ЛЕКАРСТВЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ И АСТЕНИЧЕСКОГО БУЛЬБАРНОГО ПАРАЛИЧА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
MEDICAL COMPOSITION FOR TREATING MUSCULAR ATROPHY AND ASTHENIC BULBAR PARALYSIS AND METHOD FOR PREPARING THEREOF

Область техники
Изобретение относится к лекарственной композиции для лечения мышечной атрофии и астенического бульбарного паралича и способу ее получения; изобретение относится к области традиционной китайской медицины и ее производственной технологии.
Предпосылки создания изобретения
Причиной заболеваний двигательных нейронов, в число которых входят боковой амиотрофический склероз, прогрессирующая спинальная мышечная атрофия, прогрессирующий бульбарный паралич и первичный боковой склероз, является распространенная в центральной нервной системе дегенерация двигательных нейронов верхних и нижних конечностей. Их симптомами являются снижение мышечной силы и мышечная атрофия, а также удушье и кашель во время еды, затрудненное глотание, затруднение дыхания и смерть по мере развития болезни. Боковой амиотрофический склероз с неизвестной этиологией является одним из видов хронических прогрессирующих заболеваний, которые избирательно поражают клетки переднего рога спинного мозга, двигательное ядро стволовой части мозга и корково-спинномозговой путь и признаком которых является расстройство двигательных нейронов верхних и нижних конечностей. Боковой амиотрофический склероз представляет собой наиболее распространенный тип хронического заболевания двигательных нейронов. Поскольку патогенез бокового амиотрофического склероза не вполне ясен, в западной медицине не существует особого способа его лечения за исключением поддерживающей терапии, которая заключается в обеспечении достаточного питания, положительной динамики симптомов и психологической поддержке с целью помочь пациентам в борьбе с заболеванием.
По классификации теории традиционной китайской медицины мышечная атрофия, вызванная боковым амиотрофическим склерозом и любыми другими заболеваниями, относится к синдрому вялости. В древности китайцы выдвинули точку зрения, согласно которой объектом лечения вялости должен являться канал Yangming. По мнению профессора Li Renxian в основе данного заболевания лежит слабость селезенки и почек, которой сопутствует возбуждение эндогенного метеоризма алиментарного типа и патологическая слабость кровеносных сосудов. Он считал, что лечение должно быть сосредоточено на оживлении деятельности селезенки и укреплении почек, ослаблении синдрома эндогенного метеоризма и облегчении конвульсий и спазмов за счет активизации кровообращения с целью устранения коллатеральной окклюзии: он разработал усовершенствованный рецепт оживления деятельности селезенки и укрепления почек, который обеспечивал определенный лечебный эффект. Профессор Deng Tietao считал, что симптомы бокового амиотрофического склероза вызваны недостатком слизи и гемостазом как селезенки, так и почек. Чтобы оживить деятельность селезенки и укрепить почки у пациентов, страдавших боковым амиотрофическим склерозом, он применял усовершенствованный лечебный питьевой отвар для укрепления Среднего Jiao и пополнения Qi и корень астрагала для внутривенных инъекций и инъекций в точки иглоукалывания, а также некоторые дополнительные методы лечения, такие как распаривание и омывание верхних конечностей с целью рассосать слизь, использование клизмы во избежание задержки стула, иглоукалывание, массаж, лечебное питание и психотерапия. Его метод обеспечивал некоторый, но недостаточный эффект.
Описание изобретения
Одной из задач настоящего изобретения является создание лекарственной композиции для лечения мышечной атрофии и астенического бульбарного паралича, обеспечивающей хороший эффект лечения.
Другой задачей настоящего изобретения является создание способа получения названной лекарственной композиции.
В условиях клинической практики автором изобретения было установлено, что методы лечения, связанные с нормализацией деятельности только селезенки и желудка, не обеспечивают существенного лечебного эффекта. В этой связи вместо упомянутого традиционного способа лечения автор изобретения уделил особое внимание меридиональным каналам, в особенности, каналу Du из числа восьми дополнительных каналов. Автор исследовал патогенез атрофии мышечной ткани с точки зрения теории восьми дополнительных каналов и предложил новую концепцию лечения на основе теории восьми дополнительных каналов и принцип повышения изначальной энергии, устранения вялости, питания крови и активизации грануляции. Особое внимание было уделено согреванию дополнительного Yang, пополнению жизненной сущности, активизации восьми дополнительных каналов, а также подбору и составлению смесей из некоторых лечебных трав из множества трав традиционной китайской медицины, способных согревать и оживлять деятельность канала Du и вселять бодрость духа. Так была изобретена заявленная лекарственная композиция.
