Способ уточняющей лабораторной диагностики почечно-клеточного рака
METHOD FOR SPECIFYING LABORATORY DIAGNOSIS OF RENAL CELL CARCINOMA

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и клинической биохимии. Изобретение может быть использовано для диагностики почечно-клеточного рака по соотношению уровней KIM-1 и креатинина в моче с применением метода иммуноферментного анализа.
В структуре онкологической заболеваемости россиян доля почечно-клеточного рака (ПКР) сходна с соответствующими показателями в большинстве развитых стран мира. По данным эпидемиологической статистики, в 2018 г. ПКР составлял 4,7% от общего числа выявляемых злокачественных опухолей у мужчин и 3,2% – у женщин. По темпам прироста заболеваемости за 10 лет (22,3%) ПКР занимает одно из первых мест в российской популяции. Поскольку на ранних стадиях заболевание протекает бессимптомно, доля случаев выявления ПКР на III и IV стадиях высока (14,8% и 20,0% соответственно), при этом 5-летняя выживаемость больных составляет 50% и 10% соответственно (Злокачественные новообразования в России в 2018 году. Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. 2019. 235с). Очевидна необходимость совершенствования методов ранней диагностики ПКР, в том числе поиск информативных опухолеассоциированных маркеров данного заболевания.
В качестве одного из претендентов для использования в лабораторной диагностике и при мониторинге больных ПКР в настоящее время рассматривается KIM-1 (kidney injury molecule-1) (Zhang K.J., Wilson G.D., Kara S., Majeske A., Zhang P.L., Hafron J.M. Diagnostic role of kidney injury molecule-1 in renal cell carcinoma. Int. Urol. Nephrol. 2019; 51(11): 1893-902. Doi: 10.1007/s11255-019-02231-0). Это мультифункциональный гликопротеин, который экспрессируется в эпителиальных и иммунокомпетентных клетках и вовлечен на клеточном и молекулярном уровне в патогенез ряда патологических процессов, таких как острая и хроническая почечная недостаточность (Bonventre J.V. Kidney injury molecule-1: a translational journey. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 2014; 125: 293-9; discussion 299), а также играет роль в регуляции иммунных реакций (Li Z., Ju Z., Frieri M. The T-cell immunoglobulin and mucin domain (Tim) gene family in asthma, allergy, and autoimmunity. Allergy Asthma Proc. 2013; 34(1): e21-e6. Doi: 10.2500/aap.2013.34.3646) и, возможно, в реализации противоопухолевого иммунитета (Baghdadi M., Jinushi M. The impact of the TIM gene family on tumor immunity and immunosuppression. Cell. Mol. Immunol. 2014; 11(1): 41-8. Doi: 10.1038/cmi.2013.57). Считается, что основным источником KIM-1 в моче в норме является эпителий проксимальных канальцев почек, при этом ПКР сопровождается повышением содержания KIM-1 как в моче, так и в крови (Mijuskovic M., Stanojevic I., Milovic N., Cerovic S., Petrovic D., Maksic D., et al. Tissue and urinary KIM-1 relate to tumor characteristics in patients with clear renal cell carcinoma. Int. Urol. Nephrol. 2018; 50(1): 63–70. Doi: 10.1007/s11255-017-1724-6).
За последнее десятилетие значительно возрос интерес к изучению KIM-1 как уринологического маркера ПКР. При этом, по данным ряда исследований, наилучшие диагностические результаты получены при нормировании концентраций KIM-1 на креатинин (KIM-1/Cre) (George B., Wen X., Mercke N., Gomez M., O'Bryant C., Bowles D.W., et al. Time-dependent changes in kidney injury biomarkers in patients receiving multiple cycles of cisplatin chemotherapy. Toxicol. Rep. 2020; 7: 571-6. Doi: 10.1016/j.toxrep.2020.04.003; Ghadrdan E., Ebrahimpour S., Sadighi S., Chaibakhsh S., Jahangard-Rafsanjani Z. Evaluation of urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin and urinary kidney injury molecule-1 as biomarkers of renal function in cancer patients treated with cisplatin. J. Oncol. Pharm. Pract. 2020; 26(7): 1643-49. Doi: 10.1177/1078155220901756).
Известно несколько методов диагностики ПКР, основанных на выявлении специфических биомаркеров в биологических жидкостях или самой опухоли.
Так, например, известен способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы с помощью количественного измерения содержания мРНК гена NETO2 в пораженной ткани почки в сравнении с содержанием этой мРНК в нормальной ткани (Кудрявцева А.В., Кондратьева Т.Т., Дмитриев А.А., Мельникова Н.В., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Сперанская А.С., Садритдинова А.Ф., Снежкина А.В., Дарий М.В., Урошлев Л.А., Степанов О.А., Лакунина В.А. RU2545998C2 – Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления, 2012).
