НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NOVEL COMPOUNDS AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым производным индолхиноксалина, способам их приготовления, а также их фармацевтическому применению. В частности, изобретение относится к новьм производным индолхиноксалина и их применению в лечении вирусных инфекций.
Уровень техники
Как хорошо известно, вирусы являются этиологической причиной многих, иногда угрожающих жизни, заболеваний как человека, так и животных. Например, вирусы герпеса, такие как вирус простого герпеса-1 (HSV-1), вирус простого герпеса-2 (HSV-2), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейн-Барра (EBV), вирус ветряной оспы (VZC) и вирус герпеса человека-6 (HHV 6) ассоциированы со многими распространенными вирусными заболеваниями.
Цитомегаловирусная инфекция человека (ЦМВЧ) является инфекцией, существующей на протяжении жизни, которая приводит к заболеваемости и смертности. Патологии, ассоциированные с ЦМВЧ, включают микроцефалию, гепатоспленомегалию, желтуху, энцефалит, инфекции новорожденных детей или плода в матке, и инфекции носителей с нарушениями иммунитета.
По некоторым причинам возрастает число лиц с риском ЦМВЧ инфекции, и в настоящее время 80% взрослых в Соединенных Штатах инфицированы ЦМВЧ. Особо восприимчивой группой являются те, у кого ослаблена иммунная система, такие как пациенты со СПИД, у которых ЦМВЧ может вызывать ретинит, гастрит и пневмонит. Также, ЦМВЧ-индуцированные пневмонии или гепатиты являются частыми и серьезными осложнениями трансплантаций костного мозга.
Европейский патент ЕР 0238459 касается замещенных индолхиноксалинов, имеющих общую формулу
1
2
n
2
2
2
4
5
6
4
5
6
3
где R представлен водородом или одним или несколькими, предпочтительно от 1 до 4, сходными или различными заместителями в положениях 1-4 и/или 7-10, выбранными из галогена, предпочтительно Вr, низшей алкил/алкоксильной группы, имеющей не более 4 углеродных атомов, трифторметильной группы, трихлорметильной группы; Х является группой -(CH)-R, где R представлен азотсодержащим основным остатком, таким как NH, NHR или NRR, где R, R и R независимо являются низшим алкилом или циклоалкилом, а n является целым числом от 1 до 4, и R представлен водородом, низшей алкильной/циклоалкильной группой, имеющей не более 4 атомов углерода, и физиологически приемлемыми продуктами добавления соединений с кислотами и галогеновыми аддуктами с иодом, монохлоридом иода или монобромидом иода.
Однако ясно, что все еще существует настоятельная необходимость в новых медикаментах, обладающих антивирусной эффективностью, в частности, против вируса герпеса, такого как ЦМВЧ, и задачей настоящего изобретения является обеспечение соединений, выполняющий эту потребность.
Раскрытие изобретения
В соответствии с первым аспектом изобретение обеспечивает соединение формулы (I)
где
1
3
1
6
R выбран из Н, F, Cl, Вr, СF, C-С алкокси и ОН;
2
1
6
R выбран из Н и C-С алкил;
n является 1-12;
m является 0 или 1; и
2
3
3
4
+
-
Y выбран из CH, NR, (NRR)X, О и S;
3
4
1
4
R и R независимо выбраны из Н и C-C алкил; и
-
X выбран из фармацевтически приемлемых анионов.
В соответствии с другим аспектом обеспечивается способ получения соединения формулы (I), посредством реакции соединения формулы (II)
с соединением формулы (III)
где
1
2
R, R, Y, m и n определены здесь выше в соответствии с формулой (I); и
L является удаляемой группой;
в растворителе или смеси растворителей.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы (I) в ассоциации, по крайней мере, с одним фармацевтически пригодным наполнителем.
В соответствии с одним аспектом изобретения фармацевтическая композиция является антивирусным соединением, пригодным для лечения вирусной инфекции. Дальнейшие аспекты изобретения, также как и их воплощения, определены в формуле изобретения.
Осуществление изобретения
1
3
3
В одном воплощении настоящего изобретения R в формуле (I) выбран из Н, F, Cl, Вr, СF, ОСН или ОН.
2
1
4
1
3
3
Далее, в одном воплощении изобретения, R в формуле (I) выбран из Н и C-Cалкила, например, из Н и C-С алкила, или таких как Н и СН.
