АНТИТРОМБОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ ОБЩЕГО ЭКСТРАКТА СЕМЯН ACANTHUS MOLLIS И ЕГО СОСТАВЛЯЮЩИЕ
ANTIPLATELET ACTIVITY OF CRUDE EXTRACT OF SEEDS OF ACANTHUS MOLLIS AND ITS COMPONENTS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Acanthus mollis
Настоящее изобретение относится к антитромбоцитарной активности, проявляемой общим экстрактом семян , а также каждым из его компонентов DIBOA–Glc, вербаскозидом и изовербаскозидом, и их комбинацией.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
2
2
12
IIb
3
В настоящее время атеротромбоз является ведущей причиной смерти во всем мире. Агрегация тромбоцитов играет важную роль в патофизиологии тромбоза артерий и вен, в то время как активация тромбоцитов также вносит значительный вклад в атерогенез и другие патофизиологические состояния, такие как воспаление и канцерогенез. Таким образом, антитромбоцитарная терапия является краеугольным камнем лечения пациентов с сердечно–сосудистыми заболеваниями (ССЗ) и особенно пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС). Кроме того, длительное лечение пациентов антитромбоцитарными лекарственными средствами может в значительной мере способствовать предотвращению других заболеваний, таких как рак. Доступные в настоящее время антитромбоцитарные препараты нацелены на ключевые точки активации тромбоцитов, такие как синтез тромбоксана А (TxA) через циклооксигеназу–1 (COX–1), рецептор аденозиндифосфата P2Y (АДФ) и рецептор интегрина α/β (GPIIb/IIIa). Современные исследования направлены на разработку антагонистов, нацеленных на другие рецепторы тромбоцитов, такие как рецептор тромбина, называемый протеазоактивированным рецептором–1 (PAR–1) (Michelson AD, et al. Nat Rev Drug Discov. 2010; 9:154–69; Tsoumani ME, Tselepis AD, Curr Pharm Des. 2017; Epub ahead of print).
Acanthus mollis
В последние годы в современных исследованиях особый интерес представляют натуральные продукты (оливковое масло, грибы, вино и т.д.) и их составляющие, которые проявляют несколько биологических активностей, таких как противовоспалительная, антиоксидантная и антитромбоцитарная (Kontogianni VG, et al. J. Agric. Food Chem. 2016; 22:4511–4521; Tzakos AG, et al. J Agric Food Chem. 2012; 60:6977–83; JoseN, et al. Phytother. Res. 2004; 1:43–6). Таким образом, целью настоящего исследования является изучение возможного антитромбоцитарного эффекта общего экстракта семян  и определение основных компонентов, ответственных за проявление этого эффекта.
Acanthaceae
Acanthus
Acanthus mollis
Acanthus mollis
Acanthus mollis
представляет собой большое семейство растений, включающее 4300 видов, относящихся к 346 родам (Rezanka T, et al. Phytochem. 2009; 70:1049–1054). Члены этого семейства встречаются в тропических и умеренных регионах, в основном в Средиземноморском регионе.  представляет собой род полевых цветов, которые растут на лугах, в лесах, на скалистых и поросших кустарником холмах. Наиболее важным представителем этого рода является , многолетнее травянистое растение, которое встречается в различных средиземноморских регионах, от Португалии и Северо–Западной Африки до балканских стран. Растение прорастает только весной и в начале лета. Однако, оно описано как многолетнее, потому что корневище остается живым в течение всего года. Основную листву составляют лопастные, слегка колючие, глянцевые, зеленые листья. Особым признаком листьев является их мягкая текстура, поскольку они не имеют шипов или пуха. Цветы бело–фиолетового цвета. Плод растения имеет гладкую поверхность, по размеру напоминает лимон и имеет зеленый цвет. По мере его созревания, он твердеет, раскрывается и теряет семена, которые содержит. Семена также твердые, коричневого цвета, имеют слегка мятую оболочку, и имеют овальную и плоскую форму.  