Изучение полиморфизма однонуклеотидных фрагментов au r гена металлзависимой протеазы штаммов Staphylococcus aureus, выделенных с кожи больных атопическим дерматитом

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

УДК 616.5-002-056.43-022:579.862.1]:575.174.015.3.08

Ю.А. Тюрин1'2, А.Ф. Шамсутдинов1, Р. С. Фассахов1

изучение полиморфизма однонуклеотидных фрагментов AUR гена металлзависимой протеазы штаммов staphylococcus aureus,

выделенных с кожи больных атопическим дерматитом

Федеральное бюджетное учреждение науки Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, лаборатория микробиологии, РФ, 420015, Казань; 2Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Казанский государственный медицинский университет Министерства

здравоохранения Российской Федерации, 420012, Казань, Россия

Цель - изучить гетерогенность внутренних фрагментов гена aur, кодирующего протеолитический фермент ауреолизин у штаммов Staphylococcus aureus c с различной ферментативной активностью, которые были выделены с пораженной кожи пациентов с атопическим дерматитом. Материалы и методы. В исследование были включены 125 пациентов в возрасте от 1 года до 35 лет с диагнозом атопиче-ского дерматита. Изучено 100 клинических штаммов Staphylococcus aureus в монокультуре. Идентификацию штаммов Staphylococcus aureus, кожи проводили стандартными классическими методами и подтверждали проведением видовых биохимических микротестов с помощью набора API Staph. 20 («bioMerieux SA», Франция). В работе использовали референс-штаммы S. aureus ATCC 29213, NCTC 8325. Специфические локусы гена aur детектировали методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции. Протеолитическую активность супернатантов определяли по способности расщеплять субстрат (human IgG, «Sigma») на фрагменты, используя в качестве ингибиторов металлопротеаз 0,01-0,1М растворы ЭД-ТА натрия. Секвенирование амплифицированных областей гена aur, включая предварительные этапы по выделению и очистке ДНК, были выполнены в ЗАО «Синтол», Москва. Результаты. В исследовании установлено, что у разных штаммов на высококонсервативном участке ампликона фрагмента гена aur может находится до 9 полиморфных нуклеотидов, при этом индекс нуклеотидного разнообразия для протеолитически активных штаммов был меньше (Pi= 0,04), чем для протеолити-чески неактивных (Pi=0,07, p<0,05). Необходимо отметить, что все протеолитически активные штаммы были выделены с кожи пациентов с тяжелой и средней степенью тяжести атопического дерматита (67,8±5,4 балла по шкале SCORAD), с эритематозно-сквамозной формой заболевания, а неактивные штаммы выделялись у пациентов старшей возрастной группы с легкой степенью тяжести атопического дерматита (лихеноидная форма). Ключевые слова: ауреолизин; ген aur; полиморфизм одно-нуклеотидный; Staphylococcus aureus; атопический дерматит.

Изучена гетерогенность внутренних фрагментов гена aur, кодирующего ауреолизин, у штаммов, выделенных с кожи пациентов, страдающих атопическим дерматитом. Штаммы, образующие этот фермент при атопическом дерматите, являются своего рода триггером воспалительных процессов в покровном эпителии вследствие многообразных патофизиологических эффектов данного фермента на кератиноциты кожи [9]. Ауреолизин представляет собой термолизин-подобную эндопептидазу, относящуюся к семейству M4, цинкзависимых белков, стабилизируемых ионами Ca2+ [5, 6]. Ауреолизин - необходимый фактор вирулентности стафилококков, обеспечивающий про-теолитическую посттрансляционную модификацию поверхностного фактора адгезии стафилококка ClfB и активацию других секретируемых протеаз, что в итоге обеспечивает трансформацию штаммов с выраженными адгезивными свойствами в штаммы с инвазивными свойствами [8, 10, 14]. В связи с этим нами проведено исследование генетической гетерогенности фрагментов гена aur у клинических изо-

лятов S. aureus, различающихся протеолитическими свойствами.

Материалы и методы

В исследование были включены 125 пациентов в возрасте от 1 года до 35 лет с диагнозом атопического дерматита. С участков пораженной кожи у 95 из них были изолированы 100 клинических штаммов S. aureus в монокультуре. У 30 пациентов с атопическим дерматитом с участков пораженной кожи были выделены коагулазоотрицательные стафилококки в ассоциации с грибами рода Candida spp.

