Выявление гена nifH у ассоциативных микроорганизмов яблонной тли (Aphis pomi deg. , 1773)

CIRCULATION OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI IN THE SYSTEM APPLE SHOOT - APHIDS - ANTS

A. M. Peterson, H. Mohamed, I. G. Litovchenko

Saratov State University

The role of apple aphids (Aphis pomi De Geer, 1773) and black garden ants (Lasius niger L., 1758), trophic association with the colonies of these insects, in the preservation and distribution of phytopathogenic fungi, affecting apple shoots was studied. Its shown, that the organism of apple aphids may serve as a reservoir of phytopathogenic fungi as Alternaria alternata, Fusarium incarnatum equiseti species complex and Aspergillus niger. Only one phytopathogenic species Aspergillus niger from the internal environment of ants was isolated.

Key words: phytopathogenic fungi, apple shoot, aphids, ants.

УДК 579.258

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНА NIFH У АССОЦИАТИВНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ЯБЛОННОЙ ТЛИ

Р. А. Верховский, А. А. Абалымов, Н. О. Макаров, Е. В. Глинская

Саратовский государственный университет

В результате микробиологических исследований из особей яблонной тли было выделено 2 рода бактерий - Bacillus и Pseudomonas. Способностью к росту на безазотистой среде и фиксации молекулярного азота обладали 82% бацилл: B. bataviensis, B. clausii, B. halodurans, B. horikoshii, B. lentus, B. nealsonii, B. niacini, B. oleronius, B. pumilus. Методом ПЦР анализа наличие гена nifH подтвердилось у бактерий B. clausii, B. oleronius, B. lentus и B. pumilus.

Ключевые слова: ген nifH, яблонная тля, ассоциативные микроорганизмы.

Интерес к изучению генов, кодирующих нитрогеназный ферментативный комплекс, вызван перспективами использования данных биокатализаторов в ряде отраслей биотехнологии. Микроорганизмы, имеющие нитрогена-зу и способные к фиксации молекулярного азота, находят широкое применение в производстве микробных удобрений для сельского хозяйства (Souza et al., 2014).

Целью работы являлось выявление гена nifH у ассоциативных микроорганизмов яблонной тли (Aphispomi Deg., 1773).

Объектом исследования являлись бескрылые особи зеленой яблонной тли, собранные в весенне-летний период с деревьев яблони домашней (Malus domestica Borkh., 1803) на дачных участках Саратовской области. Дано современное систематическое положение насекомых (Blackman, Eastop, 2006). В ходе исследования было изучено 1600 особей тли.

76

Выделение микроорганизмов из насекомых проводили стандартными методами (Глинская и др., 2015; Глинская и др., 2016). Первоначальную идентификацию выделенных ассоциантов осуществляли по фенотипическим признакам (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, 2005, 2007). Видовую принадлежность штаммов подтверждали секвенированием 16S рРНК в сервисной лаборатории «Синтол» (г. Москва).

Изучение способности изолятов к фиксации молекулярного азота проводили на безазотистой среде Эшби следующего состава (г/л): маннит - 20.0, К2НРО4 - 0.2, MgSO4 - 0.2, NaCl - 0.2, K2SO4 - 0.1, CaCOs - 5.0, агар - 20.0, pH 7.1- 7.3 (Меджидов, 2003).

Для штаммов, способных к росту на среде Эшби, определяли наличие гена nifH методом ПЦР-анализа. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора «Diatom™ DNA Prep 100» («ИЗОГЕН»).

На следующем этапе была проведена поисковая работа по выявлению последовательностей нуклеотидов искомого гена в генетической базе данных GenBank. Полученные данные легли в основу построения высокоспеце-фичных праймеров (рис. 1).

j Ггс41

ж

itjrt Stop Irfijth Prud-tt Prod-In In Hf dpi Fn SttS-Tn ftSfl-T* ifli-Ct ftifl-Ct S-3HdG A-i'dt

\tk m.; ri.t

Ш

MKS VJ

СССйПЯ1£ЁйССйССйС1С 10 32.3 1M.J tit.f ТШМСШШШСТСТС 1-V -ЗЙ.4 t4t. 1

ii.i Sfl.y

.! M.ii tf.1 К1Л MJ..1 HJ

icsciAicceicAhisic it -if.ii ш.к -jm.j йпмктитшинм if tar.s * 1 V fu ЙГ ЦЖ 1Щ fH ЩТЛ so si7t Ш T.V

CCIflimiCftfiliilKC If -II,J -1JB.1 -isvi. ШМТЬТССГШНШ: It -29.1 -MM -ЭИ.1

Рис. 1. Нуклеотидные последовательности праймера к гену nifH.

