Способ определения фибриногена и оценка его функциональности
METHOD FOR DETERMINING FIBRINOGEN AND FUNCTIONALITY EVALUATION THEREOF

Фибриноген - это основной гликопротеин плазмы крови, необходимый для свертывания крови. Количество фибриногена, присутствующего в плазме, прямо пропорционально способности крови образовывать тромбы. Фибриноген трансформируется в фибрин в процессе тромбообразования, таким образом, дефицит фибриногена будет выражаться в недостаточном образовании фибрина и нарушении свертывания крови.
Недостаток содержания фибриногена в плазме крови может быть вызван снижением образования фибриногена, вследствие печеночно-клеточной недостаточности или врожденной гипофибриногенемии. Диссеминированная внутрисосудистая коагуляция крови, являющаяся патологическим состоянием, приводит к повышенному потреблению фибриногена, пригодного для использования в процессах нормального тромбообразования. Очевидно, что недостаток фибриногена может привести к кровотечению.
Избыточное содержание фибриногена в крови также представляет патологическое состояние, которое, как правило, связано с воспалительными процессами. Высокое содержание фибриногена в крови может способствовать возникновению гиперкоагуляции, что нежелательно для организма.
Установлено, что увеличение концентрации фибриногена в крови также является фактором риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний. Из вышеуказанного очевидно, что мониторинг содержания фибриногена в крови является информативным тестом для оценки состояния здоровья человека, и может быть полезен как маркер, позволяющий выявлять предтромботическое состояние в организме человека до сосудистых катастроф.
В клинической практике наиболее широко используется определение фибриногена (ФГ) по Клауссу, основанное на исследовании времени образования сгустка при добавлении избыточной концентрации тромбина к разбавленной в 10-20 раз цитратной плазме. Тест выполняется на специальных коагулометрах, при этом логарифм времени образования сгустка обратно пропорционален логарифму концентрации фибриногена [Долгов В.В., Свиридов П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада» 2005: 227 с.].
Основными недостатками метода определения ФГ по Клауссу является чувствительность результатов к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, а также к продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации фибрин-мономеров и могут быть причиной как ложно низких, так и ложно повышенных результатов [Полевода О.А., Галстян Г.М., Берковский А.Л., Сергеева Е.В. Способ определения функционального фибриногена // Патент РФ №2669796],
В настоящее время накоплены многочисленные данные о важной патогенетической роли перекисного окисления липидов, являющегося неотъемлемой составляющей окислительного стресса, в инициации и развитии многих острых и хронических заболеваний. Однако активные кислородные метаболиты (АКМ), наряду с окислительной модификацией липидов, также вызывают окислительную модификацию белков, приводящую к патологическим изменениям их свойств и функций, к фрагментации и агрегации. Учитывая, что окислительная модификация белков играет большую роль в атеросклеротических процессах, окисленный ФГ представляет интерес при изучении патологии сердечно-сосудистой системы. Поскольку повышенный уровень ФГ является диагностически и прогностически значимым маркером не только атеросклероза, но и многих других хронических воспалительных заболеваний, и его окислительная модификация еще более значительно потенцирует нарушения системы гемостаза, сопряженные с эндотелиальной дисфункцией, что в конечном итоге приводит к нарушению агрегации тромбоцитов и эритроцитов и к повышенной секреции цитокинов [Ройтман Е.В., Азизова О.А., Морозов Ю.А., Асейчев А.В. Влияние окисленного фибриногена на свертывающую систему крови // Бюллетень экспер. биологии и медицины, 2004, 138, 5: 467-469.].
Известны также способы определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови [Рагино Ю.И., Баум В.А., Полонская Я.В. Патент РФ №2298189. Опубликовано 27.04.2007. Бюл, №12; Швачко А.Г., Пирязев А.П., Азизова О.А., Сергиенко В.И., Быкова А.А. Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке // Патент РФ №2595806]. Суть обоих методов заключается в предварительном приготовлении фибринового сгустка по Рутбергу, определении его массы. Затем к сгустку добавляют равные объемы физраствора и 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для денатурации и осаждения ФГ. Далее определяют окислительную модификацию фибрина с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ), как описано в работе Дубининой и соавт., 1995 [Дубинина Е.Е., Бурмистров C.O., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии, 1995, 41,1:24-26.].
Недостатком описанных методов является необходимость выделения фибринового сгустка, причем инкубация в течение 10 мин не достаточна для коагуляции окисленного фибриногена. Метод трудно выполним в условиях рутинных исследований.
