Новый принцип селекции вакцинного вируса на основе количественного уровня экспрессии G-белка главного иммуногена вируса бешенства

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 578.821.5:578.53].083.2

С. В. Грибенча1, М. А. Лосин1, Л. Ф. Грибенча1, И. В. Непоклонова2

Новый принцип селекции вакцинного вируса на основе количественного уровня экспрессии G-белка - главного иммуногена вируса бешенства

'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России;

2АНО «НИИ ДПБ» Институт болезней человека и животных, Москва

Описан новый принцип селекции вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB20M на основе количественного уровня экспрессии гликопротеина - главного иммуногена вируса бешенства. Установлена зависимость уровня количественной экспрессии гликопротеина от уровня аттенуации вакцинного вируса. Реализация нового принципа селекции вакцинного вируса позволит получить более безопасную и более иммуногенную вакцину против бешенства.

Ключевые слова: вакцинный вирус бешенства, селекция, экспрессия G-белка, патогенность, титр вируса, уровень аттенуации

A new principle in the selection of vaccinal rabies virus based on quantitation of the expression of G protein, a major immunogen of rabies virus

S. V. Gribencha1, M. A. Losich1, L. F. Gribencha1, I. V. Nepoklonova2

1D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow; 2Research Institute of Human and Animal Diseases, Moskow

The paper describes a new principle of the selection of the rabies virus vaccine strain ERA-CB20M based on quantitation of the expression of glycoprotein, a major immunogen of rabies virus. there is a correlation between the level of glycoprotein expression and that of vaccine virus attenuation. the application of the new principle for vaccine virus selection will permit a safer and more immunogenic rabies vaccine to be prepared.

Key words: vaccinal rabies virus, selection, G protein expression, pathogenicity, virus titer

Вирус бешенства занимает особое положение в инфекционной патологии. Он поражает ЦНС всех млекопитающих. После проникновения вируса бешенства в ЦНС шансы на выживание равны нулю. Поэтому современные стратегия и тактика борьбы с бешенством заключаются в предупреждении инфицирования человека и животных, а если вирус проник в организм, - в предупреждении его попадания в ЦНС и развития бешенства. Для решения последней задачи есть только два средства - антирабическая вакцина и антирабический иммуноглобулин.

Эффективность антирабической вакцины определяется триадой - вакцинным вирусом, технологией производства, методом и схемой иммунизации. Любой компонент триады существенен. Однако очевидно, что ведущим среди них является штамм вакцинного вируса.

Одним из наиболее детально изученных, перспективных и широко применяемых в ветеринарной практике вакцинных вирусов бешенства является штамм ERA и другие производные фиксированного вируса бешенства штамма SAD [1, 4, 6].

Штамм ERA, адаптированный к линии клеток ВНК-21, был любезно предоставлен нам д-ром T. Wiktor из Института Вистар (США). Однако при сравнительном исследовании нейровирулентности штамм ERA оказался более патогенен, чем штаммs Внуково-32, Внуково-37 и CVS-11, а титр вируса не превышал 6,5-6,8 lg LD^/мл [1].

Ранее нами впервые было показано, что популяция штаммов вируса бешенства гетерогенна по составу

биологических вариантов, а также установлена возможность селекции (выделения) биологических вариантов из популяции штамма вируса [8-10].

Эти данные были подтверждены международной группой исследователей в Центре научных исследований Франции под руководством Anne Flamand [5].

Используя изложенные нами ранее [8-10] принципы селекции биологических вариантов из популяции штаммов уличного вируса бешенства, мы определили задачу наших исследований, которая заключалась в селекции популяции вакцинного вируса, характеризующегося сравнительно более низкой патогенностью и количественно более выраженной экспрессией гликопротеина, с целью получения более безопасной и более иммуногенной вакцины против бешенства.

Материалы и методы

Вирус. Вирус штамм ERA, полученный от д-ра Т. Wiktor из Института Вистар (США) в 1972 г., культивировали в культуре клеток ВНК-21 в среде DMEM с 2% эмбриональной сывороткой телят. Титр вируса определяли в lg LD/мл при применении методов интрацеребрального (ic) и внутримышечного (im) заражения мышей, а также в культуре клеток ВНК-21 в lg ТСГО50/мл по стандартной методике.

