2013.V. 14 . N. 1. P. 137-150.

10. Bensinger W., SchubertM., AngK.K., et al. NCCN Task Force Report prevention and management of mucositis in cancer care. J Natl Compr Canc Netw. 2008. V. 6. Suppl 1:S1-21; quiz S22-4.

11. BromekE., Wojcikowsk, J., Daniel W.A. Involvement of the paraventricular (PVN) and arcuate (ARC) nuclei ofthe hypothalamus in the central noradrenergic regulation of liver cytochrome P450. Biochem. Pharmacol. 2013. V. 86. N. 11 P. 1614-1620.

12. Budach V., Stuschke M., Budach W., et al. Hyperfractionated accelerated chemoradiation with concurrent fluorouracil-mitomycin is more effective than dose-escalated hyperfractionated accelerated radiation therapy alone in locally advanced head and neck cancer: final results of the radiotherapy cooperative clinical trials group of the German Cancer Society 95-06 Prospective Randomized Trial. J Clin Oncol. 2005. V. 23. N. 6. P. 1125-1135.

13. CamposM.I., Campos C.N., Aarestrup F.M., Aarestrup B.J. Oral mucositis in cancer treatment: natural history, prevention and treatment. Mol Clin Oncol. 2014. V. 2. N 3. P. 337-340.

14. Mortensen H.R., Overgaard J., Jensen K., et al. Factors associated with acute and late dysphagia in the DAHANCA 6&7 randomized trial with accelerated radiotherapy for head and neck cancer. Acta Oncol. 2013. V. 52. N. 7. P. P.1535-1542.

15. Nebert D. W., WikvallK., Miller W.L. Human cytochromes P450 in health and disease. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B: Biol. Sci. 2013. V. 368. N 1612.Article ID: 20120431

16. Stiff P.J. The Challenges of Oral Mucositis and Its Therapy. J Support Oncol. 2004. V.2 (2 Suppl 2). P. 70-72.

17. Rosenthal D.I., Trotti A. Strategies for managing radiation-induced mucositis in head and neck cancer. Senin Radiat Oncol. 2009. V. 19. N1. P.29-34.

18. Ulrich C.M.., Yasui Y., Storb R., et al. Pharmacogenetics of methotrexate: toxicity among marrow transplantation patients varies with the methylenetetrahydrofolatereductase C677T polymorphism. Blood. 2001. V.98. N. 1. P.231-234.

19. Vera-Llonch M., Oster G., HagiwaraM., Sonis S. Oral mucositis in patients undergoing radiation treatment for head and neck carcinoma. Cancer. 2006. V. 106. N. 2. P. 329336.

20. Wohlschlaeger A. Prevention and treatment of mucositis: a guide for nurses. J Pediatr Oncol Nurs. 2004. V. 21. N. 5. P. 281- 287.

21. Zanger U.M., SchwabM. Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation. Pharmacol Ther. 2013. V. 138. N. 1. P. 103-141.

22. Zhu G. Lin J.C., Kim S.B., et al. Asian expert recommendation on management of skin and mucosal effects of radiation, with or without the addition of cetuximab or chemotherapy, in treatment of head and neck squamous cell carcinoma. BMC Cancer. 2016. V. 16: 24.

23. Zlotow J. M., Berger A.M., Portenay R.K., Weissman D.E. Oral manifestations and complications of cancer therapy Principles and Practice of Palliative Care and Supportive Oncology. Philadelphia: Lippencoft Williams and Wilkins. 2002. P. 182-298.