Разработка имплантируемых клеточно-и тканеинженерных конструкций вспомогательной печени для лечения печёночной недостаточности

ОБЗОРЫ

РАЗРАБОТКА ИМПЛАНТИРуЕМых КЛЕТОЧНО-

и тканеинженерных конструкций вспомогательной печени для лечения печёночной недостаточности

Н.А. Онищенко, Ю.С. Гулай, М.Ю. Шагидулин, А.О. Никольская, Л.В. Башкина

Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени акад. В.И. Шумакова, Москва, Россия

Development of implantable cell-tissue-engineering designs of auxiliary liver for the treatment of liver failure

NA. Onishchenko, Y.S Gulay, M.Y. Shagidulin, A.O. Nikolskaya, L.V. Bashkina

Academican V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russia

В статье проанализированы современные достижения и перспективы создания трансплантируемых клеточно- и тканеинженерных конструкций (КИК и ТИК) вспомогательной печени для лечения печёночной недостаточности . Подчёркивается необходимость обеспечения длительного и устойчивого функционирования имплантируемых КИК и ТИК при лечении печёночной недостаточности путём формирования в них de novo гепатоспецифических структур и превращения этих структур в новые центры восстановления повреждённой печени . КИК и ТИК приобретают указанные свойства за счёт включения в их состав ряда мало-дифференцированных клеток: тканеспецифических клеток печени (паренхиматозных и непаренхиматозных), клеток, коммитированных в гепатоцитарном направлении, и клеток костного мозга, адгезированных на биосовместимом и биодеградируемом трехмерном материале, имитирующем свойства внеклеточного матрикса В статье проведён анализ преимуществ, недостатков и перспектив применения основных групп каркасных материалов (биологические, синтетические, включая биополимерные, композитные и тканеспецифические материалы, полученные при де-целлюляризации печени) . Указывается, что биополимеры занимают предпочтительное место среди биодеградируе-мых матриксов, так как обладают не только биосовместимостью, но и свойствами «биостимуляторов» . Поскольку при изготовлении ТИК требуется обеспечение адекватного стереотипического распределения различных типов клеток на матриксе, в обзоре уделено большое внимание изготовлению микромасштабных, среднемасштабных и крупномасштабных ТИК вспомогательной печени Вместе с тем указывается, что ни одна из проблем изготовления ТИК печени (выбор источников и технологий получения мало-дифференцированных клеток, выбор матриксов и технологии их заселения клетками, выбор технологии сборки ТИК) не может считаться окончательно решённой

Ключевые слова: регенерация печени, тканеинженер-ные конструкции, стволовые/прогениторные клетки печени, трехмерные матриксы, биополимеры

The paper analyzes the achievements and prospects of creating implantable cell- and tissue-engineering designs (CEDs and TEDs) of auxiliary liver to treat liver failure . Emphasizes the need to maintenance long-term and steady function of implantable cEDs and TEDs at the treatment of liver failure, by forming in them de novo hepatospecific structures and transformation of these structures in the new centers of restorative regeneration of damaged liver . CEDs and TEDs acquire these properties due to inclusion in their designs small-differentiated cells: liverspecific cells (parenchymal and non-parenchymal), cells, committed in hepatoid direction and bone marrow cells, adherent to the biocompatible and biodegradable 3D-material, simulating the properties of the extracellular matrix The article analyzes the advantages, disadvantages and prospects for using the major groups of matrices materials (biological, synthetic,inclusive biopolymer and tissue-specific composite materials, obtained by liver decellularization). Indicates that the biopolymer materials occupy a preferred place among biodegradable scaffolds as have not only biocompatible, but also the properties of biostimulants . Since the production of the TEDs requires the provision of adequate stereotypical distribution of different types of cells in the matrix is paid great attention to the production of micro-scale, medium-scale and large-scale TEDs of auxiliary liver . However, points out that none of the problems of producing TEDs liver (choice of sources and technologies to produce small-differentiated cells, the selection matrix and technology of cell-sowing, the choice of assembly technology TEDs) can not be considered definitively settled

Keywords: liver regeneration, tissue-engineering design, liver stem/progenitors cells, 3D-matrices, biopolymers .

Проблема лечения пациентов с тяжелыми формами острой и хронической печёночной недостаточности (ПН) всё ещё далека от эффективного решения, так как показатели смертности, временной нетрудоспособности и инвалидизации больных при заболеваниях печени по-прежнему занимают одно из первых мест среди других нозологий . Полагают, что ПН развивается в результате снижения в печени количества функционирующих тканеспеци-фических структур до критического уровня, а также

e-mail: allanik64@yandex. ru

из-за уменьшения у оставшихся клеток печени чувствительности к восприятию репаративных стимулов в связи с нарушением не только клеточно-клеточ-ных и клеточно-матриксных взаимодействий, но и ввиду нарушения качества (снижения интенсивности и длительности) самих регуляторных сигналов . По современным представлениям, восстановительный морфогенез тканей и органов у высших животных и человека неразрывно связан с другими компенсаторно-адаптационными механизмами —

гипертрофией и гиперплазией клеток, входящих в состав отдельных анатомо-функциональных структур тканей [1, 2].

Между тем, такие типы механизмов способствуют компенсации утраченного объёма ткани (компенсаторная гипертрофия), нормализуют функцию ткани или органа за счёт повышения нормы функции каждой сохранившейся структурно-функциональной единицы, но не за счёт увеличения количества таких структур [3]. Кроме того, следует учитывать, что индукция клеточной пролиферации при восстановительной регенерации, а также синтез de novo тканеспецифических белков, в том числе эмбриональных белков, характерных для развития и регенерации органов, сопровождаются онтогенетически детерминированным изменением программы функционирования их генов, которая регулируется прежде всего системой региональных стволовых клеток [4]. Между тем, известно, что развитие тяжёлой недостаточности функции какого-либо жизненно важного органа сопровождается угнетением активности системы региональных стволовых клеток, как в самих повреждённых органах, так и во всём организме [5]. В результате возможность самоиндукции восстановительного морфогенеза в тканях при тяжёлом повреждёнии органов оказывается заблокированной, а процесс повреждения — необратимым . С учётом основополагающих биологических закономерностей реализации восстановительной регенерации органов и тканей у высших животных и человека исследователи различных стран мира приступили к разработке новых биотехнологических методов восстановления структуры и функции повреждённой печени путём восполнения извне дефицита отдельных тканеспецифических структур и/или стимуляции восстановительной регенерации оставшейся части печени [6] с помощью методов тканевой инженерии

1. Биотехнологические методы индукции

восстановительной регенерации

в повреждённой печени

Известно, что при хронических прогрессирующих заболеваниях печени с избыточным разрастанием в ней соединительной ткани у оставшихся клеток печени снижается чувствительность к естественным ауторегуляторным регенерацион-ным стимулам Сниженное участие гепатоцитов и некоторых других клеток печени в процессах восстановительной регенерации нарушает адекватность выработки в ней регуляторных про- и противовоспалительных сигналов (цитокинов) и антифиброгенных факторов (матриксных-метал-лопротеиназ и их ингибиторов) В результате в печени создаются условия для осуществления не восстановительной регенерации, а хронически поддерживаемого воспаления и фиброзирования [7, 8]. Именно по этой причине в экспериментальных и клинических исследованиях ведутся разработки способов индукции восстановительной регенерации печени путём трансплантации донорских гепатоцитов и клеток костного мозга (КМ) [9—11], которые, как установлено, обладают потенциалом дифференцировки в гепатоцитарном направлении [12] и оказывают прямое противовоспалительное воздействие

1.1. Трансплантация суспензии клеток печени

и костного мозга

Трансплантация суспензии гепатоцитов, как альтернатива ортотопической трансплантации печени, была изучена не только у взрослых, но и у детей с генетически обусловленной патологией метаболических процессов в печени (болезнь Вильсона — Коновалова; дефицит а-1 антитрипсина; эритро-поэтическая протопорфирия; липидозы (болезнь Нимана — Пика); тирозинемия I типа; конгениталь-ная гипербилирубинемия; семейная гиперхолесте-ролемия; синдром гипераммонемии; Гемофилия А; дефицит IX фактора, наследственная ангиоэдема) [13, 14]. В этих наблюдениях общая масса гепатоцитов, трансплантированных под капсулу селезёнки или портальную вену, составляла не более 10% от эквивалента массы печени реципиента, но это количество оказалось достаточным для частичной нормализации метаболизма [15]. Вместе с тем, несмотря на клинический эффект, выживаемость донорских гепатоцитов была низкой, и к концу наблюдения (6 мес . ) их количество не превышало 1% от массы печени реципиента [13]. Полагают, что неспособность донорских гепатоцитов длительно поддерживать эффективную метаболическую активность клеток повреждённой печени связана с тем, что гепатоциты, будучи дифференцированными клетками, способными к выполнению специфических функций, в культуре не пролиферируют, не дедифференцируются и поэтому после трансплантации не продуцируют в организме полный спектр гепатотропных факторов роста [14].