используется против псориаза и других кожных заболеваний, возникающих при несбалансированном продуцировании эйкозаноидов. Было доказано, что метанольный экстракт листьев в концентрации 200 мг/мл ингибирует активность 5–липоксигеназы (5–LOX) и циклооксигеназы–1 (COX–1) и увеличивает биосинтез 15(S)–HETE, противовоспалительного эйкозаноида (Bader A, et al. Phytother. Res. 2015; 29:108–113). Однако, насколько известно, влияние метанольного экстракта семян  на активацию тромбоцитов человека до сих пор не исследовано.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Acanthus mollis
Целью первого этапа протокола исследования по настоящему изобретению было определение наилучшего способа экстракции семян  для получения экстракта, демонстрирующего наилучшую биологическую активность в отношении агрегации тромбоцитов. Для этой цели 13 г сухих семян (хранившихся при –20°C через два дня после их сбора) измельчали–истирали в порошок в латунной ступке. Затем порошок экстрагировали последовательно 200 мл двух растворителей с постепенно увеличивающейся полярностью, сначала гексаном, а затем метанолом, в аппарате Сокслета в течение 6 часов с каждым растворителем. Этот способ экстракции был выбран после того, как в предварительных экспериментах было обнаружено, что среди всех приготовленных экстрактов (гексановый экстракт, этилацетатный экстракт, дихлорметановый экстракт и метанольный экстракт), полученных экстракцией в аппарате Сокслета, только метанольный экстракт проявлял биологическую активность в отношении агрегации тромбоцитов, в то время как все другие экстракты оказывали незначительное антитромбоцитарное действие или вообще его не имели.
in vitro
Acanthus mollis
50
50
50
2
Влияние метанольного экстракта на агрегацию тромбоцитов  тщательно изучали в человеческой плазме, обогащенной тромбоцитами (PRP), полученной от здоровых добровольцев, с помощью световой трансмиссионной агрегатометрии (СТА), как описано ранее (Mitsios JV, et al. Eur J Biochem. 2004; 271:855–862). PRP активировали арахидоновой кислотой (AA; 0,5 мМ), пептидом–6, активирующим рецепторы тромбина (TRAP–6; 10 мкМ), и АДФ (10 мкМ), в качестве агонистов. Образцы готовили выпариванием метанола в атмосфере азота и затем растворением остатка в ДМСО. Максимальную агрегацию, достигаемую в течение 4 минут после добавления каждого агониста, определяли и выражали в процентах от 100% светопропускания, откалиброванного для каждого образца (% максимальной агрегации). Ингибирующую эффективность экстракта семян выражали в виде значения IC (половина максимальной ингибирующей концентрации). Все значения получали по меньшей мере из трех независимых экспериментов, выполненных для каждого агониста тромбоцитов, с использованием 3 разных препаратов метанольного экстракта (приготовленных, как описано выше) и выражали в виде среднего значения ± стандартное отклонение (S.D.). Конечная концентрация ДМСО в каждом анализе составляла 0,01% по объему. Как показано на фиг. 1, метанольный экстракт семян  ингибирует дозозависимым образом агрегацию тромбоцитов, индуцированную АА (IC=0; 15 мг/мл) и TRAP–6 (IC=0,14 мг/мл), но не влияет на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, что указывает на то, что ингибирующий эффект экстракта затрагивает определенные пути активации тромбоцитов, опосредованные AA (которая метаболизируется в тромбоцитах посредством COX–1 с образованием ТхА, которое активирует тромбоциты через свой рецептор) и рецептором тромбина PAR–1 на тромбоцитах, который специфически активируется пептидом TRAP–6, используемым в экспериментах авторов изобретения.
