СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПИРТА В КОНТЕКСТЕ БИОРАФИНИРОВАНИЯ
METHOD FOR OBTAINING ALCOHOL IN BIOREFINING CONTEXT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение вписывается в рамки получения биотоплива. Более точно, оно относится к получению ферментов, разлагающих целлюлозу и/или гемицеллюлозу, при производстве спирта из целлюлозных или лигноцеллюлозных материалов (биотопливо второго поколения).
Современная логика экономики и логистики усматривается в том, чтобы производство биотоплива второго поколения осуществлялось на том же месте, что и производство топлива первого поколения, составляя вместе "биорафинадное производство", где повышается степень использования всего растения. Так, исходя из сахароносного растения, стараются более полно использовать сахарный тростник и лигноцеллюлозные остатки тростника.
Анализ предшествующего уровня
Начиная с 1970-тых, превращение лигноцеллюлозной биомассы в этанол посредством гидролиза основных полисахаридов в способные к брожению сахара стало объектом многих работ.
Лигноцеллюлозные остатки состоят в основном из примерно 40-50% целлюлозы, 20-25% гемицеллюлозы и 15-25% лигнина.
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces
Pichia
Candida
Pachysolen
Zymomonas
Klebsiella
Escherichia
Из этих трех полимеров: целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина, основным источником сахаров, способных к брожению в этанол, является целлюлоза, так как она состоит из глюкозы, а эта последняя легко ферментируется в этанол посредством  в испытанных высокопроизводительных промышленных процессах. Пентозы, содержащиеся в гемицеллюлозе, не превращаются с эффективностью в этанол. Чтобы можно было использовать мономерные сахара, полученные из биомассы, для получения этанола, можно использовать другие микроорганизмы рода , , , , , , .
Процесс превращения лигноцеллюлозных материалов в спирт содержит этап предварительной физико-химической обработки с последующим этапом ферментативного или химического гидролиза, этапом спиртовой ферментации высвобожденных сахаров и этапом извлечения спирта.
Целью этапа предварительной обработки является высвободить сахара, содержащиеся в гемицеллюлозах в виде мономеров, в основном пентозы, как ксилоза и арабиноза, и гексозы, как галактоза, манноза и глюкоза, и улучшить доступность целлюлозы, заключенной в матрицу лигнина и гемицеллюлозы. Существует несколько технологий: кислотная варка, щелочная варка, паровой взрыв, органосольвентный способ и т.д. Эффективность предварительной обработки измеряется степенью извлечения гемицеллюлозы и чувствительностью к гидролизу целлюлозных остатков. Лучше всего подходят предварительная кислотная обработка в мягких условиях и паровой взрыв. Они позволяют извлечь все пентозы и обеспечить хорошую доступность целлюлозы для гидролиза.
Trichoderma
Aspergillus
Penicillium
Schizophyllum
Clostridium
Целлюлозные остатки гидролизуют либо кислотным способом, либо ферментативным способом с использованием ферментов, разлагающих целлюлозу и/или гемицеллюлозу. Микроорганизмы, такие, как грибки, относящиеся к родам , ,  или , или анаэробные бактерии, относящиеся, например, к роду , производят эти ферменты, содержащие, в частности, целлюлазы и ксиланазы, подходящие для полного гидролиза полимеров, составляющих растения.
Кислотный способ, осуществляемый с помощью сильной кислоты, в частности, серной кислоты, является эффективным, но требует больших количеств химических продуктов (кислоту, затем основание для нейтрализации). Ферментативный гидролиз не имеет этого недостатка, кроме того, он осуществляется в мягких условиях и является эффективным. Зато стоимость ферментов остается слишком высокой. Поэтому была проведена большая работа, чтобы снизить их стоимость: сначала производство большего количества ферментов, путем выбора гиперпродуктивных штаммов и улучшения способов ферментации, затем путем снижения количества ферментов для гидролиза путем оптимизации стадии предварительной обработки или улучшения специфической активности этих ферментов. За последнее десятилетие основные работы были связаны с пониманием механизмов действия целлюлаз и экспрессией ферментов для выделения ферментативного комплекса, наиболее подходящего для гидролиза лигноцеллюлозных субстратов, путем модификации штаммов средствами молекулярной биологии.
