Влияние гонадэктомии на морфометрические, биохимические и гистохимические показатели развития коры головного мозга крыс

тов. Аналогичный показатель в больших полушариях головного мозга достоверных различий не выявил (таблица).

При анализе полученных результатов контрольной и подопытной групп, включающих 40-дневное потомство «старых» самок (3 группа), отмечается достоверное увеличение содержания липидов в белом веществе как мозжечка (на 30%), так и больших полушарий головного мозга (на 21%) у крысят из уменьшенных пометов.

Изменения концентрации липидов, выявляемые при окраске cуданом черным В, в мозге крыс экспериментальных групп можно расценивать как свидетельство разных темпов миелинизации нервных волокон, являющейся важным компонентом биохимического созревания мозга [4]. Ни в одной из исследованных нами групп значимого достоверного увеличения толщины коры больших полушарий не обнаружено [2, 5]. Имевшееся при этом увеличение массы головного мозга у подопытных животных (таблица) может быть связано, по крайней мере, частично с опережающими темпами миелинизации нервных волокон — фактически с нарастанием массы миелина, продуцируемого олигодендроцитами (4), обусловленной их более высокой синтетической активностью или/и их большим количеством. Изложенные данные могут, по нашему мнению, представлять интерес при оценке и у человека механизмов различий в темпах роста мозга, «растянутого» в онтогенезе на много лет, а также вариабельности показателя окончательной массы этого органа.

Литература

1. Еременко И.Р., Васильева Е.В., Николаева И.В. и др. Гистохимический анализ содержания липидов в полушариях мозга и мозжечка потомства самок крыс, перенесших длительный эмоциональный стресс в догес-

тационный период // Дальнев. мед. журнал. - 2008. - №4.

- С. 81-82.

2. Литвинцева Е.М., Рыжавский Б.Я., Матвеева Е.П. Морфологические особенности неокортекса и гиппокам-па при экспериментальном увеличении массы мозга у крыс (онтогенетический анализ) // Дальнев. мед. журнал.

- 2010. - №1. - С. 90-94.

3. Пигарева З.Д. Биохимия развивающегося мозга. -М.: Медицина, 1972. - 311 с.

4. Рыжавский Б. Я. Развитие головного мозга: отдаленные последствия некомфортных условий. - Хабаровск: Изд-во ДВГМУ, 2009. - 278 с.

5. Рыжавский Б.Я., Литвинцева Е.М., Колмакова Ю.Б. и др. Особенности развития головного мозга потомства старых самок-крыс в экспериментально уменьшенных пометах // Дальнев. мед. журнал. - 2009. - №4. - С. 101103.

6. Erkelens D.W. Normal and abnormal metabolism of lipoproteins // Curr. Probl. Dermatol. - 1991. - №20. - P. 4553.

7. Quan G., Xie C., Dietschy J.M., Turley S.D. Ontogenesis and regulation of cholesterol metabolism in central nervous system of the mouse // Brain. Res. Dev. - 2003. - Vol. 146.

- №1-2. - P. 87-98.

Координаты для связи с авторами: Еременко Инна Рамазановна — канд. мед. наук, доцент кафедры гистологии ДВГМУ, тел.: 8-(4212)-32-63-93; Васильева Елена Васильевна — канд. мед. наук, доцент кафедры гистологии ДВГМУ, тел.: 8-(4212)-32-63-93; Рыжавский Борис Яковлевич — доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой гистологии ДВГМУ, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru, тел.: 8-(4212)-31-86-68; Литвинцева Екатерина Марковна

- аспирант кафедры гистологии ДВГМУ, тел.: 8-(4212)-32-63-93.