-
-
-
Противоион X в формуле (I) может быть любым подходящим фармацевтически пригодным анионом, таким как Cl, Вr, метансульфонат, толуолсульфонат, ацетат, цитрат и малеат.
Индекс n в формуле (I) может быть выбран из любой величины между 1 и 12, такой как 2-10, или 4-10, например, 4-8; или 1-6, например 1-3.
Соединение формулы (II), применяемое для приготовления соединения изобретения, может само быть получено, как указано в ЕР 0238459, а также патенте США 4,990,510, которые включены здесь в ссылку.
2
2
Соединение формулы (III), а именно L(CH)n(Y)m(CH)nL, может быть синтезировано способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, или может быть получено от поставщиков химических препаратов.
Удаляемая группа L из формулы (III) может быть выбрана, например, из Сl, Вr, метансульфоната, толуолсульфоната, хотя специалистам в данной области техники понятно, что можно подобрать другие удаляемые группы.
Применяется такая система растворителей, где реактанты растворимы при выбранных условиях реакции, и где облегчается реакция, дающая желаемый продукт. В качестве примера могут быть выбраны один или несколько полярных апротонных или протонных растворителей, таких как ацетонитрил, THF, метанол, этанол, изопропанол, этилацетат и метилацетат. Специалистам в данной области техники известно, как подобрать такую систему растворителей, а также подходящие условия реакции.
Соединения изобретения пригодны в качестве антивирусных агентов и таким образом, в соответствии с одним аспектов изобретения, обеспечивается антивирусная фармацевтическая композиция, включающая соединение формулы (I) и, по крайней мере, один фармацевтически пригодный наполнитель.
В одном воплощении изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения вируса, выбранного из вирусов герпеса, таких как вирус простого герпеса-1 (HSV-1), вирус простого герпеса-2 (HSV-2), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейн-Барра (EBV), вирус ветряной оспы (VZC) и вирус герпеса человека-6 (HHV 6).
В одном воплощении изобретения вирусом является цитомегаловирус человека.
Фармацевтически пригодными наполнителями могут быть, например, растворители, адъюванты, носители или разбавители, такие как хорошо известные специалистам в данной области техники и описанные, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (2005). Далее, понятно, что фармацевтическая композиция изобретения, в дополнение к соединению формулы (I), может применяться совместно с другими, совместимыми лекарствами, такими как другое антивирусное лекарство при терапии множеством лекарств.
Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые, однако, не могут быть истолкованы как ограничивающие изобретение, объем которого определяется формулой изобретения. Отмечаем, что нумерация каждой одной из двух систем колец является такой же, что в общей формуле замещенного индолхиноксалина в европейском патенте ЕР 0238459.
Примеры
Получение соединений изобретения
6
6
l
13
ЯМР спектры регистрировали в ДМСО-d растворах при комнатной температуре, применяя сигнал от ДМСО-d (H:δ=2,50 ч/млн, C:δ=39,5) в качестве внутреннего стандарта, на спектрометре Broker DPX300 (300 МГц). Значения δ приведены в ч/млн. Растворители были химически чистыми и применялись полученными от поставщика.
Пример 1
Синтез алкиленовых димеров
Общая процедура (масштаб 10 ммоль)
1
2
3
В220 (формула II, R=H, R=CH, или их производные), дигалоалкан и ацетонитрил нагревали (в колбе с обратным холодильником или при 70°С) в течение 15 часов. Образованное твердое вещество отделяли фильтрацией, промывали ацетонитрилом и высушивали.
1
2
-
-
3
1a) R=Н, R=СН, n=3, m=0, 3 X=Br,
1
Выход: 70%; H-NMR δ: 8.34 (d, 1H), 7.94 (m, 2Н). 7.77 (m, 2Н), 7.43 (t, 1H), 4.93 (br. s, 2H), 3.86 (br. s, 2Н), 3.54 (br. s, 2Н), 3.27 (s, 6H), 2.39 (s, 6H), 1.77 (br. s, 2Н), 1.28 (br. s, 2Н).
l
2
-
-
3
1b) R=H, R=CH,n=5, m=0, X=Br
1
Выход: 49%; H-NMR δ; 8.35 (d, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.92 (d, 1H), 7.80 (m, 2H), 7.45 (t, 1H), 4.9: (t, 2Н), 3.85 (t, 2Н), 3.49 (m, 2Н), 3.24 (s, 6H), 2.48 (s. 3H), 2.45 (s, 3H), 1.69 (m, 2Н). 1.17 (s,6H).
