Использование моноклональных антител в судебно-медицинской экспертизе при исследовании волос

Характеристика патологических процессов в печени по данным ГУЗ «БСМЭ» УР за 1999, 2005-2009 гг.

Год Патологические процессы Число выявленных заболеваний печени к числу исследований

Жировая дистрофия печени Алко- гольный гепатит Вирус- ный гепатит Вто- ричный гепатит Цирроз печени Всего

1999 741 435 506 505 85 2272 47 %

2005 1346 800 926 932 204 4208 61 %

2006 1507 868 1005 1034 154 4568 70 %

2007 1320 760 880 902 4 О 4002 69 %

2008 1685 970 1097 1106 249 5107 84 %

2009 1780 950 1103 899 280 4848 92 %

Таблица 1 экспертиз (скоропостижная смерть, травматические повреждения, отравления, асфиксии, действие крайних температур, и др., том числе при летальных исходах на госпитальном этапе) в Удмуртской республике составил 76,2%. За этот период проведено 35619 судебно-гистологических исследований и экспертиз.

Распределение материала осуществлялось с учетом этиологических факторов, патологоанатомической классификации и МКБ-10 (1995). В ряде случаев имело место сочетание различных патологических процессов в ткани печени. Реализация поставленной цели отражена в представленной таблице №1 и на графике (рис.1).

Статистический анализ, проведенный по результатам судебно-гистологических исследований и экспертиз, свидетельствует о значительном увеличении встречаемости патологических процессов в печени при различных видах смерти. Особого внимания заслуживают показатели числа заболеваний вирусным гепатитом, алкогольной жировой дистрофией печени, что характеризует не только общемедицинские, но и социальные аспекты жизни населения. Кроме того, по отдельным годам отмечается тенденция незначительного роста заболеваемости вторичным гепатитом (неспецифическим межуточным гепатитом), который встречается в основном у лиц, умерших в стационарах от тяжелых черепно-мозговых травм и ожоговой болезни и расценивается как проявление септического состояния.

Таким образом, в Удмуртской республике на судебно-медицинском материале отмечается тенденция значительного роста числа заболеваний печени при летальных исходах от различных нозологических причин. В связи с чем, сотрудникам подразделений бюро судебно-медицинской экспертизы необходимо учитывать их как фактор, отягощающий в большинстве случаев течение основного заболевания и увеличивающий возможность потенциаль-

ного инфицирования исследователей.

Рис. 1. Динамика заболеваний печени

смерти, так и сопутствующей нозологической патологии при различных видах насильственной и ненасильственной смерти. В основу нашей работы положен анализ актов судебно-гистологических исследований соответствующего отделения бюро судебно-медицинской экспертизы Удмурткой республики.

Процент охвата микроскопическим исследованием общего числа судебно-медицинских исследований и

Литература:

1. Витер В.И., Пермяков A.B. Судебно-медицинские аспекты скоропостижной смерти. - Ижевск, 1999. - С. 119.

2. Осьминкин В.А., Кошкин Д.Ю., Крахмалева М.В. Осьминкин С.В. Судебно-медицинские исследования и их медикосоциальное значение //Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской службы РФ, материалы 5 Всероссийского съезда судебныхмедиков. -Москва-Астраханъ, 2000. - С. 45-46.

3. Осьминкин В.А., Кузнецова A.B., Белоголовкина Е.О., Кошкин Д.Ю. Медикосоциальное значение судебно-медицинских исследова-

ний // Перспективыразвития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики, материалы 6 Всероссийского съезда судебных медиков, посвященного 30-летию Всероссийского общества судебных медиков. - Москва - Тюмень, 2005. - С. 213.

4. Пермяков A.B. Скоропостижная смерть от заболеваний печени // Актуальные аспекты судебной медицины. - Ижевск, 1993.

-Вып.З. - С. 41-44.

5. Пермяков А.В.,Давыдова Л.А., Касимова Э.Х. Динамика скоропостижной и не скоропостижной смерти в периодрыночной эко-

номики//Актуальные аспекты судебноймедицины. - Ижевск, 1999. -Вып.5. - С. 33-39.

© О.Л. Горбунова, Л.Г. Зорина, 2010 УДК 340.6

О.Л. Горбунова, Л.Г. Зорина ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ВОЛОС

ГУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» УР

На материале, отобранном с пяти частей головы лиц с заведомо известными группами крови и категориями выделительства, а также волос с их одежды, изучены особенности использования моноклональных антител в су-дебно- медицинской экспертизе при исследовании волос. Изучены луковицы волос с сохранившимися влагалищными оболочками и средняя их часть. Отмечена высокая эффективность данной методики при исследовании волос с луковицами, ее быстрота и незаменимость при исследовании единичных волос с целью сохранения материала. Ключевые слова: волосы, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ, антигены, цоликлоны.

