СРЕДСТВО РАЗРЕЗАНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ CAS9 БЕЛКА ИЗ БАКТЕРИИ PASTEURELLA PNEUMOTROPICA
DNA PROTEASE CUTTING AGENT BASED ON CAS9 PROTEIN FROM PASTEURELLA PNEUMOTROPICA BACTERIA

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к новым ферментам Cas нуклеазам систем CRISPR-Cas, применяемым для разрезания ДНК иредактирования генома различных организмов. Данная технология может применяться в будущем для генной терапии наследственных заболеваний человека, а также для редактирования генома других организмов.
Уровень техники
Изменение последовательности ДНК – одна из актуальных задач биотехнологии на сегодняшний день. Редактирование и изменение геномов эукариотических и прокариотических организмов, а также манипуляции с ДНК in vitro, требуют направленного внесения двунитевых разрывов в последовательности ДНК.
Для решения этой задачи в настоящее время используют следующие методики: искусственные нуклеазные системы, содержащей домены типа «цинковые пальцы», TALEN-системы и бактериальные CRISPR-Cas системы. Первые два метода требуют трудозатратой оптимизации аминокислотной последовательности нуклеазы для узнавания конкретной последовательности ДНК. В отличие от них в случае CRISPR-Cas систем структурами, узнающими ДНК мишень, являются не белки, а короткие направляющие РНК. Разрезание конкретной ДНК мишени не требует синтеза нуклеазы или ее гена de novo, а обеспечивается за счет использования направляющих РНК, комплементарных целевой последовательности. Это делает CRISPR Cas системы удобными и эффективными инструментами разрезания различных ДНК-последовательностей. Методика позволяет осуществлять единовременное разрезание ДНК в нескольких участках при использовании направляющих РНК разной последовательностей. Такой подход используется в том числе для одновременного изменения нескольких генов в эукариотических организмах.
По своей природе CRISPR-Cas системы являются иммунными системами прокариот, способными высоко специфично вносить разрывы в генетический материал вирусов (Mojica F. J. M. et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements //Journal of molecular evolution. – 2005. – Т. 60. – №. 2. – С. 174-182).  Аббревиатура CRISPR-Cas расшифровывается как “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR associated genes” (Jansen R. et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes //Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575), что переводе с английского обозначает “короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами, и aссоциированные с ними гены”. Все CRISPR-Cas системы состоят из CRISPR кассет и генов, кодирующих различные Cas белки (Jansen R. et al. , Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575). CRISPR кассеты состоят из последовательностей-спейсеров, каждый из которых имеет уникальную нуклеотидную последовательность, и повторяющихся палиндромных повторов (Jansen R. et al. , Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575). В результате транскрипции CRISPR кассет и их последующего процессинга образуются направляющие крРНК, которые вместе с Cas белками формируют эффекторный комплекс (Brouns S. J. J. et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes //Science. – 2008. – Т. 321. – №. 5891. – С. 960-964). За счет комплементарного спаривания крРНК с целевым участком ДНК, именуемым протоспейсером, Cas-нуклеаза узнает ДНК-мишень и высоко специфично вносит в нее разрыв.
CRISPR-Cas системы, представленными одиночным белком-эффектором, разделяют на шесть различных типов (от I до VI) в зависимости от Cas белков, входящих в состав систем. В 2013 году впервые было предложено использовать систему CRISPR-Cas9, относящуюся к типу II, для редактирования геномной ДНК клеток человека (Cong L, et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23). Система CRISPR-Cas9 II типа отличается простотой состава и механизма работы: для ее функционирования необходимо формирование эффекторного комплекса, состоящего лишь из одного белка Cas9 и двух коротких РНК: крРНК (crRNA) и трейсерной РНК (tracrRNA). Трейсерная РНК комплементарно спаривается с участком крРНК, проиcходящим из CRISPR повтора, образуя вторичную структуру, необходимую для связывания направляющих РНК с Cas эффектором. Определение последовательности направляющих РНК является важным шагом в характеризации неизученных ранее Cas-ортологов. Эффекторный белок Cas9 является РНК-зависимой ДНК эндонуклеазой с двумя нуклеазными доменами (HNH и RuvC), вносящими разрывы в комплементарные нити целевой ДНК, таким образом образуя двунитевой разрыв ДНК (Deltcheva E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III //Nature. – 2011. – Т. 471. – №. 7340. – С. 602).
На сегодняшний день известно несколько CRISPR-Cas нуклеаз, способных направлено и специфично вносить двунитевые разрывы в ДНК. Технология CRISPR-Cas9 является одной из самых современных и быстроразвивающихся методик внесения разрывов в ДНК различных организмов, начиная от бактериальных штаммов и заканчивая клетками человека, а также in vitro (Song M. The CRISPR/Cas9 system: Their delivery, in vivo and ex vivo applications and clinical development by startups. Biotechnol Prog. 2017 Jul;33(4):1035-1045).
Эффекторному рибонуклеиновому комплексу, состоящему из Cas9 и дуплекса крРНК и тракрРНК, для распознавания и последующего гидролиза ДНК помимо комплементарного соответствия спейсера крРНК и протоспейсера необходимо присутствие PAM (от англ. “PAM” - protospacer adjusted motif) на ДНК мишени (Mojica F. J. M. et al. 2009). PAM представляет собой строго определенную последовательность из нескольких нуклеотидов, расположенных в системах типа II вплотную либо в нескольких нуклеотидах от 3’-конца протоспейсера на нетаргетной цепи. При отсутствии PAM гидролиза связей в ДНК с образованием двунитевого разрыва не происходит. Необходимость присутствия PAM последовательности на мишени повышает специфичность узнавания, но в то же время накладывает ограничение в выборе целевых участков ДНК, в которые необходимо внести разрыв. Таким образом, наличие нужной PAM последовательности, фланирующей ДНК-мишень с 3'-конца, является характеристикой, ограничивающей применение CRISPR-Cas систем на любых участках ДНК.
in vitro
Различные CRISPR-Cas белки используют для своей работы разные, оригинальные PAM последовательности. Использование CRISPR-Cas белков с новыми разнообразными PAM последовательностями необходимо для обеспечения возможности изменения любого участка ДНК, как , так и в геноме живых организмов. Изменение эукариотических геномов также требует использования нуклеаз малого размера для обеспечения доставки CRISPR-Cas систем в клетки посредством AAV вирусов.
Несмотря на известность ряда способов разрезания ДНК и изменения последовательности геномной ДНК, на сегодняшний день сохраняется потребность в новых эффективных инструментах для модификации ДНК в различных организмах и в строго определенных местах последовательности ДНК.