1
2
-
-
3
1c) R=9-Br, R=CH, n=3, m=0, X=Br
1
Выход: 73%; H-NMR δ: 8.39 (s, 1H), 8.08-7.81 (m, 3H), 7.73 (s, 1H), 5.16 (br. s, 2Н), 3.69 (br. s, 2H), 3.43 (br. s, 2Н), 3.25 (s, 6H), 2.39 (s, 3H), 2.37 (s, 3H), 1.88 (br. s, 2H), 1.32 (br. s, 2H).
1
2
-
-
1d) R=9-Cl, R=H, n=3, m=0, X=Br
13
6
C-NMR DMSO-d δ:21.6 (t), 25.2 (t), 35.3 (t), 50.8 (q), 59.0 (t), 63.3 (t). 112.6 (d), 120.4 (s), 121.6 (d), 126.1 (s), 126.8 (d), 127.5 (d), 129.3 (d), 129,8 (d), 131.1 (d), 138,6 (s), 139.0 (s), 139.8 (s), 142.0 (s), 144.9 (s).
1
2
-
-
2
1e) R=H, R=H, n=1, m=1, Y=CH, X=Вr
13
6
C-NMR DMSO-d δ:17-0 (t), 35.0 (t), 50.9 (q), 59.9 (t), 60.5 (t), 110.8 (d), 119.0 (s), 121.7 (d), 122.4 (d), 126.5 (d), 127.5 (d), 129.2 (d)*, 131.5 (d), 138.9 (s), 139.5 (s), 139.7 (s), 143.5 (s), 144.7 (s).
* 1 сигнал для двух углеродов.
1
2
-
-
1f) R=H, R=H, n=3, m=0, X=Вr
13
6
C-NMR DMSO-d δ:21.7 (t), 25.4 (t), 35.0 (t), 50.8 (q), 59.2(t), 63.2 (t), 110.7 (d), 119.1 (s), 121.8 (d), 122.5 (d), 126.6 (d), 127.4 (d), 129.2 (d), 129.3 (d), 131.6 (d), 139.0 (s), 139.6 (s), 139.8 (s), 143.6 (s), 144.8 (s).
Пример 2
Синтез димеров эфира
Общая процедура (масштаб 10 ммоль)
В-220 (или его производные), дигалоалкан и ацетонитрил нагревали к колбе с обратным холодильником в течение 20 часов. Образовавшееся твердое вещество выделяли фильтрацией, промывали ацетонитрилом и высушивали.
1
2
-
-
3
2а) R=H, R=СH, n=2, Y=O, m=1, X=Вr
1
Выход: 58%; H-NMR δ: 8.22 (d, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,72 (m, 2H), 7.59 (s. 1H), 7.47 (d, 1H), 7.38 (t, 1H), 7.08 (d, 1H), 4.85 (t, 2H), 4.09 (br. s, 2H), 3.93 (m, 4H), 3.29 (s, 6Н), 2.35 (s, 3Н), 2.26 (s, 3Н), 2.24 (s. 3H).
1
2
-
-
3
2b) R=9-Br, R=CH, n=2,Y=O, m=1, X=Br
1
Выход: 91%; H-NMR δ: 8.02 (d, 1H), 7.77-7.66 (m, 3Н), 7.49 (s, 1H), 7.45 (d, 2H), 7.07 (d, 2H), 4.78 (t, 2H), 4.11 (br. s, 2H), 3.95-3.90 (m, 4H), 3.27 (s, 6H), 2.31 (s, 3Н), 2.26 (s, 3Н), 2.18 (s, 3H).
Биологический анализ
Анализы антивирусной активности против цитомегаловируса человека, как описано ниже, проводили с соединением в соответствии с изобретением, а именно, с соединением 1а Примера 1. Контрольным соединением, обозначенным В-220, является 2,3-диметил-6-(N,N-диметиламиноэтил)-6Н-индоло(2,3-b)хиноксалин, описанный в европейском патенте ЕР 0238459.
Анализ ингибирующих эффектов в отношении вирусной инфекции
Для того чтобы оценить, действительно ли таргетинг структурных вирусных белков так же эффективен, как таргетинг вирусной транскрипции, был выполнен модифицированный анализ на пластинах, где один из новых антивирусных агентов сравнивали с уже известными антивирусными агентами, которые ингибируют транскрипцию ЦМВЧ [GCV (Cymevene, Roche) и PFA (Foscavir, AstraZeneca)] или инфекцию [IVIg (IVIG CP, Biotest Pharma), в качестве антитела].