Недостаточная эффективность зрелых гепатоци-тов при лечении острой или хронической ПН [16] способствовала росту интереса исследователей к индукции восстановительной регенерации в поврежденной печени с помощью регионарных стволовых и (или) прогениторных клеток (СПК) печени — овальных клеток (внутрипечёночных СПК) и клеток костного мозга (КМ), которые, как оказалось, также являются непременными участниками восстановительного морфогенеза печени [8] . Оба типа клеток признаны регионарными СПК печени, т . к . они способны экспрессировать гены гепатоцитарных белков, приобретать некоторые функции гепатоцитов [17] и восстанавливать функциональные резервы клеток повреждённой печени [18].

Интенсификации исследований по применению клеток КМ для восстановительной регенерации повреждённой печени способствовали многочисленные наблюдения способности гемопоэтических и негемопоэтических (мезенхимальных стромальных) СПК КМ (ГСК и МСК соответственно) и крови взрослого человека дифференцироваться в гепатоцитопо-добные клетки [19], а также наблюдения, доказывающие появление в печени после введения клеток КМ полноценных гепатоцитов костномозгового происхождения, которые обеспечивают коррекцию моделированной ПН [20].

В современной литературе широко обсуждается вопрос о возможности восстановительной регенерации печени при использовании клеточных технологий не только за счет усиления пролиферации гепа-тоцитов и восстановления массы паренхимы печени, но и за счет регресса уже сформировавшегося фиброза [21, 22].

Уже установлены факты антифиброзного действия СПК КМ [23, 24]. Однако не все исследователи

признают фибролитический эффект СПК КМ и даже имеются указания на возможность усиления фиброза при их применении [25]. Можно думать, что диаметрально противоположные результаты воздействия клеточной терапии на процессы фибрози-рования в печени могут быть следствием недоучёта типа и дозы используемых клеток, а также стадии (степени тяжести и обратимости) фиброзирующего процесса, при котором они применяются . В нашей работе [26] показано, что аллогенные донорские МСК КМ при трансплантации крысам с хроническим фиброзирующим повреждением печени способны предотвращать в ней развитие соединительной ткани, если МСК КМ используются в достаточной дозе (например, 5х106) и на ранних сроках развития фиброзирования, т е когда в печени ещё сохранены резервы адаптации, регуляции и перепрограммирования процессов регенерации . Тот факт, что клетки КМ имеют мезенхимальное происхождение, заставляет сомневаться в том, что в клинических условиях после трансплантации возможна их трансдифферен-цировка и длительное выполнение гепатоцитарных функций . Именно по этой причине при лечении ПН для возмещения дефицита функционирующих клеток печени и создания условий для их пролонгированной активности исследователи стремятся не только применять клетки КМ в сочетании с донорскими гепа-тоцитами [27], но и создавать условия для их контактного взаимодействия путём иммобилизации на биосовместимых матриксах

1.2. Трансплантация клеток печени и костного мозга в составе тканеподобных структур [биоинженерных конструкций]

Современный этап совершенствования разработок по созданию биоискусственной печени связывают с использованием клеток донорской печени в составе тканеподобных структур, которые в виде имплантируемых тканеинженерных конструкций предназначены обеспечивать адекватные условия для долгосрочной жизнедеятельности внесённых в них клеток (их прикрепление, контактные взаимодействия, тканеспецифическое функционирование) и способствовать достижению и длительному поддержанию клинического эффекта при их применении [28—30]. Основные направления современных исследований и возможные области применения достижений тканевой инженерии печени представлены на рис . 1 [31].

Из схемы на рис . 1 следует, что в основе успешной разработки тканеинженерных конструкций печени лежит, прежде всего, создание и использование биоматериалов (матриксов) с заданными свойствами, среди которых в качестве каркаса или носителя клеток используют натуральные, синтетические и композитные материалы.

При выборе оптимального материала и способа его изготовления должно быть одновременно учтено множество условий, определяющих его свойства, таких как внутренняя архитектоника материала, время его

Рис. 1. Основные направления исследований и возможные области применения тканевой инженерии печени

резорбции, биосовместимость, присутствие в матрик-се и контролируемое высвобождение биологически активных веществ (специфичные белки внеклеточного матрикса, факторы роста, цитокины), поддерживающих пролиферацию и рост клеток . Однако, несмотря на прогресс в области изготовления имплантируемых систем доставки биологически активных веществ и клеток в органы и ткани, создание биосовместимых матриксов остается нерешённой, а потому актуальной задачей . Преимущества, недостатки, а также перспективы использования некоторых групп материалов, изученных к настоящему времени, представлены в табл . 1 [31].

Важно подчеркнуть, что формирование самих тканеинженерных конструкций также не может считаться решённой проблемой. Используются разные технологии их изготовления, которые могут различаться по принципу сборки отдельных элементов [32] и по масштабу создаваемых при этом конструкций [33]

Различают два основных подхода при сборке элементов тканеинженерных конструкций: принцип «сверху вниз» и принцип «снизу вверх» [32]. При осуществлении принципа «сверху вниз» (нисходящий принцип) биодеградируемый и биосовместимый

носитель (матрикс) заселяется клетками в расчёте на то, что они проникнут в носитель, колонизируют его и начнут синтезировать собственный матрикс При реализации принципа «снизу вверх» (восходящий принцип) с помощью различных методов создаются тканевые строительные блоки, которые в последующем объединяются в более крупные тканевые конструкции

Масштаб создаваемых конструкций может колебаться в зависимости от размера целого органа (например, использование каркасов после децеллю-ляризации печени) до размера микротканевого элемента (сфероиды) .

Для реализации любого из этих технологических подходов исследуются матриксы с различными заданными биофизическими и биотехнологическими свойствами, наиболее пригодные из которых для тканевой инженерии печени представлены в табл 2

Из табл . 2 следует, что среди биодеградируемых матриксов, используемых для клеточных технологий, биополимерные материалы (альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения и др . ) занимают особое место, т к они обладают не только высокой био-

Таблица 1. Преимущества, недостатки и перспективы использования основных групп материалов для изготовления тканеинженерных конструкций

Тип материала Преимущества Недостатки Сложности Перспективы

Биологические Естественное Ограниченная Потенциальная Создание носителей

материалы происхождение, возможность иммуногенность, с заданными свойст-

биосовместимость, создания материала деградабельность, вами, развитие

свойства натураль- с заданными возможность созда- композитных

ного матрикса характеристиками ния композитных материалов, создание

матриксов биоактивных

с синтетическим носителей

компонентом

Синтетические Возможность Потенциальная Создание материалов Конструирование

материалы создания биополи- иммуногенность, с более выраженными носителей с задан-

меров с заданными химическая биомиметическими ными свойствами,

свойствами, нестабильность, свойствами композитных

регулируемая токсичность биоматериалов,

биосовместимость биоактивных

и биодегра- носителей

дируемость

Композитные Сочетание Нет Создание Конструирование

материалы лучших свойств неиммуногенных и носителей с задан-

натуральных биодеградируемых ными свойствами,

и биосинтетических матриксов, биоактивных

матриксов обладающих носителей

свойствами

натуральных

матриксов

Готовые Натуральное Необходимость Полная, тщательная Создание органоидов

матриксы, происхождение, наличия доноров децеллюляризация печени и прототипов

полученные сохранение органа для биоинженерной

путем структуры и предотвращения печени

децеллюля- архитектуры реакции отторжения;

ризации целых нативной ткани максимально

органов выраженные свойства

натурального

матрикса

совместимостью, но и свойствами биостимуляторов [34]. При имплантации биополимеры расщепляются на более простые соединения, которые выводятся из организма либо принимают активное участие в метаболизме на клеточном уровне Продуктами данного класса материалов, уже получившими признание на рынке биополимеров медицинского назначения, являются: композиция гетерогенного имплантируе-

