ИНСЕРЦИОННЫЙ МУТАНТ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI - МОДЕЛЬНЫЙ ШТАММ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА МЕХАНИЗМОВ ФОРМИРОВАНИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ У ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ
INSERTION MUTANT BURKHOLDERIA PSEUDOMMALLEI-MODEL STRAIN FOR MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF MECHANISMS OF FORMATION OF MULTIPLE ANTIBIOTIC RESISTANCE IN PATHOGENIC BURKHOLDERIA

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается конструирования транспозон-индуцированного мутанта возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei, несущего инактивированные последовательности генов лекарственного эффлюкса (multidrag efflux pumps) и хромосомных b-лактамаз класса А для использования в качестве модельного микроорганизма при анализе молекулярно-генетических основ множественной лекарственной устойчивости В. pseudomallei и близкородственных видов бактерий. Штамму присвоен номер КМ31 Государственной Коллекции Патогенных Бактерий «Микроб» (ГКПБ «М»). Особенностями штамма являются опосредованные инсерциями транспозона Тn9 дефекты продукции хромосомной b-лактамазы класса D (BlaD) и мембранных эффлюкс-белков Mr 27 и 71 kDa, сопровождающиеся снижением резистентности к антибиотикам цефалоспоринового ряда.
Микроорганизмы рода Burkholderia характеризуются высокой природной устойчивостью к различным антимикробным соединениям, однако, молекулярные основы лекарственной резистентности патогенных видов буркхольдерий (В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis) остаются мало изученными. Предполагается, что резистентность В. pseudomallei к отдельным классам антимикробных соединений может быть обусловлена функционированием эффлюкс-систем широкого спектра [4, 5, 6, 10], расширением спектра ферментной инактивации ингибиторов [12], изменением проницаемости клеточных оболочек для ряда антимикробных соединений [3].
Расшифровка механизмов формирования множественной лекарственной резистентности требует разработки адекватных модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих устойчивость к тем или иным группам антимикробных соединений. Необходимыми элементами здесь являются специальные маркированные штаммы с измененной чувствительностью к антибактериальным препаратам.
Известен ряд примеров конструирования маркированных штаммов различных видов патогенных буркхолдерий. Так, для анализа систем генетического обмена возбудителей мелиоидоза и сапа, методами химического и инсерционного мутагенеза был получен набор штаммов В. pseudomallei и В. mallei, несущих маркеры ауксотрофности, температурочувствительности, дефекты продукции отдельных внеклеточных ферментов [1, 2]. Для функциональной характеристики системы лекарственного эффлюкса amrAB-oprD был получен штамм В. pseudomallei с делетированной последовательностью эффлюкс-оперона, характеризующийся утратой устойчивости к антибиотикам аминогликозидной и макролидной групп [10]. Для изучения феномена расширения спектра субстратной специфичности хромосомных b-лактамаз возбудителя мелиоидоза получены лабораторные варианты, несущие аминокислотные замены в консервативных доменах ферментов и мутации в генах репрессоров blaA и blaD [7, 8, 12]. Вместе с тем, маркированных штаммов патогенных буркхолдерий, несущих изменения в детерминантах резистентности различных функциональных групп и предназначенных для генетического анализа механизмов формирования множественной лекарственной устойчивости до настоящего времени получено не было.
Штамм В. pseudomallei 57576 SMR2, послуживший прототипом сконструированному штамму В. pseudomallei 57576 SMRT21 (КМ31), является селекционированным стабильным вариантом штамма дикого типа В. pseudomallei 57576 и имеет повышенный уровень резистентности к антимикробным соединениям цефалоспоринового (МПК 200 мкг/мл) и фторхинолонового (МПК>500 мкг/мл) рядов. Данный полирезистентный вариант характеризуется повышенной экспрессией ряда мембранных эффлюкс-протеинов и продуцирует b-лактамазу класса D с цефалоспориназной активностью.
r
Целью изобретения является получение стабильного мутанта В. pseudomallei с инактивированным геном хромосомной b-лактамазы класса D {blaD) и дефектами продукции эффлюкс-белков M27 и 71kDa, сохраняющего свои свойства при хранении, культивировании на питательных средах и при пассажах через организм лабораторных животных, и предназначенного для исследования роли данных R-детерминант в развитии лекарственной устойчивости множественного типа у возбудителя мелиоидоза и близкородственных микроорганизмов.