В качестве действующих ингредиентов лекарственной композиции, предложенной в настоящем изобретении, используют экстракты следующих трав традиционной китайской медицины: 1-10 весовых частей женьшеня и 1-10 весовых частей Epimedium; предпочтительно, в соотношении 2-10 весовых частей женьшеня и 2-8 весовых частей Epimedium; особо предпочтительно, в соотношении 5 весовых частей женьшеня и 5 весовых частей Epimedium или 5 весовых частей женьшеня и 2 весовые части Epimedium, или 9 весовых частей женьшеня и 7 весовых частей Epimedium, или 3 весовых части женьшеня и 1 весовая часть Epimedium.
Применяемый в лекарственной композиции женьшень получают из высушенного корня и подземного побега растения Acanthopanax gracilistylu, который согласно принятой в традиционной китайской медицине классификации лечебных свойств является сладким, слегка горьким и мягким. Применяемый в лекарственной композиции Epimedium получают из высушенных и надземных частей Aceranthus Sagittatus S. et Z., Epimedium Sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim, Epimedium wushanense T.S.Ying или корейского Epimedium, растения Berberidaceae, а его лечебные свойства согласно традиционной китайской медицине характеризуются как острые, сладкие и теплые.
Из лекарственной композиции, предложенной в настоящем изобретении, могут быть приготовлены любые фармацевтически приемлемые лекарственные формы, такие как инъекция, капсула, пилюля, таблетка или жидкости для перорального применения в соответствии с обычной технологией приготовления лекарственных средств. Инъекция является предпочтительной лекарственной формой.
Способ получения лекарственной композиции согласно настоящему изобретению заключается в том, что осуществляют следующие стадии:
(1) отвешивают травы традиционной китайской медицины согласно установленной рецептуре:
(2) 1-3 раза экстрагируют женьшень при помощи спирта крепостью от 60 до 90%, смешивают полученные экстракты, фильтруют и концентрируют смешанные экстракты, чтобы получить концентрированный раствор, добавляют в концентрированный раствор очищенную воду, чтобы разбавить его, и перемешивают его до получения однородного раствора, затем смесь охлаждают и фильтруют; вводят разбавленный фильтрат в абсорбционную колонну с макропористой смолой и последовательно элюируют колонну водным элюентом и спиртом крепостью от 70% до 90%, собирают элюат и удаляют примеси, затем концентрируют элюат и высушивают его, чтобы получить экстракт женьшеня:
(3) 2-5 раз отваривают Epimedium в воде и экстрагируют, при этом весовое соотношение воды и Epimedium составляет каждый раз от 10 до 30, смешивают полученные экстракты, фильтруют и концентрируют смешанные экстракты, чтобы получить концентрированный раствор, добавляют в концентрированный раствор спирт до тех пор, пока концентрация спирта в растворе не достигнет от 60% до 80%, охлаждают и фильтруют раствор, концентрируют полученный фильтрат, чтобы получить концентрированный раствор, добавляют в концентрированный раствор воду и перемешивают его, пока он не станет однородным, затем охлаждают и фильтруют; вводят полученный фильтрат в абсорбционную колонну с макропористой смолой и последовательно элюируют колонну водным элюентом и спиртом крепостью от 40% до 60%, собирают элюат и удаляют примеси, затем концентрируют элюат и высушивают его, чтобы получить экстракт Epimedium;
(4) смешивают смесь экстрактов, полученных на стадиях (2) и (3), с обычным адъювантом, чтобы получить лекарственную композицию.
На стадии (2) колонну со смолой в указанном порядке элюируют водным раствором аммиака с рН 8-9 и спиртом крепостью 20%, а на стадии (3) колонну со смолой в указанном порядке элюируют очищенной водой и спиртом крепостью 20%.
Удаление примесей на стадии (2) осуществляют следующим образом.
В полученный элюат добавляют очищенную воду, чтобы крепость спирта составила от 40% до 60%: полученный раствор пропускают через нейтральную абсорбционную колонну с оксидом алюминия и собирают выходящий поток; в выходящий поток добавляют соответствующее количество активированного угля и затем орошают его в течение 20 минут; не дают выходящему потоку остыть и подвергают его фильтрации всасыванием при помощи пластинчатого фильтра; собирают и концентрируют полученный фильтрат, чтобы получить концентрированный раствор; раствор охлаждают в течение по меньшей мере 24 часов, предпочтительно, 24-36 часов и фильтруют.
Удаление примесей на стадии (3) осуществляют следующим образом.
В элюат добавляют соответствующее количество диатомовой земли и перемешивают до получения однородной смеси; 2-5 раз осуществляют экстракцию при помощи безводного спирта; экстракты смешивают и концентрируют.