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
Наиболее подходящим микроорганизмом для получения целлюлаз является грибок . Дикие штаммы способны выделять в присутствиим субстрата-индуктора, например, целлюлозы, ферментативный комплекс, который считается лучше всего адаптированным к гидролизу целлюлозы. Ферменты ферментативного комплекса имеют три основных типа активности: эндоглюканазы, экзоглюканазы и целлобиазы.  продуцирует также другие белки, обладающие необходимыми свойствами для гидролиза лигноцеллюлозных материалов, например, ксиланазы. Для экспрессии ферментов, разлагающих целлюлозу и/или гемицеллюлозу, необходимо присутствие субстрата-индуктора. На состав ферментативного комплекса большое влияние оказывает природа углеродсодержащего субстрата. Это имеет место в случае ксилозы, которая в сочетании с углеродсодержащим субстратом-индуктором, таким как целлюлоза или лактоза, позволяет значительно улучшить активность указанной ксиланазы.
Trichoderma reesei
Мутационные методы классической генетики позволили выбрать штаммы , являющиеся суперпродуцентами целлюлаз, такие как штаммы MCG77 (Gallo - патент US 4275167), MCG 80 (Allen, A.L., Andreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi, 1982, 12, 451-459, 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) и CL847 (Durand и др., 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels", Paris. H.HESLOT Ed, pp 39-50). Эти улучшения позволили получить суперпродуктивные штаммы, менее чувствительные к катаболитной репрессии, на мономерных сахарах, в частности, глюкозе, например, по сравнению с дикими штаммами.
Trichoderma reesei
Aspergillus niger
Trichoderma reesei
Рекомбинантные штаммы были получены из штаммов  Qm9414, RutC30, CL847, клонируя гетерологичные гены, например, инвертазу , позволяющую  использовать сахарозу как источник углерода. Эти штаммы сохранили свою суперпродуктивность и свою способность к культивированию в ферментере.
Trichoderma reesei
Способ получения целлюлаз с помощью  был предметом значительных улучшений в отношении перехода на промышленный масштаб.
Trichoderma reesei,
Trichoderma reesei
Чтобы получить хорошую продуктивность по ферментам, необходимо вносить источник углерода, быстро усваиваемый для роста  и субстрат-индуктор, который делает возможной экспрессию целлюлазы и секрецию в культурной среде. Целлюлоза может выполнять обе эти функции, однако ее сложно использовать на стадии промышленного применения, и ее заменяли растворимыми источниками углерода, как глюкоза, ксилоза или лактоза, причем лактоза также играет роль субстрата-индуктора. В качестве индукторов были описаны и другие растворимые сахара, как целлобиоза и фосфороза, но они слишком дороги, чтобы использоваться на стадии промышленного применения. Однако было установлено, что продуктивность  в образовании целлюлаз с растворимыми субстратами намного ниже продуктивности, полученной на целлюлозе "в массе". Это связано с репрессорным эффектом легко усваиваемых сахаров при высокой концентрации. Непрерывный подвод растворимых углеродсодержащих субстратов позволил устранить катаболитную репрессию, ограничивая остаточную концентрацию в культурах и оптимизируя количество сахара, позволяющего получить лучший выход и лучшую продуктивность ферментов (см. патент FR-B-2 555603, зарегистрированный от лица настоящего Заявителя).
В промышленном способе получения ферментов, разлагающих целлюлозу, лактоза остается одним из наиболее подходящих и наименее дорогих субстратов, тем не менее, она остается дорогой и составляет около трети себестоимости ферментов. Несмотря на все реализованные достижения, стоимость ферментов остается значительной статьей расходов (от 30 до 50%) в превращении целлюлозной биомассы в спирт. Кроме того, в случае применения лактозы как источника углерода для получения целлюлаз способ зависит от внешнего источника углерода. Поэтому использование углеродсодержащих субстратов с фильер (как остатки гидролизованной гемицеллюлозы или барда с этанольной ферментации) является существенным шагом вперед, если индукторный источник углерода легко доступен.