S
S
Заявляемый штамм В. pseudomallei KM31 получен в результате направленного генетического конструирования, включающего этапы инсерционного мутагенеза клеток полирезистентного варианта В. pseudomallei 57576, отличающегося высоким уровнем устойчивости к цефалоспоринам и фторхинолонам, путем встраивания в его хромосому транспозона Tn9 из репликона RP1::Tn9 T от донора Е. coli K-12 (RP1::Tn9) T, отбор мутантных клонов, утративших устойчивость к препаратам b-лактамной группы с последующим скринингом дефектов продукции индивидуальных поринов наружной мембраны и экспрессии хромосомной b-лактамазы класса D.
Основные свойства штамма:
кулътурально-морфологические: грамотрицательные полиморфные палочки, растут в факультативных аэробных условиях на полноценных питательных средах (L-агар, МПА, МПБ, agar и бульон Хоттингера, Nutrient agar (Difco), Nutrient broth (Difco), Pseudomonas agar P (Difco) при оптимуме температуры 37°С и оптимальной рН 6.8-7.2. На плотных питательных средах через 24 ч культивирования формируются полупрозрачные колонии цвета среды в S-форме, через 48 ч и более происходит морфологическая диссоциация колоний с образованием S-R вариантов. В бульоне через 24-48 ч культура вызывает помутнение среды и образование пленки на поверхности;
биохимическая активность: в тесте Хью-Лейфсона окисление глюкозы (+), ферментация (-); оксидаза (+), каталаза (+), желатиназа (+), аргининдигидролаза (+), лизиндекарбоксилаза (-), орнитиндекарбоксилаза (-), Аrа (-);
устойчивость к антибиотикам: резистентен к офлоксацину (МПК>500 мкг/мл), пефлоксацину (МПК>500 мкг/мл), хлорамфениколу, канамицину (МПК>500 мкг/мл), чувствителен к цефтазидиму (МПК<25 мкг/мл);
отношение к видовым диагностическим сывороткам: агглютинируется диагностической мелиоидозной сывороткой;
r
антигенный спектр: дефектен по продукции белков наружной мембраны M27 и 71kDa;
50
3
вирулентность: обладает сниженной вирулентностью для белых мышей (LD>1×10 м.к.).
питательные потребности: прототроф
R
R
S
S
R
R
R
-
генетические особенности: Ofx Pfx Caz (chr::Tn9) RP1::Tn9 T Cm Tc Km BlaD
Полученный в результате конструирования штамм В. pseudomallei 57576 SMRT21 депонирован в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») под номером КМ31.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Определение основных культуральных свойств инсерционного мутанта В. pseudomallei КМЗ 1.
При посеве в L-бульон (рН 6.8) через 48 ч при 37°С культура штамма В. pseudomallei КМ31 дает рост в виде равномерного помутнения питательной среды с образованием на поверхности тонкой пленки. На пластинках L-агара через 24-48 ч образует полупрозрачные колонии цвета среды в гладкой (S) форме. При посеве на агар Хоттингера через 48 ч наблюдается образование диссоциативных S-R или R-вариантов. В мазках из бульонных и агаровых культур клетки имеют вид грамотрицательных полиморфных палочек.
Штамм имеет спектр биохимической активности, характерный для В. pseudomallei.
-
На среде Хью-Лейфсона окисляет, но не ферментируют глюкозу; обладает оксидазной, каталазной, аргининдигидролазной и желатиназной активностями; не проявляет лизиндекарбоксилазную и орнитиндекарбоксилазную активность; не утилизирует из минимальной среды арабинозу (Аrа).
Результаты определения устойчивости штамма к антибиотикам различных классов приведены в таблице 1.