Известен способ диагностики светлоклеточного ПКР с помощью количественного определения экспрессии мРНК генов СА9, HIG2, STC2 в опухолевой ткани относительно нормальной (Карпухин А.В., Апанович Н.В. RU2643586C1 – Способ диагностики светлоклеточного почечноклеточного рака, 2016).
Известен способ диагностики светлоклеточного ПКР по наличию гиперметилирования по крайней мере у двух маркеров из группы генов MIR-132, MIR-125b-1, MIR-137, MIR-375, MIR-193a, MIR-1258, MIR-34b/c методом МС-ПЦР в опухолевой ткани (Логинов В.И., Ходырев Д.С., Брага Э.А., Береснева Е.В., Пронина И.В., Бурденный А.М., Казубская Т.П., Карпухин А.В. RU2683251C1 – Способ диагностики светлоклеточного почечно-клеточного рака и способ прогнозирования метастазирования на основе группы генов микроРНК, 2017).
Тем не менее, перечисленные методы диагностики, в отличие от предлагаемого в нашей заявке способа, предполагают использование в качестве материала для исследования гистологических образцов опухолевой и нормальной ткани почки, что подразумевает выполнение инвазивной процедуры биопсии. Биопсию почки при подозрении на ПКР выполняют крайне редко из-за высокого числа осложнений этой процедуры. Это является ограничивающим фактором, в особенности при ранней стадии заболевания.
Известен способ диагностики ПКР, включающий в себя выявления в сыворотке крови антител к зрительному аррестину – аррестину 1 – иммунометрическими методами, например иммуноблотом или иммуноферментным анализом (Замятнин А.А., Бажин А.В., Балдин А.В., Винаров А.З., Головастова М.О., Гришина А.Н., Зерний Е.Ю., Королев Д.О., Савватеева Л.В., Филиппов П.П. RU2707884C1 – Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию антител к зрительному аррестину, 2018). Отличиями от предлагаемого в настоящей заявке способа являются использование в качестве биомаркера для выявления ПКР антител к аррестину, количественное измерение которых предполагается выполнять в сыворотке крови.
Известен способ ранней диагностики ПКР по определению белка аррестина 1, при котором образец сыворотки крови пациента прокачивают через микрочип с иммобилизованными моноклональными антителами к аррестину 1 (Замятнин А.А., Балдин А.В., Винаров А.З., Зерний Е.Ю., Королев Д.О., Савватеева Л.В., Филиппов П.П., Шляпников Ю.М., Малахова Е.А., Шляпникова Е.А. RU2741245C1 – Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию белка зрительного аррестина в сыворотке крови). Отличиями от предлагаемого в настоящей заявке способа являются использование белка аррестина I как биомаркера для выявления ПКР, выбор сыворотки крови в качестве материала для исследования, а также применение микрочипов с моноклональными антителами в качестве метода обнаружения биомаркера.
Известен способ диагностики и прогнозирования развития ПКР на основе определения в биологическом образце пациента (сыворотка крови, цельная кровь, плазма, моча и/или тканевой образец) совокупности биомаркеров CA12, CA9, EGLN3, HIG2, TGFB3, NMU, PMP22, PNMA2, TNFRSF7, FABP6, CD70 (CD27L) и NPY1 (Hulick P, Iliopoulos O. US2010222230A1 – Diagnostic and prognostic methods for renal cell carcinoma, 2007). В качестве методов выявления перечисленных белков могут выступать ИФА, вестерн-блот, иммунопреципитация и иммунофлуоресцентный анализ. Если показатели по крайней мере двух биомаркеров оказываются повышены по сравнению с референсными значениями, установленными у доноров, делается заключение о том, что обследуемый имеет риск наличия или развития ПКР.
Известен способ диагностики и мониторинга ПКР с помощью выявления в биологическом образце обследуемого (цельная кровь, плазма, слюна или моча) повышенного уровня по крайней мере одного из трех полипептидов – AQP-1, ADFP и/или Pax-2 (Kharasch ED, Morrissey JJ. US2012115747A1 – Methods Of Renal Cancer Detection, 2009).
Тем не менее, в двух перечисленных выше способах используется оценка панелей, включающих выявление спектра пептидов, не содержащего KIM-1.