У всех пациентов определяли тяжесть заболевания по оценочной шкале SCORAD [16]. По тяжести заболевания пациенты, инфицированные S. aureus, были разделены на 2 группы. Первая группа включала лиц в возрасте от 1 года до 13 лет c эритематозно-сквамозной формой заболевания среднетяжелой и тяжелой степени (67,8±5,4 балла по шкале SCORAD) и с высоким уровнем колонизации пораженной кожи (104 - 105 КОЕ на 1 см2). Вторая группа включала пациентов (n = 25) в возрасте от 12 до 25 лет с лихеноидной формой заболевания легкой степени (27,5±4,7 балла по шкале SCORAD) и невысоким уровнем колонизации (103 КОЕ/см2) пораженной кожи S. aureus.

Идентификацию штаммов S. aureus, выделенных с кожи, проводили стандартными классическими методами [1] и подтверждали дополнительным проведением видовых биохимических микротестов с помощью набора API Staph. 20 («bioMerieux SA», Франция) в лаборатории микробиологии ФБУН КНИИЭМ (зав. лаб. Л.Т. Баязитова). Контроль качества проводили на референс-штаммах Staphylococcus aureus ATCC 29213 и NCTC 8325.

Культивирование штаммов S. aureus проводили в мясопеп-тонном бульоне (МПБ, Россия) в течение 18 ч. Для индукции протеолитической активности в культуральную среду добавляли раствор А (1,5% раствор человеческого сывороточного альбумина, разведенного в стерильной питательной среде 199) в соотношении 1 мл раствора А на 100 мл МПБ. Выращенные бактерии центрифугировали при 3800 g при температуре 4°С в течение 30 мин. Осадок использовали для выделения бактериальной ДНК с помощью наборов ZR Genomic DNA II KitTM, супернатанты использовали для определения протеолитической активности.

Протеолитическую активность супернатантов определяли по количеству расщепленного иммуноглобулина (IgG человека, «Sigma», США) оригинальным способом [2]. Активность супер-натантов выражали в условных единицах (усл.), где 1 ед. соответствовала расщеплению 1 микромоля субстрата в 1 мл супер-натанта за 1 мин при температуре 25°С.

Специфические участки S. aureus выявляли методом мульти-праймерной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использовали специфичные для гена aur праймеры (из работы [16]): aur-F: 3-TAGTAGCACACGAATTAACACACG-5, aur-R: 3 - TTCCCT-ATTGCTTGAATCACG-5; и специфичные для гена yqiL (праймеры из работы [17]): yqiL-R: 5-cagcatacaggacacctattggc-3, yqiL-F: 5-CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC-3. Ген yqiL кодирует фермент фосфат-ацетилтрансферазу (КФ 2.3.1.9) и является конститутивным. Синтез праймеров осуществлен в ЗАО «Синтол» (Москва, Россия). Амплификацию исследуемых фрагментов ДНК выполняли, используя 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl pH 9,0; 50 мМ KCl; 2 мМ MgCl2, по 250 мкМ каждого дНТФ, 2,5 ед. TaqF полимеразы и по 15 нмоль каждого праймера. Реакцию амплификации проводили на амплифи-каторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 95°С - 3 мин, 30 циклов: 94°С - 1 мин, 65°С - 1 мин, 72°С - 1 мин. Продукты амплификации (праймерспецифические

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №1, 2014

Протеолитические свойства штаммов S. aureus с секвенирован-ными фрагментами гена aur

Штаммы

Протеолитическая активность супернатантов, усл. ед.

S. aureus ATCC 29213 S. aureus NCTC 8325 S. aureus 2 S. aureus 7 S. aureus 3 S. aureus 33 S. aureus 14 S. aureus 13 S. aureus 39

1,2±0,02-10-5 1,5±0,02-10-5 0,98±0,09-10-5 0,79±0,0L10-5 1,4±0,0240-5 0,77±0,0240-5 0 0 0

ампликоны для гена aur - 498 п.н. и генаyqiL - 393 п.н.) анализировали методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле, используя для визуализации интеркалирующий краситель этидиум-бромид и маркеры FastRuler Low Range DNA Ladder. Визуализацию и фотосъемку гелей проводили с использованием транслюминатора «Vilber Lourmat» (Франция) и системы обработки изображений «Биотест-1» (Россия).