мого геля — СфероГЕЛЬ

Таблица 2. Результаты изучения пригодности матриксов с различными биофизическими и биотехнологическими свойствами для тканевой инженерии печени

Тип каркаса Материал Тип использованных клеток Результат

Пористый материал PLGA, PLLA rHCs, rBMMSCs, ГПХБ Клетки садились на матриксе высокой плотностью, выживали, синтезировали альбумин [35], демонстрировали длительную выживаемость до 4 нед. культивирования [36, 37]

Полые волокна PET, PU, PES, PTFE, EVAL HCs, ESCs Высокий уровень пролиферации 1х108/см3 матрикса в течение 20 сут. с экспрессией специфических эндодермальных генов [38]

Внеклеточный матрикс Хитозан, гиалуро-новая кислота HCs, rLSCs, QSG-7701, rFLCs Сборка клеток в тканеподобную структуру, синтез трансаминаз, альбумина, мочевины, креатинина, глюкозы [39, 40]

Полиэфиры бактериального происхождения Клетки печени крысы Через 90 сут. после трансплантации в деградирующем матриксе выявлены живые клетки с фенотипом гепатоцитов

Микроинкапсулирование PEG-гидрогель rHCs, hFLCs, hESCs Клетки образовали гепатоподобную конструкцию, в течение 12 сут. проявляющую высокую синтетическую активность альбумина, мочевины [33]

СфероГЕЛЬ Клетки печени крысы Через 365 суток после трансплантации в печень клетки печени с фенотипом гепатоцитов активно функционировали с формированием de novo гепатоидных структур (желчные протоки) [41]

Альгинат HepG2, C3A, BMMSCs Поддержание роста и функционирования клеток [42, 43]

«Коллагеновый сэндвич» «Коллагеновый каркас» HCs, hFLCs, hESCs, HepG2 Выживаемость клеток, синтез мочевины, активизация Р450, в течение 14 сут. [44]

Сфероиды PDMS rHCs, N^^3, HepG2 Выживаемость клеток при высокой плотности заселения

Фибриновый гель hFLCs, hUVECs Формирование сосудистоподобных структур, высокая пролиферация [45]

Гепатоподобный каркас Нативный матрикс из децеллюляризи-рованной печени гИСб Выживание клеток с функционированием в сроках более 45 сут. [46]. Сохранение лобулярной структуры и сосудистого русла с минимальным ишемическим повреждением при пересадке in vivo [47]

PLGA — сополимер молочной и гликолевой кислот; PLLA — полимер молочной кислоты; PET— полиэтилен-терефталат; PU — полиуретан; PES — полисульфон; PTFE — политетрафлюороэтилен; EVA — этиленвинилацетат; PEG — полиэтилен-гликоль; PDMS — полидиметилсилоксан; HCs — гепатоцитоподобные клетки; BMMSCs — мезенхимальные стромальные клетки костного мозга; FLCs — фетальные клетки печени; ESCs — эмбриональные стволовые клетки; LSCs — лейкемические стволовые клетки; QSG-7701 — линия человеческих гепатоцитоподобных клеток; HepG2— линия клеток гепатокарциномы человека; C3A — линия клеток гепатокарциномы человека; NIH/3T3 — мышиные эмбриональные фибробласты; UVECs — эндотелиальные клетки пупочной вены

В настоящее время биополимерные импланты СфероГЕЛЬ и ЭластоПОБ разрешены для применения в клинической практике в России [48, 49]. По своим свойствам СфероГЕЛЬ представляет собой комплекс пептидов и гликозамингликанов и имеет вид зернистого желеобразного вещества По аминокислотному составу СфероГЕЛЬ идентичен коллагену, но превосходит его по содержанию гексозаминов в 2 раза, а уроновых кислот — более чем в 15 раз . Размер микрочастиц в Геле от 30 до 300 мкм, набухаемость не менее 87%, рН 4,8—7,2 . Среднее время биорезорбции в организме — от нескольких недель до 9 мес , что зависит от места имплантации и размера частиц; выпускается в инъекционной форме, в шприцах 1,2 и 5 мл .

ЭластоПОБ изготавливается в виде пленки или губки ЭластоПОБ-3й, пористая структура которой получена методом выщелачивания из нанокомпозит-ного материала на основе бактериального сополимера полиоксибутират-оксивалериат и полиэфира Среднее время резорбции имплантата в организме — от 6 мес . до 1 года, в зависимости от места имплантации, формы и размеров изделия

В экспериментальных исследованиях с моделированием у крыс острой ПН (резекция 2/3 печени) и трансплантацией в брыжейку тонкой кишки КИК, изготовленного на основе биополимера ЭластоПОБ (клетки донорской печени, иммобилизованные на матриксе ЭластоПОБ-3й) нами было не только констатировано быстрое восстановление нарушенных биохимических показателей поврежденной печени, но и были выявлены в деградирующем матриксе ЭластоПОБ через 90 сут . после их трансплантации живые клетки с фенотипом гепатоцитов и новообразованные полнокровные сосуды, поддерживающие их жизнеспособность [14].

В опытах с моделированием хронической ПН (затравка CCL4) и имплантацией в поврежденную печень клеточно-инженерных конструкций (КИК) на основе матрикса СфероГЕЛЬ (клетки печени и МСК КМ в отношении 5:1 в биодеградируемом геле СфероГЕЛЬ-лонг) нами было констатировано [41], что имплантация КИК, также как и имплантация суспензии клеток печени (преимущественно гепато-цитов), ускоряет нормализацию биохимических показателей (АлАТ, АсАТ, ЩФ и общий белок крови) поврежденной печени, однако нормализация морфологических показателей печени (снижение количества дегенерированных гепатоцитов, гепатоцитов с липидными включениями, увеличение количества двуядерных гепатоцитов и накопление гепатоцитами гликогена) и степень ее дефиброзирования были более выражены при имплантации КИК Кроме того, гистологически уже на 90 сут и далее на всем сроке наблюдения (365 сут ) после трансплантации в печень КИК путём множественных инъекций в паренхиму среди введенных клеток выявлялись активно функционирующие с фенотипом гепатоцитов клетки Более того, в зонах трансплантации определялись формирующиеся de novo структуры печёночных долек (пролиферирующие гепатоциты, желчные протоки и сосуды), тогда как после трансплантации гепатоцитов в виде суспензии подобных признаков не наблюдалось Полученные результаты позволили нам заключить, что более высокий уровень и пролонгированные сроки поддержания восстановительной регенерации печени при трансплантации КИК (наблюдение до 1 года) обусловлены созданием в

КИК оптимальных условий для пролонгированной жизнедеятельности клеток, включённых в их структуру . Нельзя исключить также, что пролонгированная выживаемость гепатоцитов в КИК обусловлена присутствием в них ММСК КМ, которые формируют как местный, так и общий толерогенный фон в организме реципиента (установлено повышение FoxP3+ Тгед клеток) [50].

Между тем на ранних этапах разработки и создания систем «Вспомогательная печень» для более эффективной иммунной защиты донорских гепато-цитов применялись технологии инкапсуляции клеток в альгинат [51]. Было продемонстрировано, что микроинкапсулированные гепатоциты выживали более 3 мес после их интраперитонеального введения крысе-реципиенту на фоне иммунопротекции; микроинкапсулированные гепатоциты функционировали и компенсировали дефицит функции печени до 4 нед . у животных с моделью токсической печёночной недостаточности [52—54]. Точно так же была протестирована эффективность микросфер в качестве матриксов для гепатоцитов при трансплантации животным с моделями метаболической (энзимной) недостаточности [55] и острой печёночной недостаточности [56].

На культурах клеток печёночных линий было показано, что матриксы не просто служат опорой для клеток — их функции намного сложнее и разнообразнее Они предназначены обеспечивать роль каркаса и создавать трёхмерную структуру, требуемую для обеспечения клеточной пролиферации, дифференцировки, а также клеточно-матриксных и межклеточных взаимодействий . На культурах клеток печёночных линий была продемонстрирована способность этих клеток к реализации указанных функций при использовании натуральных и синтетических биосовместимых и биодеградируемых материалов, полимеров с белковым покрытием, различных типов нановолокон, в том числе наново-локон с модифицированной поверхностью, матрик-сов из децеллюляризированных органов, а также показана способность к усилению этих клеточных функций при добавлении в культуральную среду ростовых факторов [57, 58].