Использование остатков гидролизованной гемицеллюлозы для получения целлюлаз было описано в патентной заявке FR-A-2 881753, поданной от лица настоящего Заявителя. Эти остатки являются эффективными индукторами получения целлюлаз и ведут к смесям, эффективным при гидролизе лигноцеллюлозных материалов. Применение этих остатков имеет, тем не менее, целый ряд потенциальных ограничений:
- их использование влечет предварительную обработку, на которой будет растворена гемицеллюлоза,
- изменение растительного сырья, как, например, простая замена разновидности рискует повлечь изменения в составе остатков и тем самым изменение состава ферментов,
- присутствие ингибиторов, в частности, в зависимости от растения и условий предварительной обработки, имеет опасность возникновения проблем с воспроизводимостью культур,
- высокое содержание ксилозы в остатках (например, соломы) приводит к гемицеллюлазе, которая не особенно требуется для гидролиза субстрата, уже освобожденного от большей части этой гемицеллюлозы.
С другой стороны, в этой патентной заявке также было описано использование барды с ферментации гидролизатов лигноцеллюлозного сырья. Характеристики, полученные с этим источником углерода, эквивалентны и даже лучше характеристик, полученных с классическими субстратами, но, возможно, что новые поколения ферментов с улучшенными характеристиками гидролиза и штаммы дрожжей, приспособленные к условиям ферментации, не потребуют количества индукторного источника углерода в пропорции, не сравнимой с продукцией фермента.
Использование источника углерода с воспроизводимым составом, не содержащего ингибиторов и не зависящего или мало зависящего от обрабатываемого сырья, было бы значительным достижением. Этот источник углерода, оставаясь доступным на месте, позволил бы также разработать концепцию "биорафинирования".
Сущность изобретения
Настоящее изобретение описывает способ получения спирта из предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы, в котором этап ферментативного гидролиза проводится с ферментами, разлагающими целлюлозу и/или гемицеллюлозу, полученными при использовании по меньшей мере одного типа отходов с другого процесса получения этанола, использующего в качестве сырья сахароносные растения.
Описание фигур
Фигура 1 описывает схему способа изменения производства спирта согласно настоящему изобретению.
Фигура 2 описывает схему способа изменения производства спирта согласно настоящему изобретению, использующего в качестве лигноцеллюлозного сырья остатки сахароносных растений.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к использованию отходов, полученных в ходе других процессов получения биотоплива, например, но без ограничений, сахарных сиропов с промывки свеклы или сахарного тростника, или мелассы с сахарных заводов, для получения ферментов, разлагающих целлюлозу и/или гемицеллюлозу, штаммами микроорганизмов, разлагающих целлюлозу, использующих в качестве источника углерода сахарозу, натуральную или после модификации.
Trichoderma
Aspergillus
Penicillium
Schizophyllum
Trichoderma reesei
Микроорганизмы, разлагающие целлюлозу, относятся к родам , ,  или , предпочтительно к виду .
Сиропы, содержащие сахарозу, используемые в настоящем изобретении, поступают с процессов получения биотоплива первого поколения и, в частности, получаются при промывке свеклы или сахарного тростника, или происходят из мелассы с сахарных заводов.
Основным источником углерода может быть сахароза, полученная из этого сиропа, или быть дополнением к промышленному растворимому сахару, как лактоза или ксилоза, или экстрактом гемицеллюлозной фракции в мономерной форме, полученным в результате предварительной обработки биомассы, или экстрактом барды с ферментации продуктов гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, или их смесью. Эти два последних экстракта могут также служить индукторами для получения целлюлаз.
Задачей изобретения является предложить легкодоступный источник углерода, позволяющий получить ферменты, разлагающие целлюлозу и/или гемицеллюлозу, с активностями, подходящими для гидролиза целлюлозной биомассы, совместимый с рядом технологических схем производства биоспирта в различных контекстах.