Для секвенирования амплифицированных областей гена aur использовали те же праймеры - aur-F и aur-R, что и для амплификации, и тот же протокол программы амплификации. Работы по секвенированию, включая предварительные этапы по выделению и очистке ДНК, были выполнены в ЗАО «Синтол» (Москва).

Методы специального анализа данных. Анализ и выравнивание последовательностей внутреннего фрагмента гена aur проводили с использованием программы BLASTN V.2.2.27+ на сайте NCBI (URL:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi). Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей внутреннего фрагмента проводили с помощью набора статистических функций программы DnaSP v. 5.01.

Результаты и обсуждение

При анализе супернатантов было установлено, что в случае 23 (23%) штаммов не было обнаружено про-теолитической активности супернатантов, как в условиях индукции активности, так и при ее отсутствии, а супернатанты 77 (77%) штаммов обладали протеоли-тической активностью, но 37 штаммов обнаруживали протеолитическую активность при отсутствии индукции, а 40 штаммов - только при ее индукции. Те 23 штамма, которые при росте на жидкой среде не образовывали протеолитически активных супернатан-тов, были выделены с кожи пациентов с лихеноидной формой атопического дерматита легкой степени (возраст пациентов составил от 20 до 35 лет).

Методом мультипраймерного ПЦР-анализа выявлены праймерспецифические ампликоны («500 п.о.) гена aur и праймерспецифические ампликоны («395 п.н.) гена yqi (гена "домашнего хозяйства"), у 95 штаммов S. aureus, у 5 клинических штаммов данные ампликоны не выявлялись, поэтому эти штаммы были отнесены нами к нетипируемым и исключены из дальнейшего исследования.

Методом случайной выборки из 95 штаммов нами были сформированы 2 группы из протеолитически активных (n = 4: 2, 7, 3, 33) и протеолитически неактивных (n = 3: 14, 13, 39) штаммов (см. таблицу).

Секвенирование ампликонов фрагментов гена aur выбранных штаммов показало высокую степень гомологии (89-98%) с фрагментом генома штамма S. aureus NCTC 8325 (gi|88193823|ref|NC_007795.1), который

Штаммы

S. aureus NCTC 8325 S. aureus № 2 S. aureus № 7 S. aureus № 3 S. aureus № 33

S. aureus NCTC 8325 S. aureus № 39 S. aureus № 14 S. aureus № 13

Аминокислотная последовательность

230

.HQGKL .HQG .HQG .HQG .HQG

RL RL RL

2Ю

..HQGKL

,HR .HR

..HQG

RL RL RL

SAFSF NDQTG SAFSF NDQTG SAFSF NDQTG SAFSF NDQTG SAFSF NDQTG A

SAFSF NDQTG SAFSF NDQTFV SAFSF NDQTfV SAFSF N@QTG

В

255

QATLI TNEDE N... QATLI TNEDE D... QATLI TNEDE S...

QA@LI TNEDE N... QATLI TNEDE D...

QATLI TNEDE N....

QAS Q^S

LI TNG LI TNG

DE N... DE N...

QATLI TNGDE

Фрагмент аминокислотной последовательности стафилококкового фермента ауреолизина. В рамку взяты замены аминокислот, установленные у изолятов по сравнению с референс-штаммом S. aureus NCTC 8325. А - первичная аминокислотная последовательность у протеолитически активных изолятов S. aureus (2, 3, 7, 33); B - первичная аминокислотная последовательность у протеолитически неактивных изолятов S. aureus (39, 14,13). Протеолитически активный референс-штамм S. aureus NCTC 8325.

относится к гену aur, кодирующему Zn-зависимую ме-таллопротеазу.

При анализе однонуклеотидных полиморфизмов в ампликонах фрагментов ДНК клинических штаммов рассчитывали показатель нуклеотидного разнообразия (Pi), характеризующий число нуклеотидных различий на определенном участке между двумя сравниваемыми последовательностями [17]. Установлено, что показатель нуклеотидного разнообразия (Pi = 0,04) в группе протеазоактивных штаммов был меньше, чем в группе протеазонеактивных (Pi = 0,07): число полиморфных однонуклеотидных участков в 1-й группе составило 6, а в группе протеазонеактивных - 9. Всего при анализе всех ампликонов фрагментов aur-гена и попарном их сравнении установлено 14 точечных мутаций, при этом стоп-кодонов выявлено не было.