Животные. Патогенность вируса исследовали в опытах на белых беспородных мышах массой 6-7, 12-13 и 16-18 г, морских свинках массой 270-330 г, белых крысах массой 200-250 г и кроликах шиншилла массой 2-2,5 кг при различных методах заражения (табл. 1, 2).

Контактная информация:

Грибенча Сергей Васильевич, д-р мед. наук, рук. лаб.; e-mail: gribencha@rambler.ru

44

Таблица 1

Сравнительное исследование патогенности вирусов штамм ERA и ERA-CB20M в опытах на мышах,

зараженных в мозг, мышцу и подкожно

Метод заражения Масса животных, г Объем инокулята, мл Вирус штамм ERA* Вирус штамм ERA-CB20M**

титр вируса или доза, mic LD^ пали/число животных в опыте титр вируса или доза, mic LD50 пали/число животных в опыте

6-7 0,03 6,53 6,83

Внутримозговой (ic) 16-18 0,03 6,45 6,5

6-7 0,1 3,82 < 3,0

Внутримышечный (im) 16-18 0,2 1,9 < 1,0

12-13 0,2 6000 0/10 6000 0/10

6-7 0,5 1 051 000 6/10 1 063 000 4/10

0,5 105 000 2/10 106 000 0/10

Подкожный (sc) 16-18 0,5 1 051 000 2/10 1 063 000 0/10

0,5 105 000 0/10 105 000 0/10

12-13 0,5 6000 0/10 6000 0/10

Примечание. * - вирус штамм ERA с титром вируса 7,53 lg LD5!/мл и 400 нг/мл G-белка представляет собой смесь трех популяций (сборов) вируса под номерами 1а, 1б, 1в (см. табл. 3); ** - вирус ERA-CB20M с титром вируса 7,9 lg LD^/мл и 1900 нг/мл гликопротеина представляет собой смесь трех популяций вируса под номерами 6, 10 и 11 (см. табл. 3). Эти смеси популяций вирусов ERA и ERA-CB20M были использованы для сравнительного изучения их патогенности для мышей, морских свинок, белых крыс и кроликов; mic - мышиная интрацеребральная lg LD50.

Таблица 2

Сравнительное исследование патогенности вирусов штамм ЕRA и ЕRA-СВ20М в опытах на морских свинках, белых крысах и кроликах

Вид и масса Метод заражения, Доза вируса в Вирус штамм ERA Вирус штамм ERA-СВ20М

животных объем в мл micLD50 заболели пали заболели пали

Морские свинки im 0,5 1 580 000 2/10 1/10 1/10 0/10

270-330 г sc 0,5 1 580 000 0/5 0/5 0/5 0/5

im 0,5 1 580 000 2/5 1/5 0/5 0/5

Белые крысы im 0,5 158 000 0/5 0/5 1/5 0/5

200-250 г sc 0,5 1 580 000 1/5 0/5 0/5 0/5

Кролики im 1,0 3 160 000 0/5 0/5 0/5 0/5

шиншилла im 1,0 316 000 0/3 0/3 0/3 0/3

2-2,5 кг sc 1,0 3 160 000 0/3 0/3 0/3 0/3

Селекция популяции вируса штамм ERA-CB20M. Культуру клеток ВНК-21 заражали вирусом ERA в дозах 50, 250, 1250, 6250 и 31 250 LD50 Через 5, 7, 10 и 13 дней делали сборы вируса. Определяли титр вируса в каждой пробе сборов путем внутримозгового заражения мышей массой 6-7 г, а также количество гликопротеина (в нг/ мл), иммуноферментным методом, разработанным нами совместно с проф. Л. Б. Эльбертом [3], на основе полученных нами моноклональных антител (1-С5) к гликопротеину вакцинного вируса штамма Внуково-32 [2].

Разработанный нами вариант твердофазного иммуноферментного анализа для количественного определения гликопротеина (в нг/мл) в сборах вирусов предусматривает организацию в 96-луночных пластиковых панелях трехслойного “сандвича”, где первый слой представлен моноклональными антителами (МКА 1-С5) к G-белку [2], а следующие два - антигенным тест-материалом и упомянутыми выше МКА, конъюгированными с пероксидазой хрена [3].