УДК 611.813.1 - 018 (612.621.31 + 612.616.31) - 092.9 : 599.323.4 О.В. Задворная1, О.А. Лебедько2, Р.В. Учакина2, Б.Я. Рыжавский1

ВЛИЯНИЕ ГОНАДЭКТОМИИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РАЗВИТИЯ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

Дальневосточный государственный медицинский университет1, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел.: 8-(4212)-32-63-93, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru; Институт охраны материнства и детства СО РАМН2, 680022, ул. Воронежская, 49, кор. 1, г. Хабаровск

Половые гормоны являются важными регуляторами развития головного мозга. Особенно важна их роль в критические периоды, когда программируется гендерные различия органа [1]. У человека этот период приходится на 2-3 триместры беременности, у крыс — на первую неделю постнатального онтогенеза [6]. В то же время из-

вестно, что отклонения полового развития могут формироваться и в более поздние периоды жизни, проявляясь преждевременным половым созреванием или запаздыванием этого процесса, а также развитием, не соответствующим генетическому полу [2]. Во всех подобных ситуациях обнаруживаются отклонения концентрации половых сте-

роидов [2, 14]. При этом выявляются отклонения высшей нервной деятельности, психики [10, 11], что подтверждает зависимость мозга от данных гормонов, причем в периоды, не относимые к критическим. Это может объясняться влиянием половых гормонов на такие существенные компоненты развития мозга и его функционирования, как процессы миелинизации, апоптоз, свободнорадикальное окисление [12-14]. В то же время, влияние изменений концентрации половых гормонов в препубертатном периоде онтогенеза на морфологические и гистохимические показатели развития мозга, его коры не изучено, что и определило цель настоящей работы — исследовать отсроченное действие дефицита половых стероидов, обусловленного кастрацией, на показатели развития и состояния нейронов коры головного мозга.

Материалы и методы

Исследование проведено на крысах из 6 пометов, которые были разделены на две группы — опытную и контрольную. Экспериментальным животным обоего пола в 30-дневном возрасте под эфирным наркозом была проведена гонадэктомия. Контрольным животным проведена ложная операция. В опытную группу вошли 12 самцов и 11 самок, в контрольную — 11 самцов и 9 самок. Подопытные и контрольные животные каждой из групп содержались одновременно в условиях одного вивария, корм и воду получали ad libittun. В 50-дневном возрасте изучались показатели поведения животных в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ), как описано в [3].

В 60-дневном возрасте производили забой животных декапитацией. На электронных весах определяли массу тела, головного мозга, правого полушария. Из собственно теменной доли (СТД) сразу после декапитации готовили криостатные срезы толщиной 20 мкм, на которых ставили реакции на НАДН- и НАДФН-дегидрогеназы (НАДН-д, НАДФН-д) по [5]. Левое полушарие мозга фиксировали в жидкости Карнуа. Затем его разрезали в переднетемен-ной (ПТД) и собственно теменной (СТД) долях строго перпендикулярно длиннику и верхней поверхности левого полушария, пользуясь схемами Светухиной [9], и заливали в парафин, готовили срезы толщиной 7 мкм, окрашивали их галлоцианином по Эйнарсону [4]. Величину активности НАДН-д и НАДФН-д, концентрацию нуклеиновых кислот (НК) определяли при помощи компьютерной морфометрии на аппарате «Мекос» по оптической плотности продуктов реакции в цитоплазме клеток (при ^=550 нм). В каждом случае исследовалось не менее 25 клеток слоя II и V неокортекса, поля I гиппокампа. Измерение толщины коры головного мозга проводили в трех участках ПТД и СТД при помощи окуляр-микрометра MOB-15 при увеличении объектива х8. Определяли плотность расположения нейронов в 5 стандартных полях зрения слоя II и V неокортекса и поля I гиппокампа при помощи окуляра х10 при увеличении объектива х40. На аппарате «Мекос» также измеряли площадь сечения ядрышек, ядер и цитоплазмы нейронов тех же локализаций.