Источник углерода для роста, в основном сахарозы, получают из сахарных сиропов после диффузионной промывки свекольной пульпы или из мелассы, поступающей с рафинадного завода. Можно также использовать сахарный сироп или мелассу, полученные при промывке сахарного тростника.
Особым этапом приготовления сусла из сахаросодержащих растений является экстракция сахарозы. Этот сахар находится в свободном состоянии в вакуолях растительных клеток. Его экстракция проводится либо путем прессования, либо промывкой в горячей воде, осуществляемой в противотоке предварительно нарезанных растений.
Так, свеклу обычно промывают, чтобы удалить землю, затем режут на стружку. Затем экстрагируют сахарный сироп путем диффузии в горячей воде. Этот первый сироп обычно предназначен для этанольной ферментации, но может использоваться в настоящем изобретении, концентрированным или в виде сахарного сиропа, как источник углерода для получения целлюлаз. Можно также использовать мелассу - побочный продукт рафинирования сахара, содержащую до 50 вес.% сахарозы (таблица 2).
В случае сахарного тростника тростник измельчают и прессуют с добавлением горячей воды, чтобы растворить сахара. Затем с сахарным сиропом, возможно, концентрированным, поступают аналогично тому, как в случае со свеклой.
Таблица 1
Примерный состав сахарных сиропов, получаемых при диффузии в горячей воде свеклы и при измельчении и прессовании сахарного тростника. Долю примесей обычно уменьшают фильтрацией и/или осаждением солей.
Сироп сахарной свеклы
Сироп сахарного тростника
Сухие вещества (вес.%)
15
20
Сахара, всего (% сух.в.)
94
>90
из них сахароза (% сух.в.)
94
85
из них глюкоза (% сух.в.)
0
7,5
из них фруктоза (% сух.в.)
0
7,5
другие (% сух.в.)
6
<10
<b>Таблица 2</b>Примерный химический состав мелассы сахарной свеклы и сахарного тростника (источники: INRA и Yang и др. (2007))
Свекольная меласса
Меласса сахарного тростника
Сухие вещества (вес.%)
73
73
Неорганические вещества (% сух.в.)
13
14
Азотсодержащие вещества, всего (% сух.в.)
15
6
Сахара, всего (% сух.в.)
64
64
из них сахароза (% сух.в.)
64
43
из них глюкоза (% сух.в.)
0
10,5
из них фруктоза (% сух.в.)
0
10,5
Кальций (г/кг сух.в.)
3,7
7,4
Фосфор (г/кг сух.в.)
0,3
0,7
Калий {г/кг сух.в.)
82
40
Используемая лигноцеллюлозная биомасса выбрана из соломы, древесины, лесных культур, остатков спиртообразующих, сахароносных растений и злаковых, отходов бумажной промышленности и продуктов превращения целлюлозных и лигноцеллюлозных материалов.
В варианте реализации, показанном на фигуре 2, лигноцеллюлозные остатки происходят из сахароносных растений, из которых получают сахарные сиропы, использующиеся для получения ферментов, разлагающих целлюлозу и/или гемицеллюлозу.
Trichoderma reesei
Лигноцеллюлозное сырье подвергают предварительной обработке, которая может иметь любой характер, с гидролизом или без гидролиза гемицеллюлозы. После предварительной обработки целлюлозную фракцию, очищенную или нет от гидролизованной гемицеллюлозной фракции и, при необходимости, от лигнина, гидролизуют ферментами, разлагающими целлюлозу и/или гемицеллюлозу, полученными с помощью особых штаммов, причем когда углеродсодержащие субстраты происходят из целлюлозной или лигноцеллюлозной биомассы, наиболее эффективными и наиболее подходящими являются целлюлазы, полученные с . Как написано выше, указанные ферменты получены при использовании по меньшей мере одного типа отходов с другого процесса получения этанола.