Acanthus mollis
6
1
1
13
Затем был проведен анализ фитохимического профиля метанольного экстракта семян . Остаток, полученный после испарения метанола в атмосфере азота (5 мг), растворяли в 0,5 мл ДМСО–d и переносили в пробирки для ЯМР (5 мм), регистрировали спектры Н–ЯМР и указывали характерные пики (фиг.2А). Триметилсилилпропановую натриевую соль (TMSP–d4) использовали в качестве контрольного соединения. ЯМР–эксперименты выполняли в Центре ядерного магнитного резонанса Университета Янины, на спектрометре Briiker LC–NMR AV–500 (Briiker). Условия эксперимента были следующими: количество сканирований (NS) = 256, T=298 K, время эксперимента=30 мин, 500 МГц). Систему ЯМР контролировали с помощью программного обеспечения Top Spin (Briiker). Оценка результатов основана на 2DH–C HSQC и HMBC спектрах.
n
Для определения основных соединений метанольного экстракта также использовали метод ЖХ–МС в качестве дополнительного метода к ЯМР–спектроскопии и наоборот. Образцы из метанольного экстракта разбавляли до концентрации 0,05 мг/мл. Десять мкл отфильтрованного образца (0,45 мкм) вводили в прибор ЖХ–МС. Все эксперименты LC–MS выполняли на масс–анализаторе с квадрупольной ионной ловушкой (Agilent Technologies, модель MSD trap SL), переоборудованном в бинарную ВЭЖХ–систему 1100, оснащенную дегазатором, автосамплером, детектором с диодной матрицей и источником для ионизации электрораспылением (Agilent Technologies, Karlsruhe, Germany). Все аппаратные компоненты контролировали с помощью программного обеспечения Agilent Chemstation. Разделение выполняли на аналитической колонке Zorbax Eclipse XDB–C18 15 см × 5,6 мм (Agilent, USA) при скорости потока 0,6 мл/мин, используя смесь вода/муравьиная кислота (99,9:0,1 об./об.) в качестве растворителя А и ацетонитрил в качестве растворителя В. Градиент, использованный для анализа, был следующим: 0–6 мин 90% А, изократическое элюирование; 6–10 мин 95–85% A; 10–15 мин 85% А, изократическое элюирование; 15–20 мин 85–75% A; 20–35 мин 75–60% A; 35–40 мин 60–90% A. UV/vis спектры регистрировали в диапазоне 200–550 нм, а хроматограммы получали при 280 и 330 нм.
2
3
2
3
m/z
m/z
Сканирование как ионов предшественника, так и продукта (MS и MS) на фенольные соединения контролировали при отрицательной полярности в диапазоне от  50 до  1200. Условия источника ионизации были следующими: капиллярное напряжение 3,5 кВ; температура осушающего газа 350°C; скорость потока и давление азота, 11 л/мин и 50 фунтов на кв. дюйм (344,7 Кпа), соответственно. Максимальное время накопления в ионной ловушке и количество повторов МС для получения средних спектров МС задавали, равными 30 и 3 мс, соответственно. Записывали хроматограмму по полному ионному току (TIC) (фиг. 3А), УФ–хроматограмму и спектры MS, MS и MS. Идентификация основных соединений (1, 2 и 3) была основана на измерениях точных масс псевдомолекулярных [MH]~ ионов и их паттерна фрагментации, как описано ранее (Wolf RB, et al. J Nat Prod. 1985; 48:59–63; Ryan D, et al. J Chromatogr. A 1999; 832:87–96). Согласно результатам, пик 1 содержит соединение 2–O–β–D–глюкопиранозил–4–гидрокси–1,4–бензоксазин–3–он (димер) (DIBOA–Glc), пик 2 содержит в основном вербаскозид и следовое количество изовербаскозида (изоактеозид), тогда как пик 3 содержит в основном изовербаскозид и следовое количество вербаскозида. Все характеристики этих соединений обобщены в таблице ниже.