Свободнорадикальное окисление (СРО) изучали методом хемилюминесценции (ХМЛ). Регистрацию ХМЛ в гомогенатах коры правого полушария головного мозга 24 подопытных и 21 контрольных крыс осуществляли, используя люминесцентный спектрометр LS 5OB «PERKIN

Резюме

Исследован неокортекс и гиппокамп крыс (самцов и самок), которые в 30-дневном возрасте были подвергнуты кастрации (контроль — ложная операция). В 50-дневном возрасте животных тестировали в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ), в 60-дневном — декапити-ровали. Исследовали массу мозга и полушария, толщину неокортекса, плотность расположения в коре нейронов, их размерные характеристики, концентрацию в цитоплазме РНК, активность НАДН- и НАДФН-дегидрогеназ (НАДН-д и НАДФН-д), интенсивность свободнорадикального окисления (СРО). Установлено, что кастрация 30-дневных крысят не отразилась на массе мозга и полушария, толщине неокортекса, и в то же время произошло увеличение численной плотности нейронов у самок в слое II ПТД, у самцов — в слоях II и V СТД. Гонадэктомия привела к увеличению интенсивности процессов СРО в коре головного мозга, снижению исследовательской активности и повышению уровня тревожности животных обоего пола.

Ключевые слова: кора мозга, морфометрия, свободнора-дикальное окисление, кастрация.

O.V. Zadvornaya, O.A. Lebedko, R.V. Uchakina, B.Ya. Ryzhavskii

THE INFLUENCE OF GONADECTOMY ON MORPHOMETRIC, BIOCHEMICAL AND HISTOCHEMICAL INDICATORS OF DEVELOPMENT OF CORTEX OF THE BRAIN IN RATS

Far Eastern State Medical University;

Mother and Child Care Institute of Siberian Branch of Russian Academy for Medical sciences, Khabarovsk

Summary

The neocortex and hippocampus of rats (males and females) the animals that at 30-day age have been subjected to castration (the control is false operation) are investigated. At 50-day age animals were tested in raised cross-shaped labyrinth, in 60-day - decapitated. Investigated mass of the brain and hemisphere, a thickness of a neocortex, locating density in a cortex of neurones, their dimensional characteristics, concentration of RNA in cytoplasm, activity of NADH - and NADPH-dehydrogenase (NADH-d and NADPH-d), intensity of free radical oxygen (FRO). It is established that castration of 30-day infant rats did not influence the mass of the brain and hemisphere, thickness of neocortex, and at the same time there was increased number of neurons in females in layer II of anterior parietal lobus, in males - in layers II and V of parietal lobus. Gonadectomy has led to increased intensity of FRO processes in the cortex of the brain, reduced research activity and increased anxiety in animals of both sexes.

Key words: cortex of brain, morphometry, free radical oxygen, castration.

ЕЬМЕИ», как описано ранее [7]. Иммуноферментным методом в сыворотке крови крыс определяли концентрации эстрадиола и прогестерона (у самок) и тестостерона (у самцов). Статистическую обработку количественных данных проводили с помощью пакета программ 81а11811са 6.0.

Показатели Самцы Самки

опыт

Масса тела, г - 60 дн. 153,8±10

Масса абс., мг: - мозга 1712±20

- правого полушария 607±106

Масса отн., мг - мозга 11,6±0,65

- правого полушария 4,1±0,215

Хемилюминесценция, усл. ед. - Ssp 0,15±0,009

- h 1,144±0,045*

Sind-1 1,47±0,06*

H 2,12±0,13*

Sind-2 4,65±0,23*

Толщина, мкм: ПТД кора 1582±30

- слой I 155±9,25

СТД кора 1161±28

- слой I 137±5,39

Число нейронов в стандартном поле зpeния ПТД: - слой II 18±0,43

- слой V 8,6±0,32

СТД: - слой II 18±0,35*

- слой V 9,3±0,36*

- гиппокамп 23,4±0,38

Число свешиваний 1,7±0,68

- стойки 8,3±1,23

- груминг 3,3±0,72

- принюхивание 4,3±0,6

- движение 12,6±1,49

- выход в открытые рукава 1,6±0,46

- заход в закрытые рукава 2,5±0,45

Исследовательская активность 13,5±2,3

- уровень тревожности 10,8±1,85

Интегральный показатель: - исследовательская активность 24±1

- уровень тревожности 180±40

Примечание. * — различия с контролем статистически достоверны (р<0,05), в скобках — медиана.