Известен способ определения функциональности фибриногена, включающий исследование цельной крови с помощью тромбоэластографии (ТЭГ). Гепаринизированную кровь и батроксобин вносят в кювету для ТЭГ, после чего проводят тест, определяют параметр максимальной амплитуды на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена рассчитывают по формуле [Полеводова О.А., Галстян Г.М., Берковский А.Л., Сергеева Е.В. Способ определения функционального фибриногена // Патент РФ №2669796].
Основным недостатком определения функциональности ФГ является использование специального фермента, выделенного из яда гремучей змеи Boothrops atrox, батроксобина, который является нефизиологическим ферментом для человеческого ФГ, а также низкая производительность и высокая себестоимость анализа с использованием специального прибора, тромбоэластографа. Перечисленные недостатки не позволят широко использовать данный метод оценки функциональности фибриногена.
450
450
Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу является способ определения ФГ при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности [Патент РФ №2703541, G01N 33/86, опубл. 21.10.2019 Бюл. №30], заключающийся в рекальцификации плазмы крови хлоридом кальция с последующей регистрацией степени коагуляции на фотометре для иммуноферментного анализа. С целью повышения точности теста используют в качестве активатора фибрин-стабилизирующего фактора полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000. Запускают реакцию в параллельных 2 сериях добавлением 25 мМ раствора хлорида кальция к пробе, содержащей цитратную плазму, ПЭГ-3350 и вероналовый буфер (VBS) с рН 7,4, тщательно перемешивают, измеряют оптическую плотность проб, далее инкубируют в течение 60 мин при 37°С. В первой серии опыта определяют содержание белка в фибриновом сгустке стандартным способом с использованием биуретового реактива, во второй серии опыта определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0 и 60 мин. Расчет содержания фибриногена проводят по формуле: ФГ (г/л) = ΔА × 5,12, где: ΔА - изменение оптической плотности пробы во второй серии, при коагуляции плазмы; 5,12 - коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции плазмы в г/л, представляющий собой отношение белка в фибриновом сгустке к изменению оптической плотности в пробе при коагуляции плазмы. Функциональность фибриногена рассчитывают, как разность между количеством фибриногена, определенным данным способом и по методу Клаусса, вычисляя разницу в % к белку в фибриновом сгустке. Функциональность фибриногена определяют как нарушенную при разнице более 10%.
Недостатком данного метода является использование дополнительного химического реактива (полиэтиленгликоля) для активации фибрин стабилизирующего фактора.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала лабораторных тестов для определения фибриногена и его функциональности, а также удешевление себестоимости путем исключения ПЭГ из теста.
Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении производительности, доступности теста для рутинных исследований, повышении точности за счет полной коагуляции плазменного фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы крови человека в условиях гипоосмолярности.
Технический результат достигается тем, что для повышения производительности определение ФГ анализ проводят в 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшетах и турбидиметрически определяют коагуляцию с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. Высокая точность определения ФГ обеспечивается снижением осмолярности путем добавления дистиллированной воды в пробу, которая усиливает коагуляцию фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы.
Изобретение поясняется фигурами:
Фиг. 1. Корреляционный анализ ФГ по Клауссу и предлагаемому методу. Обозначения: по оси X - фибриноген по Клауссу; по оси Y - фибриноген по разработанному методу
Фиг. 2. Корреляционный анализ ФГ по Клауссу и предлагаемому методу без 3 проб цитратной плазмы влияющих на выбросы из линейного тренда данных по ФГ. Обозначения: по оси X - фибриноген по Клауссу; по оси Y - фибриноген по разработанному методу.
450
450
Способ осуществляют следующим образом: проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1, готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем для запуска контактного пути активации плазменного гемостаза цитратной плазмы в лунки иммунологических планшет с плоским дном добавляют оптимальные концентрации растворов хлорида кальция, равные объемы дистиллированной воды и вероналового буфера (VBS) с рН 7,4. Тщательно перемешивают пробы и измеряют поглощение при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (0 мин - бланк A), далее пробы инкубируют в течение 120 мин при 37°С и измеряют степень коагуляции при 450 нм. (Опыт А). Расчет содержания фибриногена проводят по формуле:
450
ФГ, г/л = ΔА × 4,9
где:
450
450(опыт)
450(бланк)
ΔА - изменение оптической плотности пробы при коагуляции плазмы - (А - А);
4,9 - коэффициент для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции плазмы в г/л.