Антигенным тест-материалом служили пробы популяций (сборов) вирусов, вирусные и вакцинные полуфабрикаты, а также готовая культуральная антирабическая вакцина. С целью удаления растворимой фракции гликопротеина, не обладающего антигенной активностью, тестируемые образцы обрабатывали ПЭГ-6000. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере.

Оптическую плотность реакционной смеси в лунках оценивали в приборе Reader (“Labsystems Multiskan”, Великобритания) при длине волны 450 нм. Количество G-белка в испытуемых популяциях вируса рассчитывали по кривой зависимости оптической плотности от этой концентрации для стандартного антигенного образца. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Определение количества G-белка в пробах сборов вируса рассматривали как основной критерий селекции популяции вируса. Основанием для такого подхода служили работы [7, 13, 14], в которых было установлено наличие корреляции между степенью аттенуации штамма вируса бешенства и уровнем экспрессии гена гликопротеина. Так, высокопатогенные штаммы вируса бешенства экспрессируют низкий уровень G-белка, низкий уровень МНС второго класса и не индуцируют апоптоз нейронов, тогда как слабовирулентные штаммы вируса наоборот [11]. Далее технология селекции заключалась в отборе из сборов каждого пассажа той популяции вируса, в которой определяли наиболее высокий уровень гликопротеина и титр вируса. Популяции (сборы) вируса, в которых определяли наиболее высокий уровень гликопротеина, затем использовали для последующих пассажей, сборов и титрований.

В результате проведенных пассажей удалось селекционировать популяцию вируса с относительно стабильной высокой экспрессией гликопротеина от 500 до 2400 нг/мл, которая явилась основой нового вакцинного штамма вируса бешенства ERA-CB20M. Выделенный биологический вариант прошел 20 последовательных пассажей в культуре клеток ВНК-21 и получил новое обозначение - вакцинный вирус штамм ERA-CB20M (С - селекция, В - вариант, 20 - 20 последовательных пассажей, М - Москва).

Кроме того, в ходе проведенных пассажей по селекции новой популяции вакцинного вируса ERA-СВ20М возникло предположение, что вирус ERA-СВ20М менее патогенен, чем исходный вирус штамм ERA. Для решения этого принципиального для вакцинного ви-

45

руса вопроса важно было сравнительно изучить патогенность этих вирусов для лабораторных животных.

Сравнительное изучение патогенности вирусов ERA и ERA-CB20M. Для сравнительного изучения патогенности вирусов ERA и ERA-CB20M в опытах на мышах, морских свинках, белых крысах и кроликах мы использовали смесь трех популяций (сборов) вируса ERA в равных объемах (1а, 1б, 1в в табл. 3), а также смесь трех популяций (сборов) вируса ERA-СВ20М под номерами 6, 10, 11 (см. табл. 3). Смесь популяций вируса штамм ERA содержала 400 нг/ мл G-белка, а смесь популяций вируса штамм ERA-СВ20М - 1900 нг/мл гликопротеина.

Результаты

Сравнительное исследование патогенности вирусов ERA и ERA-СВ20М в опытах на беспородных белых мышах, зараженных в мозг, мышцу и подкожно

Из табл. 1 видно, что существенная разница между патогенностью вирусов ERA и ERA-CB20M при применении метода самого высокопатогенного внутримозгового заражения отсутствует как для молодых (6,53 и 6,83 lg LD50), так и для взрослых мышей (6,45 и 6,5 lg LD50 соответственно).

Однако при методе внутримышечного заражения (см. табл. 1) выявляется определенная повторяемая разница в патогенности между вирусами. Более высокая патогенность штамма ERA по сравнению с вирусом ERA-CB20M установлена как для молодых (3,82 и < 3,0 lg LD/мл), так и для взрослых животных (1,9 и < 1,0 lg LD/мл соответственно).

