ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕСЯ ЭКСПАНСИЕЙ ГЕКСАНУКЛЕОТИДНЫХ ПОВТОРОВ В ЛОКУСЕ C9ORF72

1. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, содержащие в своем геноме гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, встроенную в эндогенный локус C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1.
2. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по п. 1, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере тридцать повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.
3. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по п. 1 или 2, где экспансия гексануклеотидных повторов предусматривает по меньшей мере 90 повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.
4. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по любому из пп. 1-3, где животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, характеризуются (i) повышенной экспрессией транскриптов C9orf72 по сравнению с контрольным животным, содержащим локус C9orf72 дикого типа, (ii) повышенным количеством очагов РНК по сравнению с контрольным животным, содержащим локус C9orf72 дикого типа, (iii) повышенным уровнем белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольным животным, содержащим локус C9orf72 дикого типа, или (iv) любой комбинацией (i)  - (iii).
5. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по любому из предыдущих пунктов, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, расположена между первым некодирующим эндогенным экзоном и экзоном 2 эндогенного локуса C9orf72.
6. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по п. 5, где эндогенный локус C9orf72 содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, или ее варианты.
7. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по любому из предыдущих пунктов, где животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, или клетка животного, отличного от человека, представляет собой клетку грызуна.
8. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по п. 7, где грызун представляет собой крысу или мышь, или где клетка животного, отличного от человека, представляет клетку крысы или клетку мыши.
9. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по п. 8, где животное, отличное от человека, представляет собой мышь, или клетка животного, отличного от человека, представляет собой клетку мыши, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит девяносто два повтора гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, и где мышь или клетка мыши проявляют все из следующих трех характеристик: (i) повышенной экспрессии транскриптов C9orf72 по сравнению с контрольным животным, содержащим локус C9orf72 дикого типа, (ii) повышенного количества очагов РНК по сравнению с контрольным животным, содержащим локус C9orf72 дикого типа, и (iii) повышенного уровня белков с дипептидными повторами по сравнению с контрольным животным, содержащим локус C9orf72 дикого типа.
10. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по любому из предыдущих пунктов, где животное, отличное от человека, является гомозиготным по гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.
11. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по любому из пп. 1-9, где животное, отличное от человека, является гетерозиготным по гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.
12. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по п. 11, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, представляет собой первую гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, где животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, также являются гетерозиготными по второй гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, и где первая последовательность, характеризующаяся экспансией, содержит количество повторов, отличное от второй гетерологичной последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов.
13. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по п. 12, где первая гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией повторов, содержит от одного до трех повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, а вторая гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией повторов, содержит от четырех до ста повторов гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1.
14. Животное, отличное от человека, или клетка животного, отличного от человека, по любому из предыдущих пунктов, где клетка животного, отличного от человека, представляет собой эмбриональную стволовую клетку, двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, клетку головного мозга, клетку коры, нейронную клетку, мышечную клетку, клетку сердца или зародышевую клетку.
15. Иммортализованная клеточная линия или двигательный нейрон, полученные из эмбриональной стволовой клетки по п. 14.
16. Эмбриональная стволовая клетка животного, отличного от человека, в геноме которой содержится гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1.
17. Эмбрион животного, отличного от человека, полученный из эмбриональной стволовой клетки по п. 16.
18. Способ получения животного, отличного от человека, в геноме которого содержится гексануклеотидная последовательность, при этом способ предусматривает модифицирование генома животного, отличного от человека, так, что он содержит гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, в эндогенном локусе C9orf72, где гетерологичная последовательность, характеризующаяся экспансией гексануклеотидных повторов, содержит по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1.
19. Способ по п. 18, где модифицирование обеспечивается за счет способа, предусматривающего
(а) введение в эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, конструкции на основе нуклеиновой кислоты, содержащей вставочную нуклеиновую кислоту, где вставочная нуклеиновая кислота содержит в направлении от 5’ к 3’ (i) 5’-плечо гомологии, которое гомологично целевой 5’-последовательности локуса C9orf72, (ii) гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, и (iii) 3’-плечо гомологии, которое гомологично целевой 5’-последовательности локуса C9orf72;
(b) получение генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки грызуна из (a) и
(c) создание грызуна с применением генетически модифицированной эмбриональной стволовой клетки грызуна из (b).
20. Способ по п. 19, где вставочная нуклеиновая кислота дополнительно содержит между 5’- и 3’-плечами гомологии один или более генов, кодирующих один или более селективных маркеров.
21. Способ по п. 19 или 20, где вставочная нуклеиновая кислота дополнительно содержит один или более сайтов для сайт-специфической рекомбинации между 5’- и 3’-плечами гомологии.