Результаты и обсуждение

Гонадэктомированные крысы характеризовались резким снижением концентрации в крови половых стероидов. У самцов уровень тестостерона составлял 0,664±0,17 нмоль/л (контроль — 8,46±2,74 нмоль/л), у подопытных самок концентрация прогестерона равнялась 0,391±0,158 нмоль/л (контроль — 25,9±15,4 нмоль/л). Кастрация животных обоего пола не привела к изменениям массы их мозга и полушария (таблица), что свидетельствует об отсутствии или невысокой степени зависимости темпов роста мозга в исследованном возрастном интервале от половых гормонов и позволяет полагать, что гендерные различия массы мозга [8] обусловливаются различиями массы тела. Толщина коры ПТД и СТД у гонадэктоми-рованных крыс также не имела достоверных отличий от таковых в контроле. В то же время, численная плотность

нейронов у подопытных самок была увеличена в слое II ПТД, у самцов — в слое II и V СТД (таблица). При этом размеры ядрышек, ядер, цитоплазмы нейронов ПТД, СТД и гиппокампа, концентрация РНК в цитоплазме нейронов всех изученных локализаций у животных обоего пола не имели межгруповых различий с контрольными. Активность НАДН-д у гонадэктомированных самцов в нейронах слоя V СТД была выше, чем в контроле (0,513±0,037 против 0,396±0,034 усл. ед.), у кастрированных самок наблюдалось снижение активности НАДФН-д в нейронах гиппокампа (0,479±0,037 против 0,642±0,06 усл. ед.).

Изучение интенсивности СРО (таблица) в ткани коры головного мозга показало ее достоверное увеличение у экспериментальных животных обоего пола, по сравнению с контролем. Как у самок, так и у самцов опытной группы было выявлено статистически значимое увели-

чение интенсивности свободнорадикальных процессов ^р), концентрации гидроперекисей липидов (Ь) и скорости образования перекисных радикалов (8тё-1). При этом достоверно снизились резистентность к перекисно-му окислению (Н), антиоксидантная и антирадикальная защита (8тё-2). В контрольных группах самцов и самок были выявлены достоверные гендерные различия: у самцов 8зр, Ь, 8тё-1 и 8тё-2 выше, чем у самок, в группах подопытных крыс эти различия сохранились.

Таким образом, эффект гонадэктомии проявился увеличением активности СРО у крыс обоего пола. В противоположность обнаруженным ранее разнонаправленным изменениям у самцов и самок введение препарата тестостерона — «Сустанона-250» [3] привело к снижению у самцов и повышению у самок.

Анализ поведения крыс в ПКЛ в 50-дневном возрасте показал однонаправленные изменения медиан значений в подопытных группах самцов и самок, по сравнению с контрольными группами. У самок подопытной группы медиана числа стоек была увеличена более чем в 1,5 раза, по сравнению с контрольной группой (таблица). Медиана числа заходов в закрытые рукава у экспериментальных самцов снизилась в 1,5 раза. Наблюдалось двукратное уменьшение медианы числа выходов в открытые рукава в подопытных группах самцов и самок, по сравнению с контролем. Эти изменения обусловили уменьшение медианы интегрального показателя — исследовательской активности: у самцов в 2 раза, у самок в 3 раза. Параллельно с этим возросла медиана интегрального показателя уровня тревожности в подопытных группах самцов и самок в 1,6 раза и в 2,8 раза соответственно (таблица).