Таблица
Пик
R<sub>1</sub> (мин)
[M–H]<sup>–</sup> (m/z)
–MS<sup>2</sup>[M–H]<sup>–</sup> (m/z) (%)
–MS<sup>3</sup>[основной пик]<sup>–</sup> (m/z) (%)
Соединения
1
12,0
685(100)342(12)
342(100)
134(100), 180(28), 162(15)
DIBOA–Glc
2
23,6
623(100)
461(100)
135(100), 315(99), 161(16), 297(19)
вербаскозид изовербаскозид (следовое количество)
3
24,6
623(100)
461(100) 315(3)
135(100) 315(96) 161(12) 297(12)
изовербаскозид вербаскозид (следовое количество)
Для идентификации основных соединений, их выделяли с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ). Остаток, полученный после выпаривания метанола в атмосфере азота (20–60 мг), снова растворяли в метаноле (3,2 мл). 3,1 мл отфильтрованного образца (0,45 мкм) вносили в прибор для ВЭЖХ (система препаративной хроматографии, Shimadzu, Япония) и выполняли разделение на аналитической колонке Ascentis C18 (25 см × 21,2 мм, с внутренним диаметром 10 мкм) (Shimadzu, Япония) при скорости потока 16 мл/мин, используя смесь вода/муравьиная кислота (99,9:0,1 об./об.) в качестве растворителя А и ацетонитрил в качестве растворителя В. Градиент, использованный для анализа, был таким же, как описано в экспериментах с ЖХ–МС, и получали UV/vis спектры при 280 и 330 нм. Фракции лиофилизировали перед использованием в последующих экспериментах.
2
3
Три фракции выделяли вышеуказанным методом ВЭЖХ и затем анализировали с помощью ЖХ–МС в тех же экспериментальных условий, которые описаны выше. Записывали TIC хроматограммы, УФ–хроматограммы и MS, MS и MS спектры. Согласно полученным результатам, фракция 1 соответствовала DIBOA–Glc (фиг. 3В), в то время как фракция 2 (фиг. 3C) и фракция 3 (фиг. 3D) представляли собой смесь вербаскозида и изовербаскозида, причем содержание вербаскозида в фракции 2 превышало содержание изовербаскозида, в то время как в фракции 3 изовербаскозид находится в большем количестве по сравнению с вербаскозидом. Для подтверждения присутствия вербаскозида и изовербаскозида были использованы аутентичные стандартные соединения (Medchem Express, США) в требуемой концентрации, 0,05 мг/мл (фиг. 4).
6
1
Кроме того, выделенные методом ВЭЖХ фракции анализировали с помощью ЯМР. Каждую фракцию (5 мг) растворяли в 0,5 мл ДМСО–d и переносили в пробирки для ЯМР (5 мм), и регистрировали спектры H–ЯМР. В качестве контрольного соединения снова использовали триметилсилилпропановую натриевую соль (TMSP–d4). Полное распределение фракции 1 в виде DIBOA–Glc (фиг. 2B), фракции 2 (фиг. 2C) и фракции 3 (фиг. 2D) в виде смеси вербаскозида и изовербаскозида соответствовало ранее опубликованным значениям (Hartenstein H, et al. Phytochemistry. 1994; 35:827–828; Kanchanapoom T. et al. Phytochemistry. 2011; 58:637–640; Yin H et al. J Chromatogr. A. 2008; 1205:177–181).