Сущность изобретения
Pasteurella pneumotropica
P. pneumotropica
Задачей настоящего изобретения является создание новых инструментов для изменения последовательности геномной ДНК одноклеточных или многоклеточных организмов на основе систем CRISPR-Cas9. Существующие в настоящее время системы имеют ограниченное применение из-за специфичной последовательности РАМ, которая должна присутствовать на 3'-конце участка ДНК, подвергающегося модификации. Поиск новых ферментов Cas9 с другими РАМ последовательностями позволит расширить арсенал имеющихся средств для образования двунитевого разрыва в необходимых, строго определенных местах в молекулах ДНК разных организмов. Для решения этой задачи авторами была охарактеризована ранее предсказанная для бактерии  ()
CRISPR нуклеаза II типа PpCas9, которая может быть применена для внесения направленных изменений в геном как этого, так и других организмов. Существенными признаками, отличающими настоящее изобретение, являются: (а) короткая, отличающаяся от других известных последовательность PAM; (б) относительно малый размер охарактеризованного белка PpCas9 – 1055 аминокислотных остатков (а.о.).
о
о
Указанная задача решается путем применения белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5’-NNNN(A/G)T-3’ в указанной молекуле ДНК. В некоторых вариантах изобретения данное применение характеризуется тем, что образование двунитевого разрыва в молекуле ДНК происходит при температуре от 35С до 45С.
Указанная задача также решается путем создания способа изменения последовательности геномной ДНК одноклеточного или многоклеточного организма, включающего введение в по меньшей мере одну клетку этого организма эффективного количества: а) либо белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, либо нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и б) либо направляющей РНК, содержащей последовательность, образующую дуплекс с нуклеотидной последовательностью участка геномной ДНК организма, непосредственно примыкающей к нуклеотидной последовательности 5’-NNNN(A/G)T-3’, и взаимодействующей с указанным белком после образования дуплекса, либо последовательности ДНК, кодирующей указанную направляющую РНК; при этом взаимодействие указанного белка с направляющей РНК и нуклеотидной последовательностью 5’-NNNN(A/G)T-3’ приводит к образованию двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5’-NNNN(A/G)T-3’.  В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что дополнительно включающий введение экзогенной последовательности ДНК одновременно с направляющей РНК.
В качестве направляющей РНК может быть использована смесь из крРНК (crRNA) и трейсерной РНК (tracrRNA), способных образовать комплекс с участком целевой ДНК и белком PpCas9. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве направляющей РНК может быть использована гибридная РНК, сконструированная на основе крРНК и трейсерной РНК. Методы конструирования гибридной направляющей РНК известны специалистам (Hsu PD, et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):827-32). Один из вариантов конструирования гибридной РНК раскрыт в Примерах ниже.
Изобретение может быть использовано как для разрезания целевой ДНК in vitro, так и для модификации генома какого-либо живого организма. Модификация генома может проводиться прямым способом – разрезанием генома в соответствующем сайте, а также вставкой экзогенной последовательности ДНК за счет гомологичной репарации.
В качестве экзогенной последовательности ДНК может быть использован любой участок двунитевой или однонитевой ДНК из генома организма, отличного от организма, используемого при введении (или смесь таких участков между собой и с другими фрагментами ДНК), при этом этот участок (или смесь участков) предназначен для интеграции в место двуцепочечного разрыва в целевой ДНК, образованного под действием нуклеазы PpCas9. В некоторых вариантах изобретения в качестве экзогенной последовательности ДНК может быть использован участок двуцепочечной ДНК из генома организма, используемого при введении белка PpCas9, но при этом измененный мутациями (заменой нуклеотидов), а также вставками или делециями одного или нескольких нуклеотидов.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение универсальности доступных систем CRISPR-Cas9, позволяющее использовать нуклеазу Cas9 для разрезания геномной или плазмидной ДНК в большем количестве специфических сайтов и специфических условий.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1.  Схема устройства локуса CRISPR PpCas9 системы. DR - direct repeat, или прямой повтор - регулярно повторяющийся участок, входящий в состав CRISPR кассеты.
Фиг. 2. PAM скрининг in vitro. Схема эксперимента.
Фиг. 3. Разрезание нуклеазой PpCas9 фрагментов 7N библиотеки при разных температурах проведения реакции.
Фиг. 4. (А) Анализ результатов in vitro скрининга нуклеазы PpCas9 с использованием расчета логарифма изменения доли каждого конкретного нуклеотида в каждой позиции PAM (FC). (Б) PAM Logo нуклеазы PpCas9. Для каждой позиции обозначены частоты представленности аденина, цитозина, тимина и гуанина. Высота букв соответствует частоте представленности нуклеотида в данной позиции PAM последовательности.
Фиг. 5. Проверка влияния однонуклеотидных замен в первой позиции PAM на эффективность разрезания нуклеазой PpCas9 ДНК-мишени.
Фиг. 6. Проверка значимости нуклеотидных позиций в PAM последовательности PpCas9.
Фиг. 7. Проверка влияния замены A на G в 5ой позиции PAM на эффективность разрезания нуклеазой PpCas9 ДНК-мишени.
Фиг. 8. Проверка влияния однонуклеотидных замен в 7ой позиции PAM на эффективность разрезания нуклеазой PpCas9 ДНК-мишени.
Фиг. 9. Разрезание различных сайтов ДНК с помощью белка PpCas9. Дорожки 1 и 2 – положительный контроль.
Фиг. 10. Проверка распознавания нуклеазой PpCas9 PAM последовательности CAGCATT. Дорожки 1 и 2 – положительный контроль.
Фиг. 11. Схема инструмента разрезания ДНК PpCas9.
Фиг. 12. Эксперимент по разрезанию ДНК -мишени. Использованы гибридные направляющие РНК разной длины.
Staphylococcus aureus
Фиг. 13. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков PpCas9 и Cas9 из  при помощи программы NCBI BLASTp (default parameters).
Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами. Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100.
Термин "специфически гибридизуется" относится к ассоциации между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот или в достаточной степени комплементарными последовательностями, что разрешает такую гибридизацию в предопределенных условиях, обычно использующихся в данной области.
непосредственно
Фраза "двунитевой разрыв, расположенный  перед нуклеотидной последовательностью РАМ" означает, что двунитевой разрыв в целевой последовательности ДНК будет произведен на расстоянии от 0 до 25 нуклеотидов перед нуклеотидной последовательностью РАМ.
Под экзогенной последовательностью ДНК, вводимой одновременно с направляющей РНК, следует понимать последовательность ДНК, подготовленную специально для специфической модификации двуцепочечной целевой ДНК в месте разрыва, определяемого специфичностью направляющей РНК. Подобной модификацией может быть, например, вставка или делеция определенных нуклеотидов в месте разрыва целевой ДНК. Экзогенной ДНК может служить как участок ДНК из другого организма, так и участок ДНК из того же организма, что и целевая ДНК.
Под белком, содержащим определенную аминокислотную последовательность следует понимать белок, имеющий аминокислотную последовательность, составленную из указанной аминокислотной последовательности и, возможно, других последовательностей, соединённых пептидными связями с указанной аминокислотной последовательностью. Примером других последовательностей может служить последовательность сигнала ядерной локализации (NLS), или другие последовательности, обеспечивающие повышенную функциональность для указанной аминокислотной последовательности.