В процессе отваривания в воде на стадии (3) количество добавляемой воды по весу в 10-30 раз, предпочтительно, 15-25 раз превышает количество трав, а первый процесс экстракции длится от 0,5 до 2 часов, при этом длительность каждой последующей экстракции составляет от 0,5 до 1 часа.
В качестве макропористой абсорбционной смолы, применяемой в колонне на стадии (2), предпочтительно используют любую смолу типа АВ-8, типа D101 и типа DM-130.
В качестве макропористой абсорбционной смолы, применяемой в колонне на стадии (3), предпочтительно используют смолу типа АВ-8, типа NKA и типа S-8.
Способ согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения заключается в том, что осуществляют следующие стадии.
(1) травы традиционной китайской медицины сначала очищают и измельчают, а затем отвешивают согласно установленной рецептуре;
(2) при помощи спирта крепостью от 60% до 90% 3 раза экстрагируют корень женьшеня; в первый раз женьшень в течение 1-2 часов экстрагируют при помощи спирта, количество которого по весу от 8 до 12 раз превышает количество женьшеня; во второй раз женьшень в течение 1-2 часов экстрагируют при помощи спирта, количество которого по весу от 6 до 10 раз превышает количество женьшеня; в третий раз женьшень в течение 0,5-1 часа экстрагируют при помощи спирта, количество которого по весу от 6 до 10 раз превышает количество женьшеня. Полученные экстракты смешивают и фильтруют, не давая остыть, затем конденсируют при пониженном давлении, одновременно извлекая спирт, чтобы получить концентрированный раствор; затем концентрированный раствор помещают в сосуд из нержавеющей стали, добавляют в концентрированный раствор очищенную воду и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь охлаждают в течение 24-36 часов, выдерживают до достижения ею комнатной температуры и фильтруют при помощи пластинчатого фильтра, пластинчатый фильтр предпочтительно промывают небольшим количеством воды. Фильтрат разбавляют очищенной водой и держат готовым к использованию. Вводят полученный разбавленный фильтрат в абсорбционную колонну с макропористой смолой, такой как смола типа АВ-8 или колонну с любой иной применимой смолой и промывают в указанном порядке водным раствором аммиака с рН 8-9 и спиртом крепостью 20%. Колонну элюируют спиртом крепостью 80% и собирают элюат. Добавляют в элюат очищенную воду, чтобы получить спиртовой раствор крепостью 50%. Пропускают раствор через абсорбционную колонну с оксидом алюминия и собирают и смешивают выходящий поток; затем промывают колонну со смолой небольшим количеством спирта крепостью 50%, и смешивают выходящие потоки и держат готовыми к использованию. Добавляют в смесь соответствующее количество активированного угля и затем доводят смесь до кипения и орошают в течение 20 минут. Не дают смеси остыть, и подвергают ее фильтрации всасыванием при помощи пластинчатого фильтра. Собирают и концентрируют полученный фильтрат, чтобы получить концентрированный раствор. Охлаждают раствор в течение ночи. Осуществляют осветление раствора фильтрацией при помощи пластинчатого фильтра, высушивают фильтрованный раствор при пониженном давлении. Затем получают светло-желто-белый аморфный порошок, т.е. экстракт женьшеня.
(3) 2-5 раз, предпочтительно, 4 раза осуществляют экстракцию Epimedium. Количество воды но весу, которое добавляют при каждой экстракции, предпочтительно в 10-30 раз превышает количество Epimedium. В первый раз Epimedium экстрагируют в течение 0,5-2 часов и в течение 0,5-1 часа каждый последующий раз. Полученные экстракты смешивают, фильтруют, не давая им остыть, и конденсируют при пониженном давлении, чтобы получить концентрированный раствор, который затем помещают в сосуд из нержавеющей стали. В концентрированный раствор добавляют спирт до тех пор, пока его концентрация не достигнет 70%. Раствор охлаждают, фильтруют и концентрируют, извлекая при этом спирт. В концентрированный раствор добавляют очищенную воду и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь охлаждают, фильтруют и держат готовой к использованию. Полученный раствор Epimedium пропускают через абсорбционную колонну с макропористой смолой типа АВ-8 и промывают в указанном порядке очищенной водой и спиртом крепостью 20%. Колонну элюируют спиртом крепостью 50%, и собирают элюат. В элюат добавляют соответствующее количество диатомовой земли и перемешивают до получения однородной смеси; 2-5 раз осуществляют экстракцию при помощи безводного спирта; экстракты смешивают, концентрируют при пониженном давлении, одновременно извлекая спирт, и высушивают. Затем получают экстракт Epimedium в виде светло-желтого порошка.