Четкие различия в патогенности вирусов для мышей выявлены и при подкожном методе их введения. Так, при подкожном введении вируса ERA в дозе 1 051 000 micLD50 из 10 молодых мышей заболели 6, а из 10 молодых мышей, инфицированных вирусом

Количество G-белка

Таблица 3

основного иммуногена вакцинного вируса бешенства не зависит от титра вируса

в популяции вакцинного вируса штамм ERA-CB20M

Номера групп популяций вирусов в зависимости от титра вируса Условные номера популяции вирусов Штамм вируса День сбора вирусов Титр вируса, lg LD^/мл Количество G-белка, нг/мл

i 1а ERA 5-й 6,8 450

1б ERA 3-й 7,3 520

1в ERA 7-й 7,5 200

2 ERA-CB20M 3-й 6,8 525

3 ERA-CB20M 7-й 6,9 1400

4 ERA-CB20M 3-й 7,5 844

II 5 ERA-CB20M 7-й 7,9 1600

6 ERA-CB20M 5-й 7,9 1900

7 ERA-CB20M 3-й 7,82 450

8 ERA-CB20M 7-й 7,83 220

III 9 ERA-CB20M 5-й 8,0 1250

10 ERA-CB20M 3-й 8,0 2400

11 ERA-CB20M 8-й 8,0 1600

12 ERA-CB20M 5-й 8,2 2780

13 ERA-CB20M 5-й 8,0 2400

14 ERA-CB20M 5-й 8,04 1250

15 ERA-CB20M 5-й 8,3 1000

16 ERA-CB20M 5-й 8,33 2400

17 ERA-CB20M 5-й 8,32 3100

ERA-CB20M, - 4 животных. При заражающей дозе 105 000 LD вируса ERA заболели 2 мыши, и ни одна мышь не заболела при инфицировании вирусом ERA-СВ20М. Для взрослых мышей при дозе заражения 1 051 000 micLD50 пали 2 из 10 мышей, инфицированных вирусом ERA, и ни одна мышь при заражении вирусом ERA-CB20M. Оба вируса оказались апатоген-ными при заражающей дозе 1 051 000 micLD50, а также при дозе 6000 micLD50 для мышей массой 12-13 г как при im-, так и при sc-методах заражения.

Сравнительное исследование патогенности вакцинных вирусов ERA и ERA-СВ20М в опытах на морских свинках, белых крысах и кроликах, зараженных внутримышечно и подкожно

Из табл. 2 видно, что из 2 заболевших морских свинок, зараженных внутримышечно вирусом ERA в дозе 1 580 000 micLD50, одно животное пало, а другое выздоровело с выраженным параличом левой задней лапки (место инфицирования). Из 10 морских свинок, зараженных вирусом ERA-CB20M в дозе 1 580 000 micLD50, заболело только одно животное, которое выздоровело с параличом левой задней лапки. При подкожном методе заражения животных в дозе 1 580 000 micLD50 оба вируса оказались апатогенными.

При внутримышечном заражении белых крыс вирусом ERA в дозе 1 580 000 micLD50 заболели 2 крысы, из которых 1 выздоровела с остаточным параличом левой задней лапки, и ни одно животное не заболело из группы крыс, зараженных вирусом ERA в дозе 158 000 LD50.

Из 2 групп белых крыс, зараженных вирусом ERA-СВ20М, заболело только 1 животное, которое выздоровело после инокуляции 158 000 LD50 (см. табл. 2). При подкожном заражении белых крыс вирусом ERA в дозе 1 580 000 LD50 заболело и выздоровело одно животное, и ни одна крыса не заболела из группы животных, инфицированных вирусом ERA-CB20M. Наконец, оба вируса (ERA и ERA-CB20M) оказались апатогенными при заражении кроликов в мышцу в дозах 3 160 000 или 316 000 micLD50 подкожно в дозе 3 160 000 micLD50.

Количество G-белка — основного иммуногена вакцинного вируса бешенства не зависит от титра вируса в конкретной популяции (сборе) вакцинного вируса ERA-CB20M Ранее нами [8-10], а затем международной группой исследователей [5] было установлено, что популяция штаммов вируса бешенства гетерогенна по биологическим вариантам, которые определяют разнообразие биологических свойств. Другие исследователи [11, 31, 14] выявили корреляцию между уровнем экспрессии гликопротеина вируса бешенства и степенью патогенности вируса. Поэтому следующей задачей наших исследований было выяснение вопроса: существует ли зависимость количества определяемого G-белка в конкретном сборе (популяции) вируса от его титра.