Под экзогенной последовательностью ДНК, вводимой одновременно с направляющей РНК, следует понимать последовательность ДНК, подготовленную специально для специфической модификации двуцепочечной целевой ДНК в месте разрыва, определяемого специфичностью направляющей РНК. Подобной модификацией может быть, например, вставка или делеция определенных нуклеотидов в месте разрыва целевой ДНК. Экзогенной ДНК может служить как участок ДНК из другого организма, так и участок ДНК из того же организма, что и целевая ДНК.
Под эффективным количеством вводимых в клетку белка и РНК следует понимать такое количество белка и РНК, которое при попадании в указанную клетку будет способно образовать функциональный комплекс, то есть комплекс, который будет специфически связываться с целевой ДНК и производить в ней двунитевой разрыв в месте, определяемом направляющей РНК и РАМ последовательностью на ДНК. Эффективность этого процесса может быть оценена при помощи анализа целевой ДНК, выделенной из указанной клетки с помощью стандартных методов, известных специалистам.
Доставка белка и РНК в клетку может быть осуществлена различными способами. Например, белок может быть доставлен в виде ДНК-плазмиды, которая кодирует ген этого белка, как мРНК для трансляции этого белка в цитоплазме клетки, или как рибонуклеопротеидный комплекс, включающий этот белок и направляющую РНК. Доставка может быть осуществлена различными методами, известными специалистам.
Нуклеиновая кислота, кодирующая компоненты системы, может быть введена в клетку, непосредственно или опосредованно: за счет трансфекции или трансформации клеток известными специалистам способами, за счет использования рекомбинатного вируса, за счет манипуляций с клеткой, таких как микроинъекция ДНК и т.п.
Доставка рибонуклеинового комплекса, состоящего из нуклеазы и направляющих РНК и экзогенной ДНК (при необходимости) может осуществляться путем трансфекции комплексов в клетку или за счет механического введения комплекса внутрь клетки, например, микроинъекции.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, который необходимо ввести в клетку, может быть интегрирована в хромосому или может представлять собой внехромосомно реплицирующуюся ДНК. В некоторых вариантах для обеспечения эффективной экспрессии гена белка с вводимой в клетку ДНК необходимо изменить последовательность этой ДНК в соответствии с типом клетки в целях оптимизации кодонов при экспрессии, обусловленное неравномерностью частот встречаемости синонимичных кодонов в кодирующих областях генома различных организмов. Оптимизация кодонов необходима для увеличения экспрессии в клетках животных, растений, грибов или микроорганизмов.
Для функционирования белка, имеющего последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в эукариотической клетке необходимо, чтобы этот белок оказался в ядре этой клетки. Поэтому, в некоторых вариантах изобретения, для образования двунитевых разрывов в целевой ДНК используют белок, имеющий последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и который дополнительно модифицирован с одного или с обоих концов добавлением одного или нескольких сигналов ядерной локализации. Например, может быть использован сигнал ядерной локализации из вируса SV40. Для эффективной доставки в ядро сигнал ядерной локализации может быть отделен от основной последовательности белка спейсерной последовательностью, например, описанной в Shen B, et al. "Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting", Cell Res. 2013 May;23(5):720-3. Также, в других вариантах осуществления, может быть использован другой сигнал ядерной локализации, или альтернативный метод доставки указанного белка в ядро клетки.
P. pneumotropica
Настоящее изобретение охватывает применение белка из организма , гомологичного ранее охарактеризованным белкам Cas9, для внесения двуцепочечных разрывов в молекулы ДНК в строго определенных положениях. Использование CRISPR нуклеаз для внесения направленных изменений в геном имеет ряд преимуществ. Во-первых, специфичность действия системы определяется последовательностью крРНК, что позволяет использовать один тип нуклеазы для всех локусов-мишеней. Во-вторых, методика позволяет доставить в клетку сразу несколько направляющих РНК, комплементарных разным генам-мишеням, что позволяет осуществлять единовременное изменение сразу нескольких генов.
Pasteurella pneumotropica ATCC 35149
Pasteurella pneumotropica (P. pneumotropica)
PpCas9 – Cas нуклеаза, найденная в бактериях , являющихся патогенами грызунов, обитающих в легких животных.  CRISPR Cas9 система (далее CRISPR PpCas9) относится к IIC типу CRISPR Cas систем и состоит из CRISPR кассеты, несущей четыре прямых повтора (direct repeats, DR) последовательностью 5’ATTATAGCACTGCGAAATGAAAAAGGGAGCTACAAC3’ разделенных последовательностями уникальных спейсеров. Ни один из спейсеров системы не совпадает по последовательности с известными на сегодня бактериофагами или плазмидами, что не позволяет определить требуемый PpCas9 PAM биоинформатическим анализом. К CRISPR кассете прилегает ген эффекторного Cas9 белка PpCas9, а также гены белков Cas1 и Cas2, участвующих в адаптации, встраивании новых спейсеров. Рядом с Cas генами была обнаружена последовательность, частично комплементарная прямым повторам, складывающаяся в характерную вторичную структуру, - предполагаемая трейсерная РНК (tracrRNA) (Фиг. 1)
Знание характерной архитектуры РНК-Cas белкового комплекса систем IIC типа позволила предсказать направление транскрипции CRISPR кассеты: пре-крРНК транскрибируется в противоположном от Cas генов направлении (Фиг.1)
Таким образом, анализ последовательности локуса PpCas9 позволил предсказать последовательности трейсерной и направляющих РНК (Таблица 1).
in vitro
in vitro
in vitro
Для проверки активности PpCas9 нуклеазы и определения требуемого PpCas9 PAM мотива, были проведены эксперименты по воссозданию реакции разрезания ДНК . Для определения PAM последовательности белка PpCas9 использовали  разрезание двунитевых PAM библиотек. Для этого необходимо было получить все компоненты эффекторного комплекса PpCas9: направляющие РНК и нуклеазу в рекомбинантной форме. Определение последовательности направляющих РНК позволило синтезировать  молекулы crRNA и tracrRNA.  Синтез осуществляли с помощью набора NEB HiScribe T7 RNA synthesis. Двунитевые ДНК библиотеки представляли собой фрагменты  размером 374 пар нуклеотидов (п.н.), содержащие последовательность протоспейсера, фланкированную рандомизированными семью нуклеотидами (5’-NNNNNNN-3’) c 3’ конца: 5’- Для разрезания этой мишени использовали направляющие РНК следующей последовательности:
tracrRNA:
5’GCGAAATGAAAAACGUUGUUACAAUAAGAGAUGAAUUUCUCGCAAAGCTCUGCCUCUUGAAAUUUCGGUUUCAAGAGGCAUCUUUUU
и crRNA:
uaucuccuuucauugagcac
5’ GUUGUAGCUCCCUUUUUCAUUUCGC.