При выборе матриксов для тканевой инженерии печени предпочтение отдается наличию у них сходства с 3й-структурой и внутренней архитектоникой нативного внеклеточного матрикса печени [59]. Размер пор и общая пористость матрикса играют важную роль в поддержании специфических функций адгезированных клеток печени Размер пор влияет на массоперенос кислорода и питательных веществ внутрь носителя и тем самым поддерживает рост, жизнеспособность и функцию клеток в трансплантате Клетки не мигрируют, если размеры пор матрикса более 500 мкм, поскольку они не распознают поверхность для прикрепления Каркасы с пористостью от 50 до 150 мкм и большим количеством сообщающихся пор наиболее желательны для культивирования гепатоцитов в биоинженерных конструкциях [60].

Размер пор и общая пористость матрикса должны обеспечивать в нём не только диффузионные процессы (поступление кислорода, питательных веществ, факторов роста, элиминацию продуктов распада), но также осуществлять активный массо-перенос-дренаж и доставку кислорода, питательных веществ, регуляторных факторов и удаление продук-

тов метаболизма за счёт прорастания в него сосудов для долговременного обеспечения биологических свойств и физиологических функций клеток, а также предотвращения их ишемического повреждения и гибели [61].

Первыми такими гепатоподобными функциональными структурами были преваскуляризированные, недеградируемые поливинилалкогольные губки с адгезированными на них гепатоцитами . Такие губки содержали около 5х108 гепатоцитов и этого количества было вполне достаточно для замещения функций печени крысы [62—64]. Полная преваску-ляризация конструкции достигалась путем предварительной имплантации полых губок в хорошо ва-скуляризированные ткани (ткани брыжейки кишки) на срок более недели с последующим заселением гепатоцитами [63].

В более поздних исследованиях ускорения васку-ляризации конструкции добивались модификацией её поверхности рекомбинантными факторами роста, такими как VEGF [65, 66], а применение таких конструктов способствовало увеличению выживаемости животных в моделях острой и хронической печёночной недостаточности, в том числе у крупных животных [67, 68].

Показано, что использование 3й-биоматриксов само по себе способствует формированию разветвленной сети сосудистоподобных структур и анастомозов с сосудами реципиента [69], и эти данные служат дополнительным подтверждением предпочтительности использования технологии 3й-культивирования клеток печени в тканеинженер-ных конструктах [70, 71].

Для ускоренного формирования разветвлённой сети сосудистоподобных структур в конструктах и анастомозирования их с сосудами реципиента было предложено проводить предварительное сокульти-вирование стволовых и (или) прогениторных клеток человека — клеток печени плода (Human fetal liver cells, hFLCs), эндотелиальных клеток пупочной вены (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) и мезенхимальных стволовых клеток (mesenchymal stem cells, hMSCs) на коллагеново-фибронектино-вом матриксе in vitro в течение 48 ч . [72]. В течение этого срока происходило формирование ветвистых структур из эндотелиальных клеток (спрутинг), что позволяло рассматривать формирование этих структур как подтверждение преваскуляризации конструкта . Спустя 10 сут . после трансплантации аналогичных конструктов в ткань головного мозга (или под оболочки) иммунодефицитных мышей можно было через отверстия в черепе наблюдать сформировавшееся сосудистое русло, связанное с сосудами реципиента . К 14 дню hFLCs активно мигрировали в ткани мозга, дифференцировались и проявляли синтетическую функцию (альбумин) После 30 сут тканеинженерный эквивалент уже имел высокоспецифическую морфологию: тяжистые структуры из гепатоцитов, чередующиеся с синусо-идными капиллярами и желчными канальцами

Иммуногистохимический анализ подтвердил совершившуюся дифференцировку клеток плода печени в гепатоциты (выявление синтеза альбумина) [72]

Известен ещё один способ ускоренной васкуля-ризации трансплантата путем использования биологически васкуляризированного матрикса-каркаса (BioVaSc) . Его получают из децеллюляризирован-ного сегмента тонкой кишки свиньи, который после обработки представляет собой сохранные трубчатые капиллярные структуры в коллагеновой матрице [73]

В целом для обеспечения длительной жизнедеятельности клеток печени и выполнения ими тканеспецифических функций в составе тканеин-женерных конструкций матриксы, используемые в этих конструкциях для засева их клетками, должны обладать свойствами, имитирующими регулятор-ные свойства аутогенного нативного внеклеточного матрикса

Хотя «идеальные» матриксы всё ещё не созданы, важно, что уже к настоящему времени определены направления поиска для создания матрикса со свойствами, идентичными печёночному внеклеточному матриксу

Важно также подчеркнуть, что внеклеточный матрикс является предпочтительным субстратом для адгезии и функционирования не только молодых паренхиматозных клеток, но и развивающихся непаренхиматозных (холангиоциты, купферовские, звездчатые, эндотелиальные клетки, pit-клетки и др . ) клеток печени. Структура и состав внеклеточного матрикса, в свою очередь, зависят от метаболической активности ансамблей клеток, прикрепившихся к нему, которые за счёт синтеза и секреции внеклеточных матриксных белков могут менять не только состав, но и свойства внеклеточного матрик-са, определяя состояние микросреды и микроокружения для всех типов клеток

Из вышеизложенного следует, что помимо ге-патоцитов, чья тканеспецифическая функция нужна прежде всего, необходимо, чтобы все остальные виды непаренхиматозных клеток также присутствовали в составе тканеинженерной конструкции, так как они играют важную роль в поддержании жизнедеятельности гепатоцитов и участвуют в воспроизводстве белков внеклеточного матрикса (фибронектин, ламинин, коллаген и др . ) [74]. Обеспечение стереотипического изготовления матрик-сов с набором и размещением всех клеток печени пока остается нерешённой задачей . К этому следует добавить, что современные стратегии сборки элементов тканеинженерных конструкций печени не обеспечивают наличия в тканеинженерном эквиваленте печени венозной, портальной и желчной сетей И хотя некоторые исследователи, использующие принцип сборки «снизу вверх» (bottom-up — см . выше), сообщают об успешном создании перфузируемой синусоидальной микроархитектуры печени, полученной с помощью микротехнологии [75, 76], такие конструкты очень сложны в производстве и пока непригодны для клинического применения [77]. Иными словами, поиск технологии создания идеального каркаса с синусоидальной микроархитектурой [78], активно производящего регуляторные сигналы [79] для стимуляции длительного выживания и функционирования всех типов клеток в составе имплантируемого тканеинже-нерного конструкта — продолжается .

Рис. 2. Свойства «идеального» матрикса, предназначенного для тканевой инженерии печени

2. ^временные технологии изготовления тканеинженерных конструкций (ТИК) печени

2.1. Способы изготовления микромасштабных тканеинженерных конструкций основаны на применении Bio MEMS-технологий и технологии создания 3D-культуры ткани печени методом наложения

BioMEMS-технология применяется для трехмерного конструирования тканей, в том числе печени, путем культивирования клеток в предварительно организованном пространстве в условиях контролируемого микроокружения (путём пространственного и временного распределения клеток, а также управляемого воздействия биофизических и биохимических факторов на микроуровне). Для этих целей используют микроэлектромеханические системы Bio MEMS, которые уже в настоящее время применяют для проведения биомедицинских исследований (создание кремниевых, стеклянных и полимерных подложек, ДНК и белковых микрочипов и др . ) [80], а также тестирования лекарственных средств, химических и биологических агентов [81].

BioMEMS-технологии могут позволить также конструировать более сложную тканевую структуру печени при использовании микрофлюидных систем Эти системы характеризуются использованием ма-триксов с микроканалами для распределения клеток и свободного проникновения кислорода при культивировании в условиях биореактора [82]. При культивировании отдельных типов клеток либо их смесей в микрофлюидных системах формируются сосудисто-подобные структуры [83, 84], желчные капилляры, поддерживается активная синтетическая функция гепатоцитов на сроках более 30 сут . [85].