USAGE OF MONOCLONAL ANTIBODIES IN FORENSIC INVESTIGATION OF HAIR O.L. Gorbunova, L.G. Zorina

Features of monoclonal antibody usage in the practice of forensic medicine investigations of men egesta traces on the material evidence were studied. The traces of saliva, sperm, vaginal egesta of different sizes and concentration were investigated. The high effectiveness of this method was marked. This method usage is indispensable during pressing examination devoted with men egesta traces.

Key words: monoclonal antibody, immunofermental the analysis, antigenes, coliclon.

Одной из задач судебно-биологической экспертизы является определение групповой принадлежности объектов биологического происхождения. К объектам биологического происхождения, в том числе относятся и волосы. Исследование волос наиболее трудоемкая экспертиза, тем более что при исследовании единичных волос выводы (особенно без определения групповой принадлежности) зачастую являются не категоричными.

Волосы являются эпидермическими роговыми образованиями, состоящими из корневой части, укрепленной в коже под углом и стволовой части (стержня), имеющей форму веретена.

Корень волоса заканчивается утолщением (волосяная луковица), а периферический конец - верхушкой. Луковица жизнеспособного волоса имеет на конце вдав-ление, занятое сосочком кожи и имеет два эпителиальных влагалища: внутреннее и наружное. Волос с оболочками расположен в волосяной сумке, в которую впадает проток сальной железы.

Исследуемые волосы, не всегда предоставляются в достаточном количестве, а с получением высокоактивных изогемагглютинирующих сывороток возникают определённые трудности. Все это значительно затрудняет определение групповой принадлежности волос, при этом возникает опасность уничтожения в ходе исследования единичных улик.

В связи с выше изложенным мы попытались определить групповую принадлежность волос с помощью моноклональных антител (МКА), учитывая их более высокую специфичность и биологическую активность, а также то, что для данного вида исследования требуется значительно меньшее количество материала, чем для РАЭ (методические рекомендации Института криминалистики УНТО ФСБ России). МКА используются в работе сотрудниками Института криминалистики УНТО ФСБ России и в лаборатории физиологии кроветворения ГУ Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук.

В нашей лаборатории накоплен некоторый опыт по применению МКА для определения групповых АВН-анти-генов системы АВО и антигенов системы Льюис в волосах методом иммуноферментного анализа. В работе нами были использованы МКА анти-А - А27, анти-В - В8, анти-Н - Н8, полученные из предприятия (ООО) «Гематолог».

Отбор и подготовка материала

Для исследования использовали корневые отделы волос с луковицами и хорошо сохранившимися влагалищными оболочками, а также центральные части этих же волос с волосистой части головы лиц с заведомой группой крови. По возможности отбирали волосы с различной морфологической картиной. Учитывая то, что на одном предмете при производстве экспертиз возможно присутствие волос разных лиц, перед определением групповой принадлежности необходимо тщательное морфологическое сравнение.

Проводили исследование в четырех группах волос:

1). Корневые концы волос сохранившимися влагалищными оболочками и обработанные смесью этанола и диэтилового эфиром (1:1),

2). Корневые концы волос сохранившимися влагалищными оболочками и не обработанные смесью этанола и диэтиловым эфиром,

3). Волосы без луковиц и обработанные смесью этанола и диэтилового эфиром,

4). Волосы без луковиц и не обработанные смесью этанола и диэтилового эфиром.

Частицы волос измельченные до 1-2 мм (5-10 шт.) помещали в пластиковые пробирки (1,5 мл) с этанол-эфирной смесью, выдерживали 30 мин и центрифугировали при 1000 об/мин для осаждения частиц на дно. Затем удаляли этанол-эфирную смесь и в пробирки заливали этанол. Частицы волос осаждали центрифугированием. Этанол удаляли почти полностью. Оставшиеся 50-75 мкл этанола, содержащие частицы волос, пипетировали и переносили на предметные стекла, желательно с ограничительными кольцами или на стекла с лунками для предотвращения растекания материала. Этанол высушивали. Частицы волос использовали в дальнейших исследованиях.

Методика исследования.

РАЭ волос

Определение групповой принадлежности волос проводили с помощью РАЭ на стекле. Для проведения исследования отмытые пробы с частицами волос переносили на предварительно обезжиренные стекла (по 1-2 частицы волоса для каждого реагента) и растирали под стереомикроскопом при помощи пробирки до возможно более однородного состояния. Препараты фиксировали этанолом 20 минут. Выявление антигенов системы АВО проводили реакцией абсорбции-элюции с вышеуказанными моноклональными антителами. Абсорбцию антител проводили в течение 2 часов при +4°С во влажных камерах. По окончанию абсорбции, не связавшиеся антитела удаляли промыванием препаратов осажденным изотоническим раствором хлорида натрия 2 раза по 10 минут. После этого препараты споласкивали холодной водой и подсушивали. Элюцию связавшихся антител проводили 0,1% взвесью соответствующих тест-эритроцитов при +48°С в течение 30 минут. Экспозиция при комнатной температуре 1 час. Учет результатов микроскопический.