(4) В смесь экстрактов, полученных на стадиях (2) и (3), добавляют какой-либо обычный адъювант и буферные соли, такие как 1,2-пропиленгликоль, первичный кислый фосфат натрия и вторичный кислый фосфат натрия. Затем в смесь добавляют воду для инъекций до тех пор, пока объем такой водяной смеси не достигнет 10-20 мл. Полученный раствор охлаждают после тепловой обработки и затем поочередно фильтруют через микропористую мембрану и ультрафильтрационную мембрану. Фильтрат фасуют, упаковывают и стерилизуют, чтобы получить лекарственную композицию для инъекций.
Аналогичным образом из экстрактов, полученных на стадиях (2) и (3), в соответствии с обычной технологией приготовления лекарственных средств получают лекарственные формы, такие как инъекция, капсула, пилюля, таблетка или жидкости для перорального применения.
Как показали испытания на лечебный эффект, лекарственная композиция способна противодействовать торможению регенерационной способности нервных окончаний, причиной которого у пациентов, страдающих боковым амиотрофическим склерозом, является сыворотка, способствовать регенерации и восстановлению поврежденных нервных окончаний, повышать плавательную выносливость подопытных животных, значительно повышать мышечную силу, значительно тормозить рост активности креатинфосфокиназы у мышей с мышечным утомлением и защищать функционирование скелетных мышц.
Женьшень, который согласно его мягким свойствам характеризуется как сладкий и легкий, смешивают с небольшой дозой сладкого и теплого Epimedium, чтобы получить лекарственную композицию согласно настоящему изобретению, которая не только способствует повышению жизненного тонуса и изначальной энергии и питанию почечного-yang, но также не отличается чрезмерной теплотой или сухостью. Несмотря на то что действующие ингредиенты, входящие в состав лекарственной композиции согласно изобретению, экстрагируют только из двух трав традиционной китайской медицины, они обладают выраженной эффективностью и отличаются полной совместимостью. Лекарственная композиция представляет собой новое эффективное и безопасное лекарственное средство традиционной китайской медицины для лечения мышечной атрофии, вызванной заболеваниями двигательных нейронов (в число которых входят боковой амиотрофический склероз, прогрессирующая спинальная мышечная атрофия, прогрессирующий бульбарный паралич и первичный боковой склероз), прогрессирующей мышечной дистрофии, врожденной миопатии и астенического бульбарного паралича.
Варианты осуществления
Варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы на следующих далее примерах получения лекарственной композиции в виде лекарственных форм, которые представляют собой инъекции, капсулы, таблетки и пилюли.
Пример 1
Лекарственную композицию приготовили из двух трав традиционной китайской медицины, которые использовали в следующем весовом соотношении: 5 весовых частей женьшеня и 2 весовые части Epimedium.
Процесс приготовления состоял из следующих стадий.
(1) Две названные травы традиционной китайской медицины очистили и измельчили, а затем отвесили согласно рецептуре.
(2) Трижды осуществили экстракцию женьшеня при помощи спирта крепостью 70%. В первый раз в женьшень добавили спирт, количество которого в 10 раз превышало количество порошка женьшеня, смесь нагрели до точки кипения, и в течение 1 часа осуществляли экстракцию при данной температуре. Во второй раз в женьшень добавили спирт, количество которого в 8 раз превышало количество женьшеня, оставшегося после первой экстракции, смесь нагрели до точки кипения, и в течение 1 часа осуществляли экстракцию при данной температуре. В третий раз в женьшень добавили спирт, количество которого в 8 раз превышало количество женьшеня, оставшегося после второй экстракции, смесь нагрели до точки кипения, и в течение 0,5 часа осуществляли экстракцию при данной температуре. Три полученных экстракта смешали и профильтровали, не давая остыть, затем конденсировали при пониженном давлении, чтобы получить концентрированный раствор, который поместили его в сосуд из нержавеющей стали. В концентрированный раствор добавили очищенную воду и перемешали его до получения однородной смеси. Смесь охладили в течение 24 часов, выдержали охлажденный раствор до достижения им комнатной температуры и отфильтровали его при помощи пластинчатого фильтра. Пластинчатый фильтр промыли небольшим количеством воды. Разбавили фильтрат очищенной водой и оставили готовым к использованию. Полученный концентрированный раствор женьшеня пропустили через абсорбционную колонну с предварительно очищенной макропористой смолой типа АВ-8 и затем промыли в указанном порядке водным раствором аммиака с рН 8-9 и спиртом крепостью 20%. Колонну элюировали спиртом крепостью 80% и собрали элюат. В элюат добавляли очищенную воду до тех пор, пока концентрация спирта не достигла 50%.