Жирным шрифтом выделена последовательность crRNA, комплементарная протоспейсеру (целевой ДНК последовательности).
pneumotropica
E.coli
Для получения рекомбинантного белка PpCas9 его ген был клонирован в плазмиду pET21a. В качестве кодирующей ген ДНК, использовалась ДНК, синтезированная в компании Integrated DNA Technologies (IDT). Последовательность была кодон-оптимизирована для исключения редких кодонов, встречающихся в геноме P.. Клетки  Rosetta были трансформированы полученной плазмидой pET21a-6xHis-PpCas9.
о
о
о
500 мкл ночной культуры разводили в 500 мл среды LB, и растили клетки при температуре 37 С до достижения оптической плотности 0.6 отн.ед. Синтез целевого белка индуцировали добавлением ИПТГ до концентрации 1 мМ, после чего клетки инкубировали при температуре 20 C в течение 6 часов. Затем проводили центрифугирование клеток на скорости 5000 g в течение 30 минут, полученные осадки клеток замораживали при температуре -20 С.
Осадки размораживали на льду в течение 30 минут, ресуспензировали в 15 мл лизисного буфера (Tris-HCl 50мМ pH 8, 500 мМ NaCl, β-меркаптоэтанол 1мМ, имидазол 10 мМ) с добавлением 15 мг лизоцима и снова инкубировали на льду в течение 30 минут. Затем клетки разрушали воздействием ультразвука в течение 30 минут и центрифугировали в течение 40 минут на скорости 16000 g. Полученный супернатант пропускали через фильтр 0,2 мкм и наносили на колонку HisTrap HP 1 mL (GE Healthcare) на скорости 1 мл/мин.
Хроматографию проводили при помощи FPLC хроматографа AKTA (GE Healthcare) на скорости 1 мл/мин. Колонку с нанесенным белком промывали 20 мл лизисного буфера с добавлением 30 мМ имидазола, после чего белок смывали лизисным буфером с добавлением 300 мМ имидазола.
о
Затем, фракцию белка, полученную в ходе афинной хроматографии, пропускали через гель-фильтрационную колонку Superdex 200 10/300 GL (24 мл), уравновешенную следующим буфером: Tris-HCl 50 мМ pH 8, 500 мМ NaCl, 1 мМ DTT. При помощи концентратора Аmicon (с фильтром на 30 кДа) фракции, соответствующие мономерной форме белка PpCas9, сконцентрировали до 3 мг/мл, после чего очищенный белок хранили при температуре -80 С в буфере, содержащем 10% глицерин.
In vitro
реакцию порезки линейных PAM библиотек проводили в объёме 20 мкл в следующих условиях. Реакционная смесь состояла из: 1X CutSmart буфера (NEB), 5 мМ DTT, 100 нМ PAM-библиотеки, 2 мкМ трРНК/крРНК, 400 нМ белка PpCas9. В качестве контроля аналогичным образом были приготовлены пробы, не содержащие РНК. Пробы инкубировали при различных температурах и анализировали методом гель-электрофореза в 2% агарозном геле. В случае правильного узнавания и специфического разрезания ДНК белком PpCas9 должны формироваться два фрагмента ДНК длиной порядка 326 и 48 пар оснований (см. Фиг. 2).
Результаты опыта показали, что PpCas9 обладает нуклеазной активностью и разрезает часть фрагментов PAM библиотеки. Градиент температур (Фиг. 3) показал, что белок активен в диапазоне температур 35 – 45 °С. В дальнейшем в работе в качестве рабочей использовалась температура 42 °С.
Реакцию разрезания библиотеки повторяли в подобранных условиях. Продукты реакции наносили на 1.5% агарозный гель и подвергали электрофорезу. Непорезанные фрагменты ДНК длиной 374 п.н. экстрагировали из геля и подготавливали для высокоэффективного секвенирования с помощью набора NEB NextUltra II. Образцы секвенировали на платформе Illumina и далее проводили анализ последовательностей биоформатическими методами: определяли разницу в представленности нуклеотидов в отдельных позициях PAM (NNNNNNN) в сравнении с контрольным образцом с использованием подхода, описанного в (Maxwell CS, et al., A detailed cell-free transcription-translation-based assay to decipher CRISPR protospacer-adjacent motifs. Methods. 2018 Jul 1;143:48-57). Кроме того, для анализа результатов построили PAM лого (Фиг. 4).
in vitro
Оба подхода к анализу данных (Фиг. 4) указывают на значимость 5, 6 и 7 позиций PAM. Таким образом, в результате  анализа удалось установить предположительную PAM последовательность для PpCas9: NNNNATT. Однако эта последовательность является лишь предположительной в силу неточности результатов, получаемых скрининговыми подходами к определению PAM.
ATT
В связи с этим для уточнения последовательности была произведена проверка значимости отдельных позиций последовательности PAM. Для этого проводили реакции in vitro разрезания ДНК фрагментов, содержащих ДНК-мишень 5’- atctcctttcattgagcac-3’, фланкированную PAM последовательностью CAAC(или ее производных):  5’-
Все реакции разрезания ДНК проводили в следующих условиях:
1xCutSmart буфер
400 нM PpCas9
20 нM  ДНК
2 мкM crRNA
2 мкM tracrRNA
Время инкубации - 30 минут, температура проведения реакции - 42 °С.
Замена первой позиции PAM на все четыре возможные варианта нуклеотидов не повлияла на эффективность работы белка (Фиг. 5).
Предсказанная значимость пятой и шестой была подтверждена экспериментально путем однонуклеотидных замен (пурин на пиримидин и наоборот) в каждой из позиций PAM. При заменах в пятой и шестой позициях белок практически переставал работать.  При замене в седьмой позиции эффективность работы PpCas9 снижалась в два раза, что отражает сниженные требования к нуклеотиду в этой позиции (Фиг. 6). Таким образом, согласно полученным результатам in vitro PAM скрининга нуклеазы PpCas9, в пятой позиции РАМ наиболее вероятными нуклеотидами являются аденин или гуанин, что удалось подтвердить экспериментально (Фиг. 7). Замена А на G никак не снижала эффективность разрезания фрагмента.
in vitro
Согласно результатам in vitro скрининга фрагменты с “T” либо с “C” в седьмой позиции должны распознаваться более эффективно. Для окончательной проверки значимости нуклеотидов в этой позиции были проведены дополнительные эксперименты. Результаты проведенных  тестов показали, что при замене нуклеотида “Т” в седьмой позиции на A или G эффективность разрезания снижается на 40-50% (Фиг. 8). Таким образом, седьмая позиция PAM является менее консервативной в сравнении с пятой и шестой:  пурины в седьмом положении лишь снижают эффективность узнавания, но не препятствуют белку PpCas9 вносить двунитевые разрывы в ДНК.