Таким образом, хотя кастрация животных не привела к изменениям массы мозга, толщины неокортекса, размеров нейронов и концентрации РНК, однако она вызвала у самцов увеличение численной плотности нейронов в слое II и V СТД и активности НАДН-д в нейронах слоя V СТД, у самок возрастание численной плотности нейронов в слое II ПТД и снижение активности НАДФН-д в нейронах гиппокампа. Выявленные морфометрические, гисто-и биохимические отклонения показателей развития мозга сочетались с изменениями поведения крыс в ПКЛ.

Литература

1. Бабичев В.Н. Нейроэндокринный эффект половых гормонов // Успехи физиологических наук. - 2005. - Т. 36, №1. - С. 54-67.

2. Жуковский М.А. Детская эндокринология: рук-во для врачей. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1995. - 656 с.

3. Задворная О.В., Лебедько О.А., Рыжавский Б.Я. Влияние введения сустанона-250 самцам и самкам крыс в препубертатном периоде онтогенеза на показатели их

развития и свободнорадикальное окисление в коре головного мозга // Дальнев. мед. журнал. - 2010. - №2. - С. 108-111.

4. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия. - М.: Медицина, 1965. - 400 с.

5. Лойда З., Госсрау Р., Шиблерт Т. Гистохимия ферментов. - М.: МИР, 1982. - 270 с.

6. Резников А.Г. Прогестагены, беременность и здоровье плода // Гинекология. - 2003. - Т.5 №6. - С. 260-262.

7. Рыжавский Б.Я., Лебедько О.А., Белолюбская Д.С. и др. Отдаленные последствия пренатального воздействия свинца на развитие головного мозга // Морфология.

- 2007. - Т. 131, №1. - С. 27-31.

8. Рыжавский Б.Я. Развитие головного мозга: отдаленные последствия влияния некомфортных условий. -3-е изд., доп. - Хабаровск: Изд-во ДВГМУ, 2009. - 278 с.

9. Светухина В.М. Цитоархитектоника новой коры мозга в отряде грызунов (белая крыса) // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1962. - Т.42, №2. - С. 31-45.

10. Kerr I.E., Beck S.G., Handa R.J. Androgens selectively modulate C-fos messenger RNA indaction in the rat hippocampus following novelty // Neuroscience. - 1996.

- Vol. 74, №3. - P. 757-766.

11. Luine V.N., Richards S.T., Wu V.Y. et al. Estradiol enhances learning and memory in a spatial memory task and effects levels of monoaminergic neu-rotransmitters // Horm. Behav. - 1998. - Vol. 34, №2. - P. 149-162.

12. McCarthy M.M., Besmer H.R. Influence of maternal grooming, sex and age on Fos immunoreactivity in the preoptic area of neonatal rats: implications for sex-uali differentation // Dev. Neurosci. - 1997. - Vol. 19, №6. - P. 557-560.

13. Perrin J. S. Growth of white matter in the adolescent brain: role of testosterone and androgen receptor // Neurosci.

- 2008. - Vol. 28, №38. - P. 9519-9524.

14. Tunez L., Collado J.A., Medina F.J. et al. 17-beta estradiol may effect vulnerability of striatum in a 3-nitropropionic acid induced experimental model of Huntingtons disease in ovariectomized rats // Neurochem Int.

- 2006. - Vol. 45, №5. - P. 367-373.

Координаты для связи с авторами: Задворная Ольга Викторовна — аспирант кафедры гистологии, цитологии, клеточной биологии ДВГМУ, e-mail: nauka@maiI. fesmu.ru, тел./факс: 8-(4212)-32-63-93; Лебедько Ольга Антоновна — доктор мед. наук, зав. клинико-диагностической лабораторией НИИ охраны материнства и детства ДНЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН, e-mail: iоmоd@yandex.ru, тел.: 8-(4212)-98-05-91; Учаки-на Раиса Владимировна — доктор биол. наук, профессор, гл. науч. сотрудник НИИ охраны материнства и детства СО РАМН; Рыжавский Борис Яковлевич — доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой гистологии ДВГМУ, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru, тел./факс: 8-(4212)-32-63-93.