Для этого в сборах культурального вируса штамм ERA и ERA-CB20M определяли количество G-белка [3] и титр вируса путем внутримозгового заражения молодых мышей массой 6-8 г. Результаты исследований представлены в табл. 3.

46

Из таблицы видно, что на фоне низкой вариабельности титра вируса наблюдается широкая вариабельность значений количества G-белка в исследуемых сборах вакцинного вируса бешенства штамм ERA и ERA-CВ20М. При этом количественный уровень гликопротеина не зависит от титра вируса. Так, в I группе вирусов ERA и ERA-СВ20М инфекционные титры колебались от

6.8 до 7,5 lg LD/мл, а количества G-белка - от 200 до 1400 нг/мл.

Во II группе популяции вирусов практически выявлены одни и те же титры вируса 7,82-7,9 5 lg LD/мл, однако количество G-белка колебалось в широких пределах (220-1900 нг/мл). Наконец, в III группе популяции сборов вируса, в которой титры вируса незначительно варьировали (8,0-8,33 5 lg LD/мл), наблюдали троекратное колебание количества G-белка (1000-3100 нг/мл).

Количественный уровень G-белка зависит только от штамма вируса. Так, в I группе вирусов титры популяций вируса штамм ERA-CB20M (№ 2, 3, 4) колебались от

6.8 до 7,5 5 lg LD/мл, а количество G-белка - от 525 до 1400 нг/мл, тогда как в популяциях вируса штамм ERA (№ 1а, 1б, 1в) с такими же титрами вируса (6,8, 7,3 и 7,5 5 lg LD/мл), как в популяциях штамм ERA-CB20M, количество гликопротеина не превышало 200-520 нг/мл.

Обсуждение

В настоящем исследовании представлен новый принцип селекции популяции вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB20M. Новый принцип основан на селекции популяции (биологического варианта) вируса с наиболее высоким уровнем экспрессии гликопротеина - основного иммуногена вируса бешенства [12]. Полученный в результате селекции вариант вакцинного вируса штамм ERA-CB20M отличается от популяции родительского вируса штамма ERA сравнительно меньшим уровнем патогенности для белых мышей, морских свинок и белых крыс (см. табл. 1, 2) и более высоким уровнем экспрессии G-белка (см. табл. 3).

Важно подчеркнуть, что при сравнительном исследовании патогенности вирусов ERA и ERA-CB20M для лабораторных животных были использованы одинаковые дозы заражения в LD50. Тем не менее патогенность вируса штамм ERA (смесь популяций 1а, 1б, 1в) оказалась более выраженной для лабораторных животных по сравнению с вирусом штамм ERA-CB20M (смесь популяций 6, 10, 11; см. табл. 1 ,2). Уровень экспрессии G-белка вируса штамм ERA-CB20M (популяции 6, 10, 11) был выше (1900, 2400, 1600 нг/мл), чем вируса штамм ERA (450, 520 и 200 нг/мл; см. табл. 3).

При этом важно констатировать, что результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют об отсутствии какой-либо корреляции между титром вируса, днем сбора вируса и количеством гликопротеина в конкретных популяциях вируса штамм ERA-CB20M. ^едова-тельно, уровень экспрессии G-белка, в условиях наших экспериментов не зависит от титра вируса.

Возникает вопрос: с чем связан более высокий уровень экспрессии G-белка вируса штамм ERA-CВ20М по сравнению с вирусом штамм ERA. Из технологии приготовления концентрированной антирабической вакцины из штамма Внуково-32 известно, что полуфабрикаты вируса содержали от 100 до 250 нг/мл гликопротеина, и только концентрирование вируса позволяло повышать уровень гликопротеина до > 900 нг/мл - уровень гликопротеина в концентрированной вакцине (личное сообщение проф. Л. Б. Эльберта).

В условиях наших экспериментов концентрирование вируса не проводили. Поэтому единственное объяснение более высокого уровня гликопротеина (1900, 2400,

1600 нг/мл) в популяциях вируса ERA-CВ20М (6, 10, 11) по сравнению с вирусом ERA (450, 520 и 200 нг/мл) -это установленное нами наличие корреляционной связи между уровнем патогенности (или апатогенности) для лабораторных животных вирусов ERA и ERA-CВ20М и уровнем экспрессии G-белка.