Материал для гидролиза суспендируют в водной фазе из расчета от 6 до 40% сухого вещества, предпочтительно от 20 до 30%. Значение pH устанавливают от 4 до 5,5, предпочтительно от 4,8 до 5,2, и температуру от 40 до 60°C, предпочтительно от 45 до 50°C. Реакцию гидролиза запускают добавлением целлюлаз; обычно используется количество от 10 до 30 мг белков, выделяющихся на грамм предварительно обработанного субстрата, или меньше. Реакция обычно продолжается от 15 до 48 часов, в зависимости от эффективности предварительной обработки, состава смеси целлюлаз и количества добавленных ферментов. Реакцию отслеживают по анализу выделяющихся сахаров, в частности, глюкозы. Раствор сахаров отделяют от твердой негидролизованной фракции, состоящей в основном из лигнина, фильтрацией или центрифугированием; его используют для этанольной ферментации.
Обычно спирт отделяют от ферментированного сусла перегонкой, и остаток образуется из барды после перегонки. Эта барда, обогащенная индуктором, может использоваться как индукторный источник углерода для получения ферментов, разлагающих целлюлозу и/или гемицеллюлозу, как описано в патентной заявке FR-A-2881753.
Trichoderma
Aspergillus
Penicillium
Schizophyllum
Trichoderma reesei
Trichoderma reesei
A. niger
Trichoderma reesei,
Штаммы, использующиеся для получения ферментов, разлагающих целлюлозу и/или гемицеллюлозу, являются штаммами грибков, относящихся к роду , ,  или , предпочтительно . Однако, некоторые грибки, относящиеся к этим родам, в частности, , не могут использовать сахарозу как источник углерода. Таким образом, необходимо прибегать к генномодифицированным штаммам, например, экспрессирующим инвертазу , как описано для  Berges и сотр. (Curr. Genet. 1993, 6-8, 24 (1-2): 53-59), чтобы сахарозу можно было использовать как источник углерода. Независимо от этого, штаммы можно модифицировать, чтобы улучшить ферменты, разлагающие целлюлозу и/или гемицеллюлозу, способами мутации-селекции, как, например, штамм IFP CL847 (французский патент FR-B-2555803); могут также использоваться штаммы, усовершенствованные методами генной рекомбинации.
Эти штаммы культивируют в ферментерах с перемешиванием и аэрацией в условиях, совместимых с условиями их роста и продукции ферментов. В зависимости от его природы, углеродсодержащий субстрат, выбранный для получения биомассы, вводят в ферментер перед стерилизацией или стерилизуют отдельно и вводят в ферментер после стерилизации последнего, чтобы получить начальную концентрацию от 20 до 35 г/л. На этой стадии можно не добавлять источник индуктора. Водный раствор, содержащий субстрат, выбранный для получения ферментов, готовят в концентрации 200-250 г/л; этот раствор должен содержать субстрат-индуктор. Его вводят после исчерпания исходного субстрата, чтобы внести оптимизированное количество, составляющее от 35 до 45 мг/г клеток ("подпитка"). На этой стадии "подпитки" остаточная концентрация сахара в культурной среде ниже 1 г/л.
За этапом ферментативного гидролиза следует этап ферментации, затем этап перегонки и выделения полученного спирта.
В случае этанольной ферментации, получаемым спиртом является этанол.
Clostridium
Clostridium acetobutylicum
В случае ферментации типа ацетобутильной, или ABE, в конце процесса получают смесь спиртов, состоящую из бутанола и этанола. Этот тип ферментации реализуется бактериями, относящимися к роду , более точно, к виду .
Clostridium bejerinckii
Равным образом, если ферментация относится к типу IBE, где используются штаммы , получают смесь, состоящую из изопропанола, бутанола и этанола.
Этап ферментативного гидролиза и ферментации может осуществляться одновременно (способ SSF - Simultaneous Saccharification and Fermentation), за ними идет этап перегонки и выделения полученного спирта.
Пример 1 дан в качестве сравнения, а пример 2 иллюстрирует изобретение, не ограничивая его объем.