В результате проведенных исследований удалось сделать следующий вывод: PAM, распознаваемый нуклеазой PpCas9, соответствует следующей формуле 5’- NNNN(A/G)T-3’. Последовательности NNNNRTY (NNNN(A/G)-T-(T/C)) распознаются более эффективно чем NNNNRTR (NNNN-(A/G)-T-(A/G)).
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1
. Тестирование активности белка PpCas9 в разрезании различных ДНК мишеней.
in vitro
Для того, чтобы проверить способность PpCas9 узнавать различные последовательности ДНК, фланкированные 5’-NNNN(A/G)T-3’ последовательностью, были проведены эксперименты по  разрезанию ДНК-мишеней  из последовательности гена grin2b человека (см. Таблицу 2).
Таблица 2. ДНК-мишени гена grin2b человека.
последовательность
PAM
TATCTCCTTTCATTGAGCAC
C
A
A
A
C
C
C
CAGCTGAAGTAATGTTAGAG
C
C
A
C
<b>A</b>
<b>T</b>
T
AATAAGAAAAACATTATTAT
C
A
C
C
<b>A</b>
<b>T</b>
T
GGGGCTATAAGTACACAAGC
C
C
T
G
C
A
T
CGTTCTCAGAAGAGCCCCCC
C
A
G
C
<b>A</b>
<b>T</b>
T
CCCACGAGAAAGATGATTTC
C
A
C
C
<b>A</b>
<b>T</b>
C
В реакции разрезания в качестве мишени использовался ПЦР фрагмент гена grin2b, несущий сайты узнавания (Таблица 2), предположительно распознаваемыми PpCas9 в соответствии с PAM консенсусом 5’-NNNN(A/G)T-3’. Для узнавания этих последовательностей были синтезированы крРНК, направляющие PpCas9 на данные сайты.
Реакции разрезания проводились в подобранных для PpCas9 условиях, результат представлен на Фиг. 9. Из Фиг. 9 видно, что фермент PpCas9 успешно порезал три из четырех мишеней с подходящим PAM.
Мишень на шестой дорожке имела PAM последовательность CAGCATT, которая согласно предсказаниям на основании результатов «depletion analysis» должна эффективно распознаваться белком. Однако в данном эксперименте узнавание данного фрагмента не произошло.
Поэтому была произведена дополнительная проверка PAM CAGCATT на другой мишени-протоспейсере, ограниченной таким же PAM (Фиг. 10). В этом случае PAM эффективно распознавался, что приводило к порезке ДНК. Таким образом, белок имеет некие дополнительные предпочтения к последовательности ДНК мишени, возможно связанные со вторичной структурой ДНК.
Таким образом, проведенные исследовательские испытания показали наличие нуклеазной активности у PpCas9, а также позволили определить его PAM последовательность и верифицировать последовательности направляющих РНК.
PpCas9 рибонуклеопротеиновый комплекс специфически вносит разрывы в мишени, ограниченные PAM 5’ NNNN(A/G)T 3’ c 5’ конца протоспейсера. Схема PpCas9-РНК комплекса представлена на Фиг. 11.
Пример 2
. Использование гибридной направляющей РНК для разрезания ДНК мишени.
sgRNA - форма направляющих РНК, которая представляет собой слитые воедино tracrRNA (трейсерная РНК) и crRNA. Для подбора отимальной sgRNA были сконструированы три варианта этой последовательности, отличающиеся длиной tracrRNA – crRNA дуплекса. РНК синтезировали in vitro и проводили с ними эксперименты по разрезанию ДНК -мишени (Фиг. 12)
В качестве гибридных РНК были использованы следующие РНК последовательности:
UAUCUCCUUUCAUUGAGCAC
1 - sgRNA1 25DR: GUUGUAGCUCCCUUUUUCAUUUCGCGAAAGCGAAAUGAAAAACGUUGUUACAAUAAGAGAUGAAUUUCUCGCAAAGCTCTGCCUCUUGAAAUUUCGGUUUCAAGAGGCAUCUUUUU
2 - sgRNA2 36DR
UAUCUCCUUUCAUUGAGCAC
GUUGUAGCUCCCUUUUUUCAUUUCGCAGUGCUAUAAUGAAAAUUAUAGCACUGCGAAAUGAAAAACGUUGUUACAAUAAGAGAUGAAUUUCUCGCAAAGCUCUGCCUCUUGAAAUUUCGGUUUCAAGAGGCAUCUUUUU
Жирным шрифтом обозначена 20-нуклеотидная последовательность, обеспечивающая спаривание с ДНК -мишенью (вариабельная часть sgRNA). Кроме того, в эксперименте делали контрольную пробу без  РНК, а также положительный контроль - порезка мишени с помощью crRNA+trRNA.
В качестве ДНК мишени использовалась последовательность, содержащая сайт узнавания 5’ tatctcctttcattgagcac 3’ с соответсвующим консенсусу PAMCAACATT:  5’-
Жирным шрифтом обозначен сайт узнавания, заглавными буквами PAM.
Реакцию проводили в следующих условиях: концентрация ДНК последовательности, содержащей PAM (CAACATT) – 20 нM, концентрация белка – 400 нM, концентрация РНК - 2 мкM; время инкубирования - 30 минут, температура инкубирования - 37 °С.
Подобранные sgRNA1 и sgRNA2 оказались так же эффективны, как и нативные последовательности tracrRNA и crRNA: разрезание произошло в более 80% ДНК-мишенях (Фиг. 12).
Эти варианты гибридной РНК могут быть использованы для разрезания любой другой целевой ДНК при изменении последовательности, непосредственно спаривающейся с ДНК -мишенью.
Пример 3
P. pneumotropica.
. Белки Cas9 из близкородственных организмов, относящихся к
P. pneumotropica не
Staphylococcus aureus
На сегодняшний день в  охарактеризовано ни одного фермента системы CRISPR-Cas9. Сравнимый по размерам белок Cas9 из  идентичен PpCas9 на 28 % (Фиг. 13, степень идентичности была рассчитана по программе BLASTp, default parameters). Похожая степень идентичности существует и для других известных белков Cas9 (не показано).
Таким образом, белок PpCas9 существенно отличается по аминокислотной последовательности от других Cas9 белков, изученных на сегодняшний день.
Специалисту в области генетической инженерии очевидно, что полученный и охарактеризованный в данном Описании вариант последовательности белка PpCas9 может быть изменен без изменения функции самого белка (например, направленным мутагенезом аминокислотных остатков, напрямую не влияющих на функциональную активность (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108)). В частности, специалисту известно, что могут быть изменены неконсервативные аминокислотные остатки, не затрагивающие остатки, определяющие функциональность белка (определяющие его функцию или структуру). Примерами таких изменений могут служить замены неконсервативных аминокислотных остатков на гомологичные. Некоторые из участков, содержащих неконсервативные аминокислотные остатки, приведены на Фиг. 12. В некоторых вариантах осуществления изобретения возможно использование белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5’-NNNN(A/G)T-3’ в указанной молекуле ДНК. Гомологичные белки могут быть получены путем мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) соответствующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого модифицированного белка Cas9 на сохранение его функций в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.