in vitro
После проведенного выше анализа изучали биологический эффект трех фракций в отношении агрегации тромбоцитов  в PRP методом СТА, как описано выше, используя в качестве агонистов AA (0,5 мМ) и TRAP–6 (10 мкМ), поскольку общий экстракт ингибировал агрегацию тромбоцитов, вызванную только этими 2 агонистами (фиг. 1). Каждую фракцию растворяли в ДМСО и использовали в конечной концентрации 1 мг/мл. Стандарты вербаскозида и изовербаскозида также растворяли в ДМСО и использовали с конечной концентрацией 1 мг/мл. Как показано на фиг. 5А, из 3–х фракций только фракция 1 (DIBOA–Glc) ингибировала агрегацию тромбоцитов, вызванную АА, демонстрируя пороговую концентрацию (более низкую концентрацию, которая индуцирует максимальный ингибирующий эффект), равную 0,2 мг/мл. Эта концентрация была ненамного ниже концентрации общего экстракта – 0,25 мг/мл (что и следовало ожидать, поскольку была использована очищенная фракция из общего экстракта, проявляющего ингибирующую активность в отношении АА–индуцированной агрегации тромбоцитов). Следовательно, была использована комбинация фракции 1 с фракцией 2 или 3 (при массовом соотношении 1:1) или комбинация 3–х фракций (при массовом соотношении 1:1:1). Как показано на фиг. 5А, фракции 2 или 3 не ингибируют агрегацию тромбоцитов, однако они в значительной степени увеличивают антитромбоцитарный эффект фракции 1, при этом максимальное ингибирование наблюдается в случае использования комбинации 3–х фракций. Это говорит о том, что вербаскозид и изовербаскозид проявляют синергический ингибирующий эффект с DIBOA–Glc в отношении АА–индуцированной агрегации тромбоцитов. Для дополнительного подтверждения этого предположения было изучено влияние стандартов вербаскозида и изовербаскозида в комбинации с фракцией 1 (DIBOA–Glc). Как показано на фиг. 6А, вербаскозид и изовербаскозид по отдельности или в комбинации друг с другом не ингибируют АА–индуцированную агрегацию тромбоцитов, но значительно усиливают антитромбоцитарный эффект фракции 1 (DIBOA–Glc), максимальное ингибирование наблюдалось при добавлении их комбинации к фракции 1.
Затем оценивали биологический эффект трех фракций в отношении агрегации тромбоцитов, вызванной TRAP–6. Как показано на фиг. 5В, ингибирующая активность главным образом наблюдалась в фракции 3 (содержащей в основном изовербаскозид и следовое количество вербаскозида), тогда как в фракции 2 (содержащей основном вербаскозид и следовое количество изовербаскозида) эта активность проявлялась в гораздо меньшей степени. Фракция 1 не обладала ингибирующей активностью в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной TRAP–6, а также не усиливала ингибирующую активность, наблюдаемую в фракции 3 (фиг. 5В). Эти результаты позволяют предположить, что ингибирующий эффект общего метанольного экстракта в отношении TRAP–6–индуцированной агрегации тромбоцитов в первую очередь связан с изовербаскозидом. Для дополнительного подтверждения этого предположения, было изучено влияние стандартов изовербаскозида и вербаскозида, взятых по отдельности и в комбинации (при массовом соотношении 1:1), а также в комбинации с фракцией 1 (DIBOA–Glc) (при массовом соотношении 1:1:1). Как показано на фиг. 6B, только изовербаскозид ингибировал агрегацию тромбоцитов, в то время как вербаскозид или фракция 1 (DIBOA–Glc), или их комбинация не увеличивали ингибирующий эффект изовербаскозида.
Acanthus mollis
В целом, метанольный экстракт семян  ингибирует агрегацию тромбоцитов, опосредованную через путь АА и рецептор PAR–1. Ингибирующий эффект в случае АА в первую очередь связан с содержанием DIBOA–Glc, при этом комбинация DIBOA–Glc с изовербаскозидом, вербаскозидом, а также их комбинацией приводит к синергетическому эффекту. Напротив, ингибирующий эффект в отношении агрегации тромбоцитов, опосредованной рецептором PAR–1, обусловлен исключительно содержанием изовербаскозида.