Иммуноферментный анализ

Принцип метода заключается в одно- или двухстадийном выявлении антигена в образце, нанесенном на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ), способную связывать белки и некоторые другие высокомолекулярные соединения. Детекция антигена проводится с помощью антител, меченных пероксидазой хрена.

Материалы:

1. Боратный буфер (рН 9,0).

2. Нитроцеллюлозная мембрана (НЦМ), размер пор по 45 мкм.

3. Моноклональные антитела (МКА) анти-А, анти-В, анти-Н, анти^е-а, анти- Lе-в, меченые пероксидазой хрена.

4. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

5. ФСБ с 0,3% твином-20.

6. Субстратный раствор (0,25% раствор перикиси водорода в ФСБ с 0,5 мг(мл 4-хлор-1-нафтола).

7. Смесь спирта с диэтиловым эфиром (1:1).

Частицы волос

После предварительной подготовки материала (с помощью этанол-эфирной смеси) 1-2 частицы волоса и параллельно корневой конец волоса с сохранившейся луковицей измельчали, помещали в пробирки и заливали небольшим избытком дистиллированной воды. После экстракции при 4°С от нескольких часов (для свежих образцов) до суток, экстракт центрифугировали. Надо-садочную жидкость разводили 1:1 боратным буфером и наносили по 2 мкл на 5 полосок НМЦ. Каждую полоску инкубировали в растворе МКА анти-А, анти-В, анти-Н, анти^е-а, анти^е-в, меченных пероксидазой хрена, в течение 30 минут при комнатной температуре на ротационном шейкере. После инкубации полоски НЦМ отмывали 2 раза по 10 минут в ФСБ с 0,3%-ым ТШЕЕ^20 и 2 минуты в ФСБ. Пероксидазную активность выявляли в субстратном растворе в течение 30 минут. В зонах локализации ферментативной активности образуется нерастворимый темно-синий осадок. Проявленные, отмытые в дистиллированной воде и высушенные НЦМ могут храниться в течение длительного времени.

Образцы слюны и потожировых выделений

Для подготовки материала кусочки марли с образцами слюны и потожировых выделений измельчали, помещали в пробирки и заливали небольшим избытком дистиллированной воды. После экстракции при +4°С от нескольких часов удаляли предмет-носитель, экстракт центрифугировали. Надосадочную жидкость разводили 1:1 боратным буфером и наносили по 2 мкл на 5 полосок НМЦ. Каждую полоску инкубировали в растворе МКА анти-А, анти-В, анти-Н, анти^е-а, анти^е-в, меченными пероксидазой хрена, в течение 30 минут при комнатной температуре на ротационном шейкере. После инкубации полоски НМЦ отмывали 2 раза по 10 минут в ФСБ с

0,3%-ым ТШЕЕ^20 и 2 минуты в ФСБ. Пероксидазную активность выявляли в субстратном растворе в течение 30 минут. В зонах локализации ферментативной активности образуется нерастворимый темно-синий осадок. Проявленные, отмытые в дистиллированной воде и высушенные НЦМ могут храниться в течение длительного времени.

Данная методика, на наш взгляд, незаменима в тех случаях, когда волосы, представленные для исследования, являются единичными, и установление групповой принадлежности волоса в РАЭ приводит к тому, что последний расходуется в ходе исследования.

Выводы:

1). Предложенная методика удобна и проста в производстве, намного более чувствительна, чем РАЭ и может оказаться самой необходимой при производстве срочных экспертиз, так как ответ можно дать в течение нескольких дней.

2). Единичные волосы на вещественных доказательствах в некоторых экспертизах могут оказаться единственной уликой, а определение групповой принадлежности волос в РАЭ не всегда удается и может привести к уничтожению волоса.

3). В нашем случае получена существенная разница между волосами, не обработанными и обработанными эфирно-этиловой смесью, что связано с сохранением на необработанных волосах потожировых выделений.

4). Получен положительный результат с одним жизнеспособным волосом, у которого имелась луковица с хорошо сохранившимся корневым влагалищем, имеющим эпителиальные оболочки. При этом основная часть волоса сохранилась для дальнейшего исследования.

5). В волосах без луковиц, обработанных и не обработанных эфирно-этиловой смесью, результат получен не убедительный.