Полученный раствор пропустили через нейтральную абсорбционную колонну с оксидом алюминия и собрали выходящий поток. Колонну также очистили небольшим количеством спирта крепостью 50%, затем смешали выходящие потоки. В смешанный выходящий поток добавили соответствующее количество активированного угля, довели до кипения и орошали в течение 20 минут. Не давая смешанному выходящему потоку остыть, его подвергли фильтрации всасыванием при помощи пластинчатого фильтра. Полученный фильтрат собрали и концентрировали, чтобы получить концентрированный раствор. Раствор охладили в течение ночи. Для фильтрации раствора использовали осветляющий пластинчатый фильтр, фильтрат конденсировали и высушили при пониженном давлении. Затем получили экстракт женьшеня.
(3) Четыре раза осуществили экстракцию Epimedium. Количество добавляемой воды каждый раз в 20 раз превышало по весу количество трав. В первый раз Epimedium экстрагировали в течение 1 часа и в течение 0,5 часа в последующем.
Полученные экстракты смешали и отфильтровали, не давая остыть, затем конденсировали при пониженном давлении, чтобы получить концентрированный раствор, который поместили в сосуд из нержавеющей стали. В концентрированный раствор добавляли спирт до тех пор, пока его концентрация не достигла 70%. Раствор охладили, отфильтровали и концентрировали при одновременно извлечении спирта. В концентрированный раствор добавили очищенную воду и перемешивали его до тех пор, пока он не стал однородным. Смесь охладили и отфильтровали. Раствор Epimedium пропустили через адсорбционную колонну с макропористой смолой типа АВ-8 и промыли в указанном порядке очищенной водой и спиртом крепостью 20%.
Колонну элюировали спиртом крепостью 50% и собрали элюат. В элюат добавили соответствующее количество диатомовой земли и перемешали до получения однородной смеси. Для экстрагирования смеси трижды использовали безводный спирт. Экстракты смешали, концентрировали при пониженном давлении и высушили, одновременно извлекая спирт. Затем получили экстракт Epimedium.
(4) В смесь экстрактов, полученных на стадиях (2) и (3), добавили какой-либо обычный адъювант, такой как 1,2-пропиленгликоль, первичный кислый фосфат натрия и вторичный кислый фосфат натрия. Затем в полученную на данной стадии смесь добавляли воду для инъекций до тех пор, пока объем раствора не достиг 16 мл. Полученный раствор нагрели и кипятили в течение 30 минут, затем выдержали до комнатной температуры и охладили. Затем раствор поочередно отфильтровали через микропористую мембрану и ультрафильтрационную мембрану. Фильтрат расфасовали, упаковывали и стерилизовали, чтобы получить лекарственную композицию для инъекций согласно настоящему изобретению.
Пример 2
В данном примере лекарственную композицию приготовили из двух трав традиционной китайской медицины, которые использовали в следующем весовом соотношении: 9 весовых частей женьшеня и 7 весовых частей Epimedium.
Стадии приготовления лекарственной композиции в деталях в целом аналогичны стадиям (1)-(3) Примера 1. Были добавлены некоторые адъюванты, и в соответствии с обычной технологией приготовления лекарственных средств была получена лекарственная композиция в виде капсул.
Пример 3
В данном примере лекарственную композицию приготовили из двух трав традиционной китайской медицины, которые использовали в следующем весовом соотношении: 5 весовых частей женьшеня и 5 весовых частей Epimedium.
Стадии приготовления лекарственной композиции в деталях в целом аналогичны стадиям (1)-(3) Примера 1. Были добавлены некоторые адъюванты, и в соответствии с обычной технологией приготовления лекарственных средств была получена лекарственная композиция в виде таблеток.
Далее на примере испытаний на животных пояснено защитное действие, которое лекарственная композиция согласно настоящему изобретению оказывает на культивированные in vitro двигательные нейроны.
Задача: выявить защитное действие лекарственной композиции согласно настоящему изобретению (JWL) в виде инъекции на культивированные in vitro двигательные нейроны.
Методы: При помощи центрифугирования в градиенте плотности выделили двигательные нейроны спинного мозга у эмбрионов мышей и осуществили их первичное культивирование. С целью определить модель возбуждения токсичности моторными аминокислотными рецепторами и оценить защитное действие предложенной в настоящем изобретении лекарственной композиции (JWL) на двигательные нейроны добавили глутаминовую кислоту. Методом МТТ определили жизнеспособность клеток. Для измерения длины ствола нейритов применили метод иммуногистохимического окрашивания и анализ изображения. При помощи биохимического анализатора в супернатанте культуры обнаружили лактатдегидрогеназу. Для наблюдения утраты клеток использовали метод принудительного подсчета нейронов TUNEL.