22. Способ по п. 21, где вставочная нуклеиновая кислота дополнительно содержит между 5’- и 3’-плечами гомологии ген рекомбиназы и ген селективного маркера, фланкированные сайтами распознавания для рекомбиназы, при этом сайты распознавания для рекомбиназы ориентированы для направленного вырезания.
23. Способ по любому из пп. 19-22, где 5’-плечо гомологии идентично или фактически идентично экзону 1 эндогенного локуса C9orf72 или его части.
24. Способ по п. 23, где 5’-плечо гомологии содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:23.
25. Способ по любому из пп. 19-24, где 3’-плечо гомологии идентично или фактически идентично по меньшей мере части интрона 1 эндогенного локуса C9orf72.
26. Способ по п. 25, где 3’-плечо гомологии содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:25.
27. Способ по любому из пп. 18-26, где вставочная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4.
28. Способ по любому из пп. 18-26, где вставочная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:6.
29. Способ по любому из пп. 18-28, дополнительно предусматривающий стадию скрещивания грызуна, полученного на стадии (с), с тем, чтобы получить грызуна, гомозиготного по вставке.
30. Способ по любому из пп. 18-29, где животное, отличное от человека, представляет собой грызуна.
31. Способ по п. 30, где грызун представляет собой крысу или мышь.
32. Животное, отличное от человека, получаемое с помощью способа по любому из пп. 18-31.
33. Способ идентификации кандидатного терапевтического средства для лечения заболевания или состояния, ассоциированных с наличием последовательности, характеризующейся экспансией гексануклеотидных повторов, при этом способ предусматривает
(а) введение кандидатного средства животному, отличному от человека, или в клетку животного, отличного от человека, содержащие локус C9orf72, генетически модифицированный с тем, чтобы содержать последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов, содержащую по меньшей мере один повтор гексануклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1;
(b) проведение одного или более анализов для определения того, оказывает ли кандидатное средство влияние на один или более признаков, симптомов и/или состояний, ассоциированных с заболеванием или состоянием, и
(c) идентификацию кандидатного средства, которое оказывает влияние на один или более признаков, симптомов и/или состояний, ассоциированных с заболеванием или состоянием, в качестве кандидатного терапевтического средства.
34. Способ по п. 33, где кандидатное средство вводят in vivo животному, отличному от человека, и при этом необязательно проводят in vitro анализ ткани, выделенной из животного, отличного от человека, после введения кандидатного средства.
35. Способ по п. 33, где кандидатное средство вводят in vitro в двигательный нейрон, полученный из эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой.
36. Способ по любому из пп. 33-35, где анализ представляет собой количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) для выявления продуктов гена C9orf72.
37. Способ по п. 36, где qPCR выполняют с праймером и/или зондом, имеющими нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80 или любой их комбинацией.
38. Способ по любому из пп. 33-35, где анализ представляет собой измерение очагов РНК, содержащих транскрипты смысловой или антисмысловой РНК C9orf72.
39. Способ по п. 38, где анализ представляет собой флуоресцентную гибридизацию in situ с применением одного или более зондов, имеющих нуклеотидную последовательность, изложенную под любой из SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 и/или SEQ ID NO:84.
40. Способ по любому из пп. 33-35, где анализ представляет собой измерение белков с дипептидными повторами polyGA.
41. Клетка-хозяин, содержащая гетерологичную последовательность, характеризующуюся экспансией гексануклеотидных повторов.
42. Клетка-хозяин по п. 41, где клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.
43. Система CRISPR/Cas, содержащая белок Cas и/или одну или более gRNA, где одна или более gRNA кодируются ДНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49; SEQ ID NO:50 и их комбинации.
44. Система CRISPR/Cas по п. 43, где одна или более gRNA предусматривают первую, вторую и третью gRNA, где первая gRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, где вторая gRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 44, и где третья gRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 50.
45. Система CRISPR/Cas по п. 44, дополнительно содержащая четвертую gRNA, кодируемую ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 47.
46. Система CRISPR/Cas по п. 45, дополнительно содержащая пятую, шестую и седьмую gRNA, где пятая gRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 46, шестая gRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 48, и седьмая gRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 49.
47. Система CRISPR/Cas по любому из пп. 42-46, где gRNA содержит tracrRNA, кодируемую ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO:63, 64 или 65.
48. Система CRISPR/Cas по п. 47, где tracrRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO:63.
49. Система CRISPR/Cas по п. 47, где tracrRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO:64.
50. Система CRISPR/Cas по п. 47, где tracrRNA кодируется ДНК, содержащей последовательность, изложенную под SEQ ID NO:65.
51. Система CRISPR/Cas по любому из пп. 43-50, дополнительно содержащая конструкцию для экспрессии, где конструкция для экспрессии содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, и/или ДНК, кодирующую по меньшей мере одну gRNA, и где конструкция для экспрессии необязательно дополнительно содержит ген устойчивости к лекарственному средству.