Технология создания 3D-культуры ткани печени методом наложения предусматривает сложение нескольких 2й-слоев клеток и служит для имитации естественной структуры ткани печени. Метод [86] позволяет создать условия для формирования желчных капилляров и «гепатоподобных структур», секретирующих альбумин уже спустя 5 сут . [87] после наложения слоев при культивировании гепатоцитов (малых гепатоцитов) или смеси клеток (малые гепатоциты, звездчатые и эндотелиальные клетки) на пористых мембранах [88].

В последнее время предложен ещё один подход к созданию 3й-культур ткани печени методом наложения . Способ предусматривает изготовление муль-тикомпонентных гидрогелевых волокон (d«300 мкм) с клетками и их последующую сборку в трансплантируемые тканеинженерные эквиваленты . Гепатоциты и эндотелиальные клетки, полученные из человеческих iPSCs (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки), инкапсулировали в мультикомпонентные волокна, причем для гепатоцитов в состав волокна входила галактоза, а для эндотелиальных клеток — коллаген I типа . На стадии in vitro полученные конструкции помещались в питательную среду для культивирования в течение 8 сут . Затем тканеин-женерные эквиваленты, изготовленные методом наложения, пересаживали мышам, подвергшимся резекции 70% печени . В опытах in vivo при моделировании ПН у мышей было продемонстрировано, что присутствие эндотелиальных клеток в тканеин-женерных эквивалентах и их расположение в непосредственной близости от клеток паренхимы значительно улучшает функционирование гепатоцитов и способствует васкуляризации трансплантата, в то время как в трансплантате, содержащем только

гепатоциты, развитие сосудов не наблюдалось ни на 2, ни на 4 нед . после пересадки [89].

Полагая, что только в 3D-тканеинженерных эквивалентах возможно одновременное поддержание и фенотипа ткани и пролиферации клеток соответствующей ткани при обеспечении их соотношения и пространственного распределения, недавно была предложена новая 3D-органотипическая модель структуры печени в виде сложного двухслойного сэндвича [74]. Эта модель содержит три вида клеток: гепатоциты, клетки синусоидального эндотелия и клетки Купфера в количестве и в соотношении, соответствующем их содержанию в печени in vivo . Клетки располагаются на верхней и нижней поверхности полимерного матрик-са-прослойки (на верхней поверхности — синусоидальные эндотелиальные и купферовские клетки, на нижней поверхности — гепатоциты), которая имитирует пространство Диссе, а точнее, создаёт базальную мембрану, для этих клеток . Используемая полимерная прослойка является оптически прозрачной, получена методом самосборки полиэлектролитных биополимерных мультислоёв (PEM) и характеризуется биофизическими свойствами — растяжимостью по модулю Юнга и толщиной (400— 600 нм), сопоставимыми с параметрами нативной ткани . Вся эта сложная конструкция со стороны нижней свободной поверхности гепатоцитов дополнительно укреплена слоем коллагена . Поддержание фенотипа и соотношения всех использованных типов клеток при моделировании этой микромасштабной тканеинженерной конструкции печени по данным авторов продолжалось более 12 сут . культивирования [74].

В ряде работ показано, что для формирования 3D-культуры клеток печени (микромасштабной тканеинженерной конструкции) целесообразно использовать гидрогели из нановолоконной целлюлозы (Growdex, nanofibrillar cellulose, NFC-hydrogel) [90], а также гиалуронан-желатиновый гидрогель Extracel (HG), (CellSystems, Германия) [91], которые способствуют формированию в культуре многоклеточных сфероидов с выраженной апикобазаль-ной полярностью, с функционирующими желчными канальцевыми структурами, и органотипическими клетками печени при засеве этих матриксов или клетками линии Hepa RG (клетки гепатокарциномы человека) или прогениторными клетками печени Сфероиды сохраняли жизнеспособность и демонстрировали функциональную активность в течение 14 сут . культивирования . И хотя данная модель преподносится авторами как успешная модель печёночной ткани человека для исследования лекарств и химических веществ in vitro, использованные матриксы признаны также подходящими для тканевой инженерии печени [92]

2.2. Технологии изготовления

(культивирования и самосборкиJ

среднемасштабных тканеинженерных

конструкций печени

Культивирование гепатоцитов в проточном биореакторе на полимерных дисках. Выделенные из печени человека гепатоциты культивировали на дисках в проточном биореакторе в течение 6 сут . Скорость потока питательной среды, подаваемой перпендикулярно поверхности диска, составляла 24 мл/мин.

В биореакторе использовали диски размером 18 мм в диаметре и 1 мм толщиной, изготовленные из биодеградируемого матрикса-полимера молочной кислоты (poly-(L-lacticacid), PLLA) . Было показано, что при использовании такой технологии из живых гепатоцитов формируются сфероиды диаметром от 50 до 250 мкм со структурой, напоминающей строение печени и с признаками активной синтетической функции этих клеток (синтез альбумина), выраженной детоксикационной активностью (цито-хром P-450). На 6 сут . культивирования выявление актиновых филаментов авторы рассматривали как признак формирования желчных капилляров в новообразованных гепатоидных структурах [93].

Культивирование гепатоцитов в проточном биореакторе в условиях микрогравитации. Матриксы, изготовленные из поли^-молочногликолевой кислоты (PLGA, срок деградации «6мес), размером 1х4х5мм были засеяны первичной культурой мышиных гепатоцитов и культивировались в течение 7 и 14 сут . в проточном биореакторе в условиях микрогравитации [94].

Часть тканеинженерных эквивалентов после 7 сут культивирования была пересажена в брюшную полость NOD-SCID мышей . Показано, что культивирование гепатоцитов в биореакторе в условиях перфузии и микрогравитации существенно улучшает физиологические показатели клеток в сравнении со статичной культурой (исследовали уровень синтеза альбумина, мочевины, активность цитохрома Р-450 в течение 14 сут культивирования), а также обусловливает более выраженный результат трансплантации образовавшегося конструкта (выраженная васкуляризация конструкта, активный и продолжительный (14 сут . ) синтез альбумина гепатоцитами) . Полагают, [94] что отчётливо позитивные результаты предварительного культивирования гепатоцитов в условиях перфузии и микрогравитации связаны с активным массопереносом и снижением затрат энергии на преодоление гравитации

Культивирование трёх видов клеток печени на матригеле. Мелкодисперсный затвердевший гель, содержащий смесь белков базальной мембраны из кожи человека засевали человеческими iPSc-клетками, коммитированными в гепатоцитарном направлении (iPSC-derived hepatic endoderm cells, iPSC-Hes) в смеси с человеческими эндотелиаль-ными клетками из пупочной вены (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) и человеческими МСК из костного мозга (human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs) . В течение 48—72 ч . клетки формировали на матригеле устойчивые ас-социаты — «зачатки» печени (iPSC-derived liver bud) размером 4—7 мм . Выращенные in vitro «зачатки» ткани печени гетеротопически имплантировались в организм иммунодефицитных мышей . Лучшие результаты были получены при трансплантации «зачатков» в брыжейку тонкой кишки ближе к печени рядом с воротной веной . В течение 24—48 ч . трансплантат начинал кровоснабжаться, т к к этому сроку образовались анастомозы с сосудистой сетью реципиента . Успешная перфузия во многом объяснялась формированием сосудистоподобной сети в условиях in vitro (благодаря присутствию в ассоциате эндотелиальных клеток) . В течение 2 сут после пересадки сосудистая сеть развивалась и созревала, а к 7—14 сут . приобретала ор-ганоспецифическое строение На тех же сроках

появлялась активная специфическая синтетическая функция гепатоцитов — синтез альбумина и a-1-антитрипсина. Спустя 30—60 сут . после трансплантации образовавшихся зачатков печень мыши приобретала видо-специфический (человеческий) тип метаболизма лекарственных средств [95].

2.3. Технологии изготовления

крупномасштабных тканеинженерных

конструкций печени

Технология ЗD-биопечати тканей представляет собой послойную автоматическую (роботизированную) сборку трехмерных функционирующих предварительно сформированных массивов тканей и органных тканеинженерных эквивалентов с использованием клеточных сфероидов или тканеподобных фрагментов в качестве строительных блоков . Благодаря своим размерам, физическим свойствам, форме, контролируемому составу, известным пространственным характеристикам сфероиды или тканеподобные микрокусочки используются в качестве исходного конструкта для автоматизированного распределения или цифрового «впечатывания» их в матриксные слои, например гидрогелевые . После заполнения каждого отдельного матриксного слоя клеточными сфероидами следует их сборка и создание макротканевых структур или органных конструктов с помощью биопринтера [96]

Однако в настоящее время использование технологии биопечати не привело к получению длительно функционирующей тканевой культуры печени: описана лишь методика культивирования смеси клеток на микрочипах (подушечки из акриламидного геля с добавлением белков внеклеточного матрикса) в течение 7 сут . , причем для сокультивирования использовалась смесь клеток, состоящая из HepG2, LX-2 (hepatic-stellate cells), первичных фибробластов из стенки воротной вены (PFs) и эндотелиальных клеток аорты быка (bovineaortic endothelial cells, BAECs) [97].