1. Материалы и методы
1.1. Экспериментальные материалы
1.1.1. Лекарственные препараты
R
Предложенным в изобретении способом приготовили лекарственную композицию в виде инъекции в 8-мл ампуле (с содержанием сырьевого лекарственного препарата 0,94 г/мл). Компанией Aventis был изготовлен препарат Riluiek Riluzole, имеющий регистрационный номер для импортных лекарственных препаратов Н200020006 и номер партии 28097. Перед использованием его необходимо развести 0,9-процентным раствором NaCl-0,01 N HCl.
1.1.2. Реагенты
У компании Sigma приобрели среду для культивирования L15, тетраметилендиамин, парензим (1:250). полилизин, кроличьи антитела против NF-200, инсулин, проявитель диаминобензидина, МТТ и диметилсульфоксид. Лошадиную сыворотку и ламинин поставила компания Gibco BRL. Фетальную бычью сыворотку произвела компания Hyclone, а комплект TUNEL изготовила компания Roche Molecular Biochemical. Средства мочения биотином двойных антител и средства мечения пероксидазой из хрена тройных антител произвела компания Beijing Zhongshan Biologic Products Co., Ltd. Остальные реагенты были произведены в Китае с соблюдением существующих на рынке требований к химической чистоте.
1.1.3. Животные
Самки беременных чистопородных лабораторных мышей с "коротким хвостом" Данфорта со сроком беременности от 10 до 14 дней были поставлены Ветеринарным центром. Институтом военно-полевой хирургии, госпиталем Дейпин. Третьим военно-медицинским университетом. Чунцин, Китай.
1.1.4. Приборы
Прибор для мечения ферментом (DG3022A, Шанхай), система анализа изображений (Image Pro Plus 4.5, США), автоматический биохимический анализатор (ВесhМаn СХ7, США).
1.2. Методы
1.2.1. Исходная культура двигательных нейронов спинного мозга эмбрионов мышей
3
5
2
Были отобраны мыши со сроком беременности около 14 дней, у эмбрионов которых извлекли спинной мозг ниже плоскости ствола мозга, и после удаления спинномозговых оболочек и сосудов разрезали его на части объемом от 1 до 2 мм. Затем небольшие части в течение 30 минут подвергли перевариванию 0,125-процентными ферментами поджелудочной железы при температуре 37°C и пропустили через стальное сито №200. Отфильтрованную жидкость добавили в центрифужную пробирку, в которую предварительно поместили 1 мл 4-процентного альбумина бычьей сыворотки, и центрифугировали в течение 10 мин (300 г). Супернатант извлекли, растворили и осадили при помощи среды для культивирования L15 и затем добавили в 5-мл центрифужную трубку, в которую предварительно поместили 1 мл 6,8-процентного метризамида, и центрифугировали в течение 15 минут (500 г). Жидкость светлого цвета между двумя слоями жидкости извлекли методом всасывания и центрифугировали в течение 10 минут (300 г). Супернатант извлекли, растворили при помощи среды для культивирования L15 и затем получили суспензионную культуру нейронных клеток переднего рога спинного мозга. Концентрацию суспензии довели до 4,5×l0/мл. Суспензию поместили на культуральный планшет с 24 и 96 лунками и выращивали в инкубаторе с СО. Через 24 часа использовали поддерживающую среду для культивирования. Через 48 часов добавили 12,5 µг/мл 5-Fu и через 24 часа извлекли методом всасывания, после чего использовали для культивирования свежую поддерживающую среду.
1.2.2. Контроль условий проведения эксперимента
После культивирования двигательных нейронов в течение 72 часов 0,5-, 1- и 5-процентную жидкую лекарственную композицию для инъекций согласно настоящему изобретению, разведенную свежей средой для культивирования, в указанном порядке добавили в экспериментальную группу, в группу Rilutek добавили Riluzole (с конечной концентрацией 10 µмоль/л), а в контрольную группу добавили такое же количество среды для культивирования. Все три группы одновременно культивировали в течение 24 часов. Для возбуждения токсичности моторными аминокислотными рецепторами добавили глутаминовую кислоту (с конечной концентрацией 0,5 ммоль/л) и через 24 часа определили все показатели.