Определяют дисфункциональность фибриногена как разность между количествами фибриногена, определенными данным способом и по методу Клаусса в %, и при разнице более 5% определяют как нарушенную функциональность фибриногена.
2
Подбор оптимальной осмолярности в тестируемых пробах путем добавления дистиллированной воды для усиления коагуляции фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы. К 50 мкл пулированной цитратной плазмы в лунках 96-ти луночных иммунологических планшет с плоским дном добавляют возрастающие количества дистиллированной воды (от 10 до 100 мкл), объем в опытных пробах доводят буфером VBS до 100 мкл, добавляют 50 мкл 25 мМ CaCl, тщательно перемешивают и инкубируют в течение 60 мин при 37°С и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 450 нм каждые 5 мин, включая 0 минуту (бланк) для определения степени коагуляции плазмы и продолжают в течение 60 мин для оценки завершенности процесса. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, коагуляция плазмы при рекальцификации усиливается при снижении осмолярности в тестируемых пробах при добавлении дистиллированной воды в пробах. Максимальная коагуляция фибриногена наблюдается при разбавлении плазмы в 2 раза (0,075 М NaCl) и достигает 147% по сравнению с контролем пулированной плазмы без разбавления. Снижение осмолярности плазмы не приводит к изменению скорости коагуляции фибриногена (10 мин), а вызывает образование более плотного фибринового сгустка, которая проявляется более высокой мутностью опытных проб при рекальцификации цитратной плазмы. На 60 минуте инкубации от 50 до 90 мкл дистиллированной воды в пробе незначительно повышают плотность фибринового сгустка (примерно на 4%). Поэтому в дальнейших исследованиях добавляли 50 мкл дистиллированной воды к 150 мкл тестовой системы.
Определение фибриногена предлагаемым способом и методом Клаусса
2+
В лунки 96-ти луночные плоскодонных планшет последовательно вносят по 50 мкл цитратной плазмы, буфера VBS, дистиллированной воды (общим объем - 150 мкл) и тщательно перемешивают. Реакцию коагуляции цитратной плазмы запускают добавлением 50 мкл 25 мМ Са. Пробы тщательно перемешивают и инкубируют в течение 0-300 мин. Изменение оптической плотности проб при коагуляции плазмы (образование фибринового сгустка) тестируют турбидиметрически при длине волны 450 нм от 0 и до 300 мин через определенные интервалы времени инкубации. Параллельно в исходных цитратных плазмах определяют фибриноген по Клауссу с использованием коммерческих наборов «Фибриноген» (Hemosil, Италия) на автоматическом гематологическом анализаторе ACL 8/9/1000 System, (Instrum. Lab. Company, США). Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, полная коагуляция плазмы наблюдается при инкубации в течение 120 мин. Дальнейшая инкубация незначительно (на уровне 5%) приводит к возрастанию оптической плотности проб. Для перевода изменений оптической плотности пробы при коагуляции рассчитывали коэффициент (фактор) как отношение содержания ФГ в пробах цитратной крови, определенной по методу Клаусса, к изменению оптической плотности (ΔА450) на 120 минуте инкубации. Среднее значение фактора составило 4,90±0,45. Следовательно, ошибка эксперимента составляет менее 10% от концентрации фибриногена.
2+
Определение фибриногена при рекальцификации плазмы в присутствии ПЭГ-4000 (прототип) и методом Клаусса. В этих же пробах цитратной плазмы определяли ФГ по известному прототипу, т.е. при рекальцификации плазмы в присутствии активатора фибрин-стабилизирующего фактора, ПЭГ-4000. Для этого в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет последовательно вносят по 50 мкл цитратной плазмы, 84 мкл буфера VBS, 16 мкл 10% ПЭГ-4000 и 50 мкл 25 мМ Са. Пробы тщательно перемешивают и инкубируют в течение 0-180 мин. Определяют степень коагуляции плазмы турбидиметрически по изменению мутности в пробах при длине волны 450 нм. Рассчитывают коэффициент для перевода изменений оптической плотности проб в количество ФГ в г/л как отношение содержания ФГ, определенного по методу Клаусса, в пробах цитратной крови к изменению оптической плотности ΔА450 на 120 минуте инкубации. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, полная коагуляция плазмы наблюдается при инкубации в течение 120 мин. Дальнейшая инкубация незначительно увеличивает плотность фибринового сгустка менее 5% за исключением пробы №17. Возможно это связано с гипокоагуляцией, связанной с низкой генерацией тромбина, а не фибрин-стабилизирующего фактора, который активируется ПЭГом. Для перевода изменений оптической плотности плазмы при коагуляции (при рекальцификации) рассчитывали коэффициент как отношение содержания ФГ, определенного по методу Клаусса, в пробах цитратной крови к изменению оптической плотности (ΔА450) на 120 минуте инкубации. Среднее значение фактора составил 4,90±0,41. Таким образом, расчетный переводной коэффициент оказался равным с коэффициентом, который был получен для предлагаемого способа определения фибриногена (см. выше, табл. 2). Учитывая то, что в обоих тестах используется один и тот же принцип детекции коагуляции плазмы при образовании фибринового сгустка, метод турбидиметрии, одинаковое среднее значение переводного коэффициента (пересчет изменений оптической плотности проб при коагуляции в количество ФГ в г/л) подтверждает достоверность обоих тестов при количественном определении фибриногена.