Наиболее близким к предлагаемому в нашей заявке способу является метод обнаружения острого воспаления почки, хронической почечной недостаточности и ПКР, при котором уровень KIM-1 у обследуемого сравнивается с референсным значением. В том случае, если измеренный уровень KIM-1 превышает референсный в 4 раза, у пациента диагностируется ПКР (Bonventre JV, Sabbisetti VS. US10712349B2 – Circulating KIM-1 levels for detection of pathologies associated with injury to, or cancer of, the kidney, 2014). Авторы измерили сывороточные уровни KIM-1  в группе здоровых доноров, у пациентов, перенесших хирургическое вмешательство на сердце, которые не имели почечной недостаточности, и в группе больных ПКР. Среднее значение KIM-1 в перечисленных группах составило 64,4 пг/мл, 205,7 пг/мл и 1458 пг/мл, соответственно. На основании полученных данных авторы определили референсное значение маркера – 97 пг/мл. При этом пациенту с подозрением на ПКР (имеющему предрасположенность к ПКР или проявляющему симптомы заболевания), сывороточный уровень KIM-1 у которого в четыре раза превышает референсный, ставится диагноз ПКР. В тех случаях, когда уровень KIM-1 у пациента с подтвержденным ПКР превышает 400 пг/мл, он попадает в группу риска более агрессивного, более распространенного ПКР и/или более низкой выживаемости (в сравнении с теми пациентами, которые имеют уровень KIM-1 < 400 пг/мл).
Кроме того, на основании сывороточного уровня KIM-1 авторы предлагают определять степень дифференцировки ПКР. В тех случаях, когда у пациента с подтвержденным ПКР KIM-1 находится в диапазоне 100-145 пг/мл, определяется высокодифференцированная опухоль (G1); при KIM-1 в диапазоне 150-900 пг/мл – умеренно дифференцированная (G2); 950-1200 пг/мл – низкодифференцированная (G3); выше 1200 пг/мл – недифференцированный рак (G4).
В качестве методов определения KIM-1  в сыворотке крови авторы предлагают использовать следующие методы: Вестерн-блот, радиоиммуноанализ, хемилюминесцентный иммуноанализ, ИФА, мультиплексный анализ, метод флуоресцентно меченных антител, пассивную гемагглютинацию, масс-спектрометрию, жидкостную хроматограцию – масс-спектрометрию, высокоэффективную жидкостную хроматограцию (ВЭЖХ), газовую хроматорацию – масс-спектрометрию, капиллярный электрофорез – масс-спектрометрию, ЯМР-спектрометрию и тандемную масс-спектрометрию-ВЭЖХ.
Сходством с предлагаемым в нашей заявке способом является использование для диагностики ПКР маркера KIM-1. Тем не менее, представленный способ не подразумевает его нормирование на уровень креатинина в моче, что является потенциальным недостатком, поскольку использование нормированных величин KIM-1/Cre позволяет нивелировать индивидуальные колебания KIM-1, зависящих от степени концентрированности мочи. Кроме того, представленный способ предполагает использование широкого спектра методов для выявления KIM-1, что может создать сложности стандартизации оценки его референсных значений при применении различных методик.
Техническим результатом заявляемого нами способа является разработка алгоритма уточняющей диагностики ПКР у обследуемых с подозрением на ПКР путем определения соотношения KIM-1/Cre в моче, которое может быть измерено с помощью доступных методов иммуноферментного и биохимического анализа.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что в средней порции утренней мочи обследуемых определяют соотношение KIM-1 и креатинина, и если  уровень KIM-1/Cre превышает 3,4 нг/мг креатинина, то диагностируют ПКР.
Изобретение поясняется подробным описанием, примерами исполнения, таблицей и иллюстрацией, на которой  изображено распределение показателя KIM-1/Cre в моче в группе здоровых доноров и больных ПКР.
Способ выполняют следующим образом.
Обследуемым с подозрением на ПКР измеряют соотношение KIM-1/Cre в моче.
В качестве объекта исследования KIM-1 и креатинина служит средняя порция утренней мочи. Мочу собирают до инвазивных диагностических или лечебных процедур. Уровни KIM-1 в моче исследуют иммуноферментным методом с использованием, например, тест-системы EnzoLife Sciences KIM-1 ELISA (США). Преаналитическая подготовка мочи включает ее центрифугирование при 3000 g в течение 15 минут. Дальнейшая работа осуществляется с супернатантом.  Если анализ не проводят в течение суток, то образцы мочи аликвотируют и замораживают при -80 °C. Уровни креатинина в моче исследуют параллельно с KIM-1 биохимическим методом на анализаторе Beckman-Coulter AU680.
У обследуемого по совокупности полученных результатов определения уровней KIM-1 и креатинина в моче оценивается соотношение KIM-1/Cre. Если данное соотношение превышает 3,4 нг/мг креатинина, у больного диагностируется рак почки.
Преимущества данного способа демонстрируется представленными ниже данными.
Структура обследованных групп.
Уровни KIM-1 и креатинина были измерены у 119 больных с подтвержденным диагнозом «почечно-клеточный рак». В группу вошли 76 мужчин и 43 женщины, средний возраст больных составил 59,7 года (28-79 лет). Диагноз у больных установлен на основании данных клинического и инструментального обследований и верифицирован по результатам морфологического исследования операционного материала. I стадия заболевания установлена у 72 пациентов (в том числе, T1a – у 50; T1b – у 22 больных), II стадия – у 4, III стадия – у 27, IV стадия – у 16 больных. Контрольную группу составили 59 условно здоровых добровольцев: 25 мужчин и 34 женщины; средний возраст – 43,1 года (22-79 лет).