Пример 4
. Описанная в настоящем изобретении система PpCas9 в комплексе с направляющими РНК может быть использована для изменения последовательности геномной ДНК многоклеточного организма, в том числе эукариотического. Для введения система PpCas9 в комплексе с направляющими РНК в клетки этого организма (во все клетки или в часть клеток) могут быть применены различные подходы, известные специалистам. Например, методы доставки CRISPR-Cas9 систем в клетки организмов раскрыты в источниках (Liu C et al., Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications. J Control Release. 2017 Nov 28;266:17-26; Lino CA et al., Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018 Nov;25(1):1234-1257), и в источниках, раскрытых внутри этих источников.
Для эффективной экспрессии нуклеазы PpCas9 в эукариотических клетках будет желательно провести оптимизацию кодонов для аминокислотной последовательности белка PpCas9 методами, известными специалистам (например, IDT codon optimization tool).
Для эффективной работы нуклеазы PpCas9 в эукариотических клетках необходимо обеспечить импорт этого белка внутрь ядра эукариотической клетки. Для этого можно использовать сигнал ядерной локализации из Т-антигена вируса SV40 (Lanford et al., Cell, 1986, 46: 575–582), соединённый с последовательностью PpCas9 с помощью спейсерной последовательности, описанной в Shen B, et al. "Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting", Cell Res. 2013 May;23(5):720-3 или без нее. Таким образом, полная аминокислотная последовательность нуклеазы, транспортируемой внутрь ядра эукариотической клетки, будет представлять собой следующую последовательность: MAPKKKRKVGIHGVPAA-PpCas9-KRPAATKKAGQAKKKK (далее PpCas9 NLS). Для доставки белка с приведенной выше аминокислотной последовательностью, могут быть использованы по меньшей мере два подхода.
Доставка в виде гена осуществляется путем создания плазмиды, несущей ген PpCas9 NLS под регуляцией промотора (например, CMV промотора) и последовательности, кодирующей направляющие РНК под регуляцией U6 промотора. В качестве ДНК- мишеней используются ДНК последовательности фланкированные 5’- NNNN(G/A)T -3’, например, последовательности гена grin2b человека:
5’-CAGCTGAAGTAATGTTAGAG-3’
Таким образом, кассета для экспрессии sgРНК выглядит следующим образом:
<img file="00000005.jpg" he="39" wi="160" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Жирным шрифтом выделена последовательность U6 промотора, далее идет последовательность, необходимая для узнавания целевой ДНК, а далее идет последовательность, образующая структуру sgRNA, которая выделена красным.
Плазмидную ДНК очищают и трансфицируют в клетки человека HEK293 c помощью реагента Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Клетки инкубируют в течение 72 часов, после чего из них выделяется геномная ДНК с помощью колонок для очистки геномной ДНК (Thermo Fisher Scientific). Целевой ДНК сайт анализируется с помощью секвенирования на платформе Illumina с целью определения числа вставок-делеций в ДНК, происходящих в целевом сайте по причине направленного двунитевого разрыва и последующей его репарации.
Для амплификации целевых фрагментов используют праймеры, фланкирующие предположительное место внесения разрыва.
После амплификации пробы готовятся по протоколу реагента Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB) для подготовки образцов к высокопроизводительному секвенированию. Затем проводится секвенирование на платформе Illumina 300cycles, прямое прочтение. Результаты секвенирования анализируются биоинформатическими методами. В качестве детекции разрезания принимается вставка или делеция нескольких нуклеотидов в целевой последовательности ДНК.
Доставка в виде рибонуклеинового комплекса осуществляется путем инкубации рекомбинантной формы PpCas9 NLS c направляющими РНК в CutSmart буфере (NEB). Рекомбинантный белок получают из бактериальных клеток-продуцентов, очищая его с помощью аффинной хроматографии (NiNTA, Qiagen) разделением по размеру (Superdex 200).
Белок смешивают с РНК в соотношении 1:2 (PpCas9 NLS :  sgRNA), инкубируют в течение 10 минут на комнатной температуре, затем смесь трансфицируют в клетки.
Далее проводится анализ экстрагированной из них ДНК на предмет вставок-делеций в целевом ДНК сайте (как описано выше).
Pasteurella pneumotropica
Охарактеризованная в настоящем изобретении нуклеаза PpCas9 из бактерии имеет ряд преимуществ относительно ранее охарактеризованных Cas9 белков.
PpCas9 обладает коротким, двухбуквенным, отличным от других известных Cas нуклеаз PAM мотивом, необходимым для функционирования системы. В изобретении было показано, что для функционирования PpCas9 достаточно присутствия короткого PAM мотива (RT), распложенного в 4 нуклеотидах от протоспейсера.
Известные на сегодняшний день большинство Cas нуклеаз, способных вносить двунитевые разрывы в ДНК, имеют сложные многобуквенные PAM последовательности, ограничивающие выбор последовательностей, пригодных для разрезания. Среди изученных Cas нуклеаз, распознающих короткие PAM, только PpCas9 может распознавать последовательности, фланкированные RT мотивом.
Второе преимущество PpCas9 – малый размер белка (1055 а.о). На сегодняшний день это единственный изученный малоразмерный белок, обладающий двухбуквенной RT PAM последовательностью.