Определение жизнеспособности клеток методом МТТ
2
После тщательного удаления культурального раствора из 96-луночного культурального планшета при помощи всасывающей трубки в каждую лунку добавили 10 µл раствора МТТ с концентраций 5 мг/мл. После 4-х часового увлажнения 5-процентной СО при температуре 37°С супернатант удалили и в каждую лунку добавили 100 µл диметилсульфоксида. Планшет и течение 5 минут при комнатной температуре держали на портативном вибраторе. После полного растворения и измерения окрашенных веществ с использованием автоматического прибора мечения ферментом для определения жизнеспособности клеток использовали волну длиной λ=570 нм и опорную волну длиной λ=630 нм, и измерили оптическую плотность.
Иммуногистохимическое окрашивание NF-200
На 6-й день культивированные клетки зафиксировали обычным способом и заклеили планшет, добавили кроличье моноклональное антитело против NF-200 (1:1000) и через 24 часа (4°С) добавили меченный биотином диантииммуноглобулин (1:300). Спустя 60 минут (37°С) добавили меченную пероксидазой хрена стрептавидин-пероксидазу (1:300), которая участвовала в реакции в течение 60 минут (37°С). Для промывания, которое в общей сложности трижды в течение 5 минут осуществляли между описанными стадиями, использовали 0,01 моль LPBS. Для окрашивания в течение 5 минут использовали раствор диаминобензидина, спирт для градиентной дегидратации, ксилол для придания прозрачности и нейтральную смолу для заклеивания. В отрицательной контрольной группе для иммуногистохимической реакции вместо антисыворотки NF-200 использовали фосфатно-буферный раствор. Были последовательно использованы два покровных стекла и на каждое из них поместили 50 произвольно выбранных NF-200-позитивных нейронов. При помощи системы анализа изображений Quantimet-a измерили длину ствола нейрита.
Детектирование лактатдегидрогеназы
Из 24-луночного планшета извлекли культивированные клетки. Супернатант тщательно удалили путем отсасывания, рассортировали и пронумеровали. Для определения активности лактатдегидрогеназы в супернатанте использовали автоматический биохимический анализатор.
Детектирование методом TUNEL
2
2
Культивированные клетки зафиксировали обычным способом и заклеили планшет на 30 часов при помощи 0,3-процентного HO/метанола. Добавили раствор 0,1-процентного тритона и 0,1-процентного цитрата натрия и поместили на лед на 2 минуты. Добавили терминальную дезоксинуклеотид-трансферазу и меченный флуоресцином дезоксиуридинтрифосфат для инкубации в течение двух часов при температуре 37°С. Для инкубации в течение двух часов при температуре 37°С добавили связанное с пероксидазой хрена антифлуоресциновое антитело. Для окрашивания использовали нитросиний тетразолий/5-бром-4-хлориндолилфосфатазу. Для промывания, которое в обшей сложности трижды в течение 5 минут осуществляли между описанными стадиями, использовали 0,01 моль LPBS. Раствор дегидратировали и после того, как он стал прозрачным, запечатали. В отрицательную контрольную группу не добавляли терминальную дезоксинуклеотид-трансферазу. Испытание осуществили трижды для каждой экспериментальной группы. Число позитивных нейронов, окрашенных при помощи TUNEL, было подсчитано в пяти случайно выбранных полях зрения.
Статистический анализ
Данные были представлены с учетом среднеквадратичного отклонения . Для сравнения величин средней квадратичной ошибки был применен критерий Стьюдента. Для сравнения значимости различий между группами был проведен вариационный анализ.
2. Результаты
2.1. Морфология двигательных нейронов спинного мозга
Через четыре часа после посева нейронов клетки начали прилипать к стенке. Клетки являлись однородными и имели круглую или овальную форму. Спустя 24 часа в некоторых двигательных нейронах были обнаружены нейриты, при этом нейриты двигательных нейронов имели значительно большую длину в 1-процентной группе JWL. После культивирования в течение от 48 до 72 часов рост клеток на стенках заметно усилился; в клеточном теле стало постепенно появляться зернистое вещество; окружность оставалась четкой; росло число и длина нейритов. Спустя 96 часов нейриты заполнили поля зрения в перекрестном расположении. После роста в течение 5-6 дней клетки двигательных нейронов являлись наиболее округлыми и отличались лучшим преломлением. Ядра располагались по центру или сбоку клеток. Ядра имели яркий цвет и были легко отличимы от перикариона. Были заметны ядра и ядрышки. На пятый день культивирования после добавления в нейриты двигательных нейронов контрольной группы глутаминовой кислоты они начали уменьшаться. Культивированные нейроны 1-процентной группы JWL для инъекций демонстрировали лучший рост и отличались приемлемой плотностью. Нейриты были большими и толстыми и пересекались друг с другом.