Таким образом, выявленная ранее корреляционная связь между уровнем экспрессии гликопротеина [13, 14] и уровнем патогенности вирусов бешенства подтверждена на модели вакцинного вируса бешенства и использована как критерий селекции для получения менее патогенного, но с более выраженной экспрессией G-белка вакцинного вируса штамм ERA-CВ20М.

Установленная вариабельность количества гликопротеина в сборах вакцинного вируса ERA-CВ20М позволяет предположить, что популяция вируса остается гетерогенной, но закономерности, определяющие колебания популяции вируса с выраженной экспрессией G-белка, пока неясны.

В заключение необходимо отметить, что включение дополнительного экспресс-метода контроля - определения количественного уровня экспрессии гликопротеина в посевном вирусе, полуфабрикатах, а также в готовой вакцине - позволит существенно сократить цикл производства и создать эффективную технологию с заданными параметрами иммуногенности антирабической вакцины.

ЛИТЕРАТУРА

1. Грибенча Л. Ф., Селимов М. А. Cравнительное изучение RCT-40 и патогенности признаков культуральных вакцинных штаммов вируса бешенства // Материалы симпозиума по бешенству - 24-27 октября 1972 г. Москва. - C. 43-46.

2. Грибенча С. В., Василенко О. В., Фуралев В. А. и др. Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурным белкам вируса бешенства штамм «Внуково-32» // Вопр. вирусол. - 1991. - № 4. - C. 318-321.

3. Грибенча С. В., Эльберт Л. Б., Алипер Т. И. и др. Количественное определение гликопротеина - основного иммуногена вакцинного вируса бешенства, методом иммуноферментного анализа // Труды Московского международного ветеринарного конгресса. - М., 2005.

4. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству. Восьмой доклад. - Женева, 1992. - C. 18.

5. Benmansour A., BrahimiM., Tuffereau C. et al. Rapid sequence evolution of street rabies glycoprotein is related to the highly heterogeneous nature of the viral population // Virology. - 1992. - Vol. 187. - P. 33-45.

6. Blancou J. La vaccination des renards contre la rage // Ann. Med. Vet. -1985. - Vol. 129. - P 329-337.

7. FaberM., Pulmanausahakul M., Hadawadekar S. et al. Over-expression of the rabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response // J. Virol. - 2002. - Vol. 76. - P. 3374-3381.

8. Gribencha S. V, Vanag K. A., Obukhova V. R., Shubladze A. K. Experimental studies of chronic rabies // Ann. Virol. (Institute of Pasteur). -1980. - Vol. 131. - P. 302-312.

9. Gribencha S. V, Vanag K. A., Barinsky I. F. Separation of 2 street rabies strain population into two biological variants //Acta Virol. - 1981. Vol. 25. - P. 168.

10. Gribencha S. V, Gribanova L. Ja., Malkov G. B., Barinsky I. F. Population structure of some street rabies virus strains // Arch. Virol. - 1989.

- Vol. 104. - P 347-350.

11. Hooper D. G. The role of immune response in the pathogenesis ofralnes // J. Neurovirol. - 2005. - Vol. 11. - P 88-92.

12. MacfarlanR. I., DietzscholdB., Koprowsky H. et al. Stimulation of cytotoxic T-lyphocyte responses by rabies virus glycoprotein and identification of on immunodominant domain // Mol. Immunol. - 1986. - Vol. 23.

- P. 733-741.

13. Sarmento Luciana, LiXia, Howerth Elizabeth et al. Glycoprofein - mediated induction of opoptosis limits the spread of attenuated rabies viruses in the central nervous system of mice // J. Neurovirol. - 2005. - Vol. 11.

- P. 571-581.

14. Wang Zhi W., Sarrmento L., Wang Y. et al. Attenuated Rabies virus activates while Pathogenic rabies virus evades, the host innate immune responses in the central nervous system // J. Virol. - 2005. - Vol. 79, N 19.

- P. 12554-12565.

Поступила 24.03.11

47