Конструирование праймеров осуществлялась совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной биологии Саратовского национального исследовательского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского, синтез праймеров - в сервисной лаборатории «Синтол» (г. Москва). Постановка полимеразной цепной реакции проводилась с помощью набора «GenePakDNAPCRtest фирмы» («ИЗОГЕН»).

В результате микробиологических исследований из особей яблонной тли было выделено 2 рода бактерий - Bacillus и Pseudomonas. Интерес для дальнейшей работы представляли спорообразующие бактерии рода Bacillus, которые имели высокие индексы встречаемости (до 80%) и количественные показатели (до 105 КОЕ в пробе). Способностью к росту на безазотистой среде Эшби и фиксации молекулярного азота обладали 82% бацилл: B. bataviensis, B. clausii, B. halodurans, B. horikoshii, B. lentus, B. nealsonii, B. niacini, B. oleronius, B. pumilus (Глинская и др., 2015).

Постановка ПЦР проводилась для B. soli, B. lentus, B. oleronius, B. clausii, B. pumilus, B. sp. (положительный контроль) (рис. 2).

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что ген т/И является консервативным. На дорожках 2, 3 (рис. 2А) и дорожках 1, 2 (рис. 2Б) хорошо визуализируются продукты полимеразной цепной реакции, размер которых составляет 850 п.н., что соответствует размеру искомого гена т/И (842 п.н.).

А

Б

Рис. 2. Результаты электрофореза продуктов ПЦР. А: 1 - B. soli, 2 - B. lentus, 3 - B. oleronius, 4 - B. sp., 5 - маркер молекулярного веса. Б: 1 - B. clausii, 2 - B. pumilus, К+ - B. sp., М - маркер молекулярного веса

Небольшое отклонение от контроля наблюдается у B. lentus, что, вероятно, можно объяснить высокой концентрацией продукта ПЦР, либо модификацией (удлинением) гена nifH у данного вида. Для бактерий B. soli ген nifH выявлен не был.

Таким образом, в ходе проведенных исследований установлена способность к фиксации молекулярного азота (рост на среде Эшби) у спорооб-разующих бактерий - ассоциантов яблонной тли: B. bataviensis, B. clausii, B. halodurans, B. horikoshii, B. lentus, B. nealsonii, B. niacini, B. oleronius, B. pumilus. Методом ПЦР анализа наличие гена nifH подтвердилось у бактерий B. clausii, B. oleronius, B. lentus и B. pumilus. Дальнейшее изучение ферментов нитрогеназного комплекса, а также кодирующих их генов позволит создать новые микробиологические препараты для улучшения азотного питания растений и повышения их урожайности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Глинская Е. В., Аникин В. В., Верховский Р. А., Абалымов А. А. Биологические свойства бактерий - ассоциантов яблонной тли (Aphis pomi Deg., 1773) // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Серия: Химия. Биология. Экология. 2015. Т. 15. № 3. С. 48-51.

Глинская Е. В., Верховский Р. А., Макаров Н. О., Абалымов А. А. Поиск целлюлоли-тических ферментов у ассоциативных микроорганизмов тли // Тр. Ставр. отделения Рус.

энтомол. о-ва. Мат. VIII Межд. науч.-практ. интернет-конф. «Актуальные вопросы энтомологии». Ставрополь, 2016. Вып. 12. С. 85-86.

Меджидов М. М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М.: Медицина, 2003. 208 с.

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. London, New York: Springer. 2001. Vol. 3. 1450 p.

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. London, New York: Springer. 2005. Vol. 2. 1106 p.

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. London, New York: Springer. 2007. Vol. 2. 1136 p.

Blackman R. L., Eastop V. F. Aphids on the World's Herbaceous Plants and Shrubs. CAB International, Wallingford. 2006. 987 p.

Souza E. M., Chubatsu L. S., Huergo L. F, Monteiro R., Camilios-Neto D., Wassem R., Pedrosa F. O. Use of nitrogen-fixing bacteria to improve agricultural productivity // BMC Proc. 2014. Vol. 8 (Suppl 4): O23.

DETECTION OF GENE NIFH IN ASSOCIATIVE MICROORGANISMS

OF APHIS POMI

R. A. Verchovsky, A. A. Abalymov, N. O. Makarov, E. V. Glinskay

Saratov State University

As a result of microbiological studies of apple aphid has been allocated two genes of bacteria - Bacillus and Pseudomonas. The ability to grow in nitrogen-free medium and fixation of molecular nitrogen had 82% Bacillus: B. bataviensis, B. clausii, B. halodurans, B. horikoshii, B. lentus, B. nealsonii, B. niacini, B. oleronius, B. pumilus. PCR method confirmed the presence of nifH gene in bacteria B. clausii, B. oleronius, B. lentus and B. pumilus.

Key words: gene nifH, Aphispomi, associative microorganisms.