2
3
4
4
2
50
Вирулентность мутанта В. pseudomallei KM31 определяли на белых мышах. Животных заражали внутрибрюшинно (10 животных в группе) культурой штамма в дозах 1×10, 1×10, 1×10 м.к. В течение времени наблюдения (20 сут) отмечали гибель 50% животных от дозы 1×10 м.к. (LD дикого штамма -1×10 м.к.).
Пример 2. Анализ экспрессии мажорных белков клеточных мембран инсерционного мутанта В. pseudomallei КМ31.
Для изучения экспрессии белков клеточных мембран у сконструированного штамма В. pseudomallei использовали электрофорез в SDS-полиакриламидных гелях по Laemmli [9] и иммуноблоттинг по Towbin [11] препаратов мембранных белков с иммуноглобулинами поликлональных козлиных сывороток к препарату наружной мембраны В. pseudomallei.
r
r
r
Анализ препаратов клеточных мембран, выделенных из исследованных штаммов, в SDS-PAGE и иммуноблоттинге показал, что у полирезистентного варианта 57576 SMR2 наблюдалась гиперпродукция мажорных белков M27, 39, 71 kDa и исчезновение белка M45 kDa (фиг.1), тогда как инсерционный мутант KM31 характеризовался утратой продукции мажорных мембранных протеинов M27 и 71 kDa (фиг.2).
Пример 3. ПЦР-анализ последовательности гена blaD инсерционного мутанта В. pseudomallei КМ31.
Детекцию последовательности blaD проводили в полимеразной цепной реакции с парой праймеров blaDfw и blaDrv, специфичных фланкирующим регионам кодирующих последовательностей b-лактамаз класса D Burkholderia pseudomallei (табл.2).
9
2
Культуры исследуемых штаммов выращивали на Nutrient agar (Difco) в течение 24-48 ч при 37°С. 200 мкл бактериальной суспензии в 0.15 М NaCl pH 7.2 плотностью 2×10м.к./мл смешивали с равным объемом лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 100 мМ КСl, 5 мМ MgCl 0.2 мг/мл желатина, 0.9% Nonidet P-40, 0.9% Твин 20, 150 мкг/мл про-теиназы К), аккуратно перемешивали, инкубировали при 65°С 120 мин и прогревали при 96°С 30 мин для инактивации фермента. Пробы центрифугировали (10.000 об/мин, 1 мин), 10 мкл супернатанта использовали при постановке ПЦР. Последовательность гена blaD амплифицировали по программе: прогрев 94°С 5 мин, 35 циклов (94°С 30 с, 60°С 30 с, 72°С 45 с), финальная элонгация 72°С 5 мин. Продукты ПЦР анализировали в 1,5% агарозном геле.
В результате проведенного анализа установлено, что штаммы В. pseudomallei дикого типа и вариант с высоким уровнем устойчивости к препаратам цефалоспоринового ряда несут интактную последовательность гена b-лактамазы D, тогда как у инсерционного мутанта В. pseudomallei КМЗ 1 данная последовательность нарушена в результате инсерции Tn9 и не детектируется в ПЦР со специфическими праймерами (фиг.3).
Таблица 1
Устойчивость исходных штаммов и транспозон-индупированного мутанта В. pseudomallei к антибиотикам различных классов
Штамм
Фенотип резистентности
МПК, мкг/мл
Ofx
Pfx
Caz
Cm
Km
57576
Ofx<sup>S</sup> Pfx<sup>S</sup> Cfz<sup>S</sup> Cm<sup>R</sup>
10
10
25
>100
>100
57576 SMR2*
Ofx<sup>R</sup> Pfx<sup>R</sup> Cfz<sup>R</sup> Cm<sup>R</sup>
>500
>500
200
>500
>100
57576 SMRT21 (КМ31)
Ofx<sup>R</sup> Pfx<sup>R</sup> Cfz<sup>S</sup> Cm<sup>R</sup>
>500
>500
<25
>500
>100
Примечания: Ofx - офлоксацин, Pfx - пефлоксацин, Caz - цефтазидим. Cm - хлорамфеникол, Km - канамицин, * - полирезистентный вариант, использованный при транспозонном мутагенезе. МПК определена для инокулума 5×10<sup>4</sup> м.к. на L-агаре.