СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOIDS IN VEGETABLE RAW MATERIAL BY FLUORIMETRIC METHOD

Изобретение относится к фармации, а именно к фармацевтической химии, и может быть использовано для количественного определения фармакологически активных веществ - флавоноидов в лекарственном растительном сырье.
Известен способ количественного определения флавоноидов методом гравиметрии, спектрофотометрии, фотоколориметрии (Природные флавоноиды / Д.Ю.Корулькин [и др.]. - Новосибирск: Академическое изд-во 'Тео, 2007. - 232 с.); полифенольных соединений фотометрическим методом (SU 1215708, A61K 35/78, 1986); рутина путем применения реакции с диазотированным сульфаниламидом, сопровождающейся возникновением оранжевой окраски (SU 139473, 1961).
Прототипом разрабатываемого метода является способ определения рибофлавина флуориметрическим методом (ФС 42 7024-02 от 21.03.2002 «Рибофлавин»).
Он заключается в приготовлении испытуемого раствора путем растворения рибофлавина в водном растворе уксусной кислоты. Аналогичным образом приготовляется раствор стандартного образца рибофлавина. Измеряют интенсивность флуоресценции стандартного раствора при 530 нм (длина волны возбуждения около 444 нм). После измерения добавляют в раствор натрия гидросульфит и измеряют интенсивность флуоресценции. Разность между двумя показаниями прибора равна интенсивности флуоресценции стандартного образца.
Аналогичным образом измеряют интенсивность флуоресценции испытуемого образца. Содержание рибофлавина в субстанции (%) рассчитывают по формуле.
Используемая ранее спектрофотометрическая методика позволяет получить информацию о количественном содержании в растительном сырье суммы флавоноидов в пересчете на стандарт индивидуального вещества, что является достаточно условным, разработанная методика отличается высокой специфичностью и позволяет определить содержание индивидуальных флавоноидов (рутин, кверцетин) в различных видах лекарственного растительного сырья.
Задача изобретения - разработка нового, специфичного и высокочувствительного метода для контроля качества лекарственного растительного сырья по количественному содержанию действующих веществ - флавоноидов.
Техническим результатом изобретения является возможность определения содержания индивидуальных флавоноидов (рутин, кверцетин) в различных видах лекарственного сырья без их предварительного разделения.
Способ количественного определения флавоноидов в растительном сырье включает исчерпывающую экстракцию растительного сырья спиртом этиловым, оптимальной для каждого вида сырья концентрации, получение спиртового извлечения, содержащего флавоноиды, добавлением к извлечению спиртового раствора алюминия хлорида, согласно изобретению проводят флуориметрирование полученного раствора при длинах волн по возбуждению и длинах волн по регистрации, которые индивидуальны для каждого конкретного соединения флавоноидной природы, относительно спиртового раствора алюминия хлорида в сравнении со стандартными растворами индивидуальных флавоноидов, обработанных в тех же условиях, что и извлечение из сырья.
Предлагаемый метод, в отличие от имеющихся, позволяет получить информацию о количественном содержании в растительном сырье не суммы флавоноидов в пересчете на стандарт индивидуального вещества, что является достаточно условным, а определить содержание индивидуального флавоноида (рутин, кверцетин), в индивидуальных спектральных максимумах каждого из которых проводится определение.
Пример 1. Определение рутина в траве зверобоя продырявленного
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 50% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее извлечение фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали в фильтрат. Вату помещают в колбу для экстрагирования и прибавляют 30 мл 50% спирта. Экстракцию повторяют еще дважды в описанных выше условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводят 50% спиртом до метки и перемешивают (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25,0 мл помещают 1,0 мл раствора А, 1,0 мл раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 40 мин проводят измерения на флуориметре при длине волны по возбуждению 426 нм, по регистрации 512 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Фоновым раствором выступает раствор, состоящий из 1,0 мл спиртового раствора алюминия хлорида, доведенного до 25,0 мл спиртом этиловым 95%.
В качестве стандартного раствора используют раствор, состоящий из 1,0 мл стандартного раствора рутина, 1 капли разведенной уксусной кислоты, 1 мл 2% раствора алюминия хлорида, доведенного 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Данные о содержание рутина в исследуемом объекте в концентрационных единицах считываются с дисплея прибора.
Пример 2. Определение рутина в траве синюхи голубой
Аналитическую пробу сырья (около 1,0 г), измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в колбу со шлифом на 150 мл и дважды порциями по 25 мл экстрагируют 70% спиртом этиловым на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение двух часов. Извлечения фильтруют в колбу на 100 мл через складчатый фильтр и доводят спиртом этиловым 70% до метки.
Отбирают 1,0 мл фильтрата, помещают в мерную колбу на 25,0 мл, добавляют 1,0 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом, доводят 95% спиртом этиловым до метки и флуориметрируют через 40 мин при длине волны по возбуждению 426 нм, по регистрации 512 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Фоновым раствором выступает раствор, состоящий из 1,0 мл спиртового раствора алюминия хлорида, доведенного в колбе на 25,0 мл спиртом этиловым 95% до метки.
В качестве стандартного раствора используют раствор, состоящий из 1,0 мл стандартного раствора рутина, 1 мл 2% раствора алюминия хлорида, доведенного 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Данные о содержании рутина в исследуемом объекте в концентрационных единицах считываются с дисплея прибора.
Примечание. Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина: около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.
Пример 3. Определение кверцетина в траве горца перечного
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 90% спирта, содержащего 1% концентрированной хлористоводородной кислоты, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют еще раз указанным выше способом, затем еще 1 раз 90% спиртом в течение 30 мин. Извлечения фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу, промывают фильтр 90% спиртом и доводят объем фильтрата 90% спиртом до метки (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 2 мл раствора А, прибавляют 2 мл 1% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 20 мин проводят измерения на флуориметре при длине волны по возбуждению 460 нм, по регистрации 495 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Фоновым раствором выступает раствор, состоящий из 1,0 мл спиртового раствора алюминия хлорида, доведенного до 25,0 мл спиртом этиловым 95%. В качестве стандартного раствора используют раствор, состоящий из 1,0 мл стандартного раствора кверцетина, 2 мл 1% раствора алюминия хлорида, доведенного 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Данные о содержание кверцетина в исследуемом объекте в концентрационных единицах считываются с дисплея прибора.
Примечание. Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) кверцетина: около 0,05 г (точная навеска) ГСО кверцетина, предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.
В таблице приведены результаты определения флавоноидов предлагаемым способом в различном растительном сырье.
Предлагаемый способ позволяет получить информацию о количественном содержании в растительном сырье не суммы флавоноидов в пересчете на стандарт, а определить содержание индивидуального флавоноида (рутин, кверцетин), в специфичных максимумах определения каждого из которых проводится определение.
Таблица
Растительный объект
Содержание флавоноидов, %
Трава зверобоя продырявленного
0,14
Рутин
Трава синюхи голубой
0,039
Рутин
Трава горца перечного
0,0045
Кверцетин