При помощи окрашивания методом TUNEL в контрольной группе с добавлением глутаминовой кислоты была обнаружена утрата клеток двигательных нейронов и большая утрата клеточных тел, тогда как в однопроцентной группе JWL для инъекций утрата клеточных тел была значительно меньшей.
2.2. Влияние лекарственной композиции для инъекций согласно настоящему изобретению на нормальные двигательные нейроны, см. Таблицу 1 .
Статистические данные жизнеспособности клеток двигательных нейронов в 0,5-, 1- и 5-процентных группах JWL для инъекций отличались от данных контрольной группы (при Р<0,05). Жизнеспособность клеток в 1-процентной группе JWL была значительно выше. чем в группе Rilutek (при Р<0,05). Рост нейритов двигательных нейронов спинного мозга в 0,5- и 1-процентных группах JWL был значительно большим, чем в контрольной группе (при Р<0,05), и значительно отличался от группы Rilutek (при Р<0,05).
Таблица 1
Группа
Концентрация
Оптическая плотность
Нейриты (длина в µм)
Контрольная группа
0,230±0,130
159,71±48,95
Группа Rilutek
10 ммоль/л
0,266±0,141
192,08±89,07
0,5% группа JWL
4.5 µт/л
0,317±0,054
1
1,2
315,96±32,32
1% группа JWL
9 µг/л
1,2
0,396±0,087
1,2
373,46±80,24
5% группа JWL
45 µг/л
0,329±0,097
1
151,46±69,97
Примечание: 1. По сравнению с контрольной группой при Р<0,05.2. По сравнению с группой Rilutek при Р<0.05
2.3. Влияние лекарственной композиции для инъекций согласно настоящему изобретению на потерю лактатдегидрогеназы двигательными нейронами в результате возбуждения токсичности моторными аминокислотными рецепторами, см. Таблицу 2 .
Как показали результаты испытаний, содержание лактатдегидрогеназы в культуральных супернатантах 0,5-процентной группы JWL и групп Rilutek было ниже, чем в контрольной группе при Р<0,05, и значительно не отличалось при Р>0,05, что позволяет предположить, что и 0,5-процентная группа JWL, и группа Rilutek обеспечивают снижение потери лактатдегидрогеназы двигательными нейронами в результате повреждения глутаминовой кислотой.
Таблица 2
Группа
Концентрация
Лактатдегидрогеназа
Контрольная группа с добавлением глутаминовой кислоты
67,75±5,12
Rilutek+группа с добавлением глутаминовой кислоты
10 ммоль/л
58,50±4,20
1
0.5% группа JWL+группа с добавлением глутаминовой кислоты
4.5 µг/л
59,00±4,97
1
1% группа JWL+группа с добавлением глутаминовой кислоты
9 µг/л
61,50±3,11
5% группа JWL+группа с добавлением глутаминовой кислоты
45 µг/л
69,00±5,35
2
Примечание: 1. По сравнению с контрольной группой при Р<0,05.2. По сравнению с группой Rilutek при Р<0,05
2.4. Влияние лекарственной композиции для инъекций согласно настоящему изобретению на утрату клеток двигательными нейронами в результате возбуждения токсичности моторными аминокислотными рецепторами, см. Таблицу 3 .
Число TUNEL-позитивных клеток в 1-процентной группе JWL и группе Rilutek было меньшим, чем в контрольной группе (при Р<0,05). Число TUNEL-позитивных клеток в 0,5-процентной группе JWL и 5-процентной группе JWL уменьшилось, значительно не отличаясь от контрольной группы (при Р>0,05), но значительно отличаясь от группы Rilutek при Р<0,05.
Таблица 3
Группа
Концентрация
Число TUNEL-позитивных клеток
Контрольная группа с добавлением глутаминовой кислоты
19,8±5,63
Rilutek+группа с добавлением глутаминовой кислоты
10 ммоль/л
11,2±2,84
1
0.5% группа JWL+группа с добавлением глутаминовой кислоты
4.5 µг/л
16,2±2,08
2
1% группа JWL+группа с добавлением глутаминовой кислоты
9 µг/л
9,8±4,34
1
5% группа JWL+группа с добавлением глутаминовой кислоты
45 µг/л
16,4±3,65
2
Примечание: 1. По сравнению с контрольной группой при Р<0,05.2. По сравнению с группой Rilutek при Р<0,05
Как показывает описанное испытание, предложенная в настоящем изобретении лекарственная композиция обладает защитным действием как на нормальные двигательные нейроны, так и двигательные нейроны, поврежденные в результате возбуждения токсичности моторными аминокислотными рецепторами.