Пример 1. Сравнительные исследования определения ФГ разработанным способом и методом Клаусса для корреляционного анализа и оценки функциональности ФГ.
Проведены сравнительные исследования содержания фибриногена разработанным способом и методом Клаусса в 101 образце цитратной плазмы. Результаты представлены на фиг. 1.
Как видно из графика корреляционного анализа, представленной на фиг. 1, наблюдается заметные выбросы из линейного тренда данных по ФГ только в 3 пробах цитратной плазмы. Если исключить их из расчета (см. фиг. 2), то мы получаем еще более высокое совпадение результатов определения ФГ двумя методами.
Однако, как отмечалось выше, основными недостатками метода определения ФГ по Клауссу является чувствительность результатов к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, а также к продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации фибрин-мономеров и могут быть причиной как ложно низких, так и ложно повышенных результатов. Представленный график корреляционного анализа как раз экспериментально подтверждает данный факт. Как отмечалось выше, с увеличением степени окисления фибриногена снижается скорость превращения его в фибрин под действием тромбина. Данный эффект в методе определения ФГ по Клауссу должен давать заниженный результат, что нами и показано двумя независимыми способами. Полученные данные свидетельствуют о том, что только в одной пробе из исследованных проб (всего 101) метод Клаусса дает заниженный результат (3,9 г/л), в то время как предлагаемый метод - 5,9 г/л. Патофизиологический эффект в данном случае - это предотвращение тромбоза за счет снижения превращения ФГ в фибрин под действием тромбина.
В 5 пробах цитратной плазмы, где метод Клаусса дает завышение ФГ по сравнению с предлагаемым методом, свидетельствует о том, что окисление (минимальное) in vivo ФГ вызывает быстрое превращение ФГ в фибрин под действием тромбина. Данный обнаруженный экспериментальный факт свидетельствует об обратном патофизиологическом эффекте - это гиперкоагуляция и как следствие - тромбоз. Следует отметить, что данные эффекты наблюдаются и при нормальном содержании ФГ, т.е. когда в организме отсутствует воспалительный процесс как причина окислительной модификации ФГ. У данных лиц, возможно, дисфибриногенемия обусловлена генетическими мутациями.
Таким образом, определение ФГ двумя методами (предлагаемым и по Клауссу) расширяют лабораторный арсенал как для количественной оценки уровня ФГ, так и дисфункциональности ФГ (таблица 4).
Как видно из данных, представленных в таблице 4, в 14 пробах (44%) определение ФГ по методу Клаусса дало заниженные значения (колебания от 7% до 22%) ФГ. В 6 пробах получены завышенные результаты по ФГ (19%). Колебания составили от 11 до 23%. Суммарно дисфункциональность ФГ выявлена в 63% тестированных проб цитратной крови. Как было выше отмечено, окислительная модификация ФГ вызывает снижение свертываемости крови за счет того, что окисленный ФГ хуже активируется тромбином. Учитывая возрастной контингент пациентов клиники, можно сделать вывод о компенсаторной реакции гемостаза с возрастом, т.е. организм защищается от тромбоза. В каждой пятой пробе дисфункциональность ФГ обусловлена повышенной чувствительностью окисленного ФГ к действию тромбина. Данный факт может приводить к склонности к тромбозам и требует коррекции гиперкоагуляции для профилактики тромбозов. Причем во всех 6 пробах содержание ФГ по Клауссу не превышает нормальное значение.
Таким образом, исследование дисфункциональности ФГ расширяет диагностическую значимость скрининга ФГ с использованием новых методов в лабораторной практике для ранней профилактики сосудистых катастроф.