На 0 дпи (день после инфекции) эксперимента одновременно добавляли антивирусные агенты и ТВ40/Е, таким образом показывая, насколько агенты ингибируют инфекцию. Результаты данных экспериментов были получены при сравнении количества инфицированных клеток в обработанных лунках с позитивными контролями, путем подсчета ингибирования инфекции за счет анализируемых агентов. Эксперименты повторяли со штаммом ЦМВЧ AD-169 и с клиническим изолятом, соответственно, в основном с теми же самыми результатами.
Ингибирующий эффект анализируемых веществ показан в таблице 1, в виде % ингибирования инфекции. Эти данные являются результатом анализов на планшетах с применением штамма AD-169 и ТВ40 фибробластов легких человека, инфицированных ЦМВЧ.
Таблица 1
Ингибирующий эффект анализируемых веществ в виде % ингибирования инфекции
Вещество
Ингибирующий эффект, %
1а
100
IVIG (контроль)
100
В-220 (контроль)
20
Лефлуномид (контроль)
25-50
Фоскавир (контроль)
20-50
Ганцкловир (контроль)
20-30
Результаты анализа показывают, что соединения изобретения обладают отличным ингибирующим эффектом в отношении вирусной инфекции.
Анализ ингибирования сборки и выхода ЦМВЧ
Инфицированные фибробласты легких человека (HL клетки) обрабатывали антивирусным агентом В-220 и другими контрольными веществами, как показано в таблице 2, и с соединением изобретения 1а для того, чтобы оценить эффект соединений изобретения в отношении ЦМВЧ инфекции, сборки и выхода.
Антивирусные агенты добавляли на 3 или 5 день после инфекции (дпи) в этих экспериментах, и оставляли в культуре до 7 дпи. Далее надосадочную жидкость и разрушенные клетки переносили в новые клеточные культуры на ночь, и затем окрашивали на экспрессию IE. Результаты показывают, насколько вещества препятствуют вирусной сборке и выходу. Более конкретно, на 3 дпи большинство вирусных каспид собиралось в ядре, в то время как на 5 дпи они в основном приобретали оболочку в цитоплазме, и некоторые начинали образовывать вторичную оболочку.
В таблице 2 показан ингибирующий эффект антивирусных веществ с применением модифицированной системы анализа на планшетах. Некоторые вещества показали 100% ингибирование экспрессии IE по результатам измерения окрашивания IE, и по результатам электронной микроскопии не отмечалось образования каспид в ядрах большинства обработанных клеток. Соединение изобретения, обозначенное 1а, показало очень хорошие результаты, совпадающие с результатами, полученными с ганцикловиром.
Таблица 2
Ингибирующий эффект антивирусных веществ
Вещество
Ингибирование 3 дпи (%)
Ингибирование 5 дпи (%)
1а
95-100
85-95
В-220 (контроль)
65-85
65-80
Лефлуномид (контроль)
65-80
80-90
Фоскавир (контроль)
85-100
65-85
Ганцикловир (контроль)
100
80-95
Механизм действия
Не связываясь с какой-либо теорией механизма действия соединений изобретения, отмечается, что анализ соединения изобретения 1а показал очень явное ингибирование экспрессии IE. Далее, данные электронной микроскопии показали повреждение сборки вируса. Действительно, техника анализа с получением изображения, использованная для идентификации и подсчета стабильных промежуточных частиц ЦМВЧ показала повреждение связывания покрытых оболочкой белков и вирусной каспидой. Взятые вместе, эти данные показывают высокий потенциал для применения соединений изобретения для антивирусной терапии. Также, при применении соединений изобретения в комбинации по крайней мере с одним другим антивирусным агентом, таким как при лечении множеством лекарств, ожидается синергистический эффект, и риск приобретенной лекарственной резистентности может быть снижен или устранен.
Токсичность
Соединения изобретения не показывают какой-либо токсичности при анализе с окрашиванием пропидиум-иодидом клеточных культур инфицированных и неинфицированных фибробластов легких человека. Концентрация соединения 1а, в 10 раз превосходящая использованную в эксперименте, не показала токсичности в интервале 0-7 дпи. Концентрация соединений, использованных в вирусных экспериментах, была на микромолярном уровне. Клеточная токсичность В-220 была продемонстрирована для концентраций выше 100 мкМ.