На сегодняшний день пациенты с сердечно–сосудистыми заболеваниями получают антитромбоцитарную терапию, включающую в первую очередь аспирин (который ингибирует агрегацию тромбоцитов, вызванную COX–1 и, следовательно, АА) и антагонист рецептора АДФ P2Y12 (клопидогрел, прасугрел или тикагрелор) (Kalantzi Kl, et al. Expert Rev Clin Pharmacol. 2012; 5:319–36; Tsoumani ME, Tselepis AD, Curr Pharm Des. 2017; Epub ahead of print)). Однако в нескольких исследованиях было показано, что у некоторых пациентов, получающих аспирин или клопидогрел, отсутствует адекватная реакция на действие этих препаратов и наблюдается новое ишемическое сердечно–сосудистое событие (явление, называемое резистентностью к аспирину или клопидогрелю). Недавние исследования показали важную клиническую эффективность антагониста PAR–1 (ворапаксар) в предотвращении атеротромботического события, однако его терапевтическая польза ограничена из–за увеличения риска кровотечения (Moschonas IC et al. Int J Cardiol. 2015; 185:9–18).
Acanthus mollis
Поэтому, основываясь на результатах настоящего исследования, описанные выше компоненты семян  можно рассматривать в качестве новых терапевтических агентов для использования пациентами с сердечно–сосудистыми заболеваниями, поскольку они могут заменить аспирин у пациентов с резистентностью к аспирину (DIBOA–Glc отдельно или в комбинации с вербаскозидом или/и изовербаскозидом), а также для применения в качестве специфического антагониста рецептора тромбина PAR–1 на тромбоцитах (изовербаскозида). Наконец, общий экстракт можно использовать в качестве важной добавки дополнительно к стандартной терапии аспирином и антагонистом P2Y12 у этих пациентов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Acanthus mollis
На фиг. 1 показаны характерные кривые зависимости доза–ответ для ингибирующего эффекта метанольного экстракта семян  в отношении агрегации тромбоцитов, вызванной AA (0,5 мМ) (A) и TRAP–6 (10 мкМ) (В) и отсутствующего в случае АДФ (10 мкМ) (С). Конечная концентрация ДМСО составляла 0,01% по объему.
1
Acanthus mollis
6
На фиг. 2 показан 1D H–ЯМР–спектр метанольного экстракта семян  (A), фракции 1 (B), фракции 2 (C) и фракции 3 (D) в ДМСО–d (NS=256, Т=298K, время эксперимента=30 минут, 500 МГц). Как можно видеть на фиг. 2C и 2D, фракции 2 и 3 содержат смесь вербаскозида и изовербаскозида.
A. mollis
На фиг. 3 показана (A) TIC хроматограмма метанольного экстракта , на которой указаны основные компоненты, (B) МС спектр фракции 1 (m/z 685,1, Rt=11,9 мин), (C) МС спектр фракции 2 (m/z 623,2, Rt=23,6 мин) и (D) МС спектр фракции 3 (m/z 623,2, R=24,5 мин).
На фиг. 4 показано наложение полных ионных хроматограмм (A) фракции 2 (черный), стандартов вербаскозида (красный) и изовербаскозида (зеленый), демонстрирующее наличие вербаскозида и небольшого количества изовербаскозида в фракции 2, и (B) фракции 3 (черный), стандартов вербаскозида (красный) и изовербаскозида (зеленый), демонстрирующее наличие изовербаскозида и небольшого количества вербаскозида в фракции 3.
Фиг.5 представляет собой гистограмму, демонстрирующую влияние фракций 1, 2 и 3, а также их комбинаций на агрегацию тромбоцитов человека в PRP, индуцированную (A) AA (0,5 мМ) и (B) TRAP–6 (10 мкМ). Конечная концентрация каждой фракции в PRP составляла 1 мг/мл. Конечная концентрация ДМСО в PRP составляла 0,01% по объему. *P <0,05 и **P <0,01 по сравнению с фракцией 1.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму, демонстрирующую влияние фракции 1, вербаскозида и изовербаскозида, а также их комбинаций на агрегацию тромбоцитов человека в PRP, индуцированную (A) AA (0,5 мМ) и (B) TRAP–6 (10 мкМ). Конечная концентрация в PRP каждого используемого агента составляла 1 мг/мл. Конечная концентрация ДМСО составляла 0,01% по объему. *P <0,05 и **P <0,01 по сравнению с фракцией 1.