Технология децеллюляризации-рецеллюляриза-ции печени. Децеллюляризация целого органа позволяет получить его соединительно-тканный каркас (коллаген I, III, IV типов, фибронектин, ламинин) с сохранной архитектоникой печёночного матрикса: остается практически интактной глиссонова капсула (играет важную роль при перфузии органа), сохраняются каркасы печёночных долек, триад, центральных вен, воротной вены и микропористая структура матрикса паренхимы; сосуды сохраняют диаметр просвета и форму, остается проходимым микрососудистое русло; желчные протоки также остаются практически сохранными, кроме минимальных разрывов в мелких ветвях [98]. Эти же авторы показали, что в (матриксе) децеллюляризированной печени обязательно присутствуют и ростовые факторы, однако, содержание их снижено: VEGF (19%), IGF-1 (13%), HGF (19%) и bFGF (20%), по сравнению с содержанием в нативной печени, принятой за 100%

Метод создания трансплантатов печени путем децеллюляризации-рецеллюляризации находится на самом раннем этапе его освоения, однако представляется очень перспективным [99,100—102], так как на сегодняшний день максимальный вес свиной печени, поддающейся децеллюляризации, составляет 506±27 г, а такой вес печени после её рецеллю-ляризации может обеспечить компенсацию печёночных функций [98].

Отмечено, что даже после частичной рецел-люляризации каркаса печени нативными свиными гепатоцитами в перфузируемой органной культуре печени наблюдался синтез альбумина и мочевины. На 4 сут . в перфузируемой культуре уровень альбумина и мочевины был выше, чем в культуре свиных гепатоцитов на коллагеновом слое, но ниже, чем в культуре гепатоцитов в двойном коллагено-вом геле [98].

Частично рецеллюляризированная печень крысы сохраняла также белково-синтетическую функцию в течение 5 сут . в условиях непрерывной перфузии, а после пересадки признаки ишемического повреждения гепатоцитов отсутствовали в течение 8 ч [99]

При заселении каркаса децеллюляризированной печени крысы смесью человеческих эндотелиальных клеток и человеческих фетальных печёночных про-гениторных клеток наблюдалась дифференцировка этих клеток в гепатоциты, холангиоциты и эндотели-альные клетки с сохранением микроархитектуры печени и формированием сосудистой выстилки [102]. Изучение состава каркаса с помощью иммуноги-стохимического анализа выявило сохранение в ней ряда гликозаминогликанов, выступающих в качестве сайтов прикрепления факторов роста, регулирующих клеточный фенотип, миграцию и дифференцировку клеток

Заключение

Анализ проблемы лечения ПН путём восстановления структуры и функции повреждённой печени убеждает в перспективности её решения путём совершенствования методов клеточной и тканевой инженерии

Назначение этих методов обеспечить разработку и применение имплантируемых длительно функционирующих клеточно- и тканеинженерных конструкций (КИК и ТИК соответственно) печени, способных стать центрами формирования de novo специализированной ткани печени, для перепрограммирования процессов регенерации в собственной повреждённой печени с заместительного (фиброзирующего) типа на восстановительный (де-фиброзирующий) тип . Для выполнения этих функций КИК и ТИК должны содержать оптимальный набор тканеспецифичных малодифференцированных клеток (стволовые и (или) прогениторные паренхиматозные и непаренхиматозные клетки) с высоким потенциалом пролиферации и дифференцировки, которые способны вступать в клеточно-клеточные и клеточно-матриксные взаимодействия, а также регулировать свою тканеспецифическую активность благодаря адгезии на биосовместимом и биоде-градируемом 30-матриксе, выполняющем функции внеклеточного матрикса

Среди основных групп матриксов при разработке КИК и ТИК предпочтение отдаётся биологическим (фибрин, коллаген) и синтетическим (биополимерным) матриксам (Матригель, СфероГЕЛЬ, ЭластоПОБ), т . к . они обладают не только биосовместимостью и биодеградабельностью, но и свойствами биостимуляторов Несмотря на ожидаемую перспективность применения ТИК для возмещения дефицита ткани печени ни одна из проблем изготовления ТИК вспомогательной печени (выбор источников и технологии получения малодиффе-

ренцированных клеток печени, выбор матриксов и технологии их заселения клетками, выбор технологии изготовления и сборки ТИК и др . ) не может считаться окончательно решённой и требует продолжения комплексных исследований .

Благодарности

Данная работа выполнена в рамках проекта ФЦПИР 2014-2020 Минобрнауки России (Соглашение № 14.610.21.0001).

ЛИТЕРАТУРА:

I. Саркисов Д . С. Регенерация и её клиническое значение. М: Изд-во Медицина; 1970 .

2 . Бабаева А . Г . Регенерация . Факты и перспективы . М .: Изд-во РАМН; 2009 .

3 . Igarashi Y ., DHoore W ., Goebbels R . M . et al . Beta-5 score to evaluate pig islet graft function in a primate pre-clinical model . Xenotransplantation 2010; 17(6): 449-59 .

4 . Онищенко Н . А. , Шагидулин М . Ю ., Крашенинников М . Е . и др . Повреждения органов и тканей, требующие применения клеточных технологий . В: Пинаев Г . П ., Богданова М . С ., Кольцова А . М ., редакторы Клеточные технологии для регенеративной медицины СПб: Изд-во Политехнического Ун-та; 2011. с . 25-43 .

5 Шумаков В И , Онищенко Н А , редакторы Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций . Москва: Лавр; 2009

6 . Booth С ., Soker T. , Baptista P . et al . Liver bioengineering: current status and future perspectives . World J . Gastroenterology 2012; 18(47): 6926-34 .

7 Люндуп А В , Онищенко Н А , Крашенинников М Е и др О роли синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга в обеспечении регенераторной стратегии здоровой и поврежденной печени (Аналитический обзор) Вестник трансплантологии и искусственных органов 2010; XII(1): 78-85 .

8 Онищенко Н А , Люндуп А В , Деев Р В и др Синусоидальные клетки печени и клетки костного мозга как компоненты единой функциональной системы регуляции восстановительного морфогенеза в здоровой и поврежденной печени . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(2): 78-92 .

9 . Petersen B . E ., Bowen W . С ., Patrene K . D . et al . Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells . Science 1999; 284(5417): 1168-70 .

10 . Theise N . D ., Nimmakayalu M ., Gardner R . et al . Liver from bone marrow in humans . Hepatology 2000; 32(1): 11-6 .

II. Alison M . R ., Poulsom R ., Jeffery R . et al . Hepatocytesfrom non-hepatic adult stem cells Nature 2000; 406(6793): 257

12 . Oh S . H . , Witek R . P ., Bae S . H . et al . Bone marrow-derived hepatic oval cells differentiate into hepatocytes in 2-acetylaminofluorene/ partial hepatectomy-induced liver regeneration Gastroenterology 2007; 132(3): 1077-87 .

13 Dhawan A , Puppi J , Hughes R D et al Human hepatocyte transplantation: current experience and future challenges . Nat . Rev . Gastroenterol . Hepatol . 2010; 7(5): 288-98 .

14 . Smets F ., Najimi M . S . F., Sokal E . M . Cell transplantation in the treatment of liver diseases . Pediatr . Transplant . 2008; 12: 6-13 .

15 . Asonuma K ., Gilbert J . С ., Stein J . E . et al . Quantitation of transplanted hepatic mass necessary to cure the Gunn rat model of hyperbilirubinemia . J . Pediatr . Surg . 1992; 27(3): 298-301.