Материалы и методы
Клеточная культура
2
Фибробласты легких человека, HL-клетки (MRC-5), использованные в данных экспериментах, инкубировали при 37°С и 5% СO в растворе MEM со средой Эрла и L-глутамином (от GIBCO), в которую добавляли 10% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) и 1% пенициллин и стрептомицин (PeSt).
2
В начале экспериментов HL-клетки хранили во флаконах для клеточной культуры Falcon 175 см. Для снятия клеток с флакона для клеточной культуры при перенесении их в 48-луночные планшеты (Becton Dickinson) для инфекции и инкубации с антивирусными агентами, применяли трипсин и ЭДТА.
Клетки инкубировали до тех пор, пока не достигалось 50% слияние при тех же самых условиях, как указано выше, и применяли до 26 пассажа.
Инфекция клеток ЦМВЧ
2
HL клетки инфицировали ЦМВЧ, вирусным штаммом ТВ 40/Е (эндотелиальный адаптированный клинический изолят (UR1814), любезно предоставленный профессором G. Jahn) и вирусным штаммом AD-169, соответственно, при множественности инфекции (МОI) 0,02, и инкубировали до 3 или 5 дня после инфекции (дпи) при 37°С и 5% СO в той же самой среде, как указано выше. Некоторые клетки (для эксперимента 0 дпи) одновременно подвергали воздействию антивирусных агентов (см. выше). Негативный контроль оставляли неинфицированным.
Обработка клеток ингибиторами и антивирусными агентами
Существующую среду (в экспериментах 3 и 5 дпи) заменяли и добавляли новую среду, с ингибиторами и антивирусными агентами при различных концентрациях. Однако это было сделано одновременно с инфекцией на 0 дпи эксперимента и оставлено на инкубацию до 1 дпи. Среду, содержащую IVIg, инкубировали в течение часа с вирусом на льду перед добавлением к клеткам.
Модифицированный анализ на планшетах
В экспериментах 3 и 5 дпи надосадочную жидкость от MRC-5 клеток переносили в не-инфицированные клетки для оценки количества экскретированного вируса. К оставшимся клетках добавляли новую среду и разрушали стеклянными шариками при встряхивании микропланшетов на IKA-Vibrax-VXR при 300 встряхиваниях в минуту в течение 10 минут. Далее клеточный детрит переносили в неинфицированные клетки для оценки количества инфекционных внутриклеточных вирусных частиц.
После инфицирования вирусными частицами новых клеток в течение примерно одного часа среду сменяли, отмывая от клеточного детрита.
В экспериментах 0 дпи клетки немедленно фиксировали на 1 дпи (в соответствии с процедурой, разъясненной ниже).
Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток
Новые HL клетки (на 3 и 5 дни эксперимента) фиксировали на следующий день параформальдегидом (ПФА) в течение 15 минут при комнатной температуре (КТ). Для того чтобы сделать клетки проницаемыми, применяли 0,3% Тритон Х в Фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) для 15 минутной инкубации при КТ с последующим блокированием фона блокатором фона от DAKO в течение 20 минут при КТ, с количеством, достаточным для покрывания внутренней поверхности. После этого все микропланшеты инкубировали с первичными антителами (мышиными), разбавленными 1:100, против предраннего антигена (IEA, Antigene) в течение 45 минут при 8°С. Далее клетки инкубировали с вторичными антителами, кроличьими и мышиными ФИТЦ (Daco Cytomation), разбавленными 1:100, в течение 45 минут при 8°С, и одновременно окрашивали DAPI (Sigma), разбавленными до 1:250. DAPI является химическим веществом, окрашивающим ядра клеток.
Позитивный и негативный контроли для обоих типов клеток обрабатывали, соответственно, как указано выше.
Иммунофлуоресцентный микроскопический анализ
Клетки анализировали флуоресцентной микроскопией с применением Nikon Eclipse ТЕ 2000-U. Количество клеток, экспрессирующих IEA, в двух различных частях лунки, определяли невооруженным глазом и сравнивали с общим количеством клеток (указываемых DAPI), в тех же самых частях. Эти значения применяли для оценки процента инфицированных клеток в каждой лунке, в которой подсчитывали количество ингибирования, вызванного разными веществами. Данный способ подсчета инфицированных клеток в двух частях лунки и применения на всю лунку был выбран потому, что общее количество клеток в лунке невозможно подсчитать вручную.