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программы Statistica 10 (StatSoft. Inc., США). Построение графиков и диаграмм осуществляли с помощью программы Microsoft Excel 2010. Статистический анализ отличий групп по количественным показателям проводили с использованием непараметрических критериев – U-критерия Манна-Уитни или критерия Краскела-Уоллеса, достоверными считали отличия при р<0,05.
Результаты определения уровня KIM-1, концентрации креатинина в моче и нормированной величины KIM-1/Cre у доноров и в общей группе больных ПКР приведены в табл. 1.
Уровни KIM-1, равно как и соотношение KIM-1/креатинин у больных ПКР статистически достоверно отличались от соответствующих показателей в группе здоровых лиц (p<0,00001, критерий Манна-Уитни). Медиана уровня KIM-1 в группе больных ПКР оказалась в 3,3 раза выше, чем у здоровых лиц; медиана соотношения KIM-1/Cre – в 3,1 раза выше.
Таблица 1
Уровни KIM-1, креатинина в моче и uKIM-1/Cre у здоровых доноров
и больных ПКР
<b>Параметр</b>
<b>n</b>
<b>KIM-1, нг/мл</b>
<b>Креатинин, мг/мл</b>
<b>uKIM-1/Cre, нг/мг креатинина</b>
Здоровые лица   Мин-макс   Медиана (IQR)
59
0,03 – 2,830,71 (0,35 – 1,23)
0,24 – 2,110,98 (0,55 – 1,42)
0,05 – 3,390,77 (0,49 – 1,18)
Больные ПКР   Мин-макс   Медиана (IQR)
119
0,10 – 35,02,36 (1,43 – 5,93)
0,10 – 3,201,08 (0,66 – 1,60)
0,20 – 39,12,42 (1,41 – 4,61)
В диаграмме (Фиг.1), KIM-1/Cre у условно здоровых доноров не превышает 3,39 нг/мг креатинина. Таким образом, в тех случаях, когда соотношение KIM-1/Cre превышает 3,4 нг/мг, в 100% случаев диагностируется ПКР.
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами.
Пример 1.
Пациентка Н., 63 лет. При ультразвуковом исследовании в октябре 2019 г. обнаружено узловое образование левой почки с четким контуром солидной структуры, не деформирующее контур почки, размерами 29х27х32 мм. По данным КТ было выявлено гиповаскулярное опухолевое образование левой почки без признаков вовлечения чашечно-лоханочной системы. По результатам остеосцинтиграфии признаков специфического очагового поражения костей скелета не обнаружено. Соотношение KIM-1/Cre составило 4,63 нг/мг. В дальнейшем пациентке была выполнена операция в объеме лапароскопической резекции левой почки. По данным морфологического исследования послеоперационного материала был диагностирован светлоклеточный почечноклеточный рак почки G2. Окончательный диагноз: Рак левой почки I ст. pT1aN0M0.
Таким образом, значение KIM-1/Cre (> 3,4 нг/мг) у данной больной свидетельствует о наличии ПКР, что и было подтверждено патоморфологическими данными.
Пример 2.
Пациентка Ж., 67 лет. При УЗИ-обследовании по месту жительства в феврале 2019 г. выявлено опухолевое образование правой почки размерами 19х16х17 мм. По данным остеосцинтиграфии признаков специфического очагового поражения костей скелета не выявлено. Соотношение KIM-1/Cre составило 2,02. Пациентке была выполнена операция в объеме лапароскопической резекции правой почки. По данным патоморфологического исследования была диагностирована онкоцитома. Окончательный диагноз: Онкоцитома правой почки.
Таким образом, показатель KIM-1/Cre (< 3,4 нг/мг) в данном случае не позволяет утверждать, что у пациентки будет диагностирован ПКР.
Необходимо отметить, что уровни KIM-1/Cre, превышающие 3,4 нг/мл, были в исследуемой популяции выявлены у 42 из 119 больных ПКР. То есть предложенный алгоритм, как и алгоритмы для опухолей других локализаций, основанные на определении опухолеассоциированных маркеров, «работает в одну сторону»: если его уровень превышает заявленный, это свидетельствует о наличии злокачественного новообразования.
Предложенное изобретение в клинической практике позволит со 100%-ной чувствительностью диагностировать ПКР у пациентов с образованиями в почке, выявленными по результатам лучевых методов обследования, что приводит к улучшению результатов диагностики у данной группы пациентов, более раннему началу лечения и положительному экономическому эффекту вследствие снижения затрат на диагностику.