PpСas9 – новая, малоразмерная Cas нуклеаза, имеющая короткий, простой в использовании PAM, отличающийся от известных на сегодняшний день PAM последовательностей других нуклеаз. Белок PpCas9 разрезает с высокой эффективностью различные ДНК-мишени, в том числе и при 37 °С, и может стать основой нового инструмента геномного редактирования.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий»
<120> СРЕДСТВО РАЗРЕЗАНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ CAS9 БЕЛКА ИЗ БАКТЕРИИ PASTEURELLA PNEUMOTROPICA
<130> 1
<160> 2
<210> 1
<211> 1055
<212> PRT
<213> Pasteurella pneumotropica
<220>
<223> белок, гомологичный Cas9
<400> 1
Met Gln Asn Asn Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Leu Gly Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Ile Gly Trp Ala Val Val Glu Ile Asp Glu Glu Ser Ser Pro
20                  25                  30
Ile Arg Leu Ile Asp Val Gly Val Arg Thr Phe Glu Arg Ala Glu Val
35                  40                  45
Ala Lys Thr Gly Glu Ser Leu Ala Leu Ser Arg Arg Leu Ala Arg Ser
50                  55                  60
Ser Arg Arg Leu Ile Lys Arg Arg Ala Glu Arg Leu Lys Lys Ala Lys
65                  70                  75                  80
Arg Leu Leu Lys Ala Glu Lys Ile Leu His Ser Ile Asp Glu Lys Leu
85                  90                  95
Pro Ile Asn Val Trp Gln Leu Arg Val Lys Gly Leu Lys Glu Lys Leu
100                 105                 110
Glu Arg Gln Glu Trp Ala Ala Val Leu Leu His Leu Ser Lys His Arg
115                 120                 125
Gly Tyr Leu Ser Gln Arg Lys Asn Glu Gly Lys Ser Asp Asn Lys Glu
130                 135                 140
Leu Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ile Ala Ser Asn His Gln Met Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Ser Glu Tyr Arg Thr Pro Ala Glu Ile Ala Val Lys Lys Phe Gln
165                 170                 175
Val Glu Glu Gly His Ile Arg Asn Gln Arg Gly Ser Tyr Thr His Thr
180                 185                 190
Phe Ser Arg Leu Asp Leu Leu Ala Glu Met Glu Leu Leu Phe Gln Arg
195                 200                 205
Gln Ala Glu Leu Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Thr Thr Leu Leu Glu Asn
210                 215                 220
Leu Thr Ala Leu Leu Met Trp Gln Lys Pro Ala Leu Ala Gly Asp Ala
225                 230                 235                 240
Ile Leu Lys Met Leu Gly Lys Cys Thr Phe Glu Pro Ser Glu Tyr Lys
245                 250                 255
Ala Ala Lys Asn Ser Tyr Ser Ala Glu Arg Phe Val Trp Leu Thr Lys
260                 265                 270
Leu Asn Asn Leu Arg Ile Leu Glu Asn Gly Thr Glu Arg Ala Leu Asn
275                 280                 285
Asp Asn Glu Arg Phe Ala Leu Leu Glu Gln Pro Tyr Glu Lys Ser Lys
290                 295                 300
Leu Thr Tyr Ala Gln Val Arg Ala Met Leu Ala Leu Ser Asp Asn Ala
305                 310                 315                 320
Ile Phe Lys Gly Val Arg Tyr Leu Gly Glu Asp Lys Lys Thr Val Glu
325                 330                 335
Ser Lys Thr Thr Leu Ile Glu Met Lys Phe Tyr His Gln Ile Arg Lys
340                 345                 350
Thr Leu Gly Ser Ala Glu Leu Lys Lys Glu Trp Asn Glu Leu Lys Gly
355                 360                 365
Asn Ser Asp Leu Leu Asp Glu Ile Gly Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Lys
370                 375                 380
Thr Asp Asp Asp Ile Cys Arg Tyr Leu Glu Gly Lys Leu Pro Glu Arg
385                 390                 395                 400
Val Leu Asn Ala Leu Leu Glu Asn Leu Asn Phe Asp Lys Phe Ile Gln
405                 410                 415
Leu Ser Leu Lys Ala Leu His Gln Ile Leu Pro Leu Met Leu Gln Gly
420                 425                 430
Gln Arg Tyr Asp Glu Ala Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp His Tyr Gly
435                 440                 445
Lys Lys Ser Thr Glu Thr Thr Arg Leu Leu Pro Thr Ile Pro Ala Asp
450                 455                 460
Glu Ile Arg Asn Pro Val Val Leu Arg Thr Leu Thr Gln Ala Arg Lys
465                 470                 475                 480
Val Ile Asn Ala Val Val Arg Leu Tyr Gly Ser Pro Ala Arg Ile His
485                 490                 495
Ile Glu Thr Ala Arg Glu Val Gly Lys Ser Tyr Gln Asp Arg Lys Lys
500                 505                 510
Leu Glu Lys Gln Gln Glu Asp Asn Arg Lys Gln Arg Glu Ser Ala Val
515                 520                 525
Lys Lys Phe Lys Glu Met Phe Pro His Phe Val Gly Glu Pro Lys Gly
530                 535                 540
Lys Asp Ile Leu Lys Met Arg Leu Tyr Glu Leu Gln Gln Ala Lys Cys
545                 550                 555                 560
Leu Tyr Ser Gly Lys Ser Leu Glu Leu His Arg Leu Leu Glu Lys Gly
565                 570                 575
Tyr Val Glu Val Asp His Ala Leu Pro Phe Ser Arg Thr Trp Asp Asp
580                 585                 590
Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Ala Asn Glu Asn Gln Asn Lys
595                 600                 605
Gly Asn Leu Thr Pro Tyr Glu Trp Leu Asp Gly Lys Asn Asn Ser Glu
610                 615                 620
Arg Trp Gln His Phe Val Val Arg Val Gln Thr Ser Gly Phe Ser Tyr
625                 630                 635                 640
Ala Lys Lys Gln Arg Ile Leu Asn His Lys Leu Asp Glu Lys Gly Phe
645                 650                 655
Ile Glu Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr Val Ala Arg Phe Leu Cys
660                 665                 670
Asn Phe Ile Ala Asp Asn Met Leu Leu Val Gly Lys Gly Lys Arg Asn
675                 680                 685
Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile Thr Ala Leu Leu Arg His Arg Trp
690                 695                 700
Gly Leu Gln Lys Val Arg Glu Gln Asn Asp Arg His His Ala Leu Asp
705                 710                 715                 720
Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr Val Ala Met Gln Gln Lys Ile Thr
725                 730                 735
Arg Phe Val Arg Tyr Asn Glu Gly Asn Val Phe Ser Gly Glu Arg Ile
740                 745                 750
Asp Arg Glu Thr Gly Glu Ile Ile Pro Leu His Phe Pro Ser Pro Trp
755                 760                 765