Пример 1: Получение ферментов на лактозе
3
4
4
2
4
4
2
2
4
4
2
2
4
2
Получение целлюлаз проводится в ферментере с механическим перемешиванием. Среда имеет следующий состав: KOH 1,66 г/л, HPO (85%) 2 мл/л, (NH)SO 2,8 г/л, MgSO·7HO 0,6 г/л, CaCl 0,6 г/л, MnSO 3,2 мг/л, ZnSO·7HO 2,8 мг/л, CoCl 4,0 мг/л, FeSO·7HO 10 мг/л, кукурузный экстракт 1,2 г/л, противовспенивающее средство 0,5 мл/л.
Trichoderma reesei
Ферментер, содержащий 1,75 л неорганической среды и 70 г лактозы, стерилизуют при 120°C, затем засеивают 0,25 л жидкой прекультуры штамма  CL847. Среда прекультуры, в которую добавлен фталат калия в концентрации 5 г/л для регулирования изменения pH, идентична среде ферментера. Рост грибков в прекультуре производится на лактозе, при концентрации 30 г/л. Рост инокулята длится от 2 до 3 дней и происходит при температуре от 27 до 30°C на многолистовой мешалке.
После 46 часов выращивания исходный субстрат ферментера исчерпывается, и непрерывно в течение 142 часов вводится раствор лактозы концентрацией 250 г/л при расходе 4,5 мл/ч.
Температуру на стадии роста биомассы контролируют на 27°C, затем на 25°C до исчерпания культуры. pH держат на 5 на стадии роста, затем на 4 до заканчивания культуры путем добавления раствора аммиака, который доставляет азот, необходимый для синтеза экскретируемых белков. Содержание растворенного кислорода удерживается выше 15-20% с помощью аэрации и перемешивания.
За получением ферментов следят путем количественного определения внеклеточных белков по методу Folin (Lowry) после отделения мицелия фильтрацией или центрифугированием. Активность разложения целлюлозы определяется методом активности по фильтровальной бумаге (UPF: устройство с фильтровальной бумагой) в отношении полной активности и целлобиазной активности, причем считается, что активность лимитирует процесс ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. Активность по UPF измеряют на ватмане № 1 при начальной концентрации 50 г/л; определяют количество пробы анализируемого ферментативного раствора, которая выделяет эквивалент 2 г/л глюкозы (колориметрический анализ) за 60 минут. Целлобиазную активность измеряют на целлобиозе концентрацией 20 мМ; определяют количество пробы, которая выделяет 0,5 г/л глюкозы (ферментативный анализ) за 30 минут.
Активности (в ед./мл) выражены в микромолях глюкозы, выделяющейся в минуту на миллилитр ферментативного раствора.
Аналитическое определение на конечном сусле дало следующие результаты:
Израсходованный субстрат, г/л
79,6
Биомасса, г/л
13,5
Белки, мг/мл
37,8
UPF, ед./мл
22,1
Целлобиазы, ед./мл
25,2
Пример 2: Получение ферментов на сахарозе
A. niger
Получение ферментов ведется в тех же условиях, что и в примере 1, но лактоза на периодической стадии заменена сахарозой, а подпитка проводится раствором из 60% лактозы и 40% сахарозы. Используемым штаммом является штамм, производный от CL847, преобразованный инвертазой  (Berges и др., 1993).
Trichoderma reesei
Ферментер, содержащий 1,75 л неорганической среды с 40 г чистой сахарозы, засеивается 0,25 л жидкой прекультуры штамма  CL847. Углеродсодержащий субстрат прекультуры является глюкозой с концентрацией 20 г/л. После 48 часов выращивания, по исчерпании исходного субстрата, в течение 165 часов непрерывно вводят раствор концентрацией 200 г/л, состоящий из 60% лактозы и 40% сахарозы, с расходом 5 мл/ч.
Аналитическое определение на конечном сусле дало следующие результаты:
Израсходованный субстрат, г/л
71,9
Биомасса, г/л
12,2
Белки, мг/мл
32
UPF, ед./мл
23
Целлобиазы, ед./мл
34
Продукции полученных ферментов являются близкими в отношении выхода и ферментативной активности. Эти значения совместимы с осуществлением эффективного ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. Этот ферментативный гидролиз и ферментация дают для обоих примеров близкие результаты в терминах получения спиртов.