16 . McKenzie T.J ., Lillegard J . B . , Nyberg S . L. Artificial and bioartificial liver support Semin LiverDis 2008; 28: 210-7

17 . Киясов А . П . , Гумерова А . А . , Титова М . А . Овальные клетки — предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты? Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 2(4): 55-8

18 . Fausto N ., Campbell J . S . The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation . Mech . Dev . 2003; 120: 117-30 .

19 Sawitza I , Kordes С , Hausinger D The niche of stellate cells within rat liver. J . Hepatol . 2009; 50(5): 1617-24 .

20 . Черных Е . Р ., Останин А. А. , Пальцев А . И . Стволовые клетки в регенерации печени: новые подходы к лечению печеночной недостаточности Гепатология 2004; 5; 24-33

21 Arthur M J Reversibility of liver fibrosis and cirrhosis following treatment for hepatitis С . Gastroenterology 2002; 122: 1525-8 .

22 Friedman S L Reversibility of hepatic fibrosis and cirrhosisis it all hype? Nat . Clin . Pract . Gastroenterol . Hepatol . 2007; 4: 236-7 .

23 Dai L J , Li H Y , Guan L X et al The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis Stem Cell Res . 2009; 2(1): 16-25 .

24 . Киясов А. П ., Одинцова А.Х, Гумерова А.А. и др . Трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2008; 3(1): 70-5 .

25 Russo F P , Alison M R , Bigger B W et al The bone marrow functionally contributes to liver fibrosis . Gastroenterology 2006; 130: 1807-21.

26 . Онищенко Н .А ., Люндуп А. В ., Газизов И . М ., и др . Двухфазная динамика фибролитического действия мультипотентных мезенхи-мальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга при моделиро-

вании хронического фиброзирующего повреждения печени . Вестник трансплантологии и искусственных органов 2011; XIII(3): 51-8 .

27 . Shagidulin M ., Onishchenko N ., Krasheninnikov M . et al . Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure . British J . of Surgery 2010; 94(S4): 37-8 .

28 . Bates R . С ., Edwards N . S ., Yates J . D . Spheroids and cell survival . Crit . Rev . Oncol . Hematol . 2000; 36(2-3): 61-74 .

29 . Zahir N ., Weaver V . M . Death in the third dimension: apoptosis regulation and tissue architecture . Curr. Opin . Genet . Dev. 2004; 14(1): 71-80 .

30 . Grossmann J . Molecular mechanisms of «detachment- induced apoptosis - Anoikis» . Apoptosis 2002; 7(3): 247-60 .

31. Chistiakov D .A . Liver regenerative medicine: advances and challenges . Cells Tissues Organs 2012; 196(4): 291-312 .

32 . Lu T ., Li Y ., Chen T . Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering Int J Nanomedicine 2013; 8: 337-50 .

33 Li Y S , Harn H J , Hsieh D K et al Cells and materials for liver tissue engineering . Cell Transplant . 2013; 22(4): 685-700 .

34 . Севастьянов В . И . Биоматериалы, системы доставки лекарственных веществ и биоинженерия Вестник трансплантологии и искусственных органов 2009; XI(3): 69-70

35 . Kim S . S . , Utsunomiya H ., Koski J .A . et al . Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels Ann Surg 1998; 228(1): 8-13 .

36 . Hanada S ., Kojima N ., Sakai Y . Soluble factor-dependent in vitro growth and maturation of rat fetal liver cells in a three-dimensional culture system . Tissue Eng . Part A . 2008; 14(1): 149-60 .

37 Jiang J , Kojima N , Guo L et al Efficacy of engineered liver tissue based on poly-L-lactic acid scaffolds and fetal mouse liver cells cultured with oncostatin M, nicotinamide, and dimethyl sulfoxide . Tissue Eng . 2004; 10(9-10): 1577-86 .

38 . Matsumoto K., Mizumoto H ., Nakazawa K. et al . Hepatic differentiation of mouse embryonic stem cells in a bioreactor using polyurethane/ spheroid culture . Transplant . Proc . 2008; 40(2): 614-6 .

39 . Yan Y ., Wang X ., Pan Y . et al . Fabrication of viable tissue-engineered constructs with 3D cell-assembly technique Biomaterials 2005; 26(29): 5864-71.

40 . Zhang F., Xu R ., Zhao M . J . QSG-7701 human hepatocytes form polarized acini in three-dimensional culture J Cell Biochem 2010; 110(5): 1175-86 .

41. Шагидулин М . Ю ., Онищенко Н .А ., Крашенинников М . Е . и др . Трансплантация клеточно-инженерных конструкций в печень обеспечивает длительную поддержку процессов восстановительной регенерации в поврежденной печени Вестник трансплантологии и искусственных органов 2013; XV(2): 64-74.

42 Kinasiewicz A , Gautier A , Lewinska D et al Culture of C3A cells in alginate beads for fluidized bed bioartificial liver Transplant Proc . 2007; 39(9): 2911-3 .

43 Lan S F , Safiejko-Mroczka B , Starly B Long-term cultivation of HepG2 liver cells encapsulated in alginate hydrogels: a study of cell viability, morphology and drug metabolism . Toxicol . in vitro 2010; 24(4): 1314-23 .

44 . Zhang S ., Tong W ., Zheng B . et al . A robust high-throughput sandwich cell-based drug screening platform . Biomaterials 2011; 32(4): 1229-41.

45 Xiong A , Austin T W , Lagasse E et al Isolation of human fetal liver progenitors and their enhanced proliferation by three-dimensional coculture with endothelial cells . Tissue Eng . Part A. 2008; 14(6): 995-1006 .

46 Lin P , Chan W C , Badylak S F et al Assessing porcine liver-derived biomatrix for hepatic tissue engineering Tissue Eng 2004; 10(7-8): 1046-53 .

47 . Uygun B . E . , Soto-Gutierrez A ., Yagi H . et al . Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix . Nat . Med . 2010; 16(7): 814-20 .

48 . Марковцева М . Г ., Немец Е .А., Севастьянов В . И . Пористые трёхмерные носители для культивирования и трансплантации клеток на основе сополимера гидроксибутирата с гидроксивалератом Вестник трансплантологии и искусственных органов 2006; 2: 83-88

49 Севастьянов В И , Перова Н В , Немец Е А , и др Примеры экспериментально-клинического применения биосовместимых материалов в регенеративной медицине В: В И Севастьянов, М П Кирпичников, редакторы Биосовместимые материалы (учебное пособие) . М: Изд-во «МИА»; 2011; Ч . II, гл . 3, с . 237-52 .

50 . Готье С . В ., Шагидулин М . Ю ., Онищенко Н .А . и др . Коррекция хронической печеночной недостаточности при трансплантации клеток

печени в виде суспензии и клеточно-инженерных конструкций [экспериментальное исследование) . Вестник РАМН 2013; 4; 44-51.

51. Davis M . W ., Vacanti J . P . Toward development of an implantable tissue engineered liver. Biomaterials 1996; 17(3): 365-72 .

52 . Balladur P ., Crema E ., Honiger J . et al . Transplantation of allogeneic hepatocytes without immunosuppression: long-term survival . Surgery 1995; 117(2): 189-94 .

53 . Dixit V., Darvasi R . , Arthur M . et al . Restoration of liver function in Gunn rats without immunosuppression using transplanted microencapsul a ted hepatocytes . Hepatology 1990; 12(6): 1342-9 .

54 Wong H , chang T M Bioartificial liver: implanted artificial cells microencapsulated living hepatocytes increases survival of liver failure rats . Int . J . Artif . Organs 1986; 9(5): 335-6 .

55 . Demetriou A .A ., Whiting J . F . , Feldman D . et al . Replacement of liver function in rats by transplantation of microcarrier-attached hepatocytes . Science 1986; 233(4769): 1190-2 .

56 . Bosman D . K ., de Haan J . G ., Smit J . et al . Metabolic activity of microcarrier attached liver cells after intraperitoneal transplantation during severe liver insufficiency in the rat . J . Hepatol . 1989; 9(1): 49-58 .

57 . Kazemnejad S ., Allameh A. , Soleimani M . et al . Biochemical and molecular characterization of hepatocyte-like cells derived from human bone marrow mesenchymal stem cells on a novel three-dimensional biocompatible nanofibrous scaffold J Gastroenterol Hepatol 2009; 24(2): 278-87 .

58 Piryaei A , Valojerdi M R , Shahsavani M et al Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells on nanofibers and their transplantation into a carbon tetrachloride-induced liver fibrosis model . Stem Cell Rev . 2011; 7(1): 103-18 .