Ala Phe Phe Lys Glu Asn Val Glu Ile Arg Ile Phe Ser Glu Asn Pro
770                 775                 780
Lys Leu Glu Leu Glu Asn Arg Leu Pro Asp Tyr Pro Gln Tyr Asn His
785                 790                 795                 800
Glu Trp Val Gln Pro Leu Phe Val Ser Arg Met Pro Thr Arg Lys Met
805                 810                 815
Thr Gly Gln Gly His Met Glu Thr Val Lys Ser Ala Lys Arg Leu Asn
820                 825                 830
Glu Gly Leu Ser Val Leu Lys Val Pro Leu Thr Gln Leu Lys Leu Ser
835                 840                 845
Asp Leu Glu Arg Met Val Asn Arg Asp Arg Glu Ile Ala Leu Tyr Glu
850                 855                 860
Ser Leu Lys Ala Arg Leu Glu Gln Phe Gly Asn Asp Pro Ala Lys Ala
865                 870                 875                 880
Phe Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Lys Gly Gly Ala Leu Val Lys Ala Val
885                 890                 895
Arg Leu Glu Gln Thr Gln Lys Ser Gly Val Leu Val Arg Asp Gly Asn
900                 905                 910
Gly Val Ala Asp Asn Ala Ser Met Val Arg Val Asp Val Phe Thr Lys
915                 920                 925
Gly Gly Lys Tyr Phe Leu Val Pro Ile Tyr Thr Trp Gln Val Ala Lys
930                 935                 940
Gly Ile Leu Pro Asn Arg Ala Ala Thr Gln Gly Lys Asp Glu Asn Asp
945                 950                 955                 960
Trp Asp Ile Met Asp Glu Met Ala Thr Phe Gln Phe Ser Leu Cys Gln
965                 970                 975
Asn Asp Leu Ile Lys Leu Val Thr Lys Lys Lys Thr Ile Phe Gly Tyr
980                 985                 990
Phe Asn Gly Leu Asn Arg Ala Thr Ser Asn Ile Asn Ile Lys Glu His
995                 1000                1005
Asp Leu Asp Lys Ser Lys Gly Lys Leu Gly Ile Tyr Leu Glu Val Gly
1010                1015                1020
Val Lys Leu Ala Ile Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Val Asp Glu Leu Gly
1025                1030                1035                1040
Lys Asn Ile Arg Pro Cys Arg Pro Thr Lys Arg Gln His Val Arg
1045                1050                1055
<210> 2
<211> 3168
<212> DNA
<213> Pasteurella pneumotropica
<220>
<223> белок, гомологичный Cas9
<400> 2
atgcaaaata atccattaaa ttacatttta gggttagatt taggcattgc ttctattggt       60
tgggcggttg tggaaattga tgaggagagt tcacctattc gcttaattga tgtgggcgtc      120
cgtacatttg aacgggctga agtcgctaaa accggcgaaa gtttagcatt gtctcgtcgt      180
ttagctcgtt catcacggcg attaattaaa cgccgagcag agcgattaaa aaaagcaaaa      240
cgtttattaa aagcagaaaa gattttacat tctattgatg aaaaattacc cattaatgtt      300
tggcagcttc gagtaaaagg attgaaggaa aaactcgaac gtcaggagtg ggcagcggtt      360
ttattacatt tgtcaaagca tcgtggctat ttatcacaac gtaaaaatga gggtaaaagt      420
gataataaag agctgggggc attactttca ggtatcgcaa gtaaccacca aatgttgcaa      480
tcctccgaat atcgtacccc tgcagaaatt gcagtcaaaa aatttcaagt agaagaagga      540
catattcgta atcaacgtgg atcttatacc cataccttta gccgtttgga tttgttggca      600
gaaatggaat tattatttca acgccaagct gagttaggca attcttacac gtccaccaca      660
ttattagaaa atttgacggc gttactaatg tggcaaaagc cagctcttgc gggtgatgcg      720
attttaaaaa tgttgggcaa gtgtaccttc gaacccagcg aatataaagc cgcaaaaaat      780
agttattctg ctgaacgttt tgtgtggtta accaagctga ataatttacg cattttagaa      840
aatggcacgg aaagagcttt aaatgacaat gaacgttttg ctttgcttga gcaaccgtat      900
gagaaatcaa aattaactta tgctcaagtg agagcaatgc ttgcgttatc tgataatgct      960
attttcaaag gggttcgtta tttaggcgaa gataaaaaaa cagtagagag caaaactacg     1020
ttgatagaaa tgaagtttta tcatcaaatc cgcaaaacat taggcagtgc agaattaaaa     1080
aaggaatgga atgagttaaa aggcaattcc gatttattag atgagattgg cacggcattt     1140
tcgttgtata aaacggatga tgatatttgc cgttatttag agggaaaact accagaaagg     1200
gtattaaatg cgttattgga aaatttaaat ttcgataaat ttattcaact ttcacttaaa     1260
gccttacacc aaattttacc attgatgctg caagggcaac gttatgatga ggcggtttct     1320
gcgatttatg gtgatcatta tggtaaaaaa tcgacagaaa caacccgctt gttgccgact     1380
attcctgccg atgaaatccg aaatcctgtg gtattacgca ccctgaccca agcccgtaaa     1440
gtgatcaatg cggtggtgcg gttatatggt tcgcctgccc gtattcatat tgaaacagcg     1500
agagaagtcg gcaaatctta ccaagatcgt aaaaaacttg aaaaacagca agaagataat     1560
cgtaagcaac gtgaaagtgc ggtcaaaaaa tttaaagaaa tgtttccgca ttttgtgggg     1620
gagccgaaag gtaaagatat tttaaaaatg cgattgtatg agttacaaca agcgaaatgt     1680
ttatattctg gaaaatcttt agaacttcat cgtttgcttg agaaggggta tgtagaagtg     1740
gatcacgctt tgccattttc tcgcacgtgg gatgatagct ttaataataa agtactggtg     1800
cttgccaacg agaaccaaaa taaaggcaat ttaacgcctt atgaatggtt agatggtaaa     1860
aataacagtg agcgttggca acattttgtt gtacgagtac aaaccagcgg tttctcttat     1920
gctaaaaaac aacgcatttt gaaccataaa ttggatgaaa aagggtttat cgaacgtaat     1980
ttaaacgata ctcgctatgt agctcgtttc ttatgtaact ttattgccga taatatgttg     2040
ttggttggta aaggcaagcg aaacgtgttt gcttcaaacg ggcaaatcac ggcgttattg     2100
cggcatcgtt ggggcttaca aaaagtgcgt gaacagaatg atcgccacca cgcactggac     2160
gcggttgtgg tggcttgctc tactgtggca atgcaacaaa aaatcactcg atttgtgaga     2220
tataacgaag gaaatgtctt tagcggtgaa cgtatcgatc gtgaaactgg cgagattatt     2280
ccattacatt ttccaagccc ttgggctttt ttcaaagaga atgtggaaat tcgcattttt     2340
agtgaaaatc caaaattgga attagaaaat cgcctgcctg attatccgca atataatcac     2400
gaatgggtgc aaccattgtt tgtttcgaga atgccaaccc gaaaaatgac agggcaaggg     2460
catatggaaa cggtaaaatc cgcaaaacga ttaaatgaag gtttaagtgt gttaaaagtc     2520
cctttaacac aacttaaatt gagtgattta gaacgaatgg ttaatcgtga tcgtgaaatt     2580
gcattgtatg aatccttaaa agcacgttta gagcaatttg gtaacgaccc agccaaagcc     2640
tttgccgaac cattctataa aaagggtggg gcattagtca aagcagtccg attggaacaa     2700
acacaaaaat cgggggtatt agtacgtgat ggtaacggtg ttgcggataa tgcttcaatg     2760
gtacgggttg atgtttttac taaaggtgga aaatatttct tagtgccgat ttatacttgg     2820
caggtagcga aagggatttt accgaatagg gctgcgacac aaggtaaaga tgaaaatgat     2880
tgggatatta tggatgaaat ggctactttc caattttctc tatgtcaaaa tgatctaatt     2940
aaattagtta ccaaaaagaa aacaatcttt ggatatttta atggattaaa tagagctact     3000
agcaatataa atattaaaga gcatgatcta gataagtcta aagggaaatt aggtatttac     3060
ttagaagttg gtgtaaaact agctatttcc cttgaaaagt accaagtcga cgaactcggc     3120
aaaaatatcc gtccttgtcg tccgactaaa cgacagcacg tgcgttaa                  3168
<---