Сравнение транслированных нуклеотидных последовательностей с эталонными штаммами S. aureus ATCC 29213, и NCTC 83-25 (см. рисунок), проведенное с использованием программы BLASTX V.2.2.27+, показало, что для всех клинических штаммов характерна одна общая аминокислотная замена в положении Lys233Arg (см. рисунок). Протеолитически активные штаммы содержат также еще по одной аминокислотной замене в одном из положений: Asn255Asp, Asn255Ser, Thr247Ala. Что касается протеолитически неактивных штаммов, то у данных штаммов выявлены дополнительно по 3 или 4 аминокислотные замены в зависимости от штамма, в следующих положениях: Gln231Arg, Gly244Val, Thr247Ser, Glu252Gly (см. рисунок).

В многочисленных микробиологических исследованиях показано, что условно-патогенный вид S. aureus способен интенсивно колонизировать кожу пациентов с атопическим дерматитом вследствие повреждения местных защитных механизмов [9, 11, 15]. Большинство

штаммов секретируют протеолитические ферменты, при этом ключевая роль в активации других секретируе-мых стафилококковых протеаз принадлежит ауреолизи-ну [7]. Ауреолизин кодируется геном aur, содержащим множество полиморфных участков, формирующих несколько аллельных форм [13, 18]. В нашем исследовании установлено, что у разных штаммов на высококонсервативном участке ампликона фрагмента гена aur может находится до 9 полиморфных нуклеотидов, при этом индекс нуклеотидного разнообразия для протеоли-тически активных штаммов был меньше (Pi = 0,04), чем для протеолитически неактивных (Pi = 0,07; p < 0,05). Необходимо отметить, что все протеолитически активные штаммы были выделены с кожи пациентов с тяжелой и средней степенью тяжести атопического дерматита (67,8±5,4 балла по шкале SCORAD), с эритематозно-сквамозной формой заболевания, а неактивные штаммы выделялись у пациентов старшей возрастной группы с легкой степенью тяжести атопического дерматита (ли-хеноидная форма).

По данным литературы, ген aur отличается большим числом полиморфизмов, индекс нуклеотидного разнообразия для полного гена составляет Pi = 0,05, что почти в 5 раз больше, чем для других генов «домашнего хозяйства» S. aureus, которые традиционно используются для видового MLST-типирования [12]. Выявленные нами генетические особенности протеолитически неактивных штаммов, в частности обнаружение большего числа мутантных аллелей по сравнению с протеолитически активными штаммами, может приводить к изменению формирования активного центра протеолитического фермента у этих штаммов и как следствие - к ослаблению вирулентности стафилококков, заселяющих пораженные участки кожи при атопическом дерматите.

Сведения об авторах

Тюрин Юрий Александрович (Tjurin Jurij Aleksandrovich) - вед. науч. сотр., зав. лаб. иммунологии и разработки аллергенов, ФБУН КНИИЭМ, Роспотребнадзора, Казань; ассистент каф. биологической химии Казанского государственного медицинского университета, e-mail: immunolab@yandex.ru;

Шамсутдинов Антон Феликсович (Shamsutdinov Anton Feliksovich) - мл. науч. сотр., лаб. иммунологии и разработки аллергенов, ФБУН КНИИЭМ Роспот-ребнадзора, Казань, e-mail: shamsutdinov@mail.ru;

Фассахов Рустэм Салахович (Fassahov Rustjem Salahovich) - д-р мед. наук, проф., дир. ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора; зав. каф. аллергологии и иммунологии, Казань, e-mail: farrys@mail.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дмитренко О.А., Белокрысенко С.С., Лаврова Н.В., Прохоров В.Я., Гинцбург А.Л. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2006; 8 (2, Прилож. 1): 15.

2. Патент РФ №2373538. Способ определения IgG-протеиназной активности. Тюрин Ю.А., куликов С.Н., Фассахов Р.С. и др. Бюллетень изобретений № 32 от 20.11.2009.

3. ArvidsonS. Biochim. Biophys. Acta. 1973; 302: 149-57.

4. Banbula A., Potempa J., Travis J., Fernandez-Catalan C., Mann K., HuberR, Bode W, MedranoF. Structure. 1998; 6: 1185-93.