59 . Vasanthan K . S ., Subramanian A ., Krishnan U . M . et al . Role of biomaterials, therapeutic molecules and cells for hepatic tissue engineering . Biotechnol . Adv . 2012; 30(3): 742-52 .

60 . Wu C ., Pan J ., Bao Z ., Yu Y . Fabrication and characterization of chitosan microcarrier for hepatocyte culture J Mater Sci Mater Med . 2007; 18(11): 2211-4 .

61 Murua A , Portero A , Orive G et al Cell microencapsulation technology: towards clinical application J Control Release 2008; 132(2): 76-83 .

62 uyama S , Kaufmann P M , Takeda T et al Delivery of whole liver-equivalent hepatocyte mass using polymer devices and hepatotrophic stimulation . Transplantation 1993; 55(4): 932-5 .

63 . Takeda T., Murphy S . , Uyama S . et al . Hepatocyte transplantation in Swine using prevascularized polyvinyl alcohol sponges . Tissue Eng . 1995; 1(3): 253-62 .

64 . Kneser U ., Kaufmann P .M ., Fiegel H . C . et al . Long-term differentiated function of heterotopically transplanted hepatocytes on three-dimensional polymer matrices J Biomed Mater Res 1999; 47(4): 494-503 .

65 Kedem A , Perets A , Gamlieli-Bonshtein I et al Vascular endothelial growth factor-releasing scaffolds enhance vascularization and engraftment of hepatocytes transplanted on liver lobes Tissue Eng . 2005; 11(5-6): 715-22 .

66 . Hou Y.T ., Ijima H ., Takei T. et al . Growth factor/ heparin-immobilized collagen gel system enhances viability of transplanted hepatocytes and induces angiogenesis . J . Biosci . Bioeng . 2011; 112(3): 265-72 .

67 . Navarro-Alvarez N ., Soto-Gutierrez A ., Chen Y . et al . Intramuscular transplantation of engineered hepatic tissue constructs corrects acute and chronic liver failure in mice . J . Hepatol . 2010; 52(2): 211-9 .

68 Katsuda T , Teratani T , Ochiya T et al Transplantation of a fetal liver cell-loaded hyaluronic acid sponge onto the mesentery recovers a Wilson's disease model rat . J . Biochem . 2010; 148(3): 281-8 .

69 Zhou P , Lessa N , Estrada D C et al Decellularized liver matrix as a carrier for the transplantation of human fetal and primary hepatocytes in mice . Liver Transpl . 2011; 17(4): 418-27 .

70 Levenberg S , Huang N F , Lavik E et al Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds PNAS USA 2003; 100(22): 12741-6 .

71. Soto-Gutierrez A . , Zhang L ., Medberry C . et al . A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement Tissue Eng Part C . Methods 2011; 17(6): 677-86 .

72 Takebe T , Koike N , Sekine K et al Engineering of human hepatic tissue with functional vascular networks Organogenesis 2014; 10(2): 260-7 .

73 . Schanz J ., Pusch J ., Hansmann J . et al . Vas cularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research . J . Biotechnology 2010; 148(1): 56-63 .

74 Larkin A L , Rodrigues R R , Murali T M et al Designing a multicellular organotypic 3D liver model with a detachable, nanoscale polymeric Space of Disse . Tissue Eng . Part C . Methods 2013; 19(11): 875-84

75 . Liu Tsang V. , Chen A.A., Cho L. M . et al . Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photo patterning of cellular hydro gels FASEB J . 2007; 21(3): 790-801.

76 Hsu W M , Carraro A , Kulig K M et al Liver-assist device with a microfluidics-based vascular bed in an animal model Ann Surg 2010; 252(2): 351-7 .

77 Borenstein J T , Weinberg E J , Orrick B K et al Microfabrication of three-dimensional engineered scaffolds Tissue Eng . 2007; 13(8): 1837-44 .

78 Kulig K M , Vacanti J P Hepatic tissue engineering Transpl Immunol . 2004; 12(3-4): 303-10 .

79 Mooney D J , Vandenburgh H Cell delivery mechanisms for tissue repair. Cell Stem Cell 2008; 2(3): 205-13 .

80 Sudo R Multiscale tissue engineering for liver reconstruction Organogenesis 2014; 10 (2): 216-24 .

81 Borenstein J T , Vunjak-Novakovic G Engineering tissue with BioMEMS . IEEE Pulse 2011; 2(6): 28-34 .

82 Goral V N , Hsieh Y C , Petzold O N et al Perfusion-based micro fluidic device for three-dimensional dynamic primary human hepatocyte cell culture in the absence of biological or synthetic matrices or coagulants . Lab . Chip . 2010; 10(24): 3380-6 .

83 Chung S , Sudo R , Mack P J et al Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a micro fluidic platform Lab Chip 2009; 9(2): 269-75

84 Zervantonakis I K , Kothapalli C R , Chung S et al Micro fluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments Biomicrofluidics 2011; 5(1): 13406 .

85 . Yamada M ., Utoh R ., Ohashi K . et al . Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydro gel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions Biomaterials 2012; 33(33): 8304-15 .

86 Sudo R , Mitaka T , Ikeda M et al Reconstruction of 3D stacked-up structures by rat small hepatocytes on micro porous membranes . FASEB J . 2005; 19(12): 1695-7 .

87 Okano T Current Progress of Cell Sheet Tissue Engineering and Future Perspective . Tissue Eng . Part A 2014; 10: 1089 .

88 Kasuya J , Sudo R , Mitaka T et al Spatiotemporal control of hepatic stellate cell-endothelial cell interactions for reconstruction of liver sinusoids in vitro . Tissue Eng . Part A 2012; 18(9-10): 1045-56 .

89 Du C , Narayanan K , Leong M F et al Induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes and endothelial cells in multi-component hydrogel fibers for liver tissue engineering . Biomaterials 2014; 35(23): 6006-6014

90 Bhattacharya M , Malinen M M , Lauren P et al Nanofibrillar cellulose hydrogel promotes three-dimensional liver cell culture J Control Release 2012; 164(3): 291-8 .

91 Vanderhooft J L , Alcoutlabi M , Magda J J et al Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydro gels for tissue engineering . Macromol . Biosci . 2009; 9(1): 20-98 .

92 Malinen M M , Kanninen L K , Corlu A et al Differentiation of liver progenitor cell line to functional organotypic cultures in 3D nanofibrillar cellulose and hyaluronan-gelatin hydro gels Biomaterials 2014; 35(19): 5110-21.

93 . Torok E ., Lutgehetmann M ., Bierwolf J . et al . Primary human hepatocytes on biodegradable poly (l-lactic acid) matrices, a promising model for improving transplantation efficiency with tissue engineering Liver Transpl . 2011; 17(2): 104-14 .

94 . Zhang S ., Zhang B ., Chen X . et al . Three-dimensional culture in a microgravity bioreactor improves the engraftment efficiency of hepatic tissue constructs in mice . J . Mater . Sci . Mater . Med . 2014; 25(12): 2699-709 .

95 Takebe T , Zhang R R , Koike H et al Generation of a vascular zed and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant . Nat . Protoc . 2014; 9(2): 396-409 .

96 Mironov V , Visconti R P , Kasyanov V et al Organ printing, tissue spheroids as building blocks . Biomaterials 2009; 30(12): 2164-74.

97 Woodrow K , Wood M , Saucier-Sawyer J et al Biodegradable Meshes Printed with Extracellular Matrix Tissue eng Part A 2009; 15(5): 1169-79 .

98 . Yagi H . , Fukumitsu K ., Fukuda K . et al . Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation, a regenerative medicine approach . Cell Transplant . 2013; 22(2): 231-42 .

99 . Uygun B . E ., Soto-Gutierrez A ., Yagi H . et al . Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix . Nat . Med . 2010; 16(7): 814-20 .

100 . Baptista P . M ., Siddiqui M . M ., Lozier G . et al . The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid . Hepatology 2011; 53(2): 604-17 .

101. Shupe T . , Williams M . , Brown A . et al . Method for the decellularization of intact rat liver . Organogenesis 2010; 6(2): 134-6 .

102 . Wang Y ., Cui C . B ., Yamauchi M . et al . Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds . Hepatology 2011; 53(1): 293-305 .

Поступила: 10.01.2015