5. Hirasawa Y., Takai T., Nakamura T., MitsuishiK., GunawanH., Suto H. et al. J. Invest. Dermatol. 2010; 130: 614-7.

6. KubicaM., GuzikK., Koziel J., Zarebski M., Richter W. et al. PLoS

ONE. 2008; 3(1): e1409.

7. Lee S.E., Jeong S.K., Lee S.H. Yonsei Med. J. 2010; 51(6): 808-22.

8. McAleese F.M., Walsh E.J., Sieprawska M., Potempa J., Foster T.J. J. Biol. Chem. 2001; 276: 29969-78.

9. Ohnemus U., KohrmeyerK., HoudekP., Rohde H., Wladykowski E., VidalS. et al. J. Invest. Dermatol. 2008; 128: 906-16.

10. Sabat A. J., Wladyka B., Kosowska-Shick K., Grundmann H., van Dijl J.M., Kowal J. et al. BMC Microbiology. 2008; 8: 129.

11. Sabat A., KosowskaK., PoulsenK., KasprowiczA., SekowskaA., van den BurgB. et al. Infect. Immun. 2000; 68: 973-6.

12. Shaw L., Golonka E., Potempa J., Foster S. J. Microbiology. 2004; 150: 217-28.

13. Sieprawska-Lupa M., Mydel P., Krawczyk K., Wojcik K., Puklo M., LupaB. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 8: 4673-9.

14. Karlsson A., Arvidson S. Variation in extracellular protease Production among clinical isolates of Staphylococcus aureus due to different levels of expression of the protease repressor sarA. Infect. Immun. 2002; 4239-46.

15. Enright M.C., Day N.P.J., Davies C.E., Peacock S.J., Spratt B.G. Multilocus Sequence typing for characterization of methicillin-resis-tant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(3): 1008-15.

16. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD index. Consensus Report of the European task Force on Atopic Dermatitis. Dermatology. 1993; 186(1): 23-31

17. NeiM., Miller J.C. A Simple method for estimating average number of nucleotide substitutions within and between populations from restriction data. Genetics. 1990; 125: 873-9.

18. Kuhn G., Francioli P., Blanc D.S. Evidence for clonal evolution among highly polymorphic genes in methicillin-resistant Staphylo-coccus aureus. J. Bacteriol. 2006; 188: 169-78.

Поступила 16.04.13

A STUDY OF THE SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM FRAGMENTS OF THE AUR GENE METALLOPROTEASE STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATED FROM THE SKIN OF PATIENTS WITH ATOPIC DERMATITIS

Yu. A. Tuyrin1,2, A.F. Shamsutdinov1, and R. S. Fassahov1

1 Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan, Russia; 2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Objective: to study the heterogeneity of internal fragments of the aur gene coding a proteolytic enzyme aureolysin in strains of Staphylococcus aureus with different enzymatic activity, which were allocated with the affected skin of patients with atopic dermatitis. Materials and methods: the study included 125 patients aged 1 to 35 years old with the diagnosis of atopic dermatitis. 100 clinical strains of Staphylococcus aureus were studied in monoculture. Identification of the strains of Staphylococcus aureus in skin was performed using standard classical methods. Specific biochemical microtests using a set of APIs Staph 20 (bioMerieux SA, France) were conducted to confirm the obtained results. Reference strains of S. aureus ATCC 29213, NCTC at 8.325 were used. Specific aur gene loci were detected by the method of multiplex polymerase chain reaction. Proteolytic activity was determined by the ability to split the substrate (human IgG, Sigma) into fragments using as inhibitors of matrix 0.01-0.1M solutions of sodium EDTA. The sequencing of the amplified areas of aur gene, including the preliminary stages of separation and purification of DNA, was performed by Syntol, Moscow. Results: different strains of the conservative plot amplicon fragment of aur contains up to 9 polymorphic nucleotides. The index of the nu-cleotide diversity for proteolytic active strains was less (Pi = 0.04) than for proteolytically inactive (Pi = 0.07), p < 0.05. It should be noted that all proteolytically active strains were isolated from the skin of patients with high and moderate severity of atopic dermatitis (67.8 ± 5.4 points on SCORAD scale) with erythematous form of the disease. The inactive strains were allocated in patients of older age with reduced severity of atopic dermatitis (with the dry form of skin lesions). Key words: aureolysin; aur gene; single nucleotide polymorphism; Staphylococcus aureus atopic dermatitis